PDF — 467 Кбайт - ДНК

Новый подход к исследованию биоценоза урогенитального тракта у женщин методом
ПЦР в режиме реального времени.
Болдырева М.Н., д.м.н., в.н.с. ин-та иммунологии ФМБА России,
Тумбинская Л.В., к.б.н., рук. отд. инновационного развития
ЗАО «НПФ ДНК-Технология»,
Донников А.Е. зам. ген. директора по качеству
«Многопрофильная диагностическая лаборатория»
В настоящее время инфекционно-воспалительные заболевания урогенитального
тракта у женщин занимают в структуре акушерско-гинекологической заболеваемости
первое место в мире. Их частота в различных популяциях колеблется от 30 до 80 % (Е. Ф.
Кира, 1994, Коршунов В.М. и соавт. 1999; Mead P.B. et al, 1993).
Заболевания, вызванные условно-патогенной микрофлорой могут протекать как с
клинически выраженной симптоматикой, так и бессимптомно (Кубанова А.А. и соавт.,
1996; Klebanoff M.A. et al, 2004). Бессимптомное течение заболевания в ряде случаев
приводит к развитию серьезных осложнений. Установлено, что урогенитальные
заболевания, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, являются причиной
увеличения риска заболевания инфекциями, передающимися половым путем (сифилис,
трихомониаз, гоноррея, хламидиоз) (Wiesenfeld HC et al, 2003; Brotman RM et al, 2007) и
ВИЧ-инфекцией (Hashemi F.B. et al. 1999; Sewankambo N. et al., 1997).
Несвоевременная диагностика инфекционных заболеваний, вызванных условнопатогенной микрофлорой, может стать причиной нарушения репродуктивной функции
женщины. Так, воспалительные процессы в малом тазу могут нарушать нормальный
транспорт ооцита, и стать причиной трубного бесплодия (Hager W.D., et al. 1983).
Заболевания, вызванные условно-патогенной микрофлорой у матери, могут быть
причиной спонтанных абортов (French J.I. et al., 1999), преждевременных родов (Leitich H.
et al., 2003), а также внутриутробного инфицирования (French J.I. et al., 1999) и задержки
внутриутробного развития плода (Paneth N.S., 1995).
Своевременно не диагностированные заболевания могут стать причиной
осложнений после хирургических вмешательств на органах малого таза (Larsson PG,
Carlsson B., 2002) и постнатальных осложнений матери и ребенка (Paneth N.S., 1995).
Проблема усугубляется отсутствием надежных объективных методов лабораторной
диагностики, доступных практическому здравоохранению, позволяющих на ранних
стадиях, в короткие сроки и до развития осложнений диагностировать такие заболевания.
Учитывая важность и актуальность решения проблемы объективной лабораторной
диагностики урогенитальных инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных
условно-патогенной микрофлорой для репродуктивного здоровья женщин, возникла
настоятельная потребность в разработке и внедрении в практическое здравоохранение
новых диагностических подходов, позволяющих своевременно (до развития осложнений)
диагностировать такие заболевания. Также необходимо определение объема
медикаментозного
вмешательства
и
осуществление
объективного
контроля
эффективности лечения и выздоровления пациенток.
В
настоящее
время
для
диагностики
инфекционно-воспалительных
урогенитальных заболеваний у женщин используют следующие методы клинической и
лабораторной диагностики.
Клиническая диагностика включает выяснение и анализ жалоб, сбор анамнеза и
физикальный осмотр пациента (Бодяжина В.И. и соавт., 1990; Василевская Л.Н. и соавт.,
1985). Результаты клинической диагностики дают возможность только лишь
предположить наличие заболевания, так как инфекции, передающиеся половым путем
(трихомониаз, гонорея, сифилис и хламидиоз) и вызванные условно-патогенной
микрофлорой в подавляющем большинстве случаев не имеют специфических
1
клинических симптомов. Клиническое обследование не позволяет установить
этиологическую природу заболевания, которая выявляется исключительно с помощью
лабораторных методов исследования.
Наиболее частым заболеванием, ассоциированным с нарушением микрофлоры
урогенитального тракта является бактериальный вагиноз. БВ встречается у 24% женщин в
структуре общей гинекологической заболеваемости и у 87,7% больных, обращающихся по
поводу обильных длительных выделений (Кира Е.Ф., 1995).
Под бактериальным вагинозом понимают полимикробный клинический синдром,
характеризующийся специфическими аномалиями вагинальных выделений и нарушением
вагинальной экологии, при котором нормальная флора замещается факультативными и
строго анаэробными микроорганизмами. При этом наблюдается пролиферация условнопатогенной флоры (Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. и др.).
Для упрощения диагностики бактериального вагиноза и повышения ее
достоверности разработано несколько критериев.
Критерии Амсела (Spiegel CA, Amsel R, Holmes KK, 1983) – наиболее быстрый и
распространенный способ диагностики баквагиноза. Наличие трех из четырех признаков
(рН отделяемого влагалища более 4,5; белые гомогенные выделения, покрывающие
слизистую влагалища; положительный аминный тест с КОН и наличие «ключевых
клеток»). Наличие бессимптомных форм бактериального вагиноза в 50% случаев, а также
недостаточно высокая чувствительность критериев Амсела привели к поиску более
чувствительных методов для диагностики бактериального вагиноза.
Широкое распространение получила балловая диагностическая система
Ньюджента (Nugent criteria) (Nugent RP et al, 1991). Эта система основана на подсчете
бактерий в мазке, окрашенном по Граму, определенной морфологии и характере
окрашивания, соответствующих лактобактериям, гарднереллам, бактероидам и
мобилункусу. При наборе от 7 до 10 баллов ставится диагноз бактериальный вагиноз.
Система Ньюджента применяется на Западе наравне с критериями Амсела, тем не менее в
одном многоцентровом исследовании было показано, что у 11% женщин с диагнозом
бактериальный вагиноз по критериям Амсела система Ньюджента не подтверждала
диагноз, а у 30% женщин с бактериальным вагинозом по системе Ньюджента
отсутствовали критерии Амсела (Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М., 2003).
Дискордантность полученных результатов может быть связана с тем, что при
микроскопии можно выявить только те микроорганизмы, которые обладают размерами,
достаточными для визуализации. Многие виды и роды условно-патогенных
микроорганизмов имеют похожие морфотипы, тогда как их патогенные свойства и
чувствительность к антибиотикам могут значительно отличаться. Некоторые бактерии,
например Atopobium vaginae (Ferris MJ et al.2004;), Mycoplasma hominis, т.д., о которых
известно, что они ассоциированы с развитием бактериального вагиноза, не
визуализируются при микроскопии.
Недостатком микроскопического исследования мазков, окрашенных по Граму,
является качественная оценка, ограниченная определением морфотипа без возможности
видовой характеристики микроорганизмов и приблизительная количественная оценка
состава микробиоты. Микроскопия не позволяет идентифицировать ряд этиологически
значимых для развития патологических процессов условно-патогенных возбудителей.
Имеет место субъективизм и зависимость результата исследования от профессиональной
квалификации врача клинической лабораторной диагностики.
Более информативным является способ диагностики урогенитальных заболеваний,
вызванных
условно-патогенной
микрофлорой,
путем
микробиологического
(культурального) исследования (Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985). Этот способ
позволяет установить видовой состав аэробных, факультативно-анаэробных и некоторых
облигатно-анэробных бактерий и тем самым подтвердить принадлежность
2
микроорганизмов к морфотипам, обнаруженным при микроскопии мазков, окрашенных
по Грамму (Анкирская А.С. и соавт., 2001).
Количественная оценка роста микроорганизмов на питательных средах
характеризует их этиологическую значимость у конкретного пациента. Так, например,
установлены критерии нормобиоты урогенитального тракта у женщин при использовании
культуральной диагностики:
1) общая микробная обсемененность – не превышает 106 -108 КОЕ/мл;
2) абсолютно преобладают лактобациллы;
3) условно-патогенные микроорганизмы определяются в низком титре (104
КОЕ/мл) или отсутствуют (Анкирская А.С. и соавт. 2001).
До настоящего времени культуральный метод остается «золотым стандартом»
этиологической лабораторной диагностики любого инфекционного процесса, в том числе
вызванного условно-патогенной микрофлорой.
Однако и культуральный способ диагностики не лишен ряда серьезных
недостатков. Условно-патогенная биота, являющаяся наиболее частой причиной
урогенитальных заболеваний у женщин, представлена, главным образом, анаэробными
микроорганизмами. Для обеспечения анаэробных условий культивирования таких
микроорганизмов требуется специальное оснащение лаборатории дорогостоящим
оборудованием,
специальные
селективные,
питательные
среды
и
высококвалифицированные врачи микробиологи. Подавляющее большинство лечебных
учреждений практического здравоохранения в настоящее время не имеют подобных
условий.
Кроме того, в последние годы молекулярно-биологическими методами был
обнаружен целый ряд новых, этиологически значимых условно-патогенных
микроорганизмов (Atopobium vaginae, Mycoplasma genitalium и др.), которые либо не
поддаются культивированию, либо являются трудно культивируемыми стандартной
техникой (Ferris MJ et al.2004; Zhou X et al, 2004).
Существенными недостатками культурального метода также являются длительные
сроки культивирования микроорганизмов (в среднем 5 дней) и необходимость сохранения
их высокой жизнеспособности до момента поступления биоматериала в лабораторию, что
накладывает дополнительные ограничения на его хранение и транспортировку. В случае
использования сухого тампона для взятия биоматериала, срок транспортировки образца в
лабораторию ограничен часами. При использовании транспортных сред продолжается
размножение микроорганизмов до поступления в лабораторию и возможно изменение их
количественного соотношения. Культуральный метод не дает точной количественной
оценки
и используется только для ориентировочной оценки соотношения
микроорганизмов между собой (приказ №535 от 22.04.85).
Объективные и субъективные ограничения методов лабораторной диагностики,
применяемые сегодня в мировой медицинской практике, приводят к большому количеству
диагностических ошибок: при манифестированном баквагинозе - более чем в 60%, при
кандидозном вульвовагините – до 77%; при микст-инфекции – до 87% (Schwiertz A. et al.
2006). Все это побуждает к поиску новых подходов к оценке микрофлоры
урогенитального тракта.
Достижения молекулярной биологии, связанные с разработкой метода
полимеразной цепной реакции (ПЦР), предоставили новые возможности в изучении
микробного состава различных биотопов человека. В последние годы ПЦР широко
используется в лабораторной практике для качественной идентификации инфекций,
передающихся половым путем, таких как трихомониаз, гонорея, ВИЧ инфекция и т.д.
Преимуществом этого метода является то, что он имеет высокую специфичность и
чувствительность, универсален для диагностики любых микроорганизмов и поэтому
лишен недостатков, связанных с высокими требованиями ряда микроорганизмов к
3
условиям культивирования. К достоинствам метода следует отнести также возможность
тестирования большого количества любых клинических образцов.
На сегодняшний день метод ПЦР широко используется в российской лабораторной
практике, в том числе и для идентификации условно-патогенной микробиоты
урогенитального тракта – Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis,
Ureaplasma urealiticum, Ureaplasma parvum и т.д. Однако «классическая» ПЦР с
регистрацией результата по окончании реакции не предполагает количественной
характеристики микроорганизмов, что не позволяет врачу клиницисту оценить состояние
биоценоза в целом.
Нормофлора урогенитального тракта характеризуется большим количеством
разнообразных микроорганизмов.
Очень редкие из них действительно вызывают
заболевание. К патогенным микроорганизмам, при выявлении которых обязательно
назначается этиотропная терапия, относят такие как Treponema pallidum, Neisseria
gonorrhoeae, Haemophilus ducrei, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, а также
простейшее Trichomonas vaginalis. Существует большая группа условно патогенных
микроорганизмов, которые могут вызывать заболевание при определенных условиях —
это микоплазмы (Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans), уреаплазмы (Ureaplasma
urealyticum, Ureaplasma parvum), энтерококки, энтеробактерии, стафилококки,
стрептококки, гарднереллы (Gardnerella vaginalis), дрожжеподобные грибы (Candida spp.).
Эти же микроорганизмы могут входить в состав нормального физиологического
микробиоценоза гениталий (Савичева А.М., 2008).
Дисбиотические процессы характеризуются нарушением количественных
соотношений нормо- и условно-патогенной микрофлоры при большом видовом
разнообразии последней. Поэтому качественная оценка условно-патогенной микрофлоры,
не позволяет определить этиологическое значение тех или иных микроорганизмов в
развитии дисбиотических нарушений, что, в свою очередь, может привести к
диагностическим ошибкам и назначению неадекватной терапии, которая, в ряде случаев,
лишь усугубляет течение заболевания.
Успех лечения бактериального вагиноза зависит от правильности выбранной
тактики для каждой конкретной пациентки. А это неизбежно влечет за собой
количественную оценку условно-патогенной микрофлоры урогенитального тракта в
соотношении с количеством нормальной флоры. Это является принципиальным моментом
для понимания этиологии возникшего дисбаланса.
Компания «НПО ДНК-Технология» предлагает новый подход к исследованию
условно-патогенной флоры, основанный на комплексной оценке основных групп
микроорганизмов, формирующих урогенитальный биоценоз, методом ПЦР в режиме
реального времени. Предлагаемый подход дает возможность количественно исследовать
нормофлору, наличие, степень и характер дисбаланса условно-патогенной и
нормальной флоры, что позволяет в случае необходимости выбрать правильную терапию
и контролировать эффективность её проведения.
Для этого разработаны и предлагаются клинико-диагностическим лабораториям
наборы реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом
ПЦР в режиме реального времени Фемофлор 16, Фемофлор 8 и Фемофлор 4 (см. табл.1).
4
Таблица 1. Состав комплектов реагентов Фемофлор.
Группа
Контроль
Диагностика
нормоценоза
Аэробные
микроорганизмы
(факультативные
анаэробы)
Анаэробные
микроорганизмы
(строгие анаэробы)
Специфические компоненты
комплекта реагентов
Фемофлор 4
Enterobacterium spp.
Streptococcus spp.
√
√
√
√
Eubacterium spp.
Sneathia spp./Leptotrihia
spp./Fusobacterium spp.
Megasphaera spp./Veilonella
spp./Dialister spp.
√
√
Грибы
Atopobium vaginae
Mycoplasma (hominis +genitalium )
Ureaplasma (urealyticum + parvum)
Candida spp.
√
√
√
Lachnobacterium spp./ Clostridium spp.
Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
Peptostreptococcus spp.
Группа
Микоплазм
Фемофлор 16
√
√
√
√
√
Staphylococcus spp.
Gardnerella vaginalis/Prevotella
bivia/Porphyromonas spp.
√
√
√
√
Фемофлор 8
√
√
√
√
√
Положительный контроль
Контроль взятия материала
общая бактериальная масса
нормофлора – Lactobacillus spp. /ВК
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
Из одной биопробы методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального
времени выполняется количественная оценка общей бактериальной массы,
урогенитальной нормофлоры (лактобациллы) и комплекса аэробных и анаэробных
микроорганизмов, микоплазм, грибов рода Candida, участвующих в развитии
дисбиотических процессов в урогенитальном биоценозе.
 Сравнение количества лактобацилл с общей бактериальной массой
позволяет исследовать состояние нормофлоры.
 Сравнение количеств представителей условно-патогенной биоты с
количеством лактобацилл позволяет определять этиологическую
значимость тех или иных микроорганизмов в развитии дисбиоза и степень
его выраженности.
 Количественное определение геномной ДНК эпителиальных клеток
человека, попадающих в биопробу при правильном взятии материала,
обеспечивает контроль качества преаналитического этапа, исключает
получение ложноотрицательных результатов исследования.
 Использование предлагаемого способа диагностики не только дает
возможность
врачу-клиницисту
определять
объем
необходимого
вмешательства,
но
и
позволяет
определить
этиологическую
направленность терапии.
 Индивидуальный подход к терапии позволит уменьшить число побочных
эффектов для пациентов в результате избыточного приема лекарственных
препаратов.
 Впервые можно выполнять мониторинг действия лекарственных
средств на микробиоту, включая оценку эффективности лечения и
восстановления нормоценоза.
5

Программное обеспечение, разработанное для амплификатора ДТ-96,
позволяет настроить параметры интерпретации результатов, согласно
критериям, принятым в каждой конкретной лаборатории.
Для получения корректных результатов большое значение имеет качество взятия
образца биоматериала для исследования, его хранение, транспортировка и
предварительная обработка. Для этого в системе предусмотрена возможность анализа
контроля взятия материала. Данный показатель служит для контроля правильности взятия
материала врачом-клиницистом и позволяет отличать случаи биоценозов со сниженной
бактериальной массой, от случаев некорректного взятия материала.
Рис.1. Результат исследования биоценоза урогенитального тракта (набор реагентов
комплектация Фемофлор 16), полученный при работе с амплификатором ДТ-96.
Определение этиологической структуры дисбаланса необходимо для решения
вопросов, связанных с терапией. Дисбаланс между нормальной и условно патогенной
флорой, в зависимости от этиологической причины, может быть анаэробными, аэробными
и смешанными. Инфекционный процесс, вызванный грибами рода Candida, может
протекать без дисбиотических нарушений со стороны условно-патогенной флоры, а также
может сочетаться с дисбиозом.
Предлагаемый подход к исследованию состояния урогенитального биоценоза у
женщин показан для:
- оценки качественного и количественного состава микроорганизмов, образующих
биоценоз урогенитального тракта;
- определения этиологической причины инфекционного процесса, что делает
возможным осуществление направленной этиологической терапии;
- определения степени выраженности дисбиотических нарушений, в результате
чего становится возможной индивидуализация объема терапии;
- осуществления мониторинга эффективности проводимой терапии и оценки
результатов лечения;
- мониторинг восстановления нормальной микрофлоры;
- контроль проведения гормонозаместительной терапии при менопаузе.
6
Таким образом, впервые предложено объективное исследование, позволяющее
наиболее полно и точно охарактеризовать качественный и количественный состав
биоценоза урогенитального тракта у женщин. В рамках данного исследования возможно
выявление 23 групп микроорганизмов (факультативных и облигатных анаэробов,
микроаэрофилов, микоплазм и грибов). Для проведения этого анализа разработано
русскоязычное программное обеспечение для детектирующего амплификатора ДТ-96,
позволяющее автоматически анализировать полученные данные и выдавать заключение в
удобном для интерпретации виде. Данный метод пригоден как для повседневной
лабораторной диагностики, так и в качестве чувствительного и высокоспецифичного
инструмента для научных исследований.
В дополнение к настоящему методу, который позволяет определить
этиологическую причину инфекционного процесса вызванного условно-патогенной
биотой, рекомендуется:
- использование метода световой микроскопии для лабораторного подтверждения
местной воспалительной реакции,
- качественное ПЦР исследование возбудителей урогенитальных инфекций,
передаваемых половым путем - Chlamidia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas
vaginalis и др.
Список использованной литературы:
1. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики
оппортунистических инфекций влагалища. Клиническая микробиология и
антимикробная химиотерпия., 2001, т.3, №2, с.190-194.
2. Бодяжина В.И., Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология:
Руководство для врачей. – М.: Медицина, 1990. – 540с.
3. Василевская Л.Н., Грищенко В.И., Кобзева Н.В., Юровская В.П. Гинекология:
учебник, - М., Медицина, 1985.
4. Кира Е.Ф. 1994. Клиника и диагностика бактериального вагиноза // Акушерство и
гинекология, № 2, С. 32-35.
5. Кира Е. Ф. Бактериальный вагиноз (клиника, диагностика, лечение) // Автореферат
дисс. докт. мед. наук.- Санкт-Петербург, 1995.
6. Коршунов В. М., Володин Н. Н., Ефимов Б. А., Саркисов С. Э. и др.
Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных
дисбактериозах, Москва. – 1999. – 80с.
7. Кубанова А. А., Аковбян В. А., Федоров С. М., Бакалова Л. А., Халатов А. О.
Состояние проблемы бактериального вагиноза // Вестник дермат. и венерол.—
1996.— № 3.— С. 22–26.
8. Методическиe указания МУ 1.3.1888-04. Организация работы при исследованиях
методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими
агентами III-IV групп патогенности, Москва. – 2004.
9. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования,
применяемых
в
клинико-диагностических
лабораториях
лечебнопрофилактических учреждений. Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985.
10. Савичева А.М., Лабораторная диагностика и терапия репродуктивно значимых
инфекций // Лечащий врач. – 2008. - № 3.
11. Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М.. Применение влагалищных свечей Нео-Пенотран
для проведения деконтаминации влагалища перед плановой беременностью //
Русский медицинский журнал. - 2003. - Том 11,N 16 . - С. 935-937.
12. Brotman RM, Erbelding EJ, Jamshidi RM, et al. Findings associated with recurrence of
bacterial vaginosis among adolescents attending sexually transmitted diseases clinics. J
Pediatr Adolesc Gynecol. 2007 Aug;20(4):225-31.
7
13. Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE. et al. Association of Atopobium vaginae, a recently
described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis.
2004 Feb 13;4:5.
14. French JI, McGregor JA, Draper D et al. Gestational bleeding, bacterial vaginosis, and
common reproductive tract infections: risk for preterm birth and benefit of treatment.
Obstet Gynecol. 1999 May;93(5 Pt 1):715-24.
15. Hager WD, McDaniel PS Treatment of serious obstetric and gynecologic infections with
cefoxitin. J Reprod Med. 1983 May;28(5):337-40.
16. Hashemi FB, Ghassemi M, Roebuck KA, Spear GT Activation of human
immunodeficiency virus type 1 expression by Gardnerella vaginalis. J Infect Dis. 1999
Apr;179(4):924-30.
17. Klebanoff M.A., Schwebke JR, Zhang J et al. Vulvovaginal symptoms in women with
bacterial vaginosis. Obstet Gynecol, 2004; 104:267-272.
18. Larsson PG, Carlsson B. Does pre- and postoperative metronidazole treatment lower
vaginal cuff infection rate after abdominal hysterectomy among women with bacterial
vaginosis? Infect Dis Obstet Gynecol. 2002;10(3):133-40.
19. Leitich H, Bodner-Adler B, Brunbauer M, Kaider A, Egarter C, Husslein P. Bacterial
vaginosis as a risk factor for preterm delivery: a meta-analysis. Am J Obstet Gynecol.
2003 Jul;189(1):139-47.
20. Mead P. B. Epidemiology of bacterial vaginosis // Am. J. Obstet. Gynecol.- 1993.Vol.169, N.2, pt.2. – P.446-449.
21. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is
improved by a standardized method of gram stain interpretation. J Clin Microbiol. 1991
Feb;29(2):297-301.
22. Paneth NS.The problem of low birth weight.. Future Child. 1995 Spring;5(1):19-34.
23. Schwiertz A, Taras D, Rusch K, Rusch V. Throwing the dice for the diagnosis of vaginal
complaints? Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2006 Feb 17;5:4, 1-7.
24. Sewankambo N, Gray RH, Wawer MJ et al,.HIV-1 infection associated with abnormal
vaginal flora morphology and bacterial vaginosis. Lancet. 1997 Aug 23;350(9077):54650.
25. Spiegel CA, Amsel R, Holmes KK: Diagnosis of bacterial vaginosis by direct gram stain
of vaginal fluid. J Clin Microbiol 1983, 18:170-7.
26. Wiesenfeld HC.;Hillier, Sharon L.;et al. Bacterial vaginosis is a strong predictor of
Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clin Infect Dis. 2003 Mar
1;36(5):663–66
27. Zhou X, Bent SJ, Schneider MG et aal Characterization of vaginal microbial
communities in adult healthy women using cultivation-independent methods.
Microbiology. 2004 Aug;150(Pt 8):2565-73.
8