оценка качества образцов сухой крови для ранней диагностике
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования « КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Направление: 06.03.01 (ОКСО 020400.62) - биология ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ОБРАЗЦОВ СУХОЙ КРОВИ ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ ВИЧ ИНФЕКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ Работа завершена: “___” 20 г. (М.М. Унмэну) Работа допущена к защите: Научный руководитель к.б.н., доцент “ ___” 20 г. (Г.Ю. Яковлева) г. (О.Н. Ильинская) Заведующий кафедрой д.б.н., профессор “ ___” 20 Казань – 2015 СОДЕРЖАНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ 4 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 1.1 Общая характеристика ВИЧ 6 1.1.1 Морфология и структура ВИЧ 6 1.1.2 Организация генома ВИЧ 8 1.1.3 Репликативный цикл ВИЧ-1 9 1.2 Патофизиология ВИЧ-инфекции 12 1.2.1 Первичная инфекция 12 1.2.2 Бессимптомная инфекция или латентный период 13 1.2.3 Симптоматическая инфекция и СПИД 13 1.3 Передача ВИЧ от матери ребенку 13 1.4 Методы диагностики ВИЧ-инфекции 15 1.5 Сухие пятна крови (СПК) – удобный альтернативный способ сбора материала 18 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ 20 2 МАТЕРИАЛЫ ИМЕТОДЫ 20 2.1 Объект исследования 20 2.2 Отбор проб с помощью метода СПК 20 2.2.1 Необходимые материалы 20 2.2.2 Техника отбора проб СПК 20 2.2.4 Техника сушки образцов крови 22 2.2.5 Упаковка и хранение образцов СПК 23 2.2.6 Доставка образцов СПК в Центральную диагностическую вирусологическую лабораторию 24 2.3 ПЦР диагностика ВИЧ-инфекции 24 2.4 Статистическая обработка 25 2 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Анализ образцов сухих пятен крови для проверки их качества и оценить их пригодность для ПЦР анализа на присутствии ВИЧ 3.2 26 26 Влияние антиретровирусной терапии ВИЧ инфицированных матерей на рождении у них здорового ребенка 29 ВЫВОДЫ 30 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 31 3 ВВЕДЕНИЕ Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Это инфекция, которая возникла в начале 80-х годов, значительно распространилась по всему миру. По данным Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) примерно 33.6 – 36.1 млн человек в мире живут с ВИЧ-1.Особенно сильно данное заболевание распространено в странах Африки (Уганда, Ботсвана, Зимбабве и страны Западной Африки), в Юго-Восточной Азии (Тайланд, Малазия). Африка является континентом, наиболее пострадавшим от этого вируса, и в настоящее время остается эпицентром пандемии. Несмотря на то, что в этом регионе проживает всего 10% всего мирового населения, 68% из них инфицированы ВИЧ-1, а это составляет 22.5 миллиона человек. В развивающихся странах, в том числе и Бенине, в полном соответствиисрекомендациям Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), для борьбы с ВИЧ-инфекцией назначается антиретровирусная терапия [World Health Organization, 2010]. Действия в этом направлении заключались в основном в консультировании, тестированиях и исследованиях, проводимых для улучшения лечения ВИЧ-инфекции и диагностики заболевания. Особое внимание в исследованиях уделяется диагностике заболевания детей, рожденных ВИЧ-позитивной матерью. Особенно интересна диагностика заболевания детей, рожденных ВИЧ-позитивной матерью. Такие дети, из-за слабости их иммунной системы,являются наиболее уязвимыми к этой болезни. Ранняя диагности заболевания в данном случае играет основную роль. Сухие пятна крови (СПК) – удобный альтернативный способ сбора материала для определения вирусной нагрузки ВИЧ-1 и проведения генотипического теста на резистентность. использоваться для изучения Данный распространения способ может ВИЧ среди населения,скрининга и подтверждения ВИЧ статуса у отдельных лиц. 4 Образцы СПК очень удобны для скрининговых программ больших масштабов и эпидемиологического надзора. Преимущество этого метода в том, что используется капиллярная кровь (из пятки, пальца, уха), исключающая венопункцию. СПК нетребует замораживания, и образцы можно пересылать для исследований в центральную лабораторию почтой [Rottinghaus et al.,2012]. Однако, нарушения при отборе проб может привести к неправильным результатам и, как следствие, потере времени необходимого для лечения ребенка. В связи с этим целью данной работы является оценка качества образцов сухих пятен крови для проведения ПЦР диагностики ВИЧ инфекции. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1) Провести анализ образцов сухих пятен крови для проверки их качества и оценить их пригодность для ПЦР анализа на присутствии ВИЧ. 2) Оценить влияние антиретровирусной терапии инфицированных матерей на рождении у них здорового ребенка. 5 ВИЧ 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Общая характеристика ВИЧ ВИЧ является ретровирусом(семейство Retroviridae), который передается половым путем, через кровь или ее продукты и перинатально. Имеются 2 варианта вируса – ВИЧ-1 и ВИЧ-2.ВИЧ-2 эндемичен в Западной Африке и менее патогенен. ВИЧ-1 имеет несколько подтипов, обозначаемых буквами от А до К. Распространение различных подтипов в географических регионах варьирует; свыше 90% людей, инфицированных ВИЧ-1, проживает в развивающихся странах. ВИЧ-инфекция, или синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) – антропонозная инфекция, в основе которой лежит нарушение Т-клеточного иммунитета в результате длительной циркуляции вируса в лимфоцитах, макрофагах и клетках нервной ткани. Вирус, проникнув в организм, разносится кровью и лимфой по всем органам и тканям, поражает клетки иммунной системы (Т-хелперы и макрофаги). Это приводит: к нарушению защитной функции иммунной системы, угнетению реакций иммунной системы на антигены; подавлению синтеза антител к ВИЧ; подавлению фагоцитоза; к снижению продукции интерферона, интерлейкинов и комплемента [Мейл c cоавт., 2007]. Таким образом, ВИЧ-инфекция отличается тотальным поражением иммунной системы. 1.1.1 Морфология и структура ВИЧ Вирус иммунодефицита человека имеет: сферическую форму от 90 до 120 нм в диаметре; капсид и суперкапсид, пронизанный гликопротеиновыми шипами; диплоидный геном, состоящий из двух идентичных плюсоднонитевых молекул РНК; фермент обратную транскриптазу (ревертазу), необходимый для синтеза ДНК на матрице вирусной РНК.Схема строения ВИЧ-1 представлена на рисунке 1. 6 Рисунок 1 – Структура ВИЧ. Приведено из [Coffin et al.,1992] Вирус иммунодефицита человека относится к сложным вирусам, то есть имеет суперкапсид сферической формы, образованный двойным липидным слоем с гликопротеиновыми "шипами". Липидный бислой, представляет собой фрагменты цитоплазматической мембраны, «захваченные» вирусом при отпочковании и выходе из клетки-хозяина; содержит несколько белков клеточного происхождения, В липидной мембране вируса также находятся мембранные белки клеток, в том числе человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) классов I, II и молекулы адгезии (ICAM-1, LFA-1, CD63, CD55). Капсид ВИЧ окружен матриксной оболочкой, образованной из матриксного белка p17. Около двух тысяч молекул этого белка образуют слой толщиной 5-7 нм, располагающийся между внешней оболочкой и капсидом вируса. Капсид образует белок p 24 [Шуази с соавт., 2004]. Вирусные ферменты: обратная транскриптаза (RT), интеграза (IN) и протеаза (PR). 7 1.1.2 Организация генома ВИЧ Внутри капсида находится геном вируса. После проникновения вируса в клетку геном подвергается обратной транскрипции в комплементарную ДНК, которая встраивается в геном клетки хозяина. Геном ВИЧ-1 характеризуется большой изменчивостью и полиморфизмом. Геном представляет собой две копии однонитевой РНК, включает приблизительно 9200 пар оснований и имеет девять открытых рамок считывания (рисунок 2). Три из этих рамок считывания кодируют предшественник полипептидов Gag-Pol и Env, которые впоследствии расщепляются на отдельные белки. Белки р9 и р7 (структурные белки) связывают нуклеиновые кислоты. 9 генов ВИЧ-1 кодируют, по крайней мере, 15 белков. Концы генома представлены длинными концевыми повторами (LTR), которые управляют продукцией новых вирусов и могут активироваться и белками вируса, и белками инфицированной клетки. Рисунок 2 – Схема геномной организации ВИЧ-1 Ген pol кодирует ферменты: обратную транскриптазу (RT), интегразу (IN) и протеазу (PR). Ген gag кодирует полипротеинGag/p55, расщепляемый вирусной протеазой до структурных белков p6, p7, p17,p24. 8 Ген env кодирует белок gp160, расщепляемый клеточной эндопротеазой на структурные белки gp41 и gp120. Другие шесть генов – tat, rev, nef, vif, vpr, vpu (vpx у ВИЧ-2) – кодируют белки, отвечающие за способность ВИЧ-1 инфицировать клетки и производить новые копии вируса. Репликация ВИЧ-1 invitro возможна без генов nef, vif, vpr, vpu, однако их продукты необходимы для полноценной инфекции invivo. 1.1.3 Репликативный цикл ВИЧ-1 Основные этапы репликативного цикла ВИЧ-1, являются общими для всех ретровирусов [Goff, 2004]. Их знание необходимы для понимания патофизиологии ВИЧ-1 инфекции и, прежде всего, каждый шаг представляет собой потенциальную мишень для антиретровирусной терапии [Nielsen et al., 2005]. Вирус взаимодействует с клеткой хозяина через специфическое взаимодействие gp120 и его рецептора, молекулы CD4 (рисунок 3) [Weiss, 2002]. Эта фиксация вызывает конформационные изменения корецепторов, после этого происходит слияние вирусной мембраны с цитоплазматической мембраной клетки-мишени [Koning et al., 2002]. А Б Рисунок 3 – Модель связывания (а) и проникновения ВИЧ-1 в Тлимфоцит-хелпер (б) 9 Раздевание вируса и обратная транскрипция. Попадая в цитоплазму, вирус постепенно разделяется на частицы и начинает распространяться в ней (рисунок 4). Полученные вирусные частицы вступают в процесс обратной транскрипции вирусного генома. Обратная транскриптаза синтезирует комплементарную вирусной РНК цепь ДНК и генерирует на каждом конце генома одинаковые длинные концевые повторы (LTR). РНКаза Н разрушает цепь РНК, в то время как создается цепь ДНК. Вирусный геном соединяется с клеточными и вирусными белками и образует комплекс белков и нуклеопротеидов, что создает условия для последующей интеграции. Рисунок 4 – Схема транскрипции После обратной транскрипции, вирусный геном транспортируется в ядро клетки (рисунок 5). После предварительной интеграции комплекса в ядре, вирусная ДНК интегрируется в хромосомную ДНК из инфицированной клетки под действием вирусной интегразы. Затем вирус существует в виде провируса. 10 б a Рисунок 5 – Схема интеграции вирусного генома От вирусного промотора, расположенного 5 'LTR, интегрированные копии ДНК ВИЧ-1 используются в качестве матрицы для синтеза РНК через вирусную РНК-полимеразы II и контактные взаимодействия тат белка и факторов транскрипции (рисунок 6). б a Рисунок 6 – Схема транскрипции (а) и перевод (б) вирусного генома Белки Pr55Gag Pr160Gag и поли-Pol в месте со вспомогательными белками (ВИФ, ВПР, NEF) и вновь синтезированным вирусным геном, обединяются в мембране, чтобы затем соединиться с белками оболочки, gp120 и gp41 (рисунок 7), что стимулирует высвобождение новых вирусных 11 частиц. Вирусные протеазы расщепляют предшественников белка и Pr55Gag Pr160Gag Pol, формируется капсид и затем вирус принимает свою характерную форму конуса. Затем вирус может начать новый цикл репликации. А Б Рисунок 7 – Сборка (7а) и выход (7b) новых вирионов 1.2 Патофизиология ВИЧ-инфекции 1.2.1 Первичная инфекция Первичное инфицирование - это период между поступлением вируса в организм и возникновением специфического иммунного ответа против вируса. Хотя некоторые люди не имеют симптомов в течение этого периода, у 50% - 90% инфицированных людей развивается неспецифические симптомы, похожие на грипп. Этот этап длится в течение от трех до шести недель. Первичная инфекция характеризуется очень активной репликацией вируса. Кроме того, массивная репликация вируса в CD4 + Т-клеток приводит к их разрушению во время первичной инфекции. Тем не менее, первичная инфекция вызывает создание специфического иммунного ответа против ВИЧ-1. Поэтому, через несколько недель после инфицирования (от одной недели и до трех месяцев) количество CD4 + Т-клеток вернется к 12 нормальной жизни, и вирусная нагрузка в плазме останется низкой [Venereol, 2005] (Рисунок 8). Рисунок 8 – Эволюция биомаркеров в течение инфекции 1.2.2 Бессимптомная инфекция или латентный период После первичной инфекции, инфицированный человек переходит в состояние клинической латентности. Это состояние характеризуется отсутствием симптомов и оппортунистических инфекций. Баланс между вирусом и иммунной системой сохраняется в течение нескольких лет, не влияя на здоровье ВИЧ-инфицированного пациента. Вирусная нагрузка попрежнему остается высокой в течение этого периода. Баланс сохраняется до того момента, как ВИЧ-1 постепенно начинает превалировать над торганизмом (8-10 лет). 1.2.3 Симптоматическая инфекция и СПИД Этот этап характеризуется появлением аномалий или неспецифических клинических признаков болезни. Потеря веса, опухание желез, диарея и лихорадка – это симптомы, которые часто встречаются. Кроме того, у людей могут также развиваться генерализованный кандидоз, герпес и волосистая лейкоплакия. СПИД формируется на фоне разрушения иммунной системы (снижения CD4 – Т-клеток) и увеличения виремии. Этот более серьезный 13 этап инфекции характеризуется развитием оппортунистических инфекций (атипичная пневмония, туберкулез, токсоплазмоз) и серьезных новообразований в различных частях тела. Для людей с тяжелыми формами иммуносупрессии, иммунная система не может остановить распространение этих микроорганизмов, так как CD4 – Т-клетки "памяти были уничтожены иммунная система не достаточно сильна, чтобы восстановить эффекторные Т-клетки. Все эти проблемы, угрожают жизни. Без лечения, пациент, как правило, проживает примерно три года. 1.3 Передача ВИЧ от матери ребенку Более 90% ВИЧ-инфекций среди детей, зараженных в результате вертикальной передачи от матери ребенку (ПМР), возникают преимущественно во время родов или в период кормления грудью [Cock et al., 2000]. В большинстве случаев, однако, можно предотвратить заражение ВИЧ у ребенка, родившегося от ВИЧ-инфицированных матерей. Во многих «северных» странах ВИЧ-инфекции у детей в настоящее время контролируется. Скрининг на ВИЧ беременных женщин, лечение с применением АРВ-препаратов позволяет снизить вирусную нагрузку у беременных женщин во время родов, кесарева сечения и кормления грудью и способствует резкому снижение уровня передачи ВИЧ от матери ребенку (ниже 2%). В Африке, наоборот. Высокий уровень рождаемости и заражения матери ВИЧ-инфекции, трудности в доступе к профилактическим мероприятиям, а также практика широкого кормления грудью в настоящее обеспечивают очень высокий уровень передачи ВИЧ-инфекции от матери ребенку. Без вмешательства для предотвращения передачи ВИЧ от матери ребенку, риск составляет от 30% до 40%. Усилия, направленные на расширение доступа к антиретровирусной терапии должны идти рука об руку с мероприятий для снижения ПМР. В настоящее время, в наиболее пострадавших странах, эти меры не достигают даже охвата 10% населения. Доступ к тестированию на ВИЧ и лечению и АРВ-терапии эффективны у беременных женщин остается одним из основных препятствий для 14 эффективного контроля ПМР [Руководство по детским спидом в Африке, 2006]. 1.4 Методы диагностики ВИЧ-инфекции Экспресс-методы Одной из инноваций в диагностике ВИЧ стали экспресс-тесты, результаты которых могут оцениваться уже через 10-15 минут. Наиболее эффективные и точные результаты получаются при помощи иммунохроматографических тестов, основанных на принципе капиллярного потока. Они представляют собой специальные полоски, на которые наносится кровь или другие исследуемые жидкости (слюна, моча). При наличии антител к ВИЧ, спустя 10-15 минут на тесте появляются цветная и контрольная полоска – положительный результат. При отрицательном результате – появляется только контрольная полоска [http://myfamilydoctor.ru/sovremennye-metody-diagnostiki-vich-infekcii/]. ИФА тест-системы На первом этапе диагностики для выявления ВИЧ-инфекции применяется скрининговый тест (ИФА), который основан на созданных в лабораториях белках ВИЧ, улавливающих вырабатывающиеся в организме в ответ на инфицирование специфические антитела. После их взаимодействия с реагентами (ферментами) тест-системы изменяется окраска индикатора. Далее эти изменения цвета обрабатываются на специальной аппаратуре, которая и определяет результат выполненного анализа. Такие ИФА-тесты способны показывать результат уже через несколько недель после внедрения ВИЧ-инфекции. Этот анализ определяет не наличие вируса, а выявляет выработку антител к нему. Иногда, в организме человека выработка антител к ВИЧ начинается через 2 недели поле заражения, но у большинства людей они вырабатываются на более поздних сроках, спустя 3-6 недель. Существует четыре поколения ИФА-тестов с различной чувствительностью. В последние годы чаще применяются тест-системы III и IV поколения, которые созданы на основе синтетических пептидов или рекомбинантных белков и обладают 15 большей специфичностью и точностью. Они могут использоваться для диагностики ВИЧ-инфекции, мониторинга распространенности ВИЧ и обеспечения безопасности при проверке донорской крови. Точность ИФАтест-систем III и IV поколения составляет 93-99% (более чувствительны тесты, которые выпускаются в странах западной Европы – 99%). Для выполнения ИФА-теста проводится забор 5 мл крови из вены пациента. Между последним приемом пищи и анализом должно пройти не менее 8 часов (как правило, он выполняется утром натощак). Такой тест рекомендуется сдавать не ранее, чем через 3 недели после предполагаемого заражения (например, после незащищенного полового акта с новым половым партнером). Результаты ИФА-теста получаются через 2-10 дней: отрицательный результат: указывает на отсутствие инфицирования ВИЧ и не требует обращения к специалисту; ложноотрицательный результат: может наблюдаться на ранних сроках инфицирования (до 3 недель), при поздних стадиях СПИДа при выраженном подавлении иммунитета и при неправильно проведенной подготовке крови; ложноположительный результат: может наблюдаться при некоторых заболеваниях и при неправильно проведенной подготовке крови; положительный результат: указывает на заражение ВИЧ инфекцией, требует проведения ИБ и обращения пациента к специалисту в центр СПИДа [http://myfamilydoctor.ru/sovremennye-metody-diagnostiki-vichinfekcii/]. Иммунный блоттинг Окончательный диагноз инфицирования ВИЧ может устанавливаться только после получения положительного результата иммунного блоттинга (ИБ). Для его проведения применяется нитроцеллюлозная полоска, на которую нанесены вирусные белки. Забор крови для ИБ выполняется из вены. Далее она подвергается специальной обработке и содержащиеся в ее сыворотке белки разделяют в специальном геле по их заряду и молекулярной массе (манипуляция воздействием проводится электрического на поля). 16 специальной На гель из аппаратуре сыворотки под крови накладывают нитроцеллюлозную полоску и проводят блоттинг («промакивание») в специальной камере. Полоска обрабатывается и если в используемых материалах есть антитела к ВИЧ, то они связываются с антигенными полосами на ИБ и проявляются в виде линий. ИБ считается положительным если: по критериям AmericanCDC – на полоске есть две или три линии gp41, p24, gp120/gp160; по критериям AmericanFDA – на полоске есть две линии р24, р31 и линия gр41 или gр120/gр160. В 99,9% случаев положительный результат ИБ указывает на ВИЧ-инфицирование. При отсутствии линий – ИБ является отрицательным. При выявлении линий с gр160, gр120 и gр41- ИБ является сомнительным. Такой результат может выявляться при: начальных стадиях ВИЧ-инфицирования ; туберкулезе; онкологических заболеваниях; беременности; частых трансфузиях крови. В таких случаях рекомендуется выполнение повторного исследования при помощи набора другой фирмы. Если же после дополнительного ИБ результат остается сомнительным, то необходимо наблюдение в течение полугода (через каждые 3 месяца проводятся ИБ) [http://myfamilydoctor.ru/sovremennye-metody-diagnostiki-vich-infekcii/]. Полимеразная цепная реакция Тест на ПЦР может определять РНК вируса. Его чувствительность достаточно высока и он позволяет выявлять ВИЧ-инфицирование уже через 10 дней после заражения. В некоторых случаях ПЦР может давать ложноположительные результаты, т. к. его высокая чувствительность может реагировать и на антитела к другим инфекциям. Данная методика диагностики является дорогостоящей, требует специального оборудования и высокой квалификации специалистов. Эти причины не дают возможности проводить ее при массовом тестировании населения. ПЦР применяется в таких случаях: для выявления ВИЧ у новорожденных, которые родились от ВИЧ-инфицированных матерей; для выявления ВИЧ в «периоде окна» или при сомнительном ИБ; для контроля концентрации ВИЧ в крови; для исследования донорской крови. Только по тесту ПЦР диагноз ВИЧ не 17 ставится, а проводится в качестве дополнительного метода диагностики для разрешения спорных ситуаций [http://myfamilydoctor.ru/sovremennye-metodydiagnostiki-vich-infekcii/]. 1.5 Сухие пятна крови (СПК) – удобный альтернативный способ сбора материала Пробы на фильтровальной бумаге или сухие пятна крови (СПК)-это забор крови на фильтровальную пористую бумагу с гладкой поверхностью, без потерянных волокон, обладающую влагостойкостью. Эта бумага устойчива к воздействию кислот и оснований, обладает способностью поглощать и удерживать кровь по капиллярам. Эти характеристики делают эту бумагу интересной для сбора, транспортировки и хранения проб. СПК используется в вирусологии, токсикологии и биохимии. Прибегать к этому способу, в качестве основы для сбора крови, стали в 1960 году, тест Гатри был использован как способ сохранения каплей крови новорожденных для скрининга на фенилкетонурию. Использование систем сбора, бумажного фильтра для сбора, транспортировки и хранения крови является общепризнанным в настоящее время. Метод СПК устойчив к комнатной температуре и не требует холодовой цепи. Это, таким образом, удобный инструмент исследования, особенно в условиях материальных трудностей, он позволяет применять все тесты для диагностики и мониторинга ВИЧинфекции: диагностика новорожденных детей, рожденных ВИЧ- инфицированными матерями, дозорного эпиднадзора по ВИЧ-инфекции, выявление провирусной ДНК, а затем количественного определения РНК, и исследования на вирусные антигены. Этот способ также позволяет облегчить сбор образцов у пациентов, живущих в сельской местности или в городах, удаленных от центров. Сохранение СПК при низкой температуре обеспечивает хорошую стабильность РНК. Наконец, использование СПК, дешевле сбора крови с помощью пробирок, таким образом, является более доступным для стран с ограниченными ресурсами, где этот метод занимает важное место в стратегии диагностики и мониторинга людей, живущих с 18 ВИЧ. Благодаря развитию науки мы в эти дни имеем новый продукт СПК [www.fondation-gsk.fr]. 19 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объект исследования Работа выполнена на базе центральной диагностической вирусологической лаборатории (PNLS) в г. Котону (Республика Бенин). В лаборатории проводятся следующие виды анализов: - Тестирование на ВИЧ с использованием методов ИФА и имуноблотинга; - Раннее выявление ВИЧ-инфекции у новорожденных, полученных от ВИЧ инфицированных матерей с использованием ПЦР аназиза. В работе исследовались образцы сухих пятен крови (СПК), отобранных у детей от ВИЧ-инфицированных матерей. В экспериментах принимали участие 302 ребенка (мальчики и девочки) в возрасте от 0 до 18 месяцев. Работа проводилась в течении трех лет: 2010, 20112 и 2013 гг. 2.2 Отбор проб с помощью метода СПК 2.2.1 Необходимые материалы Комплект для отбора проб крови состоит из фильтровальной бумагис гладкой поверхностью, без потерянных волокон и обладающей высокой влагостойкостью, иглы, латексных х перчаток, штатива для образцов СПК, пакетов -осушители, карты-индикатора влажности, упаковковдля СПК, ватных тампонов и 70 % этанола. 2.2.2 Техника отбора проб СПК Для детей до 10 кг, отбор крови осуществляется из пятки. Для детей от 10 кг и больше – из большого пальца (рисунок 9). 20 Рисунок 9 – Отбор проб СПК Затем проводится идентификацию каждого образца СПК и заполняется анкета для ПЦР. Медицинский персонал должен вымыть руки и надеть перчатки, желательно без обработки порошком. После этого надо рассположитьногу ребенка носком вниз и обработать пальцы спиртом (70%), а затем доть спирту высохнуть (рисунок 10). А Б Рисунок 10 – Положениеног ребенка (А) и дезинфекция места отбора крови (Б). 21 Нужно слегка надавить на ногу для ускорения потока крови. Затем делается укол.Затем сделать отметкукровью в каждом кружке промокательной бумаги, слегка касаясь бумаги и покрывая ею всей поверхности круга.способом надо заполнить все пять кругов (рисунок 11). А Б Рисунок 11 – Укол в месте отбора проб (А) и отметки кровью на фильтровальной бумаге (Б) Затем надо обработать место прокола ватным тампоном и после этого покрыть повязкой, если это возможно. 2.2.4 Техникасушки образцов крови Для получения СПК образцы взятой крови на фильтровальной бумагеоставляют при комнатной температуре в течение не менее четырех часов в горизонтальном положении. Для этого используется соответствующий штатив (рисунок 12). Время высыхания зависит от температуры и влажности помещения, можно оставить сохнуть и на всю ночь. 22 Рисунок 12 – Метод сушки СПК 2.2.5 Упаковка и хранение образцов СПК После высушивания образцов, надо поместить каждую карту СПК в вакуумный пакет (рисунок 13 А). Если индивидуальная упаковка невозможна, карту помещают на лист бумаги- пергамин, упаковывают в мешки пергамин с добавлением осушителей.Чтобы карта с образцами СПК не двигалась, лист бумаги сгибают (рисунок 13 Б).Затем образцы СПК упаковывают в вакуумный пакет с осушителями (рисунок 13 В). Максимальное количество карт в одном пакете – 10.В вакуумный пакет необходимо добавить от 2 до 3 пакетиков осушителей (до 10, если несколько карт) (рисунок 13 Г). 23 А Б В Г Рисунок 13 – Упаковкаи сохранение образцов СПК Из пакета удаляется воздух, и он плогтно закрывается.На пакете указываются идентификационные данные, дата и количество карт СПК в одном пакете.Образцы хранятся при комнатной температуре не больше 30 дней. По истечении 30 дней, образцы следует хранить при температуре20°C. 2.2.6 Доставка образцов СПК в Центральную диагностическую вирусологическую лабораторию В день доставки образцов СПК, карты с образцамии СПК проходят последнюю проверку. Проводится заменакарт-индикаторов влажности и пакетов- осушителей, даже если они все еще в хорошем состоянии. Затем образцы помещают в полиэтиленовый пакет и в бумажный конверт, который содержит описание груза, схемуприема, а также листы заявки на ПЦР. 2.3 ПЦР диагностика ВИЧ-инфекции К методам диагностики ВИЧ относится метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), которым выявляется РНК вируса.Результат анализа принято называть положительным (вирус обнаружен), отрицательным (вируса нет) 24 или сомнительным (маркеры вируса есть, но не все, результат не может считаться положительным). 2.4 Статистическая обработка Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе “ Excel 7.0.”. Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение σ в ней не превышало 13%. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности Р<0.05. 25 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Анализ образцов сухих пятен крови для проверки их качества и оценить их пригодность для ПЦР анализа на присутствии ВИЧ Ранняя диагностика ВИЧ-1 у новорожденных, родившихся от матерей с ВИЧ, позволяет быстропомочь ребенку. Отбор проб для оценки качества образцов СПК у детей в возрасте от 0 до 18 месяцев от ВИЧ-позитивных матерей проводился в 2010, 2012 и 2013 годах. Отобранные пробы были доставлены в центральную диагностическую вирусологическую лабораторию (PNLS) в г. Котону (Республика Бенин). Всего было исследовано 302 образца, 35 из которых – в 2010 году, 168 – в 2012 и 134 – в 2013 году (рисунок 14). 130 проб принадлежало девочкам и 172 пробы (56.96%)– мальчикам. Рисунок 14 – Распределение образцовСПК, отобранных у детей в возрасте от 0 до 18 месяцев от ВИЧ-позитивных матерей Следует отметить, что наибольший процент некачественных образцов отмечался в 2010 году (рисунок 15) и составлял 25.72 %. 26 Рисунок 15 – Анализ качества образцов СПК При анализе проб СПК были выявлены нарушения, представленные на рисунке 16. Смешивание соседних пятен крови Пятно с кольцом сыворотки Недостаточное количество крови Полосатое и эродированное пятно Рисунок 16 – Нарушения при отборе проб СПК В результате проведенной работы были сделаны методические рекомендации, которые необходимо выполнять младшему медицинскому 27 персоналу при отборе проб. В результате выполнения этих рекомендаций количество недействительных проб СПК значительно снизилось. Так в 2012 году они составляли 11.9%, а в 2013 только 6.72% от общего количества проб. В результате работы с младшим медицинским персоналом и выполнения ими рекомендаций уменьшилось и разнообразие нарушений при отборе проб СПК (рисунок 17). Так если в 2010 году были представлены все 5 видов нарушений, то в 2012 году они ограничились только 3, а в 2013 – 2 видами. Нарушение, связанное со смешиванием соседнихпятенкрови являлось основным как в 2010, так и в последующие года. За то нарушения «недостаточное количество крови» и «полосатое и эродированное пятно» полностью отсутствовали в 2012 и 2013 годах. Нарушение «неверная идентификация» было вторым по значимости в 2010 и 2012 годах и полностью отсутствовало в 2013 году. Рисунок 17 – Анализ разнообразных нарушений при отборе проб СПК Следовательно, проведение анализа некачественных проб СПК и разработка рекомендаций по предотвращению нарушений при отборе проб привели к значительному снижению их количества и уменьшению 28 разнообразия вариантов. Все это приводит к более быстрому получению информации о состоянии здоровья ребенка родившегося у ВИЧ-позитивной матери и в случае положительного ПЦР анализа незамедлительному его лечению. 3.2 Влияние антиретровирусной терапии ВИЧ инфицированных матерей на рождении у них здорового ребенка На следующем этапе работы было оценено влияние антиретровирусной терапии ВИЧ инфицированных матерей на рождении у них здорового ребенка. В эксперименте принимали участие 299 женщин, из которых 28% (83 человека) от общего числа испытуемых принимали лекарства. Как видно из рисунка 18 в среднем у 73.32 ± 4.71% женщин, не проходящих курс антиретровирусной терапии, рождались ВИЧ негативные новорожденные, в то время как у женщин, принимающих препараты – 98.03 ± 2.00%. Следовательно, применение антиретровирусной терапии повышает количество, % шанс рождения здорового ребенка даже у ВИЧ инфицированных матерей. А Б 100 80 60 40 20 0 1 2 варианты Рисунок 18 – Влияние антиретровирусной терапии ВИЧ инфицированных матерей на рождение ВИЧ-позитивных (А) и ВИЧнегативных новорожденных 29 ВЫВОДЫ 1) При анализе образцов сухих пятен крови было выделено 5 различных нарушений, 3 из которых были устранены к 2013 году. 2) Применение антиретровирусной терапии ВИЧ инфицированных матерей приводит к увеличению новорожденных в 1.3 раза. 30 количества ВИЧ-негативных СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНЫХ ИСТОЧНИКОВ 1) Мейл, Д. Иммунология [Text] / Д. Мейл, Дж. Бростофф, Д.Б. Рот, А. Ройт: М., изд-во «Логосфера», 2007. С.317-324. 2) Biotop et Physiopathologie du VIH, 2010- [www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/SIDA/6diagnostic.htm] 3) Choisy, M. Adaptative Molecular evolution in different human immune deficiency virus groups and subtypes [Text] / M. Choisy, C.H. Woelk, J.F. Guegan, D. Robertson //Comparative study of J Virol –2004 – V.78.N.4 – P.1962-1970. 4) Coffin, J.M. Structure and classification of retroviruses [Text] / J.M. Coffin, Levy J.A. // Ed. The retroviridae, New York, plenum-1992- P.19-50. 5) Goff, S.P. Genetic control of retrovirus susceptibility in mammalian cells [Text] / S.P. Goff // Annurev genetic-2004 – V.38- P.61-85. 6) Guthrie, R. A simple phenylalanine method for detecting phenyl ketonuria in large populations of new born in fants [Text] / R. Guthrie, A. Susi // Pediatrics-1963-V.32- P.338–343. 7) Hannon, W.H. A quality as surance program for human immunodeficiency virus seropositivitys creening of dried-blood spot specimens [Text] / W.H. Hannon, D.S. Lewis, W.K. Jones, M.K. Powel // Infect Control Hosp Epidemiol. – 1989. –V. 10- P.8–13. 8) Klein, R.Z. Neonatal screening for hypothyroidism [Text] / R.Z. Klein // Adv Pediatr-1979-V. 26-P.417–440. 9) Koudokpon, C.H. Impact de la mauvaise réalisation des prélèvements DBS dans le diagnostic précoce de l’infection à VIH1 chez le nouveau-né de mère séropositive ,2010, Rapport de fin de formation de licence à l’EPAC. [Text] / C.H. Koudokpon // HOUNMENOU M.M., 2010- P.12-37 10) Leelawiwat, W. Dried blood spots for the diagnosis and quantization of HIV-1: stability ystudies and evaluation of sensitivity and specificity for the diagnosis of infant HIV-1in fection in Thailand [Text] / W. Leelawiwat // J Virol Methods.-2009- V. 155.N.2- P.109-117. 31 11) Levy, Jay A. HIV pathogenesis: 25 years of progress and persistent challenges [Text] / Jay A. Levy // AIDS-2009- V23:147-160. 12) Nielsen, M.H. Molecular strate giesto inhibit HIV replication [Text] / M.H. Nielsen, F.S. Pedersen, J. Kjems / / Retrovirology-2005-P.2-10. 13) ONUSIDA. Le point sur l’épidémie mondiale de SIDA. Genève. Programme commundes Nations Unies surleVIH/SIDA [ Text] / Rapport sur l’ épidémie du SIDA. ONUSIDA-2009. 14) Pantaleo, G Mechanics of disease: The immune pathogenesis of immunodeficiency virus infection [Text] / G. Pantaleo, C. Graziosi, A.S. Fausi // N. Engl. J. Med, V 328-P.327-333. 15) Rottinghaus, E.K. Dried blood spot specimens are a suitable alternative sample type for HIV-1 viral load measurement and drug resistance genotyping in patients receiving first-line antiretroviral therapy [Text] / E.K. Rottinghaus, R. Ugbena, K. Diallo, O. Bassey, A. Azeez, J. Devos, G. Zhang, J. Aberle-Grasse, J. Nkengasong, C. Yang // Clin Infect Dis. – 2012 – V.54.N.8. – P. 1187-1195. 16) Venereol Infectionà VIH: Manifestations cutanéo- muqueuses delaprimo-infectionàVIH [Text] / Venereol // AnnDermatol - 2005- V132 P.7S357S37. 17) Weiss, R.A. HIV receptors and cellular tropism.[Text] / R.A. Weiss, // IUBMB Life-2002-V. 53-P.201-205. 18) Déroulement du prélèvement DBS pour le diagnostic précoce, 2010[www.fondation-gsk.fr] 19) World Health Organization. Towards universal access: scaling up priority HIV/AIDS interventions in the health sector. Progress report. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 2010. 32
