Диссертация - Казанский государственный медицинский

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ)
ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
На правах рукописи
Хайбуллина Светлана Францевна
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПАТОГЕНЕЗА
ХАНТАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
14.03.03 – патологическая физиология
Диссертация на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Научный консультант:
д.б.н., доцент Ризванов А.А.
КАЗАНЬ – 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ГЛАВА 1.
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................. 6
1.1 Актуальность исследования .................................................................................................................. 6
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................................... 13
2.2. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусный легочный
синдром (ХЛС) ........................................................................................................................................... 24
2.2.1. Эпидемиология хантавирусов ..................................................................................................... 24
2.2.2. Серологическая прослойка населения проживающего в эндемичных районах ..................... 30
2.2.3. Вирус и структура вириона ......................................................................................................... 31
2.2.4. Хантавирусы и их естественные хозяева ................................................................................... 35
2.2.5. Инфицирование человека ............................................................................................................ 39
2.2.6. Рекомбинация геномов хантавирусов ........................................................................................ 40
2.2.7. Клинические проявления хантавирусной инфекции ................................................................ 41
2.2.8. Патогенез ГЛПС и ХЛС ............................................................................................................... 44
2.2.9. Иммунный ответ к хантавирусным антигенам .......................................................................... 48
2.2.10. Генетические маркеры патогенеза хантавирусной инфекции ............................................... 55
2.2.11. Роль цитокиов в патогенезе хантавирусой инфекции............................................................. 56
2.2.12. Лечение хантавирусной инфекции и вакцинация ................................................................... 60
ГЛАВА 3. MАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................................................ 63
3.1. Клеточные линии и реагенты ......................................................................................................... 63
3.2. Сыворотки крови человека ............................................................................................................. 64
3.3. Вирус ................................................................................................................................................. 64
3.4. Метод непрямого бляшкообразования .......................................................................................... 65
3.5. Выделение общей РНК ................................................................................................................... 65
3.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) ................................... 65
3.7. Синтез кДНК .................................................................................................................................... 67
3
3.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ............................................................................................ 68
3.9. Анализ ДНК-чипов .......................................................................................................................... 68
3.11. Иммунофлуоресцентный анализ .................................................................................................. 68
3.12. Иммуногистохимический анализ ................................................................................................. 70
3.13. Получение клеточной линии, экспрессирующей р78 ................................................................ 71
3.14. Твёрдофазный иммуноферментный анализ (ИФА) ................................................................... 71
3.15. Анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA) ............................................. 72
3.16. Мультиплексный анализ ............................................................................................................... 73
3.17. Микоплазменный тест ................................................................................................................... 74
3.18. Иммуноблотинг ............................................................................................................................. 75
3.20. Mодифицированный анализа белка по Лоури ............................................................................ 75
3.21. Получение поликлональных антител к гликопротеину G2. ...................................................... 76
3.22. Получение реассортантных вирусов in vitro ............................................................................... 76
3.23. Клональная селекция хантавирусов............................................................................................. 77
3.24. Скрининг вирусных реассортантов ............................................................................................. 77
3.25. Анализ TUNEL............................................................................................................................... 77
3.26. Статистический анализ ................................................................................................................. 78
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ....................................................................................... 79
4.1. Получение и исследование реассортантов хантавирусов ............................................................ 79
4.1.1 Выявление реассортации у вирусов ANDV и SNV ................................................................ 79
4.1.2. Иммуногистохимический анализ реассортанта V1 ............................................................... 82
4.1.3 Эффективность репликации реассортантов в клетках Vero E6 ............................................. 83
4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОГЕНЕЗА ХАНТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ IN VITRO .................... 84
4.2.1 Влияние ФНО-α на накопление нуклеокапсидного белка SNV в культуре клеток Vero E6 . 84
4.2.3 Определение влияния ФНО-α на проницаемость монослоя HUVEC ...................................... 91
4.2.4 Инфицирование альвеолярных макрофагов человека вирусом SNV ....................................... 92
4
4.2.5 Синтез ФНО-α инфицированными SNV и обработанными ЛПС альвеолярными
макрофагами человека ........................................................................................................................... 94
4.2.6 Эффект надосадочной жидкости, взятой от инфицированных SNV и обработанных ЛПС
альвеолярных макрофагов, на проницаемость монослоя клеток HUEVEC ..................................... 95
4.2.7 Регуляция экспрессии клеточных генов в эндотелиальных клетках вирусами SNV и PHV . 98
4.2.8 Следующие группы генов изменялись под действием хантавирусной инфекции ............... 105
4.2.9 Анализ TaqMan экспрессии отдельных генов .......................................................................... 108
4.2.10 Влияние репликации вирусов на внутриклеточный уровень мРНК гена CCL5 ................. 110
4.2.11 Вирус AND стимулирует экспрессию индуцируемого интерфероном белка MxA в клетках
эндотелия ............................................................................................................................................... 112
4.2.12 Эффективность репликации хантавирусов в клетках Vero E6, A549 и HUVEC ................. 112
4.2.13 Влияние хантавирусной инфекции на транскрипцию гена MxA ......................................... 114
4.2.14 Влияние репликации вирусов на экспрессию гена р78 ......................................................... 115
4.2.15 Влияние репликации ANDV на транслокацию IRF-3 в ядро клетки.................................... 118
4.2.16 Влияние хантавирусной инфекции на внутриклеточные уровни белка р78 ....................... 118
4.2.17 Влияние экспрессии р78 на репликацию ANDV в клетках Vero E6 .................................... 120
4.2.18 Внутриклеточная локализация белка р78 в ANDV инфицированных клетках HUVEC .... 122
4.2.19 Влияние хантавирусной инфекции на активацию факторов ядерной транскрипции PML,
SP100 и ISG-20 в клетках HUVEC in vitro ......................................................................................... 124
4.2.21 Колокализация PML с SP100 и его частичная колокализация с DAXX в инфицированных
хантавирусом клетках HUVEС ........................................................................................................... 126
4.2.22 PML тесно связан с ISG-20 в инфицированных хантавирусом клетках HUVEC ............... 128
4.2.24 Активация PML требует экспрессии хантавирусного белка ................................................. 133
4.2.25 PML и SUMO имеют различную локализацию в инфицированных хантавирусом клетках
HUVEC .................................................................................................................................................. 135
4.2.26 Изучение цитокинового профиля сывороток больных ГЛПС .............................................. 137
5
4. 3.1. АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ НИЗКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА РИБАВИРИНА
ПРИ ХАНТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ............................................................................................... 142
4.3.1. Неэффективность рибавирина в ингибировании выделения ФНО-α, вызванного активацией
RANTES и интерлейкина-6 в инфицированных вирусом АND эндотелиальных клетках
пупочного канатика человека .............................................................................................................. 142
4.3.2 Препарат Рибавирин подавляет транскрипцию гена CCL5 в клетках HUVEC,
инфицированных вирусом ANDV ...................................................................................................... 144
4.3.3 Эффект различных концентраций препарата Рибавирин на накопление S-сегмента мРНК
вируса ANDV и CCL5 в клетках HUVEC .......................................................................................... 146
4.3.4 Влияние ФНO-α и препарата Рибавирин на активацию NF-κB .............................................. 152
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ ...................................................................................................................... 155
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................................................ 175
ВЫВОДЫ .................................................................................................................................................. 177
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...................................................................................................................... 179
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................................................ 182
СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА ............................................................................... 222
6
ГЛАВА 1.
ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность исследования
Проблема терапии вирусных заболеваний остается актуальной и недостаточно исследованной
в медицине. Эта актуальность обусловлена, с одной стороны, высокой встречаемостью этого вида
патологии, а с другой — отсутствием эффективных терапевтических подходов для их лечении.
Вирусные
геморрагические
лихорадки
(ВГЛ)
являются
острыми
заболеваниями,
характеризующимися нарушениями молекулярных и клеточных процессов, регулирующих
реологические свойства крови. Эндотелиальные клетки являются мишенью для вирусов,
вызывающих ВГЛ (N.A. Dalrymple et al., 2012; R. Rodrigues et al., 2012). Проникнув в клетку,
вирусы используют внутриклеточные механизмы для собственной репликации, таким образом,
внося нарушения в ее нормальные физиологические процессы. Несмотря на интенсивные
исследования, молекулярные механизмы патогенеза ВГЛ остаются недостаточно исследованными.
Именно поэтому до сих пор не существует эффективных методов лечения этих заболеваний.
Начало 21-го века ознаменовалось значительным расширением эпидемических ареалов
геморрагических лихорадок. Например, значительное распространение получила Конго-Крымская
геморрагическая лихорадка (R.M. Vorou, 2009). Были отмечены изменения в ареалах
распространения хантавирусных инфекций, таких как геморрагической лихорадки с почечным
синдромом (ГЛПС) в странах Европы и в России (T.K. Dzagurova et al., 2008). На основании этих
данных можно сделать заключение, что в настоящее время происходит интенсивное
распространение возбудителей ВГЛ. Основной причиной распространения ВГЛ являются
изменение климата, расширение производственной деятельности человека и развитие туризма.
Таким
образом,
человечество
стоит
перед
новым
вызовом
21
века:
стремительным
распространением ВГЛ на фоне отсутствия эффективных терапевтических средств.
В Российской Федерации ГЛПС является наиболее значимой из ВГЛ. Республика Татарстан
относится к зоонозным очагам ГЛПС, где инфекционным агентом является хантавирус Пуумала
(англ. Puumala virus, PUUV), вызывающий легкую форму заболевания с летальным исходом менее
7
0,4% (N.A. Khismatullina et al., 2015). Исследования тканей умерших пациентов выявило наличие
вирусных антигенов в эндотелиальных клетках капилляров, а дальнейшие исследования in vitro
подтвердили высокую чувствительность этих клеток к инфицированию хантавирусами (M. Mori et
al., 1999; S.R. Zaki et al., 1995). Многочисленные исследования тканей умерших от ГЛПС выявили
отсутствие поражений, связанных с репликацией вируса (M. Mori, et al., 1999; S.R. Zaki, et al.,
1995). Поэтому было высказано предположение, что патогенез хантавирусной инфекции
определяется реакцией организма на проникновение вируса и его репликацию. На основании
накопленных данных была предложена гипотеза «цитокинового шторма» для объяснения
патогенеза этого заболевания (L.T. Figueiredo et al., 2014). Считается, что активация провоспалительных цитокинов в ответ на хантавирусную инфекцию приводит к нарушению
регуляции
гемодинамических
параметров,
стимулируя
иммунный
ответ
и
активируя
эндотелиальные клетки. Это в совокупности может приводить к нарушениям физиологических
процессов регуляции коагуляционного каскада, приводящим к агрегации кровяных пластинок
(тромбоцитов) и развитию коагулопатии, проявляющейся в виде геморрагического синдрома.
Значительные успехи в нашем понимании механизмов иммунного ответа и факторов его
регуляции существенно изменили подходы в методах лечения многих заболеваний. Например,
получило широкое распространение применение антител к различным воспалительным цитокинам
при лечении ревматоидного артрита, а моноклональные антитела к ИЛ-5 используются при
лечении бронхиальной астмы (G. Garcia et al., 2013; R.N. Maini et al., 2000). Одним из ярких
примеров терапевтического использования моноклональных антител является лечение ряда
аутоиммунных заболеваний антителами к интерферону (B. Skurkovich et al., 2003; S. Skurkovich et
al., 2005). Однако принципы лечения ГЛПС и других хантавирусных инфекций остаются
неизменными и малоэффективными в течение последних 50 лет и включают, в основном,
симптоматическую
терапию, которая не способна подавлять
вирусную
репликацию
и
предотвращать патологическое действие цитокинов (Z. Bi et al., 2008; C.B. Jonsson et al., 2008).
Основной причиной отсутствия новых методов лечения хантавирусных инфекций, как уже
отмечено, является наша ограниченность в понимания патогенеза заболевания. Это связано, в
основном, с отсутствием модели на животных in vivo, а проведение исследований in vitro возможно
только в лабораториях с повышенной степенью биобезопасности.
Таким образом, несмотря на многолетние исследования, молекулярные основы патогенеза
хантавирусных инфекций остаются во многом неизвестными. Именно отсутствие глубокого
понимания
молекулярных
механизмов
ГЛПС
является
основной
причиной
отсутствия
8
патогномоничной терапии и методов предупреждения заболевания. Поэтому существует
необходимость всесторонних исследований патогенеза ГЛПС с целью выявления и использования
маркеров диагностики, лечения и предупреждения болезни.
Цель работы: выявление молекулярных и клеточных механизмов патогенеза хантавирусной
инфекции.
Задачи исследования:
1.
Анализ
транскрипционной
активности
в
эндотелиальных
клетках
человека,
инфицированных патогенными и непатогенными хантавирусами.
2. Анализ механизмов активации ядерных транскрипционных факторов в эндотелиальных
клетках человека, инфицированных различными хантавирусами.
3. Анализ механизмов антивирусной защиты, опосредованной активацией интерферониндуцированных факторов в клетках человека, инфицированных хантавирусами.
4. Изучение механизмов активации интерферон-индуцированных белков в клетках,
инфицированных хантавирусами.
5. Изучение роли сывороточных цитокинов в механизме иммунного ответа против
хантавирусных инфекций.
6. Выявление причин низкой эффективности лечения хантавирусной инфекции препаратом
Рибавирин.
7.
Анализ
особенностей
репликации
реассортантных
вирусов
между
различными
патогенными хантавирусами.
Научная новизна
Новыми являются данные по транскрипционной активности в эндотелиальных клетках,
инфицированных патогенными и непатогенными для человека хантавирусами. Впервые показана
активация ядерных транскрипционных факторов в клетках, инфицированных хантавирусами, и
выявлены механизмы, объясняющие отсутствие цитопатического эффекта в этих клетках.
Несомненной новизной обладают данные об активации уникального цитокинового профиля в
клетках, инфицированных хантавирусами, позволяющие объяснить гистологические изменения,
обнаруженные у больных хантавирусной инфекцией. Впервые показана активация интерферониндуцированных генов (ИИГ) в клетках, инфицированных хантавирусами, а также зависимость
вирусной репликации от способности клеток активировать интерферон индуцированные белки.
Приоритетными являются данные о возможности ингибирования хантавирусной репликации
путем
активации
интерферон
индуцированных
белков.
Новыми
являются
результаты,
9
указывающие на то, что патогенез хантавирусной инфекции у человека, вызванной вирусом
Пуумала, определяется активацией цитокинов в сыворотке крови. Впервые показано, что тяжесть
заболевания определяется активацией ИЛ-12 и ИФН-γ. Новизной обладают данные о влиянии
препарата Рибавирин на активацию цитокинов в клетках, инфицированных хантавирусом.
Показано, что неэффективность препарата Рибавирин при лечении хантавирусной инфекции,
возможно, определяется его неспособностью ингибировать активацию цитокинов, вызванную
инфекцией. Впервые получены реассортанты между патогенными для человека штаммами
хантавирусов, циркулирующими в генетически отдаленных популяциях мелких грызунов, а также
исследованы инфекционные характеристики новых химерных вирусов и их отличие от
родительских штаммов.
Теоретическая и практическая значимость
Патогенез хантавирусных инфекций у человека остается в основном мало изученным. Это
является основной причиной отсутствия эффективных препаратов для лечения и профилактики
заболевания. Вирусы являются нецитопатичными, поэтому фармакологическое влияние на
внутриклеточные процессы, активированные хантавирусной инфекцией, представляется наиболее
логичным в подходе к лечению хантавирусной инфекции. Однако именно эта область знаний
оставалась наименее изученной. Поэтому полученные данные о влиянии хантавирусной инфекции
на внутриклеточные процессы является важным шагом в дальнейшей разработке препаратов для
лечения и предупреждения инфекции. В этом разрезе, особенно интересными представляются
полученные данные о чувствительности хантавирусной инфекции к активации интерферониндуцированных белков. Поэтому, данные об эффективности ингибирования хантавирусной
инфекции путем активации внутриклеточных интерферон-индуцированных механизмов выявили
новый подход к лечению хантавирусной инфекции. Также впервые показаны механизмы
активации интерферон-индуцированных белков в клетках, инфицированных хантавирусом. Таким
образом, был выявлен круг белков —
потенциальных мишеней для терапевтического
вмешательства. Далее, нужно отметить, что получены данные, подтверждающие гипотезу о роли
активации цитокинов у больных ГЛПС. Показано, что тяжесть заболевания определяется
активацией ИЛ-12 и ИФНγ. Более того, активация этих цитокинов приводит к развитию легкой
формы болезни. Поэтому сделано заключение, что лекарственные вещества, способные
активировать ИЛ-12 и ИФНγ в крови больных ГЛПС, могут обладать высокой терапевтической
эффективностью при лечении этого заболевания. Таким образом, выявлены две потенциальные
мишени для лечения хантавирусной инфекции, включающие интерферон-индуцируемые белки и
10
цитокины ИЛ-12 и ИФНγ. Проведенные исследования впервые представили объяснение
неэффективности препарата Рибавирин при лечении хантавирусной инфекции, что представляет
важный вклад в разработку новых подходов к лечению ГЛПС. Важность полученных данных
определяется и тем, что прежние представления о лечении хантавирусных инфекции
противовирусными препаратами неприменимы к лечению хантавирусных инфекций. Показана
важность купирования «цитокинового шторма», вызванного хантавирусной инфекцией, поскольку
активация цитокинов определяет тяжесть заболевания.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Инфицирование эндотелиальных клеток человека вирусом Син Нобре (SNV) активирует
транскрипционный фактор PML и приводит к образованию нуклеарных телец внутри клеточного
ядра.
2. Активация интерферон зависимого белка MxA (р78) ингибирует хантавирусную
репликацию и определяет эффективность репликации хантавирусов в культуре клеток.
3. Препарат Рибавирин подавляет хантавирусную репликацию, но не ингибирует активацию
цитокинов, вызванную ФНО-α.
4. Патогенные хантавирусы Андес (AND) и Син Нобре (SNV), циркулирующие в различных
подвидах мелких грызунов, образуют реассортанты in vitro, способные к репликации в клетках
Vero E6.
Связь работы с базовыми научными программами
Представленная работа была поддержана грантом Национального Института Здоровья (NIH)
за номером AI36418, AI39808, AI45059и AI65359, а также офисом The Medical Service and Research
Service of the Veteran Affairs Sierra Nevada Health Care System. Кроме того, исследования были
финансированы Российским Министерством Науки и образования ФСП №14.А18.21.1930, ФСП
№16.552.11.7083. Работа выполнена за счет
средств субсидии, выделенной в рамках
государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях
повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров
(5-ТОП-100).
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на ежегодных естественно-научных конференциях
Университета Штата Невада (г. Рено, Лейк Тахо, США, 1998 г. и 2006 г.). Кроме того, результаты
представлены на IV Международной конференции по геморрагической лихорадке с почечным
синдромом и хантавирусному легочному синдрому (г. Атланта, США, 1998 г.), V Международной
11
конференции по геморрагической лихорадке с почечным синдромом и хантавирусному легочному
синдрому (г. Аннси, Франция, 2001 г.), VI Международной конференции по геморрагической
лихорадке с почечным синдромом и хантавирусному легочному синдрому и хантавирусам (г. Сеул,
Корея, 2004 г.), VII Международной конференции по ГЛПС, ХЛС и хантавирусам (г. Буэнос Аэрес,
Аргентина, 2007 г.). Также результаты были представлены на 22-м ежегодном собрании
Американского общества Вирусологов (г. Давис, США, 2003 г.), и на собрании Американского
общества Микробиологов: Viral Immune Evasion (г. Акапулько, Мексика, 2005 г.). Кроме того,
результаты исследований были доложены на VI Ежегодном Международном симпозиуме
«Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (г. Казань, Россия, 2013 г.), на IV
Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления,
аутоиммунного
ответа
Межгосударственной
Содружества
и
развития
опухоли»
научно-практической
Независимых
Государств
(г.
Казань,
конференции
в
обеспечение
Россия,
«Вклад
2014
г.),
на
XII
государств-участников
санитарно-эпидемиологического
благополучия населения в современных условиях» (г. Саратов, Россия, 2014 г.); на V
Международной конференции «New concepts on the mechanisms of inflammation, autoimmunity and
tumorogenesis» (г. Казань, Россия, 2015 г.), на 19-й Международной конференции молодых ученых
«Биология – наука ХХI века» (г. Пущино, Россия, 2015 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, опубликованных в ведущих
рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских
диссертаций, а также 27 тезисов докладов на международных конференциях и конгрессах.
Место выполнения работы
Основные экспериментальные данные получены автором за время работы в лабораториях
профессора Стива Ст. Джоура в Университете штата Невада, г. Рено, США (1996–2010) и в
Казанском (Приволжском) федеральном университете (2010-2015).
Структура и объем работы
Диссертация
состоит
из
введения,
обзора
литературы,
результатов
исследования,
обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы (405 ссылок) и списка
иллюстративного материала. Работа содержит 46 рисунков и 13 таблиц.
Личный вклад автора
Все данные, приведенные в работе, получены при непосредственном участии диссертанта на
всех этапах проведения исследования, а именно: составление плана работы, подготовка и
12
проведение экспериментов, анализ и систематизация полученных данных, а также оформление
публикаций.
На основании самостоятельной работы автора решена важная патофизиологическая задача
исследования роли активации клеточного ответа в патогенезе хантавирусной инфекции, что вносит
важный вклад в разработку методов и научных принципов поиска новых эффективных
лекарственных средств лечения хантавирусной инфекции. Данные, полученные лично автором,
демонстрируют возможность использования методов активации интерферон-индуцируемых
белков в качестве нового подхода в поиске терапевтических средств лечения хантавирусной
инфекции. Кроме того, автором показана значимость активации ИЛ-12 и ИФН-γ в развитии легкой
формы клинического течения хантавирусной инфекции, что открывает новые перспективы в
подборе терапевтических средств лечения хантавирусной инфекции.
13
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Вирусные геморрагические лихорадки: разнообразие этиологических агентов,
распространение, клиническое течение и методы терапии
Вирусные геморрагические лихорадки (ВГЛ) представляют из себя группу заболеваний,
вызываемых оболочечными РНК вирусами, принадлежащими к различным семействам вирусов,
включая аренавирусы, буньявирусы, филовирусы и флавивирусы (M. Bray, 2005; T.W. Geisbert et
al., 2004). Эти вирусы также характеризуются внутрицитоплазменным репликационным циклом и
не являются цитопатогенными (A. Vaheri et al., 2013). В настоящее время, по разным оценкам,
ежегодно регистрируется от 50 до 100 миллионов случаев ВГЛ в мире (R.V. Gibbons et al., 2002;
J.C. Zapata et al., 2014), при этом смертность составляет до 60 миллионов в год. Большинство ВГЛ
являются зоонозными заболеваниями. Случаи ВГЛ регистрируются по всему миру и обычно
совпадают с ареалами обитания носителей и/или переносчика вируса. Вспышки ВГЛ носят
спорадический характер, при этом вирусы могут появляться на новых териториях, недавно
освоенных
носителем
репликационного
цикла
патогена
в
вирусов
респираторный тракт при вдыхании
природе.
вызывающих
Заражение
ВГЛ.
человека
не
Инфицирование
является
происходит
частью
через
контаминированного аэрозоля или через кровь. Следует
отметить, что некоторые ВГЛ могут переноситься горизонтально от одного пациента к другому,
таким образом, представляя угрозу распространения заболевания.
ВГЛ регистрируются на территориях соответствующих ареалу носителя. Например,
лихорадка Денге диагностируется на территориях являющихся ареалом для комаров рода Aedes
aegypti и Aedes albopictus (E. Little et al., 2011) В то время как геморрагическая лихорадка с
почечным синдромом (ГЛПС) регистрируется в ареалах проживания рыжей полевки, а
хантавирусный легочный синдром (ХЛС) регистрируется в местах обитания оленьего хомячка ((S.
Escutenaire et al., 2002) (R.A. Loehman et al., 2012). На территории России зарегистрированы
зоонозные очаги ГЛПС (территоря между Волгой и Уралом, а также Дальний Восток) и КонгоКрымской геморрагической лихорадки (ККГЛ) (Юг России, Крымский полуостров) (S.B. Garanina
14
et al., 2009) (H. Miyamoto et al., 2003). В совокупности, десятки тысяч случаев ВГЛ регистрируется
на территории Российской Федерации ежегодно с частотой смертельных случаев доходящей до
5%. Следует отметить, что увеличение экономических связей и расширение туристических
контактов между различными странами и континентами остро ставит вопрос о возможности
заражения граждан России ВГЛ за пределами Российской Федерации, а также увеличивает риск
распространения экзотических ВГЛ на територии Российской Федерации.
Развитие туризма и экономических связей со станами Южной Азии и Латинской Америки,
увеличивает вероятность заражение граждан российской Федерации вирусом Денге. Лихорадка
Денге это острое вирусное заболевание зачастую сопровождающееся смертельным исходом (D.J.
Gubler, 1998). Лихорадка Денге регистрируется в странах Южной Азии, Латинской Америки и на
островах Карибского моря (A. Amarasinghe et al., 2011). Заболевание может проявляться в форме
системной лихорадки или в виде геморрагического синдрома (S.H. Waterman et al., 1989). (V. Dietz
et al., 1996). Ежегодно в мире регистрируется от 50 до 100 миллионов случаев лихорадки Денге (S.
Bhatt et al., 2013). По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более
2,5 миллиарда человек (более 40% населения мира) подвергаются риску заболевания лихорадкой
Денге (S.B. Halstead, 2007); (D.J. Gubler, 1998). Всвязи с существенным изменением климата, ареал
распространения комаров переносчиков значительно расширился, что привело к ежегодному
увеличению
случаев
заболевания.
Например,
если
в
1970х
годах,
лихорадка
Денге
регистрировалась в 9 странах, то теперь заболевание диагностируется в более чем 100 странах
мира (S. Ranjit et al., 2011). Другим примером, подтверждающим значительное увеличение
заболеваемости Денге, является тот факт, что если в 2008 году было зарегистрировано 1,2
миллиона случаев лихорадки Денге в странах ареала обитания комаров переносчиков, то в 2010
году
было
зарегистрировано
уже
2,3
миллиона
случаев
(увеличение
(http://77.rospotrebnadzor.ru/index.php/san-epid/40-2009-08-20-06-08-14/1141-san-epid).
в
2
раза!)
Увеличение
случаев лихорадки Денге зарегистрировано не только в исторически эндемичных очагах, но также
появляется угроза распространения заболевания на Европейском континенте, который исторически
не является эндемичным. Например, в 2010 году лихорадка Денге была зарегистрированa во
Франции и Хорватии ((I. Gjenero-Margan et al., 2011).(O. Engler et al., 2013) (G. La Ruche et al., 2010)). А в
2012 году, более 2,000 случаев лихорадки Денге было зарегистрировано в Португалии (C.A. Sousa
et al., 2012) Исследования Bouzid и коллег показали увеличение риска инфицирования вирусом
Денге в странах северной Европы связанного со значительными изменениями климата (M. Bouzid
et al., 2014). Похожая ситуация наблюдается и в странах Юго Восточной Азии. Например, после
15
длительного перерыва, рост заболевания зарегистрирован в Сингапуре (A.H. Mohd-Zaki et al.,
2014). Также в 2014 году, после 10 летнего перерыва, отмечено значительное увеличение случаев
лихорадка Денге на островах Тихого Океана (A.H. Mohd-Zaki, et al., 2014) (K. Limkittikul et al.,
2014); (L. Bravo et al., 2014). Среди заболевших, в 500,000 случаях ожидатся развитие тяжелой
формы лихорадки Денге и потребуется госпитализация. Смертность от лихорадки Денге достигает
5% (WHO, Prevention and Control of Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever, WHO, SEARO, 1999).
Таким образом, можно сделать вывод, что эпидемиологическая ситуация по лихорадке Денге
продолжает оставаться напряженной не только всвязи с увеличением числа заболевших, но и
вследствии вовлечения новых эпидареалов.
Комары рода Aedes aegypti являются основными переносчиками вируса у человека, в то
время как Aedes albopictus является переносчиком Денге вируса у обезьян (L.B. Carrington et al.,
2014); (H. Delatte et al., 2010). Местом обитания комаров Aedes aegypti является водная среда,
главным образом в искусственных емкостях вблизи жилья человека и часто внутри помещений
(M.A. Roslan et al., 2013; T. Tsunoda et al., 2014). Укусы комаров этого рода происходят в дневное
время суток (T.W. Scott et al., 2000). Комары рода Aedes albopictus первоначально были
обитателями лесных опушек (H. Delatte, et al., 2010). Однако расширение активности человека
существенно изменило ареал распространения этого комара. В настоящее время характерным
считается размножение Aedes albopictus в скоплениях дождевой воды в старых автомобильных
покрышках. Транспортировка этих покрышек привела к расширению ареала заселения комара.
Например, если в 1997 году ареал обитания Aedes albopictus занимал несколько районов северной
Италии, то к 2007 году уже вся территория Италии обьявлена ареалом обитания насекомого (R.
Veronesi et al., 2015). Успешному распространению Aedes albopictus также способствует
устойчивость отложенных яиц к высыханию (T.W. Geisbert, et al., 2004). Комары являются
хозяевами-переносчиками вируса, в организме которого вирусная репликация может сохраняться
от 3 месяцев и более. После инфицирования насекомого, вирус диссеминирует по всему
организму, где наибольшее его накопление обнаруживается в слюнных железах (S. Sim et al.,
2012).
Последние
исследования
показали
способность
вируса
влиять
на
поведение
инфицированных комаров. Так результаты, опубликованные Sim с коллегами, показали
транскриптационную активацию генов регулирующих иммунный ответ и пищевое поведение
комара (S. Sim, et al., 2012). К примеру, вирус способен активировать гены регулирующие
обоняние насекомого, таким образом, увеличивая способность комара к поиску места укуса.
Вследствии этого, комар меньше проводит время на одном человеке, улетая еще не вполне сытым,
16
что увеличивает опастность укусов большего числа людей. Это поведение комара приводит к
значительному увеличению количества зараженных людей.
Вирус передается людям через укус инфицированной самки комара. В процессе укуса,
комар выделяет в кожу на месте укуса слюну, вызывающую локальное воспаление. На месте укуса
происходит первичное размножение вируса. Считается, что вирус заражает клетки Лангерганса
(дендритные клетки кожи), моноциты и макрофаги (S.J. Wu et al., 2000); (S.B. Halstead et al., 1977;
Z. Kou et al., 2008). Последние исследования показали, что вирус изначально инфицирует незрелые
дендритные клетки кожи ((S. Taweechaisupapong et al., 1996) (S.J. Wu, et al., 2000); (M. Marovich et
al., 2001). Вирус использует различные рецепторы для проникновения в клетку мишень. Например,
было показано что вирус денге проникает в клетку посредством связывания вирусного
гликопротеина Е с клеточным рецептором кладгерином (E.G. Acosta et al., 2008; H.M. van der
Schaar et al., 2008). В другом исследовании было показано, что вирус связывается с поверхностным
CD209 рецептором на поверхности дендритных клеток (E. Navarro-Sanchez et al., 2003; B.
Tassaneetrithep et al., 2003). Исследования, проведенные Chen с коллегами показали, что вирус
использует CD14 рецептор для инфицирования моноцитов (Y.C. Chen et al., 1999). Несмотря на
интенсивные исследования, до сих пор нет консенсуса по поводу клеток где происходит первичная
репликация вируса. Долгое время считалось, что вирус реплицируется в клетках эффекторах
иммунной системы. В подтвержление этому приводились данные о репликации вируса денге в
мононуклеарных лейкоцитах (N.J. Marchette et al., 1973);(N.J. Marchette et al., 1975). Далее, еще
одним аргументом в пользу этого предположения был тот факт что впервые вирус Денге был
выделен из белых клеток крови (R.M. Myers et al., 1965). Кроме того, вирусные антигены
обнаруживались в лейкоцитах крови больных незадолго до окончания периода виремии (N.J.
Marchette, et al., 1973). Также, исследование аутопсийных образцов показало наличие антигенов
вируса Денге в макрофагах, дендритных клетках, моноцитах и лимфоцитах (N. Bhamarapravati et
al., 1967; K. Jessie et al., 2004). Недавно интересная гипотеза была представлена Noisakran с
коллегами (S. Noisakran et al., 2010). Авторы предложили новую концепцию первичной
репликации вируса Денге, где ведущая роль отводится мегакариоцитам. Представленная гипотеза
основывается на том, что ранняя стадия Денге инфекции характеризуется резким снижением
количества циркулирующих тромбоцитов (C. Mitrakul et al., 1977). Ранняя тромбоцитопения
сочетается с мегакариоцитопенией в костном мозге (H.R. Bierman et al., 1965); (E.R. Nelson et al.,
1964); (E.R. Nelson et al., 1966). Далее, мегакариоцитопения сменяется нормоцитопенией и
гиперцитопенией на момент развития первых симптомов заболевания (S. Na-Nakorn et al., 1966;
17
E.R. Nelson et al., 1964; E.R. Nelson, et al., 1966). Далее, вирус Денге был обнаружен и выделен из
тромбоцитов больных вторичной Денге инфекцией (M. Saito et al., 2004). Кроме того, было
показано, что тромбоциты восприимчивы к инфекции вирусом Денге и способны поддерживать
вирусную репликацию (S. Noisakran, et al., 2010). Таким образом, клетки миелоидного ряда
(макрофаги, моноциты и дендритные клетки) считаются основными носителями вируса Денге.
Однако, не исключена потенциальная роль других клеток крови, включая мегакариоциты и
тромбоциты, в процессе пропагации вируса.
Вирус Денге относится к семейству Togaviridae рода Flavivirus. Вирионы содержат РНК
геном положительной полярности размером 11 кб (Рисунок 1).
Рисунок 1 – РНК вируса Денге
5’UTR – 5’ нетранслируемый регион; C – нуклеокапсидный белок; M – матричный белок; E
– оболочечный белок; NS –неструктурный белок; 3’UTR нетранслируемый регион.
Вирусная РНК кодирует один полипептид который в результате пост-трансляционной
модификации производит три структурных белка (C, prM/M, E) и семь неструктурных белков (NS)
(J. Jarmer et al., 2014).
Вирусная РНК заключена внутри протеинового кора, покрытого двухслойной липидной
оболочкой из фосфолипидов и холестерола. Вирусная РНК инфекционна, поэтому проникновение
РНК внутрь клетки является достаточным для индукции вирусной репликации. Вирионы размером
40-45 нм в диаметре. (Рисунок 2).
18
Fig 2. Ctruktura viriona Dengue
Рисунок 2 – Структура вириона Денге
Вирусная РНК находитсяVirusnaya
внутри RNA
нуклеокапсидного
nahodistya vnutri белка окруженного оболочечными и
матриксными белками.
nukleokapsidnogo belka okruzchennogo
Существуют 5 серотипов
вирусаI matrichnym
Денге, имеющие
obolochechnym
belkami 60-80% структурной гомологии
(http://web.stanford.edu/group/virus/flavi/2000/dengue.htm).
Инфицирование
каждым
серотипом
вируса вызывает клинически схожее заболевание у человека. Заболевание вызывает длительный и
стойкий иммунитет. Однако антитела, выработанные к одному серотипу, не обладают кроссреактивностью к другим серотипам. Поэтому, иммунитет выработанный к вирусу Денге одного
серотипа не защищает от инфицирования другим серотипом.
Зоонозные ареалы серотипов вируса Денге претерпели серьезные изменения в 90х годах
прошлого столетия. Например, эпидемиологические исследования в конце 20-го века показали, что
серотипы 1 и 2 вируса Денге регестрировались в Странах Старого и Нового Света, в то время как
серотипы 3 и 4 были отмечены исключительно в Странах Юго-Восточной Азии (S. Fahri et al.,
2013); (D.S. Burke et al., 1988; R.S. Lanciotti et al., 1994; N. Sangkawibha et al., 1984). Однако
эпидемиологическая картина распространения вирусных серотипов претерпела значительные
изменения 30 лет спустя, где серотипы 3 и 4 вируса Денге обнаруживались за пределами
традиционного ареала в Странах Латинской Америки и Карибского региона (M.G. Guzman et al.,
2010).Такие значительные изменения в распространении серотипов вируса объясняются прежде
всего торгово-промышленными связями и развитием туризма. Однако особое внимание следует
обратить на быстроту распространения серотипов 3 и 4. Исследования Messer с коллегами
показали, что распространение вируса Денге серотипа 3 происходило в западном направлении из
Шри Ланки в страны Восточной Африки и далее с Латинскую Америку (W.B. Messer et al., 2003).
Интересным является тот факт, что после регистрации вспышки лихорадки Денге обусловленной
19
серотипом 3 в Шри Ланке в 1989 году, уже в 1994 году лихорадка Денге серотипа 3
регистрировалась в Никарагуа и Панаме (1995). Эти данные представляют наглядный пример тому,
как быстро ВГЛ могут распрлостраняться по всему миру. Недавно 5-й серотип Денге вируса был
обнаружен в Малазии (J.M. da Silva Voorham, 2014). Хотя результаты исследования не
окончательны и тебуют дальнейшего подтверждения, возможность циркуляции дополнительных
серотипов Денге вируса становится вполне вероятной.
Репликационный цикл вируса начинается вскоре после проникновения в клетку мишень (K.
Clyde et al., 2006). После связывания с поверхностным рецептором, вирус проникает в клетку
путем эндоцитоза (Рисунок 3). Внутри клетки, вирусная оболочка сливается с мембраной
эндосомы высвобождая вирионы в цитоплазму. Внутри клетки происходит «раздевание» вириона и
вирусная РНК попадает в цитоплазму.
Рисунок 3 – Репликационный цикл вируса Денге
Вирус проникает в клетки путем связывания с поверхностным рецептором, сопровождающимся
эндоцитозом. Раздевание вируса происходит в цитоплазме, при этом высвобождается вирусная
РНК, которая в последующем используется для процессов транскрипции и трансляции. Вирус
использует клеточные механизмы для собственной репликации и созревания. Зрелые вирионы
выделяются путем экзоцитоза.
Вирусная РНК используется в качестве матричной РНК для первоначального синтеза
белков, однако вскоре вирусная репликация переключается на синтез молекулы комплементарной
РНК отрицательной полярности которая, в свою очередь, используется для синтеза вирусной РНК
20
положительной полярности. Вновь синтезированные вирусная РНК и белки используются для
сборки вируса в аппарате Гольджи. Готовые вирионы выделяются посредством экзоцитоза.
Денге инфекция может протекать в 2х формах: Лихорадка Денге или Геморрагическая
Лихорадка Денге. Инкубационный период длится до 2 недель, после чего острые симптомы
заболевания проявляются в виде озноба, боли в спине, суставах (особенно коленных суставах).
Лихорадка достигает 400С и у большинства больных сочетается с гиперэмией лица, инъекцией
сосудов склер, гиперэмия зева. Лихорадка Денге протекает благоприятно. Только у менее чем 1%
больных развивается кома и остановка дыхания. Клинико-лабораторные данные демонстрируют
лейкопению с относительным лимфо и моноцитозом и тромбоцитопенией. Клинически, у больных
наблюдается артралгия, миалгия, перефирическая лимаденопатия. На 3-й день после первых
симптомов, наступает ремиссия, которая длится 1-3 дня, после чего появляются лихорадка и
основные симптомы заболевания. Характерным диагностическим симптомом лихорадки Денге
является экзантема. Экзантема чаще всего малопапулезная, появляющаяся на туловище и затем
распространяющаяся на конечности. Сыпь характеризуется зудом и оставляет после себя
шелушение. Элемены сыпи наблюдаются в течение 3-7 дней. Затем температура спадает и
наступает период ремиссии. Геморрагический синдром наблюдается редко, у 1-2% больных.
Период ремиссии характеризуется длительной астенией, мышечной болью и болью в суставах.
Гемморагическая лихорадка Денге начинается остро с высокой температурой (до 400С),
кашлем, тошнотой, рвотой и болями в животе. В отличии лихорадки Денге, геморрагическая
лихорадка не характеризуется болями в суставах. С прогрессированием заболевания состояние
больного быстро ухудшается, развивается лимфаденопатия и гепатомегалия. По классификации
ВОЗ, выделяют 4 степени тяжести заболевания. Степень 1 характеризуется лихорадкой,
появлением кровоизлияний на сгибе локтя. Симптом «проба жгута» положительная. В крови
наблюдается
тромбоцитопения
и
увеличение
гематокрита.
Вторая
степень
тяжести
характеризуется признаками присущими первой степени, однако, характерным является появление
спонтанных внутрикожных и желудочно-кишечных кровотечений. Степени 3 присуще развитие
циркуляторной
недостаточности
и
возбуждение.
Наконец
четвертая
степень
тяжести
характеризуется как циркуляторный шок. Третья и четвертая степени тяжести также носят
название шоковый синдром Денге. При обследовании больного отмечается беспокойство,
холодные и липкие конечности сочетаются с теплым туловищем. Отмечается бледность лица,
цианоз губ, у половины больных выявляются петехии, локализующиеся чаще на лбу и на
дистальных участках конечностей. Гипотензивный сидром сопровождается снижением пульсового
21
давления, тахикардией, цианозом конечностей и патологические рефлексы. Смерть чаще наступает
на 4-5-й день болезни. Кровавая рвота, кома или шок являются прогностически неблагоприятными
признаками. Распространенный цианоз и судороги представляют собой терминальные проявления
болезни. Больные, пережившие критический период болезни, становятся конвалесцентами.
Повторных случаев заболевания не набдюдается.
ККГЛ является острым зоонозным заблеванием вызываемым вирусом семейства
Bunyaviridae, рода Nairovirus. В природе, возбудитель ККГЛ циркулирует в популяциях грызунов,
крупного и мелкого рогатого скота, птиц. Также клещи рода Hyalomma marginatus, Dermacentor
marginatus, Ixodes ricinus
являются резервуаром вируса ККГЛ, которые после заражения
становятся носителями вируса и способны передавать вирус потомству через яйца. Вирус
передается человеку при укусе клеща или при контакте с кровью зараженного животного или
человека. Поэтому медицинский персонал и работники бойни подвержены высокому риску
заражения ККГЛ.
Впервые вирус ККГЛ был идентифицирован в 1945 году советским ученым Чумаковым
М.П. во время вспышки заболевания в Крыму. Позже, в 1956 году, идентичный вирус был выделен
из крови больного лихорадкой в Конго. В результате инфекционный возбудитель получил
название вирус конго-крымской геморрагической лихорадки. ККГЛ регистрируется во многих
странах включая Россию, Турцию, страны Ближнего Востока, Средней Азии, Китае и странах
Африки (Конго, Кения, Уганда, и
тд). Заболевание характеризуется сезонностью когда
большенство случаев диагностируется в период с мая по август (H. Hoogstraal, 1979; F.M. Vescio et
al., 2012). Вирус ККГЛ имеет сферическую форму с диаметром 92-96 нм. Вирусный геном состоит
из 3-х одноцепочечных молекул РНК отрицательной полярности имеющих название S (малый), M
(средний) и L (большой) отражающих размер молекулы (Рисунок 4). S, M и L сегменты кодируют
нуклеокапсидный белок, гликопротеины и РНК зависимую РНК полимеразу, соответственно.
Каждый вирусный сегмент покрыт нуклеокапсидным белком и упакован внутри липидной
оболочки.
22
Рисунок 4 – Структура вируса ККГЛ
Вирусная РНК состоит из 3 сегментов: S –малый, M- средний и L –большой. Вирусная РНК
находится внутри липидной оболочки, в которую погружены гликопротеины.
Несмотря на интенсивные исследования, специфичный вирусный рецептор на поверхности
клетки до сих пор неустановлен. Некоторые исследования позволяют предположить, что вирус
связывается с клатрин рецептором и затем проникает в клетку путем эндоцитоза (M. Simon et al.,
2009). Внутри клетки, мембрана эндосомы сливается с оболочкой вириона в результате чего
вирусная РНК и полимераза высвобождаются в цитоплазму. Синтез положительно полярной
вирусной РНК отмечается очень рано после инфекции. Наши знания о механизмах репликации
вируса ККГЛ ограничены и считается, что они во многом похожина те, что используются другими
членами семейства Bunyaviridae. Так было показано, что Bunyaviridae использует cap-snaching
механизм для инициирования синеза РНК. Для этого вирусная полимераза расщеляет клеточную
мРНК в области 5’ конца на куски длиной 15 нуклеотидов, которые используются в качестве
праймеров для транскрипции не-полиаденилированной вирусной мРНК (D. Garcin et al., 1995).
Вирусная мРНК короче, чем геномная РНК, поскольку транскриция терминирутся с области
крючка
(hairpin).
Механизм,
контролирующий
синтез
полноразмерной
вирусной
РНК
положительной полярности, которая может служить основой для синтеза вирусной геномной РНК
отрицательной полярности, остается неизвестным.
Механизмы, регулирующие синтез вирусных белков и транспортировку в места сборки
вириона, до сих пор стаются мало изученными. Например известно, что ненарушенная функция
системы микротрубочек исключительно важна для успешной репликации вируса ККГЛ (I.
Andersson et al., 2004). Авторы показали, что вирусный нуклеопротеин (НП) не обнаруживается в
аппарате Голджи, что предполагает синтез НП белка в эндоплазматическом ретикулуме. Далее,
23
авторами было показано, что система актиновых филаментов участвует в транспортировке НП в
перинуклеарную зону. Исследования вирусных гликопротеинов (ГП) показали, что они
синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме, однако потом ГП транспортируются в аппарат
Гольджи. Гликопротеины синтезируются в виде одного белка предшественника, который потом
разрезается, образует 2 белка: Gn и Gc. Gn белок содержит аминокислотную последовательность
(мотив), необходимый для локализации ГП в аппарате Голджи, где происходит сборка вирионов.
Gc белок не содержит подобной аминокислотной последовательности и поэтому не способен
самостоятельно локализоваться в аппарате Голджи. Исследования показали, что локализации Gc в
аппарате Голджи возможна только при наличии Gn (I. Andersson, et al., 2004). Было высказано
предположнение, что формирование Gn и Gc гетеро-олигомеров является необходимым условием
для локализации ГП в Голджи.
поверхность
Вирионы формируются внутри Голджи, траспортируются на
и выделяются из клетки с помощью экзоцитоза. Процессы транспортировки и
экзоцитоза системы микровизикул обеспечиваются слаженной работой системы микротрубочек
(A. Luini et al., 2008) (M. Simon et al., 2009).
Заражение человека вирусом ККГЛ происходит при укусе клещем носителем вируса или
контакте с зараженной кровью. Считается, что вирус проникает в кровь и накапливается в клетках
ретикуло-эндотелиальной системы. Исследования показали, что вирус ККГЛ реплицируется в
макрофагах и дендритных клетках, полученных путем дифференциации моноцитов (F.J. Burt et al.,
1997); (A.M. Connolly-Andersen et al., 2009). Посмертные исследования органов выявили
множественные геморрагии в слизистых оболочках желудка, кишечника, также кровоизлияния
наблюдаются в веществе головного мозга, легких и почках.
Различают
4
стадии
заболевания:
инкубационный
период,
прегеморрагический,
геморрагический и стадию выздоровления. Продолжительность каждой фазы идивидуальна у
каждого больного (F. Weber et al., 2008). Инкубационный период длится до 14 дней после чего
заболевание развивается бурно с признаками общей интоксикации. Прегеморрагический период
характеризуется признаками интоксикации и длится в среднем 3-4 дня. Больные жалуются на
слабость, головную боль и слабость. Однако основным сиптомом является лихорадка, которая
длится до 8 дней и характеризуется двойным пиком, за что и получила название «двугорбой
лихорадки». Геморрагический период характеризуется выраженным тромбогеморрагическим
синдромом, который и определяет тяжесть заболевания. Клинически в этот период наблюдается
появление гемморагической сыпи на коже и слизистых оболочках, гематомы, возможны
24
желудочные кровотечения. С ухудшением состояния появляются носовые и маточные
кровоизлияния, обширные гематомы кожных покровов, кровохаркание. В наиболее тяжелых
случаях наблюдается массивные желудочные кровотечения, появляются боли в животе, понос,
рвота. В этох случаях отмечается увеличение печени, положительный сиптом Пастернацкого и
снижение артериального давления. Лихорадка длится до 10 дней, после чего наступает период
выздоровления, который характеризуется прекращением кровотечения. Однако астеничный
синдром может продолжаться до 2 месяцев.
Лечение
больных
ККГЛ
симптоматическое
с
использованием
специфического
иммуноглобулина. Также была показана эффективность противовирусных препаратов, таких как
рибавирин и реаферон.
2.2. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусный легочный
синдром (ХЛС)
2.2.1. Эпидемиология хантавирусов
Хантавирусы принадлежат семейству Bunyaviridae, роду Хантавирусов. В природе
хантавирусы циркулируют среди мелких грызунов. Хорошо известно, что географическое
распределение и эпидемиология хантавирусов в целом отражают распределение и естественное
развитие их первичных носителей-грызунов (таблица 1). У своих естественных хозяев-грызунов,
хантавирусы вызывают бессимптомную инфекцию, тогда как инфекция у человека может
вызывать острое тяжёлое заболевание. Считается, что человек заражается при вдыхании аэрозоля
контаминированного вирусом. Общепринятым считается мнение, что человек может заразиться
после прямого контакта с инфицированными грызунами или их выделениями, однако существует
доказанный случай передачи ANDV от человека к человеку (P.J. Padula et al., 1998) (C. MartinezValdebenito et al., 2014). Несмотря на существование дополнительных сведений, указывающих на
возможность передачи ANDV от человека к человеку, случай, указанный выше, является
единственным подтверждённым горизонтального распространения хантавирусной инфекции у
человека. В Старом Свете существует два основных региона, где регистрируется большая часть
случаев хантавирусной инфекции: (1) Европа (включая европейскую часть России) и (2) Восточная
Азия (Китай, Корея и дальневосточные регионы России). В Китае ежегодно регистрируется до
100 000 случаев ГЛПС (Y.Z. Zhang et al., 2010) и примерно 900 случаев регистрируется в Корее и
на Дальнем Востоке России (2008. South Korean Centers for Disease Control and Prevention, Seoul,
South Korea.; (Y.Z. Zhang, et al., 2010). В Европе, большая часть случаев ГЛПС диагностирована в
25
России (3000 случаев), Финляндии (3000 случаев), Швеции (2000 случаев) и менее 100 лучаев
приходится на другие европейские страны (G.E. Olsson et al., 2009; E.A. Tkachenko et al., 2013). В
России, территория между Волгой и Уралом является наиболее напряженным зоонозным очагом
ГЛПС. Самые высокие показатели заболеваемости зарегистрированы в республиках Татарстан,
Башкортостан, Удмуртии, Самарской и Оренбургской областях (S.B. Garanina, et al., 2009).
Другими очагами неблагоприятной эпидемиологической ситуации являются территории на
Дальнем Востоке (Приморский, Хабаровский края, Амурская область) и Западной Сибири
(Омская, Тюменская, Новосибирская области). Кроме того, последние годы выявлены новые
природные очаги в Центральном Федеральном округе (Тульская, Рязанская, Воронежская,
Липецкая, Тамбовская, Орловская, Курская области), что привело к росту общей заболеваемости
ГЛПС в России в 3 раза. В течение последнего десятилетия наблюдается снижение числа
регистрируемых случаев на Дальнем Востоке, Урале и Сибири. В то же время, недавно был
обнаружен уникальный природный очаг ГЛПС в субтропической зоне Краснодарского края на
территории Большого Сочи (T.K. Dzagurova, et al., 2008)
Большая часть больных ГЛПС — это лица в возрасте от 20 до 50 лет (E. Pal et al., 2005).; (S.H.
Lee et al., 2013) (R.G. Nurgaleeva et al., 1999). Обычно регистрируется более высокая доля
заболевших среди мужчин по сравнению с женщинами (B. Niklasson et al., 1993); (S.H. Lee, et al.,
2013).;(R.G. Nurgaleeva, et al., 1999). Большинство случаев заболевания ГЛПС происходит в
сельской местности (S.H. Lee, et al., 2013).; (R.G. Nurgaleeva, et al., 1999). По этой причине ГЛПС
является профессиональным заболеванием фермеров, лесных рабочих, пастухов, лесорубов,
военных и т.д. (R.G. Nurgaleeva, et al., 1999). Несмотря на то, что сезонные пики случаев ГЛПС
варьируют в зависимости от штамма хантавируса, они всегда совпадают с повышенной
сельскохозяйственной активностью весной и осенью (P. Makary et al., 2010; R.G. Nurgaleeva, et al.,
1999). Например, большинство случаев, вызванных вирусом Хантаан (HTNV) и Пуумала (PUUV),
возникают осенью, тогда как большая часть случаев ГЛПС, вызванной вирусом Добрава (DOBV),
регистрируется поздней весной и летом (R.G. Nurgaleeva, et al., 1999); (F. Cui et al., 2013; I. Kuzman
et al., 2003). Единичные случаи хантавирусной инфекции регистрируются ежегодно, однако
крупные эпидемические вспышки, вызванные PUUV, выявляются каждые 3–4 года (D.H. Kruger et
al., 2013; B. Niklasson, et al., 1993; O. Vapalahti et al., 2003). Эпидемические вспышки обычно
связаны с увеличенным размером и изменениями в структуре популяций рыжих полёвок
(Clethryonomis glariolus), основного резервуара PUUV среди грызунов (B. Niklasson, et al., 1993; O.
26
Vapalahti, et al., 2003). Летальность ГЛПС варьирует от 0,1% до 10% в зависимости от вируса,
вызвавшего заболевание (таблица 1).
Таблица 1 – Клинические проявления, географическое распределение и резервуар (вид
грызунов) патогенных хантавирусов
Хантавирусы
Заболевание
у человека
Летальность, %
Географическое
распределение
Резервуар
грызунов)
(вид
Восточная Азия
Apodemus agrarius
(Азиатские
подвиды)
Вирус Хантаан (H.W.
ГЛПС
Lee et al., 1982)
10–15
Вирус Амур (L.N.
ГЛПС
Yashina et al., 2000)
Среди
людей
Азия
(Сибирь,
регистрируются
Дальний Восток Apodemus peninsula
немногочисленн
России)
ые случаи
Вирус Сеул (H.W.
ГЛПС
Lee, et al., 1982)
3–15
Азия
Rattus norvegicus
Вирус
Добрава
(DOBV) (T. AvsicГЛПС
Zupanc et al., 1992; A.
Plyusnin et al., 2001)
9–12
Европа (Балканы)
Apodemus flavicollis
DOBV-подобный
вирус
(G.A.
ГЛПС
Aliamovskaia et al.,
2005)
Низкая
Европа
(Северный
Кавказ)
Apodemus
ponticus
Вирус Сааремаа и
другие
DOBVподобные
штаммы
вируса, резервуаром
которых
служит
Apodemus
agrarius ГЛПС
(B. Klempa et al.,
2003; A. Plyusnin et
al., 2003; C. Sibold et
al., 2001; O. Vapalahti,
et al., 2003)
Низкая
Европа
Apodemus agrarius
(Европейские
подвиды)
(S.)
27
Продолжение таблицы 1
Хантавирусы
Заболевание
у человека
Летальность, %
Географическое
распределение
Резервуар (вид
грызунов)
Вирус Пуумала (M.
BrummerГЛПС
Korvenkontio et al.,
1999)
0,1–1
Европа
Clethrionomys
glareolus
Вирус Тула (A.
Plyusnin, et al.,
ГЛПС (?)
2001; D. Schultze et
al., 2002)
Сероположитель
ность
регистрируется в Европа
немногочисленн
ых случаях
Вирус Хабаровск
(L.N. Yashina, et al., ГЛПС (?)
2000)
Сероположитель
ность
Азия
(Сибирь,
регистрируется в Дальний Восток Microtus fortis
немногочисленн России)
ых случаях
Microtus arvalis
Вирус Син Номбре
(J.S. Duchin et al.,
ХЛС
1994; K.B. Nolte et
al., 1995)
40–60
Вирус Нью-Йорк
(B. Hjelle et al., ХЛС
1995)
Среди
людей
регистрируются Северная
немногочисленн Америка
ые случаи
Peromyscus
leucopus
Вирус
Мононгахела (A.
Plyusnin, et al., ХЛС
2001; L.V. Rhodes,
3rd et al., 2000)
Среди
людей
регистрируются Северная
немногочисленн Америка
ые случаи
Peromyscus
maniculatus (лесные
подвиды)
Вирус Байоу (A.S.
ХЛС
Khan et al., 1995)
Среди
людей
регистрируются Северная
немногочисленн Америка
ые случаи
Oryzomys palustris
Вирус канала Блэк
Крик (A.S. Khan et ХЛС
al., 1996)
Среди
людей
регистрируются Северная
немногочисленн Америка
ые случаи
Sigmodon hispidus
Северная
Америка
Peromyscus
maniculatus
(пастбищные
подвиды)
28
Продолжение таблицы 1
Хантавирусы
Заболевание
у человека
Вирус Мулшу (J.A.
Rawlings et al., ХЛС
1996)
Летальность, %
Географическое
распределение
Среди
людей
регистрируются Северная
немногочисленн Америка
ые случаи
Резервуар (вид
грызунов)
Sigmodon hispidus
Вирус Анд (D.A.
Enria et al., 2001; N. ХЛС
Lopez et al., 1996)
43–56
Oligoryzomys
Южная Америка
longicaudatus
(Аргентина,
(Южная
Чили)
Аргентина)
Вирус Лечигуанос
(D.A. Enria, et al., ХЛС
2001)
26
Южная Америка Oligoryzomys
(Аргентина)
flavescens
Вирус Оран
(«Северных Анд»
(M.C. Bohlman et
al.,
2002;
D.A.
Enria, et al., 2001; S. ХЛС
Levis et al., 2004; S.
Levis et al., 1998;
P.J. Padula et al.,
2000)
18–40
Южная Америка
“Oligoryzomys
longicaudatus”*
(Северная
Аргентина)
Hu39694
(D.A.
ХЛС
Enria, et al., 2001)
Среди
людей
регистрируются Южная Америка Oligoryzomys
немногочисленн (Аргентина)
flavescens(?)
ые случаи
Вирус
Лагуна
Негра (D.A. Enria,
ХЛС
et al., 2001; A.M.
Johnson et al., 1997)
9–29
Южная Америка
Calomys laucha
Вирус Чокло (M.J.
ХЛС
Vincent et al., 2000)
25
Южная Америка
Oligoryzomys
fulvescens
29
Продолжение таблицы 1
Хантавирусы
Заболевание
у человека
Летальность, %
Географическое
распределение
Резервуар (вид
грызунов)
Вирус Джуквитиба
(A. Suzuki et al.,
2004;
M.I. ХЛС
Vasconcelos et al.,
1997)
Среди
людей
регистрируются Южная Америка Oligoryzomys
немногочисленн (Бразилия)
nigripes
ые случаи
Вирус Арарахара
(A.M. Johnson et al., ХЛС
1999)
Среди
людей
регистрируются Южная Америка
Bolomys lasiurus
немногочисленн (Бразилия)
ые случаи
Вирус Кастело Дос
Сонхос
(A.M.
ХЛС
Johnson,
et
al.,
1999)
Среди
людей
регистрируются Южная Америка Oligoryzomyys
немногочисленн (Бразилия)
(?)
ые случаи
Вирус Араукария
(S.M. Raboni et al., ХЛС
2005)
39
ssp.
Южная Америка Bolomys lasiurus (?)
(Бразилия)
или Akodon ssp. (?)
* Виды грызунов, рассматриваемые как подвиды Oligoryzomys longicaudatus, в Северной
Аргентине демонстрируют, по данным исследования митохондриальной ДНК, генетические
различия на видовом уровне.
Изменения в популяции грызунов способны
влиять на масштаб эпидемических вспышек
хантавирусной инфекции у людей. Например, продемонстрировано, что каждые 2–3 года рыжие
полёвки дают два выводка за один сезон. Грызуны из первого выводка, родившиеся ранней весной
или поздней зимой, претерпевают быстрое развитие и обретают способность к оплодотворению в
тот же год (A.D. Bernshtein et al., 1999). Животные из второго выводка, родившиеся поздней весной
или в середине лета, становятся способными к оплодотворению на следующий год. Было показано
что, процент животных положительных на наличие вирусного антигена и антител к вирусным
белкам выше среди первого выводка по сравнению со вторым (48% против 8%) (A.D. Bernshtein, et
al., 1999). По этой причине был сделан вывод, что животные из первого поколения могут быть
основным резервуаром хантавируса среди рыжих полёвок. Это поколение способно поддерживать
персистирующую инфекциию и служит резервуаром вируса в промежутках от одного зоонозного
цикла до следующего. Дополнительным подтверждением того, что года когда рыжие полёвки
приносят два выводка за один сезон являются важными в поддержании хантавирусной
30
персистенции и распространении вируса является то, что крупные эпидемические вспышки
хантавирусной инфекции среди людей совпадают имено с этими годами (A.D. Bernshtein, et al.,
1999; А.Н.С. Бернштейн А.Д., Копылова Л.Ф., 1987)
Вирус Сеул (SEOV) является единственным хантавирусом, циркулирующим среди домашних
крыс (Rattus norvegicus и Rattus rattus) и вызывает заболевание у человека в городских условиях
(H.W. Lee, et al., 1982); (K. Sugiyama et al., 1987). Большая часть вызванных SEOV случаев ГЛПС
происходит весной и ранним летом, а летальность составляет 1–5% (K.H. Yoo et al., 1994).
В 1993 году, новый штамм хантавирусов был идентифицирован при изучении вспышки
пневмонии неизвестной этиологии в США. Штамм вируса был в последствие назван Син Номбре
(SNV), стал новым членом рода хантавирусов, вызывающих хантавирусный легочный синдром
(ХЛС). Это открытие положило начало дальнейшим исследованиям, приведшим к идентификации
множества других вирусов, вызывающих подобное заболевание, включая вирусы Мононгахела,
Нью-Йорк, вирус Блэк Крик канала, вирус Байоу, вирус Aндес (ANDV), Оран, Лечигуанос,
Hu39694 и множество других. Подсемейство грызунов Нового Света, Sigmodontinae, является
естественным резервуаром для этих вирусов (A.M. Johnson, et al., 1997). Хотя ХЛС
диагностируется
на
всей
территории
США,
большинство
случаев
этого
заболевания
регистрируется в западных штатах и вызывается вирусом SNV. В настоящее время ХЛС также
диагностируется в нескольких странах Южной Америки, включая Аргентину, Бразилию, Чили,
Боливию, Парагвай и Уругвай. ХЛС характеризуется высокой летальностью (40–50%) (A.S. Khan
et al., 1996; S. Levis et al., 1997)
2.2.2. Серологическая прослойка населения проживающего в эндемичных районах
Серологическая прослойка среди населения проживающего в эндемичных регионах
варьирует от 1% до 20–45% (S.W. Aberle et al., 1999; B. Niklasson, et al., 1993; R.G. Nurgaleeva, et
al., 1999; L. Zoller et al., 1995). В исследованиях был выявлен неодинаковый уровень естественной
иммунной прослойки в различных географических зонах и ландшафтах. Так, в Башкирии в зоне
липовых лесов иммунная прослойка во всех районах была весьма высокой (более 20,1%); на
Средней Волге, в зоне южной тайги в Предуралье и Западной Сибири, большинстве других
районов Башкирии она была высокой (10,1-20%) или средней (5,1-10%), а на остальных
территориях - низкой (менее 5%) или полностью отсутствовала (степные и полупустынные
31
районы). Это свидетельствует не о различной восприимчивости населения на разных территориях,
а о различной активности природных очагов инфекции в том или ином районе.
Только у 0,2–0,5% населения США обнаруживаются антитела против хантавирусов (C.B.
Jonsson et al., 2001) Исследования заболеваемости ХЛС позволяют предположить, что
эпидемические вспышки в Северной Америке связаны с ростом популяций Peromyscus
manucalatus — основного грызуна-резервуара SNV (A.S. Khan, et al., 1996). Пик регистрации
частоты случаев ХЛС у человека возникает поздней осенью или ранним летом с одинаковым
соотношением среди заболевших мужчин и женщин (A.S. Khan, et al., 1996). Исследования в
Южной Америке выявили низкую сероконверсию среди здоровых доноров в Бразилии (L.B.
Iversson et al., 1994). Однако в Аргентине серологическая позитивность варьирует от 0,1–1,5% в
центральной и южной Аргентине, и до 20% и выше в северной части Аргентины (D.A. Enria, et al.,
2001). В другом исследовании продемонстрировано, что до 40% парагвайских индейцев имеют
антитела
к
хантавирусу
(J.F.
Ferrer
et
al.,
1998).
Таким
образом,
серологическая
распространённость антител к хантавирусу у людей очевидным образом зависит от штамов
хантавируса, циркулирующего в данном регионе (то есть от их способности вызывать
сероконверсию у людей, не вызывая острое заболевание), а также условий окружающей среды,
например, жилищных условий и контакта с грызунами.
2.2.3. Вирус и структура вириона
Хантавирусы являются вирусами с отрицательно полярной трёхсегментной одноцепочечной
геномной РНК (C.B. Jonsson, et al., 2001)Большой (L), средний (M) и малый (S) геномные сегменты
кодируют РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), гликопротеиновый белок предшественник
(ГПП) двух оболочечных гликопротеинов (G1 и G2) и нуклеокапсидный белок (N), соответственно
(рисунок 5).
32
Рисунок 5 – Структура вириона хантавируса
Три сегмента хантавирусной РНК (small- малый) S сегмент; Medium (средний) M сегмент и Large
(большой) L sсегмент окружены нуклеокапсидным белком формируя рибонуклеопротеин (RdRp).
RdRp находится внутри липидной оболочки в которую погружены гликопротеины (Glycoporoteins)
G1 и G2.
В вирионе, вирусная РНК образует комплекс с N-белком, формируя отдельные L, M и Sрибонуклеокапсидные (RdRp) структуры. Нуклеокапсиды и RdRp упаковываются внутри
липидной мембраны, содержащей вирусные гликопротеины. Каждый вирион обычно содержит
эквимолярные количества каждой из трех геномных вирусных РНК (K.L. Hutchinson et al., 1996).
Исследования с использованием метода электронной микроскопии выявили, что хантавирусные
вирионы являются сферическими или овальными частицами размером 80–120 нм в диаметре (C.S.
Goldsmith et al., 1995). Репликация хантавирусов происходит исключительно в цитоплазме. RdRp
инициирует синтез положительно полярной цепи мРНК из геномных сегментов L, M и S РНК
(вирусная РНК), используя механизм «cap-snatching» (E.F. Dunn et al., 1995; D. Garcin, et al., 1995).
Хотя механизмы, которыми хантавирусная RdRp проводит транскрипцию и репликацию по
большей части остаются неизученными, предполагается, что эти функции регулируются
конформационными изменениями в структуре RdRp. Через некоторое время после начала
первичной транскрипции, RdRp инициирует репликацию посредством синтеза комплементарной
РНК (кРНК) с помощью пока еще неизвестного механизма. Вновь синтезированная кРНК может, в
свою очередь, использоваться в качестве матрицы для синтеза вирусной РНК, которая способна:
(1) служить матрицей для генерации мРНК на ранней стадии инфекции или (2) упаковываться в
новые вирусы на поздних стадиях. Предполагается существование двух механизмов синтеза
33
вирусной РНК: (1) УТФ-инициированный синтез генома и (2) механизм затравки и перестройки
(V.E. Chizhikov et al., 1995; D. Garcin, et al., 1995)
С самых ранних стадий инфекции, N-белок экспрессируется в наибольших количествах по
сравнению с другими вирусными белками. Показано, что мРНК, кодирующая N-белок, выявляется
в инфицированных клетках через 6 часов после инфицирования хантавирусом (K.L. Hutchinson, et
al., 1996), а вскоре после этого в цитоплазме выявляется хантавирусный N-белок (C.B. Jonsson, et
al., 2001). По этой причине предполагается, что хантавирусный N-белок, аналогично другим
членам семейства Bunyaviridae, является ключевым в цикле репликации вируса (G. Blakqori et al.,
2003; K. Flick et al., 2003; R. Flick et al., 2001). Например, путём энкапсидации вирусной РНК и
таким образом формировании рибонуклеопротеинового (РНП) комплекса, хантавирусный N-белок
способен защищать вновь синтезированную вирусную РНК от разрушения нуклеазами. Также, при
сборке
вириона,
N-белок
взаимодействует
напрямую
с
цитоплазматическим
доменом
гликопротеина G1 вируса, инициируя сборку вириона. Кроме того, N-белок, возможно, играет роль
в предотвращении внутрицепочечной гибризизации вирусных РНК (D. Kolakofsky et al., 1991).
Механизмы N-белковой энкапсидации вирусной РНК мало изучены. Показано, что 93 C-концевых
аминокислоты хантавирусного N-белка содержат сайтом связывания с РНК (P. Gott et al., 1993).
Недавно, в центральной консервативной области N-белка вируса HTNV, расположенной между aa
175 и 217, были обнаружены дополнительные сайты связывания с РНК (X. Xu et al., 2002). Nбелки, вероятно, различают вирусную
и невирусную РНК
(вирусная РНК, мРНК и
комплементарная РНК) и связываются с выступающими структурами, образованными 3' и 5'концами вирусной РНК (M.A. Mir et al., 2004). Позднее было продемонстрировано, что интактная
вторичная конформация и первичная последовательность 23-х нуклеотидов длинного выступа
вирусной РНК имеют значение для связывания с N-белком с высоким сродством через одиночный
N-белковый тример, взаимодействующий с одиночным выступом (M.A. Mir et al., 2005).
Недавние исследования выявили, что хантавирусный N-белок взаимодействует с белками
клетки хозяина. Например, N-белки вируса Тула (TUL) и HTNV взаимодействуют с малым
убиквинин-подобным модификатором-1 (SUMO-1) и его конъюгированным ферментом 9 (P.
Kaukinen et al., 2003; A. Maeda et al., 2003). Также N-белок вируса PUUV может взаимодействовать
с DАХХ белком, способствующим апоптозу (X.D. Li et al., 2002). Совокупно эти данные
указывают на то, что, в дополнение к своей роли в репликации хантавирусов, N-белок способен
взаимодействовавать с белками клетки хозяина. Природа этих взаимодействий остаётся
34
малоизученной. Предполагается, что взаимодействие N-белка с белками клетки-хозяина играет
важную роль в процессах репликации вируса и оказывает влияние на жизнеспособность клеткихозяина. Например, хантавирус способствует собственной репликации, блокируя активацию
противовирусных белков клетки-хозяина и препятствуя апоптозу инфицированных клеток. В свою
очередь белки клетки-хозяена могут связываться с хантавирусным N-белком, таким образом
снижая внутриклеточный уровень N-белка необходимого репликации вируса.
Хантавирусный гликопротеиновый предшественник (ГПП) синтезируется в рибосомах
цитоплазмы (M.N. Pensiero et al., 1992; C.S. Schmaljohn et al., 1987). Сигнальные пептиды ГПП
способствуют переносу гликопротеина в эндоплазматический ретикулум (ЭПР) где он котрансляционно расщепляется на 2 гликопротеина, G1 и G2. Расщепление ГПП происходит по
консервативной аминокислотной последовательности WAASA (C. Lober et al., 2001). Всё ещё
оставаясь в ЭР, G1 и G2 подвергаются гликозилированию и образуют гетеродимеры (D. Antic et al.,
1992; A. Ruusala et al., 1992; X. Shi et al., 2002). Формирование гетеродимеров является условием
для транспорта и удерживания G1 и G2 внутри аппарата Гольджи (C.S. Schmaljohn et al., 1986).
Наши исследования и исследования других групп показали, что экспрессируемые по отдельности
G1 или G2 остаются в ЭПР и не могут транспортироваться в аппарат Гольджи (V.M. Deyde et al.,
2005). Однако, когда оба гликопротеина экспрессируются вместе, они транспортируются в аппарат
Гольджи (V.M. Deyde, et al., 2005). Таким образом, формирование G1/G2-комплекса необходимо
для транспорта хантавирусных гликопротеинов в аппарат Гольджи. В аппарате Гольджи
заканчивается формирование G1/G2-комплексов, и они оказываются готовыми к сборке вирусных
частиц (C.S. Schmaljohn, et al., 1986). Известно, что гликопротеины ответственны за связывание с
клеточными рецепторами и проникновение в клетку (J. Arikawa et al., 1985; Y. Okuno et al., 1986;
T.F. Tsai et al., 1984). Предполагается, что хантавирусы используют рецепторы интегрина для
связывания с клеткой (I.N. Gavrilovskaya et al., 1999). Однако интегрины возможно не
единственные рецепторы, определяющие проникновение вируса в клетку. Например, было
показано, что HTNV проникает в клетку посредством клатрин-зависимого эндоцитоза (M. Jin et
al., 2002). Вскоре после проникновения в клетку антигены HTNV обнаруживаются в эндосомах,
откуда они постепенно транспортируются в лизосомы (M. Jin, et al., 2002). Предполагается, что
воздействие на хантавирусные частицы эндосомальной среды с небольшой кислотностью способно
вызвать конформационные изменения поверхностных белков, что приводит к слиянию эндосом с
вирусной липопротеиновой оболочкой подобно тому, что было продемонстрировано для вируса
леса Семлики (M. Jin, et al., 2002; M. Kielian, 1995). Слияние вирусных и эндосомальных мембран
35
способно приводить к высвобождению вирусных РНП в цитоплазму, где происходит репликация
хантавируса.
Хантавирусная RdRp обеспечивает транскрипцию и репликацию вирусной РНК. По этой
причине предполагается, что
RdRp должна обладать эндонуклеазной, транскриптазной,
репликазной и, вероятно, РНК-хеликазной активностью. Хантавирусная RdRp инициирует
транскрипцию вскоре после проникновения вириона в клетку и его «раздевания» (D. Kolakofsky, et
al., 1991). Для инициации транскрипции хантавирусная RdRp катализирует эндонуклеолитическое
расщепление нуклеотидов 7–18 по направлению к 5'-кэпу молекулы мРНК в цитоплазме клеткихозяина (D. Garcin, et al., 1995; C. Rossier et al., 1986). Таким образом, предполагается, что RdRp
содержит места связывания кэпа мРНК клетки-хозяина и геномной РНК. Однако эти регионы, или
домены, на RdRp в настоящее время остаются нераспознанными.
Вскоре после инициации первичной транскрипции посредством пока ещё не установленного
механизма RdRp начинает репликацию вируса, то есть синтез антигеномной комплементарной
РНК, которая используется в качества шаблона для синтеза вирусной РНК.
2.2.4. Хантавирусы и их естественные хозяева
Тысячелетия ко-эволюции и видообразования хантавирусов с определёнными видами грызунов
привели к выраженной конгруэнтности филогенетических деревьев вирусов и их хозяев (A.
Plyusnin, et al., 2001). Филогенетические деревья показывают, что вирусы циркулирующие в одном
биологическом виде хозяина грызуна образуют единый кластер, отдельный от кластера вирусов
циркулирующих в другом хозяине. Вирусные кластеры четко различаются с самого основания
филогенического дерева. До настоящего времени было выявлено только несколько случаев
обнаружения хантавируса в грызунах не являющихся основными хозяинами. К таким инциндентам
относятся: (1) обнаружение в грызунах Microtis вируса Хабаровск, который является
монофилетическим с вирусом Топографов у леммингов (O. Vapalahti et al., 1999); (2) обнаружение
в популяции P. leucopus вируса Нью-Йорк, который филогенетически близок к SNV-подобным
вирусам обычно циркулирующим среди P. maniculatus (S.P. Morzunov et al., 1998)и (3) выявление
вируса Саремаа среди Apodemus Agrarius, в то время как Apodemus flavicollis считается природным
резервуаром этого вируса (K. Nemirov et al., 1999; A. Plyusnin et al., 1997). Следует отметить, что
недавние исследования авторами генетической вариабельности DOBV-подобных хантавирусов в
центральной России с высокой степенью уверенности указывают на то, что смена хозяина
36
напрямую с A. flavicollis на Apodemus agrarius является крайне маловероятным сценарием , что
указывает на опосредованный характер распространения хантавирусов (Морзунов и др.,
неопубликованные данные) (Рисунок 6).
Рисунок 6 – Филогенетические взаимоотношения хантавирусов на основании 560нуклеотидного фрагмента S-сегмента генома
Филогенетическое древо содержит типичных представителей трёх главных филогенетических
групп хантавирусов, резервуарами которых служат члены семейств Murinae, Sigmodontinae и
Arvicolinae (показаны в затушёванных овалах). Невзвешенный анализ максимального приближения
(вариант поиска по методу «ветвей и границ») различий нуклеотидных последовательностей
между этими хантавирусами выполнялся с помощью PAUP* (*и другие методы) версии 4.0b10 на
37
компьютере марки PowerMac G4. Доверительные интервалы бутстреп-анализа (показаны рядом с
соответствующими ветвлениями) были получены в 1000 попыток эвристического поиска. Анализ
включал нуклеотидные последовательности S-сегмента генома штамма Solovey/AP61/1999 вируса
Амур (учётный номер в генетическом банке данных [GenBank] AB071183), штамма 76-118
(M14626) вируса Хантаан, штамма DOB/Saaremaa/160V (AJ009773) вируса Сааремаа, штамма
3970/87 (L41916) вируса Добрава, штамма 80-39 (NC_005236) вируса Сеул, штамма Chile-9717869
(NC_003466) вируса Анд, штамма 22819 (AF482714) вируса Лечигуанос, штамма NM R11 (L37904)
вируса Син Номбре, штамма RI-1 (U09488) вируса Нью-Йорк, штамма Moravia/5302v/95
(NC_005227) вируса Тула, штамма MC-SB-47 (U19304) вируса Исла Виста, штамма PH-1 (Z49098)
вируса Проспект Хилл, штамма Mf-43 (U35255) вируса Хабаровск, штамма Ls136V (AJ011646)
вируса Топографов и штамма CG1820 (M32750) вирус Пуумала.
Интересно, что при изучении хантавирусного филогенетического древа, создается впечатление,
что эволюция хантавирусов со своими хозяевами из разных подсемейств грызунов оказывает
влияние на способность вируса вызывать специфические клинические проявления у человека.
Например, большая часть хантавирусов, связанных с подсемейством Sigmadontinae, известна как
возбудители ХЛС. Эти вирусы распространены среди нескольких видов грызунов Нового Света из
подсемейства Sigmadontinae. Эти вирусы отличаются от других представителей семейства
Хантавирусов тем, что они вызывают тяжелые заболевания учеловека. Также летальность при этом
заболевании 40–50%, что так же выше по сравнению с летальностью при инфицировани другими
представителями этого семейства.
Тяжёлые заболевания с более низкой летальностью (до 10–15%) вызываются группой
хантавирусов Старого Света, которые эволюционировали совместно со своими хозяевами из
подсемейства Murinae. Представителями этой групы вирусов являются Hantaan, Dobrava, Saaremaa,
и другие. У человека мышиные вирусы вызывают ГЛПС, которое поражает, главным образом,
функции почек. В течение последних 15 лет выяснилось, что географическое распределение этих
вирусов в Евразии зеркально отражает распределение их хозяев-грызунов, полевых и лесных
мышей, в Европе, Восточной Азии и на Дальнем Востоке России (A. Plyusnin, et al., 2001).
Несмотря на то что летальность при ГЛПС ниже чем при инфицировании вирусами из
подсемейства Sigmadontinae, считается, что это заболевание представляет серьезную угрозу
здоровью человека.
38
Среди хантавирусов, резервуаром которых являются грызуны подсемейства Arvicolinae, только
PUUV, резервуаром которого является Clethrionomys glareolus, вызывает ГЛПС, часто называемую
эпидемической нефропатией (ЭН) (M. Linderholm et al., 2001). Интересно, что несколько других
членов этой группы, связанных с видами полёвок рода Microtus как Нового, так и Старого Света,
представляются непатогенными для человека. Штаммы PUUV, вызывающие лёгкую форму
заболевания у человека (с летальностью менее 1%), распределены, главным образом, по всей
Европе — от Франции до Уральских гор в России и от Скандинавии до Балкан. Непатогенные
хантавирусы, резервуаром которых являются грызуны из рода Microtus, представлены в Северной
Америке вирусом PHV, вирусом Исла Виста и несколькими другими тесно связанными вирусными
генотипами.
Вирусы могут обнаруживаться в моче и других выделениях инфицированных грызунов в
течение нескольких месяцев или лет после инфицирования. Самцы с большей вероятностью, по
сравнению с самками, выделяют вирус (A.J. Kuenzi et al., 2001). В цикле передачи хантавирусов не
обнаруживается переносчиков. Считается, что инфекция распространяется горизонтально путём
вдыхания
аэрозоля,
содержащего
вирус.
Кроме
того,
в
нескольких
исследованиях
продемонстрировано, что вирус может передаваться посредством укуса. Например, у самцов
обнаруживается более высокая распространённость антител к PUUV и большая вероятность
выявления хантавирусных антигенов в крови по сравнению самками. Также обнаруживается
большее количество ран на коже самцов серо/антиген-положительных животных по сравнению с
серо/антиген-негативными самцами или самками животных. Поэтому было сделано заключение о
возможности заражения животных через слюну после укуса зараженным животным (K.L.
Hutchinson et al., 2000; A.J. Kuenzi, et al., 2001; E.W. Otteson et al., 1996)
Высокая распространённость антиген PUUV-положительных самцов, по сравнению с самками,
предполагается в качестве основного фактора распространения вируса (E.W. Otteson, et al., 1996).
Например, по сравнению с самками, оставляющие (A.D. Bernshtein, et al., 1999) гнездо самцы
способны пересекать большие расстояния. Предполагается, что мигрирующие самцы могут
внедрять вирус в незаражённые популяции (A.D. Bernshtein, et al., 1999). Кроме того, попадание
новых штаммов вирусов в популяцию животных инфицированных другим штамом хантавируса
может приводить к появлению рекомбинантных вирусов (A.D. Bernshtein, et al., 1999).
Эксперименты с лабораторными животными выявили, что молодые животные восприимчивы к
инфекции и демонстрируют развитие хронической инфекции (G.R. Kim et al., 1985; T. Nakamura et
39
al., 1985). С другой стороны, у взрослых животных инфекция носит преходящий характер, и
животные, в конечном итоге, избавляются от вируса (G.R. Kim, et al., 1985; T. Nakamura, et al.,
1985). Хантавирусная инфекция может передаваться горизонтально среди грызунов-носителей (R.
Yanagihara et al., 1985). Однако новорождённые животные защищены материнскими антителами
(A.D. Bernshtein, et al., 1999; M.K. Borucki et al., 2000; А.Н.С. Бернштейн А.Д., Копылова Л.Ф.,
1987). Защита новорождённых животных представляется важной для выживаемости, поскольку
продемонстрировано, что инфицирование является фатальным для животных-сосунков (G.R. Kim,
et al., 1985) (T. Kurata et al., 1983). Эксперименты с использованием nude мышей
продемонстрировали важность для животных защиты с помощью T-клеточного иммунитета от
фатальных хантавирусных инфекций. Продемонстрировано, что цитотоксичные T-лимфоциты
обязательны для устранения вируса, поскольку перенос иммунных цитотоксичных T-лимфоцитов
защищает новорождённых мышат от фатальной и хронической инфекции (H. Asada et al., 1987; T.
Nakamura et al., 1985)
2.2.5. Инфицирование человека
Взаимоотношения между хантавирусами и их естественными хозяевами влияют на
распространение вирусов в природе. Например, показано, что по сравнению с животными
инфицированными SNV, у животных инфицированных PUUV выделение вируса с мочей
происходит чаще. Изучение мочи инфицированных животных показало, что РНК вируса SNV
редко выделяется из мочи, тогда как РНК вируса PUUV легко детектируется в моче грызунов.
Однако хантавирусы передаются от грызунов к человеку не только путём вдыхания
инфицированного материала. Имеются также убедительные данные о том, что SNV может
передаваться человеку при укусе инфицированным животным (J. Lobas et al., 2000).
Считается, что заражение человека хантавирусами происходит через дыхательные пути
посредством вдыхания содержащего вирус аэрозоля. Контаминированная вирусом моча, фекалии
или слюна считается основным источником хантавирусов в аэрозоле. Эпидемиологический анализ
вспышек заболевания в Аргентине (1995–1996 гг.) указывает на передачу хантавирусной инфекции
от человека к человеку в 2-х случаях, когда у врачей, оказывавших помощь пациентам, развился
ХЛС (D. Enria et al., 1996) (R.M. Wells et al., 1997). Также исследования вспышки заболевания в
южной части Аргентины и Чили (1996–1997 гг.) предоставили прямые генетические
доказательства в поддержку передачи хантавирусной инфекции от человека к человеку (P.J. Padula,
40
et al., 1998; J. Toro et al., 1998). В настоящее время передача от человека к человеку
продемонстрирована только для вируса АNDV, резервуаром которого является Oligoryzomis
longicaudatus. Обследование случаев ХЛС, вызванных SNV, не выявило случаев передачи
инфекции от человека к человеку (P.S. Zeitz et al., 1997). Также, больные ГЛПС считаются
неконтагиозными.
2.2.6. Рекомбинация геномов хантавирусов
Рекомбинация
геномных
сегментов
используется
сегментированными
вирусами
для
достижения высокой инфекционности и адаптации к новым животным-хозяевам (D. Li et al., 1995;
G. Peng et al., 1996; R.G. Webster et al., 1971). Рекомбинационная стратегия позволяет быстро
образовывать вирусы с совершенно новыми генетическими характеристиками. Этот механизм
продемонстрирован на примере феномена антигенных сдвигов вируса гриппа, приводящего к
глобальным пандемиям (R.G. Webster, et al., 1971; J.F. Young et al., 1979). Исследования
проведенные учеными из Центра по контролю за распространениями заболеваний США (CDC,
USA) и Института медицинских исследований инфекционных заболеваний в Форт Детрик США
(Fort Detrick, USA) показали возможность естественного возникновения рекомбинации между
генетически близко расположенными штаммами SNV в пределах локальных популяций грызунов
(W.W. Henderson et al., 1995) (D. Li, et al., 1995). Естественная рекомбинация между генетически
близкими штаммами одного и того же хантавируса возникает относительно часто, если вирусы
циркулируют в одной и той же популяции грызунов. Было высказано предположение, что
благодаря рекомбинации могут возникать уникальные штаммы хантавирусов с новыми
характеристиками вирулентности или новым диапазоном хозяев-грызунов (D. Li, et al., 1995). С
другой стороны, создаётся впечатление, что рекомбинация между генетически различными
хантавирусами возникает редко, даже если они случайно смогут инфицировать одного и того же
хозяина-грызуна (W.W. Henderson, et al., 1995; D. Li, et al., 1995). Были предложены следующие
объяснения описанному феномену: (i) низкая жизнеспособность реассортантов между генетически
сильно различающимися хантавирусами или (ii) редкость благоприятного стечения обстоятельств
для того, чтобы вирусы циркулирующие среди различных грызунов-хозяев инфицировали одно и
то же животное (W.W. Henderson, et al., 1995; L.L. Rodriguez et al., 1998). Тем не менее, учеными из
CDC была продемонстрирована возможность рекомбинации между штаммами хантавирусов,
циркулирующих в различных хозяев-грызунов, в условиях in vitro (W.W. Henderson, et al., 1995).
Предпочтительная рекомбинация с гомологичными L-M и L-S сегментами описана для многих
41
вирусов семейства Bunyaviridae (B.J. Beaty et al., 1985; Y. Higuchi et al., 1992; A.A. Sall et al., 1999).
Аналогично этому гомологичные сегменты L и M, и L и S обнаруживаются в равных пропорциях,
когда для инфицирования клеток используют тесно связанные штаммы SNV (CC107 и NMR11)
(L.L. Rodriguez, et al., 1998). Важность M-сегмента для рекомбинантной репликации и передачи
буньявирусов продемонстрирована ранее (B.J. Beaty et al., 1981). Например, эффективность
заражения мышей рекомбинантным вирусом содержащим M-сегмент вируса Ла-Кросс была
значительно выше таковой вируса содержащего M-сегмент SSHV.
2.2.7. Клинические проявления хантавирусной инфекции
Хантавирусы вызывают две клинически различающиеся формы заболевания: геморрагическую
лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусный легочной синдром (ХЛС). ГЛПС
характеризуется развитием почечной недостаточности и нарушениями свёртываемости крови,
тогда как для ХЛС характерны пневмония и кардио-васкулярные нарушения. ГЛПС и
ХЛС являются острыми инфекционными заболеваниями. Заражение происходит через верхние
дыхательные пути при вдыхании контаминированного вирусом аэрозоля. После относительно
короткого инкубационного периода (1–2 недели), у пациентов как с ГЛПС, так и с ХЛС
развиваются высокая лихорадка и миалгии (B. Hjelle et al., 1995; M. Kanerva et al., 1998)
Клинические проявления ГЛПС и ХЛС существенно различаются (таблица 2). Например,
почечная недостаточность характерна для ГЛПС, тогда как ХЛС характеризуется развитием
пневмонии и нарушениями функций сердца. Кроме того, для ГЛПС характерно развитие
геморрагического синдрома, который может варьировать от мелких петехий до тяжёлых
внутренних кровотечений. В тяжелых случаях, возможно развитие синдрома диссеминированного
внутрисосудистого свёртывания (ДВС) крови у больных ГЛПС. ДВС и почечная недостаточность
являются основными причинами смерти у пациентов с ГЛПС, тогда как тяжёлая сердечнолёгочная недостаточность приводит к летальному исходу у больных ХЛС.
42
Таблица 2 – Клинические проявления и изменения лабораторных показаний при ГЛПС и ХЛС
ГЛПС
ХЛС
Инкубационный
период
2–3 недели
1–2 недели
Ранние симптомы
Лихорадка, миалгии, разбитость, Лихорадка, миалгии, разбитость
гиперемия
лица,
инъекция
конъюнктивы
Антитела
В
дебюте
присутствуют IgM
Число
тромбоцитов
Снижено
Снижено
Иммунные
комплексы
Присутствуют в дебюте
Не сообщается
ДВС
Обычно развивается на 4-й день Не сообщается
дебюта заболевания
заболевания В
дебюте
заболевания
присутствуют IgM
Кинин и активация Присутствуют в раннем периоде Редко
комплемента
после дебюта
Кровоточивость
Варьирует
от
тяжёлых
кровотечений
Почечная
недостаточность
Один из основных симптомов
Редко
Пневмония
Редко
Основной симптом
Основная причина ДВС
и
смерти
недостаточность
Шок
Гипотензия и шок
диатеза
до Редко
внутренних
почечная Тяжёлая
сердечно-лёгочная
недостаточность
Гипотензия и шок
Результаты клинико-лабораторных исследований при ГЛПС и ХЛС выявляют снижение числа
тромбоцитов (M. Kanerva, et al., 1998; C.J. Peters et al., 1999) и лимфоцитоз со сдвигом
лейкоцитарной формулы влево (R.M. Lewis et al., 1991). Кроме того, на ранней стадии ГЛПС и
ХЛС обнаруживаются признаки повышения концентрации крови. Например, увеличение
гематокрита и снижение концентрации белка в сыворотке крови возникает в первую неделю ГЛПС
(T.M. Zhang et al., 1993). Аналогично, повышение уровня гематокрита (95% пациентов) и
увеличение протромбинового времени (81% пациентов) обнаруживают в крови при ХЛС (C.
43
Santana Rde et al., 2006). Несмотря на то, что лабораторные данные при ГЛПС и ХЛС во многом
схожи, повышенный уровень комплемента и иммунных комплексов (ИК) выявляется только при
ГЛПС. Повышенный уровень ИК и компонентов активированного комплемента обнаруживают в
сыворотке крови при всех формах ГЛПС (I.N. Gavrilovskaia et al., 1987; K. Penttinen et al., 1981; X.P.
Yi et al., 1991). При ХЛС aктивация комплемента и формирование ИК не обнаружены. Поэтому
можно предположить что активация комплемента и формирование ИК являются лабораторными
признаками, которые отличают ГЛПС и ХЛС друг от друга.
Клинически ГЛПС может протекать в 3 формах: легкая, средней тяжести или тяжелая.
Зачастую тяжесть заболевания определяется штаммом. Обычно, после заражения вирусами HTNV
или DOBV, инкубационный период длится от 2 до 3 недель после чего наблюдается типичная
клиническая картина где можно выделить 4 периода болезни включающих лихорадочный, период
олигурии, полиурии и выздоровления. Следует отметить, что у некоторых больных период
олигурии характеризуется полным отсутствием продукции мочи, в таких случаях период олигурии
еще подразделяют на анурический и олигурический периоды. Также, у некоторых больных
развивается гипотензивный сидром, что позволило некоторым исследователям выделить
дополнительный гипотензивный период. Клическая картина ГЛПС определяется вовлечением ряда
органов и систем, например, таких как нервная система, ораны желудочно-кишечного тракта и
сердечно-сосудистой систем. Такое обширное вовлечение различных органов является причиной
проявления болезни с широким спектром симптомов и признаков (J.A. Lednicky, 2003). Например,
было показано что инфекция вирусом DOBV сопровождается необычно широким вовлечением
легочной системы и развития пневмонии (M. Schutt et al., 2004).
Эпидемическая нефропатия (НЭ) является мягкой формой ГЛПС и вызвается вирусом PUUV
(B. Settergren, 2000). НЭ характеризуется инкубационным периодом достигающим 8 недель.
Заболевание характеризуется острым началом с признаками лихорадки, болями в животе и/или в
спине, головными болями. Эти симптомы сопровождаются появлением признаков поражения
почек. Поскольку заболевание протекает относительно мягче, чем ГЛПС, клиницисты не всегда
обнаруживают все фазы заболевания. НЭ как правило имеет благоприятные прогноз. Тем не менее,
у некоторых больных PUUV инфекция может привести к тяжелым осложнениям, в том числе
рассеянному энцефаломиелиту и гипопитуитаризму (T. Hautala et al., 2002; R. Krause et al., 2003).
Респираторные проявления описаны у 30%-50% пациентов с выраженными аномалиями на
рентгенографии грудной клетки (A.T. Nguyen et al., 2001). Также, в некоторых случаях
44
наблюдается развитие тяжелой легочной недостаточности (E. Seitsonen et al., 2006). У некоторых
больных могут возникать
постконвалесцентный почечный синдром характеризующийся
снижением функций почек.
ХЛС является наиболее тяжелым заболеванием, вызванным хантавирусами с частотой
смертельных исходов достигающих 40%. Клиническое течение ХЛС делится на три периода:
продромальный или лихорадочный, сердечно-сосудистый и выздоровления. ХЛС характеризуется
инкубационным периодом от 14 до 17 дней после чего начинается продромальная фаза
сопровождающаяся миалгией, общим недомоганием, лихорадой и кашлем с насморком. Также,
ранними признаками болезни являются значительная депрессия функции миокарда приводящего к
существенному снижению сердечного выброса и гипотензии (S.M. Raboni, et al., 2005). Оценка
легочной функции выявляет снижение уровня парциального давления O2 и низкие результаты
пульсоксиметрии. Симптомы ХЛС несколько отличаются в зависимости от штамма возбудителя.
Например, поражение почек и миозит наиболее часто описываются в случаях заражение вирусами
Bayou и Black Creek (B. Hjelle et al., 1996). В тоже время нейропсихологические нарушения
наблюдаются у некоторых больных ХЛС (R.O. Hopkins et al., 1998). Также, были зарегистрированы
случаи SNV инфекции без развития сердечно-сосудистых расстройств (P.T. Kitsutani et al., 1999).
2.2.8. Патогенез ГЛПС и ХЛС
Многие аспекты патогенеза ГЛПС И ХЛС остаютя малоизученными. В настоящее время
отсутствует единая теория объясняющая патогенез ГЛПС и ХЛС. Предполагается, что
инфицирование эндотелиальных клеток играет ключевую роль в патогенезе ГЛПС и ХЛС. Это
предположение базируется на том, что хантавирусные антигены зачастую обнаруживаются в
эндотелиальных клетках при исследовании тканей умерших от ГЛПС и ХЛС (S.R. Zaki, et al., 1995;
X.L. Zhang et al., 1987). Кроме того, в этих тканях были обнаружены признаки повышенния
проницаемости микрососудистого эндотелия (S.R. Zaki, et al., 1995) (L. Fedorchenko Iu et al., 1990).
Однако механизмы, благодаря которым хантавирусы вызывают повышение проницаемости
эндотелия, остаются неизвестными, поскольку 1) в исследованных тканях не было обнаружено
признаков повреждения эндотелия, вызванного репликацией хантавирусов (M. Kanerva, et al., 1998;
S.R. Zaki, et al., 1995); 2) хантавирусы не оказывают цитопатического действия in vitro (M.N.
Pensiero et al., 1992; M. Temonen et al., 1993) и 3) хантавирусная инфекция in vitro не оказывает
влияния на проницаемость монослоя эндотелиальных клеток (J.B. Sundstrom et al., 2001).
45
Совокупно эти данные указывают на то, что патогенез ГЛПС и ХЛС наиболее вероятно является
многофункциональным и включает повреждение эндотелия, активацию иммунного ответа,
цитокинов и хемокинов и т.д.
Используя ДНК чипы, было продемонстрировано, что транскрипционная активность клеточной
РНК значительно изменена в эндотелиальных клетках инфицированных хантавирусом in vitro (E.
Geimonen et al., 2002). Авторами было показано изменение экспрессии многих генов, включая
противовирусные факторы, факторы транскрипции, факторы роста, хемокины, рецепторы,
структурные белки, индуцируемые интерфероном гены и специфические киназы. Активация этих
генов возможна только при наличии репликации хантавирусов и не зависит от индукции
эндогенного интерферона. Авторами было показано что инфекция вирусом PHV приводила к
изменениям в транскриптационной активности 67 генов через 24 часа после инфекции, в то время
как уровень транскрипции был изменен только у 3 генов при инфицировании клеток вирусом
HTNV. Кроме того, авторами было отмечено, что ранняя транскрипционная активация
интерферон-зависимых генов является фундаментальным отличием непатогенных хантавирусов,
каковым является PHV от патогенных, таких как HTNV и NYV. Кроме того, инфекция вирусом
HTNV характеризовалась активацией хемокинов, молекул адгезии и факторов регулирующих
активацию комплемена, что не было характерно для клеток инфицированных вирусами PHV или
NYV. В другом исследовании, проведенном с использованием крысиной модели хантавирусной
инфекции, также была показана активация интерферон-зависимых белков, хемокинов и цитокинов,
подобно тому что было описано при инфицировании клеток человека in vitro (S.L. Klein et al.,
2004). Однако, авторы показали что у самцов экспрессия белков теплового шока (hsp70) была
значительно выше по сравнению с самками. Эти данные позволили сделать предположение что
хантавирусная инфекция вызывает отличные реакции в мужском организме по сравнению с
женским и эти различия, возможно, находят отражение в высокой заболеваемости мужчин по
сравнению с женщинами.
ИК обнаруживаются в сыворотке крови больных ГЛПС еще до выявления специфических
антител (I.N. Gavrilovskaia, et al., 1987; K. Penttinen, et al., 1981). Уровни ИК постепенно
увеличиваются в течение фебрильной, олигурической и полиурической фаз ГЛПС. Концентрация
ИК снижается в фазу реконвалесценции, хотя в некоторых случаях они могут сохраняться на
высоком уровне в течение нескольких недель после выздоровления. Остаётся спорным вопрос
46
относительно того, коррелируют ли уровни ИК в сыворотке крови с тяжестью клинических
проявлений (I.N. Gavrilovskaia, et al., 1987; K. Penttinen, et al., 1981).
Электронная микроскопия биопсийного материала почек, взятого через 3 дня после начала
ГЛПС, выявила наличие C3-компонента комплемента и депозиты IgM по ходу базальных мембран
капилляров почечных клубочков (E.J. Jokinen et al., 1977; E.J. Jokinen et al., 1978). В том же
исследовании C3 компонент комплемента и депозиты IgM были продемонстрированы в
интерстициальных тканях почек, взятых при аутопсии в поздние сроки заболевания (9–35 день
после появления первых симптомов заболевания). Депозиты ИК на базальных мембранах
капилляров наблюдались до 19-го дня болезни, тогда как депозиты в интерстициальных тканях и
системе канальцев нефрона регистрировались и на 35-й день от начала заболевания (E.J. Jokinen, et
al., 1977; E.J. Jokinen, et al., 1978). Морфологически, отличительные признаки ИК-опосредованного
повреждения тканей больных ГЛПС наиболее выражены в капиллярах мозгового слоя почек и
проявляются в виде некроза и преимущественно нейтрофильного клеточного инфильтрата (J.
Lahdevirta, 1971; J. Mustonen et al., 1994; J.B. Sundstrom, et al., 2001). Было высказано
предположение, что некроз, ишемия и кровоизлияния в мозговом слое почек при ГЛПС вызваны
воспалительно-клеточной инфильтрацией (Y. Collan et al., 1991; J. Mustonen, et al., 1994; J.B.
Sundstrom, et al., 2001; M. Temonen et al., 1996).
Размер ИК отличается в зависимости от фазы заболевания в момент их формирования.
Например, фракционный анализ ИК, собранных в фазу реконвалесценции, выявляет низкую
молекулярную массу ИК. Однако анализ ИК, собранных на более раних стадиях, обнаруживает
фракции низкой и высокой молекулярной массы. Вариации в размерах ИК, вероятно, обусловлены
количественным соотношением антиген/антитело в крови на момент формирования ИК. Например,
на ранней стадии инфекции ИК формируются в присутствии больших количеств вируса в крови и
относительно низких уровнях антиген-специфичных антител. Во время олигурической фазы и
фазы конвалесценции ИК формируются в условиях низкой концентрации вирусных антигенов в
крови в сочетании с высокими уровнями вирус специфичных антител.
Размер ИК оказывает влияние на эффективность их удаления из циркуляторного кровотока.
Например, купферовские клетки эффективно удаляют из крови растворимые иммунные комплексы
большого размера (W.M. Bogers et al., 1991; A.G. Johansson et al., 1996). Напротив, иммунные
комплексы малого размера менее эффективно удаляются из крови купферовскими клетками и
макрофагами селезёнки. Поэтому мелкие ИК, формируемые на ранней стадии ГЛПС, могут
47
циркулировать в крови дольше. Кроме того, способность устранения ИК купферовскими клетками
и макрофагами селезёнки варьирует и в течение инфекции снижаться, вызывая удлинение периода
циркуляции ИК, и способствуя отложению их в тканях. Как подтверждение этого утверждения,
было показано, что способность печени к удалению частиц из кровотока существенно снижена при
ГЛПС (V.A. Figurnov et al., 1985). Таким образом, можно предположить что размер ИК и снижение
клиренсной активности печени могут способствовать длительной циркуляции ИК в крови у
больных ГЛПС. Длительная циркуляция ИК может приводить к локальной активации
комплемента, цитокинов и хемокинов, увеличению экспрессии молекул адгезии.
Показано, что классический и альтернативный пути активации комплемента задействованы при
ГЛПС (A. Paakkala et al., 2000). Тяжесть заболевания коррелирует со степенью активации
комплемента (J. Sane et al., 2012). Увеличение сывороточных уровней активированного C1компонента комплемента обнаруживается при ГЛПС на 5–6-й день заболевания (D. Yan et al.,
1981). Кроме того, присутствие активированного C1 в сыворотке крови совпадает по времени с
проявлениями геморрагического синдрома, протеинурией и шоком (M. Lee, 1987). Снижение
сывороточной концентрации C3-компонента комплемента на ранних стадиях ГЛПС коррелирует с
длительными геморрагическими проявлениями и ДВС (M. Lee, 1987). Было показано, что в
течение всех четырёх стадий ГЛПС отсутствуют различия в сывороточной концентрации C4
компонента комплемента. Напротив, сывороточные концентрации активированных компонентов
комплемента, например, C3a, C4a и C5a, существенно увеличиваются на ранних стадиях инфекции
(M. Lee et al., 1989). Показано, что ИК, содержащие подклассы антител IgG1 и IgG3, являются
мощными активаторами классического пути активации комплемента (Y.M. Lucisano Valim et al.,
1991). Однако, ИК содержащие IgG1 и IgG3 плохо связываются с рецептором комплемента 1 (Y.M.
Lucisano Valim, et al., 1991) который используется для транспорта удаления ИК из крови.
Выраженная экспрессия этого рецептора обнаружена на эритроцитах, поэтому считается что эти
клетки играют важную роль в клиренсе ИК из крови. После адсорбции эритроцитами, ИК
доставляются в печень и селезёнку, где они диссоциируются от эритроцитов и захватываются
макрофагами или купферовскими клетками (W.P. Arend et al., 1971; L.A. van Es et al., 1984). Однако
природа ИК сформировавшихся при ГЛПС, харакреризующихся высоким соделжанием IgG1 и
IgG3 может негативно сказываться на их клиренсе и способствовать длительной циркуляции в
крови. А это, в свою очередь, может приводить к активации комплемента.
48
Вызывающие ГЛПС и ХЛС хантавирусы не оказывают цитопатического действия на большую
часть типов клеток. Поэтому патологические изменения органов при ГЛПС и ХЛС не являются
обусловленными вирус-индуцированным некрозом клеток. Наиболее вероятно, что клеточные
изменения развиваются в результате косвенных механизмов, таких как
иммунные реакции,
ингибирующее или активирующее влияние цитокинов и хемокинов, ИК и активация комплемента.
2.2.9. Иммунный ответ к хантавирусным антигенам
Хантавирусы не вызывают гибели инфицированных клеток, что было показано в
экспериментах in vitro (J. Hardestam et al., 2005; M.N. Pensiero, et al., 1992). Также, отсутствуют
убедительные доказательства цитопатического действия хантавирусов в органах и тканях больных
ГЛПС и ХЛС (M. Kanerva, et al., 1998; M. Linderholm, et al., 2001; M. Mori, et al., 1999; M. Temonen,
et al., 1996). На основании этих данных, был сделан вывод что патогенез хантавирусной инфекии
не связан с вирусной репликацией и скорее всего имеет опосредованный характер. Поэтому, было
высказано предположение, что структурные изменения в эндотелиальных клетках и увеличение
проницаемости эндотелия связано с цитопатическим воздействием иммунного ответа к вирусным
антигенам.
Различают два основных вида иммуннитета: гуморальный и клеточный. Оба вида
иммунного ответа играют важную роль в защите от вирусных патогенов. Например, раннее
образование вирус специфичных антител способствует связыванию антигена и препятствует его
расспространению
в
организме.
Роль
клеточного
иммунитета
сводится
к
элиминации
инфицированных клеток и, таким образом, препятствует распространению вируса. Следует
отметить, что роль гуморального и клеточного иммунитета в противовирусной защите
определяется и характером патогена. Например, если вирусный репликационный цикл включает
гибель инфицированной клетки, то связывание свободных вирионов антителами может
предотвращать инфицирование соседних клеток и, как результат, ограничивать диссеминацию
патогена. Однако, в случаях когда вирус нецитопатичен, элиминация инфекционного агента с
помощью антител затруднена. В таких случаях, роль клеточного иммуннитета исключительно
важна. ЦТЛ способны распознавать вирусные антигены на поверхности клеток, что приводит к
распознаванию инфицированных клеток и скорейшей их элиминации. Как результат, репликация
вируса и его распространение оказываются прерванными.
49
Два вида иммунного ответа характеризуются как особым клеточным составом, так и
продуктом активации и механизмами защитного действия. Гуморальный иммунитет представлен
популяцией В лимфоцитов и плазмоцитов вырабатывающих антитела. Клеточный иммунитет
характеризуется активацией ЦТЛ, воздействующих непосредственно на инфицированную клетку
вызывая ее гибель. Активация гуморального или клеточного иммунного ответа определяется
присутствием Т хелперов (ТН); где ТН первого типа (ТН1) активируют клеточный иммунный
ответ, соответственно ТН2, стимулируют пролиферацию В клеток, то есть гуморальный
иммунитет.
Гуморальный иммунный ответ при ГЛПС и ХЛС характеризуются высокими уровнями антихантавирусных IgM, появляющихся в сыворотке в вначале заболевания. Сывороточные уровни
IgM достигают своего максимума, как правило, на 7–11-й день после появления клинических
симптомов (X.S. Meng et al., 2003; P.J. Padula, et al., 2000). Антитела класса IgM направлены против
всех трёх структурных белков хантавирусов, включая нуклеокапсидный белок и 2 гликопротеина
(A. Lundkvist et al., 1993; A. Lundkvist et al., 1997; L.G. Zoller et al., 1993). Хотя раннее появление
вирус специфических IgM в сыворотке крови подробно описано для большинства хантавирусных
инфекций, PUUV инфекция, в некоторых случаях, характеризуется отсроченным IgM ответом.
Поэтому у этих пациентов отрицательный результат исследования на IgM исключает
хантавирусную инфекцию только после 6-го дня заболевания (H. Kallio-Kokko et al., 1998). Уровни
IgM снижаются в фазу реконвалесценции заболевания, что обычно совпадает с повышением
содержания анти-хантавирусных IgG (J. Groen et al., 1992; H.W. Lee, 1982).
Циркуляция IgG изотипов в целом сопоставима при ГЛПС и ХЛС. Оба вируса индуцируют
ранний IgG1-ответ, который усиливается с прогрессированием заболевания. Хотя вирусспецифичные антитела подкласса IgG1 вырабатываются против всех структурных белков (A.
Lundkvist et al., 1993), средние титры антител к гликопротеинам G1 и G2 выше, по сравнению с
титром к N-белку (P. Bostik et al., 2000). Уровни IgG2 обычно неизменены при ГЛПС и ХЛС (P.
Bostik, et al., 2000; A. Lundkvist, et al., 1993) Вирус-специфичные IgG3 против N и G1-белков
обычно выявляются в крови пациентов к моменту госпитализации. Они достигают пика во время
фазы конвалесценции и постепенно снижаются; причем угасание титра антител может
происходить в течение десятилетий после перенесённой инфекции (P. Bostik, et al., 2000; J. Groen et
al., 1994; A. Lundkvist, et al., 1993). В настоящее время не выявлена активация IgG4-ответа у
больных с ХЛС, однако
существуют литературные данные, указывающие на наличие анти-
50
хантавирусных IgG4 в некоторых случаях ГЛПС (P. Bostik, et al., 2000; J. Groen, et al., 1994).
Несмотря на активацию разных подклассов IgG антител у больных с ГЛПС, кореляция между
тяжестью заболевания и уровнями подклассов IgG не была обнаружена (P. Bostik, et al., 2000).
Исследования показали, что разные изотипы антител класса IgG корелируют с активацией
определённых популяций CD4+ T-хелперов и формированием специфических лимфокиновых
профилей (D.N. Forthal et al., 1994; M. Hashido et al., 1997; E.G. Torfason et al., 1987; D.K. Wagner et
al., 1989). CD4+ T-хелперы способны индуцировать секрецию антиген-специфичными Bлимфоцитaми либо IgG1 (TH2-клетки) или IgG2a (TH1-клетки) изотипы IgG. Поэтому можно
сделать вывод, что ранняя активация подклассов IgG1 и IgG3 при ГЛПС и ХЛС без существенных
изменений уровней подклассов IgG2 указывает на активацию иммунного ответа TH2-типа.
IgA являются наиболее важным компонентом иммунитета слизистых оболочек. Поскольку
заражение хантавирусами происходит, главным образом, через слизистые верхних дыхательных
путей, посредством вдыхания инфекционного аэрозоля, наличие нейтрализующих IgA может
существенно влиять на возможность заражения вирусом. Материнские нейтрализующие IgA и IgG
защищают новорождённых крысят от летальных доз SEOV после внутриутробного инфицирования
(K. Dohmae et al., 1993; K. Dohmae et al., 1998). Механизмы, IgA-опосредованной антивирусной
защиты остаются малоизученными. Имеется ряд данных указывающих на то, что нейтрализующие
IgA способны ингибировать репликацию вирусов путём связывания с вирусами находящимися
внутри инфицированных клетках, таким образом нейтрализуя вирус внутриклеточно (M.B.
Mazanec et al., 1992). Наибольшие уровни анти-PUUV IgA выявляются в сыворотке крови в острую
фазу и ранний период фазы конвалесценции и постепенно снижаются с прогрессированием
заболевания. Таким образом, антитела класса IgA, подобно антителам класса IgM, являются
маркёрами ранней стадии инфекции (C. de Carvalho Nicacio et al., 2000). Интересно, что схожие
результаты были получены и при исследовании динамики IgA в крови при заражении вирусами
проникающими через слизистые оболочки, включая вирус кори, ротавирус и энтеровирусы (B.S.
Coulson et al., 1990; K. Johansen et al., 1994; M.B. Mazanec et al., 1987).
Хантавирусные инфекции, в отличие от других вирусных заболеваний, таких как например,
грипп, цитомегаловирусная инфекция и инфекция, вызванная вирусом
Эпштейна–Барр,
характеризуются существенным повышением уровня сывороточных IgE (O.A. Alexeyev, 1991; O.A.
Alexeyev et al., 1994). Высокие уровни общего и хантавирус-специфичного IgE обнаруживаются в
сыворотке крови в острую фазу заболевания, после чего они постепенно снижаются (O.A.
51
Alexeyev, et al., 1994). Хотя уровень вирус-специфичного IgE положительно коррелирует с
тяжестью заболевания при многих вирусных инфекциях включая корь, ВИЧ и респираторносинцитиальный вирус (D.E. Griffin et al., 1985; J. Groen, et al., 1992) (R.C. Welliver et al., 1986), у
пациентов инфицированных PUUV, такой корреляции с клиническими показателями не
обнаруживается (O.A. Alexeyev, et al., 1994).
Нейтрализующие антитела могут выявляться на ранней стадии заболевания; обычно уже в
фебрильную стадию нейтрализирующие антитела регистрируются в сыворотке больных
(O.A.
Alexeyev, et al., 1994; J. Horling et al., 1992; A. Lundkvist, et al., 1997). Фебрильная фаза заболевания
характеризуется низкими уровнями хантавирус-специфичного IgG в сыворотке крови. В тоже
время высокие титры анти-хантавирусного IgM являются характерными для этого периода
заболевания. Этот факт позволил сделать вывод, что IgM играют главную роль в опосредованной
антителами нейтрализации вируса (A. Lundkvist, et al., 1993). ГЛПС характеризуется
перманентным повышением уровня нейтрализующих антител в течение 2-х лет после
перенесенного заболевания. Также было показано наличие высокого титра нейтрализующих
антител в сыворотке конвалесцентов через 10–20 лет после перенесённой инфекции. Эти данные
позволили предположить вероятность длительного персистирования PUUV в организме
конвалесцентов. Однако локализация вирусной персистенции и ее форма остаются неизвестными
(A. Lundkvist, et al., 1993; B. Settergren et al., 1991).
Предполагается, что G1- и G2-гликопротеины являются вирусными белками активирующими
продукцию нейтрализующих антител при хантавирусной инфекции. Например, показано что
моноклональные антитела (МАт) к белкам G1 и G2, но не N-белку, проявляют нейтрализующую
активность in vitro (J. Arikawa et al., 1989; J.R. Dantas, Jr. et al., 1986; A. Lundkvist et al., 1991; A.
Lundkvist et al., 1992), что позволило предположить важную роль этих белков в противовирусной
защите. Это утверждение было подтверждено в экспериментах in vivo. Например, эксперименты с
использованием модели новорожденных мышей показали, что МАт против гликопротеинов HTNV
способны защитить животных получивших летальную дозу вируса (C.S. Schmaljohn et al., 1990).
Далее,
было
показано
что
вакцинация
животных
бакуловирусом,
экспрессирующим
гликопротеины HTNV или SEOV, вызывает выработку нейтрализующих антител и защищает
грызунов от инфицирования вирусами HTNV и SEOV (C.S. Schmaljohn, et al., 1990). В публикации,
посвящённой серологическим характеристикам хантавирусной инфекции в Южной Америке,
показано, что N-белок не стимулирует выработку нейтрализующих антител в ответ на ХЛС (M.
52
Bharadwaj et al., 2000). Аналогично, иммунизация лесных полёвок кор-частицами химерного
вируса гепатита B, содержащими фрагменты нуклеокапсидного белка PUUV, не сопровождалась
продукцией нейтрализующих антител (R. Ulrich et al., 1998). Однако, несмотря на то, что антитела
к N-белку не обладают нейтрализующей активностью, эксперименты на животных показали
частичную защиту лесных полёвок от PUUV-инфекции (O. Vapalahti et al., 2001) и существенное
увеличение продолжительности жизни животных после инфицирования летальной дозой HTNV
(K. Yoshimatsu et al., 1993). Предполагается, что механизм защиты антител к N-белку может быть
связан с антител-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью или комплементопосредованным цитолизом (O. Vapalahti, et al., 2001).
В литературе детально описана высокая степень перекрёстной реактивности хантавирусных
антигенов, особенно внутри каждой из трёх групп вирусов, резервуарами которых являются (i)
грызуны подсемейства Murinae (HTNV, SEOV и DOBV), (ii) Arvicolinae (PUUV, PHV) и (iii)
Sigmodontinae (SNV и ANDV-подобные вирусы) (O. Vapalahti, et al., 2001). Хотя перекрёстная
реактивность обнаруживается среди генетически близких хантавирусных серотипов, наличие
реактивности между более отдалёнными хантавирусами считается маловероятной (Y.K. Chu et al.,
1995; Y.K. Chu et al., 1995; S. Jenison et al., 1994; C.S. Schmaljohn et al., 1985). Следует отметить,
что основным антигеном определяющим перекрёстную реактивность является N-белок, тогда как
G1- и G2 белки обладают меньшей перекрёстной реактивностью (S. Jenison, et al., 1994; H.
Sheshberadaran et al., 1988). Для объяснения этого феномена Ruo с коллегами предположили
наличие консервативных антигенных участков в нуклеокапсидных белках всех хантавирусов (S.L.
Ruo et al., 1991). Так, например, было показано существование трех эпитопов расположенных на Nконцах N-белка перекрёстно реагирующих между HTNV, SEOV и DOBV, вирусами которые в
природе циркулируют среди грызунов семейства Murinae (F. Elgh et al., 1997). Аналогично,
перекрёстно-реагирующие эпитопы обнаружены на N-конце N-белка вирусов SNV и PUUV
циркулирующих среди грызунов семейств Sigmodontinae и Arvicolinae. Как и ожидалось, эти
эпитопы обладают меньшей перекрёстной реактивностью с HTNV, SEOV и DOBV. Феномен
кросреактивности объясняется высокой степенью гомологичности на уровне аминокислотной
последовательности N-белка внутри каждой группы хантавирусов. Сравнительный анализ
аминокислотной последовательности концевых регионов N-белка хантавирусов выявили 83,7–
90,7% гомологии между вирусами HTNN, SEOV и DOBV, когда как гомология между SNV и
PUUV достигала лишь 74,4%. Если гомология в аминокислотной последовательности N-белка
была довольно высокой внутри вирусов циркулирующих в определенном семействе грызунов, этот
53
показатель был значительно ниже при сравнении белковых сиквенсов всех хантавирусных
штаммов и составлял 44,2 - 46,5% (F. Elgh, et al., 1997). Таким образом можно предположить что
высокая кросс-реактивность внутри хантавирусов, циркулирующих в популяциях одного
подсемейства
грызунов,
основана
на
высоком
уровне
гомологии
в
аминокслотной
последовательности N-белка. По аналогии, низкая перекрестная реактивность между вирусами
циркулирующими в популяции различных подсемейств грызунов объясняется низким уровнем
гомологии в аминокислотной последовательности N-белка.
N-белок является превосходной антигенной мишенью для активации иммунного ответа, так как
он способен активировать быстрый и сильный иммунный ответ на ранней стадии инфекции (A.
Lundkvist, et al., 1997; L. Zoller et al., 1989). Поэтому определение линейных эпитопных
детерминант на этом белке может послужить основой для разработки методов диагностики и
исследования патогенеза хантавирусной инфекции. N- и C-концы хантавирусного N-белка
демонстрируют
существенные
различия
в
распределении
антигенных
детерминант,
распознаваемых B-лимфоцитами (K. Johansen, et al., 1994; O. Vapalahti et al., 1995; O. Vapalahti et
al., 1992; T. Yamada et al., 1995). Например, было продемонстрировано, что C-конец N-белка не
содержит основных хантавирусных антигенных эпитопов (S. Jenison, et al., 1994; O. Vapalahti, et al.,
1995; O. Vapalahti, et al., 1992; T. Yamada, et al., 1995). Напротив несколько антигенных
детерминант были обнаружены на N-конце N-белка PUUV, HTNV и SNV (S. Jenison, et al., 1994; O.
Vapalahti, et al., 1995; O. Vapalahti, et al., 1992; T. Yamada, et al., 1995). Например, иммуногенные
эпитопы вирусов PUUV и Tula были идентифицированны в положении с 1 по79 и с 1 по 61
аминокислот соответственно (A. Lundkvist et al., 1996; A. Lundkvist et al., 1996). Также,
иммуногенные эпитопы были обнаружены между 1 и 103 аминокислотой N-концевой части Nбелка вируса HTNV которые реагировали с кроссреактивными Мат (J. Horling et al., 1996). Эти
исследования позволяют предположить что иммуногенные эпитопы расположеы на N-конце Nбелка всех хантавирусов. Однако, Wang и коллеги показали наличие антигенного сайта на С-части
N-белка. Так авторами был обнаружен кроссреактивный участок расположенный между 233 и 304
фминокислотами (M. Wang et al., 1993). Так же, основной иммуногенный домен расположен на Сконце N-белка вируса SNV (S. Jenison, et al., 1994; T. Yamada, et al., 1995).
Изучение клеточного иммунитета к хантавирусам показало, что мононуклеарные лейкоциты
крови чувствительны к инфицированию хантавирусами. Было показано, что от 2 до 20%
лейкоцитов больных ГЛПС позитивны на присутствие хантавирусных антигенов. Более того,
54
исследования выявили кореляцию между количеством вирус позитивных лейкоцитов и тяжестью
заболевания (Z.O. Yao et al., 1989). Также, внутриклеточный вирус был инфекционным и
выделялся из клеточной фракции, в то время как тромбоцитарная популяция была свободна от
вируса (Z.Q. Yao, 1987). Однако популяция лейкоцитов содержащая инфекционный вирус остается
неизвестной.
Большое количество исследований посвящено изучению изменений в популяционном составе
лейкоцитов крови больных ГЛПС (J.S. Duchin, et al., 1994) (S.R. Zaki, et al., 1995). Например, было
показано,
что
количество
циркулирующих
моноцитов
увеличивалось
значительно
у
хантавирусных больных (R.M. Lewis, et al., 1991). Увеличение количества моноцитов корелировало
с тяжестью заболевания и было выше у больных с тяжелой формой болезни. Изменения в
популяции лимфоцитов было в основном связано с увеличением числа Т (CD3) лимфоцитов и В
клеток (СВ190 и 9СВ20). Опять же, эти изменения были более выражены у пациентов с тяжелой
формой заболевания в острой фазе. Популяционный анализ лимфоцитов выявил повышение
количества ЦТЛ (CD8) в то время как количество Т хелперов (CD4) оставалось неизменным. Эти
изменения приводили к снижению CD4/CD8 соотношения ниже 1,0. Уровень Т хелперов и ЦТЛ
изменялся в течение заболевания и соотношение CD4/CD8 увеличивалось становясь выше 1.0 в
олигурическую фазу болезни (L.B. Chen et al., 1990; C. Huang et al., 1994; R.M. Lewis, et al., 1991).
Выявление штамм-специфичных цитотоксических T-лимфоцитов в крови инфицированных
животных и доноров-конвалесцентов показывает, что цитотоксические T-лимфоциты играют
важную роль в патогенезе хантавирусной инфекции (K. Araki et al., 2003; F.A. Ennis et al., 1997).
Хантавирусный N-белок считается основным антигеном, активирующим цитотоксические Tлимфоциты. В настоящее время идентифицировано несколько эпитопов T-лимфоцитов на
молекуле N-белка HTNV, SNV и PUUV. Некоторые эпитопы являются вирус-специфичными, то
есть
эпитоп-специфичные
цитотоксические
T-лимфоциты
уничтожают
только
клетки,
экспрессирующие N-белок соответствующего хантавируса.
Роль вирус-специфичных CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ) в элиминации вируса
подробно изучена на примере многих вирусов. Известно, что анти-вирусная активность CD8+ ЦТЛ
нередко взаимосвязаны и зачастую сопровождаются апоптозом инфицированных клеток и
повреждением тканей (J. Groen, et al., 1994; D. Kagi et al., 1994). Например, пассивный перенос
специфичных к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ) CD8+ ЦТЛ позволяет предотвратить
инфицирование BALB/c мышей соответствующим вирусом (M.J. Cannon et al., 1988; L.G. Guidotti
55
et
al.,
В
1996).
активированными
других
ЦТЛ,
исследованиях
описано
повреждение
у мышей,
печёночных
инфицированных
клеток,
вирусом
вызванное
лимфоцитарного
хориоменингита, и у мышей инфицированных вирусом гепатита B (HBV) (K. Ando et al., 1993; J.
Gossmann et al., 1995). Увеличение количества CD8+ ЦТЛ описано в тканях больных с тяжелой
формой ГЛПС и ХЛС. Так, например, T-лимфоциты (главным образом CD8+) обнаруживаются в
мононуклеарно-клеточных инфильтратах почек при остром течении ГЛПС (J. Mustonen, et al.,
1994; M. Temonen, et al., 1996). В лёгочной ткани больных ХЛС обнаружено высокое содержание
мононуклеарных лейкоцитов, включая лимфоциты, моноциты и макрофаги (M. Mori, et al., 1999;
S.R. Zaki, et al., 1995). Создаётся впечатление, что хантавирус-специфичные ЦТЛ распознают и
разрушают инфицированные клетки, что, вероятно, является одним из механизмов повреждения
тканей и патологических изменений при хантавирусной инфекции (F.A. Ennis, et al., 1997).
2.2.10. Генетические маркеры патогенеза хантавирусной инфекции
Существует
мнение,
что
HLA
генотип
влияет
на
отбор
иммуногенных
эпитопов
хантавирусного N-белка (H.L. Van Epps et al., 1999). Например, ЦТЛ клоны были обнаружены в
крови больного ХЛС в острой фазе заболевания; при этом клоны были способны распознавать
эпитопы N-белка SNV (aa 234-242 и aa 131-139) и рестриктированы по HLA C7 и HLA B35
генотипам, соответственно (F.A. Ennis, et al., 1997). Также три линий ЦТЛ, полученные из крови
конвалесцентов
HNTV-инфекции,
выявили
их
специфичность
в
отношении
эпитопа
расположенного между аминокислотами 12 и 20 и были рестриктированы по HLA B51 гаплотипу
(H.L. Van Epps, et al., 1999). Также, линии ЦТЛ, распознающие C-терминальные аминокислоты Nбелка HNV (aa 421-429) и рестриктированые по HLA A1 гаплотипу были выделены из крови
больных ГЛПС. Кроме того, шесть эпитопов CD8+ ЦТЛ были идентифицированы на N-белке
PUUV которые были рестриктированы по различными аллелями HLA, включая A2, A28, B7 и B8
(H.L. Van Epps et al., 2002). Далее, была продемонстрирована связь между определёнными
гаплотипами HLA и тяжестью ГЛПС. Было показано, что гаплотип HLA B8 и DR3
чаще
обнаруживается у больных с тяжёлой PUUV-инфекцией, тогда как аллель HLA B27 ассоциирована
с лёгким течением заболевания (J. Mustonen et al., 1998). Также был показан
высокий риск
развития тяжёлого ХЛС у пациентов, имеющих HLA-B*3501 гаплотип (E.D. Kilpatrick et al., 2004).
У пациентов с тяжелой формой ХЛС и которым требуется искусственная вентиляция лёгких, чаще
обнаруживаются SNV-специфичные T-лимфоциты, по сравнению с пациентами у которых
56
заболевание характеризуется как средней тяжести и не требует искусственной вентиляции лёгких
(E.D. Kilpatrick, et al., 2004).
Аминокислотная последовательность вирусных эпитопов способна оказывать влияние на
цитокиновые характеристики CD8+ ЦТЛ (G.T. Belz et al., 2001). Поскольку цитокины могут
активировать цитотоксическиe T-лимфоциты, участвующие в повреждении тканей, то можно
сделать вывод, что HLA-характеристика пациента может, в конечном итоге, определять степень и
характер повреждений тканей, вызываемых иммунным ответом (как минимум, связанное с CD8
ЦТЛ). Интересно было бы установить в будущем, оказывают ли влияние HLA-характеристики на
преимущественное повреждение лёгких у больных ХЛС или почек у больных ГЛПС.
До недавнего времени исследованиям роли цитотоксических T-лимфоцитов в патогенезе
хантавирусных инфекций мешало отсутствие экспериментальной модели, где инфекция протекала
бы так же, как у человека. С публикацией Hooper с коллегами ситуация изменилась. Было
показано, что у сирийских хомячков ANDV инфекция вызывает заболевание схожее по
проявлениям с ХЛС у человека (R.L. Brocato et al., 2014). Авторы указывают, что эта модель
является ценным инструментом для изучения роли различных эпитопов ЦТЛ при поражении
лёгких у больных ХЛС. Другая модель близкая по проявлениям к PUUV-инфекции у человека
была продемонстрирована с использованием Cynomolgus macaques модели. Авторы утверждают,
что эта модель является незаменимым инструментом в исследовании патогенеза PUUV инфекции,
тестирования потенциальных вакцин и противовирусных средств (J. Klingstrom et al., 2002).
2.2.11. Роль цитокиов в патогенезе хантавирусой инфекции
Цитокины являются небольшого размера белками (не более 30кДа) играющими важную роль в
установлении и поддержании межклеточных связей. Цитокины продуцируются практически всеми
видами клеток и биологически активны в малых концентрациях. Биологический эффект цитокинов
реализуется через связывание с рецептором на поверхности клетки мишени. К группе цитокинов
относятся: интерлейкины, монокины, интерфероны и хемокины. В зависимости от структуры и
биологической активности выделяют группу противовоспалительных, провоспалительных и
регуляторных цитокинов. Цитокины гетерогенны по аминокислотному составу, аминокислотной
последовательности, наличию углеводных остатков и по степени полимеризации молекулы.
Цитокины участвующих главным образом в формировании и регуляции защитных реакций
организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в регуляции ряда
57
нормальных физиологических функций. Накоплен значительный материал, позволяющий
выделить цитокины в новую самостоятельную систему регуляции, наряду с нервной и
эндокринной системами поддержания гомеостаза, причем, все три системы тесно взаимосвязаны. В
настоящее время гены большинства цитокинов клонированы и получены рекомбинантные аналоги,
с биологическими свойствими полностью соответствующими оригиналу. Семейство цитокинов
включает более 200 молекул.
Действие цитокинов не является антиген-специфиченым, поэтому диагностика заболевания по
цитокиновому профилю не представляется возможной. Тем не менее, выраженность цитокиновой
реакции может влиять на тяжесть заболевания и развитие осложнений. Например, Bozza и коллеги
показали что концентрация ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-13, ИФН-γ, MCP-1 и ФНО-α
было значительно выше у больных с септическим шоком (Crit Care. 2007;11(2):R49). Более того,
сывороточная концентрация ИЛ-6, ИЛ-8 и GCSF была ранним маркером ухудшения органной
функции и органной недостаточности. Далее, изменения сывороточных уровней ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ6, ИЛ-8, MCP-1 and G-CSF у больных с сепсисом коррелировало с вероятностью развития
смертельного исхода. В другом исследовании, было показано, что высокий сывороточный уровень
ИЛ-6 and ИЛ-10 у больных с лептоспирозом может свидетельствовать о развитии осложнений
(E.A. Reis et al., 2013). Далее, повышенное соотношение ФНО-α to ИФН-γ было обнаружено у
больных геморрагической лихорадкой денге по сравнению с больными, у которых был
диагностирован денге шок (Y. Collan, et al., 1991)
Изменение уровней сывороточных цитокинов было показано у больных ГЛПС и ХЛС.
Является общепризнанным, что активация цитокинов играет ключевую роль в патогенезе
хантавирусных инфекций. Считается, что увеличение проницаемости сосудов у больных ГЛПС
связано с цитокиновой активацией иммунного ответа. При этом, высказывается мнение, что
цитокины совместно с активированными лейкоцитами нарушают целостность эндотелиального
монослоя увеличивая проницаемость сосудистого ложа.
Ранняя активация воспалительных цитокинов обнаружена в крови больных ГЛПС и ХЛС.
Например, сывороточные уровни ФНО-α достигают максимальных уровней к 3–5-му дню после
начала заболевания и остаются повышенными в течение 7–10 дней (T. Krakauer et al., 1995). Среди
всех исследованных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-γ и ГМ-КСФ) в
крови госпитализированных пациентов с ГЛПС повышаются только концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10
(A.J. Zajac et al., 1998). Эти данные согласуются с хорошо известным фактом регуляторного
58
влияния ИЛ-6 и ИЛ-10 на ФНО-α. Например, ФНО-α и ИЛ-10 образуют авторегуляторную петлю в
которой ФНО-α индуцирует продукцию ИЛ-10, в то время как ИЛ-10 выступает ингибитором
продукции ФНО-α (T. van der Poll et al., 1994). ФНО-α и ИЛ-6 имеют много схожего в
физиологических процессах запускаемых при повышении продукции этих цитокинов; известно,
что эти цитокины имеют синергичный эффект (A.K. Abbas et al., 1997).
Повышенное содержание ФНО-α в сыворотке крови больных ГЛПС и ХЛС указывает на
важную роль этого цитокина в патогенезе этих заболеваний. Кроме того, большое число ФНО-αположительных клеток обнаруживается в биопсийных образцах почки и лёгких от больных ГЛПС
и ХЛС, соответственно (M. Mori, et al., 1999; M. Temonen, et al., 1996). В почечных биоптатах у
больных ГЛПС, ФНО-α
позитивные клетки расположены в перитебелярном пространстве в
основном вокруг дистальных тубул и собирательных дуктов (M. Temonen, et al., 1996).
Морфологическое исследование показало, что клетки продуцирующие ФНО-α возможно состоят
из
лимфоцитов,
моноцитов
и
макрофагов.
Повышенное
производство
ФНО-α
может
способствовать привлечению лейкоцитов в ткани пораженные вирусами. Активированные
лейкоциты обладают способностью к удалению клеток зараженных вирусом а также клирансу
клеточного дебриса. Однако, привлечение лейкоцитов в область инфицированных тканей не
является единственной функцией ФНО-α . Например, было показано, что ФНО-α значительно
снижает репликацию респираторно-синцитиального вируса (K.M. Neuzil et al., 1996). Кроме того,
добавление ФНО-α в культуральную среду клеток MDCK инфицированных вирусом гриппа
снижало его репликацию (H. Van Campen, 1994). Таким образом можно сделать заключение, что
ФНО-α обладает плиотропным эффектом, активируя лейкоциты, стимулируя иммунный ответ,
повышая проницаемость эндотелия и ингибируя вирусную репликацию.
ФНО-α является наиболее изученным цитокином. Установлено, что ФНО-α является
многофункциональным провоспалительным цитокином, который синтезируется в основном
моноцитами и макрофагами (M. Baer et al., 1998). Патологические изменения после введения ФНОα включают воспаление и кровоизлияния в лёгких, микроаггрегацию лейкоцитов и миграцию
полиморфноядерных лейкоцитов в систему микроциркуляции лёгких (J.R. Bradley, 2008; S.J. Smart
et al., 1994; Y. Song et al., 2001). В эндотелиальных клетках, подвергнутых действию ФНО-α,
увеличивается
прокоагулянтная
активность
и
способность
к
адгезии
полиморфноядерных клеток (L.A. Madge et al., 2001) (A. Burke-Gaffney et al., 1996)
лимфоцитов
и
59
ФНО-α является пирогеном, поэтому одним из первых симптомов повышенной сывороточной
концентрации цитокина является лихорадка. Однако, ФНО-α способен активировать лейкоциты,
стимулируя их миграцию, фагоцитоз и продукцию цитокинов. Кроме того, ФНО-α способен
повышать проницаемость эндотелиального барьера. Было показано, что обработка in vitro
монослоя эндотелиальных клеток цитокином ФНО-α приводит к увеличению проницаемости без
видимого цитопатического эффекта (A.H. Stolpen et al., 1986). Исследования показывают, что
ФНО-α способен усиливать капиллярную проницаемость венул in vivo (Y. Abe et al., 1990; C.J.
Horvath et al., 1988; E.S. Yi et al., 1992). Исследования механизма действия цитокина на
эндотелиальную проницаемость выявили, что ФНО-α деполимеризует F-актин и способствует
формированию межклеточных промежутков (S.E. Goldblum et al., 1993; A.H. Stolpen, et al., 1986)
Повышенная концентрация сывороточного уровня ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-10 у больных ГЛПС была
показана многими авторами (A.A. Borges et al., 2008; I. Kyriakidis et al., 2013; M. Linderholm et al.,
1996). Было обнаружено, что повышенный уровень ИЛ-6 в сыворотке больных ГЛПС коррелирует
с вероятностью смертельного исхода. Увеличение продукции ИЛ-10 зачастую происходит
одновременно с повышением сывороточной концентрации ФНО-а. Поэтому было высказано
предположение, что ГЛПС характеризуется одновременной активацией ТН1 и ТН2 типов
иммунного ответа. Однако активация ТН1 иммунитета корелирует с тяжестью заболевания (A.A.
Borges, et al., 2008). ТН1 тип иммунного ответа характеризуется повышенной сывороточной
концентрацией цитокинов ИФН-γ и ИЛ-12 которые способствуют активации ЦТЛ. Исследования
выявили повышение уровней ИФНg и ИЛ-12 в крови у больных ГЛПС (A. Saksida et al., 2011; M.
Wang et al., 2009). Эти данные свидетельствуют о роли ТН1 в патогенезе ГЛПС.
Циркулирующий ЦТЛ были обнаружены у больных ГЛПС, таким образом указывая на
активацию ТН1 типа иммунного ответа. Интересно, что эти ЦТЛ были способны распознавать
хантавирусные антигены и выделять ИФН-γ при стимуляции хантавирусными антигенами. Более
того, ИФН-γ продуцируемый клетками ЦТЛ стимулировал выделение ФНО-α макрофагами,
цитокина известного своим разрушительным влиянием на эндотелиальную целостность и
способствующим повышению проницаемости сосудов (C.F. Nathan et al., 1983). Кроме того, ИФН-γ
является важным цитокином способствующим in situ созреванию натуральных киллеров (НК)
(G.N. Barber, 2001; D.W. Mann et al., 1985; A. Matsukawa et al., 2000). Таким образом можно
предположить, что увеличение сывороточной концентрации ИФН-γ может способствовать
созреванию НК, которые в свою очередь способны удалять инфицированные клетки легочного
60
эпителия и эндотелиальные клетки (F.A. Ennis, et al., 1997; T. Kambayashi et al., 2000).
Исследования in vitro выявили основную роль N белка в активации ИФН-γ и ИЛ-12 в лейкоцитах
от ГЛПС конвалесцентов. Интересно, что лейкоцитами конвалесцентов характеризовались более
высокой продукцией ИФН-γ и ИЛ-12, в то время как активация ИЛ-4 и ИЛ-6 была незначительной
(C. de Carvalho Nicacio et al., 2001; F.A. Ennis, et al., 1997). Таким образом, можно заключить, что
цитокиновый профиль сыворотки больных ГЛПС способен активировать ТН1 тип иммунного
ответа, и N белок, возможно, является ключевым антигеном в его активации.
2.2.12. Лечение хантавирусной инфекции и вакцинация
В настоящее время отсутствует специфическая терапия хантавирусной инфекции. Лечение в
основном поддерживающее и симптоматичное. Терапевтические меры включают регулирование
жидкостного балланса, мониторинг гемодинамических параметров и контроль электролитного
баланса (D.A. Enria, et al., 2001; M. Linderholm, et al., 2001). Огромное значение имеет опыт
лечащего врача. Несколько препаратов, предложенных для лечения хантавирусной инфекции,
включают ИНФ-α, стероиды и циклофосфамиды (J. Bai et al., 1997; R. Dunst et al., 1998).
Использование Рибавирина снизило смертность при аднимистрации в момент появления первых
признаков заболевания (J.W. Huggins et al., 1991). Однако, рибавирин был неэффективным при
использовании в разгар клинических симптомов (G.J. Mertz et al., 2004).
Поскольку хантавирусы переносятся грызунами и распространяются с помощью аэрозоля,
основными средствами профилактики инфекции являются мероприятия, направленные на
уменьшение контакта с грызунами. Эти меры включают защиту жилищ от грызунов, правильное
хранение пищи, дезинфекцию и удаление пойманных грызунов и их выделений (M.S. Cetron et al.,
2002)
Первая
противохантавирусная
вакцина
была
разработана
с
использованием
вируса,
полученного из мозга грызунов (K. Yamanishi et al., 1988). Инактивированная вакцина существенно
снижала вирусный титр после инфицирования животных вирусом Хантаан (штаммы B-1, KHF-83-6
и 1BL) (K. Yamanishi, et al., 1988). Доступная на рынке инактивированная вакцина «Хантавакс»
(Hantavax) продемонстрировала 97%-ную частоту сероконверсии среди добровольцев через месяц
после вакцинации (H.W. Cho et al., 1999; H.W. Cho et al., 2002). Повторная вакцинация повышала
сероконверсию до 100% получивших вакцину (H.W. Cho, et al., 2002). У 50% вакцинированных
были обнаружены нейтрализующие антитела через год после вакцинации (H.W. Cho, et al., 2002).
61
Был сделан вывод о том, что вакцина «Хантавакс» хорошо переносится и вызывает иммунный
ответ у всех реципиентов (H.W. Cho, et al., 2002).
Другой подход к разработке вакцины основан на использовании вируса, пассированного в
культуре клеток. Три клеточные линии, включая почечные клетки золотистого хомячка (GHKC),
клетки Vero E6 и почечные клетки монгольской песчанки (MGKC), были использовали для
пассажа вируса (Y. Choi et al., 2003; G. Song et al., 1992; Z.Y. Zhu et al., 1994). Результаты
испытания клеточных вакцин на добровольцах выявили низкий уровень побочных эффектов по
сравнению с вакцинами полученными с использованием животных. Например, две вакцины,
полученные из клеточных культур, и одна вакцина, полученная пассажем через головной мозг
мышей-грудничков (SMB), тестировались в крупномасштабном клиническом испытании,
включавшем 55 699 добровольцев (J.W. Hooper et al., 2001). Побочные эффекты наблюдались у
7,29% получивших SMB-вакцину. Однако более низкая частота побочных эффектов выявилась
среди добровольцев, получивших GHKC и MGKC вакцины, 3,01% и 1,9% соответственно (J.W.
Hooper, et al., 2001)
Бивалентная вакцина против SEOV и HTNV была разработана учеными США и Китая (J.W.
Hooper, et al., 2001; W. Liu et al., 2000; Y. Ruan et al., 1999). После вакцинации высокий уровень
хантавирус-специфичных
антител
выявлялся
у
99,04%
добровольцев,
причем
частота
сероконверсии увеличивалась до 100% через две недели после повторной вакцинации (Y. Ruan, et
al., 1999). Титры нейтрализующих антител так же увеличивались, при этом у 100% реципиентов
нейтрализующие антитела обнаруживались спустя две недели после введении первой дозы (Y.
Ruan, et al., 1999). Во II фазе клинического испытания, побочные эффекты регистрировались у 2–
4% вакцинированных добровольцев. Частота сероконверсии варьировала от 87,6% до 96,3%. В
настоящее время 4 миллиона доз пяти доступных на рынке противохантавирусных вакцин
ежегодно производится в Китае (J.W. Hooper, et al., 2001).
Широко используются рекомбинантные методы разработки хантавирусных вакцин, включая
бакуловирусную экспрессию, экспрессию в E. coli, использование химерных и мозаичных корантигенов вируса гепатита B, рекомбинантные вакцина-вирусы, упакованные альфавирусные
репликоны и ДНКовые вакцины (J.W. Hooper et al., 1999; A. Lundkvist, et al., 1996; M.N. Pensiero et
al., 1988; C.S. Schmaljohn, et al., 1990; R. Ulrich, et al., 1998). Каждая из рекомбинантных вакцин
продемонстрировала высокий уровень сероконверсии и защиту экспериментальных животных.
62
Однако, несмотря на всю эту обширную работу, в настоящее время рекомбинантные вакцины на
рынке отсутствуют.
Недавно интересный подход к разработке хантавирусных вакцин был разработан учеными
Медицинского Исследовательского Института Инфекционных Заболеваний Армии США
(USMRIID). Было предложено производить вирус специфичные очеловеченные Fab фрагменты,
специфичные к хантавирусам, в гусиных яйцах (D. Meyre et al., 2014). Хорошо известен факт
высокого содержания в желтке гусиного яйца Fab фрагментов, которые обычно называются
иммуноглобулинами Y (IgY). Этот феномен был использован учеными для крупномасштабного
производства Fab фрагментов к хантавирусным белкам. Преимущество использования Fab
фрагментов заключается в отсутствии побочных эффектов, которые зачастую присутствуют при
использовании обычных иммуноглобулинов и связанны с Fc фрагментом молекулы антител (H.M.
Grey, 1967; M.L. Lundqvist et al., 2006). Гуси были иммунизированы плазмидной ДНК,
кодирующей М сегмент хантавирусного генома. Желтки собранных яиц использовались для
выделения и очистки Fab фрагментов. Высокая эффективность полученного препарата была
показана с использованием модели хантавирусной инфекции у сирийских хомячков (D. Meyre, et
al., 2014).
63
ГЛАВА 3. MАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Клеточные линии и реагенты
Эндотелиальные клетки вен пупочного канатика (HUVEC), клетки почечного эпителия
зеленой мартышки Vero клон E6 (Vero E6) и клетки легочного эпителия человека (тип II) А549
были получены из американской коллекции типовых культур ATCC (American Type Culture
Collection).
Клетки
HUVEC
растили
на
среде
MCDB 131,
обогащённой
сосудистым
эндотелиальным фактором роста человека (VEGF), 2% гидрокортизоном, 10% фетальной
сывороткой крови крупного рогатого скота (FBS), фактором роста фибробластов человека (0,5 мл;
1 мкг/мл), аскорбиновой кислотой, гепарином (0,5 мл; 1 мкг/мл) и гентамицином (Clonetics
Corporation; Уолкерсвилль, Мериленд). Клетки использовали между 2-м и 4-м пассажем. Клетки
A549 и Vero E6 растили на модифицированной среде Дульбекко (Dulbecco’s modified Eagle’s
medium - DMEM), содержащей 10% FBS и 50 мкг/мл гентамицина. Все клеточные линии
содержали во влажной атмосфере 5% СО2 при 370С.
Альвеолярные макрофаги человека выделяли из бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ). Сбор
бронхо-альвеолярного лаважа проводили на основании разрешения комитета по этике
Университета штата Невада (г. Рино). Сбор БАЛ регулярно проводится с диагностической целью в
ветеранском госпитале города Рино (Veterans Affairs Sierra Nevada Health Care System, Рино,
Невада). Нами отбиралась часть сбора БАЛ, которая оставалась после проведения клинических
тестов в госпитале. Для сбора лаважа привлекались добровольцы, у которых отсутствовали
хронические или острые вирусные заболевания. Волонтерам представлялась возможность
подробного ознакомления с процедурой и протоколом выделения альвеолярных макрофагов.
Процедура сбора БАЛ заключалась в промывании дыхательных путей раствором PBS (pH 7.4)
содержащих 50 мкг/мл гентамицина. Для сбора БАЛ (4x50 мл) использовался бронхоскоп Olympus
B4, позволяющий собирать лаваж с дистальных отделов бронхиального дерева.. Клеточную
составляющую БАЛ отделяли от остального содержимого промывных вод центрифугированием в
градиенте плотности фикола. Алвеолярные макрофаги выделяли путем адгезии в течение 72 часов
при 370С (5% СО2). Из каждого образца промывных вод получали в среднем 2–5 млн клеток.
64
Препарат Рибавирин был получен от компании Sigma. Интерферон-α (ИФН-α), ФНО-α были
приобретены у компаний Sigma и R&D Systems, соответственно. Цитохалазин, Пентоксифиллин и
Рибавирин были приобретены у компании Sigma. N(G)-монометил-l-аргинина, ингибитор синтазы
оксида азота и ИФН-γ были любезно предоставлены J. Maciejewski, National Institutes of Health,
Бетесда,
3.2. Сыворотки крови человека
Сыворотки крови больных ГЛПС были собраны в различные сроки после начала
заболевания. Венозную кровь (5 мл) собирали в пробирку с гелем и ускорителем образования
сгустка для отделения сыворотки от клеток крови. Пробирки центрифугировали (3000 об/мин) и
0.5 мл аликвоты полученной сыворотки хранили при -800С. Образцы сывороток здоровых доноров
были также собраны и хранились при -800С. Разрешение комитета по этике Казанского
(Приволжского) федерального университета на проведение исследований было получено на
основании статьи 20, Федерального Законодательства по «Защите Здоровья Граждан Российской
Федерации» N323-FZ, 11.21.2011.
3.3. Вирус
В исследованиях использовали вирус Андес (Andes virus [ANDV], штамм 23), вирус Син
Номбре (Sin Nombre virus [SNV], штамм Convict Creek 107 [CC107], любезно предоставленный
Connie Schmaljohn), вирус Проспект Хилл (Prospect Hill virus [PHV]) и вирус Хантаан (Hantaan
virus [HTNV]). Матричную культуру каждого вируса приготавливали путем выращивания вирусов
в культуре клеток Vero E6. Клетки Vero E6 инокулировали каждым вирусом индивидуально с
множественностью инфицирования (MOI) в диапазоне от 0,01 до 3. Инкубацию проводили в
течение 1 часа при температуре 370С и атмосфере содержащей 5% СО2. По окончании инкубации,
вирусный инокулят удаляли, клетки промывали культуральной средой и добавляли свежую
культуральную среду. Культивирование инфицированных Vero E6 продолжалось 14 дней.
Вирусный сток состоял из культуральной среды и соскоба клеточного монослоя. Собранный
материал
подвергался
2-х
кратному
циклу
заморозки
и
разморозки
для
выделения
внутриклеточного вируса. После этого, остатки клеток удаляли путем центрифугирования в
течение 1 часа при 40С и 30,000 об/мин.
65
3.4. Метод непрямого бляшкообразования
Поскольку хантавирусы не вызывают цитопатичный эффект, вирусный титр определяется
методом непрямого бляшкообразования. Для этого, клетки Vero E6 при 80% плотности моносля
инокулировали 10-кратными серийными разведениями каждого штамма хантавирусов. Инкубацию
проводили в течение 1 часа при температуре 370С и атмосфере содержащей 5% СО2. По истечении
инкубации, культуральную среду удаляли, клетки промывали свежей культуральной средой и
добавляли свежую культуральную среду, содержащую 0.6% агарозы. Клетки инкубировали под
агарозной средой в течение 14 дней. По окончании инкубации агарозную среду удаляли, монослой
фиксировали ледяным раствором смеси 3:1 ацетона и метанола (10 минут, комнатная температура).
После фиксации монослой инкубировали с антителами мыши к нуклеокапсидному белку вируса
Пуумала (1:1000; CDC) в течении 1 часа при 370С. После 3-х кратной промывки (ФСБ; 0,5% Твин),
монослои инкубировали со вторичными антителами к иммуноглобулинам мыши (1:5000; Santa
Cruz), конъюгированными с щелочной фосфатазой. Связавшиеся антитела выявляли с
использованием набора Alkaline Phosphate Substrate Kit I (Vector). Обычно, вирусный титр
определялся в пределах 3–6105 бляшко-образующих единиц (БОЕ).
3.5. Выделение общей РНК
Общую РНК выделяли с использованием реагента Trizol (Invitrogen) согласно протоколу
производителя. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой (Life Technology) для удаления
возможной ДНК контаминации. Полученную РНК хранили при температуре –80 °C.
3.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
Флуоресцентные зонды (пробы) и праймеры для ПЦР-РВ были разработаны с применением
программного обеспечения Primer Express (Applied Biosystems) в соответствии с рекомендациями
производителя. Последовательности использованных праймеров и проб представлены в таблице 3.
Праймеры были синтезированы компанией Invitrogen (Карлсбад, Калифорния), а пробы
синтезировались компанией ABI (Applied Biosystems). Каждая ПЦР-РВ (25 мкл) включала 1 мкл
кДНК, 1х Platinum qPCR Supermix-UDG (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), 20 нМ каждого
праймера и 100 нМ пробы. Рибосомная РНК (18S) использовалась в качестве внутреннего
контроля.
66
Таблица 3 – Праймеры и зонды для ПЦР-РВ
Ген
Прямой праймер
Обратный праймер
Зонд*
CCL5
cccgcagaggaagcacaa
gcgaagatttcccgtaaactttc
actacgcgggctgc
IL6
ctgcgcagctttaaggagttc
ccatgctacatttgccgaaga
cagtccagcctgaggg
ANDV S
tcacgccaggacgatttagg
ggctttgacctgtgctggaa
caattgcttgtggcctt
P78
ggccagcaagcgcatct
tggagcatgaagaactggatga
cagccacatccctttg
Cig5
cctgcttggtgcctgaatct
gcgcatatattcatccagaataagg
cagaagatgaaagactcct
Bcl2
cctgtggatgactgagtacctgaa
ctacccagcctccgttatcct
ctgcacacctggatc
SNV S
gggtctttttgttcaggcaaga
ttggatggagaggattgatgaat
acaacgagcagccaga
HTNV S
gcagcagttagcctccttggt
tgccgctgccgtaagtagt
tcctgcaacaaacagg
*Зонды для ПЦР-РВ содержат 5'-концевую флуоресцентную метку FAM и 3'-концевой гаситель
RTQ-1.
Стандартные графики для относительной количественной оценки РНК S-сегмента
хантавируса,
мРНК,
кодирующей
клеточные
белки,
и
18S
рРНК
строили, используя
последовательные разведения кДНК, полученные от инфицированных и неинфицированных
контрольных образцов, или серийные разведения плазмидной ДНК (Таблица 4) в зависимости от
специфики эксперимента. В каждом эксперименте значения ПЦР-РВ, полученные для S-сегмента
хантавирусной РНК, а также для мРНК, кодирующей клеточные белки, нормализовали по
значениям ПЦР-РВ для 18S рРНК соответствующего образца.
Число
копий
транскрипта
рассчитывалось
с
использованием
уравнения
копия/мкл = (концентрация/молекулярная масса) × 6,02217 × 1023. Произвольные единицы,
использованные для построения графика данных ПЦР-РВ представляют число копий транскрипта
скорректированное относительно количества 18S рибосомальной РНК в контрольном образце.
Колонки ошибки на графике представляют стандартную ошибку для реакций ПЦР-РВ, которые
выполнялись дважды.
67
Таблица 4 – Плазмиды, кодирующие кДНК генов хантавирусов, использованные для построения
стандартных кривых в реакциях ПЦР-РВ
Плазмида
Сегмент
pCMV AndesNuc
S
Основа
pCMV tag4B
Праймеры
F ccaccatgagcaccctccaag;
Размер вставки
1316 пн
R ctacttgtcatcgtcatccttgtagtccaacttaagtg
pcDNA Andes G1
M
pcDNA 3
F aagcttaccatggaagggtggtatctg;
2013 пн
R ggatcctcaatgagtcgtatctgacca
pCR Andes L
L
pCR-XL-TOPO
F cagatgatnaarcatgaytggtc;
692 пн
R ccgtggttcacatagctg
pCR CC107 S
S
pCR-XL-TOPO
F gggatacgtaagccaagacatc;
410 пн
R ggacaacgatctggagcaca
pCR CC107 G1
M
pCR-XL-TOPO
F ctccgcacgaagaagcaaacac;
583 пн
R gtaacrcartatgtctt
pGEM CC107 L
L
pGEM-TE
F ttaaaagtacatccagagacaccag;
1058 пн
R ttttagcctcctcatttagatttc
пн — пар нуклеотидов.
3.7. Синтез кДНК
Для отжига праймеров, 5 нг тотальной РНК смешивали с 2 нг случайных праймеров (Invitrogen,
Карлсбад, Калифорния) и нагревали до 70 °C в течение 10 мин. Полученный продукт быстро
охлаждали до 4 °C и использовали для синтеза кДНК. Реакционная смесь (20 мкл) состояла из 10
мМ каждого dNTP (GIBCO BRL/Life Technologies, Inc), 2 мкл буфера RT (Promega, Мэдисон,
Висконсин), 200 ЕД M-MLV RT (Promega, Мэдисон, Висконсин) и 20 ЕД ингибитора РНКазы
68
rRNasin (Promega, Мэдисон, Висконсин), куда добавляли 2 мкл кДНК. После инкубации в течение
10 мин при 25 °C, реакцию продолжали в течение 1 часа при 42 °C. Реакцию останавливали путем
нагрева до 95 °C в течение 5 минут. Полученная кДНК хранилась при температуре –20 °C.
3.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР проводили с использованием Platinum Taq полимеразы (Life Technologies).
Амплификацию проводили в течении 35 циклов: денатурация при 94 °С в течение 30 с, отжиг при
60 °С в течение 30 с, элонгация при 68 °С в течение 1 мин. Продукты ПЦР разделялись в 1%
агарозном геле и визуализировались с помощью окраски этидиум бромидом. Молекулы ДНК
ожидаемого размера вырезались из геля и очищались с помощью QIAquick Gel Extraction Kit
(QIAGEN) согласно рекомендациям производителя. Анализ нуклеотидной последовательности
выполнялся с помощью секвенатора ABI Prism 3730 DNA Analyzer. Полученные нуклеотидные
последовательности анализировали с помощью алгоритмов BLAST BLASTN, BLASTX и BLASTP
(National Center for Biotechnology Information). Все анализы сиквенсов, разработка праймеров,
рестрикционный анализ и определение открытых рамок считывания проводили с помощью
программного пакета DNA Star (Lasergene).
3.9. Анализ ДНК-чипов
Изменения во внутриклеточной концентрации мРНК оценивали с использованием набора
Human Genome HG-U95 Gene Chip (Affymetrix) согласно рекомендациям производителя. При этом
кДНК синтезировали, как было описано выше, используя 5 мкг общей РНК. После очищения
(колонка Clean-up Spin), 10 мкг кДНК использовали для получения биотин-меченой кДНК. Затем
кДНК (15 мкг) фрагментировалась и использовалась для реакции гибридизации. В конце
гибридизации
образцы
промывались
и
окрашивались
стрептавидин
фикоэритрином
и
использовались для сканирования согласно протоколу Affymetrix. Анализ микрочипов Affymetrix,
версия 4.0.1, использовался для корректировки и масштабирования результатов, а также сравнения
изменений экспрессии клеточной мРНК между инфицированными и ложно-инфицированными
контрольными клетками. Три отдельных анализа выполнялись для определения действительности
данных.
3.11. Иммунофлуоресцентный анализ
69
Монослои инфицированных хантавирусом клеток фиксировались ледяной смесью метанола
и ацетона (3:1) в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем монослои высушивали и
хранили при -200С. Перед началом использования, монослои промывали ФСБ, содержащим 0,1%
Твин 20 (ФСБ-Твин 20) (pH 7,4) и инкубировали последовательно с глицином (10 ммоль в ФСБ pH
7,4; 30 минут при комнатной температуре) и с TritonX 100 (0,1% в ФСБ pH 7,4; 30 минут при
комнатной температуре). Затем, монослои промывали в ФСБ-Твин 20 (pH 7,4) и использовали для
инкубации со смесями антител (30 минут, при комнатной температуре), описанными в таблице 5.
Таблица 5 – Антитела, использованные для определения внутриклеточной локализации белка р78 и
белков хантавирусов
Антигены
ЭПС/р78
Пары антител
антитела к кальнексину (1:200;
анти-р78 кроличья сыворотка (1;200)
Affinity Bioreagents)
Гольджи/р78
антитела к белку 58K (1;200; Sigma)
анти-р78 кроличья сыворотка (1;200)
N-белок/ЭПС
Моноклональные антитела к N-
Антитела к кальнексину (1:200; Affinity
белку PUUV (1:100; Dr. Ksiazek,
Bioreagents)
CDC)
N-белок/Гольджи
Моноклональные антитела к N-
Антитела к белку 58K (1;200; Sigma)
белку PUUV (1:100; Dr. Ksiazek,
CDC)
G1,2/ЭПС
Моноклональные антитела к G1/2
Антитела к кальнексину (1:200; Affinity
ANDV (1:100; собственная
Bioreagents)
разработка)
G1,2/Гольджи
Моноклональные антитела к G1/2
Антитела к белку 58K (1;200; Sigma)
ANDV (1:100; собственная
разработка)
PML/SP100
PML/DAXX
Моноклональные антитела к PML
Анти-SP100 кроличья сыворотка
(1:100; Santa Cruz)
(1:100; Santa Cruz)
Моноклональные антитела к PML
Анти-SP100 кроличья сыворотка
(1:100; Santa Cruz)
(1:100; Santa Cruz)
70
PML/ISG20
SNV G2
Моноклональные антитела к PML
Анти-ISG20 кроличья сыворотка
(1:100; Santa Crus)
(1:5,000; Dr. Mechti)
Кроличьи антитела к пептидам SNV Противокроличьи антитела
конъюгированные с щелочной
(1:500)
фосфотазой (AP) (1:2000; Vector)
ANDV G2
Кроличьи анти-ANDV G2
Противокроличьи антитела
противопептидные антитела (1: 500) коъюгированные с AP (1: 2000; Vector)
ANDV
ANDV сыворотка конвалесцентов
Противочеловеческие антитела
(1: 1000)
конъюгированные с AP (1: 2000;
Vector)
IRF-3
Моноклональные антитела к IRF-3
Противомышиные антитела
(1:200; Santa Cruz).
конъюгированные с Alexa 488 (1: 500;
Santa Cruz)
После инкубации с антиген-специфичными первичными антителами, монослои промывали
(трёхкратно ФСБ-Твин 20, pH 7,4) и обрабатывали (30 минут, комнатная температура, в темноте)
соответствующими флюоресцирующими антителами: противокроличьи Alexa 488 (зелёная
флюоресценция,
Molecular
Probes,
Eugene,
OR),
противокроличьи
Alexa
555
(красная
флюоресценция, Molecular Probes, Юджин, Орегон), противомышиные Alexa 488 (зелёная
флюоресценция, Molecular Probes, Юджин, Орегон) или противомышиные Alexa 555 (красная
флюоресценция, Molecular Probes, Юджин, Орегон) (Таблица 5). Препараты промывали
(трёхкратно; ФСБ-Твин 20, pH 7,4) и исследовали, используя флюоресцентный конфокальный
микроскоп (Nicon C1). Изображения обрабатывали с помощью программы Easy C1.
3.12. Иммуногистохимический анализ
Монослои клеток фиксировались ледяным раствором метанола:ацетона (3:1) и высушивались.
После регидрации (инкубирование в ФСБ, содержащем 0,1% Твин 20 в течении 10 минут),
монослои инкубировались с первичными антителами в течении 18 часов при 40 C. Затем, монослои
промывались (трёхкратно; ФСБ-Твин 20) и инкубировались со вторичными видоспецифичными
антителами против иммуноглобулинов животных. Вторичные антитела были конъюгированы со
71
щелочной фосфатазой. Присутствие комплекса антиген-антитело выявлялось с помощью набора
Alkaline Phosphatase Substrate KIT I kit (Vector).
3.13. Получение клеточной линии, экспрессирующей р78
Клетки
Vero
E6
трансфицировались
двумя
плазмидами:
1)
pcDNA3-HA-MxA(р78),
содержавшей открытую рамку считывания (ORF) гена р78 (любезно предоставлено доктором
Халлером, Фрейбургский университет, Германия) или 2) плазмидой pEGFP-puro, содержавшей
зелёный флуоресцентный белок (GFP) и ген устойчивости к пиромицину (J Virol. 1990
Jul;64(7):3370-5). Липофектамин (Life Technology) был использован для трансфицирования клеток
согласно рекомендациям производителя. Для этого, 3 мкг каждой плазмиды инкубировали
(20 минут, 250C) с 15 мкл липофектамина в 100 мкл среды OptiMem (Life Technology) для
формирования липофектамин/ДНК комплексов. Монослои клеток Vero E6 промывали в среде
OptiMem (Life Technology) и инкубировали с комплексами липофектамин/ДНК в течение 6 часов
при 370C, CO2. По окончании инкубации, среду заменяли на свежую среду DMEM, содержащую
10% FBS. Трансфицированные клетки Vero E6 культивировали в течение 48 часов (370C, CO2).
Эффективность трансфекции определяли путём подсчёта GFP-положительных клеток, используя
флуоресцентный микроскоп.
Для получения стабильно трансформированных клеток, трансфицированные клетки Vero E6
растили на чашках Петри, содержащей среду DMEM (10% FBS) с добавлением 1 мкг/мл
пиромицина (MP Biomedicals). Присутствие пиромицина в среде позволяло проводить селекцию
тех клеток, в которых происходила геномная интеграция (трансформация) плазмиды pEGFP-puro.
В результате трансформации, только клетки, содержащие плазмиду pEGFP-puro выживали в
присутствии антибиотика и формировали колонии. Колонии трансформированных клеток Vero E6
анализировали на присутствие плазмид pcDNA3-HA-MxA(р78) и pEGFP-puro. Колонии,
содержащие обе плазмиды, были использованы в дальнейших исследованиях. Клеточные линии
Vero E6, трансфицированные плазмидой pEGFP-puro (VE6/GFP) получали согласно описанию
выше и использовали в качестве контроля.
3.14. Твёрдофазный иммуноферментный анализ (ИФА)
Содержание цитокинов в культуральной среде определяли с помощью метода иммуноферментного
(ИФА) анализа согласно рекомендациям производителя (R&D Systems). В лунки добавляли
72
кроличьи антитела (1:1000) к соответствующему цитокину и инкубировали 18 часов при 40С. Затем
лунки промывали (трехкратно; ФСБ-Твин 20, рН 7,4) и добавляли образцы. Лунки блокировали в
течение 1 часа раствором 5% обезжиренного молока в ФСБ-Твин 20, рН 7,4. В качестве
позитивного контроля использовали последовательные разведения рекомбинантного цитокина.
Лунки без добавления цитокина служили отрицательным контролем. После 3-х кратной отмывки
(ФСБ-Твин 20, рН 7,4) в лунки добавляли мышиные антитела к соответствующему цитокину
(1:1000; ФСБ-Твин 20, рН 7,4: 5% обезжиренное молоко), конъюгированные с пероксидазой хрена
(HRP). Связавшиеся антитела выявляли с помощью TMB реагента (Pierce) с помощью
спектрофотометра при длине волны 405нм. Результаты ИФА представляли как соотношение (OD
эксперимента)/(OD фона).
3.15. Анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA)
Фракция ядерного белка была собрана с использованием стандартной методики описанной
Singer с соавторами (2003, Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol 285:L1087-L1098). Вкратце,
обработанные клетки дважды промывали ледяным раствором PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3
мМ Na2HPO4, 1,4 мМ КН2РО4) и собирали в 100 мкл PBS содержащий 1 мкг/мл апротинина, 1
мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл ингибитора соевого трипсина, и 1 мкг/мл пепстатина A. Клетки
осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин при 40С. Осадок промывали
дважды 1 мл буфера A [10 мМ HEPES (рН 7,9), 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 0,5 мМ DTT и 0,5 мМ
PMSF] и центрифугировали, как описано выше. Супернатант удаляли, а осадок, содержащий
клеточные белки, растворяли в 100 мкл гипотонического лизирующего буфера А, содержащего
0,1% Nonidet P-40. Затем растворы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин при 40С.
Супернатант, содержащий цитозольную фракцию, переносили в новую пробирку. Осадки,
содержащие ядерные белки, растворяли в высокосолевом буфере В [20 мМ HEPES (рН 7,9), 1,5 мМ
MgCl2, 0,42 М NaCl, 0,2 мМ Na2 ЭДТА, рН 8,0, 25% глицерина, 0,5 мМ ДТТ и 0,5 мМ ФМСФ] и
центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин при 40С. Супернатант, содержащий ядерные
белки затем разбавляли равным объемом буфера C [20 мМ HEPES (рН 7,9), 50 мМ KCl, 25%
глицерина, 0,5 мМ DTT и 0,5 мМ PMSF]. Концентрации белка для всех экстрактов были
определены методом бицинхониновой кислоты (BCA) с использованием бычьего сывороточного
альбумина в качестве стандарта.
73
Анализ изменений электрофоретической подвижности был произведен с использованием
набора EMSA (Promega). Для этого 4 мкг ядерного экстракта инкубировали с 32P-мечеными NF-κB
олигонуклеотидами. Избыток немеченого NF-κB олигонуклеотида добавлялся к реакции для
выявления специфичности конкурентного связывания.
Вкратце, 3,5 пМ консенсусных олигонуклеотидов NF-κB были помечены с использованием
1 мкКи
32
Р-АТФ в буфере содержащем 5 единиц T4 полинуклеотидной киназы, 70 мМ ТрисHCl
(рН 7,6), 10 мМ MgCl2 и 5 мМ DTT при 370С в течение 10 мин. Реакцию останавливали
добавлением 50 мМ ЭДТА и добавляли равный объём буфера 10 мМ ТрисHCl (рН 8,0),
содержащего 1 мМ ЭДТА. Неинкорпорированная радиоактивная метка удалялась с помощью гельхроматографии на Sephadex G-50 колонках. Реакцию связывания ядерной фракции клеточных
белков с меченными нуклеотидами проводили с использованием связывающего буфера,
содержащего 4% глицерина, 1 мМ MgCl2, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ДТТ, 50 мМ NaCl, 10 мМ ТрисHCl
(рН 7,5) и 0,05 мг / мл поли-ди-DC. Нуклеарные экстракты клеток HeLa, поставляемые в
комплекте, были использованы в качестве положительного контроля. Реакции связывания
проводили при комнатной температуре в течение 20 мин и останавливали путем добавления 10
кратного объема загрузочного буфера, содержащего 250 мМ ТрисHCl (рН 7,5), 0,2%
бромфеноловой
синего
и
40%
глицерина.
Образцы
наносили
на
4%
акриламидный
неденатурирующий гель размером 1,0-мм 10 х 12 см и подвергали электрофорезу при 100 В. Гели
высушивали в течение ночи при комнатной температуре и экспонировали на чувствительном к
радиоактивности экране Phosphorimager (BioRad).
3.16. Мультиплексный анализ
Метод мультиплексного анализа на основе технологии xMAP Luminex использовали для
определения сывороточных цитокинов/хемокинов в крови больных ГЛПС и здоровых доноров.
Количественный
анализ
уровня
цитокинов/хемокинов
оценивали
флуориметрии на мультиплесном анализаторе Bioplex®200™
методом
проточной
(Bio-Rad) в соответствии с
инструкцией фирмы производителя (Bio-Rad). Перед постановкой каждой реакции, прибор
калибровался с использованием калибровочного набора. Для этого сыворотки больных ГЛПС
наносили в лунку 96 планшеты и инкубировали (2 часа при комнатной температуре при
постоянном помешивании) с микрочастицими-носителями антител к соответствующим цитокинам.
После
промывки
Промывочным
буфером
(2х),
микрочастицы
инкубировали
с
74
биотинилированными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре при постоянном
помешивании. По окончании инкубации, образцы промывали (2х) и в каждую лунку наносили
стрептавидин (1:10,000) на 30 минут при комнатной температуре и постоянном помешивании.
Затем, промытые микрочастицы ресуспендировали в промывочном буфере и анализировали с
помощью программы Bio-Plex Manager, версия 6.0. Микрочастицы инкубированные с серийными
разведениями заданных концентраций контрольных растворов каждого цитокина использовались в
качестве контроля и для построения стандартной кривой.
Концентрация каждого аналита была рассчитана на основании стандартной кривой с
помощью программного обеспечения Bio-Plex Manager™ software. На основании стандартных
кривых бала подтверждена линейность тест-системы (валидация теста), после чего полученные
экспериментальные значения были подставлены в стандартную кривую и получены абсолютные
значения концентрации белков в исследуемых биологических образцах.
3.17. Микоплазменный тест
Все клеточные культуры использованные в исследованиях были проанализированны на
присутствие микоплазмы с использованием стандартного теста American Type Cell Collection
(ATCC). Анализ проводили согласно рекомендациям производителя.
Клетки (104 - 105 клеток) собирали в лизирующий буфер и центрифугировали при 13000 об/мин в
течение 3 минут при 40С. Супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в 50 мкл буфера для
лизиса и инкубировали при 370С в течение 15 минут. Затем образцы нагревали до 950С в течение
10 мин для инактивации протеаз. После центрифугирования 3000 об/мин в течение 5 минут при
40С, супернатант собирали в новую пробирку. Супернатант содержал клеточную ДНК, которую
использовали для ПЦР анализа на наличие микоплазменной ДНК.
ПЦР реакция проводилась с использованием реактивов, приложенных к набору. Для этого,
вначале приготавливали реакционную смесь, содержащую универсальные праймеры, способные
определять до 60 различных штаммов микоплазм, включая наиболее распространенные штаммы
M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M.hyorhinis, M. orale, M. pirum, M. salivarium, and A.
Laidlawii. К ПЦР смеси (20 мкл) добавляли 2,5 мкл универсальных праймеров, доводя общий
объем реакционной смеси до 22,5 мкл. Набор также содержал положительные и отрицательные
контроли. Каждая реакция проводилась в дубликатах. Начальная денатурация 940С в течение 1,5
мин; Параметры ПЦР: 20 циклов ПЦР включали денатурацию 940С, 30 сек, отжиг 60,50 30 сек и
75
элонгацию 720 45 сек. В течении ПЦР, температура отжига постепенно снижалась на 0,50 С за цикл
(например, 700С в течение 1 цикла, затем 69,50С в течение 2 цикла, и т.д., до 60,50С).
Заключительный цикл включал элонгацию при 720С в течение 4 мин с последующим хранением
при 40.
3.18. Иммуноблотинг
Образцы клеточного материала лизировали в 200 мкл (106 клеток/40 мкл) 0.1% раствора натрия
додецил сульфата (SDS). Kлетки ресуспендировали в 100 мкл четырёхкратного электрофорезного
буфера для нанесения образцов на гель, содержащего 0,4 М Tris-HCl (pH 6,9), 40% глицерола, 10%
SDS, 0,01% протеазного ингибитора BPB (Boehringer Mannheim) и 10% β-меркаптоэтанола.
Клеточные лизаты нагревали до 1000С в течение 5 минут на водяной бане, после чего
непосредственно использовали в экспериментах или хранили при -200С. Эквивалентная нагрузка
на каждую дорожку SDS-геля достигалась путём количественного определения белка с помощью
модифицированного анализа белка по Лоури (Pierce, Рокфорд, Иллинойс) и подтверждалась с
помощью окраски геля по Кумасси. Белки разделялись с помощью электрофореза (15 минут,
4 мА/см2) и переносились на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга (Bio-Rad,
Ричмонд, Калифорния).
После переноса белков, мембрану блокировали в течение 1 часа в
растворе 5% обезжиренного молока в трис-фосфатном буфере (TФБ) и 0,5% Tween 20. После
трёхкратного промывания мембраны инкубировали (18 часов, 40C) с первичными антителами
(мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсидному белку вируса Пуумала (GB04-BF07; 1:1
000; антитела получены от T. Ksiazek, Centers for Disease Control and Prevention, Атланта,
Джорджия)). Далее мембраны инкубировали со вторичными HRP конъюгированными антителами
(Vector
Laboratories,
Inc,
Бурлингейм,
Калифорния).
Комплексы
антиген-антитело
идентифицировали с помощью HRP субстрата (Vector Laboratories, Inc, Бурлингейм, Калифорния)
согласно инструкции производителя.
3.20. Mодифицированный анализа белка по Лоури
Один миллилитр модифицированного по Лоури реагента добавляли в каждую пробирку
содержащую образец. Все хорошо перемешивалось и инкубировалось при комнатной температуре
в течение 10 мин. В конце 10-минутной инкубации, в каждую пробирку добавлялась 100 мкл
приготовленного 1х Folin-Ciocalteu реагента. Смесь перемешивалась и инкубировалась при
76
комнатной температуре в течение 30 мин. Затем оптическая плотность образцов определялась с
помощью спектрофотометрии при длине волны 750 нм. За негативный контроль принимался
раствор, в котором собирались образцы. Затем значения негативного контроля вычитались из
значений оптической плотности испытуемого образца. Все эксперименты проводились 3 раза. Для
определения белковой концентрации данные оптической плотности образца сравнивали со
значениями стандартной кривой, предварительно построенной с использованием белка BSA в
качестве стандарта.
3.21. Получение поликлональных антител к гликопротеину G2.
Анти-пептидные антитела получали к пептидам, синтезированным на основе аминокислотных
последовательностей гликопротеина G2 хантавирусов ANDV (штамм 23), вируса SNV (штамм
CC107).
Участок
гликопротеина
G2
SNV,
расположенный
на
C-конце
(aa
480-489;
CPVRNRKNKAN), и участок гликопротеина G2 ANDV, расположенный на C-конце (aa 480-488;
CPRRGHKKTV), синтезировали с помощью Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer.
Очищенные с применением ВЭЖХ пептиды ковалентно сшивали с белком-переносчиком
гемоцианин лимфы улитки (KLH) через N-концевой цистеин пептида для формирования пептидбелковых конъюгатов. Смесь пептидов ANDV или SNV с полным адъювантом Фрейнда
использовали для иммунизации кроликов. Сыворотку собирали через 2 месяца после первой
иммунизации. Специфические антитела к гликопротеину G2 ANDV и SNV очищали с
применением аффинной хроматографии на колонке SulfoLink Kit (Pierce), коньюгированной с
соответствующими пептидами. Специфичность генерируемых анти-G2 антител определялась с
помощью ИФА и иммуноблотинга.
3.22. Получение реассортантных вирусов in vitro
Монослой клеток Vero E6 инфицировали смесью вирусов ANDV и SNV при MOI 1. Через 1 час
инкубации (370C, 5% CO2) вирусный инокулят удаляли, клетки дважды промывали раствором
Хэнкса и добавляли свежую культуральную среду. Культивирование инфицированных Vero E6
продолжалось 14 дней. Вирусный сток состоял из культуральной среды и соскоба клеточного
монослоя. Собранный материал подвергался 2-х кратному циклу заморозки и разморозки для
выделения
внутриклеточного
вируса.
После
0
этого
клеточный
центрифугирования в течение 1 часа при 4 С и 30,000 об/мин.
дебрис
удалялся
путем
77
3.23. Клональная селекция хантавирусов
Монослой клеток Vero E6 инфицировался 500 мкл исследуемого вирусного сбора (разведение
–4
10 ) и инкубировался в течение 1 часа (370C, 5% CO2). После инкубации вирусный инокулят
удалялся, клетки дважды промывались раствором Хэнкса и покрывались средой, содержащей
агарозу (DMEM, 2% FBS, 0,6% агароза). Через 12 дней, 500 мкл нейрального красного (1:1000)
добавляли поверх агарозной среды, инкубирование продолжалось в течение последующих 24х часов (370C, 5% CO2). При этом инфицированные клетки аккумулировали нейтральный красный
краситель, что позволяло определять инфицированные клетки по красному окрашиванию.
Вирусные бляшки собирали и индивидуально переносили на свежий монослой клеток Vero E6 в
24-луночном планшете, где инкубирование продолжалось в течение еще 10 дней (370C, 5% CO2).
По окончании инкубации, инфицированные клетки и культуральная жидкость собирали и хранили
при –800C. Аликвоты собранного материала использовали для выделения общей РНК с
использованием реагента Trizol согласно рекомендациям производителя (Invitrogen).
3.24. Скрининг вирусных реассортантов
Для
скрининга потенциальных вирусных реассортантов проводили два цикла вирусной
селекции. После первого цикла селекции, вирусные клоны анализировали на присутствие РНК,
кодирующей S, M и L сегменты вирусов SNV и ANDV с использованием смеси специфических
праймеров и проб по технологии ПЦР-РВ. Общая РНК из клеток Vero E6, инфицированных
хантавирусами SNV или ANDV, использовалась в качестве положительного контроля. Для реакций
ПЦР-РВ нами были использованы наборы Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step
System (Promega). Реакции ПЦР-РВ проводились на ABI Prism 7000 Sequence Detection System.
Рекомбинанты, удовлетворявшие Ct-критерию для SNV и ANDV, отбирались для селекции во
втором цикле селекции. Для этого общая РНК из отобранных образцов анализировалась на
наличие S-, M- и L-сегментов SNV и ANDV с использованием тех же праймеров и проб,
использованных в первом цикле селекции.
3.25. Анализ TUNEL
Анализ TUNEL выполнялся с применением набора in situ Cell Death-POD kit (Roche) в
соответствии с инструкциями производителя. Клетки HUVEC растили на стеклянных покровных
78
стёклах в течение двух дней, фиксировали в 4% параформальдегиде и обрабатывали 3% перекисью
водорода в течение 10 минут при комнатной температуре для блокирования эндогенных
пероксидаз. Проницаемость мембраны фиксированных клеток увеличивали путем инкубации с
Triton-X100 (0,1% 2 мин на льду). После этого, монослой HUVEC инкубировали с метящим
реагентом в течение часа 370C), после чего монослой инкубировали в AEC субстрате (DAKO
Laboratories). Апоптозные клетки визуализировали с помощью световой микроскопии на
микроскопе Nikon Optiphot-2. Для расчёта числа апоптозных клеток фотографировали через 20×
объектив шесть случайных полей зрения. Изображения распечатывали и считали число
апоптозных клеток.
3.26. Статистический анализ
Статистический анализ выполнялся с помощью t-критерия Стьюдента для сравнений между
индивидуальными экспериментальными группами (инфицированные и неинфицированные).
Статистическую значимость устанавливали на p <0,05. Данные представляли как среднее значение
± стандартное отклонение.
79
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Получение и исследование реассортантов хантавирусов
В наших исследованиях мы ставили задачу определить возможность рекомбинации между
патогенными вирусами SNV и ANDV in vitro. SNV и ANDV вирусы являются генетически
различными хантавирусами, циркулирующими среди различных мелких грызунов, обитающих в
географически отдаленных регионах (Peromyscus maniculatus and Olygorysomis longicaudatus,
соответственно) (A. Plyusnin, et al., 2001). В наших исследованиях мы проанализировали частоту
реассортаций между ANDV и SNV вирусами, а также генетический анализ вирусного потомства.
4.1.1 Выявление реассортации у вирусов ANDV и SNV
Для получения реассортантных вирусов, клетки Vero E6 инфицировали ANDV и SNV с
высоким соотношением вирус на клетку (MOI 3). Спустя 12 дней после инфицирования, клетки
выявляли путем окрашивания нейтральным красным красителем. Бляшки были отобраны и
использованы для последующего определения вирусной РНК с помощью метода ПЦР-РВ.
Используя данную методику, нами было исследовано 337 вирусных бляшек на наличие вирусных
реассортаций между ANDV и SNV. Среди изученных бляшек рекомбинантные генотипы были
выявлены в 30 бляшках (8,9% от общего числа изученных бляшек) (таблица 6). Большая часть
дочерних бляшек сохранила родительский генотип ANDV (281 бляшка) и SNV (26 бляшек). Был
выявлен только один моноплоидный тип реассортантного генома. Этот реассортант содержал Sсегмент от SNV, M-сегмент от ANDV и L-сегмент от SNV и был обнаружен всего в 10 бляшках.
Большая часть реассортантных бляшек содержала диплоидные S, M или L-сегменты от обоих
родительских штаммов (всего 20 бляшек). Большая часть вирусного потомства с диплоидными
сегментами включала S или M-сегменты (обнаружены в 18 бляшках), тогда как только 2
рекомбинанта содержали L-сегменты ANDV и SNV. Эти результаты согласуются с ранее
опубликованными результатами Rodriguez и коллеги (Virology. 1998 Mar 1;242(1):99-106).
Далее, нами был проведен анализ стабильности отобранных реассортантных вирусов в ходе
второго цикла селекции (таблица 7). Анализ бляшек, содержащих диплоидные геномы, выявил, что
ни одна из бляшек очищенных реассортантных вирусов не дала роста родительских штаммов и не
сохранила рекомбинантный генотип. Только один диплоидный реассортант (A15), который
80
изначально содержал S и L-сегменты от обоих родительских вирусов, дал рост дочерних бляшек,
содержащих L-сегмент только от SNV (таблица 7). Другие реассортанты сохранили тот же
генотип, что и исходные рекомбинантные вирусы (таблица 7).
Таблица 6 – Обзор генотипов и частоты реассортантных вирусов
Генотип
Число клонов
S-сегмент M-сегмент L-сегмент
A
A
A
281
S
S
S
26
S
A
S
10
AS
S
S
1
AS
AS
S
10
AS
A
AS
2
A
AS
S
2
AS
A
S
4
AS
S
A
1
Рекомбинант V1 сохранил свой моноплоидный генотип на протяжении всех пассажей (Рисунок
7). Поэтому этот рекомбинантный вирус был отобран последующего анализа с использованием
метода иммуногистохимии.
81
Рисунок 7 – ПЦР анализ реассортанта VI
M — ДНК-маркёр с 1000 оснований; 1 — L-сегмент SNV; 2 — M-сегмент SNV; 3 — S-сегмент
SNV; 4 — L-сегмент AND; 5 — M-сегмент AND; 6 — S-сегмент AND.
Таблица 7 – Описание отдельных реассортантных вирусов, обнаруженных после первого и второго
цикла селекции
Рекомбинанты
Первое очищение
Второе очищение
A15.1
SASMALAS
SASMALS
A54.1
SASMALAS
SASMALAS
A23.1
SASMALS
SASMALS
A28.1
SASMALS
SASMALS
VI.1
SSMALS
SSMALS
VI.3
SSMALS
SSMALS
82
4.1.2. Иммуногистохимический анализ реассортанта V1
Иммуногистохимический анализ был выполнен для подтверждения результатов генетического
тестирования. Рекомбинантный вирус V1 (таблица 7) был отобран для иммуногистохимического
анализа по той причине, что геном данного вируса содержал S и L сегменты от одного
родительского
штамма,
а
М
сегмент
от
другого
(SSNVMANDVLSNV).
Для
проведения
иммуногистохимического анализа, монослои Vero E6 инфицировались вирусами ANDV, SNV и
рекомбинантным вирусом V1 при MOI 1. Инфицированные монослои затем фиксировались и
инкубировались со специфическими антителами против гликопротеина G2 ANDV или SNV
(Рисунок 8). Монослои клеток Vero E6, инфицированные ANDV, окрашивались при инкубации со
специфическими антителами против G2-пептида ANDV, тогда как при использовании
специфических анти-G2-антител SNV такого не наблюдалось. Аналогично, монослои Vero E6,
инфицированные SNV, демонстрировали окрашивание при инкубации со специфичными к G2 SNV
антителами. Окрашивания не обнаруживалось при инкубации инфицированных SNV клеток со
специфическими антителами к G2 ANDV. Как и ожидалось, монослои Vero E6, инфицированные
рекомбинантным вирусом V1, показали наличие ANDV-G2 при инкубации со специфическими
антителами к G2 ANDV, тогда как не обнаруживалось окрашивания в монослоях, инкубированных
со специфическими антителами к G2 SNV (Рисунок 8).
Рисунок 8 – Иммуногистохимический анализ реассортанта V1
Vero E6 монослои инфицировались вирусом ANDV, SNV или V1. После фиксации, монослои
инкубировали с кроличьими антителами к G2 гликопротеину вируса ANDV или к G2
гликопротеину вируса SNV. Затем, монослои инкубировали с козлиными антителами против
83
кроличьих иммуноглобулинов которые были конъюгированы со щелочной фосфатазой.
Присутствие вирусных антигенов выявлялось с использованием набора Alkaline Phosphatase
Substrate KIT I kit (Vektor).
4.1.3 Эффективность репликации реассортантов в клетках Vero E6
Для выяснения, отличается ли рекомбинантный вирус V1 от своих родительских штаммов в
своей способности к репликации, клетки Vero E6 инфицировались вирусами ANDV, SNV или
рекомбинантным вирусом. В заранее определённые промежутки времени РНК собиралась и
использовалaсь для анализа накопления геновной РНК кодирующей S сегмент хантавирусов с
использованием метода ПЦР-РВ. РНК кодирующая S-сегмент вируса ANDV была обнаружена в
Относительные ед.
инфицированных образцах уже через час после инокуляции вируса (Рисунок 9).
Время (час)
Штамм вируса
Вирусный титр
Рисунок 9 – Сравнительный анализ репликации вирусов AND, SNV и V1
А. Аккумуляция вирусной РНК. Клетки Vero E6 инфицировались вирусами AND, SNV или
реассортантным вирусом V1. Общая РНК собиралась через 1, 3, 24 и 72 часа и использовалaсь для
анализа накопления РНК кодирующей S сегмент хантавирусов с использованием метода ПЦР-РВ.
84
Б. Титр вируса в культуральной среде. Супернатанты собирали через 72 часа после инфицирования
клеток Vero E6 вирусами AND, SNV и V1. Титры вирусов определялись методом непрямого
бляшкообразования.
С прогрессированием инфекции внутриклеточные уровни РНК вируса ANDV продолжали
увеличиваться. Несмотря на то, что РНК S-сегмента вируса SNV и вируса V1 обнаруживалась в
инфицированных Vero E6 клетках через час после инфицирования, внутриклеточные уровни
вирусной РНК были в 10 раз ниже, чем в клетках Vero E6, инфицированных ANDV.
Для определения отражает ли скорость аккумулирования S-сегментной РНК эффективность
репликации ANDV, SNV и рекомбинантного вируса V1, нами были проведены эксперименты по
определению вирусного титра в клеточной культуре Vero E6 с помощью метода непрямого
бляшкообразования. Супернатанты с Vero E6 клеток, инфицированных вирусами ANDV, SNV и
рекомбинантного вируса V1 были собраны через 7 дней после инокуляции вирусов и
использовались для определения титра вирусов (Рисунок 9). Наиболее высокий вирусный титр был
обнаружен в супернатантах Vero E6, инфицированных ANDV. Эффективность репликации SNV
была ниже по сравнению с ANDV и рекомбинантным вирусом V1. Рекомбинантный вирус V1
продемонстрировал эффективность репликации, близкую к таковой у ANDV.
В наших экспериментах реассортантный генотип между
вирусами SNV и ANDV
образовывался в 8,9% случаев. После повторной селекции сохранился только один моноплоидный
генотип, содержащий S- и L-сегменты от SNV родительского штамма и M-сегмент от ANDV. Эти
результаты указывают на важность сохранения S- и L-сегментов от одного родительского штамма.
Можно сделать предположение, что эти сегменты играют значительную роль в вирусной
репликации.
4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОГЕНЕЗА ХАНТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ IN VITRO
4.2.1 Влияние ФНО-α на накопление нуклеокапсидного белка SNV в культуре клеток Vero E6
Vero E6 клетки были использованы для исследования влияния ФНО-α на накопление
нуклеокапсидного белка вируса SNV (штамм SNV Конвикт Крик 107 [CC107]). Рекомбинантный
ФНО-α (50 нг/мл; 107 ЕД/мл) добавляли в культуральную среду после инфицирования клеток
85
Vero E6 вирусом SNV. Через 4 дня, инкубационную среду удаляли и заменяли на новую,
содержащую соответствующую концентрацию цитокина. В различные моменты времени после
инфицирования брали пробы клеток и исследовали их на накопление белка вирусного
нуклеокапсида с помощью иммуноблотинга. Мембраны с перенесенными белками инкубировались
с моноклональными антителами к нуклеокапсидному белку вируса PUUV, обладающими широким
спектром кросс реактивности с N белкам хантавирусов.
В наших экспериментах ФНО-α (50 нг/мл) снижал накопление нуклеокапсидного белка в
клетках Vero E6 на 1-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й и 7-й день после инфицирования (Рис. 10), но не оказывал
влияния на процент инфицированных клеток или проявления видимого цитопатического эффекта в
ФНО-α
Дни после инфекции
Контроль
клетках Vero E6.
Рисунок 10 – Анализ эффекта ФНО-α на накопление N белка SNV в клетках Vero E6
Нуклеокапсидный белок SNV выявлялся с использованием антител к нуклеокапсидному белку
вируса PUUV. Клетки Vero E6 обрабатывали ФНО-α в концентрации 50 нг/мл, клетки без
добавления ФНО-α использовали в качестве контроля. Новая среда содержащая соответствующую
концентрацию цитокина добавлялась к культуре на 4-й день после инфицирования (п.и.)
86
Для изучения эффекта меньших концентраций ФНО-α, инфицированные
клетки Vero E6
инкубировали в присутствии 50, 10 и 1 нг/мл (5×104, 104 и 103 ЕД/мл, соответственно) цитокина. В
данном эксперименте свежая среда, содержащая ФНО-α, не добавлялась на 4-й день после
инфицирования. Все концентрации ФНО-α оказывали подавляющий эффект на накопление
вирусного нуклеокапсидного белка в клетках Vero E6 на 1-й, 3-й, 4-й и 5-й день после
инфицирования. Не отмечалось изменений уровня накопления вирусного нуклеокапсидного белка
на 6-й и 7-й день после инфицирования (Рисунок 11). Вероятно, это обусловлено деградацией
Дни после инфекции
ФНО-α через 5 дней после инфицирования.
Рисунок 11 – Анализ накопления N белка SNV в клетках Vero E6, обработанных различными
концентрациями ФНО-α
Клетки Vero E6 инкубировались в присутствии различных концентраций ФНО-α (50, 10 и 1 нг/мл).
Kлетки без добавления ФНО-α использовались в качестве контроля. На 4-й день после
87
инфицирования новая среда не добавлялась. Общий белок собирался и использовался для анализа
накопления вирусного нуклеокапсидного белка методом иммуноблота.
Известным является факт увеличения синтеза оксида азота в клетках в присутствии ФНО-α (W.
Song et al., 2000; J. Yamaoka et al., 2000). Поскольку оксид азота обладает неспецифичной
противовирусной активностью, увеличение его концентрации в инфицированных клетках может
объяснять подавляющий эффект ФНО-α на накопление нуклеокапсида SNV. Для изучения этой
гипотезы нами были использованы схемы изолированного или сочетанного использования ФНО-α
и N(G)-монометил-l-аргинина (MMA) — ингибитора синтазы оксида азота. ИФН-γ известен как
ингибитор вирусной репликации, поэтому он был использован как позитивный контроль для
сравнения ингибирующего эффекта ФНО-α в отношении нуклеокапсидного белка вируса SNV
(1000 ЕД/мл) (Рисунок 12). В этом эксперименте ФНО-α добавляли сразу после инфицирования и
на 4-й день. ФНО-α (1 нг/мл) оказывал подавляющий эффект на накопление нуклеокапсидного
белка вируса SNV в клетках Vero E6 на 3-й, 4-й, 5-й, 6-й и 7-й день после инфицирования.
Ингибитор синтазы оксида азота не устранял подавляющего эффекта ФНО-α на накопление
нуклеокапсидного белка SNV в инфицированных клетках. Ингибирующий эффект ИФН-γ на
накопление вирусного бела в инфицированных клетках Vero E6 превышал таковой ФНО-α.
ИФН-γ
ФНО-α +MMA
ФНО-α
ФНО-α+ ПТФ
ФНО-α
ПТФ
Конроль
Дни после инфекции
Контроль
88
Рисунок 12 – Анализ эффектa ФНО-α, N(G)-монометил-l-аргинина (ММА), ИФН-γ и
пентоксифиллина на накопление N белка SNV в клетках Vero E6
A. Клетки Vero E6 инфицировали вирусом SNV и инкубировали в присутствии ФНО-α (1 нг/мл),
ФНО-α и ММА (5 мкмоль) или ИФН-γ (1000 ЕД/мл). В качестве контроля использовали клетки,
инфицированные вирусом SNV. B. Клетки Vero E6 инкубировали в присутствии ФНО-α (1 нг/мл)
или пентоксифиллином (ПТФ) (5 ммоль) изолированно или в сочетании. В качестве контроля
использовали клетки, инфицированные вирусом SNV.
Известно, что противовоспалительный препарат пентоксифиллин устраняет эффекты ФНО-α
(C. Elbim et al., 1995; S. Ohdama et al., 1991). Поэтому чтобы удостовериться, что ингибирующий
эффект
ФНО-α
не
обусловлен
паракринными
воздействиями,
а
является
результатом
непосредственного влияния цитокина на накопление вирусного нуклеокапсидного белка в
инфицированных
клетках
Vero E6,
клетки
инкубировали
в
присутствии
ФНО-α
или
пентоксифиллином изолированно или в сочетании (Рисунок 12Б). Для этого пентоксифиллин (5
89
ммоль) добавляли в среду Vero E6, инфицированных SNV, изолированно или в сочетании с ФНО-α
(10 нг/мл). ФНО-α снижал накопление вирусного нуклеокапсидного белка в клетках Vero E6 к 7му дню после инфицирования. Пентоксифиллин не оказывал влияния на накопление вирусного
нуклеокапсидного белка в клетках Vero E6 к 7-му дню после инфицирования. Сочетанное
применение ФНО-α и пентоксифиллина устраняло эффект цитокина и восстанавливало накопление
вирусного нуклеокапсидного белка до уровня контрольной группы (Рисунок – 12 Б).
4.2.2 Влияние инфицирования SNV и обработки ФНО-α на проницаемость монослоя клеток
HUVEC
Эндотелиальные клетки являются мишенью хантавирусной инфекции в организме. Поэтому
нами были проведены исследования по инфицированию эндотелиальных клеток пупочной вены
человека (HUVEC) вирусом SNV с целью выяснения восприимчивости этих клеток к инфекции.
Нами было обнаружено, что HUVEC восприимчивы к инфекции вирусом SNV. Экспрессия N
белка и накопление S сегментной РНК были выявлены на ранних стадиях инфицирования
(Рисунок 13). Синтез вирусных белков и накопление вирусной РНК обнаруживaлись на
протяжении 72 часов после инфекции (Рисунок 13). Инфицирование HUVEC сопровождалось
накоплением инфекционного вируса в клеточной среде, где титры SNV вируса достигали 2.3х10-3.
Культивирование HUVEC в присутствии ФНО-α (10 нг/мл) снижало накопление нуклеокапсидного
белка SNV на 1-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й и 7-й день после инфицирования и не оказывало
цитопатического эффекта.
Модифицированная камера Бойдена (Boyden chamber) использовалась для определения
влияния SNV инфекции на проницаемость монослоя эндотелиальных клеток in vitro. HUVEC
использовались между 2-м и 4-м пассажами. Клетки выращивались на мембранных вставках 24луночных планшет для формирования верхнего и нижнего компартментов. Трансмембранная
диффузия HRP использовалась для выявления изменений проницаемости эндотелиальных
монослоёв согласно описанию Feldmann и коллеги (H. Feldmann et al., 1996). Когда монослои
HUVEC достигали 100% плотности (2-й или 3-й день), клетки инфицировались SNV с MOI 0,01.
Иммуногистохимическое окрашивание инфицированных монослоёв выявило, что примерно 90%
клеток HUVEC экспрессировали белки SNV через 10 дней после инфицирования. Инфицирование
монослоя HUVEC вирусом SNV не вызывало статистически значимого увеличения проницаемости
(Рисунок 14).
90
A
M
24
72
Bремя (часы)
K
12
72
4000000
Относитльные
ед
B
12
2000000
0
24
Время (часы)
Рисунок 13 – Анализ экспрессии N белка вируса SNV и накопления S сегмента вирусной РНК в
клетках HUVEC. Клетки HUVEC инфицировали с MOI 1
А. Общий белок собирался через 12, 24 и 72 часа после инфекции. Накопление вирусного N белка
определяли методом иммуноблота. Моноклональные антитела к N белку вируса PUU перекрестно
реагирующие с N белком вируса SNV использовали для визуализации N белка в клетках HUVEC.
В. Общая РНК собиралась через 12, 24 и 72 часа после инфекции и использовалась для
определения внутриклеточных уровней S сегмента вируса SNV методом ПЦР-РВ.
Время
(дни)
Рисунок 14 – Эффект SNV инфекции на проницаемость монослоя HUVEC
Представлены изменения оптической плотности (длинa волны 470 нм) культуральной среды в
нижнем компартменте камеры Boyden инфицированных SNV (пунктирная линия) и контрольных
(неинфицированных) (непрерывная линия) монослоёв HUVEC. Каждая точка означает три
91
отдельных эксперимента (два образца на эксперимент). Эти значения сравнивались по критерию
Стьюдента для одной выборки, а значение p <0,05 считалось статистически значимым.
Однако, в течение всего периода наблюдения, концентрация HPR в нижнем компартменте
инфицированных монослоёв клеток была выше, чем в том же компартменте неинфицированных
контрольных монослоях клеток. Различия в концентраци HRP между инфицироваными и
неинфицироваными клетками не были достоверны. Однако на протяжении всего периода
наблюдения
сохранялась
тенденция
к
увеличению
проницаемости
HUVEC
монослоя
инфицированного SNV по сравнению с неинфицированным контролем. Наши результаты
указывают
на
активацию
эндотелиальных
клеток,
инфицированных
SNV.
Увеличение
проницаемости эндотелия не было вызвано цитотоксическим эффектом SNV.
4.2.3 Определение влияния ФНО-α на проницаемость монослоя HUVEC
ФНО-α (50 нг/мл) добавляли в верхний компартмент камеры Boyden. HRP также добавляли в
верхний компартмент камеры Boyden. Изменения в проницаемости монослоя HUVEC оценивали
по появлению HRP в нижнем компартменте. Выбор концентрации цитокина основывался на
литературных данных (H. Feldmann, et al., 1996; Y. Ishii et al., 1992), в которых сообщалось об
отсутствии увеличения проницаемости клеток эндотелия при концентрациях ФНО-α ниже 4 нг/мл.
В наших экспериментах ФНО-α (10 и 50 нг/мл) вызывал стабильный подавляющий эффект на
накопление нуклеокапсидного белка вируса SNV в HUVEC. Поэтому нами была выбрана
концентрация ФНО-α 50 нг/мл для исследования влияния ФНО-α на проницаемость монослоя
HUVEC. В наших экспериментах ФНО-α продемонстрировал статистически значимое (p <0,05,
p <0,001) повышение проницаемости монослоя клеток HUVEC через 5 и 24 часа от начала
эксперимента, соответственно (Рисунок 15).
92
Время (час)
Рисунок 15 – Эффект ФНО-α на проницаемость монослоя HUVEC
Изменения проницаемости монослоя HUVEC оценивали по изменениям оптической плотности
(длинa волны 470 нм) в нижнем компартменте. Неактивированый монослой HUVEC представлен
незакрашенными столбцами; монослой HUVEC, активированый ФНО-α (50 нг/мл), представлен
закрашенными столбцами. Значения, существенно отличающиеся от контрольных, помечены
звёздочками (*p <0,05, **p <0,001).
4.2.4 Инфицирование альвеолярных макрофагов человека вирусом SNV
В более ранних исследованиях (S.R. Zaki, et al., 1995) сообщалось о присутствии альвеолярных
макрофагов, экспрессирующих антигены вируса SNV в лёгких у фатальных случаев ХЛС. Однако
природа хантавирусного антигена в альвеолярных макрофагах оставалась неизвестной. Поэтому
нами были проведены эксперименты по выявлению способности макрофагов к инфицированию
хантавирусами и экспрессии вирусных белков. Альвеолярные макрофаги человека были выделены
из бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ). БАЛ (4x50 мл) был собран с использованием бронхоскопа
Olympus B4, который вводили в дистальные дыхательные пути. Клеточную составляющую БАЛ
отделяли от остального содержимого промывных вод центрифугированием по градиенту
плотности в фиколле. Алвеолярные макрофаги выделяли путем адгезии в течении 72 часов при
370С (5% СО2). Из каждого образца промывных вод получали в среднем 2–5 млн клеток. Клетки
разделяли в равной пропорции, формируя две группы: контрольную и группу, инфицированных
SNV. Через час адсорбции неприкреплённые вирусные частицы удалялись путём обильного
промывания, и добавлялась новая среда. Равные объемы надосадочной (200 мкл) жидкости
собирали через 4 и 7 дней после инфицирования для определения количества вирусов. На 7-й день
93
после инфицирования клетки промывались, фиксировались и окрашивались иммунной сывороткой
конвалесцентов ХЛС с целью выявления SNV-положительных клеток. Наши результаты показали,
что альвеолярные макрофаги человека могут быть инфицированы SNV in vitro. Наличие
хантавирусных антигенов в инфицированных альвеолярных макрофагах было продемонстрировано
характерным для хантавирусных белков пятнистым паттерном окраски (примерно 65% клеток
были положительны) и локализацией вирусных антигенов в цитоплазме инфицированных клеток
(Рисунок 16 А и Б). В неинфицированных контрольных клетках наличие вирусных антигенов не
наблюдалось (Рисунок 16 В). Для выявления синтеза инфекционных вирионов, супернатант от
инфицированных альвеолярных макрофагов использовали для заражения монослоя клеток
Vero E6. Через 1 час инкубации, монослои промывались, покрывались 0,6% агарозы и
инкубировались в течение 14 дней. Далее, агароза удалялась, а клетки промывались,
фиксировались и окрашивались. Наши результаты показывают, что aльвеолярные макрофаги
человека образуют относительно небольшое количество SNV вирионов (<0,1 БОЕ/мл).
Б
В
Рис. 16. Инфицирование SNV альвеолярных макрофагов человека.
Рисунок 16 – Инфицирование альвеолярных макрофагов человекам вирусом SNV
Клетки
инфицировались
SNV
(индекс
множественности
заражения
0,01)
и
Клетки инфицировались
вирусом
SNV
(MOIAntigeny
0,01) и культивировались
в течение
7 дней.
Антигены
культивировались
в течение
7 дней.
virusa SNV выявлялись
путём
иммунного
окрашивания
конвалесцентной
сывороткой
ХЛС пациентов.
Результаты иммунного
вируса выявлялись
путем
иммуногистохимии
с использованием
конвалесцентной
сыворотки от
визуализировались с помощью микроскопа Nikon ES 800 с применением
больногоокрашивания
ХЛС. Результаты
иммунного окрашивания визуализировались с помощью микроскопа
дифференциальной
интерференционной
контрастной
микроскопии.
Изображения
Nikon ES 800 с применением дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии.
получали с помощью встроенной в микроскоп камеры (Photonic Science, Миллхэм,
Изображения
получали
с помощьюобеспечения
встроенной Image
в микроскоп
Science,(Media
Миллхэм,
Англия)
и программного
Pro Plusкамеры
image 9Photonic
analysis software
Англия) Cybernetics,
и программного
обеспечения Image
Pro Plus
image analysis
software
(Media Cybernetics,
Силвер-Спрингс,
Мэриленд).
Резкость
изображений
увеличивалась
с
помощьюМэриленд).
программы Резкость
Micro-tome
версии 4.0 (Vay-Tek,
Inc., Фейрфилд,
Айова).
Силвер-Спрингс
изображений
увеличивалась
с помощью
программы Micro-
tome версии
4.0 (Vay-Tec,
Inc, Фейрфилд,
Айова). А. Альвеолярные
макрофаги
человека,
А. Альвеолярные
макрофаги
человека, инфицированные
SNV. Присутствие
антигенов
инфицированные
SNV. Присутствие
антигенов
SNV выявляли
с помощью
красного окрашивания
SNV выявляется
с помощью красного
окрашивания
щелочной
фосфатазой.
щелочной фосфатазой. Б. SNV антигены выявляются в виде характерного пятнистого окрашивания
B. SNV-инфицированные альвеолярные макрофаги имеют характерный пятнистый
характер окрашивания и цитоплазматическую локализацию вирусных антигенов.
C. Неинфицированные альвеолярные макрофаги человека. Увеличение ×200 (А и C) и
×400 (B).
94
в цитоплазме клеток. В. Неинфицированные альвеолярные макрофаги человека. Увеличение х200
(А и В) и х400 (Б).
4.2.5 Синтез ФНО-α инфицированными SNV и обработанными ЛПС альвеолярными
макрофагами человека
Выделенные альвеолярные макрофаги человека подсчитывались и культивировались в
шестилуночных планшетах при плотности 106 клеток/лунку. Через 24 часа инкубации, клетки
инфицировались SNV или обрабатывались липополисахаридом (ЛПС) (1 мкг/мл; Sigma). Через
4 дня после обработки надосадочная жидкость собиралась и использовалась для количественного
твёрдофазного иммуноферментного анализа (ИФА или ELISA) с помощью Quantikine ELISA Kit
(R&D System, Миннеаполис, Миннесота). Инфицированные SNV альвеолярные макрофаги
человека вырабатывали значительно меньше ФНО-α по сравнению с альвеолярными макрофагами,
обработанными ЛПС (Рисунок 17). Интересно, что взятые у некоторых доноров альвеолярные
макрофаги не производили значимых уровней ФНО-α в ответ на инфицирование вирусом, тогда
(ng/ml, 103)
ФНО-α
как в тех же самых клетках развивался мощный цитокиновый ответ на стимуляцию ЛПС.
Рисунок 17 – Активация ФНО-α в надосадочной жидкости альвеолярных макрофагов человека
инфицированных SNV или обработанных ЛПС
95
Альвеолярные макрофаги человека не обрабатывались (столбец 1), инфицировались SNV
(столбец 2) или обрабатывались ЛПС (столбец 3). Значения, существенно отличающиеся от
контрольных, помечены звёздочками (** p <0,001).
4.2.6 Эффект надосадочной жидкости, взятой от инфицированных SNV и обработанных ЛПС
альвеолярных макрофагов, на проницаемость монослоя клеток HUEVEC
Надосадочная жидкость, инфицированных и обработанных ЛПС альвеолярных макрофагов
человека, добавлялась к верхнему компартменту камеры Boyden, содержащему монослой клеток
HUVEC. Надосадочная жидкость от инфицированных вирусом SNV альвеолярных макрофагов
человека не вызывала статистически значимых различий в проницаемости монослоя клеток
HUVEC. Однако статистически значимое увеличение проницаемости монослоя клеток HUVEC
наблюдалось через 24 часа после добавления надосадочной жидкости, взятой от обработанных
ЛПС альвеолярных макрофагов (Рисунок 18).
Время (час)
Рисунок 18 – Увеличение проницаемости монослоя эндотелиальных клеток после добавления
супернатанта культуры альвеолярных макрофагов человека, инфицированных SNV
В качестве контроля представлены HUVEC без добавления среды от макрофагов (незакрашенные
столбцы) и альвеолярные макрофаги человека, стимулированые ЛПС (затенённые столбцы) или
инфицированные SNV (закрашенные столбцы). Показаны изменения оптической плотности (длинa
волны 470 нм) среды в нижнем компартменте в течение инкубационного времени. Значения,
существенно отличающиеся от контрольных, помечены звёздочками (** p <0,001).
96
Хорошо известно, что воспалительные цитокины способны регулировать экспрессию вирусных
генов и синтез вирусного белка. Например, ФНО-α подавляет экспрессию генов вируса гепатита B
у трансгенных мышей (P.N. Gilles et al., 1992) и репликацию вируса иммунодефицита человека 1го типа в моноцитах периферической крови и альвеолярных макрофагах (B.R. Lane et al., 1999).
Наши данные показали, что ФНО-α подавляет накопление нуклеокапсидного белка SNV в
инфицированных клетках Vero E6. ФНО-α демонстрирует подавляющий эффект в концентрациях
1 нг/мл, что близко к уровню секреции этого цитокина инфицированными альвеолярными
макрофагами в наших экспериментах. Эффект ФНО-α является обратимым, а для поддержания
подавляющего эффекта требуется периодическое добавление свежей среды, содержащей ФНО-α.
Подавляющий эффект ФНО-α на накопление нуклеокапсидного белка SNV не опосредуется
индукцией эндогенного синтеза оксида азота инфицированными клетками. Это согласуется с
результатами Rosenkranz-Weiss и коллег (P. Rosenkranz-Weiss et al., 1994), которые показали, что
действуя изолированно, ни ФНО-α, ни ИНФ-γ, ни ИЛ-1 не способны активировать синтазу оксида
азота и увеличить синтез оксида азота в клетках. Подавление накопления нуклеокапсидного белка
SNV в клетках Vero E6 после обработки ФНО-α не обусловлено активацией внутриклеточных
путей ИНФ-γ опосредованной антивирусной защиты, поскольку накопление нуклеокапсида SNV в
клетках Vero E6 почти полностью подавляется ИНФ-γ, тогда как подавление, индуцированное
ФНО-α, не столь выражено.
Для дальнейшего исследования механизма, лежащего в основе связанного с ФНО-α подавления
накопления нуклеокапсида SNV, нами изучено влияние пентоксифиллина на уровень вирусного
нуклеокапсида в инфицированных клетках. Исследования выявили способность этого препарата
устранять эффекты ФНО-α. Так было показано, что пентоксифиллин защитил клеточную линию
L929 от опосредованной ФНО-α цитотоксичности и цитостаза (G.W. Takahashi et al., 1994). Ohdama
с соавторами (S. Ohdama, et al., 1991) сообщили о предотвращении индуцированного ФНО-α
подавления экспрессии тромбомодулина на поверхности эндотелиальных клеток после их
инкубации с пентоксифиллином. В наших экспериментах пентоксифиллин не изменял уровень
экспрессии нуклеокапсидного белка SNV. Однако в сочетании с ФНО-α он устранял подавляющий
эффект цитокина. Механизм анти-ФНО-α активности пентоксифиллина не до конца изучен, но
исследователи предполагают, что эффект может быть связан с его селективным подавлением
внутриклеточных сигнальных каскадов. Например, пентоксифиллин устраняет индуцированную
97
ФНО-α полимеризацию актиновых нитей, которые играют важную роль во внутриклеточной
активации (1995, Eur. Cytokine Netw. 6:113–120).
Hаименьшая концентрация ФНО-α, использованная в наших экспериментах, составила 1 нг/мл.
Вызывало интерес смогут ли инфицированные SNV альвеолярные макрофаги человека
продуцировать ФНО-α соизмеримо с данной концентрации. Эксперименты с инфицированными
альвеолярными макрофагами человека показали, что клетки от 3-х из 10 (30%) доноров
синтезировали ФНО-α в концентрации 1 нг/мл после инфицирования SNV. Интересно, что SNV
инфекция не активировала синтез ФНО-α в альвеолярных макрофагах выделенных от семи
доноров. Напротив, альвеолярныe макрофаги от тех же семи доноров после стимуляции ЛПС
отвечали существенным увеличением выделения ФНО-α в надосадочную жидкость. Эти данные
указывают на то, что SNV-инфекция у альвеолярных макрофагов человека не всегда
сопровождается увеличением продукции ФНО-α и что продукция этого цитокина зависит от
индивидуальной реактивности пациента.
Гистологическое исследование образцов тканей, взятых у умерших от ХЛС пациентов,
выявило, что хантавирусы не вызывают цитопатических эффектов в эндотелиальных клетках
кровеносных сосудов, несмотря на присутствие хантавирусных антигенов в этих клетках (M.
Kanerva, et al., 1998; R. Yanagihara et al., 1990; S.R. Zaki, et al., 1995). Однако ряд исследователей
(W.W. Franke et al., 1987; E.A. Jaffe et al., 1978) обнаружили, что проницаемость сосудов может
возникать без повреждения эндотелиальных клеток. Было показано, что проницаемость сосудов
может быть повышена в результате разрушения адгезивных контактов между эндотелиальными
клетками и деградации фибринa в базальной мембране эндотелия, который необходим для,
поддержания роста и жизнеспособности эндотелия. SNV инфекция эндотелиальных клеток не
приводит к существенному увеличению проницаемости эндотелиального монослоя. Однако нами
показана четкая тенденция к увеличению проницаемости SNV инфицированного монослоя клеток
HUVEC. Мы полагаем, что это статистически незначимое, но стабильное увеличение
проницаемости
монослоя
HUVEC
является
признаком
структурных
изменений
в
межэндотелиальных контактах в ответ на инфицирование SNV.
Результаты экспериментов in vitro показали, что ФНО-α способен увеличивать проницаемость
эндотелиального монослоя (J. Brett et al., 1989). Однако концентрации цитокина, применявшиеся в
тех экспериментах, были существенно выше (1,8 нг/мл), чем вырабатываемые in vitro
инфицированными SNV клетками, как показано в наших экспериментах. Наши данные
согласуются с работой, выполненной Ishii с соавторами (Y. Ishii, et al., 1992), которые обнаружили,
98
что проницаемость эндотелиального монослоя не увеличивается в ответ на концентрации ФНО-α
ниже 4 нг/мл. Концентрации ФНО-α в образцах сыворотки крови, взятой у пациентов с
геморрагическими лихорадками, вызванными другими возбудителями (вирусы Puumala, Hantaan,
Junin и др.) (M.V. Heller et al., 1992; T. Krakauer, et al., 1995), никогда не превышали 100 пкг/мл.
Мы считаем, что ввиду низкой продукции ФНО-α альвеолярными макрофагами после
инфицирования SNV этот цитокин сам по себе не может рассматриваться как единственная
причина повышения проницаемости сосудов и как, следствие этого, отёка лёгких.
В заключение следует сказать, что в данном исследовании нами продемонстрировано
следующее: (i) ФНО-α обладает подавляющим эффектом на накопление нуклеокапсидного белка
SNV в инфицированных клетках; (ii) альвеолярные макрофаги человека восприимчивы к
инфицированию
SNV
и
реагируют
выработкой
ФНО-α;
(iii)
надосадочная
жидкость
инфицированных альвеолярных макрофагов человека неспособна индуцировать проницаемость
эндотелиального монослоя; (iv) инфицирование эндотелиального монослоя вирусом SNV приводит
к незначительному повышению проницаемости, которая может быть признаком структурных
изменений в межклеточных контактах эндотелия.
Анализ активации клеточных генов в эндотелиальных клетках человека, инфицированных
патогенными и непатогенными хантавирусами.
4.2.7 Регуляция экспрессии клеточных генов в эндотелиальных клетках вирусами SNV и
PHV
Для изучения влияния хантавирусной инфекции на экспрессию клеточных генов, клетки
HUVEC инфицировались in vitro вирусами SNV и PHV при MOI 3. Эффективность инфицирования
определялась путём иммунного окрашивания монослоёв клеток HUVEC, инфицированных SNV и
PHV,
через
48 часов
после
инфицирования
с
помощью
моноклональных
антител
к
нуклеокапсидному белку вируса Пуумала (Dr. T. Ksiazek, Special Pathogen Branch, CDC, Атланта)
(Рисунок 19).
99
control
Контроль
SNV
SNV
PHVPHV
Рисунок 19 – Выявление хантавирусных антигенов в клетках HUVEC, инфицированных SNV и
PHV
Инфицированные SNV и PHV (MOI 3) монослои клеток HUVEC инкубировались последовательно
с сывороткой ХЛС конвалесцентов и с антителами против иммуноглобулнов человека
конъюгированными со щелочной фосфатазой. Хантавирусные антигены визуализировались с
помощью Phosphatase Substrate KIT I kit (Vector).
В наших исследованиях применялись ДНК чипы, содержащие 12 625 генов человека.
Экспрессия клеточных генов в инфицированных хантавирусами клетках HUVEC сравнивалась с
таковой в ложно-инфицированных клетках, согласно указаниям производителя, при этом различие
в экспрессии генов в 2 раза рассматривалось как значимая. Только изменения в 2 раза и более в
экспрессии клеточных генов рассматривались как существенные и были представлены в таблице 8.
Спустя четыре часа после инфицирования число генов, экспрессия которых усиливалась в
клетках HUVEC, существенно не отличалась между группами PHV и SNV (18 генов против
14 генов). Однако через 12 часов после инфицирования, SNV инфицирование усиливало
экспрессию 175 генов HUVEC, по сравнению с 36-ю генами, экспрессия которых увеличивалась в
HUVEC, инфицированных PHV. Экспрессия только двух генов снижалась в клетках,
инфицированных SNV (таблица 8). Гены, экспрессия которых увеличилась, представляют собой
группу регуляторов внутриклеточного ответа, включая противовирусные факторы, факторы
транскрипции, факторы роста, хемокины, рецепторы, структурные белки, метаболические
факторы, киназы и другие.
100
Таблица 8 – Изменения экспрессии клеточных генов в клетках HUVEC, инфицированных SNV и
PHV
Ген
номер
Интерферон-индуцируемые белки
4 ч п.и.
Интерферон-индуцируемый
17-кДа белок
M13755
Интерферон-индуцируемый
белок 9-27
J04164
Интерферон-индуцируемый
56-кДа белок
M24594
Интерферон-индуцируемый
белок с лейиновой «молнией»
U72882
Интерферон-индуцируемый
белок 6-16 кДа
U22970
Кратность изменения#
PHV
SNV
12 ч п.и. 4 ч п.и.
12 ч п.и.
2,7
2,7
3,4
2,9
10,0
5,3
6,7
4,3
5,4
3,7
Интерферон-индуцируемый
M30818
белок медиатор клеточной
резистентности (MxB)
8,8
8,2
Ретиноевая
кислота
интерферон-индуцируемый
белок 58 кДа
4,1
2,3
8,3
6,3
Интерферон-стимулируемый
предшественник
хемоаттрактанта Tлимфоцитов
Интерферон-индуцируемый
и U34605
AF030514
M14660
78,1
54-кДа белок
Интерферон-индуцируемый
p78 белок
M33882
HEM45
Cig5
#
17,4
15,8
U88964
11,9
9,5
AF026941
68,0
10,8
221,5
Значения представлены как кратные изменения по сравнению с ложно-инфицированными
контрольными клетками.
101
Транскрипционный
факторы транскрипции
Интерферон-индуцируемые
Продолжение таблицы 8
фактор M97936
ISGF-3 84 и 91 кДа¶
Регуляторный
фактор U53831
интерферона 7B¶
Регуляторный
2,3
13,2
4,2
2,9
интерферона 1
интерфероном
10,8
5,1
Ген (2-5") олиго A синтетазы E
M11810
28,7
15,5
2-5" олигоаденилат синтетаза
M87434
5,5
8,9
4,7
4,1
2-5" олигоаденилат синтетаза AJ22508
изоформа 59 кДа
2-5"
белок
олигоаденилат M87284
15,8
синтетазы 69 кДа
Ядерный фактор NF-IL6
X52560
2,1
Ядерный фактор NF9
U10324
3,5
Ядерный
Ядерные факторы
56,4
11,4
фактор L05072
2-5 синтетаза, индуцируемая X04371
Олигосинтетазы
2,8
матриксный
белок AJ131186
5,3
NMP200
NF-каппа-B p65 дельта 3
U33838
R каппа B
X80878
Ядерный фосфопротеин ¶
L22342
Активированный
рецептор L07592
пролифератора пероксисом
11,2
3,6
9,0
3,2
7,8
3,7
6,9
102
Продолжение таблицы 8
AP-2
фактор
транскрипции ¶
бета- X95694
корецептор U41843
Dr1-связанный
(DRAP1) ¶
46,7
15,9
3,1
27,0
Факторы транскрипции
TTF-I
взаимодействующий AF00560
пептид 20
вакуолярного Z71460
H(+)-АТФаза
типа 115 кДа ¶
белок D85131
Myc-связанный
«цинковый палец»¶
2,7
NFI/CAAT-связывающий
5,8
2,5
FK506 связывающий 36-кДа AF038847
белок ¶ (FKBP36)
4,9
3,0
7,4
AF038847
6,4
фактор транскрипции 5 (CTF5)
Белок p160¶
U88153
nkx-2.8 ген гомеобокса
AF000297
Фактор
удлинения D50495
транскрипции S-II, hS-II-T1 ¶
Лиганд Fit3
Белки, связанные с ростом/гибелью
3,0
U03858
Тромбоцитарный фактор роста M63193
эндотелия
Эндотелин-2
M65199
Специфический
белок, L13720
останавливающий рост
Белок,
сосудистым
связанный
60,1
3,0
15,1
28,4
54,0
49,2
5,0
178,7
2,1
157,0
с U43142
эндотелиальным
фактором роста
3,8
2,2
103
Продолжение таблицы 8
Предшественник B
сосудистого
U48801
эндотелиального
3,1
фактора роста
Fas-связанный превращающий U86214
фермент 2
летального
белка
2,4
интерлейкина-1b
p53 клеточный
антиген
опухолевый X02469
Белки, связанные с ростом/гибелью
Apo/DR3 лиганд
4,2
AF055872
Отрицательный
программируемой
клетки ICH-1S
регулятор U13022
гибели
Отрицательный
программируемой
клетки ICH-1S
регулятор U13021
гибели
Связанный с PDGF белок
Трансформирующий
роста-бета
67,5
2,7
2,0
U41745
6,6
4,0
фактор M38449
4,1
EST-домен белка ERF
U15655
10,5
H2A.X
X14850
3,8
Связанный
с
опухолью U43916
гомолог мембранного белка
5,4
Белок NuMA
Z11584
219,4
Гомолог белка MAD (hMAD-3)
U68019
198,5
Ген USF2
Y07661
9,7
Белок семейства tob ¶
D64109
Белок erg2
M17254
2,3
14,1
6,4
104
Продолжение таблицы 8
Белки, связанные с апоптозом
Белки, связанные с ростом/гибелью
Белок 51C
L36818
135,4
Белок,
связанный
с
рецептором 2
туморнекротического фактора Trap3
Белок bcl-2 ¶
103,8
MM13995
Белок,
связанный
метастазами (mta1)
87,0
3,0
с U35113
Гомолог MAD4
82,7
AF040963
GSK-3 связывающий
FRAT2
70,3
белок AF062739
65,6
Ядерная фосфатаза двойной U93181
специфичности (SBF1)
49,1
Гомолог FK-506 связывающего L37033
белка (FKBP38)
123,1
Летальный
рецептор-6, AF068868
связанный с рецептором ТНФ
2,9
Белок, связанный с рецептором U12597
ТНФ 2-го типа (TRAP3) ¶
20,7
42,1
124,5
2,0
5,2
TAFII70-альфа
L25444
BRCA2
U50535
5,4
Bak
U16811
4,6
MDR15
X68829
70,3
Гомологичный домен Src
AL04975
47,3
8
Цитокины/Хемокины
95,3
CC
хемокиновый
генный AF088219
кластер ¶
NF-AT3
2,2
3,6
3,7
4,6
L41066
16,0
U83192
3,6
Пост-синаптический плотный
белок 95
105
4.2.8 Следующие группы генов изменялись под действием хантавирусной инфекции
Интерферон-индуцируемые гены (ИИГ) в инфицированных хантавирусом клетках. Группа
ИИГ состоит из ряда генов с различной активностью, включая противовирусную. Группа ИИГ
была нами разделена на три подгруппы: i) собственно ИИГ; ii) факторы транскрипции, связанные с
интерфероновой стимуляцией и iii) олигосинтетазы. Несмотря на раннюю стадию инфекции (4 и
12 часов после инфицирования), изменения в транскрипции 11 и 12 генов группы ИИГ
обнаружились в эндотелиальных клетках, инфицированных PHV и SNV, соответственно
(таблица 8). Усиление транскрипционной активности интерферон-индуцируемого белка 54 кДа
обнаруживалось только в клетках, инфицированных SNV. Кроме того, транскрипция Cig5 (ген
индуцируемого интерфероном белка) усиливалась через 4 часа после инфицирования SNV, тогда
как транскрипция этого гена в эндотелиальных клетках, инфицированных PHV, не изменялась.
Через 12 часов после инфицирования транскрипционная активность гена Cig5 усиливалась в
эндотелиальных клетках, инфицированных PHV, однако транскрипция Cig5 в эндотелиальных
клетках, инфицированных SNV, была примерно в 3 раза выше по сравнению с эндотелиальными
клетками, инфицированными PHV.
Хантавирусная инфекция значительно влияла на транскрипцию генов олигосинтетаз
(таблица 8).
Транскрипция
4-х генов
олигосинтетаз
усиливалась
спустя
12 часов
после
инфицирования хантавирусами эндотелиальных клеток. Хотя внутриклеточные уровни тех же
генов изменялись в клетках инфицированных обоими вирусами, нами были обнаружены вирусспецифичные различия в уровне активации генов. Например, транскрипция генов 2-5 синтетазы,
индуцируемой интерфероном, и 2-5" олиго-синтетазы E усиливалась в 10,8 и в 28,7 раза
соответственно в HUVEC инфицированных PHV через 12 часов после инфицирования. В то же
время увеличение транскипционной активности тех же генов в HUVEC инфицированных SNV
возрастало в 5,1 и 15,5 раз, соответственно. Однако транскрипция 2-5" олигоаденилат синтетазы
белка 69 кДа в HUVEC, инфицированных PHV не изменялась, тогда как инфицирование SNV
усиливало экспрессию этого гена в 15,9 раза.
Транскрипция трёх IRF генов (IRF-7, IRF-1 и IRF-9) активируется в клетках инфицированных
хантавирусоми (таблица 8). Транскрипционная активность IRF-9 в HUVEC была существенно
выше после инфицирования (через 4 часа) SNV и PHV по сравнению с неинфицированным
контролем. Однако усиление транскрипции IRF-9 было выше в клетках, инфицированных SNV, по
106
сравнению с PHV (2,8 против 12,2). Внутриклеточные уровни IRF-9 оставались высокими через
12 часов после инфицирования SNV, по сравнению с PHV (2,3 против 54,5). Внутриклеточные
уровни транскриптов IRF-7 увеличивалась через 12 часов после инфицирования SNV и PHV.
Инфицирование SNV значительно усиливало транскрипцию IRF-7 в HUVEC, по сравнению с PHV
(4,2 против 11,4 раза). Транскрипция IRF-7 увеличивалась через 12 часов после инфицирования
только в клетках, инфицированных SNV.
Ядерные факторы и факторы транскрипции. Инфицирование SNV усиливало транскрипцию
17 генов, образующих группy нуклеарных и транскрипциonnых факторoв. Транскрипция большeй
части генов (13 генов) увеличивалась к 12 часам после инфицирования, тогда как меньшая группа
генов (4 гена) характеризовалась усилением транскрипции через 4 часа после инфицирования.
Транскрипционная активность восьми генов, кодирующих нуклеарные и транскрипционные
факторы, была повышена в HUVEC инфицированных PHV. Причем, активация 4 генов этой
группы
была
временной
и
выявлялась
только
через
4
часа
после
инфицирования.
Транскрипционная активность же других 4-х генов оставалась увеличивалась только спустя
12 часов после инфицирования.
Гены, связанные с ростом клеток и апоптозом. Одной из самых представительных является
группа генов связанных с регуляцией клеточного роста или клеточной смерти (таблица 8). Эта
группа генов была разделена на две под-группы: 1. кодирующие белки, связанные с ростом или
гибелью клетки и 2. белки, связанные с апоптозом. Транскрипционная активность 36 генов
увеличивалась
в
клеткaх,
инфицированных
SNV.
Большая
часть
этих
генов
(31 ген)
характеризовалась увеличением транскрипции через 12 часов после инфицирования, тогда как
транскрипция только 5 генов увеличивалась через 4 часа после инфицирования. Напротив,
активация транскрипции была отмечена у значимо малочисленной группы генов (3 гена) в HUVEC
клетках инфицированных вирусом PHV.
Вирусная инфекция может оказывать существенное влияние на жизнеспособность клеток. В
исследованиях in vitro было показано, что вирусы, вызывающие геморрагический синдром у
человека, способны приводить к гибели клетки (1998, J. Immunol. 161:6338–6346.; 1985, J. Pathol.
147:199–209; 1993, J. Clin. Invest. 91:1301–1309.). Гибель клетки путём апоптоза зачастую
используется как форма защиты макроорганизма от репликации и распространения вируса (2003,
Nature 424:516–523). В исследованиях in vitro было показано, что хантавирусы не оказывают
цитопатического воздействия на инфицированные клетки (2000, J. Virol. 74:11966–11971; 1992, J.
107
Virol. 66:5929–5936.; 2001, J. Virol.75:6070–6085; 1990, Arch. Virol. 111:281–286.). Taк же,
исследования аутопсийных тканей не выявили повреждения эндотелиальных клеток, несмотря на
обнаружение вирусных антигенов (1995, Am. J. Pathol. 146:552–579). Результаты наших
исследований
показали,
что
хантавирусная
инфекция
активирует
транскрипцию
генов,
кодирующих тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток и белок Bcl2. Повышение
внутриклеточного уровня транскриптов этих генов возможно препятствует развитию аппоптоза в
инфицированных хантавирусом клетках. Используя TUNEL анализ мы обнаружили, что число
апоптозных клеток не различается между неинфицированными контрольными клетками и
клетками, инфицированными PHV и SNV (Рисунок 20).
Рисунок 20 – Анализ активации аппоптоза в клетках HUVEC инфицированных вирусами SNV и
PHVс помощию TUNEL метода
Клетки HUVEC были инфицированы вирусами SNV или PHV. Монослои были фиксированны
5% параформальдегидом и использованы для изучения активации апоптоза.
Гены хемокинов. Нами было показано повышение внутриклеточного уровня мРНК для генного
кластера CC хемокинов, включающего MPIF-1, HCC-2, HCC-1, LEC и CCL5 (1999, J. Interferon
Cytokine Res. 19:227–234.) в клетках HUVEC инфицированных SNV и PHV (таблица 8).
Увеличение экспрессии генов расположенных в этом кластере обнаруживалось через 4 часа после
инфицирования и оставалось повышенным спустя 12 часов. Следует отметить что, патогенные и
непатогенные хантавирусы активировали транскритационную активность CC хемокинов на ранней
стадии инфекции.
108
4.2.9 Анализ TaqMan экспрессии отдельных генов
Поскольку ген CCL5 был частью генного кластера CC хемокинов, включённого
в
аффиметрический ДНК чип, нами было принято решение изучить экспрессию мРНК CCL5 в
инфицированных хантавирусом клетках. Кроме того, нами был изучен эффект патогенных и
непатогенных хантавирусов на внутриклеточные уровни мРНК CCL5 в эндотелиальных клетках.
Изменения внутриклеточного уровня мРНК CCL5 оценивались с помощью ПЦР-РВ. Кроме того,
нами были исследованы внутриклеточные уровни мРНК p78, Cig5 и Bcl2. Выбор генов был
основан на результатах полученных с использованием аффиметрического ДНК чипа, где
повышенная
транскрипционная
активность
этих
генов
была
обнаружена
в
клетках
инфицированных хантавирусом. Изменения уровней транскрипционной активности выбранных
генов в инфицированных SNV и PHV эндотелиальных клетках нормализовались к уровню 18S
РНК в той же группе (Рисунок 21).
Несмотря на то что данные полученные с использоваием аффиметрических ДНК чипов
выявили повышение транскрипционной активности гена CCL5 в инфицированных PHV
эндотелиальных клетках, нами не было обнаружeно существенных различий в транскрипции гена
CCL5 между контрольными клетками и клетками, инфицированными PHV с использованием
метода ПЦР-РВ (Рисунок 21, А). Напротив, инфицированные SNV эндотелиальные клетки
характеризовались существенным повышением внутриклеточного уровня мРНК CCL5 через 4 и
12 часов после инфицирования (Рисунок 21, А). Mы убеждены, что это различие между данными
аффиметрикс ДНК чипами и ПЦР-РВ может объясняться спецификой каждого метода. Например,
CCL5 был частью CC хемокинового кластера в ДНК микропанели. Таким образом, высокий
уровень гибридизации не обязательно связан с изменениями экспрессии гена CCL5, но может быть
связан с изменениями экспрессии других генов (MPIF-1, HCC-2, HCC-1, LEC), включённых в этот
кластер. В то время как методика ПЦР-РВ предполагает использование пробы и праймеров
специфичных для гена CCL5 что увеличивает специфичность и точность оценки экспрессии гена
CCL5.
109
B
A
10.00
10.00
100,00
C
1000,00
10.00
SNV 12h
SNV 3h
PH 12h
PH 3h
1,00
control
SNV 12h
SNV 12h
SNV 3h
SNV 3h
control
control
1.00
PH 3h
PH 3h
1.00
PH 12h
PH 12h
10,00
D
100,00
SNV 12h
SNV 3h
PH 12h
SNV 12h
SNV 3h
PH 12h
PH 3h
control
control
1.00
1,00
PH 3h
10,00
Рисунок 21 – Анализ методом ПЦР-РВ внутриклеточных уровней CCL5, p78, Cig5 и Bcl2 в
инфицированных SNV и PHV клетках HUVEC
Общая РНК из клеток HUVEC, инфицированных SNV и PHV, собиралась через 4 и 12 часов после
инфицирования и использовалась для анализа ПЦР-РВ уровней экспрессии генов А — CCL5; Б —
p78, В — Cig5 и Г — Bcl2. Значения ПЦР-РВ упорядочивались до уровня 18S РНК в том же
образце и представлялись относительно значений в ложно инфицированных контрольных клетках.
Изменения в транскрипционной активности генов кодирующих p78 и Cig5, выявленные
методом ПЦР-РВ, были аналогичны изменениям, обнаруженным ранее в исследованиях с
применением ДНК чипа. Инфицирование эндотелиальных клеток PHV вызывает существенные
изменения в транскрипции генов p78 и Cig5. Транскрипционная активность гена p78 усиливалась в
инфицированных PHV клетках через 4 часа после инфицирования, тогда как транскрипция этого
110
гена при инфицировании SNV существенно не изменялась (Рисунок 21, Б). Однако, более
выраженное усиление транскрипции гена p78 в эндотелиальных клетках инфицированных SNV
обнаруживалось через 12 часов после инфицирования по сравнению с PHV (99 кратное увеличение
по сравнению с 10 кратным увеличением, соответственно).
Внутриклеточные уровни мРНК гена Cig5 существенно не отличались через 4 часа после
инфицирования PHV или SNV (Рисунок 21, В). Однако анализ транскрипционной активности гена
Cig5 через 12 часов после инфицирования показал, что инфицированные SNV эндотелиальные
клетки отвечают более выраженной активацией Cig5 по сравнению с клетками, инфицированными
PHV (в 278 раз против 15 раз).
Аналогично данным полученным с использованием ДНК чипа, ПЦР-РВ метод выявил
увеличение транскрипции гена Bcl2 при инфицировании HUVEC обоими вирусами (Рисунок 21,
Г). Однако транскрипция гена Bcl2 в PHV инфицированных клетках была существенно выше
только к 12 часам после инфицирования, тогда как уровни мРНК этого же гена были существенно
выше к 4-м часам после инфицирования клеток SNV, и оставалась на высоком уровне к 12 часам
после инфицирования.
4.2.10 Влияние репликации вирусов на внутриклеточный уровень мРНК гена CCL5
Для определения того, требуется ли репликация вируса для активации транскрипции клеточных
генов, мы использовали репликационно дефектные вирусы облучённые гамма лучами. Несмотря
на то, что вирусы были репликационно дефектными, они сохраняли внешнюю структуру вириона и
поэтому были способны связываться с клеточными рецепторами. Общая РНК собиралась в
определённые моменты времени после инфицирования (4, 12, 24 и 72 часа после инфицирования).
Внутриклеточные уровни S-сегмента РНК SNV использовали как маркер для выявления
эффективности вирусной репликации в клетках HUVEC. Оценка экспрессии мРНК CCL5 была
выбрана для выявления корреляций между вирусной репликацией и
транскипционной
активностью клеточных генов (рисунок 22, А и Б).
Нами обнаружeно, что динамика вирусной репликации существенно различалась между
клетками, инфицированными облучёнными и необлучёнными вирусами. Например, когда клетки
инфицировались необлучённым вирусом, нами были обнаружены высокие уровни РНК S-сегмента
вируса SNV на ранней стадии инфекции который не измененялся в течение всего эксперимента
111
(72 часа) (рисунок
демонстрировали
22, А). Напротив, хотя клетки, инфицированные облучённым SNV,
присутствие
S-сегмента
РНК
к
4-м часам
после
инфицирования,
внутриклеточные уровни S-сегмента РНК SNV существенно снижались к 12 часам после
инфицирования, по сравнению с клетками, инфицированными необлучённым вирусом. С
прогрессированием инфекции внутриклеточные уровни S-сегмента РНК SNV продолжали
снижаться в клетках инфицированных облучённым SNV, тогда как уровни S-сегмента РНК SNV
оставались повышенными в клетках, инфицированных необлучённым SNV.
A
ед.
Относительные
Arbitrary units
100000
10000
1000
0
24
48
72
hours P.I.
Время (час)
B
12
Относительные ед.
arbitrary units
10
8
cont
6
SNV
4
SNV irrad
2
0
3
12
24
72
hours PI
Время (час)
Рисунок 22 – Влияние репликации хантавирусов на экспрессию гена CCL5
Общая РНК бралась из культуры клеток HUVEC, инфицированной SNV и облучённым гаммаизлучением SNV через 3, 12, 24 и 72 часа после инфицирования. А.Репликация SNV определялась
112
путём измерения внутриклеточных уровней S-сегмента SNV. ■ — инфицированные SNV; • —
инфицированные SNV, облучённым гамма-излучением. Б. Транскрипционная активность гена
CCL5
Анализы
уровня
мРНК
гена
CCL5
выявили
значительное
повышение
в
клетках,
инфицированных необлучённым SNV, по сравнению с ложно инфицированными клетками, в
12 часов после инфицирования (рисунок 22, Б). Внутриклеточные уровни мРНК гена CCL5
оставались
повышенными
до
72-х часов
после
инфицирования.
Напротив,
когда
для
инфицирования клеток использовали инактивированные облучением SNV, экспрессия мРНК гена
CCL5 не подвергалась существенному изменению, по сравнению с ложно инфицированными
контрольными клетками, и оставалась на существенно более низком уровне по сравнению с
клетками, инфицированными необлучённым SNV (рисунок 22, Б).
4.2.11 Вирус AND стимулирует экспрессию индуцируемого интерфероном белка MxA в
клетках эндотелия
Было высказано предположение что вирусная репликация в эндотелиальных клетках
ингибируется вследствии активации механизмов противовирусной защиты в ответ на вирусную
репликацию. Нами было показано, что инфицирование эндотелиальных клеток человека
способствует увеличению транскрипционной активности генов кодирующих белки с известной
противовирусной активностью. Ген кодирующий белок р78 был одним среди группы генов
кодирующих белки ингибирующие репликацию вирусов. Поэтому нами было принято решение
изучить механизмы активации р78 в эндотелиальных клетках инфицироанных хантавирусом.
Также, нами были изусены механизмы противовирусной активности белка р78.
4.2.12 Эффективность репликации хантавирусов в клетках Vero E6, A549 и HUVEC
Клетки Vero E6, A549 и HUVEC инфицировались штаммом 23 ANDV с MOI 1. Общая РНК
собиралась в определённые моменты времени после инфицирования для анализа накопления
хантавирусной РНК. Внутриклеточные уровни S-сегмента РНК ANDV использовали для оценки
эффективности экспрессии хантавирусных генов в различных типах клеток (Рисунок 23).
113
Внутриклеточные уровни S-сегмента РНК ANDV были сравнимы в клетках Vero E6, A549 и
HUVEC через 3 часа после инфицирования (Рисунок 23). Однако дальнейшее накопление Sсегмента РНК различалось между этими клеточными линиями. Например, к 24-м часам после
инфицирования внутриклеточные уровни S-сегмента РНК ANDV повышались примерно в 10 раз в
клетках Vero E6 и HUVEC, тогда как в клетках линии A549 уровни S-сегмента ANDV повышались
примерно в 2 раза (Рисунок 23). Внутриклеточные уровни S-сегмента РНК ANDV продолжали
увеличиваться в клетках Vero E6 до 72 часов после инфицирования. Напротив, уровни S-сегмента
РНК ANDV в клетках HUVEC существенно снижались в тот же период времени, возвращаясь к
уровням, наблюдавшимся через 3 часа после инфицирования. Внутриклеточные уровни S-сегмента
ANDV в клетках A549 продолжали увеличиваться в течение 72-х часов после инфицирования, хотя
они не достигали уровней, выявленных в клетках Vero E6 (Рисунок 23).
Рисунок 23 – Анализ внутриклеточных уровней S-сегмента РНК вируса ANDV в клетках Vero
E6, HUVEC и A549 с помощью ПЦР-РВ TaqMan
114
Клетки Vero E6, HUVEC и A549 инфицировались штаммом 23 ANDV с MOI 1. Общая РНК
собиралась через 3, 12, 24, 48 и 72 часа после инфицирования. Анализ ПЦР-РВ выполнялся с
помощью зондов MGB на устройстве ABI Prism 7000 Sequence Detection System. Стандартные
графики для относительной количественной оценки S-сегмента РНК ANDV и 18S РНК строились с
использованием последовательных разведений кДНК из инфицированных и неинфицированных
контрольных
образцов,
соответственно.
Значения
S-сегмента
ANDV
корректировались
относительно значений гена 18S в соответствующем образце. Все реакции ПЦР-РВ выполнялись
дважды.
Для оценки эффективности хантавирусной репликации, супернатанты инфицированных клеток
Vero E6, A549 и HUVEC собирали через 24 и 72 часа после инфицирования и определяли титр
ANDV (таблица 9). Результаты показали, что клетки Vero E6 поддерживают репликацию ANDV,
где титры вируса в надосадочной жидкости клеточной культуры достигали 105 БОЕ/мл к 72м часам после инфицирования (таблица 9). Напротив, титры ANDV в надосадочной жидкости
культур клеток HUVEC и A549 были в 100 раз ниже, чем в культуре клеток Vero E6 (таблица 9).
Таблица 9 – Титр ANDV в надосадочной жидкости культур клеток Vero E6, A549 и HUVEC
Культура
клеток
Титр вируса
24 часа после инфицирования
72 часа
после
инфицирования
Vero E6
7103
4105
A549
5102
7103
HUVEC
1101
4103
4.2.13 Влияние хантавирусной инфекции на транскрипцию гена MxA
Для дальнейшего анализа механизмов контролирующих различия в репликации ANDV в
HUVEC и A549 клетках, мы определялили внутриклеточные уровни РНК гена р78. Результаты
115
показали, что транскрипция гена р78 в клетках A549 и HUVEC увеличивалась сразу после
инфицирования ANDV (Рисунок 24). Однако дальнейшая активация транскрипции гена р78
зависела от типа клеток. Например, инфицирование ANDV увеличивало уровни РНК р78 в клетках
A549 и HUVEC. Однако, внутриклеточные уровни транскриптов РНК р78 в клетках HUVEC были
выше по сравнению с показателем в клетках A549 (10.5 условных единицы против 3.0 условных
Относительные ед.
единиц, соответственно) (Рисунок 24).
Время (час)
Рисунок 24 – Увеличение экспрессии гена р78 в культуре клеток HUVEC и A549 при
инфицировании ANDV
4.2.14 Влияние репликации вирусов на экспрессию гена р78
Для определения необходимости вирусной репликации для активации транскрипции гена р78,
инфикционный и
инактивированный гамма-излучением вирусы были использовали для
инфицирования монослоя клеток HUVEC. Общая РНК собиралась в установленные моменты
времени после инфицировании (1, 24 и 72 часа после инфицирования) и использовалась для
определения уровня репликации вирусов и влияния вирусной репликации на внутриклеточныe
уровни РНК р78. Внутриклеточные уровни РНК S-сегмента ANDV использовали для определения
эффективности репликации хантавирусов в клетках HUVEC.
Высокие уровни S-сегмента ANDV обнаруживались в клетках HUVEC, инфицированных
сохранившим инфекционность хантавирусом к первому часу после инфицирования (Рисунок 25,
А). Внутриклеточные уровни РНК S-сегмента ANDV оставались на высоком уровне в клетках
HUVEC до 72-х часов после инфицирования. Хотя внутриклеточные уровни РНК S-сегмента
116
ANDV были повышены в клетках HUVEC через час после инфицирования инактивированным
ANDV, они значительно снижались в течение последующих 72-х часов и были примерно в 100 раз
меньше, чем в клетках инфицированных необлучённым ANDV.
Внутриклеточные уровни РНК р78 существенно различались между клетками HUVEC,
инфицированными сохранившим инфекционность и облучённым гамма-излучением ANDV
(Рисунок 25, Б). Например, внутриклеточные уровни РНК р78 в клетках HUVEC, инфицированных
ANDV, повышались примерно в 2 раза, по сравнению с ложно-инфицированными клетками, к
первому часу. Уровни РНК р78 оставались повышенными в клетках, обработанных сохранившим
инфекционность ANDV, в течение следующих 72-х часов (в 5 раз выше чем в контрольных
клетках). Напротив, внутриклеточные уровни РНК р78 в клетках HUVEC, обработанных
инактивированным гамма-излучением ANDV, снижались через час после инфицирования. Спустя
24 часа внутриклеточные уровни РНК р78 повышались примерно в 3 раза по сравнению с
неинфицированными клетками. Однако к 72-м часам после инфицирования, внутриклеточные
уровни РНК р78 в клетках, обработанных облучённым инактивированным ANDV, возвращались к
уровням ниже, чем в ложно-инфицированных контрольных клетках.
Относительные ед.
117
Время (час)
Относительные ед.
Б
Время (час)
Рисунок 25 – Транскрипционная активность гена р78 в клетках HUVEС и A549 при
инфицировании ANDV
Клетки HUVEC инфицировались сохранившим инфекционность и облучённым гамма-излучением
инактивированным штаммом 23 ANDV. Общая РНК собиралась через 3, 24 и 72 часа после
инфицирования. Анализ ПЦР-РВ выполняли с помощью проб на устройстве ABI Prism 7000
Sequence Detection System.
A — внутриклеточные уровни S-сегмента ANDV в клетках HUVEC, инфицированных
сохранившим инфекционность и облучённым гамма-излучением инактивированным ANDV.
Значения S-сегмента РНК ANDV корректировались относительно значений гена 18S в
соответствующем образце. B — внутриклеточные уровни гена р78 в клетках HUVEC,
инфицированных
сохранившим
инфекционность
и
облучённым
гамма-излучением
инактивированным ANDV. Значения гена р78 корректировались относительно значений гена 18S в
118
соответствующих образцах. Скорректированные значения затем выражались как относительные
значения для того же гена, экспрессированного в контрольной неинфицированной группе.
4.2.15 Влияние репликации ANDV на транслокацию IRF-3 в ядро клетки
Транскрипция гена р78 регулируется интерферон-регулирующим фактором 3 (IRF-3), который
в свою очередь активируется интерфероном (1999, J Interferon Cytokine Res 19:1–13.). В норме,
IRF-3 является белком цитоплазмы. Однако, при активации, IRF-3 образует фосфорилируется и
перемещается в ядро клетки и инициирует транскрипцию. Поэтому нами было принято решение
изучить, влияние хантавирусной инфекции на внутриклеточную локализацию IRF-3, где
обнаружение IRF-3 в ядре инфицированных клеток являлось бы доказательством активации этого
транскрипционного фактора. Монослои клеток HUVEC фиксировались через 48 часов после
инфицирования вирусом ANDV и инкубировались с анти-IRF-3 антителами (Рисунок 26, А-В).
Неинфицированные монослои клеток HUVEC использовали в качестве контрольных. В
неинфицированных клетках HUVEC (Рисунок 26, А) локализация IRF-3 ограничивалась
цитоплазмой. Однако через 48 часов после инфицирования IRF-3 перемещался в ядра клеток
HUVEC, инфицированных ANDV.
.
Рисунок 26 – Ядерная транслокация IRF-1 в клетках HUVEC, инфицированных ANDV
Монослои клеток
HUVEC инфицировались ANDV с MOI
1. Инфицированные и
неинфицированные монослои фиксировались (3:1 метанол:ацетон) и использовались для
определения внутриклеточной локализации IRF-3 с помощью анти-IRF-3 моноклональных антител
(1:200; Santa Cruz). A — неинфицированный монослой клеток HUVEC; Б — монослой клеток
HUVEC, инфицированный ANDV, спустя 24 часа после инфицирования;
4.2.16 Влияние хантавирусной инфекции на внутриклеточные уровни белка р78
119
Клеточные белки HUVEC и A549 собирались в определённые моменты времени после
инфицирования (24, 48 и 72 часа после инфицирования) и использовались для анализа
внутриклеточных уровней белка р78 с помощью метода вестерн блота.
Инутриклеточный уровень белка р78 оставался неизменным в контрольных клетках HUVEC на
протяении всего эксперимента (Рисунок 27 А). Однако повышенние внутриклеточного уровня
белка р78 обнаруживалось в клетках HUVEC к 24 часам после инфицирования. Уровни р78 белка
продолжали увеличиваться с прогрессированием инфекции. Отличная картина экспрессии р78
обнаруживалась в клетках A549, инфицированных ANDV (Рисунок 27 Б). В клетках A549 не
наблюдалось изменений экспрессии белка р78, в сравнении с неинфицированными клетками A549,
в любой момент времени после инфицирования.
Б
Рисунок 27 – Анализ экспрессии белка р78 в инфицированных ANDV клетках HUVEC и A549
Клетки HUVEC и A549 инфицировались штаммом 23 ANDV с MOI 1. Общий белок собирался
через 24, 48 и 72 часа после инфицирования и анализировались с помощью метода вестерн-блот.
Белок р78 выявляли при помощи инкубации с кроличьими поликлональными антителами к белку
р78 (1:50). Комплексы антиген-антитело идентифицировались козьими противокроличьими HRPконъюгированными антителами. А. Экспрессия белкар78 в инфицированных ANDV клетках
HUVEC. M-маркёр 1, 3 и 5 — неинфицированные контрольные клетки HUVEC (24, 48 и 72 часа,
соответственно). 2, 4 и 6 — клетки HUVEC, инфицированные вирусом ANDV клетки ( 24, 48 и
72 часа, соответственно). Б. Экспрессия белка р78 в клетках A549, инфицированных ANDV. Mмаркёр 1, 3, и 5 — неинфицированные клетки A549 (24, 48, и 72 96 часa после соответственно) 2, 4,
и 6 — инфицированные вирусом ANDV клетки (24, 48, 72 и 96 часов после инфицирования
120
соответственно) .С — положительный контроль, клетки HUVEC, обработанные ИФН-γ в течении
72 часов.
4.2.17 Влияние экспрессии р78 на репликацию ANDV в клетках Vero E6
Mонослои клеток VE6/р78 (клон 1) и VE6/GFP (клон 1) инфицировались вирусом ANDV с MOI
1. Общая РНК, общий белок и супернатант собирались в определённые моменты времени после
инфицирования. Тотальная РНК использовалась для определение внутриклеточных уровней мРНК
кодирующей р78 и S-сегмент вируса ANDV. Аккумуляция N-белка вируса ANDV и белка р78
определялась количественно с помощью вестерн-блота. Титры вируса устанавливались методом
непрямого бляшкообразования.
Транскрипционная и трансляционная активация белка р78 была обнаружена в клетках Vero E6,
трансфицированных плазмидой pcDNA-HA-MxA(р78), (Рисунок 28, А и В соответственно).
Конституциональная экспрессия белка р78 клетками Vero E6 подавляла репликацию ANDV.
Внутриклеточные уровни N-белка ANDV были ниже в р78-трансфицированных клетках Vero E6
по сравнению с клетакми трансфицированными pEGFP-puro плазмидой (Рисунок 28, В).
Аналогично, внутриклеточные уровни S-сегмента РНК ANDV были в 10 раз ниже в клетках Vero
E6, трансфицированных р78, по сравнению с клетками трансфицированными pEGFP-puro
плазмидой (3,0106 против 2,5105). Клетки Vero E6, трансфицированные pEGFP-puro плазмидой,
поддерживали репликацию ANDV, где вирусные титры достигали 2105 на 6-й день после
инфицирования. Однако в клетках VE6/р78 репликация ANDV подавлялась, что проявлялось в
снижении вирусного титра до 3103 на 6-й день после инфицирования.
Относительные ед.
121
Рисунок 28 – Инфицирование ANDV клеток Vero E6, трансфицированных р78
Трансфицированные плазмидой содержащей ОРС гена р78, клетки Vero E6 были инфицированы
вирусом ANDV Общий белок клеток Vero E6, трансфицированных pEGFP -puro плазмидой или
плазмидой содержащей ОРС гена р78, разделяли в SDS-PAGE, переносили на PDVD мембрану и
инкубировали с анти-р78- кроличьей сывороткой (А) и анти-SNV-N- моноклональными
антителами (Б). 1 — трансфицированные pEGFP-puro контрольные клетки Vero E6; 2 — клетки
Vero E6, трансфицированные р78. В – Тотальная РНК контрольных клеток Vero E6 и клеток
трансфицированных плазмидой содержащей ОРС гена р78 собиралась на 6-й день после
инфицирования и использовалась для определения уровня мРНК кодирующей белок р78 с с
помощью метода ПЦР-РВ. 1 — контрольные клетки Vero E6, трансфицированные pEGFP-puro
плазмидами; 2 — клетки Vero E6, трансфицированные р78.
122
4.2.18 Внутриклеточная локализация белка р78 в ANDV инфицированных клетках HUVEC
Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1. Через пять дней после
инфицирования
клеточные
монослои
фиксировались
и
использовались
для
изучения
внутриклеточнoй локализации белка р78. Сочетания антител, использованных для этого
исследования, обобщeны в таблица 9 (материалы и методы).
Экспрессия белка р78 была обнаружена только в цитоплазме контрольных клеток HUVEC. Для
определения внутриклеточной локализации белка р78, монослои клеток HUVEC инфицированных
ANDV инкубировались с 1. комбинацией антител к р78
и эндоплазматической сети (ЭПС)
(Рисунок 29, А-С) или 2. комбинацией антител к р78 и коплексу Гольджи (КГ) (Рисунок 29, Г-Ж).
В клетках HUVEC часть белка р78 сочеталась с ЭПС, тогда как другая часть была неравномерно
распределена в цитоплазме за пределами ЭПС (Рисунок 29, А-В). Кроме того, было ясно, что белок
р78 не локализовался в КГ (Рис. 29, D-F). Инкубация монослоёв клеток HUVEC с антителами к
PUUV N
(Рисунок 30, B) и к белку р78 (Рисунок 30, А) выявила колокализацию р78 и
хантавирусного N-белка (Рисунок 30, С). В тоже время локализация белка р78 (Рисунок 30, Г) не
совпадала с локализацией хантавирусных гликопротеинов (Рисунок 30 Д).
123
Рисунок 29 — Внутриклеточная локализация белка р78
Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV при MOI 1. Инфицированные и
неинфицированные монослои фиксировались (3:1 метанол:ацетон) через 5 дней после
инфицирования и использовались для определения внутриклеточной локализации белка р78.
Локализация белка р78 выявлялась с помощью анти-MxA кроличьей сыворотки (1:200).
Определение расположения ЭС и КГ выявлялось с помощью антител против кальнексина (1:200;
Affinity Bioreagents) и антител к белку 58K (1:200; Sigma), соответственно.
А — внутриклеточная локализация белка р78; противокроличьи антитела Alexa 555 (красная
флюоресценция, Molecular Probes, Юджин, Орегон) использовались для визуализации белка р78.
B
—
внутриклеточная
локализация
ЭР;
для
визуализации
белка
ЭР
применяли
противомышиные антитела Alexa 488 (зелёная флюоресценция, Molecular Probes, Юджин, Орегон);
C — наложенные изображения А и B.
D — внутриклеточная локализация белка р78; для визуализации белка р78 применяли
противокроличьи антитела Alexa 488 (зелёная флюоресценция, Molecular Probes, Юджин, Орегон);
E — внутриклеточная локализация аппарата Гольджи; для визуализации аппарата Гольджи
применяли противокроличьи антитела Alexa 555 (красная флюоресценция, Molecular Probes,
Юджин, Орегон);
F — наложенные изображения D и E.
124
Д
Ж
Рисунок 30 – Внутриклеточная локализация белков р78, и вирусных белков: N белка и ГП
Монослои
клеток
неинфицированные
HUVEC
монослои
инфицировались
фиксировались
ANDV
(3:1
при
MOI
1.
метанол:ацетон)
Инфицированные
через
5 дней
и
после
инфицирования и использовались для определения внутриклеточной локализации белка р78.
Локализация белков р78, N белка и ГП выявлялась с помощью анти- р78 кроличьей сыворотки
(1:200); белки N и G1/G2 вируса ANDV были выявлены с помощью МАт к N белку вируса PUUN
(1:100; Dr. Ksiazek, CDC) и Мат к G1/G2 ГП (1:100; разработано в лаборатории) соответственно. А
— внутриклеточная локализация белка р78; противокроличьи антитела Alexa 555 (красная
флюоресценция, Molecular Probes, Юджин, Орегон) использовались для визуализации белка р78.
Б — внутриклеточная локализация N белка вируса ANDV; anti-mouse-Alexa 488 антитела (Green
fluorescent, Molecular Probes, Eugene, OR); В — наложенные изображения А и Б. Г —
внутриклеточная локализация белка р78; для визуализации белка р78 применяли противокроличьи
антитела Alexa 488 (зелёная флюоресценция, Molecular Probes, Юджин, Орегон); Д —
внутриклеточная локализация G1/G2 белков вируса АNDV; antimouse-Alexa 488 (Green fluorescent,
Molecular Probes, Eugene, OR); Ж — наложенные изображения Г и Д.
4.2.19 Влияние хантавирусной инфекции на активацию факторов ядерной транскрипции
PML, SP100 и ISG-20 в клетках HUVEC in vitro
Ранее мы показали, что хантавирусная инфекция повышает транскрипционную активность в
клетках HUVEC. Так например, нами было показано что хантавирусная инфекция активирует
интерферон-индуцируемые гены в клетках HUVEC уже на ранней стадии инфекции. Активация
125
клеточного ответа может, как минимум отчасти, быть опосредованной через индукцию
транслокации из цитоплазмы в ядро белков регуляторов транскрипции. Показано, что PML может
индуцироваться интерфероном и повышать вирусную резистенцию в клетках макроорганизма (T.
Regad et al., 2001). Поэтому нами было принято решение установить влияние хантавирусной
инфекции на активацию PML в клетках HUVEC.
Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с MOI 1. Через 72 часа
инфицированные монослои фиксировались и инкубировались с моноклональными анти-PML и
кроличьими анти-N-белок ANDV антителами. Небольшое число и низкая интенсивность PML NB
обнаруживались в ложно-инфицированных клетках HUVEC через 72 часа после инфицирования
(Рисунок 31, А). Однако число PML NB и интенсивность их окраски увеличивались, по сравнению
с ложно-инфицированными клетками, в клетках HUVEC, инфицированных ANDV и HTNV
(Рисунок 31, Б, В).
Б
В
Рисунок 31 – Активация PML в клетках HUVEC инфицированных вирусами ANDV и HTNV
Монослои HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с MOI 1. Через 72 часа, монослои
фиксировались и инкубировались с моноклональными анти-PML антителами и кроличьей анти-Nбелок ANDV сывороткой. Противомышиные антитела Alexa-488 и противокроличьи антитела
Alexa-555 использовали для визуализации PML и хантавирусных антигенов. А — Ложноинфицированный монослой клеток HUVEC; Б — Монослои клеток HUVEC, инфицированные
ANDV; В — Монослои клеток HUVEC, инфицированные HTNVю
Активация PML в инфицированных хантавирусом клетках HUVEC была дополнительно
подтверждена с использованием метода вестерн-блот (Рисунок 32, А) и анализом пиксельной
интенсивности флуоресценции (Рисунок 32, Б).
Относительные ед.
126
Контрольl
Флюоресцентные ед.
Б
Время (час)
Рисунок 32 – Активация PML в клетках HUVEC инфицированных вирусами АNDV и HTNV
Монослои HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с MOI 1. Через 72 часа, монослои
фиксировались и инкубировались с моноклональными анти-PML антителами и кроличьей анти-Nбелок ANDV сывороткой. Противомышиные антитела Alexa-488 и противокроличьи антитела
Alexa-555 использовали для визуализации PML и хантавирусных антигенов. А — Ложноинфицированный монослой клеток HUVEC; Б — Монослои клеток HUVEC, инфицированные
ANDV; C — Монослои клеток HUVEC, инфицированные HTNV;
4.2.21 Колокализация PML с SP100 и его частичная колокализация с DAXX в
инфицированных хантавирусом клетках HUVEС
Активация PML вызывает ядерную транслокацию SP100 и DAXX и их колокализацию в NB.
Поэтому мы решили выяснить, совпадает ли локализация PML с SP100 и DAXX в
инфицированных хантавирусом клетках HUVEC.
127
Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV или HTNV с MOI 1. Ложноинфицированные монослои клеток HUVEC использовались в качестве контрольных. Монослои
фиксировались через 72 часа после инфицирования и инкубировались в сочетании с антителами
против PML-SP100 и PML-DAXX (Рисунок 33 и 34). Наши результаты показали, что PML и SP100
колокализовались в клетках HUVEC, инфицированных ANDV и HTNV (Рисунок 33). Однако PML
был обнаружен преимущественно вокруг DAXX в инфицированных клетках HUVEC (Рисунок 34).
Только небольшая часть PML была обнаружена тесно связанной с DAXX (Рисунок 34).
Б
В
Г
Д
Е
Ж
З
И
Рисунок 33 – Внутриклеточная локализация PML и SP100 в клетках HUVEC, инфицированных
ANDV и HTNV
Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с ИМЗ 1 в течение 72-х часов.
Монослои фиксировались и инкубировались с моноклональными антителами анти-PML и
кроличьими антителами анти-SP100. Противомышиные антитела Alexa-488 и противокроличьи
антитела Alexa-555 использовали для визуализации PML и SP100. A — внутриклеточная
локализация PML в ложно-инфицированных клетках HUVEC; Б — внутриклеточная локализация
SP100 в ложно-инфицированных клетках HUVEC; В — наложенные изображения A и B; Г —
внутриклеточная
локализация
PML
в
инфицированных
ANDV
клетках
HUVEC;
Д—
внутриклеточная локализация SP100 в инфицированных ANDV клетках HUVEC; Е — наложенные
128
изображения Г и Д; Ж — внутриклеточная локализация PML в инфицированных HTNV клетках
HUVEC; З — внутриклеточная локализация SP100 в инфицированных HTNV клетках HUVEC;
И — наложенные изображения Ж и З;
Г
Б
В
Д
Е
Рисунок 34 – Внутриклеточная локализация PML и DAXX в клетках HUVEC, инфицированных
вирусами ANDV и HTNV
Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с MOI 1. Через 72-х часа, монослои
фиксировались и инкубировались с моноклональными антителами анти-PML и кроличьими
антителами анти-DAXX. Противомышиные антитела Alexa-488 и противокроличьи антитела
Alexa-555 использовали для визуализации PML и DAXX. A — внутриклеточная локализация PML
в инфицированных ANDV клетках HUVEC; Б — внутриклеточная локализация DAXX в
инфицированных ANDV клетках HUVEC; В — наложенные изображения A и Б; Г —
внутриклеточная локализация PML в инфицированных HTNV в клетках HUVEC; Д —
внутриклеточная локализация DAXX в инфицированных HTNV клетках HUVEC; Е — наложенные
изображения Г и Д.
4.2.22 PML тесно связан с ISG-20 в инфицированных хантавирусом клетках HUVEC
Ранее нами была показана активация транскрипции гена ISG-20 в инфицированных
хантавирусом клетках HUVEC. ISG-20 -интерферон-индуцируемый белок, тесно связанный с PML
129
NB (C. Gongora et al., 1997). Связь PML со многими индуцируемыми белками, включая ISG-20,
является важным компонентом активности интерферона (C. Gongora, et al., 1997). По этой причине
мы приняли решение проверить, оказывает ли влияние хантавирусная инфекция на ядерную
локализацию ISG-20 в клетках HUVEC.
Клетки HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с MOI 1. Общий белок собирали через 72 часа
после инфицирования и использовали для определения экспрессии белка ISG-20. Полученные
нами данные показали, что инфицирование ANDV и HTNV усиливает экспрессию ISG-20 в
Относительные ед.
клетках HUVEC спустя 72 часа после инфицирования (Рисунок 35).
контроль
Рисунок 35 – Влияние инфицирования ANDV и HTNV на экспрессию ISG-20 в клетках HUVEC
Клетки HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с MOI 1. Общий белок собирали на 72-м часу
после инфицирования и использовали для определения экспрессии белка ISG-20 с помощью
вестерн-блота. Ложно-инфицированные клетки HUVEC использовали в качестве контрольных.
Кроличьи анти-ISG-20 антитела использовали для определения экспрессии ISG-20.
Клетки HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с MOI 1 и использовались для определения
локализации ISG-20 и PML (Рисунок 36). Было обнаружено, что инфицирование ANDV и HTNV
усиливает экспрессию PML и ISG-20 в клетках HUVEC через 72 часа после инфицирования. Оба
белка обнаруживались в ядре. Однако ISG-20 распределялся по всему ядру, а его распределение
было тесно связано и лишь частично перекрывало распределение PML NB (Рисунок 36 З и Г).
130
Б
В
Г
Д
Е
Ж
Рисунок 36 – Внутриклеточная локализация PML и ISG-20 в клетках HUVEC инфицированных
ANDV и HTNV
Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV и HTNV с MOI 1. Через 72 часа монослои
фиксировались и использовались для исследования локализации PML и ISG-20. A —
внутриклеточная локализация ISG-20 в ложно-инфицированных клетках HUVEC; Б —
внутриклеточная локализация PML в инфицированных ANDV клетках HUVEC; В —
внутриклеточная локализация ISG-20 в инфицированных ANDV клетках HUVEC; Г —
наложенные изображения Б и В; Д — внутриклеточная локализация PML в инфицированных
HTNV клетках HUVEC; Е — внутриклеточная локализация ISG-20 в инфицированных HTNV
клетках HUVEC; Ж — наложенные изображения Д и Е.
2.23 Хантавирусная репликация необходима для активации PML в клетках HUVEC.
Клетки HUVEC инфицировались сохранившими инфекционность либо инактивированными
(облучёнными гамма-излучением) вирусами ANDV или HTNV с MOI 1. Накопление S-сегмента
РНК ANDV и HTNV использовали для оценки эффективности репликации хантавирусов в клетках
131
HUVEC. Общая РНК собиралась через 72 часа после инфицирования и использовалась для
определения эффективности репликации ANDV и HTNV с применением метода ПЦР-РВ.
Накопление S-сегмента РНК хантавирусов в клетках HUVEC, инфицированных гаммаоблучёнными инактивированными ANDV и HTNV полностью отсутствовало (Рисунок 37, А, Б). В
то же время наблюдалось увеличение накопления транскриптов S-сегмента вирусов ANDV и
Относительные ед
HTNV в клетках инфицированных репликационно компетентными вирусами (Рисунок 37, А, Б).
Относительные ед
Время (час)
Время (час)
Рисунок 37 – Гамма-излучение ингибирует репликацию хантавирусов. Клетки HUVEC
инфицировались
сохранившими
инфекционность
и
облучёнными
гамма-излучением
инактивированными вирусами ANDV и HTNV с MOI 1
Общая РНК собиралась через 1, 3, 24 и 72 часа после инфицирования. Анализ ПЦР-РВ выполнялся
на устройстве ABI Prism 7000 Sequence Detection System. А - Накопление S-сегмента РНК ANDV в
132
клетках HUVEC, инфицированных сохранившими инфекционность и облучёнными гаммаизлучением вирусами ANDV;
Б - Накопление S-сегмента РНК HTNV в клетках HUVEC, инфицированных сохранившими
инфекционность и облучёнными гамма-излучением вирусами HTNV;
Облученный вирус;
необлученный вирус;
Влияние репликации хантавирусов на активацию PML определялось с применением метода
иммунофлюоресценции.
Монослои
клеток
HUVEC
инфицировались
сохранившими
инфекционность и облучёнными гамма-излучением вирусами ANDV и HTNV с MOI 1. После
фиксации (метанол:ацетон 3:1) монослои инкубировались с моноклональными анти-PML
антителами и кроличьими анти-N-белок ANDV антителами. Ложно-инфицированные монослои
клеток HUVEC использовались в качестве контрольных (Рисунок 38). Повышенное количество
точек и интенсивность окрашивания на PML обнаруживались в клетках HUVEC, подвергшихся
воздействию инфекционных
вирусов ANDV и HTNV. Однако PML NB в клетках HUVEC,
инфицированных облучёнными гамма-излучением вирусами, не отличалось от показателя в
ложно-инфицированных клеток HUVEC (Рисунок 38).
Б
В
Г
Д
Рисунок 38 – Влияние репликации вирусов ANDV и HTNV на активацию PML в клетках HUVEC
Монослои клеток HUVEC инфицировались сохранившими инфекционность и облучёнными гамма-
133
излучением вирусами ANDV и HTNV при MOI 1. Через 72 часа, монослои фиксировались и
инкубировались с моноклональными антителами анти-PML и кроличьими антителами анти-Nбелок ANDV. Противомышиные антитела Alexa-488 и противокроличьи антитела Alexa-555
использовали для визуализации PML и хантавирусного N-белка. А - PML в ложноинфицированных клетках HUVEC; Б - PML в клетках HUVEC, инфицированных облучёнными
гамма-излучением вирусами ANDV; В - PML в клетках HUVEC, инфицированных облучёнными
гамма-излучением вирусами ANDV; Г - PML в клетках HUVEC, инфицированных ANDV; Д - PML
в клетках HUVEC, инфицированных HTNV.
4.2.24 Активация PML требует экспрессии хантавирусного белка
PML, SP100 и ISG-20 принадлежат к группе интерферон-индуцируемых белков. Активация
PML и ISG-20 связана с повышенной продукцией ИФН типа I. Однако ранее нами было показано,
что хантавирусная инфекция не активирует транскрипцию гена интерферона в клетках HUVEC.
Однако, активации PML, SP100 и ISG-20 может быть ассоциирована с экспрессией вирусных
белков или присутствием вирусных транскриптов. По этой причине нами было принято решение
определить, может ли накопление вирусных транскриптов и/или белков вызывать активацию PML
в
инфицированных
хантавирусами
клетках.
Для
этого,
клетки
A549
обрабатывались
циклогексимидом (CXM; 100 нг/мл; 6 ч при 370C, 5% CO2) перед инфицированием вирусом ANDV
(MOI 1). Общая РНК и белки собирались через 72 часа после инфицирования и использовались для
определения накопления S-сегмента вирусной РНК и N-белка, соответственно. Кроме того,
монослои клеток A549, обработанные CXM, инфицировались ANDV и HTNV и через 72 часа
инкубировались с моноклональными анти-PML и кроличьими анти-N-белок ANDV антителами.
Как и ожидалось, CXM ингибировал накопление N-белка ANDV в клетках A549, чего не
происходило в необработанных клетках (Рисунок 39, А). Однако обработка CXM не оказывала
влияния на накопление S-сегмента РНК ANDV (Рисунок 39, B). Тем не менее, активация PML NB
выявлялась только в клетках, инфицированных ANDV без обработки CXM (Рисунок 39, В).
Относительные
134
Г
Б
В
Д
Е
Рисунок 39 – Влияние репликации хантавируcов на активацию PML. Клетки A549 обрабатывались
CXM (100 нг/мл; 6 ч при 370C, 5% CO2) перед инфицированием ANDV (MOI 1)
Общая РНК и белки собирались через 72 часа после инфицирования для определения накопления
S-сегмента вирусной РНК и N-белка, соответственно. Кроме того, монослои клеток A549,
обработанные CXM, инфицировались ANDV и HTNV. Через 72 часа монослои фиксировались и
инкубировались моноклональными анти-PML и кроличьими анти-N-белок ANDV антителами. А влияние CXM на экспрессию белка ANDV в клетках A549; 1 - инфицированные ANDV клетки
135
A549, обработанные CXM; 2 - инфицированные ANDV клетки A549 без обработки; Б - влияние
CXM на накопление S-сегмента РНК ANDV в клетках A549;
В - иммуногистохимическое
исследование влияния CXM на способность ANDV вызывать активацию PML в клетках A549.
I.
Эффект
CXM
на
аккумуляцию
ANDV
S
сегмента
РНК
аккумуляция ANDV S сегмента РНК в клетках A549 ;
в
клетках
A549:
аккумуляция ANDV S
сегмента РНК в клетках A549 обработанных CXM
II.
А - PML в ложно-инфицированных контрольных клетках
A549; Б - PML в
инфицированных ANDV клетках A549; В - PML и N-белок ANDV в клетках A549; Г PML в обработанных CXM ложно-инфицированных клетках A549; Д - PML в
обработанных CXM инфицированных ANDV клетках A549; Е - PML и N-белок ANDV в
клетках A549, обработанных CXM и инфицированных ANDV.
4.2.25 PML и SUMO имеют различную локализацию в инфицированных хантавирусом
клетках HUVEC
Продемонстрировано, что для SUMO модификации PML требуется их колокализациa в NB. По
этой причине нами было принято решение определить, подвергается ли PML SUMO-модификации
в инфицированных хантавирусами клетках HUVEC. Монослои HUVEC инфицировались ANDV с
MOI 1. Ложно-инфицированные монослои клеток HUVEC использовали в качестве контрольных.
Монослои фиксировали через 72 часа после инфицирования и использовали для определения
локализации PML и SUMO. Нами было обнаружено что PML локализовался в ядре
инфицированных ANDV клеток HUVEC. Однако выяснилось, что SUMO локализуется в
цитоплазме инфицированных ANDV клеток HUVEC и его локализация не совпадает с PML
(Рисунок 40, B, C).
136
В
Б
Рисунок 40 – Субклеточная локализация PML, SUMO и N-белка ANDV в клетках HUVEC
Монослои клеток HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1. Инфицированные монослои (72 часа
после инфицирования) фиксировались и инкубировались с моноклональными анти-PML,
кроличьими анти-SUMO и анти-N-белок ANDV антителами. Противомышиные антитела Alexa-488
и противокроличьи антитела Alexa-555 использовали для визуализации PM, SUMO и N-белка
ANDV. A - локализация N-белка ANDV и PML совпадает в инфицированных ANDV клетках
HUVEC; Б - локализация PML и SUMO в инфицированных ANDV клетках HUVEC; В локализация PML и SUMO в ложно-инфицированных клетках HUVEC
Показано, что локализация N-белка совпадает с локализацией SUMO в цитоплазме (P.
Kaukinen, et al., 2003). Кроме того, показано, что N-белок хантавируса подвергается
SUMOмодификации
(P.
Kaukinen,
et
al.,
2003).
Таким
образом,
используя
реакцию
иммунопреципитации, нами было принято решение выяснить, взаимодействует ли N-белок ANDV
с SUMO. Обнаружилось, что локализация N-белка ANDV совпадала с локализацией SUMO в
цитоплазме инфицированных клеток HUVEC (Рисунок 41, A). Взаимодействие между SUMO и Nбелком ANDV дополнительно анализировалось с помощью реакции иммунопреципитации. Лизаты
инфицированных ANDV клеток HUVEC собирали, избегая денатурации белка, и инкубировали с
кроличьими анти-SUMO антителами. Комплексы антиген-антитело инкубировали с анти-PML или
анти-N-белок
ANDV
моноклональными
антителами
(Рисунок
41).
N-белок
ANDV
иммунопреципитировался антителами против SUMO в клеточных лизатах инфицированных клеток
HUVEC (Рис. 41; IA, линия 2). Однако уровни иммунопреципитации PML посредством SUMO не
различались между ложно-инфицированными и инфицированными ANDV клетками HUVEC
(Рисунок 41; IIA, линия 1 и 2, соответственно).
137
Рисунок 41 – Взаимодействие между PML, S-сегментом РНК вируса ANDV и белка SUMO
Клетки HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1. Общий белок собирался через 72 часа после
инфицирования и использовался для инкубации с анти-SUMO антителами. Комплексы антителобелок разделялись в SDS-геле и инкубировались с мышиными анти-PML или моноклональными
анти-N-белок PUU антителами. I — N-белок ANDV II — PML. A — иммунопреципитация; Б —
SDS-гель клетки A549; В — SDS-гель 18S. 1 — ложно-инфицированные клетки A549; 2 —
инфицированные ANDV клетки A549.
4.2.26 Изучение цитокинового профиля сывороток больных ГЛПС
Было высказано предположение, что увеличение проницаемости сосудов и кровотечения
наблюдаемые у больных ГЛПС могут быть результатом действия провоспалительных цитокинов.
Однако разнообразие клинических симптомов трудно объяснить только активацией ФНО-α. Кроме
того, нами и другими исследователями была показана in vitro активация множества цитокинов
ранее неизученных у больных ГЛПС. Поэтому нами были проведены эксперименты по изучению
развернутого цитокинового профиля больных ГЛПС.
Клиническое описание больных. Двадцать девять больных ГЛПС (24 мужчины и 5 женщин) были
включены в наше исследование (Таблица 10). Средний срок госпитализации составил 15 день, а
средняя продолжительность лихорадочных и олигурической периоды составила 4,5 ± 1,2 дней и 6,7
138
±
1.9
дней
соответственно.
Диагноз
ГЛПС
был
основан
на
клинической
картине,
эпидемиологических данных и последующего серологического подтверждения. Анализ мочи
выявил протеинурию и гематурию в 3 и 4 случаях, соответственно. Исследование УЗИ показало
наличие отека почек. В семи случаях развились осложнения включая ДВС и синдром острой
почечной недостаточности. Повышенные уровни сыворотки креатинина и мочевины были
обнаружены в 16 и 17 случаях, соответственно. Количество тромбоцитов уменьшилось на ранней
стадии заболевания (159,4 ± 32,1 кл/мкл) с последующим восстановлением до уровня здоровых
(449 ± 40.46 кл/мкл) к концу госпитализации.
Сывороточный уровень цитокинов. Сывороточные концентрации ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-10,
ИЛ-8, ИЛ-12 (р70) и CCL2 цитокинов были изучены у больных ГЛПС в раннем и позднем периоде
заболевания. Из 29 случаев ГЛПС, парные сыворотки были собраны только у 14 больных, в то
время как тольно одна сыворотка была собрана у 15 больных. Первый образец был собран во время
поступления в стационар в то время как вторая сыворотка собиралась перед выпиской в стадии
конвалесценции.
Таблица 10 – Клиническая характеристика ГЛПС
Показатели
Титр антител (1)
Титр антител (2)
Госпитализация (дни)
Фебрильная фаза (дни)
Олигурическая фаза (дни)
Сывороточная мочевина
(mg/dL)
Сывороточный
креатинин (μmol/dL)
Тромбоциты (1)
Тромбоциты (2)
Кровотечения
Почечная
недостаточность/эдема*
Пол (M/Ж)
Значение P значение**
895±105
2041.5±25
15.7±2.4
4.5±1.2
6.7±1.9
60.2±25.1 >0.05
229.4±19.
4
159.4±32.
1
449.9±40
6 out of
14
8 out of
14
12/2
<0.006
>0.05
>0.05
*УЗИ диагностика
** P значения по сравнению с контролем
139
Лихорадочная фаза болезни характеризуется значительно сниженными уровнями ИЛ-2 и
ИЛ-12 (p70), в то время как уровни ИЛ-10 и CCL2 были значительно увеличены по сравнению с
сыворотками здоровых людей (Таблица 11.). Во время фазы олигурии, сывороточные уровни ИЛ-2
и ИЛ-12 (p70) оставалась значительно сниженными по сравнению со здоровым контролем. Однако,
концентрация ИЛ-10 и CCL2 продолжала увеличиваться в сыворотке и была выше той что была
арегистрирована в лихорадочную фазу. Кроме того, уровни ИЛ-1β, оказались значительно
сниженными, а уровень CXCL8 значительно увеличенным по сравнению с сывороткой здоровых
людей. Сывороточные уровни ИЛ-2, ИЛ-12 (p70), ИЛ-10 и CCL2 не изменялись в фазу полиурии и
оставались схожими с тем, что обнаруживалось в лихорадочный период. В период
конвалесценции, сывороточные уровни ИФН-γ, ИЛ-10 и CCL2 были значительно увеличены; в то
время как сывороточные уровни ИЛ-1β и ИЛ-12 (p70) значительно снизились по сравнению с
показателями у здоровых людей.
Наши данные свидетельствуют о том, что в ходе ГЛПС, происходят существенные изменения в
сыворотке уровней цитокинов и хемокинов, которые участвуют в регуляции воспаления и
активации иммунной реакции.
Таблица 11 – Показатели сывороточного уровня цитокинов у больных ГЛПС
ИЛ-1β
Здоровый
контроль фебрильная
20±7
12.6±1.8
<0.02
25.3±5.0
13.5±4.0
ИЛ-2
12.2±2.1
ИЛ-8
218.0±58
ИЛ-10
26.4±4.1
ИЛ-12(p75)
352.2±28
CCL2
994.1±35
ИФН-γ
2.4±1.5
<0.002
376.5±120
70.8±4.2
<0.0006
5.8±2.5
<3.8E-7
9451.4±178
<0.005
ГЛПС (фазы болезни)
олигурическая
9.7±5.2
<0.03
1.4±0.8
<0.001
3.2±0.6
<3.9E-5
493.9±156
<0.05
132.9±10.2
<0.002
5.6±2.3
<9.8E-13
7533.1±215
<4.5E-5
полиурическая
1.9±0.5
<6.6E-8
16.2±4.1
3.5±4.2
<0.02
191.4±45
53.4±25
2.3±10
<2.1E-6
5554.5±124
<1.0E-6
конвалесцентная
50.9±29
6.8±3.1
<0.01
24.6±9.8
253.4±36
42.7±4.6
<0.03
32±4.7
<1.8E-10
5228.1±115
<4.1E-5
140
Две группы больных ГЛПС различающихся по сывороточному уровню ИФН-γ и ИЛ-12 (p70).
Дальнейший анализ сывороточных уровней цитокинов в сыворотках отобранных в фазу
конвалесценции выявил наличие двух групп больных различающихся по сывороточной
концентрации ИФН-γ (Таблица.12). Первая группа (группа 1) характеризуется повышением уровня
ИФН-γ по сравнению со здоровым контролем (l123.5 ± 25 против 20 ± 7 нг / мл соответственно,)
p≤0.0034 Манн-Уитни ), в то время как вторая группа (группа 2) характеризовалась уровнями
ИФН-γ, (12,3 ± 5,1) сопоставимыми с тем, что обнаруживалось в контроле. Повышенние
концентрации ИФН-γ обычно ассоциируется с активацией ЦТЛ ответа. Кроме того, активация ЦТЛ
сопровождается
увеличением
сывороточного
ИЛ-12.
Поэтому,
нами
было
решено
проанализировать наличие различий в сывороточных уровнях IL-12 между группами 1 и 2.
Изучение полученных результатов не выявило статистичеси значимых различий в уровнях ИЛ-12
между группами 1 и 2 (р <0,053). Далее, мы приняли решение исследовать наличие различий в
тяжести заболевания между этими двумя группами больных ГЛПС. Показатели длительность
лихорадочного периода и фазы олигурии, а также длительности госпитализации были
использованы для оценки тяжести заболевания. Группа 1 и Группа 2 значительно отличались по
всем отобранным параметрам. Длительность лихорадки и олигурической фазы болезни были
значительно короче в группе 1 по сравнению с группой 2 (р <0,0245 и р <0,0015 соответственно).
Кроме того, длительность госпитализации была значительно короче в группе 1 по сравнению с
группой 2 (р <0,01938). Далее, вторая группа больных характеризовалась более высокой частотой
случаев кровотечений (80% против 0% в Group1) и почечной недостаточносиь (80% против 44,4%
в Group1).
Наши данные позволяют предположить что случаи ГЛПС храктеризующиеся высокими
уровнями сывороточного ИФН-γ как правило, имеют более мягкой иечение заболевания и
меньшую частоту серьезных осложнений. Поскольку длительность фазы олигурии является
основным клиническим параметром, указывающим на повреждение почек, а также служит
индикатором тяжести заболевания, мы предположили, наличие корреляции между сывороточным
ИФН-γ и продолжительностью олигурической фазы. Действительно, регрессионный анализ
показал наличие значительной корреляции между ИФН-γ и продолжительностью фазы олигурии
(R-Sq = 78,1%), таким образом, поддержав правельность нашу гипотезу. Далее, нами было решено
проверить
наличие
корреляции
между
продолжительностью
олигурической
фазы
и
сывороточными уровнями ИЛ-12 (p70). Корреляция между олигурической фазы в ИЛ-12 (p70)
была слабой (R-пл = 38%). Однако, если кореляционный анализ проводился между
141
продолжительностью олигурической фазы и ИФН-γ или 12 (p70) уровень кореляции значительно
увеличивался (R-пл = 84,7%). Эти данные позволяют предположить, что ИФН-γ и ИЛ-12 (р70)
влияют на тяжесть заболевания однако механизмы их активности, вероятно, различны.
Таблица 12 – Различия в лабораторных показателях и значениях сороточных ИЛ12(р40) и ИНФ-γ у
2-х групп больных ГЛПС
Значения
Группа1
Группа2
ИФН-γ
123.5±25
<0.0034*
<0.02**
131.3±60.1
<0.1*
<0.053**
985.5±240
<0.4**
1874.7±256
<0.9**
14.3±1.1
<0.019**
3.9±1.2
<0.02**
5.4±1.8
<0.002**
13.5±24.2
<0.004*
<0.28**
187.0±20.5
<0.05*
<0.18**
205±67
<0.5*
<0.2**
474.1±26
<0.02*
<0.3**
0/9 (0%)
4/9 (44.4%)
12.3±5.1
<0.001*
P value
ИЛ-12(p75)
P значение
Титр антител (1)
P значение
Титр антител (2)
P значение
Госпитализация (дни)
P значение
Фебрильная фаза (дни)
P значение
Олигурическая фаза (дни)
P значение
Сывороточная мочевина
P значение
P значение
Сывороточный креатинин
P значение
P значение
Platelet counts (1st)
P value
P value
Platelet counts (2nd)
P value
P значение
Кровотечения
Почечная
недостаточность/эдема*
*P значения по сравнению с контролем
**P значения между Группой1 и Группой 2
29.8±40.2
Здоровый
крнтроль
20±7
352.2±28
768.2±135.2
1984.8±143
18.2±1.2
5.6±0.5
9.0±1.0
116.2±79
<0.7*
66.3±20.3
293±98
<0.001*
5.2±2.1
77.2±79
<0.005*
283±45
406.4±158
<0.2*
283±45
4/5 (80%)
4/5 (80%)
142
Различия в клинической картине группы 1 и группы 2. Хотя средние сывороточные уровни
креатинина и мочевины были выше в группе 2 по сравнению с группой 1, эти различия не были
статистически значимыми. Кроме того, снижение количества тромбоцитов было более
выраженным в группе 2 чем в группе 1 (77 ± против 205 ± соответственно). Однако, эти различия
не были статистически значимыми. Также, не было разницы между группой 1 и группой 2 в
количестве тромбоцитов в конвалесцентной фазе заболевания (496 против 406 соответственно).
Группе 2 характеризовалась более высокой частотой обнаружения эритроцитов в моче (4 из 6; 66%
против 0 из 9; 0%) что свидетельствует, о том что у больных в группе 2, развивались признаки
поражения почек.
В заключение, увеличение сывороточных уровней ИФН-γ, ИЛ-10, CCL2, и ИЛ-12 были
обнаружены у больных ГЛПС сравнению с контрольной группой. Различия в уровнях цитокинов
зависили от фазы и тяжести заболевания. Значительное увеличение ИФН-γ было обнаружено в
сыворотке больных с мягкой формой ГЛПС. Кроме того, высокая корреляция была обнаружена в
уровнях ИФН-γ и ИЛ-12 и легкой формой заболевания. Кроме того, сывороточные уровни CCL2
были значительно повышены у больных ГЛПС по сравнению с контролем. CCL2 может играть
роль
в
патогенезе
ГЛПС
как
хемоаттрактант
усиливающий
тканевую
инфильтрацию
мононуклеарных лейкоцитов.
4. 3.1. АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ НИЗКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА
РИБАВИРИНА ПРИ ХАНТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
В настоящее время не существует специфической терапии ГЛПС и ХЛС. Лечение, главным
образом, симптоматическое и во многом опирается на врачебный опыт. С разной степенью
успешности предпринимались попытки применения нескольких препаратов, включая ИФН-α,
глюкокортикоиды и циклофосфамид (J. Bai, et al., 1997). В отсутствие эффективной терапии,
лечение ГЛПС и ХЛС основывается на осторожной инфузионной терапии, мониторинге
гемодинамики и контроле водно-электролитного баланса.
4.3.1. Неэффективность рибавирина в ингибировании выделения ФНО-α, вызванного
активацией RANTES и интерлейкина-6 в инфицированных вирусом АND эндотелиальных
клетках пупочного канатика человека
Эффект рибавирина на репликацию вируса АND в клетках HUVEC. Для определения in vitro
эффекта рибавирина на репликацию вируса ANDV, клетки HUVEC инфицировали ANDV с MOI 1.
143
Ложно-инфицированные клетки HUVEC использовали в качестве контроля. Спустя час после
инфицирования рибавирин (50 мкг/мл) добавляли в культурaльную среду. Накопление S-сегмента
РНК ANDV измеряли с помощью ПЦР в реальном времени. Кроме того, титр ANDV определяли с
помощью метода непрямого бляшкообразования с использованием культуральной среды
собранной через 72 часа после инфицирования.
Полученные результаты показали, что в инфицированных клетках, не подвергшихся
воздействию препарата Рибавирин, уровень S-сегмента РНК вируса ANDV существенно
повышался к 12 часам после инфицирования, достигая максимума к 24-м часам после
инфицирования (Рисунок 42). Добавление препарата Рибавирин (50 мкг/мл) существенно снижало
уровни S-сегмента РНК ANDV к 12-и, 24-м и 72-м часам после инфицирования (Рисунок 42).
Снижение уровня вирусной РНК могло быть связано с цитотоксичным действием препарата.
Поэтому нами было принято решение изучить влияние препарата Рибавирин на жизнеспособность
клеток. С помощью TUNEL теста было продемонстрировано, что препарат Рибавирин (50 мкг/мл)
не способен индуцировать апоптоз в клетках HUVEC (данные не показаны).
Относительные
relative unitsед
1000000
100000
10000
1
3
12
24
72
hours
Время
(час) PI
Рисунок 42 – Эффект препарата Рибавирин на накопление S-сегмента РНК ANDV в клетках
HUVEC
Клетки HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1. Препарат Рибавирин (50 мкг/мл) добавляли в
культуру через час после инфицирования. Анализ ПЦР-РВ выполнялся с помощью MGB зондов на
устройстве ABI Prism 7000 Sequence Detection System.
144
Клетки инфицированные вирусом ANDV;
клетки инфицированные вирусом ANDV
и обработанные препаратом Рибавирин (50 mkg/ml)
Аналогично, апоптоз не выявлялся в клетках HUVEC, инфицированных ANDV и
обработанных препаратом Рибавирин (50мкг/мл) (данные не показаны). Поэтому нами был сделан
вывод о том, что ингибирование препаратом Рибавирин репликации ANDV в клетках HUVEC не
обусловлено его цитотоксической активностью.
Ингибирование препаратом Рибавирин репликации вируса ANDV было продемонстрировано с
помощью метода непрямого бляшкообразования в супернатанте собранном через 72 часа после
инфицирования клеток. Титр вируса ANDV в надосадочной жидкости культуры клеток HUVEC
составил 102±20 БОЕ/мл. Титр вируса ANDV в клетках HUVEC, обработанных препараом
Рибавирин составил 2,75±1,9 БОЕ/мл, что было существенно (p <0,001) ниже по сравнению с
клетками не обработанными препаратом.
4.3.2 Препарат Рибавирин подавляет транскрипцию гена CCL5 в клетках HUVEC,
инфицированных вирусом ANDV
Ранее нами и другими исследователями было продемонстрировано, что хантавирусная
инфекция активирует транскрипцию гена CCL5 в клетках HUVEC (J.B. Sundstrom, et al., 2001).
Поэтому нами было решено провести исследование влияния препарата Рибавирин на активацию
транскрипции гена CCL5 в HUVEC инфицированных ANDV с использованием метода ПЦР-РВ.
Уровни мРНК CCL5 существенно повышались в инфицированных вирусом ANDV клетках
через 12, 24 и 72 часа после инфицирования по сравнению с ложно-инфицированными клетками
(Рисунок 43). Обработка препаратом Рибавирин не оказывала влияния на уровни мРНК CCL5 в
ложно-инфицированных клетках в каждый выбранный момент времени (3, 12, 24 и 72 часа после
инфицирования) (Рисунок 43). Однако препарат Рибавирин существенно снижал уровни мРНК
CCL5 в инфицированных ANDV клетках через 12, 24 и 72 часа после инфицирования по
сравнению с инфицированными клетками, не обработанными препаратом (Рисунок 43).
Эти данные демонстрируют, что препарат Рибавирин подавляет активацию транскрипции гена
CCL5 в инфицированных ANDV клетках. Создаётся впечатление, что путём подавления
репликации вируса ANDV препарат Рибавирин препятствует активации гена CCL5.
145
A
1.00E+04
Относительные
relative units
ед
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
1.00E-01
1h
3h
12h
24h
48h
72h
48h
72h
hous PI
Время (час)
100000
10000
Отностительные
relative units
ед
БB
1000
100
10
1
0.1
1h
3h
12h
24h
hours PI
Время (час)
Рисунок 43 – Влияние препарата Рибавирин на уровни мРНК CCL5 в инфицированных ANDV
клетках HUVEC
Клетки HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1. Препарат Рибавирин (50 мкг/мл)
добавляли в культуру через час после инфицирования. Анализ ПЦР-РВ выполнялся с помощью
MGB зондов на устройстве ABI Prism 7000 Sequence Detection System. A.Внутриклеточные уровни
S сегмента вирусной РНК; Б. Внутриклеточные уровни мРНК CCL5.
Ложноинфицированные клетки HUVEC;
ложноинфицированные клетки HUVEC обработанные препаратом Рибавирин (50 mkg/ml);
клетки HUVEC инфицироанные вирусом ANDV;
клетки HUVEC инфицированные вирусом ANDV и обработанные препаратом Рибавирин (50
mkg/ml)
146
4.3.3 Эффект различных концентраций препарата Рибавирин на накопление S-сегмента
мРНК вируса ANDV и CCL5 в клетках HUVEC
Клетки HUVEC инфицировались вирусом ANDV с MOI 1. Препарат Рибавирин (1, 10 и 50
мкг/мл) добавлялся к культурам инфицированных и ложно-инфицированных клеток через час
после инфицирования.
Влияние препарата Рибавирин на накопление S-сегмента РНК вируса ANDV зависило от
концентрации препарата (Рисунок 44, А). В концентрациях 10 и 50 мкг/мл рибавирин значительно
подавлял уровни S-сегмента РНК вируса ANDV через 12, 24 и 72 часа после инфицирования
(Рисунок 44, А; серые и чёрные столбики, соответственно). Напротив, рибавирин в концентрации 1
мкг/мл влиял на уровень вирусной РНК только через 48 часов после инфицирования (Рисунок 44,
А; заштрихованный столбик).
Аналогично рибавирин оказывал зависимый от дозы эффект на транскрипционную активность
гена CCL5 в инфицированных клетках. Например, обработка препаратом Рибавирин (50 и 10
мкг/мл) уменьшала уровень мРНК CCL5 через 24 и 72 часа после инфицирования по сравнению с
необработанными инфицированными клетками (Рисунок 44, Б). Однако препарат Рибавирин в дозе
1 мкг/мл не оказывал эффекта на уровень мРНК CCL5 (Рисунок 44, Б).
Наши
данные
указывают,
что
ингибирующий
эффект
препарата
Рибавирин
на
транскрипционную активность гена CCL5 коррелирует с его противовирусной активностью.
Также, эффект препарата Рибавирин на транскрипционную активность
гена CCL5 был
дозозависимым. Только высокие дозы препарата ингибировали активацию гена CCL5, в то время
как низкие дозы не оказывали влияния.
147
Рисунок 44 – Зависимый от дозы эффект Рибавирина на накопление S-сегмента РНК вируса ANDV
и мРНК CCL5 в клетках HUVEC
Клетки HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1
Рибавирин (1, 10 и 50 мкг/мл) добавляли в культуру через час после инфицирования. Анализ
TaqMan выполнялся с помощью TaqMan MGB зондов на устройстве ABI Prism 7000 Sequence
Detection System. Стандартные графики для относительной количественной оценки S-сегмента
ANDV, CCL5 и 18S РНК строились путём последовательного разведения кДНК, взятой из
инфицированных и неинфицированных контрольных образцов, соответственно. Все реакции
TaqMan выполнялись дважды.
А – Зависимый от дозы эффект рибавирина на накопление S-сегмента РНК ANDV.
Б – Зависимый от дозы эффект рибавирина на накопление мРНК CCL5
148
Ложноинфицированные клетки HUVEC;
обработанные препаратом Рибавирин (50 mkg/ml);
ложноинфицированные клетки HUVEC
ложноинфицированные клетки HUVEC
oобработанные препаратом Рибавирин (10 mkg/ml);
ложноинфицированные клетки HUVEC обработанные препаратом Рибавирин (1 mkg/ml);
Клетки HUVEC инфицированные вирусом;
клетки HUVEC инфицированные вирусом
ANDV и обработанные препаратом Рибавирин (50 mkg/ml);
клетки HUVEC инфицированные вирксом ANDV и обработанные препаратом
Рибавирином (10 mkg/ml);
клетки HUVEC инфицированные вирусом ANDV и
обработанные препаратом Рибавирин (1 mkg/ml)
Препарат Рибавирин модулирует клеточный ответ, активируемый ФНO-α. ФНO-α является
хорошо известным медиаторoм воспалительной реакции, и активатором экспрессии молекул
адгезии in vivo и in vitro (J.S. Kang et al., 2003). Повышенные уровни ФНO-α обнаружены в
сывороткaх пациентов с хантавирусной инфекцией (M. Linderholm, et al., 1996). Наши данные и
результаты других исследователей показывают, что хантавирусная инфекция не активирует ФНOα в клетках HUVEC. В тоже время, нами была показана активация ФНO-α в инфицированных
хантавирусом лёгочных макрофагах in vitro. Поэтому нами было принято решение изучить эффект
препарата Рибавирин на транскрипционную активность гена CCL5 в HUVEC инфицированных
ANDV культивированных в присутствии ФНO-α . Через час после инфицирования клеток HUVEC
вирусом ANDV, ФНO-α (10 нг/мл) и рибавирин (50 мкг/мл) были добавлeны в культуральную
среду. Общая РНК собиралась через 24 и 72 часа после инфицирования. Для оценки накопления Sсегмента РНК вируса ANDV применяли метод ПЦР-РВ.
Характер накопления S-сегмента РНК вируса ANDV в клетках HUVEC был аналогичен
наблюдаемому ранее, когда уровни вирусной РНК достигали своего максимума через 24 часа
после инфицирования (Рисунок 45, А). Препарат Рибавирин снижал накопление S-сегмента РНК
вируса ANDV через 24 и 72 часа после инфицирования по сравнению с инфицированными ANDV
контрольными клетками (Рисунок 45, А). Аналогично накопление S-сегмента РНК вируса ANDV в
клетках HUVEC снижалось под действием препарата Рибавирин через 24 часа после
инфицирования (Рисунок 45, А). K 72 часам после инфицирования, уровни S-сегмента РНК вируса
ANDV снижались в инфицированных ANDV клетках до того же уровня, что и в инфицированных
клетках обработанных препаратом Рибавирин и ФНO-α (Рисунок 45, А). Данные ПЦР-РВ были
подтверждены результатами определения вирусного титра в культуральной среде. Было выявлено,
149
что препарат снижает вирусный титр в клетках инфицированных вирусом ANDV. Как и
ожидалось, ФНО-α снижает титры вируса, а комбинированное применение препарата Рибавирин и
ФНО-α еще более снижает вирусную репликацию и продукцию вирионов (Таблица 13)
Таблица 13 – Титр вируса ANDV в супернатанте клеток HUVEC, культивированных в присутствии
рибавирина и ФНО-α
Группа
ANDV
Титрr, БОЕ (72
3,0×103 ±
часа
после
2
инфицирования)
ANDV+рибавирин
ANDV+
ФНO-α
ANDV+рибавирин+
ФНO-α
2,5 ± 1,2
2,7×103 ±3
1,5 ± 0,5
Препарат Рибавирин (50 мкг/мл) не оказывал влияния на уровни мРНК CCL5 в ложноинфицированных клетках HUVEС через 24 часа, тогда как уровни мРНК CCL5 существенно
снижались через 72 часа в клетках обработанных препаратом (Рисунок 45, Б). Добавление ФНO-α
(10 нг/мл) в культуральную среду существенно увеличивалo уровни мРНК CCL5 в ложноинфицированных клетках HUVEC через 24 и 72 часа по сравнению с контрольными клетками
(Рисунок 45, Б). Аналогично ФНO-α в сочетании с рибавирином существенно увеличивал уровни
мРНК CCL5 в ложно-инфицированных клетках на 24 и 72 часа по сравнению с контрольными
клетками (Рисунок 45, Б).
150
Относительные
ед
Контроль
Рибавир
ФНОРибавирин +
Время (час)
Относительные
ед
Б
Время (час)
Относительные ед
В
Время (час)
Рисунок 45 – Влияние Рибавирина и ФНO-α на активацию CCL5 и ИЛ-6 в клетках HUVEC
инфицированных ANDV
Клетки HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1. Препарат Рибавирин (50 мкг/мл)
добавляли в культуру через час после инфицирования. ФНO-α добавлялся в культуру через час
после инфицирования вместе с препаратом Рибавирин. Анализ ПЦР-РВ выполнялся с помощью
151
MGB зондов на устройстве ABI Prism 7000 Sequence Detection System. Стандартные графики для
относительной количественной оценки S-сегмента ANDV,CCL5, ИЛ-6 и 18S РНК строили путём
последовательного разведения кДНК, взятой из инфицированных и неинфицированных
контрольных образцов, соответственно.
А - Накопление S-сегмента РНК вируса ANDV в клетках HUVEC, обработанных
препаратом Рибавирин и ФНO-α (10 нг/мл). Б - Влияние обработки рибавирином на накопление
мРНК CCL5 в активированных ФНO-α клетках HUVEC. В - Влияние обработки препаратом
Рибавирин на накопление мРНК ИЛ-6 в активированных ФНO-α клетках HUVEC. M - ложноинфицированные клетки; A - инфицированные ANDV клетки.
Ложноинфицированные клетки HUVEC;
Ложноинфицированные клетки HUVEC
обработанные препаратом Рибавирин
HUVEC клетки инфицироанные ANDV;
HUVEC клетки инфицироанные ANDV и
обработанные препаратом Рибавирин
Таким образом препарат Рибавирин не оказывал влияния на ФНO-α индуцированное накопление
мРНК CCL5 в клетках HUVEC.
Внутриклеточные уровни мРНК CCL5 в клетках HUVEC значительно увеличивались после
инфицирования вирусом AND по сравнению с контрольными клетками через 24 и 72 часа
(Рисунок 45, B). Как и ожидалось, препарат Рибавирин существенно снижал уровни мРНК CCL5 в
клетках HUVEC через 24 и 72 часа после инфицирования вирусом AND по сравнению с клетками,
не обработанными препаратомРибавирин (Рисунок 45, B). ФНO-α существенно увеличивал уровни
мРНК CCL5 в инфицированных ANDV клетках HUVEC на 24-м и 72-м часу после инфицирования
по сравнению с ложно-инфицированными клетками (Рисунок 45, B). Интересно, что ФНO-α не
оказывал влияния на индуцированное вирусом ANDV накопление мРНК CCL5 в клетках HUVEC
через 24 и 72 часа. Препарат Рибавирин в сочетании с ФНO-α существенно снижал уровни мРНК
CCL5
только
к
72-м часам
после
инфицирования
вирусом
ANDV
инфицированными клетками, обработанными только ФНO-α (Рисунок 45, Б).
по
сравнению
с
152
ФНO-α (10 нг/мл) увеличивал внутриклеточные уровни мРНК ИЛ-6 в ложно-инфицированных
клетках HUVEС через 24 и 72 часа (Рисунок 45, Б). Препарат Рибавирин снижал уровни мРНК ИЛ6 только к 72-м часам после инифицирования в ложно-инфицированных клетках HUVEC.
Препарат Рибавирин не оказывал влияния на уровень мРНК ИЛ-6 в клетках обработанных ФНO-α
через 24 и 72 часа после инфицирования вирусом AND (Рисунок 45, Б). Инфицирование ANDV
увеличивало уровни мРНК ИЛ-6 в клетках HUVEC через 24 часа (Рисунок 45, Б). Однако уровни
мРНК ИЛ-6 увеличивались в клетках HUVEC, обработанных ФНO-α (10 нг/мл) (Рисунок 45, Б).
Препарат Рибавирин не оказывал влияния на уровни мРНК ИЛ-6 в инфицированных ANDV
клетках HUVEC (Рисунок 45, Б). Аналогично не наблюдалось изменений в уровнях мРНК ИЛ-6 в
клетках инкубированных в присутствии препарата Рибавирин и ФНO-α (Рисунок 45, Б).
Наши данные указывают, что препарат Рибаварин неспособен подавлять стимулированную
ФНO-α активацию CCL5 и ИЛ-6 в клетках HUVEC, инфицированных ANDV.
4.3.4 Влияние ФНO-α и препарата Рибавирин на активацию NF-κB
Наши результаты показали, что ФНO-α увеличивает внутриклеточные уровни мРНК CCL5 и
ИЛ-6 в инфицированных ANDV клетках HUVEC. Известно что NF-κB регулирует активацию
генов CCL5 и ИЛ-6 (J. Pekalski et al., 2013). Поэтому нами было принято решение определить
активируется ли NF-κB в ответ на ФНO-α и/или инфицирование ANDV. Клетки HUVEC были
инфицированы вирусом ANDV с MOI 1. Через 72 часа после инфицированы, ядерная фракция
отбиралась и использовались для анализа EMSA.
153
ФНО-α
Рибавирин
контроль
Неспецифичное
связывание
Рисунок 46 – Влияние Рибавирина на ФНO-α индуцированную активацию NF-κB в клетках
HUVEC
Клетки HUVEC инфицировались ANDV с MOI 1. Препарат Рибавирин и ФНO-α добавлялись в
культуру клеток через час после инфицирования. Фракция белков ядра клеток собиралась через 72
часа после инфицирования и использовалась для определения связывания с олигонуклеотидами,
кодирующими последовательность ДНК для NF-κB. Анализ изменений электрофоретической
подвижности выполнялся с использованием 4 мкг ядерного экстракта в присутствии
32
P-меченых
NF-κB олигонуклеотидов. Избыток немеченого NF-κB олигонуклеотида добавлялся к реакции
154
(линия 2) для специфического конкурентного связывания. На рисунке представлен эксперимент
наиболее репрезентативный из 3 повторов.
В ложно-инфицированных клетках HUVEC, слабое связывание ядерных белков наблюдалось
при наличии олигонуклеотидов, кодирующих последовательность ДНК для NF-κB (Рисунок 46,
линия 1). Это связывание устранялось в присутствии избытка немеченого NF-κB олигонуклеотида,
показывая, что наблюдаемое увеличение связывания наблюдается является специфичным для NFκB (Рисунок 46, линия 2). Рибавирин не оказывал влияния на связывание ядерных белков с NF-κB
олигонуклеотидами (Рисунок 46, линия 3), тогда как ФНO-α существенно увеличивал связывание
ядерных белков с NF-κB олигонуклеотидами (Рисунок 46, линия 4). Связывание ядерных белков
немного снижалось в ложно-инфицированных клетках HUVEC, обработанных комбинацией ФНOα и рибавирина (Рисунок 46, линия 5).
Инфицирование ANDV не влияло на связывание ядерных белков с NF-κB олигонуклеотидом по
сравнению с ложно-инфицированными клетками (Рисунок 46, линия 6). Аналогично, связывание
ядерных белков с NF-κB олигонуклеотидом не изменялось в инфицированных ANDV клетках
HUVEC, обработанных перепаратом Рибавирин (50 мкг/мл) (Рисунок 46, линия 7). ФНO-α (10
нг/мл) увеличивал связывание ядерных белков с NF-κB олигонуклеотидами в инфицированных
ANDV клетках HUVEC (Рисунок 46, линия 8). Интересно, что ФНO-α индуцирует связывание
ядерных белков с NF-κB олигонуклеотидами в клетках HUVEC инфицированных ANDV в
большей степени по сравнению с ложно-инфицированными клетками HUVEC (Рисунок 46, линия
4 в сравнении с линией 8). Связывание ядерных белков с NF-κB олигонуклеотидами оставался
повышенным в инфицированных ANDV клетках HUVEC, обработанных ФНO-α и препаратом
Рибавирин (Рисунок 46, линия 9).
155
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ
Предполагается, что рекомбинация между тесно связанными хантавирусами возникает часто
при условии, что вирусы присутствуют у одного хозяина-грызуна. Однако естественные
рекомбинации между более отдалённо связанными хантавирусами крайне редки и могут возникать
только при условии, если: i) различные виды животных занимают одну и ту же экологическую
нишу и ii) одно и то же животное-хозяин восприимчиво к инфицированию двумя разными
штаммами вируса (W.W. Henderson, et al., 1995). Один из способов проанализировать возможность
возникновения генетических рекомбинаций между отдалённо связанными хантавирусами является
эксперимент in vitro с инфицированием клеток двумя разными хантавирусами. В настоящее время
эффективность получения рекомбинантов между отдалеными хантавирусами мало изучена.
Существуют единичные публикации по этому вопросу.
Например, в одном исследовании
продемонстрирована низкая эффективность рекомбинации (4 из 163-х рекомбинант) между
отдалённо связанными хантавирусами (BCCV и NMR11) (L.L. Rodriguez, et al., 1998). Напротив, в
другой публикации сообщалось о выявлении рекомбинант у 68,19% потомства вируса при
инфицировании клеток отдалённо связанными хантавирусами Хантаан и Сеул (W. Kang et al.,
2002). Наше исследование было посвящено анализу возникновения генетических рекомбинаций
между двумя отдалёнными хантавирусами SNV и ANDV.
Хотя SNV и ANDV оба представляют собой вирусы, резервуарами которых являются грызуны
подсемейства Sigmadontinae, они циркулируют у географически разделённых грызунов.
Естественный хозяин SNV — североамериканский грызун Peromyscus maniculatus (P. maniculatus),
тогда как ANDV циркулирует среди Oligoryzomys longicaudatus (O. longicaudatus) в Южной
Америке (A. Plyusnin, et al., 2001). В нашем исследовании, после инфицирования вирусами SNV и
ANDV клеточной культуры Vero E6, среди 337 дочерних бляшек было обнаружено тридцать
(8,9%) рекомбинантных вирусов. Процент рекомбинантных вирусов был выше, чем обнаруженный
в исследовании Rodriguez и др (L.L. Rodriguez, et al., 1998), когда они использовали отдалённо
связанные вирусы SNV и вирус канала Блэк Крик (BCCV). В исследовании Rodriguez et all только
один рекомбинантный вирус и четыре диплоидных вируса были обнаружены среди 163-х (3%)
дочерних вирусов SNV и BCCV, что ниже чем в нашем исследовании (8.9%). Относительно
156
высокий процент
рекомбинантных вирусов, обнаруженных в нашем исследовании, можно
объяснить более высоким MOI обоих вирусов, использованных для начального инфицирования
клеточной культуры. Например, в своём эксперименте авторы использовали MOI 3, тогда как в
исследовании Rodriguez и др. использовался MOI 1.
Как уже упоминалось, P. maniculatus является естественным хозяином SNV, тогда как BCCV
циркулирует среди Sigmodon hispidus (S. hispidus) (P.E. Rollin et al., 1995). Низкая эффективность
рекомбинации вирусов между SNV и BCCV объясняется существенными различиями между
вирусами на уровне нуклеотидной и аминокислотной последовательности. Анализ генетических
различий между SNV и BCCV выявил схожесть на 70,7% нуклеотидной последовательности Sсегмента, включая некодирующие регионы. В нашем исследовании
была обнаружена ещё
меньшaя схожесть (54,8%) между последовательностью всего S-сегмента ANDV и SNV.
Идентичность нуклеотидной последовательности между всем M-сегментом SNV и BCCV
составляет 73,2%, сходство аминокислотной последовательности составляет 79,7% для SNV и
BCCV и 77,6% для ANDV и SNV. Тем не менее, процент образовавшихся между SNV и ANDV
рекомбинаций был выше по сравнению с описываемым Rodriguez и др. для вирусов SNV и BCCV.
Различия в частоте возникновения рекомбинантных вирусов могут зависеть от нескольких
факторов: MOI инфицирования, конформационные свойства и способность вирусных белков
взаимодействовать с вирусной РНК.
Интересно, что предпочтительность рекомбинации с гомологичными сегментами L-M и L-S
описана для многих вирусов семейства Bunyaviridae (B.J. Beaty, et al., 1985) (V. Urquidi et al., 1992).
Аналогично, в наших исследованиях выявлено, что большая часть дочерних рекомбинантных
вирусов содержали гомологичные S- и L-сегменты, тогда как только небольшая часть вирусного
потомства содержали один из гетерологичных S- или L-сегментов (V. Urquidi, et al., 1992).
Напротив, частота гомологичных L- и S-сегментов у вирусного потомства существенно отличается
между тесно и отдалённо связанными хантавирусами. Например, гомологичные L и M или L и Sсегменты обнаруживаются в одинаковой пропорции, когда для инфицирования клеточной
культуры используют тесно связанные штаммы SNV (CC107 и NMR11) (D. Li, et al., 1995). Однако
одновременное инфицирование клеточной среды VeroE6 отдалённо связанными вирусами даёт в
результате один устойчивый тип рекомбинантного вируса, содержащего гомологичные S- и Lсегменты (L.L. Rodriguez, et al., 1998). В наших экспериментах отдалённыe хантавирусы обладали
склонностью к образованию рекомбинантных вирусов с гомологичными S- и L-сегментами.
157
Значение M-сегмента для репликации буньявирусов продемонстрировано ранее (B.J. Beaty, et
al., 1981). Например, только содержащие M-сегмент от вируса Ла Кросс рекомбинантные вирусы
эффективно передавались лабораторным мышам естественным переносчиком москитом, тогда как
передача рекомбинантного вируса, содержащего M-сегмент от SSHV, была неэффективной. Mсегмент буньявирусов кодирует два гликопротеина, функция которых заключается в связывании с
рецепторами и в регуляции процесса созревания вируса (B.J. Beaty, et al., 1981). Поскольку
рекомбинантные и родительские вирусы могут обнаруживаться в слюнных железах москитов,
было высказано предполoжение, что различия в частоте передачи вирусов могут быть обусловлены
различиями в эффективности созревания между рекомбинантным вирусом и SSHV.
В наших экспериментах рекомбинанты образовывались с S- и L-сегментами от SNV и с Mсегментом от ANDV. M-сегмент кодирует вирусные гликопротеины, отвечающие за связывание с
клеточными рецепторами на поверхности клеток, и, поэтому, этот сегмент может влиять на
эффективность связывания вируса с клеткой-мишенью. По этой причине мы предполагаем, что
инфекционность рекомбинантного вируса будет близка к инфекционности ANDV. Полученные
нами данные выявили, что титры рекомбинантного вируса отличаются от титров родительского
штамма SNV и очень похожи на титры ANDV. Похоже, что рекомбинация сохраняющая Mсегмент от ANDV способствует репликации вируса вследствие увеличения его инфекционности.
Эффекты замены M-сегмента на созревание вирусов и внеклеточный транспорт гликопротеинов
остаются неизученными. Рекомбинанты (например, описанные в данной монографии) могут
находить различное применение. Они могут способствовать установлению роли каждого сегмента
в определении диапазона хозяев и в изучении патогенеза каждого вирусного штамма. Например,
опубликована статья, в которой сообщалось, что, как минимум, два южноамериканских
хантавируса— ANDV и вирус Мапорал— вызывают ХЛС у сирийских хомяков, однако SNV не
способен вызвать заболевание у хомяков, хотя у инфицированных животных возникали антитела
против SNV. Поэтому мы считаем что рекомбинантные вирусы, подобные описанным в этой
работе, могут стать инструментом в изучении причин патогенности ANDV и аттеннуированности
SNV на модели ХЛС у сирийских хомячков. Поскольку ANDV вызывает ХЛС в эксперименте у
хомяков, а SNV в том же эксперименте не способен вызвать заболевание, это придаёт
рекомбинантным вирусам значимость в определении — имеет ли специфический сегмент (S, M
или L) значение в развитии ХЛС. Поэтому, существует возможность, что новые хантавирусы
окажутся
способными
вирулентностью.
генерировать
in
vivo
рекомбинантные
вирусы
с
повышенной
158
Нами использованы ДНК аффиметрикс чипы для выявления изменений в транскрипционной
активности клеточных генов в эндотелиальных клетках, вызванных инфицированием патогенным
(SNV) и непатогенным (PHV) вирусом. Полученные нами результаты указывают на то, что
патогенные
и
непатогенные
хантавирусы
вызывают
различный
клеточный
ответ
в
инфицированных эндотелиальных клетках. Различия в активации экспрессии клеточных генов
обнаруживались уже через 4 часа после инфицирования. С прогрессированием инфекции различия
в клеточном ответе на инфицирование между патогенными и непатогенными хантавирусами
становились более выраженными. В целом SNV индуцировал в 5 раз больше генов, чем
непатогенный PHV (экспрессия 175 генов усиливалась в инфицированных SNV клетках, по
сравнению с 36-ю генами при инфицировании PHV).
Одной из самых интригующих находок было увеличение экспрессии ИИГ в инфицированных
хантавирусом эндотелиальных клетках. Патогенные и непатогенные хантавирусы были
сопоставимы в отношении индукции ИИГ. Активация ИИГ в клетках млекопитающих обычно
возникает после воздействия ИФН-α и/или ИФН-β (C.E. Samuel, 1991). Поэтому
мы
предположили, что активация ИИГ в инфицированных хантавирусами клетках возникает из-за
повышенного синтеза ИФН-β. Однако мы не обнаружили изменений в транскирционной
активности
гена ИФН-β в клетках, инфицированных патогенными или непатогенными
хантавирусами. Кроме тогоб, мы не наблюдали различий в концентрации ИФН-β в образцах
культур, взятых через 4 и 12 часов после инфицирования клетoк SNV and PHV хантавирусами и
ложно-инфицированными контрольными клетками (данные не показаны). Предполагается, что на
ранней стадии активация ИИГ в инфицированных хантавирусами клетках сопровождается
взаимодействием вирусных белков и/или РНК с клеточной системой транскрипции генов без
начального высвобождения ИФН-β (C.E. Samuel, 1991). Недавно было показано, что активация
некоторых IRF не требует стимуляции ИФН-β и может индуцироваться только вирусной
инфекцией (S.J. Baigent et al., 2002).
Опосредованная интерфероном активация транскрипции клеточных генов происходит с
помощью IRF. Семейство IRF включает девять факторов, которые вместе с белком STAT
осуществляют передачу сигналов в ядро клетки, где происходит активация противовирусных
генов (C.E. Samuel, 1991). Активация многих клеточных генов происходит посредством IRF-3 и
IRF-1транслокации в ядро клетки (S.J. Baigent, et al., 2002; W. Du et al., 1993; M. Yoneyama et al.,
1998). Например, в промоторе генов олигосинтетаз существует место связывания с IRF-1 который
159
служит активатором транскрипции. Кроме того, было показано что экспрессия белка p78
контролируется IRF-3 и IRF-1 (S.J. Baigent, et al., 2002; W. Du, et al., 1993). Активация
транскрипции гена RANTES контролируется IRF-3 (R. Lin et al., 1999).
Наши данные выявили, что экспрессия трёх IRF [IFR7, IRF-1 и IRF-9 (ISGF-3)] активировалась
в инфицированных хантавирусами клетках. Интересно, что экспрессия всех факторов была выше в
клетках, инфицированных SNV, по сравнению с клетками, инфицированными PHV. Среди этих
трёх генов экспрессия IRF-9 была значительно увеличена после инфицирования (4 часа после
инфицирования), из чего следует, что внутриклеточная передача сигнала, приводящая к усилению
экспрессии ИИГ, может индуцироваться через связывание вируса или вирусных белкoв с
клеточным рецептором, при этом репликация вируса не является необходимым условием для
активации ИИГ. Экспрессия некоторых IRF не изменялась в инфицированных хантавирусами
клетках. Это ожидаемо, поскольку не все белки IRF синтезируются de novo в инфицированных
клетках. Некоторые IRF, например IRF-3, постоянно присутствуют в клетке, перемещаясь между
цитоплазмой и ядром. Однако в случае инфекции, IRF3 фосфорилируется и накапливается в ядре
(I. Marie et al., 1998; M. Sato et al., 1998). Фосфорилирование IRF приводит к его димеризации что
является необходимым условием для транслокации этих белков в ядро клетки где они
стимулируют транскрипцию генов ИИГ (K.P. Kumar et al., 2000; R. Lin, et al., 1999).
Вирусная инфекция может значительно влиять на жизнеспособность клетки. Например, многие
вирусы (вирус простого герпеса 1, ВИЧ, аденовирус, цитомегаловирус) вызывают цитопатические
изменения в инфицированных клетках. Кроме того, вирусы, вызывающие геморрагические
синдромы у человека, также вызывают гибель клетки в системах in vitro (P. Avirutnan et al., 1998;
A. Baskerville et al., 1985). Исследования in vitro продемонстрировали, что инфицирование
хантавирусом не вызывает цитопатического эффекта в клетках (S.F. Khaiboullina et al., 2000; J.B.
Sundstrom, et al., 2001). Аналогично, не удалось обнаружить повреждения эндотелиальных клеток
обусловленного репликацией хантавирусов при исследовании фатальных случаев ХЛС (S.R. Zaki,
et al., 1995). Обнаруженное нами увеличение транскрипции генов тромбоцитарного фактора роста
эндотелия и белка Bcl2 в сочетании со множеством других противоапоптозных белков и факторов
роста может объяснить отсутствие апоптоза в инфицированных клетках. Кроме того,
активированный хантавирусной инфекцией VEGF, необходим для поддержания жизнеспособности
эндотелиальных клеток (D.W. Leung et al., 1989). VEGF вырабатывается эндотелиальными
клетками и связывается с рецептором на поверхности эндотелия, таким образом обеспечивая
160
жизнеспособность клеток и стимулируя клеточный рост. Помимо VEGF, нами была обнаружена
повышенная экспрессия гена Bcl2. Bcl2 подавляет программируемую гибель клетки, стимулируя
рост и сохранение жизнеспособности (D.W. Leung, et al., 1989).
Используя микропанели, нами выявлена повышенная транскрипция генного кластера CC
хемокинов. Этот кластер включает ген CCL5, основной функцией которого является привлечение
мононуклеарных иммунных эффекторов к месту воспаления (T. Kawai et al., 1999; T.J. Schall et al.,
1990). Общепринятым является мнение, что цитокины играют важную роль в патогенезе
вызванной хантавирусами повышенной проницаемости сосудов (S.R. Zaki, et al., 1995). Наши
данные выявили усиление транскрипции кластера генов СС хемокинов, включающей CCL5.
Усиление транскрипции гена CCL5 так же продемонстрировано в эндотелиальных клетках,
инфицированных хантавирусами штаммов Хантаан, Нью-Йорк и PHV.
CCL5 не оказывает прямого влияния на проницаемость эндотелия. Потому вклад этого
хемокина
в
патогенез
хантавирусной
инфекции,
вызывающей
повышение
сосудистой
проницаемости, может быть опосредованным через усиление миграции иммунных эффекторов
через эндотелиальный монослой. CCL5 вызывает селективную миграцию моноцитов, лимфоцитов,
M и лимфобластов (T. Kawai, et al., 1999; T.J. Schall, et al., 1990; S. Sozzani et al., 1991) . Таким
образом, мы полагаeм, что хантавирусная инфекция может избирательно индуцировать миграцию
мононуклеарных
иммунных
подтверждается результатами
эффекторов в инфицированные ткани. Это
исследования тканей
от
смертельных
предположение
случаев ХЛС,
где
интерстициальная пневмония сочеталась с преимущественно с мононуклеарно-клеточной
инфильтрацией (M. Mori, et al., 1999; S.R. Zaki, et al., 1995). My уверены, что вызванная высокой
концентрацией CCL5, миграция лейкоцитов через сосудистый эндотелий способна нарушать
целостность эндотелиалия, увеличивая его проницаемость.
Белок р78 человека является одним из наиболее подробно описанных интерферониндуцируемых белков (ИИБ) с антивирусной активностью. Данные исследований in vitro и
экспериментов in vivo показывают, что экспрессия только белка р78 достаточна для блокирования
репликации вируса в отсутствии других ИИБ (H. Arnheiter et al., 1996; O. Haller et al., 1998). В
норме только небольшие количества белка р78 присутствуют в клетках (J.F. Goetschy et al., 1989).
Однако стимуляция клеток интерфероном (ИФН) I типа приводит к накоплению белка р78 в
цитоплазме, где он становится доступным для взаимодействия с вирусными белками (P. Staeheli et
al., 1993). Белок р78 является GTPазой и принадлежит к суперсемейству динамин-подобных GTPаз
161
(O. Haller, et al., 1998; P. Staeheli, et al., 1993). Собственно GTPазная активность белка р78
необходима для его противовирусной активности.
Белок p78 имеет широкий спектр противовирусной активности. Например, было показано что
клетки, экспрессирующие белок р78, обладают высокой степенью противовирусной защиты в
отношении нескольких членов семейства Orthomyxoviridae, включая вирусы гриппа A и C и вирус
Тогото (H. Arnheiter, et al., 1996; O. Haller, et al., 1998). Кроме того, репликация вирусов семейств
Paramyxoviridae, Rhabdoviridae и Togaviridae подавляется белком р78 in vivo и in vitro. Репликация
вирусов Ла Кросс, лихорадки Рифт Вэлли, флеботомной лихорадки, Пуумала, Тула и Хантаан,
принадлежащих к семейству Bunyaviridae, подавляется в клетках Vero E6, конституционально
экспрессирующих белок р78 (M. Frese et al., 1996; M. Kanerva, et al., 1998). Было показано, что
белок р78 препятствует внутриклнточному накоплению хантавирусных РНК и белков in vitro (M.
Frese, et al., 1996).
Механизмы противовирусного действия р78 не до конца изучены. Считается, что связывание
белка р78 с вирусными белками обязательно для его противовирусной активности. Например,
физическое взаимодействие р78 с вирусными компонентами было продемонстрировано in vitro в
экспериментах с использованием метода ко-преципитации р78 и капсидного белка вируса Тогото
(O. Haller, et al., 1998). Похоже, что р78 способен связываться с нуклеокапсидным белком вирусов.
Например, белок р78 связывается с нуклеокапсидным (N) белком вируса Тогого (Koch et al., 1998)
и Ла Кросс, формируя кополимеры р78/N (G. Kochs et al., 2002). Создаётся впечатление, что путём
связывания с N-белком, р78 оказывает влияние на внутриклеточный транспорт N-белка и
предотвращает его накопление в местах сборки вируса (Kochs et al., 2002, Koch et al., 1998).
Белок
р78
является
ключевым
компонентом
антивирусной
системы,
индуцируемой
интерфероном I типа (/) (P. Staeheli, et al., 1993). Геном человека кодирует два белка Mx (р78 и
MxB), гены которых расположены на хромосоме 21 (J.F. Goetschy, et al., 1989). Противовирусная
активность, однако, была показана только для белка р78 (M. Frese, et al., 1996); Haller and Kochs,
2002, PNAS 99:3153–3158; Horisberger, 1992, Somat. Cell Mol Genet 14:123–131; Pavlovic et al., 1990,
J Virol 64:3370–3375). В норме, когда клетки не инфицированы, белок р78 локализуется в
цитоплазме и имеет характерный гранулярный вид (Kochs et al., 2002; Aebi et al., 2002).
Предполагается, что гранулы представляют собой комплексы белка р78, которые могут быть
связаны со структурами цитоскелета или везикулярными структурами (Horisberger, 1992; Accola et
al., 2002).
162
Хорошо известным является тот факт что разные клеточные линии отличаются по своей
способности поддерживать репликацию хантавирусов. Например, изначально клетки A549 часто
использовали для вделения и поддержания хантавирусов in vitro (French et al.,1981). Однако в
последующем было продемонстрировано что клетки Vero E6 могут поддерживать репликацию
хантавирусов на существенно более высоком уровне по сравнению с клетками A549 (Temonen et
al., 1993, J Gen Virol 74:515–518; Johnson, 2001, CTMI 256:1–15). Последующие исследования
показали что клетки VeroE6 лишены генов интерферона I типа ввиду хромосомной делеции в
геноме (Diaz et al., 1988, PNAS 85:5259–5263). По это причине данные клетки не способны
синтезировать ИФН- (ИФН типа I) в ответ на вирусную инфекцию и, как следствие этого, они не
способны экспрессировать индуцируемые интерфероном гены (Diaz et al., 1988, PNAS 85:5259–
5263; Wichmann et al., 2002, J Virol 76:8890–8899). В результате этого клетки VeroE6
поддерживают репликацию многих вирусов, включая хантавирусы (Temonen et al., 1993, J Gen
Virol 74:515–518). Однако эффективность этих клеток в поддержании репликации хантавирусов
существенно снижалась при трансфекции геном р78 человека (Frese et al., 1996, J Virol 70:915–923;
Kanerva et al., 1996, Virology 224:55–64). Учитывая это, нами было принято решение установить,
может ли активация экспрессии белка р78 быть причиной пониженной эффективности
хантавирусной репликации в клетках A549 и HUVEC по сравнению с Vero E6. Хотя клетки
HUVEC и A549 отвечают увеличением трансрипции гена р78 после инфицирования хантавирусом,
клетки HUVEC демонстрируют более выраженную активацию гена р78, по сравнению с клетками
A549, при инфицировании ANDV. Таким образом, нами был сделан вывод о том, что клеточная
способность к поддержанию репликации хантавирусов обратно пропорциональна активации
экспрессии р78. Следовательно, возможно предположить, что клеточные линии, имеющие низкую
способность
к
поддержанию
репликации
хантавирусов,
характеризуются
высокой
транскрипционной активностью гена р78. Однако несмотря на то, что транскрипционная
активность р78 была повышена в клетках HUVEC и А549, она сопровождалось повышением
экспрессии кодируемого белка только в клетках HUVEC. Экспрессия белка р78 была повышена в
клетках А549 только через 72 часа после инфицирования хантавирусами, в то время как
экспрессии этого белка в HUVEC клетках была повышена уже через 24 часа.
Повышенная экспрессия белка р78 в инфицированных клетках зависит от репликации
хантавируса.
В
наших
исследованиях
только
клетки
инфицированные
репликационно
компетентным вирусом ANDV отвечали повышением экспрессией белка р78. В то же время
экспрессия белка р78 не обнаруживалась в клетках инокулированных репликационно дефектным
163
вирусом.
Напротив,
активация
гена
р78
в
эндотелиальных
клетках,
обработанных
инактивированным хантавирусом, была временной и никогда не достигала уровня клеток,
инфицированных
вирусом,
сохранившим
инфекционность.
Эти
результаты
позволяют
предположить, что простого связывания вируса с клеточной поверхностью недостаточно для
долгосрочной индукции белка р78.
Активация транскрипции гена p78 регулируется IRF-3 (Baigent et al., 2002, J Virol 76: 8979–
8988.). В норме, IRF-3 обнаруживается в цитоплазме клеток в своей неактивной форме (Reich,
2002, J Interferon Cytokine Res 22:103–109). Вирусная инфекция приводит к транслокации IRF-3 в
ядро клетки, где он способен активировать множество интерферон-индуцируемых генов, включая
р78 (Reich, 2002, J Interferon Cytokine Res 22:103–109; Melchjorsen и Paludan, 2003, J Gen Virol
84:2491–2495; Hiscott et al., 1999, J Interferon Cytokine Res 19:1–13). В наших экспериментaх было
показано, что инфицирование вирусом ANDV вызывает транслокацию IRF-3 в ядро клетки уже
через 24 часа после инфицирования. Поэтому нами был сделан вывод, что активация транскрипции
гена р78 в инфицированных вирусом ANDV клетках требует репликации вируса и нуклеарной
транслокации IRF-3.
Исследования механизмов супрессии вирусной репликации посредством р78 выявили, что
белки р78 могут связываться с вирусным N-белком (Koch et al., 1998, Methods 15:255–263; Kochs et
al., 2002, PNAS 99:3153–3158). Предполагается, что это происходит путём формирования
комплексов р78/N-белок. Белок р78 оказывает влияние на транспортировку вирусных белков
внутри клетки а также блокирует накопление N-белка, необходимого для сборки вируса (Johnson,
2001, CTMI 256:1–15). Mы обнаружили, что белок р78 находится в цитоплазме клетки, а также,
частично, он обнаруживается в ЭПС. Хантавирусный N-белок кже локализовался в цитоплазме,
точнее в перинуклеарной области клетки и, что самое важное, вместе с белком р78.
Предполагается, что хантавирусный N-белок, присутствующий в перинуклеарной области
инфицированных клеток и является мембрано-связанным белком (Ravkov et al., 2001, J Virol
75:1808–1815). Наши данные позволяют предположить, что белок р78 накапливается в месте
расположения хантавирусного N-белка в цитоплазме или вблизи ЭПС, где происходит синтез Nбелока. Кроме того, мы продемонстрировали, что белок р78 не колокализуется с хантавирусными
гликопротеинами. Эти результаты указывают на то, что хантавирусные гликопротеины с меньшей
вероятностью являются мишенью для р78. Кроме того, белок р78 не обнаруживается в аппарате
Гольджи, позволяя предположить, что аппарат Гольджи не является местом колокализации р78 и
N-белка.
164
Выявленная нами колокализации р78 с хантавирусным N-белком важна для понимания
ингибиторного эффекта белка р78 на репликацию хантавирусов. Сборка хантавирусов происходит
в аппарате Гольджи (Ravkov et al., 2001, J Virol 75:1808–1815; Johnson and Schmaljohn, 2001, CTMI
256:15–32). По этой причине единственный путь предотвращения или существенного снижения
репликации хантавирусов включает подавление транспорта хантавирусного N-белка в аппарат
Гольджи. Показано, что белок р78 связывается с N-белком вирусов Ла Кросс и Тогото (Koch et al.,
1998, Methods 15:255–263; Kochs et al., 2002, PNAS 99:3153–3158) и накапливается вместе с ним в
виде комплекса р78/N-белок в перинуклеарной области (Kochs et al., 2002, PNAS 99:3153–3158).
Это перераспределение вирусного
N-белка под действием р78 оказывает влияние на
эффективность репликации вируса. Также предполагается, что уменьшение количества свободного
вирусного N-белка в клетках может блокировать амплификацию вирусного генома (Kochs et al.,
2002, PNAS 99:3153–3158). Эти данные указывают на то, что наблюдаемая колокализация белка
р78 с N-белком ANDV может отражать схожий механизм ингибирования вирусной репликации,
используемый р78 для подавления размножения хантавируса в клетках человека.
В заключение следует сказать, что нами было продемонстрировано индуцирование
хантавирусами экспрессии белка р78 в клетках человека. Эффективность экспрессии белка р78
зависила от типа клеток. Клетки, в которых вирусная инфекция активирует экспрессию р78, в
меньшей степени способны поддерживать репликацию хантавирусов. Для экспрессия белка р78
необходима репликации вируса и транслокации IRF-3 в ядро клетки. Наши данные позволяют
предположить, что N-белок ANDV является мишенью для белка р78 связывание с которым
подавляет репликацию хантавирусов.
Используя аффиметрические ДНК чипы, нами было показано, что хантавирусная инфекция
активирует различные клеточные процессы в клетках HUVEC in vitro. Однако механизмы,
посредством которых хантавирусы индуцируют активацию клеточных генов, остаются в
большинстве своем неизвестными.
Широко известна роль белка PML в регуляции клеточного роста, дифференцировке
гематопоэтических клеток, карциногенезе и апоптозе (Mu et al., 1997, Carcinogenesis 18,2063–
2069.;Wang et al., 1998, Science279, 1547–1551). В норме PML локализуется в ядерных тельцах
(NB) расположенных в клеточном ядре (Borden, 2002, Mol.CellBiol.22,5259–5269). Предполагается,
что PML, содержащийся в NB, способен участвовать в процессах пост-трансляционной
модификации ядерных белков (Wang et al., 1998, Science279, 1547–1551; ;2005, Nature 437,147–
153). Кроме того, PML в NB может участвовать в регуляции процессов транскрипции, репликации
165
или репарации ДНК. Показано, например, что ранняя транскрипция и геномная репликация
нескольких вирусов, включая вирусы герпеса, аденовирусы и вирус обезьян 40, возникают
поблизости от PML находящегося в NB (Maul, 1998, Bioessays20,660–667.;Everett, 2001,
Oncogene20,7266–7273). Кроме того, вновь синтезированная РНК обнаруживается по периферии
PML в NB, указывая на то, что этот участок является местом транскрипции определённых генов
(Boisvert et al., 2000, J.CellBiol. 148,283–292).
Наши данные указывают на активацию PML в HUVEC клетках инфицированных хантавирусом
in vitro. Количество и интенсивность окраски PML в NB увеличивались в клетках HUVEC,
инфицированных ANDV и HTNV, уже через 3 часа после инфицирования и оставались
повышенными до 72-х часов после инфицирования. Результаты, полученные нами, указывают на
новый механизм активации клеточных ответов в инфицированных хантавирусами клетках,
дополнительно к уже известным путям связянным с активацией NF-kB и IRF-3 (Sundstrom et al.,
2001, J.Virol.75,6070–6085.). Кроме того, наши данные показывают, что при хантавирусной
инфекции активируются NB-белки расположенные в ядре клетки. Это происходит даже несмотря
на то, что транскрипция и репликация вирусов происходит исключительно в цитоплазме. Усиление
экспрессии PML в инфицированных хантавирусом клетках требует репликации хантавируса и, что
особенно важно, синтеза хантавирусных белков.
Локализация PML совпадает с локализацией SP100 в NB в инфицированных хантавирусом
клетках HUVEC. Белок SP100 является фактором регуляции транскрипции и компонентом NB
(Lamond & Earnshaw, 1998, Science 280, 547–553; Seeler et al., 1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,7316–
7321). SP100 взаимодействует с белком гетерохроматина 1 (HP1), который действует как репрессор
транскрипции (Seeler et al., 1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,7316–7321). Кроме того, SP100 может
действовать как репрессор транскрипции, связываясь с клеточной ДНК (Seeler et al., 1998,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,7316–7321;Lehming et al., 1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA95, 7322–7326).
Так например было показано, что SP100 снижает транскрипционную активность ETS1 (Yordy et
al., 2004, Oncogene23,6654–6665;Yordy et al., 2005, Oncogene24,916–931). Таким образом, можно
предположить, что колокализации SP100 с PML в NB, позволяет белку SP100 участвовать в
регуляции транскрипционной активности в ядере клеток HUVEC, инфицированных хантавирусом.
Предполагается, что SUMO-1 модификация PML не требует локализации PML в NB (Maul et
al., 2000, J.Struct.Biol.129,278–287). Однако модификация SUMO-1 обязательна для привлечения
белка DAXX в NB (Ishov et al., 1999, J.CellBiol. 147,221–234). Создаётся впечатление, что уровень
SUMO-1 модификации PML может определять количество белка DAXX привлекаемого в NB (Maul
166
et al., 2000, J.Struct.Biol.129,278–287). Нами было показано, что усиление экспрессии PML в
инфицированных хантавирусом клетках не увеличивает его модификацию белком SUMO-1. Кроме
того, наши данные демонстрируют, что усиление экспрессии PML не сопровождается его
колокализацией с DAXX. В наших экспериментах PML только частично колокализовался с DAXX
и только небольшие количества PML обнаруживались вблизи DAXX. Более того, наши результаты
позволяют с большой долей уверенности предположить что DAXX не колокализуется с PML в NB,
поскольку PML не был SUMO-1 модифицированным в инфицированных хантавирусом клетках
HUVEC. Известно, что SUMO-1 модификация необходима для колокализации PML и DAXX.
Известно, что локализация DAXX в NB коррелирует с апоптозной активностью DAXX. Например,
взаимодействие PML с DAXX требуется для активации Fas-индуцированного апоптоза (Torii et al.,
1999, EMBOJ.18,6037–6049.). Более того, DAXX-мутанты, не обладающие способностью
локализоваться в NB, не способствуют Fas-индуцированному апоптозу клеток (Torii et al., 1999,
EMBOJ.18,6037–6049.). Кроме того, было показано что при отсутствии PML, способность DAXX
активировать гибель клетки заметно уменьшается (Zhong et al., 2000, J.Exp.Med.191,631–640). Эти
данные показывают, что DAXX и PML, в случае колокализации в NB, способны вызывать апоптоз.
Нами и другими исследователями было показано, что хантавирусная инфекция не вызывает
апоптоз в клетках HUVEC (Khaiboullina et al., 2000, J.Virol.74,11966–11971;Khaiboullina et al., 2004,
ViralImmunol.17,234–251;Sundstrom et al., 2001, J.Virol.75,6070–6085.;Pensiero et al., 1992,
J.Virol.66,5929–5936). Наши результаты позволяют предположить, что хантавирусы не вызывают
апоптоз в инфицированных клетках HUVEC, поскольку усиление экспрессии PML не
сопровождается SUMO-1 модификацией, таким образом, предотвращая локализацию DAXX в NB.
PML принадлежит семейству интерферон-индуцированных генов, поскольку количество и
интенсивность PML в NB увеличивается в ответ на стимуляцию интерфероном (Lavau et al., 1995,
Oncogene 11,871–876.;Grotzinger et al., 1996, Eur.J.Biochem.238,554–560;Nason-Burchenal et al.,
1996, Blood 88, 3926–3936.). Чрезмерная экспрессия PML индуцирует устойчивость к инфекциям,
вызываемым вирусами везикулярного стоматита и гриппа А (Chelbi-Alix et al., 1998,
J.Virol.72,1043–1051.;Iki et al., 2005, Virology343,106–115.). Тот факт, что многие вирусы нарушают
целостность PML в NB, указывает на важность PML в активации противовирусной защиту клеток
(Chee & Roizman, 2004, J.Virol.78,4185–4196;Nicewonger et al., 2004, J.Virol.78,9412–9422;Evans &
Hearing, 2003, J.Virol.77,5295–5304.;Blondel et al., 2002, Oncogene21,7957–7970). Возможно что
противовирусная активность PML связана с активацией противовирусной защиты (Djavani et al.,
2001, J.Virol.75,6204–6208;Bonilla et al., 2002, J. Virol.76,3810–3818). Наши данные по активации
167
PML в инфицированных хантавирусами клетках HUVEC представляет собой один из механизмов
который потенциально может использоваться для активации интерферон-индуцируемых генов в
клетках HUVEC инфицированных антавирусами.
Наши данные показали, что хантавирусная инфекция активирует транскрипцию гена ISG-20 в
клетках HUVEC. ISG-20- интерферон-индуцируемый белок, тесно связанный с PML в NBs
(Gongora et al., 1997, J.Biol.Chem.272,19457–19463.). Нами показано, что экспрессия ISG-20
усиливается при инфицировании хантавирусами клеток HUVEC. Кроме того, мы обнаружили, что
ISG-20 локализуется в ядре и тесно связана с PML. ISG-20 является РНКазой, и подобно РНКазe L
регулируется интерфероном (Nguyen et al., 2001, Biochemistry40,7174–7179;Espert et al., 2003,
J.Biol.Chem. 278,16151–16158.). Мы также показали, что хантавирусная инфекция активирует р78,
ещё один интерферон-индуцируемый белок, в клетках HUVEC (Khaiboullina et al., 2005, J.Med.
Virol.75,267–275.). Поэтому можно сделать вывод, что инфицирование клеток HUVEC
хантавирусами приводит к активации PML, формированию NB и активации ISG-20. В результате,
наблюдается значительная активация ИИГ в инфицированных клетках вызывающее снижение
вирусной репликации. Эти данные позволяют предположить, что короткая фаза виремии у
хантавирусных больных связана с активацией ИИГ в эндотелиальных клетках.
Нами был проанализирован цитокиновый профиль сыворотки двадцати девяти больных ГЛПС.
Диагноз ГЛПС был поставлен на основании клинической картины, эпидемиологических данных и
серологического
подтверждения.
Лабораторные
тесты
выявили
повышением
уровня
сывороточного креатинина мочевины у больных ГЛПС. Кроме того, было показано снижение
количества тромбоцитов на ранней стадии заболевания с последующем возвращением этого
показателя к нормальному уровню на стадии выздоровления. В большинстве, исследованные
случаи ГЛПС характеризовались легким течением.
Принято считать, что ГЛПС патогенез обусловлен "цитокиновым штормом". Это утверждение
основано на значительном количестве публикаций указывающих на высокие сывороточные уровни
провоспалительных цитокинов у больных ГЛПС (F.A. Bozza et al., 2007). Например, высокие
уровни ФНО-α, ИЛ-6, и CXCL8 были описаны в сыворотке больных ГЛПС на ранних и поздних
стадиях заболевания. Кроме того, повышенные сывороточные уровни ИЛ-10 и растворимого ИЛ2R были описаны в сыворотке больных ГЛПС (I. Kyriakidis, et al., 2013). В настоящем
исследовании мы обнаружили повышенные уровни CXCL8 и ИЛ-10 в сыворотке ГЛПС по
сравнению со здоровыми донорами. Сывороточные уровни ИЛ-2 были снижены на ранней стадии
168
заболевания, однако, к концу заболевания ИЛ-2 повышался в сыворотке больных превосходя
значения у здоровых доноров. Таким образом, наши данные согласуются с уже опубликованными
исследованиями, свидетельствующими об активации воспалительных цитокинов в сыворотке
больных ГЛПС.
Хорошо известна активация ЦТЛ ответа у больных ГЛПС. Многочисленные исследования
показали наличие хантавирус-специфических Т-клеток в крови ГЛПС в фазе выздоровления.
Кроме того, CD8 + Т-клеточная инфильтрация была описана в почках у больных ГЛПС (I.
Kyriakidis, et al., 2013). Эти данные свидетельствуют о том, что ЦТЛ могут играть роль в
патогенезе ГЛПС. Активация ЦТЛ строго контролируется, причем ИЛ-12 и ИФН-γ играют в этом
ключевую роль. Для примера, ИЛ-12 стимулирует пролиферацию лимфобластов активированных
митогеном. Кроме того, ИЛ-12 активирует натуральные киллеры (NK) клетки что способствует
активации ЦТЛ. Было показано, что ИЛ-12 стимулирует выработку ФНО-α и ИФН-γ клетками NK
и ЦТЛ. Поэтому нами был проведен детальный анализ активации ИФН-γ и ИЛ-12 при ГЛПС, а
также, проведен корреляционный анализ между сывороточными уровнями этих цитокинов и
тяжестью заболевания. В результате нами было выделено 2 группы больных ГЛПС которые
различались по сывороточному уровню ИФН-γ. В итоге, мы обнаружили, что больные с высоким
уровнем в ИФН-γ сыворотке имели значительно более короткий период госпитализации и
продолжительность лихорадочной и олигурической фаз заболевания.
Клинически, фаза олигурии является наиболее значимой в течении ГЛПС, поскольку именно в
эта фаза отражает снижение функции почек. Скорость фильтрации почек снижается заметно во
время олигурической фазы и клинически представлена снижением диуреза. Протеинурия и
повышение уровня сывороточного креатинина и мочевины также характерны для олигурической
фазы (I. Kyriakidis, et al., 2013). Кроме того, снижение диуреза является одним из критериев,
используемых для определения степени тяжести заболевания, где тяжелая форма заболевания
характеризуется меньшим объемом мочи. Кроме того, фаза олигурии считается наиболее важной
из-за высокой вероятности развития угрожающих жизни осложнений. Наши данные выявили
корреляцию между высоким уровнем в сыворотке ИФН-γ и более короткой продолжительностью
олигурической фазы заболевания. Интересно, что нами была обнаружена слабая корреляция между
продолжительностью олигурической фазы и сывороточного уровня ИЛ-12. Однако, корреляция
была значительно выше между этими показателями когда добавляли значения ИФН-γ в анализ.
Эти данные свидетельствуют о том, что оба, ИФН-γ и ИЛ-12 играют роль в патогенезе ГЛПС. В
169
частности, возможно, что ИФН-γ и ИЛ-12 снижают вероятность повреждения почек и облегчают
процесс фильтрации. В совокупности, наши данные указывают на то, что случаи ГЛПС
характеризующиеся высоким уровнем сывороточных ИЛ-12 и ИФН-γ имеют тенденцию к
развитию более мягкой формы болезни. С другой стороны, случаи с низким уровнем ИЛ-12 и
ИФН-γ
в
сыворотке
могут
приводить
к
развитию
более
тяжелой
формы
болезни,
характеризующейся длительной госпитализацией и продолжительностью фазы олигурии.
Уровень корреляция между продолжительностью олигурической фазы и сывороточных
уровней ИЛ-12 и ИФН-γ был выше по сравнению с анализом проведенным с использованием
показателей только одного цитокина. Эти данные свидетельствуют о том, что ИФН-γ и ИЛ-12
происходят из различных источников. ИФН -γ производится различными иммунными клетками,
включая NK-клетки, Th1 лимфоциты и ЦТЛ. ИЛ-12 секретируется макрофагами после
праймирования антигенном. Следовательно, можно предположить, что у больных ГЛПС
происходит активация разнообразного пула лейкоцитов. Несмотря на то, ИФН-γ и ИЛ-12 имеют
различное происхождение, они оказывают синергическое действие на активацию Th1 типа
иммунного ответа. Для примера, ИЛ-12 усиливает продукцию Т-клетками ИФН-γ. В свою очередь,
ИФН-γ способствует дальнейшей стимуляции ИЛ-12 фагоцитами. Наши данные выявили высокие
уровни ИФН-γ в сыворотке у больных с легкой формой ГЛПС. Таким образом, нам
представляется, что активация Тh1 типа иммунного ответа связано с менее тяжелым
прогрессированием заболевания. Активация Тh1 типа иммунных реакций при хантавирусной
инфекции хорошо документированы. Циркулирующие хантавирус-специфические Т-клетки
обнаружены в крови конвалесцентов ХЛС (F. Villinger et al., 1999). Тем не менее, роль этих клеток
в патогенезе ГЛПС оставалась по большому счету неизвестной. Наши данные показывают, что
активация Тh1 типа иммунного ответа может играть защитную роль, предотвращая повреждение
тканей. Дополнительные исследования, в том числе с большим количеством больных, помогут в
большей мере разъяснить роль Тh1 лимфоцитов в патогенезе хантавирусной.
ИЛ-10 является мощным ингибитором ИФН-γ в лимфоцитах, что является регуляторным
механизмом способствующим развитию Th2 типа иммунного ответа (F. Villinger, et al., 1999). Мы
обнаружили, что уровни ИЛ-10 были значительно выше в сыворотке ГЛПС в течение
лихорадочной, олигурической и конвалесцентной фазах, что вероятно, свидетельствует
о
поляризации Т-хелперов в Th2 фенотип. Тем не менее, значительная активация ИФН-γ была
обнаружена в периоды олигурии и полиурии. Активация ИФН-γ указывает на дифференциацию
170
лимфоцитов в сторону Th1типа. Поэтому, становится очевидным, что Th1 и Th2 типы иммунного
ответа активируется в течении ГЛПС. Таким образом, можно заключить что ГЛПС не отличается
преференцией в активации того или иного иммунного ответа. Интересно, что анализ
сывороточных уровней ИЛ-10 не выявил различий между группами 1 и 2, в то время как уровни
ИФН-γ были значительно выше в группе 1 случая по сравнению с группой 2. Эти данные
показывают, что тип Th2 иммунный ответ в равной степени активации в обеих группах случаев.
Однако, группа 1 характеризуется большей активацией Th1 типа иммунного ответа по сравнению с
группой 2. Следовательно, мы полагаем, что Th1 и Th2 иммунный ответ необходимы для
выздоровления, но активация Th1 иммунного ответа является центральной и может служить
маркером для определении тяжести заболевания.
Наши данные продемонстрировали значительно повышенный уровень хемокина CCL2 в
сыворотке ГЛПС по сравнению с контрольной группой. Хотя уровни CCL2 были увеличены в
обеих группах, хемокин оставался несколько ниже в группе 1, по сравнению с группой 2. CCL2
является хемоаттрактантом способствующим миграции мононуклеарных лейкоцитов, таких как
моноциты, Т-клетки памяти и дендритных клеток, к месту инфекции. Исследования биопсии
почек, собранных в летальных случаях ГЛПС, выявили значительную инфильтрацию тканей
лимфоцитами, моноцитами и макрофагами. Таким образом, можно предположить, что CCL2
играет роль в инфильтрации лимфоцитами почечной ткани больных ГЛПС. Кроме того, CCL2
играет значительную роль в развитии типа Th2 иммунного ответа. Например, было показано, что
CCL2 селективно ингибирует производство ИЛ-12 дендритными клетками и макрофагами.
Сывороточные уровни CCL2 отличались незначительно между группой 1 и группы 2, где случаи с
более мягкой форме заболевания, имели более низкие уровни CCL2, в то время как случая с более
тяжелой формой ГЛПС имели более высокие уровни этого хемокина. CCL2 является одним из
многих хемокинов, ответственных за миграцию лейкоцитов к месту инфекции. Таким образом,
незначительные различия в уровне CCL2 между группами 1 и 2 свидетельствуют скорее о
важности этого цитокина как хемоатрактанта.
Рибавирин
(1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид)-синтетический
аналог
нуклеотидов (D.G. Streeter et al., 1973), обладающий широким спектром противовирусной
активности (J.F. Hruska et al., 1980; P.B. Jahrling et al., 1984; J.S. Oxford, 1975). Были предложены
различные механизмы для объяснения механизмов противовирусного действия препарата
Рибавирина (S. Crotty et al., 2000; J.S. Oxford, 1975). Ингибирование препаратом Рибавирином
171
вирусной репликации in vitro объясняется «катастрофической ошибкой» механизма транскрипции
вируса (S.N. Cohen et al., 1973; I.N. Gavrilovskaia, et al., 1987). Несмотря на свою высокую
эффективность in vitro, терапевтическая эффективность препарата Рибавирина при хантавирусной
инфекции остаётся спорной. Например, показано, что препарат Рибавирин эффективен только для
ранней терапии геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), в то время как
показана неэффективность препарата при лечении ХЛС.
Несмотря на высокую эффективность препарата Рибавирин против многих РНК-вирусов in
vitro, его клинически эффективность подтверждена только при лечении хронического гепатита C
(вирус HCV) и инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ) (M. Temonen, et
al., 1996). Очевидно, что прямая противовирусная активность препарата Рибавирин оказывает
небольшой вклад в его клиническую эффективность. Таким образом предполагается, что механизм
терапевтической эффективности препарата Рибавирин может включать иммуномодулирующие
свойства. В ряде исследований сообщается о цитокиновой активации в мононуклеарных клетках
периферической крови, эпителиальных клетках лёгких и других клетках человека, обработанных
препаратом Рибавирин in vitro (R. Dunst, et al., 1998). Современные данные указывают на то, что
препарат Рибавирин способствует активации иммунного ответа ассоциированного с Тh1хелперами, обеспечивающими удаление инфицированных вирусом клеток.
Клинические исследования указывают на раннюю цитокиновую активацию при ГЛПС и ХЛС.
Высокие уровни в сыворотке крови ФНО-α, ИЛ-6 и ИЛ-1 обнаруживаются в острую фазу ГЛПС
(Viral Immunol 1995, 8:75-79). Поскольку хантавирусы не оказывают цитопатического действия,
предполагается, что патогенез ГЛПС, главным образом, обусловлен активацией цитокинового
каскада (J Infec Dis 1999, 179:295-302; Clin Immunol Immunopathol 1996, 78:47-55; Curr Top Microb
Immunol 2001, 256:153-169). Поэтому можно предположить, что ингибирование индуцированных
хантавирусами цитокинов может предотвращать чрезмерную воспалительную реакцию, которая
считается
основной
причиной
сердечно-легочного
шока
при
ХЛС.
Несмотря
на
продемонстрированную эффективность препарата Рибавирин у пациентов с ГЛПС, эффект
препарата на активацию цитокинов при хантавирусной инфекции остаётся, мало изученым. Нами
было высказано предположение, что низкая эффективность терапии препаратом Рибавирин при
ХЛС может быть обусловлена его неспособностью подавить цитокиновую активацию, вызванную
хантавирусной инфекцией.
172
Эндотелиальные клетки являются основной мишенью хантавирусной инфекции in vivo (B.
Hjelle, et al., 1996). Поэтому нами была использована in vitro модель с использованием
эндотелиальных клеток человека для изучения влияния препарата Рибавирин на активацию
цитокинов, вызванную хантавирусной инфекцией. Мы показали, что препарат подавляет
репликацию вируса АNDV в эндотелиальных клетках in vitro. Противовирусный эффект препарата
Рибавирин коррелирует с ингибированием активации CCL5, вызванной репликацией вируса
АNDV в эндотелиальных клетках. Кроме того, мы показали, что препарат Рибавирин не способен
подавить опосредованную ФНO-α активацию CCL5 и ИЛ-6 в эндотелиальных клетках
инфицированных вирусом АNDV. Мы полагаем, что ФНO-α опосредованная активация NF-κB
приводит к усилению экспрессии ИЛ-6 и CCL5 в эндотелиальных клетках, инфицированных
вирусом АNDV. Хотя препарат Рибавирин подавляет репликацию вируса АNDV, он не оказывает
влияния на активацию NF-κB вызванную ФНO-α, которая поддерживает транскрипционную
активацию ИЛ-6 и CCL5.
В ряде исследований сообщается, что препарат Рибавирин демонстрирует различное влияние
на синтез цитокинов в зависимости от типa клеток. Поэтому нами было принято решение
установить влияет ли препарат на активацию CCL5 в инфицированных ANDV клетках. Наши
результаты показали, что препарат Рибавирин дозо-зависимо подавляет транскрипционную
активность гена CCL5 в инфицированных ANDV клетках; этот эффект коррелирует с подавлением
репликации ANDV.
Известно, что CCL5 является хемоаттрактантом для мононуклеарных иммунных эффекторных
клеток вызывая их миграцию в область инфицирования. Поэтому, вызываемая вирусом ANDV
активация
транскрипции
гена
CCL5
позволяет
объяснить
патогенез
интерстициальной
мононуклеарной пневмонии, диагностируемой в случаях ХЛС (B. Hjelle, et al., 1996). Наши данные
по
ингибированию
инфицированных
препаратом
ANDV
Рибавирин
эндотелиальных
транскрипционной
клетках
активности
свидетельствует
о
CCL5
в
потенциальной
терапевтической эффективности препарата при ХЛС. Однако клинические исследования
демонстрируют, что препарат не оказывает значимого влияния на клиническую картину или
летальность
при
ХЛС.
Предполагается,
что
вирусная
инфекция
или
активация
прововоспалительных цитокинов играют одинаковую роль в патогенезе хантавирусной инфекции.
По этой причине мы полагаем, что препарат Рибавирин, хотя и является мощным
противовирусным препаратом, обладает слабым влиянием на вызываемую вирусом активацию
прововоспалительных цитокинов.
173
В литературе описана повышенная концентрация ФНO-α и ИЛ-6 в сыворотке крови больных с
хантавирусной инфекцией (I. Kyriakidis, et al., 2013). Также, мы ранее продемонстрировали
активацию ФНO-α в альвеолярных макрофагах человека, инфицированных вирусом SNV. Кроме
того, увеличение количества ФНO-α -положительных клеток описано при исследовании тканей
лёгких
умерших больных ХЛС. Эти данные показывают, что ФНO-α играет важную роль в
патогенезе хантавирусной инфекции. ФНO-α является мощным активатором ряда цитокинов в
эндотелиальных клетках, включая ИЛ-6. Поэтому нами было принято решение провести
дополнительное исследование эффектов ФНO-α на активацию цитокинов в клетках HUVEC,
инфицированных ANDV. Полученные нами результаты
выявили, что ФНO-α усиливает
экспрессию ИЛ-6 в инфицированных ANDV клетках HUVEC. ФНO-α и ИЛ-6 обладают общностью
физиологических эффектов, которые часто носят синергичный характер. Например, оба цитокина
усиливают экспрессию молекул адгезии, способствуют миграции лейкоцитов и активируют
острофазные белки в печени (S.J. Baigent, et al., 2002). Поэтому создаётся впечатление, что ФНO-α
может способствовать развитию воспалительного ответа в инфицированных вирусом ANDV
клетках, через усиление эксрессии ИЛ-6 и активацию CCL5. В целом, нами было показано, что
препарат
Рибавирин
неспособен
предотвратить
активацию
CCL5
и
ИЛ-6
в
клетках
инфицированных вирусом ANDV и культивированных в присутствии ФНO-α. Таким образом,
наши данные показывают, что препарат Рибавирин обладает ограниченным эффектом на
вызванную ФНO-α активацию цитокинов в инфицированных ANDV клетках.
Экспрессия генов CCL5 и ИЛ-6 регулируется через активацию фактора транскрипции NF-κB.
Известно, что ФНO-α активирует транскрипционную активность NF-κB (Immunobiology. 1995
Jul;193(2-4):193-203). Однако остается неизвестным эффект хантавирусной инфекции на
активность NF-κB. Наши данные указывают, что вирус ANDV не увеличивает связывание ядерных
белков с NF-κB через 72 часа после инфицирования. Однако ФНO-α увеличивает связывание NFκB в ложно-инфицированных клетках и клетках инфицированных ANDV через 72 часа. Поэтому
возможно предположить, что вызванная ФНO-α активация CCL5 и ИЛ-6 в инфицированных
ANDV клетках регулируется через механизмы связанные с активацией NF-κB.
Наши данные указывают, что препарат Рибавирин существенно снижает репликацию вируса
ANDV в клетках HUVEC. Кроме того, противовирусный эффект препарата коррелировал с
ингибированием транскрипции гена CCL5 в клетках инфицированных ANDV. В целом принято
считать, что провоспалительные цитокины, такие как ФНO -α и ИЛ-6, играют существенную роль
в патогенезе хантавирусной инфекции (S.J. Baigent, et al., 2002). Поэтому мы полагаем, что хотя
174
препарат Рибавирин и снижает вирусную нагрузку и подавляет репликацию вирусов при ХЛС,
препарат не способен подавить активацию цитокинов, вызывающую воспаление в тканях. Как
результат, терапевтическая эффективность препарат Рибавирин может быть ограниченной при
ХЛС, что и наблюдается в клинических испытаниях.
Однако мы полагаем что применение препарат Рибавирин на ранних стадиях заболевания
может быть терапевтически эффективным ввиду поскольку подавление хантавирусной репликации
может препятствовать активации прововоспалительных цитокинов, таких как ФНO-α. Недавно
было продемонстрировано, что препарат Рибавирин в сочетании с антителами против
прововоспалительных цитокинов существенно снижает летальность и частоту осложнений у
инфицированных хантавирусом животных (W.E. Severson et al., 2003). Такой подход сочетает
подавление репликации вирусов и продолжающегося воспалительного ответа, поскольку оба
процесса являются причиной осложнений и летальности при ХЛС.
175
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВГЛ
остаются
серьезной
проблемой
здравоохрпения
в
связи
с
их
быстрым
распространением и отсутствием методов специфического лечения. Хантавирусы представляют
группу инфекционных агентов, вызывающих 2 клинические формы геморрагических лихорадок:
ГЛПС и ХЛС. Оба заболевания могут иметь летальный исход. Также, в настоящее время
отсутствуют специфические методы лечения, а терапия в основном симптоматическая. Основной
причиной отсутствия методов лечения ГЛПС и ХЛС является низкий уровень наших знаний
патогенеза заболевания. Это во многом связано с отсутствием адекватных моделей на животных.
В работе был использован подход in vitro для изучения механизмов патогенеза
хантавиусной инфекции у человека. Были использованы первичные клеточные линии для
максимального приближения полученных данных к тем, что наблюдаются у больных. Поскольку
основной мишенью хантавирусов являются эндотелиальные клетки, были использованы
первичные культуры эндотелиальных клеток человека. Кроме того, альвеолярные макрофаги
человека были использованы для выявления роли иммунных клеток в патогенезе хантавирусной
инфекции.
Полученные результаты подтвердили литературные данные, указывающие на то, что
хантавирусы не вызывают цитопатического эффекта в клетках. Также было подтверждено
преположение о том, что механизмы патогенеза кроются в реакции организма на инфекцию. В
связи с этим, был проведен анализ клеточного ответа на хантавирусную инфекцию. Была впервые
обнаружена активация различных генов, регулирующих многие физиологические процессы внутри
клетки. Нами был проведен детальный анализ активации генов, принадлежащих к группам
интерферон-индуцируемых генов (ИИГ), нуклеарных трансткрипторных факторов и цитокинов в
клетках, инфицированных хантавирусами.
Показано, что хантавирусная репликация чувствительна к ингибирующему действию
белков, кодируюмых ИИГ. Например, было показано, что итерферон-зависимый белок р78
способен ингибировать репликацию хантавирусов. Кроме того, была обнаружена взаимосвязь
между патогенностью хантавирусов и их способностью активировать ИИГ. Так, полученные
176
данные показали, что непатогенные хантавирусы характеризуются большей способностью
активировать ИИГ по сравнению с патогенными хантавирусами. Далее, наши данные указывают
на механизмы актиации ИИГ через нуклеарную транслокацию IRF3 белка. Таким образом, можно
высказать предположение, что лекарственные препараты, способные активировать ИИГ, будут
эффективны при лечении хантавирусной инфекции.
Исследование механизмов транскрипционной активации выявило повышение активности
нуклеарных транскрипционных факторов. Было показано, что хантавирусная инфекция вызывает
транслокацию белка PML в ядро клетки и его ко-локализацию с белком S100. Однако перенос
белка PML в ядро не сопровождался его колокализацией с белком DAXX, что может объяснить
отсутствие цитопатического эффекта в клетках, ифицированных хантавирусом. Следует отметить,
что полученные данные впервые представили объяснение отсутствию гибели клеток при
инфицировании хантавирусом.
Проведенные исследования подтвердили роль цитокинов в патогенезе ГЛПС. Так, была
показана активаци ИЛ-12 и ИФН-γ в сыворотке крови больных ГЛПС и была показана зависимость
между уровнем активации этих цитокинов и тяжестью заболевания. Выявлено, что больные с
высокими сывороточными уровнями ИЛ-12 и ИФН-γ характеризуются более легким течением
заболевания. Поскольку ИЛ-12 и ИФН-γ являются цитокинами, активирующими ЦТЛ, можно
предположить, что активация этой популяции лейкоцитов оказывает протективное действие на
течение заболевания. Вероятный механизм такого эффекта может заключаться в ранней
элиминации инфицированных клеток и, таким образом, прерывания патологического процесса,
вызванного репликацией хантавируса.
В результате анализа механизмов действия препарата Рибавирин было показано, что он
обладает выраженной противовирусной активностью. Однако мехаизмы низкой эффективности
препарата при лечении хантавирусных инфекций оставались неизвестными. Нами были проведены
исследования по способности препарата Рибавирин подавлять активацию цитокинов, вызванную
реликацией хантавирусов. Выяснилось, что препарат подавляет активацию цитокинов если
используется сразу после инфицирования. Однако в присутствии воспалительного цитокина ФНОα препарат Рибавирин не был способен снижать цитокиновый ответ в клетках, даже несмотря на
то, что он подавлял вирусную репликацию. Таким образом, полученные данные подтвердили роль
цитокинов в патогенезе хантавирусной инфекции и важность контролирования цитокинового
ответа при лечении заболевания.
177
ВЫВОДЫ
1. Инфекция вирусами SNV и PHV приводит к различным изменениям транскрипционной
активности в эндотелиальных клетках человека. Инфицирование клеток патогенным хантавирусом
SNV приводила к изменению экспрессии 20 интерферон-индуцированных генов, 17 факторов
транскрипции и 35 генов, связанных с клеточным ростом и апоптозом. Инфицирование клеток
непатогенным хантавирусом PHV приводила к изменению экспрессии 17 интерферониндуцированных генов, 4 факторов транскрипции и 3 генов, связанных с клеточным ростом и
апоптозом.
При инфицировании хантавирусами наблюдалась активация транскрипции кластера
генов, кодирующий хемокины.
2. В клетках, инфицированных патогенными вирусами ANDV или HTNV, происходит
нуклеарная транслокация ядерного транскрипционного фактора PML, сопровождающаяся колокализацией PML и белка S100 в ядрах клеток. Белок DAXX располагается вне комплекса PMLS100, что объясняет отсутствие цитопатического эффекта вирусов на инфицированные клетки.
3. Инфекция патогенным SNV и непатогенным PHV вирусами активирует интерферониндуцированные гены (ИИГ) в эндотелиальных клетках человека. Активация ИИГ обусловлена
транслокацией IRF3 в клеточное ядро.
4. Репликация патогенного хантавируса ANDV обратно пропорциональна активации р78 —
одного из представителей семейства ИИГ. Механизм антивирусной активности белка р78
опосредован связыванием с нуклеокапсидным белком хантавируса.
5. Хантавирусная инфекция характеризуется повышенным уровнем CXCL8, ИЛ-10, CCL2,
ИЛ-12 и ИФНγ в сыворотке крови больных ГЛПС. Кроме того, корреляционный анализ выявил,
что активация ИЛ-12 и ИФНγ была наиболее выражена у больных с легкой формой заболевания,
что указывает на роль цитотоксических лимфоцитов в патогенезе хантавирусной инфекции у
человека. Повышенное содержание хемокина ССL2 в сыворотке крови больных ГЛПС может
объяснить увеличение миграции мононуклеарных лейкоцитов в инфицированные хантавирусом
ткани у больных.
6. Препарат Рибавирин подавляет вирусную репликацию в эндотелиальных клетках
человека. Ингибирование вирусной репликации сопровождалось снижением активации хемокина
178
CCL5 в инфицированных клетках. Однако, препарат Рибавирин не влияет на активацию цитокинов
в клетках, инфицированных хантавирусом в присутствии ФНО-α, что может объяснять низкую
эффективность препарата Рибавирин при лечении больных ГЛПС.
7. Продемонстрирована принципиальная возможность получения хантавирусных
реассортантов между патогенными штаммами ANDV и SNV, циркулирующими в различных видах
грызунов. Наиболее стабильными являются реассортантные хантавирусы, имеющие S и L
сегменты вируса SNV и М сегмент вируса ANDV.
179
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
AND – Хантавирус Андес
DAXX – (от англ. Death-associated protein) белок
DMEM - (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) среда Игла, модифицированная под Дульбекко
FBS – коровьей фетальной сывороткой
GFP - (от англ. Green Fluorescent Protein) зелёный флюоресцирующий белок
HTNV (от англ. Hantaan) - вирус Хантаан
HUVEC (от англ. human umbilical vein endothelial cells) – эндотелиальные клетки пупочной
вены человека
IRF – (от англ. Interferon regulatory factor) - регулирующий интерферон фактор
ISG-20 (от анг. Interferon-stimulated gene) – интерферон стимулирующий ген
MMA – монометил-аргинин
MPIF (от англ. Myeloid progenitor inhibitory factor ) – миелоидный ингибирующий фактор
MxA (от англ. Myxovirus resistance protein) – интерферон зависимый белок
NIH (от англ.National Institutes of Health) – Н ационального Института Здоровья
ORF - (от англ. Open Reading Frame) - открытая рамка считывания
pH (лат. pondus Hydrogenii)- водородный показатель
PHV (от англ. prospect Hill virus) – вирус Проспект Хилл
PML (от англ. promyelocytic leukemia gene) - ген промиелоцитарного лейкоза
PUUV – хантавирус Пуумала
180
SNV (от англ. Sin Nombre virus) – вирус Син Номбре
ВГЛ - вирусные геморрагические лихорадки
ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИИГ - индуцируемые интерфероном гены
ИЛ- 2 – интерлейкин-2
ИЛ-10 - интерлейкин-10
ИЛ-12 – интерлейкин-12
ИЛ-1β – интерлейкин 1 бетта
ИЛ-5 – интерлейкин-5
и-РНК – информационная РНК
ИФА – иммуноферментный анализ
ИФН-β – интерферон - бетта
ИФН-γ – интерферон - гамма
КГ – комплекс Гольджи
кДа – килодальтон
кДНК – конформационная ДНК
МИ - множественность инфицирования
мкг – микрограмм
мкл – микролитр
мРНК – матричная РНК
нМ – нанометр
181
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени
РНК – рибонуклеиновая кислота
ФБС – фосфатно-солевой буфер
ФНО-α – фактор некроза опухоли – альфа
ХЛС –– хантавирусный легочной синдром
ЦТЛ –- цитотоксические T- лимфоциты
ЭПС –- эндоплазматическая сеть
182
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Алекина.Н.С. Сравнительная эколого-эпизоотологическая характеристика лесных
полевок (Скйшопотув) Среднего Предуралья / Н.С. Алекина, А.Д. Бернштейн, Л.Ф. Копылова
// Зоологический журнал. – 1987. – Vol.66. – P.1397-1406.
2.
Abe Y. Vascular hyperpermeability induced by tumor necrosis factor and its augmentation by
IL-1 and IFN-gamma is inhibited by selective depletion of neutrophils with a monoclonal antibody /
Y. Abe, S. Sekiya, T. Yamasita, F. Sendo // J Immunol. – 1990. – Vol.145, №9. – P.2902-2907.
3.
Aberle S.W. Nephropathia epidemica and Puumala virus in Austria / S.W. Aberle, P. Lehner,
M. Ecker, J.H. Aberle, K. Arneitz, G. Khanakah, A. Radda, I. Radda, T. Popow-Kraupp, C. Kunz,
F.X. Heinz // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. – 1999. – Vol.18, №7. – P.467-472.
4.
Acosta E.G. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is
dependent on clathrin-mediated endocytosis / E.G. Acosta, V. Castilla, E.B. Damonte // J Gen Virol.
– 2008. – Vol.89, №Pt 2. – P.474-484.
5.
Alexeyev O.A. Elevated levels of total and Puumala virus-specific immunoglobulin E in the
Scandinavian type of hemorrhagic fever with renal syndrome / O.A. Alexeyev, C. Ahlm, J.
Billheden, B. Settergren, G. Wadell, P. Juto // Clin Diagn Lab Immunol. – 1994. – Vol.1, №3. –
P.269-272.
6.
Alexeyev O.A. Two cases of hyperimmunoglobulinemia E in patients with hemorrhagic fever
with renal syndrome / O.A. Alexeyev // Scand J Infect Dis. – 1991. – Vol.23, №3. – P.391.
7.
Aliamovskaia G.A. Detection of direct markers of cytomegalovirus. Research of the spectrum
and avidity of antiviral antibodies in infants and preschool children / G.A. Aliamovskaia, E.S.
Keshishchian, S.M. Adueva, A.A. Medzhidova, N.E. Fedorova, B. Pustowoit, M.V. Malakhova, E.N.
Il'ina, V.M. Govorun, A.A. Kushch // Vopr Virusol. – 2005. – Vol.50, №1. – P.14-19.
8.
Amarasinghe A. Dengue virus infection in Africa / A. Amarasinghe, J.N. Kuritsk, G.W.
Letson, H.S. Margolis // Emerg Infect Dis. – 2011. – Vol.17, №8. – P.1349-1354.
9.
Andersson I. Role of actin filaments in targeting of Crimean Congo hemorrhagic fever virus
nucleocapsid protein to perinuclear regions of mammalian cells / I. Andersson, M. Simon, A.
183
Lundkvist, M. Nilsson, A. Holmstrom, F. Elgh, A. Mirazimi // J Med Virol. – 2004. – Vol.72, №1. –
P.83-93.
10.
Ando K. Mechanisms of class I restricted immunopathology. A transgenic mouse model of
fulminant hepatitis / K. Ando, T. Moriyama, L.G. Guidotti, S. Wirth, R.D. Schreiber, H.J. Schlicht,
S.N. Huang, F.V. Chisari // J Exp Med. – 1993. – Vol.178, №5. – P.1541-1554.
11.
Antic D. Maturation of Hantaan virus glycoproteins G1 and G2 / D. Antic, K.E. Wright, C.Y.
Kang // Virology. – 1992. – Vol.189, №1. – P.324-328.
12.
Araki K. Hantavirus-specific CD8(+)-T-cell responses in newborn mice persistently infected
with Hantaan virus / K. Araki, K. Yoshimatsu, B.H. Lee, H. Kariwa, I. Takashima, J. Arikawa // J
Virol. – 2003. – Vol.77, №15. – P.8408-8417.
13.
Arend W.P. Studies on antigen-antibody complexes. II. Quantification of tissue uptake of
soluble complexes in normal and complement-depleted rabbits / W.P. Arend, M. Mannik // J
Immunol. – 1971. – Vol.107, №1. – P.63-75.
14.
Arikawa J. Cell fusion by haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) viruses and its
application for titration of virus infectivity and neutralizing antibody / J. Arikawa, I. Takashima, N.
Hashimoto // Arch Virol. – 1985. – Vol.86, №3-4. – P.303-313.
15.
Arikawa J. Characterization of Hantaan virus envelope glycoprotein antigenic determinants
defined by monoclonal antibodies / J. Arikawa, A.L. Schmaljohn, J.M. Dalrymple, C.S. Schmaljohn
// J Gen Virol. – 1989. – Vol.70 ( Pt 3). – P.615-624.
16.
Arnheiter H. Mx transgenic mice--animal models of health / H. Arnheiter, M. Frese, R.
Kambadur, E. Meier, O. Haller // Curr Top Microbiol Immunol. – 1996. – Vol.206. – P.119-147.
17.
Asada H. Role of T lymphocyte subsets in protection and recovery from Hantaan virus
infection in mice / H. Asada, M. Tamura, K. Kondo, Y. Okuno, Y. Takahashi, Y. Dohi, T. Nagai, T.
Kurata, K. Yamanishi // J Gen Virol. – 1987. – Vol.68 ( Pt 7). – P.1961-1969.
18.
Avirutnan P. Dengue virus infection of human endothelial cells leads to chemokine
production, complement activation, and apoptosis / P. Avirutnan, P. Malasit, B. Seliger, S. Bhakdi,
M. Husmann // J Immunol. – 1998. – Vol.161, №11. – P.6338-6346.
19.
Avsic-Zupanc T. Characterization of Dobrava virus: a Hantavirus from Slovenia, Yugoslavia
/ T. Avsic-Zupanc, S.Y. Xiao, R. Stojanovic, A. Gligic, G. van der Groen, J.W. LeDuc // J Med
Virol. – 1992. – Vol.38, №2. – P.132-137.
184
20.
Baer M. Tumor necrosis factor alpha transcription in macrophages is attenuated by an
autocrine factor that preferentially induces NF-kappaB p50 / M. Baer, A. Dillner, R.C. Schwartz, C.
Sedon, S. Nedospasov, P.F. Johnson // Mol Cell Biol. – 1998. – Vol.18, №10. – P.5678-5689.
21.
Bai J. The therapeutic effect of purified human leucocytic interferon-alpha on hemorrhagic
fever with renal syndrome / J. Bai, K. Zhu, G. Zhou // Zhonghua Nei Ke Za Zhi. – 1997. – Vol.36,
№2. – P.90-93.
22.
Baigent S.J. Inhibition of beta interferon transcription by noncytopathogenic bovine viral
diarrhea virus is through an interferon regulatory factor 3-dependent mechanism / S.J. Baigent, G.
Zhang, M.D. Fray, H. Flick-Smith, S. Goodbourn, J.W. McCauley // J Virol. – 2002. – Vol.76, №18.
– P.8979-8988.
23.
Barber G.N. Host defense, viruses and apoptosis / G.N. Barber // Cell Death Differ. – 2001. –
Vol.8, №2. – P.113-126.
24.
Baskerville A. Ultrastructural pathology of experimental Ebola haemorrhagic fever virus
infection / A. Baskerville, S.P. Fisher-Hoch, G.H. Neild, A.B. Dowsett // J Pathol. – 1985. – Vol.147,
№3. – P.199-209.
25.
Beaty B.J. Evolution of bunyaviruses by genome reassortment in dually infected mosquitoes
(Aedes triseriatus) / B.J. Beaty, D.R. Sundin, L.J. Chandler, D.H. Bishop // Science. – 1985. –
Vol.230, №4725. – P.548-550.
26.
Beaty B.J. Molecular basis of bunyavirus transmission by mosquitoes: role of the middle-
sized RNA segment / B.J. Beaty, M. Holterman, W. Tabachnick, R.E. Shope, E.J. Rozhon, D.H.
Bishop // Science. – 1981. – Vol.211, №4489. – P.1433-1435.
27.
Belz G.T. Diversity of epitope and cytokine profiles for primary and secondary influenza a
virus-specific CD8+ T cell responses / G.T. Belz, W. Xie, P.C. Doherty // J Immunol. – 2001. –
Vol.166, №7. – P.4627-4633.
28.
Bernshtein A.D. Dynamics of Puumala hantavirus infection in naturally infected bank voles
(Clethrinomys glareolus) / A.D. Bernshtein, N.S. Apekina, T.V. Mikhailova, Y.A. Myasnikov, L.A.
Khlyap, Y.S. Korotkov, I.N. Gavrilovskaya // Arch Virol. – 1999. – Vol.144, №12. – P.2415-2428.
29.
Bhamarapravati N. Pathology of Thailand haemorrhagic fever: a study of 100 autopsy cases /
N. Bhamarapravati, P. Tuchinda, V. Boonyapaknavik // Ann Trop Med Parasitol. – 1967. – Vol.61,
№4. – P.500-510.
185
30.
Bharadwaj M. Humoral immune responses in the hantavirus cardiopulmonary syndrome / M.
Bharadwaj, R. Nofchissey, D. Goade, F. Koster, B. Hjelle // J Infect Dis. – 2000. – Vol.182, №1. –
P.43-48.
31.
Bhatt S. The global distribution and burden of dengue / S. Bhatt, P.W. Gething, O.J. Brady,
J.P. Messina, A.W. Farlow, C.L. Moyes, J.M. Drake, J.S. Brownstein, A.G. Hoen, O. Sankoh, M.F.
Myers, D.B. George, T. Jaenisch, G.R. Wint, C.P. Simmons, T.W. Scott, J.J. Farrar, S.I. Hay //
Nature. – 2013. – Vol.496, №7446. – P.504-507.
32.
Bi Z. Hantavirus infection: a review and global update / Z. Bi, P.B. Formenty, C.E. Roth // J
Infect Dev Ctries. – 2008. – Vol.2, №1. – P.3-23.
33.
Bierman H.R. Hematodepressive Virus Diseases of Thailand / H.R. Bierman, E.R. Nelson //
Ann Intern Med. – 1965. – Vol.62. – P.867-884.
34.
Blakqori G. Functional L polymerase of La Crosse virus allows in vivo reconstitution of
recombinant nucleocapsids / G. Blakqori, G. Kochs, O. Haller, F. Weber // J Gen Virol. – 2003. –
Vol.84, №Pt 5. – P.1207-1214.
35.
Bogers W.M. Kupffer cell depletion in vivo results in preferential elimination of IgG
aggregates and immune complexes via specific Fc receptors on rat liver endothelial cells / W.M.
Bogers, R.K. Stad, D.J. Janssen, N. van Rooijen, L.A. van Es, M.R. Daha // Clin Exp Immunol. –
1991. – Vol.86, №2. – P.328-333.
36.
Bohlman M.C. Analysis of hantavirus genetic diversity in Argentina: S segment-derived
phylogeny / M.C. Bohlman, S.P. Morzunov, J. Meissner, M.B. Taylor, K. Ishibashi, J. Rowe, S.
Levis, D. Enria, S.C. St Jeor // J Virol. – 2002. – Vol.76, №8. – P.3765-3773.
37.
Borges A.A. Role of mixed Th1 and Th2 serum cytokines on pathogenesis and prognosis of
hantavirus pulmonary syndrome / A.A. Borges, G.M. Campos, M.L. Moreli, R.L. Moro Souza, F.P.
Saggioro, G.G. Figueiredo, M.C. Livonesi, L.T. Moraes Figueiredo // Microbes Infect. – 2008. –
Vol.10, №10-11. – P.1150-1157.
38.
Borucki M.K. Role of maternal antibody in natural infection of Peromyscus maniculatus with
Sin Nombre virus / M.K. Borucki, J.D. Boone, J.E. Rowe, M.C. Bohlman, E.A. Kuhn, R. DeBaca,
S.C. St Jeor // J Virol. – 2000. – Vol.74, №5. – P.2426-2429.
39.
Bostik P. Sin nombre virus (SNV) Ig isotype antibody response during acute and
convalescent phases of hantavirus pulmonary syndrome / P. Bostik, J. Winter, T.G. Ksiazek, P.E.
Rollin, F. Villinger, S.R. Zaki, C.J. Peters, A.A. Ansari // Emerg Infect Dis. – 2000. – Vol.6, №2. –
P.184-187.
186
40.
Bouzid M. Climate change and the emergence of vector-borne diseases in Europe: case study
of dengue fever / M. Bouzid, F.J. Colon-Gonzalez, T. Lung, I.R. Lake, P.R. Hunter // BMC Public
Health. – 2014. – Vol.14. – P.781.
41.
Bozza F.A. Cytokine profiles as markers of disease severity in sepsis: a multiplex analysis /
F.A. Bozza, J.I. Salluh, A.M. Japiassu, M. Soares, E.F. Assis, R.N. Gomes, M.T. Bozza, H.C. CastroFaria-Neto, P.T. Bozza // Crit Care. – 2007. – Vol.11, №2. – P.R49.
42.
Bradley J.R. TNF-mediated inflammatory disease / J.R. Bradley // J Pathol. – 2008. –
Vol.214, №2. – P.149-160.
43.
Bravo L. Epidemiology of dengue disease in the Philippines (2000-2011): a systematic
literature review / L. Bravo, V.G. Roque, J. Brett, R. Dizon, M. L'Azou // PLoS Negl Trop Dis. –
2014. – Vol.8, №11. – P.e3027.
44.
Bray M. Pathogenesis of viral hemorrhagic fever / M. Bray // Curr Opin Immunol. – 2005. –
Vol.17, №4. – P.399-403.
45.
Brett J. Tumor necrosis factor/cachectin increases permeability of endothelial cell monolayers
by a mechanism involving regulatory G proteins / J. Brett, H. Gerlach, P. Nawroth, S. Steinberg, G.
Godman, D. Stern // J Exp Med. – 1989. – Vol.169, №6. – P.1977-1991.
46.
Brocato
R.L.
A
lethal
disease
model
for
hantavirus
pulmonary syndrome
in
immunosuppressed Syrian hamsters infected with Sin Nombre virus / R.L. Brocato, C.D.
Hammerbeck, T.M. Bell, J.B. Wells, L.A. Queen, J.W. Hooper // J Virol. – 2014. – Vol.88, №2. –
P.811-819.
47.
Brummer-Korvenkontio M. Epidemiological study of nephropathia epidemica in Finland
1989-96 / M. Brummer-Korvenkontio, O. Vapalahti, H. Henttonen, P. Koskela, P. Kuusisto, A.
Vaheri // Scand J Infect Dis. – 1999. – Vol.31, №5. – P.427-435.
48.
Burke D.S. A prospective study of dengue infections in Bangkok / D.S. Burke, A. Nisalak,
D.E. Johnson, R.M. Scott // Am J Trop Med Hyg. – 1988. – Vol.38, №1. – P.172-180.
49.
Burke-Gaffney A. Tumour necrosis factor-alpha-induced ICAM-1 expression in human
vascular endothelial and lung epithelial cells: modulation by tyrosine kinase inhibitors / A. BurkeGaffney, P.G. Hellewell // Br J Pharmacol. – 1996. – Vol.119, №6. – P.1149-1158.
50.
Burt F.J. Immunohistochemical and in situ localization of Crimean-Congo hemorrhagic fever
(CCHF) virus in human tissues and implications for CCHF pathogenesis / F.J. Burt, R. Swanepoel,
W.J. Shieh, J.F. Smith, P.A. Leman, P.W. Greer, L.M. Coffield, P.E. Rollin, T.G. Ksiazek, C.J.
Peters, S.R. Zaki // Arch Pathol Lab Med. – 1997. – Vol.121, №8. – P.839-846.
187
51.
C. Martinez-Valdebenito C. Person-to-person household and nosocomial transmission of
andes hantavirus, Southern Chile, 2011 / C. Martinez-Valdebenito, M. Calvo, C. Vial, R. Mansilla, C.
Marco, R.E. Palma, P.A. Vial, F. Valdivieso, G. Mertz, M. Ferres // Emerg Infect Dis. – 2014. –
Vol.20, №10. – P.1629-1636.
52.
Cannon M.J. Cytotoxic T cells clear virus but augment lung pathology in mice infected with
respiratory syncytial virus / M.J. Cannon, P.J. Openshaw, B.A. Askonas // J Exp Med. – 1988. –
Vol.168, №3. – P.1163-1168.
53.
Carrington L.B. Human to mosquito transmission of dengue viruses / L.B. Carrington, C.P.
Simmons // Front Immunol. – 2014. – Vol.5. – P.290.
54.
Cetron M.S. Yellow fever vaccine. Recommendations of the Advisory Committee on
Immunization Practices (ACIP), 2002 / M.S. Cetron, A.A. Marfin, K.G. Julian, D.J. Gubler, D.J.
Sharp, R.S. Barwick, L.H. Weld, R. Chen, R.D. Clover, J. Deseda-Tous, V. Marchessault, P.A. Offit,
T.P. Monath // MMWR Recomm Rep. – 2002. – Vol.51, №RR-17. – P.1-11; quiz CE11-14.
55.
Chen L.B. Abnormalities of T cell immunoregulation in hemorrhagic fever with renal
syndrome / L.B. Chen, W.S. Yang // J Infect Dis. – 1990. – Vol.161, №5. – P.1016-1019.
56.
Chen Y.C. Bacterial lipopolysaccharide inhibits dengue virus infection of primary human
monocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD14-dependent mechanism / Y.C. Chen,
S.Y. Wang, C.C. King // J Virol. – 1999. – Vol.73, №4. – P.2650-2657.
57.
Chizhikov V.E. Complete genetic characterization and analysis of isolation of Sin Nombre
virus / V.E. Chizhikov, C.F. Spiropoulou, S.P. Morzunov, M.C. Monroe, C.J. Peters, S.T. Nichol // J
Virol. – 1995. – Vol.69, №12. – P.8132-8136.
58.
Cho H.W. Antibody responses in humans to an inactivated hantavirus vaccine (Hantavax) /
H.W. Cho, C.R. Howard // Vaccine. – 1999. – Vol.17, №20-21. – P.2569-2575.
59.
Cho H.W. Review of an inactivated vaccine against hantaviruses / H.W. Cho, C.R. Howard,
H.W. Lee // Intervirology. – 2002. – Vol.45, №4-6. – P.328-333.
60.
Choi Y. Inactivated Hantaan virus vaccine derived from suspension culture of Vero cells / Y.
Choi, C.J. Ahn, K.M. Seong, M.Y. Jung, B.Y. Ahn // Vaccine. – 2003. – Vol.21, №17-18. – P.18671873.
61.
Chu Y.K. A vaccinia virus-vectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge
with Hantaan and Seoul viruses but not Puumala virus / Y.K. Chu, G.B. Jennings, C.S. Schmaljohn //
J Virol. – 1995. – Vol.69, №10. – P.6417-6423.
188
62.
Chu Y.K. Cross-neutralization of hantaviruses with immune sera from experimentally
infected animals and from hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary
syndrome patients / Y.K. Chu, G. Jennings, A. Schmaljohn, F. Elgh, B. Hjelle, H.W. Lee, S. Jenison,
T. Ksiazek, C.J. Peters, P. Rollin, et al. // J Infect Dis. – 1995. – Vol.172, №6. – P.1581-1584.
63.
Clyde K. Recent advances in deciphering viral and host determinants of dengue virus
replication and pathogenesis / K. Clyde, J.L. Kyle, E. Harris // J Virol. – 2006. – Vol.80, №23. –
P.11418-11431.
64.
Cohen S.N. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro / S.N. Cohen,
A.C. Chang, H.W. Boyer, R.B. Helling // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1973. – Vol.70, №11. –
P.3240-3244.
65.
Collan Y. Nephropathia epidemica: mild variant of hemorrhagic fever with renal syndrome /
Y. Collan, M.J. Mihatsch, J. Lahdevirta, E.J. Jokinen, T. Romppanen, E. Jantunen // Kidney Int
Suppl. – 1991. – Vol.35. – P.S62-71.
66.
Connolly-Andersen A.M. Crimean Congo hemorrhagic fever virus infects human monocyte-
derived dendritic cells / A.M. Connolly-Andersen, I. Douagi, A.A. Kraus, A. Mirazimi // Virology. –
2009. – Vol.390, №2. – P.157-162.
67.
Coulson B.S. Comparison of rotavirus immunoglobulin A coproconversion with other indices
of rotavirus infection in a longitudinal study in childhood / B.S. Coulson, K. Grimwood, P.J.
Masendycz, J.S. Lund, N. Mermelstein, R.F. Bishop, G.L. Barnes // J Clin Microbiol. – 1990. –
Vol.28, №6. – P.1367-1374.
68.
Crotty S. The broad-spectrum antiviral ribonucleoside ribavirin is an RNA virus mutagen / S.
Crotty, D. Maag, J.J. Arnold, W. Zhong, J.Y. Lau, Z. Hong, R. Andino, C.E. Cameron // Nat Med. –
2000. – Vol.6, №12. – P.1375-1379.
69.
Cui F. Spatial analysis of hemorrhagic fever with renal syndrome in Zibo City, China, 2009-
2012 / F. Cui, T. Wang, L. Wang, S. Yang, L. Zhang, H. Cao, Y. Zhang, H. Hu, S. Zhai // PLoS One.
– 2013. – Vol.8, №6. – P.e67490.
70.
da Silva Voorham J.M. A possible fifth dengue virus serotype / J.M. da Silva Voorham // Ned
Tijdschr Geneeskd. – 2014. – Vol.158. – P.7946.
71.
Dalrymple N.A. Roles for endothelial cells in dengue virus infection / N.A. Dalrymple, E.R.
Mackow // Adv Virol. – 2012. – Vol.2012. – P.840654.
72.
Dantas J.R. Characterization of glycoproteins of viruses causing hemorrhagic fever with renal
syndrome (HFRS) using monoclonal antibodies / J.R. Dantas, Jr., Y. Okuno, H. Asada, M. Tamura,
189
M. Takahashi, O. Tanishita, Y. Takahashi, T. Kurata, K. Yamanishi // Virology. – 1986. – Vol.151,
№2. – P.379-384.
73.
de Carvalho Nicacio C. Immunoglobulin A responses to Puumala hantavirus / C. de Carvalho
Nicacio, E. Bjorling, A. Lundkvist // J Gen Virol. – 2000. – Vol.81, №Pt 6. – P.1453-1461.
74.
de Carvalho Nicacio C. T-helper and humoral responses to Puumala hantavirus nucleocapsid
protein: identification of T-helper epitopes in a mouse model / C. de Carvalho Nicacio, M. Sallberg,
C. Hultgren, A. Lundkvist // J Gen Virol. – 2001. – Vol.82, №Pt 1. – P.129-138.
75.
Delatte H. Blood-feeding behavior of Aedes albopictus, a vector of Chikungunya on La
Reunion / H. Delatte, A. Desvars, A. Bouetard, S. Bord, G. Gimonneau, G. Vourc'h, D. Fontenille //
Vector Borne Zoonotic Dis. – 2010. – Vol.10, №3. – P.249-258.
76.
Deyde V.M. Interactions and trafficking of Andes and Sin Nombre Hantavirus glycoproteins
G1 and G2 / V.M. Deyde, A.A. Rizvanov, J. Chase, E.W. Otteson, S.C. St Jeor // Virology. – 2005. –
Vol.331, №2. – P.307-315.
77.
Dietz V. The 1986 dengue and dengue hemorrhagic fever epidemic in Puerto Rico:
epidemiologic and clinical observations / V. Dietz, D.J. Gubler, S. Ortiz, G. Kuno, A. Casta-Velez,
G.E. Sather, I. Gomez, E. Vergne // P R Health Sci J. – 1996. – Vol.15, №3. – P.201-210.
78.
Dohmae K. In utero and mammary transfer of hantavirus antibody from dams to infant rats /
K. Dohmae, U. Koshimizu, Y. Nishimune // Lab Anim Sci. – 1993. – Vol.43, №6. – P.557-561.
79.
Dohmae K. Maternal transfer of Hantavirus antibodies in rats / K. Dohmae, Y. Nishimune //
Lab Anim Sci. – 1998. – Vol.48, №4. – P.395-397.
80.
Du W. Mechanisms of transcriptional synergism between distinct virus-inducible enhancer
elements / W. Du, D. Thanos, T. Maniatis // Cell. – 1993. – Vol.74, №5. – P.887-898.
81.
Duchin J.S. Hantavirus pulmonary syndrome: a clinical description of 17 patients with a
newly recognized disease. The Hantavirus Study Group / J.S. Duchin, F.T. Koster, C.J. Peters, G.L.
Simpson, B. Tempest, S.R. Zaki, T.G. Ksiazek, P.E. Rollin, S. Nichol, E.T. Umland, et al. // N Engl J
Med. – 1994. – Vol.330, №14. – P.949-955.
82.
Dunn E.F. Transcription of a recombinant bunyavirus RNA template by transiently expressed
bunyavirus proteins / E.F. Dunn, D.C. Pritlove, H. Jin, R.M. Elliott // Virology. – 1995. – Vol.211,
№1. – P.133-143.
83.
Dunst R. Severe thrombocytopenia and response to corticosteroids in a case of nephropathia
epidemica / R. Dunst, T. Mettang, U. Kuhlmann // Am J Kidney Dis. – 1998. – Vol.31, №1. – P.116120.
190
84.
Dzagurova T.K. Discovery, clinical and etiological characteristic of hemorrhagic fever with
renal syndrome in the subtropical zone of Krasnodar region / T.K. Dzagurova, E.A. Tkachenko, V.
Iunicheva Iu, V.G. Morozov, A.F. Briukhanov, V.N. Bashkirtsev, N.S. Sedova, B. Klempa, D.
Kruger // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. – 2008, №1. – P.12-16.
85.
E. Little Co-occurrence patterns of the dengue vector Aedes aegypti and Aedes mediovitattus,
a dengue competent mosquito in Puerto Rico / E. Little, R. Barrera, K.C. Seto, M. Diuk-Wasser //
Ecohealth. – 2011. – Vol.8, №3. – P.365-375.
86.
Elbim C. Effects of pentoxifylline on human polymorphonuclear neutrophil responses to TNF
in whole blood / C. Elbim, M. Lefebvre, J. Hakim, M.A. Gougerot-Pocidalo // Eur Cytokine Netw. –
1995. – Vol.6, №2. – P.113-120.
87.
Elgh F. Serological diagnosis of hantavirus infections by an enzyme-linked immunosorbent
assay based on detection of immunoglobulin G and M responses to recombinant nucleocapsid
proteins of five viral serotypes / F. Elgh, A. Lundkvist, O.A. Alexeyev, H. Stenlund, T. AvsicZupanc, B. Hjelle, H.W. Lee, K.J. Smith, R. Vainionpaa, D. Wiger, G. Wadell, P. Juto // J Clin
Microbiol. – 1997. – Vol.35, №5. – P.1122-1130.
88.
Engler O. Seroprevalence of hantavirus infections in Switzerland in 2009: difficulties in
determining prevalence in a country with low endemicity / O. Engler, J. Klingstrom, E. Aliyev, C.
Niederhauser, S. Fontana, M. Strasser, J. Portmann, J. Signer, S. Bankoul, F. Frey, C. Hatz, A. Stutz,
A. Tschaggelar, M. Mutsch // Euro Surveill. – 2013. – Vol.18, №50. – P.20660.
89.
Ennis F.A. Hantavirus pulmonary syndrome: CD8+ and CD4+ cytotoxic T lymphocytes to
epitopes on Sin Nombre virus nucleocapsid protein isolated during acute illness / F.A. Ennis, J. Cruz,
C.F. Spiropoulou, D. Waite, C.J. Peters, S.T. Nichol, H. Kariwa, F.T. Koster // Virology. – 1997. –
Vol.238, №2. – P.380-390.
90.
Enria D. A. Clinical manifestations of New World hantaviruses / D.A. Enria, A.M. Briggiler,
N. Pini, S. Levis // Curr Top Microbiol Immunol. – 2001. – Vol.256. – P.117-134.
91.
Enria D. Hantavirus pulmonary syndrome in Argentina. Possibility of person to person
transmission / D. Enria, P. Padula, E.L. Segura, N. Pini, A. Edelstein, C.R. Posse, M.C.
Weissenbacher // Medicina (B Aires). – 1996. – Vol.56, №6. – P.709-711.
92.
Escutenaire S. Behavioral, physiologic, and habitat influences on the dynamics of Puumala
virus infection in bank voles (Clethrionomys glareolus) / S. Escutenaire, P. Chalon, F. De Jaegere, L.
Karelle-Bui, G. Mees, B. Brochier, F. Rozenfeld, P.P. Pastoret // Emerg Infect Dis. – 2002. – Vol.8,
№9. – P.930-936.
191
93.
Fahri S. Molecular surveillance of dengue in Semarang, Indonesia revealed the circulation of
an old genotype of dengue virus serotype-1 / S. Fahri, B. Yohan, H. Trimarsanto, S. Sayono, S.
Hadisaputro, E. Dharmana, D. Syafruddin, R.T. Sasmono // PLoS Negl Trop Dis. – 2013. – Vol.7,
№8. – P.e2354.
94.
Fedorchenko Iu L. Vascular permeability, microcirculation and biologically active substances
in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome / L. Fedorchenko Iu, B.Z. Sirotin, E.N.
Rozhkovskaia // Ter Arkh. – 1990. – Vol.62, №6. – P.71-74.
95.
Feldmann
H.
Filovirus-induced
endothelial
leakage
triggered
by
infected
monocytes/macrophages / H. Feldmann, H. Bugany, F. Mahner, H.D. Klenk, D. Drenckhahn, H.J.
Schnittler // J Virol. – 1996. – Vol.70, №4. – P.2208-2214.
96.
Ferrer J.F. High prevalence of hantavirus infection in Indian communities of the Paraguayan
and Argentinean Gran Chaco / J.F. Ferrer, C.B. Jonsson, E. Esteban, D. Galligan, M.A. Basombrio,
M. Peralta-Ramos, M. Bharadwaj, N. Torrez-Martinez, J. Callahan, A. Segovia, B. Hjelle // Am J
Trop Med Hyg. – 1998. – Vol.59, №3. – P.438-444.
97.
Figueiredo L.T. Hantaviruses and cardiopulmonary syndrome in South America / L.T.
Figueiredo, W.M. Souza, M. Ferres, D.A. Enria // Virus Res. – 2014. – Vol.187. – P.43-54.
98.
Figurnov V.A. Liver changes in hemorrhagic fever with the nephrotic syndrome / V.A.
Figurnov, P. Fedianin Iu, V.I. Krizhanovskii, A.B. Pirogov, R.S. Mateishen // Sov Med. – 1985,
№11. – P.96-97.
99.
Flick K. Rescue of Hantaan virus minigenomes / K. Flick, J.W. Hooper, C.S. Schmaljohn,
R.F. Pettersson, H. Feldmann, R. Flick // Virology. – 2003. – Vol.306, №2. – P.219-224.
100.
Flick R. Reverse genetics system for Uukuniemi virus (Bunyaviridae): RNA polymerase I-
catalyzed expression of chimeric viral RNAs / R. Flick, RF. Pettersson // J Virol. – 2001. – Vol.75,
№4. – P.1643-1655.
101.
Forthal D.N. Measles virus-specific functional antibody responses and viremia during acute
measles / D.N. Forthal, G. Landucci, A. Habis, M. Zartarian, J. Katz, J.G. Tilles // J Infect Dis. –
1994. – Vol.169, №6. – P.1377-1380.
102.
Franke W.W. Immunolocalization of plakoglobin in endothelial junctions: identification as a
special type of Zonulae adhaerentes / W.W. Franke, H.P. Kapprell, P. Cowin // Biol Cell. – 1987. –
Vol.59, №3. – P.205-218.
192
103.
Frese M. Inhibition of bunyaviruses, phleboviruses, and hantaviruses by human MxA protein
/ M. Frese, G. Kochs, H. Feldmann, C. Hertkorn, O. Haller // J Virol. – 1996. – Vol.70, №2. – P.915923.
104.
Garanina S.B. Genetic diversity and geographic distribution of hantaviruses in Russia / S.B.
Garanina, A.E. Platonov, V.I. Zhuravlev, A.N. Murashkina, V.V. Yakimenko, A.G. Korneev, G.A.
Shipulin // Zoonoses Public Health. – 2009. – Vol.56, №6-7. – P.297-309.
105.
Garcia G. Anti-interleukin-5 therapy in severe asthma / G. Garcia, C. Taille, P. Laveneziana,
A. Bourdin, P. Chanez, M. Humbert // Eur Respir Rev. – 2013. – Vol.22, №129. – P.251-257.
106.
Garcia G. The 5' ends of Hantaan virus (Bunyaviridae) RNAs suggest a prime-and-realign
mechanism for the initiation of RNA synthesis / D. Garcin, M. Lezzi, M. Dobbs, R.M. Elliott, C.
Schmaljohn, C.Y. Kang, D. Kolakofsky // J Virol. – 1995. – Vol.69, №9. – P.5754-5762.
107.
Gavrilovskaia I.N. Cellular entry of hantaviruses which cause hemorrhagic fever with renal
syndrome is mediated by beta3 integrins / I.N. Gavrilovskaya, E.J. Brown, M.H. Ginsberg, E.R.
Mackow // J Virol. – 1999. – Vol.73, №5. – P.3951-3959.
108.
Gavrilovskaia I.N. Determination of specific immune complexes and dynamics of their
circulation in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome / I.N. Gavrilovskaia, V.K.
Podgorodnichenko, N.S. Apekina, E.A. Gorbachkova, S.B. Bogdanova // Mikrobiol Zh. – 1987. –
Vol.49, №4. – P.71-76.
109.
Geimonen E. Pathogenic and nonpathogenic hantaviruses differentially regulate endothelial
cell responses / E. Geimonen, S. Neff, T. Raymond, S.S. Kocer, I.N. Gavrilovskaya, E.R. Mackow //
Proc Natl Acad Sci U S A. – 2002. – Vol.99, №21. – P.13837-13842.
110.
Geisbert T.W. Exotic emerging viral diseases: progress and challenges / T.W. Geisbert, P.B.
Jahrling // Nat Med. – 2004. – Vol.10, №12 Suppl. – P.S110-121.
111.
Gibbons R.V. Dengue: an escalating problem / R.V. Gibbons, D.W. Vaughn // BMJ. – 2002.
– Vol.324, №7353. – P.1563-1566.
112.
Gilles P.N. Tumor necrosis factor alpha negatively regulates hepatitis B virus gene expression
in transgenic mice / P.N. Gilles, G. Fey, F.V. Chisari // J Virol. – 1992. – Vol.66, №6. – P.39553960.
113.
Gjenero-Margan I. Autochthonous dengue fever in Croatia, August-September 2010 / I.
Gjenero-Margan, B. Aleraj, D. Krajcar, V. Lesnikar, A. Klobucar, I. Pem-Novosel, S. KurecicFilipovic, S. Komparak, R. Martic, S. Duricic, L. Betica-Radic, J. Okmadzic, T. Vilibic-Cavlek, A.
193
Babic-Erceg, B. Turkovic, T. Avsic-Zupanc, I. Radic, M. Ljubic, K. Sarac, N. Benic, G. MlinaricGalinovic // Euro Surveill. – 2011. – Vol.16, №9.
114.
Goetschy J.F. Regulation of the interferon-inducible IFI-78K gene, the human equivalent of
the murine Mx gene, by interferons, double-stranded RNA, certain cytokines, and viruses / J.F.
Goetschy, H. Zeller, J. Content, M.A. Horisberger // J Virol. – 1989. – Vol.63, №6. – P.2616-2622.
115.
Goldblum S.E. TNF-alpha induces endothelial cell F-actin depolymerization, new actin
synthesis, and barrier dysfunction / S.E. Goldblum, X. Ding, J. Campbell-Washington // Am J
Physiol. – 1993. – Vol.264, №4 Pt 1. – P.C894-905.
116.
Goldsmith C.S. Ultrastructural characteristics of Sin Nombre virus, causative agent of
hantavirus pulmonary syndrome / C.S. Goldsmith, L.H. Elliott, C.J. Peters, S.R. Zaki // Arch Virol. –
1995. – Vol.140, №12. – P.2107-2122.
117.
Gongora C. Molecular cloning of a new interferon-induced PML nuclear body-associated
protein / C. Gongora, G. David, L. Pintard, C. Tissot, T.D. Hua, A. Dejean, N. Mechti // J Biol Chem.
– 1997. – Vol.272, №31. – P.19457-19463.
118.
Gossmann J. Murine hepatitis caused by lymphocytic choriomeningitis virus. II. Cells
involved in pathogenesis / J. Gossmann, J. Lohler, O. Utermohlen, F. Lehmann-Grube // Lab Invest.
– 1995. – Vol.72, №5. – P.559-570.
119.
Gott P. RNA binding of recombinant nucleocapsid proteins of hantaviruses / P. Gott, R.
Stohwasser, P. Schnitzler, G. Darai, E.K. Bautz // Virology. – 1993. – Vol.194, №1. – P.332-337.
120.
Grey Duck H.M. immunoglobulins. II. Biologic and immunochemical studies / H.M. Grey // J
Immunol. – 1967. – Vol.98, №4. – P.820-826.
121.
Griffin D.E. Changes in plasma IgE levels during complicated and uncomplicated measles
virus infections / D.E. Griffin, S.J. Cooper, R.L. Hirsch, R.T. Johnson, I. Lindo de Soriano, S.
Roedenbeck, A. Vaisberg // J Allergy Clin Immunol. – 1985. – Vol.76, №2 Pt 1. – P.206-213.
122.
Groen J. Class and subclass distribution of Hantavirus-specific serum antibodies at different
times after the onset of nephropathia epidemica / J. Groen, M. Gerding, J.G. Jordans, J.P. Clement,
A.D. Osterhaus // J Med Virol. – 1994. – Vol.43, №1. – P.39-43.
123.
Groen J. Serum antibodies to structural proteins of Hantavirus arise at different times after
infection / J. Groen, J. Dalrymple, S. Fisher-Hoch, J.G. Jordans, J.P. Clement, A.D. Osterhaus // J
Med Virol. – 1992. – Vol.37, №4. – P.283-287.
124.
Gubler D.J. Dengue and dengue hemorrhagic fever / D.J. Gubler // Clin Microbiol Rev. –
1998. – Vol.11, №3. – P.480-496.
194
125.
Guidotti L.G. To kill or to cure: options in host defense against viral infection / L.G. Guidotti,
F.V. Chisari // Curr Opin Immunol. – 1996. – Vol.8, №4. – P.478-483.
126.
Guzman M.G. Dengue: a continuing global threat / M.G. Guzman, S.B. Halstead, H. Artsob,
P. Buchy, J. Farrar, D.J. Gubler, E. Hunsperger, A. Kroeger, H.S. Margolis, E. Martinez, M.B.
Nathan, J.L. Pelegrino, C. Simmons, S. Yoksan, R.W. Peeling // Nat Rev Microbiol. – 2010. – Vol.8,
№12 Suppl. – P.S7-16.
127.
H.L. Van Human memory cytotoxic T-lymphocyte (CTL) responses to Hantaan virus
infection: identification of virus-specific and cross-reactive CD8(+) CTL epitopes on nucleocapsid
protein / H.L. Van Epps, C.S. Schmaljohn, F.A. Ennis // J Virol. – 1999. – Vol.73, №7. – P.53015308.
128.
H.L. Van Long-lived memory T lymphocyte responses after hantavirus infection / H.L. Van
Epps, M. Terajima, J. Mustonen, T.P. Arstila, E.A. Corey, A. Vaheri, F.A. Ennis // J Exp Med. –
2002. – Vol.196, №5. – P.579-588.
129.
Haller O. Mx proteins: mediators of innate resistance to RNA viruses / O. Haller, M. Frese,
G. Kochs // Rev Sci Tech. – 1998. – Vol.17, №1. – P.220-230.
130.
Halstead S.B. Dengue / S.B. Halstead // Lancet. – 2007. – Vol.370, №9599. – P.1644-1652.
131.
Halstead S.B. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. II. Identity of blood and tissue
leukocytes supporting in vitro infection / S.B. Halstead, E.J. O'Rourke, A.C. Allison // J Exp Med. –
1977. – Vol.146, №1. – P.218-229.
132.
Hardestam J. HFRS causing hantaviruses do not induce apoptosis in confluent Vero E6 and
A-549 cells / J. Hardestam, J. Klingstrom, K. Mattsson, A. Lundkvist // J Med Virol. – 2005. –
Vol.76, №2. – P.234-240.
133.
Hashido M. Herpes simplex virus-specific IgM, IgA and IgG subclass antibody responses in
primary and nonprimary genital herpes patients / M. Hashido, T. Kawana // Microbiol Immunol. –
1997. – Vol.41, №5. – P.415-420.
134.
Hautala T. Hypophyseal hemorrhage and panhypopituitarism during Puumala Virus Infection:
Magnetic Resonance Imaging and detection of viral antigen in the hypophysis / T. Hautala, T.
Sironen, O. Vapalahti, E. Paakko, T. Sarkioja, P.I. Salmela, A. Vaheri, A. Plyusnin, H. Kauma // Clin
Infect Dis. – 2002. – Vol.35, №1. – P.96-101.
135.
Heller M.V. Increased tumor necrosis factor-alpha levels in Argentine hemorrhagic fever /
M.V. Heller, M.C. Saavedra, R. Falcoff, J.I. Maiztegui, F.C. Molinas // J Infect Dis. – 1992. –
Vol.166, №5. – P.1203-1204.
195
136.
Henderson W.W. Naturally occurring Sin Nombre virus genetic reassortants / W.W.
Henderson, M.C. Monroe, S.C. St Jeor, W.P. Thayer, J.E. Rowe, C.J. Peters, S.T. Nichol // Virology.
– 1995. – Vol.214, №2. – P.602-610.
137.
Higuchi Y. Sequence analysis of the large (L) protein of simian virus 5 / Y. Higuchi, Y.
Miyahara, M. Kawano, M. Tsurudome, H. Matsumura, S. Kusagawa, H. Komada, M. Nishio, Y. Ito
// J Gen Virol. – 1992. – Vol.73 ( Pt 4). – P.1005-1010.
138.
Hjelle B. Hantavirus pulmonary syndrome, renal insufficiency, and myositis associated with
infection by Bayou hantavirus / B. Hjelle, D. Goade, N. Torrez-Martinez, M. Lang-Williams, J. Kim,
R.L. Harris, J.A. Rawlings // Clin Infect Dis. – 1996. – Vol.23, №3. – P.495-500.
139.
Hjelle B. Hantaviruses: clinical, microbiologic, and epidemiologic aspects / B. Hjelle, S.A.
Jenison, D.E. Goade, W.B. Green, R.M. Feddersen, A.A. Scott // Crit Rev Clin Lab Sci. – 1995. –
Vol.32, №5-6. – P.469-508.
140.
Hjelle B. Molecular linkage of hantavirus pulmonary syndrome to the white-footed mouse,
Peromyscus leucopus: genetic characterization of the M genome of New York virus / B. Hjelle, S.W.
Lee, W. Song, N. Torrez-Martinez, J.W. Song, R. Yanagihara, I. Gavrilovskaya, E.R. Mackow // J
Virol. – 1995. – Vol.69, №12. – P.8137-8141.
141.
Hoogstraal H. The epidemiology of tick-borne Crimean-Congo hemorrhagic fever in Asia,
Europe, and Africa / H. Hoogstraal // J Med Entomol. – 1979. – Vol.15, №4. – P.307-417.
142.
Hooper J.W. DNA vaccination with hantavirus M segment elicits neutralizing antibodies and
protects against seoul virus infection / J.W. Hooper, K.I. Kamrud, F. Elgh, D. Custer, C.S.
Schmaljohn // Virology. – 1999. – Vol.255, №2. – P.269-278.
143.
Hooper J.W. Vaccines against hantaviruses / J.W. Hooper, D. Li // Curr Top Microbiol
Immunol. – 2001. – Vol.256. – P.171-191.
144.
Hopkins R.O. Neuropsychological impairments following hantavirus pulmonary syndrome /
R.O. Hopkins, V. Larson-Lohr, L.K. Weaver, E.D. Bigler // J Int Neuropsychol Soc. – 1998. – Vol.4,
№2. – P.190-196.
145.
Horling J. Antibodies to Puumala virus in humans determined by neutralization test / J.
Horling, A. Lundkvist, J.W. Huggins, B. Niklasson // J Virol Methods. – 1992. – Vol.39, №1-2. –
P.139-147.
146.
Horling J. Khabarovsk virus: a phylogenetically and serologically distinct hantavirus isolated
from Microtus fortis trapped in far-east Russia / J. Horling, V. Chizhikov, A. Lundkvist, M. Jonsson,
196
L. Ivanov, A. Dekonenko, B. Niklasson, T. Dzagurova, C.J. Peters, E. Tkachenko, S. Nichol // J Gen
Virol. – 1996. – Vol.77 ( Pt 4). – P.687-694.
147.
Horvath C.J. Recombinant tumor necrosis factor increases pulmonary vascular permeability
independent of neutrophils / C.J. Horvath, T.J. Ferro, G. Jesmok, A.B. Malik // Proc Natl Acad Sci U
S A. – 1988. – Vol.85, №23. – P.9219-9223.
148.
Hruska J.F. Effects of ribavirin on respiratory syncytial virus in vitro / J.F. Hruska, J.M.
Bernstein, R.G. Douglas, Jr., C.B. Hall // Antimicrob Agents Chemother. – 1980. – Vol.17, №5. –
P.770-775.
149.
Huang C. Hemorrhagic fever with renal syndrome: relationship between pathogenesis and
cellular immunity / C. Huang, B. Jin, M. Wang, E. Li, C. Sun // J Infect Dis. – 1994. – Vol.169, №4.
– P.868-870.
150.
Huggins J.W. Prospective, double-blind, concurrent, placebo-controlled clinical trial of
intravenous ribavirin therapy of hemorrhagic fever with renal syndrome / J.W. Huggins, C.M.
Hsiang, T.M. Cosgriff, M.Y. Guang, J.I. Smith, Z.O. Wu, J.W. LeDuc, Z.M. Zheng, J.M. Meegan,
Q.N. Wang, et al. // J Infect Dis. – 1991. – Vol.164, №6. – P.1119-1127.
151.
Hutchinson K.L. Sin Nombre virus mRNA synthesis / K.L. Hutchinson, C.J. Peters, S.T.
Nichol // Virology. – 1996. – Vol.224, №1. – P.139-149.
152.
Hutchinson K.L. Transmission of Black Creek Canal virus between cotton rats / K.L.
Hutchinson, P.E. Rollin, W.J. Shieh, S. Zaki, P.W. Greer, C.J. Peters // J Med Virol. – 2000. –
Vol.60, №1. – P.70-76.
153.
Ishii Y. Tumor necrosis factor-alpha-mediated decrease in glutathione increases the
sensitivity of pulmonary vascular endothelial cells to H2O2 / Y. Ishii, C.A. Partridge, P.J. Del
Vecchio, A.B. Malik // J Clin Invest. – 1992. – Vol.89, №3. – P.794-802.
154.
Iversson L.B. Human infection by Hantavirus in southern and southeastern Brazil / L.B.
Iversson, A.P. da Rosa, M.D. Rosa, A.V. Lomar, G. Sasaki Mda, J.W. LeDuc // Rev Assoc Med
Bras. – 1994. – Vol.40, №2. – P.85-92.
155.
Jaffe E.A. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by
morphologic and immunologic criteria / E.A. Jaffe, R.L. Nachman, C.G. Becker, C.R. Minick // J
Clin Invest. – 1973. – Vol.52, №11. – P.2745-2756.
156.
Jaffe E.A. Synthesis of fibronectin by cultured human endothelial cells / E.A. Jaffe, D.F.
Mosher // J Exp Med. – 1978. – Vol.147, №6. – P.1779-1791.
197
157.
Jahrling P.B. Passive antibody therapy of Lassa fever in cynomolgus monkeys: importance of
neutralizing antibody and Lassa virus strain / P.B. Jahrling, C.J. Peters // Infect Immun. – 1984. –
Vol.44, №2. – P.528-533.
158.
Jarmer J. Variation of the specificity of the human antibody responses after tick-borne
encephalitis virus infection and vaccination / J. Jarmer, J. Zlatkovic, G. Tsouchnikas, O. Vratskikh, J.
Strauss, J.H. Aberle, V. Chmelik, M. Kundi, K. Stiasny, F.X. Heinz // J Virol. – 2014. – Vol.88,
№23. – P.13845-13857.
159.
Jenison S. Characterization of human antibody responses to four corners hantavirus infections
among patients with hantavirus pulmonary syndrome / S. Jenison, T. Yamada, C. Morris, B.
Anderson, N. Torrez-Martinez, N. Keller, B. Hjelle // J Virol. – 1994. – Vol.68, №5. – P.3000-3006.
160.
Jessie K. Localization of dengue virus in naturally infected human tissues, by
immunohistochemistry and in situ hybridization / K. Jessie, M.Y. Fong, S. Devi, S.K. Lam, K.T.
Wong // J Infect Dis. – 2004. – Vol.189, №8. – P.1411-1418.
161.
Jin M. Hantaan virus enters cells by clathrin-dependent receptor-mediated endocytosis / M.
Jin, J. Park, S. Lee, B. Park, J. Shin, K.J. Song, T.I. Ahn, S.Y. Hwang, B.Y. Ahn, K. Ahn // Virology.
– 2002. – Vol.294, №1. – P.60-69.
162.
Johansen K. Serum IgA immune response to individual rotavirus polypeptides in young
children with rotavirus infection / K. Johansen, L. Granqvist, K. Karlen, G. Stintzing, I. Uhnoo, L.
Svensson // Arch Virol. – 1994. – Vol.138, №3-4. – P.247-259.
163.
Johansson A.G. Liver cell uptake and degradation of soluble immunoglobulin G immune
complexes in vivo and in vitro in rats / A.G. Johansson, T. Lovdal, K.E. Magnusson, T. Berg, T.
Skogh // Hepatology. – 1996. – Vol.24, №1. – P.169-175.
164.
Johnson A.M. Genetic investigation of novel hantaviruses causing fatal HPS in Brazil / A.M.
Johnson, L.T. de Souza, I.B. Ferreira, L.E. Pereira, T.G. Ksiazek, P.E. Rollin, C.J. Peters, S.T. Nichol
// J Med Virol. – 1999. – Vol.59, №4. – P.527-535.
165.
Johnson A.M. Laguna Negra virus associated with HPS in western Paraguay and Bolivia /
A.M. Johnson, M.D. Bowen, T.G. Ksiazek, R.J. Williams, R.T. Bryan, J.N. Mills, C.J. Peters, S.T.
Nichol // Virology. – 1997. – Vol.238, №1. – P.115-127.
166.
Jokinen E.J. Nephropathia epidemica: immunohistochemical study of pathogenesis / E.J.
Jokinen, J. Lahdevirta, Y. Collan // Clin Nephrol. – 1978. – Vol.9, №1. – P.1-5.
167.
Jokinen E.J. Renal immune complexes in epidemic nephropathy / E.J. Jokinen, Y. Collan, J.
Lahdevirta // Lancet. – 1977. – Vol.1, №8019. – P.1012-1013.
198
168.
Jonsson C.B. Replication of hantaviruses / C.B. Jonsson, C.S. Schmaljohn // Curr Top
Microbiol Immunol. – 2001. – Vol.256. – P.15-32.
169.
Jonsson C.B. Treatment of hantavirus pulmonary syndrome / C.B. Jonsson, J. Hooper, G.
Mertz // Antiviral Res. – 2008. – Vol.78, №1. – P.162-169.
170.
Kagi D. Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxicity / D.
Kagi, F. Vignaux, B. Ledermann, K. Burki, V. Depraetere, S. Nagata, H. Hengartner, P. Golstein //
Science. – 1994. – Vol.265, №5171. – P.528-530.
171.
Kallio-Kokko H. Evaluation of Puumala virus IgG and IgM enzyme immunoassays based on
recombinant baculovirus-expressed nucleocapsid protein for early nephropathia epidemica diagnosis
/ H. Kallio-Kokko, O. Vapalahti, A. Lundkvist, A. Vaheri // Clin Diagn Virol. – 1998. – Vol.10, №1.
– P.83-90.
172.
Kambayashi T. Emergence of CD8+ T cells expressing NK cell receptors in influenza A
virus-infected mice / T. Kambayashi, E. Assarsson, J. Michaelsson, P. Berglund, A.D. Diehl, B.J.
Chambers, H.G. Ljunggren // J Immunol. – 2000. – Vol.165, №9. – P.4964-4969.
173.
Kanerva M. Pathogenesis of puumala and other hantavirus infections / M. Kanerva, J.
Mustonen, A. Vaheri // Rev Med Virol. – 1998. – Vol.8, №2. – P.67-86.
174.
Kang J.S. Silymarin inhibits TNF-alpha-induced expression of adhesion molecules in human
umbilical vein endothelial cells / J.S. Kang, S.K. Park, K.H. Yang, H.M. Kim // FEBS Lett. – 2003. –
Vol.550, №1-3. – P.89-93.
175.
Kang W. A preliminary genetic reassortment between Hantaan virus and Seoul virus strains /
W. Kang, C. Huang, X. Bai, W. Yang, G. Li // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. – 2002. –
Vol.23, №1. – P.46-49.
176.
Kaukinen P. Non-covalent interaction between nucleocapsid protein of Tula hantavirus and
small ubiquitin-related modifier-1, SUMO-1 / P. Kaukinen, A. Vaheri, A. Plyusnin // Virus Res. –
2003. – Vol.92, №1. – P.37-45.
177.
Kawai T. Selective diapedesis of Th1 cells induced by endothelial cell RANTES / T. Kawai,
M. Seki, K. Hiromatsu, J.W. Eastcott, G.F. Watts, M. Sugai, D.J. Smith, S.A. Porcelli, M.A.
Taubman // J Immunol. – 1999. – Vol.163, №6. – P.3269-3278.
178.
Khaiboullina S.F. Effects of tumor necrosis factor alpha on sin nombre virus infection in vitro
/ S.F. Khaiboullina, D.M. Netski, P. Krumpe, S.C. St Jeor // J Virol. – 2000. – Vol.74, №24. –
P.11966-11971.
199
179.
Khan A.S. Fatal illness associated with a new hantavirus in Louisiana / A.S. Khan, C.F.
Spiropoulou, S. Morzunov, S.R. Zaki, M.A. Kohn, S.R. Nawas, L. McFarland, S.T. Nichol // J Med
Virol. – 1995. – Vol.46, №3. – P.281-286.
180.
Khan A.S. Hantavirus pulmonary syndrome in Florida: association with the newly identified
Black Creek Canal virus / A.S. Khan, M. Gaviria, P.E. Rollin, W.G. Hlady, T.G. Ksiazek, L.R.
Armstrong, R. Greenman, E. Ravkov, M. Kolber, H. Anapol, E.D. Sfakianaki, S.T. Nichol, C.J.
Peters, R.F. Khabbaz // Am J Med. – 1996. – Vol.100, №1. – P.46-48.
181.
Khan A.S. Hantavirus pulmonary syndrome: the first 100 US cases / A.S. Khan, R.F.
Khabbaz, L.R. Armstrong, R.C. Holman, S.P. Bauer, J. Graber, T. Strine, G. Miller, S. Reef, J.
Tappero, P.E. Rollin, S.T. Nichol, S.R. Zaki, R.T. Bryan, L.E. Chapman, C.J. Peters, T.G. Ksiazek //
J Infect Dis. – 1996. – Vol.173, №6. – P.1297-1303.
182.
Khismatullina N.A. Epidemiological dynamics of nephropathia epidemica in the Republic of
Tatarstan, Russia, during the period of 1997-2013 / N.A. Khismatullina, M.M. Karimov, K.S.
Khaertynov, E.A. Shuralev, S.P. Morzunov, I.M. Khaertynova, A.A. Ivanov, I.V. Milova, M.B.
Khakimzyanova, G.S. Sayfullina, A.A. Gaynullin, A.V. Ivanov, A.A. Rizvanov, S.F. Khaiboullina //
Epidemiol Infect. – 2015. – P.1-9.
183.
Kielian M. Membrane fusion and the alphavirus life cycle / M. Kielian // Adv Virus Res. –
1995. – Vol.45. – P.113-151.
184.
Kilpatrick E.D. Role of specific CD8+ T cells in the severity of a fulminant zoonotic viral
hemorrhagic fever, hantavirus pulmonary syndrome / E.D. Kilpatrick, M. Terajima, F.T. Koster,
M.D. Catalina, J. Cruz, F.A. Ennis // J Immunol. – 2004. – Vol.172, №5. – P.3297-3304.
185.
Kim G.R. Pathogenesis of Hantaan virus infection in suckling mice: clinical, virologic, and
serologic observations / G.R. Kim, K.T. McKee, Jr. // Am J Trop Med Hyg. – 1985. – Vol.34, №2. –
P.388-395.
186.
Kitsutani P.T. Acute Sin Nombre hantavirus infection without pulmonary syndrome, United
States / P.T. Kitsutani, R.W. Denton, C.L. Fritz, R.A. Murray, R.L. Todd, W.J. Pape, J. Wyatt
Frampton, J.C. Young, A.S. Khan, C.J. Peters, T.G. Ksiazek // Emerg Infect Dis. – 1999. – Vol.5,
№5. – P.701-705.
187.
Klein S.L. Differential expression of immunoregulatory genes in male and female Norway
rats following infection with Seoul virus / S.L. Klein, A. Cernetich, S. Hilmer, E.P. Hoffman, A.L.
Scott, G.E. Glass // J Med Virol. – 2004. – Vol.74, №1. – P.180-190.
200
188.
Klempa B. Genetic interaction between distinct Dobrava hantavirus subtypes in Apodemus
agrarius and A. flavicollis in nature / B. Klempa, H.A. Schmidt, R. Ulrich, S. Kaluz, M. Labuda, H.
Meisel, B. Hjelle, D.H. Kruger // J Virol. – 2003. – Vol.77, №1. – P.804-809.
189.
Klingstrom J. Wild-type Puumala hantavirus infection induces cytokines, C-reactive protein,
creatinine, and nitric oxide in cynomolgus macaques / J. Klingstrom, A. Plyusnin, A. Vaheri, A.
Lundkvist // J Virol. – 2002. – Vol.76, №1. – P.444-449.
190.
Kochs G. Antivirally active MxA protein sequesters La Crosse virus nucleocapsid protein into
perinuclear complexes / G. Kochs, C. Janzen, H. Hohenberg, O. Haller // Proc Natl Acad Sci U S A.
– 2002. – Vol.99, №5. – P.3153-3158.
191.
Kolakofsky D. Bunyavirus RNA synthesis: genome transcription and replication / D.
Kolakofsky, D. Hacker // Curr Top Microbiol Immunol. – 1991. – Vol.169. – P.143-159.
192.
Kou Z. Monocytes, but not T or B cells, are the principal target cells for dengue virus (DV)
infection among human peripheral blood mononuclear cells / Z. Kou, M. Quinn, H. Chen, W.W.
Rodrigo, R.C. Rose, J.J. Schlesinger, X. Jin // J Med Virol. – 2008. – Vol.80, №1. – P.134-146.
193.
Krakauer T. Serum levels of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1, and interleukin-6 in
hemorrhagic fever with renal syndrome / T. Krakauer, J.W. Leduc, H. Krakauer // Viral Immunol. –
1995. – Vol.8, №2. – P.75-79.
194.
Krause R. Puumala virus infection with acute disseminated encephalomyelitis and multiorgan
failure / R. Krause, S. Aberle, R. Haberl, F. Daxbock, C. Wenisch // Emerg Infect Dis. – 2003. –
Vol.9, №5. – P.603-605.
195.
Kruger D.H. Hantaviruses as zoonotic pathogens in Germany / D.H. Kruger, R.G. Ulrich, J.
Hofmann // Dtsch Arztebl Int. – 2013. – Vol.110, №27-28. – P.461-467.
196.
Kuenzi A.J. Antibody to sin nombre virus in rodents associated with peridomestic habitats in
west central Montana / A.J. Kuenzi, R.J. Douglass, D. White, Jr., C.W. Bond, J.N. Mills // Am J Trop
Med Hyg. – 2001. – Vol.64, №3-4. – P.137-146.
197.
Kumar K.P. Regulated nuclear-cytoplasmic localization of interferon regulatory factor 3, a
subunit of double-stranded RNA-activated factor 1 / K.P. Kumar, K.M. McBride, B.K. Weaver, C.
Dingwall, N.C. Reich // Mol Cell Biol. – 2000. – Vol.20, №11. – P.4159-4168.
198.
Kurata T. Immunofluorescence studies of disseminated Hantaan virus infection of suckling
mice / T. Kurata, T.F. Tsai, S.P. Bauer, J.B. McCormick // Infect Immun. – 1983. – Vol.41, №1. –
P.391-398.
201
199.
Kuzman I. The biggest epidemic of hemorrhagic fever with renal syndrome in Croatia / I.
Kuzman, I. Puljiz, D. Turcinov, A. Markotic, B. Turkovic, B. Aleraj, Z. Andric, D. Petkovic, V.
Tutek, B. Herendic, M. Iskra, N. Pandak, Z. Misetic, L. Peric, D. Jelaska, M. Majetic-Sekovanic, D.
Ledina, L. Misic-Majerus, R. Radonic // Acta Med Croatica. – 2003. – Vol.57, №5. – P.337-346.
200.
Kyriakidis I. Serum TNF-alpha, sTNFR1, IL-6, IL-8 and IL-10 levels in hemorrhagic fever
with renal syndrome / I. Kyriakidis, A. Papa // Virus Res. – 2013. – Vol.175, №1. – P.91-94.
201.
Lahdevirta J. Nephropathia epidemica in Finland. A clinical histological and epidemiological
study / J. Lahdevirta // Ann Clin Res. – 1971. – Vol.3. – P.1-54.
202.
Lanciotti R.S. Molecular evolution and epidemiology of dengue-3 viruses / R.S. Lanciotti,
J.G. Lewis, D.J. Gubler, D.W. Trent // J Gen Virol. – 1994. – Vol.75 ( Pt 1). – P.65-75.
203.
Lane B.R. TNF-alpha inhibits HIV-1 replication in peripheral blood monocytes and alveolar
macrophages by inducing the production of RANTES and decreasing C-C chemokine receptor 5
(CCR5) expression / B.R. Lane, D.M. Markovitz, N.L. Woodford, R. Rochford, R.M. Strieter, M.J.
Coffey // J Immunol. – 1999. – Vol.163, №7. – P.3653-3661.
204.
Lednicky J.A. Hantaviruses. a short review / J.A. Lednicky // Arch Pathol Lab Med. – 2003. –
Vol.127, №1. – P.30-35.
205.
Lee H.W. Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever, from
wild urban rats / H.W. Lee, L.J. Baek, K.M. Johnson // J Infect Dis. – 1982. – Vol.146, №5. – P.638644.
206.
Lee H.W. Korean hemorrhagic fever / H.W. Lee // Prog Med Virol. – 1982. – Vol.28. – P.96-
113.
207.
Lee M. Coagulopathy in hemorrhagic fever with renal syndrome (Korean hemorrhagic fever)
/ M. Lee, B.K. Kim, S. Kim, S. Park, J.S. Han, S.T. Kim, J.S. Lee // Rev Infect Dis. – 1989. – Vol.11
Suppl 4. – P.S877-883.
208.
Lee M. Coagulopathy in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome / M. Lee // J
Korean Med Sci. – 1987. – Vol.2, №4. – P.201-211.
209.
Lee S.H. Epidemiology of hemorrhagic fever with renal syndrome in Korea, 2001-2010 / S.H.
Lee, B.H. Chung, W.C. Lee, I.S. Choi // J Korean Med Sci. – 2013. – Vol.28, №10. – P.1552-1554.
210.
Leung D.W. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen / D.W.
Leung, G. Cachianes, W.J. Kuang, D.V. Goeddel, N. Ferrara // Science. – 1989. – Vol.246, №4935. –
P.1306-1309.
202
211.
Levis S. Genetic diversity and epidemiology of hantaviruses in Argentina / S. Levis, S.P.
Morzunov, J.E. Rowe, D. Enria, N. Pini, G. Calderon, M. Sabattini, S.C. St Jeor // J Infect Dis. –
1998. – Vol.177, №3. – P.529-538.
212.
Levis S. Hantavirus pulmonary syndrome in northwestern Argentina: circulation of Laguna
Negra virus associated with Calomys callosus / S. Levis, J. Garcia, N. Pini, G. Calderon, J. Ramirez,
D. Bravo, S. St Jeor, C. Ripoll, M. Bego, E. Lozano, R. Barquez, T.G. Ksiazek, D. Enria // Am J
Trop Med Hyg. – 2004. – Vol.71, №5. – P.658-663.
213.
Levis S. New hantaviruses causing hantavirus pulmonary syndrome in central Argentina / S.
Levis, J.E. Rowe, S. Morzunov, D.A. Enria, S. St Jeor // Lancet. – 1997. – Vol.349, №9057. – P.998999.
214.
Lewis J. D. Dengue type 3 infection. Nicaragua and Panama, October-November 1994 / J. D.
Lewis // Wkly Epidemiol Rec. – 1995. – Vol.70, №6. – P.41-43.
215.
Lewis R.M. Changes in populations of immune effector cells during the course of
haemorrhagic fever with renal syndrome / R.M. Lewis, H.W. Lee, A.F. See, D.B. Parrish, J.S. Moon,
D.J. Kim, T.M. Cosgriff // Trans R Soc Trop Med Hyg. – 1991. – Vol.85, №2. – P.282-286.
216.
Li D. Complete nucleotide sequences of the M and S segments of two hantavirus isolates
from California: evidence for reassortment in nature among viruses related to hantavirus pulmonary
syndrome / D. Li, A.L. Schmaljohn, K. Anderson, C.S. Schmaljohn // Virology. – 1995. – Vol.206,
№2. – P.973-983.
217.
Li X.D. Hantavirus nucleocapsid protein interacts with the Fas-mediated apoptosis enhancer
Daxx / X.D. Li, T.P. Makela, D. Guo, R. Soliymani, V. Koistinen, O. Vapalahti, A. Vaheri, H.
Lankinen // J Gen Virol. – 2002. – Vol.83, №Pt 4. – P.759-766.
218.
Limkittikul K. Epidemiological trends of dengue disease in Thailand (2000-2011): a
systematic literature review / K. Limkittikul, J. Brett, M. L'Azou // PLoS Negl Trop Dis. – 2014. –
Vol.8, №11. – P.e3241.
219.
Lin R. Essential role of interferon regulatory factor 3 in direct activation of RANTES
chemokine transcription / R. Lin, C. Heylbroeck, P. Genin, P.M. Pitha, J. Hiscott // Mol Cell Biol. –
1999. – Vol.19, №2. – P.959-966.
220.
Linderholm M. Clinical characteristics of hantavirus infections on the Eurasian continent / M.
LinderholmF. Elgh // Curr Top Microbiol Immunol. – 2001. – Vol.256. – P.135-151.
221.
Linderholm M. Elevated plasma levels of tumor necrosis factor (TNF)-alpha, soluble TNF
receptors, interleukin (IL)-6, and IL-10 in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome / M.
203
Linderholm, C. Ahlm, B. Settergren, A. Waage, A. Tarnvik // J Infect Dis. – 1996. – Vol.173, №1. –
P.38-43.
222.
Liu W. Safety and immunogenicity of inactivated bivalent EHF vaccine in humans / W. Liu,
X. Xu, Y. Ruan, S. Weng, W. Liu, W. Zhou, G. Dong, H. Gu, Z. Zhu, Z. Xu // Zhonghua Liu Xing
Bing Xue Za Zhi. – 2000. – Vol.21, №6. – P.445-447.
223.
Lobas J. Genetic analysis of sin nombre hantavirus in Iowa / J. Lobas, J.J. Smith, M.D.
Moore, C. Grose, J.E. Rowe, S.C. St Jeor // Pediatr Infect Dis J. – 2000. – Vol.19, №4. – P.355-358.
224.
Lober C. The Hantaan virus glycoprotein precursor is cleaved at the conserved pentapeptide
WAASA / C. Lober, B. Anheier, S. Lindow, H.D. Klenk, H. Feldmann // Virology. – 2001. –
Vol.289, №2. – P.224-229.
225.
Loehman R.A. Prediction of Peromyscus maniculatus (deer mouse) population dynamics in
Montana, USA, using satellite-driven vegetation productivity and weather data / R.A. Loehman, J.
Elias, R.J. Douglass, A.J. Kuenzi, J.N. Mills, K. Wagoner // J Wildl Dis. – 2012. – Vol.48, №2. –
P.348-360.
226.
Lopez N. Genetic identification of a new hantavirus causing severe pulmonary syndrome in
Argentina / N. Lopez, P. Padula, C. Rossi, M.E. Lazaro, M.T. Franze-Fernandez // Virology. – 1996.
– Vol.220, №1. – P.223-226.
227.
Lucisano Valim Y.M. The effect of antibody isotype and antigenic epitope density on the
complement-fixing activity of immune complexes: a systematic study using chimaeric anti-NIP
antibodies with human Fc regions / Y.M. Lucisano Valim, P.J. Lachmann // Clin Exp Immunol. –
1991. – Vol.84, №1. – P.1-8.
228.
Luini A. Morphogenesis of post-Golgi transport carriers / A. Luini, A.A. Mironov, E.V.
Polishchuk, R.S. Polishchuk // Histochem Cell Biol. – 2008. – Vol.129, №2. – P.153-161.
229.
Lundkvist A. Antigenic variation of European haemorrhagic fever with renal syndrome virus
strains characterized using bank vole monoclonal antibodies / A. Lundkvist, A. Fatouros, B.
Niklasson // J Gen Virol. – 1991. – Vol.72 ( Pt 9). – P.2097-2103.
230.
Lundkvist A. Bank vole monoclonal antibodies against Puumala virus envelope
glycoproteins: identification of epitopes involved in neutralization / A. Lundkvist, B. Niklasson //
Arch Virol. – 1992. – Vol.126, №1-4. – P.93-105.
231.
Lundkvist A. Characterization of Puumala virus nucleocapsid protein: identification of B-cell
epitopes and domains involved in protective immunity / A. Lundkvist, H. Kallio-Kokko, K.B.
204
Sjolander, H. Lankinen, B. Niklasson, A. Vaheri, O. Vapalahti // Virology. – 1996. – Vol.216, №2. –
P.397-406.
232.
Lundkvist A. Characterization of Tula virus antigenic determinants defined by monoclonal
antibodies raised against baculovirus-expressed nucleocapsid protein / A. Lundkvist, O. Vapalahti, A.
Plyusnin, K.B. Sjolander, B. Niklasson, A. Vaheri // Virus Res. – 1996. – Vol.45, №1. – P.29-44.
233.
Lundkvist A. Immunoglobulin G subclass responses against the structural components of
Puumala virus / A. Lundkvist, S. Bjorsten, B. Niklasson // J Clin Microbiol. – 1993. – Vol.31, №2. –
P.368-372.
234.
Lundkvist A. Puumala and Dobrava viruses cause hemorrhagic fever with renal syndrome in
Bosnia-Herzegovina: evidence of highly cross-neutralizing antibody responses in early patient sera /
A. Lundkvist, M. Hukic, J. Horling, M. Gilljam, S. Nichol, B. Niklasson // J Med Virol. – 1997. –
Vol.53, №1. – P.51-59.
235.
Lundkvist A. The humoral response to Puumala virus infection (nephropathia epidemica)
investigated by viral protein specific immunoassays / A. Lundkvist, J. Horling, B. Niklasson // Arch
Virol. – 1993. – Vol.130, №1-2. – P.121-130.
236.
Lundqvist M.L. Immunoglobulins of the non-galliform birds: antibody expression and
repertoire in the duck / M.L. Lundqvist, D.L. Middleton, C. Radford, G.W. Warr, K.E. Magor // Dev
Comp Immunol. – 2006. – Vol.30, №1-2. – P.93-100.
237.
Madge L.A. TNF signaling in vascular endothelial cells / L.A. Madge, J.S. Pober // Exp Mol
Pathol. – 2001. – Vol.70, №3. – P.317-325.
238.
Maeda A. The intracellular association of the nucleocapsid protein (NP) of hantaan virus
(HTNV) with small ubiquitin-like modifier-1 (SUMO-1) conjugating enzyme 9 (Ubc9) / A. Maeda,
B.H. Lee, K. Yoshimatsu, M. Saijo, I. Kurane, J. Arikawa, S. Morikawa // Virology. – 2003. –
Vol.305, №2. – P.288-297.
239.
Maini R.N. Anti-cytokine therapy for rheumatoid arthritis / R.N. Maini, P.C. Taylor // Annu
Rev Med. – 2000. – Vol.51. – P.207-229.
240.
Makary P. Disease burden of Puumala virus infections, 1995-2008 / P. Makary, M. Kanerva,
J. Ollgren, M.J. Virtanen, O. Vapalahti, O. Lyytikainen // Epidemiol Infect. – 2010. – Vol.138, №10.
– P.1484-1492.
241.
Mann D.W. Pulmonary compartmentalization of interferon and natural killer cell activity /
D.W. Mann, G. Sonnenfeld, J. Stein-Streilein // Proc Soc Exp Biol Med. – 1985. – Vol.180, №2. –
P.224-230.
205
242.
Marchette N.J. Dengue virus replication in cultures of peripheral blood leukocytes during the
course of dengue haemorrhagic fever / N.J. Marchette, J.S. Sung Chow, S.B. Halstead, S. Lolekha, B.
Pongpanich // Southeast Asian J Trop Med Public Health. – 1975. – Vol.6, №3. – P.316-321.
243.
Marchette N.J. Studies on the pathogenesis of dengue infection in monkeys. 3. Sequential
distribution of virus in primary and heterologous infections / N.J. Marchette, S.B. Halstead, W.A.
Falkler, Jr., A. Stenhouse, D. Nash // J Infect Dis. – 1973. – Vol.128, №1. – P.23-30.
244.
Marie I. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback
through interferon regulatory factor-7 / I. Marie, J.E. Durbin, D.E. Levy // EMBO J. – 1998. –
Vol.17, №22. – P.6660-6669.
245.
Marovich M. Human dendritic cells as targets of dengue virus infection / M. Marovich, G.
Grouard-Vogel, M. Louder, M. Eller, W. Sun, S.J. Wu, R. Putvatana, G. Murphy, B. Tassaneetrithep,
T. Burgess, D. Birx, C. Hayes, S. Schlesinger-Frankel, J. Mascola // J Investig Dermatol Symp Proc.
– 2001. – Vol.6, №3. – P.219-224.
246.
Matsukawa A. Chemokines and innate immunity / A. Matsukawa, C.M. Hogaboam, N.W.
Lukacs, S.L. Kunkel // Rev Immunogenet. – 2000. – Vol.2, №3. – P.339-358.
247.
Mazanec M.B. Immunoglobulin A monoclonal antibodies protect against Sendai virus / M.B.
Mazanec, J.G. Nedrud, M.E. Lamm // J Virol. – 1987. – Vol.61, №8. – P.2624-2626.
248.
Mazanec M.B. Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies / M.B.
Mazanec, C.S. Kaetzel, M.E. Lamm, D. Fletcher, J.G. Nedrud // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1992. –
Vol.89, №15. – P.6901-6905.
249.
Meng X.S. Using recombinant antigens of Hantavirus to study the kinetics of serum IgA, IgG,
IgM antibodies in the acute-phase of hemorrhagic fever renal syndrome / X.S. Meng, Y.P. Chen, C.
Li, J.S. Yu, Y.M. Guo, Q.F. Zhang, Y.L. Sun, D.X. Li // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du
Xue Za Zhi. – 2003. – Vol.17, №3. – P.254-257.
250.
Mertz G.J. Placebo-controlled, double-blind trial of intravenous ribavirin for the treatment of
hantavirus cardiopulmonary syndrome in North America / G.J. Mertz, L. Miedzinski, D. Goade, A.T.
Pavia, B. Hjelle, C.O. Hansbarger, H. Levy, F.T. Koster, K. Baum, A. Lindemulder, W. Wang, L.
Riser, H. Fernandez, R.J. Whitley, G. Collaborative Antiviral Study // Clin Infect Dis. – 2004. –
Vol.39, №9. – P.1307-1313.
251.
Messer W.B. Emergence and global spread of a dengue serotype 3, subtype III virus / W.B.
Messer, D.J. Gubler, E. Harris, K. Sivananthan, A.M. de Silva // Emerg Infect Dis. – 2003. – Vol.9,
№7. – P.800-809.
206
252.
Meyre D. Comment on: Valette et al. Melanocortin-4 receptor mutations and polymorphisms
do not affect weight loss after bariatric surgery. PLOS ONE 2012; 7(11):E48221 / D. Meyre, P.
Froguel, F.F. Horber, J.G. Kral // PLoS One. – 2014. – Vol.9, №3. – P.e93324.
253.
Mir M.A. The hantavirus nucleocapsid protein recognizes specific features of the viral RNA
panhandle and is altered in conformation upon RNA binding / M.A. Mir, A.T. Panganiban // J Virol.
– 2005. – Vol.79, №3. – P.1824-1835.
254.
Mir M.A. Trimeric hantavirus nucleocapsid protein binds specifically to the viral RNA
panhandle / M.A. Mir, A.T. Panganiban // J Virol. – 2004. – Vol.78, №15. – P.8281-8288.
255.
Mitrakul C. Hemostatic and platelet kinetic studies in dengue hemorrhagic fever / C.
Mitrakul, M. Poshyachinda, P. Futrakul, N. Sangkawibha, S. Ahandrik // Am J Trop Med Hyg. –
1977. – Vol.26, №5 Pt 1. – P.975-984.
256.
Miyamoto H. Serological analysis of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) patients
in Far Eastern Russia and identification of the causative hantavirus genotype / H. Miyamoto, H.
Kariwa, K. Araki, K. Lokugamage, D. Hayasaka, B.Z. Cui, N. Lokugamage, L.I. Ivanov, T.
Mizutani, M.A. Iwasa, K. Yoshimatsu, J. Arikawa, I. Takashima // Arch Virol. – 2003. – Vol.148,
№8. – P.1543-1556.
257.
Mohd-Zaki A.H. Epidemiology of dengue disease in Malaysia (2000-2012): a systematic
literature review / A.H. Mohd-Zaki, J. Brett, E. Ismail, M. L'Azou // PLoS Negl Trop Dis. – 2014. –
Vol.8, №11. – P.e3159.
258.
Mori M. High levels of cytokine-producing cells in the lung tissues of patients with fatal
hantavirus pulmonary syndrome / M. Mori, A.L. Rothman, I. Kurane, J.M. Montoya, K.B. Nolte, J.E.
Norman, D.C. Waite, F.T. Koster, F.A. Ennis // J Infect Dis. – 1999. – Vol.179, №2. – P.295-302.
259.
Morzunov S.P. Genetic analysis of the diversity and origin of hantaviruses in Peromyscus
leucopus mice in North America / S.P. Morzunov, J.E. Rowe, T.G. Ksiazek, C.J. Peters, S.C. St Jeor,
S.T. Nichol // J Virol. – 1998. – Vol.72, №1. – P.57-64.
260.
Mustonen J. Association of HLA B27 with benign clinical course of nephropathia epidemica
caused by Puumala hantavirus / J. Mustonen, J. Partanen, M. Kanerva, K. Pietila, O. Vapalahti, A.
Pasternack, A. Vaheri // Scand J Immunol. – 1998. – Vol.47, №3. – P.277-279.
261.
Mustonen J. Renal biopsy findings and clinicopathologic correlations in nephropathia
epidemica / J. Mustonen, H. Helin, K. Pietila, M. Brummer-Korvenkontio, K. Hedman, A. Vaheri, A.
Pasternack // Clin Nephrol. – 1994. – Vol.41, №3. – P.121-126.
207
262.
Myers R.M. Experiences with the Isolation of Dengue Virus Types 1, 2 and 4 from Human
Blood / R.M. Myers, D.E. Carey, F.M. Rodriques // Indian J Med Res. – 1965. – Vol.53. – P.191198.
263.
Nakamura T. Differential susceptibility and resistance of immunocompetent and
immunodeficient mice to fatal Hantaan virus infection / T. Nakamura, R. Yanagihara, C.J. Gibbs, Jr.,
H.L. Amyx, D.C. Gajdusek // Arch Virol. – 1985. – Vol.86, №1-2. – P.109-120.
264.
Nakamura T. Immune spleen cell-mediated protection against fatal Hantaan virus infection in
infant mice / T. Nakamura, R. Yanagihara, C.J. Gibbs, Jr., D.C. Gajdusek // J Infect Dis. – 1985. –
Vol.151, №4. – P.691-697.
265.
Na-Nakorn S. Bone-marrow studies in Thai haemorrhagic fever / S. Na-Nakorn, A.
Suingdumrong, S. Pootrakul, N. Bhamarapravati // Bull World Health Organ. – 1966. – Vol.35, №1.
– P.54-55.
266.
Nathan C.F. Identification of interferon-gamma as the lymphokine that activates human
macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity / C.F. Nathan, H.W. Murray, M.E.
Wiebe, B.Y. Rubin // J Exp Med. – 1983. – Vol.158, №3. – P.670-689.
267.
Navarro-Sanchez E. Dendritic-cell-specific ICAM3-grabbing non-integrin is essential for the
productive infection of human dendritic cells by mosquito-cell-derived dengue viruses / E. NavarroSanchez, R. Altmeyer, A. Amara, O. Schwartz, F. Fieschi, J.L. Virelizier, F. Arenzana-Seisdedos, P.
Despres // EMBO Rep. – 2003. – Vol.4, №7. – P.723-728.
268.
Nelson E.R. Dengue Fever: A Thrombocytopenic Disease? / E.R. Nelson, H.R. Bierman //
JAMA. – 1964. – Vol.190. – P.99-103.
269.
Nelson E.R. Haematology of Thai haemorrhagic fever (dengue) / E.R. Nelson, S. Tuchinda,
H.R. Bierman, R. Chulajata // Bull World Health Organ. – 1966. – Vol.35, №1. – P.43-44.
270.
Nelson E.R. Hematologic Findings in the 1960 Hemorrhagic Fever Epidemic (Dengue) in
Thailand / E.R. Nelson, H.R. Bierman, R. Chulajata // Am J Trop Med Hyg. – 1964. – Vol.13. –
P.642-649.
271.
Nemirov K. Isolation and characterization of Dobrava hantavirus carried by the striped field
mouse (Apodemus agrarius) in Estonia / K. Nemirov, O. Vapalahti, A. Lundkvist, V. Vasilenko, I.
Golovljova, A. Plyusnina, J. Niemimaa, J. Laakkonen, H. Henttonen, A. Vaheri, A. Plyusnin // J Gen
Virol. – 1999. – Vol.80 ( Pt 2). – P.371-379.
208
272.
Neuzil K.M. Protective Role of TNF-alpha in respiratory syncytial virus infection in vitro and
in vivo / K.M. Neuzil, Y.W. Tang, B.S. Graham // Am J Med Sci. – 1996. – Vol.311, №5. – P.201204.
273.
Nguyen A.T. Respiratory manifestations of hemorrhagic fever with renal syndrome.
Retrospective study of 129 cases in Champagne-Ardenne and Lorraine / A.T. Nguyen, C. Penalba, P.
Bernadac, S. Jaafar, M. Kessler, P. Canton, B. Hoen // Presse Med. – 2001. – Vol.30, №2. – P.55-58.
274.
Niklasson B. An epidemiologic study of hemorrhagic fever with renal syndrome in
Bashkirtostan (Russia) and Sweden / B. Niklasson, B. Hornfeldt, M. Mullaart, [et al] // Am J Trop
Med Hyg. – 1993. – Vol.48, №5. – P.670-675.
275.
Noisakran S. Cells in dengue virus infection in vivo / S. Noisakran, N. Onlamoon, P.
Songprakhon, H.M. Hsiao, K. Chokephaibulkit, G.C. Perng // Adv Virol. – 2010. – Vol.2010. –
P.164878.
276.
Nolte K.B. Hantavirus pulmonary syndrome in the United States: a pathological description
of a disease caused by a new agent / K.B. Nolte, R.M. Feddersen, K. Foucar, S.R. Zaki, F.T. Koster,
D. Madar, T.L. Merlin, P.J. McFeeley, E.T. Umland, R.E. Zumwalt // Hum Pathol. – 1995. – Vol.26,
№1. – P.110-120.
277.
Nurgaleeva R.G. An epidemiological analysis of hemorrhagic fever with renal syndrome
morbidity in the Republic of Bashkortostan in 1997 / R.G. Nurgaleeva, E.A. Tkachenko, A.G.
Stepanenko, I.M. Mustafin, S.G. Kireev, T.K. Dzagurova, A.E. Dekonenko, L.A. Klimchuk, G.D.
Minin // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. – 1999, №6. – P.45-49.
278.
Ohdama S. Pentoxifylline prevents tumor necrosis factor-induced suppression of endothelial
cell surface thrombomodulin / S. Ohdama, S. Takano, K. Ohashi, S. Miyake, N. Aoki // Thromb Res.
– 1991. – Vol.62, №6. – P.745-755.
279.
Okuno Y. Haemagglutination-inhibition test for haemorrhagic fever with renal syndrome
using virus antigen prepared from infected tissue culture fluid / Y. Okuno, K. Yamanishi, Y.
Takahashi, O. Tanishita, T. Nagai, J.R. Dantas, Jr., Y. Okamoto, M. Tadano, M. Takahashi // J Gen
Virol. – 1986. – Vol.67 ( Pt 1). – P.149-156.
280.
Olsson G.E. Predicting high risk for human hantavirus infections, Sweden / G.E. Olsson, M.
Hjertqvist, A. Lundkvist, B. Hornfeldt // Emerg Infect Dis. – 2009. – Vol.15, №1. – P.104-106.
281.
Otteson E.W. Occurrence of hantavirus within the rodent population of northeastern
California and Nevada / E.W. Otteson, J. Riolo, J.E. Rowe, S.T. Nichol, T.G. Ksiazek, P.E. Rollin,
S.C. St Jeor // Am J Trop Med Hyg. – 1996. – Vol.54, №2. – P.127-133.
209
282.
Oxford J.S. Inhibition of the replication of influenza A and B viruses by a nucleoside
analogue (ribavirin) / J.S. Oxford // J Gen Virol. – 1975. – Vol.28, №3. – P.409-414.
283.
Pa l E. Hemorrhagic fever with renal syndrome in the Pomurje region of Slovenia--an 18-year
survey / E. Pal, F. Strle, T. Avsic-Zupanc // Wien Klin Wochenschr. – 2005. – Vol.117, №11-12. –
P.398-405.
284.
Paakkala A. Complement activation in nephropathia epidemica caused by Puumala hantavirus
/ A. Paakkala, J. Mustonen, M. Viander, H. Huhtala, A. Pasternack // Clin Nephrol. – 2000. – Vol.53,
№6. – P.424-431.
285.
Padula P.J. Genetic diversity, distribution, and serological features of hantavirus infection in
five countries in South America / P.J. Padula, S.B. Colavecchia, V.P. Martinez, M.O. Gonzalez Della
Valle, A. Edelstein, S.D. Miguel, J. Russi, J.M. Riquelme, N. Colucci, M. Almiron, R.D. Rabinovich
// J Clin Microbiol. – 2000. – Vol.38, №8. – P.3029-3035.
286.
Padula P.J. Hantavirus pulmonary syndrome outbreak in Argentina: molecular evidence for
person-to-person transmission of Andes virus / P.J. Padula, A. Edelstein, S.D. Miguel, N.M. Lopez,
C.M. Rossi, R.D. Rabinovich // Virology. – 1998. – Vol.241, №2. – P.323-330.
287.
Pekalski J. Spontaneous NF-kappaB activation by autocrine TNFalpha signaling: a
computational analysis / J. Pekalski, P.J. Zuk, M. Kochanczyk [et al.] // PLoS One. – 2013. – Vol.8,
№11. – P.e78887.
288.
Peng G. Frequent occurrence of genetic reassortment between influenza C virus strains in
nature / G. Peng, S. Hongo, H. Kimura, Y. Muraki [et al.] // J Gen Virol. – 1996. – Vol.77 ( Pt 7). –
P.1489-1492.
289.
Pensiero M.N. Expression of the Hantaan virus M genome segment by using a vaccinia virus
recombinant / M.N. Pensiero, G.B. Jennings, C.S. Schmaljohn, J. Hay // J Virol. – 1988. – Vol.62,
№3. – P.696-702.
290.
Pensiero M.N. Hantaan virus infection of human endothelial cells / M.N. Pensiero, J.B.
Sharefkin, C.W. Dieffenbach, J. Hay // J Virol. – 1992. – Vol.66, №10. – P.5929-5936.
291.
Pensiero M.N. The Hantaan virus M-segment glycoproteins G1 and G2 can be expressed
independently / M.N. Pensiero, J. Hay // J Virol. – 1992. – Vol.66, №4. – P.1907-1914.
292.
Penttinen K. Circulating immune complexes, immunoconglutinins, and rheumatoid factors in
nephropathia epidemica / K. Penttinen, J. Lahdevirta, R. Kekomaki, B. Ziola, A. Salmi, A. Hautanen,
P. Lindstrom, A. Vaheri, M. Brummer-Korvenkontio, O. Wager // J Infect Dis. – 1981. – Vol.143,
№1. – P.15-21.
210
293.
Peters C.J. Spectrum of hantavirus infection: hemorrhagic fever with renal syndrome and
hantavirus pulmonary syndrome / C.J. Peters, G.L. Simpson, H. Levy // Annu Rev Med. – 1999. –
Vol.50. – P.531-545.
294.
Plyusnin A. Dobrava hantavirus in Estonia: does the virus exist throughout Europe? / A.
Plyusnin, O. Vapalahti, V. Vasilenko, H. Henttonen, A. Vaheri // Lancet. – 1997. – Vol.349, №9062.
– P.1369-1370.
295.
Plyusnin A. Genetic interaction between Dobrava and Saaremaa hantaviruses: now or
millions of years ago? / A. Plyusnin, A. Vaheri, A. Lundkvist // J Virol. – 2003. – Vol.77, №12. –
P.7156-7157;
296.
Plyusnin A. Virus evolution and genetic diversity of hantaviruses and their rodent hosts / A.
Plyusnin, S.P. Morzunov // Curr Top Microbiol Immunol. – 2001. – Vol.256. – P.47-75.
297.
Raboni S.M. Clinical survey of hantavirus in southern Brazil and the development of specific
molecular diagnosis tools / S.M. Raboni, G. Rubio, D.E.B. L, A. Zeferino, I. Skraba, S. Goldenberg,
C.N. Dos Santos // Am J Trop Med Hyg. – 2005. – Vol.72, №6. – P.800-804.
298.
Ranjit S. Dengue hemorrhagic fever and shock syndromes / S. Ranjit, N. Kissoon // Pediatr
Crit Care Med. – 2011. – Vol.12, №1. – P.90-100.
299.
Rawlings J.A. Cocirculation of multiple hantaviruses in Texas, with characterization of the
small (S) genome of a previously undescribed virus of cotton rats (Sigmodon hispidus) / J.A.
Rawlings, N. Torrez-Martinez, S.U. Neill, G.M. Moore, B.N. Hicks, S. Pichuantes, A. Nguyen, M.
Bharadwaj, B. Hjelle // Am J Trop Med Hyg. – 1996. – Vol.55, №6. – P.672-679.
300.
Regad T. PML mediates the interferon-induced antiviral state against a complex retrovirus via
its association with the viral transactivator / T. Regad, A. Saib, V. Lallemand-Breitenbach, P.P.
Pandolfi, H. de The, M.K. Chelbi-Alix // EMBO J. – 2001. – Vol.20, №13. – P.3495-3505.
301.
Reis E.A. Cytokine response signatures in disease progression and development of severe
clinical outcomes for leptospirosis / E.A. Reis, J.E. Hagan, G.S. Ribeiro, A. Teixeira-Carvalho, O.A.
Martins-Filho, R.R. Montgomery, A.C. Shaw, A.I. Ko, M.G. Reis // PLoS Negl Trop Dis. – 2013. –
Vol.7, №9. – P.e2457.
302.
Rhodes L.V. Hantavirus pulmonary syndrome associated with Monongahela virus,
Pennsylvania / L.V. Rhodes, 3rd, C. Huang, A.J. Sanchez, [et al.] // Emerg Infect Dis. – 2000. –
Vol.6, №6. – P.616-621.
211
303.
Rodrigues R. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus-infected hepatocytes induce ER-stress
and apoptosis crosstalk / R. Rodrigues, G. Paranhos-Baccala, G. Vernet, C.N. Peyrefitte // PLoS One.
– 2012. – Vol.7, №1. – P.e29712.
304.
Rodriguez L.L. Genetic reassortment among viruses causing hantavirus pulmonary syndrome
/ L.L. Rodriguez, J.H. Owens, C.J. Peters, S.T. Nichol // Virology. – 1998. – Vol.242, №1. – P.99106.
305.
Rollin P.E. Isolation of black creek canal virus, a new hantavirus from Sigmodon hispidus in
Florida / P.E. Rollin, T.G. Ksiazek, L.H. Elliott [et al.] // J Med Virol. – 1995. – Vol.46, №1. – P.3539.
306.
Rosenkranz-Weiss P. Regulation of nitric oxide synthesis by proinflammatory cytokines in
human umbilical vein endothelial cells. Elevations in tetrahydrobiopterin levels enhance endothelial
nitric oxide synthase specific activity / P. Rosenkranz-Weiss, W.C. Sessa, S. Milstien [et al.] // J Clin
Invest. – 1994. – Vol.93, №5. – P.2236-2243.
307.
Roslan M.A. Vertical infestation of the dengue vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus in
apartments in Kuala Lumpur, Malaysia / M.A. Roslan, A. Shafie, R. Ngui, Y.A. Lim, W.Y. Sulaiman
// J Am Mosq Control Assoc. – 2013. – Vol.29, №4. – P.328-336.
308.
Rossier C. La Crosse virus small genome mRNA is made in the cytoplasm / C. Rossier, J.
Patterson, D. Kolakofsky // J Virol. – 1986. – Vol.58, №2. – P.647-650.
309.
Ruan Y. A study on immunogenicity and safety of bivalent inactivated vaccine against
hemorrhagic fever with renal syndrome / Y. Ruan, X. Xu, W. Liu [et al.] // Zhonghua Yu Fang Yi
Xue Za Zhi. – 1999. – Vol.33, №6. – P.340-342.
310.
Ruche G. La First two autochthonous dengue virus infections in metropolitan France,
September 2010 / G. La Ruche, Y. Souares, A. Armengaud, F. Peloux-Petiot, P. Delaunay, P.
Despres, A. Lenglet, F. Jourdain, I. Leparc-Goffart, F. Charlet, L. Ollier, K. Mantey, T. Mollet, J.P.
Fournier, R. Torrents, K. Leitmeyer, P. Hilairet, H. Zeller, W. Van Bortel, D. Dejour-Salamanca, M.
Grandadam, M. Gastellu-Etchegorry // Euro Surveill. – 2010. – Vol.15, №39. – P.19676.
311.
Ruo S.L. Monoclonal antibodies to three strains of hantaviruses: Hantaan, R22, and Puumala /
S.L. Ruo, A. Sanchez, L.H. Elliott, L.S. Brammer, J.B. McCormick, S.P. Fisher-Hoch // Arch Virol.
– 1991. – Vol.119, №1-2. – P.1-11.
312.
Ruusala A. Coexpression of the membrane glycoproteins G1 and G2 of Hantaan virus is
required for targeting to the Golgi complex / A. Ruusala, R. Persson, C.S. Schmaljohn, R.F.
Pettersson // Virology. – 1992. – Vol.186, №1. – P.53-64.
212
313.
Saito
M.
Association
of
increased
platelet-associated
immunoglobulins
with
thrombocytopenia and the severity of disease in secondary dengue virus infections / M. Saito, K.
Oishi, S. Inoue [et al.] // Clin Exp Immunol. – 2004. – Vol.138, №2. – P.299-303.
314.
Saksida A. Serum levels of inflammatory and regulatory cytokines in patients with
hemorrhagic fever with renal syndrome / A. Saksida, B. Wraber, T. Avsic-Zupanc // BMC Infect Dis.
– 2011. – Vol.11. – P.142.
315.
Sall A.A. Genetic reassortment of Rift Valley fever virus in nature / A.A. Sall, P.M. Zanotto,
O.K. Sene [et al.] // J Virol. – 1999. – Vol.73, №10. – P.8196-8200.
316.
Samuel C.E. Antiviral actions of interferon. Interferon-regulated cellular proteins and their
surprisingly selective antiviral activities / C.E. Samuel // Virology. – 1991. – Vol.183, №1. – P.1-11.
317.
Sane J. Complement activation in Puumala hantavirus infection correlates with disease
severity / J. Sane, O. Laine, S. Makela [et al.] // Ann Med. – 2012. – Vol.44, №5. – P.468-475.
318.
Sangkawibha N. Risk factors in dengue shock syndrome: a prospective epidemiologic study
in Rayong, Thailand. I. The 1980 outbreak / N. Sangkawibha, S. Rojanasuphot, S. Ahandrik [et al.] //
Am J Epidemiol. – 1984. – Vol.120, №5. – P.653-669.
319.
Santana Rde C. Clinical and laboratory findings related to a favorable evolution of hantavirus
pulmonary syndrome / C. Santana Rde, G.M. Campos, L.T. Figueiredo [et al.] // Rev Soc Bras Med
Trop. – 2006. – Vol.39, №3. – P.237-240.
320.
Sato M. Positive feedback regulation of type I IFN genes by the IFN-inducible transcription
factor IRF-7 / M. Sato, N. Hata, M. Asagiri [et al.] // FEBS Lett. – 1998. – Vol.441, №1. – P.106110.
321.
Schall T.J. Selective attraction of monocytes and T lymphocytes of the memory phenotype by
cytokine RANTES / T.J. Schall, K. Bacon, K.J. Toy, D.V. Goeddel // Nature. – 1990. – Vol.347,
№6294. – P.669-671.
322.
Schmaljohn C.S. Antigenic and genetic properties of viruses linked to hemorrhagic fever with
renal syndrome / C.S. Schmaljohn, S.E. Hasty, J.M. Dalrymple [et al.] // Science. – 1985. – Vol.227,
№4690. – P.1041-1044.
323.
Schmaljohn C.S. Antigenic subunits of Hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia
virus recombinants / C.S. Schmaljohn, Y.K. Chu, A.L. Schmaljohn, J.M. Dalrymple // J Virol. –
1990. – Vol.64, №7. – P.3162-3170.
213
324.
Schmaljohn C.S. Hantaan virus M RNA: coding strategy, nucleotide sequence, and gene
order / C.S. Schmaljohn, A.L. Schmaljohn, J.M. Dalrymple // Virology. – 1987. – Vol.157, №1. –
P.31-39.
325.
Schmaljohn C.S. Hantaan virus replication: effects of monensin, tunicamycin and
endoglycosidases on the structural glycoproteins / C.S. Schmaljohn, S.E. Hasty, L. Rasmussen [et al.]
// J Gen Virol. – 1986. – Vol.67 ( Pt 4). – P.707-717.
326.
Schultze D. Tula virus infection associated with fever and exanthema after a wild rodent bite /
D. Schultze, A. Lundkvist, U. Blauenstein [et al.] // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. – 2002. –
Vol.21, №4. – P.304-306.
327.
Schutt M. Life-threatening Dobrava hantavirus infection with unusually extended pulmonary
involvement / M. Schutt, H. Meisel, D.H. Kruger [et al.] // Clin Nephrol. – 2004. – Vol.62, №1. –
P.54-57.
328.
Scott T.W. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto
Rico: blood feeding frequency / T.W. Scott, P.H. Amerasinghe, A.C. Morrison [et al.] // J Med
Entomol. – 2000. – Vol.37, №1. – P.89-101.
329.
Seitsonen E. Corticosteroids combined with continuous veno-venous hemodiafiltration for
treatment of hantavirus pulmonary syndrome caused by Puumala virus infection / E. Seitsonen, M.
Hynninen, E. Kolho [et al.] // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. – 2006. – Vol.25, №4. – P.261-266.
330.
Settergren B. Clinical aspects of nephropathia epidemica (Puumala virus infection) in Europe:
a review / B. Settergren // Scand J Infect Dis. – 2000. – Vol.32, №2. – P.125-132.
331.
Settergren B. Specific Puumala IgG virus half a century after haemorrhagic fever with renal
syndrome / B. Settergren, C. Ahlm, P. Juto, B. Niklasson // Lancet. – 1991. – Vol.338, №8758. –
P.66.
332.
Severson W.E. Ribavirin causes error catastrophe during Hantaan virus replication / W.E.
Severson, C.S. Schmaljohn, A. Javadian, C.B. Jonsson // J Virol. – 2003. – Vol.77, №1. – P.481-488.
333.
Sheshberadaran
H.
Antigenic
relationship
between
hantaviruses
analysed
by
immunoprecipitation / H. Sheshberadaran, B. Niklasson, E.A. Tkachenko // J Gen Virol. – 1988. –
Vol.69 ( Pt 10). – P.2645-2651.
334.
Shi X. Golgi localization of Hantaan virus glycoproteins requires coexpression of G1 and G2
/ X. Shi, R.M. Elliott // Virology. – 2002. – Vol.300, №1. – P.31-38.
214
335.
Sibold C. Dobrava hantavirus causes hemorrhagic fever with renal syndrome in central
Europe and is carried by two different Apodemus mice species / C. Sibold, R. Ulrich, M. Labuda [et
al.] // J Med Virol. – 2001. – Vol.63, №2. – P.158-167.
336.
Sim S. Dengue virus infection of the Aedes aegypti salivary gland and chemosensory
apparatus induces genes that modulate infection and blood-feeding behavior / S. Sim, J.L. Ramirez,
G. Dimopoulos // PLoS Pathog. – 2012. – Vol.8, №3. – P.e1002631.
337.
Simon M. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus entry and replication is clathrin-, pH- and
cholesterol-dependent / M. Simon, C. Johansson, A. Mirazimi // J Gen Virol. – 2009. – Vol.90, №Pt
1. – P.210-215.
338.
Simon M. Microtubule-dependent and microtubule-independent steps in Crimean-Congo
hemorrhagic fever virus replication cycle / M. Simon, C. Johansson, A. Lundkvist, A. Mirazimi //
Virology. – 2009. – Vol.385, №2. – P.313-322.
339.
Skurkovich B. Anticytokine therapy, especially anti-interferon-gamma, as a pathogenetic
treatment in TH-1 autoimmune diseases / S. Skurkovich, B. Skurkovich // Ann N Y Acad Sci. –
2005. – Vol.1051. – P.684-700.
340.
Skurkovich B. Anti-interferon-gamma antibodies in the treatment of autoimmune diseases /
B. Skurkovich, S. Skurkovich // Curr Opin Mol Ther. – 2003. – Vol.5, №1. – P.52-57.
341.
Smart S.J. TNF-alpha-induced transendothelial neutrophil migration is IL-8 dependent / S.J.
Smart, T.B. Casale // Am J Physiol. – 1994. – Vol.266, №3 Pt 1. – P.L238-245.
342.
Song G. Preliminary human trial of inactivated golden hamster kidney cell (GHKC) vaccine
against haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) / G. Song, Y.C. Huang, C.S. Hang [et al.] //
Vaccine. – 1992. – Vol.10, №4. – P.214-216.
343.
Song W. Tumor necrosis factor-alpha induces apoptosis via inducible nitric oxide synthase in
neonatal mouse cardiomyocytes / W. Song, X. Lu, Q. Feng // Cardiovasc Res. – 2000. – Vol.45, №3.
– P.595-602.
344.
Song Y. A low level of TNF-alpha mediates hemorrhage-induced acute lung injury via p55
TNF receptor / Y. Song, L. Ao, C.D. Raeburn, C.M. Calkins [et al.] // Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol. – 2001. – Vol.281, №3. – P.L677-684.
345.
Sousa C.A. Ongoing outbreak of dengue type 1 in the Autonomous Region of Madeira,
Portugal: preliminary report / C.A. Sousa, M. Clairouin, G. Seixas, B. Viveiros, M.T. Novo, A.C.
Silva, M.T. Escoval, A. Economopoulou // Euro Surveill. – 2012. – Vol.17, №49.
215
346.
Sozzani S. The signal transduction pathway involved in the migration induced by a monocyte
chemotactic cytokine / S. Sozzani, W. Luini, M. Molino, P. Jilek, B. Bottazzi, C. Cerletti, K.
Matsushima, A. Mantovani // J Immunol. – 1991. – Vol.147, №7. – P.2215-2221.
347.
Staeheli P. Mx proteins: GTPases with antiviral activity / P. Staeheli, F. Pitossi, J. Pavlovic //
Trends Cell Biol. – 1993. – Vol.3, №8. – P.268-272.
348.
Stolpen A.H. Recombinant tumor necrosis factor and immune interferon act singly and in
combination to reorganize human vascular endothelial cell monolayers / A.H. Stolpen, E.C. Guinan,
W. Fiers, J.S. Pober // Am J Pathol. – 1986. – Vol.123, №1. – P.16-24.
349.
Streeter D.G. Mechanism of action of 1- -D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide
(Virazole), a new broad-spectrum antiviral agent / D.G. Streeter, J.T. Witkowski, G.P. Khare [et al.]
// Proc Natl Acad Sci U S A. – 1973. – Vol.70, №4. – P.1174-1178.
350.
Sugiyama K. Four serotypes of haemorrhagic fever with renal syndrome viruses identified by
polyclonal and monoclonal antibodies / K. Sugiyama, S. Morikawa, Y. Matsuura [et al.] // J Gen
Virol. – 1987. – Vol.68 ( Pt 4). – P.979-987.
351.
Sundstrom J.B. Hantavirus infection induces the expression of RANTES and IP-10 without
causing increased permeability in human lung microvascular endothelial cells / J.B. Sundstrom, L.K.
McMullan, C.F. Spiropoulou [et al.] // J Virol. – 2001. – Vol.75, №13. – P.6070-6085.
352.
Suzuki A. Identifying rodent hantavirus reservoirs, Brazil / A. Suzuki, I. Bisordi, S. Levis, J.
Garcia, L.E. Pereira, R.P. Souza, T.K. Sugahara, N. Pini, D. Enria, L.T. Souza // Emerg Infect Dis. –
2004. – Vol.10, №12. – P.2127-2134.
353.
Takahashi G.W. Pentoxifylline inhibits tumor necrosis factor-alpha-mediated cytotoxicity and
cytostasis in L929 murine fibrosarcoma cells / G.W. Takahashi, R.B. Montgomery, W.L. Stahl, C.A.
Crittenden, M.A. Valentine, D.R. Thorning, D.F. Andrews, 3rd, M.B. Lilly // Int J
Immunopharmacol. – 1994. – Vol.16, №9. – P.723-736.
354.
Taweechaisupapong S. DC-SIGN (CD209) mediates dengue virus infection of human
dendritic cells / B. Tassaneetrithep, T.H. Burgess, A. Granelli-Piperno, C. Trumpfheller, J. Finke, W.
Sun, M.A. Eller, K. Pattanapanyasat, S. Sarasombath, D.L. Birx, R.M. Steinman, S. Schlesinger,
M.A. Marovich // J Exp Med. – 2003. – Vol.197, №7. – P.823-829.
355.
Taweechaisupapong S. Langerhans cell density and serological changes following
intradermal immunisation of mice with dengue 2 virus / S. Taweechaisupapong, S. Sriurairatana, S.
Angsubhakorn, S. Yoksan, M.M. Khin, S. Sahaphong, N. Bhamarapravati // J Med Microbiol. –
1996. – Vol.45, №2. – P.138-145.
216
356.
Temonen M. Cytokines, adhesion molecules, and cellular infiltration in nephropathia
epidemica kidneys: an immunohistochemical study / M. Temonen, J. Mustonen, H. Helin, A.
Pasternack, A. Vaheri, H. Holthofer // Clin Immunol Immunopathol. – 1996. – Vol.78, №1. – P.4755.
357.
Temonen M. Susceptibility of human cells to Puumala virus infection / M. Temonen, O.
Vapalahti, H. Holthofer, M. Brummer-Korvenkontio, A. Vaheri, H. Lankinen // J Gen Virol. – 1993.
– Vol.74 ( Pt 3). – P.515-518.
358.
Tkachenko E.A. Actual problems of hemorrhagic fever with renal syndrome / E.A.
Tkachenko, A.D. bernshtein, T.K. Dzagurova, V.G. Morozov, R.A. Slonova, L.I. Ivanov, D.V.
Trankvilevskii, D. Kruger // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. – 2013, №1. – P.51-58.
359.
Torfason E.G. Subclass restriction of human enterovirus antibodies / E.G. Torfason, C.B.
Reimer, H.L. Keyserling // J Clin Microbiol. – 1987. – Vol.25, №8. – P.1376-1379.
360.
Toro J. An outbreak of hantavirus pulmonary syndrome, Chile, 1997 / J. Toro, J.D. Vega,
A.S. Khan, J.N. Mills, P. Padula, W. Terry, Z. Yadon, R. Valderrama, B.A. Ellis, C. Pavletic, R.
Cerda, S. Zaki, W.J. Shieh, R. Meyer, M. Tapia, C. Mansilla, M. Baro, J.A. Vergara, M. Concha, G.
Calderon, D. Enria, C.J. Peters, T.G. Ksiazek // Emerg Infect Dis. – 1998. – Vol.4, №4. – P.687-694.
361.
Tsai T.F. Hemagglutination-inhibiting antibody in hemorrhagic fever with renal syndrome /
T.F. Tsai, Y.W. Tang, S.L. Hu, K.L. Ye, G.L. Chen, Z.Y. Xu // J Infect Dis. – 1984. – Vol.150, №6.
– P.895-898.
362.
Tsunoda T. Winter refuge for Aedes aegypti and Ae. albopictus mosquitoes in Hanoi during
Winter / T. Tsunoda, T.C. Cuong, T.D. Dong, N.T. Yen, N.H. Le, T.V. Phong, N. Minakawa // PLoS
One. – 2014. – Vol.9, №4. – P.e95606.
363.
Ulrich R. Chimaeric HBV core particles carrying a defined segment of Puumala hantavirus
nucleocapsid protein evoke protective immunity in an animal model / R. Ulrich, A. Lundkvist, H.
Meisel, D. Koletzki, K.B. Sjolander, H.R. Gelderblom, G. Borisova, P. Schnitzler, G. Darai, D.H.
Kruger // Vaccine. – 1998. – Vol.16, №2-3. – P.272-280.
364.
Urquidi V. Non-random reassortment between the tripartite RNA genomes of La Crosse and
snowshoe hare viruses / V. Urquidi, D.H. Bishop // J Gen Virol. – 1992. – Vol.73 ( Pt 9). – P.22552265.
365.
Vaheri A. Uncovering the mysteries of hantavirus infections / A. Vaheri, T. Strandin, J.
Hepojoki, T. Sironen, H. Henttonen, S. Makela, J. Mustonen // Nat Rev Microbiol. – 2013. – Vol.11,
№8. – P.539-550.
217
366.
Van Campen H. Influenza A virus replication is inhibited by tumor necrosis factor-alpha in
vitro / H. Van Campen // Arch Virol. – 1994. – Vol.136, №3-4. – P.439-446.
367.
van der Poll T. Regulation of interleukin 10 release by tumor necrosis factor in humans and
chimpanzees / T. van der Poll, J. Jansen, M. Levi, H. ten Cate, J.W. ten Cate, S.J. van Deventer // J
Exp Med. – 1994. – Vol.180, №5. – P.1985-1988.
368.
van der Schaar H.M. Dissecting the cell entry pathway of dengue virus by single-particle
tracking in living cells / H.M. van der Schaar, M.J. Rust, C. Chen, H. van der Ende-Metselaar, J.
Wilschut, X. Zhuang, J.M. Smit // PLoS Pathog. – 2008. – Vol.4, №12. – P.e1000244.
369.
van Es L.A. Factors influencing the endocytosis of immune complexes / L.A. van Es, M.R.
Daha // Adv Nephrol Necker Hosp. – 1984. – Vol.13. – P.341-367.
370.
Vapalahti O. Cloning and sequencing of Puumala virus Sotkamo strain S and M RNA
segments: evidence for strain variation in hantaviruses and expression of the nucleocapsid protein /
O. Vapalahti, H. Kallio-Kokko, E.M. Salonen, M. Brummer-Korvenkontio, A. Vaheri // J Gen Virol.
– 1992. – Vol.73 ( Pt 4). – P.829-838.
371.
Vapalahti O. Hantavirus infections in Europe / O. Vapalahti, J. Mustonen, A. Lundkvist, H.
Henttonen, A. Plyusnin, A. Vaheri // Lancet Infect Dis. – 2003. – Vol.3, №10. – P.653-661.
372.
Vapalahti O. Human B-cell epitopes of Puumala virus nucleocapsid protein, the major antigen
in early serological response / O. Vapalahti, H. Kallio-Kokko, A. Narvanen, I. Julkunen, A.
Lundkvist, A. Plyusnin, H. Lehvaslaiho, M. Brummer-Korvenkontio, A. Vaheri, H. Lankinen // J
Med Virol. – 1995. – Vol.46, №4. – P.293-303.
373.
Vapalahti O. Human immune response, host genetics, and severity of disease / O. Vapalahti,
A. Lundkvist, A. Vaheri // Curr Top Microbiol Immunol. – 2001. – Vol.256. – P.153-169.
374.
Vapalahti O. Isolation and characterization of a hantavirus from Lemmus sibiricus: evidence
for host switch during hantavirus evolution / O. Vapalahti, A. Lundkvist, V. Fedorov, C.J. Conroy, S.
Hirvonen, A. Plyusnina, K. Nemirov, K. Fredga, J.A. Cook, J. Niemimaa, A. Kaikusalo, H.
Henttonen, A. Vaheri, A. Plyusnin // J Virol. – 1999. – Vol.73, №7. – P.5586-5592.
375.
Vasconcelos M.I. Hantavirus pulmonary syndrome in the rural area of Juquitiba, Sao Paulo
metropolitan area, Brazil / M.I. Vasconcelos, V.P. Lima, L.B. Iversson, M.D. Rosa, A.P. da Rosa,
E.S. da Rosa, L.E. Pereira, E. Nassar, G. Katz, L.H. Matida, M.A. Zaparoli, J.J. Ferreira, C.J. Peters
// Rev Inst Med Trop Sao Paulo. – 1997. – Vol.39, №4. – P.237-238.
218
376.
Veronesi R. Macrocyclops albidus (Copepoda: cyclopidae) for the Biocontrol of Aedes
albopictus and Culex pipiens in Italy / R. Veronesi, M. Carrieri, B. Maccagnani, S. Maini, R. Bellini
// J Am Mosq Control Assoc. – 2015. – Vol.31, №1. – P.32-43.
377.
Vescio F.M. Environmental correlates of Crimean-Congo haemorrhagic fever incidence in
Bulgaria / F.M. Vescio, L. Busani, L. Mughini-Gras, C. Khoury, L. Avellis, E. Taseva, G. Rezza, I.
Christova // BMC Public Health. – 2012. – Vol.12. – P.1116.
378.
Villinger F. Markedly elevated levels of interferon (IFN)-gamma, IFN-alpha, interleukin (IL)-
2, IL-10, and tumor necrosis factor-alpha associated with fatal Ebola virus infection / F. Villinger,
P.E. Rollin, S.S. Brar, N.F. Chikkala, J. Winter, J.B. Sundstrom, S.R. Zaki, R. Swanepoel, A.A.
Ansari, C.J. Peters // J Infect Dis. – 1999. – Vol.179 Suppl 1. – P.S188-191.
379.
Vincent M.J. Hantavirus pulmonary syndrome in Panama: identification of novel hantaviruses
and their likely reservoirs / M.J. Vincent, E. Quiroz, F. Gracia, A.J. Sanchez, T.G. Ksiazek, P.T.
Kitsutani, L.A. Ruedas, D.S. Tinnin, L. Caceres, A. Garcia, P.E. Rollin, J.N. Mills, C.J. Peters, S.T.
Nichol // Virology. – 2000. – Vol.277, №1. – P.14-19.
380.
Vorou R.M. Crimean-Congo hemorrhagic fever in southeastern Europe / R.M. Vorou // Int J
Infect Dis. – 2009. – Vol.13, №6. – P.659-662.
381.
Wagner D.K. Serum immunoglobulin G antibody subclass response to respiratory syncytial
virus F and G glycoproteins after first, second, and third infections / D.K. Wagner, P. Muelenaer,
F.W. Henderson, M.H. Snyder, C.B. Reimer, E.E. Walsh, L.J. Anderson, D.L. Nelson, B.R. Murphy
// J Clin Microbiol. – 1989. – Vol.27, №3. – P.589-592.
382.
Wang M. Cellular immune response to Hantaan virus nucleocapsid protein in the acute phase
of hemorrhagic fever with renal syndrome: correlation with disease severity / M. Wang, J. Wang, Y.
Zhu, Z. Xu, K. Yang, A. Yang, B. Jin // J Infect Dis. – 2009. – Vol.199, №2. – P.188-195.
383.
Wang M. Expression of non-conserved regions of the S genome segments of three
hantaviruses: evaluation of the expressed polypeptides for diagnosis of haemorrhagic fever with renal
syndrome / M. Wang, C. Rossi, C.S. Schmaljohn // J Gen Virol. – 1993. – Vol.74 ( Pt 6). – P.11151124.
384.
Waterman S.H. Dengue fever / S.H. Waterman, D.J. Gubler // Clin Dermatol. – 1989. –
Vol.7, №1. – P.117-122.
385.
Weber F. Interferon and cytokine responses to Crimean Congo hemorrhagic fever virus; an
emerging and neglected viral zonoosis / F. Weber, A. Mirazimi // Cytokine Growth Factor Rev. –
2008. – Vol.19, №5-6. – P.395-404.
219
386.
Webster R.G. Antigenic variation in influenza virus. Biology and chemistry / R.G. Webster,
W.G. Laver // Prog Med Virol. – 1971. – Vol.13. – P.271-338.
387.
Welliver R.C. Predictive value of respiratory syncytial virus-specific IgE responses for
recurrent wheezing following bronchiolitis / R.C. Welliver, M. Sun, D. Rinaldo, P.L. Ogra // J
Pediatr. – 1986. – Vol.109, №5. – P.776-780.
388.
Wells R.M. An unusual hantavirus outbreak in southern Argentina: person-to-person
transmission? Hantavirus Pulmonary Syndrome Study Group for Patagonia / R.M. Wells, S. Sosa
Estani, Z.E. Yadon, D. Enria,[ et al.] // Emerg Infect Dis. – 1997. – Vol.3, №2. – P.171-174.
389.
Wu S.J. Human skin Langerhans cells are targets of dengue virus infection / S.J. Wu, G.
Grouard-Vogel, W. Sun, [et al.] // Nat Med. – 2000. – Vol.6, №7. – P.816-820.
390.
Xu X. The RNA binding domain of the hantaan virus N protein maps to a central, conserved
region / X. Xu, W. Severson, N. Villegas, C.S. Schmaljohn, C.B. Jonsson // J Virol. – 2002. – Vol.76,
№7. – P.3301-3308.
391.
Yamada T. Antibody responses to Four Corners hantavirus infections in the deer mouse
(Peromyscus maniculatus): identification of an immunodominant region of the viral nucleocapsid
protein / T. Yamada, B. Hjelle, R. Lanzi, C. Morris, B. Anderson, S. Jenison // J Virol. – 1995. –
Vol.69, №3. – P.1939-1943.
392.
Yamanishi K. Development of inactivated vaccine against virus causing haemorrhagic fever
with renal syndrome / K. Yamanishi, O. Tanishita, M. Tamura, H. Asada, K. Kondo, M. Takagi, I.
Yoshida, T. Konobe, K. Fukai // Vaccine. – 1988. – Vol.6, №3. – P.278-282.
393.
Yamaoka J. Suppressive effect of zinc ion on iNOS expression induced by interferon-gamma
or tumor necrosis factor-alpha in murine keratinocytes / J. Yamaoka, T. Kume, A. Akaike, Y.
Miyachi // J Dermatol Sci. – 2000. – Vol.23, №1. – P.27-35.
394.
Yan D. Studies on immunopathogenesis in epidemic hemorrhagic fever: sequential
observations on activation of the first complement component in sera from patients with epidemic
hemorrhagic fever / D. Yan, X. Gu, D. Wang, S. Yang // J Immunol. – 1981. – Vol.127, №3. –
P.1064-1067.
395.
Yanagihara R. Experimental infection of human vascular endothelial cells by pathogenic and
nonpathogenic hantaviruses / R. Yanagihara, D.J. Silverman // Arch Virol. – 1990. – Vol.111, №3-4.
– P.281-286.
220
396.
Yanagihara R. Experimental infection with Puumala virus, the etiologic agent of nephropathia
epidemica, in bank voles (Clethrionomys glareolus) / R. Yanagihara, H.L. Amyx, D.C. Gajdusek // J
Virol. – 1985. – Vol.55, №1. – P.34-38.
397.
Yao Z.Q. Identification of epidemic hemorrhagic fever virus in human leukocytes / Z.Q. Yao
// Zhonghua Yi Xue Za Zhi. – 1987. – Vol.67, №9. – P.497-498.
398.
Yao Z.Q. The distribution and duration of hantaan virus in the body fluids of patients with
hemorrhagic fever with renal syndrome / Z.O. Yao, W.S. Yang, W.B. Zhang, X.F. Bai // J Infect Dis.
– 1989. – Vol.160, №2. – P.218-224.
399.
Yashina L.N. Genetic diversity of hantaviruses associated with hemorrhagic fever with renal
syndrome in the far east of Russia / L.N. Yashina, N.A. Patrushev, L.I. Ivanov, R.A. Slonova, V.P.
Mishin, G.G. Kompanez, N.I. Zdanovskaya, Kuzina, II, P.F. Safronov, V.E. Chizhikov, C.
Schmaljohn, S.V. Netesov // Virus Res. – 2000. – Vol.70, №1-2. – P.31-44.
400.
Yi E.S. Endotoxin, interleukin-1, and tumor necrosis factor cause neutrophil-dependent
microvascular leakage in postcapillary venules / E.S. Yi, T.R. Ulich // Am J Pathol. – 1992. –
Vol.140, №3. – P.659-663.
401.
Yi X.P. The distribution of epidemic hemorrhagic fever (EHF) viral antigen in tissues from
EHF autopsies / X.P. Yi, S.F. Xing // Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. – 1991. – Vol.20, №2. – P.110112.
402.
Yoneyama M. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation
of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300 / M. Yoneyama, W. Suhara, Y.
Fukuhara, M. Fukuda, E. Nishida, T. Fujita // EMBO J. – 1998. – Vol.17, №4. – P.1087-1095.
403.
Yoo K.H. Haemorrhagic fever with renal syndrome in Korean children. Korean Society of
Pediatric Nephrology / K.H. Yoo, Y. Choi // Pediatr Nephrol. – 1994. – Vol.8, №5. – P.540-544.
404.
Yoshimatsu K. Protective immunity of Hantaan virus nucleocapsid and envelope protein
studied using baculovirus-expressed proteins / K. Yoshimatsu, Y.C. Yoo, R. Yoshida, C. Ishihara, I.
Azuma, J. Arikawa // Arch Virol. – 1993. – Vol.130, №3-4. – P.365-376.
405.
Young J.F. Evolution of human influenza A viruses in nature: recombination contributes to
genetic variation of H1N1 strains / J.F. Young, P. Palese // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1979. –
Vol.76, №12. – P.6547-6551.
406.
Zajac A.J. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector
function / A.J. Zajac, J.N. Blattman, K. Murali-Krishna, D.J. Sourdive, M. Suresh, J.D. Altman, R.
Ahmed // J Exp Med. – 1998. – Vol.188, №12. – P.2205-2213.
221
407.
Zaki S.R. Hantavirus pulmonary syndrome. Pathogenesis of an emerging infectious disease /
S.R. Zaki, P.W. Greer, L.M. Coffield, C.S. Goldsmith, K.B. Nolte, K. Foucar, R.M. Feddersen, R.E.
Zumwalt, G.L. Miller, A.S. Khan, et al. // Am J Pathol. – 1995. – Vol.146, №3. – P.552-579.
408.
Zapata J.C. The role of platelets in the pathogenesis of viral hemorrhagic fevers / J.C. Zapata,
D. Cox, M.S. Salvato // PLoS Negl Trop Dis. – 2014. – Vol.8, №6. – P.e2858.
409.
Zeitz P.S. Assessment of occupational risk for hantavirus infection in Arizona and New
Mexico / P.S. Zeitz, J.M. Graber, R.A. Voorhees, C. Kioski, L.A. Shands, T.G. Ksiazek, S. Jenison,
R.F. Khabbaz // J Occup Environ Med. – 1997. – Vol.39, №5. – P.463-467.
410.
Zhang T.M. Early analysis of viremia and clinical tests in patients with epidemic hemorrhagic
fever / T.M. Zhang, Z.Q. Yang, M.Y. Zhang, Z.J. Hu, J.M. Xiang, J.W. Huggins, T.M. Cosgriff, J.I.
Smith // Chin Med J (Engl). – 1993. – Vol.106, №8. – P.608-610.
411.
Zhang X.L. Detection of viral antigens in various organs in 14 fatal cases of epidemic
hemorrhagic fever / X.L. Zhang, X.H. Wang, C.Z. Liu // Zhonghua Nei Ke Za Zhi. – 1987. – Vol.26,
№8. – P.461-463, 509-410.
412.
Zhang Y.Z. Hantavirus infections in humans and animals, China / Y.Z. Zhang, Y. Zou, Z.F.
Fu, A. Plyusnin // Emerg Infect Dis. – 2010. – Vol.16, №8. – P.1195-1203.
413.
Zhu Z.Y. Investigation on inactivated epidemic hemorrhagic fever tissue culture vaccine in
humans / Z.Y. Zhu, H.Y. Tang, Y.J. Li, J.Q. Weng, Y.X. Yu, R.F. Zeng // Chin Med J (Engl). –
1994. – Vol.107, №3. – P.167-170.
414.
Zoller L. Immunoblot analysis of the serological response in Hantavirus infections / L. Zoller,
J. Scholz, R. Stohwasser, L.B. Giebel, K.K. Sethi, E.K. Bautz, G. Darai // J Med Virol. – 1989. –
Vol.27, №3. – P.231-237.
415.
Zoller L. Seroprevalence of hantavirus antibodies in Germany as determined by a new
recombinant enzyme immunoassay / L. Zoller, M. Faulde, H. Meisel, B. Ruh, P. Kimmig, U.
Schelling, M. Zeier, P. Kulzer, C. Becker, M. Roggendorf, et al. // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. –
1995. – Vol.14, №4. – P.305-313.
416.
Zoller L.G. A novel mu-capture enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant
proteins for sensitive and specific diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome / L.G. Zoller,
S. Yang, P. Gott, E.K. Bautz, G. Darai // J Clin Microbiol. – 1993. – Vol.31, №5. – P.1194-1199.
222
СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА
Рисунок 1 – РНК вируса Денге…………………………………………………..……………………..….16
Рисунок 2 – Структура вириона Денге………………………………………………………………...….17
Рисунок 3 – Репликационный цикл вируса Денге…………………………………………………....….18
Рисунок 4 – Структура вируса ККГЛ……………………………………………………………….....….21
Таблица 1 – Клинические проявления, географическое распределение и резервуар (вид грызунов)
патогенных хантавирусов……………………………………………………………………………....….25
Рисунок 5 – Структура вириона хантавируса………………………………………………………...….31
Рисунок 6 – Филогенетические взаимоотношения хантавирусов на основании 560-нуклеотидного
фрагмента S-сегмента генома. ………………………………………………………………………...….35
Таблица 2 – Клинические проявления и изменения лабораторных показаний при ГЛПС и
ХЛС……………………………………………………………………………………………………....….41
Таблица 3 – Праймеры и зонды для ПЦР-РВ……………………………………………..……….....….65
Таблица 4 – Плазмиды, кодирующие кДНК генов хантавирусов, использованные для построения
стандартных кривых в реакциях ПЦР-РВ………………………………..…………………………...….66
Таблица 5 – Антитела, использованные для определения внутриклеточной локализации белка р78 и
белков хантавирусов…………………………………………………………………………………...….68
Таблица 6 – Обзор генотипов и частоты реассортантных вирусов…..……………………………..….79
Рисунок 7 – ПЦР анализ реассортанта VI .………………………………………………………..… ..80
Таблица 7 – Описание отдельных реассортантных вирусов, обнаруженных после первого и второго
цикла селекции ……..…………………………………………………………………………………..….80
Рисунок 8 – Иммуногистохимический анализ реассортанта V1..…………………………………. .….81
Рисунок
9
–
Сравнительный
анализ
репликации
вирусов
AND,
SNV
и
V1.
…………………………………………………………………………………………………………...….82
Рисунок 10 – Анализ эффекта ФНО-α на накопление N белка SNV в клетках Vero
E6………………………………………………………………………………………………………...….84
Рисунок 11 – Анализ накопления N белка SNV в клетках Vero E6 обработанных различными
223
концентрациями ФНО-α……………………………………………………………………………....….85
Рисунок
12
–
Анализ
пентоксифиллина
на
эффектa
ФНО-α,
накопление
N(G)-монометил-l-аргинина
N
белка
(ММА),
SNV
ИФН-γ
в
и
клетках
Vero E6…………………………………………………………………………………………………..….87
Рисунок 13 – Анализ экспрессии N белка вируса SNV и накопления S сегмента вирусной РНК в
клетках HUVEC. Клетки HUVEC инфицировали с MOI 1…………………………………………..….89
Рисунок 14 – Эффект SNV инфекции на проницаемость монослоя HUVEC……………………....….89
Рисунок 15 – Эффект ФНО-α на проницаемость монослоя HUVEC………………………………..….91
Рисунок
16
–
Инфицирование
альвеолярных
макрофагов
человекам
вирусом
SNV
……………………………..……………………………………………………………………………..….92
Рисунок 17 – Активация ФНО-α в надосадочной жидкости альвеолярных макрофагов человека
инфицированных SNV или обработанных ЛПС……………………………………………………...….93
Рисунок 18 – Увеличение проницаемости монослоя эндотелиальных клеток после добавления
супернатанта
культуры
альвеолярных
макрофагов
человека
инфицированых
SNV……………………………………………………………………………………………………...….94
Рисунок 19 – Выявление хантавирусных антигенов в клетках HUVEC, инфицированных SNV и
PHV……………………………………………………………………………………………………....….98
Таблица 8 – Изменения экспрессии клеточных генов в клетках HUVEC, инфицированных SNV и
PHV………………………………………………………………………………………………..….....….99
Рисунок 20 – Анализ активации аппоптоза в клетках HUVEC инфицированных вирусами SNV и
PHVс помощию TUNEL метода………………………………………………………………….......….106
Рисунок 21 – Анализ методом ПЦР-РВ внутриклеточных уровней CCL5, p78, Cig5 и Bcl2 в
инфицированных SNV и PHV клетках HUVEC…………………………………………………......….109
Рисунок 22 – Влияние репликации хантавирусов на экспрессию гена CCL5……………………..…111
Рисунок 23 – Анализ внутриклеточных уровней S-сегмента РНК вируса ANDV в клетках Vero E6,
HUVEC и A549 с помощью ПЦР-РВ TaqMan……………….……………………………………....….113
Таблица 9 – Титр ANDV в надосадочной жидкости культур клеток Vero E6, A549 и
HUVEC………………………………………………………………………………………………....….114
Рисунок 24 – Увеличение экспрессии гена MxA в культуре клеток HUVEC и A549 при
инфицировании ANDV……………………………………..………………………………………....….115
Рисунок 25 – Транскрипционная активность гена р78 в клетках HUVEС и A549 при инфицировании
224
ANDV…………………………………………..……………………………………………………....….117
Рисунок
26
–
Ядерная
транслокация
IRF-1
в
клетках
HUVEC,
инфицированных
ANDV…………………………………………………………………………………………..……....….118
Рисунок 27 – Анализ экспрессии белка р78 в инфицированных ANDV клетках HUVEC и
A549………………………………………………………………………………………………….....….119
Рисунок 28 – Инфицирование ANDV клеток Vero E6, трансфицированных р78………………....…121
Рисунок 29 — Внутриклеточная локализация белка р78……………………………………….......….123
Рисунок 30 – Внутриклеточная локализация белков р78, и вирусных белков: N белка и ГП…....…124
Рисунок 31 – Активация PML в клетках HUVEC инфицированных вирусами ANDV и
HTNV…………………………………………………………………………………………………...….125
Рисунок 32 – Активация PML в клеьках HUVEC инфицированных вирусами АNDV и
HTNV……………………………………………………………………………………………….....….126
Рисунок 33 – Внутриклеточная локализация PML и SP100 в клетках HUVEC, инфицированных
ANDV и HTNV………………………………………………………………………………………..….127
Рисунок 34 – Внутриклеточная локализация PML и DAXX в клетках HUVEC, инфицированных
вирусами ANDV и HTNV…………………………………………………………………………...….128
Рисунок 35 – Влияние инфицирования ANDV и HTNV на экспрессию ISG-20 в клетках
HUVEC………………………………………………………………………………………………..….129
Рисунок 36 – Внутриклеточная локализация PML и ISG-20 в клетках HUVEC инфицированных
ANDV и HTNV………………………………………………………………………………………...….130
Рисунок 37 – Гамма-излучение ингибирует репликацию хантавирусов………………………....….131
Рисунок 38 – Влияние репликации вирусов ANDV и HTNV на активацию PML в клетках
HUVEC………………………………………………………………………………………………...….132
Рисунок 39 – Влияние репликации хантавируcов на активацию PML………………….………..….134
Рисунок 40 – Субклеточная локализация PML, SUMO и N-белка ANDV в клетках HUVEC.
………………………………………………………………………………………………………....….136
Рисунок 41 – Взаимодействие между PML, S-сегментом РНК вируса ANDV и белка
SUMO.……………………………………………………………………………………………….....….137
Таблица 10 – Клиническая характеристика ГЛПС……………………………………………….....….138
Таблица 11 – Показатели сывороточного уровня цитокинов у больных ГЛПС…………………..…139
Таблица 12 – Различия в лабораторных показателях и значениях сороточных ИЛ12(р40) и ИНФ-γ у
2-х групп больных ГЛПС……………………………………………………………………………..….141
225
Рисунок 42 – Эффект Рибавирина на накопление S-сегмента РНК ANDV в клетках
HUVEC………………………………………………………………………………………………....….143
Рисунок 43 – Влияние Рибавирина на уровни мРНК CCL5 в инфицированных ANDV клетках
HUVEC..........................................................................................................................................….145
Рисунок 44 – Зависимый от дозы эффект Рибавирина на накопление S-сегмента РНК вируса ANDV
и мРНК CCL5 в клетках HUVEC………………………………………………………………….....….147
Таблица 13 – Титр вируса ANDV в супернатанте клеток HUVEC, культивированных в присутствии
Рибавирина и ФНО-α...........................................................................................................................….149
Рисунок 45 – Влияние Рибавирина и ФНO-α на активацию CCL5 и ИЛ-6 в клетках HUVEC
инфицированных ANDV…………………………………………………………………………………150
Рисунок 46 – Влияние Рибавирина на ФНO-α индуцированную активацию NF-κB в клетках
HUVEC…………………………………………………………………………………………………….153