жирные кислоты мембранных липидов живых тканей почек

Химия растительного сырья. 2000. №2. С. 41–45.
УДК 630*181.324
ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ ЖИВЫХ ТКАНЕЙ ПОЧЕК
ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ
*
 Е.В. Алаудинова, П.В. Миронов , С.М. Репях
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск,
660049 (Россия), e-mail: repyakh@pop3.kts.ru
Работа посвящена изучению состава жирных кислот мембранных фосфолипидов меристематических тканей почек
лиственницы сибирской в различные периоды годового цикла, а также изучению изменения жирно-кислотного состава
фосфолипидов при замораживании зимующих почек
Введение
Липиды – основные компоненты клеточных мембран и единственные вещества в растениях, которые,
подобно воде, должны находиться в жидком фазовом состоянии, необходимом для нормального
функционирования мембран. Последнее в свою очередь во многом зависит от состава жирных кислот
липидов. Снижение температуры может вызвать физическое изменение состояния гидрофобного
мембранного матрикса, поэтому живые клетки очень чутко реагируют на изменение температуры
окружающей среды, изменяя жирно-кислотный состав мембранных липидов [1,2].
Самое удивительное свойство многолетних древесных растений, произрастающих в холодных
климатических условиях – способность переносить в середине зимы сильные морозы – связано с
разнообразными структурно-химическими изменениями, возникающими в клетках живых тканей. До сих
пор такие изменения мало исследованы. В определенной мере это связано с тем, что живые клетки и ткани
составляют лишь малую часть дерева. Выделение этих тканей в чистом виде, в достаточном для
исследований количестве, не всегда возможно. Поэтому изучение вещественного состава жирных кислот
мембранных липидов живых тканей морозостойких древесных растений в различные периоды годового
цикла представляет несомненный интерес.
Среди хвойных пород, образующих древостои Сибири, лиственница сибирская (Larix sibirica L.)
обладает наибольшей морозостойкостью. В зимнее время в естественных условиях она выдерживает
понижение температуры до – 60 °С [3], а меристематические ткани почек лиственницы могут сохранять
жизнеспособность при замораживании до – 196 °С [4]. Поэтому в качестве объекта исследования были
выбраны меристематические ткани почек лиственницы сибирской.
Ранее [5] было установлено, что при определенных условиях замораживания зимующих почек
лиственницы в их меристеме наблюдается распад мембранных липидов (фосфолипидов), с одновременной
утратой почками жизнеспособности. Для выяснения изменений, возникающих в составе жирных кислот
*
Автор, с которым следует вести переписку.
Е.В. АЛАУДИНОВА, П.В. МИРОНОВ, С.М. РЕПЯХ
42
фосфолипидов при условии летального замораживания, была поставлена задача определения жирнокислотного состава фосфолипидов меристематических тканей почек, выделенных из предварительно
замороженных побегов.
Экспериментальная часть
Целью настоящей работы являлось исследование жирно-кислотного состава мембранных фосфолипидов
меристематических тканей почек Larix sibirica L., а также его изменения при условии летального
замораживания зимующих почек лиственницы. Отбор проб проводили в различные периоды годового
цикла, соответствующие различным фенологическим состояниям дерева. Меристематические ткани
боковых почек побегов последнего года выделяли механически, срезая их по границе с ксилемой после
удаления коры вместе с почечными чешуями.
Для получения препарата суммарных мембранных липидов из гомогената меристематической ткани
выделяли
комплекс
клеточных
мембран,
осаждая
фракцию
клеточных
стенок
посредством
центрифугирования при 500 g в течение 3 мин. Надосадочную жидкость, содержащую комплекс мембран,
центрифугировали при 22000 g в течение 30 мин. Осадок фиксировали изопропиловым спиртом и
экстрагировали липиды по методу Блайя и Дайера. Разделение суммарных липидов проводили методом
адсорбционной колоночной хроматографии. Жирно-кислотный состав фосфолипидов устанавливали
методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Жирные кислоты анализировали в виде их метиловых
эфиров на хроматографе «Хром-5» с пламенно-ионизационным детектором с использованием насадочной
колонки, заполненной хроматоном N-AW-DS c нанесенной жидкой фазой – диэтиленгликольсукцинатом
(DEgS) 20%.
С целью выявления изменения состава жирных кислот при замораживании зимующие побеги (январь)
медленно охлаждали со скоростью 3,5 °С/ч до –15 °С и –20 °С и выдерживали при этих температурах в
течение суток. При этом побеги сохраняли жизнеспособность. Далее зимующие побеги замораживали со
скоростью 15 °С/ч до –60 °С, оттаивали со скоростью 5 °С/ч и выдерживали при +5 °С в течение суток.
Выделение суммарных фосфолипидов из комплекса клеточных мембран меристематических тканей почек и
определение состава их жирных кислот проводили, как описано выше.
Обсуждение результатов
Результаты определения вещественного состава жирных кислот фосфолипидов в различные периоды
годового цикла приведены в таблице 1. В структуре фосфолипидов обнаружено 14 жирных кислот.
Динамика жирнокислотного состава носит сезонный характер.
Анализ хроматограмм позволил разделить жирные кислоты на 5 групп, в зависимости от степени их
ненасыщенности: насыщенные, моноеновые, диеновые, триеновые, тетраеновые, и вычислить индекс
двойной связи (ИДС), характеризующий степень ненасыщенности липидов. Динамика содержания
основных групп жирных кислот фосфолипидов представлена в таблице 2.
Фосфолипиды
характеризуются
высоким
содержанием
насыщенных
кислот,
особенно
перед
распусканием почек (49,86% от суммы кислот). В течение года среди насыщенных кислот преобладала
пальмитиновая С
16:0.
Ее содержание изменялось от 10,17 до 29,89% от суммы кислот. Среди моноеновых
кислот преобладали пальмитолеиновая С16:1 и олеиновая С18:1.
ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ …
43
Е
Таблица 1. Состав жирных кислот фосфолипидов, % к сумме кислот
Жирная кислота
Месяц отбора проб
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
I
II
III
IV
V
Лауриновая
0,28
0,61
0,64
1,12
1,27
1,26
1,13
0,67
0,65
0,92
0,30
2,26
Миристиновая
0,41
0,12
0,20
0,28
0,17
0,88
0,74
0,32
0,28
1,03
0,18
1,21
Пальмитиновая
25,24
23,31
21,30
17,83
12,29
10,17
10,96
11,59
12,96
22,54
27,38
29,89
Пальмитолеиновая
3,53
4,31
4,45
8,37
10,64
10,90
10,15
10,94
10,21
5,62
5,56
2,01
Стеариновая
8,60
9,23
8,69
4,72
4,08
4,81
4,40
4,22
5,08
5,18
4,50
1,60
Олеиновая
10,82
12,61
12,78
10,14
9,23
8,03
8,07
9,46
9,13
14,23
11,45
2,81
Линолевая
21,74
21,99
21,82
20,35
20,95
20,33
21,83
20,31
20,24
19,57
15,88
29,74
Линоленовая
12,08
10,26
14,63
19,63
20,86
20,78
19,92
18,54
20,83
13,83
7,85
5,31
Эйкозановая
3,98
3,72
3,94
3,21
3,75
4,45
3,99
4,39
4,53
5,98
8,34
14,90
Эйкозеновая
0,83
2,02
2,90
3,34
3,11
3,17
3,12
3,31
4,07
1,08
2,67
2,44
Эйкозодиеновая
2,42
2,41
2,37
2,05
2,13
2,52
2,41
2,56
1,17
0,34
1,59
2,08
Эйкозотриеновая
2,57
3,82
2,51
4,72
6,49
6,73
6,23
6,05
5,95
5,50
4,23
1,18
Арахидоновая
2,97
2,21
0,83
0,63
1,24
1,91
1,69
2,49
1,58
1,01
5,56
2,25
Эруковая
4,53
3,38
2,94
3,61
3,79
4,06
5,36
5,15
3,32
3,17
4,51
2,32
Таблица 2. Основные группы жирных кислот фосфолипидов, % к сумме кислот
Месяц отбора проб
Группа
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
I
II
III
IV
V
Насыщенные
38,51
36,99
34,77
27,16
21,56
21,57
21,22
21,19
23,50
35,65
40,70
49,86
Моноеновые
19,71
22,32
23,07
25,46
26,77
26,16
26,70
28,86
26,73
24,10
24,19
9,58
Диеновые
24,16
24,40
24,19
22,40
23,08
22,85
24,24
22,87
21,41
19,91
17,47
31,82
Триеновые
14,65
14,08
17,14
24,35
27,35
27,51
26,15
24,59
26,78
19,33
12,08
6,49
Тетраеновые
2,97
2,21
0,83
0,63
1,24
1,91
1,69
2,49
1,58
1,01
5,56
2,25
ИДС
1,24
1,22
1,26
1,46
1,60
1,62
1,60
1,58
1,56
1,26
1,18
1,02
В осенне-зимний период содержание моноеновых кислот возрастало до максимума (28,85% от суммы
кислот), а перед распусканием хвои уменьшалось до 6,2%. В группе диеновых кислот в течение всего года
преобладала линолевая кислота С18 : 2, которая определяла характер динамики содержания жирных кислот с
двумя двойными связями. В осенне-зимний период их доля оставалась неизменной (около 23% от суммы
кислот) и перед распусканием хвои достигала максимума (31,82% от суммы кислот). Наиболее резкие
колебания содержания наблюдались в группе триеновых кислот (от 6,49% в начале мая до 27,51% в ноябре).
Основной кислотой этой группы являлась линоленовая кислота С18:3. В период покоя отмечалось
накопление кислот этой группы, а в период начала вегетации резкое снижение их содержания.
Арахидоновая кислота С20 : 4 представляет группу тетраеновых кислот. В течение года ее содержание
колебалось от 0,63 до 5,56% от суммы кислот. Отмечалось повышение содержания в весенне-летний период.
Ранее [6] при исследовании жирных кислот фосфолипидов почек и камбиальной зоны тополя
бальзамического наблюдалась схожая картина годовой динамики арахидоновой кислоты. В период
наибольшей физиологической активности (начало мая) в количестве кислот всех пяти групп происходили
существенные изменения: резко снижалось количество моноеновых и триеновых кислот и увеличивалось
содержание насыщенных и диеновых кислот. В таблице 2 приведена динамика индекса двойных связей
Е.В. АЛАУДИНОВА, П.В. МИРОНОВ, С.М. РЕПЯХ
44
(ИДС) в фосфолипидах меристематических тканей лиственницы сибирской. В начале мая в период
подготовки к активному росту хвои, в фосфолипидах резко повышалась концентрация пальмитиновой
кислоты, что приводило к снижению ИДС до 1,02. Осенью уровень ненасыщенности жирных кислот
повышался за счет увеличения содержания линоленовой С18 : 3 и эйкозотриеновой С20 : 3 кислот, а также
снижения содержания насыщенных кислот. В период покоя значение ИДС в фосфолипидах оставалось на
стабильно высоком уровне (около 1,60), так как содержание ненасыщенных жирных кислот достигало 80%
от суммы кислот. Это подтверждает важную роль фосфолипидов при формировании морозоустойчивого
состояния мембран растительных клеток. Поддержанию в «жидком» фазовом состоянии липидов
мембранного комплекса в зимнее время способствовало большое количество ненасыщенных жирных кислот
в структуре фосфолипидов.
Содержание низкомолекулярных кислот (лауриновой С12 : 0 и миристиновой С14) в фосфолипидах
невысоко и в течение года изменялось от 0,48 до 3,47% от суммы кислот. В динамике их содержания
наблюдается два максимума: перед распусканием хвои (3,48%) и в ноябре (2,14%). Поскольку длина
углеродной цепи жирной кислоты влияет на температуру ее плавления, то низкомолекулярные жирные
кислоты, как и высоконенасыщенные, могут способствовать поддержанию жидкой консистенции липидов,
смещая точку перехода в твердое состояние в низкотемпературную область.
В таблице 3 приведены результаты изменения состава жирных кислот фосфолипидов при замораживании
побегов. Из приведенных результатов следует, что распад фосфолипидов в зимующих почках, содержащих
влагу в капиллярно-пористой структуре мембран [5], сопровождался существенным изменением их жирнокислотного состава. При этом происходило насыщение двойных связей, приводящее к увеличению
содержания предельных кислот вдвое. Содержание суммы линолевой и линоленовой кислот снижалось с
38,85 до 18,53% от суммы кислот. Наряду с увеличением содержания в фосфолипидах эйкозеновой кислоты
отмечалось исчезновение эйкозотриеновой. Вместе с тем доля эйкозодиеновой не изменялась, а
арахидоновой возрастала в 1,5 раза.
Таблица 3. Изменение состава жирных кислот фосфолипидов при замораживании побегов
Зимующие почки (январь)
Жирная кислота
Контроль
Охлаждение от –20 °С,
Охлаждение от –15 °С,
15 °С/ч
15 °С/ч
Лауриновая
0,67
0,69
1,59
Миристиновая
0,32
0,30
1,95
Пальмитиновая
11,59
11,66
22,01
Пальмитолеиновая
9,94
9,95
5,90
Стеариновая
4,22
4,30
10,71
Олеиновая
10,46
10,31
2,92
Линолевая
20,31
20,31
12,81
Линоленовая
18,54
18,55
5,72
Эйкозановая
4,39
4,39
14,83
Эйкозеновая
3,31
3,36
9,79
Эйкозодиеновая
2,56
2,49
2,25
Эйкозотриеновая
6,05
6,10
0,00
Арахидоновая
2,49
2,51
3,61
Эруковая
5,15
5,08
5,91
ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ …
Е
45
Таким образом, наименее устойчивыми к замораживанию оказались фосфолипиды, имеющие в своем
составе остатки линолевой, линоленовой и эйкозотриеновой кислот.
Поскольку содержание этих кислот при замораживании в летальных условиях снижалось, очевидно, что
в большей степени разрушались фосфолипиды, содержащие именно эти кислоты.
Полученные результаты свидетельствуют о том, при замораживании зимующих почек, не содержащих в
капиллярно-пористой системе мембран объемной фазы воды, способной к кристаллизации, их
жизнеспособность полностью сохранялась. Деградация фосфолипидов [4] и изменение их жирно-кислотного
состава не происходили. Однако при наличии даже небольшого количества влаги в капиллярно-пористой
системе мембран зимующие ткани утрачивают способность выносить понижение температуры до –60°С.
Вероятно, кристаллизация воды индуцирует активацию мембранно-связанных липолитических ферментов и,
как следствие, существенное изменение состава жирных кислот мембранных липидов.
Список литературы
1.
Фуксман И.Л., Ильинова М.К., Саукконен Л.А., Степанов А.А. Изменения жирно-кислотного состава липидов хвои
сосны обыкновенной в течение годичного цикла // Химия древесины. 1986. № 3. С. 101-108.
2.
Новицкая Г.В., Сальникова Е.Б., Суворова Т.А. Изменения ненасыщенности жирных кислот липидов растений
озимой и яровой пшеницы в процессе закаливания // Физиология и биохимия культурных растений. 1990. Т.22. №3.
С.257-264.
3.
Хлебникова Н.А., Гирс Г.И., Коловский Р.А. Физиологическая характеристика хвойных растений Сибири в зимний
период // Труды ИлиД СО АН СССР. Красноярск, 1963. Т. 60. С. 5-16.
4.
Миронов П.В., Левин Э.Д. Переохлаждение и обезвоживание хвойных зачатков в зимующих почках лиственницы
сибирской // Физиология растений. 1985. Вып. 4. С. 695-700.
5.
Миронов П.В., Алаудинова Е.В., Репях С.М. Повреждение мембран меристематических тканей Larix sibirica при
внутриклеточном льдообразовании // Проблемы химико-лесного комплекса. Красноярск, 2000. 3 с. (в печати).
6.
Исаева Е.В. Арахидоновая кислота Populus balsamifera как предшественник простагландинов: Автореф. дис …
канд. хим. наук. Красноярск, 1991. 24 с.
Поступило в редакцию 8 сентября 2000 года