морфофункциональные изменения в печени крыс при

Журнал анатомии и гистопатологии. – 2014. – Т. 3, № 3
УДК 616.36–004–018.001.6
© Е. И. Лебедева, О. Д. Мяделец, 2014
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В
ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
ЦИРРОЗЕ
Е. И. Лебедева, О. Д. Мяделец
УО «Витебский государственный медицинский университет», г. Витебск, Беларусь
В статье представлены результаты морфологического исследования цирроза печени у белых крыс, а
также установлен широкий спектр выраженных патобиохимических изменений, включающий гиперферментемию, нарушение белоксинтезирующей функции печени, диспротеинемию, гипогликемию, гиперхолестеролемию. Результаты проведенных гистохимических исследований позволили констатировать, что
введение крысам четыреххлористого углерода и этанола методом свободного выпаивания вызвало существенные нарушения строения и энергетического обмена в печени.
Ключевые слова: цирроз печени, морфология, гистохимия, биохимия, лабораторные крысы.
© E. I. Lebedeva, O. D. Myadelets, 2014
Morphofunctional Changes in a Rat Liver with Experimental Cirrhosis
The article presents the results of the morphological study of liver cirrhosis in white rats. A wide range of
expressed pathobiochemical changes was installed including hyperfermentemia, disturbance of the protein
synthesis in liver, dysproteinemia, hypoglycemia, hypercholesterolemia. The results of histochemical studies
allowed to state that the introduction of carbon tetrachloride and ethanol in rats by free giving to drink caused
substantial violations of the structure and energy metabolism in liver.
Keywords: liver cirrhosis, morphology, histochemistry, biochemistry, laboratory rats.
Введение
Под термином цирроз печени (ЦП)
понимают хроническое полиэтиологическое прогрессирующие заболевание печени, характеризующиеся диффузным разрастанием соединительной ткани с образованием фиброзных септ, узлов регенерации печеночной ткани, состоящих из
функционально неполноценных гепатоцитов, изменением архитектоники печени и развитием псевдодолек, портальной
гипертензии, значительным уменьшением массы гепатоцитов и различной степенью гепатоцеллюлярной недостаточности
[6]. Современная мировая статистика
свидетельствует, что в последние годы
вырос процент смерти от ЦП [7]. Смертность от ЦП в Беларуси в 2009 г. составила 23.9%, а в 2010 г. – 24.9% [2]. Несмотря
на определенные успехи в понимании патогенеза и терапии этого заболевания необходимо отметить, что данные о состоянии митохондриального аппарата гепатоцитов, функции электрон-транспортной
цепи митохондрий, содержании гликогена, развития фиброзной ткани при ЦП
неоднозначны [1, 9]. До сих пор неизвестно, какие факторы оказывают влияние на
прогноз жирового гепатоза как спутника
и предшественника цирроза [10, 11].
С учетом выше сказанного исследование морфофункциональных изменений
в печени при циррозе представляет значительный интерес. Целью настоящего
исследования явилась оценка морфофункциональных изменений в печени белых крыс при использовании модели токсического цирроза печени.
Материал и методы исследования
Исследование проведено на половозрелых беспородных белых крысах
обоего пола массой 180–250 г в осеннезимний период. Животных содержали в
пластико-металлических клетках с опилками, по 6 особей в каждой клетке, при
естественном освещении, со свободным
доступом к корму и воде. Все исследования проводили в одно и то же время суток
с соблюдением принципов, изложенных в
Конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (г. Страсбург,
1986), и согласно правилам лабораторной
практики РБ (приложение к приказу Министерства здравоохранения Республики
Беларусь № 31 от 31.10.2006). На выполнение данных исследований получено
разрешение этического комитета Витебского государственного медицинского
51
Е. И. Лебедева, О. Д. Мяделец
университета. Выбор данного вида лабораторных животных обусловлен, в первую
очередь, возможностью экстраполяции
органных и тканевых изменений у крыс
на таковые у человека. Кроме того, этому
способствовали простота содержания и
легкость выполнения с крысами различных процедур (фиксация, введение растворов веществ с помощью зонда и т.д.).
Животные были разделены на три
группы: опытная (n=12, 6 самцов и 6 самок), контрольная (n=12, 6 самцов и 6 самок) и интактная (n=12, 6 самцов и 6 самок). Токсическое поражение печени моделировали путем длительного внутрижелудочного введения 40%-го масляного
раствора четыреххлористого углерода
(ССL4) 2 раза в неделю в утренние часы за
4 часа до кормления. Параллельно с этим
вместо воды в качестве питья крысы получали 5%-ный раствор этанола из поилок в режиме свободного доступа в течение 19 недель. Контрольные (плацебо)
животные получали эквиобъемное количество растворителя ССL4 (оливковое
масло), а в качестве питья – кипяченую
воду из поилок в режиме свободного доступа. Интактные животные – крысы того
же возраста и веса, что и экспериментальные. Степень выраженности патологических изменений, регистрируемых у
животных, подвергшихся длительной интоксикации, определяли с помощью гистологических, гистохимических, гистоэнзимологических и биохимических исследований.
В качестве материала для биохимических исследований использовали сыворотку крови животных, которую получали
по общепринятой методике. Для определения активности аланинаминотрасферазы (GPT, U/L) и аспартатаминотрансферазы (GOT, U/L) использовали кинетичекский метод IFCC без пиридоксаля,
гаммаглутамилтранспептидазы (γ-GGT,
U/L) – кинетичекский метод, щелочной
фосфатазы (ALP, U/L) – кинетичекский
метод с образованием 4-нитрофенола.
Для оценки углеводного и белкового обмена у контрольных и экспериментальных животных определяли содержание
глюкозы, общего белка, альбумина, мочевины, и мочевой кислоты. Концентрацию
глюкозы (Gl, ммоль/л) определяли ферментативным методом, концентрацию
общего белка (Pr, г/л) – биуретным мето-
52
дом. Альбумин (Alb, г/л) определяли
прямым колориметрическим методом с
бромкрезоловым зеленым, мочевину (Ur,
ммоль/л)
–
ферментативнокинетическим методом с уреазой и ГЛДГ,
мочевую кислоту (UА, мкмоль/л) – энзиматическим методом с уриказой и пероксидазой. Для оценки липидного обмена
определяли содержание общего холестерола и триацилглицеролов. Общий холестерол (Chol, ммоль/л) определяли энзиматическим колориметрическим РАРметодом,
триацилглицеролов
(TАG,
ммоль/л) – колориметрическим энзиматическим методом с глицерофосфорной
оксидазой. Общий билирубин (Bil,
ммоль/л) определяли с диазониевой солью сульфаниловой кислоты. Биохимические анализы выполняли на биохимическом автоматическом анализаторе EuroLyser (EUROLab, Instruments GmbH; Австрия) с использованием стандартных диагностических наборов реактивов фирмы
«Cormay» (Польша) согласно приложенным к ним инструкциям.
Материалом для патоморфологических исследований служили фрагменты
нормальной и патологически измененной
левой боковой доли печени животных.
Для выявления общих гистологических
изменений фрагменты органа фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального
забуференного формалина (рН 7.2–7.4).
Проводку осуществляли в автомате для
гистологической обработки ткани STP120 (тип карусель, Германия), заливку –
на станции для заливки ткани парафином
EC350 (Германия). С каждого блока с помощью ротационного микротома НМ
340Е (MICROM, Laborgerate GmbH; Германия) получали серийные срезы толщиной 4–5 мкм)и окрашивали их гематоксилином и эозином в автоматическом
программируемом приборе для цитологических и гистологических исследований HMS70 (Германия). Ранние фибропластические изменения выявляли при
помощи окраски вручную по методу Маллори в собственной модификации. Степень фиброзных изменений печени оценивали по шкале Knodell [4]. Гликоген
выявляли по методу Шабадаша. В нефиксированных срезах печени (10 мкм), приготовленных на микротоме-криостате
НМ525 (MICROM, International GmbH;
Германия), гистохимически определяли
Морфофункциональные изменения в печени крыс при экспериментальном циррозе
содержание общих липидов суданом III,
IV, с докраской ядер гематоксилином
Гарриса и заключали в глицерин. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) определяли по методу Нахласа на криостатных срезах. Приготовление красителей,
постановку соответствующих контролей
проводили в соответствии с прописями,
проведенными в руководствах [5, 8]. Изучение гистологических препаратов, их
микрофотографирование выполняли с
помощью микроскопа OLYMPUS BX 51 со
встроенной видеокамерой OLYMPUS XC
30 (Япония) при увеличении окуляра
SWH 10X-H/26,5 и объективов UPLanFL
20×/0,50, 40×/0,75, 60×/1,42 с программным обеспечением анализа изображений
ImageScope Color. Статистический анализ
полученных результатов проводили в
табличном процессоре Microsoft Office Excel 2007 и STATISTIKA 6,0. Определяли
средние значения, стандартные отклонения. Учитывая малую выборку животных,
неправильное распределение исследуемых признаков, а также неравенство дисперсий для статистической обработки полученных результатов, был использован
непараметрический U-критерия Манна–
Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0.05.
Результаты и их обсуждение
У подопытных крыс с моделью токсического цирроза были зафиксированы
резко выраженные изменения биохимических показателей морфофункционального состояния печени. Наблюдалось существенное увеличение трансминаз в сыворотке крови. У самцов отмечалось увеличение активности GOT в 1.9 раза
(р<0.002), а у самок – в 2.3 раза
(р<0.002). Активность GPT увеличилась
еще более значительно у самцов – в 5.3
раза (р<0.002), а у самок – в 9.2 раза
(р<0.002), по сравнению с данными контрольной группы. Результаты изучения
активности индикаторных ферментов позволяют утверждать, что зафиксированное повышение активности трансминаз в
сыворотке крови свидетельствует о повреждении мембран гепатоцитов, повышении их проницаемости, а также гибели
клеток, которое сопровождается выходом
внутриклеточных субстанций в кровь. О
преимущественном повреждении внеш-
них мембран клеток печени свидетельствует значительное увеличение активности
GOT по сравнению с изменением активности цитоплазматического фермента –
GPT,
имеющего
митохондриальноцитоплазматическую локализацию.
Активность ALP у экспериментальных животных возросла у самцов в 3.6
раза (р<0.002), и у самок – в 1.6 раза
(р<0.002), а активность γ-GGT сыворотки
крови превысила данные, полученные в
контрольной группе крыс, у самцов в 2.5
раза (р<0.002), а у самок – в 3.7 раза
(р<0.002).
Исследование ключевого показателя
пигментного обмена общего билирубина
сыворотки крови выявило достоверное
увеличение его содержания в крови у
крыс с циррозом: у самцов в 2.3 раза
(р<0.002), а у самок – в 2.1 раза (р<0.002)
по сравнению с контрольной группой. На
развитие массивного некроза части гепатоцитов указывает увеличение активности γ-GGT и ALP в крови крыс, а повышение концентрации общего билирубина,
преимущественно за счет его прямой
фракции, на фоне высокой активности γGGT и ALP дает основание для утверждения, что у подопытных животных имело
место не только формирование синдрома
цитолиза, но и развитие синдрома внутрипеченочного холестаза.
Изменения углеводного обмена
проявились в снижении уровня глюкозы в
сыворотке крови крыс у самцов в 1.9 раза
(р<0.002), а у самок – в 1.5 раза (р<0.002)
по сравнению с контролем. Выявленная
гипогликемия связана с нарушением
процессов гликогенолиза и глюконеогенеза в печени экспериментальных животных.
Влияние четыреххлористого углерода и этанола на белковый обмен в организме подопытных крыс проявилось в
увеличении Pr у самцов в 1.3 раза
(р<0.002), а у самок – в 1.2 раза (р<0.002)
по сравнению с контрольной группой.
Увеличение содержания общего белка в
сыворотке крови, по-видимому, можно
рассматривать как проявление репаративных процессов в гепатоцитах. Результаты исследования сыворотки крови животных контрольной и опытных групп
свидетельствуют о снижении уровня Alb у
самцов в 1.3 раза (р<0.002), а у самок – в
1.4 раза (р<0.002), снижение уровня со
53
Журнал анатомии и гистопатологии. – 2014. – Т. 3, № 3
Рис. 1. Печень контрольных животных. Окраска гематоксилином и эозином. Об. 20.
Рис. 2. Печень животных при экспериментальном циррозе. Обозначения: а – самцы,
б – самки. Окраска по методу Маллори в
собственной модификации. Об. 20.
держания Ur у самцов в 1.5 раза
(р<0.002), а у самок – в 1.8 раза (р<0.002)
и увеличение UА у самцов в 2.1 раза
(р<0.002), а у самок – в 3 раза (р<0.002).
Патобиохимические изменения белкового обмена у крыс с циррозом печени отражают нарушения белоксинтезирующей
функции печени, формирование диспротеинемии, что, по-видимому, связано с
нарушением морфофункционального статуса гепатоцитов вследствие их повреждения свободными радикалами, обуслав-
54
ливающими гепатотоксический эффект
ССL4.
Верификация изменений липидного
обмена, возникающих при циррозе печени, в значительной мере базируется на
данных исследования содержания в сыворотке крови Chol и TG. Изменения липидного обмена у крыс с циррозом состояли в выраженной гиперхолестеролемии, связанной как с увеличением содержания по сравнению с контролем Chol у
самцов в 3.3 раза (р<0.002), а у самок – в
2.5 раза (р<0.002), так и с увеличением
содержания TG у самцов в 1.6 раза
(р<0.002), а у самок – в 1.2 раза (р<0.002).
Выявленные изменения биохимических показателей морфофункционального состояния гепатоцитов при экспериментальном циррозе были верифицированы данными гистологического исследования ткани печени крыс.
Морфологическая картина печени
крыс контрольной группы по данным
гистологического исследования в целом
соответствовала
критериям
нормы
(рис. 1).
Гистологическое исследование печени крыс с интоксикацией ССL4 и этанолом показало существенные отличия в
структуре органа по сравнению с контролем. На микропрепаратах наблюдалась
белковая и жировая дистрофия печеночных клеток, интенсивное разрастание соединительной ткани, узловая трансформация паренхимы печени с формированием ложных долек, разделенных между
собой фиброзными тяжами. Степень
фиброза соответствовала 4-м баллам по
шкале Knodell. У части животных отмечались явления асцита. Следует отметить,
что у самок фиброз был выражен сильнее
(рис. 2). В соединительнотканных прослойках отмечалось образование шунтирующих сосудов. Наряду с дистрофией,
некрозом, фибропластическими процессами и перестройкой печеночных долек
наблюдались признаки регенераторной
активности. Она выражалась в гипертрофии гепатоцитов и наличии небольшого
количества двуядерных клеток при диффузном прорастании паренхимы соединительной тканью. Под капсулой наблюдалось увеличение наружной терминальной пластинки.
Характерной особенностью гепато-
Е. И. Лебедева, О. Д. Мяделец
Рис. 3. Гликоген в печени контрольных животных. Окраска по методу Шабадаша. Об.
20.
Рис. 4. Гликоген в печени животных при
экспериментальном циррозе. Окраска по
методу Шабадаша. Об. 20.
Рис. 5. Активность СДГ в печени крыс. Обозначения: а – у контрольных животных, б –
при экспериментальном циррозе. Окраска по методу Нахласа. Об. 20.
цитов является их способность запасать и
утилизировать гликоген как основной
энергетический метаболит печени. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что у контрольных
животных гликоген выявлялся в виде зерен фиолетово-вишневого цвета, которые
заполняли всю цитоплазму, как бы нафаршировывая ее (рис. 3), но в части гепатоцитов он был распределен в виде сети.
Нужно отметить, что у отдельных
контрольных крыс количество гликогена
было меньше. В этих случаях он выявлялся в виде мелких зерен, относительно
равномерно заполняющих цитоплазму, и
имел более светлую окраску. Интоксикация животных ССL4 и этанолом в течение
19 недель вызывала резкое достоверное
мозаичное снижение количества гликогена по сравнению с контролем (рис. 4). В
большинстве клеток гликоген не выявлялся. Клетки, переполненные гликогеном, встречались крайне редко. В гепатоцитах преобладал крупноглыбчатый, агрегированный гликоген. В отдельных
клетках одновременно наблюдалась различная окраска гранул гликогена: малиновая, лиловая и с синим оттенком.
У животных с асцитом гликоген, как
правило, не выявлялся, достаточно редко
встречались клетки с единичными глыбками гликогена, которые иногда сливались в гомогенную лиловую массу. Следует также отметить, что на препаратах отмечалось гомогенное розовое окрашивание соединительной ткани. Можно предположить, что это – углеводные компоненты гликопротеиновых и мукоидных
образований. В соединительной ткани
встречались также лейкоциты, переполненные гликогеном.
При изучении активности фермента
внутренней мембраны митохондрий СДГ
у подопытных крыс были обнаружены
характерные
отклонения
экспрессии
фермента от контроля (рис. 5). На гистохимических препаратах отчетливо выделялись три группы клеток: с высокой,
средней и низкой активностью. Среди печеночных долек преобладали дольки, в
которых активность фермента в гепатоци-
55
Морфофункциональные изменения в печени крыс при экспериментальном циррозе
Рис. 6. Распределение липидов в печени животных при экспериментальном циррозе. Обозначения: а – самцы, б – самки. Окраска суданом III, IV. Об. 20.
тах была низкой. Вместе с тем, в меньшем
количестве обнаруживались дольки, в которых
гепатоциты
демонстрировали
среднюю и высокую активность. На препаратах ложные дольки большого диаметра с высокой активностью фермента
всех гепатоцитов встречались редко. Чаще встречались дольки большого диаметра, у которых расположение гепатоцитов
со средней и низкой степенью активности
фермента было мозаичным в виде скоплений.
При длительной интоксикации животных в печени отмечалось увеличение
содержания липидов. В единичных микропрепаратах печени у контрольных животных в цитоплазме гепатоцитов выявлено незначительное количество липидных включений.
У самцов отмечалась мелко-и среднекапельная жировая инфильтрация,
распространяемая по всей паренхиме органа (рис.6а).
У самок жировая дистрофия имела
более выраженный характер, выявлялась
крупнокапельная форма (рис. 6б). Как известно, при жировой дегенерации печени
свободные жирные кислоты, холестерол и
фосфолипиды накапливаются в лизосомах гепатоцитов. Одной из причин может
быть нарушение окислительных процессов в митохондриях. Согласно литературным данным, одним из основных механизмов стеатоза печени считают подавление секреции триацилглицеролов, что ведет к их накоплению в гепатоцитах
(Manne et al., 2002; Freneaux et al., 2004).
Выводы
У подопытных животных данными
морфологического исследования верифицировано формирование моно- и
56
мультилобулярного цирроза печени, умеренной стромальной и слабой паренхиматозной активности с преобладанием жировой паренхиматозной дистрофии гепатоцитов и с увеличением содержания холестерола и триацилглицеролов в сыворотке крови.
Установлен широкий спектр выраженных патобиохимических изменений,
включающий гиперферментемию, нарушение белоксинтезирующей функции печени, формирование диспротеинемии,
гипогликемии, гиперхолестеролемии. Установлены отчетливые половые различия
изученных биохимических показателей
сыворотки крови, свидетельствующих о
более высокой устойчивости самок к развитию цирроза печени.
Результаты проведенных гистохимических исследований позволили констатировать, что введение крысам CCl4 и
этанола методом свободного выпаивания
вызвало существенные нарушения энергетического обмена гепатоцитов, проявляющиеся в снижении содержания гликогена и СДГ.
Список литературы
1.
Морфометрия митохондриального аппарата гепатоцитов нормальной и цирротически измененной печени крыс / Н.Н.
Безбородкина [и др.] // Цитология. 2008.
Т. 50, №3. С 228–235.
2. Здравоохранение в Республике Беларусь:
официальный статистический сборник за
2011 г. Минск: ГУ РНМБ, 2012. 304 с.
3. Камышников В. С. Клинико-лабораторная
диагностика заболеваний печени / В.С.
Камышников. М.: Медпресс-информ,
2013. 96 с.
4. Комарова Д. В. Морфологическая диагностика инфекционных поражений печени /
Д.В. Комаров. СПб.: Сотис, 1999. 244 с.
Журнал анатомии и гистопатологии. – 2014. – Т. 3, № 3
5. Лилли Р. Патогистологическая техника и
практическая гистология / Р. Лилли. М.:
Мир, 1969. 645 с.
6. Логинов А. С. Клиническая морфология
печени / А.С. Логинов, Л.И. Аруин. М:
Медицина, 1985. 240 с.
7. Машанов А. В. Острое отравление этанолом и его комплексное повреждающее
действие на функциональные возможности печени / А.В. Машанов // Бюллетень
ВСНЦ СО РАМН. 2013. №6 (94). С. 153–
157.
8. Роскин Г. И. Микроскопическая техника /
Г.И. Роскин. М.: Советская наука, 1951. 447
с.
9. Состояние дыхательной цепи митохондрий печени крыс с экспериментальным
токсическим гепатитом / А.П. Ширяева [и
др.] // Цитология. 2007. № 47(2). С. 125–
132.
10. Nonalcoholic steatohepatitis / C.P Day [et al.]
// Gastroenterology. 2005. Vol. 129. P. 113–
121.
11. Namilton D. L. Liver indjury with alcoholiclike hyaline after gastroplasty for morbid
obesity / D.L. Namilton // Gastroenterology.
1983. Vol. 85. P.722–726.
Информация об авторах
Мяделец Олег Данилович – докт. мед. наук,
профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и
эмбриологии УО “Витебский государственный
медицинский университет”. 210023, Республика
Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27.
Лебедева Елена Ивановна – аспирант, ассистент
кафедры
гистологии,
цитологии
и
эмбриологии УО “Витебский государственный
медицинский университет”. 210023, Республика
Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27.
Поступила в редакцию 2.09.2014 г.
57