ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ СЕРДЕЧНО

Использование СИ для анализа
элементного состава ультрамалых объектов
в
биологии, медицине, в технологиях
создания новых материалов
Трунова В.А.
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт неорганической
химии им. А. В. Николаева СО РАН, Новосибирск, valna‐t@mail.ru
1
Институты совместно с которыми были выполнены представленные
исследования на станции РФА-СИ ВЭПП-3
1.Институт неорганической химии им. А.В.Николаева СО РАН
2. Институт археологии и этнографии СО РАН
3.Институт водных и экологических проблем СО РАН
4.Институт геологии и минералогии им. В.С. Соболева СО РАН
5.Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН
6.Лимнологический институт СО РАН
7.Институт геохимии им. А.П. Виноградова СО РАН
8.Институт систематики и экологии животных СО РАН
9.Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
10.Институт патологии кровообращения им. Е.N.Мешалкина ФГУ
11.Новосибирский Государственный университет
12.ФГУ
научно
исследовательский
институт
Региональной
патологии
и
патоморфологии СО РАМН
13.Новосибирский государственный педагогический университет
2
В ИНХ СО РАН были получены новые металлоорганические соединения, летучие b-дикетонаты
редкоземельных элементов. Эти вещества использовались для сухой вакуумной литографии
(сухое осаждение, проявление и травление резистов, это позволяет исключить жидкостные
процессы из технологического цикла и реализовать замкнутый процесс создания рисунка.
Исследовались соединения нового класса для данного их использования. Станция РФА на
ВЭПП-4 позволяла поднимать энергию до 100 кэВ. Определялись лантаноиды по К-серий.
Исследования пленок ( ̴ 100 Ǻ) b-дикетонатов на кремнии в технологическом цикле было
осуществлено методом SRXRF.
Спектр плёнки – образца сравнения La, Sm
и Tm, наложенный на кремниевую подложку.
Концентрация каждого из элементов 1×10-7
г/см2
Спектр bдикетоната тербия
(Tb) до (а) и после
(б) термообработки
№1 – пленка из пролена для рентгеновского анализа № 416 (Chemplex, USA), толщина 2,5 мкм;
№2 – майларовая пленка №.021464 (Chemplex, USA), толщина 2,5 мкм; №3 – майларовая пленка
№ 01865-AB (Structure Probe, Inc., USA), толщина 2.5 мкм; №4 – пищевая пленка (исследовалась
на предмет возможного использования).
Оценка величины отношения Sp (элемент) / Sp (некогерентного рассеяния) для различных
химических элементов в различных майларовых плёнках. Энергия возбуждения флуоресценции
(Eex) = 17 кэВ. Для анализа биологических объектов (мышечных тканей) была выбрана пленка
№3
S p (э л е м е н т ) / S p (н е к о г е р т н . р а с с е я н и я )
0.08
0.07
film №1
film №2
0.06
film №3
0.05
film №4
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
4
K
Ca
Ti
Fe
Co
Ni
Cu
Zn
Br
Sr
SRXRF data
Пробоподготовка образцов прекурсоров (silicon- organic):
Пленка Mylar натягивалась между двумя фторопластовыми кольцами, на неё
по 5 мкл капельно 5 +5 +5 (15) мкл наносился прекурсор на майларовую
поверхность 5 мкл микропипеткой. Образец высушивался при постоянной
температуре Т = 40 0С. Для образцов прекурсоров и GMDS-стандарта время
сушки составляло порядка 5 минут..
Precursors
K
Ca
Ti
V
Cr
Mn
Fe
Ni
Cu
Zn
Se
Br
Pb
GMDS/MERK
0,05
0,01
1*
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
1*
1*
1*
0,01
mylar
0,08
0,01
0,48
<LLD
<LLD
0,01
0,01
0,01
0,02
1,19
0,15
1,4
0,02
<LLD
<LLD
R‐11.
0,07
0,01
0,37
<LLD
<LLD
0,01
0,02
0,01
0,01
1,48
<LLD
3,4
0,02
R‐12.
0,03
<LLD
0,05
<LLD
<LLD
0,01
0,01
<LLD
0,01
0,52
<LLD
4,2
0,02
R‐17.
0,02
0,01
0,18
<LLD
<LLD
0,01
0,01
0,01
<LLD
0,83
2,0
0,75
0,01
R‐20.
0,03
0,01
0,27
<LLD
<LLD
0,01
0,01
<LLD
0,01
0,71
1,1
116
0,08
5
Films
K
Ca
V
Cr
Mn
Fe
Ni
Zn
Br
relative to GMDS
1
1
1
1
1
1
1
1
1
r-20-p146 / T=400 /1 lot.
2.54
0.68
0.5
0.574
1.14
1.04
1.68
1.25
151
r-20-p150 / T=100 /2 lot.
0.81
0.32
0.86
1.81
1
1.35
1.52
1.47
323
r-20-p153 / T=400 /2 lot.
1.82
0.85
1.75
1.24
1
2.32
0.619
0.612
134
r-20-p156 / T=700 /2 lot.
2.99
1.42
0.78
2.28
1
2.78
2.73
1.29
27
r-20-p189 / T=400 /3 lot.
0.45
0.87
0.96
0.851
0.667
0.833
1.19
1.44
<LLD
Zn
Br
r-20-1.
0.39
4.1
r-20-2.
1.6
236
r-20-3.
0.25
7.7
Precursors R-20
relative to GMDS (Merk)
6
Выводы
• Некоторые примеси были обнаружены в
анализируемых прекурсорах (e.g. Br);
• Уровень концентраций примесей во всех
прекурсорах был различный и разный из разных
лотов.
• Примеси, которые были найдены в прекурсорах ,
были обнаружены и в пленке карбонитрида кремния
(PECVD).
Институт Катализа СО РАН
При исследовании сырья тяжёлых нефтяных фракций до и после
глубокой переработки требуются знания о тяжелых металлах (V, Ni, Mo –
единицы, десятки ppm). На первых этапах исследователь получает золу в
массе 3-5 мг и ему нужно знать микро состав примесей в ней тяжелых
металлов, метод SRXRF позволяет это сделать.
7
Подготовка стандартных образцов
Сухой материал стандартного образца
(размер зерен порядка 90 мкм) подвергался
прессованию (P=100 - 150 кг/см2).
Масса таблетки составляла ̴ 5 - 10 мг.
(диаметр пресс-формы 6 - 8 мм)
Приготовленные таблетки стандартов
упаковывались в майларовую пленку для
рентгеновского анализа (толщина 2.5 мкм) и
закреплялись фторопластовыми кольцами.
Энергия возбуждающих квантов:
13 кэВ, 16 кэВ, 18 кэВ, 20 кэВ, 22 кэВ
8
Институт систематики и экологии
животных СО РАН
Проведена работа по изучению
проблем дальних миграций насекомых;
идентификации географических
популяций насекомых; усвоению
химических элементов из кормового
растения насекомых на различных
фазах их развития; миграции
элементов по фазам онтогенеза.
Двумерное распределение различных
элементов при исследовании на образце;
размер всех изображений 40 * 46 точек,
пиксел 200 *250 µm2
Типичная масса мотылька от 1 до 30 мг.
Наиболее подвижными элементами в теле
мотылька являются Ca, Zn, Zr и Mo.
Наиболее удобными элементами при
идентификации популяций данного вида
оказывается Br и Sr
9
10000
Искусственная среда
Питательная среда
1000
Пронимфы
Куколки
Чешуйки пронимфы
Концентрация, мкг/г
Мотылек
100
10
1
0.1
K
Ca
Fe
Cu
Zn
Br
Rb
Sr
Zr
Mo
Элементы
10
Институт теоретической
и экспериментальной
биофизики РАН
Результаты
анализа
образцов
различных
участков ЖКТ кролика
Результаты
анализа
образца
плотных
эндогенных
фракций
отделов ЖКТ кролика.
Наблюдается
ярко
выраженная
тенденция
увеличения концентраций
одних
элементов
в
направлении от желудка до
прямой кишки. Кроме
того, эта информация нова
в том плане, что здесь
представлена «география»
распределения элементов
по различным отделам
ЖКТ.
11
Желудочно-кишечный тракт кролика (плотная эндогенная фракция)
Прослеживаются основные места всасывания отдельных элементов (медь - желудке, кальций –
в подвздошной кишке, железо - 12-перстной кишке, и т.д.), что соответствует литературным
12
данным
Содержание элементов в тканях животных разных экспериментальных
групп
Содержание
Cu в тканях животных разных
Содержание
экспериментальных групп
250
14.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
мкг/г
200
150
100
Позв.
Позв.
ГКОП+Т
ГКОП
Интактные
ГКОП
Интактные
ГКОП+Т
ГКОП
ГКОП+Т
Позв.
Se в тканях животных разных
ДОТК
Почка
Тонк.к.
ГКОП+Т
ГКОП
Интактные
ГКОП+Т
ГКОП
Интактные
ГКОП+Т
ГКОП
ГКОП
мкг/г
мкг/г
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
Интактные
ГКОП+Т
ГКОП
*
Интактные
ГКОП+Т
ГКОП
ГКОП+Т
ГКОП
Интактные
ГКОП+Т
ГКОП
Интактные
Интактные
Тонк.к.
Тонк.к.
экспериментальных групп
60
50
40
30
20
10
0
300
200
Почка
Почка
Содержание
экспериментальных групп
500
400
ДОТК
Интактные
ДОТК
Fe в тканях животных разных
100
0
ГКОП+Т
ГКОП
Интактные
ГКОП+Т
ГКОП
Интактные
ГКОП+Т
Тонк.к.
Интактные
Содержание
ГКОП
Интактные
ГКОП+Т
Почка
0
ГКОП+Т
ДОТК
ГКОП
Интактные
ГКОП+Т
ГКОП
50
Интактные
мкг/г
экспериментальных групп
мкг/г
Zn в тканях животных разных
Позв.
Количество Fe в почке, тонком кишечнике и позвонке у больных животных ниже, чем у интактных, а у
леченых близко к интактным Количество Se и Cu в почке имеет такой же характер изменений 13
Уровень
Zn в толстом кишечнике и позвонке у больных животных ниже.
Изменение содержания Zn, K, и Se в течение шести
месяцев в ногтях рук трех человек
200
концентрация(м
кг/г)
d-1
Zn
180
d-2
d-3
160
140
120
100
80
60
окт
нояб
дек
янв
февр
март
окт
нояб
дек
янв
февр
март
3560
K
ко
н
ц
ен
тр
ац
и
я(м
кг/г)
3060
d-1
d-2
d-3
2560
2060
1560
1060
560
60
окт
нояб
дек
янв
февр
март
2.0
нояб
дек
Se
1.8
концентрация(м
кг/г)
окт
янв
d-1
февр
d-2
март
d-3
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
окт
нояб
дек
янв
февр
март
окт
нояб
дек
янв
февр
14
март
Институт Региональной патологии и патоморфологии СО РАМН
Содержание химических элементов в пункции
печени человека (mобразца ≈ 0.5 мг)
12000
10000
150
C, ppm
C, ppm
8000
6000
4000
100
50,1
2000
0
LIV., ppm
0,1
P
S
Cl
K
Ca
Mn
Ni
Cu
Zn
2,4
2,4
17
St.BL-1577 10,2
0,2
190
Fe
7300230014003100 740 290
ST.BL-1577 1120750026609700 121 263
LIV., ppm
As
Se
Br
Rb
Sr
Mo
130 0,17
1,2
25
17
0,9
1,5
131
1,1
9
18
0,2
3,2
0,1
15
Институт патологии кровообращения им. Е.N.Мешалкина ФГУ
Химические элементы находятся в динамическом равновесии, как с
функциональной активностью организма, так и с окружающей средой. Важно
знать, как и в каких количествах распределяются химические элементы в
миокарде и сосудистой системе. Имеются единичные работы по
распределению химических элементов в разных отделах сердца, выполняющих
разную функциональную нагрузку.
Пробоподготовка:
Приготовление тонких срезов миокарда (сырая ткань).
Высушивание, без нагревания (в течение суток)
с одновременным выдерживанием под прессом.
Взвешивание сухого фрагмента ткани.
Упаковка образцов в майларовые пленки ( толщина 2,5 мкм).
Масса образцов составляла от 9 до 1мг (сырая ткань).
После этапа пробоподготовки – от 5 to 0.5 mg (сухой вес).
Патологии:
Материал:
Патоанатомический -аутопсия
Биопсийный
Операционный
• ишемическая болезнь сердца
• приобретенные пороки сердца
• сосудистая патология (аневризма аорты,
расслоение
аорты)
• кардиомиопатия (трансплантация
сердца)
16
Отбор образцов
• миокард 4-х отделов
сердца (ПЖ, ЛЖ, ПП,
ЛП)
• клапаны сердца
• магистральные
сосуды (аорта, легочная
артерия)
• периферические
сосуды (вены, артерии)
• атеросклеротические
бляшки
17
Оценка воспроизводимости результатов анализа
(на примере образца ткани миокарда (5 мг) гипертрофированного
левого желудочка сердца человека (ишемия))
Приведены результаты лишь для образца ткани миокарда гипертрофироанного левого желудочка сердца
человека, так как именно образцы такого рода (из всех исследуемых) дают наибольшие значения
вариабельности среднего значения концентраций химических элементов, что, вероятно, связано с
18
неоднородностью их распределения в ткани.
Распределения химических элементов по различным участкам
миокарда, ИБС
K
Fe
ЛП
2000
1500
ПП
1000
400
500
200
0
0
ПЖ
ИМ ЛЖ
М ЖП
ПЖ
Mn
1.4
ПП
0.8
ПП
0.6
М ЖП
Sr
6
ПП
ЛЖ
ИМ ЛЖ
рубец ЛЖ
ПЖ
ЛЖ
4
2
0
ИМ ЛЖ
М ЖП
рубец ЛЖ
ЛП
8
0
0
М ЖП
ИМ ЛЖ
0.5
0.2
ПЖ
ПЖ
1
0.4
ЛЖ
0
рубец ЛЖ
1.5
100
50
2
ЛЖ
ЛП
150
ПП
ЛП
2.5
1.2
1
ЛЖ
ИМ ЛЖ
М ЖП
рубец ЛЖ
ЛП
Rb
600
ПП
ЛЖ
Zn
ЛП
800
рубец ЛЖ
ПЖ
ИМ ЛЖ
М ЖП
рубец ЛЖ
Для K и Rb мак. содержания (напр., ЛЖ) приходятся на мин. Zn (напр., ЛЖ) и наоборот. Недостаток Zn может
активизировать механизм физиологической защиты - активация Na+-K+(Rb+).В экспериментах, проведенных на крыс
было показано, что при недостатке кислорода увеличивается потребление Rb . Распределение каждого элемента по
19
отделам различно. K, Fe, Zn, Mn, Cr и Rb – носит более ярко выраженный неравномерный характер. Максимум
содержания Fe и Mn отмечается в межжелудочковой перегородке.
20
Содержание микроэлементов в миокарде левого желудочка (ишемическая
болезнь сердца) по сравнению с нормой (определялось 18 хим.элементов,
59 проб, снято и обработано ̴более 800 спектров)
Процент от нормы, %
400
300
200
норма
100
0
Se
K
Rb
Mn
Cu
Fe
Sr
Cr
Ca
По степени отклонения от нормы в миокарде ЛЖ больных ИБС можно выделить три группы МЭ. В I
гр. МЭ, содержание которых достоверно снижено по сравнению с нормой (Se, Rb, K). Вторую (II) гр.
составили МЭ, содержание которых было близко к норме (Mn, Cu). Третья (III) группа – МЭ,
21
содержание которых в миокарде было умеренно повышенным (Sr, Cr, Fe, Ca).
22
Здоровые дети (n=5) и дети с врожденным пороком сердца (ТМС) (n=20)
Cu
Zn
Se
Br
Rb
Sr
23
Сравнение элементного состава биопротезов с собственными клапанами
пациента
биопротез
собственный клапан
100
10
1
0,1
Cr
Ni
Se
Br
Rb
Данная патология характеризуется нарушением структуры клапанов сердца, которые могут
срастаться или не смыкаться. Хирургическая коррекция заключается в замене клапана. В данных
случаях используются биопротезы, которые являются недолговечными. На данном слайде показаны
отличия биопротеза от собственного клапана. Возможно, эти различия будут учтены при
24
производстве биопротезов.
Роль химических элементов в формировании аневризмы аорты
(биопсия)
600
* - достоверные различия с аортой
аорта
аневризма
*
к онцен трация Х Э, у.е.
500
*
400
*
*
300
200
*
100
*
*
*
0
V
Ni Cr Sr Fe Mn Ca Co Zn Cu
S
Cl Br Se As
K
Rb
25
Нормированные концентрации химических элементов в стенке
аорты при ее различных патологических состояниях.
* – достоверные различия с аортой без аневризмы.
нормализованные концентрации
800
аорта
аневризма
расслоение
*
700
600
*
500
*
*
400
*
*
*
300
200
100
*
*
*
0
V
Ni
Cr
Sr
Fe
Mn
Ca
Co
Zn
Cu
S
Cl
Br
Se
As
K
Rb
Патология аорты выражается в нарушении структуры ее стенки. Аорта расширяется (аневризма) и в
итоге расслаивается, что приводит к разрыву аорты и мгновенной смерти. Диагностика степени
расширения аорты необходима для кардиохирургической операции. На данном слайде видно, что при
формировании аневризмы и расслоении аорты содержание одних ХЭ достоверно ниже по сравнению
с неизмененной аортой, а других повышено. Дисбаланс в содержании ХЭ обусловлен развитием
26
дисплазии соединительной ткани
Человек
Исследовано 60 проб биопсийного материала
Собственное
сердце
реципиента
(аутопсия)
Донорское сердце
(биопсия,
аутопсия)
дилатационная
кардиомиопатия
27
Сердце, патология --дилатационная
кардиомиопатия (биопсия)
масса образца 0.5 мг
28
Процентные соотношения химических элементов в миокарде у
пациентов с кардиомиопатией по сравнению с нормой
300
ЛЖ
Процент от нормы
250
ПрЖ
200
150
100
50
0
Sr
Mn
Ni
Ca
Fe
K
Se
Br
Cr
Cu
Cl
Zn
S
Rb
29
Содержание химических элементов в левом и правом желудочках
сердца больных с ДКМП и в группе сравнения (по данным аутопсии)
30
Биопсия и аутопсия донорского сердца
31
По результатам анализов метод РФА-СИ фрагментов аутопсийного и
биопсийного материала физиологами сделаны следующие выводы:
Дефицит Cu может провоцировать синдром Марфана, формирование аневризмы аорты.
Дефицит Zn приводит к развитию пороков сердца.
Дефицит Se -- возрастает риск развития коронарной болезни, инфаркта миокарда и
кардиомиопатии.
В миокарде больных с ИБС на фоне сниженного содержания К повышено содержание всех
ХЭ, особенно Ca, Fe, Rb.
Повышенное содержание Fe в артериальной стенке может свидетельствовать о начальном
развитии атеросклеротических процессов.
Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) с выраженной гипертрофией миокарда
(пересадка сердца) -- снижено содержание основных ХЭ: K, Ca, Sr, Mn, Fe, Ni, Se по
сравнению с нормой в 2 раза. Единственным возможным маркером патологии ДКМП
является повышенное в 2 раза содержание Rb.
Знание тех или иных нарушений обменных процессов, связанных с макро- и
микроэлементами, позволит восстановить баланс ХЭ и таким образом предупредить
развитие сердечно-сосудистых заболеваний.
32
Благодарю за внимание
33