ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕСИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕСИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ИМЕНИ Н.Э. БАУМАНА» На правах рукописи БИЛАЛОВ ИЛЬФАТ НУРАХМАТОВИЧ ПОЛОВЫЕ И ВИДОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ NO–ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПОЧЕК 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Каримова Руфия Габдельхаевна, доктор билогических наук, доцент Казань – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. Введение………………………………………………………………………..…..5 Основная часть…………………………………………………………………....10 1. Анализ состояния вопроса, задачи исследования и перспективы его решения…………………………………………………………………………..12 1.1. Оксид азота (II) – газообразный мессенджер…………………………….12 1.2. Образование оксида азота в почках………………………………………14 1.3. Роль оксида азота в регуляции клубочковой фильтрации……………...20 1.4 Роль оксида азота в регуляции канальцевой реабсорбции ……………..23 1.5 Роль оксида азота в регуляции канальцевой секреции ………………….27 1.6 Роль NO в реализации инкреторной функции почек ………………..….30 2. Материал и методы исследований……………………………….......................35 3. Собственные исследования………………………………………………….…...41 3.1. Половые особенности системы оксида азота у разных видов животных…………………………………………………………………….…...41 3.2. Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на гидроуретическую функцию почек….......44 3.2.1 Содержание суммарного количества нитрат-и нитрит-анионов в плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке L-аргинином…………………………………………………………………...…44 3.2.2 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного пола при нагрузке L-аргинином ……………………………………....50 3.2.3 Содержание суммарного количества нитрат-и нитрит-анионов в плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке хлофузаном…………………………………………………………………….....55 3.2.4 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного пола при нагрузке хлофузаном ……………………………………….57 2 Стр. 3.2.5 Содержание суммарного количества нитрат-и нитрит-анионов в плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке L-NAME……..60 3.2.6 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного пола при нагрузке L-NAME…………………………….……………..62 3.3 Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на ионоуретическую функцию почек…..…….64 3.3.1 Натрийуретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз……….…...……..67 3.3.2 Калийуретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз …………………..….……..69 3.3.3 Хлоруретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз………………………….….71 3.3.4 Кальцийуретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз……….…….……73 3.3.5 Фосфоруретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз………….……….76 3.4 Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на почечные процессы: клубочковую фильтрацию, канальцевую реабсорбцию, канальцевую секрецию …………….……...……86 3.5 Экспериментальная острая почечная недостаточность………….……………86 3.5.1 Активность системы оксида азота при экспериментальной острой почечной недостаточности……………………………………………………….86 3 Стр. 3.5.2 Гидроуретическая и ионоуретическая функция почек после введения доноров оксида азота при экспериментальной острой почечной недостаточности……………………………………………………..……………88 3.5.3 Динамика изменения почечных процессов: фильтрации, реабсорбции и секреции после введения доноров оксида азота при экспериментальной острой почечной недостаточности……………………………………………...…..…...92 Заключение…………………………………………….………………………….95 Список сокращений……………………………………………………………...107 Список литературы………………………………………………………...........108 Приложения……………………………………………………………..….…….134 4 Введение Актуальность темы исследования. Оксид азота II (NO) является короткоживущей и легко подвергающейся химическим трансформациям, высоко реактивной сигнальной молекулой, оказывающей пусковое и модулирующее влияние на многие физиологические процессы. В 1980 г. R. F. Furchgott и J. W. Zawadzki впервые описали релаксацию кусочков аорты с интактным эндотелием в ответ на ацетилхолин. Это свидетельствовало о присутствии вещества, выделяемого эндотелиальными клетками и влияющего на миоциты, которое было названо эндотелийзависимым релаксирующим фактором (EDRF) [95]. Позже R.M.J. Palmer et al. [182] установили, что эндотелий-зависимый релаксирующий фактор – это оксид азота (II). В 1998 году R. Furchgott, Luis J. Ignarro и Ferid Murad стали лауреатами Нобелевской премии в области физиологии и медицины «За открытие роли оксида азота как сигнальной молекулы в регуляции сердечнососудистой системы». Анализу роли оксида азота в организме посвящено несколько обзоров: C.J. Lowenstein et al., К.Г. Гуревича, Х.М. Маркова, S.P. Sharma, А.В. Бабушкиной [1, 6, 16, 140, 217]. Оксид азота, синтезируемый в эндотелиальных, мезангиальных и эпителиальных клетках почек участвует в регуляции ренального кровотока, водно-солевого обмена [16], процессов фильтрации [231], реабсорбции, секреции, инкреции [107, 170]. Существуют данные об экспрессии всех изоформ нитроксидсинтазы (NOS) в почках, а также о постоянном синтезе оксида азота в эндотелии почечных сосудов, мезангиоцитах, эпителиальных клетках почечных канальцев, собирательных трубочек и в области "macula densa" [16]. В различных отделах почек представлены все три изоформы NOS-1 (нейрональная NOS), NOS-2 (индуцибельная NOS) и NOS-3 (эндотелиальная NOS). Все изоформы NO-синтаз, каждая из которых имеет свои особенности как в локализации так и в механизмах действия на почечные процессы (фильтрации, реабсорбции, секреции и инкреции), 5 катализируют образование оксида азота [41, 110, 147, 174, 248]. Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) определяется соотношением тонуса афферентных и эфферентных артериол. Результаты исследований методом микроперфузии показывают, что афферентные артериолы особенно чувствительны к оксиду азота по сравнению с эфферентными артериолами клубочков, в следствии чего может происходит изменение СКФ [62, 74]. Эксперименты P.A. Ortiz и др. доказывают влияние оксида азота на различные транспортные системы, локализованные в канальцах нефрона, которые способствуют обратному всасыванию или секреции веществ [178]. Во многих экспериментах натрийуретическое и мочегонное действие оксида азота не сопровождались изменениями в скорости клубочковой фильтрации или почечного кровотока [122, 194], тем самым доказывая, что NO непосредственно ингибирует Na+ и водный транспорт в стенках канальцев нефрона, механизм которого не до конца раскрыт на сегодняшний день. Экспериментально доказано, что расположение изоформ NO-синтаз в почках имеет половую специфичность [205] и более высокая активность системы оксида азота выявлена у самок, по сравнению с самцами [145, 214]. Однако вопрос о состоянии системы NO у разных видов животных, половая специфичность эффектов химических соединений, являющихся донорами или ингибиторами оксида азота на регуляцию деятельности почек, остается актуальным на сегодняшний день. Степень разработанности темы. Теоретической базой для исследования системы оксида азота послужили труды Х.М. Маркова (19962001 г.г.), N.G. Majmudar et al. (1999-2000 г.г.), O.V. GlushkovskayaSemyachkina et al. (2006-2011 г.г.), C. Jennifer Sullivan et al. (2006-2010 г.г.), Р.Г. Каримовой (2009-2015 г.г.). Х.М. Марков (1996) экспериментально доказал участие оксида азота в почечных процессах и написал несколько обзоров о роли NO в физиологии и патологии почек [16]. O.V. Glushkovskaya-Semyachkina et al. (2006), N.G. Majmudar et al. (2000) установили, что общая активность системы оксида 6 азота в организме у самок намного выше, чем у самцов животных [145, 214]. Исследования C. Jennifer Sullivan et al. посвящены изучению активности различных изоформ NO-синтаз в почечной ткани, которые выясняли половую специфичность в их расположении [205]. Исследования Р.Г. Каримовой посвящены изучению комплексной нитроксидергической реакции организма на соединения бензофуроксанового ряда, которые являются экзогенными донорами оксида азота [11]. Половая специфичность системы оксида азота, а также половые особенности эффектов доноров NO и ингибиторов его синтаз на различные процессы, протекающие в организме, в частности в почках, остаются не изученными. Цель исследования – изучить половые и видовые особенности NO–зависимых механизмов регуляции деятельности почек. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1. Определить половые особенности системы оксида азота у разных видов животных; 2. Изучить зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на гидроуретическую функцию почек от пола животного; 3. Изучить зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на ионоуретическую функцию почек от пола животного; 4. Изучить зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на процессы фильтрации, реабсорбции, секреции в почках от пола животного; 5. Изучить влияние доноров NO на процессы фильтрации, реабсорбции и секреции на модели острой почечной недостаточности; Научная новизна. Впервые установлено, что система оксида азота видоспецифична и ее активность, а также физиологические эффекты доноров NO и ингибитора NOS зависят от пола животного. Установлено, 7 что концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови и моче зависит от дозы и путей введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз. Установлено, что изменение активности системы оксида азота, путем введения доноров оксида азота и ингибитора NO- синтаз, сопровождается изменением почечных процессов фильтрации, реабсорбции и секреции в зависимости от пола животного. Половая специфичность выявлена в процессе секреции при введении эндогенного донора – L-аргинина, в процессе реабсорбции при введении экзогенного донора – хлофузана. Впервые показано, что в модели острой почечной недостаточности введение доноров оксида азота восстанавливает выделение ионов натрия, хлора, реабсорбцию воды, а также снижает концентрацию мочевины и креатинина в сыворотке крови, увеличивая их экскрецию с мочой. Восстановление экскреции мочевины и креатинина с мочой, а также реабсорбции воды происходит более эффективно при введении эндогенного донора – L-аргинина, а восстановление экскреции ионов с мочой, при введении экзогенного донора – хлофузана. Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа содержит новые решения актуальной научной проблемы выявления половой специфичности системы NO организма у разных видов животных. Установленные факты о половой специфичности системы оксида азота позволяют научно обоснованно организовывать эксперименты и создавать оптимальные условия для грамотной интерпретации полученных результатов при физиологических и патологических состояниях. Установленные изменения в организме при поступлении доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз расширяют представления о половой специфичности деятельности почек, что необходимо учитывать для правильной дозировки препаратов, являющихся NO донорами, при лечении различных заболеваний. Доноры оксида азота можно применять как средства, восстанавливающие процессы реабсорбции и секреции в почках при лечении нефропатий. 8 Результаты исследований внедрены в учебный процесс в ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», а также могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических, ветеринарных и медицинских факультетах ВУЗов. Методология и методы исследования Основой для наших исследований явилось участие оксида азота в различных физиологических и патофизиологических процессах в организме. Предметом исследования служила система оксида азота в аспекте ее участия в регуляции различных процессов и функций почек. Объектом исследования служили белые нелинейные крысы (425), кролики (20), кошки (20), овцы (20) и крупный рогатый скот (10). Для решения поставленных задач применялись физиологические и биохимические методы исследования. Особенности NO-зависимых механизмов регуляции фильтрации, реабсорбции и секреции у животных разного пола определяли при повышении и снижении активности системы оксида азота за счет применения доноров NO и ингибитора его синтаз. Активность системы оксида азота определяли по концентрации нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Система оксида азота видоспецифична. В плазме крови и моче крыс, кошек, коров, овец уровень метаболитов NO выше у самок; в плазме крови и моче кроликов – у самцов. Физиологические эффекты доноров NO и ингибитора его синтаз зависят от пола животного. 2. Концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови и моче зависит от дозы и путей введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз. Максимально эффективная доза L-аргинина – при внутрижелудочном введении – 200 мг/кг, при внутрибрюшинном введении – 20 мг/кг; хлофузана – 2 мг/кг; L-NAME – 20 мг/кг. 9 3. Объем суточного диуреза, интенсивность экскреции натрия и калия положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови. Повышение объема диуреза, натрийуреза и калийуреза при введении доноров NO обусловлено снижением канальцевой реабсорбции, интенсивность которой при введении эндогенного донора оксида азота – L-аргинина ниже у самцов, а при введении экзогенного донора – хлофузана у самок. 4. В модели острой почечной недостаточности введение доноров оксида азота восстанавливает секрецию мочевины, экскрецию ионов хлора, натрия и реабсорбция воды. Восстановление экскреции мочевины и креатинина с мочой, а также реабсорбции воды происходит более эффективно при введении эндогенного донора – L-аргинина, а восстановление экскреции ионов с мочой, при введении экзогенного донора – хлофузана. Степень достоверности и апробации результатов. Биометрическая обработка цифрового материала проведена на персональном компьютере по общепринятым методикам вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. Основные результаты исследований доложены и получили одобрение на: Международной научно-технической конференции «Прикладная электродинамика, фотоника и живые системы» (Казанский национально исследовательский технический университет имени А.Н. Туполева – КАИ. – Казань, 2013); 17-ой международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущинский государственный естественно-научный физиологического государственный институт. общества медицинский – имени Пущино, И.П. университет. 2013); Павлова – ХХII съезде (Волгоградский Волгоград, 2013); Международной научной конференции «Научное и кадровое обеспечение инновационного развития агропромышленного комплекса» посвященная 140летию академии (Казань, 2013); XIII Всероссийской молодежной научной 10 конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2014); 18-ой международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2014); «Ветеринарная актуальные Всероссийской медицина проблемы» и научно-практической зоотехния, (Казань, 2014); образование, конференции производство: Международной научной конференции «Актуальные вопросы зоотехнии и ветеринарной медицины: опыт, проблемы и пути их решения», посвященная 95 летию зоотехнического образования в Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (Казань, 2015). 11 Основная часть 1. Анализ состояния вопроса и перспективы его решения 1.1 Оксид азота – газообразный мессенджер Оксид азота является свободным радикалом, играющим роль универсального модулятора разнообразных функций организма, включая регуляцию дыхания, поддержания сердечно-сосудистого гомеостаза, иммунного статуса организма, активности макрофагов, экспрессии генов, пластичности нервной ткани, памяти, секрецию нейротрансмиттеров [14, 16, 57, 139, 156, 162, 170, 220]. Оксид азота (II), представляет собой восстановленную форму моноокиси азота (NO) (период полураспада которого составляет несколько секунд) [2]. NO – в химическом отношении – это липофильная молекула газа, растворимая в воде и жирах, состоящая из одного атома азота и одного атома кислорода и имеющая непарный электрон, который превращает ее в высоко реактивный радикал, свободно проникающий через биологические мембраны и легко вступающий в реакции с другими соединениями. В организме оксид азота образуется из L-аргинина под действием трех изоформ фермента NO-синтазы [8, 158, 164, 245]. Этот процесс представляет собой комплексную окислительную реакцию, где молекулярный кислород присоединяется к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина (рисунок 1) [57]. В настоящее время идентифицированы три основные формы этого фермента, каждая из которых кодируется собственным геном [23]. К конститутивным формам NO-синтазы относятся эндотелиальная (eNOS, тип III), которая впервые была обнаружена в эндотелии кровеносных сосудов, и нейрональная (nNOS, тип I). Конститутивные изоформы NO-синтазы экспрессируются в эндотелиоцитах, нейронах и других клетках. Ca2+ под влиянием определенных стимулов (ацетилхолин, гистамин, 5-оксиптриптамин, глутамат и др.) входит в клетку, где связывается в единый 12 комплекс с кальмодулином в цитозоле. Комплекс Ca-кальмодулин выступает как кофактор и активирует NO-cинтазу. Под влиянием NOS образуются очень малые количества NO, которые измеряются пикомолями. NO активирует клеточный фермент гуанилатциклазу (ГЦ), что приводит к образованию циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), который и опосредует все эффекты NO [139, 156]. 2Arg + 3NADPH + 4О2 + 3H = = 2Cit + 2NO + 3NADPH + 4H2O, где Arg - аргинин; Cit – цитруллин Рисунок 1 Синтез и метаболизм оксида азота (Bredt D.S. Nitric Oxide in the Nervous System // Ed. by Vincent S.. - N.Y.: Academic Press, 1995. P. 1-21) Третья изоформа NO-синтазы - индуцибельная (iNOS, тип II) – была идентифицирована в цитоплазме иммунных, гладкомышечных, эпителиальных клеток, гепатоцитах и нефронах. В отличие от eNOS и nNOS, она не экспрессируется постоянно (конститутивно). Индуцибельная кальций независимая NO-синтаза синтезируется в течение 6-8 часов в ответ на действие триггеров иммунонейроэндокринной системы – цитокинов, эндоили экзотоксинов [22, 24, 25, 56, 159]. Изучение состояния системы оксида азота в организме имеет важное значение для раскрытия механизма физиологических и патологических процессов. 13 1.2 Образование оксида азота в почках Существуют сведения об экспрессии всех изоформ нитроксидсинтазы в почках и постоянном синтезе оксида азота в эндотелии почечных сосудов, мезангиоцитах, эпителиальных клетках почечных канальцев, собирательных трубочек и в области плотного пятна (macula densa) [16, 35]. Исследованиями многих ученых установлено расположение различных изоформ NO-синтаз в почечных структурах [253]. Доказано присутствие мРНК и иммунореактивного белка каждой изоформ NOS в почечных канальцах и сосудистых сегментах (верхних, верхних и нижних передних, нижних и задних) [94, 116, 139, 153, 160,]. Изучено распределение ферментативной активности NOS на уровне изолированных канальцев и сосудистых сегментов. Об активности NOS в почках судят по концентрации нитрит- и нитрат-анионов, уровню цГМФ в почечной гистохимическому определению ткани или отражающей NADPH-диафоразы, каталитическую активность NOS [8]. NADPH-диафораза – фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий реакцию восстановления амидолипоевой кислоты в амид дегидролипоевой кислоты. NADPH диафораза обнаруживается в сегменте «плотного пятна» почек крыс, в афферентных и эфферентных артериолах [41]. Этот факт требует дополнительных доказательств, поскольку реакция NADPH-диафораза-тетразолий не особо специфична для NOS, так как она может обнаруживать и другие соединения, в том числе ферменты. M.L. Biondi, J.C. Romero проводили количественное определение NOS и их ферментативную активность за счет выявления вторичного мессенджера циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в тканях. Они установили, что мозговой слой почек собак имеет больший потенциал для синтеза NO, чем корковый слой почек [54]. Исследования M. Mckee и соавт., а также F. Park и соавт. показали, что мозговой слой почек содержит большее количество иммунореактивного белка с общей ферментативной активностью NOS по сравнению с корковым слоем [39, 85, 153]. M. Mckee и соавторы определили 14 большее количество nNOS-, eNOS- и iNOS-иммунореактивного белка во внутреннем и внешнем мозговом слое почек относительно коры [153]. Дальнейшие исследования B.A. Moridani и R.L. Kline в гомогенате почек крыс [158] доказывают, что каталитическая активность NOS в интерстиции мозгового слоя почти в 10 раз больше, чем в корковом слое [253]. мРНК нейрональной NO-синтазы ранее была обнаружена в медуллярных отделах собирательных трубочек методом микродиссекции в ПЦР [138, 187], а также nNOS была обнаружена в культуре клеток медуллярных отделов собирательных трубочек мышей [56], и в общей почечной ткани из внутреннего мозгового гомогената [70, 116]. Таким образом, эти исследования дают убедительные доказательства того, что мозговой слой почек более обогащен ферментом NO-синтазой, которая здесь имеет более выраженную активность, по сравнению с корковым слоем почек. Имунногистохимическим методом установлено наличие nNOS только в плотном пятне [41, 113, 174], тогда как методом микродиссекции в почечных сосудах и канальцах показано наличие мРНК нейрональной NO-синтазы в плотном пятне, внутренних и внешних собирательных канальцах, клубочках, дуговых артериях, почечных нервах и в периваскулярной соединительной ткани [41, 66, 187]. Также иммуногистохимическим анализом выявлена гендерная зависимость расположения nNOS. У самцов крыс более интенсивно окрашивается nNOS в канальцах почек, а у самок – в сосудах клубочков [98]. Следовательно, экспрессия изоформ NO-синтаз в почках также может иметь половую зависимость [205]. Это объясняется тем фактом, что общая активность, системы оксида азота в организме у самок намного выше, чем у самцов [86, 145, 167, 214,]. NOS-1 (nNOS) преимущественно локализована в плотном пятне (macula densa), нейронах, капсуле Боумена-Шумлянского, собирательных канальцах, где она участвует в регуляции клубочковой гемодинамики, секреции ренина и натрийуреза [42, 64, 91, 128, 174]. 15 Deyin Lu и соавторы в своих опытах продемонстрировали наличие в плотном пятне трех изоформ нейрональной NOS (nNOS-α, nNOS-β и nNOSγ). Уровень nNOS-α, nNOS-β и nNOS-γ был измерен в изолированых микродиссекциях захватом лазера [175, 212, 223]. В организме наиболее распространенной нейрональной NO-синтазой является nNOS–α, которая обнаруживается в головном мозге, в почках, кишечнике, надпочечниках, в сердце и скелетных мышцах; реже встречается nNOS-β: только в эмбрионах и nNOS-γ: в почках, скелетных мышцах и эмбрионах [235]. Некоторые авторы используют для определения активности NOS измерение количества превращенного радиоактивного L-аргинина в L-цитруллин методом микродиссекции в отдельных сегментах почек. Количественное определение образования цитруллина позволяет произвести точный расчет активности NOS. У крыс ферментативная активность выше в медуллярных отделах собирательных трубочек, микродиссекциях клубочков, в прямых кровеносных сосудах (vasa recta), и существенно ниже в прямом участке проксимального канальца (pars recta), в сегменте собирательных трубочек, в наружных медуллярных отделах собирательных трубочек, в корковых частях толстого восходящего колена, в мозговых частях толстого восходящего колена, в тонком нисходящем отделе петле Генле. Значительное количество ферментативной активности NOS в медуллярных отделах собирательных трубочек и прямых кровеносных сосудах согласуется с предыдущими исследованиями F.Wu et al., в которых доказывается тот факт, что мозговой слой почек имеет значительно большую активность NOS, чем корковый слой [248] Одной из потенциальных проблем, связанных с использованием ферментативных тестов для количественного определении NO-синтаз в отдельных сегментах нефрона является вероятность того, что эндогенные ингибиторы NOS, например АДМА (асимметричный диметиларгинин), могут 16 присутствовать в различных сегментах нефрона, что может снизить достоверность результатов. После идентификации ферментативной активностью почечных NOS, сегментов стал вопрос с наибольшей об определении разновидности изоформ NOS в медуллярных отделах собирательных трубочек, микродиссекциях клубочков, в прямых кровеносных сосудах vasa recta. Исследователи указывают на наличие нейрональной NO-синтазы, индуцибельной NO-синтазы и эндотелиальной NO-синтазы в медуллярных отделах собирательных трубочек. Это согласуется с предыдущими исследованиями, которые определили наличие мРНК и иммунореактивного белка для всех трех изоформ NOS в медуллярных отделах собирательных трубочек и внутреннем мозговом слое. Методом микродиссекции был найден мРНК индуцибельной NO-синтаз в дуговых и междольковых артериях, клубочках, проксимальных канальцах, толстых восходящих коленах и собирательных канальцах [70, 120]. Выявление мРНК индуцибельной NO-синтазы с кальций-независимой активностью в медуллярных отделах собирательных трубочек также согласуется с предыдущими работами, которые обнаруживают их в почках крыс методом ПЦР [164], методом гибридизации мРНК [120], а также в культуре клеток медуллярных отделов собирательных трубочек почек крыс [56] и во всём гомогенате почечной ткани внутреннего мозгового слоя [116, 153, 160]. Некоторые исследователи предполагают, что iNOS (индуцибельная NOS) конститутивно экспрессируется в толстой части восходящего колена нефрона [139, 94], а также в дуговых артериях [147]. ПЦР-исследования обнаруживают мРНК эндотелиальной NO-синтазы в клубочках, дуговых артериях, междольковых артериях и афферентных артериолах [138], исследования иммуногистохимическим методом – в эндотелиальных клетках пре- и постгломерулярных сосудов [41]. 17 Наличие мРНК эндотелиальной NOS свидетельствует об экспрессии ее в медуллярных отделах собирательных трубочек [174], в клубочках, дуговых артериях, междольковых артериях и афферентных артериолах [138], а также в культуре клеток медуллярных отделах собирательных трубочек почек мышей [56] и мозговом гомогенате почек в целом [153]. Наличие еNOS в эндотелиальных клетках сосудов и канальцах играет важную роль в поддержании скорости клубочковой фильтрации, сосудистого тонуса и почечного кровотока [42, 64, 128]. M.J. Solhaug и соавторы изучили локализацию eNOS в почечных сегментах у крыс в антенатальном и постнатальном периодах онтогенеза. eNOS обнаруживается в эндотелиальных клетках, недифференцированных внутрипочечных капиллярных сетях у плодов в возрасте 14 суток. У плодов и новорожденных интенсивность иммуноокрашивания eNOS гораздо сильнее в развивающейся сосудистой системе коркового слоя почек, чем мозгового. По мере созревания почек, после рождения, иммуноокрашивание eNOS постепенно уменьшается в корковом слое, а экспрессия еNOS в мозговом слое постепенно увеличивается в эндотелиальных клетках сосудистых пучков и капилляров и достигает высокого уровня у взрослых крыс [88, 89]. При определении роли оксида азота в толстой части восходящего колена петли Генле, пришли к выводу, что NO вырабатывается при участии eNOS. Этот факт подтверждается путем прямых измерений NO в изолированном, перфузированном материале, а также в суспензии с толстой частью восходящего колена петли Генле с использованием двух различных методов: NO-специфическим флуоресцентным красителем [111, 220] и NOселективным электродом [110, 176]. Еще одним важным моментом исследований является наличие относительно больших количеств ферментативной активности nNOS и eNOS в сосудистых структурах коры почек, особенно в афферентных артериолах и клубочках. В отличие от медуллярных отделов собирательных трубочек, мРНК нейрональной NO-синтазы и эндотелиальной NO-синтазы были 18 обнаружены только в микродиссекциях клубочков, в прямых кровеносных сосудах vasa recta. Это согласуется с предыдущими исследованиями на крысах [41, 138, 174]. Полученные данные позволяют предположить, что эти сегменты с nNOS и eNOS оказывают наибольшее биологическое действие. Хотя eNOS является мембранно-связанной, а nNOS – цитозольной, механизм их действия сходен. Нейрональная NO-синтаза и эндотелиальная NO-синтаза присутствуют в дуговых и междольковых артериях, афферентных артериях клубочков, и сосудах vasa recta, в то время как мРНК индуцибельной NO-синтазы обнаруживается только в дуговых артериях [147, 248]. Кроме того, некоторые исследователи отмечают, что введение селективного ингибитора nNOS аминогуанидина не изменяет кровоток в почках крыс [115, 116]. Эти результаты показывают, что NO, регулирующий почечное сосудистое сопротивление продуцируется при участии nNOS или eNOS. Принято считать, что еNOS является основным источником оксида азота в кровеносных сосудах, хотя другие изоформы, особенно nNOS могут быть экспрессированы в сосудах почечной ткани. W.H. Beierwaltes в своих исследованиях установил, что селективное ингибирование nNOS с 7-нитроиндазолом (7-NI) не оказывает влияния на изменение почечного кровотока у крыс [50, 51], когда как C.S. Wilcox et al. выявили обратный эффект: хроническое ингибирование nNOS, приводит к снижению почечного кровотока у крыс [249]. Оксид азота играет важную роль в регуляции клубочковой гемодинамики [197]. Экспериментальные данные из микроперфузионных исследований показывают, чувствительны к что афферентные сосудорасширяющему артериолы действию оксида особенно азота, по сравнению с эфферентными артериолами клубочков [74]. Тем не менее, существуют противоречивые данные по этому поводу [41, 74]. Исследования на крысах показали, что NO может оказывать большее влияние на мозговое кровообращение почек, чем на корковый кровоток у взрослых крыс [146]. 19 Имеющиеся в литературе сведения указывают на то, что локализация NOS изоформ в структурах почек различна, что свидетельствует об участии NO во многих физиологических процессах, протекающих в почках. 1.3 Роль оксида азота в регуляции клубочковой фильтрации Как биологический мессенджер, оксид азота играет важную роль в регуляции клубочковой гемодинамики в роли сосудорасширяющего фактора [197] и, как следствие, влияет на процесс фильтрации [231]. В экспериментах обнаружено относительно большое количество ферментативно активного nNOS и eNOS в сосудистых структурах коркового слоя почек [41, 138, 174]. Тем не менее, существуют противоречивые данные относительно того, что афферентные или эфферентные артериолы являются основным источником синтезированного в эндотелии NO [41, 74]. Результаты исследований методом микроперфузии показывают, что афферентные артериолы особенно чувствительны к оксиду азота, по сравнению с эфферентными артериолами клубочков, что приводит к повышению активности клубочковой фильтрации [74]. Скорость клубочковой фильтрации (СКФ)определяется соотношением тонуса афферентной и эфферентной артериол. Вазодилатация афферентных артериол приводит к увеличению СКФ, тогда как тонус эфферентных артериол остается почти неизменным. NO является мощным сосудорасширяющим веществом, поэтому чем больше NO действует на афферентные артериолы, тем больше СКФ [62]. Снижение СКФ в ответ на торможение NO-синтаз, является косвенным предположением более высокой чувствительности к NO афферентных артериол относительно эфферентных [186]. Функциональные исследования показывают, что острое ингибирование NOS приводит к уменьшению коэффициента клубочковой фильтрации [54, 66, 67, 253]. Однако не все исследователи обнаруживают снижение СКФ в ответ на торможение NO-синтаз [80, 81, 114, 173,]. В большинстве случаев натрийуретическое и гидроуретическое действие оксида азота не 20 сопровождается изменениями в скорости клубочковой фильтрации и почечного кровотока [122, 194]. В процессе фильтрации задерживаются белки, которые практически не должны присутствовать в моче в норме у здорового человека и животных. Естественной преградой на пути проникновения белков в просвет нефрона служит гломерулярный фильтр, а часть профильтровавшихся белков подвергаются реабсорбции в проксимальных отделах нефрона. Некоторые исследования показывают, что у здоровых крыс при различных вариантах увеличения мочеотделения проявляется кратковременная протеинурия [12]. Гемодинамика клубочка контролируется NO-зависимыми процессами, а проницаемость для белков гломерулярного фильтра во многом определяется отрицательным зарядом образующих его молекул. Блокада продукции NO при введении метилового эфира L-нитроаргинина приводила к небольшому усилению мочеотделения, к увеличению выделения белка, и к увеличению экскреции альбумина. Однократное введение неселективных ингибиторов NO, вызывает изменение клубочковой фильтрации для белков, по видимому, воздействуя на его заряд. Это приводит к развитию острой селективной протеинурии и снижению коэффициента клубочковой фильтрации [67, 96, 123, 124]. Длительная блокада продукции NO вызывала у крыс протеинурию и альбуминурию [48]. Этот эффект объясняется развитием гипертензии и последующим поражением почечных клубочков при хронической блокаде NO-синтазы [218]. Протеинурия при действии производных аргинина, обладающих высоким положительным зарядом, свидетельствует не только об их влиянии на заряд фильтрационной мембраны, но и об участии NO-зависимых процессов в регуляции фильтрации в почечных клубочках [13]. В экспериментах K. Prasun et al. [84] показано изменение клубочковой проницаемости для белков и участие оксида азота в качестве важного механизма в сохранении проницаемости барьера капилляров клубочков при их повреждении. В инкубированных клубочках с ингибитором NO-синтаз 21 протеинурия увеличивается, что связано со снижением NO. Авторы доказывают, что не только оксид азота является регулятором клубочковой проницаемости для белка, но и повышение биодоступности O2-[84]. В почках существует тесная взаимосвязь между процессами клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции в канальцах [232]. Во многом это достигается деятельностью комплекса тубулогломерулярной обратной связи (TOC). При этом концентрация глюкозы и NaCl в канальцах имеет четко определенную концентрацию. Если эта концентрация понижена – это сигнал для повышения СКФ, если повышена – сигнал для снижения [243]. Недостаток поступления натрия хлорида в плотное пятно (macula densa) увеличивает скорость клубочковой фильтрации [32]. Таким образом, функции клубочков регулируются за счет механизма тубулярно- гломерулярной обратной связи. Сигналы из дистальных канальцев поступают в специальный реабсорбцию. "почечный центр", координирующий Этот центр «macula densa» группа фильтрацию и призматических эпителиальных клеток дистального отдела нефрона, которые входят в состав юкстагломерулярного комплекса почки. Повышенное поступление ионов Na+ и воды в дистальные отделы нефрона служит стимулом для освобождения юкстагломерулярным аппаратом вазоактивных веществ (ренина). Ренин вызывает и поддерживает спазм афферентных артериол с перераспределением почечного кровотока, запустеванием артериол и уменьшением СКФ. Всё это приводит к уменьшению экскреции солей и воды. Оксид азота играет важную роль в регуляции системы TОС [174, 234, 242]. Из всего изученного, можно сделать заключение о том, что оксид азота играет важную роль в процессе клубочковой фильтрации, поддерживает тонус гломерулярного фильтра и участвует в регуляции его за счет общего снижения артериального давления и за счет влияния на внутрипочечные механизмы ауторегуляции. Однако недостаточно изучен вопрос о гендерной 22 зависимости активности NO-синтаз в артериолах клубочков и их роль в процессе регуляции клубочковой фильтрации. 1.4 Роль оксида азота в регуляции канальцевой реабсорбции В регуляции процесса реабсорбции принимают участие различные биологические активные вещества, вырабатываемые в самой почке и вне ее. К ним относится и оксид азота, который действует на различные транспортные системы, локализованные в канальцах нефрона и регулирующие перемещение растворенного вещества и растворителя по нефрону [178]. Влияние NO на транспорт ионов и воды доказано во многих экспериментах [14, 28, 79, 107, 147, 149, 170, 209]. Установлено, что стимуляция продукции оксида азота донорами увеличивает экскрецию Na+, К+, воды и некоторых органических веществ. Ингибирование оксида азота с использованием нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) оказывает антинатрийуретическое и антидиуретическое действие [82, 87, 178, 237]. Этот эффект подтверждается и снижением экскреции Na+ и объема мочи у еNOS нокаутных-мышей [172]. Во многих ситуациях натрийуретическое и мочегонное действие оксида азота не сопровождалется изменениями в скорости клубочковой фильтрации или почечного кровотока [122, 194], тем самым доказывая, что NO непосредственно ингибирует Na+ и водный транспорт в стенках канальцев нефрона. В почках активная реабсорбция натрия происходит в большей части в канальцах благодаря активности Na+/K+-АТФазы. Она обеспечивает движущую силу для натрия в базолатеральной мембране и транспортировку натрия из клетки в интерстиций. Вход натрия в клетку происходит за счет различных переносчиков. Содержание Na+/H+ обменника 3 типа (NHE3) высокое в проксимальных канальцах [90], в то время как «тиазид чувствительные» (подавляются тиазидовыми диуретиками) Na+, Cl--котранспортеры (TSC) участвуют в реабсорбции натрия и хлора в апикальной поверхности дистальных извитых канальцах. В толстой 23 восходящей части петле Генле Na/K/2Cl котранспортер (BSC1) и NHE3 несут основную ответственность за реабсорбцию натрия [155]. Ряд исследований показывают влияние NO на натриевый и водный транспорт в проксимальных канальцах [67, 100, 121, 207] за счет ингибирования Na+/H+ обменника (NHE), а также Na+/K+-АТФазы в собирательных канальцах [227]. В корковом сегменте собирательных трубочек (CCD) Na+ транспортируется через эпителиальные натриевые каналы (ENaC) и через базолатеральные Na+/K+-АТФазы.. Доноры оксида азота Spermine–Nitric oxide complex hydrate (SPER/NO) и нитроглицерин уменьшают активность ENaC в сегменте собирательных трубочек у крыс [227]. Этот эффект был также подтвержден с эндотелий производными NO, которые снижают деятельность ENaC [227]. В отличие от этого, Lu et al. (1997) наблюдают увеличение активности ENaC в связи с NO. Это, скорее всего, косвенное воздействие, посредством активации базолатеральных K+каналов [141]. Таким образом, влияние NO как ингибитора или активатора ENaC в сегментах собирательных трубочек остается спорным. Оксид азота ингибирует Na+/K+-АТФазу в проксимальных канальцах, но не в сегментах собирательных трубочек. Тем не менее, это несоответствие может быть объяснено различием окислительных процессов в эпителиальных клетках, которые могут противостоять эффекту NO на транспорт Na+ [33, 192]. В толстой части восходящего колена петли Генле поглощается 20-30% фильтрата NaCl [104], потому что это водонепроницаемый отдел, который генерирует большую часть осмотического давления, что приводит к поглощению жидкости в системе собирательных канальцев. Таким образом, логично предположить, что эффект действия NO проявляется в толстой части восходящего колена. Транспорт NaCl в толстой части восходящего колена происходит как через трансцеллюлярные, так и парацеллюлярные пути. Трансцеллюлярное поглощение является активным процессом, в котором Na и Cl входят в клетки толстой части восходящего колена через просвет Na-K-2Cl котранспортера. Ионы Cl- выходят из базолатеральной мембраны 24 через Cl- каналы или K-Cl котранспортер [105]. Базолатеральной Na-KАТФазой создается движущая сила для поступления NaCl путем выведения Na+ через базолатеральные мембраны [156]. Na+ также реабсорбируется через парацеллюлярные пути [108, 229]. C.F. Plato и соавт. впервые были продемонстрировано влияние NO на поглощение NaCl на изолированных перфузированных канальцах. Они показали, что доноры NO ингибируют всасывание Cl- [196]. Эти данные свидетельствуют еще о том, что NO который образуется в других отделах, таких как афферентные артериолы, сосуды Recta и т.д., может регулировать транспорт NaCl в толстой части восходящего колена нефрона почек. Оксид азота, который вырабатывается в толстой части восходящего колена выступает в качестве физиологически активного вещества, подавляющего всасывание NaCl [196]. Тот факт, что NO вырабатывается в толстой части восходящего колена, был подтвержден путем прямых измерений NO в изолированных, перфузированных материалах, а также в суспензии с толстым восходящим коленом с использованием двух различных методов: NO-специфическим флуоресцентным красителем [111, 220] и NO-селективным электродом [110, 176]. Ингибирующий эффект NO в толстом восходящем колене нефрона для Cl- может быть связан с торможением одного из транспортеров мембраны (Na-K-2Cl котранспортера или K+ каналов) или одного из базолатеральных переносчиков (Na+/K+-АТФазы; Cl- канала или K-Cl котранспортера). Исследование механизма действия Na-K-2Cl котранспортера это подтвердило [177]. Рядом с толстой частью восходящего колена происходит также транспорт ионов Na+ через тонкие восходящие ветви. Предполагаемый эффект NO на Na+-транспортную деятельность в этих сегментах изучен недостаточно [97]. Влияние NO в толстой части восходящего колена является более выраженным, чем в проксимальных канальцах. В этом сегменте NO 25 уменьшает поглощение свободного Cl- и НСО3-, оказывает прямое тормозящее действие на Na-K-2Cl котранспортер и Na/H обменник, а также стимулирует апикальные K+ каналы. Оксид азота препятствует реабсорбции бикарбонатов, снижая деятельность Na+/H + обменника. Реабсорбция HCO3- регулируется прежде всего за счет этого апикального транспортера [101, 102, 103]. С участием оксида азота в дистальных канальцах происходит активная и факультативная (альдостеронзависимая) реабсорбция электролитов и пассивная реабсорбция воды, регулируемая антидиуретическим гормоном. Классическим механизмом биологического действия NO является стимулирование растворимой гуанилатциклазы. Это приводит к повышению производства циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и воздействие на протеинкиназы, такие как протеинкиназы G. Исследования влияния цГМФ активированного с NO на NHE3 [193] и Na+/K+ - АТФазы [134, 135] в проксимальных канальцах показали, что NO-индуцированное продукция цГМФ имеет решающее значение для регуляции транспорта Na+ в проксимальных канальцах. Интересно, что S. Sasaki и соавт. показали, что цГМФ образуется при введении донора оксида азота SNAP в клетках проксимальных канальцев в организме, в результате чего снижается поглощение Na+ в эпителиальных клетках, а также толстом восходящем колене петли Генле [177]. Этот факт позволяет предположить, что транспорт цГМФ необходим для регуляции транспорта Na+ [190]. Это может быть результатом активации протеинкиназы G или тирозинкиназы Src сигнальных путей от внеклеточной цГМФ [204, 211]. Активация комплекса тирозинкиназы Src связана с эндоцитозом Na+/K+-АТФазы, а также NHE3 в почечных клетках [119, 199, 211]. Помимо активации цГМФ путей существуют альтернативные сигнальные механизмы, которые могли бы объяснить эффект NO на транспорт ионов Na+. Повышение количества продуктов окисления NO2 или N2O3, способствует тому, что они вступают в реакцию с остатками цистеина 26 белков, т.е. в реакцию S-нитрозилирования [191]. S-нитрозотиолы могут регулировать деятельность ионных каналов и транспортеров, как, например Na+/K+–АТФазы [117]. Однако вклад S-нитрозилирования не достаточно изучен и требует дальнейших исследований [154]. Эти исследования демонстрируют, что NO производится различными типами клеток, влияет на конкретные транспортеры ионов, деятельность которых осуществляется с помощью клеточных сигнальных механизмов, таких как активация цГМФ. Оксид азота влияет на реабсорбцию натрия, хлора, калия, бикарбонатов и других ионов в почках, эти эффекты имеют специфичность действия в сегментах канальцев нефрона. Неизученным остается вопрос о влиянии NO на процессы реабсорбции в зависимости от пола животных. 1.5 Роль оксида азота в регуляции канальцевой секреции В процессе образования мочи ряд веществ, например, некоторые органические кислоты, не проникают в фильтрат, но тем не менее оказываются в конечной моче в результате канальцевой секреции. В результате секреции в мочу поступают вещества из крови капилляров, окружающих канальцы, либо образующиеся в клетках канальцев ионы водорода, ионы калия, мочевина, мочевая кислота, креатинин и аммиак. Секреция осуществляется за счет их активного транспорта канальцевым эпителием, особенно в проксимальных сегментах. В зависимости от состояния организма эти системы могут менять направление активного переноса веществ, обеспечивающих или их секрецию или обратное всасывание. В эпителии проксимального извитого канальца синтезируется большая часть почечного L-аргинина — субстрата NOS. Высокая активность фермента обусловлена функциональными особенностями данного отдела нефрона и напрямую связана с регуляцией таких процессов, как секреция 27 креатинфосфата, активная и облигатная реабсорбция электролитов, воды, некоторых органических веществ с их транспортом в интерстиций [14, 28]. Большая часть К+ реабсорбируется до альдостерон-чувствительных дистальных отделов нефрона, а в мочевыводящих каналах в основном секретируется, особенно в конце дистальных канальцев, соединяющих канальцах и сегментах собирательных трубочек [99]. При снижении концентрации K+ его реабсорбция происходит в собирательных трубочках наружного мозгового вещества [99, 251]. M. Lu и W.H. Wang с использованием целых клеток методом локальной фиксации установили, что NO-доноры увеличивают активность калиевого канала, а ингибитор NO-синтаз уменьшает его активность [143]. Однако реакция NO с супероксидом и продукт этой реакции – пероксинитрит может проявлять тормозящий эффект. Кислород производные свободные радикалы супероксида могут быть образованы путем различных оксидаз, таких как ксантиноксидазы, NADPH оксидазы и в некоторых условиях и за за счет NOS [40, 152, 183]. Механизм NO ингибирования Na+, по видимому, связан с прямым воздействием на апикальные Na+ каналы и возможно, тормозящим действим на базолатеральные К+ каналы. Различные эффекты NO на транспорт Na+ обусловлены различным уровнем супероксида и, таким образом пероксинитрита [178]. Влияние NADPH оксидаз также было происследовано C. Schreck и P.M. O'Connor, которые рассматривали действие О2-, имеющего тормозящее действие, на апикальную калиевую секрецию через ROMK-каналы [216]. У млекопитающих есть два типа переносчиков мочевины: мочевина транспортер (UT)-A и UT-B. UT-переносчики в основном находятся только в эпителиальных клетках почек, в то время как UT-B более широко распространен в почках, сердце, мозге, семенниках, мочевыводящих путях и других тканях [252]. UT-семейство состоит из шести типов UT-A1 – UT-A6 [44, 132, 137]. Полученные данные в экспериментах на мышах с нарушением переноса мочевины, позволили исследовать каждый тип и их 28 физиологическую функцию. В почках удаление UT-A1/UT-A3 приводит к полиурии, указывая на то, что внутрипочечное выведение мочевины играет важную роль в общей способности концентрировать мочу. Стимулирование или угнетение этих транспортеров во многом зависит от цАМФ (циклический аденозинмонофосфат), вазопрессина или от увеличения внутриклеточного кальция [188, 201, 240]. В литературе мало сведений, свидетельствующих о влиянии оксида азота на секрецию мочевины, тем не менее, отмечается опосредованное влияние его в связи с другими веществами. В опытах, проведенных с использованием L-аргинина – донора оксида азота, на кроликах, не обнаружено существенного влияния на креатинин и мочевину сыворотки крови [78]. Содержание креатинина, как и других продуктов азотистого обмена, в плазме крови, используется для изучения функции почек. Содержание креатинина в крови – величина довольно постоянная. Повышение его содержания происходит параллельно нарастанию азотемии, но в отличие, например, от мочевины, уровень которой динамично реагирует даже на небольшие изменения функции почек, креатинин является более устойчивым показателем. Уровень креатинина мало подвержен влиянию внепочечных факторов, в то время как содержание остаточного азота и мочевины снижается при малобелковой диете. Определение креатинина является обязательным методом выявления почечной недостаточности, содержание креатинина в крови и клубочковая фильтрация являются основными лабораторными критериями диагностики почечной недостаточности. H. Mohammad et al. в своих экспериментах на кроликах при введении донора оксида азота L-аргинина не наблюдают существенного влияния на креатинин сыворотки крови [78]. После изучения доступной литературы, можно сделать вывод о том, что, влияние оксида азота на процесс секреции в почках мало изучено и требует дальнейших исследований. Тем не менее, было представлено несколько доказательств того, что опосредованно оксид азота может принять 29 участие в регуляции процесса секреции. Например, секреция калия зависит от поступления натрия в клетку, а оксид азота увеличивает натрийурез. Секреция мочевины во многом зависит от цАМФ, вазопрессина или от увеличения внутриклеточного кальция. 1.6 Роль NO в реализации инкреторной функции почек Инкреторная функция почки заключается в синтезе и выведении в кровоток физиологически активных веществ, которые действуют на различные органы и ткани или обладают преимущественно местным действием, регулируя почечный кровоток и метаболизм почки. К ним можно отнести ренин, простагландины, эритропоэтин, кинины и многие другие. Характеризующееся как основное сосудорасширяющее вещество, регулирующее тонус сосудов, а также ингибирующее в почках канальцевый транспорт ионов, оксид азота влияет на высвобождение ренина [87, 149, 213, 245, 250]. C.M. Sayago в результате своих опытов выяснил, что изменение образования эндогенного цГМФ, не связанного с почечной гемодинамикой, участвует в стимуляции выработки ренина. Одним из источников цГМФ может быть NO-зависимый механизм [213]. В клетках macula densa NOS представлена нейрональной изоформой. Продуцируемый оксид азота посредством регуляции образования циклического гуанозинмонофосфата участвует в регуляции сократимости мезангиальных клеток и подоцитов. Данный механизм модулирует ультрафильтрационный коэффициент в противоположном ангиотензину II направлении [133]. Регуляция образования ренина осуществляется за счет образования цАМФ. Циклические нуклеотиды являются вторичными мессенджерами, которые объединяют различные стимулирующие сигналы в секреции ренина. В расщеплении цАМФ участвуют фосфодиэстеразы (ФДЭ). Фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов не обладают абсолютной специфичностью в отношении субстратов, в большинстве случаев одна и 30 таже форма фермента способна гидролизовать как цАМФ, так и цГМФ. Соотношение скоростей гидролиза этих двух нуклеотидов может быть существенно разным. Оно зависит от формы фермента (есть более специфичные в отношении цАМФ, например 3-ий тип и есть более специфичные к цГМФ, такие как 5-ый тип [71]. ФДЭ-3 ингибирует цГМФ, в то время как ФДЭ-5 – цГМФ. Ингибирование ФДЭ-5 запринастом приводит к увеличению цГМФ, который может подавлять ФДЭ-3, увеличивая эндогенный цАМФ, и тем самым стимулируя выработку ренина. Это раскрывает путь, по которому NO может косвенно стимулировать образование ренина [52]. Установлено, что оксид азота, образованный нейрональной изоформой NOS в плотном пятне, участвует в процессе стимуляции образования ренина. Снижение поступления натрия активирует nNOS в «плотном пятне» [66, 168]. Исследования Х.R. He et al. in vitro и W.H. Beierwaltes et al. in vivo, позволили предположить, что нейрональные изоформы (nNOS) в «плотном пятне» являются одним из компонентов ренин-стимулирующих путей [50, 51, 83, 202]. Тем не менее, цГМФ сам по себе может привести к двойным действиям, ингибированию или стимуляции высвобождения ренина. Ian Reid в обзорной статье 1994 году написал, что цГМФ образуется под влиянием NO и не может действовать непосредственно на высвобождение ренина, а действует на цГМФ-тормозимую фосфодиэстеразу (ФДЭ)-3, изменяя гидролиз цАМФ [203]. Эти косвенные данные подтверждаются тем, что введение милринона – ингибитора ФДЭ-3, а также изопротеренола (ингибитора цГМФ-фосфодиэстеразы) повышает активность выработки ренина у кроликов по цАМФ-зависимому пути [61]. A. Kurtz et al., используя изолированные перфузии почек, также сообщили, что торможение ФДЭ-3 с милриноном или Trequinsin, стимулирует секрецию ренина. Это дает основание предположить о цАМФ-опосредованном механизме образования ренина при участии NO [225]. Дополнительные доказательства были предоставлены U.G. Friis et al. с помощью изолированных ЮГА 31 (юкстагломерулярный аппарат) клеток [65]. Они сообщили, что в клетках ЮГА экспрессируется ФДЭ-3 изоформа и воздействие ингибитора цГМФфосфодиэстеразы – Trequinsin увеличивает производство цАМФ, тем самым стимулируя высвобождение ренина из этих клеток. Проведенные H.M. Bosse эксперименты на крысах с блокадой NOS нитро-L-аргинин метиловым эфиром (L-NAME, 40 мг/кг) показали изменения активности синтаз оксида азота в «плотном пятне» и секреции ренина. Гистохимические исследования подтверждают участие NO, выработаемого в macula densa, в регуляции ренина [73, 126, 185, 215, 236]. Также исследования в различных системах подтвердили и угнетающее действие NO и цГМФ на секрецию ренина [53, 244]. Ответ может быть связан с расположением определенных изоформ синтазы оксида азота в юкстагломерулярных клетках. Стимуляция эндотелиальных изоформ синтаз оксида азота и увеличение почечного кровотока приводит к повышению эндотелий-производных NO и цГМФ и активации киназы GII в ЮГА клетках, что в свою очередь ингибирует высвобождение ренина [245]. Есть доказательства того, что nNOS играет важную роль в регуляции функции почек при солевой нагрузке. Во-первых, крысы на высокой солевой диете имеют более высокий уровень нитратов и нитритов плазмы крови и повышенный уровень почечной экскреции нитритов и нитратов [76, 106, 219] и увеличение уровня цГМФ [219]. Это дает возможность предположить, что NO-активность выше при высоком потреблении NaCl. Во-вторых, обнаружено, что острое увеличение концентрации NaCl способствует производству NO в плотном пятне [136, 180]. Deyin Lu в своих опытах на крысах с высоким потреблением соли доказывает участие бета-изоформы nNOS в ослаблении механизма тубулогломерулярной обратной связи и образовании цГМФ [212]. Взаимодействие оксида азота и ангиотензина II, которые участвуют в регуляции функции почек, было продемонстрировано во многих исследованиях [184, 250]. Эффект действия ANG II на почечную 32 гемодинамику и выделительную функцию уже известен, но новые данные были описаны при участии NO или O2-. В исследованиях Lopez и соавт. показывают, что введение ANG II в почки крысам, вызывает снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и уровня NO в почечной ткани [210]. Кроме того, при введении ANG II в дозе, не влияющей на скорость клубочковой фильтрации, происходит снижение CКФ после торможения NOS [228]. Этот ответ был значительно ослаблен одновременным действием супероксиддисмутазы или NOS ингибитора [149, 210]. Эти данные ясно показывают роль взаимодействия ANG II, NO и O2-, в регулировании СКФ, а также в регуляции почечной гемодинамики, экскреции натрия и поддержании артериального давления. Дисбаланс между этими веществами может быть вовлечен в развитии феномена NaCI-чувствительности и артериальной уменьшение гипертензии. содержания Повышение NO и ведет O2--деятельности к вызывает несоответствию между окислительным и антиоксидантными механизмами в тканях, участвуя во многих патофизиологических процессах в организме [129]. Рисунок 2. Взаимосвязь между ренин-ангиотензиновой системой, супероксид-анионом и оксидом азота в почках [129] 33 Хроническое введение ангиотензина II повышает NO-зависимый кровоток в коре почек [195], а также активность эндотелиальной NO-синтазы [60, 118]. В некоторых источниках сообщается, что ангитензин II увеличивает активность NOS 3 [60], что при этом не меняет активность в мозговом слое почек [71, 118]. Это вызывает ряд предположений: 1) ANG II снижает еNOS экспрессию в некоторых мозговых структурах при одновременном повышении его в других, или 2) ANG II стимулирует несколько путей, которые имеют противоположные эффекты на еNOS. Aнгиотензин II повышает образование NO и супероксид аниона (O2-) в почках [46, 210] в частности толстом восходящего колене [69, 189]. Супероксид (O2- ) в свою очередь не только снижает биодоступность NO в толстом восходящем колене [178], но и повышает экспрессию еNOS в эндотелиальных клетках [239]. Мозговой слой почек имеет самый высокий потенциал для производства NO [158], имеются предположения, что ANG II уменьшает экспрессию еNOS в мозговом толстом восходящем колене через NO, и что это снижение частично смягчается ANG II индуцированным увеличением O2-. Возможные регуляторные эффекты NO на ренин и ангиотензин II являются спорными, но различные данные позволяют предположить, что могут быть как характеризующие ингибирующие, взаимодействие так между и стимулирующие этими пути, дилятаторными и констрикторными системами. Недостаточно изученным на сегодняшний день остается половая специфичность системы оксида азота и его участие в регуляции деятельности почечных процессов. 34 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проведены в условиях лаборатории кафедры физиологии и патофизиологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» в период с 2010 по 2015 годы в соответствии с планом научных исследований (номер государственной регистрации 01980002094). Исследования проведены на 425 белых нелинейных крысах обоего пола массой тела 220-250 г, на 20 кроликах, на 20 овцах содержащихся в вивариях кафедры физиологии и патофизиологии, на 20 кошках неопределенной породы в ЛКЦ Казанской государственной академии ветеринарной медицины, на 5 коровах и 5 быках в хозяйствах «Красный восток» Апастовского района. В результате решения задач, поставленных в рамках данной работы, исследовали 550 проб крови и 515 проб мочи. У крыс кровь брали из хвостовой вены, у овец из яремной вены, у кошек и кроликов из бедренной вены в строго определенное время - 8-9 часов дня. Содержание животных соответствовало правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), утвержденным МЗ СССР 06.07.73. Кормили лабораторных животных натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР от 12.-8.77. Коров и быков кормили сбалансированным рационом, утвержденным в хозяйствах Апастовского района. Экспериментальные группы животных формировали с учетом массы тела и пола. физиологические, При проведении экспериментов биохимические (кинетические, были использованы калориметрические, спектрофотометрические) методы исследования. Суммарную концентрацию нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и в моче определяли путем восстановления нитратов в нитриты цинковой пылью (ООО Арсенал, Украина) и последующим определением концентрации нитритов спектрофотометрическим методом. 35 Таблица - 1 Общая схема исследований Определение половой специфичности системы оксида азота в регуляции деятельности почек 1. Половые особенности системы оксида азота у разных видов животных Определение метаболитов оксида азота (нитрат-, нитрит-анионов) в плазме крови и моче нелинейных крыс, кроликов, кошек, овец, коров и быков 2. Зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NOсинтаз от пола животного Интактные Контроль Нагрузка L- аргинином в дозе: Нагрузка Нагрузка крысы: хлофузаном L-NAME Внутрижелудочное Внутрибрюшин нагрузка в дозе: в дозе: самцы введение ное введение водой 1 мг/кг 10 мг/кг самки 2 мг/кг 20 мг/кг 20 мг/кг 100 мг/кг 200 мг/кг 500 мг/кг 1000 мг/кг 3. Зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NOсинтаз на гидроуретическую функцию почек от пола животного Интактные Контроль - Нагрузка L- Нагрузка Нагрузка L-NAME крысы: нагрузка аргинином в хлофузаном в в дозе: дозе: дозе: самцы водой 200 мг/кг 2 мг/кг 20 мг/кг самки 4. Зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NOсинтаз на ионоуретическую функцию почек от пола животного Интактных Контроль Нагрузка Нагрузка Нагрузка L-NAME крыс: нагрузка L- аргинином хлофузаном в в дозе: в дозе: дозе: самцов водой 200 мг/кг 2 мг/кг 20 мг/кг самок 5. Зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NOсинтаз на процессы фильтрации, реабсорбции, секреции в почках от пола животного при нагрузке донорами оксида азота и игибитором NOсинтаз 6. Влияние доноров NO на процессы фильтрации, реабсорбции и секреции на модели острой почечной недостаточности 36 Для этого к 1 мл плазмы добавили 1 мл 6 % раствора цинка сульфата (ООО «Спектр-Хим», Россия) и оставляли на 1 ч при температуре ниже 15° С. Центрифугировали при 6000 об./мин (3000 g). В супернатант добавляли эквивалентное количество гидроксида натрия (300 мкл 1 N раствора), центрифугировали и 1 мл надосадочной жидкости переносили в соответствующую по нумерации пластиковую пробирку с предварительно добавленными туда 0,11 г цинковой пыли, 0,5 мл аммиачного буфера, 20 мкл аммиачного комплекса сульфата меди. Пробирки укупорили и встряхивали в течение 30 мин. Цинковую пыль осаждали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 мин. Затем в каждую пробирку вносили по 1 мл раствора ацетата натрия и 1 мл раствора 1-нафтиламина солянокислого (реактив Грисса ((«Вектон», Россия)). Измеряли оптическую плотность спустя 30 мин на "Фотометре фотоэлектрическом КФК – 3 – 01 – ЗОМЗ" (Россия) при длине волны 520 нм [3]. Концентрацию натрия в сыворотке крови и моче определяли колориметрическим методов на "Анализаторе биохимическом фотометрическом кинетическом Би-Ан" (Россия) с набором реактивов («Ольвекс», Россия) с использованием ионов уранилацетата, которые при взаимодействии с ионами натрия образуют нерастворимый уранилацетат натрия. Содержание оставшегося в растворе уранилацетата определяли на основе его реакции с тиогликолятом аммония, в результате которого образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 405 нм [30]. Концентрацию колориметрическим хлоридов в крови методом на и в моче "Анализаторе определяли биохимическом фотометрическом кинетическом Би-Ан" (Россия) с набором реактивов («Ольвекс», Россия) меркуриотиоцианатом, без депротеинизации которые при в кислой взаимодействии среде с с ионами трехвалентного железа и азотной кислотой формирует окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 540 нм. [30]. 37 Концентрацию калия в сыворотке крови и моче определяли турбидиметрическим методом без депротеинизации с набором реактивов («Ольвекс», Россия). При взаимодействии ионов калия с ионами тетрафенилбората в щелочной среде образуется стабильная суспензия. Оптическую плотность суспензии измеряли при длине волны 578 нм на "Анализаторе (Россия), биохимическом которая фотометрическом пропорционально кинетическом концентрации ионов Би-Ан" калия в исследуемом образце [30]. Концентрацию кальция в сыворотке крови и моче определяли унифицированным колориметрическим методом с набором реактивов («Ольвекс», Россия). Кальций в щелочной среде образует окрашенный комплекс с о-крезолфталеин комплексоном. Интенсивность окраски по оптической плотности при 570 нм (на "Анализаторе биохимическом фотометрическом кинетическом Би-Ан" (Россия)) пропорциональна концентрации кальция в пробе [30]. Количество фосфора спектрофотометрическим в сыворотке методом на крови и моче "Анализаторе определяли биохимическом фотометрическом кинетическом Би-Ан" (Россия) с набором реактивов («Ольвекс», Россия). Метод основан на способности фосфат ионов образовывать в кислой среде с молибдатом аммония в присутствии детергента фосфорномолибденовый комплекс, оптическая плотность которого при длине волны 340 нм пропорциональна концентрации неорганического фосфора в исследуемом образце [30]. Концентрацию общего белка в сыворотке крови и моче определяли при помощи биуретовой реакции с набором реактивов («Ольвекс», Россия), с последующим измерением оптической плотности на "Анализаторе биохимическом фотометрическом кинетическом Би-Ан" (Россия) при длине волны 540 нм. Концентрацию мочевины в сыворотке крови и в моче определяли ферментативным кинетическим методом с набором реактивов («Ольвекс», 38 Россия). Мочевина гидролизуется в присутствии уреазы с образованием иона аммония и CO2. Ионы аммония реагируют с α–кетоглутаратом и НАДН в присутствии глутаматдегидрогеназы (ГЛДГ) с образованием глутамата и НАД. Оптическую плотность проб и стандарта измеряли через 30 секунд и через 60 с на "Анализаторе биохимическом фотометрическом кинетическом Би-Ан" (Россия) при длине волны 340 нм. Концентрацию креатинина в сыворотке крови и моче определяли кинетическим методом с набором реактивов («Ольвекс», Россия). В щелочной среде креатинин взаимодействует с пикриновой кислотой с образованием окрашенного в красный цвет продукта, оптическую плотность которого измеряли после 30 с и 90 с на "Анализаторе биохимическом фотометрическом кинетическом Би-Ан" (Россия) при длине волны 510 нм. По разности оптической плотности рассчитывали концентрацию креатинина в пробе и в стандарте. Острое повреждение почек изучали на 25 крысах (n=5) инициированием инъекции 50 % водного раствора глицерина в мышцы задних конечностей (всего 10 мл/кг массы). За 24 часа до инъекции животных лишали доступа к воде. За 2 часа до введения глицерина крысам внутрижелудочно вводили 10 % раствор L-аргинина в дозе 200 мг/кг, хлофузан 0,1 % в дозе 2 мг/кг и L-NAME в дозе 20 мг/кг. Сразу после введения глицерина доступ к воде восстанавливали. Спустя 72 ч после инъекции регистрировали суточный объём мочи и забирали образец мочи для анализа (n=20). Затем животных декапитировали для забора крови и ткани почки. Скорость клубочковой фильтрации определяли пробой Реберга-Тареева по формуле Кокрофта-Голта: F1 = (u1/p)v1, где Fi - клубочковая фильтрация; U1 - концентрация креатинина в моче; Vi минутный диурез в первой порции мочи; р - концентрация креатинина в плазме крови. 39 Клиренс креатинина - показатель, по которому оценивают очистительную способность почек - рассчитывали по формуле: Клиренс = UV/P где U — концентрация креатинина в моче; V — объем мочи; Р — концентрация креатинина в плазме. Наряду с оценкой скорости клубочковой фильтрации для оценки функции почек использовали показатель канальцевой реабсорбции воды по формуле: R= C-V/C x 100% где R – реабсорбция воды в канальцах (%), С— клиренс (клубочковая фильтрация (мл/мин), V — диурез (мл/мин). Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием критерия Стьюдента. 40 3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Половые особенности системы оксида азота у разных видов животных Для выявления половых и видовых особенностей системы оксида азота определили количество его метаболитов: нитрит- и нитрат-анионов в плазме крови половозрелых самок (n=5) и половозрелых самцов (n=5). Установили, что содержание нитрат- и нитрит-анионов (NOх) в плазме крови видоспецифично: у крыс составляет 33…35 мкмоль/л, у овец 34…39 мкмоль/л, у кошек 47…77 мкмоль/л, у кроликов 51…87 мкмоль/л, у крупного рогатого скота 70…73 мкмоль/л (рисунок 1). Наименьшая активность системы оксида азота отмечается у крыс и овец. У крыс-самок концентрация метаболитов в плазме крови составляет 35,57±2,577 мкмоль/л, у крыс-самцов – 32,19±2,526 мкмоль/л, у овцематок – 39,19±0,782 мкмоль/л, баранов – 34,36±0,782 мкмоль/л. В плазме крови котов содержание NOх на 49 % выше аналогичного показателя крыс (47,80±2,069 мкмоль/л против 32,19±2,526 мкмоль/л; р<0,01). Концентрация NOх плазмы кошек превышает на 119 % концентрацию нитрат- и нитрит-анионов в крови крыс (77,82±1,798 мкмоль/л против 35,57±2,577 мкмоль/л; р<0,001). У кроликов образование оксида азота происходит также интенсивно: у самцов уровень метаболитов NO составляет 87,95±2,069 мкмоль/л (р<0,01), у самок – 51,99±1,024 мкмоль/л (р<0,001). Сравнительное изучение уровня метаболитов NO в плазме крови показало, что у крольчих содержание NOх в крови 1,46 раза (р<0,01) выше, чем у крыс-самок; у кошек – в 2,19 раза (р<0,0002); у коров – в 2,07 раза (р<0,001). Содержание NOх в плазме крови самцов имеет аналогичную зависимость: у кроликов-самцов уровень нитрати нитрит-анионов в 2,73 раза (р<0,001) выше, чем у крыс-самцов; у котов – в 1,49 раза (р<0,01); у быков – в 2,20 раза (р<0,001). 41 Концентрациянитрат- и нитрит-анионов в плазме крови, мкмоль/л 100 Содержание в крови метаболитов NOх у самок мкмоль/л Содержание в крови метаболитов NOх у самцов мкмоль/л * 90 * 80 * * 70 60 * 50 * 40 30 20 10 0 крысы кролики кошки овцы крупный рогатый скот Рисунок 1 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови у разных видов животных (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с уровнем NOх у крыс (р<0,01) Видоспецифичность характерна и для содержания метаболитов NO в моче: у кошек 29…48 мкмоль/л, у крыс 65…69 мкмоль/л, у овец 77…93 мкмоль/л, у кроликов 77…104 мкмоль/л. Уровень содержания NOх в моче у крыс (самцы и самки), овец (самки) и крольчих одинаков, находится в пределах 67…73 мкмоль/л. При этом у кошек, котов, овцематок, крольчих отмечается отрицательная корреляция с содержанием нитрат- и нитританионов в плазме крови (у кошек r= -0,99; р<0,001), и котов r= -0,81; р<0,01), овцематок r= -0,54 (р<0,0001), крольчих r= - 0,18 (р<0,001)); а у крыс (у самок r= 0,71; р<0,01) и у самцов r= 0,76; р<0,001), баранов (r= 0,99; р<0,001), кроликов-самцов (r= 0,50; р<0,001)) положительная корреляция (рисунок 2). У кошек содержание нитрат- и нитрит-анионов в моче ниже в 1,45 раза (р<0,05), у котов – в 2,26 раза (р<0,001), относительно уровня NOх в моче 42 крыс. Содержание NOх в моче у баранов в 1,43 раза (р<0,002) и кроликовсамцов – в 1,59 раза выше (р<0,001), чем у крыс-самцов. Концентрация нитрат- и нитрит-анионов в моче мкмоль/л Содержание метаболитов NOх в моче у самок мкмоль/л Содержание метаболитов NOх в моче у самцов мкмоль/л 120 * * 100 80 60 * 40 * 20 0 крысы кролики кошки овцы Рисунок 2 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в моче у разных видов животных (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с уровнем NOх у крыс (р<0,05) Результаты экспериментов показали, что система NO у разных видов животных имеет половую специфичность. Образование оксида азота в организме у самок протекает более интенсивно по сравнению активностью системы NO в организме самцов. Так, у баранов содержание NOх в крови выше на 13 % (р<0,01), в моче на 21 % (р<0,001), чем у самок, у кошек этот показатель в плазме крови выше на 63 % (р<0,001), в моче на 65 % (р<0,01). Однако, у кроликов отмечается обратная зависимость: у самцов концентрация NOх в плазме крови выше на 70 % (р<0,001), уровень нитрат- и нитрит-анионов в моче выше – на 35 % (р<0,01), относительно аналогичного показателя у самок. 43 Таким образом установлено, что система оксида азота, о которой мы судили по содержанию стабильных метаболитов нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче, имеет видовую и половую специфичность. 3.2 Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на гидроуретическую функцию почек Ранее установленная зависимость активности системы оксида азота от вида и пола животного вызвала необходимость изучения эффектов при нагрузке донорами NO и ингибитором синтаз оксида азота. Изучение состояния системы оксида азота в организме у разных видов животных выявило зависимость полученных эффектов от пола животных, поэтому в дальнейших исследованиях экспериментальные группы животных состояли из половозрелых самцов и половозрелых самок. 3.2.1. Содержание суммарного количества нитрат-и нитританионов в плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке L-аргинином Для определения половых особенностей физиологических эффектов L-аргинина предварительно изучили активность системы оксида азота при введении индиферентного вещества. Для этого крысам (n=5) вводили 3 мл воды внутрижелудочно и через 2 часа брали кровь для определения количества метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов). У интактной группы крыс кровь брали без введения веществ в желудок. Установлено, что суммарная концентрация нитрат- и нитрит-анионов в крови меняется при введении индифферентного вещества. Концентрация нитрат- и нитрит анионов в плазме крови белых крыс-самок после введения дистиллированной воды составляет 44 39,92±6,819 мкмоль/л, что достоверно не отличается от соответствующего показателя у интактных крыс (35,57±2,577 мкмоль/л). У самцов этот показатель находится на уровне 46,68±2,577 мкмоль/л, что достоверно выше в 1,45 раза (р<0,02) относительно интактной группы (32,19±2,526 мкмоль/л; рисунок 3). интактные Концентрация нитрат- и нитрит-анионов, мкмоль/л контрольные 60 50 ** 40 30 20 10 0 Содержание в крови у самок метаболитов Содержание в крови у самцов метаболитов NO мкмоль/л NO мкмоль/л Рисунок 3 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови у крыс интактной и контрольной группы (n=5) Примечание: ** - достоверно по сравнению с уровнем NOх у крыс (р<0,05) Фоновое содержание NOx в моче у самок белых крыс составило 67,19±5,702 мкмоль/л, у самцов - 67,43±1,982 мкмоль/л. После введения индифферентного вещества значение этого показателя у самок увеличивается в 1,39 раза (р<0,001), у самцов выявлена тенденция к увеличению (таблица 1). Для выявления зависимости активности системы оксида азота при нагрузке субстратом для NOS от пола, дозы и пути введения L-аргинина были созданы 10 групп крыс, состоявших из половозрелых самок (n=5) и 10 групп, состоявших из самцов. L-аргинин вводили в виде 10 % раствора в 45 дозах 20 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг, 500 мг/кг и 1000 мг/кг внутрижелудочно и внутрибрюшинно. Известно, что пик повышения концентрации нитрат- и нитританионов в крови отмечается через два часа внутрижелудочного введения [9, 10, 11]. Исходя из этого, активность системы NO определяли через 2 часа после введения их в желудок. Выявлены половые особенности и дозазависимый характер изменения уровня содержании нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче у крыс при введении субстрата NO-синтаз – L-аргинина. Максимальное повышение концентрации метаболитов NO отмечается при внутрижелудочном введении L-аргинина в дозе 200 мг/кг, при внутрибрюшинном – в дозе 20 мг/кг. Установлено, что при нагрузке L-аргинином в дозе 20 мг/кг организм самцов белых крыс реагирует повышением уровня стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови в 1,35 раза относительно интактной группы (р<0,001), у самок отмечается только тенденция к увеличению исследуемого показателя (таблица 1). После введения L-аргинина (100 мг/кг) содержание NOx в плазме крови самок увеличивается в 1,49 раза (р<0,05), у самцов – в 1,64 раза (р<0,05) относительно интактной группы; нагрузка в дозе 200 мг/кг сопровождается увеличением NOx в организме самок в 3,16 раза (р<0,01), в организме самцов - в 2,0 раз (р<0,001). У самок при нагрузке L-аргинином в дозе 500 мг/кг отмечается тенденция к увеличению исследуемого показателя относительно интактной группы, у самцов – к снижению (в 1,18 и 1,20 раза соответственно). При введении L-аргинина в дозе 1000 мг/кг у самок выявлено снижение концентрации NOx в плазме крови в 1,41 раза (р<0,001), у самцов напротив увеличение – в 1,78 раза (р<0,001) относительно интактной группы. Концентрация метаболитов NO в моче при нагрузке L-аргинином также изменяется дозазависимо. Введение L-аргинина в дозе 20 мг/кг вызывает увеличение содержания стабильных метаболитов оксида азота в моче в 1,63 раза у самок 46 (р<0,001), в 1,47 раза у самцов (р<0,001). Нагрузка L-аргинином в дозе 100 мг/кг вызывает увеличение величины исследуемого показателя в 2,42 раза у самок (р<0,001), в 1,63 раза (р<0,001) у самцов относительно интактной группы. Повышение вводимой дозы L-аргинина, вводимого в организм, до 200 мг/кг сопровождается также увеличением NOx в 1,66 и 2,0 раза соответственно (р<0,001); до 500 мг/кг – в 3,11 и 2,99 раза (р<0,001); до 1000 мг/кг – в 1,91 и 1,98 раза (р<0,001) относительно интактной группы (таблица 2). Таблица 2 – Содержание метаболитов NO в плазме крови и моче крыс разного пола (n=5) Содержание метаболитов NO, мкмоль/л Доза, Вещество мг/кг в плазме крови самок L- самцов в моче самок самцов 20 43,78±5,640 43,54±2,9112 109,68±3,3311 2 99,06±4,5511 2 100 53,19±4,355 2 52,95±6,952 2 110,16±2,4201 2 162,3±8,5891 2 200 112,33±3,7041 2 64,29±5,9051 2 111,36±6,9271 2 135,02±1,9391 2 аргинин 500 42,09±2,069 26,88±2,5261 208,65±7,3551 2 202,13±10,6471 2 1000 25,19±0,5121 2 57,29±3,3321 2 128,27±3,7041 2 133,58±5,9791 2 контроль 39,92±6,819 46,68±2,5772 93,99±1,536 2 73,71±6,564 интактные 35,57±2,577 32,19±2,526 67,19±5,702 67,43±1,982 Примечание. 1 - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) 2 - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Таким образом, зависимость уровня нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче крыс от дозы L-аргинина носит параболический характер. Для определения ответной реакции системы NO при введении индифферентного вещества внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. 47 Суммарная концентрация нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови белых крыс после внутрибрюшинного введения физиологического раствора составляет у самок 35,09±6,257 мкмоль/л, у самцов - 33,64±4,646 мкмоль/л, что достоверно не отличается от соответствующего показателя у интактных Концентрация нитрат- и нитрит-анионов, мкмоль/л крыс (35,57±2,577 мкмоль/л и 32,19±2,526 мкмоль/л соответственно). Содержание метаболитов NOх в крови у самок мкмоль/л Содержание метаболитов NOх в крови у самцов мкмоль/л 120 ** 100 ** 80 60 ** 40 20 0 интакт. гр. контрольная гр. 20мг/кг 100мг/кг 500мг/кг 1000мг/кг Рисунок 4 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в крови у крыс после внутрибрюшинного введения L-аргинина (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,01) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,01) Установлено, что при внутрибрюшинном введении физиологического донора NO – L-аргинина в дозе 20 мг/кг организм белых крыс-самок отвечает повышением нитрат- и нитрит-анионов в крови в 2,97 раза (103,88±2,820 мкмоль/л (р<0,001) против 35,57±2,577 мкмоль/л), организм самцов – в 2,52 раза (84,81±4,840 мкмоль/л против 32,19±2,526 мкмоль/л; р<0,005). Введение L-аргинина в более высоких дозах сопровождалось тенденцией к увеличению нитрат- и нитрит-анионов в крови у крыс обоего пола (рисунок 4). У крыс-самцов также нагрузка L-аргинином (500 мг/кг) приводили к увеличению метаболитов NO в 1,29 раза (41,61±2,820 мкмоль/л против 32,19±2,526 мкмоль/л; р<0,05) по сравнению с интактной группой. 48 Зависимость уровня метаболитов от дозы внутрибрюшинного вводимого L-аргинина по аналогии с внутрижелудочным введением имеет параболический характер, тогда как зависимость эффект в отношении уровня NOх в моче прямолинейна. Внутрибрюшинное введение L-аргинина в дозе 20 мг/кг вызывает увеличение содержания стабильных метаболитов оксида азота в моче в 1,39 раза (р<0,01), в дозе 100 мг/кг – в 1,89 раза (р<0,01), в дозе 500 мг/кг – в 2,78 раза (р<0,001), в дозе 1000 мг/кг – в 5,32 раза (р<0,001) относительно интактной группы (рисунок 5). Содержание метаболитов NOх в моче у самок мкмоль/л Содержание метаболитов NOх в моче у самцов мкмоль/л Концентрация нитрат и нитрит анионов, мкмоль/л 400 * * 350 300 250 * 200 150 * 100 * * * * 50 0 интактная гр. контрольная гр. 20мг/кг 100мг/кг 500мг/кг 1000мг/кг Рисунок 5 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в моче у крыс самок после внутрибрюшинного введения L-аргинина (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,01) При внутрибрюшинном введении высоких доз L-аргинина (1000 мг/кг) через 5-10 мин отмечается снижение двигательной активности крыс, углубленное, редкое дыхание, отказ от пищи и воды. Такое состояние продолжается 15–30 минут и постепенно возвращается к физиологической норме. 49 Установлено, что повышение активности системы оксида азота при введении эндогенного донора NO имеет половую специфичность. При внутрижелудочном введении L-аргинина в дозе 200 и 500 мг/кг содержание нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови у крыс-самок выше в 1,75 раза (р<0,005) и 1,57 раза (р<0,01) соответственно относительно уровня метаболитов NO крыс-самцов. При внутрибрюшинном введении L-аргинина (20 мг/кг) отмечается похожая картина. Уровень метаболитов оксида азота в крови крыс-самок в 1,22 раза (р<0,05) выше, чем у самцов. Содержание метаболитов NO при нагрузке L-аргинином в моче изменяется в зависимости от пола животного. При внутрижелудочном введении L-аргинина в дозе 100 мг/кг уровень NOх в моче выше у крыс-самок в 1,47 раза (р<0,005) по сравнению с самцами. После введения – L-аргинина в дозе 200 мг/кг этот показатель у крыс-самцов 1,21 раза выше (р<0,05) по сравнению с самками. Следовательно, физиологический эффект L-аргинина у крыс-самок проявляется более интенсивно, чем у самцов. 3.2.2 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного пола при нагрузке L-аргинином Установлено, что объем мочи у интактных крыс-самок составляет 1,62±0,096 мл/100 г, самцов – 1,48±0,243 мл/100 г. Введение индифферентного вещества (воды) привело к увеличению объема мочи у самок в 1,69 раза (р<0,01) по сравнению с интактной группой. При нагрузке L-аргинином в дозе 20 мг/кг у самок отмечено увеличение объема мочи в 1,48 раза (р<0,001), в дозе 100 мг/кг – в 1,98 раза (р<0,0001); в дозе 200 мг/кг – в 1,69 раза (р<0,001). Введение субстрата NOS в дозе 1000 мг/кг приводит к уменьшению исследуемого показателя в 1,67 раза (р<0,001) относительно интактной группы. У крыс-самцов при нагрузке L-аргинином в дозе 100 мг/кг объем мочи увеличивается в 2,9 раза (р<0,001), 50 в дозе 200 мг/кг – в 3,34 раза (р<0,001) относительно интактной группы (рисунок 6). объем мочи у самок, мл/100г Объем суточного диуреза, мл/100г объем мочи у самцов, мл/100г 6 5 4 3 ** ** ** ** 2 ** 1 0 Рисунок 6 – Объем суточного диуреза у крыс после внутрижелудочного введения L-аргинина (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,01) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,001) Внутрибрюшинное введение индифферентного вещества (физиологического раствора) привело к уменьшению объема мочи у самок в 2,84 раза (р<0,01) по сравнению с интактной группой. При внутрибрюшинном введении L-аргинина также происходит достоверное повышение объема суточного диуреза. Установлено, что при внутрибрюшинном введении L-аргинина в дозе 20 мг/кг происходит уменьшение диуреза в 1,32 раза (р<0,05) у крыс-самок по сравнению с интактной группой. При введении субстрата NOS в дозе 100 мг/кг отмечается тенденция к уменьшению объема мочи у самцов и к увеличению у самок (рисунок 7). Физиологический донор оксида азота в более высоких дозах вызывает увеличение объема мочи у крыс-самок: в дозе 500 мг/кг – в 1,36 раза (р<0,05); в дозе 1000 мг/кг – в 1,29 раза (р<0,05) по сравнению с интактной группой. У 51 крыс-самцов происходит увеличение объема диуреза после введения Lаргинина в дозе 500 мг/кг в 2,2 раза (р<0,005) и в дозе 1000 мг/кг – в 3,07 раза (р<0,05). Объем суточного диуреза у самок Объем суточного диуреза у самцов Объем мочи, мл/100г 6 5 ** 4 ** 3 ** 2 ** ** 1 0 интакт. контрольная гр. 20мг/кг 100мг/кг 500мг/кг 1000мг/кг Рисунок 7 – Объем суточного диуреза у крыс после внутрибрюшного введения L-аргинина (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Следовательно, объем суточного диуреза зависит от продукции NO в организме: чем больше образуется оксида азота, тем интенсивнее диурез. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и объемом суточного диуреза наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,58; р<0,01 для самок и r=0,57; р<0,001 для самцов; рисунок 7). Эффект субстрата NOS – L-аргинина на диурез более выражен у самцов. Так, при введении L-аргинина в дозе 100 мг/кг объем диуреза у крыссамцов на 36 % выше, чем у самок (р<0,01), а в дозе 200 мг/кг – на 80 % (р<0,001). Установлено уменьшение объема потребляемой воды у крыс после нагрузки L-аргинином во всех дозах, аналогично предыдущим результатам при внутрижелудочном введении. 52 Объем потребляемой воды у интактных самок составляет – 8,8±0,262 мл/100 г, у самцов – 6,17±0,436 мл/100 г. При нагрузке L-аргинином в дозе 20 мг/кг наблюдается уменьшение объёма потребляемой воды у самок крыс в 1,4 раза (р<0,002; рисунок 8). Введение L-аргинина в дозе 100 мг/кг снижает объем потребляемой воды у крыс-самок в 1,23 раза (р<0,05). Введение L-аргинина крысам-самкам в дозе 200 мг/кг снижает объем потребляемой воды в 1,5 раза, в дозе 500 мг/кг – в 1,44 раза, в дозе 1000 мг/кг – в 2,17 раза (р<0,05). Между содержанием нитрат- и нитританионов в плазме крови и объемом потребляемой воды отмечается положительная слабая корреляция (r=0,30; р<0,01). Объем потребляемой воды, мл/100г объем воды у самок, мл/100г объем воды у самцов, мл/100г 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** ** ** ** интактные контрольные L- аргинин 20 L- аргинин 100 ** ** ** L- аргинин 200 L- аргинин 500 L- аргинин 1000 Рисунок 8 – Объем потребляемой воды у крыс после внутрижелудочного введения L- аргинина (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Внутрижелудочное введение L-аргинина в дозе 100 мг/кг у крыссамцов снижает объем потребляемой воды в 1,25 раза (р<0,05), а увеличение дозы (1000 мг/кг) привело к повышению потребляемой воды в 1,26 раза (р<0,05) по сравнению с интактной группой. 53 Объем потребляемой воды изменяется в зависимости от пола животного. Так, у крыс-самок интактной группы этот показатель выше в 1,43 раза (р<0,05); после введения L-аргинина (100 мг/кг) – в 1,41 раза (р<0,05) по сравнению с самцами. После введения L-аргинина в более высоких дозах (1000 мг/кг) объем потребляемой воды больше в 1,91 раза (р<0,05) у крыс-самцов по сравнению с самками. Установлено, что объем потребляемой воды у крыс-самок при внутрибрюшинном введении L-аргинина снижается во всех экспериментальных группах. При введении L-аргинина в дозе 20 мг/кг этот показатель снижается в 5,30 раза (р<0,001), в дозе 100 мг/кг – в 4,13 раза (р<0,001), в дозе 500 мг/кг – в 2,49 раза (р<0,01) и в дозе 1000 мг/кг – в 4,44 раза (р<0,001) по сравнению с интактной группой (рисунок 9). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови (после введении Lаргинина в дозах 20 и 500 мг/кг) и объемом выпитой воды наблюдается положительная корреляция (r=0,33; р<0,01 и r=0,98; р<0,01). Объем потребляемой воды, мл/100г Объем потребляемой воды у самок Объем потребляемой воды у самцов 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** ** интакт. ** ** контрольная гр. 20мг/кг ** ** ** ** 100мг/кг ** 500мг/кг 1000мг/кг Рисунок 9 – Объем потребляемой воды у крыс после внутрибрюшинного введения L-аргинина (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) 54 Внутрибрюшинное введение L-аргинина в дозе 20 мг у крыс-самцов снижает объем потребляемой воды в 1,24 раза (р<0,05), в дозе 100 мг/кг – в 1,41 раза (р<0,01) и в дозе 500 мг/кг – в 1,59 раза (р<0,05) по сравнению с интактной группой. Положительная корреляция объема выпитой воды с уровнем метаболитов NO крови наблюдается в дозе 20 мг/кг (r=1,00; р<0,001), 500 мг/кг (r=0,52; р<0,01) и 1000 мг/кг (r=0,60; р<0,001). Таким образом, установлена половая специфичность в изменении потребляемой воды при внутрибрюшинном введении донора оксида азота – L-аргинина в дозах 20 и 1000 мг/кг. У крыс-самок значение этого показателя ниже в 2,64 раза (р<0,01) и в 3,39 раза (р<0,05) соответственно по сравнению с самцами. 3.2.3 Содержание суммарного количества нитрат-и нитрит-анионов в плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке хлофузаном Для выявления гендерной зависимости физиологических эффектов экзогенного донора оксида азота белым крысам вводили хлофузан внутрижелудочно в виде 0,1 % суспензии в дозах 1 мг/кг и 2 мг/кг. Установлено повышение уровня нитрат- и нитрит- анионов в крови и моче у крыс при нагрузке экзогенным донором NO – хлофузаном. Нагрузка хлофузаном в дозе 1 мг/кг сопровождалась повышением содержания продукции оксида азота в плазме крови у самок в 1,59 раза (56,57±3,774 мкмоль/л против 35,57±2,577 мкмоль/л; р<0,01), у самцов – в 2,03 раза (65,26±3,409 мкмоль/л против 32,19±2,526 мкмоль/л; p<0,001) относительно интактной группы (рисунок 10). 55 Концентрация нитрат и нитрит анионов мкмоль/л Содержание в крови у самок метаболитов NO мкмоль/л Содержание в крови у самцов метаболитов NO мкмоль/л 80 ** 70 ** ** 60 ** 50 ** 40 30 20 10 0 интактные контрольные хлофузан 1 мг/кг хлофузан 2 мг/кг Рисунок 10 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в крови у крыс после введения хлофузана (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) ** - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) Нагрузка хлофузаном в дозе 2 мг/кг сопровождалась повышением концентрации метаболитов оксида азота в плазме крови самок в 1,98 раза (70,57±4,355 мкмоль/л против 35,57±2,577 мкмоль/л; р<0,001). У самцов введение хлофузана в этой дозе не привело к изменению уровня метаболитов NO в крови. Эффект экзогенного донора имеет половую специфичность, так при введении хлофузана в дозе 2 мг/кг содержание нитрат- и нитрит-анионов в крови выше у крыс-самок в 2,18 раза (p<0,001) относительно аналогичного показателя у самцов. При нагрузке хлофузаном концентрация нитрат- и нитрит-анионов в моче достоверно увеличилась в 2,01 и 2,64 раза (p<0,001) у самок и самцов соответственно (рисунок 11). Увеличение нагрузки в 2 раза привело к повышению концентрации нитрат- и нитрит- анионов в моче у самок в 2,47 раза (p<0,001) и у самцов аналогично в 1,79 раза (p<0,05). 56 Концентрация нитрат и нитрит анионов, мкмоль/л Содержание в моче у самок метаболитов NO мкмоль/л Содержание в моче у самцов метаболитов NO мкмоль/л 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ** ** ** ** ** интактные контрольные хлофузан 1 мг/кг хлофузан 2 мг/кг Рисунок 11 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в моче у крыс после введения хлофузана (n=5) Примечание: *- достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) **- достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Нагрузка соединением фуроксанового ряда (хлофузаном), сопровождалась дозозависимым изменением функциональной активности системы оксида азота в организме белых крыс. Содержание метаболитов NO в моче при введении соединения в дозе 1 мг/кг выше у крыс-самцов в 1,32 раза (p<0,01) по сравнению с самками, в дозе 2 мг/кг выше у крыс-самок в 1,38 раза (p<0,001) по сравнению с самцами. Таким образом, у самок зависимость уровня NOх от дозы прямая, а у самцов – параболическая. 3.2.4 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного пола при нагрузке хлофузаном Установлено повышение суточного диуреза при введении экзогенного донора NO – хлофузана в дозе 1 и 2 мг/кг. Нагрузка белых крыс хлофузаном (1 мг/кг) сопровождалась достоверным повышением объема суточного диуреза в 4,39 раза (р<0,05) и 57 2,21 раза (р<0,03) у самок и самцов соответственно. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и объемом суточного диуреза наблюдается положительная корреляция (r=1,0; р<0,03). Увеличение дозы привело к еще большему эффекту: у самок – повышению объема суточного диуреза в 5,16 раза (р<0,001). У самцов отмечена лишь тенденция к Объем суточного диуреза, мл/100г повышению (рисунок 12). объем мочи у самок, мл/100г объем мочи у самцов, мл/100г 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** ** ** интактная группа контрольная группа 1 мг/кг хлофузан 2 мг/кг хлофузан Рисунок 12 – Объем суточного диуреза у крыс после введения хлофузана (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Установлено, что увеличение объема суточного диуреза при введении экзогенного донора NO имеет половую специфичность, так при введении хлофузана в дозе 2 мг/кг этот показатель выше у крыс-самок в 4,64 раза (р<0,001) по сравнению с самцами. Установлено увеличение потребляемой воды при введении экзогенного донора хлофузана в дозе 1 мг/кг у самцов и снижение при нагрузке в дозе 2 мг/кг у самок и самцов. 58 Объем потребляемой воды после введения хлофузана (1 мг/кг) у самок достоверно не меняется, а у самцов происходит увеличение в 1,52 раза (р<0,05) по сравнению с интактной группой. При нагрузке хлофузаном в дозе 2 мг/кг наблюдается уменьшение объёма потребляемой воды у крыс-самок в Объем потребляемой воды, мл/100г 2,41 раза (р<0,01), у самцов 2,61 раза (р<0,01) соответственно (рисунок 13). объем воды у самок, мл/100г объем воды у самцов, мл/100г 12 10 ** 8 6 ** ** ** 4 ** 2 0 интактные контрольные 1 мг/кг хлофузан 2 мг/кг хлофузан Рисунок 13 – Объем потребляемой воды у крыс после введения хлофузана (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и объемом потребляемой воды наблюдается отрицательная корреляция у крыссамок (r= -1,0; р<0,05) и высокая положительная корреляция у крыс-самцов (r=1,0; р<0,05). Полученные результаты указывают о большей выраженности эффекта экзогенного донора у самок, чем у самцов. 59 3.2.5 Содержание суммарного количества нитрат-и нитрит-анионов в плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке L-NAME Для снижения образования оксида азота в организме белым крысам вводили NG-nitro-L-arginine-methyl-ester (L-NAME) – неселективный ингибитор NO-синтаз в дозах: 10 мг/кг и 20 мг/кг внутрижелудочно в виде 10 % водного раствора. В условиях блокады NOS уровень метаболитов NO в крови у крыс снижается в прямой зависимости от дозы вводимого ингибитора NOS (рисунок 14). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови при введении L-NAME в дозе 10 мг/кг и 20 мг/кг наблюдается средняя положительная корреляция у крыс-самцов (r=0,40; р<0,01). Содержание в крови у самок метаболитов NO мкмоль/л Содержание в крови у самцов метаболитов NO мкмоль/л Концентрация NOх, мкмоль/л 60 50 40 -* 30 ** ** 20 ** 10 0 интактные контрольные L- NAME 10 L- NAME 20 Рисунок 14 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в крови у крыс после введения L-NAME (n=5) Примечание: ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) * - достоверно по сравнению с контрольнй группой (р<0,05) 60 Нагрузка L-NAME в дозе 10 мг/кг сопровождалась снижением концентрации нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови самок в 1,44 раза (р<0,05) и которая составила при этом 26,63±1,024 мкмоль/л. У крыс-самцов блокада NOS привела к снижению уровня метаболитов NO в крови в 1,34 раза (р<0,05) относительно интактной группы. Увеличение нагрузки в 2 раза привело к еще более выраженному эффекту – снижению стабильных метаболитов оксида азота в крови у крыс-самок в 1,93 (р<0,05), а в крови самцов – в 3,22 раза соответственно (р<0,05). Степень ингибирования NO-синтаз зависит от пола животного. Так, у крыс-самцов при введении в организм L-NAME в дозе 10 мг/кг содержание метаболитов NO в крови ниже в 1,11 раза (р<0,01) относительно их уровня у самок; а при введении L-NAME в дозе 20 мг/кг – в 1,85 раза (р<0,05). Концентрация нитрат- и нитрит-анионов в моче при ингибировании NO-синтаз также снижается. Содержание в моче у самок метаболитов NO мкмоль/л Концентрация нитрат и нитрит анионов мкмоль/л Содержание в моче у самцов метаболитов NO мкмоль/л 120 ** 100 80 60 ** ** 40 ** ** 20 0 интактные контрольные L- NAME 10 L- NAME 20 Рисунок 15 – Содержание нитрат- и нитрит-анионов в моче у крыс после введения L-NAME (n=5) Примечание: *- достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,001) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,001) 61 Нагрузка L-NAME в дозе 10 мг/кг вызывает снижение концентрации метаболитов оксида азота в моче у самок в 1,50 раза (р<0,001), у самцов – в 1,83 раза (р<0,001) относительно интактной группы; введение ингибитора NOS в дозе 20 мг/кг привело к еще более выраженному эффекту – снижению стабильных метаболитов оксида азота в 2,06 раза и 2,21 раза (р<0,001) соответственно (рисунок 15). Таким образом, ингибитор NO-синтаз L-NAME снижает активность системы оксида азота в зависимости от пола животного. У самцов эффект – L-NAME более выражен, чем у самок. 3.2.6 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного пола при нагрузке L-NAME При нагрузке L-NAME в дозе 10 мг/кг объем суточной мочи у самок снижается в 1,76 раза (р<0,01), у самцов отмечается тенденция к снижению этого показателя (рисунок 16). Объем суточного диуреза мл/100г объем мочи у самок, мл/100г объем мочи у самцов, мл/100г 3,5 ** 3 ** 2,5 2 1,5 ** 1 0,5 0 интактные контрольные L- NAME 10 L- NAME 20 Рисунок 16 – Объем суточного диуреза у крыс после введения L-NAME (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (p<0,001) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,001) 62 Введение в организм L-NAME в дозе 20 мг/кг повышает суточный диурез в 1,88 раза (р<0,05) по сравнению с интактной группой. У самцов наблюдается снижение суточного объема мочи по сравнению с животными контрольной группы в 1,35 раза (р<0,05). Объем суточного диуреза зависит от активности NOS и от пола животного. Так, при введении в организм L-NAME в дозе 20 мг/кг объем суточного диуреза у крыс-самцов в 1,65 раза ниже (р<0,001), чем у самок. При нагрузке L-NAME в дозе 10 мг/кг потребление воды снижается у самок в 3,17 раза (р<0,001), у самцов – в 1,93 раза (р<0,001). Введение L-NAME в дозе 20 мг/кг у самок снижает потребление воды в 1,76 раза (р<0,001), а у самцов – в 1,98 раза (р<0,001) по сравнению с интактными животными (рисунок 17). Объем потребляемой воды, мл/100г объем воды у самок, мл/100г объем воды у самцов, мл/100г 10 9 8 7 6 ** 5 ** ** ** 4 ** 3 ** 2 1 0 интактные контрольные L- NAME 10 L- NAME 20 Рисунок 17 – Объем потребляемой воды у крыс после введения L-NAME (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,001) ** - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,001) 63 Интенсивность снижения потребляемой воды при ингибировании NO-синтаз зависит от пола животного. Так, при введении L-NAME в дозе 20 мг/кг у крыс-самцов объем выпитой в течении суток воды в 1,61 раза (р<0,05) ниже по сравнению с самками. При нагрузке L-аргинином увеличение концентрации нитрат- и нитрит-анионов в крови сопровождается увеличением объема выделяемой мочи, а при ингибировании NO-синтаз – снижением. Результаты экспериментов показали, что система NO у крыс имеет половую специфичность. Для зависимости почечных процессов от активности системы оксида азота, о которой мы судили по содержанию нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче, также характерна гендерная специфичность. 3.3 Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на ионоуретическую функцию почек Ранее была установлена половая специфичность активности системы оксида азота и ответной реакции организма на введение доноров оксида азота и ингибиторов его синтаз. Дальнейшие исследования направлены на выявление половой специфичности ионоуретической функции почек при разных уровнях активности системы NO. 3.3.1 Натрийуретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз Для изучения обмена ионов в организме, а также для изучения экскреторной функции почек, были поставлены эксперименты на белых нелинейных крысах. Для этого были созданы 8 групп крыс, состоявших из половозрелых самок: первая группа интактная, вторая группа с нагрузкой L-аргинином в дозе 200 мг/кг, третья группа с нагрузкой ингибитором синтаз 64 NO – L-NAME в дозе 20 мг/кг, четвертая с нагрузкой экзогенным донором NO хлофузаном в дозе 2 мг/кг (n=5). Аналогичные группы состояли из половозрелых самцов. Для сбора мочи крыс помещали в специальные клетки обменники. Повышение активности системы оксида азота путем введения физиологического донора – L-аргинина и экзогенного донора хлофузана приводит к увеличению суточного диуреза, а снижение активности системы влияет противоположно, уменьшая диурез. Установлено изменение натрийуреза у крыс при применении доноров NO и ингибитора NO-синтаз. Повышение активности системы NO путем введения L-аргинина привело к увеличению натрийуреза, снижение активности системы при введении L-NAME не изменяет интенсивность экскреции натрия. Содержание натрия в сыворотке крови у белых крыс составило 105,67±14,148 ммоль/л и 91,6±6,301 ммоль/л у самок и самцов соответственно. При нагрузке L-аргинином в дозе 200 мг/кг отмечается тенденция к снижению натрия в сыворотке крови у крыс-самок, а у самцов наоборот тенденция к повышению исследуемого показателя (рисунок 18). Концентрация натрия в плазме крови, ммоль/л Содержание натрия в плазме крови у самок Содержание натрия в плазме крови у самцов 160 140 120 100 80 60 40 20 0 * исходный уровень * после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 18 – Концентрация натрия в плазме крови у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) 65 Уровень содержания натрия в моче у крыс-самок составил 0,27±0,015 ммоль/100г/24часа, у самцов – 0,16±0,014 ммоль/100г/24часа. После нагрузки L-аргинином содержание натрия в моче повысилось в 2,69 раза (р<0,001) и 5,04 раза (р<0,05) у самок и самцов соответственно. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией натрия в моче наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,98; р<0,0005). Установлено увеличение концентрации натрия в сыворотке крови после введения хлофузана у самцов в 1,25 раза (р<0,05). У самок имеется лишь тенденция к увеличению значения исследуемого показателя по сравнению с исходным уровнем. Между содержанием нитрат- и нитританионов в плазме крови и концентрацией натрия в сыворотке крови наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,68; р<0,005). Экскреция натрия с мочой закономерно снижается у самок в 1,93 раза (р<0,03), а у самцов остается на том же уровне (рисунок 19). Концентрация натрия в моче ммоль/100г/24часа Содержание натрия в моче у самок Содержание натрия в моче у самцов 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 * * исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 19 – Концентрация натрия в моче у крыс после введения доноров и ингибитора оксида азота (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) При нагрузке L-NAME (20 мг/кг) отмечается увеличение концентрации натрия в крови крыс-самцов в 1,45 раза (р<0,05) относительно 66 исходного уровня, у самок имеет лишь тенденцию к увеличению. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией натрия в сыворотке крови наблюдается отрицательная корреляция (r= -0,91; р<0,001 у самок, r= -0,30; р<0,0001 у самцов). Значение исследуемого показателя в моче достоверно не меняется. 3.3.2 Калийуретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз В сыворотке крови белых крыс содержание калия составляет 4,59±0,342 ммоль/л и 5,68±0,222 ммоль/л у самок и самцов соответственно. Нагрузка физиологическим донором NO привело к увеличению калия в крови у самок в 1,19 раза (р<0,05), у самцов этот показатель не изменился. Содержание калия в моче меняется в зависимости от активности системы оксида азота: у самок после нагрузки L-аргинином увеличивается в 3,74 раза (р<0,05) и у самцов – в 5,5 раза (р<0,005) по сравнению с контрольной группой (рисунок 20). Концентрация калия в плазме крови, ммоль/л Содержание калия в плазме крови у самок Содержание калия в плазме крови у самцов 7 * 6 * 5 4 3 2 1 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 20 – Концентрация калия в плазме крови у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) 67 При поступлении хлофузана в организм наблюдается следующая динамика изменения концентрации калия: у крыс-самцов в сыворотке крови концентрация снижается 1,13 раза (р<0,05). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией калия в сыворотке крови наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,77; р<0,001 у самок, r=0,86; р<0,001 у самцов). Экскреция калия с мочой имеет лишь тенденцию к увеличению (рисунок 21). Концентрация калия в моче,ммоль/100г/24 часа Содержание калия в моче у самок Содержание калия в моче у самцов 0,35 0,3 * 0,25 * 0,2 0,15 0,1 0,05 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 21 – Концентрация калия в моче у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Количество калия в сыворотке крови и моче у крыс после введения L-NAME достоверно не отличается относительно исходных значений. 68 3.3.3 Хлоруретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз Количество хлоридов в сыворотке крови у крыс интактной группы составило у самок 92,8±3,104 ммоль/л, а у самцов 98±2,232 ммоль/л. Установлено, что при нагрузке L-аргинином достоверных изменений количества хлоридов в сыворотке крови у крыс не наблюдается, в моче увеличивается их экскреция в 6,44 раза (р<0,005) и 2,49 раза (р<0,05) у самок и самцов соответственно (рисунок 22). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией хлоридов в моче наблюдается средняя положительная корреляция у самок (r=0,54; р<0,001) и отрицательная у самцов (r=-0,57; р<0,0001). Содержание хлора в плазме крови у самок Концентрация хлоридов в плазме крови, ммоль/л Содержание хлора в плазме крови у самцов 120 * 100 * 80 60 40 20 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 22 – Концентрация хлоридов в плазме крови у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,01) 69 В сыворотке крови содержание хлоридов после повышения активности системы оксида азота экзогенным донором имеет тенденцию к снижению у крыс-самок, а у самцов снижается в 1,08 раза (р<0,01). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией хлоридов в сыворотке крови наблюдается отрицательная корреляция у крыс-самок (r=-0,92; р<0,05) и положительная корреляция у крыс-самцов (r=0,98; р<0,0001). Экскреция хлоридов с мочой снижается в 5,33 раза (р<0,05) и в 9,33 раза у самок и самцов соответственно (рисунок 23). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией хлоридов в моче наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,61; р<0,001 у самок, r=0,97; р<0,001 у самцов). Содержание хлоридов в сыворотке крови меняется в зависимости от активности системы оксида азота. Так, у самцов после нагрузки L-NAME уровень СI-- снижается в 1,19 раза (р<0,001), что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови. Содержание хлора в моче у самок Концентрация хлоридов в моче, ммоль/100г/24часа Содержание хлора в моче у самцов 1,2 * 1 * 0,8 0,6 0,4 0,2 * * * 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 23 – Концентрация хлоридов в моче у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) 70 Экскреция хлоридов с мочой аналогично снижается у самцов крыс в 3,09 раза (р<0,05), а у самок крыс наблюдается лишь тенденция к снижению по сравнению с исходными значениями. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией хлоридов в моче наблюдается положительная корреляция (r=0,21; р<0,001 у самок, r=0,97; р<0,001 у самцов). 3.3.4 Кальцийуретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз Установлено, что изменение активности системы оксида азота влияет на содержание кальция в сыворотке крови и экскрецию его с мочой. Введение эндогенного донора L-аргинина сопровождается увеличением экскреции кальция с мочой, введение экзогенного донора хлофузана сопровождается увеличением кальция в сыворотке крови и тенденцией к увеличению экскреции с мочой, а введение ингибитора оксида азота L-NAME сопровождается увеличением в сыворотке крови и моче (рисунок 24, 25). Содержание кальция в плазме крови у самок Концентрация кальция в плазме крови, ммоль/л Содержание кальция в плазме крови у самцов * 3 * * * 2,5 2 1,5 1 0,5 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 24 – Концентрация кальция в плазме крови у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,005) 71 В сыворотке крови белых крыс содержание кальция имеет тенденцию к снижению после нагрузки L-аргинином по отношению к исходному значению. Соответственно происходит увеличение в моче ионов кальция у самок 2,75 раза, у самцов – в 23,33 раза (р<0,001). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией кальция в моче наблюдается положительная корреляция: у самок (r=0,60; р<0,001) и отрицательная корреляция у самцов (r=-0,97; р<0,0001). Введение хлофузана в организм белых крыс сопровождается увеличением кальция в сыворотке крови у самок в 1,36 раза (р<0,001), у самцов в 1,87 раза (р<0,001) по сравнению с исходным значением, которая имеет отрицательную корреляцию (рисунок 23). Экскреция кальция достоверно не меняется, имеется лишь тенденция к увеличению у крыс обоего пола (рисунок 24). Содержание кальция в моче у самок Концентрация кальция в моче, ммоль/100г/24часа Содержание кальция в моче у самцов 0,035 * 0,03 0,025 0,02 0,015 * 0,01 * * 0,005 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 25 – Концентрация кальция в моче у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,005) 72 Снижение активности синтаз оксида азота привело к увеличению кальция в сыворотке крови в 1,49 раза (р<0,001) и в 1,93 раза (р<0,005) у самок и самцов соответственно. Между содержанием нитрат- и нитританионов в плазме крови и концентрацией кальция в сыворотке крови наблюдается отрицательная корреляция (r= -0,28; р<0,002 у самок, r= -0,47; р<0,005 у самцов). Экскреция кальция с мочой увеличивается у самок в 3,09 раза (р<0,005) у самцов – в 3,25 раза (р<0,001) по сравнению с исходными значениями. Эффект субстрата NO-синтаз L-аргинина на экскрецию кальция имеет половую специфичность. Так, у крыс-самцов концентрация кальция в моче выше в 3,38 раза (р<0,001) по сравнению с самками. Ингибирование NOсинтаз влияет на экскрецию кальция сильнее у самок, чем у самцов (выше в 1,75 раза; р<0,05). 3.3.5 Фосфоруретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз Установлено, что количество неорганического фосфора в сыворотке крови уменьшается во всех группах при введении доноров и ингибитора оксида азота. Экскреция исследуемого вещества с мочой имеет тенденцию к увеличению при введении L-аргинина у самок и самцов. При введении хлофузана и L-NAME экскреция фосфора с мочой у самок имеет тенденцию к увеличению, у самцов достоверно уменьшается (рисунок 26). Количество неорганического фосфора в крови у крыс контрольной группы составляет 1,47±0,121 ммоль/л и 1,41±0,085 ммоль/л у самок и самцов соответственно. Нагрузка физиологическим донором NO привело к уменьшению фосфора в крови у самок в 1,96 раза (р<0,005), у самцов – в 1,28 раза (р<0,05). 73 Содержание фосфора в плазме крови у самок Концентрация фосфора в плазме крови, ммоль/л Содержание фосфора в плазме крови у самцов 1,8 1,6 1,4 * 1,2 * 1 * * 0,8 * * 0,6 0,4 0,2 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 26 – Концентрация фосфора в плазме крови у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Экскреция неорганического фосфора с мочой имеет лишь тенденцию к увеличению, без достоверных отличий (рисунок 27). Установлено снижение фосфора в сыворотке крови при введении хлофузана в 1,77 раза (р<0,01) и в 1,92 раза (р<0,005) у самок и самцов соответственно. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией фосфора в сыворотке крови наблюдается положительная корреляция (r=0,98; р<0,001). Выявлено достоверное снижение экскреции фосфора с мочой у самцов в 5,00 раз (р<0,05), а у самок отмечена тенденция к увеличению. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией фосфора в моче наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,85; р<0,001). Снижение активности системы оксида азота привело к снижению фосфора в сыворотке крови у самок и самцов в 1,65 раза (р<0,005) и в 1,86 раза (р<0,01) соответственно. Отмечается снижение экскреции фосфора с мочой у самцов в 6,52 раза (р<0,05). У самок имеется лишь тенденция к 74 увеличению этого показателя по сравнению с исходным значением (рисунок 27). Установлено, что концентрация фосфора в сыворотке крови увеличивается при введении L-аргинина, у крыс-самцов более интенсивно, чем у самок (выше в 1,47 раза; р<0,05). При нагрузке L-аргинином увеличение концентрации нитрат- и нитрит-анионов в крови сопровождается увеличением объема выделяемой мочи, а также повышением экскреции ионов натрия, кальция, хлора и калия с мочой. Выявлена половая специфичность физиологического эффекта NO на ионоуретическую функцию почек, который более выражен у самцов. Содержание фосфора в моче у самок Концентрация фосфора в моче, ммоль/100г/24 часа Содержание фосфора в моче у самцов 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 * * 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 27 Концентрация фосфора в моче у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) На введение ингибитора синтаз оксида азота – L-NAME наблюдается более высокая чувствительность организма самцов, по сравнению с самками. Снижение образования оксида азота влияет на транспорт многих ионов в почечных канальцах. 75 Увеличение в организме NO без участия синтаз оксида азота сопровождается изменением ионоуретической функции почек, но отличается от действия эндогенного донора оксида азота – L-аргинина. Физиологический эффект NO на ионоуретическую функцию почек более выражен у самцов относительно самок. 3.4 Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз на почечные процессы: клубочковую фильтрацию, канальцевую реабсорбцию, канальцевую секрецию Ранее была установлена половая специфичность активности системы оксида азота, а также изменение гидроуретической и ионоуретической функции почек на введение доноров оксида азота и ингибитора NOS. Дальнейшие исследования направлены на выявление половой специфичности изменения почечных процессов при разных уровнях активности системы NO. Для изучения процессов клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции, канальцевой секреции были поставлены эксперименты на белых нелинейных крысах. Установлено, что при введении L-аргинина происходит увеличение суточного диуреза у самок и самцов крыс в 1,75 раза и в 2,01 раза соответственно по сравнению с интактной группой (р<0,05; рисунок 28). Снижение образования оксида азота путем введения блокатора синтаз оксида азота привело к уменьшению суточного диуреза у самцов в 1,71 раза (р<0,03), а у самок имело лишь тенденцию к уменьшению. Увеличение образования оксида азота путем введения экзогенного донора – хлофузана сопровождается тенденцией к увеличению суточного диуреза у крыс. 76 Объем суточного диуреза, мл/сут Объем суточного диуреза у самок Объем суточного диуреза у самцов 16 14 * 12 * 10 8 6 * * 4 2 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-аргинина L-аргинина Рисунок 28 – Объем суточного диуреза у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) При введении L-аргинина крысам происходит увеличение протеинурии у самцов, что не наблюдается у самок. Содержание общего белка в крови при этом не изменяется. Ингибитор синтаз оксида азота достоверно не меняет содержание общего белка в сыворотке крови, но повышает протеинурию. Введение хлофузана сопровождается снижением концентрации общего белка в крови у крыс-самок и достоверно не влияет на протеинурию. Установлено, что в сыворотке крови интактных белых крыс содержание общего белка составляет 76,5±4,057 г/л и 63,65±5,200 г/л у самок и самцов соответственно. В группе животных, получавших L-аргинин, этот показатель имеет тенденцию к снижению (рисунок 29). 77 Содержание общего белка в плазме крови у самок Концентрация общего белка в плазме крови, г/л Содержание общего белка в плазме крови у самцов 100 90 80 * 70 60 50 40 30 20 10 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 29 – Концентрация общего белка в плазме крови у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Увеличение мочеотделения у крыс-самок после введения L-аргинина не сопровождалось повышением протеинурии, а у самцов интенсивность протеинурии увеличилась в 4,16 раза (р<0,001) по сравнению с исходным значением (рисунок 30). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией общего белка в моче наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,64; р<0,001). Установлено, что введение экзогенного донора оксида азота – хлофузана снижает содержание общего белка в крови в 1,18 раза (р<0,05), тогда как у самцов наблюдается обратная реакция, имеющяя отрицательную корреляцию с содержанием нитрат- и нитрит- анионов в крови (рисунок 29). Протеинурия при этом имеет лишь тенденцию к увеличению. 78 Концентрация общего белка в моче, г/100г/24 часа Содержание общего белка в моче у самок Содержание общего белка в моче у самцов 0,045 0,04 * 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 исходный уровень после введения L-аргинина после введения L-NAME после введения хлофузана Рисунок 30 – Концентрация общего белка в моче у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,001) Содержание общего белка в крови после нагрузки ингибитором синтаз оксида азота – L-NAME имеет тенденцию к увеличению; интенсивность протеинурии повышается у самок и у самцов. Установлено, что содержание общего белка в крови имеет половую специфичность. Так у крыс-самок концентрация общего белка плазмы крови выше в 1,20 раза (р<0,05) по сравнению с этим показателем у самцов. При введении L-аргинина происходит увеличение содержания белка в моче более интенсивно (в 6,17 раза (р<0,001)) у самцов по сравнению с самками. Содержание общего белка в сыворотке крови при ингибировании NO-синтаз выше у самок, чем у самцов (в 1,19 раза; р<0,005). Содержание мочевины в крови у крыс контрольной группы составляет 5,62±0,382 ммоль/л и 5,04±0,785 ммоль/л у самок и самцов соответственно. Введение крысам физиологического донора оксида азота в дозе 200 мг/кг сопровождается тенденцией снижения данного показателя в сыворотке крови (рисунок 31). 79 Содержание мочевины в плазме крови у самок Концентрация мочевины в плазме крови, ммоль/л Содержание мочевины в плазме крови у самцов 8 7 6 5 4 3 2 1 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 31 – Концентрация мочевины в плазме крови у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,001) Выделение мочевины с мочой составляет 1,66±0,187 ммоль/100г/24часа и 2,11±0,381 ммоль/100г/24часа у самок и самцов соответственно. После нагрузки L-аргинином этот показатель достоверно увеличивается у самок 3,69 раза (р<0,01) у самцов в 4,24 раза (р<0,005) (рисунок 30). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией мочевины в моче наблюдается слабая положительная корреляция (r=0,27; р<0,001). Введение крысам хлофузана не сопровождается достоверным изменением содержания мочевины в сыворотке крови от исходного значения. Экскреция мочевины снижается у крыс-самок в 1,63 раза (р<0,05) и у самцов – в 2,05 раза (р<0,05; рисунок 32). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией мочевины в моче наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,90; р<0,001). Введение крысам L-NAME сопровождается тенденцией снижения мочевины в сыворотке крови. Достоверно снижается экскреция с мочой у самцов в 2,81 раза (р<0,01), что не наблюдается у крыс-самок. 80 Содержание мочевины в моче у самок Содержание мочевины в моче у самцов Концентрация мочевины в моче, ммоль/100г/24 часа 14 12 * 10 8 6 4 2 * 0 исходный уровень после введения L-аргинина после введения L-NAME после введения хлофузана Рисунок 32 – Концентрация мочевины в моче у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Установлено, что содержание мочевины в сыворотке крови при введении хлофузана меняется в зависимости от половой специфичности, так у крыс-самок этот показатель выше в 1,35 раза (р<0,05), чем у самцов. Ингибирование NO-синтаз сопровождается увеличением содержания мочевины в сыворотке крови у крыс-самцов в 1,16 раза (р<0,05) по сравнению с самками. Установлено, что содержание креатинина в сыворотке крови у крыссамцов выше в 1,21 раза (р<0,05), чем у самок. После нагрузки L-аргинином содержание креатинина в крови у крыс-самок увеличивается в 3,38 раза (р<0,001), у самцов – в 2,85 раза (р<0,001) по сравнению с исходными значениями (рисунок 33). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией креатинина в моче наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,82; р<0,001). Увеличение креатинина в моче при высокой активности системы оксида азота свидетельствует об участии NO в процессе экскреции. У самок это показатель повышается в 3,94 раза 81 (р<0,05) у самцов – в 3,72 раза (р<0,025) по сравнению с крысами интактной группы (рисунок 34). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией креатинина в моче наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,90; р<0,001). Концентрация креатинина в плазме крови, ммоль/л Содержание креатинина в плазме крови у самок Содержание креатинина в плазме крови у самцов 300 250 * * 200 150 100 * * 50 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 33 – Концентрация креатинина в крови у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,01) Концентрация креатинина в сыворотке крови после введения экзогенного донора оксида азота – хлофузана уменьшается у самцов в 1,55 раза, что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитританионов в плазме крови (р<0,01), а у самок остается на исходном уровне. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией креатинина в моче наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,90; р<0,005). При этом выделение с мочой креатинина снижается в 2,49 раза (р<0,02) и в 2,96 раза (р<0,01) у самок и самцов соответственно (рисунок 32). Содержание креатинина в крови меняется в зависимости от активности системы оксида азота. Так у самцов после введения ингибитора NO-синтаз уровень креатинина в сыворотке крови снижается в 1,72 раза (р<0,005). Экскреция креатинина при блокаде синтаз оксида азота снижается у самок в 82 1,86 раза (р<0,05) у самцов – в 2,87 раза (р<0,005). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче и концентрацией креатинина в моче наблюдается высокая отрицательная корреляция у самок (r=-0,40; р<0,05) и положительная корреляция у самцов (r=0,57; р<0,05) по сравнению с исходным значением. Этот факт доказывает участие NO в процессе экскреции креатинина. Содержание креатинина в моче у самок Концентрация креатинина в моче, ммоль/100г/24 часа Содержание креатинина в моче у самцов 140 * * 120 100 80 60 40 * 20 * * * 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 34 – Концентрация креатинина в моче у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Введение донора оксида азота L-аргинина сопровождается тенденцией снижения скорости клубочковой фильтрации у самок, а у самцов наоборот к увеличению. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и скоростью клубочковой фильтрации наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,99; р<0,001). Это еще раз доказывает тот факт, что общая активность системы оксида азота в организме у самок намного выше, чем у самцов (рисунок 35). 83 Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин Скорость клубочковой фильтрации у самок Скорость клубочковой фильтрации у самцов 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 * 0,4 0,3 0,2 0,1 0 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 35 – Скорость клубочковой фильтрации у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Скорость клубочковой фильтрации по креатинину снижается после введения хлофузана у самок в 2,19 раза (р<0,02). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и скоростью клубочковой фильтрации наблюдается средняя отрицательная корреляция (r=-0,56; р<0,001). Скорость клубочковой фильтрации у самцов имеет тенденцию к снижению. Скорость клубочковой фильтрации при введении блокаторов синтаз оксида азота сдвигается в сторону снижения, но достоверных изменений не выявлено. Введение эндогенного донора оксида азота – L-аргинина сопровождается снижением реабсорбции воды у самок на 0,35 % (р<0,05), у самцов – на 0,57 % (р<0,05) по сравнению с интактной группой (рисунок 36). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и скоростью клубочковой фильтрации наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,76; р<0,001 у самок, r=0,15; р<0,001 у самцов). 84 Канальцевая реабсорбция воды, % Канальцевая реабсорбция воды у самок Канальцевая реабсорбция воды у самцов 100 * 99,5 * * 99 * 98,5 98 97,5 исходный уровень после введения после введения после введения L-аргинина L-NAME хлофузана Рисунок 36 – Канальцевая реабсорбция воды у крыс после введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) Блокада синтаз оксида азота сопровождается увеличением канальцевой реабсорбции воды у самцов на 0,22 % (р<0,005). Между содержанием нитрати нитрит-анионов в плазме крови и канальцевой реабсорбцией наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,98; р<0,001). Канальцевая реабсорбция воды у самок после введения L-NAME имеет тенденцию к увеличению по сравнению с исходным уровнем (рисунок 36). Этот факт доказывает более высокую чувствительность организма самцов к действию L-NAME, по сравнению с самками. Реабсорбция воды после введения экзогенного донора оксида азота хлофузана имеет лишь тенденцию к снижению у самок и самцов. Увеличение в организме NO без участия синтаз оксида азота сопровождается изменением процессов и функций почек. Таким образом, установлено, что изменение активности системы оксида азота путем введения доноров и ингибитора NO-синтаз, сопровождается изменением почечных процессов фильтрации, реабсорбции и секреции в зависимости от пола животного. 85 3.5 Влияние доноров NO на процессы фильтрации, реабсорбции и секреции на модели острой почечной недостаточности Экспериментальную острую почечную недостаточность вызывали по G. Greven на 20 беспородных крысах путем внутримышечного введения 10 мл/кг 50,0 % глицерина, разведенного на физиологическом растворе, после предварительного, в течение суток, лишения крыс пищи и воды. Для безопасности и уменьшения гибели животных половину дозы вводили в правую заднюю лапу, а другую – в левую. Глицерин вызывает некроз мышц (рабдомиолиз) и высвобождение миоглобина в кровь. Свободный миоглобин оказывает нефротоксическое действие, образует сгустки в канальцах нефронов, а также связывает NO, вызывая интраренальную вазоконстрикцию и ишемию почечной ткани. Гиповолемия вследствие отёка некротизированных мышц тоже вносит вклад в ишемическое повреждение почек. Все эти события в комплексе приводят к развитию ОПН. При патологических процессах, протекающих на фоне гипоксии или ишемии активность NO-синтазного механизма может снижаться, а активность нитритредуктазных систем повышаться. Эксперименты с использованием ингибитора оксида азота были остановлены, так как первая группа крыс, получивших глицерин и L-NAME умирали на первые сутки. 3.5.1 Активность системы оксида азота при экспериментальной острой почечной недостаточности При экспериментальной глицериновой острой почечной недостаточности содержание нитрат- и нитрит-анионов меняется на 3 сутки: в крови увеличивается, а в моче уменьшается. 86 Установлено, что содержание стабильных метаболитов оксида азота в крови увеличивается в 1,37 раза (р=0,01), а в моче снижается в 1,57 раза (р=0,01) по сравнению с интактной группой. Установлено, что при введении эндогенного донора оксида азота – L-аргинина в дозе 200 мг/кг, не происходит достоверных изменений в содержании нитрат- и нитрит-анионов в крови, по сравнению с контрольной группой. Однако содержание NOх в моче при этом повышается в 2,25 раза (р=0,001), что свидетельствует о активности синтаз оксида азота при поступлении субстрата оксида азота – L-аргинина (рисунок 37). Содержание в крови метаболитов NO мкмоль/л Содержание в моче метаболитов NO мкмоль/л Уровень нитрат- и нитританионов, мкмоль/л 160 ** 140 120 ** 100 ** 80 * 60 * * 40 20 0 инт. гр. конт. гр. L-аргинин хлофузан Рисунок 37 – Содержание метаболитов NO в плазме крови и моче крыс после введении доноров и ингибитора оксида азота при экспериментальной острой почечной недостаточности (n=5) Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,01) ** - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,01) Установлено, что при введении экзогенного донора оксида азота – хлофузана, происходит увеличение содержания NOх в крови и моче в 1,49 раза и в 3,14 раза (р<0,001) соответственно по сравнению с контрольной группой. Суточная экскреция с мочой конечных стабильных метаболитов оксида азота снижается при остром повреждении почек, что свидетельствует об угнетении синтеза оксида азота в организме. 87 Экзогенный донор оксида азота имеет большую активность, по сравнению с эндогенным донором, за счет того, что образование NO не происходит ферментативным путем. 3.5.2 Гидроуретическая и ионоуретическая функция почек после введения доноров оксида азота в модели экспериментальной острой почечной недостаточности Выход свободного миоглобина при введении глицерина, оказывает нефротоксическое действие, образует сгустки в канальцах нефронов, а также связывает NO, вызывая интраренальную вазоконстрикцию и ишемию почечной ткани. Все эти изменения сопровождаются нарушениями почечных функций. Установлено, что моделирование ОПН введением глицерина, сопровождается увеличением суточного диуреза в 2,49 раза (р=0,001) по сравнению с исходным значением. При введении физиологического донора оксида азота – L-аргинина происходит еще большее увеличение диуреза у крыс по сравнению с интактной группой в 3,35 раза (р=0,001), тогда как введение экзогенного донора – хлофузана не приводит каким либо изменениям (остается на высоком уровне и составляет 16,47±0,962 мл/cут против 6,54±0,877 мл/cут у интактной группы; р=0,001). Содержание натрия в сыворотке крови на третий день ОПН достоверно не меняется, а при введении L-аргинина имеет тенденцию к увеличению, хлофузаном увеличивается в 1,13 раза (р=0,01) по сравнению с контрольной группой. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и содержанием натрия в сыворотке крови наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,64; р=0,01). Оксид азота увеличивает экскрецию натрия с мочой при повышении активности системы оксида азота, в данном случае этот эффект не наблюдается. Экскреция натрия с мочой за сутки в контрольной группе имеет 88 тенденцию к увеличению, по сравнению с интактной группой. Введение эндогенного донора – L-аргинина привело к уменьшению экскреции натрия в 2,43 раза (составило 0,21±0,027 ммоль/100г/24 часа (р=0,05)), что достоверно не отличается от значений интактных крыс (0,27±0,015 ммоль/100г/24 часа; таблица 3). Таблица 3 – Содержание ионов в крови в модели острой почечной недостаточности на 3 сутки (n=5) Показатель Натрий в крови, ммоль/л Калий в крови, ммоль/л Хлор в крови, ммоль/л Кальций в крови, ммоль/л Фосфор в крови , ммоль/л Интактные Контроль 105,67±14,148 106,67±1,080 4,59±0,342 4,77±0,725 92,82±3,103 84,33±2,858 1 L-аргинин 112,33±5,492 5,50±0,255 1 85,67±2,944 Хлофузан 120,33±2,273 2 6,96±0,177 1, 2 85,00±2,549 1 1,82±0,115 2,71±0,396 1 2,58±0,011 1 2,45±0,166 1 1, 2 1,47±0,121 1,47±0,274 2 2,34±0,050 3,59±0,498 1 Примечание: 1 - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) 2 - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и содержанием натрия в моче наблюдается низкая положительная корреляция (r=0,05; р=0,01). Введение экзогенного донора привело к уменьшению экскреции натрия в 5,10 раза (р=0,05; р=0,001) по сравнению с контрольной группой, что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитританионов в крови (r=-0,75; р=0,05). Экзогенный донор – хлофузан вызывает уменьшение экскреции натрия, тогда объем диуреза остается на том же высоком уровне как в контрольной группе без введения доноров оксида азота Установлено, что содержание калия в крови в контрольной группе достоверно не меняется, а при введении донора оксида азота увеличивается. При введении L-аргинина содержание калия в сыворотке крови выше в 1,20 раза (r=0,08; р=0,05), относительно контроля, что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,09; р=0,05), а при введении хлофузана этот показатель выше в 1,51 раза (р=0,001) 89 по сравнению с исходным значением, что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,26; р=0,001). Экскреция калия с мочой увеличивается у крыс с ОПН в 1,80 раза (р=0,01), что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитританионов в крови (r=0,62; р=0,001). Введение доноров оксида азота привело к еще большему эффекту, так, при введении L-аргинина отмечается лишь тенденция к увеличению, а при введении хлофузана экскреция калия повышается в 1,56 раза (р=0,01), по сравнению с контрольной группой (таблица 4). Таблица 4 – Экскреция ионов с мочой в модели острой почечной недостаточности на 3 сутки (n=5) Показатель Диурез в сутки, мл/сут Натрий в моче, ммоль/100г/24 часа Калий в моче, ммоль/100г/24 часа Хлор в моче, ммоль/100г/24 часа Кальций в моче, ммоль/100г/24 часа Фосфор в моче, ммоль/100г/24 часа Интактные 6,54±0,877 Контроль 16,27±1,098 1 L-аргинин 21,93±1,404 1, 2 Хлофузан 16,47±0,962 1 0,27±0,015 0,51±0,129 0,21±0,027 2 0,10±0,002 1, 2 0,05±0,006 0,09±0,008 1 0,13±0,017 1 0,14±0,005 1,2 0,16±0,051 0,77±0,110 1 0,55±0,079 1 0,27±0,016 1, 2 0,0022±0,0006 0,011±0,0017 1 0,0149±0,0006 1 0,0132±0,0006 1 1, 2 0,045±0,002 0,046±0,003 0,075±0,004 0,029±0,010 Примечание: 1 - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) 2 - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) При этом наблюдается отьрицательная корреляция экскреция калия с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,27; р=0,001). Установлено, что выход свободного миоглобина после введения глицерина, сопровождается уменьшением содержания хлоридов в крови на 3 сутки в 1,10 раза (р=0,05) и увеличением экскреции с мочой в 4,81 раза (р=0,001). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и содержанием хлоридов в моче наблюдается высокая положительная 90 корреляция (r=0,99; р=0,001). При введении эндогенного донора оксида азота – L-аргинина и экзогенного донора – хлофузана не происходят достоверные изменения в содержании хлоридов в крови. Экскреция хлоридов с мочой имеет тенденцию к снижению при введении L-аргинина, достоверно снижается при введении хлофузана в 2,85 раза (р=0,01), по сравнению с контрольной группой, что слабо отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,25; р=0,05) Содержание кальция при почечной недостаточности на 3 сутки увеличивается в крови в 1,35 раза (р=0,01), что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,90; р=0,001) и в моче в 5,00 раз (р=0,005) по сравнению с исходным значением, и достоверно не меняется в группах крыс, которым вводили доноры оксида азота (имеется лишь тенденция к увеличению по сравнению с контрольной группой). Выявлено увеличение фосфора в крови у крыс с ОПН в 2,44 раза (р=0,004), что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитританионов в крови (r=-0,94; р=0,01). Экскреция данного вещества с мочой при этом имеет тенденцию к снижению по сравнению с исходным значением. Введение эндогенного донора оксида азота – L-аргинина привело к снижению фосфора в крови в 2,44 раза (р=0,05) до исходного значения (по сравнению с контрольной группой), что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,26; р=0,001). Экскреция фосфора с мочой при этом имеет тенденцию к увеличению. Введение экзогенного донора – хлофузана также снижает в крови содержание фосфора в 1,53 раза (р=0,05), что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,96; р=0,05) и увеличивает экскрецию с мочой в 2,58 раза (р=0,01), что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,41; р=0,001). 91 3.5.3 Динамика изменения почечных процессов: фильтрации, реабсорбции и секреции после введения доноров оксида азота в модели экспериментальной острой почечной недостаточности Уровень мочевины в крови может повышаться вследствие ряда внепочечных факторов, а также как проявление почечной недостаточности. При тяжелой почечной недостаточности уровень мочевины в крови может достигать очень больших цифр, превышая норму. Экспериментальная острая почечная недостаточность вызванная глицерином, также сопровождается увеличением содержания мочевины в крови в 13,35 раза (р<0,001) и уменьшением экскреции с мочой в 3,25 раза (р=0,05), что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,87; р=0,05). Введение L-аргинина приводит к снижению мочевины в крови в 1,41 раза (р=0,07), что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,99; р=0,01). Аналогично экскреция мочевины с мочой увеличивается в 8,80 раза (р=0,01) по сравнению с контрольной группой, что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитританионов в крови (r=0,82; р=0,001). Введение хлофузана сопровождается тенденцией к снижению мочевины в крови и достоверным увеличением экскреции с мочой в 8,37 раза (р=0,005), но с отрицательной корреляцией с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,39; р=0,05). Оксид азота увеличивает экскрецию мочевины, большую активность проявляет эндогенный донор (таблица 5). Содержание креатинина в крови — величина довольно постоянная, тем не менее почечная недостаточность сопровождается увеличением его в 13,90 раза (р<0,001) и снижением секреции с мочой в 3,25 раза (р=0,05), что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,06; р=0,01). Накопление его в организме приводит к нарушениям других систем организма, которые могут завершаться смертью. Введение L-аргинина привело к снижению креатинина в крови в 2,86 раза (р=0,01), что 92 отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,57; р=0,01) и тенденцией к увеличению экскреции с мочой по сравнению с контрольной группой. Аналогичное снижение креатинина в крови происходит при введении хлофузана. Скорость клубочковой фильтрации при этой патологии также снижается в 30,69 раза (р=0,005), что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,07; р=0,02). Скорость клубочковой фильтрации при введении L-аргинина имеет тенденция к увеличению по сравнению с контрольной группой. Таблица 5 –Изменение почечных процессов: фильтрации, реабсорбции и секреции в модели острой почечной недостаточности на 3 сутки (n=5) Показатель Диурез в сутки, мл/сут Мочевина в крови, ммоль/л Мочевина в моче, ммоль/100г/24 часа Креатинин в крови, мкмоль/л Креатинин в моче, мкмоль/100г/24 часа СКФ, мл/мин Канальцевая реабсорбция воды, % Интактные 6,54±0,877 Контроль 16,27±1,098 1 L-аргинин 21,93±1,404 1, 2 Хлофузан 16,47±0,962 1 5,62±0,382 75,04±2,833 1 53,05±8,987 1, 2 68,88±11,965 1 1,66±0,187 0,51±0,331 1 4,49±0,924 1, 2 4,27±0,445 1, 2 662,33±126,993 66,33±1,080 921,67±51,232 1 322,67±132,933 2 1 31,62±6,459 0,798±0,122 16,31±3,992 1 0,026±0,008 1 19,10±1,192 1 0,109±0,042 1 11,50±1,257 1 0,030±0,006 1 99,39±0,026 53,11±9,268 1 82,38±7,425 1, 2 60,35±7,327 1 Примечание: 1 - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05) 2 - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05) Установлено, что при экспериментальной ОПН снижается канальцевая реабсорбция воды на 46 % (р=0,01) по сравнению с исходным значением, что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,09; р=0,001). При введении L-аргинина происходит повышение реабсорбции на 35,53 % (р=0,06), что положительно коррелирует с 93 содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,65; р=0,001), а при введении хлофузана отмечается лишь тенденция к увеличению по сравнению с контрольной группой. Таким образом, увеличение активности системы оксида азота путем введения доноров, облегчает течение экспериментальной острой почечной недостаточности, вызванной глицерином. 94 Заключение Оксид азота непрерывно продуцируется ферментативным путем в организме животных и человека, участвует в основных процессах клеточного метаболизма, обладает широким спектром биорегуляторного действия в организме. Система оксида азота привлекает внимание многих ученых, изучается интенсивность образования его при нагрузке различными препаратами, при разных физиологических состояниях лабораторных животных, но при этом не учитывается половая и видовая специфичность образования NO. Участие оксида азота (NO) в различных физиологических и патофизиологических процессах предполагает использование его в качестве одного из маркеров прогнозирования исхода и течения болезней. В ходе эксперимента установили, что содержание NOх в плазме крови видоспецифично: у крыс составляет 33…35 мкмоль/л, у овец 34…39 мкмоль/л, у кошек 47…77 мкмоль/л, у кроликов 51…87 мкмоль/л. Наименьшая активность системы оксида азота отмечается у крыс и овец. Предполагаемая нами зависимость активности системы оксида азота от особенностей пищеварения и интенсивности обмена веществ не выявлена. Так, у овец (животные с многокамерным желудком) и крыс (животные с однокамерным желудком) концентрация метаболитов оксида азота плазмы крови не имеет достоверных отличий. Установлено низкое содержание метаболитов оксида азота у кошек в моче по сравнению с уровнем NOх плазмы крови, тогда как у других видов животных отмечается обратная зависимость. Результаты экспериментов показали, что система NO у разных видов животных имеет половую специфичность. Образование оксида азота в организме у самок протекает более интенсивно по сравнению c активностью системы NO в организме самцов. Полученные данные согласуются с сообщением Шимановского Н.Л., Гуревича К.С. 2000, Каримовой Р.Г., 2011, 95 установившими аналогичную разницу в содержании нитрит- и нитратанионов у людей и крыс. Однако, в организме кроликов отмечается обратная зависимость: у самцов концентрация NOх выше, чем у самок. Таким образом установлено, что система оксида азота, о которой мы судили по содержанию стабильных метаболитов (нитрат- и нитрит-анионов) в крови и моче имеет видовую и половую специфичность, которые необходимо учитывать при определении состояния различных физиологических и патофизиологических процессов. Предположительно половая специфичность системы NO объясняется интенсивностью образования эстрогенов и андрогенов в организме животных разных видов. Ранее установленная активность системы оксида азота от вида животных и от гендерных отличий поставили перед нами задачу изучить эффекты нагрузки донорами оксида азота и ингибитором NOS. Выявлен дозазависимый характер изменения уровня нитрат- и нитританионов в крови и моче у крыс при введении субстрата NO-синтаз – L-аргинина. Максимальное повышение концентрации метаболитов NO отмечается при внутрижелудочном введении L-аргинина в дозе 200 мг/кг, при внутрибрюшинном – в дозе 20 мг/кг. Зависимость уровня метаболитов NO в крови от дозы вводимого L-аргинина, как внутрижелудочного, так и внутрибрюшинного имеет параболический характер, тогда как зависимость уровня NOх в моче – прямолинейна. L-аргинин в низких дозах (20 мг/кг и 200 мг/кг) повышает концентрацию метаболитов оксида азота в плазме крови и моче. Дальнейшее повышение дозы (500 мг/кг и 1000 мг/кг) не изменяет уровень метаболитов NO. Предположительно, это может быть связано с синтезом конкурентного ингибитора – АДМА или с ограничением транспорта L-аргинина как субстрата NO-синтазы в клетку симметричным диметиларгинином [4]. Повышение эндогенного активности донора NO системы имеет оксида половую азота при введении специфичность. При внутрижелудочном введении L-аргинина в дозе 200 и 500 мг/кг содержание 96 нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови у крыс-самок выше, чем у самцов. При внутрибрюшинном введении L-аргинина (20 мг/кг) отмечается похожая картина. При внутрижелудочном введении L-аргинина в дозе 100 мг/кг уровень NOх в моче выше у крыс-самок по сравнению с самцами. Следовательно, физиологический эффект L-аргинина у крыс-самок проявляется более интенсивно, чем у самцов. Это свидетельствует также о том, что экспрессия изоформ NO-синтаз в почках имеет половую зависимость [205]. Введение эндогенного экзогенного донора – донора L-аргинина, – хлофузана, как сопровождалось и введение дозозависимым изменением функциональной активности системы оксида азота в организме белых крыс и зависимостью от пола. При введении хлофузана в одинаковых дозах ответная реакция организма на NO-донор у крыс-самок проявлялась ярче, чем у самцов. У самок зависимость уровня NOх от дозы прямая, а у самцов – параболическая. В условиях блокады NOS уровень метаболитов NO в крови у крыс снижается в прямой зависимости от дозы вводимого ингибитора NOS. У самцов более выражен эффект – L-NAME, чем у самок. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови при введении L-NAME в дозе 10 мг/кг и 20 мг/кг наблюдается средняя положительная корреляция у крыссамцов (r=0,40 (р<0,01)). Объем суточного диуреза зависит от продукции NO в организме: чем больше образуется оксида азота, тем интенсивнее диурез. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и объемом суточного диуреза наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,58 (р<0,01) для самок и r=0,57 (р<0,001) для самцов). Эффект субстрата NOS – L-аргинина на суточный диурез более выражен у самцов. Так, при введении L-аргинина в дозе 100 мг/кг объем диуреза у крыс-самцов на 36 % выше, чем у самок (р<0,01), а в дозе 200 мг/кг – на 80 % (р<0,001). Аналогичное повышение суточного диуреза наблюдается при введении экзогенного донора NO – 97 хлофузана. Увеличение метаболитов оксида азота и объема мочи происходит кратковременно, в течение 2-2,5 часов. Предположительно, увеличение объема суточного диуреза связано с действием оксида азота на различные транспортные системы, локализованные в канальцах нефрона, которые регулируют перемещение растворенного вещества и растворителя по нефрону [178]. Полученные данные согласуются с сообщениями других ученых, которые доказывают, что NO непосредственно ингибирует водный транспорт в стенках канальцев нефрона [122, 194]. Снижение суточного диуреза при ингибировании NO-синтаз подтверждает участие NO-зависимых механизмов в регуляции транспорта воды в канальцах нефрона. Полученные данные согласуется с данными других исследователей [43, 149]. Увеличение суточного диуреза не сопровождается увеличением объема потребляемой воды после нагрузки L-аргинином, однако зависит от пола животного. Так, у крыс-самок интактной группы этот показатель выше в 1,43 раза (р<0,05); после введения L-аргинина (100 мг/кг) – в 1,41 раза (р<0,05) по сравнению с самцами. После введения L-аргинина в более высоких дозах (1000 мг/кг) объем потребляемой воды больше в 1,91 раза (р<0,05) у крыс-самцов по сравнению с самками. Введение экзогенного донора – хлофузана в малых дозах повышает объем потребляемой воды, в больших дозах уменьшает. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови (при введении хлофузана) и объемом потребляемой воды наблюдается отрицательная корреляция у крыс-самок (r= -1,0; р<0,05) и высокая положительная корреляция у крыс-самцов (r=1,0; р<0,05). При ингибировании NO-синтаз также выявлено уменьшение потребление воды. Так при введении L-NAME в дозе 20 мг/кг у крыс-самцов объем выпитой в течении суток воды в 1,61 раза (р<0,05) ниже по сравнению с самками. С изменением объема суточного диуреза происходят соответствующие изменения в ионном составе сыворотки крови и мочи. Повышение активности системы NO сопровождается увеличением экскреции ионов натрия, калия. Полученные результаты сопоставляются с данными 98 зарубежных и отечественных ученых, где введение физиологических доноров NO сопровождалось увеличением экскреции воды и натрия [149]. Предположительно это связано с уменьшением реабсорбции воды и натрия, усилением секреции К+ в извитых канальцах нефрона, так как оксид азота влияет на ионный транспорт Na, K-АТФазу, Na/K/2Cl котранспортер (BSC1) и NHE3 [144]. Установлено увеличение экскреции хлоридов в моче при введении L-аргинина в 6,44 раза (р<0,005) и 2,49 раза (р<0,05) у самок и самцов соответственно. При нагрузке с L-NAME происходит снижение хлоридов в крови у самцов в 1,19 раза (р<0,001) и аналогично в моче в 3,09 раза (р<0,05). У крыс-самок таких изменений не выявлено. Экзогенный донор оксида азота хлофузан вызывает снижение концентрации хлоридов в крови и экскрецию хлоридов с мочой. Повышение экскреции хлоридов с мочой при введении субстрата NO-синтаз – L-аргинина, предположительно связано с блокадой транспортных систем для хлоридов в извитых канальцах нефрона. Экзогенный донор оксида азота – хлофузан, работает как ингибитор NOcинтаз, предположительно это связано с активацией депонированного оксида азота в виде S-нитрозотиолов. Установлено, что эндогенный донор L-аргинин увеличивает экскрецию кальция с мочой, когда содержание его в сыворотке крови достоверно не меняется, а экзогенный донор - хлофузан увеличивает содержание кальция в сыворотке крови и имеет тенденцию к увеличению экскреции с мочой. Предположительно это может быть связано с уменьшением активности белков транспортеров в извитых канальцах под воздействием оксида азота. Введение ингибитора оксида азота L-NAME сопровождается увеличением кальция в сыворотке крови и моче. Количество неорганического фосфора в сыворотке крови уменьшается во всех группах при введении доноров и ингибитора оксида азота. Экскреция исследуемого вещества с мочой имеет тенденцию к увеличению при введении L-аргинина у самок и самцов, а при введении хлофузана и L-NAME 99 у самок имеет тенденцию к увеличению, у самцов достоверно уменьшается. Предположительно это связано с изменением транспорта неорганического фосфора в извитых канальцах почек и половыми отличиями в расположении NO-синтаз. Установлено, что оксид азота участвует в процессах фильтрации. Так при введении L-аргинина крысам происходит увеличение у самцов протеинурии, что не наблюдается у самок. Ингибитор синтаз оксида азота достоверно не изменяет содержание общего белка в сыворотке крови, но повышает протеинурию. Полученные результаты можно сопоставлять с данными Кутиной А.В., которая предполагала участие NO в регуляции ультрафильтрации в почечных клубочках, где блокада синтаз оксида азота вызывала протеинурию [13]. Введение экзогенного донора хлофузана сопровождается снижением общего белка в крови у крыс-самок и не влияет на протеинурию. Установлено влияние оксида азота на экскрецию мочевины. При повышении активности системы NO путем введения L-аргинина происходит снижение мочевины в сыворотке крови и достоверно увеличивается экскреция ее с мочой у самок в 3,69 раза (р<0,01), у самцов – в 4,24 раза (р<0,005). Введение экзогенного донора – хлофузана не сопровождается изменением содержания мочевины в крови, но достоверно уменьшает уровень ее в моче у самок и самцов. Ингибирование синтаз оксида азота сопровождается тенденцией снижения мочевины в сыворотке крови и достоверно снижается экскреция с мочой у самцов в 2,81 раза (р<0,01), что не наблюдается у крыс самок. Таким образом, можно предположить, что оксид азота, образуемый с участием NO-синтазы, влияет на транспортные системы мочевины (UT)-A и UT-B в извитых канальцах. Тем не менее некоторые исследователи в своих опытах, проведенных с использованием L-аргинина на кроликах, не обнаруживают существенного влияния на концентрацию мочевины в сыворотки крови [78]. 100 Оксид азота влияет на экскрецию креатинина с мочой, однако, H. Mohammad и соавторы в своих экспериментах на кроликах при введении донора оксида азота L-аргинина не наблюдают существенного влияния на креатинин сыворотки крови [78]. При повышении активности системы оксида азота путем введения L-аргинина происходит увеличение креатинина в сыворотке крови и увеличение его экскреции с мочой. Cнижение активности системы NO при введении – L-NAME сопровождается уменьшением экскреции креатинина с мочой. Введение экзогенного донора оксида азота – хлофузана уменьшает количество креатинина в сыворотке крови и экскрецию его с мочой. Предположительно, снижение креатинина в моче связано с уменьшением экспрессии оксида азота после ингибирования NO-синтаз. Введение донора оксида азота L-аргинина сопровождается тенденцией к снижению скорости клубочковой фильтрации у самок, а у самцов - к увеличению, что может быть связано с половыми отличиями в расположении изоформ NO синтаз в почках [205]. Это доказывает еще тот факт, что общая активность системы оксида азота в организме у самок намного выше, чем у самцов [214, 145, 167]. После введения хлофузана скорость клубочковой фильтрации по креатинину снижается у самок в 2,19 раза (р<0,05), у самцов наблюдается тенденция к снижению. Предположительно, это может быть связано с увеличением оксида азота в организме, который влияет на тонус афферентных и эфферентных сосудов в почках. Ингибирование синтаз оксида азота сопровождается тенденцией к снижению CКФ. Установлено снижение реабсорбции воды при введении L-аргинина. При введении экзогенного донора – хлофузана наблюдается тенденция к снижению реабсорбции, а при ингибировании синтаз оксида азота увеличивается у самцов на 0,22 % (р<0,005), у самок имеет тенденцию к увеличению. Это доказывает участие оксида азота в процессах реабсорбции воды в извитых канальцах нефрона. 101 Ранее установленное участие системы оксида азота в гидроуретических и ионоуретических функциях, а также в почечных процессах фильтрации, реабсорбции, секреции привели к изучению этих процессов в экспериментальных нефропатиях. Нагрузка донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз производили у крыс-самок, так как выраженность их эффектов в организме самок более высокая, по сравнению с самцами. При патологических процессах, протекающих на фоне гипоксии или ишемии, активность NO-синтазного механизма может снижаться и повышаться [8]. Установлено, что активность системы оксида азота меняется при экспериментальной острой почечной недостаточности, так содержание NOХ в крови увеличивается в 1,37 раза (р=0,01), а в моче снижается в 1,57 раза (р=0,01) по сравнению с интактной группой. Введение эндогенного донора и экзогенного донора оксида азота приводит к повышению активности системы оксида азота. Гидроуретическая и ионоуретическая функция почек при ОПН меняется после введения доноров оксида азота. Выявлено увеличение суточного диуреза при введении доноров оксида азота и уменьшение экскреции натрия в 2,43 раза и в 5,10 раза (р=0,05) по сравнению с контрольной группой, что достоверно не отличается от значений интактных крыс. Установлено увеличение экскреции ионов калия при поступлении доноров оксида азота, а также тенденция к увеличению экскреции кальция, фосфора, тенденция к снижению экскреции ионов хлора. Экспериментальная острая почечная недостаточность, вызванная глицерином, также сопровождается увеличением содержания мочевины в крови 13,35 раза (р<0,0001) и уменьшением экскреции с мочой в 3,25 раза (р=0,05). Лечение с применением L-аргинина сопровождается снижением мочевины в крови в 1,41 раза (р=0,05) и увеличением экскреции с мочой 8,80 раза (р=0,01), а лечение хлофузаном сопровождается тенденцией к снижению мочевины в крови и достоверным увеличением экскреции с мочой в 8,37 раза (р=0,005). Экспериментальная почечная недостаточность сопровождается увеличением 102 креатинина в плазме крови в 13,90 раза (р<0,001) и снижением экскреции с мочой в 3,25 раза (р=0,05). Лечение с применением L-аргинина сопровождается снижением креатинина в крови в 2,86 раза (р=0,01) и тенденцией к увеличению секреции с мочой, аналогичный процесс происходит при лечении хлофузаном. Скорость клубочковой фильтрации и канальцевая реабсорбция воды при ОПН снижается. Снижение скорости клубочковой фильтрации менее выражено при лечении L-аргинином, где отмечается тенденция к увеличению скорости клубочковой фильтрации по сравнению с контрольной группой. Канальцевая реабсорбция воды при лечении L-аргинином повышается на 35,53 % (р=0,05), а при лечении хлофузаном отмечается лишь тенденция к увеличению, по сравнению с контрольной группой. Таким образом, активация системы оксида азота путем введения доноров снижает нефротоксичность, интраренальную вазоконстрикцию и ишемию почечной ткани в модели острой почечной недостаточности. Итоги выполненного исследования 1. Система оксида азота видоспецифична: уровень нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови крыс составляет 33…35 мкмоль/л, у овец 34…39 мкмоль/л, у кошек 47…77 мкмоль/л, у кроликов 51…87 мкмоль/л, у крупного рогатого скота 70…73 мкмоль/л. Уровень нитрат- и нитрит-анионов в моче крыс составляет 65…69 мкмоль/л, кошек 29…48 мкмоль/л, овец 77…93 мкмоль/л, кроликов 77…104 мкмоль/л. 2. Активность системы оксида азота и физиологические эффекты доноров NO и ингибитора его синтаз зависят от пола животного. В организме самок крыс, кошек, коров, овец уровень метаболитов NO выше, чем в организме самцов. В организме кроликов активность системы NO выше у самцов, чем у самок. 3. Концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови и моче зависит от дозы и путей введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз. Зависимость концентрации нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче при 103 внутрижелудочном введении доноров NO и ингибитора его синтаз, а также при внутрибрюшинном введении в крови – параболическая, а в моче при внутрибрюшинном введении – прямолинейная. 4.1. Физиологический эффект L-аргинина как эндогенного донора оксида азота в максимально эффективной дозе (200 мг/кг) более выражен у самок. Концентрация метаболитов оксида азота в организме при этом повышается в 3,16 раза (р<0,01), а организме самцов - в 2,0 раза (р<0,001) по сравнению с исходным уровнем. 4.2. Максимально эффективной дозой хлофузана для самок является – 2 мг/кг (уровень метаболитов NO увеличивается в 1,98 раза; р<0,001), для самцов – 1 мг/кг (уровень метаболитов NO увеличивается в 2,03 раза; p<0,001). 4.3. Физиологический эффект L-NAME как блокатора NOS (20 мг/кг) более выражен у самцов. Концентрация метаболитов оксида азота в организме при этом снижается у крыс-самцов в 3,22 раза (р<0,05), а у самок – в 1,93 раза (р<0,05). 5. Содержание нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови положительно коррелирует с объемом суточного диуреза (r=0,58; р<0,01). При нагрузке эндогенным донором оксида азота в дозе 200 мг/кг интенсивность повышения суточного диуреза выше у самцов (в 3,34 раза; р<0,001) относительно интактной группы), а при нагрузке экзогенным донором – у самок (увеличение в 5,16 раза; р<0,001). 6.1. Повышение экскреции натрия, калия, хлоридов, кальция и фосфора при введении L-аргинина в организме самок положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в моче. В организме самцов-крыс повышение экскреции натрия и фосфора положительно коррелирует с концентрацией метаболитов NO в моче, а интенсивность экскреции хлора и кальция – отрицательно. Интенсивность выделения кальция с мочой выше у крыс-самцов в 3,38 раза (р<0,001) по сравнению с самками. 6.2. Нагрузка экзогенным донором оксида азота приводит к снижению экскреции ионов хлора с мочой у самцов в 5,33 раза (р<0,05), у самок – в 104 9,33 раза соответственно и снижению экскреции ионов фосфора у самцов в 5,00 раз (р<0,05) через сутки после введения. 7. Канальцевая реабсорбция воды при введении доноров оксида азота снижается. Реабсорбция воды при введении эндогенного донора оксида азота – L-аргинина ниже у самцов, а при введении экзогенного донора (хлофузана) – у самок. Концентрация мочевины в моче увеличивается при нагрузке эндогенным донором NO и этот эффект более выражен у самцов. 8. В модели острой почечной недостаточности введение доноров оксида азота восстанавливает секрецию мочевины, экскрецию ионов хлора, натрия и реабсорбция воды. Восстановление экскреции мочевины и креатинина с мочой, а также реабсорбции воды происходит более эффективно при введении эндогенного донора – L-аргинина, а восстановление экскреции ионов с мочой, при введении экзогенного донора – хлофузана. Рекомендации учебному и практическому процессу 1. При изучении системы оксида азота у разных видов животных необходимо учитывать половую и видовую специфичность влияния доноров и ингибиторов оксида азота и других факторов, изменяющих состояние этой системы. 2. Результаты исследований рекомендуется использовать при анализе патофизиологических процессов нефропатий, а также при дозировании препаратов, являющихся NO-донорами и применяемых для лечения различных заболеваний. 3. Теоретические и практические результаты диссертации рекомендуются использовать в учебном процессе в профильных ВУЗах и факультетах повышения квалификации специалистов, а также при написании учебных пособий по физиологии, терапии, диагностики сельскохозяйственных и домашних животных. 4. Доноры NO могут применятся как лечебные средства при острой почечной недостаточности. 105 Перспективы дальнейшей разработки темы заключается в том, что полученные нами результаты являются основой для изучения влияния оксида азота и доноров NO на различные физиологические и патофизиологические процессы в организме и в частности почках у разных видов животных в клинической практике. 106 Список cокращений АДМА – асимметричный диметиларгинин ОТ ПЦР – Обратная транскрипция полимеразной цепной реакции СКФ – скорость клубочковой фильтрации цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат ЮГА – юкстагломерулярный аппарат EDRF – эндотелий-зависимый релаксирующий фактор eNOS – эндотелиальная NO-синтаза ENaC – эпителиальные натриевые каналы iNOS – индуцибельная NO-синтаза L-NAME – N-нитро-L-аргининметиловый эфир NMDA-рецепторы – N-метил-D-аспартат-рецепторы nNOS – нейрональная NO-синтаза NO – оксид азота (II) NHE – Na / H обменник TSC – Na+, Cl--котранспортеры TGF (ТОС) – тубулогломерулярная обратная связь 107 Список литературы 1. Бабушкина А.В. L-аргинин с точки зрения доказательной медицины // Украинский медицинский журнал. – 2009. – №6 (74). – С. 43-48. 2. Башкатова В.Г., Микоян В.Д., Косачев Е.С. Оксид азота и его свойства // Нейрохимия. – 1996. – Т. 13, № 2. – С. 115-120. 3. Веремей И.С., Солодков А.П. Восстановление NO3 в NO2 цинковой пылью в присутствии аммиачного комплекса сульфата меди// Сборник научных трудов. Витебск, - 1999. – С. 274-277. 4. Гилинский М.А., Брусенцев Е.Ю. Эндогенная регуляция биодоступности оксида азота. Клинические корреляты и подходы к анализу // Бюллетень Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук: научнотеоретический журнал. – 2007. – № 3. – С. 109-115. 5. Гогин Е.Е. Гипертоническая болезнь // М.: Медицина. – 1997. – 399 с. 6. Гуревич К.Г., Шимановский H.JI. Оксид азота: биосинтез, механизмы действия, функции // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. – 2000. – № 4. – С. 16-22. 7. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика // Новосибирск: Издательство Новосибирского университета. – 2002. – C. 459. 8. Зенков Н.К., МеньщиковаЕ.Б., Реутов В.П. NO-синтазы в норме и при патологии различного генеза // Вестник РАМН. – 2000. – № 4. – С. 30-34. 9. Каримова Р.Г., Гарипов Т.В. Нитроксидергическая система: влияние соединений фуроксанового ряда // Ветеринарная медицина домашних животных. Сборник статей. – Казань, 2009. – С. 85-88. 10.Каримова Р.Г. Содержание оксида азота и нитрозотиолов в крови крыс под влиянием замещенного бензодифуразана // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2009. – № 2 (25). – С. 231. 11.Каримова Р.Г., Гарипов Т.В. Полезный приспособительный эффект нитроксидергической системы // Известия Самарской сельскохозяйственной академии. – 2011. – № 1. – С. 42 - 46. 108 12.Кутина А.В., Захаров В.В., Наточин Ю.В. Экскреция белка почкой крыс при разных типах диуреза//Бюл. экспер. биол. – 2008. – Т. 146, №12. – С. 613-616. 13.Кутина А.В., Шахматова Е.И., Наточин Ю.В. Влияние блокатора продукции оксида азота на экскрецию альбумина почкой крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 150, № 12. – С. 634-636. 14.Кутырина И.М. Современные аспекты патогенеза почечной артериальной гипертонии// Нефрология. – 2000. – Т. 4, № 1. – С. 112-115. 15.Лунгина О.Г., Островский М.А., Каламкаров Г.Р. Действие оксида азота на ответы фоторецепторных клеток сетчатки лягушки // Сенсорные системы. – 2002. – Т. 16, № 2. – С. 116-120. 16.Марков Х.М. Окись азота в физиологии и патологии почек // Вестник РАМН. – 1996. – № 7. – С. 73-78. 17.Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Стресс-лимитирующая система оксида азота //Росс.физиол. журнал. – 2000. – Т. 86, № 10. – С. 1283-1292. 18.Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П.Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия. – 2000. – Т.65, № 4. – С. 485-503. 19.Направленный синтез химических соединений – основной путь создания новых лекарственных средств / Гарипов Т.В., Каримова Р.Г., Ишкаева Д.Р., Шиндала М.К., Кленков М.Ю. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. – 2003. – Т.177. – С.27-33. 20.Оксид азота и его свойства / В.Г.Башкатова, В.Д. Микоян, Е.С.Косачев// Нейрохимия. – 1996. – Т. 13, № 2. – С. 115–120. 21.Рецкий М.И., Близнецова Г.Н. Методические рекомендации по определению стабильных метаболитов оксида азота в плазме (сыворотке) крови // Москва. Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. РАСХН. – 2007. – С. 119-123. 109 22.Савин А.В. Методы измерения ионных токов // Нижний Новгород.– 1998. 23.Салей А.П., Рецкий М.И. Роль оксида азота в формировании мотивационного поведения и обучения // Вестник ВГУ. Серия: химия, биология, фармация. – 2003. – № 1. – С. 75-80. 24.Современные методы моделирования оксалатного нефролитиаза / А.Ю. Жариков., В.М.Брюханов, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов // Нефрология. – 2008. – Т. 12, № 4. – С. 28-35. 25.Сомова Л.М., Плехова Н.Г. Оксид азота как медиатор воспаления // Вестник ДВО РАН. – 2006. – № 6. – С. 7-80. 26.Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник // Соровский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. – С. 27-34. 27.Солодков А.П., Веремей И.С. Фотометрический метод определения нитратов и нитритов в биологических жидкостях // Сборник научных трудов. Витебск, - 1999. – С. 274-277. 28.ЦыгинА.Н. Артериальная гипертензия и функциональные нарушения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом и пиелонефритом // Нефрология и диализ. – 2001. – № 2. – С. 239-241. 29.Эндотелий функция и дисфункция / З.А. Лупинская, А. Г. Зарифьян, Т. Ц. Гурович, С.Г. Шлейфер // Кыргызско-Российский Славянский Университет. – 2008. – С. 34-62. 30.Энциклопедия клинических лабораторных тестов / под редакцией Н.У. Тица // М.: Издательство Лабинформ. – 1997. – С. 845. 31.Adamczak M., Ritz E. Role of glomerular pressure in progression in Seldin and Giebisch's The kidney. Physiology and Pathophysiology. Fourth edition // Amsterdam. – 2008. – V.2. – P. 2537. 32.Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus / V. Vallon,J. Schroth,J. Satriano, R.C. Blantz,S.C. Thomson,T. Rieg // Nephron Physiol. – 2009. – V. 111(3). – P. 30-38. 110 33.Aldosterone-induced increases in superoxide production counters nitric oxide inhibition of epithelial Na channel activity in A6 distal nephron cells / L.Yu, H.F. Bao, J.L. Sellf, D.C. Eaton, M. Helmy// Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2007. – V. 293. – P. 1666–1677. 34.Ammonium transport in the kidney: new physiological concepts and their clinical implications/ T.D. DuBose, D.W. Good, L.L. Hamm, S.M. Wall // J. Am. Soc. Nephrol. – 1991. – V. 1. – P. 1193-1203. 35.Anggаrd E. Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine // Lancet. – 1994. – V.343. – P. 1199–1206. 36.An economy of water in renal function referable to urea / J.L. Gamble, C.M. McKhann, A.M. Butler, E. Tuthill // Am. J. Physiol. – 1934. – V. 109. – P. 139-154. 37.Antibody blockade of TNF-alpha reduces inflammation and scarring in experimental crescentic glomerulonephritis / S.B. Khan, H.T. Cook, G. Bhangal, J. Smith, F.W. Tam, C.D. Pusey // Kidney Int. – 2005. – V. 67. – P. 1812–1820. 38.Aiello S., Remuzzi G., Noris N. Nitric oxideendothelin balance after nephron reduction // Kidney Int. – 1998. – V. 53 (65). – Р. 63-67. 39.Ai-Ping Z., Allen W. Nitric Oxide in Renal Cortex and Medulla // Hypertension. – 1997. – V. 29. – P. 194-198. 40.Babior B.M. NADPH oxidase: an update // Blood. – 1999. – V. 93. – P. 1464– 1476. 41.Bachman S., Bosse H. M., Mundel P. Topography of nitric oxide synthesis by localizing constitutive NO synthases in mammalian kidney // Am. J. Physiol. – 1995. – V. 268. – P. 885–898. 42.Bachmann S., Mundel P. Nitric oxide in the kidney: Synthesis, localization, and function // Am. J. Kidney Dis. – 1994. – V. 24. – P. 112–129. 43.Baer P.G., Navar L.G., Guyton A.C. Renal autoregulation, filtration rate, and electrolyte excretion during vasodilatation // Am. J. Physiol. – 1970. – V. 219. – P. 619-625. 111 44.Bagnasco S.M. Gene structure of urea transporters // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2003. – V. 284. – P. 3–10. 45.Barnett, R.N., Skodon, S.B., Goldberg, M.H. Performance of kits used for clinical analysis of calcium in serum // Am. J. Clin. Path. – 1973. – V. 59. – P. 836–843. 46.Baylis C., Harvey J., Engels K. Acute nitric oxide blockade amplifies the renal vasoconstrictor actions of angiotension II // J. Am. Soc. Nephrol. – 1994. – V. 5. – P. 211-214. 47.Baylis C., Bloch J. Nitric oxide in renal physiology and pathophysiology // Nephrol. Dial. Transplant. – 1996. – V. 11. – P. 1955-1957. 48.Baylis C., Mitruka B., Deng A. Chronic blockade of nitric oxide synthesis in the rat produces systemic hypertension and glomerular damage // J. Clin. Invest. – 1992. – V. 90. – P. 278-281. 49.Basolateral Na + /H + exchange maintains potassium secretion during diminished sodium transport in the rabbit cortical collecting duct/ S.Muto,S. Tsuruoka,Y. Miyata,A. Fujimura,E. Kusano,W. Wang, D.Seldin, G.Giebisch // Kidney Int. – 2009. – V. 75. – P. 25–30. 50.Beierwaltes W.H. Selective neuronal nitric oxide synthase inhibition blocks furosemide-stimulated renin secretion in vivo // Am. J. Physiol. Renal Fluid Electrolyte Physiol. – 1995. – V. 269. – P. 134-139. 51.Beierwaltes W.H. Macula densa stimulation of renin is reversed by selective inhibition of neuronal nitric oxide synthase // Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. – 1997. – V. 272. – P. 1359-1364. 52.Beierwaltes W.H. cGMP stimulates renin secretion in vivo by inhibiting phosphodiesterase-3 // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2006. – V. 290. – P. 1376-1381. 53.Beierwaltes W.H.,Carretero O.A.Nonprostanoid endothelium- derived factors inhibit renin release // Hypertension. – 1992. – V. 19. (SupplII). – P. II68– II73. 112 54.Biondi M.L.,RomeroJ. C.Nitric oxide-mediated reactions stimulate cyclic GMP levels in the dog kidney // J. Vasc. Med. Biol. – 1990. – V. 2. – P. 294298. 55.Blake-Palmer K.G., Karet F.E. Cellular physiology of the renal H+ATPase // Curr.Opin.NephrolHypertens. – 2009. – V. 18. – P. 433–438. 56.Blockade of pressure natriuresis induced by inhibition of synthesis of nitric oxide in dogs / M.G. Salom, V. Lahera, F. Miranda-Guardiola, J.C. Romero // Am. J. Physiol. – 1992. – V. 262. – P. 718-722. 57.Bredt D.S. Nitric Oxide in the Nervous System // Ed. by Vincent S. - N.Y.: Academic Press, – 1995. – P. 1-21. 58.Bryan N.S., Bian K., Murad F. Discovery of the nitric oxide signaling pathway and targets for drug development // Frontiers in Bioscience. – 2009. – V. 14. – P. 1–18. 59.Cardiac glycoside downregulates NHE3 activity and expression in LLC-PK1 cells / S.Oweis,L.Wu,P.R. Kiela,H. Zhao, D.Malhotra,F.K. Ghishan,Z. Xie,J.I. Shapiro, J. Liu // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2006. – V. 290. – P. 9971008. 60.Changes in NOS activity and protein expression during acute and prolonged ANG II administration / C. Moreno, A. Lopez, M.T. Llinas, F. Rodriguez, A. Lopez-Farre, E. Nava, F.J. Salazar // Am. J. Physiol. RegulIntegr. Comp. Physiol. – 2002. – V. 282. – P31-37. 61.Chiu T., Reid I.A. Role of cyclic GMP-inhibitablephosphodiesterase and nitric oxide in the beta adrenoreceptor control of renin secretion // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1996. – V. 278. – P. 793–799. 62.Christian D., Arnfried U.K., Markus P.S. The role of nitric oxide in the regulation of glomerular haemodynamics in humans // Handrock. Nephrol. Dial Transplant. – 2004. – V. 19. – P. 1392–1397. 63.Codina J.,Dubose T.D. Molecular regulation and physiology of the H+,K+ATPases in kidney // Semin. Nephrol. – 2006. – V. 26. – P. 345–351. 113 64.Collecting duct-derived endothelin regulates arterial pressure and Na excretion via nitric oxide / M.P. Schneider, Y. Ge, D.M. Pollock, J.S. Pollock, D.E. Kohan // Hypertension. – 2008. – V. 51. – P. 1605-1610. 65.Control of renin secretion from rat juxtaglomerular cells by cAMP-specific phosphodiesterases / U.G. Friis, B.L. Jensen, S. Sethi, D.Andreasen, P.B. Hansen, O.Skott // Circ. Res. – 2002. – V. 90. – P. 996–1003. 66.Coordinate regulation of renal expression of nitric oxide synthase, renin, and angiotensinogen mRNA by dietary salt / I. Singh, M. Grams, W.H. Wang, T. Yang, P. Killen, A. Smart, J. Schnermann, J.P. Briggs// Am. J. Physiol. – 1996. – V. 270. – P. 1027-1037. 67.De Nicola L.,BlantzR.C., GabbaiF.B.Nitric oxide and angiotensin II // J. Clin. Invest. – 1992. – V. 89. – P. 1248–1256. 68.Dietary K + regulates apical membrane expression of maxi-K channels in rabbit cortical collecting duct / F.Najjar,H. Zhou,T. Morimoto,J.B. Bruns, H.S.Li,W. Liu,T.R. Kleyman,L.M. Satlin // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2005. – V. 289. – P. 922-932. 69.Dickhout J.G., Mori T., Cowley A.W. Tubulovascular nitric oxide crosstalk: buffering of angiotensin II-induced medullary vasoconstriction // Circ. Res. – 2002. – V. 91. – P. 487–493. 70.Differential expression and induction of mRNAs encoding two inducible nitric oxide synthases in rat kidney / M.G. Mohaupt, J.L. Elzie, K.Y. Ahn, W.L. Clapp, C.S. Wilcox, B.C. Kone // Kidney Int. – 1994. – V. 46. – P. 653–665. 71.Dousa T.P. Cyclic-3′,5′-nucleotide phosphodiesteraseisozymes in cell biology and pathophysiology of the kidney // Kidney Int. – 1999. – V. 55. – P. 29–62. 72.Endothelial nitric oxide synthase protein is reduced in the renal medulla of two-kidney, one-clip hypertensive rats / A. Wickman, I.J. Andersson,J. Jia, L. Hedin, G. Bergstrom // J. Hypertens. – 2001. – V. 19. – P. 1665-1673. 73.Endothelium-derived NO stimulates pressure-dependent renin release in conscious dogs / P.B. Persson, J.E. Baumann, H. Ehmke, E. Hackenthal, H.R. 114 Kirchheim, B. Nafz // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte. Physiol. – 1993. – V. 264. – P. 943-947. 74.Edwards R.M., Trizna W. Modulation of glomerular arteriolar tone by nitric oxide synthase inhibitors // J. Am. Soc. Nephrol. – 1993. – V. 4. – P. 1127– 1132. 75.Effect of aldosterone on BK channel expression in mammalian cortical collecting duct / G.Estilo, W.Liu, N.Pastor-Soler, P.Mitchell, M.D.Carattino, T.R.Kleyman,L.M. Satlin // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2008. – V. 295. – P. 780-788. 76.Effects of endothelins on renin secretion from isolated mouse renaljuxtaglomerular cells / T. Ritthaler, H. Scholz, M. Ackermann, G.Riegger, A. Kurtz, B.K. Kramer // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1995. – V. 268. – P. 39-45. 77.Effects of barium and 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride on proximal tubule ammonia transport/ E.E. Simon, C. Merli, J. Herndon, E.J. Cragoe, L.L. Hamm // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1992. – V. 262. – P. 36-39. 78.Effect of L-arginine therapy on plasma NO2 and NO3 levels, and blood pressure in uremic rabbits / H. Mohammad, A.K. Khemomal, I. Muhammad, R. Mona, K. Nusratullah, K. Haresh, A.W. Shaheena, // J. Ayub. Med. Coll. Abbottabad. – 2011. – V. 23(2) 79.Effects of NG-monomethyl-L-arginine and L-arginine on acetylcholine renal response / V.Lahera,M.G. Salom,M.J. Fiksen-Olsen, L.Raij, J.C. Romero // Hypertension. – 1990. – V. 15. – P. 659–663. 80.Effects of enalapril and eprosartan on the renal vascular nitric oxide system in human essential hypertension / C. Delles, J. Jacobi, S. John, I. Fleischmann, R.E. Schmieder // Kidney Int. – 2002. – V. 61. – P. 1462–1468. 81.Effect of nitric oxide synthase inhibition on renal hemodynamics in humans: reversal by L-arginine / M. Wolzt [et al.] // Am. J. Physiol. – 1997. – V. 272. – P. 178-182. 115 82.Effects of NG-nitro-L-arginine methyl ester on renal function and blood pressure / V.Lahera, M.G. Salom, F. Miranda-Guardiola, S. Moncada, J.C. Romero // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1991. – V. 261. – P. 1033-1037. 83.Effect of nitric oxide on renin secretion. II. Studies in the perfused juxtaglomerular apparatus / X-R. He, S.G. Greenberg, J.P. Briggs, J.B. Schnermann // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1995. – V. 268. – P. 953-959. 84.Effect of Nitric Oxide Synthase Inhibition on Proteinuria in Glomerular Immune Injury / К.D. Prasun, S. Mukut, PuDuann, A.L. Elias // Exp. Biol. Med. – 2006. – V. 231. – P. 576-584. 85.Evidence for the presence of smooth muscle α-actin within pericytes of the renal medulla / F.Park, D.L. Mattson, L.A. Roberts, A.W. Cowley // Am. J. Physiol. – 1997. – V. 273. – P. 1742-1748. 86.Evidence for a difference in nitric oxide biosynthesis between healthy women and men / P. Forte, B.J. Kneale, E. Milne, P.J. Chowienczyk, A. Johnston, N. Benjamin, J.M. Ritter // Hypertension. – 1998. – V. 32. – P. 730-734. 87.Exogenous cGMP prevents decrease in diuresis and natriuresis induced by inhibition of NO synthesis / V. Lahera, J. Navarro, M.L. Biondi, L.M. Ruilope, J.C. Romero // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1993. – V. 264. – P. 344-347. 88.Expression of endothelial nitric oxide synthase in developing rat kidney / K.H.Han, J.M. Lim, W.Y. Kim, H. Kim, K.M. Madsen, J. Kim // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2005. – V. 288. – P. 694-702. 89.Expression of endothelial nitric oxide synthase in the postnatal developing porcine kidney / M.J. Solhaug, U. Kullaprawithaya, X.Q. Dong, K.W. Dong // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2001. – V. 280. – P. 12691275. 116 90.Expression of NHE-3 in the apical membrane of rat renal proximal tubule and thick ascending limb / M. Amemiya, J.Loffing, M.Lotscher, B.Kaissling, R.J.Alpern, O.W. Moe // Kidney Int. – 1995. – V. 48. – P. 1206-1215. 91.Expression of nitric oxide synthase in kidney macula densa cells / P.Mundel, S. Bachmann, M. Bader, A. Fischer, W. Kummer, B. Mayer, W. Kriz // Kidney Int. – 1992. – V. 42. – P. 1017-1019. 92.Fenton R.A. Urea transporters and renal function: lessons from knockout mice // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2008. – V. 17. – P. 513-518. 93.Flow-dependent K + secretion in the cortical collecting duct is mediated by a maxi-K channel / C.B. Woda, A. Bragin, T.R. Kleyman, L.M. Satlin // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2001. – V. 280. – P. 786-793. 94.Foster J.M., Carmines P.K., Pollock J.S.PP2B-dependent NO production in the medullary thick ascending limb during diabetes // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2009. – V. 297. – P. 471-480. 95.Furchgott R.F., Zawadzki J.W. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of vascular smooth muscle by acetylcholine // Nature. – 1980. – V. 286. – Р. 373-376. 96.Gabbai F.B., Blantz R.C. Role of nitric oxide in renal hemodynamics // Semin. Nephrol. – 1999. – V. 19. – P. 242-250. 97.Garvin J.L., Herrera M., Ortiz P.A. Regulation of renal NaCl transport by nitric oxide, endothelin, and ATP: clinical implications // Annu. Rev. Physiol. – 2011. – V. 73. – P. 359–376. 98.Gender-related differences in advanced glycationendproducts, oxidative stress markers and nitric oxide synthases in rats / X.Wang, K. Desai, B.H. Juurlink, J. Champlain, L. Wu // Kidney Int. – 2006. – V. 69. – P. 281-287. 99.Giebisch G. Renal potassium transport: mechanisms and regulation // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 1998. – V. 274. – P. 817-833. 100. Glomerular and tubular interactions between renal adrenergic activity and nitric oxide / F.B. Gabbai [et al.] // Am. J. Physiol. – 1995. – V. 268. – P. 1004-1008. 117 101. Good D.W. The thick ascending limb as a site of renal bicarbonate reabsorption// Semin. Nephrol. – 1993. – V. 13. – P. 225-235. 102. Good D.W. Hyperosmolality inhibits bicarbonate absorption in rat medullary thick ascending limb via a protein-tyrosine kinase-dependent pathway // J. Biol. Chem. – 1995. – V. 270. – P. 9883 - 9889. 103. Good D.W., Watts B.A. Functional roles of apical membrane Na / H exchange in rat medullary thick ascending limb // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1996. – V. 270. – P. 691 - 699. 104. Greger R., Velazquez H.The cortical thick ascending limb and early distal convoluted tubule in the urinary concentrating mechanism // Kidney Int. – 1987. – V. 31. – P. 590 - 596. 105. Greger R.,Schlatter E.Properties of the basolateral membrane of the cortical thick ascending limb of Henle’s loop of rabbit kidney. A model for secondary active chloride transport // Pflugers Arch. – 1983. – V. 396. – P. 325 - 334. 106. Griffin K.A., Picken M., Bidani A.K. Radiotelemetric BP monitoring, antihypertensives and glomeruloprotection in remnant kidney model // Kidney Int. – 1994. – V. 46. – P. 1010 - 1018. 107. Gustavo R. A., Ortiz P.A. Constitutive endocytosis and recycling of NKCC2 in rat thick ascending Limbs // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2010. – V. 299. – P. 1193-1202. 108. Hebert S.C., Andreoli T.E. Control of NaCl transport in the thick ascending limb // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1984. – V. 246. – P. 745-756. 109. Hedrich R., SchroederJ.I., Fernandez J.M. Patch-clamp studies on higher plant cells a perspective // Trends. biochemistry science. – 1987. – V. 12. – P. 49-52. 110. Herrera M., Silva G., Garvin J.L. Ahigh-salt diet dissociates NO synthase-3 expression and NO production by the THAL // Hypertension. – 2006. – V. 47. – P. 95-101. 118 111. High-salt diet increases sensitivity to NO and eNOS expression but not NO production in THALs / P.А. Ortiz, B.A. Stoos, N.J. Hong, D.M. Boesch, C.F. Plato, J.L. Garvin // Hypertension. – 2003. – V. 41. – P. 682-687. 112. Huang D.Y., Osswald H., Vallon V. Sodium reabsorption in thick ascending limb of Henle’s loop: effect of potassium channel blockade in vivo // Br. J. Pharmacol. – 2000. – V. 130. – P. 1255–1262. 113. Immunocytochemical localization of distinct isoforms of nitric oxide synthase in the juxtaglomerular apparatus of normal rat kidney / A. Toji, S.S. Gross, L. Zhang, C.C. Tisher, H.W. Schmidt, C.S. Wilcox, K. Madsen // J. Am. Soc. Nephrol. – 1994. – V. 4. – P. 1438–1447. 114. Impact of NOsynthase inhibition on renal hemodynamics in normotensive and hypertensive subjects / J. Jacobi, M.P. Schneider, S. John, R.E. Schmieder// J. Hypertens. – 2002. – V. 20. – P. 525-530. 115. Impact of surgery on nitric oxide in rats: evidence for activation of inducible nitric oxide synthase / G. Losonczy, J.F. Bloch, L. Samsell, M. Schoenl, R. Venuto, C. Baylis // Kidney Int. – 1997. – V. 51. – P. 1943–1949. 116. Inducible nitric oxide synthase and blood pressure / D.L. Mattson, C. Maeda, T. Bachman, A. W. Cowley // Hypertension. – 1998. – V. 31. – P. 1520. 117. Inhibition of purified (Na+,K+)-ATPase activity from porcine cerebral cortex by NO generating drugs / T. Sato, Y.Kamata, M. Irifune, T. Nishikawa // Brain Res. – 1995. – V. 704. – P. 117–120. 118. Increased activity and expression of Ca (2+)-dependent NOS in renal cortex of ANG II-infused hypertensive rats / S.Y. Chin, K.N. Pandey, S.J. Shi, H. Kobori, C. Moreno, L.G. Navar // Am. J. Physiol. – 1999. – V. 277. – P. 797804. 119. Increased intracellular pH at the macula densa activates nNOS during tubuloglomerular feedback / R. Liu, O.A. Carretero, Y. Ren, J.L. Garvin // Kidney Int. – 2004. – V. 67. – P. 1837-1843. 119 120. In situ hybridization localization of mRNA encoding inducible nitric oxide synthase in rat kidney / K. Y.Ahn,M. G.Mohaupt, K.М. Madsen, B. C.Kone // Am. J. Physiol. – 1994. – V. 267. – P. 748-757. 121. Interactive control of renal function by alpha 2-adrenergic system and nitric oxide: role of angiotensin II / V. Vallon, O.W. Peterson, F.B. Gabbai, R.C. Blantz, S.C.Thomson // J. Cardiovasc. Pharmacol. – 1995. – V. 26. – P. 916922. 122. Intrarenal nitric oxide activity and pressure natriuresis in anesthetized dogs / D.S. Majid, S.A. Omoro, S.Y. Chin, L.G. Navar // Hypertension. – 1998. – V. 32 – P. 266–272. 123. Ito S., Johnson C.S., Carretero O.A. Modulation of angiotensin II-induced vasoconstriction by endothelium-derived relaxing factor in the isolated microperfused rabbit afferent arteriole // J. Clin. Invest. – 1991. – V. 87. – P. 1656–1663. 124. Ito S., Ren Y. Evidence for the role of nitric oxide in macula densa control of glomerular hemodynamics // J. Clin. Invest. – 1993. – V. 92. – P. 1093– 1098. 125. Jennifer L., Steven C. BK channels in the kidney: role in K+ secretion and localization of molecular components // Am. J. Physiol. – 2006. – V. 291. – P. 517-529. 126. Johnson R.A., Freeman R.H. Renin release in rats during blockade of nitric oxide synthesis // Am. J. Physiol. – 1994. – V. 266. – P. 1723-1729. 127. Kakoki M., Zou A.P., Mattson D.L. The influence of nitric oxide synthase 1 on blood flow and interstitial nitric oxide in the kidney // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2001. – V. 281. – P. 91-97. 128. Kone B.C., Baylis C. Biosynthesis and homeostatic roles of nitric oxide in the normal kidney//Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 1997. – V. 272. – P. 561578. 129. Kopkan L.,Сervenka L. Renal Interactions of Renin-Angiotensin System, Nitric Oxide and Superoxide Anion: Implications in the Pathophysiology of 120 Salt- Sensitivity and Hypertension // Physiol. Res. – 2009. – V. 58 (Suppl. 2). – P. 55-67. 130. L-arginine infusion decreases plasma total homocysteine concentrations through increased nitric oxide production and decreased oxidative status in Type II diabetic patients / C. Faldetta [et al.] // Diabetologia. – 2002. – V. 45. – P. 1120-1127. 131. L-arginine supplementation in peripheral arterial disease: no benefit and possible harm / A.M. Wilson [et al.] // Circulation. – 2007. – V. 116. – P. 188 - 195. 132. Levin E.J., Quick M., Zhou M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter// Nature. – 2009. – V. 462. – P. 757–761. 133. Leyssac P.P., Holstein-Rathlou N-H., Skott O. Renal blood flow, early distal sodium, and plasma renin concentrations during osmotic dieresis // Am. J. Physiol. Regulatory. Integrative. Comp. Physiol. – 2000. – V. 279. – P. 12681276. 134. Liang M.,Knox F.G. Nitric oxide reduces the molecular activity of Na+,K+ATPase in opossum kidney cells // Kidney Int. – 1999. – V. 56. – P. 627–634. 135. Linas S.L.,Repine J.E. Endothelial cells regulate proximal tubule epithelial cell sodium transport // Kidney Int. – 1999. – V. 55. – P. 1251-1258. 136. Liu R., PittnerJ., Persson A.E. Changes of cell volume and nitric oxide concentration in macula densa cells caused by changes in luminal NaCl concentration // J. Am. Soc. Nephrol. – 2002. – V. 13. – P. 2688–2696. 137. Localization of the urea transporter UT-B protein in human and rat erythrocytes and tissues / R.T. Timmer, J.D. Klein, S.M. Bagnasco, J.J. Doran, J.W.Verlander, R.B. Gunn, J.M. Sands // Am. J. Physiol. – 2001. – V. 281. – P. 1318-1325. 138. Localization and regulation of endothelial NO synthase mRNA expression in rat kidney / K. Ujiie, J. Yuen, L. Hogarth, R. Danziger , R.A. Starr // Am. J. Physiol. – 1994. – V. 267. – P. 296-302. 121 139. Location of an inducible nitric oxide synthase mRNA in the normal kidney / J.J. Morrissey, R. McCracken, H. Kaneto, M. Vehaskari, D. Montani, S. Klahr // Kidney Int. – 1994. – V. 45. – P. 998-1005. 140. Lowenstein C.J., Dinerman J.L., Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messengers // Ann. intern. Med. – 1994. – V.120. – P. 227-237. 141. Lu M., Giebisch G., Wang W. Nitric oxide-induced hyperpolarization stimulates low-conductance Na+ channel of rat CCD // Am. J. Physiol. – 1997. – V. 272. – P. 498-504. 142. Lu M., Wang W.H. Nitric oxide regulates the low-conductance K + channel in basolateral membrane of cortical collecting duct // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 1996. – V. 270. – P. 1336-1342. 143. Lu M., Wang W.H. Reaction of nitric oxide with superoxide inhibits basolateral K+ channels in the rat CCD // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 1998. – V. 275. – P. 309-316. 144. Lu M., Wang X., Wang W. Nitric oxide increases the activity of the apical 70-pS K channel in TAL of rat kidney // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 1998. – V. 274. – P. 946-950. 145. Majmudar N.G., RobsonS.C., Ford G.A. Effects of the menopause, gender, and estrogen replacement therapy on vascular nitric oxide activity // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2000. – V. 85. – P. 1577– 1583. 146. Mattson D.L., Lu S., Cowley A.W. Role of nitric oxide in the control of the renal medullary circulation // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 1997. – V. 24. – P. 587-590. 147. Mattson D.L., Wu F. Nitric oxide synthase activity and isoforms in rat renal vasculature // Hypertension. – 2000. – V. 35. – P. 337–341. 148. Mattson D.L.,Wu F. Control of arterial blood pressure and renal sodium excretion by nitric oxide synthase in the renal medulla // Acta. Physiol. Scand. – 2000. – V. 168. – Р. 149–154. 149. Majid D.S., Navar L.G. Nitric oxide in the control of renal hemodynamics and excretory function // Am. J. Hypertens. – 2001. – V. 4. – P. 74-82. 122 150. Manning R.D., HuL., Tan D.Y., Meng S. Role of abnormal nitric oxide systems in salt-sensitive hypertension// Am. J. Hypertens. – 2001. – V. 14. – P. 68-73. 151. Mechanisms of renal effects of different agents stimulating production of cGMP/ S. Grandes, M.J. Gallego, A. Riesco, A. López Farré, I. Millas, S. Casado, L.Hernando, C. Caramelo // Am. J. Physiol. – 1991. – V. 261. – P. 1109-1114. 152. Mechanism of superoxide generation by neuronal nitric-oxide synthase / S. Pou, L. Keaton, W. Surichamorn, G.M. Rosen // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 9573–9580. 153. Mckee M., Scavone C., Nathanson J. A.Nitric oxide, cGMP, and hormone regulation of active sodium transport // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. – V. 91. – P. 12056–12060. 154. Mike A. Gasotransmitters: Novel Regulators of Epithelial Na + Transport // Front Physiol. – 2012. – V. 3. – P. 83. 155. Molecular cloning, primary structure, and characterization of two members of the mammalian electroneutral sodium-(potassium)-chloride cotransporter family expressed in kidney / G. Gamba, A. Miyanoshita, M. Lombardi, J. Lytton, W.S. Lee, M.A. Hediger, S.C. Hebert // J. Biol. Chem. – 1994. – V. 269. – P. 17713–17722. 156. Molony D.A., Reeves W.B., Andreoli T.E. Na:K:2Cl cotransport and the thick ascending limb // Kidney Int. – 1989. – V. 36. – P. 418–426. 157. Moncada S., Higgs A. Mechanisms of disease: the L-arginine - nitric oxide pathway // New Engl. J. Med. – 1993. – V. 329. – Р. 2002-2012. 158. Moridani B.A., Kline R.L. Effect of endogenous L-arginine on the measurement of nitric oxide synthase activity in the rat kidney // Can. J. Physiol. Pharmacol. – 1996. – V. 74. – P. 1210–1214. 159. Mori M., Gotoh T. Regulation of nitric oxide production by arginine metabolic enzymes // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2000. – V. 275. – P. 715-719. 123 160. Mount P.F., Power D.A. Nitric oxide in the kidney: functions and regulation of synthesis // Acta. Physiol. (Oxf). – 2006. – V. 187. – P. 433– 446. 161. Nagami G.T. Luminal secretion of ammonia in the mouse proximal tubule perfused in vitro//J. Clin. Invest. – 1988. – V. 81. – P. 159-164. 162. Nagami G.T. Effect of bath and luminal potassium concentration on ammonia production and secretion by mouse proximal tubules perfused in vitro // J. Clin. Invest. – 1990. – V. 86. – P. 32–39. 163. Nakaki T. Physiological and clinical significance of NO (nitric oxide) – areview // Keio J. Med. – 1994. – V. 43. – Р. 15-26. 164. Nakanishi K., Mattson D.L., Cowley A.W. Role of renal medullary blood flow in the development of l-NAME hypertension in rats // Am. J. Physiol. – 1995. – V. 268. – P. 317-323. 165. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells// FASEB J. – 1992. – V.6. – Р. 3051-3064. 166. Negative feedback regulation of endothelial cell function by nitric oxide / G.M. Buga, J.M. Griscavage, N.E. Rogers, L.J. Ignarro //Circ. Res. – 1993. – V. 73. – P. 808–812. 167. Neugarten J. Sex hormones and renal nitric oxide synthases / J.Neugarten, Q. Ding, A. Friedman, J. Lei, S.Silbiger // J. Am. Soc. Nephrol. –1997. – V. 8. –P. 1240-1246. 168. Neuronal nitric oxide synthase-deficient mice have impaired renin release but normal blood pressure / J. Sällström, M. Carlström, B.L. Jensen, O. Skоtt, R.D. Brown, A.E.Persson // Am. J. Hypertens. – 2008. – V. 21 (1). – P. 111116. 169. NHE4 is critical for the renal handling of ammonia in rodents / S.Bourgeois, L.V. Meer, B.Wootla, M. Bloch-Faure, R. Chambrey, G.E. Shull, L.R. Gawenis, P. Houillier // J. Clin. Invest. – 2010. – V. 120. – P. 1895–1904. 170. Nitric oxide production by mouse renal tubules can be increased by a sodium-dependent mechanism / S. Kempson, N. Thompson, L. Pezzuto, H. Glenn Bohlen // Nitric Oxide. – 2007. – V. 17(1). – P. 33-43. 124 171. Nitric oxide, cell signaling and cell death/ G.A. Blaise, D. Gauvin, M. Gangal, S. Authier // Toxicology. – 2005. – V. 208. – P. 177-192. 172. Nitric oxide produced by endothelial nitric oxide synthase promotes diuresis / J.M. Perez-Rojas, K.M. Kassem, W.H. Beierwaltes, J.L. Garvin, M. Herrera // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2010. – V. 298. – P. 10501055. 173. Nitricoxidesynthaseisoformsandglomerularhyperfiltrationinearlydiabeticnep hropathy / R. Veelken, K.F. Hilgers, A. Hartner, A. Haas, K.P. Böhmer, R.B. Sterzel // JAmSocNephrol. – 2000. – V. 11. – P. 71–79. 174. Nitric oxide synthase in macula densa regulates glomerular capillary pressure / C.S. Wilcox, W.J. Welch, F. Murad, S.S. Gross, G. Taylor, R. Levi, H.W. Schmidt // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1992. – V. 89. – P. 1199311997. 175. Oberbaumer I., Moser D., Bachmann S. Nitric oxide synthase 1 mRNA: tissue-specific variants from rat with alternative first exons // Biol. Chem. – 1998. – V. 379. – P. 913-919. 176. Ortiz P.A., Hong N.J., Garvin J.L. Luminal flow induces eNOS activation and translocation in the rat thick ascending limb // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2004. – V. 287. – P. 274–280. 177. Ortiz P.A., HongN.J., Garvin J.L. NO decreases thick ascending limb chloride absorption by reducing Na-K-2Clcotransporter activity // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2001. – V. 281. – P. 819-825. 178. Ortiz P.A., Garvin J.L. Role of nitric oxide in the regulation of nephron transport // Am. J. Physiol Renal Physiol. – 2002. – V. 282. – P. 777-784. 179. Ortiz P.A., Garvin J.L. Interaction of O(2)(−) and NO in the Thick Ascending Limb // Hypertension. – 2002. – V. 39. – P. 591–596. 180. Ouabain induces endocytosis of plasmalemmal Na/K-ATPase in LLC-PK1 cells by a clathrin-dependent mechanism / J. Liu, R. Kesiry, S.M. Periyasamy, D. Malhotra, Z. Xie, J.I. Shapiro // Kidney Int. – 2004. – V. 66. – P. 227–241. 125 181. Ouabain-induced endocytosis of the plasmalemmal Na/K-ATPase in LLCPK1 cells requires caveolin-1 / J.Liu, M. Liang, L. Liu, D. Malhotra, Z. Xie, J.I. Shapiro // Kidney Int. – 2005. – V. 67. – P. 1844–1854. 182. Palmer R.M.J., FerrigeA.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor // Nature. – 1987. – V. 327. – Р. 534-526. 183. Parks D.A.,Granger D.N.Xanthine oxidase: biochemistry, distribution and physiology // Acta. Physiol. Scand Suppl. – 1986. – V. 548. – P. 87–99. 184. Patzak A., Persson A.E. Angiotensin II-nitric oxide interaction in the kidney // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 2007. – V. 16. – P. 46-51. 185. Parallel regulation of constitutive NO synthase and renin at JGA of rat kidney under various stimuli / H.M. Bosse, R. Bohm, S. Resch, S. Bachmann // Am. J. Physiol. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1995. – V. 269. – P. 793– 805. 186. Physiological role of nitric oxide in regulation of renal function in humans / W.G. Haynes [et al.] // Am. J. Physiol. – 1997. – V. 272. – P. 364-371. 187. Polymerase chainreaction localization of constitutive nitric oxide synthase and solub leguanylatecyclase messenger RNA sin microdissectedrat nephron segments / Y.Terada, K. Tomita, H. Nonoguchi, F.Marumo // J. Clin. Invest. – 1992. – V. 90. – P. 659-665. 188. Potter E.A., Stewart G., Smith C.P. Urea flux across MDCK-mUT-A2 monolayers is acutely sensitive to AVP, cAMP, and [Ca2+]i// Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2006. – V. 291. – P. 122-128. 189. Production of superoxide through NADH oxidase in thick ascending limb of Henle’s loop in rat kidney / N.Li, F.X.Yi, J.L. Spurrier, C.A.Bobrowitz, A.P. Zou// Am J Physiol Renal Physiol. – 2002. – V. 282. – P. 1111-1119. 190. Production and role of extracellular guanosine cyclic 3′, 5′ monophosphate in sodium uptake in human proximal tubule cells / S. Sasaki, H.M. Siragy, J.J. Gildea, R.A. Felder, R.M. Carey // Hypertension. – 2004. – V. 43. – P. 286291. 126 191. Protein S-nitrosylation: purview and parameters / D.T. Hess, A. Matsumoto, S.-O. Kim, H.E. Marshall, J.S. Stamler // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2005. – V. 6. – P. 150–166. 192. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue / M.N.Helms, L.Jain,J.L. Self, D.C. Eaton // J. Biol. Chem. – 2008. – V. 283. – P. 22875–22883. 193. Regulation of NHE3 by nitric oxide in Caco-2 cells / R.K. Gill, S. Saksena, I.A. Syed, S. Tyagi, W.A. Alrefai, J. Malakooti, K. Ramaswamy, P.K. Dudeja // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2002. – V. 283. – P. 747-756. 194. Renal responses to intra-arterial administration of nitric oxide donor in dogs / D.S. Majid, A. Williams, P.J. Kadowitz, L.G. Navar// Hypertension. – 1993. – V. 22. – P. 535-541. 195. Renoprotective effects of nitric oxide in angiotensin II-induced hypertension in the rat / S.Y. Chin, C.T. Wang, D.S. Majid, L.G. Navar// Am. J. Physiol. – 1998. – V. 274. – P. 876-882. 196. Plato C.F., Stoos B.A., Wang D., Garvin J.L. Endogenous nitric oxide inhibits chloride transport in the thick ascending limb// Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 1999. – V. 276. – P. 159-163. 197. Raij J.,Baylis C. Glomerular actions of nitric oxide// Kidney Int. – 1995. – V. 48. – P. 20-32. 198. Reduction in basal nitric oxide activity causes albuminuria / Ott C., Schneider M.P., Delles C., Schlaich M.P., Schmieder R.E. // Diabetes. – 2011. – V. 60(2). – Р. 572-576. 199. Regulation of apical NHE3 trafficking by ouabain-induced activation of the basolateral Na+-K+-ATPase receptor complex / H.Cai, L. Wu, W. Qu, D. Malhotra, Z. Xie, J.I. Shapiro, J. Liu // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2008. – V. 294. – P. 555-563. 200. Regulation of the V-ATPase in kidney epithelial cells: dual role in acid-base homeostasis and vesicle trafficking / D. Brown, T.G. Paunescu, S. Breton, V. Marshansky // J. Exp. Biol. – 2009. – V. 212. – P. 1762–1772. 127 201. Regulation of UT-A1-mediated transepithelial urea flux in MDCK cells / O. Frohlich, J.D. Klein, P.M. Smith, J.M. Sands, R.B. Gunn // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2006. – V. 291. – P. 600-606. 202. Reid I.A., Chou L. Effects of blockade of nitric oxide synthesis on the renin secretory response to furosemide in conscious rabbits // Clin. Sci. (Lond). – 1995. – V. 88. – P. 657-663. 203. Reid I.A. Role of nitric oxide in the regulation of renin and vasopressin secretion // Front Neuroendocrinol. – 1994. – V. 15. – P. 351–383. 204. Renal interstitial guanosine cyclic 3′, 5′-monophosphate mediates pressurenatriuresis via protein kinase G / X.-H.Jin,H.E.McGrath,J.J. Gildea,H.M. Siragy,R.A. Felder, R.M. Carey // Hypertension. – 2004. – V. 43 – P. 1133– 1139. 205. Renal NOS activity, expression, and localization in male and female spontaneously hypertensive rats / C.S. Jennifer, L.P. Jennifer, A.H. Kelly,, S.P. Jennifer // Am. J. Physiol. – 2010. – V. 298. – P. 61-69. 206. Restoring vascular nitric oxide formation by L-arginine improves the symptoms of intermittent claudication in patients with peripheral arterial occlusive disease / R.H. Böger [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 1998. – V. 32. – P. 1336–1344. 207. Role of renal interstitial pressure in natriuresis of systemic nitric oxide inhibition / J.A.Haas,A.A.Khraibi,M.A.Perella,F.G.Knox // Am. J. Physiol. – 1993. – V. 264. – P. 411-414. 208. Role of cGMP-kinase II in the control of renin secretion and renin expression / C. Wagner, A. Pfeifer, P. Ruth, F. Hofmann, A. Kurtz // J. Clin. Invest. – 1998. – V. 102. – P. 1576-1582. 209. Role of muscarinic receptors in renal response to acetylcholine / J.C. Yun, G. Oriji, J.R. Gill, B.R. Coleman, J. Peters, H. Keiser // Am. J. Physio. Renal Fluid. Electrolyte Physiol. – 1993. – V. 265. – P. 46-52. 128 210. Role of superoxide in modulating the renal effects of angiotensin II / B. Lopez, M.G. Salom, B. Arregul, F. Valero, F.J. Fenoy // Hypertension. – 2003. – V. 42. – P. 1150-1156. 211. Role of SRC family kinase in extracellular renal cyclic guanosine 3′,5′monophosphate- and pressure-induced natriuresis / N.R.F. Nascimento, B.A. Kemp, N.L. Howell, J.J. Gildea, C.F. Santos, T.E. Harris, R.M. Carey // Hypertension. – 2011. – V. 58. – P. 107–113. 212. Saltsensitive splicevariant of nNOS expressedinthe macula densa cells / D. Lu, Y. Fu, A. Lopez-Ruiz, R. Zhang, R. Juncos, H. Liu, R.D Jr Manning, L. Juncos, R. Liu // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2010. – V. 298. – P. 14651471. 213. Sayago C.M., Beierwaltes W.H. Nitric oxide synthase and cGMPmediated stimulation of renin secretion // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2001. – V. 281. – P. 1146-1151. 214. Sex-related differences in nitric oxide content in healthy and hypertensive rats at rest and Semyachkina,T.G. under stress Anishchenko,T.A. conditions / Sindyakova, O.V.GlushkovskayaO.V.Leksina, V.A. Berdnikova // Bull. Exp. Biol. Med. – 2006. – V. 142. – P. 9-11. 215. Scholz H., Kurtz A. Involvement of endothelium-derived relaxing factor in the pressure control of renin secretion from isolated perfused kidney // J. Clin. Invest. – 1993. – V. 91. – P. 1088–1094. 216. Schreck C., O'Connor P.M. NAD(P)H oxidase and renal epithelial ion transport // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2011. – V. 300(5). – P. 1023-1029. 217. Sharma S.P. Nitricoxide and the kidney / Indian. J. Nephrol. – 2004. – V.14. – P. 77-84 218. Short-term nitric oxide inhibition induces progressive nephropathy after regression of initial renal injury / C.K. Fujihara, C.R. Sena, D.M. Malheiros, A.L. Mattar, R. Zatz // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2006. – V. 290. – P. 632-640. 129 219. Shultz P.J., Tolins J.P. Adaptation to increased dietary salt intake in the rat.Role of endogenous nitric oxide // J. Clin. Invest. 1993. V. 91. P. 642-650. 220. Silva G., Beierwaltes W.H., Garvin J.L. Extracellular ATP stimulates NO production in rat thick ascending limb // Hypertension. – 2006. – V. 47. – P. 563-567. 221. Snyder S.H. Janus faces of nitric oxide / S.H. Snyder // Nature. – 1993. – Vol. 364. – Р. 577 222. Sörensen M.V.,LeipzigerJ. The essential role of luminal BK channels in distal colonic K+ secretion //J. Med. Invest. – 2009. – V. 56. – P. 301. 223. Splice variants of neuronal nitric oxide synthase are present in the rat kidney / C. Smith, M. Merchant, A. Fekete, H.L. Nyugen, P. Oh, Y.L. Tain, J.B. Klein, C. Baylis // Nephrol. Dial. Transplant. – 2009. – V. 24. – P. 1422-1428. 224. Star R.A. Southwestern Internal Medicine conference: Nitric Oxide //Am. J. Med. Sci. – 1993. – V.306. – P. 348-357. 225. Stimulation of renin secretion by nitric oxide is mediated by phosphodiesterase 3 / A. Kurtz, K.H. Götz, M. Hamann, C. Wagner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – V. 95. – P. 4743–4747. 226. Stoos B.A.,CarreteroO.A., Garvin J.L. Endothelial-derived nitric oxide inhibits sodium transport by affecting apical membrane channels in cultured collecting duct cells // J. Am. Soc. Nephrol. – 1994. – V. 4. – P. 1855–1860. 227. Stoos B.A., GarciaN.H., Garvin J.L. Nitric oxide inhibits sodium reabsorption in the isolated perfused cortical collecting duct // J. Am. Soc. Nephrol. – 1995. – V. 6. – P. 89–94. 228. Superoxide scavenging attenuates renal responses to ANG II during nitric oxide synthase inhibition in anesthetized dogs / D.S. Majid, A. Nishiyama, K.E. Jackson, A. Castillo // Am. J. Physiol. – 2005. – V. 288. – P. 412-419. 229. The medullary thick limb: function and modulation of the single-effect multiplier / S.C. Hebert, W.B. Reeves, D.A. Molony, T.E. Andreoli // Kidney Int. – 1987. – V. 31. – P. 580-589. 130 230. The renal-ATPases: physiology, regulation, structure/ M.L. Gumz, I.J. Lynch, M.M. Greenlee, B.D. Cain, C.S. Wingo // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2010. – V. 298. – P. 12-21. 231. The complex role of nitric oxide in the regulation of glomerular ultrafiltration / R.C. Blantz, A. Deng, M. Lortie, K. Munger, V. Vallon, F.B. Gabbai, S.C. Thomson // Kidney Int. – 2002. – V. 61. – P. 782–785. 232. Thomson S.C., Blantz R.C. Homeostatic efficiency of tubuloglomerular feedback in hydropenia, euvolemia, and acute volume expansion // Am. J. Physiol. – 1993. – V. 264. – P. 930-936. 233. Thomson S.C.,VallonV., Blantz R.C.Resetting protects efficiency of tubuloglomerular feedback // Kidney Int. – 1998. – V. 54 Suppl 67. – P. 65-70. 234. Thorup C., Persson A.E.G. Inhibition of locally produced nitric oxide resets tubuloglomerular feedback mechanism // Am. J. Physiol. – 1994. – V. 267. – P. 606-611. 235. Тissue- and development-specific expression of multiple alternatively spliced transcripts of rat neuronal nitric oxide synthase / M.A. Lee, L. Cai, N. Hübner, Y. A. Lee, K. Lindpaintner // J. Clin. Invest. – 1997. – V. 100. – Р. 1507–1512. 236. Tonic stimulation of renin gene expression by nitric oxide is counteracted by tonic inhibition through angiotensin II / K. Schricker, I. Hegyi, M. Hamann, B. Kaissling, A. Kurtz // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – V. 92. – P. 8006– 8010. 237. Turban S., Wang X.Y., Knepper M.A. Regulation of NHE3, NKCC2, and NCC abundance in kidney during aldosterone escape phenomenon: role of NO // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2003. – V. 285. – P. 843-851. 238. Tolins J.P., Shultz P.J. Endogenous nitric oxide synthesis determinessensitivity to the pressor effect of salt // Kidney Int. – 1994. – V. 46. – P. 230–236. 131 239. Upregulation of endothelial and inducible nitric oxide synthase expression by reactive oxygen species / J. Zhen, H. Lu, X.Q. Wang, N.D. Vaziri, X.J. Zhou // A. J. Hypertens. – 2008. – V. 21. – P. 28–34. 240. UT-A2: a 55-kDa urea transporter in thin descending limb whose abundance is regulated by vasopressin / J.B. Wade, A.J. Lee, J. Liu, C.A. Ecelbarger, C. Mitchell, A.D. Bradford, J. Terris, G.H. Kim, M.A. Knepper // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 2000. – V. 278. – P. 52-62. 241. Vaziri N.D., Wang X.Q. cGMP-mediated negative-feedback regulation of endothelial nitric oxide synthase expression by nitric oxide // Hypertension. – 1999. – V. 34. – P. 1237-1241. 242. Vallon V., Thomoson S.C. Inhibition of local nitric oxide synthase increases the homeostatic efficiency of tubuloglomerular feedback // Am. J. Physiol. – 1995. – V. 268. – P. 892-899. 243. Vallon V. The proximal tubule in the pathophysiology of the diabetic kidney// Am. J. Physiol. Regul. – 2011. – V. 300(5).Р. 1009. 244. Vidal M.J., RomeroJ.C., VanhoutteP.M. Endothelium derived relaxing factor inhibits rennin release // Eur. J. Pharmacol. – 1988. – V. 149. – P. 401– 402. 245. Wagner C., Kurtz A. Regulation of renal renin release // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 1998. – V. 7. – P. 437–441. 246. Wang Y., Marsden P.A. Nitric oxide synthases: biochemical and molecular regulation // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – 1995. – V.4. – Р. 12-22. 247. Wu G., Morris S.M. Arginine metabolism in mammals. In: Cynober LA ed. Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition // Boca Raton, CRC Press. – 2004. – P. 153–167. 248. Wu F., Park F., Cowley A.W., Mattson D.L. Quantification of nitric oxide synthase activity in microdissected segments of the rat kidney // Am. J. Physiol. Renal Physiol. – 1999. – V. 276. – P. 874-881. 132 249. Wilcox C.S., Deng X., Welch W.J. NO generation and action during changes in salt intake: roles of nNOS and macula densa // Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. – 1998. – V. 274. – P. 1588-1593. 250. Wilcox C.S. Oxidative stress and nitric oxide deficiency in the kidney: a critical link to hypertension // Am. J. Physiol. – 2005. – V. 289. – P. 913-935. 251. Wingo C.S., Armitage F.E. Rubidium absorption and proton secretion by rabbit outer medullary collecting duct via HK-ATPase // Am. J. Physiol. Renal Fluid Electrolyte Physiol. – 1992. – V. 263. – P. 849-857. 252. Xuechen X. L., GuangpingG.C., BaoxueB.Y.Urea transporter physiology studied in knockout mice // Front Physiol. – 2012. – V 3. – P. 217 253. Zou A.P., Wu F., Cowley A.W. Protective effect of angiotension II-induced increase in nitric oxide in the renal medullary circulation // Hypertension. – 1998. – V. 31. – P. 271-276. 133 Приложение 134 135