материалы конференции - Российское общество

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА РАМН СЕКЦИЯ МОРФОЛОГИИ ОТДЕЛЕНИЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК РАМН НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА РАМН VIII всероссийская конференция по патологии клетки СБОРНИК НАУЧНЫХ ТРУДОВ 11–12 ноября 2010 г. Москва УДК 616.091 + 591 ББК 52.5-55.6 C23 РЕДАКЦИОННАЯ КОМИССИЯ: Председатели Председатель – член-корр. РАМН, профессор Л.В. Кактурский Зам. председателя – профессор О.В. Макарова Ответственный секретарь – докт. биол. наук М.В. Кондашевская Члены комиссии: проф. Т.Г. Бархина доцент Т.А. Белоусова проф. М.Н. Болтовская докт. биол. наук Г.Б. Большакова докт. мед. наук С.В. Буравков проф. Л.М. Ерофеева канд. биол. наук А.М. Косырева докт. мед. наук Л.П. Михайлова проф. С.В. Савельев канд. мед. наук В.П. Черников проф. В.В. Яглов канд. мед. наук Н.В. Яглова ISBN 978-5-91629-004-2 С23 Сборник научных трудов VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. – М.: МДВ, 2010. – 324 с. В сборник включены материалы докладов, заявленных на VIII Всероссийскую конференцию по патологии клетки. Представленные работы затрагивают широкий спектр научных вопросов, для решения которых использованы современные методы морфологических исследований. Содержание сборника отражает сферы интересов цитологов, гистологов, молекулярных биологов, эмбриологов, патоморфологов, онкологов, фармакологов и других специалистов в области биологии и медицины. УДК 616.091 + 591 ББК 52.5-55.6 ISBN 978-5-91629-004-2 © НИИ МЧ РАМН, 2010 Сборник научных трудов Гибель кардиомиоцитов при артериальной гипертензии Азова М.М. Российский университет дружбы народов, Москва Сердечно-сосудистые заболевания, будучи основной причиной смертности во всем мире, являются одной из главных проблем современного здравоохранения. Наряду с ишемической болезнью сердца, частым источником развития сердечной недостаточности становится артериальная гипертензия, сопровождающаяся морфофункциональными изменениями миокарда левого желудочка (�� M�� .�� A�� . Fortuno�� et�� al�� ., 2001; В.И Целуйко, Н.А. Кравченко, 2004). Потеря кардиомиоцитов выступает одним из ключевых событий в развитии сердечной недостаточности. Гибель клеток может осуществляться тремя принципиально отличающимися способами: некрозом, апоптозом и аутофагией. Исследования последних лет указывают на наличие взаимосвязи между сигнальными путями, индуцирующими данные процессы (S. Kos- tin et al., 2003; Nishida K., Otsu K., 2008). Однако именно апоптотическая гибель наиболее значима для тканей миокарда при артериальной гипертонии. Усиление апоптоза, сопровождающее гипертрофию левого желудочка, было показано у спонтанно гипертензивных крыс, крыс с ренальной гипертензией, ангиотензин �� II�� -индуцированной гипертензией и на других экспериментальных моделях (R. Hamet et al., 1995; Z. Li et al., 1997; X. Zhang et al., 1993). Апоптоз, или программированная клеточная гибель, представляет собой регулируемый процесс, сопровождающийся фрагментацией ДНК, конденсацией ядра и образованием апоптозных телец, поглощаемых макрофагами и соседними клетками. Главными компонентами, обеспечивающими процесс апоптоза, выступают каспазы, «рецепторы смерти» на клеточной мембране (Fas, TNFR и др.) и митохондрии. Существуют два основных пути инициации апоптоза. Первый (внешний) путь реализуется через систему связанных с мембраной рецепторов, которые при взаимодействии с лигандами активируют каспазу 8, запуская, таким образом, состоящий из каспаз протеолитический каскад. Второй (внутренний) путь не сопровождается активацией каспазы 8 и требует участия факторов, высвобождающихся из митохондрий (А.В. Гордеева и соавт., 2004; S. Nagata, P. Golstein, 1995; G.M. Cohen, 1997; M. Enary et al., 1998; B. Antonsson, J-C. Martinou, 2000). Триггерными механизмами апоптоза кардиомиоцитов могут выступать перегрузка, оксидативный стресс, действие цитокинов и др. Одним из главных факторов, вызывающих апоптотическую гибель кардиомиоцитов и гипертрофию миокарда, является перегрузка сердца, сопровождающая ар3 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки териальную гипертензию, что было подтверждено на экспериментальных моделях (крысы и мыши с сужением аорты) (E. Teiger et al., 1996; B. Ding et al�� ., 2000; �� A�� . �� Gonzalez� �� et� �� al�� ., 2003). Однако несомненный интерес представляют исследования, согласно которым в генетических моделях гипертензии, в отличие от экспериментальных, механический стресс не является основным индуктором апоптоза, т.к. запрограммированная клеточная гибель и гипертрофия левого желудочка сердца в данном случае были описаны как явления, независящие от величины артериального давления, как в отношении сроков формирования, так и в отношении наследования (B.A. Innes et al., 1998; А.Ю. Постнов и соавт., 2003). В связи с вышеприведенными данными встает вопрос, не имеющий на сегодняшний день однозначного ответа: отличаются ли механизмы инициации апоптоза при различных формах артериальной гипертензии? Выявление механизмов запуска апоптотической гибели клеток и возможности их блокады, может стать теоретической основой разработки стратегии лекарственной терапии сердечной недостаточности при различных формах артериальной гипертензии, а также будет способствовать поиску генетических детерминант, обусловливающих развитие гипертрофии миокарда при первичной артериальной гипертензии. Изменения биоаминов селезёнки и иммунобиохимических показателей крови крыс при воздействии иммуномодулятором в условиях экспериментального токсического гепатита Алексеева Л.А., Гурьянова Е.А. ФГОУ ВПО «Чебоксарский государственный университет им. И.Н. Ульянова», Чебоксары Иммунные реакции, происходящие в организме, приводят как к существенным морфологическим изменениям селезёнки, так и к изменениям её нейромедиаторного статуса. Нейромедиаторы представлены во всех цитоструктурах органа и обеспечивают функции селезёнки наряду с цитокинами. В настоящее время можно корректировать нарушенные звенья иммунной системы веществами, способствующими её восстановлению. Среди многочисленных иммуномодулирующих препаратов наиболее адекватны организму человека природные, естественные иммуномодуляторы. К ним относится T�� рансферфактор (ТФ), являющийся концентратом природных пептидов, получаемых из молозива коров, полностью очищенным от крупных дисперсных белков. Целью нашего исследования явилось изучение влияния ТФ в различ- 4 Сборник научных трудов ных дозах на нейромедиаторный статус селезёнки и показатели крови крыс при экспериментальном токсическом гепатите через 1, 2 и 3 недели приёма ТФ. Объектом исследования служила селезёнка 45 белых беспородных крыссамцов массой 180–200 г. при экспериментальном токсическом гепатите (ЭТГ). Последний моделировали двукратным в\м введением 0,2 мл 50 % масляного раствора четырёххлористого углерода в дозе 1 г/кг. Выделяли 5 групп животных:1-я – интактные (�� n�� =5); 2-я – контрольные крысы, которым в\м вводилось 0,2 мл растительного масла (n=10); 3-я – крысы с ЭТГ (n=10), 4-я и 5-я группы – крысы с ЭТГ, которым ежедневно давали ТФ в дозе 0,05 г/кг и 0,1 г/кг. Морфологические признаки гепатита появляются на 5–7-е сутки после второго введения токсиканта. Материал забирали на 7, 14, 21-е сутки после второго введения раствора четырёххлористого углерода. Криостатные срезы толщиной 15 мкм окрашивали люминисцентно-гистохимическим методом Фалька-Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной. Общий анализ крови проводился с помощью автоматического гематологического анализатора «МК 4110» (Япония). Количественное определение IgG, M и А проводили методом радиальной иммунодиффузии. У крыс с экспериментальным токсическим гепатитом на фоне введения ТФ в дозе 0,05 г/кг наблюдается восстановление содержания моноаминов в гранулярных люминесцирующих клетках (ГЛК) реактивного центра на 7-е сутки, в красной пульпе селезёнки – на 21-е сутки (табл.). На фоне лечения ТФ в дозе 0,1 г/кг содержание катехоламинов и серотонина в структурах возвращается к норме на 14-е сутки. В анализах крови значительные изменения выявлены в 5-й группе крыс, получавших ТФ в дозе 0,1 г/кг (у крыс 3-й и 4-й групп показатели крови достоверно не отличались) и, в основном, со стороны лейкоцитарного ростка. Число лейкоцитов увеличивается в 1,3 раза за счёт лимфоцитов до 14-дневного срока эксперимента, затем их процентное содержание несколько снижается. Число нейтрофилов с 14-го дня эксперимента увеличивается. Возможно, увеличение числа лейкоцитов в периферической крови связано с повышением концентрации катехоламинов в плазме, которые в свою очередь стимулируют клеточный цикл и увеличивают выход зрелых клеток костного мозга в периферическую кровь. Уровень базального и стимулированного фагоцитоза постепенно нарастает. Концентрация IgA в крови имеет 2 пика повышения: через 1 и 3 недели, концентрация IgG – 1 пик на 21-е сутки эксперимента, что свидетельствует о повышении функциональной активности В-клеток и усилении гуморальных факторов защиты под действием ТФ. Можно предположить как непосредственное действие препарата на синтез и секрецию биогенных аминов в ГЛК, так и опосредованное – через увеличение влияния на вегетативную нервную систему. 5 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Таким образом, динамика содержания нейромедиаторов селезёнки и показателей крови крыс свидетельствуют об иммуномодулирующем действии ТФ, особенно выраженном в дозе 0,1 г/кг. Морфологическая оценка репаративных процессов при использовании обогащенной тромбоцитами плазмы крови Алексеева Н.Т., Глухов А.А., Остроушко А.П. Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж Структурно-функциональный анализ изменений, возникающих в тканях при использовании различных методов лечения, имеет большое значение для оценки межклеточных взаимодействий в норме и патологии. Целью работы явилось выявление особенностей структурной организации клеточного и сосудистого компонентов мягких тканей в период формирования рубца при использовании обогащенной тромбоцитами плазмы крови (ОТПК). Эксперимент выполнен на 14 беспородных крысах-самцах, которые были разделены на контрольную и экспериментальную группы по 7 животных в каждой. В обеих группах животным под общим обезболиванием в стерильных условиях наносили по одной стандартной стерильной ране на передней поверхности бедра длиной 1,0 см. Лечение ран у животных контрольной группы не проводили. В опытной группе при лечении ран местно применяли ОТПК с концентрацией тромбоцитов не менее 1 млн/мкл. Для получения тромбоцитарного концентрата из хвостовой вены крысы забирали кровь по отработанной методике. Забор материала для морфологического исследования осуществляли на 14-е сут после нанесения раны. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин. Полученные срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Установлено, что у животных контрольной группы в зоне раны в поверхностных и глубоких участках дермы сохранялись очаги лейкоцитарной инфильтрации, что свидетельствовало о наличии умеренной воспалительной реакции. В сетчатом слое наблюдались признаки расстройства кровообращения, которые проявлялись многочисленными расширенными сосудами и стазами эритроцитов. Среди коллагеновых волокон отмечалось большое количество малодифференцированных клеток и фибробластов. Эпителизация раны была завершена, но эпидермис в зоне рубца истончен. В препаратах опытной группы рубец был представлен соединительной тканью, без выраженных признаков воспалительного процесса. Четко определялись структурированные волокнистые компоненты, рубцевание раны 6 Таблица 14-е сутки 21-е сутки 4-я 0,05 г/кг 3-я ЭТГ 5-я 0,1 г/кг 4-я 0,05 г/кг 3-я ЭТГ 5-я 0,1 г/кг 4-я 0,05 г/кг 3-я ЭТГ Контрольная группа КА С КА С КА С КА С КА С КА С КА С КА С КА С КА 4,3 ± 0,2 4,3 6,5 6,5 3,1 3,1 4,2 4,2 7,8 7,8 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,2 0,09 0,09 0,11 0,11 0,16 0,16 0,11 0,11 7,7 7,7 4,8 4,8 3,5 3,5 3,6 3,6 4,6 4,6 5,3 5,3 6,03 6,03 3,5 3,5 7,2 7,2 11,5 11,5 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,15 0,15 0,08 0,08 0,12 0,12 0,12 0,12 0,17 0,17 0,18 0,18 0,14 0,14 0,13 0,13 0,11 0,11 0,48 0,48 19,8 19,8 9,75 9,75 18,7 18,7 16,4 16,4 10,8 10,8 13,2 13,2 23,8 23,8 16,3 16,3 14,2 14,2 31,3 31,3 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,1 0,1 0,16 0,16 0,14 0,14 0,17 0,17 0,13 0,13 0,12 0,12 0,18 0,18 0,09 0,09 0,12 0,12 0,11 0,11 7,3 7,3 3,5 3,5 4,3 4,3 5,9 5,9 5,8 5,8 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,11 0,11 0,15 0,15 0,19 0,19 0,09 0,09 0,1 0,1 14,2 14,2 4,5 4,5 3,6 3,6 4,1 4,1 3 3 6,8 6,8 10,3 10,3 4,5 4,5 7,4 7,4 28,4 28,4 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,2 0,2 0,2 0,2 0,09 0,09 0,19 0,19 0,11 0,11 0,12 0,12 0,5 0,5 0,18 0,18 0,15 0,15 0,14 0,14 С Адренергические волокна a. centralis Лимфоциты реактивного центра лимф. узелка ГЛК реактивного центра лимф. узелка Лимфоциты маргинальной зоны лимф. узелка 7-е сутки 5-я 0,1 г/кг Исследуемые структуры Группы крыс Сроки Динамика люминесценции катехоламинов (КА) и серотонина (С) (у.е.) в структурах селезёнки крыс с экспериментальным токсическим гепатитом (ЭТГ) и при введении Трансферфактора per os в дозе 0,05 г/кг и 0,1 г/кг Сборник научных трудов 7 8 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 3-я ЭТГ Контрольная группа КА С КА С КА С КА С КА С КА С КА С КА С КА С Примечание: * – достоверные показатели. С не не не не не 14,6 14,6 26,3 26,3 вы- вы- вы- вы- вы- ± ± ± ± явл явл явл явл явл 0,15 0,15 0,17 0,17 КА 14,8 14,8 Не Не 10,2 10,2 14,5 14,5 не не 10,13 10,13 17,7 17,7 5,3 5,3 14,8 14,8 22,4 22,4 ± ± вы- вы- ± ± ± ± вы- вы± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,1 0,1 явл явл 0,12 0,12 0,12 0,12 явл явл 0,17 0,17 0,15 0,15 0,1 0,1 0,09 0,09 0,18 0,18 4-я 0,05 г/кг ГЛК красной пульпы 5-я 0,1 г/кг 4,3 4,3 7,1 7,1 2,5 2,5 6,2 6,2 9,02 9,02 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,19 0,19 0,15 0,15 0,05 0,05 0,18 0,18 0,23 0,23 3-я ЭТГ 5,9 5,9 3,8 3,8 4,2 4,2 5,8 5,8 3,5 3,5 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,12 0,12 0,16 0,16 0,18 0,18 0,13 0,13 0,1 0,1 4-я 0,05 г/кг Эритроциты красной пульпы 5-я 0,1 г/кг не выявл 3-я ЭТГ 27,1 27,1 не не не не не не не не ± ± вы- вы- вы- вы- вы- вы- вы- вы0,18 0,18 явл явл явл явл явл явл явл явл 4-я 0,05 г/кг ГЛК маргинальной зоны лимф. узелка 5-я 0,1 г/кг Исследуемые структуры Группы крыс Сроки Окончание таблицы 1 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Сборник научных трудов было полностью завершено. Вокруг коллагеновых волокон уменьшено количество малодифференцированных клеточных элементов. Сосудистая реакция отличалась снижением васкуляризации, что характерно для завершения процессов рубцевания. Интактный эпидермис был полностью сформирован, в зоне разреза придатки кожи отсутствовали. Таким образом, использование ОТПК способствовало стимуляции репаративных процессов. Это выражалось в ускорении формирования зрелых тканей. Преобладание коллагеновых волокон, окруженных фибробластами, на фоне купирования воспалительной реакции, снижения сосудистого компонента в зоне рубца, в сочетании с достаточным уровнем кровообращения в тканях паравуальной области способствовало образованию нежных рубцов. В опытной группе животных, в отличие от контрольной, четко прослеживалась корреляция между скоростью эпителизации раневой поверхности и созреванием грануляционной ткани с последующим формированием рубца. Сравнительная характеристика лимфоидных скоплений в разных зонах почек у детей и взрослых Аминова Г.Г. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Известно, что воспалительные процессы в почках связаны с различными неблагоприятными внешними и внутренними факторами, определяющими характер изменения почечной паренхимы (Альбини Б. и др., 1982; Клара С., 1986; Jenkins �� K�� .�� R�� ., Fultz N�� .�� H�� ., 2005). Когда действие этих факторов оказывается не столь значительным, реакция почечной ткани ограничивается образованием локальных инфильтратов. Целью данного исследования явилось изучение почек, полученных от практически здоровых городских жителей, погибших от случайных причин, без патологии органов мочевыделительной системы. Исследовались почки в двух возрастных группах: дети в возрасте 4–7 лет и взрослые – 36–60 лет. Секционный материал заливался в парафин, гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, методами Ван Гизон, Маллори. Определялась частота присутствия инфильтратов, их морфологические особенности у детей и взрослых, клеточный состав. Клетки в лимфоидных инфильтратах подсчитывались с помощью сетки С.Б. Стефанова на стандартной площади среза, равной 880 мкм². Статистическая обработка результатов проведена по программе «STATISTICA 6.0». Анализ результатов – с использованием средней арифметической, ошибки средней, критерия Стьюдента. Различия принимались за достоверные при р<0,05. Как показали наши исследования, инфильтраты в паренхиме почек имели место в подавляющем большинстве исследованных случаев (более 80 %). 9 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Как у детей, так и у взрослых они состояли преимущественно из скоплений клеток лимфоидного ряда. Локализация, размеры и плотность распределения клеток на стандартной площади среза были различны. Лимфоидные скопления могут распределяться по всей паренхиме органа или локализоваться в какой-либо его части. Сравнительно редко лимфоидные инфильтраты отмечаются в капсуле почек и непосредственно под ней, что позволяет предположить их лимфогенное происхождение, т. к. именно капсула почек обильно снабжена хорошо развитой сетью лимфатических капилляров. В корковом веществе скопления клеток лимфоидного ряда встречаются наиболее часто. Несколько реже они отмечаются в мозговом веществе органа. Поскольку лимфатическая система сосредоточена в соединительнотканной основе почек, здесь она представлена слабее, по сравнению с капсулой, поэтому наличие инфильтратов в корковом и мозговом веществе почек скорее свидетельствует о преимущественно гематогенном их происхождении. Не исключен и восходящий путь проникновения возбудителя инфекции, т. к. подобного рода инфильтраты образуются в стенках чашечек и лоханки почек, а также в нижележащих отделах выделительной системы (Григоренко Д.Е., 2010). Инфильтраты как у детей, так и у взрослых людей возникают исключительно в соединительнотканных промежутках паренхимы почек, располагаясь вокруг артериол или рядом с ними, тесно контактируют с их стенками, а также структурными элементами почки, но никогда не захватывают клубочковую или канальцевую систему исследуемого органа. Нередко они также плотно прилегают к стенкам венул и лимфатических капилляров. Скопления клеток лимфоидного ряда представлены небольшими образованиями овальной или неправильной формы. Размеры инфильтратов, как и плотность распределения клеток в них, различны. В пределах самого инфильтрата распределение клеток может быть плотным и относительно равномерным, тогда скопление клеток имеет округлую или овальную форму в зависимости от того, насколько позволяет соединительнотканная строма почек. В других случаях распределение клеток лимфоидного ряда может быть неравномерным. Обычно клетки плотнее располагаются в центральных зонах, тогда как по периферии их концентрация постепенно снижается. У детей изредка обнаруживаются структуры с более разреженным центром. В таких случаях центральные разреженные участки содержат большое количество малодифференцированных клеток (бластов – до 8,6 % и больших лимфоцитов – до 12 %), однако, делящиеся клетки в них обнаружены не были. В лимфоидных скоплениях почек детей и взрослых доминируют малые лимфоциты (соответственно, 58,28 % и 59,73 %). Средние лимфоциты чаще встречаются у взрослых людей (соответственно, 7,62 % и 12,08 %). Несколько реже в инфильтратах взрослых людей встречаются плазматические клетки (соответственно, 3,97 % и 1,34 %). В отличие от детей, у 10 Сборник научных трудов взрослых людей более высокая доля приходится на гранулоциты: нейтрофилы (у детей – 0,66 %, у взрослых – 1,34 %) и эозинофилы (у детей – 0,66 %, у взрослых – 2,68 %). Деструкция клеток примерно одинаково протекает в обеих исследованных группах людей, но макрофагальная реакция более выражена в детском возрасте. В стенках чашечек и лоханки лимфоидные скопления встречаются редко, они имеют вытянутую форму, различаются своими размерами, имеют относительно невысокую плотность распределения клеток на исследуемой площади среза. Чаще всего они располагаются по ходу пучков гладкомышечных волокон, реже – в собственной пластинке слизистой оболочки. В тканях собственной пластинки слизистой оболочки чашечек и лоханки клетки лимфоидного ряда встречаются редко, они диффузно распределяются на всем её протяжении. Клетки представлены, в основном, малыми лимфоцитами и небольшим числом единичных плазматических клеток. Таким образом, исследования показали, что инфильтраты в почечной паренхиме здоровых людей встречаются практически постоянно, что свидетельствует о напряженном состоянии органа как в детском возрасте, так и у взрослых людей. Клеточный состав инфильтратов представлен, главным образом, клетками лимфоидного ряда. Разница в цитоархитектонике инфильтратов сводится к увеличенному содержанию плазматических клеток у детей, а гранулоцитов у взрослых. Кроме того, у детей в инфильтратах могут присутствовать бласты. Экспрессия клаудинов в эпителиальных опухолях различного генеза Бабиченко И.И. Российский университет дружбы народов, Медицинский факультет, Москва Плотные контакты принимают участие в формировании механических связей между рядом лежащими клетками, сохраняя полярность их расположения, они представляют один из компонентов клеточной дифференцировки. Плотные контакты состоят из трёх основных видов молекул: окклудина, клаудинов и адгезивных молекул контактов, при этом предполагается, что основная функциональная нагрузка приходится на клаудины. Несмотря на тот факт, что роль этих белков в процессах онкогенеза изучена мало, можно предполагать их участие в формировании автономных клеточных популяций, способных к инфильтративному росту и процессам метастазирования. Иммуногистохимическим (ИГХ) методом была исследована экспрессия клаудинов (клаудин-1, -2, -3, -5) на различных этапах развития опухолей – от 11 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки интраэпителиальных изменений до инвазивных форм рака – в клетках многослойного плоского эпителия (слизистая оболочка рта – СОР), переходного эпителия (уротелий мочевого пузыря) и железистого эпителия (эндометрий). Для ИГХ использовали очищенные антитела кроличьей антисыворотки к клаудинам -1, -2, -3, -5 (LabVision). Визуализацию иммунных комплексов проводили при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена. Экспрессию белков выявляли на наружной мембране эпителиальных клеток. В результате проведенных исследований была выявлена определенная тканевая специфика в экспрессии клаудинов, в различных тканях, как правило, отмечалась экспрессия нескольких белков, но с различной степенью выраженности. Для эпителия СОР наиболее информативным был клаудин-1, для уротелия – клаудин-3, для железистого эпителия – клаудины -1, -2 и -3. В многослойном плоском эпителии СОР по мере снижения дифференцированности клеток от нормального эпителия до лейкоплакии с признаками плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии (SIN) и плоскоклеточного рака отмечалось снижение экспрессии всех исследованных клаудинов, наиболее выраженные изменения были характерны для клаудина-1. Потерю неопластическими клетками СОР белков плотных контактов – клаудинов можно интерпретировать как снижение клеточной адгезии, что представляет важный этап прогрессии и метастазирования раковых опухолей. По сравнению с неизмененным переходным эпителием мочевого пузыря, по мере снижения дифференцировки эпителиальных клеток в опухолях с низким злокачественным потенциалом, папиллярных уротелиальных карциномах и инвазивных опухолях отмечалось возрастание экспрессии клаудина-3. Сходные изменения наблюдались нами и при исследовании клаудинов в железистом эпителии эндометрия, так наиболее злокачественные формы аденокарциномы – серозного типа – характеризовались высоким уровнем экспрессии клаудинов -1 и -3, в то время как в аденокарциноме эндометриоидного типа преобладала экспрессия клаудина-2. Наши исследования показывают, что в отличие от опухолей из многослойного плоского эпителия, в переходном и железистом эпителии опухолевый рост характеризуется высокой экспрессией клаудинов и сопровождает инвазивные свойства раковых клеток. В подобных опухолевых образованиях нами также была выявлена гиперэкспрессия рецепторов к эпидермальному фактору роста-1 и -2 (EGFR и c-erbB-2), а также матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2). Скорее всего, именно подобный комплексный фенотип опухолевых клеток и определяет их высокую выживаемость и злокачественность. 12 Сборник научных трудов Структурно-функциональные изменения в паренхиме щитовидной железы при ишемической болезни сердца и алкогольной кардиомиопатии Байбаков С.Е., Дронова М.В. Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, медицинский институт, Тамбов, Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж В настоящий момент представляется неясным, являются ли изменения функции щитовидной железы благоприятной адаптивной реакцией на болезнь, снижая или повышая энергетические потребности тканей, либо неблагоприятным ответом, вызывающим повреждение тканей, в частности, гипо- или гипертиреоз и соответствующие морфологические изменения в щитовидной железе (ЩЖ). Однако в доступной литературе эти изменения не описаны с применением современных морфометрических и статистических методик. Целью данного исследования явилось выявление патологических изменений в щитовидной железе умерших от патологии сердца. В ходе работы были изучены ЩЖ в 150 аутопсийных случаях. Причины смерти – патология сердца и травмы (подтверждены результатами патологоанатомического исследования). Контрольная группа включала аутопсийный материал – 50 человек, смерть которых была связана с механическими воздействиями. После фиксации в 10% формалине получали серийные срезы, которые окрашивали гематоксилином. С помощью программы Adobe Photoshop CS определяли морфометрические параметры, характеризующие морфофункциональное состояние щитовидной железы: 1) фолликулярный индекс (ФИ) = 1/2(L+H), где L – наибольший размер фолликула, Н – наименьший размер фолликула; 2) высота фолликулярного эпителия; 3) индекс накопления коллоида (ИНК) = d/2h, где d – внутренний диаметр фолликула, h – высота фолликулярного эпителия; 4) отношение площади паренхимы к площади стромы в срезах; 5) масса ЩЖ (г) и объем ЩЖ (мл). В 83% случаев (средний возраст 52,1±9,23, соотношение мужчины/женщины 7/1) при наступлении смерти вследствие ИБС и алкогольной кардиомиопатии, отмечались следующие изменения в ЩЖ: диффузный склероз стромы с атрофическими изменениями паренхимы (соотношение площадь паренхимы/площадь стромы в срезе равнялась 1,33). В 64% наблюдений отмечено образование очагов пролиферации, из них размерами до 1 см (латентные «малые узелки») – 43%, более 1 см – 21% наблюдений (табл. 1). 13 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Таблица 1 Распространённость узловых образований щитовидной железы (по аутопсийным материалам) Нозология ИБС и алкогольная КМП Диаметр узла Менее 1 см 1 см и более 21% 10% Всего 31% Травмы 7% 4% 11% Итого 28% 14% 42% Морфометрические показатели ЩЖ при патологии сердца представлены в табл. 2. Таблица 2 Морфометрические показатели щитовидной железы при ИБС и алкогольной кардиомиопатии (КМП) Морфометрические показатели ЩЖ Высота фолликулярного эпителия (мкм) Фолликулярный индекс Индекс накопления коллоида Масса ЩЖ (гр.) Объём ЩЖ (мл) Алкогольная КМП ИБС Контроль 4,32+ 0,22 5,76±0,14 4,5 1± 0,37 156,53±6,06 5,84± 0,77 21,30±5,48 19,90± 5,42 64,23± 2,76 19,76± 0,92 17,25±5,95 16,1±4,2 101, 12± 3,15 17,62±0,61 18,80±4,93 17,6±5,3 Таким образом, проведенное исследование позволяет констатировать, что функциональная активность щитовидной железы при ИБС повышается (высокие значения ИНК и высоты фолликулярного эпителия, низкие значения ФИ), при этом значения массы и объёма ниже, чем в группе контроля. При алкогольной КМП, наоборот, функциональная активность снижена (значения ФИ высокие, а высота фолликулярного эпителия и ИНК – низкие), тогда как значения массы и объёма выше, чем в контроле. Встречаемость узлов различного диаметра при ИБС и алкогольной кардиомиопатии – 31%, при травме – 11%. Выводы: 1. При ишемической болезни сердца повышается функциональная активность щитовидной железы и увеличивается частота встречаемости узлов. 2. Алкогольная кардиомиопатия сопровождается снижением функциональной активности щитовидной железы и увеличением частоты встречаемости узловых образований. 3. Узловые образования встречаются с практически одинаковой частотой при ИБС и алкогольной кардиомиопатией. 14 Сборник научных трудов 4. При ИБС функциональная активность щитовидной железы повышается, тогда как при алкогольной КМП – снижается. 5. Пато- и морфогенез узловых образований при ИБС и алкогольной кардиомиопатии различны. Морфофункциональные особенности эндотелиоцитов при осложненном течении геморрагической лихорадки с почечным синдромом Байгильдина А.А., Дубовая Т.К., Лебедева А.И., Вагапова В.Ш. ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава», ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Росздрава», Уфа Важными компонентами защиты организма от циркулирующих в крови инфекционных агентов, наряду с клетками моноцитарного происхождения, являются клетки эндотелия сосудов. Находясь на границе между кровью и тканями, они первыми вовлекаются в патогенез различных заболеваний, в том числе и геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), возбудитель которого – хантавирус – обладает выраженным тропизмом к эндотелию сосудов. Это заболевание занимает в России первое место среди природноочаговых инфекций, характеризуется системным поражением мелких сосудов и почек. Эндотелий сосудов секретирует вазорегуляторы, про- и антикоагулянты, факторы роста, адгезивные молекулы и др. Структурные изменения эндотелиальных клеток (ЭК), сопровождающиеся дисбалансом выделения этих веществ, определяются как эндотелиопатия, которая может существенно влиять на течение и прогноз заболевания. Целью работы явилась оценка структурно-функционального состояния ЭК сосудов при осложненном течении ГЛПС на основе изучения ультраструктуры и особенностей метаболизма ЭК. В программу исследования вошли 48 больных с серологически подтвержденным диагнозом ГЛПС в возрасте от 29 до 65 лет с осложнениями – острой почечной недостаточностью, ДВС-синдромом, инфекционнотоксическим шоком, острой дыхательной недостаточностью, разрывом капсулы почек. Аутопсийный материал легких, почек, печени и головного мозга людей, умерших в периоды олигурии и полиурии, фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида, обезвоживали в спиртах по Б. Уикли. Срезы готовили на ультратоме LKB-III 8800 (Швеция), контрастировали 2% раствором уранилацетата, цитратом свинца по Рейнольдсу, изучали в трансмиссионном микроскопе JEM-100 CX II фирмы «JEOL» (Япония) при увеличениях 15 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки 5200–29000 раз. Концентрации эндотелина-1 в плазме крови, sVCAM-1 и VE-кадгерина в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с использованием тест-наборов �� Biomedica�� Group�� , �� Technoclone�� и �� Bender�� MedSystems (Австрия). Количество циркулирующих ЭК определяли по методу J�� . �� Hladovec�� . Результаты исследования обрабатывали с помощью пакета программ Statistica 7.0 for Windows: определяли медиану и интерквартильный интервал [25%; 75%], достоверность межгрупповых различий средних величин оценивали по критерию �� U�� Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы р принимали равным 0,05. Ультраструктурный анализ показал, что ЭК сосудов печени и почек при ГЛПС повреждаются значительнее, чем ЭК сосудов легких и головного мозга. Большинство ЭК сосудов печени и особенно почек, слущены и практически все они находятся в состоянии некробиоза: ядра пикнотичны, митохондрии разрушены, трубочки эндоплазматического ретикулума укорочены, цитоплазма заполнена мелкими везикулами, вакуолями и остаточными тельцами, глыбчатыми скоплениями рибосом, включениями хантавирусов. Люминальная поверхность этих ЭК сглажена, на аблюминальной обнаруживаются признаки отрыва от базальной мембраны. В сосудах легких и головного мозга десквамированных ЭК меньше, и повреждения этих клеток менее выражены. Ядра этих клеток имеют овальную форму с маргинизированным хроматином, в цитоплазме содержатся вакуоли, микровезикулы и включения хантавирусов. Митохондрии набухшие, с разрушенными кристами; люминальная поверхность клеточной мембраны образует многочисленные выросты и складки. Результаты исследования уровня маркеров дисфункции ЭК сосудов в крови больных ГЛПС с осложненным течением представлены в таблице. Содержание некоторых маркеров дисфункции эндотелия в крови больных ГЛПС при тяжелой форме с осложнениями на фоне базисной терапии Таблица период период период контроль показатель олигурии полиурии Эндотелин-1, фмоль/мл 0,07 [0,05; 0,16]* 0,124 [0,09; 0,19]* 0,4 [0,3; 0,55] sVCAM-1, нг/мл 157 [102; 175]* 1675 [1575; 1675]* 963 [915; 1103] VE-кадгерин, нг/мл 0,66 [0,6; 0,8]* 0,52 [0,31; 0,61]* 1,07 [1,03; 1,08] Циркулирующие ЭК, ×10 /л 4 12 [8; 14]* 22,5 [18; 23]* 4 [2,5; 5,5] * – статистическая значимость различий с контролем (р<0,05) Таким образом, ЭК сосудов при осложненном течении ГЛПС претерпевают как морфологические, так и функциональные изменения, причем струк16 Сборник научных трудов турной дегенерации подвержены преимущественно ЭК печени и почек. Внутриклеточные повреждения могут быть инициированы как самим хантавирусом, так и продуктами измененного под его влиянием метаболизма. Снижение метаболической активности ЭК доказывается гипопродукцией эндотелина-1, VCAM-1 и VE-кадгерина, которые секретируются только ЭК. Полученные результаты указывают на развитие эндотелиопатии при ГЛПС. Следует отметить, что циркулирующие ЭК, содержащие хантавирусы, могут поддерживать дальнейшее распространение возбудителя по системе кровообращения, обеспечивая ему «защиту» от действия факторов иммунной системы организма. Исследование содержания гликогена в нейтрофильных гранулоцитах крови в зависимости от химического состава принимаемой пищи Бакуев М.М., Шахбанов Р.К., Мусаева Д.О. Дагестанская государственная медицинская академия, Махачкала Важным и почти неизученным вопросом следует считать возможность участия нейтрофильных лейкоцитов в процессах пищеварения. Известный факт, описанный еще Х.С. Коштоянцем в 1950�� г., увеличения количества циркулирующих лейкоцитов, названный «пищеварительным лейкоцитозом», которое имеет место на высоте пищеварения, не стал предметом дальнейших углубленных исследований с целью выяснения его причин и механизмов. Можно предположить, что на пищеварение, а конкретно на всасывание продуктов распада пищевых веществ, лейкоциты реагируют как на внедрение или возможное внедрение антигенов во внутреннюю среду. По немногочисленным литературным данным, имеющимся в настоящее время, это напоминает реакцию лейкоцитов на наличие в организме воспалительного очага. В этом смысле поступление продуктов распада пищи в рыхлую соединительную ткань стенки тонкой кишки можно рассматривать как воспалительный процесс в миниатюре. Поскольку в ходе пищеварения это происходит регулярно, факт образования большого количества лейкоцитов на пике пищеварительного процесса, вполне объясним. Целью работы было изучение динамики содержания гликогена в нейтрофильных лейкоцитах при приёме пищи разного состава и на разных стадиях пищеварительного процесса. Для её выполнения использовались мазки, приготовленные из лейкомассы здоровых людей (добровольцев), принимавших белковую, жирную и углеводную пищу. 17 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Материал для исследования брали через 2, 4, 6 час после приёма пищи и натощак. Окраску мазков проводили по методу Мак-Мануса, с использованием реактива Шиффа и 1 % йодной кислоты (Шик-реакция). Через 2 часа после приёма смешанной пищи отмечается достоверный рост содержания гликогена в нейтрофилах крови до 2,21±0,11 (натощак – 1,69±0,08). В последующем (до 4 часов) эта тенденция продолжается. Большинство нейтрофилов (в основном, сегментоядерные) представляются насыщенными продуктами цитохимической реакции. В последующем снижение концентрации продуктов реакции продолжается и к 6 часам приближается к контрольным значениям. В мазках преобладают клетки с меньшим содержанием гранул, наряду с которыми нередко встречаются нейтрофилы (почти все сегментоядерные) или чрезмерно насыщенные, или слабо насыщенные окрашенными гранулами. При приёме жирной пищи изменения количественных показателей содержания гликогена в нейтрофилах аналогичны наблюдаемым при приеме белковой пищи. Так, к 2 часам отмечается значительное снижение количества ШИК-положительных гранул (1,05±0,06). В мазках преобладают клетки с умеренным и малым содержанием гранул с продуктами цитохимической реакции. В некоторых сегментоядерных нейтрофилах просматривается неравномерность распределения окрашенных продуктов. Картина значительно изменена в мазках, приготовленных через 4 часа после приёма пищи; редко встречаются клетки с малым содержанием гранул. Основная масса нейтрофилов насыщена продуктами реакции. Плотность расположения гранул такова, что вся цитоплазма клеток диффузно окрашена. Гранулярность выявляется только в околоядерной зоне. Сходное распределение гранул наблюдается в палочкоядерных и юных формах, хотя в последних гранулярность окрашенных продуктов более заметна. Таким образом, как следует из приведенных в работе данных, относительно быстрый (через 2 часа) рост содержания гликогена в нейтрофильных лейкоцитах крови отмечается при приеме углеводной и смешанной пищи. В то же время несколько специфична направленность изменений содержания гликогена при приёме белковой пищи. Так, через 2 часа наблюдается достоверное снижение количества гранул гликогена, а через 4 часа имеет место такой же рост, который сохраняется и к времени третьего исследования (через 6 часов). Колебания содержания гликогена в нейтрофилах при приеме жирной пищи сходны с теми, что и при белковой. Обобщая эти результаты, можно предположить, что есть определённая взаимосвязь между концентрацией гликогена в плазме крови и степенью насыщения его гранулами нейтрофилов. Данный процесс, по-видимому, совершается в период гранулогенеза в красном кост18 Сборник научных трудов ном мозге. Это в определённой степени подтверждается наличием зависимости между направленностью изменений содержания гликогена в нейтрофилах и составом принимаемой пищи. Изучение процессов апоптоза желудочного эпителия при H. Pylori-ассоциированном хроническом атрофическом гастрите Балабеков А.В., Чуков С.З., Правдина И.А. Ставропольская государственная медицинская академия, Ставрополь Одной из актуальных проблем современной медицины является диагностика и лечение заболеваний желудочно-кишечного тракта. В настоящее время, благодаря идентификации этиологического фактора предраковых заболеваний желудка – H. pylori, появилась реальная возможность предупреждения развития рака желудка путем своевременного выявления тех патологических изменений слизистой оболочки, которые при длительном существовании приводят к развитию неопластической трансформации желудочного эпителия. Существует ряд возможных механизмов, посредством которых H. pylori-инфекция может принимать участие в процессах мутагенеза желудочного эпителия. Одним из подобных механизмов может быть усиленное клеточное обновление в воспаленной слизистой оболочке. Повышение интенсивности клеточного деления увеличивает частоту мутаций вследствие появления ошибок при репликации генов, а также за счет уменьшения времени для репарации ДНК. Согласно генетической модели Fearon E.R. и Vogelstein B.A., человеческий желудочный канцерогенез представляет собой многоэтапный процесс, связанный с прогрессирующим накоплением генетических и эпигенетических нарушений на каждом этапе. Эти нарушения включают ряд изменений онкогенов, генов-супрессоров опухолей (антионкогенов), регуляторов клеточного цикла, генов-репарантов ДНК, клеточных адгезивных молекул, теломеров и теломеразной активности, а также развитие генетической нестабильности в различных микросателлитных последовательностях ДНК. Нормальный белок �� p�� 53 является транскрипциональным фактором и опосредует различные клеточные функции: регуляцию цикла клеточного деления, репарацию ДНК, апоптоз. При различных формах повреждения геномной ДНК белок p53 может вызывать остановку клеточного цикла на уровне перехода фаз G1 – S, тем самым предоставляя время для репарации ДНК и предотвращая размножение мутантных клеток. При невозможности адекватной репарации ДНК p53 активирует апоптоз посредством регуляции транскрипции и прямого взаимодействия с Bcl-2 и Bax. Аномалии, описанные в ге- 19 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки не p53 при опухолях у человека, обычно представлены точечными мутациями или аллельными делециями, приводящими к утрате функции p53, вследствие чего этот «страж генома» теряет способность к активации защитных механизмов – остановки клеточного цикла и апоптоза. Общеизвестно, что рак желудка развивается с высокой долей вероятности в случаях прогрессирования H. pylori-ассоциированного антрального хронического гастрита с распространением поражения на фундальный отдел желудка и формированием хронического атрофического гастрита с исчезновением главных желудочных желез и появлением нового типа слизистой оболочки – кишечной метаплазии. Исследования проведены на 180 пациентах в возрасте от 18 до 80 лет с симптомами диспепсии, у которых при эндоскопическом исследовании диагностирован �� H�� . �� Pylori�� -ассоциированный гастрит. Проводили ЭГДС с множественными биопсиями (по 2 биоптата из тела и антрального отдела желудка и один биоптат из области угла желудка, с учетом требований модифицированной Сиднейской системы) с последующим гистологическим изучением биоптатов. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 4 мкм. Для иммуногистохимической идентификации р53 использовали первичные антитела в разведении 1:200 и стрептавидинбиотиновую систему визуализации LSAB2 (DakoCytomation, Denmark-USA). Обработку материала проводили в соответствии с инструкциями производителя, докраску ядер выполняли гематоксилином Майера. При хроническом атрофическом гастрите экспрессия р53 выявлялась в антральном отделе у 22 из 55 (40,0%) пациентов. При развитии атрофии и псевдопилорической метаплазии в кислотопродуцирующих отделах желудка экспрессия р53 выявлялась у 18 из 36 пациентов (50,0%) в области инцизуры и у 4 из 7 (57,1%) в теле. Все пациенты были H. pylori-позитивными. Как следует из полученных данных, экспрессия мутантного протеина р53, приводящая к несостоятельности апоптоза в поврежденной слизистой оболочке, нарастала при хроническом H. pylori-ассоциированном гастрите в проксимальном направлении, от антрального отдела в направлении большой кривизны тела желудка. Однако, выявленные различия были статистически недостоверны (�� P�� > 0,05 при сравнении показателей в антральном отделе, в области инцизуры и в теле желудка). При анализе частоты экспрессии р53 в зависимости от стадии развития атрофии, нами получены следующие данные. Наибольшая частота экспрессии р53 обнаружена при умеренной и выраженной атрофии, и эти различия были достоверными при сравнении с неатрофическим гастритом, но недостоверны по сравнению со слабой атрофией. 20 Сборник научных трудов Ядерная экспрессия р53 в желудочных эпителиоцитах в случаях кишечной метаплазии выявлялась в антральном отделе у 21 (58,3%) пациентов, в области инцизуры – у 20 (58,8%) и в теле – у 14 (58,3%) пациентов. Все пациенты были H. pylori-позитивными. Таким образом, при H. pylori-ассоциированном хроническом атрофическом гастрите, наибольшая частота экспрессии р53 обнаруживается при умеренной и выраженной стадиях атрофии. При развитии метапластических изменений экспрессия р53 с большей частотой выявляется при кишечной метаплазии, чем при псевдопилорической, что свидетельствует о более выраженном нарушении процессов апоптоза с повышением риска малигнизации. Рост клеток культуры спинного мозга крысы под действием глицина Балашевич Т.В., Никандров В.Н. ГНУ Институт физиологии НАН Беларуси, Минск Способность защищать клетки от избыточного действия катехоламинов, глутамата, аспартата, проявлять тормозную нейротрансмиссию практически во всех отделах ЦНС, участие в синтезе глутатиона, белков, порфиринов, азотистых оснований уже многие годы позволяют использовать глицин в лечении инсульта, нейропатии, эпилепсии, судорожных состояний, различных нейродегенеративных заболеваний и деменций. Между тем, данные литературы о влиянии данной аминокислоты на пролиферативную активность, рост и дифференцировку клеток нервной ткани малочисленны и фрагментарны. Более того, всплывают факты повреждающего действия глицина на клетки мозга. По изменению содержания ДНК, РНК и общего белка можно судить о скорости роста, развития и дифференцировки клеток в культуре. С такой позиции целесообразно изучить влияние глицина в широком диапазоне концентраций на содержание полинуклеотидов и морфологические особенности клеток нервной ткани. Стерильно извлеченные эксплантаты спинного мозга 1–2 сут новорожденных крысят подвергали механическому и ферментативному диспергированию (0,025% раствор трипсина). Клеточную суспензию высевали в чашки Петри (диаметр 35 мм) со специальным покрытием в синтетическую питательную среду DMEM, содержащую 15% сыворотки крови (эмбриональная телячья + лошадиная сыворотка, 1:1) и 25 мкг/мл гентамицина. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе при 37 °С со сменой среды каждые 3 суток. Через 14 суток количество клеток возрастало в 5–9 раз, большинство клеток достигло начальных этапов дифференцировки, а культура стала гетерогенной. Для исследования использовали питательную среду, содержащую 0,5% сыворотки, с целью исключить влияние ростовых факторов и питательных 21 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки веществ, содержащихся в сыворотке. На следующий день в среду вносили глицин в концентрациях 0,01; 0,1; 1,0; 10,0; 25,0; 50,0 мМ. По истечении 72 ч определяли содержание РНК, ДНК, белка с использованием двухволновой спектрометрии, которая описана в работе О. Warburg (1942) по методике Ю.Б. Филлиповича (1975). Определение морфологических особенностей клеток проводили с помощью прижизненной микроскопии (микроскоп «Opton», Германия). Статистическую значимость полученных результатов оценивали при помощи теста непараметрического анализа (критерий Манна–Уитни) в программе Statistica 6.0. В результате проведённого исследования было показано, что глицин увеличивал долю живых клеток первичной культуры спинного мозга во всём диапазоне концентраций. Оптимальные условия для развития нейронов и астроцитов отмечали при концентрации аминокислоты 0,01–25,0 мМ, а для развития олигодендроглии, которая является наиболее чувствительной к гипоксии и другим негативным факторам, – 25,0–50,0 мМ. В данном исследовании главным неблагоприятным фактором является продолжительная депривация сыворотки (72 ч). Содержание ДНК и РНК в клетках изучаемой культуры под действием глицина на 11–27% превышало контрольные значения, что позволяет предположить положительное влияние глицина на рост, развитие и пролиферативную активность клеток спинного мозга. Достоверное увеличение уровня РНК отмечали в концентрациях аминокислоты 1,0 и 10,0 мМ. По результатам прижизненной микроскопии именно в этих концентрациях аминокислоты дифференцировка нейронов достигала более законченного состояния, чем в контроле или других концентрациях (табл.). Дифференцировка нейронов проявлялась в формировании массивных аксональных и дендритных, дихотомической рамификации отростков, элонгации клеточной сомы, формировании тигроидной субстанции и взаимодействий по типу «нейрон–нейрон». Таблица Содержание нуклеиновых кислот и белка в клетках культуры спинного мозга через 72 ч после влияния Биополимер, Контроль мкг/мл 42,11 Белок ±6,58 2,80 РНК ±0,20 2,10 ДНК ±0,21 0,01 46,73 ±2,29* 2,97 ±0,40 2,31 ±0,28 Концентрация глицина, мМ 0,1 1,0 10,0 25,0 48,01 47,58 44,64 42,27 ±2,02* ±8,09 ±5,04 ±3,90 3,08 3,19 3,11 3,00 ±0,38 ±0,10* ±0,14* ±0,29 2,67 2,23 2,21 2,16 ±0,07* ±0,19 ±0,23 ±0,24 50,0 34,11 ±2,48 2,86 ±0,46 2,13 ±0,21 ∗ – различия достоверны по отношению к контролю при P ≤ 0,05 (n=5). Результаты представлены как M±s. 22 Сборник научных трудов Инкубация клеток культуры спинного мозга крыс с глицином в концентрации 0,01–10,0 мМ увеличивала количество внутриклеточного белка на 6–11%. Более высокое содержание глицина в культуральной среде угнетало синтез белка. Возможно, концентрация 50,0 мМ глицина является предпороговой дозой, при которой цитотоксический эффект данной аминокислоты начинает преобладать над общеметаболическим. Изложенные данные позволяют считать, что глицин в концентрации 0,01–50,0 мМ оказывал положительное влияние на жизнеспособность, рост, развитие и дифференцировку клеток первичной культуры спинного мозга крысы в неблагоприятных условиях окружающей среды, что проявлялось в увеличении содержания макромолекул и изменении морфологии клеток. Методология патоморфологического исследования операционного материала при раке поджелудочной железы Балдин Д.Г., Цыганов С.Е. , Сетдикова Г.Р., Паклина О.В. ГУ Клиническая больница им. С.II. Боткина, Москва, Федеральное медико-биологическое агентство РФ, Клиническая больница №119, Новогорск Непременным залогом успешной диагностики и лечения опухолей поджелудочной железы (ПЖ) является правильно полученный и обработанный операционный материал. Морфологическое исследование играет основную роль в оценке качества хирургического лечения и определении факторов риска развития локального рецидива. Целью работы явилась разработка протоколов морфологического исследования операционного материала при резекции поджелудочной железы. Работа основана па операционном материале, полученном от 36 больных, находившихся на лечении в ГУ им. Боткина и КБ № 119 в 2009–2010 гг. по поводу протоковой аденокарциномы (ПАK) – 30 случаев, эндокринноклеточного рака – 6 случаев. Среди больных преобладали мужчины – 29 человек, возраст больных колебался от 35 до 65 лет (средний возраст 50 лет). Начальным этапом диагностики является подробное и последовательное макроскопическое изучение препарата. Оценивали размеры удаленной части органа или всех составляющих органокомплекса, в результате гастропанкреатодуоденальной резекции (часть желудка, двенадцатиперстной кишки, дистальный отдел общего желчного протока, желчный пузырь, начальный отдел тощей кишки), цвет и сохранность архитектоники паренхимы, плотность и ее равномерность. Затем приступали к непосредственному описанию опухоли ПЖ (размер, цвет, плотность, макроскопическая распространенность на 23 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки смежные органы). Изучали изменения протоковой системы, оценивали проходимость основных протоков зондами; измеряли диаметр протоков в наиболее узкой и широкой их части, описывали состояние слизистой. Для морфологической оценки распространения ПAK ПЖ брали фрагменты ткани, прилежащие к двенадцатиперстной кишке. Также исследованию подвергались регионарные лимфоузлы, парапанкреатическая клетчатка со всех сторон железы. Для оценки радикальности операции исследовали края резекции ПЖ, главного панкреатического и общего желчного протоков. Предварительно окрашенную цветными чернилами (Микром) часть удаленной ПЖ вырезали параллельными пластинами толщиной 0,5 см, перпендикулярно к главному панкреатическому протоку. Это позволяло определить правильную ориентацию кусочка, а при необходимости и идентификацию нескольких фрагментов ткани, обрабатываемой в одной кассете и фиксацией препарата в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. В дальнейшем пластины железы разрезали на фрагменты размером 1x1 см. Операционный материал изучали на серийных или ступенчатых срезах с целью уточнения характера процесса и гистотопографии рака железы. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, при необходимости ставили иммуногистохимические реакции. При микроскопическом исследовании использовали следующий протокол: гистологический тип опухоли, степень ее злокачественности, стадию опухолевого процесса по системе pТNM, радикальность оперативного вмешательства, наличие периневральной инвазии, инвазии лимфатических сосудов и вен, изменения в окружающей опухоль паренхиме железы, а также состояние удаленных лимфоузлов, согласно лимфатическим коллекторам. Таким образом, последовательное, подробное и комплексное морфологическое исследование операционного материала при раках ПЖ играет ключевую роль в установлении характера новообразования и его гистогенеза, способствует определению степени структурной и функциональной дифференцировки опухолевых клеток, радикальности оперативного вмешательства. Все это играет важную роль в стадировании опухолевого процесса, выявлении пациентов с высоким риском развития местного рецидива, определении индивидуального прогноза и плана лечения больных раком ПЖ. 24 Сборник научных трудов Распределение маркеров апоптоза в спайках брюшной полости в зависимости от органотопической локализации Барканов В.Б., Воробьев А.А. Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград Изучение спаечного процесса является важной задачей, решение которой может дать «ключ» к пониманию и, в конечном итоге, управлению этим процессом в клинических условиях. Актуальность изучения спаечного процесса и межклеточных взаимодействий в спайках обусловлено тем, что до 90�� % оперативных вмешательств на органах брюшной полости осложняется спайкообразованием (�� Imudia�� A�� .�� N�� . et�� al�� ., 2008). Особый интерес представляет изучение апоптоза в спайках, так как выраженность данного процесса влияет на прогрессирование спаечного процесса, частоту рецидивов спайкообразования после адгезиолизиса и скорость развития спаек (�� Saed�� G�� .�� M�� ., �� Diamond M.P., 2002). Исследование апоптоза в спайках требует не только количественного или морфологического исследования спаек. Важным представляется изучение процесса запрограммированной гибели клеток в структуре самой спайки (�� Liakakos T. et al., 2001). Цель настоящего исследования – установить морфологические закономерности процесса апоптоза в спайках брюшной полости в зависимости от их локализации. Работа была выполнена на операционном материале спаек, полученных от 30 пациентов. Исследуемые спайки были разделены в зависимости от места прикрепления на участки, припаянные к печени, желчному пузырю и двенадцатиперстной кишке. Вторым местом прикрепления во всех случаях был большой сальник. Для проведения морфологического исследования спайки фиксировали в нейтральном 10% формалине, материал заливали в парафин по стандартной методике, срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван Гизон. Иммуногистохимическое исследование проведено с использованием моноклональных антител к маркеру апоптоза – индуцибельной каспазе-3 – наборами �� DakoCytomation�� (�� Glostrup�� , Дания). Морфометрическая обработка цифровых фотографий произведена при помощи программы Image Tool for Windows, ver.3.00 (UTHSCSA, USA. 2002) и оригинального программного пакета «�� Polosa�� », 2006, что позволило разделить бинаризированное и негативизированное изображение спайки на 100 областей с определением яркости каждого участка в системе RGB с экспортом в матрицу Excel. Математическая обработка проводилась непосредственно из общей матрицы данных Excel (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ 25 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки STATGRAPH 5.1 (Microsoft, USA) и включала определение показателей средней, её среднеквадратичного отклонения и ошибки репрезентативности. При морфометрическом исследовании спаек было обнаружено, что экспрессия каспазы-3 различается в зависимости от органотопической локализации. Так, в ткани спаек, фиксированных к печени, относительная площадь, занимаемая иммунопозитивным материалом, составляла 8,63±0,94 %. В спайках, фиксированных к желчному пузырю, экспрессия каспазы-3 обнаружена на 4,15±0,47 % от общей площади. Спайки, припаянные к двенадцатиперстной кишке, экспрессировали каспазу-3 на 6,32±1,01 % площади. Распределение каспазы-3 на протяжении спаек от места органотопической фиксации до сальника также имело различие (рис. 1). Рис. 1. Экспрессия каспазы-3 в спайках брюшной полости в зависимости от места органотопической фиксации. Так, в ткани спаек, фиксированных к печени, экспрессия каспазы-3 имела вид нормального распределения, с низким уровнем в областях фиксации и высоким уровнем иммунопозитивных клеток в середине спайки. В спайках, адгезированных к желчному пузырю, наибольший уровень каспазы-3 отмечался в области прикрепления к желчному пузырю, в то время как другие участки характеризовались низким уровнем экспрессии каспазы-3. Исследование спаек, фиксированных к двенадцатиперстной кишке, показало, что достоверно значимых различий между экспрессией каспазы-3 в разных участках спаек нет, иммунопозитивный материал относительно равномерно распределялся в структуре спаек. Таким образом, можно говорить о наличии градиента экспрессии каспазы-3 в структуре спаек брюшной полости с различной органотопической фиксацией. 26 Сборник научных трудов Ультраструктурные критерии повреждения клеток дыхательной и пищеварительной систем при аллергической альтерации Бархина Т.Г., Голованова В.Е., Гущин М.Ю., Кондратьев В.Е. НИИ морфологии человека РАМН, Москва В экологически неблагоприятных регионах аллергические заболевания являются наиболее распространенными среди общей заболеваемости. Учитывая тенденцию данных болезней к омоложению, актуальность проблемы всё время возрастает. Следует особо отметить, что клеточные и особенно субклеточные изменения при этом касаются разных клеточных популяций и имеют некоторые характерные особенности, обнаруженные при аллергическом рините (АР), бронхиальной астме (БА), атопическом дерматите, частично подтвержденные в эксперименте. Поэтому целью нашего исследования явился поиск и анализ ультраструктурных критериев изменений эпителиальных клеток при АР и БА и попытка оценить полученные критерии при экспериментальном моделировании. Были исследованы соскобы слизистой оболочки из полости носа, бронхоальвеолярные смывы, биоптаты тонкой и толстой кишки пациентов при АР и БА, а также экспериментальный материал (легкие, тонкая и толстая кишка) после введения морским свинкам гетерологичных антимитохондриальных антител (имитация аутоаллергической альтерации). Материал был исследован на полутонких срезах при помощи сканирующей (СЭМ) и трансмиссионной (ТЭМ) электронной микроскопии. Установлено, что при аллергических заболеваниях дыхательной системы (АР и БА) наблюдаются морфофункциональные сдвиги не только в клетках респираторных органов, но и в органах пищеварительной системы и в клетках периферической крови. При исследовании эпителиальных клеток слизистых оболочек носа и бронхов установлено, что реснитчатые (РК) и бокаловидные клетки (БК) подвергаются значительным изменениям с определенными характерными признаками. В РК отмечены 3 основных ультраструктурных признака: 1) деформация, сглаживание или утолщение ресничек; 2) просветление гиалоплазмы и нуклеоплазмы с локусами внутриклеточных отеков; 3) деструкция органелл, ответственных за белковый синтез. Эти 3 признака главенствуют в cлизистой оболочке как носа, так и бронхов. Ультраструктурные изменения в БК отличаются значительной гетерогенностью: 1) отечность, гипертрофия и гиперплазия БК; 2) перерастянутость секреторными гранулами, нарушение целостности апикальных мембран; 3) при ТЭМ отмечены гетерогенные по 27 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки электронной плотности гранулы муцина, нарушения целостности апикальных мембран, значительные повреждения ядер, признаки готовности клеток к апоптозу. Схожие изменения наблюдаются в эпителии органов пищеварительной системы. Следует особенно отметить однотипность изменений БК обеих систем, что подкрепляется фактом единства гистогенеза эпителия дыхательной и пищеварительной систем и межтканевым единством: бронхиальный и альвеолярный эпителий и эпителиальная выстилка пищеварительной системы относятся к системе пограничных тканей. При сравнительном анализе изменений, выявленных в эпителии тонкой и толстой кишки, следует отметить увеличение количества и степени структурных нарушений в дистальном направлении, схожие изменения эпителиоцитов и однотипность повреждений митохондрий. Как и в дыхательной системе, отмечена особая причастность к патологическому процессу именно БК тонкой и толстой кишки. Они находились в разной стадии накопления секрета, что создавало яркую мозаичность срезов ворсинок и крипт. Многие БК были перерастянуты секреторными гранулами, отмечены признаки клазматоза. При ТЭМ наблюдалась отечность клеток, просветление гиалоплазмы, расширение пространства упорядоченных и сглаженных интердигитаций, нечеткие контуры боковых мембран. В переполненных БК наблюдались гетерогенные по электронной плотности гранулы муцина, значительные повреждения ядер. В цитоплазме выявлена гиперплазия свободно лежащих полисом, изменения эндоплазматического ретикулума, редукция комплекса Гольджи, отмечено исчезновение внутримитохондриальных электронноплотных включений. При исследовании тканей толстой кишки на полутонких срезах наблюдались более выраженные структурные нарушения: расширение межклеточных промежутков, отечность и расслоение стромы, хаотичность коллагеновых фибрилл, вакуольная дистрофия энтероцитов. На ультратонких срезах толстой кишки наблюдалась яркая общая реакция митохондрий эпителиальных клеток: резкое набухание, увеличение расстояния между наружными и внутренними кристами, фрагментация и дискомплексация крист, гомогенизация матрикса. В матриксе митохондрий обнаружены миелиноподобные структуры, кристаллоидные и концентрические фигуры, признаки неполноценности мембран. В энтероцитах наблюдались изменения, свидетельствующие о нарушении белкового обмена, просветление гиалоплазмы и нуклеоплазмы, перераспределение митохондрий к апикальной части клеток. Субмикроскопические изменения в БК были разнообразные: структурные нарушения ре- 28 Сборник научных трудов гистрировались от дна крипт до апикальной части, наблюдалось чередование «светлых» и «темных» БК, все клетки имели гетерогенные секреторные гранулы, обнаруживались деструктивные изменения ядер и ядрышек, отмечались изменения метаболического характера. Выявленные ультраструктурные нарушения в эпителиальных клетках дыхательной и пищеварительной систем свидетельствуют об их активном вовлечении в процесс аллергической альтерации. Характерные ультраструктурные повреждения клеток разных органов отражают полиспецифичность аллергических и аутоаллергических процессов и их широкое влияние на разные системы организма. Влияние окислительного стресса на локализацию и свойства ядрышкового белка фибрилларина в культуре клеток HeLa Барыкина Н.В. Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Ядрышко – специализированный клеточный компартмент, служащий для образования рибосом; в состав ядрышек клеток человека �� HeLa�� входит около 700 белков. Отличительной особенностью ядрышка является его высокая чувствительность к внешним воздействиям, особенно тем, которые вызывают клеточную смерть. Под действием стрессовых факторов ядрышко изменяет общую структурную организацию и функциональную активность, о чем свидетельствуют, в частности, изменения локализации ключевых ядрышковых белков. Большинство реакций клетки на внешние стимулы сопровождается изменением окислительно-восстановительного баланса, что связано с образованием активных форм кислорода. Роль активных форм кислорода в изменении функционального и белкового состояния ядрышка на данный момент неизвестна. Целью данной работы являлось изучение воздействия окислительного стресса, вызываемого перекисью водорода (Н2О2) на локализацию и подвижность белка фибрилларина, участвующего в транскрипции, а также на функциональную активность ядрышка клеток человека в целом. Эффекты воздействия окислительного стресса на локализацию фибрилларина изучали с помощью метода непрямой иммуноцитохимии. Подвижность белка ядрышка исследовалась методами иммуноблоттинга и FRAP с помощью конфокальной лазерной микроскопии. Функциональная активность ядрышка 29 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки оценивалась методами РНК-ДНК гибридизации in situ, визуализации транскрипции с помощью предшественников БрУТФ и 5-флуороуридина, а также путем гель-электрофореза суммарной клеточной РНК. Кроме того, мы сопоставили ответ ядрышка с изменением состояния других систем клетки, включая митохондрии и цитоскелет, в ответ на окислительный стресс. Воздействие 50–100 мкм Н2О2 в течение 0,5–2 часов приводит к существенному изменению локализации фибрилларина: фибрилларин мигрировал в нуклеоплазму, тогда как в нормальных клетках белок располагался в виде фокусов в ядрышке. Воздействие 100 мкМ Н2О2 не вызывает массовой гибели клеток, о чём свидетельствуют данные микроскопического анализа, а также выявление маркерного белка поздних стадий апоптоза, PARP-1, на иммуноблотах. Изменения в локализации белка совпадают с дезорганизацией митохондрий, о чём свидетельствует прижизненная окраска клеток красителем �� TMRE�� . Миграция фибрилларина из ядрышек сопровождается замедлением электрофоретичекой подвижности белка. Реакция фибрилларина происходит одновременно с реорганизацией актинового и тубулинового цитоскелета. Данные конфокального анализа показали, что после воздействия окислительного стресса существенно изменяется доля мобильной, т. е. активной, фракции белка. Полученные результаты позволяют заключить, что белок ядрышка фибрилларин быстро и, более того, специфичным образом реагирует на окислительный стресс, вызываемый в клетках HeLa пероксидом водорода. Изменение в локализации белка происходит после 30 мин воздействия окислительного стресса. А уменьшение электрофоретической подвижности уже в течение первых 5 мин инкубирования с Н2О2 свидетельствует в пользу изменения молекулярной массы фибрилларина в результате окислительного стресса. Хорошо согласуются с полученными данными наблюдения об изменении доли мобильной фракции фибрилларина после фотообесцвечивания области ядрышка. Работа имеет не только фундаментальное значение, но представляет также практический интерес в связи с тем, что окислительный стресс, сопровождающийся изменением морфофункционального состояния ядрышка, связан со многими заболеваниями, в частности, с болезнями Альцгеймера и Паркинсона. 30 Сборник научных трудов Периферическое введение лигандов мю-опиоидных рецепторов изменяет содержание бета-эндорфина в межклеточном пространстве поясной коры мозга крыс и поведение животных при моделировании эмоционального стресса Башкатова В.Г., Колпаков А.А., Умрюхин А.Е., Судаков С.К. НИИ морфологии человека РАМН, НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, Москва Установлено, что эндогенная опиоидная система мозга наряду с другими нейротрансмиттерными системами играет важную роль в механизмах эмоционального стресса. Известно, что структура опиоидных рецепторов и эндогенных опиоидных пептидов в ЦНС и на периферии одинакова, однако центральные и периферические функции эндогенной опиоидной системы различны, что достигается избирательной проницаемостью гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для большинства опиоидных пептидов. В связи с этим, центральные и периферические функции эндогенной опиоидной системы исследуются раздельно. В наших недавних экспериментах показано, что центральное и периферическое звено эндогенной опиоидной системы функционируют как единое целое, взаимодействуя между собой по принципу реципрокности. Целью данной работы явилось изучение влияния лигандов мю-опиоидных рецепторов, не проникающих через ГЭБ, на выделение бета-эндорфина из нервных окончаний передней поясной коры мозга, а также на показатели эмоциональности крыс в условиях моделирования эмоционального стресса. Работа выполнена на 102 половозрелых крысах-самцах Вистар. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ (19.06.2003 г.). Первая часть исследования была посвящена определению содержания бета-эндорфина в мозге крыс до, во время и после действия стрессорных факторов. Содержание бета-эндорфина в межклеточном пространстве поясной коры мозга крыс определяли с помощью метода микродиализа с последующим проведением иммуноферментного анализа в полученных диализатах. Первый диализат собирали в условиях свободного поведения крыс за 1 ч до стрессорной нагрузки, второй – во время 1 ч иммобилизации крыс на платформе, а третий – в условиях свободного поведения крыс в течение 1 ч после их освобождения от стрессорной нагрузки. Определение уровня тревожности проводили путем тестирования животных в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ). Для оценки состояния депрессивности крыс использовали тест Порсолта («принудительное плавание»). Для проведения биохимических и поведенческих экспериментов животные были разделены 31 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки на 3 группы. Крысы контрольной группы получали дистиллированную воду, животные 1-ой группы – раствор антагониста мю-опиоидных рецепторов метилналоксона и животные 2-ой группы – раствор агониста этих рецепторов лоперамида. В результате экспериментов установлено, что иммобилизационный стресс приводил к незначительному увеличению концентрации бета-эндорфина в межклеточном пространстве передней поясной коры мозга крыс. Внутрижелудочное введение антагониста мю-опиоидных рецепторов метилналоксона вызвало трехкратное увеличение содержания этого пептида в поясной коре. Однако, введение агониста лоперамида привело лишь к несущественному снижению выброса бета-эндорфина. Иммобилизационный стресс на фоне введения лоперамида вызвал выраженный выброс бета-эндорфина из нервных окончаний передней поясной коры, в то время как введение метилналоксона практически не влияло на изменения уровня бета-эндорфина при стрессе. В результате проведения поведенческих экспериментов было обнаружено, что введение как лоперамида, так и метилналоксона приводило к снижению уровня тревожности животных. Наибольшие изменения наблюдались после введения агониста мю-опиоидных рецепторов лоперамида. При исследовании поведения животных в тесте «принудительное плавание» было показано, что после введения антагониста мю-опиоидных рецепторов метилналоксона происходит увеличение общего времени погружений и уменьшение времени активного плавания. При введении агониста этих рецепторов лоперамида подобных изменений не наблюдалось. Таким образом, установлено, что периферическое введение лоперамида оказывает, в основном, анксиолитическое действие, в то время как периферическое действие метилналоксона выражается в основном в депрессивном влиянии. Эти результаты коррелируют с полученными данными об усилении выброса бета-эндорфина из нервных окончаний в коре мозга крыс при периферическом введении метилналоксона. Введение лоперамида вызывало некоторое уменьшение выброса бета-эндорфина, однако эмоциональный стресс приводил к массивному выбросу бета-эндорфина, чего не наблюдалось при введении метилналоксона. По-видимому, именно это и обуславливало противотревожное действие лоперамида. Полученные данные в очередной раз подтверждают гипотезу реципрокного взаимодействия центрального и периферического звеньев эндогенной опиоидной системы. Подавление активности периферических опиоидных рецепторов, вероятно, располагающихся в слизистой оболочке желудочнокишечного тракта, приводит к увеличению выделения бета-эндорфина в поясной коре мозга крыс, что свидетельствует об активации центрального зве32 Сборник научных трудов на эндогенной опиоидной системы. Активация периферических опиоидных рецепторов лоперамидом приводит к подавлению активности центрального звена, по-видимому, в основном за счет обнаруженного нами ранее, существенного снижения плотности опиоидных рецепторов в коре мозга, а не в результате снижения выброса бета-эндорфина из окончаний нервных клеток. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 08-04-00780. Влияние семакса на морфологию миокарда и уровень апоптоза кардиомиоцитов при развитии инфаркта миокарда у крыс Бердалин А.Б., Гаврилова С.А., Голубева А.В., Буравков С.В., Кошелев В.Б. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва Ранняя реперфузия при инфаркте миокарда (ИМ) уменьшает размеры зоны некроза и улучшает качество жизни пациентов. Однако как клиницисты, так и экспериментаторы отмечают, что при ИМ страдают регионы сердца, напрямую не задетые ишемией, возможно из-за сократительного стресса или из-за воздействия на миокард факторов воспаления, а реперфузия не всегда способна улучшить состояние этих зон. В наших более ранних исследованиях Семакс, нейропротекторный пептид (фрагмент АКТГ4-7), примененный в острую стадию ИМ благоприятно влиял на ремоделирование миокарда, нормализовывал баланс между энергообеспечиващим и сократительным аппаратами кардиомиоцитов, улучшал рабочие характеристики миокарда, не влияя при этом на размер зоны некроза (Гаврилова С.А., Голубева А.В. и др., 2008). Мы предположили, что Семакс может улучшать состояние условно интактного миокарда. Именно состояние и количество ткани миокарда, не затронутой ишемией, является определяющим в прогнозе у пациентов с ИМ. Целью нашего исследования являлась оценка влияния Семакса на морфологию миокарда крысы и уровень апоптоза кардиомиоцитов в условиях ишемии и ишемии-реперфузии; в особенности в регионах сердца, непосредственно не задетых ишемией. Необратимую ишемию и реперфузию после 2,5-часовой ишемии моделировали на самцах �� Rattus�� norvegicus�� по методу Селье (Гаврилова С.А., 2006). Пробы забирали из зоны риска и областей, непосредственно не задетых ишемией: передней стенки левого желудочка (ПС); верхней части боковой стенки левого желудочка (БС) и межжелудочковой перегородки (МП) через 3 сут после операции. Семакс вводили в/бр в дозе 150 мг/кг через 15 мин и через 2 ч 15 мин от начала коронароокклюзии. Пробы фиксировали по стандартным методикам для проведения гистологического анализа на светооптическом уровне и окрашивали 33 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки гематоксилином-эозином. Апоптоз выявляли методом �� TUNEL�� -анализа при помощи набора ApopTag (CHEMICON). Для удобства оценки морфологических характеристик ткани использовали полуколичественную шкалу; например для поперечной исчерченности: «-» – отсутствует; «+» – наблюдаются единичные волокна продольной направленности с поперечной исчерченностью; «++» – встречаются пучки волокон с поперечной исчерченностью; «+++» – поперечная исчерченность видна почти везде на продольно срезанных кардиомиоцитах. Данные полуколичественной оценки морфологических характеристик представлены в таблице 1. Через 3 сут от развития необратимой ишемии миокарда в области ПС развился обширный некроз кардиомиоцитов. У крыс из групп с реперфузией в области ПС наблюдали большую сохранность клеток, но ткань была диффузно инфильтрирована клетками воспаления, увеличились зоны кровоизлияний. Обращают на себя внимание изменения в условно интактном миокарде, ярче выявляемые в модели ишемии-реперфузии. Таблица 1 Полуколичественная оценка основных морфологических признаков повреждения миокарда левого желудочка крыс (световая микроскопия) Признак Поперечная исчерченность Степень повреждения ткани Кровоизлияния Немиоцитарные клетки Контрактуры Интактный контроль Необратимая ишемия Ишемияреперфузия ПС БС МП ПС БС МП ПС БС МП +++ +++ +++ – + ++ – + + – – – +++++ ++ ++ ++++ +++ +++ – – – ++ – – +++ – – + + + +++ ++ ++ – – – + + + +++++ +++ +++ ++ +++ +++ В области БС и МП обнаружили контрактуры кардиомиоцитов, разволокнение миофибрилл. Введение Семакса не изменило значимо морфологическую картину на светооптическом уровне. В таблице 2 представлены данные по результатам �� TUNEL�� -анализа. Уровень апоптоза как в зоне риска, так и в условно интактном миокарде статистически значимо выше в группах с необратимой ишемией и ишемией-реперфузией (И; ИР) сравнительно с интактным контролем (К). Семакс (С) статистически значимо снизил апоптотический индекс во всех регионах инфарктного сердца. 34 Сборник научных трудов Таблица 2 Апоптотический индекс (% TUNEL+ клеток от общего числа). Данные представлены в виде среднего по группе ± стандартное отклонение. * – статистически значимые отличия групп с препаратом по сравнению с группами без него Стенка ПС БС МП Группа К И И+С ИР ИР+С 0,18±0,08 0,20±0,10 0,15±0,06 6,31±6,18 2,13±1,01 1,26±0,32 0,97±0,64* 0,87±0,50* 0,36±0,26* 7,12±7,47 1,24±0,37 2,40±2,41 1,64±0,79* 0,66±0,52* 0,43±0,18* Воздействие оксидативного стресса, механизмы активации апоптоза (как внешние, так и внутриклеточные), влияние функциональной перегрузки, гиперактивация симпатического отдела вегетативной нервной системы, воспаление могут выступать причинами гибели клеток в районах, непосредственно не подвергавшихся ишемии. Семакс статистически значимо снижал уровень апоптоза кардиомиоцитов без видимого влияния на морфологию миокарда. Учитывая результаты наших ранних исследований (снижение гипертрофии кардиомиоцитов, сохранность ответов артериального давления на инфузию фенилэфрина, способность миокарда отвечать на нагрузку добутамином у инфарктных крыс, получавших пептид, по сравнению с инфарктным контролем), можно сформулировать гипотезу: Семакс оказывает свое влияние через снижение гиперактивации симпатического отдела нервной системы. Межклеточные взаимодействия в культуре гепатоцитов крыс разного возраста в норме и после воздействия мелатонина Беспятых А.Ю., Голиченков В.А. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва Согласно одной из теорий, процесс старения является следствием потери интеграции клеток организма, то есть нарушения межклеточных взаимодействий. Маркером межклеточных взаимодействий в культуре клеток может служить степень ее синхронности по изменению какого-либо параметра. Ранее было показано ухудшение степени межклеточных взаимодействий с возрастом в культуре гепатоцитов печени крыс, в качестве параметра синхронности культуры был взят ритм синтеза в ней белка. Разреженные культуры молодых крыс (105 кл/мл) в норме не синхронны (ритм синтеза белка не 35 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки выявляется), тогда как в плотных культурах (106 кл/мл) выявляется отчетливый ритм синтеза белка. В клетках плотных культур старых крыс наблюдается потеря синхронности, ритм синтеза белка в них не выявляется. После обработки такой культуры мелатонином степень межклеточных взаимодействий повышается, вследствие чего в культуре регистрируется ритм синтеза белка. В нашей работе в качестве параметра синхронности культуры была взята динамика концентрации ионов кальция в гепатоцитах крыс. Целью работы являлось определение степени межклеточных взаимодействий в культуре гепатоцитов крыс и изменения их с возрастом, а также влияние на межклеточные взаимодействия мелатонина. Клетки суточных культур молодых (3–4 мес.) и старых (2 года) крыс, разной степени плотности, окрашенные флуоресцентным красителем Fluo3AM, связывающим ионы кальция, исследовали при помощи конфокального микроскопа фирмы Zeiss. Некоторые культуры обрабатывали мелатонином (50 нМ). Данные статистически обрабатывали в программе Stadia. Было показано, что в клетках плотной культуры молодых крыс наблюдалась одинаковая динамика внутриклеточного кальция [коэффициент корреляции (к.к.) достигал 100 %]. Среди клеток разреженной культуры общей синхронности не наблюдали – культуру можно разделить на группы клеток (23–33 %, к.к. внутри групп 0,65–0,92) с динамикой кальция, сходной только внутри группы, но не между группами. После обработки разреженных несинхронных культур мелатонином клетки их синхронизировались (в выборке клеток наблюдали сходную динамику кальция) (78,6–100 % синхронных клеток, к.к. 0,76–0,91). При исследовании динамики кальция в клетках плотной культуры старых крыс с нарушенными межклеточными взаимодействиями (в норме несинхронных) было показано, что до обработки мелатонином динамика кальция в клетках не совпадает, отдельные клетки показывают противоположный тип динамики, то есть в целом культура не синхронна. После воздействия на такую культуру мелатонина динамика клеток становится более сходной, и культура синхронизуется, хотя и не полностью (72 % синхронных клеток, к.к. 0,5–0,84). Таким образом, была произведена оценка степени межклеточных взаимодействий в культуре гепатоцитов молодых крыс в норме и после воздействия мелатонина, а также показано нарушение степени межклеточных взаимодействий в плотной культуре гепатоцитов крыс с возрастом и восстановление интеграции клеток такой культуры при воздействии на них мелатонина. 36 Сборник научных трудов О возможном влиянии острой перегрузки сердца на интенсивность апоптотической гибели клеток миокарда левого желудочка Благонравов М.Л., Онуфриев М.В. Российский университет дружбы народов, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва Известно, что хроническая перегрузка сердца сопровождается повышением интенсивности апоптоза кардиомиоцитов (КМЦ). Об этом свидетельствуют данные ряда авторов, изучавших явление программированной клеточной гибели (ПКГ) сердечных миоцитов как в клинике, так и в эксперименте (�� Diep Q�� .�� N�� . �� et�� al.�� , 2002; �� Choi Y�� .�� H�� . �� et�� al�� ., 2009). Вместе с тем влияние остро возникающей перегрузки левого желудочка (ЛЖ) на процесс ПКГ в миокарде остаётся малоизученным. Апоптотическая гибель клеток, независимо от механизма её индукции, обеспечивается каспазным каскадом, в котором основным исполнительным ферментом является каспаза-3 (Chowdhury I. et al., 2008). Активность последней можно использовать в качестве маркера, косвенно отражающего интенсивность апоптоза клеток в ткани (Gurtu V. et al., 1997; Thornberry N.A.). Целью исследования явилось изучение влияния острой гемодинамической перегрузки сердца на интенсивность апоптоза клеток ЛЖ. Работа была выполнена на 20�� взрослых самцах кроликов породы «Шиншилла» массой 3,0–3,5 кг. У 15 животных моделировали острую перегрузку ЛЖ сердца: под общим обезболиванием производили хирургическую операцию по сужению восходящей аорты на 1/3 от её первоначального диаметра путём создания искусственного стеноза с использованием металлической спирали. Далее исследование проводили на 1, 3 и 5-е сутки после операции (по 5�� кроликов в каждой группе соответственно). Контрольная группа (5�� кроликов) была представлена интактными животными. У кроликов под наркозом вскрывали грудную клетку и забирали сердце. Ткань миокарда ЛЖ измельчали и затем гомогенизировали в среде выделения. Гомогенаты центрифугировали и полученные супернатанты использовали для оценки активности каспазы-3. Супернатант инкубировали в реакционном буфере в двух параллельных пробах, одна из которых содержала субстрат каспазы-3 Ac-DEVD-AMC, а другая – Ac-DEVD-AMC и специфический ингибитор каспазы-3 Ac-DEVDCHO. Активность ферментов определяли флюориметрическим методом по скорости расщепления синтетического флюорогенного субстрата Ac-DEVDAMC («Biomol», США) [А.А. Яковлев и др., 2001]. 37 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Статистический анализ данных проводили на основе программ, разработанных на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН, а также с помощью программы «�� Biostat�� ». Отличие средних считалось достоверным при p≤0.05. На рисунке 1 представлена динамика активности ферментов, расщепляющих субстрат каспазы-3. Общая протеолитическая активность ферментов в пробах с субстратом каспазы-3 Ac-DEVD-AMC (общая DEVD-расщепляющая активность) достоверно увеличивается к 1-м суткам острой перегрузки ЛЖ с 0,70±0,06 (в контроле) до 1,31±0,21 пмоль AMC/мин/мг белка. На 3-и сутки от начала эксперимента она становится ещё выше, достигая 1,55±0,29 пмоль AMC/мин/мг белка, а к 5-м суткам несколько снижается (до 1,19±0,21 пмоль AMC�� /мин/мг белка), оставаясь, однако, достоверно выше контрольного значения. Активность каспазы-3, под которой мы подразумеваем разность между общей DEVD-расщепляющей активностью и неспецифической активностью, оставшейся после ингибирования каспазы-3, на 1-е сутки исследования достоверно увеличивается: с 0,32±0,08 (в контрольной группе) до 0,90±0,26 пмоль AMC/мин/мг белка. К 3-м суткам этот показатель достигает максимума – 1,04±0,26 пмоль �� AMC�� /мин/мг белка. На 5-е сутки активность каспазы-3 начинает снижаться и приобретает значение 0,64±0,19 пмоль AMC/мин/мг белка, причем отличие от контроля на данном сроке не является достоверным. Рис. 1. Динамика активности ферментов, расщепляющих субстрат каспазы-3, при острой гемодинамической перегрузке левого желудочка сердца. Светлые столбики – активность каспазы-3, тёмные столбики – общая DEVD�� -расщепляющая активность. *�� p�� ≤0,05 по сравнению с контролем для каспазы-3, **p≤0,05 по сравнению с контролем для общей DEVD-расщепляющей активности. 38 Сборник научных трудов Таким образом, на ранних сроках острой гемодинамической перегрузки сердца имеет место достоверное повышение активности каспазы-3 в миокарде ЛЖ с максимумом на 3-и сутки эксперимента, что может указывать на интенсификацию механизмов, ответственных за апоптотическую гибель клеток. Поскольку основной объем миокардиальной ткани представлен кардиомиоцитами, а повышение активности каспазы-3 в нашем исследовании было довольно значительным, можно предположить, что происходит повышение интенсивности апоптоза именно этого типа клеток. Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. Ультраструктурные изменения в клетках различной локализации при введении неорганических наноразмерных частиц интактным животным Бородин Ю.И., Бгатова Н.П., Шедина В.В., Рачковская Л.Н. НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск Актуальным и перспективным является использование нанотехнологий в диагностике и лечении опухолевых заболеваний. Для доставки наночастиц к опухолевым клеткам разрабатываются новые таргетные технологии, которые позволяют целенаправленно транспортировать лекарственные препараты непосредственно к злокачественным клеткам. Полагают, что применение нанотехнологии позволит значительно уменьшить дозы токсичных противоопухолевых препаратов, и, соответственно, снизить выраженность нежелательных побочных эффектов. Наночастицы не являются биологически инертными и, вероятно, могут накапливаться в клетках, обладающих фагоцитарной активностью – моноцитах, макрофагах, эндотелии, дендритных клетках и т.д. Перечисленные клетки играют важную роль при развитии опухолевого процесса. Воздействия на их функцию могут привести как к подавлению, так и к стимуляции опухолевого роста. Поэтому актуальными являются исследования механизмов биологического действия наночастиц в зависимости от размера, исходного материала и других физико-химических особенностей строения, а также от дозы и способа введения. Целью данной работы было исследование влияния наноразмерных частиц лития на структуру клеток при их введении интактным животным в предполагаемую область моделирования опухолевого процесса. В эксперименте использовали мышей самцов линии �� CBA�� весом 25–30 г, полученных из вивария ИЦиГ СО РАН. Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества 39 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. Использовали наноразмерные частицы препарата лития, разведенные в физиологическом растворе, которые вводили в область бедра экспериментальным животным через сутки в течение 10 дней по 100 мкл взвеси на животное (в дозе 0,058 мг на животное). Для светооптического и электронно-микроскопического исследования материал бедра забирали на 10-й день после введения наноразмерных частиц лития. Для изучения биологических образцов в просвечивающем режиме электронного микроскопа их фиксировали в 1% растворе ОsO4 на фосфатном буфере (pH=7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым синим, изучали под световым микроскопом и выбирали необходимые участки тканей для исследования в электронном микроскопе. Из отобранного материала получали ультратонкие срезы толщиной 35–45 нм на ультратоме LKB-NOVA, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM 1010. Через 10 суток после введения наноразмерных частиц лития в область бедра экспериментальным животным, в мышечной ткани бедра наблюдали локальные участки некротического повреждения ткани и участки регенерации. Между мышечными волокнами отмечали большое содержание кровеносных капилляров, фибробластов и макрофагов. Электронно-плотный материал – частицы лития – обнаруживали в фрагментах мышечных волокон. Фагосомы с литиевыми частицами отмечали в цитоплазме макрофагов мышечной ткани бедра. Выявляли наноразмерные частицы лития на поверхности фрагментов клеток в просвете краевого синуса регионарного подвздошного лимфатического узла. Наблюдали фагоцитоз частиц лития макрофагами и наличие фагосом с литием в их цитоплазме. Вторичные лизосомы с наноразмерными частицами лития наблюдали в цитоплазме нефроцитов проксимального отдела нефрона почки и цитоплазме гепатоцитов. Исследованные клетки, содержащие в фагосомах и лизосомах наноразмерные частицы лития, имели признаки набухания – расширенные цистерны эндоплазматической сети, слабо выраженные кристы в митохондриях. Таким образом, введение в течение 10 суток наноразмерных частиц лития в область бедра экспериментальным животным приводит к некрозу тканей в месте введения. Полученные нами ранее данные (Ю.И. Бородин и др., 2010) о значительном возрастании концентрации ТБК-активных продуктов в мышечной ткани бедра мышей после введения наноразмерных частиц лития, позволяют заключить, что их повреждающее действие в области введения связано с образованием свободных радикалов, приводящим к развитию воспаления. В то же время, отмеченное восстановление мышечных волокон пу40 Сборник научных трудов тем образования миотубул после введения лития свидетельствует о том, что данные частицы не только оказывают повреждающее действие в месте их введения, но и способствуют развитию регенераторных процессов. Внутримышечное введение наноразмерных частиц лития в область бедра экспериментальным животным приводит к их накоплению в фрагментах мышечных волокон, в фагосомах макрофагов мышечной ткани бедра и регионарного подвздошного лимфатического узла, в нефроцитах проксимального отдела нефрона почки и гепатоцитах. Происходит ли изменение функциональной активности клеток, в которых идет накопление наноразмерных частиц лития, требует дальнейшего исследования. Лаброциты в раннем постнатальном морфогенезе бульбоуретральных желез человека Боронихина Т.В., Яцковский А.Н., Горский В.В. Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава, Москва Характер и последовательность исследованных нами ранее возрастных морфофункциональных изменений бульбоуретральных желез человека позволили выделить несколько периодов их постнатальной перестройки. Интервал от грудного до подросткового возраста включительно является периодом реализации процессов морфогенетического роста желез. Этот период характеризуется прогрессивным развитием железистой паренхимы, высоким уровнем пролиферации эпителиоцитов, усилением секреторной активности желез и адаптивными изменениями состава секреторного продукта. Максимального развития бульбоуретральные железы достигают к юношескому возрастному периоду. Достаточно низкий уровень андрогенов у детей до препубертатного возраста предполагает участие иных, возможно локальных регуляторов в контроле морфо- и гистогенеза бульбоуретральных желез. Такими регуляторами могут быть, в том числе, тучные клетки соединительной ткани желез. Целью настоящего исследования явилось изучение динамики численности и функциональной активности популяции лаброцитов бульбоуретральных желез в период их морфогенетического роста. Исследовали бульбоуретральные железы детей от грудного до препубертатного возраста, подростков и юношей (всего 20 случаев). Тучные клетки выявляли на парафиновых срезах, окрашенных толлуидиновым синим. В каждом случае определяли среднее число лаброцитов в строме желез по результатам их учета в 30 полях зрения при увеличении 40×10. Оценивали интенсивность окрашивания гранул в цитоплазме клеток и рассчитывали индекс их насыщенности гепарином. Одновременно среди лаброцитов определяли те, что проявляли признаки разной степени (слабой, умеренной, выраженной) дегрануляции и рассчитывали индекс дегрануляции. 41 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Лаброциты выявлялись преимущественно в междольковых соединительнотканных перегородках стромы бульбоуретральных желез и реже обнаруживались в соединительной ткани внутри долек рядом с концевыми отделами. Выявленные клетки были округлой, овальной или вытянутой формы, некоторые клетки имели короткие отростки. Цитоплазма лаброцитов была заполнена крупной фиолетовой (метахроматической) зернистостью. Интенсивность окрашивания гранул и клеток варьировала от слабой до выраженной. Результаты количественного учета лаброцитов в строме бульбоуретральных желёз у лиц разного возраста свидетельствуют, что среднее число лаброцитов в железах из расчета на одно поле зрения постепенно растет от грудного периода жизни (1,29± 0,04 в п/зр) до подросткового возраста, когда их количество характеризуется максимальным значением (3,95± 0,14 в п/зр, P < 0,05). В юношеском возрасте количество тучных клеток в соединительной ткани желез статистически значимо снижается, вследствие чего их среднее число становится близким к значению показателя для грудных детей (1,47±0,05 в п/зр, P < 0,05). Подсчет различных по интенсивности окрашивания лаброцитов позволил оценить степень насыщенности их гепарином. Наименьшие значения данного показателя зарегистрированы в бульбоуретральных железах детей грудного возраста (0,36 ± 0,04). В следующей возрастной группе (1–3 года) индекс насыщенности тучных клеток гепарином увеличивается (0,59± 0,04, P < 0,05) и затем последовательно возрастает до подросткового периода жизни (2,69± 0,14). У юношей значения этого показателя несколько снижаются (2,07± 0,09, P < 0,05). Возрастные колебания индекса дегрануляции лаброцитов в бульбоуретральных железах имеют сходную динамику. Значения этого показателя нарастают в промежутке от грудного (0,31± 0,03) до подросткового (0,48 ± 0,04, P < 0,05) периодов жизни, а затем снижаются у юношей (0,35±0,03, P < 0,05). Таким образом, в ранний период постнатального онтогенеза в соединительной ткани бульбоуретральных желез зарегистрированы изменения количества и показателей функциональной активности популяции лаброцитов. Относительное число этих клеток, индекс насыщения их гепарином, а также индекс дегрануляции возрастали от грудного до подросткового возраста, а затем снижались и становились минимальными у юношей. Полученные данные позволяют предполагать участие тучных клеток в качестве локальных регуляторов в процессах морфогенеза бульбоуретральных желез. Бесспорным является влияние выделяемого лаброцитами гистамина на трофику тканей через увеличение проницаемости капилляров. Возможно участие этих соединительнотканных клеток в контроле секреторной активности гландулоцитов, что находит подтверждение в данных литературы о способности гистамина 42 Сборник научных трудов и протеаз лаброцитов стимулировать биосинтез и экструзию в мукоцитах экзокринных желез. Наконец, не исключено участие лаброцитов в регуляции процессов морфогенетической перестройки стромы желёз за счет присущей им способности выделять компоненты аморфного вещества и активировать фибриллогенез. В юношеском возрасте, когда бульбоуретральные железы достигают максимального развития, они находятся под контролем андрогенов и, по-видимому, не требуют иных, помимо гормональных, регуляторов их функциональной активности. Состояние пролиферативных процессов в клетках внутрипротоковой карциномы молочной железы Бриллиант А.А., Сазонов С.В. ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия Росздрава, Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург Одним из механизмов опухолевой трансформации и прогрессии является нарушение регуляции клеточного цикла с ингибированием апоптоза и активацией пролиферации. В связи с этим особенное значение имеет изучение протеинов, регулирующих клеточный цикл и инициирующих пролиферацию, таких как маркер пролиферации Ki-67. Для многих опухолей, норма быстрого увеличения числа клеток оценивается иммунореактивностью Ki-67, кроме того количество клеток, экспрессирующих этот белок, коррелирует со степенью злокачественности опухоли, особенностями ее клинического течения и прогнозом. Из данных литературы не удалось обнаружить сведения о существовании каких-либо закономерностей в гистотопографии пролиферативных процессов в карциноме молочной железы. Таким образом, целью нашей работы являлось изучить особенности гистотопографии пролиферативного процесса во внутрипротоковой карциноме молочной железы. Всего исследовано 87 карцином молочной железы, полученных из различных медицинских учреждений г. Екатеринбурга. Для изучения пролиферативного процесса в карциноме молочной железы определяли количество клеток, экспрессирующих белок Ki-67, с использованием иммуногистохимического метода окраски в автостейнере «DAKO» с моноклональными антителами к Ki�� -67 (�� Clon�� MIB�� -1, мышь). Предварительно гистологические препараты обрабатывались в миниавтоклаве «Paskal» (Dako Citomation). Экспрессию Ki-67 оценивали с помощью световой микроскопии, представляли в виде индекса пролиферации в % к основному числу клеток опухоли. Статистическая обработка данных производилась с использованием стандартного пакета программ Statistica 6. 43 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Для выявления закономерностей пролиферативных процессов в опухоли выделяли три зоны. Первая зона содержит клетки, непосредственно расположенные у стенки протока, третья – в центральной части просвета протока, вторая – между двумя другими зонами. Установлено, что во всех исследованных внутрипротоковых карциномах обнаруживаются пролиферирующие клетки, экспрессирующие �� Ki�� -67. В соответствии со степенью пролиферации все исследованные случаи были распределены по трем группам. В первую группу вошли случаи внутрипротоковых карцином, в которых отмечена значительная пролиферативная активность (более 30% клеток, экспрессирующих белок �� Ki�� -67, 20 случаев). Вторую группу составили случаи внутрипротоковых карцином со средней пролиферативной активностью (экспрессия от 10 до 30% клеток, 30 случаев). Третья группа представлена случаями внутрипротоковых карцином со слабо выраженной пролиферативной активностью (менее 10% клеток опухоли включительно экспрессируют Ki-67, 37 случаев). Показано, что выделенные ранее три гистотопографические зоны достоверно различаются по уровню экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках всех трех групп (табл.1). В первой зоне первой группы определяется наибольшее число пролиферирующих клеток – индекс пролиферации 89,0±1,36%. Во второй зоне первой группы индекс пролиферативной активности клеток составил 50,29 ±1,22%. В третьей гистотопографической зоне первой группы индекс пролиферации Ki-67 оказался минимальным – 11,5±1,36%. Среднее значение индекса пролиферации для первой группы составило 50,26±1,27%. Проанализировав данные пролиферативной активности опухоли во второй группе, обнаружили, что в первой зоне индекс пролиферации опухоли максимально выражен и составляет 29,82±0,45%. Во второй и третьей зонах коэффициент пролиферации составил 18,97±0,24% и 10,0±0,83% соответственно. Среднее значение пролиферативной активности в ткани карциномы в этой группе составляет 19,6±0,57%. Таблица 1 Гистотопографические особенности пролиферативной активности внутрипротоковой карциномы молочной железы Номер группы 1 44 Номер зоны 1 2 3 Значение индекса пролиферации 89±1,36% 50,29±1,22% 11,5±1,36% Достоверность различий по зонам P(1–2) <0,001 P(1–3) <0,001 P(2–3) <0,001 Сборник научных трудов Окончание таблицы 1 Номер группы 2 3 Номер зоны 1 2 3 1 2 3 Значение индекса пролиферации 29,82±0,45% 18,97±0,24% 10,0±0,83% 8,89 ±0,36% 6,4±0,23% 2,6±0,89% Достоверность различий по зонам P(1–2) <0,001 P(1–3) <0,001 P(2–3) <0,001 P(1–2) <0,001 P(1–3) <0,001 P(2–3) <0,001 В третьей группе случаев внутрипротоковой карциномы молочной железы, аналогично первым двум, обнаружена такая же особенность в распределении клеток, экспрессирующих �� Ki�� -67. В первой зоне индекс пролиферации составил 8,89±0,36%, во второй и третьей – 6,4±0,23% и 2,6±0,89% соответственно. Среднее значение пролиферативного индекса в группе – 5,96±0,23%. Таким образом, в ходе проведенных исследований внутрипротоковой карциномы молочной железы обнаружена закономерность изменений индекса пролиферации в опухоли. Большинство клеток, экспрессирующих �� Ki�� -67, локализованы непосредственно у стенки протока. По мере удаления от пристеночной зоны опухоли индекс пролиферации достоверно снижается. Популяционные характеристики тканевых базофилов Быков Э.Г. Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж Выдвигается положение о наличии в интерстиции органов тканеспецифических популяций тканевых базофилов (ТБ) и предлагаются их идентификационные характеристики. Совокупность ТБ, диффузно распределенных в организме, является филогенетически древней ассоциацией одноклеточных желез, функция которых заключается в поддержании тканевого гомеостаза выводимыми в интерстиций биологически активными соединениями. В основу популяционных характеристик такой ассоциации положены показатели ее объема, возраст элементов, их топография, агрегатное состояние цитоплазмы, ее тинкториальные характеристики, способы выведения продуктов биосинтеза в интерстиций. Адекватные методические решения предусматривают фиксацию объектов в формалин-содержащих фиксаторах в присутствии производных цетилпиридиния. Объем совокупности ТБ определяется гистоэнзимологической идентификацией маркера ТБ – «химазы», фермента, гидролизирующего хло45 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки рацетат нафтола АС-Д. Наличие полианионов с различным уровнем заряда определяется окрашиванием толуидиновым синим в градиенте рН фталатного буфера в пределах 1,5–6,0. Этапы биосинтеза гепарина оцениваются после окрашивания альциановым синим – Шифф-реактивом – крезилвиолетом, а биологически активные амины выявляются методами люминисцентной гистохимии. Оценка объема совокупности ТБ, исходя из случайного распределения ее элементов, проводится путем подсчета при прямой микроскопии с иммерсионным объективом относительно квадратов, в пределах которых устанавливается наличие ТБ, а их особенности идентифицируются в соответствии с классификационной таблицей. Подсчет производится по прямым линиям, пересекающим паренхиму или стенку органа. Совокупный объем популяции ТБ получают после идентификации активности «химазы». Формы базофилов и их функциональные особенности идентифицируют на срезах, окрашенных толуидиновым синим, а наличие биогенных аминов – полихромным методом люминисцентно-гистохимического исследования. Топография ТБ оценивается соответственно стратификации стенок полых органов. Показатели возраста, функционального состояния ТБ, способов выведения продуктов биосинтеза кодируются и заносятся в ячейки таблицы. Классификационными признаками ТБ являются: возраст, топография, тинкториальные характеристики цитоплазмы, стадии биосинтеза гепарина, способы выведения продуктов биосинтеза в интерстиций, формирование цитопластов после денуклеации ТБ и клазматоза цитоплазмы. Последние представляют ограниченные мембраной локусы цитоплазматического материала с тинкториальными характеристиками, соответствующими уровню эстерификации полианионов. Юные ТБ отличаются малой величиной с центрально расположенным ядром и гетерохроматином. С возрастом происходит смещение ядра под цитолемму, оно уменьшается в размерах, пикнотизируется и может быть элиминировано из цитоплазмы в интерстиций. Старые тканевые базофилы обладают малой величиной, пикнотизированным ядром, окрашивающимся тиазиновыми красителями в зеленый цвет, объем их цитоплазмы уменьшается, обычно она гомогенна и гамма-метахроматична. Степень эстерификации цитоплазматических полианионов оценивают после окрашивания толуидиновым синим соответственно значению рН буфера. Полихромазия цитоплазмы при полихромном окрашивании позволяет решить вопрос о стадии биосинтеза гепарина: синее окрашивание свидетельствует о наличии его несульфатированного предшественника – кислого полисахарида, красное – о наличии моносульфата гепарина (β-гепарина), метахромазия с крезилвиолетом – о формировании молекул тетрасульфата гепарина. Этот прием позволяет проследить не только этапы синтеза гепарина, но и наблюдать сочетание биополимеров, обсуждая вопросы об ускорении или торможении биосинтетической активности ТБ. 46 Сборник научных трудов Способы либеризации гепариноидов и других веществ рассматриваются в связи с экзоцитозом гранул, их внутриклеточным лизисом. Последнее связано с выведением молекул гистамина и дофамина через плазмолемму базофила. Объем выборки, необходимый для анализа, определяется методом аккумулированных средних, исходя из положений предельной теоремы, с учетом случайного распределения редко встречающихся клеточных элементов. Первичные статистики получают в форме, включающей данные о наличии и уровне индивидуально обусловленной вариабельности, судя по значениям коэффициента вариации. Устанавливаются параметры распределения и с помощью распределений на плоскости Пирсона диагностируется статистическая модель совокупности ТБ. Последнее является основанием для выбора критерия схожести/различимости в зависимости от требуемой строгости доказательств в ряде критериев Вилкоксона – Смирнова – Колмогорова – Крамера фон Мизеса. Для работы с совокупностями ТБ пригоден критерий Вилкоксона в модифицированной форме, содержащий значения непосредственно самого критерия, его верхней и нижней границ. Используется программное решение, обеспечивающее получение конечных результатов при сопоставлении групп объектов в матричной форме. Документом исследования совокупности ТБ, распределенных в интерстиции, является диаграмма, содержащая данные о величине популяции и численности ее составляющих. Межклеточные взаимодействия в гистоархитектонике глоточной миндалины при лечении иммуномодуляторами микробного происхождения Быкова В.П. ФГУ «Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России», Москва Иммуномодуляторы микробного происхождения (ИМП) – лекарственные препараты, восстанавливающие в терапевтических дозах функции иммунной системы, представляют собой комплексные антигенные препараты вакцинного типа, приготовленные на основе бактериальных лизатов местной микрофлоры верхних дыхательных путей (ИРС19, бронхомунал, рибомунил, бронхо-ваксом) и ротоглотки (имудон). Оказывают вакцинирующее специфическое и иммуностимулирующее неспецифическое действие. Главной мишенью считаются фагоцитирующие клетки. Широко используются в клинической иммунологии при лечении местных инфекций с хроническим течением в оториноларингологии, стоматологии и педиатрии. При назначении 47 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ИМП отмечается увеличение количества фагоцитов, повышение фагоцитоза и внутриклеточного киллинга, повышение продукции провоспалительных цитокинов, необходимых для инициации гуморального и клеточного иммунитета, увеличение продукции антител и антиген-специфических Т-хелперов и Т-киллеров (Н.Г. Шеянов, 2008). Фармакологическое действие ИМП определяется основными составляющими этих препаратов: липополисахаридами (ЛПС) клеточных мембран грамотрицательных бактерий, липопротеинами, пептидогликанами грамположительных бактерий, бактериальной ДНК с частым повторением CpG мотивов. ИМП – это сложный антигенный комплекс, состоящий из патогенассоциированных молекулярных паттернов (pathogen-associated molecular patterns – PAMPs), которые, как известно, служат лигандами распознающих рецепторов врожденного иммунитета (pattern-recognition receptors – PRRs). Природа PAMPs и способ терапевтической «доставки» (воздействие на слизистую оболочку верхних дыхательных путей и ротоглотки, включая область лимфаденоидного глоточного кольца) определяют быстрый терапевтический эффект, сопровождающийся увеличением в слюне секреторных антител и лизоцима (Т.С. Полякова, Л.А. Лучихин, 2004). Морфофункциональное состояние небных и глоточной миндалин у детей, склонных к местным инфекциям верхних дыхательных путей и ротоглотки (так называемые «часто болеющие дети»), после курсового лечения ИМП, представляет особый интерес для целей дальнейшей коррекции вторичных иммунодефицитных состояний. Однако реактивные изменения лимфоэпителиальных органов глотки, которые первыми реагируют на местные аппликации ИМП, как правило, остаются за пределами внимания клинических иммунологов. Исследованы гипертрофированные глоточные миндалины (аденоиды) детей, получивших курсовое лечение препаратами ИРС19, имудон, ликопид, бронхомунал, а также в ряде случаев иммуномодуляторами растительного происхождения (ИОВ-малыш, эуфорбиум, туя). Иммуногистохимическое исследование проводили с помощью панели моно- и поликлональных антител, используемых для оценки возрастной гистоархитектоники этого лимфоидного органа после аденотомии. Данные, полученные при изучении возрастной гистоархитектоники глоточной миндалины (Д.В. Калинин), служили базовой характеристикой и составили группу сравнения. Как и у детей, не получавших ИМП, установлена экспрессия TLR2, TLR4 и TLR9 клетками покровного и ретикулярного эпителия зоны лимфоэпителиального симбиоза, а также фолликулярными дендритными клетками и эндотелиальными клетками венул. Однако в отличие от возрастных аналогов группы сравнения, обращала на себя внимание резко выраженная пролиферативная активность лимфоидных клеток (Ki67+) в парафолликулярной 48 Сборник научных трудов зоне, перегруженность отводящих лимфатических сосудов эффекторными Т- и В-клетками (преимущественно с фенотипом CD3+, CD5+, bcl-2+, CD19+), увеличение лимфоцитарного представительства в зоне лимфоэпителиального симбиоза за счет В-клеток с фенотипом CD19+, CD20+, CD79a+, CD23+, а также интраэпителиальных клеток с фенотипом СD14+ и CD21+. В диффузной лимфоидной ткани резко увеличилось число клеток с фенотипом CD68+ и CD14+ на фоне возрастания Т-клеток с тимическим фенотипом (Tdt+, CD1a+), а также отмечено увеличение количества сосудов (по CD34+). Отличительным признаком фолликулярной гиперплазии стало появление аберрантных фолликулов, светлые центры которых отличались увеличением экспрессии молекул bcl-2+ и интернализацией В-клеток мантии, разделяющих единое пространство светлого центра на фрагменты. Таким образом, структура глоточной миндалины детей, получавших терапию иммуномодуляторами микробного происхождения, отражает напряжение реакций врожденного и адаптивного иммунитета. Это находит выражение в повышении пролиферативной активности клеток диффузной лимфоидной ткани и клеток герминативных центров, увеличенной продукции постмитотических эфекторных В- и Т-клеток c миграцией их в зону лимфоэпителиального симбиоза, а также высокой экспрессии маркеров клеток моноцитарномакрофагальной системы (CD68, CD14 и CD21) как и коэкспрессирующих молекул СD80 (B7-1). Лимфоцитарные стазы в отводящих лимфатических коллекторах и межэпителиальные лимфоциты в зоне лимфоэпителиального симбиоза документируют два основных потока эффекторных Т- и В-клеток в аденоидах: вынос клеток из миндалины в системный кровоток и создание лимфоцитарного барьера на уровне эпителия. Последнее является выражением эффекторных функций врожденного и адаптивного иммунного ответа. Аберрантное строение герминативных центров в условиях нагрузки ИМП, выражающееся увеличением числа В-клеток с экспрессией молекулы bcl-2 в зоне центроцитов, указывает на возможность нарушения позитивной и негативной селекции дифференцирующихся В-клеток через апоптоз, что не исключает вероятности сохранения аутореактивных клеток как предпосылки развития в будущем аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний. На основании полученных данных допустимо предположить, что массированная нагрузка PAMPs при ИМП, приводит к чрезвычайной «задействованности» активационных сигнальных механизмов клеток врожденного иммунитета через TLRs, которые контролируют адаптивный иммунитет на уровне герминативных центров вторичных фолликулов, что не исключает возможности сбоя регуляции механизмов позитивной и негативной селекции и повышает риск выживания аутореактивных клонов. 49 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Реакция кардиомиоцитов левого желудочка cердца крыс на действие различных режимов 2g гипергравитации Вареник Е.Н., Липина Т.В., Шорникова М.В., Краснов И.Б., Ченцов Ю.С. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Исследования реакций различных систем организма животных и человека при изменении гравитации занимают центральное место в космической биологии и медицине. Так, увеличение гравитационной нагрузки, или гипергравитация, активно изучается как одно из приоритетных средств, направленных на борьбу с негативными последствиями действия длительной невесомости на организм. Ранее показано, что искусственная прерывистая гравитация оказывает положительное действие на скелетную мускулатуру и сердце млекопитающих при космическом полёте (Рохленко, Мульдияров, 1981). Однако детального анализа кардиомиоцитов (КМЦ) под действием прерывистой гипергравитации не проводилось. Сравнительный анализ изменений КМЦ при действии гипергравитации разного режима (круглосуточной и прерывистой) может способствовать выявлению универсальных адаптивных механизмов миокарда к работе в условиях изменения функциональной нагрузки сердца. В эксперименте использовали самцов крыс Вистар. Изучены 3 группы животных: 1) подвергавшиеся ежедневному одночасовому воздействию гипергравитации величиной 2 g в течение 19 сут (крыс размещали на центрифуге в ограничивавших их подвижность пеналах); 2) подвергавшиеся круглосуточной 2 g гипегравитации 19 сут (использовали нефиксированное содержание крыс по 6 особей в клетке); 3) контрольная – интактные крысы, содержащиеся в помещении с центрифугой при ее вращении. Клетки с животными 1-й и 2-й групп для создания 2 g гравитации помещали по периферии центрифуги с радиусом 3,6 м, скоростью вращения – 22 об/мин. Постановка эксперимента осуществлялась сотрудниками лаборатории морфологии Государственного научного центра РФ Института Медико-биологических проблем РАН. После окончания эксперимента крыс декапитировали с помощью гильотины. Кусочки миокарда левого желудочка (в области верхушки сердца) фиксировали по стандартной методике и заключали в Эпон 812. По полутонким срезам с поперечным ходом волокон в миокарде, окрашенным метиленовым синим, определяли площади поперечного сечения КМЦ с помощью программы ImageScope и относительное число кровеносных капилляров (на один КМЦ). Для электронно-микроскопического анализа продольно ориентированные на пирамитоме КМЦ резали на ультратоме LKB III. Ультратонкие срезы контрастировали раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу, просматривали в электронном микроскопе JEM-100C при 80 кВ. По негативам 50 Сборник научных трудов и цифровым изображениям (файлам) оценивали число межмитохондриальных контактов (ММК) на сто митохондрий (отдельно в каждой зоне локализации митохондрий в КМЦ – околоядерной, межфибриллярной, субсарколеммальной околососудистой) как показатель функциональной нагрузки на КМЦ. Статистический анализ данных проводили непараметрическим критерием Манна–Уитни в программе Statistica 5.5. Различия признавались значимыми при р<0.05. Средняя масса крыс при часовом действии 2 g через 19 сут снижена по сравнению с контролем на 14,5%, средняя масса сердца также уменьшена относительно контроля на 25%. При круглосуточном 2 g вращении крыс, через 19 сут масса крыс и масса сердец имела лишь тенденцию к уменьшению на 7 и 11% соответственно. При обоих режимах 2 �� g�� воздействия выявлена гипертрофия КМЦ верхушки левого желудочка: средняя площадь поперечного сечения КМЦ возрастала на 7% и на 41% в 1-й и 2-й группах соответственно, по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы. Относительное число капилляров через 19 сут повышено при одночасовом 2 g воздействии на 11,4% и имело тенденцию к увеличению на 10% при круглосуточном 2 �� g�� воздействии. Электронно-микроскопическое исследование КМЦ крыс, подвергавшихся в течение 19 сут воздействию 2 �� g,�� показало, что морфология клеток незначительно изменена относительно контроля при обоих режимах гипергравитации. При этом, при ежедневной одночасовой 2 g перегрузке в КМЦ отмечены митохондрии разной плотности, небольшие отёки саркоплазмы, аппарат Гольджи локализовался не только в околоядерной, но и в субсарколеммальной зоне. Количество ММК имело тенденцию к увеличению относительно контроля в межфибриллярной зоне и достоверно увеличено в двух других зонах. В КМЦ крыс, подвергавшихся круглосуточному 2 �� g�� воздействию, также выявлены отеки саркоплазмы (чаще в околоядерной области), митохондрии имели нормальную ультраструктуру, но регулярно встречались длинные межфибриллярные митохондрии, иногда наблюдались нарушения структуры миофибрилл. Количество ММК повышено, по сравнению с контролем, во всех зонах локализации митохондрий в КМЦ. Таким образом, реакция КМЦ на одночасовое и круглосуточное воздействие 2 �� g�� гипергравитации в течение 19 сут является однонаправленной: развивается гипертрофия КМЦ, сопровождающаяся ростом числа капилляров и ростом количества ММК в КМЦ, что отражает перестройку миокарда в ответ на повышение функциональной нагрузки на сердце. Изменения описанных параметров отличаются при изученных режимах 2 g по степени выраженности, что согласуется с разной длительностью самих воздействий. Работа выполнена при финансовой поддержке INTAS (грант №99-1190, № 99-1191). 51 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки О структурно-функциональной реорганизации воздухоносных путей и респираторных отделов лёгких крыс в условиях инфицирования на фоне стресса Вахитов Э.М., Лабутин И.В. ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава», Оренбург Согласно канонам классической микробиологии, исход любого инфекционного процесса определяется тремя компонентами: патогеном, макроорганизмом и условиями внешней среды. Цель настоящего исследования – изучить влияние длительного эмоционально-болевого стресса на адаптивные возможности организма экспериментальных животных в ходе инфекционного процесса, протекающего в воздухоносных и респираторных отделах лёгких. Для этого 25 беспородных крыс-самцов массой 280–300 г., подвергали ежедневному стрессированию в течение 5 ч на протяжении 10 сут. В специальной камере животных подвергали воздействию тока силой 4 мА, избежать которое животные могли только путём ухода на платформу, расположенную в центре камеры. Это приводило к выработке условного рефлекса избегания, проявлявшегося в постоянном нахождении крыс на платформе. Последующее нанесение коротких сильных ударов тока (6мА в течение 2 секунд) через пол платформы сопровождалось формированием стрессорной реакции у животных, обусловленной как наличием конфликта между выработанным условным рефлексом избегания и безусловным болевым раздражителем, а также постоянным ожиданием болевого раздражения. Двадцати крысам после стрессирования интратрахеально вводили Escherichia coli, обладающую антилактоферриновой активностью в дозе 2 млн КОЕ. Пять оставшихся крыс предназначались для контроля. Материалом для исследования служили кусочки лёгкого, которые обрабатывали, используя светооптические, электронно-микроскопические и иммуноцитохимические методики (идентификация экспрессии протеинов р53 и bsl-2). Установлено, что при длительном эмоционально-болевом стрессировании структурно-функциональная реорганизация эпителиальной выстилки свидетельствует о лимитировании её приспособительных возможностей. В лёгких нарастают явления периваскулярного отека. Местами эпителий внутрилёгочных бронхов десквамируется. На субмикроскопическом уровне цитоплазма реснитчатых клеток приобретает «ажурный» вид за счет крупных везикул, образующихся на месте бывших митохондрий. В апикальной части большинства 52 Сборник научных трудов реснитчатых клеток снижается количество свободных рибосом и полисом. У стрессированных животных, подвергавшихся инфицированию, были выявлены специфические этапы адгезивных и эндоцитозных взаимодействий бактерий с эпителиоцитами, фибробластами, макрофагами и эндотелиоцитами, включая внутриклеточное персистирование микробов в системе эндосом и комплекса Гольджи. При прямом контакте с микробными клетками мерцательный эпителий и альвеолоциты лёгочных ацинусов имели признаки существенных ультраструктурных и иммуноцитохимических изменений (в цитоплазме возрастало число лизосом и аутофагосом, эндоплазматическая сеть резко расширена, увеличивались объём ядер с деконденсированным хроматином, размеры перинуклеарных пространств и поровых комплексов, количество клеток с признаками апоптоза). Помимо лизированных, внутриклеточно расположенных бактерий, обнаружены реактивно изменённые жизнеспособные микробы, контактирующие с везикулярно-тубулярными компартментами клеток хозяина. Отмечено лимитирование функциональной активности альвеолярных макрофагов (по показателям эффективности фагоцитоза). На основании морфологической картины, наблюдаемой в ходе настоящего исследования, антилактоферриновую активность бактерий можно отнести к факторам хронизации инфекционного процесса. С другой стороны, длительное стрессорное воздействие на организм хозяина приводит к лимитированию адаптивных возможностей клеток и тканей органов дыхательной системы в ответ на интервенцию микроорганизмов с вирулентными свойствами. Сравнительная морфологическая характеристика слизистой оболочки поперечной ободочной и нисходящей кишки у больных синдромом раздраженного кишечника Визе-Хрипунова М.Б., Кактурский Л.В., Михайлова Л.П., Сидорова Е.И. НИИ морфологии человека РАМН, Москва, Ульяновский Государственный университет, Ульяновск Синдром раздраженного кишечника (СРК) – это функциональное расстройство кишечника, при котором боли в животе, дискомфорт связаны с дефекацией или ее нарушением (Drossman D.A., 2006; Головенко О.В., 2007). Cоциальная значимость СРК определяется высокой распространенностью заболевания и трудностями лечения этой категории пациентов. В литературе данные о морфологических изменениях слизистой оболочки кишечника при 53 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки синдроме раздраженной кишки представлены единичными работами описательного характера. Целью работы было изучение морфологических изменений слизистой оболочки поперечноободочной и нисходящей кишки при разных клинических вариантах синдрома раздраженного кишечника. Исследовали биоптаты слизистой оболочки поперечной ободочной и нисходящей кишки от больных с разными клиническими вариантами течения синдрома раздраженного кишечника: с преобладанием запора –12 биоптатов поперечной ободочной и 12 – нисходящей кишки, диарейным синдромом – соответственно, 16 и 12 биоптатов, болевым синдромом – соответственно, 12 и 8 биоптатов. Биоптаты фиксировали в 10% нейтральном формалине и окрашивали гематоксилином и эозином, по Маллори, альциановым синим, толуидиновым синим. Оценивали объемную долю структурных компонентов слизистой оболочки поперечноободочной и нисходящей кишки: бокаловидных клеток, эпителия и стромы. При морфологическом исследовании биоптатов поперечноободочной и нисходящей кишки во всех исследованных группах наблюдений определялись слабо или умеренно выраженная гиперплазия слизистой оболочки, умеренная или выраженная гиперплазия бокаловидных клеток и умеренная диффузно-очаговая инфильтрация слизистой оболочки лимфоцитами, гистиоцитами с примесью нейтрофилов. При сравнительном морфометрическом исследовании структурные компоненты слизистой оболочки поперечноободочной кишки во всех исследованных группах пациентов различались между собой по содержанию объемной доли бокаловидных клеток и стромы . В группе больных с преобладанием диареи по сравнению с пациентами других групп наблюдений показатели объемной доли бокаловидных клеток были достоверно выше, а стромы – ниже, и составили, соответственно, 36,8 ± 1,4 об% и 28,3± 1,8 об%. При сравнительном морфометрическом исследовании структурных компонентов слизистой оболочки нисходящего отдела кишки в группе больных с преобладанием диареи по сравнению с другими исследованными группами наблюдений, как и в поперечноободочной кишке, наибольшую объемную долю составили бокаловидные клетки (30,1±2,2 об%,), а в группе с преобладанием боли – этот показатель был наименьшим (2,8±0,7об%). Показатель объемной доли стромы был достоверно выше в группе больных с преобладанием запора, по сравнению с группами пациентов с диарейным и болевым синдромом. Таким образом, при сравнительном морфометрическом исследовании структурных компонентов слизистой оболочки поперечноободочной и нисхо54 Сборник научных трудов дящей кишки установлено, что у больных с преобладанием диарейного синдрома отмечается выраженная гиперплазия бокаловидных клеток, тогда как при болевом синдроме объемная доля бокаловидных клеток минимальная. Реакция культивируемых нормальных и трансформированных клеток кожи человека на действие растительных факторов роста Вильданова М.С., Онищенко Г.Е., Смирнова Е.А. Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Жасмоновая (ЖК) и абсцизовая кислоты (АБК) являются факторами роста растений, которые в научной литературе принято называть растительными гормонами. Эти вещества выделяются клетками растений и действуют в низкой концентрации как регуляторы роста и дифференцировки. ЖК относится к растительным гормонам стресса и участвует в ответе растений на повреждение или внедрение патогена. Жасмонаты, как и некоторые другие фитогормоны, в некоторых экспериментальных системах проявляют противоопухолевую активность в отношении клеток животных, однако механизмы этого влияния не известны. АБК участвует в регуляции процессов перехода растения в состояние покоя. Что касается клеток животных, действие АБК на них не изучено. В связи с этим, целью нашего исследования было изучение реакции нормальных и трансформированных клеток человека на действие данных растительных гормонов. В качестве объектов исследования были использованы культивируемые клетки линии А431 (эпидермоидная карцинома человека) и линии НаСа�� t�� (кератиноциты человека). Действие разных концентраций ЖК и АБК оценивали через 24 часа после добавления в среду культивирования с помощью МТТтеста. В качестве методов исследования были использованы прижизненные наблюдения, иммуноцитохимические и цитохимические методы анализа, а также электронная микроскопия. Проведенные исследования показали, что ЖК является цитотоксичной как по отношению к клеткам эпидермоидной карциномы человека (при концентрациях от 1 мМ до 4 мМ), так и по отношению к кератиноцитам человека (при концентрациях от 2 мМ до 4 мМ), тогда как АБК снижает жизнеспособность клеток А431 при концентрации 2 мМ, но не оказывает цитотоксического эффекта на культуру НаСаt. Поэтому для дальнейших исследований действия ЖК и АБК на нормальные и трансформированные клетки была выбрана концентрация 2 мМ. При этой концентрации ЖК в обеих культурах наблюдалась гибель 30% клеточной популяции. При использовании АБК гибель клеток 55 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки трансформированной линии �� A�� 431 составила 25%, тогда как для нетрансформированных клеток HaCat стимуляции клеточной гибели не наблюдалось. Таким образом, ЖК является цитотоксичной как для трансформированных клеток А431, так и для нетрансформированных клеток �� HaCat�� , а АБК цитотоксична только для трансформированных клеток. В связи с этим мы провели анализ клеточных структур, на которые, как на потенциальные мишени, может быть направлена цитотоксическая активность данных веществ. Иммуноцитохимическое окрашивание, прижизненные окрашивания и электронно-микроскопическое исследование показали, что ЖК вызывает гипертрофию элементов вакуолярной системы в обоих типах клеток. Как в нормальных, так и трансформированных клетках, наблюдается значительное расширение диктиосом аппарата Гольджи, резкое увеличение числа вторичных лизосом и аутофагосом, разнообразных по форме и по структуре внутренних включений. АБК вызывает резкое увеличение протяженности диктиосом аппарата Гольджи и значительное возрастание числа вторичных лизосом и аутофагосом в трансформированных клетках. В нетрансформированных клетках АБК вызывает появление гигантских аутофагосом и большого числа кавеол. Таким образом, элементы вакуолярной системы реагировали на действие растительных гормонов как в трансформированных, так и нормальных клетках. Вместе с тем, АБК вызывала изменения состояния митохондрий и актинового цитоскелета только в трансформированных клетках эпидермоидной карциномы человека А431. Реакция митохондрий на действие данного агента проявлялась в нарушении целостности наружной мембраны и беспорядочной ориентации крист. Актиновый цитоскелет изменял свою локализацию, что проявлялось в скоплении актина в области межклеточных контактов. Следовательно, митохондрии и актиновый цитоскелет могут быть мишенями для действия АБК только в трансформированных клетках. Сопоставление реакции нормальных и трансформированных клеток на действие разнонаправленных растительных гормонов показывает, что как для ЖК, так и для АБК основной мишенью воздействия является вакуолярная система, но в опухолевых клетках только для АБК выявлены дополнительные мишени воздействия – актиновые микрофиламенты и митохондрии. При этом в изученном диапазоне концентраций ЖК является цитотоксичной по отношению к обоим вариантам культур, тогда как АБК цитотоксична только для опухолевых клеток. Работа поддержана РФФИ № 08-04-007-50-а, НШ 1861.2003.4 56 Сборник научных трудов Влияние полициклических ароматических углеводородов на пролиферацию клеток в условиях экспрессии АH-рецептора и без Волков М.С., Дубовая Т.К., Кобляков В.А., Болотина Н.А. ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Москва Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются наиболее распространенными канцерогенными загрязнителями окружающей среды. В процессе химического канцерогенеза принято выделять две стадии: инициации и промоции. В результате инициации происходят необратимые изменения в геноме. Стадия промоции обусловлена эпигенетическими механизмами. Одним из главных событий опухолевой промоции является стимуляция пролиферации и ингибирование межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК). Считается, что промоторный эффект ПАУ реализуется через взаимодействие исходной неметаболизированной молекулы канцерогена с Ah-рецептором. Ранее нами было показано, что канцерогенные ПАУ ингибируют МЩК в культуре гепатом, как экспрессирующих, так и не экспрессирующих Ah-рецептор. В данной работе мы изучали влияние ПАУ на пролиферацию в культурах клеток гепатом, экспрессирующих (Hep G2) и не экспрессирующих Ahрецептор (Г-27). Клетки обрабатывались различными канцерогенными ПАУ в концентрации 5 мкг/мл среды. Было показано, что канцерогенные ПАУ стимулировали пролиферацию клеток Г-27, определяемую по приросту количества клеток. В клетках Hep G2 увеличения количества клеток не наблюдалось, поскольку в этой культуре ПАУ, благодаря экспрессии Ah-рецептора, метаболизировались с образованием веществ, вызывающих токсический эффект. Далее исследовалось методом проточной цитофлуорометрии количество клеток, находившихся в различных фазах клеточного цикла. Оказалось, что канцерогенные ПАУ увеличивали количество клеток, находящихся в фазах G2+S, по сравнению с контролем как в культуре Г-27, так и Hep G2. Эти данные свидетельствуют, что изучаемые вещества стимулируют пролиферацию. Для изучения механизма стимуляции пролиферации мы исследовали действие ПАУ на активность транскрипционного фактора NF-kB, принимающего участие как в стимуляции пролиферации, так и в антиапоптической защите клеток. Трансфекция клеток Г-27 или Hep G2 регуляторным участком гена NF-kB показала, что активация NF-kB происходит только в клетках Г-27, но не в Hep G2. Эти данные были подтверждены методом полимеразной цепной реакции при изучении экспрессии гена IkB, активируемого NF-kB. Изучение механизма активации NF-kB показало, что этот процесс связан с ак57 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки тивацией киназы �� IKK�� по неизвестному механизму. Наши предыдущие исследования показали, что канцерогенные ПАУ стимулируют активацию транскрипционного фактора АР-1 в клетках, экспрессирующих Ah-рецептор. Таким образом, в нашем исследовании впервые было показано, что в клетках помимо Ah-рецептора существует некий, ранее неизвестный фактор, взаимодействие с которым канцерогенных ПАУ приводит к стимуляции пролиферации и к ингибированию МЩК. Механизм стимуляции пролиферации в клетках, экспрессирующих и не экспрессирующих Ah-рецептор, различен. В первом случае стимуляция пролиферации обусловлена активацией транскрипционного фактора АР-1, а во втором – NF-kB. Работа поддержана грантом РФФИ 10-04-00107а. Исследование структуры опухоли молочной железы и регионарных лимфатических узлов при экспериментальном канцерогенезе молочной железы Волкова М.С., Асташов В.В., Казаков О.В., Чепик В.И. НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск В работе проведено структурно-клеточное исследование молочной железы, подмышечных (�� I�� порядка) и брыжеечных лимфатических узлов в условиях индуцированного канцерогенеза молочной железы. Эксперименты проведены на 60 крысах-самках Вистар в возрасте 3 месяца, масса 220–250 г. В качестве канцерогенного агента использовано вещество N-метил-N-нитрозомочевина (MНM). Опухоль молочной железы индуцировали (под эфирным наркозом) по описанной методике (Джиоев Ф.К., 1989), путем подкожных инъекций MНM в дозе 2,5 мг на крысу, растворенной в 0,2 мл воды для инъекций, 1 раз в неделю в течение 5 недель, в область 2-й молочной железы у основания правой передней конечности. Интактные крысы служили контролем. Эвтаназия животных осуществлялась под эфирным наркозом через 6 месяцев. Для гистологического исследования забирали молочную железу, подмышечные лимфатические узлы I порядка. В молочной железе крыс, которым вводили МНМ, визуально наблюдали образование опухоли. Паренхима опухоли представлена крупными клетками вытянутой формы фибробластического типа. Отмечено присутствие других клеточных форм: гигантские многоядерные клетки типа Тутона и типа остеокластов, воспалительные элементы, преимущественно лимфоплазмоцитарные. Клетки опухоли инфильтрируют окружающую жировую клетчатку. Клетки строятся в пучки, которые изгибаются, образуя «вихревые», «муаровые» структуры. Наря- 58 Сборник научных трудов ду с «муаровыми» структурами редко встречаются поля фиброза, миксоматоз межуточного вещества, скопления гигантских многоядерных клеток. Строма скудная, представлена аргирофильными волокнами с прослойками коллагеновых волокон. Хорошо выражена лимфоплазмоцитарная инфильтрация, локализующаяся, преимущественно, по ходу сосудов. Встречаются обширные очаги некроза и кровоизлияний, обилие митозов, в том числе атипичных. В подмышечных (�� I�� порядка) лимфатических узлах при экспериментальной опухоли молочной железы выявлены структурные признаки угнетения клеточного звена иммунитета (значительно уменьшена площадь тимусзависимой зоны – на 36,8%). Транспорт лимфы через лимфатический узел повышен (увеличена площадь мозговых синусов – на 28%). В структурных компонентах подмышечных (�� I�� порядка) лимфатических узлов выявлены опухолевые клетки (в герминативных центрах – 1,53%, в паракортикальной зоне – 1,96%, в мозговых тяжах – 3,19%, в мозговых синусах – 3,37% от общего числа клеток), а также угнетение процессов пролиферации и бласттрансформации клеток лимфоидного ряда (уменьшается число лимфобластов, средних и малых лимфоцитов) и активации процессов пролиферации клеток плазматического ряда (увеличено количество плазмобластов и незрелых плазматических клеток), отмечается макрофагальная реакция. В структурных компонентах брыжеечных лимфатических узлов выявлены структурные признаки угнетения гуморального звена иммунитета: уменьшены площади В-зависимой зоны – на 16%, мозговых тяжей – на 22,8% и активации клеточного звена иммунитета (увеличена площадь тимусзависимой зоны – на 62%). Транспортная функция лимфатического узла снижена, в лимфатическом узле преобладает прямой путь транспорта лимфы: площадь мозговых синусов уменьшается на 14,7%, а краевого синуса увеличивается на 73,6%. В структурных компонентах брыжеечных лимфатических узлов выявлены опухолевые клетки, составляющие 5,3% от общего числа клеток в герминативных центрах, 1,97% – в паракортикальной зоне, 3,16% – в мозговых тяжах, 1,84% – в мозговых синусах. Отмечено также угнетение процессов пролиферации и активации бласттрансформации клеток лимфоидного ряда – уменьшается число лимфобластов, средних лимфоцитов и увеличивается число малых лимфоцитов. Таким образом, при анализе полученных данных выявлено, что опухоль молочной железы (6 месяцев) по своему строению представляет собой плеоморфную фибросаркому, развивающуюся из стромы молочной железы. В подмышечных лимфатических узлах �� I�� -го порядка выявлены структурные признаки, свидетельствующие о снижении их барьерно-детоксикационной функции, что на морфологическом уровне выражается в появлении метастазов в лимфатическом узле, уменьшении площади паракортикальной зоны, угнетении процессов пролиферации и бласттрансформации клеток лимфоидного ряда, увеличении площади синусной системы. В брыжеечных лимфатических узлах выявлена структурная реакция, которая выражается, с одной стороны, в гипер59 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки плазии функционально-значимых отделов паренхимы лимфатических узлов, ответственных за Т-звено иммунного ответа, в увеличении численности зрелых эффекторных лимфоидных клеток (малых лимфоцитов в герминативных центрах), изменении транспортного потенциала (уменьшена площадь мозговых синусов) а с другой стороны – в метастазировании в лимфатический узел, в уменьшении площади зон, ответственных за В-звено иммунного ответа. Иммуногистохимическое исследование экспрессии муцина 1, 5АС, 6, 2 типов в карциномах различных анатомических отделов желудка Гаганов Л.Е., Корсакова Н.А. Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, Москва Муцины (�� MUC�� ) относятся к подклассу высокомолекулярных гликопротеинов (Carlstedt I., et al., 1983). В норме слизистая оболочка желудка экспрессирует MUC1, MUC5АС и MUC6, которые выполняют защитные функции, а также передают сигналы, стимулирующие иммунные реакции. Экспрессия MUC1 наблюдается в слизистых клетках покровно-ямочного эпителия антрального отдела, в эпителиоцитах желёз фундального и антрального отделов; MUC5АС вырабатывается фовеолярным эпителием всех отделов; MUC6 – железами антрального типа, мукопептидными клетками шеечной зоны желез антрального и фундального отделов. В очагах кишечной метаплазии появляется экспрессия MUC2 (�� Atlas Genet. Cytogenet. Oncol. Haematol., 2009). В карциномах желудка нарушаются как количественные, так и качественные показатели секреции муцинов. Ранее предпринимались попытки систематизировать эти изменения, использовать показатели экспрессии того или иного муцина в качестве прогностического маркера, создать иммунофенотипическую классификацию карцином желудка, однако результаты таких исследований фрагментарны, противоречивы и не дают комплексной оценки экспрессии муцинов в карциномах всех анатомических отделов (Wei X. et al., 2005; Barresi V. et al., 2006; Lillehoj E.P. et al., 2007; Li X-H. et al., 2008; Schmitz J.M. et al., 2009). Цель исследования – сравнительное изучение иммуногистохимической (ИГХ) экспрессии MUC1, -5АС, -6 и -2 в карциномах желудка, развившихся в кардиальном, фундальном и антральном отделах и переходных зонах между ними вне зависимости от гистологического типа опухоли. Исследован операционный материал 55 гастрэктомий пациентов (30 мужчин, 25 женщин в возрасте 27–75 лет). В кардии локализовалось 11 карцином, на границе кардии и тела (переходная зона �� I�� ) – 8, в теле – 9, на границе тела и антрального отдела (переходная зона II) – 10, в антральном отделе – 17. Стадийность: 60 Сборник научных трудов Tins�� – 1 наблюдение, �� I�� – 1, �� II�� – 14, �� III�� – 39. По гистологическим типам опухоли распределились следующим образом: аденокарциномы – 12 наблюдений, низкодифференцированные аденокарциномы с перстневидноклеточным и/или недифференцированным компонентом – 22, перстневидноклеточный рак, в части случаев с наличием недифференцированного компонента рака – 20, недифференцированный рак – 1. ИГХ исследование проводили по стандартной методике (Зверь- ков И.В., 1986; Гуревич Л.Е. и соавт., 1999). Использовали моноклональные антитела к муцинам («Novocastra»), применяли KIT фирмы DAKO (Strept AB Complex/HRP Duet, Mouse/Rabbit); в качестве хромогена использовали диаминобензидин – ДАВ (SIGMA) и AEC (DAKO), ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Экспрессию оценивали по количеству иммунореактивных клеток, на 100 учтенных при увеличении х400. По степени иммунореактивности сформировано 5 групп: �� I�� – минимальная иммунореактивность (окрашено 1–5 опухолевых клеток), II – слабая (6–25), III – умеренная (26–50), IV – высокая (более 50), V�� – отсутствие ИГХ окрашивания. Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ �� SigmaPlot�� 11 и Microsoft�� Excel�� . Характеристика распределения представлена вычислением средней арифметической (M) и стандартного отклонения (s) в виде (М±s). Для сравнения частот использовали критерий хиквадрат Пирсона для таблиц сопряжённости. Различия считали значимыми при р < 0,05. Установлено, что экспрессия �� MUC�� 1, �� MUC�� 5АС, �� MUC�� 6 и �� MUC�� 2 в большинстве опухолевых клеток карцином желудка была диффузной цитоплазматической и перинуклеарной, MUC1 – мембранно-цитоплазматической. В 3-х наблюдениях экспрессия MUC2 была ядерной. Распределение карцином, экспрессирующих муцины, по анатомическим отделам желудка Тип муцина MUC1* MUC5АС MUC6 MUC2 р Таблица 1 Отделы и переходные зоны Антральный 16 (n=17) 11 (n=17) 9 (n=17) 9 (n=17) =0,035 Зона II 9 (n=10) 6 (n=10) 5 (n=10) 3 (n=10) =0,053 Фундальный 9 (n=9) 1 (n=9) 1 (n=9) 1 (n=9) <0,001 Зона I 7 (n=8) 7 (n=8) 6 (n=8) 5 (n=8) =0,57 Кардиальный 11 (n=11) 3 (n=11) 5 (n=11) 7 (n=11) =0,004 M s 10,4 5,6 5,2 5,0 – 3 4 3 3 – Где n – количество наблюдений; M – среднее; s – стандартное отклонение;* р<0,001 при сравнении результатов экспрессии для MUC1 и MUC2. 61 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Показатели экспрессии муцинов в карциномах разных отделов желудка неоднородны (табл. 1). Наиболее частым экспрессируемым муцином является MUC1 [51 наблюдение (10,4±3,0)], наиболее редким – MUC2 [25 наблюдений (5±3)] – р<0,001. Карциномы кардиального и фундального отделов экспрессировали MUC1 во всех случаях. Самая редкая экспрессия – MUC5, MUC6 и MUC2 – были в фундальном отделе (по 1 наблюдению, p<0,001). На границах анатомических отделов различия в частоте экспрессии были несущественными (для переходной зоны I р=0,57; для переходной зоны II р=0,053). Число иммунореактивных к муцинам раковых клеток в различных анатомических отделах желудка Тип муцина Антральный 401 MUC1* (n=1000) 222 MUC5AC** (n=1000) 121 MUC6*** (n=1000) 102 MUC2**** (n=1000) р <0,001 Отделы и переходные зоны Фундальный 551 524 (n=1000) (n=1000) 229 7 (n=1000) (n=1000) 135 6 (n=1000) (n=1000) 19 2 (n=1000) (n=1000) <0,001 <0,001 Зона II Зона I 546 (n=1000) 354 (n=1000) 293 (n=1000) 106 (n=1000) <0,001 Кардиальный 446 (n=1000) 116 (n=1000) 125 (n=1000) 151 (n=1000) <0,001 Таблица 2 M s 494 67 186 131 136 102 76 63 - - Где n – количество наблюдений; M – среднее; s – стандартное отклонение; * р<0,001 при сравнении результатов между отделами для MUC1; ** р<0,001 для MUC5АС; *** р<0,001 для MUC6; **** р<0,001 для MUC2. Наибольшее количество опухолевых клеток экспрессировали MUC�� 1 (высокая иммунореактивность), наименьшее – �� MUC�� 2 (низкая иммунореактивность) – p<0,001. Наибольшая иммунореактивность к муцинам наблюдалась в карциномах, развившихся на границах анатомических отделов – р<0,001 (табл. 2). Цитоархитектоника брыжеечных лимфатических узлов при моделировании элементов невесомости Гарунова К.А. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Сопутствующими факторами моделируемой невесомости является перераспределение жидких сред организма в переднюю (краниальную) часть тела 62 Сборник научных трудов животного, отсутствие опоры на задние конечности, снижение афферентации от экстерорецепторов, снижение двигательной активности (гипокинезия). Сочетание этих факторов в условиях космических полетов отрицательно сказывается на функциональных системах организма и может приводить к различным патологическим состояниям (Газенко О.Г., Парфенов Г.П., 1982; Константинова И.В.,1988; Цапов Е.Г., 2003). Известно, что органы иммуногенеза относятся к наиболее лабильным системам при различных изменениях внешней и внутренней среды организма, и их состояние является показателем иммунологической активности организма, в целом (Сапин М.Р., 1982; Бородин Ю.И., 1987; Сапин М.Р., Никитюк Д.Б., 2000). Учитывая, что периферические органы иммунной системы, в частности, лимфатические узлы, в условиях моделирования невесомости мало изучены, целью нашей работы являлось исследование состояния брыжеечных лимфатических узлов крыс при 30-суточной невесомости и возможности их восстановления. Объектом исследования были половозрелые крысы-самцы массой 250– 300 г, 3-месячного возраста. Гипокинезию моделировали при помощи мягкой фиксации хвоста крысы поролоновыми зажимами (во избежание некроза) к подвижной основе, на протяжении всей длины клетки, под углом в 45º. Задние лапки крыс находились выше уровня пола на 1 см. С помощью передних лапок животные могли передвигаться по клетке, свободно пользоваться водой и пищей. По окончании эксперимента животные забивались методом декапитации (гильотиной). Изучены лимфатические узлы крыс, которые в течение 30 суток подвергались воздействию моделированной невесомости, а также спустя 30 суток после прекращения эксперимента (по 10 животных в группе). Брыжеечные лимфатические узлы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 4–5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином по Маллори и Ван–Гизон. На стандартной площади гистологического среза в 880 мкм² в брыжеечных лимфатических узлах изучали клеточный состав в центрах размножения лимфоидных узелков, мякотных тяжах, мозговом синусе. Проведена статистическая обработка количественных показателей содержания клеток. Достоверность различий средних величин оценивали по Стьюденту (Лакин Г.Ф., 1990). Выявлено, что длительное влияние 30-суточной моделируемой невесомости приводит к выраженному уменьшению в центрах размножения лимфоидных узелков содержания молодых форм клеток (бластов и больших лимфоцитов) от 21,59% до 3,78% по сравнению с интактной группой животных. Доля малых лимфоцитов достоверно не меняется (20,55% – 20,06%), наряду с увеличением числа деструктивно измененных клеток в 12,8 раза (от 2,75% до 35,22%). В мякотных тяжах лимфатических узлов содержание лимфоцитов (малых и средних) в эксперименте снижается всего в 1,3 раза, но отмеча63 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ется наибольшее увеличение числа деструктивных клеток в органе (от 4,24% до 35,17%). Число молодых клеток сохраняется на уровне интактных значений. В мякотных тяжах сохраняются только единичные формы плазматических клеток по сравнению с интактной группой. В мозговых синусах лимфатического узла в эксперименте уменьшается количество малых лимфоцитов в 1,7 раза (от 42,50% до 25,11%), а молодые формы клеток исчезают. Резкое увеличение содержания деструктивно измененных и разрушенных клеток в мозговых синусах (от 3,12% до 32,73%) сопровождается снижением количества макрофагов в 10,7 раза (от 38,92% до 3,63%). Спустя 30 суток после окончания действия моделируемой невесомости во всех структурных зонах брыжеечных лимфатических узлов снижаются процессы деструкции клеток (от 35,22% до 10,00%). По сравнению с экспериментом, во всех зонах лимфатического узла увеличивается содержание молодых форм клеток, особенно в центрах размножения лимфоидных узелков за счет больших лимфоцитов – до 10,83% (в 5,0 раз). Клетки с картинами митозов появляются в центрах размножения лимфоидных узелков и в мякотных тяжах (2,46% и 1,46%, соответственно). Усиливается макрофагальная реакция, при которой число макрофагов увеличивается от 3,63% до 6,01% в мозговых синусах, и они появляются в мякотных тяжах (8,08%). В мозговых синусах и в мякотных тяжах увеличивается доля плазмоцитов – до 6,46% (в 5,8 раза) и до 4,00% (в 8,0 раз), соответственно. Таким образом, установлено, что воздействие 30-суточной невесомости оказывает угнетающее воздействие на функциональное состояние брыжеечных лимфатических узлов крыс. Выявлено резкое снижение лимфоцитопоэза с подавлением бласттрансформации и пролиферативной активности клеток. Резкое торможение созревания плазматических клеток характеризует снижение гуморального иммунитета в органе. Изменения в кооперации клеток в органе связаны с резким усилением деструктивных процессов в условиях действия факторов невесомости. Наши результаты исследований согласуются с данными Березиной Е.А. (2009), Григоренко Д.Е., Ганиевой А.И. (2010), изучающих лимфоидную ткань в стенках пищеварительного тракта. Перестройка цитоархитектоники в брыжеечном лимфатическом узле крыс в отдаленный период, после окончания 30-суточной невесомости, направлена на восстановление функциональной активности органа, что подтверждается усилением лимфоцитопоэтической функции, активным созреванием плазматических клеток на фоне резкого снижения деструктивных процессов. 64 Сборник научных трудов Реактивные изменения в структурах поясничного утолщения спинного мозга крыс при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите Гилерович Е.Г., Федорова Е.Ф., Карпенко М.Н., Тихомирова М.С., Абдурасулова И.Н., Захарова Е.Т., Коржевский Д.Э. НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург Реактивные изменения клеток в спинном мозге крыс изучаются при перерезках проводящих путей, травмах и некоторых его заболеваниях. Основное внимание исследователями уделяется мотонейронам вентральных рогов, меньше – нейронам дорсальных рогов спинного мозга. Практически никем не изучались клетки Х пластинки Рекседа, центральной частью которой является спинномозговой канал. Задача настоящей работы состояла в изучении реактивных изменений клеток спинного мозга: нейронов, астроцитов, эпендимоцитов центрального канала при остром аутоиммунном процессе. В качестве модели для исследования мы использовали острый экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, вызванный введением гомогената гомологичного спинного мозга. При использовании данной модели иммунный воспалительный ответ возможен на все компоненты миелина, в результате чего проявляется развернутая клиническая симптоматика заболевания (развитие парезов, параличей и пр.). Работа выполнена на 14 крысах линии Вистар. Применены традиционные гистологические методики и иммуногистохимические реакции (выявление PCNA – маркера пролиферации, глиального фибриллярного кислого белка – маркера астроцитов, нейроспецифического белка �� GAP�� -43 – маркера регенерации, даблкортина – маркера нейробластов, бета-тубулина – белка, ассоциированного с микротрубочками, и Iba1 – маркера микроглии и макрофагов). При морфологическом исследовании препаратов выявлялась гетерогенная картина воспалительного процесса. Инфильтраты были обнаружены в области конского хвоста, корешков спинного мозга, в его сером и белом веществе. Клеточный состав этих инфильтратов представлен лейкоцитами, лимфоцитами и микроглиальными клетками. Клеточные инфильтраты обнаруживались также вокруг сосудов, образуя своеобразные «муфты». Иммуногистохимические исследования (�� PCNA�� ) свидетельствуют о различной степени выраженности пролиферативных процессов в спинном мозге разных животных. Иммунопозитивные для микроглии и макрофагов клетки были обнаружены не только в инфильтратах, но и в белом и даже сером веществе спинного мозга. Все морфологические изменения были связаны с интенсивностью воспалительного аутоиммунного процесса и не зависели от уровня среза поясничного 65 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки утолщения. Морфологические изменения наблюдались и в тех случаях, где не было обнаружено инфильтратов: в вентральных рогах отмечалась деформация мотонейронов, гиперхроматоз, вакуолизация цитоплазмы. Мотонейроны в этих условиях показывали морфологические признаки аксональной реакции, связанной с повреждением проводящих путей спинного мозга. Повреждается и часть чувствительных нейронов дорсальных рогов спинного мозга. Как в вентральных, так и в дорсальных рогах спинного мозга наблюдалось большое число астроцитов. Глиальный фибриллярный кислый белок определялся в цитоплазме клеток, которые часто имели по два ядра и неправильную форму, а их отростки были расширены и укорочены. Такая морфологическая картина характерна для астроцитарного глиоза. Особое внимание в данной работе уделено изучению реактивных процессов в эпендимоцитах центрального канала спинного мозга. В норме эпендимные клетки, образующие центральный канал, расположены в один ряд и соединены друг с другом плотными межклеточными контактами, как всюду в ЦНС на границе раздела сред. Предполагается, что в эпендимной и субэпендимной зонах стенки центрального канала у взрослых животных присутствуют стволовые/прогениторные клетки. При выраженном воспалительном процессе в спинном мозге реактивные изменения в эпендимных клетках проявляются в следующем: клетки располагаются в несколько рядов, при этом они местами расположены более рыхло, чем в норме. Митотически делящиеся и PCNA-иммунореактивные эпендимоциты выявлены среди клеток стенки центрального канала, что свидетельствует о возможности их пролиферации. Иммуногистохимически в подэпендимных структурах центрального канала обнаружен нейроспецифический белок �� GAP�� -43, являющийся маркером регенеративных процессов. Иммунореактивные к GAP-43 структуры иногда наблюдаются в стенке и под эпендимой центрального канала у крыс контрольной группы. В случае воспалительного процесса клетки, содержащие �� GAP�� -43, присутствуют в большем количестве и могут находиться во внутреннем ряду клеток эпендимнной зоны. Кроме того, иммунореактивными к �� GAP�� -43 являются тонкие волокна, расположенные снаружи от эпендимоцитов центрального канала, занимающие иногда до половины площади Х пластинки Рекседа. В случае экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита интенсивность иммуногистохимической реакции к �� GAP�� -43 в области этой пластинки бывает разной: иногда иммунореактивных гранул много, иногда они едва определяются. Учитывая тот факт, что нейроспецифический белок GAP-43 является маркером регенерации, разная степень иммуногистохимической реакции может определять интенсивность регенераторного процесса в каждом конкретном случае. Ни в контрольных, ни в опытных образцах спинного мозга в стенке центрального канала мы не наблюдали реакции на даблкортин и 66 Сборник научных трудов бета-тубулин III, что свидетельствует о том, что клетки нейронального ряда из прогениторных клеток стенки центрального канала спинного мозга при аутоиммунном воспалительном процессе в условиях зрелого микроокружения не образуются. Таким образом, реактивные изменения клеток в ответ на аутоиммунный воспалительный процесс в условиях зрелого микроокружения могут приводить к активации прогениторных клеток стенки центрального канала. Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-00742. Ультраструктурные изменения клеток легких при экспериментальном аутоиммунном процессе Голованова В.Е., Бархина Т.Г., Кондратьев В.Е. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Аутоиммунные или т.н. аутоаллергические нарушения все чаще встречаются в клинической практике, значительно усложняя диагностику и лечение целого ряда заболеваний. К этим заболеваниям относятся и классические аллергические нозологии, и аутоиммунные болезни, в т.ч. коллагенозы, первичный билиарный цирроз, аутоиммунный гепатит, миопатия, альвеолит, дилатационная кардиомиопатия, пернициозная анемия и инфекционные процессы. Установлено, что при аутоаллергическом повреждении в крови обнаруживаются антитела к собственным клеточным органеллам. Их патогенетическая роль до конца не выяснена, но по одной из гипотез они принимают непосредственное участие в аутоиммунном повреждении и являются ранним диагностическим признаком начала процесса. По данным различных источников для выяснения патогенетической роли аутоиммунных антител первые эксперименты проводились в Научно-исследовательской аллергологической лаборатории в Москве и в Институте экспериментальной медицины Центрального университета Венесуэлы. Тогда исследовали показатели изолированной митохондриальной фракции печени in vitro и клетки печени интактных морских свинок in vivo при действии гетерологичных антител к клеточным органеллам с помощью морфологических и патофизиологических методов. Эти данные свидетельствуют о необходимости изучения действия этих антител на клетки различных органов для уточнения или опровержения стереотипных внутриклеточных изменений при аутоиммунных процессах. Целью представленного исследования было изучить комплекс ультраструктурных повреждений в легких при аутоаллергической альтерации. Митохондриальную, ядерную и лизосомальную фракции выделяли в среде, содержащей 0,25 М сахарозу (рН 7,5) по �� S�� . Fleischer�� и �� B�� . Fleischer�� . Контро- 67 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки лем чистоты фракций служила электронная микроскопия. Гетерологичные антитела получали пятикратной иммунизацией кроликов митохондриальной, ядерной, лизосомальной фракциями или гомогенатом печени интактных морских свинок, содержащих белок – 20 мг на инъекцию. Титры гетерологичных антител к клеточным органеллам печени морских свинок определяли в реакции связывания комплемента. Титры митохондриальных антител составили 1:1280–1:2560; ядерных – 1:1280; лизосомальных – 1:640; антитела к гомогенату печени определялись в титре 1:320; контрольное определение реакции митохондриального антитела с сывороткой интактного кролика составило титр 1:20. При проведении перекрестных реакций выявлены относительно высокие титры митохондриальных (1:80) и ядерных (1:160) антител во взаимодействии с лизосомальным антигеном. Моделирование аутоаллергического процесса было проведено на морских свинках путем внутривенного введения сыворотки с гетерологичными антителами к клеточным структурам в дозе 0,6 мл цельной иммунной сыворотки. Морским свинкам контрольной группы вводили такую же дозу сыворотки контрольного кролика. Через 5, 10 и 30 минут после инъекций был получен экспериментальный материал: печень, поджелудочная железа, надпочечники, почки, легкие, сердце, тонкая и толстая кишка. В данной работе были исследованы полутонкие и ультратонкие срезы легких. При изучении полутонких срезов легких морских свинок установлено, что изменения наблюдались во всех клеточных популяциях: клетках аэрогематического барьера – альвеолоцитах I типа и эндотелиоцитах кровеносных капилляров; альвеолоцитах �� II�� типа, альвеолярных макрофагах, эндотелиоцитах артериол и венул, лимфоцитах, тромбоцитах, гранулоцитах. Так, при введении ядерных антител отмечалось разрастание интерстициальной ткани легких; при введении лизосомальных антител – значительное расширение сосудов микроциркуляторного русла, переполненных форменными элементами; при введении митохондриальных антител – отек клеток. При ТЭМ общими для всех аутоиммунных сывороток были однотипные изменения ядер, такие как неровность контуров за счет утолщения внутренней ядерной мембраны и расширения перинуклеарного пространства, укрупнение ядрышек, перераспределение гетеро- и эухроматина, отдельные апоптотические тельца. В альвеолоцитах �� II�� типа наблюдались значительные нарушения ультраструктуры митохондрий (деструкция, гомогенизация, фрагментация крист) и осмиофильных ламеллярных телец, их редукция и отечность, т.е. признаки нарушения синтеза сурфактанта. Обнаруженные в клетках цитофагосомы свидетельствовали о повышенной утилизации поврежденных структур. 68 Сборник научных трудов В сосудах микроциркуляторного русла отмечено резкое расширение просвета за счет истончения стенок эндотелиоцитов. Встречались отдельные сосуды с отечными эндотелиоцитами с малым количеством органелл, дегранулированным эндоплазматическим ретикулумом, без пиноцитозных везикул. Внутри сосудов были видны измененные гранулоциты и тромбоциты с большим количеством псевдоподий. В периваскулярных пространствах обнаружены лимфоциты, тромбоциты и гранулоциты, что отражает повышенную проницаемость сосудов. Итак, при экспериментальном моделировании аутоаллергического процесса установлено, что повреждаются основные компоненты всех клеточных популяций легких. Это ведет к нарушениям обменных процессов, необходимых для нормального функционирования легких и может клинически проявляться при различных аутоиммунных реакциях, а также усугублять течение заболеваний и сенсибилизацию, влиять на иммунный статус и вовлекать в каскад аутоиммунного поражения органы разных систем. Нейрон-глиальное взаимодействие при изменениях режима синаптической передачи Гореликов П.Л. НИИ морфологии человека РАМН , Москва Изменения режима функционирования синаптической передачи являются основной причиной активизации белок-синтезирующего аппарата нейронов (Gueorguiev V. et al., 2000; Dunckley T., Lukas R., 2003). Современная концепция трехстороннего синапса (�� tripartite�� synapse�� ), вписывает в классическую композицию химического синапса третий, функционально необходимый компонент – примыкающую к синапсу глиальную клетку, которая непосредственно принимает участие в организации синаптической передачи и модулирует ее активность (Araque A. et al., 1999; Araque A. et al., 2001; Todd K.J., Robitaille R., 2006). Однако механизмы и характер совместного участия нейронов и глиоцитов в синаптическом действии требуют всестороннего изучения. Цель работы – исследовать закономерности изменений белок-синтези- рующих систем нейронов и глиоцитов при разных режимах функционирования синаптической передачи. Применяли экспериментальную модель дозированной депривации синаптической передачи в верхнем шейном симпатическом ганглии путем однократного подкожного введения кроликам димеколина – холинолитика, который вызывает блокирование разного количества никотиновых рецепторов в холинергических синапсах, вплоть до полной их депривации, пропорционально вводимым дозам и времени после введения препарата (Першин Б.Н., 69 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки 1966; Бровцына Н.Б. и др., 1996). Ганглий исследовали через 1, 3, 5, 7, 9 и 11 ч после введения димеколина в дозах: 10, 30 и 50 мг/кг. Определяли содержание нуклеиновых кислот в цитоплазме нейронов и в сателлитных глиоцитах после окрашивания парафиновых срезов по методу Эйнарсона методом сканирующей фотографической цитофотометрии. В обоих типах клеток полученные результаты относили за счет изменений рРНК, так как в цитоплазме нейронов нуклеиновые кислоты, в основном, представлены рРНК (Гайцхоки В.С.,1980), а ДНК глиоцитов отличается стабильностью (Peters A., Sethares C., 2004). Изменения режимов функционирования синаптической передачи в холинергических синапсах сопровождали заметно выраженные, как в цитоплазме нейронов, так и в глиальных клетках, количественные изменения рРНК (табл.). Поскольку рРНК является ключевым параметром функционального потенциала белок-синтезирующей системы, по крайней мере на уровне трансляционных процессов синтеза белка (Grannemann S., Baserga S., 2004; Dresios�� J�� . et�� al�� ., 2006), полученные изменения свидетельствуют в пользу современных представлений (Araque A. et al., 2001; Wang H., Tiedge H., 2004; Todd K.J., Robitaille R., 2006) о метаболической основе пластических перестроек синапсов и активном участии в этих процессах глиальных клеток, в том числе, в холинергических синапсах верхнего шейного ганглия. Важно отметить, что при частичной депривации никотиновых рецепторов (10 и 30 мг/кг) наблюдается высокий уровень корреляции изменений белоксинтезирующих систем нейронов и глиальных клеток (коэффициент корреляции 0,86 и 0,95), тогда как при полной их первоначальной депривации (50 мг/кг) этого не наблюдается. Таким образом, в краниальном шейном ганглии сателлитные глиоциты проявляют высокую метаболическую лабильность в ответ на изменения синаптической активности. Метаболическое обеспечение пластических перестроек холинергических синапсов при изменениях режима их функционирования обеспечивается при помощи кооперативного взаимодействия нейронов и глиоцитов. 70 Сборник научных трудов Таблица Сравнение динамики содержания рРНК в симпатических нейронах и глиоцитах при разных уровнях блокады никотиновых холинорецепторов Содержание рРНК Содержание рРНК в расчете на один нейрон в расчете на один глиоцит Сроки В отн. ед. В отн. ед. (ч) В% В% оптической оптической к контролю к контролю плотности плотности Контроль 241±6 100,0±2,5 20,6±0,3 100,0±1,5 Незначительное количество первоначально блокированных холинорецепторов (доза 10 мг/кг) 1 414±13 171,8±3,1 30,3±0,6 147,1±2,0 3 323±12 134,0±3,7 23,4±0,5 113,6±2,1 5 312±12 129,5±3,8 22,8±0,4 110,7±1,75 7 257±12 106,6±4,7 18,7±0,5 90,8±2,7 9 241±10 100,0±4,1 17,8±0,5 86,4±2,8 11 242±11 100,4±4,5 15,2±0,5 73,8±3,3 Значительное количество первоначально блокированных холинорецепторов (доза 30 мг/кг) 1 298±11 123,7±3,7 25,3±0,4 122,8±1,6 3 302±12 125,3±4,0 24,3±0,6 118,0±2,5 5 360±11 149,4±3,1 25,2±0,4 122,3±1,6 7 301±12 124,9±4,0 22,1±0,5 107,3±2,3 9 271±8 112,4±3,0 20,4±0,4 99,0±2,0 11 239±11 99,2±4,6 18,6±0,4 90,3±2,15 Полное первоначальное блокирование холинорецепторов (доза 50 мг/кг) 1 3 5 7 9 11 258±9 259±8 270±13 326±12 270±16 246±11 107,1±3,5 107,5±3,1 112,0±4,8 135,3±3,7 112,0±5,9 102,1±4,5 25,1±0,6 18,8±0,5 21,0±0,6 24,6±0,535 29,1±0,8 21,7±0,35 121,8±2,4 91,3±2,7 101,9±2,9 119,4±2,2 141,3±2,75 105,3±1,6 71 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Межклеточные взаимодействия в ткани печени в условиях тиреоидного дисбаланса при хронической эндогенной интоксикации Горячев А.Н., Калашникова С.А. Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград В настоящее время эндогенную интоксикацию (ЭИ) принято рассматривать в рамках хронического системного воспалительного ответа. При длительно существующей ЭИ развивается эндокринопатия, которая усугубляет течение патологического процесса и приводит к более раннему формированию синдрома полиорганной недостаточности. Ряд авторов указывает на то, что коррекция эндокринных нарушений уменьшает выраженность повреждения печени и почек и может служить основой для патогенетической терапии (Malik R., Hodgson H., 2002; Калашникова С.А., 2009). В связи с этим представляло интерес изучение выраженности и механизмов повреждения органов-мишеней в условиях предшествующего эндокринного дисбаланса при хронической ЭИ. Данная работа посвящена изучению повреждения печеночной паренхимы при хронической ЭИ на фоне тиреоидного дисбаланса. Выбор печени в качестве изучаемого органа-мишени обусловлен тем, что печень метаболизирует гормоны и токсические соединения, а мембраны гепатоцитов содержат большое количество рецепторов к тиреоидным гормонам. Цель исследования – установить закономерности ФНО-зависимого апоптоза в ткани печени при экспериментальном воспроизведении хронической ЭИ в условиях гипер- и гипотиреоза. Работа была выполнена на 45 нелинейных белых крысах обоего пола массой 180–210 г. Выбор, содержание животных, моделирование патологических процессов и выведение крыс из опыта осуществляли на основе базисных нормативных документов МЗ РФ и рекомендаций ВОЗ. При моделировании хронической ЭИ у 12 животных была использована классическая модель с преимущественным поражением печени, основанная на комбинированном введении малых доз бактериального липополисахарида и тетрахлорметана (Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005). Для моделирования гипертиреоза 12 животным перорально вводили препарат «L-тироксин» в течение 7 дней. Затем воспроизводили хроническую ЭИ в ее классической модели. Моделирование гипотиреоидного состояния 12 крысам проводилось путем введения препарата «Мерказолил» в течение 7 дней. Далее моделировалась классическая хроническая ЭИ. В качестве контрольной группы использовали 9 животных. Животных выводили на 30-е, 60-е и 90-е сутки эксперимента путем передозировки нембутала. Хроническую ЭИ верифицировали по увеличению содержания в плазме крови веществ средней молекулярной массы (ВСММ) и их олигопептидных фракций, концентрации малонового диальдегида (МДА). 72 Сборник научных трудов Определение концентраций ТТГ, Т3 и Т4 в сыворотке крови для оценки тиреоидного статуса проводилось методом иммуноферментного анализа. Морфологическое исследование тканей печени проводилось по стандартной методике. В качестве маркеров апоптоза использовались моноклональные антитела к антигенам TRAIL и caspase-3. Для количественной оценки морфологических изменений использовали программный пакет Image Tool for Windows. В результате исследования было установлено, что при моделировании классического варианта хронической ЭИ на всем протяжении эксперимента нарастало содержание маркеров ЭИ и увеличивалась концентрация тиреоидных гормонов. У животных с предшествующим гипертиреозом показатели маркеров ЭИ были достоверно выше, чем у крыс с классической ЭИ. В то же время у крыс с гипотиреозом концентрации ВСММ, МДА были достоверно меньше, нежели в группе с классической ЭИ (р<0,05). При гистологическом исследовании ткани печени установлено, что размеры ретикулярных эндотелиоцитов, размер их ядер, количество некротизированных гепатоцитов и гепатофиброз нарастали в ряду: животные с ЭИ на фоне гипотиреоза<крысы с классической ЭИ< животные с ЭИ на фоне гипертиреоза. При иммуногистохимическом исследовании �� TRAIL�� максимальная экспрессия определялась в группе животных с гипертиреозом. Минимальная экспрессия – в группе крыс с гипотиреозом (рис. 1). Рис. 1. Относительная площадь иммунопозитивного материала TRAIL в ткани печени у животных с классической ЭИ и тиреоидным дисбалансом. 73 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки При иммуногистохимическом исследовании экспрессии каспазы-3 была обнаружена аналогичная тенденция в распределении иммунопозитивного материала в ткани печени. Таким образом, повышенное содержание тиреоидных гормонов в сыворотке крови утяжеляло течение хронической ЭИ, в то время, как дефицит тиреоидных гормонов приводил к уменьшению повреждения гепатоцитов. Данный аспект актуален не только для проводимой патогенетической коррекции хронической ЭИ, но и для прогноза течения ЭИ в условиях дисбаланса тиреоидных гормонов. Особенности микроциркуляции в органах репродукции в возрастном аспекте Греф В.В., Бурчак Н.Н., Старкова Е.В., Асташов В.В., Ларионов П.М. НИИ клинической и экспериментальной лимфологии РАМН, Новосибирский государственный университет, Новосибирск Структурно-функциональная единица лимфатической системы – лимфатический регион, состоит из 3-х звеньев: интерстициальные несосудистые пути – «прелимфатические пути» – первое звено, второе – сосудистое, третье – регионарные лимфатические структуры, содержащие лимфоидную ткань. Первое звено лимфатического аппарата – это неклеточный компонент рыхлой соединительной ткани, окружающей стенки сосудов микроциркуляторного русла, клеточные элементы паренхимы и соединительнотканные клетки. Ряд авторов описывает интерстициальное пространство как промежуточное звено гематолимфатического барьера. Изучение процессов старения и профилактики возрастных изменений невозможно без понимания роли микроциркуляторного русла тканей половых органов. Особенности старения женского организма заключаются в более резком падении уровня половых гормонов после истощения фолликулярного запаса яичников, гормонпродуцирующая функция которых во многом зависит от кровоснабжения и лимфатического дренажа. Лимфатическая система, являясь основным коллектором интерстициальной жидкости, участвует в регуляции клеточного метаболизма и тканевых обменных процессов. Расстройства микроциркуляции, в том числе связанные с возрастными или физиологическими (беременность) особенностями, приводят к изменению гистоархитектоники дренажного лимфатического русла и лимфатических капилляров в интерстиции матки и яичников. Таким образом, при оценке морфологических параметров сосудистой системы половых органов необходимо учитывать характер структурной перестройки лимфатического русла. К 74 Сборник научных трудов сожалению, исследования лимфатического звена проводят редко, во многом это связано со сложностью дифференцировки эндотелиальных клеток лимфатических и кровеносных микрососудов. В последние годы для этого активно используется ферментная гистохимия. Так для лимфатического эндотелия характерна выраженная активность фермента 5’-нуклеотидазы (5Н), в то же время в кровеносных капиллярах его активность существенно ниже или совсем не определяется. Гидролитическая активность щелочной фосфатазы (ЩФ), наоборот, выше в эндотелиоцитах кровеносных сосудов. Таким образом, дифференцировка лимфатического эндотелия от кровеносного осуществляется при двойном гистохимическом окрашивании с определением в тканях неспецифической ЩФ и 5Н (Kato S., 1997–2003). Цель исследования – выявление особенностей микроциркуляторного русла тканей половых органов и возможности коррекции изменений, возникающих при различных нарушениях микроциркуляции. Исследования проводились на экспериментальных животных, объект исследования – подслизистый слой миометрия. Исследования проведены на 120 крысах-самках линии Vistar нескольких возрастных групп. Животные разделены на группы без коррекции и группы с коррекцией – до планируемой беременности получали комплексный препарат «Гармония Сил» и облучение низкоинтенсивным шумовым электромагнитным излучением ЭМИ КВЧ области проекции тимуса и региона яичников. Облучение КВЧ проводилось в течение двух минут ежедневно на протяжении 10 дней. Препарат «Гармония Сил» животные получали энтерально в течение 20 суток из расчета 7 мг на 100 г веса животного в сутки во время кормления. Измерение гистоархитектоники микрососудистого русла проводилось с помощью программно-аппаратного комплекса с флуоресцентным микроскопом «Carl Zeiss Fl 40» и встроенной фотокамерой. Определяли плотность микрососудов – абсолютное количество микрососудов в 1 кв. мм окулярной квадратно-сетчатой тестовой системы. По данным гистохимического анализа, выявлено, что у животных активного репродуктивного периода значительно преобладает абсолютная плотность кровеносных микрососудов над лимфатическими (474,4±4,21 по сравнению с 116,63±3,97) в подслизистом слое миометрия. Во время протекания физиологической беременности данная тенденция сохраняется (527,7±9,11 и 166,02±1,33). В периоде угасания репродуктивной функции более выраженные изменения претерпевает лимфатическое русло, причем как в миометрии, так и в яичниках. Соответственно, в тканях половых органов с возрастом происходит существенное ухудшение микроциркуляции, ведущее к нарушению интерстициального гуморального транспорта и лимфатического дренажа, в результа- 75 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки те чего в межклеточном пространстве накапливаются продукты перекисного окисления липидов и запускаются процессы окислительного повреждения тканей. Учитывая вышеизложенное, в качестве корригирующего средства был использован комплекс «Гармония Сил», состоящий из лекарственных растений с высокой концентрацией биофлавоноидов и лиофилизированной икры морского ежа. Морфометрические и гистохимические исследования выявили, что на фоне приема препарата происходит нормализация проницаемости стенок лимфатических капилляров тканей половых органов, стимуляция метаболической активности лимфоцитов у животных всех возрастных групп и усиление дренажно-детоксикационной функции лимфатической системы, что способствует восстановлению и сохранению структурной целостности тканей. При использовании ЭМИ КВЧ у животных зрелого репродуктивного возраста происходит улучшение капиллярного кровотока и увеличение абсолютной плотности кровеносных микрососудов. Таким образом, выявленные изменения кровеносного и лимфатического звена микроциркуляторного русла половых органов на фоне комплексного использования методов позволяют улучшить трофику тканей и дренаж интерстициального пространства даже у животных в периоде угасания репродуктивной активности. Динамика цитоархитектоники лимфоидной ткани в стенке мочеточника в старших возрастных группах человека Григоренко Д.Е. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Применение в практической медицине морфологических данных позволяет разрабатывать новые подходы для оценки состояния структурных компонентов стенки мочеточника при воспалительных процессах, а также при применении реконструктивной пластики мочевых путей и в послеоперационный период (Деревянко И.М., 1979; Лопаткин Н.А., Люлько А.В., 1987). Для понимания причин обострения неспецифических воспалительных процессов с поражением мочевыделительной системы необходимо изучение лимфоидных структур в стенках выделительной системы, состояние которых является отражением их иммунологической активности у условно здорового человека (Сапин М.Р., 1996; Девятов А.С., 2003; Асфандияров Ф.Р., 2004). В литературе довольно мало работ, посвященных изучению распределения лимфоидной ткани в стенках органов выделительной системы (Кафаров З.А., 1989; Бахмет А.А., 1994). Исходя из этого, целью настоящего исследования является 76 Сборник научных трудов изучение особенностей распределения цитоархитектоники лимфоидной ткани в стенке мочеточника в старших возрастных группах у человека. Исследование проведено на секционном материале 13 человек подросткового, 1-го и 2-го зрелого возраста (13–60 лет), которые погибли в результате травм и других случайных причин. Материал изучался в тех случаях, когда при патологоанатомическом вскрытии не было обнаружено хронической или острой патологии. Фрагменты мочеточников фиксированы в 10% формалине, проведены по спиртам возрастающей концентрации и залиты в парафин. Гистологические срезы мочеточников толщиной 4–5 мкм окрашены гематоксилином-эозином и по Маллори. На единице площади гистологического среза (880 мкм2) в стенках мочеточника изучен клеточный состав слизистой оболочки и подслизистой основы. Проведена статистическая обработка полученных количественных показателей. Исследование показало, что в подростковом и 1-м зрелом возрастах на гистологических срезах в стенке мочеточника слабо выражена граница между слизистой оболочкой и подслизистой основой. Лимфоидная ткань в эти возрастные периоды в стенке органа представлена диффузно-ассоциированной лимфоидной тканью, состоящей из рассеянных, редко расположенных клеток. У подростков в слизистой оболочке мочеточника основную долю клеток составляют стромальные клетки (55,5%). Выявлено 25% деструктивно измененных и разрушенных клеток и всего 13,9% малых лимфоцитов. В стенке мочеточника вокруг многочисленных мелких сосудов часто встречаются тучные клетки (5,5%). В подслизистой основе содержание малых лимфоцитов в 1,6 раза больше, чем в слизистой оболочке. Здесь выявлены средние лимфоциты (2,3%) и макрофаги (4,6%). Процессы деструкции клеток в подслизистой основе выражены в 2,1 раза слабее, чем в слизистой оболочке. В период 1-го зрелого возраста в слизистой ободочке и в подслизистой основе мочеточника довольно редко встречаются малые лимфоциты – от 5,9% до 7,3%. В слизистой оболочке резко преобладает содержание стромальных клеток (до 70,5%) и выявлено то же число разрушенных клеток, что у подростков (24,0%). В подслизистой основе мочеточника стромальных клеток выявлено меньше, чем в слизистой оболочке – на 15,5%. Однако, в отличие от подросткового возраста, в подслизистой основе достоверно усиливается деструкция клеток (на 7,5%) и появляются эозинофилы. Во 2-м зрелом возрасте, по сравнению с 1-м зрелым возрастом, в слизистой оболочке мочеточника увеличивается доля лимфоцитов (до 19,1%). Здесь выявлено от 4 до 10 межэпителиальных лимфоцитов, мигрирующих в просвет органа, появляются зрелые (антителпродуцирующие) плазматические клетки (1,6%). В слизистой оболочке вокруг и в просвете расширенных сосудов видны эозинофилы, нейтрофилы (7,0%) и тучные клетки (1,4%). 77 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки В отличие от предыдущих возрастных периодов, во 2-м зрелом возрасте в подслизистой основе мочеточника появляются скопления лимфоидных клеток, имеющие вид предузелков. Лимфоидные скопления состоят из малых лимфоцитов (31,4%), средних и больших лимфоцитов, общее содержание которых (лимфоцитов) в 2,4 раза больше, чем в слизистой оболочке. Плазматические клетки представлены плазмоцитами (0,9%) и плазмобластами (1,4%). В виде единичных клеток (менее 1%) выявлены макрофаги и эозинофилы. В слизистой оболочке и в подслизистой основе мочеточника в равном количестве присутствуют деструктивно измененные клетки и фибробласты. Вокруг кровеносных сосудов видны концентрически расположенные лимфоциты. В межмышечных пучках мышечной оболочки отмечаются цепочки лимфоцитов и тяжи из лимфоцитов и плазматических клеток. Исследование показало, что с возрастом общая доля лимфоидной ткани в стенке мочеточника нарастает. Во 2-м зрелом возрасте в стенке органа появляются лимфоидные скопления. С возрастом зоны локализации лимфоидной ткани распространяются вглубь стенки органа в подслизистую основу и заполняют пространство между мышечными пучками мышечной оболочки. Для 2-го зрелого возраста характерно присутствие значительного количества лимфоцитов, мигрирующих через эпителиальный слой в просвет органа, и появление плазматических клеток, что является отражением возрастного усиления антигенного воздействия мочи на стенку мочеточника (Мовет Г.З., 1985). С возрастом резко усиливается деструкция клеток (в 1,5–2 раза), по сравнению с подростковым возрастом. Отмеченное накопление клеток гранулоцитарного ряда, в том числе тучных клеток, в стенке мочеточника и в просвете расширенных кровеносных сосудов связано, видимо, с проявлением аллергической и воспалительной реакций и нарушением проницаемости сосудов в старших возрастных группах человека (Серов В.В., Шехтер А.В., 1981). Электронно-микроскопическое исследование межклеточных контактов иммуннокомпетентных клеток в ткани саркомы 45 после воздействия низкоинтенсивным микроволновым резонансным излучением на крыс-опухоленосителей Гудцкова Т.Н., Жукова Г.В., Суханова М.И. ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий», Ростов-на-Дону Разработка способов индукции и/или усиления собственных цитотоксических иммунных реакций организма, направленных на борьбу с опухолью, является актуальной проблемой онкологии. В настоящее время исследуется 78 Сборник научных трудов возможность использования в качестве противоопухолевого фактора низкоинтенсивного микроволнового резонансного излучения (РИ), соответствующего по частоте собственному излучению водосодержащих сред (Сини- цын Н.И., Петросян В.И., Ёлкин В.А. и др., 2002). Целью работы было изучение особенностей межклеточных контактов при реализации местных иммунных реакций в тканях саркомы 45 после воздействия РИ на крыс-опухоленосителей. Исследование проводили на 18 белых беспородных половозрелых самцах крыс массой 180–200 г с перевивной саркомой 45. В основной группе (n=12) воздействие осуществляли на область головы животного по алгоритмам активационной терапии (Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А., 1990). Продолжительность курса 3–4 нед. Контролем служили интактные крысы с саркомой 45 (n=6). Материалом исследования служили ткани опухоли, изъятые сразу после умерщвления крыс под эфирным наркозом. Ткань опухоли фиксировали в растворе Карнуа, парафиновые блоки готовили по стандартной методике. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Браше в модификации Симаковой Р.А. Для электронно-микроскопического исследования препараты готовили по общепринятой методике. Ультратонкие срезы, полученные на ультратоме УМТП-4, изучали и фотографировали на электронном микроскопе Philips ЕМ 208. У половины животных воздействие РИ вызывало торможение роста саркомы 45 более чем на 80%. При микроскопическом исследовании ткани опухолей крыс контрольной группы отмечены лишь единичные лимфоциты, иммунные клетки других типов не встречались. Ядра лимфоцитов содержали большое количество конденсированного хроматина и очень мало деконденсированного. В цитоплазме почти отсутствовали органеллы, за исключением свободных рибосом. Лимфоциты располагались на некотором отдалении от опухолевых клеток, не контактируя с ними. Указанные признаки свидетельствовали об их функциональной пассивности. При торможении роста опухоли после применения РИ наблюдались явные признаки активации клеток иммунной системы: возрастало количество лимфоцитов, появлялись плазматические клетки и макрофаги. Иммунные клетки наблюдались в капсуле, а также в виде лимфоплазмоцитарного барьера шириной 145–165 мкм на границе с опухолью. Значительное количество лимфоцитов и плазмоцитов отмечено непосредственно среди опухолевых клеток. Выявлены признаки активации таких лимфоцитов: цитоплазма содержала большое количество митохондрий с хорошо развитыми кристами, митохондриальный матрикс отличался значительной электроннооптической плотностью, в цитоплазме имелись многочисленные скопления рибосом и полирибосом, выявлены хорошо развитый комплекс Гольджи, лизосомы. Были обнаружены многочисленные контакты лимфоцитов и макрофа79 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки гов с опухолевыми клетками, а также контакты между иммунными клетками различного типа. Часто встречались контакты опухолевых клеток с одним или двумя лимфоцитами. Контакты носили множественный точечный характер, отростки лимфоцита вдавливались вглубь цитоплазмы клетки-мишени, при этом целостность плазматических мембран обеих клеток сохранялась. Встречались макрофаги, контактирующие с опухолевыми клетками. При этом мембраны макрофага и клетки опухоли лежали параллельно на большой протяженности. Межклеточное пространство в зоне контактов было заполнено электронноплотным содержимым. Были обнаружены и более сложные контакты, когда макрофаг одновременно контактировал с несколькими опухолевыми клетками и лимфоцитом. Таким образом, в результате исследования получены сведения об особенностях взаимодействий между иммунными и опухолевыми клетками при реализации противоопухолевого эффекта низкоинтенсивного микроволнового резонансного излучения. Ультраструктурная характеристика местного клеточного иммунитета при раке молочной железы после неоадьювантной аутогемохимиотерапии в сочетании с экстракорпоральным омагничиванием аутокрови Гудцкова Т.Н., Непомнящая Е.М., Старжецкая М.В. ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий», Ростов-на-Дону Состояние противоопухолевой защиты осуществляют многие системы гомеостаза, но в особенности иммунная система. Одним из современных путей повышения эффективности химиотерапии является применение различных химических и физических воздействий на организм больных, обладающих иммуномодулирующим эффектом. В РНИОИ разработан и успешно применяется в лечении злокачественных опухолей метод аутогемохимиотерапии (АГХТ), заключающийся в инкубировании цитостатиков с аутокровью перед введением (Сидоренко Ю.С., 2002). В ряде исследований выявлена связь между повышением неспецифической резистентности организма под влиянием переменного магнитного поля и повышением противоопухолевой сопротивляемости (Гаркави Л.Х., Шихлярова А.И. и соавт., 1996, 2001). Данные о модифицирующем действии переменного магнитного поля на иммунокомпетентные клетки, являющиеся важнейшим звеном противоопухолевой защиты, послужили основанием применения магнитного поля в качестве метода аутогемомагнитотерапии при 80 Сборник научных трудов проведении неоадьювантной АГХТ у больных местнораспространенным раком молочной железы. Проведено сравнительное электронно-микроскопическое исследование рака молочной железы после АГХТ c экстракорпоральным фракционным омагничиванием аутокрови в двух модификациях. Первая группа больных (30 чел.) получила АГХТ по схеме �� CMFAV�� c�� экстракорпоральным фракционным омагничиванием аутокрови. Вторая группа больных (25 чел.) получила, кроме того, дополнительный курс экстракорпоральной аутогемомагнитотерапии (АГМТ), предваряющий неоадьювантную АГХТ. В первой группе основным клеточным компонентом стромы являлись фибробласты, ультраструктурное строение которых говорило об их функциональной синтетической активности. Лимфоциты встречались довольно редко и, как правило, в зоне скопления некротических масс. Буквально вся поверхность лимфоцитов была окружена некротическими остатками опухолевых клеток. Создавалось впечатление, что они «налипают» на мембрану лимфоцитов по мере их продвижения в зоне некроза. Наружная мембрана лимфоцитов имела небольшие выпячивания, а лежащие в непосредственной близости от нее мелкие мембраноограниченные округлые тельца являлись, по-видимому, фрагментами отшнурованной от лимфоцитов цитоплазмы. Контактов между лимфоцитами, либо лимфоцитами и опухолевыми клетками отмечено не было. Макрофаги в опухолях этой группы отсутствовали. В строме раковых опухолей второй группы кроме фибробластов, были обнаружены многочисленные лимфоциты. Они чаще встречались в виде скоплений или островков среди обломков раковых клеток, составлявших зону некроза. Между мембранами соседних лимфоцитов часто можно было наблюдать щелевидные и точечные контакты. Как и в предыдущей группе обращало на себя внимание «налипание» на поверхность лимфоцитов некротизированных остатков раковых клеток. Однако у лимфоцитов в этой группе цитоплазматические выросты были лучше выражены, и в большем количестве вокруг них располагались отшнурованные фрагменты цитоплазмы. В опухолях второй группы встречались и макрофаги, количество которых было, однако, незначительно. Макрофаги имели эксцентрично расположенное ядро, часто с глубокими инвагинациями ядерной мембраны и содержали мелкодисперсный хроматин, конденсированный по периферии ядра. В цитоплазме наблюдался развитый комплекс Гольджи, а также гладкий эндоплазматический ретикулум, митохондрии. По периферии макрофагов имелись пальцевидные отростки. Макрофаги контактировали непосредственно с раковыми клетками, образуя с их клеточной мембраной равномерные, плотные (щелевые) контакты. В опухолевых клетках наружная мембрана в месте контакта с макрофагом часто не определялась. 81 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Таким образом, во второй группе в отличие от первой встречалось большее количество лимфоцитов в более активном состоянии. Кроме того отмечались многочисленные контакты между ними. Подобные лимфоциты, находящиеся в контакте с клеткой-мишенью, относят к субпопуляции Т-киллеров. Они осуществляют короткодистантный контактный механизм иммунитета. Отсутствие плазматических клеток также является косвенным подтверждением того, что наблюдаемые нами лимфоциты относятся к Т-популяции. Также только в группе с предварительным проведением аутогемомагнитотерапии встречали макрофаги, контактировавшие как с некротизированными остатками раковых клеток, так и с самими клетками. Взаимодействие лимфоцитов и макрофагов с опухолевыми клетками, а также контакты между ними, являются морфологическим доказательством иммунной реакции на опухоль. Проведенное сравнительное электронно-микроскопическое исследование позволило получить данные, свидетельствующие об иммуностимулирующем действии на иммунокомпетентные клетки больных раком молочной железы экстракорпорального омагничивания аутокрови при проведении аутогемохимиотерапии. Иммуногистохимическое исследование влияния космического полета на иннервацию пальцев хрящепалого геккона Гулимова В.И., Барабанов В.М., Савельев С.В. НИИ морфологии человека РАМН, Москва В орбитальных экспериментах изучены многие виды позвоночных. Все они сходны в том, что без специальных фиксирующих приспособлений проводят весь полёт или значительную его часть в состоянии флотации. Нами выбран хрящепалый геккон (Chondrodactylus turneri), который отличается от других объектов космической биологии способностью сохранять прикреплённое положение и естественную локомоцию с первых минут возникновения невесомости до завершения эксперимента. Поведение животных в полёте, прослеженное по видеозаписям, не имело серьёзных отличий от наземного. Изучение скелета группы животных, перенесших полет (ГП), методом рентгеновской микротомографии и гистологическое исследование пальцев не выявили достоверных различий между ГП и отложенным синхронным контролем (ОСК). Однако использование иммуногистохимических методов позволило предположить, что различия могут быть найдены с помощью нейрональных маркёров. Данное исследование предпринято для проверки этого предположения. 82 Сборник научных трудов Изучены второй и третий пальцы передних конечностей 5-ти взрослых самок хрящепалого геккона ГП после 12-ти сут орбитального эксперимента на спутнике «ФОТОН-М» № 3 и пальцы самок ОСК, которые содержались на Земле в контейнере, идентичном полётному. Все животные были подвергнуты эвтаназии согласно требованиям Американской Ассоциации Ветеринарной Медицины (AVMA). Материал фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7.4) с последующей заливкой в гистовакс и изготовлением сагиттальных и поперечных срезов толщиной 8–10 мкм. Для иммуногистохимического выявления нервов и механорецепторов были использованы антитела к нейрофиламентам-200 (�� Anti�� -�� Neurofilament�� 200, rabbit�� , �� polyclonal�� , «�� Sigma») в разведениях 1:80–1:320. Визуализация проводилась хромогеном DAB с добавлением NiCl2. Ранее мы впервые показали разнообразие механорецепторов и обильную иннервацию подпальцевых пластинок хрящепалого геккона, сделав вывод о том, что в норме адгезия у этих рептилий осуществляется под контролем нервной системы. При сравнении ГП и ОСК обнаружены все нейрональные элементы, описанные нами для интактных животных. Выявлены некоторые новые закономерности распределения механорецепторов, общие для обеих групп. Так, ламеллярные рецепторы (ЛР – пластинчатые или пачиниеподобные тельца) локализованы преимущественно в тех частях подпальцевых пластинок, которые непосредственно контактируют с субстратом. Проксимальнее (ближе к основанию подпальцевой пластинки, где её прямое соприкосновение с субстратом невозможно), они исчезают, уступая место свободным нервным окончаниям. Возможно, это связано с особенностями механорецепции, локомоции или неравномерностью и разнообразием нагрузок, приходящихся на разные части пальца. Обнаружен и ряд отличий между ГП и ОСК. Дифференциальное окрашивание волокон внутри одного нерва и вакуолизация (наличие неокрашенных зон) отмечены для обеих групп. Однако если для ОСК характерны незначительные количественные отличия по иммунопозитивности, то у животных ГП можно было видеть на поперечных срезах нервов резко отличающиеся друг от друга нервные волокна: 1 – равномерно и очень интенсивно окрашенные, 2 – окрашенные слабо и вакуолизированные, 3 – полностью иммунонегативные. В некоторых крупных нервах можно увидеть лишь несколько отдельных иммунопозитивных волокон, тогда как все остальные остаются неокрашенными. Только в полёте отмечено окрашивание, при котором нервное волокно на поперечном срезе выглядит прозрачным по краям, а в центре расположена тёмно-синяя иммунопозитивная зона неправильной формы с радиальными выростами. Свободных нервных окончаний в ГП выявлено значительно меньше, чем в ОСК. Это может быть связано с их редукцией, но вероятнее – 83 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки с тем, что при небольшом диаметре они оказываются почти неокрашенными и неразличимы у животных ГП. Другое заметное отличие касается морфологии ЛР. Если в ОСК капсулы ЛР имеют чёткую слоистую структуру, а центральное волокно (или волокна) хорошо просматриваются, то в ГП картина иная. После полёта многие ЛР в поперечном сечении имеют неправильную угловатую форму, тогда как в ОСК – только округлую или овальную. Слоистая структура капсулы не видна или слабо выражена. Полости между слоями капсулы ЛР в ОСК малы по размеру и имеют форму щелей или вогнуто-выпуклых линз, в то время как в ГП они значительно больше и разнообразнее по форме. У некоторых ЛР отмечены окрашенные зоны на периферии капсулы. Центральное волокно ЛР в ГП, если оно иммунопозитивно, выглядит значительно более тонким, чем в ОСК, или гипертрофированным и пустым: при неокрашенной внутренней части волокна – тонкая иммунопозитивная каёмка по краю его поперечного среза. Во многих случаях вообще не удаётся увидеть центральное волокно ЛР, что при смазанной слоистой структуре сильно затрудняет дифференцировку поперечных срезов ЛР от сходных с ними по размеру вспомогательных клеток. Таким образом, даже при кратковременном (12 сут) космическом полёте в нервной системе пальца хрящепалого геккона происходят структурные изменения, предположительно связанные с метаболизмом �� NF�� -200. Выявленные изменения могли быть следствием разрушения, нарушения синтеза и/ или перераспределения NF-200. Для уточнения, расшифровки механизмов и функционального значения этих процессов необходимы дальнейшие исследования. Морфофункциональное состояние клеток пуркинье мозжечка в отдаленные сроки после гамма-облучения в малых дозах Гундарова О.П. Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж Мозжечок – отдел головного мозга, образующий вместе с мостом задний мозг. Составляя 10% массы головного мозга, он включает в себя половину всех нейронов ЦНС. Это свидетельствует о больших возможностях обработки информации и соответствует функции мозжечка как главного органа сенсомоторной интеграции на уровне ствола мозга и надсегментарного центра вегетативной регуляции. Мозжечок находится под пристальным вниманием радиобиологов в связи с рано возникающими структурными и клиническими проявлениями при действии ионизирующего излучения. Хотя клетки Пуркинье считаются своеобразным ин84 Сборник научных трудов дикатором радио-чувствительности нервной системы, реакция его нейронов на малые радиационные воздействия остается неизученной. Эксперимент проведен на 30 белых беспородных крысах-самцах массой 200 г, которых подвергали однократному общему облучению в дозах, являющихся крайними для малых доз, т.е. 0,1 и 1,0 Зв. Мозжечок забирали через 1,5 года после воздействия, фиксировали в формалине, Карнуа, пропаноле и окрашивали гематоксилин-эозином, по Нисслю, Бонхегу и Ши. У каждого животного из 100 нейронов подсчитывали в процентах количество нормохромных, гипо-, гиперхромных, пикноморфных клеток и клеточных теней. Морфометрически определяли площадь поперечного сечения клетки, цитоплазмы, ядра и ядрышка в мкм2 с последующим расчетом соответствующих индексов. С помощью компьютерной программы Image J в клетках определяли содержание общего белка, в цитоплазме и ядрышках – РНК и в ядрах – ДНК в экстинциях. Основные результаты приведены в таблице. Состояние клеток Пуркинье через 1,5 года после малых радиационных воздействий Показатели клеток Пуркинье Нормохромные клетки Гипохромные клетки Гиперхромные клетки Пикноморфные клетки Клеточные тени Площадь клетки Площадь цитоплазмы Площадь ядра Площадь ядрышка Содержание белка в клетке Содержание ДНК в ядре Содержание РНК в цитоплазме Содержание РНК в ядрышке Ядерно-клеточный индекс Ядерно-цитоплазматический индекс Ядрышко-ядерный индекс Таблица Группы животных БиологичесОбщее Общее кий облучение облучение контроль 0,1 Зв 1,0 Зв 63,7±3,7 57,7±2,1 54,9±3,3 22,3±2,6 21,4±0,9 19,6±2,2 3,31±1,3 5,5±1,2 8,4±4,3 1,7±0,7 1,5±0,9 0,54±0,01 9,03±4,7 14,0±1,9 16,47±4,0 11046±887 8553±978 8299±973 7865±778 2361±892 5993±788 3087±362 2493±311 2909±301 369±51 394±66 339±36 2,02±0,81 1,24±0,06 1,55±0,07 1,84±0,42 1,96±0,33 2,12±0,08 2,03±0,05 2,15±0,03 2,33±0,10 2,07±0,06 2,14±0,06 2,22±0,02 0,26±0,02 0,30±0,02 0,35±0,03 0,4±0,11 0,34±0,09 0,49±0,09 0,12±0,01 0,16±0,01 0,12±0,02 Видно, что основные показатели морфофункционального состояния нейронов облученных животных практически соответствуют таковым у животных возрастного контроля, а имеющиеся колебания имеют стохастический характер, т.е. не связаны как с облучением, так и его дозой. 85 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Взаимодействие нейромедиаторсодержащих структур тимуса и селезёнки при иглоукалывании Гурьянова Е.А. ФГОУ ВПО «Чебоксарский государственный университет им. И.Н. Ульянова», Чебоксары Известно, что акупунктура относится к методам, восстанавливающим иммунный статус, причем иммуномодулирующий эффект акупунктуры во многом реализуется изменением активности тимуса и селезёнки. Регуляторными факторами, обеспечивающими функции тимуса и селезёнки, наряду с цитокинами, являются нейромедиаторы: катехоламины, гистамин, серотонин. По данным литературы, некоторые методы акупунктуры способствуют улучшению иммунологических показателей крови, а также замедлению инволюции тимуса. Основными нейромедиаторсодержащими цитоструктурами тимуса и селезёнки являются гранулярные люминесцирующие клетки (ГЛК) и тучные клетки. Целью настоящей работы является изучение взаимовлияния цитоструктур тимуса и селезёнки после сеанса акупунктуры. Люминесцентно-гистохимическими методами Фалька-Хилларпа для выявления катехоламинов и серотонина и Кросса для выявления гистамина, а также методом Унна для выявления мукополисахаридов были исследованы тимус и селезёнка 55 белых крыс-самцов массой 180–200 г, взятые после иглоукалывания в симметричные точки акупунктуры �� LI�� 11 и �� GV�� 14. Выделяли следующие группы: 1-я – интактная (№=5); 2-я – контрольная – 10-мин. воздействие иглой рядом с точками акупунктуры, где электрокожное сопротивление (ЭКС) составляет более 100 кОм (№=10); 3-я – опытная, в которой 10 мин воздействовали стальными иглами в вышеуказанные точки акупунктуры, где ЭКС=55–65 кОм (№=40). Органы извлекали в глубокой стадии эфирного наркоза через 15 мин, 1, 2, 4 ч после иглоукалывания. Поскольку концентрация биогенных аминов в клетках тимуса подвержена сезонным колебаниям с наиболее их высоким содержанием весной, мы попытались исключить влияние сезонности, поэтому все эксперименты проводились в одно и то же время суток в весенний период. Наши исследования по изучению влияния иглоукалывания на содержание биогенных аминов в люминесцирующих структурах тимуса и селезенки показали, что ГЛК премедуллярной зоны тимуса, тимоциты коркового и мозгового вещества, реагируют быстрее и интенсивнее, чем ГЛК субкапсулярной зоны тимуса и ГЛК красной пульпы селезенки. Наиболее чувствительными к иглоукалыванию являются премедуллярные, тучные и субкапсулярные ГЛК тимуса и ГЛК реактивного центра селезенки. По данным литературы, премедуллярные ГЛК тимуса и ГЛК реактивного центра селезёнки играют роль 86 Сборник научных трудов аминопродуцентов, а субкапсулярные ГЛК тимуса и ГЛК красной пульпы – в большей степени, аминопоглотителей. Среди них встречаются макрофаги, интердигитирующие клетки, а также клетки нейроэндокринной системы, что подтверждено иммуногистохимическими методами. ГЛК впервые найдены П. Мотавкиным (1977) в оболочках головного мозга и названы аминоцитами. ГЛК выявлены в тимусе, селезенке, аппендиксе, костном мозге, лимфатических узлах, плаценте, коже. Через 15 мин после иглоукалывания по содержанию гистамина усиливается влияние ГЛК премедуллярной и ГЛК субкапсулярной зон тимуса на на ГЛК реактивного центра лимфоидного узелка селезенки и на стенку центральной артерии. Через 1 ч после иглоукалывания снижение гистамина в реактивном центре лимфоидного узелка селезенки сопровождается ослаблением взаимосвязи между ГЛК премедуллярной зоны тимуса и ГЛК реактивного центра селезенки. Повышение катехоламинов и серотонина в реактивном центре лимфоидного узелка селезенки сопровождается появлением сильной положительной корреляционной взаимосвязи между ГЛК премедуллярной зоны тимуса и ГЛК реактивного центра селезенки. Следовательно, в тандеме начинают работать Т-клетки зоны тимуса и клетки В-зависимой зоны селезенки. Корреляционная связь между ГЛК премедуллярной зоны тимуса и адренергическими нервными волокнами центральной артерии достигает максимальных значений. При анализе корреляционных связей по содержанию гистамина через 2 ч после иглоукалывания впервые появляется положительная сильная связь между премедуллярными ГЛК тимуса и ГЛК красной пульпы селезенки, и возобновляется связь между субкапсулярными ГЛК тимуса и ГЛК красной пульпы селезенки. По содержанию моноаминов через 2 ч после иглоукалывания обращает на себя внимание появление положительной средней по катехоламинам и сильной по серотонину связи между премедуллярными ГЛК тимуса и ГЛК красной пульпы селезенки, которые ни на одном сроке не дали взаимосвязи и, следовательно, работают вразнобой. При исследовании связей по содержанию гистамина через 4 ч после иглоукалывания, значения исследованных взаимосвязей приближаются к первоначальным показателям. По содержанию моноаминов появляется новая сильная положительная связь между субкапсулярными ГЛК тимуса и ГЛК реактивного центра селезенки. Таким образом, установлено, что нейроаминсодержащие структуры центрального и периферического органов иммунитета связаны между собой и взаимно влияют друг на друга. Сильные связи по гистамину соединяют в союз субкапсулярные ГЛК тимуса и ГЛК красной пульпы селезёнки. Сеанс аку87 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки пунктуры усиливает влияние премедуллярных и субкапсулярных ГЛК тимуса на ГЛК реактивного центра селезёнки. Наибольшее усиление связей по содержанию гистамина отмечается через 2 ч после иглоукалывания. По содержанию катехоламинов и серотонина иглоукалывание приводит к усилению связей между премедуллярными ГЛК тимуса и ГЛК реактивного центра селезёнки лишь через 1 ч после процедуры. Максимум взаимодействия по моноаминам между структурами тимуса и селезёнки наблюдается через 4 ч после процедуры. Экспрессия регулятора клеточного цикла p16INK4a при предопухолевых изменениях эпителия шейки матки Данилова Н.В. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва По данным ВОЗ, заболеваемость раком шейки матки в России среди женщин детородного возраста (15–44 года) занимает 2-е место, уступая только раку молочной железы (IARC 2005). Это определяет актуальность проблемы точной и своевременной диагностики в первую очередь предопухолевых изменений эпителия шейки матки. Важнейшую роль в патогенезе рака шейки матки играет папилломавирус человека (�� Human�� Papillomavirus�� ). Под действием онкопротеинов вируса нарушается регуляция клеточного цикла, что приводит к неконтролируемому делению клеток плоского эпителия шейки матки. Одним из главных регуляторов клеточного цикла является белок �� pRb�� (�� protein�� retinoblastoma�� ). Фосфорилирование �� pRb�� ведет к его инактивации в контрольной точке G1/S клеточного цикла и активирует пролиферацию клетки (�� Park�� I�� .�� K�� . et al., 2004). В дефосфорилированном состоянии данный белок активен и препятствует переходу клетки к делению. Состояние �� pRb�� регулируется множеством белков клеточного цикла, в том числе и ингибиторами циклин-зависимых киназ, к которым относится и белок p16INK4a. Угнетая активность циклин-зависимых киназ 4 и 6 (Murphy N. et al., 2004), p16INK4a останавливает рост и деление клетки, но в его отсутствие циклин-зависимые киназы связываются с циклином �� D�� 1,4, результатом является фосфорилирование pRb. Таким образом, отсутствие p16INK4a активирует пролиферацию клеток. Парадоксальным является тот факт, что при раке шейки матки экспрессия р16, наоборот, возрастает. Это объясняется тем, что онкопротеины папилломавируса человека (Е6 и Е7) инактивируют �� pRb�� , что вызывает бесконтрольное деление клеток и в то же время увеличение экспрессии р16INK4a 88 Сборник научных трудов по механизму отрицательной обратной связи, так как известна способность рRB осуществлять негативную регуляцию синтеза р16INK4A (Kim Y.T. et al., 2005). Таким образом, кажущаяся на первый взгляд парадоксальной для опухолевых клеток гиперэкспрессия белка р16INK4A, ингибирующего переход клетки в �� S�� -фазу, в случае карцином шейки матки, где этиологическим моментом является HPV и где, как следствие, под действием Е7 инактивирован рRB, в действительности может служить индикатором злокачественной трансформации клеток эпителия шейки матки. Результаты исследований экспрессии р16 при �� SIL�� противоречивы. Подавляющее большинство ученых полагают, что экспрессия коррелирует с тяжестью неопластического процесса (Agoff S.N. et al., 2003; Duggan M.A. et al., 2006). По некоторым данным, �� p�� 16 экспрессируется в 100% случаев при �� HGSIL�� (�� Keating�� J�� .�� T�� . et al., 2001). При �� LGSIL�� от 81,3% до 100% случаев положительной экспрессии р16 (�� Keating�� J�� .�� T�� . et al., 2001; �� Qiao�� X�� . et al., 2005). Экспрессия р16 является признанным фактором прогноза степени неопластического процесса. Однако ряд авторов не обнаружили корреляции между степенью неопластического процесса и уровнем экспрессии р16INK4a. Исследование проводилось на архивном материале 58 биопсий шейки матки, которые были разделены на 2 группы: �� LGSIL�� (8 наблюдений), �� HGSIL (49 наблюдений) на основании пересмотра тремя квалифицированными врачами-патологоанатомами, независимо друг от друга. Срезы с архивных блоков монтировали на высокоадгезивные стекла (Polysine Slides, Menzel GmbH&Co KG; Germany). Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием набора CINtec р16 Histology Kit MTM�� Laboratories�� AG�� (�� Heidelberg�� , �� Germany�� ) (клон �� E�� 6�� H�� 4). Протокол иммуногистохимического исследования соответствовал инструкции производителя. Препараты изучали на микроскопе Leica LB2 HC, анализ экспрессии маркера проводили в течение двух суток после окраски. Оценку реакции на р16 INK4a производили полуколичественным методом по системе, предлагаемой производителем набора и широко используемой в различных исследованиях (�� Redman R.I. et al., 2008). При выявлении р16 определялась диффузная ядерно-цитоплазматическая реакция в клетках эпителия. В группе �� LGSIL�� экспрессия маркера зарегистрирована в 37,5% случаев, все эти случаи демонстрировали высокий уровень экспрессии маркера (диффузно более чем в 80% клеток). Отсутствие реакции – 62,5% случаев. В группе HGSIL маркер экспрессировался в 73,5% случаев, из них в 16,3% наблюдалась умеренная экспрессия (от 5 до 80% клеток эпителиального пласта, диффузно), а в 57,2% – выраженная. Отсутствие реакции – 26,5% случаев. Уровень экспрессии маркера в группе �� HGSIL�� был статистически выше, чем при LGSIL (р < 0.05). 89 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Полученные результаты согласуются с данными литературы (Duggan M.A. et al., 2006; �� Wang�� J�� .�� L�� . et al., 2006). При �� HGSIL�� белки �� HPV�� Е6 и Е7, воздействуя на специфические белки клетки, вызывают увеличение экспрессии р16 (Park I.K. et al., 2004). В основе LGSIL лежат другие процессы, не связанные с воздействием вирусов высокого онкогенного риска, и потому отмечалась более низкая экспрессия р16 в этих группах. Различия экспрессии р16 в группах HGSIL�� и �� LGSIL�� отражают разную природу этих процессов, различный биологический потенциал и подтверждают гипотезу о низкой вероятности перехода LGSIL в HGSIL (Wright T.C. et al., 2002). Таким образом, обнаружена молекулярно-биологическая гетерогенность группы �� HGSIL�� – в 13 из 49 случаев (26,5%) экспрессия р16 была отрицательна, а положительная только в 73,5% случаев. Эти результаты не согласуются с данными других исследований (Keating J.T. et al., 2001; Agoff S.N. et al., 2003), в которых при HGSIL p16 экспрессировался в 90–100% случаев. Возможной причиной может быть отсутствие представлений о четких гистологических критериях оценки, что приводит к высокой вариабельности заключений у различных специалистов. Митохондриально-направленный антиоксидант SKQ1 ускоряет заживление ран у старых мышей Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Фёдоров А.В., Егоров М.В., Ильинская О.П. Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Москва Известно, что репаративные возможности тканей снижаются с возрастом. При старении, в частности, происходит увеличение продолжительности заживления ран, что в первую очередь связывают с пролонгацией этапа воспалительной реакции. В связи с этим актуальными являются исследования, направленные на поиск и разработку препаратов, активирующих процессы репаративной регенерации тканей. Ранее было показано, что митохондриально адресованные производные пластохинона (соединения группы SkQ), избирательно нейтрализующие образование митохондриями активных форм кислорода, представляют собой наиболее активные из известных геропротекторов. В экспериментах на животных показано, что они снижают смертность на ранних и средних этапах старения и предотвращают развитие целого ряда возрастных патологий (Анисимов В.Н. и др., 2008; Бакее- ва Л.Е. и др., 2008). Целью данной работы было изучить действие антиоксиданта SkQ1 [10-(2’,3’-диметилхинонил-6’) децилтрифенилфосфония бромида] на процесс 90 Сборник научных трудов заживления кожных ран у старых мышей. Эксперимент проводили на самках старых (возраст 28 месяцев, вес 25–30 г.) и молодых (возраст 3 месяца, вес 18–20 г.) мышей линии Balb/C (n=19). Животные опытной группы с 3-х месячного возраста до окончания эксперимента получали SkQ1 ежедневно с питьевой водой (28,8 нмоль/кг веса в сут). Мыши контрольной группы и молодые животные не получали �� SkQ�� 1. Всем животным под наркозом наносили полнослойную кожную рану в межлопаточной области площадью ~0,5 см2. На 1, 3, 7 и 9-е сут. после операции проводили цифровую макрофотосъёмку раневой области. На фотоизображениях измеряли площадь ран, используя программу ImageJ [National Institutes of Health (NIH) http:/rsb.info.nih. gov/ij/].Заборматериаладлягистологическогоанализаувсехживотныхпроводили на 9-е сутки. Образцы тканей фиксировали смесью Буэна, после стандартной гистологической обработки готовили поперечные срезы кожи толщиной 4 мкм, окрашивали гематоксилин-эозином и по Маллори. Фотоизображения получали с использованием цифровой фотокамеры Leica�� DFC�� 320 (Германия) на микроскопе Leica DM 5000 B (Германия). Измерение площади ран у контрольных животных подтвердило тот факт, что у старых мышей заживление происходит значительно медленнее, чем у молодых. Однако у старых мышей, длительно принимавших �� SkQ�� 1, происходило достоверное (Р<0,05) ускорение сокращения площади ран по сравнению с животными того же возраста, не получавшими SkQ1. При этом темпы заживления ран у старых мышей, получавших SkQ1, и молодых контрольных животных были сходными. Анализ гистологических препаратов выявил полное заживление ран на 9-е сут у контрольных молодых мышей, в то время как у старых животных были обнаружены значительные нарушения процесса заживления – нейтрофильная инфильтрация, слабо выраженная краевая эпителизация и отсутствие новообразования соединительной ткани дермы. Напротив, у старых животных, получавших �� SkQ�� 1, наблюдали полную эпителизацию ран с образованием соединительнотканного рубца в те же сроки, что и у молодых животных. Ранее было показано, что пожизненный прием �� SkQ�� 1 замедляет развитие многочисленных признаков старения и увеличивает продолжительность жизни мышей (Анисимов В.Н. и др., 2008). Возможно, это обусловлено антиоксидантным действием SkQ1, которое предотвращает окислительные повреждения тканей, накапливающиеся с возрастом. С этих позиций описанный выше эффект SkQ1 можно рассматривать как пример остановки запрограммированного ослабления репарационных процессов при старении. Факт значительного ускорения заживления ран под действием SkQ1 у старых животных свидетельствует о перспективности проведения дальнейших исследований механизма действия митохондриально-направленных антиоксидантов применительно к длительно незаживающим ранам. Работа выполнена при поддержке НИИ Митоинженерии МГУ. 91 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Клеточные элементы в системе биоаминового обмена эндометрия тела матки крыс в процессе полового цикла Диндяев С.В., Виноградов С.Ю. ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия», Иваново Морфофункциональное состояние эндометрия контролируется многими факторами, в т.ч. биогенными аминами. В настоящее время недостаточно изучены биоаминпозитивные клеточные элементы эндометрия и их рабочие интеграции. Цель работы: провести спектрофлуоресцентный и морфометрический анализ биоаминпозитивных клеток эндометрия тела матки крыс для выявления закономерностей их пространственных коопераций и дифференцирования содержания в них гистамина, серотонина и катехоламинов в течение полового цикла. Работа выполнена на 120 интактных самках крыс репродуктивного возраста в осенне-зимний период, которые были распределены на группы по стадиям полового цикла. Приготовленные в соответствии с флуоресцентно– гистохимическими методами Фалька-Хилларпа и Кросса-Эвана-Роста, выявляющими исследуемые моноамины, криостатные срезы изучали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И3 с фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А. В эндометрии тела матки крыс основными структурами, в которых цитоспектрофлуориметрически определяются биоамины, являются тучные клетки (ТК), макрофаги (МФ), симпатические нервные волокна, покровные и железистые эпителиоциты. Выявляемость флуоресцирующих нервных волокон крайне непостоянна (чаще в стадии позднего диэструса и раннего эструса). Плотность пространственного распределения флуоресцирующих ТК минимальна в метаэструс, максимальна – в поздний диэструс. Окраска криостатных срезов сафранином – альциановым синим по методу Дезага выявляет достоверно большее количество ТК, чем флуоресцентная микроскопия. В ранний диэструс наблюдается значимое увеличение пространственной плотности ТК, выявляемых указанным методом. Плотность пространственного распределения МФ минимальна в поздний диэструс, максимальна – в ранний эструс. В ТК и МФ наименьшее содержание биоаминов отмечено в стадии позднего эструса и метаэструса. Максимальная концентрация катехоламинов и серотонина в ТК выявляется в проэструсе, гистамина – в позднем диэструсе и проэструсе. Наибольшее содержание биоаминов в МФ регистрируется в позднем диэструсе. Корреляционный анализ показывает сохранение в течение всего полового цикла сильной линейной свя- 92 Сборник научных трудов зи между концентрациями серотонина и катехоламинов в нервных волокнах, ТК и в МФ (r=0,7–0,95). В стадии поздний эструс и метаэструс количество серотонина и катехоламинов в эпителиоцитах и содержимом просвета матки недостаточно для проведения микроспектрофлуориметрии. Гистамин в течение полового цикла постоянно присутствует в эпителиальных клетках и содержимом просвета матки. Наибольшее его содержание в этих элементах отмечается в проэструсе, наименьшее – в метаэструсе и раннем диэструсе. Цикличность концентраций гистамина в железистых и покровных эпителиоцитах характеризуется высокой степенью положительной связи с динамикой содержания этого моноамина в ТК (�� R�� =0,886 и �� R�� =0,943 соответственно) и более низкой в макрофагах (R=0,543 и R=0,6). Таким образом, в течение полового цикла наблюдается выраженная динамика содержания серотонина, катехоламинов и особенно гистамина в ТК и МФ, покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия матки крыс, характеризующаяся рядом достоверных корреляций. Поддержание адекватных уровней моноаминов в различные фазы полового цикла может модулировать начальные этапы подготовки эндометрия к возможной имплантации зародыша. Таблица Параметры пространственной и биоамингистохимической организации клеточных элементов эндометрия тела матки крыс в процессе полового цикла, M±m Ранний эструс СТК КТК ГТК ТКФ ТКД rСК Поздний эструс 2,75±0,25* 2,91±0,27 0,64±0,13* 0,58±0,09* 4,49±0,42* 4,33±0,48 0,31±0,06* 0,32±0,04 0,35±0,04 0,41±0,03 0,89 0,85 СМФ 3,58±0,32 2,87±0,33* КМФ 0,81±0,11* 0,69±0,11 ГМФ 4,47±0,05* 3,17±0,47* ПМФ 0,59±0,06* 0,33±0,02* rСК 0,70 0,88 Метаэструс Ранний диэструс Тучные клетки 3,09±0,34 3,74±0,42* 0,61±0,12 0,73±0,11* 4,18±0,42 4,44±0,45* 0,23±0,01* 0,35±0,04* 0,39±0,04 0,55±0,04* 0,93 0,95 Макрофаги 2,93±0,31 3,65±0,41* 0,68±0,09 0,78±0,09* 2,92±0,37 4,10±0,51* 0,22±0,03* 0,36±0,04* 0,95 0,90 Поздний диэструс Проэструс 3,38±0,50 4,05±0,61* 0,72±0,13 0,77±0,16 4,66±0,46* 4,81±0,59 0,49±0,05* 0,42±0,07 0,50±0,06 0,43±0,01 0,88 0,94 3,80±0,37 3,57±0,44* 0,83±0,06* 0,76±0,08* 4,74±0,59* 3,83±0,45* 0,17±0,02* 0,21±0,03 0,84 0,90 93 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ГЭП ГЭЖ ГСМ Ранний эструс Поздний эструс 3,19±0,37* 3,35±0,38* 2,37±0,27* 2,77±0,26 3,06±0,33 2,25±0,22 Окончание таблицы Ранний Поздний Проэструс диэструс диэструс Эпителий матки 2,71±0,22 3,67±0,45* 6,06±0,44* 6,95±0,64 2,95±0,31 3,77±0,42* 5,96±0,60* 7,62±0,77* 1,72±0,14* 1,26±0,16* 2,17±0,20* 4,09±0,37* Метаэструс * достоверность отличий данного параметра от аналогичного в предыдущей стадии полового цикла (p < 0,05). СТК – содержание серотонина в тучных клетках, КТК – содержание катехоламинов в тучных клетках, ГТК – содержание гистамина в тучных клетках, ТКФ – плотность пространственного распределения флуоресцирующих тучных клеток, ТКД – плотность пространственного распределения тучных клеток, выявляемых по методу Дезага, СМФ – содержание серотонина в макрофагах, КМФ – содержание катехоламинов в макрофагах, ГМФ – содержание гистамина в макрофагах, ПМФ – плотность пространственного распределения флуоресцирующих макрофагов, ГСМ – содержание гистамина в содержимом просвета матки, ГЭП – содержание гистамина в покровных эпителиоцитах, ГЭЖ – содержание гистамина в железистых эпителиоцитах. rСК коэффициент линейной корреляции содержания серотонина и катехоламинов по точкам зондирования. Экспрессия циклина D1 и катенинов в клетках солидно-псевдопапиллярных опухолей поджелудочной железы Дубова Е.А., Подгорнова М.Н., Щёголев А.И. ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий», Москва Солидно-псевдопапиллярные опухоли (СППО) поджелудочной железы считаются редкими новообразованиями с неустановленным гистогенезом, развивающиеся, главным образом, у молодых женщин и характеризующиеся относительно благоприятным прогнозом. В последнее время при изучении онкогенеза различных опухолей большая роль отводится изучению механизмов активации различных онкогенов. Целью исследования явилось иммуногистохимическое изучение особенностей экспрессии циклина D1 и катенинов в клетках СППО. Работа основана на комплексном морфологическом исследовании операционного материала 15 больных, находившихся на лечении в Институте хирургии имени А.В. Вишневского в 1998–2008 гг. Среди пациентов было 14 женщин в возрасте от 15 до 67 лет (средний возраст – 35,2 года) и 1 муж- 94 Сборник научных трудов чина 61 года. Проводили гистологическое исследование препаратов опухоли, окрашенных гематоксилином и эозином, а также иммуногистохимическое исследование с использованием антител к циклину D1 (LabVision, готовый к употреблению), α-, β- и γ-катенинам (Novo Castra, 1:50). При гистологическом исследовании препаратов СППО выявлялись участки солидного и сосочкового строения. Псевдососочки обычно наблюдались в центральной части опухолевого узла. Ближе к капсуле опухоль имела преимущественно солидное строение, напоминающее структуру нейро-эндокринных опухолей. При иммуногистохимическом изучении препаратов выявлено нарушение экспрессии катенинов. Так, реакция с β-катенином отмечалась как в цитоплазме, так и в ядрах опухолевых клеток, при этом в ядрах она была более выраженной. В 6 наблюдениях нами было установлено резкое снижение экспрессии, а в 9 – отсутствие экспрессии γ-катенина. Реакция с α-катенином была отрицательной во всех изученных образцах опухолевой ткани. В противоположность этому в нормальных ацинарных, протоковых и островковых клетках поджелудочной железы отмечалась выраженная мембранная экспрессия всех изученных типов катенинов. Нами также установлено, что во всех наблюдениях СППО выявляется положительная реакция циклина D1 в ядрах опухолевых клеток, а в окружающей ткани поджелудочной железы – отрицательная реакция. Таким образом, в клетках СППО выявлено нарушение экспрессии катенинов, в особенности β-катенина, что, видимо, является результатом мутаций различных генов. Известно, что помимо связующей роли между кадхеринами и цитоскелетом клетки, β-катенин участвует в �� Wnt�� -сигнальной трансдукции путем взаимодействия с �� Tcf�� /�� Lef�� – транскрипционными факторами и активации β-катенин-Tcf/Lef-зависимой транскрипции генов. Мутации самого β-катенина или его гена в 3 экзоне приводят к тому, что образуется β-катенинTcf�� /�� Lef�� -комплекс, накапливающийся в ядрах, что подтверждается результатами проведенного нами иммуногистохимического исследования. В ядрах вышеуказанный комплекс активирует ряд онкогенов, в том числе и циклин D1, что выявлено нами на гистологических препаратах новообразований. Выявленные нами изменения лежат в основе нарушений межклеточной адгезии с формированием своеобразных псевдососочковых структур в ткани опухоли, а также прогрессии новообразования. Наряду с этим следует отметить, что СППО характеризуются медленным ростом, а также низкой частотой развития метастазов. Это указывает на возможность существования факторов и механизмов, ингибирующих вышеуказанные пути, что требует дальнейшего изучения. 95 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Увеличение длины гипертрофированных кардиомиоцитов у больных с патологией сердца, сопровождающейся дилатацией левого желудочка Егорова И.Ф., Сухачева Т.В., Серов Р.А. Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, Москва Степень гипертрофии миокарда традиционно оценивают по увеличению диаметра кардиомиоцитов (КМЦ), а изменение длины КМЦ при развитии гипертрофии миокарда изучено лишь в немногочисленных исследованиях. Вместе с тем, разработана гипотеза о том, что увеличение диаметра КМЦ связано с утолщением стенки желудочка, а увеличение длины КМЦ – с расширением его полости (Grant C. et al., 1965; Gerdes A.M., 2002). Для проверки и дальнейшей разработки данной гипотезы предпринято исследование размеров и структуры КМЦ дилатированного левого желудочка (ЛЖ) у кардиохирургических больных. Исследование выполнено на материале интраоперационных биопсий миокарда 23 больных с дилатацией ЛЖ: 4 больных дилатационной кардиомиопатией (ДКМП) 22–50 лет, 6 больных клапанными пороками сердца с преобладанием аортальной (АН – 3 больных) или митральной (МН – 3 больных) недостаточности в возрасте 38–59 лет и 13 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) с аневризмой передней стенки ЛЖ 40–62 лет. У двух больных (ДКМП и МН) получено по 2 биопсии миокарда. Конечно-диастолический и конечно-систолический объем ЛЖ достигали соответственно у больных ДКМП 318±47 и 192±35 мл, у больных АН и МН – 376±92 и 200±70 мл, у больных ИБС 372±120 и 244±95 мл при норме – 110–145 и 45–75 мл. Образцы миокарда фиксировали в растворе глютарового альдегида и параформальдегида и заливали в аралдит. Полутонкие срезы окрашивали ШИК и метиленовым синим. На продольных срезах, проходящих через ядро, не менее чем у 50 КМЦ для каждого больного измеряли диаметр, длину и оценивали степень утраты миофибрилл (УМФ) по 4-х балльной шкале: УМФ нет (УМФ=0), зоны УМФ занимали менее 10% (УМФ=1), 10–50% (УМФ=2) и более 50% (УМФ=3) площади среза клетки. При обработке данных использовали параметрические и непараметрические методы статистики. Гипертрофия миокарда ЛЖ у большинства больных была значительной (ср. диаметр КМЦ более 26 мкм), реже – умеренной (ср. диаметр КМЦ – 21– 25 мкм) и только у 3 больных (2 МН и 1 ИБС) – слабой (ср. диаметр КМЦ – 16–20 мкм) по классификации Kunkel B. et al. (1978). Средний диаметр КМЦ при ДКМП составил 29,1±7,9 мкм, при АН и МН – 24,6±5,6 мкм, при ИБС – 96 Сборник научных трудов 29,9±6,4 мкм. КМЦ были несколько сокращены, их средняя длина при ДКМП составила 55,0±6,5 мкм, при АН и МН – 58,5±12,0 мкм, при ИБС – 69,8± 20,8 мкм. У всех больных значительная доля КМЦ имела признаки частичной УМФ. В большинстве случаев преобладали КМЦ со слабой или, реже, с умеренной УМФ (соответственно: УМФ=1 или УМФ=2). У каждого больного проведено сопоставление средних размеров КМЦ в группах клеток, имеющих разную степень УМФ. У всех больных ДКМП, АН и МН средние диаметры КМЦ со слабой, умеренной и значительной степенью УМФ достоверно не различались. Вместе с тем, средняя длина КМЦ достоверно нарастала по мере усиления УМФ у 3 больных ДКМП, 2 больных с АН и 2 больных с МН. Результаты демонстрировали, что у данных больных перестройка с нарастающей УМФ развивалась в гипертрофированных КМЦ после завершения их поперечного роста и сопровождалась ростом этих клеток в длину. Полученные данные совпадали с результатами экспериментального исследования, выполненного на модели развития гипертрофии миокарда в результате перегрузки давлением, в котором было установлено, что дилатация ЛЖ, происходящая на стадии декомпенсации гипертрофированного сердца, сопровождалась увеличением длины гипертрофированных КМЦ, уже завершивших свой рост в ширину (Wang X., et al., 1999). Средняя длина КМЦ у обследованных больных ДКМП, АН и МН прямо коррелировала с конечно-систолическим объемом ЛЖ (r= 0,64; p=0,047), что подтверждало предположение о связи между дилатацией ЛЖ и выявленным удлинением гипертрофированных КМЦ, которое происходило в ходе перестройки этих клеток с УМФ после завершения их поперечного роста. У больных ИБС с аневризмой передней стенки ЛЖ перестройка КМЦ с нарастанием УМФ в 7 наблюдениях сопровождалась удлинением КМЦ и в 4 наблюдениях – достоверным увеличением диаметра КМЦ. Продолжение поперечного роста КМЦ в ходе нарастающей УМФ у больных ИБС соответствовало представлению о том, что перестройка КМЦ с УМФ при данной патологии обусловлена развитием хронической гибернации, а не изменением миокарда на поздней стадии гипертрофии – в отличие от больных ДКМП, АН или МН. Дилатация ЛЖ больных ИБС была обусловлена не изменением размеров КМЦ, а аневризмой, площадь которой коррелировала с конечнодиастолическим (r=0,92; p<0,00001) и конечно-систолическим (r=0,90; p<0,00001) объемом ЛЖ. Результаты исследования демонстрируют рост КМЦ в длину, который происходит в процессе перестройки этих клеток с УМФ на поздней стадии 97 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки гипертрофии и при развитии хронической гибернации миокарда. У больных ДКМП, АН или МН удлинение КМЦ развивается после завершения поперечного роста этих клеток и прямо коррелирует с увеличением полости дилатированного ЛЖ. Реакция гепатоцитов на пренатальную травму печени Ельчанинов А.В., Большакова Г.Б. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Регенерация печени млекопитающих в постнатальном периоде подробно изучена. Основными клеточными компонентами восстановления массы печени после обширной гепатэктомии в постнатальном периоде являются пролиферация и гипертрофия гепатоцитов в оставшейся части органа (Сидорова В.Ф. и др., 1966; Michalopoulos G.K., 1997, 2007). Клеточные основы регенерации печени млекопитающих после травмы в пренатальном периоде остаются неизученными. Целью нашей работы было изучить способность пренатальной печени крыс к регенерации после частичной гепатэктомии. В исследовании использовали разработанную нами модель (Ельчани- нов А.В., Большакова Г.Б., 2010), позволяющую удалять 20% массы печени плода. По нашим данным, печень 17 сут плодов крысы практически полностью состоит из гепатоцитов и гемопоэтических клеток – 39,0±1,3% и 44,0±1,3% соответственно, что не противоречит результатам исследований других авторов (Greengard O., Federman M., 1972; Vassy J. et al., 1988). Поэтому при изучении регенерации плодной печени мы обратили внимание именно на изменения, происходящие с этими клетками. Исследовали митотическую активность и ядерно-цитоплазматическое отношение гепатоцитов печени крыс на 17-е сут пренатального развития в различные сроки после гепатэктомии. У каждой самки оперировали 5–6 плодов, неоперированные плоды той же самки использовали в качестве контроля. Животных выводили из опыта через 6 ч, 1–25 сут после операции. Печень взвешивали, фиксировали в жидкости Карнуа, после стандартной проводки заливали в парафин. Срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Кроме того, готовили мазкиотпечатки, которые фиксировали в метиловом спирте, окрашивали гематоксилином и эозином. В каждой группе было по 7–8 животных. На гистологических препаратах, с помощью морфометрической сетки с 10 узлами, определяли объемную плотность гепатоцитов, эндотелиоцитов и гемопоэтических клеток. Для каждого животного просчитывали 200 точек. Митотический индекс гепатоцитов определяли на 6000 клеток для каждого жи- 98 Сборник научных трудов вотного, значения выражали в промилле. На мазках-отпечатках определяли ядерно-цитоплазматическое отношение, у каждого животного измеряли 100 гепатоцитов. Межгрупповые сравнения проводили с использованием критерия Стьюдента (в случае нормального распределения) или критерия Манна-Уитни с помощью программы SigmaStat 3.5. Для сравнения митотических индексов и ядерно-цитоплазматических отношений применяли z-критерий. По нашим данным, масса печени постепенно нарастает с 1–25 сут как в опыте (с 153,7±21,9 мг до 1677,1±278,6 мг), так и в контроле (с 182,6±17,5 мг до 1648,6±376,1 мг). Восстановление массы печени (239,8±71,5 мг в контроле, 233,9±59,5 мг в опыте, р = 0,85) происходит уже на вторые сут после операции, то есть еще в пренатальном периоде. Сравнение объемной плотности учитываемых компонентов показало, что через 3 ч после операции соотношение компонентов в печени подопытных плодов не отличается от значений соответствующего контроля. Через 1 сут после операции объемная плотность гепатоцитов больше, а гемопоэтических клеток – меньше, чем в оперированной печени (гепатоциты: 48,9±1,3% – в опыте, 36,4±1,3% – в контроле, р =0,002; гемопоэтические клетки: 41,2±1,3% – в опыте, 47,2±1,3% – контроле). Через 2 сут различия отсутствовали, однако через 3 сут объемная плотность гепатоцитов была больше в печени подопытных плодов (71,1±1,2% в опыте, 67,2±1,3% в контроле, р = 0,0027). Из этого можно заключить, что в период восстановления массы печени соотношение ее главных компонентов остается постоянным, следовательно, регенерация носит органотипический характер. Митотический индекс гепатоцитов через 6 ч после операции снижается (в опыте 5,1±0,3‰, в контроле 9,9±0,5‰, p<0,001), однако через 1 сут происходит его повышение (в опыте 16,0±0,6‰, в контроле 7,7±0,4‰, p<0,001). Через 3 сут после операции также было обнаружено значимое повышение митотического индекса (в опыте 0,9±0,1‰, в контроле 0,5±0,1‰, p = 0,0039). Во все указанные сроки после операции различия площади гепатоцитов и их ядер в опытных и контрольных группах были недостоверными (p>0,05). Таким образом, увеличение объемной плотности гепатоцитов в оперированной печени через 1 и 3 сут после гепатэктомии можно объяснить, прежде всего, их гиперплазией, что подтверждается повышением митотического индекса через 1 и 3 сут после операции. Гипертрофия гепатоцитов на данной стадии развития не выражена. Полученные результаты свидетельствуют о высокой регенераторной способности печени плода. При этом восстановление фетальной печени оказывается возможным, несмотря на то, что механизмы пренатального развития печени и ее регенерации у взрослых млекопитающих различны (Michalopou- los G.K., 2007). 99 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Корреляция молекулярных механизмов гибели клеток пигментного эпителия сетчатки с амилоидогенезом у больных возрастной макулярной дегенерацией Ермилов В.В., Махонина О.В. Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград Изучение процесса амилоидообразования на сегодняшний день является одной из актуальных проблем в мировой науке. Нами в 1990–2000 гг. были опубликованы работы (Ермилов В.В.,1993; Ермилов В.В., Серов В.В., 1994; Ермилов В.В., Трофименко О.В, 1998), обосновывающие инициирующую роль локального старческого амилоидоза в патогенезе возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Само по себе старение является важнейшим фактором риска возникновения этой патологии глаза, приводящей к необратимому снижению центрального зрения и к слепоте. Установлено, что апоптоз следует рассматривать как общий конечный путь гибели клеток при многих заболеваниях сетчатки, включая различные формы дегенерации и дистрофии. Сравнительно недавно исследователями, изучающими молекулярные механизмы повреждающего действия света на структуры глаза, было показано, как высокотоксичный синглетный кислород, образующийся при облучении основного флуорофора липофусциновой гранулы – бис-ретинилиден-этаноламина (в англоязычной литературе сокращенно А2Е) – синим светом, повреждает не только биохимические компоненты клетки пигментного эпителия, но и атакует сами молекулы А2Е, превращая их в еще более токсичную эпоксидную форму (Островский М.А., 2005; Allikmets R.N., Singh N., Sun H. et al., 1997; Sun H., Nathans, J., 2001; Sparrow, J.R., Zhou, J. et al., 2002). Также недавно стало известно, что ключевую роль в активном удалении трансретиналя из фоторецепторной мембраны диска после фотолиза родопсина играет специальный белок – т.н. АТФ-связывающий кассетный переносчик ретиналя (ATP-binding cassette transporter�� of�� retinal�� , сокращенно ABCR�� ). Этот мембранный белок, располагающийся в краевой «петле» фоторецепторного диска, активно переносит свободный трансретиналь через фоторецепторную мембрану в цитоплазму наружного сегмента, где с помощью фермента ретинолдегидрогеназы трансретиналь превращается в трансретинол, который переносится из фоторецепторной клетки в субретинальное межклеточное пространство (Zhou, J. et al., 2002). Здесь происходит его взаимодействие с белком зрительного цикла – т.н. межфоторецепторным ретинол-связывающим белком (interphotoreceptor retinoid binding protein�� , �� IRBP�� ), с помощью которого переносится в клетку пигментного эпителия сетчатки. Появившиеся в последние годы сведения указывают на то, что мутация гена, кодирующего синтез одного из ключевых участников зрительно- 100 Сборник научных трудов го цикла, а именно синтез белка АВС�� R�� , ответственна за избыточное накопление в пигментном эпителии липофусциновых гранул и за возникновение ВМД (Allikmets R.N., Singh N., Sun H. et al., 1997). Учитывая современные знания о молекулярных механизмах апоптоза окулярных структур и повреждающего действия света на клетки пигментного эпителия сетчатки, мы в своем исследовании сочли возможным предположить наличие связи между ними и концепцией амилоидогенеза при ВМД, предложенной и опубликованной нами в журнале «Архив патологии» (Ермилов В.В., Серов В.В., 1994). На секционном материале нами была изучена частота различных форм амилоидоза и связь амилоидных отложений в тканях глаза с ВМД. Для этого с помощью селективных методов выявления амилоида и его типов, а также электронной микроскопии было исследовано 111 глаз людей старше 50 лет с прижизненным офтальмологическим исследованием, у которых после смерти были обнаружены морфологические признаки ВМД. У обследованных больных амилоидные отложения в тканях заднего отдела глаза были обнаружены в 47 случаях (42,3%). Как и при других формах старческого локального амилоидоза, обнаруженный при ВМД амилоид был устойчив к действию перманганата калия и к 2-ч обработке щелочным гуанидином. Все типы морфологических изменений при ВМД, а именно друзы, гистологически представляющие собой скопление эозинофильного, �� PAS�� -положительного гомогенного вещества между основной мембраной пигментного эпителия сетчатки и коллагеновой частью мембраны Бруха, пигментные изменения и экссудативные изменения в глазах без амилоидоза и с амилоидозом имели четкую тенденцию повышаться с возрастом. С помощью конго красного и тиофлавина-Т впервые удалось установить амилоидную природу содержимого друз и отложений в самой мембране Бруха. При электронно-микроскопическом исследовании массивные скопления фибрилл амилоида были обнаружены в содержимом друз, во внутреннем коллагеновом слое мембраны Бруха с примыкающими к ним вплотную фрагментами деградирующих клеток пигментного эпителия сетчатки. При подсчете количества ядер пигментного эпителия сетчатки в макулярной и парамакулярной области у больных ВМД обнаружено четкое уменьшение их количества с возрастом, причем наименьшее количество ядер пигментного эпителия сетчатки оказалось в глазах с ВМД при амилоидозе. Таким образом, наше исследование показало, что амилоидные отложения в структурных элементах заднего отдела глаза способствуют развитию и усугубляют течение ВМД. Тесная связь амилоидных отложений с молекулярными механизмами, обеспечивающими деградацию клеток пигментного эпителия сетчатки, позволяет высказать предположение об участии этих клеток в амилоидогенезе. 101 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Реактивные изменения в пульпе зубов крыс при воздействии эмоционально-холодового стресса Ерофеева Л.М., Островская И.Г., Вавилова Т.П. ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава», НИИ морфологии человека РАМН, Москва Известно, что действие стресс-факторов сопровождается изменениями количественного и качественного состава белков смешанной слюны, что способствует, по мнению многих авторов, деминерализации твердых тканей зубов (Кузнецов П.А., 2000; Кузьмина Э.М. с соавт., 2001; Тарасенко Л.М. с соавт., 2002). Однако причины декальцинации твёрдых тканей зубов могут быть связаны не только с угнетением защитных свойств слюны, но и с функциональным состоянием клеток пульпы зубов, обеспечивающих трофику твёрдых тканей. Цель исследования: оценить в эксперименте влияние эмоциональнохолодового стресса различной продолжительности на структурно-функциональное состояние пульпы зубов. Для моделирования эмоционально-холодового стресса крыс погружали в емкость с холодной водой (t=+4ºC) на 10 минут 1 раз в сут в течение 4-х и 30-ти сут. Контролем служили интактные крысы. Крыс декапитировали под эфирным наркозом. Из верхних и нижних резцов извлекали пульпу, фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для биохимических исследований ткань гомогенизировали в фарфоровой ступке на холоду с добавлением 0,5 М раствора трис-HCl буфера (рН=7,3). Методом спектрофотометрии в пульпе определяли активность щелочной фосфатазы (ЩФ) и выражали в мкмоль/мин·г ткани. Иммуноферментным методом определяли содержание белков: эндотелина-1 (фг/мг ткани), интерлейкина-1β, интерлейкина-6, аннексина V (пг/мг ткани), α-дефензинов (нг/мг ткани). Исследование показало, что длительное воздействие эмоциональнохолодового стресса вызывает выраженную воспалительную реакцию в пульпе, сопровождающуюся структурными и метаболическими нарушениями. После 4-х сут воздействия отмечалась гиперемия центрального и одонтобластического слоев пульпы. В центральном слое выявлялись крупноочаговые кровоизлияния, расширение лимфатических капилляров. Слоистая структура пульпы сохранялась, однако не выявлялся слой Вейля, вероятно, из-за миграции клеток из преодонтобластического слоя. В преодонтобластическом слое встречались отдельные делящиеся клетки. Одонтобластический слой разрежен, наблюдалась вакуолизация одонтобластов. В центральном слое пульпы 102 Сборник научных трудов увеличено количество лимфоцитов, плазматических клеток и гранулоцитарных лейкоцитов. Отдельные лимфоциты обнаруживались и в одонтобластическом слое. После 30-ти сут воздействия одонтобластический слой был практически полностью опустошен. Редко расположенные одонтобласты с деструктивно измененными ядрами и вакуолизированной цитоплазмой. Следует отметить наличие в одонтобластическом слое макрофагов и лейкоцитов. Центральный слой пульпы инфильтрирован лимфоцитами, плазматическими клетками, нейтрофилами и эозинофилами. Кровеносные сосуды характеризовались набухшим эндотелием, отмечались выраженные периваскулярные и интерстициальные отеки. Наряду с выраженными морфологическими изменениями в пульпе экспериментальных крыс, на 30-е сут выявлялся расширенный слой предентина, что может быть связано с замедлением процессов его обызвествления. Результаты исследования биохимических показателей пульпы дополняют морфологические наблюдения, а также свидетельствуют о нарушении метаболических процессов. Так, установлено, что в пульпе зубов интактных крыс количество ИЛ-1β, регулятора Т-клеточного иммунитета, в 2 раза превышает содержание ИЛ-6, стимулирующего трансформацию В-лимфоцитов в плазматические клетки и синтез антител. К 4 сут эксперимента имелась тенденция к снижению количества ИЛ-1β, при этом количество ИЛ-6 возрастало почти в 3 раза (р<0,001), по сравнению с показателями животных контрольной группы. К 30-м сут эмоционально-холодового стресса количество ИЛ-1β продолжало снижаться, а количество ИЛ-6 сохранялось повышенным, но было ниже, чем при 4-х сут стрессе. Для оценки реакции эндотелия на стресс, определяли количественное содержание эндотелина (ЭТ-1). На 4-е сут в пульпе зубов крыс определялась лишь тенденция к повышению содержания ЭТ-1 (р>0,1). На фоне длительного стресса содержание ЭТ-1 понижалось (р<0,05), как по сравнению с интактными крысами, так и при сопоставлении с 4-х сут стрессорным воздействием. Наряду с этим, выявлено увеличение (в 2,5 раза на 30-е сут опыта) концентрации α-дефензинов – белков, синтезируемых нейтрофилами, что свидетельствует об усилении миграционной активности этих клеток. Трофическая функция пульпы зубов определяется транспортом кальция и фосфатов из одонтобластов в зону предентина. В связывании ионов кальция в клетках участвует аннексин V. Согласно полученным нами данным, 4-х сут стресс вызывал повышение (р<0,05) содержания аннексина �� V�� в пульпе зубов крыс, а длительный, 30-ти сут стресс, напротив, – снижение (р<0,05), как по отношению к показателям контрольных животных, так и опытных, подвергнутых 4-х сут стрессорному воздействию. О нарушении процессов ми103 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки нерализации эмали свидетельствует также уменьшение (р<0,001) содержания щелочной фосфатазы в пульпе у животных после 30-ти сут воздействия стресса. Таким образом, результаты исследования показали, что эмоциональнохолодовой стресс вызывает в пульпе зубов развитие воспалительной реакции, сопровождающейся гиперемией, периваскулярными и интерстициальными отеками, лейкоцитарной инфильтрацией и оказывает значительное влияние на метаболические процессы. Длительный эмоционально-холодовой стресс приводит к вакуолизации и гибели одонтобластов, а также влияет на фосфорно-кальциевый обмен в пульпе зубов, что выражается снижением активности щелочной фосфатазы в 3 раза и уменьшением содержания аннексина �� V�� в 2 раза, что в результате, приводит к нарушению процессов обызвествления дентина. Исследование слизистой оболочки околоносовых пазух при аллергическом и хроническом полипозных риносинуситах Ефремова О.А., Любовцева Л.А. Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Чебоксары Полипозные риносинуситы – широко распространённое хроническое воспалительное заболевание слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух, природа и механизм развития которых окончательно не выяснены (Абдуллаев Б., 2009). Целью настоящего исследования явилась морфологическая оценка состояния эпителиального покрова носовых полипов у больных полипозными риносинуситами. Микроскопическому исследованию были подвергнуты полипы околоносовых пазух человека, выделенные в ходе операционного вмешательства от 23 больных с диагнозом «аллергический полипозный риносинусит» (АПР) и 23 – с хроническим полипозным риносинуситом (ХПР). Депарафинированные срезы исследовали при окраске гематоксилином и эозином, толуидиновым синим по Унна, методом Массона-Фонтаны. Свежие криостатные срезы обрабатывали люминесцентно-гистохимическим методом Фалька-Хилларпа (1969) на катехоламины и серотонин и методом Кросса (с соавт., 1971) на гистамин. Найдено, что как при АПР, так и при ХПР встречались участки эпителия с признаками метаплазии, гиперплазии и атрофии. Более того, имелись места, полностью или частично лишённые клеток. В собственной пластинке интактной слизистой оболочки околоносовых пазух люминесцентно-гистохимическими методами нами выявлены единичные ГЛК. ГЛК – клетки полигональной фор104 Сборник научных трудов мы, со множеством ярких, желтых округлых гранул разного размера с содержанием гистамина 17,6±0,2 у.е., катехоламинов 3,6±0,26 у.е. и серотонина 29,6±2,6 у.е. При АПР содержание гистамина в ГЛК было 53,5±0,9 у.е., т.е. возросло в 3,1 раза по сравнению со здоровыми тканями, а при ХПР увеличилось в 3,3 и было равно 57,3±1,6 у.е. Содержание КА в ГЛК при АПР возросло в 2,1 раз (7,5±0,1 у.е.) по сравнению со здоровыми тканями, а при ХПР увеличилось в 3,6 раз (12,9±1,8 у.е.). Что касается серотонина, то его содержание при АПР в ГЛК было 32,2±0,4 у.е., т.е. практически не изменилось, а при ХПР увеличилось в 1,3 раза по сравнению со здоровыми тканями и достигло 39,6±1,8 у.е. Среднее значение серотонинового индекса в интактной слизистой оболочке составило 6,33 у.е., а при АПР оно было равно 4,38 у.е. т.е. уменьшилось в 1,4 раза. При ХПР коэффицент серотонинового индекса составил 3,19 у.е., т.е. уменьшился в 1,9 раз. Исходя из полученных данных нами выявлено, что значение серотонинового индекса при АПР в 1,4 раз выше, чем при ХПР. Было установлено, что во всех случаях серотониновый индекс был больше 1, что говорит (Девойно Л. В., 1983) о преобладании влияния серотонина в этих структурах. При окраске по методу Массона-Фонтаны в многорядном реснитчатом эпителии и в эпителии желёз собственной пластинки интактной слизистой оболочки нами выявлены серотонинсодержащие клетки. Число индолсодержащих клеток в эпителии интактной слизистой оболочки составило 29,7 в поле зрения, а в эпителии желёз – 24,5. У пациентов при АПР число индолсодержащих клеток в эпителии составило 12,5, т.е. уменьшилось в 2,4 раза по сравнению с интактной слизистой оболочкой. Содержание серотонинсодержащих клеток эпителия желёз при АПР практически не изменилось и составило 25,5. При ХПР число индолсодержащих клеток в эпителии составило 10,5, т.е. уменьшилось в 2,8 раз по сравнению со здоровыми тканями. Число серотонинсодержащих клеток эпителия желёз составило 9,1, т.е. уменьшилось в 2,7 раз. И при АПР, и при ХПР в стенке сосудов собственной пластинки слизистой оболочки выявлены серотонинсодержащие эндотелиальные, гладкомышечные и адвентициальные клетки. Их число при ХПР (9,1) в 1,1 раз преобладало над их содержанием при АПР (8,3). При окраске полихромным толуидиновым синим в собственной пластинке интактной слизистой оболочки околоносовых пазух вдоль сосудов нами выявлены единичные ß-хроматичные тучные клетки, большинство которых были дегранулированными. Их число составило 1,4 в поле зрения. И при АПР, и при ХПР преобладали ß-хроматичные дегранулированные тучные клетки. При АПР их число составило 11,9, т.е. увеличилось в 8,5 раз, а при ХПР число тучных клеток составило 17,1, т.е. возросло в 12,2 раза. 105 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Таким образом, было установлено, что при ХПР число тучных клеток в 1,4 раза было больше, чем при АПР. Выводы: 1. При полипозных риносинуситах толщина эпителия значительно варьировала и различалась даже в пределах одного и того же среза. 2. И при АПР, и при ХПР происходит увеличение гистамина, катехоламинов и серотонина по сравнению со здоровыми тканями. 3. При полипозных риносинуситах коэффициент серотонинового индекса значительно снизился. 4. В эпителии слизистой оболочки и желёз определялись серотонинсодержащие клетки, число которых при АПР и ХПР уменьшилось более чем в два раза. 5. Как при ХПР, так и при АПР число тучных клеток увеличилось в 10 раз по сравнению со здоровыми тканями. Характеристики клеток респираторного отдела легких на светооптическом уровне при бактериальных пневмониях Зибиров Р.Ф., Козлов Д.В. ГОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия Росздрава, Смоленск Респираторные отделы легких состоят из морфофункциональных единиц – ацинусов, которые являются системой разветвлений терминальной бронхиолы, включающей респираторные бронхиолы �� I�� , �� II�� и �� III�� порядка. Последняя генерация респираторных бронхиол делится на альвеолярные ходы, в которые открываются альвеолы. Данные морфологии и физиологии говорят о том, что ацинус – функциональная единица легкого, целостно реагирующая на различные патологические процессы [2], поэтому именно ее следует брать за основу морфологического изучения легочной патологии. Цель исследования: определение характеристик клеток при светооптическом изучении легочной ткани на примере бактериальных пневмоний. Задачи работы. 1. Выполнить забор аутопсийного материала у пациентов страдавших бактериальной пневмонией. 2. Провести дифференцировку клеточных элементов ткани в дистальных отделах легочных ацинусов. Материалы и методы. Ткань легких, забранную для гистологического исследования, фиксировали в 10%-ом водном нейтральном растворе формалина и подвергали парафиновой проводке. Окраску гистологических срезов 106 Сборник научных трудов толщиной 4–5 мкм осуществляли гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизону, по описанным прописям [1]. Во всех случаях проводился забор материала на микробиологическое исследование. Исследование гистологических образцов проводилось под иммерсионным объективом при общем увеличении 1275. Результаты исследования. Было исследовано 600 полей зрения ткани легких, в части из которых присутствовали признаки очаговой пневмонии. В образцах легких без гистологических признаков пневмонии преобладали эндотелиальные клетки, альвеолоциты 1-го и 2-го порядка, фибробласты. В образцах легких с признаками очаговых пневмоний преобладали макрофаги и нейтрофильные лейкоциты. При дифференцировке клеточных элементов в альвеолах мы ориентировались на их характерное расположение (альвеолоциты 1-го и 2-го порядка расположены на базальной мембране и обращены к просвету альвеолы; эндотелиоциты обращены к просвету легочных капилляров; макрофаги чаще локализуются в просвете альвеол; фибробласты определяются в соединительной ткани межальвеолярных перегородок). Кроме того, обращали особое внимание на диаметр клеток (эндотелиоциты и эпителиоциты 1-го порядка – около 5 мкм, большие альвеолярные клетки – 8–15 мкм, альвеолярные макрофаги 20–25 мкм) и форму клеточных ядер (удлиненные и уплощенные в эндотелиоцитах и эпителиоцитах 1-го порядка, округлой формы с ядрышками в кариоплазме – в эпителиоцитах 2-го порядка, бобовидной формы, эксцентрично расположенное – в альвеолярных макрофагах, веретеновидное – в фибробластах). Следует обратить внимание, что вышеперечисленные признаки часто теряют свое значение при светооптическом исследовании, например, вследствие частичного попадания клеток в срез на микропрепарате [2]. Базальная мембрана эпителиоцитов не всегда различима, что создает трудности в дифференцировке их от клеток эндотелия капилляров и интерстиция. Это приобретает особое значение в очагах ателектазов легочной ткани. В очагах воспаления возникают трудности при дифференцировке нейтрофильных лейкоцитов и альвеолярных макрофагов, которые изменяются после фагоцитоза бактериальных агентов. Литература 1. Гистологическая техника: учебное пособие // В. В. Семченко, С. А. Барашкова, В. Н. Ноздрин, В. Н. Артемьев.– 3-е изд.– Омск–Орел: Омская областная типография. – 2006. – 290 с. 2. Легкое в норме // И. К. Есипова. – Новосибирск: Наука, 1975. – 287 с. 107 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Кооперативное взаимодействие монои полинуклеарных фагоцитов, опосредованное нейтрофилокинами, в процессе формирования противохолерного иммунитета Иванова И.А., Васильева Г.И., Киселева А.К., Беспалова И.А., Дорошенко Е.П. ФГУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону В последние годы внимание исследователей привлекает иммунофагоцитарная система, комплексное представление о которой сформировалось в начале 90-х годов и позволило рассматривать эту систему не только как центральное звено неспецифической защиты от инфекционных заболеваний, но и как иммунорегуляторную систему, направленную на стабилизацию организма (Исачкова Л.М., Плехова Н.Г., 1997). Функциональная кооперация между клетками иммунорегуляторной системы – макрофагами (Мф) и нейтрофилами (Нф) изучена пока недостаточно. В то время как иммунорегуляторная роль Мф в отношении Нф не вызывает сомнения, регуляция функциональной активности Мф нейтрофилами только начинает изучаться. В последние годы установлено, что Нф секретируют низкомолекулярные пептиды, нейтрофилокины (НфК), способные регулировать практически все функции Мф (Долгушин И.И. и др., 1995; Васильева Г.И. и др., 2005). Цель настоящего исследования – изучение влияния нейтрофилокинов, индуцированных микробными клетками (м. к.) �� Vibrio�� cholerae�� , на функциональную активность Мф в процессе формирования противохолерного иммунитета. Для получения Нф перитонеального экссудата экспериментальным животным вводили внутрибрюшинно 0,1% раствор гликогена на стерильном забуференном физиологическом растворе (рН 7,2). Через 4 ч животных усыпляли хлороформом, Нф вымывали из брюшной полости средой 199, содержащей 20% сыворотки крупного рогатого скота и 5 ед/мл гепарина. В полученном экссудате, по морфологическим данным, Нф составляли от 90 до 96%. Жизнеспособность клеток, оцененная в тесте с трипановым синим, составляла 96–98%. Средой 199 доводили концентрацию Нф до 106 кл/мл, разливали в пластиковые чашки Петри по 3 мл и инкубировали при комнатной температуре 1 ч. Затем экссудат сливали, и монослой обрабатывали индукторами нейтрофилокинов. В качестве индукторов НфК использовали убитые м. к. V�� . �� cholerae�� Eltor�� 2044 (25 м.к. на Нф). Чашки помещали в термостат и инку- 108 Сборник научных трудов бировали 4 ч при 37º С в атмосфере 5% СО2. По окончании указанного срока супернатанты получали центрифугированием культуральных жидкостей при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Получение перитонеальных Мф от экспериментальных животных осуществляли общепринятым способом (Кротко- ва М.Р., 1971). Фагоцитарную активность Мф определяли по ранее описанной методике (Васильева Г.И. и др., 1983). Фагоцитоз оценивали по следующим показателям: проценту активных фагоцитов (ПАФ) – отношению активных фагоцитов с захваченными микробами к числу подсчитанных; фагоцитарному индексу ФИ1 и ФИ4 – числу микробов в одном фагоците через 1 и 4 ч инкубации, соответственно; индексу завершенности фагоцитоза (ИЗФ) – отношению разности между ФИ1 и ФИ4 к ФИ1 и по индексу активации киллинга (ИАК), который определяли по формуле: ИАК = ИЗФо – ИЗФк , где ИЗФо и ИЗФк соответствуют ИЗФ в опыте (с добавлением НфК) и контроле. Активность лизосом в Мф оценивали в однослойной культуре клеток по их способности включать флюоресцирующий краситель акридиновый оранжевый (Учитель И.Я., 1978). Учитывали процент клеток, содержащих ярко-оранжевые гранулы – лизосомы (Khavkin et al�� ., 1977). Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью статистических таблиц для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала (Стрелков Р.Б., 1980). Результаты наших исследований показали, что поглотительная способность Мф под влиянием нейтрофилокинов не изменялась: ПАФ и ФИ1 оставались на уровне контроля. В то же время нейтрофилокины усиливали переваривающую способность Мф: ИАК составлял +0,6±0,01. Исследование влияния нейтрофилокинов на лизосомный аппарат Мф выявило, что они вызывают лабилизацию лизосомных мембран. Это имеет положительное значение, так как такие изменения мембран являются показателем активации обменных процессов в клетке и защитных механизмов, обеспечивающих захват и уничтожение чужеродных агентов с помощью кислых гидролаз и катионных белков лизосом, для чего необходим выход этих биологически активных компонентов из лизосом. Таким образом, проведенные исследования показали, что нейтрофилокины, индуцированные холерными вибрионами, усиливают основную функцию Мф – киллинг микроорганизмов, которому помогает вызываемая этими медиаторами лабилизация лизосомных мембран. 109 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Влияние радиации в малых дозах на проницаемость микрососудов различных зон коры головного мозга Ильичева В.Н. Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж Влияние малых доз радиации на головной мозг является актуальной проблемой в связи с риском облучения при применении высокотехнологичного оборудования. Целью работы явилось изучение маркера трансэндотелиального переноса в микрососудах – активности щелочной фосфомоноэстеразы (ЩФ). В основу эксперимента, проведенного в ГНИИИ МО РФ (г. Москва), положены данные о лучевой нагрузке ликвидаторов аварии на ЧАЭС. Объектом изучения служили белые беспородные крысы-самцы массой 170–200 г. Животные подвергались общему фракционированному гамма-облучению (спектр 1,2 МэВ). Поглощенная доза облучения составила 0,5 Зв. Животных забивали декапитацией спустя 1, 3, 7, 14 и 30 суток под эфирным наркозом. Активность ЩФ выявляли реакцией азосочетания с альфа-нафтилфосфатом и прочным синим РР. Объектом изучения служили участки новой, старой и древней коры головного мозга крыс В результате исследования было установлено, что в течение первых 3-х суток наблюдалось увеличение активности изучаемого фермента в новой и старой коре, в более «древних» отделах происходило снижение активности. Спустя 7 суток наблюдалось достоверное снижение активности во всех исследуемых зонах, более выраженное в новой коре. На 14-е сутки происходила нормализация значений активности ЩФ в древней коре, в то время как в новой и старой коре ферментативная активность оставалась существенно сниженной. К концу периода наблюдений нормализация активности ЩФ была отмечена во всех исследованных отделах коры головного мозга крыс. Таким образом, можно сделать вывод, что при действии радиации в дозе 0,5 Зв наиболее уязвимыми являются «молодые» отделы коры, где изменения активности ЩФ происходили в ранние сроки наблюдения, а стабилизация – в более поздние. В филогенетически «древних» отделах коры эти процессы были менее выражены и происходили в более короткие сроки. 110 Сборник научных трудов Структурные изменения в поджелудочной железе кошки на разных сроках нарушения артериального кровообращения Кадыров Р.К. ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, Казань Проблема ишемического повреждения поджелудочной железы остаётся одной из самых актуальных и недостаточно изученных в медицине и биологии. Эта актуальность обусловлена в первую очередь запросами клинической медицины. Механизм ишемических повреждений разнообразных клеток поджелудочной железы и возможность их последующей регенерации остаются не до конца исследованными. Целью настоящей работы явилось экспериментальное изучение морфологии поджелудочной железы на разных сроках нарушения артериального кровообращения. Исследование поджелудочной железы проводилось на 38 кошках с помощью гистологических методов, а также методами ЭПР- и ЯМР- спектроскопии. С помощью электронной микроскопии уже через 5 минут ишемии отмечается гомогенизация и набухание базальных мембран, отек субэндотелиального пространства с разволокнением на отдельных участках коллагеновых волокон, в цитоплазме клеток эндотелия обнаруживаются пиноцитозные пузырьки. С помощью ЭПР-спектроскопии в тканях нормальной поджелудочной железы можно выявить сигналы с g-факторами 1,94, 1,92 и 1,89, исходящими от железосерных белков, а также сигнал с g-фактором 2,025, исходящим от окисленного центра сукцинаткоэнзимредуктазы. ЭПР–спектроскопия через 5 минут ишемии позволяет определить увеличение интенсивности сигналов с �� g�� =1,94, �� g�� =1,92 и 1,89 с параллельным уменьшением сигнала с g=2,025, что свидетельствует о негативных процессах в митохондриальной дыхательной цепи. При увеличении продолжительности ишемии отмечается дальнейший рост интенсивности сигнала с g=1,94, g=1,92, g=1,89 и снижение интенсивности сигнала с g=2,025. В ЯМР-спектрах тканей поджелудочной железы определяется довольно интенсивный сигнал от фосфокреатина и незначительный сигнал от неорганического фосфата. ЯМР-спектроскопия показывает уже через 5 минут ишемии снижение, по сравнению с контролем, интенсивности сигнала от фосфокреатина и увеличение интенсивности сигнала от неорганического фосфата, что свидетель111 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ствует об ухудшении энергетического метаболизма. Дальнейшее увеличение продолжительности ишемии приводит к росту интенсивности сигнала от неорганического фосфата и спаду выраженности сигнала от фосфокреатина. На основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод, что наиболее ранние изменения в поджелудочной железе при ишемии возникают в эндотелии микроциркуляторного русла, которые можно выявить с помощью электронной микроскопии, а ранние ишемические повреждения в паренхиме поджелудочной железы можно определить с помощью спектроскопических методов. Межклеточные взаимодействия в возрастной гистоархитектонике глоточной миндалины Калинин Д.В. ФГУ «Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России», Москва В свете современной концепции врожденного иммунитета (Medzitov R., 2000), функционирование адаптивного иммунитета млекопитающих зависит от врожденной иммунной системы. Встреча с патогеном, распознавание его антигенной структуры и первый ответ реализуются механизмами врожденного иммунитета. Выявление клеточных структур, несущих распознающие рецепторы и ко-рецепторы врожденного иммунитета, в сочетании с иммунофенотипированием клеток адаптивного иммунитета в возрастном аспекте представляется весьма актуальным для создания базовых данных о структурных особенностях возрастного иммунного реагирования глоточной миндалины на морфологическим уровне. Материалом послужили аденоиды 80 часто болеющих детей в возрасте от 15 месяцев до 15 лет, полученные после классической аденоидэктомии (55), частичной аденотомии (8) и аденотонзиллэктомии (17). Операции были выполнены по поводу хронического аденоидита и аденоидита в сочетании с гипертрофией небных миндалин или хроническим тонзиллитом в сроки не менее 4 недель от последнего респираторного заболевания. Все дети были разделены на 3 группы в соответствии с клиническими представлениями о становлении иммунной системы: 24 ребенка в возрасте 1–3 года (I группа), 23 ребенка 4–7 лет (II группа), 33 ребенка 8–15 лет (III группа). Операционный материал оценивали макроскопически, фиксировали в 10% забуференном формалине и заливали в парафин. Срезы толщиной 4– 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон, альциановым синим, в ряде случаев проводили ШИК-реакцию. Иммуногистохимическое исследование выполнялось на серийных парафиновых 112 Сборник научных трудов срезах отобранных образцов (случайная выборка), не менее чем в 6 случаях из каждой возрастной группы. Панель моно- и поликлональных антител включала: основные дифференцировочные маркеры (CD1a, CD3, CD5, CD14, CD19, CD20, CD21, CD23, CD68, CD79a, Tdt), маркеры пролиферации и апоптоза (Ki67, p53), антиапоптотический маркер (bcl2), рецепторы врожденного иммунитета (TLR2, TLR4, TLR9), ко-рецептор врожденного иммунитета (B7-1), цитокератины (H.M. Weight, клон 34βE12). Для демаскировки антигенов в случае необходимости использовали СВЧ-печь [инкубация в цитратном (pH 6,2) или трис-ЭДТА (pH 9,0) буферах, по рекомендации производителей первичных антител]. Для визуализации реакций применяли готовые тест-системы с универсальными вторичными антителами, меченными хромогеном (3,3'-диаминобензидин и/или перманентный красный). Позитивные результаты иммуногистохимической реакции учитывали при наличии двух негативных контролей: на специфичность реакции и отсутствие активной эндогенной пероксидазы. Гистопрепараты оценивали и фотографировали на микроскопе Leica DM 5000. Структура глоточной миндалины детей младшей возрастной группы отличалась преобладанием реакций клеточного звена иммунитета в виде пролиферации лимфоцитов диффузной лимфоидной ткани при активном формировании структур гуморального иммунитета в виде фолликулярной гиперплазии. Во всех возрастных группах лимфоидная ткань глоточной миндалины взаимодействует с покровным и лакунарным эпителием. Характер этого взаимодействия проявляется проникновением лимфоцитов в эпителиальный пласт, перестроенный в эпителиальный ретикулум, формирующий зону лимфоэпителиального симбиоза (ЛЭС), или проникновением эффекторных лимфоцитов в дифференцированный респираторный эпителий в виде интраэпителиальных лимфоцитов (ИЭЛ). Соотношение площади ЛЭС, проецируемой на вторичные фолликулы, и ИЭЛ, проецируемых на межфолликулярную диффузную лимфоидную ткань, по мере взросления ребенка менялось в сторону расширения участков ИЭЛ. Проникновение �� CD�� 19+ �� B�� -лимфоцитов в �� T�� -зависимую �� CD�� 3+, �� CD�� 5+ парафолликулярную зону, как и проникновение Т-клеток в В-зависимый герминативный центр вторичного фолликула c наличием CD21+ фолликулярных дендритных клеток, CD23+ и �� CD�� 14+ клеток указывает на активные межклеточные взаимодействия клеток основных популяций адаптивного иммунитета и отражает кооперацию клеток гуморального и клеточного звеньев в иммунном ответе. На взаимодействие Т- и В-лимфоцитов указывает также экспрессия молекулы В7-1 клетками герминативного центра и парафолликулярной лимфоидной ткани. 113 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Обнаружена мембранная экспрессия TLR2 и TLR4 клетками респираторного эпителия и клетками ретикулярного эпителия зон лимфоэпителиального симбиоза, дендритными клетками герминативных центров фолликулов, эндосомальная экспрессия TLR9 – клетками респираторного эпителия, эпителиальными ретикулярными клетками в зонах лимфоэпителиального симбиоза, дендритными клетками герминативных центров лимфоидных фолликулов, эндотелиальными клетками вен с высоким эндотелием. Возрастных различий по экспрессии �� TLR�� 2 и �� TLR�� 4 не было выявлено, отмечена лишь высокая экспрессия TLR9 у детей младшей возрастной группы. Рецепторы врожденной иммунной системы, обнаруженные в клетках респираторного эпителия и ретикулярных эпителиальных клетках зоны лимфоэпителиального симбиоза, допустимо рассматривать в качестве инициатора врожденного и адаптивного иммунного ответа в глоточной миндалине. Экспрессия рецепторов врожденного иммунитета дендритными клетками герминативных центров лимфоидных фолликулов и ко-рецепторных молекул врожденного иммунитета подтверждает участие механизмов врожденного иммунитета в управлении адаптивным иммунным ответом на этапе клональной пролиферации. У детей младшей возрастной группы в парафолликулярной зоне у нижнего полюса фолликулов выявлена популяция Т-клеток с тимическим фенотипом (CD1a+ Tdt+), а также В1а В-клетки с фенотипом CD19+ CD5+. Вывод. Функциональная незрелость иммунной системы, отмечаемая клинически, на уровне лимфоэпителиального органа у детей младшей группы находит выражение в преобладании Т-клеточных реакций, активном ангиогенезе, наличии B1a B-лимфоцитов в парафолликулярной лимфоидной ткани на фоне фолликулярной гиперплазии и наличии популяции Т-клеток с тимическим фенотипом (Tdt+ CD1a+). Участие распознающих рецепторов в инициации иммунного воспаления у больных псориазом Катунина О.Р., Кубанова А.А., Резайкина А.В. ФГУ «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий», Москва Кожа человека обладает структурами, активирующими и привлекающими клетки врожденного иммунитета для выполнения барьерной функции в ответ на внедрение патогена. Молекулярная структура патогена отличается от структуры клеток организма хозяина, при его проникновении клетки ко- 114 Сборник научных трудов жи первыми распознают его как «чужое». Эти высоко консервативные и избегающие мутаций молекулярные структуры микроорганизмов, отсутствующие у многоклеточных организмов, называются патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (pathogen-associated molecular patterns – PAMPs). К ним относятся липополисахариды клеточной стенки грамотрицательных бактерий, пептидогликаны грамположительных бактерий, ДНК и РНК вирусов, фрагменты белковых молекул. Рецепторы на клетках врожденного иммунитета, которые распознают PAMPs, называются паттерн распознающими рецепторами – pattern recognition receptors (PRRs). Одним из наиболее важных классов PRRs являются толл-подобные рецепторы (toll-like receptors – TLRs). Исследования распознающих рецепторов в коже стали проводиться сравнительно недавно, их активация была подтверждена при некоторых заболеваниях кожи инфекционной этиологии. Менее изучена роль TLR�� s�� при хронических воспалительных дерматозах, и, в частности, при псориазе. Целью настоящего исследования явилось изучение роли паттерн распознающих рецепторов у больных псориазом как компонента врожденного иммунитета, в формировании доиммунного воспаления, оцениваемого по показателям содержания TLR2, TLR4 и TLR9. Материалом для исследования служили биоптаты, полученные из очагов пораженной кожи 30 больных псориазом (18 мужчин и 12 женщин) в возрасте от 22 до 68 лет. Продолжительность заболевания составила от 5 до 35 лет. Группу сравнения составили 10 здоровых добровольцев. Исследуемые больные и здоровые лица группы сравнения статистически достоверно не отличались по полу и возрасту. Биоптаты подвергали стандартной гистологической обработке. Изучение количества и распределения толл-подобных рецепторов 2, 4 и 9 классов (�� TLR�� 2, �� TLR�� 4 и �� TLR�� 9) в структурах кожи проводилось иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител к TLR2, TLR4 и TLR9 производства фирмы «Abbiotec» (США) и стрептавидин-биотинилированных вторичных антител �� Novocastra�� Peroxidase�� Detection�� System�� , производства «Leica Microsystems» (Великобритания). Постановку реакции осуществляли согласно протоколам, прилагаемым к используемым моноклональным антителам. Подсчет площади экспрессии толл-подобных рецепторов в эпидермисе и в дерме осуществляли с применением компьютерной программы анализа изображения �� ImageJ�� путем определения площади клеток с положительной реакцией в квадратных пикселях, в дерме определяли содержание экспрессии толл-подобных рецепторов на стенках сосудов, вы- 115 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ражали в процентах. При сравнении количественных показателей использовали тест Манна-Уитни. Гипотезы различия считали статистически значимыми при уровне достоверности ниже 0,005 (р<0,05). Как показали результаты исследования, в биоптатах, полученных из очагов поражения у больных псориазом, экспрессия �� TLR�� 2 и �� TLR�� 4 наблюдалась в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, отсутствовала в роговом и паракератотическом слоях. В верхних рядах клеток эпидермиса наблюдалось усиление интенсивности иммуногистохимической окраски. Повышение содержания TLR2 и TLR�� 4 происходило за счет выраженного акантоза и, как следствие, увеличения площади эпидермиса. Площадь экспрессии �� TLR�� 2 в эпидермисе на отрезке длиной 0,5мм была достоверно повышена до 2104937 pix² [1499199; 2207776] (р<0,001), TLR 4 – до 2075337 pix² [1459871; 2277101] (р<0,001). В дерме экспрессия TLR2 и TLR4 наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках макрофагального и гистиоцитарного ряда воспалительных инфильтратов, на эпителиоцитах потовых желез и наружного корневого влагалища волосяных фолликулов. Отмечалось увеличение площади экспрессии TLR2 на эндотелии сосудов до 5% [5; 9] (р<0,001), TLR4 до 8% [5; 9] (р<0,001). У здоровых лиц экспрессия �� TLR�� 2 и �� TLR�� 4 наблюдалась в базальном, шиповатом и зернистом слоях эпидермиса, в роговом слое отсутствовала, была выражена равномерно без тенденции к усилению интенсивности в каком-либо слое эпидермиса. Площадь экспрессии TLR2 у здоровых лиц в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм составляла 460000 pix² [412730; 481030], �� TLR�� 4 – 468910 �� pix�� ² [413156; 480832], в дерме у здоровых лиц экспрессия �� TLR�� 2 и �� TLR�� 4 наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках макрофагального и гистиоцитарного ряда, располагающихся периваскулярно. Площадь экспрессии TLR2 и TLR4 на эндотелии сосудов у здоровых лиц составила в среднем по 2%. Реакция с моноклональными антителами к TLR9 была отрицательной в эпидермисе и дерме как у больных псориазом, так и у здоровых лиц. Таким образом, у здоровых лиц TLR2 и TLR4 присутствуют в эпидермисе и дерме, выполняя функцию фильтра, который контролирует проникновение генетически чужеродных веществ. Повышение у больных псориазом экспрессии TLR2 и TLR4, присутствующих на клетках эпидермиса, эндотелиоцитах, макрофагах и гистиоцитах воспалительного инфильтрата, подтверждает роль микробной флоры в активации иммунного воспаления и может быть связана с распознаванием PAMPs микроорганизмов, обсеменяющих кожные покровы или возможных патогенов, поступающих из окружающей среды. 116 Сборник научных трудов Особенности экспрессии белков клаудина-1, е-кадхерина и β-катенина при лейкоплакии и плоскоклеточном раке слизистой облочки рта Катушкина А.А., Ковязин В.А., Бабиченко И.И., Григорьян А.С. Российский университет дружбы народов, ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХ Росмедтехнологий», Москва Кадхерин-катениновая система эпителиоцитов и плотные контакты между ними обеспечивают связь клеток в многослойном плоском эпителии. Для большинства злокачественных новообразований характерны нарушения в кадхерин-катениновой системе, в частности, отсутствие экспрессии Е-кадхерина на поздних стадиях злокачественной трансформации. В раковых опухолях отмечается также изменение экспрессии клаудина-1 – мембранного белка плотных контактов. Это указывает на участие белков клеточной адгезии в онкогенезе. Целью данного исследования являлось изучение с помощью иммуногистохимической методики (ИГХ) особенностей экспрессии Е-кадхерина, β-катенина и клаудина-1 при лейкоплакии с различной выраженностью неопластических изменений клеток (SIN1, SIN2, SIN3) и плоскоклеточном раке СОР. При лейкоплакии слизистой оболочки рта (СОР) в соответствии с классификацией ВОЗ 2005 года выделяют 3 степени неопластической трансформации клеток – SIN (Squamous Intraepithelial Neoplasia). Были исследованы биоптаты СОР 67 пациентов (12 – плоскоклеточный рак, 45 – лейкоплакия, 10 – без патологических изменений). Для ИГХ использовали очищенные антитела кроличьей антисыворотки к клаудину-1 (LabVision), моноклональные антитела к Е-кадхерину (�� LabVision�� ) и очищенные антитела кроличьей антисыворотки к β-катенину (LabVision). Визуализацию иммунных комплексов проводили при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (BioGenex, США). Экспрессию белков выявляли на наружной мембране эпителиальных клеток по критерию H-score в четырех рядах клеток над базальной мембраной. Оценку показателей проводили в соответствующих участках тканей. В результате проведенного исследования было выявлено, что экспрессия Е-кадхерина и β-катенина была одинаковой во всех исследованных случаях. Отличий в экспрессии данных белков в неизмененном эпителии при лейкоплакии (�� SIN�� 1, �� SIN�� 2, �� SIN�� 3) и при плоскоклеточном раке СОР не выявлено, отмечалась выраженная реакция во всех исследованных слоях. 117 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Экспрессия клаудина-1 менялась в зависимости от степени злокачественной трансформации клеток: в неизмененном эпителии отмечалась выраженная экспрессия белка всеми клетками базального ряда; при лейкоплакии (�� SIN�� 1) только часть клеток первого ряда экспрессировала клаудин-1, однако данный белок определялся на мембранах всех клеток в вышележащих рядах; при лейкоплакии SIN2 клаудин-1 выявлен только в 3-м и 4-м рядах; при лейкоплакии SIN3 экспрессия отмечалась единичными клетками в 3-м и 4-м рядах эпителиоцитов. При плоскоклеточном раке экспрессия зависела от степени дифференцировки: в 8-ми случаях недифференцированного рака клаудин-1 отсутствовал во всех рядах; в 4-х случаях дифференцированного рака СОР экспрессия белка отмечалась единичными клетками только в центральной части опухолевых образований. Таким образом, экспрессия мембранного белка плотных контактов клаудина-1 может служить показателем степени неопластической трансформации эпителиальных клеток в многослойном плоском эпителии СОР, в то время как белки кадхерин-катениновой системы являются малоинформативными для данного вида патологии. Структурно-функциональная перестройка коры надпочечников при алкогольной интоксикации Кварацхелия А.Г., Семенов С.Н. ГОУ ВПО Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж В настоящее время особое значение придается изучению механизмов действия алкоголя на регулирующие системы организма. Актуальность таких исследований обусловлена большим удельным весом острых и хронических отравлений этанолом среди прочих экзогенных интоксикаций. В то же время общеизвестна важнейшая роль надпочечных желез в гормональной регуляции организма. В эксперименте на 68 белых беспородных крысах-самцах массой 250 г изучено морфофункциональное состояние коры надпочечников при хронической алкогольной интоксикации в условиях свободного доступа к корму, воде и 15% этанолу в течение 2-х месяцев. В результате эксперимента были сформированы 4 группы животных: употребляющих только воду (1-я, контрольная группа), предпочитающих воду (2-я группа), употребляющих воду и этанол в равных пропорциях (3-я группа), предпочитающих только этанол (4-я группа). По окончании эксперимента извлеченные надпочечники фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, парафиновые срезы окрашивали 118 Сборник научных трудов гематоксилином и эозином, состояние коркового вещества оценивали путем визуальной микроскопии и морфометрии. Полученные результаты свидетельствуют о существенных морфофункциональных изменениях коры надпочечных желез при хронической алкогольной интоксикации, выраженность которой определяется количеством потреблявшегося этанола. У животных третьей группы наблюдалось повышение морфофункциональной активности надпочечников, о чем свидетельствовало увеличение кровенаполнения пучковой и сетчатой зон, а также увеличение размеров ядер адренокортикоцитов. Умеренные морфологические изменения выявлены и в клубочковой зоне. У животных четвертой группы признаки повышения морфофункциональной активности пучковой зоны были выражены в большей степени, чем у предшествующей группы. Клубочковая зона сохраняла свое строение. В ней достаточно часто встречались адренокортикоциты с пикнотичными ядрами. В пучковой зоне отмечалось усиление полнокровия сосудов. Сетчатая зона состояла из однотипных клеток и отмечалась ее инфильтрация лимфоцитами. Состояние коры надпочечников животных второй группы визуально соответствовало контролю, в то же время эндокриноциты клубочковой и пучковой зон обнаруживали умеренные, но достоверные изменения карио- и цитометрических характеристик. Таким образом, представленные данные показывают высокую чувствительность всех слоев коры надпочечников к действию алкогольной интоксикации. Наибольшему влиянию действия алкоголя подвергается пучковая зона надпочечников, однако достоверные морфометрические изменения отмечены во всех зонах. Современные методы изучения пространственной организации клеток головного мозга Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г. НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург Пространственная реконструкция структурных элементов нервной ткани является актуальной задачей, решение которой необходимо для совершенствования представлений о цитоархитектонике различных мозговых структур и изучения межклеточных взаимодействий в ЦНС в норме и при патологии. Классические подходы, использовавшиеся ранее для создания объемных моделей, трудоемки и несовершенны. Современные достижения в области конфокальной лазерной микроскопии и компьютерных технологий создают основу для решения поставленной задачи. 119 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Цель настоящего исследования состояла в разработке методических подходов, обеспечивающих селективную визуализацию различных клеток головного мозга в толстых срезах, что необходимо для проведения трехмерной реконструкции клеток ЦНС по группе оптических срезов при помощи конфокального микроскопа. Исследован головной мозг лабораторных животных и человека. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде (Коржевский Д.Э. и др., «Морфология», 2006, т. 129, вып. 1), который обеспечивает лучшее сохранение антигенов, в сравнении с другими методами фиксации. После фиксации и обезвоживания часть объектов просветляли и хранили в метилсалицилате [Коржевский Д.Э, Гиляров А.В., «Морфология», 2008, т. 134, вып. 6, с. 76–78], а другую часть заливали в парафин. Затем изготавливали парафиновые срезы толщиной 15– 30 мкм и срезы толщиной 100–300 мкм. В дальнейшем срезы регидратировали и иммуноцитохимически выявляли астроциты при помощи антител к глиальному фибриллярному кислому белку (�� GFAP�� ) (Коржевский и др., «Морфология», 2009, т. 135, вып. 3) и микроглиоциты при помощи антител к белку Iba-1 (Кирик О.В. и др., «Морфология», 2010, т. 136, вып. 2). Для визуализации клеток в конфокальном лазерном микроскопе использовали флуорохромы FITC (флуоресцеин-изотиоцианат), TRITC (тетраметилродамин изотиоцианат) и BODIPY-FL. После постановки иммуноцитохимической реакции часть срезов заключали без предварительного обезвоживания в водорастворимую заключающую среду. Другую часть срезов обезвоживали, просветляли в ксилоле и заключали в полистирол. Полученные препараты исследовали при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM�� 510 �� Meta�� (�� Zeiss�� , Германия). Обработку изображений и трехмерную реконструкцию объектов проводили с применением компьютерных программ, входящих в пакет 3D-for LSM. Использование различных вариантов обработки срезов показало, что обезвоживание и просветление срезов в ксилоле приводит к исчезновению флуоресценции FITC, но не оказывает существенного влияния на флуоресценцию TRITC и BODIPY-FL. При этом незначительное ослабление свечения TRITC и �� BODIPY�� -�� FL�� в глубоких слоях препарата можно откорректировать при съемке при помощи автоматического пошагового увеличения мощности лазера или степени усиления фотодетектора. Применение использованных методических подходов позволяет однозначно идентифицировать выявляемые иммунопозитивные клетки как астроциты и микроглиоциты и реконструировать их сложную форму с учетом взаимоотношения с другими клеточными элементами. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что 120 Сборник научных трудов предлагаемые методические подходы можно успешно применять для объемной реконструкции и определения пространственных взаимоотношений глиальных клеток в головном мозге млекопитающих и человека в норме и при патологии. Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект 10-04-00180а). Клетки инфильтрата вокруг капилляров сердца в зоне инфаркта и интактных зонах Корнева Ю.С., Козлов Д.В. ГОУ ВПО Смоленская Государственная медицинская академия Росздрава, Смоленский областной институт патологии, Смоленск В настоящее время усилия многих исследователей направлены на поиск путей снижения смертности от инфаркта миокарда (ИМ). Одним из решений данной проблемы является стимуляция ангиогенеза и формирование полноценного рубца, в которых непосредственное участие принимают клеточные популяции: фибробласты, фиброциты, эндотелиоциты, макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты (ПЯЛ). В то же время при изучении ИМ патоморфологи основное внимание уделяют клеткам инфильтрата в самой зоне инфаркта, реже в демаркационной зоне, совсем не изучая их в интактных зонах сердца. Целью работы было изучение вида и количества клеток инфильтрата при ИМ, в демаркационной и интактных зонах сердца в зависимости от сроков и кратности ИМ. Исследовано 47 сердец с признаками ИМ. Во время аутопсии вырезали кусочки ткани из центра видимой зоны некроза, из демаркационной зоны, расположенных вправо и влево от ИМ. Кусочки, соответствующие этим зонам, забирали из контралатеральных стенок соответствующего непораженного желудочка и межжелудочковой перегородки. Осуществляли парафиновую проводку материала. Окрашенные гематоксилином и эозином срезы подвергали микроморфометрическим исследованиям при увеличении х 400. Поле зрения выбирали так, чтобы в его центре располагался капилляр, вокруг которого производили подсчет клеток: фибробластов, фиброцитов, плазматических клеток, лимфоцитов, макрофагов и ПЯЛ. В каждой зоне исследовали по 10 полей зрения, с учетом отсутствия перекрытия изучаемых полей зрения. Затем рассчитывали общее среднее количество исследуемых клеток, а также средний показатель для каждой популяции как для пораженного и интактных отделов сердца, так и для каждой зоны. Для этого суммировалось количество клеток во всех полях зрения и выводился средний показатель. 121 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки В 27-и случаях ИМ был острым (ОИМ), в 10-ти из них давность ИМ соответствовала 1–2 сут, в 6-ти случаях ИМ этот срок составил 3– 4 сут, в 5-ти случаях – более 5 сут (максимум до двух недель). В 26-и наблюдениях ИМ был повторным (ПИМ): 10 умерших на 1–2 сут, 3 – на 3–4 сут и 9 случаев – более 5 сут. Зона некроза локализовалась в левом желудочке либо в межжелудочковой перегородке. Значение средней клеточности в пораженном отделе сердца по сравнению с интактными зонами всегда было выше, при этом значения в непораженных зонах между собой отличались незначительно. По сравнению с ПИМ, ОИМ всегда имел большую клеточность, с более ярко выраженным воспалительным характером (табл.). Наибольшая клеточность во всех зонах отмечена на поздних сроках, в период активного замещения дефекта сердечной мышцы грануляционной тканью. Вероятно, это связано с влиянием на пролиферацию клеток общей и местной гипоксии. При ОИМ и ПИМ на 3–4 сут, по сравнению с другими сроками, наблюдали снижение среднего числа клеток в интактных зонах при нарастающем их числе в зоне некроза. Минимальная макрофагальная и ПЯЛ- инфильтрация при ОИМ (0,32 и 2,54 клеток в поле зрения соответственно для зоны некроза), постепенно нарастала к 3–4 сут (1,23 и 9,93 клеток соответственно), а ко времени рубцевания ИМ число макрофагов продолжало увеличиваться, тогда как число ПЯЛ уменьшалось (1,4 и 3,34). При ПИМ это соотношение менялось: для макрофагов от 0,036 на 1–2 сут до 4,2 на 3–4 сут, снижаясь после 5 сут до 2,49. По сравнению с интактными зонами, количество лимфоцитов в зоне некроза повышалось, достигая максимума к исходу 5 сут. Число плазмоцитов было всегда минимально, незначительно нарастая после 5 сут. При ПИМ в 1–2 сут число фибробластов и фиброцитов во всех зонах было повышенным, но позже средние значения их также были выше при ОИМ. Выводы: – при инфаркте миокарда изменения количества клеток происходят как в зоне некроза, так и в интактных отдаленных зонах. Эти изменения происходят синхронно; – при остром инфаркте миокарда клеточность выше, чем при повтором инфаркте миокарда, что указывает на лучшие регенераторные процессы и, возможно, снижающуюся вероятность летального исхода. – при повторном инфаркте миокарда отмечено исходно большее количество фибробластов и фиброцитов, которое в динамике нарастает незначительно, по сравнению с острым инфарктом миокарда. При последнем более выражена воспалительная реакция ткани, проявляющаяся повышенным содержанием полиморфноядерных лейкоцитов в зоне некроза и в интактных зонах. 122 Сборник научных трудов Таблица Среднее количество фибробластов, фиброцитов, макрофагов, плазмоцитов и ПЯЛ в исследуемых зонах сердца в разные сроки ОИМ и ПИМ Сроки и кратность ИМ ОИМ 3–4 сут ОИМ 5 сут и более ПИМ 1–2 сут ПИМ 3–4 сут ПИМ 5 сут и более Интактный отдел Отдел сердца с некрозом (межжелудочковая (левый желудочек Правый перегородка либо межжелудочковая желудочек либо левый перегородка) желудочек) 1,8 0,925 1,03 2,62 1,26 1,23 1,32 1,13 1,005 1,3 0,83 0,88 1,63 1,3 1,4 Реакции митохондрий и других ультраструктур клеток Сертоли при питьевом применении сульфатной минеральной воды и радиационном облучении крыс Королев Ю.Н., Гениатулина М.С., Никулина Л.А. ФГУ «РНЦ восстановительной медицины и курортологии Росздрава», Москва Развитие адаптационных, компенсаторно-восстановительных реакций организма под влиянием различных раздражителей, в том числе природных или искусственных лечебных физических факторов, сопровождается усилением биоэнергетических реакций. Постоянный расход энергии на биосинтез мембранных структур, процессы секреции и другие энергопотребляющие процессы в клетках пополняется, в основном, за счет митохондрий (Мх), количество которых постоянно меняется в зависимости от биоэнергетических потребностей организма. В настоящей работе представлены данные об адаптационных изменениях Мх и других органелл в клетках Сертоли семенников крыс под влиянием питьевой сульфатной натриево-магниево-кальциевой минеральной воды (МВ) с концентрацией сульфата 2,8 г/л и минерализацией 3,5 г/л. Эта вода применялась на здоровых крысах-самцах (вводилась внутрижелудочно по 3,0 мл в течение 18 дней), а также перед и после радиационного облучения крыс (доза 2 Гр., мощность 0,66 Гр/мин). Животные контрольной группы получали водопроводную воду, интактные крысы никаким воздействиям 123 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки не подвергались. В исследовании был использован метод трансмиссионной электронной микроскопии (�� JEM�� 100 �� CX�� ). Морфометрический анализ выполнялся с помощью автоматизированной системы МОР – Видеоплан. Результаты исследования показали, что питьевая сульфатная МВ оказывала существенное влияние на состояние Мх в клетках Сертоли у здоровых животных. Это проявлялось в тенденции к увеличению числа Мх и в достоверном увеличении их средней площади (на 48,8%, р<0,01). Адаптационные реакции гиперплазии и гипертрофии приводили к увеличению суммарной площади Мх на 70,2% (р<0,01), что свидетельствовало об усилении биоэнергетических процессов в этих клетках. Отмечались также явления гиперплазии со стороны белоксинтезирующих структур: гранулярной эндоплазматической сети, рибосом и полисом. Следовательно, у здоровых животных под влиянием сульфатной МВ возрастали структурно-функциональные резервы клеток и, соответственно, повышался уровень их адаптационной защиты. Это положение было подтверждено в других экспериментах, где применялась та же питьевая сульфатная МВ, использованная в качестве фактора первичной и вторичной профилактики пострадиационных нарушений в клетках Сертоли. Было установлено, что у животных, подвергнутых радиационному облучению (контрольная группа), число Мх повышалось на 12,3% (р<0,05), однако их средняя и суммарная площадь, наоборот, уменьшалась, соответственно, на 41,4% (р<0,01) и на 35,3% (р<0,01). Т.е., при действии радиации без предварительной профилактики нарушался нормальный ход развития адаптационных реакций со стороны Мх, в связи с чем отчетливо снижался общий уровень биоэнергетических процессов. Уменьшалось также содержание белоксинтезирующих структур, тогда как содержание лизосом и фагосом, наоборот, возрастало (р<0,01). У животных опытной группы, которые перед радиационным облучением получали курс питьевой сульфатной МВ, процессы адаптационной гиперплазии Мх возрастали более значительно (на 63,8%, р<0,01), их средняя площадь увеличивалась на 33,9% (р<0,01), а суммарная – более чем в 2 раза (р<0,01). Эти реакции Мх сопровождались повышенной интенсивностью белоксинтезирующих процессов. Применение питьевой сульфатной МВ в раннем пострадиационном периоде (вторичная профилактика) приводило, в отличие от контроля и первичной профилактики, к ослаблению процессов гиперплазии Мх, в результате чего количество их снизилось на 11,9% (р<0,05). Однако при этом резко возрастала средняя (на 79,6%, р<0,01 ) и, в меньшей степени, суммарная (на 49,2%, р<0,01) площадь Мх. Это означает, что ультраструктурные признаки усиления биоэнергетики в клетках Сертоли проявлялись в виде гипертрофии Мх, обусловленной гиперпластическими процессами на уровне внутримитохон- 124 Сборник научных трудов дриальных структур (мембраны крист и др.). Такое укрупнение Мх носило адаптационный характер и отражало особенности энергетического обеспечения клеток при действии питьевой сульфатной МВ в пострадиационном периоде. Этим процессам сопутствовало повышение числа белоксинтезирующих структур, в частности, рибосом (р<0,01) и снижение числа лизосом и фагосом (р<0,01). Следовательно, применение питьевой сульфатной МВ как у здоровых животных, так и в условиях первичной и вторичной профилактики пострадиационных нарушений, приводило к активации адаптационных реакций со стороны Мх и других ультраструктур клеток Сертоли. Благодаря усилению процессов биоэнергетики, которые лежат в основе обеспечения адаптационных, компенсаторно-восстановительных реакций, клетки Сертоли становились более устойчивыми и способными в большей степени противостоять действию радиации. Иммунокомпетентные клетки-мишени центрального и периферического органов иммунитета мышей при акупунктуре Кроткова О.С., Иванова О.В., Гурьянова Е.А., Любовцева Е.В. ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», Чебоксары Одной из острых проблем медицины являются иммунодефицитные состояния. В этом плане представляет интерес акупунктура – метод, улучшающий работу иммунной системы и увеличивающий резервные возможности организма. Инструментами адаптивной иммунной системы служат Т- и В-лимфоциты. Однако субпопуляционный состав лимфоцитов центральных и периферических органов, а также их взаимодействие после акупунктуры изучены недостаточно. Цель работы – исследование локализации и распределения CD4+ и CD8+ клеток в тимусе и селезёнке на разных сроках после иглоукалывания в точки, влияющие на иммунную систему. Исследования были проведены на 37 белых беспородных мышах-самцах в осенний период. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и по методу Унна. Для выявления субпопуляций �� CD�� 4+ и �� CD�� 8+ применяли иммуногистохимические методики с применением соответствующих моноклональных антител. Выделяли 3 группы животных: 1-я – интактные мыши (�� N�� =5); 2-я – контрольная – мыши (N=12), которым оказывали воздействие акупунктурной иглой 125 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки 10 мин рядом с точкой акупунктуры; 3-я – мыши (�� N�� =20), которым проводили иглоукалывание в течение 10 мин в точки акупунктуры меридиана толстого кишечника �� LI�� 4, обладающую иммуномодулирующим эффектом, и заднесрединного меридиана GV 14, влияющую на симпатическую нервную систему. Тимус и селезенку извлекали через 15 мин, 1, 2 и 4 ч после иглоукалывания под эфирным наркозом. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы Statistica 6. Достоверность различий между опытными и интактной группой оценивали по t-критерию Стьюдента и критерию МаннаУитни. Установлено, что иглоукалывание в точки акупунктуры �� LI�� 4 и �� GV�� 14 изменяет морфо-функциональное состояние тимуса и селезенки мышей: вызывает перераспределение клеточных популяций в лимфоидных узелках селезенки и дегрануляцию и миграцию тучных клеток в тимусе мышей. При анализе субпопуляции Т-лимфоцитов в тимусе через 15 мин после иглоукалывания содержание тимоцитов с фенотипом �� CD�� 4+ и �� CD�� 8+ во всех исследованных структурах увеличилось, кроме толщи коркового слоя, где понизилось содержание CD8+позитивных клеток. Через 1 ч после акупунктуры численность субпопуляции Т-лимфоцитов понизилась по сравнению с предыдущим сроком, однако оставалась выше, чем у интактной группы. По истечении 2 ч число �� CD�� 4+ и �� CD�� 8+ тимоцитов достигает своего максимума в эксперименте и увеличивается более чем 8 раз во всех исследованных зонах по сравнению с интактной группой, кроме толщи коркового слоя, где число CD8+ клеток приблизилось к значениям интактной группы. Через 4 ч после процедуры исследованные субпопуляции лимфоцитов снизились более чем в 3,5 раза практически во всех структурах по сравнению с предыдущим сроком, но оставались выше, чем у интактной группы. В контрольной группе на всех сроках наблюдались процессы, похожие на реакции, наблюдаемые при стрессе. В селезенке число CD4+ спленоцитов достигает максимума через 15 мин после иглоукалывания, к концу опыта сохраняется повышенным более, чем в 2 раза. Это может свидетельствовать об активации иммунокомпетентных клеток и формировании системной иммунной реакции. Изменение числа CD8+ спленоцитов красной пульпы носило волнообразный характер: через 15 мин – достоверно снижается более чем в 2 раза по сравнению с интактной группой, через 1 ч – увеличивается более чем в 3 раза, через 2 ч вновь снижается, но остается выше по сравнению с интактной группой, а концу эксперимента становится меньше, чем в интактной группе. Количество CD4+ и CD8+ спленоцитов под капсулой к концу эксперимента становилось ниже, чем в интактной группе. 126 Сборник научных трудов Таким образом, иглоукалывание в точки акупунктуры �� LI�� 4 и �� GV�� 14 вызывает перераспределение клеточных популяций в тимусных дольках и лимфоидных узелках селезенки крыс. Как в центральном лимфоидном органе (тимусе), так и в периферическом (селезенка) в ходе эксперимента содержание CD4+ и CD�� 8+ клеток в большинстве исследованных структур увеличивается и остается повышенным к концу эксперимента, что свидетельствует об активно идущих процессах пролиферации и дифференцировки. Анализ повреждения и гибели нейронов головного мозга генетически модифицированных мышей при экспериментальной модели эпилепсии Кругляков П.П., Шиханов Н.П., Кузнецов С.Л., Подрезова Е.П., Иванов Н.М., Смирнова Г.В., Ховряков А.В., МакКхан Г.-II, Сосунов А.А. Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва, Мордовский государственный университет, Саранск, Колумбийский университет, Нью-Йорк Изучение и выяснение причин и механизмов повреждения и гибели нейральных элементов центральной нервной системы (ЦНС) является в настоящее время одной из актуальных проблем современной теоретической и практической медицины. Среди многих этио-патогенетических факторов, определяющих повреждение и гибель нервных клеток, перевозбуждение нейронов вследствие активации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов лежит в основе многих заболеваний головного мозга и наиболее ярко проявляется при эпилепсии (Engel, Pedley, 1977). Одной из распространенных форм эпилепсии является височная эпилепсия, связанная прежде всего с поражением гиппокампа (Мухин М.Ю., 2000). Морфологически патология гиппокампа при этом определяется как «склероз» и проявляется в гибели многих нейронов с развитием заместительного глиоза, а также сопровождается существенной трансформацией синаптических взаимосвязей между нервными клетками (Fisher et al., 1998). Среди многих экспериментальных подходов для анализа височной эпилепсии наибольшее признание и распространение получили модели с использованием каиновой кислоты (КК) и пилокарпина (ПК). Воздействие данных веществ на нейральные элементы головного мозга сопровождается значительным повреждением и гибелью нейронов с образованием аномальных синаптических взаимосвязей, что проявляется через латентный период в развитии спонтанной эпилептической судорожной активности (Houser, 1999). Известно, что судорожная эпилептическая активность в каиновой и пилокарпиновой моделях эпилепсии у крыс вызывает развитие 127 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки компенсаторных реакций, проявляющихся в активизации процессов размножения предшественников, обеспечивая нейрогенез, что существенно влияет на пополнение популяции дифференцированных клеточных элементов, поддерживая тем самым жизнедеятельность всех тканевых компонентов головного мозга (Scharfman et al., 2000). Целью настоящей работы являлось иммуногистохимическое исследование повреждения нейронов гиппокампа в каиновой и пилокарпиновой моделях эпилепсии. Исследование выполнено на инбредных линиях мышей FVB и С57В, полученных из Jackson Laboratory. Всего в работе использовано 210 мышейсамцов в возрасте 7–10 недель, массой тела 19–25 г. В работе также использовали линии генетически модифицированных мышей с различной экспрессией фермента ABAD�� и рецептора �� RAGE�� , а также нокаутные мыши без нейропептида Y. Фермент ABAD, относящийся к суперсемейству энзимов-редуктаз, располагается в митохондриях, отличается высоким сродством в амилоидному в-пептиду и, как полагают, принимает участие в генезе болезни Альцгеймера, воспалительных и ишемических повреждениях нейронов. �� RAGE�� относится к суперсемейству иммуноглобулинов и является основным рецептором для конечных продуктов гликозилирования, а также окисления белков и липидов, образующихся в большом количестве при диабете, воспалении, стрессе и болезни Альцгеймера (Schmidt et al., 2000). Повреждение нейронов гиппокампа моделировали введением каиновой кислоты (КК) и пилокарпина (ПК). КК вводили внутрибрюшинно дробно в дозе 10 мг/кг каждый час до появления выраженной судорожной активности. ПК вводили внутрибрюшинно в дозе 220–300 мг/кг. Для идентификации поврежденных нейронов использовали окраску крезил фиолетовым, метод серебрения, флюоресцентный метод с FluoroJade B. Количественные показатели обрабатывали программой Origin 6.1. Исследование инбредных линий мышей показало значительные различия в чувствительности животных к судорожному эффекту КК. Средняя доза КК, вызывающая развитие судорог, соответствовала 37±4,7 мг/кг у FVB мышей и 25±3,5 мг/кг у С57В мышей. Количество поврежденных нейронов в первые сутки после введения КК достоверно не различалось в двух линиях, однако на пятые сутки у мышей FVB число поврежденных нейронов в пирамидном слое гиппокампа было достоверно выше, чем у животных линии C57B. Следует отметить, что, несмотря на высокую вариабельность, в степени повреждения нейронов хорошо выявлялась прямая зависимость между интенсивностью судорожного синдрома и степенью повреждения нервных клеток. Особенно ярко такая зависимость проявлялась при сравнении эпилептического статуса в виде частых приступов судорог и практически постоянного тремора, и относительно редкими судорожными «припадками» в виде прыж128 Сборник научных трудов ков, стояния на задних лапах или движения назад. В первом случае наблюдалось массивное поражение нейронов на всем протяжении аммонова рога, большинства вставочных нейронов и, как правило, клеток-зерен зубчатой извилины. При кратковременных судорогах, как правило, обнаруживалось только локальное поражение разных областей гиппокампа: зоны СА3, хилуса, отдельных участков СА1, нейроны зубчатой извилины оставались обычно малоповреждёнными. ПК вызывал более выраженный судорожный синдром у мышей FVB, в сравнении с мышами С57В, также как и развитие эпилептического статуса. Однако мыши линии С57В чаще умирали даже без выраженного предшествующего судорожного синдрома. Степень повреждения в разных отделах гиппокампа достоверно не различалась у двух линий мышей, а зависела только от интенсивности судорожного синдрома. Можно отметить, что высокие дозы (300 мг/кг) ПК обычно приводили не только к значительному поражению всех отделов гиппокампа (зубчатая извилина оставалась менее измененной), но и к повреждению нейронов во многих других областях головного мозга. В некоторых случаях при массивных диффузных поражениях мозга гиппокамп оставался относительно малоизмененным и только интернейроны давали положительную окраску при серебрении и с Fluoro Jade В. Иммуногистохимическое исследование фермента ABAD показало, что после судорожного периода при введении КК и ПК наблюдается повышение экспрессии данного энзима в нейронах аммонова рога и зубчатой извилины, проявляющееся в усилении интенсивности окраски (или флюоресценции) клеток. Анализ степени повреждения нейронов при этом свидетельствует о некотором «защитном» эффекте повышенной экспрессии ABAD. В связи с этим животные с повышенной экспрессией фермента ABAD являются более устойчивыми к нейротоксическому эффекту КК и ПК. Однако у животных с повышенной экспрессией рецептора �� RAGE�� наблюдается обратная зависимость, проявляющаяся в снижении устойчивости нейронов, что приводит к большей их гибели при введении КК и ПК. Возможно, данный рецептор понижает протекторные свойства нейронов, оказывая влияние на сигнальные пути, ведущие к повреждению клеток и их гибели. Трансгенные животные с отсутствием полноценного нейропептида Y�� были менее устойчивы к воздействию КК, что проявлялось в снижении порога развития судорог, а также степени повреждения нейронов. У данных животных, в отличие от других, изученных в работе, наблюдалась высокая степень избирательного повреждения нейронов гиппокампа и преимущественно зоны СА1 аммонова рога. При эпилепсии многие поврежденные нейроны имели вид мелких округлых телец, интенсивно окрашенных крезил фиолетовым или серебром, при флюоресценции с Fluoro Jade светящиеся мелкие тельца встречались гораздо реже, обычно флюоресцировали тела клеток с отростками. Сравнение им129 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки прегнированных препаратов с флюоресценцией позволяет заключить, что темно-окрашенные тельца соответствуют клеточным ядрам. Такое изменение нейронов, приобретающих вид мелких телец, соответствует апоптическому варианту гибели клетки. Известно, что апоптоз широко распространен в гиппокампе при поражении нейронов вследствие их перевозбуждения. Обращает внимание и временная динамика таких изменений – апоптические тельца обнаруживались чаще на 5-е сутки после введения нейротоксических агентов – время достаточное для реализации программы апоптоза. При интерпретации этих данных следует отметить, что, несмотря на нередко полярно противоположные точки зрения исследователей, по морфологическим критериям дифференцировка апоптоза и некроза является неоднозначной, поскольку изменения клеток при апоптозе и некрозе не различаются в начальные сроки повреждения, и судьба клеток определяется, как полагают, уровнем поступления кислорода: в условиях гипоксии/ишемии наступает некроз, а при достаточном напряжении кислорода развивается апоптоз. Таким образом, использованные в работе модели височной эпилепсии являются наиболее широко распространенными при анализе механизмов не только развития спонтанной возбудимости нейронов, но и их повреждения и гибели при перевозбуждении. Исследование механизмов повреждения нейронов в изученных линиях животных позволяет не только выяснить некоторые закономерности ответной реакции клеток на перевозбуждение и определить вне- и внутриклеточные сигнальные пути, участвующие в реализации внешних воздействий, но и имеет большое значение для клинической практики с целью расширения возможностей клеточной терапии многих заболеваний головного мозга. Цитометрические параметры гепатоцитов белых крыс в постнатальном онтогенезе в зависимости от физических свойств пищи Кузнецова Т.И., Хайруллин Р.М. ИМЭиФК Ульяновский государственный университет, Ульяновск Свойства потребляемой пищи являются одним из главных факторов, определяющих морфогенез органов пищеварительного тракта. В современной литературе немало публикаций посвящено изучению влияния химических свойств ингредиентов пищи на постнатальный морфогенез гепатоцитов, однако характер воздействия физических свойств потребляемой пищи на их морфофункциональные особенности остается практически неизученным. Целью исследования явилось изучение влияния питания диспергированной пищей на постнатальный морфогенез гепатоцитов белых крыс. Иссле- 130 Сборник научных трудов дование проводили на 100 самцах белых беспородных крыс. На 21-е сутки постнатального онтогенеза животных случайным образом разделили на контрольную и опытную группы. Животных контрольной группы содержали на стандартном рационе, основу которого составляли зерна пищевых злаков и овощи. Животным опытной группы давали пищу того же состава, но после тщательного механического размельчения. Объектом проведенных гистологических исследований служили участки печеночной ткани, которую у контрольных и опытных животных исследовали на 60-е (ранний пубертатный период), 120-е (поздний пубертатный период), 180-е (репродуктивный период) сутки постнатального онтогенеза. Определяли следующие цитологические параметры: площадь сечения ядра и цитоплазмы гепатоцитов, их ядерноцитоплазматическое отношение (ЯЦО), с помощью ШИК-реакции и цифровой денситофотометрии определяли количественное содержание гликогена в цитоплазме. В период с 60-х по 120–е сутки постнатального онтогенеза у животных контрольной группы наблюдается уменьшение значения ЯЦО гепатоцитов (р<0,05), что сопровождается одновременным уменьшением площади сечения их ядер и увеличением площади сечения цитоплазмы (р<0,05) (табл.). В отличие от животных контрольной группы, у опытных животных наблюдается возрастание (р<0,05) значения ЯЦО гепатоцитов, которое достигает на 120-е сутки 20,72±0,10%, что выше значения соответствующего показателя животных контрольной группы (р<0,05). Параметры гепатоцитов белых крыс в норме (контроль) и при питании диспергированной пищей (опыт) Показатели Площадь сечения ядра (мкм2) Площадь сечения цитоплазмы (мкм2) Ядерно-цито- плазматическое отношение (%) Гликоген (в единицах удельной оптической плотности) Возраст Группа контроль опыт контроль опыт контроль Таблица 60-суточные 120-суточные 180-суточные 42,30±0,29 41,05±0,17+ 38,13±0,13+ 34,68±0,23* 39,61±0,16*+ 38,25±0,12+ 201,87±1,54 216,82±1,36+ 221,93±0,91+ 179,69±1,24* 193,64±0,81*+ 191,74±0,74* 21,23±0,17 19,45±0,12+ 17,45±0,08+ опыт 19,56±0,12* 20,72±0,10*+ 20,07±0,08*+ контроль 0,202±0,004 0,259±0,007+ 0,269±0,006 опыт 0,273±0,003*+ 0,218±0,002*+ 0,305±0,004*+ Примечание: *статистически значимое отличие по сравнению с контрольным значением (р<0,05), +статистически значимое отличие по сравнению с предыдущим значением (р<0,05). 131 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Увеличение ЯЦО гепатоцитов в период от 60-х до 120-х суток у животных опытной группы сопровождается возрастанием значений площадей сечения их ядер и цитоплазмы (р<0,05). В цитоплазме гепатоцитов 60-суточных опытных животных наблюдается большее количество гликогена, чем в гепатоцитах контрольных животных (р<0,05). К 120-суточному возрасту количество гликогена снижается, тогда как у 120-суточных контрольных животных его уровень возрастает, оказываясь выше значения количества гликогена в цитоплазме гепатоцитов опытных животных. В последующий период (120–180-е сутки) постнатального онтогенеза происходит снижение значения ЯЦО гепатоцитов в контрольной и опытной группах, где самое низкое значение отмечается у гепатоцитов 180-суточных контрольных животных (17,45±0,08%). В данный период у животных контрольной и опытной групп наблюдается уменьшение площади сечения ядер гепатоцитов (р<0,05). При этом различия между показателями площади сечения ядер гепатоцитов животных обеих экспериментальных групп статистически не значимы (р>0,05). Площадь сечения цитоплазмы гепатоцитов животных контрольной группы увеличивается до 221,93±0,91 мкм2, тогда как площадь сечения цитоплазмы гепатоцитов печени 180-суточных животных опытной группы статистически значимо не изменяется, составляя 191,74± 0,74 мкм2 (р<0,05). При этом количество гликогена в гепатоцитах 180-суточных животных опытной группы больше, чем в гепатоцитах контрольной группы данного возраста (р<0,05). На всех этапах онтогенеза площадь сечения ядер и цитоплазмы гепатоцитов животных опытной группы не превосходит площади сечения ядер и цитоплазмы гепатоцитов контрольных животных. Результаты исследования позволяют сделать выводы о том, что длительное потребление диспергированной пищи вызывает статистически значимые структурно-функциональные изменения в клетках печени белых крыс, выражающиеся в уменьшении площадей сечения их ядер и цитоплазмы у опытных животных в период с 60-х по 180-е сутки постнатального онтогенеза. Таким образом, физические свойства пищи могут выступать фактором морфогенеза тканей органов пищеварительной системы в постнатальный период. 132 Сборник научных трудов Морфометрическая и гистохимическая характеристика слизистой оболочки полости рта при введении цитостатиков Леонтьева И.В. Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург Широкое применение цитостатиков в современной медицине сопровождается частым развитием осложнений со стороны многих систем органов, в том числе пищеварительной системы. В частности, при химиотерапии онкологических заболеваний нередко имеет место повреждение слизистой оболочки полости рта с развитием мукозита. Между тем, тканевые и клеточные механизмы этого явления изучены недостаточно. В этой связи целью настоящего исследования явился экспериментальный морфофункциональный анализ слизистой оболочки полости рта при введении цитостатиков. Для постановки эксперимента использовали 280 самок белых беспородных мышей с массой тела 23–25 г. Экспериментальной группе животных через каждые 48 ч внутрибрюшинно вводили циклофосфан из расчёта 400 мг/кг массы тела в течение 1–6 сут. Животным контрольной группы с той же периодичностью внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Объектом исследования явилась слизистая оболочка языка, которая в клинических условиях наиболее часто поражается воспалительным процессом при цитостатической терапии. Материал от животных получали через 1 сут после 1-й и 3-й инъекций, а также через 10, 15 и 20 сут после 3 инъекций препарата с целью изучения обратимости изменений, вызванных циклофосфаном. На гистологических срезах (поперечные и продольные срезы различных участков языка), окрашенных гематоксилином–эозином, измеряли толщину эпителиального пласта (ТЭП), митотическую активность в базальном слое эпителия, толщину соединительнотканного компонента слизистой оболочки языка, относительный объём сосудов и плотность расположения клеток в соединительной ткани слизистой оболочки языка. На парафиновых срезах проводили гистохимическое выявление суммарных белков в покровном и железистом эпителиях, на криостатных срезах тетразолиевым методом выявляли НАДН-диафоразу (НАДН-д). Концентрации суммарных белков и активность НАДН-д оценивали цитофотометрическим методом. Все показатели оценивали в разных топографических зонах органа, а именно: на дорсальной поверхности (ДП) языка в области сосочков и между ними и на вентральной поверхности (ВП) языка. 133 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки На фоне введения цитостатика визуально отмечено увеличение ТЭП на ДП языка (в большей степени между сосочками) и уменьшение ТЭП на ВП языка. По данным морфометрического исследования, после 3-й инъекции циклофосфана ТЭП возрастает на 43% и 28% в межсосочковой области и на вершине нитевидных сосочков языка, соответственно. Это увеличение происходит за счет рогового и зернистого слоев. На ВП языка отмечается уменьшение ТЭП на 40% в результате истончения шиповатого слоя на 60%. Толщина рогового слоя при этом увеличивается на 20%. На фоне отмены препарата происходит постепенная нормализация ТЭП на ВП языка и ДП между сосочками, на вершине сосочков языка на 20-е сутки после отмены препарата сохраняется значимое увеличение ТЭП на 11%. Отмечается снижение митотической активности эпителиоцитов во всех топографических зонах. Максимально (на 67%) митотическая активность снижается на ВП языка. На 20-е сутки после отмены препарата показатели митотической активности не отличаются от контрольных, а на 15-е сутки в межсосочковой области и на ВП языка превышают их на 37% и 56% соответственно. Толщина соединительнотканного компонента слизистой оболочки языка на фоне введения циклофосфана увеличивается во всех топографических зонах: после 3-й инъекции препарата превышает контрольные значения на 71, 101 и 69% в области сосочков языка, между ними и на ВП, соответственно. При введении высоких доз циклофосфана относительный объем кровеносных сосудов в соединительнотканном компоненте достоверно уменьшается на обеих поверхностях. После 3-й инъекции цитостатика происходит снижение относительного объема кровеносных сосудов на 16% (ДП) и 26% (ВП) по сравнению с величиной показателя в контрольной группе. На 20-е сутки после отмены цитостатика относительный объем кровеносных сосудов в обеих локализациях значимо не отличается от контрольных показателей. Концентрации суммарных белков в шиповатом и роговом слоях эпителия на фоне введения циклофосфана уменьшаются по сравнению с контролем во всех топографических зонах. Наиболее выраженное снижение (на 40%) наблюдается в шиповатом слое на ДП в области сосочков языка после введения 3 инъекций цитостатика. Концентрации суммарных белков в роговом слое эпителия также уменьшаются в большей степени в области сосочков языка на ДП на 30,5%, в межсосочковой области и на вентральной поверхности – на 14,5% и 16,5%, соответственно. В эпителии смешанных слюнных желез происходит снижение концентрации суммарных белков на 34,5% по сравнению с контролем уже после 1-й инъекции циклофосфана. На 20-е сутки после отмены препарата величина данного показателя значимо не отличается от таковой в контрольной группе во всех локализациях. Активность НАДН-д в базальном и шиповатом слоях эпителия в ходе эксперимента значимо пони134 Сборник научных трудов жается на 10–15% после 3 инъекций циклофосфана и остаётся сниженной по сравнению с показателями группы контроля на 20-е сутки после отмены препарата на 20%. Полученные данные свидетельствуют о повреждающем действии цитостатика на ткани слизистой оболочки полости рта, которое имеет обратимый характер. Выраженность повреждения и степень обратимости неодинаковы в различных топографических зонах. Плотность распределения, топография и секреторная активность тучных клеток в слизистой оболочке полости рта при введении цитостатиков Леонтьева И.В. Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург Тучные клетки (ТК) играют важную роль в поддержании тканевого гомеостаза в нормальных условиях и при развитии патологических состояний, активно участвуют в разнообразных защитных реакциях. Вместе с тем, их состояние при развитии поражений слизистой оболочки полости рта, часто возникающих в ходе цитостатической терапии, остается малоизученным. Целью настоящей работы явилось изучение распределения и функциональной активности популяции ТК слизистой оболочки полости рта при экспериментальной цитостатической терапии. Опыты проведены на 280 самках белых беспородных мышей с массой тела 23–25 г. Животным каждые 48 ч внутрибрюшинно вводили циклофосфан 400 мг/кг в течение 1–6 сут (экспериментальная группа) или физиологический раствор (контроль). Материал (язык) получали через 1 сут после 1 и 3-й инъекций, а также через 10, 15 и 20 сут после трёх инъекций препарата с целью изучения обратимости изменений, вызванных циклофосфаном. На гистологических срезах, окрашенных азур ΙΙ–эозином по Романовскому, с использованием морфометрической сетки определяли топографическое распределение и плотность расположения ТК с последующим перерасчетом на условный 1 мм² площади сечения соединительной ткани. Показатели оценивали в собственной пластинке слизистой оболочки на дорсальной поверхности (ДП) языка и в собственной пластинке и подслизистой основе – на вентральной поверхности (ВП). Степень дегрануляции ТК оценивали полуколичественно по 4-х балльной шкале. На ДП языка плотность расположения ТК в собственной пластинке снижается на 35,8% после 1-й инъекции циклофосфана и на 44,9% – после 3-й инъекции. На фоне отмены препарата количество ТК возрастает и до135 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки стигает контрольных значений на 15-е сут после отмены цитостатика. На 20-е сут после отмены происходит максимальное снижение величины показателя – на 55,1%, по сравнению с контролем. На ВП плотность расположения ТК в соединительнотканном компоненте снижается на 22,4 и 36,5% после 1-й и 3-й инъекций циклофосфана соответственно. На 10-е сут после отмены препарата происходит возвращение значения показателя к контрольным величинам. На 15-е сут после отмены показатель достигает максимального значения, превышая контрольные на 14,2%. На 20-е сут после отмены цитостатика величина показателя снижается на 41,2% по сравнению с контрольной группой. В ходе эксперимента с введением высоких доз циклофосфана изменяется топографическое распределение ТК. В слизистой оболочке на ДП языка в 3 раза возрастает, по сравнению с контролем, доля ТК, расположенных в непосредственной близости к базальной мембране. Одновременно более чем в 3 раза уменьшается их доля в глубоких отделах собственной пластинки. На фоне отмены препарата происходит постепенная нормализация топографического распределения ТК, однако на 20-е сут после отмены цитостатика доля ТК вблизи базальной мембраны более чем в 2 раза снижается по сравнению с данной величиной в контрольной группе. При этом доля ТК в глубоких отделах собственной пластинки возрастает в 1,2 раза. В слизистой оболочке на ВП языка после 3-й инъекции циклофосфана доля ТК в подслизистой основе снижается в 2 раза по сравнению с контрольными значениями. Одновременно доля ТК, лежащих вблизи базальной мембраны, возрастает в 1,5 раза. На фоне отмены препарата доля ТК в подслизистой основе увеличивается и на 20-е сут после отмены в 1,3 раза превышает данный показатель в контрольной группе. Доля ТК в непосредственной близости к базальной мембране достигает контрольных значений на 10-е сут после отмены циклофосфана, а затем уменьшается в 1,7 раза на 15 и 20-е сут после отмены препарата. При кратковременном введении высоких доз цитостатика изменяется относительное содержание ТК с различной степенью дегрануляции. После 3-й инъекции циклофосфана доля ТК с сильной степенью дегрануляции увеличивается в 2,5 раза в слизистой оболочке на обеих поверхностях языка. Одновременно уменьшается доля ТК с отсутствующей дегрануляцией почти в 3 раза на ДП и почти в 2,5 раза на ВП языка. На 20-е сут после отмены препарата доля клеток с сильной степенью дегрануляции в соединительной ткани ДП превышает данный показатель в контрольной группе в 1,5 раза, на ВП значение показателя возвращается к контрольной величине. Доля ТК с отсутствующей дегрануляцией превышает контрольные значения почти в 2 раза на ДП языка и почти в 1,5 раза на ВП. Доля ТК с умеренной степенью дегрануляции в 2,5 раза снижается по сравнению с контролем на 20-е сут после отмены препарата как на ДП, так и на ВП. 136 Сборник научных трудов Таким образом, на фоне введения цитостатиков происходит уменьшение количества ТК в собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой основе полости рта, увеличивается доля клеток с сильной степенью дегрануляции, возрастает пул клеток, лежащих в непосредственной близости к базальной мембране. Данные изменения более выражены на ДП, чем на ВП языка и, вероятно, обусловлены реакцией ТК на повреждение тканей и их участием в регуляции воспалительного процесса. О мышцах, обслуживающих рабочие центры пищеварения и эмоций Литвиненко Л.М. Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Кафедра анатомии человека, Москва Существуют мышцы сгибатели, разгибатели, приводящие, отводящие, вращающие, супинаторы, пронаторы, опускатели, подниматели, оппонирующие, напрягатели, сфинктеры и т.д. Перечисленные мышцы действуют на суставы или на кожу, на внутренние органы. Эти мышцы имеют определенную форму и величину, достаточную для выполнения предназначенной функции. Однако среди многообразных мышц существуют еще мышцы, выполняющие иную, на первый взгляд, необычную функцию. Это мышцы, включающие различные механизмы в организме, например, механизм глотания, эвакуаторные механизмы для органов малого таза и другие. Что нам известно о механизме глотания? По данным БМЭ (1977, т. 6, 162, автор – Усольцев Н.Н.), акт глотания состоит из трех фаз: произвольной ротовой и непроизвольных – глоточной быстрой и пищеводной медленной. Включение в работу непроизвольного механизма глотания обусловлено раздражением рецепторов слизистой оболочки мягкого неба и глотки. Так написано в энциклопедии. Однако просто подвигайте нижней челюстью или корнем языка, или щечными мышцами, или поднимите мягкое небо, и вам захочется проглотить слюну. То же самое произойдет, если вы представите вкусную пищу, вспомните или встретите любимого человека. Значит, не все так просто, и не только слизистая оболочка мягкого неба и глотки могут включить глотательный механизм. Сам механизм глотания мы не рассматриваем, он изучен и описан. Нас интересуют только способы включения этого механизма и как непосредственно включается непроизвольная фаза глотания. Оказывается, этот важный и сложный рефлекторный механизм включают разные мышцы, которые иннервируются разными черепными нервами. Если взять только одну мышцу – верхний констриктор глотки, именно с нее начинается непроизвольная фаза глотания, то можно отметить, что эта мыш137 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ца состоит из четырех частей (Синельников Р.Д., Синельников Я.Р., 1990): язычно-глоточной, которая начинается от корня языка, челюстно-глоточной, которая начинается от заднего конца челюстно-подъязычной линии нижней челюсти, щечно-глоточной – начинается от крыловидно-нижнечелюстного шва (фасциальная, подвижная структура), от которого берет начало также щечная мышца и четвертая, самая верхняя часть верхнего констриктора глотки – крыло-глоточная, берет начало от крючка и медиальной пластинки крыловидного отростка, тесно связана с мышцами мягкого неба. Таким образом, верхний констриктор глотки связан со структурами, дергающими эти отдельные части верхнего констриктора глотки. То есть, при движении языка, нижней челюсти, щечной мышцы, а также мягкого неба механически, как бы извне раздражается верхний констриктор глотки и включается непроизвольный механизм глотания. Так, жевательные мышцы участвуют в акте глотания через нижнюю челюсть, которая просто тянет верхний констриктор глотки, включая механизм глотания. Какие же черепные нервы при этом участвуют в акте глотания? Подъязычный нерв – XII пара, тройничный – V пара, лицевой – VII пара, блуждающий – X пара. Однако не только эти мышцы и перечисленные нервы включают очень важный для организма глотательный механизм. Существуют мышцы, которые обеспечивают работу координационных центров совместной деятельности соматической, поперечнополосатой мускулатуры и висцеральной, гладкомышечной мускулатуры и желез. Для этих мышц характерна небольшая их величина, в их функцию входит только включить определенный механизм, который в дальнейшем развивается автоматически (хотя возможно совмещение функций). Например, работа глоточного центра пищеварения обеспечивается языкоглоточным нервом (Литвиненко Л.М., 1997). До выделения пищеварительного сока околоушной железой происходит процесс проглатывания. Глотательный механизм включает шилоглоточная мышца, которая иннервируется из глоточного центра пищеварения (ядра языкоглоточного нерва). Эта мышца начинается на шиловидном отростке височной кости и вплетается в стенку глотки между ее верхним и средним констрикторами. Это не случайно. Шилоглоточная мышца при сокращении раздражает стенку глотки снаружи. Проще, дергает ее. После чего срабатывает «закон кишечника» Бейлисса и Стерлинга (Bayliss W.M., Starling E.H., 1901). Из закона следует, что выше участка раздражения происходит сокращение мышц стенок кишки, а ниже – расслабление. Этот закон авторами был написан в 1899 году применительно к кишке, и раздражителем кишки является химус, т.е. внутренний раздражитель (раздражитель слизистой). Этот закон применим и к глотке. Однако раздражитель может быть как внутри глотки – пища, так и снаружи в виде поперечно-полосатой мышцы, дергающей стенку глотки. 138 Сборник научных трудов Таким образом, мы видим, что в непроизвольной части механизма глотания участвуют мышцы, иннервируемые V, VII, IX, X, XII парами черепных нервов. Лицевой, языкоглоточный, блуждающий нервы обслуживают, соответственно, ротовой, глоточный и желудочно-кишечный рабочие центры пищеварения, которые состоят из соматического двигательного и вегетативного ядер (Литвиненко Л.М., 1997). Импульсы из центров пищеварения подходят вначале к поперечнополосатым мышцам, а потом к железам и гладким мышцам. Так, при воздействии на глоточный центр пищеварения вначале включается механизм проглатывания, а затем происходит выделение секрета околоушной слюнной железой. Механизм проглатывания в этом случае включается шилоглоточной мышцей, что и является основной функцией этой мышцы. Т.е., шилоглоточная мышца обслуживает глоточный рабочий центр пищеварения. Однако этот центр является и эмоциональным рабочим центром, что соответствует принципу мультипараметрического взаимодействия функциональных систем организма человека (Судаков К.В., Умрюхин П.Е., 2010). Рабочие центры пищеварения и эмоций в соответствии с принципом иерархического доминирования находятся под влиянием коры головного мозга, подкорки, лимбической системы, промежуточного мозга, ретикулярной формации и других центров ствола мозга. За счет эмоциональных влияний обеспечивается мотивационное поведение человека. Известно, что при волнении у человека включается глотательный механизм и человек непроизвольно проглатывает слюну. Эту функцию обеспечивает шилоглоточная мышца. Гистопатологическое исследование регионарных лимфатических узлов при экспериментальном канцерогенезе простаты Ломшаков А.А., Асташов В.В., Казаков О.В., Чепик В.И. НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск В настоящее время для разработки новых эффективных методов комплексной противоопухолевой терапии необходимо проведение исследований структурно-метаболических изменений в регионарном лимфатическом русле при конкретных видах опухолей. В значительной степени это связано с ролью лимфатических узлов, обеспечивающих барьерную функцию при опухолевом процессе (замедление лимфооттока, создание благоприятных условий для фагоцитоза и др.). 139 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки В работе проведено структурно-клеточное исследование простаты, тазовых (являющихся лимфатическими узлами �� I�� порядка для простаты) лимфатических узлов в динамике (5, 18 и 28 сут) индуцированного канцерогенеза простаты. Работа проведена на половозрелых мышах-самцах линии СВА (120 особей). Экспериментальная модель злокачественного опухолевого роста в предстательной железе создавалась путем инъецирования в паренхиму предстательной железы клеточного штамма асцитной опухоли Эрлиха (0,2 мл асцитической жидкости содержали 500–550х103 атипичных опухолевых клеток). Инъекции производили под эфирным наркозом. Эвтаназия животных осуществлялась под эфирным наркозом на 5, 18 и 28 сут роста опухоли. Контролем служили интактные животные. Для гистологического исследования забирали простату, тазовые лимфатические узлы. Результаты исследования показали, что на 5 сут индуцированного канцерогенеза простаты формируется опухолевый узел размером 1,5–2 мм, состоящий из полиморфных атипичных клеток. В тазовых лимфатических узлах, являющихся лимфатическими узлами �� I�� порядка для простаты, на 5 сут эксперимента выявлены структурные признаки активации клеточного звена иммунитета – отмечено увеличение площади тимус-зависимой зоны на 74,9%. При этом в структурных компонентах лимфатических узлов, ответственных за гуморальное звено иммунитета, на фоне уменьшения площадей вторичных лимфоидных узелков (на 64,2%) и мозговых тяжей (на 18%), выявлено увеличение числа зрелых форм клеток лимфоидного ряда – малых лимфоцитов в герминативных центрах (на 13%) и незрелых форм клеток плазматического ряда – плазмобластов в мозговых тяжах (в 3,2 раза), в мозговых тяжах увеличивается число макрофагов (на 69,7%). Микроскопически на 18 сутки опухоль представлена обширными солидными пластами резко полиморфных клеток, разделенных тонкими прослойками соединительной ткани. Редкие железистые структуры и отсутствие отчетливых признаков функциональной дифференцировки и гистогенетической принадлежности опухолевых клеток позволяет рассматривать исследуемую опухоль как низкодифференцированную солидно-трабекулярную аденокарциному с выраженными признаками анаплазии. На 18 сутки опухолевого роста в синусной системе тазовых лимфатических узлов встречаются крупные клетки, отличающиеся выраженным полиморфизмом. По сравнению с 5 сутками, в лимфатических узлах сохраняются структурные признаки активации клеточного звена иммунитета, но при этом площадь тимусзависимой зоны уменьшена на 20%. Отмечаются структурные признаки активации гуморального звена иммунитета (увеличена площадь вторичных лимфоидных узелков – в 2,7 раза, мозговых тяжей – на 18,2%, В-зоны – на 24,5%; увеличе140 Сборник научных трудов но число лимфо- и плазмобластов, средних лимфоцитов) на фоне снижения транспортной функции лимфатического узла (уменьшена площадь мозговых синусов – на 25%). Выявлены признаки макрофагальной реакции (увеличено число макрофагов) в структурных компонентах лимфатических узлов. На 28-е сутки после введения клеток наблюдается инфильтрирующий рост опухоли. Клетки инфильтрируют и разрушают окружающую жировую клетчатку и поперечнополосатые мышцы, врастают в сосуды. В крупных сосудах можно наблюдать опухолевые эмболы. Отмечается выраженная митотическая активность клеток с большим количеством патологических митозов. В синусной системе тазовых лимфатических узлов на 28-е сутки опухолевого роста увеличивается число опухолевых клеток. Встречаются крупные клетки с 2-я или несколькими ядрами. Отмечается значительное варьирование их формы, размеров и плотности. В мозговом веществе лимфатических узлов выявлены структурные признаки активации пролиферации клеток плазматического ряда (увеличивается число плазмобластов, незрелых плазматических клеток). Как и на 18-е сутки, выявлены структурные признаки активации клеточного звена иммунитета (увеличена площадь тимусзависимой зоны). По сравнению с 18-ми сутками опухолевого роста усиливается транспорт лимфы через лимфатический узел (увеличена площадь мозговых синусов). Полученные данные показали, что в динамике роста опухоли в простате наблюдается постепенное нарастание признаков тканевого и клеточного атипизма в опухолевой ткани, распространения опухолевых клеток лимфогенным путем метастазирования, на фоне структурной реорганизации регионарных лимфатических узлов, с признаками структурной активации Т-зависимой зоны, плазматизации лимфоидной паренхимы, макрофагальной реакции. Являются ли выделяемые бактериями в кишечнике мембранные нановезикулы средством межклеточного взаимодействия и элементом механизма патогенеза? Луста К.А., Козловский Ю.Е., Хомякова Т.И. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Изучение молекулярно-клеточных основ взаимодействия бактерий и макроорганизма имеет большое фундаментальное и практическое значение. Аэромонады широко распространены в окружающей среде и способны вызывать инфекционный процесс у человека. Патогенные свойства этих бактерий определяются продукцией большого количества факторов вирулентности. Процессы развития инфекционного процесса при заболеваниях, вызванных бактериями Aeromonas, недостаточно изучены, а механизмы выделения токсинов и 141 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки их взаимодействия с клетками организма-хозяина неизвестны. В работах последнего десятилетия показано, что ряд грамотрицательных бактерий выделяет мембранные нановезикулы (МНВ), ограниченные внешней мембраной бактерий и содержащие внутри компоненты периплазмы. Предполагается, что они являются средствами доставки патогенных факторов в ткани организма животного. За последний год был проведен протеомный анализ изолированных везикул из патогенных бактерий, идентифицировано более 100 различных белков. Среди них выявлены белки, характерные для внешней мембраны бактерий (предшественник липопротеина, белок внешней мембраны TolC, антиген внешней мембраны, предшественник фосфолипазы, каналообразующий белок tsx, рецептор колицина I, цитолетальные разрыхляющие токсины и другие), периплазматического пространства [протеаза, β-глюкозидаза, белокпереносчик липопротеина, предшественник сульфатазы (�� YdeN�� ), цитотоксичная металлопротеаза] и цитоплазмы. Кроме того, в МНВ было установлено наличие ДНК. К настоящему времени не было известно, продуцируют ли бактерии рода Aeromonas подобные везикулы. Целью работы было выяснение возможности участия нановезикул в межклеточном взаимодействии и в механизме патогенеза при инфекциях этими бактериями. Были использованы апатогенный штамм A. hydrophila: 342-1, три патогенных штамма: Е 8-8, Н 336 и Н 1-6-05 и A. salmonicida. Культуры были посеяны на свежую агаризованную среду �� LB�� в чашках Петри и выращивались в течение 20 ч при 37оС. Для получения изолированных МВ культуру A.salmonicida выращивали в жидкой среде �� LB�� до ранней стационарной фазы. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием, после фильтрации супернатанта и ультрацентрифугирования осадок МНВ ресуспендировали в буфере HEPES. Для электронно-микроскопических исследований чистых культур бактерий отдельные колонии заливали расплавленным агаром, вырезали, фиксировали в смеси глутаральдегида и формальдегида, обезвоживали в этаноле и заключали в смолу �� LR�� White�� . Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Для негативного контрастирования каплю бактериальной суспензии или изолированных МНВ помещали на покрытые формваровой пленкой и углеродом электронно-микроскопические сеточки и контрастировали уранилацетатом или молибдатом аммония. Проводили изучение пристеночной микрофлоры различных отделов кишечника здоровых крыс Вистар. Препараты исследовали с помощью электронного микроскопа Zeiss Libra 200. В результате исследований на поверхности клеток грамотрицательных бактерий A. hydrophila и A. salmonicida были выявлены многочисленные мембранные везикулы, размеры которых варьировали от 10 до 250 нм в диаметре. Наибольшее количество везикул выявлялось на внешнем крае колоний. Был 142 Сборник научных трудов представлен процесс отпочковывания везикул от бактериальной клетки. При использовании культуры бактерий A. salmonicida были получены препараты изолированных МНВ, проведена их электронно-микроскопическая визуализация. Популяция везикул была гетерогенна: их размеры варьировали от 30 до 200 нм в диаметре. МНВ были окружены бислойной мембраной и имели внутри электронноплотное содержимое. На ультратонких срезах кишечника крыс обнаружены морфологически разнообразные бактерии, в непосредственной близости от которых выявлены скопления гетерогенных мембранных нановезикул. Свободные нановезикулы были также обнаружены в виде цепочек из нескольких пузырьков, внутри гликокаликса между микроворсинками апикальной поверхности эпителиоцитов. Таким образом, установлено, что бактерии A. hydrophila и A. salmonicida в чистых культурах выделяют в окружающую среду многочисленные мембранные нановезикулы. Подобные везикулы были также обнаружены на поверхности кишечника крыс, среди скоплений пристеночных микроорганизмов разных видов. Продемонстрирован процесс взаимодействия МНВ с гликокаликсом и микроворсинками апикальной поверхности эпителиоцитов. Получены препараты изолированных МНВ. Учитывая данные, представленные в литературе последних лет, можно предположить, что мембранные нановезикулы, выделяемые бактериями A. hydrophila и A. salmonicida, являются основным элементом механизма патогенеза. Кроме того, тот факт, что штаммы аэромонад продуцируют МНВ независимо от патогенности бактерий, может свидетельствовать о том, что функции этих частиц более широки. Возможно, они представляют собой средство коммуникации грамотрицательных бактерий с другими клетками прокариот и эукариот. Влияние акупунктуры на взаимодействия биоаминов в нейромедиаторных структурах гипоталамуса Любовцева Е.В., Любовцева Л.А., Любовцев В.В. Чебоксарский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Чебоксары В настоящее время известно, что гипоталамус регулирует процессы иммуногенеза с помощью центров медиобазальной области. Вследствие чего изменение нейромедиаторного окружения в этих центрах меняет автономную регуляцию функций органов, зависящих от гипоталамуса. Целью исследования является выявление влияния акупунктуры на корреляционные взаимосвязи нейромедиаторов в биоаминсодержащих структурах гипоталамуса. Задачами исследования является: 1. Выявление корреляционных взаимодействий между биоаминами в нервных и тучных клетках гипота- 143 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ламуса немедленно, спустя 30 мин и 4 часа после снятия стальной иглы после 10 мин экспозиции. 2. Определение серотонинового индекса (СИ) в изучаемых структурах гипоталамуса. 3. Выявление биоамин-инактивирующих веществ (гепарина и МАО) в биоаминсодержащих структурах гипоталамуса. Исследования проведены на 260 белых беспородных крысах-самцах весом от 180 до 200 грамм. Материал брали в осенне-зимний период под глубоким эфирным наркозом, срезы делали в криостате толщиной 15 мкм. Структуры гипоталамуса выделяли из фронтальных срезов мозга по методу Palcovits (1973) в соответствии с координатами по атласу �� Konig�� and�� Klippel�� (1963). Исследовали паравентрикулярное ядро А 5150 – А 5780, одним блоком аркуатное ядро и срединное возвышение А3750 – А 4620. Точку акупунктуры (ТА) ТR-20 (цзяо-сунь) на теле животного определяли с помощью атласа �� V�� о11 (1976) и прибора ПЭА-1 на предварительно выбритом участке, а также анатомо-топографическим методом. Кроме того, измеряли электрокожное сопротивление с помощью стандартного прибора Элитерис 5 УМ 003. Железную иглу вводили под эфирным наркозом. Контролем служили крысы, которым в таких же условиях проводили акупунктуру в кожу бедра вне ТА. Первую группу составили интактные животные (15 крыс). Вторая группа была контрольной (15 крыс), с электрокожным сопротивлением в100 кОм и выше. Третья группа (15 крыс) подвергалась воздействию иглотерапии в точку гипоталамуса 20Х с обеих сторон, ЭКС составило 55–65 кОм. Четвертая группа (15 крыс) подвергалась воздействию иглотерапии в точку гипоталамуса 20Х с обеих сторон, ЭКС 55–65 кОм. Нами использовались люминесцентногистохимические методы выявления катехоламинов (КА) и серотонина (С) по Фальку (1969), гистамина по Кроссу с соавт. (1977), а также исследовали гепарин по А. Унна и моноаминоксидазу (МАО) по Гленнеру. При изучении корреляционных взаимоотношений между биоаминами в тучных клетках интактных крыс (табл. 1) определено, что связь между КА и серотонином, а также между КА и гистамином слабая отрицательная, между серотонином и гистамином корреляционные взаимодействия также отрицательные, но сильные. По условиям метода отрицательность связи говорит о раздельном влиянии каждого из нейромедиаторов на структуру. Сразу после снятия иглы картина меняется мало. Через 30 мин связи усиливаются, но остаются отрицательными. Через 4 часа тучные клетки дегранулируют. Возникшие вновь мелкие тучные клетки кроме КА не содержат пока никаких других аминов. Серотониновый индекс меньше 1, что по условиям метода говорит о сильном влиянии адренергического звена вегетативной нервной системы. 144 Сборник научных трудов Таблица 1 Корреляционные взаимодействия КА/серотонин КА/гистамин С/гистамин Серотон.индекс Интактные -0,4 -0,4 -0,75 0,4 Сразу после Через 30 мин -0,4 -0,8 -0,3 -0,5 -0,7 -0,65 0,4 0,84 В нервных клетках гипоталамуса у интактных крыс корреляционные взаимоотношения между всеми биоаминами слабые отрицательные. Сразу после снятия иглы корреляционные взаимоотношения остаются слабыми отрицательными, за исключением связи серотонин/гистамин, где связь становится сильной положительной. В остальные экспериментальные сроки после воздействия акупунктуры корреляционные взаимоотношения остаются слабыми, как у интактных крыс. Серотониновый индекс в нервных клетках, за исключением первого экспериментального срока, остается ниже единицы (табл. 2). Таблица 2 Корреляционные взаимодействия КА/серотонин КА/гистамин С/гистамин Серотон.индекс Интактные Сразу после Через 30 мин Через 4 ч. -0,025 -0,2 -0,4 0,86 -0,2 -0,3 0,7 2,16 -0,06 -0,25 0,3 0,06 -0,03 -0,2 0,2 0,03 Сразу после снятия иглы содержание МАО в нервных клетках увеличивается и через 4 часа становится максимальным. В тучных клетках сразу после снятия иглы содержание МАО вначале повышается, через 30 мин – снижается и далее клетки дегранулируют. Чем моложе тучные клетки, тем интенсивнее они окрашиваются в темно-синий цвет. Сразу после снятия иглы и через 30 мин сульфатация гепарина увеличивается. Через 4 часа наступает дегрануляция тучных клеток, иногда с тотальным распадом. Появляются, очевидно, молодые мелкие мало сульфатированные гепариновые тучные клетки и белковые, окраска которых по Унна зеленая. Выводы: Иглоукалывание в точку гипоталамуса Т�� R�� -20 не изменяет отрицательных корреляционных взаимоотношений в структурах гипоталамуса, также как и серотонинового индекса, он во всех случаях остается ниже единицы, что говорит о сильном влиянии вегетативного звена нервной системы ТR-20. 145 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Адаптивно-интегративная реакция кожных трансплантатов под воздействием эплира Малиновская И.С. ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, Томск Одним из стимуляторов адаптации и интеграции трансплантатов кожи может являться экстракт полярных липидов иловых сульфидных грязей (эплир), представляющий собой высокоминерализированный осадок донных отложений пресноводных озер (ООО «Биолит», г. Томск). Широкий спектр биологически активных компонентов эплира (фосфолипиды, каротиноиды, высокомолекулярные ненасыщенные жирные кислоты, простагландины и др.) обуславливает его ангиогенное, антигипоксическое, противовоспалительное и иммуномодулирующее действия (Саратиков А.С., Буркова В.Н., Курако- лова Е.А., 2004; Логвинов С.В., Арий Е.Г., Байтингер В.Ф., 2004). Непосредственное влияние эплира на приживление кожных трансплантатов не исследовалось, в связи с чем, цель данной работы состояла в изучении морфофизиологических реакций тканей кожного трансплантата после его пересадки под воздействием 1%-го масляного раствора эплира. Эксперименты проведены на беспородных белых крысах, распределенных на 4 группы: 1-й группе (n=48) проведена трансплантация несвободного аксиального пахового лоскута (НАПЛ); 2-й (n=55) – реплантация свободного аксиального пахового лоскута (САПЛ), 3-й (n=48) – трансплантация НАПЛ с аппликацией эплира, 4-й (n=55) – реплантация САПЛ с аппликацией эплира. 0,5 мл 1%-го масляного раствора эплира наносили на лоскут с захватом 1 см реципиентной зоны, после чего накладывали сухую стерильную повязку (с 1-х по 7-е сут после операции). Операции и выведение из эксперимента осуществляли под внутримышечным наркозом «Zoletil-50»®. Швы снимали по показаниям: в 1-й, 2-й группах на 7-е сут после операции, в 3-й, 4-й – на 5-е сут. Материал лоскутов для исследования забирали через 3, 5, 7, 10, 14, 30 сут после операций. Контроль – кожа паховой области интактных животных (�� n�� =24). Сосудистое русло исследовали на инъецированных микроанатомических препаратах (масса Героты). Тканевые реакции изучали на гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, толуидиновым синим. Ультрамикроскопическое исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе «JEM-100 CXII». Полученные результаты обрабатывали в программе «Statistica 6.0». Приживление кожных трансплантатов характеризуется 3-мя основными периодами: �� I�� – период острых сосудистых нарушений и травматического воспаления – адаптация трансплантата (1–7-е сут); �� II�� – период образования со- 146 Сборник научных трудов судистых связей и пролиферации – адаптация и интеграция трансплантата (5–14-е сут); �� III�� – период окончательной перестройки сосудистого русла и реорганизации трансплантата – его интеграция (с 14-х сут). I�� . Адаптация лоскутов начинается в интраоперационном периоде, проявляясь сосудистым спазмом. В результате реперфузии свободного лоскута (2-я, 4-я группы) развивается кратковременная вазодилатация, сменяющаяся повторным спазмом. Микроциркуляция на периферии лоскутов блокирована. Данный процесс длится 2–3-е сут, после чего развивается вазодилатация. Удельная площадь открытых сосудов уменьшена по сравнению с таковой с явлениями полнокровия, стаза, сладжа и тромбоза. Динамика роста удельной площади открытых сосудов в группах с применением эплира достоверно возрастает к 7-м сут по сравнению с 1-й и 2-й группами. В зоне операционной раны архитектоника тканей нарушена, усилена пролиферация клеток, в дерме – очаги лейкоцитарногистиоцитарной инфильтрации, много малодифференцированных клеток, снижено количество производных кожи. Характерным признаком тканей 3-й, 4-й групп является наличие в межклеточном веществе и в цитоплазме эпителиоцитов, фибробластов и гистиоцитов крупных вакуолей с гомогенным содержимым средней электронной плотности жироподобной структуры, что является прямым подтверждением проницаемости эплира. Средняя продолжительность воспалительной реакции лоскутов 1-й, 2-й групп 7–8 сут, а 3-й, 4-й – 4–5 сут. II�� . Инициирующим механизмом интеграции лоскута является прорастание сосудов через его границу, которое в 1-й, 2-й группах наблюдается к 7-м сут, а в 3-й, 4-й – к 5-ым сут. Множественные сосудистые связи образуются в 1-й, 2-й группах к 14-е сут, в 3-й, 4-й – к 10-м сут, что сопровождается увеличением численной плотности сосудов. В тканях возрастает численная плотность и синтетическая активность клеток, что обеспечивает ликвидацию посттравматических последствий структурно-функционального характера и является основой интеграции лоскута в окружающие ткани. Полная эпителизация ран наблюдается в 1-й, 2-й группах к 10-м сут, в 3-й, 4-й – на 7–8-е сут. При этом в группах с аппликацией эплира отмечалось более интенсивное восстановление волосяного покрова, отсутствовали признаки выраженного воспаления и реакции отторжения на шовный материал. III�� . К 30-м сут сосудистая архитектоника лоскутов восстановлена. Молодая соединительная ткань рубца преобразуется в зрелую, среди фибробластных клеток много фиброцитов и фиброкластов. В 3-й, 4-й группах численность фибробластов и макрофагов снижена относительно контроля. Под волосяным покровом отсутствует видимая граница трансплантата. Максимальное количество осложнений в трансплантатах (венозный тромбоз, краевой и тотальный некроз лоскутов) приходится на период с 3-х по 7-е сут, и вызвано, прежде всего, острыми нарушениями гемодинамики. По 147 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки сравнению с 1-й, 2-й группами, в группах с применением эплира наблюдается достоверно меньшее количество осложнений, что обусловлено прямым воздействием эплира на клеточные элементы тканей трансплантатов, уменьшением застойных явлений в их сосудистом русле и ранним образованием сосудистых связей с реципиентным ложем. Варианты конформаций и трехмерных композиций коллагеновых волокон внутренних оболочек Минигазимов Р.С., Вагапова В.Ш. Башкирский государственный медицинский университет, Уфа Исследование структурной организации поверхности внутренних оболочек имеет теоретическое и практическое значение. Трехмерной световой микроскопией (Минигазимов Р.С. Трехмерная световая микроскопия биологических оболочек // Морфологические ведомости. –2009. – №3. – С. 95–96) на пленочных препаратах секционного материала серозных и синовиальных оболочек изучены рельеф поверхности и рельефообразующие подпокровные коллагено-волокнистые структуры. Рельеф поверхности плевры, а также брюшины, покрывающей диафрагму, желудок, кишечник и маточные трубы, характеризуется наличием регулярной волнистости. Подпокровные (ПП) коллагеновые волокна (КВ) указанных серозных оболочек (СО) расположены параллельно в один ряд и формируют поверхностный коллагеновый волокнистый слой (ПКВС). Волокна его имеют спиралевидную конформацию, обусловленную укладкой коллагеновых фибрилл в них по спирали. Нередко, спиралевидная волнистость соседних КВ, подвергающихся одинаковому моделирущему влиянию, подобны друг другу, как реплики. Синхронизированная волнистость КВ придает волнистость всему ПКВС, а последний, в свою очередь, инициирует подобную волнистость базальной мембраны и клеточной поверхности СО. Эта «базовая» волнистость имеет период колебаний от 20 до 30 мкм, равный длине шага спирали. Когда спиралевидные волнистости соседних волокон имеют симметричную форму и полностью синхронизированы по длине, амплитуде и фазе колебаний, на поверхности ПКВС формируются регулярные волны с симметричными склонами возвышений и углублений. Такие волны ориентированы перпендикулярно к направлению КВ ПКВС. Длина отдельной волны поверхности, определяемая нами как протяженность ее фронта, равняется сумме диаметров КВ, участвующих в ее формировании. Интервал между волнами поверхности равен периоду волнистости КВ – длине шага спирали. Смещение фаз колебаний соседних волокон на определенный угол сопровождается смещением направления фронта волны поверх148 Сборник научных трудов ности на соответствующий «азимутальный» угол от перпендикулярного к волокнам направления. При изменении длины и амплитуды волнистости КВ, соответственно, изменяется интервал между волнами поверхности и их высота. Для рельефа ПКВС характерно наличие фигур дивергенции-конвергенции волн поверхности (фигура дивергенции в обратном направлении является фигурой конвергенции). Они ориентированы вдоль волн поверхности, соответственно, поперек направлению волокон ПКВС, поэтому длина этих фигур соответствует сумме поперечных сечений участвующих в них КВ. В начале фигуры дивергенции появляется закладка новой волны, которая на протяжении данной фигуры, в ряду 3–8 соседних КВ, приобретает размеры и форму соседних волн. Новая волна поверхности формируется за счет постепенного удлинения КВ на протяжении фигуры дивергенции на длину одной волнистости – на длину шага спирали. Удлинение КВ в фигуре дивергенции указывает место и направление дискретного расширения площади поверхности СО (или ее сужения – в обратном направлении). Сумма фигур дивергенции за вычетом фигур конвергенции в одном направлении является показателем вектора, величины и интенсивности расширения (изменения) площади СО. Чем больше указанных фигур, тем короче волны поверхности, то есть рельеф с короткими волнами характерен для участков интенсивного изменения площади поверхности. Это положение в особенности касается СО малых форм, имеющих небольшой радиус кривизны сферической поверхности (желчного пузыря, перикарда и эпикарда). В связи с тем, что тонкая кишка подобна цилиндру малого, но равномерного диаметра, площадь ее СО является равномерной на протяжении, и КВ ее ПКВС имеют постоянную длину. Наблюдается значительное разнообразие в самой спиралевидной конформации изучаемых волокон. Так, КВ ПКВС легочной и пристеночной плевры справа, брюшины широкой связки матки слева имеют форму спиралей левого вращения. На других участках СО и в синовиальной мембране обоих коленных суставов, ПП КВ формируют спирали правого вращения. Чаще всего глубокие и поверхностные участки шага спирали КВ являются асимметричными, соответственно, несимметричными являются и склоны формируемых ими волн поверхности. Так, к примеру, у ПП КВ легочной плевры обычно превалируют протяженности глубоких участков шагов спиралей, поэтому на поверхности ПКВС формируются регулярные волны с широкими пологими понижениями, чередующиеся с узкими гребневидными возвышениями. В диафрагмальной плевре превалирует протяженность поверхностного участка шага спирали ПП КВ, поэтому на поверхности ПКВС формируются регулярные волны из широких пологих возвышений, чередующиеся с узкими бороздами. Эти две формы волн с вариациями являются характерными для рельефа поверхности СО. В принципе, обе эти формы волн у ПКВС имеют место 149 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки одновременно: КВ в нем распределены в тонкий одинарный упорядоченный ряд, поэтому рельеф одной его поверхности является обратным зеркальным отражением рельефа поверхности обратной стороны, то есть, если на одной его поверхности имеется гребень, то на другой – такой же конфигурации и размеров борозда. Поверхность брюшины печени, селезенки не имеет регулярной волнистости. ПП КВ брюшины этих органов не формируют обособленный ПКВС – они распределены по нескольким рядам и направлениям. Базальная мембрана брюшины тонкой кишки и широкой связки матки имеет свою регулярную волнистость, параллельную базовой волнистости, с длиной волны 10 мкм, то есть ее коллагеновые фибриллы ориентированы и синхронно волнисты. ПП КВ ареолярно-фиброзного типа синовиальной оболочки формируют обособленный слой из одинарного ряда волокон, который имеют регулярную волнистость с периодом 20–30 мкм. На люминальной поверхности синовиальных оболочек имеются регулярные волны с интервалом 10 мкм. Гетерогенность околопротокового клеточного микроокружения молочной железы при дисгормональных гиперплазиях в условиях воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения Мнихович М.В. ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Росздрава», Рязань Реальная оценка эффективности низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в отношении заболеваний молочных желез отсутствует, показания, противопоказания, параметры излучения и т.д. не разработаны. В литературе, отсутствуют работы, оценивающие структурно-функциональные изменения в молочных железах при воздействии лазерного луча. Целью настоящей работы явилось изучение влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы маммогенеза в условиях гиперэстрогенемии и при кистозной мастопатии в эксперименте. Молочные железы изучались у 185 белых беспородных девственных самок крыс. Первая группа – гиперэстрогенезированные крысы (ГЭ, введение синэстрола в/м 10 мг на 200 г массы 1 р/нед), которые в группе опыта получали облучение НИЛИ в течение 2, 4 и 8 нед. Вторая группа – животные, у которых воспроизводили кистозную мастопатию (КМ), а затем эти крысы также получали облучение НИЛИ. Группами сравнения служили крысы, у которых моделировали ГЭ и КМ, но эти животные не подвергались облуче150 Сборник научных трудов нию. В качестве источника НИЛИ использовали аппарат на гелий-неоновой основе ЛГН–111 с длиной волны 0,63 мкм и мощностью на выходе световода 13 мВт, время экспозиции 5 и 10 мин. Крыс выводили из опыта, согласно «Правилам проведения работы с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза от 13.11. 1984 г. № 724) и приказу № 755 от 12.08.1977 г. Минздрава СССР «О гуманном обращении с экспериментальными животными». Для выявления популяций тучных клеток срезы окрашивали толуидиновым синим, основным коричневым, проводилась �� PAS�� -реакция. Морфофункциональное состояние паренхимы и стромы молочной железы крыс оценивалось по 26 морфометрическим параметрам. Проводилась также электронная микроскопия. У ГЭ крыс при облучении НИЛИ в течение 2 нед в фибробластах определялись деструктивные изменения, сосуды полнокровны, эндотелий местами поврежден. Установлено, что в строме молочных желез (МЖ) этих животных произошло снижение числа нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, увеличение эозинофилов и фибробластов, по сравнению с контролем (р<0,05). У ГЭ крыс при облучении в течение 4 нед изменение стромы МЖ характеризовались усилением процессов ангиогенеза, увеличением числа тучных клеток и появлением в них признаков активации. Активация фибробластов околопротоковой стромы выражалась в большей мере при облучении МЖ в течение 10 мин. МЖ животных при ГЭ и облучении НИЛИ в течение 8 нед характеризовалась усилением процессов ангиогенеза, увеличением числа эозинофилов, тучных клеток с признаками дегрануляции, появлением фибробластов с высокой секреторной активностью, отмечены признаки апоптоза эпителиоцитов и фибробластов. Влияние НИЛИ на МЖ при КМ в течение 2 нед характеризовалось признаками активации фибробластов (расширение цистерн эндоплазматической сети, гиперплазия митохондрий), усилением процессов ангиогенеза. Все дозы НИЛИ практически одинаково влияли на клеточный состав околопротоковой стромы – приводили к увеличению числа тучных клеток, нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и фибробластов, снижению % моноцитов (р<0,05). У крыс при КМ и облучении НИЛИ в течение 4 нед в околопротоковой строме МЖ отмечено усиление процессов ангиогенеза, а также секреторной активности фибробластов (увеличение комплекса Гольджи, расширение эндоплазматической сети и наличие в цитоплазме мелкозернистой субстанции и разнонаправленных нитей коллагена), увеличение числа тучных клеток, выявлены признаки апоптоза эпителиоцитов и фибробластов. У животных при КМ и облучении НИЛИ в течение 8 нед в околопротоковой строме МЖ выявлены тучные клетки, контактирующие с тонкостенными кровеносными сосудами околопротоковой стромы, образуя вокруг них гнезд151 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ные скопления. Мембрана тучных клеток характеризовались множеством дупликатур в виде сосочков и выпячиваний. Вдоль плазмолеммы фибробластов отмечены новообразованные коллагеновые фибриллы с четкой поперечной исчерченностью, формирующиеся в мелкие пучки. Среди полей коллагена и вблизи сосудов отмечаются сформированные апоптозные тельца. Таким образом, при ГЭ и КМ низкоинтенсивное лазерное излучение вызывает в строме молочной железы усиление активности фибробластов и тучных клеток, увеличение числа тучных клеток, появление нетипичных форм тучных клеток. Морфологическая характеристика клеточного микроокружения, экстрацеллюлярного матрикса и особенностей микроциркуляторного русла при раке, фиброаденоме и дисгормональных гиперплазиях молочных желез Мнихович М.В., Тернов М.М. ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Росздрава», Рязань К пониманию морфогенеза рака молочной железы (РМЖ) и доброкачественных заболеваний молочной железы следует подходить с позиции рассмотрения структурно-функциональной перестройки двух филогенетически и анатомо-физиологически взаимосвязанных тканевых компонентов – па ренхимы и стромы. Цель исследования заключалась в выяснении морфологических особенностей экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), ангиогенеза и клеточного микроокружения при РМЖ, дисгормональных гиперплазиях и фиброаденоме молочной железы. Исследованы молочные железы (МЖ), удаленные при операциях по поводу дисгормональных заболеваний, фиброаденом (ФА) и РМЖ (87 случаев): диффузная кистозная мастопатия (КМ) – 22 случая, узловая КМ – 14 случаев, фиброаденома МЖ – 21 случай, склерозирующий аденоз – 3 случая и первично выявленный РМЖ – 27 случаев (инвазивные формы аденокарциномы). Возраст больных 21–79 лет. Материал изучался при помощи световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Установлено, что ЭЦМ стромы при РМЖ содержит большое количество тонких аргирофильных фибрилл, встречаются также толстые коллагеновые фибриллы, сконцентрированные в периваскулярной ткани и в очагах десмопластической реакции. При электронной микроскопии в ЭЦМ стромы при РМЖ обнаруживаются тонкие и более толстые микрофибриллы, с попереч152 Сборник научных трудов ной исчерченностью или реже без нее, располагающиеся в виде пучков вблизи фибробластов и миоэпителиоцитов. Сосудистое звено ЭЦМ при РМЖ представлено микрососудами венулоподобного, протокапиллярного, синусоидного и капиллярного (наиболее многочисленны) типов. Оформленная базальная пластинка в сосудах отсутствует. Периваскулярная ткань при РМЖ напоминала соединительную ткань, содержащую рыхлые коллагеновые волокна с фрагментами растущих сосудов и клетками (фибробласты и макрофаги). В исследованном материале РМЖ, обращает на себя внимание отсутствие перицитов. Опухолевые клетки контактируют с эндотелиальными посредством отростков последних, опухолевые клетки располагаются близко к эндотелию, который окружен электронноплотным материалом. Клеточная инфильтрация при РМЖ достаточно высокая, особенно на периферии опухоли. Среди клеток стромы инвазивной карциномы МЖ выявлялись фибробласты, моноциты, лимфоциты, фиброциты и миофибробластоподобные коллагенобразующие клетки. Фиброциты располагались среди большого количества коллагеновых и эластических волокон, что являлось характерным расположением фиброцитов только в строме при РМЖ. ЭЦМ при фиброаденомах МЖ представлен полями гиперэластоза, гиалиноза, выявляются скопления фрагментированных эластических волокон, тонкие и толстые коллагеновые микрофибриллы с поперечной исчерченностью и без нее, утолщение базальной мембраны, а также аморфный гранулированный материал и зебровидный коллаген, который располагается в основном вблизи базальных мембран протоков и деформированных сосудов. Клеточный состав фиброаденом представлен фибробластами на различных стадиях дифференцировки, моноцитами, лимфоцитами и макрофагами. Коллагеновые микрофибриллы с поперечной исчерченностью формируют подобие ложа, в котором располагаются клеточные элементы. Фибробласты, формируют с макрофагами и лимфоцитами контакты в виде плотных щелевых. Отмечены лимфоциты, образующие пальцевидные выпячивания цитоплазмы в сторону макрофагов. Обнаруживалась миграция лимфоцитов в эпителиальный пласт. Здесь же можно видеть суженные («удушенные») сосуды с утолщенными склерозированными стенками. Изменения стромы при диффузных и узловых КМ имеют стереотипные характеристики ЭЦМ и клеточного микроокружения. Строма представлена плотной соединительной тканью, с очагами гиперэластоза и гиалиноза, среди волокон которой имеются как собственно соединительнотканные клетки, так и клетки гематогенного происхождения. В строме МЖ при узловых и диффузных КМ определяются наряду с клеточной инфильтрацией, толстые и тонкие микрофибриллы с поперечной исчерченностью и без нее, гранулярный аморфный материал. В пролиферативных формах КМ доминируют 153 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки толстые микрофибриллы. В околопротоковой строме наблюдается миграция лимфоцитов в эпителиальный пласт паренхимы железы. Лишь местами остаются сохранившиеся миоэпителиальные клетки с упорядоченными скоплениями микрофиламентов и гемидесмосом, в местах расположения которых базальная мембрана утолщена и разрыхлена. Вокруг сосудов, в особенности вокруг венул и капилляров, группируются лимфоциты, у которых отмечены контакты с эпителиоцитами и плазмоцитами. Таким образом, установлено, что структурно-функциональное состояние экстрацеллюлярного матрикса, ангиоархитектоники и клеточного микроокружения при дисгормональных гиперплазиях, фиброаденомах и раке молочной железы различно. Структурно-функциональное изучение экстрацеллюлярного матрикса, паренхимы и стромальных элементов при фиброаденомах и дисгормональных гиперплазиях крайне необходимо для определения прогноза и выбора методов лечения. О генезе экспериментальных сарком Мойжесс Т.Г. НИИ канцерогенеза Онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва Происхождение сарком, индуцированных инородным телом, до сих пор недостаточно ясно. Хотя большинство изученных сарком было классифицировано как фибро- или малодифференцированные, в работе Johnson et. al. (1973) на основании данных электронной микроскопии была высказана гипотеза о происхождении этого вида сарком из клеток мелких сосудов. Для прояснения данного вопроса предпринята представленная работа. Целью работы было изучение природы клеток-предшественников сарком, индуцированных в экспериментальной модели канцерогенеза подкожной имплантацией мышам пластинок из поливинилхлорида. Анализировали поведение этих клеток в 2-мерной и 3-мерной культурах. Для этого через 9 мес. после имплантации клетки, населяющие окружающую пластинку соединительнотканную капсулу без признаков роста опухоли, культивировали in vitro на пластике и в матригеле. На пластике клетки размножались и в течение 10 суток давали монослой типа монослоя фибробластоподобных клеток. В редкой культуре эти клетки имели характерный фенотип (с многочисленными отростками, оканчивающимися мелкими расширениями; при окраске антителами против α-SM-актина наблюдалась положительная окраска стресс-фибрилл) На втором-четвертом пассаже клеток в плотном монослое появлялись фокусы роста типа �� cobblestones�� , характерные для эпителия и эндотелия. Изолированные из таких фо154 Сборник научных трудов кусов клетки не имели ярковыраженной морфологии «начальных клеток», но давали положительную окраску на α-�� SM�� -актин. Эти же клетки демонстрировали способность накапливать Dil ac-LDL (ацетилированные липиды низкой плотности, конъюгированные с флюорохромом, эндоцитоз которых маркирует клетки эндотелия и макрофаги) в течение 5 часов. Прививка 600000 таких клеток под кожу сингенным мышам привела к образованию медленнорастущих фибросарком. При клонировании смешанной культуры с двумя типами роста было получено 9 клонов, клетки 5 из них в первом пассаже на флаконах демонстрировали характерную морфологию «начальных клеток». Далее при пассировании клетки этих клонов утрачивали указанную морфологию, хотя продолжали экспрессировать α-�� SM�� -актин. В остальных 4-х клонах такая картина наблюдалась уже в первом пассаже. В одном из клонов окраска на α-SM-актин была диффузной и не во всех клетках. В дальнейших пассажах в плотном монослое клоны давали рост полностью типа cobblestones. При посадке на поверхность матригеля клоны проявляли индивидуальность в способности образовывать тубулоподобные структуры. Клетки одного из клонов обнаружили способность к образованию типичных для эндотелия капилляроподобных структур, сформировавшихся через 4 часа после посева, и сохранявшихся около суток, затем распадающихся на кучки клеток. Два других исследованных клона образовали подобные, но деформированные структуры. В последующие десять суток клетки с поверхности прорастают вглубь матригеля, образуя характерные ветвящиеся структуры типа second sprooting�� (�� Ljubimov�� е�� t�� al�� ., 2004). Клетки, формирующие вторичные структуры, также накапливали Dil ac-LDL. Предлагается гипотеза, объясняющая описанные свойства клетокпредшественников сарком. При имплантации пластинки, макрофаги, ее покрывающие, выделяют ангиогенный фактор, приводящий к размножению эндотелиальных клеток. Те же макрофаги продуцируют �� TGF�� -�� β�� , что видоизменяет эндотелиальные клетки, побуждая их к экспрессии αSM-актина (Frid et�� al�� ., 2002). Однако способность накапливать �� Dil�� ac�� -�� LDL�� выдает родство клеток с эндотелием. Вероятно, в отсутствие TGF-β в условиях культивирования in vitro происходит частичная реверсия, и клетки приближаются вновь к эндотелиальному фенотипу. Т.о. полученные данные свидетельствуют в пользу возникновения изучаемых сарком из эндотелиальных клеток. Это подтверждается: 1) типом роста на твердом субстрате (�� cobblestones�� ), 2) способностью к образованию капилляроподобных структур при посеве на поверхность матригеля, 3) способностью эндоцитировать Ac-LDL. 155 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Метод FRAP в изучении эффективности действия специфичных к мРНК белка eGFP антисмысловых олигонуклеотидов в дермальных фибробластах мыши Молчанова Е.С. , Семенова М.Л. , Кошелева Н.В. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Открытиями последних десятилетий в области генетики и молекулярной биологии показана возможность модуляции экспрессии генов антисмысловыми олигонуклеотидами (АсОДН), направленными на матричные РНК и ингибирующими трансляцию. АсОДН и их производные находят применение в клинике для лечения онкологических заболеваний, ряда вирусных и бактериальных инфекций. Открытым остается вопрос об оценке эффективности воздействия АсОДН на белки-мишени в различных клетках. Целью исследования стала разработка на основе метода FRAP способа полуколичественной оценки экспрессии флуоресцентного белка eGFP и изучение с применением разработанной технологии эффективности воздействия АсОДН на экспрессию этого белка в дермальных фибробластах eGFP+ мышей. Подбор АсОДН производили при помощи программ Mfold и Genebee и Oligo 6. Специфичность подобранных последовательностей проверяли с помощью программы BLAST 2.2. Для работы использовали немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК гена egfp. В качестве действующих на мишень агентов были выбраны две различающиеся вторичной структурой последовательности АсОДН: последовательность, образующая вторичную структуру «шпилька» (АсОДН «шпилька», 18 звеньев) и последовательность, не формирующая вторичную структуру (линейный АсОДН, 17 звеньев). Дермальные фибробласты выделяли из ткани лоскута кожи брюшной области самцов мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J возраста 11 сут, культивировали в стандартных условиях (37оС, 5% СО2) в полной ростовой среде DМЕМ/F12 (1:1) с добавлением глютамина (2мМ L), гентамицина (50мкг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, ежедневно добавляя АсОДН в экспериментальные группы. Оценку эффективности действия АсОДН проводили на микроскопе Axiovert 200M с лазерной конфокальной приставкой LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия) на 8-е сутки инкубации с АсОДН. На основе метода FRAP (оценка восстановления интенсивности флуоресценции после фотоотбеливания) мы разработали способ, позволяющий оценить изменение количества флуоресцентного белка-мишени по изменению интенсивности его флуоресценции. Различия интенсивности флуоресценции 156 Сборник научных трудов eGFP в образцах оценивали по степени восстановления интенсивности флуоресценции в ядрах клеток, подвергшихся фотоотбеливанию. В циклах FRAP характер восстановления флуоресценции в зоне фотоотбеливания у соседних клеток одного образца зависел от уровня интенсивности флуоресценции до начала фотоотбеливания. Кривые изменения интенсивности флуоресценции в циклах FRAP аппроксимировали квадратичной функцией, на полученном графике находили точку, производная в которой равна 0 (точка выхода на плато), рассчитывали разницу в интенсивности флуоресценции в точке начала восстановления флуоресценции и в точке выхода на плато. Данная величина прямо зависела от интенсивности флуоресценции до начала фотоотбеливания (чем выше была начальная интенсивность флуоресценции, тем больше значение рассчитанной разности). Рассчитываемая разница интенсивности флуоресценции белка-мишени в циклах FRAP позволила полуколичественно оценить уровень белка eGFP в клетках. С применением разработанного способа полуколичественной оценки уровня экспрессии белка на основе метода FRAP исследовали эффективность действия специфичных к мРНК egfp АсОДН, имеющих линейную вторичную структуру, и АсОДН, формирующих вторичную структуру «шпилька». Линейный АсОДН практически не влиял на экспрессию белка eGFP. В циклах FRAP разности в интенсивности флуоресценции в точке начала восстановления флуоресценции и в точке выхода на плато в контрольном образце и в образце после инкубации с линейным АсОДН были сходны и напрямую зависели от интенсивности флуоресценции до начала фотоотбеливания. После инкубации с АсОДН «шпилькой» белка eGFP в клетках стало настолько мало, что его количество после фотоотбеливания не восстанавливалось (рассчитываемая в циклах FRAP разность была отрицательна). Снижение уровня экспрессии белка eGFP после воздействия АсОДН «шпилька» было подтверждено с помощью вестерн-блота. Таким образом, была разработана методика для полуколичественной оценки изменения содержания белка в клетке после воздействия антисмысловых олигонуклеотидов с использованием АсОДН к мРНК гена �� GFP�� на модели подавления синтеза зеленого флуоресцентного белка в eGFP+-клетках с применением метода FRAP. С помощью разработанной на основе FRAP методики были получены данные о воздействии специфичных АсОДН на экспрессию белка eGFP в фибробластах мышей линии C57BL/6-Tg(ACTBEGFP)1Osb/J), было показано, что наличие вторичной структуры «шпильки» влияет на проникновение АсОДН в клетки и эффективность специфичного действия. Результаты этого исследования могут быть использованы для оценки изменений уровня экспрессии флуоресцентных белков в клетках и дадут возможность расширить использование АсОДН в клеточной терапии. 157 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Исследования выполнены в рамках Программы поддержки научноисследовательской работы молодых ученых ВУЗов России компании Сarl Zeiss, Германия (грант №2-13). Сопоставление особенностей экспрессии маркеров прогрессии рака желудка с классическими критериями классификации P. Laurén (1965) Москвина Л.В. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва Рак желудка – одна из самых распространенных опухолей в мире, удерживающая лидирующие позиции в структуре мировой онкологической смертности (WHO, 2005). В России, по данным ВОЗ, первичная заболеваемость раком желудка занимает второе место в структуре онкологических заболеваний. Одна из наиболее старых и наиболее часто используемых классификаций рака желудка – классификация �� P�� . �� Laur�� é�� n�� (1965), которая до настоящего времени не имеет очевидных молекулярных подтверждений. Поиск молекулярнобиологических оснований для классических критериев классификации P. Laurén позволит объяснить ее беспрецедентную популярность, а изучение особенностей экспрессии маркеров адгезии, пролиферации и апоптоза в сопоставлении с классическими характеристиками диффузного и кишечного типов рака желудка поможет выявить ряд новых прогностических критериев и будет способствовать развитию знаний по биологии опухолевого роста. Проведено исследование экспрессии основных молекул �� Wnt�� -пути, регулирующего пролиферацию и адгезию. На основании изучения данных литературы, для анализа были выбраны: р53, �� Ki�� -67, �� bcl�� -2 – для оценки прогрессии и пролиферативной активности опухоли; β-catenin – один из основных участников Wnt-пути, участвующий в регуляции пролиферации и адгезии клеток; E-cadherin – одна из основных молекул адгезии, взаимодействующая с β-catenin; P-cadherin как агент, вступающий в конкуренцию с Е-cadherin; Claudin�� -1 – белок, регулирующий метастазирование опухоли, значимость которого до конца не выяснена. Исследование проведено на архивном материале эндоскопических биопсий централизованной окружной лаборатории патоморфологии и цитологии САО г. Москвы за 2004–2008 гг. Для исследования было отобрано 73 случая: 34 случая (48%) опухолей кишечного типа, 39 случаев (52%) опухолей диффузного типа. Средний возраст составил 65,2±9,38 лет (медиана 67) и 67,3±9,34 (медиана 70) для пациентов с опухолями кишечного и диффузного типа соответственно. Иммуногистохимические исследования проводили на парафиновых срезах толщиной 4 мкм с исполь158 Сборник научных трудов зованием первичных антител – р53 DO-7, Ki-67 MM1, bcl-2 100/D5, β-catenin 17C2, E-cadherin, P-cadherin (Novocastra, UK), Claudin-1 (Biocare Medical, USA�� ). Статистическая обработка результатов производилась с использованием пакета программ Microsoft Office 2005 и Statistica 6.0 по критериям MannWhitney, Wilcoxon. Выраженная экспрессия р53 была отмечена в 13,16% опухолей диффузного типа и в 28,57% опухолей кишечного типа (р<0,05). Исследование с использованием Ki-67 позволило установить высокий уровень экспрессии в случае опухолей диффузного и кишечного типов (27,03% и 23,68% случаев соответственно). Экспрессия bcl-2 в опухолях диффузного типа незначительно выше, чем в опухолях кишечного типа (67,89% и 41,43% соответственно). Экспрессия маркеров адгезии β-catenin и claudin-1 характеризовалась 37,83% и 50,00% положительных клеток в опухолях диффузного типа и 44,44% и 45,71% – в опухолях кишечного типа соответственно. Выраженная положительная реакция с Е-кадгерином в группе кишечного типа опухолей отмечена в 31,43%, диффузного – в 7,89%, р=0,039. Экспрессия атипичной молекулы адгезии Р-кадгерина зарегистрирована в 51,32% исследованных случаев. Статистической значимости при попытке выявления зависимости уровня экспрессии от гистологического типа опухоли не выявлено. Выявленные тенденции требуют дальнейшего изучения на бóльшей выборке. В настоящем исследовании не выявлено существенных различий между опухолями диффузного и кишечного типов ни по уровню экспрессии маркеров пролиферации и апоптоза, характеризующих темп роста опухоли, ни по уровню экспрессии маркеров адгезии, характеризующих склонность опухоли к инвазивному росту. Таким образом, принципы, положенные в основу классификации �� P�� . �� Laur�� é�� n�� , не имеют достаточных молекулярно-биологических оснований, а ее клиническая и прогностическая значимость, по-видимому, несколько преувеличена. Аутоиммунные сыворотки как инструмент для выявления белков ядерного матрикса Мурашева М.И. , Ченцов Ю.С. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Ядерный белковый матрикс – гетерогенный компонент, который выявляется после экстракции из ядра ДНК, РНК и гистонов (Ченцов и др., 1999; Косых, Ченцов, 2002). Он представлен внутриядерной белковой сетью, остаточными ядрышками и ламиной, и играет большую роль в простран159 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ственной организации синтеза ДНК и РНК в интерфазном ядре (Berezney et. al., 1995). Известно, что некоторые белки, входящие в состав ядра в течение интерфазы, после диссоциации ядра и ядрышка в профазе мигрируют и обнаруживаются в составе периферического хромосомного материала (ПХМ) (Van Hooser, et al�� ., 2005). ПХМ представляет собой поверхностный слой на митотических хромосомах клеток животных и растений. Иммуноцитохимическим методом было показано, что митотические хромосомы участвуют в переносе в дочерние клетки как ядрышковых белков, так и белков ядерного матрикса. ПХМ не содержит ДНК и состоит из белков и РНК ядрышек, а также белков матрикса интерфазного ядра, за исключением ламинов (Нernandez-Verdun et. al., 1994; Ченцов, 2000). В настоящее время у многих ядрышковых белков, входящих в состав ПХМ, функции описаны, в то время как неядрышковых белков выявлено значительно меньше, и у большей их части функции остаются невыясненными (Ченцов и др., 1999; Косых, Ченцов, 2002; Van Hooser, et al., 2005). Неизученными остаются природа и химизм связи белковых компонентов с хромосомой. Известно, что сыворотки, полученные из крови людей, страдающих аутоиммунными заболеваниями, содержат антитела ко многим внутриклеточным белкам (Hollingsworth, et al., 1996; Hong et al., 2001). Цель работы – используя иммунофлуоресцентные методы, определить молекулярные массы новых белков, а также описать локализацию белков в интерфазных ядрах, на митотических хромосомах и в ядерном матриксе. Для определения стабильности связи исследуемых белков с поверхностью хромосом была изучена их локализация при воздействиях, приводящих к значительному изменению объема хромосом: искусственной деконденсации и деконденсации с последующей реконденсацией. Также была проведена деконденсация хромосом с последующей обработкой клеток РНКазой. Работа выполнена на клетках культуры почки эмбриона свиньи (СПЭВ). В настоящей работе мы использовали как инструмент для выявления новых неядрышковых полипептидов две аутоиммунные сыворотки, которые предположительно относятся к белкам ядерного матрикса. Сыворотки больных аутоиммунными заболеваниями были получены из Института ревматологии (Санкт-Петербург). Для характеристики антител сывороток использовался метод иммуноблоттинга. Для выявления белков ядерного матрикса из клеток удаляли хроматин, РНП и гистоны по модифицированному методу (Berezney, Coffey, 1977). Для искусственной деконденсации хромосом использовали 15% раствор Хенкса (Киреев и др., 1988). Для искусственной реконденсации хромосом клетки переносили в нормальную ростовую среду. Чтобы удалить РНК, клетки обрабатывали раствором РНКазы А в концентрации 100 мкг/мл. С помощью метода иммуноблоттинга мы показали, что антитела аутоиммунных сывороток связываются с ранее неизвестными белками: первые коньюгируют с полипептидами, имеющими молекулярную массу (ММ) 38 кДа, а вторые 160 Сборник научных трудов связываются с белками с ММ 50 кДа. В ядерном матриксе антитела к белку с ММ 38 кДа окрашивают только периферию остаточных ядрышек интерфазных клеток, а антитела к белку с ММ 50 кДа неоднородно окрашивают ядро и периферию остаточных ядрышек. В необработанных интерфазных клетках антитела к белку с ММ 50 кДа выявлены в зоне околоядрышкового хроматина, а также в ядре в виде небольших скоплений. В то же время антитела к белку с ММ 38 кДа замечены в зоне околоядрышкового хроматина, а также в виде большого количества ярких мелких гранул на фоне диффузно окрашенного ядра. При окраске антителами к белку с ММ 50 кДа нативных митотических клеток, а также при экспериментальной деконденсации хромосом и деконденсации с последующей реконденсацией флуоресценция наблюдалась на периферии набухших хромосом в виде муфты. Такая же картина наблюдается при деконденсации хромосом с последующей обработкой препаратов РНКазой. Исходя из этих данных, можно полагать, что белок с ММ 50 кДа сохраняет прочную связь с периферией хромосом, поскольку она не нарушается при значительных изменениях объема тела хромосом и обработке РНКазой. При окраске митотических клеток антителами к белку с ММ 38 кДа как в норме, так и после деконденсации хроматина флуоресценция обнаруживается по длине хромосом в виде отдельных светящихся фрагментов и мелких гранул. В то же время в опыте с деконденсацией и последующей реконденсацией флуоресценция наблюдалась на периферии хромосом, а также в виде гранул в цитоплазме. Вместе с тем, при деконденсации хромосом с последующей обработкой препаратов РНКазой этот белок выявляли только на периферии набухших хромосом в виде муфты. На основании полученных данных можно заключить, что белок с ММ 38 кДа может быть ассоциирован не только с ДНК, но и с РНК. Из представленных данных можно сделать вывод, что исследованные белки ядерного матрикса переносятся в митозе ПХМ и могут иметь различную устойчивость связи с периферией хромосом, также как и основные белки ядрышка, такие как фибрилларин, В-23 (Мухарьямова и др., 1998; Косых, Ченцов, 2002), нуклеолин (Utama et al., 2002). Пространственно-временная организация активности генома нервных клеток в условиях измененного фоторежима Мустафин А.Г., Ярыгин В.Н. Российский государственный медицинский университет, Москва Проводили изучение закономерностей пространственно-временной организации активности генома нейроцитов спинальных стволовых и корковых популяций в норме и условиях постоянного освещения или инверсии освещения. 161 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Животные контрольной группы (крысы Wistar, 160–200 г) содержались в условиях чередования света и темноты. Первая экспериментальная группа животных находилась в течение 1,5 месяцев в условиях непрерывного освещения. Вторая – содержалась в условиях инвертированного освещения в течение 6–7 суток. Четвертая – в течение 18–19 суток. Для исследования в течение 2-х суток брали спинномозговые ганглии (СМУ), поясничное утолщение спинного мозга (СМ), кору мозжечка (М), супрахиазматические ядра гипоталамуса (СХЯ), зрительную область коры большого мозга (ЗК). Срезы органов культивировали in vitro. Часть срезов каждого органа инкубировали с 3Н-уридином, вторую половину – с 3Н-лейцином. Синтез РНК и белков оценивали методом авторадиографии. У животных контрольной группы отмечены монофазные суточные ритмы. Расчетные максимумы интенсивности транскрипции клеток СМУ, СМ, М, СХЯ соответствуют темновому периоду суток. В ЗК акрофаза наблюдается в световой период суток и находится в противофазе с акрофазами спинальных и стволовых популяций нейронов. Исследованные отделы нервной системы (НС) крыс различаются уровнем транскрипции и трансляции. Среднесуточные показатели транскрипции и трансляции СМ составили 45,3±11,4 и 97,0±13,2, СМУ – 100,4±13,5 и 42,7±4,8, М – 48,6±6,1 и 53,3±2,6, СХЯ – 31,6±8,8 и 52,6±5,0, ЗК – 46,5±3,0 и 67,7±8,3 соответственно. Пространственная организация систем транскрипции и трансляции в нервной системе интактных животных выражается в пространственных градиентных изменениях интенсивности транскрипции и трансляции клеток срезов периферических, спинальных, стволовых и корковых популяций. Коэффициенты корреляции временных рядов интенсивности включения Н3-уридина клеток СМ, СМУ, СХЯ и М демонстрируют положительную связь разной степени интенсивности, что, видимо, свидетельствует об их определенной пространственной взаимосвязи. В ЗК пространственная корреляционная связь с указанными выше популяциями имеет отрицательный характер. Между максимумами интенсивности включения 3Н-уридина и 3Н-лейцина часто можно отметить интервал (от 2 до 14 ч), зависящий, по всей вероятности, от длительности посттрансляционных процессов. Как будет показано далее, длительность внутренних акрофаз может меняться в активированных нейронах разных отделов НС. На этом основании можно сделать предположение о временной зависимости суточного ритма трансляции РНК от ритма транскрипции ДНК. Непрерывное освещение в течение 1,5 мес. приводит в СМУ и М к незначительным изменениям среднесуточных позиционных градиентов показателей суточного ритма включения 3Н-уридина; в СМ, СХЯ и ЗК – к поч- 162 Сборник научных трудов ти двукратному повышению мезора и амплитуды ритма синтеза суммарных РНК. Ритм интенсивности синтеза белка в СМУ, СМ, СХЯ, ЗК характеризуется незначительным снижением мезора. Амплитуда в указанных популяциях значительно более снижена, что свидетельствует о сглаженности ритма. В срезах коры мозжечка значительно возрастают оба показателя. Можно предположить, что процесс десинхронизации суточных ритмов генной активности может быть вызван ослаблением пространственных связей клеточных популяций на тканевом уровне. Полученные нами данные по изучению кинетики интенсивности транскрипции и трансляции в условиях измененного фотопериода показывают, что отличающиеся по положению популяции нервных клеток характеризуются неодинаковыми сроками и различной степенью перестройки ритмов синтеза первичных генных продуктов. Так в клетках �� C�� МУ, СМ, М после 6–7 дней фотоинверсии фазовые сдвиги акрофазы составили 9 ч 29 мин, 8 ч 39 мин, 13 ч 58 мин для суточного ритма синтеза суммарной РНК и 5 ч 49 мин, 10 ч 08 мин, 5 ч 15 мин для ритма синтеза суммарных белков, соответственно. Через 18– 19 дней изменения фоторежима найденные величины фазовых сдвигов этих ритмов в основном сохраняют сходные величины в указанных органах (6 ч 30 мин, 10 ч 39 мин, 8 ч 32 мин и 6 ч 24 мин, 10 ч 10 мин, 9 ч 33 мин). Следовательно, инверсия суточных ритмов синтеза первичных генных продуктов в указанных клеточных системах осуществляется путем фазового сдвига влево со скоростью около одного часа в сутки и, видимо, завершается в течение недели продолжения эксперимента. В то же время, в СХЯ и ЗК инверсия освещения сопровождается неодинаковыми сдвигами акрофаз ритмов транскрипции (10 ч 33 мин и 1 ч 08 мин; 3 ч 56 мин и 1 ч 29 мин соответственно) через 6–7 и 17–18 дней фотоинверсии. Вероятно, подстройка ритмов активности генома клеток зрительной коры большого мозга и супрахиазматических ядер гипоталямуса к новому фотопериоду за 18–19 дней вероятно еще не завершена. Таким образом, содержание животных в условиях постоянного и измененного освещения сопровождается перестройкой пространственных градиентов интенсивности синтеза первичных генных продуктов клеток, спинальных, стволовых и корковых популяций НС; десинхронизацией суточных ритмов интенсивности транскрипции и трансляции. Следовательно, фотопериодичность является важным датчиком времени для суточной динамики активности хроматина, оказывая влияние на клеточно-популяционные механизмы пространственно-временной организации систем транскрипции и трансляции периферических и центральных отделов нервной системы. Системам транскрипции и трансляции клеток нервной ткани свойственна единая пространственно-временная организация, которая является самостоятельной 163 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки характеристикой морфо-функционального состояния организма и находится в причинно-следственных отношениях с такими интегративными его свойствами, как адаптивность к определенным условиям среды, резистентность к различного рода внешним воздействиям. Морфологическая и электронно-микроскопическая характеристика серозных цистаденокарцином яичников после различных вариантов неоадьювантной химиотерапии Непомнящая Е.М., Голотина Л.Ю., Гудцкова Т.Н., Тартанова Т.М. ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий», Ростов-на-Дону Совершенствование методов химиотерапии рака яичников остается одним из приоритетных направлений в онкогинекологии. Обширные исследования, проводимые в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте по методам, разработанным Ю.С. Сидоренко (2002), показали, что введение цитостатиков, инкубированных на аутобиосредах организма, не изменяя их фармакологических и фармакокинетических свойств, приводит к снижению токсического действия химиоперепаратов. Одним из таких методов является аутолимфохимиотерапия (АЛХТ). Изучены морфологические изменения в 45 серозных цистаденокарциномах яичников. В группу исследования вошли больные, получавшие неоадьювантную АЛХТ – 25 человек. Контрольную группу составили 20 больных с неоадьювантной стандартной системной химиотерапией (СХТ), проведенной по общепринятой методике. Для проведения АЛХТ выполняли дренирование грудного лимфатического протока, производили сбор лимфы в объеме 1200–2000 мл в стерильные емкости по 250–500 мл с глюгициром. Порции лимфы инкубировали с цитостатиками в течение 30 мин в термостате, затем вводили внутривенно капельно. При обоих методах химиотерапии применяли �� CMFV�� схему. Ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для морфометрических исследований был использован автоматизированный измерительный комплекс «САГА» на базе ПК. Для электронно-микроскопического исследования препараты готовили по общепринятой методике. Ультратонкие срезы, полученные на ультратоме УМТП-4, изучали и фотографировали на электронном микроскопе ПЭМ-100. В серозных цистаденокарциномах яичников под действием неоадъювантной АЛХТ наблюдались некробиотические и дистрофические процессы. 164 Сборник научных трудов Площадь паренхиматозного компонента в опухолях под действием неоадьювантной АЛХТ по отношению к контролю была снижена на 42,3% (площадь паренхимы после СХТ – 61,3±3,4%, после АЛХТ – 19±2,1%). Стромальный компонент опухоли был увеличен на 41,8% и составлял 72,8±6,8% (площадь стромы опухоли после СХТ – 31,0±2,1%). Индекс повреждения паренхимы был равен 69, что позволило отнести описанные изменения в серозных цистаденокарциномах к III степени терапевтического патоморфоза. Существенно отличались показатели митотической активности и количества дистрофических раковых клеток в исследуемых группах. После СХТ митотическая активность опухолей составляла в среднем 11,3±1,3‰, тогда как после АЛХТ – 1,9±0,7‰, а количество дистрофически измененных раковых клеток в контроле было 60,6±5,5‰, а после АЛХТ – 258,3±21,5‰, т.е. увеличилось в 4,3 раза. Ультраструктурное исследование также выявило различия в клетках опухолей исследуемых групп. После СХТ межклеточные пространства были увеличены, в них можно было наблюдать клеточное содержимое в виде отдельных органелл и плазматического материала, что указывало на разрушение части раковых клеток. Во многих из них произошло «расплавление» участков кариолеммы, что свидетельствовало о нарушении ее целостности. Имело место заметное расслоение ее листков, с образованием «карманов». Гетерохроматин был распределен неравномерно в виде мелко- и крупноглыбчатых скоплений. Во многих раковых клетках определялась вакуолизация цитоплазмы и обширные участки просветления. Мембраны эндоплазматической сети часто были разрушены, при этом уменьшилось количество рибосом на мембранах, как и общее число свободных рибосом в цитоплазме раковых клеток. Расплавление крист митохондрий, набухание и вакуолизация их матрикса свидетельствовали о снижении синтетических процессов. Однако значительная часть раковых клеток сохранила свою целостность, что, вероятно, в дальнейшем может обусловливать развитие рецидива опухоли. После АЛХТ во всех раковых клетках отмечались некробиотические и дистрофические процессы различной степени выраженности. В части раковых клеток, имевших относительно сохранный вид, тем не менее, наблюдалось тотальное повреждение митохондрий, которое выражалось в их набухании, просветлении матрикса и расплавлении крист. Каналы гладкого эндоплазматического ретикулума были значительно расширены, что приводило к образованию в цитоплазме многочисленных вакуолей различного размера. Во многих клетках отмечалось нарушение цитоплазматической мембраны: ее расслоение, образование крупных пор и как следствие – развитие отека цитоплазмы и всех органелл. В клетках с выраженной степенью повреждения цитоплазматическая мембрана отсутствовала на обширных участ165 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ках, наблюдалось вымывание содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство. Хроматин в ядрах всех раковых клеток был резко конденсирован в виде крупных глыбок и располагался преимущественно вдоль ядерной мембраны. Совокупность описанных явлений вела к необратимым некротическим процессам в клетках и, в конечном итоге, к их гибели. Среди раковых клеток, преимущественно в зонах некроза, располагались макрофаги с многочисленными фагосомами, которые способствовали резорбированию раковых клеток. Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствовали о более выраженном регрессе опухоли, наступавшем при неоадъювантной АЛХТ, что полностью коррелировало с динамикой клинического течения заболевания. Участие P2Y-рецепторов в процессах нейроонтогенеза и регенерации периферического нерва Нигметзянова М.В., Рагинова Е.Б., Рагинов И.С. Казанский государственный медицинский университет, Казань За последние годы накоплено большое количество данных о значительной роли P2Y-рецепторов в регуляции процессов пролиферации, миграции, дифференцировки и гибели клеток (�� Burnstock�� , �� De�� Ryck�� , 2008). В спинальных ганглиях показана экспрессия �� P�� 2�� Y�� (1), �� P�� 2�� Y�� (2), �� P�� 2�� Y�� (4) и �� P�� 2�� Y�� (6) рецепторов (�� Ruan�� , �� Burnstock�� , 2003). При этом большинство малых (ноцицептивных) нейронов спинального ганглия экспрессируют P2Y1 рецепторы (Ruan, Burnstock�� , 2003; �� Gerevich�� et�� al�� ., 2004), а большие (проприоцептивные) и средние (тактильные) нейроны экспрессируют преимущественно �� P�� 2�� Y�� 4 рецепторы (Ruan, Burnstock, 2003). Цель нашего исследования – оценить эффекты агонистов и антагонистов �� P�� 2�� Y�� -рецепторов на регенерацию и развитие периферического нерва у крыс. В спинальном ганглии L5 на разных сроках после травмы (15, 30, 90-е сутки) и после рождения (Р15, Р30 и Р90) подсчитывали количество нейронов различных популяций на фоне введения блокаторов P2Y-рецепторов: сурамина, reactive blue2 и PPADS, а также агонистов: УТФ и ксимедона. У тех же животных в седалищном нерве оценивали количество регенерирующих (после травмы) и растущих (при нейроонтогенезе) волокон. Полученные данные свидетельствуют о значительной роли P2Y-рецепторов в периферической нервной системе. Так, их активация при помощи агонистов сопровождается увеличением количества выживающих нейронов и регенерирующих миелиновых волокон после травмы нерва, а при нейроонтогенезе ускоряется процесс развития. Блокаторы P2Y-рецепторов хотя и имели некоторые позитивные эффекты (под влиянием �� PPADS�� уменьшалась отеч166 Сборник научных трудов ность конечности после травмы нерва), в целом, на процессы регенерации и развития оказывают негативное влияние. Например, под влиянием reactive blue2 количество регенерирующих безмиелиновых волокон уменьшилось на 73,8%. Полученные данные указывают на перспективность дальнейших исследований влияния �� P�� 2�� Y�� -рецепторов на процессы регенерации и нейроонтогенеза для внедрения в клиническую практику. Плазминоген и стрептокиназа защищают клетки нервной ткани от повреждающего действия ионов аммония или глутамата Никандров В.Н., Жук О.Н., Полукошко Е.Ф., Тумилович М.К., Гронская Р.И., Лукашевич В.С., Вашкевич Е.И. ГНУ «Институт физиологии НАН Беларуси», Минск Молекулярные аспекты функционального обеспечения клеток нервной ткани и инициации в них патологических процессов далеки от полной ясности. Одной из важных проблем патоневрологии является нейродегенерация, вызываемая дисбалансом звена «NH4+–глутамат». В 1999–2000 гг. нами впервые была продемонстрированы способность стрептокиназы (�� SK�� ) и плазминогена (Pg) защищать клетки нервной ткани от повреждающего действия гидропероксида, охлаждения, депривации белков сыворотки крови, а также нейротрофические свойства SK и Pg (последнего – для клеток симпатической нервной системы, чувствительных ганглиев и трансформированных клеток). Цель настоящей работы – выяснить возможности защитного эффекта данных белков при повреждающем действии ионов аммония или глутамата. Методом электронной микроскопии показано, что при экспозиции органотипической культуры неокортекса новорожденных крыс в питательной среде DMEM�� с дефицитом по белкам сыворотки (0,5% эмбриональной телячьей сыворотки) уже через 24 ч в астроцитах отмечены конденсация хроматина, утрата характерной морфологии и вакуолизация цитоплазматических органелл. В ядрах нейронов наблюдали реактивные изменения. В нейропиле отростки теряли правильную форму, их мембрана расслаивалась, исчезали органеллы. Добавление NH4+ (0,1 М) вызвало резкие изменения ультраструктуры, в первую очередь, астроцитов (накопление электронноплотного материала у внутренней мембраны ядра, вакуолизацию цитоплазмы, появление в ней миелиновых телец, исчезновение участков плазматической мембраны). Добавление глутамата (100 мкМ) вело к нарушениям структуры всех типов клеток. Через 24 ч в астроцитах присутствовали дегенеративные изменения вплоть до полного исчезновения органелл цитоплазмы и «оголения» ядер, накопление гиперхромного материала в ядре. В нейронах ядра теряли округлость, отмечены конденса167 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ция хроматина, рост плотности митохондрий, разбухание лизосомоподобных образований, отсутствие участков цитоплазматической мембраны, микровакуолизация цитоплазмы, появление в ней структур типа миелиновых телец. В нейропиле также были резко выражены деструктивные проявления. Одновременное с глутаматом или ионами аммония добавление SK (2000 МЕ/мл – 10–5 M) или Pg (10–7 M) предохраняло клетки от деструктивных изменений в течение всего периода исследования. Организация всех типов клеток была сохранена. В присутствии SK клетки, особенно нейроциты, приобретали овальную форму, ядра удлинялись, в отдельных нейронах ядра смещались к цитоплазматической мембране. В присутствии Pg в цитоплазме нейронов увеличивались плотность полисом и количество митохондрий. В органотипической культуре неокортекса крысы ионы аммония вызвали увеличение содержания α1-антитрипсина с одновременным нарастанием его активности, но не трипсиноподобной активности и активности α2макроглобулина. Этот эффект усиливался с ростом концентрации ионов, он снимался при добавлении �� SK�� и, в значительной мере, �� Pg�� . Вместе с тем в присутствии Pg при меньшей концентрации ионов аммония (10 мкМ) нарастала активность α2-макроглобулина. На диссоциированных и органотипических культурах краниального шейного ганглия, органотипических культурах спинального ганглия методами световой и фазовоконтрастной микроскопии установлено, что через 24–48 ч после добавления 100 мМ или 1 мМ ионов аммония (или же глутамата) происходит гибель 100% или ≤ 50% клеток культур соответственно. Судя по размеру и плотности зоны роста ганглиев, четкости ядра, прозрачности цитоплазмы, неповрежденным отросткам, во всех случаях SK (20–2000 МЕ/мл, 10–7–10–5 M) или Pg (10–9–10–7 M) предохраняли клетки от деструкции. В культурах глиомы С6, судя по результатам витальной окраски, после добавления ионов аммония или глутамата в концентрации 10–25 мМ или 1– 50 мМ соответственно через 24 ч отмечена гибель клеток, предотвращаемая полностью или частично одновременным добавлением �� Pg�� или �� SK�� . Казеинолитическим методом показано, что уже через 20 мин при добавлении 0,1 МЕ/мл SK и концентрации ионов аммония 25–50 мМ уровень АТРактивируемого протеолиза в клетках глиомы С6 возрастал, а в присутствии 2000 МЕ/мл SK снижался при всех концентрациях ионов аммония (0,1– 50,0 мМ). В этих условиях μМCa2+- и мМCa2+-активируемый протеолиз стимулировался независимо от концентрации SK. При добавлении 0,1 МЕ/мл SK в широком диапазоне концентраций глутамата (10 мМ–0,1 нМ) уровень АТР-активируемого протеолиза существенно не менялся, а в присутствии 2000 МЕ/мл �� SK�� он снижался во всем диапазоне концентраций глутамата, тогда как μМCa2+- и мМCa2+-активируемый протеолиз также стимулировался не168 Сборник научных трудов зависимо от �� SK�� концентрации. Ионы аммония (1–50 мМ) вызвали увеличение активности каспазы 3 в клетках глиомы С6, зависящее от концентрации ионов (при концентрации 50 мМ активность энзима возрастала на 29%) и предотвращаемое одновременным добавлением Pg (5∙10–8 M). Pg (5∙10–8 M) усиливал образование клетками глиомы С6 интерлейкина-6. При повреждающем воздействии ионов аммония (0,1–50,0 мМ), вызвавшем падение уровня цитокина вследствие гибели клеток, стимулирующее действие �� Pg�� сохранялось. В отличие от этого глутамат (0,1–100,0 мМ) увеличивал продукцию клетками С6 интерлейкина, не вызывая дегенеративных изменений клеток глиомы С6, а Pg не стимулировал продукцию цитокина. Приведенные данные наглядно демонстрируют, что Pg и SK оказывают протективное действие на структуру и функционально-метаболические характеристики ряда клеток нервной ткани при повреждающем действии ионов аммония или глутамата. Изменение нервных стволов при хроническом панкреатите Никитин П.Н., Сетдикова Г.Р., Паклина О.В., Цыганов СЕ. Кафедра патологической анатомии МФ ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет ФА по 30 и CP РФ, Москва Главным механизмом развития боли при хроническом панкреатите (ХП) является панкреатическая невропатия, связанная с инфильтрацией иммунными клетками внутрипанкреатических нервов и раздражением болевых рецепторов в результате воспалительно-деструктивных изменений в строме поджелудочной железы (ПЖ). Цель исследования – выявление у больных изменения нервных стволов (НС) при ХП и определение взаимосвязи этих изменений с болевым синдром. Работа основана на операционном материале, полученном от 30 больных, находившихся на лечении в клинической больнице № 119 с 2005 по 2009 гг. по поводу ХП. Среди больных преобладали мужчины (24 человек), возраст больных колебался от 28 до 68 лет (средний возраст 48 лет). Женщины среди них составляли 6 человек, возраст которых колебался от 45–63 лет (средний возраст 49 лет). Контролем служили 7 образцов неизмененной ткани ПЖ (аутопсийный материал). Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, проводили импрегнацию серебром. Статистический анализ проводили при помощи программы �� STATISTICA�� 6.0. За уровень статистической значимости принимали р<0,05. 169 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки В результате проведенного исследования отмечено, что при ХП поражение НС наблюдали в виде периневральной инфильтрации зрелыми лимфоцитами, а также отека и набухания миелиновых волокон. На фоне нарастания выраженности фиброзных изменений и воспалительной инфильтрации прослеживалась тенденция к увеличению деструктивно-измененных нервов в диаметре (г=0,38, р=0,01). При этом доля занимаемой нервной ткани в ПЖ при ХП увеличивалась (0,29 %), по сравнению с контролем (0,10 %), что вероятнее всего связано со стимуляцией измененными НС нейробластов. Также нами установлено, что источником болевого синдрома при ХП могут быть нервы, расположенные в склерозированной парапанкреатической клетчатке. В этих нервах выявлены аналогичные дегенеративные изменения, а отдельные нервы были полностью разрушены. Таким образом, при хроническом панкреатите происходят деструктивные изменения как интрапанкреатических, так и парапанкреатических нервных стволов, которые, вероятнее всего, являются источником боли. Возникший периневрит, а в последующем стимуляция нейробластов, приводят к возникновению «порочного круга», который усугубляет выраженность болевого синдрома. Реактивные изменения кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии Новаковская С.А., Рубахов К.О., Говоров М.И., Арчакова Л.И. ГНУ «Институт физиологии НАН Беларуси», Минск Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) относится к заболеваниям миокарда, в основе которых лежит повреждение и гибель кардиомиоцитов. Основная роль в развитии ДКМП отводится процессам апоптоза, который рассматривается как мембранозависимый процесс программируемой клеточной гибели, вызывающий структурную перестройку сердца в результате необратимых изменений кардиомиоцитов. Ведущую роль при развитии апоптоза играют аутоиммунные и генетические нарушения, изменяющие экспрессию генов, механизмы синтеза цитоскелетных белков и пептидов в клетках миокарда (дистрофина, тайтина, ангиотензина). Разрушающее действие на внеклеточный коллагеновый матрикс миокарда оказывают провоспалительные цитокины – фактор некроза опухоли ФНО-α, интерлейкин-1α, интерлейкин-1β, интерлейкин-6, интерлейкин-8, которые содержатся в плазме крови больных с ДКМП. Целью работы явилось изучение особенностей ультраструктурной организации кардиомиоцитов при ДКМП, определение субмикроскопических основ 170 Сборник научных трудов данного заболевания прижизненно на биопсийном материале, полученном трансфеморальным доступом с помощью направляющего катетера из стенки правого желудочка. Работа выполнена электронно-микроскопическим методом на биоптатах миокарда больных с ДКМП. Срезы готовили на ультратоме �� LKB�� и просматривали в электронном микроскопе JEM – 100 CX. Электронно-микроскопические исследования указывают на различный характер деструктивных процессов, развивающихся в миокарде больных при ДКМП. Во многих кардиомиоцитах выражены дистрофические изменения – крупные плотные лизосомы, резкая вакуолизация саркоплазмы, деформация ядер с маргинальной агрегацией хроматина, уплотнение и последующая вакуолизация митохондрий с разрывами наружной мембраны. К неспецифическим, но характерным изменениям следует отнести резкое изменение формы ядер многих кардиомиоцитов, дезориентацию миофибрилл и их лизис. Происходит некроз кардиомиоцитов, сопровождающийся необратимой деструкцией и лизисом цитоплазматических органелл и саркоплазмы, нарушением целостности сарколеммы, лизисом ядра. Процесс сопровождается замещением распадающихся кардиомиоцитов разрастающейся соединительной тканью. Часть клеток миокарда переживает запрограммированную гибель – апоптоз, при котором наблюдаются характерные изменения ультраструктуры кардиомиоцита. В начальной фазе развития апоптоза отмечаются кардиомиоциты с выраженной складчатостью нуклеолеммы и маргинальной агрегацией глыбок гетерохроматина, образующих в ядре серповидные шапки с повышенной электронной плотностью. Одновременно выявляются клетки в развернутой фазе апоптотического процесса, о чем свидетельствуют инвагинация кариолеммы с образованием ядерных выступов, а также полная фрагментация кариоплазмы с образованием разобщенных фрагментов ядра. Формируются выпячивания клеточной цитоплазмы, в которых содержатся митохондрии и другие внутриклеточные органеллы с последующим их отторжением в окружающее интерстициальное пространство. На конечную фазу апоптоза кардиомиоцитов указывают конгломераты фрагментов клеточных структур в межклеточном пространстве – остаточных телец, имеющих сферическую или веретенообразную формы и содержащих мелкие фрагменты ядра и цитоплазмы. Апоптоз в миокарде протекает асинхронно, апоптозные клетки рассеяны диффузно и могут чередоваться с клетками, подвергшимися некротическому распаду. Электронно-микроскопические исследования эндомиокардиальных биоптатов больных с ДКМП указывают на необратимые дегенеративные измене- 171 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ния в кардиомиоцитах. Отмеченные особенности ультраструктурных изменений кардиомиоцитов при отсутствии в миокарде воспалительной реакции свидетельствуют о том, что элиминация части клеток при ДКМП осуществляется путем апоптоза. При ДКМП отмечается мозаичность поражения кардиомиоцитов. Наряду с клетками с сохраненной ультраструктурой в миокарде локализуются клетки с выраженными дистрофическими, некротическими и апоптозными изменениями. Сравнительная характеристика морфологического строения стенки аорты при расслаивающей аневризме и гипертонической болезни Новикова Е.Г., Титова Г.П., Галанкина И.Е. ГУЗМ «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского», Москва Термин «расслаивающая аневризма аорты» (РАА) был введен в клиническую практику в 1819 году. Под расслаивающей аневризмой аорты подразумевают дефект интимы аорты с последующим проникновением потока крови в средний слой. При этом образуется второй («ложный») просвет аорты, и в каждом из них существует кровоток. Сообщаются они друг с другом посредством фенестраций. Структурная основа этого процесса во многом остается неясной. В НИИ СП им. Н.В. Склифосовского за последние 5 лет концентрируются больные РАА для оперативного лечения. Проведено морфологическое (в том числе электронно-микроскопическое) исследование 105 наблюдений РАА. Преобладали мужчины (79%), средний возраст 57 лет, с выраженными признаками артериальной гипертензии (АГ) (масса сердца в 97% случаев превышала 500 г) и минимальными проявлениями атеросклероза. 5 человек в этой группе имели явные признаки синдрома Марфана, в некоторых наблюдениях обнаруживали те или иные проявления несовершенного десмогенеза. Группы сравнения составили 14 умерших от травмы мужчин в возрасте 45–55 лет с признаками АГ и выраженной гипертрофией миокарда (масса сердца 450–500 г), а также 17 пострадавших от тяжелой сочетанной травмы в возрасте 35–50 лет без соматической патологии. Исследовали стенку аорты в восходящей части, дуге и нисходящей части (до 10–12 объектов в каждом случае) с использованием специальных окрасок. Для электронно-микроскопического исследования использовался биопсийный (12 набл.) и аутопсийный (8 набл.) материал, забранный не позднее 10 часов после наступления смерти. 172 Сборник научных трудов Учитывая, что расслоение стенки аорты, как правило, происходит в наружном субадвентициальном отделе мышечного слоя, возникла необходимость детализации строения ее в норме. На аутопсийном материале 17 пострадавших от тяжелой сочетанной травмы выявлено, что регулярно расположенные извитые эластические мембраны наиболее сконцентрированы субинтимально и в средней части медии, с некоторым разрежением субадвентициально. Между ними и нежными коллагеновыми волокнами плотно «упакованы» гладкомышечные клетки (ГМК). Ближе к адвентиции в мышечном слое отмечается иное соотношение между эластикой и коллагеном – уплотнение коллагеновых волокон и преобладание их в структуре коллагеново-эластического каркаса, а также более рыхлое расположение эластических волокон за счет появления между ними мелких кровеносных сосудов. При АГ коллагеново-эластический каркас мышечного слоя, в основном, сохранен. Отмечается некоторое распрямление эластических мембран за счет потери извитости, реже – фрагментация. В отдельных ГМК появляется отек цитоплазмы и повреждение органелл, свидетельствующие о дистрофических изменениях, что более выражено в наружной трети медиального слоя. Значительно реже при АГ дистрофические изменения приводят к гибели ГМК и образованию микродефектов между эластическими мембранами с заполнением их мукоидным аморфным веществом. Тяжелые дистрофические изменения ГМК и образовавшиеся полости сопровождаются расширением пространства между эластическими мембранами. Деструкция эластических мембран и ГМК сопровождается перерастяжением аорты с увеличением ее периметра на 0,5–0,7 см. При этом увеличивается плотность коллагеновых волокон; они огрубляются, приобретают хаотичную направленность, что, по-видимому, способствует предотвращению разрыва аорты при ее перерастяжении. Все вышеперечисленные изменения выявляются преимущественно в восходящем отделе аорты. При РАА имеют место тяжелые нарушения коллагеново-эластического каркаса медии. Эластические мембраны истончены, разволокнены, отмечается сглаженность их на большем протяжении, а также их выраженная фрагментация. Электронно-микроскопически при РАА наблюдается уменьшение аморфного компонента эластических мембран при неизмененном или увеличенном микрофибриллярном. С микрофибриллярным компонентом связывают биомеханические свойства эластических структур. Увеличение эластических фибрилл ограничивает степень растяжимости эластического волокна, а соответственно и эластических мембран сосудистой стенки. Процесс разрушения эластического каркаса сопровождается уменьшением и разрежением коллагеновых волокон с нарушением соотношения между тонкими и толстыми коллагеновыми волокнами. Образующиеся дефекты между фрагментиро173 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ванными эластическими волокнами обширны и заполнены аморфным межуточным веществом, количество поврежденных ГМК значительно увеличено по сравнению с группой сравнения. Эти изменения приводят к нарушению эластичности аорты, снижению ее упругости, что при перерастяжении может привести к расслоению стенки. При РАА, в отличие от АГ в группе сравнения, изменения в стенке аорты наблюдаются во всех ее отделах. Таким образом, тяжелые повреждения коллагеново-эластического каркаса и гладкомышечных клеток стенки аорты при расслаивающей аневризме с максимальной их выраженностью у больных с синдромом Марфана, обусловленных их генетическим дефектом, усугубляются в течение жизни при присоединении артериальной гипертензии. При гипертензии повышается напряжение в медиальной оболочке аорты, в результате страдает и без того сложный механизм питания гладкомышечных клеток. Это приводит к нарушению синтеза коллагена и эластина. При врожденных аномалиях развития соединительной ткани эти нарушения приобретают прогрессирующий характер и являются структурной основой формирования расслоения стенки, т.е. формирования расслаивающей аневризмы аорты. Влияние пептидсодержащих биопрепаратов на ультраструктуру эпителия сосудистого сплетения желудочков мозга при острой ишемии Новикова Л.Н, Арчакова Л.И. ГНУ «Институт физиологии НАН Беларуси», Минск Сосудистое сплетение желудочков мозга является основным продуцентом цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), а также наиболее важной зоной гематоликворного барьера (ГЛБ). В литературе имеются немногочисленные данные, касающиеся влияния ишемии и реперфузии на структурно-функциональную организацию эпителия сплетения, обеспечивающего секрецию ЦСЖ, синтез ряда гормонов, нейротрофических факторов и факторов роста фибробластов и эндотелия. Раскрытие стадийности патофизиологического каскада и установление основных механизмов изменения функционального состояния и морфологии ткани мозга при ишемическом и реперфузионном повреждении позволило патогенетически обосновать необходимость использования нейропротекторов с целью метаболической защиты клеток мозга при данных повреждениях. Однако в литературе отсутствуют работы, посвященные изучению влияния пептидсодержащих биопрепаратов на морфофункциональную организацию сосудистого сплетения желудочков мозга при его ишемическом и реперфузионном повреждении. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение морфофункционального состояния эпителия сосудистого сплетения желу174 Сборник научных трудов дочков мозга на фоне применения актовегина и кортексина в реперфузионный период после острого ишемического повреждения сплетения методом трансмиссионной электронной микроскопии. Исследования проведены на кроликах-самцах породы шиншилла, массой 3,0–3,5 кг (п=48), выращенных в виварии при стандартных условиях. Острую ишемию вызывали путем наложения лигатур на обе общие сонные артерии. Организацию эпителия сплетения изучали после 30-ти мин и 3-х ч ишемии (I и II группы), через 72 ч после 30-ти мин и 3-х ч ишемии без лечения (III и IV группы) и на фоне применения препаратов в реперфузионный период (�� V�� и �� VI�� группы). Подготовка материала для исследований произведена по общепринятой методике, используемой в трансмиссионной электронной микроскопии. Острая ишемия вызывает ряд деструктивных изменений в ультраструктурной организации эпителия сплетения. Эпителиоциты характеризуются неоднородностью повреждения, в большинстве случаев определялись ишемические повреждения различной степени. Характерно увеличение количества темных эпителиоцитов, вопрос о функциональной роли которых остается спорным. Отмечается увеличение количества щелевидных контактов между эпителиальными клетками, что ведет к повышению проницаемости ГЛБ в сосудистом сплетении. Микроворсинки и реснички на апикальной поверхности эпителиоцитов имеют вид вакуолеподобных образований, количество их незначительно уменьшено. В цитоплазме большинства эпителиоцитов содержатся вакуоли различных размеров. Наиболее значительные структурные преобразования обнаружены в митохондриях, количество которых при остром ишемическом повреждении снижено. Большая их часть представлена округлыми и увеличенными в размерах органеллами с резко очерченными кристами. Встречаются темные митохондрии, лишенные крист, но имеющие двойную наружную мембрану, весь их объем заполнен электронно-плотными гранулами. Степень повреждения митохондрий варьировала не только в разных клетках, но и в пределах одной клетки. В ядрах эпителиоцитов отмечается перераспределение хроматина с образованием плотных осмиофильных глыбок разнообразной формы и размеров. Оболочки ядер образуют глубокие инвагинации, за счет чего ядра приобретает неправильную форму. Отмечается уменьшение размеров ядер эпителиоцитов, что свидетельствует об ослаблении их синтетической и секреторной функции. При ишемии и последующей реперфузии отмечается значительное снижение количества микроворсинок и ресничек на апикальной поверхности эпителиоцитов. Цитоплазма большинства эпителиоцитов обеднена органеллами, содержит вакуоли различных размеров и атипичные митохондрии в малом количестве. В ядрах эпителиоцитов отмечается выраженная гиперконденсация 175 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки хроматина, примыкающего к внутренней ядерной мембране, фрагментация ядер, что характерно для второй стадии апоптотического процесса. Установлено, что применение актовегина и кортексина в реперфузионный период приводит к снижению степени выраженности деструктивных изменений в эпителиоцитах сплетения, способствует сохранению структуры мембран их ядер и главных внутриклеточных органелл. Наблюдаются эпителиоциты как с измененными ядрами, так и с ядрами нормальной структуры. Отмечается увеличение количества микроворсинок и ресничек на апикальной поверхности эпителиоцитов, а также значительное снижение числа вакуолей в них, что свидетельствует о менее выраженных нарушениях секреции ЦСЖ эпителиоцитами сплетения. Митохондрии характеризуются меньшей степенью деструкции и присутствуют в цитоплазме в большем количестве, что подтверждает положительный эффект данных препаратов на уровень энергетических процессов в эпителиоцитах сплетения. Применение актовегина и кортексина оказывает ярко выраженный протекторный эффект на структуру ядер и митохондрий ишемизированных эпителиоцитов сосудистого сплетения желудочков мозга, что способствует поддержанию их в функционально активном состоянии. Морфологическая реакция эпителия и лимфоидных образований бронхов на хроническое воздействие радиации низкой интенсивности Оганесян М.В., Чава С.В., Кудряшова В.А., Ризаева Н.А. ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва Для современной космической медицины и радиобиологии актуальна оценка эффектов длительного воздействия ионизирующего излучения в диапазоне «малых доз». Медико-биологические последствия такого воздействия полностью неизвестны, что в значительной мере касается органов иммунной системы. Радиация относится к одной из причин приобретенного иммунодефицита, связанного с подавлением Т-системы, гуморального и неспецифического фагоцитарного звеньев иммунитета. Изучение реакции со стороны эпителия слизистой оболочки бронхов и ассоциированной с их стенками лимфоидной ткани (БАЛТ) позволяет выявить структурно-функциональные изменения органов иммунной системы и определить закономерности адаптивной реакции на радиационное воздействие. Цель исследования – изучение структурной организации эпителия и лимфоидных образований в стенках бронхов у мышей при хроническом воздействии радиации низкой интенсивности. 176 Сборник научных трудов Эксперименты проводились на 110 мышах-самцах линии F1 (CBA x C57BL6) массой 20–23 г, которые в течение 70 дней подвергались общему равномерному гамма-облучению до суммарной дозы 500 сГр. После окончания радиационного воздействия проводилась оценка адаптационных процессов в организме животных до 90 суток от начала восстановительного периода. Изучаемый материал бронхов и легких фиксировали в специальном растворе «иммунофикс». Для изучения микротопографии, строения эпителия и лимфоидных образований стенки бронхов срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали обзорными гистологическими и гистохимическими методами – гематоксилином и эозином, азуром-IIэозином, по Маллори и Гримелиусу. Лимфоидная ткань стенок главных и внутрилегочных бронхов у мышей представлена лимфоидными узелками, не имеющими центров размножения, предузелками и лимфоидными скоплениями в толще слизистой оболочки и подслизистой основы. Непосредственно под базальной мембраной находится тонкий непрерывный субэпителиальный слой клеток лимфоидного ряда. На ранних сроках восстановительного периода (14-е сутки) после хронического радиационного воздействия количество лимфоидных структур (внутриэпителиальных и субэпителиальных) в стенке главных и внутрилегочных бронхов возрастает, изменяется их клеточный состав: количество макрофагов, средних лимфоцитов, лимфобластов и плазмоцитов. На 30-е сутки – изменения клеточного состава лимфоидных структур более резкие: увеличение функциональной активности макрофагов, усиление пролиферации и дифференцировки клеток лимфоидного ряда. На 60-е, 90-е сутки заметно уменьшается число малых лимфоцитов и плазмоцитов, клеток с картинами митозов и молодых клеток лимфоидного ряда, в то время как количество разрушенных и погибающих клеток резко возрастает. Функционирование узелков и лимфоидных скоплений осуществляется в кооперации с эпителиальными клетками. Отмечается метаплазия мерцательного эпителия слизистой оболочки бронхов с уменьшением числа или утратой ресничек, замещение реснитчатого эпителия кубическим; активная секреция бокаловидных клеток, изменение соотношения между бокаловидными клетками и реснитчатыми клетками; лимфоплазмоцитарная инфильтрация подслизистой основы; утолщение базальной мембраны. Через 90 суток после прекращения радиационного воздействия не происходит полного восстановления клеточного состава местных иммунных образований БАЛТ. Лимфоидная ткань и эпителий стенок бронхов при радиационном воздействии характеризуется значительной адаптационной изменчивостью клеток – усиленной дифференцировкой, пролиферацией, интеграцией клеток в стенках бронхов под влиянием иммунных механизмов тканевой регуляции. 177 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Морфологические и некоторые иммунологические аспекты заболеваний щитовидной железы Оразалиева А.М., Плескановская С.А., Ламанова Дж. Б. Туркменский государственный медицинский институт, Ашхабад В настоящее время заболевания щитовидной железы занимают ведущее место в структуре всех эндокринопатий. Однако в формировании патологии щитовидной железы (ЩЖ) остается открытым вопрос о доли участия иммунной системы. Целью настоящего исследования являлось выявление степени корреляции между морфологическими изменениями в ткани щитовидной железы и иммунным ответом лимфоцитов периферической крови на растворимый тканевой антиген щитовидной железы (ТАГЩЖ) in vitro у больных с патологией щитовидной железы. Обследовано 40 больных с клиническим диагнозом «многоузловой зоб III степени» (МУЗ) и 120 практически здоровых лиц в возрасте 16–45 лет, у которых до и после хирургического удаления узлов щитовидной железы определяли индекс сенсибилизации лимфоцитов (ИСЛ) к ТАГЩЖ (Плесканов- ская С.А., 1982). Кусочки ЩЖ, удаленные во время операции, заливали в парафин и готовили срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Результаты исследования математически обработаны. Морфологическое исследование тканей ЩЖ от больных с клиническим диагнозом МУЗ выявило микро-макрофолликулярный зоб в 38,5% случаев, аденому – в 26,9%, тиреоидит Хашимото – в 19,2% случаев, злокачественные новообразования – в 15,4% случаев. Иммунологическое исследование показало, что ИСЛ у большинства больных является надежным критерием диагностики патологии ЩЖ. До операции он достоверно отличается от показателей в контрольной группе практически здоровых лиц и коррелирует с морфологическим диагнозом следующим образом: ИСЛ минимально повышен против уровня контроля у больных с микро-макрофолликулярным зобом (�� p�� <0,05), максимально – у больных с лимфосаркомой (�� p�� <0,001). У больных с тиреоидитом Хашимото ИСЛ достоверно снижен против уровня контроля (p<0,01). Через месяц после операции ИСЛ у больных с тиреоидитом Хашимото существено увеличивается, но не достигает уровня контроля, тогда как у больных с аденомой – он прогрессивно снижается. Таким образом, при патологии щитовидной железы с клиническим диагнозом «многоузловой зоб» морфологическое исследование дает полный расширенный диагноз. Иммуноморфологические параллели при данной патологии указывают на существенную роль иммунной системы в формировании морфологической характеристики тиреоидитов. 178 Сборник научных трудов Ультрамикроскопическое строение клеток стенки мелких бронхов при хроническом обструктивном заболевании легких Островский Н.Н., Дельцова Е.И., Кулинич-Миськив М.О. Ивано-Франковский национальный медицинский университет МЗ Украины, Ивано-Франковск Хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ) – одно из самых тяжелых заболеваний, занимает второе место в мире среди инфекционных заболеваний и четвертое место в структуре смертности, характеризуется стойкой тенденцией к повышению распространенности. Особенного внимания требуют исследования патогенетических механизмов ремоделяции бронхов, их морфологической перестройки в прогрессировании ХОЗЛ. Целью исследования было электронно-микроскопическое изучение состояния слизистой оболочки бронхов при ХОЗЛ. Забор тканей стенки бронха у 9 больных ХОЗЛ ІІ стадии, их электронномикроскопическое исследование проводили согласно общепринятым методам и изучали в электронном микроскопе ПЭМ-125К при ускоряющем напряжении 75 кВ с последующим фотографированием при увеличении от 2000 до 25000 раз. В биоптатах бронхов, полученных от больных хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ), выявлены значительные изменения компонентов слизистой оболочки – эпителия и собственной пластинки. Электронномикроскопический анализ показал, что в эпителиоцитах слизистой оболочки присутствуют альтеративные и дистрофические изменения. На срезах наблюдаются «светлые» и «темные» эпителиоциты. В цитоплазме клеток выявляли многочисленные цистерны гладкой эндоплазматической сети, большие осмиофильные включения, единичные фаголизосомы. На их апикальной, местами денудированной поверхности располагаются редкие реснички разной длины. Эти клетки связаны между собой с помощью простых межклеточных контактов, которые расширены. Эти изменения можно отнести к воспалительным, катарально-склеротическим. Незначительные бокаловидные клетки находились в разных фазах секреторного цикла. Базальные клетки сохраняли нормальное строение. В соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболочки бронха выявляются дистрофические и склеротические изменения с нарушением кровоснабжения. Склерозирующие изменения наиболее выражены в подэпителиальной зоне, где наблюдались толстые пучки коллагеновых волокон. В клеточном компоненте наблюдаются многочисленные макрофаги с большим количеством органелл, инвагинациями кариолеммы. Наличие в 179 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки макрофагах остаточных телец и вакуолей свидетельствует о развитии в них дистрофических процессов, с одной стороны, и преимущественно конечных этапов фагоцитоза – с другой. Фибробластический ряд был представлен фибробластами, фиброцитами и миофибробластами. В цитоплазме активных фибробластов выявлялось большое количество цистерн гранулярной эндоплазматической сети, свободных рибосом, вакуолей, мультивезикулярных телец, гипертрофированный комплекс Гольджи. Транс-локализация цистерн комплекса Гольджи характеризует его высокую активность и возможность секретировать продукты всей поверхностью клеток. Мы наблюдали также большее, чем у здоровых, количество фиброцитов в окружении многочисленных коллагеновых волокон, что свидетельствует о появлении старых клеток с пониженной секреторной активностью, но сохраняющих функции регуляции метаболизма и механической стабильности соединительной ткани. У значительного числа фибробластов в цитоплазме выявлялись тонкие микрофиламенты, которые локализовались беспорядочно, что дает основание отнести их к миофибробластам. Выявленные фибробласты/ миофибробласты имели ядро с многочисленными инвагинациями кариолеммы и необычные «депозиты» гранулярного материала в цитоплазме клеток (миофибриллы на поперечном срезе). Пучки микрофиламентов занимали более половины площади цитоплазмы и были идентичны элементам контрактильного аппарата гладких миоцитов стенки бронхов. В окружности клеток располагались коллагеновые волокна и тонкие нити протофибриллярного материала. Представленные клетки обладали признаками клеток фибробластического ряда, которые могут, согласно современным данным, играть ключевую роль в избыточной продукции коллагена и процессах фиброзирования стенки воздухоносных путей при ХОЗЛ. В подэпителиальном компартменте собственной пластинки слизистой оболочки бронха выявлялись также средние и большие лимфоциты (плазмоциты), которые имеют значение в ремоделировании стенки дыхательных путей в патогенезе ХОЗЛ (Saetta M. et al.,1998, Gizycki M.J., 2002). Плазмоциты содержали многочисленные цистерны гранулярной эндоплазматической сети, что указывает на высокую активность синтеза в них иммуноглобулинов. Одновременно мы выявили единичные фибробласты/фиброкласты, которые имели признаки фибробластов, т.е. продуцентов коллагена, и фиброкластов, которые резорбируют коллаген. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что при ХОЗЛ имеет место повреждение слизистой оболочки бронхов со значительным разрастанием соединительной ткани в ее собственной пластинке. Считается, что хроническое повреждение эпителия слизистой оболочки и его репаративная регенерация при этом происходят путем активации и постоянной 180 Сборник научных трудов секреции провоспалительных цитокинов, которые влияют на эпителий, и ростовых факторов, которые приводят к последующей хронизации и ремоделированию в подэпителиальных компартментах. Эти факторы могут в дальнейшем индуцировать повреждение подлежащей базальной мембраны путем активации как фибробластов/миофибробластов, так и более глубоко расположенных структур, включая гладкие мышцы бронхов, слизистые железы и стенки кровеносных сосудов. Влияние алиментарного дефицита магния на структуру эндотелия артериол миокарда крыс Паньшин Н.Г., Смирнов А.В. ГОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград Эндотелий играет огромную роль в поддержании структурной и функциональной целостности сосудистой стенки и является ответственным за ее антитромбогенный потенциал, регуляцию сосудистого тонуса, а также участвует в формировании воспалительного и иммунного ответа. Проведено множество исследований, подтверждающих тесную взаимосвязь между дисфункцией эндотелия и формированием атеросклеротического поражения сосудов. Дисфункция эндотелия сопровождается повышением уровня синтеза молекул адгезии, что приводит к адгезии лейкоцитов, росту концентрации провоспалительных цитокинов, высокой сосудистой проницаемости, усилению окисления ЛПНП, пролиферации и миграции гладкомышечных клеток, а также активации тромбоцитов. В связи с этим значительно вырос интерес к выявлению механизмов взаимосвязи между недостаточностью магния и развитием поражения сосудов миокарда. В экспериментах �� in�� vitro�� было показано, что внеклеточный магний задействован в регуляции активности эндотелия, в частности, способен влиять на синтез NO, захват и метаболизм ЛПНП, пролиферацию и экспрессию генов в клетках. Ferré S. с соавт. показали, что низкая концентрация магния в эндотелиальных клетках ускоряет процессы старения, что может быть фактором риска развития атеросклероза. Целью настоящего исследования является изучение влияния алиментарного дефицита магния на структуру эндотелия артерий миокарда крыс. Изучение функции эндотелия проводилось на 19 крысах-самцах массой 200– 250 г. Первая группа (�� n�� =11), являлась группой контроля и получала магнийсбалансированную диету (0,5 г элементарного магния на кг диеты). Остальные 8 крыс содержались на диете, которая состояла из 20,0% казеина, 70,0% крахмала, 0,3% DL-метионина, 0,2% холина битартрата, 5% кукурузного масла, 1% поливитаминной смеси. 3,5% диеты составляла полимине181 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ральная смесь, аналогичная полиминеральной смеси AIN-76 (�� MP�� Biomedical), не содержащая магния. Весь рацион готовился на деионизированной воде, эту же воду в ходе эксперимента использовали в качестве питьевой воды для животных, находящихся на диете. Скорость и глубину развития гипомагнезиемии контролировали, определяя содержание магния в плазме и эритроцитах животных спектрофотометрическим методом по цветной реакции с титановым желтым. После этого для проведения электронно-микроскопического исследования животных забивали под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Фиксацию кусочков миокарда размером 1 мм3 производили в течение 12 ч в 4%-м растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1%-м растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (�� pH�� =7,4) при температуре +4 °С. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50–90 нм получали на ультрамикротоме LKB-8800 и монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5%-м растворе уранилацетата на 50°-м этаноле в течение 40 минут и 0,3%-м растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучали в электронном микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование проводили с использованием фотопластинок «Для ядерных исследований». Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической чернобелой бумаге «Унибром 160 БП». При электронно-микроскопическом исследовании эндотелия артериол миокарда обнаружено истончение цитоплазмы эндотелиоцитов, наибольшая толщина отмечалась в области ядра. В цитоплазме наблюдали множество пиноцитозных везикул, а также просветление матрикса за счет отека. Ядра эндотелиоцитов имели неровные контуры, глубокие инвагинации ядерной оболочки. Гетерохроматин распределялся по периферии ядра, а также в виде островков. Гладкомышечные клетки мелких артериол меняли свое расположение на радиальное. Их форма становилась неправильной. Форма ядра приближалась к округлой, отмечалось увеличение количества нуклеоплазмы. В цитоплазме наблюдалось просветление перинуклеарных областей за счет внутриклеточного отека. В отдельных клетках происходило увеличение количества митохондрий при уменьшении количества актиновых микрофиламентов и их смещении к периферии клетки. Осмиофильные тельца располагались под плазмолеммой. 182 Сборник научных трудов Таким образом, при моделировании алиментарного дефицита магния выявлены ультраструктурные изменения в эндотелии и гладких миоцитах артериол миокарда, которые свидетельствует о возникновении функциональных расстройств. Обнаруженные морфологические признаки, характерные для длительной вазоконстрикции, возможно, способствуют повреждению эндотелия и ишемии миокарда. Секреторный цикл и гибель нейроцитов крупноклеточных ядер гипоталамуса при нарушении кровообращения Папков В.Г., Баранова Т.Ю., Громова Т.М., Услонцев Д.Н. ГОУ ВПО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Рязань Особенностью жизненного цикла нейроцитов является их пребывание в периоде G1 в течение всей жизни. Вступления клеток в следующий S-период не происходит, поскольку в процессе филогенеза сформировалось особое свойство нейроцитов, а именно отсутствие обновления этой клеточной популяции. Клетки, находящиеся в G1-периоде, характеризуются более высокой устойчивостью к воздействию различных патогенных воздействий в отличие от клеток, находящихся в S-периоде. Структурной особенностью супраоптических (СОЯ) и паравентрикулярных (ПВЯ) ядер является их обильная васкуляризация, уровень которой превосходит степень васкуляризации всех других отделов головного мозга. По степени васкуляризации данные ядра можно сравнить с почечными клубочками. Изучая процесс нейросекреции у экспериментальных животных, А.Л. Поленов (1968) на основании морфологических признаков выделил следующие стадии (фазы): 1-я фаза – покой и начало синтеза, 2-я фаза – накопление, 3-я фаза – выведение и 4-я фаза – опустошение. Наряду с этими фазами А.Л. Поленов выделил состояние депонирования нейросекрета. Целью настоящего исследования явилось выяснение условий, ведущих к гибели данных клеток, а также выяснение реакции нейроцитов крупноклеточных ядер гипоталамуса человека при различных видах нарушения кровообращения. Для оценки состояния нейроцитов использовалось определение процентного соотношения клеток, находящихся в различных фазах нейросекреторного процесса. Исследованы супраоптические и паравентрикулярные ядра гипоталамуса 158 человек средней возрастной группы. Смерть людей наступила от различных заболеваний, протекающих с хронической сердечной недостаточно- 183 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки стью (атеросклеротический кардиосклероз, ревматический порок сердца) и с острой сердечной недостаточностью (инфаркт миокарда, острая коронарная недостаточность), а также от механической асфиксии (повешение и утопление). Контрольную группу наблюдений составили 9 человек, погибших вследствие обширных травм с повреждением магистральных сосудов. Гипоталамус фиксировали в жидкости Буэна, после чего проводилась заливка в целлоидин-парафин. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ставилась ШИК-реакция с докраской тионином, проводили выявление нейросекрета по Майоровой. Для вычисления процентного соотношения нейроцитов, находящихся в различных фазах нейросекреторного цикла, изучено состояние 100 клеток в каждом ядре. Состояние депонирования нейросекрета условно обозначено в качестве 5-й фазы. Результаты подсчета обработаны статистически. Результаты исследования показали следующее соотношение нейроцитов, находящихся в различных фазах нейросекреторного цикла. В контрольной группе наблюдений это соотношение составило соответственно: 1-я фа- за – 13,4±1,39%; 2-я фаза – 28±1,83%; 3-я фаза – 28,0±1,83%; 4-я фаза – 29,2±1,85%; 5-я фаза – 1,4±0,48%. При заболеваниях, протекающих с хронической сердечной недостаточностью, происходит достоверное возрастание количества нейроцитов с признаками фазы опустошения (4-я) и фазы депонирования (5-я). Тяжелых дистрофических изменений и гибели нейроцитов с развитием нейронофагии в данных наблюдениях не обнаружено. Заболевания, протекающие с острой сердечной недостаточностью, характеризуются аналогичным состоянием нейроцитов. При механической асфиксии большое количество нейроцитов (до 19%) находится в состоянии баллонной дистрофии, относящейся к необратимым процессам и ведущей к гибели клетки. В то же время в других отделах головного мозга вакуольная дистрофия возникает лишь в единичных клетках. Количество нейроцитов СОЯ, имеющих признаки первых трех фаз, снижено, а число клеток, находящихся в 4-й и 5-й фазах, – значительно повышено. В ПВЯ снижено количество клеток с признаками 1-й и 2-й фаз, увеличена численность клеток, имеющих признаки 3-й, 4-й и 5-й фаз. Проведенное исследование показывает, что в условиях постепенно развивающейся сердечной недостаточности нейроциты СОЯ и ПВЯ сохраняются и их функционирование продолжается, хотя характер течения нейросекреторного процесса меняется. При механической асфиксии, протекающей с острым, резко выраженным, прекращением газообмена, в значительной части нейроцитов возникают обширные необратимые некробиотические изменения. 184 Сборник научных трудов Таким образом, в условиях глубокого, внезапного нарушения газообмена наиболее тяжелое поражение нейроцитов происходит в СОЯ и ПВЯ гипоталамуса, имеющих наиболее высокие уровни васкуляризации и метаболизма. Полученные результаты исследования соответствуют данным М.О. Самойлова (1985) о том, что в условиях нарушения кровоснабжения преимущественно поражаются те нейроны, которые имеют обильную васкуляризацию. Реактивные изменения нейронов вентро-базального комплекса таламуса в условиях деафферентации Пашина Н.Р. ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, Москва Работа проведена на животных (кошках), перенесших операцию по перерезке половины покрышки среднего мозга. Эта модель позволяет изучать механизмы восстановления афферентного паралича на поведенческом, электрофизиологическом, светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях. Вентро-базальный ядерный комплекс таламуса – главный подкорковый соматосенсорный центр, где происходит переключение сенсорной информации, идущей в кору. Поскольку на поведенческом уровне была прослежена динамика восстановления двигательных нарушений у животных после операции, данное морфологическое исследование преследовало цель получить структурные корреляты этим компенсациям на уровне вентро-постеро-латерального ядра (ВПЛ) таламуса. Электронно-микроскопически были изучены оба ядра до и после операции на сроках 5 дней, 1 месяц, 3 месяца и 1 год после операции (это сроки «кризисных» временных параметров, выявленных на поведенческом уровне). Первая неделя – самая тяжелая, животные не способны управлять деафферентированной конечностью, она пассивна и загнута вовнутрь, после первого месяца утраченный рефлекс – удар лапой по мишени, начинает восстанавливаться, а в конце 3-го у 90% животных регистрируется 100% ответная реакция на стимул. На стороне операции в нейронах ВПЛ выявлялись реактивные изменения в двух направлениях: по «светлому и «темному» типу. Одни нейроны демонстрировали явления хроматолиза с изменением и набуханием митохондрий, каналов ЭПС, аппарата Гольджи, лизосом, появлением светлых участков цитоплазмы без полисом, вакуолизацией; другие – темную деструкцию, когда в резко осмиофильном матриксе не выявлялись отдельные органеллы. Осо185 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки бенно ярко деструктивные изменения проявлялись в аксонных окончаниях перерезанных нервных волокон. Глиальный индекс был резко увеличен. Интересно, что структурные изменения затронули и нейронный пул ВПЛ на интактной стороне, хотя и в значительно меньшей степени. Через 3 месяца и 1 год после операции состояние нейронов ВПЛ как на стороне операции, так и на противоположной было близко к норме. Были выявлены многочисленные синаптические гломерулы, когда на одном центральном дендрите оканчивались несколько аксонных терминалей с разным количеством синаптических пузырьков, т.е. с разной степенью функциональной активности. Таким образом, проведенное исследование показало устойчивость нервного центра в целом в условиях деафферентации. После операции происходит реорганизация синаптических связей между травмированными и нетравмированными нейронами ВПЛ, что обеспечивает его функциональную активность и восстановление двигательных реакций у животного. Анализ вызванных ответов в гиппокампе при аппликации субстанций, изменяющих функциональное состояние межклеточного матрикса Пашкевич С.Г., Денисов А.А., Кульчицкий В.А. ГНУ «Институт физиологии НАН Беларуси», Минск Основу внеклеточного матрикса мозга составляют гликозаминогликаны, гликопротеины и протеогликаны, которые являются мишенями для многих лекарственных препаратов. Исходя из этого даже априорно можно заключить, что ряд побочных эффектов этих препаратов, особенно тех, которые связаны с нейротропными проявлениями, обусловлен изменением структурного и/или функционального состояния экстрацеллюлярного матрикса мозга. Это предположение верифицируется в разнообразных экспериментальных моделях и получает подтверждение (Кульчицкий с соавт., 2003, 2005, 2008, 2009). Пространственно-функциональные сдвиги во внеклеточном матриксе мозга сопровождаются изменением условий межнейронных коммуникаций, что отражается на эффективности передачи сигналов. В представленном тексте сообщения изложены результаты исследования, целью которого был анализ особенностей формирования постсинаптических потенциалов и популяционных спайков в СА1 области гиппокампа при модификации структурнофункционального состояния межклеточного матрикса. Опыты проведены на срезах толщиной 400 мкм 4-х недельных крысят (n=29), которые инкубировали в течение 30 мин при 20°С в растворе искусственной цереброспинальной жидкости (ИЦСЖ), которую насыщали карбогеном (95% кислорода и 5% углекислого газа). Перфузию ИЦСЖ, содержа186 Сборник научных трудов щей гиалуронидазу («Белмедпрепараты», Беларусь) или хондроитинсульфат («Белмедпрепараты», Беларусь), осуществляли со скоростью 4 мл/мин при 28,9 °C. Параметры стимуляции (12–20 мкА) подбирали на основании формирования популяционных спайков (ПС) в stratum pyramidale СА1 и возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) в stratum radiatum гиппокампа после предварительной перерезки коллатералей Шаффера вблизи СА3. При перфузии срезов мозга ИЦСЖ, содержащей низкие концентрации хондроитинсульфата (0,001%, 0,0001%), зафиксировано падение амплитуды вызванных ответов в СА1 области гиппокампа, а при концентрации 0,1–0,01% отмечен прирост амплитуды ПС при ослаблении ВПСП (рисунок). В данном случае одной из причин своеобразных input-output взаимоотношений в СА1 области гиппокампа может выступать предварительная перфузия среза раствором гиалуронидазы (не отмечено на рисунке). Это предположение подтверждается результатами других опытов, когда после перфузии 0,01% раствором хондроитинсульфата происходит увеличение амплитуды ПС без сдвига паттерна ВПСП. Амплитуда возбуждающих постсинаптических потенциалов (черные квадраты) и популяционных спайков (белые квадраты) при перфузии с 40 по 60 мин срезов гиппокампа раствором 0,01% хондроитинсульфата в искусственной цереброспинальной жидкости. Рисунок выполнен в программе «NFS view». На протяжении 20-мин перфузии гиалуронидазы в концентрациях от 1,0 до 10,0 Ед/мл не отмечено сдвигов паттерна ПС и ВПСП. Однако после прекращения перфузии наблюдалось плавное снижение амплитуды ПС на протяжении до 20–40 мин. Как уже отмечено выше, добавление в ИЦСЖ 0,01–0,1% раствора хондроитинсульфатом вело к возрастанию амплитуды ПС при одновременном снижении амплитуды ВПСП. После прекращения перфузии хондроитинсульфатом происходило воссоздание исходных параметров вызванных ответов. При этом вначале восстанавливалась амплитуда ВПСП, 187 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки а затем – ПС. Таким образом, субстанции, способные изменять функциональное состояние внеклеточного матрикса мозга, нарушают input-output взаимоотношения в СА1 области гиппокампа, что на уровне целостного организма может отразиться на процессах запоминания и обучения. Проведен ультраструктурный анализ срезов гиппокампа с помощью электронного микроскопа JEM-100 B (Япония) после аппликации гиалуронидазы (0,1 Ед/мл) или хондроитинсульфата (0,1%). Срезы фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере. Через 10 мин после аппликации гиалуронидазы установлено рассредоточение клеточных элементов нейропиля и появление прозрачных синаптических везикул. После добавления хондроитинсульфата выявлено уменьшение ширины синаптической щели в зоне аксо-дендритных контактов на 15–20% и увеличение числа синаптических везикул на 40–50% в активной зоне синапса вблизи пресинаптической мембраны. Протяженность пре- и постсинаптических мембран возрастала, что отражало увеличение функциональной активности синаптических комплексов. Таким образом, установлены закономерные ультраструктурные сдвиги в гиппокампе после аппликации гиалуронидазы и хондроитинсульфата, способных изменять картину вызванных ответов в гиппокампе. Следовательно, перспективно целенаправленно изучить отклики элементов внеклеточного матрикса мозга на действие субстанций и лекарственных препаратов, точкой приложения которых будут не только классические мишени в мозге, но и экстрацеллюлярный матрикс, что расширит возможности патогенетической терапии ряда заболеваний нервной системы. Морфометрическое исследование Th1 и Th2 клеток в сосудистой стенке при атерогенезе у человека Пигаревский П.В., Мальцева С.В., Восканьянц А.Н., Селиверстова В.Г., Снегова В.А. Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург Модифицированные липопротеины низкой плотности (мЛПНП) играют ключевую роль в атерогенезе, способствуя образованию пенистых клеток и вызывая развитие иммунного воспаления в стенке артерий. В ответ на образующиеся мЛПНП в интиме артерий накапливаются макрофаги и Т-лимфоциты. Т-лимфоциты, инфильтрирующие атеросклеротические поражения, представлены, в основном, CD4+ клетками, которые способны ухудшать течение атеросклероза. Однако, согласно последним данным, Т-хелперные лимфоциты не являются однородной популяцией и разделяются на две субпопуляции: 188 Сборник научных трудов Th1 и Th2 клетки. Предполагается, что они выполняют противоположные функции в стенке артерий и, прежде всего, в отношении мЛПНП. Установлено, что нарушение Th1/Th2 баланса в пользу Th1 клеток может приводить к развитию клеточных аутоиммунных процессов. Целью настоящей работы явилось количественное исследование Т-лимфоцитов и их главных иммунорегуляторных субпопуляций: Th1 и Th2 клеток, а также В-лимфоцитов и макрофагов в стенке аорты в динамике атеросклероза у человека. Объектом исследования стал аутопсийный материал (25 случаев), полученный от мужчин (средний возраст 60±8 лет), умерших в результате острой сердечно-сосудистой недостаточности атеросклеротической этиологии. Иммуноморфологическому и микроскопическому исследованию в каждом случае были подвергнуты неизмененные участки аорты и различные типы атеросклеротических поражений. Иммуноморфологическое исследование проводили высокочувствительным двухступенчатым стрептавидин-биотиновым методом. С помощью моноклональных антител выявляли: INF-γ (Th1)- и IL-4 (Th2)- позитивные клетки, а также CD3, CD20-лимфоциты и CD68-клетки. При морфометрическом исследовании в пределах интимы каждого сосуда исследовали 10 полей зрения, в которых определяли абсолютное количество иммуногистохимически положительных клеток. Значимость различий между изучаемыми выборками выявляли с помощью t-критерия Стьюдента. Анализ содержания в интиме аорты человека INF-γ позитивных мононуклеаров показал, что уже на начальной стадии атерогенеза (липидные пятна) их численность возрастает в 7 раз (Р<0,05) по сравнению с нормальными участками сосуда. Столь же высокое содержание этих клеток характерно для липидно-фиброзных бляшек. В выраженных фиброзных бляшках с мощной соединительнотканной покрышкой наблюдается снижение численности таких мононуклеаров до нормального уровня. Сходная закономерность отмечается и в отношении звездчатых клеток. Исследование показало, что по мере прогрессирования атеросклероза в зоне поражений резко увеличивается численность звездчатых клеток, экспрессирующих INF-γ. Вероятно, в зависимости от типа антигена звездчатые клетки способны направлять дифференцировку исходных Т-хелперов в сторону Th1 или Th2 лимфоцитов. При изучении распределения �� IL�� -4 выявлена противоположная закономерность. По мере прогрессирования заболевания численность мононуклеаров, экспрессирующих в своей цитоплазме IL-4, снижается и в липиднофиброзных и фиброзных бляшках падает более, чем в 2 раза (Р<0,05) по сравнению с нормальными участками сосуда. Аналогичный процесс наблюдается и в звездчатых клетках. 189 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Морфометрическое исследование макрофагов показало, что в липидных пятнах их количество возрастает в 2,7 раза (Р<0,05), а в липидно-фиброзных бляшках – в 2,4 раза (Р<0,05) по сравнению с нормальными участками сосуда. Большая часть этих макрофагов в дальнейшем трансформируется в пенистые клетки, которые составляют основу истинной атеросклеротической бляшки, а меньшая часть, несущая МНС белки класса �� I�� (так же, как и звездчатые клетки), участвует в презентации антигенов и активирует �� CD�� 4+ клетки, являющиеся промоторами Th1 и Th2 иммунного ответа. Таким образом, впервые удалось показать, что в атеросклеротических поражениях, начиная с самых ранних стадий, превалируют Th1 лимфоциты и звездчатые клетки, экспрессирующие мощный провоспалительный цитокин INF-γ. Численность популяции �� Th�� 2 клеток на всех стадиях атерогенеза, напротив, оказывается сниженной, а продукция противовоспалительного цитокина �� IL�� -4 – подавленной. Подобное изменение баланса между про- и антивоспалительными клетками может способствовать развитию Th1- иммунного ответа на откладывающиеся в сосудистой стенке мЛПНП. Патогистологический анализ изменений щитовидной железы у крупного рогатого скота Пилов А.Х., Урусбамбетов А.Х., Соттаев М.Х. Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова, Кабардино-Балкарская государственная сельскохозяйственная академия им В.М. Кокова, Нальчик В современных условиях мультифакториального техногенного загрязнения наблюдается неуклонный рост показателей патологии щитовидной железы. Изменение структуры тиреоидной патологии является, очевидно, экологически и социально обусловленным. В этой связи возрастает значимость объективизации микроскопического исследования щитовидной железы (ЩЖ) при дифференциальной диагностике патологического процесса. Зобная трансформация ЩЖ, как правило, связана с пролиферативными изменениями в системе тиреона, что сопровождается нарушением нормальных гемо-тканевых отношений, обеспечивающих оптимальную трофику, дифференцировку и функциональную состоятельность паренхиматозных и стромальных структур. Объектами изучения были ЩЖ крупного рогатого скота (взрослые особи). Было приготовлено 100 гистосрезов ЩЖ и изучено 50 препаратов ЩЖ крупного рогатого скота (КРС). Простым и достаточно объективным показателем активности органа является индекс Брауна, который представляет со190 Сборник научных трудов бой отношение диаметра фолликулов к высоте тиреоидного эпителия. При этом следует отметить особенность индекса, – чем больше его числовое выражение, тем ниже активность железы. Индекс Брауна у крупного рогатого скота составил 50,2. Диаметр фолликулов ее – 244,9±14,1; высота тиреоцитов в микрометрах – 4,86±1,1. Нормальную структуру железы установили в 20,5% срезов, гипофункцию – в 46,5% и тенденцию к снижению активности – в 33%. На фоне гипофункции ЩЖ в них обнаруживаются разные патологические процессы, в том числе доброкачественные опухоли (аденомы). Макроскопически аденомы представляют собой одиночный (солитарный), хорошо инкапсулированный узел. Соединительнотканная капсула узла хорошо выражена. Капсула отделяет узел от окружающей ткани железы, которая не поражена патологическим процессом. Аденомы округлой или овальной формы, мягкоэластической консистенции, разной величины. На разрезе ткань узла светло-коричневого цвета, однородного вида. При наличии вторичных изменений в узле определяются беловатые плотные очажки или ложные кисты с желтоватой прозрачной жидкостью. По гистологической структуре в нашем материале выделены следующие виды аденом: эмбриональная (трабекулярная) аденома, микрофолликулярная аденома, онкоцитарная (аденома из β-клеток), папиллярная аденома и смешанная аденома. Эмбриональная (трабекулярная) аденома образована трабекулярными структурами, которые состоят из мелких темных клеток. Среди трабекул встречаются солидные структуры и единичные мелкие фолликулы без просвета. Трабекулы разделены тонкими прослойками соединительной ткани. Строма трабекулярных аденом скудная. В некоторых аденомах отмечается отек стромы и очаги гиалиноза. Микрофолликулярная аденома встречается реже, она состоит из мелких примитивных фолликулов. Среди фолликулов могут встречаться солидные или тубулярные структуры. Фолликулы выстланы низким призматическим или кубическим эпителием. В центральной части аденомы фолликулы расположены рассеянно, а по периферии – компактно. По своему строению аденома мономорфная, резко отличается от окружающей ткани железы. Возможно наличие очагов гиалиноза и отека в центральной части узла. Онкоцитарная аденома состоит из крупных светлых клеток с эозинофильной зернистой цитоплазмой (β-клетки, клетки Ашкинази). Клетки образуют трабекулярные, солидные и папиллярные структуры. Среди описанных β-клеток встречается небольшое количество мелких кубических клеток. В β-клетках ядра круглой формы, расположены центрально. Папиллярная аденома характеризуется образованием папиллярных структур внутри фолликулов. Папиллярные структуры возникают в результате пролиферации фолликулярного эпителия. Строма папиллярной аденомы слабо развита. В участках пролиферации эпителия ядра гиперхромные с умеренным полиморфизмом, фолликулярными, солидными и папиллярными структурами. 191 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки При всех видах аденом возможно развитие вторичных изменений узла: склероз, гиалиноз, участки петрификации, кровоизлияния, некроз и кистообразование. Механизм образования кист в аденомах такой же, как и в узловых зобах. Кистозные полости в аденомах заполнены бурыми массами или желтоватой прозрачной жидкостью. Таким образом, для аденом характерны следующие макро- и микроскопические признаки: – аденома представляет собой, как правило, солитарный узел; – мономорфность строения; – четко выраженная капсула на всем протяжении опухоли; – различие в гистологическом строении аденомы и окружающей тиреоидной ткани; – атрофия окружающей тиреоидной ткани вследствие сдавления опу- холью. Структурные изменения в ЩЖ КРС, на наш взгляд, следует рассматривать, как предзобные состояния, оказывающие влияние на весь организм, как единое целое. В условиях Кабардино-Балкарии при дефиците йода в биосфере у крупного рогатого скота нарушается функция ЩЖ, и на этом фоне развиваются патологоморфологические изменения, одним из которых являются доброкачественные опухоли (аденомы) ЩЖ. Сравнительная характеристика и условия выделения мезенхимальных стромальных клеток из различных источников Повещенко О.В., Повещенко А.Ф., Ким И.И., Янкайте Е.В., Ульянов Е.В., Любарский М.С., Овсянникова Т.В., Чекалина М.В., Коненков В.И. НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск Мезенхимальные мультипотентные стромальные клетки (МСК) представляют большой интерес из-за их способности содействовать репарации органов и тканей и возможности получения в короткий срок достаточного количества клеточного материала за счет экспансии клеток �� in�� vitro�� . МСК способны дифференцироваться не только в пределах мезодермальной линии в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлении, но и преодолевать линиеспецифичность и дифференцироваться в клетки тканей экто- и эндо- 192 Сборник научных трудов дермального происхождения, что определяет высокую пластичность этих клеток. Репаративный потенциал МСК обусловлен и паракринным действием путем секреции биологически активных молекул-цитокинов, хемокинов, ростовых факторов. Важной биологической особенностью МСК является и иммуномодулирующая активность, что позволяет использовать МСК с целью восстановления кроветворения и профилактики РТПХ при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам с гемобластозами. МСК впервые выделены из костного мозга как минорная популяция. Но инвазивность процедуры забора костного мозга и снижение количества клеток с возрастом и при заболеваниях диктуют поиск альтернативных источников. Цель работы – на основе анализа способов выделения и морфофункциональных свойств фибробластоподобных клеток, полученных из липоаспирата, периферической крови и эндометрия, произвести сравнительную характеристику мезенхимальных стромальных клеток различного тканевого происхождения. Несмотря на разницу в количестве клоногенных прекурсоров, все исследуемые клетки способны к интенсивному делению и экспансии in vitro. Количество выделенных МСК из 1 мл жировой ткани одинаково в норме и при лимфедеме, динамика роста клеток, выделенных из жира при вторичной лимфедеме, несколько превышает динамику роста клеток нормальной жировой ткани. МСК периферической крови обладают низкой адгезивной способностью (30%), но высокой пролиферативной активностью. МСК, выделенные из эндометрия неферментативным способом, имеют максимальную из всех анализируемых источников адгезивную и пролиферативную активность. МСК, выделенные из липоаспирата здоровых доноров, больных лимфедемой, периферической крови и эндометрия имеют фибробластоподобную морфологию, экспрессируют специфичные маркеры CD90, CD106 на высоком уровне, гемопоэтические маркеры CD34, CD45, CD3, CD19, CD14, HLA-DR в минимальном количестве. Фенотипическая гетерогенность популяции, как правило, наблюдается на начальных пассажах. Таким образом, получены новые данные о морфо-функциональных свойствах МСК в зависимости от локализации в различных тканях. Результаты сравнительных исследований имеют, несомненно, практическую ценность для оптимизации технологий трансплантации. 193 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Реактивные изменения кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс при развитии экспериментального аутоиммунного миокардита Погодина Л.С., Земцова Л.В., Гаврилова С.А., Морозова М.П., Ченцов Ю.С. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Разработка методов диагностики и терапии сердечно-сосудистых заболеваний невозможна без сведений об изменении структуры кардиомиоцитов (КМЦ), о путях их повреждения и гибели на разных этапах патогенеза. Мало изученным в этом отношении остается аутоиммунный миокардит – одно из наиболее распространенных и трудно диагностируемых аутоиммунных заболеваний, которое может быть вызвано различными инфекционными и неинфекционными агентами и приводит к развитию сердечной недостаточности и даже гибели больного. Для создания экспериментальной модели аутоиммунного миокардита животным вводят сердечный миозин в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ); последний используется для усиления иммунного ответа. Изменения миокарда описаны, как правило, на поздних стадиях, когда в сердце наблюдается значительный воспалительный процесс. Ранее нами было изучено развитие изменений в миокарде и КМЦ левого желудочка крыс, начиная с 2 сут после их иммунизации сердечным миозином в смеси с ПАФ (Морозова и др., 2008; Pogodina E.A., 2008). Однако ПАФ сам по себе вызывал выраженную воспалительную реакцию в миокарде (видимо, из-за присутствия в его составе убитых микобактерий), что затрудняло интерпретацию результатов. В связи с этим цель данной работы – исследование изменений структуры КМЦ левого желудочка крыс при развитии аутоиммунного миокардита, индуцированного сердечным миозином крысы в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ), отличающимся от ПАФ отсутствием микобактерий. Беспородным крысам-самцам (225±25 г) однократно подкожно в четыре точки спины инъецировали очищенный сердечный миозин крысы (800 мкг/кг) с НАФ (1:1). Другой группе крыс аналогичным образом вводили НАФ с физиологическим раствором (1:1). Третью группу составляли интактные животные (контроль). На 4, 14 и 21-е сут после иммунизации крыс наркотизировали хлоралгидратом, вырезали кусочки миокарда левого желудочка, которые фиксировали для световой и электронной микроскопии. На парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, с помощью компьютерной программы «�� Image�� Scope�� » определяли площадь поперечного сечения кардиомиоцитов в их ядросодержащей части. Для статистической обработки ис- 194 Сборник научных трудов пользовали программу «Statistica» с учетом непараметрического критерия Манна-Уитни. Светооптический анализ показал, что в миокарде крыс, инъецированных миозином с НАФ, наблюдается воспаление уже на 4-е сут, которое усиливается на 14-е сут и наиболее выражено на 21-е сут. Воспаление носит диффузноочаговый характер и проявляется инфильтрацией лимфоцитами, макрофагами, увеличением числа тучных клеток, расширением кровеносных сосудов, отеком интерстиция. В КМЦ таких очагов нарушена исчерченность, характерны сегментарные контрактуры, изменение формы ядра и степени конденсации хроматина. У крыс, инъецированных одним НАФ, начиная с 14 сут и в большей степени к концу опыта, в миокарде наблюдаются сходные изменения, но менее выраженные. По данным морфометрического анализа, средняя площадь поперечного сечения КМЦ крыс, инъецированных миозином с НАФ, достоверно увеличена по сравнению с интактным контролем на всех сроках опыта, но особенно на 21-е сут (на 29%). У животных, инъецированных одним НАФ, этот показатель тоже возрастает, но с 14-х сут и менее значительно (к 21-м сут – на 15%). Электронно-микроскопический анализ показал, что у животных, инъецированных миозином с НАФ, на всех сроках опыта выделяется два основных типа КМЦ в очагах воспаления. Одни КМЦ – с инвагинированным ядром, увеличенной конденсацией хроматина, контрактурами миофибрилл, вплоть до образования широких поперечных гомогенных полос, с просветленными, иногда разрушающимися митохондриями; характерны выступы сарколеммы в виде «почек» и «фестонов», заполненных митохондриями. Другой тип КМЦ характеризуется просветленной цитоплазмой, ядрами нормальной структуры или просветленными с диффузным хроматином, миофибриллами с участками разволокнения и лизиса, отсутствием «почек» и «фестонов». Митохондрии этих клеток в основном нормальной структуры, но располагаются довольно разрозненно, каналы саркоплазматического ретикулума расширены. В КМЦ и того, и другого типов иногда присутствуют аутофагические вакуоли и аутофаголизосомы, также встречаются разъединенные вставочные диски. Изредка наблюдаются КМЦ, сочетающие черты обоих типов. На 4-е сут после иммунизации в воспалительных очагах преобладают КМЦ первого типа, на 14-е сут увеличивается количество клеток второго типа, и на 21-е сут они преобладают. У крыс, инъецированных одним НАФ, в очагах воспаления также можно выделить два типа КМЦ, сходных с вышеописанными. На 14-е сут встречаются в основном КМЦ первого типа, на 21-е сут они по-прежнему преобладают, хотя количество КМЦ второго типа несколько увеличивается. 195 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Исходя из этих результатов, можно сделать следующие выводы: 1) на первых этапах развития воспаления в миокарде крыс, иммунизированных миозином с НАФ, в большей степени повреждается сократительный и энергопродуцирующий аппарат КМЦ, нарушается структура ядра – отмеченные признаки, судя по ранее полученным данным (Погодина и др., 2006), могут свидетельствовать о развитии апоптоза КМЦ, видимо, в результате действия провоспалительных факторов клеток, инфильтрирующих миокард; 2) по мере развития воспаления увеличивается число КМЦ с повреждениями сарколеммы и последующим отеком, что вызывает увеличение средней площади поперечного сечения КМЦ; 3) повреждения КМЦ, приводящие к их отеку и, видимо, последующему некрозу, обусловлены, в основном, развитием специфической аутоиммунной реакции в миокарде, т.е. действием специфических антимиозиновых антител. ФНО-зависимый апоптоз как основной механизм гибели эндокриноцитов при хронической эндогенной интоксикации Полякова Л.В., Калашникова С.А. Волгоградский научный центр РАМН, Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград Клеточные реакции на повреждение, вызываемые эндогенными токсическими соединениями (ЭТС), несмотря на многообразие последних, являются стереотипными для подавляющего большинства клеток. В то же время механизмы гибели различных эндокриноцитов могут иметь свои особенности. Универсальным инициатором развития эндотоксиновой агрессии является бактериальный липополисахарид (ЛПС), активирующий цитокиновый каскад и стимулирующий выброс медиаторов эндотоксинемии. При этом ведущим механизмом гибели клеток при хронической эндогенной интоксикации (ЭИ) является ФНО-зависимый апоптоз. В связи с вышеизложенным представляется целесообразным изучение роли ФНО-зависимого апоптоза в устранении эндокриноцитов при экспериментальной хронической ЭИ. Целью настоящего исследования является установление основных закономерностей гибели клеток в различных органах эндокринной системы. Работа была выполнена на 75 белых беспородных крысах обоих полов массой 180–200 г, согласно основным положениям правил лабораторной практики (�� GLP�� ), нормативным документам, предложенным ВОЗ. Воспроизведение хронической ЭИ осуществлялось путем сочетанного введения бактериального ЛПС (липополисахрид �� S�� . �� thyphimurium�� , наборы «�� Sigma�� ») и те196 Сборник научных трудов трахлорметана по методике В.Б. Писарева и соавт. (2002) и В.В. Новочадова (2005). Животные выводились из эксперимента на 30, 60 и 90-е сут путем передозировки нембуталового наркоза 100–150 мг/кг. При иммуногистохимическом исследовании органов эндокринной системы (аденогипофиза, щитовидной железы, надпочечника, яичника) было установлено, что в базофильных аденоцитах гипофиза, щитовидной железе и яичниках на всех сроках эксперимента выявлена гиперэкспрессия TRAIL (�� Apo�� 2�� L�� ) – лиганда �� DR�� 3, �� DR�� 5, запускающего механизм апоптоза, нарастающая по мере увеличения длительности хронической ЭИ (с 30 до 90-х сут) в 1,5 раза (табл. 1). Параллельно увеличивалось количество иммунопозитивных клеток против каспазы-3, достигающее максимальных значений к окончанию эксперимента (90-е сут ЭИ). Таблица Экспрессия маркеров апоптоза эндокриноцитов при хронической эндогенной интоксикации Маркеры ФНО-зависимого апоптоза Сроки эксперимента 30 сут 60 сут 90 сут Аденогипофиз TRAIL 4,7±0,8 6,3±0,6* 7,0±0,6 Caspase-3 8,3±0,7 11,1±0,9* 16,2±1,4* Щитовидная железа TRAIL 5,2±0,8 6,8±0,7* 7,3±0,7 Caspase-3 3,6±0,3 4,2±0,3 4,8±0,4 Надпочечник TRAIL 2,3±0,2 4,1±0,4* 4,2±0,5 Caspase-3 1,8±0,2 3,3±0,2* 3,5±0,3 Яичник TRAIL 5,2±0,4 6,8±0,7* 7,3±0,7 Caspase-3 3,6±0,8 4,2±0,3 4,8±0,4 р<0,05 по сравнению с предыдущим сроком эксперимента В связи с этим, не оставляло сомнений, что ведущим механизмом гибели эндокриноцитов при ЭИ в аденогипофизе, щитовидной железе и яичниках являлся именно TRAIL-зависимый апоптоз. В то же время в надпочечниках количество иммунопозитивных клеток против основных маркеров TRAILзависимого апоптоза не имело достоверных различий с контрольной группой. Таким образом, несмотря на идентичность воздействия эндогенных токсических соединений по длительности и концентрации, мы наблюдали различия в механизмах гибели эндокриноцитов. Мы пришли к выводу, что в механизмах устранения эндокриноцитов в аденогипофизе (базофильные клетки), щитовидной железе и яичниках при 197 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки хронической ЭИ имеет место высокое значение ФНО-зависимого апоптоза. Для ацидофильных аденоцитов и спонгиоцитов пучковой зоны коры надпочечников ФНО-зависимый апоптоз в условиях хронической эндогенной интоксикации не является типичным. Реактивные изменения эпителия слизистой оболочки желудка при инфицировании различными штаммами Helicobacter pylori Поморгайло Е.Г. ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Росздрава, Омск Ведущее место среди факторов патогенности слизистой оболочки желудка, как у взрослых, так и у детей в настоящее время занимает инфекция �� Helicobacter pylori (НР). Инфекция вызывает альтерацию эпителиального барьера и нарушает тем самым процесс нормального клеточного обновления эпителия слизистой оболочки желудка. Действие бактерии может приводить к возникновению разнонаправленных в отношении уровня клеточного обновления ткани заболеваний: от минимальных морфологических изменений (относительное равновесие между пролиферацией и гибелью клеток) к атрофическому гастриту и язвенной болезни (избыточная клеточная гибель) до рака желудка (гиперпролиферация эпителия). Вероятно, многообразие патологических изменений в организме человека, вызванных этой бактерией, обусловлено генетической гетерогенностью штаммов НР. Показано, что человек инфицирован различными штаммами НР, которые значительно отличаются по вирулентности (патогенности). Наиболее токсикогенные штаммы НР содержат в составе хромосомы гены – cagA, babA, vacA и iceA, которые кодируют факторы, обусловливающие вирулентность НР. Роль конкретных штаммов НР в нарушении клеточного обновления изучена плохо. Цель исследования – установить особенности клеточного обновления эпителия слизистой оболочки желудка при инфицировании человека различными штаммами НР. Объект исследования – биоптаты слизистой оболочки антрального отдела желудка, полученные при фиброгастродуоденоскопии у 106 больных подростков, инфицированных бактерией НР из гастроэнтерологического отделения ДКБ №2 г. Омска. Средний возраст больных – 14,3 года, средняя длительность заболевания 3,5 года. Исследование одобрено локальным комитетом по этике. 198 Сборник научных трудов Полученные фрагменты слизистой оболочки желудка фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин по общепринятой методике. Генотипирование HР осуществлялось из биоптатов антрального отдела желудка методом ПЦР (тест-система «Хеликопол-II» НПФ «Литех» (Россия). Определяли наличие генов cagA и babA2, а также полиморфизм генов vacA по сигнальному и среднему участку (подтипы s1/s2 и m1/m2, соответственно) и iceA (подтипы iceA1/iceA2). Для определения пролиферации (маркер Ki67) и апоптоза (маркер CPP32) эпителия проводили иммуногистохимическое исследование (сыворотки фирм DAKO�� , Дания и �� Novocastra�� , Великобритания, соответственно) на парафиновых срезах с применением стрептавидин-биотинового метода (набор LSAB2 Systems�� , �� HRP�� «�� DAKO�� », Дания). В препаратах при 400-кратном увеличении микроскопа определяли индекс пролиферации (ИП) и индекс апоптоза (ИА) как процент положительно окрашенных ядер эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в 5 случайно выбранных полях зрения (≥500 клеток). Статистическую обработку данных проводили при помощи U-критерия Манна – Уитни. В биоптатах слизистой оболочки антрального отдела желудка при инфицировании больных разными штаммами НР отмечалось расширение зоны пролиферации (меченные �� Ki�� 67 клетки) в сторону покровно-ямочного эпителия и в глубокие отделы желез. При исследовании апоптоза меченные СРР32 клетки также выявлялись в покровно-ямочном эпителии и глубине желез. Средние ИП и ИА эпителиоцитов в слизистой оболочке антрального отдела желудка были выше у больных подростков, инфицированных cagA(+) штаммами, по сравнению с больными носителями cagA(-) штаммов бактерии (ИП – 28,5% и 13,6%, р<0,05; ИА – 18,2% и 8,5%, соответственно, р<0,05). Кроме того, показано значительное увеличение у носителей babA2(+) штаммов НР по сравнению с подростками, инфицированными �� babA�� 2(-) штаммами бактерии, ИП (25,0% и 14,4%, соответственно; р<0,05) и ИА (19,4% и 10,5%, соответственно; р<0,05). При анализе данных клеточного обновления эпителия слизистой оболочки желудка и генотипирования vacA(+) штаммов НР выявлялось увеличение ИА почти в 2 раза у больных подростков, инфицированных vacAs1(+) или vacAs�� 2(+) штаммами (16,2% и 13,2%, соответственно) по сравнению с больными с vacAs�� 1(-) или vacAs�� 2(-) (8,0% и 7,2%, соответственно). При этом статистически достоверных различий ИП эпителиоцитов слизистой оболочки желудка у подростков со штаммами vacAs1(+) или vacAs2(+) по сравнению с vacAs1(-) или vacAs2(-) штаммами НР не обнаружено. 199 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Отличий ИП и ИА эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в биоптатах больных подростков, инфицированных vacAm1, vacAm2, iceA1 и iceA2 позитивными и негативными штаммами НР, не обнаружено. Таким образом, более значимое увеличение темпов клеточного обновления эпителиоцитов слизистой оболочки антрального отдела желудка отмечается при инфицировании cagA(+) и babA2(+) штаммами НР по сравнению с изменениями, вызванными cagA(-) и babA2(-) штаммами бактерии. Кроме того, значительное увеличение ИА эпителиоцитов наблюдается в слизистой оболочке желудка при инфицировании vacAs1(+) или vacAs2(+) штаммами НР, что, однако, не сопровождается параллельным увеличением пролиферации этих клеток. Иммуногистохимическое выявление нейронспецифической енолазы в клетках островков Лангерганса поджелудочной железы человека в норме и при сахарном диабете 1 и 2 типов Прощина А.Е., Савельев С.В., Барабанов В.М., Кривова Ю.С. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Нейронспецифическая енолаза (�� NSE�� ) была первым найденным ферментным нейроспецифическим белком. NSE – гликолитический фермент (2-фосфо-D-глицерат гидролаза), относящийся к семейству енолаз. Енолазы в организме человека существуют в различных вариантах димеров, состоящих из трех иммунологически различающихся субъединиц (альфа, бета и гамма): альфа-субъединица енолазы выявляется в различных тканях, бетасубъединица – только в сердце и поперечнополосатой мускулатуре, гаммаенолаза – в нервных и нейроэндокринных клетках, в том числе и в клетках панкреатических островков. Для изучения роли NSE в развитии сахарного диабета 1 и 2 типов было проведено иммуногистохимическое исследование поджелудочной железы человека. Нами были исследованы аутопсийные образцы хвоста поджелудочных желез шести взрослых пациентов с клиническим диагнозом сахарный диабет (СД) 1 типа и 13 пациентов – с диагнозом СД 2 типа. Контролем служил аутопсийный материал 11 поджелудочных желез людей, не страдавших нарушением углеводного обмена. Образцы всех поджелудочных желез фиксировали в забуференном формалине. Кусочки поджелудочных желез заливали в парафин и готовили срезы толщиной 10 мкм. Для выявления эндокринных клеток и нервных элементов были применены иммуногистохмические мето- 200 Сборник научных трудов ды. Депарафинированные, гидратированные срезы обрабатывали 3% раствором Н2О2 в течение 10 мин для блокировки эндогенной пероксидазы. Срезы инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин с антителами к инсулину (мышиные моноклональные антитела, Sigma, 1:2000), глюкагону (мышиные моноклональные антитела, Sigma, 1:2000–1:8000) и NSE (мышиные моноклональные, Ab-1, (Clone E27), Thermo Scientific, ready to use). Для выявления этих антигенов использовали систему UltraVision Detection System Anti-polyvalent, HRP/DAB (LabVision Corp). В контрольных образцах поджелудочной железы человека в островках Лангерганса реакция и на инсулин, и на глюкагон была положительной. NSE также была обнаружена в клетках панкреатических островков. В двух случаях CД1 у взрослых пациентов маркирование антителами к инсулину показало, что инсулин-содержащие клетки в островках поджелудочной железы отсутствовали. Выявление глюкагон-содержащих клеток показало, что в этих двух случаях альфа-клетки составляли основную массу островка. Реакция на NSE в этих случаях в клетках островков отсутствовала. Отсутствие иммуногистохимической реакции на инсулин в островках Лангерганса поджелудочной железы при развитии тяжелой формы СД 1 типа является характерным признаком. Считается, что при развитии этого типа СД разрушаются бета-клетки, и основную массу островка составляют глюкагонсекретирующие клетки. Однако отсутствуют данные о том, что при тяжелой форме СД1 в островковых клетках не выявляется NSE. В литературе описаны случаи остаточной секреции инсулина при СД1, и соответственно сохранности бета-клеток даже в течение многих лет после манифестации данного заболевания. В четырех остальных случаях, в клетках островков поджелудочной железы пациентов, страдавших СД1 типа, реакция на инсулин и нейронспецифическую енолазу в той или иной степени сохранялась, что подтверждает гипотезу о корреляции уровня содержания инсулина и нейронспецифической енолазы в бета-клетках поджелудочной железы взрослых больных. При исследовании иммунореактивности NSE в двух случаях тяжелой формы СД2 было выявлено отсутствие реакции на глюкагон в ряде долек поджелудочной железы, в других дольках интенсивность реакции была заметно снижена. В одном из этих случаев была также заметно нарушена и секреция инсулина. Реакция на NSE, при отсутствии реакции на глюкагон, также отсутствовала или была снижена (в островках с остаточной секрецией глюкагона), несмотря на секрецию во всех этих островках инсулина. В остальных 11 случаях СД2 реакция на все три типа антител была положительной. Однако, еще в 4 случаях СД2 нами были выявлены признаки 201 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки амилоидоза поджелудочной железы, который вызывается отложениями белка амилина. Эндокринные клетки были вытеснены в этих случаях на периферию островка. Амилин синтезируется бета-клетками и больных, и здоровых людей, но у здоровых он накапливается в секреторных гранулах вместе с инсулином, откуда секретируется (тоже вместе с инсулином), не откладываясь в островках. Предполагается, что в бета-клетках амилин может являться физиологическим модулятором секреции инсулина, но включение его в амилоидные отложения ведет к снижению его активности, а в итоге к нарушению секреции инсулина. По некоторым данным, NSE выявляется не только в инсулин-, но и в глюкагонсодержащих клетках островков и катализирует реакцию превращения 2-фосфо-Д-глицериновой кислоты в фосфоенолпируват. Это соединение накапливается в большом количестве в бета-клетках и, по всей видимости, принимает участие в механизме стимуляции секреции инсулина. Таким образом, можно предположить, что в ряде случаев при сахарном диабете обоих типов патологические процессы ускоряются из-за нарушения гликолиза в островковых клетках при отсутствии нейронспецифической енолазы или снижении ее концентрации, и, соответственно, снижения продукции гормонов поджелудочной железы. Роль ядрышковых белков – нуклеофозмина и нуклеолина в регуляции пролиферации опухолевых клеток Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Смирнова Е.А., Пробатова Н.А., Павловская А.И., Шабанов М.А. Российский Онкологический научный центр им Н.Н. Блохина РАМН, Москва Определение количества пролиферирующих клеток с помощью антитела к �� Ki�� -67 имеет важное значение для оценки степени злокачественности новообразований, особенностей их клинического течения, прогноза, выживаемости больных. Этот маркер нашел широкое применение в практической онкологии. Однако не всегда между уровнем экспрессии антигена Ki-67 и темпом роста опухолей выявляется четкая корреляция. Одной из причин такого несоответствия может быть разная скорость клеточной пролиферации, регулируемая аргирофильными белками областей ядрышковых организаторов (Ag-ОЯОР-белки) – нуклеофозмином и нуклеолином. Установлена четкая корреляция между уровнем экспрессии Ag-ОЯОР-белков и скоростью пролиферации опухолевых клеток. Так, например, было показано, что чем выше уровень экспрессии Ag-ОЯОР-белков, тем короче время удвоения количества 202 Сборник научных трудов опухолевых клеток в культурах, а также в перевиваемых опухолях с разным временем удвоения опухолевых масс. Те же закономерности найдены и при изучении опухолей человека .Эти белки могут также оказывать влияние на скорость клеточной пролиферации, вступая во взаимодействие с другими регуляторами митотического цикла (белок ретинобластомы �� pRb�� , транскрипционный фактор E2F и регулируемые им гены циклинов Е и А, ДНК-полимеразы α и др.) Ag-ОЯОР-белки участвуют не только в регуляции пролиферации, но так же, при локализации на плазматической мембране, в механизмах адгезии, что приводит к ослаблению межклеточных и клеточно-матриксных адгезивных связей и способствует росту миграционной активности опухолевых клеток, их инвазии и метастазированию. Учитывая изложенное, целью настоящей работы явилось изучение экспрессии Ag-ОЯОР-белков – нуклеофозмина и нуклеолина и антигена Ki-67 в немелкоклеточных раках лёгких до 3 см в диаметре, условно называемых «малыми» раками с разным клиническим течением, а также в папиллярном раке щитовидной железы (ПРЩЖ) с высокой степенью агрессивности и выявление значения этих показателей в определении прогноза данных новообразований, их способности к инвазии и метастазированию. Выявление Ag-ОЯОР-белков проводили гистохимически с применением реакции с нитратом серебра, для иммуногистохимического исследования нуклеофозмина и нуклеолина использовали моноклональные антитела к этим белкам. Количество пролиферирующих клеток определяли с применением моноклональных антител к антигену Ki-67. Гистохимическую и иммуногистохимическую реакцию оценивали как низкую, умеренную, высокую и очень высокую и определяли долю клеток с разной интенсивностью. Проведенное исследование показало, что определяющим прогностическим фактором течения «малых» раков лёгких являлась скорость клеточной пролиферации: чем выше была экспрессия Ag-ОЯОР-белков – нуклеофозмина и нуклеолина, тем агрессивней оказалось течение опухолей. Так, опухоли одной группы, характеризовавшиеся очень высокой экспрессией AgОЯОР-белков и умеренным количеством пролиферирующих клеток имели наиболее неблагоприятный прогноз даже при наличии стадии T1N0M0 (IA). В противоположность этому, опухоли другой группы, несмотря на высокое количество пролиферирующих клеток, характеризовались значительно лучшим прогнозом. Особенностью опухолей этой группы являлась преимущественно умеренная экспрессия Ag-ОЯОР-белков (нуклеофозмина и нуклеолина). Некоторые больные этой группы даже с наличием метастазов в стадии T1N1M0 (IIA) тем не менее имели более благоприятный прогноз, чем больные в первой группе. При исследовании ПРЩЖ, 10-летняя выживаемость при котором наблюдается в 90–98% случаев, было выявлено, что клетки опухоли характеризовались высокой экспрессией нуклеофозмина и нуклеолина. В опухоли также наблюдались группы клеток с высокой экспрессией Ag-ОЯОР-белков на их 203 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки поверхности. Количество клеток, экспрессирующих антиген �� Ki�� -67, было низким, что обычно встречается при благоприятном течении заболевания. Однако представленный случай ПРЩЖ характеризовался агрессивным течением, он обладал выраженным инвазивным ростом, дал регионарные и отдалённые метастазы, быстро прогрессировал, и больная скончалась через три месяца после операции. Выявленное несоответствие между количеством пролиферирующих клеток и агрессивным течением папиллярного рака щитовидной железы можно объяснить высоким уровнем экспрессии Ag-ОЯОР-белков – нуклеофозмина и нуклеолина в большинстве опухолевых клеток, что вызывало повышенную скорость пролиферации. Кроме того, высокая экспрессия Ag-ОЯОР-белков, особенно их локализация на плазматической мембране, способствовала инвазивному росту и метастазированию. Таким образом, одновременное исследование скорости клеточной пролиферации – продолжительности митотического цикла (экспрессии AgОЯОР-белков – нуклеофозмина и нуклеолина) и фракции роста (количества пролиферирующих клеток – антиген �� Ki�� -67) даёт наиболее полную информацию о пролиферативном статусе новообразований и их прогнозе. Результаты исследования также показывают, что повышенная экспрессия мембранноассоциированных Ag-ОЯОР-белков характерна для опухолей с высоким инвазивно-метастатическим потенциалом. Влияние гормонов, простагландинов и лекарственных препаратов на процесс агрегации эритроцитов человека Ройтман Е.В., Муравьев А.В., Тихомирова И.А. ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» МЗСР РФ, Москва, Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского, Ярославль На процесс агрегации в норме и при патологии свое влияние оказывает значительное количество различных факторов, модулирующих состояние внутренней среды организма или относящихся к внешним, в частности, медикаментозные воздействия. Феномен адренергической агрегации эритроцитов известен достаточно давно, однако его значение исследовано мало. В качестве основных методов исследования использовали определение СОЭ цитратной крови или микроскопии эритроцитарной суспензии с �� Hct�� =40% при последующей видеорегистрации и компьютерном анализе изображения (Муравьев А.В., 2003; Horga J.F. et al., 2000). 204 Сборник научных трудов Феномен адреноиндуцированной агрегации эритроцитов проявляется in vitro также и в низкоконцентрированных суспензиях этих клеток в физиологическом растворе (Hct=0,05%-0,2%) при использовании в качестве индуктора агрегации растворов адреналина, аденозиндифосфата (АДФ) и норадреналина (0,02 ммоль/л). Этот процесс обратим и обладает волновым характером, что дает возможность фиксации таких его параметров как время образования линейных эритроцитарных агрегатов, время образования трехмерных эритроцитарных конгломератов, степень и скорость агрегации. Отмечено, что препараты, стимулирующие α- и β-адренорецепторы (адреналин, норадреналин), обладают высокой агрегирующей активностью при достаточно низкой скорости агрегации. Вероятно, в изменении агрегации эритроцитов под влиянием адреналина участвует циклический АМФ. Об этом свидетельствует выраженное снижение агрегационной реакции при инкубации клеток с папаверином, который препятствует распаду цАМФ, ингибируя активность фосфодиэстераз. Не только один папаверин, но и комбинация «папаверин+адреналин» заметно снижают агрегацию эритроцитов. Следует отметить, что при обследовании хирургических больных также выявлено наличие данного феномена, встречавшегося только у пациентов, находящихся в состоянии стресса (например, операционного). При этом интенсивность и продолжительность стресс-агрегации эритроцитов позволяют судить о выраженности и длительности действия стресс-факторов. Другая серия исследований, проведенных нами in vitro,�� продемонстрировала снижение агрегации эритроцитов в условиях их инкубации с простагландином Е1 (ПГЕ1, в концентрации 10–8 М), подтверждая тем самым вероятность активации аденилатциклазного сигнального пути при данном клеточном ответе, поскольку известно, что ПГЕ1 является мощным стимулятором активности аденилатциклазы. Разница, по сравнению с контролем, составила более 52% (р<0,01). ПГЕ2 (в концентрации 10–8 М) также способствовал уменьшению агрегатообразования эритроцитов, но в значительно меньшей степени. В тех же условиях ПГФ2α, напротив, выраженно стимулировал повышение агрегатообразования эритроцитов. Действие сочетания «адреналин+ПГФ2α», также проявилось in vitro усилением агрегации эритроцитов, что может быть связано с активацией кальциевого сигнального пути. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ в эритроцитах при их механическом нагружении в присутствии Са2+ (50– 100 µM) сопровождалось выраженным снижением фильтруемости, тогда как, предварительная инкубация эритроцитов с блокатором кальциевых каналов верапамилом (10–5 М) статистически достоверно уменьшала проагрегационный эффект адреналина. Сходные изменения агрегации эритроцитов происходили при связывании Са2+ в среде инкубации клеток при помощи кальциевого хелатора ЭГТА. 205 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Особый интерес вызывает инсулин, влияние которого на изучаемый процесс реализуется в виде снижения агрегации эритроцитов. Наибольший эффект (–50%, р<0,01) был выявлен при инкубации эритроцитов с самой низкой из выбранных нами концентраций препарата. В этих условиях также заметно снижалось число клеток, приходящихся на один агрегат (на 15%, р<0,05). Зависимость «доза препарата – агрегационный эффект» хорошо описывается уравнением степенной функции: y = 2,14x-0,45 при достоверности аппроксимации данных этим уравнением R2 = 0,997. Среди лекарственных препаратов пентоксифиллин является наиболее часто используемым средством для коррекции нарушений реологических свойств крови. В экспериментальных и клинических исследованиях прямых эффектов этого лекарственного препарата (in vitro 0,02 мг/мл; пациенты с церебральным атеросклерозом, получающие курс препарата по 1200 мг/сут в течение 4 нед) были выявлены сходные изменения свойств клеток. При исходно высокой агрегации отмечалось достоверное снижение интегрального индекса агрегации, в то время как у лиц с изначально низкой агрегацией после терапии установлен ее существенный прирост. Выявлено, что позитивный микрореологический эффект пентоксифиллина связан с его способностью ингибировать активность фосфодиэстераз в клетках. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что для достижения конечного результата – адаптации микрореологических свойств эритроцитов в условиях изменяющихся потребностей организма, корпоративно участвуют две внутриклеточные сигнальные системы – кальциевая и аденилатциклазная, что в результате обеспечивает гибкую систему регуляции клеточных свойств эритроцитов. Межклеточные взаимодействия: от микроокружения к гистионам и клеточным сетям Савостьянов Г.А., Магницкая Е.Г., Грефнер Н.М., Голубева Т.Б. Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Межклеточные взаимодействия позволяют рассматривать ткань как единую систему в виде клеточной сети, которая и обеспечивает исполнение всех тканевых функций. При изучении таких взаимодействий внутри эпителиев возможны локальный и глобальный подходы. При локальном подходе исследуется микро206 Сборник научных трудов окружение клеток и строение клеточных ниш. Предметом глобального подхода должны служить состав и строение клеточной сети в целом. Оба подхода предполагают описание как геометрического, так и топологического аспектов гистоархитектуры (Маресин, 1990). Однако необходимость разделения топологического и геометрического аспектов структуры клеточных ниш и сетей осмыслена недостаточно и пока не вошла в практику. При этом в настоящее время преобладает локальный подход, сводящийся лишь к геометрическому описанию микроокружения. Клеточная сеть в целом пока не стала самостоятельным объектом исследования, тем более не общепризнана задача по изучению топологии таких сетей. К тому же существующие в настоящее время методы реконструкции трехмерной структуры эпителиев по серийным срезам, даже при использовании компьютерных технологий, не обладают необходимой разрешающей способностью. В итоге пространственная организация эпителиев, т.е. трехмерное строение их клеточных сетей, остается неизвестным. Это – важный пробел, восполнение которого – весьма актуальная задача. Для решения этой проблемы недавно были разработаны теоретические основы структурной гистологии (Савостьянов, 2005). Ниже дана ее суть. 1. Элементарной морфофункциональной единицей ткани является не клетка, а клеточная группа – гистион. Гистионы возникают в результате специализации и интеграции клеток, т.е. разделения функций между ними. Формализованное описание этих процессов позволяет вычислять состав и структуру гистионов и классифицировать их в виде периодической системы, параметры которой определяемы экспериментально и пригодны для измерения развития многоклеточности. Гистионы представляют собой самостоятельный, упускаемый до сих пор уровень биологической организации, лежащий между уровнями клеток и тканей. 2. Ткани возникают в результате полимеризации гистионов и представляют собой одно-, двух- и трехмерные клеточные сети. Проявлением гистионного строения сетей является их регулярность. Зная состав и структуру гистионов и правила их полимеризации, можно вычислять варианты строения клеточных сетей. Эти сети определяют внутриклеточную структуру, отражают геометрию и топологию пространственной организации эпителиев и являются их моделями. Компьютерная реализация моделей с помощью специальной программы Гистоарх дает возможность визуализировать форму клеток и их взаимосвязи, определяя характер как клеточного микроокружения и строения внутриэпителиальных клеточных ниш, так и структуру клеточных сетей пласта в целом. Кроме того, Гистоарх позволяет получать сечения моделей в любых направлениях (Савостьянова с соавт., 2007). Использование моделей позволяет прогнозировать развитие тканей и направления их адаптивных изменений, а также предсказывать и затем экспе207 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки риментально обнаруживать неизвестные ранее варианты гистоархитектуры. Кроме того, с помощью моделей выявлен ряд новых свойств эпителиальных пластов, среди которых важнейшими являются анизотропия, трансляционная симметрия и слайсовое строение (где слайсы – это элементарные блоки гистоархитектуры). Получен также комплекс новых информативных признаков для характеристики тканевого строения. 3. Построенные модели служат базой для разработки нового подхода к изучению пространственной организации реальных эпителиев. Его суть сводится к сравнению физических или оптических тканевых срезов с сечениями моделей и выбору той из них, которая совпадает с реальностью. Эта модель и будет отражать трехмерное строение эпителия и топологию его клеточной сети. 4. С помощью этого подхода была проведена реконструкция трехмерного строения ряда покровных и сенсорных эпителиев и впервые установлено трехмерное строение их клеточных сетей (Савостьянов, 2005). Установлен также характер их перестройки при регенерации (Магницкая с соавт., 2009). При этом оказалось, что новый подход радикально повышает разрешающую способность и результативность методики изучения пространственной организации эпителиев при одновременном ее упрощении. 5. Предлагаемая теория и новый подход могут использоваться при изучении перестройки трехмерной структуры различных тканей и их клеточных сетей в ходе нормального развития и в патологии. Список литературы. Савостьянова Е.Г., Воробьев А.В., Грефнер Н.М., Левченко В.Ф. и Савостьянов Г.А. На пути к трехмерной гистологии // Морфология. – 2007. – том 131, вып. 1. – С. 8–17. Магницкая Е.Г., Грефнер Н.М., Голубева Т.Б., Воробьев А.В., Левчен- ко В.Ф. и Савостьянов Г.А. Трансформация трехмерного строения эпителия в развитии // Сенсорные Системы. – 2009. – том 23, вып. 4. – С. 334–345 Маресин В.М. Пространственная организация эмбриогенеза. – М.: Наука, 1990. – 169 с. Савостьянов Г.А. Основы структурной гистологии. Пространственная организация эпителиев. – СПб. – Наука, 2005. – 375 с. 208 Сборник научных трудов Клетки эпидермоидной карциномы человека восстанавливают исходный фенотип после снятия воздействия сукцинатом витамина Е Савицкая М.А., Кисурина-Евгеньева О.П. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва Многие витамины могут оказывать благоприятное воздействие на клетки и способствовать их выживанию. В некоторых случаях такое воздействие обусловлено антиоксидантными свойствами этих соединений, благодаря которым подавляется избыточное образование свободных радикалов кислорода, наблюдаемое при действии на клетки повреждающих факторов и нередко приводящее к гибели клетки. Хорошо известным антиоксидантом является витамин Е. При этом производные витаминов способны вызывать противоположные эффекты и приводить к гибели клеток. Интересно, что такое действие может быть селективным по отношению к злокачественным опухолевым клеткам. Производное антиоксиданта витамина Е, α-токоферилсукцинат (сукцинат витамина Е, СВЕ) обладает потенциальными противоопухолевыми свойствами как in vitro, так и in vivo, подавляя пролиферацию злокачественно трансформированных клеток, вызывая их гибель или дифференцировку, снижая способность к инвазии и т.д. В литературе практически отсутствуют данные, касающиеся эффектов воздействия СВЕ на компоненты цитоскелета, однако то, что СВЕ способен вызывать изменение формы клеток, было показано для культуры клеток меланомы мыши ещё в 1982 г (Prasad and Edwards- Prasad, 1982). Целью данной работы было исследовать индукцию гибели клеток культуры эпидермоидной карциномы человека при действии СВЕ, изучить состояние компонентов цитоскелета и выяснить, являются ли эффекты воздействия СВЕ на клетки обратимыми. Работа проводилась на культуре клеток линии �� A�� 431 (эпидермоидная карцинома человека). Клетки выращивали во флаконах на 5 мл в среде �� DMEM�� с добавлением 10% фетальной сыворотки телёнка и 5мг/мл гентамицина при 37°C и 5% CO2. При постановке эксперимента клетки снимались раствором Версенатрипсина (ПанЭко) и рассаживались на стёкла в чашки Петри. Раствор СВЕ (40мкМ) в 96%-м этаноле был внесён на 2-е сутки после посадки. Для определения обратимости эффекта СВЕ на 2-е сутки инкубации была произведена отмывка клеток и дальнейшее культивирование в среде без СВЕ в течение 1 и 3 суток. Оценка количества гибнущих клеток производилась по морфологическим признакам на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Для визуализации актинового цитоскелета использовался фаллоидин-TRITC. Количественный подсчёт клеток выявил, что через 48 ч после начала инкубации клеток А431 в присутствии СВЕ значительно повышается величина апоптотического индекса. Усиление гибели клеток сопровождается изменением 209 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки их формы: цитоплазма клеток поджимается, ламеллы уменьшаются, формируются цитоплазматические отростки. Цитохимическое выявление F�� -актина продемонстрировало, что при воздействии СВЕ на 2-е изменение формы клеток сопровождается снижением выраженности ламелл по сравнению с контролем, формированием цитоплазматических выростов различной формы и длины, содержащих в своём составе актиновые микрофиламенты, уменьшением выраженности стресс-фибрилл. Таким образом, СВЕ вызывает не только изенение формы клеток, но и реорганизацию актинового компонента цитоскелета. После удаления СВЕ из среды культивирования на 1-е сутки значительных изменений апоптотического индекса не происходит, и он по-прежнему сильно превышает соответсвующую величину в контроле. При этом форма клеток остаётся изменённой, клетки имеют различные актин-содержащие цитоплазматические выросты; кроме того, встречаются клетки с хорошо выраженной ламеллой, на краях которой сосредоточен F�� -актин. На 3-и сутки после прекращения воздействия величина апоптотического индекса у клеток, инкубировавшихся в присутствии СВЕ, понижается, величина его приближается к контрольному уровню. Форма клеток и структура актинового цитоскелета при этом также практически не отличаются от таковых в контроле. Таким образом, сукцинат витамина Е вызывает индукцию гибели клеток в культуре эпидермоидной карциномы человека, сопровождающуюся изменением их формы и перестройкой актинового цитоскелета. При этом эффект воздействия СВЕ оказывается обратимым, причём процесс восстановления занимает длительное время (3 суток). Из полученных результатов следует, что для эффективного проявления противоопухолевых свойств сукцината витамина Е, по-видимому, необходимо его долговременное действие на трансформированные клетки. Работа поддержана РФФИ № 08-04-007-50-а, НШ 1861.2003.4. Состояние митотического цикла в клетках почечного эпителия после односторонней нефрэктомии Сазонов С.В. ГОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Росздрава, Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург В настоящее время сформированы представления о зависимости типа регенерации нефрона от уровня организации его различных отделов, характера повреждающего фактора и глубины повреждения. Однако, опубликованные работы по изучению состояния пролиферации в почке после односторонней не- 210 Сборник научных трудов фрэктомии, не позволяют дать полную характеристику изменений митотического цикла клеток эпителия в коллатеральном органе. Цель настоящей работы – изучить особенности прохождения клетками эпителия почки периодов клеточного цикла после односторонней нефрэктомии, используя метод проточной ДНК-цитометрии. Эксперименты проведены на крысах-самцах линии �� Wistar�� с исходной массой 170–180 граммов (240 особей). Состояние пролиферативных процессов в почке изучали в модели индуцированной (репаративной) регенерации. Индукцию регенераторных процессов вызывали путем выполнения односторонней нефрэктомии. Состояние процессов клеточной регенерации оценивали с помощью комплекса методов. Для изучения обзорной гистологической картины почки вырезанные кусочки фиксировали в 10% нейтральном формалине. Заливку производили в парафин. На гистологических срезах толщиной до 10 мкм, окрашенных гематоксилином-эозином, определяли величины митотического индекса (МИ), статмокинетического индекса (СКИ) в эпителии почечных канальцев, рассчитывали продолжительность митоза. Для определения статмокинетического индекса животным за 8 ч до забоя однократно, внутрибрюшинно вводили винбластин в дозе 2 мг/кг. Значения индекса выражали в %. Методом проточной цитометрии (Мейсель, Козинец) с помощью трехпараметрического комплекса ЛОМО-ГОИ определяли количество ДНК в клеточных ядрах с одновременным распределением анализируемой клеточной популяции по плоидности и фазам клеточного цикла. На полученных ДНК-гистограммах, одновременно с определением плоидности клеток, производили распределение анализируемой клеточной популяции по фазам митотического цикла. После распределения клеток по классам плоидности рассчитывали временные параметры митотического цикла. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью параметрических методов по стандартным программам. Проведенные исследования показали, что уже через 32 ч после односторонней нефрэктомии в клетках эпителия оставшейся почки наблюдается увеличение МИ. В основе этого увеличения лежит выход клеток из периода покоя клеточного цикла в �� S�� период цикла (табл.). Максимальный подъем величины МИ выявлен через 36 ч, когда он составляет 4,8±0,82%, а пролиферативного пула – через 32 ч после нефрэктомии. Через 40 ч после нефрэктомии в эпителии канальцев коллатеральных почек животных наблюдается снижение числа клеток, вступивших в пролиферацию, что сопровождается уменьшением величины МИ. Как было установлено при расчете СКИ, увеличение значений МИ не связано с ростом продолжительности митоза, но имеет в своей основе истинное увеличение числа клеток, вступивших в пролиферацию, что подтверждается 211 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки исследованиями величины пула клеток, имевших ядра с количеством ДНК большим, чем 2с. Через 40 ч после нефрэктомии у животных наблюдается уменьшение величины пролиферативного пула за счет ДНК-синтезирующих клеток и уменьшение величины МИ. Через 56 и 72 ч после нефрэктомии происходит уменьшение величины МИ и пролиферативного пула до уровня значений контрольной группы. Таким образом, в оставшейся после односторонней нефрэктомии почке происходит повышение уровня активности пролиферации в сроки 32–40 ч после операции, что обусловлено стимуляцией выхода клеток почечного эпителия в митотический цикл при сохранении неизменными временных параметров прохождения периодов цикла. Распределение клеток почечного эпителия по периодам клеточного цикла (%) после односторонней нефрэктомии Время после нефрэктомии (ч) 32 40 48 56 Контроль Периоды клеточного цикла G0+1 87,80±1,11* 93,00±0,57* 96,20±0,72 95,00±0,40 98,80±0,42 S 11,40±0,83* 5,80±0,59* 3,20±0,52* 3,60±0,46* 0,40±0,07 G2 0,80±0,33 1,20±0,18 0,60±0,22 1,40±0,22 0,80±0,33 Таблица Величина пролиферативного пула S+G2 12,20±1,11* 7,00±0,57* 3,80±0,72* 5,00±0,40* 1,20±0,42 Примечание: *Достоверность определялась по отношению к соответствующему показателю контрольной группы животных. Математический анализ состояния нейроцитов коры головного мозга собак при комбинированном действии факторов среды Саурина О.С. ГОУ ВПО «Орловский государственный университет», Орел Проблема биологических эффектов ионизирующих излучений, особенно в центральной нервной системе, постоянно привлекает внимание исследователей. Это связано с интенсивным развитием ядерной энергетики и имеющими при этом место аварийными ситуациями. Задача осложняется тем, что на развитие лучевого поражения могут повлиять сопутствующие факторы, в частности, измененная газовая среда в виде гипероксии и гипоксической гипоксии. К настоящему времени сформировалась парадигма радиозащитного действия дыхания гипоксическими газовыми смесями во время облучения. 212 Сборник научных трудов Это продемонстрировано на различных видах животных и применяется в онкорадиобиологии. Однако данных о модифицирующем действии измененной газовой среды при высоких дозах ионизирующего излучения недостаточно для корректного вывода о путях радиомодификации в этих условиях. Для оценки развития структурно-функциональных изменений в головном мозге при действии изучаемых факторов нами разработана математическая модель, адекватно отражающая выявленные нейроморфологические эффекты и их прогностическое развитие. Нами был спланирован и проведен эксперимент на собаках, которым облучали голову в дозах от 5 до 100 Зв. Животных выводили из эксперимента через 0,1; 0,5; 2,0 и 5 часов. Каждой группе соответствовал адекватный виварийный контроль. Для изучения комбинированного воздействия измененной газовой среды использовали полуоткрытые камеры, куда подавалась газовая смесь с содержанием кислорода 5, 7, 10 и 99%. Проведенными исследованиями установлено, что нервные клетки во всех отделах головного мозга собак реагируют на изучаемые факторы однотипными изменениями, которые не являются специфическими, а возникают при действии самых различных факторов среды. Морфологические изменения нейроцитов существенно зависят от дозы облучения, выявляются в момент появления неврологической симптоматики и подразделяются на деструктивные, реактивные и компенсаторно-приспособительные, или нормохромные. После облучения головы собак в дозе 75 Зв через 0,5 часа (время появления судорог) на светооптическом уровне в сенсомоторной коре выявляются незначительные изменения. Если облучение проводить в условиях снижения кислорода до 5%, то количество клеток с деструктивными изменениями возрастает, но резервное время развития неврологических расстройств увеличивается. Уравнение регрессии, описывающее динамику воздействия изучаемых факторов на изменение количества деструктивных нейроцитов, выглядит так: ДН=0,12+0,02x+0,04y-0,16z-0,01x²+0,05y²+0,14z²+0,36xyz. Коэффициент детерминации для составленной модели R²=0,85. Анализируя линейные и нелинейные составляющие коэффициентов уравнения, можно предположить, что с увеличением дозы облучения, времени после воздействия, содержания кислорода в среде, а также при совместном влиянии изучаемых параметров количество деструктивных нейроцитов будет увеличиваться. При облучении головы собак в чистом нормобарическом кислороде наблюдается достоверное снижение показателя нервно-клеточного индекса по сравнению с контролем. Применение чистого нормобарического кислорода через 20 минут после облучения приводит к достоверному уменьшению количества нормохромных клеток и увеличению количества деструктивных и реактивных нейроцитов по сравнению с животными, облученными в обычных условиях. Следовательно, гипероксия после облучения приводит к более выраженным морфологическим изменениям в сенсомоторной коре головного мозга собак. 213 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Уравнение регрессии для нормохромных нейроцитов выглядит следующим образом: НХ=0,69-0,11x–0,26y+0,35z+0,38yz+0,13x²+0,12y²-0,29z²0,29xyz. Величина коэффициента детерминации составила R²=0,67. Таким образом, облучение в условиях гипоксической гипоксии снижает тяжесть патоморфологических изменений в ранние сроки пострадиационного периода. Облучение в условиях нормобарического кислорода и применение его после облучения усиливает неврологическую симптоматику и радиационное поражение клеток. Морфофункциональные изменения в клетках Панета кишечника кроликов-сосунков, зараженных холерными вибрионами с различной антилизоцимной активностью Саямов С.Р., Черепахина И.Я., Помухина О.И., Ткачева Т.И., Балахнова В.В., Бурлакова О.С. ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону Известно, что бактерии в целях сохранения (персистенции) популяции в организме хозяина способны выделять ряд субстанций, подавляющих его защитные механизмы. In vivo и in vitro многие микроорганизмы секретируют фактор, специфически взаимодействующий с лизоцимом (естественным антисептиком эукариотических клеток), и инактивируют его. Эта способность бактерий определяется как антилизоцимная активность (АЛА), которой в персистенции бактерий отводится одно из ведущих мест. Лизоцим как фактор неспецифического иммунитета, имеет широкое распространение во многих органах и тканях животных и человека и, в частности, он обнаруживается в тонком кишечнике в гранулах клеток Панета (КП). Клетки Панета – клетки кишечника, обеспечивающие антибактериальную защиту организма. При столкновении с бактериями они выделяют антимикробные вещества (в частности, лизоцим) в просвет крипт. Известно, что малодифференцированные клетки Панета идентифицируются по наличию лизоцима в незрелых секреторных гранулах, содержание которого увеличивается по мере созревания гранул (Шахламов В.А., Солнышкова Т.Г., 1992). Эти же авторы доказали, что при воздействии на клетки Панета холерным токсином происходит постепенное снижение их функциональной активности, которое сопровождается нарушением синтеза гранул в районе комплекса Гольджи. Функции клеток Панета до конца не изучены. Целью наших исследований было определить наличие морфофункциональных изменений в клетках Панета при воздействии на них холерных ви214 Сборник научных трудов брионов с различным уровнем антилизоцимной активности (АЛА) при внутрикишечном заражении кроликов-сосунков. Клетки Панета энтероцитов здоровых и инфицированных холерными вибрионами крольчат изучали методом электронной микроскопии. Для этого брали фиксированные глутаральдегидным и осмиевым фиксаторами фрагменты тонкой кишки животных, заключённые в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы просматривались в электронном микроскопе JEM – 100 B. Ранее нами было установлено, что культуры, изолированные от больных холерой, обладали низкой АЛА (1–2,3 мкг/мл), от вибриононосителей – несколько выше (3–4 мкг/мл), а у штаммов, выделенных из окружающей среды, АЛА была наиболее высокой (4–12 мкг/мл). При этом установлена прямая корреляция между показаниями АЛА и уровнем патогенности изучаемых штаммов. Так, в группе токсигенных (�� ctx�� +�� tcp�� +) штаммов средний показатель АЛА составил 3,59±0,82 мкг/мл, в группе потенциально патогенных, т.е. лишенных гена холерного токсина, но сохранивших ген пилеобразования (ctx-tcp+) – 4.1±0,38 мкг/мл, у авирулентных (ctx-tcp-) – 5,3±0,47 мкг/мл. В опытах по характеристике морфофункциональных изменений клеток Панета использовали 3 штамма холерных вибрионов эльтор: а) выделенный от больного холерой (�� ctx�� + tcp�� +), АЛА – 2 мкг/мл; б) выделенный от вибриононосителя (ctx- tcp+), АЛА – 3 мкг/мл; в) авирулентный штамм, выделенный из речной воды (ctx- tcp-), АЛА – 4 мкг/ мл. Крольчата, зараженные вирулентным штаммом, выделенным от больного, пали на следующий день с типичным холерогенным синдромом. АЛА при этом практически не изменилась. Крольчата, зараженные культурой от вибриононосителя, не пали, в кишечнике визуальных изменений не было, штамм сохранял жизнеспособность в течение всего срока эксперимента, при этом АЛА резко повысилась с 3 до 7 мкг/мл, что свидетельствует о роли этого признака в персистенции холерных вибрионов и, возможно, формировании вибриононосительства. У крольчат, инфицированных водным штаммом, патолого-анатомические изменения отсутствовали. Штамм быстро (в течение суток) погибал, при этом АЛА у выживших в первые часы клеток снизилась с 4 до 1 мкг/мл. Таким образом, можно констатировать, что лишь высокие показания АЛА способствуют выживанию и персистенции холерных вибрионов в организме хозяина. При анализе морфофункциональных изменений в КП энтероцитов кишечника было установлено следующее. У интактных животных в цитоплазме КП содержались гранулы низкой и высокой электронной плотности, очевидно, находящиеся на разных этапах созревания. У крольчат, зараженных штаммом от больного холерой, КП содержали меньше гранул секрета, чем клетки интактных животных. Гранулы чаще всего имели электроннонеплотное содержимое. Уменьшение количества секреторных гранул согласуется 215 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки с данными литературы об усилении секреции лизоцима клетками Панета в крипты тонкого кишечника в ответ на введение патогенных микроорганизмов (Шахламов В.А., Солнышкова Т.Г., 1992). Штамм холерных вибрионов, выделенный от носителя с высокой АЛА, вызвал резкое повышение количества в цитоплазме КП секреторных гранул средней и высокой электронной плотности. Это, вероятно, связано с тем, что КП компенсаторно активно реагируют на инфицирование кишечника холерными вибрионами с высокой АЛА (вызывающей быструю деградацию лизоцима) путем образованием новых секреторных гранул, содержащих этот белок. У крольчат, инфицированных невирулентным штаммом, выделенным из воды, резко снизившим АЛА, КП выглядели так же, как и у интактных животных. Таким образом, результаты наших исследований показали, что функциональная активность клеток Панета напрямую зависит от уровня антилизоцимной активности холерных вибрионов. Максимальные изменения в структуре клеток вызывают штаммы, обладающие наиболее высокой антилизоцимной активностью. Реакция нейроцитов сенсомоторной коры на малые радиационные воздействия в ранние и отдаленные сроки Сгибнева Н.В. МОУ ВПО Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж В практике радиационной защиты под термином «малые дозы» понимают дозы, которые не вызывают ярко проявляющихся последствий облучения. Считается, что при этом могут возникать лишь стохастические эффекты. Для млекопитающих эти дозы составляют 50 сЗв. Однако никаких структурнофункциональных обоснований этой дозы, в частности для головного мозга, не приводится. Многолетние клинические наблюдения показали, что нервно-психические нарушения у лиц, длительное время находящихся в условиях контакта с «малыми дозами» ионизирующего излучения, развиваются на выраженном астеническом фоне и представляют собой, в целом, нарушения центральных регуляторных механизмов. Наиболее часто они проявляются повышенной эмоциональной напряженностью, тревожностью, чувством психического дискомфорта, страхом, угнетенным настроением, а также нарушением социального взаимодействия индивидуумов, что выражается ростом социальноэкономических требований. В данной ситуации не всегда возможно отличить истинную патологию от проявлений радиофобии, т.к. в большей мере стра- 216 Сборник научных трудов дает психическое состояние человека, подверженного радиоактивному воздействию. В эксперименте на 48 белых беспородных крысах-самцах, массой 200– 230 г, подвергнутых общему гамма-облучению в дозе 0,5 Зв с мощностью дозы 50 сГр/ч гамма-квантами Со60, изучена структурно-функциональная перестройка нейроцитов больших полушарий головного мозга. Участки сенсомоторной коры (граница полей FPa и FPp, слои III, IV, V) забирали через 1 сут и 1 год пострадиационного периода, фиксировали в формалине, пропаноле и жидкости Карнуа. Парафиновые срезы окрашивали туллоидиновым синим по Нисслю, азуром А по методике Shea S.K., гематоксилином и эозином. В процессе исследования подсчитывали количество нервных и глиальных клеток на единицу площади, из них определяли количество нормохромных клеток, реактивных (по гипо- и гиперхромному типам), а также количество нейроцитов с альтеративными изменениями (пикноморфные клетки, клеточные тени). Статистическая обработка результатов проводилась при помощи компьютерной программы Microsoft�� Excel�� , основные результаты которой представлены в таблице. Таблица клетки-тени Пикноморфные Глиальных клеток всего на единицу площади Глия сателлитная 19,0± 0,8 Деструктивные нейроциты гипохромные Биолог. контроль Реактивные нейроциты гиперхромные 0,5 Зв с мощ. 24,2± 50 сГр/ч 1,5 через 1 сут Биолог. 23,3± контроль 1,3 0,5 Зв с мощ. 27± 50 сГр/ч 2* через 1 год 11,6± 0,6* 5,0± 0,5* 5,3± 0,4 2,0± 0,2 1,6± 0,1* 13,0± 1,7 6,0± 0,8 13,0± 0,8 7,2± 0,4 2,0± 0,3 1,0± 1,2* 6,0± 0,6 3,2± 0,1* 2,0± 0,2 2,0± 0,2* 0,80± 0,05 2,0± 0,2* 12,0± 0,5 23,2± 1,2* 5,0± 0,5 7,6± 1,2 8,0± 0,6 5,5± 0,2 2,0± 0,2 1,5± 0,1 1,20± 0,05 20,0± 0,4 6,5± 0,7 Нормохромные нейроциты Нейроцитов всего на единицу площади Способ и время после воздействия Соотношение различных типов нейроцитов сенсомоторной коры крыс после действия гамма-излучения Примечание: *p < 0,05 – достоверное отличие от контроля. 217 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки В итоге можно заключить, что воздействующий фактор не вызывает существенной перестройки в сенсомоторной коре как в ранние, так и в отдаленные сроки наблюдения, большинство нервных клеток остается интактными. Отметить можно лишь некоторые изменения реактивного характера, происходящие по гиперхромному типу, через 1 год после облучения, что свойственно нервным клеткам как высоко чувствительным структурам к различным воздействующим факторам. Это подтверждает полученные ранее в нашей лаборатории данные о незначительном влиянии исследуемой дозы ионизирующего излучения и на другие отделы головного мозга. Морфофункциональные особенности неоангиогенеза в околоопухолевых участках подслизистой оболочки при раке желудка Сеньчукова М.А., Стадников А.А., Шевлюк Н.Н., Боков Д.А. ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава» Оренбург Оценка ангиогенеза опухоли в настоящее время рассматривается как один из самых успешных маркеров прогноза течения заболевания, наличия метастазов и чувствительности к противоопухолевой терапии. Морфофункциональная характеристика сосудов на участках, расположенных рядом с опухолью, исследована недостаточно. Изучение особенностей строения и архитектоники сосудистого русла на прилежащих к опухоли участках может способствовать раскрытию механизмов опухолевого роста. Цель настоящего исследования – установить особенности строения сосудов подслизистой основы на участках, пограничных с опухолью, у больных раком желудка. Для этого исследовали гистопрепараты подслизистой основы желудка у 63 радикально оперированных больных раком желудка. Материал для исследования забирали сразу же после удаления пораженного органа, отступя 3–5 см от видимого края опухоли, и подвергали стандартной гистологической обработке с окраской гематоксилином Майера и эозином. Морфометрические исследования выполняли с использованием окуляр-микрометра МОВ-1,5. Проводили измерение толщины стенок сосудов, размеров эндотелиальных клеток. Полученные данные сопоставлены с клиническими особенностями опухолевого процесса у оперированных больных. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием критерия t Стьюдента для сравнения средних значений величин и критерия z для оценки долей. Проведенное исследование позволило установить вовлечение в патологический ангиогенез сосудов подслизистой основы желудка на участках, рас218 Сборник научных трудов положенных рядом с опухолью. Особенности строения сосудистой стенки позволили нам выделить несколько типов сосудов в исследованных гистопрепаратах. Большинство сосудов, расположенных рядом с тканью опухоли, не имели мышечной оболочки. Внутренняя оболочка состояла из уплощенных эндотелиальных клеток, подэндотелиальный слой отсутствовал. Сосуды этого типа отличались разнообразием форм и размеров. Окружающая их соединительная ткань содержала большое количество толстых коллагеновых волокон и отличалась плотной компактной структурой. Толщина стенок описанных сосудов колебалась от 6,6 до 34,5 мкм и в среднем составляла 17,43+4,05 мкм. Наличие выраженной мышечной оболочки было характерным для сосудов артериального типа. Толщина их стенки составляла 56,2±2,6 мкм. Преобладание в подслизистой желудка сосудов этого типа отмечено в 9 (14,3%) случаях. Наибольший интерес представляли сосуды микроциркуляторного русла, имеющие полостное или трубчатое строение и образованные одним слоем эндотелиальных клеток. Окружающая сосуды соединительная ткань была представлена рыхлыми пучками тонких фибрилл. Ядра клеток, выстилающих полостные и трубчатые сосуды, имели некоторые отличительные особенности. В полостных образованиях клетки имели уплощенные темные ядра с довольно однородной структурой. В трубчатых структурах ядра клеток были овальной формы, округлые на поперечных срезах, с нежно-сетчатой структурой хроматина. Полостные образования встречались не только в подслизистой основе, но и в мышечной пластинке слизистой оболочки желудка. Продольный размер ядер эндотелиальных клеток не отличался между собой в сосудах микроциркуляторного русла, но был достоверно меньше, чем в лишенных мышечной оболочки сосудах первого типа (16,6±1,23 мкм, 16,74±1,17 и 22,41±1,27 мкм соответственно). При сравнении поперечных размеров ядер установлено, что максимальный размер имели светлые овальной формы ядра эндотелиальных клеток в сосудах трубчатого типа. Они были более чем в 2 раза больше ядер клеток, выстилающих сосуды, имеющие полостное строение, и почти в 4 раза больше ядер клеток в сосудах первого типа (9,97± 0,81 мкм, 4,01±0,06 мкм и 2,62±0,28 мкм соответственно). Предполагаем, что отличия в строении ядер описанных сосудов могут свидетельствовать об их различном происхождении и неодинаковой роли, которую они играют в опухолевой прогрессии при раке желудка. Мы сопоставили наличие сосудов, образованных одним слоем эндотелиальных клеток, в подслизистой основе желудка с клиническими характеристиками опухолевого процесса. У 25 из 28 больных (89,3%) с метастазами в регионарных лимфоузлах в ближайших к опухоли участках подслизистой основы обнаружены описанные выше сосуды, тогда как у больных без метастазов они выявлены только в 8 из 35 случаев (22,8%). Из этих 8 больных 5 имели стадию �� T�� 3�� N�� 0�� M�� 0. Содержание полостных структур в мышечной пла219 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки стинке слизистой оболочки желудка также было достоверно выше в группе больных с метастазами в лимфоузлах. Выраженная тенденция к увеличению количества сосудов микроциркуляторного русла и полостных образований в мышечной пластинке слизистой оболочки отмечена при увеличении размеров опухоли и снижении степени ее дифференцировки. Таким образом, наличие в подслизистой основе желудка сосудистых структур, имеющих полостное или трубчатое строение, образованных одним слоем эндотелиальных клеток свидетельствует о высокой агрессивности опухолевого процесса у больных раком желудка и может служить одним из критериев риска лимфогенного метастазирования у больных раком желудка. Пластичность моноаминоксидазы в нейропиле некоторых структур мозга крыс с разной локомоцией Сергутина А.В. Научный центр неврологии РАМН, Москва В последние годы возрос интерес к исследованиям пластичности ЦНС. Среди этих исследований важное место занимает изучение изменений активности ферментов, связанных с обменом нейромедиаторов, локализованных в нейропиле отдельных структур мозга. Целью настоящей работы являлась количественная оценка изменений активности моноаминоксидазы (МАО, субстрат триптамин) в корково-подкорковых структурах мозга крыс Вистар с высокой и низкой локомоцией при гиперфункции дофаминергической системы, вызванной введением L-ДОФА, и после ее отмены. Из литературы известно, что триптамин является модулятором серотонинергических рецепторов. Исследовали животных с двигательной активностью более 140 пересечений квадратов (высокая локомоция) (n=16) и двигательной активностью менее 70 пересечений квадратов (низкая локомоция) (n=16) в «открытом поле». В 1-ой группе опытных крыс, соответственно с высокой (n1=4) и низкой (n1=4) локомоцией, изучали гиперфункцию дофаминергической системы, которую вызывали с помощью L-ДОФА-содержащего препарата мадопар-125 (Roche, Швейцария). Его вводили ежедневно в течение 2-х недель в дозе 25,5 мг/кг массы тела, создавая физиологическое действие, соответствующее дозе 50 мг/кг массы тела чистого L-ДОФА. Во 2-ой группе опытных крыс с высокой (n2=4) и низкой (n2=4) локомоцией изучали отмену L-ДОФА через 2 недели после его последнего введения. Контрольным животным с высокой и низкой локомоцией вводили физиологический раствор. В криокатных срезах (толщина 20 мкм) сенсомоторной коры (слои III и V), хвостатом и прилежащем ядрах, гиппокампе (поле СА 3) выявляли активность 220 Сборник научных трудов МАО (субстрат триптамин) (�� Glenner�� , �� Burtner�� , �� Broun�� , 1957), которую количественно определяли на микроскопе ЛЮМАМ- И3 (Россия). Из таблиц 1 и 2 можно видеть, что активность МАО, локализованная в нейропиле всех исследованных структур мозга, различается как между этими структурами, так и между животными с особенностями локомоции. Выявляются различия активности МАО в структурах мозга и в зависимости от контрольной серии животных высокой и низкой локомоции, что в целом свидетельствует о выраженной пластичности цитохимического показателя активности МАО. В работе использовали соответствующий контроль активности МАО в мозге крыс с разной локомоцией при исследовании влияния L-ДОФА и его отмены. У крыс с высокой локомоцией под влиянием L-ДОФА значимо снижается активность МАО в слоях сенсомоторной коры и исследованных ядрах стриатума, тогда как в гиппокампе активность МАО несколько возрастает. Отмена L-ДОФА приводит к возрастанию активности МАО в слоях коры и хвостатом ядре, а в прилежащем ядре и гиппокампе – к ее нормализации (табл.). У крыс с низкой локомоцией под влиянием �� L�� -ДОФА активность МАО значимо снижается в хвостатом ядре и не изменяется в остальных исследованных структурах мозга. При отмене �� L�� -ДОФА не только сохраняется снижение активности МАО в хвостатом ядре, но активность фермента снижается и в слое V сенсомоторной коры (табл.). Полученные данные свидетельствуют, что у крыс с высокой локомоцией ответная реакция МАО на влияние L-ДОФА проявляется во всех структурах мозга, в основном в виде ее торможения, а отмена L-ДОФА сопровождается активированием МАО в коре и хвостатом ядре. У крыс с низкой локомоцией торможение МАО проявляется менее значительно (хвостатое ядро), оно сохраняется и после отмены �� L�� -ДОФА, проявляясь и в структурах коры. Можно заключить о различной ответной реакции мозга крыс с особенностями локомоции на введение L-ДОФА и ее отмену по показателю активности МАО. Таблица Изменения активности МАО (M±SEM) в ЦНС крыс Вистар с высокой и низкой локомоцией в «открытом поле» при введении L-ДОФА (2 недели) и после его отмены Группа крыс Контроль и опыт Слой III коры Слой V коры Крысы с высокой локомоцией Контроль 1 L-ДОФА Контроль 2 0,649± 0,005 0,711± 0,005 0,614±0,005 94,6%∗ 0,642±0,005 90,3%∗ 0,435± 0,004 0,565± 0,004 Отмена L-ДОФА 0,519±0,004 119,3%∗ 0,636±0,004 112,6%∗ 221 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Окончание таблицы Группа крыс Контроль и опыт Хвостатое ядро Прилежащее ядро Гиппокамп Группа крыс Контроль и опыт Слой III коры Слой V коры Хвостатое ядро Прилежащее ядро Гиппокамп Крысы с высокой локомоцией Контроль 1 L-ДОФА Контроль 2 0,515± 0,004 0,710± 0,005 0,377± 0,006 0,486±0,004 94,3%∗ 0,580±0,005 81,7%∗ 0,395±0,006 104,8%∗ 0,386± 0,003 0,591± 0,005 0,401±0,004 Отмена L-ДОФА 0,415±0,003 107,5%∗ 0,580±0,005 98,1% 0,395±0,004 98,4% Крысы с низкой локомоцией Контроль 1 L-ДОФА Контроль 2 0,565± 0,005 0,626± 0,005 0,492± 0,004 0,512± 0,005 0,513± 0,006 0,581±0,005 102,9% 0,630±0,005 100,7% 0,455±0,004 92,5%∗ 0,514±0,005 100,5% 0,496±0,006 96,8% 0,422± 0,004 0,565± 0,004 0,423± 0,003 0,453± 0,005 0,393± 0,004 Отмена L-ДОФА 0,433± 0,004 102,6% 0,497± 0,004 90,6%∗ 0,279± 0,003 89,7%∗ 0,464±0,005 102,5% 0,398±0,004 101,3% Изменения выражены в % по отношению к контрольному уровню, принятому за 100%. ∗ – р < 0,05. Каждое воздействие имеет свой контроль. Опыт использования структурно-информационного анализа в оценке функциональной организации комплекса Гольджи фибробластов человека Сесорова И.С., Лазоренко Т.В. Ивановская государственная медицинская академия, Иваново Известно, что комплекс Гольджи является сложно организованной в пространственно-временных отношениях динамической мембранной системой, морфологические характеристики которой могут изменяться во времени и зависеть от функциональной активности органеллы. Поэтому, представляется сложным подбор математических методов оценки функциональной организации комплекса Гольджи. В связи с этим, мы использовали структурно-ин- формационный анализ, который позволяет получить интегральные критерии 222 Сборник научных трудов состояния органеллы с позиции теории информации и может, на наш взгляд, дать более четкое представление об организации, функционировании и адаптивных возможностях комплекса Гольджи, а также дает возможность проведения сравнительного анализа органеллы в разных клетках. Для получения информационной характеристики комплекса Гольджи необходимо выбрать число учитываемых морфологических показателей органеллы и вероятность их нахождения в определенный момент времени. В качестве таких параметров мы взяли процентное соотношение мембран органеллы, приходящихся на три основных структурных элемента комплекса Гольджи: везикулы, трубочки и цистерны. Процентное соотношение мембран определялось на электронограммах 30 диктиосом комплекса Гольджи фибробластов кожи человека, с помощью морфометрической решетки. Совокупность полученных данных была разбита на 14 классов методом кластерного анализа с помощью программы Statistica 6.0. Классы приняли за число возможных состояний комплекса Гольджи, которое использовалось при расчетах следующих информационных показателей: Н – информационная энтропия (негэнтропия); Нмах (Q) – максимальная информационная емкость системы (максимальная энтропия системы); S – абсолютная организация системы; R – относительная организованность системы или коэффициент избыточности; �� h �� – относительная энтропия или коэффициент сжатия информации. Максимальная информационная емкость определялась логарифмом по основанию «2» от числа состояний системы: Н mах (Q)=n log2m, где n – число компонентов в системе, m – число возможных позиций. Под информационной энтропией понимается отрицательная величина суммы произведений вероятностей нахождения системы в определенном структурном или функциональном состоянии и соответствующих им двоичных логарифмов: где Н – информационная энтропия, Pi – вероятность нахождения системы в структурном состоянии. Абсолютная организация системы: . Относительная организованность системы: . Относительная энтропия: . По показателям максимальной энтропии, систему мембран комплекса Гольджи фибробластов человека можно отнести к очень сложным детерминированным биологическим системам, у которых все «входящие», «проме223 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки жуточные» и «выходные» параметры должны находиться в жестких функциональных зависимостях. При этом низкий коэффициент сжатия информации (31%), характеризует высокую степень упорядоченности и структурной целостности органеллы. Большая доля избыточной информации (69 бит) указывает на большой морфо-функциональный резерв, благодаря чему комплекс Гольджи может быстро адаптироваться к различным факторам среды и функциональным нагрузкам, например, транспортировке и гликолизированию больших объемов транспортируемых молекул, а также на степень развития регуляторных механизмов, обеспечивающих структурную целостность этой сложной органеллы. Таким образом, информационные показатели можно использовать для характеристики органеллы, при подборе методов исследования, а также для сравнительного анализа состояния секреторного аппарата клеток разных типов и тканей, или находящихся в разных условиях, или при разной функциональной нагрузке. Изучение активности метастина при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы Сетдикова Г.Р., Паклина О.В., Цыганов С.Е. Клиническая больница № 119 Федерального Медико-Биологического Агентства России, Химки, Клиническая больница им. С.П. Боткина, Москва Протоковая аденокарцинома (ПАК) составляет 75% от числа всех первичных опухолей поджелудочной железы (ПЖ), при которой уровень заболеваемости равен уровню смертности. Низкие уровни выживания связаны с агрессивным биологическим фенотипом, который характеризуется ранней местной инвазией и метастазированием. Одной из причин этого является изменение в генах-супрессорах опухолевых клеток. Метастин (�� KISS�� -1) относится к генам, подавляющим метастатическую активность опухоли. Впервые описан в 1996 году как ген-супрессор в клетках меланомы. Целью нашего исследования явилось изучение активности метастина при протоковой аденокарциноме. Работа основана на операционном материале, полученном от 30 больных, находившихся на лечении в ГУ им. С.П. Боткина и КБ № 119 в 2007–2009 годах по поводу протоковой аденокарциномы. Для контроля взяли 7 образцов неизмененной ткани поджелудочной железы (аутопсийный материал). Среди больных преобладали мужчины 24 человек, возраст больных колебался от 28 до 224 Сборник научных трудов 68 лет, средний возраст – 48 лет. Женщины среди них составляли 6 человек, возраст которых колебался от 45–63 лет, со средним возрастом – 49 лет. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. В им- муногистохимическом исследовании использовали стрептавидин-биотин-пе- роксидазный метод, согласно схеме, рекомендуемой фирмой-производителем, на парафиновых срезах толщиной 2 мкм с докраской ядер гематоксилином (Shandon). В качестве первичных антител использовали �� Metastin�� фирмы (�� Abcam�� ). Интенсивность реакций оценивали полуколичественным методом (–)-отрицательная реакция; (+) – слабая очаговая реакция; (++) – средняя, (+++) – интенсивная с распространением по всей цитоплазме. В результате проведенного исследования отмечена интенсивная реакция (+++) в 85,0% (6 из 7) ткани контроля. В образцах ткани с подтвержденными метастазами (7 из 30) отмечалась слабая (+) очаговая реакция. В оставшихся 23 образцах экспрессия выглядела следующим образом: интенсивная (+++) в 4,4% (1 из 23), средняя интенсивность (++) встречалась в 82,6% (19 из 23), слабая (+), в 13,0% (3 из 23). Таким образом, снижение экспрессии метастина в ПАК ПЖ может быть связано с худшим прогнозом. Необходимо дальнейшее изучение метастина, как независимого прогностического фактора для оценки выживаемости пациентов с раком поджелудочной железы. Механизмы клеточной гибели лютеоцитов яичника Сковородин Е.Н., Вехновская Е.Г. ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», Уфа Механизмы формирования и инволюции эндокриноцитов желтого тела яичника изучены недостаточно. Установлено, что образование желтого тела сопровождается быстрой пролиферацией и дифференциацией фолликулярных клеток (Smith, 1994). Компетентные клетки и цитокины вовлекаются в образование и регрессию желтого тела у различных видов животных (Brannstorm, Norman, 1993). В желтом теле крупного рогатого скота происходит экспрессия генов, ответственных за образование интерлейкина-1β (IL-1β), �� IFN�� -γ, β �� TNF�� -ά (�� Petroff�� et�� al�� ., 1999). Эти цитокины эффективно действуют на клетки желтого тела in vitro (Nothnick, Pate, 1990; Fairchild, Pate, 1991; Fairchild, Pate, 1992; Townson, Pate, 1994). Иммуногистохимические исследования позволили установить ведущую роль макрофагов в лютеолизисе. Т-лимфоциты способны продуцировать факторы, ингибирующие миграцию макрофагов. Количество клеток, продуцирующих этот фактор, в различные стадии функционирования желтых тел существенно изменяется (Pate, 1994; Zhao, 1998; Bove, 2000). 225 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Цель работы – с помощью гистологических, гистохимических и электронно-микроскопических методов выяснить закономерность гибели лютеоцитов желтых тел яичника коров в норме, при патологии и при введении синтетического аналога простагландина F2α – эстуфалана. Для получения кусочков желтых тел беременности (2–3 мес стельности), полового цикла и персистентного желтого тела проводили биопсию яичников. Материал обрабатывали с помощью общепринятых методов. Установили, что желтые тела беременности, полового цикла и персистентные имеют между собой существенную структурную разницу. Ультраструктура желтого тела беременности свидетельствует о том, что это – активно функционирующая эндокринная железа, представленная крупными лютеоцитами и тека-лютеиновыми клетками с признаками активного синтеза и секреции, а также крупными лютеоцитами в состоянии «покоя». Все эти клетки взаимодействуют между собой через межклеточные контакты, окружены рыхлой соединительной тканью, содержащей малодифференцированные клетки и макрофаги. Желтое тело имеет развитое микроциркуляторное русло, образованное, главным образом, капиллярами фенестрированного типа. На ультраструктурном уровне желтое тело полового цикла представлено крупными лютеоцитами и тека-лютеиновыми клетками с признаками умеренной синтетической активности. Лютеолитические процессы хорошо выражены, отмечено упрощение межклеточных контактов, фиброзные изменения соединительной ткани, нарушения кровообращения в регионе микроциркуляторного русла, апоптоз лютеоцитов с последующим фагоцитозом апоптозных телец макрофагами. Гибель клеток в персистентных желтых телах развивается по типу дистрофии, а затем некроза. Вначале отмечаются обратимые изменения органелл, в дальнейшем – разрушение клеточных мембран, прежде всего у митохондрий, появление крупных капель нейтральных жиров. В дальнейшем развивается фокальный некроз цитоплазмы лютеоцитов, который заканчивается гибелью клетки с последующим фагоцитозом ее остатков макрофагами. При изучении лютеолитических процессов мы впервые обнаружили факт высокой активности макрофагов желтого тела. По нашим данным, макрофаги активно внедряются в разрушающиеся по типу липофанероза крупные лютеиновые клетки. Цитоплазма последних заполнена крупными каплями жира и содержит митохондрии с вакуолизированными и разрушенными кристами. Если у макрофага клеточная мембрана сохранена, то у лютеиновой клетки она видна только в отдельных участках межклеточного взаимодействия. Подобные взаимоотношения наблюдаются часто, особенно по отношению к лютеоцитам с необратимыми изменениями цитоплазмы. Фагоцитоз лютеиновых клеток, разрушающихся по типу липофанероза, напоминает аналогичные картины формирования атеросклеротических бляшек в аорте. 226 Сборник научных трудов Полученные данные указывают на то, что синтетический аналог простагландина F2α эстуфалан обладает лютеолитическим действием на желтые тела полового цикла коров. Исходя из полученных данных, наиболее оптимальной дозой эстуфалана для коров является 500 мкг. При этом морфологические изменения в тканях желтого тела напоминают естественные лютеолитические процессы в желтых телах полового цикла, но с более выраженными дистрофическими изменениями не только в крупных лютеоцитах, но и в текалютеиновых клетках. Вследствие развития анемии и ишемии сосудов железы происходит активация макрофагов, уничтожающих погибающие клетки. В то же время фиброзные процессы выражены слабо, что приводит к быстрому рассасыванию желтого тела без его персистенции и образования лютеинизированных тел. Морфологическая характеристика эндокринных клеток тощей и подвздошной кишки потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени Смекалина О.Ю., Брюхин Г.В. Челябинская государственная медицинская академия, Челябинск На фоне продолжающегося демографического кризиса в России одной из актуальных проблем на сегодняшний день остается воспроизводство здорового потомства. В настоящее время отмечается увеличение числа женщин фертильного возраста с различными экстрагенитальными заболеваниями, что является ведущим фактором в случаях беременности с высоким риском. Особое место среди этих заболеваний занимают болезни гепатобилиарной системы. В связи с этим, целью настоящего исследования явился анализ особенностей морфофункционального состояния эндокринных клеток тонкого кишечника потомства матерей с хроническим экспериментальным поражением печени. В эксперименте были использованы белые лабораторные крысы-самки «Вистар» и их потомство на 45-е сутки. Животные были разделены на 2 группы: 1) потомство от интактных матерей (контрольная группа); 2) потомство от матерей с хроническим экспериментальным поражением печени с помощью �� E�� .coli, морфологические изменения при котором соответствуют таковым при гепатите А. Эндокринные клетки в эпителии слизистой оболочки тощей и подвздошной кишки выявляли общепринятой методикой серебрения в модификации Гримелиуса с использованием импрегнации азотнокислым серебром. Оценивалось общее количество эндокринных клеток, а также их функциональное состояние путем определения субпопуляционного состава 227 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки эндокриноцитов с учетом их гранулярного насыщения и уровня дегрануляции по методике Линднера в нашей модификации. В ходе проведения исследования нами установлено, что у потомства подопытных животных в эпителии слизистой оболочки, как тощей, так и подвздошной кишки, количество эндокриноцитов достоверно превышает таковое в контроле. В расчете на 100 эпителиоцитов количество эндокринных клеток в тощей кишке подопытных животных составило 1,14±0,07 клеток (контроль – 0,72±0,05), в подвздошной – 1,5±0,04 и 0,79±0,06 клеток соответственно (р<0,05). Анализ субпопуляционного состава эндокриноцитов по степени гранулярного насыщения позволил выявить следующие закономерности (табл.). Таблица Субпопуляционный состав эндокриноцитов тонкого кишечника, р<0,05 Тощая кишка, контроль Тощая кишка, опыт Подвздошная Подвздошная кишка, кишка, контроль опыт Эндокриноциты с низкой степенью гранулярного насыщения,% 46,2±0,83 34,53±0,92 48,71±1,14 37,95±1,2 Эндокриноциты с высокой степенью гранулярного насыщения,% 54,18±0,93 65,27±1,12 52,18±1,13 61,84±0,86 Индекс гранулярного насыщения эндокриноцитов 1,21±0,17 1,74±0,15 1,16±0,18 1,77±0,22 Эндокриноциты с низкой степенью дегрануляции,% 72,31±0,45 76,63±0,38 54,99±1,03 73,98±0,72 Эндокриноциты с высокой степенью дегрануляции,% 27,72±0,67 23,37±0,51 44,17±0,92 25,77±0,87 Индекс дегрануляции эндокриноцитов 1,02±0,07 0,83±0,01 1,27±0,02 0,83±0,01 Как видно из таблицы, у подопытных крысят в тощей кишке содержание эндокриноцитов с высокой степенью гранулярного насыщения превышает таковое в контроле. Соответственно, содержание клеток с низким уров228 Сборник научных трудов нем гранулярного насыщения у подопытных крысят снижено по сравнению с контролем. Аналогичная ситуация наблюдается и в подвздошной кишке. Эти данные находятся в полном соответствии с изменением величины индекса гранулярного насыщения. Анализ субпопуляционного состава эндокриноцитов по степени дегрануляции позволил выявить следующие закономерности (табл.). Как видно из таблицы, у подопытных крысят в эпителии слизистой оболочки тонкого кишечника содержание эндокриноцитов со слабой степенью дегрануляции превышает таковое в контроле, в то время как число клеток с высокой степенью дегрануляции, напротив, снижено. Эти данные полностью согласуются со снижением у подопытных крысят индекса дегрануляции эндокриноцитов. Секреторный процесс любой клетки включает две стадии: синтетическую и выделительную. Первая стадия морфологически оценивается с помощью теста гранулярного насыщения клетки, вторая – с помощью оценки степени дегрануляции клетки. В нашем исследовании выявлено, что количество эндокриноцитов слизистой оболочки тощей и подвздошной кишки повышено в опыте по сравнению с контролем, что можно рассматривать как своеобразную компенсаторно-приспособительную реакцию. У подопытной группы крысят среди эндокриноцитов преобладают клетки с высоким уровнем гранулярного насыщения, что позволяет говорить об усилении синтетической стадии секреторного цикла. Но в то же время, у них снижено число активно дегранулирующих клеток, что свидетельствует об угнетении процесса выделения секрета. Исходя из этого, можно говорить о нарушении сопряжения стадий секреторного цикла, что указывает на нарушение процесса ауторегуляции. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что у самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени рождается потомство с компрометированным эндокринным статусом. Структурные изменения в респираторных отделах легких при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила Смирнов А.В., Бутенко А.М., Быхалов Л.С. Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва, Волгоградский научный центр РАМН и АВО, Волгоград На сегодняшний день лихорадка Западного Нила (ЛЗН) остается одним из наиболее актуальных арбовирусных инфекционных заболеваний, что обусловлено, сохраняющимся ростом заболеваемости среди населения в южных ре- 229 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки гионах России, некоторых странах Европы, Азии, Африки, Северной Америки (Львов Д.К. с соавт., 2004; Crichlow R., Bailey J., 2004; Diallo D. et al., 2008; Goody R.J., 2008; Siddharthan V., 2009). Как показано в ряде отечественных и зарубежных исследований, вспышки лихорадки Западного Нила протекают в большинстве случаев с развитием серозного менингита, менингоэнцефалита и охватывают в короткий срок значительные группы населения (Писарев В.Б. с соавт., 2004; Львов Д.К. с соавт., 2004; Шмидт М.В., 2006; Писарев В.Б., Бутенко А. М., 2007). Примерно в 24% случаев заболевание протекает без поражения ЦНС под маской острого лихорадочного состояния с общим интоксикационным синдромом и/или респираторной вирусной инфекции, однако у пациентов с синдромами иммунного дефицита, при иммуносупрессорной терапии после трансплантации органов (легких, печени, почек) отмечена манифестация заболевания с высокой летальностью (Львов Д.К. с соавт., 2004; Григорьева Н.В., 2005; Писарев В.Б. с соавт., 2007; Cushing M.M., 2004; Costa A.N., 2008; Allain J.P, Stra- mer S L., 2009). Цель нашей работы – охарактеризовать морфологические особенности респираторных отделов легких при экспериментальном моделировании ЛЗН. Моделирование лихорадки Западного Нила (ЛЗН) производилось в лаборатории арбовирусных инфекций (зав. лаб. проф. А.М. Бутенко) ГУ НИИ вирусологии РАМН им. Д.И. Ивановского (директор, академик РАМН Д.К. Львов). В работе использовали белых мышей-самцов массой 10±2 г в возрасте 30 суток, которые были заражены вирусом Западного Нила (ЗН), астраханский штамм (Астр 901), подкожно в разведении 10–20,3 мл (10 животных). Заболевших животных с клинической симптоматикой ЛЗН забивали на 14-е сутки (период реконвалесценции, 10 животных) под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Контролем служили ложноинфицированные мыши-самцы (10 животных), которым подкожно вводили 0,3 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Ткань легкого фиксировали в течение 12 часов в 4% растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (рН = 7,4) при температуре +4оС. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50–90 нм получали на ультрамикротоме LKB-8800 и монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5%-м растворе уранилацетата на 50о этаноле в течение 40 минут и 0,3%-м растворе цитрата 230 Сборник научных трудов свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопластинок «Для ядерных исследований». Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической чернобелой бумаге «Унибром 160 БП». При исследовании мышей с клиническими проявлениями ЛЗН, выведенных из эксперимента на 14-е сутки (период реконвалесценции), у животных отмечается значительное уменьшение неврологической симптоматики. В большинстве альвеол обнаруживался серозно-геморрагический экссудат. В межальвеолярных перегородках отмечено появление единичных нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов. Обнаруживалось умеренно выраженное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла, капилляров межальвеолярных перегородок во всех наблюдениях. Выявлено краевое стояние и адгезия нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов в сосудах микроциркуляторного русла. В отдельных случаях отмечено нарушение целостности стенок в сосудах микроциркуляторного русла, повреждение эндотелиальной выстилки с апоптозными изменениями в эндотелиоцитах, агрегацией тромбоцитов и образованием микротромбов. При электронно-микроскопическом исследовании легких у животных с клинической картиной лихорадки Западного Нила на 14-е сутки эксперимента обнаруживается различная выраженность ультраструктурных изменений в респираторных отделах легких. В альвеолах в большинстве случаев сохранялись дистрофические изменения в респираторных эпителиоцитах. В их цитоплазме выявлены участки повреждения органелл и плазматической мембраны, зоны внутриклеточного отека. Базальная мембрана капилляров во многих участках была истончена и разрыхлена. Встречались межальвеолярные перегородки с локальной деструкцией базальной мембраны. В некоторых эндотелиоцитах обнаруживается очаговый выраженный отёк цитоплазмы с образованием крупных пузырьковидных митохондрий с лизисом крист. Утолщение межальвеолярных перегородок сопровождалось снижением средней площади воздушного пространства альвеол легких на 25,1% (Р<0,001) по сравнению с контролем на фоне прогрессивного увеличения толщины межальвеолярных перегородок на 25,3% (Р<0,001), что свидетельствует о сохранении морфологических признаков повреждения различных компонентов респираторных отделов легких, несмотря на уменьшение неврологической симптоматики. 231 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Особенности повреждения и регенерации β-клеток панкреатических островков при экспериментальном сахарном диабете Снигур Г.Л., Спасов А.А., Воронкова М.П., Буланов А.Е. Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград На сегодняшний день одной из ведущих медико-социальных проблем, имеющей ранг социально-значимого заболевания, является сахарный диабет (СД). Современная фармакология ведет активный поиск антидиабетических средств с новыми механизмами действия, которые способны регулировать секрецию инсулина, стимулировать пролиферацию и препятствовать гибели β-клеток. Целью работы явилось выявление особенностей повреждения и репаративной регенерации β-эндокриноцитов панкреатических островков при экспериментальном сахарном диабете. Исследование выполнено на белых крысах-самцах, массой 300–340 г, разделенных на группы: 1 – интактная (n=10); 2 – стрептозотоцин-индуцированный СД (n=10); 3 – стрептозотоцин-индуцированный СД на фоне введения гимнемовых кислот (n=10). Диабет моделировали ежедневным в/в введением стрептозотоцина в дозе 20 мг/кг в течение 5 дней. В 3-й группе перорально вводили экстракт гимнемовых кислот в дозировке 280 мг/кг, 2 раза/сутки. Животные контрольной группы и с моделью СД получали питьевую отстоянную воду в аналогичном объеме. Спустя три недели, соблюдая принципы гуманного отношения, животных выводили из эксперимента. Ткань поджелудочной железы фиксировали в течение 24 часов в 10% растворе нейтрального забуференного формалина и заливали в парафиновые блоки с последующей окраской гематоксилином-эозином и проведением иммуногистохимического исследования с инсулином и маркерами апоптоза и пролиферации по протоколам фирм-производителей с использованием систем детекции «LSAB» и «En Vision» и хромогеном – диаминобензидином. Морфометрический анализ проводили с помощью программы анализа изображений «ВидеоТестМорфо-4». Определяли индексы апоптоза и пролиферации (число β-клеток панкреатических островков с признаками апоптоза и пролиферации на 100%). Статистическую обработку данных проводили в программе «MS Excel» с расчетом базовых статистических показателей (M, m) и использованием парного t-критерия Стьюдента при достоверности p<0,05. 232 Сборник научных трудов В контрольной группе животных отмечалась слабая или умеренная экспрессия факторов пролиферации и апоптоза. Индекс пролиферации составлял – 1,5%, апоптотический индекс – 4,1%. У крыс со стрептозотоцин-индуцированным СД определялся выраженный отек междольковой соединительной ткани и полнокровие кровеносных капилляров. В коллабированных панкреатических островках отмечалась умеренная лимфоцитарная инфильтрация. В большинстве островков отмечались выраженные деструктивные изменения β-клеток и разрастание соединительной ткани. Инсулин-позитивные клетки располагались поодиночке или в виде мелких скоплений в центральных отделах островков. Отмечалась их гипертрофия с выраженной экспрессией инсулина и умеренной экспрессией факторов пролиферации (индекс пролиферации – 2,3%). Отмечалась выраженная экспрессия факторов апоптоза в большинстве β-эндокриноцитов. Индекс апоптоза достоверно увеличивался по сравнению с контрольной группой. В группе животных со стрептозотоцин-индуцированным СД, получавших экстракт гимнемовых кислот, в панкреатических островках сохранялась умеренная лимфоцитарная инфильтрация, полнокровие капилляров и деструктивные изменения β-эндокриноцитов. Единичные островки были полностью склерозированы. Отмечалась умеренно выраженная гипертрофия β-эндокриноцитов центральных отделов островков с выраженной экспрессией инсулина. Мелкие островки без признаков воспаления и деструкции располагались в тесной связи с выводными протоками. Среди ацинарных клеток определялись единичные инсулин-позитивные клетки или их скопления. Экспрессия факторов пролиферации носила выраженный характер. Индекс пролиферации составлял 3,2% (статистически достоверное увеличение по сравнению со 2-й группой). Отмечалась экспрессия факторов пролиферации в клетках эпителия протоков и единичных клетках ацинарной ткани, расположенных в непосредственной близости от островков Лангерганса. Умеренная экспрессия протеинов апоптоза отмечалась в единичных β-эндокриноцитах. Индекс апоптоза составил 13,3% (статистически достоверное уменьшение по сравнению со 2-й группой). Таким образом, выявлены особенности цитотоксического действия стрептозотоцина – гибель β-клеток происходит за счет активации ФНО-зависимого апоптоза (TRAIL-опосредованный механизм). Увеличение индекса пролиферативной активности при моделировании СД обусловлено репарацией не только островковых β-клеток, но и ациноинсулярных клеток и клеток эпителия протоков. За счет инкретиноподобного действия гимнемовых кислот при экспериментальном СД активируется репаративная регенерация и угнетается апоптоз β-клеток. 233 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Современные методические подходы изучения миграции клеток с использованием генетических маркеров Соловьева А.О., Повещенко А.Ф., Шевченко А.В., Коненков В.И. НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск Изучение свойств и функций стволовых клеток (СК) остается важнейшим и интригующим направлением современной медицины и биологии. В течение последних десятилетий активно разрабатываются методы клеточной терапии, в частности трансплантации стволовых клеток, в том числе мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, с целью замещения в организме поврежденных клеток и тканевых структур и восстановления функций различных органов. Костный мозг – единственный орган, в котором сосуществуют и функционально взаимодействуют два различных типа стволовых клеток: гемопоэтические и мезенхимальные. Главными функциями мезенхимальных стволовых клеток костного мозга являются: 1) формирование гемопоэзиндуцирующего микроокружения; 2) формирование стромального микроокружения; 3) участие в морфогенезе; 4) самоподдержание и восстановление пула мезенхимальных стволовых клеток; 5) участие в гомеостатических реакциях организма и в процессах регенерации, репарации и адаптации системы мезенхимальных клеток в норме и патологии. Область применения клеточных технологий в лечении многих патологий неуклонно расширяется. Немаловажным вопросом для применения клеточных технологий является изучение миграционной способности клеток костного мозга. Другими актуальными и не до конца исследованными остаются такие вопросы как: 1) определение оптимального вида трансплантируемого клеточного материала – фенотип и специализация клеток, культивированные или свежевыделенные, видовая принадлежность; 2) количество (доза) клеток на одно введение и на весь курс лечения; 3) путь и метод введения клеток; 4) механизм действия пересаженных клеток в эксперименте; 5) безопасность самой процедуры трансплантации, отсутствие побочных эффектов после нее. Целью исследования было изучение миграционной активности и пластичности клеток костного мозга в условиях эксперимента in vivo. Исследовали миграционную активность in vivo клеток костного мозга самцов линии СВА в возрасте 2–3 месяцев при сингенной трансплантации самкам. В качестве маркера миграции был использован SRY-ген клеток костного мозга самцов. В разные сроки после внутривенной трансплантации (через 1 час, 24 часа, 1 месяц, 3 месяца) были исследованы кожа, лимфатические узлы, мышцы, печень, селезенка, сердце, головной мозг сингенных реципиентов (самок линии СВА). Кроме того, был проведен сравнительный анализ 234 Сборник научных трудов количества распределения клеток в органах животных-реципиентов через 1 месяц после трансплантации по указанному маркеру. Из органов животных реципиентов выделялась ДНК. Результаты миграции стволовых клеток костного мозга мышей-доноров оценивались по наличию в тканях и органах в организме реципиента маркера: SRY – гена Y-хромосомы, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). С помощью ПЦР-анализа установлено, что через час после трансплантации маркер определялся в лимфатических узлах, печени, селезенке, сердце, сходные результаты были получены в образцах ДНК органов, забор которых производился через 24 часа. В образцах ДНК органов через 1 и 3 месяца маркер, помимо названных органов, определялся в головном мозге. Анализ миграции клеток в органы животных-реципиентов, забор которых был проведен через месяц, показал, что при внутривенном введении клеток костного мозга обнаружено максимальное количество маркера (�� SRY�� -гена) в селезенке и печени, причем в селезенке незначительно больше, чем в печени. Еще меньше маркера обнаружено в лимфатических узлах. В коже и в головном мозге определяемого маркера обнаружено значительно меньше по сравнению другими группами. В биологии стволовых клеток костного мозга пока больше вопросов, чем ответов. Именно поэтому работы по исследованию свойств клетокпредшественников костного мозга являются интригующими и привлекательными для исследователей. Однако уже сегодня имеющиеся многообещающие экспериментальные данные результатов исследований указывают на возможность клинического применения стволовых клеток костного мозга. Полученные экспериментальные результаты имеют как теоретическое, так и прикладное значение, поскольку расширяют представления о миграции и пластичности трансплантированных клеток-предшественников. Повреждение фагоцитирующих клеток при псевдотуберкулезной инфекции Сомова Л.М., Дробот Е.И., Плехова Н.Г. НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток Патология клетки издавна занимает центральное место в иерархии общепатологических процессов. С внедрением молекулярных методов исследования учение о повреждении клетки как фундаментальном биологическом явлении получило дальнейшее развитие. Было показано, что наряду с некрозом существует вторая, запрограммированная форма гибели клетки, названная апоптозом. Доказано, что апоптоз ответствен за многочисленные процессы, происходящие в организме как в норме, так и при патологии (Аббасова и др., 1999; Пальцев, Аничков, 2000). Однако до сих пор малочисленны сведения о 235 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки запрограммированной гибели клеток при инфекционных заболеваниях. На наш взгляд, феномен апоптоза, особенно индукция его в нейтрофилах и макрофагах, составляющих первую линию антиинфекционной защиты организма, имеет прямое отношение к инициации и прогрессированию инфекционных процессов. Апоптоз нейтрофильных гранулоцитов привлекает к себе внимание исследователей с позиций его роли в разрешении и контроле воспаления (Cox et al., 1995; Hastell, 1996; Serhan et al., 2007). Цель работы – дать морфофункциональную характеристику повреждения клеток – эффекторов воспаления, провести дифференциацию типов клеточных повреждений при псевдотуберкулезной инфекции. В экспериментах in vivo проводилось внутрибрюшинное заражение мышей вирулентным штаммом 3260 Yersinia pseudotuberculosis в дозе 5х105 микробных клеток. В динамике инфекции (1, 3, 7, 10, 14 и 21 сут после заражения), с применением люминесцентной микроскопии исследовали морфологию клеток периферической крови и очага воспаления (перитонеального экссудата). Для выявления некротически поврежденных клеток использовали краситель акридиновый оранжевый («Serva», США). При нарушении проницаемости плазмолеммы клетки приобретают способность к свечению в красно-оранжевом спектре, тогда как жизнеспособные клетки имеют зеленое свечение. Для выявления апоптоза клеток применяли метод окрашивания красителем Hoechst 33342 («Sigma», США). С помощью фазового контраста подсчитывали 100 клеток и определяли процент апоптотически измененных клеток по наличию специфического свечения. Установлено, что процентное содержание фагоцитов перитонеального экссудата, подверженных некрозу, возрастало в первые трое суток после инфицирования животных (рис. 1). В последующие сроки процент некротических клеток снижался, достигая нулевого значения через 10–14 суток после инфицирования. Аналогичные изменения обнаружены при исследовании клеток периферической крови. При исследовании клеток перитонеального экссудата было определено, что процент апоптотических клеток достоверно увеличивался по сравнению с контролем, с максимальными показателями через 7–14 сут после заражения (рис. 2). В периферической крови процентное содержание фагоцитов, подверженных апоптозу, постепенно возрастало к 21-м сут после инфицирования. Таким образом, анализ полученных нами данных показывал, что при экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции фагоциты подвержены некрозу в первые 3 суток после заражения, а в последующие сроки – апоптозу. В эксперименте по заражению крыс Y. pseudotuberculosis в дозе 5Х105 микробных клеток на одно животное получены аналогичные данные. Максимальное количество клеток перитонеального экссудата, подверженных 236 Сборник научных трудов некрозу, составляло 78% через 3 сут после заражения. Максимальное количество клеток, вступивших в апоптоз, выявлено через 10 сут после заражения (18%). В отпечатках печени зараженных животных обнаружены фагоциты в состоянии апоптоза. Рис. 1. Показатели некроза клеток перитонеального экссудата мышей, зараженных внутрибрюшинно Y. pseudotuberculosis. Рис. 2. Показатели (%) апоптоза клеток мышей, зараженных внутрибрюшинно Y. pseudotuberculosis. 237 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки О реализации апоптозной доминанты нейросекреторных клеток крупноклеточных ядер гипоталамуса млекопитающих в условиях инфицирования организма Стадников А.А., Шевлюк Н.Н., Козлова А.Н. ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава», Оренбург Целью настоящего исследования явилось определение генетически программированнной гибели клеток в популяции нейросекреторных клеток (НСК) супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса крыс в условиях инфицирования организма животных бактериальными патогенами (штаммы Staphylococcus aureus с различными персистентными свойствами). Объектом исследования служили белые беспородные крысы-самцы (n=30) массой 180–230гг. Инфицирование животных осуществляли путём интраназального однократного введения каждому животному взвеси микроорганизмов. Экспериментальные животные были разделены на две группы. Животным первой группы (�� n�� =15) вводили взвесь суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus с антикарнозиновой активностью в объёме 0,2 мл взвеси, содержащей 200 млн. микробов/мл. Животным второй группы (n=15) вводили взвесь штамма Staphylococcus aureus без антикарнозиновой активности в том же объёме. Материал для исследования (гипоталамус, гипофиз, фрагменты лёгкого) брали у животных через 3, 7 и 10 суток после инфицирования. Контролем служили те же органы крыс (n=9), которым интраназально однократно вводили 0,2 мл физиологического раствора. Полученный материал обрабатывали с использованием комплекса морфологических методов: световая и электронная микроскопия, иммуноцитохимия (выявление белков р53 и bcl2), морфометрия. Анализ препаратов и электронограмм показал, что в ранние сроки наблюдения на фоне воспалительного процесса в лёгких в исследованных клеточных элементах воздухоносного отдела (эпителиоциты, фибробласты, леймиоциты, эндотелиоциты, макрофаги) наблюдался феномен укрытия и длительной сохранности прокариотических клеток Staphylococcus aureus в мембранных компартментах эукариотических клеток (эндосомы, канальцы и везикулы эндоплазматического ретикулума, структуры комплекса Гольджи). Лучшая сохранность микробов наблюдалась в случае внутриклеточного персистирования более вирулентных микроорганизмов (штамм с антикарнозиновой активностью) в клеточных элементах лёгких. Морфологическими эквивалентами адаптивных преобразований в эпителиальных, соединительнотканных и гладкомышечных клетках, находившихся в условиях взаимо- 238 Сборник научных трудов действия с микроорганизмами, являлись повышение доли эухроматиновых структур в ядре, повышение числа поровых комплексов в кариолемме, возрастание площади структур эндоплазматической сети, увеличение размеров митохондрий, возрастание площади, занимаемой комплексом Гольджи, и возрастание содержания в клетке свободных рибосом. В гипоталамусе экспериментальных животных установлена активизация нейросекреторных клеток супраоптических и паравентрикулярных ядер. В нейросекреторных клетках отмечалось повышение объёмов их тел, ядер и ядрышек, увеличение объёма органелл и синтеза нейросекрета. На фоне активизации синтеза нейросекрета в нейронах нонапептидергических ядер гипоталамуса отмечалось повышенное повреждение ультраструктурных компонентов нейросекреторных клеток, а также нарушение вывода (блокировка экструзии) нейросекрета. При этом у животных, инфицированных стафилококком с антикарнозиновой активностью, были более выражены признаки ультраструктурных повреждений нейросекреторных клеток и нарушения высвобождения нейросекрета. Изменения в нейросекреторных клетках ядер переднего гипоталамуса свидетельствуют об их вовлечении в регуляцию взаимодействий про- и эукариот в условиях инфицирования организма бактериальными патогенами. Полученные данные ещё раз подтверждают имеющиеся сведения об участии гипоталамических нейропептидов в регуляции адаптивных и защитных реакций организма. Анализ иммуноцитохимических реакций в популяциях нейронов крупноклеточных ядер гипоталамуса экспериментальных животных в сравнении с контрольными показал возрастание экспрессии белка р53 на фоне некоторого снижения экспрессии bcl2. Причём, у животных, инфицированных более вирулентным штаммом стафилококка, возрастала доля нейросекреторных клеток с признаками экспрессии р53 и уменьшалось число клеток, экспрессирующих Bcl2, что указывает на возрастание готовности клеток к апоптозу. Активизация экспрессии р53 в нейронах супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса в условиях инфицирования организма животных более вирулентными штаммами микроорганизмов свидетельствует о том, что в ходе эволюционных взаимодействий про- и эукариот как у про-, так и у эукариот сформировались адаптивные механизмы, обеспечивающие выживание как макро-, так и микроорганизмов в условиях их постоянных взаимодействий. У прокариот это выразилось в появлении и совершенствовании более вирулентных форм, способных к длительной персистенции в условиях макрооргнизма, а у эукариотических организмов это выразилось в совершенствовании различных способов уничтожения микроорганизмов, а также и в совершенствовании способности элиминировать дефектные клетки (одним 239 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки из таких способов и является апоптоз). В ходе длительного естественного отбора и сформировались адаптивные механизмы, обеспечивающие стабильность и долговременность существования систем «макроорганизм – микроорганизм» с минимальными потерями для тех и других. Результатом этого является тот факт, что существование практически любых многоклеточных организмов немыслимо без их симбиоза (в самых различных формах) с прокариотами. Морфофункциональное состояние эндометрия при хроническом эндометрите Старосветская Н.А., Михалева Л.М., Болтовская М.Н., Михалев С.А. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Хронический эндометрит (ХЭ) встречается в 80–90% случаев у женщин репродуктивного возраста, характеризуется длительным латентным течением и неспецифичностью клинических симптомов. ХЭ является причиной нарушения генеративной функции и/или осложненного течения беременности, родов и послеродового периода (Тетруашвили Н.К., 2000; Корнева И.Е. и соавт., 2003; Корсак В.С. и соавт., 2005 и др.). В настоящее время существование ХЭ как самостоятельного заболевания не вызывает сомнений. В качестве нозологической единицы ХЭ выделен в МБК-10 и гистологической классификации опухолей женских половых органов (1994). Учитывая растущую распространенность заболевания, тяжесть его последствий, неоднозначность морфологических критериев диагноза ХЭ, актуальной проблемой является совершенствование методов верификации и контроля эффективности лечения ХЭ. В настоящее время выявлены многочисленные особенности эндометрия при хроническом воспалительном процессе: экспрессия рецепторов стероидных гормонов, факторов роста и белков-регуляторов клеточного цикла, процессы пролиферации и апоптоза, клеточные и медиаторные факторы местного иммунитета, компоненты внеклеточного матрикса и экспрессия металлопротеиназ, эпителиально-стромальные взаимоотношения (Кузнецо- ва А.В. с соавт., 2001; Котиков А.Р., 2006; Шуршалина А.В., 2007; Бессмертная В.С., 2009; Disep B. et al., 2004; Bayer-Garner I.B. et al., 2004; Sukhikh G.T. et�� al�� ., 2007), однако имеются лишь единичные данные о функциональной активности эндометриальных желез (Попова Т.В., 1990). Целью работы стало изучение экспрессии гликоделина, одного из основных секреторных белков эндометрия, при ХЭ. Материалом исследования явились соскобы слизистой оболочки полости матки от 25 пациенток репродуктивного возраста, полученные в средней стадии фазы пролиферации (8–11 сут менструального цикла). Материал разделен на 240 Сборник научных трудов две группы. Первая группа представлена 18-ю пациентками, которым была выполнена гистероскопия с раздельным диагностическим выскабливанием по поводу дисфункциональных маточных кровотечений и бесплодия. Другая группа – 7 пациенток, которые перенесли раздельное диагностическое выскабливание перед плановой операцией по поводу миомы тела матки (группа сравнения). Материал фиксировали в 10%-ном формалине, заключали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Ван-Гизону. Гликоделин выявляли методом непрямого иммуноокрашивания с использованием оригинальных моноклональных антител и системы визуализации UltraVision TL-015-HD (LabVision). В результате проведенного морфологического исследования в материале из первой группы были выявлены признаки ХЭ, характеризующегося наличием инфильтратов, состоящих преимущественно из лимфоцитов и плазмоцитов, вокруг кровеносных сосудов, около или в просвете отдельных желез эндометрия. Определялись лимфоидные фолликулы как вблизи базального слоя эндометрия, так и в поверхностных слоях функционального слоя. Строма эндометрия часто уплотненная, присутствовали вытянутые фибробластоподобные клетки, формирующие некие «завихрения» вокруг желез. В отдельных участках стромы эндометрия отмечалось разрастание соединительной ткани. Обращали на себя внимание изменения со стороны кровеносных сосудов в виде склеротических изменений их стенки. Нарушалось функциональное состояние железистого и поверхностного эпителия. Железы имели округлую или трабекулярную форму с вариабельной клеточной пролиферацией, нередко с индифферентным эпителием. В эндометрии с признаками ХЭ в 15 из 18 случаев (83,3%) была обнаружена экспрессия гликоделина в эпителиоцитах желез с интенсивностью от умеренной до сильной. В группе сравнения эндометрий морфологически соответствовал средней стадии фазы пролиферации, признаков ХЭ выявлено не было. Гликоделин в эндометриальных железах не выявлялся, что соответствовало его нормальной циклической динамике – отсутствию синтеза и секреции в пролиферативной фазе, началу продукции в средней секреторной фазе (имплантационное окно) и достижению пика секреции на 22–24-е сут цикла (Julkunen et al., 1986; Seppala et al., 1988; Waites, et al., 1988). Отсутствие секреции гликоделина в периовуляторном периоде является принципиально важным для реализации репродуктивной функции, поскольку он обладает контрацептивной активностью, блокируя связывание сперматозоидов с zona pellucida яйцеклетки (Oehninger S. et al., 1995; Seppala M. et al., 2007). По мнению ряда авторов, отсутствие гликоделина обеспечивает возможность взаимодействия гамет в период «фертилизационного окна», закрывающегося с началом эндометриального синтеза гликоделина на 5–6-е сут после овуляции. 241 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Таким образом, обнаруженная нами продукция гликоделина в пролиферативной фазе цикла, связанная с наличием хронического воспалительного процесса, может быть одним из патогенетических механизмов развития бесплодия при ХЭ, а выявление гликоделина в пролиферирующем эндометрии может оказаться потенциальным маркером, увеличивающим точность морфологической верификации ХЭ. Использование методов молекулярной генетики для изучения патологии клетки Стволинская Н.С. Московский педагогический государственный университет, Москва В середине 80-х годов был введен в практику новый молекулярногенетический метод, позволяющий в течение нескольких ч клонировать следовые количества молекул ДНК и РНК. Это – метод полимеразной цепной реакции. В 90-е годы значительно расширились возможности молекуляр- но-генетических исследований с введением в практику информационнокомпьютерных технологий. В результате выполнения программы «Геном человека» была расшифрована полная нуклеотидная последовательность генома человека и выявлена структура значительной части генов. В настоящее время большинство генов человека картировано, т.е. приписано к определенной хромосоме в определенный локус. Таким образом, составляется карта хромосом человека. Одновременно с этим решается задача определения функции генов. Достижения в изучении генома человека позволяют по-другому взглянуть на проблему патологии клетки. Известно более 5000 наследственных патологий, причиной которых является дефект в работе фермента или структурного белка. Дефект белка чаще всего связан с мутацией на генном уровне. С помощью методов молекулярной генетики удается выявить не только дефектный белок, но и мутантный ген этого белка, расположенный в определенном локусе хромосомы. В 80-е годы ХХ века было известно о лизосомных болезнях, доказана наследственная составляющая этих заболеваний. Часть этих заболеваний относят к болезням накопления мукополисахаридов. Патология обусловлена дефектом лизосомных ферментов, разрушающих мукополисахариды. Не полностью разрушенные биополимеры накапливаются в клетках и межклеточном пространстве, что вызывает тяжелые последствия у больного. В настоящее время выявлено несколько ферментов, ответственных за описанную патологию, и установлена локализация на хромосомах генов, отвечающих за работу этих ферментов. 242 Сборник научных трудов Молекулярно-генетическими методами активно изучаются и пероксисомные болезни. В пероксисомах печени и почек происходит огромное число реакций детоксикации вредных и ядовитых соединений, окисление жирных кислот. В пероксисомах осуществляются первые этапы синтеза фосфолипидов, которые впоследствии используются на уровне организма. Различные нарушения в функционировании пероксисом связаны с неспособностью клетки импортировать белки в пероксисомы или с ошибкой попадания ферментов пероксисом в другие клеточные органеллы. Генетические болезни могут быть связаны не только с органоидами клетки, но и с функционированием цитоскелета. Нарушение любого белка из спектринового комплекса эритроцитов может изменить форму этой клетки, что в свою очередь приводит к клиническим проявлениям. Изучено достаточное количество наследственных патологий по спектриновому комплексу эритроцитов, показаны молекулярные дефекты белков и хромосомная локализация соответствующих генов. В последние годы активно развивается новое направление медицинской генетики – митохондриальные наследственные патологии. Полностью расшифрована нуклеотидная последовательность ДНК в митохондриях человека и выяснены особенности организации митохондриальных генов. Известно, что мутации в митохондриальной ДНК являются причиной более ста болезней. Несмотря на то, что в митохондриях имеется своя собственная ДНК, большинство митохондриальных белков кодируется ядерными генами. Описано множество мутаций по генам, кодирующим ферментные комплексы окислительного фосфорилирования в клетках человека. Такие дефекты генов приводят обычно к развитию миопатий и энцефаломиопатий, так как клетки мышц и мозга являются наиболее энергозатратными. Использование методов молекулярной генетики позволило глубже понять процесс трансформации нормальных клеток в опухолевые. Именно с помощью этих методов было установлено, что перерождение нормальной клетки связано с возникновением определенного количества мутаций по нескольким генам, принимающим участие в регуляции клеточного деления, дифференцировки клеток и программируемой клеточной гибели – апоптоза. В настоящее время картировано значительное количество раковых онкогенов и генов-супрессоров опухолей. Возможность работать с нормальными и дефектными генами имеет большое практическое значение для генотерапии. Введение нормальных генов в дефектные клетки позволяет вылечить больного или облегчить его состояние, хотя на этом пути делаются только первые шаги. 243 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Литература. 1. Ридли М. Геном: автобиография вида в 23 главах. – М.: Эксмо, 2009. – 432 с. 2. Стволинская Н.С. Истоки и перспективы международной программы «Геном человека» // Биология в школе. – 2002. – № 2, С. 12–17. 3. Фаллер Дж.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. – М.: БиномПресс, 2006. – 256 с. Динамика соотношения путей гибели эпидермоцитов при термических ожогах кожи и стимуляции регенерации импульсным светом Столбовская О.В., Хайруллин Р.М. Ульяновский государственный университет, медицинский факультет, Ульяновск Поддержание клеточного гомеостаза кожи в норме обеспечивается сбалансированностью процессов пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели. В ходе регенерации поврежденного органа развиваются определенные взаимоотношения путей гибели клеток. Целью работы явилось изучение соотношения путей клеточной гибели эпидермоцитов лабораторных мышей в области ожоговых ран кожи по типу некроза и апоптоза. Экспериментальное исследование проводили на половозрелых белых мышах (n=105) массой 20–25г. Все экспериментальные исследования осуществляли в соответствии с международными этическими нормами и правилами работы с лабораторными животными. Для нанесения ожоговой травмы применялся термокоагулятор с температурой поверхности 360±20°С. Обжигаемая коагулятором стандартная поверхность представляла собой участок кожи размером 5 мм2. Животным в асептических условиях под эфирным наркозом наносился ожог на заднюю треть спины после удаления волосяного покрова в зоне повреждения. Длительность нанесения ожога составляла 2 секунды. Термическое воздействие в выбранном диапазоне приводило к поражению кожи, сходному с ожогом III-б степени у человека с формированием плотного струпа белого цвета, отчетливо заметного на фоне интактной кожи. При этом развивался некроз, поражающий все слои и структуры дермы. Животные были разделены на 3 группы: контрольную группу составили животные, рана у которых не подвергалась дополнительным воздействиям после ожога; первую опытную группу составили животные, у которых область ожоговой раны подвергалась экспозиции светодиодным импульсным световым излучением красного спектра в течение 2-х минут; вторую опытную группу – животные, которым осуществлялась экспозиция светодиодным импульсным световым 244 Сборник научных трудов излучением красного спектра кожи в области проекции тимуса в течение 4-х минут. Источник света имел следующие параметры: средняя мощность излучения – 2,5 мВт; импульсная мощность излучения – 5 мВт; частота повторения импульса – 50 Гц; длительность импульса – 5 мсек. Выведение животных из эксперимента для проведения исследований производили на исходе 3, 5, 9, 11, 15, 21, 28 суток. Для выявления структуры хроматина гибнущих клеток препараты окрашивали на ДНК по Фёльгену. В эпителиальном пласте перинекротической зоны ожогового регенерата кожи подсчитывали не менее 500 клеток росткового слоя. В каждой серии опытов определяли количество эпидермоцитов с разными формами изменений ядра по методу Р.К. Данилова с соавт. (2001). После нанесения ожога в коже мышей на 3-и сутки отмечается глубокий коагуляционный некроз, охватывающий все слои дермы. Зона некроза занимает до 90–94% площади раны. На основании кариологического анализа эпидермоцитов росткового слоя эпидермиса в перинекротической зоне по мере удаления от раны снижается число пикнотизированных клеток с деформированными ядрами. Гибнущие клетки составляли 325,3±2,8 (M±m), среди них преобладали клетки с перинуклеарными вакуолями и деформированными ядрами (84%). Остальная часть клеток (50,7±1,52) характеризовалась конденсацией хроматина с крупными глыбками. С 5 по 11-е сутки в ростковом слое эпителиального регенерата количество гибнущих эпителиоцитов в ростковом слое изменяется от 239,3±3,9 до 127,5±2,47. Преобладающей формой деструкции клеток остается перинуклеарный отек (от 188,3±1,82 до 98,8±0,9). В базальном слое сохраняется митотическая активность. По пути апоптоза погибает от 36,0±1,26 до 12,67±0,84 клеток. На 15-е сутки слой некроза выявляется в виде узкой полоски на поверхности ожогового регенерата, около 50% раневой поверхности закрыто краевым эпидермальным пластом. Среди некротизированных эпидермоцитов преобладают клетки с перинуклеарным отеком (51,3±1,05), а по пути апоптоза погибает 13,67±0,61 клеток. С 21 по 28-е сутки количество гибнущих по типу некроза эпидермоцитов снижается с 24,3±0,61 до 15,50±0,56, по типу апоптоза с 3,67±0,21 до 0,83±0,40. Таким образом, в контрольной группе животных количество эпидермоцитов росткового слоя эпидермиса, гибнущих по типу некроза, статистически значимо превышает содержание клеток, гибнущих по пути апоптоза, на всём протяжении эксперимента. В условиях коррекции регенерации ожоговой раны кожи динамика соотношения путей гибели эпидермоцитов зависела от способа воздействия. При прямом воздействии на поверхность регенерирующей кожи отличия наблюдались, начиная с 5 суток, в зоне раны макроскопически наблюдалась активация процессов эпителизации, площадь регенерирующего эпителия пре245 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки вышала в 2 раза показатели контрольной группы. В двух опытных группах различалась динамика гибели клеток росткового слоя эпидермиса по типу апоптоза: в группе животных при прямом стимулирующем действии на рану импульсным световым излучением красного спектра количество гибнущих клеток составляло 69,00±2,62, а при воздействии на кожу в области проекции тимуса – 52,67±1,52 (различия статистически значимы при уровне р<0,05). В целом, в опытной группе животных, раны которых заживали под воздействием импульсного светового излучения красного спектра на кожу области проекции тимуса, наблюдалась динамика гибели клеток по типу некроза и апоптоза, аналогичная динамике этих процессов в контрольной группе. В группе животных со стимулирующим воздействием импульсного светового излучения красного спектра непосредственно на область раны особенностью является выраженность некроза эпидермоцитов на ранних стадиях развития воспалительной ожоговой реакции, но этот путь гибели клеток завершается быстрее, чем у животных контрольной и второй опытной группы – с 21 суток наблюдения. Пролиферирующие кардиомиоциты и клетки-предшественники кардиомиоцитов в миокарде больных гипертрофической кардиомиопатией Сухачева Т.В., Чудиновских Ю.А., Еремеева М.В., Серов Р.А., Самсонова М.В., Черняев А.Л., Бокерия Л.А. Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, Москва, ФГУ НИИ Пульмонологии ФМБА России, Москва Гипертрофическая обструктивная кардиомиопатия (ГОКМП) – тяжелое генетически обусловленное заболевание, которое сопровождается гипертрофией межжелудочковой перегородки (МЖП) с обструкцией выводного отдела левого желудочка (ЛЖ) и требует хирургического лечения. В современной мировой литературе отсутствуют данные о пролиферативном потенциале кардиомиоцитов (КМЦ) МЖП больных ГОКМП. Целью настоящего исследования было выявление пролиферирующих КМЦ и клеток-предшественников КМЦ в миокарде МЖП в сопоставлении с клинико-морфологическими особенностями больных ГОКМП. Проведено исследование интраоперационных биопсий миокарда МЖП 38 больных ГОКМП 18–61 года с толщиной МЖП 23,9±5,0 мм, градиентом давления на выводном отделе ЛЖ 90,8±34,0 мм рт. ст., конечно-систолическим объемом ЛЖ 23,6±10,2 мл, конечно-диастолическим объемом 80,5±24,4 мл и фракцией выброса ЛЖ 74±7%. 246 Сборник научных трудов Пролиферирующие (�� Ki�� 67-позитивные) КМЦ и с-�� kit�� -позитивные предшественники КМЦ выявляли методом конфокальной иммуногистохимии с помощью специфических моноклональных антител. Принадлежность клеток к КМЦ определяли по специфическому выявлению саркомерного α-актина. На полутонких срезах, окрашенных реактивом Шиффа, измеряли диаметр КМЦ. В этих клетках полуколичественно оценивали степень утраты миофибрилл, а также по методу �� Sutton�� M�� . �� et�� al�� . (1980) определяли выраженность непараллельного расположения миофибрилл (disarray). На препаратах, окрашенных по Массону, оценивали долю фиброза в миокарде. У 29 больных изменения КМЦ изучали на ультраструктурном уровне. Полученные данные анализировали с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. В миокарде МЖП большинства больных ГОКМП обнаружена умеренная гипертрофия КМЦ – средний диаметр КМЦ составил 23,9±5,0 мкм. В КМЦ 18,4% пациентов выявлены зоны утраты миофибрилл, наличие которых прямо коррелировало с фракцией выброса ЛЖ (r=0,45, p=0,007) и обратно – с конечно-систолическим объемом ЛЖ (�� r�� =-0,37, �� p�� =0,03). У 57,9% больных были обнаружены КМЦ с непараллельным расположением миофибрилл, которые чаще встречались у пациентов с более крупными КМЦ (r=0,51, p=0,001). Периваскулярный и интерстициальный фиброз составлял у разных больных 7–72% (ср. 42±15%). В КМЦ были выявлены ультраструктурные изменения, характерные для гипертрофированного миокарда. Клетки имели крупные ядра неправильной формы с инвагинациями ядерной оболочки и большими ядрышками. В большинстве клеток обнаружены цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума, а также структуры комплекса Гольджи, часто отмечали расширение трубочек Т-системы. Во многих КМЦ наблюдали множественные вставочные диски. Наряду с обычными КМЦ цилиндрической формы были встречены КМЦ неправильной формы, в которых, как правило, присутствовали непараллельные миофибриллы. Небольшие очаги утраты миофибрилл были обнаружены лишь в единичных КМЦ. В отдельных КМЦ регистрировали проявления дистрофии: миелиноподобные тельца, аутофагосомы, жировые включения, отложения α-гликогена. У одного больного в нескольких КМЦ были обнаружены центриоли. Методом иммуноконфокальной микроскопии в миокарде выявлены две группы пролиферирующих КМЦ: зрелые КМЦ диаметром 23,9±16,9 мкм и мелкие округлые КМЦ с тонким ободком саркоплазмы, содержащей саркомерный α-актин, диаметр которых составлял 5,9±1,7 мкм. Наличие этих двух типов клеток было взаимосвязано (r=0,62, p<0,001) и прямо коррелировало со степенью фиброза в миокарде (соответственно: r=0,43, p=0,007 и r=0,36, 247 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки p=0,03). Зрелые Ki67-положительно окрашенные КМЦ были обнаружены у 97% больных, их доля составляла 0,002–0,31% (ср. 0,03±0,06%) всех КМЦ и прямо коррелировала с толщиной МЖП (r=0,34, p=0,04) и с градиентом давления на выводном отделе ЛЖ (r=0,36, p=0,03). Мелкие незрелые Ki67позитивные КМЦ были выявлены у 92% больных и составляли 0,0003–0,23% от всех КМЦ (ср. 0,02±0,04%). Количество их было выше у больных с более выраженной степенью гипертрофии КМЦ (r=0,35, p=0,03). C-kit-положительно окрашенные предшественники КМЦ, содержащие саркомерный �� α�� -актин, обнаружены у 82% пациентов, они имели средний диаметр 7,1±1,7 мкм и составляли 0,0006–0,82% всей популяции КМЦ (ср. 0,05±0,15%). Их число прямо коррелировало с количеством зрелых (r=0,52, p=0,001) и мелких незрелых (r=0,49, p=0,002) пролиферирующих КМЦ, а также со степенью гипертрофии КМЦ (r=0,51, p=0,001) и степенью фиброза миокарда МЖП (r=0,46, p=0,0045). Таким образом, миокард МЖП взрослых больных ГОКМП характеризуется умеренной гипертрофией КМЦ и выраженным периваскулярным фиброзом. КМЦ демонстрируют ультраструктурные признаки гипертрофии, атрофии, непараллельного расположения миофибрилл и, в редких случаях, утраты миофибрилл. В миокарде большинства больных имеется в среднем 0,03% зрелых и 0,02% мелких незрелых пролиферирующих КМЦ, а также около 0,05% с-kit-позитивных клеток-предшественников КМЦ, содержащих саркомерный α-актин. Пролиферативная активность зрелых КМЦ прямо коррелирует с толщиной МЖП, градиентом давления на выводном отделе ЛЖ и со степенью фиброза миокарда. Количество мелких незрелых пролиферирующих КМЦ и клеток-предшественников КМЦ повышено у больных с большей степенью гипертрофии КМЦ и фиброза миокарда МЖП. Ультраструктурная характеристика паренхимы и стромы печени при воздействии наноматериалов Суходоло И.В., Мильто И.В. ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, Томск Развитие биомедицинских технологий, основанных на применении наноразмерных материалов, открывает перспективы для создания новых методов диагностики и лечения заболеваний человека и животных. Наноразмерные частицы магнетита изучаются как самостоятельные терапевтические агенты для локальной гипертермии, как основа для создания магнитоуправляемых систем целевой доставки лекарств, а также как контрастные вещества при магнитно-резонансных исследованиях. Большинство 248 Сборник научных трудов работ по изучению биологических свойств наноматериалов выполнено на уровне in vitro. Целью настоящего исследования было выявить и охарактеризовать ультраструктурные изменения паренхимы и стромы печени при внутривенном введении суспензии наноразмерных суперпарамагнитных частиц магнетита. Исследование проводилось на 60 беспородных крысах-самцах, массой 150±30 г, из которых были сформированы 4 группы: 1-я группа (10 крыс) – интактные животные; 2-я группа (10 крыс) – контрольная – многократное введение стабилизирующего раствора – в хвостовую вену каждые двое суток вводили по 2 мл стабилизирующего раствора; 3-я группа (20 крыс) – однократное введение суспензии магнетита – в хвостовую вену было введено 2 мл стандартизированной суспензии магнетита (0,1 г(Fe3O4)/кг массы тела); 4-я группа (20 крыс) – многократное введение cуспензии магнетита – в хвостовую вену крыс каждые двое суток вводили по 2 мл стабилизированной суспензии магнетита (0,1 г(Fe3O4)/кг массы тела). Из наноразмерных частиц магнетита готовили суспензию на основе водносолевого стабилизирующего раствора, содержащего хлорид натрия, цитрат натрия и динатриевую соль 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфониевой кислоты. Полученную суспензию подвергали сонификации, центрифугированию и фильтрованию. Концентрацию магнетита в суспензии устанавливали по концентрации железа рентгено-флуоресцентным методом. Распределение частиц магнетита по размерам в суспензии устанавливали методом лазерной дифракции. Электронно-микроскопическое исследование печени крыс проводили на 1 и 40-е сутки после однократного (0,1г(Fe3O4)/кгмассы тела) внутривенного введения (3-я группа), а также на 40-е сутки (суммарная доза 2г(Fe3O4)/кгмассы те) у животных с многократным внутривенным введением суспензии наноразла мерных частиц магнетита (4-я группа). Фрагменты печени (V≈1мм3) фиксировали в 4% параформальдегиде на буфере Хэнкса (рН 7,4) в течение 24 ч при 4ºС, затем в 1% OsO4 на том же буфере в течение 3 ч при 4ºС. Обезвоживали и заливали в смесь эпон-аралдит. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм окрашивали 1% раствором толуидинового синего в насыщенном растворе буры. Ультратонкие срезы помещали на сетки, контрастировали уранилацетатом, после чего просматривали на электронном микроскопе JEM-100 CX II и фотографировали при увеличении 3600, 7200 и 48000. Ультраструктурное исследование печени крыс выявило накопление частиц магнетита в клетках Купфера и гепатоцитах. В цитоплазме клеток Купфера через 1 сутки после однократного внутривенного введения суспензии наноразмерного магнетита (0,1 г(Fe3O4)/кгмассы тела) повсеместно выявляются гранулы диаметром до 1,5 мкм, содержащие магнетит и окруженные биологической 249 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки мембраной. Наличие биологической мембраны, окружающей гранулы в клетках Купфера, свидетельствует о проникновении магнетита в клетку механизмом фагоцитоза с формированием фагосом. Гранулы, в зависимости от количества содержащихся в них наноразмерных частиц магнетита и характера их распределения, можно разделить на: электронноплотные гранулы, заполненные наноразмерными частицами магнетита и их агломератами, лежащими компактно и плотно прилегающие друг к другу; гранулы, содержащие умеренное количество наноразмерных частиц магнетита; полые гранулы – содержат незначительное количество наноразмерных частиц магнетита и их агломератов. На электроннограммах выглядят как светлые, окруженные мембраной структуры. Преобладание в клетках Купфера электронноплотных гранул на 1-е сутки после внутривенного введения суспензии наноразмерных частиц магнетита свидетельствует о том, что наиболее интенсивно поглощение частиц из кровеносного русла и удаление их из системной циркуляции происходит в первые 24 часа после инъекции. Свободно лежащих в цитоплазме клеток Купфера частиц магнетита и их агломератов не обнаружено. В цитоплазме гепатоцитов повсеместно выявляются не окруженные мембраной наноразмерные частицы магнетита, просвет цистерн ЭПР расширен, имеется большое количество рибосом и митохондрий округлой формы. К 40 суткам количество гранул в клетках Купфера представляется сниженным по сравнению с 1-ми сутками. Содержание в гранулах частиц магнетита уменьшено, что проявляется значительным снижением электронной плотности. В цитоплазме гепатоцитов на 40-е сутки хорошо визуализируются ЭПР, рибосомы, большое количество митохондрий и липидные включения. Повсеместно в цитоплазме расположены отдельные частицы магнетита размером 60–90 нм, лишенные мембраны. В просвете синусоидных капилляров после многократного внутривенного введения суспензии наноразмерных частиц магнетита на 40-е сутки (2г(Fe3O4)/кгмассы тела) выявляются частицы магнетита и их агломераты. Гранулы клеток Купфера, содержащие магнетит (не менее 50 на клетку), окружены биологической мембраной, преобладают электронноплотные гранулы, заполненные частицами магнетита. На 40-е сутки после многократного введения суспензии наноразмерного магнетита гепатоциты имеют округлое, центрально расположенное ядро с преобладанием эухроматина. В цитоплазме выявляется большое количество митохондрий, рибосомы, ЭПР, просвет цистерн которого значительно расширен. Повсеместно в цитоплазме гепатоцитов располагаются отдельные 250 Сборник научных трудов частицы, не окруженные биологической мембраной, аналогичные тем, что расположены в просвете синусоидных капилляров. Частицы имеют размер 60– 90 нм. Кроме того, частицы магнетита встречаются в пространстве Диссе, что свидетельствует об их способности проникать через стенку синусоида. Вероятно, при проникновении через стенку синусоида осуществляется сепарация частиц магнетита по размерам с проникновением в пространство Диссе самых малых частиц суспензии. Таким образом, внутривенное введение крысам суспензии частиц магнетита приводит к накоплению их в фагосомах клеток Купфера, а также в цитоплазме гепатоцитов, в которых частицы располагаются свободно. Паренхиматозные и стромальные элементы печени обладают способностью элиминировать наноразмерный магнетит. В гепатоцитах крыс процесс выведения наночастиц протекает медленнее, нежели в клетках стромы. Период полного выведения наноматериала в рамках сроков предпринятого эксперимента не установлен. Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов VEGF в скелетных мышцах при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей Тепляков С.А., Яглова Н.В., Черников В.П. Российский государственный медицинский университет, Московский факультет, кафедра факультетской хирургии, НИИ морфологии человека РАМН, Москва В регуляции клеточного метаболизма в условиях пониженного содержания кислорода существенную роль играет транскрипционный фактор HIF-1 (индуцируемый гипоксией фактор – 1), адаптирующий клеточный метаболизм к анаэробным условиям. Например, он вызывает увеличение синтеза в клетках VEGF (фактора роста эндотелия сосудов), имеющего ключевое значение в процессах неоваскуляризации тканей, в частности при гипоксии. В крови и в мышцах было обнаружено значительное увеличение концентраций HIF-1 и зависимых от него регуляторных белков (VEGF, эритропоэтина и др.) при моделировании состояния острой ишемии скелетных мышц, однако результаты работ по характеристике этих показателей при хронической ишемии у животных и человека являются малочисленными и крайне противоречивыми. Целью настоящей работы было иммуногистохимическое изучение уровней экспрессии белков �� HIF�� -1 и �� VEGF�� в биоптатах икроножной мышцы пациентов с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей (ХАНК) разной степени выраженности и сравнение этих результатов с пока- 251 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки зателями количественного иммуноферментного анализа концентрации VEGF в плазме крови у тех же больных. В работе использовались кроличьи поликлональные антитела фирмы «�� Santa�� Kruz�� Biotechnology�� » и набор реактивов для визуализации пероксидазной реакции Ultra Vision. Концентрацию VEGF определяли в плазме крови иммуноферментным методом с использованием набора реактивов фирмы �� Invitrogen�� . Пациенты (20 человек с ХАНК) и здоровые добровольцы (3 человека – группа контроля) были предупреждены об условиях эксперимента и дали письменное согласие на добровольное участие в нем. В результате иммуногистохимического исследования у больных людей была отмечена сравнительно высокая экспрессия HIF-1 в ядрах мышечных волокон. При этом степень экспрессии как �� HIF�� -1, так и VEGF в их саркоплазме в целом, незначительно отличалась от контроля. Были замечены лишь отдельные хаотично расположенные миоциты с достаточно высокой интенсивностью окраски. Последние, вероятно, представляют собой окислительные мышечные волокна, которые, по данным литературы, составляют меньшинство в икроножной мышце, и которые, в отличие от гликолитических волокон, более чувствительны к гипоксии. Таким образом можно заключить, что при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей усиленная экспрессия �� HIF�� -1 и �� VEGF�� сохраняется в отдельных (вероятнее всего – окислительных) мышечных волокнах икроножной мышцы пациентов. Количественное определение фактора роста сосудистого эндотелия в плазме крови этих больных с помощью иммуноферментного анализа выявило статистически значимое увеличение концентрации VEGF в сравнении с контролем в 2,1 раза (с 278,0 ± 13,6 пг/мл до 583,8 ± 29,2 пг/мл). На основании результатов наших исследований и данных литературы можно сделать вывод о том, что в условиях хронической ишемии скелетные мышцы в течение длительного времени сохраняют потенциал для адаптации к гипоксическим условиям, который может реализовываться, в частности, через попытку усиления процессов неоваскуляризации с участием фактора роста эндотелия сосудов VEGF. Реакция тканей желудка крысы в ответ на стресс в условиях эксперимента Тимофеева М.О., Спивак И.А., Швецов Э.В. Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва Изучение влияния стрессовых факторов на организм, поиск адаптации и подготовки его к чрезвычайным воздействиям окружающей среды продол- 252 Сборник научных трудов жает оставаться актуальной проблемой современного общества. Для решения этих задач необходим комплексный подход специалистов различных областей клинической и фундаментальной медицины. Целью настоящего исследования является изучение реакции тканей, клеток слизистой оболочки и подслизистой основы желудка при эмоциональном стрессе. Эксперимент проводился на 50 крысах-самцах линии Вистар массой 220±5,2 г (Х±5х) в возрасте 4-х месяцев в осенне-зимний период. Эти животные были выбраны ввиду их устойчивости к инфекциям. Животных содержали в течение 10-ти дней в клетках по 10 особей на карантине. В помещении вивария они находились с естественным освещением в клетках, в условиях неограниченного доступа к корму и воде. Далее крысы были типированы в тесте «Открытое поле» по степени устойчивости к стрессу и разделены на группы: №1 – устойчивые к стрессу (контроль); №2 – предрасположенные к стрессу (контроль); №3 – предрасположенные к стрессу и получившие стресс; №4 – предрасположенные к стрессу, получившие стресс (+ ПВДС). Через 7– 10 дней после первого исследования в «Открытом поле» крысам группы №4 внутрибрюшинно вводили пептид, вызывающий дельта-сон (ПВДС, DSIP), в дозе 10 мкг на крысу (300 г) в объеме 1 мл физиологического раствора. DSIP�� – дельта-сон индуцирующий пептид, который является антистрессорным и ноотропным средством с антивирусным и иммуностимулирующим действием. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 мл физиологического раствора. В качестве модели острого эмоционального стресса применяли иммобилизацию животных с электрокожным раздражением. Крыс изолировали в индивидуальных плексигласовых боксах (160х65х 50 мм), ограничивающих их подвижность. Животным в течение 1 часа наносили электрокожные раздражения в области спинки, по стохастической схеме пороговыми значениями переменного тока, напряжением 4–6 В, частотой – 50 Гц и длительностью импульсов – 1 мс. Длительность одной стимуляции составляла 30 секунд (Коплик Е.В., 2000). Эмоциональный стресс у животных оценивали по изменению веса органов мишеней – надпочечников и тимуса. После окончания эксперимента крыс выводили из опыта при помощи метода декапитации. Изолированный желудок фиксировали 10% нейтральным формалином. Кусочки для микроанатомических исследований были вырезаны из передней и задней стенок кардиального, фундального и пилорического отделов желудка. Микроскопические препараты изготавливали по стандартной методике с использованием спиртовой проводки и заливки в парафин (Меркулов Г.А., 1956). Морфологические особенности оболочек желудка крыс исследовали на гистологических срезах при малом увеличении микроскопа МБИ – 9. Клеточный состав определяли при увеличении Х900 с масляной иммерсией. Количественные показатели оценивали с использованием стандартной морфологической сетки 253 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки (Стефанов С.Б.) в пяти полях зрения путем случайного смещения окулярной сетки. При изучении гистологических срезов передней и задней стенок желудка различия в их строении выявлено не было. На гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, изучали морфологические особенности оболочек желудка, состояние однослойного цилиндрического железистого эпителия, клеточный состав соединительной ткани. При микроскопическом исследовании гистологических препаратов желудка животных после проведенного эксперимента определялась лейкоцитарная инфильтрация, основная локализация которой выявлялась в собственной пластинке слизистой оболочки. Значительная часть лейкоцитов локализовалась непосредственно по ходу кровеносных сосудов или имела диффузный характер распределения. Клеточный состав лейкоцитарной популяции имел существенную вариабельность в пределах группы, однако наблюдались и достоверные закономерности. Среди клеток лимфоидного ряда во всех группах преобладали, в основном, малые лимфоциты. Значительные различия в клеточном составе соединительной ткани были зафиксированы в №3 и №4 экспериментальных группах. Среди всех клеточных форм в подслизистой основе желудка крыс группы №3, преобладали макрофаги (6,79±0,27), в отличие от группы №4, где они полностью отсутствовали в полях зрения, p<0,05. В группе №3 выявлялось большое количество деструктивно измененных и разрушенных клеток в виде «теней», количеством 5,01±0,4, что в 1,6 раз больше, по сравнению с группой №2, в которой они составили 3,05±0,18, p>0,05. В слизистой оболочке желудка деструктивным изменениям подверглись в значительной мере эпителиоциты, а в подслизистой основе – клетки лейкоцитарного ряда. Массовая гибель клеточных форм в острую стадию эксперимента объясняет увеличение количества макрофагов в данных структурных компонентах стенки желудка крыс. На основании полученных данных можно предположить, что деструктивные процессы в описываемых зонах стенки желудка крысы при стрессе активизируются, по сравнению с контрольной группой крыс в 2,1 раза. Практическое отсутствие сформированных лимфоидных узелков в структурно-функциональных зонах желудка крыс в первые сутки эксперимента и наличие диффузной лейкоцитарной инфильтрации свидетельствует о необходимости дальнейших экспериментальных исследований в отдаленный период. 254 Сборник научных трудов Ретикулярные эпителиоциты тимуса и их реактивность в период эмбриогенеза Торбек В.Э. Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, кафедра гистологии, Москва Эпителиальные клетки являются главным фактором, формирующим микроокружение, которое определяет развитие Т-лимфоцитов в тимусе. Ретикулярные эпителиоциты являются источником сигналов, обусловливающих формирование рецепторов для антигенов и разделение Т-лимфоцитов на субпопуляции CD4+ (Т-хелперов) и CD8+ (Т-цитотоксических). Ретикулярные эпителиоциты, несущие комплекс «пептид-аутологичная молекула ГКГ» рассматриваются как источники сигналов к выживанию лимфоцитов при положительной селекции, а дендритные клетки – как источник сигналов к индукции апоптоза (Nossal G.J, 1997). Вместе с тем имеются сведения, что в условиях культуры ткани ретикулярные эпителиоциты способны индуцировать активацию и апоптоз тимоцитов (Ярилин А.А. и др., 2000). Эпителиальные клетки тимуса могут без какой-либо активации синтезировать in vitro ряд цитокинов, основным из которых является IL-8 (Шарова Н.И. и др., 2008). Вероятно, эта способность реализуется эпителиоцитами тимуса также in vivo, и «цитокиновая сеть» тимуса является вектором, определяющим направление перемещения тимоцитов внутри органа в процессе их созревания. Одним из важных внутриклеточных компонентов ретикулярных эпителиоцитов тимуса являются вакуоли. Тимические гормоны локализуются именно в них (�� Auger�� C�� . �� et�� al�� ., 1982). Показано, что клетки коркового вещества продуцируют короткодистантные гормоны (ά1, β3, β4 –тимозины), действующие в тимусе, а мозгового вещества – длиннодистантные, поступающие в кровь (Janossy G. еt al.,1986). Целью настоящего исследования явилось изучение структурно- функциональных изменений в ретикулярных эпителиоцитах тимуса новорожденных крыс, развивающихся в условиях измененного уровня кортикостероидов в функциональной системе мать-плод. В первой опытной группе крысам с 17 суток беременности до родов ежедневно вводили гидрокортизон-ацетат, доза которого на 17-е сутки беременности составляла 10 мг/кг, а затем снижалась до 7–8мг/кг. Во второй опытной группе беременным самкам под эфирным наркозом проводили двустороннюю адреналэктомию. Прооперированные животные получали подсоленную 255 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки воду. Тимус интактных и экспериментальных новорожденных животных изучали на светооптическом и ультраструктурном уровнях. Анализировали ультраструктуру секреторных ретикулярных эпителиоцитов и несекреторных (опорных, изолирующих) эпителиоцитов коркового вещества, секреторных эпителиоцитов мозгового вещества тимуса. В тимусе новорожденных животных в норме несекреторные ретикулярные эпителиальные клетки имеют вытянутую форму, располагаются на базальной мембране под капсулой или окружают адвентициальные клетки сосудов в корковом веществе, изолируя периваскулярные пространства. Ядра в этих клетках овальные, в цитоплазме содержатся пучки тонофиламентов, развиты органеллы синтеза. Вакуоли встречаются редко. В секреторных клетках коркового вещества, как правило, содержатся небольшие вакуоли. В вакуолях определяются мелкие везикулы, а также аморфный или гранулярный материал различной электронной плотности в небольшом количестве. Вакуоли часто располагаются вблизи элементов комплекса Гольджи. Иногда в одной клетке содержится два комплекса Гольджи и элементы гранулярной цитоплазматической сети. Митохондрии имеют классическую структуру. В овальных ядрах клеток выявляется, в основном, эухроматин. Секреторные эпителиоциты мозгового вещества имеют большие листовидные цитоплазматические отростки. Светлые ядра клеток оттеснены на периферию. Крупные вакуоли часто располагаются в виде гроздей. Вакуоли имеют гладкие стенки или выстланные единичными длинными микроворсинками. При введении беременным самкам гидрокортизона в секреторных ретикулярных эпителиоцитах коркового и мозгового вещества тимуса новорожденных животных выявляются признаки гипертрофии клеток. В корковом веществе наблюдается увеличение количества вакуолей, утолщение пучков тонофиламентов. В мозговом веществе отмечается некоторое увеличение объема вакуолей. Характер содержимого вакуолей при этом изменяется мало. Встречаются клетки с крупными интраплазматическими полостями, выстланными большим количеством коротких микроворсинок. В вакуолях и интраплазматических полостях содержится аморфный материал различной электронной плотности. В тимусе потомства адреналэктомированных самок в ретикулярных эпителиальных клетках мозгового вещества выявляются очень крупные, расширенные, компактно расположенные вакуоли. В них накапливается электронноплотный материал, обнаруживаются миелиноподобные тельца. В цитоплазме клеток наблюдается увеличение числа первичных и вторичных лизосом. В ряде случаев нарушается целостность плазмолеммы клеток. С помощью 256 Сборник научных трудов иммуногистохимических методов исследования установлено, что гормоны в подобных клетках не обнаруживаются (Bach. J., 1990). Таким образом, при адреналэктомии беременных самок в тимусе потомства выявляются ультраструктурные признаки снижения функциональной активности ретикулярных эпителиоцитов, что, вероятно, связано с повышением содержания эндогенных кортикостероидов. различная адаптация к γ-излучению радиочувствительных и радиорезистентных клеток связана с перестройками хроматина Тырсина Е.Г. Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва Преодоление индуцированной облучением радиорезистентности злокачественных клеток до сих пор остается одной из актуальных задач радиационной онкологии. Для решения этой проблемы необходима полная информация о биологии клеток, переживших облучение, в том числе, их адаптационном потенциале, который экспериментально определяется по выраженности радиоадаптивного ответа (РАО) – феномена временного повышения радиорезистентности, индуцированного предварительным облучением клеток в малых дозах. Однако до сих пор не ясно, зависит ли величина РАО от степени клеточной радиочувствительности и как связан процесс формирования РАО со структурной организацией хроматина. Ранее мы обнаружили, что хроматин радиочувствительных и радиорезистентных клеток различался как по исходной компактизации, так и по степени относительной релаксации после облучения в повреждающих дозах. Поэтому мы предположили, что от структурной организации хроматина зависит не только степень радиочувствительности, но и поддержание гомеостаза клетки, её адаптационные возможности. Это можно установить, регистрируя изменения конформации хроматина под действием малых доз в ходе адаптивного ответа, что и определило цель работы: выяснить имеется ли связь между выраженностью РАО и степенью клеточной радиочувствительности, а также какова роль реорганизации хроматина в процессе развития радиоадаптивного ответа. Исследования проводили на клеточной модели, состоящей из родительской линии злокачественных фибробластов джунгарского хомячка ДХ-ТК- и радиорезистентной линии ПОК-20 – потомков родительских клеток, выживших после γ-облучения в дозе 20 Гр. Клетки облучали на γ-установке «Агат-Р» с источником излучения 60Со, мощностью 0,77 Гр/мин. По кривым «доза- 257 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки эффект» в качестве адаптирующих были выбраны дозы в области «плеча», не снижавшие выживаемость клеток, и равные 0,1 и 0,3 Гр для родительских клеток и 0,1 и 0,5 Гр для потомков. В качестве повреждающих использовали дозы LD50 и LD20 , которые составили 1,5 и 3 Гр для обеих линий, с 5-часовым интервалом после применения адаптирующих доз. Для количественной оценки РАО проводили учет цитогенетических повреждений (микроядер) в клетках и рассчитывали коэффициент адаптивного ответа (КАО). Для исследования вклада структурных перестроек хроматина в механизм развития РАО методом аномальных временных зависимостей вязкости оценивали степень компактизации хроматина в условиях наличия и отсутствия РАО, а также зависимость относительной релаксации хроматина от времени инкубации клеток после действия адаптирующего облучения в различных дозах. Было обнаружено, что РАО для радиочувствительных клеток смещен в область более низких как адаптирующих, так и разрешающих доз. Максимум РАО для радиочувствительных клеток ДХ-ТК- был зафиксирован при адаптирующей дозе 0,3 Гр и повреждающей дозе 1,5 Гр, коэффициент адаптивного ответа КАО = 0,4±0,1. Для радиорезистентных клеток ПОК-20 – соответственно 0,5 Гр и 3,0 Гр, при КАО = 0,45±0,1. Облучение в адаптирующих дозах индуцировало в клетках обеих линий релаксацию хроматина, время которой не зависело ни от дозы, ни от степени радиочувствительности клеток и составляло примерно 5 часов после адаптирующего облучения. Однако скорость и степень релаксации хроматина резистентных клеток ПОК-20 были выше, чем у родительских ДХ-ТК- во всем диапазоне адаптирующих доз. Так, относительная релаксация хроматина клеток ПОК-20 составляла 2,4±0,3, что превышало этот показатель для клеток ДХ-ТК- в 1,7 раза. Сопоставив данные по конформационным перестройкам хроматина с эффективностью радиоадаптивного ответа мы выявили следующую закономерность: чем в большей степени выражена реакция клеток на адаптирующее воздействие облучения (повышение вязкости хроматина), тем более эффективен их адаптивный ответ на последующее действие разрешающей дозы. По-видимому, большая релаксация хроматина резистентных клеток в ответ на адаптирующее облучение способствует и большей стимуляции в них репарационных процессов, необходимых для устранения повреждений от последующего воздействия разрешающей дозы. Наблюдалась интересная тенденция: в области регистрации РАО компактизация хроматина клеток обеих линий при действии адаптирующей и повреждающей доз была выше, чем при действии только повреждающей дозы. А в области доз, где РАО не выявлялся, при совместном воздействии адаптирующей и повреждающей доз, наоборот, хроматин оказался более релаксированным, чем при облучении в одной повреждающей дозе. 258 Сборник научных трудов Полученные результаты свидетельствуют о том, что развитие РАО непосредственно связано с конформационными изменениями в структуре хроматина. Вероятно, индуцированная облучением в адаптирующих дозах релаксация хроматина на начальных этапах развития РАО приводит защитные системы клетки в состояние повышенной «готовности», а завершающая стадия РАО – временное повышение радиоустойчивости, наоборот, характеризуется повышенной компактизацией клеточного хроматина. Влияние фотодинамического воздействия на макрофаги Ударцева О.О., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б., Тарарак Э.М. РАН ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем, Москва Фотодинамическое воздействие (ФДВ) – неинвазивный метод, компонентами которого являются лазерное облучение и фотосенсибилизатор. Фотосенсибилизатор под действием света определенной длины волны переходит в возбужденное состояние. Далее протекает ряд химических реакций, в результате которых образуются активные формы кислорода (АФК), токсичные для клеток. В основе метода лежит различная способность клеток разных типов накапливать фотосенсибилизатор, что позволяет избирательно влиять на отдельные популяции клеток. В настоящее время ФДВ является перспективным методом лечения неонкологических заболеваний, в том числе пролиферативных заболеваний сосудов, таких как атеросклероз и рестеноз. Атеросклеротические поражения сосудов – это результат сложного взаимодействия нескольких типов клеток, поэтому нельзя однозначно указать клетки-мишени для ФДВ. В настоящей работе мы оценивали эффекты ФДВ на моноцит-производные макрофаги (Мф), которым отводится ключевая роль в формировании поражений сосудистой стенки. Моноциты выделяли из периферической крови человека методом центрифугирования в градиенте плотности и культивировали согласно стандартному протоколу. 7-дневную культуру адгезированных клеток считали первичной культурой макрофагов и использовали в экспериментах. Сульфонированный фталоцианин алюминия (ГУП НИОПИК РФ) [Фотосенс® (ФС®)], в конечной концентрации 10 мкг/мл добавляли к среде культивирования на 24 часа и определяли его накопление в клетках в перерасчете на общий клеточный белок. Для проведения ФДВ клетки инкубировали с ФС® 24 часа, отмывали от него и облучали с помощью лазерного аппарата АЗОР (λ = 675 нм) дозами 1–20 Дж/см2. Жизнеспособность клеток оценивали методом МТТ-теста. Образование внутриклеточных АФК детектировали с помощью 2,7-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетата (H2DCFDA), состояние митохондрий и лизосом 259 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки определяли с помощью мито- и лизотрекера соответственно. Способ клеточной гибели определяли цитохимически (набор АннексинV-FITC/ пропидиййодид) и иммуноцитохимически (окрашивание антителами к каспазе 3). Установлено, что за 24 часа Мф накапливали значительное количество ФС® – 2,1 нг ФС®/мг белка. Облучение клеток, нагруженных ФС®, снижало их жизнеспособность дозозависимым образом. LD90 для МФ составляла 15 Дж/см2. При средних и высоких дозах (5 Дж/см2 и выше) облучения клетки погибали путем некроза. Низкие дозы лазерного облучения обладали меньшим повреждающим действием, гибель Мф в этом случае происходила по пути апоптоза. Добавление ФС® в среду культивирования приводило к увеличению как доли окрашенных лизотрекером клеток, так и интенсивности их окрашивания, что свидетельствовало о закислении лизосомального компартмента клеток, т.е. об активации лизосом. АФК, образующиеся в результате ФДВ, оказывали повреждающее воздействие на митохондрии и лизосомы. Так, после ФДВ было выявлено уменьшение доли клеток, содержащих лизо- и митотрекеры, и уменьшение интенсивности флуоресценции зондов в них. Таким образом, ФДВ с использованием ФС® может эффективно элиминировать Мф. Разработанная нами модель in vitro может применяться для изучения чувствительности клеток разных типов к ФДВ с использованием различных фотосенсибилизаторов. Работа выполнена при поддержке Госконтракта Миннауки № 02.518.11.7141. Реакция нейронов головного мозга на малые радиационные воздействия Федоров В.П., Афанасьев Р.В., Зуев В.Г., Сгибнева Н.В., Гундарова О.П., Маслов Н.В. МОУ ВПО Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж, ГНИИ Военной медицины МО РФ, Москва Влияние возросшего радиационного фона на организм, и в частности, на центральную нервную систему, представляет интерес, так как наблюдается значительный рост заболеваний психического характера. При этом не всегда возможно отличить истинную патологию от проявлений радиофобии. Единственным объективным критерием в этом случае являются морфологические исследования, причем проследить все стадии изменений в ранние и отдаленные сроки, выявить дозо-временные зависимости и наиболее критические 260 Сборник научных трудов мишени для ионизирующего излучения возможно только в экспериментах на животных с последующей экстраполяцией полученных данных на человека. Эксперимент выполнен на 400 белых беспородных крысах-самцах в возрасте 2 месяцев, что соответствует среднему возрасту ликвидаторов аварии на ЧАЭС. Животные подвергались общему однократному или в течение рабочей недели гамма-облучению в дозах 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 Зиверт. Отделы головного мозга (сенсорная и моторная кора, подкорковые ядра, таламус, мозжечок) забирали в первые часы и сутки, а также через 1, 6, 12, 18 и 24 месяца после воздействия. Фиксировали в формалине, жидкости Карнуа, пропаноле или готовили криостатные срезы. Обзорные срезы окрашивали гемотоксилин-эозином и по Нисслю. Общий белок выявляли по Бонхегу, а нуклеиновые кислоты по Shae S.K. Основные окислительно-восстановительные ферменты (СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ), ЩФ выявляли по общепринятым методикам. В результате исследования было установлено, что нейроны всех изученных отделов головного мозга реагируют на измененный радиационный фон реактивными, деструктивными и компенсаторно-приспособительными изменениями, и по их соотношению в пострадиационном периоде выделено три стадии: начальных проявлений, выраженных изменений и восстановления. В стадию начальных проявлений, которая наблюдается в первые часы и сутки после облучения, происходило изменение соотношения различных типов нейронов. Так отмечалось снижение количества нормохромных клеток за счет увеличения числа гиперхромных и гипохромных нейроцитов. В этот период не происходило достоверного снижения цитокариометрических показателей, но наблюдалась тенденция к увеличению дистрофически и некротически измененных нервных клеток. Особенно заметно в первые сутки колебание состояния нуклеиновых кислот. При всех дозах облучения происходит снижение содержания ДНК, не связанное с дозой облучения и носящее истинный характер, так как происходит на фоне одновременного уменьшения объема ядер. Причем изменения кариометрических показателей также носят стохатистический характер и не зависят от дозы облучения и уровня снижения содержания ДНК. Аналогично изменялось и содержание РНК как в цитоплазме, так и в ядрышках нейроцитов. Сходные изменения демонстрировали показатели содержания общего белка изученных образований головного мозга. Активность окислительно-восстановительных ферментов (СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ) в отличие от других показателей достоверно снижалась. Снижался и активный транспорт в капиллярной стенке, о чем свидетельствует снижение активности ЩФ (р<0,5). Причем, при одной и той же поглощенной дозе изменения более выражены при однократном облучении, чем при фракционированном. В стадию выраженных изменений, продолжающуюся до 30 суток пострадиационного периода, появлялись умеренно выраженные измене261 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ния нейронов. Они сопровождались иным соотношением различных типов клеток с преобладанием гиперхромных нейронов и увеличением их числа с признаками гидропической дистрофии и коагуляционного некроза. В этот же период наблюдалось значимое снижение кариометрических показателей нейронов в начале и восстановление их к концу этого периода. Анализ изменений ядерного цитоплазматического индекса нейронов свидетельствует о незначительных структурно-функциональных изменениях, имеющих фазный характер и зависящих от срока пострадиационного периода. На фоне снижения объема тела и ядер клеток, увеличения количества пикноморфных нейронов отмечалось увеличение содержания белка и нуклеиновых кислот. Это свидетельствует о состоянии функционального напряжения нейронов, морфологически проявляющегося умеренным гипохромным их окрашиванием и укрупнением базофильных глыбок. На протяжении этого периода наблюдалось снижение активности ключевых ферментов биоэнергетического обмена: СДГ – в цикле лимонной кислоты, ЛДГ – в процессе гликолиза, что компенсировалось увеличением активности пентозофосфатного пути превращения углеводов. Это предотвращает окислительное повреждение мембранных структур клеток, а также облегчает пути доставки Д-рибозы и НАДФ-Н для биосинтеза нуклеиновых кислот и белка. Активный транспорт в эндотелии капилляров остается сниженным, что сочетается, видимо, с патологическими изменениями периваскулярных астроцитов. Все это приводит к появлению очагов переваскулярного и перицеллюлярного отека. В третью фазу, продолжающуюся до 6 месяцев пострадиационного периода, происходила постепенная нормализация в соотношении морфологических типов нейронов, цито- и кариометрических их показателей, содержания белка и нуклеиновых кислот, активности дегидрогиназ и гидролаз. Т.о., в стадию восстановления преобладают адаптационные изменения, заключающиеся в расширении объема физиологической изменчивости нейронов. К концу наблюдения (2 г.) значимые морфологические изменения не выявляются, а практически соответствуют возрастному контролю в виде уменьшения нейроцитов на единице площади, изменения их тинкториальных свойств по гипо- или гиперхромному типу, а также увеличения с возрастом количества клеточных теней. В целом в поздние сроки преобладают адаптационные изменения, заключающиеся в расширении объема физиологической изменчивости нейронов. 262 Сборник научных трудов Реакция нейроцитов коры и подкорковых ядер головного мозга на острую алкогольную интоксикацию Федоров Н.В. ГОУ ВПО Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж Известно, что алкоголь практически во всех концентрациях является несомненным нейротропным фактором. Последствиям его влияния на организм, в частности, на центральную нервную систему, посвящено довольно большое количество исследований. Однако его влияние на головной мозг при острой интоксикации остается неизученным. Определенный интерес могут представлять данные по сравнительной оценке корковых и подкорковых структур мозга на действие этанола в дозе, приводящей к раннему нарушению дееспособности. Эксперимент проведен на 60 белых крысах-самцах линии Вистар, массой 200 г. Подопытным животным внутрибрюшинно вводили 15%-ный этиловый спирт в дозе 2,25 г/кг. Контролем служили крысы, которым вводили физиологический раствор, также находившиеся в условиях вивария. Объекты исследования (сенсомоторная кора, хвостатое ядро) забирали по мере развития неврологической симптоматики через 3, 10, 17, 35, 60, 150, 300 и 600 минут после ведения алкоголя, фиксировали в растворах Бехера, Карнуа или замораживали в твердой углекислоте. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином и крезилвиолетом по Нисслю. Проведенные исследования показали, что в сенсомоторной коре наблюдаются выраженные реактивные изменения по гиперхромному типу в ранние (3 мин) и отдаленные (300–600 мин) сроки наблюдения. Во все сроки наблюдения было увеличено количество пикноморфных клеток, а к концу наблюдения это увеличение по отношению к контролю становилось достоверным. В интервале от 60 до 150 мин наблюдения преобладали клетки с изменениями по гипохромному типу. В интервале от 10 до 35 мин, когда крысы засыпали, наблюдалось восстановление нормохромных клеток до контрольных значений и уменьшение количества клеток, как с реактивными, так и деструктивными изменениями. 263 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Реакция нейроцитов подкорковых ядер несколько отличалась от таковой в коре. Так, первые достоверные изменения отмечены только через 35 мин после воздействия. При этом достоверно увеличивалось количество нервных клеток, измененных как по гипо-, так и гиперхромному типам (р<0,5) по сравнению с контролем. В интервале 60–300 мин преобладали нормохромные клетки, с незначительным увеличением гиперхромных нейронов. К 600 мин наблюдения изменения достигали своей наибольшей выраженности. Достоверно снижалось количество нормохромных клеток и значимо возрастало количество реактивных нейронов по гиперхромному типу, а также количество клеток с альтеративными изменениями в виде пикноморфных нейронов и клеточных теней. Наряду с описанными изменениями в коре и подкорковых ядрах постоянно встречались нейроны с тотальным или очаговым хроматолизом, а также мелкоячеистой вакуолизацией цитоплазмы. В гиперхромных нейронах довольно часто встречался очаговый или периферический хроматолиз. Таким образом, выраженные изменения нейроцитов в подкорковых ядрах появляются позже, чем в коре, но сохраняются более длительное время. В обеих структурах мозга изменения носят фазный характер. Полученные результаты отражают неоднозначность подхода исследователей к оценке первичности изменений структур мозга при действии этанола. Одни авторы отмечают, что этанол первично действует на подкорковые структуры, а затем на кору. Другие исследователи отмечают первичность изменений коры. Такое разночтение экспериментальных данных связано, видимо, с различными методическими подходами к изучаемой проблеме. Функциональное состояние нейронов мозга и тироцитов щитовидной железы в эксперименте Хапажева М.Ж., Курашинова Л.Т., Гутова Ф.З. Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова, Нальчик Интегрирующим центром в регуляции функциональной активности щитовидной железы является нейросекреторная система гипоталамуса. Принимая во внимание участие в этом процессе коры больших полушарий головного мозга, представляет интерес в экспериментальных условиях (с использованием электрофизиологической и гистологической техники), изучить морфофункциональные изменения нейронов сенсомоторной коры, нейросекреторных клеток супраоптического ядра (СОЯ), паравентрикулярного ядра (ПВЯ), гипоталамуса и тироцитов щитовидной железы (ЩЖ) при воздействии психотропного препарата аминазина, что и явилось задачей настоящего исследования. 264 Сборник научных трудов Изучению и обобщению подвергались 2 группы животных (белые крысысамцы, масса 190–220 г): 1 группа – контрольная (n=10); 2 группа – животные, подвергавшиеся многократному (ежедневно в течение 12 сут) внутримышечному введению аминазина в дозе 10 мг/кг (�� n�� =20). У всех групп осуществлялась запись импульсной электрической активности нейронов сенсомоторной коры, СОЯ, ПВЯ переднего гипоталамуса с помощью универсальной пятиканальной физиологической установки типа УЭФПТ-5, после чего крысы забивались декапитацией. Для гистологического изучения брали участки головного мозга (СОЯ, ПВЯ, гипоталамус) и ЩЖ. Материал фиксировали в 10% растворе формалина, жидкости Буэна, заливали в парафин. Срезы головного мозга окрашивались гематоксилином и эозином, а также по Нисслю. Срезы ЩЖ окрашивали гематоксилином и эозином. С помощью окуляр-микрометра измеряли диаметр ядер нейроцитов СОЯ, ПВЯ гипоталамуса, а в ЩЖ – диаметр фолликулов, высоту тироцитов, диаметр ядер тироцитов. Полученные данные подвергались биометрической обработке. В условиях многократного введения аминазина отмечена выраженная реакция нейронов в изучаемых нервных образованиях. В сенсомоторной коре 74% нейронов отвечают снижением функциональной активности, 10% – повышением функциональной активности, 16% – остаются ареактивными к многократному воздействию препарата. Средняя частота импульсных электрических разрядов при указанных выше состояниях составили соответственно: 5±0,4 имп/сек, против 10±0,6 имп/сек в контроле, 16±0,7 имп/сек, против 11±0,3 имп/сек в контроле, 11±0,5 имп/сек, против 10±0,7 имп/сек в контроле. В СОЯ 64% нейронов отвечали снижением функциональной активности, у 18% нейронов выявлено повышение функциональной активности, 18% нейронов остаются ареактивными к воздействию препарата. Средняя частота импульсных электрических разрядов, соответственно данным функциональным состояниям, составила: 6±0,4 им/сек, против 11±0,8 имп/сек в контроле, 17±0,5 имп/сек, против 12±0,6 имп/сек в контроле, 13±0,8 имп/сек, против 12±0,7 имп/сек в контроле. В ПВЯ 68% нейронов отвечали снижением функциональной активности, у 11% нейронов выявлено повышение функциональной активности, 21% нейронов остаются ареактивными к воздействию препарата. Средняя частота импульсных электрических разрядов при данных функциональных состояниях составила соответственно: 3±0,2 имп/сек, против 11±0,6 имп/сек в контроле, 18±0,7 имп/сек, против 12±0,5 имп/сек в контроле, 14±0,4 имп/сек, против 12±0,7 имп/сек в контроле. Морфологический анализ отделов головного мозга показал неоднотипность реакций нейронов на воздействие препарата. В сенсомоторной коре наиболее часто встречаются нейроны с набухшими телами и их ядрами, ча- 265 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки стичным хроматолизом базофильного вещества. Изредка встречаются сморщенные клетки. Эти признаки наиболее выражены в 3, 5 слоях коры. Морфологические изменения нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса при многократном введении препарата отражены в таблице 1. Изменения ядер нейроцитов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса при многократном введении аминазина Условия опыта Многократное введение Контроль Таблица 1 Диаметр ядер нейроцитов в мкм СОЯ ПВЯ 5,4±0,26 5,2±0,17 7,6±0,19 7,4±0,34 На фоне изменения функционального состояния нервной системы введением аминазина наблюдаются морфологические изменения в щитовидной железе, что отражено в таблице 2. Морфологические показатели щитовидных желез при введении в организм аминазина Морфологический показатель Условия опыта Многоразовое введение Контроль Диаметр ядер тироцитов в мкм 5,5±0,16 4,3±0,23 Высота тироцитов в мкм 8,9±0,12 7,6±0,27 Таблица 2 Диаметр фолликулов в мкм 37±0,31 48±0,24 Приведенные в работе данные свидетельствуют о том, что при введении аминазина в указанной дозе наблюдается неоднотипность реакций нейронов изучаемых нервных образований, что определяется различным исходным состоянием клеток до воздействия препарата, а также длительностью его введения. Результаты эксперимента свидетельствуют о существовании тесной корреляционной зависимости между функциональным состоянием изученных нервных образований и щитовидной железы. Взаимосвязь изменений альвеолярных макрофагов со структурными основами «шокового легкого» Харин Г.М., Шакирова А.З. ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава», Казань В настоящее время механическая и термическая травма обуславливают высокую смертность и летальность населения, связанную, в первую очередь, с развитием последствий шокогенных повреждений, полиорганной недо266 Сборник научных трудов статочности. Среди жизненно важных органов, повреждение которых играет решающую роль, легким принадлежит первостепенное значение. Согласно многочисленным данным литературы, возникновение респираторного дистресс-синдрома взрослых (РДСВ) при различных видах шока («шокового легкого») увеличивает возможность летального исхода от 25,5% до 85–90%. Структурные основы РДСВ при экстремальных состояниях достаточно подробно изучены многими авторами и характеризуются тяжелыми мозаичными гемоциркуляторными и гемокоагуляционными нарушениями с одновременно возникающими расстройствами газообмена и бронхиальной проходимости, что способствует присоединению воспалительных изменений в органе. Достоверным критерием фатального и необратимого течения РДСВ являются развивающиеся процессы организации и фиброза легочной ткани. В развитии отмеченных осложнений, следует подчеркнуть роль механизмов местной неспецифической защиты, которые осуществляются, главным образом, путём взаимодействия трёх клеточных популяций: макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов. Исключительное положение среди них занимают макрофаги, обладающие фагоцитарной и секреторной активностями. Основная роль в выполнении нереспираторных функций легких отводится альвеолярным макрофагам (АМ), относящимся к свободным клеткам с уникальной способностью метаболической адаптации к существованию в аэробных условиях. Обладая полифункциональностью и значительным арсеналом секретируемых биологически активных веществ, АМ участвуют в патогенезе различных заболеваний легких. Однако участие АМ в патогенезе шока и его последствий остается мало изученным, а имеющиеся данные противоречивы. В связи с этим нами был проведен комплексный, сравнительный анализ изменений клеточного состава бронхо-альвеолярного смыва (БАС), ультраструктуры АМ и гистологической структуры легочной ткани у крыс с травматическим и ожоговым шоком. Ранняя реакция организма на шокогенные повреждения сопровождалась однотипными и фазными изменениями морфофункционального состояния АМ, отличающимися, в зависимости от этиологии повреждающего фактора, лишь по срокам своего проявления. Общее количество АМ в БАС возрастало, что отражало реакцию экстренной адаптации. Зафиксирован приток клеток-предшественников и/или миграция зрелых макрофагов из интерстиция, при этом отмечено прогрессирующее уменьшение числа жизнеспособных клеточных элементов. Значительная часть АМ находилась в состоянии набухания с выраженной деструкцией внутриклеточных органелл и резким обеднением лизосомального аппарата, что сочеталось с повреждением значительного количества альвеолоцитов II типа. Все это приводило к нарушению аэрогематического барьера и развитию интерстициального отека. Рост числа нежизнеспособных АМ прямо коррелиро267 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки вал с выраженностью различных проявлений синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови в легких, а также с увеличением относительных площадей ателектазов, острой эмфиземы, появлением пневмонических фокусов, гиперплазией бронх-ассоциированной лимфоидной ткани и начальными признаками коллагенообразования. Аналогичная закономерность выявлялась и на высоте торпидной стадии шока. Наряду с нежизнеспособными дегенеративными формами макрофагов в БАС находилось значительное количество молодых форм АМ, ультраструктура которых характеризовалась активным ядром и мощным лизосомальным аппаратом. Таким образом, изложенные факты не вызывают сомнений в том, что после шокогенных повреждений возникает сложная система межклеточных взаимодействий в легких с прямыми и обратными связями. Деструктивные изменения значительного количества АМ как одно из проявлений «шокового легкого», несомненно, включает в себя повреждение рецепторного аппарата макрофагов, что влечет за собой нарушение этих взаимодействий. Увеличение субпопуляции жизнеспособных АМ в данных условиях является компенсаторно-приспособительной реакцией, направленной на выполнение метаболической, защитной и иммунной функции макрофагов. Однако на определенных стадиях травматической и ожоговой болезней, АМ могут выступать потенциальным источником факторов, повреждающих легочную ткань и приводящих к прогрессированию воспалительных и фибропластических процессов. Механизмы участия АМ в различных проявлениях РДСВ представляются весьма сложными и далеко не однозначными. Есть все основания полагать, что результаты изучения клеточного состава БАС могут служить дополнительными диагностическими критериями тяжести и прогнозирования исходов шокогенных повреждений, а расшифровка роли АМ в цепи последовательности развития «шокового легкого» является перспективной задачей в плане поиска путей патогенетической терапии шока. О межклеточных взаимодействиях в системе фагоцитоза при экспериментальных шокогенных повреждениях Харин Г.М., Сабитова А.М. ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Росздрава, Казань Среди факторов защиты, обеспечивающих адаптацию организма к пост агрессивным состояниям, важная роль отводится системе фагоцитоза. Исследования взаимодействия различных клеточных и гуморальных факторов этой 268 Сборник научных трудов системы способствуют объяснению некоторых механизмов поддержания гомеостаза после шокогенных воздействий на организм. В экспериментах на 300�� белых беспородных крысах нами проведено сравнительное изучение количества и функциональной активности нейтрофилов (Нф) крови, поглотительной способности звездчатых ретикулоцитов (ЗР) печени и уровня плазменного фибронектина (ФН) в динамике раннего периода травматической и ожоговой болезни. Фагоцитарная способность Нф определялась прямым визуальным методом с определением фагоцитарной активности, фагоцитарного индекса и коэффициента завершенности фагоцитоза, а также по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) и уровню люминолзависимой хемилюминесценции крови. Поглотительная способность ЗР оценивалась по клиренсу желатинизированного раствора казеиновой туши методом спектрофотометрии. Концентрация ФН определялась в плазме крови иммуноферментным методом. Проведенные исследования показали, что ранняя реакция организма на шокогенные повреждения сопровождалась достоверным угнетением фагоцитарных реакций Нф, протекающих с нарушением метаболической активности по показателям хемилюминесценции и НСТ-теста. Одновременно наблюдалось ухудшение клиринговой функции ретикулоэндотелиальной системы на фоне падения концентрации ФН. Прослеженные изменения коррелировали с тяжестью шокового процесса. Купирование шока сопровождалось улучшением функциональной активности Нф и ЗР печени и гиперфибронектинемией. В постшоковом периоде у подопытных животных наблюдалась тенденция к активации фагоцитарных реакций, степень выраженности которых зависела от наличия или отсутствия воспалительных осложнений. Однонаправленность изменений различных факторов неспецифической защиты организма свидетельствовала о возможной их взаимосвязи, обусловленной взаимодействием нейтрофилов и макрофагов. Это положение было подтверждено нами в опытах с искусственной стимуляцией или блокадой системы мононуклеарных фагоцитов, которые подтвердили возможность модулирования активности фагоцитарных реакций в динамике постагрессивных состояний. На фоне предварительной стимуляции ЗР продигиозаном развитие шокового процесса имело более пролонгированный характер со снижением летальности подопытных крыс на 20 % и сопровождалось возрастанием поглотительной и микробицидной активности Нф. Стимуляция клеточных элементов в торпидной фазе шока характеризовалась увеличением количества циркулирующих Нф, превышающим его рост у «нелеченных» животных, повышением их микробицидной активности, а 269 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки также способствовала сохранению высокого уровня ФН и усилению поглотительной функции ЗР. Развитие шокового процесса у крыс, подвергшихся предварительной «блокаде» ЗР печени, приводило к выраженной нейтропенической реакции и более тяжелой депрессии нейтрофильного фагоцитоза. На высоте шока выявлялось падение уровня плазменного ФН почти на 50 %. Искусственная «блокада» ЗР в разгаре торпидной фазы шока сопровождалась резким снижением количества Нф, угнетением их поглотительной и бактерицидной активности. Метаболическая активность и резервные возможности Нф были ниже по сравнению с изменениями при «чистом» шоке. Одновременно прослеживалась выраженная гипофибронектинемия. Анализ полученных результатов позволил установить, что состояние печеночных макрофагов коррелирует с выраженностью изменений Нф при шоке, и взаимосвязь между ними может осуществляться в значительной мере с помощью плазменного ФН. Полученные факты дали основание рассматривать феномен снижения нейтрофильного фагоцитоза, сочетающийся с гипофибронектинемией, как своеобразный критерий, косвенно свидетельствующий о депрессии клеточных элементов системы мононуклеарных фагоцитов. Микрохирургия преимплантационных эмбрионов млекопитающих при помощи системы «лазерный скальпель – лазерный пинцет» Храмова Ю.В., Сергеев С.А., Ракитянский М.М., Семенова М.Л., Агранат М.Б. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Микрохирургия является важной частью работы с ооцитами и преимплантационными эмбрионами и применяется как в эксперименте, так и в клинической практике. Микрохирургические манипуляции производят на эмбрионах от стадии зиготы (0,5 сут развития) до стадии бластоцисты (3,5 сут). В клиниках вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) для проведения преимплантационной генетической диагностики производят биопсию редукционного тельца или бластомера, разрезают zona pellucida эмбриона при проведении вспомогательного хэтчинга. В экспериментальной эмбриологии при помощи микрохирургических методов вводят генетические конструкции в пронуклеус зиготы и генномодифицированные клетки в полость бластоцисты для получения трансгенных животных. В клиниках и лабораториях для осуществления этих процедур используют микроманипуляторы. Так, например, при биопсии эмбриона двумя стеклянными иглами разрушают участок zona 270 Сборник научных трудов pellucida и через полученное отверстие с помощью игл для биопсии изымают бластомер или редукционное тельце. В последнее время широкое применение в эмбриологии нашли лазерные технологии. Классическое применение лазера – лазерный скальпель, а относительно новое – лазерный пинцет. В связи с этим целью нашей работы было разработать метод проведения микрохирургических манипуляций с преимплантационными эмбрионами мыши и человека при помощи системы лазерный скальпель – лазерный пинцет. А именно, подбирали оптимальные параметры установки для проведения слияния бластомеров мыши на стадии двух клеток, проводили биопсию редукционного тельца/бластомера с помощью системы лазерный скальпель – лазерный пинцет, а также осуществляли процедуру вспомогательного хэтчинга с помощью фемтосекундного лазера и исследовали жизнеспособность эмбрионов после лазерного воздействия. В работе мы использовали половозрелых самок линии �� DBA�� , а также гибридов С57�� Bl�� /�� CBA�� . Эмбрионы на стадии двух клеток (1,5 сут развития) вымывали из яйцеводов по стандартному протоколу (Манк, 1990). Эксперименты проводили с использованием установки на основе фемтосекундного хром-форстеритового лазера с длиной волны 620 нм, импульсной мощностью 1–15 мВт, длительностью импульсов 100 фс и инвертированного микроскопа с эпи-положением лазерного луча, разработанной в отделе лазерной плазмы Объединенного института высоких температур РАН. Эмбрионы мыши помещали в микрокаплю среды для манипуляций, покрывали минеральным маслом, для получения отверстия в блестящей оболочке проводили серию выстрелов в режиме «лазерный скальпель». Затем с помощью непрерывного волоконного иттербиевого лазера с длиной волны 1028 нм, работающего как лазерный пинцет, захватывали редукционное тельце и вытаскивали его через полученное отверстие. При проведении слияния бластомеров сначала подбирали оптимальные параметры установки, так наибольшая эффективность процедуры была зафиксирована при легкой расфокусировке системы. Выстрелы проводили в режиме «лазерный скальпель» точно по линии контакта бластомеров. В среднем требовалось 3–4 выстрела. Для визуализации процесса слияния мембраны эмбрионы окрашивали флуоресцентным красителем FM�� 4-64 (�� F�� 34653, �� Invitrogen�� ) при +4ºС и фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида в ФБС, затем изготавливали тотальные препараты, которые изучали при помощи конфокального микроскопа (Axiovert 200M 510 Meta, Zeiss). При проведении вспомогательного хэтчинга делали небольшое отверстие в блестящей оболочке эмбрионов из опытной группы с помощью лазерного скальпеля, а эмбрионы из группы контроля просто находились в соседней капле среды. После процедуры вспомогательного лазерного хэтчинга ставили культуру эмбрионов. Через 3 дня культуру снимали, делали прижизненные фотографии, затем проводили окрашивание эмбрионов флуо271 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ресцентными красителями Hoechst (Sigma�� , �� B�� -2261) и propidium iodide (�� Invitrogen, P1304MP). Затем эмбрионы фиксировали и изготавливали препараты «раздавленная капля». На рисунке 1 представлены этапы слияния бластомеров эмбрионов. В среднем на полное слияние требовалось 90 мин. Рис. 1. Слияние бластомеров 2-хклеточного эмбриона: А) эмбрион до выстрела; В) сразу после выстрела; С) через 30 минут после выстрела; D) сразу после второго выстрела; E) окончательный вид эмбриона; F) флуоресцентное окрашивание поверхностной мембраны подтверждает слияние бластомеров (конфокальная микроскопия). На рисунке 2 приведены результаты цитологического анализа эмбрионов, развившихся после проведения вспомогательного лазерного хэтчинга. Рис. 2. Бластоциста после процедуры лазерного вспомогательного хэтчинга: бластоциста выходит из zona pellucida через надрез, сделанный лазерным скальпелем (А); все клетки бластоцисты не имеют повреждений («+» Хехст-окрашивание, «-» йодид пропидия) (В). 272 Сборник научных трудов Таким образом, мы подобрали оптимальные параметры установки для проведения микроманипуляций с преимплантационными эмбрионами и доказали, что лазерное воздействие не снижает жизнеспособность объектов. Индекс межклеточных отношений как показатель баланса и дисфункции взаимодействий клеточных систем Худоерков Р.М. Научный центр неврологии РАМН, Москва Одной из актуальных задач современной неврологии является познание закономерностей работы и взаимоотношений разных нейронных систем головного мозга в условиях физиологической нормы и патологии. Решение поставленной задачи во многом зависит не только от использования новых современных методов адекватной оценки функции нейрона, но и от новых методических подходов при оценке взаимодействий разных нейронных систем. В настоящей работе были проанализированы исследования, выполненные нами ранее (Худоерков Р.М., 2001; Худоерков Р.М., Герштейн Л.М., 2005; Худоерков Р.М., Доведова Е.Л., 2006; Худоерков Р.М., Воронков Д.Н., 2007; Худоерков Р.М. и др., 2007), которые проводились на клеточном и субклеточном уровнях. На клеточном уровне изучали нейроны коры больших полушарий, различающиеся по структуре и функции – слои III и V, и нейроны подкорковых образований – хвостатого ядра. При изучении на субклеточном уровне сравнивали в целом две популяции нейронов – коры больших полушарий и подкорковых образований. При работе на клеточном уровне применяли методы количественной цитохимии (определяли содержание белка) и компьютерной морфометрии (оценивали морфометрические характеристики нейронов и нейроглии), на субклеточном уровне, методами биохимии, определяли величины удельной активности тирозингидроксилазы, триптофангидроксилазы и моноаминоксидаз, типы А и Б – ферментов, участвующих в синтезе и катаболизме дофамина и серотонина. Исследования проводили на крысах Вистар и Август. Животных изучали как в плане межлинейных различий, так и в плане устойчивости к стрессу. В качестве экспериментального воздействия использовали введение животным препаратов леводопы, галоперидола, амфетамина и ряда нейропептидов. На основе полученных данных было установлено, что устойчивость взаимодействия между клеточными системами определяется с помощью индекса межклеточных отношений, согласно формуле c = a/b, где (a и b) – параметры нейрохимических или морфометрических измерений, например, содержания клеточных или тканевых метаболитов, величины удельной активности фермен- 273 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки тов, глионейрональный показатель и т.д. Согласно этому положению, в условиях физиологической нормы, между клеточными системами мозга поддерживается определенный баланс отношений, при нарушении которого возникает дисфункция. Таким образом, устойчивость взаимодействия между клеточными системами зависит не от уровня нейрохимических или морфологических показателей, регистрируемых в данных системах, а от величины отношения между этими показателями, т.е. величины индекса межклеточных отношений, который позволяет наиболее адекватно судить о степени возникшей дисфункции или пластической перестройки нейронных систем при экспериментальных воздействиях. Влияние ваготомии на микроциркуляцию крови и состояние водного метаболизма в печени и тонкой кишке крыс Цибулевский А.Ю., Дубовая Т.К., Быков А.В. Российский государственный медицинский университет, Москва Учитывая тесные взаимосвязи между органами гастро-дуоденального региона (в значительной степени опосредованные нервными механизмами), а также факт достаточно широкого применения в абдоминальной хирургии операций, сопряженных с перерезкой нервных проводников, в настоящей работе предпринята попытка провести сравнительное морфофункциональное исследование эффекта ваготомии на микрогемодинамику и состояние водного обмена в печени (П) и проксимальном отделе тонкой кишки (ТК). В эксперименте использовали 76 беспородных крыс-самцов с массой 180–210 г. У 42 из них производили двустороннюю поддиафрагмальную стволовую ваготомию, остальные (в том числе 9 ложнооперированных) служили контролем. Через 1, 7, 14, 30, 60 и 220 сут после операции под уретановым наркозом определяли скорость местного кровотока (СМК) в паренхиме П и мышечной оболочке ТК полярографическим методом. Для морфологического анализа кусочки П фиксировали в 10 % забуференном формалине. На парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли площадь синусоидных капилляров методом компьютерной морфоденситометрии с использованием телевизионной установки «ДиаМорф». Для выявления микрососудов в стенке ТК замороженные срезы импрегнировали азотнокислым серебром. Содержание общей воды в тканях исследованных органов определяли весовым методом по разнице массы влажных и высушенных (при 60° С в течение 5 сут) образцов. Магнитно-релаксационные характеристики (времена спин-решеточной и спин-спиновой релаксации – Т1 и Т2 соответственно) тканей исследованных органов регистрировали на приборе 274 Сборник научных трудов «�� Minispec�� PC�� -120». Полученные данные обрабатывались стандартными методами вариационной статистики. Показано, что ваготомия приводила к существенным изменениям системы микроциркуляции крови в тканях П и ТК. При этом динамика этих перестроек имела органную специфику. Так, несмотря на то, что изменения размеров синусоидных капилляров П и емкостных микрососудов (посткапиллярных венул и венул) ТК в условиях ваготомии по своей направленности в целом совпадали (увеличивались), временная структура этих преобразований в исследованных органах заметно различалась. Соответствующая кривая в П имела одновершинный характер (с максимумом через 7 сут), в то время как в ТК – двухвершинный (с максимумами через 7 и 30 сут). При этом в П увеличение площади синусоидов коррелировало с уменьшением СМК во все изученные сроки, в ТК – только через 1, 30 и 60 сут. Кроме того, в ТК отмечалось временное (через 14 сут) увеличение СМК. Изменения водного метаболизма в данных органах в условиях ваготомии проявлялись в повышении содержания общей воды и увеличении Т1 и Т2. Существенно, что динамика содержания общей воды как в П, так и в ТК в значительной степени соответствовала кинетике СМК и размерам изученных микрососудов. Лишь в ТК через 7 и 14 сут не выявлялось такой корреляции: достоверное повышение содержания общей воды отмечалось на фоне отсутствия изменений СМК (7 сут) и, напротив, отсутствие отклонений содержания общей воды – при увеличении СМК (14 сут). Общей чертой перестройки водного метаболизма П и ТК в условиях ваготомии явилась разница во времени изменения Т1 и содержания общей воды. Достоверные отклонения первого из них были зарегистрированы уже через 1 сут, в то время как второго — через 7 сут. Это обстоятельство подтверждает высокую информативность магнитно-релаксационных характеристик в плане выявления ранних (скрытых) нарушений обмена воды в тканях. Кроме того, измерение времени магнитной релаксации протонов (более 80 % которых в биологических объектах приходится на воду) позволяет судить о динамической структуре последней. Так, достоверное увеличение Т1 и Т2 в тканях П и ТК в условиях ваготомии с высокой долей вероятности указывает на уменьшение степени структурированности воды и повышение ее подвижности. К концу исследованного срока практически все определяемые параметры приближались к исходным значениям. Обсуждая патогенетические механизмы нарушений микрогемодинамики и водного метаболизма в П и ТК при ваготомии, можно предположить, что в их развитие существенный вклад вносят такие факторы, как перераспределение кровотока между органами гастро-дуоденальной системы, децентрализация интрамурального нервного аппарата, развитие в его нейронах нейродистро275 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки фического процесса и, как следствие, нарушение баланса нейромедиаторов в тканях и дефицит нейротрофинов. Кроме того, в этих условиях, по всей вероятности, нарушается функционирование местного нейро-гуморального механизма, представленного комплексом «нервная терминаль – тканевый базофил – эндокриноцит», играющего важную роль в регуляции микроциркуляции крови. Развивающиеся при этом расстройства водного обмена, по-видимому, обусловлены нарушением проницаемости капилляров и плазмолеммы клеток тканей (в первую очередь, по отношению к электролитам и белкам), изменением осмотического и онкотического давления в интерстициальном секторе вследствие расстройства тканевого метаболизма, вызванного гипоксией. Образующиеся при этом недоокисленные продукты также могут оказывать заметное влияние на распределение воды в тканях. Таким образом, ваготомия приводит к нарушениям микроциркуляции крови и расстройствам водного метаболизма в П и ТК, которые проявляются в расширении микрососудов, уменьшении СМК, увеличении содержания общей воды, уменьшении степени ее структурированности и повышении подвижности. При этом выявлены определенные органные особенности перестроек микроциркуляторной системы и водного обмена в данных условиях. Морфологические изменения при хроническом панкреатите Цыганов С.Е., Никитин П.Н., Сетдикова Г.Р., Паклина О.В, Туманова Е.Л. Кафедра патологической анатомии МФ ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет ФА по ЗО и СР РФ, Москва Хронический панкреатит (ХП) является длительно текущим воспалительным заболеванием поджелудочной железы (ПЖ), характеризующимся прогрессирующим фиброзом стромы железы и, как следствие, нарушением ее функции. Цель исследования – характеристика и степень выраженности фиброза при хроническом панкреатите. Работа основана на операционном материале, полученном от 30 больных с ХП. Контролем служили 7 образцов неизмененной ткани ПЖ (аутопсийный материал). Среди больных преобладали мужчины (24 больных), средний возраст – 48 лет. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 2 мкм, стрептавидин-биотин-пероксидазным методом, с докраской ядер гематоксилином фирмы �� Shandon�� по схеме, реко- 276 Сборник научных трудов мендуемой фирмой производителем (�� LabVision�� , USA�� ). В качестве первичных антител использовали виментин, десмин («DAKO»), коллаген I, III, V�� типов (�� Novocastra�� ). Площадь структур, окрашенных десмином, виментином и коллагенами рассчитывали с помощью программы WCIF ImageJ. Интенсивность реакций оценивали полуколичественным методом: (-/0) – отрицательная, (+/1) – слабая, (++/2) – средняя, (+++/3) – интенсивная. Статис- тический анализ проводили при помощи программы STATISTICA 6.0. Установлено, что в неизмененной ткани ПЖ экспрессировался только коллаген III типа фибробластами соединительнотканных междольковых перегородок. Площадь окрашенных структур составила 1,7%. При исследовании ХП были получены следующие данные: n=30 Коллаген I Коллаген III Коллаген V Площадь окрашенных Pixel структур (S) Среднее значение % Pixel % Pixel % Десмин Pixel % Виментин Pixel % 2584 1,34 44687 12,68 64139 14,76 27853 7,17 121456 34,76 Гистологические изменения при ХП вариабельны в разных дольках. На фоне увеличения фиброзных изменений в железе прослеживалась тенденция к нарастанию экспрессии виментина (r = 0,44, p<0,01), тогда как экспрессия десмина падала и наблюдалась только в стенках сосудов и клеточной фиброзной ткани (r = -0,57, p<0,01). Площадь окрашенных структур виментином в среднем составила 34,76%, что соответствовало грубоволокнистым фиброзным изменениям в строме железы, в отличие от десмина (S=7,17), который характерен для гладкомышечной и ретикулярной ткани. Также мы отметили, что фиброз в строме содержал коллаген III и V типов, которые равномерно окрашивали междольковые перегородки. По мере прогрессирования процесса, в центре междольковых фиброзных перегородок откладывался коллаген I типа. При этом прослеживалась прямая зависимость между экспрессией коллагена III и V типов (r = 0,46, p<0,05) и обратная – между экспрессией коллагена I и III типов (r = -0,43; p<0,05). Таким образом, фиброзный процесс при хроническом панкреатите носит стадийный рубцовый характер, о чем можно судить по неравномерному распределению коллагена различных типов и появлению коллагена I типа. 277 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Ультраструктурное и иммуногистохимическое изучение механизмов гибели кардиомиоцитов при различных заболеваниях сердца Цыпленкова В.Г. Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава, Москва C�� целью изучения механизмов гибели кардиомиоцитов (КМЦ) было проведено электронно-микроскопическое и иммуногистохимическое изучение миокарда больных при различных заболеваниях сердца: алкогольной, диабетической, ишемической кардиомиопатиях, аритмогенной дисплазии правого желудочка, пароксизмальных тахиаритмиях, синдроме Вольфа-ПаркинсонаУайта, миокардитах. Материалом служили эндомиокардиальные и инцизионные биопсии, полученные от пациентов с этими видами патологии. От каждого пациента часть блоков, фиксированных в забуференном параформальдегиде, обрабатывалась по общепринятым методам для ультраструктурного анализа, а часть блоков была залита в парафин для проведения реакции �� TUNEL�� , указывающей на начальную стадию апоптоза, с использованием набора Apop Tag Plus («Oncor Inc.» USA). Светооптически и электронно-микроскопически при всех заболеваниях отмечались очаги деструкции и гибели КМЦ. Кроме этого, при ишемической и диабетической кардиомиопатиях выявлялись КМЦ с признаками «гибернации» и дедифференцировки, с ультраструктурой, характерной для фетальных КМЦ. При миокардитах характерны были очаги лимфоцитарной инфильтрации, некроза КМЦ и заместительного склероза. При ишемической и диабетической кардиомиопатиях иммуногистохимически были выявлены множественные Tunel-положительные КМЦ. Электронно-микроскопически также можно было наблюдать развернутую стадию апоптоза КМЦ и апоптотические тела. У пациентов с пароксизмальными тахиаритмиями и синдромом ВольфаПаркинсона-Уайта процесс апоптоза был генерализован, что подтверждалось как иммуногистохимически, так и электронно-микроскопически. При аритмогенной дисплазии правого желудочка в его миокарде отмечались обширные поля гибели КМЦ с замещением фиброзно-жировой тканью. Иммуногистохимически обнаруживались �� Tunel�� -положительные одноядерные КМЦ, а также двух- и трехядерные клетки, в которых одно из ядер было Tunel-положительным, а другое или два других – Tunel-негативными. Электронно-микроскопически развернутой фазы апоптоза КМЦ не было обнаружено, отмечались признаки маргинации хроматина и микромитохондри- 278 Сборник научных трудов оз. В большом числе КМЦ выявлялись выраженные признаки активизации аутофагических процессов: вакуолизация с появлением крошковидного содержимого и остатков органелл внутри вакуолей, накопление липофусцина, лизосом, аутофагосом. При аритмогенной дисплазии правого желудочка электронномикроскопически на серийных срезах были обнаружены этапы процесса экструзии ядра за пределы КМЦ. В интерстиции миокарда можно было обнаружить ядра КМЦ, окруженные только ядерной оболочкой, а иногда и тонким ободком саркоплазмы. Явление потери ядра КМЦ мы также наблюдали при миокардитах и некоторых формах кардиомиопатий. Полученные результаты позволяют считать обнаруженный нами феномен экструзии ядер КМЦ за пределы клетки одной из форм программированной клеточной гибели. Активизация аутофагии в кардиомиоцитах хронических алкоголиков, возможно, препятствует развитию кардиомиопатии Цыпленкова В.Г., Илларионова Н.Г. Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава, Москва, Российский государственный медицинский университет Росздрава, Москва Злоупотребление алкоголем является серьезным фактором, влияющим на продолжительность жизни и здоровье населения. В частности, известно, что регулярное употребление алкоголя даже в «умеренных» дозах может приводить к развитию алкогольной кардиомиопатии с последующей дилатацией полостей сердца и сердечной недостаточностью. В последнее время многими исследователями были предприняты попытки объяснения этого сценария за счет апоптотической гибели кардиомиоцитов (КМЦ), что в стабильной клеточной популяции может вести к нарушению сократимости, ремоделированию клеток, ткани и органа. Настоящее исследование имело своей целью изучение ультраструктурной организации КМЦ в биоптатах эндомиокарда хронических алкоголиков со стажем употребления алкоголя 10–20 лет. Были изучены эндомиокардиальные биоптаты пациентов двух возрастных групп – 27–40 лет (3 пациента) и 50–60 лет (4 пациента), имеющих нарушения ритма сердца и проводимости миокарда, но без признаков дилатации полостей, значимых стенозов коронарных артерий и недостаточности кровообращения. Материал для исследования был получен во время диагно- 279 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки стической коронаро-вентрикулографии. Фиксация биоптатов проводилась в забуференном параформальдегиде и четерыхокиси осмия с последующей обычной проводкой и заливкой в эпоксидные смолы. Далее образцы исследовались на полутонких срезах после окраски гематоксилином и эозином, а также электронно-микроскопически после контрастирования в электронном микроскопе JEM-100cx при ускоряющем напряжении 80 квт и увеличениях от 5000 до 26000 раз. Изучение биоптатов больных хроническим алкоголизмом показало наличие в кардиомиоцитах выраженных признаков активизации процессов аутофагии. Обнаруживались крупные вакуоли, содержащие остатки органелл КМЦ, крошковидный материал, миелиноподобные образования, в околоядерной зоне отмечались скопления липофусцина и лизосом, встречались аутофагосмы, остаточные тела. Указанные признаки были наиболее выражены в группе пациентов 27–40 лет, в старшей возрастной группе обнаружены признаки ремоделирования КМЦ – их гипертрофия наряду с аттенуацией, накопление мелких митохондрий – микромитохондриоз, участки лизиса и атрофии миофибрилл. В настоящее время активизация аутофагических процессов рассматривается как протективный механизм, препятствующий ремоделированию клеток и запуску программы апоптоза (B.Levine, G.Kroemer, 2008). Представляется вероятным, что длительное злоупотребление алкоголем у изученных пациентов не приводило к дилатационной кардиомиопатии и сердечной недостаточности, благодаря активности аутофагических процессов. Нейро-сосудистые взаимоотношения седалищного нерва и его двигательного сегментарного центра при холодовой нейропатии Чайковский Ю.Б., Геращенко С.Б., Дельцова Е.И. Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, Ивано-Франковский национальный медицинский университет МЗ Украины, Ивано-Франковск Холодовые нейропатии возникают при отморожениях конечностей разной степени, синдромах «траншейной и иммерсионной стопы». Изучение вопросов криопатологии периферических нервов и их сегментарных центров имеет большое значение, однако в литературе отсутствуют данные относительно строения двигательных сегментарных центров седалищного нерва (нейроциты передних рогов спинного мозга) при криогенном повреждении. 280 Сборник научных трудов Целью исследования было электронно-микроскопическое изучение состояния нейронов передних рогов спинного мозга под влиянием холодового фактора. В эксперименте холодовую нейропатию вызывали путем ежедневного одноразового охлаждения бедра, голени и стопы 5–6 мл хлорэтила на протяжении 10 дней. Критерием отбора животных для морфологического исследования служили стойкие клинические признаки отморожения тазовой конечности первой степени – отек, гиперемия. Первый забор материала проводили через 24 ч после сеанса охлаждения для исключения непосредственной реакции нервного ствола на действие холодового фактора и далее на 5–10-е сутки опыта. При электронно-микроскопическом исследовании мотонейронного пула седалищного нерва в спинном мозге после 5-разового охлаждения тазовой конечности установлено, что он состоит из трех видов клеток по степени электронной плотности цитоплазмы – «темных», «светлых» и «промежуточных». Ядра «светлых» нейронов имели обычный вид с округлыми контурами и равномерно распределенным хроматином. Электронная плотность ядра и цитоплазмы низкая. Митохондрии сохраняют округлую форму, часть из них набухшая, с разреженными кристами. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в агранулярной эндоплазматический сети, в которой происходит удлинение и нарастание количества цистерн. На периферии клеток определяются скопления профилей агранулярной эндоплазматической сети с проявлениями вакуольной трансформации. В цитоплазме нейроцитов наблюдаются единичные вакуоли, образованные из разных мембранных структур клетки – митохондрий и эндоплазматической сети. В «темных» нейроцитах с повышенной осмиофильностью цитоплазмы наблюдается нарушение конфигурации ядер за счет появления неглубоких инвагинаций и выпячиваний. Перинуклеарные цистерны несколько расширены. Митохондрии в нейроцитах этого вида увеличены в размерах, их кристы сохранены. Определяется гипертрофия и гиперплазия эндоплазматической сети и аппарата Гольджи. Осмиофилия обусловлена мелкогранулярным строением гиалоплазмы. Значительно возрастает количество лизосом. Количество нейроцитов с умеренной осмиофильностью цитоплазмы («промежуточных») наименьшее. Им присуща микровакуолизация цитоплазмы, удлинение и расширение цистерн эндоплазматической сети, повышение плотности микрофиламентов и микротрубочек, особенно в области аксонного холмика. Для нейронов всех видов характерны изменения гранулярной эндоплазматической сети, цистерны которой теряют упорядоченное расположение и становятся частично дегранулированными. Белоксинтезирующий аппарат представлен преимущественно полисомами и свободными рибосомами. 281 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки На 10-е сутки в двигательном сегментарном центре седилищного нерва превалирует субпопуляция мотонейронов промежуточного типа. Их ядра имеют округлую форму, на отдельных участках наблюдается расширение перинуклеарных цистерн. В цитоплазме выявляется большое количество растянутых цистерн агранулярной и гранулярной эндоплазматической сети с частичной дегрануляцией последних. Наиболее выраженные изменения отмечаются в элементах аппарата Гольджи и проявляются выраженной гиперплазией и вакуольной трансформацией. При 10-кратном охлаждении ультраструктурный анализ изменений перикарионов мотонейронов двигательного центра седалищного нерва указывает на их преимущественно компенсаторно-приспособительный характер. Одним из возможных объяснений этому является замедление ретроградного аксонного транспорта, посредством которого к телу нервной клетки доставляются специфические химические вещества, сигнализирующие о повреждении периферического отростка, и продукты обмена, способные повреждать трофический центр нейроцита. Одновременно нами получены данные о нарушении структурнофункциональной организации микрогеморусла, которые свидетельствуют о его значении в патоморфогенезе холодовой нейропатии и являются неспецифической компенсаторной реакцией в системе нейрон-капилляр. В динамике холодовой нейропатии седалищного нерва нами выделено две стадии: 1 – адаптивных, компенсаторных изменений нервных волокон (5 сут опыта); 2 – глубоких деструктивных нарушений нервных волокон. Дисциркуляторные и гипоксические нарушения обусловливают глубокие изменения организации осевых цилиндров, дезинтеграцию миелиновой оболочки, дистрофические изменения нейролеммоцитов, которые приводят к распаду отдельных нервных волокон. В целом, холодовая нейропатия характеризуется углублением патологических нарушений нервных волокон. Однако степень выраженности реакций нейронов сегментарных центров не коррелирует с тяжестью повреждения нервных волокон в связи с замедлением ретроградного аксонного транспорта, т. е. с повреждением канала обратной связи. Особенности ультраструктурной организации эндотелиальных клеток инсулином Чекмарева И.А, Филатов В.В., Втюрин Б.В. ФГУ «Институт хирургии им. А.В. Вишневского Росмедтехнологий», Москва Инсулинома – наиболее часто встречаемая нейроэндокринная опухоль (НЭО) поджелудочной железы, в клетках которой определяются специфиче- 282 Сборник научных трудов ские В-гранулы. Гистологическое строение опухоли разнообразно – солидное, альвеолярное, трабекулярное, смешанное и др. Строма опухоли может быть гиалинизирована, с кальцификатами и амилоидом. Основными критериями злокачественности НЭО являются: метастазы, обширная инвазия окружающих тканей, инвазия сосудов, периневральная инвазия, размеры опухоли более 2–3 см, митозы больше 2 на 10 репрезентативных полей зрения, индекс Ki-67 больше 2 %, некрозы, экспрессия цитокератина 19 (Гуревич Л.Е., 2009). Образование сосудов является важным фактором, обусловливающим пролиферацию опухолевых клеток и прогрессию процесса. Целью данного исследования было изучение ультраструктурных изменений в эндотелиальных клетках инсулином. Из 20 биоптатов НЭО, поступивших для электронно-микроскопического исследования, в 6 случаях диагноз (инсулинома поджелудочной железы) был подтвержден гистологическим и иммуногистохимическим методами исследования. При электронно-микроскопическом исследовании в цитоплазме эндотелиоцитов отмечали большое количество везикул различного размера, количество митохондрий уменьшено, они были с просветленным матриксом и нарушенной ориентацией крист. Встречались сосуды фенестрированного типа. Стенка сосудов была значительно истончена, с многочисленными тонкими цитоплазматическими выростами на люминальной поверхности, что является свидетельством активного трансэндотелиального транспорта. Межклеточные контакты местами нарушены. Базальная мембрана набухшая, фрагментированная. Нарушение целостности эндотелиальной выстилки, базальной мембраны, т. е. компонентов, обеспечивающих структурно-функциональную полноценность гемотканевого барьера, исключает избирательность транспорта веществ. Опухолевые клетки прилежали к базальному слою сосудов. Специфические гранулы, содержащие инсулин, находили не только в цитоплазме опухолевых клеток, но и в межклеточном и перикапиллярном пространстве. Функционально активное состояние эндотелиальных клеток и нарушение целостности базального слоя приводило к проникновению специфических гранул в цитоплазму эндотелиальных клеток, а затем и в кровеносное русло. Проведенное электронно-микроскопическое исследование показало, что ослабление межклеточных связей, нарушение целостности базального слоя, повышенная функциональная активность эндотелиоцитов являются предпосылками к метастазированию опухоли. 283 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Экспрессия генов, ассоциированных с циклом клеточного деления и резорбцией матрикса, в периферической крови и суставном хряще больных остеоартрозом на ранней и поздней стадиях заболевания Четина Е.В., Братыгина Е.А., Зайцева Е.М., Семенова Л.А., Алексеева Л.И., Макаров С.А. НИИ ревматологии РАМН, Мoсква Остеоартроз (ОА) – наиболее распространенное полиэтиологическое заболевание, которому подвержено 10–16% населения земного шара. ОА характеризуется дегенеративно-дистрофическими изменениями в тканевых компонентах сустава: прежде всего в суставном гиалиновом хряще, а также в субхондральной кости, синовиальной оболочке, капсуле сустава и связочном аппарате. Патогенез ОА до конца не ясен. Наши предварительные исследования показали, что в основе развития ОА лежат процессы разрушения внеклеточного матрикса, обусловленные фенотипическими изменениями хондроцитов, сходными с их гипертрофией в эмбриональной ростковой пластинке. Однако молекулярные механизмы, обусловливающие эти фенотипические изменения, и причины нарушения гомеостаза суставного хряща при ОА до конца неясны. Поскольку переход хондроцитов в состояние гипертрофии в ростковой пластинке сопровождается прекращением их пролиферативной активности, фенотипические изменения этих клеток могут регулироваться консервативной протеинкиназой mTOR (mammalian target of rapamycin), которая контролирует метаболическую активность клеток в ответ на внутриклеточные и внешние сигналы. �� mTOR�� стимулирует анаболические процессы, которые обусловливают клеточный рост и пролиферацию посредством увеличения биосинтеза белка и липогенеза, а также ингибирует аутофагию, представляющую главный катаболический процесс в клетке. Однако персистентная активация �� mTOR�� приводит к дисбалансу анаболических и катаболических процессов и аккумуляции свободных радикалов, которые благоприятствуют развитию болезней старения. В работе использованы 33 образца периферической крови первичных больных ОА (средний возраст 58±7,4), 27 образцов периферической крови здоровых доноров (средний возраст 55±8,3), 7 образцов хряща бедренной кости коленного сустава больных ОА (средний возраст 56±8,9) после операции по артропластике сустава и 9 образцов хряща бедренной кости коленного сустава здоровых людей (средний возраст 33±9,5). Посредством количественной ПЦР в режиме реального времени в образцах периферической крови и хряща проведена оценка уровней экспрессии ключевых генов, связанных с 284 Сборник научных трудов основными фазами онтогенеза клетки: пролиферацией (�� mTOR�� ), гипертрофией хондроцитов (COL10A1), аутофагией (ATG1), апоптозом (р21, каспаза 3); индикатором воспаления (TNFα), а также с резорбцией матрикса (ММР-13) больных ОА по сравнению со здоровыми контролями. Бета-актин использовали в качестве «гена домашнего хозяйства». Анализ экспрессии генов в образцах периферической крови первичных больных ОА показал, что у 13 из 33 человек экспрессия �� mTOR�� оказалась значительно ниже нормы, а у остальных пациентов – повышена. В связи с этим пациенты были разделены на две подгруппы. В подгруппе с повышенной экспрессией mTOR (20 пациентов) экспрессия генов ATG1, р21, каспазы 3 и TNFα�� также значительно превышала уровни экспрессии этих генов у здоровых контролей. При этом значительное превышение экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ р21 по сравнению с экспрессией �� mTOR�� свидетельствует о преобладании процессов блокирования активности цикла клеточного деления. А пропорциональное увеличение экспрессии р21 и каспазы 3 может свидетельствовать о повышенной апоптозной активности. Пациенты подгруппы из 13 человек, которые отличались значительно более низкими уровнями экспрессии гена mTOR, чем здоровые доноры, имели близкие к нормальным значения экспрессии ATG1 и р21, хотя экспрессия каспазы 3 и TNFα у них была значительно повышена. Пониженная экспрессия mTOR при нормальной экспрессии ATG�� 1 может свидетельствовать о недостатке критических трофических факторов, который приводит к активации механизма аутофагии для генерации дополнительной энергии. Это, вероятно, сопровождается повышенной апоптозной активностью как следствие высокой экспрессии каспазы 3. Анализ экспрессии тех же генов в хрящевой ткани больных ОА на поздних сроках заболевания показал, что экспрессия mTOR в этих образцах была значительно повышена, а экспрессия ATG1, р21, каспазы 3 и TNFα оказалась значительно ниже, чем у здоровых доноров. Что касается экспрессии генов, участвующих в деградации хрящевой ткани, то в хряще наблюдали существенное повышение экспрессии �� COL�� 10�� A�� 1, маркера гипертрофии хондроцитов, и ММР-13 – главной металлопротеиназы, ответственной за разрушение коллагена внеклеточного матрикса. Следовательно, группа больных ОА на ранней стадии заболевания неоднородна и состоит из пациентов как с существенно пониженной экспрессией mTOR в периферической крови, лимитирующей анаболические процессы в клетках, так и пациентов, имеющих значительно более высокие уровни экспрессии этого гена, способствующие накоплению свободных радикалов, по сравнению со здоровыми донорами. Однако общим для обеих групп является повышение экспрессии индикатора апоптоза – каспазы 3 и провоспалитель285 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки ного цитокина – TNFα. Разрушение хрящевой ткани на поздней стадии ОА сопровождается значительно более высокой экспрессией mTOR, что может быть связано с формированием клонов хондроцитов. Работа осуществлена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 09-04-01158-а). Уровень экспрессии мРНК генов cdc2 и tpa в активированных лимфоцитах как показатель степени пролиферации Чулкина М.М., Бурменская О.В., Савилова А.М. ЗАО «НПФ ДНК‑Технология», Москва, ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова», Москва, ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва Изучение отдельных популяций клеток в различных физиологических состояниях является важным инстументом в клинических и научных исследованиях. Для иммунологических исследований наиболее информативным и доступным представляется изучение популяций лимфоцитов. Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) – классический метод исследования функциональной активности лимфоцитов, который основан на способности сенсибилизированных Т- и В-лимфоцитов в культуре трансформироваться в малодифференцированные бластные клетки под действием неспецифических или специфических стимулов. Степень пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови в ответ на стимул оценивают in vitro по включению меченого 3Н‑тимидина в ДНК. Целью работы являлся поиск альтернативных способов оценки РБТЛ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), поскольку использование радиоактивной метки ограничивает применение РБТЛ на практике. В качестве маркеров реакции были выбраны гены, активность которых возрастает при митозе: ген топоизомеразы II альфа (TPA) и ген белка CDC2 (cell division cycle 2), контролирующего клеточный цикл. Выделение фракции мононуклеарных клеток на фиколле проводили по стандартной методике. В стерильный планшет раскапывали по 105 выделенных клеток на лунку в объеме 100 мкл, добавляли по 10 мкл стокового раствора ФГА (итоговая концентрация 2.5 мкг/мл). Планшет помещали в СО2‑инкубатор, насыщенный водяным паром, на 7 суток при 37 °С, 5 % СО2. Через определенное количество часов брали пробы клеток и выделяли РНК. В итоге предварительных экспериментов по активации клеток периферической крови митогеном фитогемагглютинином (ФГА) из 12 здоровых доноров 286 Сборник научных трудов было отобрано 2 донора (30 и 32 лет), наиболее различающиеся по амплитуде ответа клеток на стимуляцию. Далее была построена развернутая кинетика ответа для клеток этих доноров (рис. 1). Рис. 1. Кинетика изменения уровней экспрессии мРНК генов tpa и cdc2 в мононуклеарных клетках крови, стимулированных ФГА. Оценку РБТЛ по включению меченого 3Н-тимидина проводили по стандартной методике. Полученные значения сведены в таблицу. Таблица Сравнение результатов оценки степени пролиферации лимфоцитов, полученных двумя методами Индекс Донор стимуляции, 72 часа 1 2 6,1 9,3 Относительное кол-во мРНК, 72 часа cdc2 tpa 72,1 45,4 138,7 119,8 Относительное кол-во мРНК, 106 часов cdc2 tpa 288,9 181,9 282,8 330,8 Относительное кол-во мРНК, 128 часов cdc2 tpa 419,3 358,0 158,8 263,0 Определение уровня экспрессии мРНК проводили с помощью ПЦР «в реальном времени» с предварительной обратной транскрипцией. Для каждого образца проводили ПЦР со специфическими праймерами на гены tpa и cdc2. Праймеры и зонды для ПЦР были подобраны с учетом структур экзонов и интронов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК на этих генах. Помимо стимулированных лимфоцитов (рис. 1), в качестве отрицательного контроля и для определения относительного количества мРНК использовали точки спонтанной пролиферации без добавления ФГА (не показано; в клетках без стимуляции уровень мРНК исследуемых генов не изменяется со временем). 287 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки В ходе исследования с использованием метода ПЦР в режиме «реального времени» были разработаны системы для определения экспрессии мРНК генов tpa и cdc2 в лимфоцитах. Основные результаты нашей работы: – в РБТЛ с активацией ФГА экспоненциальное увеличение уровней экспрессии генов cdc2 и tpa, измеренных по повышению уровня содержания в клетках соответствующих мРНК, начинается со вторых суток культивирования (рис. 1); – максимум экспрессии мРНК генов cdc2 и tpa приходится на 4–6-е сутки реакции (114–140 часов) (рис. 1); – уровень экспрессии мРНК генов cdc2, tpa возрастает в сотни раз по сравнению с исходным уровнем в крови здоровых доноров и нестимулированными лимфоцитами; следовательно, оценка этого уровня с помощью ПЦР является доступным и надежным методом. В экспериментах, описанных в данной работе, мы использовали мРНК генов tpa и cdc2 для оценки степени пролиферации, поскольку продукты этих генов непосредственно задействованы в процессе деления лимфоцитов в ответ на митогенные стимулы. Использование подобных маркеров может позволить напрямую заменить методику радиоактивного мечения ДНК при оценке пролиферативного ответа не только в лимфоцитах, но и в других популяциях клеток, поскольку регуляция митоза в разных эукариотических клетках протекает сходным образом. Результаты проведенных экспериментов могут быть использованы в дальнейшей работе как в научных разработках, так и в клинической практике, поскольку РБТЛ является удобной и наглядной моделью исследования функциональной активности лимфоцитов in vitro. Современные иммуногистохимические подходы к изучению нервных аппаратов сердца и магистральных сосудов крысы и человека Чумасов Е.И., Петрова Е.С., Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э. НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург Для изучения периферической нервной системы, наряду с классическими нейрогистологическими (импрегнационными) методами и суправительной окраской метиленовым синим, широко используются гистохимические методы флуоресцентной микроскопии по Фальку и обработки тканей глиоксалевой кислотой для выявления катехоламинов, методы Гленнера, Колле и Фриденвальда. С помощью этих методов удалось дифференцировать эфферентные сплетения в сосудах мозга, сердца и ряда других органов. Они, попрежнему, остаются перспективными, хотя и обладают рядом недостатков. В последние десятилетия, особенно начиная с 90-х годов, когда, кроме основ288 Сборник научных трудов ных медиаторов, были открыты в нервной системе другие трансмиттеры и регуляторные пептиды, появились совершенно новые иммуногистохимические подходы к исследованию тканей ЦНС и ПНС. Цели работы – отработка и использование иммуногистохимических методик для выявления нервных аппаратов (ганглиев и нервных сплетений) в стенках крупных магистральных сосудов и в миокарде и сравнительная морфологическая оценка результатов. Материал исследования – сердце крыс Вистар и фрагменты правого предсердия, аорты, сонных и коронарных артерий человека, полученные при аутопсии через 12 часов после смерти. Ткани фиксировали в растворе цинкформол-этанол и проводили иммуногистохимические реакции по выявлению ряда специфических нейрональных маркеров. Для этого использовали моноклональные антитела к белку синаптических везикул – синаптофизину (СФ), к белку нейрофиламентов (НФ), к белку промежуточных филаментов – периферину (П). С помощью иммуногистохимической реакции на СФ в правом предсердии крыс и человека были выявлены многочисленные синаптофизинположительные терминали (СФПТ) с четкими контурами, толщиной от 0,5 до 1,5 мкм, заполненные зернистостью черно-коричневого цвета. Терминальные аксоны находятся в тесной связи с миокардиальными волокнами и сопровождающими их капиллярами. Они образуют различной плотности сплетения не только в миокарде и эпикарде, но также вокруг vasa vasorum артериальных и венозных сосудов сердца (аорты и легочных, коронарных артерий, полых и легочных вен); СФПТ, располагающиеся в виде тонкого нежного сплетения на поверхности гладкомышечной стенки этих сосудов, постепенно переходят на артериолы, капилляры; последние, как правило, сопровождаются лишь одиночными терминалями. Значительный интерес представляют данные о неравномернорсти распределения СФПТ в различных участках миокарда. Чрезвычайно высокая плотность СФПТ отмечена нами в проводящей системе (синусном и атриовентрикулярном узлах правого предсердия), средняя – в рабочем миокарде предсердия, относительно низкая – в апикальной части миокарда желудочков у крысы и человека. Любопытным фактом для нас стало обнаружение в правом ушке сердца ребенка (12 лет) субэндотелиального густого нервного сплетения, представленного СФПТ. СФПТ избирательно выявляются также в интрамуральных ганглиях и параганглиях, находящихся в сердце и адвентиции аорты, легочного ствола, коронарной артерии. В ганглиях они локализуются вокруг перикарионов нейронов в виде густого синаптического перицеллюлярного сплетения; причем тела самих нейронов данным методом не выявляются, но их можно дифференцировать при докраске по Нисслю. В параганглиях этим иммуногистохимическим методом очень избирательно выявляются хромаффинные клетки. Тела их, как 289 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки правило, окрашиваются в темно-коричневый цвет, а ядра остаются светлыми. На хромаффинных клетках и вокруг них, как и вокруг парасимпатических вегетативных нейронов, обнаружены синаптические терминали преганглионарных волокон в виде мелких и крупных гранул, пластинок, окрашивающихся в черный цвет. С помощью реакции на НФ установлено, что иммунопозитивные аксоны, в основном, выявляются в крупных, средних и мелких нервных пучках аортально-пульмонального сплетения, а также в нервных сплетениях во всех оболочках сердца. НФ-положительные аксоны и их пучки обнаружены в различных отделах предсердий и желудочков, причем в предсердиях они проходят не только в продольном направлении, но и «переплетают» миокардиальные волокна в поперечном направлении, и таким образом пронизывают весь миокард в виде трехмерного сплетения. Наибольшая плотность НФ-аксонов в составе сплетений обнаружена в миокарде и эндокарде предсердий, включая «ушки» сердца. Используя иммуногистохимическую реакцию на П, в адвентиции крупных артериальных сосудов, в эндокарде, миокарде и эпикарде сердца у крысы и человека были выявлены в большом количестве не только различной толщины нервные стволики, пучки и сплетения аксонов, но и макро- и микроганглии. Особенно хорошо развитое нервное сплетение из различной толщины пучков П-положительных аксонов обнаружено в соединительной ткани и жировой клетчатке эпикарда правого предсердия и ушка сердца человека. В этом сплетении часто встречаются микроганглии (12–25 нейронов), небольшие группы (из 3–7 нейронов) и одиночно рассеянные в сплетении клетки. Нейроны избирательно окрашиваются в темно-коричневый цвет, имеют различные размеры, характерную для клеток вегетативной нервной системы мультиполярную или биполярную форму и светлое неокрашенное ядро. Иногда хорошо видно, как отходящие от их перикариона немногочисленные отростки вступают в состав нервных пучков общего сплетения. Часть пучков поверхностного сплетения эпикарда следует в глубь ткани сердца и объединяется с основным миокардиальным нервным сплетением. Таким образом, результаты настоящей работы показывают, что использованные иммуногистохимические методы являются достаточно адекватными и перспективными для решения многих задач, связанных с углубленным изучением нормального строения нервных аппаратов, уточнением их топографии, а также определением их изменений при патологических состояниях. 290 Сборник научных трудов Митотический цикл и радиационный канцерогенез Шабалкин И.П., Ягубов А.С., Григорьева Е.Ю. Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН, лаборатория молекулярно-биологических методов исследований, лаборатория радиоизотопных методов исследований, Москва Известно, что наиболее радиочувствительным периодом митотического цикла является S-период (период синтеза ДНК). Однако, в течение S-периода радиорезистентность меняется. Это обусловлено тем, что согласно литературным данным, в S-периоде существуют, как минимум, две фазы синтеза ДНК, разделенные промежутком времени, когда синтез ДНК не наблюдается, т.е. когда клетки по плоидности принадлежат к S-периоду (их плоид- ность =3с), но не включают ДНК. Причем, по данным авторадиографии, фаза интенсивного синтеза ДНК обогащена АТ-парами оснований, а фаза слабого синтеза – ГЦ-парами. Деление S-периода на две фазы, хотя и подтверждается данными литературы, однако, в биологии до сих пор данный факт не получил широкого признания. Отсюда, одна из первых задач нашего исследования состояла в том, чтобы, используя клетки эпителия роговицы глаза мыши в качестве модели, методом авторадиографии показать, что S-период клеток эпителия роговицы имеет, по крайней мере 2 фазы, различающиеся между собой по продолжительности (S1 и S2,). Установлено: средняя продолжительность митотического цикла эпителиальных клеток роговицы равна 91 ч, G2- периода – около 4 ч, G1- периода – 59 ч, �� S�� -периода – 26 ч. При этом период синтеза ДНК включает в себя две фазы: S1 и S2. Средняя продолжительность S1 фазы равна 14 ч, S2 – 6 ч. Между фазами имеется промежуток времени (6 ч), в течение которого синтез ДНК не наблюдается. Уровень синтеза ДНК определяли с помощью 3 Н-тимидина. Вторая задача настоящего исследования была связана с изучением действия однократного гамма-облучения дозой 4 Гр на клетки эпителия роговицы мышей в S1 и S2 фазах S-периода. Облучение проводили через 100 мин после введения 3Н-тимидина. Показано, что после однократного облучения клетка использует время на репарацию своих повреждений за счет G1- периода. Это выражается в том, что после облучения общая продолжительность S�� -периода увеличивается с 26 ч до 37 ч, занимая промежуток времени, на который в норме приходится G1-период первого митотического цикла. Так как G1-период – это этап жизненного цикла клетки, который отвечает за рост и 291 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки развитие в организме, то сокращение времени, в течение которого осуществляются те или иные процессы регуляции дифференцировки клеток, может быть фактором, способствующим появлению истинно патологических клеток. Данный феномен проявляется в том случае, если облучение действует на S-период клетки неоднократно, что индуцирует процессы репарации в клетке в течение всего G1-периода. Тем самым в популяции появляются клетки, у которых остаются только две функции: воспроизведение и деление, за которые отвечают S-период, G2-период и митоз. Выживание и миграционный потенциал мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфецированных генами egfp, vegf и fgf2, при трансплантации в область травмы спинного мозга крысы Шаймарданова Г.Ф., Рубашкина Я.О., Газизов И.М., Салафутдинов И.И., Ризванов А.А., Челышев Ю.А. Учреждение Российской академии наук институт биохимии и биофизики Казанского Научного Центра РАН, Казанский государственный медицинский университет, Казанский государственный университет, Казань Мононуклеарные клетки крови пуповины человека интенсивно исследуют как источник стволовых и прогениторных клеток для трансплантаций при посттравматических и постишемических дефектах нервной ткани, а также для лечения нейродегенеративных заболеваний (Zhao et al., 2004; Kuh et al., 2005). Они характеризуются содержанием стволовых кроветворных, стволовых мезенхимных, прогениторных эндотелиальных клеток и других клеточных предшественников, а также низкой иммуногенностью, доступностью и простотой получения. На ряде экспериментальных моделей установлено, что клетки крови пуповины, вырабатывая колониестимулирующий фактор 1, тромбопоэтин и интерлейкин-11, обладают иммуномодулирующим действием, а также продуцируют ряд трофических факторов, включая NGF и VEGF (Suen et al., 1994; Taguchi et al., 2004; Vendrame et al., 2004). Мезенхимные стволовые клетки из крови пуповины, трансплантированные в зону перерезки зрительного тракта у новорождённых крыс, секретируют факторы роста (NT3, BDNF, CNTF, TGFбета1), поддерживают выживание нейронов и регенерацию аксонов (Zwart et al., 2009). При травме спинного мозга введение клеток крови пуповины человека в кровоток угнетает воспалительную реакцию, оказывает нейротрофическое влияние, стимулирует неоваскуляризацию (Chen et al., 2008), снижает экспрессию проапоптозных генов и поддерживает 292 Сборник научных трудов выживание нейронов (�� Dasari�� et�� al�� ., 2009). Показана возможность дифференцировки мультипотентных предшественников из крови пуповины человека в нейральные клетки. Трансплантация подобных клеток при экспериментальной травме спинного мозга крысы улучшает показатели регенерации и сопровождается дифференцировкой этих предшественников в олигодендроциты, локализованные вокруг некротических полостей (Cho et al., 2008). Для клеток крови пуповины человека оптимизированы методы генетической модификации (�� Oldak�� et�� al�� ., 2002). Эти клетки начинают применять для доставки терапевтических генов нейротрофических факторов (�� VEGF�� , �� BDNF�� ) с целью стимулирования нейрорегенерации (Ikeda et al., 2004; Kuh et al., 2005). Цель работы – изучить выживание и миграционный потенциал в области травмы спинного мозга крысы трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфецированных геном усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Оценить площадь патологических полостей и выживание миелиновых волокон при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфецированных генами фактора роста эндотелия сосудов и фактора роста фибробластов (VEGF и FGF2) в область повреждения. Мононуклеарные клетки перед трансплантацией генетически модифицировали методом электропорации плазмидными векторами pBud-EGFP и pBud�� -VEGF-FGF2. Двухкассетная плазмида �� pBud�� -VEGF-FGF2 способна экспрессировать одновременно и независимо два белка – VEGF и FGF2. Контузионную травму, являющуюся наиболее адекватной клинической картине, осуществляли после ламинэктомии на уровне восьмого сегмента с помощью стандартного вертикально падающего металлического стержня весом 10 г с определенной высоты (в данных экспериментах с высоты 12,5 мм) (Gruner, 1992). Трансфецированные клетки крови пуповины в количестве 500 тыс. в 5 мкл DPBS гамильтоновским шприцем вводили в две точки на расстоянии 1 мм ростральнее и каудальнее от эпицентра травмы и 0,5 мм латеральнее срединной линии (краниальную точку сдвигали вправо, каудальную – влево). Животным контрольной группы по той же схеме вводили DPBS без клеток. В спинном мозге животных специфическое свечение белка в трансплантируемых клетках нами выявлено на расстоянии не менее 10 мм от точки инъекции. Это свечение наиболее интенсивно на ранних сроках после травмы спинного мозга и введения клеток (2–6 суток), четко прослеживается на более поздних сроках (14–21 сутки) и постепенно затухает к 30 суткам. При травме спинного мозга крысы трансплантация клеток крови пуповины человека стимулирует в области повреждения матриксную металлопротеиназу 2, что снижает иммунореактивность хондроитинсульфат протеогликанов и образование глиального рубца (Veeravalli et al., 2009). 293 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Трансплантация клеток, экспрессирующих VEGF и FGF2, приводит к уменьшению суммарной площади патологических полостей и увеличению числа миелиновых волокон в спинальных трактах по данным светооптической морфометрии в сравнении с контрольной группой. Таким образом, достаточно длительное выживание и выраженный миграционный потенциал мононуклеарных клеток крови пуповины человека при их трансплантации в область повреждения спинного мозга позволяет рассчитывать на положительный терапевтический эффект. Разработка диагностических панелей при иммунофенотипировании лейкозов и метастазов нейробластомы в костный мозг у детей при использовании метода традиционной иммуноцитохимии Шатинина Н.Н., Байдун Л.В. ГУ Российская детская клиническая больница, Москва В детском возрасте большую часть опухолей составляют гемобластозы, опухоли ЦНС, нейробластомы, опухоли мягких тканей, опухоли почек и костей. Несмотря на высокую агрессивность злокачественных опухолей у детей, при точном диагнозе и адекватной терапии именно в этой области уже достигнуты хорошие результаты в лечении. В повседневной онкогематологической практике микроскопия всё чаще сочетается с проточной цитометрией. Однако встречаются ситуации, при которых проточная цитометрия не может быть использована или должна быть дополнена. В качестве дополнительного диагностического метода мы использовали традиционную иммуноцитохимию на мазках с оценкой ее результатов в световом микроскопе. Приводим преимущества метода традиционной иммуноцитохимии на мазках: 1) возможность проведения иммунофенотипирования при отсутствии жидкого костного мозга; 2) возможность сопоставления полученных данных с морфологией; 3) более длительные сроки работы с образцами; 4) возможность использования панелей антител, принятых в проточной цитометрии и иммуногистохимии; 5) упрощённые варианты хранения и транспортировки материала; 6) отсутствие необходимости в специальном сложном оборудовании. В задачу исследования входило создать информативные диагностические панели при иммунофенотипировании острых лейкозов и метастазов нейробластомы в костный мозг у детей на мазках костного мозга методом традиционной иммуноцитохимии. 294 Сборник научных трудов Были исследованы мазки костного мозга 100 детей (средний возраст 5 лет, мальчики – 65%, девочки – 35%) в момент первичной диагностики острого лейкоза до начала терапии. Исследование образцов жидкого костного мозга проводили на проточном цитометре и параллельно методом традиционной иммуноцитохимии (Глузман Д.Ф. и соавт., 2005). Использовали следующие антитела: CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD15, CD19, CD20, CD30, CD33, CD34, CD41, CD42, CD44, CD45, CD52, CD56, CD57, CD61, CD68, CD79а, CD99, NSE, Desmin, NF, Syn., анти-MPO, PGP9,5 и TdT. В качестве систем визуализации использовали реагенты фирм DАКО, NC и LabVision, а в качестве хромогена – диаминобензидин. Сравнительный анализ полученных данных выявил совпадение результатов иммунофенотипирования, выполненного двумя разными методами. Были определены наиболее информативные для первичной диагностики острых лейкозов антитела: анти-MPO, TdT, CD1а, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, СD13, CD19, CD20, CD33, CD34, CD41, CD42, CD45, CD61, CD68 и CD79a. Использование этой панели антител для иммунодиагностики, в сочетании с морфологическим и цитохимическим анализом, позволяет определить линейное происхождение бластных клеток и выделить основные варианты острого лейкоза, что особенно важно при недостатке нативного материала и невозможности использования проточной цитометрии в момент первичной диагностики. Опухоли из симпатической нервной системы, к которым относится нейробластома, составляют примерно 7–11% среди опухолей у детей и занимают третье место после опухолей ЦНС. По литературным данным, до 70% пациентов на момент диагностики имеют метастазы в костный мозг. Даже на гистологическом срезе при простой световой микроскопии морфологу бывает сложно определить природу опухоли, т.к. нейробластому относят к обширному семейству мелко-кругло-клеточных опухолей. Были исследованы мазки костного мозга 37 детей, больных нейробластомой (средний возраст детей составил 3,4 года, дети до 1 года составили 37%, в исследуемой группе мальчики составили 68%, девочки – 32%). Использование панели антител: CD45, CD56, CD57, CD99, Desmin, NB84a, NF, Syn., PGP9, 5 & NSE для иммуноцитохимического исследования костного мозга больных нейробластомой с выраженным поражением костного мозга подтвердило информативность спектра использованных антител для диагностики метастазов нейробластомы в костный мозг. Удалось выделить наиболее информативные сочетания антител, которые могут быть использованы для выявления изолированных опухолевых клеток, как при первичной диагностике, так и при мониторинге болезни. 295 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования иммуноцитохимического исследования костного мозга при первичной диагностике и мониторинге острого лейкоза и нейробластомы. *Приносим глубокую благодарность за постоянную помощь в практической реализации детской программы «Сердце ребёнка» Совету Лютеранской Церкви и её прихожанам (Япония, г. Хиросима). Использование молекулярно-генетических методов для дифференциальной диагностики пролиферирующих лейомиом и лейомиосарком матки Шикеева А.А., Кекеева Т.В., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А. Российский государственный медицинский университет, ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва Лейомиосаркомы (ЛМС) матки – редкие агрессивные опухоли гладкомышечного происхождения, с частотой до 5% от всех злокачественных новообразований матки. Одной из проблем диагностики ЛМС матки является сложность верификации ЛМС и пролиферирующим лейомиом (ЛМ), т.к. использование морфологических критериев не всегда информативно. Микросателлитные ДНК – тандемно организованные высокоповторяющиеся последовательности длиной 1–4 п.н., располагающиеся в нетранслируемых областях генома, обладающие генетической нестабильностью в опухолях. Для микросателлитов характерны гетерозиготные делеции [потеря гетерозиготности (ПГ)] и увеличение копий повторов [микросателлитная нестабильность (МН)]. Данные изменения могут быть чувствительным маркером опухолевых клеток и внешним проявлением дестабилизации генома. Уровень экспрессии генов в опухоли резко отличается от такового в нормальной ткани. Изменение экспрессии генов может происходить за счет структурных изменений последовательности ДНК, либо за счет нарушения эпигенетической регуляции. Гиперметилирование регуляторных районов генов – один из механизмов нарушения эпигенетической регуляции. Аномальное метилирование промотора генов-супрессоров опухолевого роста можно рассматривать как один из функциональных маркёров канцерогенеза или как проявление процесса злокачественного перерождения опухоли. 296 Сборник научных трудов Целью данной работы являлась разработка молекулярно-генетической тест-системы для дифференцировки ЛМС и пролиферирующих ЛМ матки. Материалы и методы: ДНК было получена из 47 образцов операционного материала от 19 пациенток (19 образцов ЛМС, 5 образцов пролиферирующих ЛМ, 4 образца метастазов). В качестве контроля в данном исследовании использовались образцы опухолевой ткани и смежных с ними нормальных тканей, полученные от 38 пациенток с диагнозом пролиферирующая ЛМ. Микросателлитный анализ 6 маркёров, расположенных в хромосомных областях: 3p14 (D3S1295), 9p21 (D9S942), 10q22 (D10S218), 10q22 (D10S1146), 10q26 (D10S1213) и 10p13 (D10S24), проводился методом ПЦР с последующим электрофорезом в 6% денатурирующем ПААГ. Анализ аномального метилирования промотора генов DAPK1 (9q34) и RASSF1A (3p21) проводился с помощью МЧ-ПЦР с последующим электрофорезом в 8% ПААГ. Проводили сравнительный статистический анализ выявленных генетических и эпигенетических изменений в ЛМС и пролиферирующих ЛМ. Результаты: Проведен анализ ПГ/МН локусов 3р14, 9p21, 10q22, 10q26, 10p13. В ЛМС получены следующие частоты: D3S1295 – 8\17 (47%); D10S218 – 8\16 (50%); D10S1146 – 7\17 (41%); D10S1213 – 7\17 (41%); D10S24 – 7\15 (47%). В образцах пролиферирующих лейомиом ПГ/МН не обнаружено. Проведен анализ аномального метилирования регуляторных районов генов-супрессоров опухолевого роста DAPK1 и RASSF1A. В ЛМС получены следующие частоты: DAPK1 – 3\19 (13%); RASSF1A – 7\19 (44%). В образцах пролиферирующих ЛМ аномальное метилирование было показано только для промотора гена RASSF1A; частота составила 3\19 (8%).Чувствительность и специфичность тест-системы составили 89% и 92% соответственно. Вывод: В ЛМС обнаружена высокая частота ПГ/МН по всем исследуемым локусам (в среднем 42%), в противоположность в пролиферирующих ЛМ ПГ/МН не обнаружено. В ЛМС частота метилирования промотора генов DAPK1 и RASSF1A составила 13% и 44% соответственно. Чувствительность тест-системы 89%, специфичность тест-системы 92%. Таким образом, показана перспективность использования микросателлитного анализа и анализа аномального метилирования локусов 3�� p�� , 9�� p�� , 9�� q�� , 10�� q�� и 10�� p�� для дифференцировки ЛМС и пролиферирующих ЛМ, но, несомненно, необходимы дальнейшие исследования данных маркеров на большем количестве пациентов. 297 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Нарушение стромально-клеточных взаимоотношений в соединительной ткани организма матери, опосредованное через морфофункционально неполноценную плаценту, – основа патогенеза гестоза Шорников А.И., Меркулова Л.М., Плюхин С.В. ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», Чебоксары От морфофункционального состояния соединительной ткани, обусловленного генетическими особенностями и воздействием факторов внутренней и внешней среды, зависит поддержание гомеостаза и жизнеобеспечение всех органов и систем. Поломы в этой системе неизбежно ведут к нарушениям в макроорганизме. Плацента, являясь основным источником веществ, регулирующих нормальное течение беременности, обеспечивает взаимодействие между матерью и плодом. Функции самой плаценты регулируются продуцирующимися в ней нейроиммуноэндокринными медиаторами и механизмами их инактивации. Нарушение функциональных возможностей плаценты является важной причиной в патогенезе различных осложнений беременности, например, гестоза. Это подтверждается в клинике тем, что симптомы гестоза исчезают после родоразрешения. Целью исследования явилось изучение особенностей локализации биогенных аминов (катехоламины, гистамин и серотонин), эндогенного гепарина, функциональной активности клеточных структур и морфологических изменений в плаценте и периферической крови при нормальной беременности и гестозах. Исследован материал от 107 женщин, у которых беременность на сроке 33–40 недель осложнилась развитием гестоза. Контрольную группу составили 43 женщины с физиологическим течением беременности. Для выявления биогенных аминов применяли люминесцентно-гистохимические методы Фалька и Кросса. Эндогенный гепарин определялся путем флуорохромирования берберин-сульфатом по L. Enerbak. Функциональную активность клеток определяли по состоянию нуклеиновых кислот путем флуорохромирования акридиновым оранжевым по В.Н. Карнаухову, с определением параметра α, как соотношение интенсивности свечения одно- и двуспиральных нуклеиновых кислот. Для выявления сульфат-содержащих гликозаминогликанов применялся метод окраски толуидиновым синим по Унна. Функциональное состояние гепаринового протеогликана определялось окрашиванием препаратов альциановым синим-сафранином по S. Spicer. Идентификацию морфологических структур осуществляли последовательной окраской одних и тех же препаратов различными методами. 298 Сборник научных трудов Установлено, что биогенные амины выявляются в виде диффузного свечения эпителия амниона и синцитиотрофобласта, сосудов, волокнистых и клеточных структур ворсин хориона. При нарастании степени тяжести гестоза отмечается повышение интенсивности свечения биогенных аминов, особенно гистамина. На фоне этого в плаценте снижается количество гранулярных клеток и мастоцитов, особенно при тяжелых формах гестоза. В сохранившихся клетках исчезает гепариновый протеогликан. Одновременно в стромальных элементах появляется сафранинофилия. При гестозах легкой степени выявляются молодые формы мастоцитов. Сопоставление уровней гистамина в крови, взятой с материнской поверхности плаценты и из межворсинчатого пространства, выявило резко повышенное его содержание в последней (выше в 1,7 раза). Это, возможно, связано с тем, что именно здесь, на границе соприкосновения чужеродных в антигенном отношении тканей матери и плода, происходят процессы, проявляющиеся в виде физиологического «умеренного воспаления», контролируемого и регулируемого системой соединительной ткани, каковой является и кровь. Изучение функциональной активности клеточных элементов крови и плаценты показало, что в начальных стадиях развития гестоза повышается параметр α, при прогрессировании гестоза он резко снижается, что говорит о срыве компенсаторных возможностей местных и общих регулирующих систем. Таким образом, нами установлено наличие в строме ворсин хориона клеток, активно участвующих в регуляции гомеостаза на уровне соприкосновения тканей матери и плода. Выявлен нарастающий дисбаланс в содержании биогенных аминов между стромой и клеточными элементами с одновременной сменой пула этих клеток более молодыми формами и их распадом с исчезновением гепаринового протеогликана при тяжелых формах гестоза. Нарастание сафранинофилии (нарушение гистамин/гепаринового индекса) стромы свидетельствует о срыве местных регулирующих механизмов и переходе патологического процесса на системный уровень, проявляющийся резким ростом уровня биогенных аминов в межворсинчатом пространстве и периферической крови. Дисбаланс в содержании биогенных аминов с преобладанием гистамина свидетельствует об «избыточном воспалении» (Sacks G.P. et al., 1999; Redman C.W.G., Sargent I.L., 2003), проявляющемся системным воспалительным ответом со стороны материнского организма. В результате проведенных исследований мы пришли к заключению, что в основе патогенеза гестоза лежит неадекватный иммунный ответ матери на развивающийся плод, опосредованный через морфофункционально неполноценную плаценту и проявляющийся нарушением иммунного баланса во взаимодействии стромальных и клеточных элементов в органах и тканях. 299 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Состав и структура «конкрементов» сосудистых сплетений латеральных желудочков головного мозга человека Юнеман О.А., Савельев С.В. НИИ морфологии человека РАМН, Москва Проблеме конкрементогенеза в различных структурах головного мозга посвящено много работ российских и зарубежных авторов. Однако большинство из них касается в основном конкрементогенеза эпифиза. Структура и состав «конкрементов» сосудистых сплетений изучены гораздо меньше. Большинство авторов полагает, что «конкременты» сосудистого сплетения представляют собой кальцификаты или содержат широкий набор элементов, таких как цинк, медь, железо, марганец и т.д. Другие исследователи считают, что «конкременты» состоят преимущественно из коллагена. Нет ясности и в вопросе источников происхождения «конкрементов» и их возможного влияния на работу сосудистых сплетений. Целью нашей работы явилось изучение структуры, состава, локализации «конкрементов» сосудистых сплетений латеральных желудочков головного мозга человека. Работа проведена на аутопсийном материале. Исследованы сосудистые сплетения 51-го человека в возрасте 47–94 года. Аутопсийный материал фиксировали в 4% формалине и подвергали стандартной гистологической проводке. Для исследования состава «конкрементов» использовали рентгеноструктурный анализ и иммуногистохимические реакции с применением антител к коллагенам первого и четвертого типов («Sigma»). При визуальном исследовании с помощью бинокуляра обнаружено, что «конкременты» сосудистого сплетения латеральных желудочков головного мозга человека представляют собой шаровидные полупрозрачные белые образования размером 100–200 мкм. В некоторых случаях «конкременты» более или менее равномерно распределены в ткани сплетения, в других случаях в строме обнаружено небольшое количество «конкрементов». Большая часть из них локализовалась в кистоподобных образованиях на свободном конце сплетения. В редких случаях цвет не менялся. При гистологическом исследовании сосудистых сплетений обнаружены «конкременты» различных типов. Большинство представляет собой шаровидные структуры размером 100– 200 мкм с выраженной слоистой структурой красновато-коричневого, темномалинового или синего цвета, которые локализуются в основном в центре стромы сплетения. В некоторых случаях на поверхности этих «конкрементов» видны образования размером не более 5–7 мкм, представляющие собой правильные квадраты или шестиугольники. В некоторых случаях в ткани 300 Сборник научных трудов сплетений обнаруживались бесформенные образования светло-коричневого или красно-коричневого цвета. Этот вид «конкрементов» в основном встречается в концевых участках ворсин. Нами выделено несколько стадий образования шаровидных «конкрементов». Судя по исследованию гистологических препаратов, рост «конкрементов» может происходить разными способами. В одних случаях рост начинался с образования затравки в центре с последующим наслоением вещества. В других случаях образование «конкрементов» начиналось с краев, так что центр «конкремента» какое-то время оставался свободным. Образование бесформенных «конкрементов» начинается с появления уплотнения на концевых отделах ворсин сплетения. При этом обнаруживается дегенерация эпендимального слоя: клетки становятся плоскими, либо эпендимальный слой в этих участках ворсин исчезает полностью, что свидетельствует о потере способности к фильтрации в этих участках. Для изучения состава «конкрементов» был проведен рентгеноструктурный анализ. В ходе исследования выяснилось, что в состав «конкрементов» сплетения всходят только органические вещества. Далее был проведен иммуногистохимический анализ «конкрементов» сосудистых сплетений с использованием антител к коллагенам первого и четвертого типов. Выяснилось, что доля коллагенов как первого, так и четвертого типа в «конкрементах» сосудистого сплетения очень невысока. В некоторых случаях небольшое количество коллагенов было распределено по краям «конкрементов», в других случаях, напротив, иммунопозитивной оказалась центральная часть. Таким образом, установлено, что плотные образования в сосудистых сплетениях головного мозга человека не являются конкрементами и состоят из неизвестного вещества, по-видимому, белковой или углеводной природы. Структура простаты и регионарных лимфатических узлов при экспериментальной хронической алкогольной интоксикации и венозном застое в малом тазу Юров М.А., Асташов В.В., Казаков О.В., Чепик В.И. НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск Большинство урологов считают застойные явления крови в венах малого таза основным этиологическим фактором более чем у двух третей больных хроническим простатитом. Застою крови в венах малого таза и простаты способствуют гиподинамия, переохлаждение, а также хронические интоксикации – в первую очередь алкогольная. Моделирование хронической алкогольной интоксикации позволяет получить характерные патологические из301 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки менения, сравнимые с таковыми у человека при длительном злоупотреблении алкоголем. В работе проведено структурно-клеточное исследование простаты, тазовых (являющихся лимфатическими узлами �� I�� порядка для простаты) лимфатических узлов в условиях хронической алкогольной интоксикации и венозном застое (в период компенсации) в малом тазу. Работа проведена на нелинейных крысах-самцах массой 220–260 г в количестве 60 особей. Животные были разбиты на 3 группы: 1. интактные животные (контроль); 2. хроническая алкогольная интоксикация (15% водный раствор этилового спирта, в течение 2 месяцев); 3. хроническая алкогольная интоксикация с экспериментальным венозным застоем в малом тазу. Венозный застой (двухстороннее лигирование внутренних подвздошных вен) создавался под нембуталовым наркозом (40 мг/кг веса внутрибрюшинным введением) за 21 день до окончания приема животными 15% водного раствора этилового спирта. Эвтаназия животных осуществлялась под нембуталовым наркозом. Для гистологического исследования забирали простату и тазовые (хвостовые) лимфатические узлы. Исследование структуры простаты при хронической алкогольной интоксикации выявило, по сравнению с контролем, увеличение площади паренхимы на 8% и уменьшение стромы – на 22,8%. В паренхиме отмечается расширение просветов (на 22,3%) концевых секреторных отделов собственных желез, накопление в них секрета. В простате значительно увеличиваются относительные площади артериол (в 2,9 раза) и венул (на 35%). В регионарных (тазовых) лимфатических узлах, при хронической алкогольной интоксикации выявлены структурные признаки активации как клеточного (увеличена площадь паракортикальной зоны на 18%), так и гуморального звеньев иммунитета (увеличена площадь вторичных лимфоидных узелков на 28%, увеличено число незрелых форм клеток лимфоидного и плазматического рядов), выраженной макрофагальной реакции (увеличено число макрофагов). Транспорт лимфы через лимфатический узел снижен (уменьшена площадь мозговых синусов на 24%). Исследование структуры простаты на 21-е сутки венозного застоя (лигирование внутренних подвздошных вен) в малом тазу, в условиях хронической алкогольной интоксикации, по сравнению с только хронической алкогольной интоксикацией, выявило уменьшение площади паренхимы простаты на 10% и увеличение стромы – на 32,4%. Площадь концевых секреторных отделов собственных желез уменьшается на 32,6%, в них отмечается накопление и уплотнение секрета. В простате, по сравнению с только хронической алкогольной интоксикацией, увеличены относительные площади, как венул (на 25%), так и артериол (на 77,6%). В условиях венозного застоя в малом та302 Сборник научных трудов зу в тазовых лимфатических узлах выявлены структурные признаки, указывающие на активацию гуморального звена иммунитета (увеличена площадь вторичных лимфоидных узелков, мозговых тяжей, увеличено число незрелых форм клеток лимфоидного и зрелых – плазматического рядов) и угнетения клеточного (уменьшена площадь тимусзависимой зоны на 44,6%) звена иммунитета, увеличено число макрофагов. Транспорт лимфы через лимфатический узел повышен (площадь мозговых синусов увеличена на 80%). Таким образом, при хронической алкогольной интоксикации, выявленные изменения свидетельствуют: в простате – о структурной дезорганизации собственных желез, увеличении плотности микрососудов в строме; в регионарных (тазовых) лимфатических узлах – о проявлениях эндогенной интоксикации в организме (увеличена площадь Т-зоны, площадь структурных компонентов, ответственных за гуморальное звено иммунитета, уменьшена транспортная функция, макрофагальная реакция). При венозном застое в малом тазу в условиях хронической алкогольной интоксикации, структурно-функциональные преобразования в простате свидетельствуют о циркуляторном (застойном) повреждении: уменьшено паренхиматозно-стромальное и увеличено артерио-венулярное (дилятация артериол и венул) соотношение, отек паренхимы, уменьшены просветы концевых секреторных отделов собственных желез, застой и уплотнение секрета. В тазовых лимфатических узлах наблюдаются структурные преобразования, свидетельствующие об активации их лимфопоэтической функции, выражающиеся в увеличении площади В-зависимой зоны иммунного ответа, числа зрелых плазматических клеток в ней, усилении дренажной функции (увеличение площади мозгового вещества, мозговых синусов). Особенности функционирования камбиальных и дочерних клеток эпителиально-стромальной морфофункциональной зоны в фиброаденоме молочной железы Явишева Т.М., Щербаков С.Д., Голубева И.С., Савлучинская Л.А. Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва В литературе появляются сведения о том, что нормальный эпителий, доброкачественные и злокачественные опухоли построены по типу эпидермальнопролиферативных единиц с камбиальной клеткой в центре. Однако, возникновение опухолевого процесса многие авторы связывают с изменениями в отдельно взятой морфофункциональной единице. Поэтому целью нашего исследования явилось изучение кооперативного взаимодействия тканевых единиц, возможной дифференцировки камбиальных клеток в системе этих 303 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки единиц в условиях доброкачественной опухоли. Исследовали ткань фиброаденомы молочной железы от 15 больных в возрасте от 40 до 60 лет. Проводили морфометрический анализ отпечатков ткани на анализаторе изображения «Видеотест-3,2». Вычисляли площади клеток, степень их эллиптичности, содержание различных субпопуляций клеток в пласте. Ранее нами показано, что эпителий состоит из структур типа розеток, в которых одна центральная камбиальная клетка окружена 6–7 периферическими. При делении камбиальных клеток образуются материнские и дочерние клетки, создающие электрическое поле, в котором дифференцируются дочерние клетки. Однако созревание дочерних клеток происходит не в одной розетке, а в морфофункциональной зоне, состоящей из двух субъединиц (по 12 розеток в каждой), работающих поочередно. Лишь поле 12 пар материнских и дочерних клеток, расположенных в одной и той же субъединице, достаточно для растяжения дочерних клеток и их дифференцировки. При этом определяется вектор поляризации дочерней клетки, вдоль которого будет происходить ее дальнейшее деление. 6 пар материнских и дочерних клеток создают поле пороговой величины, при котором дифференцировки дочерних клеток нет. Однако эпителиальные дочерние клетки не могут дифференцироваться без клеток стромы. В строме существуют такие же морфофункциональные зоны, как и в эпителии. Функционируя вместе, они образуют единую эпителиально-стромальную морфофункциональную зону, где эпителий и строма оказывают друг на друга противоположный эффект за счет вырабатываемых ими регуляторных факторов. Факторы эпителиальных клеток вызывают сжатие чувствительных к ним клеток, а факторы стромальных – наоборот, удлинение. Так, 12 образовавшихся эпителиальных дочерних клеток, спазмированные за счет своих факторов роста, лишь тогда растягиваются силами электрического поля, т.е. дифференцируются, когда факторы роста 12 стромальных клеток расслабят их кортекс. При образовании доброкачественной эпителиальной опухоли нарушения возникают сначала в одной из субъединиц эпителия, в то время как подлежащая строма не изменена. Численность камбиальных клеток в этой субъединице эпителия падает до 8, а в соответствующей субъединице стромы остается, как и в норме, 12 клеток. В отличие от другой субъединицы, где существует равновесие между численностью камбиальных клеток эпителия и стромы, здесь изначально камбиальных клеток стромы на 4 больше, чем эпителия. Поэтому в 1 субъединице стромальных пар материнских и дочерних клеток также образуется на 4 больше, чем эпителиальных. Затем, при вступлении в пролиферацию камбиальных клеток 2 субъединицы и по мере образования материнских и дочерних клеток 4 пары эпителиальных материнских и дочерних клеток этой субъединицы сразу же будут подвергаться воздействию уже име304 Сборник научных трудов ющихся регуляторных факторов 4 «лишних» стромальных дочерних клеток 1 субъединицы, что вызовет релаксацию кортекса этих 4 эпителиальных клеток 2 субъединицы и возможность поляризоваться под действием электрического поля. Несмотря на то, что электрическое поле во 2 субъединице создалось 4 парами материнских и дочерних клеток эпителия и ниже порогового (создается 6 парами), растяжение дочерних клеток будет происходить, т.к. это поле будет взаимодействовать с полем 1 субъединицы, образующимся 8 парами эпителиальных клеток, значение которого выше порогового. При этом эпителиальные дочерние клетки с положительным электрическим зарядом в одной субъединице будут отклоняться и поляризоваться в сторону отрицательно заряженных материнских клеток в другой субъединице и наоборот. Причем, отклонение 4 дочерних клеток в электрическом поле 2 субъединицы (как более слабом) будет значительнее, чем 8 таких клеток в поле 1 субъединицы. Следовательно, в каждый пролиферативный период численность векторов роста дочерних клеток увеличивается на 4 до тех пор, пока их не станет 20. Это связано с тем, что количество эпителиальных дочерних клеток в обеих субъединицах равно 20 (8+12), и каждая такая клетка имеет свой постоянный угол отклонения (линии напряженности, в соответствии с которыми они поляризуются, всегда определенным образом распределены в пространстве). Поэтому такие дочерние клетки и их производные будут располагаться не параллельно базальной мембране, как в норме, а под углом к ней, что приводит к развитию объемного образования. В результате, эпителиальный очаг неракового роста состоит из 4, 8, 12, 16 и 20 лучистых секторов, каждый из которых представлен новообразованными тканевыми структурами. Следовательно, такие структуры в лучистом секторе – это производные от деления одной камбиальной клетки. Морфологическая характеристика секреторного цикла фолликулярных тироцитов при воздействии липополисахарида Яглова Н.В. НИИ морфологии человека РАМН, Москва В последние годы опубликовано большое количество работ, посвященных изучению изменения функциональной активности щитовидной железы (ЩЖ) при различных соматических заболеваниях и оценке роли дисфункции ЩЖ в течении соматических заболеваний различного генеза, в частности, инфекционных заболеваний и сепсиса. Одной из конститутивных патогенассоциированных молекул, постоянно присутствующих в системном кровотоке у млекопитающих и человека, является липополисахарид (ЛПС) – 305 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий микрофлоры кишечника. Его концентрация в крови повышается при физиологическом и патологическом стрессе и различных заболеваниях. Влияние ЛПС на морфофункциональное состояние ЩЖ является малоизученным вопросом, что и обусловило цель исследования. Самцам крыс Вистар массой тела 200–220 г интраперитонеально вводили ЛПС �� E�� . �� coli�� («�� Sigma�� », США) в дозе 10 мг/кг, растворенный в 100 мкл физиологического раствора. Крысам контрольной группы вводили аналогичный объем физиологического раствора. Животных выводили из эксперимента через 1, 3, 6, 12 и 24 ч после введения ЛПС. В сыворотке крови методом ИФА («Monobind», США) определяли содержание тиреотропного гормона (ТТГ), тироксина (Т4), трийодтиронина (ТЗ), кортикостерона, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкинов (ИЛ)-2, ИЛ-12, интерферона-γ. Препараты ЩЖ изучали методами световой и электронной трансмиссионной микроскопии, компьютерной морфометрии. Проводили статистическую обработку данных. Статистически значимыми считали различия при р<0,01. Через 1 ч после введения ЛПС отмечалось достоверное снижение содержания Т4 и Т3 и повышение содержания ТТГ в сыворотке крови, а также резкий рост концентрации ФНО-α. В периферической зоне долей ЩЖ наблюдалось двукратное увеличение размеров фолликулов, высоты фолликулярных тироцитов, размеров их ядер, по сравнению с показателями контрольной группы. Большинство тироцитов находилось в фазе синтеза и накопления секреторных гранул, однако содержание в них коллоидных капель было низким. В фолликулах отмечалось увеличение количества фолликулярных тироцитов с цитоплазматическими выростами, закрывающими контакт их апикальной поверхности с полостью фолликула. Таким образом, в данный срок наблюдений имело место нарушение баланса в сторону преобладания синтетических процессов и процессов выведения тиреоглобулина в полость фолликулов. В центральных зонах долей ЩЖ отмечалось увеличение размеров ядер клеток, резкое набухание и отек митохондрий с деструкцией их крист. Наряду с усилением синтетических процессов, в фолликулярных тироцитах наблюдалось усиление процессов резорбции и накопления коллоидных капель в цитоплазме. Через З ч после введения ЛПС, по сравнению с предыдущим сроком, в периферической зоне ЩЖ интенсивность процессов выделения содержимого секреторных гранул в полость фолликулов была снижена. Тем не менее, синтетические процессы в периферической зоне превалировали над процессами резорбции тиреоглобулина, что особенно было выражено в центральной зоне. 306 Сборник научных трудов Через 6 ч после введения ЛПС показатели тиреоидного статуса крыс соответствовали значениям контрольной группы. Синтетическая активность тироцитов была выше, чем в клетках ЩЖ контрольной группы. Особенно заметно эти процессы были выражены в периферической зоне железы. Усиленный синтез белкового продукта происходил на фоне выраженного энергодефицита, вызванного деструктивными изменениями большинства митохондрий и нарушениями микроциркуляции крови в железе. В ЩЖ появились первые признаки синхронизации процессов синтеза и резорбции тиреоглобулина. Спустя 12 ч после введения ЛПС в фолликулярных тироцитах происходило снижение интенсивности как процессов выделения тиреоглобулина в полость фолликулов ЩЖ, так и его интернализации в виде образования коллоидных капель в цитоплазме фолликулярных тироцитов, что привело к снижению уровня Т4 в сыворотке крови. Через 24 ч после введения ЛПС отмечалось статистически значимое снижение концентрации ТТГ, Т4, а также повторный рост концентрации провоспалительных цитокинов и снижение кортикостерона. В центральных долях отмечалось уменьшение размеров фолликулов и относительная сбалансированность синтетических и резорбционных процессов. В периферических зонах между этими процессами отмечался выраженный дисбаланс. Большинство фолликулярных тироцитов осуществляло активный биосинтез секреторных и лизосомальных белков. Синтетические процессы происходили на фоне выраженного энергодефицита, связанного с нарушением микроциркуляции и усилением продукции тиреоглобулина. Вероятно, это приводило к отёку и гибели митохондрий и, как следствие, увеличению количества лизосом и аутофаголизосом. Признаки интернализации тиреоглобулина не выявлялись. Таким образом, ЛПС оказывает выраженное прямое избирательное действие на секреторные процессы в фолликулярных тироцитах. ЛПС активирует фазу синтеза тиреоглобулина независимо от уровня ТТГ в сыворотке крови, и подавляет интернализацию тиреоглобулина за счет угнетения фазы резорбции в периферической зоне и снижения протеолиза резорбированного тиреоглобулина в тироцитах центральной зоны долей. Эти изменения обусловливают снижение выделения тиреоидных гормонов в системный кровоток. Следовательно, ЛПС оказывает регуляторное действие на продукцию гормонов фолликулярными тироцитами ЩЖ, усиливая синтез и депонирование прогормона, не подавляя, однако, функциональную активность фолликулярных тироцитов. 307 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Влияние трансплантации эмбриональной нервной ткани на изменения клеток и клеточного микроокружения голубого пятна и черной субстанции Ярыгин В.Н., Малинина И.Е. Российский государственный медицинский университет, Москва Выяснение жизнеспособности, реактивных изменений и функциональной активности клеток трансплантатов эмбриональной ткани голубого пятна и черной субстанции в головном мозге реципиентов представляется важным в связи с нарушением содержания норадреналина и дофамина в окончаниях аксонов соответствующей популяции нейронов голубого пятна и черной субстанции при различных органических поражениях и механических травмах мозга. Целью данного исследования явилось изучение состояния морфофункциональных показателей невроцитов голубого пятна (ГП) и черной субстанции (ЧС) и их микроокружения (тканевой среды) при трансплантации эмбриональных клеток голубого пятна и черной субстанции в головной мозг млекопитающих. Работа выполнена на крысах Wistar, массой 150–280 г, содержавшихся в обычных условиях вивария. В исследованиях использовались следующие группы животных: 1) с трансплантатом эмбрионального ГП в третий желудочек головного мозга, 2) с трансплантатом эмбриональной ЧС в третий желудочек головного мозга, 3) ложнооперированный контроль, 4) интактный контроль. Крысам первой и второй групп в трехмесячном возрасте была проведена пересадка эмбриональной нервной ткани (ЭНТ) голубого пятна и черной субстанции. Донорами служили 14-сут эмбрионы крыс �� Wistar�� . Исследование трансплантатов проводили через три мес и один год после пересадки ЭНТ. Ткань пересаживали в третий желудочек головного мозга интактных крыс. Степень морфологической дифференцировки нейронов оценивали при микроскопическом анализе препаратов по результатам вычислений площади сечений нейронов, ядер и объему ядрышек. Статистическую обработку проводили по критерию Стьюдента. Функциональная морфология ядер ГП и ЧС животных контрольных групп (интактные и ложнооперированные животные) соответствует вариантам нормы. Все животные первой и второй групп имели трансплантаты преимущественно средних размеров с жизнеспособными норадренергическими или дофаминергическими нейронами. Трансплантаты хорошо интегрированы с мозгом хозяина (прослеживается тесная связь с тканью мозга реципиента в основном в области боковой стенки желудочка и срединного возвышения). 308 Сборник научных трудов Клетки трансплантатов, развивающиеся 3 мес, характеризуются соответствующими размерами клеток ГП и ЧС взрослых животных и не содержат признаков дегенеративных изменений, что подтверждается предшествующими экспериментами. Однако, незначительное число невроцитов пересаженной ЭНТ, развивающихся один год, претерпевают дистрофические изменения: размеры и форма клеток варьируются, имеются отдельные сморщенные клетки. Объем ядрышек трехмесячного трансплантата ГП незначительно увеличивается, а в соответствующем трансплантате ЧС практически не изменяется. Что касается трансплантатов, развивающихся один год, то объем ядрышек претерпевает незначительное уменьшение. Такое уменьшение объема характерно как для трансплантатов ГП, так и ЧС. Изменение площади сечения нейронов (веретенообразных) незначительно, коррелирует с изменением объема ядрышек (кв. мкм). Через 3 мес после трансплантации: 263±15 (ГП), 275±20 трансплантат (ГП), 259±20 (ложнооперированные), 262±20 (интактные); через 12 мес: 258±10 (ГП), 251±10 (трансплантат ГП), 260±20 (ложнооперированные), 257±20 (интактные). Результаты проведенных исследований подтверждают сведения о приживляемости трансплантатов на длительное время, их структурной и функциональной интеграции с головным мозгом реципиента. Эмбриональная нервная ткань голубого пятна и черной субстанции, трансплантированная в третий желудочек головного мозга интактных крыс Вистар, приживляется, структурно и функционально интегрирует с мозгом экспериментальных животных. Через один год после пересадки клетки трансплантатов являются жизнеспособными, морфологические характеристики клеток соответствуют невроцитам голубого пятна и черной субстанции интактного контроля. 309 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Содержание Гибель кардиомиоцитов при артериальной гипертензии Азова М.М.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Изменения биоаминов селезёнки и иммунобиохимических показателей крови крыс при воздействии иммуномодулятором в условиях экспериментального токсического гепатита Алексеева Л.А., Гурьянова Е.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Морфологическая оценка репаративных процессов при использовании обогащенной тромбоцитами плазмы крови Алексеева Н.Т., Глухов А.А., Остроушко А.П.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Сравнительная характеристика лимфоидных скоплений в разных зонах почек у детей и взрослых Аминова Г.Г.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Экспрессия клаудинов в эпителиальных опухолях различного генеза Бабиченко И.И. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Структурно-функциональные изменения в паренхиме щитовидной железы при ишемической болезни сердца и алкогольной кардиомиопатии Байбаков С.Е., Дронова М.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Морфофункциональные особенности эндотелиоцитов при осложненном течении геморрагической лихорадки с почечным синдромом Байгильдина А.А., Дубовая Т.К., Лебедева А.И., Вагапова В.Ш.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Исследование содержания гликогена в нейтрофильных гранулоцитах крови в зависимости от химического состава принимаемой пищи Бакуев М.М., Шахбанов Р.К., Мусаева Д.О.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Изучение процессов апоптоза желудочного эпителия при H. Pylori-ассоциированном хроническом атрофическом гастрите Балабеков А.В., Чуков С.З., Правдина И.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Рост клеток культуры спинного мозга крысы под действием глицина Балашевич Т.В., Никандров В.Н. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Методология патоморфологического исследования операционного материала при раке поджелудочной железы Балдин Д.Г., Цыганов С.Е. , Сетдикова Г.Р., Паклина О.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 310 Сборник научных трудов Распределение маркеров апоптоза в спайках брюшной полости в зависимости от органотопической локализации Барканов В.Б., Воробьев А.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Ультраструктурные критерии повреждения клеток дыхательной и пищеварительной систем при аллергической альтерации Бархина Т.Г., Голованова В.Е., Гущин М.Ю., Кондратьев В.Е.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Влияние окислительного стресса на локализацию и свойства ядрышкового белка фибрилларина в культуре клеток HeLa Барыкина Н.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Периферическое введение лигандов мю-опиоидных рецепторов изменяет содержание бета-эндорфина в межклеточном пространстве поясной коры мозга крыс и поведение животных при моделировании эмоционального стресса Башкатова В.Г., Колпаков А.А., Умрюхин А.Е., Судаков С.К.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Влияние семакса на морфологию миокарда и уровень апоптоза кардиомиоцитов при развитии инфаркта миокарда у крыс Бердалин А.Б., Гаврилова С.А., Голубева А.В., Буравков С.В., Кошелев В.Б.. . . . . . . . . . 33 Межклеточные взаимодействия в культуре гепатоцитов крыс разного возраста в норме и после воздействия мелатонина Беспятых А.Ю., Голиченков В.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 О возможном влиянии острой перегрузки сердца на интенсивность апоптотической гибели клеток миокарда левого желудочка Благонравов М.Л., Онуфриев М.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Ультраструктурные изменения в клетках различной локализации при введении неорганических наноразмерных частиц интактным животным Бородин Ю.И., Бгатова Н.П., Шедина В.В., Рачковская Л.Н. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 Лаброциты в раннем постнатальном морфогенезе бульбоуретральных желез человека Боронихина Т.В., Яцковский А.Н., Горский В.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Состояние пролиферативных процессов в клетках внутрипротоковой карциномы молочной железы Бриллиант А.А., Сазонов С.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 Популяционные характеристики тканевых базофилов Быков Э.Г.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 311 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Межклеточные взаимодействия в гистоархитектонике глоточной миндалины при лечении иммуномодуляторами микробного происхождения Быкова В.П.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Реакция кардиомиоцитов левого желудочка cердца крыс на действие различных режимов 2g гипергравитации Вареник Е.Н., Липина Т.В., Шорникова М.В., Краснов И.Б., Ченцов Ю.С. . . . . . . . . . . . 50 О структурно-функциональной реорганизации воздухоносных путей и респираторных отделов лёгких крыс в условиях инфицирования на фоне стресса Вахитов Э.М., Лабутин И.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 Сравнительная морфологическая характеристика слизистой оболочки поперечной ободочной и нисходящей кишки у больных синдромом раздраженного кишечника Визе-Хрипунова М.Б., Кактурский Л.В., Михайлова Л.П., Сидорова Е.И.. . . . . . . . . . . . 53 Реакция культивируемых нормальных и трансформированных клеток кожи человека на действие растительных факторов роста Вильданова М.С., Онищенко Г.Е., Смирнова Е.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 Влияние полициклических ароматических углеводородов на пролиферацию клеток в условиях экспрессии АH-рецептора и без Волков М.С., Дубовая Т.К., Кобляков В.А., Болотина Н.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 Исследование структуры опухоли молочной железы и регионарных лимфатических узлов при экспериментальном канцерогенезе молочной железы Волкова М.С., Асташов В.В., Казаков О.В., Чепик В.И. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 Иммуногистохимическое исследование экспрессии муцина 1, 5АС, 6, 2 типов в карциномах различных анатомических отделов желудка Гаганов Л.Е., Корсакова Н.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 Цитоархитектоника брыжеечных лимфатических узлов при моделировании элементов невесомости Гарунова К.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 Реактивные изменения в структурах поясничного утолщения спинного мозга крыс при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите Гилерович Е.Г., Федорова Е.Ф., Карпенко М.Н., Тихомирова М.С., Абдурасулова И.Н., Захарова Е.Т., Коржевский Д.Э. . . . . . . . . . . . . . 65 Ультраструктурные изменения клеток легких при экспериментальном аутоиммунном процессе Голованова В.Е., Бархина Т.Г., Кондратьев В.Е. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 312 Сборник научных трудов Нейрон-глиальное взаимодействие при изменениях режима синаптической передачи Гореликов П.Л.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 Межклеточные взаимодействия в ткани печени в условиях тиреоидного дисбаланса при хронической эндогенной интоксикации Горячев А.Н., Калашникова С.А. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 Особенности микроциркуляции в органах репродукции в возрастном аспекте Греф В.В., Бурчак Н.Н., Старкова Е.В., Асташов В.В., Ларионов П.М. . . . . . . . . . . . . . 74 Динамика цитоархитектоники лимфоидной ткани в стенке мочеточника в старших возрастных группах человека Григоренко Д.Е.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 Электронно-микроскопическое исследование межклеточных контактов иммуннокомпетентных клеток в ткани саркомы 45 после воздействия низкоинтенсивным микроволновым резонансным излучением на крыс-опухоленосителей Гудцкова Т.Н., Жукова Г.В., Суханова М.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Ультраструктурная характеристика местного клеточного иммунитета при раке молочной железы после неоадьювантной аутогемохимиотерапии в сочетании с экстракорпоральным омагничиванием аутокрови Гудцкова Т.Н., Непомнящая Е.М., Старжецкая М.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 Иммуногистохимическое исследование влияния космического полета на иннервацию пальцев хрящепалого геккона Гулимова В.И., Барабанов В.М., Савельев С.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 Морфофункциональное состояние клеток Пуркинье мозжечка в отдаленные сроки после гамма-облучения в малых дозах Гундарова О.П. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 Взаимодействие нейромедиаторсодержащих структур тимуса и селезёнки при иглоукалывании Гурьянова Е.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 Экспрессия регулятора клеточного цикла p16INK4a при предопухолевых изменениях эпителия шейки матки Данилова Н.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 Митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 ускоряет заживление ран у старых мышей Демьяненко И.А., Васильева Т.В., Фёдоров А.В., Егоров М.В., Ильинская О.П.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 313 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Клеточные элементы в системе биоаминового обмена эндометрия тела матки крыс в процессе полового цикла Диндяев С.В., Виноградов С.Ю.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Экспрессия циклина D1 и катенинов в клетках солидно-псевдопапиллярных опухолей поджелудочной железы Дубова Е.А., Подгорнова М.Н., Щёголев А.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 Увеличение длины гипертрофированных кардиомиоцитов у больных с патологией сердца, сопровождающейся дилатацией левого желудочка Егорова И.Ф., Сухачева Т.В., Серов Р.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 Реакция гепатоцитов на пренатальную травму печени Ельчанинов А.В., Большакова Г.Б.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 Корреляция молекулярных механизмов гибели клеток пигментного эпителия сетчатки с амилоидогенезом у больных возрастной макулярной дегенерацией Ермилов В.В., Махонина О.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 Реактивные изменения в пульпе зубов крыс при воздействии эмоционально-холодового стресса Ерофеева Л.М., Островская И.Г., Вавилова Т.П.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 Исследование слизистой оболочки околоносовых пазух при аллергическом и хроническом полипозных риносинуситах Ефремова О.А., Любовцева Л.А. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 Характеристики клеток респираторного отдела легких на светооптическом уровне при бактериальных пневмониях Зибиров Р.Ф., Козлов Д.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 Кооперативное взаимодействие моно- и полинуклеарных фагоцитов, опосредованное нейтрофилокинами, в процессе формирования противохолерного иммунитета Иванова И.А., Васильева Г.И., Киселева А.К., Беспалова И.А., Дорошенко Е.П. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 Влияние радиации в малых дозах на проницаемость микрососудов различных зон коры головного мозга Ильичева В.Н. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Структурные изменения в поджелудочной железе кошки на разных сроках нарушения артериального кровообращения Кадыров Р.К.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 314 Сборник научных трудов Межклеточные взаимодействия в возрастной гистоархитектонике глоточной миндалины Калинин Д.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Участие распознающих рецепторов в инициации иммунного воспаления у больных псориазом Катунина О.Р., Кубанова А.А., Резайкина А.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Особенности экспрессии белков клаудина-1, Е-кадхерина и β-катенина при лейкоплакии и плоскоклеточном раке слизистой облочки рта Катушкина А.А., Ковязин В.А., Бабиченко И.И., Григорьян А.С.. . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 Структурно-функциональная перестройка коры надпочечников при алкогольной интоксикации Кварацхелия А.Г., Семенов С.Н.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Современные методы изучения пространственной организации клеток головного мозга Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Клетки инфильтрата вокруг капилляров сердца в зоне инфаркта и интактных зонах Корнева Ю.С., Козлов Д.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Реакции митохондрий и других ультраструктур клеток Сертоли при питьевом применении сульфатной минеральной воды и радиационном облучении крыс Королев Ю.Н., Гениатулина М.С., Никулина Л.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 Иммунокомпетентные клетки-мишени центрального и периферического органов иммунитета мышей при акупунктуре Кроткова О.С., Иванова О.В., Гурьянова Е.А., Любовцева Е.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 Анализ повреждения и гибели нейронов головного мозга генетически модифицированных мышей при экспериментальной модели эпилепсии Кругляков П.П., Шиханов Н.П., Кузнецов С.Л., Подрезова Е.П., Иванов Н.М., Смирнова Г.В., Ховряков А.В., МакКхан Г.-II, Сосунов А.А. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 Цитометрические параметры гепатоцитов белых крыс в постнатальном онтогенезе в зависимости от физических свойств пищи Кузнецова Т.И., Хайруллин Р.М.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 Морфометрическая и гистохимическая характеристика слизистой оболочки полости рта при введении цитостатиков Леонтьева И.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 315 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Плотность распределения, топография и секреторная активность тучных клеток в слизистой оболочке полости рта при введении цитостатиков Леонтьева И.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 О мышцах, обслуживающих рабочие центры пищеварения и эмоций Литвиненко Л.М.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 Гистопатологическое исследование регионарных лимфатических узлов при экспериментальном канцерогенезе простаты Ломшаков А.А., Асташов В.В., Казаков О.В., Чепик В.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 Являются ли выделяемые бактериями в кишечнике мембранные нановезикулы средством межклеточного взаимодействия и элементом механизма патогенеза? Луста К.А., Козловский Ю.Е., Хомякова Т.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Влияние акупунктуры на взаимодействия биоаминов в нейромедиаторных структурах гипоталамуса Любовцева Е.В., Любовцева Л.А., Любовцев В.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 Адаптивно-интегративная реакция кожных трансплантатов под воздействием эплира Малиновская И.С. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 Варианты конформаций и трехмерных композиций коллагеновых волокон внутренних оболочек Минигазимов Р.С., Вагапова В.Ш.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 Гетерогенность околопротокового клеточного микроокружения молочной железы при дисгормональных гиперплазиях в условиях воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения Мнихович М.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 Морфологическая характеристика клеточного микроокружения, экстрацеллюлярного матрикса и особенностей микроциркуляторного русла при раке, фиброаденоме и дисгормональных гиперплазиях молочных желез Мнихович М.В., Тернов М.М. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 О генезе экспериментальных сарком Мойжесс Т.Г.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 Метод FRAP в изучении эффективности действия специфичных к мРНК белка eGFP антисмысловых олигонуклеотидов в дермальных фибробластах мыши Молчанова Е.С. , Семенова М.Л. , Кошелева Н.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 316 Сборник научных трудов Сопоставление особенностей экспрессии маркеров прогрессии рака желудка с классическими критериями классификации P. Laurén (1965) Москвина Л.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 Аутоиммунные сыворотки как инструмент для выявления белков ядерного матрикса Мурашева М.И. , Ченцов Ю.С.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 Пространственно-временная организация активности генома нервных клеток в условиях измененного фоторежима Мустафин А.Г., Ярыгин В.Н.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 Морфологическая и электронно-микроскопическая характеристика серозных цистаденокарцином яичников после различных вариантов неоадьювантной химиотерапии Непомнящая Е.М., Голотина Л.Ю., Гудцкова Т.Н., Тартанова Т.М. . . . . . . . . . . . . . . . 164 Участие P2Y-рецепторов в процессах нейроонтогенеза и регенерации периферического нерва Нигметзянова М.В., Рагинова Е.Б., Рагинов И.С. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 Плазминоген и стрептокиназа защищают клетки нервной ткани от повреждающего действия ионов аммония или глутамата Никандров В.Н., Жук О.Н., Полукошко Е.Ф., Тумилович М.К., Гронская Р.И., Лукашевич В.С., Вашкевич Е.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . 167 Изменение нервных стволов при хроническом панкреатите Никитин П.Н., Сетдикова Г.Р., Паклина О.В., Цыганов СЕ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 Реактивные изменения кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии Новаковская С.А., Рубахов К.О., Говоров М.И., Арчакова Л.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .170 Сравнительная характеристика морфологического строения стенки аорты при расслаивающей аневризме и гипертонической болезни Новикова Е.Г., Титова Г.П., Галанкина И.Е.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 Влияние пептидсодержащих биопрепаратов на ультраструктуру эпителия сосудистого сплетения желудочков мозга при острой ишемии Новикова Л.Н, Арчакова Л.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 Морфологическая реакция эпителия и лимфоидных образований бронхов на хроническое воздействие радиации низкой интенсивности Оганесян М.В., Чава С.В., Кудряшова В.А., Ризаева Н.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 Морфологические и некоторые иммунологические аспекты заболеваний щитовидной железы Оразалиева А.М., Плескановская С.А., Ламанова Дж. Б.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 317 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Ультрамикроскопическое строение клеток стенки мелких бронхов при хроническом обструктивном заболевании легких Островский Н.Н., Дельцова Е.И., Кулинич-Миськив М.О.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 Влияние алиментарного дефицита магния на структуру эндотелия артериол миокарда крыс Паньшин Н.Г., Смирнов А.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 Секреторный цикл и гибель нейроцитов крупноклеточных ядер гипоталамуса при нарушении кровообращения Папков В.Г., Баранова Т.Ю., Громова Т.М., Услонцев Д.Н.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Реактивные изменения нейронов вентро-базального комплекса таламуса в условиях деафферентации Пашина Н.Р.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Анализ вызванных ответов в гиппокампе при аппликации субстанций, изменяющих функциональное состояние межклеточного матрикса Пашкевич С.Г., Денисов А.А., Кульчицкий В.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 Морфометрическое исследование Th1 и Th2 клеток в сосудистой стенке при атерогенезе у человека Пигаревский П.В., Мальцева С.В., Восканьянц А.Н., Селиверстова В.Г., Снегова В.А..188 Патогистологический анализ изменений щитовидной железы у крупного рогатого скота Пилов А.Х., Урусбамбетов А.Х., Соттаев М.Х.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 Сравнительная характеристика и условия выделения мезенхимальных стромальных клеток из различных источников Повещенко О.В., Повещенко А.Ф., Ким И.И., Янкайте Е.В., Ульянов Е.В., Любарский М.С., Овсянникова Т.В., Чекалина М.В., Коненков В.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192 Реактивные изменения кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс при развитии экспериментального аутоиммунного миокардита Погодина Л.С., Земцова Л.В., Гаврилова С.А., Морозова М.П., Ченцов Ю.С.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 ФНО-зависимый апоптоз как основной механизм гибели эндокриноцитов при хронической эндогенной интоксикации Полякова Л.В., Калашникова С.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 Реактивные изменения эпителия слизистой оболочки желудка при инфицировании различными штаммами Helicobacter pylori Поморгайло Е.Г.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 318 Сборник научных трудов Иммуногистохимическое выявление нейронспецифической енолазы в клетках островков Лангерганса поджелудочной железы человека в норме и при сахарном диабете 1 и 2 типов Прощина А.Е., Савельев С.В., Барабанов В.М., Кривова Ю.С.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 Роль ядрышковых белков – нуклеофозмина и нуклеолина в регуляции пролиферации опухолевых клеток Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Смирнова Е.А., Пробатова Н.А., Павловская А.И., Шабанов М.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 Влияние гормонов, простагландинов и лекарственных препаратов на процесс агрегации эритроцитов человека Ройтман Е.В., Муравьев А.В., Тихомирова И.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 Межклеточные взаимодействия: от микроокружения к гистионам и клеточным сетям Савостьянов Г.А., Магницкая Е.Г., Грефнер Н.М., Голубева Т.Б.. . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 Клетки эпидермоидной карциномы человека восстанавливают исходный фенотип после снятия воздействия сукцинатом витамина Е Савицкая М.А., Кисурина-Евгеньева О.П.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Состояние митотического цикла в клетках почечного эпителия после односторонней нефрэктомии 210 Сазонов С.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 Математический анализ состояния нейроцитов коры головного мозга собак при комбинированном действии факторов среды Саурина О.С.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 Морфофункциональные изменения в клетках Панета кишечника кроликов-сосунков, зараженных холерными вибрионами с различной антилизоцимной активностью Саямов С.Р., Черепахина И.Я., Помухина О.И., Ткачева Т.И., Балахнова В.В., Бурлакова О.С.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214 Реакция нейроцитов сенсомоторной коры на малые радиационные воздействия в ранние и отдаленные сроки Сгибнева Н.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 Морфофункциональные особенности неоангиогенеза в околоопухолевых участках подслизистой оболочки при раке желудка Сеньчукова М.А., Стадников А.А., Шевлюк Н.Н., Боков Д.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218 Пластичность моноаминоксидазы в нейропиле некоторых структур мозга крыс с разной локомоцией Сергутина А.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220 319 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Опыт использования структурно-информационного анализа в оценке функциональной организации комплекса Гольджи фибробластов человека Сесорова И.С., Лазоренко Т.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 Изучение активности метастина при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы Сетдикова Г.Р., Паклина О.В., Цыганов С.Е. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224 Механизмы клеточной гибели лютеоцитов яичника Сковородин Е.Н., Вехновская Е.Г. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225 Морфологическая характеристика эндокринных клеток тощей и подвздошной кишки потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени Смекалина О.Ю., Брюхин Г.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227 Структурные изменения в респираторных отделах легких при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила Смирнов А.В., Бутенко А.М., Быхалов Л.С. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229 Особенности повреждения и регенерации β-клеток панкреатических островков при экспериментальном сахарном диабете Снигур Г.Л., Спасов А.А., Воронкова М.П., Буланов А.Е.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 Современные методические подходы изучения миграции клеток с использованием генетических маркеров Соловьева А.О., Повещенко А.Ф., Шевченко А.В., Коненков В.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 Повреждение фагоцитирующих клеток при псевдотуберкулезной инфекции Сомова Л.М., Дробот Е.И., Плехова Н.Г.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 О реализации апоптозной доминанты нейросекреторных клеток крупноклеточных ядер гипоталамуса млекопитающих в условиях инфицирования организма Стадников А.А., Шевлюк Н.Н., Козлова А.Н. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 Морфофункциональное состояние эндометрия при хроническом эндометрите Старосветская Н.А., Михалева Л.М., Болтовская М.Н., Михалев С.А.. . . . . . . . . . . . . 240 Использование методов молекулярной генетики для изучения патологии клетки Стволинская Н.С.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242 Динамика соотношения путей гибели эпидермоцитов при термических ожогах кожи и стимуляции регенерации импульсным светом Столбовская О.В., Хайруллин Р.М. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244 320 Сборник научных трудов Пролиферирующие кардиомиоциты и клетки-предшественники кардиомиоцитов в миокарде больных гипертрофической кардиомиопатией Сухачева Т.В., Чудиновских Ю.А., Еремеева М.В., Серов Р.А., Самсонова М.В., Черняев А.Л., Бокерия Л.А. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246 Ультраструктурная характеристика паренхимы и стромы печени при воздействии наноматериалов Суходоло И.В., Мильто И.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов VEGF в скелетных мышцах при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей Тепляков С.А., Яглова Н.В., Черников В.П.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251 Реакция тканей желудка крысы в ответ на стресс в условиях эксперимента Тимофеева М.О., Спивак И.А., Швецов Э.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 Ретикулярные эпителиоциты тимуса и их реактивность в период эмбриогенеза Торбек В.Э.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 различная адаптация к γ-излучению радиочувствительных и радиорезистентных клеток связана с перестройками хроматина Тырсина Е.Г.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257 Влияние фотодинамического воздействия на макрофаги Ударцева О.О., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б., Тарарак Э.М.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259 Реакция нейронов головного мозга на малые радиационные воздействия Федоров В.П., Афанасьев Р.В., Зуев В.Г., Сгибнева Н.В., Гундарова О.П., Маслов Н.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 260 Реакция нейроцитов коры и подкорковых ядер головного мозга на острую алкогольную интоксикацию Федоров Н.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Функциональное состояние нейронов мозга и тироцитов щитовидной железы в эксперименте Хапажева М.Ж., Курашинова Л.Т., Гутова Ф.З. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264 Взаимосвязь изменений альвеолярных макрофагов со структурными основами «шокового легкого» Харин Г.М., Шакирова А.З.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 О межклеточных взаимодействиях в системе фагоцитоза при экспериментальных шокогенных повреждениях Харин Г.М., Сабитова А.М. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268 321 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Микрохирургия преимплантационных эмбрионов млекопитающих при помощи системы «лазерный скальпель – лазерный пинцет» Храмова Ю.В., Сергеев С.А., Ракитянский М.М., Семенова М.Л., Агранат М.Б.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270 Индекс межклеточных отношений как показатель баланса и дисфункции взаимодействий клеточных систем Худоерков Р.М.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 Влияние ваготомии на микроциркуляцию крови и состояние водного метаболизма в печени и тонкой кишке крыс Цибулевский А.Ю., Дубовая Т.К., Быков А.В. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274 Морфологические изменения при хроническом панкреатите Цыганов С.Е., Никитин П.Н., Сетдикова Г.Р., Паклина О.В, Туманова Е.Л.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276 Ультраструктурное и иммуногистохимическое изучение механизмов гибели кардиомиоцитов при различных заболеваниях сердца Цыпленкова В.Г.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 Активизация аутофагии в кардиомиоцитах хронических алкоголиков, возможно, препятствует развитию кардиомиопатии Цыпленкова В.Г., Илларионова Н.Г.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279 Нейро-сосудистые взаимоотношения седалищного нерва и его двигательного сегментарного центра при холодовой нейропатии Чайковский Ю.Б., Геращенко С.Б., Дельцова Е.И.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280 Особенности ультраструктурной организации эндотелиальных клеток инсулином Чекмарева И.А, Филатов В.В., Втюрин Б.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282 Экспрессия генов, ассоциированных с циклом клеточного деления и резорбцией матрикса, в периферической крови и суставном хряще больных остеоартрозом на ранней и поздней стадиях заболевания Четина Е.В., Братыгина Е.А., Зайцева Е.М., Семенова Л.А., Алексеева Л.И., Макаров С.А. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284 Уровень экспрессии мРНК генов cdc2 и tpa в активированных лимфоцитах как показатель степени пролиферации Чулкина М.М., Бурменская О.В., Савилова А.М.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 Современные иммуногистохимические подходы к изучению нервных аппаратов сердца и магистральных сосудов крысы и человека Чумасов Е.И., Петрова Е.С., Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э.. . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 322 Сборник научных трудов Митотический цикл и радиационный канцерогенез Шабалкин И.П., Ягубов А.С., Григорьева Е.Ю. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 Выживание и миграционный потенциал мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфецированных генами egfp, vegf и fgf2, при трансплантации в область травмы спинного мозга крысы Шаймарданова Г.Ф., Рубашкина Я.О., Газизов И.М., Салафутдинов И.И., Ризванов А.А., Челышев Ю.А. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292 Разработка диагностических панелей при иммунофенотипировании лейкозов и метастазов нейробластомы в костный мозг у детей при использовании метода традиционной иммуноцитохимии Шатинина Н.Н., Байдун Л.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294 Использование молекулярно-генетических методов для дифференциальной диагностики пролиферирующих лейомиом и лейомиосарком матки Шикеева А.А., Кекеева Т.В., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 Нарушение стромально-клеточных взаимоотношений в соединительной ткани организма матери, опосредованное через морфофункционально неполноценную плаценту, – основа патогенеза гестоза Шорников А.И., Меркулова Л.М., Плюхин С.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298 Состав и структура «конкрементов» сосудистых сплетений латеральных желудочков головного мозга человека Юнеман О.А., Савельев С.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300 Структура простаты и регионарных лимфатических узлов при экспериментальной хронической алкогольной интоксикации и венозном застое в малом тазу Юров М.А., Асташов В.В., Казаков О.В., Чепик В.И. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 Особенности функционирования камбиальных и дочерних клеток эпителиально-стромальной морфофункциональной зоны в фиброаденоме молочной железы Явишева Т.М., Щербаков С.Д., Голубева И.С., Савлучинская Л.А.. . . . . . . . . . . . . . . . . 303 Морфологическая характеристика секреторного цикла фолликулярных тироцитов при воздействии липополисахарида Яглова Н.В.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305 Влияние трансплантации эмбриональной нервной ткани на изменения клеток и клеточного микроокружения голубого пятна и черной субстанции Ярыгин В.Н., Малинина И.Е. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308 323 VIII Всероссийская конференция по патологии клетки Сборник научных трудов Издательство МДВ Подписано в печать 08.09.2010. Формат 60×90 1/16 Печать офсетная. Бумага офсетная. Усл. п.л. 20 Тираж 250 экз.

материалы конференции - Российское общество

Related documents

Products

Support

материалы конференции - Российское общество

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib