Модельные организмы, генетические манипуляции и
advertisement
Модельные организмы, генетические манипуляции и моделирование заболеваний Модельные организмы - организмы, используемые в качестве моделей для изучения тех или иных свойств, процессов или явлений живой природы • Позволяют проводить эксперименты, невыполнимые на людях • Живые организмы проявляют высокую степень сходства на молекулярном уровне, некоторые гены могут сохраниться входе эволюции у далеких видов Характеристики модельных организмов • • • • Хорошо изучены Легко содержать и разводить в лаборатории Короткое время генерации Легкодоступны для классических экспериментов по скрещиванию, а также прямого манипулирования с геномом • Близкое к человеку положение на филогенетическом древе Группы модельных организмов для изучения генетических заболеваний человека Класс организмов Преимущества Недостатки и ограничения Приматы Близки к человеку генетически, биохимически и физиологически. Сходное строение мозга. Дорогостоящие исследования. Длительный цикл развития, малочисленное потомство. Этические проблемы. Другие млекопитающие Относительно близки к человеку на разных уровнях. У грызунов короткий цикл развития и многочисленное потомство. Кроме грызунов, длительный цикл развития, малочисленное потомство. Некоторые заболевания невозможно моделировать. Другие позвоночные Хорошие модели для изучения ранних стадий эмбрионального развития. Короткий цикл развития и многочисленное потомство. Сложности с генетическими манипуляциями. Отсутствуют ортологи многих генов человека. Беспозвоночные C. elegans и D. melanogaster очень легко разводить в лабораторных условиях и проводить генетический анализ. Подходят для изучениямоделей заболеваний на клеточном уровне. Эволюционно далеки от человека, следовательно отличаются многие процессы и отсутствуют ортологи многих генов. Human gene Drosophila gene Affect when mutated Hox genes Hox genes Alteration of anteriorposterior identities PAX6 eyeless Defects of the eyes SALL1 salm or salr Defects of the auditory system TWIST1 twist Malformations of mesodermal derivatives NKX2-5 tinman Defects in heart specification and function • Дрожжи Saccharomyces cerevisiae • Плодовая мушка Drosophila melanogaster • Нематода Caenorhabditis elegans • Рыба Danio rerio • Мышь Mus musculus Humans Animal models Mutant Gene Mutant Gene Mutant or missing Protein Mutant or missing Protein Mutant Phenotype (disease) Mutant Phenotype (disease model) Sequence analysis (BLAST) can connect animal genes to human genes Humans Animal models Mutant Gene Mutant Gene Mutant or missing Protein Mutant or missing Protein Mutant Phenotype (disease) Mutant Phenotype (disease model) Relating phenotypes Humans Animal models Mutant Gene Mutant Gene Mutant or missing Protein Mutant or missing Protein Mutant Phenotype (disease) Mutant Phenotype (disease model) Фенотип модельного организма исследуется, исходя из проявления заболевания у человека • Анатомические, морфологические, гистологические исследования • Метаболические, физиологические, поведенческие тесты • Молекулярно-генетический анализ экспрессии (как уровень экспрессии, так и ее локализация) • Получение и исследование клеточных линий Анатомическое и морфологическое фенотипирование модели заболевания Ellis–van Creveld syndrome Трансгенные организмы • Экзогенная ДНК внедряется в геном клеток зародышевого пути • Для изменения генома модельных организмов разработано множество методов • Трансген – чужеродная ДНК используемая при трансгенезе Способы введения трансгенов • Микроинъекция в пронуклеус • Перенос генов в гаметы и предшественники половых клеток • Перенос генов в плюрипотентные клетки эмбриона или культивируемые плюрипотентные клетки • Перенос генов в соматические клетки (клонирование) Различные способы получение генетически модифицированных мышей Микроинъекция в пронуклеус Somatic cell nuclear transfer Регуляция трансгена на уровне экспресии • Экзогенные промоторы позволяют регулировать экспрессию трансгенов • На экспрессию трансгенов может влиять эффект положения и структура трансгенного локуса Индуцибельная экспрессия трансгенов Tetracycline-inducible expression (уровень транскрипции) Tamoxifen-inducible expression (уровень трансляции) Таргетная модификация генома • Gene targeting –модификация определенного гена/генов организма • Chromosome engineering – крупные модификации ДНК Таргетинг генов с использованием эмбриональных стволовых клеток Подходы к таргетингу генов для создания «нулевых» аллелей или более мягких мутаций 1. Gene knockouts – полное выключение гена 2. Gene knock-ins – выключение гена с внедрением репортерного гена (lacZ, GFP) 3. Создание точечных мутаций 4. Кондиционная инактивация генов Используется процесс гомологичной рекомбинации (кроме п. 4) Исследование функций гена, моделирования заболеваний Позитивно-негативная селекция для отбора стволовых клеток с желаемым генотипом Knock-in Замена только первого экзона Выключение гена и локализация его нормальной экспрессии GFP Кондиционная инактивация генов • Инактивация в определенных тканях или в определенное время • Для изучения генов, жизненно важных на ранних стадиях развития или в некоторых тканях • Используются сайт-специфические системы рекомбинации микроорганизмов Кондиционная инактивация генов с использованием системы Cre-loxP Возможно создание индуцибельного Cre трансгена Chromosome engineering • Создание крупных хромосомных перестроек • Для моделирования хромосомных заболеваний человека • Используются сайт-специфические системы рекомбинации микроорганизмов Chromosome engineering Таргетная инактивация гена с использованием нуклеаз с «цинковыми пальцами» Таргетная инактивация генов на уровне РНК • Gene knockdown • Не требуется получения трансгенных животных 1. Интерференция РНК 2. Морфолиновые антисмысловые олигонуклеотиды Случайный мутагенез • Для внесения случайных мутаций в геном • Получение большого количества мутантов, последующая фенотипическая селекция и анализ генотипа 1. Химический мутагенез 2. Инсерционный мутагенез – Gene trapping (ловушка гена) – Транспозонный мутагенез Алкилирующие агенты Анализ генотипа при химическом мутагенезе • Гетеродуплексный анализ • NGS Gene trapping Метод похож на knock-in, но встройка происходит случайно Транспозоновый мутагенез Использование трансгенных животных для моделирования заболеваний человека и изучения функций генов • Генетические, аутоимунные заболевания, рак, инфекционные заболевания • Среди генетических чаще исследуются моногенные заолевания, реже – мультифакторные, хромосомные • Мышь – наиболее популярные модельный объект • Беспозвоночные используются для исследования клеточной или молекулярной основы заболевания Human disease genes in model organisms Disease Human Mouse Fruit fly Worm Yeast Bacteria Ataxia ATM MEI-41 T06E4.3 TEL1 telangiectasia ATM Breast BRCA1,2 BRCA1,2 cancer Cystic CFTR CFTR MDR50 mrp-1,2 YCF1 MDL fibrosis Duchenne DMD SPEC-B F15D3.1a muscular dys DMD HNP colon MSH2 MSH2 SPEL1 msh-2 MSH2 MUTS cancer Huntingtin HD HD disease (huntingtin) (huntingtin) Werner syndrome Wilson disease Waardenburg syndrome WRN WRN MUS309 wrn-1 SGS1 RECQ WND ATP7B CA-P60A B0365.3 CCC2 f834 PAX3 PAX3 CG6716-P vab-3 Мутации потери функции Loss-of-function • Моделируются при селективной инактивации ортологичного гена • Чаще рецессивные 1. Нулевый аллели, кондиционная инактивация 2. Гуманизированные аллели (humanized allele) 3. Ликовые мутации (leaky mutations) Мутации приобретения функции Gain-of-function • Моделируются при экспрессии мутантного трансгена • Чаще моногенные, онкогенные Моделирование хромосомных заболеваний • Делеции и дупликации относительно небольшого размера модилируются при помощи хромосомной инженерии • Нарушение числа хромосом моделировать сложно из-за ограниченной синтении хромосом человека и мыши Моделирование синдрома Дауна с использованием сегментной трисомии 16 хромомсомы Моделирование синдорома Дауна с использованием трансхромосомных мышей Моделирование онкологических заболеваний • Knockouts для моделирования потери функции онкосупрессора • Модели активации онкогенов • Моделирование спорадического рака Трудности в повторении фенотипа человека на мышах • • • • Отличия в наборе генов Отличия в генетическом фоне Отличия в регуляции и экспресии генов Отличия в биохимических и метаболических путях • Отличия в клеточной физиологии и развитии и тд. Гуманизированные мыши • Линии мышей, в которых нивелированы те или иные отличия от человека в физиологии, биохимии и тд eyeless/Pax-6 genes Pax-6 mRNA in situ hybridisation in human fetus Achondroplasia Fibroblast growth factor receptor (FGFR) Выводы • Модельные организмы важны для изучения функций генов, понимания механизма заболевания, тестирования новых препаратов. • «Полезность» модельного организма зависит от многих факторов: эволюционную близость, практические преимущества и ограничения, этически проблемы. • Черви и насекомые используются для анализа на клеточном уровне, рыбы и мыши – на более высоком. • Генетические манипуляции, как правило, заключаются во внедрении чужеродной ДНК в клетки зародышевого пути для получения трансгенного организма. • Микроинъекции в пронуклеус часто используются для внедрения чужеродного гена (нормального или мутантного). • Модификация эндогенных генов может осуществляться методом таргетинга генов или случайным мутагенезом. Выводы • Таргетинг генов основан на процессе гомологичной рекомбинации в клетке. • Сайт-специфическая рекомбинация позволяет контролировать место и время экспрессии трансгена. • Кондиционные нокауты позволяют выключать жизненно важные на ранних стадиях развития гены. • На модельных организмах также изучаются крупные хромосомные перестройки. • Возможно выключение генов на уровне РНК, а не ДНК. • При крупномасштабных экспериментах по мутагенезу зачастую применяются методы случайного мутагенеза. • В качестве модельных объектов могут использоваться стволовые клетки, в том числе полученные из соматических Can computer models replace animal models in research? • Even though computer models are limited by what is already known about a process or disease, they are valuable tools that scientists can use to suggest ideas that then can be tested in real organisms. The information that results from the experiments continually enhances the computer modeling approaches. Thus, the two types of models go hand in hand, relying on each other to advance our understanding of health.
