Механизмы спонтанного свертывания плазмы крови у пациентов

На правах рукописи
Липец Елена Николаевна
Механизмы спонтанного свертывания плазмы крови у
пациентов с различными патологиями
03.01.02 - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва
2013Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
«Гематологический научный центр» » Министерства здравоохранения Российской
Федерации
и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Центр теоретических
проблем физико-химической фармакологии»
Российской академии наук
Научный руководитель:
доктор физико-математических наук,
Пантелеев Михаил Александрович
Официальные оппоненты:
Каминский Юрий Георгиевич,
доктор биологических наук, заведущий
лабораторией Института теоретической и
экспериментальной биофизики РАН
Твердислов Всеволод Александрович, доктор
физико-математических наук, заведующий кафедрой
биофизики МГУ им. Ломоносова
Bедущая организация:
ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр
детской гематологии, онкологии и иммунологии
имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России
Защита диссертации состоится « 17 » декабря 2013 года в
часов
на заседании Диссертационного совета Д.002.252.01 при ФГБУ «Центр теоретических
проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу ул.Саморы Машела, д.1,
г.Москва, ГСП-7
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Центр теоретических
проблем физико-химической фармакологии» РАН.
Автореферат разослан «
»
2013 года
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат медицинских наук
Николаева Ирина Сергеевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
2
Система свертывания крови — каскад ферментативных реакций в плазме крови,
который обеспечивает остановку кровотечения при повреждении кровеносной
системы. В то же время чрезмерная активация этой системы вследствие различных
патологий может приводить к образованию тромбов там, где они не нужны, и вызывать
нарушение кровоснабжения тканей. В процессе свертывания выделяют три звена:
сосудистое, тромбоцитарное и плазменное. Сужение сосудов, вазоконстрикция,
уменьшает ток крови через поврежденный участок или пережимает разрыв, если
повреждение маленькое. Тромбоциты при активации агрегируют, образуя рыхлый
сгусток, не пропускающий клетки крови. Каскад ферментативных реакций белков
плазмы приводит к образованию плотного фибринового геля, не пропускающего
плазму. Все звенья свѐртывания тесно взаимодействуют.
В настоящий момент не существует универсального метода, позволяющего
оценить состояние всей системы свертывания в целом. Рассматривают отдельно
тромбоцитарный, отдельно плазменный гемостаз в гомогенной системе без потока
крови и сосудистой стенки. Результаты анализов недостаточно хорошо отражают
клиническое состояние пациентов. Известно, что при различных патологиях в плазме
пациентов может появляться прокоагулянтный материал: активные факторы
свертывания; прокоагулянтные везикулы, выпущенные опухолевыми клетками,
клетками крови, эндотелием; TF, основной физиологический активатор свертывания,
может появляться на эндотелии и моноцитах под действием липополисахаридов, ТНФ,
ИЛ1,повышенной концентрацией С-реактивного белка. Только в нескольких работах
сопоставляли наличие активирующего материала и риск тромботических осложнений,
большинстве случаев функциональная значимость перечисленных факторов не ясна.
Определить ее с помощью гомогенных тестов на свертывание крови сложно из-за
добавления сильного внешнего активатора и перемешивания с ним.
Наиболее близким к физиологии анализом плазменного свертывания является
метод Тромбодинамики (ТД). В этом методе регистрируется рост сгустка в свободной
от тромбоцитов плазме от поверхности с нанесенным тканевым фактором. Если в
плазме пациента присутствуют факторы, способные запустить свертывание, метод
позволяет увидеть в объеме плазмы образование центров спонтанного свертывания.
Цель работы: выяснение механизмов формирования спонтанных сгустков (СС) в
плазме крови пациентов с различными заболеваниями.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать воспроизводимость и стабильность СС, оценить частоту их
встречаемости при различных патологиях.
2. Определить роль различных путей активации плазменного свертывания в
3
образовании СС: контактной активации, пути тканевого фактора (ТФ),
циркулирующих активных факторов.
3. Выяснить, почему спонтанное свертывание происходит неоднородно по всему
объему, запускается от отдельных центров.
Научная новизна. Обнаружен новый феномен спонтанного свертывания в
свободной от тромбоцитов плазме пациентов с различными патологиями. Показано, что
присутствие в плазме крови пациентов циркулирующего тканевого фактора лишь в
малой доле случаев является причиной спонтанного свертывания. Среди активных
факторов, имеющих значительное время жизни в плазме, причиной спонтанного
свертывания могут быть факторы IXa и XIa.
Показано, что циркулирующие микровезикулы, выделенные из плазмы
пациентов и даже здоровых доноров способны не только ускорять реакции
свертывания, но и самостоятельно активировать спонтанное свертывание плазмы крови
по контактному пути. Эта реакция показана как в плазме, так и в системе с
очищенными факторами контактного пути. Значимость этой реакции для процесса
свертывания подтверждается в тесте Тромбодинамики.
Научно-практическое значение. Преобладание феномена спонтанных сгустков у
пациентов говорит о его возможной диагностической значимости. Проведение
предложенных в работе дополнительных тестов для выяснения природы спонтанного
свертывания может помочь в дальнейшем для выбора адекватной терапии. Данные о
влиянии микровезикул на плазменное свертывание вносит вклад в понимание
регуляции гемостаза.
Положения, выносимые на защиту:
1. У пациентов с острой лейкемией, инфарктом миокарда, гемолитической
анемией наблюдается гиперкоагуляцонное состояние, при котором обнаружено явление
спонтанного свертывания плазмы крови in vitro. При этом в плазме больного через 1050 минут появляются активные центры спонтанного свертывания, из которых
начинают расти фибриновые сгустки. Светорассеяние и скорость роста этих сгустков
похожи на соответсвующие характеристики сгустка, растущего от поверхности,
покрытой таневым фактором.
2. Исследовано, является ли молекулярной причиной этого явления повышение в
плазме пациентов уровня активных факторов Va, VIIa, IXa и XIa. Показано, что
причиной спонтанного свертывания могут быть только факторы IXa и XIa. Эти
факторы вызывают свертывание от отдельных центров, подобно плазме пациентов при
добавлении в плазму здоровых доноров в концентрациях, составляющих десятые доли
процента от физиологических концентраций предшественников.
3. Факторы Va и VIIa при добавлении в плазму здоровых добровольцев
4
незначительно влияют на скорость роста сгустка и вызывают равномерное свертывание
плазмы.
4. На группе пациентов с различными болезнями показано, что большинство
случаев возникновения СС не связано с присутствием в плазме крови пациентов
циркулирующего тканевого фактора. ТФ вносил вклад в образование СС лишь в 4 из 23
образцов плазм со СС.
5. Основным источником спонтанного свертывания являются циркулирующие
в крови микровезикулы. Они способны не только ускорять реакции свертывания, но и
самостоятельно активировать спонтанное свертывание плазмы крови по контактному
пути. Это подтвержается тем, что спонтанные сгустки пропадают при осаждении
микровезикул и в плазме большинства пациентов со спонтанными сгустками
количество микровезикул повышено.
Апробация работы. Работа прошла апробации: 1 ноября 2013 года на заседании
межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической
фармакологии РАН.
Результаты диссертационной работы были представлены: Gordon Research
Conference on Hemostasis (Waterville Valley, NH, USA, 22-27.07 2012), ―54th ASH 2012
Annual Meeting and Exposition‖ (Atlanta, GA, USA, 8-11.12 2012), IV Съезд биофизиков
России, симпозиум III «Физика - медицине и экологии» (Нижний Новгород, Россия, 2225.08.2012), Конгресс гематологов России (Москва, Россия, 2-4.07.2012), V-ой
Конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой
хирургии (Москва, Россия, 3-5.02.2011)
Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 6 научных
работ. Статей в рецензируемых журналах – 1; публикаций в трудах конференций и
съездов – 5.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на___страницах
машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 – обзора
литературы, главы 2 – описания материалов и методов, главы 3 – описание
экспериментальных результатов, главы 4 – обсуждения результатов), выводов и
библиографического указателя, включающего ___ источников. Работа выполнена на
базе ФГБУ Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в
лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией д.ф.-м.н.
Пантелеев М.А.).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении показана актуальность исследуемой темы, сформулированы цели и
5
задачи, дана общая характеристика работы.
Глава 1 посвящена обзору литературы. Она содержит сведения о плазменном звене
гемостаза человека. Рассмотрены основные прокоагулянтные изменения системы
свертывания предположительно способные приводить к активации свертывания без
повреждения сосудов. Особое внимание уделено свойствам и происхождению
микрочастиц как наиболее вероятной причине спонтанного свертывания. Описаны
существующие методы оценки плазменного гемостаза и их способность реагировать на
прокоагулянтный материал.
В главе 2 описываются материалы и методы, используемые в работе. Приводятся
реактивы, использованные при проведении экспериментов, методика забора крови у
пациентов и приготовления из нее свободной от тромбоцитов и обедненной везикулами
плазмы. Краткое описание основных методик приведено ниже.
Тромбодинамика.
Для наблюдения роста сгустка в пространстве в 150 мкл плазмы добавляли 6 мкл
раствора ингибитора контактной активации CTI (5 мг/мл), инкубировали 10 мин при
37º, в опытах с добавлением факторов свертывания добавляли 3 мкл раствора
соответствующего фактора, рекальцифицировали 3 мкл Са(1М), заливали в кювету.
Кювета помещалась в термостат, в нее опускалась подложка с нанесенным тканевым
фактором. От пленки тканевого фактора начинался рост сгустка, который
фиксировался по сигналу светорассеяния на цифровую камеру. По фотографиям
сгустка определяли зависимость размера сгустка от времени. Стационарная скорость
роста сгустка определялась как линейная аппроксимация этой зависимости на участке
от 10 до 40 мин с момента начала роста сгустка. Для определения времени начала
спонтанного свертывания на снимке выделялась максимальная область, занятая
плазмой, не включающая сгусток от активатора и стенки кюветы. В этой области
вычислялась зависимость площади свернувшейся плазмы от времени. Время
достижения площади свернувшейся плазмы 5% (T0.05) от площади всей выделенной
области или время достижения средней интенсивности светорассеяния в выделенной
области 10% от максимума (T0.1) отопределялось как время начала спонтанного
свертывания (рис.1).
Активаторы для метода тромбодинамики изготовлены по методике, описанной в
[Fadeeva OA et al. Biochemistry 2010] CTI растворялся в буфере 75мМ HEPES, 140мМ
NaCl, рН=7.4. Высокая концентрация буфера бралась для стабилизации рН в пределах
7.2-7.6.
6
A
B
Нормальный
донор
5
3
6
2
5 мин 20 мин 35 мин 50 мин
1 mm
Диффузная Вкрупноклеточн
ая лимфома
1
4
тромбофилия
1 – плазма
2 – сгусток
3 – иммобилизованный
тканевый фактор
4 – термостат, T=37ºC
5 – световой диод, λ=625нм
6 – CCD камера
лимфогрануле
матоз
Интенсивность светорассеяния, у.е.
C
Размер сгустка, мкм
10000
tg-стационарная скорость
1500
1000

500
0
0
10
20
30
40
50
8000
6000
4000
T0.1
2000
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин
60
Время, мин
Рис1. А. Принципиальная схема установки. В. снимки растущего сгустка в нормальной плазме
и в плазме пациентов. Активирующая поверхность расположена по нижнему краю снимка, светлая
полоса на ней – растущий сгусток, светлые области, возникающие вдали от активатора –
спонтанные сгустки. С. Определение скорости роста сгустка и времени начала спонтанного
свертывания (Т0.1). Стационарная скорость роста сгустка определяется как тангенс угла наклона
линейной аппроксимации зависимости размера сгустка от времени в интервале от 10 до 40 мин
после начала свертывания. Время начала спонтанного свертывания определялось как время
достижения средней интенсивностью светорассеяния свободного объема плазмы 10% от
максимума либо время свертывания 5% свободного объема плазмы (исключались стенки кюветы и
пространство занятое сгустком от активатора).
Приготовление VIIai
Метод инактивации VIIa был взят из статьи [Arnljots B et al. J Vasc Surg 1997] с
изменениями. Ингибитор ТФ готовился из VIIa (препарат Novo Seven, Novo Nordisk,
Дания) блокированием активного сайта. VIIa инкубировался с PPACK в течении 60 мин
при 4ºС в соотношении 1:2. Полученный VIIai очищался от PPACK диализом с
перемешиванием против буфера Tris 6 ч при комнатной температуре. Конечная
концентрация VIIai измерялась на спектрофотометре по поглощению на 280 нм.
7
Приготовление везикул.
Искусственные фосфолипидные везикулы 80% PC, 20% PS готовились по протоколу
рекомендованному Avanti Polar Lipids с незначительными изменениями. Фосфолипиды
Avanti гамильтовым шприцом переносились в круглодонную колбу, высушивались 30
мин под струей азота от хлороформа, 30 мин гидратировались в буфере 20 мМ HEPES,
140 мМ NaCl, рН=7.5 при Т>50°C. Колба при этом была закреплена на шейкере.
Полученный раствор подвергался циклу заморозки-разморозки, нагревался до Т>50°C
и пригонялся через мембрану экструдера. Диаметр пор 100 нм.
Цитометрия.
Измерение везикул проводилось на цитометре Becton Dickinson FACSCalibur (San
Jose, CA, USA) с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson) по
методике из работы [Joop K et al. Thromb Haemost 2001] с модификациями. 200 мкл
свободной от тромбоцитов плазмы центрифугировали 30 мин при 16000 g, 180 мкл
плазмы удаляли. Оставшиеся 20 мкл ресуспензировали в 180 мкл буфера А (150 мМ
NaCl, 2.7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0.4 мМ NaH2PO4, 20 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0.5%
бычьего сывороточного альбумина, pH 7.4, отфильтрован через мембрану 0.22 мкм),
содержащего 3,8% цитрата. Далее образец повторно центрифугировали 30 мин при
16000 g, удаляли 180 мкл супернатанта.
К 5 мкл полученного раствора везикул добавляли 35 мкл буфера А с Са(10мМ) (без
Са в контроле с ЕДТА), 5 мкл 10% аннексина V-FITC, 5 мкл антитела anti-CD61-PerCP,
инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Перед измерением добавляли 200
мкл буфера А с 2,5 мМ Са) (без Са в контроле с ЕДТА). Измерение на цитометре
проводили в течение 1мин на минимальной скорости потока. События считались по
свечению в канале FL1. Для количественной оценки концентрации микровезикул в
образце использовались калибровочные шарики Count Bright Beads (Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA) для получения концентрации везикул в плазме концентрацию в
образце домножали на коэффициент 250/5/10. Границу гейтирования по FL1 выбирали
из опыта с добавлением 5 мкл EDTA в концентрации 100 мМ при окрашивании,
границу по FL3 по опыту без добавления антител. В координатах прямого и бокового
светорассеяния выделялась область, соответствующая тромбоцитам, и исключалась из
области везикул.
Измерение активности факторов контактного пути.
Активность факторов контактного пути оценивалась по скорости расщепления
субстрата к fXIIa, fXIa, и калликреину S2302. Поглащение на длине волны 405 нм от
продукта расщепления субстрата измерялся на приборе Appliskan (Thermo Scientific Ins,
Waltham, Massachusetts, USA). В лунку планшета заливали 8 мкл субстрата S2302 (2
мМ), 92 мкл образца. Образцы готовились следующим образом: 1 мл свободной от
тромбоцитов плазмы центрифугировали 30 мин при 16000 g, верхние 90% —
8
обедненная везикулами плазма (овп), нижние 10% ресуспензировали в 900 мкл буфера
А с цитратом, проводили повторное центрифугирование, удаляли 90% супернатанта.
Далее концентрат везикул либо разводили в 5 раз буфером А с цитратом, либо
отмывали еще 2 раза буфером А и разводили в 5 раз. Для каждого донора проводили
измерения следующих образцов: обедненная везикулами плазма данного донора;
везикулы после первой отмывки (содержащие разведенную в 50 раз плазму); везикулы
после первой отмывки с добавлением CTI в конечной концентрации 200мкг/мл;
везикулы после 3х отмывок; везикулы после 3х отмывок с добавлением fXII в конечной
концентрации 22 нМ; буфер; буфер с добавлением 22 нМ fXII.
Глава 3 содержит результаты работы.
Частота возникновения СС при различных патологиях, воспроизводимость СС.
Проводя анализ тромбодинамики для пациентов с различными патологиями, мы
регулярно наблюдали образование сгустков вдали от активатора (Рис. 1). Спонтанные
сгустки возникали у 4 из 12 пациентов с аутоиммунной гемолитической анемией, у 2 из
5 пациентов с острым лейкозом, у 6 из 10 пациентов с инфарктом миокарда, у 1 из 35
нормальных доноров. Т.о. при патологии СС встречаются существенно чаще, чем в
норме.
При повторах на одном образце плазмы со СС феномен неизменно воспроизводился,
коэффициент вариации времени начала спонтанного свертывания (T0.1) составил
11±12% (n=12). После цикла заморозки и разморозки плазмы феномен формирования
спонтанных сгустков также сохранялся, T0.1 в среднем менялось на -10±60% (n=7). Т.о.
скорость образования СС в отдельных образцах может существенно изменяться как в
сторону замедления, так и в сторону ускорения, но качественного систематического
сдвига не происходит, что указывает на возможность работы в размороженной плазме.
При хранении свободной от тромбоцитов плазмы в течение 3 ч при комнатной
температуре T0.1 меняется на 8±11% (n=3). Хранение 5-8 часов может приводить к
снижению интенсивности зарастания, но сам феномен по-прежнему сохраняется (рис.
3а).
Контактная активация от поверхностей кювет и пробирок всегда присутствует в
любой постановке in vitro. Можно было бы предположить, что СС возникают в
результате того, что добавленного ингибитора контактного пути CTI недостаточно для
полного ингибирования контактной активации от стенок кюветы. В этом случае
увеличение отношения поверхности к объему кюветы должно было бы приводить к
уменьшению Т0.05. В опытах на 3х образцах плазмы со СС было показано, что при
увеличении ширины кюветы от 0.85 до 2.4 мм T0.05 достоверно не меняется,
следовательно, активация идет в объеме плазмы.
Роль различных путей активации в образовании СС. (Опыты на модельной
гиперкоагуляции) Известно, что при ряде патологий в крови могут циркулировать
9
активные факторы. Чтобы проверить, могут ли они приводить к спонтанному
свертыванию в тесте тромбодинамики, мы сравнивали результаты теста на плазме
пациентов и на плазме здоровых доноров с добавлением факторов, имеющих
значительное время жизни в плазме: fVa, fVIIa, fIXa, fXIa, TF.
Добавление факторов Va, VIIa и растворимого TF приводило к равномерному
зарастанию объема плазмы, что нетипично для плазмы пациентов. Напротив, факторы
IXa и XIa вызывали появление отдельных центров свертывания, как в большинстве
клинических образцов (рис.2А).
В плазме пациентов в подавляющем большинстве случаев появление спонтанных
сгустков сочетается с повышенной стационарной скоростью роста сгустка. На рис.2В
представлено распределение стационарной скорости для анализов со СС и без. Второе
сдвинуто в область высоких скоростей. Из активных факторов Va, VIIa, растворимого
TF, IXa и XIa только два последних вместе с инициированием спонтанных сгустков
существенно и достоверно влияли на стационарную скорость (рис. 2C).
Рис2. А. Характерные картины спонтанного свертывания при добавлении активных факторов.
В. Распределение скоростей роста сгустка в плазме пациентов со СС и без. С. Изменение
стационарной скорости роста сгустка при добавлении активных факторов в плазму здоровых
доноров.
10
СС в плазме пациентов стабильны в течении 3-х и более часов (рис.3А). Было не
ясно, могут ли только активные факторы IXa и XIa сохранять активность так долго. Мы
сравнили стабильность СС, вызванных добавлением этих факторов в плазму здоровых
доноров, с такими же данными на плазме пациентов. 75 рМ фактора IXа, приводящие к
появлению СС через 20-30 мин после добавления, через 3 часа исчезали (рис 3В),
спонтанные в плазме пациентов и при добавлении 150 рМ XIа были более стабильны
(рис 3С), но тоже исчезали быстрее, чем у пациентов. Эти данные указывают на то, что
факторы IXa и XIa играют роль в формировании спонтанных сгустков, но их
недостаточно для объяснения стабильных СС. Активные факторы должны быть как-то
защищены от ингибирования, либо должны нарабатываться.
Рис.3 Зависимость 1/время начала
спонтанного свертывания от времени
хранения в плазме пациентов (А), в плазме
здоровых доноров с добавлением 75рМ IXa
(В) и 150pM XIa (С). T0.1 нормировано на
T0.1 для данной плазмы, измеренное в
первой точке.
Роль прокоагулянтных зимогенов в
образовании СС. Возможно, что в
плазме пациентов нет дополнительного
активирующего материала, но понижен
порог активации. В таком случае всегда
присутствующая в эксперименте in
vitro, но слишком слабая, чтобы
превысить порог в нормальной плазме,
контактная активация может запустить
свертывание в плазме пациента. Мы
добавляли в плазму здоровых доноров
прокоагулянтные зимогены, которые
по нашим ожиданиям должны влиять
на порог [Panteleev MA et al. Biophys J
2010]: fII, fV, и те, от которых влияния
не ожидали: fVIII, fIX. Удвоение
концентраций этих зимогенов в плазме
здоровых доноров не вызывало ни появления спонтанных сгустков, ни существенного
увеличения скоростей (рис.2С). Т.о. либо эти зимогены существенно не влияют на
11
порог, либо к образованию СС приводит дополнительная активация.
Роль различных путей активации в образовании СС. (Опыты на естественной
гиперкоагуляции.)
Для определения вкладов в спонтанное свертывание различных активных факторов в
плазме пациентов мы блокировали их ингибитором тканевого фактора инактивированным фактором VIIa (VIIai) (n=23), ингибитором fXIa - антителом к
фактору XI (fXI mAb) (n=8), ингибитором к фактору IXa, Nitrophorin2 (n=8). На рис. 4А
можно увидеть характерные картины спонтанного свертывания, соответствующие
постановкам без добавления ингибиторов, с добавлением fXI mAb, Nitrophorin2, VIIai.
Средние 1/T0.05 по каждой постановки для 8 доноров представлены на рис. 4В.
Ингибирование тканевого фактора было существенным для 4 из 23 образцов плазмы
для пациентки с острым лейкозом, с раком печени и илиофеморальным тромбозом, с
волосатоклеточным лейкозом и с аутоимунной гемолитической анемией. Ингибиторы
факторов IXa и XIa в большинстве случаев приводили к исчезновению СС либо
приводили к их сильному уменьшению.
Рис.4 А. Характерные снимки растущего сгустка в тесте Тромбодинамики для 4х постановок:
без добавления ингибиторов, с добавлением fXI mAb, Nitrophorin2, VIIai. В. Средние по 8 донорам
1/T0.05 для каждой из перечисленных постановок.
Т.о. СС могут возникать в плазме в результате присутствия ТФ, но в большинстве
случаев причина другая. Факторы IXa и XIa являются вероятной причиной спонтанного
свертывания, но только их присутствием нельзя объяснить неравномерность
спонтанного свертывания и длительного сохранения феномена в плазме пациентов.
Роль микрочастиц в образовании СС. При активации от равномерно распределенного
в плазме белка естественно ожидать равномерного зарастания, т.к. количество молекул
на много порядков превышает количество центров зарастания. Достаточно малое
12
количество таких центров, возможно, объясняется тем, что активный фактор
связывается с более редкими крупными частицами, на поверхности которых
свертывание запускается быстрее. Естественные кандидаты на роль таких частиц –
фосфолипидные везикулы.
Центрифугированием на больших ускорениях везикулы можно осадить.
Центрифугирование 30 мин на 16000g нормальной плазмы с добавленным fIXa либо
fXIa приводит к очищению среднего слоя от СС. В верхнем слое СС также не
образуются, а нижний зарастает значительно быстрее, чем исходная свободная от
тромбоцитов плазма. Подобным образом ведет себя и спонтанное свертывание в
разных слоях плазмы пациентов.
Для активации свертывания может быть важна фосфолипидная мембрана везикул, а,
возможно, находящиеся на поверхности белки. Мы восполняли средние 40% (n=12)
либо верхние 90% (n=10) отцентрифугированной на 16000g плазмы пациентов
искусственными фосфолипидными везикулами в концентрации 0.5мкМ. Два способа
отбора плазмы не давали качественных различий, поэтому результаты будут приведены
для объединенной группы. Концентрация фосфолипидных везикул 0.5мкМ была
выбрана так, чтобы скорости роста сгустка приблизительно восстанавливались до
скоростей в свободной от тромбоцитов плазме. При данном режиме
центрифугирования микровезикулы не удаляются из верхних слоев полностью,
поэтому мы считали, что картина спонтанного свертывания не восстановилась при
добавлении искусственных везикул, если количество центров спонтанного свертывания
уменьшилось более чем в 2 раза. В плазме пациентов скорости роста сгустка при
добавлении везикул возрастали, но картина СС не восстановилась у 17 из 22 пациентов
(рис.5А). В модели зарастающей плазмы с добавлением факторов IXа и XIа количество
центров СС также существенно снижалось (Рис.5C).
Более прямой способ определение природы активирующих частиц – проточная
цитометрия. pfp здоровых доноров содержало 290±170 PS+ частиц/мкл, из них 150±120
тромбоцитарных (CD61+) (n=6). Концентрация везикул была измерена для 7 пациентов
со СС. У 5 из них их (с наследственной гемолитической анемией, в состоянии сепсиса,
с гемофилией А через сутки после операции тазобедренного сустава, с множественной
миеломой и пневмонией, с лимфогранулематозом на фоне химиотерапии) количество
везикул было повышено, в среднем составляло 2070±620 PS+, 1220±720 CD61+
частиц/мкл. У двух пациентов (бактериальный эндокардит, гемофилия А во время
операции) количество везикул было нормальным: 390 и 120 PS+, 230 и 80 CD61+
частиц/мкл соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что в
большинстве случаев микрочастицы играют ключевую роль в образовании СС. Причем
эта роль не сводится к предоставлению фосфолипидной поверхности.
13
A
5 мин
25 мин
45 мин
B
5 мин
свободная от
тромбоцитов
плазма
свободная от
тромбоцитов
плазма
обедненная
везикулами
обедненная
везикулами
обедненная
везикулами
+0.5μM PL
обедненная
везикулами
+0.5μM PL
C
свободная от
тромбоцитов
плазма
5 мин
20 мин
35 мин
50 мин
25 мин
45 мин
65 мин
1 mm
свободная от
тромбоцитов
плазма + 150 pM
XIa
обедненная
везикулами + 150
pM XIa
обедненная
везикулами +0.5μM
PL
обедненная
везикулами +0.5μM
PL+150pM XIa
Рис. 5 Характерные картины зарастания после центрифугирования и восполнения
фосфолипидных везикул в плазме пациентов в случае, когда спонтанные сгустки
восстанавливались(А) (n=5) и не восстанавливались (В) (n=17), в плазме нормального донора с
добавленным fIXa (С) (n=4). Спонтанные сгустки в плазме с добавленым
фXIa при
центрифугировании и восполнении восстанавливаются аналогично образцам с фIXa (n=3).
Активация контактного пути везикулами. В литературе есть данные, что
активированные тромбоциты и микровезикулы могут активировать плазму по
контактному пути [Van Der Meijden et al J Thromb Haemost 2012, Back J et al Biochem
Biophys Res Commun 2010, Muller F et al 2009]. Мы хотели проверить, могут ли
циркулирующие в плазме везикулы приводить к спонтанному свертыванию в тесте
14
тромбодинамики. Для этого на группе нормальных доноров ставилась ТД на свободной
от тромбоцитов плазме и плазме, обогащенной везикулами (нижние 30% после
центрифугирования 30мин. при 16000g), а также оценивалась активность факторов
контактного пути в образцах с выделенными везикулами и с разведенной в 50 раз
цитратной плазмой в качестве источника fXII и кофакторов.
У большинства нормальных доноров в плазме обогащенной везикулами возникают
СС (Рис 6A). Скорость расщепления субстрата в образце с везикулами и разведенной,
очищенной от везикул плазме доноров достоверно(p<0.05) возрастала в 2.9±0.5 раз по
сравнению с образцом с плазмой. Добавление ингибитора фактора XII достоверно
снижало действие везикул (рис.6B). Добавление 22нМ чистого фактора XII в образец с
везикулами увеличивало скорость расщепления субстрата в 1.7±0.2 раз по сравнению с
образцом только везикул (рис.6С).
Приведенные данные показывают, что циркулирующие микрочастицы активируют
плазму по контактному пути.
Рис 6. Снимки роста сгустка в свободной от тромбоцитов плазме и в обогащенной везикулами в
3,3 раза плазме нормального донора (А). Скорость расщепления субстрата для факторов XIIа, XIа,
калликреина S2302 в следующих образцах: везикулы после 3х отмывок , обедненная везикулами
15
плазма (овп); везикулы после первой отмывки (содержащие разведенную в 50 раз плазму)
(везикулы+овп); везикулы после первой отмывки с добавлением CTI в конечной концентрации
200мкг/мл (везикулы+овп+CTI); (B) везикулы после 3х отмывок с добавлением fXII в конечной
концентрации 22нМ (везикулы+fXII); буфер; буфер с добавлением 22нМ fXII (буфер+fXII). (С) На
диаграмме представлены средние значения по 7 донорам ±sе.
Глава 4 посвящена обсуждению основных результатов работы.
Главным результатом настоящей работы является обнаружение феномена
спонтанного свертывания в плазме крови пациентов с гематологическими
нарушениями и выявление его механизма, в большинстве случаев связанного с
циркулирущими микровезикулами, активирующими плазму по контактному пути, и
факторами IXa и XIa.
Феномен СС воспроизводился при повторах, заморозке и разморозке, сохраняется
при стоянии плазмы более 3 ч. Мы также предполагали, что образование СС может
быть связано с неудачным забором крови, когда в пробирку попадает некоторое
количество тканевого фактора или происходит частичный гемолиз. Долгое стояние
крови и тряска при транспортировке также может приводить к везикуляции клеток
крови и появлению CC. Однако СС появляются и в пробах, где не было допущено
ошибок при подготовке, и причина находится в самой плазме. Это подтверждается тем,
что из 29 пациентов, со СС, которых мы наблюдали длительное время, у 16 СС
возникали повторно, а так же тем, что у пациентов они возникают стабильно
значительно чаще, чем у здоровых доноров.
В настоящем исследовании мы предпочли подход "широкого фронта", используя
плазму от большого количества пациентов с разными патологиями. Это является
существенным недостатком, так как в результате статистика по каждой отдельной
патологии недостаточна для четких заключений по ней. Однако это позволило нам
оценить распространенность и универсальность феномена образования СС. Результаты,
полученные на разных пациентах, указывают в то, что ключевые механизмы патологии
у разных пациентов очень схожи.
Так, в рассмотренных нами случаях активация по внешнему пути встречалась редко,
в 4 из 23 случаев.
Факторы XIа и IXа могут образовываться не только в процессе подготовки пробы in
vitro, но по литературным данным и в крови больного [Undas A et al Thromb Res 2011,
Luszczak J et al Blood Coagul Fibrinolysis 2011, Minnema MC et al Arterioscler Thromb
Vasc Biol 2000]. Поэтому активные факторы можно рассматривать как отдельный
способ активации свертывания. В пользу их роли в образовании СС говорит то, что в
отличие от других долгоживущих в плазме факторов VIIа и Vа, добавление в плазму
нормального донора факторов IXа и XIа дают картину CC отдельными облаками. С
16
другой стороны СС в нормальной плазме с добавленными факторами XIа и особенно
IXа были менее стабильны во времени, чем СС в плазме пациентов. Эти данные
показывают, что присутствие факторов IXа или XIа не всегда достаточно для
объяснения большинства случаев возникновения СС у пациентов.
В тех редких случаях у пациентов мы встречаем равномерное свертывание объема
плазмы, причиной этого может быть присутствие в плазме факторов VIIа, Vа,
растворимого TF. Рост от отдельных редких центров, как в плазме большинства
пациентов, так и в модели с добавлением факторов XIа и IXа указывает, что в плазме
присутствуют частицы, сильно ускоряющие реакции активации либо активирующие
свертывание сами. Естественные кандидаты на роль таких частиц – фосфолипидные
везикулы. Дополнительное центрифугирование свободной от тромбоцитов плазмы,
приводящее к осаждению везикул и частиц подобной плотности и размера приводит к
исчезновению СС, либо их значительному уменьшению. Скорость роста сгустка при
этом так же замедляется в результате недостатка фосфолипидной поверхности. Если
возместить недостаток фосфолипидной поверхности искусственными везикулами,
скорость роста сгустка от активатора восстанавливается, а спонтанные сгустки у 17 из
22 пациентов - нет. Для них, по-видимому, является важным состав поверхности
везикул. В тех случаях, когда восполнение фосфолипидов приводило к восстановлению
СС (5 образцов плазмы пациентов) основной причиной возникновения СС является
компонент, растворенный в плазме, т.к. искусственные фосфолипидные везикулы сами
по себе не могут активировать свертывание, а только ускоряют его. Этот вывод
подтверждается данными цитометрии. У 5 из 7 пациентов со СС в тесте ТД мы
наблюдали повышенное количество аннексин положительных частиц по сравнению с
нормой.
Прямая проверка способности микровезикул активировать свертывание по
контактному пути подтвердила, что даже везикулы от здоровых доноров способны это
делать. Эти данные находятся в отличном согласии с недавней работой [Van Der
Meijden et al J Thromb Haemost 2012], которая продемонстрировала способность
тромбоцитарных и эритроцитарных везикул активировать генерацию тромбина. В
данной работе мы не исследовали детально происходение микрочастиц, но крайне
интересно, что даже везикулы, выделенные из плазмы здорового донора, могли
активировать свертывание по контактному пути. Можно предположить, что в норме
процесс скомпенсирован ингибиторами, и только изменение количества или качества
везикул (в возможной комбинации с факторами, которые этими же везикулами могут и
производиться) ведет к его реализации.
Наша экспериментальная постановка не включает многие физиологические
элементы (стенка сосуда и поток), и мы не наблюдали прямой коррелляции спонтанных
сгустков с тромбозами. Однако, это достаточно физиологический функциональный
17
тест, и появление СС указывает на явные аномальности у пациентов с болезнями,
ассоциироваными с риском тромбоза. Полученные данные указывают на возможную
значимость феномена в понимании механизмов развития гиперкоагуляции и может
иметь диагностическую значимость.
Подводя итог, наши данные показывают, что спонтанные сгустки в большинстве
случаев обусловлены сочетанием прокоагулянтных микровезикул, активирующих
плазму по контактному пути, и циркулирующих факторов XIa и IXa. В ряде
(меньшинстве) случаев механизм может быть другим, связанным с ТФ или другими
факторами.
ВЫВОДЫ
1. У пациентов с повышенным риском тромботических осложнений (больные
острой лейкемией, инфарктом миокарда, гемолитической анемией) обнаружено
явление спонтанного свертывания плазмы крови in vitro. При этом в плазме больного
через 10-50 минут появляются центры спонтанного свертывания, из которых начинают
расти фибриновые сгустки. Светорассеяние и скорость роста этих сгустков похожи на
соответствующие характеристики сгустка, растущего от поверхности, покрытой
таневым фактором.
2. Среди прокоагулянтных факторов, имеющих длительное время жизни в
плазме, причиной спонтанного свертывания могут быть только факторы IXa и XIa.
3. На группе пациентов с различными болезнями показано, что большинство
случаев возникновения СС не связано с присутствием в плазме крови пациентов
циркулирующего тканевого фактора. ТФ вносил вклад в образование СС лишь в 4 из 23
образцов плазм со СС.
4. Основным источником спонтанного свертывания являются циркулирующие
в крови микровезикулы. Они способны не только ускорять реакции свертывания, но и
самостоятельно активировать спонтанное свертывание плазмы крови по контактному
пути. Это подтвержается тем, что спонтанные сгустки пропадают при осаждении
микровезикул и в плазме большинства пациентов со спонтанными сгустками
количество микровезикул повышено.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Panteleev M.A., Balandina A.N., Lipets E.N., Ovanesov M.V., Ataullakhanov F.I.,
Task-oriented modular decomposition of biological networks: trigger mechanism in
blood coagulation. Biophys J 2010; 98 (9):1751-1761.
2. Липец Е.Н., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А.;«Роль различных путей
18
3.
4.
5.
6.
активации свертывания в образовании спонтанных сгустков в свободной от
тромбоцитов плазме». Материалы конференции «Клиническая гемостазиология и
гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» 2011. с. 288-289
Lipets EN, Vlasova O.A., Urnova E.S., Margolin O.V., Soloveva A.A., Ataullakhanov
FI, Panteleev MA, Circulating procoagulant microparticles and coagulation factors IXa
or XIa cooperatively induce spontaneous clotting in plasmas of patients with
hematological disorders. ASH 2012
Липец Е.Н., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А. Механизмы образования
спонтанных сгустков в свободной от тромбоцитов плазме. IV Съезд биофизиков
России, симпозиум III «Физика - медицине и экологии» Сборник тезисов,
симпозиум III, c.142
Липец Е.Н., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А. Роль циркулирующих
активных факторов и микровезикул в образовании спонтанных сгустков в
свободной от тромбоцитов плазме. Конгресс гематологов России. Сборник
тезисов, с.59
Lipets EN, Ataullakhanov FI, Panteleev MA Contribution of circulating active
coagulation factors and microvesicles to spontaneous clotting of hematology patients’
plasma. Gordon Research Conference on Hemostasis 2012
19