возрастные особенности изменений в системе глутатиона в сердце крыс при иммобилизационном стрессе

експериментальні роботи
УДК [612.17+577·15]:57.042./048
возрастные особенности изменений
в системе глутатиона в сердце крыс
при иммобилизационном стрессе
В. Н. ШВЕЦ1, В. В. ДАВЫДОВ2
Запорожский государственный медицинский университет;
Государственное учреждение «Институт охраны здоровья детей и подростков АМНУ»;
e-mail: davydov@kharkov.com
1
2
С целью выяснения причин возрастного снижения устойчивости сердца к стрессу было предпринято изучение состояния пула глутатиона и активности ферментов его метаболизма в сердце
взрослых и старых крыс при иммобилизационном стрессе. Исследования показали отсутствие различий в состоянии пула глутатиона в миокарде взрослых и старых интактных крыс. При иммобилизационном стрессе у крыс обеих возрастных групп происходит уменьшение содержания восстановленного
глутатиона. У взрослых животных параллельно увеличивается содержание окисленного глутатиона в
сердце, чего не наблюдается у старых крыс. Обсуждается возможность возрастного изменения преимущественных путей утилизации восстановленного глутатиона в сердце при стрессе.
К л ю ч е в ы е с л о в а: старение, миокард, иммобилизационный стресс, пул глутатиона.
П
ри старении происходит изменение
чувствительности тканей к свобод­
норадикальному повреждению [1,2].
Одним из частных проявлений этого являет­
ся возрастная модуляция пероксидного окис­
ления липидов в сердце крыс при стрессе [3],
формирование которого, как известно, тесно
связано со стимуляцией свободнорадикальных
процессов в миокарде [4, 5]. Однако причины
возникновения этого феномена до настоящего
времени все еще не ясны.
Важную роль в защите тканей от свобод­
норадикального повреждения играет антиок­
сидантная система. Особое положение в ней
занимает глутатион. Это связано с тем, что он
принимает участие в утилизации пероксида
водорода и органических пероксидов [6, 7], а
также в конъюгации цитотоксических карбо­
нильных продуктов метаболизма [8, 9]. Сущест­
вуют сведения о том, что изменение уровня глу­
татиона выступает в качестве чувствительного
маркера оксидативного стресса [10, 11]. Вместе
с тем до настоящего времени отсутствуют чет­
кие представления о возрастных особенностях
участия глутатиона в антиоксидантной защи­
те клеток, а также проявлении его антистрес­
сорного эффекта при старении. Учитывая это,
целью работы явилось изучение содержания
глутатиона и активности ферментов его мета­
болизма в сердце взрослых и старых крыс при
иммобилизационном стрессе.
74
Материалы и методы
Работа выполнена на 48 крысах-самцах
линии Вистар 12- и 24-месячного возраста.
Все животные были поделены на 2 подгруппы:
1 – интактные и 2 – крысы, подвергнутые им­
мобилизационному стрессу путем фиксации
на спине в течение 30 минут. Развитие стресса
контролировали по уровню 11-оксикортико­
стероидов [12] и адреналина [13] в крови.
Животных декапитировали под легким
эфирным наркозом. Извлекали сердце. Вы­
деляли миокард левого желудочка, который
гомогенизировали в стеклянном гомогениза­
торе Поттера–Эльвейема в среде выделения,
содержащей 0,25 М сахарозы и 0,01 М трис
(рН 7,4). Гомогенат фильтровали через 4 слоя
марли и центрифугировали в течение 10 минут
при 1000 g. Полученный супернатант повтор­
но центрифугировали в течение 20 минут при
10 000 g. Супернатант использовали в качест­
ве постмитохондриальной фракции миокарда.
Фракционирование проводили при 4–6 °С.
В постмитохондриальной фракции опре­
деляли активность глутатионпероксидазы [14],
глутатион-S-трансферазы [15] и глутатионре­
дуктазы [16], а также измеряли содержание
карбонилированных протеинов [17].
Для определения концентрации глутатио­
на миокард гомогенизировали с 1 н раствором
охлажденной хлорной кислоты. Полученный
гомогенат центрифугировали при 5000 g в те­
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
В. Н. ШВЕЦ, В. В. ДАВЫДОВ
чение 15 минут. Супернатант нейтрализовали
и использовали для определения содержания
окисленного и восстановленного глутатиона
[18]. Расчеты проводили по калибровочной
кривой. Содержание восстановленного глута­
тиона определяли также и в депротеинизиро­
ванных пробах постмитохондриальной фрак­
ции.
Содержание протеина определяли по ме­
тоду Лоури.
Полученные данные подвергали статисти­
ческой обработке с использованием непарамет­
рического метода Вилкоксона–Манна–Уитни.
При иммобилизационном стрессе у 12-ме­
сячных крыс возрастает концентрация окис­
ленного глутатиона на 67% по сравнению с та­
ковой у интактных животных. Одновременно
у них уменьшается уровень восстановленности
пула глутатиона (GSH/GSSG) в сердце в 2,2
раза по сравнению с его исходной величиной.
У старых крыс, подвергнутых 30-минут­
ной иммобилизации, происходит уменьшение
концентрации восстановленного глутатиона в
сердце на 23% по сравнению с его исходным
уровнем. Однако изменения концентрации
окисленного глутатиона и уровня восстанов­
ленности пула глутатиона в миокарде у них не
происходит.
Сходные результаты получены и при из­
мерении концентрации восстановленного глу­
татиона в постмитохондриальной фракции
миокарда взрослых и старых крыс после их
30‑минутной иммобилизации (рис. 1).
Для оценки причин возникновения обна­
руженных сдвигов у крыс исследованных групп
было проведено определение глутатионперок­
сидазной, глутатионтрансферазной и глутати­
онредуктазной активности в сердце животных.
Исследования показали, что как у взрослых,
так и у старых крыс, после 30-минутной иммо­
билизации изменения глутатионпероксидазной
и глутатионтрансферазной активности в пост­
Результаты и обсуждение
Результаты определения концентрации
окисленного и восстановленного глутатио­
на в сердечной мышце крыс представлены в
табл. 1. Из нее видно, что у старых (24-месяч­
ных) животных концентрация окисленного и
восстановленного глутатиона в миокарде со­
ответствует ее величине у взрослых 12-месяч­
ных крыс. Аналогичным образом активность
ферментов метаболизма глутатиона (глутатион­
пероксидазы, глутатион-S-трансферазы и глу­
татионредуктазы) в постмитохондриальной
фракции сердечной мышцы у старых крыс не
отличается от ее величины у взрослых живот­
ных (табл. 2).
Т а б л и ц а 1. Возрастные особенности изменения концентрации глутатиона в сердце (мкмоль/мг белка) крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу (M ± m)
Группа животных
Глутатион
восстановленный (GSH)
Глутатион окисленный
(GSSG)
GSH/GSSG
Взрослые
Старые
Интактные
Стресс
Интактные
Стресс
2,9 ± 0,1
2,6 ± 0,1
3,1 ± 0,2
2,4 ± 0,1*
0,093 ± 0,020
0,151 ± 0,002*
0,122 ± 0,023
0,104 ± 0,004
36 ± 9
17 ± 1*
31 ± 3
24 ± 3
Примечание. В исследованиях использовалось 5 – 6 крыс. * Р < 0,05 по сравнению с интактными
Т а б л и ц а 2. Активность ферментов метаболизма глутатиона в постмитохондриальной фракции
сердца взрослых и старых крыс (нмоль/мин на 1 мг белка), подвергнутых иммобилизационному стрессу
(M ± m)
Группа животных
Глутатион-пероксидаза
Глутатион-S-трансфераза
Глутатион-редуктаза
Взрослые
Старые
Интактные
Стресс
Интактные
Стресс
25,5 ± 2,3
25,5 ± 0,7
22,5 ± 1,7
20,5 ± 1,5
6,7 ± 0,6
6,0 ± 0,3
5,5 ± 0,7
7,0 ± 0,7
0,57 ± 0,10
0,55 ± 0,06
0,43 ± 0,05
1,2 ± 0,2*
В исследованиях использовалось 5 – 6 крыс. * Р < 0,05 по сравнению с интактными
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
75
експериментальні роботи
нмоль/г протеина
утилизации восстановленного глутатиона. Ха­
рактер обнаруженных изменений концентра­
ции окисленного и восстановленного глутатио­
на, позволяет высказать предположение, что у
старых крыс, в отличие от взрослых животных,
ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ
*
*
повышается интенсивность использования
ɫɬɪɟɫɫ
восстановленного глутатиона для конъюгации
с карбонильными продуктами свободноради­
кального окисления. Обращает на себя внима­
ние тот факт, что появление этих особенностей
не связано с модуляцией глутатионперокси­
дазной и глутатионтрансферазной активности
ɜɡɪɨɫɥɵɟ
ɫɬɚɪɵɟ
в кардиомиоцитах.
ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ
*
*
Можно предположить, что одной из воз­
интактные крысы
в состоянии стресса
ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ
ɫɬɪɟɫɫ
*
можных причин появления возрастных разли­
ɫɬɪɟɫɫ
чий в уровне снижения концентрации восста­
Рис. 1. Концентрация восстановленного глутановленного глутатиона в сердце при стрессе
тиона в постмитохондриальной фракции мио­
является изменение скорости глутатионре­
карда взрослых и старых крыс, подвергнутых
Ɋɢɫ.1.
Ʉɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹ ɜɨɫɫɬɚɧɨɜɥɟɧɧɨɝɨ
ɝɥɭɬɚɬɢɨɧɚ (ɧɦɨɥɶ/ɝ
ɛɟɥɤɚ)
ɜ Однако отсутствие разли­
дуктазной
реакции.
иммобилизационному
стрессу. В экспериментах
в содержании
использовалось
по 5–6
крыс. *ɦɢɨɤɚɪɞɚ
Р < 0,05 по
сравɜɡɪɨɫɥɵɟ
ɫɬɚɪɵɟ
ɩɨɫɬɦɢɬɨɯɨɧɞɪɢɚɥɶɧɨɣ
ɮɪɚɤɰɢɢ
ɜɡɪɨɫɥɵɯ
ɢчийɫɬɚɪɵɯ
ɤɪɵɫ, восстановленного NADP в
серд­це взрослых и старых крыс, подвергнутых
нению
с
интактными
ɫɬɚɪɵɟ
иммобилизации [19], а также до­
ɩɨɞɜɟɪɝɧɭɬɵɯ
ɢɦɦɨɛɢɥɢɡɚɰɢɨɧɧɨɦɭ
ɫɬɪɟɫɫɭ.
ȼ 30-минутной
ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ
стоверное повышение глутатионредуктазной
ɢɫɩɨɥɶɡɨɜɚɥɨɫɶ
ɩɨ 5 – 6 ɤɪɵɫ.
митохондриальной
фракции миокарда не про­
активности в постмитохондриальной фракции
исходит.
У
взрослых
крыс
этом не изменя­
миокарда старых иммобилизированных живот­
* - Ɋ < 0,05 ɩɨ ɫɪɚɜɧɟɧɢɸ
ɫ при
ɢɧɬɚɤɬɧɵɦɢ
ется и глутатионредуктазная активность. В то
ных, противоречат данному предположению.
ɰɟɧɬɪɚɰɢɹ ɜɨɫɫɬɚɧɨɜɥɟɧɧɨɝɨ
ɝɥɭɬɚɬɢɨɧɚ (ɧɦɨɥɶ/ɝ ɛɟɥɤɚ) ɜ
Другой возможной причиной появле­
же время у старых, подвергнутых 30-минутной
ɟɧɧɨɝɨ
ɝɥɭɬɚɬɢɨɧɚ
(ɧɦɨɥɶ/ɝ
ɛɟɥɤɚ)
ɜ
ния
возрастных различий в снижении уров­
иммобилизации
животных,
наблюдается
по­
ɚɥɶɧɨɣ ɮɪɚɤɰɢɢ ɦɢɨɤɚɪɞɚ ɜɡɪɨɫɥɵɯ ɢ ɫɬɚɪɵɯ ɤɪɵɫ,
ня
восстановленного
глутатиона в сердце при
вышениеɢ глутатионредуктазной
на
ɨɤɚɪɞɚ
ɜɡɪɨɫɥɵɯ
ɫɬɚɪɵɯ
ɤɪɵɫ, ȼ активности
ɢɦɦɨɛɢɥɢɡɚɰɢɨɧɧɨɦɭ
ɫɬɪɟɫɫɭ.
ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ
стрессе
могут
быть
различия
в интенсивности
179% по сравнению с ее исходной величиной.
ɭ
ɫɬɪɟɫɫɭ.
ȼ
ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ
стимуляции
свободнорадикальных
процес­
Полученные результаты свидетельствует о
ɩɨ 5 – 6 ɤɪɵɫ.
сов
в
миокарде
взрослых
и
старых
крыс
при
том, что, несмотря на отсутствие возрастных
их
иммобилизации.
Однако
наши
данные
5 ɩɨ ɫɪɚɜɧɟɧɢɸ
ɫ
ɢɧɬɚɤɬɧɵɦɢ
различий в состоянии пула глутатиона в мио­
свидетельствуют о том, что у взрослых крыс
ɤɬɧɵɦɢ
карде интактных крыс, при иммобилизацион­
при иммобилизации происходит значительно
ном стрессе у взрослых и старых животных
более выраженное снижение концентрации
имеются некоторые особенности в изменении
восстановленного глутатиона в миокарде, чем
содержания окисленного и восстановленно­
у старых животных. Согласно существующим
го глутатиона в сердце. Так, у взрослых крыс,
представлениям, снижение концентрации это­
иммобилизация сопровождается выраженным
го метаболита отражает интенсивность прояв­
снижением уровня восстановленности пула
ления оксидативного стресса [10, 11]. Выска­
глутатиона, о чем свидетельствует уменьшение
занному предположению противоречат также
соотношения индекса GSH/GSSG в миокарде.
сведения об одинаковом уровне накопления в
Возникновение этого сдвига связано с увели­
постмитохондриальной фракции миокарда у
чением концентрации окисленного глутатиона
взрослых и старых иммобилизированных крыс
в сердце.
карбонилированных протеинов (рис. 2), ко­
У старых крыс, в отличие от взрослых, в
торые являются чувствительными маркерами
сердце при иммобилизационном стрессе про­
оксидативного стресса [20].
исходит значительное уменьшение концентра­
Изложенное выше позволяет предполо­
ции восстановленного глутатиона. И, что ха­
жить, что в процессе онтогенеза происходит
рактерно, этот сдвиг не сопровождается у них
изменение роли глутатиона в антиоксидантной
увеличением концентрации окисленного глу­
защите миокарда при стрессе. По всей вероят­
татиона в миокарде.
ности, при старении она существенно выше,
Анализ полученных результатов свиде­
чем в более молодом возрасте, когда повыша­
тельствует о том, что при иммобилизационном
ется значение других антиоксидантов в защите
стрессе в клетках миокарда формируются не­
миокарда от действия повреждающих факто­
которые возрастзависимые особенности путей
ров стресса.
76
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
В. Н. ШВЕЦ, В. В. ДАВЫДОВ
мкмоль/мг протеина
*
*
5,0
5
4,5
4,0
4
3,5
3
3,0
2,5
2,0
2
1,5
1,0
1
0,5
0
*
*
*
*
*
ɜɡɪɨɫɥɵɟ
в щурів обох вікових груп спостерігається зни­
ження кількості відновленого глутатіону. У до­
рослих тварин паралельно відбувається збіль­
шення вмісту окисленого глутатіону в серці,
чого не відмічається у старих щурів. Обгово­
ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ
рюється
можливість вікових змін найважливі­
ɫɬɪɟɫɫ
ших
шляхів утилізації відновленого глутатіону
в серці під час стресу.
К л ю ч о в і с л о в а: старіння, міокард,
іммобілізаційний стрес, пул глутатіону.
ɫɬɚɪɵɟ
ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ
в состоянии стресса
ɫɬɪɟɫɫ
age-specific peculiarities
of changes of glutathione
system in rat’s heart under
immobilization stress
интактные крысы
ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ
ɫɬɪɟɫɫ
V. N. Shvets1, V. V. Davydov2
Рис. 2. Изменение концентрации карбонилированных протеинов в постмитохондриальной
1
Zaporozhie State Medical University;
фракции сердца взрослых и старых крыс при им2
Institute of Children and Adolescents Health Care,
мобилизационном стрессе. В экспериментах исAcademy of Medical Scinces оf Ukraine, Kharkov;
пользовалось по 5–6 крыс. * Р < 0,05 по сравнеe-mail: davydov@kharkov.com
Ɋɢɫ.2.
ɤɚɪɛɨɧɢɥɢɪɨɜɚɧɧɵɯ ɛɟɥɤɨɜ ɜ
нию сɂɡɦɟɧɟɧɢɟ
интактными
ɜɡɪɨɫɥɵɟ
ɫɬɚɪɵɟ ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ
S u m m aɢr yɫɬɚɪɵɯ
ɩɨɫɬɦɢɬɨɯɨɧɞɪɢɚɥɶɧɨɣ ɮɪɚɤɰɢɢ ɫɟɪɞɰɚ (ɦɤɦɨɥɶ/ɦɝ ɛɟɥɤɚ) ɜɡɪɨɫɥɵɯ
ɫɬɚɪɵɟ
ɤɪɵɫ ɩɪɢ ɢɦɦɨɛɢɥɢɡɚɰɢɨɧɧɨɦ
ɫɬɪɟɫɫɟ. ȼ ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ ɢɫɩɨɥɶɡɨɜɚɥɨɫɶ
ɩɨ 5 pool and activity of its
State of glutathione
Особый интерес представляет выяснение
metabolism
enzymes
in the hearts of adult and
– 6 ɤɪɵɫ.особенностей путей утилизации восстановлен­
rats
during
immobilization
stress were studied­
aged
* - Ɋного
< 0,05
ɩɨ ɫɪɚɜɧɟɧɢɸ
ɫ ɢɧɬɚɤɬɧɵɦɢ
глутатиона
(в глутатионтрансферазной
и
in order to find out the causes of age-dependent
глутатионпероксидазной реакциях) в сердце
decrease of heart resistance to stress. The study
старых иммобилизированных крыс, которые
revealed the absence of difference between state
могут формировать основу для появления
ɧɢɟ ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ
ɤɚɪɛɨɧɢɥɢɪɨɜɚɧɧɵɯ
ɛɟɥɤɨɜ ɜ of glutathione pool in myocardium of adult and
возрастных различий
в механизме адаптации
aged intact rats. Rats of both age groups showed
к его
свободнорадикальному
пов­
ɨɣɤɚɪɛɨɧɢɥɢɪɨɜɚɧɧɵɯ
ɮɪɚɤɰɢɢмиокарда
ɫɟɪɞɰɚ (ɦɤɦɨɥɶ/ɦɝ
ɛɟɥɤɚ)
ɛɟɥɤɨɜ
ɜ ɜɡɪɨɫɥɵɯ ɢ ɫɬɚɪɵɯ
the decrease of reduced glutathione content in the
реждению
при стрессе.
высказанное
ɚɰɢɨɧɧɨɦ ɫɬɪɟɫɫɟ.
ȼ ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ
ɢɫɩɨɥɶɡɨɜɚɥɨɫɶ
ɩɨ 5 heart during immobilization stress. Adult rats had
ɦɤɦɨɥɶ/ɦɝ
ɛɟɥɤɚ)
ɜɡɪɨɫɥɵɯ
ɢ ɫɬɚɪɵɯОднако
предположение требует тщательной экспери­
ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ
ɢɫɩɨɥɶɡɨɜɚɥɨɫɶ ɩɨ 5
simultaneous increase of oxidized glutathione con­
ментальной проверки.
centration in the heart unlike in aged rats. The
ɪɚɜɧɟɧɢɸ ɫ ɢɧɬɚɤɬɧɵɦɢ
possibility of age-specific changes of pathways of
ɦɢ
вікові особливості змін
reduced glutathione utilization’ in the heart during
у системі глутатіону в серці
stress is discussed.
щурів за іммобілізаційного
стресу
В. М. Швець1, В. В. Давидов2
Запорізький державний медичний університет;
2
Інститут охорони здоров’я дітей та
підлітків АМН України, Харків;
e-mail: davydov@kharkov.com
1
З метою з’ясування причин вікового зни­
ження стійкості серця до стресу здійснено
вивчення стану пула глутатіону та активності
ферментів його метаболізму в серці дорослих
та старих щурів за іммобілізаційного стресу.
Дослідження показали відсутність розбіжнос­
тей у стані пула глутатіону в міокарді старих та
інтактних щурів. За іммобілізаційного стресу
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
K e y w o r d s: ageing, myocardium, immobi­
lized stress, states of glutathione pool.
1. Lakatta E. G. // Circ.Res. – 2001. – 88. –
P. 984–986.
2. Lakatta E. G., Sollott S. J., Pepe S. // Novartis
Found. Symp. – 2001. – 235. – P. 172–196.
3. Davydov V. V., Shvets V. N. // Exp. Gerontol. –
2001. – 36. – P. 1155–1160.
4. Меерсон Ф. З. Патогенез и предупреждение
стрессорных и ишемических повреждений
сердца. – М.: Медицина, 1984. – 270 с.
5. Kovacs P., Juranek I., Stankovicova Т., Svec P.
// Pharmazie. – 1996. – 51, N 1. – P. 51–53.
6. Dickinson D. A., Forman H. J. // Biochem.
Pharmacol. – 2002. – 64. – P. 1019–1026.
77
експериментальні роботи
7. Меньшиков Е. Б., Ланкин В. З., Зенков Н. К.
/ Окислительный стресс. Прооксиданты и
антиоксидант. – М.: Слово, 2006. – 556 с.
8. Cheng J. Z., Yang Y., Singh S. P. et al. //
Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2001. –
282, N 5. – P. 1268–1274.
9. Hiratsuka A., Tobita K., Saito H., Sakamoto Y.
// Biochem. J. – 2001. – 355. – P. 237–244.
10. Ozer M. K., Parlakpinar H., Cigremis Y. et al.
// Моl. Cell. Biochem. – 2005. – 273, N 1–
2. – P. 169–175.
11. Sahin E., Gtimulu S. // Clin. Exp. Pharmacol.
Physiol. – 2007. – 34, N 5–6. – P. 425–431.
12. Резников А. Г. Методы определения
гормонов. – К.: Наук. думка, 1980. – 536 с.
13. Atrac C., Madnusson T. A. // Acta Pharmacol.
Toxicol. – 1978. – 42. – P. 35–57.
14. Ланкин В. З., Тихазе А. К., Ковалевская А. Л.
и др. // Докл. АН СССР. – 1981. – 261,
№ 6. – С. 1461–1470.
15. Mannervik В., Guthenberg С. / Methods
Enzymology. – 1981. – 77. – Р. 231–235.
16. Hong-Gyum К., Sung-Min H., Su-Jung K. et al.
// Molecules and Сells. – 2003. – 16, N 3. –
P. 278–284.
17. Дубинина Е. Е. // Вопр. мед. химии. –
2000. – № 4. – С. 36–47.
18. Verbunt R. I. A. M., van Dockum W. G.,
Bastiaanse E. M. L. et al. // Mol. Cell.
Cardiol. – 1995. – 144. – P. 85–92.
19. Levine R. L. // Free Radical Biol. Med. –
2002. – 32, N 9. – P. 790–796.
20. Reinheckel Т., Noack H., Lorenz S. et al. // Free
Radical. Res. – 1998. – 29, N4. – P. 297–305.
Отримано 28.03.2008
78
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6