ФГБУ «РКНПК» Министерства Здравоохранения РФ Институт
advertisement
ФГБУ «РКНПК» Министерства Здравоохранения РФ Институт Клинической Кардиологии им. А.Л.Мясникова На правах рукописи Лакомкин Сергей Владимирович Влияние апелина на сократимость миокарда при сердечной недостаточности в эксперименте и определение его диагностической и прогностической ценности у больных с хронической сердечной недостаточностью. 14.01.05 - кардиология 03.03.01 - физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, проф. С.Н.Терещенко доктор медицинских наук, проф. В.И. Капелько 1 Москва-2015 год Оглавление. Оглавление ……………………………………………………………..…….2-4 Список сокращений………………………………………………………….5-8 Введение…………………………………………………………………...…9-12 Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………….……………….........12-42 I.1. Общие свойства апелин-APJ системы…………………...………..13-25 I.1.1. Апелин-APJ система………………………………………………..13-14 I.1.2. Влияние апелина на обмен веществ…………………………...…...14-15 I.1.3. Роль апелина при ангио- и канцерогенезе, фиброзе, нарушениях функции печени и почек, других патологиях………15-16 I.1.4. Апелин-APJ и РААС……...…………………………………….......16-17 I.1.5. Взаимодействие Апелин-APJ системы с лекарственными препаратами …………………….………………17-18 I.1.6. APJ как механорецептор…………………………………………....18-19 I.1.7. Действие апелина на сердечно-сосудистую систему…………..…19-23 I.1.8. Пути сигнализации APJ-рецептора в кардиомиоцитах……….….23-24 I.1.9. Апелин и проводящая система сердца………………………….…24-25 I.2. Апелин-APJ система и нарушение кровообращения………….…25-31 I.2.1. Экспериментальные исследования………………………………..25-27 I.2.2. Активность апелин-APJ системы у больных с СН…..……….….27-31 I.3. Исследование действия апелина при введении in vivo у человека………………………………………………………..….31-33 I.4. Модификация апелинов, их аналоги и новые блокаторы рецепторов APJ…………………………………………….………..33 I.5. Апелин как биомаркёр. Сравнение с другими биомаркёрами ХСН……………………………………………...…34-40 I.6. Общая характеристика моделей СН………………………….…..40-42 2 I.7. Глава II. Резюме………………………………………………….……….….42 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ……….…...42-55 II.1. Экспериментальное исследование………………………………42-50 II.1.1. Методы оценки СН у животных……………………………….....42-47 II.1.1.1. Эхокардиография……………………………………………....….42-43 II.1.1.2. Импедансная кардиография (ИКГ)……………………….……43-46 II.1.1.3. Катетеризация левого желудочка сердца…………………..….46-47 II.1.1.4. Гистологическое исследование………………………………....47 II.1.2. Общая характеристика экспериментов……………………….….47 II.1.3. Протоколы исследований……………………………………......47-50 II.1.3.1. Исследование апелинов при болюсном введении контрольным крысам…………………………………………....47-48 II.1.3.2. Исследование апелинов при инфузионном введении…………49-50 II.1.4. Изопротереноловая модель СН………………………………….50 II.2. Клиническое исследование………………………………..……50-55 II.2.1. Общая характеристика больных…………………………..……50-52 II.2.2. Лабораторные методы диагностики…………………………....52-54 II.2.3. Эхокардиографическое исследование…………………..………54-55 II.3. Статистическая обработка данных……………………………....55 Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ…………………………………………………..55-91 III.1. Клиническое исследование.………………………………….….55-60 III.1.1. Диагностическое значение биомаркеров при ХСН……………55-58 III.1.1.1. Корреляционный анализ………………………………………...58-59 III.1.2. Прогностическое значение апелина-12 и других биомаркёров ХСН…………………………………………..…..59-60 III.2. Экспериментальное исследование………………………….…61-91 III.2.1. Метод импедансной кардиографии…………………………....61-62 III.2.2. Сравнение инвазивных и неинвазивных показателей сократимости на инотропные стимулы…………………….…62-63 III.2.3. Катехоламиновая модель сердечной недостаточности………63-64 3 III.2.4. Оценка тяжести ХСН эхокардиографическим методом у крыс……………………………………………….....64-66 III.2.5. Сократимость и расслабимость сердец с ХСН, измеренная инвазивными методами…………………………...66-68 III.2.6. Болюсное введение апелинов…………………………………..68-77 III.2.6.1. Апелин-12-0 (нативный)………………………………………..68-70 III.2.6.2. Апелин-12-1………………………………………………………70-72 III.2.6.3. Апелин-12-2………………………………………………………72-74 III.2.6.4. Апелин-12-3………………………………………………………74-75 III.2.6.5. Апелин-12-4………………………………………………………75-77 III.2.7. Инфузионное введение апелинов 12-0 и 12-2 здоровым крысам………………………………………………....77-84 III.2.8. Инфузионное введение апелинов 12-0 и 12-2 крысам с хронической сердечной недостаточностью…….…………........84-88 III.2.9. Эхокардиографическое исследование крыс с сердечной недостаточностью……………………………………………..…..88-90 III.2.10. Заключение………………………………………………………90-91 Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ……………………………...91-103 IV.1. Клиническое исследование……………………………………....91-93 IV.1. 1. Сравнение диагностического и прогностического значения апелина-12 и галектина-3 с другими биомаркёрами…………...91-93 IV.2. Экспериментальное исследование…………………………….....93-103 IV.2.1. Метод импедансной кардиографии……………………………….93-95 IV.2.2. Характеристика хронической сердечной недостаточности, вызванной подкожным введением изопротеренола………….…95-96 IV.2.3. Аналоги апелинов………………………………………………....96-99 IV.2.4. Инфузионное введение апелина-12-0 и апелина-12-2 здоровым животным…………………………………………..…99-100 IV.2.5. Характеристика действия апелина-12-0 и апелина-12-2 у животных с ХСН…………………………………………………100-103 4 ВЫВОДЫ……………………………………………………………….….103-104 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………….….104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………....105-130 Список сокращений. АД – артериальное давление [мм рт. ст.] АМФ – аденозинмонофосфат АПФ – ангиотензин-превращающий фермент АПФ-2 – ангиотензин-превращающий фермент второго типа АЦП – AT1 – аналого-цифровой преобразователь рецептор к ангиотензину II первого типа Вч-ТнТ – тропонин Т, измеренный высокочувствительным способом ГМФ – гуанозинмонофосфат ДДЛЖ – диастолическое давление в левом желудочке [мм рт. ст.] ДКМП – дилатационная кардиомиопатия ДППZ – длительность периода предизгнания, измеренная по импедансограмме ДППAo – длительность периода предизгнания, измеренная по сигналу давления в аорте иАПФ – ингибиторы АПФ ИБС – ишемическая болезнь сердца ИЗО – изопротеренол (искусственный агонист β-адренорецепторов) ИКГ – импедансная кардиография ИЛ интерлейкин – ИМТ – индекс массы тела ИМ – инфаркт миокарда КДО – конечно-диастолический объем ЛЖ [мл] КДД – конечное диастолическое давление [мм рт. ст.] КМЦ – кардиомиоциты КСО – конечно-систолический объем ЛЖ [мл] ЛАГ – легочная артериальная гипертензия 5 ЛЖ – левый желудочек сердца ЛДГ – лактатдегидрогеназа ЛКА – левая коронарная артерия МВ-КФК – МВ-фракция креатинкиназы МКМ – ММР – микроманометр (Милларовский катетер) матриксные металлопротеиназы МОК – минутный объем крови [мл/мин] НАДФ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат ОСН – острая сердечная недостаточность ОНМК – острое нарушение мозгового кровообращения ОКС – острый коронарный синдром ПЦР – полимеразная цепная реакция РААС – ренин-ангиотензин-альдостероновая система САС – симпатадреналовая система САД – среднее артериальное давление в аорте [мм рт. ст.] СВ – сердечный выброс (СД), СДЛЖ – систолическое давление в левом желудочке [мм рт. ст.] СН – сердечная недостаточность СР – саркоплазматический ретикулум С-РБ – С-реактивный белок СУЗС – степень утолщения задней стенки левого желудочка ТЭЛА – тромбоэмболия легочной артерии УО – ударный объем левого желудочка [мл] ФВ – фракция выброса (%) ХСН – хроническая сердечная недостаточность ХОБЛ – хроническая обструктивная болезнь легких ЦНС – центральная нервная система ЧСС – частота сердечных сокращений ЭхоКГ – эхокардиография APJ – трансмембранный семидоменный рецептор апелина, связанный с 6 G-белком AUС – (area under the curve) площадь под ROC- кривой Akt – семейство серин/треониновых протеинкиназ, фосфорелирующих разные внутриклеточные белки BMPR2 – (bone morphogenetic protein receptor, type II) рецептор костно-морфогенетического протеина 2 BNP – (brain natriuretic peptide) мозговой натрийуретический пептид DAG – (diacylglycerol) диацилглицерин DEP – (duration of ejection period) длительность периода изгнания DS – крысы линии Dahl, чувствительные к нагрузке NaCl , «солечувствительные» DR – крысы линии Dahl устойчивые к нагрузке NaCl , «солеустойчивые» +dP/dTmax – скорость нарастания давления в желудочке сердца -dP/dTmax – скорость убывания давления в желудочке сердца dP/dtmax/P – максимальная скорость нарастания давления в ЛЖ отнесённая к давлению при котором она достигается (индекс сократимости Верагута (Veragut-Krayenbuhl), ИС) [с-1] dZ/dt – первая производная Z-сигнала импедансограммы (ΔZ) d2Z/dt2 – вторая производная Z-сигнала импедансограммы (ΔZ) eNOS – эндотелиальная NO-синтаза ERK1/2 – (extracellular signal-regulated kinase) внеклеточная сигналрегулируемая киназа Gq – G-белок, связанный с APJ-рецептором GPCR – (G-protein-coupled receptors) рецепторы, сопряжённые с G-белком HIF-1α – (hypoxia-inducible factor 1-alpha) гипоксией индуцируемый фактор 1α IP3 – инозитолтрифосфат IL – интерлейкин KLF2 – (Krűppel-Like-Factor-2) Круппель-подобный фактор-2 L-NAME – (NG-mono-methyl-L-arginine ester) NG-моноэтиловый эфир 7 L–аргинина LV-CR-Exp , (КР) – экспоненциальная константа расслабления сердца [с-1] MMP – (matrix metalloproteinase) матриксная металлопротеиназа MLCK – (myosin light-chain kinase) киназа легких цепей миозина NHE – Na+-H+-обменник NCX – Na+-Ca2+-обменник NT-proBNP – N-терминальный мозговой натрийуретический пептид NOS1 – нейрональная NO-синтаза NOS3 – эндотелиальная NO-синтаза PAo – давление в аорте PЛЖ – давление в левом желудочке сердца PIP2 – фосфатидилинозитол дифосфат PKC – протеинкиназа С PLC – фосфолипаза С Pyr-апелина-13 – пироглутамат апелина-13 PEP, Д-ПП – (pre-ejection period) длительность периода предизгнания RyR2 – рианодиновый рецептор саркоплазматического ретикулума SERCA2 – АТФаза, основной Са2+ насос саркоплазматического ретикулума SR – саркоплазматический ретикулум S-нитрозоглутатион – донатор и депонированная форма NO в организме Sd – площадь поперечного сечения ЛЖ в конце диастолы [см2] Ss – площадь поперечного сечения ЛЖ в конце систолы [см2] TNF-α – (tumor necrosis factor) фактор некроза опухоли α ТнI – VTI – тропонин I интеграл линейной скорости кровотока [см] VEGF – (vascular endothelial growth factor) фактор роста эндотелия сосудов 8 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) является исходом многих сердечно-сосудистых заболеваний. По данным исследований ЭПОХА-ХСН и MONICA распространенность ХСН в популяции достигает 7% [1]. За последние десятилетия произошёл кардинальный пересмотр тактики лечения сердечной недостаточности, стали широко применяться бета-адреноблокаторы, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (иАПФ) и антагонисты альдостерона, которые влияют непосредственно на патогенез болезни, блокируя ренин-ангиотензин-альдостероновую (РААС) и симпато-адреналовую (САС) системы. Несмотря на это пятилетняя выживаемость больных с III-IV ФК ХСН остается низкой (25% у мужчин и 38% у женщин) [2-4] и проблемы её лечения при громадных экономических затратах (100 млрд. долларов в США и Европе ежегодно [95]) далеки от разрешения. Недавно возникло понятие диастолической сердечной недостаточности, которая в свою очередь требует отдельных подходов к лечению [113-116]. Диагностика СН также претерпела изменения. Не так давно в арсенале врачей появились эхокардиография (ЭхоКГ), МРТ, МСКТ. Вместе с тем клиницистам необходимы надежные и дешевые биомаркеры, способные определить тяжесть и исход заболевания. Сейчас для этих целей используются мозговой натрийуретический пептид (BNP) и его N-терминальный фрагмент (NT-proBNP). Хотя эти маркёры обладают высокой чувствительностью, они не лишены важных недостатков. Во-первых, их отличает низкая специфичность, зависимость от функции почек, пола, возраста и др. Во-вторых, у BNP и NT-proBNP есть «серая зона», которая мешает достоверно интерпретировать их показатели. Втретьих, эти пептиды не дают точный прогноз выживаемости больных с 9 ХСН. Всё это заставляет учёных искать новые маркёры и сейчас активно изучаются такие вещества как эндотелин-1, тропонины, хромогранин, адипонектин, растворимый ST2-рецептор, матриксные металлопротеиназы, остеопрогерин, белки-лектины, апелин и другие. Биомаркёры чаще всего задействованы в патологических цепях развития ХСН и поэтому, помимо диагностических свойств, могут рассматриваться в качестве мишеней для терапии или непосредственно являться лекарственными средствами. Это особенно актуально в связи с тем, что, существующая патогенетическая терапия ХСН себя исчерпала и необходим поиск новых, желательно безвредных для организма лекарственных препаратов. Пептид апелин является одним из таких средств. Апелин изначально синтезируется во множестве тканей из 77-членного пропетида, который под действием пептидаз делится на более мелкие фрагменты. Высокий уровень пептида обнаружен в тканях сердечнососудистой системы. Как было показано, его концентрация в крови менялась на разных стадиях ХСН и были попытки использовать его как биомаркёр. У него есть специфический рецептор APJ, а систему апелин-APJ рассматривают как антагонист системе ангиотензин II – АТ1. Кроме того, пептид является гипотензивным агентом и антагонистом альдостероновой системы. Недавно было открыто его положительное инотропное действие как на изолированных препаратах, так и на целом организме у животных и человека [13,18,21,23]. Некоторые исследователи считают его одним из самых мощных инотропных агентов [19,20]. Поскольку апелин синтезируется в организме, он обладает малой токсичностью. Опираясь на эти данные, мы решили изучить свойства апелина как маркёра ХСН у людей, создать искусственные модификации пептида, обладающие большей устойчивостью in vivo и попытаться использовать их для лечения сердечной недостаточности у животных. Цель исследования Изучить диагностическую и прогностическую ценность концентрации пептида апелина в плазме крови больных ХСН при дилатационной 10 кардиомиопатии и ИБС различных функциональных классов. Оценить влияние апелина-12 и его синтетических аналогов на сократимость миокарда на модели сердечной недостаточности у животных, вызванной катехоламином (изопротеренолом). Задачи 1. Оценить диагностическую и прогностическую ценность концентрации апелина-12 в крови больных ХСН при ИБС и ДКМП, провести сравнение с другими биомаркёрами ХСН (галектин-3, NT-proBNP и тропонин Т). 2. Изучить действие апелина-12 и его 4-х синтетических аналогов на сократительную функцию сердца неинвазивными (эхокардиография и импедансная кардиография) и инвазивным (катетеризация желудочка сердца Милларовским катетером) методами у здоровых животных. 3. Изучить кардиотропное действие апелина-12 на катехоламиновой модели сердечной недостаточности и отобрать его наиболее эффективный синтетический аналог. 4. Оценить возможность использования неинвазивного метода импедансной кардиографии у животных для оценки сократимости сердца. Научная новизна Впервые было определено прогностическое значение уровней апелина12 у больных с ХСН ишемической этиологии и при кардиомиопатии различных функциональных классов. Впервые было показано, что апелин-12 не является маркёром тяжести сердечной недостаточности у больных с ХСН при ДКМП и ИБС. Впервые были установлены различия в кардиотропном действии апелина-12 и его аналогов, зависящие от способа модификации молекулы. Впервые было установлено различие кардиотропного эффекта апелинов на сердцах здоровых животных и больных ХСН. У здоровых животных апелины больше увеличивали сократимость, а у больных – расслабимость миокарда. При этом сердца животных с ХСН реагировали на апелин сильнее, чем здоровые. 11 Впервые установлено, что модификация молекулы апелина-12 посредством замены аргинина на метиларгинин, а метионина на норлейцин (апелин-12-2) оказывает более выраженное кардиотропное действие на сердца животных с ХСН, чем апелин-12. Это дало основание рекомендовать данную молекулу для создания лекарственного средства. У крыс впервые применён метод неинвазивной тетраполярной импедансной кардиографии для оценки сократительной способности сердца в сочетании с прямой катетеризацией сердца и эхокардиографическими данными. Практическая значимость Показано, что апелин-12 является менее достоверным диагностическим и прогностическим маркером, чем NP-proBNP и вч-ТнТ. Кардиотропное действие апелина-12 и его синтетических аналогов в экспериментах на животных оказалось более сильным у животных с ХСН по сравнению с нормальными животными. Наиболее сильным кардиотоническим эффектом из всех синтетических аналогов, как на сердцах in vivo, так и на изолированных кардиомиоцитах обладал аналог апелин-12-2. При этом повышалась расслабимость и сократимость миокарда. Эти данные позволили рекомендовать данный аналог для дальнейшей разработки в качестве лекарственного средства для лечения ХСН. Доклинические исследования данной молекулы проходят в настоящее время в ИЭК РКНПК. ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В последнее время внимание учёных всё чаще привлекают пептиды, синтезируемые в организме как в норме, так и при различных патологиях сердечно-сосудистой системы. Они могут модулировать функцию сердца посредством воздействия на кальциевый транспорт, ионные насосы, энергетический обмен. Для аутопептидов характерна низкая токсичность и малое число побочных реакций, поэтому на их основе возможно создание 12 лекарственных средств лечения сердечной недостаточности и биомаркёров, имеющих как диагностическое, так и прогностическое значение. Одним из таких перспективных пептидов является апелин. I.1. Общие свойства апелин-APJ системы I.1.1. Апелин-APJ система. Еще до открытия апелина в 1993 году O’Dowd с соавт. обнаружил новый GPCR-рецептор, который сначала был назван орфановым (то есть «сиротским» - так называют все рецепторы без известного лиганда), а впоследствии переименован в APJ. APJ – это семидоменный трансмембранный рецептор, сопряжённый с G-белком [5,154]. Известно о способности APJ к интернализации схожей с рецепторами AT1, то есть он обладает возможностью погружаться с поверхности мембраны внутрь клетки, становясь ядерным рецептором. Однако этот механизм до конца не изучен [25,72]. Ген, кодирующий APJ, находится в длинном плече XI хромосомы. Последовательность нуклеотидов ДНК определена с помощью полимеразноцепной реакции (ПЦР) и установлено, что она на 30-50% идентична рецептору к ангиотензину II первого типа (AT1), а сам рецептор состоит из 377 аминокислот [5]. Тем не менее, ангиотензин II на APJ рецептор не действует. APJ-рецепторы встречаются практически во всех органах человека. Наибольшее их количество обнаружили в лёгких, сердечно-сосудистой системе, почках, ЦНС, щитовидной железе и жировой ткани [8]. Лиганд к вновь открытому рецептору оставался неизвестен вплоть до 1998 г., когда Tatemoto и соавт. выделили из экстракта желудка быка новый пептид, названный апелином. Он и оказался искомым лигандом к APJ [6]. Дальнейшие исследования показали, что ген апелина находится в X хромосоме, была расшифрована его аминокислотная последовательность. Первоначально апелин синтезируется как 77-аминокислотный пропептид, который под действием эндопептидаз делится на более короткие фрагменты [6-8]. На сегодняшний день известны апелины, состоящие из 36, 19, 17, 15, 13 13 и 12 аминокислотных остатков, обладающие различным биологическим действием. Апелин преимущественно оказывает своё влияние паракринным путём, то есть вырабатывается в клетках и действует на «ближайшее окружение», хотя и эндокринный путь остаётся очень важным [37]. Можно предположить, что экспрессия апелина в тканях неотрывно связана с распространённостью в них рецепторов APJ. За его внутриклеточную секрецию отвечает аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум и секреторные пузырьки [34]. Выработку пептида потенцирует множество факторов, в числе которых гипоксия [75], ишемия [24], начальная стадия сердечной недостаточности [63-66], повышение концентрации глюкозы в крови, ожирение [58] и дегидратация [55-57]. Обратным эффектом на экспрессию апелина обладают инсулин и ангиотензин II. [37,59]. Период полужизни апелина в крови у человека составляет менее 5 минут, а метаболизм тесно связан с активностью АПФ [18,47]. Важная роль принадлежит апелин-APJ системе в процессах адгезии вируса иммунодефицита человека на поверхности клетки [9], жировом и углеводном обмене при развитии сахарного диабета 2 типа, гомеостазе жидкости [54-57]. У млекопитающих апелины полностью идентичны между собой по структуре, рецепторы же APJ могут незначительно отличаться. Например, APJ рецепторы, выделенные из тканей человека и крысы, гомологичны между собой на 74% [74]. I.1.2. Влияние апелина на обмен веществ. Апелины и APJ-рецепторы присутствуют как в почках, так и во многих областях головного мозга. Их высокая концентрация обнаружена в супраоптическом и паравентрикулярном ядрах гипоталамуса, то есть областях, отвечающих за гомеостаз жидкости [35]. В этих ядрах синтез и секреция апелина регулируется вазопрессином [54]. С другой стороны, инъекция апелина непосредственно в желудочек мозга тормозит освобождение вазопрессина, что приводит к падению его концентрации в 14 плазме на 40%. Из этого следует, что пептид обладает диуретическими свойствами [55,56]. При водной нагрузке концентрация апелина в крови повышается, а при повышении осмолярности крови - падает. При этом концентрация вазопрессина изменяется противоположным образом [155]. То есть апелин является важным регулятором гомеостаза жидкости в организме [57]. In vitro было показано, что апелин образуется в жировой ткани и влияет на обмен глюкозы и жиров как адипоцитокин [58]. Введённый внутривенно, он снижает концентрацию сахара в плазме при глюкозной нагрузке через инсулинозависимый и инсулинонезависимый механизмы [59,60]. У животных «нокаутных» по гену апелина уменьшается чувствительность тканей к инсулину, а экзогенное введение пептида приводит к её восстановлению [61]. I.1.5. Роль апелина при ангио- и канцерогенезе, фиброзе, нарушениях функции печени и почек, других патологиях. По некоторым данным апелин подобен эндотелиальному фактору роста сосудов (VEGF) и способствует ангиогенезу через недавно найденный BMPR-2 рецептор. Также он ингибирует апоптоз эндотелиальных клеток, в то время как сведения о его влиянии на экспрессию гладкомышечных клеток вен и артерий противоречивы. Усиленный рост сосудов в опухолях под действием апелина, то есть его проканцерогенное действие, активно изучается онкологами [76-78]. По данным Karadag S. с соавторами [176] уровень апелина у пациентов с гемодиализом был равен 1,45 ± 0,37 нг/мл и он отрицательно коррелировал с возрастом, диаметром левого предсердия, ФВ, КДД, общим холестерином и холестеринами низкой и высокой плотности, паратиреоидным гормоном и уровнем щелочной фосфатазы. Уровень апелина в крови возрастал при хроническом гепатите прямо пропорционально поражению печени: при фиброзе – в 2 раза, при циррозе – в 3 раза [177]. У больных с ревматоидным артритом на ранних стадиях уровень апелина в крови резко падал по сравнению со здоровыми пациентами, поэтому авторы предложили 15 использовать его в качестве биомаркёра этого заболевания [178]. Усовершенствовав метод масс-спектрометрии, учёные установили, что основная форма в которой апелин находится в плазме крови здоровых людей – это пироглутамил апелина-13 [(pyr)apelin-13], а его концентрация варьирует от 7,7 до 23,3 пиког/мл [179]. У мышей, нокаутированных по гену апелина, высококалорийная диета вызывала ожирение и недостаточность через 18 месяцев. В митохондриях таких животных наблюдалось сниженное окисление глюкозы и жирных кислот. Введение апелина в течение 4-х месяцев восстанавливало не только окисление в митохондриях, но и сократимость и расслабимость сердца [180]. О роли апелин-APJ системы при разных заболеваниях можно прочитать в современных обзорах [162,171,181185]. I.1.4. Апелин-APJ и РААС. Несмотря на то, что APJ и AT1 рецепторы очень похожи между собой по структуре (оба являются семидоменными, то есть 7 раз прошивают клеточную мембрану) и значительно совпадают по аминокислотной последовательности, ангиотензин II не является лигандом для APJ, что доказано в опытах на культуре фибробластов и клеток яичника Китайского хомячка [6]. По современным представлениям системы апелин-APJ и РААС являются антагонистами, и их действие на АД, венозный тонус и гомеостаз жидкости разнонаправлено [36]. Вероятно, в организме APJ и AT1 рецепторы расположены недалеко друг от друга, так как тесно взаимодействуют между собой. In vitro доказана димеризация этих рецепторов между собой [48, 157]. В этом процессе апелин, а не ангиотензин-II играет главную роль, при этом действие ангиотензина-II ослабляется. Связывание апелина со своим рецептором тормозит образование ангиотензина-II, а фармакологическая блокада АТ1 сопровождается повышением выработки апелина и APJ. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ), как эндокарбоксипептидаза, разрушает пептид, отщепляя последовательно по одной аминокислоте с Сконца [45,46]. Апелин может уменьшать прессорное действие ангиотензина16 II, как через механизмы связанные с эндотелиальной NO-синтазой, так и независимыми путями [38, 39]. У «нокаутных» по APJ-рецепторам мышей вазоконстрикторная реакция на ангиотензин-II была более выражена, чем у мышей дикого типа [16]. Ангиотензин-II в свою очередь оказывает прямое тормозящее действие на экспрессию генов апелина и APJ [37]. Животные, которым вводились малые субпрессорные дозы ангиотензина-II в течение 24 часов, демонстировали снижение экспрессии апелина в сердце, и этот эффект снимался блокадой АТ1-рецепторов [40]. У крыс линии SHR со спонтанной артериальной гипертензией повышалась плотность АТ 1-рецепторов, но уменьшалось количество APJ и концентрация апелина. Фармакологическая блокада АТ1 приводила к дозозависимому усилению активности апелин-APJ системы и снижению у этих животных артериального давления [41]. АПФ-2 – отрицательный регулятор РААС, который превращает ангиотензин-II в неактивный ангиотензин-1-7. Апелин также является субстратом АПФ-2. У мышей, нокаутированных по гену апелина, снижена и концентрация АПФ-2. В сердцах мышей с ХСН in vivo с отсутствием гена рецептора АТ1 апелин через свой APJ-рецептор повышал АПФ-2 и сократимость. Таким образом, РААС и АПФ-2 связаны через апелин-APJ систему [158]. Согласно последним экспериментальным данным, апелин защищал сердце мышей от фиброза и ремоделирования сосудов при введении ангиотензина-II. Своё благотворное действие на эти патологические процессы апелин оказывал через NO-зависимый механизм [42]. I.1.5. Взаимодействие Апелин-APJ системы с лекарственными препаратами Изучали роль РААС и апелиновой системы в экспериментальном почечном фиброзе у мышей. Обструкция одной почки вызывала в ней экспрессию апелина-APJ по сравнению со здоровой почкой. Это приводило к увеличению фосфорилирования Akt/eNOS и повышению уровня NO. Блокада АТ1 рецепторов ангиотензина II лозартаном повышала экспрессию апелина и почечный фиброз. А вот если на фоне лозартана блокировали APJ рецепторы 17 с помощью агента F13A, то фиброз уменьшался, как и фосфорилирование Akt/eNOS. Ингибирование eNOS введением L-NAME также повышало фиброз [172]. Высокие солевые нагрузки приводили к гипертензии у крыс линии Dahl и через 7 недель у них развивалась ХСН. У крыс повышался атеросклероз, ремоделирование, экспрессировались факторы фиброза (проколлаген 1 и 3-го типа, фибронектин), снижалась фракция выброса и фракция укорочения. При этом снижалась экспрессия апелина и APJ и фосфорилирование Akt и eNOS. Все это снималось введением ольмесартана, блокатором ангиотензинового рецептора АТ1. Добавка L-NAME отменяла вызванные сартаном улучшения функции сердца и ремоделирования, связанные с апелин-APJ системой [173]. Апелин-APJ система также участвует в эффекте статинов. Статины повышали экспрессию Круппель-подобного фактора-2 (KLF2) и тромбомодулина, которую апелин снижал. Статины конкурентно с апелином ингибировали адгезию моноцитов на эндотелии и могли транскрипционно регулировать экспрессию APJ с положительной обратной связью [174]. I.1.6. APJ как механорецептор Была изучена роль APJ-рецепторов на модели сердечной гипертрофии, вызванной коарктацией аорты у мышей. Часть животных была нокаутирована только по гену апелина, другая часть – только по гену APJ. В этой модели кардиомиоциты испытывали хроническую перегрузку давлением с последующим развитием сердечной недостаточности. Мыши, лишённые гена APJ, показали большую устойчивость к развитию гипертрофии и сердечной недостаточности, в то время как группа без гена апелина не отличалась от контрольной. Об этом также свидетельствовали молекулярные маркёры гипертрофии – α и β тяжёлые цепи миозина. То есть APJ-рецепторы имеют двойственную природу: с одной стороны, они хеморецепторы, активируемые апелином, с другой – механорецепторы, реагирующие на перегрузку давлением [43]. Эти данные получили подтверждение в работе A. Strohbach и соавт. Они сравнивали экспрессию апелинов и APJ на монослойных 18 культурах эндотелиальных клеток человека, подвергая их различным напряжениям сдвига, например 1,5 дин/см2, что характерно для кровотока в венах, и 20 дин/см2, соответствующее артериальному кровотоку. При этом маленькие нагрузки повышали экспрессию APJ в артериях гораздо больше, чем в венах. Большие напряжения, напротив, способствовали активной выработке APJ в венах. Ситуация с экспрессией апелина была полностью противоположной. [67]. Возможная связь реакции апелин-APJ системы с перерастяжением камер сердца, а также функциональную связь APJ рецепторов через G-белки с многофункциональным белком β-арестином при гипертонии и формировании СН рассматривается в обзоре [159]. I.1.7. Действие апелина на сердечно-сосудистую систему. APJ-рецепторы расположены в эндотелии вен и артерий, также они представлены в гладкомышечном слое сосудов. В сердце рецепторы находятся на цитоплазматической мембране кардиомиоцитов и эндотелиальных клеток эндокарда. Известно, что в предсердиях экспрессия апелина многократно выше, чем в желудочках и это, возможно, главный источник апелина крови [33,34]. Высокая концентрация апелина и APJ обнаружена в областях гипоталамуса, ответственных за регуляцию сердечнососудистой системы [35]. Доказано, что низкомолекулярные апелины (12, 13 и 17-й) обладают более выраженным эффектом на сердце и сосуды за счёт высокой афинности к APJ, в то время как апелин-36 медленнее диссоциирует от рецептора [8,73]. Фрагменты короче 12 аминокислот биологически инертны [11,12]. Действие апелина на сосуды зависит от нескольких факторов: состояния эндотелия, фазы сна или бодрствования, функциональности рецепторного аппарата. Апелин рассматривается как артериальный и венозный вазодилататор, снижающий тонус как резистивных, так и ёмкостных сосудов, уменьшая тем самым периферическое сосудистое сопротивление и пред- и постнагрузку на сердце [13]. Вазодилатирующее действие апелина связано с его влиянием на внутреннюю оболочку сосудов и 19 реализуется через NO-зависимый механизм. Апелин-APJ система стимулирует транскрипцию и фосфорилирование эндотелиальной NOсинтазы, воздействуя на Gi-белки (ингибиторные) и фосфоинозитидный путь [16,17]. Это повышает концентрацию нитратов и нитритов в плазме. Блокада NO-синтазы L-NAME (NG-mono-methyl-L-arginine ester) значительно ослабляет сосудорасширяющие эффекты апелина [12]. Если эндотелийзависимый вазодилататорный эффект на 2/3 опосредован NO-синтазой, то на 1 /3 он зависит от простациклинового пути, на который L-NAME уже не влияет [44]. Доказано, что апелин схожим образом расширяет коронарные артерии [18]. Также пептид может воздействовать непосредственно на APJ-рецепторы гладкомышечных клеток сосудов, активируя Gq-белки, что способствует активации фосфолипазы С, протеинкиназы С и киназы лёгких цепей миозина. В итоге это ведёт к сокращению мышечной оболочки сосуда, то есть к вазоконстрикции [28,30]. Этот эффект апелина доказан в опытах на артериях, лишённых интимы [14,15]. После введения в течение 30 дней мышам LNAME, блокатора eNOS, развивалась гипертензия и эндотелиальная дисфункция (кольца таких сосудов не реагировали на ацетихолин). Введение Pyr-апелина-13 внутрибрюшинно в дозе 296 мкг/кг таким животным не снижало, а повышало на 20 мм рт. ст. среднее АД [164]. При введении апелина в область продолговатого мозга (rostral ventrolateral medulla) также наблюдались прессорные реакции со стороны сосудов [86,87]. На модели перевязки сонных артерий у мышей, нокаутированных по генам апелина или APJ, показано, что апелин способствует миграции клеток в зону повреждения и росту неоинтимы. При этом экспрессия APJ-рецептора возрастала в 10 раз, а апелина только в 5 раз [161]. Апелин-APJ система может включаться в ремоделировании сосудов при ЛАГ [162]. Аэробные часовые тренировки пожилых людей (67-70 лет) 3 раза в неделю через 8 недель приводили к повышению уровня апелина и NO в плазме крови и уменьшению жесткости стенки сонных артерий [163]. 20 Что касается сердца, то гипоксия вызывает увеличение выработки апелина в кардиомиоцитах, по-видимому, через гипоксия-индуцибельный фактор 1α (HIF-1α) перфузированного по [49]. На модели Лангендорфу, и в изолированного культуре сердца, кардиомиоцитов новорождённых крыс было показано, что ишемия, как и гипоксия, вызывает увеличение экспрессии апелина в 6-8 раз. Пептид, добавленный перед гипоксией или ишемией, в концентрации 30 пкмоль/л защищает культуру кардиомиоцитов от апоптоза, а изолированное сердце от ишемических и реперфузионных повреждений [50]. Своё защитное действие апелин реализует через фосфорилирование и активацию растворимых киназ (RISK) [51]. Также он предохраняет кардиомиоциты от активных форм кислорода, образующихся при реперфузии. Уменьшение оксидативного стресса происходит путём повышения активности супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы, а также через NO-зависимый механизм [156]. Кроме того, апелин препятствует ещё одному фактору повреждения - открытию митохондриальной поры [50]. Известно о защитной роли пептида от негативного воздействия катехоламинов, в частности, изопротеренола [22]. Исследования, проведённые в лаборатории метаболизма миокарда РКНПК, показали, что апелин ограничивает зону инфаркта миокарда, если вводится до ишемии или в самом начале реперфузии [10,53]. Часть авторов рассматривает возможность его применения в качестве средства защиты миокарда при остром инфаркте миокарда, а также во время проведения ангиопластики и операций коронарного шунтирования [52]. Введение Pyr[1]apelin-13 в течение 5 дней после ишемии миокарда и реперфузии у крысхроников уменьшало размер инфарктной зоны, снижало уровни ЛДГ, МВ-СК и МДА в крови [160]. На модели ишемии задней конечности мыши продемонстрировано уменьшение зоны некроза и увеличичение неоангиогенеза под действием апелина [84]. Влияние апелина на сократимость изучалось в опытах на целом сердце [19], полосках предсердий [20] и одиночных кардиомиоцитах [21], где он 21 оказывал инотропное влияние на миокард даже в субнаномолярных концентрациях (0,01-10 нМ). Поэтому некоторые исследователи считают его одним из наиболее мощных положительных инотропных агентов на сегодняшний день [19]. Этот эффект апелина был заметен в опытах на животных как при болюсном введении (повышался dP/dT и СВ), так и при хронической инфузии с помощью вживлённых микронасосов. В этом случае гипертрофия стенок левого желудочка не развивалась. [13,22-24]. Кардиомиоциты мышей, лишённых генов апелина и APJ, имели слегка нарушенную сократимость [25]. В тоже время такие мыши выглядели нормальными, не отличались от обычных животных по массе тела, потреблению пищи, частоте сердечных сокращений (ЧСС) и морфологии миокарда. Однако с возрастом (более 6 месяцев), и особенно при перегрузке давлением (модель коарктации аорты), у них развивалась тяжёлая сердечная недостаточность без гипертрофии миокарда [26]. Все это говорит о важной роли системы апелин-APJ для поддержания работы сердца в условиях перегрузки давлением. Важно отметить, что инотропное действие пептида не зависело от ангиотензина II, эндотелина-1, катехоламинов или освобождения NO [19]. Инотропный эффект апелина у здоровых крыс значительно уменьшался при селективной блокаде Na+-H+-обменника сарколеммы, а стимуляция этого обменника приводила к внутриклеточному защелачиванию и повышению чувствительности сердечных миофибрилл к ионам Ca2+. Апелин, активируя обменник и ионные токи водорода и натрия, увеличивал внутриклеточный pH. Таким образом, повышение сократимости миокарда под влиянием апелина связано с Na+-H+-обменником [21,27]. По данным других авторов апелин повышал сократимость сердец через активацию MLCK, PKC и фосфорилирование ERK1/2, повышал чувствительность миофибрилл к Са2+. Блокада РКС снимала положительный инотропный эффект апелина [165]. Как у нормальных мышей, так и у нокаутированных по гену апелина и APJ, апелин практически не влиял на входящие Ca2+ токи изолированных кардиомиоцитов [19]. Однако, часть авторов приводит 22 данные, что пептид повышал внутриклеточный Ca2+ в изолированных кардиомиоцитах [29] и трабекулах, выделенных из сердец крыс с СН [28]. По всей видимости, более выраженный эффект апелин оказывает на кальций, содержащийся в цистернах саркоплазматического ретикулума, нежели чем на Са2+, входящий через ионные каналы сарколеммы. I.1.8. Пути сигнализации APJ-рецептора в кардиомиоцитах По современным представлениям механизм инотропного действия апелина включает в себя несколько стадий (рис. 1): 1) Взаимодействие APJ-рецептора с апелином на клеточной мембране 2) Активация связанного с рецептором Gq-белка 3) Активация фосфолипазы С (PLC), которая приводит к образованию инозитолтрифосфата (IP3) и диацилглицерина (DAG) 4) IP3 действует на Ca2+-насосы саркоплазматического ретикулума, повышая Ca2+, внутриклеточный что ведёт к увеличению сократимости миоцита. 5) С другой стороны, DAG активирует протеинкиназу С (РКС), которая фосфорилирует Na+-H+-обменник. При накоплении ионов Na в клетке включаются сарколеммальные Na+-Ca2+-обменники, способные увеличивать внутриклеточную концентрацию Ca2+. Работа Na+-H+-обменника внутриклеточной среды приводит и повышению к защелачиванию чувствительности миофибрилл клетки к Ca2+, что также повышает сократимость кардиомиоцитов. Рисунок 1. Известные к настоящему времени внутриклеточные механизмы инотропного действия апелина [31]. Обозначения: Ap – апелин, Gq – G-белок, связанный с APJ-рецептором, PLC – фосфолипаца С, SR – саркоплазматический ретикулум, NHE – Na+-H+-обменник, NCX – Na+-Ca2+23 обменник, PKC – протеинкиназа С, PIP2 – фосфадилинозитол дифосфат, IP3 – инозитолтрифосфат, DAG – диацилглицерин. I.1.9. Апелин и проводящая система сердца Хотя по данным пэтч-клямпа (пэтч-клямп - электрофизиологическая методика для изучения свойств ионных каналов) апелин мало влиял на входящие трансмембранные токи кальциевых каналов [29,121], в эксперименте на бодрствующих овцах введение больших болюсных доз апелина-13 (1 мг) приводило к двухфазному изменению давления и ЧСС (острое падение АД и увеличение ЧСС, которое сменялось подъёмом АД и падением ЧСС). В этот момент у части животных на ЭКГ регистрировались разные степени AV-блокады. Одновременно достоверно повышались концентрации аргинин-вазопрессина, адренокортикотропина, альдостерона, кортизола, предсердного и мозгового натрийуретического гормона, циклической АМФ и ГМФ в плазме крови [32]. Y.M. Kim в опытах на культурах изолированных продемонстрировал прямой кардиомиоцитов дромотропный новорождённых эффект апелина. крыс Пептид, введённый в концентрации 200 нмоль/л, повышал скорость проведения возбуждения на 31%. Известно, что длительная фибрилляция предсердий у человека связана с повышенной активностью НАД(Ф)H-оксидазы. У таких людей также снижается концентрация апелина в тканях предсердий. Активность НАД(Ф)H-оксидазы в предсердиях мышей, нокаутированных по гену апелина, повышалась в 2,7 раза по сравнению с мышами дикого типа, 24 поэтому апелин можно электрофизиологических рассматривать свойств как предсердий эндогенный [68]. регулятор APJ-подобную иммунореактивность находили в области Т-тубул и интеркалярных дисков кардиомиоцитов (КМЦ), выделенных из ЛЖ крыс. В концентрации 10 нМ апелин увеличивал скорость проведения в монослоях КМЦ [21]. На КМЦ из предсердий кролика измеряли токи и потенциалы. Пептид в дозе 1 и 10 нМ укорачивал длительность потенциала действия, не изменяя амплитуду потенциала действия и потенциала покоя. В этих же концентрациях апелин повышал быстрый Na+-ток, ультрабыстрые K+-токи и токи Na+/Ca2+обменника, но уменьшал поздний Na+-ток, Ca2+-токи L-типа, а выходящие выпрямляющие K+-токи не изменял [166]. I.2. Апелин-APJ система и нарушение кровообращения. I.2.1. Экспериментальные исследования. Система апелин-APJ изучалась в экспериментальных исследованиях как при острой, так и при хронической сердечной недостаточности. На модели острого инфаркта миокарда у крыс активность апелин-APJ увеличивалась в течение первых 24 часов после инфаркта и сохранялась на повышенном уровне до 6 недель в случае развития СН. [24,49]. В другой работе тяжёлая СН создавалась с помощью повторных введений изопротеренола. Доказательством тяжести патологии служило выраженное падение АД и рост КДД ЛЖ. У таких животных отмечалось снижение экспрессии апелин-APJ системы, однако одновременное введение с изопротеренолом апелина способствовало защите сердца от повреждений и задерживало развитие СН [22]. На изолированных трабекулах, выделенных из сердец с СН после инфаркта миокарда, апелин улучшал сократимость кардиомиоцитов [28]. Как уже было упомянуто, мыши, лишённые гена апелина, были более чувствительны к развитию СН при коарктации аорты, а с возрастом у таких мышей СН развивалась сама по себе [26]. У людей с дилатационной кардиомиопатией концентрация апелина в миокарде падала в 2-2,5 раза, а концентрация APJ возрастала в 2,5-4 раза [167]. То же самое 25 наблюдали в инфарктной зоне в эксперименте на хорьках. Мыши, нокаутированные по гену апелина, хуже переносили ИМ, чем животные дикого типа. У них было снижено фосфорилирование Akt- и ERK-киназ в миокарде и уже на 1-3-й день после ИМ повышались концентрации нейтрофилов и макрофагов и активность TNFa, IL-1b, IL-6 и матриксных металлопротеиназ - MMP8, MMP9 и MMP12 по сравнению с нормальными животными. Сократимость этих сердец по данным ЭхоКГ и импедансографии была снижена, а введение апелина уменьшало размер инфарктной зоны и повышало сократимость [167]. Интересное исследование проведено японскими учёными W. Koguchi с соавт. Они использовали для своих экспериментов крыс серии Dahl. Одни из них были «солечувствительные» (DS), другие, служившие контролем, «солеустойчивые» (DR). Всем животным с 6-ой недели назначалась солевая диета (8% NaCl). У линии DS развивалась гипертония и впоследствии тяжёлая сердечная недостаточность, в то время как контрольная группа DR оставалась здоровой. Затем крысам серии DS вшивались микронасосы, часть из которых вводила апелин-13-пироглютомат (AP-13-pyr) в дозе 20 мкг/кг/день (подгруппа DSHF-AP), другие насосы были заряжены физиологическим раствором (подгруппа DSHF-V). Несмотря на то, что уровни АД у группы DSHF-AP оставались сопоставимы со значениями DSHF-V (повышено в 2 раза по сравнению с DR), у них было отмечено значительное уменьшение гипертрофии ЛЖ (ИММЛЖ 2,74 DSHF-AP vs 4,49 DSHF-V) и веса лёгких (5,5 г vs 12,6 г). По данным внутрижелудочковой импедансной кардиографии ЛЖ-индекс сократимости (отношение давления в ЛЖ к его объёму) уменьшался в 2,3 раза в подгруппе DSHF-V и восстанавливался у DSHF-AP практически до значений контроля (2,39 мм рт. ст./мл DR vs 2,3 DSHF-AP). При цитогистохимическом исследовании у пролеченных животных найдено значимое снижение интерстициального и периваскулярного фиброза. Кроме того, у группы DSHF-AP почти в 4 раза повышалась экспрессия рецепторов APJ в сравнении с DSHF-V [62]. 26 У собак с ХСН после ИМ уровень апелина (но не APJ) в плазме и его экспрессия в миокарде были снижены по сравнению с контролем, снижена была и сократимость миокарда. Введение апелина повышало сократительную функцию и снижало КДД [168]. У крыс с почечной гипертонией развивалась ХСН с систолической и диастолической недостаточностью, с периваскулярным фиброзом в почках. Введение pyr-апелин-13 в дозах 1 и 10 мкг/кг улучшало сократительную функцию и расслабление сердца, уменьшался фиброз. При этом апелин накапливался в клеточной мембране КМЦ, а концентрация белка APJ в ней снижалась [169]. I.2.2. Активность Апелин-APJ системы у больных сердечной недостаточностью К настоящему времени проведено немало исследований по оценке активности апелин-APJ системы как в крови, так и в тканях при различных формах и тяжести СН у человека. В своей работе M. Chen оценивала экспрессию апелина у 11 больных ХСН, которым имплантировалось ресинхронизирующее устройство. Было замечено, что уровнь апелина в тканях левого желудочка повышался более чем в 2 раза после имплантации устройства. Также уровень апелина измерялся в плазме больных ХСН различных функциональных классов (n = 83). При ФВ>45%, средняя концентрация апелина составила 3.98±0.34 нг/мл, при 45%>ФВ>25% – 6.08±0.72 нг/мл, при ФВ<25% – 4.11±0.58 нг/мл. Таким образом, активность пептида увеличивалась уже при лёгких формах ХСН, достигая максимума у пациентов средней тяжести, и снижалась у тяжёлых больных [63]. G. Foldes измерял концентрации апелина в крови и тканях миокарда методом HPLC и экспрессию апелина и APJ по mРНК c помощью ПЦРанализа. Исследованию подвергались образцы сердец здоровых доноров (n=9) по тем или иным причинам непригодных для трансплантации, а также пациентов с СН 3-4 ф.к. по NYHA с идиопатической ДКМП (n=6) или ИБС 27 (n=7). У последних двух групп кусочки миокарда получали с помощью катетерной биопсии полостей сердца. Установлено, что выработка апелина в левом желудочке увеличивалась в 4.7 раза при ХСН, обусловленной ИБС, и в 3.3 раза при ДКМП. У больных снижались как концентрации апелина плазмы, так и количество рецепторов APJ в желудочках и предсердиях. В сердцах доноров уровень апелина был в 200 раз выше в правом предсердии, чем в левом желудочке (650 пг/мг. vs 2.8 пг/мг), что ещё раз доказывает гипотезу о важной роли предсердий в секреции апелина [64]. В более поздних работах K. S. Chong изучали концентрацию апелина в плазме больных трансплантацию ХСН сердца. различной Все этиологии, пациенты (n=202) направленных были на различных функциональных классов и имели ФВ<35%. При этом большинство (73%) из включённых в протокол обладали тяжёлой СН (3-4 ф.к.) со средней ФВ=15,6%. Выяснилось, что по сравнению с контрольной группой (3,76 нг/мл), у больных уровень апелина был значительно ниже (0,85 нг/мл) и его концентрация коррелировала с пиковым поглощением кислорода, ФВ ПЖ, но не с возрастом, полом, ИМТ, почечной функцией или концентрациями NTproBNP [65]. В исследование J Goetze было включено 53 пациента с нормальной функцией сердца и тяжёлыми паренхиматозными заболеваниями лёгких (хроническая обструктивная болезнь лёгких, фиброз, эмфизема), 10 больных с идиопатической лёгочной гипертензией и повышенным давлением в правом предсердии и 22 человека с выраженной дисфункцией левого желудочка без лёгочной патологии. В то время как NT-proBNP оказался неэффективен для отличия больных с паренхиматозной лёгочной патологией от здоровых, апелин-36 снижался у таких пациентов в 3,3 раза по сравнению с контрольной группой (35 vs 117 мкмоль/л). Также соответственно в 2,1 и 4 раза падала его концентрация при ХСН и лёгочной гипертензии [66]. Следовательно, апелин может реагировать как на левожелудочковую, так и на правожелудочковую недостаточность и патологию лёгких. Некоторые авторы 28 считают, что апелин, тормозя апоптоз эндотелиальных клеток и стимулируя пролиферацию гладкомышечных клеток, может напрямую участвовать в патогенезе лёгочной гипертензии [80,85]. P. Francia наблюдала 14 пациентов (9 мужчин и 5 женщин) с ХСН различной этиологии 3-4 ф.к. (ФВ<35%), плохо поддающейся медикаментозной коррекции. На ЭКГ у больных регистрировалась полная блокада левой ножки пучка Гиса (QRS>120 мс), в связи с чем им имплантировались ресинхронизирующие устройства. Оценивался уровень апелина плазмы до, а также через 2 дня и 9 месяцев после начала бивентрикулярной стимуляции. До имплантации ресинхронизатора концентрация пептида составляла в среднем 0,47 нг/мл, что было в два раза ниже, чем у здоровых добровольцев (0,97 нг/мл); через 2 дня изменений не происходило; однако через 9 месяцев уровни апелина в крови больных (0,99 нг/мл) не отличались от контрольной группы [69]. Несколько иные данные получили финские учёные, исследовавшие пациентов с идиопатической ДКМП и ФВ<45%. В протоколе приняло участие 65 человек, большая часть которых имела лёгкие проявления СН (1-2 ф.к. по NYHA). Все они получали оптимальную медикаментозную терапию, включая бета-блокаторы и иАПФ. Уровни апелина-13 в плазме не отличались у больных различных функциональных классов СН и никак не коррелировали с пиковым потреблением кислорода. Более того, исследователи не нашли разницы между концентрацией пептида у больных и в контрольной группе. При этом, такие биомаркёры как NT-pro-BNP, ИЛ-6, TNF-α и норадреналин достоверно повышались у больных и имели связь с тяжестью СН [70]. B. Chandrasekaran изучал концентрации апелина-12 в крови коронарного синуса, аорты и почечной вены у пациентов с ХСН различной этиологии (n=9). Полученные данные сравнивались с контрольной группой (n=8) и выглядели следующим образом: апелин в коронарном синусе (310 vs 470 пкг/мл), аорте (330 vs 340 пкг/мл), почечной вене (290 vs 300 пкг/мл). В целом, уровень апелина больных СН был ниже, а более высокая его 29 концентрация у больных в аорте по сравнению с коронарным синусом говорит, что сердце, возможно, не единственный важный источник в продукции апелина [71], но продукция апелина миокардом при ХСН падает. Стоит отдельно упомянуть роль пептида при лёгочной гипертензии. Апелин ингибировал вазоконстрикторные эффекты эндотелина-1 на изолированных резистивных лёгочных артериях, выделенных у нормальных крыс, но не оказывал подобных влияний на сосудах, взятых у животных с ЛГ. Это может быть связано со снижением количества APJ-рецепторов в артериях животных, подвергнутых гипоксии [79]. На монокроталиновой модели лёгочной гипертензии in vivo было показано, что апелин нормализует индексы сократимости ПЖ по сравнению с контрольными животными (dP/dtmax и dP/dtmin) [88]. При остром введении апелин расширял лёгочные артерии и снижал в них давление. Хотя эти эффекты были достаточно скромные, порядка 10-17%, возможно, что при хроническом введении его лечебное действие оказалось бы более выраженным [89-91]. Очевидно, что система апелин-APJ играет важную роль в развитии как левожелудочковой, так и правожелудочковой сердечной недостаточности, участвуя в ремоделировании сосудов легких [74,162,170,171]. Анализируя эти клинико-экспериментальные данные, можно найти общие закономерности в работе апелин-APJ системы. Концентрация апелина в плазме начинает расти при начальных проявлениях ХСН и достигает максимальных значений у больных средней тяжести. Дальнейшее утяжеление патологии ведёт к значительному снижению уровня пептида. До конца не ясно, почему так происходит. Стоит отметить, что у разных авторов средние концентрации апелина в крови контрольных групп сильно разнились и колебались от 90 до 3580 пкг/мл (то есть отличались более чем в 40 раз) [18]. Эти разногласия могут быть обусловлены как несовершенством используемых тест-систем (низкая специфичность к апелину, кросс-реакции между апелинами разной длины), так и неполной экстракцией апелинов из плазмы. Не стоит забывать и о 30 субъективном аспекте в трактовке тяжести сердечной недостаточности. Ошибки могут подстерегать в непонимании факторов, влияющих на систему апелин-APJ. Как мы уже знаем, АПФ разрушает пептид и приём иАПФ или сартанов, вероятно, влияет на концентрацию апелина в крови. I.3. Исследование действия апелина при введении in vivo у человека. Помимо изучения активности системы апелин-APJ при СН, были предприняты попытки экзогенного введения апелина людям с целью оценки его воздействий на сердечно-сосудистую систему. A. Japp и N. Cruden [18,47] использовали четыре схемы назначения пептида добровольцам и больным ХСН. В первом случае в возрастающих дозах (0,3-3 нмоль/мин., по 6 минут каждая ступень) вводился AP-13-pyr в сравнении с ацетилхолином и нитропруссидом натрия. Протокол охватывал 26 здоровых добровольцев и 18 больных ХСН 2-3 ф.к. Проводилась оценка кровотока лучевой артерии и вены. Все три агента вызывали дозозависимую артериальную дилатацию, но только ацетилхолин показал более мощный эффект у здоровых, чем у больных. Это необычно, так как и апелин и ацетилхолин действуют через один и тот же эндотелий-зависимый механизм. Вазодилатирующее свойство апелина нивелировалось в случае одновременного введения с пептидом L-NAME. На венозный кровоток апелин влияния почти не оказывал в отличие от нитропруссида натрия. Вторая схема включала 6 человек без ХСН и гемодинамически значимых стенозов коронарных артерий, которым выполнялась коронароангиография и интракоронарно болюсно вводился апелин-36 (дозы 20 и 200 нмоль/2мл). Эффект апелина сравнивался с нитроглицерином (болюс 100 мкг/2мл). Коронарный проводник находился в устье ствола ЛКА, а контрастирование сосудов с оценкой скорости потока осуществлялось до и через 30 сек. после каждого введения. Другой катетер располагался в левом желудочке сердца для измерения систолического давление, КДД и dP/dTmax. Доза апелина 20 нмоль не влияла на скорость коронарного кровотока, а болюс 200 нмоль значимо увеличивал ее. В отличие от нитроглицерина, введение 31 которого сопровождалось повышением ЧСС и снижением среднего АД, апелин не изменял эти показатели. Инъекция 200 нмоль пептида повышала в желудочке dP/dTmax и слегка снижала КДД. В третьем протоколе здоровым добровольцам внутривенно вводили нарастающие концентрации апелина-36 или AP-13-pyr (30; 100; 300 нмоль/мин по 5 мин. каждая). Из вены другой руки осуществлялся забор крови в исходном состоянии, на пике инфузии максимальной дозы, а также через 5 и 30 минут после прекращения введения. Концентрация апелина в плазме варьировала от 0,24 пкг/мл в исходном состоянии до 116 пкг/мл на пике введения. Однако, уже через 5 мин. после прекращения инфузии уровень пептида снижался до 40 пкг/мл, а через 30 мин. достоверно не отличался от исходного. Это позволило авторам работы предположить, что период полувыведения апелина составляет менее 5 мин. В последнем исследовании проводилась инфузия AP-13-pyr больным ХСН (n=8) и здоровым добровольцам (n=8). Концентрации апелина составили 30; 100 и 300 нмоль/мин по 5 минут каждая доза, кумулятивно. Через 30 минут «отмывки» вводились такие же объёмы плацебо. Оценивались параметры гемодинамики и осуществлялся отбор крови на BNP, аргинин-вазопрессин и активность ренина плазмы (базовый уровень; через 5; 15 и 30 минут после инфузии). Установлено, что апелин достоверно повышал СВ и снижал АД и периферическое сосудистое сопротивление как у больных, так и у здоровых. ЧСС повышалась также в обеих группах, хотя эффект был более выраженным у добровольцев. По-видимому, это связано с приёмом бета-блокаторов в группе ХСН. Активность ренина и BNP была достоверно выше у пациентов с ХСН, а введение апелина не изменяло их концентрацию как у здоровых, так и у больных. Исследование с введением апелина в течение 6 часов здоровым добровольцам (n=8) провёл G. Barnes. Было показано, что инфузия апелина (30 нмоль/мин) увеличивала СВ, ЧСС, скорость потока в лёгочной артерии и 32 уменьшала периферическое сосудистое сопротивление по сравнению с плацебо [117]. I.4. Модификация апелинов, их аналоги и новые блокаторы рецепторов APJ. Синтезируются новые формы апелина для внутрисосудистого введения, которые должны дольше циркулировать в кровотоке и продолжительное время оказывать свое действие. Например, создана пироглютаматная модификация апелина-13 (AP-13-pyr), где молекула защищена с N-конца [15]. Разработаны различные циклические аналоги апелина [92]. Замена Стерминального остатка фенилаланина на D-аланин в пептиде избирательно подавляла его гипотензивное действие [120]. Созданы аналоги апелина: NleInpBrF pyr-1-apelin-13 (apelin analogue I) и NleAibBrF pyr-1-apelin-13 (apelin analogue II) более устойчивые к действию АПФ, которые в концентрации 1,5 мкг/мл при 20 мин реперфузии на модели тотальной ишемии и реперфузии сердец по Лангендорфу повышали восстановление и уменьшали размер инфарктной зоны (особенно аналог-2) [167]. Ведутся работы по созданию пролонгированной таблетированной формы препарата. Мыши, нокаутированные по гену апелина, практически не отличаются от животных дикого типа, а значит, скорее всего, существуют другие, ещё не открытые, лиганды для APJ-рецептора [25]. Создан агонист APJ-рецептора (ML233), селективность которого более чем в 21 раз превосходит его воздействия на АТ-1 [175]. Изучается и другой селективный блокатор APJрецептора (ML221), действие которого проверено на клеточных культурах in vitro, а его физиологическое свойство in vivo ещё предстоит изучить. По предварительным данным он в 37 раз более избирателен к APJ рецепторам, чем к АТ-1 [93-94]. I.5. Апелин как биомаркёр. Сравнение с другими биомаркёрами ХСН. Morrow и de Lemos [96] сформулировали основные критерии для «идеального» биомаркёра. Во-первых, он должен обладать точностью и 33 повторяемостью результатов, коротким временем измерения, доступностью для клиницистов и приемлемым по цене. Во-вторых, определяемый параметр должен нести в себе информацию, которую не всегда возможно получить из других методов диагностики, а главное, он должен способствовать принятию правильного медицинского решения. Биомаркёры, являясь биологически активными веществами, часто сами вовлечены в патологический процесс, поэтому они могут рассматриваться в качестве мишеней для терапевтического воздействия. По их концентрации можно диагносцировать, выявлять стадии и давать кратковременный и долговременный прогноз исхода заболевания. Что касается ХСН, то используемые здесь маркёры условно делят на 7 типов [97]: 1. Маркёры воспаления (С-реактивный белок, ИЛ-1, 6, 18, TNF-α, APO-1) 2. Маркёры оксидативного стресса (миелопероксидаза, малоновый альдегид, окисленные ЛПНП, изопростаны) 3. Маркёры ремоделирования внеклеточного матрикса (матриксные металлопротеиназы, тканевые ингибиторы металлопротеиназ, коллагеновые пропептиды) 4. Нейрогормоны (норадреналин, ренин, ангиотензин-2, альдостерон, аргинин-вазопрессин и эндотелиин) 5. Маркёры повреждения миоцитов (сердечные тропонины T и I, киназа лёгких цепей миозина-1, МВ-КФК) 6. Маркёры напряжения миоцитов (BNP, NT-pro-BNP, проадреномедуллин, растворимый ST2- рецептор) 7. Новые (хромогранин, адипонектин, остеопрогерин, галектин-3 и апелин). BNP и NT-proBNP. В настоящее время для диагностики ХСН наиболее широко применяются BNP и NT-proBNP. Оба этих пептида синтезируются в кардиомиоцитах из единого 134-аминокислотного предшественника, который делится эндопептидазами на две части: 32-аминокислотный BNP и 7634 аминокислотный NT-proBNP. Эти пептиды вызывают артериальную вазодилатацию, повышение диуреза и натрийуреза, снижают активность РААС и САС [98]. Катаболизм обоих пептидов происходит в почках и концентрация напрямую зависит от функции почек, возраста, пола, миокардиального фиброза, но главный фактор, влияющий на их экспрессию, это перерастяжение кардиомиоцитов [99]. Поэтому, BNP и NT-proBNP чётко реагируют на развитие СН, особенно при её декомпенсации. Для BNP критерием декомпенсации сердечной недостаточности является концентрация в плазме крови более 400 пкг/мл, в тоже время у полностью здоровых людей она не превышает 100 пкг/мл. Между этими значениями находится так называемая «серая зона», когда о наличии заболевания судить только по уровню пептида затруднительно [100]. NT-proBNP также имеет «серую зону», но его концентрация ещё сильно зависит и от возраста. NTproBNP отличает более продолжительное время полужизни, чем BNP, поэтому он считается лучшим показателем напряжения желудочков и предиктором прогноза [101]. Доказательства того, что натрийуретические пептиды могут иметь как диагностическое, так и прогностическое значение при ХСН было получено в крупных рандомизированных исследованиях PRIDE, AD-HERE и STARS-BNP. В исследовании AD-HERE на 48629 больных с острой декомпенсированной СН была обнаружена почти линейная зависимость между уровнем BNP и госпитальной смертностью [102]. Концентрация BNP точно отражала выживаемость больных с острой декомпенсированной СН независимо от ФВ ЛЖ [103]. BNP лучше предсказывал смертность, чем уровни норадреналин или эндотелиин-1 в плазме [101]. Есть данные о пользе BNP и NT-proBNP для стратификации риска развития СН у бессимптомных больных, особенно пожилых, гипертоников, пациентов с сахарным диабетом или бессимптомным атеросклеротическим поражением коронарных артерий. Сердечные тропонины. Кардиомиоциты повреждаются вследствие тяжёлой ишемии, а также из-за перенапряжения, воспаления, окислительного 35 стресса или под действием нейрогормонов. Сердечные тропонины Т и I являются миофибриллярными белками и появляются в системном кровотоке при повреждении клеток сердца, поэтому они используются в первую очередь как маркёры острого коронарного синдрома. При ХСН происходит хроническое микроповреждение миокарда и с появлением в арсенале врачей высокочувствительных тестов определения тропонинов их стали использовать в качестве маркёров СН. По данным исследований тропонин I оставался независимым предсказателем смертности, а повышение тропонина Т более 0,02 нг/мл у больных с ХСН достоверно увеличивало риск их смерти [104-105]. То есть наличие высокого уровня сердечных тропонинов в крови больных ХСН является плохим прогностическим фактором. Новые биомаркёры. В настоящее время изучаются и другие маркёры СН. Хорошие обзоры по биомаркерам при ХСН можно найти в работах [107,108]. Например, хромогранин А – полипептидный гормон, который вырабатывается в миокарде и обладает потенциально негативными инотропными свойствами. Его уровень в плазме поднимается у больных с СН [109]. Адипонектин – пептид, состоящий из 244 аминокислот. Находится в обратной связи с ИМТ. Его концентрация в плазме повышается у тяжёлых больных с ХСН, особенно при наличии сердечной кахексии. Этот белок был предиктором смертности у больных с СН [110]. Галектин-3. Галектины относятся к белкам-лектинам, которые способны связываться с β-галактозидами, маннозой и другими углеводами [122,123]. У млекопитающих их семейство насчитывает 15 представителей. Практическую значимость в кардиологии получил только галектин-3. Галектины - это цитоплазматические белки, которые, однако, могут секретироваться клетками. Они не имеют сигнальной последовательности и не являются гормонами. Связываясь с поверхностью клетки, лектины влияют на работу её рецепторов, оказывают регуляторное действие [124], изменяют клеточную активность и мембранный транспорт [125]. 36 Секреция галектина-3 регулируется цитоплазматической мембраной [126]. За выработку галектина-3 ответственны в основном макрофаги, но его экспрессия может осуществляться и в других клетках [128,129]. Пептид вырабатывается во многих органах и тканях: лёгких, селезёнке, желудке, кишечнике, надпочечниках, яичнике, матке, сердце, мозжечке, поджелудочной железе и печени [127]. Галектин-3 принимает участие в фиброзе. Известно, что фиброз и формирование рубца – ключевые процессы ремоделирования сердца. В этом задействованы фибробласты, миофибробласты и макрофаги [130-132]. Концентрация белка-лектина повышалась при фиброзирующих процессах различных органов: циррозе печени [133,134], идеопатическом фиброзе лёгкого [135], хроническом панкреатите [136]. На животных моделях отмечено повышение уровня галектина при фиброзе сердца [137,138] и почек [139]. Галектин-3 рассматривают в качестве важного посредника для удаления конечных продуктов гликозилирования белков. Считается, что эти молекулы образуются в неферментативных реакциях между белками и остатками сахаров. Накапливаясь с возрастом и при окислительном стрессе, они поглощаются клетками и играют важную роль в формировании почечной и сердечной недостаточности [140]. Есть данные, что продукты распада белков вносят вклад в повышение жёсткости миокарда [141]. Галектин-3, выводя такие комплексы из организма, защищает ткани от повреждения и препятствует формированию фиброза [142,143]. Известно, что галектин участвует в патологических процессах атеросклероза и диабета. Уровень экспрессии галектина-3 в тканях миокарда резко повышался при развитии СН и достоверно отличался у крыс с компенсированной и декомпенсированной СН. Установлено, что сосредоточение галектина-3 в тканях тесно связано с макрофагами, фибробластами и внеклеточным матриксом, но не с кардиомиоцитами. Интересно, что инфузия галектина-3 в 37 перикард здоровых крыс приводила к снижению ФВ с 66,1 до 51,8%. При этом достоверно повышалось отношение сырого веса лёгких к весу тела [144]. Большое клиническое исследование по изучению маркёров СН у больных выполнено в Голландии – Deventer-Alkmar Heart Failure study (DEAL-HF) [145]. В этом протоколе приняло участие 232 пациента с ХСН IIIIV ф.к. по NYHA. Целью исследования было выявление прогностической ценности нового биомаркёра галектина-3 в сравнении с широко известным маркёром СН – NT-proBNP. При ROC-анализе смертности больных область под кривой (AUС) для галектина равнялась 0,612, а для NT-proBNP – 0,611. То есть оба этих маркёра оказались схожи по прогнозу выживаемости, но выше всего показатели смертности были у пациентов с одновременно повышенными уровнями и галектина-3 и NT-proBNP. В такой когорте она в 1,5 – 2 раза превышала значения других групп. В работе Ravi V. Shah и др. [146] сравнивались концентрации галектина-3 в долговременным плазме с прогнозом эхокардиографическими у 115 пациентов с показателями острой и одышкой, поступивших в отделение БИТ. В дальнейшем 76-и пациентам из них был поставлен диагноз острая сердечная недостаточность (ОСН). Концентрация галектина-3 имела прямую связь с возрастом, функцией почек, уровнями NTproBNP и С-реактивного белка. Из 115 обследованных больных более высокие концентрации галектина имели те пациенты, которые умерли в течение первого года или 4-х лет, что позволило авторам исследования рассматривать галектин-3 в качестве независимого предиктора смертности больных ХСН. В протоколах [83,106,147,186] также обнаружено, что высокие концентрации галектина-3 в крови связаны с высоким риском развития ХСН, ремоделированием сердца, высокой смертностью. В тоже время в исследовании AHFS (Acute heart failure syndromes) на 3622 пациентах в США показано, что галектин-3 не обеспечивал хорошего 38 прогноза ОСН и проявлял себя только совместно с BNP. Повышение его концентраций было обычно связано с развитием почечной дисфункции [187]. Есть данные другой работы, где галектин-3 также больше коррелировал с функцией почек, чем с тяжестью СН [188]. Галектин-3 оказался более сильным критерием прогноза исхода СН, чем NT-proBNP, хотя и проигрывал ему в точности постановки диагноза ХСН. В последнее время галектин-3 рассматривают как маркёр фиброза, а его повышение свидетельствует о морфологическом прогрессировании заболевания [150-151]. Следовательно, галектин-3 может в дальнейшем использоваться в качестве вероятной терапевтической мишени для воздействия на патологические процессы СН. Нужно учитывать, что галектин-3 является модулятором воспаления, апоптоза и фиброза при почечных заболеваниях [152-153]. Совместное применение галектина-3 с другими маркёрами СН, которые уже вошли в широкую клиническую практику [97,148,149], может значительно повысить точность прогноза для пациентов, что в конечном итоге поможет определить оптимальную тактику ведения ХСН. Апелин. Изменения концентрации апелина в плазме при СН [63-66,71] и лёгочной гипертензии [66,80] наводит на мысль, что он может быть маркёром этих заболеваний. Прежде всего, его следует сравнивать с BNP и NT-proBNP – основными маркёрами, применяемыми в настоящее время для диагностики СН [81]. В своей работе A. Tycinska установила, что у больных после ОИМ апелин-36 хуже, чем BNP отражал нарушение систолической функции ЛЖ [82]. В других исследованиях также сообщалось, что NTproBNP был более сильным маркёром тяжести СН, чем апелин [70]. R. van Kimmenade с соавт. показал, что в предсказании 60-дневного исхода острой СН апелин уступал не только NT-proBNP, но и галектину-3. Диагностическая ценность апелина также оказалась сомнительной [83]. При изучении апелина плазмы у больных с острым ИМ с и без подъёма сегмента ST он продемонстрировал положительную корреляцию с КФК, МВ-КФК и 39 тропонином I у больных первой группы и отрицательную корреляцию с уровнями тех же маркёров у вторых. Не было выявлено корреляции с ФВ, СРБ и шкалами TIMI и GRACE. [118] В тоже время в работе [119] показано, что при ОИМ с первичной ангиопластикой достоверным предсказателем исхода заболевания являлся не абсолютный уровень апелина плазмы, а скорость его падения в течение 5 дней от начала лечения. Была попытка использовать апелин у крыс как маркёр лёгочной гипертензии, вызванной гипоксией. Однако, концентрация пептида в плазме не коррелировала с давлением в правом желудочке, то есть он не был маркёром ЛГ. Даже BMP оказался более специфичен для правожелудочковой недостаточности [79]. Goetze и др. видят возможность совместного применения апелина-36 и NT-proBNP для дифференцировки одышки, вызванной кардиальными и лёгочными причинами. [66]. Несмотря на противоречивость данных, большинство авторов отмечают фазность изменений апелина крови при развитии ХСН. В начальный период болезни происходит повышение концентрации апелина, которая при утяжелении состояния понижается. I.6. Общая характеристика моделей СН. Экспериментальные модели СН у животных создаются для изучения механизмов патогенеза ХСН у человека и определения эффективности воздействия на них лекарственных средств. Отметим, что моделирование на животных не даёт полного соответствия патогенетическим процессам СН у людей. В эксперимент чаще берутся молодые и исходно здоровые животные, в то время атеросклерозом, как у человека ожирением, течение диабетом, ХСН часто гипертонией сопровождается и другими сопутствующими заболеваниями. На крупных животных (свиньи, собаки, овцы) легче изучать ХСН, но эти модели дороги и трудны в исполнении. Поэтому эксперименты обычно проводят на грызунах (кролики, крысы, мыши). К моделям предъявляются следующие требования: 1) созданная ХСН должна максимально соответствовать патологическим процессам у людей; 2) 40 причины, вызывающие СН, должны быть схожими; 3) модель должна позволять изучать стадии развития СН; 4) необходимо воспроизводить предсказуемые и контролируемые симптомы; 5) биохимические и гемодинамические параметры должны быть измеряемыми; 6) модель должна быть технически выполнима, экономически приемлема и не противоречить международным стандартам по проведению медико-биологических исследований с использованием животных. Существует множество моделей ХСН, их подробное описание можно найти в обзорах [195-197]. Таб. 1 показывает соответствие между животными моделями СН и различными этиологиями ХСН у людей [197]. Таблица 1. Соответствие экспериментальных моделей ХСН различной этиологии у человека. Этиология СН у людей Острая ишемия Системная гипертензия Перегрузка давлением Перегрузка объёмом Кардиомиопатии Миокардиты Лёгочная гипртензия 1) 2) 1) 2) 3) 1) 1) 2) 3) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 1) 2) 1) 2) Техника выполнения модели Перевязка коронарных артерий Микроэмболия Линия крыс со спонтанной гипертензией (SHR-F) Линия крыс, склонная к гипертонической СН (SHHF/Mcc-facp) Солечувствительные крысы (Dahl-S) Сужение аорты Аортокавальная фистула Аортальная недостаточность Анемия Токсическая Адриамициновая Амфетаминовая Катехоламиновая Этаноловая Тауриновая недостаточность Диабетическая (стрептозотоцин-индуцированная) Радиоактивная Аутоиммунная Болезнь Шагаса Гипоксическая Монокроталиновая Из множества моделей мы выбрали катехоламиновую как самую простую в воспроизводстве и за её соответствие ишемической кардиомиопатии у человека. I.7. Резюме 41 Для улучшения диагностики и прогноза исходов СН целесообразно применять несколько маркёров [111-112]. Некоторые биомаркёры сами являются участниками патологических цепей ХСН, поэтому они могут служить терапевтическими мишенями. При их изучении возможно создание новых лекарственных средств лечения ХСН. На исследовании двух таких вещества – апелина и галектина-3 – мы решили сфокусироваться в нашем исследовании. Глава II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II.1. Экспериментальное исследование II.1.1. Методы оценки СН у животных. Существует множество инвазивных и неинвазивных методов оценки функций сердца для определения СН: ЭхоКГ, импедансная кардиография, катетеризация желудочков сердца, фармакологические пробы с допмином и добутамином, функциональные нагрузочные пробы [194], оценка биохимических маркёров СН. Из инструментальных методов обследования «золотым стандартом» во всём мире считается эхокардиография. II.1.1.1. Эхокардиография. Исследование функции сердца наркотизированных крыс выполняли на аппарате iE33 (Philips Ultrasound, Bothell WA, USA) с использованием датчика S12-4 (12-4 MГц). Конечно-диастолический и конечно-систолический размеры левого желудочка (ЛЖ), а также толщину задней стенки ЛЖ измеряли в М-режиме из парастернального доступа в проекции длинной оси сердца; площадь поперечного сечения ЛЖ в конце диастолы (Sd, см2) и в конце систолы (Ss, см2) определяли из парастернального доступа в проекции по короткой оси сердца на уровне папиллярных мышц, рассчитывая процент изменения площади поперечного сечения ЛЖ в систолу по следующей формуле: ΔS%= (Sd- Ss)/ Sd х 100. Объемы ЛЖ (КДО, КСО) и фракцию выброса оценивали с использованием модифицированного алгоритма 42 Симпсона из апикального доступа в трёх проекциях (4-х и 2-х камерных и по длинной оси ЛЖ). Интеграл линейной скорости кровотока (VTI, см) – эквивалент ударного объема, а также ударный объем ЛЖ (УО, мл) и сердечный выброс (МОК, мл/мин) определяли с помощью допплеровского исследования в импульсном режиме на уровне выходного тракта ЛЖ. II.1.1.2. Импедансная кардиография (ИКГ) В нашей работе мы применяли ещё один неинвазивный способ оценки сердечной деятельности – импедансную кардиографию. Этот метод был разработан ещё в прошлом веке, но после его модификации Хаютиным В.М. с сотрудниками он стал использоваться для оценки сократимости сердца у людей [191]. Принципы импедансного метода. Импедансным сопротивлением Z называется сопротивление проводника переменному току. Для импедансной кардиографии принято измерять сопротивление тканей грудной клетки. Кровь обладает наименьшим из всех тканей удельным сопротивлением, поэтому наиболее легкий путь для прохождения электрического тока представляют кровеносные сосуды, расположенные вдоль действующего электрического поля. Во время сердечного цикла заметно изменяется кровенаполнение крупных сосудов грудной клетки: аорты, лёгочной артерий, полых вен, что отражается на импедансной кривой Z. В сигнале её первой производной (dZ/dt) принято выделять три волны: А-волна – отражает сокращение предсердий и изгнание из них крови; В-волна – следует после закрытия митрального клапана; С-волна (contraction) – отражает изгнание крови в аорту. Наиболее важным и надежным показателем сократимости сердца, получаемым из импедансной кривой, является длительность периода предизгнания – Д-ПП. В течение этого периода электрическое возбуждение охватывает весь миокард желудочков сердца и происходит электромеханическое сопряжение миоцитов с их сокращением, в результате развивается усилие, необходимое для изгнания крови (PЛЖ > PАо). Чем лучше 43 сократимость миокарда, тем короче Д-ПП. Импедансный метод позволяет оценивать лишь сократимость ЛЖ сердца. В наших опытах Д-ПП измеряли как интервал времени в миллисекундах от вершины зубца R на ЭКГ до точки максимума второй производной Z-сигнала в области нарастания волны C-волны (d2Z/dt2) на импедансограмме (то есть времени открытия аортального клапана) (рис. 2). Рисунок 2. Метод определения длительности периода предизгнания (Д-ПП, PEP) с использованием точки наибольшего ускорения нарастания Z-сигнала (A max) в начале фазы изгнания (метод В.М.Хаютина). Черными кружками показаны точки начала и окончания отсчета времени. Первая – на восходящем участке R-зубца ЭКГ, вторая (метка начала фазы изгнания) – точка максимума второй производной первичного Z-сигнала (d 2Z/dt2). На сигнале dZ/dt (первая производная Z-сигнала) эта точка соответствует его наиболее быстрому увеличению, а положение ее на первичном Z-сигнале весьма близко к началу пульсовой волны [190]. Да данной записи волны А и В выражены недостаточно чётко поэтому не обозначены. Д-ПП R-зубец ЭКГ Z-аортограмма C-волна dZ/dt A max d2Z/dt2 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 с Для оценки функционирования сердца мы также использовали длительность периода изгнания (ДПИ; DEP). Его рассчитывали в миллисекундах как разность между длительностью электромеханической систолы ЛЖ (интервал между вершиной зубца R на ЭКГ и точкой минимума первой производной сигнала давления ЛЖ) и Д-ПП. В наших экспериментах крысам устанавливали 4 игольчатых электрода: два токовых, через которые подавался переменный электрический ток (3,5 мА) – под нижней челюстью и на левой ноге; и два измерительных – над рукояткой грудины и на мечевидном отростке (в области проекции восходящей аорты на грудную клетку). Одновременно регистрировали ЭКГ 44 во II стандартном отведении и АД на хвосте. Для стабилизации параметров гемодинамики во время экспериментов животное подогревали до температуры 38 оС. Сигнал ИКГ (ΔZ) фиксировали с помощью модифицированного для работы с мелкими лабораторными животными реоплетизмографа РПКА-2-01 (Медасс, Россия) с расширенной полосой пропускания (от 0,1 до 150 Гц при несущей частоте 40 кГц и амплитуде импульсов тока 3.5 мА). Сигналы ЭКГ и АД подавали на «Biograph-4» (Cанкт-Петербургский государственный университет аэрокосмического приборостроения). Все сигналы оцифровывали с частотой 1 кГц с помощью аналого-цифрового преобразователя (АЦП) NI-USB-6210 («National Instruments», США) и записывали на жесткий диск компьютера. Для записи и обработки физиологических сигналов были разработаны собственные программы (автор – Е.В. Лукошкова). Величины всех параметров рассчитывали на основе анализа записей первичных сигналов, подвергнутых предварительной процедуре пульс-синхронного усреднения, которая обеспечивает автоматический расчет “усредненных форм” сигналов по 40 кардиоциклам каждые 5 с. Для этого сначала производили интерполяцию и переоцифровку сегментов ЭКГ-сигнала, содержащих QRS комплекс, с шагом 0,2 мс, что необходимо для точного определения положения вершины R зубца в каждом кардиоцикле. Затем все фрагменты пульсовых волн исследуемых сигналов синхронизовали, совмещая во времени вершины R зубцов. Синхронизированные по R зубцу сигналы подвергали медианной фильтрации для удаления помех и сильно отличающихся по форме или амплитуде волн. Полученные семейства кривых усредняли и рассчитывали первые и вторые производные сигналов ΔZ и давления, применяя метод полиномиальной фильтрации-дифференцирования Савицкого-Голаи [192]. Чтобы обеспечить аккуратность оценки амплитуд максимумов производных этих сигналов и необходимое разрешение при измерении соответствующих временных интервалов, снова применяли интерполяцию с переходом к дробному шагу 45 0,1 мс. В результате получали хорошо воспроизводимые кривые с минимумом помех и разрешением во времени до 0,1 мс, несмотря на сравнительно небольшую частоту аппаратной оцифровки (шаг 1 мс). Расчет ЧСС производили каждые 5 с по средней длительности RR интервалов для каждого из наборов кардиоциклов. В экспериментах на животных Д-ПП сравнивали с индексами сократимости, оцениваемые по кривой давления в ЛЖ при одновременной катетеризации сердца. Была показана высокая корреляция между этими показателями при введении различных инотропных агентов и физиологических пробах [193]. II.1.1.3. Катетеризация левого желудочка сердца. Тонкий Милларовский прецизионный катетер (SciSense Instruments, Канада, диаметр – 0,53 мм) с тензометрическим датчиком на конце вводился через правую сонную артерию сначала в дугу аорты, а затем, через аортальный клапан, непосредственно в полость левого желудочка сердца. Он был связан с усилителем (Hugo Sachs Elektronik, Германия). В дальнейшем сигнал направлялся на АЦП NI-USB-6210 («National Instruments», США) для записи на жёсткий диск компьютера. Другой полиэтиленовый катетер PE-50 (Braintree Scientific Inc., США) вставляли через бедренную артерию в брюшную аорту для регистрации среднего артериального давления. Он был связан с электроманометром (Gould Statham P23 Db, CША), сигнал от которого усиливался прибором «Biograph-4» и также подавался на плато АЦП. Одновременно с катетеризацией сердца велась запись ИКГ и ЭКГ. Измеряли традиционные показатели сократимости – максимальную скорость развития давления (dP/dtmax) и индекс Veragut [204] (dP/dtmax/P – максимальная скорость нарастания давления в ЛЖ отнесённая к давлению при котором она достигается). Для характеристики процесса расслабления использовали максимальную скорость снижения давления (dP/dt min), а также производный из неё индекс расслабимости по аналогии с индексом сократимости. Кроме того, вычисляли константы скорости снижения 46 давления в изоволюмической [205] и ауксоволюмической [206] фазах кардиоцикла. II.1.1.4. Гистологическое исследование. В конце опыта из середины боковой стенки ЛЖ вырезали кусочек миокарда и фиксировали с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином полутонких срезов. Образцы просматривали под световым микроскопом. Работа проведена в Отделе сердечно-сосудистой патологии ИКК РКНПК. II.1.2. Общая характеристика экспериментов Эксперименты проводили на базе Лаборатории экспериментальной патологии сердца Института экспериментальной кардиологии и Отдела хронической ишемической болезни сердца института клинической кардиологии ФГБУ РКНПК МЗ РФ. В опытах использовали самцов крыс линии Wistar, которые находились под кетаминовым наркозом (100 мг/кг). Животных содержали в виварии согласно международным правилам содержания животных. Световой день составлял 12 часов. Еда и питьё ad libitum. II.1.3. Протоколы исследований II.1.3.1. Исследование апелинов при болюсном введении контрольным крысам. Контрольным крысам со средним весом 385±5 гр. болюсно вводили нативный апелина-12-0 (n=8) или его синтетические аналоги (лаборатория синтеза пептидов, рук. Беспалова Ж.Д.) апелин-12-1 (n=11), апелин-12-2 (n=6), апелин-12-3 (n=7) и апелин-12-4 (n=9) для отбора наиболее перспективной модификации с целью создания лекарственного средства. Во всех синтетических аналогах метионин в 10-м положении был заменён на норлейцин. В 2 и 3 модификациях аргинин на N-конце меняли на метиларгинин, а в 4-ой модификации – на нитроаргинин. В модификациях 3 и 4 к фенилаланину на С-конце молекулы присоединяли амидную группу (таб. 2). 47 Таблица 2. Структура нативного апелина-12 и его синтетических модификаций. Структурная формула Название 1 Апелин-12-0 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 H–Arg–Pro–Arg–Leu–Ser–His–Lys–Gly–Pro–Met–Pro–Phe–OH H–Arg–Pro–Arg–Leu–Ser–His–Lys–Gly–Pro–Nle–Pro–Phe–OH Апелин-12-1 Апелин-12-2 2 Апелин-12-3 H–( Nα–Me )Arg–Pro–Arg–Leu–Ser–His–Lys–Gly–Pro–Nle–Pro–Phe–OH H–( Nα–Me )Arg–Pro–Arg–Leu–Ser–His–Lys–Gly–Pro–Nle–Pro–Phe–NH2 Апелин-12-4 H–Arg(NG-NO2)–Pro–Arg–Leu–Ser–His–Lys–Gly–Pro–Nle–Pro–Phe–NH2 Апелины применяли в дозах 0,01; 0,05; 0,1; 0,3 и 0,5 мг/кг. Все препараты вводили в объёме 0,5 мл физиологического раствора в ярёмную вену, кумулятивно, каждая последующая доза через 10 минут после предыдущей в порядке нарастания. Одновременно регистрировали ЭКГ, ИКГ и давление в ЛЖ с помощью Милларовского катетера и давление в брюшной аорте катетером PE-50 в течение всего периода введения препаратов, а также 10 минут до начала эксперимента и 10 минут после последней инъекции (рис. 3). Рисунок 3. Дизайн исследования апелинов у крыс при болюсных введениях. II.1.3.2. Исследование апелинов при инфузионном введении. В эксперимент включали как контрольных, так и животных больных ХСН, которая была вызвана двукратным подкожным введением изопротеренола с разницей в 24 часа. Всем крысам через 2 месяца после инъекций изопротеренола проводили контрольную ЭхоКГ для выявления развившейся ХСН. 48 Исследование выполняли на приборе Philips iE33 с датчиком S-12-4 (4-12 МГц). Некоторым больным животным апелин-12-2 вводили в дозах 2; 10; 50 мкг/кг/мин под контролем ЭхоКГ ступеньками по 10 мин (рис. 4). Рисунок 4. Дизайн исследования апелинов у крыс при инфузионном введении под контролем ЭхоКГ. На следующий день всем больным крысам проводили инфузию расширенного диапазона доз Ап-12-0 и Ап-12-2 (0,5; 2; 10; 20 и 50 мкг/кг/мин ступеньками по 10 мин) под контролем импедансной кардиографии (ИКГ) и Милларовского катетера, введённого в ЛЖ (рис. 5). Этот же протокол использовался также для контрольной группы животных, которым введение апелинов под контролем ЭхоКГ не проводилось. Рисунок 5. Дизайн исследования апелинов у крыс при инфузионном введении под контролем ИКГ и катетеризации ЛЖ Милларовским катетером. Инфузию апелина-12-0 выполняли 22 контрольным и 15 больным ХСН животным со средним весом 421±13 и 396±6 г соответственно. Апелин-12-2 вводили 22 контрольным и 11 крысам с ХСН средним весом 459±9 и 501±10 г, соответственно. II.1.4. Изопротереноловая модель СН. 49 В клинической практике около половины случаев ХСН развивается после перенесённого инфаркта миокарда. Ещё из работ Rona G. 1959 г. [198] известно, что катехоламины вызывают изменения в миокарде похожие на постинфактные. Изопротеренол, являясь синтетическим катехоламином, стимулирует β-адренорецепторы, что приводит к перегрузке кардиомиоцитов кальцием и увеличению потребления ими кислорода. При этом часть клеток гибнет и замещается соединительной тканью. Возникает фиброз и кардиосклероз, снижается сократительная функция сердца, развивается ХСН [200]. Теперь такие модели широко применяются для проверки эффективности различных фармакологических препаратов [199]. Опыты были выполнены на самцах крыс Wistar массой 400-450 г. Изопротеренол им вводили подкожно дважды с перерывом в сутки. Разовые дозы варьировались от 85 до 180 мг/кг, то есть кумулятивные были вдвое выше. Смертность составляла от 15 до 40%. II.2. Клиническое исследование II.2.1. Общая характеристика больных Набор больных осуществлялся на базе клинических отделений ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ. В протокол было включено 108 больных (77 мужчин и 32 женщины) в возрасте от 23 до 82 лет (средний возраст 56 лет) с ИБС и ДКМП и развившейся на этом фоне ХСН 1-4 ф.к. по NYHA. У 14 больных ФВ была более 45%, у 94 пациентов менее 40%. Средняя ФВ составила 32,2±8,63%. Характеристика обследованных пациентов представлена в таб. 3. Таблица 3. Характеристика больных, включённых в исследование. ФК ХСН I II III IV всего ИБС ДКМП ИБС ДКМП ИБС ДКМП ИБС ДКМП Пол (М/Ж) 6/6 8/1 12/3 12/5 20/7 5/2 5/2 9/5 Возраст 58,5±9,5 44,8±9,3 58,2±11,7 44,8±13,5 62,6±11,5 48,9±12,6 69,8±6,5 50,1±15,3 ИМТ 29,2±4,8 28,3±3,6 29,0±6,2 30,4±5,0 28,9±4,8 26,9±2,5 26,3±4,2 25,7±4,0 77/31 56,5± 13,9 28,5± 4,8 50 Курение (да/нет) 5/7 3/6 11/4 9/8 14/13 2/5 4/10 3/4 51/57 Сразу после включения в исследование до начала терапии больным проводился забор крови на биомаркёры. Также до назначения лекарственных препаратов выполнялась ЭхоКГ с оценкой систолической и диастолической функции сердца. Телефонный мониторинг пациентов или их родственников осуществлялся через один год после включения в исследование с оценкой конечных точек. За конечную точку принималась смерть пациента или госпитализация по поводу ХСН (рис. 6). Рисунок 6. Дизайн клинического исследования Пациенты с сердечной недостаточностью (n=108) РАНДОМИЗАЦИЯ Пациенты с ИБС (n=61) ФК: I (n=12) II (n=15) III (n=27) IV (n=7) Пациенты с ДКМП (n=47) I (n=9) II (n=17) III (n=7) IV (n=14) Забор крови на биомаркёры; ЭхоКГ ЭЭЭЭЭХОэхокардиография Телефонный мониторинг пациентов (или их родственников) через 12 мес. после включения в исследование В протокол не включались пациенты с тяжёлыми сопутствующими соматическими патологиями (печёночная и почечная недостаточность, онкологические и ревматологические заболевания, ХОБЛ II ст. и выше, хронические гепатиты), лица, в течение последних 3 месяцев перенесшие ОНМК, ТЭЛА или ОКС. Из работы исключались пациенты, причина ХСН которых не была связана с ДКМП или ИБС (тяжёлые клапанные пороки, перикардиты, гипертоническое сердце и т.п.), а также больные с тиреотоксикозом или сахарным диабетом. 51 Группа контроля состояла из 40 здоровых человек (17 мужчин и 23 женщины) и условно разделялась на две подгруппы: от 18 до 35 лет (25 человек, средний возраст 26±2,7) и старше 35 лет (15 человек, средний возраст 57,5±9,7) II.2.2. Лабораторные методы диагностики. Образцы крови забирались у больных натощак сразу после поступления в стационар и осмотра лечащим врачом до назначения медикаментозной, в т.ч. внутривенной диуретической, терапии. 10 мл крови из локтевой вены помещались в пробирку, содержащую раствор ЭДТА (из расчёта 2 мг/мл крови). Пробирка центрифугировалась в течение 10 минут со скоростью 3500 об/мин при температуре +4º С. Супернатант в объёме 0,5 мл разливался в отдельные пробирки типа Eppendorf. Аликвоты замораживались и хранилась при температуре -70º С не более 1 месяца с момента взятия крови. Оценка биомаркёров проводилась в Отделе нейрогуморальных и иммунологических исследований НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова РКНПК. Для определения в плазме концентрации апелина-12 использовался набор Enzyme Immunoassay Kit for Apelin-12 (Phoenix Pharmaceuticals, США, каталожный номер EK-057-23), работающий по принципу иммуноферментного анализа. В лунку набора помещали 50 мкл плазмы крови, 25 мкл первичных антител и 25 мкл биотинилированного пептида. Иммунопланшет инкубировался при температуре 20º С в течение 2 часов, после чего лунка четырёхкратно отмывалась 350 мкл предварительно подготовленного буферного раствора. Добавлялось 100 мкл стрептовидинпероксидазы хрена с последующей повторной инкубацией при 20º С в течение 1 часа и четырёхкратной отмывкой буферным раствором. Затем добавлялось 100 мкл тетраметил бензидина, снова проводилась инкубация в течение 1 часа, и добавлялось 100 мкл двухнормального раствора соляной кислоты. Анализ образцов проводился с помощью микропланшетного фотометра Sunrise и автоматичеcкого микропланшетного промывателя 52 Columbus M12/4CH (Tecan, Австрия). Расчет результатов проводился с помощью компьютерной программы Mogellan 4.0. Диапазон измерений был 0-100 нг/мл, линейный диапазон измерений тест-системы составил 0,08 – 1,55 нг/мл. Концентрация галектина-3 в крови определялась иммуноферментным анализом. Технология была аналогична методу, применённому для оценки апелина-12. Использовались коммерческие наборы Human Galectin-3 Platinum Elisa (eBioscience, США). Чувствительность тест-системы составила 0,12 нг/мл. Опеределение концентрации NT-proBNP и тропонина Т (вч-ТнТ) проводилось электрохемилюминисцентным способом (принцип «сэндвича») на анализаторе Elecsys 2010 (Roche , Швейцария) с использованием соответствующиех коммерческих наборов proBNP II (Roche, каталожный номер 04842464190) и Troponin T hs (Roche, каталожный номер 05092744190). Анализ состоял из нескольких этапов. При первой инкубации антиген в образце (15 мкл), биотинилированное моноклональное NT-proBNP- специфичное (тропонин Т-) антитело и моноклональное NT-proBNP(тропонин Т-) специфичное антитело, меченное рутениевым комплексом, вступают в реакцию с формированием сэндвич-комплекса. Вторая инкубация: после добавления микрочастиц, покрытых стрептавидином, образовавшийся комплекс связывается с твердой фазой посредством взаимодействия биотина и стрептавидина. Реакционная смесь аспирируется в измерительную ячейку, где микрочастицы оседают на поверхность электрода в результате магнитного взаимодействия. Затем с помощью буфера ProCell удаляются не вступившие в реакцию вещества. Далее приложенное к электроду напряжение вызывает хемилюминесцентную эмиссию, которая измеряется фотоумножителем. Результаты определяются с помощью двухточечной калибровочной кривой, полученной для данного инструмента, и референсной калибровочной кривой, данные которой сообщены в штрих-коде набора реагентов. Диапазон измерений NT-proBNP: 5-35000 пг/мл (0.6-4130 пмоль/л) или до 70000 пг/мл 53 (8277 пмоль/л) для образцов с 2-кратным разведением. Диапазон измерений для тропонина Т: 3-10000 пг/мл. За норму принимали концентрацию вчТропонина Т ≤3,0 пг/мл. II.2.3. Эхокардиографическое исследование ЭхоКГ выполнялось по стандартным рекомендациям с оценкой систолической и диастолической функции ЛЖ на приборе Philips iE33 с фазированным секторным кардиологическим датчиком S5-1 совместно с сотрудниками отделения хронической ишемической болезни сердца РКНПК. Исследование проводилось в положении пациента лежа на левом боку. Определялся конечно-систолический (КСО, мл) и конечно-диастолический (КДО, мл) объемы ЛЖ с расчетом ФВ (%). Структуры сердца визуализировались при «В»- и «М»-сканировании по общепринятой методике. «В»-режим использовался для общей оценки расположения строения и функции структур сердца. Для количественной оценки объемных показателей и глобальной сократимости ЛЖ применялся метод Симпсона, известный также как методом дисков. В основе метода лежит реконструкция ЛЖ из 20 дисков – срезов ЛЖ на разных уровнях. Для измерения объемных показателей в обеих проекциях ЛЖ делится на 20 дисков ai и bi одинаковой высоты; площади дисков (ai × bi×π/4) суммируются, сумма умножается затем на длину левого желудочка. Метод предполагает получение взаимно перпендикулярных изображений в двух- и четырехкамерной позициях. После получения и фиксации изображения в обеих проекция в фазу систолы и диастолы внутренний контур ЛЖ выделяется курсором, после чего аппарат автоматически рассчитывает объемные показатели ЛЖ. Диастолическую функцию ЛЖ оценивали по результатам исследования трансмитрального диастолического кровотока в импульсном доплеровском режиме. Измерялись Е – пик диастолического наполнения во время фазы быстрого наполнения ЛЖ и А – пик диастолического наполнения ЛЖ во время систолы ЛП. Затем по отношению пиков Е и А делался вывод о трансмитральном потоке. Существует 4 типа трансмитрального потока: 1 тип – нормальный поток, 2 54 тип – замедленная релаксация, 3 тип – псевдонормализация, 4 тип – рестрикция. II.3. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку полученного материала проводили с использованием программы Excel из пакета MS Office 2010 и статистической программы STATISTICA 6.0, где предусмотрена возможность параметрического и непараметрического анализа. Параметрический анализ проводили с помощью непарного t-критерия Стьюдента. Для оценки достоверности межгрупповых различий применяли непарный непараметрический метод анализа по Манн-Уитни (U-критерий). ROC-анализ выполнялся в программе MedCalc 12.5. Исследуемые параметры представлены в зависимости от типа распределения непрерывных признаков как среднее арифметическое значение (M) ± стандартное отклонение (SD) (M ± ошибка средней (SE) для экспериментального исследования) или медиана значения (Ме), интерквартильный интервал [LQ;UQ] с указанием 25-го и 75го перцентилей их распределения. За минимальный уровень значимости принято р<0,05. ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ III.1. Клиническое исследование III.1.1. Диагностическое значение биомаркеров при ХСН. Концентрации биомаркёров в крови и основные ЭхоКГ-показатели различных групп больных ХСН представлены в таб. 4 и таб. 5. Таблица 4. Основные ЭхоКГ-параметры больных ХСН различных групп. Функциональный класс ХСН 1 2 3 4 Этиология ХСН Фракция выброса % 37±8,5 32±7,6 31±7,8 28±9,2 КДО мл 214 [188; 255] 230 [211; 265] 218[167; 240] 202[179; 311] КСО мл 125 [111; 163] 160 [128; 187] 144 [108; 166] 147 [114; 238] 55 ДКМП ИБС 29±8,2 33±8,7 244[210; 338] 212[157; 230] 167 [127; 231] 136 [90; 159] Видно, что у тяжёлых больных была ниже ФВ, а у пациентов с ДКМП были больше КДО и КСО. Таблица 5. Средние концентрации биомаркёров в крови больных ХСН различных групп. Функциональный класс ХСН 1 2 3 4 Этиология ХСН ДКМП ИБС Средняя концентрация по всей выборке Апелин-12 нг/мл 0,8±0,35 0,81±0,29 0,68±0,38 0,82±0,35 Галектин-3 нг/мл 12,5±4,09 9,98±3,71 10,68±5,95 8,7±4,05 NT-proBNP пкг/мл 854 [394; 1368] 1014 [657; 1759] 2770 [2093; 4351] 6021 [3059; 7861] Тропонин Т пкг/мл 9,5 [5,2; 12,1] 12,6 [7,9; 26] 19,6 [12,1; 39,3] 33,9 [19,6; 45,2] 0,7±0,34 0,81±0,34 11,08±3,34 10,06±5,4 1807 [743; 3861] 2137 [1029; 3640] 14,8 [7,9; 33,8] 19,7 [12,3; 39,3] 0,77±0,35 10,4±4,76 2033 [877; 3639] 19,5 [10,7; 37] Средний уровень апелина-12 у здоровых добровольцев составил 0,86±0,22 нг/мл, притом в подгруппе молодых он был 0,9±0,23, а в подгруппе старше 35 лет 0,78±0,19 нг/мл. Однако статистически значимых различий между подгруппами не было (p=0,058), как и не выявлено достоверности между средними концентрациями у больных различных функциональных классов ХСН (везде p>0,05). Также не обнаружено статистически значимой разницы между уровнем апелина у пациентов с ИБС и ДКМП (p=0,1). Достоверность прослеживалась лишь при сравнении концентраций пептида у пациентов с 3 ф.к. ХСН и контрольной подгруппой молодых (0,68±0,38 vs 0,9±0,23 нг/мл, p=0,006), а также больных с ДКМП и молодыми добровольцами (0,7±0,34 vs 0,9±0,23 p=0,004). В тоже время уровни NT-proBNP у всей контрольной группы были ниже 100 пкг/мл, а средние концентрации у больных 1-4 ф.к. составляли 854 [394; 1368]; 1014 [657; 1759]; 2770 [2093; 4351]; 6021 [3059; 7861] пкг/мл соответственно. Статистически значимых отличий концентраций NT-proBNP не было только при сравнении 1 и 2 ф.к. (p=0,2), что может быть объяснено несколько условными клиническими границами между этими функциональными классами, во всех остальных случаях достоверность была высокой (p<0,001). Таким образом, в нашем исследовании NT-proBNP в 56 отличие от апелина-12 лучше отражал тяжесть сердечной недостаточности (рис. 7). Рисунок 7. Сравнение концентраций NT-proBNP и Апелина-12 в крови больных 1-4 ф.к. ХСН и здоровых добровольцев. Средние концентрации галектина-3 также как и апелина-12 не отражали тяжесть течения сердечной недостаточности. Достоверные различия отмечались лишь при сравнении больных с 1 и 4 ф.к. (p=0,027), притом у более лёгких пациентов его уровень был несколько выше. Также не было различий между концентрациями биомаркёра у пациентов с ИБС и ДКМП (p=0,23). 57 В тоже время тропонин Т, измеренный высокочувствительным способом, как и NT-proBNP отражал тяжесть сердечной недостаточности, однако уступал последнему в чувствительности (таб. 6). Таблица 6. Сравнение концентраций вч-ТнТ у больных 1-4 ф.к. ХСН с помощью Uкритерия. Указана статистическая значимость (p). ф.к. ХСН 1 2 3 4 0,147 0,033 0,197 0,002 0,003 0,122 1 2 3 Стоит отметить, что ни один из изучаемых нами маркёров не был специфичен к этиологии сердечной недостаточности. III.1.1.1. Корреляционный анализ Не отмечались корреляции между уровнем апелина-12 и ФВ ЛЖ (r = 0,16; p=0,13) (рис. 8), КДО (r = 0,14; p=0,15) и КСО (r = -0,12; p=0,22). Также не наблюдалась корреляция между концентрациями апелина-12 и NT-proBNP в плазме крови (r= -0,13; p=0,17); возрастом (r= 0,10; p=0,30), полом (r= -0,18; p=0,17), курением (r= 0,04; p=0,6) и индексом массы тела (r= -0,05; p=0,6). Рисунок 8. Корреляция между фракцией выброса ЛЖ и уровнем апелина в плазме крови. 58 NT-proBNP, напротив, имел умеренную обратную корреляцию с ФВ (r= -0,39; p<0,001) и прямую с уровнем тропонина Т (r= 0,43; p<0,001). Тропонин Т помимо этого имел связь с КДО (r= -0,32; p<0,001) и возрастом (r= 0,41; p<0,001). Галектин-3 имел лишь умеренную отрицательную корреляцию с уровнем тропонина Т (r= -0,35; p<0,001). III.1.2. Прогностическое значение апелина-12 и других биомаркёров ХСН Рисунок 9. ROC-анализ влияния концентраций Апелина-12, Галектина-3, NT-proBNP и вчТнТ на конечные точки. 59 100 Чувствительность 80 60 40 Апелин-12 NT-proBNP Галектин-3 вч-TнT 20 0 0 20 40 60 80 100-специфичность 100 В течение одного года было зарегистрировано 42 конечные точки (из них 15 смертей). ROC-анализ показал, что хорошим маркером прогноза был NT-proBNP (АUC 0,729), несколько хуже оказался вч-ТнТ (AUC 0,657). В тоже время исходные концентрации апелина-12 и галектина-3 в плазме оказывали слабое влияние на прогноз (AUC 0,573 и 0,566, соответственно) (рис. 9). Сравнение ROC-кривых выявило, что AUC для NT-proBNP достоверно отличался от Апелина-12 и Галектина-3 (p≤0,05), а вот с AUC вч-ТнТ (p≥ 0,05) достоверности не было. AUC других биомаркёров между собой достоверно не различались. III.2. Экспериментальное исследование III.2.1. Метод импедансной кардиографии. 60 На рис. 10 представлены записи усреднённых сигналов ЭКГ, давления в ЛЖ и скорости его нарастания (dP/dt), давления в аорте (PAo) и его второй производной (d2P/dt2), импедансной кардиограммы ΔZ и её второй производной (d2Z/dt2). Все сигналы синхронизированы по зубцу R. Видно, что длительность интервалов от зубца R до пика dP/dt в ЛЖ и до пика второй производной давления в аорте (сплошная вертикальная линия), если датчик располагается вблизи аортального клапана, практически совпадают – они характеризуют длительность периода предизгнания (ДПП, PEP). Его продолжительность, определяемая по ИКГ (вертикальная пунктирная линия, см. раздел “методы”), немного больше – на 5-6 мс. При отодвигании микроманометра (МКМ) от клапана до области перехода дуги в нисходящую аорту это отличие нивелировалось, а если датчик давления находился дистальнее, то регистрируемая волна PAo, наоборот, отставала от волны ΔZ. Рисунок 10. Записи усредненных сигналов ЭКГ, давления в ЛЖ (P ЛЖ), и скорости его нарастания (dPЛЖ/dt), давления в аорте (PAo) и его второй производной (d2PAo /dt2), импедансной кардиограммы ΔZ и ее второй производной (d 2Z /dt2). Вертикальные линии: начало волны изгнания по P Ao (сплошная) и импедансу ΔZ (пунктир). Введение в аорту катетера с МКМ практически не отражалось на форме синхронно записываемого импедансного Z-сигнала. Однако аккуратные 61 измерения ДППZ при введении и перемещении катетера позволили обнаружить небольшие (<10%), но достоверные его изменения, особенно при прохождении МКМ через клапан (переход из ЛЖ в аорту и обратно). III.2.2. Сравнение инвазивных и неинвазивных показателей сократимости на инотропные стимулы. Наблюдалась очень тесная корреляция (r=0,987) между длительностью периодов предизгнания, измеренного с помощью артериального микроманометра и импедансной кардиомиографии (рис. 11). Рисунок 11. Оценка согласованности результатов измерений длительности периода предизгнания, определяемой по сигналу давления в аорте (ДПП Ao, МКМ вблизи клапана) и по импедансной кардиограмме (ДППZ): а – тренды ДППAo (черная кривая) и ДППZ (серая кривая). Стрелки указывают начало инфузии разных доз допамина: 1 - 20 мкг/кг/мин; 2 - 15 мкг/кг/мин; 3 10 мкг/кг/мин. Укорочение ДПП соответствует усилению сократимости; б - корреляция (по Pearson) между ДППZ и ДППAo; в - их сопоставление по методу Бланда-Альтмана. Высокая корреляция (r=0,92) наблюдалась между ДПП измеренными методомами катетеризации и импедансной кардиомиографии при введении известного инотропного агента дофамина (10 мкг/кг/мин) (рис. 12). 62 Рисунок 12. Относительные величины (% к фону) градуальных изменений сократимости определяемой неинвазивно по ДППZ и инвазивно по (dPЛЖ/dt)max/dPЛЖ во время инфузии допамина (10 мкг/кг/мин) и восстановления. Для каждой крысы (n=10) проводили одну пробу с допамином, на каждую реакцию приходилось 16-18 измерений (всего 169 пар точек). Увеличению сократимости соответствует уменьшение ДПП Z и, наоборот, увеличение индекса Верагута – индивидуальные графики слева. Справа – график корреляции % - изменений одновременно измеренных величин параметров (dPЛЖ/dt)max /dPЛЖ и 1/(ДППZ-5 мс) (коэффициент корреляции по Пирсону). Таким образом, наши исследования показали соотвествие между инвазивными и неинвазивными методами исследования и одинаковую динамику в ответ на инотропный агент (допамин). III.2.3. Катехоламиновая модель сердечной недостаточности. Морфогистологическое исследование сердец крыс с ХСН. Изучение морфологических изменений в сердцах крыс на модели сердечной недостаточности, вызванной введением изопротеренола, было проведено в отделе патоморфологии ФГБУ РКНПК совместно с сотрудниками Ждановым В. С., Веселовой С. П. и Цыплёнковой В. Г. на 5 опытных и 6 контрольных животных. На снимках обнаружены очаги трансмурального некроза как в стенке левого, так и правого желудочков. В ЛЖ чаще поражалась область верхушки. В сердцах, подвергнутых воздействию изопротеренола видна клеточная инфильтрация фибробластами и макрофагами очагов некроза, развитие аневризм. Эндокард поражался в большей степени, чем эпикард (рис. 13). 63 Рисунок 13. Микроскопическое исследование ЛЖ крысы через 2 мес. после введения изопротеренола в дозе 120 мг/кг дважды. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение х400. Выживаемость. При введении малой дозы изопротеренола (85 мг/кг дважды) выживали все животные. При повышении однократной дозы ИЗО до 120, 150 и 180 мг/кг выживаемость животных через 2 недели составила 60, 53 и 43%, а количество животных с ХСН из них 24, 27 и 26,7%, соответственно. III.2.4. Оценка тяжести ХСН эхокардиографическим методом у крыс. В предварительной серии экспериментов на 61 контрольном животном нами установлено, что в отличие от человека, ФВ ЛЖ крыс была значительно выше и составляла в среднем 84±1%. Критерием развития сердечной недостаточности мы считали ФВ менее 70%, при этом средняя ФВ в группе больных животных составила 58±6%. При такой ФВ у крыс наблюдалась как клиническая картина СН (отёки, гидроторакс, гидроперикард, одышка, малоподвижность), так и морфологические критерии СН (рубцы и аневризмы, кардиосклероз ЛЖ). 64 Следуя рекомендациям Хабриева Р.У. [201], первоначально мы вводили 85 мг/кг изопротеренола (ИЗО) дважды через сутки. При этой дозе по данным ЭхоКГ на 3-й день после введения отмечалась тенденция к снижению интеграла скорости потока (VTI) без изменения ФВ (таб. 7), то есть наблюдалась диастолическая СН. Однако через 3 месяца после введения ИЗО, ЭХО-показатели возвращались к нормальным значениям или даже превышали их, что, по-видимому, сопряжено с увеличением массы тела. Таблица 7. Кардиодинамика сердец крыс, получивших изопротеренол в дозе 85 мг/кг дважды (ЭхоКГ). Частота сокращений, мин-1 Контроль (12) 410±9 3 дня (9) 410±18 3 месяца (7) 407±8 Минутный объём, мл/мин 81±8 60±6 116±4 ** 0,62±0,05 0,61±0,06 0,81±0,08 0,09±0,02 0,09±0,02 0,12±0,02 86±2 86±3 85±1 3,7±0,2 2,7±0,2 ** 4,15±0,15 0,28±0,02 0,32±0,03 0,36±0,03 * Конечнодиастолический объём, мл Конечносистолический объём, мл Фракция выброса, % VTI, см Площадь ЛЖ, см2 Степень уменьшения площади, 78±3 78±2 63±3 ** % При использовании больших кумулятивных доз ИЗО (240-360 мг/кг) через 3 месяца ФВ снижалась на 25% (доза 180 мг/кг дважды), КДО увеличился вдвое, а КСО – в несколько раз (таб. 8), то есть развивалась систолическая СН. Минутный объем изменялся в меньшей степени, что говорит о хороших компенсаторных возможностях крыс. Удлинялись изометрические фазы сокращения и расслабления, уменьшалась длительность фазы наполнения сердца. Таким образом, при меньших дозах наблюдалось преимущественно нарушение диастолы сердца, а при боольших присоединялось и нарушение систолы. 65 С первой недели введения появлялись и клинические признаки сердечной недостаточности: адинамия, потеря или резкий набор веса, отеки, хриплое дыхание. Эти признаки максимально прогрессировали ко 2-3 месяцу после введения ИЗО. Таблица 8. Кардиодинамика сердец крыс, получивших изопротеренол в высоких дозах. Контроль (n=36) 0 ИЗО-2 (n=11) 120*2 ИЗО-3 (n=15) 150*2 ИЗО-4 (n=9) 180*2 – 2 недели 2 недели 2 месяца Частота сокращений (мин-1) 385±8 383±14 381±7 349±19 Минутный объём (мл/мин) 97±4 88±5 73±6 * 85±8 Конечный диастолический объём (мл) Конечный систолический объём (мл) Фракция выброса (%) 0,84±0,05 0,92±0,09 1,1±0,1* 0,14±0,02 0,22±0,04 0,23±0,06 2,11±0,22 ** 0,94±0,14 84±1 78±3 72±3** 57±4 ** VTI, см 3,51±0.13 3,02±0,12 * – 3,93±0,2 Площадь ЛЖ в диастоле (см2) Степень уменьшения площади ЛЖ в систоле (%) 0,44±0,02 0,46±0,03 0,45±0,03 66±2 61±4 57±3 ** 0,77±0,06 ** 44±3 ** доза (мг/кг) Срок Фазовый анализ показал, что при ХСН прежде всего страдает диастола: удлинялись изометрические фазы расслабления и сокращения (до 28%) и укорачивались фазы наполнения (до 20%) и изгнания (до 11%). III.2.5. Сократимость и расслабимость сердец с ХСН, измеренная инвазивными методами. Сердца животных с ХСН, выявленной ЭхоКГ, были катетеризированы для инвазивной оценки их функции (таб. 9). Таблица 9. Функция сердца крыс, получивших изопротеренол в дозах 240-360 мг/кг. Контроль Артериальное давление 120±2 (6) ИЗО-240 (6) 119±10 ИЗО-360 (9) 111±5 66 Частота сокращений (мин-1) 425±6 388±16 381±11 ** Систолическое давление (мм рт.ст.) Диастолическое давление (мм рт.ст.) Максимальная скорость развития давления (мм рт.ст./с) Максимальная скорость снижения давления (мм рт.ст./с) Индекс сократимости (с-1) 144±5 139±13 135±5 3±1 5±3 9±2 * 12830±800 10910±917 10220±820 * 10980±590 7030±1068 * 7260±590 * 147±6 139±17 117±7 * Индекс расслабимости (с-1) 138±14 86±10 * 90±11 * Константа скорости изоволюмического расслабления Константа логистическая изоволюмического расслабления Константа скорости ауксоволюмического расслабления Константа времени ауксоволюмического расслабления * p< 0.05; ** p < 0.01 158±19 81±12 * 103±12 * 408±44 120±13 ** 238±34 300±35 149±11 ** 172±12 * 3,7±0,6 6,9±0,5 ** 6,0±0,4 * Обнаружены явные признаки СН – снижение индексов сократимости на 20,5% и расслабимости на 35%, причем нарушение расслабления было более выражено, особенно свидетельствует в фазе снижение начального константы наполнения скорости ЛЖ, о чём ауксоволюмического расслабления. Таблица 10. Коэффициенты корреляции эхокардиографических и инвазивных показателей Обозначения: КДО – конечнодиастолический объём, КСО - конечносистолический объём, ФВ – фракция выброса, Ss – площадь ЛЖ в диастоле, ΔS – степень уменьшения площади ЛЖ в систоле. КДО, мл КСО, мл ФВ ЛЖ, % Ss, см2 ΔS, % Максимальная скорость развития -0,77 давления -0,74 0,72 -0,83 0,77 67 Индекс сократимости Верагута -0,86 -0,84 0,81 -0,89 Максимальная скорость -0,81 -0,75 -0,69 -0,84 снижения давления Экспоненциальная константа -0,63 -0,58 0,51 -0,69 расслабления Конечное диастолическое 0,86 0,77 -0,66 0,81 давление Корреляционный анализ между показателями ЭхоКГ и 0,80 -0,72 0,49 -0,61 данными, полученными при катетеризации сердца, выявил тесную связь между инвазивными (индексом сократимости и КДД) и неинвазивными показателями (КДО, КСО, площадью левого желудочка в диастолу и ФВ). III.2.6. Болюсное введение апелинов Задачей этого этапа являлось изучение болюсного внутривенного введения различных аналогов апелина на сократимость сердца и гемодинамику наркотизированных контрольных крыс. III.2.6.1. Апелин-12-0 (нативный) Болюсное введение нативного апелина-12-0 вызывало изменение многих параметров функции сердца и гемодинамики. Преобладающим эффектом было отчётливое дозозависимое снижение АД. Соответственно снижалось систолическое и диастолическое давление в ЛЖ, а также максимальная скорость нарастания и падения внутрижелудочкового давления (+dP/dtmax и -dP/dtmin) (рис. 14). Рисунок 14 . Изменение среднего артериального давления (САД), индекса сократимости Верагута (+dP/dtmax/P) и экспоненциальной константы расслабления (LV-CR-Exp) у 68 наркотизированных крыс при внутривенном болюсном введении апелина-12-0 в дозе 0,3 мг/кг. Уже при дозе 0,05 мг/кг регистрировалось статистически значимое падение АД на 40-й секунде введения (14% от исходного, p=0,01). Максимальное снижение среднего АД наблюдалось при дозах 0,3 и 0,5 мг/кг (45% от исходного, 3-я минута введения, p<0,001). Систолическое давление также падало дозозависимо. Эффект регистрировался уже с дозы 0,05 мг/кг (9,2%, p=0,02). Максимальное снижение давления наблюдалось при дозе 0,3 мг/кг (30% от исходного на 3ей, минута введения, p<0,001). 69 Конечно-диастолическое давление снижалось слабо, на 2-4%, статистическая значимость наблюдалась лишь на больших дозах 0,3 и 0,5 мг/кг и то лишь в начале введения. ЧСС изменялась слабо и разнонаправленно. Хронотропный эффект лежал в пределах 2-4%. Индекс Верагута, который отражал сократимость, имел двухфазный характер. Максимальный эффект регистрировался на дозе 0,3 мг/кг. В начале (на 1-й минуте введения) он незначительно повышался (до 5,8%, p=0,02), но к третьей минуте индекс снижался на 11% от исходного (p=0,01), затем несколько стабилизировался, и вновь продолжал падение с максимумом снижения на 23-ей минуте от начала введения (21%, p=0,03). То есть сократимость в начале улучшалась, а затем снижалась. Экспоненциальная константа расслабления обычно дозозависимо падала на первых секундах (максимальное снижение на -17,2%, 3-я минута дозы 0,3 мг/кг, p=0,03). Затем отмечалось восстановление (на 13-й минуте -2% от исходного, p=0,37) и дальнейшее падение (-16,5% к 23-ей минуте, p=0,01). Таким образом, расслабление ухудшалось. Период предизгнания (ДПП, PEP) на первых секундах введения укорачивался (на дозе 0,3 мг/кг на 40-й секунде регистрировалось максимальное падение -7,3%; p=0,003), но затем он удлинялся (до 19,1% (p=0,001) на 4-й минуте) и оставался увеличенным в среднем на 7-9% от исходного к концу периода наблюдения. Подобным образом PEP изменялся и при малых дозах, но недостоверно. III.2.6.2. Апелин-12-1 Замена легкоокисляемого метионина в 10-м положении на более устойчивую искусственную аминокислоту норлейцин приводило к усилению гипотензивного действия уже при малых концентрациях (рис. 15). 70 Рисунок 15. Изменение среднего артериального давления (САД), индекса сократимости Верагута (+dP/dtmax/P) и экспоненциальной константы расслабления (LV-CR-Exp) у наркотизированных крыс при внутривенном болюсном введении апелина-12-1 в дозе 0,05 мг/кг. Гипотензивный эффект начинался с дозы 0,01 мг/кг при котором АД падало уже на первой минуте на 16,7% после введения (p=0,002) и восстанавливалось к 10-й минуте (-1% от исходного; p=0,26). Эффект был наиболее выражен при дозах 0,05 и 0,1 мг/кг, когда АД максимально снижалось на 35,7 и 34, 1% от исходного, соответственно (p<0,001), а при больших дозах (0,3 и 0,5 мг/кг) АД снижалось меньше (до 20,3 и 18,1 %; p<0,001). То есть наблюдалась колоколообразная зависимость эффекта от дозы пептида. Систолическое давление падало на первых секундах введения самых маленьких доз (до 18% уже на дозе 0,05 (p<0,001) и слегка восстанавливалось к концу периода наблюдения, оставаясь тем не менее на 1,5-2% ниже 71 исходного. Максимальное падение систолического АД (на 20,5%) наблюдалось при дозе 0,1 мг/кг (6-я минута; p=0,004). КДД изменялось слабо, чаще в сторону уменьшения на 1-2 мм рт. ст. от исходного (p=0,03-0,01). ЧСС носила двухфазный характер. В первые секунды она падала на 1,58% (p=0,01). Возможно, это было связано с холодовым воздействием болюса на синусный узел, так как мы вводили раствор комнатной температуры в ярёмную вену. В последующем ЧСС повышалась до исходных значений, а иногда и превышала их на 2-3%. По-видимому, это было связано с барорефлексом, но, вопреки нашим ожиданиям, эффект не был выраженным. Таким образом, ЧСС изменялась слабо. Индекс Верагута также носил двухфазный характер. Обычно в первые 20 секунд он дозозависимо снижался от 0,4% при дозе 0,01 мг/кг (p=0,24) и до 9,4% при дозе 0,5 мг/кг (p=0,001). Затем индекс восстанавливался, превышая исходные значения к концу первой минуты, особенно при малых концентрациях (на 10,5% при дозе 0,05 мг/кг p=0,002). На дозах 0,3 и 0,5 мг/кг он достигал исходных значений и снова падал к концу периода наблюдения на 1,5-2%. То есть сократимость сначала падала, затем восстанавливалась и снова снижалась. Константа расслабления снижалась от 9-11% на дозе 0,01 мг/кг (p=0,01) до максимальных значений 35-38% на дозе 0,05 мг/кг (p=0,003). На больших дозах падение было не так выражено (21%; доза 0,5 мг/кг; p=0,05). То есть расслабление замедлялось, притом более выражено при меньших дозах. PEP укорачивался на всех дозах к концу третьей минуты. Максимальные изменения были на 40-й секунде при дозе 0,05 мг/кг (12,5% p=0,002), затем он несколько восстанавливался к концу периода наблюдения. На больших дозах к 10-й минуте отмечались положительные значения. III.2.6.3. Апелин-12-2 72 В апелине-12-2 помимо норлейцина в 10-м положении дополнительно на N-конце заменён аргинин на метиларгинина. Такая замена привела к резкому уменьшению гипотензивного эффекта пептида (рис. 16). Рисунок 16. Изменение среднего артериального давления (САД), индекса сократимости Верагута (+dP/dtmax/P) и экспоненциальной константы расслабления (LV-CR-Exp) у наркотизированных крыс при внутривенном болюсном введении апелина-12-2 в дозе 0,3 мг/кг. Максимальное падение АД наблюдалось на максимальной дозе (0,5 мг/кг) и составляло всего 2,9% (p=0,06). На остальных дозах эффект был меньше. Систолическое давление также менялось слабо. Сначала шёл подъём с максимумом на 1-ой минуте (до 5,2% на дозе 0,3 мг/кг (p=0,01), затем было падение (до -2,3% на дозе 0,5 мг/кг; p=0,12) КДД поднималось на 1-2 мм рт. ст. Максимальный подъём был на дозе 0,5 мг/кг (с -5 до -2,1 мм рт. ст. (p=0,06)). ЧСС изменялось в пределах 1,5%. В первые 40 секунд после введения наблюдалось дозозависимое падение индекса Верагута от -2,4% на дозе 0,2 мг/кг (p=0,05) до -5,1% на дозе 73 0,5 мг/кг (p=0,001). Затем, индекс немного восстанавливался, иногда до положительных значений (+1% – +1,6% от исходного; доза 0,5 мг/кг (p=0,06)). То есть сократимость сначала снижалась, а затем улучшалась. Константа расслабления на 1-ой секунде после введения снижалась дозозависимо (5,5% при дозе 0,05 мг/кг, p=0,02). Максимальное снижение (13,3%) на дозе 0,5 мг/кг (p=0,001). Затем шло её восстановление до исходного уровня. То есть расслабление сначала замедлялось, а затем восстанавливалось. РЕР (ДПП) укорачивался дозозависимо (доза 0,05 мг/кг максимально на -2,9% от исходного, 1-я минута введения (p<0,001); доза 0,5 мг/кг максимально на -4,9% от исходного, 1-я минута введения (p=0,002). К концу периода наблюдения РЕР возвращался к исходным значениям. III.2.6.4. Апелин-12-3 Следующая модификация апелина-12 отличалась от апелина-12-2 добавлением амидной группы на С-конце пептида. Такая замена также уменьшила гипотензивные свойства пептида по сравнению с природным (рис. 17). Рисунок 17. Изменение среднего артериального давления (САД), индекса сократимости Верагута (dP/dtmax/P) и экспоненциальной константы расслабления (LV-CR-Exp) у наркотизированных крыс при внутривенном болюсном введении апелина-12-3 в дозе 0.2 мг/кг. 74 Снижение АД наблюдалось на первых секундах введения и было дозозависимым (на 90-й секунде после введения от 0,6% при дозе 0,05 мг/кг, p=0,27 до 3,8% при дозе 0,5 мг/кг, p=0,03). Систолическое давление изменялось слабо. На маленьких дозах (0,05 мг/кг) оно поднималось в первые 20-30 сек до +2,6-2,7% (p=0,004) и восстанавливалось до +0,4-1% к концу периода (p=0,23). При больших дозах (0,3-0,5 мг/кг) наблюдалось падение систолического давления (-2,9%; 25-я сек введения дозы 0,3 мг/кг, p=0,01) с восстановлением до исходных значений к концу периода наблюдений (7-10-й минуте). КДД также изменялось слабо. В основном в сторону повышения на 0,51% (с -8,6 до -7,5 мм рт. ст. на 15-й сек введения дозы 0,5 мг/кг, p=0,01). В основном наблюдалось незначительное падение ЧСС в начале введения (на 2-3%) с восстановлением до исходного к концу периода наблюдения. Индекс Верагута снижался на первых секундах введения с последующим восстановлением к концу периода наблюдения (максимум 75 падения на 4,5% был зафиксирован на 15-й секунде введения дозы 0,1 мг/кг, p=0,007) Экспоненциальная константа расслабления снижалась на всех дозах, в основном на первых секундах введения. Максимальное падение (-10,7%) регистрировалось на 15-й сек на дозе 0,1 мг/кг, p=0,01). К концу периода наблюдения индекс восстанавливался, хотя и не полностью, достигая значений от (-0,5%) до (-1%) от исходного. РЕР слегка укорачивался к 1-й минуте, максимально на 1,6-1,7% при дозе 0,05 мг/кг, однако, достоверность отмечалась лишь на дозах 0,05 мг/кг и 0,01 мг/кг (p<0,01), а затем восстанавливался к исходным значениям. III.2.6.5. Апелин-12-4 Модификация этой молекулы посредством замены метиларгинина на нитроаргинин (Arg(NG-NO2)) вновь вернула пептиду способность значительно снижать АД и замедлять расслабление миокарда. Однако апелин12-4, в отличие от апелинов 12 и 12-1, не смог удерживать сниженное АД продолжительное время – АД стабилизировалось уже в пределах 10 мин (рис. 18). Рисунок 18. Изменение среднего артериального давления (САД), индекса сократимости Верагута (dP/dtmax/P) и экспоненциальной константы расслабления (LV-CR-Exp) у наркотизированных крыс при внутривенном болюсном введении апелина-12-4 в дозе 0.2 мг/кг. 76 У этого пептида вновь наблюдался дозозависимый гипотензивный эффект, однако, несколько меньший и менее продолжительный, чем у Ап-12-0 и Ап-12-1: от 3,6% на 1-й минуте при дозе 0,05 мг/кг (p=0,04) до 21,4% на 3ей минуте дозы 0,5 мг/кг (p=0,001). К концу периода наблюдения САД восстанавливалось. Систолическое давление снижалось больше всего на дозе 0,2 мг/кг (40я секунда введения, 15,2%, p=0,001) КДД возрастало максимум на 1,5-2 мм рт. ст. от исходного уровня на больших дозах. ЧСС изменялось слабо, чаще сначала снижалось на первых секундах после начала введения на 1,5-2%, затем немного возрастала. Больше всего ЧСС повышалась на максимальной дозе 0,5 мг/кг, где к 3-ей минуте она возрастала на 5,2% от исходного уровня (p=0,04). Индекс Верагута показал двухфазное дозозависимое изменение. В первые 20 сек. от начала введения он снижался (максмально на 3,2% при дозе 77 0,2 мг/кг, p=0,02), но на 2-ой минуте возрастал с максимумом на 9,5% при дозе 0,5 мг/кг, (p=0,02). Экспоненциальная константа расслабления (ЭКР) дозозависимо падала, а затем, несколько восстанавливалась к концу периода наблюдения. Максимальное падение ЭКР отмечалось к концу первой минуты при дозе 0,2 мг/кг и было -16% (p=0,01). Восстановление ее было до -5% (доза 0,2-0,3 мг/кг, p=0,01) и даже превышало исходную величину на 5,7% при дозе 0,5 мг/кг, однако, недостоверно. РЕР укорачивался к концу 1-ой минуты после введения, а затем, восстанавливался к исходным значениям. Максимальное укорочение (5,1% от исходного) наблюдалось при дозе 0,3 мг/кг, (p=0,005). Таким образом, для дальнейших экспериментов при разработке лекарственного средства лечения СН нами был выбран апелин-12-2, так как он значимо не снижал системного АД и, согласно результатам опытов Н. Ундровинаса (статья в ж. Кардиология, в печати), лучше влиял на работу внутриклеточных кальциевых насосов. III.2.7. Инфузионное введение апелинов 12-0 и 12-2 здоровым крысам Для выявления физизиологического действия апелина-12-2 в сравнении с природным пептидом у здоровых животных мы использовали инфузионное внутривенное введение препаратов. Апелин вводился с помощью шприцевого насоса кумулятивно в возрастающих концентрациях от 0,5 до 50 мкг/кг/мин ступеньками по 10 мин. В этом случае эффекты были более стабильны, чем при болюсном введении. Таблица 11. Исходные параметры контрольных животных перед введением апелинов 12-0 и 12-2. ЧСС – частота сердечных сокращений. АД – среднее давление в аорте. СДЛЖ – систолическое давление в левом желудочке сердца; ДДЛЖ – диастолическое давление в левом желудочке сердца; +dP/dtmax/P – индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp - экспоненциальная константа расслабления; ДПС – длительность периода систолы. ДПП – длительность периода предизгнания. Исходное состояние Апелин-12-0 Апелин-12-2 78 ЧСС (уд/мин) АД (мм рт.ст.) СДЛЖ (мм.рт.ст.) ДДЛЖ (мм.рт.ст.) +dP/dtmax/P (с-1) LV-CR-Exp (с-1) ДПП (PEP) (мс) ДПС (DEP) (мс) n=13 n=8 443±8 115±3 158±3 3,4±1,6 154±11 99±7 18,0±0,7 14,0±1,2 420±10 120±1 137±2 3,8±0,7 149±6 107±7 20,3±0,5 15,2±0,6 Исходные параметры этих серий практически не различались за исключением СДЛЖ (таб. 11). Инфузия апелинов сопровождалась дозозависимым, хотя и небольшим, повышением ЧСС и СД, а также показателей сократимости и расслабимости (+dP/dtmax/P, LV-CR-Exp), снижением PEP (рис. 19). Рисунок 19. Эффект внутривенной инфузии апелина-12-2 с возрастающей скоростью (0,52-5-10-50 мкг/кг/мин) на среднее артериальное давление (АД), частоту сердечных сокращений (ЧСС), максимальную скорость развития давления в ЛЖ (ДЛЖ-Vmax), индекс сократимости Верагута (ИС), и экспоненциальную константу расслабления (LV-CR-Exp) сердец крыс из контрольной группы. Тонкими линиями показана динамика изменения показателей в каждом опыте, а толстыми линиями – средние величины. 79 Преимущество апелина-12-2 перед нативным проявилось уже при сравнении эффектов малой дозы 2 мкг/кг/мин. При данной скорости введения наблюдалось достоверное увеличение ЧСС (p<0,01), индекса сократимости (у апелина-12-2 прирост ИС в 4 раза превышал прирост ИС нативного пептида, p<0,02). Константа расслабимости у апелина-12-2 также была достоверно выше (p<0,02) по сравнению с апелином-12-0 (рис. 20). Рисунок 20. Влияние инфузии апелина-12-0 и апелина-12-2 в концентрации 2 мкг/кг/мин на физиологические параметры сердца здоровых крыс. Обозначения: ЧСС – частота сердечных сокращений; СД – систолическое давление; +dP/dtmax/P – индекс сократимости сердца Верагута; КР – экспоненциальная константа расслабления. 80 В связи с наличием кумулятивного эффекта точно определить дозозависимость не удалось, поэтому физиологическое действие максимальной дозы сравнивали не с состоянием перед введением каждой дозы, а с исходными параметрами до введения препаратов. У пептидов часто наблюдается «колоколообразная» зависимость на кривых доза-эффект. Поэтому мы сравнивали эффекты на малых дозах, выбрав концентрацию 2 мкг/кг/мин и максимальный эффект в диапазоне доз 10-50 мкг/кг/мин. Чаще всего он совпадал с максимальной дозой 50 мкг/кг/мин, но иногда наблюдался при меньших концентрациях (20 или 10 мкг/кг/мин) (Рис 21). Рисунок 21. Изменения показателей функции сердца контрольных животных при инфузии апелина-12-0 и апелина-12-2 (в процентах к исходному уровню; М±SE) при малых дозах 0,5-2 мкг/кг/мин (А) и при максимальном эффекте в диапазоне доз 10-50 мкг/кг/мин (Б). САД – среднее артериальное давление; ЧСС – частота сердечных сокращений; СД – систолическое давление в левом желудочке; +dP/dtmax/P – индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp – экспоненциальная 81 константа расслабления левого желудочка сердца; PEP – длительность периода предизгнания; DEP – длительность периода изгнания. Достоверность указана между эффектами Ап-12-0 и Ап-12-2. Если при малых концентрациях (0,5-2 мкг/кг/мин) значимые различия наблюдались только по индексу сократимости Верагута (увеличивался на 6,8% у Ап-12-2 против 0,5% у Ап-12-0; p<0,05) и длительности периода изгнания (DEP изменялся разнонаправлено на -2,8% у аналога против +2% у нативного пептида; p<0,01) (Рис 21А), то при максимальном эффекте в 82 диапазоне больших доз достоверность была достигнута по всем параметрам (Рис 21Б). На больших дозах видно, что давление в аорте при введении апелина12-2 повышалось меньше, чем у природного пептида (1,1% против 5,4%), а ЧСС увеличивалась достоверно больше (на 11,7% против 3,4%). СДЛЖ повышалось на 7,2% против 2,7%, а индекс Верагута на 12,9% против 3,3%, соответственно. Константа расслабления возрастала на 9,4% против 3,1%, то есть улучшалось расслабление сердца. Временныо е показатели сократимости у апелина 12-2 были значительно лучше, чем у апелина-12-0. PEP уменьшалась в среднем на 9,9% против 4,1%, а DEP укорачивалась на 7,1%, против 2%, соответственно. Рисунок 22. Изменения показателей сократимости и расслабимости сердец здоровых крыс в зависимости от дозы апелина-12-0 и после прекращения введения препарата. Обозначения: +dP/dtmax/P – индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp – экспоненциальная константа расслабления левого желудочка сердца; PEP – длительность периода предизгнания; DEP – длительность периода изгнания. Значения даны в % к исходным величинам (n=8). Рисунок 23. Изменения показателей сократимости и расслабимости сердец здоровых крыс в зависимости от дозы апелина-12-2 и после прекращения введения препарата. Обозначения: +dP/dtmax/P – индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp – экспоненциальная константа 83 расслабления левого желудочка сердца; PEP – длительность периода предизгнания; DEP – длительность периода изгнания. Значения даны в % к исходным величинам (n=9). Из рисунков 22 и 23 видно, что при введении обоих апелинов здоровым животным дозозависимо повышался индекс сократимости Верагута. Только при введении ап-12-2 он возрастал больше (максимум 13,5±4,6% при дозе 50 мкг/кг/мин; p<0,05 по сравнению с исходной величиной), чем при инфузии ап-12-0 (максимум 3,6±2,6% при дозе 20 мкг/кг/мин; н.д.) (рис.22). Точно также увеличивалась и константа расслабления (максимум при дозах 50 мкг/кг/мин 14,8±2,3%; p=0,004 vs 3,7±5,8%; н.д.) При отмене препарата показатели возвращались к исходным значениям (рис.23). Из рисунка видно, что по действию на индекс сократимости и константу расслабления ап-12-2 действовал достоверно сильнее, чем ап-12-0. Период предизгнания также дозозависимо снижался в большей степени у ап-12-2 с максимальным эффектом при дозе 50 мкг/кг/мин (-6,9% против -5,9%), а при отмене возвращался к исходным значениям. Другой временной параметр (DEP) при введении ап-12-0 изменялся только при большой концентрации (-8,2% при 50 84 мкг/кг/мин) (рис.22), в тоже время у апелина 12-2 этот параметр достоверно уменьшался, начиная с 2 мкг/кг/мин (рис.23). Таким образом, при возрастании дозы апелин-12-2 вызывал у здоровых животных улучшение сократимости и расслабимости достоверно сильнее, чем природный пептид и был более эффективен по сравнению с апелином-120. III.2.8. Инфузионное введение апелинов 12-0 и 12-2 крысам с хронической сердечной недостаточностью Аналогичный протокол был применён у крыс с ХСН, вызванной введением изопротеренола. Таблица 12. Исходные параметры контрольных животных перед введением апелинов 12-0 и 12-2. ЧСС – частота срдечных сокращений. АД – среднее давление в аорте. СДЛЖ – систолическое давление в левом желудочке сердца; ДДЛЖ – диастолическое давление в левом желудочке сердца; +dP/dtmax/P – индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp - экспоненциальная константа расслабления; ДПС – длительность периода систолы. ДПП – длительность периода предизгнания. Исходное состояние ЧСС (уд/мин) АД (мм.рт.ст.) СДЛЖ (мм.рт.ст.) ДДЛЖ (мм.рт.ст.) +dP/dtmax/P (с-1) LV-CR-Exp (с-1) ДПП (PEP) (мс) ДПС (DEP) (мс) Апелин-12-0 n=8 379±10 109±10 132±9 8,2±3,8 130±13 69±10 18,5±1,5 64,5±2,4 Апелин-12-2 n=8 364±9 113±1 125±2 7,3±0,6 123±8 61±3 21,9±1,7 67,1±2,3 Как мы видим из таблицы (таб. 12), исходное состояние групп мало отличается друг от друга, а по сравнению с контрольными животными отмечено значительное повышение ДДЛЖ и снижение индексов сократимости и, особенно, расслабимости (таб. 11). Действие апелинов-12-0 и 12-2 на показатели гемодинамики и функцию сердца животных с ХСН представлены на рис. 24. Рисунок 24. Изменения показателей функции сердца животных с ХСН при инфузии апелина-12-0 и апелина-12-2 (в процентах к исходному уровню; М±SE) при малых дозах 0,5-2 85 мкг/кг/мин (А) и при максимальном эффекте в диапазоне доз 10-50 мкг/кг/мин (Б). САД – среднее артериальное давление; ЧСС – частота сердечных сокращений; СД – систолическое давление в левом желудочке; +dP/dtmax/P – индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp – экспоненциальная константа расслабления левого желудочка сердца; PEP – длительность периода предизгнания; DEP – длительность периода изгнания. Достоверность указана между эффектами Ап-12-0 и Ап-12-2. САД менялось недостоверно как для больших, так и для малых концентраций. ЧСС малые дозы практически не меняли, а в области больших концентраций синтетический аналог увеличивал ЧСС более чем в 2 раза 86 (14,2% vs 6,7%). По СД достоверные различия между апелинами наблюдались уже в области малых доз (-1% vs +1,9%), а при больших концентрациях они были более выражены (+2,1% vs +6,1%). Индекс сократимости достоверно не менялся как для малых, так и для больших доз, однако, константа расслабления возрастала, притом в области максимальных концентраций эффект ап-12-2 был в 2,5 раза сильнее, чем у природного аналога (20,5% vs 8,5%). Временные параметры: длительности периодов предизгнания и изгнания укорачивались как на малых, так и на больших дозах. При больших концентрациях различия были более выражены (PEP: Ап-12-0 -4.9% vs -10,3% Ап-12-2; DEP: -2,2% vs -8,4%, соответственно). Рисунок 25. Изменения показателей сократимости и расслабимости сердец крыс с ХСН в зависимости от дозы апелина-12-0 и после прекращения введения препарата. Обозначения: +dP/dtmax/P – индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp – экспоненциальная константа расслабления левого желудочка сердца; PEP – длительность периода предизгнания; DEP – длительность периода изгнания. Значения даны в % к исходным величинам (n=8). Рисунок 26. Изменения показателей сократимости и расслабимости сердец крыс с ХСН в зависимости от дозы апелина-12-2 и после прекращения введения препарата. Обозначения: +dP/dtmax/P – индекс сократимости Верагута; LV-CR-Exp – экспоненциальная константа расслабления левого желудочка сердца; PEP – длительность периода предизгнания; DEP – длительность периода изгнания. Значения даны в % к исходным величинам (n=7). 87 При введении ап-12-0 (рис. 25) индекс сократимости у животных с ХСН повышался слабо, не более чем на 4,9% от исходного при дозе 0,5 мкг/кг/мин (p=0,03) и при отмене препарата он в течение 10 минут возвращался к исходному уровню. В отличие от этого введение апелина-12-2 дозозависимо повышало сократимость и продолжало повышать после отмены препарата индекс Верагута до 5,4% от исходного уровня (10-я минута прекращения введения, p=0,01). Константа расслабимости сердец с ХСН при введении ап12-0 имела два максимума повышения – при дозах 2 и 50 мкг/кг/мин (11%). При введении ап-12-2 (рис. 26) также наблюдалось два максимума при 10 и 50 мкг/кг/мин (15,8%) (достоверность от исходного уровня начиналась с дозы 10 мкг/кг/мин). После отмены препарата константа имела тенденцию к восстановлению, но не достигала исходного уровня за 10 мин наблюдения. Длительность периода предизгнания при введении ап-12-0 укорачивалась уже с малых доз, но максимум укорочения (-3,3%) наблюдался при максимальной дозе 50 мкг/кг/мин (н.д.). При отмене препарата он имел чёткую тенденцию возвращаться к исходному уровню. При введении апелина-12-2 животным с 88 ХСН PEP снижался более резко, до -9,5% от исходного уровня при максимальной дозе) (p<0,05 для всех доз). После отмены препарата PEP продолжал укорачиваться до -13% от исходного уровня за 10 минут. Достоверные различия в действии на PEP природного и синтетического апелинов начинались уже с дозы 10 мкг/кг/мин (p<0,01). DEP при введении ап-12-0 животным с ХСН изменялся недостоверно и разнонаправлено: укорачивался в области малых и средних доз (2 и 10 мкг/кг/мин) до -1,8%, но при больших дозах (20 и 50 мкг/кг/мин) удлинялся до 3,9%. При отмене была тенденция к возвращению к исходному уровню. При введении животным с ХСН синтетического аналога ап-12-2 укорочение DEP наблюдалось во всём диапазоне доз с максимумом -6% при дозе 20 мкг/кг/мин (p=0,01). При отмене препарата DEP возвращался к исходным значениям, хотя за 10 мин так и не достигал начального уровня. Таким образом, если у здоровых крыс оба апелина больше влияли на параметры сократимости сердца, то у больных животных с ХСН больше изменялись показатели расслабимости. При этом относительные изменения показателей у животных с ХСН были больше, чем в контрольной группе, и действие апелина-12-2 было более выражено, чем у апелина-12-0. III.2.9. Эхокардиографическое исследование крыс с сердечной недостаточностью. Часть крыс с ХСН (n=5) под кетаминовым наркозом были исследованы методом эхокардиографии. Эти животные имели явные признаки СН: ЛЖ был расширен, диастолический объём увеличен более чем в 1,5 раза (1,39±0,28 мл по сравнению с 0,84±0,05 мл в контроле). ФВ составляла 57±5%, тогда как в норме у крыс она была 84±1%. Последующее введение возрастающих доз апелина-12-2 (2-10-50 мкг/кг/мин) ступеньками по 10 минут повышало функциональные показатели работы сердец (рис. 27 и рис. 28). 89 Рисунок 27. Влияние инфузии Апелина-12-2 (10 мкг/кг/мин) на фракцию выброса крысы с ХСН, вызванной изопротеренолом (крыса № 4). Эхокардиография. А – исходное состояние; Б – через 10 минут после введения апелина. ФВ возрасла с 49% до 71%. А Б Рисунок 28. Изменения эхокардиографических параметров сердец крыс с ХСН при внутривенном введении апелина-12-2 с разной скоростью. Параметры измерены в конце 10-й 90 минуты введения каждой дозы и выражены в процентах к исходному состоянию. ФВ – фракция выброса; СУЗС – степень утолщения задней стенки ЛЖ; МОК – минутный объём крови. (n=5) Параметры увеличивались при введении возрастающих доз в разной степени. Это неудивительно, потому что у пептидов часто наблюдается «колоколообразная» зависимость на кривых доза-эффект. В наших экспериментах наиболее эффективной была дозировка 10 мкг/кг/мин, под влиянием которой прирост МОК (17±6%) и ФВ (8±2,8%) были статистически значимы. Степень утолщения задней стенки достоверные различия показала только на дозе 50 мкг/кг/мин (31,4±10,9%; p=0,04). Таким образом, наблюдалось полное соответствие с результатами опытов катетеризации сердца в которых отмечалось повышение систолического давления ЛЖ. III.2.10. Заключение Таким образом, результаты экспериментов показали, что апелин-12-2 меньше снижает системное давление, чем другие аналоги, и больше поднимает сократимость и расслабимость миокарда, чем природный апелин- 91 12-0. Поэтому апелин-12-2 может служить молекулой для дальнейшей разработки лекарственного средства лечения СН. ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ IV.1. Клиническое исследование IV.1.1. Сравнение диагностического и прогностического значения апелина-12 и галектина-3 с другими биомаркёрами. В нашей работе апелин-12 не показал диагностической ценности. Хотя значения апелина в крови больных были идентичны результатам исследования K.S. Chong [65], где средний уровень пептида пациентов с ХСН составлял 0,85 нг/мл и коррелировал с ФВ, концентрации апелина-12 у наших больных (0,77 нг/мл) не имели связи с ФВ ЛЖ. В тоже время у контрольной группы средние значения пептида в зарубежной работе были значительно выше, чем у нас (3,76 vs 0,86 нг/мл). В исследовании J.P. Goetze [66] концентрация апелина здоровых также превышала этот показатель больных ХСН в 2,1 раза (p<0,01). K.H. Miettinen сравнивал значения пептида у больных ХСН, вызванной ДКМП, и у здоровых добровольцев [70]. Уровни апелина в этих группах, как и у нас, статистически значимо между собой не отличались (24,1 [19,0; 28,7] vs 26,5 [3,4; 97,9] пкг/мл, p>0,05). Слабыми оказались у нас и прогностические свойства пептида (AUC 0,573). В исследовании [83] апелин также был плохим маркёром 60-дневного прогноза исхода СН (AUC 0,54), уступая и NT-proBNP и галектину-3. Причин отрицательного результата может быть несколько. Как мы уже упоминали, зарубежные учёные указывают на повышение апелина в крови при лёгкой степени сердечной недостаточности с достижением максимума у больных средней тяжести и последующим снижением уровня пептида у тяжёлых пациентов. Таким образом, лёгкие и тяжёлые больные ХСН имеют примерно одинаковые концентрации апелина, что затрудняет его использование в качестве маркёра СН. Вторая причина скрывается в 92 механизмах экспрессии апелина. Системы апелин-APJ и РААС тесно связаны между собой и повышение активности одной неизменно влечёт снижение активности другой. В экспериментальных исследованиях было доказано, что связывание апелина ангиотензина-II, а со своим рецептором фармакологическая блокада тормозит АТ 1 образование сопровождается повышением выработки апелина и APJ. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ), как эндокарбоксипептидаза, разрушает пептид, отщепляя последовательно по одной аминокислоте с С-конца [45,46]. В свой протокол мы включали пациентов, которые чаще всего уже длительно получали базовую терапию, в том числе иАПФ или сартаны. Поэтому степень активности РААС у всех больных была разной, что не могло не повлиять на экспрессию апелина. Отдельно стоит упомянуть о методике определения пептида в крови. Напомним, что у иностранных авторов средние концентрации апелина плазмы даже в контрольных группах сильно разнились и колебались в пределах от 90 до 3580 пкг/мл [18]. Эти разногласия могут быть обусловлены как несовершенством используемых тест-систем (низкая специфичность к апелину), так и неполной экстракцией апелинов из плазмы. Производители тест-систем также обращают внимание на возможные кроссреакции между апелинами 12, 13 и 36. Галектин-3, как и апелин-12, в нашем протоколе не проявил себя в качестве хорошего маркёра диагностики СН. Средняя концентрация галектина-3 у наших больных ХСН была 10,4 нг/мл, в то время как в исследовании DEAL-HF она составляла 18,6 нг/мл [145]. Возможно, это связано с тем, что у зарубежных учёных преобладали тяжёлые больные III-IV ф.к. В тоже время, как и мы, исследователи не нашли корреляций между галектином-3 и ФВ, а также этиологией СН. По прогнозу выживаемости же у голландских учёных галектин-3 и NT-proBNP были идентичны (AUC 0,612 и 0,611, соответственно). Не проявил себя галектин-3 прогностическим маркёром и в исследовании AHFS [187]. В этой работе повышение уровня галектина-3 связывали обычно с почечной дисфункцией, которую мы 93 детально не изучали. В другом протоколе [188] галектин-3 плазмы больше коррелировал с функцией почек, чем с тяжестью ХСН. Поэтому возникает много вопросов: является ли галектин-3 маркёром ХСН или ухудшения функции почек? Может ли блокада галектина-3 остановить патологические процессы в сердце и почках? [189]. В нашем исследовании вч-ТнТ лучше, чем апелин и галектин-3, отражал тяжесть сердечной недостаточности и был достоверно повышен у тяжёлых больных III и IV ф.к. Тропонин также лучше предсказывал прогноз исхода СН. Наши данные подтверждают хороший диагностический потенциал тропонина в качестве маркёра диагностики и прогноза ХСН и соотносятся с результатами крупных международных исследований Val-HeFT и GISSI-HF, где вчТнТ выявлял тяжесть и хорошо предсказывал исход ХСН [207]. Традиционный маркёр СН – NT-proBNP хорошо выявлял тяжесть СН, повышаясь в среднем от 854 пкг/мл в I ф.к. до 6021 пкг/мл в IV ф.к. Из всех изученных нами биомаркёров он был лучшим в прогнозе исхода СН (AUC 0,729). Таким образом, наши данные соответствуют крупным международным исследованиям PRIDE, AD-HERE и STARS-BNP [101-102]. IV.2. Экспериментальное исследование. IV.2.1. Метод импедансной кардиографии. Чаще всего сократительную способность миокарда у животных, как и у людей, измеряют с помощью эхокардиографии. Она является «золотым стандартом», но требует специализированного дорогостоящего оборудования и высокого уровня квалификации. В качестве альтернативы используют инвазивные методы катетеризации полостей сердца катетерами разных типов, в том числе Милларовскими и импедансными петлевыми, способными измерять кривые давление-объем в одиночных кардиоциклах. Такие методы применяют, как правило, в острых опытах и они связаны с прохождением через аортальный клапан или верхушку сердца. При этом створки клапана могут повреждаться, 94 а проведение катетера через верхушку часто осложняется кровотечением, что влияет на точность измерения сократимости. В нашей работе мы применили метод импедансной кардиографии (ИКГ) с накожными электродами для оценки сократимости сердца по длительности периода предизгнания (PEP). При этом плетизмограф был переделан под работу с животными, у которых частота сердечных сокращений в несколько раз превышает ЧСС у человека. Был разработан специальный пакет компьютерных программ (д.б.н. Е.В. Лукошкова) для определения интервалов PEP с точностью до 0,1 мс, а самое главное – применен способ упрощенного автоматического определения начала и конца периода предизгнания, запатентованный для человека В.М. Хаютиным с соавторами [191] от пика зубца R на ЭКГ до максимума второй производной импедансного сигнала (d2Z/dt2) (рис. 2). Этот метод может быть использован у одного животных многократно. Для оценки эффективности ИКГ мы сравнили показатели, полученные с его помощью с традиционными инвазивными методами и известными показателями сократимости, разработанными еще в прошлом веке: dP/dt [208] и dP/dtmax /P (индекс Верагута (Veragut-Krayenbuhl) [204]), где P – это давление, развиваемое ЛЖ в момент измерения максимума dP/dt. В наших экспериментах PEP оказался очень близок к интервалу QA из работ Нортона и Кубичека [208-209], а коэффициент корреляции PEP как с dP/dtmax, так и с индексом Верагута значительно превышал его. При этом высокая корреляция между инвазивными и неинвазивными показателями сохранялась не только на пике эффекта, но и в любой момент действия инотропного фактора (рис. 11). Это позволяло следить за изменением сократимости при введении фармакологических препаратов. На 60 здоровых крысах длительность PEP, измеренная инвазивным методом с катетеризацией левого желудочка сердца Милларовским катетером и методом импедансной кардиографии, различалась лишь на 5 миллисекунд и наблюдалась высокая степень корреляции между ними (r=0,95). 95 Были проведены фармакологические пробы с инфузией положительного инотропного агента допамина в дозах 10, 15 и 20 мкг/кг/мин и получены еще более тесные корреляции между PEP измеренным инвазивным и неинвазивным методом (r=0,987), а коэффициент корреляции между PEP и индексом Верагута составил 0,92 (рис. 12). Таким образом, мы доказали, что наружная ИКГ может применяться для оценки сократительной способности сердца у животных. IV.2.2. Характеристика хронической сердечной недостаточности, вызванной изопротеренолом. Для создания модели хронической сердечной недостаточности мы вводили животным изопротеренол – искусственный катехоламин (агонист βадренорецептора). Эту модель предложил Rona G. в середине прошлого века [198] и она продолжает использоваться до сих пор [201, 202]. При ХСН, вызванной изопротеренолом, диастола страдает больше, чем систола. Это может быть связано с нарушением функции митохондрий. Такую же картину наблюдали и другие авторы при целенаправленной блокаде энергообразования [210-211]. Matsuyoshi с соавторами [212] показал, что у сердец крыс, перфузируемых кровью после введения ИЗО, замедляется расслабление. При этом в миокарде уменьшается выработка белков Са 2+транспорта. При перевязке коронарных артерий также удлинялась фаза изометрического расслабления. Под действием ИЗО снижалась растяжимость сердца у мышей [213]. Снижение расслабления и сократимости миокарда приводило к неполному опорожнению левого желудочка в систолу, повышению КДД и росту диастолической упругости желудочка [214]. Рост КДД - это адаптивный признак, так как повышенная диастолическая упругость облегчает развитие силы в систолу и способствует нормализации систолического давления. Но дальнейшее ухудшение расслабления и снижение сократимости приводит к дилатации полостей желудочков сердца. Это происходит при активации воспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-17, вызывающих экспрессию 96 матричных металлопротеиназ ММР-2 и ММР-9 [215]. Нарушенная геометрия ЛЖ приводит к нарушению систолы – уменьшаются ФВ и ΔS, так развивается систолическая ХСН. Неполное удаление Са 2+ из цитоплазмы приводит к субконтрактурам миофибрилл, что можно наблюдать и на гистологических срезах и это еще больше повышает КДД ЛЖ. Снижение сократимости изолированных КМЦ желудочка и замедленный ритм спонтанных сокращений изолированных предсердий наблюдается уже через 1 неделю после ежедневного введения малых доз ИЗО [216]. При повышении КДД повышается венозное давление, что обеспечивает достаточный приток крови к сердцу, а периферическое сопротивление снижается, и это облегчает изгнание крови из желудочков. При этом из-за снижения артериовенозного градиента давления кровообращение внутренних органов ухудшается. При недостатке компенсаторных резервов развивается ХСН либо с недостаточностью притока крови к сердцу или ХСН с повышением периферического сопротивления. Повышение КДД является характерным признаком как диастолической, так и систолической ХСН. При диастолической СН КДД повышается из-за нарушения расслабления и уменьшения объема ЛЖ в фазу наполнения желудочка кровью. При систолической ХСН КДД повышается не только изза снижения расслабления желудочка, но и из-за снижения изгнания и увеличения остаточного объема крови в расширенном желудочке. В сердцах с ХСН Са2+ плохо удаляется из цитоплазмы кардиомиоцитов в диастолу из-за нарушения работы внутриклеточных Са2+ насосов, что в свою очередь приводит к их плохому расслаблению и способствует возникновению аритмий. IV.2.3. Аналоги апелинов. Нашей задачей было отобрать один из 4-х аналогов апелина-12, синтезированных в лаборатории синтеза пептидов (рук. Ж.Д. Беспалова) ФГБУ РКНПК, обладающих повышенной протеолитической устойчивостью и большей стабильностью при хранении, с целью последующей разработки 97 лекарственного средства лечения ХСН. Сначала мы проверили биологическую активность синтетических аналогов апелина при болюсном введении в возрастающих дозах, сравнивая их с нативным пептидом. Многочисленные данные свидетельствуют, что практически все апелины оказывают гипотензивное дествие [12,19,217,218]. Этот эффект объяснялся наличим фенилаланина на С-конце пептида, так как его замена на d-аланин устраняла данный эффект [120,218]. Величина гипотензивного действия была обратно пропорциональна количеству аминокислот во фрагментах. Так апелин-36 оказывал минимальное, а апелин-12 – максимальное действие, вдвое превышающее эффект апелина-13 [12]. Типичное действие апелина-13 у крыс и овец одинаковое – быстрое снижение АД с повышением частоты сокращений сменяется обратными изменениями [32]. Для апелина-12 в наших опытах была характерна аналогичная динамика. Вместе с тем следует отметить, что наиболее значительным гипотензивным эффектом обладали апелин-12-0 и особенно апелин-12-1, в то время как эффект на АД у апелина-12-4 был умеренным. Разница между ними состоит в том, что в первых двух пептидах С-конец содержал гидроксильную группу, а в апелине-12-4 она была заменена амидной группой. Является ли данная модификация определяющей или большее значение приобретает модификация N-конца в апелине-12-4, ещё предстоит выяснить. В пользу последнего предположения говорят наши данные о том, что метилирование аргинина на N-конце молекулы апелина-12-1 (апелин-12-2 и апелин-12-3) резко уменьшает или полностью устраняет гипотензивный эффект. Если механизм гипотензивного действия апелина в целом ясен и включает в себя активацию эндотелиальной NO-синтазы, то его прямое действие на миокард не столь очевидно. Положительный инотропный эффект апелина in vivo может маскироваться изменениями гемодинамики: уменьшением притока к сердцу, о чём свидетельствует снижение площади 98 ЛЖ в диастолу [13,220], и падением диастолического давления в ЛЖ. Кроме того, значительно падает и АД. Следствием этого является снижение систолического давления в ЛЖ и максимальной скорости развития давления. Однако, индекс сократимости повышался тем сильнее, чем глубже было падение давления. Естественное компенсаторное повышение сократимости характерно для ситуаций с резким падением АД. В ситуациях, не связанных со снижением АД – при действии апелинов-12-2 и 12-3, – повышение сократимости было весьма умеренным или даже сниженным (рис. 16 и рис. 17). Снижение константы расслабления происходило пропорционально снижению АД (r = 0,89), но имело иной характер. Здесь можно выделить три компонента, определяющих скорость расслабления. Во-первых, известно, что скорость снижения давления в ЛЖ определяется в первую очередь величиной систолического давления. В основе этой зависимости лежит способность миоплазматического Са2+ стимулировать скорость своего удаления в саркоплазматический ретикулуум (СР). Во-вторых, действие апелина-12 и его I и IV аналогов, сопровождавшееся снижением АД, обусловлено активацией NO-синтаз [12,16,19]. Известно, что образуемый эндотелиальной NOсинтазой оксид азота активирует протеинкиназу G и ингибирует протеинкиназу А [218,221], при этом снижается поступление Са 2+ в клетки по медленным кальциевым каналам [222] и прекращается фосфорилирование фосфоламбана, что снижает скорость поглощения Са 2+ в СР [223]. Эндотелиальная NO-синтаза in vivo гораздо более активна, чем in vitro в связи с её механической активацией потоком крови в сосудах и её влиянием на регуляцию внутриклеточного транспорта Са2+. В-третьих, наряду с этим существует и чисто механический компонент расслабления, обусловленный растяжением эластического компонента миофибрилл при их сокращении. В ходе расслабления этот компонент, представленный скорее всего гигантским белком миофибрилл – тайтином [114,224], осуществляет дополнительное растяжение саркомеров и сердечной 99 мышцы в целом. При ослаблении силы сокращения из-за снижения притока и сопротивления действие данного компонента ослабляется, что может вносить свой вклад в пропорциональное снижение константы расслабления. Таким образом, гемодинамическая разгрузка сердца служит вероятной причиной снижения константы расслабления в наших опытах. При этом уменьшение ударного объёма предотвращается повышением сократимости миокарда. Изменения сократимости и расслабимости противоположны (r=0,85, и r=0,89, соответственно, при корреляции с АД), что также свидетельствует в пользу представления о расхождении инотропизма и механики миокарда. В тех случаях, когда АД оставалось неизменным, например, апелина-12-2 при действии аналогов и 12-3, константа расслабления не изменялась, что соответствует более раннему наблюдению [220]. IV.2.4. Инфузионное введение апелина-12-0 и апелина-12-2 здоровым животным. При инфузии апелина-12-0 и апелина-12-2 эффекты были более стабильными, чем при болюсном введении. Были использованы возрастающие кумулятивные дозы в 100-кратном диапазоне от 0,5 до 50 мкг/кг/мин ступеньками по 10 минут. Исходные параметры этих двух групп животных различались мало (таб. 11). Из-за кумулятивных эффектов исходное состояние гемодинамики перед каждой дозой изменялось, поэтому мы сравнивали эффект воздействия на 10-й минуте каждой дозы не с состоянием перед введением этой дозы, а с исходным до всяких введений. У пептидов при снятии кривой доза-эффект часто наблюдается колоколообразная зависимость. Диапазон доз мы разбили на 2 части: малые дозы (0,5-2 мкг/кг/мин) и большие (10-50 мкг/кг/мин). Хотя сохранялась тенденция увеличения эффекта при увеличении дозы, для некоторых параметров максимум эффекта наблюдался не при 50, а при 20 или даже 10 мкг/кг/мин. Для оценки сократимости, расслабимости и гемодинамики мы выбрали 7 основных параметров: среднее давление в аорте (САД), частоту 100 сердечных сокращений (ЧСС), систолическое давление (СД), индекс сократимости Верагута (+dP/dtmax/P), экспоненциальную константу расслабления (LV-CR-Exp), длительность периода предизгнания (PEP), длительность периода изгнания (DEP). На здоровых животных уже в области малых доз апелин-12-2 сильнее повышал индекс Верагута и уменьшал DEP, была тенденция к большему снижению PEP и повышению ЧСС, чем у природного апельна-12-0, а вот экспоненциальный индекс расслабления аналог повышал слабее нативного пептида. Сократимость сердец возрастала (рис. 21А). В области больших доз эти различия между апелинами становились значимыми по всем параметрам, а больше всего по ЧСС, индексу Верагута и PEP (рис. 21Б). То есть созданный нами апелин-12-2 повышал не только сократимость, но и расслабимость сердец лучше, чем это делал природный пептид. При прекращении введения препаратов параметры сократимости и расслабимости возвращались к исходным величинам в ближайшие 10 минут или имели тенденцию к восстановлению (рис. 22 и рис. 23). Только индекс расслабления после прекращения введения апелина 12-0 оставался повышенным. То есть для проявления своего инотропного действия на здоровый миокард апелин должен постоянно присутствовать в крови в повышенной концентрации. IV.2.5. Характеристика действия апелина-12-0 и апелина-12-2 у животных с ХСН. Исходное состояние двух групп животных с ХСН мало отличалось друг от друга (таб. 12), однако сильно разнилось со здоровыми крысами (таб. 11). Оба апелина оказывали кардиотоническое действие, повышая сократимость и улучшая расслабление миокарда, причём влияние апелина12-2 было более сильным и продолжительным. Итак, действие апелина-12-2 на больной миокард было более выраженным, чем у апелина-12-0. Если у здоровых животных апелины 101 больше повышали сократимость, то у больных они сильнее влияли на расслабимость. Животные с ХСН оказались более чувствительными к апелинам, чем здоровые. Возможно, различные эффекты апелинов на параметры сокращения и расслабления здорового и больного миокарда связаны с различным влиянием пептидов на обмен NO в миокарде и разным воздействием их на NO-синтазы. При блокаде NO-синтаз пропадают и гипотензивные свойства апелинов [12]. Естественными источниками оксида озота в сердце являются NO-синтазы эндотелиальная (NOS3), локализованная не только в эндотелиоцитах, но и на мембране кардиомиоцитов, а также нейрональная (NOS1), находящаяся в клетках. Они оказывают разное действие. Стимуляция NOS3, нитрозилируя медленные кальциевые каналы, ингибирует вход Са 2+ в кардиомиоциты и тем самым оказывает отрицательное инотропное действие [222]. Стимуляция же нейрональной NO-синтазы (NOS1), находящейся вблизи саркоплазматического ретикулума, связана с окислением сульфгидрильных групп на молекуле рианодинового рецептора RyR2 [227]. Это способствует выходу Са2+ из положительному саркоплазматического инотропному эффекту. нитрозоглутатион дозозависимо ретикулума, Также и и донор приводит NO – к S- активировал канал RyR2 и увеличивал выход Са2+ [228]. Поскольку активность NO-синтаз в миокарде при ХСН снижена, естественно предполагать, что действие проникающего в клетки экзогенного оксида азота, выработку которого стимулирует апелин, будет способствовать повышению сократимости миокарда. Апелин стимулировал расслабление миокарда больных животных, в то время как его эффект на здоровые сердца был слабо выражен. Известно, что ингибирование NOS1 или отсутствие гена этой синтазы сочетается с сильным замедлением расслабления изолированных кардиомиоцитов [229]. Это позволяет полагать, что в нормальных условиях активность NOS1 способствует расслаблению саркоплазматический через ретикулум, стимуляцию транспорта осуществляемую Са 2+ посредством в S102 нитрозилирования кальциевой АТФазы SERCA2 [230,231]. Очевидно, что при сниженной активности NO-синтаз в миокарде при ХСН эффект апелина, реализуемый, по крайней мере частично, посредством образования оксида азота, должен быть сильнее. При этом стимулирующий расслабление эффект проявлялся гораздо лучше при инфузии, чем при болюсном введении. По всей видимости, это обусловлено увеличением времени, в течение которого апелин контактирует с кардиомиоцитами в достаточной эффективной концентрации. Вместе с тем следует иметь в виду, что избыточное накопление оксида азота в клетках под действием апелина на NOS3 может извратить эту реакцию [232,233], а также активировать протеинкиназу G, замедляющую поглощение Са2+ [234]. В связи с этим подбор наиболее эффективной дозировки апелина является совершенно необходимым при дальнейшей разработке препарата. Прямое действие NO, выработку которого может стимулировать апелин, изменяется в зависимости от состояния внутриклеточных NO-синтаз. Например, при гипертонии, вызванной ангиотензинном II [231], а также при блокаде NO-синтаз или стенозе аорты у здоровых крыс [235]. В этой работе сердечный пептид интермедин, действие которого было опосредованно NOS3, оказывал отрицательный инотропный эффект, а при блокаде NO- синтаз его действие было противоположным, при этом ускорялось и расслабление миокарда. Известно, что активность NO-синтаз снижена при разных видах патологии сердца [232,236,237], а недостаточное S- нитрозилирование рианодинового рецептора RyR2 приводило к накоплению Са2+ в миоплазме - кальциевой перегрузке [230], возможно, из-за сниженной функции кальциевой АТФазы ретикулума [232]. Также ингибирование NOS1 или отсутствие гена этой синтазы сочеталось с сильным замедлением расслабления изолированных кардиомиоцитов [229]. В этих условиях экзогенный оксид азота, стимулированный апелином, может восстановить 103 нужный уровень S-нитрозилирования, что сопровождается ускорением расслабления и облегчением наполнения ЛЖ [225,226]. В нашей работе наблюдалось значительное снижение диастолического давления в ЛЖ в группе животных c ХСН. В этом эффекте видную роль может играть S-нитрозилирование белков, в частности, тайтина, от которого зависит упругость миокарда [232,238]. В работе [239], выполненной на сердцах здоровых молодых добровольцев, предварительное введение ингибитора NO-синтаз значительно увеличивало КСО ЛЖ и уменьшало ударный объём. На этом фоне донатор оксида азота S-нитрозоглутатион восстанавливал эти параметры и даже немного повышал ударный объём. Следует отметить, что доза S-нитрозоглутатиона была столь мала, что не вызвала снижения АД, и следовательно, наблюдаемые эффекты были целиком обусловлены действием NO на миокард. Можно полагать, что повышенная реакция расслабления миокарда животных с ХСН при введении апелина связана с имевшимся снижением активности NO-синтаз. ВЫВОДЫ: 1. Апелин-12 не может служить диагностическим маркёром при ХСН, вызванной ишемической болезнью сердца или дилатационной кардиомиопатией. 2. Апелин-12 и галектин-3, в отличие от NT-proBNP и тропонина Т, не являются эффективными биомаркёрами прогноза ХСН. 3. Природный апелин-12 при болюсном введении оказывает значительное гипотензивное действие у здоровых крыс. Замена метионина на норлейцин в молекуле апелина-12 (апелин-12-1), повышает устойчивость пептида в крови и усиливает гипотензивный эффект в 5-6 раз. 4. Гипотензивное действие апелина-12 и его аналогов (апелина-12-1 и апелина-12-4) обусловлено наличием аргинина на N-конце пептида и фенилаланина на С-конце. Метилирование аргинина на N-конце 104 (апелин-12-2 и 12-3) устраняет гипотензивный эффект, а его нитрозилирование (апелин-12-4) лишь укорачивает продолжительность гипотензии. 5. Синтетический аналог апелин-12-2 более эффективно повышает сократимость и расслабление сердец с ХСН, чем природный пептид, и может быть рекомендован для разработки лекарственного средства на его основе. 6. Импедансная кардиография может быть использована для оценки сократимости сердца у животных. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ: Определение концентраций апелина-12 и галектина-3 в крови больных ХСН не рекомендуется использовать для оценки тяжести и прогноза исхода заболевания. Для этих целей лучше использовать NT-proBNP или сердечный тропонин. Положительное инотропное действие апелина-12-2 у животных с ХСН позволяет рекомендовать его для дальнейшей разработки лекарственного средства лечения декоменсации хронической сердечной недостаточности. Рекомендуется использовать импедансную кардиографию в качестве неинвазивного метода оценки сократительной функции сердца у животных. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: 1. Хроническая сердечная недостаточность / Агеев Ф.Т., Арутюнов Г.П., Беленков Ю.Н. и др. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 105 2. Терещенко С.Н., Демидова И.В., Левчук Н.Н., Кобалава Ж.Д. Клинико-статистический анализ хронической сердечной недостаточности. Тер.архив, 1999, 1:42-46. 3. Ho KK, Pinsky JL, Kannel WB, Levy D. The epidemiology of heart failure: the Framingham Study. J Am Coll Cardiol. 1993 Oct; 22 (4 Suppl A):6A-13A. 4. Bonneaux L., Barendregt J.J., Meetr K. et al. Estimating clinical morbidity due to ischemic heart disease and congestive heart failure: future rise of heart failure. Am J Public Health. 1994; 84: 20-8. 5. O’Dowd BF, Heiber M, Chan A, et al. A human gene that shows identity with the gene encoding the angiotensin receptor is located on chromosome 11. Gene 1993; 136:355e60. 6. Tatemoto K, Hosoya M, Habata Y, Fujii R, et al. Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Oct 20;251(2):471-6. 7. Habata Y, Fujii R, Hosoya M, Fukusumi S, et al. Apelin, the natural ligand of the orphan receptor APJ, is abundantly secreted in the colostrum. Biochim Biophys Acta 1999; 1452:25–35. 8. Hosoya M, Kawamata Y, Fukusumi S, Fujii R, et al. Molecular and functional characteristics of APJ. Tissue distribution of mRNA and interaction with the endogenous ligand apelin. J Biol Chem 2000; 275: 21061–7. 9. Cayabyab, M., Hinuma, S., Farzan, M., Choe, H., et al. (2000). Apelin, the natural ligand of the orphan seven-transmembrane receptor APJ, inhibits human immunodeficiency virus type 1 entry. J Virol 74(24), 11972–11976. 10. Писаренко О.И., Шульженко В.С., Пелогейкина Ю.А., Студнева И.М., и др. Влияние экзогенного пептида апелина-12 на восстановление функции и метаболизма изолированного сердца крысы после ишемии. Кардиология. 2010;50(10):44-9. 106 11. Kawamata Y, Habata Y, Fukusumi S, Hosoya M, et al. Molecular properties of apelin: tissue distribution and receptor binding. Biochim Biophys Acta 2001; 1538:162–71. 12. Tatemoto K, Takayama K, Zou MX, Kumaki I, et al. The novel peptide apelin lowers blood pressure via a nitric oxide-dependent mechanism. Regu Pept 2001; 99:87–92. 13. Ashley EA, Powers J, Chen M, et al. The endogenous peptide apelin potently improves cardiac contractility and reduces cardiac loading in vivo. Cardiovasc Res 2005; 65:73e82. 14. Maguire J, Kleinz M, Pitkin S, et al. [Pyr1]Apelin-13 Identified as the Predominant Apelin Isoform in the Human Heart. Vasoactive Mechanisms and Inotropic Action in Disease. Hypertension 2009; 54:598e604. 15. Katugampola SD, Maguire JJ, Matthewson SR, et al. [(125)I](Pyr(1))Apelin-13 is a novel radioligand for localizing the APJ orphan receptor in human and rat tissues with evidence for a vasoconstrictor role in man. Br J Pharmacol 2001; 132:1255e60. 16. Ishida J, Hashimoto T, Hashimoto Y, et al. Regulatory roles for APJ, a seventransmembrane receptor related to angiotensin-type 1 receptor in blood pressure in vivo. J Biol Chem 2004; 279:26274e9. 17. Jia YX, Lu ZF, Zhang J, et al. Apelin activates L-arginine/nitric oxide synthase/nitric oxide pathway in rat aortas. Peptides 2007; 28:2023e9. 18. Japp AG, Cruden NL, Barnes G, et al. Acute cardiovascular effects of apelin in man: potential role in patients with chronic heart failure. Circulation 2010; 121:1818e27. 19.Szokodi I, Tavi P, Foldes G, et al. Apelin, the novel endogenous ligand of the orphan receptor APJ, regulates cardiac contractility. Circ Res 2002; 91:434e40. 20. Maguire J, Kleinz M, Pitkin S, et al. [Pyr1]Apelin-13 Identified as the Predominant Apelin Isoform in the Human Heart. Vasoactive 107 Mechanisms and Inotropic Action in Disease. Hypertension 2009; 54:598e604. 21. Farkasfalvi K, Stagg MA, Coppen SR, et al. Direct effects of apelin on cardiomyocyte contractility and electrophysiology. Biochem Biophys Res Commun 2007; 357:889e95. 22. Jia YX, Pan CS, Zhang J, Geng B, et al. Apelin protects myocardial injury induced by isoproterenol in rats. Regul Pept 2006; 133:147–54. 23. Berry MF, Pirolli TJ, Jayasankar V, Burdick J, Morine KJ, Gardner TJ, et al. Apelin has in vivo inotropic effects on normal and failing hearts. Circulation 2004; 110: II187–93. 24. Atluri P, Morine KJ, Liao GP, Panlilio CM, et al. Ischemic heart failure enhances endogenous myocardial apelin and APJ receptor expression. Cell Mol Biol Lett 2007; 12:127–38. 25. Charo DN, Ho M, Fajardo G, et al. Endogenous regulation of ardiovascular function by apelin-APJ. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009; 297:H1904e13. 26. Kuba K, Zhang L, Imai Y, et al. Impaired heart contractility in Apelin gene-deficient mice associated with aging and pressure overload. Circ Res 2007; 101:e32e42. 27. Karmazyn M, Gan XT, Humphreys RA, et al. The myocardial Na(+)H(+) exchange: structure, regulation, and its role in heart disease. Circ Res 1999;85:777e86. 28. Dai T, Ramirez-Correa G, Gao WD. Apelin increases contractility in failing cardiac muscle. Eur J Pharmacol 2006; 553:222e8. 29. Wang C, Du JF, Wu F, et al. Apelin decreases the SR Ca2+ content but enhances the amplitude of [Ca2+]i transient and contractions during twitches in isolated rat cardiac myocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 294:H2540e46. 108 30. Masri B, Lahlou H, Mazarguil H, Knibiehler B, Audigier Y. Apelin (65– 77) activates extracellular signal-regulated kinases via a PTX-sensitive G protein. Biochem Biophys Res Commun 2002;290:539–45. 31. Japp AG, Newby DE. The apelin-APJ system in heart failure: pathophysiologic relevance and therapeutic potential. Biochem Pharmacol 2008; 75:1882e92. 32. Charles CJ, Rademaker MT, Richards AM. Apelin-13 induces a biphasic haemodynamic response and hormonal activation in normal conscious sheep. J Endocrinol 2006;189:701–10. 33. Kleinz MJ, Davenport AP. Immunocytochemical localization of the endogenous vasoactive peptide apelin to human vascular and endocardial endothelial cells. Regul Pept 2004;118:119–25. 34. Kleinz MJ, Skepper JN, Davenport AP. Immunocytochemical localisation of the apelin receptor, APJ, to human cardiomyocytes, vascular smooth muscle and endothelial cells. Regul Pept 2005; 126:233– 40. 35. De Mota N, Lenkei Z, Llorens-Corte`s C. Cloning, pharmacological characterization and brain distribution of the rat apelin receptor. Neuroendocrinology 2000;72:400e7. 36. Ashley E, Chun HJ, Quertermous T. Opposing cardiovascular roles for the angiotensin and apelin signaling pathways. J Mol Cell Cardiol 2006;41:778e81. 37. Barnes G, Japp AG, Newby DE. Translational promise of the apelin-APJ system. Heart. 2010 Jul;96(13):1011-6. 38. Zhong JC, Huang Y, Yung LM, et al. The novel peptide apelin regulates intrarenal artery tone in diabetic mice. Regul Pept 2007; 144:109e14. 39. Gurzu B, Petrescu BC, Costuleanu M, et al. Interactions between apelin and angiotensin II on rat portal vein JRAAS 2006;7:212e16. 40. Iwanaga Y, Kihara Y, Takenaka H, Kita T. Down-regulation of cardiac apelin system in hypertrophied and failing hearts: possible role of 109 angiotensin II-angiotensin type 1 receptor system. J Mol Cell Cardiol 2006; 41:798e806. 41. Zhong JC, Huang DY, Liu GF, et al. Effects of all-trans retinoic acid on orphan receptor APJ signaling in spontaneously hypertensive rats. Cardiovasc Res 2005;65:743e50 42. Siddiquee K, Hampton J, Khan S, Zadory D, et al. Apelin protects against angiotensin II-induced cardiovascular fibrosis and decreases plasminogen activator inhibitor type-1 production. J Hypertens. 2011 Apr; 29(4):724-31. 43. Scimia MC, Hurtado C, Ray S, Metzler S, et al. APJ acts as a dual receptor in cardiac hypertrophy. Nature. 2012 Aug 16;488(7411):394-8. 44. Salcedo A, Garijo J, Monge L, et al. Apelin effects in human splanchnic arteries. Role of nitric oxide and prostanoids. Regul Pept 2007; 144:50e55. 45.Vickers, C., Hales, P., Kaushik, V., Dick, L., et al. (2002). Hydrolysis of biological peptides by human angiotensinconverting enzyme-related carboxypeptidase. J Biol Chem 277(17), 14838– 14843. 46. Burrell, L. M., Johnston, C. I., Tikellis, C., & Cooper, M. E. (2004). ACE2, a new regulator of the rennin-angiotensin system. Trends Endocrinol Metab 15(4), 166–169. 47. Japp AG, Cruden NL, Amer DAB, et al. Vascular effects of apelin in vivo in man. J Am Coll Cardiol 2008; 52:908e13. 48. Chun HJ, Ali ZA, Kojima Y, et al. Apelin signaling antagonizes Ang II effects in mouse models of atherosclerosis. J Clin Invest 2008; 118:33433354. 49. Ronkainen VP, Ronkainen JJ, Hanninen SL, et al. Hypoxia inducible factor regulates the cardiac expression and secretion of apelin. FASEB J 2007; 21:1821e30. 50. Zeng XJ, Zhang LK, Wang HX, et al. Apelin protects heart against ischemia/reperfusion injury in rat. Peptides 2009; 30:1144e52. 110 51. Smith CC, Mocanu MM, Bowen J, et al. Temporal changes in myocardial salvage kinases during reperfusion following ischemia: studies involving the cardioprotective adipocytokine apelin. Cardiovasc Drugs Ther 2007; 21:409e14. 52. Rastaldo R, Cappello S, Folino A, Losano G. Effect of apelin-apelin receptor system in postischaemic myocardial protection: a pharmacological postconditioning tool? Antioxid Redox Signal. 2011 Mar 1;14(5):909-22. 53. Писаренко О.И., Серебрякова Л.И., Пелогейкина Ю.А., Студнева И.М., и др. Участие NO-зависимых механизмов действия апелина в защите миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения. Кардиология. 2012;52(2):52-8. 54. Reaux-Le Goazigo A, Morinville A, Burlet A, et al. Dehydration-induced crossregulation of apelin and vasopressin immunoreactivity levels in magnocellular hypothalamic neurons. Endocrinology 2004; 145:4392e400. 55. De Mota N, Reaux-Le Goazigo A, El Messari S. Apelin, a potent diuretic neuropeptide counteracting vasopressin actions through inhibition of vasopressin. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:10464e9. 56. Hus-Citharel A, Bouby N, Frugie`re A, et al. Effect of apelin on glomerular hemodynamic function in the rat kidney. Kidney Int 2008; 74:486e94. 57. Azizi M, Iturrioz X, Blanchard A, et al. Reciprocal regulation of plasma apelin and vasopressin by osmotic stimuli. J Am Soc Nephrol 2008; 19:1015e24. 58. Boucher J, Masri B, Daviaud D, et al. Apelin, a newly identified adipokine upregulated by insulin and obesity. Endocrinology 2005;146:1764e71. 59. Dray C, Knauf C, Daviaud D, et al. Apelin stimulates glucose utilization in normal and obese insulin-resistant mice. Cell Metab 2008;8:437e45. 111 60. Li L, Yang G, Li Q, et al. Changes and relations of circulating visfatin, apelin, and resistin levels in normal, impaired glucose tolerance, and type 2 diabetic subjects. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2006;114:544e8. 61. Yue P, Jin H, Aillaud-Manzanera M, et al. Apelin is necessary for the maintenance of insulin sensitivity. Am J Physiol Endocrinol Metab 2009; 298:E59e67. 62. Koguchi W, Kobayashi N, Takeshima H, Ishikawa M, et al. Cardioprotective effect of apelin-13 on cardiac performance and remodeling in end-stage heart failure. Circ J. 2012;76(1):137-44. 63. Chen MM, Ashley EA, Deng DX, Tsalenko A, et al. Novel role for the potent endogenous inotrope apelin in human cardiac dysfunction. Circulation 2003; 108:1432–9. 64. Foldes G, Horkay F, Szokodi I, Vuolteenaho O, Ilves M, et al. Circulating and cardiac levels of apelin, the novel ligand of the orphan receptor APJ, in patients with heart failure. Biochem Biophys Res Commun 2003; 308:480–5. 65. Chong KS, Gardner RS, Morton JJ, Ashley EA, McDonagh TA. Plasma concentrations of the novel peptide apelin are decreased in patients with chronic heart failure. Eur J Heart Fail 2006; 8:355–60. 66. Goetze JP, Rehfeld JF, Carlsen J, Videbaek R, et al. Apelin: a new plasma marker of cardiopulmonary disease. Regul Pept 2006;133:134–8. 67. A. Strohbach, M. Busch, S.B. Felix, R. Busch. The Apelin/APJR system regulates vascular mechanotransduction in human endothelial cells. Eur Heart J. 2011; Vol. 32 (Abstr suppl): 521. P3180. 68. Y.M. Kim, A. Sachedina, M.H. Singh, S.Ray, L. Zhang. Modulation of atrial electrophysiology and oxidative stress by the endogenous peptide hormone apelin: implications in human atrial fibrillation. European Heart Journal 2011, vol. 32 (Abstract Suppl), 941-942, abstr 5154. 112 69. Francia P, Salvati A, Balla C, De Paolis P, Pagannone E, Borro M, et al. Cardiac resynchronization therapy increases plasma levels of the endogenous inotrope apelin. Eur J Heart Fail 2007;9:306–9. 70. Miettinen KH, Magga J, Vuolteenaho O, Vanninen EJ, et al. Utility of plasma apelin and other indices of cardiac dysfunction in the clinical assessment of patients with dilated cardiomyopathy. Regul Pept 2007; 140:178–84. 71. Chandrasekaran B, Kalra PR, Donovan J, Hooper J, et al. Myocardial apelin production is reduced in humans with left ventricular systolic dysfunction. J Card Fail. 2010 Jul;16(7):556-61. 72. Hunyady L, Catt KJ, Clark AJ, Gáborik Z. Mechanisms and functions of AT(1) angiotensin receptor internalization. Regul Pept. 2000 Jul 28;91(13):29-44. 73. Masri B, Morin N, Pedebernade L, Knibiehler B, Audigier Y. The apelin receptor is coupled to Gi1 or Gi2 protein and is differentially desensitized by apelin fragments. J Biol Chem. 2006 Jul 7;281(27):18317-26. 74. Andersen CU, Hilberg O, Mellemkjær S, et al. Apelin and pulmonary hypertension. Pulm Circ. 2011 Jul-Sep;1(3):334-46. 75. Eyries M, Siegfried G, Ciumas M, Montagne K, et al. Hypoxia-induced apelin expression regulates endothelial cell proliferation and regenerative angiogenesis. Circ Res. 2008 Aug 15;103(4):432-40. 76. Rayalam S, Della-Fera MA, Kasser T, Warren W, Baile CA. Emerging role of apelin as a therapeutic target in cancer: a patent review. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2011 Sep; 6(3):367-72. 77. Tang SY, Xie H, Yuan LQ, Luo XH, et al. Apelin stimulates proliferation and suppresses apoptosis of mouse osteoblastic cell line MC3T3-E1 via JNK and PI3-K/Akt signaling pathways. Peptides. 2007 Mar;28(3):70818. 113 78. Berta J, Kenessey I, Dobos J, Tovari J, et al. Apelin expression in human non-small cell lung cancer: role in angiogenesis and prognosis. J Thorac Oncol. 2010 Aug;5(8):1120-9. 79. Andersen CU, Markvardsen LH, Hilberg O, Simonsen U. Pulmonary apelin levels and effects in rats with hypoxic pulmonary hypertension. Respir Med. 2009 Nov;103(11):1663-71. 80. Chandra SM, Razavi H, Kim J, Agrawal R, et al. Disruption of the apelin-APJ system worsens hypoxia-induced pulmonary hypertension. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011 Apr;31(4):814-20. 81. Mair J. Biochemistry of B-type natriuretic peptide--where are we now? Clin Chem Lab Med. 2008;46(11):1507-14. 82. Tycinska AM, Sobkowicz B, Mroczko B, et al. The value of apelin-36 and brain natriuretic peptide measurements in patients with first STelevation myocardial infarction. Clin Chim Acta. 2010 Dec 14;411(2324):2014-8. 83. van Kimmenade RR, Januzzi JL Jr, Ellinor PT, et al. Utility of aminoterminal pro-brain natriuretic peptide, galectin-3, and apelin for the evaluation of patients with acute heart failure. J Am Coll Cardiol. 2006 Sep 19;48(6):1217-24. 84. Kidoya H, Naito H, Takakura N. Apelin induces enlarged and nonleaky blood vessels for functional recovery from ischemia. Blood. 2010 Apr 15;115(15):3166-74. 85. Tero-Pekka Alastalo, Molong Li, Vinicio de Jesus Perez, et al. Disruption of PPARγ/β-catenin–mediated regulation of apelin impairs BMP-induced mouse and human pulmonary arterial EC survival. J Clin Invest. 2011; 121(9):3735–3746 86. Yao F, Modgil A, Zhang Q, Pingili A, et al. Pressor effect of apelin-13 in the rostral ventrolateral medulla: role of NAD(P)H oxidase-derived superoxide. J Pharmacol Exp Ther. 2011 Feb;336(2):372-80. 114 87. Zhang Q, Yao F, Raizada MK, O'Rourke ST, Sun C. Apelin gene transfer into the rostral ventrolateral medulla induces chronic blood pressure elevation in normotensive rats. Circ Res. 2009 Jun 19;104(12):1421-8. 88. Falcão-Pires I, Gonçalves N, Henriques-Coelho T, et al. Apelin decreases myocardial injury and improves right ventricular function in monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009 Jun; 296(6):H2007-14. 89. Huang P, Fan XF, Pan LX, Gao YQ, et al. [Effect of apelin on vasodilatation of isolated pulmonary arteries in rats is concerned with the nitric oxide pathway]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2011 Feb;27(1):1-5. 90. Feng JH, Li WM, Wu XP, Tan XY, et al. Hemodynamic effect of apelin in a canine model of acute pulmonary thromboembolism. Peptides. 2010 Sep;31(9):1772-8. 91. Ferreira AJ, Shenoy V, Yamazato Y, Sriramula S, et al. Evidence for angiotensin-converting enzyme 2 as a therapeutic target for the prevention of pulmonary hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 2009 Jun 1; 179(11):1048-54. 92. Hamada J, Kimura J, Ishida J, Kohda T, et al. Evaluation of novel cyclic analogues of apelin. Int J Mol Med. 2008 Oct;22(4):547-52. 93. Maloney PR, Khan P, Hedrick M, Gosalia P, et al. Discovery of 4-oxo-6((pyrimidin-2-ylthio)methyl)-4H-pyran-3-yl 4-nitrobenzoate (ML221) as a functional antagonist of the apelin (APJ) receptor. Bioorg Med Chem Lett. 2012 Nov 1; 22(21):6656-60. 94. Macaluso NJ, Pitkin SL, Maguire JJ, Davenport AP, Glen RC. Discovery of a competitive apelin receptor (APJ) antagonist. ChemMedChem. 2011 Jun 6; 6(6):1017-23. 95. Rosamond W, Flegal K, Friday G, Furie K, et al. American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the 115 American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 2007 Feb 6;115(5):e69-171. 96. Morrow DA, de Lemos JA. Benchmarks for the assessment of novel cardiovascular biomarkers. Circulation. 2007 Feb 27;115(8):949-52. 97. Braunwald E. Biomarkers in heart failure. N Engl J Med. 2008 May 15; 358(20):2148-59. 98. Daniels LB, Maisel AS. Natriuretic peptides. J Am Coll Cardiol. 2007 Dec 18; 50(25):2357-68. 99. Tang WH, Francis GS, Morrow DA, Newby LK, et al. National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: clinical utilization of cardiac biomarker testing in heart failure. Clin Biochem. 2008 Mar;41(4-5):210-21. 100. Maisel AS, Krishnaswamy P, Nowak RM, et al.; Breathing Not Properly Multinational Study Investigators. Rapid measurement of Btype natriuretic peptide in the emergency diagnosis of heart failure. N Engl J Med. 2002 Jul 18; 347(3):161-7. 101. Masson S, Latini R, Anand IS, Vago T, et al.; Val-HeFT Investigators. Direct comparison of B-type natriuretic peptide (BNP) and aminoterminal proBNP in a large population of patients with chronic and symptomatic heart failure: the Valsartan Heart Failure (Val-HeFT) data. Clin Chem. 2006 Aug; 52(8):1528-38. 102. Fonarow GC, Peacock WF, Phillips CO, Givertz MM, Lopatin M; ADHERE Scientific Advisory Committee and Investigators. Admission B-type natriuretic peptide levels and in-hospital mortality in acute decompensated heart failure. J Am Coll Cardiol. 2007 May 15; 49(19):1943-50. 103. Moe GW, Howlett J, Januzzi JL, Zowall H; Canadian Multicenter Improved Management of Patients With Congestive Heart Failure (IMPROVE-CHF) Study Investigators. N-terminal pro-B-type natriuretic peptide testing improves the management of patients with suspected 116 acute heart failure: primary results of the Canadian prospective randomized multicenter IMPROVE-CHF study. Circulation. 2007 Jun 19;115(24):3103-10. 104. Horwich TB, Patel J, MacLellan WR, Fonarow GC. Cardiac troponin I is associated with impaired hemodynamics, progressive left ventricular dysfunction, and increased mortality rates in advanced heart failure. Circulation. 2003 Aug 19;108(7):833-8. 105. Hudson MP, O'Connor CM, Gattis WA, et al. Implications of elevated cardiac troponin T in ambulatory patients with heart failure: a prospective analysis. Am Heart J. 2004 Mar;147(3):546-52. 106. Qiu-Sheng YIN, Bing SHI, Lan Dong, Lei BI. Comparative study of galectin-3 and B-type natriuretic peptide as biomarkers for the diagnosis of heart failure. Journal of Geriatric Cardiology (2014); 11: 79−82. 107. Navaid Iqbal, Bailey Wentworth, Rajiv Choudhary, et al. Cardiac biomarkers: new tools for heart failure management. Cardiovasc Diagn Ther 2012;2(2):147-164. 108. Kalogeropoulos AP, Georgiopoulou VV, Butler J. Clinical adoption of prognostic biomarkers: the case for heart failure. Prog Cardiovasc Dis. 2012 Jul-Aug;55(1):3-13. 109. Pieroni M, Corti A, Tota B, Curnis F, et al. Myocardial production of chromogranin A in human heart: a new regulatory peptide of cardiac function. Eur Heart J. 2007 May;28(9):1117-27. 110. Kistorp C, Faber J, Galatius S, Gustafsson F, et al. Plasma adiponectin, body mass index, and mortality in patients with chronic heart failure. Circulation. 2005 Sep 20;112(12):1756-62. 111. Lee DS, Vasan RS. Novel markers for heart failure diagnosis and prognosis. Curr Opin Cardiol. 2005 May;20(3):201-10. Review. 112. Zethelius B, Berglund L, Sundström J, Ingelsson E, et al. Use of multiple biomarkers to improve the prediction of death from cardiovascular causes. N Engl J Med. 2008 May 15;358(20):2107-16. 117 113. Капелько В. И. Роль процесса расслабления в нарушении сократительной функции при различной патологии сердца. Бюлл. ВКНЦ 1982; 1:99-107. 114. Капелько В. И. Диастолическая дисфункция. Кардиология. 2011; 1:79-90. 115. Терещенко С. Н., Жиров И. В. Диастолическая сердечная недостаточность: разрешимы ли трудности диагностики и лечения? Терапевтический архив 2009; 11:73-76. 116. Агеев Ф. Т. Диастолическая сердечная недостаточность: 10 лет знакомства. Сердечная недостаточность 2010; 11:5-6. 117. Barnes G; Alam S; Carter G; et al. Prolonged Apelin Infusion Causes Sustained Increases in Cardiac Output in Humans. European Heart Journal. 2011. 32 (Abstract Supplement), 965. 118. Kahraman Cosansu; Huseyin Altug Cakmak; Erkan Yildirim; Bilgehan Karadag; Lale Koldas. The prognostic value of apelin in patients with acute coronary syndrome. J Am Coll Cardiol. 2011; 57(14s1):E1270-E1270. 119. Kuklinska AM, Sobkowicz B, Sawicki R, Musial WJ, et al. Apelin: a novel marker for the patients with first ST-elevation myocardial infarction. Heart Vessels. 2010 Sep;25(5):363-7. 120. Lee DK, Saldivia VR, Nguyen T, Cheng R, et al. Modification of the terminal residue of apelin-13 antagonizes its hypotensive action. Endocrinology. 2005 Jan;146(1):231-6. 121. Chamberland C, Barajas-Martinez H, Haufe V, Fecteau MH, et al. Modulation of canine cardiac sodium current by Apelin. J Mol Cell Cardiol. 2010 Apr; 48(4):694-701. 122. Barondes S.H, Cooper D.N.W., Gitt M.A., Leffler H. Galectins: structure and function of a large family of animal lectins. J Biol Chem 1994; 269: 20807–20810. 118 123. Cooper D.N. Galectinomics: finding themes in complexity. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 209–231. 124. Ochieng J., Furtak V., Lukyanov P. Extracellular functions of galectin3. Glycoconjugate Journal 2004; 19: 527–535. 125. Lipkowitz M., Leal-Pinto E., Cohen B.E., Abramson R.G. Galectin 9 is the sugar-regulated urate transporter/channel UAT. Glycoconjugate Journal 2004; 19: 491–498. 126. Mehul B., Hughes R.C. Plasma membrane targeting, vesicular budding and release of galectin 3 from the cytoplasm of mammalian cells during secretion. J Cell Sci 1997; 110: 1169–1178. 127. Kim H., Lee J., Hyun J.W., et al. Expression and immunohistochemical localization of galectin-3 in various mouse tissues. Cell Biol Int 2007; 31: 655–662. 128. Hughes R.C. The galectin family of mammalian carbohydratebinding molecules. Biochem Soc Transact 1997; 25: 1194–1198. 129. Hughes R.C. Secretion of the galectin family of mammalian carbohydrate-binding family proteins. Biochem Biophys Acta 1999; 1473: 172–185. 130. Friedman S.L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem 2000; 275: 2247–2250. 131. Brown R.D., Ambler S.K., Mitchell M.D., Long C.S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2005; 45: 657–687. 132. De Cavanagh E.M., Ferder M., Inserra F., Ferder L. Angiotensin II, mitochondria, cytoskeletal, and extracellular matrix connections: an integrating viewpoint. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009; 296: H550–H558. 119 133. Hsu D.K., Dowling C.A., Jeng K.C., et al. Galectin-3 expression is induced in cirrhotic liver and hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 1999; 81: 519–526. 134. Henderson N.C., Mackinnon A.C., Farnworth S.L., et al. Galectin-3 regulates myofibroblast activation and hepatic fibrosis. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 5060–5065. 135. Nishi Y., Sano H., Kawashima T., et al. Role of galectin-3 in human pulmonary fibrosis. Allergol Int 2007; 56: 57–65. 136. Wang L., Friess H., Zhu Z., et al.: Galectin-1 and galectin-3 in chronic pancreatitis. Lab Invest 2000; 80: 1223–1241. 137. Liu Y.H., D’Ambrosio M., Liao T.D., et al. N-acetyl-seryl-aspartyllysyl-proline prevents cardiac remodeling and dysfunction induced by galectin-3, a mammalian adhesion/growth-regulatory lectin. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009; 296: H404–H412. 138. Friedman S.L.: Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem 2000; 275: 2247–2250. 139. Henderson N.C., Mackinnon A.C., Farnworth S.L., et al. Galectin-3 expression and secretion links macrophages to the promotion of renal fibrosis. Am J Pathol 2008; 172: 288–298. 140. Vlassara H., Li Y.M., Imani F., et al. Identification of galectin-3 as a high-affinity binding protein for advanced glycation end products (AGE): a new member of the AGE-receptor complex. Mol Med 1995; 1: 634– 646. 141. Hartog J.W., Voors A.A., Bakker S.J., et al. Advanced glycation endproducts (AGEs) and heart failure: pathophysiology and clinical implications. Eur J Heart Fail 2007; 9: 1146–1155. 142. Iacobini C., Oddi G., Menini S., et al. Development of agedependent glomerular lesions in galectin-3/AGE-receptor-3 knockout mice. Am J Physiol 2005; 289: F611–F621. 120 143. Iacobini C., Menini S., Oddi G., et al. Galectin-3/AGE-receptor 3 knockout mice show accelerated AGE-induced glomerular injury: evidence for a protective role of galectin-3 as an AGE receptor. FASEB J 2004; 18: 1773–1775. 144. Sharma U.C., Pokharel S., van Brakel T.J. et al. Galectin-3 marks activated macrophages in failure-prone hypertrophied hearts and contributes to cardiac dysfunction. Circulation 2004; 110: 3121–3128. 145. Dirk J. A. Lok, Peter Van Der Meer, Pieta W. Bruggink-André de la Porte et al. Prognostic value of galectin-3, a novel marker of fibrosis, in patients with chronic heart failure: data from the DEAL-HF study Clin Res Cardiol 2010; 99(5): 323–328. 146. Ravi V. Shah, Annabel A. Chen-Tournoux, Michael H. Picard et al. Galectin-3, cardiac structure and function, and long-term mortality in patients with acutely decompensated heart failure. European journal of heart failure journal of the Working Group on Heart Failure of the European Society of Cardiology 2010; 12, Issue: 8, Pages: 826-832. 147. Milting H., Ellinghaus P., Seewald M. et al. Plasma biomarkers of myocardial fibrosis and remodeling in terminal heart failure patients supported by mechanical circulatory support devices. J Heart Lung Transplant 2008; 27: 589–596. 148. De Boer R.A., Voors A.A., Muntendam P., Van Gilst W.H., Van. Veldhuisen D.J. Galectin-3: a novel mediator of heart failure development and progression. Eur J Heart Fail 2009; 11: 811– 817 (review). 149. De Boer R.A., Lili Yu., Dirk J. van Veldhuisen. Galectin-3 in cardiac remodeling and heart failure. Curr Heart Fail Rep 2010; 7: 1– 8 (review). 150. Felker GM, Fiuzat M, Shaw LK, Clare R, et al. Galectin-3 in ambulatory patients with heart failure: results from the HF-ACTION study. Circ Heart Fail. 2012; 5:72–78. 121 151. Lok DJ, Van Der Meer P, de la Porte PW, Lipsic E, et al. Prognostic value of galectin-3, a novel marker of fibrosis, in patients with chronic heart failure: data from the DEAL-HF study. Clin Res Cardiol. 2010; 99:323–328. 152. Tang WH, Shrestha K, Shao Z, Borowski AG, et al. Usefulness of plasma galectin-3 levels in systolic heart failure to predict renal insufficiency and survival. Am J Cardiol. 2011; 108:385–390. 153. Okamura DM, Pasichnyk K, Lopez-Guisa JM, et al. Galectin-3 preserves renal tubules and modulates extracellular matrix remodeling in progressive fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 2011; 300: F245–F253. 154. Guide to Receptors and Channels (GRAC), 5-th edition/ British Journal of Pharmacology. 2012; v.164, suppl.1, S30. 155. Blanchard A, Steichen O, De Mota N, et al. An abnormal apelin/vasopressin balance may contribute to water retention in patients with the syndrome of inappropriate antidiuretic hormone (SIADH) and heart failure. J Clin Endocrinol Metab.2013 May;98(5):2084-9. 156. Pisarenko OI, Lankin VZ, Konovalova GG, et al. Apelin-12 and its structural analog enhance antioxidant defense in experimental myocardial ischemia and reperfusion. Mol Cell Biochem. 2014 Jun;391(1-2):241-50. 157. Siddiquee K, Hampton J, McAnally D, May L, Smith L. The apelin receptor inhibits the angiotensin II type 1 receptor via allosteric transinhibition. Br J Pharmacol. 2013 Mar;168(5):1104-17. 158. Sato T, Suzuki T, Watanabe H, et al. Apelin is a positive regulator of ACE2 in failing hearts. J Clin Invest. 2013 Dec 2;123(12):5203-11. 159. Scimia MC, Blass BE, Koch WJ. Apelin receptor: its responsiveness to stretch mechanisms and its potential for cardiovascular therapy. Expert Rev CardiovascTher. 2014 Jun; 12(6):733-41. 160. Azizi Y, Faghihi M, Imani A, et al. Post-infarct treatment with [Pyr1]apelin-13 reduces myocardial damage through reduction of oxidative 122 injury and nitric oxide enhancement in the rat model of myocardial infarction. Peptides. 2013 Aug; 46:76-82. 161. Kojima Y, Kundu RK, Cox CM, et al. Upregulation of the apelin-APJ pathway promotes neointima formation in the carotid ligation model in mouse. Cardiovasc Res. 2010 Jul 1; 87(1):156-65. 162. Kim J. Apelin-APJ signaling: a potential therapeutic target for pulmonary arterial hypertension. Mol Cells. 2014 Mar; 37(3):196-201. 163. Fujie S, Sato K, Miyamoto-Mikami E, Hasegawa N, et al. Reduction of arterial stiffness by exercise training is associated with increasing plasma apelin level in middle-aged and older adults. PLoS One. 2014 Apr 1; 9(4): e93545. 164. Nagano K, Ishida J, Unno M, et al. Apelin elevates blood pressure in ICR mice with L-NAME-induced endothelial dysfunction. Mol Med Rep. 2013 May;7(5):1371-5. 165. Perjés Á, Skoumal R, Tenhunen O, Kónyi A, et al. Apelin increases cardiac contractility via protein kinase Cε- and extracellular signalregulated kinase-dependent mechanisms. PLoS One. 2014 Apr 2; 9(4):e93473. 166. Cheng CC, Weerateerangkul P, Lu YY, Chen YC, et al. Apelin regulates the electrophysiological characteristics of atrial myocytes. Eur J Clin Invest. 2013 Jan; 43(1):34-40. 167. Wang W, McKinnie SM, Patel VB, Haddad G, et al. Loss of Apelin exacerbates myocardial infarction adverse remodeling and ischemiareperfusion injury: therapeutic potential of synthetic Apelin analogues. J Am Heart Assoc. 2013 Jul ; 2(4):e000249. 168. Wang M, Gupta RC, Rastogi S, Kohli S, et al. Effects of acute intravenous infusion of apelin on left ventricular function in dogs with advanced heart failure. J Card Fail. 2013 Jul; 19(7):509-16. 123 169. Pang H, Han B, Yu T, Zong Z. Effect of apelin on the cardiac hemodynamics in hypertensive rats with heart failure. Int J Mol Med. 2014 Sep; 34(3):756-64. 170. Hofmann AD, Friedmacher F, Takahashi H, et al. Decreased apelin and apelin-receptor expression in the pulmonary vasculature of nitrofeninduced congenital diaphragmatic hernia. Pediatr Surg Int. 2014 Feb; 30(2):197-203. 171. Yu XH, Tang ZB, Liu LJ, Qian H, et al. Apelin and its receptor APJ in cardiovascular diseases. Clin Chim Acta. 2014 Jan 20; 428:1-8. 172. Nishida M, Okumura Y, Oka T, Toiyama K, et al. The role of apelin on the alleviative effect of Angiotensin receptor blocker in unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Nephron Extra. 2012 Jan; 2(1):39-47. 173. Fukushima H, Kobayashi N, Takeshima H, et al. Effects of olmesartan on Apelin/APJ and Akt/endothelial nitric oxide synthase pathway in Dahl rats with end-stage heart failure. J Cardiovasc Pharmacol. 2010 Jan; 55(1):83-8. 174. McLean DL, Kim J, Kang Y, et al. Apelin/APJ signaling is a critical regulator of statin effects in vascular endothelial cells -- brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012 Nov; 32(11):2640-3. 175. Khan P, Maloney PR, Hedrick M, Gosalia P, et al. Functional Agonists of the Apelin (APJ) Receptor. 2011 Mar 25 [updated 2011 Dec 12]. Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program [Internet]. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US). 176. Karadag S, Ozturk S, Gursu M, et al. The relationship between apelin and cardiac parameters in patients on peritoneal dialysis: is there a new cardiac marker? BMC Nephrol. 2014 Jan 16; 15:18. 177. Hala O. El-Mesallamy, Nadia M. Hamdy, Hanan H. Rizk, Abdel- Rahman El-Zayadi. Apelin Serum Level in Egyptian Patients with Chronic Hepatitis C. Mediators of Inflammation. Volume 2011, pp.1-7. 124 178. Di Franco M, Spinelli FR, Metere A, et al. Serum levels of asymmetric dimethylarginine and apelin as potential markers of vascular endothelial dysfunction in early rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm. 2012:347268. 179. Zhen EY, Higgs RE, Gutierrez JA. Pyroglutamyl apelin-13 identified as the major apelin isoform in human plasma. Anal Biochem. 2013 Nov 1;442(1):1-9. 180. Alfarano C, Foussal C, Lairez O, Calise D, et al. Transition from metabolic adaptation to maladaptation of the heart in obesity: role of apelin. Int J Obes (Lond). 2014 Jul 16. 181. Kazemi-Bajestani SM, Patel VB, Wang W, Oudit GY. Targeting the ACE2 and Apelin Pathways Are Novel Therapies for Heart Failure: Opportunities and Challenges. Cardiol Res Pract. 2012; 2012:823193. 182. Aydin S, Eren MN, Sahin I, Aydin S The role of apelins in the physiology of the heart. Protein Pept Lett. 2014; 21(1):2-9. 183. Charles CJ. Update on apelin peptides as putative targets for cardiovascular drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2011 Jun; 6(6):633-44. 184. Wang W, Bodiga S, Das SK, Lo J, Patel V, Oudit GY. Role of ACE2 in diastolic and systolic heart failure. Heart Fail Rev. 2012 Sep; 17(45):683-91. 185. Quazi R, Palaniswamy C, Frishman WH. The emerging role of apelin in cardiovascular disease and health. Cardiol Rev. 2009 Nov-Dec; 17(6):283-6. 186. Ho JE, Liu C, Lyass A, Courchesne P, et al. Galectin-3, a marker of cardiac fibrosis, predicts incident heart failure in the community. J Am Coll Cardiol. 2012 Oct 2;60(14):1249-56. 125 187. Fermann GJ, Lindsell CJ, Storrow AB, et al. Galectin 3 complements BNP in risk stratification in acute heart failure. Biomarkers. 2012 Dec; 17(8):706-13. 188. Gopal DM, Kommineni M, Ayalon N, Koelbl C, et al. Relationship of plasma galectin-3 to renal function in patients with heart failure: effects of clinical status, pathophysiology of heart failure, and presence or absence of heart failure. J Am Heart Assoc. 2012 Oct; 1(5):e000760. 189. Ahmad T, Felker GM. Galectin-3 in heart failure: more answers or more questions? J Am Heart Assoc. 2012 Oct;1 (5):e004374. 190. Хаютин В.М., Лукошкова Е.В., Ермишкин В.В., Сонина Р.С. Сократимость левого желудочка сердца человека: неинвазивное определение при каждом кардиоцикле. Кардиология. 2010. №4. Том 50. 38-44. 191. Хаютин В.М., Николаев Д.В., Ермишкин В.В, Лукошкова Е.В. Способ непрерывной динамической оценки сократимости левого желудочка сердца человека. Патент на изобретение №2362483. Приоритет от 24.04.2006. 192. Press W H, Teukolsky S A, Vetterling W T, Flannery B P 1992 Numerical recipes in C: the art of scientific computing (Cambridge University Press) p 994. 193. В.В.Ермишкин, Е.В.Лукошкова, В.Л.Лакомкин, А.А.Абрамов, В.А.Колесников, С.В.Лакомкин, В.И.Капелько. Неинвазивная оценка сократимости миокарда крыс. 2013; 8(20): 26-31. 194. Д.М. Аронов, В.П. Лупанов. Функциональные пробы в кардиологии, МЕДпресс-информ, Москва, 2007. 195. David Gross. Animal Models in Cardiovascular Research. Springer science+business Media, LLC, Heidelberg, London, New York, 2009. 126 196. Craig Lygate. Surgical models of hypertrophy and heart failure: Myocardial infarction and transverse aortic constriction. Volume 3, Issue 3, Autumn 2006, Pages 283–290. 197. Muders F, Elsner D. Animal models of chronic heart failure. Pharmacol Res. 2000 Jun; 41(6):605-12. Review. 198. Rona G, Chappel CI, Balazs T, Gaudi R. An infarct-like myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat. AMA Arch Pathol. 1959 Apr; 67(4):443-55. 199. Garjani A, Andalib S, Biabani S, et al. Combined atorvastatin and coenzyme Q10 improve the left ventricular function in isoproterenolinduced heart failure in rat. Eur J Pharmacol. 2011 Sep;666(1-3):135-41. 200. Carll AP, Willis MS, Lust RM, Costa DL, Farraj AK. Merits of noninvasive rat models of left ventricular heart failure. Cardiovasc Toxicol. 2011 Jun;11(2):91-112. Review. 201. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М. "Медицина", 2005г. стр. 418-420. 202. Teerlink JR, Pfeffer JM, Pfeffer MA. Progressive ventricular remodeling in response to diffuse isoproterenol-induced myocardial necrosis in rats. Circ Res. 1994 Jul;75(1):105-13. 203. Geng B, Chang L, Pan C, Qi Y, Zhao J, Pang Y, Du J, Tang C. Endogenous hydrogen sulfide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jun 4;318(3):75663. 204. Veragut UP, Krayenbuhl HP. Estimation and quantification of myocardial contractility in the closed chest dog. Cardiologia 1965; 47 : 96-112. 205. Frederiksen JW, Weiss JL, Weisfeldt ML. Time constant of isovolumic pressure fall: determinants in the working left ventricle. Am J Physiol. 1978; 235:H701-H706. 127 206. Капелько ВИ, Орлова ЦР. Константы скорости расслабления левого желудочка: влияние механических и инотропных факторов. Кардиология 1986; 6, 79-82. 207. Masson S, Anand I, Favero C, et al; Valsartan Heart Failure Trial (ValHeFT) and Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Insufficienza Cardiaca–Heart Failure (GISSI-HF) Investigators. Serial measurement of cardiac troponin T using a highly sensitive assay in patients with chronic heart failure: data from 2 large randomized clinical trials. Circulation. 2012 Jan 17; 125(2):280-8. 208. Norton K, Iacono G, Vezina M. Assessment of the pharmacological effects of inotropic drugs on left ventricular pressure and contractility: an evaluation of the QA interval as an indirect indicator of cardiac inotropism. J Pharmacol Toxicol Methods. 2009 Sep-Oct;60(2):193-7. 209. Kubicek WG, Kottke J, Ramos MU, Patterson RP, Witsoe DA, Labree JW, Remole W, Layman TE, Schoening H, Garamela JT. The Minnesota impedance cardiograph - theory and applications. Biomed Eng. 1974 Sep; 9(9):410-6. 210. Капелько ВИ, Горина МС, Новикова НА. Сравнительная оценка сокращения и расслабления сердечной мышцы при уменьшении концентрации кальция в перфузате, ацидозе и метаболической блокаде. в сб. "Метаболизм миокарда" Москва, "Медицина" 1983, 45-59. 211. Капелько ВИ, Новикова НА. Функциональные признаки энергодефицитной и гипокальциевой недостаточности сердца. в сб."Новое в кардиологии" (ред.Чазов ЕИ) Москва, "Медицина" 1985, 90-95. 212. Matsuyoshi YN, Nishiyama A, Takaki М et al. Left ventricular function of isoproterenol-induced hypertrophied rat hearts perfused with blood: mechanical work and energetics. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009; 297:H1736-H1743 128 213. Prunier F, Gaertner R, Louedec L et al. Doppler echocardiographic estimation of left ventricular end-diastolic pressure after MI in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002; 283: H346–H352. 214. Brooks WW, Conrad CH. Isoproterenol-Induced Myocardial Injury and Diastolic Dysfunction in Mice: Structural and Functional Correlates. 2009; 59 (4): 339-343. 215. Feng W, Li W. The study of ISO induced heart failure rat model. Exp Mol Pathol. 2010; 88(2):299-304. 216. Krenek P, Kmecova J, Kucerova D et al. Isoproterenol-induced heart failure in the rat is associated with nitric oxide-dependent functional alterations of cardiac function. European Journal of Heart Failure 2009; 11: 140–146. 217. Lee DK, Saldivia VR, Nguyen T, Cheng R, George SR, O’Dowd BF. Characterization of apelin, the ligand for the APJ receptor. J Neurochem. 74(1):34-41;2000. 218. Ladeiras-Lopes R; Ferreira-Martins J; Leite-Moreira AF. The apelinergic system: the role played in human physiology and pathology and potential therapeutic applications. Arq. Bras. Cardiol. vol.90 no.5 2008. 219. Synthetic peptides. A user’s guide. Second edition. Ed. By G.A.Grant. New York Oxford University Press 2002. 220. Berry MF, Pirolli TJ, Jayasankar V, et al. Apelin has in vivo inotropic effects on normal and failing hearts. Circulation. 2004 Sep 14; 110(11 Suppl 1):II 187-93. 221. Barouch L.A., Harrison R.W., Skaf M.W, et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial confinement of nitric oxide synthase isoforms. Nature 416 (6878): 337-339; 2002,19 222. Poteser, M., Romanin, C., Schreibmayer, W., Mayer, B., Groschner, K. S-nitrosation controls gating and conductance of the alpha 1 subunit of class C L-type Ca(2+) channels. (2001) J Biol Chem. 276, 14797–14803. 129 223. Liu, J., Sirenko, S., Juhaszova, M., Ziman, B., et al. A full range of mouse sinoatrial node AP firing rates requires protein kinase A-dependent calcium signaling. (2011) J. Mol. Cell. Cardiol., 51, 730–739. 224. Linke WA. Sense and stretchability: The role of titin and titinassociated proteins in myocardial stress-sensing and mechanical dysfunction. Cardiovasc Res 2008; 77: 637-648. 225. Paulus WJ, Bronzwaer JG. Myocardial contractile effects of nitric oxide. Heart Fail Rev. 2002; 7(4): 371-83. 226. Massion PB, Feron O, Dessy C., Balligand J.-L. Nitric Oxide and Cardiac Function: Ten Years After, and Continuing. Circ Res 2003; 93:388-398. 227. Salama G, Menshikova EV, Abramson JJ. Molecular interaction between nitric oxide and ryanodine receptors of skeletal and cardiac sarcoplasmic reticulum. Antioxid. Redox Signal. 2000; 2(1): 5-16. 228. Xu L, Eu JP, Meissner G, Stamler JS. Activation of the cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) by poly-S-nitrosylation. Science 1998; 279: 234–237 229. Zhang YH1, Zhang MH, Sears CE, et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 2008; 102(2):242-9. 230. Gonzalez DR, Beigi F, Treuer AV, Hare JM. Deficient ryanodine receptor S-nitrosylation increases sarcoplasmic reticulum calcium leak and arrhythmogenesis in cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 20612-7. 231. Zhang YH, Jin CZ, Jang JH, Wang Y. Molecular mechanisms of neuronal nitric oxide synthase in cardiac function and pathophysiology. J Physiol. 2014 Apr 22. [Epub ahead of print] 232. Lima B, Forrester MT, Hess DT, Stamler JS. S-nitrosylation in cardiovascular signaling. Circ Res 2010; 106, 633-646. 130 233. Капелько ВИ. Редокс-регуляция ритма сердца. Биохимия 2012; т 77, № 11, с. 1491-1503. 234. Filice E1, Angelone T, De Francesco EM, et al. Crucial role of phospholamban phosphorylation and S-nitrosylation in the negative lusitropism induced by 17β-estradiol in the male rat heart. Cell Physiol Biochem. 2011; 28(1):41-52 235. Pires AL, Pinho M, Alves BS et al. Reverse myocardial effects of intermedin in pressure-overloaded hearts: role of endothelial nitric oxide synthase activity. J Physiol. 2013; 591(Pt 3):677-87. 236. Silberman GA, Fan TH, Liu H, et al. Uncoupled cardiac nitric oxide synthase mediates diastolic dysfunction. Circulation 2010; 121(4):51928. 237. Марков ХМ. Система оксида азота и болезни кровообращения. Москва «Полиграф-Сервис» 2011, 632 с. 238. Krüger M, Kötter S, Grützner A et al. Protein kinase G modulates human myocardial passive stiffness by phosphorylation of the titin springs. Circ Res. 2009; 104(1):87-94. 239. Rassaf T, Poll LW, Brouzos P, et al. Positive effects of nitric oxide on left ventricular function in humans. European Heart Journal 2006; 27: 1699–1705. 131
