ОСНОВЫ ГИСТОХИМИИ Раздел 2. Микротехника
advertisement
1 ОСНОВЫ ГИСТОХИМИИ Раздел 2. Микротехника СОДЕРЖАНИЕ (используйте гипертекст) Глава 1. Фиксация тканей 1. Химическая фиксация (общие положения) 1.1. Альдегиды 1.2. Соли неорганических кислот 1.2.1. Хромовая кислота и ее соли 1.2.2. Соли ртути 1.2.3. Четырехокись осмия 1.3. Органические кислоты 1.3.1. Пикриновая кислота 1.3.2. Сульфосалициловая кислота 1.3.3. Трихлоруксусная кислота 1.4. Спирты 1.5. Ацетон 1.6. Фиксирующие смеси Глава 2. Физические методы фиксации 2.1. Замораживание образцов ткани 2.1.1. Процесс кристаллизации воды в тканях при низких температурах 2.1.2. Криометоды. Прямое замораживание ткани до T = -10 - -20° С (без дегидратации) 2.1.3. Криометоды. Глубокое замораживание ткани до T = -78 - -196°С (без дегидратации) 2.1.4. Твердая углекислота. Жидкий азот 2.2. Сублимационная дегидратация тканей 2 2.2.1. Теоретические основы сублимационной сушки 2.2.2. Уровень вакуума в сушильной камере 2.2.3. Температурный режим сублимации 2.2.4. Сопротивление высушенного слоя 2.2.5. Определение конца сушки 2.2.6. Обработка лиофилизированной ткани 2.2.7. Артефакты, возникающие при сублимационно сушке тканей 2.2.8. Аппараты для лиофильной сушки ткани для гистохимического анализа 2.2.9. Лиофилизация растительной ткани 2.3. Замещение в замороженном состоянии Глава 3. Микротомия тканей Общие положения 3.1. Приготовление блоков ткани для микротомии 3.1.1. Парафин 3.1.2. Целлоидин 3.2. Микротомы 3.2.1. Микротомы для пропитанной ткани 3.2.2. Ножи для микротомов 3.2.3. Микротомы для замороженной ткани 3.2.4. Криостат 3.2.5. Резаки, Вибратомы 3. 3. Манипуляции со срезами 3.3.1. Подготовка предметных и покровных стекол 3.3.2. Автоматы для гистологической обработки Контрольные вопросы Рекомендуемая литература 3 Глава 1. Фиксация тканей Общие положения Практическое осуществление гистохимических методов обычно состоит из двух операций: 1) приготовление тонкого среза тканей (или других типов цитологических и гистологических препаратов: мазки, отпечатки и др.); 2) проведение гистохимической реакции в соответствии с поставленной задачей и анализ полученных препаратов. Однако уже на первой стадии возникает ряд проблем, преодоление которых требует специальных дополнительных операций. Как известно, ткани животных (и растений) содержат около 80-90% воды и обладают такими вязко-эластичными свойствами, специальной дополнительной обработки, ткани, сделать тонкие срезы которые не позволяют без непосредственно из нативной ткани, годные для проведения гистохимической реакции и последующего микроскопического анализа. (Тонкими срезами для цитологических (цитохимических) исследований обычно называются срезы толщиной 2-5 мкм; для гистологических исследований и проведения гистохимических реакций - 5 - 25 мкм) Другая проблема связана с тем, что после умерщвления животных и извлечения ткани из организма в ткани продолжаются различные биохимические процессы, приводящие к нарушению морфологической и биохимической структуры, характерные для нативного состояния. Эти, так называемые, постмортальные изменения, приводят к необратимым артефактам. Таким образом, на первом этапе гистохимической процедуры необходимо осуществить максимально быструю остановку биохимических процессов для уменьшения постмортальных изменений и изменения вязкоупругих свойств ткани таким образом, чтобы было возможно изготовить тонкие срезы. 4 Для решения этих задач и подготовки образца нативной ткани для изготовления срезов (КРИОТОМИЯ ТКАНЕЙ) используются специальные операции - ФИКСАЦИЯ (химическая фиксация и фиксация с использованием физических методов - криометоды, вакуумная сублимационная сушка и др.) и ЗАЛИВКА фиксированного материала в твердые материалы (парафин, полимерные смолы). Кроме этого, имеется ряд методов прямого изготовления срезов из замороженной ткани без предварительной химической фиксации образцов. 1. Химическая фиксация (общие положения) Химическая фиксация связана с использованием специальных химических фиксаторов - соединений, приводящих к быстрой остановке биохимических процессов в тканях и клетках, после извлечения их из организмов и органов. Несомненно, что химические фиксаторы приводят к определенным изменениям химического строения и химических свойств некоторых эндогенных химических субстратов клеток и тканей. К химическим фиксаторам предъявляются три основные требования (рис.1): Рис.1. Схема химической фиксации (синим цветом выделены достоинства химической фиксации, красным цветом – возможные причины артефактов) · прежде всего, фиксаторы не должны разрушать морфологическое 5 строение клеток и тканей; · фиксаторы должны быстро проникать в ткань за счет диффузии и иметь высокую скорость взаимодействия с внутриклеточными и внутритканевыми соединениями; · фиксаторы должны изменениям приводить к обратимым химическим внутриклеточных и внутритканевых эндогенных соединений, или к необратимым изменениям, которые, однако, не влияют на качественные и количественные параметры последующей гистохимической реакции. В качестве химических фиксаторов используются альдегиды, кислоты, соли неорганических кислот, спирты и другие соединения. 1.1. Альдегиды На рис. 2 приведены основные моно- и диальдегиды, используемые в качестве химических фиксаторов: Рис. 2. Структура некоторых альдегидов – химических фиксаторов. 1 – 5 - моноальдегиды, 6 – 8 - диальдегиды Из общих свойств альдегидов, нарушающих фиксирующие свойства, необходимо отметить их окисление до кислот, восстановление до спиртов и полимеризацию (рис.3): 6 Рис.3. Основные реакции альдегидов Фиксирующие действия альдегидов связаны, главным образом, с их реакцией реакцию с с тканевыми белками. Например, активным атомом водорода формальдегид вступает в белков с образованием метиленового мостика. Реакция протекает в две стадии (рис.4): 1 стадия – образование промежуточного оксиметильного соединения, 2 – образование метиленового мостика между двумя молекулами белка: Рис.4. Образование метиленовых мостиков при взаимодействии белков с альдегидами Одним из самых распространенных химических фиксаторов являются растворы, приготовленные на основе формалина - 40% раствора формальдегида в воде. Формальдегид - газ с резким запахом, растворим в воде. Насыщенный раствор формальдегида в воде называется формалином. При хранении в растворе формальдегид полимеризуется до плохо растворимого в воде 7 осадка белого цвета - параформа (параформ выпускается в виде тонкодисперсного белого порошка с сильным запахом формалина): Реакции тканевых белков с глутаральдегидом, очень распространенным фиксатором, особенно для электронной микроскопии недостаточно изучены. Предположительно фиксирующей способностью обладают олигомеры глутаральдегида, которые образуются в результате его полимеризации в концентрированных растворах. В результате такой полимеризации возникает молекула последовательность которой содержит фиксатора, максимальная 5 атомов углерода, соединяющая ("сшивающая") три молекулы белка. Как упоминалось выше, альдегиды, в основном, вступают в реакцию с активным водородом аминогруппы белков, сульфгидрильных связей, гуаниновых и фенольных групп (рис. 5). Реакции альдегидов с нуклеопротеидами связаны с их взаимодействием с пиримидиновыми, пуриновыми основаниями и с белковыми компонентами (рис.6). С липидами формальдегид не взаимодействует, кроме фосфатидилэтаноламина. С углеводами формальдегид и другие альдегиды не реагируют. Стабилизация гликогена в тканях связана с влиянием альдегидов на белки, окружающие гликоген. 8 Рис.5. Основные химические группы и соединения, с которыми взаимодействуют альдегиды Акролеин и кротональдегид содержат в своей молекуле этиленовую группу, которая более реакционноспособна, однако, "сильная" фиксация тканевых белков для гистохимических реакций менее предпочтительна, чем мягкая фиксация формальдегидом и глутаральдегидом. Ацетальдегид и 2-оксиадипинальдегид - облают слабыми фиксирующими свойствами и плохо сохраняют морфологическую структуру ткани и поэтому редко используются как химические фиксаторы. Так как 2оксиадипинальдегид лишь незначительно инактивирует некоторые ферменты, этот альдегид иногда используется в гистохимии ферментов. Метиленовый мостик, образованный формальдегидом с молекулами белка, может разрываться (гидролизоваться), для тщательная (длительная) промывка водой (рис.6). чего требуется 9 Рис.6. Гидролиз метиленовых мостиков Такие альдегиды, "крепкие" сшивки как глутаральдегид и акролеин вызывают более белковых молекул, что может приводить к ингибированию активности многих ферментов. Поэтому формальдегид, ацетальдегид, оксиадипинальдегид являются более предпочтительными при гистохимическом изучении ферментов. Температура, длительность фиксации и концентрация альдегида не имеют большого значения для сохранности тонких структур и активности многих внутриклеточных соединений. Однако для гистохимического анализа необходимо стремиться к уменьшению времени фиксации и предпочтительно проводить фиксацию при низкой температуре (+4 С). Скорость диффузии альдегидов в ткань снижается в ряду: акролеин> формальдегид>оксиадипинальдегид. В связи с этим необходимо стремиться выбирать для фиксации образцы тканей меньшего размера (стремиться к уменьшению толщины тканевого образца). Иногда можно использовать смесь альдегидов: например, медленно проникающий глутаральдегид использовать в смеси с формальдегидом или акролеином и т.д. Фиксация альдегидами обычно осуществляется путем погружения образца ткани в растворы альдегидов (1, Рис. 7); путем внутрисосудистой перфузии органа раствором фиксатора перед выделением образца ткани (2, Рис.7); в парах альдегидов при определенной влажности (3, Рис.7) (данный способ особенно часто используется в случае лиофилизированных тканей, см. ниже). 10 Рис. 7. Методы использования альдегидов в качестве фиксаторов. 1 – погружение, 2 – перфузия, 3 – фиксация в парах. Обозначения: ф – фиксатор, а – кусочки тканей, т – перфузируемый орган, к – контейнер с тканевыми образцами, п - параформ Для поддержания физиологическом уровне рН фиксирующих растворов (рН = 7,4 - 7,6) обычно альдегидов на используются кокодилатный или фосфатный буферы. В сильно щелочных растворах фиксатора возможна реакция Канницаро, в альдегидов образуются спирты и кислоты. результате которой из Веронал-ацетатный буфер Михаэлиса и трисбуфер взаимодействуют с альдегидами и поэтому их нельзя использовать для приготовления альдегидных фиксаторов. При хранении водных растворов альдегидов в них образуются кислоты (например, в формалине - предварительная обработка муравьиная кислота), исходных поэтому необходима растворов альдегидов перед приготовлением из них фиксирующих растворов (нейтрализация кислот, перегонка в вакууме, встряхивание с активированным углем, пропускание через колонку с сефадексом G-10 и др.). 1.2. Соли неорганических кислот 1.2.1. Хромовая кислота и ее соли Хромовая кислота образуется при взаимодействии хромового ангидрида с водой: 11 Хромовая кислота сильный окислитель, в ткани проникает очень медленно - за 4 часа проникает на глубину 1,4 мм. Во время фиксации хромовая кислота и ее соли вызывают осаждение цитоплазматических и ядерных белков. Взаимодействуя с водой хроматы способны образовывать комплексы Cr-O-Cr, функциональными которые группами могут белков гидроксильными и др.), образуя вступать в реакцию с (карбоксильными, аминными, мостики, аналогичные метиленовым, которые образуются при взаимодействии формальдегида с белками. Считается, что ионы хрома, в основном, связываются с карбоксильными группами белков и, в конечном счете, как указывает Э.Пирс, действие хрома проявляется в разрыве внутренних (солевых) связей в молекулах белка и увеличении количества находящихся в основных групп, реактивном состоянии, что приводит к повышению ацидофильных свойств образующихся комплексов хром-белок. В гистохимических исследованиях соли хрома используются редко, за исключением некоторых хромаффиновой специальных реакций, например в реакции на катехоламины, а также для стабилизации липидов и нуклеиновых кислот. 1.2.2. Соли ртути Соли ртути, главным образом, сулема (двухлористая ртуть), используются для фиксации, в основном, благодаря избирательному взаимодействию с SH-группами белков. Хотя необходимо отметить, что как и другие ионы металлов, ионы карбоксильными и ртути взаимодействуют гидроксильными группами также с белков. Взаимодействие сулемы с SH-группами белков протекает в две стадии: 12 Вторая стадия реакции имеет главного значения протекает медленно и, по-видимому, не для процесса фиксации тканевых Реакция SH-групп белков с ртутью например, при изучении нуклеиновых белков. является необратимой, поэтому, кислотными группами нуклеотидов) или кислот (ртуть реагирует с сульфидрильных групп белков необходимо избегать ртутьсодержащих фиксаторов, хотя ряд реакций на белки (реакции Миллона, Сакагуши, тетразониевого сочетания) можно проводить после фиксаторов, в состав которых входят ионы ртути. 1.2.3. Четырехокись осмия Четырехокись осмия, кислота", один или как часто ее называют "осмиевая из широко используемых фиксаторов, особенно в электронной микроскопии. Фиксатор легко взаимодействует с липидами, особенно с нейтральными липидами, содержащими остатки непредельных карбоновых жирных кислот - олеиновой, линолевой, линоленовой. Механизм взаимодействия четырехокиси осмия с тканевыми липидами до конца не изучен, но считается, что этот фиксатор образует нестабильные моноэфиры циклического типа в результате окисления двойных связей жирных кислот (рис. 8): Рис. 8. Схема взаимодействия OsO4 с жирными кислотами Соединение I может образовывать стабильные диэфиры при реакции с соединениями, содержащими гидроксильные группы (рис.9): 13 Рис.9. Образование диэфирных связей соединения I (рис.9) с цепями, содержащими гидроксильные группы При избытке непредельных соединений осмиевая кислота может образовывать комплексные соединения (рис.10): Рис. 10. Образование комплексных соединений OsO4 с непредельными соединениями Согласно другим данным, осмиевая кислота может образовывать сшивки между двумя участками непредельных жирных кислот (рис.11): Рис. 11. Образование сшивки соединения I (рис. 9) с непредельными жирными кислотами Показано, что для четырехокиси осмия можно построить следующий ряд активности взаимодействия с различными другими реакционными группами химических соединений: SH-группы > -С=С-группы > 14 концевые аминогруппы > -S-S-группы > -СНО-группы >концевые ОН-группы >-ОН-группы ароматического кольца. 1.3. Органические кислоты 1.3.1. Пикриновая кислота Пикриновая кислота – 2,4,6- тринитрофенол, кристаллическое желтого вещество цвета, растворимое в воде. Растворы пикриновой кислоты легко диффундируют в ткани и вызывают коагуляцию тканевых белков. При этом образуются солеподобные соединения, в которых белковая часть представляет катион, а остаток пикриновой кислоты - анион. Растворы 2,4,6-тринитрофенола используются в чистом виде как фиксаторы редко, обычно пикриновая кислота входит в состав фиксирующих смесей. Наиболее распространен фиксатор Боуэна - смесь пикриновой кислоты, формальдегида и уксусной кислоты используется для фиксации тканевого материала для иммуногистохимических методов, для фиксации гликогена и мукополисахаридов. 1.3.2. Сульфосалициловая кислота 15 Сульфосалициловая кислота вызывает коагуляцию белков и потерю коллоидными структурами цитоплазмы сольватных оболочек, что приводит к хорошей морфологической и биохимической сохранности тканей. Сульфосалициловая кислота часто используется самостоятельно или в смеси с другими фиксаторами белков, углеводов, липидов, гликогена, мукополисахаридов. 1.3.3.Трихлоруксусная кислота Трихлоруксусная острым кислота, представляющая бесцветные кристаллы с запахом, хорошо растворимые в воде, широко используется в общей биохимии для осаждения белков. Однако в качестве гистохимического фиксатора на белки это соединение используется крайне редко. 1.4. Спирты Из спиртов в качестве химических фиксаторов используются чаще всего этиловый (1) и метиловый (2) спирты: (1) (2) Фиксирующее действие спиртов связано с осаждением белков. Точных данных о механизмах осаждения белков спиртами в настоящее время не имеется, однако, существует несколько предположений на этот Например, считается, что под действием спиртов возможен поперечных сшивок в белковой цепи (рис. 12). счет. разрыв 16 Рис.12. Возможные точки приложения спирта во время фиксации белков Согласно другим данным, оболочки появление спирты могут нарушать сольватные входящих в белки групп, "уплотнять молекулы" и вызывать новых конфигураций функциональных групп в белковой молекуле. Фиксация белков спиртами в ряде случаев обратима, однако, большинство ферментов необратимо теряет активность после обработки тканевых образцов или срезов ткани спиртами. различные фиксирующие Обычно спирты входят в смеси, например, широко известный фиксатор Карнуа состоит из абсолютного спирта, хлороформа и уксусной кислоты и широко используется для фиксации нуклеиновых кислот, белков, гликогена, мукополисахаридов и др. 1.5. Ацетон Ацетон (диметилкетон) представляет летучую жидкость, смешивающуюся с водой в любых соотношениях. Ацетон обезвоживает коллоиды цитоплазмы и приводит к осаждению белков, что не приводит к глубоким изменениям в структуре белка и поэтому действие ацетона обратимо при добавлении к фиксированным тканям воды. Однако, ацетон, также как и спирты, приводит к сильному сжатию ткани и это надо учитывать при анализе морфологических характеристик ткани. 17 1.6. Фиксирующие смеси В заключение краткого обзора неорганических соединений, основных групп используемых в органических и качестве химических фиксаторов тканей, необходимо отметить, что в большинстве случаев для гистохимической фиксации используются смеси, составленные из нескольких специальные фиксирующие фиксирующих соединений, рассмотренных выше. Для примера можно привести следующие широко используемые фиксаторы: · Фиксатор Шаффера - смесь формалина и спирта; · Фиксатор Ружа - смесь формалина и уксусной кислоты, которая предохраняет ткань от сморщивания); · Жидкость Карнуа - смесь этанола, хлороформа и уксусной кислоты (рис.13); · Фиксатор представляющий смесь сулемы и уксусной кислоты; · Фиксатор Боуэна - смесь пикриновой кислоты, формалина и уксусной кислоты. Рис.13. Фиксатор Карнуа Из приведенных примеров видно, что часто к фиксирующим соединениям добавляется ледяная уксусная кислота, которая сама по себе 18 не обладает выраженными фиксирующими свойствами, но ее добавление в гистохимический фиксатор приводит обычно к ускорению диффузии основного фиксатора в ткань. Для этой же цели иногда используется диметилсульфоксид, который также увеличивает проницаемость тканей для основного фиксатора. 19 Глава 2. Физические методы фиксации Физические методы фиксации тканей для гистохимических целей основываются на использовании методов, связанных с действием низких температур, в диапазоне -78 - -196 °С, низкотемпературной фиксации на биологическую ткань. При тканей (криофиксации) для гистохимического анализа происходят два процесса - резкое снижение скорости биохимических процессов в тканях, связанных, в основном, с сильным уменьшением активности тканевых ферментов и кристаллизация воды в тканях (в тканях 80-90% воды!), что приводит к возможности изготовить из замороженных тканей срезы толщиной 5 - 150 мкм. Физические методы фиксации применяются в условиях простой низкотемпературной консервации ткани без дегидратации с хранением образцов ткани при низкой температуре. Другой вариант низкотемпературной фиксации связан с обезвоживанием замороженной ткани при помощи сублимационной сушки ткани в вакууме при низкой температуре (лиофильная сушка, «freeze-drying» ) или путем замещения замороженной воды в тканях некоторыми органическими растворителями также при низкой температуре (замещение в замороженном состоянии, «freeze-substitution»). [Термин “…при низкой температуре..” обозначает температуру ниже температуры замораживания воды]. Для замораживания ткани используются в основном низкотемпературные холодильники и некоторые хладоагенты – твердая углекислота и жидкий азот. В научной литературе высказывается мнение, что низкотемпературные методы не являются в общем смысле слова методом фиксации ткани, т.к. многие метаболические процессы будут продолжаться в ткани, как только она будет нагрета до температуры таяния льда. Точно также при попадании воды в лиофилизированную ткань в ней возобновятся метаболические процессы, которые приведут к неисправимым артефактам в 20 гистохимическом препарате. Однако эти «недостатки» физических методов имеют важное значение для гистохимии, особенно в тех случаях, когда необходимо исследовать ферменты или эндогенные химические соединения, которые под действием химических фиксаторов меняют свое местоположение в тканях и клетках (экстракция, растворение и др.) или разрушаются химическими фиксаторами. 2.1. Замораживание образцов ткани 2.1.1. Процесс кристаллизации воды в тканях при низких температурах При замораживании ткани вода в ней, в зависимости от температуры, находится в различных кристаллических состояниях от монокристаллического, поликристаллического до стекловидного состояния. Это зависит от скорости замораживания. Можно выделить 3 зоны влияния скорости замораживания на состояние льда в тканях (Пушкарь и соавт.,1978) (рис. 14): I зона - скорость охлаждения меньше 1 °C/с. Вода успевает выйти из клеток и происходит изменяют форму и внеклеточная кристаллизация воды. Клетки резко меняют размеры вследствие дегидратации и гиперконцентрации веществ. II зона - скорость охлаждения 1-100°C/с. При образование довольно больших кристаллов льда этом отмечается внутри клеток, вызывающих повреждение ультраструктуры клеток. Рис.14. Образование кристаллов воды в тканях при разных скоростях замораживания 21 III зона - скорость замораживания 100-1000°С/c Размеры кристаллов льда уменьшаются до минимальных размеров, при этом достигается хорошая сохранность структуры клеток. Однако технически таких скоростей замораживания тканей достичь очень трудно. Обычно для гистохимических реакций, анализируемых с помощью оптических микроскопов, скорость замораживания тканей в диапазоне 1100°C/с вполне достаточна для получения хороших результатов. 2.1.2. Криометоды. Прямое замораживание ткани до T = -10 - -20° С (без дегидратации) В данном случае особых манипуляций с тканью не производится, можно заморозить ткань в низкотемпературном холодильнике в специальных контейнерах. Однако необходимо отметить, что в замороженной таким образом ткани продолжаются, хотя и с замедленной скоростью, биохимические процессы, а также происходит обезвоживание ткани и конденсация воды на поверхности ткани, что может привести к артефактам. 2.1.3. Криометоды. Глубокое замораживание ткани до T = -78 - -196°С (без дегидратации) Для охлаждения тканей до этих температур используется твердая углекислота (t = -78,5 °С) и жидкий азот (t = -195,8 °С) и процесс замораживания проводится в сосудах Дьюара. 2.1.4. Твердая углекислота. Жидкий азот Твердая углекислота. При замораживании ткань обычно помещается на хорошо теплопроводимую поверхность (лучше всего металлическую подложку) и опускается в сосуд Дьюара с сухой углекислотой. При этом необходимо помнить, что для некоторых гистохимических реакций нельзя допускать контакта тканей с металлами. При температуре сухой углекислоты ткань можно хранить довольно долгое время. В данном случае трудности хранения связаны с техническими сложностями - испарением 22 "сухого льда" и необходимостью постоянного возобновления запаса углекислоты в сосуде Дьюара. Другим источником твердой углекислоты углекислота в баллонах, сохраняющаяся является под давлением сжиженная (сжижается углекислота при t = 20 °С под давлением 5,11 МПа - 50 атм.). В баллонах под давлением углекислота находится в сжиженном виде, поэтому баллон с жидкой углекислотой переворачивают вверх дном, чтобы углекислота могла "выливаться" из баллона. Баллон соединяют специальным шлангом с испарителем (небольшая металлическая емкость), на поверхность которого помещается образец ткани. Вентиль баллона открывается, углекислота попадает в испаритель, в котором жидкая за счет быстрого адиабатического расширения углекислота охлаждается до твердой углекислоты приводит поверхности (-78,5°С), что к охлаждению испарителя, и, соответственно, ткани до t=-78,5°С (рис.15). Рис.15. Замораживание образцов ткани на специальном испарителе углекислотой из баллона Как правило, такое замораживание, в основном, используется для микротомии тканей, т.е. для получения тонких срезов ткани на специальных микротомах (см. ниже). Жидкий азот. При замораживании тканей в жидком азоте необходимо учитывать некоторые особенности этого сжиженного газа. Невзирая на низкую температуру жидкого азота (t кип.= -195,8°С) при прямом замораживании тканей в нем Рис.16, 1) нельзя добиться высокой 23 скорости замораживания. Это происходит в связи с образованием газового (азотного) слоя вокруг ткани за счет быстрого испарения азота на поверхности замораживаемой ткани, который приводит к уменьшению скорости замораживания ткани (кривая 1). Рис.16. Замораживание ткани в жидком азоте. Объяснения в тексте Для предотвращения образования вокруг замораживаемой ткани газового слоя и, соответственно, увеличения скорости замораживания образцов ткани (кривая 2), используются промежуточные жидкости, которые должны обладать двумя свойствами: не замерзать при температуре жидкого азота и хорошо "смачивать" погружаемую в них ткань (рис.16, 2). Этим двум условиям отвечают, в частности, два соединения: изопентан и пропанбутановая смесь. С изопентаном (жидкость) работать не очень удобно, т.к. при температуре жидкого азота он переходит в твердое состояние. Смесь пропан-бутан (газ) более удобна в работе, хотя при использовании объемов в несколько десятков миллилитров водорода, проводить охлаждение смеси необходимо в атмосфере чтобы избежать образования взрывоопасных смесей пропан- бутана с кислородом воздуха. Но при небольших объемах (несколько мл), можно работать на воздухе, соблюдая стандартную технику при работе безопасности с огнеопасными соединениями. Ткани, замороженные при температуре твердой углекислоты и жидкого азота, нельзя использовать непосредственно для гистохимических целей, 24 так как из замороженных тканей до невозможно сделать тонкие срезы. таких температур практически Поэтому "глубокое замораживание" может служить или для быстрой остановки биохимических тканях, или для низкотемпературного процессов в консервирования ткани для последующего использования в гистохимической процедуре. Если температура ткани при "глубоком замораживании", поднимается до -10 - -5°С происходит рост кристаллов льда, что может приводить к нарушению тонкой морфологической структуры изменениям микробиохимической структуры, соответствующим артефактам. Если ткани что будет температура повышается до положительных значений, то вода и вероятным приводить к образцов в ткани ткани переходит в свое естественное для тканей жидкое состояние и консервирующее действие низких температур прекращается: в размороженных тканях начинают протекать быстрые разрушительные биохимические процессы. Совершенно очевидно, что если создать условия, при которых замороженная в образце ткани вода будет испаряться или растворяться без перехода в жидкую фазу, можно, при помощи такой низкотемпературной дегидратации, сохранить и морфологию и распределение внутриклеточных соединений, максимально приближенные к нативному состоянию. 2.2. Сублимационная дегидратация тканей Сублимационная дегидратация (вакуумная сушка тканей), представляет метод низкотемпературного происходит в вакууме в обезвоживания образцов тканей, которое результате возгонки (сублимации) воды из состояния льда в пар, минуя жидкую фазу. 2.2.1. Теоретические основы сублимационной сушки Давление паров льда определяется состоянием равновесия между молекулами пара и твердой фазы (льда). водяного пара больше, чем Если парциальное равновесное давление при давление заданной температуре, то начинается переход пара в лед, т.е. конденсация. 25 Если давление пара над твердой фазой ниже равновесного давления, то твердая фаза переходит в пар, т.е. происходит возгонка льда или сублимация льда. Таким образом, если поместить замороженную ткань (вода в образце ткани в виде льда) в вакуум, создаваемый в специальной камере, это приведет к уменьшению парциального давления водяного пара надо льдом в замороженной ткани и лед из ткани начнет сублимироваться. В результате вакуумной сублимации льда происходит дегидратация ткани. Естественно, что в процессе сублимации необходимо поддерживать такую температуру ткани, которая Рис.17. Испарение воды при нормальном давлении и в вакууме при низкой температуре препятствует плавлению льда в ткани и переходу воды в жидкое состояние (рис.17). Для проведения сублимационной сушки необходимо выбрать оптимальные условия сушки - степень вакуума (разряжение в вакуумной камере), температурный режим высушивания, время сушки и геометрию вакуумной системы. 2.2.2. Уровень вакуума в сушильной камере Температура тканевого образца в вакуумной камере определяет величину давления насыщенных паров воды над льдом. Например, при 26 температуре +100°С давление пара воды над жидкой фазой равно около 760 торр (торр = мм рт.ст.). T, Co -10 P, торр 1,95 -30 -50 -70 2,91х10-1 2,90х10-2 -100 2,00х 10-3 1,00х 10-5 -150 -183 7,00х 10-15 1,00х 10-22 Поэтому при нормальном давлении при температуре +100°С вода активно испаряется (кипение). Если понижать температуру воды, то уменьшается давление насыщенных паров. В таблице представлены некоторые значения давления насыщенного пара воды при низких температурах. Как видно из приведенных данных, при t = -180°С в сушильной камере необходимо создать вакуум порядка 10-22 торр. Это технически невозможно (в настоящее время удается получить вакуум в реальных технических приборах около 10-8 торр, но для реальных биологических тканей можно использовать установки с вакуумом в камере не более 10-5 - 5х10-5 торр. Это значит, что для сушки тканей нижним температурным уровнем является -100°С. сублимационной сушки Верхний зависит предел температуры для от поведения воды внутри тканевого образца (см. ниже). Наиболее оптимально сублимационную сушку вести при t = -50 - -70°С, для чего нужно создавать в сушильной камере вакуум порядка 10-3 торр. Выбор оптимальной геометрии установки для сублимационной сушки замороженной ткани определяется расположением специальной ловушки для паров воды, испарившихся из ткани. Для этой цели обычно используется азотная ловушка, имеющая температуру поверхности -196°С. Считается, что при температуре поверхности ловушки ниже молекула пара воды фиксируется на ней с одного соударения молекулы -100°С одного соударения, т.е. с пара удаляются из объема сушильной камеры. При температуре поверхности ловушки выше -100°С фиксация молекул паров воды может не происходить с первого соударения. Молекулы пара воды должны будут несколько раз "удариться" о стенки камеры и ловушки, при этом они теряют кинетическую энергию и 27 затем могут фиксироваться на поверхности ловушки. Это, естественно, приводит к удлинению времени сублимации замороженной ткани. При конструировании установки для сублимации льда из замороженной ткани обычно стремятся расположить поверхность ловушки как можно ближе к высушиваемой ткани. Это связано со свободным пробегом молекул пара из замороженной ткани. Величина свободного пробега зависит от уровня вакуума. Например, при разряжении 10-2 торр длина свободного пробега равна 5 мм, а при 10-3 торр уже 50 мм. Таким образом, при расстоянии между высушиваемыми образцами и азотной ловушкой менее 5 см в сушильной камере Рис. 18. Расположение сушильной камеры и ловушки. 1 – менее предпочтительное, 2 – оптимальное расположение необходимо создать вакуум не выше 10-3 торр. При этом, конструктивно, необходимо так расположить азотную ловушку, чтобы траектория молекул испарившейся воды из ткани до поверхности ловушки была прямой линией. На рис. 18 показано два варианта расположения азотной ловушки. Вариант 2 является оптимальным, хотя в реальных приборах для сублимационной сушки гистологического материала используются оба варианта. 2.2.3. Температурный режим сублимации Температура, при которой необходимо вести сублимационную сушку образцов тканей определяется положением криоскопической точки растворов, которая связана с понижением температуры замерзания 28 растворов, по сравнению с температурой замерзания чистого растворителя при увеличении концентрации раствора, например, солей. Так как в биологических тканях содержится около 80 - 90% воды, в которой растворены различные соли, в ходе сублимации льда концентрация солей в тканевом образце будет увеличиваться и, таким образом, точка замерзания растворов тканевых солей будет падать в сторону отрицательных температур (рис.19). Для растворов солей в воде считается, что точка эвтектики (ТЭ - температуры, при которой имеется равновесие между жидкой (ЖФ), твердой фазой (ТФ) и парообразной фазы (ПФ) раствора, находится в области -20 - -25°С. Поэтому, если сушка проводится при температуре выше -20 - -25°С (Т1) есть опасность, что на определенном этапе сушки произойдет плавление льда в ткани, а это чревато значительными артефактами (см. ниже). Таким образом, температура замороженной ткани Рис.19. Диаграмма состояния воды и положения точки эвтектики при сублимации льда из замороженной ткани. Стрелкой 1 показан сдвиг диаграммы в процессе концентрирования солей в высушиваемом образце ткани. Объяснения в тексте. при сублимационной сушке не должна быть выше -30°С (Т2). В этом случае высушиваемая ткань надежно защищена от плавления льда в ходе сушки и появления в ткани многочисленные наблюдения, что жидкой фазы воды. Однако, сушка при -40 - -50°С лучшему сохранению морфологической структуры тканей. имеются приводит к 29 2.2.4. Сопротивление высушенного слоя Длительность сушки в большей степени определяется правильно выбранной геометрией образца ткани. Если взять кусочек ткани равного объема в виде кубика или тонкой пластинки, то во втором случае сушка будет и более быстрой и результат более качественным. В этом случае, кроме увеличения поверхности испарения льда уменьшается сопротивление высушиваемого слоя. На рисунке 20. представлена схема образца ткани в определенный момент сушки. Слой 1 - полностью высохшая ткань, слой 2 - промежуточная зона и слой 3 - содержит лед. Границы между 2 и 1 слоями и между 3 и 2 слоями являются границами испарения. Слой 1 является гигроскопичным и оказывает сопротивление парам воды, выходящими из слоя 3. Рис.20. Слои в тканевом образце в процессе сублимации льда Это сопротивление называется "сопротивлением высушенного слоя". разные годы В делались попытки количественно оценить сопротивление высушенного слоя. По оценкам И.Герша сопротивление высушенного слоя зависит от квадрата толщины высушенного слоя. 2.2.5. Определение конца сушки Определение конца сушки в обычных рутинных экспериментах, с использованием лиофильной сушки тканей, задача довольно сложная и она решается эмпирически, при помощи контрольных экспериментов. В 1954 году М.Янсен описал лиофильную установку, в сушильной камере которой были вмонтированы торсионные весы и измеритель 30 температуры высушиваемых тканей. Было показано, что в конце сушки наблюдалось колебание температуры, которое коррелировало с достижением постоянного веса ткани (результаты измерений М.Янсена показаны на рис. 21). Рис.21. Изменение температуры (синий график), вакуума (красный график) и веса ткани (зеленый график) в процессе лиофильной сушки В специальных опытах нами показано, что измерение температуры образцов высушиваемых тканей является надежным способом определения длительности сушки, что особенно важно при первых сушках серийного экспериментального материала. 2.2.6. Обработка лиофилизированной ткани Как правило, наиболее логично проводить химическую фиксацию образцов ткани, высушенных при сублимационной сушке, в газообразных фиксаторах, в частности, в парах формальдегида при определенной влажности и температуре. Источником формальдегидного газа в этом случае может являться параформ, который при нагревании деполимеризуется (см. раздел Химическая фиксация). Фиксированная таким образом ткань может заливаться в парафин в вакууме (см. раздел Микротомия). Сублимационная сушка ткани имеет большое значение для проведения гистохимических реакций на белки, некоторые ферменты и метаболиты, 31 которые чувствительны к посмертным изменениям и действию химических фиксаторов. В некоторых случаях сублимационная сушка является единственно возможным методом для гистохимической реакции. Например, для прямого гистохимического выявления биогенных моноаминов (катехоламины подготовки и индоламины) ткани является наиболее оптимальным сублимационная методом сушка т обработка лиофилизированной ткани в газообразном формальдегиде при определенной влажности и температуре. 2.2.7. Артефакты, возникающие при сублимационно сушке тканей Главные артефакты, возникающие тканевых образцов связаны, температурного режима с при нашей сублимационной точки расплавления льда сушке зрения, с нарушением и разрушением ткани, вызванным резким усилением испарения воды при плавлении льда в образцах ткани в процессе сушки. Другая группа артефактов связана с недостаточной сушкой ткани, в результате которой, особенно внутри образца, имеется зона разрушенной ткани. Такая зона не высохшей ткани может приводить к порче всего образца ткани. Если ткань хорошо высушена, она извлечении ее из сушильной камеры очень гигроскопична и возможна конденсация воздуха, особенно, если высушенная ткань, извлеченная при воды из из камеры, имеет температуру ниже комнатной. В связи с этим, в конце сушки, перед извлечением высушенной ткани из камеры, необходимо поднимать температуру образцов выше комнатной для предотвращения конденсации на их поверхности воды. Высушенную ткань обычно сохраняют для последующих опытов в эксикаторе концентрированной серной кислотой (активированный уголь, цеолиты и т.д.). над или пятиокисью фосфора, другими осушителями 32 Качество сушки и артефакты обычно оцениваются или обнаруживаются, к сожалению, только при микроскопическом анализе ткани. 2.2.8. Аппараты для лиофильной сушки ткани для гистохимического анализа В периодической научной литературе, многочисленных обзорах и монографиях лиофилизации описано много гистологических разных конструкций образцов для приборов для гистохимических исследований. Один из детальных обзоров таких аппаратов имеется в монографии Э.Пирса «Гистохимия» (см. список рекомендуемой литературы). На рис. 22 представлена схема типичной вакуумной системы, используемой для Рис. 22. Схема вакуумной системы для сублимации воды из тканевых образцов для гистохимического анализа сублимационной сушки тканей для последующего гистохимического анализа. На рис.23 представлен внешний вид уникального прибора для сублимационной сушки гистологического материала, разработанный в Центре аналитической микроскопии РАН в Пущино. Отличительной особенностью этого прибора является наличие шлюзовой камеры для ввода и вывода образцов ткани из сушильной камеры во время лиофилизации гистологической ткани и встроенных электронных весов для взвешивания образцов ткани во время лиофильной сушки образцов тканей. 33 Рис. 23. Прибор для сублимационной сушки образцов ткани Центра аналитической микроскопии Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино). Слева – общий вид, справа – вид сушильной камеры 2.2.9. Лиофилизация растительной ткани Все, что было описано выше относительно лиофилизации тканей для последующего гистохимического анализа относится к исследованиям ткани животных. Лиофилизация растительной ткани имеет свои особенности, что сильно отличает методы лиофилизации растительной ткани от лиофилизации ткани животных. В «Ботанической гистохимии» У.Дженсен подробно рассматривает особенности лиофилизации растительной ткани и замечает, что «…техника лиофильной сушки – хороший пример тех осложнений, с которыми приходится иногда сталкиваться при применении к растительному материалу методов, разработанных для ткани животных. В 1934 году Т.Гудспид и Ф.Убер впервые использовали технику лиофильной сушки для растительных тканей. При этом они обнаружили, что сушка этих тканей требует значительно больше времени и что ткани, высушенные этим способом, чрезвычайно плохо пропитываются парафином… После этого лиофильная сушка растительных тканей не практиковалась до 1954 г. ..».. Наиболее удовлетворительные и даже отличные результаты были получены 34 при использовании специального метода – лиофилизации при низком вакууме в токе газа. Схема аппарата для лиофильной сушки в токе газа показана на рис. 24. Рис.24. Схема прибора для лиофилизации в токе газа. 1 – газ (СО2 или N2), 2 – колонка с осушителем газа (CaCl2), 3 – трубка, подводящая газ в сушильную камеру, 4 – вакуумный насос, 5 – ловушка воды, 6,7 – Дьюары с охлаждающей жидкостью, 8 – контейнер с образцами тканей, 9 парафин После высушивания образцов растительной ткани в данной установке сосуд 7 убирается, а сушильная камера нагревается, парафин расплавляется, и высушенные образцы тканей пропитываются парафином в вакууме. Детали использования лиофильной сушки для растительной ткани подробно описаны в «Ботанической гистохимии» У.Дженсена (см. список рекомендованной литературы). 2.3. Замещение в замороженном состоянии Для проведения дегидратации замороженной ткани при сублимационной сушки требуется довольно сложная помощи аппаратура, состоящая из вакуумных насосов, вентилей, трубопроводов, сушильных камер, азотных (или другого типа) ловушек, систем измерения вакуума и др., что является серьезным препятствием для широкого использования лиофилизации в гистохимической практике. Имеется другой метод для низкотемпературной дегидратации тканей, основанный на растворении льда в замороженной ткани некоторыми органическими растворителями. Для реализации этого метода не требуется сложная аппаратура. В.Симпсон в 1941 году впервые предложил в качестве органических растворителей льда в замороженной ткани метилцеллозольв и этиловый 35 спирт, не замерзающие, соответственно, при температурах -78°С и 40°С. Метилцеллозольв метоксиэтанола), не - монометиловый эфир этиленгликоля (2- является химическим фиксатором, хорошо смешивается с водой. Поэтому в случае метилцеллозольва происходит только дегидратация ткани. Для замещения в замороженном состоянии метилцеллозольв охлаждается твердой углекислотой до температуры -78°С, замороженная ткань опускается в специальных контейнерах в сосуд с охлажденным метилцеллозольвом на некоторое время. Все операции проводятся в сосуде Дьюара с твердой углекислотой (рис.25). Рис.25. Схема оснащения сосуда Дьюара для проведения замещения в замороженном состоянии Так как температура плавления метилцеллозольва ниже температуры твердой углекислоты, не требуется никаких дополнительных технических средств. Лед в тканях растворяется метилцеллозольвом и замещается им. В результате ткань обезвоживается и пропитывается метилцеллозольвом. Для замещения в замороженном состоянии используются растворители: ацетон (температура также другие плавления -95.35°С), н-бутанол (температура плавления -89.5°С), смесь этанола и метанола (температура плавления метанола -97.9°С), пропиленгликоль (температура плавления 60°С) и др. Абсолютный 114.15°С) при этиловый спирт (температура температуре твердой углекислоты не плавления обладает фиксирующими свойствами, и приводит только к растворению льда и его замещению в тканях. 36 Глава 3. Микротомия тканей Общие положения Микротомия тканей - комплекс методик и соответствующих приборов для изготовления срезов тканей толщиной от 2-3 мкм до 100-150 мкм. В зависимости от вида предподготовки образцов тканей перед изготовлением срезов можно предложить следующую классификацию методов микротомии: · Микротомия тканей, фиксированных химическими фиксаторами и залитых в пропитывающие среды, · Микротомия замороженных тканей (без предварительной фиксации, после фиксации, без заливки в пропитывающие среды). · Микротомия нативных образцов тканей или образцов фиксированной, не залитой в пропитывающие среды. 3.1. Приготовление блоков ткани для микротомии Для микротомии фиксированных тканей в ряде случаев необходимо такую ткань пропитать различными материалами таким образом, чтобы при изготовлении срезов ткань не деформировалась. В качестве пропитывающих материалов используются: · полимерные материалы, растворимые в воде, которые при высыхании полимеризуются до образования твердых полимерных блоков; · водорастворимые материалы в нагретом виде, которые при комнатной температуре образуют гели, плотность которых можно увеличить специальной дальнейшей обработкой; · материалы, растворимые в органических растворителях. В этом случае, 37 после химической фиксации водными растворами фиксаторов, вода из фиксированных тканей должна быть удалена, например, последовательным замещением органическими растворителями, замещением в замороженном состоянии, лиофилизацией. В случае лиофилизированного материала, образцы тканей можно пропитывать прямо в расплавленных материалах (парафин) в специальной камер при небольшом вакууме Конструкция одного из (несколько таких десятков мм рт. ст.). приборов используемых в Центре аналитической микроскопии, приведена на рис.26. Рис.26. Установка для пропитывания в вакууме парафином гистологического материала. Слева: вид спереди, 1 – камера для образцов ткани, 2 – регулятор температуры, 3 – манометр; Справа: вид сверху, 1 – контейнер для тканевых образцов, 2 – термометр, 3 – контейнер с тканевыми образцами внутри заливочной камеры. Насос и шланги для охлаждения камеры не показаны. (Центр аналитической микроскопии). Пропитка парафином тканевых образцов на этой установке производится следующим образом. После включения установки терморегулятором устанавливается температура в ванночке +56°С. Крышка термостатируемой 38 камеры (1) для лиофилизированных тканей открывается и туда наливается расплавленный парафин, крышка закрывается и камера подключается к насосу – происходит дегазация парафина (уровень разряжения над парафином контролируется манометром). Затем, после впуска воздуха в камеру, ее крышка открывается, и в ячейки контейнера помещаются лиофилизированные образцы тканей, крышка закрывается и камера откачивается. Видно как из тканевых образцов выходят пузырьки воздуха, после прекращения их выделения нагрев камеры выключается и установка подключается к водопроводной системе – вода пропускается через специальные каналы в теле камеры и парафин быстро затвердевает. Контейнер с залитыми в парафин тканями вынимается из камеры и блоки тканей извлекаются из ячеек контейнера. 3.1.1. Парафин Парафины имеют разную температуру плавления – от +45 - +50°С (мягкий парафин) до +58 - +60°С (твердый парафин). Для пропитывания тканей обычно рекомендуется парафин с более высокой плавления. Смешиванием "мягкого" температурой и "твердого" парафинов можно получить парафины с разной температурой плавления. Так как парафин не растворяется в воде, для пропитывания им фиксированной ткани (в случае водосодержащих фиксаторов), необходимо предварительно удалить из ткани воду и заместить ее органическими растворителями парафина. Для этой цели широко применяется ступенчатое, последовательное, обезвоживание фиксированной ткани спиртами с возрастающей концентрацией (от 30% до 100%) с последующим замещением спирта одним из органических растворителей парафина: бензолом, сероуглеродом, четыреххлористым др.(рис. 27). углеродом, толуолом, хлороформом, ксилолом и 39 Рис.27. Последовательность операций при заливке фиксированной ткани в парафин Необходимо стремиться к применению более летучих растворителей, т.к. при этом происходит более быстрое удаление растворителя из ткани при замещении его парафином. С этой точки зрения наиболее удобным являются сероуглерод и хлороформ. В настоящее время выпускается три типа парафиновых смесей под общим названием Парапласты («Regular», «Plus» и «Х-Tra»). Эти смеси включают кроме парафинов с разной температурой плавления разные полимерные добавки, придающие Парапластам разную твердость. На основе личного опыта показано, что заливка в Парапласт типа «Х-Tra» позволяет получать срезы толщиной 2-4 мкм, что соответствует паспортным данным. Материал, залитый в другие типы Парапластов, позволяет успешно делать срезы толщиной 5-10 мкм (Парапласты выпускаются фирмой «Сигма»). 3.1.2. Целлоидин Целлоидин является термопластическим материалом, представляющим смесь мононитроцеллюлозы, динитроцеллюлозы и камфоры (огнеопасен !, растворим в абсолютного этанола используется для органических - растворителях, диэтилового пропитки например, в смеси эфира). Раствор целлоидина фиксированного, предварительно обезвоженного материала путем пропитки в серии растворов целлоидина с 40 повышающейся растворе концентрацией. Окончательная заливка производится в целлоидина с концентрацией 8-12%. Уплотнение целлоидинового блока проводится в парах хлороформа, после чего блок залитой ткани хранится в 70 - 80% растворе этилового спирта. 3.2. Микротомы 3.2.1. Микротомы для пропитанной ткани Из образцов тканей, залитых в парафин, целлоидин или другие материалы, срезы обычно приготавливаются с использованием двух типов микротомов: ротационных и салазочных. В ротационном микротоме массивный нож закреплен на основании микротома, а блок залитой ткани находится в специальном держателе, закрепленном в подвижной части микротома (рис. 28): Рис.28. Современный ротационный микротом с электроприводом типа НМ 350 (фирма «Микром», Германия). Толщина срезов – 0.25 30 мкм. Держатель режущего инструмента позволяет использовать стандартные ножи, одноразовые лезвия, стеклянные, твердосплавные и алмазные ножи. На рисунке показан микротом со стереомикроскопом для наблюдения за процессом резки. В салазочном микротоме наоборот нож закреплен в держателе, который является подвижным элементом относительно блока ткани (рис.29). 41 Рис. 29. Салазочный микротом фирмы «Микром» (Германия) типа НМ 400R. Имеет очень удобную систему для быстрой смены держателей образцов ткани, ручную и автоматическую установку толщины срезов в диапазоне 1-60 мкм. В обоих случаях держатель блока ткани имеет устройство для микроподачи блока перпендикулярно плоскости ножа, что обеспечивает получение срезов разной толщины. На рис. 30 и 31 показано рабочее место для микротомии тканей в Центре Рис.30. Рабочее место для микротомии. Слева направо видны: нагревательный столик для расправления срезов, ротационный микротом, салазочный микротом с термостатируемым столиком (на переднем плане – блок питания термостолика). Центр аналитической микроскопии аналитической микроскопии, оснащенное ротационным и салазочным микротомами фирмы Reichert , выпуска середины-конца 60-х годов, которая производит самые лучшие микротомы в мире. Кстати, необходимо отметить, что при правильной и аккуратной эксплуатации микротомы представляют «вечные» приборы. Рабочее место для микротомии крупным планом показано на рис. 31. 42 Рис.31. Рабочий стол для микротомии крупным планом: 1 – нагревательный столик для расправления срезов ткани на предметных стеклах (заливка в парафин), 2 – ротационный микротом (Reichert), 3 – салазочный микротом (Reichert) с термостоликом (4) (СССР), 5 – банка с предметными стеклами в смеси спирт-эфир, 6 – баночка с покровными стеклами в смеси спирт-эфир На микротомах фирмы Reichert, выпущенных даже начала века, получаются и сегодня прекрасные результаты. На рисунке приведенном в разделе «Краткая история гистохимии» показан внешний вид салазочного микротома руководства фирмы Reichert, «Краткий курс воспроизведенный практической из замечательного гистологии», написанной А.В.Немиловым, в 1909 г., хранителем Анатомо-гистологического кабинета С.-Петербургского Университета, ассистентом проф. А.С.Догеля (см. рисунок в разделе Краткая история гистохимии). Можно видеть, что внешне этот микротом не сильно отличается от микротома этой же фирмы, на котором мы работаем в настоящее время (рис.32). 43 Рис. 32. Внешний вид современного салазочного микротома фирмы «Reichert». 1 - держатель блока ткани, 2 - ручка наклона блока ткани по оси Х. 3 - рука наклона блока ткани по оси Y, 4 - фиксатор положения блока ткани, 5 - ручка макроподачи блока ткани относительно ножа, 6 - фиксатор держателя 1, 7 фиксатор положения блока ткани после макроподачи, 8 - гайка-прищепка автоматической микроподачи блока ткани при резке ткани, 9 - ручка установки толщины срезов. 10 - блок автоматической установки толщины срезов, 11 - контейнер для неудачных срезов и отходов заливочного материала, 12 - держатель микротомного ножа, 13 - микротомный нож. 14 ползунок, совершающий продольное движение вдоль направляющих салазок (15) микротома (сзади ползунок (14) имеет специальную ручку для управления движением ползунка). Рис.33. Ротационный микротом типа 2055 Autocut фирмы Reichert 44 Современные салазочные и ротационные микротомы представляют прецизионные электромеханические приборы, позволяющие удобно, быстро и надежно делать серийные срезы тканей. Одна из последних моделей ротационного микротома типа 2055 Autocut фирмы Reichert показан на рис. 33. В комплект микротома 2055 Autocut, как и к другим современным микротомам, входит большой набор дополнительных приспособлений, например, для крепления блоков ткани, залитых в разные материалы: парафин, целлоидин и другие полимерные материалы (рис. 34) Рис.34. Набор держателей блоков тканей из комплекта микротома 2055 Autocat Для удобства наблюдения и контроля за качеством резки к микротомам прилагаются специальные оптические насадки - бинокулярные стереомикроскопы (а) или специальные лупы (б) (рис.35). Рис.35. Два типа оптических насадок для микротомов Наконец, для крепления ножа, в комплект современного микротома входит набор специальных блоков, позволяющих применять различные микротомные ножи, регулировать угол расположения ножа, относительно блока ткани и, что не менее важно, сделать работу на микротоме безопасной (рис. 36). 45 Рис.36. Набор держателей ножа для микротомов Микротомный нож представляет очень острый инструмент и невнимательное обращение с ним может привести к серьезным травмам !! Одиночные срезы или ленточки срезов переносят на предметное стекло кисточкой. Пипеткой вносят каплю воды под срезы и переносят предметное стекло со срезом на нагревательный столик (t = +30 - +37°С). Срезы хорошо расправляются на поверхности капли воды. После расправления срезов, вода из-под них осторожно убирается полоской фильтровальной бумаги и срезы обычно высушиваются (предметные стекла перед использованием покрывают клеющим составом и маркируются). В случае, когда использование воды не желательно, срезы можно расправить, осторожно нагревая на нагревательном столике. Однако, если срезы сильно сморщены, что встречается довольно часто, добиться хорошего расправления срезов без воды довольно тяжело. 3.2.2. Ножи для микротомов Ножи для микротомов также как прецизионный узел микротома, обеспечивающий установку толщины среза, являются важнейшими элементами микротомов, от качества которых и правильного использования зависит конечный результат микротомирования и, естественно, результат 46 эксперимента (Помните: восстановить испорченный срез ткани невозможно !) Ножи для микротомов представляют сложные и высокоточные устройства, требующие аккуратного отношения, с другой стороны представляют большую опасность при невнимательной с ними работе. Стандартные ножи выпускаются двух типов (фирма Reichert), различающихся профилем тела ножа и его режущей части (рис. 37). Рис. 37. Микротомные ножи: а - общий вид ножа, б - два профиля ножей Ножи первого типа (1) используются для резки «мягких» блоков, когда ткань залита в целлоидин или парафин. Ножи второго типа (2) применяются, как правило, для резки образцов тканей, заключенных в твердые парафины или замороженной ткани на специальных микротомах (см. ниже). Качество режущей кромки ножа проверяется при помощи микроскопа при небольшом увеличении (рис.38). Рис. 38. Справа представлены микро фотографии кромки ножа на разных стадиях ее исправления:1 - страшные зазубрины, возникшие, по-видимому, вследствие какой-то аварии или грубого нарушения правил пользованием ножом; 2 - шлифовка ножа привела к значительному улучшению кромки ножа. 3 - дальнейшая обработка ножа привела к полному восстановлению нормального качества режущей кромки микротомного ножа. 47 За всю мою почти сороколетнюю работу на микротомах я не видел кромок микротомного ножа приведенного на фото 1 рис.38. Эта фотография взята из руководства к микротомам фирмы Reichert и, наверное, приведена авторами руководства как крайняя стадия состояния ножа. Для исправления микротомных ножей используются специальные приспособления, одним из которых является обушок (а’), надеваемый на массивную часть ножа, для того чтобы задать необходимый угол кромке ножа при его заточке. Геометрические параметры режущей кромки ножа показаны на рис. 39. Рис. 39. Геометрия микротомных ножей: а) положение ножа при заточке, правке и полировке ножа, а‘ - обушок; б) углы режущей кромки ножа. В описании микротомов обычно детально приведен протокол манипуляций, связанных с правкой ножей, рекомендации по использованию специальных приспособлений, шлифовочных и полировочных материалов. Учитывая важность правильной заточки ножа для получения качественных срезов (ножом с кромкой показанной на рис. 38 (1 и 2) вообще нельзя получить нормальные срезы!) необходимо внимательно изучить руководство к микротому, особенно разделы, касающиеся уходу за микротомным ножом. Во всех микротомах, выпускаемых в последние годы используются специальные сменные, одноразовые ножи (лезвия) и специальные держатели таких лезвий. Одноразовые лезвия очень удобны, изготавливаются из стали разной прочности, и позволяют приготавливать срезы разной толщины (до 2 мкм) из материала залитого в разные твердые и «мягкие» парафины. Кроме 48 этого, специальные одноразовые лезвия используются для резки замороженной ткани в криостате. При использовании таких одноразовых ножей отпадает сложная операция правки «толстых» ножей, которая требует большого навыка. «Отработанные» одноразовые лезвия можно с успехом использовать для подрезки парафиновых блоков при их подготовке к микротомированию. 3.2.3. Микротомы для замороженной ткани Срезы из нефиксированной и фиксированной ткани можно приготовить из замороженной специальными ткани при помощи микротомов, снабженных устройствами для поддержания низкой температуры ткани в процессе резки. В старых моделях микротомов для замороженной ткани («замораживающих» микротомах) использовалась жидкая углекислота для замораживания ткани. Углекислота «выливалась их специальных баллонов, где она находилась под давлением в жидком состоянии, в специальный испаритель, который выполнял роль подставки для ткани. В испарителе углекислота вследствие быстрого расширения охлаждала испаритель и ткань, находившаяся на нем быстро замораживалась. На этом принципе был выполнен, выпускался Харьковским заводом много лет наш отечественный прибор, который широко использовался в практической работе. Автору этого учебника в 60-х годах удалось работать на таком замораживающем микротоме и при определенной тренировке и сноровке на нем можно было устойчиво получать хорошие срезы. В Онкологическом Институте им. Герцена (Москва) мне удалось увидеть работу на таком микротоме мастеров высокого класса, которые получали за несколько минут превосходные срезы при срочной операционной биопсии !! Крупные иностранные фирмы выпускали специальные принадлежности к обычному микротому, который превращал его в замораживающий микротом с использованием жидкой углекислоты. Например, известная в мире фирма Reichert широко к салазочному микротому типа OmE 49 выпускала специальный держатель ткани (рис.40), подключенный к баллону с жидкой углекислотой, который перевернут для выпуска жидкой углекислоты через специальный шланг, подключенный к испарителюподставке для образца ткани. Рис.40. Слева - баллон с углекислотой; Справа - испаритель углекислоты, подключенный к баллону. 1 - образец ткани, 2 - ручки для управления потоком углекислоты, 3 - колпачок, который снимается после замораживание ткани, перед резкой ткани. Однако в настоящее время на смену жидкой углекислоте пришел специальный «термоэлектрический Пельтье. Такой столик, столик», работающий на принципе выпускаемый раньше в СССР на одном подмосковном заводе, установленный на указанном салазочном микротоме OmE фирмы Reichert, работает в Центре аналитической микроскопии нормально много лет и позволяет приготавливать серийные срезы из замороженной ткани (см. выше). Главными преимуществами приготовления срезов из замороженной ткани является быстрота приготовления срезов и отсутствие необходимости использовать органические растворители и промежуточные материалы для заливки образцов ткани. Срезы при резке остаются на ноже, в капельке растаявшей воды, содержащейся в срезе или добавленной на нож, когда он выведен из зоны замороженной ткани. Срез осторожно переносится мягкой кисточкой, смоченной водой в плоский сосуд с водой (например, в чашку Петри). Предметное стекло подводится под срез, который аккуратно кисточкой переносится на поверхность стекла. Лишняя вода отсасывается 50 из-под среза полоской фильтровальной бумаги, и срез высушивается на стекле в защищенном от пыли месте. В ряде методов, срезы предварительно проводятся через гистохимическую процедуру и затем переносятся на предметное стекло. 3.2.4. Криостат В отличие от микротомов для замороженной ткани, в криостате микротом помещен в специальную холодильную камеру, в которой поддерживается температура -10 - -20°С. Таким образом, весь процесс резки ткани и некоторые последующие манипуляции со срезами проходят при низкой температуре. Резка ткани в криостате является прекрасным методом для подготовки срезов тканей для гистохимического выявления активности ферментов, белков, липидов и др. внутриклеточных и внутритканевых соединений. В криостате срезы остаются замороженными Обычно они осторожно кисточкой, которая на ноже также микротома. находится в криостате, переносятся на предметное стекло. Перед резкой ткани в криостате весь инструментарий и предметные стекла необходимо поместить в криостат для их охлаждения. Замороженный срез аккуратно расправляется на стекле, которое затем слегка нагревается, лед в срезе тает и срез плотно прилипает к стеклу. При необходимости предметные стекла перед помещением в криостат покрываются клеющим составом (см. ниже). После расправления, срезы высушиваются при комнатной температуре или в криостате. Крупные фирмы выпускают сложные и высокопроизводительные криостаты для получения качественных срезов для гистологии и гистохимии. Приборы высокого класса отличаются наличием приспособлений позволяющих процесс резки замороженной ткани проводить с высокой точностью, надежностью и комфортом. К сожалению, в России не выпускаются фирменные криостаты, хотя еще в 80-х годах в Москве можно было купить неплохой криостат типа МК-20, на 51 котором мне и моим коллегам удалось работать много лет. На рис. 41 слева показан внешний вид криостата МК-20, а справа - вид холодильной камеры этого криостата, в которой находится специальный «качающийся микротом». Рис.41. Криостат МК-20 Из зарубежных криостатов можно привести замечательный прибор Jung Cryocut 1800 (фирма Лейка), позволяющий изготавливать срезы толщиной 16- мкм при температуре до -35 °С . Другой криостат этой же фирмы Frigocut 2800 оснащен двумя измерителями температуры - температуры камеры криостата и отдельного измерителя температуры образцов, что очень важно при приготовлении качественных срезов. В нашем криостате МК-20 измеряется только температура камеры криостата и работающий на криостате должен внимательно следить за качеством резки: как только ткань становиться более «мягкой» или начинает сильно сморщиваться на ноже, это значит, что температура ткани «поднялась» - необходимо сделать небольшой перерыв для «охлаждения» ткани (слова «поднялась» и «охлаждение» взяты в кавычки, т.к. температура ткани все равно осталась в минусовом диапазоне). Температура ткани выше -7 - -8°С не дает возможности делать качественные срезы. Поэтому раздельное измерение и контроль температуры камеры и образца ткани выгодно отличает криостат Frigocut 2800 от других приборов. На этом криостате можно получать срезы толщиной 0.5 - 60 мкм при температуре камеры до -40 °С (0.5 мкм - это очень тонкий срез!!! и не каждому криостату это под силу). 52 Рис.42. Два криостата фирмы «Цейсс». Слева - HM 500M и справа - НМ 505Е Фирма «Микром», входящая в группу предприятий фирмы «Карл Цейсс» производит ряд микротомов и криостатов. Две модели криостатов этой фирмы показаны на рис. 42. Криостат НМ 500 О обеспечен устройством для точного и безопасного ! (все операции около открытого ножа в криостате, как, например, в криостате МК-20, опасны и требуют повышенного внимания) подведения ножа к образцу ткани, температура камеры до -40 °С, толщина срезов в диапазоне 0.5 - 300 мкм (модификация данного криостата НМ 500 О обеспечивает быстрое замораживание ткани и регулярное его охлаждение в диапазоне -5 - 55 °С, модификация НМ 500 М имеет электрический привод резки, а модель НМ 500 ОМ имеет элементы приведенных двух модификаций криостата). Криостат НМ 505 Е представляет удобный, компактный прибор с легко очищаемой камерой, в которой поддерживается температура до -35 °С , имеется автоматическая микро-макроподача ножа при изготовлении срезов толщиной от 1 до 500 мкм. Держатель ножа этого криостата позволяет, кроме использования обычных стандартных ножей, применять одноразовые лезвия и одноразовые лезвия из магнитного материала. Как правило, все современные криостаты снабжены так называемыми «антироллерными» устройствами, предотвращающими скручивание срезов во время резки, что позволяет получать качественные и серийные срезы «легко» и надежно (вообще работа на криостатах, даже самых современных, занятие сложное и требует усидчивости, внимания и тренировки). 53 3.2.5. Резаки, Вибратомы Из образцов нативной ткани или после их химической фиксации, но без заливки в специальные пропитывающие материалы, можно приготовить срезы тканей толщиной выше 25 микрон при помощи специальных микротомов- резаков и вибратомов. Например, на вибратомах фирмы "Lancer" (США, рис.43) или вибратоме Vibroslice - фирм Campden Instruments (Англия) и Labortehnik (Германия) (рис.44) можно приготовить срезы толщиной 25-50 мкм из нативной ткани и серийные срезы из фиксированной ткани. Рис. 43. Общий вид вибратома фирмы «Lancer» (США) (Vibratome, Series 1000) Рис.44. Вибратом фирмы Campden Instruments (Англия). (Схема элементов управления работы вибратома см. рис.45) В этих вибратомах образец ткани приклеивается к неподвижному держателю (подставке) при помощи специального клея (цианокрилатный клей полимеризуется при соприкосновении с водой). 54 Нож вибратома - лезвие безопасной бритвы совершает вертикальное движение и продольное - вибрирующее. После каждого среза держатель ножа передвигается вдоль оси резания на определенное расстояние, которое определяет толщину срезов. Исследователь может задавать толщину срезов и получать серии срезов заданной толщины. На рис. 45 показана схема вибратома фирмы «Campden Instruments». Рис.45. Основные элементы управления работывибратома фирмы «Campden Instruments»: 1 - режущий инструмент (лезвие бритвы), 2 - подставка для образца ткани, 3 - ванночка в которой находится образец ткани на подставке, 4 - ручка для перемещения ванночки с образцом ткани относительно режущего инструмента, 5 - ручка для регуляции частоты вибрации режущего инструмента. Другая возможность микротомии нативной и фиксированной ткани (без заливки в пропитывающие материалы) специальных микротомов-резаков (рис.46): связана с использованием 55 Рис.46. Общий вид микротомарезака (Центр аналитической микроскопии). (Блок питания и педаль дистанционного управления на рис. не показаны) В таких резаках, впервые предложенных МакИльвейном, нож (половинка лезвия безопасной бритвы), совершает только вертикальное движение (без продольной вибрации). В этом случае трудно получить срезы толщиной менее 100 мкм. Образец ткани помещается на специальный столик, покрытый фильтровальной бумагой, смоченной физиологическим раствором. В одном из вариантов резака нашей конструкции ткань помещается в специальный держатель из агар-агара (6-8% раствор), а лезвие бритвы закрепляется на основании резака на боковой поверхности специальной ванночки. Главным преимуществом микротомии на вибротомах или резаках является отсутствие необходимости предобработки ткани промежуточными растворителями и заливочными материалами. Однако при помощи этих видов микротомии невозможно получить серии тонких срезов. Срезы нативной ткани являются прекрасной моделью динамических процессов кислорода, активные в клетках и транспортные тканях механизмы для изучения многих in vitro - потребление (захват, секреция), биосинтетические процессы и др. (метод переживающих срезов ткани). В гистохимии срезы нативной ткани используются не часто, хотя есть методы, например, так называемый моноамины, в котором используются глиоксалевый метод на биогенные срезы тканей, приготовленные на вибратоме. Кроме этого, срезы тканей полученные на резаках и вибратомах успешно применяются в иммуногистохимии. С моей точки зрения, срезы из нативной ткани и фиксированной ткани без заливок в дополнительные 56 материалы имеют большую перспективу в гистохимии, которая еще не достаточно раскрыта. 3.3. Манипуляции со срезами 3.3.1. Подготовка предметных и покровных стекол Обычно срезы тканей помещаются на специальные предметные стекла размером 76х26 мм, и толщиной 1,5 мм. Требования к толщине предметных стекол приобретают особое значение, когда используются тонкие срезы и проводится анализ препаратов при больших увеличениях микроскопа. Покровные стекла - тонкие стекла, которыми покрывают срезы после проведения гистохимической реакции. Толщина покровных стекол играет важную роль при работе с объективами микроскопов с большой апертурой. Это связано с тем, что каждый объектив характеризуется, в частности, рабочим расстоянием - расстоянием поверхности от его фронтальной линзы до препарата. Это расстояние уменьшается при увеличении апертуры обьектива. Предметные и покровные стекла после тщательного промывания и обезжиривания обычно хранятся в смеси этилового спирта и эфира. Для различных манипуляций со срезами используется определенный инструментарий для переноса срезов, их раскладки на стеклах, расправления и др. (пинцеты, иглы, кисточки из мягкой шерсти, тонкие полоски фильтровальной бумаги и т.д.). Набор инструментария, как правило, является индивидуальным для каждого исследователя и подбирается им с учетом личного навыка и исследуемой ткани. Для приклеивания срезов к предметным стеклам используются специальные клеи, что препятствует отклеиванию и порче срезов во время гистохимических реакций. Один из таких клеев готовится на основе куриного белка, глицерина и желатины. Перед помещением срезов на предметные стекла, на их поверхность тонким слоем наносится клей. Для маркировки препаратов на предметные стекла наносятся специальные 57 надписи при помощи специальных чернил на основе смеси белка куриного яйца и черной туши или при помощи флолмастера. Один из наиболее удачных способов нанесения маркировки заключается в том, что сначала один из краев предметного стекла матируется, а затем простым карандашом на матовой поверхности наносится соответствующая надпись. В этом случае надпись устойчива при попадании на нее воды и различных растворителей во время манипуляций с препаратами. 3.3.2. Автоматы для гистологической обработки Различными фирмами выпускаются специальные автоматические приборы для гистологической проводки образцов ткани, в которых проводятся все операции от фиксации кусочков ткани до заливки их в парафин. В качестве примеров таких приборов можно привести установку для автоматической проводки - HMP 300 (Zeiss) с микропроцессорным управлением, Hypercenter XP (Shandon), автомат для гистологической проводки карусельного типа Citadel 1000/200 (Shandon) и мн. др. Приборы этого типа представляют сложные технические автоматизированные системы и их использование оправдано в случае проводки большого количества гистологического материала, например, при лабораторно-клинических гистологических анализах в крупных медицинских центрах. В обычной научно-исследовательской работе использование гистологических автоматов не эффективно. Контрольные вопросы 1. 2. 3. 4. 5. Общие задачи химической фиксации. Проблемы химической фиксации, артефакты. Альдегиды, используемые для приготовления химических фиксаторов. Особенности применения формалина как фиксатора, параформ. Глутаральдегид как химический фиксатор. Взаимодействие белков с альдегидами. Использование альдегидной фиксации в гистохимии. Связь структуры альдегидов с их фиксирующей способностью. 6. Буферы и альдегидная фиксация. Хранение альдегидных фиксаторов. 7. Формалиновые смеси (фиксаторы): жидкость Бэкера, Шабадаша, смесь Пирсона, солевой забуференный формалин. 58 8. Ионы металлов как фиксаторы. Хромовая кислота, основные свойства, область использования, механизм фиксации. 9. Соли ртути, механизмы фиксации, область использования в гистохимии. Смесь сулема - уксусная кислота. 10. Четырехокись осмия, основные механизмы фиксации, область использования в гистохимии. 11. Пикриновая кислота, механизмы фиксации. Смесь Боуэна. 12. Сульфосалициловая кислота, механизмы фиксации. 13. Спирты как фиксаторы для гистохимии, механизмы действия. Спиртовые смеси (Жидкость Карнуа). 14. Ацетон - химический фиксатор, механизмы действия. 15. Что такое физическая "фиксация"? 16. Использование низких температур, общие принципы. Кристаллизация воды в тканях, значение для фиксации. 17. Общая классификация криометодов фиксации тканей для гистохимии. Прямое замораживание тканей (до -10 - -20 град. С, без дегидратации). 18. Глубокое замораживание тканей (до -78 - -196 град. С, без дегидратации). 19. Замораживание тканей при помощи твердой углекислоты. 20. Жидкий азот, замораживание ткани, скорость замораживания, использование "промежуточных жидкостей" (изопентан, пропан). 21. Сублимационная сушка тканей как "физическая" фиксация. Общие принципы сублимационной сушки. 22. Определение конца сублимации. Сопротивление высушенного слоя. Артефакты при сублимационной сушке, методы их уменьшения. 23. Основные приемы обработки лиофилизированной ткани для гистохимических целей. 24. Метод замещения льда в тканях в замороженном состоянии, основные принципы. 25. Что такое микротомия тканей? "Толстые" и "тонкие" срезы. 26. Типы микротомии (классификация). Типы микротомов (ротационный, салазочный). 27. Криостат. Резаки и вибратомы. 28. Материалы для заливки тканей для микротомии (общая характеристика). 29. Водорастворимые пластмассы (поливиниловый спирт. полиэтиленгликоли). Гелеобразующие заливочные материалы (желатин, агар). 30. Парафин (способы заливки). 31. Заливка ткани в целлоидин. 32. Подготовка предметных и покровных стекол. Основные параметры предметных и покровных стекол (толщина, размеры и др.). Маркировка предметных стекол. 33. Приклеивание срезов к предметным стеклам. Получение срезов на замораживающем микротоме: манипуляции со срезами. 34. Изготовление срезов из парафиновых блоков (перенос срезов, расправление срезов) 59 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА ( Раздел 2) 1. Ромейс Б. Микроскопическая техника, ИИЛ, М., 1954 2. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия, Изд. АН Венгрии, Будапешт, 1962 3. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. Мир, М., 1980 4. Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. ИИЛ, М., 1962 5. Конарев В.Г. Цитохимия и гистохимия растений, М., Высшая школа,1965 6. Дженсен У. Ботаническая гистохимия, М., Мир, 1965 7. Саркисов Д.С., Лопатенок А.А. Применение пластических масс для заключения гистологических и анатомических препаратов, Медгиз, 1961, М. 8. Микроскопическая техника. Руководство. Под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова, Медицина, М., 1996, гл.1-4. 9. Бойчук Н.В., Исламов Р.Р., Улумбеков Э.Г., Челышев Ю.А. Гистология, Медицина, М., 1998 10. Gahan P.B. Plant histochemistry and cytochemistry. An introduction. Academic Press, London, 1984