Стромальные клетки жировой ткани :

Стромальные клетки
жировой ткани :
перспективы использования в
медицине
Калинина Н.И., Рубина К.А., Сысоева В.Ю.,
Цоколаева З.И., Ефименко А.Ю., Трактуев Д.О.,
Марч К.Л., Чаусская И.Ю, Дробышев А.Ю.,
Парфенова Е.В., Ткачук В.А.
Факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова
Российский кардиологический научный центр
Московский государственный медико-стоматологический университет
ООО «Генная и клеточная терапия»
Университет Индианы, США
1
Жировая ткань – доступный источник
прогениторных клеток
Нервная ткань
Трансплантация в
поврежденный орган
Сосуды
Миокард
жировая
ткань
выделение клеток
многократное увеличение
числа клеток
2
Выделение стромальных клеток из жировой ткани
Жировая ткань
Ферментативная обработка
Разделение на фракции
Лизис эритроцитов в осадке
Осадочная фракция:
клетки стромы, сосудов,
лейкоциты, эритроциты
Фильтрация
Осаждение
Культивирование
через 2 дня после выделения
3
Свежевыделенные СКЖТ содержат
прогениторные клетки
83,8%
34,6%
11,4%
1,4%
1,6%
0,4%
Зеленый – изотипический контроль; красный – антитела
4
Cтромальные клетки жировой ткани
обладают пластичностью
Кардиомиоциты
Эндотелий
(Planat-Benard, et al 2004)
Нейроны и глия
(Yang et al, 2004)
СКЖТ
Хондроциты
Остеобласты
Гепатоциты
(M. Seo et al, 2005)
β-клетки
поджелудочной железы
Адипоциты
(Zuk et al, 2002)
(Timper et al, 2006)
Использование в реконструктивной хирургии
5
Развитие сосудистой сети под влиянием СКЖТ
Контроль
100 мкм
bFGF
СКЖТ человека
100 мкм
100 мкм
Окраска на СD31 мыши
6
Введение стромальных клеток жировой ткани
стимулирует восстановление кровотока
Количество сосудов
p<0.01
Сосуд / волокно
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Без клеток
Без
Ишемия Ишемия +
ишемии
клетки
Кровоток (лазер-допплер)
%
ишемия +
клетки
Кровоток
60
40
20
ишемия
Введены клетки
0
1
5
10 дни
7
Введение СКЖТ после инфаркта
миокарда улучшает функцию сердца
СКЖТ в периинфарктной зоне сердца
крысы через 7 дней после введения
Фракция выброса левого желудочка
(ЭХОКГ) через 1 месяц после ИМ у крыс
% ФВ
60
p< 0,01
40
20
0
- СКЖТ, меченные DAPI
Контроль
СКЖТ
Облученные
СКЖТ
8
Формирование капилляро-подобных структур в
культуре кардиомиоцитов
CD31
Колтчество капилляроподобных структур
5.0
2.5
0.0
1день
3 день
5 день
9
СКЖТ стабилизируют капилляро-подобные
структуры в культуре кардиомиоцитов
Количество сосудов в поле
зрения
8
Количество сосудов через 8 дней
культивирования
50мкм
7
CD31
6
*
5
4
3
2
1
0
СКЖТ
КМЦ
КМЦ
+
СКЖТ
КМЦ
+
Конд.
среда
10
Количество сосудов в поле зрения
СКЖТ стимулируют формрование капилляроподобных структур в культуре кардиомиоцитов
не содержащей зрелых сосудистых клеток
8 Количество сосудов через 8 дней
культивирования
7
2%
32%
КМЦ
6
5
4
3
<0,01%
0,13%
2
CD31,
NG2
депл.
КМЦ
1
CD31-Alexa488
0
СКЖТ
КМЦ
NG2-Alexa488
КМЦ КМЦ КМЦ депл. обогащ.
+
+
КМЦ КМЦ
+
СКЖТ Конд. mitC
+
+
среда СКЖТ СКЖТ СКЖТ
11
СКЖТ стимулируют рост кровеносных сосудов
Активация эндотелиальных клеток:
продукция ангиогенных и подавляющих апоптоз
факторов роста (VEGF, bFGF, HGF, TGFβ)
Стабилизация формирующихся сосудов:
взаимодействие перицитов с
растущими сосудами
Cтимуляция дифференцировки:
резидентных прогениторных клеток
Использование для восстановления кровоснабжения тканей
12
Проблемы клеточной терапии
• Гибель трансплантированных клеток
• Трансплантация на носителях
• Обработка клеток перед трансплантацией
• Перенос инфекций животных
• Иммунная реакция на белки животных
• Использование собственной сыворотки
крови пациента
• Использование синтетических
заместителей сыворотки
13
Аутологичная сыворотка стимулирует
пролиферацию СКЖТ
Митотический индекс %
(на 1000 клеток)
Апоптотический индекс %
(на 1000 клеток)
5,68
2,09
4,12
1,69
Среда с
синтетическими
добавками
Аллогенная
Сыворотка
1,26
Аутологическая
сыворотка
Среда с
синтетическими
добавками
Аллогенная
Сыворотка
Аутологическая
сыворотка
3,5
14
Гипоксия стимулирует
пролиферацию СКЖТ человека
р < 0.01
%
Прирост клеток
+150
+100
+50
21% O2
1% O2
0
15
Гипоксия стимулирует экспрессию
про-ангиогенных факторов СКЖТ
160
мРНК, ПЦР в реальном времени
* *
140
Относительные единицы
120
100
СКЖТ нормоксия
(21% О2)
*
СКЖТ гипоксия
(1% О2)
80
60
40
*
20
0
VEGF HGF c-met PLGF FGF2 CD34 Ang1TGF-β1 GM-CSF
VEGF HGF c-met PLGF FGF2 CD34 Ang1TGF-β1 GM-CSF
16
Фактор роста , нг/ 106 клеток, ELISA
Гипоксия стимулирует секрецию
про-ангиогенных факторов СКЖТ
50
p<0.001
p<0.05
40
30
20
10
0
VEGF
- нормоксия
HGF
- гипоксия
17
Кондиционированная среда СКЖТ, культивированных в
условиях гипоксии, стимулирует образование
капилляроподобных структур
0% FBS
normASC
A
Кондиц.
среда
20% FBS
hypASC
Эндотел.
клетки
Суммарная длина трубочек, мкм
СКЖТ
Формирование
трубочек на
Матригеле
B
30000
**
25000
20000
15000
10000
5000
0
0%FBS
20%FBS
normASC
hypASC
p<0,05
18
СКЖТ, культивированные в условиях гипоксии
стимулируют васкуляризацию имплантатов Матригеля
- контроль
A
Г
CD31 (зеленый)
гип СКЖТ
норм СКЖТ
Б
20 μm
Д
В
20 μm
Е
20 μm
NG2 (красный)
19
СКЖТ, культивированные в условиях гипоксии
стимулируют рост кровеносных сосудов
Крупные сосуды
Капилляры
p<0.05
Количество сосудов / площадь
среза (DAPI)
Количество сосудов / площадь
среза (DAPI)
180
(диаметр более 50 мкм)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
-контроль +контроль
Норм СКЖТ
Гип СКЖТ
p<0.05
2,5
2
1,5
1
0,5
0
-контроль +контроль
Норм СКЖТ
Гип СКЖТ
20
Носители позволяют повысить
эффективность трансплантации СКЖТ
коллапан
гидроксиапатит
21
Ближайшие перспективы применения СКЖТ
в медицине
На пленках и носителях
для лечения язв,
восстановления костной
ткани
Раневые повязки
Культивирование
на аутологичной
сыворотке
Инкубация в
условиях гипоксии
перед
трансплантацией
протезов сосудов
Восстановление
кровоснабжения
ишемизированных
тканей
22
Спасибо за внимание !
23
Культивированные СКЖТ более эффективно
стимулируют рост капилляров по сравнению
со свежевыделенными клетками
24
25
73
CD
+
rt
so
a
49
D
C
CD
73C
D49
a+
sor
t
26
Гипоксия стимулирует продукцию
про-ангиогенных факторов СКЖТ
%, mRNA
700
600
Р <0,001
500
Р <0,01
400
300
Р <0,01
200
100
0
VEGF
HGF
bFGF
Ang-1
TGF β
GM-SCF
27