Роль митохондрий в развитии окислительного стресса при экспериментальном рабдомиолизе
advertisement
На правах рукописи Чупыркина Анастасия Андреевна Роль митохондрий в развитии окислительного стресса при экспериментальном рабдомиолизе 03.01.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории структуры и функций митохондрий НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук профессор Зоров Дмитрий Борисович доктор биологических наук Плотников Егор Юрьевич доктор биологических наук Официальные оппоненты: профессор Шишкин Сергей Сергеевич кандидат биологических наук Киселевский Дмитрий Борисович Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии РКНПК МЗСР РФ Защита состоится « » ɦɚɪɬɚ 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д. 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33, стр. 2 С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва. Ленинский проспект, д.33, к. 1. Автореферат разослан «»ɹɧɜɚɪɹ2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский Актуальность проблемы Рабдомиолиз – острый некроз мышц, приводящий к высвобождению содержимого мышечных клеток в систему циркуляции (Vanholder R. et al, 2007). Наиболее типичная причина рабдомиолиза – тяжелые травмы, например, вследствие техногенных катастроф, стихийных бедствий. Тем не менее, существует достаточно большое количество и других факторов, способствующих гибели мышечных клеток. К ним относятся чрезмерные физические нагрузки, высоковольтные в том числе электротравмы, эпилептические припадки, гипертермия, нарушения инфекции, электролитного баланса, ряд лекарственных препаратов (Bosch X. et al., 2009). Наиболее развивающаяся недостаточность. опасным примерно Лечение последствием в 30% таких рабдомиолиза случаев пациентов острая в является почечная настоящее время недостаточно эффективно, и смертность среди них довольно высока (Brivet F. et al., 1996). Причиной дисфункции почки при рабдомиолизе в настоящее время считается миоглобин, который фильтруется в почечных канальцах, вызывая их обструкцию, а его гемовая группа способствует развитию в них окислительного стресса (Zager R. et al., 1996; Boutad O. et al., 2010). Основным клиническим методом лечения таких пациентов в настоящее время является введение в кровь растворов бикарбоната и/или маннитола (Ron D. et al., 1984). Однако применение этого метода ограничено, и кроме того, многими исследователями он считается неэффективным (Brown C. et al., 2004). Фундаментальные механизмы, лежащие в основе повреждения почечных структур при рабдомиолизе, изучены достаточно слабо. Особенно мало известно об участии митохондрий, хотя они являются ключевыми регуляторами окислительного стресса и гибели/выживания клеток. Кроме того, практически ничего не известно о роли оксида азота (NO) в повреждении при миоглобинурии. При этом NO является важным модулятором окислительного стресса, который может играть роль как повреждающего, так и защитного агента. Особенный интерес этот медиатор приобрел после открытия митохондриальной NO-синтазы (Giulivi C. et al., 3 1998), дающей возможности регуляции продукции активных форм кислорода (АФК) непосредственно на уровне митохондрии (Brown G. et al., 2001) Таким образом, расширение представлений о механизмах воздействия миоглобина на почечные клетки при рабдомиолизе и о потенциальных защитных механизмах является очень актуальным. В данной работе было изучено функционирование митохондрий, развитие в них окислительного стресса и продукция NO на моделях экспериментального рабдомиолиза in vivo и in vitro. Цель и задачи исследования Целью работы являлось исследование участия митохондрий в гибели клеток почки под действием миоглобина, а также поиск стратегий защиты. Задачи работы: 1. Исследование функционирования митохондрий клеток почки при экспериментальном рабдомиолизе. 2. Оценка изменения продукции NO при рабдомиолизе. 3. Исследование влияния митохондриально-адресованных соединений на развитие почечной недостаточности при рабдомиолизе. 4. Исследование влияния протеолитического расщепления миоглобина на развитие окислительного стресса в клетках почки. Научная новизна работы Получены новые данные о механизмах развития окислительного стресса в клетках почки при рабдомиолизе. Была показана центральная роль митохондрий клеток почки в развитии острой почечной недостаточности при рабдомиолизе. На основании этого была исследована возможность использования митохондриально-адресованных антиоксидантов для предотвращения дисфункции почки. Также было показано влияние протеолитического расщепления миоглобина клетками канальцев на развитие в них окислительного стресса и повреждение митохондрий. 4 Научно-практическое значение работы Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют представление о механизмах развития миоглобин - индуцированной острой почечной недостаточности, а также о возможных перспективных методах ее лечения. Полученные данные о защитном действии митохондриальноадресованных соединений и ингибиторов протеолиза могут быть использованы для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать или предотвращать проявления острой почечной недостаточности, спровоцированной миоглобином. Основные положения, выносимые на защиту 1. При рабдомиолизе происходит нарушение функционирования митохондрий почки, сопровождающееся развитием неспецифической проницаемости внутренней мембраны и окислительным стрессом. 2. При воздействии миоглобина на митохондрии почки развивается нитрозильный стресс, за который может быть ответственна митохондриальная NO-синтаза. 3. Дисфункция почки при рабдомиолизе сопровождается протеолитической деградацией миоглобина в клетках почечных канальцев, что играет важную роль в повреждении митохондрий почки. 4. Митохондриально-адресованный предотвращает развитие антиоксидант острой почечной SkQR1 недостаточности, спровоцированной рабдомиолизом. Апробация работы Отдельные аспекты работы представлялись на следующих конференциях: XV Международной конференции «Ломоносов-2008», IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицинской науки», (Ярославль, 2009), III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», (Ростов-на-Дону, 2009), 14 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, 5 (Пущино, 2010), конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», (Пущино 2011), XXIII Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", (Москва, 2011), 15-ой Европейской Биоэнергетической Конференции EBEC (Дублин, 2008), конференции EuroNanoMedicine, (Словения, 2009). Публикации Основные положения диссертации опубликованы в 15 печатных работах. Из них 3 – в журналах, рекомендованных ВАК. Структура и объём диссертации Диссертация написана на 117 страницах, содержит 69 рисунков и 10 таблиц и состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Благодарности» и «Список литературы». Список литературы включает 179 источников. Материалы и методы исследования Эксперименты проводились на самцах белых крыс весом 200±20 г. Индукция рабдомиолиза проводилась по стандартной методике введением 50%-ого водного раствора глицерина в мышцы лап крысы из расчета 10 мл/ кг, по половине дозы в каждую лапу (Zurovsky Y., 1993). В определенное время у крыс производился забор крови и почек для определения биохимических параметров; у части животных забирались почки для гистологических исследований. Митохондрии почек крысы выделяли стандартным методом дифференциального центрифугирования. Скорость потребления кислорода митохондриями определяли на полярографе Oxygraph-2k (Oroborus, Австрия), оснащенном закрытым платиновым электродом Кларка. Основная среда инкубации (СИ) полярографического опыта содержала: 250 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES, 1 мМ ЭГТА, 0,1 % БСА, 5 мМ сукцинат натрия и 10 мкМ ротенон. Вестерн-блоттинг. Содержание белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты. Электрофорез белков проводили по Лэммли (Laemmli, 1970). По окончании электрофореза белки из геля переносили на 6 PVDF мембрану (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, UK) согласно методике, описанной ранее (Towbin et al., 1992). Искомые белковые локусы на мембране детектировали с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL (Еnhanced chemiluminescence system, Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, UK). Малоновый диальдегид (МДА) определяли с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК) по методу, предложенному Uchiyama and Mihara (Uchiyama M. and Mihara M., 1977) с некоторыми модификациями. Определение нитрита проводили колориметрическим методом Грисса (Griess P., 1879) с небольшими модификациями. АФК (Calbiochem, детектировали San Diego, с помощью США) в виде 2,7-дихлорфлуоресцеина мембран-проникающего диацетатного эфира (2,7-DCF DA). Флуоресценцию DCF детектировали используя длину волны возбуждающего света 488 нм, и регистрируя флуоресценцию в диапазоне 505-530 нм. Первичная культура клеток почки была получена из почек новорожденных крысят. Ферментативная обработка была проведена 0,5% коллагеназой 2 типа. Клетки культивировали в инкубаторе при температуре 37ºС и 5% СО2. Определение гема проводилось спектроскопическим методом, предложенным Berry E. и Trumpower B. (Berry E. and Trumpower B., 1987), основанном на образовании комплекса пиридина с гемохромом. Определение ионов свободного железа проводилось хромазурольным способом, предложенным Callahan J. и Cook K. (Callahan J. and Cook K., 1982). В присутствии хромазурола В и цетилтриметил- аммония бромида железо образует окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 637 нм. Метод позволяет определять ионы двух- и трехвалентного железа. Результаты Развитие острой почечной недостаточности при экспериментальном рабдомиолизе 7 В первую очередь в работе была определена динамика основных физиологических и биохимических параметров, характеризующих развитие острой почечной недостаточности при моделировании рабдомиолиза. Были оценены такие параметры, как уровни мочевины и креатинина (отражают состояние азотвыделительной функции почек), концентрации в крови ферментов - маркеров гибели клеток и цитохрома с. Определение динамики повышения в крови концентрации продуктов азотного обмена: мочевины и креатинина и маркеров развития острой почечной недостаточности показало, что острая уремия и азотемия (рис. 1А), спровоцированные рабдомиолизом, достигали своего пика на второй день: концентрация креатинина увеличивалась в среднем до 220 мкМ, по сравнению с 50 мкМ в контроле, а концентрация мочевины – до 51 мМ, по сравнению с 8 мМ в контроле. Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), отражающие степень повреждения ткани, также были максимальны на вторые сутки после индукции рабдомиолиза, затем быстро снижались и примерно через две недели достигали субнормальных значений (рис. 1Б). Это свидетельствует о том, что в первые двое суток после индукции рабдомиолиза происходит интенсивная гибель клеток, как мышечных, вследствие травматической инъекции глицерина, так, возможно, и почечных, вследствие развившегося в них окислительного стресса. Причины, приводящие к развитию острой почечной недостаточности Рис. 1. Развитие почечной недостаточности при миоглобинурии. Повышение в крови концентрации креатинина и мочевины (А), а также АЛТ и ЛДГ (Б) свидетельствуют о развитии ОПН в первые сутки после рабдомиолиза. Указано время после введения глицерина. 8 при рабдомиолизе, до конца не ясны. Главным нефротоксичным фактором в настоящее время считается миоглобин, оказывающийся в крови, а затем и в почке после разрушения мышцы. Подвергаясь окислению до метмиоглобина, он становится источником активных форм кислорода и приводит к окислительному стрессу в клетках почки (Zager R., 1996, Reeder B. et al., 2002). При этом судьба самого миоглобина в почечном канальце неизвестна. В этой связи была исследована динамика появления миоглобина в кровеносной системе (не показано) и почечной ткани (рис. 2). Для этого иммуноблоттингом со специфическими антителами были проанализированы гомогенаты почек контрольных крыс и крыс после индукции Рис. 2. Появление миоглобина в ткани почки крыс на разных сроках после индукции рабдомиолиза. В подписях на дорожках указано время после индукции рабдомиолиза. В качестве стандарта на миоглобин (МБ) использовали гомогенат мышцы крысы (3 мкг). рабдомиолиза. Как видно на рис. 2, миоглобин в почке появляется уже через 4 ч после индукции рабдомиолиза и достигает максимальной концентрации через 15 ч. Через 24 ч в почке остаются только следы миоглобина, в то время как в контрольной почке он вообще не детектируется. Развитие окислительного стресса при моделировании рабдомиолиза Таким образом, было показано, что высвободившийся в кровь миоглобин быстро и эффективно фильтруется в почке, накапливаясь в почечных канальцах. Уже менее чем через сутки он, видимо, подвергается деградации, в результате которой перестает детектироваться специфичными антителами. Однако даже через 48 ч в почке нами обнаружены признаки значительного окислительного стресса, в частности, уровень продуктов окисления липидов, МДА в сыворотке (А) и почке (Б) на вторые сутки после индукции рабдомиолиза увеличен примерно в 1,5 раза по сравнению с контролем (рис.3). 9 Рис. 3. Увеличение уровня МДА в сыворотке крови (А) и в ткани почки (Б) крыс через 48 часов после индукции рабдомиолиза по сравнению с контролем. * - p<0,05 по сравнению с контролем. Повреждение митохондрий клеток почки при рабдомиолизе Анализ наличия в сыворотке крови цитохрома с использовался в данной работе как маркер повреждения и гибели клеток почки. Было показано, что уже через 5 ч после индукции рабдомиолиза цитохром с появляется в крови, достигая максимума своей концентрации к 15 ч после индукции рабдомиолиза (рис. 4). Это может свидетельствовать о сильном повреждении клеток почки и индукции в них апоптотической либо некротической гибели. Кроме того, наличие цитохрома с в крови наводит на мысль о серьезном повреждении митохондрий условиях этой патологии. контр 5ч 16ч 24ч 48ч цит. с что в Заметим, контрольных сыворотках Рис. 4. Появление цитохрома с в сыворотке крови крыс, на разных сроках после индукции рабдомиолиза. Вестерн-блоттинг. В качестве положительного контроля использованы выделенные митохондрии почки. в цитохром не детектировался. Таким образом, очевидно, критическими что в развитии острой почечной недостаточности при рабдомиолизе являются первые два дня и, видимо, именно в этот период происходят основные события, приводящие к дисфункции почки. Кроме того, вероятно, миоглобин является лишь индуктором деструктивных процессов, которые 10 продолжают развиваться тогда, когда миоглобин в почке уже не детектируется. Возможно, на одном из этапов элиминации/деградации миоглобин может быть инициатором окислительного стресса внутри клетки. Одним из основных источником свободных радикалов в клетке, особенно при патологических состояниях, являются митохондрии. Поэтому было исследовано функционирование митохондрий почек при рабдомиолизе, а также влияние на них миоглобина в системе in vitro. В первую очередь были проанализированы функциональные характеристики митохондрий, выделенных из почек в различные сроки после индукции рабдомиолиза. В качестве основных параметров мы использовали скорости дыхания в состояниях V4S, V3U дыхательный контроль и уровень МДА. Результаты всех измерений усреднены и представлены в табл. № 1 и на рис. 5. Таблица 1. Функциональные характеристики препаратов митохондрий, выделенных из почек крыс на различных сроках после индукции рабдомиолиза и содержание в них МДА. Приведены средние значения, n = 3-9. * - p<0,05 по сравнению с контролем Проба, срок после нмоль О2/мин*мг белка дыхательный индукции S U контроль V4 V3 рабдомиолиза Контроль ср. 23,0 ±3,3 115,6 ± 16,0 5,2 ± 0,3 4ч 26,1 ± 4,7 117,0 ± 20,2 4,6 ± 0,2 15 ч 30,3 ± 2,6* 129,7 ± 4,7 4,3 ± 0,3 24 ч 32,5 ± 1,8* 150,2 ± 37,2* 4,6 ± 1,0 48 ч 17,4 ± 3,6 113,8 ± 10,6 6,7 ± 1,0 8 сут (192 ч) 15,6 ± 2,6 97,1 ± 14,6 6,2 ± 0,3 Из табл. 1 видно, что скорость дыхания в состоянии V4S заметно возрастает в течение первых 24 ч после индукции рабдомиолиза, что говорит о нарушении проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, очевидно, вследствие ее окислительной модификации. И действительно, уровень МДА, определенный в этих митохондриях, увеличен более чем в два раза по сравнению с контролем (рис. 5). Одновременно, в первые сутки после индукции рабдомиолиза наблюдается 11 некоторое снижение дыхательного контроля, примерно на 20%, в то время как максимальная скорость дыхания митохондрий в V3U состоянии достоверно не меняется в изучаемом промежутке времени. ВестернРис. 5. Уровень МДА, определенный в митохондриях, выделенных из почек крыс в различные сроки после индукции рабдомиолиза. * - p<0,05 по сравнению с контролем. блоттинг митохондрий, изолированных из почек крыс, показал, что уже через 4 ч после индукции рабдомиолиза из митохондрий начинает выходить цитохром с (рис. 6). Таким образом, можно заключить, что при рабдомиолизе происходит нарушение функционирования митохондрий клеток почки. Влияние миоглобина на функционирование митохондрий in vitro Для исследования влияния миоглобина на митохондрии клеток почки была использована система in vitro, в которой изолированные митохондрии клеток почки были инкубированы с миоглобином. Были проанализированы функциональные характеристики дыхания митохондрий после инкубации с миоглобином и уровень МДА, поскольку именно эти параметры наиболее значимо изменялись in vivo. Результаты представлены на рис. 7. Было выявлено, что при концентрации среде 4ч 15ч 24ч 48ч цит. с Рис. 6. Выход цитохрома с из митохондрий, изолированных на разных сроках после индукции рабдомиолиза. 12 миоглобина свыше 100 в мкМ возрастает скорость дыхания в состоянии V4S (рис. 7А), то есть миоглобин некоторому приводит к разобщению дыхания. Также было отмечено контроля при высоких значительное падение дыхательного концентрациях миоглобина коррелирующее с ним повышение уровня МДА (рис. 7В), и (рис. 7Г). При этом, уже начиная с небольших концентраций миоглобина, наблюдалось заметное уменьшение максимальной скорости дыхания митохондрий в состоянии V3U (рис. 7Б). Причиной снижения максимальной скорости может быть либо разрушение вследствие проксимальных сильного элементов окислительного электрон-транспортной стресса, либо цепи ингибирование терминальной цитохромоксидазы. Очевидно, миоглобин может нарушению функционирования механизмов, приводящих к непосредственно митохондрий. разобщению, приводить Для к определения изолированные почечные митохондрии инкубировались с миоглобином в присутствии ингибитора открытия митохондриальной поры, циклоспорина А и в присутствии хелатора ионов железа - дефероксамина. Результаты экспериментов представлены на рис. 8. Рис. 7. Влияние инкубации митохондрий почки с миоглобином на величины скоростей дыхания митохондрий V4S (А) и V3U (Б), дыхательный контроль (В) и продукцию МДА (Г). * - p<0,05 по сравнению с контролем. 13 На рис. 8 видно, что циклоспорин А достаточно эффективно предотвращает нарушение функционирования митохондрий при инкубации их с миоглобином, приводя к восстановлению дыхательного контроля (рис. 8Б) и снижению уровня МДА (рис. 8А). Однако восстановление параметров при этом не достигает контрольных значений. Дефероксамин также частично восстанавливал функции циклоспорин А и дефероксамин митохондрий. Заметим, что и эффективно предотвращали выход цитохрома с из митохондрий (рис. 8В). Очевидно, дисфункция митохондрий под действием миоглобина связана в первую очередь с открытием митохондриальной поры вследствие окислительного стресса. Дефероксамин хелатирует ионы железа и таким образом предотвращает их участие в окислительно-восстановительных реакциях. Однако, в последнее время появились данные, что дефероксамин обладает также антиоксидантными свойствами и препятствует образованию поперечных сшивок в миоглобине под действием перекисей – модификации, обладающей сильными прооксидантными свойствами (Reeder B. et al, Рис. 8. Влияние дефероксамина (DFO, 2 мМ) и циклоспорина (CsA, 100нМ) на изменения дыхательного контроля митохондрий, концентрации МДА и выход цитохрома с из митохондрий при инкубации их в присутствии 100 мкМ миоглобина. На блоте представлены митохондрии (1), митохондрии + 100 мкМ миоглобина (2), митохондрии + 100 мкМ миоглобина + 100 нМ циклоспорин А(3), митохондрии + 100 мкМ миоглобина + 2 мМ DFO(4). * - p<0,05 по сравнению с мб. 14 2008). Развитие нитрозильного стресса Помимо окислительного стресса, нами также было показано значительное увеличение уровня нитрита в сыворотке крови через 48 ч после индукции рабдомиолиза (данные не представлены). Мы предположили, что за избыточную продукцию NO в этом случае может быть ответственна митохондриальная NO-синтаза. Для определения ее роли в увеличении продукции оксида азота под действием миоглобина изолированные митохондрии почки крысы инкубировались с миоглобином в присутствии донора NO-синтазы L-аргинина и ее ингибитора метилового эфира Nω-нитро-L-аргинина миоглобина значительно (LNAME). Было показано, что в присутствии количество увеличивается, образующегося при этом митохондриями присутствие нитрита L-аргинина положительно влияет на этот процесс (рис. 9А). Увеличение продукции оксида азота коррелирует с увеличением уровня продуктов перекисного окисления митохондриальных липидов (рис. 9Б). Ингибитор NO-синтазы LNAME приводил к значительному снижению уровня оксида азота в среде(рис. 9А), и снижению количества МДА в митохондриях (рис. 9Б). Очевидно, развивающийся нитрозильный стресс при рабдомиолизе обусловлен активацией именно митохондриальной NO-синтазы. Рис. 9. Уровень нитрита (А) и МДА (Б), определенный в супернатанте митохондрий после инкубации их с миоглобином в присутствии донора NO Lаргинина (LA) и ингибитора NO-синтазы Nω-нитро-L-аргинина (LNAME). * - p<0,05 по сравнению с контролем, ** - по сравнению со 100 мкМ МБ. 15 Влияние митохондриально-адресованных соединений на развитие почечной недостаточности Как было показано выше, в развитие окислительного стресса в почке при рабдомиолизе активно вовлекаются митохондрии, которые, в свою очередь, могут служить источником АФК. В этой связи представляется целесообразным использование веществ, специфически удаляющих АФК из митохондрий – митохондриально-адресованных антиоксидантов группы SkQ. Они представляют собой конъюгат замещенного хинона (антиоксидантная часть) и липофильного монокатиона, обеспечивающего доставку соединения в матрикс митохондрии благодаря электродвижущей Рис. 10. Концентрации мочевины и креатинина и количество цитохрома с в крови крыс через 48 ч после индукции рабдомиолиза и при лечении SkQR1, доза 100 нмоль/кг. *- p<0,05 по сравнению с контролем,** - p<0,05 по сравнению с рабдомиолизом силе, создаваемой электрохимическим потенциалом ионов водорода. Соединения вводили внутрибрюшинно одновременно с индукцией рабдомиолиза, а затем каждые 12 ч. Оценка эффективности их действия производилась на вторые сутки после индукции рабдомиолиза. 16 Лечение рабдомиолизных крыс SkQR1 in vivo оказалось достаточно эффективным: наблюдалось значительное снижение уровня мочевины и креатинина в сыворотке крови (рис. 10А, Б) и уменьшение количества цитохрома с в сыворотке крови (рис. 10В). Было показано, что такая процедура также приводит к некоторому снижению уровня МДА (рис. 10Г). Гистологические исследования срезов почки через 48 ч после индукции рабдомиолиза и лечения SkQR1 показали уменьшение некротических очагов примерно на 25% и на 30% уменьшение количества гиалиновых цилиндров (данные не приведены). Таким образом, митохондриально-адресованный антиоксидант SkQR1 может эффективно использоваться для предотвращения дисфункции почки при рабдомиолизе. Другие исследованные в данной работе митохондриально- адресованные соединения оказалась неэффективными в предотвращении развития повреждения почки и почечной недостаточности (данные не представлены). Рис. 11. Изменение дыхательного контроля и уровня МДА изолированных митохондрий почки при инкубации их с нативным и протеолизированным миоглобином (МБ). * - p<0,05 по сравнению с нативным миоглобином. Влияние протеолитической деградации миоглобина на его нефротоксичность и взаимодействие с митохондриями В работе была показана возможность поглощения миоглобина клетками почечных канальцев. Очевидно, что в дальнейшем миоглобин в клетке может подвергаться протеолитической деградации. Исходя из этих 17 предпосылок было, исследовано воздействие на митохондрии и клетки почки протеолитически расщепленного миоглобина. В работе использовали миоглобин, инкубированный с пепсином в течение одного часа, так как при такой длительности инкубации получалось примерно одинаковое инкубации количество изолированных различных митохондрий пептидов. почки с Результаты нативным и процессированным миоглобином представлены на рис. 11. Обнаружено, значительно более что протеолизированный выраженными миоглобин прооксидантными обладает свойствами. Он приводит к значительному падению дыхательного контроля (рис. 11А) и более чем двукратному повышению уровня МДА по сравнению с нативным белком (рис. 11Б). Рис. 12. Сравнение действия обычного миоглобина (МБ) и миоглобина, подвергшегося протеолизу (клеточная культура). Ингибиторы протеаз значительно снижают уровень продукции АФК клетками канальцев, по сравнению с нативным миоглобином Аналогичный эффект наблюдался нами в другой системе - на клеточной культуре почки (рис. 12).Видно, что протеолизированный миоглобин более чем в два раза увеличивает уровень флуоресценции DCF, что означает увеличение уровня АФК. Добавление в среду инкубации с миоглобином 18 смеси ингибиторов протеаз значительно снижает уровень продукции АФК в клетках канальцев, по сравнению с нативным миоглобином (рис. 12). Таким образом, индуцированного по крайней мере окислительного в стресса этой в модели развитии миоглобинповреждения участвует протеолиз миоглобина. Появление продуктов деградации миоглобина в ткани почки при рабдомиолизе Рис. 13. Содержание гема и ионов свободного железа в митохондриях и цитозоле клеток почки через 5 часов после индукции рабдомиолиза. * p<0,05 по сравнению с контролем. Дальнейшим этапом данной работы стали анализ продуктов деградации миоглобина в ткани почки при рабдомиолизе и исследование возможности использования ингибиторов протеаз для предотвращения развития дисфункции почки. Гем и суммарная концентрация ионов железа (2- и 3-валентное железо) были определены отдельно в митохондриях и цитозоле почек, через 5 и 48 ч после индукции рабдомиолиза. Суммарные данные (определение уровня гема, ионов железа во фракциях митохондрий и цитозоля клеток почки) представлены на рис. 13 и рис. 14. Выявлено, что уже через 5 ч (рис. 13) после индукции рабдомиолиза в митохондриях и цитозоле почки значительно повышается уровень гема (в митохондриях примерно в 10 раз, в цитозоле – примерно в 19 6 раз). Однако и через 48 ч уровень гема в митохондриях все еще остается достаточно высоким, превышая контрольные значения в 3 раза (рис. 14). Аналогичным образом изменяется уровень ионов железа: через 5 ч после индукции рабдомиолиза в митохондриях и в цитозоле он увеличивается примерно в 2,5 и в 4 раза соответственно (рис. 13, 14). Таким образом, при рабдомиолизе в клетках почки наблюдается увеличение концентрации продуктов деградации миоглобина. Очевидно, что продукты деградации миоглобина могут также приводить к развитию сильного окислительного стресса, непосредственно повреждая митохондрии и другие клеточные структуры. Рис. 14. Содержание гема и ионов свободного железа в митохондриях и цитозоле клеток почки через 48 часов после индукции рабдомиолиза. * p<0,05 по сравнению с контролем. Известно, что высокие концентрации гема в клетке являются цитотоксичными и могут вызывать блок клеточного цикла, ингибировать клеточный рост и пролиферацию, окислять липиды, воздействовать на цитоскелет (Gonzales-Michaca L. et al., 2004). Высокие концентрации свободного железа также очень токсичны, так как железо легко вступает в окислительно-восстановительные реакции, приводя к увеличению продукции АФК. Таким образом, поглощение миоглобина клетками канальцев и его протеолиз – важный этап в развитии окислительного стресса и дисфункции почки при рабдомиолизе. 20 Выводы 1. Показано нарушение функционирования митохондрий почки in vivo при экспериментальном рабдомиолизе и при действии миоглобина in vitro. 2. Дисфункция митохондрий вызвана развитием неспецифической проницаемости митохондрий и сопровождается окислительным стрессом и повышением продукции NO. 3. При рабдомиолизе в клетках почки повышается уровень продуктов деградации миоглобина - гема и ионов железа. 4. Митохондриально-адресованный антиоксидант SkQR1 уменьшает дисфункцию почки при рабдомиолизе. Список публикаций 1. Plotnikov E.Y., Chupyrkina A.A., Pevzner I.B., Isaev N.K., Zorov D.B. Myoglobin causes oxidative stress, increase of NO production and dysfunction of kidneys mitochondria. Biochim biophis acta. 2009, 1792 (8): 796-803. 2. Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Чупыркина А.А., Даньшина М.И., Янкаускас С.С., Моросанова М.А., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Горячева Е.С., Пирогов Ю.А., Исаев Н.К., Зоров Д.Б. Новое поколение скулачев-ионов, обладающих выраженным нефро- и нейропротекторным действием. Биохимия, 2010, том 75, вып. 2, с. 177 – 184. 3. Plotnikov E.Y., Chupyrkina A.A., Jankauskas S.S., Pevzner I.B., Silachev D.N., Skulachev V.P, Zorov D.B. Mechanisms of nephroprotective effect of mitochondria-targeted antioxidants under rhabdomyolysis and ischemia/reperfusion. Biochim Biophys Acta. 2011 Jan;1812(1):77-86. 4. Плотников Е.Ю., Янкаускас С.С., Чупыркина А.А., Певзнер И.Б., Cкулачев В.П., Зоров Д.Б. Механизмы нефропротекторного действия митохондриально-адресованных антиоксидантов при ишемии/реперфузии почки и рабдомиолизе. // Тезисы конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино, с. 704-709, 2011. 21 5. в Чупыркина А.А., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Участие митохондрий миоглобин-индуцированном окислительном стрессе в клетках почки // Тезисы XV Международной конференции «Ломоносов-2008», Москва, с. 50, 2008 6. Плотников Е.Ю., Чупыркина А.А., Васильева А.К., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Роль активных форм кислорода и азота в патогенезе острой почечной недостаточности. // Тезисы IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, с. 474, 2008 7. Plotnikov E.Y., Chupyrkina A.A., Vasileva A.K., Kazachenko A.V., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. The role of reactive oxygen and nitrogen species in the pathogenesis of acute renal failure. Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports, 1777, S58-59, 2008. 8. Чупыркина А.А., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Исследование взаимодействия миоглобина и митохондрий почки в системе in vitro. // Тезисы Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицинской науки», Ярославль, с. 73, 2009. 9. Jankauskas SS, Chupyrkina AA, Plotnikov EY, Kazachenko AV, Kirpatovsky VI, Zorov DB. Effects of mitochondria-targeted antioxidants on acute renal failure. // EuroNanoMedicine с.96, 2009. 10. Чупыркина А.А., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Использование митохондриально - адрессованных антиоксидантов для предотвращения дисфункции почки при рабдомиолизе. // Тезисы III международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на Дону, с. 127, 2009. 11. Чупыркина А.А., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Механизм токсичного действия миоглобина при рабдомиолизе. // Тезисы 14 Международной Пущинской школы конференции молодых ученых. Пущино, с. 69, 2010. 12. Zorov D.B., Isaev N.K., Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Chupyrkina A.A., Pevzner I.B., Khryapenkova T.G., Jankauskas S.S., Morosanova M.A.,. Danshina M.I., Goryacheva E.S., Lozier E.R., Stelmashook E.V. Effects of SkQs on oxidative stress-mediated injuries of kidney and brain. // Тезисы докладов с 22 конференции с международным участием Homo Sapiens Liberatus Workshop. at A.N.Belozersky Inst., 2010 13. Чупыркина А.А., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Роль взаимодействия миоглобина с компонентами клетки в развитии дисфункции почки при миоглобинурии. // Тезисы XXIII Международной зимней молодежной научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, с. 117, 2011. 14. Pevzner I.B., Plotnikov E.Y., Chupyrkina A.A., Jankauskas S.S., Silachev D.N, Skulachev V.P. and Zorov D.B. Mechanisms of nephroprotective effect of mitochondria-targeted antioxidants under rhabdomyolysis and ischemia/reperfusion, Torino, Italy, FEBS J, p. 400, 2011. 15. Plotnikov E.Y, Chupyrkina A.A, Jankauskas S.S, Pevzner I.B., Zorova L.D., Skulachev V.P. and Zorov D.B. Nephroprotective potential of mitochondriatargeted antioxidants under rhabdomyolysis and ischemia/reperfusion, 7-th National Scientific Practical Smolensk, p. 231-232, 2011. Conference with International participation,