Коксаки-аденовирусный рецептор и показатели воспаления у
advertisement
Институт клинической кардиологии имени А.Л. Мясникова ФГБУ «Российский кардиологический научно- производственный комплекс" Министерства здравоохранения РФ На правах рукописи Гупало Елена Михайловна Коксаки-аденовирусный рецептор и показатели воспаления у больных с нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии сердечнососудистой системы 14.01.05 - кардиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Руководитель отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма и проводимости сердца НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ РКНПК д.м.н., профессор Голицын Сергей Павлович Научный консультант: В.н.с. лаборатории клеточной адгезии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК д.б.н. Бурячковская Людмила Ивановна Москва 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 ВВЕДЕНИЕ 9 Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17 1.2 Современные взгляды на этиологию нарушений проводимости сердца. Значение аутоиммунных механизмов в 17 развитии нарушений проводимости сердца 1.2 Возможности использования периферических цитокинов в 25 выявлении миокардиального воспаления. Участие цитокинов в патологическом ремоделировании миокарда 1.3 Эндомиокардиальная биопсия в диагностике воспаления в 30 миокарде. Показания и ограничения 1.4 Применение магнитно-резонансной томографии как 33 неинвазивного метода диагностики воспалительных поражений миокарда 1.5 Коксаки-аденовирусный рецептор как фактор патогенеза воспалительных заболеваний миокарда и 37 нарушений проводимости сердца 1.6 Заключение 45 Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47 2.1 Структура исследования 47 2.2 Характеристика групп обследованных больных 48 2.3 Специальные методы обследования 54 2.3.1 Определение уровня цитокинов в сыворотке крови 54 2.3.2 Методика определения аутоантител к β1-адренорецептору 54 и М2-холинорецептору 2.3.3 Методика вирусологических проведения эндомиокардиальной исследований и биопсии, 56 иммуногистохимической 2 окраски полученных биоптатов с последующим количественным анализом полученных препаратов 2.3.4 Методика проведения МРТ сердца с внутривенным 61 контрастированием гадолинием 2.3.5 Методика иммунофлуоресцентной окраски тромбоцитов на 65 КАР 2.4 Методы статистической обработки результатов исследований 66 Глава III. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 68 3.1 Данные магнитно-резонансной томографии (МРТ) сердца у 68 больных групп «блокады» и «КМП» 3.2 Исследование периферических маркеров воспаления 3.3.Исследование аутоантител к антигенным 73 детерминантам, 76 моделирующих различные участки β1-адренорецепторов и М2холинорецепторов у пациентов групп «КМП», «блокады» и среди здоровых добровольцев 3.4 Результаты иммуногистохимического и вирусологического 78 исследования эндомиокардильных биоптатов пациентов группы «КМП» 3.5 Исследование экспрессии Коксаки-аденовирусного рецептора 84 (КАР) в образцах ЭМБ больных группы «КМП» 3.6 Исследование экспрессии Коксаки-аденовирусного рецептора 87 (КАР) на тромбоцитах больных исследуемых групп, а также здоровых добровольцев 3.7 Оценка значимости очагового и интерстициального фиброза в 92 развитии нарушений ритма и проводимости у больных групп «КМП» и «блокады» 3.8 Определение значимости воспалительного компонента в 99 формировании нарушений ВЖ проводимости у пациентов группы «КМП», а также ВЖ и АВ проводимости у пациентов 3 группы «блокады» 3.9 Определение наиболее диагностически ценных показателей для 102 выявления признаков субклинического воспаления у больных с нарушениями проводимости группы «блокады» Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ 107 ВЫВОДЫ 128 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 130 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CD19+ - В-лимфоциты CD3+ - Т-лимфоциты CD4+ - Т-хелперы CD8+ - Т-цитотоксические CD68+ - макрофаги CD45RO - Т-лимфоциты активированные IgG – иммуноглобулин G IgM – иммуноглобулин M pvB19 – парвовирус Б19 АВ-блокада - атриовентрикулярная блокада АД – артериальное давление АДПЖ – аритмогенная дисплазия правого желудочка БЛНПГ – блокада левой ножки пучка Гиса БПНПГ – блокада правой ножки пучка Гиса БСА – бычий сывороточный альбумин ВГЧ6 – вирус герпеса человека 6 типа ВЖ-блокада – внутрижелудочковая блокада ВКМ – внутриклеточный матрикс ВПГ1-2 – вирус простого герпеса 1-2 типа ВСС - внезапная сердечная смерть 5 ВЭБ – вирус Эпштейна-Барр ГБ – гипертоническая болезнь ГКМП – гипертрофическая кардиомиопатия ДАБ – диаминобензидин ДКМП – дилатационная кардиомиопатия ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЖТ – желудочковая тахикардия ЖЭ – желудочковая экстрасистолия ИБС – ишемическая болезнь сердца КМП - кардиомиопатия НРС - нарушения ритма сердца ИЛ- (1-18)- интерлейкин (1-18) КАР – коксаки-аденовирусный рецептор КДО ЛЖ – конечно-диастолический объем КДР ЛЖ - конечный диастолический размер левого желудочка КСО ЛЖ – конечно-систолический объем КСР ЛЖ - конечный систолический размер левого желудочка ЛП - левое предсердие ЛЖ – левый желудочек ПЖ – правый желудочек МРТ сердца - магнитно-резонансная томография сердца 6 ОТП – обогащенная тромбоцитами плазма ПК – позднее контрастирование ПСС – проводящая система сердца ПЦР – полимеразная цепная реакция РК – раннее контрастирование РНК – рибонуклеиновая кислота СДЛА – систолической давление легочной артерии СН – сердечная недостаточность ТЗСЛЖ – толщина задней стенки левого желудочка ТМЖП – толщина межжелудочковой перегородки ТТГ – тиреотропный гормон Т4 – тироксин общий ТРФ-β1 – трансформирующий ростовой фактор-β1 ФБ – фосфатный буфер ФВ ЛЖ – фракция выброса левого желудочка ФК – функциональный класс ФЖ – фибрилляция желудочка ФНОα – фактор некроза опухоли ХМ-ЭКГ - холтеровское мониторирование ЭКГ УО – ударный объем ЧСС - частота сердечных сокращений 7 ЧСС макс - максимальная частота сердечных сокращений ЧСС мин - минимальная частота сердечных сокращений ЧСС ср - средняя частота сердечных сокращений ЭМБ – эндомиокардиальная биопсия ЭХО-КГ - эхокардиографическое исследование 8 ВВЕДЕНИЕ Нарушения ритма и проводимости сердца (НРС) являются одной из причин заболеваемости и смертности в развитых странах. У значительного количества больных причина нарушений ритма и проводимости остается неясной. В таких случаях аритмии принято называть «идиопатическими». Очевидно, что неустановленная причина аритмии грозит как отсутствием или неполным эффектом от медикаментозного лечения, так и рецидивом после интервенционного воздействия. Нельзя сказать, что такие нарушения ритма и проводимости сердца не привлекают к себе внимание. Интенсивно изучается связь «идиопатических» аритмий с воспалением. Еще в конце XX века было высказано предположение о возможном подобных больных, который «латентном» миокардите потенциально способен участвовать у в формировании условий возникновения электрофизиологических механизмов развития НРС, в том числе фатальных желудочковых аритмий [Lecomte D. и соавт. 1993]. Эти выводы были сделаны на основании гистологического анализа миокарда подобных больных, в результате которого в ряде случаев обнаруживались признаки, характерные для воспаления [Strain и соавт. 1983, Sugrue D. и соавт 1984]. Одной из причин идиопатических НРС могут быть аутоиммунные факторы, связанные с латентным воспалительным процессом. Его следствием может являться как прямое изменение электрофизиологических свойств кардиомиоцитов, способствующее интерстициального так и формированию отека миокардиальное повреждение, проаритмогенного миокарда. В отделе субстрата, клинической электрофизиологии ИКК им. А.Л.Мясникова ФГУ РКНПК в течение ряда лет проводились работы по изучению иммунного статуса у больных идиопатическими нарушениями ритма сердца [Д.С. Грачева 2002г., Т.Я. Антидзе 2003 г., Н.В. Лоладзе 2004, М.С. Бекбосынова и др. 2007г.]. Кроме того, были разработаны высокочувствительные диагностические системы для 9 детекции аутоантител к β1-адренорецептору и М2-холинорецептору. В основе этих систем использованы синтезированные в лаборатории синтеза пептидов Института руководством экспериментальной Беспаловой моделирующие различные Ж.Д кардиологии полипептидные участки РКНПК под последовательности, β1-адренорецептора и М2- холинорецептора. Кроме того, для получения искусственного антигена, наиболее близко повторяющего пространственную структуру 2-й внеклеточной петли β1-адренорецептора, в лаб. Р.Ш. Бибилашвили, была рассчитана структура полипептида β25. Используя синтезированные полипептиды, в лаборатории иммунохимии, под руководством Ефремова Е.Е. созданы методики выявления аутоантител в сыворотке больных. Полученные диагностические системы позволили установить, что у 25% пациентов с идиопатическими желудочковыми аритмиями диагностировано повышение уровня антител к синтезированным пептидным последовательностям, моделирующим различные холинорецепторов, участки превышающие β1-адренорецепторов референсные значения, и а М2также обнаружена прямая связь между повышением уровня антител к β1адренорецепторам и выраженностью количественных проявлений желудочковых нарушений ритма сердца (желудочковой экстрасистолией) [Рогова М.М. 2013]. В ходе этой работы было показано, что больные, отличающиеся от здоровых лиц только наличием нарушений ритма сердца, имеют патологические показатели иммунограммы крови. Однако отдельные показатели клеточного и/или гуморального иммунитета только частично характеризуют особенности иммунологического «фенотипа» больных с идиопатическими аритмиями. Хорошо известно, что поражаться в ходе воспаления может не только рабочий миокард, но ткань проводящей системы сердца с развитием нарушений проводимости сердца. Однако участию воспалительных процессов в формировании идиопатических нарушений проводимости сердца 10 посвящено гораздо меньше внимания. Связано это в первую очередь с отсутствием полноценных периферических маркеров, способных отражать воспаление в тканях сердца. Золотым стандартом диагностики воспалительных поражений миокарда на сегодняшний день является эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) с последующим гистологический анализом, дополненным иммуногистохимическими критериями. Однако изза потенциального риска осложнений, в том числе жизнеугрожающих, применение ЭМБ ограничено рядом клинических ситуаций, характерных, скорее, для фульминантных форм воспалительных поражений миокарда [Cooper L и соавт. 2007] . В связи с этим весьма актуальным является поиск дополнительных неинвазивных методов диагностики, способных выявлять признаки латентного миокардиального воспаления, проявляющегося нарушениями проводимости сердца. Хорошо стандартизованным методом, направленным на диагностику миокардита, является МРТ сердца с контрастированием. Именно с его помощью в отдельных случаях изолированных нарушений проводимости сердца удается установить их истинную причину, которой зачастую бывает миокардит [Mahmod M. и соавт. 2012, Prochnau, D. и соавт. 2012], однако, больших исследований, посвященных значимости этого метода у подобной группы больных не проводилось. Введение в стандарт исследования эндомиокардиальных биоптатов молекулярно-генетических методов, таких, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволило верифицировать потенциальных возбудителей миокардитов, которыми в большинстве случаев являются вирусы. На сегодняшний день наиболее часто в эндомиокардиальных биоптатах обнаруживают парвовирус В19 (pVB19) и вирус герпеса 6 типа (ВГЧ 6) [Maisch B. и соавт., 2012]. Однако с учетом широкой распространенности этих вирусов в популяции остается неясным вопрос об их роли в этиологии и патогенезе воспалительных заболеваний миокарда. Cреди вирусов11 возбудителей миокардитов наиболее изучены аденовирусы и вирусы Коксаки [9], путь проникновения которых в клетки опосредован специальным белком, Коксаки-аденовирусным рецептором (КАР). В миокарде КАР, белок плотных контактов, локализован преимущественно на мембранах клеток проводящей системы, а также на вставочных дисках [Bergelson J. и соавт 1997, Lim B. и соавт. 2008]. Именно на вставочных дисках расположено множество межклеточных контактов, осуществляющих электромеханическое сопряжение в сокращающемся сердце. Однако помимо физиологической роли в формировании межклеточных контактов, было доказано, что КАР принимает участие в развитии Коксаки В3 индуцированного миокардита, приводящего к кардиомиопатии [Knowlton K. 2008]. Более того, неопровержимые данные свидетельствуют об участии КАР и в АВ проведении [Lim X. и соавт. 2008, Lim B. и соавт. 2008]. Расположение этого белка в структурах проводящей системы и участие в воспалительном поражении сердца позволяет предположить, что он играет роль в развитии нарушений проводимости воспалительной этиологии. Вне зависимости от причины, патофизиологической основой воспалительных изменений является инфильтрация миокарда клетками иммунной системы, которые активно секретируют различные цитокины: фактор некроза опухоли - (ФНОα), интерлейкин-1β (ИЛ-1β), ИЛ-6, трансформирующий ростовой фактор – (ТРФ-β1) и многие другие биологически активные вещества. Под влиянием медиаторов воспаления развивается отек в очаге воспаления, происходит значительное изменение свойств кардиомиоцитов. Часть клеток некротизируется, их место вследствие активации механизмов репарации ткани замещается соединительной тканью, развивается фиброзирование. Появление в сердце участков, отличающихся клеточным составом и электрофизиологическими свойствами от остального миокарда, может приводить к возникновению НРС. Одновременно те же патогенетические механизмы воспаления могут служить основой для 12 патологического ремоделирования миокарда, что позволяет ряду авторов сделать вывод о том, что идиопатические нарушения ритма и проводимости сердца могут быть ранней манифестацией единого патологического процесса в сердце, ведущего к развитию миокардита и дилатационной кардиомиопатии [Chiale P 1995, 2001]. Анализ латентного публикаций, посвященных воспалительного поражения возможностям в миокарде у диагностики больных с нарушениями проводимости сердца, показал, что поиск периферических маркеров не дал результатов. В то же время, неустановленная вовремя причина нарушений проводимости грозит необратимым прогрессированием патологического процесса в миокарде и развитием более тяжелых сердечных заболеваний с развернутой клинической картиной. В этой связи сохраняется необходимость выявления дополнительных периферических маркеров латентного воспалительного процесса у больных с идиопатическими нарушениями проводимости сердца, а также оценки возможности использования уже имеющихся методов диагностики. 13 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучить экспрессию коксаки-аденовирусного рецептора и диагностические возможности показателей воспаления у больных с нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии сердечно-сосудистой системы. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Определить уровни кардиомиоцитов аутоантител (β1-адренорецептору к мембранным и рецепторам М2-холинорецептору) и цитокинов (ФНОα, ТРФβ1 и ИЛ-6) у больных с нарушениями проводимости сердца без органического процесса в миокарде. 2. Изучить в сравнении экспрессию коксаки-аденовирусного рецептора на тромбоцитах у лиц с нарушениями проводимости без органического поражения сердца и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии. 3. Проанализировать взаимосвязь между признаками воспаления в миокарде (по данным ЭМБ), вирусной персистенцией и экспрессией КАР у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии. 4. Оценить возможность МРТ в выявлении воспаления миокарда у больных с нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии сердца и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии. 5. Дать оценку выраженности фиброза миокарда по данным МРТ у больных с нарушениями атриовентрикулярной и внутрижелудочковой проводимости и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии. 14 НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Впервые у больных идиопатическими нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии миокарда исследованы показатели периферических маркеров воспаления и аутоиммунных процессов, оценены данные МРТ сердца с в/в контрастированием. Продемонстрирована высокая диагностическая значимость аутоантител к IgM М2-холинорецепторам, а также впервые введенного экспериментального показателя – процента КАР-позитивных тромбоцитов в выявлении воспаления в миокарде. Впервые показано, что процент тромбоцитов, экспрессирующих КАР напрямую связан с аутоиммунными (антитела IgG к β1-адренорецептору и М2-холинорептору) и провоспалительными (ФНО-α и ИЛ-6) показателями у больных идиопатическими нарушениями проводимости, а также у больных с клиническим синдром дилатационной кардиомиопатии Работа впервые продемонстрировала повышенное содержание трансформирующего ростового фактора β1 в сыворотке пациентов с идиопатическими нарушениями проводимости сердца. Впервые выявлено, что повышенная экспрессия КАР на мембранах кардиомиоцитов связана с более тяжелым функциональным классом сердечной недостаточности, наличием поражения правых отделов сердца, а низкая экспрессия КАР в миокарде ассоциирована с замедлением внутрижелудочковой проводимости у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии. Впервые исследован вклад очагового фиброза в развитие нарушений проводимости как у больных без органического поражения миокарда так и у больных с клиническим синдромом кардиомиопатии. Впервые показано, что сочетание двух МРТ феноменов – отека и гиперемии – может быть наиболее перспективным в диагностике латентного 15 воспалительного поражения миокарда у больных с нарушениями проводимости сердца. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ На основании выполненного исследования определен круг диагностических маркеров, сочетание которых позволяет предполагать воспалительную этиологию нарушений проводимости сердца у пациентов без органической патологии. Показано, что для оценки прогноза развития заболевания у больных с идиопатическими нарушениями проводимости необходимо дополнительное исследование уровня аутоантител IgM к М2холинорецептору, уровня экспрессии КАР-рецептора тромбоцитами, а также проведение МРТ сердца с целью выявления или исключения отека и гиперемии. Выявленный воспалительный и аутоиммунный компонент у пациентов с идиопатическими нарушениями проводимости может быть использован для определения показаний к применению специфической терапии, а также служить убедительным обоснованием более тщательного наблюдения за подобными пациентами. 16 ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Современные взгляды на этиологию нарушений проводимости сердца. Значение аутоиммунных механизмов в развитии нарушений проводимости сердца Патология проводящей системы сердца (ПСС) привлекает внимание исследователей на протяжении столетия. За столь длительный период времени сформировались устоявшиеся представления об этиологии различных вариантов поражения ПСС. На сегодняшний день известно, что причинами развития атриовентрикулярных (АВ) и внутрижелудочковых (ВЖ) блокад может быть широкий спектр кардиологических заболеваний, в связи с чем подразумевается, что нарушения проводимости сердца являются вторичными по отношению к основному заболеванию сердца [1]. Это может быть проиллюстрировано на примере одного из проявлений поражения ПСС – нарушения атриовентрикулярной (АВ) проводимости. Приобретенная АВ блокада может являться результатом различных патологических процессов, таких как инфильтрация, фиброз или потеря контакта между различными отделами здоровой проводящей системы. Причинами АВ блокад может быть целый ряд различных заболеваний сердца, таких как ИБС, ДКМП, саркоидоз [2]. Список как наиболее часто встречающихся, так и крайне редких причин нарушения АВ проведения представлен в таблице 1 [3]. В ряде случаев при обследовании больных с нарушениями АВ проводимости не удается обнаружить признаков органического поражения сердца и несердечных заболеваний. При этом причиной АВ блокады может являться дегенеративное поражение ПСС, выявляемое наиболее часто среди пожилых людей. Билатеральная склероатрофия и дегенерация ножек пучка Гиса в средних и дистальных отделах, а также фиброз верхних отделов межжелудочковой перегородки – типичные гистологические признаки болезни Ленегра. При этом идиопатический фибротический процесс 17 ограничен исключительно системой Гиса-Пуркинье и не сопровождается воспалительными изменениями в прилежащем рабочем миокарде [4]. В отличие от болезни Ленегра для болезни Лева характерно поражение проксимальных отделов пучков Гиса. Это заболевание манифестирует брадикардией и ненаследственной АВ блокадой прогрессирующей различной дегенерации степени и вследствие кальцификации проводящей системы, а также фиброза опорных структур сердца. Для болезни Лева характерно начало на четвертом-пятом десятилетии жизни (позже, чем для болезни Ленегра), однако значимые клинические симптомы проявляются еще позднее [5]. Таблица 1. Частые и редкие причины АВ блокады высокой степени среди людей молодого и среднего возраста [3] Наиболее частые причины АВ блокады высокой степени среди людей молодого и среднего возраста 1. Ишемическая болезнь сердца 2. Дегенеративные заболевания: болезни Ленегра (склеродегенеративный процесс, поражающий исключительно проводящую систему) и Лева (кальцификация проводящей системы и клапанов), митохондриальная миопатия 3. Неишемическая кардиомиопатия – семейные формы и спорадические случаи ДКМП 4. Инфекционные причины – Лайм-боррелиоз, поражение Trypanosoma cruzi, ревматизм, миокардит, болезнь Чагаса, миокардит, вызванный Aspergillus, инфекция Herpes zoster 5. Ревматические и аутоиммунные заболевания – гигантоклеточный миокардит, анкилозирующий спондилоартрит, ревматоидный артрит, системная склеродермия, системная красная волчанка. 6. Инфильтративные заболевания – амилоидоз, саркоидоз, опухоли, неходжкинская лимфома, множественная миелома 7. Вагус-зависимые 8. Ятрогенные причины, включая лекарственные препараты Очень редкие причины АВ блокады высокой степени среди людей молодого и среднего возраста 1. Нейромышечные или неврологические расстройства – мышечная дистрофия Беккера, миотоническая мышечная дистрофия и др. 2. Метаболические причины – гипоксия, гиперкалиемия, нарушения функции щитовидной железы 3. Индуцированные радиацией 4. Ассоциированные с психиатрическими заболеваниями 5. Острая ревматическая лихорадка 6. Необъяснимый апоптоз проводящей системы 7. Некомпактный миокард левого желудочка 18 Дегенеративные процессы играют не последнюю роль и в развитии нарушений ВЖ проведения. Неоднократно проводились попытки исследования морфологических изменений миокарда, соответствующих нарушению ВЖ проводимости по типу блокады левой ножки пучка Гиса (БЛНПГ). Сходные патологические морфологические изменения миокарда (гипертрофия миокарда, изменения митохондрий, пространственная дезорганизация миофибрилл, интерстициальный фиброз) обнаруживаются по результатам исследования образцов ЭМБ у 90,5% здоровых лиц с БЛНПГ и у 100% пациентов с кардиомиопатией, сопровождающейся БЛНПГ [6]. Результаты этого и других морфологических исследований [4, 7], а также большого проспективного популяционного исследования, выполненного Eriksson и соавт. (1998) позволяют предположить, что нарушение внутрижелудочковой проводимости по типу БЛНПГ может являться результатом медленно прогрессирующего дегенеративного заболевания, поражающего не только проводящую систему, но и миокард в целом [8]. Вполне возможно, что фиброзирование проводящей системы при этих заболеваниях является следствием латентного воспалительного процесса, который возникает при поражении компонентов проводящей системы циркулирующими аутоантителами. Существует несколько гипотез, объясняющих происхождение аутоантител в условиях патологии. Первая основана на антигенной мимикрии между собственными антигенами миокарда и антигенами инфекционных агентов [9]. Другая гипотеза предполагает, что провоцирующим фактором образования эндогенных аутоантител является открытие доступа иммунной системе к антигенам, в норме скрытым физиологическими барьерами, что происходит при массивном некротическом повреждении миокарда любой этиологии. Аутоиммунные реакции, приводящие к повреждению ПСС, возможно, играют одну из ключевых ролей в развитии и поддержании идиопатических нарушений ритма и проводимости сердца [10]. Ассоциация между 19 присутствием аутоантител к различным структурам миокарда в сыворотке крови и такими нарушениями ритма, как мерцательная аритмия, брадикардия, блокады сердца, а также желудочковые и наджелудочковые аритмии, была подтверждена в ходе многочисленных исследований [11-15]. Спектр выявляемых аутоантител в таких работах широк и включает антитела как к эндоплазматическим антигенам – тропонину, митохондриальным белкам, тяжелой цепи миозина, Na/K- АТФазе, так и к цитоплазматическим рецепторам. Одним из подтверждений аутоиммунной этиологии нарушений проводимости сердца являются работы Maisch B. и соавт., в ходе которых с помощью непрямого иммунофлуоресцентного метода было показано, что аутоантитела к клеткам АВ узла выявляются в 22% случаев АВ блокады I-III степени, в то время как среди больных с другими заболеваниями сердца в отсутствии нарушений АВ проводимости эти аутоантитела обнаруживаются только в 10% случаев [16]. По данным ряда исследований идиопатическая полная блокада сердца в 30-45,5% случаев ассоциирована с аутоантителами к клеткам Пуркинье [17,18]. Однако несмотря на наличие большого количества исследований, использующих метод непрямой иммунофлуоресценции в детекции аутоантител к различным структурам миокарда, прогностическая роль выявляемых в этих работах антител не определена [16]. Одной из патологий ПСС с известной аутоиммунной этиологией является врожденная полная поперечная блокада сердца. Врождѐнной полной АВ блокадой называют блокаду, диагностированную во время внутриутробного развития, а также в течение первых 28 дней жизни ребѐнка. Ее распространѐнность в общей популяции живых новорождѐнных детей составляет 1:15 000 – 1:22 000. В большинстве случаев подобная блокада обусловлена замещением АВ узла фиброзной тканью или нарушением проведения импульса с миокарда предсердий на АВ узел [17]. Реже встречается врождѐнная аплазия АВ узла [20-22]. Наиболее распространѐнной причиной, обусловливающей 60–90% случаев врождѐнной 20 полной АВ блокады, является внутриутробная системная красная волчанка, возникающая при аутоиммунных заболеваниях матери и протекающая с образованием антител anti-Ro/SSA и anti-La/SSB. Проникая через плаценту, эти антитела связываются с антигенами клеток АВ узла плода, нарушая функционирование их ионных каналов, активируют апоптоз и потенцируют развитие воспалительного процесса с последующим замещением погибших клеток соединительной тканью [23]. В последние годы все больше работ посвящено исследованию возможной роли антител к цитоплазматическим антигенам, β1- адренорецепторам и М2-холинорецепторам, как в патогенезе заболеваний с известной аутоиммунной природой, таких как болезнь Чагаса, миокардит, дилатационная кардиомиопатия (ДКМП), так и в развитии идиопатических нарушений ритма и проводимости сердца [24, 25]. Наибольшее количество литературных данных накоплено об участии аутоантител в развитии и прогрессировании ДКМП. Частота выявления аутоантител к β1- адренорецептору в сыворотке пациентов ДКМП варьирует в диапазоне 2660%, при этом их наличие связано с ухудшением сократительной функции ЛЖ, а также с повышением частоты развития желудочковых аритмий и более высоким риском ВСС [13, 14]. Прямая взаимосвязь между аутоантителами к β1-адренорецепторам и развитием ДКМП была продемонстрирована в ходе экспериментальных работ, в которых введение лабораторным животным полипептидной последовательности, моделирующей вторую внеклеточную цепь человеческого β1-адренорецептора, приводила к сходным с ДКМП морфологическим изменениям миокарда [26]. Работы Jahns R. и соавт. наглядно продемонстрировали, что аутоиммунная атака, направленная против β-адренорецептора, играет ключевую роль в развитие ДКМП [27]. Несмотря на то, что в настоящее время накоплено достаточно данных, свидетельствующих о роли антител к β1-адренорецепторам в генезе различных заболеваний миокарда, остаются малоизученными механизмы их 21 воздействия на кардиомиоциты и участие в процессах ремоделирования миокарда. Предполагается, что в результате связывания аутоантител с β1адренорецептором активируются внеклеточные сигнал-регулируемые киназы (ERK), вследствие чего развивается гипертрофия миокарда и снижается его сократительная функция [28]. Известно также, что аутоантитела обладают положительным хронотропным и инотропным действием на кардиомиоциты за счет адреномиметического действия [29]. Проаритмогенные свойства антител к β1-адренорецептору обусловлены их способностью напрямую изменять различных электрофизиологические механизмов. Их свойства прямыми миокарда эффектами посредством принято считать способность увеличивать длительность потенциала действия за счет усиления кальциевого тока через каналы L-типа, индуцировать раннюю постдеполяризацию, и снижать плотность калиевых каналов. Эти эффекты по данным Fukada Y. и соавторов, затрагивающие преимущественно процессы реполяризации, потенциально могут способствовать формированию условий для развития желудочковых нарушений ритма сердца [12]. Подтверждением этого является проспективное исследование, выполненное Pei J. и соавторами. Его результаты продемонстрировали, что повышенный уровень аутоантител к β1-адренорецепторам у больных с сердечной недостаточностью как ишемической, так и неишемической этиологии ассоциирован с увеличением общей смертности и может быть независимым предиктором ВСС [15]. Помимо участия аутоантител в патогенезе желудочковых нарушений ритма у больных с органическими заболеваниями миокарда, данные Chiale с соавт. [30] свидетельствуют о более высоком уровне антител к β1- и β2 адренорецепторам у больных с первичными нарушениями ритма по сравнению с контрольной группой здоровых добровольцев. При этом титры антител у больных с аритмиями и ДКМП сопоставимы. Эти данные позволили авторам предположить, что идиопатические нарушения ритма и 22 проводимости сердца могут предшествовать развитию более грозных заболеваний, таких как ДКМП. Помимо антител к β1-адренорецепторам у пациентов с нарушениями ритма и проводимости сердца часто выявляются антитела к М2холинорецепторам. Согласно литературным данным [31-33], при дисфункции синусового узла наличие подобных аутоантител отмечено у 75% больных, при мерцательной аритмии – в 25% случаев, желудочковой тахикардии – в 40%. Введение лабораторным животным антител к М2-холинорецептору, выделенных из сывороток крови пациентов с болезнью Чагаса, может приводить к развитию у них АВ блокады и брадиаритмий [32]. Изменение электрофизиологических свойств миокарда под действием антител к М2холинорецептору происходит из-за подавления входящего кальциевого тока, что приводит к угнетению синусового и АВ-узлов, и возможно, объясняет генез брадиаритмии [34]. Это дает основание предположить непосредственное участие аутоиммунных механизмов в развитии нарушений проводимости сердца [33, 35]. Объяснить возникновение тахиаритмий можно исходя из способности антител к М2-холинорецепторам увеличивать выходящие калиевые токи, приводя к уменьшению длительности потенциала действия [34]. Следствием подобного воздействия является неравномерное укорочение эффективных рефрактерных периодов в миокарде предсердий, что служит важным патогенетическим фактором развития и поддержания мерцательной аритмии [36]. Таким образом, накопленные литературные данные свидетельствуют о том, что появление антител к рецепторным структурам кардиомиоцитов сопровождает как органические заболевания сердца, так и идиопатические нарушения ритма и проводимости сердца. При этом аутоантитела могут как отражать иммунно-опосредованное повреждение миокарда, так и быть вовлеченными непосредственно в патогенез заболевания. Все это позволяет 23 предположить значимую роль аутоиммунных факторов в развитии и поддержании нарушений ритма и проводимости сердца. Можно также предположить, что идиопатические нарушения ритма и проводимости могут быть первым проявлением и отражением медленно прогрессирующего патологического процесса в миокарде. Активация аутоиммунных механизмов в генезе развития нарушений ритма и проводимости сердца является лишь одним из возможных компонентов воспалительного процесса. Многочисленные работы свидетельствуют о роли латентного воспалительного процесса в миокарде, как фактора развития и прогрессирования нарушений ритма сердца [37-39]. Случаи острого возникновения АВ блокад высокой степени также иллюстрируют, что нарушения проводимости могут быть единственным проявлением первичного воспалительного поражения миокарда. Нарушение АВ проводимости часто сопровождает острую фазу вирусного или идиопатического миокардита. Среди 3055 пациентов с подозрением на острый миокардит, которые были скринированы в ходе исследования European Study of the Epidemiology and Treatment of Inflammatory Heart Disease (ESETCID), у 18% больных регистрировались аритмии высоких градаций, включая желудочковые аритмии и полную блокаду сердца [40]. Хорошо известен пример миокардита, обусловленного болезнью Лайма, при котором может отмечаться вариабельность степени нарушения АВ проводимости, а также болезни Чагаса, для которой характерно развитие нарушений проводимости, прогрессирующих вплоть до полной поперечной блокады. Большая частота развития АВ блокады характерна для другого редкого аутоиммунного заболевания – гигантоклеточного миокардита, при котором до 25% пациентов требуют постоянной кардиостимуляции вследствие АВ блокады 2-3 степени [41]. Подтвердить воспалительную этиологию нарушений АВ проводимости у больных без клинико-инструментальных признаков основного заболевания 24 сердца неоднократно пытались с помощью эндомиокардиальной биопсии (ЭМБ). По данным Sekiguchi et al. (1981) для миокарда больных с АВ блокадой характерна дегенерация миофибрилл в 93% случаев, их дезорганизация в 73% и интерстициальный фиброз в 93% [42]. Выполненное позднее исследование Uemura A. (2001), включившее 50 пациентов с АВ блокадой 2-3 степени неуточненной этиологии, при использовании Далласских критериев только в 6% случаев выявило признаки активного миокардита [43]. Низкий процент активных миокардитов в этом исследовании, вероятно, обусловлен ограничением самого метода ЭМБ, при котором в большей степени оцениваются морфологические изменения в миокарде желудочков непосредственно под эндокардом, а также невысокой чувствительности Далласских критериев. Согласно другому исследованию, у 8,3% больных лимфоцитарным миокардитом встречается блокада сердца высоких степеней [44]. Исследование Batra et al., продемонстрировало, что нарушения АВ проводимости при подтвержденном ЭМБ миокардите обратимо в 67% случаев, в 28% случаев пациенты с персистирующей АВ блокадой требуют имплантации электрокардиостимулятора [45]. Таким образом, воспалительное поражение как изолированно проводящей системы, так и миокарда в целом имеет большое значение в генезе нарушений проводимости. Определение основного заболевания, которым может являться субклиническое воспаление миокарда, является необходимым для оценки прогноза заболевания, уточнения лечебных подходов. 1.2 Возможности использования периферических цитокинов в выявлении миокардиального воспаления. Участие цитокинов в патологическом ремоделировании миокарда. Хорошо известно, что в развитии и поддержании воспаления в миокарде центральную роль играют цитокины. Цитокины – 25 низкомолекулярные воспалительных межсистемные белки, реакций, являющиеся способные взаимодействия. медиаторами регулировать Благодаря их иммунных и межклеточные и влиянию происходит изменение свойств кардиомиоцитов, запуск их апоптоза, включаются другие механизмы, способные приводить к изменению электрофизиологических свойств миокарда и служить основой для развития нарушений ритма и проводимости сердца. На начальных этапах вирусного поражения сердца многочисленные инфильтрирующие миокард клетки, такие как гранулоциты, макрофаги, дендритные, тучные клетки, Т и В-лимфоциты, секретируют воспалительные цитокины [46]. Их повышенный уровень является необходимым звеном в иммунной защите против микробных патогенов. Это демонстрирует повышенный уровень воспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (ИЛ) -1α, ИЛ-1β, ИЛ-6, фактор некроза опухоли альфа (ФНОα) у пациентов с острым миокардитом. Однако при длительном повышении концентрации воспалительных цитокинов в крови начинают доминировать механизмы патологического ремоделирования миокарда. В пользу этого свидетельствует то, что длительное повышение уровня ФНОα, ИЛ-1 и ИЛ-18 в крови способствует хронизации воспаления, индукции аутоиммунных механизмов и прогрессированию миокардита в ДКМП [47-49]. Одним из главных регуляторов воспалительного ремоделирования в миокарде является ФНОα. Этот цитокин присутствует в миокарде не постоянно, его синтез макрофагами увеличивается в ответ на механический стресс или обширное некротическое повреждение миокарда вне зависимости от этиологии. Так, концентрация ФНОα значительно увеличена в сыворотке крови больных с острым инфарктом миокарда [50]. В условиях длительной гиперэкспрессии ФНОα провоцирует гипертрофию кардиомиоцитов, способствует ремоделированию внеклеточного матрикса, запускает процессы апоптоза [51]. Способность ФНОα напрямую влиять на ремоделирование миокарда была доказана в экспериментах на животных. Показано, что 26 системное экзогенное введение ФНОα в концентрациях, сопоставимых с теми, которые обнаруживают в кровотоке при сердечной недостаточности, индуцирует развитие ДКМП [52]. Наряду с этим имеются сведения о том, что ФНОα дозозависимо снижает сократимость миокарда [53]. Эндогенное повышение концентрации ФНОα в экспериментально созданных условиях с помощью индукции кардиоспецифической гиперсекреции у трансгенных мышей вызывает развитие миокардита и КМП, что подтверждает важную роль этого цитокина в патогенезе воспалительного поражения миокарда [54]. Кардиоспецифическая гиперэкспрессия ФНОα приводит к повышению активности ренин-ангиотензиновой системы за счет увеличения экспрессии ангиотензин-превращающего фермента [55], уменьшению синтеза коллагена и экспрессии мРНК проколлагена в условиях in vitro, а также вызывает дисбаланс между синтезом экстраклеточного матрикса и его деградацией. Преобладание тех или иных эффектов ФНОα зависит от длительности воздействия. При недолгом воздействии этот цитокин индуцирует активацию матриксных металлопротеиназ, что приводит к деградации компонентов внеклеточного матрикса и проявляется прогрессирующей дилатацией левого желудочка. При длительном повышении концентрации ФНОα в крови происходит активация целого ряда механизмов, включая повышение экспрессии ТРФ-β1, что приводит к избыточному отложению коллагена и повышению жесткости левого желудочка [56]. Таким образом, благодаря множеству механизмов ФНОα приводит к ремоделированию миокарда, что способствует развитию сердечной недостаточности. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что для больных сердечной недостаточностью характерна повышенная концентрация в плазме крови ФНОα [51, 55, 57-59]. Однако, несмотря на большое количество экспериментальных данных и предпосылки использования антагонистов многообещающие этого цитокина, рандомизированное исследование по оценке эффективности подобного 27 препарата в лечении ДКМП были остановлены досрочно из-за высокой смертности в группе лечения [60]. Для многих воспалительных цитокинов характерна двойственность эффектов: через активацию цитопротекторное действие, различных а при систем длительно проявляется повышенном их уровне экспрессии начинают доминировать их дезадаптивные свойства. Хорошо иллюстрирует эту двойственность эффектов ИЛ-6. С одной стороны, ИЛ-6 способен осуществлять выживаемость свои кардиомиоцитов индуцированных моделей цитопротекторные функции, улучшая при миокарда в повреждении ишемии-реперфузии, в ходе условиях гемодинамической объемной перегрузке, а также при воспалительных заболеваниях миокарда. С другой стороны, следствием его повышения является активирование механизмов гипертрофии миокарда [61-65]. Участие в регуляции гипертрофии сердечных миоцитов было продемонстрировано в экспериментальных условиях у крыс с помощью продолжительной инфузии ИЛ-6 [59]. В ходе этой работы было обнаружено, что высокие концентрации ИЛ-6 приводят к концентрической гипертрофии левого желудочка, повышению объемной доли коллагена, увеличению жесткости миокарда. ИЛ6 способен оказывать кардиодепрессивное действие, уменьшая концентрацию внутриклеточного кальция как напрямую, так и потенцируя эффекты ФНОα и ИЛ-1 [67]. Одновременно высокий уровень ИЛ-6 ассоциирован с риском внезапной сердечной смерти [68]. Помимо ИЛ-6, в патогенезе дисфункции ЛЖ может принимать участие ИЛ-2 [69]. Высокие концентрации ИЛ-2 в сыворотке крови являются предиктором тяжелого течения ДКМП [69, 70], Сходными эффектами обладает и ИЛ-1. Подобно ИЛ-6, повышение концентрации ИЛ-1 ассоциировано с гипертрофией миокарда при перегрузке объемом и давлением [71, 72]. Повышение концентрации ИЛ-1 стимулирует активацию процессов апоптоза, снижает синтез коллагена [73] оказывает антипролиферативное действие на 28 сердечные фибробласты продемонстрировали Исследования [74]. синергизм воздействия в условиях для ИЛ-1 и in vitro ФНО на контрактильную функцию сердца [75]. Противоречивые данные получены в экспериментальных работах, посвященных ИЛ-4. С одной стороны исследования, выполненные на лабораторных животных, свидетельствуют о том, что блокирование ИЛ-4 специфическими антителами в значительной степени уменьшает тяжесть течения миокардита [76], в то же время, применение антагонистов к рецепторам ИЛ-4 способствует усугублению течения этого заболевания [77]. Центральную роль в регуляции функции фибробластов и внеклеточного матрикса (ВКМ) играет основной профиброгенный цитокин, трансформирующий ростовой фактор β1 (ТРФ-β1). Находясь в ВКМ в латентной форме, он активируется под действием широкого спектра сигналов, как правило, появляющихся при поражении тканей. ТРФ-β1 регулирует целый ряд процессов, включая клеточный рост, апоптоз, дифференцировку, миграцию, а также продукцию ВКМ [78]. ТРФ-β1 индуцирует превращение фибробластов из клеток-предшественников в патологические миофибробласты [79, 80], его повышенный уровень определяет обусловленный воспалением фиброз [81]. Подавление активности ТРФ-β1 блокирующими антителами предотвращает развитие поствоспалительного фиброза и формирование воспалительной КМП [79]. На сегодняшний день в литературе накоплен обширный материал, посвященный участию цитокинов в патогенезе воспалительных поражений миокарда. Благодаря их множественным эффектам осуществляется регулирование воспаления в миокарде, что в том числе обуславливает его патологическое ремоделирование. Кроме того, естественное течение воспалительного процесса, характеризующееся отеком и заменой погибших кардиомиоцитов элементами соединительной и жировой ткани, может приводить к структурному и электрическому ремоделированию миокарда. 29 Однако исследований, направленных на оценку уровня периферических цитокинов при идиопатических аритмиях, недостаточно. Принимая во внимание способность воспалительных цитокинов регулировать как физиологические, так и патологические процессы в миокарде, можно предположить, что их повышенный уровень в периферической крови может отражать различные стадии субклинического воспалительного процесса, проявляющееся идиопатическими нарушениями проводимости сердца. 1.3 Эндомиокардиальная биопсия в диагностике воспаления в миокарде. Показания и ограничения. Разнообразие клинических проявлений воспалительного поражения миокарда обуславливают трудности, как в выборе методов диагностики заболевания, так и в достижении согласия экспертов относительно оптимальных диагностических критериев. Введение в клиническую практику в начале 80-х годов XX века эндомиокардиальной биопсии (ЭМБ) обеспечило появление объективного метода прижизненной диагностики миокардита [82]. Однако крайняя неоднородность результатов ЭМБ и отсутствие единых диагностических критериев на этом этапе привели к существенным различиям в трактовке морфологических изменений, что снижало значимость метода [83]. Морфологические критерии, принятые в Далласе (США, 1986), могут считаться первой попыткой разработки стандартизованных рекомендаций по гистопатологической классификации миокардитов [84]. Согласно этим критериям, выделяют активный и пограничный миокардит. При этом активный миокардит характеризуется воспалительной клеточной инфильтрацией и признаками некроза (миоцитолиз) или повреждения миоцитов. При пограничном миокардите имеются менее выраженные признаки воспалительной инфильтрации в отсутствие признаков повреждения миоцитов. Однако в последующем стала очевидна низкая чувствительность Далласских критериев, что связано с 30 несколькими причинами. Во-первых, отсутствие возможности прицельной биопсии, т.е. получения образцов из участков миокарда без учета возможного наличия в них воспалительного поражения, что в свою очередь привело к необходимости забора большого количества (до 15 образцов) биоптатов [85]. Во-вторых, к недостаткам Далласских критериев относят и то, что в соответствии с ними предусматривается оценка клеточной инфильтрации только с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, что не дает представления о вкладе клеток различных популяций в воспалительное поражение миокарда [86]. К существенным недостаткам Далласских критериев можно отнести и их невысокую прогностическую значимость. Так, при сравнении прогноза в группах активного и пограничного миокардита в исследовании Angelini A. и соавт, статистически значимых различий в комбинированном показателе общей смертности и частоты выполнения трансплантации сердца между группами отмечено не было [87]. Для повышения диагностической ценности ЭМБ в 1999 г. Далласские критерии были пересмотрены иммуногистохимическими и дополнены критериями: количественными активное воспаление диагностируется при наличии в 1 мм2 ≥14 воспалительных клеток, включая Т- и В- лимфоциты и их активированные формы, а также до четырех макрофагов [88]. Верхний предел нормы для определения воспаления был установлен как два стандартных отклонения от количества инфильтрирующих клеток в миокарде здоровых людей, умерших от внесердечных причин, и панели из 50 биопсированных пациентов с артериальной гипертензией. В стандарт исследования эндомиокардиальных биоптатов были также введены молекулярно-генетические методы, такие, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или гибридизация in situ, что позволило верифицировать потенциальных возбудителей миокардитов [88,89,90]. 31 На сегодняшний день экспертами Американской ассоциации кардиологов, Американской коллегии кардиологов и Европейского общества кардиологов принят документ, по которому были определены клинические сценарии, согласно которым выполнение биопсии признано приемлемым (таблица 2) [91]. Таблица 2. Клинические ситуации, при которых рекомендовано проведение ЭМБ [91]. NN Клиническая ситуация Класс Уровень рекомендоказадаций тельности Впервые развившаяся СН продолжительностью менее 2 нед. при I B нормальных размерах ЛЖ или его дилатации и наличии нарушений гемодинамики 2 Впервые развившаяся СН продолжительностью от 2 нед до 3 мес I B при наличии дилатации ЛЖ и впервые возникших желудочковых аритмий, блокады сердца II и III степени, а также в отсутствие ответной реакции на стандартное лечение в течение 1-2 нед 3 CН продолжительностью более 3 мес при дилатации ЛЖ и IIa C впервые возникших желудочковых аритмиях, блокады сердца II и III степени, а также в отсутствие ответной реакции на стандартное лечение в течение 1-2 нед. 4 СН, обусловленная ДКМП, при любой длительности ее течения, в IIa C случае предполагаемых аллергических реакций и/или эозинофилии 5 СН, которая может быть связана с предполагаемой IIa C антрациклиновой КМП 6 СН, связанная с рестриктивной КМП неустановленной этиологии IIa C 7 Предполагаемые опухоли сердца IIa C 8 КМП неустановленной этиологии у детей IIa C 9 Впервые развившаяся СН продолжительностью от 2 нед до 3 мес IIb C при наличии дилатации ЛЖ, но в отсутствие впервые возникших желудочковых аритмий или блокады сердца II-III степени, а также при ответной реакции на стандартное лечение в течение 1-2 нед 10 СН продолжительностью более 3 мес при дилатации ЛЖ, но в IIb C отсутствие впервые возникших желудочковых аритмий или блокады сердца II и III степени, а также при ответной реакции на стандартное лечение в течение 1-2 нед 11 СН, связанная с гипертрофической КМП неустановленной IIb C этиологии 12 Предполагаемая аритмогенная дисплазия правого желудочка IIb C 13 Желудочковые аритмии неустановленной этиологии IIb C 14 Фибрилляция предсердий неустановленной этиологии III Примечание: СН – сердечная недостаточность; ЛЖ – левый желудочек; ДКМП – дилатационная кардиомиопатия; КМП – кардиомиопатия. 1 32 Введение строгих показаний для выполнения ЭМБ обусловлено с риском осложнений при выполнении этой процедуры, в первую очередь с возможностью перфорации стенки желудочка и развитием тампонады сердца, а также желудочковых или наджелудочковых аритмий, блокад сердца, осложнений, связанных с пункцией сосудов. Однако по данным центров с большим опытом выполнения ЭМБ, риск такого осложнения, как, например, гемоперикард при проведении этой процедуры крайне мал и составляет менее 0,01% для левожелудочковой биопсии и менее 0,1% для правожелудочковой [92]. Таким образом, согласно консенсусу экспертов применение ЭМБ для исключения воспалительной этиологии в развитии идиопатических нарушений ритма без сопутствующей сердечной недостаточности оправдано только в случае фибрилляции желудочков или устойчивых/неустойчивых желудочковых тахикардий. В случаях же малосимптомного воспалительного поражения миокарда, проявляющегося нарушениями ритма и проводимости сердца, единственно возможным методом уточнения диагноза можно назвать магнитно-резонансную томографию (МРТ) сердца с контрастированием 1.4 Применение неинвазивного метода магнитно-резонансной диагностики томографии воспалительных как поражений миокарда. Латентное течение воспалительных поражений миокарда, проявляющееся нарушениями ритма и проводимости сердца, не всегда позволяет применять «золотой стандарт» диагностики - ЭМБ. В этой связи особый интерес представляют собой неинвазивные методы визуализации миокарда, среди которых широкое распространение получила магнитнорезонансная томография (МРТ). Применение МРТ с контрастным усилением хорошо зарекомендовало себя не только как способ получения точной информации об анатомических особенностях сердца, его функции, но и 33 состоянии тканей сердца, что особенно важно для выявления воспалительного поражения миокарда. В 2009 г. был разработан и рекомендован к использованию стандартный протокол МРТ-исследования, включающий комплексную оценку трех феноменов: отека миокарда, гиперемии, выявления очагов некроза и/или фиброза. Этот метод рядом исследователей рассматривается как неинвазивная альтернатива ЭМБ в диагностике миокардитов [93, 94]. Отек миокарда определяется на Т2 взвешенных изображениях как область высокой интенсивности МР-сигнала. Диагностическим критерием отека является отношение интенсивности сигнала от миокарда к интенсивности сигнала от скелетных мышц более 1,9 [95]. Этот феномен является специфическим маркером острого повреждения миокарда вне зависимости от этиологии и хорошо коррелирует с уровнем сывороточных маркеров некроза. Сам по себе отек миокарда может приводить к повышению интерстициального гидростатического давления, некрозу капилляров за счет их компрессии и вследствие этого снижению функции левого желудочка и развитию аритмий. [96]. Еще два диагностических феномена основаны на анализе изображений, полученных при контрастировании миокарда хелатами гадолиния. Принцип использования хелатов гадолиния основан на том, что, являясь по структуре инертными внеклеточными агентами, они не могут проникать через мембрану кардиомиоцитов и поэтому распределяются в интерстициальном пространстве [97]. Повреждение клеточных мембран, миоцитолиз, вазодилатация и иммунная реакция вследствие воспаления увеличивают миокардиальный капиллярный интерстициального пространства. кровоток Все это и объемную проявляется долю увеличением интенсивности сигнала миокарда на Т1-взвешенных изображениях в течение первых 3-4 минут после введения препарата за счет увеличения объема крови в миокарде и быстрого распространения гадолиния в интерстициальном 34 пространстве и называется ранним контрастированием (РК) [98]. Количественно оценивается абсолютное или нормализованное к скелетным мышцам отношение интенсивности сигнала миокарда до и после внутривенного введения контрастного препарата. Увеличение интенсивности сигнала в абсолютных значениях на 45 и более процентов или нормализованного в 4 и более раз отражает наличие гиперемии при острых воспалительных поражениях миокарда. Длительное присутствие гадолиния, так называемое позднее контрастирование (ПК), наблюдается в местах необратимого повреждения миокарда через 10-15 минут после введения препарата на T1-взвешенных изображениях. Наличие участков позднего накопления контраста свидетельствует о некрозе или фиброзе миокарда вследствие увеличения интерстициального пространства и замещения кардиомиоцитов коллагеновым матриксом [99]. Локализация очагов позднего накопления гадолиния может указывать на этиологию поражения миокарда. Так, для ишемического поражения миокарда характерны субэндокардиальные зоны поражения миокарда в соответствии с расположением окклюзированной коронарной артерии. Для воспалительных очагов наиболее типична субэпикардиальная и интрамуральная локализация, однако обнаружение субэндокардиальных или трансмуральных очагов не исключает диагноз миокардита [100]. Подобная локализация очагов может наблюдаться, например, у больных с парвовирус В19 ассоциированным миокардитом и может быть объяснена коронарным вазоспазмом. В 2007 году на основании этих трех феноменов были сформулированы диагностические критерии миокардита («Lake Louise Criteria»), согласно которым наличие двух из трех перечисленных феноменов соответствует гистологически подтвержденном миокардиту с диагностической точностью в 78%, чувствительностью в 67% и специфичностью 91%. Однако со временем стали появляться данные о том, что эти критерии обладают 35 высокой чувствительностью, специфичностью и сопоставимостью с результатами ЭМБ только у больных острым миокардитом с длительностью симптомов менее 14 дней. В случаях хронического миокардита эти показатели снижаются и составляют 63%, 40%, 52% соответственно [101]. Результаты отдельных работ создали предпосылки для использования МРТ сердца проводимости при обследовании больных с сердца. дифференциальной Так, высокая диагностике нарушениями ритма и значимость причины этого нарушений метода ритма в была продемонстрирована на примере больных с внезапно возникшей АВ блокадой в работе Prochnau D. и соавт. (2012). Выявление очагов позднего накопления гадолиния в перегородочной области оказалось решающим в установлении воспалительной этиологии патологического процесса в миокарде этих больных [102]. У асимптоматических пациентов с БЛНПГ и нормальной эхокардиографической картиной МРТ сердца в одной трети случаев позволяет уточнить диагноз, выявляя изменения, характерные для ДКМП [103]. Однако необходимо отметить, что опыт по применению МРТ в определении этиологии нарушений ритма и проводимости сердца недостаточен, больших исследований по оценке тонкой структуры миокарда у больных с идиопатическими нарушениями ритма сердца не проводилось. Большое распространение получило исследование зон позднего накопления гадолиния в качестве предиктора неблагоприятных аритмических событий у пациентов с дисфункцией миокарда желудочков. Тканевая гетерогенность у этих больных с участками невозбудимого миокардиального рубца и гибернирующего миокарда может быть потенциальным субстратом для циркуляции волн re-entry. Согласно данным Yokokawa M. и соавт. обнаруженные у больных с ДКМП очаги накопления гадолиния как правило, нетрансмуральные и расположены в базальных отделах свободной стенки левого желудочка, а также базальных и средних отделах межжелудочковой перегородки [104]. Нетрансмуральный рубец, 36 вовлекающий жизнеспособный миокард, будучи медленно проводящей зоной, может быть хорошим субстратом для поддержания желудочковых тахикардий. Приблизительно у 40% больных ДКМП выявляются зоны интрамурального накопления гадолиния в межжелудочковой перегородке. Их наличие является предиктором желудочковой тахикардии и ВСС [96]. В 2013 году вышел мета-анализ, подтвердивший достоверную связь позднего накопления гадолиния по данным МРТ с риском желудочковых аритмий у пациентов со сниженной ФВ ЛЖ как ишемической, так и неишемической этиологии [105]. Таким образом, в настоящее время МРТ сердца рассматривается рядом авторов как наиболее перспективный метод неинвазивной диагностики воспалительных поражений миокарда. С учетом необходимости дифференциальной диагностики «идиопатических» нарушений ритма и проводимости сердца, в ряде случае применение МРТ сердца, является единственно возможной альтернативой ЭМБ. 1.5 Коксаки-аденовирусный рецептор как фактор патогенеза воспалительных заболеваний миокарда и нарушений проводимости сердца. Спектр причин возникновения воспалительного поражения миокарда, в том числе, как причины нарушений ритма и проводимости сердца, широк и включает как инфекционные – вирусные, бактериальные, протозойные, грибковые и паразитарные факторы, так и неинфекционные – аутоиммунные, токсические и аллергические. Воспалительное поражение миокарда может быть ассоциировано с системными аутоиммунными заболеваниями, такими, как саркоидоз, равматоидный артрит, синдром Шегрена, системная красная волчанка, дерматомиозит, болезнь Крона [92]. Однако наибольшее клиническое значение в этиологии миокардиального воспаления имеют вирусы, определение которых стало возможным лишь с внедрением в 37 стандарт исследования образцов эндомиокардиальной биопсии (ЭМБ) молекулярно-генетических методов, таких, как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Наиболее крупный регистр этиологии воспалительных заболеваний сердца был создан в Германии и формировался на протяжении более чем 20 лет. Он включил анализ эндомиокардиальных биоптатов около 11 тысяч пациентов. Согласно этому, так называемому, Марбургскому регистру, встречаемость вирусов в биоптатах составляет около 36% [92]. Основными вирусами, определяемыми в миокарде больных воспалительными заболеваниями, являются парвовирус В 19, вирус герпеса человека 6 типа А/В, вирусы Коксаки, аденовирус, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр (таблица 3). Таблица 3. Основные вирусы, определяемые в эндомиокардиальных биоптатах согласно Марбургскому регистру (1990-2010) [92]. Вирусы Нуклеино- % встречаемости Клетки-мишени вая кислота Вирусы Коксаки А+В РНК 1,9 Миоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, CD4+ Т-клетки, макрофаги Echo-вирусы РНК 0,01 Гепатит С РНК 0,2 (Япония) Грипп А+В РНК <1 Вирус кори РНК <1 Вирус краснухи РНК <1 Аденовирус 1,2,3,5 типов ДНК 1,6 Миоциты Парвовирус В 19 ДНК 30 Эндотелиальные клетки (семейство эритровирусов) Вирус герпеса человека 6 ДНК 3 Т клетки типа А/В Цитомегаловирус ДНК 2 Миоциты, эндотелиальные клетки, фибробласты, Вирус Эпштейна-Барр ДНК 1,2 В-, Т-клетки, макрофаги Вирус иммунодефицита ДНК 0,5 CD4+ Т-клетки, человека макрофаги Патогенетические механизмы, лежащие в основе поражения миокарда многими вирусами, неизвестны. Большая часть информации о 38 патофизиологии вирусного поражения сердца и постинфекционного аутоиммунного миокардита получена в ходе экспериментальных работ на лабораторных животных при исследовании модели Коксаки-вирусного миокардита. Хорошо известно, что попадая в организм через гастроинтестициальный или респираторный тракт, представители семейства энтеровирусов атакуют сердечную ткань как вторичный орган-мишень. Проникновение вирусов в клетки-мишени происходит за счет их взаимодействия со специфически рецепторами. Одним из таких специализированных рецепторов является коксаки-аденовирусный рецептор (КАР). Впервые этот рецептор был обнаружен на базолатеральных мембранах эпителиальных клеток группой исследователей под руководством Дж. Бергельсона в 1997 г [107]. Позднее стало известно, что он определяется и на других тканях и клетках организма человека и животных. В эмбриональном периоде этот рецептор экспрессируется в нервной системе – головном мозге, нейроэпителиальных клетках, периферических нейронах ганглиев, мышцах, эпителиальных клетках печени, легких, почек, глаз, поджелудочной железы и сердце [108]. Количество КАР в сердце после рождения уменьшается [109, 110]. Выявлены существенные различия между незрелым миокардом крысиных эмбрионов, где КАР распределяется диффузно, и зрелым миокардом, где КАР локализуется исключительно во вставочных дисках, которые связывают концы кардиомиоцитов. КАР принадлежит поверхностных молекул межклеточные контакты. межклеточном к и семейству локализуется Он распознавании, играет роль опосредует иммуноглобулин-подобных в зонах, в отвечающих клеточной адгезии взаимодействие за и между гомотипичными клетками. По своему строению этот рецептор состоит из двух иммуноглобулин-подобных доменов: мембран-связывающего домена (D1) и цитоплазматического (D2) (Рис. 1). Вирус Коксаки и аденовирус связываются с этим рецептором через различные сайты связывания домена 39 D1. Изучение структуры этого белка путем кристаллизации показало возможность формирования для D1 домена гомодимера. Участки белка, способные к димеризации, высоко консервативны в ходе эволюции, что предполагает их функциональную значимость. Предполагается, что именно благодаря способности D1 домена к димеризации осуществляется участие КАР в формировании межклеточных контактов и адгезии [107]. Рисунок 1. Структура КАР КАР располагается под поверхностью клеток в недоступных на первый взгляд местах, получивших название «плотных контактов». Подобные плотные контакты (tight junctions) между эпителиальными клетками регулируют поток ионов и макромолекул через интактный эпителий, и служат для разделения апикальной и базолатеральной мембранных перегородок. Физиологическая роль КАР на сегодняшний день не вполне ясна. Не вызывает сомнения его значимость в эмбриогенезе. Экспериментальные работы на лабораторных животных с использованием технологий генного 40 нокаута продемонстрировали, что исходное отсутствие этого рецептора приводит к смерти эмбриона в результате перикардиального отека из-за измененной организации кардиомиоцитов с миофибрилл нарушением и функций увеличения сердечной пролиферации мышцы [111]. Выключение кодирующего КАР гена, на стадии постнатального развития приводит к замедлению АВ проведения из-за синхронного уменьшения экспрессии белка щелевых контактов – коннексина 45. Потеря такого рецептора, как КАР, хоть и компенсируется миокардом, но изменение электрических свойств АВ узла приводит к прогрессирующей АВ блокаде [111, 112]. Эти данные подтверждают, что образуя гомо и гетеродимеры посредством экстраклеточных иммуноглобулин-подобных доменов, КАР входит в состав сложных белковых комплексов, вероятно, отвечающих за передачу сигнала. Полученные экспериментальные данные позволяют предполагать участие белков плотных контактов в развитии нарушений проводимости сердца. Для проникновения в клетку аденовирусам и вирусам Коксаки необходимо получить доступ к КАР, который в норме скрыт в плотных контактах. Происходит это с помощью дополнительных рецепторов, упрощающих вирусное инфицирование. Таким рецептором является в первую очередь DAF (decay-accelerating factor), после связывания с которым вирусная частица активирует два сигнальных пути, открывающих для нее вход в клетку. Первый из этих путей обеспечивает перемещение вируса в область плотного контакта и его соединение с КАР. Благодаря второму вирусные частицы проникают внутрь клетки и высвобождают свою ДНК, что завершает процесс инфицирования [107, 113]. Помимо DAF вирусы Коксаки (серотипы В1 и В3, В5) используют ряд белков, выступающих в роли своеобразных "ко-рецепторов" и способствующих проникновению в клетку. Такими белками являются αV-интегрины (в настоящее время известно более 41 20 интегринов, представляющих собой семейство молекул адгезии вирусного агента к клеточной мембране кардиомиоцита) [114]. Подобно эпителиальным клеткам, сократительная ткань сердца содержит множество высокоспециализированных межклеточных контактов, осуществляющих электромеханическое сопряжение в сокращающемся сердце. Взаимодействие между соседними кардиомиоцитами осуществляется через вставочный диск, структуру, содержащую различные типы контактов, повреждение которых приводит, в том числе и к аритмиям [115, 116]. Три типа межклеточных контактов связаны с нормальной работой вставочного диска: адгезивные, десмосомы и щелевидные контакты. Щелевые контакты состоят из белков коннексинов и осуществляют электрическое сопряжение между кардиомиоцитами. В большом количестве коннексины экспрессируются специализированными клетками проводящей системы. Плотные контакты – это четвертый тип контактов, располагающихся на вставочных дисках кардиомиоцитов, который ранее не ассоциировался с аритмией [114], однако новейшие данные свидетельствуют о противоположном. На трансгенных мышах с пониженной экспрессией КАР было доказано, что уменьшение количества КАР в миокарде предрасполагает к развитию фибрилляции желудочков (ФЖ) во время острого периода индуцированного инфаркта миокарда. Причина этого заключается в замедлении электрического проведения по желудочкам. Подробный анализ ишемизированных кардиомицитов с низкой экспрессией КАР выявил низкую амплитуду натриевого тока в зонах вставочных дисков [117]. Более того, хорошо известен наследственный компонент, предрасполагающий к развитию ФЖ и ВСС во время инфаркта миокарда [118]. Наиболее тесная взаимосвязь установлена между ФЖ и генетической последовательностью, располагающейся в 21q21 хромосомном локусе, непосредственно после двух генов, одним из которых является CXADR [119]. Белковым продуктом CXADR является КАР. Эти данные дополнительно подтверждают, что КАР 42 может модифицировать миокардиальную проводимость и уязвимость для аритмии при острой ишемии в отсутствие таких вторичных структурных изменений, как гипертрофия кардиомиоцитов или фиброз, вызывая исключительно электрическое ремоделирование. Помимо своей физиологической роли КАР играет роль в патогенезе воспалительных заболеваний сердца. Доказано, что он является ключевым участником развития миокардита, вызванного Коксаки В3 вирусами, который в последующем может приводить к формированию ДКМП [120]. Литературные данные свидетельствуют также и о том, что само повышение экспрессии КАР в отсутствии вирусной инфекции может способствовать активации провоспалительного каскада, миграции в миокард натуральных киллеров и макрофагов и, таким образом, вызывать развитие изменений миокарда, наблюдаемых при КМП [121]. Регуляция экспрессии CAR осуществляется цитокинами и увеличивается в сердечной ткани взрослых животных, страдающих от аутоиммунного миокардита, что свидетельствует об усилении экспрессии этого рецептора в ответ на воспаление [122]. Повышение экспрессии КАР и его перераспределение со вставочных дисков на латеральные мембраны клеток было доказано при исследовании эксплантных сердец больных воспалительной КМП. Более того, усиление экспрессии КАР в сердцах больных воспалительной КМП было более выражено, чем в сердцах больных ишемической КМП [114]. Эти данные противоречат более поздней работе Tatrai E. с соавт., результаты которой не выявили разницы в количестве мРНК КАР в эксплантных сердцах больных ДКМП и ИБС [123]. Согласно данным другой работы, экспрессия КАР повышена в 96% сердец больных ДКМП. При этом КАР выявлялся в миоцитах, эндотелиальных и интерстициальных клетках [124]. Последние данные свидетельствуют о том, что КАР присутствует на поверхности тромбоцитов [125], клеток, обладающих способностью захватывать вирусы [126, 127]. Хорошо известно, что основной функцией 43 тромбоцитов является участие в механизмах тромбообразования. Они первыми отвечают на сосудистое повреждение, а также нарушение целостности эндотелия. Помимо этого, тромбоциты являются также воспалительными эффекторными клетками и принимают участие в широком спектре воспалительных реакций от острого воспаления до поддержания механизмов приобретенного иммунитета [128-130]. В ответ на появление в кровотоке провоспалительных факторов тромбоциты активируются, экспрессируют на своей мембране различные рецепторы, агрегируют друг с другом и взаимодействуют с другими клетками крови [129]. Находясь в системном кровотоке эти клетки способны первыми реагировать как на появление в крови инфекционных агентов, в том числе, способных вызывать миокардит, так и на увеличение концентрации воспалительных цитокинов. Более того, способность этих клеток экспрессировать КАР делает их еще одной мишенью в инфекционном процессе, вызываемом вирусами Коксаки и аденовирусами. Таким образом, литературные данные свидетельствуют о том, что белок плотных контактов, КАР, принимает как непосредственное участие в патогенезе вирус ассоциированных воспалительных поражений миокарда, так и нарушений проводимости сердца. Вероятным ключом к пониманию физиологических механизмов функций этого ремоделирования рецептора миокарда в является определение патологических условиях воспаления. В организме многие клетки реагируют единообразно на поступающие извне сигналы. Тромбоциты, клетки крови, способны напрямую реагировать на системное воспаление. С одной стороны их способность экспрессировать КАР, с другой стороны возможность участвовать как в инфекционном, так и воспалительном процессе дает право предположить, что они могут сходно с кардиомиоцитами экспрессировать этот рецептор, что может помочь в выявлении периферических маркеров 44 латентного миокардита, проявляющегося нарушениями ритма и проводимости сердца. 1.6. Заключение. Нарушения проявлением проводимости субклинического сердца могут воспалительного быть единственным поражения миокарда. Диагностика воспаления в миокарде в подобных случаях затруднена, в связи с тем, что показаний для применения «золотого» стандарта диагностики, ЭМБ, у пациентов с идиопатическими нарушениями проводимости сердца без сопутствующей сердечной недостаточности нет. С учетом этого единственно возможным методом уточнения диагноза является МРТ сердца с контрастированием, которая также имеет существенные ограничения. Все это заставляет обращаться к поиску периферических маркеров субклинического воспаления в миокарде. В качестве одного из возможных маркеров рассматриваются антитела к поверхностным мембранным рецепторам кардиомиоцитов – М2-холинорецептору и β1-адренорецептору. В настоящее время имеются данные, подтверждающие участие этих аутоантител в развитии и поддержании нарушений проводимости сердца, как у пациентов с первичными заболеваниями миокарда, так и у лиц без признаков патологии ССС. Еще одним маркером, зарекомендовавшим себя в выявлении миокардиального воспаления, являются воспалительные цитокины. Их значение при идиопатических нарушениях проводимости сердца не достаточно изучено. Однако на сегодняшний день не обнаружено периферических маркеров в полной мере способных отражать патологический процесс в миокарде, что во многих случаях затрудняет постановку диагноза, и препятствует подбору адекватной терапии. В этой связи особое внимание привлекают мембранные рецепторы, обеспечивающие проникновение вирусов в клетку, особенно КАР. Участие этого белка плотных контактов, расположенного в структурах проводящей системы, в воспалительном поражении сердца может предполагать его 45 участие, и в развитии нарушений проводимости. Понимание роли КАР в патогенезе нарушений проводимости сердца и вероятность отражения его изменений на клетках периферической крови, тромбоцитах, может быть использовано в поиске периферических маркеров субклинического воспаления в миокарде у больных с нарушениями проводимости сердца. Круг этих вопросов и явился основанием для проведения настоящей работы. 46 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Структура исследования Все больные, включенные в исследование, были разделены на две группы. В первую группу вошли 38 пациентов с нарушениями атриовентрикулярной (АВ) и внутрижелудочковой (ВЖ) проводимости (14 мужчин и 24 женщины, средний возраст 39,3±11,0 лет, группа «блокады»), у которых в процессе клинико-инструментального обследования не было выявлено признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы. Вторую группу исследования (группа «КМП»), сформировали 23 больных (10 мужчин и 13 женщин, средний возраст 40,5±10,5 лет), данные клинико-инструментального клиническому диагнозу обследования у дилатационной которых соответствовали кардиомиопатии (наличие дилатированных камер сердца, снижение сократительной функции левого желудочка). Исключение у пациентов этой группы ИБС, ГБ, пороков сердца (врожденных и приобретенных), наследственных кардиомиопатий, а также наличие временной связи декомпенсации сердечной недостаточности с респираторным заболеванием у 8 (31%) больных дало основание заподозрить воспалительный генез имеющихся изменений. В группу контроля вошли 12 здоровых добровольцев. Всем пациентам, включенным в исследование, помимо стандартного клинико-инструментального воспалительных цитокинов обследования ФНОα, ИЛ-6, определялся ТРФ-β1, уровень антител к β1- адренорецептору, М2-холинорецептору, проводилась оценка экспрессии КАР на мембранах тромбоцитов, а также выполнялось МРТ сердца с отсроченным контрастированием. Всем больным группы «КМП» выполнялась эндомиокардиальная биопсия с последующим рутинным гистологическим анализом; 47 иммуногистохимическим анализом присутствия воспалительных клеток CD3+,CD4+, CD8+, CD45RO, CD68+; вирусологический анализом биоптатов методом ПЦР на наличие парвовируса В19, вирусов герпеса 1-2 типа, вируса ЭпштейнаБарр, цитомегаловируса, вируса герпеса 6 типа, вируса Коксаки В3; иммуногистохимическим анализом экспрессии КАР кардиомиоцитами. Рис. 2. Структура исследования. 2.2 Характеристика групп обследованных больных Все больные, включенные в исследование, находились на лечении в отделе клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца и отделе заболеваний миокарда и сердечной недостаточности ИКК им. А.Л. Мясникова РКНПК. 48 Предварительное клинико-инструментальное и лабораторное обследование включало в себя общеклинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, определение концентрации Т4 и ТТГ в сыворотке крови, регистрацию ЭКГ в 12ти отведениях, эхокардиографическое исследование, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру, велоэргометрию по стандартному коронароангиографию протоколу (КАГ). Брюса, Результаты в некоторых случаях клинико-инструментального обследования больных обеих групп представлены в таблице 4. Критерии исключения из исследования: 1. Ишемическая болезнь сердца 2. Гипертоническая болезнь более 2 степени по классификации ВОЗ от 2008г. 3. Дисфункция синусового узла 4. Имплантированный ЭКС 5. Острые инфекционные и воспалительные процессы и/или хронические воспалительные процессы в стадии обострения. 6. Злокачественные новообразования в настоящее время. 7. Коллагенозы: ревматизм, системная красная волчанка, склеродермия и др. 8. Заболевания почек с нарушением их функций - развитие признаков почечной недостаточности (снижение клубочковой фильтрации 60 мл/мин). 9. Заболевания печени с нарушением ее функций - развитие признаков печеночной недостаточности (повышение уровня печеночных ферментов в 3 раза и более). 10. Заболевания эндокринной системы 11. Заболевания органов дыхательной системы: бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких и др. 49 12. Заболевания пищеварительной системы, в том числе язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки 13. Заболевания мочеполовой системы 14. Психические расстройства, алкоголизм, заболевания центральной нервной системы. В группе «блокады» у 14 (36,8%) из 38 пациентов регистрировалась АВ блокада II степени с эпизодами преходящей блокады III степени или постоянная полная исследование поперечная клинически блокада, на проявлявшаяся момент включения эпизодами в слабости, головокружения, пресинкопальными и синкопальными состояниями. У 24 из 38 больных группы «блокады» определялось нарушение ВЖ проводимости по типу блокады правой ножки пучка Гиса (БПНПГ) – у 5 (13,2%) больных, по типу блокады левой ножки пучка Гиса (БЛНПГ) - у 19 (50%) (средняя ширина комплекса QRS 146,3±10,9). Оценить давность нарушений ВЖ проводимости у этих пациентов не представлялось возможным в связи со случайным выявлением изменений ЭКГ и отсутствием клинической симптоматики. По результатам опроса только у 7 (13,2%) из всех 38 пациентов с нарушениями проводимости сердца в анамнезе имелись сведения о частых респираторных инфекциях. У этих пациентов диагнозы гипертонической болезни (ГБ), пороков сердца (врожденных и приобретенных), первичных заболеваний миокарда (дилатационная кардиомиопатия [ДКМП], гипертрофическая кардиомиопатия, аритмогенная дисплазия правого желудочка) исключались на основании отсутствия характерных изменений по данным рентгенографии органов грудной клетки, эхокардиографии (ЭХОКГ), а также отсутствия характерных жалоб, семейного анамнеза, повышенных цифр АД при ежедневном самоконтроле АД, а также при контроле АД на приеме у врача (критериями нормального АД считались значения АД не выше 140/90 мм рт. 50 ст.). Исключение ИБС проводилось на основании отсутствия характерных жалоб, факторов риска, значимых депрессий и элеваций сегмента ST по данным ЭКГ и 12-канального холтеровского мониторирования ЭКГ (ХМЭКГ), отрицательных результатов нагрузочной пробы (стресс- эхокардиографическое исследование на велоэргометре по стандартному протоколу Брюса). В семи случаях выполнялась коронароангиография (КАГ), диагностировавшая интактные коронарные артерии. По данным ЭХОКГ патологических изменений у пациентов этой группы не выявлено: КДР ЛЖ составил 4,8±0,46 см, КСР ЛЖ – 3,5±0,54 см, при ФВ ЛЖ – 63,2±3,4%, размер правого желудочка – 2,5±0,3, признаков повышения давления в легочной артерии не выявлялось. Отсутствие признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы позволило считать нарушения проводимости у пациентов этой группы идиопатическими. Обследование пациентов группы «блокады» проводилось на «чистом фоне». У пациентов группы «КМП» (n=23) длительность заболевания от момента клинического дебюта составила 1,25[0,69; 4,85] лет. Протокол обследования был аналогичен таковому для группы «блокады». У всех больных этой группы (таблица 4) регистрировались клинические проявления сердечной недостаточности, соответствующие II-IV функциональному классу по NYHA.Оценить истинную продолжительность заболевания в большинстве случаев не представлялось возможным в связи с предполагаемым периодом субклинического снижения сократительной функции левого желудочка. Результаты ЭХОКГ у больных группы «КМП» подтвердили значительное расширение камер сердца, преимущественно левого желудочка (КДР ЛЖ=7,2±0,84 см), значительное снижение его сократительной способности (ФВ ЛЖ=31,9±8,2%). У 11 больных (47,8%) наблюдалось расширение правого желудочка и повышение давления в легочной артерии (средние значения этих показателей по группе составили 3,5±0,9 см и 31,9±8,2 мм рт. ст., соответственно). 51 Исключение у пациентов этой группы ишемической болезни сердца (по данным КАГ у всех пациентов этой группы были выявлены интактные коронарные артерии), ГБ, пороков сердца (врожденных и приобретенных), а также связь клинического дебюта с респираторным заболеванием (у ряда пациентов) дало основание заподозрить воспалительный генез имеющихся изменений миокарда. Пациенты группы «КМП», включенные в исследование, получали терапию ингибиторами АПФ, бета-блокаторами, диуретиками. По данным стандартной ЭКГ у 12 (52,2%) из 23 больных группы «КМП» имелись признаки нарушения ВЖ проводимости по типу БЛНПГ (ширина комплекса QRS 174,8±24,1 мс). У 5 (21,7%) пациентов отмечалось замедление АВ проводимости, проявлявшееся удлинением интервала PQ до 220-300 мс. У всех пациентов этой группы регистрировался синусовый ритм. Выраженность нарушений ритма сердца оценивалась на основании результатов ХМЭКГ. По данным ХМ ЭКГ в группе «блокады» общее число ЖЭ за сутки составило 0,5[0;14,5], в группе «КМП» – 1601 [117;4231]. Кроме того, несмотря на проводимую больным группы «КМП» медикаментозную терапию, включающую бета-блокаторы, по данным ХМ ЭКГ у них регистрировались пробежки ЖТ (2,5[1,0;5,0] в сутки). Анализ частотных показателей синусового ритма сердца за сутки в группе «блокады» показал, что средняя ЧСС составила 67,0±14,6 уд в мин, максимальная ЧСС 127,8±31,7 уд. в мин., минимальная ЧСС 47,0±11,5 уд. в мин. В группе «КМП» средняя ЧСС составила 71,5±10,0 уд. в мин., максимальная ЧСС 119,5±22,4 уд. в мин., минимальная ЧСС 49,8±8,3 уд. в мин. 52 Таблица 4. Клинико-инструментальные характеристики обследованных групп больных, включенных в исследование Средний возраст, лет Мужской пол – n (%) Длительность заболевания от момента клинического дебюта до включения в исследование СН, ФК (NYHA) Данные ЭХОКГ Данные, ЭКГ ХМЭКГ Терапия КДО ЛЖ (в мл) КДР ЛЖ (в см) КСР ЛЖ (в см) ФВ ЛЖ (в %) ТМЖП (в см) ТЗСЛЖ (в см) Размер правого желудочка (в см) СДЛА (мм рт.ст.). ЧСС средняя ЧСС максимальная ЧСС минимальная Общее количество ЖЭ Количество эпизодов ЖТ Устойчивый синусовый ритм – n (%) Нарушение АВ проводимости – n (%) Нарушение ВЖ проводимости – n (%) по типу БЛНПГ по типу БПНПГ иАПФ/БАР – n (%) бета-блокаторы – n (%) Диуретики – n (%) АМР – n (%) Амиодарон – n (%) Дигоксин – n (%) Группа «блокады» n=38 Группа «КМП» n=23 39,3±11,0 14 (36,8) от 2 недель 40,5±10,5 10 (43,5) 1,25[0,69; 4,85] 0 81±12,6 2,4±1,44 4,8±0,46 3,5±0,54 63,2±3,4 0,9±0,15 0,9±0,13 2,5±0,3 25,7±2,3 67±14,6 127,8±31,7 47,0±11,5 0,5[0;14,5] 0 7,2±0,84 5,2±1,1 31,9±8,2 0,9±0,25 0,8±0,13 3,5±0,9 31,9±8,2 71,5±10,0 119,5±22,4 49,8±8,3 1601[117;4231] 2,5[1,0;5,0] 38 (100) 14 (36,8) 24 (63,2) 19 5 - 23 (100) 5 (21,7) 12 (52,2) 12 0 21 (91,3) 20 (86,9) 18 (78,3) 18 (78,3) 0 0 227±82,6 Примечания: Данные представлены как М (±σ), как Ме [25;75] или как количество больных (в %). СН – сердечная недостаточность, ФК – функциональный класс, КДО ЛЖ – конечнодиастолический объем левого желудочка, КДР ЛЖ – конечно-диастолический размер левого желудочка, КСР ЛЖ – конечно-систолический размер левого желудочка, ТМЖП – толщина межжелудочковой перегородки; ТЗСЛЖ – толщина задней стенки левого желудочка ФВ ЛЖ – фракция выброса левого желудочка, СДЛА – систолическое давление в легочной артерии, ЧСС – частота сердечных сокращений, БЛНПГ –блокада левой ножки пучка Гиса, БПНПГ – блокада правой ножки пучка Гиса, ЖЭ – желудочковые экстрасистолы, ЖТ – желудочковые тахикардии, ЖЭ – желудочковые экстрасистолы, ЖТ – желудочковая тахикардия, иАПФ – ингибиторы ангиотензин превращающего фермента, БАР – блокаторы ангеотензиновых рецепторов, АМР – антагонисты минералкортикоидных рецепторов, 53 2.3 Специальные методы обследования 2.3.1 Определение уровня цитокинов в сыворотке крови Исследование концентрации ФНОα, ТРФ-β1, ИЛ-6 в сыворотке проводили стандартным непрямым иммуноферментным методом (ELISA) на планшетном фотометре Anthos-2020 (Anthos Labtec, Австрия) с помощью наборов «Human TNF-alpha Platinum ELISA», «Human TGF-β1 Platinum ELISA», «Human IL-6 Platinum ELISA» («eDioscience – Bender Medsystems», США-Австрия). Согласно прилагаемым к диагностическим наборам справочным материалам в сыворотке здоровых добровольцев ФНОα не определяется, уровень ИЛ-6 не превышает 12,7 пг/мл, (среднее значение 5,8 пг/мл), для ТРФ-β1 диапазон значений составляет 5222-13731 (при среднем значении 6723±1978) пг/мл. 2.3.2 Методика определения аутоантител к β1- адренорецептору и М2-холинорецептору Всем пациентам обеих исследуемых групп и лицам из группы здоровых добровольцев проводилось определение уровня IgG и IgM к β1адренорецептору и М2-холинорецептору. В ходе работы использовались линейные антигенные детерминанты, моделирующие 2-ю внеклеточную петлю β1- адренорецептору и 1-ю и 2-ю внеклеточную петлю М2холинорецептору (таблица 5). Использованные в работе полипептиды были получены в лаборатории синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ (рук. лаб. Беспалова Ж.Д ). Для получения линейных полипептидов применялся твердофазный метод с использованием Fmoc-методологии. Полипептиды синтезированы в ручном варианте по стандартным протоколам твердофазного синтеза и после необходимых постсинтетических процедур очищены до чистоты не менее 95% с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). 54 Таблица 5. Пептидные последовательности, моделирующие различные участки β1адренорецептора и М2-холинорецептора. Шифр Фрагмент Формула пептида Мол. последовательности масса β1-адренорецептор β8 197-222 β25 HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR 3255.0 NCWRAESDEARRCYNDPKCSDSVCK 2932.4 М2-холинорецептор 83 – 98 MRI YTVIGYWPLGVVCDL 1795.5 Химерные молекулы (83-98)-(171-182) MRI-MRIV (М2+М2) YTVIGYWPLGVVCDL 3228.8 VEDGECYIQFFS Для создания высокоэффективных синтетических антигенов, наиболее близко повторяющих структуру и антигенные свойства природного антигена – мускаринового рецептора – были предприняты попытки получения двух новых конформационных синтетических антигенов – «химерных» молекул, в которых пептидные цепочки, соответствующие разным внеклеточным петлям этих белков, соединены дисульфидными связями. Кроме того для получения искусственного антигена, наиболее близко повторяющего пространственную структуру 2-й внеклеточной петли β1-адренорецептора, в лаборатории генной инженерии Института экспериментальной кардиологии РКНПК (рук. Бибилашвили Р.Ш.) была рассчитана структура полипептида β25. Одним из факторов стабилизации этой молекулы являются две дисульфидные связи между двумя парами остатков цистеина Cys209–Cys215 и Cys199–Cys220 [131]. несимметричные Химерные дисульфиды, молекулы, и пептид бициклический дисульфид, были получены представляющие β25, собой представляющий методами классической пептидной химии в растворе и очищены с помощью ОФ-ВЭЖХ. Структура 55 пептидов подтверждена спектроскопии; данными гомогенность масс-спектрометрии и 1 Н-ЯМР- пептидов подтверждена данными проводили стандартным непрямым результатов реакции аналитической ВЭЖХ. Определение аутоантител иммуноферментным методом. Учет иммуноферментного анализа (ИФА) осуществляли на спектрофотометре «Immunotech LMA01» при длине волны λ = 450 нм. Для проведения ИФА были использованы реагенты, входящие в состав коммерческого тест-набора «АмерКард Анти-TmsA», применяемого для определения антител к микросомальной фракции щитовидной железы в сыворотке крови человека (ТУ 9398-370-00228753-00). Уровень искомых аутоантител определяли как отношение оптической плотности – ОП450 иммуноферментной реакции исследуемого образца к рассчитанной критической оптической плотности – ОПкрит., которая определялась по формуле: ОПкрит = ОПсред+ удвоенное стандартное отклонение, где ОПсред– среднеарифметический результат по всем исследуемым сывороткам крови пациентов. Положительными считали образцы, отношение ОП которых к ОП крит было больше или равно 1,0. 2.3.3 Методика проведения эндомиокардиальной биопсии, вирусологических исследований и иммуногистохимической окраски полученных биоптатов с последующим количественным анализом полученных препаратов Всем больным группы «КМП» выполняли коронароангиографию (КАГ) с последующим выполнением эндомиокардиальной биопсии (ЭМБ). Основанием для проведения ЭМБ служило наличие сердечной недостаточности продолжительностью более 3 месяцев при дилатации ЛЖ и впервые возникших желудочковых аритмиях, а также при отсутствии 56 ответной реакции на стандартное лечение в течение 1-2 недель или наличия устойчивых или неустойчивых желудочковых тахикардий неустановленной этиологии, что соответствует Консенсусу Европейского кардиологического общества (ESC), Американской Ассоциации сердца (AHA), Американского колледжа кардиологов (ACC) 2007[83] . КАГ с последующей ЭМБ проводилась в лаборатории рентгенологии и эндоваскулярных методов лечения (руководитель лаборатории, д.м.н., проф. Самко А.Н.). ЭМБ выполнялась в конце ангиографического исследования с использованием биопсийных щипцов Biopsy Forceps для ЭМБ фирмы «Cordis». В ходе исследования проводился забор 3-4 биоптатов правого или левого желудочка размером 1 мм3 из области верхушки, боковой стенки ЛЖ или апикально-перегородочной части ПЖ. Осложнений в ходе проведения ЭМБ не наблюдали. Одну часть каждого образца ЭМБ заливали в парафин, с последующим приготовлением срезов толщиной около 5-7 мкм и подвергали рутинному гистологическому исследованию, включавшему окраску гематоксилином и эозином, по Массону, толуидиновым синим, жировым красным Гистологический анализ препаратов ЭМБ осуществлялся в отделе сердечнососудистой патологии (рук. отдела д.м.н. Постнов А.Ю.). При гистологическом анализе препаратов ЭМБ исследовали степень гипертрофии кардиомиоцитов, а также их ядер, проводили качественную оценку дегенеративных изменений миокарда. Другую часть каждого образца охлаждали для приготовления иммуногистохимической воспалительных оценкой инфильтратах, криосрезов присутствия а также с последующей иммунных КАР. Степень клеток в остроты воспалительного процесса в образцах ЭМБ оценивали по количественному и качественному составу иммунных клеток различных популяций в инфильтратах, а также по распространенности и тяжести деструктивных изменений кардиомиоцитов, наличию некротизированных кардиомиоцитов. 57 Иммуногистохимическая окраска препаратов ЭМБ с последующим анализом выполнялась ст.н.с. отдела сердечно-сосудистой патологии к.м.н. Чумаченко П.В. Методика иммуногистихимической окраски биоптатов Иммунную окраску осуществляли на криостатных срезах толщиной 5 мкм. После просушивания образцов в течение 20 мин срезы либо использовали, либо хранили при температуре -20ºС не более 3 суток. После высушивания стекла со срезами фиксировали в 10% растворе ацетона при температуре + 4ºС в течение 10 мин, затем промывали проточной водой в течение 10 мин. В классическом виде (в ручном режиме) в срезах блокировали эндогенную пероксидазу или щелочную фосфатазу. В качестве блокирующих реагентов использовалась Н2О2 или левамизол. После блокады избавлялись от неспецифической сорбции белка 1% раствором бычьего сывороточного альбумина и наносили на срез антитела первого этажа в рабочей концентрации (характеристики антител первого этажа указаны в таблице 6). Таблица 6. Характеристики антител, использованных в исследовании. Обозначение Клон/код CD3 UCHT-1 Идентифицируемые клетки или структуры Т-лимфоциты CD4 CLB-159 Т-хелперы CD8 - CD45RO UCHL-1, Цитотоксические клетки Активированные лимфоциты CD68 KP-1 CAR H300 Sc-15405 Источник «MP Biomedicals», Германия «MP Biomedical» Германия Т- «Сорбент», Россия Т- «Abcam Biochemicals», Великобритания Макрофаги «Abcam Biochemicals», Великобритания Коксаки-аденовирусный «Santa Cruz рецептор Biotechnology», США Рабочее разведение 1:100 1:50 1:50 1:10 1:100 1:500 58 Экспонировали антитела на срезе в течение суток при 4 ºС или в течение 30-60 мин при комнатной температуре. Далее, после промывки в фосфатном буфере на срез наносили вторичные антитела к IgG мыши/кролика фирмы «Сорбент». Следующий этап методики заключался в мечении изучаемого антигена пероксидазой хрена в комплексе со стрептавидин/биотином и выявлении данной метки свежеприготовленным раствором 3,3’диаминобензидина (ДАБ) с перекисью водорода. Обычно для окраски использовался PAP (пероксидаза-анти-пероксидазный метод) комплекса фирмы «MP-Biomedicals», США. При выполнении двойного иммуногистохимического окрашивания первичные антитела выявляли, используя комбинации вторичных антител и комбинации различных субстратов. Для двойных иммунных окрасок использовали комбинации методов, включающих PAP (пероксидаза-антипероксидазный) метод и алкалин-фосфатаза-анти-алкалин фосфатазный метод. Однако в большинстве случаев, помимо ручной (классической) методики, для иммуногистохимической реакции использовался иммуногистостейнер BenchMark® XT фирмы «Ventana» (Roche, Франция). Иммуногистостейнер проводил иммуногистохимические реакции в автоматическом режиме. Для постановки иммуногистохимической реакции в этом приборе использовались антитела к CD3+, CD4+, CD8+ Т-клеткам и CD68+ макрофагам, поставляемые фирмой «Ventana» в комплекте к данному прибору. Рабочие концентрации первичных антител соответствовали концентрациям, рекомендуемым в прилагаемой инструкции. В качестве метки антител при окраске с помощью иммуногистостейнера использовали метку пероксидазой или щелочной фосфатазой. Количественный анализ фиброза миокарда выполняли на препаратах ЭМБ, окрашенных трихромом по Массону, с помощью Aperio Scan Scope CS (Aperio Technologies Inc, США) в режиме Positive Pixel Count вычислением 59 процентного отношения негативных пикселей к общему числу пикселей в препарате (участкам, прокрашиваемым соответствующим синим при окраске фиброзным по изменениям Массону, и программой автоматически присваивались негативные пиксели, рис. 3А, Б). Интенсивность окраски клеточных мембран на КАР в окрашенных иммуногистохимических препаратах оценивалась автоматически по трехбальной шкале с помощью Aperio Scan Scope CS в режиме Membrane (рис. 3В,Г). Максимальной окраске клеточных мембран присваивалась третья степень, минимальной – первая. Рисунок 3. А, Б – Исследование степени интерстициального фиброза, В, Г – Иммуногистохимическая окраска мембран кардиомиоцитов на КАР. А – Пример выбора зоны количественного обсчета степени интерстициального фиброза с помощью Aperio ScanScope CS в режиме Positive Pixel Count препарата (окрашивание по Массону) Синим (указано стрелкой) окрашены участки интерстициального фиброза миокарда. Б – образец ЭМБ с признаками диффузного интерстициального фиброза. Окраска по Массону. А – подсчет с помощью Aperio ScanScope CS в режиме Membrane препарата, 60 иммуногистохимически окрашенного на КАР. Стрелками указано очерчивание мембран клеток программой автоматически. Б – препарат ЭМБ больного с тяжелой дилатационной кардиомиопатией. Отмечается интенсивное равномерное окрашивание мембран кардиомиоцитов, интерстициального пространства. Исследование образцов ЭМБ на наличие вирусов Во всех эндомиокардиальных биоптатах изучали наличие вируса герпеса 1-2 типов (ВПГ1-2), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса ЭпштейнаБарр (ВЭБ), вируса герпеса 6 типа (ВГЧ6), парвовируса B19 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР в реальном времени для определения ДНК герпесвирусов и парвовируса B19 проводили с помощью тест-систем фирмы «Интерлабсервис»: «АмплиСенс EBV/CMV/HHV-6скрин-FL», «АмплиСенс HSV1-2», «АмплиСенс Parvovirus B19-FL». Для ПЦР-РВ использовали прибор «RotorGene 3000» и программное обеспечение к нему - «Rotor-Gene 6.0». Для выделения ДНК из биоптатов использовали реагенты фирмы «Интерлабсервис» – «ДНК-Сорб Б». Исследование наличия вируса Коксаки В3 методом ПЦР проводилось в НИИ Институт Вирусологии РАМН имени Д.И. Ивановского в лаборатории онтогенеза вирусов под руководством проф. Носика Н.Н. 2.3.4 Методика проведения МРТ сердца с внутривенным контрастированием гадолинием МРТ сердца выполнялась на сверхпроводящем магнитно-резонансном томографе “Magnetom Avanto” (Siemens, Германия) с полем 1,5 Тл, с поверхностной радиочастотной катушкой для грудной клетки. МРТ сердца проводилась при синхронизации с ЭКГ в следующей последовательности: 1) первоначально, после регистрации топограмм, получали серии срезов в поперечной плоскости по методике “Turbo Spin Echo” для оценки анатомии исследуемой области. Получали Т1–взвешенные изображения с TR (время повторения), равным интервалу R–R ЭКГ, ТЕ (время эхо), равным 25 61 мс, матрицей 128 × 256 элементов, толщиной среза 8 мм, полем изображения 35–38 см (в зависимости от конституциональных особенностей пациента), двумя усреднениями и числом срезов, равным 10–12; 2) следующим этапом получали Т2-взвешенные изображения с использованием сегментированной последовательности triple inversionrecovery и подавлением сигнала от жира (Т2-STIR, TR/TE = 2210/81) для выявления отека в миокарде ЛЖ. Срезы ориентировали в двух- и четырехкамерной проекциях по длинной оси и по короткой оси ЛЖ от основания до верхушки. 3) затем получали серию изображений по методике кино-МРТ для расчета массы миокарда и объемных показателей ЛЖ (TrueFISP), TR = 40 мс, TE = 6 мс, угол отклонения вектора намагниченности 40°, поле изображения 35 см, толщина среза 8 мм, число кадров в кинопетле от 12 до 16 в зависимости от частоты сердечных сокращений. Ориентация срезов та же, что при получении Т2-взвешенных изображений. Для проведения исследования с контрастированием сразу после выполнения кино-МР-последовательностей внутривенно вводили контрастный препарат. В качестве контрастного препарата использовался неионный парамагнитный комплекс гадолиний–ДТПА (“Магневист”, фирма Schering, Германия). Общая доза контрастного препарата рассчитывалась в зависимости от массы пациента (0,15 ммоль/кг или 0,3 мл/кг веса тела). Первая доза контрастного препарата составляла 10 мл и вводилась со скоростью 4 мл/с. Оставшаяся доза контрастного препарата (10–18 мл) вводилась внутривенно струйно. Сразу после введения первой дозы контрастного препарата для исследования раннего контрастирования получали Т1-взвешенные изображения, для чего применяли импульсную последовательность “Turbo Spin Echo” со следующими параметрами: TR < (RR – 50 мс), TE = 1,2 мс, угол отклонения вектора намагниченности 8°, толщиной среза 10 мм, матрицей 128 × 80 элементов и полем изображения 30 62 см. Изображения по короткой оси сердца (3 среза) получали на уровне базального, среднего и верхушечных отделов левого желудочка. Томограммы ориентировали по короткой оси ЛЖ в двухкамерной позиции, с расстоянием между срезами 6 мм. Следующим этапом было исследование с отсроченным контрастированием, для чего использовалась специальная сегментированная последовательность inversion-recovery (IR). Для оптимальной контрастности изображения у каждого пациента перед выполнением отсроченного контрастирования индивидуально подбиралось время инверсии (TI), с помощью специальной программы TI-Scout. Значение TI составляло, как правило, 260-300 мc. Исследование выполняли через 10 минут после введения общей дозы контрастного препарата с помощью двух программ сканирования (TR=207 мc, ТЕ=4 мc, угол отклонения вектора намагниченности 40, матрица 128х256, поле изображения 30 и 35 см, толщина среза 8 мм, количество усреднений 8; True FISP TR/TE=700/1.2, FA=10). Исследование выполнялось на задержке дыхания в течение 8 с, срезы ориентировали по длинной оси ЛЖ в двухкамерной и четырехкамерной проекциях, а также по короткой оси ЛЖ – от основания сердца до верхушки в двухкамерной проекции. Присутствие отека миокарда, а также оценка раннего и отсроченного контрастирования гадолинием исследовали в каждом из 17 сегментов миокарда ЛЖ на 3 срезах по короткой оси ЛЖ: в его базальном отделе (6 сегментов), на уровне папиллярных мышц, где выделялось 6 сегментов, на уровне верхушки (4 сегмента) и непосредственно верхушечный сегмент (рис. 4) [132]. 63 Рисунок. 4. Сегментарная модель деления ЛЖ [132], взятая для оценки присутствия отека миокарда, раннего и отсроченного контрастирования гадолинием. Выявление сегментов с повышенным содержанием воды (отека миокарда) проводилось при сопоставлении интенсивности сигнала (ИС) миокарда на Т2-взвешенных изображениях и ИС от скелетной мышцы. Значение относительного содержания воды в сегменте более 2 указывало на наличие отека миокарда. Выявление гиперемии миокарда с исследованием раннего контрастирования гадолинием (РК) проводилось в каждом из 17 сегментов на Т1-взешенных изображениях до и после введения контраста. Сегмент считался накопившим контраст в раннюю фазу исследования при увеличении ИС после введения контраста в 4 и более раз по сравнению с исходной. При этом оценка увеличения ИС проводилась с учетом увеличения ИС скелетной 64 мышцей после введения контраста (использовалась ИС от m. erector spinae) и рассчитывалась по формуле: где ИСс контраст – интенсивность сигнала миокарда исследуемого сегмента после введения контрастного препарата; ИСс исходно - интенсивность сигнала миокарда исследуемого сегмента до введения контрастного препарата; ИСм контраст – интесивность сигнала от скелетной мышцы после введения контрастного препарата; ИС м исходно – интенсивность сигнала от скелетной мышцы до введения контрастного препарата. Для количественной оценки позднего контрастирования (ПК) миокарда на каждом срезе в двухкамерной проекции по короткой оси ЛЖ с помощью ручной обводки определяли площадь контрастированного миокарда, результаты по каждому срезу затем суммировались. Полученный результат умножался на толщину среза миокарда и таким образом вычислялся объем миокарда с поздним контрастированием гадолинием. Затем определялся процент пораженного миокарда по соотношению объема пораженного миокарда к общему объему миокарда, вычисленному по результатам кино-МРТ. 2.3.5 Методика иммунофлуоресцентной окраски тромбоцитов на КАР Взятие крови. Кровь для исследования брали из локтевой вены самотеком утром натощак с 0,13 М (рН 7,3) раствором цитрата натрия. Через 15 мин после взятия и транспортировки при комнатной температуре кровь центрифугировали при 180 g в течение 17 минут для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Методика иммунофлуоресцентной окраски тромбоцитов на КАР. 65 1 мл обогащенной тромбоцитами плазмы фиксировали в 1 мл 4% раствора формальдегида 10 минут при комнатной температуре, отмывали фосфатным буфером (ФБ) рН 7,4 с помощью центрифугирования (5 мин при 2000 g). Осадок ресуспендировали в 0,4 % растворе казеина или бычьего сывороточного альбумина (БСА) на ФБ и инкубировали 30 минут при 37°С для снижения уровня неспецифического связывания антител с мембраной. Полученную взвесь тромбоцитов инкубировали 30 мин при 37°С с моноклональными антителами к КАР H-300 фирма «Santa Cruz Biotechnology», США. После инкубации тромбоциты отмывали 3 раза ФБ центрифугированием при 2000 g по 5 мин и метили вторыми антителами (фикоэритрин-коньюгат козьих антител к иммуноглобулину кролика, разведение 1:1000 30 мин) при 37°С для введения флуоресцентной метки к первым антителам с последующей отмывкой ФБ 3 раза при тех же условиях. Осадок наносили на каплю заключающей среды (желатин) на предметном стекле, накрывали покровным стеклом и для стабилизации образца помещали на 10 минут в холодильную камеру при +4°С. Полученные образцы анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с компьютерной регистрацией изображения на микроскопе Leica DM5000B при увеличении в 1000 раз с компьютерной регистрацией изображения. Процент КАР-положительных тромбоцитов определялся подсчетом окрашенных клеток в 10 и более полях зрения при суммарной оценке 2000 клеток в каждом препарате. 2.4 Методы статистической обработки результатов исследований Статистическая обработка полученных результатов включала методы описательной статистики: вычисление средних, стандартных отклонений, а также медианы и 25й и 75й перцентилей, определение критериев значимости - тест Манна-Уитни и F-критерий Фишера. Сравнение групп осуществлялось критерием Стьюдента для нормальных распределений, а также критерием Крускала-Уоллиса для ненормальных распределений. При сравнении групп 66 использовались непараметрические методы: U-тест Манн-Уитни для сравнения непрерывных величин. Значение р<0,05 считалось статистически значимым. Корреляционный анализ между переменными проводился по методу Спирмена. Степень корреляционной взаимосвязи между признаками оценивалась в зависимости от значений коэффициента корреляции R. Для сопоставления диагностической ценности различных показателей применялся «ROC-анализ» (Receiver Operating Characteristic) с помощью построения характеристических кривых зависимости чувствительности и специфичности исследуемых признаков. Наибольшее значение площади под ROC-кривой показателя характеризовало (наилучшее наивысшую соотношение диагностическую между ценность чувствительностью и специфичностью в отношении исследуемого явления). Ввод данных, их редактирование и статистический анализ осуществлялся с помощью статистического пакета Статистика 8, SPSS 20. 67 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Данные магнитно-резонансной томографии (МРТ) сердца у больных групп «блокады» и «КМП» Для оценки структуры миокарда, а также для исключения воспалительного генеза нарушений проводимости сердца, пациентам группы «блокады» было выполнено МРТ сердца с в/в контрастированием гадолиний содержащим препаратом. По такому же протоколу было выполнено МРТ больным группы «КМП». Результаты, полученные в обеих группах, были сопоставлены между собой. Из 61 больных обеих групп («блокады» n=38; «КМП» n=23) МРТ сердца удалось провести 55 пациентам. Выполнить исследование оказалось невозможным у двоих больных на фоне тяжелого клинического состояния, у троих – в связи с имплантированным электрокардиостимулятором и в одном случае – из-за выраженной клаустрофобии. У 11 из 55 (20%) пациентов не удалось интерпретировать полученные результаты в связи с выраженными артефактами изображения на фоне нарушений ритма сердца. В полной мере результаты МРТ сердца удалось оценить и сопоставить между собой у 22 больных из группы «КМП» и 22 – из группы «блокады». На первом этапе исследования до введения контрастного препарата у всех пациентов группы «КМП» проводилась оценка морфологии и функции сердца. Результаты представлены в таблице 7. Согласно данным таблицы, у больных группы «КМП» в отличие от пациентов группы «блокады» отмечалось расширение полости и увеличение объема миокарда ЛЖ, значительное снижение его УО, а также сократительной способности (КДО ЛЖ 261,4±133,9 мл, КСО ЛЖ 219,7±131,3мл, ФВ ЛЖ 20,3±13,6 УО ЛЖ 41,3±17,5, объем миокарда ЛЖ 130,9±80,7 см3). В то же время у пациентов группы «блокады» отмечались нормальные размеры анатомических структур и нормальная сократительная функция миокарда ЛЖ (КДО ЛЖ 107,3±25,1мл, КСО ЛЖ 49,3,7±9,96 мл, ФВ ЛЖ 52,2±4,5мл, УО ЛЖ 66,8±13,7 мл, объем 68 миокарда ЛЖ 71,9±15,8 см3; р=0,0015, 0,002, 0,0001, 0,002, 0,0012 соответственно). Таблица 7. Оценка анатомических структур и функции сердца по данным МРТ в группах «блокады» и «КМП» Показатели МРТ сердца Конечный диастолический объем левого желудочка, мл (КДО ЛЖ) Конечный систолический объем левого желудочка, мл (КСО ЛЖ) Фракция выброса левого желудочка, % (ФВ ЛЖ) Ударный объем левого желудочка (УО ЛЖ) Объем миокарда левого желудочка (см3) Группа «блокады» Группа «КМП» Р M±SD M±SD 107,3±25,1 261,4±133,9 0,0015 49,3,7±9,96 219,7±131,3 0,002 52,2±4,5 20,3±13,6 0,0001 66,8±13,7 41,3±17,5 0,002 71,9±15,8 130,9±80,7 0,0012 Примечание: обозначения M – среднее значение, SD – стандартное отклонение. Для оценки возможных воспалительных изменений в миокарде у пациентов обеих группы была проведена МРТ по трем стандартным методикам: оценка отека миокарда на Т2-взвешенных изображениях, а также раннего (РК) и позднего (ПК) контрастирования гадолиний-содержащим контрастом. Полученные результаты исследования представлены в таблице 8. Отек на Т2 взвешенных изображениях выявлялся в 2-7 сегментах у 4 (18,2%) пациентов группы «блокады» и в 3-11 сегментах у 8 (36,4%) больных группы «КМП». Признаки отека выявлялись в сегментах различной локализации.. При оценке РК на Т1 взвешенных изображениях усиление интенсивности МР-сигнала определялось в 3-17 сегментах у 7 (31,8%) пациентов группы «КМП» и в 3-10 сегментах у 7 (31,8%) – группы «блокады». У пациентов группы «блокады» зоны гиперемии располагались 69 преимущественно в перегородочной и боковой стенке, у пациентов группы «КМП» зоны гиперемии выявлялись с одинаковой частотой в различных сегментах миокарда ЛЖ. В некоторых случаях зона гиперемии совпадала с зонами отека или ПК (рис. 5,6) Таблица 8. Оценка результатов МРТ сердца, по трем стандартным методикам, выполненным в группах «блокады» и «КМП» Пациенты с признаками отека на Т2взвешенных изображениях Количество сегментов ЛЖ с выявляемым отеком Пациенты с положительным феноменом раннего контрастирования миокарда (РК) Количество сегментов ЛЖ с феноменом раннего контрастирования Пациенты с наличием позднего контрастирования (ПК) Количество сегментов ЛЖ с феноменом позднего контрастирования (ПК) Объем поражения, (см3). % миокарда с феноменом ПК от общего объема миокарда Количество пациентов с двумя и более положительными МРТ-феноменами Группа «блокады» (n=22) Группа «КМП» (n=22) Р 4 (18,2%) 8(36,4%) 0,38 от 2 до 7 от 3 до 11 - 7 (31,8%) 7 (31,8%) 0,94 от 3 до 10 от 3 до 17 0 12 (54,5%) от 2 до 17, 0 - 0 22,8[16,95;51,1] - 0 26,6[12,3;41,7] - 2 (9,1%) 7 (31,8%) 0,024 Примечание: данные представлены как Me – медиана, [25, 75] –25-й и 75-й перцентиль. В фазу позднего контрастирования у лиц группы «блокады» зоны патологического накопления гадолиния обнаружены не были. В противоположность этому у 12 пациентов группы «КМП» присутствовали очаги ПК, что свидетельствовало о наличии фиброзно-некротических очагов в миокарде. У четырех пациентов с феноменом ПК очаги располагались преимущественно субэндокардиально, еще у четверых – субэпикардиально, у остальных четырех регистрировался различный характер очагов, включая трансмуральный. Количество пораженных сегментов у ПК-положительных 70 больных колебалось от 2 до 17, процент пораженного миокарда составлял от 6,5 до 59% , в среднем 26,6 [12,3;41,7] %. Поскольку критерием воспалительного поражения миокарда является наличие более двух воспалительных феноменов, мы проанализировали обе исследуемые группы согласно этому критерию. В группе блокады у двух (9,1%) пациентов отмечалось наличие двух МРТ-феноменов. В обоих случаях регистрировался отек и гиперемия миокарда, хотя по другим параметрам они не отличались от остальных больных данной группы. В группе «КМП» два и более положительных феномена было зарегистрировано у 7 (31,8%) больных, из них у двух отмечались все три МРТ-признака воспаления (рис. 5, 6). Таким образом, результаты МРТ сердца позволили заподозрить воспалительное поражение миокарда у 9,1% больных группы «блокады» и у 31,8% больных группы «КМП». 71 Рисунок 5. Сопоставление с помощью модели сегментарного деления «бычий глаз» патологических зон, выявленных при МР-исследовании сердца с использованием разных методик. Синим отмечены зоны отека на Т2 взвешенных изображения, красным – зоны гиперемии, зеленым – зоны, в которых выявлялись участки фиброза, диагностируемые благодаря позднему накоплению гадолиний содержащего препарата. А, Б – примеры изображений сердец пациентов группы «блокады»: А – пациент с блокадой левой ножки пучка Гиса, Б – пациентка с АВ-блокадой 3-ей степени. В, Г – изображения сердца пациентов группы «КМП». В – результаты исследования пациентки с БЛНПГ, Г – пример исследования пациентки без БЛНПГ. 72 Рисунок 6. Изображения МРТ. А, Б – пациент группы «блокады» с сочетанием двух МР-критериев воспаления – отека (А, стрелками обозначена зона отека в МЖП) и раннего контрастирования (Б, стрелкой обозначена зона РК в МЖП). В, Г, Д – пациентка группы «КМП» с сочетанием трех МР-критериев воспаления – отека (В, стрелкой обозначена зона отека), раннего (Г, стрелкой обозначена зона РК) и позднего контрастирования (Д, зоны ПК указаны стрелками). 3.2. Исследование периферических маркеров воспаления В ходе следующего этапа исследования был проанализирован уровень провоспалительных цитокинов – фактора некроза опухоли альфа (ФНОα), интерлейкина 6 (ИЛ-6) и трансформирующего ростового фактора бета 1 (ТРФ-β1) в периферической крови в трех исследуемых группах – «блокады», «КМП» и в контрольной. Результаты сопоставлены с референсными значениями диагностических наборов. Частота встречаемости пациентов с уровнем цитокинов, превышающем референсные значения, представлена в таблице 9. 73 Таблица 9. Количество пациентов с уровнем воспалительных маркеров, превышающим референсные значения диагностических тестов, в группах «блокады», «КМП» и контроля «блокады» n=38 N % 8 21,1 2 5,3 17 44,7 Маркер воспаления ФНОα ИЛ-6 ТРФ-β1 Примечание: n – число воспалительных маркеров Группа «КМП» n=23 N % 14 60,8 6 26,1 4 17,4 пациентов с присутствием контроля n=12 N % 1 8,3 0 0 0 0 в сыворотке У всех здоровых добровольцев из группы контроля ИЛ-6 и ТРФ-β1 были в пределах нормальных значений, а ФНОα выявлялся только в одном случае, и его уровень был намного ниже, чем у обследованных больных. Среди пациентов группы «КМП» ФНОα выявлялся в крови 60,8%, повышенный уровень ИЛ-6 в крови 26,1% больных, что было достоверно чаще, чем среди пациентов группы «блокады», у которых ФНОα определялся у 21,1 % больных, а ИЛ-6 – у 5,3% (р=0,024, 0,016). Наличие этих цитокинов в сыворотке крови у больных группы «КМП», вероятно, свидетельствует о высокой активности провоспалительных механизмов. Однако факт выявления пациентов с повышенным уровнем провоспалительных цитокинов среди больных группы «блокады», возможно, указывает на воспалительную этиологии идиопатических нарушений проводимости сердца у части больных этой группы. Кроме того, среди пациентов группы «блокады» достоверно чаще наблюдалось высокое содержание профибротического цитокина ТРФβ1 (в 44,7 % случаев по сравнению с 17,4% в группе «КМП», р=0,012). Сопоставление концентраций маркеров воспаления с помощью теста Крускала-Уоллиса, позволило выявить ряд отличий между исследуемыми группами (рис. 7). Уровни ФНОα и ИЛ-6 у пациентов группы «КМП» были достоверно выше, чем у лиц группы контроля (3,54[0;86,68] против 0[0;0] пг/мл для ФНОα, р=0,0195 и 2,64[0,19;12,79] против 0,095[0;1,75] пг/мл, 74 р=0,019 для ИЛ-6 соответственно). В тоже время различия в значениях ФНОα и ИЛ-6 между группами «блокады» и «КМП» были недостоверны. В свою очередь у больных группы «блокады» был зарегистрирован более высокий уровень ТРФ-β1 по сравнению со здоровыми лицами (3567 [0;21545] против 0[0;0], р=0,019). Рисунок 7. Уровень периферических маркеров воспаления в группах «блокады» (группа 1, n=38), «КМП» (группа 2, n=23) и контрольной (группа 3, n=12).Данные представлены как медиана и 25-й и 75-й перцентиль, Min –минимальное значение показателя; Max – максимальное значение показателя. Необходимо отметить, что отдельно проведенный корреляционный анализ, выполненный по данным больных группы «КМП», не выявил взаимосвязей между клинико-инструментальными показателями 75 (функциональным ЭХОКГ, классом ХМЭКГ, МРТ сердечной сердца) и недостаточности, исследуемыми параметрами периферическими маркерами воспаления. Полученные нами данные указывают на доминирующую роль в группе «КМП» провоспалительных повышением уровней поддержанию механизмов, ФНОα и ИЛ-6, патогенетических проявляющихся синхронным что, вероятно, механизмов способствует воспалительного ремоделирования миокарда. В тоже время среди пациентов группы «блокады» повышение прогрессирующий уровня ТРФ-β1 интерстициальный может фиброз указывать, миокарда, как на и на так изолированное поражение проводящей системы сердца. 3.3. Исследование аутоантител к антигенным детерминантам, моделирующих различные участки β1-адренорецепторов и М2- холинорецепторов у пациентов групп «КМП», «блокады» и среди здоровых добровольцев В ходе проведенного исследования нами был проанализирован уровень антител к поверхностным мембранным рецепторам миокарда. Частота встречаемости больных со значениями уровней аутоантител к синтезированным пептидным последовательностям β1-адренорецептора и М2-холинорецептора, полученные в группах «блокады», «КМП» и контрольной группе, представлена в таблице 10. Для пациентов группы «КМП» было характерным присутствие в сыворотке крови антител IgG к β1-адренорецептору. Повышенный титр антител IgG к последовательности β8 определялся у 73% больных, что достоверно чаще, чем среди больных группы «блокады» и у лиц контрольной группы (p=0,035, 0,004 соответственно). Повышенный титр антител к последовательности β25 наблюдали у 39,1% больных этой группы. В свою очередь, антитела к М2-холинорецепторам, в частности, IgM к MRI-MRIV 76 выявлялись чаще у пациентов группы «блокады» (55,3% против 34,7% в группе «блокады» и 8,3% в группе контроля, p=0,04, 0,024 соответственно). При сравнительном анализе значений уровней аутоантител среди всех включенных в исследование пациентов, достоверные различия были получены только в отношении IgG к β8. (рис.8). Таблица 10. Количество больных с положительными значениями уровня антител к синтезированным пептидным последовательностям, моделирующим различные участки β1-адренорецептора и М2холинорецептора в группах «блокады» (n=38), «КМП» (n=23) и контроля (n=12). Синтезированные полипептидные фрагменты β1-адренорецептора и мускаринового М2-рецептора β8 IgM β8 IgG β25 IgM β25 IgG MRI MRIV IgM MRI MRIV IgG MRI IgM MRI IgG Группа «КМП» n=23 «блокады» n=38 N 1 8 3 7 21 2 10 3 % 2,6 21,1 7,9 18,4 55,3 5,2 26,3 7,9 n 3 17 9 8 8 7 6 5 % 13,0 73,9 39,1 34,7 34,7 30,4 26,0 21,7 контроля» n=12 n 0 2 0 0 1 1 1 2 % 0 16,7 0 0 8,3 8,3 8,3 16,7 Примечание: n – число пациентов с положительными значениями аутоантител Таким образом, как среди пациентов с нарушениями проводимости сердца, так и у больных группы «КМП» отмечено присутствие аутоантител к β1-адренорецептору и М2-холинорецептору. При этом у лиц группы «блокады» достоверно чаще диагностируются антитела IgM к М2холинорецептору (MRI MRIV), а у лиц группы «КМП» - антитела к β1адренорецептору β8 и β25). Данный факт может указывать на важную роль аутоиммунных механизмов как в патогенезе воспалительных заболеваний миокарда, так и в развитии и поддержании нарушений проводимости у больных без признаков органического поражения сердца. 77 Рисунок 8. Результаты сравнения уровня антител к синтезированным пептидным последовательностям, моделирующим различные участки β1-адренорецептора и М2холинорецептора, между больными из групп «блокады» (n=38, группа 1), «КМП» (n=23, группа 2) и контроля (n=12, группа 3). Данные представлены как Me – медиана; [25, 75] - 25-й и 75-й перцентиль, Min – минимальное значение показателя; Max - максимальное значение показателя. 3.4. Результаты иммуногистохимического и вирусологического исследования эндомиокардильных биоптатов пациентов группы «КМП». Всем пациентам группы «КМП» была выполнена ЭМБ (n=23). Ее основной диагностической задачей было выявление признаков активного воспаления в миокарде. 78 Для оценки активности воспалительного процесса был выполнен количественный и качественный анализ присутствия иммунных клеток в составе инфильтратов в образцах ЭМБ, проведенный по результатам иммуногистохимического исследования. У 14 (60,9%) из 23 больных, количество иммунных клеток в ЭМБ превышало 14 на 1 мм2, что соответствует общепринятым критериям активного миокардита [92]. Выявление признаков активного миокардита по результатам ЭМБ в сочетании с наличием дилатированных полостей позволило определить диагноз этих пациентов как воспалительная кардиомиопатия. У двух больных наблюдалось классическое очаговое поражение миокарда с массивными инфильтратами, включающими скопление воспалительных клеток, среди которых доминировали CD8+ Тклетки, а также активированные Т-лимфоциты CD45RO. Располагались данные инфильтраты по ходу интрамуральных сосудов и сопровождались отложением фибрина. Во всех остальных случаях инфильтрация в биоптатах имела диффузный характер без формирования очаговых клеточных скоплений и была представлена преимущественно макрофагами. У пяти из 23 больных (21,7%) воспалительной инфильтрации в миокарде не обнаружено, а имеющиеся морфологические изменения соответствовали идиопатической дилатационной кардиомиопатии. Еще в четырех случаях активная воспалительная инфильтрация не выявлялась, однако в биоптатах отмечался значительный очагово-интерстициальный фиброз, что соответствовало хроническому миокардиту с исходом в дилатационную кардиомиопатию. В дальнейшем были сопоставлены клинико-инструментальные характеристики больных с активным миокардитом и без него, результаты представлены в таблице 11. 79 Таблица 11. Сопоставление клинико-инструментальных показателей у больных с гистологически доказанным активным миокардитом и без его признаков. Средний возраст (лет) Пол (м) Длительность заболевания от момента клинического дебюта до включения в исследование (лет) СН, ФК (NYHA) ФВЛЖ (%) КДРЛЖ (см) Данные КДОЛЖ (мл) ЭХОКГ Дилатация ПЖ СДЛА (мм рт.ст.) ЧСС средняя (уд/мин) ЧСС максимальная (уд/мин) ЧСС минимальная (уд/мин) Данные ХМЭКГ Общее количество ЖЭ Пробежки ЖТ Наличие БЛНПГ Данные ЭМБ Процент интерстициального фиброза в препарате Степень гипертрофии кардиомиоцитов по трехбалльной шкале Больные с активным миокардитом (n=14) 43,7±11,8 6(42,8%) Больные без признаков миокардита (n=9) 43,3±9,9 5(55,6%) 0,67 0,78 0,87[0,5;4,5] 3,0[1,12;9,5] 0,006 2,2±1,25 2,3±1,4 33,2±9,0 29,5±6,0 7,14±0,87 7,3±0,8 236±92 284±127 4(28,6%) 5(55,6%) 32,5[25;43] 50[31;62,5] 71,6±11,6 71,3±6,8 122±25 115±17 51,4±9,7 47,1±4,3 1092 [80;3948] 3064[659;4443] 1,5[1,0;5,0] 3,0[1,5;4,5] 7(50%) 7(77,8%) Гистологические характеристики 0,68 0,85 0,32 0,66 0,06 0,89 0,16 0,33 0,25 0,52 0,45 0,59 25,4±10,2 26,3±11,9 0,85 1,57±064 2,125±0,8 0,09 3(33,3%) 0,36 Наличие вирусов 6(42,8%) Парвовирус В19 Р Примечания: Данные представлены как М (±σ), как Ме [25;75] или как количество больных (в%). БЛНПГ – блокада левой ножки пучка Гиса, ФВ ЛЖ – фракция выброса левого желудочка, КДО ЛЖ – конечно-диастолический объем левого желудочка, КДР ЛЖ – конечно-диастолический размер левого желудочка, СДЛА – систолическое давление в легочной артерии, ЖЭ – желудочковые экстрасистолы, ЖТ – желудочковая тахикардия, ЧСС – частота сердечных сокращений, СН – сердечная недостаточность, ФК – функциональный класс. Значение р<0,05 считалось статистически значимым. Как видно из таблицы 12, для больных с активным миокардитом была характерна меньшая продолжительность заболевания от момента клинического дебюта до включения в исследование(r=-0,56, p=0,006). У них несколько реже встречалась дилатация правых отделов сердца, и наблюдалась тенденция к меньшей степени гипертрофии кардиомиоцитов. Других существенных клинико-инструментальных отличий у этих больные обнаружено не было. 80 Исходя из возможности инфекционной этиологии воспалительного поражения миокарда, биоптаты больных были проанализированы на наличие основных кардиотропных вирусов. 15 из 23 биоптатов были проанализированы на присутствие вируса Коксаки В3, во всех случаях выявить этот вирус не удалось (рис.9). Рисунок 9. Определение вируса Коксаки В3 в лизатах эндомиокардиальных биоптатов методом ПЦР анализа (n=15). К – положительный контроль (вирус Коксаки В3), номером указан порядковый номер пробы. Вирусы герпеса 1-2 типа, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус не были обнаружены во всех 23 биоптатах. В образцах ЭМБ у 9 из 23 больных (39,1%) был обнаружен парвовирус В19 в количестве от 87 до 250 000 копий ДНК на 1 мл лизата. В одном случае наличие парвовируса было ассоциировано с вирусом герпеса 6 типа в количестве 106 копий на 1 мл лизата. Сопоставление клинико-инструментальных данных больных с персистирующей парвовирусной инфекцией и без нее не выявило различий по таким показателям, как длительность заболевания, функциональный класс сердечной недостаточности, эхокардиографические данные, данные ХМЭКГ. Достоверных отличий у больных с диагностированной вирусной инфекцией, кроме присутствия CD68+ клеток, также не было обнаружено при сопоставлении результатов анализа эндомиокардиальных биоптатов (таблица 12). Более того, персистенция вируса в ЭМБ не всегда сопровождалась 81 гистологическим диагнозом активного миокардита (p=0,49). Количество иммунных клеток в инфильтратах биоптатов больных с парвовирусом и без него было сопоставимо, за исключением макрофагов, присутствующих в ЭМБ больных с парвовирусом в достоверно большем количестве (p=0,04). Таблица 12. Анализ результатов исследования эндомиокардиальных биоптатов с персистирующей парвовирусной инфекцией и без нее. Больные с парвовирусом (n=9) Гистологические характеристики Процент интерстициального фиброза в 20,6±7,4 препарате Данные ЭМБ Степень гипертрофии кардиомиоцитов по 1,375±0,5 трехбалльной шкале Диагноз активного миокардита 6(66,7%) Качественный состав клеток в инфильтрате CD3+ (Т-клетки) 8[4;22] CD4+ (Т-хелперы) 2,5[2;10] CD8+ (Т-киллеры) 5[3;15] CD68+ (макрофаги) 23,5[8,5;57,5] CD45RO (активированные Т-клетки) 2,0[0;3] Больные без парвовируса (n=14) Р 28,5±11,3 0,09 2,0±0,78 0,58 8 (57,1%) 0,49 6[3;11] 3[1;3] 5 [1;7] 4,5[1;15] 3,0[1;5,5] 0,53 0,49 0,37 0,04 0,28 Примечания: обозначения как в предыдущей таблице. Корреляционный анализ не выявил взаимосвязей между количеством копий вируса и клинико-инструментальными параметрами (функциональным классом СН, показателями ЭХОКГ, ХМЭКГ, МРТ сердца), а также выраженностью воспалительных изменений миокарда, оцениваемой по общему количеству воспалительных клеток и активированных Т-лимфоцитов (r=0,19, 0,14 соответственно). Так, в некоторых случаях у больных с большим количеством копий парвовируса в миокарде (до 250 тыс копий парвовируса В 19 на 1 мл лизата) инфильтрация иммунными клетками полностью отсутствовала (рис. 10А,Б). В то же время у больных со значительной клеточной инфильтрацией в миокарде парвовирус мог как полностью отсутствовать (рис. 10В,Г), так и присутствовать в значительном количестве (рис. 10Д,Е). 82 Таким образом, проведение ЭМБ в 60,9% случаев позволяет выявить активное воспалительное поражение миокарда, не диагностированное в ходе стандартного клинико-инструментального обследования. В ходе поиска вероятного этиологического фактора в генезе воспалительного поражения сердца в исследуемых биоптатах был выявлен парвовирус В19. Однако статистический анализ показал отсутствие связи между наличием вируса в тканях сердца и активностью клеточной реакции миокарда. Рисунок 10. Сопоставление клеточной инфильтрации и наличия вирусов в миокарде. А, В, Д – окраска срезов ЭМБ гематоксилин-эозином; Б,Г,Е – иммуногистохимическая окраска на наличие иммунных клеток Ядра клеток докрашены гематоксилином. (Б – окраска пероксидазным методом, Г – окраска щелочной 83 фосфатозой, Е – двойная метка). А,Б – препарат ЭМБ с полным отсутствием воспалительной инфильтрации в миокарде. Количество парвовируса В 19 – 250 тыс копий на 1 мл лизата миокарда. В, Г – препарат ЭМБ с диффузной клеточной инфильтрацией. Вирусы в препарате не обнаружены. Д, Е – препарат ЭМБ с выраженной очаговой клеточной инфильтрацией миокарда. Е – иммуногистохимическая окраска двойной меткой: пероксидазный способ окраски – CD3+ лимфоциты (коричневый цвет), окраска щелочной фосфатазой – CD68+ макрофаги (розовый цвет). Количество парвовируса В 19 в миокарде больного – 3,5 тыс копий на 1 мл лизата. 3.5 Исследование экспрессии Коксаки-аденовирусного рецептора (КАР) в образцах ЭМБ больных группы «КМП» Анализ материала ЭМБ методом ПЦР не выявил персистенции вируса Коксаки В3 у пациентов группы «КМП». Это сделало особенно интересным исследование экспрессии специфического рецептора этого вируса – КАР, роль которого в развитии вирусных миокардитов хорошо известна. В связи с предполагаемым участием КАР в дезорганизации межклеточных контактов и нарушении проводимости сердца, биоптаты больных группы «КМП» (n=23) были проанализированы на наличие этого рецептора. По степени интенсивности окраски на КАР пациенты были разделены на три подгруппы (рис.11). У больных, отнесенных к первой подгруппе КАРэкспрессии (минимальная КАР-экспрессия, n=3), отмечалось еле заметное окрашивание на КАР мембран кардиомиоцитов (рис. 11Г). Для второй степени КАР-экспрессии (n=14) было характерно слабое окрашивание клеточных мембран, гомогенное окрашивание цитоплазмы клеток, четкое окрашивание вставочных дисков (рис. 11В). Для больных с максимальной (третьей) степенью экспрессии КАР (n=6) было характерно плотное окрашивание в области вставочных дисков, а также по всей поверхности мембраны кардиомиоцитов, что наблюдалось и на поперечных, и на продольных срезах (рис. 11А,Б). Кроме того, в некоторых биоптатах отмечалось окрашивание межклеточного интерстициального пространства и медии интрамуральных сосудов (рис. 11Б). Согласно статистическому анализу с использованием критерия Крускала-Уоллиса, проведенному в соответствии со степенями интенсивности окраски на КАР, больные с 84 максимальной наличием интенсивностью дилатации правого окраски (третья желудочка функциональным классом сердечной степень) (p=0,012) недостаточности отличались и большим (p=0,048), чем больные с умеренной (второй) и низкой (первой) степенью КАР-экспрессии. При сопоставлении интенсивности окрашивания мембран кардиомиоцитов на КАР с присутствием парвовируса в миокарде и количеством воспалительных клеток CD3+, CD4+,CD8+, CD68+, CD45RO положительных корреляции выявить не удалось. Слабая обратная корреляционная взаимосвязь была обнаружена между количеством КАР на мембранах кардиомиоцитов и процентом интерстициального фиброза миокарда (r =0,42). Рисунок 11. Иммуногистохимическая окраска на КАР срезов ЭМБ. Ядра клеток докрашены гематоксилином. А, Б – препараты ЭМБ больного с тяжелой воспалительной кардиомиопатией, относящегося к 3-ей подгруппе по степени интенсивности окраски на КАР. А – продольный срез кардиомиоцитов. Отмечается интенсивное окрашивание 85 вставочных дисков, умеренное латеральных мембран и интерстициального пространства (стрелками указаны вставочные диски). Б – поперечный срез. Интенсивное равномерное окрашивание мембран кардиомиоцитов, интерстициального пространства, медии интрамурального сосуда (указано стрелкой). В – ЭМБ больного с воспалительной кардиомиопатией из 2-ой подгруппы по степени интенсивности окраски на КАР. Визуализируется слабое прокрашивание мембран клеток, умеренное окрашивание цитоплазмы, интерстиция, вставочных дисков (указаны стрелкой). Г – ЭМБ больного с воспалительной кардиомиопатией из 1-ой подгруппы по степени интенсивности окраски на КАР. Отмечается еле заметное окрашивание мембран клеток (указано стрелкой). Еще одним фактором, взаимосвязанным с экспрессией КАР на мембранах кардиомиоцитов, оказалась ширина комплекса QRS. У больных с узким комплексом QRS (без признаков БЛНПГ) интенсивность окраски мембран кардиомиоцитов на КАР по трехбалльной шкале была достоверно выше, чем у пациентов с широким комплексом QRS (с БЛНПГ). Этот факт был подтвержден наличием обратной корреляционной связи: чем интенсивней была экспрессия КАР на мембранах кардиомиоцитов, тем меньше была вероятность БЛНПГ (r=-0,44, p<0,05). Для выявления показателей, связанных с повышением экспрессии КАР на мембранах кардиомиоцитов, было проведено ее сопоставление с уровнем периферических маркеров воспаления. В ходе анализа было обнаружено, что у больных с уровнем ИЛ-6, превышающим референсные значения, интенсивность экспрессии КАР на мембранах кардиомиоцитов достоверно выше, чем у больных с нормальными значениями этого показателя (2,5±0,55 против 2,0±0,43, p=0,036). Взаимосвязи КАР экспрессии с другими маркерами воспаления – ФНО-α и ТРФ-β1, выявить не удалось. Таким образом, в ходе данного этапа исследования была обнаружена связь экспрессии КАР с повышением концентрации ИЛ-6 в сыворотке крови у лиц с воспалительным поражением сердца. Одновременно наибольшее содержание КАР рецептора выявлено у больных с узким комплексом QRS, более тяжелым поражением миокарда по данным эхокардиографического исследования и большим функциональным классом сердечной недостаточности, что, вероятно отражает структурное ремоделирование кардиомиоцитов. 86 3.6 Исследование экспрессии Коксаки-аденовирусного рецептора (КАР) на тромбоцитах больных исследуемых групп, а также здоровых добровольцев В рамках поиска дополнительного маркера, способного определять воспаление в миокарде у пациентов с идиопатическими нарушениями проводимости, а также учитывая данные, полученные в ходе исследования экспрессии КАР на кардиомиоцитах больных группы «КМП», нами был проанализирован уровень экспрессии КАР клетками периферической крови – тромбоцитами. У здоровых добровольцев только незначительная часть тромбоцитов экспрессировала КАР. Количество КАР-положительных тромбоцитов у них колебалось от 0,2% до 6,4 % и составило в среднем 1,75 [0,75;3,4] %. В обеих группах больных число КАР-положительных тромбоцитов было достоверно выше, чем в группе здоровых добровольцев, и составило 4,5 [2,0;8,9]% в группе «блокады» (р=0,039) и 8,0 [4,0;19,0]% (p=0,0002) в группе «КМП» (рис. 12). 87 Рисунок 12. Процент КАР-положительных тромбоцитов в группах «блокады» (группа 1, n=38), «КМП» (группа 2, n=23) и в контрольной группе (группа 3, n=12). Данные представлены как медиана и 25-й и 75-й перцентиль, Min –минимальное значение показателя; Max – максимальное значение показателя. Статистически значимых отличий между группами «блокады» и «КМП» не выявлено (р=0,23). При подробном изучении экспрессии КАР на тромбоцитах было обнаружено, что на клетках здоровых добровольцев этот рецептор экспрессирован гомогенно по всей поверхности (рис. 13А,Б). У больных исследуемых групп повышенная экспрессия КАР определялась в местах контактов между клетками (рис.13В,Г). Тромбоциты с экспрессированным на мембране рецептором находились преимущественно в составе мелких агрегатов и достаточно редко в свободном виде. Прямое сопоставление экспрессии КАР на кардиомиоцитах и тромбоцитах среди лиц группы «КМП» не позволило выявить достоверных корреляционных взаимосвязей. Учитывая, что в группе здоровых добровольцев максимальное количество тромбоцитов, экспрессирующих КАР на мембране, составило 6,4%, за условную границу КАР-позитивности было выбрано количество КАР-положительных тромбоцитов, равное 7%. Исходя из введенного нами критерия, были отобраны 28 больных (13 из группы «блокады» и 15 из группы «КМП») с процентом тромбоцитов, экспрессирующих КАР, превышающим 7 %. В результате были сформированы 2 группы пациентов: КАР-позитивные (более 7% КАР-положительных тромбоцитов) и КАРнегативные (менее 7%). При анализе периферических показателей воспаления в сформированных группах нами были обнаружен ряд достоверных отличий (таблица 13). 88 Рисунок 13. Иммунофлуоресцентная окраска тромбоцитов на КАР здорового добровольца контрольной группы (А, Б) и больного группы «КМП» (В, Г). А – образец обогащенной тромбоцитами плазмы здорового добровольца. Б – то же поле, окраска тромбоцитов на КАР. КАР распределен гомогенно по всей цитоплазме клеток. В – образец обогащенной тромбоцитами плазмы больного группы «КМП». Тромбоциты объединены в микроагрегаты. Г – то же поле, окраска тромбоцитов на КАР. Повышенная экспрессия КАР определяется в местах межклеточных контактов. А, В – световая микроскопия. Б, Г – иммунофлуоресцентная микроскопия, увеличение х1000. В подгруппе КАР-позитивных больных зарегистрирован достоверно более высокий уровень IgG к β25 и IgG к MRI по сравнению с группой лиц с низкой (менее 7%) экспрессией КАР (1,099±0,73 против 0,68±0,21, p=0,009 и 0,97±0,36 против 0,67±0,12, р=0,026). Аналогичные результаты были получены и в отношении ФНО-α и ИЛ-6. Среди пациентов с высокой экспрессией КАР на мембранах тромбоцитах значения ФНО-α и ИЛ-6 были достоверно выше, чем у лиц с экспрессией КАР, не превышающей 7% 89 (0[0;3,54] против 4,94[0;75,1] пг/мл, p=0,024 и 3,76[0,19;13,58] пг/мл против 0,19[0;0,97] пг/мл, p=0,024 ). Таблица 13. Сравнение периферических маркеров воспаления у КАРпозитивных (более 7% тромбоцитов) и КАР-негативных (менее 7% тромбоцитов) больных групп «КМП» и «блокады» Периферические показатели Антитела IgG к β25 Антитела IgG к MRI ФНОα ИЛ-6 КАРнегативные больные (n=33) 0,68±0,21 0,67±0,12 0[0;3,54] 0,19[0;0,97] КАРпозитивные больные (n=28) 1,099±0,73 0,97±0,36 4,94[0;75,1] 3,75[0,19;13,58] Р 0,009 0,026 0,0001 0,024 Примечания: Данные представлены как М (±σ) или как Ме [25;75] Для установления факторов, определяющих высокую концентрацию КАР на мембранах тромбоцитов, был проведен ROC-анализ. Этот анализ позволил выявить пять наиболее значимых показателей, связанных с повышенной экспрессией КАР на тромбоцитах: IgG β25, IgG MRI, ИЛ-6, ФНО-α, а также наличие 2 и более положительных МРТ феноменов (рис. 13). Как показано на рис. 8 наибольшей диагностической значимостью обладал уровень IgG к синтезированной полипептидной последовательности β25 (площадь [S] под кривой 0,889), что также было подтверждено в ходе сравнительного анализа. Вторым показателем аутоиммунного компонента воспаления, связанным с повышенной КАР-экспрессией на тромбоцитах, оказались антитела IgG к полипептидной последовательности MRI (S=0,722). Также значимыми для экспрессии КАР на тромбоцитах оказались такие маркеры воспаления, как ИЛ-6 (S=0,746) и ФНО-α (S=0,698). Повышение экспрессии КАР также определяется у больных с воспалением в миокарде, выявленным по данным МРТ сердца. Наличие двух и более положительных МРТ феноменов, указывающих на воспаление в 90 миокарде, продемонстрировало высокую значимость (S=0,75) для повышения КАР экспрессии. Рисунок 14. ROC-кривые, характеризующие признаки, имеющие наибольшее значение для повышения процента КАР-позитивных тромбоцитов для пациентов группы «блокады» и «КМП». Полученные данные свидетельствуют, что экспрессия КАР на тромбоцитах тесно взаимосвязана с аутоиммунными и провоспалительными показателями. К наиболее важным факторам, определяющим его повышение, относятся цитокины ИЛ-6, и ФНО и аутоантитела IgG к β25 и IgG к MRI. Подобная взаимосвязь свидетельствует о вероятной роли этого рецептора в сложных механизмах хронического воспаления и позволяет нам предложить использовать экспрессию КАР на тромбоцитах в качестве одного из периферических маркеров субклинических воспалительных поражений миокарда, проявляющихся нарушениями проводимости сердца. 91 3.7 Оценка значимости очагового и интерстициального фиброза в развитии нарушений ритма и проводимости у больных групп «КМП» и «блокады» Параллельно с текущим воспалительным процессом происходит активация противовоспалительных механизмов, способствующих репарации тканей. Унифицированным механизмом тканевого поствоспалительного ремоделирования является фиброзирование, которое в случае миокардиального воспаления может вовлекать как рабочий миокард, так и ткань проводящей системы сердца. Исходя из этого, задачей следующего этапа нашего исследования было изучение возможного вклада фиброза миокарда в развитие нарушений проводимости сердца у больных групп «КМП» и «блокады». По данным МРТ сердца очаговый фиброз миокарда (наличие очагов ПК) был выявлен нами у 12 (54,5%) из 22 больных группы «КМП». Сопоставление клинико-лабораторных показателей у ПК- позитивных и ПКнегативных пациентов позволило обнаружить, что больные с очаговым фиброзом миокарда характеризуются большим общим количеством ЖЭ (3643 [255;8500] против 659 [64;2403], р=0,04). Кроме того, эти пациенты характеризовалась большим уровнем IgG к β25 (1,16 [0,71;2,05] против 0,69 [0,54;0,93] соответственно, p=0,019) (рис.15). 92 Рисунок 15. Результаты сопоставления значений желудочковой экстрасистолии (ЖЭ) и уровня антител IgG к полипептидной последовательности β25 у больных группы «КМП» с зонами позднего контрастирования гадолинием (ПК) и без них. Данные представлены как медиана и 25-й и 75-й перцентиль, Min –минимальное значение показателя; Max – максимальное значение показателя. Корреляционный анализ также подтвердил тесную взаимосвязь между очаговым фиброзом миокарда, уровнем аутоантител IgG к последовательности β1-адренорецептора β25 и желудочковыми нарушениями ритма (рис.16). С его помощью выявлены ассоциации между общим количеством ЖЭ, наличием ЖТ, процентом миокарда с очаговым фиброзом (отношение объема миокарда с ПК к общему объему миокарда) и титром IgG к пептидной последовательности β25 (r=0,71; 0,55; 0,60 соответственно, p<0,05). 93 Рисунок 16. Взаимосвязь между уровнем антител IgG к последовательности β25, количественными проявлениями желудочковой эктопической активности и процентом объема миокарда ЛЖ с ПК по данным МРТ у больных группы «КМП». В группе «КМП» желудочковые нарушения ритма оценивались не в условиях отмены лекарственных препаратов, различия в медикаментозной терапии могли повлиять на достоверность разницы в проявлениях желудочковой эктопической активности в подгруппах. В связи с этим была предпринята попытка оценки влияния проводимой медикаментозной терапии на характер желудочковых аритмий в подгруппах. На момент записи ХМЭКГ из 12 больных с очаговым фиброзом миокарда четверо получали терапию бисопрололом, трое – карведилолом. Из шести больных без зон накопления гадолиния, находящихся на терапии бета-блокаторами, трое получали бисопролол и трое – карведилол. Антиаритмические препараты III класса (амиодарон) не получал никто. Статистический анализ не выявил достоверной разницы в проводимой терапии бета-блокаторами между исследованными подгруппами, что нивелировало возможность воздействия медикаментозной терапии на результаты исследования. 94 Таким образом, в ходе этой части анализа, выполненного на основании данных, полученных в группе «КМП», была подтверждена связь между очаговым фиброзом миокарда по данным МРТ, уровнем антитела к β1адренорецепторам, в частности, к синтезированной полипептидной последовательности β25 и желудочковыми нарушениями ритма. Таблица 14. Сопоставление показателей клинико-инструментальных исследований у больных с БЛНПГ и без нее. Средний возраст (лет) Пол (м) Длительность заболевания клинического дебюта до исследование (лет) СН, ФК (NYHA) Данные ЭХОКГ Данные ХМЭКГ от момента включения в Больные с БЛНПГ (n=12) 47,7±7,1 6 (50%) Больные без БЛНПГ (n=11) 35,4±11,3 5 (45,5%) 0,005 0,9 1,25[0,63;5,5] 1,25[0,75;3,0] 0,82 2,3±1,23 2,3±1,56 ФВ ЛЖ (%) 30±4,9 37±11,3 КДР ЛЖ (см) 7,4±0,9 7,1±0,8 КДО ЛЖ (мл) 240±127 227±82,6 Дилатацией ПЖ 5 (41,7%) 4 (36,4%) СДЛА (мм рт.ст.) 36,5[26,9;55] 35,0[21,5;50] ЧСС средняя, (уд/мин) 72±7,5 70,3±12,7 ЧСС максимальная, (уд/мин) 115±20,2 124,7±24,7 ЧСС минимальная, (уд/мин) 50,6±6,4 48,8±10,4 Общее количество ЖЭ 1492[54;3795] 1666[137;5063] Пробежки ЖТ 1,5[1;3] 4[1;14] Гистологические характеристики Процент интерстициального 28,1±12,8 22,7±0,7 фиброза в препарате Степень гипертрофии кардиомиоцитов по трехбалльной 2,0±0,7 1,5±0,7 шкале Признаки активного миокардита 7 (58,3%) 7 (63,6%) Р 0,94 0,24 0,17 0,32 0,82 0,57 0,86 0,30 0,49 0,34 0,14 0,35 0,046 0,64 Качественный и количественный состав клеток в инфильтрате Данные ЭМБ CD3+ (Т-клетки) CD4+ (Т-хелперы) CD8+ (Т-киллеры) CD68+ (макрофаги) CD45RO (активированные клетки) Т- 6,0[1,5;8,5] 3,0[2,0;3,0] 4,5[1,0;6,5] 5,5[1,5;15,5] 11,0[4,0;17,0] 3,0[1,0;10,0] 5,5[3,0;18,0] 5,0[3,0;66,0] 0,04 0,07 0,24 0,17 2,0[0;3] 3,5[1;5,75] 0,33 Наличие вирусов 4 (33%) 5(45,5%) Дополнительный исследуемый параметр Интенсивность окраски КАР на кардиомиоцитах по трехбалльной 1,9±0,5 2,4±0,5 шкале Парвовирус В19 0,75 0,04 Примечания: Данные представлены как М (±σ), как Ме [25;75] или как количество больных (в %). БЛНПГ – блокада левой ножки пучка Гиса, ФВ ЛЖ – фракция выброса левого желудочка, 95 КДО ЛЖ – конечно-диастолический объем левого желудочка, КДР ЛЖ – конечно-диастолический размер левого желудочка, СДЛА – систолическое давление в легочной артерии, ЖЭ – желудочковые экстрасистолы, ЖТ – желудочковая тахикардия, ЧСС – частота сердечных сокращений, СН – сердечная недостаточность, ФК – функциональный класс, ЭМБ – эндомиокардиальная биопсия, КАР – коксаки-аденовирусный рецептор. Значение р<0,05 считалось статистически значимым. Из 23 больных группы «КМП», включенных в исследование, 12 имели ЭКГ признаки БЛНПГ (ширина комплекса QRS 174,8±24,1 мс). Эти пациенты были выделены нами в отдельную группу. Другую группу составили больные без БЛНПГ (n=11, ширина комплекса QRS 80±12,1 мс). Группы были сопоставлены по основным клинико-инструментальным показателям и результатам эндомиокардиальной биопсии (табл. 14). Как видно из табл. 15 больные без БЛНПГ отличались более молодым возрастом (35,4±11,3 против 47,7±7,1, р=0,005). Кроме того, связь между наличием БЛНПГ и возрастом была подтверждена в ходе корреляционного анализа (r=0,57, p<0,05). Существенных отличий по тяжести сердечной недостаточности, а также по эхокардиографическим параметрам больные с БЛНПГ не обнаружили. Данные, приведенные в таблице, также свидетельствуют об отсутствии различий в количественных проявлениях клеточной инфильтрации в миокарде, наличии вирусов в биоптатах, а также интенсивности экспрессией КАР на мембранах кардиомиоцитов. Для оценки значимости фиброза миокарда в генезе БЛНПГ было выполнено МРТ сердца с отсроченным контрастированием. У 6 из 12 (50%) больных были обнаружены множественное поражение миокарда различной локализации, характерное для фиброзных изменений вследствие миокардита. Только у 2 из 12 больных (16,7%) были выявлено трансмуральные очаги ПК в области МЖП (рис.17А). Исследование образцов ЭМБ, взятых из перегородочной зоны у этих же пациентов, подтвердило соответствие выявленных с помощью МРТ участков ПК зонам крупноочагового фиброза (рис. 17Б). В участках фиброза миокарда среди масс коллагеновых волокон были «замурованы» остатки некротизированных кардиомиоцитов. Кроме 96 того, у них отсутствовали признаки активной клеточной инфильтрации, что свидетельствовало о тяжелом постмиокардитическом кардиосклерозе. При сопоставлении степени интерстициального фиброза в исследуемых образцах биоптатов больных с БЛНПГ и без нее значимых различий выявить не удалось (28,1±12,8 эндомиокардиального против биоптата, 22,7±0,7% p=0,35) (рис. от общей 17Г). При площади анализе интерстициального фиброза среди всех пациентов группы «КМП» была обнаружена тенденция к его повышению у больных с меньшими значениями ФВ ЛЖ. Кроме того, среди лиц с высоким процентом интерстициального фиброза была показана более значительная степень гипертрофии кардиомиоцитов (r=0,53, p<0,05). Гистологическая картина препаратов ЭМБ пациентов группы «КМП», выявила более выраженную гипертрофию кардиомиоцитов среди больных с БЛНПГ (2,0±0,7 против 1,5±0,7, р=0,046), что было подтверждено наличием прямой зависимости между степенью гипертрофии кардиомиоцитов и шириной комплекса QRS (r=0,43, p<0,05). 97 Рисунок 17. Оценка очагового (по данным МРТ) и интерстициального фиброза по данным ЭМБ. А – МРТ оценка очагов позднего контрастирования гадолинием интрамурального характера у больной с БЛНПГ с множественным постмиокардитическим поражением миокарда. Участки накопления контраста указаны красными стрелками. Б – ЭМБ. Биоптат, взятый из базальных отделов перегородки у той же больной. Выявляются признаки значительного очагового фиброза (указано белой стрелкой), подтвержденного данными МРТ о наличии очагов позднего контрастирования. Среди коллагеновых волокон отмечаются единичные «замурованные» кардиомиоциты (показаны черной стрелкой). Окраска по Массону. В – обсчет с помощью Aperio ScanScope CS в режиме Positive Pixel Count препарата (окрашивание по Массону) степени интерстициального фиброза. Синим (указано стрелкой) обозначены участки интерстициального фиброза миокарда. Г – образец ЭМБ с признаками диффузного интерстициального фиброза, без признаков накопления гадолиний содержащего контраста (больной без БЛНПГ). Окраска по Массону Таким образом, наличие фиброзного поражения межжелудочковой перегородки, выявляемого по данным МРТ и подтвержденного в ходе ЭМБ только у двух из 12 пациентов, вероятно, обусловило возникновение БЛНПГ. Данные МРТ свидетельствуют также об отсутствии признаков позднего накопления гадолиния у больных группы «блокады». Все это позволяет предположить, что очаговый фиброз миокарда не всегда является 98 необходимым условием для формирования нарушений ВЖ проводимости по типу БЛНПГ как у пациентов с тяжелым органическим поражением сердца, так и у больных без признаков органического поражения сердечнососудистой системы. 3.8 Определение значимости воспалительного компонента в формировании нарушений ВЖ проводимости у пациентов группы «КМП», а также ВЖ и АВ проводимости у пациентов группы «блокады» Для сопоставления активности воспалительного процесса у пациентов группы «КМП» с нарушением ВЖ проводимости и без нее был проведен количественный и качественный анализ иммунных клеток в составе инфильтратов образцов ЭМБ. У больных без БЛНПГ зарегистрировано достоверно более высокое содержание CD3+ клеток (p=0,04). Кроме того, у 2 больных этой подгруппы наблюдалось классическое очаговое поражение миокарда с массивными инфильтратами, представленными скоплением воспалительных клеток, в которых доминировали активированные Тлимфоциты CD8+, CD45RO клетки. Располагались данные инфильтраты по ходу интрамуральных сосудов и сопровождались отложением фибрина. Инфильтрация в биоптатах больных с БЛНПГ во всех случаях имела диффузный характер без формирования очаговых клеточных скоплений и была представлена в основном макрофагами. Таким образом, в ходе данного этапа работы было обнаружено, что больных с БЛНПГ группы «КМП» были старше, у них отмечалась повышенная степень гипертрофии кардиомиоцитов и меньшее число CD3+ клеток в инфильтратах. Отличий по степени интерстициального фиброза миокарда у пациентов с БЛНПГ и без нее не выявлено. Полученные результаты, вероятно, указывают на длительный анамнез заболевания, а также на хронический характер воспалительного процесса в миокарде больных с БЛНПГ группы «КМП», ведущий к значительному структурному 99 ремоделированию в первую очередь самих кардиомиоцитов, а не интерстициального пространства Для определения значимости системного воспаления в формировании нарушений ВЖ проводимости нами были сопоставлены показатели периферических маркеров воспаления у больных с БЛНПГ из группы «КМП» (n=12) и отдельно выделенной подгруппы пациентов с нарушением ВЖ проводимости из группы «блокады» (n=24) (рис. 18). Рисунок 18. Уровень периферических маркеров воспаления у пациентов с БЛНПГ из группы «КМП» (n=12) и с нарушением ВЖ проведения из группы «блокады» (n=24). Данные представлены как медиана и 25-й и 75-й перцентиль, Min –минимальное значение показателя; Max – максимальное значение показателя 100 Результаты анализа продемонстрировали достоверное повышение в сыворотке крови больных с первичным воспалительным поражением миокарда концентраций ФНО-α (4,0 [0;88,5] против 0[0;0] пг/мл, p=0,0017) и ИЛ-6 (2,7 [0,4;8,8] против 0 [0;1,1] пг/мл, p=0,016). При сравнении значений КАР-положительных тромбоцитов и уровней антител IgG к β8 было выявлено двухкратное повышение данных показателей среди лиц с клиническим синдром дилатационной кардиомиопатии. Однако полученные различия были статистически недостоверны (6,7 [4;12] против 3,0 [2,0;4,0]%, p=0,068 и 1,61 [0,81;1,96] против 0,65 [0,57;0,74], р=0,062 соответственно) (рис. 18). Эти наблюдения, вероятно, свидетельствуют об отсутствии активного системного воспалительного процесса у больных с идиопатическими нарушениями ВЖ проводимости без признаков систолической дисфункции миокарда. Учитывая отсутствие достоверных данных в пользу активного воспалительного процесса у лиц с идиопатическими нарушениями ВЖ проводимости, было проведено сопоставление уровня периферических маркеров воспаления среди больных группы «блокады» с нарушениями ВЖ и АВ проводимости. В результате исследования у лиц с АВ-блокадой были зарегистрированы достоверно более высокие значение ФНО-α (0,5[0;36,3] против 0[0;0] пг/мл, p=0,044) и КАР-положительных тромбоцитов (7,0[5,0;8,9] против 3,0[2,0;4,0]%, p=0,032) (рис.19). Проведенный периферических идиопатическими анализ маркеров продемонстрировал, воспаления нарушениями АВ характерно что для проводимости, повышение больных что с может свидетельствовать о большей значимости воспалительного компонента у этих пациентов. 101 Рисунок 19. Уровень периферических маркеров воспаления у больных группы «блокады» с нарушение АВ (n=14) и ВЖ (n=24) проводимости. Данные представлены как медиана и 25-й и 75-й перцентиль, Min –минимальное значение показателя; Max – максимальное значение показателя. 3.9 Определение наиболее диагностически ценных показателей для выявления признаков субклинического воспаления у больных с нарушениями проводимости группы «блокады» Важным этапом исследования было определение лабораторных и инструментальных показателей, наиболее точно соответствующих выявляемым по результатам ЭМБ признакам воспалительного поражения миокарда, с целью их дальнейшего использования в диагностике субклинического воспаления у пациентов с идиопатическими нарушениями проводимости. Для поиска наиболее диагностически значимых признаков, связанных с воспалением в миокарде, проводился ROC-анализ, в ходе которого использовались данные, полученные в результате исследования показателей больных группы «КМП». В результате ROC-анализа из спектра исследованных параметров были отобраны следующие показатели: МРТкритерии воспаления (S=0,750), антитела IgM к пептидным последовательностям MRI-MRIV (S=0,881) и MRI (S=0,766), а также процент КАР-положительных тромбоцитов (S=0,723) (см табл. 15 и рис. 20). 102 Таблица 15. Результаты сопоставления диагностической ценности показателей инструментального обследования и периферических маркеров, ассоциированных с наличием воспаления в миокарде в группе «КМП» (итоги ROC-анализа). Показатели, обладающие наибольшей диагностической значимостью Наличие ≥ двух положительных МРТ феноменов MRI MRIV IgM MRI IgM Процент КАР-положительных тромбоцитов ФНО-α ИЛ-6 β25 IgG β8 IgG ТРФ-β1 Феномен позднего контрастирования (ПК) по данным МРТ Наличие отека миокарда по данным МРТ Наличие раннего контрастирования (РК) по данным МРТ MRI MRIV IgG MRI IgG β8 IgM β25 IgM Специфичность Чувствительность Площадь (S) под ROCкривой 100% 50% 0,750 100% 88,9% 57,1% 35,7% 0,881 0,766 66,7 % 64,3% 0,723 44,4% 66,7% 66,7% 11,1% 66,7% 61,5% 28,6% 42,9% 64,3% 21,4% 0,500 0,468 0,556 0,369 0,413 66,7% 57,1% 0,619 66,7% 42,9% 0,607 88,9% 38,6% 0,571 44,4% 88,9% 100% 77,8% 35,7% 28,6% 21,4% 57,1% 0,536 0,504 0,567 0,647 103 Рисунок 20. ROC-кривые признаков, определяющие наличие воспаления в миокарде среди пациентов группы «КМП». Принимая за «золотой» стандарт диагностики результаты ЭМБ, определившей у 14 из 23 пациентов группы «КМП» признаки активного воспаления в миокарде, мы проанализировали чувствительность и специфичность показателей, отобранных в результате ROC-анализа. Как видно из приведенной таблицы, максимальной чувствительностью (64,3 %) обладал разработанный нами экспериментальный показатель – процент КАРположительных тромбоцитов. Значение специфичности для этого показателя было сходным и составило 66,7%. Процент КАР-положительных тромбоцитов оказался параметром с наиболее высоким соотношением специфичность/чувствительность, что делает его возможным периферическим маркером при диагностике воспаления в миокарде. Для двух из выбранных показателей – наличия более двух положительных МРТ критериев и титра антител IgM к MRI MRIV была характерна максимальная специфичность – 100%. Учитывая возможность связи антител к М2-холинорецепторам с активностью воспаления в миокарде, дополнительно был проведен корреляционный анализ, подтвердивший прямую ассоциацию уровня антител IgM к MRI MRIV с воспалительными клетками CD3+, CD4+, CD8+ и CD68+ в составе инфильтратов в миокарде (r = 0,53, 0,72, 0,67, 0,75 соответственно, при р<0,05). Прямая корреляционная зависимость с воспалительными клетками различных популяций (CD3+, CD4+, CD8+ и CD68+) была также подтверждена для антител IgM к пептидной последовательности MRI (r = 0,52, 0,76, 0,70, 0,80 соответственно, при р<0,05) (рис. 21). 104 Рисунок 21. Взаимосвязь между уровнем антител IgM к последовательностям MRI, MRI MRIV и количеством воспалительных клеток различных популяций в эндомиокардиальных биоптатах больных группы «КМП». 105 Таким образом, нами были выявлены три наиболее диагностически сильных показателя, наличие которых может свидетельствовать о субклиническом воспалении в миокарде у больных с идиопатическими нарушениями проводимости сердца без признаков органического поражения миокарда. В число этих показателей входят положительные МРТ критерии воспаления в миокарде, наличие аутоантител класса IgM к М2- холинорецептору, а также введенный нами экспериментальный показатель – процент КАР-положительных тромбоцитов. Количества пациентов в группе «КМП» с признаками активного воспаления в миокарде по данным ЭМБ недостаточно для выведения математической закономерности, отражающей индивидуальное значение каждого из выявленных в нашем исследовании наиболее значимых показателей. Также невозможно проанализировать всю группу «блокады» на наличие всех 4 положительных показателей в связи с тем, что МРТ сердца с контрастированием в ходе нашего исследования было выполнено только 22 больным группы «блокады». Однако оценивания результаты по этим 22 больным, необходимо отметить, что сочетание всех 4 выявленных параметров наблюдалось у 1 пациента, еще у 5 больных из этой группы положительными были 3 параметра. Результаты проведенного нами исследования позволяют предполагать у этих 6 больных (27,3%) воспалительный генез их нарушений проводимости, что может быть учтено в ходе дальнейшего наблюдения за этими пациентами. 106 Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ Нарушения ритма и проводимости сердца – распространенный синдром, обусловленный наличием как кардиальных, так и внекардиальных заболеваний. В тех случаях, когда причину установить не удается, и данные клинико-инструментального обследования не выявляют органическую патологию сердечно-сосудистой и других систем, как возможных причин возникновения аритмий, нарушения ритма и проводимости сердца принято называть «идиопатическими». Прогноз подобных аритмий принято считать благоприятным. Однако большие популяционные исследования, а также анализ гистологического материала (как выполненного посмертно, так и основанного на изучении эндомиокардиальных биоптатов) свидетельствуют о несовершенстве существующих диагностических подходов, не позволяющих в полной мере исключить патологический процесс в миокарде, которым в значительной части случаев является воспаление [133,134]. Именно поэтому целью нашей работы было совершенствование диагностических методов и поиск лабораторных маркеров, применение которых способствовало бы выявлению латентного воспаления миокарда, проявляющееся нарушениями проводимости. Для оценки значимости диагностических периферических маркеров в исследование была включена группа больных с клинически обоснованным подозрением на наличие воспалительной КМП. Выполнение в этой группе ЭМБ («золотого стандарта» диагностики миокардиального воспаления) позволило установить гистологический диагноз для каждого пациента. В 60,8% случаев были выявлены признаки, соответствующие активному миокардиту. Однако, по мнению консенсуса экспертов, с учетом возможных осложнений, связанных с выполнением ЭМБ, ее применение оправдано лишь при некоторых клинических сценариях [91]. В случаях идиопатических нарушений проводимости сердца выполнение ЭМБ показаний не имеет. В 107 этой связи применение МРТ, способной оценивать структуру миокарда, и введение для этого метода диагностических критериев воспалительного поражения миокарда открыло новые методические возможности в выявлении миокардитов [95, 99, 135, 136]. Более того, сопоставление результатов МРТ с данными иммуногистологических исследований позволило рассматривать этот метод как возможную альтернативу ЭМБ [137]. Все это позволило использовать МРТ в случаях идиопатических нарушений ритма и проводимости для исключения воспалительной причины их развития. Рассматривая данные МРТ, полученные нами при анализе изображений у больных группы идиопатических нарушений проводимости, самым распространенным феноменом, выявляемым практически у трети (31,8%) больных этой группы, является феномен раннего контрастирования (РК). Региональная вазодилатация является одним из классических признаков тканевого воспаления (“rubor”). Увеличение объемных показателей кровотока в воспаленном миокарде приводит к увеличенному захвату контрастного вещества в раннюю сосудистую фазу и проявляется феноменом раннего контрастирования при МРТ. Результаты ряда работ свидетельствуют, что при сопоставлении с иммуногистологическими признаками миокардита РК продемонстрировало относительно высокую специфичность как в случаях острого (специфичность 74%, чувствительность 49%, диагностическая точность 49%), так и хронического миокардита (специфичность 86%, чувствительность 62%, диагностическая точность 72%) [138]. Вторым по частоте обнаружения диагностическим МРТ-феноменом, выявленным у 18,2% больных группы «блокады», был отек миокарда (“tumor”). Хорошо известно, что лимфоцитарная инфильтрация и цитолиз миоцитов у пациентов с активной фазой миокардита повышают содержание свободной воды в миокарде, пролонгируя время релаксации Т2, что проявляется зоной гиперинтенсивного сигнала на Т2-взвешенных 108 изображениях. Однако по данным ряда исследований чувствительность, специфичность и диагностическая точность этого МРТ-феномена в диагностике воспаления в миокарде (при сопоставлении с данным ЭМБ) невысокая и определена как 58, 57 и 58 % соответственно. В связи с этим, можно предположить, что сочетанное выявление двух феноменов – отека и гиперемии – является наиболее перспективным в диагностике латентного воспалительного поражения миокарда у больных с нарушениями проводимости сердца. Сочетание этих феноменов обнаружено нами у двух пациентов (9,1%) с идиопатическими нарушениями проводимости: в обоих случаях регистрировались отек и гиперемия миокарда. Кроме того, у обоих больных можно было проследить совпадение зон гиперперфузии и отека миокарда в межжелудочковой перегородке. Вместе с тем ни у одного из пациентов группы «блокады» мы не обнаружили зон позднего контрастирования (ПК), что указывает на отсутствие участков крупноочагового фиброза в миокарде этих больных. Объяснить отсутствие очагов ПК в этой группе можно, основываясь на результатах работы Francone M. и соавт. [139]. В ходе этого исследования были сопоставлены данные МРТ с результатами ЭМБ у пациентов с различными клиническими вариантами миокардита. Кроме того, по данным ЭМБ проводился анализ количественного значения различных типов клеточной смерти в каждом из клинических вариантов миокардитов. По наблюдению этих авторов, для «аритмического» варианта миокардита характерны низкие значения некроза и апоптоза. Отсутствие некротизированной ткани у подобных больных, вероятно, обуславливает отсутствие очагов ПК в нашем исследовании у больных группы «блокады». Это подтверждает различие чувствительности ПК (от 29 до 88% по данным разных источников) при менее тяжелом течении миокардита [93]. Можно предположить, что воспаление у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца имеет фокальный характер и вовлекает 109 преимущественно кардиомиоцитов проводящую за счет систему апоптоза сердца. и Небольшая некроза и потеря ограничение распространенности патологического процесса проводящей системой сердца препятствует патологическому ремоделированию миокарда по «кардиомиопатическому» варианту. Для оценки значимости каждого из МРТ критериев в выявлении воспаления данные МРТ были сопоставлены с результатами ЭМБ у пациентов группы «КМП». По данным ЭМБ признаки активного миокардита были выявлены у 60,8% больных этой группы. В ходе анализа было выявлено, что чувствительность РК составляет 38,6% при 88,9% специфичности, чувствительность отека миокарда – 42,9% при 66,7% специфичности, чувствительность ПК 57,1% при 66,7% специфичности. Суммарно в нашем исследовании Лейк-Луизские критерии продемонстрировали 100% специфичность, но только 50% чувствительность. Полученные нами данные соответствуют общемировому опыту: ЛейкЛуизские критерии обладают максимальной чувствительностью лишь при острых миокардитах с продолжительностью клинических симптомов до 14 дней. При хроническом миокардите чувствительность и специфичность этого метода недостаточны и составляют 63 и 40% соответственно [140]. Необходимо отметить, что давность заболевания у всех больных группы «КМП» в нашем исследовании значительно превышала 14 дней, что указывало на хронический процесс в миокарде. Таким образом, чувствительность МРТ при сравнении с «золотым» стандартом диагностики – ЭМБ – в нашей работе оказалось сопоставимой с литературным данным. Проведенное нами исследование продемонстрировало важность феноменов отека и гиперемии в выявлении воспаления у больных с идиопатическими нарушениями проводимости сердца. Однако полученные данные свидетельствуют о необходимости использования и других методов при выявлении воспаления в миокарде. 110 Очевидным преимуществом МРТ является возможность исключения крупноочагового прогрессирования фиброза миокарда, нарушений ритма как и фактора возникновения проводимости. и Возможность непосредственной оценки структуры миокарда и выявления участков фиброза и некроза с помощью гадолиний-содержащего контраста позволило МРТ сохранить лидирующие позиции среди всех инструментальных методов визуализации в диагностике заболеваний сердца. Связано это в первую очередь с многочисленными данными о связи зон ПК и неблагоприятных аритмических событий у пациентов с систолической дисфункцией миокарда [104, 141-143]. Ассоциация ПК по данным МРТ с риском желудочковых аритмий у пациентов со сниженной ФВ ЛЖ как ишемической, так и неишемической этиологии была подтверждена в ходе большого метаанализа, включившего более тысячи больных [106]. В ходе проведенного нами исследования у 54,5% пациентов группы «КМП» был выявлен феномен ПК. Выполненный нами субанализ позволил установить сходную ассоциацию очагового фиброза с желудочковыми нарушениями ритма: больные с участками накопления гадолиния в миокарде продемонстрировали достоверно более высокое общее количество ЖЭ. Взаимосвязь очагового фиброза и желудочковых нарушений ритма может быть объяснена тем, что появление участков некроза и фиброза приводят к тканевой гетерогенности миокарда, что служит хорошим субстратом для возникновения и поддержания ЖЭ и ЖТ. Интересным фактом стала выявленная тесная корреляционная взаимосвязь между наличием зон ПК по данным МРТ, желудочковыми нарушениями ритма, а также титром антител IgG к полипептидной последовательности β1-адренорецептора β25. Наиболее сильная корреляционная связь (0,71; 0,60) была выявлена между наличием ЖЭ и ЖТ и антителами IgG β25. Объяснить этот факт можно исходя из современных представлений о роли инициирующих факторов в развитии нарушений ритма сердца. Согласно им, возникновение подавляющего 111 большинства ЖТ является результатом активации «спящего» аритмогенного субстрата в миокарде желудочков под действием пускового (триггерного) фактора в условиях благоприятствующих этому процессу индивидуальных «модулирующих» внешних влияний на сердце [144-146]. Рубцовые участки сердца теряют способность к сокращению и становятся электрически нейтральными, в то время как в миокарде зон, «пограничных» рубцовым, возникает широкий спектр электрофизиологических нарушений. Как показали многочисленные исследования [144, 145, 147], аритмогенный субстрат ЖТ в подавляющем большинстве случаев располагается на границе рубцового и жизнеспособного миокарда. Структурные изменения подобной «пограничной» зоны обуславливают нарушения проведения электрических импульсов и процессов реполяризации в этом участке сердца. Пограничная рубцовым изменениям зона визуализируется при МРТ в виде участков с промежуточной степенью фиброза. В литературе эта зона получила называние «серой». Масса подобной «серой» зоны является хорошим предиктором спонтанных ЖТ, их диагностической индукции при электрофизиологическом исследовании, а также смертности [148-150]. Наличие и значимость пограничной «серой» зоны в ходе нашего исследования не оценивалась, однако можно предположить, что у больных группы «КМП» именно в этих участках могут располагаться зоны перифокального воспаления. Активность воспаления в этих участках миокарда может поддерживаться вследствие аутоиммунных механизмов, отражением которых являются циркулирующие аутоантитела. С другой стороны Fukada и соавт. была продемонстрирована способность аутоантител к β1-адренорецепторам оказывать непосредственное влияние на электрофизиологические свойства миокарда. Так, к следствиям воздействия антител к β1-адренорецепторам относят увеличение кальциевого тока через каналы L-типа, и сопутствующее увеличение длительность потенциала действия, а также индуцирую ранних пост-деполяризаций путем снижения 112 плотности калиевых каналов [12]. Таким образом, воздействие триггерного фактора – аутоантител к β1-адренорецептору, вероятно, способно дополнительно модифицировать уже имеющийся аритмогенный субстрат – пограничную зону с перифокальным воспалением, и вызывать развитие желудочковых аритмий. Необходимо отметить терапия бета-блокаторами не оказала прямого влияния на результат сопоставления значений желудочковой эктопической активности, а также уровня аутоантител к β1-адренорецепторам у больных группы «КМП» с ПК и без него. Вполне вероятно, это обусловлено примерно одинаковым количеством больных, получавших бета-блокаторы в группах с наличием очагового фиброза миокарда и без него. Однако литературные данные свидетельствуют о том, что терапия карведилолом может уменьшать частоту возникновения желудочковых нарушений ритма у больных с повышенным титром аутоантител к β1-адренорецепторам [129]. В этой связи эффекты бета-блокаторов на возникновение желудочковых нарушений ритма у больных с участками ПК и повышенным титром аутоантител к β1- адренорецепторам требуют дальнейших исследований. В отличие от рассмотренных выше желудочковых нарушений ритма, очаговый фиброз миокарда, выявляемый с помощью МРТ, оказался не связанным с развитием нарушений проводимости, как у больных группы «блокады», так и у больных группы «КМП». Объяснением этого может быть с одной стороны преобладание изолированного поражения проводящей системы сердца, с меньшей степенью или отсутствием вовлечения в патологический процесс рабочего миокарда у больных с нарушениями проводимости, что подтверждают морфологические наблюдения, сделанные в работах Lev и Lenegre [4, 5]. Однако с другой стороны, нарушение ВЖ проводимости может отражать значительное структурное поражение миокарда. Результаты ряда морфологических исследований [6,7], свидетельствуют о наличии сходных 113 дегенеративных изменений в миокарде лиц со «здоровым» сердцем с БЛНПГ, и больных с КМП, сопровождающейся БЛНПГ. При этом результаты этих работ умалчивают о значимости воспалительного компонента в выявляемых у этих больных морфологических изменениях, что обусловлено в первую очередь несовершенством применявшихся диагностических критериев. Нельзя исключить, что подобные нарушения проводимости сердца могут быть обусловлены латентным воспалительным процессом, затрагивающим как рабочий миокард, так и проводящую ткань [152-154]. Одним из примеров нарушений ВЖ проводимости сердца является блокада левой ножки пучка Гиса (БЛНПГ), диагностируемая почти у 40% больных ДКМП [6, 155]. Отдельное рассмотрение в нашем исследовании эндомиокардиальных биоптатов больных КМП, сопряженной с БЛНПГ, позволило в 58,3% воспалительными выявить клетками наличие диффузной соответствующее инфильтрации активному миокардиту. Отличительной особенностью клеточных инфильтратов у таких больных было низкое количество в них CD3+ Т-клеток, что указывает на меньшую «остроту» воспаления в миокарде. Этот признак, а также более старший возраст больных, возможно, указывает на большую длительность и «хронизацию» патологического процесса в миокарде. Сходное наблюдение было сделано ранее Angelini A. и соавт., сравнивших клиническое течение и прогноз у больных (характеристика с активным миокардита и определялась пограничным с помощью миокардитом далласских критериев). По данным этих авторов, блокады ножек пучка Гиса чаще встречались в группе пациентов с пограничным миокардитом (31%), чем с активным (8%). Помимо этого, группа больных с пограничным миокардитом характеризовалась более высокими значениями КДО ЛЖ при меньшем отношении массы миокарда к объему ЛЖ, меньшей степенью выраженности воспалительной инфильтрации, а также большей длительностью периода между началом заболевания и выполнением ЭМБ. Все эти данные позволили 114 авторам прийти к выводу о том, что пограничный или «хронический» миокардит, сопровождаясь менее выраженной воспалительной инфильтрацией миокарда, тем не менее, приводит к дилатации ЛЖ [87]. Выявление дегенеративных изменений в миокарде у здоровых лиц с БЛНПГ по данным морфологических исследований [6] заставляет задуматься об их этиологии, в первую очередь о роли латентного воспалительного поражения. В связи с этим у пациентов группы «блокады» были проанализированы аутоиммунные показатели, а также периферические маркеры воспаления. В ходе нашего исследования были выбраны воспалительные цитокины ФНОα, ИЛ-6 и ТРФ-β1, патогенетическая роль которых в развитии воспалительных поражений миокарда наиболее изучена. Каждый из этих цитокинов способствует патологическому ремоделированию миокарда, индукции аутоиммунных механизмов. Среди аутоиммунных показателей наибольший интерес вызывают аутоантитела к поверхностным мембранным рецепторам – β1-адренорецептору и М2-холинорцептору. Проведенное нами исследование периферических воспалительных и аутоиммунных показателей позволило выявить некоторые особенности, позволяющие охарактеризовать группу больных идиопатическими нарушениями проводимости сердца. Так, у больных группы «блокады» значение концентрации ТРФ-β1 было достоверно выше, чем среди здоровых добровольцев. Процент больных с положительными значениями ТРФ-β1 в группе «блокады» был в 2,5 раза выше, чем среди больных группы «КМП». С учетом известной роли ТРФ-β1 в регуляции фибротических процессов нами было проведена попытка выявить взаимосвязь его повышенной концентрации и фиброза миокарда. Однако ни у одного из больных группы «блокады» признаки очагового фиброза миокарда по данным МРТ выявлены не были, в отличие от группы «КМП», в которой участки позднего накопления гадолиния регистрировались в 54,5% случаев. Сопоставление уровня ТРФ-β1 со значениями интерстициального фиброза у пациентов 115 группы «КМП» также не обнаружило корреляционных взаимосвязей. Объяснить повышение ТРФ-β1 у больных идиопатическими нарушениями проводимости можно, основываясь на данных экспериментальных работ, демонстрирующих, что ТРФ-β1 является непосредственным участником развития изолированного фиброзирования проводящей системы сердца у больных с врожденной АВ блокадой [156]. Иммуногистохимический анализ материала фетальных сердец с полной поперечной блокадой свидетельствует о том, что в подобных сердцах ТРФ-β1 экспрессируется в области межжелудочковой перегородки, а также присутствует экстраклеточно в инфильтратах CD68+ макрофагов [157]. Вполне возможно, что материнские аутоантитела SSA/Ro-SSB/La, являющиеся этиологическим фактором формирования врожденной блокады сердца, опсонизируют кардиомиоциты, что вызывает воспалительную активацию макрофагов и синтез ФНОα и ТРФβ1 [158, 159]. Эту гипотезу подтверждает также более высокий уровень ФНОα в подгруппе пациентов с нарушениями АВ проводимости по сравнению с лицами с нарушениями ВЖ проводимости группы «блокады». Также нами был подмечен более высокий КАР-положительных тромбоцитов у больных с нарушениями АВ проводимости. Вероятно, активация воспалительных механизмов играет немаловажную роль в прогрессировании именно АВ блокад. Интересным перинатально является наблюдение, диагностированной что блокадой у некоторых сердца, в детей с дальнейшем наблюдается развитие левожелудочковой КМП [160]. Этот факт может указывать на то, что повышенный уровень плазменной концентрации ТРФβ1, также как и ФНОα, может способствовать патологическому ремоделированию миокарда. В пользу этого говорит также и то, что ингибирование предотвращает активности развитие прогрессирующим ТРФ-β1 блокирующими воспалительной фиброзом и дилатацией КМП, левого антителами характеризующейся желудочка [79]. 116 Повышенный уровень экспрессии мРНК ТРФ-β1 обнаруживается в миокарде левого желудочка больных с идиопатической гипертрофической кардиомиопатией[161], ДКМП [162], равно как и в экспериментально индуцированных животных моделях гипертрофии [163], окклюзии коронарной артерии [164] и при перегрузке объемом [165]. Гиперпродукция ТРФ-β1 и у больных, и в условиях экспериментальных моделей способствует переходу из стабильной гипертрофии в сердечную недостаточность. Эти данные позволяют предположить, что ТРФ-β1 ассоциирован с перерастяжением миокарда ЛЖ и является необходимым медиатором сердечной адаптации к перегрузке объемом. Помимо этого, новейшие данные свидетельствуют о том, что ТРФ-β1 способен напрямую изменять электрофизиологические свойства кардиомиоцитов, способствуя развитию нарушений ритма и проводимости. Механизм его воздействия заключается в регулировании транскрипции и функции натриевых и калиевых каналов. ТРФ-β1 дозозависимо вызывает увеличение тока INa и уменьшение тока Ito. Вероятным следствием этих эффектов является удлинение длительности потенциала действия и появление ранних постдеполяризаций, возникающих при длительном воздействии ТРФ-β1 [166]. Таким образом, в ходе проведенного нами исследования выявлена ассоциация идиопатических нарушений проводимости сердца с повышенной концентрацией ТРФ-β1, при этом повышение его концентрации не связано с наличием крупноочагового фиброза миокарда. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что повышенный уровень ТРФ-β1 способствует как прогрессированию нарушений электрофизиологических свойств миокарда, так и его патологическому ремоделированию. Сопоставляя между собой периферические показатели воспаления больных подгрупп с БЛНПГ из числа пациентов групп «КМП» и «блокады», среди пациентов группы «КМП» нами были выявлены достоверные большие концентрации ФНО, ИЛ-6, и уровни антител IgM к полипептидной 117 последовательности β25, а также IgG к полипептидной последовательности β8. Этот факт, вероятно, свидетельствует о том, что само по себе наличие изолированных нарушений ВЖ проводимости не ассоциировано с активацией провоспалительных механизмов, ведущих к развитию тяжелого патологического ремоделирования, а является предрасполагающим фоном. При этом триггерный фактор, которым может являться вирусная инфекция, присоединяется к уже имеющимся дегенеративным изменениям миокарда. В результате подобного взаимодействия происходит активация аутоиммунных реакций и повышение концентраций воспалительных маркеров. Впоследствии напрямую и опосредованно происходит разрушение опорных структур цитоплазмы, что вызывает нарушение функции ЛЖ и развитие ДКМП. Таким образом, все полученные нами данные позволяют предположить, что идиопатические нарушения проводимости являются первоначальной стадией патологического процесса в миокарде, в последующем способного приводить к развитию КМП. Выявленные нами характеристики подгруппы с нарушениями ВЖ проводимости больных группы «блокады» согласуются с гипотезой, выдвинутой Eriksson P. и соавт., о наличии в миокарде подобных больных медленно прогрессирующего дегенеративного процесса, поражающего как и проводящую систему сердца, так и рабочий миокард [8]. На сегодняшний день основным триггером воспалительного поражения миокарда принято считать вирусную инфекцию. Наиболее изученным в развитии острых миокардитов является вирус Коксаки В3. Однако по данным европейских исследователей чаще всего в образцах ЭМБ определяют парвовирус В19 и вирус герпеса 6 типа [92]. Сходные данные были получены и в ходе нашего исследования. В миокарде 39,1% больных группы «КМП» обнаружен парвовирус В 19. Проведенный нами анализ свидетельствует о том, что наличие парвовируса в биоптатах и его количество не коррелирует 118 ни с содержанием воспалительных клеток (у некоторый пациентов с персистенцией парвовируса В19, клеточная инфильтрация отсутствует полностью), ни с тяжестью клинического течения заболевания. В ЭМБ большинства больных с парвовирусом В19 отсутствовали признаки очаговой клеточной инфильтрации, а воспалительные клетки присутствовали в незначительном количестве. В биоптатах преобладали макрофаги, что, возможно, указывает на стихающую остроту клеточной реакции в миокарде и «хронизацию» процесса. Какой вклад вносит присутствие в миокарде генома парвовируса В 19 и вируса герпеса 6 типов на фоне отсутствия признаков воспаления в сердечную дисфункцию остается неизвестным. Вполне вероятно, что их персистенция обусловлена широкой распространенностью этого патогена в популяции. Полученные нами данные согласуются с результатами ряда работ, указывающих на отсутствие прямой этиологической связи между выявляемым парвовирусом В 19 и воспалением в миокарде [167-169]. Рассматривая клеточную инфильтрацию, необходимо отметить, что только у двух пациентов группы «КМП» нами были обнаружены классические очаговые клеточные инфильтраты. У остальных пациентов выявляемая инфильтрация имела диффузный характер. Более того, сравнение больных с признаками активного миокардита, выявленного по данным ЭМБ, с больными без клеточной инфильтрации в миокарде, не продемонстрировало каких-либо отличий в клинико-инструментальных показателях. Объяснить этот факт можно большой длительностью заболевания от момента клинического дебюта до проведения ЭМБ. Можно предположить, что со временем происходит «стихание» клеточной реакции в миокарде и начинают доминировать процессы патологического ремоделирования. Полученные нами данные не опровергают гипотезу о вирусной этиологии воспалительных заболеваний миокарда. Вполне возможно, что транзиторная вирусная атака является триггерным (пусковым) 119 фактором, провоцирующим активацию различных патогенетических механизмов, приводящих к формированию КМП. Можно предположить, что после первоначального контакта вирусной активируется иммунная система, инфекции и происходит с миокардом элиминация вируса. Некротические изменения кардиомиоцитов вследствие вирусной инфекции или в ее отсутствие в дальнейшем приводят к пространственной дезорганизации миофибрилл и фиброзному замещению погибших клеток. Эти последовательные стадии воспалительного процесса можно наблюдать на тканевом уровне, они хорошо диагностируются при изучении ЭМБ. Однако кроме изменений кардиомиоцитов также сократительной функции на тканевом вносят уровне, значительный сердца. При изменения вклад этом самих в снижение основным событием патологического ремоделирования кардиомиоцитов является нарушение межклеточных контактов. Помимо хорошо известного перераспределения щелевых контактов в условиях патологии, возникают вторичные изменения, вызванные местной воспалительной реакцией. Вследствие некроза кардиомиоцитов также происходит разобщение плотных контактов. В этой связи в ряду белков плотных контактов наибольший интерес вызывает Коксаки-аденовирусный рецептор (КАР). Экспериментальные данные, полученные на животных, свидетельствуют об участии КАР в развитии нарушений АВ проводимости сердца [111, 112]. Этот факт, а также сведения о непосредственном участии этого рецептора в развитии воспалительного поражения сердца [121] позволили нам предположить, что он играет определенную роль и в развитии нарушений проводимости сердца у больных группы «КМП». Результаты проведенного нами исследования выявили значительное увеличение количества белка плотных контактов КАР на мембранах кардиомиоцитов больных группы «КМП», в отсутствие персистенции вируса Коксаки. 120 Участие КАР в патогенезе воспалительных заболеваний миокарда позволило предположить, что регуляция его экспрессии находится в прямой зависимости от активности воспаления. Однако экспериментальные данные свидетельствуют о том, что само повышение экспрессии КАР способствует активации провоспалительных каскадов, миграции в миокард натуральных киллеров и макрофагов [121]. Эти данные оставляют открытым вопрос, является ли повышение концентрации этого рецептора следствием воспалительного заболевания миокарда или же одним из патогенетических звеньев, поддерживающих воспалительных процесс и способствующих миокардиальному ремоделированию. Для поиска ответа на этот вопрос нами было проведено сопоставление интенсивности экспрессии КАР на кардиомиоцитах с выраженностью клеточной инфильтрации миокарда у больных группы «КМП». Однако выявить подобных корреляционных связей в нашей работе не удалось. Сходные результаты были получены также в работе Kaur T. и соавт, изучавших экспрессию КАР на аутопсийном материале сердец больных ДКМП. Ими также было показано отсутствие прямой взаимосвязи между высокой экспрессией КАР и признаками активного миокардита [124]. Проведенная нами оценка интенсивности экспрессии КАР на мембранах кардиомиоцитов позволила выявить его достоверное повышение у больных с уровнем ИЛ-6, превышающим референсные значения этого показателя. Анализ полученных данных указывает также и на то, что увеличение содержания КАР на клеточных мембранах характерно для больных с тяжелой степенью сердечной недостаточности и дилатацией правого желудочка. Принимая во внимание то, что высокие концентрации ИЛ-6 оказывают кардиодепрессивное действие, приводят к повышению объемной доли коллагена и, как следствие, миокардиальной жесткости [66], можно предположить, что на фоне его повышенного уровня усиливается функциональная роль КАР как белка межклеточных плотных контактов. 121 Хорошо известно, что при ДКМП мембрана вставочного диска искривляется с сопутствующим увеличением экспрессии адгезивных контактов, что, вероятно, приводит к потере гибкости и повышению ригидности в местах межклеточных контактов [115]. Не подлежит сомнению факт значительного уменьшения экспрессии в патологических условиях другого типа межклеточных контактов, щелевых контактов, в норме осуществляющих электромеханическое сопряжение между соседними кардиомиоцитами [170]. Можно предположить, что подобной заменой необходимых для синхронного сокращения кардиомиоцитов белков щелевых контактов, коннексинов, на белки плотных контактов, определяется диффузное снижение контрактильной функции миокарда ЛЖ у больных КМП. Вероятно, что обнаруженное усиление экспрессии КАР может отражать попытку организма восстановить межклеточные контакты в пораженном миокарде с прогрессирующей дилатацией, а использование в этих целях белка плотных контактов обусловлено необходимостью отграничения еще неповрежденных клеток от продуктов некротического лизиса. Литературные данные свидетельствуют также о том, что уменьшение количества КАР в миокарде приводит к замедлению проведения волны возбуждения по желудочкам за счет снижения амплитуды натриевого тока. Снижение концентрации КАР является фактором, предрасполагающим к возникновению ФЖ в остром периоде инфаркта миокарда в ходе экспериментальных животных моделей. Более того, ген, кодирующий КАР, входит в состав последовательности, генетически предрасполагающей к развитию ФЖ и ВСС в остром периоде инфаркта миокарда [117, 119]. Наше исследование продемонстрировало, что для больных с более низкой КАРэкспрессией существует хоть и слабая, но достоверная обратная корреляционная взаимосвязь с шириной комплекса QRS (r=-0,44, p<0,05), Этот факт, вероятно, указывает на участие этого рецептора в замедлении проведения электрического импульса по миокарду желудочков. 122 Таким образом, результаты нашего и ряда других исследований свидетельствуют о непосредственной роли КАР в инициированном воспалением ремоделировании миокарда. Признание важной роли этого рецептора в патогенезе воспалительных КМП привело к непосредственному исследованию факторов, влияющих на его экспрессию. Известно, что экспрессия КАР усиливается при повышении концентрации ФНОα. Нивелировать этот эффект и возвратить концентрацию КАР на мембранах кардиомиоцитов к исходному уровню способен ТРФ-β1 [122]. Согласно данным нашего исследования уровень ФНОα значительно повышен у больных группы «КМП». Кроме того, наблюдается синхронное повышение уровня ИЛ-6. Принимая во внимание функции этих цитокинов и тесное взаимное влияние, сочетанное повышение их уровня, указывает на преобладание системных воспалительных механизмов у этой категории больных. Однако хорошо известно, что концентрация цитокинов в периферической крови не отражает напрямую активность воспалительного процесса в миокарде [69, 171]. В ходе нашего исследования это подтверждается данными об отсутствии прямой корреляции между повышением их уровня, активностью воспаления в миокарде (по данным ЭМБ), а также экспрессии КАР на мембранах кардиомиоцитов. КАР является широко распространенным рецептором. Помимо кардиомиоцитов он экспрессируется на клетках различных органов и тканей. Не так давно его присутствие было обнаружено на мембране тромбоцитов, клеток крови, которые способны непосредственно реагировать на системное воспаление [125]. Существуют данные, подтверждающие изменение тромбоцитов у больных с идиопатической ДКМП [172]. Вполне вероятно, что они способствуют ухудшению микроциркуляции, усугубляя течение этого заболевания. С этой точки зрения весьма интересным нам показался факт способности тромбоцитов экспрессировать КАР. Необходимо отметить, что попытки использования оценки экспрессии КАР на клетках 123 периферической крови у больных ДКМП уже делались. В работе Liu Q. и соавт. оценка экспрессии КАР параллельно с определением РНК вируса Коксаки группы В проводилась у 50 больных ДКМП на клетках крови – лейкоцитах. Результаты этой работы свидетельствуют о том, что уровень КАР-позитивных лейкоцитов у больных ДКМП с персистенцией РНК вируса Коксаки в периферической крови был достоверно выше. Авторы этой работы предлагают использовать уровень экспрессии КАР на поверхности лейкоцитов как индикатор персистенции вирусной инфекции [173]. В то же время исследование нами ЭМБ с помощью ПЦР выявило отсутствие РНК вируса Коксаки В3 у больных группы «КМП». Вполне вероятно, что значимость этого вируса в генезе воспалительных заболеваний миокарда имеет популяционные отличия. Данные литературы свидетельствуют о том, что вирус герпеса 6 типа и парвовирус В19 являются основными на европейской территории, в то время как основной причиной миокардитов, например, в японской популяции является вирус гепатита С [92]. Можно предположить, что повышение экспрессии КАР на клетках периферической крови ассоциировано не с персистенцией вирусов в клетках, а с выраженностью системного воспаления. Результаты нашей работы подтверждают эту гипотезу, демонстрируя, что экспрессия КАР на мембранах кардиомиоцитов периферическими и тромбоцитов воспалительными тесно маркерами. ассоциирована Нами с была продемонстрирована связь повышения экспрессии КАР на мембранах тромбоцитов с такими цитокинами, как ИЛ-6 и ФНОα. Этот факт соответствует данным литературы, свидетельствующим об увеличении экспрессии КАР при повышении концентрации ФНОα, что наблюдается как на модели индуцированном вирусом Коксаки миокардита [122], так и на клетках онкологических линий [174]. Однако помимо воспалительных маркеров в ходе нашего исследования уровень экспрессии КАР на 124 тромбоцитах был тесно связан также и с аутоиммунными показателями воспаления, такими как аутоантитела IgG к β25 последовательности β1адренорецептора. Плотная ассоциация экспрессии КАР на тромбоцитах с разнообразными периферическими воспалительными маркерами делают его хорошим маркером в выявлении воспалительного процесса, в том числе проявляющегося нарушениями проводимости сердца. Согласно предположениям ряда авторов идиопатические нарушения ритма сердца могут быть ранней манифестацией единого иммунопатологического процесса в сердце, ведущего к развитию миокардита и ДКМП [35]. В литературе существует несколько гипотез, объясняющих развитие аутоиммунных реакций при воспалительных заболеваниях. Однако, вне зависимости от механизмов, вызывающих образование аутоантител, их присутствие является одним из существенных факторов прогрессирования патологического процесса в миокарде. Сопоставление значений аутоантител с результатами ЭМБ, выполненной у пациентов группы «КМП», позволило нам выявить показатель, наиболее тесно ассоциированный с клеточной воспалительной инфильтрацией миокарда. Им оказались антитела IgM к М2холинорецепторам. Эти же антитела выявлялись у половины больных идиопатическими нарушениями проводимости сердца группы «блокады». Вполне вероятно, что это свидетельствует о роли аутоиммунных механизмов как в патогенезе первичных воспалительных заболеваний миокарда, так и идиопатических нарушений проводимости. Участие антител к М2- холинорецепторам также подтверждают экспериментальные работы по иммунизации лабораторных животным антителами к М2-холинорецепторам, выделенными из сывороток крови пациентов с болезнью Чагаса [32]. Результатом подобных экспериментов является развитие у лабораторных животных АВ блокад, брадиаритмий, а также изменений, сходных с наблюдаемыми при КМП. Гистологически в сердцах таких животных отмечается клеточная инфильтрация, которая колеблется от незначительной 125 до интенсивной, при этом IgG к М2-холинорецепторам определяются на сарколемме кардиомиоцитов и CD4/CD8 клеток. Подобная Т-клеточная инфильтрация миокарда приводит к некротической деструкции кардиомиоцитов, следствием чего является экспозиция цитоплазматической порции М2-холинорецептора и поддержание аутоиммунных реакций [31, 33, 34]. Вероятнее всего, обнаружение аутоантител к М2-холинорецептору класса IgM у больных с активным миокардитом по данным ЭМБ может указывать на «свежесть» воспалительного процесса. Можно предположить, что циркулирующие антитела к М2-холинорецепторам имеют несколько точек приложения, оказывая влияние, в том числе, и на проводящую систему сердца. Присутствие тех же аутоантител у пациентов с группы «блокады», может свидетельствовать об участии воспалительных процессов в формировании идиопатических нарушений проводимости сердца. Заключение В ходе проведенного исследования у больных идиопатическими нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии миокарда оценены данные МРТ сердца с в/в контрастированием и исследованы показатели периферических маркеров воспаления и аутоиммунных процессов. Изучены диагностическая возможность ряда показателей в выявлении воспаления миокарда при сопоставлении с «золотым» стандартом диагностики – эндомиокардильной биопсией. Продемонстрирована высокая диагностическая значимость аутоантител IgM к М2-холинорецепторам, а также впервые введенного экспериментального показателя – процента КАР-экспрессирующих тромбоцитов. Исследование периферических цитокинов обнаружило достоверно большее значение ТРФβ1 у больных с идиопатическими блокадами. Результаты проведенной работы позволили оценить значение увеличения экспрессии КАР-рецептора кардиомиоцитов у пациентов с первичными воспалительными заболеваниями миокарда. 126 На основании полученных в ходе работы результатов можно предполагать, что воспалительные реакции, в том числе носящие субклинический характер, могут играть определенную роль в патогенезе идиопатических нарушений проводимости сердца. 127 ВЫВОДЫ 1. Больные с идиопатическими нарушениями проводимости сердца отличаются достоверно большей концентрацией ТРФ-β1 в сыворотке крови по сравнению со здоровыми добровольцами. Повышенный уровень ТРФ-β1, вероятно, отражает прогрессирующее фиброзирование проводящей системы сердца у подобных больных. 2. У больных идиопатическими нарушениями проводимости сердца в 55,3% случаев определяется повышенный титр аутоантител IgM к М2холинорецептору. клиническим установить, Исследование этого же показателя синдромом что дилатационной уровень аутоантител у больных кардиомиопатии IgM к с позволило М2-холинорецептору ассоциирован с количественными проявлениями клеточной воспалительной инфильтрации миокарда. 3. Введенный экспериментальный показатель – уровень КАР-экспрессии тромбоцитов – напрямую связан с аутоиммунными (антитела IgG к β1-АР и М2-ХР) и провоспалительными (ФНО-α и ИЛ-6) показателями как у больных идиопатическими нарушениями проводимости, так и у больных с клиническим синдром дилатационной кардиомиопатии. Экспрессия КАР на тромбоцитах обладает 64,3% чувствительностью и 66,7% специфичностью при диагностике воспаления в миокарде. 4. Результаты работы не обнаружили прямой связи крупноочагового фиброза миокарда по данным МРТ с нарушениями проводимости как у больных без органического поражения миокарда, так и у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии. 5. Очаговый фиброз миокарда по данным МРТ совместно с выявлением аутоантител IgG к β1-АР тесно ассоциируется с возникновением желудочковых нарушений ритма сердца у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии. 128 6. Повышенная экспрессия КАР на мембранах кардиомиоцитов у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии характерна для больных с более тяжелым поражением миокарда, что может отражать структурное ремоделирование кардиомиоцитов в условиях патологии. Низкая концентрация КАР на мембранах кардиомиоцитов у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии характерна для больных с широким комплексом QRS, что может быть обусловлено прямым вкладом функций этого рецептора в миокардиальную проводимость. 7. Экспрессия КАР на клетках миокарда у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии напрямую ассоциирована с повышенной концентрацией ИЛ-6, но не зависит от персистенции вирусов или активности клеточной инфильтрации в миокарде. 129 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для проведения дифференциального диагноза у пациентов с нарушениями проводимости сердца без признаков органической патологии сердечно-сосудистой стандартного системы клинического в диагностический обследования, алгоритм, целесообразно помимо включить исследование уровня антител IgM к М2-ХР, экспрессии тромбоцитами КАР рецептора, а также выполнение МРТ сердца с в/в контрастированием. 2. Выявление антител IgM к М2-ХР, повышенной экспрессии КАР на тромбоцитах, а также сочетания двух МРТ феноменов – отека и гиперемии – указывает на возможный воспалительный генез нарушений проводимости сердца. 3. Для оценки тяжести поражения миокарда у больных с клиническим синдромом дилатационной кардиомиопатии по данным эндомиокардиальной биопсии недостаточно подтверждения наличия клеточной воспалительной инфильтрации и вирусов в миокарде. Необходимо дополнительное определение экспрессии КАР на мембранах кардиомиоцитов. 130 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Кушаковский М.С. «Аритмии сердца». Руководство для врачей. – 1998. Санкт-Петербург: «Фолиант». – 512 с. 2. Yoshida Y, Morimoto S, Hiramitsu S, Tsuboi N, Hirayama H, Itoh T. Incidence of cardiac sarcoidosis in japanese patients with high-degree atrioventricular block // Am Heart J.- 1997. - vol. 134. - p.382-386. 3. Barra SN, Providencia R, Paiva L, Nascimento J, Marques AL. A review on advanced atrioventricular block in young or middle-aged adults // Pacing Clin Electrophysiol.- 2012.- vol.35. - p.1395-1405. 4. Lenegre J. Etiology and pathology of bilateral bundle branch block in relation to complete heart block // Prog Cardiovasc Dis. - 1964. - vol. 6. p.409-444. 5. Lev M. The pathology of complete atrioventricular block // Prog Cardiovasc Dis. - 1964 - vol. 6. - p.317-326. 6. Kuhn H, Breithardt G, Knieriem HJ, Kohler E, Losse B, Seipel L, et al. Prognosis and possible presymptomatic manifestations of congestive cardiomyopathy (cocm) // Postgrad Med J. - 1978. vol. 54. - p. 451-461 7. Davies M, Harris A. Pathological basis of primary heart block // Br Heart J. 1969. vol. 31. - p. 219-226. 8. Eriksson P, Wilhelmsen L, Rosengren A. Bundle-branch block in middleaged men: Risk of complications and death over 28 years. The primary prevention study in goteborg, sweden // Eur Heart J. - 2005. vol. 26. - p. 2300-2306. 9. Elies R, Ferrari I, Wallukat G, Lebesgue D, Chiale P, Elizari M, et al. Structural and functional analysis of the b cell epitopes recognized by antireceptor autoantibodies in patients with chagas' disease // J Immunol. - 1996. vol. 157. - p.4203-4211. 10. Родионова Е.С., Миронова Н.А., Апарина О.П., Рогова М.М., Зыков К.А., Голицын С.П. Роль аутоиммунных реакций в развитии 131 нарушений ритма и проводимости сердца // Терапевтический архив. 2012. - №4ю - с.74-78. 11. Stork S, Boivin V, Horf R, Hein L, Lohse MJ, Angermann CE, et al. Stimulating autoantibodies directed against the cardiac beta1-adrenergic receptor predict increased mortality in idiopathic cardiomyopathy // Am Heart J. - 2006. - vol. 152. - p. 697-704. 12. Fukuda Y, Miyoshi S, Tanimoto K, Oota K, Fujikura K, Iwata M, et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces early afterdepolarization and decreases in k-channel density in rabbits // J Am Coll Cardiol. - 2004. - vol. 43. - p.1090-1100. 13. Iwata M, Yoshikawa T, Baba A, Anzai T, Mitamura H, Ogawa S. Autoantibodies against the second extracellular loop of beta1-adrenergic receptors predict ventricular tachycardia and sudden death in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy // J Am Coll Cardiol. - 2001. vol.37. - p. 418-424. 14. Jahns R, Boivin V, Siegmund C, Inselmann G, Lohse MJ, Boege F. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure // Circulation - 1999. vol. 99. - p.649-654. 15. Pei J, Li N, Chen J, Li X, Zhang Y, Wang Z, et al. The predictive values of beta1-adrenergic and m2 muscarinic receptor autoantibodies for sudden cardiac death in patients with chronic heart failure // Eur J Heart Fail. - 2012. - vol.14. - p. 887-894. 16. Lotze U, Maisch B. Humoral immune response to cardiac conducting tissue // Springer Semin Immunopathol. - 1989. vol.11. - p. 409-422. 17. Под ред. Е. И. Чазова, С.П. Голицына. Руководство по нарушению ритма сердца-М: ГЭОТАР-Медиа 2008- 416с. 132 18. Fairfax A, Doniach D. Autoantibodies to cardiac conducting tissue and their characterization by immunofluorescence // Clin Exp Immunol. - 1976. vol.23. p. 1-8. 19. Obbiassi M, Brucato A, Meroni PL, Vismara A, Lettino M, Poloni F, et al. Antibodies to cardiac purkinje cells: Further characterization in autoimmune diseases and atrioventricular heart block // Clin Immunol Immunopathol. 1987. vol.42. - p.141-150. 20. Askanase AD, Friedman DM, Copel J, Dische MR, Dubin A, Starc TJ, et al. Spectrum and progression of conduction abnormalities in infants born to mothers with anti-ssa/ro-ssb/la antibodies // Lupus. - 2002. vol.11. - p.145151. 21. Baruteau AE, Fouchard S, Behaghel A, Mabo P, Villain E, Thambo JB, et al. Characteristics and long-term outcome of non-immune isolated atrioventricular block diagnosed in utero or early childhood: A multicentre study// Eur Heart J. - 2012. - vol. 33. p.622-629. 22. Michaelsson M, Engle MA. Congenital complete heart block: An international study of the natural history // Cardiovasc Clin. - 1972. - vol.4. p.85-101. 23. Brucato A, Frassi M, Franceschini F, Cimaz R, Faden D, Pisoni MP, et al. Risk of congenital complete heart block in newborns of mothers with antiro/ssa antibodies detected by counterimmunoelectrophoresis: A prospective study of 100 women //Arthritis Rheum.- 2001. - vol. 44. - p.1832-1835. 24. Рогова, М.М.; Миронова, Н.А.; Малкина, Т.А.; Кузнецова Т.В., Рвачева А.В., Агафонов В.Е., зыков К.А., Деев А.Д., Масенко В.П., Голицын С.П. Оценка показателей иммунного ответа у больных с частой желудочковой экстрасистолией без признаков органической патологии сердечно-сосудистой системы // Терапевтический архив. - 2014. - N 1. С. 10-17 133 25. Lazzerini PE, Capecchi PL, Guideri F, Acampa M, Selvi E, Bisogno S, et al. Autoantibody-mediated cardiac arrhythmias: Mechanisms and clinical implications // Basic research in cardiology. - 2008. - vol. 103. - p.1-11. 26. Matsui S, Fu ML, Katsuda S, Hayase M, Yamaguchi N, Teraoka K, et al. Peptides derived from cardiovascular g-protein-coupled receptors induce morphological cardiomyopathic changes in immunized rabbits // J Mol Cell Cardiol. - 1997. - vol. 29. - p. 641-655. 27. Jahns R, Boivin V, Hein L, Triebel S, Angermann CE, Ertl G, et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy // J Clin Invest. - 2004. - vol. 113. - p.1419-1429. 28. Hebert TE. Anti-beta1ar antibodies in dilated cardiomyopathy: Are these a new class of receptor agonists? //Cardiovasc Res.- 2007.- vol.76. - p.5-7. 29. Caforio AL, Tona F, Bottaro S, Vinci A, Dequal G, Daliento L, et al. Clinical implications of anti-heart autoantibodies in myocarditis and dilated cardiomyopathy // Autoimmunity. - 2008. vol.41.- p.35-45. 30. Chiale PA, Rosenbaum MB, Elizari MV, Hjalmarson A, Magnusson Y, Wallukat G, et al. High prevalence of antibodies against beta 1- and beta 2adrenoceptors in patients with primary electrical cardiac abnormalities.// J Am Coll Cardiol. - 1995. - vol. 26. - p.864-869. 31. Baba A, Yoshikawa T, Fukuda Y, Sugiyama T, Shimada M, Akaishi M, et al. Autoantibodies against m2-muscarinic acetylcholine receptors: New upstream targets in atrial fibrillation in patients with dilated cardiomyopathy// Eur Heart J. - 2004. - vol.25. - p.1108-1115. 32. Goin JC, Borda ES, Auger S, Storino R, Sterin-Borda L. Cardiac m(2) muscarinic cholinoceptor activation by human chagasic autoantibodies: Association with bradycardia // Heart. - 1999. - vol. 82. - p.273-278. 134 33. Villecco AS, de Liberali E, Bianchi FB, Pisi E. Antibodies to cardiac conducting tissue and abnormalities of cardiac conduction in rheumatoid arthritis // Clin Exp Immunol. - 1983. -vol. 53. - p.536-540. 34. Zhao R, Wang W, Wu B, Hoebeke J, Hjalmarson A, Fu ML. Effects of antipeptide antibodies against the second extracellular loop of human m2 muscarinic acetylcholine receptors on transmembrane potentials and currents in guinea pig ventricular myocytes // Molecular and cellular biochemistry. - 1996. - vol.163-164. - p.185-193. 35. Chiale PA, Ferrari I, Mahler E, Vallazza MA, Elizari MV, Rosenbaum MB, et al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction // Circulation.- 2001. - vol.103. - p.1765-1771. 36. Medei E, Pedrosa RC, Benchimol Barbosa PR, Costa PC, Hernandez CC, Chaves EA, et al. Human antibodies with muscarinic activity modulate ventricular repolarization: Basis for electrical disturbance // International journal of cardiology. - 2007. - vol.115. - p.373-380. 37. Шляхто Е.В., Трешкур Т.В., Пармон Е.В. и др. Идиопатические нарушения ритма: результаты проспективного наблюдени// Вестник аритмологии -2003.-№ 33-с. 5-11. 38. Новикова Д.С., Бекбосынова М.С., Голицын С.П. и соавт. С реактивный белок и интерлейкин-6 у больных с желудочковыми нарушениями ритма сердца: возможная роль воспаления в развитии желудочковых аритмий // Кардиология-2004.- №5- с. 63-66. 39. Грохотова В.В. Татарский, Р. Б., Лебедев, Д. С., Митрофанова, Л. Б., Митрофанов, Н. К., Пахомов, А. В., Игнатьева, Е. С., Маликов, К. Н., Панкова, И. А., Белякова, Л. А., Бещук, О. В. Диагностика некоронарогенных заболеваний у пациентов с желудочковыми тахикардиям // Вестник аритмологии. - 2014. - №75. с. 41-48. 135 40. Hufnagel G, Pankuweit S, Richter A, Schonian U, Maisch B. The european study of epidemiology and treatment of cardiac inflammatory diseases (esetcid). First epidemiological results // Herz. - 2000. - vol. 25. - p.279-285. 41. Okura Y, Dec GW, Hare JM, Kodama M, Berry GJ, Tazelaar HD, et al. A clinical and histopathologic comparison of cardiac sarcoidosis and idiopathic giant cell myocarditis // J Am Coll Cardiol. - 2003. - vol. 41. - p. 322-329. 42. Sekiguchi M, Hiroe M, Ogasawara S, Nishikawa T. Practical aspects of endomyocardial biopsy // Ann Acad Med Singapore. - 1981. - vol. 10. p.115-128. 43. Uemura A, Morimoto S, Hiramitsu S, Hishida H. Endomyocardial biopsy findings in 50 patients with idiopathic atrioventricular block: Presence of myocarditis // Jpn Heart J. - 2001. - vol.42. p.691-700. 44. Davidoff R, Palacios I, Southern J, Fallon JT, Newell J, Dec GW. Giant cell versus lymphocytic myocarditis. A comparison of their clinical features and long-term outcomes// Circulation. - 1991. - vol. 83. - p.953-961. 45. Batra AS, Wells WJ, Hinoki KW, Stanton RA, Silka MJ. Late recovery of atrioventricular conduction after pacemaker implantation for complete heart block associated with surgery for congenital heart disease // The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. - 2003. - vol. 125. - p.1291-1293. 46. Higuchi H, Hara M, Yamamoto K, Miyamoto T, Kinoshita M, Yamada T, et al. Mast cells play a critical role in the pathogenesis of viral myocarditis. // Circulation. - 2008. - vol.118. - p.363-372. 47. Fairweather D, Frisancho-Kiss S, Gatewood S, Njoku D, Steele R, Barrett M, et al. Mast cells and innate cytokines are associated with susceptibility to autoimmune heart disease following coxsackievirus b3 infection // Autoimmunity. - 2004. - vol.37. - p.131-145. 48. Fairweather D, Yusung S, Frisancho S, Barrett M, Gatewood S, Steele R, et al. Il-12 receptor beta 1 and toll-like receptor 4 increase il-1 beta- and il-18- 136 associated myocarditis and coxsackievirus replication// J Immunol. - 2003. vol.170. - p.4731-4737. 49. Lane JR, Neumann DA, Lafond-Walker A, Herskowitz A, Rose NR. Role of il-1 and tumor necrosis factor in coxsackie virus-induced autoimmune myocarditis // J Immunol. - 1993. - vol.151. - p.1682-1690. 50. Maury CP, Teppo AM. Circulating tumour necrosis factor-alpha (cachectin) in myocardial infarction //J Intern Med. - 1989. - vol.225. - p. 333-336. 51. Mann DL. Inflammatory mediators and the failing heart: Past, present, and the foreseeable future // Circ Res. - 2002. - vol. 91. - p.988-998. 52. Bozkurt B, Kribbs SB, Clubb FJ, Jr., Michael LH, Didenko VV, Hornsby PJ, et al. Pathophysiologically relevant concentrations of tumor necrosis factoralpha promote progressive left ventricular dysfunction and remodeling in rats // Circulation. - 1998. - vol.97. - p.1382-1391. 53. Gullestad L, Ueland T, Vinge LE, Finsen A, Yndestad A, Aukrust P. Inflammatory cytokines in heart failure: Mediators and markers // Cardiology. - 2012. - vol.122. - p.23-35. 54. Bryant D, Becker L, Richardson J, Shelton J, Franco F, Peshock R, et al. Cardiac failure in transgenic mice with myocardial expression of tumor necrosis factor-alpha //Circulation. - 1998. - vol.97. - p.1375-1381. 55. Flesch M, Hoper A, Dell'Italia L, Evans K, Bond R, Peshock R, et al. Activation and functional significance of the renin-angiotensin system in mice with cardiac restricted overexpression of tumor necrosis factor // Circulation. - 2003. - vol.108. - p.598-604. 56. Sivasubramanian N, Coker ML, Kurrelmeyer KM, MacLellan WR, DeMayo FJ, Spinale FG, et al. Left ventricular remodeling in transgenic mice with cardiac restricted overexpression of tumor necrosis factor// Circulation. 2001. - vol. 104. - p.826-831. 57. El-Menyar AA. Cytokines and myocardial dysfunction: State of the art // J Card Fail. - 2008. - vol. 14. - p.61-74. 137 58. Francis GS. Tnf-alpha and heart failure. The difference between proof of principle and hypothesis testing // Circulation. - 1999. - vol.99. - p. 32133214. 59. Petersen JW, Felker GM. Inflammatory biomarkers in heart failure // Congest Heart Fail. - 2006. - vol. 12. - p.324-328. 60. Kwon HJ, Cote TR, Cuffe MS, Kramer JM, Braun MM. Case reports of heart failure after therapy with a tumor necrosis factor antagonist // Ann Intern Med. - 2003. - vol. 138. - p.807-811. 61. Hirota H, Chen J, Betz UA, Rajewsky K, Gu Y, Ross J, Jr., et al. Loss of a gp130 cardiac muscle cell survival pathway is a critical event in the onset of heart failure during biomechanical stress // Cell. - 1999. - vol. 97. - p.189198. 62. Ito H, Miller SC, Billingham ME, Akimoto H, Torti SV, Wade R, et al. Doxorubicin selectively inhibits muscle gene expression in cardiac muscle cells in vivo and in vitro// Proc Natl Acad Sci U S A. -1990. - vol. 87. p.4275-4279. 63. Smart N, Mojet MH, Latchman DS, Marber MS, Duchen MR, Heads RJ. Il6 induces pi 3-kinase and nitric oxide-dependent protection and preserves mitochondrial function in cardiomyocytes // Cardiovasc Res. - 2006. - 69. p.164-177. 64. Yamauchi-Takihara K, Kishimoto T. Cytokines and their receptors in cardiovascular diseases--role of gp130 signalling pathway in cardiac myocyte growth and maintenance // Int J Exp Pathol. - 2000. - vol.81. - p.116. 65. Jacoby JJ, Kalinowski A, Liu MG, Zhang SS, Gao Q, Chai GX, et al. Cardiomyocyte-restricted knockout of stat3 results in higher sensitivity to inflammation, cardiac fibrosis, and heart failure with advanced age. // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2003. - vol.100. - p.12929-12934. 138 66. Melendez GC, McLarty JL, Levick SP, Du Y, Janicki JS, Brower GL. Interleukin 6 mediates myocardial fibrosis, concentric hypertrophy, and diastolic dysfunction in rats // Hypertension. - 2010. - vol.56. - p.:225-231. 67. Maass DL, White J, Horton JW. Il-1beta and il-6 act synergistically with tnfalpha to alter cardiac contractile function after burn trauma // Shock. 2002. - vol.18. - p.:360-366. 68. Sato Y, Takatsu Y, Kataoka K, Yamada T, Taniguchi R, Sasayama S, et al. Serial circulating concentrations of c-reactive protein, interleukin (il)-4, and il-6 in patients with acute left heart decompensation // Clinical cardiology. 1999. - vol.22. p.811-813. 69. Matsumori A, Yamada T, Suzuki H, Matoba Y, Sasayama S. Increased circulating cytokines in patients with myocarditis and cardiomyopathy // Br Heart J. - 1994. - vol.72. - p.561-566. 70. Furukawa Y, Kobuke K, Matsumori A. Role of cytokines in autoimmune myocarditis and cardiomyopathy// Autoimmunity. - 2001. - vol.34. - p.165168. 71. Dai RP, Dheen ST, He BP, Tay SS. Differential expression of cytokines in the rat heart in response to sustained volume overload // Eur J Heart Fail.2004. - vol. 6. - p.693-703. 72. Zhang ML, Li ZP, Xiao H. [different expressions of inflammatory cytokines in two types of cardiac hypertrophy in rats].// Beijing Da Xue Xue Bao. 2007. vol.39. - p.570-575. 73. Siwik DA, Chang DL, Colucci WS. Interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha decrease collagen synthesis and increase matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts in vitro. - Circ Res. 2000. vol.86. - p.1259-1265. 74. Palmer JN, Hartogensis WE, Patten M, Fortuin FD, Long CS. Interleukin-1 beta induces cardiac myocyte growth but inhibits cardiac fibroblast proliferation in culture // J Clin Invest. - 1995. - vol. 95. - p.2555-2564. 139 75. Schulz R, Panas DL, Catena R, Moncada S, Olley PM, Lopaschuk GD. The role of nitric oxide in cardiac depression induced by interleukin-1 beta and tumour necrosis factor-alpha // Br J Pharmacol. - 1995. vol.114. - p.27-34. 76. Afanasyeva M, Wang Y, Kaya Z, Park S, Zilliox MJ, Schofield BH, et al. Experimental autoimmune myocarditis in a/j mice is an interleukin-4dependent disease with a th2 phenotype // Am J Pathol. - 2001. - vol.159. p.193-203. 77. Eriksson U, Kurrer MO, Sebald W, Brombacher F, Kopf M. Dual role of the il-12/ifn-gamma axis in the development of autoimmune myocarditis: Induction by il-12 and protection by ifn-gamma // J Immunol. - 2001. - vol. 167. - p.5464-5469. 78. Bujak M, Frangogiannis NG. The role of tgf-beta signaling in myocardial infarction and cardiac remodeling // Cardiovasc Res. - 2007. - vol. 74. - p. 184-195. 79. Kania G, Blyszczuk P, Stein S, Valaperti A, Germano D, Dirnhofer S, et al. Heart-infiltrating prominin-1+/cd133+ progenitor cells represent the cellular source of transforming growth factor beta-mediated cardiac fibrosis in experimental autoimmune myocarditis // Circ Res. - 2009. - vol.105. - p.462470. 80. 73. Phan SH. The myofibroblast in pulmonary fibrosis // Chest. - 2002. - 2.- p.286S-289S. 81. Yu Q, Horak K, Larson DF. Role of t lymphocytes in hypertension-induced cardiac extracellular matrix remodeling // Hypertension. - 2006. - vol.48. p.98-104. 82. Mason JW. Techniques for right and left ventricular endomyocardial biopsy. // Am J Cardiol.- 1978.- vol.41 - p. 887-892. 83. Chow LH, Radio SJ, Sears TD, McManus BM. Insensitivity of right vcular endomyocardial biopsy in the diagnosis of myocarditis // J Am Coll Cardiol. - 1989. - vol. 14. - p.915-920. 140 84. 77. Aretz HT, Billingham ME, Edwards WD, Factor SM, Fallon JT, lio JJ, Jr., et al. Myocarditis. A histopathologic definition and classification // Am J Cardiovasc Pathol. - 1987. - vol.1. - p.3-14. 85. 78. Hauck AJ, Kearney DL, Edwards WD. Evaluation of postmortem endomyocardial biopsy specimens from 38 patients with lymphocytic myocarditis: Implications for role of sampling error // Mayo Clin Proc. 1989. - vol. 64. - p.1235-1245. 86. Heymans S. Myocarditis and heart failure: Need for better diagnostic, predictive, and therapeutic tools // Eur Heart J. - 2007. - vol.28. - p.12791280. 87. Angelini A, Crosato M, Boffa GM, Calabrese F, Calzolari V, Chioin R, et al. Active versus borderline myocarditis: Clinicopathological correlates and prognostic implications // Heart. - 2002. vol. 87. - p.210-215. 88. Maisch B, Portig I, Ristic A, Hufnagel G, Pankuweit S. Definition of inflammatory cardiomyopathy (myocarditis): On the way to consensus. A status report // Herz. - 2000. - vol.25. - p.200-209. 89. Pankuweit S, Portig I, Eckhardt H, Crombach M, Hufnagel G, Maisch B. Prevalence of viral genome in endomyocardial biopsies from patients with inflammatory heart muscle disease // Herz. - 2000. - vol. 25. - p. 221-226. 90. Масенко В.П., Терещенко С.Н., Скворцов А.А., Нарусов О.Ю., Зыков К.А., Белявский Е.А., Щедрина А.Ю. Воспалительная кардиомиопатия: современное состояние проблемы // Терапевтический архив. - 2010.-N 8.- с.62-71. 91. Cooper LT, Baughman KL, Feldman AM, Frustaci A, Jessup M, Kuhl U, et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: A scientific statement from the american heart association, the american college of cardiology, and the european society of cardiology // Circulation. - 2007. - vol.116. - p.2216-2233. 141 92. Maisch B, Pankuweit S. Current treatment options in (peri)myocarditis and inflammatory cardiomyopathy // Herz. - 2012. - vol. 37. - p.644-656. 93. Friedrich MG, Sechtem U, Schulz-Menger J, Holmvang G, Alakija P, Cooper LT, et al. Cardiovascular magnetic resonance in myocarditis: A jacc white paper // J Am Coll Cardiol. - 2009. - vol.53. - p.1475-1487. 94. Синицын В. Е., Стукалова О. В., Ларина О. М., Терновой С. К. Новые возможности диагностики некоронарогенных поражений миокарда: роль магнитно-резонансной томографии // Креативная кардиология. № 1. - 2008. - с. 66-73 95. Abdel-Aty H, Simonetti O, Friedrich MG. T2-weighted cardiovascular magnetic resonance imaging// Journal of magnetic resonance imaging. 2007. - vol.26. - p.452-459. 96. Lakdawala NK, Givertz MM. Dilated cardiomyopathy with conduction disease and arrhythmia // Circulation. - 2010. - vol. 122. - p.527-534. 97. Thomson LE, Kim RJ, Judd RM. Magnetic resonance imaging for the assessment of myocardial viability // Journal of magnetic resonance imaging. - 2004. - vol.19. - p.771-788. 98. Friedrich MG, Strohm O, Schulz-Menger J, Marciniak H, Luft FC, Dietz R. Contrast media-enhanced magnetic resonance imaging visualizes myocardial changes in the course of viral myocarditis // Circulation. - 1998. vol.97. p.1802-1809. 99. Mahrholdt H, Wagner A, Judd RM, Sechtem U, Kim RJ. Delayed enhancement cardiovascular magnetic resonance assessment of nonischaemic cardiomyopathies // Eur Heart J. - 2005. - vol. 26. - p.1461-1474. 100. Yilmaz A, Ferreira V, Klingel K, Kandolf R, Neubauer S, Sechtem U. Role of cardiovascular magnetic resonance imaging (cmr) in the diagnosis of acute and chronic myocarditis // Heart Fail Rev. - 2013. - vol. 18. - p.747760. 142 101. Lurz P, Daehnert I, Gutberlet M, Desch S. Renal sympathetic denervation in resistant hypertension late after surgical repair for aortic coarctation // Eur Heart J. - 2013. - vol.34. - p3500. 102. Prochnau D, Kuhnert H, Heyne JP, Figulla HR, Surber R. Cardiac magnetic resonance imaging as a tool to link cardiac conduction disease to myocarditis with minimal left ventricular impairment // Journal of electrocardiology. - 2012. - vol. 45. - p.161-163. 103. Mahmod M, Karamitsos TD, Suttie JJ, Myerson SG, Neubauer S, Francis JM. Prevalence of cardiomyopathy in asymptomatic patients with left bundle branch block referred for cardiovascular magnetic resonance imaging // The international journal of cardiovascular imaging. - 2012. vol.28. - p.1133-1140. 104. Yokokawa M, Tada H, Koyama K, Ino T, Hiramatsu S, Kaseno K, et al. The characteristics and distribution of the scar tissue predict ventricular tachycardia in patients with advanced heart failure // Pacing Clin Electrophysiol. - 2009. - vol.32. - p.314-322. 105. Assomull RG, Prasad SK, Lyne J, Smith G, Burman ED, Khan M, et al. Cardiovascular magnetic resonance, fibrosis, and prognosis in dilated cardiomyopathy // J Am Coll Cardiol. - 2006. - vol. 48. - p.1977-1985. 106. Scott PA, Rosengarten JA, Curzen NP, Morgan JM. Late gadolinium enhancement cardiac magnetic resonance imaging for the prediction of ventricular tachyarrhythmic events: A meta-analysis // Eur J Heart Fail. 2013. - vol.15. - p.1019-1027. 107. Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G, Kurt-Jones EA, Krithivas A, Hong JS, et al. Isolation of a common receptor for coxsackie b viruses and adenoviruses 2 and 5 // Science. - 1997. - vol.275. - p.1320-1323. 108. Freimuth P, Philipson L, Carson SD. The coxsackievirus and adenovirus receptor // Curr Top Microbiol Immunol. - 2008. - vol.323. p67-87. 143 109. Asher DR, Cerny AM, Weiler SR, Horner JW, Keeler ML, Neptune MA, et al. Coxsackievirus and adenovirus receptor is essential for cardiomyocyte development // Genesis. - 2005. vol.42. - p.77-85. 110. Fechner H, Noutsias M, Tschoepe C, Hinze K, Wang X, Escher F, et al. Induction of coxsackievirus-adenovirus-receptor expression during myocardial tissue formation and remodeling: Identification of a cell-to-cell contact-dependent regulatory mechanism // Circulation. - 2003. - vol. 107. p.876-882. 111. Lisewski U, Shi Y, Wrackmeyer U, Fischer R, Chen C, Schirdewan A, et al. The tight junction protein car regulates cardiac conduction and cellcell communication // J Exp Med. - 2008. - vol.205. - p.2369-2379. 112. Lim BK, Xiong D, Dorner A, Youn TJ, Yung A, Liu TI, et al. Coxsackievirus and adenovirus receptor (car) mediates atrioventricular-node function and connexin 45 localization in the murine heart // J Clin Invest. 2008. - vol.118. - p.2758-2770. 113. Coyne CB, Bergelson JM. Car: A virus receptor within the tight junction // Adv Drug Deliv Rev. - 2005. - vol.57. - p.869-882. 114. Noutsias M, Fechner H, de Jonge H, Wang X, Dekkers D, Houtsmuller AB, et al. Human coxsackie-adenovirus receptor is colocalized with integrins alpha(v)beta(3) and alpha(v)beta(5) on the cardiomyocyte sarcolemma and upregulated in dilated cardiomyopathy: Implications for cardiotropic viral infections // Circulation. - 2001. - vol.104. - p.275-280. 115. Perriard JC, Hirschy A, Ehler E. Dilated cardiomyopathy: A disease of the intercalated disc? //Trends Cardiovasc Med. - 2003. - vol.13. - p.30-38. 116. Tomaselli GF, Beuckelmann DJ, Calkins HG, Berger RD, Kessler PD, Lawrence JH, et al. Sudden cardiac death in heart failure. The role of abnormal repolarization// Circulation. - 1994. vol.90. - p.2534-2539. 117. Marsman RF, Bezzina CR, Freiberg F, Verkerk AO, Adriaens ME, Podliesna S, et al. Coxsackie and adenovirus receptor (car) is a modifier of 144 cardiac conduction and arrhythmia vulnerability in the setting of myocardial ischemia // J Am Coll Cardiol. - 2013. - vol. 63 (6) - p. 549-59. 118. Kaikkonen KS, Kortelainen ML, Linna E, Huikuri HV. Family history and the risk of sudden cardiac death as a manifestation of an acute coronary event. //Circulation. - 2006. - vol. 114. - p.1462-1467. 119. Bezzina CR, Pazoki R, Bardai A, Marsman RF, de Jong JS, Blom MT, et al. Genome-wide association study identifies a susceptibility locus at 21q21 for ventricular fibrillation in acute myocardial infarction // Nat Genet. - 2010. - vol.42. - p.688-691. 120. Knowlton KU. Cvb infection and mechanisms of viral cardiomyopathy. // Curr Top Microbiol Immunol. - 2008. - vol.323. - p.315335. 121. Yuen S, Smith J, Caruso L, Balan M, Opavsky MA. The coxsackie- adenovirus receptor induces an inflammatory cardiomyopathy independent of viral infection // J Mol Cell Cardiol. - 2011. - vol.50. - p.826-840. 122. Shi Y, Fukuoka M, Li G, Liu Y, Chen M, Konviser M, et al. Regulatory t cells protect mice against coxsackievirus-induced myocarditis through the transforming growth factor beta-coxsackie-adenovirus receptor pathway // Circulation. - 2010. - vol.121. - p.2624-2634. 123. Tatrai E, Bedi K, Kovalszky I, Hartyanszky I, Laszik A, Acsady G, et al. No mutation but high mrna expression of coxsackie-adenovirus receptor was observed in both dilated and ischemic cardiomyopathy // Forensic Sci Int. - 2011. - vol. 212. - p47-50. 124. Kaur T, Mishra B, Saikia UN, Sharma M, Bahl A, Ratho RK. Expression of coxsackievirus and adenovirus receptor and its cellular localization in myocardial tissues of dilated cardiomyopathy // Exp Clin Cardiol. - 2012. vol. 17. - p183-186. 125. Othman M, Labelle A, Mazzetti I, Elbatarny HS, Lillicrap D. Adenovirus-induced thrombocytopenia: The role of von willebrand factor 145 and p-selectin in mediating accelerated platelet clearance // Blood. 2007. vol. 109. p.2832-2839. 126. de Almeida AJ, Campos-de-Magalhaes M, Brandao-Mello CE, de Oliveira RV, Yoshida CF, Lampe E. Detection of hepatitis c virus in platelets: Evaluating its relationship to viral and host factors // Hepatogastroenterology. - 2007. - vol.54. - p.964-968. 127. Youssefian T, Drouin A, Masse JM, Guichard J, Cramer EM. Host defense role of platelets: Engulfment of hiv and staphylococcus aureus occurs in a specific subcellular compartment and is enhanced by platelet activation // Blood. - 2002. - vol.99. - p.4021-4029. 128. Semple JW, Italiano JE, Jr., Freedman J. Platelets and the immune continuum // Nature reviews. Immunology. - 2011. - vol.11. - 264-274. 129. Vieira-de-Abreu A, Campbell RA, Weyrich AS, Zimmerman GA. Platelets: Versatile effector cells in hemostasis, inflammation, and the immune continuum // Seminars in immunopathology. - 2012. - vol. 34.- p.530. 130. Weyrich AS, Zimmerman GA. Platelets: Signaling cells in the immune continuum // Trends in immunology. - 2004. - vol.25. - p.489-495. 131. Бибилашвили Р.Ш., Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Беспалова Ж.Д., Бочаров Э.В., Ефремов Е.Е., Шарф Т.В., Рогова М.М., Миронова Н.А., Зыков К.А., Голицын С.П. Новый конформационный пептидный антиген, моделирующий внеклеточной петли иммунодоминантный β1-адренорецептора. эпитоп 2-й Компьютерное моделирование, синтез, изучение пространственной структуры // Биоорганическая химия. - 2013. - том 39. - № 6. - с.658–670. 132. Cerqueira MD, W.N., Dilsizian V, et al, Standardized myocardial segmentation and nomenclature for tomographic imaging of the heart: a statement for healthcare professionals from the Cardiac Imaging Committee 146 of the Council on Clinical Cardiology of the American Heart Association //Circulation. – 2002. Vol. 105, № 4. – P.539-542. 133. Strain JE, Grose RM, Factor SM, Fisher JD. Results of endomyocardial biopsy in patients with spontaneous ventricular tachycardia but without apparent structural heart disease// Circulation. - 1983. - vol.68. p.1171-1181. 134. Sugrue DD, Holmes DR, Jr., Gersh BJ, Edwards WD, McLaran CJ, Wood DL, et al. Cardiac histologic findings in patients with life-threatening ventricular arrhythmias of unknown origin // J Am Coll Cardiol. - 1984. vol.4. - p.952-957. 135. Abdel-Aty H, Schulz-Menger J. Cardiovascular magnetic resonance t2-weighted imaging of myocardial edema in acute myocardial infarction // Recent patents on cardiovascular drug discovery. - 2007. - vol.2. - p.63-68. 136. Schulz-Menger J, Maisch B, Abdel-Aty H, Pankuweit S. Integrated biomarkers in cardiomyopathies: Cardiovascular magnetic resonance imaging combined with molecular and immunologic markers--a stepwise approach for diagnosis and treatment // Herz. - 2007.- vol.32. - p.458-472. 137. Rottgen R, Christiani R, Freyhardt P, Gutberlet M, Schultheiss HP, Hamm B, et al. Magnetic resonance imaging findings in acute myocarditis and correlation with immunohistological parameters // European radiology. 2011. - vol. 21. - p.1259-1266. 138. Gutberlet M, Spors B, Thoma T, Bertram H, Denecke T, Felix R, et al. Suspected chronic myocarditis at cardiac mr: Diagnostic accuracy and association with immunohistologically detected inflammation and viral persistence // Radiology. - 2008. - vol.246. - p.401-409. 139. Francone M, Chimenti C, Galea N, Scopelliti F, Verardo R, Galea R, et al. Cmr sensitivity varies with clinical presentation and extent of cell necrosis in biopsy-proven acute myocarditis // JACC. Cardiovascular imaging. - 2014. - vol.7. - p.254-263. 147 140. Lurz P, Eitel I, Klieme B, Luecke C, de Waha S, Desch S, et al. The potential additional diagnostic value of assessing for pericardial effusion on cardiac magnetic resonance imaging in patients with suspected myocarditis // European heart journal cardiovascular Imaging. - 2014. - vol. 15(6). p.643-50. 141. Dawson DK, Hawlisch K, Prescott G, Roussin I, Di Pietro E, Deac M, et al. Prognostic role of cmr in patients presenting with ventricular arrhythmias // JACC. Cardiovascular imaging. - 2013. - vol.6. - p.335-344. 142. Fernandez-Armenta J, Berruezo A, Mont L, Sitges M, Andreu D, Silva E, et al. Use of myocardial scar characterization to predict ventricular arrhythmia in cardiac resynchronization therapy // Europace. - 2012. - vol. 14. - p.1578-1586. 143. Mavrogeni S, Petrou E, Kolovou G, Theodorakis G, Iliodromitis E. Prediction of ventricular arrhythmias using cardiovascular magnetic resonance // European heart journal cardiovascular Imaging. - 2013. - vol.14. - p.518-525. 144. Mehta D, Curwin J, Gomes JA, Fuster V. Sudden death in coronary artery disease: Acute ischemia versus myocardial substrate // Circulation. 1997. vol.96. - p.3215-3223. 145. Myerburg RJ. Sudden cardiac death: Exploring the limits of our knowledge // Journal of cardiovascular electrophysiology. - 2001. - vol.12. p.369-381. 146. Sweeney MO. Sudden death in heart failure associated with reduced left ventricular function: Substrates, mechanisms, and evidence-based management, part i // Pacing Clin Electrophysiol. - 2001. - vol. 24. - p.871888. 147. Bello D, Fieno DS, Kim RJ, Pereles FS, Passman R, Song G, et al. Infarct morphology identifies patients with substrate for sustained ventricular tachycardia // J Am Coll Cardiol. - 2005. - vol.45. - p.1104-1108. 148 148. Heidary S, Patel H, Chung J, Yokota H, Gupta SN, Bennett MV, et al. Quantitative tissue characterization of infarct core and border zone in patients with ischemic cardiomyopathy by magnetic resonance is associated with future cardiovascular events // J Am Coll Cardiol. - 2010. - vol. 55. p.2762-2768. 149. Roes SD, Borleffs CJ, van der Geest RJ, Westenberg JJ, Marsan NA, Kaandorp TA, et al. Infarct tissue heterogeneity assessed with contrastenhanced mri predicts spontaneous ventricular arrhythmia in patients with ischemic cardiomyopathy and implantable cardioverter-defibrillator // Circulation. Cardiovascular imaging. - 2009. - vol.2. - p.183-190. 150. Yan AT, Shayne AJ, Brown KA, Gupta SN, Chan CW, Luu TM, et al. Characterization of the peri-infarct zone by contrast-enhanced cardiac magnetic resonance imaging is a powerful predictor of post-myocardial infarction mortality // Circulation. - 2006. - vol.114. - p.32-39. 151. Nagatomo Y, Yoshikawa T, Kohno T, Yoshizawa A, Baba A, Anzai T, et al. A pilot study on the role of autoantibody targeting the beta1adrenergic receptor in the response to beta-blocker therapy for congestive heart failure // J Card Fail. - 2009. - vol.15. - p.224-232. 152. Shamim W, Yousufuddin M, Cicoria M, Gibson DG, Coats AJ, Henein MY. Incremental changes in qrs duration in serial ecgs over time identify high risk elderly patients with heart failure // Heart. - 2002. - vol. 88. - p.47-51. 153. Vernooy K, Verbeek XA, Peschar M, Prinzen FW. Relation between abnormal ventricular impulse conduction and heart failure // J Interv Cardiol. - 2003. - vol.16. - p.557-562. 154. Zannad F, Huvelle E, Dickstein K, van Veldhuisen DJ, Stellbrink C, Kober L, et al. Left bundle branch block as a risk factor for progression to heart failure // Eur J Heart Fail. - 2007. vol. 9. - p.7-14. 149 155. Blanc JJ, Fatemi M, Bertault V, Baraket F, Etienne Y. Evaluation of left bundle branch block as a reversible cause of non-ischaemic dilated cardiomyopathy with severe heart failure. A new concept of left ventricular dyssynchrony-induced cardiomyopathy // Europace. - 2005. - vol. 7. - p.604610. 156. 145. Clancy RM, Backer CB, Yin X, Kapur RP, Molad Y, Buyon JP. Cytokine polymorphisms and histologic expression in autopsy studies: Contribution of tnf-alpha and tgf-beta 1 to the pathogenesis of autoimmuneassociated congenital heart block // J Immunol. - 2003. - vol. 171. - p.32533261. 157. 146. Clancy RM, Kapur RP, Molad Y, Askanase AD, Buyon JP. Immunohistologic evidence supports apoptosis, igg deposition, and novel macrophage/fibroblast crosstalk in the pathologic cascade leading to congenital heart block // Arthritis Rheum. - 2004. - vol. 50. - p.173-182. 158. Miranda ME, Tseng CE, Rashbaum W, Ochs RL, Casiano CA, Di Donato F, et al. Accessibility of ssa/ro and ssb/la antigens to maternal autoantibodies in apoptotic human fetal cardiac myocytes // J Immunol. 1998. - vol.161 - p.5061-5069. 159. Miranda-Carus ME, Askanase AD, Clancy RM, Di Donato F, Chou TM, Libera MR, et al. Anti-ssa/ro and anti-ssb/la autoantibodies bind the surface of apoptotic fetal cardiocytes and promote secretion of tnf-alpha by macrophages // J Immunol. - 2000. - vol.165. - p.5345-5351. 160. Moak JP, Barron KS, Hougen TJ, Wiles HB, Balaji S, Sreeram N, et al. Congenital heart block: Development of late-onset cardiomyopathy, a previously underappreciated sequela // J Am Coll Cardiol. - 2001. - vol.37. p.238-242. 161. Li RK, Li G, Mickle DA, Weisel RD, Merante F, Luss H, et al. Overexpression of transforming growth factor-beta1 and insulin-like growth 150 factor-i in patients with idiopathic hypertrophic cardiomyopathy // Circulation. - 1997. - vol.96. - p.874-881. 162. Pauschinger M, Knopf D, Petschauer S, Doerner A, Poller W, Schwimmbeck PL, et al. Dilated cardiomyopathy is associated with significant changes in collagen type i/iii ratio// Circulation. -1999. vol. 99. p.2750-2756. 163. Bhambi B, Eghbali M. Effect of norepinephrine on myocardial collagen gene expression and response of cardiac fibroblasts after norepinephrine treatment // Am J Pathol. - 1991. - vol.139. - p1131-1142. 164. Wunsch M, Sharma HS, Markert T, Bernotat-Danielowski S, Schott RJ, Kremer P, et al. In situ localization of transforming growth factor beta 1 in porcine heart: Enhanced expression after chronic coronary artery constriction // J Mol Cell Cardiol. - 1991. - vol.23. - p.1051-1062. 165. Villarreal FJ, Dillmann WH. Cardiac hypertrophy-induced changes in mrna levels for tgf-beta 1, fibronectin, and collagen // The American journal of physiology. - 1992. - vol.262. - p.H1861-1866. 166. Kaur K, Zarzoso M, Ponce-Balbuena D, Guerrero-Serna G, Hou L, Musa H, et al. Tgf-beta1, released by myofibroblasts, differentially regulates transcription and function of sodium and potassium channels in adult rat ventricular myocytes // PloS one. - 2013. vol.8 - p. e55391. 167. Lotze U, Egerer R, Gluck B, Zell R, Sigusch H, Erhardt C, et al. Low level myocardial parvovirus b19 persistence is a frequent finding in patients with heart disease but unrelated to ongoing myocardial injury // J Med Virol. - 2010/ - vol.82. p. 1449-1457. 168. Moimas S, Zacchigna S, Merlo M, Buiatti A, Anzini M, Dreas L, et al. Idiopathic dilated cardiomyopathy and persistent viral infection: Lack of association in a controlled study using a quantitative assay // Heart Lung Circ. - 2012. vol.21. - p.787-793. 151 169. Stewart GC, Lopez-Molina J, Gottumukkala RV, Rosner GF, Anello MS, Hecht JL, et al. Myocardial parvovirus b19 persistence: Lack of association with clinicopathologic phenotype in adults with heart failure // Circ Heart Fail. - 2011. - vol. 4. - p.71-78. 170. Severs NJ, Bruce AF, Dupont E, Rothery S. Remodelling of gap junctions and connexin expression in diseased myocardium// Cardiovasc Res. - 2008. - vol. 80. p.9-19. 171. Fairweather D, Rose NR. Inflammatory heart disease: A role for cytokines // Lupus. - 2005. - vol.14. p.646-651. 172. Erdogan D, Tayyar S, Icli A, Uysal BA, Varol E, Ozaydin M, et al. Elevated mean platelet volume is associated with impaired coronary microvascular function in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy // Platelets. - 2012. - vol.23. - p.177-183. 173. Liu Q, Su XJ, Yu Y, Liu YL. Correlation between virus persistent infection and cardic function in patients with dilated cardiomyopathy// J Zhejiang Univ Sci B. - 2013. - vol. 14(8). - p.749-53. 174. Bruning A, Runnebaum IB. Car is a cell-cell adhesion protein in human cancer cells and is expressionally modulated by dexamethasone, tnfalpha, and tgfbeta // Gene therapy. - 2003. - vol.10. - p.198-205. 152
