Механизмы формирования белкового покрытия на поверхности
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ РАН ______________________________________________________________________ На правах рукописи АБАЕВА Анастасия Александровна Механизмы формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов Специальность 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор М.А. Пантелеев Москва, 2014 Оглавление Введение .........................................................................................................................................4 Глава 1. Обзор литературы ...........................................................................................................8 1.1 Гемостаз ................................................................................................................................8 1.2 Тромбоциты ..........................................................................................................................9 1.3 Субпопуляции активированных тромбоцитов ................................................................12 1.4 Мембранные реакции ........................................................................................................19 1.5 Влияние температуры на свертывание крови .................................................................22 1.6 Трансглутаминазы .............................................................................................................23 1.6.1 Общие сведения о трансглутаминазах .....................................................................23 1.6.2 Фактор XIII ..................................................................................................................25 1.6.3 Тканевая трансглутаминаза .......................................................................................26 Постановка задачи .......................................................................................................................27 Глава 2. Материалы и методы ....................................................................................................28 2.1 Материалы ..........................................................................................................................28 2.1.1 Реагенты ......................................................................................................................28 2.2 Методы ................................................................................................................................29 2.2.1 Выделение отмытых тромбоцитов............................................................................30 2.2.2 Получение свободной от тромбоцитов плазмы .......................................................31 2.2.3 Титрование активных сайтов тромбина ...................................................................31 2.2.4 Проточная цитометрия ...............................................................................................32 2.2.5 Микроскопия ...............................................................................................................36 2.2.6 Планшетный спектрофотометр .................................................................................37 2.3 Статистическая обработка данных...................................................................................43 Глава 3. Результаты .....................................................................................................................44 3.1 Роль трансглутаминаз и полимеризации фибрина в формировании покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов ...........................................44 3.1.1 Изучение кинетики формирования двух субпопуляций тромбоцитов и распределения покрытия из фибриногена на их поверхности ........................................44 3.1.1 Выявление механизмов формирования проагрегаторной активности прокоагулянтных тромбоцитов ..........................................................................................46 3.2 Роль полимеризации фибрина в формировании покрытия из тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов........................................................................54 3.3 Роль трансглутаминаз в формировании прокоагулянтной активности активированных тромбоцитов ................................................................................................57 3.3.1 Разработка методов количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов .........................................................................................................................57 3.3.2 Зависимость прокоагулянтной активности тромбоцитов от степени активации .69 2 3.3.3 Влияние тканевой трансглутаминазы на регуляцию прокоагулянтной активности тромбоцитов .........................................................................................................................70 Глава 4. Обсуждение ...................................................................................................................73 Выводы .........................................................................................................................................80 Благодарности ..............................................................................................................................81 Список литературы ......................................................................................................................82 Список сокращений и обозначений ...........................................................................................88 3 Введение Свертывание крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, активирующихся при нарушении целостности сосудистой системы. Целью работы системы свертывания является управляемый локальный переход плазмы из жидкого состояния в желеобразное и, как результат, остановка кровотечения. Любые нарушения в тонком балансе этой системы ведут к тяжелым последствиям, связанных с тромбозами или с кровоточивостью. Неотъемлемыми Тромбоциты – участниками специализированные свертывания клетки, крови способные являются к тромбоциты. активации. Будучи активированными, они принимают участие в процессе свёртывания посредством формирования тромбоцитарного агрегата в месте повреждения кровеносного сосуда, а также в ускорении плазменного свертывания, путем предоставления своей отрицательно заряженной фосфолипидной поверхности для сборки ферментативных комплексов. Поэтому очень важно понимать механизмы регуляции прокоагулянтной и агрегаторной активности тромбоцитов. Не так давно было обнаружено, что при активации тромбоцитов двумя физиологическими агонистами (тромбином и коллагеном), образуются две отличные группы тромбоцитов, одна из которых характеризуется появлением на внешней мембране фосфатидилсерина и плотного слоя из α-гранулярных белков [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005]. Рядом ученых было показано, что основные реакции свертывания крови, такие как сборка комплекса протромбиназы и внутренней теназы, происходят на поверхности именно этой субпопуляции тромбоцитов, то есть они более прокоагулянтны. Эти тромбоциты получили название – прокоагулянтные тромбоциты, хотя в литературе можно встретить и другие названия. Дальнейшие исследования прокоагулянтных тромбоцитов показали, что, помимо белков α-гранул, они удерживают на своей поверхности белки свертывания крови: факторы VIII, VIIIа (здесь и далее буква “а” после номера фактора означает его активную форму), IX, IXа [Kempton C.L., Hoffman M. et al. 2005; Panteleev M.A. et al. 2005; London F.S., Marcinkiewicz M et al. 2004]. Этот факт также свидетельствует в пользу того, что основные реакции свертывания крови происходят на поверхности этой субпопуляции тромбоцитов. Кроме того, еще одной важной функцией тромбоцитов, как говорилось выше, является формирование тромбоцитарной пробки. Традиционно считалось, что прокоагулянтные тромбоциты не способны агрегировать изза отсутствия у них активированного GPIIbIIIa [Dale G.L. et al. 2002; Kulkarni S., Jackson S.P. 2004; Bachelot-Loza C. et al. 2006; Cosemans J.M. et al. 2008; Heemskerk J.W. et al. 2012]. Однако в недавней работе Якименко А. О. и коллеги показали, что прокоагулянтные тромбоциты вовлекаются в агрегаты за счет связывания 4 активированными рецепторами GPIIbIIIa на непрокоагулянтных тромбоцитах свободных концов молекул фибриногена на прокоагулянтных тромбоцитах в составе их белкового покрытия [Yakimenko A.O. et al]. Таким образом, еще одной важной функцией белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов является вовлечение их в тромбоцитарную пробку. Механизм формирования таких тромбоцитов, как и их способность удерживать на своей поверхности покрытие из белков, на данный момент плохо изучен. Однако было установлено, что трансглутаминазные белки, входящие в число белков, секретируемых тромбоцитами, играют важную роль в формировании прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Так, Дж. Л. Дейл с коллегами продемонстрировали в своей работе, что α-гранулярные белки являются субстратами для тромбоцитарных трансглутаминаз (тканевая трансглутаминаза и фактор XIIIa). Они показали, что использование ингибиторов трансглутаминаз приводит к блокированию образования прокоагулянтных тромбоцитов, что свидетельствует о возможной роли фактора XIIIa и тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Кроме того, Роберт Сзасз с Джорджем Дейлом в 2002 году в своей работе [Szasz R. & Dale G.L. 2002] показали возможный механизм связывания α-гранулярных белков с поверхностью тромбоцитов. В этой модели при активации тромбоцитов трансглутаминазную белки реакцию. α-гранул Затем конъюгируют серотонин-белковые с серотонином продукты через соединения связываются на поверхности клетки с еще не идентифицированным серотониновым рецептором. Кроме того, существует основание полагать, что белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов возникает за счет полимеризации фибрина под действием тромбина и пассивного вовлечения остальных белков в нити фибрина [Munnix I.C. et al. 2009]. Таким образом, встает задача исследовать влияние трансглутаминаз и полимеризации фибрина на формирование фибринового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, ответственной за их вовлечение в агрегаты. А также исследовать вопрос о влиянии трансглутаминаз на регуляцию прокоагулянтной активности тромбоцитов, а также их влияние на формирование прокоагулянтных тромбоцитов. Методы, с помощью которых ранее измеряли прокоагулянтную активность тромбоцитов, не учитывали того, что они делятся на субпопуляции [Kempton C.L., Hoffman M. et al. 2005; London F.S., Marcinkiewicz M et al. 2004]. Поэтому результаты, полученные с помощью этих методов, являются некорректными. Исходя из этого, еще 5 одной задачей данной работы была разработка метода, позволяющего количественно определить прокоагулянтную активность тромбоцитов. С помощью метода стало бы возможным исследование влияния трансглутаминаз на прокоагулянтную активность тромбоцитов. Целью данной работы являлось исследование механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Были поставлены следующие задачи исследования: 1. Исследовать роль трансглутаминаз, а также полимеризации фибрина в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, ответственной за их вовлечение в агрегаты; 2. Разработать метод, позволяющий количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов; 3. Исследовать роль тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов. Научная новизна. В настоящей работе был выявлен механизм формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Показано, что определяющую роль в формировании этого покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, играет полимеризация фибрина. Тканевая трансглутаминаза способна формировать покрытие из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако значимость этого механизма при активации тромбоцитов тромбином меньше, чем роль полимеризации. Также было разработано два метода количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов. Их суть заключалась в сборке ферментативных комплексов на поверхности активированных тромбоцитов: внутренней теназы или протромбиназы и измерении концентраций факторов Xa или IIa, соответственно, активированных этими комплексами из предшественников. С помощью метода, основанного на сборке комплекса внутренней теназы, было показано, что добавление тканевой трансглутаминазы при активации или после нее не меняет прокоагулянтную активность тромбоцитов. При этом количество прокоагулянтных тромбоцитов при добавлении тканевой трансглутаминазы во время их активации остается неизменным. Научно-практическим значением результатов данной работы является вклад в понимание свойств субпопуляций активированных тромбоцитов и их (пато)физиологической роли. Результаты данной работы могут быть использованы для создания новых методов антитромботической терапии, в диагностике тромбоцитопатий, а также иных нарушений гемостаза. 6 Положения, выносимые на защиту: 1. Полимеризация фибрина играет определяющую роль в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. 2. Трансглутаминазы способны формировать белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако значимость этого механизма при активации тромбоцитов тромбином меньше, чем роль полимеризации. 3. Разработано два метода, позволяющих количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов, основанных на сборке ферментативных комплексов протромбиназы и внутренней теназы на поверхности активированных тромбоцитов. 4. Тканевая трансглутаминаза не влияет на прокоагулянтную активность тромбоцитов, а также не влияет на количество прокоагулянтных тромбоцитов. 7 Глава 1. Обзор литературы 1.1 Гемостаз Система гемостаза – это совокупность компонентов кровеносных сосудов, крови и их взаимодействий, которая обеспечивает поддержание целостности кровеносных сосудов, жидкое состояние крови внутри сосудов и остановку кровотечения при повреждении сосуда. В остановке кровотечения участвуют сосудистое, тромбоцитарное и плазменное звенья гемостаза. Незамедлительной реакцией на травму является вазоконстрикция – сокращение гладких мышц эндотелия сосудов под действием веществ, секретируемых активированными тромбоцитами. Она приводит к сужению просвета кровеносного русла и уменьшению кровотока, что улучшает взаимодействие между тромбоцитами, факторами свертывания крови и поврежденным участком. В случае небольшой травмы вазоконстрикция может остановить кровотечение, но при обширном кровотечении она только снижает кровопотерю [Шиффман Ф.Дж. 2000]. При повреждении сосудистой стенки, покрытой эндотелием, в кровь начинают выбрасываться вещества, вызывающие активацию тромбоцитов. Будучи активированными они приклеиваются к повреждённым тканям и друг к другу, формируя агрегаты. В результате на месте повреждения образуется сравнительно рыхлая тромбоцитарная пробка, предотвращающая потерю клеток крови, но не плазмы [Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. 2008]. После образования тромбоцитарного сгустка степень сужения кровеносных сосудов уменьшается, что могло бы привести к вымыванию сгустка и возобновлению кровотечения. Однако к этому времени значительный вклад в образование сгустка начинает вносить плазменное свертывание, в ходе которого образуется фибрин, волокна которого после полимеризации образуют основу сгустка, прочно скрепляя тромбоциты и захваченные эритроциты. Через несколько часов происходит ретракция (сжатие) сгустка. Благодаря ей сгусток становится более плотным и стягивает края раны,что облегчает ее закрытие клетками соединительной ткани. По мере репарации поврежденных тканей происходит лизис сгустка системой фибринолиза, которая запускается одновременно с плазменной системой свертывания [Шмидт Р, Тевс Г.2005] In vivo все элементы системы гемостаза находятся в тесном взаимодействии. Так, тромбоциты могут быть активированы одним из главных белков системы свертывания – тромбином. В свою очередь, после активации они предоставляют фосфолипидную поверхность, необходимую для прохождения реакций системы свертывания (их 8 поверхность становится прокоагулянтной вследствие изменения ее фофсолипидного состава), а также секретируют десятки веществ, воздействующих на все звенья гемостаза, в том числе факторы свертывания V и XI, фактор Виллебрандта, фибриноген и ряд ингибиторов свертывания. В литературе чаще всего механизмы гемостаза группируют в две категории: первичный – сосудисто-тромбоцитарный, вторичный – плазменный гемостаз. Эти названия отражают существующие наблюдения: первичный гемостаз реагирует на повреждение наиболее быстро (1 – 3 мин), а вторичный делает сгусток прочным и предотвращает возникновение кровотечения (характерное время около 10 мин) [Шмидт Р, Тевс Г. 2005]. В зависимости от условий, каждый из механизмов может работать независимо от остальных. Вазоконстрикция может сама по себе обеспечить остановку кровотечения в маленьком сосуде [Шмидт Р, Тевс Г. 2005], но более крупные сосуды заметным образом не пережимаются. Тромбоцитарное свертывание лучше всего проходит в сосудах с быстрым течением, которое способно обеспечить эффективный принос тромбоцитов к месту повреждения и их адгезию; только потом этот агрегат “прорастает” фибриновой сеткой [Falati S et al. 2002]. Наоборот, для плазменной системы свертывания поток, вымывающий активные ферменты, является только помехой [Beltrami E, Jesty J. 2001]. Она лучше функционирует при медленном потоке, т.к. поток уносит активные ферменты и мешает ее работе. 1.2 Тромбоциты Как уже говорилось, одними из главных участников свертывания крови являются тромбоциты. Остановимся подробнее на их рассмотрении. Тромбоциты представляют собой безъядерные клетки крови, присутствующие в ней в концентрации 150-300 тыс/мкл и являющиеся первой защитой организма при повреждении сосуда. Диаметр этих клеток (в направлении наибольшей длины) 1-4 мкм, а толщина 0,5-0,75 мкм. Тромбоциты образуются в костном мозгу путём отщепления участков цитоплазмы от гигантских клеток - мегакариоцитов, из каждой такой клетки может возникнуть до 1000 тромбоцитов. Тромбоциты циркулируют в крови в течение 5-11 дней и затем разрушаются в печени, лёгких и селезёнке. [Шмидт Р, Тевс Г. 2005] Особенностью тромбоцитов является его способность к активации - быстрому и, как правило, необратимому переходу в новое состояние. Стимулом активации может служить практически любое возмущение окружающей среды, вплоть до простого 9 механического напряжения. Однако основными физиологическими активаторами тромбоцитов считаются: коллаген [Clemetson K.J., Clemetson J.M. 2007] - фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма и обеспечивающий ее прочность и эластичность. Все кровеносные сосуды выстланы изнутри слоем эндотелия, при повреждении кровеносного сосуда волокна коллагена обнажаются и активируют циркулирующие в крови тромбоциты; тромбин [Clemetson K.J., Clemetson J.M. 2007, Heemskerk J.W. et al. 2002, Goldsack N.R. 1988]- глобулярный белок, играет ключевую роль в каскаде свертывания крови, переводя растворимый фибриноген в нерастворимый фибрин, который полимеризуясь, формирует сгусток. Кроме того, тромбин способен активировать тромбоциты; адф (аденозиндифосфат) [Clemetson K.J., Clemetson J.M. 2007, Gachet C. 2001, Reed G.L. 2007]- появляется из разрушенных клеток сосуда или секретируется самими тромбоцитами. Он также может получаться из АТФ под действием нуклеотидаз, присутствующих в плазме и на мембранах клеток крови; тромбоксан А2 [Clemetson K.J., Clemetson J.M. 2007, Reed G.L. 2007]- вторичный активатор, синтезируемый и выбрасываемый тромбоцитами, его дополнительная функция заключается в стимуляции вазоконстрикции. Связываясь с соответствующими рецепторами на мембране тромбоцита, эти вещества способны переводить его в активированное состояние. Ниже перечислены основные виды ответов тромбоцита при его активации [Шмидт Р, Тевс Г. 2005]. Изменение формы. За счет реорганизации актинового цитоскелета дисковидные тромбоциты становятся шарообразными и начинают формировать псевдоподии при их активации в суспензии или распластываются по поверхности при адгезии [Hartwig J.H. 1992; Fox J.E. 2001]. Адгезия. Активированные тромбоциты приобретают способность прикрепляться к коллагену, а также к поверхностям, покрытым различными белками, в частности, фибриногену, за счет соответствующих рецепторов. Однако способностью к адгезии обладают и неактивированные тромбоциты. Их первичное прикрепление к месту повреждения при высоких скоростях потока происходит за счет связывания тромбоцитарных гликопротеинов (GP) Ib-V-IX с фактором Виллебранда, адсорбирующимся из плазмы крови на коллагеновых 10 волокнах. Последующее упрочнение связывания тромбоцитов с местом повреждения происходит последовательно посредством сигнализации через GPVI, связавшегося с коллагеном, активацию другого коллагенового рецептора интегрина α2β1 и активацию GPIIbIIIa, важнейшего рецептора, ответственного за контакты клеток друг с другом и с эндотелием сосудов [Auger J.M. et al. 2005; Nuyttens B.P. et al. 2011]. Агрегация. Активированные тромбоциты приобретают способность скрепляться друг с другом, благодаря чему место повреждения закрывается тромбоцитарным тромбом. Главный механизм агрегации тромбоцитов связан с активацией трансмембранного белка интегрина αIIbβ3 (GPIIbIIIa), который приобретает способность связывать свои лиганды – фибриноген, фактор Виллебранда, тромбоспондин и другие [Plow E.F. et al. 2007]. Секреция. В тромбоцитах имеются гранулы, содержащие различные вещества, которые при активации тромбоцитов выплескиваются во внеклеточное пространство. В плотных гранулах содержатся нуклеотиды (АТФ, АДФ, ГТФ, ГДФ) и ионы кальция в высокой концентрации. Альфа-гранулы содержат такие высокомолекулярные вещества, как Р-селектин, фактор Виллебранда, фибронектин, фибриноген, тромбоспондин, а также некоторые хемокины и факторы свертывания крови. Кроме того, при активации тромбоцита активируется ферментативная система, катализирующая синтез тромбоксана А2 из арахидоновой кислоты, который тоже затем секретируется из клетки [Flaumenhaft R. 2003; Reed G.L. 2007]. Формирование прокоагулянтной поверхности и везикуляция. В нормальном состоянии мембрана тромбоцитов не поддерживает реакций свертывания. В неактивированном тромбоците две стороны мембраны имеют различный фосфолипидный состав: на внешней стороне мембраны преимущественно находятся фосфатидилхолин и сфингомиелин, на внутреннем слое мембраны сосредоточены отрицательно заряженные фосфолипиды – фосфатидилсерин и фосфотидилэтаноламин. Это равновесие поддерживается работой 3-х ферментов: АТФ-зависимая аминофосфолипидная транслоказа, АТФ-зависимая флопаза, кальций-зависимая скрамблаза. АТФ-зависимая аминофосфолипидная транслоказа быстро транспортирует фосфатидилсерин и фосфотидилэтаноламин с внешнего на внутренний слой против градиента концентрации. АТФ-зависимая флопаза медленно переносит с внутреннего слоя мембраны на внешний слой фосфолипиды. Скрамблаза кальций-зависимо приводит к фосфолипидному 11 выравниванию асимметричности мембраны клетки при ее активации. Таким образом, на отрицательно внешнем слое заряженного мембраны появляется фосфатидилсерина, большое который количество необходим для связывания факторов свертывания [Zwaal R.F, Schroit A.J. 1997]. Поверхность тромбоцита становится прокоагулянтной (поддерживающей реакции свертывания), на ней формируются комплексы внутренней теназы [van Dieijen G. et al. 1981] и протромбиназы [Rosing J. et al. 1980], ускоряющие работу плазменного гемостаза на несколько порядков [Zwaal R.F. et al. 1998]. При активации от поверхности тромбоцитов также отшнуровываются микровезикулы или микрочастицы, фрагменты плазматической мембраны размером до 1 мкм, поверхность которых также является прокоагулянтной [Nieuwland R., Sturk A. 2007]. Физиологическая роль везикуляции на данный момент не ясна [Siljander P.R. 2011]. Стоит сразу отметить, что различная активация ведет к разным комбинациям описанных выше тромбоцитарных ответов [Heemskerk J.W. et al. 2002]. 1.3 Субпопуляции активированных тромбоцитов В течение многих лет исследователи предполагали, что свойства тромбоцитов при активации одинаковы, точнее, что различия между отдельными клетками не превышают обычных статистических разбросов. Только в конце 90-х годов начали появляться работы, свидетельствующие о появлении различия внутри популяций активированных тромбоцитов. [Feng P, Tracy P.B. 1998, Pasquet J.M. et al. 1998, Heemskerk J.W. et al. 1997, Patel D. et al. 2003] Однако официальной точкой открытия нового подкласса тромбоцитов (“укутанные” тромбоциты) можно считать работу Альберто Л. и его команды в 2000 году [Alberio L. et al. 2000]. Они обнаружили, что при активации тромбоцитов тромбином с коллагеном выделяется субпопуляция клеток, экспрессирующих на свою поверхность большое количество α-гранулярного фактора V. Такие тромбоциты были названы “COATFV” (коллаген и тромбин активированные тромбоциты с фактором V). Дальнейшие исследования показали, что эти тромбоциты экспрессируют на свою поверхность большое количество фосфотидилсерина. Кроме того, Альберто Л. с соавторами показали, что они способны связывать фактор Xа, т.е. эта субпопуляция клеток прокоагулянтна [Alberio L. et al. 2000]. В 2002 году Д.Дейл и коллеги показали, что COAT-FV тромбоциты не только экспрессируют на свою поверхность фактор V и фосфотидилсерин, но и удерживают на своей поверхности большое количество других α-гранулярных белков. В результате чего 12 им дали другое название «COAT» тромбоциты (т.е. тромбоциты, активированные коллагеном и тромбином), кроме того, это название отражает тот факт, что тромбоциты как бы “укутаны” в шубку из белков [Dale G.L. et al. 2002]. Однако одного четкого определения “укутанных” тромбоцитов не существует. Это связано с тем, что при активации тромбоцитов различными агонистами отделяющаяся субпопуляция не всегда имеет фиксированный набор свойств, отличающих ее от остальных тромбоцитов. Чаще всего “укутанными” тромбоцитами называют субпопуляцию клеток с большим количеством α-гранулярных белков и фосфатидилсерина на поверхности, появляющуюся при сильной активации тромбоцитов (тромбином, конвульксином, тромбином с конвульксином). В литературе можно встретить и другие названия “укутанных” тромбоцитов – некротические тромбоциты [Jackson S.P., Schoenwaelder S.M. 2010], SCIPтромбоциты (тромбоциты, индуцированные повышенной концентрацией внутриклеточного кальция) [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004], прокоагулянтные тромбоциты [Heemskerk, J. W. 2012]. В данной работе мы будем называть их прокоагулянтными тромбоцитами. Механизмы внутриклеточной сигнализации, приводящие к разделению тромбоцитов на две субпопуляции, плохо изучены. Предположение, что тромбоциты до активации принадлежат к той или иной субпопуляции, не находит подтверждения, так как количество образующихся прокоагулянтных тромбоцитов можно менять, варьируя активаторы и их концентрацию [Kempton C.L. et al. 2005]. Было показано, что в формировании прокоагулянтных тромбоцитов играет роль гамма-цепь Fc-рецептора (FcRγ), сопряженная с гликопротеином VI [Jobe S.M. et al. 2005]. Также митохондриальная пора (MPTP), по-видимому, является важным участником в формировании прокоагулянтных тромбоцитов, так как эффекторы образования MPTP регулируют появление прокоагулянтных тромбоцитов [Jobe S.M. et al. 2008]. Последнее обстоятельство и экспрессия прокоагулянтными тромбоцитами фосфатидилсерина привели к активному обсуждению в литературе возможной связи формирования прокоагулянтных тромбоцитов с процессами клеточной гибели, апоптозом и некрозом [Jackson S.P., Schoenwaelder S.M. 2010]. Было также показано, что прокоагулянтные тромбоциты характеризуются повышением концентрации внутриклеточного кальция [Topalov N.N. et al. 2012]. Дальнейшие исследования показали, что активация тромбоцитов тромбином в сочетании с конвульксином приводила к образованию субпопуляции тромбоцитов с высоким уровнем связывания на поверхности не только α -гранулярных белков, но также факторов VIII, IX, X [Kempton C.L. et al. 2005]. Кроме того, было показано, что доля 13 данной группы тромбоцитов дозо-зависимо увеличивается от повышения концентрации конвульксина при двойной активации тромбином с конвульксином. Также обнаружили, что процент тромбоцитов, которые выставляли фосфатидилсерин, измеренный связыванием аннексина V, коррелировал с процентным содержанием тромбоцитов с увеличенным связыванием коагуляционных факторов. Более того было показано, что эта субпопуляция тромбоцитов появляется как раз в тот момент, когда генерация тромбина и фактора Xa комплексами протромбиназы и внутренней теназы, соответственно, достигает своего максимума [Kempton C.L. et al. 2005]. Пантелеев М.А. с коллегами в своей работе показал, что при активации тромбоцитов тромбином образуются две субпопуляции и их отношение зависит от концентрации тромбина. Они также продемонстрировали, что одна из этих субпопуляций имеет высоко связующую способность для коагуляционных факторов (фактор IXa, фактор VIII и фактор X) и что эта та же самая субпопуляция, которая имеет высокий уровень фосфатидилсерина на своей поверхности. [Panteleev M.A. et al. 2005] Также было обнаружено, что при активации тромбоцитов тромбином или PAR1активирующем пептидом (SFLLRN) образуется субпопуляция тромбоцитов с высоким уровнем фосфатидилсерина, которая еще была способна связывать фактор IXa. Кроме того, с увеличением концентрации активатора процент этой субпопуляции доза-зависимо увеличивался. Более того было показано, что увеличение концентрации активатора также ведет к увеличению концентрации фактора Xa, активированного комплексом внутренней теназы [London F. S. et al. 2004] Таким образом можно заключить, что прокоагулянтные тромбоциты способны удерживать на своей поверхности не только белки α-гранул, но и белки свертывания крови: факторы VIII, VIIIа, IX, IX [Kempton C.L. et al. 2005; Panteleev M.A. et al. 2005; London F. S. et al. 2004]. Кроме того, рядом ученых было показано, что именно на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов происходят основные реакции плазменного звена системы свертывания крови [London F. S. et al. 2004; Kempton C.L. et al. 2005]. Одна из этих реакций состоит в активации фактора X, присутствующего в крови в виде неактивного предшественника. Эта реакция катализируется связанными с мембраной прокоагулянтного тромбоцита факторами VIIIa и IXa. Другая реакция катализирует превращение протромбина в тромбин, она ускоряется благодаря формированию комплекса факторами Va и Xa и также происходит на поверхности прокоагулянтного тромбоцита (Подробнее эти реакции будут рассмотрены в п. 1.4). Описанные реакции являются важнейшими элементами каскада свертывания крови, играя значительную роль в регуляции свертывания, что может указывать на 14 физиологическую важность прокоагулянтных тромбоцитов. Также существуют данные, согласно которым, прокоагулянтные и непрокоагулянтные тромбоциты в процессе роста тромба располагаются в разных его частях [Munnix I.C. et al. 2007]. Еще одной важной проблемой в исследовании прокоагулянтных тромбоцитов, является их способность к агрегации. Традиционно считалось, что они не способны агрегировать из-за отсутствия у них активированного GPIIbIIIa [Dale G.L. et al. 2002; Mattheij N.J. et al. 2013]. Так в 2004 году Кулкарни и Джексон показали, что образование прокоагулянтных тромбоцитов в монослое, сформированном на поверхности, ухудшает адгезию к ним прокачиваемых неактивированных тромбоцитов. Также с помощью конфокального микроскопа они исследовали рост тромба при прокачивании цельной крови с добавленным антикоагулянтом через микрокапилляры с покрытыми коллагеном стенками. Ингибирование образования прокоагулянтных тромбоцитов приводило к существенному увеличению скорости и степени роста тромба [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004]. В работе Мюнникса с коллегами методами флуоресцентной микроскопии изучалось формирование тромба в потоке на поверхности, покрытой коллагеном. Было показано, что разные кластеры тромбоцитов в тромбе ответственны за образование агрегатов и прокоагулянтную активность [Munnix I.C.A. et al. 2007]. Таким образом, в целом ряде работ можно найти те или иные свидетельства о неспособности прокоагулянтных тромбоцитов к агрегации из-за отсутствия у них активированного GPIIbIIIa [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004; Munnix I.C. et al. 2007; Dale G.L. 2002]. Однако в недавней работе Якименко и коллеги показали возможный механизм вовлечения прокоагулянтных прокоагулянтные тромбоциты тромбоцитов вовлекаются в в агрегаты. агрегаты Было за показано, счет что связывания активированными рецепторами GPIIbIIIa на непрокоагулянтных тромбоцитах свободных концов молекул фибриногена прокоагулянтных тромбоцитов в составе их белкового покрытия [Yakimenko, A. O. et al. 2012] (рис.1). 15 Рисунок 1. Способность тромбоцитов из двух различных субпопуляций связываться друг с другом. (А и В) неправильной формы - непрокоагулянтные тромбоциты, (B-C) круглой формы-прокоагулянтные. Цветные молекулы на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов - рецепторы и их лиганды. (А) Взаимодействие между непрокоагулянтными тромбоцитами происходит посредством связывания фибриногена с рецепторами GPIIbIIIa (черный). (Б) Взаимодействие между прокоагулянтными и непрокоагулянтными тромбоцитами происходит, когда рецептор GPIIbIIIa на непрокоагулянтном тромбоците связывает свободный конец молекулы фибриногена, удерживающийся на поверхности прокоагулянтного тромбоцита. (C) Взаимодействие между прокоагулянтными тромбоцитами невозможно, т.к. на их поверхности нет активных или свободных рецепторов GPIIbIIIa, способных связывать фибриноген, удерживающийся на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Кривая между тромбоцитами символизирует невозможность формирования ими агрегата посредством взаимодействия друг с другом [Yakimenko, A. O. et al. 2012]. Таким образом, еще одной важной функцией белкового покрытия прокоагулянтных тромбоцитов, по всей видимости, является вовлечение их в тромбоцитарную пробку. Однако, механизм формирования и удерживания покрытия из белков на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, как и ее функция, до сих пор слабо изучены. В последних исследованиях было показано, что прокоагулянтные тромбоциты могут быть связанными с различными заболеваниями. Было показано, что у пациентов, проходящих гемодиализ, увеличивается уровень прокоагулянтных тромбоцитов, которые могут вовлекаться в повышение тромбоза и сосудистого риска в конечной стадии заболевания почек [Valaydon Z.S., et al. 2009]. Было обнаружено, что при самопроизвольном внутричерепном кровотечении уровень прокоагулянтных тромбоцитов значительно снижен. Есть предположение, что сниженное образование прокоагулянтных тромбоцитов может вовлекаться в случаи, приводящие к самопроизвольному внутричерепному кровотечению [Prodan C.I. et al. 2009]. Д.Дейл с коллегами в своей работе показали, что использование конкурирующего амино-донора для трансглутаминаз - дансилкадаверина, а также анти-фактор XIIIa антител 9C11 и R2 приводит к блокированию образования белкового покрытия у прокоагулянтных тромбоцитов, что свидетельствует о возможной роли трансглутаминаз (фактора XIIIa и тканевой трансглутаминазы) в формировании прокоагулянтных тромбоцитов, а также их покрытия из белков (рис. 2 а-в). Также были проведены эксперименты с добавлением антител к тканевой трансглутаминазе и фактора XIIIa, и они показали присутствие обеих трансглутаминаз на поверхности прокоагулянтных 16 тромбоцитов (рис. 2 г-е). Кроме того, эксперименты показали, что α-гранулярные белки являются субстратами для трансглутаминаз тромбоцитов. [Dale G.L. et al. 2002] (В п. 1.6 будет подробно описан этот класс белков.) Рисунок 2. Дансилкадаверин и антитела к фактору XIII ингибируют производство прокоагулянтных тромбоцитов. Тромбоциты были активированы тромбином с конвульксином в присутствии различных ингибиторов, а затем покрашены на α-гранулярные белки. а) Дансилкадаверин (мкМ) – конкурирующий аминодонор для трансглутаминаз – ингибирует появление ФV, фибриногена, α2-антиплазмина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. б,в) Эффект антител 9C11 и R2 соответственно, на образование прокоагулянтных тромбоцитов, измерен по количеству фактора V. г-е) Производилось окрашивание тромбоцитов, активированных тромбином + конвульксином с добавлением изотипного контрольного антитела (г), антитела к ТТГ (д), антитела к фактору XIIIa (е); ординаты представляют связывание фактора V [Dale G.L. et al. 2002]. Р. Сзасз с Д. Дейлом в 2002 году в своей работе показали возможный модельный механизм связывания α-гранулярных белков с поверхностью тромбоцитов (рис. 3). В этой модели при активации тромбоцитов происходит дегрануляция, α-гранулярные белки присоединяются к своим традиционным рецепторам на поверхности тромбоцитов, далее они ковалентно связываются с серотонином посредством трансглутаминазной реакции. Таким образом, поверхность прокоагулянтного тромбоцита в этой модели представляет сеть связанных друг с другом α-гранулярных белков. Стабилизация этой сети, как предполагается, осуществляется трансглутаминазами. [Szasz R. & Dale G.L. 2002] 17 Рисунок 3. Модель поверхности прокоагулянтного тромбоцита. Прокоагулянтные белки связываются с их традиционным рецепторам (фактор V к фосфатидилсерину, фибриноген к гликопротеину IIb/IIIa). Также α-гранулярные белки на прокоагулянтных тромбоцитах ковалентно связываются с серотонином через трансглутаминазную реакцию. α-гранулярные белки имеют сайты связывания, которые распознают конъюгированный серотонин, через который происходит взаимодействие между белками, приводящее к формированию сети из α-гранулярных белков на поверхности прокоагулянтного тромбоцита [Szasz R. & Dale G.L. 2002]. Кокс А. и Девине Д. [Cox A., D Devine. 1994] показали, что GPIIb/IIIa на поверхности интактных клеток действует как сайт связывания фактора XIIIa. Проведя иммуннопреципитирующие эксперименты, а, затем, проведя электрофоретический анализ, обнаружили полосу перекрестно сшитого комплекса GPIIb/IIIa, фибриногена и фактора XIIIa, так как эти белки способны действовать как донорная или акцепторная молекулы в реакции переамидирования опосредованной фактором XIIIa. Возможно, что фактор XIIIa мог перекрестно сшиваться сам с тромбоцитарными субстратами. Это говорит о том, что фактор XIIIa связывается через GPIIb/IIIa, который может быть субстратом для данной трансглутаминазы и еще может быть полимеризован с фибриногеном или другими белками α -гранул, что и ведет к образованию прокоагулянтных тромбоцитов. С. Кулкарни с коллегами [Kulkarni S. et al. 2004] показали в своей работе, что фактор XIIIa и калпаин, действуя через GPIIb/IIIa, регулируют переход тромбоцитов из проадгезивного в прокоагулянтный тип. Однако, Джоб С.М. с коллегами в своей работе [Jobe S.M. et al. 2005] показал, что мыши, дефицитные по фактору XIIIa, имели сходные геморрагические диатезы, что и у людей с дефицитом фактора XIIIa. Было также показано, что отсутствие фактора XIIIa не влияло на образование прокоагулянтных тромбоцитов. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фактор XIIIa не является необходимым для образования прокоагулянтных тромбоцитов и предполагает, что другая клеточная трансглутаминаз, а именно тканевая трансглутаминаза, может компенсировать отсутствие фактора XIIIa. 18 Важно отметить, что активация тромбоцитов одним конвульксином или агонистом PAR-1 рецептора SFLLRN, а также кальциевым ионофором A23187 без тромбина, ведет к формированию субпопуляции тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, но без α-гранулярных белков на поверхности [Dale G.L. 2005; Jobe S.M. et al. 2005; Jobe S.M. et al. 2008; Topalov N.N. et al. 2012]. Это дает основания полагать, что белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов возникает за счет перехода фибриногена в фибрин, полимеризации фибрина под действием тромбина и пассивного вовлечения остальных белков в нити фибрина [Munnix I.C. et al. 2009]. Приведенные выше данные свидетельствую в пользу того, что трансгутаминазы влияют на образование белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Однако, это вероятно не единственный механизм. Кроме того, как было показано, что ключевые реакции свертывания крови протекают именно на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Также, по всей видимости, прокоагулянтные тромбоциты вовлекаются в агрегаты посредством покрытия из фибриногена на своей поверхности. Поэтому встают вопросы о влиянии трансгултаминазы на формирование прокоагулянтных тромбоцитов и регуляцию их прокоагулянтной активности, о влиянии трансглутаминаз и полимеризации фибрина на формирование фибринового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, ответственной за их вовлечение в агрегаты. 1.4 Мембранные реакции Каскад реакций свертывания состоит из сериновых протеаз, которые могут активировать друг друга путем специфического расщепления в определенных местах. Основные реакции этой системы представлены на рис. 4. 19 Рисунок 4. Основные реакции плазменной системы свертывания крови [Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. 2008]. Главный "вход" в каскаде свертывания находится на уровне фактора X. Система реакций, отвечающих за срабатывание свертывания крови, называется внешним путем свертывания, или путем тканевого фактора [Lawson J.H. et al. 1994]. Основными компонентами пути тканевого фактора являются два белка — фактор VIIa и тканевый фактор. Фактор VIIa — сериновая протеиназа, близкая по своему строению к фактору Xa. Ее основная функция заключается в активации фактора X. Однако фактор VIIa сам по себе практически не обладает ферментативной активностью. Чтобы обрести полную ферментативную активность, фактору VIIa необходим кофактор — тканевый фактор [Nemerson Y., Gentry R. 1986]. Этот трансмембранный белок присутствует в мембранах почти всех клеток организма, за исключением эндотелия сосудов и клеток крови. Связывание фактора VIIa с тканевым фактором приводит к изменению конформации фактора VIIa, и фактор VIIa приобретает способность расщеплять и активировать фактор X. Комплекс фактора VIIa и тканевого фактора называется комплексом "внешней теназы". Кроме тканевого фактора, кофактором фактора VIIa может быть отрицательно заряженная фосфолипидная поверхность. В ее присутствии фактор VIIa может активировать фактор X, хотя и очень медленно. В организме такой поверхностью могут быть мембраны активированных тромбоцитов. Фактор Xa сам по себе активирует протромбин очень плохо. Для того чтобы эта реакция шла с высокой скоростью, ему 20 необходимы кофакторы — фактор Va и отрицательно заряженная фосфолипидная поверхность [Rosing J, Tans G 1980]. В организме эта поверхность предоставляется активированными тромбоцитами, микрочастицами и липопротеинами плазмы [Heemskerk J.W. 2002; Bajaj S.P. et al. 1976; Sims P.J.et al.1989; Sinauridze E.I. et al. 2007]. При активации системы свертывания происходит активация тромбоцитов, и в результате тромбоциты экспрессируют на внешнем слое своей мембраны отрицательно заряженный фосфолипид — фосфатидилсерин и специальные белки, улучшающие связывание факторов свертывания [Rosing J, Tans G 1980]. Факторы Xa и Va связываются с отрицательно заряженной мембраной тромбоцитов по средствам кальциевых мостиков, формируя ферментативный комплекс — "протромбиназу", этот комплекс активирует протромбин в тромбин в 105 раз быстрее, чем фактор Xa один (рис. 5А) [Rosing J, Tans G 1980]. Рисунок 5. Схематический вид комплекса внутренней теназы и протромбиназы. (А) В образовании протромбиназы участвует кофактор V, который активируется тромбином до фактора Vа. Протеолитической компонентой протромбиназы является фактор Xа. Они прикрепляются к отрицательно заряженной поверхности фосфолипидной мембраны активированных тромбоцитов по средствам кальциевых мостиков. Далее происходит активация протромбина в тромбин. (Б) В образовании комплекса внутренней теназы участвует кофактор VIII, который активируется тромбином до фактора VIIIа. Протеолитической компонентой внутренней теназы является фактор IXа. Они прикрепляются к отрицательно заряженной поверхности фосфолипидной мембраны активированных тромбоцитов по средствам кальциевых мостиков. Далее происходит активация фактора X. Фактор Va представляет собой белок-кофактор, получающийся из фактора V путем частичного расщепления под действием тромбина [Monkovic D.D., Tracy P.B. 1990]. Вторая важная реакция, происходящая на поверхности активированных тромбоцитов связана с активацией фактора X. Помимо того, что этот фактор активируется комплексом внешней теназы, он активируется фактором IXa, однако это происходит крайне медленно. При сборке комплекса IXa и VIIIa на поверхности активированных тромбоцитов скорость реакции возрастает в более 10 7 раз (рис 5Б) [Panteleev M.A. et al. 2006; Ahmad S.S. et al. 2002; London F.S., Walsh P.N. 2000]. Этот комплекс во многом аналогичен комплексу протромбиназы (рис. 4) [van Dieijen G. 1981]. 21 Как и внешняя теназа, этот комплекс активирует фактор X и называется "внутренней теназой". Фактор VIII, как и фактор V является кофактором и активируется тромбином. Итак, мы видим, что количественно оценить прокоагулянтную активность тромбоцитов в зависимости от условий напрямую можно двумя способами — собрать на их поверхности комплекс протромбиназы или комплекс внутренней теназы и измерить количество тромбина или фактора Xa, соответственно, полученных из предшественников. Ранее учеными уже использовался подобный подход для изучения прокоаглулянтной активности тромбоцитов при разных условиях активации, так в статье Лондона Ф.С. и др. с помощью метода, основанного на сборке комплекса внутренней теназы, исследовалась прокоагулянтная активность тромбоцитов, стимулированных в разных концентрациях либо тромбином, либо SFLLRN [London F.S. et al. 2004]. Кемптон и коллеги в своей клеточной модельной системе измеряли прокоагулянтную активность тромбоцитов стимулированных тромбином с конвульксином по генерации тромбина и фактора Xa [Kempton C.L. et al. 2005]. Кроме того, подобный метод использовался при сборке комплекса внутренней теназы на поверхности фосфолипидов в статье Пантелеева М.А. и др. [Panteleev M.A. et al. 2005]. Однако не один из этих методов до конца не подходил для данной работы. Так как ни один из них до конца не учитывал, что разные комбинации активаторов приводят к разному количеству прокоагулянтных тромбоцитов и соответственно к разному прокоагулянтному ответу системы. Кроме того, чтобы понимать есть ли эффект трансглутаминаз на прокоагулянтную активность тромбоцитов, мы также должны точно знать, что мы работаем в линейной области данного метода. Таким образом, было решено подобрать свои параметры сборки комплексов на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов и выбрать для них линейную область. 1.5 Влияние температуры на свертывание крови Из литературных данных известно, что скорость биохимических реакций зависит от температуры. Так при повышении температуры на каждые 10°С скорость большинства реакций увеличивается в 2-4 раза [Корниш-Боуден Э. 1979]. Существуют данные, что чрезмерное переохлаждение организма (гипотермия) связано с повышенным риском кровотечений и вследствие этого повышению вероятности смерти от травм и сложных хирургических операций. Было установлено, что при температуре 33°С наблюдается ухудшение способности тромбоцитов к адгезии и агрегации по сравнению с их поведением при 37°С. Также при температурах ниже 33°С 22 было показано снижение активности белков и снижение активации тромбоцитов [Wolberg A.S. et al. 2004]. Для комплексов внешней теназы (комплекс, состоящий из тканевого фактора и фактора VIIa, активирующий ФX) и протромбиназы (комплекс, состоящий из ФXa и ФVa, превращающий протромбин в тромбин) было показано, что при повышении температуры на 10°С их активность возрастает в 2 раза (рис. 6) [Meng Z.H. et al. 2003]. Рисунок 6. Активность комплексов внешней теназы (кривая показана сплошной линией) и протромбиназы (кривая показана пунктирной линией) в зависимости от температуры [Meng Z.H. et al. 2003]. Однако зависимость активности комплекса внутренней теназы от температуры не изучалась. 1.6 Трансглутаминазы 1.6.1 Общие сведения о трансглутаминазах Трансглутаминазы - это широко распространенная группа ферментов, которая катализирует посттрансляционную модификацию белков путём формирования изопептидных связей (рис. 7) [Greenberg C.S. et al. 1991]. 23 Рисунок 7. Реакция, катализируемая трансглутаминазой. Глутамильный остаток в одном пептиде служит как ацильный донор или аминный акцептор и лизиновый остаток в другом пептиде служит ацильным акцептором или аминным донором. Трансглутаминаза (на рисунке TG) катализирует кальцийзависимое ковалентное образование поперечных связей между белками, образуя -(-глутамил)лизиновую изопептидную связь [Wang D.S. et al. 2008]. Трансглутаминазы широко распространены в различных органах, тканях и жидких средах организма. Все формы трансглутаминаз млекопитающих имеют существенную структурную гомологию, являются продуктом различных генов, возникая из дупликаций, перестроек и хромосомных сдвигов [Griffin M. et al 2002; Esposito C., Caputo I. 2004]. На данный момент девять трансглутаминазных генов идентифицированы, восемь из которых кодируют активность ферментов. Только шесть трансглутаминазных ферментов были выделены и охарактеризованы на белковом уровне, таблица 1 [Esposito C., Caputo I. 2004]. Название Синонимы Молекулярная масса, кДа Ткань Локализация Тип 1 трансглутаминазы Трансглутаминаза кератиноцита 90 Эпителий Цитозоль, Мембрана Тип 2 трансглутаминазы Тканевая трансглутаминаза 80 Повсеместно Цитозоль, ядро, внеклеточное пространство Тип 3 трансглутаминазы Тип 4 трансглутаминазы Тип 5 трансглутаминазы Тип 6 трансглутаминазы Тип 7 трансглутаминазы Эпидермальная трансглутаминаза Трансглутаминаза простаты 77 Эпителий Цитозоль 77 Простата Внеклеточное пространство Трансглутаминаза X 81 Эпителий Цитозоль Трансглутаминаза Y --- Не известно Не известно Трансглутаминаза Z 80 Повсеместно Не известно Фактор XIIIa, плазменная трансглутаминаз, Плазма, Внеклеточное Фактор XIII 83 Фибринтромбоциты пространство стабилизирующий фактор Эритроцитарный Белок полосы 4.2 77 Эритроциты Мембрана белок полосы 4.2 Таблица 1. Семейство трансглутаминаз млекопитающих [Esposito C., Caputo I. 2004]. Далее будут подробно рассмотрены только два вида трансглутаминаз, которые были обнаружены в тромбоцитах: тканевая трансглутаминаза (тип 2) и фактор XIII. 24 1.6.2 Фактор XIII Различают два вида фактора XIII: 1. плазменный фактор XIII, 2. тромбоцитарный фактор XIII. Плазменный фактор XIII Плазменный фактор XIII представляет собой тетрамер, составленный из двух Aцепей и одной B-цепи. В отличие от всех остальных трансглутаминаз он является проферментом и активируется тромбином во время свертывания крови до фактора XIIIa. Активация происходит через расщепление тромбином Arg37-Gly38 пептидной связи около амино конца A-цепи. В присутствии ионов кальция B-цепь затем диссоциирует от тетрамера, демаскируя активность фактор XIIIа (рис. 8) [Schwartz M.L. et al. 1971, Lorand L. et al. 1983]. Рисунок 8. Активация плазменного фактора III. Преобразование зимогена - фактора XIII в фермент фактор XIII активированный (A2*) происходит в два шага под действием тромбина в присутствии кальция. / Тромбин-модифицированный аллофермент (фактор XIII ) все еще не активен. Диссоциация B-цепи в присутствии ионов кальция от тетрамера, способствует конформационным изменениям необходимым для демаскировки активного цента (цистеинового тиола) в каталическом центре субъединицы A2* [ Lorand L. et al. 1983]. Тромбоцитарный фактор XIII Тромбоцитарный фактор XIII состоит только из A-цепей, он находится в плазме тромбоцита и при активации клетки выходит на поверхность. Тромбоцитарный фактор XIII составляет до 50% от всего фактора XIIIа в крови [Griffin M. et al 2002]. 25 1.6.3 Тканевая трансглутаминаза Тканевая трансглутаминаза (TTГ) представляет собой мономер. Ее внутриклеточная функция регулируется внутриклеточными концентрациями кальция и гуанозинтрифосфатом (ГТФ), которые имеют противоположное влияние на ее активность. При связывании с ГТФ фермент демонстрирует конформационные изменения, которые приводят к ингибированию его ферментативной активности. Тогда как ионы кальция ингибируют связывание с ГТФ, что приводит к активации ферментативной активности [Lee K.N. et al. 1989, Griffin M. et al 2002]. Белки α-гранул являются субстратами для ТТГ, после их выхода из клетки она способна с ними связываться. Это может свидетельствовать о схожем механизме действия при образовании прокоагулянтных тромбоцитов. [Szasz R., Dale G.L. 2003] 26 Постановка задачи Ключевые реакции свёртывания крови происходят на поверхности активированных тромбоцитов. Кроме того, важной функцией тромбоцитов является их способность к агрегации. Открытие гетерогенности активированных тромбоцитов усложнило понимание этих процессов. Анализ литературы показывает, что реально в свертывании участвует лишь несколько процентов активированных тромбоцитов, остальные же по своим неактивированных. Кроме прокоагулянтным того, несмотря на качествам не отличаются от отсутствие на прокоагулянтных тромбоцитов активного GPIIb/IIIa, эти тромбоциты вероятно способны вовлекаться в агрегаты посредством покрытия из фибриногена на своей поверхности. Однако механизм формирования этого белкового покрытия до сих пор слабо изучен. Было установлено, что трансглутаминазные белки, входящие в число белков, секретируемых тромбоцитами, играют важную роль в формировании прокоагулянтных тромбоцитов. Кроме того, существует основание полагать, что белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов возникает за счет перехода фибриногена в фибрин, под действием тромбина и пассивного вовлечения остальных белков в нити фибрина. Поэтому встал вопрос о механизмах формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Целью данной работы являлось исследование механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Были поставлены следующие задачи исследования: 1. Исследовать роль трансглутаминаз, а также полимеризации фибрина в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, ответственной за их вовлечение в агрегаты; 2. Разработать метод, позволяющий количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов; 3. Исследовать роль тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов. 27 Глава 2. Материалы и методы 2.1 Материалы 2.1.1 Реагенты Конвульксин (Pentapharm, Basel, Швейцария) Тромбин (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT , США) Коллаген (Chrono-Log, США) Простагландин E1 (MP Biochemicals, Irvine, CA, США) Трансглутаминаза II Белок (Labvision, Fremont, CA, США) Человеческий фактор IXa (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, США) Человеческий фактор VIII (Hemophil M, Baxter Russia, Moscow, Россия) Человеческий протромбин (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN, USA) Человеческий фактор V (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, США) Человеческий фактор X (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, США) RVV-V ACTIVATOR (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, США) Человеческий фактор Xa (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN, USA) Chromozym ТН (синтезирован в Российском кардиологическом научно- производственном комплексе Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи) фосфатный буфер (PBS) (Sigma, St Louis, MO, США); EDTA, Этилендиаминтетрауксусная кислота (Helicon, Москва, Россия) PPACK , Фен-Про-Арг-хлорометил кетон (Calbiochem, Darmstadt, Германия) S2765 (Chromogenix, Milano, Италия) Chromozym ТН (синтезирован в Российском кардиологическом научно- производственном комплексе Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи) Аncistron (Технология-Стандарт, Барнаул, Россия) T101 (ZEDIRA GmbH, Darmstadt, Германия) поликлональные антитела к фибриногену, конъюгированные с FITC (Labvision, Fremont, CA, США); аннексин V, конъюгированный с фикоэритрином (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR, США), флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (BD Biosciences, San Jose, CA, США) и Alexa Fluor 647 (BioLegend, San Diego, CA, США), Alexa Fluor 647 (Biolegend, San Diego, CA, США) 28 Коллаген-ассоциированный пептид (CRP) был любезно предоставлен профессором Р.В. Фарндейлом (Университет Кембриджа, Кембридж, Великобритания). Антагонист гликопротеина IIbIIIa Монафрам® (F(ab')2 фрагменты моноклональных антител, которые блокируют активность рецептора GPIIbIIIa [Byzova T.V. et al. 1994; Mazurov A.V. et al. 2001; Mazurov A.V. et al. 2002; Mazurov A.V. et al. 2004]) был любезно предоставлен профессором А.В. Мазуровым (Российский кардиологический научно-производственный комплекс, Москва, Россия). Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP), Gly-Pro-Pro-Pro (GPPP) (Bachem, Bubendorf, Швейцария) NaCl, KCl, NaH2PO4, глюкоза, цитрат натрия, NaOH, (Реахим, Москва,Россия) Сефароза CL-2B, апираза, бычий сывороточный альбумин, HEPES, CaCl2, MgCl2 (Sigma, St. Louis, MO, США). 1. Буфер для работы с тромбоцитами, pH 7.4 (Буфер А): 150 мМ NaCl 2.7 мМ KCl 1 мМ MgCl2 0.4 мМ NaH2PO4 20 мМ HEPES, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфониевая кислота 5 мМ глюкозы 0.5% бычий сывороточный альбумин 2. Цитратный буфер, рН 5.5: 100 мМ цитрата натрия 2.2 Методы Доноры крови В работе была использована кровь здоровых доноров, у которых не было болезней свертывания крови. Кровь забирали на Станции переливания крови (СПК) Гематологического научного центра Министерства здравоохранения России. Кроме того, в ряде экспериментов была использована кровь пациентов с генетическими заболеваниями, такими как дисфибриногенемия и дефицит ФXIII. Пациент с дисфибриногенемией имел гомозиготную фибриногеновую METЦ мутацию (p.Arg16Cys) в цепи А, которая предотвращала отщепление фибринопептида А, таким образом формирование фибринового сгустка не наблюдалось, хотя отщепление фибринопептида B было в норме. Тромбоциты агрегировали нормально. Пациент страдал 29 от тяжелого кровотечения и была история переливания фибриногена (последнее было 2 года назад до нашего исследования). Пациент с тяжелой формой ФXIII дефицита (FXIII <1%) имел гомозиготную вставку T866 в экзоне 6 (p.Pro255SerfsX16). 2.2.1 Выделение отмытых тромбоцитов Для получения отмытых тромбоцитов, в день проведения эксперимента, кровь здоровых доноров заготавливалась на 3.8 % цитратном буфере (для предотвращения свертывания крови) в соотношение кровь: цитрат - 9:1. Чтобы предотвратить преждевременную активацию тромбоцитов добавлялись простагландин E1 (1мМ) и апираза (0,1 единиц активности/мл). Кровь центрифугировалась при комнатной температуре при 100g в течение 8 минут. Затем отбиралась богатая тромбоцитами плазма, в которую, чтобы предотвратить агрегацию клеток, добавлялся цитратный буфер в соотношении плазма: цитрат – 3:1. Далее богатая тромбоцитами плазма центрифугировалась при 400g в течение 5 минут при комнатной температуре. После чего плазма отбиралась, а осажденные тромбоциты ресуспензировались 300 мкл буфера А. Для окончательного отделения тромбоцитов от белков плазмы крови суспензия очищалась на гель-хроматографической колонке (LKB, Швеция) (высота × ширина = 6 см × 1 см, скорость прокачки = 0,5 мл/мин) (рис. 9), упакованной сефарозой CL-2B (Sigma, St. Louis, MO, США) (высота геля = 4,5 см) и уравновешенной буфером А [Panteleev M.A. et al. 2005]. Качество отделения тромбоцитов от плазменных белков проверялось методом агрегометрии, а именно отсутствием агрегации гель-фильтрованных тромбоцитов в ответ на добавление к ним ристоцетина [Weiss H.J. et al. 1973; Козинец Г.И., Макаров В.А. 1998]. Известно, что ристоцетин не вызывает активацию тромбоцитов, однако он инициирует связывание фактора Виллебранда с гликопротеином Ib-V-IX тромбоцитов, приводящее к их агрегации (для процесса такой пассивной агрегации, не связанной с активацией тромбоцитов, иногда используют термин «агглютинация»). Тромбоциты в процессе гель-фильтрации отделяются от плазменного фактора Виллебранда, следовательно, при качественном их выделении добавление ристоцетина в суспензию не вызывает никаких тромбоцитарных ответов, что и регистрируется агрегометром. 30 Рисунок 9. Схема колонки с гелем сефароза CL-2B. Суспензия клеток (1, розового цвета) помещалась в гель сефароза CL-2B (2, голубого цвета). 3 – верхняя граница геля. Колонка и входной шланг (4) далее полностью заполнялись буфером (5, коричневого цвета). При помощи перистальтического насоса буфер прокачивался через колонку. Суспензия клеток после прохождения через гель отбиралась в пробирку из выходного шланга (6). Пунктирными стрелками показано направление течения жидкостей в колонке под действием насоса. 2.2.2 Получение свободной от тромбоцитов плазмы Свободную от тромбоцитов плазму получали из крови здоровых доноров, заготовленной на 3.8 % цитратном буфере, соотношение кровь: цитрат составляет 9:1. Кровь центрифугировалась при комнатной температуре при 1600g в течение 15 минут для отделения основной части клеток от плазмы. Далее супернатант отбирался и центрифугировался ещё 5 мин при комнатной температуре при 10.000g. В результате чего получали свободную от тромбоцитов плазму. При этом концентрация тромбоцитов в ней не превышала 106 клеток/литр. 2.2.3 Титрование активных сайтов тромбина Фирменный раствор тромбина (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, США) разводился буфером А до теоретически рассчитанной концентрации равной 5000 нМ. Для анализа активных сайтов тромбина (вычисления истинной концентрации тромбина в (необратимый растворе) ингибитор использовали тромбина) следующую разводился схему до эксперимента. следующих PPACK концентраций: 30,15,7.5,3.25,0 нМ и разливался по 50 мкл в планшет, затем добавлялось по 50 мкл тромбина в концентрации 30 нМ, после чего производилась инкубация смеси в течение 10 минут. Далее в каждую лунку планшета добавлялось по 100 мкл хромогенного субстрата (Chromozym ТН) для тромбина в конечной концентрации 0.3 мМ. Измерение изменения 31 оптической плотности раствора проводили на планшетном спектрофотометре Thermomax (Molecular Devices, США) на длине волны 405 нм при 37°С в течение 10 мин. Остаточная активность тромбина определялась по скорости гидролиза хромогенного субстрата. Дальнейший анализ проводился в программе OriginPro 7.5, где по полученным данным строились графики изменения оптической плотности во времени, после чего находилась скорость расщепления субстрата в начальный момент времени. Затем строилась кривая зависимости скорости расщепления субстрата в начальный момент времени от концентрации PPACK. Далее проводилась линейная аппроксимация и находилась концентрация, при которой скорость расщепления равна нулю. Зная данную концентрацию (А), степень ингибирования (B) тромбина PPACK и степень разведения (C) тромбина от теоретически рассчитанной концентрации 5000нМ, вычислялась экспериментальная концентрация раствора тромбина по формуле (1). Экспериментальная концентрация тромбина = А*B*C. (1) 2.2.4 Проточная цитометрия 2.2.4.1 Принцип проточной цитометрии В основе метода проточной цитометрии лежит измерение параметров одиночной клетки. Суспензию предварительно окрашенных флуоресцентными красителями клеток (как правило, в роли красителей выступают моноклональные антитела, конъюгированные с флуоресцентными метками) под давлением прогоняют через капилляр. Клетки, подхваченные потоком жидкости, выстраиваются друг за другом в цепочку благодаря принципу гидродинамического фокусирования (рис. 10), в соответствии с которым создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обволакивающей жидкостью. Образец Обволакивающая жидкость Лазер Рассеяние и флуоресценция Рисунок 10. Схема проточной ячейки цитометра. (http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_2%3A_The_Flow_Cytometer). В камеру, содержащую обволакивающую жидкость, через капилляр втекает суспензия исследуемых клеток. Камера сужается, и благодаря ламинарности течения клетки выстраиваются друг за другом. Далее при помощи лазера определяют различные свойства клеток. 32 Когда такую струю пересекает сфокусированный лазерный луч, в точке пересечения потока и луча оказывается, как правило, только одна клетка. На рис.11 изображена оптическая схема проточного цитометра. Блок обработки информации Детекторы флуоресценции Лазер Проточная ячейка Детекторы бокового (SSC) и малоуглового (FSC) рассеяния Рисунок 11. Схема устройства проточного цитометра (http://ru-ru.invitrogen.com/site/ru/ru/home/support/Tutorials.html). Основные составляющие прибора: лазер, проточная ячейка, в которой создается ламинарный поток с выстроенными в цепочку клетками, детекторы малоуглового и бокового светорассеяния, детекторы флуоресценции и блок обработки информации. Высокочувствительные датчики, расположенные вблизи проточной ячейки, фиксируют рассеяние света под углами от 2о до 19° (прямое, или малоугловое, светорассеяние (FSC)), характеризующие размеры клетки, и под углом 90° (боковое светорассеяние (SSC)), характеризующий оптическую неоднородность цитоплазмы клетки, характер клеточных включений и гранулярность клетки (всю совокупность образований, формирующих клетку, включая любые клеточные органеллы и ядро). Одновременно с этим регистрируется излучение флуоресцентных меток (FL1, FL2 и т.д.) (рис. 11), имеющее для каждого флуорофора свою длину волны. Измерение этих параметров позволяет выявлять разные типы клеток. 2.2.4.2 Исследование формирования покрытия из белков на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Тромбоциты в указанных концентрациях активировались путем инкубации с агонистами в буфере А с 2,5 мМ CaCl2 в течение 15 мин. в присутствии флуоресцентно меченных антител, разводили в 10 раз буфером А с 2,5 мМ CaCl 2 и анализировали на проточном цитометре Accuri C6 (Accuri Cytometers, Ann Arbor, MI, USA) или FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Полученные данные затем обрабатывались в 33 программе CFlow software (Accuri Cytometers) или WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Для каждой пары используемых вместе флуоресцентных меток проводили процедуру компенсации, то есть учет перекрывания их спектров флуоресценции [Fluorescence compensation in flow cytometry (электронный ресурс)]. Для того чтобы исследовать покрытие из тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, активированные тромбоциты дополнительно инкубировали с антителом к тромбоспондину в течение 5 мин., затем еще 5 мин. с вторичным флуоресцентно меченным антителом, после чего тромбоциты фиксировали в 1,5% формалине, разведенном в PBS, в течение 20 мин., разбавляли в 15 раз, и анализировали с помощью проточной цитометрии. 2.2.4.3 Исследование агрегации субпопуляций тромбоцитов на проточном цитометре. Тромбоциты в концентрации 50 тыс/мкл активировали инкубацией с агонистами в буфере А с 2,5 мМ CaCl2 в течение 15 минут в присутствии аннексина V-FITC и антиCD61-PerCP или анти-CD62P-PE, в присутствии или отсутствии 200 мкг/мл монафрама (F(ab')2 фрагменты моноклональных антител, которые блокируют активность рецептора GPIIbIIIa) и одновременным перемешиванием (600 оборотов/мин) на минишейкере MS1 (IKA, Staufen, Германия), разводили в 10 раз буфером А с 2,5 мМ CaCl2 и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, США). Полученные данные затем также обрабатывались в программе WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, США). В другой серии экспериментов тромбоциты в концентрации 50 тыс/мкл активировались путем инкубации с агонистами в буфере А с 2,5 мМ CaCl2 в течение 15 минут в присутствии PE-аннексина-V и CD42b-FITC. Затем к ним добавляли 1 мкМ PPACK и 1 мг/мл фибриногена. Тромбоциты перемешивали (600 оборотов/мин) на минишейкере MS1 (IKA, Staufen, Германия) в течение 5 минут при комнатной температуре, разводили в 10 раз буфером А с 2,5 мМ CaCl2 и анализировали на проточном цитометре. Метод измерения субпопуляций агрегировать был разработан способности тромбоцитов различных и подробно описан в статье сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О. [Yakimenko A. O. et al. 2012]. Обработка цитометрических данных по агрегации Для обработки полученных с цитометра результатов использовалась программа WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). На рисунке 12 представлены типичные диаграммы, получаемые при обработке эксперимента по агрегации на проточном цитометре. Каждая точка на диаграмме 34 соответствует одной клетке. На рис. 12 А представлено распеделение клеток по SSC (боковомуянию) и флуоресценции антител к CD61 (антитело к GPIIIa), которое мы использовали как маркер тромбоцитарный маркер. После чего выделялся регион тромбоцитарных событий – R1. Дальше производился анализ только тех событий которые попали в этот регион. На контурной диаграмме плотности распределения активированных тромбоцитов по боковому (SSC) и малоугловому (FSC) рассеянию выделяли регион одиночных тромбоцитов R2 (рис. 12 Б, по внешней линии) и не пересекающийся с ним регион агрегатов R3 (рис. 12 Б, зеленым). Затем все события, попавшие одновременно в регионы R1 и R2, изображались на точечной диаграмме распределения по боковому рассеянию (SSC) и флуоресценции меченного флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) аннексина V, связывающегося с фосфатидилсерином на поверхности активированных тромбоцитов (рис.12 В). В программе подсчитывали количество тромбоцитов для разных субпопуляци при разных условиях активации, например для проб с перемешиванием (рис.12 В,а) и для проб, в которых тромбоциты не подвергались перемешиванию (рис.12 В,б) (для контроля количества событий использовались калибровочные шарики) (данные предоставлены сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О) 35 Рисунок 12. Обработка цитометрических данных по агрегации. (А) Точечная диаграмма распределения событий по боковому рассеянию (SSC) и флуоресценции маркера тромбоцитов анти-CD61-PerCP. (Б) Контурная диаграмма плотности распределения тромбоцитов по боковому рассеянию (SSC) и малоугловому рассеянию (FSC). (В) Точечная диаграмма распределения по боковому рассеянию (SSC) и флуоресценции аннексинаV-FITC активированных тромбоцитов, не подвергавшихся перемешиванию (а) и подвергавшихся перемешиванию (б). Зеленым цветом выделен регион агрегатов. (данные получены сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О) 2.2.5 Микроскопия 2.2.5.1 Исследование формирования покрытия из белков и локализации на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов Стеклянные покровные стекла (24×24 мм, Heinz Herenz, Hamburg, Германия) очищали в дихромате калия, отмывали дистиллированной водой и высушивали при 50ºС. После этого на них наносили фибриноген в концентрации 20 мг/мл, разведенный в буфере А, инкубацией в течение 40 минут при комнатной температуре, затем остатки белка смывали дистиллированной водой и стекла высушивали при 37ºС, затем собирали как часть плоско-параллельной проточной камеры. Активация тромбоцитов производилась, как описано выше. Затем тромбоциты связывались с иммобилизованным фибриногеном в 36 плоско-параллельной проточной камере в течение 5 минут при комнатной температуре. Конфокальные изображения тромбоцитов получали на конфокальном микроскопе AxioObserver.Z1 (Carl Zeiss, Jena, Германия) с помощью объектива с увеличением 100×. 2.2.6 Планшетный спектрофотометр 2.2.6.1 Метод измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по ускорению активации фактора X комплексом внутренней теназы Для активации тромбоцитов в пробирках готовилось по 5 мкл активационных смесей. Активационные смеси содержали вещества-активаторы, доведенные до нужной концентрации буфером A. Далее в каждую пробирку с активатором добавлялись по 5 мкл тромбоцитов, разбавленных до нужной концентрации буфером А содержащим CaCl2. Концентрации в суспензиях после добавления активационных смесей составляли: 100тыс/мкл тромбоцитов, 2,5 мМ CaCl2. Тромбоциты активировались 15 минут при комнатной температуре. Для активации тромбоцитов использовались такие вещества как: тромбин, коллаген, конвульксин в ниже приведенных комбинациях: а) 10 нМ тромбина и 1, 5,100,1000 нг/мл конвульксина, б) 10,100 нМ тромбина, в) 100 нМ тромбина и 20 мкг/мл коллагена г) 20 мкг/мл коллагена, д) 100 нг/мл конвульксина. Для выяснения роли тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов брали 2 образца тромбоцитов, один из которых активировался 100 нг/мл конвульксина с добавлением тканевой трансглутаминазы (500 нМ), второй образец тромбоцитов активировался 100 нг/мл конвульксина, а через 9 мин после начала активации к нему добавлялась тканевая трансглутаминаза (500 нМ). На поверхности активированных тромбоцитов, для того чтобы наблюдать изменение прокоагулянтной активности тромбоцитов в зависимости от активатора тромбоцитов, собирался комплекс внутренней теназы - смесь общим объемом 30 мкл со следующими концентрациями компонентов: активированные тромбоциты – 8тыс/мкл (далее будет показано, что при данной концентрации метод работает линейно), CaCl2 – 2.5 мМ, фактор VIIIа – 27.5 нМ, фактор IXa – 10 нМ, фактор X – 400 нМ, PPACK – 2000 нМ (2). Вышеуказанная смесь состояла из трех подсмесей: смесь 1 - объем смеси 20 мкл, состав: активированные тромбоциты, CaCl2; смесь 2 - объем смеси 5 мкл, состав: фактор VIII, тромбин, PPACK (фактор VIII активировался 1мин тромбином, после окончания активации добавлялся PPACK); смесь 3 - объем смеси 5 мкл, состав: ФIXa, ФX. 37 Концентрации подсмесей рассчитывались с учётом (2). Доведение до нужной концентрации производили буфером А. Комплекс внутренней теназы собирался следующим образом: смесь 1 добавлялась в смесь 2, затем добавлялась смесь 3. Далее происходила активация фактор X этим комплексом в течение 4 минут при при температуре 37°С. Затем добавляли 30 мкл 50 мМ EDTA, чтобы остановить активацию фактора X и 140 мкл хромогенного субстрата S2765 такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (200 мкл) его концентрация была 0.4 мМ. Обработка результатов с планшетного спектрофотометра Метод измерения количества активированного фактора X с помощью хромогенного субстрата S2765 основан на изменении оптической плотности при отщеплении фактором Xa молекулы pNA (хромофор-п-нитроанилин) от хромогенного субстрата S2765 (рис. 13). Рисунок 13. Фактор Xa отщепляет от хромогенного субстрата(N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA) молекулу pNA (хромофор-п-нитроанилин), которая увеличивает оптическую плотность. Скорость образования pNA, т.е. изменения оптической плотности, пропорциональна ферментативной активности фактора Xa. Изменение оптической плотности при расщеплении фактором Xa субстрата регистрировалось с помощью планшетного спектрофотометра Thermomax microplate reader (Molecular Devices) в течение 30 мин с интервалом 0,6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37°С (рис.14). По полученным данным находилась скорость расщепления хромогенного субстрата в начальный момент времени, для чего было выведено теоретическое уравнение изменения оптической плотности от времени при расщеплении субстрата. Уравнение для скорости наработки pNA при расщеплении хромогенного субстрата ФXa выглядит следующим образом: (3), где P - концентрация продукта pNA, S – концентрация субстрата, Xa - концентрация фактора, которую нам нужно померить, Решаем уравнение (3): 38 (4), Таким образом, мы получили уравнение описывающее зависимость концентрации продукта от времени, т.е. изменение оптической плотности от времени. Далее находим максимальную скорость изменения оптической плотности, т.е. скорость в начальный момент времени: В данных обозначениях, уравнение изменения оптической плотности от времени (4) выглядит так: (5), где P1 - скорость изменения оптической плотности в начальный момент времени, P2=k*Xa, P3= const. С помощью уравнения (5) в программе OriginPro 7.5 аппроксимировали данные, полученные с планшетного спектрофотометра, и находили скорость изменения оптической плотности в начальный момент времени (рис. 14). Рисунок 14. Изменение оптической плотности с течением времени при расщеплении субстрата фактором Xa (тромбоциты активировались тромбином) (кривая черного цвета). Аппроксимация полученной кривой функцией (кривая красного цвета), P1=0.0393 ОП/мин Влияние температуры на активность внутренней теназы Для исследования зависимостей активностей внутренней теназы от температуры комплекс факторов VIIIа и IXа был собран на фосфолипидной поверхности путем 39 смешивания 40 мкл фосфолипидов (5000 нМ) с CaCl2 (5 мкМ) и 40 мкл смеси, содержащей фактор VIIIa (40 нМ), фактор IXa (0,2 нМ), фактор X (800 нМ), PPACK (2000нM). Фактор VIIIа был подготовлен непосредственно до эксперимента с помощью инкубации 40 нМ фактора VIII с 1 нМ тромбина в течение 1 минуты, после чего добавляли 2 мкМ PPACK для инактивации тромбина. Активация фактора X осуществлялась в течение 4 минут при температурах 20 оC, 28 оC, 37 оC, 43 оC, после чего процесс останавливался с помощью добавления 80 мкл ЭДТА (50 мМ). Затем добавляли Xa – специфичный хромогенный субстрат S2765 (конечная концентрация 0.4 мМ). Скорость расщепления хромогенного субстрата, зависящая в данном опыте от активности комплекса внутренней теназы, определялась на длине волны 405 нм с помощью прибора Thermomax microplate reader (Molecular Devices) в кинетическом режиме. 2.2.6.2 Метод измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по ускорению активации фактора II комплексом протромбиназы Тромбоциты в концентрации 50тыс/мкл активировались кальциевым ионофором в концентрации 5мкМ в присутствии 2,5 мМ CaCl2. Тромбоциты и активатор доводились до нужной концентрации буфером А. Активация тромбоцитов производилась 10 минут при комнатной температуре. Далее на поверхности активированных тромбоцитов собирался комплекс протромбиназы - смесь общим объемом 30 мкл со следующими концентрациями компонентов: активированные тромбоциты –5 тыс/мкл (далее будет показано, что при данной концентрации метод работает линейно), CaCl2 – 2.5 мМ, фактор Xа – 10 нМ, фактор II – 1,4 мкМ (6). Вышеуказанная смесь состояла из двух подсмесей: смесь 1 объем смеси 20 мкл, состав: активированные тромбоциты, CaCl2; смесь 2 - объем смеси 10 мкл, состав: фактор Xa, фактор II. Концентрации подсмесей рассчитывались с учётом (6). Доведение до нужной концентрации производили буфером А. Фактор II активировался этим комплексом в течение 5 минут при температуре 37°С. Затем эту реакцию останавливали путем добавления 270 мкл 5.6 мМ EDTA. После чего 20 мкл этой смеси переносилось в новые лунки планшета многоканальной пипеткой и далее для измерения количества наработанного фактора IIa добавлялось 180 мкл хромогенного субстрата CTH такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (200 мкл) его концентрация была 0.3 мМ. С помощью планшетного спектрофотометра Thermomax (Molecular Devices, США) определялось изменение светопропускания при расщеплении субстрата (CTH) активированным фактором II от времени в течение 30 минут с интервалом 6 сек на длине 40 волны 405 нм при температуре 37°С. Дальнейший анализ проводился в программе OriginPro 7.5 аналогично методу, описанному в п. 2.2.5.1 2.2.6.3 Сборка комплекса внутренней теназы и протромбина на искусственных поверхностях. Для выяснения работы методов в искусственных условиях брали 5 образцов по 20 мкл (концентрации CaCl2 и фосфолипидов рассчитывались с учетом (7),(8)): а) буфер A + СaCl2(5mM) , б) буфер A + СaCl2(5mM) + пленка без фибробластов /без тканевого фактора, в) пленка с фибробластами/с тканевым фактором) (+) г) фосфолипиды 2 мкМ, разведенные буфер A + СaCl2(5mM), д) фосфолипиды 400 нМ, разведенные буфер A + СaCl2(5mM). ((+) Пленки 2×2 мм2 содержали иммобилизованный ТФ или фибробласты со средней поверхностной площадью 120 пмоль/м2) Далее в этих образцах собирался либо комплекс внутренней теназы, либо протромбиназы. Сборка комплекса внутренней теназы Для этого в каждый образец добавлялось по 20 мкл смеси из факторов: IXа-0.2 нМ, VIIIa- 40 нМ и X- 800нМ (концентрации IXа, VIIIa, X рассчитывались с учетом (7)). Фактор VIII предварительно был активирован 1нМ тромбина в течение 1 мин, после чего был добавлен PPACK 2 мкМ для инактивации тромбина. Окончательная концентрация компонентов в 40 мкл: CaCl2 – 2.5 мМ, фактор VIIIа – 20 нМ, фактор IXa – 0.1 нМ, фактор X – 400 нМ (7). Далее происходила активация фактора X комплексом внутренней теназы в течение 4 минут, при 37 °С в режиме перемешивания. Затем реакцию активации фактора X останавливали путем добавления 40 мкл 20 мМ EDTA. После чего 60 мкл этой смеси переносилось в новые лунки планшета многоканальной пипеткой и далее для измерения количества наработанного фактора X добавлялось 140 мкл хромогенного субстрата S2765 такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (200 мкл) его концентрация была 0.4 мМ. С помощью планшетного спектрофотометра Thermomax (Molecular Devices, США) определялось изменение светопропускания при расщеплении субстрата (S2765) активированным фактором X от времени в течение 30 минут с интервалом 6 сек на длине 41 волны 405 нм при температуре 37°С. Дальнейший анализ проводился в программе OriginPro 7.5 Сборка комплекса протромбиназы Для выяснения роли пленок с фибробластами/тканевым фактором в сборке протромбиназы брали 5 образцов по 20 мкл (концентрации CaCl2 и фосфолипидов рассчитывались с учетом (8)): Для этого в каждый образец добавлялось по 10 мкл смеси из факторов: Va - 6 нМ, Xa – 30 нМ, II-4.2 мкМ (концентрации IXа, VIIIa, X рассчитывались с учетом (8)). Фактор V предварительно был активирован до концентрации 100 нМ : путем инкубации V (120 нМ) в течение 50 мин c RVV-V(10 нМ) при комнатной температуре. Окончательная концентрация компонентов в 30 мкл : CaCl2 – 2.5 мМ, фактор Vа – 2 нМ, фактор Xa – 10 нМ, фактор II – 1.4 мкМ (8). Далее происходила активация фактора II комплексом протромбиназы в течение 5 минут, при 37 °С в режиме перемешивания. Затем реакцию активации фактора II останавливали путем добавления 270 мкл 5.6 мМ EDTA. После чего 20 мкл этой смеси переносилось в новые лунки планшета многоканальной пипеткой и далее для измерения количества наработанного фактора IIa добавлялось 180 мкл хромогенного субстрата CTH такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (200 мкл) его концентрация была 0.3 мМ. С помощью планшетного спектрофотометра Thermomax (Molecular Devices, США) определялось изменение светопропускания при расщеплении субстрата (CTH) активированным фактором II от времени в течение 30 минут с интервалом 6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37°С. Дальнейший анализ проводился в программе OriginPro 7.5 2.2.6.4 Метод измерения прокоагулянтной активности трмбоцитов по влиянию их на свертывание плазмы Для активации тромбоцитов в 96-луночном планшете готовились по 5 мкл активационной смеси в необходимом количестве лунок. Активационные смеси содержали вещества-активаторы, доведенные до нужной концентрации буфером A. Далее в каждую лунку с активатором добавлялись по 5 мкл тромбоцитов, разбавленных до нужной концентрации буфером А содержащим CaCl2. Концентрации в суспензиях после добавления активационной смеси были: 100 тыс/мкл тромбоцитов, 2,5 мМ CaCl2. 42 Тромбоциты активировались 15 минут. Для активации тромбоцитов использовался конвульксин в концентрациях 10нг/мл и 100 нг/мл. Далее, для того чтобы наблюдать изменение прокоагулянтной активности тромбоцитов в зависимости от активатора, в суспензию активированных тромбоцитов добавлялось по 90 мкл свободной от тромбоцитов плазмы содержащей CaCl2 такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (100 мкл) его концентрация была 20 мМ. После этого с помощью планшетного спектрофотометра в течение 1,5 часов с интервалом 6 сек на длине волны 405 нм при температуре 37°С регистрировалось изменение оптической плотности при сворачивании плазмы. По полученным данным находилось время, за которое плазма сворачивается наполовину, т.е. когда оптическая плотность достигает половины от максимального значения. 2.3 Статистическая обработка данных Статистический анализ производился в программе OriginPro 7.5 (OriginLab Corporation, Northampton, Massachusetts, США) с помощью парного критерия Стьюдента или однофакторного теста ANOVA. Различие считалось статистически значимым при P < 0,05. Представлены усредненные величины ± стандартные ошибки среднего. 43 Глава 3. Результаты 3.1 Роль трансглутаминаз и полимеризации фибрина в формировании покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов 3.1.1 Изучение кинетики формирования двух субпопуляций тромбоцитов и распределения покрытия из фибриногена на их поверхности Как уже говорилось выше, долгое время считалось, что из-за отсутствия активного GPIIb/IIIa на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, они не способны вовлекаться в агрегаты [Dale G.L. et al. 2002; Mattheij N. J. et al. 2013]. Однако, Якименко и др. в своей работе показали, что прокоагулянтные тромбоциты вовлекаются в агрегаты посредством покрытия из фибриногена на их поверхности [Yakimenko A.O. et al. 2012]. Поэтому механизм формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов становится крайне актуален. На рис. 15 представлена типичная картина формирования покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Тромбоциты активировались тромбином с добавлением флуоресцентно-меченных аннексина-V и антитела к фибриногену. Кинетика образования прокоагулянтных тромбоцитов и распределение фибриногена по субпопуляциям анализировалось с помощью проточного цитометра в 0; 0,5; 1,5; 3; 5; 15; 30; 40 мин. после начала активации. В согласии с литературными данными с течением времени выделяется субпопуляция прокоагулянтных тромбоцитов, на поверхности которых присутствует большое количество фибриногена (здесь и далее количество прокоагулянтных тромбоцитов измерялось по связыванию флуоресцентно меченного аннексина-V с фосфатидилсерином экспонированном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов). И средняя флуоресценция и количество событий увеличивается в течение 40 мин до достижения плато. 44 Рисунок 15. Кинетика формирования покрытия из фибртиногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл тромбином (100нМ) и были помечены флуоресцентно меченными антителом к фибриногену и аннексином-V. На точечных диаграммах представлено распределение тромбоцитов по связыванию аннексина V (ось абсцисс) и фибриногена (ось ординат) (шкала логарифмическая) в указанные моменты времени после начала активации. Прокоагулянтные тромбоциты выделены рамкой. Представлены результаты типичного эксперимента из трех, проведенных с кровью разных доноров. Для того чтобы исследовать структуру фибринового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, активированные тромбоциты были помечены флуоресцентными аннексином-V и антителом к фибриногену и исследованы с помощью конфокальной микроскопии (рис. 16). Вопреки ожиданиям покрытие из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов было не равномерно распределено по поверхности, а локализовалось в виде “шапки” (рис 16 А). На рисунке 16 Б представлена 3-Д реконструкция. Было показано, что 85% прокоагулянтных тромбоцитов обладают такой “шапкой”. Важно заметить, что каждый из этих тромбоцитов обладает только одной такой “шапкой”. Белковое покрытие на поверхности непрокоагулянтных тромбоцитов выглядело, как несколько точек флуоресценции на поверхности тромбоцитов, что находится в согласии с литературными данными (Данные получены аспирантом ЦТП ФХФ РАН С.И. Обыденным). 45 Рисунок 16. Локализация покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл тромбином (100нМ) и были помечены флуоресцентно меченными антителом к фибриногену и аннексином-V. (А) Представлены типичные конфокальные изображения, полученные методами дифференциально-интерференционного контраста (ДИК), флуоресценции аннексина V- Alexa Fluor 647 (красный), антитела к фибриногену-FITC (зеленый). Также представлены наложения этих трех изображений. На всех панелях представлено одно поле зрения. Показаны три оптических среза тромбоцита, отстоящих друг от друга на 0,6 мкм (слой 1 и слой 2), 1,2 мкм (слой 2 и слой 3). (Б) 3-Д реконструкция того же самого прокоагулянтного тромбоцита, помеченного аннексином-V Alexa Fluor 647 (розовый) и антителом к фибриногену-FITC (зеленый). (В) Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл тромбином (100нМ) в течение 15 мин., и помечены флуоресцентно меченными антителом к фибриногену (зеленый) и аннексином-V (красный). Конфокальные изображения были собраны и затем усреднены, чтобы увидеть все слои сразу. Представлены результаты типичного эксперимента из трех, проведенных с кровью разных доноров. В общей сложности было просканировано 52 прокоагулянтных тромбоцитов, 85% прокоагулянтных тромбоцитов имели единичную фибриновую “шапку”, оставшиеся 15 % - нет. Данные получены аспирантом ЦТП ФХФ РАН С.И. Обыденным В связи с полученными данными изучение механизмов формирования белкового покрытия становится крайне актуальным. 3.1.1 Выявление механизмов формирования проагрегаторной активности прокоагулянтных тромбоцитов В работе Якименко А. О. был предложен возможный механизм вовлечения прокоагулянтных тромбоцитов в агрегаты. В данном исследовании это предположение было проверено, мы напрямую исследовали зависимость агрегации тромбоцитов от наличия активного GPIIbIIIa на поверхности непрокоагулянтных тромбоцитов, кроме того была исследована возможность агрегации прокоагулянтных тромбоцитов за счет сшивания белкового покрытия на их поверхности друг с другом за счет полимеризации фибрина. Для этого тромбоциты 46 активировались тромбином (100 нМ) (при такой активации образовывалось около 5% прокоагулянтных тромбоцитов), либо тромбином (100 нМ) + CRP (30 мкг/мл) (при этом образовывалось около 70 % прокоагулянтных тромбоцитов) в присутствии или отсутствии монафрама (200 мкг/мл) и одновременным перемешиванием (600 об/мин) в течение 15 минут, а затем анализировались на проточном цитометре. Далее определялся процент тромбоцитов покидающих регион одиночных событий после перемешивания. В согласии с литературными данными тромбоциты, активированные тромбином, эффективно формировали агрегаты, покидая суспензию после перемешивания, в то время как сильная активация тромбином с CRP ингибировала агрегацию в тромбоцитов (из-за большого числа прокоагулянтных тромбоцитов) (рис.17 А, слева). Добавление монафрама заметно снижало агрегация тромбоцитов при обоих типах актиции (рис. 17 А, справа). (Данные получены сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О.) Этот результат свидетельствует в пользу того, что для вовлечения в агрегаты прокоагулянтных тромбоцитов необходим активный GPIIbIIIa на поверхности непрокоагулянтных тромбоцитов, а также прокоагулянтные тромбоциты не могут агрегировать друг с другом Также была исследована роль белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в их вовлечении в агрегаты. Для этого тромбоциты в концентрации 50 тыс/мкл активировались тромбином (100 нМ) с CRP (10 мкг/мл) (много фибриногена на прокоагулянтных тромбоцитах) или только CRP (10 мкг/мл) (мало фибриногена на прокоагулянтных тромбоцитах) в течение 15 минут, затем к ним добавлялись 1 мкМ PPACK и 1 мг/мл фибриногена, тромбоциты перемешивались в течение 5 минут при 600 об/мин, после чего на проточном цитометре оценивалась эффективность ухода тромбоцитов разных субпопуляций в агрегаты (т.е. оценивался % тромбоцитов которые покинули регион одиночных тромбоцитов после перемешивания) (рис.17 Б). Видно, что непрокоагулянтные тромбоциты эффективно уходят в агрегаты независимо от типа активации, в то время как прокоагулянтные тромбоциты агрегируют сильно хуже в отсутствии белкового покрытия (т.е. при активации CRP). (Данные получены сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О.) 47 Рисунок 17. Уход тромбоцитов в агрегаты. (А) Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл тромбином или тромбином (100 нМ) с CRP (10 мкг/мл) в отсутствии (слева) и в присутствии (справа) монафрама. На гистограммах показан уход тромбоцитов в агрегаты без разделения на субпопуляции. Представлены усредненные по трем донорам величины ± стандартные ошибки среднего. (Б) Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл тромбином (100 нМ) с CRP (10 мкг/мл) или CRP (10 мкг/мл). На гистограммах показан уход тромбоцитов разных субпопуляций в зависимости от активации. Представлены усредненные по четырем донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Звездочками отмечена статистическая достоверность. (Данные получены сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О. Эти данные демонстрируют, что покрытие из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов играет важную роль в формировании их агрегаторной активности. Поэтому исследование механизмов его формирования являются ключевой задачей данного исследования. 3.1.2 Изучение механизмов формирования покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов Выделяют два основных наиболее вероятных механизма формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов: по средствам трансглутаминазной реакции, а также за счет полимеризации фибриногена на их поверхности. Оба механизма были детально изучены. 3.1.2.1 Тестирование существующих гипотез, используя фармакологические агенты Влияние трансглутаминаз на формирование покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов Чтобы проверить гипотезу, что трансглутаминазы способны пришивать фибриноген к поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, перед активацией тромбином к тромбоцитам был добавлен пан-трансглутаминазный ингибитор Т101 (т.е. покрытие из фибриногена может появится только за счет полимеризации) (рис. 18 А,В). 48 Рисунок 18. Тестирование трансглутаминазной гипотезы (А-Г). Тромбоциты активировались в концентрации 20 тыс/мкл (А,Б) тромбином (100нМ) в присутствии или отсутствии ингибитора трансглутаминаз Т101 (200мкМ);( В-Г) CRP (20мкг/мл) в присутствии или отсутствии ТТГ (500нМ). Тромбоциты были помечены флуоресцентно меченными аннексином-V и антителом к фибриногену и проанализированы на проточном цитометре. На гистограммах представлено (А,Б) количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в зависимости от присутствия или отсутствия фармакологических агентов во время активации. Для каждого типа активации, все результаты были нормированы на значение флуоресценции антитела к фибриногену связавшегося с фибриногеном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных стимуляцией одним активатором; (В,Г) процент прокоагулянтных тромбоцитов полученных в зависимости от типа активации. Представлены усредненные по трем донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Звездочками отмечена статистическая достоверность. Как видно из графика, это привело к незначительному уменьшению фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов (статистически не достоверному, P=0.14) и не повлияло на процент прокоагулянтных тромбоцитов. Также мы активировали тромбоциты CRP (активация, при которой исключается появление фибринового покрытия за счет полимеризации) в отсутствии или присутствии ТТГ (рис. 18 Б,Г) прокоагулянтных тромбоцитов. Добавление ТТГ во время активации тромбоцитов привело к значительному увеличению количества фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов (рис. 18 Б), их количество при этом не изменилось (рис. 18 Г). Опираясь на полученные данные можно сделать вывод, что трансглутаминазы действительно способны пришивать фибриноген к поверхности 49 прокоагулянтных тромбоцитов, однако, эта реакция, по всей видимости, не играет ключевую роль в формировании белкового покрытия. Влияние полимеризации на формирование покрытия из фибрина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Для того чтобы проверить приводит ли полимеризация фибрина к формированию белкового покрытия, был проведен эксперимент в присутствии и отсутствии ингибитора полимеризации фибрина-GPRP, используя GPPP как отрицательный контроль (рис. 19 АГ). Присутствие ингибитора полимеризации значительно уменьшало количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов активированных как тромбином с CRP (рис. 19 А), так и одним тромбином (рис. 19 Б), в то время как отрицательный контроль никак не влиял на количество фибриногена (рис. 19 А,Б). В случае активации тромбоцитов тромбином количество прокоагулянтных тромбоцитов значительно уменьшалось при добавлении ингибитора полимеризации (рис. 19 Г). Также были проведены эксперименты с анцистроном-протеазой, сворачивающей фибриноген (рис. 19 Д-Е). Тромбоциты активировались CRP в присутствии или отсутствии анцистрона. Как видно на гистограммах, анцистрон драматически увеличивает количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных путем стимуляцией CRP (активация, при которой исключается появление фибринового покрытия за счет полимеризации), в то время как обычно активация тромбоцитов CRP не приводит к появлению белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов (рис. 19 Д). Контрольные эксперименты показали, что анцистрон сам по себе не вызывает появление прокоагулянтных тромбоцитов и не влияет на их количество во время стимуляции CRP (рис. 19 Е). 50 Рисунок 19. Тестирование гипотезы о полимеризации фибрина (А-Е). Тромбоциты активировались в концентрации 20 тыс/мкл (А,В) тромбином (100нМ) с CRP (20мкг/мл) в присутствии или отсутствии ингибитора полимеризации фибрина GPRP(15мМ) или отрицательного контроля GPPP (15мМ); ( Б,Г) тромбином (100нМ) в присутствии или отсутствии ингибитора полимеризации фибрина GPRP (15мМ) или отрицательного контроля GPPP (15мМ); (Д-Е) CRP (20мкг/мл) в присутствии или отсутствии анцистрона (концентрация эквивалентна 15 ед. NIH тромбина). Тромбоциты были помечены флуоресцентно меченными аннексином-V и антителом к фибриногену и проанализированы на проточном цитометре. На гистограммах представлено (А,Б,Д) количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в зависимости от присутствия или отсутствия фармакологических агентов во время активации. Для каждого типа активации, все результаты были нормированы на значение флуоресценции антитела к фибриногену связавшегося с фибриногеном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных стимуляцией одним активатором; (В,Г,Е) процент прокоагулянтных тромбоцитов полученных в зависимости от типа активации. Представлены усредненные по 3-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Звездочками отмечена статистическая достоверность. Таким образом, можно сделать вывод, что полимеризация фибрина играет ключевую роль в формировании покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Контрольный эксперимент (рис. 20) показал, что Т101 действительно эффективно ингибирует ТТГ, в то время как ингибитор полимеризации GPRP и контрольный пептид 51 GPPP не влияют на ее активность (данные получены сотрудником ЦТП ФХФ РАН Я.Н. Котовой). Рисунок 20. Проверка специфичности работы ингибиторов. Тромбоциты активировались в концентрации 20 тыс/мкл 1-й столбец- CRP(20мкг/мл); 2-й столбец- CRP(20мкг/мл)+ ТТГ(500нМ); 3-й столбецCRP(20мкг/мл)+ ТТГ(500нМ)+ T101(200мкМ); 4-й столбецCRP(20мкг/мл)+ ТТГ(500нМ)+GPRP(15мМ); 5-й столбец- CRP(20мкг/мл)+ ТТГ(500нМ)+GPPP(15мМ). Тромбоциты были помечены флуоресцентно меченными аннексином-V и антителом к фибриногену и проанализированы на проточном цитометре. На гистограммах представлено количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в зависимости от присутствия или отсутствия фармакологических агентов во время активации. Все результаты были нормированы на значение флуоресценции антитела к фибриногену связавшегося с фибриногеном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных стимуляцией тромбоцитов CRP. Представлены усредненные по двум донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Данные получены сотрудником ЦТП ФХФ РАН Я.Н. Котовой 3.1.2.1 Тестирование существующих гипотез, используя тромбоциты пациентов с наследственными нарушениями свертывания крови Также для проверки состоятельности этих двух механизмов, были проведены эксперименты с использованием тромбоцитов от доноров с наследственными нарушениями свертывания крови, приводящих к дисфибриногенемии и дефициту ФXIII. Дисфибриногенемия - это заболевание, связанное с нарушением свертывания крови, которое вызывается дефектом полимеризации фибрина. Метц -фибриновые сгустки являются более хрупкими, чем у нормального -фибринового тромба и состоят почти целиком из тонких фибриновых волокон. Тромбоциты от здоровых доноров и пациентов с дисфибриногенемией и дефицитом ФXIII были стимулированы тромбином (рис. 21 А-Б) или тромбином с CRP (рис. 21 В-Г). Количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов у пациента с дисфибриногенемией было значительно снижено при обоих типах активации. В то время как на поверхности прокоагулянтных 52 тромбоцитов у пациента с дефицитом ФXIII наблюдалось нормальное количество фибриногена (рис. 21 А-Г ). Данные вестерн-блоттинга подтвердили, что общий уровень фибриногена и фактора XIII в лизатах тромбоцитов от здорового донора и пациента с дисфибриногенемией были неотличимы, в то время как у пациента с дефицитом ФXIII не хватало ФXIII, но уровень фибриногена был в норме. Рисунок 21. Тестирование существующих, используя тромбоциты пациентов с наследственными нарушениями свертывания крови. (А-Б) Тромбоциты здоровых доноров и пациентов с генетическими заболеваниями, активировались в концентрации 20 тыс/мкл тромбином (100 нМ) в течение 15 мин. Тромбоциты были помечены флуоресцентно меченными аннексином-V и антителом к фибриногену и проанализированы на проточном цитометре. Сокращения: здоровый-здоровые доноры, ДФ дисфибриногенемия, ФXIII деф – дефицит ФXIII. (A) На точечных диаграммах представлено связывание флуоресцентно меченных аннексина-V (ось абсцисс) и антитела к фибриногену (ось ординат) с активированными тромбоцитами здоровых доноров и пациентов с генетическими заболеваниями (Б) количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов здоровых доноров, пациенов с дисфибриногенемией и дефицитом ФXIII. (В-Г) Тромбоциты здоровых доноров и пациентов с генетическими заболеваниями, активировались в концентрации 20 тыс/мкл тромбином (100 нМ) с CRP (20 мкг / мл) в течение 15 мин. (В) То же, что и в панели А, для активации тромбином (100 нМ) с CRP (20 мкг / мл). (Г) Так же, как на панели Б, для активации с тромбином (100 нМ) с CRP (20 мкг / мл). Все результаты были нормированы на значение флуоресценции антитела к фибриногену связавшегося с фибриногеном на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов здоровых доноров, полученных стимуляцией одним тромбином (Б), тромбином с CRP (Г). Данные для здоровых доноров представлены усреднёнными по трем донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Таким образом, этот результат подтверждает исключительную важность полимеризации фибрина для формирования белкового покрытия, в то время как роль ФXIII не кажется критической. Тем не менее, вклад ТТГ не может быть исключен. 53 3.2 Роль полимеризации фибрина в формировании покрытия из тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов Для того, чтобы проверить могут ли другие белки α-гранул вовлекаться в фибриновую сеть в процессе активации тромбоцитов, тромбоциты были помечены антителлом к тромбоспондину. Тромбоциты активировались тромбином с CRP в присутствии и отсутствии ингибитора полимеризации фибрина - GPRP, используя GPPP как отрицательный контроль (рис. 22 А). Также была произведена стимуляция тромбоцитов CRP в присутствии или отсутствии анцистрона (рис. 20 А). Как видно на гистограммах, добавление ингибитора полимеризации не приводит к изменению количества тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов (рис. 22 А), в то время добавление анцистрона во время активации тромбоцитов CRP приводит к увеличению тромбоспондина на поверхности прокоагулнятных тромбоцитов почти в 3 раза (рис. 22 А), схожий эффект наблюдался для фибриногена (рис. 19 Д). Этот результат может свидетельствовать в пользу того, что полимеризация фибрина может играть важную роль для удержания тромбоспондина, также, как и для фибриногена, на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. С помощью конфокальной микроскопии было показано, что тромбоспондин на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных стимуляцией тромбоцитов тромбином с CRP (при данной активации на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов покрытие из фибриногена формируется), локализован также в виде “шапки” (рис. 22 В ). Более того локализация фибринового покрытия и тромбоспондинового на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных стимуляцией тромбином с CRP (при данной активации на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов покрытие из фибриногена практически отсутствует) или CRP с анцистроном (протеаза, сварачивающая фибриноген), совпадает (рис. 22 Г). (Данные получены сотрудником ЦТП ФХФ РАН Я.Н. Котовой совместно с аспирантом ЦТП ФХФ РАН С.И. Обыденным.) 54 Рисунок 22. Формирование покрытия из тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов и его локализация. Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл (А) тромбином (100нМ) с CRP (20 мкг / мл) в присутствии или отсутствии ингибитора полимеризации фибрина GPRP(15мМ) или отрицательного контроля GPPP (15мМ), (Б) CRP (20мкг/мл) в присутствии или отсутствии анцистрона (концентрация эквивалентна 15 ед. NIH тромбина). Тромбоциты были помечены флуоресцентно меченными аннексином-V и антителом к тромбоспондину и проанализированы на проточном цитометре. На гистограммах представлено (А,Б) количество тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в зависимости от присутствия или отсутствия фармакологических агентов во время активации. Для каждого типа активации, все результаты были нормированы на значение флуоресценции антитела к тромбоспондину связавшегося с тромбоспондином на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, полученных стимуляцией одним активатором. Представлены усредненные по 3-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Звездочками отмечена статистическая достоверность. (В) 55 Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл тромбином (100нМ) с CRP (20 мкг / мл). Представлены типичные конфокальные изображения, полученные методами (В, верхняя панель) ДИК, флуоресценции аннексина-V-FITC (зеленый), антитела к тромбоспондину-PE (красный), также представлены наложения этих трех изображений или (В, нижняя панель) ДИК, флуоресценции аннексинаV-PE (красный), антитела к фибриногену-FITC (зеленый), также представлены наложения этих трех изображений. (Г) Тромбоциты активировались в концентрации 50 тыс/мкл CRP (20 мкг / мл) в присутствии (Г, верхняя панель) тромбина (100нМ) или (Г, нижняя панель) анцистрона (концентрация эквивалентна 15 ед. NIH тромбина. Представлены типичные конфокальные изображения, полученные методами ДИК, антитела к тромбоспондину-PE (красный), антитела к фибриногену-FITC (зеленый), также представлены наложения этих трех изображений. Представлены результаты типичного эксперимента из трех, проведенных с кровью разных доноров. В общей сложности было просканировано 86 прокоагулянтных тромбоцитов, 93% из них имели единичную тромбоспондиновую “шапку”, на всех эих тромбоцитах она была колаколизована с фибриновой. Данные получены сотрудником ЦТП ФХФ РАН Я.Н. Котовой совместно с аспирантом ЦТП ФХФ РАН С.И. Обыденным. 56 3.3 Роль трансглутаминаз в формировании прокоагулянтной активности активированных тромбоцитов 3.3.1 Разработка методов количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов В данной работе было разработано два метода количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов. Первый метод основан на измерении количества активного фактора Х, наработанного комплексом внутренней теназы, второй на измерении количества тромбина, наработанного комплексом протромбиназы. Сложность в разработке данных методов заключалась в том, что за короткий промежуток времени необходимо было провести большое количество манипуляций. Дело в том, что методы направлены на изучение формирования прокоагулянтной активности тромбоцитов при разных условиях активации тромбоцитов. Поэтому, комплекс внутренней теназы/протромбиназы необходимо было собирать одновременно на нескольких образцах активированных тромбоцитов. Также из литературных данных известно, что в случае сборки комплекса внутренней теназы, фактор VIIIa крайне не стабилен и достаточно быстро распадается [Ahmad S.S.et al. 2002], поэтому активация его неактивного предшественника должна была производиться непосредственно перед сборкой комплекса. Кроме того, при разработке данных методов, необходимо было учесть, что разные комбинации активаторов дают разное количество прокоагулянтных тромбоцитов, а также добавление трансглутаминаз, вероятно, способно изменить их прокоагулянтную активность. Поэтому для каждого из методов необходимо было найти линейную область их работы. 3.3.1.1 Разработка метода измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по ускорению активации фактора X комплексом внутренней теназы Остановимся подробнее на методе, основанном на сборке комплекса внутренней теназы на поверхности активированных тромбоцитов. Проблемы, описанные выше, были решены путём введения трёх типов смесей. Первый тип смесей представлял собой активационные смеси для тромбоцитов. Второй тип – смесь, в которой ФVIII активировался тромбином, а затем путём добавления PPACK активация останавливалась. Третий тип – смесь содержащая фактор X и фактор IXа. Для того чтобы получить информацию о количестве фактора Xа, наработанного комплексом внутренней теназы, был использован хромогенный субстрат на фактор Xa. Изменение оптической плотности при расщеплении субстрата измерялось с помощью планшетного спектрофотометра. Полученные данные обрабатывались (см. п. 2.2.6.1). 57 Схематически эксперимент можно представить следующим образом: 1. t=0-15 мин. – активация тромбоцитов Для этого в момент времени t=0 мин собирается смесь 1: Тромбоциты + CaCl2 + активатор тромбоцитов 2. t=13-14 мин. – активация фактора VIII Для этого в момент времени t=13 мин собирается смесь 2: ФVIII + тромбин 3. t=14мин. – остановка активации фактора VIII Для этого в смесь 2 добавляется PPACK (необратимый ингибитор тромбина). 4. t=15 мин. – сборка комплекса внутренней теназы на поверхности активированных тромбоцитов Для этого смесь 2 (фактор VIIIa +PPACK) добавляется в смесь 1 (активированные тромбоциты + CaCl2), а затем добавляется смесь 3 (IXa+X). 4. t=16-20 мин. – активация фактора X комплексом внутренней теназы 5. t=20 мин. 5.1. Добавляется EDTA (таким образом, останавливается активация фактора X) 5.2. Добавляется хромогенный субстрат (S2765) 6. t=-21-51 мин – анализ Проверка работы методики Для проверки работы методики был проведён следующий эксперимент: тромбоциты активировались различными активаторами, затем на их поверхности собирался комплекс внутренней теназы (см. п. 2.2.6.1). Для контроля был взят образец с неактивированными тромбоцитами. Данные, полученные с планшетного спектрофотометра, были проанализированы, как описано в п. 2.2.6.1. Как мы можем видеть из графика (рис.23), при активации тромбоцитов разными активаторами скорость изменения оптической плотности (т.е. скорость расщепления субстрата) разная. В образце, где тромбоциты активировались коллагеном, субстрат фактически не расщепляется, так как коллаген является слабым активатором. В контрольном образце субстрат также фактически не расщепляется. Все эти результаты вполне согласуются с ожидаемыми. 58 Рисунок 23. Скорость расщепления субстрата фактором Xa, в зависимости от активаторов тромбоцитов. 1-й столбец – контрольный образец, тромбоциты не активировались, 2-й столбец – тромбоциты активируются тромбином (ТБ) (100 нМ), 3-й столбец – тромбин (100 нМ) + конвульксин (10 нг/мл), 4-й столбец – тромбин (100 нМ) + коллаген (20 мкг/мл), 5-й столбец – коллаген (20 мкг/мл), 6-й столбец – конвульксин (10 нг/мл). Концентрация тромбоцитов в смеси 1 – 100тыс/мкл. Представлены усредненные по 2-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Оптимизация методики проведения эксперимента Для оптимизации работы методики необходимо было провести ряд дополнительных исследований: 1. построить калибровочную кривую, которая связывает скорость расщепления субстрата и концентрацию активировавшегося фактора X; 2. проверить работает ли метод в линейной области. Построение калибровочной кривой Во всех экспериментах результаты представлялись в виде скорости изменения оптической плотности, т.е. скорости расщепления субстрата фактором Xa. Чтобы связать скорость расщепления субстрата фактором Xa и количество активировавшегося фактора X был проведен эксперимент: фактор Xa был разведен до концентраций: 512,256,128,64,32,16,8,4,2,1,0 нМ; разлит в планшет по 30 мкл, затем было добавлено по 30 мкл 100 нМ EDTA и 140 мкл хромогенного субстрата 2765 в конечной концентрации 59 0,4 мМ. Измерение оптической плотности раствора проводили в планшетном спектрофотометре. По полученным данным была построена кривая зависимости скорости расщепления субстрата от концентрации фактора Xа (рис.24). Полученная кривая была аппроксимирована прямой пропорциональностью. В результате чего получили уравнение, связывающее количество фактора Xa и скорость расщепления субстрата S2765: X= Y/P1, где P1=0,00042,54 X и Y соответственно концентрация фактора Xa и скорость расщепления субстрата S2765. В дальнейшем все полученные результаты представляются в количестве активировавшегося фактора X в нМ. Рисунок 24. Калибровочная кривая расщепления субстрата S2765 Xa фактором. (■) Представлены усредненные по 2-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего, красная кривая - аппроксимация прямой пропорциональностью X= Y/P1, где P1=0,00042, а X и Y соответственно концентрация фактора Xa и скорость расщепления субстрата S2765 Выбор линейной области Все эксперименты необходимо проводить в линейных областях, т.е. где ФX ещё не успел весь связаться и активироваться на поверхности активированных тромбоцитов. Поэтому для данной концентрации добавляемого нами фактора X поверхность тромбоцитов должна быть лимитирующим фактором. Чтобы определить концентрацию 60 тромбоцитов, подходящую для наших исследований, был проведен следующий эксперимент. При активации концентрации тромбоцитов были взяты такими, чтобы при сборке комплекса внутренней теназы, концентрации активированных тромбоцитов были: 0,1,2,4,8,16,32,64,128 тыс/мкл. Тромбоциты активировались тромбином (100 нМ) с конвульксином (10 нг/мл) в течение 15 минут (максимальная активация). На поверхности этих тромбоцитов собирался комплекс внутренней теназы (см. п. 2.2.6.1) с концентрацией фактора X (400 нМ), которая в последующем будет использоваться в экспериментах. Затем эту реакцию останавливали путем добавления ЭДТА, после чего добавлялся хромогенный субстрат на фактор Xa. Измерение оптической плотности раствора проводили в планшетном спектрофотометре. По полученным данным была построена кривая зависимости наработки фактора Xа от концентрации тромбоцитов (рис. 25). Как видно из графика для наших экспериментов нам подходят концентрации тромбоцитов от 0 до 10 тыс/мкл. Для последующих экспериментов концентрация тромбоцитов при сборке комплекса внутренней теназы была выбрана 8 тыc/мкл, а активация тромбоцитов проводилась при 100 тыc/мкл. 61 Рисунок 25. Зависимость наработки ФXa от концентрации тромбоцитов. (■) На поверхности тромбоцитов, активированных тромбином (100 нМ) с конвульксином (10 нг/мл) (максимальная активация) был собран комплекс внутренней теназы. На внутреннем графике показана линейная область метода. Представлены усредненные по 2-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего. Предполагаемый вид кривой наработки ФXa от концентрации тромбоцитов показан красной кривой. Влияние температуры на активацию фактора X комплексом внутренней теназы Из литературных данных известно, что скорость биохимических реакций зависит от температуры. Так, при повышении температуры на каждые 10°С скорость большинства реакций увеличивается в 2-4 раза. Для комплексов внешней теназы и протромбиназы было показано, что при повышении температуры на 10°С их активность возрастает в 2 раза и достигает максимума при температуре 37°С. Однако, об активности внутренней теназы таких данных нет, поэтому для понимания работы данного комплекса была измерена его ферментативная активность при температурах от 20 до 43 °С, в качестве отрицательно заряженной поверхности выступали фосфолипиды (Рис. 26). 62 Рисунок 26. Зависимость активности комплекса внутренней теназы от температуры. Представлены усредненные по 3-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего. Как видно из результатов, комплекс внутренней теназы ведет себя качественно иначе, чем протромбиназа и внешняя теназа. Максимум ферментативной активности достигается в районе 28°С, а при повышении температуры с 28°С до 37°С активность падает практически в 2 раза. В нашей работе сборка комплекса внутренней теназы проводилась при температуре 37°С. 3.3.1.2 Разработка метода измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по ускорению активации протромбина комплексом протромбиназы Как и в предыдущем методе, сборка комплекса протромбиназы на поверхности активированных тромбоцитов проводилась в несколько этапов. Первый этап - активация тромбоцитов, второй - сборка непосредственно самого комплекса путем добавления к активированным тромбоцитам факторов Xa и II, фактор Va не добавлялся, т.к. фактор V есть в α-гранулах тромбоцитов и при активации тромбоцитов происходит их дегрануляция. Для того чтобы получить информацию о количестве фактора IIа, наработанного комплексом протромбиназы, был использован хромогенный субстрат на фактор IIa. Изменение оптической плотности при расщеплении субстрата измерялось с помощью планшетного спектрофотометра. Данные, полученные со спектрофотометра, 63 аппроксимировали теоретической зависимостью оптической плотности от времени, которая была получена путём решения дифференциального уравнения, описывающего скорость изменения оптической плотности. В результате чего получали данные о зависимости скорости расщепления субстрата в начальный момент времени от способа активации тромбоцитов (см. п. 2.2.6.2). Схематически эксперимент можно представить следующим образом: 1. t=0-10 мин. – активация тромбоцитов Для этого в момент времени t=0 мин собирается смесь 1: Тромбоциты + CaCl2 + активатор тромбоцитов 2. t=10 мин. – сборка комплекса протромбиназы на поверхности активированных тромбоцитов Для этого смесь 2 (фактор II + фактор Xa) добавляется в смесь 1 (активированные тромбоциты + CaCl2) 4. t=10-15 мин. – активация ФII комплексом протромбиназы 5. t=15 мин. 5.1. Добавляется EDTA (таким образом останавливается активация ФII) 5.2. Добавляется хромогенный субстрат (Chromozym ТН) 6. t=16-46 мин – анализ Оптимизация методики проведения эксперимента Также как и для метода описанного выше, необходимо было выделить линейную область, в которой работает данный метод. Эксперимент проводился аналогичным образом. Выбор линейной области Тромбоциты в концентрации 50 тыс/мкл активировались кальциевым ионофором в концентрации 5мкМ (максимальная концентрация) в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее активированные тромбоциты разводились до концентраций 0,2,4,8,16,32 тыс/мкл и на их поверхности собирался комплекс протромбиназы (см. п. 2.2.6.2). Фактор II активировался этим комплексом в течение 5 минут. Затем эту реакцию останавливали путем добавления ЭДТА, после чего добавлялся хромогенный субстрат на фактор IIa. Измерение оптической плотности раствора проводили в планшетном спектрофотометре. Результаты эксперимента представлены на рис. 27. 64 Рисунок 27. Зависимость наработки фактора IIa от концентрации тромбоцитов. (■) На поверхности тромбоцитов, активированных кальциевым ионофором (5мкМ) (максимальная активация) был собран комплекс протромбиназы. На внутреннем графике показана линейная область работы метода. Представлены усредненные по 2-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Предполагаемый вид кривой наработки фактор IIa от концентрации тромбоцитов показан красной кривой. Как видно из графика для наших экспериментов нам подходят концентрации тромбоцитов от 0 до 8 тыс/мкл. Для последующих экспериментов концентрация тромбоцитов при сборке комплекса внутренней теназы была выбрана 5 тыс/мкл, а активация тромбоцитов проводилась при 50 тыс/мкл. 3.3.1.3 Сравнение работы 2-х методов измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов на фосфолипидах Чтобы понять, работают ли описанные методы в искусственных условиях и не вносит ли добавление тромбоцитов артефакты, была измерена прокоагулянтная активность фосфолипидов, а также пленок с фибробластами(ФБ)/тканевым фактором (ТФ), как описано в п. 2.2.6.3 (рис. 28). 65 А Б Рисунок 28. Способность метода чувствовать присутствие фосфолипидов, а также локальную концентрацию ТФ. (А) Наработка ФXa комплексом внутренней теназы. (Б) Наработка тромбина комплексом протромбиназы. Представлены усредненные по 3-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего. 66 Как можно заметить оба метода чувствуют присутствие фосфолипидов в системе, а так же их различную концентрацию. Видно, что пленка с иммобилизованным тканевым фактором имеет более высокую прокоагулянтную активность по сравнению с фибробластами в тесте с внутренней теназаой. Однако этот эффект достаточно слабый и сравним с прокоагулянтной активностью фосфолипидов в концентрации 200 нМ. Таким образом, анализируя результаты, полученные выше, можно заметить, что оба метода работают достаточно хорошо. Однако, в условиях данной работы метод, основанный на сборке комплекса внутренней теназы, наиболее подходит для данной работы. Чтобы оценить прокоагулянтную активность тромбоцитов необходимо получать различные количества прокоагулянтных тромбоцитов и добиться этого можно используя различные активаторы, в том числе и тромбин. Поэтому в случае сборки комплекса протромбиназы на поверхности активированных тромбоцитов, разделить тромбин, наработанный из протромбина этим комплексом и тромбин, добавленный в систему для активации тромбоцитов, представляется достаточно сложной задачей. 3.3.1.4 Разработка метода измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов по влиянию на свертывание плазмы Помимо изучения работы прокоагулянтной активности тромбоцитов на отдельных комплексах была предпринята попытка создать метод, работающий в плазме. Тогда бы мы смогли оценить, как разное количество прокоагулянтных тромбоцитов влияет на работу всей системы плазменного свертывания целиком. Предполагалось сделать следующий эксперимент: производилась активация тромбоцитов, затем к ним добавлялась свободная от тромбоцитов плазма. С помощью планшетного спектрофотометра измерялось время, за которое плазма свертывается наполовину. Проверка работы методики Для проверки работы методики был проведён следующий эксперимент: тромбоциты (в концентрации 200 тыс/мкл) активировались различными активаторами. В качестве контроля было взято два образца: образец без тромбоцитов и образец с неактивированными тромбоцитами. Затем добавлялось по 90 мкл свободной от тромбоцитов плазмы содержащей CaCl2 такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (100 мкл) его концентрация была 20 мМ. После этого, с помощью планшетного спектрофотометра, регистрировалось изменение оптической плотности при свертывании плазмы. Видно (таблица 2), что при добавлении в плазму тромбоцитов, активированных различными активаторами, скорость сворачивания плазмы разная, а в образце, где 67 тромбоциты отсутствовали - плазма полностью не свернулась за время проведения эксперимента, что вполне согласуется с ожидаемым результатом. Условия эксперимента Время, за которое плазма свертывается наполовину, мин Тромбоцитов нет Плазма не свернулась за время проведения эксперимента Тромбоциты без активатора 44,3±0,2 Активатор конвульксин, 10 нг/мл 34,3±0,9 Активатор конвульксин, 100 нг/мл 28,3±0,6 Таблица 2. Время, за которое плазма свернулась на половину в зависимости от условий активации тромбоцитов. Результаты представлены для 1 донора усредненные по 2-м экспериментам величины ± стандартные ошибки среднего. Выбор линейной области В ходе проведения экспериментов встал вопрос о том, какая концентрация тромбоцитов должна быть взята в данной методике, чтобы она работала в линейных областях. Был проведён следующий эксперимент: тромбоциты были взяты в концентрациях: 0, 12,5, 25, 50, 100, 168 тыс/мкл, которые были активированы 100 нг/мл конвульксина в 10 мкл в присутствии 2,5 мМ CaCl2, затем добавлялось по 90 мкл свободной от тромбоцитов плазмы, содержащей CaCl2 такой концентрации, чтобы в рабочем растворе (100 мкл) его концентрация была 20 мМ. После этого с помощью планшетного спектрофотометра регистрировалось изменение оптической плотности при свертывании плазмы. 68 Рисунок 29. Время за которое плазма свернулась наполовину в зависимости от концентрации активированных тромбоцитов. Все образцы тромбоцитов были активированы конвульксином (100 нг/мл). Результаты усреднены для 3 доноров величины ± стандартные ошибки среднего. В ходе проведения данного эксперимента стало понятно, что данный метод практически не чувствителен к разным концентрациям тромбоцитов при данных условиях активации (рис. 29). Кроме того, в ряде экспериментов было показано, что при активации тромбоцитов различными активаторами метод также слабо чувствителен и существенно зависит от доноров. Поэтому был сделан вывод о том, что данный метод не может быть использован для дальнейших исследований в данной работе. Таким образом, в данной работе мы остановились на использовании метода, основанного на сборке комплекса внутренней теназы для изучения прокоагулянтной активности субпопуляций тромбоцитов. 3.3.2 Зависимость прокоагулянтной активности тромбоцитов от степени активации Существуют данные, что прокоагулянтный ответ тромбоцитов зависит от степени их активации, т.е. количества прокоагулянтных тромбоцитов [Kempton C.L. et al. 2005]. Для того чтобы это проверить, был проведен следующий эксперимент: тромбоциты активировались в концентрации 100 тыс/мкл при комнатной температуре в буфере А в 69 присутствии 2.5 мМ CaCl2. Разная степень активации тромбоцитов достигалась следующими комбинациями активаторов: а) 100 нМ тромбина и 1, 5,100,1000 нг/мл конвульксина, б) 10,100 нМ тромбина. Далее их прокоагулянтная активность измерялась, как описано в п. 2.2.6.1. Ожидалось, что с увеличением степени активации тромбоцитов их прокоагулянтная активность будет возрастать (т.е. количество активировавшего фактора X). Однако видно, что при активации тромбоцитов тромбином 100 нМ с конвульксином 1нг/мл прокоагулянтная активность тромбоцитов достигает максимума, при дальнейшем увеличении концентрации конвульксина прокоагулянтная активность тромбоцитов резко падает (рис.30). Рисунок 30. Зависимость количества активировавшего фактора X от степени активации тромбоцитов. Представлены усредненные по 3-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего. 3.3.3 Влияние тканевой трансглутаминазы на регуляцию прокоагулянтной активности тромбоцитов В работе Д.Дейла было установлено, что трансглутаминазы играют важную роль в формировании прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Так же существовали данные о том, что основные реакции свертывания крови происходят на поверхности 70 прокоагулянтных тромбоцитов, что частично было подтверждено в п. 3.3.2. Однако роль трансглутаминаз в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов не изучалась. Для выяснения роли тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов был проведен следующий эксперимент. Было взято 2 образца тромбоцитов, один из которых активировался 100 нг/мл конвульксина с добавлением тканевой трансглутаминазы (500 нМ), второй образец тромбоцитов активировался 100 нг/мл конвульксина, а через 9 мин после начала активации к нему была добавлена тканевая трансглутаминаза (500 нМ). В качестве контроля были взяты 2 образца: образец с неактивированными тромбоцитами и образец с тромбоцитами, активированными конвульксином (100 нг/мл). Далее прокоагулянтная активность активированных тромбоцитов измерялась, как описано в п. 2.2.6.1. Данные этого эксперимента представлены на рис. 31. Рисунок 31. Наработка фактора Xa в зависимости от различных активаторов. 1-й столбец – контрольный образец, тромбоциты не активировались; 2-й столбец – тромбоциты активировались конвульксином 100 нг/мл; 3-й столбец – тромбоциты активировались конвульксином 100 нг/мл с добавлением ТТГ 500 нМ; 4-й столбец – тромбоциты активировались конвульксином 100 нг/мл и через 9 минут после начала активации тромбоцитов добавлялась ТТГ 500 нМ. Представлены усредненные по 2-м донорам величины ± стандартные ошибки среднего. Видно, что количество активировавшегося фактора X при добавлении ТТГ к тромбоцитам через 9 мин после начала активации в пределах погрешности совпадает с 71 результатами, полученными просто при активации тромбоцитов конвульксином. При добавлении ТТГ сразу при активации тромбоцитов результат также в пределах погрешности совпадает с результатами, полученными просто при активации тромбоцитов конвульксином. Количество активировавшегося фактора X в этих трёх образцах значительно больше, чем в контрольном образце с неактивированными тромбоцитами. Этот результат свидетельствует, что добавление внешней ТТГ не влияет на прокоагулянтную активность тромбоцитов. 72 Глава 4. Обсуждение Центральной задачей данной работы являлось исследование механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. В данной работе впервые было показано, что фибрин(оген) удерживается на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов посредством тромбин-индуцированной полимеризации фибрина, кроме того тканевая трансглутаминаза также способна пришивать фибриноген к их поверхности. Тем самым, мы показали, что агрегационная активность прокоагулянтных тромбоцитов формируется за счет полимеризации фибрина, а также трансглутаминазной реакции. Было показано, что добавление тканевой трансглутаминазы при активации тромбоцитов или после нее не меняет их прокоагулянтную активность, количество прокоагулянтных тромбоцитов при этом также остается неизменным. Для этого было разработано два метода количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов, основанных на сборке ферментативных комплексов на поверхности активированных тромбоцитов. Несмотря на то, что прокоагулянтные тромбоциты были открыты более 10 лет назад, [Alberio L. et al. 2000; Dale G.L. et al. 2002] механизмы формирования и удерживания покрытия из белков на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, как и его функция, до сих пор слабо изучены. В недавних исследованиях Якименко А.О. со своими коллегами пердположили возможный механизм вовлечения прокоагулянтных тромбоцитов в агрегаты [Yakimenko, A. O. et al. 2012], несмотря на отсутствие на их поверхности активной формы интегрина αIIbβ [Dale G.L. et al. 2002, Mattheij N.J. et al. 2013]. А именно, что прокоагулянтные тромбоциты вовлекаются в агрегаты за счет связывания активированными рецепторами GPIIbIIIa на непрокоагулянтных тромбоцитах свободных концов молекул фибриногена прокоагулянтных тромбоцитов в составе их белкового покрытия. В данной работе мы напрямую показали, что для вовлечения прокоагулянтых тромбоцитов в агрегаты необходима активная форма GPIIbIIIa на поверхности непрокоагулянтных тромбоцитов. Кроме того, прокоагулнятные тромбоциты не способны вовлекаться в агрегаты в отсутствии покрытия из фибриногена на их поверхности, однако они не способны агрегировать друг с другом за счет полимеризации фибрина (данные получены сотрудником ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Якименко А.О.). В связи с этим изучение механизмов формирования белкового покрытия становится чрезвычайно важным. Кроме того, тот факт, что фибриноген на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов локализуется в виде единичной “шапки” (данные получены аспирантом ЦТП ФХФ РАН Обыденным С. И.), а не как предполагалось ранее в виде “шубы” или отдельных 73 островков, как это было показано для непрокоагулянтных тромбоцитов ранее [Peerschke E. I. 1995], вызывает дополнительный интерес к изучению механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Одним из главных механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов предполагалась трансглутаминазная реакция, т.к. в работе Д.Дейла и др. было показано, что добавление дансилкадаверина-конкурирующего аминодонора для трансглутаминаз, а также специфических антител к фактору XIIIa доз зависимо снижает количество α-гранулярных белков на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Однако у мышей дефицитных по фактору XIII белковое покрытие формировалось нормально [Jobe S.M. et al. 2005]. Это заставляло задуматься о наличие дополнительных механизмов. Таким механизмом могла бы быть полимеризация фибрина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов [Munnix I.C. et al. 2009]. В пользу существования этого механизма свидетельствует то, что стимуляция тромбоцитов без тромбина (агонистом гликопротеина VI-конвульксином или PAR-1рецептора-SFLLRN) приводит к формированию прокоагулянтных тромбоцитов без белкового покрытия. Однако, серьезно этот механизм никем не изучался. В данной работе мы проверили оба этих возможных механизма. Наши результаты показали, что добавление ингибитора полимеризации фибрина GPRP в 5,5 раз уменьшает количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов при их активации тромбином и в 2,6 раз при их активации тромбином с CRP. Кроме того, стимуляция тромбоцитов CRP без тромбина, в присутствии анцистрона - протеазы, сворачивающей фибриноген, в 4 раза увеличивает количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Помимо этого, в экспериментах с тромбоцитами пациента с нарушением полимеризации фибрина (дисфибриногенемией) было показано, что количество фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов снижено почти в 5 раз при стимуляции тромбоцитов тромбином и в 8 раз при их стимуляции тромбином с CRP по сравнению со здоровыми донорами. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что механизм полимеризации фибрина играет важную роль в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Однако это не исключает возможность существования дополнительных механизмов. В согласии с данными Джоба С.М. [Jobe S.M. et al. 2005] было показано, что фибриногеновое покрытие на поверхности прокоагулянтых тромбоцитов у пациентов с дефицитом ФXIII формируется нормально. В своем исследовании Джоб С.М. предположил, что в случает дефицита ФXIII возрастает роль другой трансглутаминазы – TTГ. В нашей работе было показано, что добавление пан-трансглутаминазного 74 ингибитора - T101 не приводит к значимому уменьшению количества фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Однако, при добавлении ТТГ при активации тромбоцитов CRP, количество фибриногена на их поверхности возрастает в 3 раз. Откуда можно сделать вывод, что транглутаминазы действительно способны пришивать фибриноген к поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако этот механизм по всей видимости не является ключевым. Кроме того, было показано, что формирование покрытия из тромбоспондина, также индуцируется анцистром при стимуляции тромбоцитов CRP в отсутствии тромбина (данные получены сотрудником ЦТП ФХФ РАН Я.Н. Котовой). Поэтому несмотря на то, что ингибитор полимеризации фибрина GPRP не ингибирует формирование покрытия из тромбоспондина, основываясь на предыдущих данных по встраиванию тромбоспондина в фибриновый сгусток [Bale M. D. et al. 1995], формирование фибрина важно для удержания тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Подытоживая полученные данные, можно заключить, что полимеризация фибрина является наиболее значимым механизмом формирования покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов в то время как механизм, обусловленный трансглутаминазной реакцией, представляется второстепенным. Кроме того, механизм полимеризации фибрина является по всей видимости одним из механизмов удержания других белков -гранул на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Однако, возможно, что роль трансглутаминазной реакции может увеличиться in vivo, где секреции тромбоцитов является более значимой в связи с увеличением локальной концентрации тромбоцитов в пределах тромба. Как уже обсуждалось выше, Д.Дейлом [Dale G.L. et al. 2002] показано, что трансглутаминазы влияют на формирование белкового покрытия у прокоагулянтных тромбоцитов. Также, рядом ученых было показано, что на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов помимо белков α-гранул удерживаются такие белки как факторы VIII, VIIIа, IX, IXа [Kempton C.L. et al. 2005; Panteleev M.A. et al. 2005; London F. S. et al. 2004]. И именно на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов происходят основные реакции плазменного звена системы свертывания крови, такие как сборка комплекса протромбиназы и внутренней теназы. Поэтому, встал вопрос о влиянии трансглутаминаз на формирование прокоагулянтной активности тромбоцитов. Однако прежде чем изучать данный вопрос, необходимо было разработать метод, с помощью которого это стало бы возможным. В работе было разработано два метода основанных на сборке ферментативных комплексов на поверхности активированных тромбоцитов. Один был основан на 75 измерении количества фактора Xа, активированного из предшественника комплексом внутренней теназы, второй – на измерении количества тромбина, активированного комплексом протромбиназы. Ранее ученые применяли подобные подходы для изучения прокоагулянтной активности тромбоцитов. Ф.С. Лондон и коллеги собирали на поверхности тромбоцитов, стимулированных в разных концентрациях либо тромбином, либо SFLLRN комплекс внутренней теназы [London F. S. et al. 2004]. Кемптон C.Л. и коллеги в своей модельной системе измеряли прокоагулянтную активность тромбоцитов, стимулированных тромбином с конвульксином, по генерации тромбина и фактора Xa комплексами протромбиназы и внутренней теназы соответственно [Kempton C.L. et al. 2005]. Однако существенным недостатком данных методов являлось то, что ни один из них до конца не учитывал, что разные комбинации активаторов приводят к разному количеству прокоагулянтных тромбоцитов и соответственно к разному прокоагулянтному ответу системы. В результате чего мы могли бы выйти за область работы метода и получить ошибочный результат. Поэтому, для того чтобы изучать влияние трансглутаминаз на прокоагулянтную активность тромбоцитов, было решено подобрать свои параметры сборки комплексов на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов и выбрать для них линейную область. Для каждого из разработанных методов были подобраны такие концентрации тромбоцитов (от 0 до 10 тыс/мкл - для внутренней теназы и от 0 до 8 тыс/мкл - для протромбиназы), при которых они ведут себя линейным образом. Погрешность при воспроизведении для внутренней теназы составляла 11%, протромбиназы - 10%. Для комплекса внутренней теназы мы дополнительно исследовали влияние температуры на его ферментативную активность, т.к. в отличие от комплекса протромбиназы, сведений о его активности в литературных данных не нашлось. Оказалось, что комплекс внутренней теназы ведет себя несколько иначе, чем протромбиназа. Максимум ферментативной активности для это комплекса достигается в районе 28°С, а при повышении температуры с 28°С до 37°С активность падает практически в 2 раза. Однако, несмотря на это, сборка обоих комплексов производилась при 37°С температуре. Также мы сравнили работу двух этих методов в искусственной системе. Было показано, что они ведут схожим образом: чувствуют разные концентрации фосфолипидов и при этом слабо реагируют на внесение в систему пленок с фибробластами/тканевым фактором, что вполне соответствует ожидаемым результатам. Таким образом, был сделан вывод, что оба этих метода можно применять для изучения прокоагулянтной активности тромбоцитов. Однако, из соображений удобства было решено остановиться на методе, 76 основанном на измерении количества фактора Xа, наработанного комплексом внутренней теназы. Главным достоинством описанных выше методов является то, что в каждом случае мы работаем с системой, о которой все знаем, в отличие от полной системы свертывания крови, где происходящее на поверхности тромбоцитов является “черным ящиком”, и мы не можем точно сказать, что конкретно привело к полученному результату. В живой системе на отрицательно заряженной поверхности тромбоцитов собирается сразу несколько ферментативных комплексов. Поэтому интересно было бы провести исследование, как тромбоциты предоставляют свою поверхность для сборки сразу нескольких. Был сделан ряд попыток создать метод, работающий в свободной от тромбоцитов плазме. Однако оказалось, что этот метод слабо чувствителен к разным концентрациям активированных тромбоцитов, что не позволило в дальнейшем использовать этот метод. Полученный результат подтверждает, что тромбоциты не нужны на ранних стадиях свертывания. Можно предположить, что они играют роль в более поздних этапах, при распространении свертывания в пространстве и формирования тромбоцитарной пробки, что возможно увидеть при исследовании в потоке. Таким образом, данный метод требует значительной модернизации, что выходит за рамки настоящей работы. Таким образом, все результаты, представленные далее, были получены с помощью метода, выбранного выше. Первой поставленной задачей было исследовать прокоагулянтную активность тромбоцитов в зависимости от степени их активации. Ранее на прямую было показано, при активации тромбоцитов тромбином или PAR-1-активирующем пептидом (SFLLRN) доз зависимо увеличивается концентрация фактора Xa, активированного комплексом внутренней теназы, кроме того, возрастает и количество прокоагулянтных тромбоцитов, т.е. прокоагулянтный ответ системы тромбоцитов возрастает за счет увеличения количества прокоагулянтных тромбоцитов. В результате проведенных экспериментов было установлено, что c увеличением степени активации количество активного фактора X возрастает, как и в описанной выше работе. Однако при концентрации активаторов конвульксин 1 нг/мл + тромбин 100нМ оно достигает максимума и при дальнейшем увеличении концентрации конвульксина оно резко падает. При концентрации конвульксин 1000 нг/мл + тромбин 100нМ количество активного фактора X падает в 11±5 и становится в пределах погрешности равным количеству активного фактора X в контрольном образце, где тромбоциты не активировались ничем. Резкое уменьшение фактора Xа при больших концентрациях 77 активаторов может быть обусловлено появлением большой площади прокоагулянтной поверхности, за счет увеличения концентрации прокоагулянтных тромбоцитов, что способствует связыванию компонентов комплекса внутренней теназы в ее разных местах, что может тормозить сборку комплекса внутренней теназы. Данный результат также напрямую подтверждает, что прокоагулянтных тромбоциты более прокоагулянтны, т.к. с увеличением степени активации их количество в суспензии возрастает [Alberio L, et al. 2000; London F.S et al. 2004; Panteleev M.A. et al. 2005]. Далее был исследован вопрос о влиянии трансглутаминаз на формирование прокоагулянтной активности тромбоцитов. Были проведены эксперименты по проверке влияния тканевой трансглутаминазы на формирование прокоагулянтной активности тромбоцитов. Результаты данного эксперимента показали, что добавление тканевой трансглутаминазы в момент активации и через 9 минут после начала активации тромбоцитов не влияет на количество фактора X, активированного комплексом внутренней теназы. Этот результат свидетельствует, что добавление внешней ТТГ не влияет на прокоагулянтную активность тромбоцитов. Кроме того, добавление ТТГ к тромбоцитам во время активации не меняет количества прокоагулянтных тромбоцитов. Однако тромбоциты сами секретируют ТТГ и ее влияние на прокоагулянтную активность тромбоцитов может оказаться решающим. Так Д.Дейла и коллеги показали, что использование конкурирующего амино-донора – для трансглутаминаз-дансилкадаверина, а также анти-FXIIIa антител приводит к блокированию образования белкового покрытия у прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002], что свидетельствует о возможной роли трансглутаминаз в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов, в том числе и ТТГ. Также тромбоциты секретируют факторт XIII, который также является транглутаминазой, однако в данной работе его влияние на прокоагулянтную активность тромбоцитов не исследовалось. С. Кулкарни с коллегами [Kulkarni S., et al. 2004] показали в своей работе, что фактор XIIIa и калпаин, действуя через GPIIb/IIIa, регулируют переход тромбоцитов из проадгезивного в прокоагулянтный тип. Однако Джоб С.М. с коллегами в своей работе показал [Jobe S.M. et al. 2005], что мыши дефицитные по фактору XIIIa имели сходные геморрагические диатезы, что и у людей с дефицитом фактора XIIIa, включая высокую степень спонтанных кровотечений и внутриутробную гибель плода. Они также обнаружили, что отсутствие фактора XIIIa не влияло на образование прокоагулянтных тромбоцитов, появление прокоагулянтных фосфолипидов или полной экспрессии Р-селектина в мышиных тромбоцитах. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фактор XIIIa не является необходимым для образования прокоагулянтных 78 тромбоцитов и предполагает, что другая клеточная трансглутаминаз, а именно тканевая трансглутаминаза, может компенсировать отсутствие фактора XIIIa. Кроме того, как было показано выше, покрытие из фибриногена может формироваться на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов за счет тромбин индуцированной полимеризации, Мюнникс и коллеги в своей работе предположили, что именно в это фибриновое покрытие могут запутываться другие белки, присутствующие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов [Munnix I.C. et al. 2009]. Возможно, именно этот механизм играет также важную роль в формировании прокоагулянтной активности прокоагулянтных тромбоцитов. Таким образом, влияние трансглутаминаз на прокоагулянтную активность тромбоцитов является открытым вопросом и требует дальнейшего изучения. 79 Выводы 1. Полимеризация фибрина играет определяющую роль в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов 2. Трансглутаминазы способны формировать белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако значимость этого механизма при активации тромбоцитов тромбином меньше, чем роль полимеризации 3. Разработано два метода, позволяющих количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов, основанных на сборке ферментативных комплексов протромбиназы и внутренней теназы на поверхности активированных тромбоцитов. Для каждого из методов выбрана линейная область работы. Погрешность при воспроизведении составляет 11% для комплекса внутренней теназы и 10% для протромбиназы 4. Тканевая трансглутаминаза не влияет на прокоагулянтную активность тромбоцитов, а также не влияет на количество прокоагулянтных тромбоцитов 80 Благодарности Я глубоко признательна моему научному руководителю Михаилу Александровичу Пантелееву и директору Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову. Также Котовой Яне Николаевне, Обыденному Сергею Ивановичу и Якименко Алене Олеговне за неоценимый вклад в проведении экспериментов. Особую благодарность выражаю нашим иностанным коллегам Matthias Canault и Marie-Christine Alessi за предоставление пациентов с редкими генетическими заболеваниями. Также благодарю профессора Р.В. Фарндейла за любезно предоставленный CRP 81 Список литературы 1. Ahmad SS, London FS, Walsh PN. “The assembly of the factor X-activating complex on activated human platlets”. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2002, 1: 48-59 2. Auger J.M., Kuijpers M.J., Senis Y.A., Watson S.P., Heemskerk J.W. “Adhesion of human and mouse platelets to collagen under shear: a unifying model”. FASEB J. 2005,19(7): 825827 3. Bachelot-Loza C., Badol P., Brohard-Bohn B., Fraiz N., Cano E., Rendu F. “Differential regulation of platelet aggregation and aminophospholipid exposure by calpain”. Br J Haematol 2006; 133(4): 419-426 4. Bajaj SP, Harmony JA, Martinez-Carrion M, Castellino FJ. “Human plasma lipoproteins as accelerators of prothrombin activation”. J Biol Chem 1976, 251: 5233-5236 5. Bale M. D., Westrick L. G., and Mosher D. F. “Incorporation of thrombospondin into fibrin clots” J. Biol. Chem. 1985, 260, 7502-7508 6. Beltrami E, Jesty J. “The role of membrane patch size and flow in regulating a proteolytic feedback threshold on a membrane: possible application in blood coagulation”. Mathematical Biosciences 2001, 172: 1-13 7. Carla Esposito and Ivana Caputo. Mammalian transglutaminases. “Identification of substrates as a key to physiological function and physiopathological relevance”. The FEBS Journal 272 (2005) 615-631, 2004 8. Clemetson KJ, Clemetson JM.Platelet receptors. In: Michelson AD ed., Platelets Academic Press, pp. 117-145, 2007 9. Clemetson KJ, Clemetson JM. “Collagen Receptors as Potential Targets for Novel AntiPlatelet Agents”. Current Pharmaceutical Design 2007, 13, 2673-2683 10. Cosemans J.M., Iserbyt B.F., Deckmyn H., Heemskerk J.W. “Multiple ways to switch platelet integrins on and off”. J Thromb Haemost. 2008,6(8): 1253-1261 11. Cox A.D., Cevine D.V.. “Factor XIIIa binding to activated platelets is mediated through activation of glycoprotein IIb-IIIa”, Blood 1994, 83(4): 1006-1016 12. Dale GL. “Coated-platelets: an emerging component of procoagulant response”. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005, 3: 2185-2192, 13. Dale GL, Friese P, Batar P, Hamilton SF, Reed GL, Jackson KW, Clemetson KJ, Alberio L. “Stimulated platelets use serotonin to enhance their retention of procoagulant proteins on the cell surface”. Nature 2002, 415:175-179 14. Falati S, Gross P, Merrill-Skoloff G, Furie BC, Furie B. “Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse”. Nature Medicine 2002, 8: 1175-1181 82 15. Feng P, Tracy PB. “Not all platelets are equal procoagulants?” Blood 1998, 98: Suppl. 350a, 1441 (abstr.) 16. Flaumenhaft R. “Molecular basis of platelet granule secretion”. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003, 23: 1152-1160 17. Fox S.C., Sasae R., Janson S., May J.A., Heptinstall S. “Quantitation of platelet aggregation and microaggregate formation in whole blood by flow cytometry”. Platelets 2004, 15(2): 8593 18. Gachet Christian. “ADP receptors of platelets and their inhibition”. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2001, 86, 222-232 19. Greenberg CS, Birckbichler PJ, Rice RH. “Transglutaminases: multifunctional cross-linking enzymes that stabilize tissue”. The FASEB Journal 1991, 5: 3071-3077 20. Griffin M, Casadio R, Bergamini CM. “Transglutaminases: nature’s biological glues”. Biochemical Journal 2002, 368: 377-396 21. Goldsack NR, Chambers RC, Dabbagh K, Laurent LG. “Molecules in focus thrombin”. The International Journal of Biochemistry & CellBiology 1988, 641-646 22. Hartwig J.H. “Mechanisms of actin rearrangements mediating platelet activation”. J Cell Biol. 1992, 118(6): 1421-1442 23. Heemskerk J.W., Mattheij N.J., Cosemans J.M. “Platelet-based coagulation: different populations, different functions”. J Thromb Haemost. 2012 24. Heemskerk JW, Bevers EM, Lindhout T. “Platelet activation and blood coagulation”, Journal of Thrombosis and Haemostasis 2002, 88(2):186-193 25. Heemskerk JWM, Vuist WM., Feijge MAH, Reutelingsperger CPM, Lindhout T. “Collagen but not fibrinogen surfaces induce bleb formation, exposure of phosphatidylserine, and procoagulant activity of adherent platelets: evidence for regulation by protein tyrosine kinase-dependent Ca2+ responses”. Blood 1997, 90(7): 2615-2625 26. Jackson S.P., Schoenwaelder S.M. “Procoagulant platelets: are they necrotic?” Blood 2010, 116: 2011-2018 27. Jobe S.M., Leo L., Eastvold J.S., Dickneite G., Ratliff T.L., Lentz S.R., Di Paola J. “Role of FcRγ and factor XIIIa in coated platelet formation”. Blood 2005,106(13): 4146-4151 28. Jobe S.M., Wilson K.M., Leo L., Raimondi A., Molkentin J.D., Lentz S.R., Di Paola J. “Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis”. Blood 2008, 111: 1257-1265 29. Kempton C.L., Hoffman M., Roberts H.R., Monroe D.M. “Platelet heterogeneity: variation on coagulation complex on platelet subpopulations”. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular. Biology 2005, 25: 861-866 83 30. Kulkarni S., Jackson S.P. “Platelet factor XIII and calpain negatively regulate integrin alphaIIbbeta3 adhesive function and thrombus growth”. J Biol Chem. 2004, 279(29): 3069730706 31. Lawson JH, Kalafatis M, Stram S, Mann KG. “A model for the tissue factor pathway to thrombin. I. An empirical study”. J Biol Chem 1994, 269: 23357-23366 32. Lee K.N., Birckbichler P.J., Patterson M.K, Jr. “GTP hydrolysis by guinea pig liver transglutaminase”, Biochemical and biophysical research communications 1989, 162: 13701375 33. London FS, Marcinkiewicz M, Walsh PN. “A subpopulation of platelets responds to thrombin- or SFLLRN-stimulation with binding site for factor IXa”. Journal of Biological Chemistry 2004, 279(19): 19854-19859 34. London FS, Walsh PN. “Zymogen factor IX potentiates factor IXa-catalyzed factor X activation”. Biochemistry 2000, 39, 9850-9858 35. Lorand L, Parameswaran KN, Velasco PT, Hsu LK, Siefring GE. Jr. “New colored and fluorescent amine substrates for activated fibrin stabilizing factor (Factor XIIIa) and for transglutaminase”. Analytical Biochemistry 1983, 131(2): 419--425 36. Meng ZH, Woldberg AS, Monroe DM, Hoffman M. “The Effect of temperature and pH on activity of factor VIIa: Implications for the efficacy of high-dose factor VIIa in hypothermic and acidotic patients”. Journal of Trauma-Injury Infection & Critical Care 2003, 55: 886-891 37. Mattheij, N. J., Gilio, K., Kruchten, R. V., Jobe, S. M., Wieschhaus, A. J., Chishti, A. H., Collins, P., Heemskerk, J. W., and Cosemans, J. M. “Dual mechanism of integrin alphaIIbbeta3 closure in procoagulant platelets” J. Biol. Chem 2013 38. Monkovic DD, Tracy PB. “Activation of human factor V by factor Xa and thrombin”. Biochemistry 1990, 29: 1118-1128 39. Munnix IC, Kuijpers M J, Auger J, Thomassen CM, Panizzi P, Van Zandvoort M A, Rosing J, Bock PE, Watson SP, Heemskerk JW. “Segregation of platelet aggregatory and procoagulant microdomains in thrombus formation regulation by transient integrin activation”. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007, 27: 1-7 40. Munnix I.C.A., Cosemans J.M., Auger J.M., Heemskerk J.W. “Platelet response heterogeneity in thrombus formation”. Thromb Haemost. 2009,102(6): 1149-1156 41. Nieuwland R., Sturk A. Platelet-derived microparticles. In: Michelson A.D. Platelets (second edition). Elsevier Inc. 2007, 403-415 42. Nemerson Y, Gentry R. “An ordered addition, essential activation model of the tissue factor pathway of coagulation: evidence for a conformational cage”. Biochemistry 1986, 25: 40204033 84 43. Nuyttens B.P., Thijs T., Deckmyn H., Broos K. “Platelet adhesion to collagen”. Thromb Res. 2011, 127(Suppl. 2): S26–S29 44. Panteleev MA, Ananyeva NM, Greco NJ, Ataullakhanov FI, Saenko EL. “Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex”. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005, 3: 2545-2553 45. Panteleev MA, Ananyeva NM, Greco NJ, Ataullakhanov FI. “Factor VIIIa regulates substrate delivert to the intrinsic factor X-activating complex”, The FEBS Journal 2006, 273, 374-387 46. Pasquet J.M., Dachary-Prigent J., Nurden A.T. “Microvesicle release is associated with extensive protein tyrosine dephosphorylation in platelets stimulated by A23187 or a mixture of thrombin and collagen”. Biochem J. 1998, 333(Pt 3): 591-599 47. Patel D., Väänänen H., Jirousková M., Hoffmann T., Bodian C., Coller B.S. “Dynamics of GPIIb/IIIa-mediated platelet-platelet interactions in platelet adhesion/thrombus formation on collagen in vitro as revealed by videomicroscopy”. Blood 2003, 101(3): 929-936 48. Peerschke E. I. “Bound fibrinogen distribution on stimulated platelets. Examination by confocal scanning laser microscopy” Am. J. Pathol. 1995, 147, 678-687 49. Plow E.F., Pesho M.M., Ma Y.Q. Integrin αIIbβ3. In: Michelson A.D. Platelets (second edition). Elsevier Inc. 2007, 165-179 50. Prodan CI, Joseph PM, Vincent AS, Dale GL. “Coated-platelet levels are influenced by smoking, aspirin, and selective serotonin reuptake inhibitors”, Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5: 2149-2151 51. Reed GL. Platelet secretion. In: Michelson AD ed., Platelets Academic Press 2007, pp. 309319 52. Rosing J., Tans G., Govers-Riemslag J.W., Zwaal R.F., Hemker H.C. “The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex”. J Biol Chem. 1980, 255: 274283 53. Szasz R, Dale GL. “COAT platelets”. Current opinion in hematology 2003, 10, 351-355 54. Siljander P.R. “Platelet-derived microparticles - an updated perspective”. Thromb Res. 2011, 127(Suppl 2): S30-S33 55. Sims PJ, Wiedmer T, Esmon CT, Weiss HJ, Shattil SJ. “Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity”. J Biol Chem 1989 264: 17049-17057 85 56. Sinauridze EI, Kireev DA, Popenko NY, Pichugin AV, Panteleev MA, Krymskaya OV, Ataullakhanov FI. “Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets”. Thromb Haemost 2007, 97: 425434 57. Schwartz M.L., Pizzo S.V., Hill R.L., McKee P.A. “ The Subunit structure of human plasma and platelet factor XIII (Fibrin-stabilizing factor)”, Journal of Biological Chemistry 1971, 246(18): 5851-5854 58. Szasz R, Dale GL. “COAT platelets”. Current opinion in hematology. 10, 351-355, 2003 59. Szasz R., Dale G.L. “Thrombospondin and fibrinogen bind serotonin-derivatized proteins on COAT-platelets”. Blood 2002, 100: 2827-2831 60. Topalov N.N., Kotova Y.N., Vasil’ev S.A., Panteleev M.A. “Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation”. British Journal of Haematology 2012, 157(1): 105–115 61. van Dieijen G., Tans G., Rosing J., Hemker H.C. “The role of phospholipid and factor VIIIa in the activation of bovine factor X”. J Biol Chem. 1981, 256: 3433-3442 62. Valaydon Z.S., Lee P., Dale G.L., Januszewski A.S., Rowley K.G., Nandurkar H., Karschimkus C., Best J.D., Lyons T.J., Jenkins A.J. “Increased coated-platelet levels in chronic haemodialysis patients”. Nephrology (Carlton) 2009, 14: 148-154 63. Wang DS, Dickson DW, Malter JS. “Tissue Transglutaminase, protein cross-linking and Alzheimer ’s disease: Review and Views”. International Journal of Clinical and Experimental Pathology 2008, 1: 5-18 64. Weiss H.J., Hoyer L.W., Rickles F.R., Varma A., Rogers J. “Quantitative assay of a plasma factor deficient in von Willebrand's disease that is necessary for platelet aggregation. Relationship to factor VIII procoagulant activity and antigen content”. J Clin Invest. 1973, 52(11): 2708-2716 65. Wolberg AS, Meng ZH, Monroe DM, Hoffman MM. “A Systematic Evaluation of the Effect of Temperature on Coagulation Enzyme Activity and Platelet Function”. Journal of TraumaInjury Infection & Critical Care 2004, 65: 1221-1228 66. Yakimenko, A. O., Verholomova, F. Y., Kotova, Y. N., Ataullakhanov, F. I., and Panteleev, M. A. “Identification of different proaggregatory abilities of activated platelet subpopulations”. Biophys. J. 2012, 102, 2261-2269 67. Zwaal R.F., Schroit A.J. “Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells”. Blood 1997, 89: 1121-1132 68. Zwaal R.F., Comfurius P., Bevers E.M. “Lipid-protein interactions in blood coagulation”. Biochim Biophys Acta. 1998, 1376: 433-453 86 69. Козинец Г.И., Макаров В.А. Исследование системы крови в клинической практике. Триада-Х, Москва 1998; 454-455 70. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. Москва: Мир, 1979 71. Пантелеев МА, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология, том 1, номер 2, 174-181, 2008 72. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови. М.:Binom Publishers, 2000 73. Шмидт Р, Тевс Г. Физиология человека (том 2). Москва: Мир, 2005 74. Fluorescence compensation in flow cytometry (электронный ресурс), режим доступа: http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=13433. 87 Список сокращений и обозначений АДФ аденозиндифосфат АТФ аденозинтрифосфат ГДФ гуанозиндифосфат ГТФ гуанозинтрифосфат ДМСО диметилсульфоксид ТТГ тканевая трансглутаминаза Фактор Va буква “а” после номера фактора означает его активную форму ФС фосфатидилсерин CRP коллаген-ассоциированный пептид EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота FITC флуоресцеинизотиоцианат FL флуоресцентный канал FSC малоугловое рассеяние GPPP Gly-Pro-Pro-Pro GPRP Gly-Pro-Arg-Pro GP гликопротеин HEPES 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин]этансульфоновая кислота MPTP митохондриальная проницаемая переходная пора PAR протеаза-активированный рецептор PE фикоэритрин PPACK Фен-Про-Арг-хлорометил кетон SSC боковое рассеяние 88
