файл диссертации в формате (0 Kb.)
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное учреждение «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА» На правах рукописи ВЛАДИМИРОВА Инна Владимировна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ОВАРИАЛЬНОГО ОТВЕТА В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ 14.01.01 – акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор медицинских наук Калинина Е.А. кандидат медицинских наук Донников А.Е МОСКВА - 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................4 Глава 1. ПОЛИМОРФИЗМ ОВАРИАЛЬНЫЙ ОТВЕТ ГЕНОВ, В ОКАЗЫВАЮЩИХ ПРОГРАММАХ ВЛИЯНИЕ НА ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)......................................14 1.1 Полиморфизм гена рецептора ФСГ (follicle stimulating hormone receptor, FSHR) ..15 1.2 Полиморфизм гена рецептора лютеинизирующего гормона (luteinizing hormone, LHCGR) .................................................................................................................................21 1.3 Полиморфизм генов эстрогеновых рецепторов α и β (еstrogen receptors, ESR1и ESR2) .....................................................................................................................................23 1.4 Полиморфизм гена антимюллерова гормона и его рецептора 2 типа (аnti-Müllerian hormone (AMH), receptor type II (AMHR2)) ......................................................................27 1.5 Полиморфизм генов PAI-1 и VEGF (plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), vascular endothelial growth factor (VEGF)) ..........................................................................30 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ......................................................35 2.1 Материал исследования .................................................................................................35 2.2 Дизайн исследования .....................................................................................................36 2.3 Расчет объема выборки ..................................................................................................39 2.4 Методы исследования ....................................................................................................39 2.4.1 Общеклинические методы исследования...............................................................41 2.4.2 Гормональное исследование ...................................................................................42 2.4.3 Ультразвуковое исследование органов малого таза .............................................43 2.4.4 Спермиологическое исследование эякулята ..........................................................44 2.4.5 Специальные методы исследования. Молекулярно-генетические методы исследования ......................................................................................................................45 2.4.6 Протокол стимуляции функции яичников .............................................................48 2.4.7 Трансвагинальная пункция яичников .....................................................................49 2.4.8 Метод оплодотворения и культивирования дробящихся эмбрионов in vitro .....50 2.4.9 Перенос эмбрионов в полость матки ......................................................................51 2.4.10 Поддержка посттрансферного периода и диагностика наступления беременности .....................................................................................................................51 3 2.5 Статистический анализ полученных данных ..............................................................52 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ..54 3.1 Клиническая характеристика пациенток, включенных в исследование ...................55 3.1.1 Возрастная характеристика пациенток ..................................................................55 3.1.2 Росто-весовая характеристика пациенток ..............................................................57 3.1.3 Характеристика менструальной функции пациенток ...........................................58 3.1.4 Репродуктивный анамнез пациенток ......................................................................61 3.1.5 Анамнез перенесенных гинекологических заболеваний пациенток ...................64 3.1.6 Гормональный профиль пациенток, включенных в исследование, и его предиктивная точность в определении овариального ответа .......................................66 3.2 Ассоциация овариального ответа с особенностями оогенеза и эмбриогенеза ........69 3.3 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с типом овариального ответа на стимуляцию суперовуляции ................................................................................................72 3.4 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с качеством ооцитов .....................77 3.5 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с качеством эмбрионов ................90 3.6 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с частотой наступления беременности ......................................................................................................................100 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................................................................................104 ВЫВОДЫ................................................................................................................................ 114 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ...............................................................................116 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...................................................................................................118 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .....................................................................................................121 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Согласно определению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), бесплодие – неспособность к зачатию спустя 12 месяцев регулярной половой жизни без контрацепции [94]. Распространенность бесплодия среди супружеских пар репродуктивного возраста растет, достигая 15% [16]. Безусловно, это приводит к значительным медицинским, социальным и финансовым проблемам [2, 53]. Современная медицинская наука добилась больших успехов в понимании и лечении состояний, ассоциированных с репродуктивной функцией [10, 21]. С развитием экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), многие проблемы, связанные с бесплодием, были успешно преодолены. В 2010 году Нобелевская премия в области Физиологии и Медицины была присуждена профессору Robert G. Edwards за технологию искусственного оплодотворения in vitro - прорыва, который помог миллионам бесплодных пар во всем мире зачать и родить детей [53]. Сегодня, по оценкам экспертов, 2-3% всех родов в развитых странах являются результатом in vitro fertilisation (IVF) программ [51]. Потребность во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ) неуклонно растет, и существует постоянная необходимость в разработке новых наиболее эффективных и безопасных подходов [11, 53]. Фундаментальные и клинические исследования в сочетании с достижениями в области современных технологий привели к развитию новых методов лечения, в том числе протоколов стимуляции суперовуляции [13, 21, 31]. Однако, несмотря на постоянные усилия, направленные на повышение 5 вероятности наступления беременности, эффективность программы ЭКО попрежнему остается около 30-35% на цикл [35]. Ожидаемый результат лечения методом ЭКО в значительной степени зависит от эффективности проводимой стимуляции функции яичников, являющейся начальным этапом программы ЭКО, с использованием экзогенных гонадотропинов для индуцирования роста и созревания большого числа фолликулов [83, 53]. Получение достаточного и адекватного количества высококачественных ооцитов при минимальных рисках осложнений – главная цель стимуляции стимуляция функции суперовуляции яичников является [52]. Контролируемая «краеугольным камнем» вспомогательных технологий в лечении бесплодия [28]. Протоколы стимуляции функции яичников предусматривают использование различных препаратов гонадотропинов, гонадотропинов (ЧМГ) например, и человеческих мочевых или менопаузальных рекомбинантных фолликулостимулирующих гормонов (рФСГ) [3, 53]. Супрессия эндогенной функции гипофиза, достигаемая путем введения агонистов или антагонистов гонадотропин–рилизинг гормона (аГнРГ, антГнРГ), также используется в процессе стимуляции функции яичников с целью предотвращения преждевременной овуляции и лютеинизации фолликулов [53]. Использование экзогенных гонадотропинов «подрывает» естественный процесс доминирования одного фолликула в течение менструального цикла. С другой стороны, возможность проведения стимуляции суперовуляции значительно повышает потенциал успешного исхода программ ВРТ [28]. Однако до сих пор остается нерешенным вопрос об индивидуальной вариабельности ответа яичников на стимуляцию их функции [62]. В начале 1980-х гг были определены 3 типа овариального ответа на стимуляцию 6 суперовуляции: «бедный» (или низкий), нормальный (или «хороший») и высокий (или «гипер») ответ [98]. Однако даже спустя 30 лет нет единого определения характера овариального ответа, хотя термины широко используются как в научных исследованиях, так и в повседневной клинической практике [98]. В 2011 году на встрече Европейского общества репродуктологов и эмбриологов (European Society of Human Reproduction and Embryology, ESHRE) была определена концепция, принятая за основу, согласно которой «бедный» овариальный ответ (БОО) предполагает созревание трех и менее фолликулов при стимуляции суперовуляции высокими дозами гонадотропинов [41]. Частота «бедного» овариального ответа варьирует от 9% до 24% среди пациенток, находящихся на лечении в программах ВРТ [8; 81]. У пациенток с «бедным» овариальным ответом получают мало ооцитов, мало эмбрионов, что снижает шансы наступления беременности и эффективность программ ВРТ. Согласно Educational Bulletin American Society of Reproductive Medicine (ASRM, 2008) «гипер» ответ на стимуляцию функции яичников предполагает созревание более 10 фолликулов [22, 37]. Частота этого типа овариального ответа существенно варьирует в популяции пациенток с бесплодием от 0,1% до 33%. Непредвиденное развитие «гипер» овариального ответа может привести к такому серьезному осложнению, как синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ) [5]. Соответственно, нормальный ответ яичников на стимуляцию предполагает рост в среднем от 4 до 10 фолликулов, отсутствие критериев БОО и «гипер» ответа яичников на стимуляцию суперовуляции. Существуют различные предикторы овариального ответа (возраст, овариальный резерв, гормональный статус, неблагоприятные экзогенные факторы и другие) [66]. Определение овариального резерва помогает при 7 индивидуальном подборе дозы вводимых препаратов. Однако, несмотря на существующие предикторы, этот процесс во многом остается эмпирическим [27, 28]. Проведенные исследования показали высокую вариабельность клинических исходов стимуляции функции яичников женщин [12, 53]. Трудности в прогнозировании ответа яичников на стимуляцию суперовуляции гонадотропинами представляют собой одну из наиболее сложных проблем [53]. Понимание и прогнозирование ответа яичников на стимуляцию имеет первостепенное значение для эффективности и безопасности лечения бесплодия методом ЭКО [53]. Современные подходы к диагностике и лечению бесплодных супружеских пар основаны на достижениях фундаментальных наук в области изучения молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе реализации процесса репродукции у человека [7, с. 11-12]. Расшифровка генетических механизмов регуляции репродуктивной системы способствовать созданию персонализированного подхода может к лечению предикторы исходов бесплодия в репродуктивной медицине. Исследователями предложены различные стимуляции функции яичников, такие как возраст, овариальный резерв (объем яичников и число антральных фолликулов), гормональный статус (уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), эстрадиола, ингибина В, антимюллерова гормона (АМГ)), курение и другие [86, 34, 19, 58]. Возраст является важным маркером фертильности женщины. Увеличение возраста неизбежно приводит к снижению фертильности. Однако это не затрагивает всех женщин в равной степени [21]. «Хронологический» возраст не может быть столь же значимым предиктором, как гормональными, «биологический» функциональными возраст, профилями, который определяется являющимися более 8 значимыми факторами для прогнозирования фертильности пациенток и выбора тактики лечения [38, 4, 21]. Генетический скрининг может предоставить конкретную информацию о состоянии репродуктивной системы женщины изменчивость представляется важным фактором, [21]. Генетическая детерминирующим овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции в программе ЭКО [53]. Различия в человеческом геноме могут приводить к изменению чувствительности к ФСГ на клеточном и тканевом уровнях, влияя тем самым на овариальный ответ [53]. Клинико-ассоциативные исследования по изучению генных объединений выявили ряд полиморфизмов генов (single nucleotide polymorphism, SNP), участвующих в овариальном ответе, затрагивающих гонадотропины, стероидные гормоны и т.д. Большинство из них оказывают эффект на уровне матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) и могут приводить к количественным или функциональным белковым изменениям. Этим возможно объяснить встречающуюся индивидуальную вариабельность в ответе яичников на стимуляцию их функции [52]. Влияние полиморфизмов генов на исходы стимуляции суперовуляции в программе ЭКО анализировалось не одной группой исследователей, но фармакогенетический подход к дозированию экзогенного ФСГ по-прежнему до конца не разработан [53]. Фармакогенетика — раздел медицинской генетики и фармакологии, способный прогнозировать характер реакций индивида на лекарственные препараты в зависимости от генотипа [21]. Ряд исследователей оценили влияние биохимических звеньев в генезе секреции и активации половых стероидов, (опосредованное генами ароматазы CYP19A1, эстрогеновых рецепторов и т.д.), фолликулогенеза, а также другие аспекты [53]. Проводимые фармакогенетические исследования демонстрируют индивидуальную вариабельность исходов стимуляции функции яичников и 9 потенциальную предиктивность терапии с учетом особенностей генотипа пациенток [84]. Знания, полученные благодаря таким исследованиям, дают возможность адаптировать индивидуальными протоколы характеристиками лечения пациенток. в соответствии с Персонализированный подход при проведении программы ЭКО дает возможность прогнозирования овариального ответа на стимуляцию суперовуляции, что снижает случаи отмены лечения в связи с неэффективностью, осложнений и необходимости повторного лечения с целью достижения беременности [53; 84]. Однако, несмотря на многочисленные проведенные исследования в этой области, точное прогнозирование реакции яичников на введение экзогенных гонадотропинов в настоящее время не представляется возможным, поиск оптимальных биомаркеров продолжается [84]. Несмотря на современные достижения в области лечения бесплодия, остается необходимость индивидуализировать и оптимизировать подготовку больных к программе ЭКО, протоколы стимуляции суперовуляции, снизить вероятность неадекватного ответа яичников и развития осложнений, повышая эффективность и безопасность программ ВРТ, а также вероятность рождения живого здорового ребенка. В связи с вышесказанным, представляется актуальным, современным и перспективным изучение молекулярно-генетических предикторов ответа яичников на стимуляцию суперовуляции, особенностей фолликулогенеза, оогенеза и эмбриогенеза в программах ВРТ, чему и посвящено данное научное исследование. Цель исследования: оптимизация программ вспомогательных репродуктивных технологий с использованием молекулярно-генетических маркеров как прогностических факторов овариального ответа на стимуляцию суперовуляции. 10 Задачи исследования: 1. Оценить данные анамнеза, параметры клинического и гормонального статуса пациенток с различным овариальным ответом в программах ВРТ. 2. Определить значимые молекулярно-генетические предикторы ответа яичников на стимуляцию суперовуляции. 3. Проанализировать особенности фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза у обследуемых пациенток в зависимости от полиморфизма генов. 4. Провести анализ эффективности программ ВРТ в зависимости от полиморфизма исследуемых генов. 5. Разработать алгоритм персонализированного проведения программ ВРТ с учетом молекулярно-генетических предикторов овариального ответа. Научная новизна На основании проведенного исследования представлены и научно обоснованы новые данные об особенностях ответа яичников на стимуляцию суперовуляции с учетом молекулярно-генетических предикторов. На современном методическом уровне исследована ассоциация генотипа пациентки с процессами фолликулогенеза, оогенеза и эмбриогенеза. Впервые проведен многофакторный прогностический анализ предиктивной значимости полиморфизма генов и созданы бинарные логистические регрессионные модели с проведением ROC-анализа, согласно которым выявлены полиморфизма независимые исследованных наиболее генов, значимые позволяющие генотипы достоверно прогнозировать степень зрелости ооцитов и качество получаемых эмбрионов. На основании полученных данных проведена комплексная научная оценка исходов программ ВРТ с учетом прогностической значимости изученных молекулярно-генетических маркеров. 11 Практическая значимость В ходе проведенного исследования определена и обоснована целесообразность генотипирования пациенток перед началом проведения программы ВРТ наряду с клинико-лабораторным обследованием. Выявлены независимые генетические маркеры, детерминирующие процессы фолликулогенеза, оогенеза, эмбриогенеза, позволяющие прогнозировать овариальный ответ, степень зрелости получаемых ооцитов и качество эмбрионов. На основании этого разработан алгоритм персонализированного проведения программ ВРТ с учетом молекулярногенетических маркеров, позволяющий проводить персонифицированный подбор протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток в зависимости от генотипа с целью снижения риска развития осложнений (синдрома гиперстимуляции яичников) и получения незрелых ооцитов и эмбрионов низкого качества. Представлены практические рекомендации по реализации программы ЭКО у пациенток в зависимости от генотипа, позволяющие оптимизировать и индивидуализировать программы ВРТ с точки зрения предиктивной медицины. Положения, выносимые на защиту 1. Предикция, основанная исключительно на клинико-гормональных параметрах обследуемых пациенток, не позволяет точно определить овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции. Наибольший процент ошибок наблюдается при прогнозировании нормального овариального ответа. Вероятность «гипер» ответа яичников при этом составляет 14,6%, «бедного» овариального ответа – 9,7%. 2. Значимым независимым молекулярно-генетическим предиктором «гипер» ответа яичников на стимуляцию суперовуляции является генотип G/G полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn). У 76% носительниц 12 генотипа G/G c «гипер» ответом яичников на стимуляцию суперовуляции по исходным гормональным параметрам неточно прогнозируется нормальный овариальный ответ. 3. Вклад генетической предрасположенности в детерминацию оогенеза и эмбриогенеза составляет от 16 до 31% (на основании разработанных комплексных математических моделей). Ключевыми генами являются: для предикции получения незрелых ооцитов - LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), VEGFA -634 G>C, AMHR2 -482 A>G; для предикции эмбрионов низкого качества - ESR1 –351 A>G [XBaI]. 4. Исследованные молекулярно-генетические маркеры ассоциированы с эффективностью программ ВРТ путем детерминации овариального ответа, качества ооцитов и эмбрионов. Личный вклад автора Автор непосредственно участвовал в выборе научного направления исследования, разработке цели и задач исследования, обобщении, анализе, статистической обработке полученных данных. Автор лично принимал участие в ведении пациенток на всех этапах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ), в анализе и научной интерпретации результатов генотипирования пациенток. Соответствие диссертации паспорту полученной специальности Научные положения специальности 14.01.01 – проведенного исследования диссертации «акушерство соответствуют и соответствуют гинекология». области формуле Результаты исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии. Апробация материалов диссертации Основные положения диссертации и результаты работы представлены и доложены на XV Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2014), VII региональном научном форуме «Мать и Дитя» (Геленджик, 2014), 13 XVIII Форуме «Национальные дни лабораторной медицины России – 2014» (Москва, 2014). Работа обсуждена на межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (06.11.2014 г) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (24.11.2014 г, протокол № 15). Внедрение результатов исследования в практику Разработанный на основании полученных результатов алгоритм персонализированного проведения программ ВРТ с учетом молекулярногенетических маркеров внедрен в практическую деятельность отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых 5 входят в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК. Структура и объем диссертации Работа изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 25 рисунками. Библиографический указатель включает 102 литературных источника, из них 14 работ отечественных авторов, 88 - зарубежных авторов. 14 Глава 1. ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, ОКАЗЫВАЮЩИХ ВЛИЯНИЕ НА ОВАРИАЛЬНЫЙ ОТВЕТ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) В геноме человека идентифицированы более 10 млн однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) [92]. Влияние полиморфизма генов на исходы стимуляции функции яичников в программах ВРТ анализировалось многими фармакогенетический подход фолликулостимулирующего группами в отношении гормона (ФСГ) исследователей, дозирования до конца но препаратов не уточнен. Большинство исследований сосредоточены на полиморфизме гена рецептора ФСГ (FSHR), влиянии изменчивости различных биохимических путей, участвующих в синтезе эстрогенов (ароматаза, гены эстрогеновых рецепторов), фолликулогенезе (BMP15, АМГ) и некоторых других маркерах [53]. По современным представлениям взаимодействие генов, вовлеченных в регуляцию овариального ответа, представлено на рисунке 1. 15 Рисунок 1. Взаимодействие генов, вовлеченных в регуляцию овариального ответа (GnRh – гонадотропин-рилизинг гормон; GnRh-R - рецептор гонадотропинрилизинг гормона; LH - лютеинизирующий гормон; LH-R- рецептор лютеинизирующего гормона; FSH – фолликулостимулирующий гормон; FSH-R – рецептор фолликулостимулирующего гормона; ESR1 – рецептор эстрогенового гормона 1 типа; ESR2 – рецептор эстрогенового гормона 2 типа; AMH - антимюллеров гормон; AMHR2 – рецептор антимюллерова гормона 2 типа; Е2 – эстрадиол; ВМР15 - костный морфогенетический белок) 1.1 Полиморфизм гена рецептора ФСГ (follicle stimulating hormone receptor, FSHR) К настоящему времени ген рецептора ФСГ является первым и наиболее изученным генетическим фактором, имеющим значение при стимуляции суперовуляции [53]. Хорошо известно, что физиологическое действие ФСГ зависит от активации его рецептора (follicle stimulating hormone receptor, FSHR), который экспрессируется гранулезными клетками [53]. ФСГ играет ключевую роль в функционировании яичников, при этом его основное действие связано с пролиферацией гранулезных клеток, созреванием 16 ооцитов, синтезом эстрогенов путем активации гена ароматазы [53; 69]. Поскольку успех стимуляции функции яичников в значительной степени зависит от эффективности вводимой пациентке дозы препарата ФСГ, то основным геном, который может «объяснить» различные исходы стимуляции суперовуляции, является ген рецептора ФСГ [53]. Известно, что реакция клеток на воздействие гормонов может изменяться в зависимости от экспрессии генов рецепторов [78]. Большинство исследований в области изучения особенностей овариального ответа сфокусированы на полиморфизме гена рецептора ФСГ. Ген FSHR локализуется на участке хромосомы 2p21 и состоит из 10 экзонов [53]. В нем идентифицировано более 1400 SNPs, наиболее изученные из которых rs6165 и rs6166 [53]. Оба полиморфизма локализованы в экзоне 10, rs6165 приводит к аминокислотной замене в позиции 307 аланин (Ala) на треонин (Thr) во внеклеточном домене белка (гормон-связывающей области), а rs6166 – к аминокислотной замене аспарагин (Asn) на серин (Ser) в позиции 680 во внутриклеточном домене [53; 78]. Эти 2 полиморфизма, находясь в непосредственной близости на хромосоме, позиции в гене 919 и 2039 соответственно (рис. 2) [78], наследуются вместе, образуя устойчивые блоки сцепления [55]. Большинство исследований сфокусированы исключительно на одной из позиций, так как генотипирование одного из полиморфизмов позволяет делать выводы о другом [53]. Аллели 307Thr и 680Asn относятся к «основным» (major) аллелям, в то время как 307Ala и 680Ser являются «минорными» аллелями [78]. 17 Рисунок 2. Модель гена FSHR (A) и соответствующего белка (В) (exons экзоны, cell membrane - клеточная мембрана) [78] Ряд авторов проанализировали влияние Asn680Ser и/или Thr307Ala на исходы стимуляции суперовуляции, полученные данные были обобщены в ряде обзорных статей [67, 74, 70, 72, 73, 49]. Хотя и существуют некоторые несоответствия полученных данных (Klinkert et al., Hanevik et al.), есть достаточно доказательств, чтобы утверждать, генетическая изменчивость рецептора ФСГ влияет на результаты стимуляции суперовуляции [17]. Аллель 680Ser полиморфизма гена FSHR 2039 A>G (Asn680Ser) ассоциирован с повышенным базальным уровнем ФСГ (ключевого маркера овариального резерва и наиболее изученного предиктора типа овариального ответа на стимуляцию суперовуляции) и необходимостью введения высоких доз гонадотропинов при стимуляции функции яичников [53]. Эти данные были подтверждены в исследованиях на различных популяциях [63, 15]. В исследовании, проведенном Boudjenah et al. в 2012 г, показано, что у женщин гомозиготных по аллелю 680Ser полиморфизма гена FSHR 2039 18 A>G получали большее число зрелых ооцитов, чем у гомозигот по аллелю 680Asn ( 9,8+4,6 против 7,2+ 4,0 ооцитов, р=0,0009) [52]. Hanevik et al. (2010) в своем наблюдении выявил положительную корреляцию аллеля 680Ser полиморфизма гена FSHR 2039 A>G с частотой наступления беременности в программах ЭКО [18]. Кроме того, недавние исследования выявили связь между аллелем 680Ser полиморфизма гена FSHR 2039 A>G и высокой частотой благоприятного исхода беременности [53]. Клинические исследования по изучению влияния полиморфизма генов на исходы стимуляции функции яичников, проведенные на сегодняшний день, подтвердили предыдущие выводы о том, что у гомозиготных носителей аллеля 680Ser FSHR 2039 A>G низкая чувствительность к препаратам ФСГ может быть преодолена путем введения повышенных доз ФСГ в протоколах программ ЭКО [53]. Однако, если в генотипе встречается сочетание аллелей 680Ser и 307Ala, то отмечается склонность пациенток к «гипер» ответу, что противоречит общим выводам [47]. Носительницы аллеля 680Ser составляют до 75% пациенток в программах ЭКО [53]. В другом опубликованном мета-анализе исходов программ ВРТ у пациенток с различными генотипами полиморфизма гена FSHR 2039 A>G (Asn680Ser) внимание было сфокусировано на оценке уровня базального ФСГ, дозах вводимых препаратов рФСГ, количестве полученных ооцитов и частоте наступления беременности [62]. В этом мета-анализе сделан вывод о том, что для носителей генотипа Ser/Ser полиморфизма гена FSHR 2039 A>G (Asn680Ser) характерно повышение уровня базального ФСГ и необходимости введения более высоких доз экзогенного ФСГ в процессе стимуляции суперовуляции по сравнению с носителями аллеля 680Asn [62]. К аналогичным выводам пришел и Alviggi et al. (2012), он предполагает, что генотип Ser/Ser обладает низкой биологической активностью и приводит к снижению чувствительности рецепторов ФСГ к вводимым препаратам. В 19 этом же исследовании фармакогенетического приведены подхода к данные, стимуляции программах ВРТ, по меньшей мере, одной что функции с учетом яичников в из четырех пациенток с генотипом Ser/Ser и нормальным количеством антральных фолликулов, требуется введение повышенной дозы экзогенного ФСГ [21]. Однако существенных различий в количестве полученных ооцитов и проценте наступления беременности у пациенток в зависимости от генотипа найдено не было [62]. В другом исследовании продемонстрировано, что полиморфизм гена рецептора ФСГ FSHR 2039 A>G (Asn680Ser) также может быть ассоциирован с «гипер» ответом яичников на стимуляцию суперовуляции. Так, было установлено, что аллель 680Asn является фактором риска «гипер» ответа [47, 53]. Однако данные других исследователей не подтверждают эти результаты [85]. В ходе анализа сочетания полиморфизма генов FSHR и аnti-Müllerian hormone (AMH) было выявлено, что у женщин, гомозиготных по аллелю 680Ser гена FSHR (Asn680Ser) [rs6166] и 49Ser гена AMH (Ile49Ser) [rs10407022], получают большее количество зрелых ооцитов, чем у пациенток, гомозиготных по аллелю 680Asn гена FSHR (Asn680Ser) и/или гомозиготных по аллелю 49Ile гена AMH (Ile49Ser) (p=0,009) [52]. Недавние исследования предоставляют новые молекулярные взгляды на роль FSHR в исходах стимуляции функции яичников [53]. Показано, что изменение уровня мРНК FSHR, приводящее к изменению экспрессии рецептора на гранулезных клетках, приводит к разному овариальному ответу. Так, низкая экспрессия характерна для «бедного» овариального ответа (БОО), а высокая экспрессия дает хороший овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции гонадотропинами [82]. Показано, что уровень активности гена FSHR связан с полиморфизмом промоторной области гена. 20 Desai et al. (2013) исследовал полиморфизм в положении -29 в 5'нетранслируемой области FSHR -29G>A. Как сообщается, генотип -29А/А ассоциирован с «бедным» овариальным ответом и сниженной экспрессией FSHR [29]. Однако эти результаты были получены на небольшой выборке пациенток и требуют дальнейших исследований. Существуют также исследования, предполагающие наличие других молекулярных механизмов, влияющих на исходы стимуляции функции яичников [60]. А именно, были идентифицированы аберрантные варианты сплайсинга мРНК рецептора ФСГ (делеция экзона 2, делеция экзона 6) в гранулезных клетках, которые частично могут объяснять различия овариального ответа на стимуляцию суперовуляции препаратами рФСГ [60, 67]. В совокупности эти данные показывают, что ген FSHR может играть важную роль в исходах стимуляции функции яичников [53]. Таким образом, генотипирование FSHR совместно с дополнительными маркерами (молекулярными и другими), может помочь выделить группу пациенток с тем или иным типом овариального ответа еще до начала лечения [49]. Персонализированный подход к стимуляции суперовуляции в таких случаях изначально высокими дозами препаратов может привести к большим финансовым затратам, но в конечном итоге лечение оказывается эффективнее для пациенток за счет снижения случаев отмены или прекращения цикла [53]. Вопрос о возможных генетических вариациях рецепторов ФСГ, связанных с беременностью, остается спорным и требует дальнейших исследований на большей выборке пациенток [47]. 21 1.2 Полиморфизм гена рецептора лютеинизирующего гормона (luteinizing hormone, LHCGR) Лютеинизирующий гормон (ЛГ) — пептидный гормон, секретируемый гонадотропными клетками передней доли гипофиза [59]. Совместно с другим гипофизарным гонадотропином, например, фолликулостимулирующим гормоном, ЛГ необходим для нормальной работы репродуктивной системы [55]. ЛГ стимулирует выработку андрогенов, выступающих в роли субстрата для синтеза эстрогенов фолликулами [53]. ЛГ синергично с ФСГ стимулирует рост и созревание фолликулов, стероидогенез, процессы овуляции и лютеинизации [101]. В менструальном цикле прежде, чем произойдет овуляция, ФСГ и эстрадиол повышают выработку ЛГ гипофизом и индуцируют экспрессию рецепторов ЛГ в яичниках, способствуя созреванию ооцитов, лютеинизации и овуляции [28]. В программах ВРТ считается, что введение хорионического гонадотропина человека (ХГЧ, т.е. триггера овуляции) опосредованно активирует рецептор ЛГ [28]. Лютеинизирующий гормон является сложным белком — гетеродимерным гликопротеином [65]. По строению он похож на другие гормоны-гликопротеины — ФСГ, тиреотропный гормон (ТТГ), ХГЧ [65]. ЛГ оказывает свое влияние путем связывания с рецептором на поверхности клеток [53]. Рецептор ЛГ (LHR) является G-белком. LHR также известен как LHCGR, так как ЛГ и ХГЧ связываются с одними и теми же рецепторами (ЛГ и ХГЧ эндогенные лиганды для рецептора ЛГ) [53, 28]. LHR имеет решающее значение для поддержания теки, созревания фолликулов и овуляции [53]. LHR-опосредованные сигналы играют важную роль в ответе яичников на введение экзогенного ФСГ [28]. Ген LHCGR расположен на участке хромосомы 2p21, состоит из 11 экзонов и содержит более 520 SNPs [53]. Полиморфизмы rs4539842 22 (18insLeuGln, лейцин-глутамин), rs12470652 (Asn291Ser, аспарагин-серин) и rs2293275 (Ser312Asn) гена LHCGR ассоциируются с повышением активности рецептора [49]. Известно, по крайней мере, 300 полиморфизмов гена LHCGR, которые оказывают значительное влияние на половое развитие и фертильность. LHCGR расположен рядом с локусом, потенциально отвечающим за восприимчивость («склонность») к синдрому гиперстимуляции яичников (СГЯ), ановуляции, повышенному уровню андрогенов [28]. В небольшом исследовании случай-контроль (n=72), повышенный уровень insLeuGln [rs4539842] был обнаружен у 40,5% пациенток с СГЯ, по сравнению с контрольной группой (27,5%), однако это исследование не является статистически значимым, так как проведено на небольшой выборке пациенток [28]. Полиморфизмы 18insLeuGln, Asn291Ser и Ser312Asn гена LHR ассоциируются с повышением активности рецептора [79]. В исследовании O’Brien et al., опубликованном в 2013 г, изучался полиморфизм LHCGR G>C [rs4073366]. Результатом данной работы стал вывод о наличии повышенного риска развития синдрома гиперстимуляции яичников у носителей аллеля С данного полиморфизма (р=0,033) [28]. Это первая работа, посвященная изучению генетической изменчивости LHCGR и связи этого полиморфизма с СГЯ. В одном из исследований были проанализированы полиморфизм insLeuGln [rs4539842] и G>C [rs4073366], локализующийся после insLeuGln в интроне 1. Авторами не была найдена связь insLeuGln с овариальным ответом, и не было подтверждено предположение о том, что этот полиморфизм может быть предиктором СГЯ. Была выдвинута гипотеза, что функция полиморфизма гена LHR, продемонстрированная на культуре клеток НЕК-293 in vitro не отражает в полной мере ту ситуацию, которая происходит непосредственно в яичниках. Также было установлено, что у 23 носителей аллеля С полиморфизма rs4073366, риск СГЯ повышен в 3 раза [28]. Более того, влияние rs4073366 на риск СГЯ в значительной степени связано с гаплотипом no-insLQ/C. Это интересное открытие требует дальнейшего исследования [50, 28]. Недавние геном-ассоциированные исследования обнаружили, что LHCGR ассоциирован с уровнем в сыворотке крови стероид-связывающего глобулина (SHBGs), который может приводить к повышению в сыворотке концентраций андрогенов и эстрогенов [50, 28]. Тем не менее, влияние полиморфизма LHCGR [rs4073366] на уровни SHBG в настоящее время не известны. В то время как rs4073366 является потенциальным предиктором риска СГЯ, последствия влияния этого полиморфизма на функционирование LHR еще не выяснены [28]. В дополнение, область интрона, окружающая комплементарна mRNA аполипопротеина E (APOE) [93]. rs4073366, Учитывая, что APOE играет важную роль при захвате холестерола и в стероидогенезе, его генетическая изменчивость может быть связана и с репродуктивной функцией [93]. Таким образом, возможно, что rs4073366 может изменять восприимчивость к препаратам, использующимся при лечении бесплодия, путем модуляции стабильности мРНК АРОЕ [93]. В целом же в литературе достаточно мало информации о полиморфизме генов, который мог бы быть предиктором СГЯ, что требует проведения дальнейших исследований в этом направлении. 1.3 Полиморфизм генов эстрогеновых рецепторов α и β (еstrogen receptors, ESR1и ESR2) Эстрогеновые рецепторы (ERs) важные «кандидаты» на роль маркеров овариального ответа, так как хорошо изучено влияние эстрогенов на рост фолликулов и созревание ооцитов [53]. Кроме того, эстрогены играют 24 важную роль в подготовке эндометрия к имплантации [42]. Еще в 1978 г было установлено, что эстрогены способны увеличивать влияние ФСГ на гранулезные клетки путем усиления пролиферации и экспрессии рецепторов ФСГ [53]. Эстрогеновые сигналы воспринимаются эстрогеновыми рецепторами, которые являются внутриядерными лиганд-активирующими факторами транскрипции, состоящими из нескольких доменов, важных для узнавания гормона, связывания ДНК и активации транскрипции [53]. У людей определены 2 типа эстрогеновых рецепторов, они кодируются двумя генами ESR1(6q25.1) и ESR2 (14q23.2), соответственно. Оба гена включают в себя 8 экзонов, охватывающих >140 Кб [53]. В процессе фолликулогенеза пролиферативное влияние эстрогенов опосредуется через ERα (экспрессируется преимущественно в теке), а дифференциация и антипролиферативные эффекты, необходимые на антральной стадии, зависят от ERβ (экспрессируются в гранулезных клетках растущих фолликулов) [53]. Показано, что изменчивость генов эстрогеновых рецепторов может привести к некоторым формам бесплодия, а также влияет на исходы стимуляции функции яичников и программ ВРТ в целом [42]. Первое исследование процессов стимуляции суперовуляции с фармакогенетической позиции было проведено в 1997 г, в нем изучался полиморфизм гена ESR1. Ген ESR1 высоко изменчив (полиморфен), он содержит около 2200 SNPs, в то время как в гене ESR2 около 720 SNPs [53]. Наиболее изученными полиморфизмами гена ESR1 являются -397С>Т [rs2234693], определяемый при расщеплении участка рестриктазой Pvull, и -351A>G [rs9340799], определяемый рестриктазой Xbal, локализованные в некодирующей области гена (интроне I) и динуклеотидных повторов в промоторной зоне [53]. полиморфизм (ТА)n 25 В первых исследованиях, посвященных изучению влияния генов эстрогеновых рецепторов на репродуктивную систему, сообщалось, что локус Pvull гена ESR1 может влиять на исходы стимуляции суперовуляции и программы ЭКО в целом [54]. Кроме того, он ассоциирован с предрасположенностью пациенток к эндометриозу [42]. Динуклеотидные повторы (ТА)n в промоторной зоне гена ESR1 повышают риск развития преждевременной недостаточности яичников [44]. Также было показано, что такие повторы более распространены в генотипе пациенток с бесплодием неясной этиологии, по сравнению с женщинами с бесплодием трубного происхождения, локус ESR2 G>A [RsaI] связан с овуляторной дисфункцией неясной этиологии [53]. Таким образом, первые результаты исследований в этой области показали необходимость более тщательного и углубленного изучения полиморфизма генов эстрогеновых рецепторов с целью выявления его влияния на бесплодие. В исследованиях, проведенных Georgiou et al., Sundarrajan et al., выявили, что генотип T/T ESR1 [Pvull] ассоциирован со сниженным шансом наступления беременности у женщин в программах ВРТ [43]. Ряд других авторов (Ayvaz et al., Choi et al.) в своих исследованиях такой связи не обнаружили [44, 39], однако сделали вывод, что полиморфизм ESR1 [Pvull] влияет на течение уже наступившей беременности, а не на результативность переноса эмбриона в полость матки [53]. Пациенты с генотипом С/С ESR1 [Pvull] в программе ЭКО демонстрируют созревание большего количества фолликулов, получение зрелых ооцитов и качественных эмбрионов [44]. В исследовании Altmae et al. получены аналогичные результаты. Так, у пациенток с генотипом C/C ESR1 [PvuII] при стимуляции функции яичников в среднем получают на 5 фолликулов больше (р < 0,00001), чем у пациенток с генотипом Т/Т ESR1 [PvuII] при прочих равных условиях. Приведены 26 данные, что таким пациенткам требуются низкие дозы рФСГ при стимуляции функции яичников [53]. Кроме того, обнаружена связь между аллелем С [Pvull], большим количеством (ТА) повторов и хорошим овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции [53]. Также было выявлено, что частота встречаемости аллеля С [Pvull] ниже среди пациентов с «бедным» овариальным ответом (< 3 фолликулов) в сравнении с пациентами с нормальным овариальным ответом [43]. Ayvaz et al. (2009) в своем исследовании продемонстрировал связь другого распространенного полиморфизма гена ESR1 А>G [Xbal] с исходами стимуляции функции яичников. Стадия зрелости ооцитов и шанс наступления беременности были выше у пациенток с генотипом G/G полиморфизма гена ESR1 А>G [Xbal] [44]. Кроме того, у пациенток с генотипом G/G полиморфизма гена ESR1 А>G [Xbal] отмечается более высокий уровень эстрадиола в процессе стимуляции суперовуляции. Аналогичные исследования не выявили влияния полиморфизма генов ESR2 G>A [RsaI] и G>A [AluI] на результаты стимуляции функции яичников [53]. В исследовании de Castro et al. были представлены данные анализа мультигенной модели 680Ser FSHR 2039 A>G – T ESR1 [PvuII] – G ESR2 [AluI], которая прогнозировала «бедный» овариальный ответ при стимуляции суперовуляции препаратами рФСГ [53]. В исследовании, выполненном Boudjenah et al. (2012), продемонстрировано, что у пациенток, гомозиготных по аллелю G полиморфизма гена ESR2 [Xbal], получают большее число зрелых ооцитов, чем у пациенток гомо- или гетерозиготных по аллелю А полиморфизма гена ESR2 [Xbal] [52]. Также было определено, что пациенткам, гомозиготным по аллелю А полиморфизма гена ESR2 [Xbal], требовались большие дозы 27 препарата рФСГ в процессе стимуляции суперовуляции, чем пациенткам гомо- или гетерозиготных по аллелю G [52]. Суммируя вышеизложенное, нельзя опровергнуть мнение, что эстрогеновые рецепторы влияют определенным образом на результаты стимуляции функции яичников. Тем не менее, необходимы дальнейшие разработки в этой области, с целью подтверждения или опровержения представленных результатов. 1.4 Полиморфизм гена антимюллерова гормона и его рецептора 2 типа (аnti-Müllerian hormone (AMH), receptor type II (AMHR2)) В овариальном ответе на стимуляцию суперовуляции экзогенными гонадотропинами существует определенная вариабельность. «Бедный» овариальный ответ снижает вероятность успешного лечения [18]. С другой стороны, у пациенток с высоким овариальным ответом, существует риск развития клинически значимого синдрома гиперстимуляции яичников [90]. Синдром гиперстимуляции яичников распространенным и серьезным является достаточно широко ятрогенным осложнением в программах вспомогательных репродуктивных технологий [102]. Исследования показали, что, по сравнению с возрастом, уровнем ФСГ, ЛГ, эстрогена и ингибина В, уровень АМГ является наиболее оптимальным показателем овариального резерва и ответа на стимуляцию суперовуляции [25]. Овариальный ответ на стимуляцию функции яичников определяется, прежде всего, количеством фолликулов. В нескольких проведенных исследованиях (Barad et al., 2009; Wu et al., 2009) продемонстрирована корреляция между концентрацией сывороточного АМГ и количеством фолликулов [30, 91]. Предположительно, ряд генов, принадлежащих к «суперсемейству» трансформирующего фактора роста (transforming growth factor beta, TGFβ), играют важную роль в исходах стимуляции суперовуляции [53]. TGFβ – 28 большая группа протеинов, обладающих сходной структурой. Многие из этих белков синтезируются яичниками и важны как местные регуляторы развития фолликулов и созревания ооцитов. АМГ является одним из наиболее изучаемых в настоящее время пептидов данной группы [53]. Первоначально АМГ был известен своими регуляторными эффектами на эмбриональную дифференцировку (АМГ может способствовать деградации мюллерова протока в эмбрионах мужского пола) [102]. АМГ экспрессируется в гранулезных клетках первичных и антральных фолликулов [53], известен как ингибитор пула примордиальных фолликулов и митоза в гранулезных клетках, вследствие этого может снижать чувствительность к препаратам ФСГ. АМГ оказывает свое влияние посредством рецепторов АМГ II типа (AMHR2) [53]. Такие рецепторы присутствуют на гранулезных клетках и клетках теки [18]. Концентрация АМГ в сыворотке крови все чаще используется как предиктор овариального резерва и овариального ответа на стимуляцию суперовуляции [97, 26]. Так, низкий уровень АМГ в сыворотке крови, определяемый перед началом программы ЭКО, считается предиктором БОО и наоборот [18, 23]. Физиологическая роль АМГ не до конца изучена [23]. Ген, кодирующий АМГ, локализуется на участке хромосомы 19p13.3, а ген рецептора АМГ 2 типа расположен на хромосоме 12q13 [53]. Генетическая изменчивость функционирования АМГ представляет интерес и была описана Kevenaar et al. (2007) [18, 24]. В это исследование были включены нормогонадотропные женщины, и продемонстрирована связь полиморфизма генов AMH и AMHR2 с повышенным уровнем эстрадиола в течение всего менструального цикла, что может быть косвенным показателем повышенной чувствительности к ФСГ [18]. Kevenaar и другие исследователи определили SNPs, присутствующие в генотипе примерно 19% женщин [18]. При такой высокой распространенности данные 29 полиморфизмы целесообразно определять до начала стимуляции суперовуляции в качестве предикторов овариального ответа [18]. По данным ряда авторов, концентрацией концентрация эстрадиола в АМГ отрицательно антральных коррелирует фолликулах, это с является доказательством того, что АМГ может быть со регулятором стероидогенеза в клетках гранулезы [85]. Существуют исследования, демонстрирующие связь SNP гена AMH 146T>G (Ile49Ser) [rs10407022] и AMHR2 -482A>G [rs2002555] с высоким уровнем эстрадиола в фолликулярной фазе менструального цикла, что служит косвенным показателем повышенной чувствительности к ФСГ [53, 18]. Вместе с тем, в исследовании, проведенном Hanevik et al., опубликованном в 2010 г, изучались полиморфизмы AMH [rs10407022, rs4807216] и AMHR2 [rs2002555, rs2071558, rs3741664 и rs11170555], и не было отмечено достоверно значимого влияния ни одного из них на исход стимуляции суперовуляции [18]. В исследовании Zhao et al. (2013) сравнивались две группы пациенток: с «гипер» ответом и с нормальным овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции. Были выявлены статистически значимые различия в распределении генотипов G/G, G/T, T/T полиморфизма гена AMH 146T>G (Ile49Ser) в группе пациенток с «гипер» ответом и контрольной группой с нормальным овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции (р=0,04). Различия были обнаружены в частоте встречаемости генотипов G/G (р=0,019) и T/T (р=0,025) между этими двумя группами. Частота встречаемости аллелей G и T значительно отличалась между группой с «гипер» ответом и контрольной группой пациенток (р=0,002) [102]. Транскрипция, трансляция и экспрессия гена АМГ приводят к синтезу белка-предшественника с большой молекулярной массой, который затем расщепляется протеолитическими ферментами с образованием N- и С-конца, 30 мутации в N-концевом домене может поставить под угрозу биосинтез и биологическую активность AMГ [102]. Исследовались SNPs, влияющие на кодирующую область N-конца АМГ. Такие полиморфизмы у пациенток с «гипер» ответом яичников на стимуляцию суперовуляции могут в свою очередь влиять на синтез АМГ, стабильность и биологическую активность Сконца, таким образом, отключая сигнальный путь АМГ. В конечном счете, устраняется влияние АМГ на фолликулогенез, вызывая дисбаланс роста и созревания фолликулов. Это приводит к повышению чувствительности к экзогенной гормональной стимуляции суперовуляции, что приводит в конечном результате к развитию клинически значимого синдрома гиперстимуляции яичников. Таким образом, несмотря на многофакторную этиологию синдрома гиперстимуляции яичников, полиморфизм гена АМГ может быть одним из факторов, влияющим на сигнальные пути АМГ в гранулезных клетках [102, 96]. В дальнейшем требуется подтверждение данной гипотезы. Необходимы дополнительные исследования для определения конкретных генетических эффектов полиморфизма генов. 1.5 Полиморфизм генов PAI-1 и VEGF (plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), vascular endothelial growth factor (VEGF)) Неудачи причинами имплантации являются неэффективности наиболее программы распространенными экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки. Успешная имплантация предусматривает инвазию бластоцисты в эндометрий и начало стимуляции ею своего собственного кровоснабжения [56]. Успешная имплантация индуцирующих зависит от пролиферации паракринную реакцию трофобластических апоптоза, секреции клеток, протеаз, 31 способных воздействовать на внеклеточный матрикс эндометрия (матричные металлопротеиназы, MMPs) [56]. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) является лучшим отличительным признаком процесса ангиогенеза [57]. Дисбаланс в регулируемых процессах клеточной пролиферации или дифференцировки, вызванный повышенным числом клеток, развитие которых остановлено в фазу G1, может стать причиной неадекватного роста трофобласта [56]. При нормально протекающей имплантации клетки трофобласта делятся, пенетрируют эпителий матки, и происходит инвазия в строму [56]. Инвазия трофобласта во время имплантации не может происходить без деградации внеклеточного матрикса, которой способствует ММРs [56]. Активация ММРs при имплантации стимулируется протеазой плазмина, продукция которой регулируется ингибиторами активатора плазминогена (PAI) [52]. Таким образом, инвазия трофобласта зависит от контролируемой продукции плазмина из плазминогена, процесса регулируемого активаторами плазминогена (ПА) и ингибиторами активатора плазминогена (PAI) [56]. Ингибитор активатора плазминогена 1 является основным ингибитором ПА и, таким образом, фибринолиза [56]. Согласно проведенным исследованиям, гомозиготность по аллелю 4G полиморфизма гена PAI-1 -675 4G/5G ассоциирована с повышенной транскрипцией гена PAI-1 и, как следствие, с повышенной экспрессией гена [56]. Люди гомозиготные по аллелю 4G данного полиморфизма имеют самую высокую концентрацию PAI-1 в плазме, гетерозиготы – промежуточную, гомозиготы по аллелю 5G - самую низкую [56]. Повышенная экспрессия PAI-1 ассоциирована с ингибированием превращения (конверсии) плазминогена в плазмин и последующим гипофибринолизом [56]. Таким образом, носительство аллеля 4G полиморфизма гена PAI-1 -675 4G/5G приводит к гипофибринолизу, который в свою очередь является фактором 32 риска неудач имплантации, так как приводит к ингибированию продукции MMPs [56]. После имплантации эмбрион должен стимулировать свое собственное кровоснабжение путем активации ангиогенеза, продолжать свой рост и развитие [56]. Бластоцисты экспрессируют мРНК, кодирующую VEGF, который также способствует индукции ангиогенеза в месте имплантации [56]. Полиморфизм гена VEGF непосредственно коррелирует с синтезом белка VEGF [56]. Сосудистый эндотелиальный фактор роста является лиганд-рецептором, стимулирующим дифференциацию цитотрофобласта, инвазию, ангиогенез [56]. Имплантация представляет собой сложный процесс со взаимосвязанными механизмами, и дефект в одном звене не обязательно приведет к срыву всего процесса, вот почему так важно определить сочетание каких именно дефектов способно приводить к нарушению имплантации. Существуют исследования, демонстрирующие влияние комбинаций полиморфизма генов PAI и VEGF на неудачи имплантации в программах ВРТ. Так, в исследовании, выполненном Goodman et al. (2009), сравнивалась частота встречаемости генотипов 4G/4G PAI-1 и 1154 A/A VEGFА среди пациенток в программе ЭКО. Авторы пришли к выводу, что среди пациенток, у которых имплантация эмбрионов не наступала, выше процент гомозиготных генотипов, частота встречаемости такого полиморфизма генов, как PAI-1 4G/4G составила 36%, VEGFА 1154 A/A – 19% (р<0,05) [56]. Генотип 1154 А/А гена VEGFА обеспечивает низкую экспрессию белка VEGF и, следовательно, уменьшение ангиогенеза, инвазию цитотрофобласта, что, в конечном итоге, приводит к неудачам имплантации [56]. Хотя весь комплекс этих сложных молекулярно-клеточных механизмов недостаточно хорошо изучен, однако точно установлено, что необходима 33 синхронизация множества сигналов для созревания бластоцисты и рецептивности матки [56]. При проведении исследований, направленных на поиск ассоциации полиморфизма генов VEGF rs2071559, rs2305948, rs2010963, PAI-1 -675 4G/5G с исходом стимуляции суперовуляции, положительной корреляции выявлено не было [77, 80]. Однако в ряде случаев сделан вывод об ассоциации полиморфизма гена PAI-1 -675 4G/5G с синдромом поликистозных яичников и, как следствие, развитием «гипер» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции в популяции азиатских пациенток [77], но на популяции европейских женщин данные подтверждены не были [76]. Несмотря на имеющиеся разногласия во взглядах исследователей на проблемы репродукции, единым является факт, что будущая перспектива развития протоколов стимуляции суперовуляции заключается в необходимости учитывать совокупность гормональных, функциональных и генетических маркеров. Исходы стимуляции суперовуляции мультифакториальны, изменчивы и не всегда предсказуемы. Вариабельность в популяции нефертильных пациенток исключает возможность единого ко всем подхода в программах стимуляции суперовуляции [21]. Такая вариабельность может быть обусловлена единичными однонуклеотидными полиморфизмами (SNPs) [52]. Способность более точно прогнозировать ответ яичников на их стимуляцию будет представлять собой значительный шаг вперед в лечении бесплодия методом ЭКО [40]. Взаимодополняющая стратегия включает в себя изучение генетических закономерностей, оказывающих определенное влияние на репродуктивную систему, в частности, на ответ яичников на стимуляцию их функции [52]. Однако, несмотря на многочисленные проведенные исследования в этой области, точное прогнозирование реакции яичников на введение экзогенных 34 гонадотропинов до сих пор не представляется возможным, поиск оптимальных предикторных биомаркеров продолжается. В то же время, очевидно, что нет оснований ожидать появления одного единственного маркера, а научный поиск должен быть направлен также в сторону изучения ген-генных и ген-средовых взаимодействий. Перспективным является использование моделирования биоинформационных для создания подходов и комплексных математического многофакторных прогностических алгоритмов [20]. Исследования, проводимые до настоящего времени, не являются масштабными, а результаты остаются противоречивыми. Таким образом, проблема поиска новых наиболее оптимальных предикторов овариального ответа в программах ВРТ остается чрезвычайно актуальной для осуществления персонализированной тактики стимуляции суперовуляции, в том числе при проведении повторных циклов ЭКО и требует дальнейшего изучения и научного анализа. 35 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материал исследования Отбор пациентов для проведения данного исследования осуществлялся на базе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (заведующий – д.м.н. Калинина Елена Анатольевна) в период с декабря 2012 г по апрель 2014 г. Критерии включения пациенток в исследование: возраст пациенток от 18 до 36 лет включительно женское бесплодие трубного происхождения и/или мужской фактор бесплодия (при отсутствии выраженной патозооспермии) регулярный менструальный цикл В исследование не включались пациентки с: противопоказаниями для проведения ЭКО, в том числе с экстрагенитальной патологией, онкологическими заболеваниями и другими перенесенными оперативными вмешательствами на яичниках эндокринным фактором бесплодия (в том числе СПКЯ) эндометриозом патологией эндометрия хромосомными аномалиями пороками развития половых органов В исследование включены 160 пациенток, обратившихся для проведения программы ЭКО/ИКСИ и ПЭ, прошедших обследование, строго 36 соответствующих критериям включения/исключения, подписавших добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено комиссией по этике биомедицинских исследований при ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ (протокол № 33 от 14.12.2012 г). 2.2 Дизайн исследования Основную группу составили 80 пациенток с нормальным ответом яичников на стимуляцию суперовуляции, без наличия критериев «бедного» овариального ответа ESHRE и критериев «гипер» ответа согласно ASRM. Нормальный овариальный ответ предполагал рост от 4 до 10 фолликулов. Группа сравнения 1 сформирована из 40 пациенток с «бедным» ответом яичников на стимуляцию суперовуляции (согласно Bologna criteria, ESHRE 2011) [41]. «Бедный» овариальный ответ (БОО) - созревание менее 3х фолликулов при стимуляции суперовуляции высокими дозами гонадотропинов (300 МЕ/сут). Пациентки должны соответствовать 2 из 3 критериев: возраст женщины старше 40 лет или другие факторы риска «бедного» овариального ответа (количество антральных фолликулов менее 5-7; уровень AMГ в крови ниже 0,5-1,1нг/мл; указание на сниженный овариальный ответ в анамнезе, получение менее 3 ооцитов при применении стандартных протоколов стимуляции функции яичников). В возрасте женщин менее 40 лет при отсутствии сниженного овариального резерва, достаточно наличия 2х эпизодов «бедного» овариального ответа в анамнезе [41]. Группу сравнения 2 составили 40 пациенток с «гипер» ответом яичников на стимуляцию суперовуляции (согласно Educational Bulletin ASRM, 2008) [22, 37]. 37 Критериями оценки овариального ответа являлись: возраст женщины моложе 33 лет; наличие указаний на СГЯ в анамнезе; рост более 10 фолликулов; уровень E2 выше 3,000 - 4,000пг/мл [22, 37]. Дизайн исследования представлен на рисунке 3. Рисунок 3. Дизайн исследования Эмбриологические показатели: - количество и качество полученных ооцитов - количество полученных эмбрионов (морул, бластоцист) - качество полученных эмбрионов (класс A, B, C) Полученные ооциты классифицировались по степени зрелости согласно критериям, представленным в работе K. Elder (Кембридж) [14]: - GV (germinal vesicle, зародышевый пузырек) – окружающие клетки плотно расположены вокруг ооцита; присутствует большое ядро; такой ооцит 38 находится на стадии профазы первого мейотического деления; полярное тельце не сформировано; - МI (незрелый) – ооцит окружен плотно организованным слоем клеток лучистого венца, cumulus незначительно увеличен; такой ооцит находится на стадии метафазы первого деления мейоза; полярное тельце еще не сформировано; - МII (преовуляторный, зрелый) – клетки лучистого венца все еще окружают ооцит, но не имеют радиальной структуры, cumulus разросшийся, имеет клеточную структуру; одно полярное тельце уже выделено; ооцит находится на стадии метафазы второго деления мейоза; этот уровень созревания подходит для успешного оплодотворения; - Очень зрелый – ооцит часто визуализируется в виде бледного шара, присутствует небольшое количество клеток лучистого венца, отделенного от яйцеклетки; cumulus хорошо различим, имеет различимую клеточную структуру; полярное тельце хорошо видно; - Лютеинизированный – ооцит бледный, часто трудноразличим; вокруг ооцита cumulus образуют скопления, становится желатинозной массой; такие яйцеклетки обладают низкой фертильностью, результаты инсеминации невысоки. Эмбрионы классифицировались по морфологическим критериям в соответствии с классификацией, принятой Istanbul consensus workshop on embryo assessment (ESHRE, 2011) («модифицированная» классификация D. Gardner) [95]: Внутренняя клеточная масса I класс (А) – хорошо различима, содержит много компактно расположенных, плотно упакованных клеток; II класс (В) – хорошо различима, но имеет незначительные дефекты (небольшой объем, неплотно упакована, мало клеток); 39 III класс (С) – трудно различима, содержит всего несколько клеток. Трофэктодерма I класс (А) – хорошо организована, многоклеточная, формирует плотный эпителий; II класс (В) – содержит малое количество неравномерно распределенных клеток; III класс (С) – незначительное количество клеток. 2.3 Расчет объема выборки Для решения поставленных задач объем выборки определялся количеством изучаемых факторов риска, составляющих 10. Максимальное число предикторов, включенных в исследование не должно быть больше, чем число исходов, деленное на значение от 5 (Wasson et al., 1985) [33] до 20 (Harrell et al., 1984, 1985) [87; 88]. Для решения поставленных задач была сформирована основная группа и две группы сравнения, общее число пациенток, включенных в исследование, составило 160 человек. 2.4 Методы исследования Перед началом программы ВРТ всем пациенткам было проведено полное клинико-лабораторное обследование в соответствии с действовавшим до 2013г приказом МЗ РФ № 67 от 26.02.03г. «О применении вспомогательных репродуктивных технологий в терапии женского и мужского бесплодия»; с 2013г - в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации № 107н "О порядке использования вспомогательных ограничениях к репродуктивных их технологий, применению". противопоказаниях Обследование проводилось и в амбулаторных условиях по месту жительства пациентов или в ФГБУ «НЦАГиП им.В.И. Кулакова» МЗ РФ. 40 Применявшиеся общеклинические и специальные методы исследования представлены в таблице 1. Таблица 1 8-9 день стимуляции 6-7 день стимуляции Даные 2-3 день цикла Дата Перед вступлением в программу ВРТ № 10-11 день стимуляции Методы исследования 1 Анализ крови на ВИЧ, HBsAg, HCV, RW Х Х 2 Группа крови, Rh-фактор Х Х 3 Клинический анализ крови Х Х 4 Биохимический анализ крови Х Х 5 Общий анализ мочи Х Х 6 Коагулограмма Х Х 7 Мазок на степень чистоты из влагалища Х Х 8 ИППП Х 9 Расширенная кольпоскопия Х 10 Цитологическое исследование шейки матки Х 11 Х 12 IgG, IgM к ВПГ, ЦМВ, краснухе, токсоплазме в крови Кариотипирование 13 Спермограмма Х 14 Гормоны крови Х 15 УЗИ молочных желез Х 16 УЗИ щитовидной железы Х Х 41 Продолжение таблицы 1 17 Консультация терапевта Х 18 Флюорография легких Х 19 ЭКГ Х 20 Генотипирование 21 УЗИ органов малого таза Х Х Х Х Х Х 2.4.1 Общеклинические методы исследования Производился сбор анамнеза пациенток, изучался наследственный фактор, аллергоанамнез, перенесенные заболевания, профессиональные вредности, уточнялись особенности менструальной функции (возраст менархе, регулярность, продолжительность цикла, характер менструаций), половой функции (возраст начала половой жизни, количество браков, половых партнеров, методы контрацепции). Тщательно производился сбор анамнестических данных о репродуктивной функции пациенток (количество беременностей, наступивших преждевременных родов, естественным абортов, путем, срочных самопроизвольных и выкидышей, неразвивающихся, внематочных беременностей, наличие осложненных беременностей и родов, наличие живых детей и их развитие), уточнялось, наступали беременности с настоящим или иным половым партнером. Отмечались перенесенные гинекологические заболевания, оперативные вмешательства на половых органах (характер, объем, выполненной операции, течение послеоперационного исследований). Подробно периода, выяснялась результаты история гистологических бесплодия, причины, продолжительность, методы и эффективность проводимого лечения. Особое внимание уделялось ранее проведенным программам ВРТ (дата и место проведения, метод, схема протокола стимуляции функции яичников, 42 количество фолликулов, полученных ооцитов, эмбрионов, исход программы). Объективно оценивали такие параметры, как общее состояние пациентки, тип телосложения, производили расчет индекса массы тела (ИМТ) по формуле: ИМТ = масса тела (кг)/рост2 (м2), давали оценку состояния систем органов дыхания, кровообращения, пищеварения, мочевыделения, нервной системы. При оценке гинекологического статуса пациенток проводился осмотр наружных половых органов, осмотр влагалища и шейки матки в зеркалах, бимануальное исследование, в ходе которого определяли общее состояние влагалища, шейки матки, тела матки, придатков, тазовой брюшины, околоматочной клетчатки, выявляли наличие объемных образований органов малого таза. 2.4.2 Гормональное исследование Перед вступлением в программу ВРТ пациенткам производилась оценка гормонального статуса. Оценка гормонального фона осуществлялась в раннюю фолликулиновую фазу (5-7 день) менструального цикла. В плазме крови исследовалась концентрация таких гормонов, как: ФСГ, АМГ, Е2, пролактина (ПРЛ), ЛГ, кортизола (К), тестостерона, дегидроэпиандростерона сульфата (ДЭА-С), тиреотропного гормона (ТТГ), свободного тироксина (Т4св), соматотропного гормона (СТГ). Концентрацию прогестерона (П) оценивали в плазме крови на 20-22й день менструального цикла в лютеиновую фазу цикла. Нормативные значения концентрации гормонов в плазме крови у женщин фертильного возраста приведены в таблице 2. 43 Таблица 2 Нормативные значения концентрации гормонов в плазме крови у женщин фертильного возраста Гормональное исследование крови (единицы измерения) Нормативные показатели ФСГ (МЕ/л) 2,0 – 10,0 АМГ (нг/мл) 1,0 до 2,5 Е2 (пмоль/л) 150-480 Прогестерон (нмоль/л) лютеиновая фаза цикла Пролактин (мМЕ/л) 16-95 100-500 ЛГ (МЕ/л) 2,3- 15,0 Кортизол (нмоль/л) 100-500 Тестостерон (нмоль/л) 1,0-2,5 ТТГ (мМЕ/л) 1,0-3,8 Т4 св. (нмоль/л) 9,0-20 2.4.3 Ультразвуковое исследование органов малого таза Ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза проводилось всем пациенткам на этапе предварительного обследования на 5-7 день менструального цикла с целью исключения возможных противопоказаний для начала проведения программы ВРТ. Исследование проводилось с использованием ультразвуковых аппаратов компании «BK Medical» (Дания) трансвагинальным датчиком с частотой 3,5-7,5 МГц при опорожненном мочевом пузыре. 44 В ходе исследования оценивались такие параметры, как размеры тела матки, его форма и положение, структура миометрия, толщина и структура эндометрия, размеры яичников, выраженность фолликулярного аппарата, оценивалась степень выраженности спаечного процесса, исключалось наличие объемных образований в полости малого таза. УЗИ органов малого таза проводилось с частотой, предусматриваемой схемой протокола стимуляции функции яичников. Так, при стимуляции суперовуляции исследование по протоколу органов малого с антГнРГ, таза первое эхографическое осуществлялось на 2-3 день менструального цикла, далее ультразвуковой мониторинг фолликулогенеза и роста эндометрия проводился на 6 день стимуляции функции яичников. Затем контроль динамики роста фолликулов и эндометрия осуществлялся с целью возможной коррекции дозы вводимых препаратов и в день назначения триггера овуляции. 2.4.4 Спермиологическое исследование эякулята Оценка показателей сперматогенеза производилась дважды: при предварительном обследовании в рамках подготовки к программе ЭКО и в день трансвагинальной рекомендован пункции соответствующий яичников половой (ТВП). режим. Пациенту Сбор был материала производился в стерильный контейнер. Оценка показателей спермограммы производилась в соответствии с нормативами ВОЗ (2010) (табл. 3) [100]. 45 Таблица 3 Нормативы спермограммы (ВОЗ, 2010) [100] Показатель Нормативы ВОЗ Объем эякулята >2,0 мл pH 7,2-8,0 ед Вязкость 0,1-2,0 см Время разжижения 10-60 мин Лейкоциты <1 000 000 кл/мл Концентрация сперматозоидов >20 млн/мл Общее количество сперматозоидов >40 млн Активноподвижные (А ) >25% Активные и малоподвижные (А + В ) >50% Морфология ≥ 4 % нормальных форм Жизнеспособных 75% или более Агглютинация отсутствует Клетки сперматогенеза 2-4 кл/100 Эритроциты отсутствуют 2.4.5 Специальные методы исследования. Молекулярно-генетические методы исследования Анализ полиморфизма генов в генотипе пациенток производился в лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» МЗ РФ (заведующий – д.б.н. Трофимов Д.Ю.). ДНК (дезоксирибонуклеиновую кислоту) для генотипирования выделяли из образцов периферической крови. Определение замен однонуклеотидных последовательностей проводили с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР представляет собой одну из наиболее важных для 46 генетического исследования технологию, при которой участок ДНК амплифицируется тысячи раз [14]. Пациенткам проводилось генотипирование по указанным локусам: AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] AMHR2 -482 A>G [rs2002555] ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275] VEGFA -634 G>C [rs2010963] ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G) [rs1799889] ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили при помощи детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). ДНК для генотипирования выделяли из образцов периферической крови взятой с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в качестве антикоагулянта. До типирования полученные образцы ДНК хранили в морозильных установках при температуре -20°С. Из полученных образцов крови ДНК выделяли методом Higuchi (1989) с модификациями. Кровь, взятую на ЭДТА в качестве антикоагулянта, объемом 0,5 мл, смешивали в микроцентрифужных пробирках (объемом 1,5 мл) типа Эппендорф с лизирующим раствором (0,5 мл), состоящим из 10 мМ ТрисHCl рН 7,5, 0,32М сахарозы, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100 центрифугировали. Центрифугирование проводилось в течение 1 мин при 10 000 об/мин, супернатант удалялся, осадки клеточных ядер двукратно отмывали соответствующим буфером. В последующем протеолиз проводили 47 в буферном растворе (50 мкл), содержащим 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 50мМ KCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К, 2,5мМ MgCl, в течение 20 минут при 37°С. Инактивация протеиназы К производилась в течение 20 минут при температурном режиме 98°С. Концентрация ДНК определялась на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США) и составляла около 50-100 мкг/мл. Идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов проводили с помощью модифицированного метода «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), с использованием оригинальных олигонуклеотидов [6, 68]. Определение SNPs сначала проводилось ПЦР с праймерами, которые связываются с комплементарными последовательностями, и между циклами нагревания (для денатурации ДНК) и охлаждения (для обеспечения синтеза) синтезируются копии данной области гена [14]. Праймеры были общими для обоих вариантов нуклеотидной последовательности, после чего температуру реакционной смеси для гибридизации матрицы с олигонуклеотидными пробами понижали. Для определения типа последовательности использовали два варианта олигонуклеотидов. В первом случае олигонуклеотиды метили флуорофором, во втором – гасителем флуоресценции. Этот процесс протекал при помощи ферментов, способных соединять нуклеотидные основания и выдерживать необходимые для денатурации температурные режимы [14]. В качестве такого фермента использовалась Taq-полимераза, блокированная специфическими антителами, чтобы предотвратить неспецифический отжиг праймеров и повысить чувствительность тест-систем. В процессе генотипирования использовался один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и два олигонуклеотида сиквенсспецифичных, несущих различные флуорофоры. Соответствующие тому или другому типу последовательности олигонуклеотидные пробы метили флуорофорами, это позволяло определять два типа в одной пробирке. После 48 чего в режиме реального времени измеряли уровень флуоресценции в процессе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Генотип определялся путем анализа кривых плавления. В том случае, если анализируемый образец содержал только один тип нуклеотидной последовательности гена, т.е. гомозиготен по данному полиморфизму, совершенный температура дуплекс, была плавления выше, для чем для пробы, пробы, образующей образующей несовершенный дуплекс. В том случае, если анализировался гетерозиготный образец, содержащий два типа нуклеотидной последовательности, каждый из вариантов проб мог образовать совершенный дуплекс, поэтому температуры плавления были одинаковы. При использовании вышеперечисленных методик стало возможным выявить изменения даже в одном нуклеотидном основании в пределах исследуемого гена [14]. 2.4.6 Протокол стимуляции функции яичников Стимуляция функции яичников у всех пациенток проводилась по стандартному протоколу с антГнРГ в комбинации с рФСГ. Протокол стимуляции суперовуляции начинался со 2-3 дня менструального цикла (т.е. в раннюю фолликулиновую фазу). Доза препаратов рФСГ подбиралась индивидуально от 150 МЕ до 300 МЕ в зависимости от данных клиникогормональных показателей. Динамика роста фолликулов оценивалась при проведении УЗмониторинга. С целью предотвращения паразитарного пика эндогенного ЛГ, при достижении диаметра фолликулов 14-15мм начиналось введение препарата ангГнРг в дозе 0,25мг/сут подкожно. С целью финального дозревания ооцитов, в качестве триггера овуляции при достижении диаметра фолликулов 18 мм, вводился препарат 49 хорионического гонадотропина человека в дозе 5-10 тыс ЕД/сут за 35-36 часов до планируемой трансвагинальной пункции яичников (рис. 4). Рисунок 4. Стандартный протокол с антГнРг 2.4.7 Трансвагинальная пункция яичников Аспирация ооцитов производилась спустя 35-36 часов после инъекции препарата ХГЧ под кратковременным внутривенным наркозом посредством вакуумной аспирации фолликулов под трансвагинальным ультразвуковым мониторингом с использованием одноразовых игл (система Cook IVF). Аспират помещался в подогретые стерильные пробирки, содержащие среду с гепарином (0,5мл), предотвращающую образование кровяных сгустков. Пробирки незамедлительно передавались эмбриологу. Содержимое каждой из доставленных пробирок помещалось в чашку Петри, изучалось на предмет присутствия ооцит-кумулюсного комплекса, оценивалась степень зрелости полученных ооцитов. 50 2.4.8 Метод оплодотворения и культивирования дробящихся эмбрионов in vitro Ооциты идентифицировались сразу же после аспирации фолликулов при помощи диссекционного микроскопа на нагретой поверхности. Постоянно поддерживались необходимые температурные условия и рН среды. Качество и степень зрелости ооцитов оценивались непосредственно после аспирации, клетки преинкубировались in vitro в течение 2-3 часов при температуре 37 С в атмосфере с 5% СО2. Выбор метода оплодотворения главным образом зависел от показателей подвижности сперматозоидов, соотношения числа подвижных и неподвижных сперматозоидов, объема эякулята, наличия агглютинации. Каждый образец спермы подвергался центрифугированию, обработке в специальной среде. В случае нормозооспермии (ВОЗ, 2010) [100] преовуляторные ооциты инсеминировались, т.е. каждый ооцит переносился в каплю, содержащую подвижные сперматозоиды в концентрации примерно 100 000 на 1 мл. До переноса в инсеминационную каплю каждый ооцит изучался, при необходимости производилось иссечение больших скоплений гранулезных клеток, сгустков крови и т.д. При необходимости применялся метод ИКСИ, состоящий из нескольких этапов: 1. подготовка ооцита к инъекции, удаление кумулюса и лучистого венца; культивирование клеток в HEPES-забуферной среде в течение часа до микроманипуляции; 2. выбор сперматозоида и иммобилизация посредством раздавливания жгутика; 3. аспирация выбранного сперматозоида в инъекционную пипетку; 51 4. при помощи микроинструмента производился поворот ооцита с целью локализации полярного тельца; 5. инъекция сперматозоида с аспирированной ооплазмой в ооцит. Оценка оплодотворения производилась на 17-20й час после инсеминации (16-18й час в случае ИКСИ). Цитоплазма клетки исследовалась на предмет наличия 2 пронуклеусов и 2 полярных телец, что свидетельствовало о нормальном оплодотворении. 2.4.9 Перенос эмбрионов в полость матки Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся на 3 и/или 5 сутки после оплодотворения in vitro. В асептических условиях эмбрионы переносились в полость матки в небольшом объеме культуральной среды в просвете гибкого одноразового стерильного катетера. Количество переносимых эмбрионов не превышало двух. 2.4.10 Поддержка посттрансферного периода и диагностика наступления беременности На фоне отсутствующей либо блокированной эндогенной активности яичников методом выбора являлось назначение в посттрансферном периоде программы ЭКО и ПЭ препаратов микронизированного прогестерона или дидрогестерона, с целью поддержания функции желтого тела, секреторной трансформации эндометрия и подготовки его к имплантации, дальнейшей гормональной поддержки ранних сроков беременности [7, с. 574-578]. Начало терапии осуществлялось спустя 24 часа после ТВП яичников, дозировка возрастала с 300 мг/сут (30мг/сут в случае применения дидрогестерона) до 600 мг/сут (60мг/сут при назначении дидрогестерона). Через 14 дней после проведения переноса эмбрионов в полость матки оценивалась концентрация -субъединицы ХГЧ в крови пациенток. 52 УЗИ беременности производилось на 21й день после ПЭ в полость матки с целью визуализации плодного яйца в полости матки. Ультразвуковая диагностика сердцебиения плода проводилась в 5-6 недель беременности. 2.5 Статистический анализ полученных данных Статистическая обработка данных выполнена на компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel», пакета прикладных программ «SPSS Statistics 17.0». Для оценки предварительно характера проводился распределения тест количественных Шапиро-Уилка W. данных Поскольку в большинстве случаев распределение данных было отлично от нормального, использовались методы непараметрической статистики. В качестве меры центральной тенденции количественных признаков была выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки – верхний (H) и нижний квартили (L). Результаты представлены в виде Me (L-H). Для оценки значимости межгрупповых различий нескольких независимых выборок использовали тест Крускала-Уоллиса. В случае двух выборок применялся U-критерий Манна-Уитни для несвязанных совокупностей. Достоверность различий в частоте встречаемости качественных признаков определяли по критерию χ2 с поправкой на правдоподобие. Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону ХардиВайнберга проводили по критерию χ2 в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения. Статистически значимыми уровень значимости). считались различия при р<0,05 (95% Отношение доверительным интервалом (ДИ). шансов (ОШ) приведено с 95% 53 При построении бинарной логистической регрессионной модели использовался метод обратной селекции. Качество приближения регрессионных моделей при каждом последующем шаге оценивалось при помощи функции подобия – отрицательного удвоенного значения логарифма этой функции (-2LL). Оценка качества полученных моделей проводилась с помощью ROC-анализа. Часть дисперсии, объяснимая с помощью логистической регрессии, вычислялась по методу Наделькеркеса. С целью минимизации ошибки выборки применялись строгие критерии отбора пациенток. Оценка воздействующих факторов и исходов едина для всех пациенток. 54 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Соответственно поставленной цели и задачам исследования было обследовано 160 пациенток, обратившихся с целью проведения программы ЭКО и ПЭ по поводу бесплодия, обусловленного трубно-перитонеальным фактором и/или мужским фактором (при отсутствии выраженной патозооспермии), соответствовавших критериям включения/исключения (глава 2 «Материал и методы»). Обследование проводилось по общепринятой схеме перед началом проведения программы ВРТ. У всех пациенток отсутствовали противопоказания для проведения программы ЭКО. Все пациентки были ознакомлены с целью и поставленными задачами исследования, подписали информированное согласие. Принадлежность пациенток к группе определялась в день введения триггера овуляции. Основную группу составили 80 пациенток с нормальным овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции. Нормальный овариальный ответ предполагал получение от 4 до 10 фолликулов. Группа сравнения 1 сформирована из 40 пациенток с «бедным» ответом яичников на стимуляцию (согласно Bologna criteria, ESHRE 2011) [41]. Группу сравнения 2 составили 40 пациенток с «гипер» ответом яичников на стимуляцию (согласно Educational Bulletin ASRM, 2008) [22, 37]. 55 3.1 Клиническая характеристика пациенток, включенных в исследование 3.1.1 Возрастная характеристика пациенток Возраст пациенток, включенных в исследование, выясняли на момент начала проведения программы ЭКО и ПЭ (табл. 4). Таблица 4 Возрастная характеристика пациенток, включенных в исследование Показатель Основная группа Группа №1 Группа №2 (нормальный («бедный» («гипер» овариальный овариальный овариальный ответ) (n=80) ответ) (n=40) ответ) (n=40) Минимум 18,0 21,0 21,0 Максимум 36,0 36,0 36,0 Медиана 33,0 34,0 30,5 P25 процентиль 30,0 30,2 27,0 P75 процентиль 35,0 36,0 33,7 Тест Шапиро- ˂0,0001 ˂0,0001 0,135 Уилка (р) На основании проведенного анализа распределения пациенток, включенных в исследование, в зависимости от возрастных характеристик, выявленных различий между показателями медиан и среднего арифметического, достигнутого уровня значимости (тест Шапиро-Уилка) отмечено, что данные распределены отлично от нормального. Для дальнейшего анализа данных использовались непараметрические статистические методы с определением теста Крускала-Уоллиса. 56 Медиана возраста пациенток основной группы составила 33 года (интерквартильный интервал 30 – 35 лет), в группе сравнения № 1 – 34,0 года (интерквартильный интервал 30,2 - 36 лет), в группе сравнения № 2 – 30,5 лет (интерквартильный интервал 27 – 33,7 лет). Тест Крускала-Уоллиса выявил статистически значимые различия в возрасте между исследуемыми группами (р=0,005), что потребовало дополнительного попарного сравнения групп. Для этого применен тест Манна-Уитни, который не выявил статистически значимых различий между показателями возраста основной группы и группы сравнения № 1 (p=0,212), однако были выявлены статистически значимые различия по возрасту между группами сравнения 1 и 2 (p=0,003) и между основной группой и группой сравнения 2 (р=0,011), а именно увеличение числа пациенток моложе 30 лет в группе 2 (рис. 5). Рисунок 5. Возраст пациенток, включенных в исследование 57 Исходя из полученных данных, был сделан вывод о необходимости дополнительной стратификации пациенток по возрасту при дальнейшем анализе. 3.1.2 Росто-весовая характеристика пациенток Все пациентки, включенные в исследуемые группы, имели женский тип телосложения, правильно развитые вторичные половые признаки. Ростовесовые характеристики этих женщин представлены в таблице 5. Таблица 5 Группа № 2 («гипер» овариальный ответ) (n=40) 43,0 46,0 45,0 Максимум 90,0 95,0 74,0 Медиана 60,0 61,0 56,5 55,0 – 70,7 53,0 – 64,7 кг Интерквартильный 53,0-70,7 интервал Рост, Минимум 150,0 153,0 157,0 Максимум 176,0 176,0 175,0 Медиана 165,0 164,0 164,0 Интерквартильный 162,0–169,7 интервал ИМТ Минимум 17,9 160,2 – 167,7 17,5 160,0168,0 17,0 кг/м2 Максимум 31,1 32,8 27,2 22,1 22,7 21,0 20,4 – 26,7 19,5- 23,9 см Медиана Интерквартильный 19,9-25,2 интервал Тест КрускалаУоллиса, р Группа №1 («бедный» овариальный ответ) (n=40) Вес, Минимум Показатель Основная группа (нормальный овариальный ответ) (n=80) Росто-весовая характеристика пациенток 0,078 0,457 0,093 58 Статистически значимых различий между представленными показателями в группах пациенток выявлено не было (тест КрускалаУоллиса, p>0,05) (табл. 5). 3.1.3 Характеристика менструальной функции пациенток У всех пациенток, включенных в данное исследование, отмечался регулярный менструальный цикл. Данные, характеризующие возраст менархе пациенток, отображены на рисунке (рис. 6). Рисунок 6. Возраст менархе пациенток Для анализа данных применялись непараметрические статистические критерии. Медиана возраста менархе пациенток основной группы составила 13,0 лет (интерквартильный интервал 12 – 14 лет), в группе сравнения № 1 – 13,0 лет (интерквартильный интервал 12,2 - 14 лет), в группе сравнения № 2 – 13,0 лет (интерквартильный интервал 12 – 14 лет). Тест Крускала-Уоллиса не выявил статистически значимых различий между данным показателем в исследуемых группах (р=0,744). 59 Данные, характеризующие длительность менструального цикла пациенток, включенных в исследование, представлены на рисунке (рис. 7). Рисунок 7. Характеристика длительности менструального цикла пациенток, включенных в исследование Распределение длительности менструального цикла в днях в исследуемых группах отлично от нормального (тест Шапиро-Уилка, р=0,0001). Для непараметрические дальнейшего анализа данных применялись статистические критерии. Медиана длительности менструального цикла у пациенток основной группы составила 28,0 дней (интерквартильный интервал 28,0 – 29,7 дней), минимум – 24,0 дня, максимум - 32,0 дня; в группе сравнения № 1 медиана - 28,0 дней (интерквартильный интервал 26,0 – 28,0 дней), минимум – 21,0 день, максимум - 30,0 дней; в группе сравнения № 2 медиана - 29,0 дней (интерквартильный интервал 28,0 – 30,0 дней), минимум – 24,0 дня, 60 максимум - 30,0 дней. При проведении теста Крускала-Уоллиса выявлены статистически значимые различия в длительности менструального цикла у пациенток в исследуемых группах (p=0,0001) (рис. 7). Для попарного сравнения групп применен тест Манна-Уитни, выявивший статистически значимые различия между данным показателем в основной группе и группах сравнения (p=0,027 и р=0,044, соответственно), между группами № 1 и № 2 (p=0,001) (рис. 7). Можно предположить, что данные различия обусловлены критериями отбора групп. Данные, характеризующие длительность менструации пациенток, включенных в исследование, представлены на рисунке (рис. 8). Рисунок 8. Характеристика длительности менструации пациенток Медиана длительности менструации у пациенток основной группы составила 5,0 дней (интерквартильный интервал 4,0 – 5,0 дней), минимум – 3,0 дня, максимум - 7, 0 дней; в группе сравнения № 1 медиана - 4,0 дня (интерквартильный интервал 4,0 – 5,0 дней), минимум – 2,0 дня, максимум 7,0 дней; в группе сравнения № 2 медиана - 5,0 дней (интерквартильный интервал 4,2 – 6,0 дней), минимум – 3,0 дня, максимум - 7,0 дней. 61 Распределение длительности менструации в исследуемых группах отлично от нормального (тест Шапиро-Уилка, р=0,002). Для анализа данных применялись непараметрические статистические методы. Тест КрускалаУоллиса выявил статистически значимые различия в длительности менструации между исследуемыми группами (р=0,002). Для попарного сравнения групп применен тест Манна-Уитни. Статистически значимых различий между данным показателем в основной группе и группах сравнения выявлено не было (p=0,119; р=0,065, соответственно). Однако были выявлены статистически значимые различия в длительности менструации между группами сравнения № 1 и № 2 (p=0,012) (рис. 8). Можно предположить, что данные различия обусловлены критериями отбора групп. 3.1.4 Репродуктивный анамнез пациенток Сведения о репродуктивном анамнезе фиксировались на момент начала проведения программы ЭКО и ПЭ. Средняя продолжительность бесплодия в основной группе составила 6 лет (интерквартильный интервал 3 – 8 лет), минимум – 1,0 год, максимум 17,0 лет; в группе сравнения № 1 средняя продолжительность бесплодия 6,1 год (интерквартильный интервал 3,2 – 8,0 лет), минимум – 1,0 год, максимум - 13,0 лет; в группе сравнения № 2 средняя продолжительность бесплодия - 4,5 лет (интерквартильный интервал 3,0 – 5,0 лет), минимум – 1,0 год, максимум - 14,0 лет. Статистически значимых различий в длительности бесплодия при сравнении трех групп выявлено не было (тест Крускала-Уоллиса, р=0,06). Сведения о типе бесплодия у пациенток представлены на рисунке 9. 62 Рисунок 9. Характеристика пациенток по типу бесплодия При проведении анализа данных о типе бесплодия у обследованных пациенток не были выявлены статистически значимые различия в трех исследуемых группах (2 , p=0,534) (рис. 9). Также оценивался этиологический фактор бесплодия пациенток, включенных в исследование. Данные анализа представлены на рисунке 10. 63 Рисунок 10. Характеристика пациенток по этиологии бесплодия При проведении анализа данных об этиологии бесплодия у обследованных пациенток не были выявлены статистически значимые различия в трех исследуемых группах (2, p=0,258) (рис.10). При наличии мужского фактора бесплодия без выраженной патозооспермии оплодотворение ооцитов производилось методом ИКСИ. Статистически значимых различий между тремя исследуемыми группами по данному показателю выявлено не было (2, р=0,128). У 87 пациенток (54,4%) были проведены программы ЭКО и ПЭ в анамнезе. При этом статистически значимых отличий овариального ответа, имевшегося у пациенток и полученного в данной программе ЭКО и ПЭ, не выявлено (2, p>0,05). 64 В результате проведения предыдущих программ ЭКО и ПЭ беременность наступила у 16,3% пациенток основной группы исследования, 2,5% пациенток группы сравнения № 1, 15% - в группе сравнения № 2. Для пациенток с вторичным типом бесплодия был проведен анализ репродуктивного анамнеза. У пациенток основной группы исследования в 26,7% случаев беременность закончилась родами, в 30% - абортом на раннем сроке беременности, в 26,7% случаев произошло самопроизвольное прерывание беременности, в 46,7% была диагностирована внематочная беременность, у 16,7% пациенток – неразвивающаяся беременность. У пациенток в группе сравнения № 1 роды были в 21,1% случаев, у 42,1% беременность завершилась абортом на раннем сроке, в 31,6% случаев произошло самопроизвольное прерывание беременности, в 21,1% была диагностирована внематочная беременность, у 26,3% пациенток – неразвивающаяся беременность. У пациенток в группе сравнения № 2 роды были в 26,7% случаев, у 26,7% беременность завершилась абортом на раннем сроке, в 33,3% случаев произошло самопроизвольное прерывание беременности, у 27,6% была диагностирована внематочная беременность, у 13,3% пациенток – неразвивающаяся беременность. Статистически значимых различий по данным показателям в трех исследуемых группах выявлено не было (2, р>0,05). 3.1.5 Анамнез перенесенных гинекологических заболеваний пациенток Данные о перенесенных гинекологических заболеваниях у пациенток представлены в таблице 6. 65 Таблица 6 Структура гинекологических заболеваний у пациенток в исследуемых группах Перенесенные гинекологические заболевания Сальпингоофорит Гиперплазия эндометрия Патология шейки матки Основная группа (нормальный овариальный ответ) (n=80) Группа №1 («бедный» овариальный ответ) (n=40) 50 (62,5%) 26 (65%) 21 (52,5%) 2 (2,5%) 0 (0%) 2 (5%) 27 (33,8%) 14 (35%) 12 (30%) 6 (7,5%) 4 (10%) 0 (0%) 27 (33,7%) 7 (17,5%) 10 (25%) Эндометрит ИППП Группа Всего №2 (n=160) («гипер» овариальный ответ) (n=40) 97 (60,6%) 4 (2,5%) 53 (33,1%) 10 (6,3%) 44 (27,5%) 2 с поправкой на правдоподобие (р) 0,466 0,244 0,880 0,05 0,179 Из данных, представленных в таблице, видно, что исследуемые группы пациенток статистически значимо не различались по частоте и структуре гинекологических заболеваний. Так, в основной группе пациенток сальпингоофорит наблюдался в 62,5% случаев, гиперплазия эндометрия – 2,5%, патология шейки матки - 33,8%, эндометрит – 7,5%, ИППП – 33,7%. В группе сравнения № 1 сальпингоофорит наблюдался в 65% случаев, патология шейки матки - 35%, эндометрит – 10%, ИППП – 17,5% гиперплазии эндометрия не наблюдалось ни у одной из пациенток данной группы. В группе сравнения № 2 сальпингоофорит наблюдался в 52,5% случаев, гиперплазия эндометрия – 5%, патология шейки матки - 30%, ИППП – 25%, эндометрита не наблюдалось ни у одной из пациенток данной группы. 66 Данные о перенесенных оперативных вмешательствах на органах малого таза у пациенток представлены в таблице 7. Таблица 7 9 (22,5%) 11 (27,5%) Миомэктомия без вскрытия полости матки 9 (11,3%) 4 (10%) Полипэктомия 13 (16,3%) 7 (17,5%) Диагностическая 16 (20%) гистероскопия Диагностическая 41 (51,3%) лапароскопия Представленные данные 10 (25%) 19 (47,5%) наглядно 44 (27,5%) 2 (5%) 15 (9,4%) 2 с поправкой на правдопо-добие (р) Группа №2 («гипер» овариальный ответ) (n=40) 24 (30%) Всего (n = 160) Группа №1 («бедный» овариальный ответ) (n=40) Тубэктомия Основная группа (нормальный овариальный ответ) (n=80) Перенесенные оперативные вмешательства на органах малого таза Структура оперативных вмешательств на органах малого таза у пациенток в исследуемых группах 0,681 0,497 25 (15,6%) 35 9 (22,5%) (21,9%) 81 21 (52,5%) (50,6%) 0,802 демонстрируют отсутствие 5 (12,5%) 0,819 0,894 статистически значимых различий по структуре перенесенных оперативных вмешательств у пациенток в исследуемых группах (р>0,05). 3.1.6 Гормональный профиль пациенток, включенных в исследование, и его предиктивная точность в определении овариального ответа Уровень гормонов в плазме крови пациенток оценивался в раннюю фолликулиновую фазу (на 5-7 день) менструального цикла, уровень 67 прогестерона – в лютеиновую фазу цикла. Данные гормонального фона пациенток представлены в таблице 8. Таблица 8 ФСГ (МЕ/л) АМГ (нг/мл) Эстрадиол (пмоль/л) Прогестерон (нмоль/л) лютеиновая фаза цикла Пролактин (мМЕ/л) ЛГ (МЕ/л) Тестостерон (нмоль/л) ТТГ (мМЕ/л) Т4 св. (нмоль/л) 6, 77 (5,4 – 8,17) 1,4 (1,06 – 2,35) 8,88 (6,9 – 11,1) 0,53 (0,31 – 0,89) 5,88 (4,8 – 6,98) 2,75 (1,45 – 3,78) Тест КрускалаУоллиса (р) Группа № 2 («гипер» овариальный ответ) (n=40) Группа №1 («бедный» овариальный ответ) (n=40) Основная группа (нормальный овариальный ответ) (n=80) Гормоны (единицы измерения) Гормональный профиль пациенток, включенных в исследование 0,0001 0,0001 120,0 123,0 103,5 (66,12 – 160,0) (73,25 – 242,5) (73,0 – 167,25) 0,502 30,8 (17,92 – 40,0) 29,0 (14,0 – 43,0) 38,3 (21,5 – 48,75) 0,230 207,0 (131,25 – 375, 5) 4,94 (3,54 – 6,33) 270,5 (107,75 – 380,25) 4,85 (3,38 – 6,44) 206,0 (113,1 – 334,0) 0,685 5,34 (3,65 – 6,38) 0,538 0,8 (0,6 – 1,93) 0,94 (0,8 – 1,44) 1,23 (0,79 – 1,95) 0,054 1,6 (1,2 – 2,08) 12,25 (10,93 – 14,95) 1,48 (1,1 – 2,35) 13,15 (11,63 – 14,1) 1,69 (0,96 – 2,14) 13,2 (12,0 – 14,67) 0,973 0,713 68 Для анализа данных применялись непараметрические статистические критерии. При проведении теста Крускала-Уоллиса выявлены статистически значимые различия уровней ФСГ и АМГ в исследуемых группах (р=0,0001). Так, при оценке уровня ФСГ (МЕ/л) медиана у пациенток основной группы составила 6,77; интерквартильный интервал 5,4 – 8,17; минимум – 2,0; максимум - 13, 0; в группе сравнения № 1 медиана уровня ФСГ (МЕ/л) составила 8,88; интерквартильный интервал 6,9 – 11,1; минимум – 3,0; максимум - 32, 0; в группе сравнения № 2 медиана уровня ФСГ (МЕ/л) составила 5,88; интерквартильный интервал 4,8 – 6,98; минимум – 2,0; максимум - 10, 0. При оценке уровня АМГ (нг/мл) медиана у пациенток основной группы составила 1,4; интерквартильный интервал 1,06 – 2,35; минимум – 0,1; максимум - 13, 0; в группе сравнения № 1 медиана уровня АМГ (нг/мл) составила 0,53; интерквартильный интервал 0,31 – 0,89; минимум – 0,1; максимум - 6, 0; в группе сравнения № 2 медиана уровня АМГ (нг/мл) составила 2,75; интерквартильный интервал 1,45 – 3,78; минимум – 1,0; максимум - 16, 0. Можно предположить, что данные различия обусловлены критериями отбора групп. Далее проведен анализ предиктивной точности клинико-гормональных маркеров при прогнозировании овариального ответа для данной выборки пациенток. Прогноз нормального овариального ответа на стимуляцию суперовуляции, основанный на клинико-гормональных параметрах, исходно ожидаемый у 82 пациенток, не оправдался у 8 пациенток (9,7%), у которых развился «бедный» ответ, а у 12 пациенток (14,6%) непредвиденно развился «гипер» овариальный ответ. 69 Таким образом, примерно в 1 из 10 случаев предикция, основанная исключительно на клинико-гормональных параметрах, не позволяет точно прогнозировать овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции. Резюмируя полученные данные, представляется перспективным и актуальным поиск новых предикторов, позволяющих повысить точность прогнозирования овариального ответа. 3.2 Ассоциация овариального ответа с особенностями оогенеза и эмбриогенеза На следующем этапе исследования был проведен анализ ассоциации количества фолликулов со степенью зрелости полученных ооцитов. У всех пациенток, у которых не получены зрелые ооциты, число фолликулов не превышало 10. При созревании менее 4 фолликулов в 7,3% случаев получены только незрелые ооциты, в 22% случаев отсутствовали ооциты, пригодные для оплодотворения. При получении большего количества фолликулов такие риски составляют всего 0,8% (рис. 11). Согласно проведенному ROC-анализу (рис. 12), количество фолликулов является предиктором степени зрелости ооцитов. Площадь под кривой составила 0,94 (0,88-1,00). При критическом значении, равном 4 фолликулам, чувствительность и специфичность модели составили 90% и 79%, соответственно. 70 Качество полученных ооцитов Рисунок 11. Ассоциация количества фолликулов с качеством ооцитов Рисунок 12. ROC-анализ зависимости степени зрелости ооцитов от количества фолликулов 71 Далее был проведен поиск связи качества эмбрионов со степенью зрелости ооцитов, результат представлен в таблице 9. Таблица 9 Зависимость качества эмбрионов от степени зрелости ооцитов Качество эмбрионов Класс А и В Класс С Степень зрелости ооцитов Только зрелые Зрелые и Только ооциты незрелые незрелые ооциты ооциты отсутствуют 4 (5%) 5 (7%) 4 (100%) присутствуют 74 (95%) 63 (93%) 0 (0%) отсутствуют 47 (60%) 46 (68%) 3 (75%) присутствуют 31 (40%) 22 (32%) 1(25%) При получении только зрелых ооцитов в 95% случаев получены эмбрионы класса А и В, при получении из одного пула и зрелых, и незрелых ооцитов в 93% случаев эмбрионы были класса А и В, в то время как при аспирации только незрелых ооцитов, эмбрионы высокого качества (класс А и В) получены не были (табл. 9). Таким образом, овариальный ответ является ключевым фактором, определяющим возможность получения ооцитов, пригодных для оплодотворения. Критическим пороговым значением является созревание 4 фолликулов, так как при получении меньшего количества резко возрастает риск отсутствия ооцитов, пригодных для проведения дальнейших этапов программы. Резюмируя полученные данные, поиск новых маркеров, прогнозирующих особенности фолликулогенеза, оогенеза и эмбриогенеза, представляется актуальным и перспективным. 72 3.3 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с типом овариального ответа на стимуляцию суперовуляции В связи полиморфизма с вышесказанным исследуемых генов был с проведен типом анализ ассоциации овариального ответа. Распределение частот аллелей и генотипов для изучаемого полиморфизма генов соответствовало закону Харди-Вайнберга (табл. 10). Для оценки ассоциации генотипа пациенток с типом овариального ответа были проанализированы распределения аллелей и генотипов исследуемых генов среди трех групп пациенток. Таблица 10 Группа № 2 («гипер» овариальный ответ) (n=40) 28 (70,0%) 24 (60,0%) 21 (26,3%) 11 (27,5%) 13 (32,5%) 2 (2,5%) 1 (2,5%) 3 (7,5%) A/A 61 (76,3%) 29 (72,5%) 28 (70,0%) A/G 16 (20,0%) 9 (22,5%) 12 (30,0%) G/G 3 (3,8%) 2 (5,0%) 0 (0%) AMHR2 -482 A>G [rs2002555] Различия распределения генотипов между группами 2 с поправкой на правдоподобие (р) Группа №1 («бедный» овариальный ответ) (n=40) 57 (71,3%) Генотип T/T AMH 146 G>T T/G (Ile49Ser) [rs10407022] G/G Полиморфизм Основная группа (нормальный овариальный ответ) (n=80) Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с типом овариального ответа 0,621 0,375 73 Продолжение таблицы 10 ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] T/T 25 (31,3%) 10 (25,0%) 13 (32,5%) T/C 41 (51,3%) 23 (57,5%) 18 (45,0%) C/C 14 (17,5%) 7 (17,5%) 9 (22,5%) ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] A/A 37 (46,3%) 14 (35,0%) 18 (45,0%) A/G 35 (43,8%) 22 (55,0%) 15 (37,5%) G/G 8 (10,0%) 4 (10,0%) 7 (17,5%) FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] A/A 29 (36,3%) 14 (35,0%) 9 (22,5%) A/G 39 (48,8%) 16 (40,0%) 18 (45,0%) G/G 12 (15,0%) 10 (25,0%) 13 (32,5%) LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275] LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] G/G 39 (48,8%) 15 (38,5%) 13 (32,5%) A/G 29 (36,3%) 20 (51,3%) 22 (55,0%) 0,291 A/A G/G A/G 12 (15,0%) 1 (1,3%) 6 (7,5%) 4 (10,3%) 0 (0%) 3 (7,5%) 5 (12,5%) 0 (0%) 4 (10,0%) 0,805 A/A 73 (91,3%) 37 (92,5%) 36 (90,0%) C/C 9 (11,3%) 5 (12,5%) 3 (7,5%) G/C 35 (43,8%) 17 (42,5%) 17 (42,5%) G/G 36 (45,0%) 18 (45,0%) 20 (50,0%) A/A 10 (12,5%) 4 (10,0%) 6 (15,0%) G/A 32 (40,0%) 16 (40,0%) 20 (50,0%) G/G 38 (47,5%) 20 (50,0%) 14 (35,0%) 28 (35,0%) 7 (17,5%) 11 (27,5%) 33 (41,3%) 23 (57,5%) 23 (57,5%) 19 (23,8%) 10 (25,0%) 6 (15,0%) VEGFA -634 G>C [rs2010963] ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] SERPINE1 4G/4G (PAI-1) 5G/4G -675(5G>4G) [rs1799889] 5G/5G 0,832 0,469 0,029 0,947 0,668 0,164 74 При проведении анализа выявлена ассоциация полиморфизма FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) с типом овариального ответа. Наличие генотипа G/G предрасполагает к «гипер» ответу (2 с поправкой Бонферрони, р=0,02; ОШ=3,49 (95% ДИ 1,3-11,6)) (рис. 13). Рисунок 13. Ассоциация полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) с типом овариального ответа Далее у пациенток носительниц генотипа G/G полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) (n=13), в группе с «гипер» ответом проанализирован базальный уровень ФСГ и АМГ. Обнаружено, что у 10 пациенток с данным генотипом исходно по гормональным параметрам прогнозировался нормальный овариальный ответ. Таким образом, у пациенток носительниц генотипа G/G с гормональным фоном, позволяющим прогнозировать нормальный овариальный ответ на стимуляцию 75 суперовуляции, в 76% случаев развился «гипер» ответ яичников. Это свидетельствует о том, что предикция овариального ответа, основанная только на клинико-гормональных маркерах недостаточно информативна. По данным литературы, предположительно, ассоциация полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) с типом овариального ответа связана с влиянием генотипа на базальный уровень гормонов крови. Так, в проведенном Yao et al. мета-анализе у пациенток с генотипом А/А полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) зафиксирован более высокий уровень базального ФСГ [62]. Нами проведен анализ зависимости базального уровня ФСГ и АМГ в крови от генотипа FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), результаты которого представлены на рисунках (рис. 14; рис. 15). Рисунок 14. Базальный уровень ФСГ в зависимости от генотипа FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) Тест Крускала-Уоллиса не выявил статистически значимых различий уровня ФСГ в крови в зависимости от генотипа (р=0,849) (рис. 14). 76 Рисунок 15. Базальный уровень АМГ в зависимости от генотипа FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) Также не обнаружено статистически значимых различий уровня АМГ в крови в зависимости от генотипа (тест Крускала-Уоллиса, р=0,620) (рис. 15). Таким образом, полиморфизм гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) не оказывает статистически значимого влияния на базальный уровень гормонов в крови. Возможно, связь с типом овариального ответа объясняется разным уровнем экспрессии рецептора ФСГ на клетках гранулезы и, как следствие, повышением чувствительности к препаратам ФСГ. Аналогичное предположение высказано в работе Desai et al. [46]. Полиморфизм гена FSHR является важным прогностическим фактором исхода стимуляции функции яичников и может дополнить арсенал имеющихся маркеров. 77 3.4 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с качеством ооцитов Был проведен поиск генетических маркеров, ассоциированных со степенью зрелости получаемых ооцитов. Для оценки ассоциации генотипа пациентки и качества полученных у нее ооцитов проанализировано распределение генотипов исследуемых генов в зависимости от наличия зрелых ооцитов (табл. 11), незрелых ооцитов (табл. 12), дегенеративных ооцитов (табл. 13). Из анализа были исключены 2 пациентки с «бедным» овариальным ответом, у которых не было получено ооцитов. Таблица 11 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с наличием зрелых ооцитов 4 (28,6%) 41 (28,1%) 0,593 G/G 0 (0%) 6 (4,1%) 0,572 AMHR2 -482 A>G [rs2002555] A/A 11 (78,6%) 107 (73,3%) 0,473 A/G G/G 3 (21,4%) 0 (0%) 34 (23,3%) 5 (3,4%) 0,588 0,629 ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] T/T 3 (21,4%) 45 (30,8%) 0,346 T/C C/C 9 (64,3%) 2 (14,3%) 73 (50,0%) 28 (19,2%) 0,230 0,490 AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] Генотип T/G Полиморфизм T/T Различия между Зрелые ооциты группами, 2 с поправкой на правдоподобие (р) Отсутству- ПрисутствуДля Распределеют ют генотипа, ние р генотипов, р 10 (71,4%) 99 (67,8%) 0,521 0,570 0,612 0,587 78 Продолжение таблицы 11 ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] A/A 4 (28,6%) 65 (44,5%) 0,194 A/G 8 (57,1%) 64 (43,8%) 0,249 G/G A/A 2 (14,3%) 6 (42,9%) 17 (11,6%) 46 (31,5%) 0,517 0,279 A/G 3 (21,4%) 70 (47,9%) 0,050 G/G 5 (35,7%) 30 (20,5%) 0,164 LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275] G/G 9 (69,2%) 58 (39,7%) 0,039 A/G 4 (30,8%) 67 (45,9%) 0,226 A/A C/C 0 (0%) 4 (28,6%) 21 (14,4%) 13 (8,9%) 0,147 0,045 G/C 3 (21,4%) 66 (45,2%) 0,073 G/G A/A 7 (50%) 4 (28,6%) 67 (45,9%) 16 (11,0%) 0,492 0,078 G/A G/G 4 (28,6%) 6 (42,9%) 64 (43,8%) 66 (45,2%) 0,208 0,548 1 (0,7%) 12 (8,2%) 133 (91,1%) 0,913 0,711 0,738 44 (30,1%) 0,174 73 (50,0%) 0,410 29 (19,9%) 0,056 VEGFA -634 G>C [rs2010963] ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] G/G 0 (0%) LHCGR 872 A>G A/G 1 (7,1%) (Asn291Ser) A/A 13 (92,9%) [rs12470652] SERPINE1 4G/4G 2 (14,3%) (PAI-1) 5G/4G 6 (42,9%) -675(5G>4G) [rs1799889] 5G/5G 6 (42,9%) 0,501 0,134 0,042 0,068 0,202 0,902 0,138 При анализе распределения частоты генотипов исследуемых генов в зависимости от качества ооцитов выявлена статистически значимая ассоциация полиморфизма гена LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) со степенью зрелости ооцитов. Так, генотип G/G повышает риск отсутствия зрелых 79 ооцитов (двухсторонний точный тест Фишера, р=0,039; ОШ= 3,41( 95% ДИ 1,05-11,1)) (рис. 16). Рисунок 16. Степень зрелости полученных ооцитов в зависимости от полиморфизма гена LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) Аналогичная ассоциация выявлена и с генотипом С/С гена VEGFA -634 G>C, у носительниц которого также зафиксирован высокий риск получения только незрелых ооцитов (двухсторонний точный тест Фишера, р=0,040; ОШ= 4,09 ( 95% ДИ 1,3-11,71)) (рис. 17). 80 Рисунок 17. Степень зрелости полученных ооцитов в зависимости от полиморфизма гена VEGFA -634 G>C При сочетании двух неблагоприятных генотипов вероятность получения зрелых ооцитов составила 62,5%, тогда как для остальных сочетаний генотипов данная вероятность составила 93,4% (двухсторонний точный тест Фишера, р=0,019; ОШ= 0,12 (95% ДИ 0,03–0,52)) (рис. 18). Вероятность получения зрелых ооцитов, % 81 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% A/А A/G C/C G/G G/C G/G VEGFA: -634 G>C Рисунок 18. Вероятность получения зрелых ооцитов в зависимости от сочетания генотипов LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и VEGFA -634 G>C С целью создания комплексного многофакторного прогностического алгоритма проведено математическое моделирование. Построена бинарная логистическая регрессионная модель, в которой исходом была переменная, характеризующая получение зрелых ооцитов, предикторами – полиморфизм генов AMH 146 G>T (Ile49Ser); AMHR2 -482 A>G; ESR1 –397 T>C [PvuII]; ESR1 –351 A>G [XBaI]; FSHR 2039 G>A (Ser680Asn); LHCGR 935 A>G (Asn312Ser); VEGFA -634 G>C; ESR2 G>A [RsaI]; LHCGR 872 A>G (Asn291Ser); SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G). Проведенный анализ позволил прогнозировать получение зрелых ооцитов на основании генотипа пациентки. Анализ был проведен в семь этапов. Сначала были вовлечены все генотипы с последующим исключением наименее значимых. 82 На завершающей стадии анализа остались четыре переменные, а именно: полиморфизм генов FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), SERPINE1 (PAI1) -675(5G>4G), ESR2 G>A [RsaI] и VEGFA -634 G>C. Для последней модели значение -2LL оказалось равным 67,05; разность между значением -2LL начальной и конечной модели составила 22,959 (р=0,003). Таким образом, после исключения всех незначимых переменных, произошло значительное улучшение начальной модели. Часть дисперсии, объяснимая с помощью вышеперечисленных четырех генотипов, составляет 31,1 % (вычислено по методу Наделькеркеса). Таким образом, уравнение регрессия для последней модели имело вид (1): p=1/(1+e-z), (1) где р – вероятность получения зрелых ооцитов; Z= - 0,21 + 2,518* FSHR A/G + 0,313* FSHRG/G - 0,899* PAI-15G/4G - 2,607* PAI-15G/5G + 2,544* ESR2A/G + 2,065* ESR2A/A + 2,027* VEGFAG/C + 0,021* VEGFAG/G Точность прогнозирования получения зрелых ооцитов с использованием представленных четырех генотипов составила 93,1%. Прогноз оправдывается на 99,3% для зрелых ооцитов и на 23,1% для незрелых ооцитов. В заключение был проведен ROC-анализ для валидации полученной модели (1) (рис 19). Значение AUC для данной модели составило 0,827, 95 % доверительный интервал от 0,7 до 0,955 (рис.19). 83 Рисунок 19. ROC-анализ ассоциации полиморфизма генов FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G), ESR2 G>A [RsaI] и VEGFA 634 G>C с получением зрелых ооцитов (sensitivity – чувствительность; specificity - специфичность) Далее проведен поиск ассоциации полиморфизма исследуемых генов с наличием незрелых ооцитов (табл.12). Таблица 12 AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] Незрелые ооциты Генотип Полиморфизм Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с наличием незрелых ооцитов T/T T/G G/G Отсутствуют Присутствуют 57 (64,8%) 28 (31,8%) 3 (3,4%) 52 (72,2%) 17 (23,6%) 3 (4,2%) Различия между группами, 2 с поправкой на правдоподобие (р) Для Распредегенотипа, ление р генотипо в, р 0,202 0,166 0,560 0,511 84 Продолжение таблицы 12 AMHR2 -482 A>G [rs2002555] ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275] VEGFA -634 G>C [rs2010963] ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G) [rs1799889] А/А 59 (67,0%) 59 (81,9%) A/G 26 (29,5%) 11 (15,3%) 0,025 0,025 G/G 3 (3,4%) 2 (2,8%) 0,594 T/T 23 (26,1%) 25 (34,7%) 0,157 T/C C/C 49 (55,7%) 16 (18,2%) 33 (45,8%) 14 (19,4%) 0,140 0,498 A/A 34 (38,6%) 35 (48,6%) 0,134 A/G 44 (50,0%) 28 (38,9%) 0,106 G/G A/A 10 (11,4%) 30 (34,1%) 9 (12,5%) 22 (30,6%) 0,507 0,381 0,088 0,416 0,359 0,460 A/G G/G G/G 42 (47,7%) 16 (18,2%) 30 (34,5%) 31 (43,1%) 19 (26,4%) 37 (51,4%) 0,334 0,145 0,023 A/G 42 (48,3%) 29 (40,3%) 0,198 A/A C/C G/C G/G A/A G/A G/G 15 (17,2%) 8 (9,1%) 38 (43,2%) 42 (47,7%) 12 (13,6%) 31 (35,2%) 45 (51,1%) 6 (8,3%) 9 (12,5%) 31 (43,1%) 32 (44,4%) 8 (11,1%) 37 (51,4%) 27 (37,5%) 0,077 0,329 0,558 0,400 0,408 0,029 0,059 G/G 0 (0%) 1 (1,4%) 0,450 A/G A/A 7(8,0%) 81 (92,0%) 6 (8,3%) 65 (90,3%) 0,577 0,452 4G/4G 26 (29,5%) 20 (27,8%) 0,473 5G/4G 44 (50,0%) 5G/5G 18 (20,5%) 35 (48,6%) 17 (23,6%) 0,494 0,385 0,058 0,770 0,118 0,445 0,888 85 Генотипическая частота аллеля А полиморфизма гена AMHR2 -482 A>G была выше в группе пациенток, у которых получены незрелые ооциты (90% против 82%, р=0,045). Носительство генотипа А/А более чем в 2 раза повышает риск получения незрелых ооцитов (двухсторонний точный тест Фишера, р=0,025; ОШ=2,23 (95% ДИ 1,1-4,3)). Полученные данные четко свидетельствуют о наличии генетических факторов, определяющих степень зрелости полученных ооцитов. При этом наличие незрелых ооцитов ассоциировано с повышенным риском получения дегенеративных форм: 18,1% против 6,4% при получении всех зрелых ооцитов (р=0,042; ОШ=3,2 (95% ДИ 1,1-9,5)). Проведенный поиск генетических факторов, ассоциированных с риском получения дегенеративных ооцитов, не выявил дополнительных факторов риска, кроме полиморфизма гена LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), который, как было показано выше, ассоциирован с риском получения незрелых ооцитов (табл. 13). Таблица 13 AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] Дегенеративные ооциты Генотип Полиморфизм Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с наличием дегенеративных ооцитов отсутствуют присутству ют T/T 94 (67,6%) 15 (71,4%) T/G 39 (28,1%) 6 (28,6%) G/G 6 (4,3%) 0 (0%) Различия между группами, 2 с поправкой на правдоподобие (р) Для Распреде генотипа, ление р генотипо в, р 0,470 0,421 0,573 0,424 86 Продолжение таблицы 13 A/A 101 (72,7%) 17 (81,0%) 0,304 A/G 33 (23,7%) 4 (19,0%) 0,436 0,416 G/G T/T T/C 5 (3,6%) 43 (30,9%) 71 (51,1%) 0 (0%) 5 (23,8%) 11 (52,4%) 0,490 0,350 0,549 0,725 C/C 25 (18,0%) 5 (23,8%) 0,353 A/A A/G G/G 60 (43,2%) 65 (46,8%) 14 (10,1%) 9 (42,9%) 7 (33,3%) 5 (23,8%) 0,586 0,180 0,080 0,208 A/A A/G G/G 43 (30,9%) 66 (47,5%) 30 (21,6%) 9 (42,9%) 7 (33,3%) 5 (23,8%) 0,200 0,164 0,505 0,439 G/G 55 (39,9%) 12 (57,1%) 0,105 A/G 62 (44,9%) 9 (42,9%) 0,525 A/A C/C G/C G/G A/A G/A G/G 21 (15,2%) 16 (11,5%) 60 (43,2%) 63 (45,3%) 18 (12,9%) 58 (41,7%) 63 (45,3%) 0 (0%) 1 (4,8%) 9 (42,9%) 11 (52,4%) 2 (9,5%) 10 (47,6%) 9 (42,9%) 0,070 0,311 0,586 0,355 0,492 0,390 0,512 LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] G/G 1 (0,7%) 0 (0%) 0,869 A/G 13 (9,4%) 0 (0%) 0,149 A/A 125 (89,9%) 21 (100,0%) 0,127 SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G) [rs1799889] 4G/4G 42 (30,2%) 4 (19,0%) 0,217 5G/4G 68 (48,9%) 11 (52,4%) 0,475 5G/5G 29 (20,9%) 6 (28,6%) 0,294 AMHR2 -482 A>G [rs2002555] ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275] VEGFA -634 G>C [rs2010963] ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] 0,028 0,563 0,838 0,126 0,500 87 Аллель G полиморфизма гена LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) ассоциирован с риском получения дегенеративных ооцитов у пациенток при проведении программы ЭКО (генотипическая частота составила 79% и 62%, р=0,04) (табл. 13). Согласно аутосомно-доминантной модели наличие аллеля G в генотипе пациентки предрасполагает к получению дегенеративных ооцитов, однако данные различия не достигали статистической значимости (р=0,07; ОШ=7,87 (95% ДИ 0,5-12,5)). Так как проведенный анализ показал ассоциацию генотипа пациенток с качеством полученных ооцитов, была создана модель, позволяющая прогнозировать степень зрелости получаемых ооцитов. Проведенный анализ позволил выявить два независимых генетических предиктора степени зрелости получаемых ооцитов: генотип LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и генотип VEGFA -634 G>C (рис. 20). Рисунок 20. Степень зрелости полученных ооцитов в зависимости от сочетания генотипов LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и VEGF -634 G>C С целью создания комплексного многофакторного прогностического алгоритма проведено математическое моделирование. Построена бинарная логистическая регрессионная модель, в которой исходом была переменная, 88 характеризующая получение незрелых ооцитов, предикторами – полиморфизм генов AMH 146 G>T (Ile49Ser); AMHR2 -482 A>G; ESR1 –397 T>C [PvuII]; ESR1 –351 A>G [XBaI]; FSHR 2039 G>A (Ser680Asn); LHCGR 935 A>G (Asn312Ser); VEGFA -634 G>C; ESR2 G>A [RsaI]; LHCGR 872 A>G (Asn291Ser); SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G). Проведенный анализ позволил выявить получение незрелых ооцитов на основании генотипа пациентки. Анализ был проведен в семь этапов, сначала были вовлечены все генотипы, затем исключены наименее значимых. На завершающей стадии анализа остались четыре переменные, а именно: полиморфизм генов AMHR2 -482 A>G, ESR2 G>A [RsaI], LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), LHCGR 872 A>G (Asn291Ser). Для последней модели значение -2LL оказалось равным 198,613; разность между значением -2LL начальной и конечной модели составила 20,391 (р=0,009). Таким образом, после исключения всех незначимых переменных, произошло значительное улучшение начальной модели. Часть дисперсии, объяснимая с помощью вышеперечисленных четырех генотипов, составляет 16,1 % (вычислено по методу Наделькеркеса). Таким образом, уравнение регрессия для последней модели имело вид (2): p=1/(1+e-z), (2) где р – вероятность получения незрелых ооцитов; Z = 23,601 – 1,131* AMHR2A/G – 0,672* AMHR2G/G + 0,932* ESR2А/А + 0,168* ESR2A/G – 0,606* LHCGR (935 A>G)A/G – 1,435* LHCGR (935 A>G)A/A – 23,065* LHCGR (872 A>G)A/G – 23,627* LHCGR (872 A>G)A/A Точность прогнозирования получения незрелых ооцитов с использованием полиморфизма генов AMHR2 -482 A>G, ESR2 G>A [RsaI], 89 LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) составила 68,6 %. Прогноз оправдывается на 62,5% для зрелых ооцитов и на 73,6% для незрелых ооцитов. В заключение был проведен ROC-анализ для валидации полученной модели (2) (рис.21). Значение AUC для данной модели составило 0,704, 95 % доверительный интервал от 0,622 до 0,786 (рис. 21). Рисунок 21. ROC-анализ ассоциации полиморфизма генов AMHR2 -482 A>G, ESR2 G>A [RsaI], LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) с получением незрелых ооцитов (sensitivity – чувствительность; specificity - специфичность) Полученные ассоциированных данные с указывают качеством на наличие полученных генотипов, ооцитов, а четко указанный полиморфизм генов может быть независимым предиктором степени зрелости ооцитов в программах ВРТ. 90 3.5 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с качеством эмбрионов Для оценки ассоциации генотипа пациенток с качеством эмбрионов были проанализированы распределения аллелей и генотипов исследуемых генов в зависимости от наличия эмбрионов высокого качества (класса А и В) (табл. 14) и класса С (табл. 15). Таблица 14 Эмбрионы класса А и В Генотип Полиморфизм Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с наличием эмбрионов класса АиВ Отсутству- Присутствуют ют Различия между группами, 2 с поправкой на правдоподобие (р) Для Распрегенотипа, деление р генотипов, р 0,541 0,939 0,517 AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] AMHR2 -482 A>G [rs2002555] T/T 6 (66,7%) 93 (67,9%) T/G 2 (22,2%) 39 (28,5%) G/G A/A A/G 1 (11,1%) 7 (77,8%) 1 (11,1%) 5 (3,6%) 100 (73,0%) 33 (24,1%) 0,732 0,799 0,599 G/G 1 (11,1%) 4 (2,9%) 0,545 ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] T/T T/C C/C 2 (22,2%) 6 (66,7%) 1 (11,1%) 43 (31,4%) 67 (48,9%) 27 (19,7%) 0,463 0,179 0,572 A/A 3 (33,3%) 62 (45,3%) 0,256 A/G G/G 5 (55,6%) 1 (11,1%) 59 (43,1%) 16 (11,7%) 0,262 0,739 0,753 0,344 0,392 91 Продолжение таблицы 14 FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275] VEGFA -634 G>C [rs2010963] ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] A/A A/G G/G 3 (33,3%) 4 (44,4%) 2 (22,2%) 43 (31,4%) 66 (48,2%) 28 (20,4%) 0,478 0,174 0,285 0,263 G/G A/G A/A 44 (44,4%) 4 (44,4%) 1 (11,1%) 54 (39,4%) 63 (46,0%) 20 (14,6%) 0,104 0,491 0,312 0,145 C/C G/C G/G A/A G/A 1 (11,1%) 1 (11,1%) 7 (77,8%) 1 (11,1%) 3 (33,3%) 12 (8,8%) 65 (47,4%) 60 (43,8%) 15 (10,9%) 61 (44,5%) 0,074 0,011 0,047 0,171 0,257 G/G 5 (55,6%) 61 (44,4%) 0,823 LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G) [rs1799889] G/G A/G A/A 0 (0%) 1 (11,1%) 8 (88,9%) 1 (0,7%) 11 (8,0%) 125 (91,2%) 0,856 0,586 0,630 4G/4G 2 (22,2%) 42 (30,7%) 0,224 5G/4G 5 (55,6%) 68 (49,6%) 0,526 5G/5G 2 (22,2%) 27 (19,7%) 0,170 0,012 0,271 0,852 0,205 Проведенный анализ позволил выявить генотипы, позволяющие прогнозировать получение качественных эмбрионов. Построена бинарная логистическая регрессионная модель, в которой исходом была переменная, характеризующая получение эмбрионов класса А и В, предикторами – полиморфизм генов AMH 146 G>T (Ile49Ser); AMHR -482 A>G; ESR1 –397 T>C [PvuII]; ESR1–351 A>G [XBaI]; FSHR 2039 G>A (Ser680Asn); LHCGR 935 A>G (Asn312Ser); VEGFA -634 G>C; ESR2 G>A [RsaI]; LHCGR 872 A>G (Asn291Ser); SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G). 92 Анализ был проведен в девять этапов. Сначала были вовлечены все генотипы с последующим исключением наименее значимых. На завершающей стадии анализа остались четыре переменные, а именно: полиморфизм генов FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G), ESR2 G>A [RsaI] и VEGFA -634 G>C. Для последней модели значение -2LL оказалось равным 105,629; разность между значением -2LL начальной и конечной модели составила 22,201 (р=0,005). Таким образом, после исключения всех незначимых переменных, произошло значительное улучшение начальной модели. Часть дисперсии, объяснимая с помощью вышеперечисленных четырех генов, составляет 23,6 % (вычислено по методу Наделькеркеса). Таким образом, уравнение регрессии для последней модели имело вид (3): p=1/(1+e-z), (3) где р – вероятность получения эмбрионов класса А и В; Z= 0,212 + 1,466* FSHRA/G + 0,208* FSHRG/G – 0,701* PAI-15G/4G – 1,988* PAI-15G/5G + 1,831* ESR2A/G + 1,249* ESR2A/A + 1,895* VEGFAG/C – 0,108* VEGFAG/G Точность прогнозирования качества эмбрионов с использованием данных четырех генов составила 87,4 %. Прогноз оправдывается на 99,3% для эмбрионов класса А и В. В заключение был проведен ROC-анализ для валидации полученной модели (3). Значение AUC для данной модели составило 0,774, 95 % доверительный интервал от 0,671 до 0,877 (рис. 22). 93 Рисунок 22. ROC-анализ ассоциации полиморфизма генов FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G), ESR2 G>A [RsaI] и VEGFA -634 G>C с получением эмбрионов класса А и В (sensitivity – чувствительность; specificity - специфичность) Анализ ассоциации полиморфизма генов с наличием эмбрионов класса С представлен в таблице 15. 94 Таблица 15 AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] AMHR2 -482 A>G [rs2002555] ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275] VEGFA -634 G>C [rs2010963] T/G Различия между Эмбрионы класса С группами, 2 с поправкой на правдоподобие (р) Отсутствуют ПрисутствуДля Распреют генотипа, деление р генотипов, р 62 (66,7%) 37 (69,8%) 0,722 0,079 25 (26,9%) 16 (30,2%) 0,853 G/G A/A A/G G/G T/T T/C C/C 6 (6,5%) 64 (68,8%) 25 (26,9%) 4 (4,3%) 32 (34,4%) 44 (47,3%) 17 (18,3%) 0 (0%) 43 (81,1%) 9 (17,0%) 1 (1,9%) 13 (24,5%) 29 (54,7%) 11 (20,8%) 0,098 0,131 0,234 0,663 0,469 0,739 0,831 A/A 48 (51,6%) 17 (32,1%) 0,068 A/G G/G 36 (38,7%) 9 (9,7%) 28 (52,8%) 8 (15,1%) 0,181 0,022 A/A A/G G/G 33 (35,5%) 40 (43,0%) 20 (21,5%) 13 (24,5%) 30 (56,6%) 10 (18,9%) 0,112 0,093 0,841 G/G 32 (34,4%) 26 (49,1%) 0,176 A/G A/A 50 (53,8%) 11 (11,8%) 17 (32,1%) 10 (18,9%) 0,031 0,215 C/C G/C G/G 8 (8,6%) 47 (50,5%) 38 (40,9%) 5 (9,4%) 19 (35,8%) 29 (54,7%) 0,791 0,178 0,097 Генотип Полиморфизм Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с получением эмбрионов класса С T/T 0,264 0,715 0,029 0,160 0,045 0,239 95 Продолжение таблицы 15 ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G) [rs1799889] A/A G/A G/G G/G A/G A/A 9 (9,7%) 47 (50,5%) 37 (39,8%) 1 (1,1%) 5 (5,4%) 87 (93,5%) 7 (13,2%) 17 (32,1%) 29 (54,7%) 0 (0%) 7 (13,2%) 46 (86,8%) 0,542 0,128 0,132 0,662 0,131 0,236 4G/4G 26 (28,0%) 18 (34,0%) 0,363 5G/4G 48 (51,6%) 5G/5G 19 (20,4%) 25 (47,2%) 10 (18,9%) 0,618 0,841 0,220 0,203 0,662 Был проведен анализ ассоциации генотипа пациенток с качеством эмбрионов. Согласно аутосомно-доминантной модели носительство аллеля G полиморфизма гена ESR1 –351 A>G [XBaI] более чем в 2 раза повышает риск получения эмбрионов класса С (р=0,022; ОШ=2,3 (95% ДИ 1,1-4,6)) (рис. 23). 96 100% 90% 80% 70% G* 60% 50% 40% A/A 30% 20% 10% 0% Только Присутствуют эмбрионы эбрионы класса класса A и B C Рисунок 23. Ассоциация полиморфизма гена ESR1 –351 A>G [XBaI] с качеством эмбрионов Построена бинарная логистическая регрессионная модель, в которой исходом была переменная, характеризующая получение эмбрионов класса С, предикторами – полиморфизм генов AMH 146 G>T (Ile49Ser); AMHR2 -482 A>G; ESR1 –397 T>C [PvuII]; ESR1–351 A>G [XBaI]; FSHR 2039 G>A (Ser680Asn); LHCGR 935 A>G (Asn312Ser); VEGFA -634 G>C; ESR2 G>A [RsaI]; LHCGR 872 A>G (Asn291Ser); SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G). Анализ был проведен в семь этапов. Сначала были вовлечены все генотипы с последующим исключением наименее значимых. На завершающей стадии анализа остались четыре переменные, а именно: полиморфизм генов AMH 146 G>T (Ile49Ser), FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и LHCGR 872 A>G (Asn291Ser). Для последней модели значение -2LL оказалось равным 180,962; разность между 97 значением -2LL начальной и конечной модели составила 22,807 (р=0,004). Таким образом, после исключения всех незначимых переменных, произошло значительное улучшение начальной модели. Часть дисперсии, объяснимая с помощью вышеперечисленных четырех генов, составляет 18,5 % (вычислено по методу Наделькеркеса). Таким образом, уравнение регрессия для последней модели имело вид (4): p=1/(1+e-z), (4) где р – вероятность получения эмбрионов класса С; Z= - 22,36 – 0,79* AMHT/G – 20,621* AMHG/G + 0,993* FSHRA/G + 0,364* FSHRG/G – 1,206* LHCGR (935 A>G)A/G + 1,164* LHCGR (935 A>G)A/A + 22,888* LHCGR (872 A>G)A/G + 21,6* LHCGR (872 A>G)A/A Точность прогнозирования качества эмбрионов с использованием данных четырех генов составила 67,3 %. Прогноз оправдывается на 37,0% для эмбрионов класса А и В и на 82,9% для эмбрионов класса С. В заключение был проведен ROC-анализ для валидации полученной модели (4) (рис. 24). Значение AUC для данной модели составило 0,699, 95 % доверительный интервал от 0,616 до 0,783 (рис. 24). 98 Рисунок 24. ROC-анализ ассоциации полиморфизма генов AMH 146 G>T (Ile49Ser), FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) с получением эмбрионов класса С (sensitivity – чувствительность; specificity - специфичность) Кроме того, был проведен анализ ассоциации полиморфизма генов с наличием эмбрионов, остановившихся в развитии (табл. 16). 99 Таблица 16 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с наличием эмбрионов, Эмбрионы, остановившиеся в развитии Различия между группами, 2 с поправкой на правдоподобие (р) Генотип Полиморфизм остановившихся в развитии отсутствуют AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] AMHR2 -482 A>G [rs2002555] T/T T/G 82 (70,1%) 33 (28,2%) 27 (62,8%) 12 (27,9%) 0,245 0,588 G/G 2 (1,7%) 4 (9,3%) 0,05 A/A A/G G/G 88 (75,2%) 25 (21,4%) 4 (3,4%) 30 (69,8%) 12 (27,9%) 1 (2,3%) 0,308 0,252 0,593 0,665 ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs 2293275] T/T T/C C/C 36 (30,8%) 58 (49,6%) 23 (19,7%) 12 (27,9%) 24 (55,8%) 7 (16,3%) 0,443 0,301 0,407 0,771 A/A A/G G/G 48 (41,0%) 52 (44,4%) 17 (14,5%) 21 (48,8%) 20 (46,5%) 2 (4,7%) 0,240 0,477 0,069 0,167 A/A 38 (32,5%) 14 (32,6%) 0,568 A/G G/G 53 (45,3%) 26 (22,2%) 20 (46,5%) 9 (20,9%) 0,516 0,524 G/G A/G A/A 52 (44,8%) 46 (39,7%) 18 (15,5%) 15 (34,9%) 25 (58,1%) 3 (7,0%) 0,172 0,029 0,123 присутствуют Для генотипа, р Распре деление генотипов, р 0,112 0,983 0,082 100 Продолжение таблицы 16 VEGFA -634 G>C [rs2010963] C/C G/C G/G 13 (11,1%) 49 (41,9%) 55 (47,0%) 4 (9,3%) 20 (46,5%) 19 (44,2%) 0,499 0,364 0,446 ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G) [rs1799889] A/A G/A G/G G/G A/G A/A 17 (14,5%) 45 (38,5%) 55 (47,0%) 0 (0%) 8 (6,8%) 109 (93,2%) 3 (7,0%) 23 (53,5%) 17 (39,5%) 1 (2,3%) 5 (11,6%) 37 (86,0%) 0,156 0,064 0,254 0,269 0,248 0,137 4G/4G 30 (25,6%) 5G/4G 60 (51,3%) 16 (37,2%) 19 (44,2%) 0,109 0,269 5G/5G 27 (23,1%) 8 (18,6%) 0,354 0,857 0,164 0,163 0,366 Статистически значимой ассоциации полиморфизмов с остановкой развития эмбрионов выявлено не было. В результате определены генотипы, являющиеся независимыми предикторами качества получаемых эмбрионов. Генотипирование пациенток с целью определения неблагоприятных генотипов, а также их сочетания, позволит с достаточно высокой вероятностью (до 80%) прогнозировать качество эмбрионов. 3.6 Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с частотой наступления беременности Важным вопросом, имеющим особое практическое и научное значение, является возможность определения прогностических факторов наступления беременности и исходов программы ВРТ, чему посвящен следующий этап работы. 101 Анализируя частоту наступления беременности (ЧНБ) и частоту родов в исследуемых группах было выявлено, что в группе с нормальным овариальным ответом (n=80) ЧНБ составила 68%, родов – 80%; в группе с «бедным» ответом (n=32, у двух пациенток не были получены ооциты; у шести пациенток отсутствовали эмбрионы пригодные для переноса в полость матки), беременность наступила в 26%, роды – 74% случаев; в группе с «гипер» ответом (n=36, у четырех пациенток перенос эмбрионов в полость матки не произведен в связи с высоким риском развития клинически значимого синдрома гиперстимуляции яичников) ЧНБ - 33%, роды – 76%. Для оценки ассоциации генотипа пациенток с частотой наступления беременности были проанализированы распределения аллелей и генотипов исследуемых генов (табл. 17). Таблица 17 AMH 146 G>T (Ile49Ser) [rs10407022] AMHR2 -482 A>G [rs2002555] Беременность Генотип Полиморфизм Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с частотой наступления беременности не наступила наступила Различия между группами, 2 с поправкой на правдоподобие (р) Для Распредегенотипа ление генотипов T/T T/G G/G 49 (70,0%) 20 (28,6%) 1 (1,4%) 37 (68,5%) 14 (25,9%) 3 (5,6%) 0,506 0,452 0,219 0,423 A/A A/G G/G 52 (74,3%) 18 (25,7%) 0 (0%) 39 (72,2%) 12 (22,2%) 3 (5,6%) 0,477 0,408 0,080 0,076 102 Продолжение таблицы 17 ESR1 –397 T>C [PvuII] [rs2234693] ESR1 –351 A>G [XBaI] [rs9340799] FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) [rs2293275] VEGFA -634 G>C [rs2010963] ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) [rs12470652] SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G) [rs1799889] T/T 26 (37,1%) 14 (25,9%) 0,129 T/C 30 (42,9%) 29 (53,7%) 0,154 C/C A/A 14 (20,0%) 34 (48,6%) 11 (20,4%) 23 (42,6%) 0,567 0,316 A/G G/G 28 (40,0%) 8 (11,4%) 23 (42,6%) 8 (14,8%) 0,457 0,384 A/A A/G 22 (31,4%) 34 (48,6%) 16 (29,6%) 25 (46,3%) 0,494 0,472 G/G 14 (20,0%) 13 (24,1%) 0,371 G/G A/G A/A 32 (45,7%) 31 (44,3%) 7 (10,0%) 16 (29,6%) 28 (51,9%) 10 (18,5%) 0,050 0,256 0,135 C/C G/C G/G A/A 5 (7,1%) 29 (41,4%) 36 (51,4%) 7 (10,0%) 5 (9,3%) 29 (53,7%) 20 (37,0%) 4 (7,4%) 0,457 0,120 0,078 0,432 G/A G/G G/G A/G A/A 28 (40,0%) 35 (50,0%) 0 (0%) 7 (10,0%) 63 (90,0%) 27 (50,0%) 23 (42,6%) 1 (1,9%) 4 (7,4%) 49 (90,7%) 0,176 0,262 0,435 0,432 0,570 4G/4G 19 (27,1%) 5G/4G 35 (50,0%) 5G/5G 16 (22,9%) 18 (33,3%) 26 (48,1%) 10 (18,5%) 0,291 0,491 0,359 Проведенный анализ позволил сделать вывод 0,375 0,757 0,862 0,132 0,277 0,528 0,387 0,709 об отсутствии ассоциации полиморфизма исследуемых генов с частотой наступления беременности в программах ВРТ. Очевидно, изученные генетические маркеры, детерминируя качество половых клеток, не оказывают влияния на 103 имплантационную способность эмбрионов и эндометрия. Полученные данные согласуются с результатами, представленными в мета-анализе [62]. Выявленная ассоциация генетических предикторов с эффективностью программы ВРТ связана опосредованно через детерминацию овариального ответа, качества ооцитов и эмбрионов, не влияя на результативность переноса эмбриона в полость матки. Поиск маркеров биологических процессов, происходящих в гаметах, является перспективной предпосылкой, способной значительно повысить шанс успешных исходов в программах ВРТ и рождения здоровых детей. 104 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Как известно, примерно у 10% супружеских пар существуют проблемы с наступлением беременности естественным путем, более 80 млн пар по всему миру прибегают к лечению методом вспомогательных репродуктивных технологий [89]. Важным этапом программы экстракорпорального оплодотворения является стимуляция суперовуляции. При этом овариальный ответ широко варьирует у различных пациенток, находящихся на лечении методом ЭКО [71]. Примерно в 9-24% случаев овариальный ответ оказывается гораздо ниже ожидаемого [71]. С другой стороны, непредвиденное развитие «гипер» овариального ответа, встречающегося до 33% случаев, может привести к такому серьезному осложнению, как синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ) [75]. Имеющиеся данные согласуются с полученными в ходе настоящего исследования результатами. Так, в нашем исследовании на данной выборке пациенток прогноз нормального овариального ответа на стимуляцию суперовуляции, основанный на клинико-гормональных параметрах, не оправдался в 9,7% случаев, когда развился «бедный» ответ яичников, а в 14,6% случаев непредвиденно развился «гипер» овариальный ответ. Поэтому возможность более точно прогнозировать овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции представляет собой значительный интерес как с практической, так и с научной точки зрения [75]. Существующие маркеры исходов стимуляции суперовуляции (возраст, овариальный резерв, гормональный статус, экзогенные факторы и другие) [9, 66] не обладают точной предиктивной способностью, в связи с чем поиск оптимальных маркеров не прекращается и в настоящее время. Особое 105 внимание уделяется генетической изменчивости, которая представляется важным фактором в репродукции. С тех пор как была создана карта генома человека, был сделан значительный прогресс в поиске генов, связанных с овариальной функцией. Начиная с 2000 г, в ряде исследований прослеживается ассоциация полиморфизма генов с типом овариального ответа в программе ЭКО [62]. В связи с этим нами было проведено проспективное исследование, целью которого явился поиск молекулярно-генетических предикторов особенностей фолликулогенеза, оогенеза, эмбриогенеза в программах ВРТ. В исследование включены 160 пациенток, разделенных на 3 группы в зависимости от типа овариального ответа на стимуляцию суперовуляции: 40 пациенток с «бедным» овариальным ответом (<3 фолликулов, согласно ESHRE, 2011) [41], 40 пациенток с «гипер» ответом яичников (более 10 фолликулов, согласно ASRM, 2008) [22, 37], 80 пациенток с нормальным овариальным ответом (4-10 фолликулов). Перед проведением основного статистического анализа проверили исследуемые группы пациенток на предмет конфаундинга. Так, в группе с «гипер» ответом отмечалось увеличение числа пациенток моложе 30 лет, тенденция к удлинению менструального цикла и увеличению продолжительности менструации, уровень ФСГ был ниже, а АМГ выше по сравнению с пациентками с нормальным и «бедным» овариальным ответом. Все эти факторы при проведении дальнейшего анализа учтены как конфаундеры. В ходе проведенного анализа ассоциации полиморфизма генов с типом овариального ответа установлено, что наличие генотипа G/G полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) предрасполагает к «гипер» ответу (р=0,021; ОШ=3,49 (95% ДИ 1,3-11,6)). В исследовании, проведенном Boudjenah et al. в 2012 г, в которое было включено 427 пациенток, показано, что женщины гомозиготные по аллелю G гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) 106 имели большее число фолликулов и ооцитов, чем гомозиготы по аллелю A (9,8+4,6 против 7,2+4,0 фолликулов, р=0,0009) [52], что сопоставимо с полученными нами данными. Также представляет собой интерес тот факт, что среди пациенток с аллелем 680Ser чаще встречается синдром поликистозных яичников (СПКЯ) [21]. Проведенные исследования полиморфизма гена FSHR демонстрируют обнадеживающие результаты, которые могут быть применены в клинической практике, в частности, для персонализации подбора протоколов стимуляции суперовуляции. Подтверждением данного вывода служат и недавно проведенные мета-анализы Moron и Ruiz (2010), Altmae et al. (2011) и LaMarca et al. (2013), в которых также предполагалось, что полиморфизм гена рецептора ФСГ можно расценивать как потенциальный предиктор овариального ответа [53, 78, 70]. Предположительно, ассоциация генотипа G/G гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) с типом овариального ответа может быть связана с изначально более низким уровнем базального ФСГ в группе с «гипер» овариальным ответом. Так, в проведенном ранее исследовании у пациенток с генотипом А/А гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) зафиксирован более высокий уровень базального ФСГ в крови [62]. В своем исследовании мы провели анализ зависимости базального уровня ФСГ и АМГ в крови от генотипа FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), в результате чего статистически значимых различий выявлено не было. Полученные данные согласуются с результатами проспективного исследования, проведенного при участии 421 пациентки, в ходе которого также не была установлена ассоциация полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) с маркерами овариального резерва (ФСГ, АМГ, числом антральных фолликулов) [45]. Полиморфизм гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) не оказывает влияния на базальный уровень гормонов крови. Возможно, связь с типом 107 овариального ответа объясняется разным уровнем экспрессии рецептора ФСГ на клетках гранулезы и, как следствие, повышением чувствительности к препаратам ФСГ. Аналогичное предположение высказано в работе Desai et al. [46]. Клинические исследования по изучению влияния полиморфизма генов на исходы стимуляции функции яичников, проведенные в настоящее время, подтвердили предыдущие выводы о том, что низкая чувствительность к ФСГ может быть преодолена путем введения повышенных доз препаратов ФСГ в протоколах стимуляции суперовуляции [53]. Итак, ген FSHR является важным фактором, способным прогнозировать исход стимуляции функции яичников, и может дополнить арсенал имеющихся маркеров. Протоколы гормональной стимуляции функции яичников в программах ВРТ выходят за рамки физиологического процесса селекции, роста и созревания одного ооцита. Такая гормональная стимуляция приводит к получению большого числа ооцитов, возможно, компрометируя при этом качество самих клеток. Очевидно, что возможность получения зрелых ооцитов играет решающую роль в определении потенциально перспективных эмбрионов, что непосредственно влияет на успешность исхода программ ВРТ [16]. В связи с этим был проведен научный анализ ассоциации степени зрелости полученных ооцитов с качеством эмбрионов. Так, при аспирации только зрелых ооцитов в 95% случаев были получены эмбрионы класса А и/или В, при аспирации в одном пуле и зрелых, и незрелых ооцитов - в 93% эмбрионы были класса А и/или В, в то время как при аспирации только незрелых ооцитов, эмбрионы высокого качества (класс А и В) получены не были ни в одном случае. Основная цель стимуляции суперовуляции состоит в получении оптимального количества зрелых ооцитов, что позволило бы провести селекцию наиболее качественных эмбрионов для переноса в полость матки [52]. По данным литературы аспирация 8-10 (по некоторым публикациям до 108 15) ооцитов рассматривается как наиболее успешный результат стимуляции функции яичников [36]. В ходе проведения нашего исследования выявлено, что у всех пациенток, у которых не получены зрелые ооциты, число фолликулов не превышало 10, при созревании менее 4 фолликулов в 7,3% случаев получены только незрелые ооциты. Представляется перспективным и актуальным поиск предикторов получения незрелых ооцитов с целью индивидуализации программ ВРТ у больных с различным ответом яичников на стимуляцию их функции. Качество ооцитов зависит от многих биологических процессов, некоторые из которых могут быть оценены лишь на молекулярном уровне [32]. С целью определения генетических маркеров, связанных с процессами созревания женских гамет, проведено несколько исследований [99, 16], целью которых являлся поиск полиморфизма генов, детерминирующих созревание ооцитов [48]. Нами был проведен поиск ассоциации генотипа пациенток с качеством аспирируемых ооцитов. При анализе распределения частоты генотипов исследуемых генов в зависимости от качества ооцитов выявлена статистически значимая ассоциация полиморфизма гена LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) со степенью зрелости ооцитов. Так, генотип G/G повышает риск получения только незрелых ооцитов (р=0,039; ОШ=3,41 (95% ДИ 1,05-11,1)). Аналогичная ассоциация выявлена и с генотипом С/С гена VEGFA -634 G>C, у носительниц которого также зафиксирован высокий риск получения только незрелых ооцитов (р=0,040; ОШ= 4,09 ( 95% ДИ 1,3-11,71)). При сочетании двух неблагоприятных генотипов вероятность получения зрелых ооцитов составила 62,5%, тогда как для остальных сочетаний генотипов данная вероятность составила 93,4% (р=0,019; ОШ=0,12 (95% ДИ 0,03–0,52)). Носительство генотипа А/А полиморфизма гена AMHR2 -482 A>G более 109 чем в 2 раза повышает риск получения незрелых ооцитов (р=0,025; ОШ=2,23(95% ДИ 1,1-4,3)). Четко продемонстрирована ассоциация генотипа пациенток с исходами стимуляции суперовуляции. В то же время не существует одного единственного универсального маркера. В предыдущих исследованиях были предприняты попытки создания многофакторных моделей способных прогнозировать овариальный ответ [53]. Сегодня очевидна перспективность использования моделирования биоинформационных для создания подходов комплексных и математического многофакторных прогностических алгоритмов [20]. В связи с этим методом логистической регрессии на данной выборке пациенток нами была определена комбинация генотипов, способных с достаточной точностью прогнозировать получение незрелых ооцитов. Точность прогнозирования степени зрелости ооцитов с использованием полиморфизма генов AMHR2 -482 A>G, ESR2 G>A [RsaI], LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) составила 68,6%. Прогноз оправдывается на 62,5% для зрелых ооцитов и на 73,6% для незрелых ооцитов. При этом точность ROC-модели была достаточно высокой с площадью под кривой 70,4%. Согласно проведенным клиническим и научным исследованиям, в том числе и рандомизированным, при получении незрелых ооцитов рекомендуется их дозревание в специальной культуральной среде, а при последующем оплодотворении целесообразно исключить процедуру ИКСИ [61, 64]. Далее провели анализ ассоциации генотипа пациенток с качеством эмбрионов. Согласно аутосомно-доминантной модели носительство аллеля G полиморфизма гена ESR1 –351 A>G [XBaI] более чем в 2 раза повышает риск получения эмбрионов класса С (р=0,022; ОШ=2,3 (95% ДИ 1,1-4,6)), что согласуется с данными, полученными в исследовании Ayvaz et al. (2009) [44]. 110 Методом логистической регрессии, проведенной на данной выборке пациенток, был определен комплекс независимых генетических предикторов получения эмбрионов низкого качества класса С. При этом точность прогнозирования с использованием полиморфизма генов AMH 146 G>T (Ile49Ser), FSHR 2039 G>A (Ser680Asn), LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) и LHCGR 872 A>G (Asn291Ser) составила 67,3 %. Прогноз оправдывается на 37,0% для эмбрионов класса А и В и на 82,9% для эмбрионов класса С. Точность ROC-модели была достаточно высокой с площадью под кривой 69,9%. Учитывая прогноз получения эмбрионов низкого качества, пациенткам при носительстве неблагоприятных генотипов следует подбирать протоколы стимуляции суперовуляции, основываясь на получении большего количества фолликулов и ооцитов, с целью увеличения выборки эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки. Согласно проведенным ранее исследованиям выявляется положительная корреляция полиморфизма генов с частотой наступления беременности у пациенток в программах ЭКО [18]. Однако в данном исследовании ассоциации полиморфизма исследуемых генов с частотой наступления беременности Исследованные в программах молекулярно-генетические ВРТ выявлено маркеры не не было. оказывают непосредственного влияния на результативность переноса эмбрионов в полость матки. Аналогичные результаты представлены и в проведенном ранее мета-анализе [62]. Таким образом, тип овариального ответа является значимым фактором, влияющим на результаты ВРТ, а исследованные молекулярно-генетические маркеры, не оказывая влияния непосредственно на имплантационную способность эмбрионов и эндометрия, связаны с эффективностью ВРТ через детерминацию овариального ответа, качества ооцитов и эмбрионов. 111 По итогам проведенного исследования можно представить наиболее значимый полиморфизм генов, прогнозирующий исход стимуляции суперовуляции в программах ВРТ (табл. 18). Таблица 18 Наиболее значимые генетические маркеры, прогнозирующие исход стимуляции суперовуляции в программах ВРТ Ген FSHR Номер rs rs6166 Замена белка или кодирующей последовательности Роль полиморфизма генов в программах ВРТ 2039 G>A (Ser680Asn) Генотип G/G более чем в 3 раза повышает риск «гипер» ответа яичников на стимуляцию суперовуляции Генотип G/G более чем в 3 раза повышает риск получения только незрелых ооцитов Генотип С/С более чем в 4 раза повышает риск получения только незрелых ооцитов Генотип А/А более чем в 2 раза повышает риск получения незрелых ооцитов Аллель G более чем в 2 раза повышает риск получения эмбрионов низкого качества (класса С) LHCGR rs2293275 935 A>G (Asn312Ser) VEGFA rs2010963 -634 G>C AMHR2 rs2002555 -482A>G ESR1 -351A>G [XBaI] rs9340799 На сегодняшний день существует ряд гормональных и клинических параметров, использующихся для оптимизации и прогнозирования исходов стимуляции суперовуляции, однако они не дают полной точности. Кроме того, такие маркеры способны прогнозировать количество фолликулов, но не качество клеток. В это же время обозначенные генетические маркеры способны прогнозировать как исход стимуляции суперовуляции, так и 112 качество ооцитов и эмбрионов, и могут дополнить арсенал уже имеющихся маркеров. В последнее время особую актуальность приобрело такое понятие, как персонифицированная медицина, являющаяся достаточно новой для отечественной практики, широко внедряющаяся в различные направления здравоохранения. Под этим подразумевают методы профилактики, диагностики и лечения, основанные на данных об индивидуальных особенностях пациентки, в том числе и генетической предрасположенности к тому или иному заболеванию, состоянию или функции организма [1]. Разработка панелей генетических маркеров биологических процессов, происходящих в гаметах, является перспективной предпосылкой для персонификации программ ВРТ, что может значительно повысить шанс успешных исходов в программах ВРТ и рождения здоровых детей. Несмотря на современные достижения в области лечения бесплодия, существует необходимость подготовку больных к индивидуализировать программе ЭКО, и оптимизировать протоколы стимуляции суперовуляции, снизить вероятность неадекватного ответа яичников и развития осложнений, повышая эффективность и безопасность программ ВРТ. Поэтому одной из важнейших задач врача является наиболее точное прогнозирование возможных исходов стимуляции суперовуляции еще до вступления пациентки в программу ЭКО. Генотипирование пациенток с целью предикции исходов программ ВРТ является перспективным и актуальным методом, позволяющим индивидуализировать методы обследования и проводимую терапию бесплодия. На основании полученных результатов разработан алгоритм персонализированного проведения программ ВРТ с учетом молекулярногенетических маркеров (рис. 25). 113 Рисунок 25. Алгоритм персонализированного проведения программ ВРТ с учетом молекулярно-генетических маркеров 114 ВЫВОДЫ 1. Прогноз основанный овариального ответа исключительно на на стимуляцию суперовуляции, клинико-гормональных параметрах обследованных пациенток, не оправдывается в 9,7% случаев, когда развивается «бедный» ответ, а в 14,6% случаев - «гипер» ответ яичников. 2. Критическим пороговым значением овариального ответа является развитие 4 фолликулов, так как при меньшем количестве в 7,3% случаев получены незрелые ооциты, в 22% случаев отсутствовали ооциты, пригодные для оплодотворения. 3. Полиморфизм гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) является значимым независимым маркером, ассоциированным с типом овариального ответа. Наличие генотипа G/G предрасполагает к «гипер» ответу (р=0,021; ОШ=3,49 (95% ДИ 1,3-11,6)). Полиморфизм FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) не связан с базальным уровнем ФСГ и АМГ. 4. Ключевыми молекулярно-генетическими предикторами качества ооцитов являются: генотип G/G полиморфизма гена LHCGR 935 A>G (Asn312Ser) (р=0,039; ОШ=3,41 (95% ДИ 1,05-11,1)), генотип С/С полиморфизма гена VEGFA -634 G>C (р=0,040; ОШ= 4,09 ( 95% ДИ 1,311,71)), генотип А/А полиморфизма гена AMHR2 -482 A>G (р=0,025; ОШ=2,23 (95%ДИ 1,1-4,3)), носительство которых ассоциировано с получением незрелых ооцитов. Аллель G полиморфизма гена ESR1 –351 A>G [XBaI] ассоциирован с получением эмбрионов низкого качества класса С (р=0,022; ОШ=2,3 (95% ДИ 1,1-4,6)). 115 5. Вклад генетической изменчивости в детерминацию оогенеза и эмбриогенеза составляет от 16 до 31% (согласно комплексным ВРТ молекулярно- математическим моделям). 6. Ассоциация генетическими эффективности предикторами программ опосредована овариального ответа, качества ооцитов и эмбрионов. через с детерминацию 116 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Пациенткам, впервые обратившимся по поводу лечения бесплодия методом ЭКО, на этапе подготовки целесообразно проводить генотипирование наряду с клинико-лабораторным обследованием для возможности индивидуализированного проведения программы ВРТ. 2. При носительстве генотипа G/G полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) у пациенток с предрасположенностью к «гипер» ответу яичников для профилактики развития синдрома гиперстимуляции яичников следует персонифицировано подбирать протоколы стимуляции суперовуляции и дозы препаратов: «мягкие» протоколы, программа ЭКО в естественном цикле. 3. При носительстве генотипа А/А полиморфизма гена AMHR2 -482 A>G, генотипа G/G полиморфизма гена LHCGR 935 A>G (Asn312Ser), генотипа С/С полиморфизма гена VEGFA -634 G>C в связи с повышенной частотой получения незрелых ооцитов рекомендуется дозревание их в специальной культуральной среде. Процедура ИКСИ при оплодотворении незрелых ооцитов не рекомендуется. Супругу при этом показана предварительная консультация у андролога с целью улучшения показателей спермограммы. 4. При носительстве аллеля G полиморфизма гена ESR1 –351 A>G [XBaI], учитывая прогноз получения эмбрионов низкого качества, пациенткам показан выбор протоколов стимуляции суперовуляции для получения большего количества фолликулов, зрелых ооцитов и эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки. Целесообразно проведение процедуры ИКСИ с целью повышения вероятности оплодотворения. Таким 117 пациенткам также можно рекомендовать проведение преимплантационного генетического скрининга (ПГС). 118 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ аГнРГ - агонисты гонадотропин – рилизинг гормона антГнРГ - антагонисты гонадотропин – рилизинг гормона мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота АМГ - антимюллеров гормон БОО -«бедный» овариальный ответ ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии ГнРГ - гонадотропин – рилизинг гормон ДГЭА-С -дигидроэпиандростерон-сульфат ДИ -доверительный интервал ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота Е2 - эстрадиол ИКСИ - инъекции сперматозоида в цитоплазму ооцита ИМТ - индекс массы тела ИППП - инфекции, передающиеся половым путем К - кортизол ЛГ - лютеинизирующий гормон НЦАГиП - научный центр акушерства гинекологии и перинатологии ОШ -отношение шансов П - прогестерон ПРЛ - пролактин ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭ - перенос эмбрионов рФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон СГЯ - синдром гиперстимуляции яичников СПКЯ - синдром поликистозных яичников 119 СТГ - соматотропный гормон Т4св - тироксин свободный ТВП -трансвагинальная пункция яичников ТТГ -тиреотропный гормон УЗИ -ультразвуковое исследование ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ХГЧ - хорионический гонадотропин человека ЧМГ - человеческий менопаузальный гонадотропин ЭДТА -этилендиаминтетрауксусная кислота ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение AMH - аnti-Müllerian hormone (антимюллеров гормон) AMHR2 - аnti-Müllerian hormone receptor type II (рецептор антимюллерова гормона 2 типа) ASRM -American society of reproductive medicine (Американское общество репродуктивной медицины) AUC -area under curve (площадь под кривой) ESHRE -European society of human reproduction and embryology (Европейское общество по вопросам репродукции человека и эмбриологии) ESR - еstrogen receptor (эстрогеновый рецептор) FSHR - follicle stimulating hormone receptor (рецептор фолликулостимулирующего гормона) IVF - in vitro fertilisation (экстракорпоральное оплодотворение) IVM -in vitro maturation LHCGR - luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor (рецептор лютеинизирующего гормона) PAI-1 - plasminogen activator inhibitor-1 (ингибитор активатора 120 плазминогена -1) SNP - single nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм) TGFβ - transforming growth factor beta (трансформирующий ростовой фактор бета) VEGF - vascular endothelial growth factor (сосудистый эндотелиальный фактор роста) 121 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Баранов, В. С. Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины / В. С. Баранов. – СПб.: Н-Л, 2009. – 528 с. 2. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению / Под ред. Г. Т. Сухих, Т. А. Назаренко. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 518 c. 3. Гонадотропины в лечении бесплодия : Глава 7 / Т. А. Назаренко [и др.] // Стимуляция функции яичников / Под ред. Т.А. Назаренко. – М. : МЕДпресс-информ, 2008. – 79-91 c. 4. Жахур, Н. А. Дифференцированная тактика лечения больных с преждевременной недостаточностью яичников / Н. А. Жахур // АГ –инфо. – 2012. – №1. – С. 38-42. 5. Калинина, Е. А. Опыт применения "мягких" схем стимуляции суперовуляции у пациенток группы риска развития синдрома гиперстимуляции яичников / Е. А. Калинина, М. В. Эбзеева, Л. Н. Кузьмичев // Акушерство и гинекология. – 2010. – № 6. – С. 60-64. 6. Кофиади, полиморфизмов: И. А. Методы аллель-специфичная детекции однонуклеотидных ПЦР гибридизация и с олигонуклеотидной пробой / И. А. Кофиади, Д. В. Ребриков // Генетика. – 2006. – Т. 42 (1). – С. 22-32. 7. Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогательные репродуктивные технологии / Под ред. В.И. Кулакова, Б.В. Леонова, Л.Н. Кузьмичева. – М., 2005. – 592 с. 8. Назаренко, Т. А. "Бедный ответ". Тактика ведения пациенток со сниженный реакцией на стимуляцию гонадотропинами в программах ЭКО / 122 Т. А. Назаренко, К. В. Краснопольская. – М. : МЕДпресс-информ, 2012. – 80 c. 9. Никитин, А. И. Вредные факторы среды и репродуктивная система человека. Ответственность перед будущими поколениями : 2-е изд. доп. / А. И. Никитин. – СПб. : ЭЛБИ-СПб, 2008. – 22-59 c. 10. Современные подходы к использованию методов ВРТ у пациенток с бесплодием / К. Г. Серебренникова [и др.] // Репродуктивные технологии сегодня и завтра : матер. XVIII ежегод. междунар. конф. РАРЧ. – Самара, 2008. – С. 18-19. 11. Современные технологии лечения бесплодия у женщин с оперированными яичниками / К. Г. Серебренникова [и др.] // Международный журнал экспериментального образования. – 2010. – № 9. – С. 115-117. 12. Сухих, Г. Т. Иммунные аспекты патофизиологии синдрома гиперстимуляции яичников / Г. Т. Сухих, Т. Т. Сароян, И. Е. Корнеева // Акушерство и гинекология. – 2009. – № 3. – С. 3-6. 13. Эбзеева, М. В. Современные подходы к стимуляции суперовуляции в программах ВРТ / М. В. Эбзеева, Е. А. Калинина, Л. Н. Кузьмичев // Проблемы репродукции. – 2009. – № 4. – С. 47-49. 14. Элдер, К. Экстракорпоральное оплодотворение / К. Элдер, Б. Дэйл. – М. : МЕДпресс-информ, 2008. – 276 c. 15. A distribution of two SNPs in exon 10 of the FSHR gene among the women with a diminished ovarian reserve in Ukraine / G. Livshyts [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2009. – Vol. 26. – №1. – P. 29-34. 16. A new approach to evaluate aging effects on human oocytes: Fourier transform infrared imaging spectroscopy study / G. Gioacchini [et al.] // Fertil. Steril. – 2014. – Vol. 101, №1. – P. 120-127. 123 17. A single nucleotide polymorphism in BMP15 is associated with high response to ovarian stimulation / H. I. Hanevik [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2011. – Vol. 23, №1. – P. 97-104. 18. A single nucleotide polymorphisms in the anti-Mullerian hormone signalling pathway do not determine high or low response to ovarian stimulation / H. I. Hanevik [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2010. – Vol. 21, №5. – P. 616623. 19. Active smoking compromises IVF outcome and affects ovarian reserve / T. Freour [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2008. – Vol. 16, №1. – P. 96-102. 20. Alfirevic, A. Pharmacogenetics in reproductive and perinatal medicine / A. Alfirevic, Z. Alfirevic , M. Pirmohamed // Pharmacogenomics. – 2010. – Vol. 11, №1. – P. 65-79. 21. Alviggi, C. Hormonal, functional and genetic biomarkers in controlled ovarian stimulation: tools for matching patients and protocols / C. Alviggi, P. Humaidan, D. Ezcurra // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2012. – Vol. 10. – P. 9. 22. American Society of Reproductive Medicine. Ovarian hyperstimulation syndrome // Fertil. Steril. – 2008. – Vol. 90, № 5 (Suppl.). – P. S188-193. 23. Anti-Mullerian hormone (AMH): what do we still need to know? / A. La Marca [et al.] // Hum. Reprod. – 2009. - Vol. 24, № 9. – P. 2264-2275. 24. Anti-Mullerian hormone and anti-Mullerian hormone type II receptor polymorphisms are associated with follicular phase estradiol levels in normoovulatory women / M. E. Kevenaar [et al.] // Hum. Reprod. – 2007. – Vol. 22, № 6. – P. 1547-1554. 25. Anti-Mullerian hormone versus antral follicle count for defining the starting dose of FSH / V. T. Lan [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2013. – Vol. 27, № 4. – P. 390-399. 124 26. Anti-Mullerian hormone-based approach to controlled ovarian stimulation for assisted conception / S. M. Nelson [et al.] // Hum. Reprod. – 2009. – Vol. 24, № 4. – P. 867-875. 27. Antral follicle count in clinical practice: analyzing clinical relevance / A. Hsu [et al.] // Fertil. Steril. –2011. – Vol. 95, № 2. – P. 474-479. 28. Association between the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor (LHCGR) rs4073366 polymorphism and ovarian hyperstimulation syndrome during controlled ovarian hyperstimulation / T. O. Brien [et al.] // Reprod. Biol. Endocrinol. –2013. – Vol. 11, № 1. – P. 71. 29. Association of allelic combinations of FSHR gene polymorphisms with ovarian response / S. S. Desai [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2013. – Vol. 27, № 4. – P. 400-406. 30. Barad, D. H. Comparing anti-Mullerian hormone (AMH) and follicle- stimulating hormone (FSH) as predictors of ovarian function / D. H. Barad, A. Weghofer, N. Gleicher // Fertil. Steril. – 2009. – Vol. 91, № 4 (Suppl.). – P. 15531555. 31. Bosch, E. Individualised controlled ovarian stimulation (iCOS): maximising success rates for assisted reproductive technology patients / E. Bosch, D. Ezcurra // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2011. – Vol. 9. – P. 82. 32. Cellular and molecular aspects of ovarian follicle ageing / C. Tatone [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2008. – Vol. 14, № 2. – P. 131-142. 33. Clinical prediction rules. Applications and methodological standards / J. H. Wasson [et al.] // N. Engl. J. Med. – 1985. – Vol. 313, № 13. – P. 793-799. 34. Coccia, M. E. Ovarian reserve / M. E. Coccia, F. Rizzello // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2008. – Vol. 1127. – P. 27-30. 35. Conventional IVF as a laboratory strategy to rescue fertility potential in severe poor responder patients: the impact of reproductive aging / P. G. Artini [et al.] // Gynecol. Endocrinol. – 2013. – Vol. 29, № 11. – P. 997-1001. 125 36. Coomarasamy A. Association between the number of eggs and live birth in IVF treatment: an analysis of 400 135 treatment cycles / S. K. Sunkara [et al.] // Hum. Reprod. – 2011. – Vol. 26, № 7. - P. 1768-1774. 37. Delvigne A. Symposium: Update on prediction and management of OHSS. Epidemiology of OHSS // Reprod. Biomed. Online. – 2009. – Vol. 19, № 1. – P. 8-13. 38. Demographic characteristics and clinical profile of poor responders in IVF/ICSI: a comparative study / N. Pahdi [et al.] // J. Hum. Reprod. Sci. – 2010. – Vol. 3(2). – P. 91-94. 39. Efficacy of ER-alpha polymorphisms and the intrafollicular IGF system for predicting pregnancy in IVF-ET patients / Y. S. Choi [et al.] // Gynecol. Obstet. Invest. – 2009. – Vol. 67, № 2. – P. 73-80. 40. Elective single embryo transfer and perinatal outcomes: a systematic review and meta-analysis / R. Grady [et al.] // Fertil. Steril. – 2012. – Vol. 97, № 2. – P. 324-331. 41. ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria / A. P. Ferraretti [et al.] / Hum. Reprod. – 2011. - Vol. 26, № 7. – P. 1616-1624. 42. ESR1 rs9340799 is associated with endometriosis-related infertility and in vitro fertilization failure / D. D. Paskulin [et al.] // Disease Markers. – 2013. – Vol. 35, – № 6. - P. 907-913. 43. ESR1, ESR2 and FSH receptor gene polymorphisms in combination: a useful genetic tool for the prediction of poor responders / E. Anagnostou [et al.] // Curr. Pharmac. Biotech. – 2012. – Vol. 13, № 3. – P. 426-434. 44. Evaluation of in vitro fertilization parameters and estrogen receptor alpha gene polymorphisms for women with unexplained infertility / O. U. Ayvaz [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2009. – Vol. 26, № 9-10. – P. 503-510. 126 45. Follicle-stimulating hormone receptor gene polymorphisms are not associated with ovarian reserve markers / L. Mohiyiddeen [et al.] // Fertil. Steril. – 2012. – Vol. 97, № 3. – P. 677-681. 46. Follicle-stimulating hormone receptor polymorphism (G-29A) is associated with altered level of receptor expression in Granulosa cells / S. S. Desai [et al.] // J. Clin.Endocrinol. Metab. – 2011. – Vol. 96, № 9. – P. 2805-2812. 47. Follicle-stimulating hormone receptor polymorphism (Thr307Ala) is associated with variable ovarian response and ovarian hyperstimulation syndrome in Indian women / S. K. Achrekar [et al.] // Fertil. Steril. – 2009. – Vol. 91, № 2. – P. 432-439. 48. FSH receptor genotype does not predict metaphase-II oocyte output or fertilization rates in ICSI patients / L. Mohiyiddeen [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2013. – Vol. 27,- № 3. – P. 305-309. 49. Functional genetic polymorphisms and female reproductive disorders: Part I: Polycystic ovary syndrome and ovarian response / M. Simoni [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2008. – Vol. 14, № 5. – P. 459-484. 50. Gaunt, T. R. Cubic exact solutions for the estimation of pairwise haplotype frequencies: implications for linkage disequilibrium analyses and a web tool 'CubeX' / T. R. Gaunt, S. Rodriguez, I. N. Day // BMC bioinformatics. – 2007. – Vol. 8. – P. 428. 51. Gearhart, J. In vitro fertilization, the Nobel Prize, and human embryonic stem cells / J. Gearhart, C. Coutifaris // Cell Stem Cell. – 2011. – Vol. 8, № 1. – P. 12-15. 52. Genetic polymorphisms influence the ovarian response to rFSH stimulation in patients undergoing in vitro fertilization programs with ICSI / R. Boudjenah [et al.] // PloS One. – 2012. – Vol. 7, № 6. – P. e38700. 127 53. Genetic predictors of controlled ovarian hyperstimulation: where do we stand today? / S. Altmae [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2011. – Vol. 17, № 6. – P. 813-828. 54. Genetic profile of SNP(s) and ovulation induction / D. Loutradis [et al.] // Curr. Pharmac. Biotech. – 2012. – Vol. 13, № 3. – P. 417-425. 55. George, J. W. Current concepts of follicle-stimulating hormone receptor gene regulation / J. W. George, E. A. Dille, L. L. Heckert / Biol. Reprod. – 2011. – Vol. 84. – № 1. – P. 7-17. 56. Goodman, C. P53 tumor suppressor factor, plasminogen activator inhibitor, and vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and recurrent implantation failure / C. Goodman, R. S. Jeyendran, C. B. Coulam // Fertil. Steril. – 2009. – Vol. 92, № 2. – P. 494-498. 57. Goodman, C. Vascular endothelial growth factor gene polymorphism and implantation failure / C. Goodman, R. S. Jeyendran, C. B. Coulam // Reprod. Biomed. Online. – 2008. – Vol. 16, № 5. – P. 720-723. 58. Haller, K. Anti-FSH antibodies associate with poor outcome of ovarian stimulation in IVF / K. Haller, A. Salumets, R. Uibo // Reprod. Biomed. Online. – 2008. – Vol. 16, № 3. – P. 350-355. 59. Hormonal and functional biomarkers in ovarian response / B. Vural [et al.] // Arch. Gynecol. Obstet. –2014. – Vol. 289, № 6. – P. 1355-1361. 60. Identification and in vitro characterization of follicle stimulating hormone (FSH) receptor variants associated with abnormal ovarian response to FSH / T. Gerasimova [et al.] // J. Clin.Endocrinol.Metab. – 2010. – Vol. 95, № 2. – P. 529-536. 61. In vitro maturation, fertilization, embryo development & clinical outcome of human metaphase-I oocytes retrieved from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles / C. Alvarez [et al.] // Indian J. Med.Res. – 2013. – Vol. 137, № 2. – P. 331-338. 128 62. Influence of follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) Ser680Asn polymorphism on ovarian function and in-vitro fertilization outcome: a metaanalysis / Y. Yao [et al.] // Molec. Genet. Metab. – 2011. – Vol. 103, № 4. – P. 388-393. 63. Influence of FSHR diplotypes on ovarian response to standard gonadotropin stimulation for IVF/ICSI / L. Lazaros [et al.] // J. Reprod. Med. – 2013. – Vol. 58, № 9-10. – P. 395-401. 64. IVF versus ICSI for the fertilization of in-vitro matured human oocytes / M. Walls [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2012. – Vol. 25, № 6. – P. 603-607. 65. Jiang, X. Structural biology of glycoprotein hormones and their receptors: insights to signaling / X. Jiang, J. A. Dias, X. He // Molec. Cell. Endocrinol. – 2014. – Vol. 382, № 1. – P. 424-451. 66. La Marca, A. Individualization of controlled ovarian stimulation in IVF using ovarian reserve markers: from theory to practice / A. La Marca, S. K. Sunkara // Hum. Reprod. Update. – 2014. – Vol. 20, №1. – P. 124-140. 67. Lalioti M. D. Impact of follicle stimulating hormone receptor variants in fertility / M. D. Lalioti // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. – 2011. – Vol. 23, № 3. – P. 158-167. 68. Lyon, E. Mutation detection using fluorescent hybridization probes and melting curve analysis / E. Lyon // Expert Rev. Mol. Diagn. – 2001. – Vol. 1, № 1. – P. 92-101. 69. Mohiyiddeen, L. Single-nucleotide polymorphisms in the FSH receptor gene and ovarian performance: future role in IVF / L. Mohiyiddeen, L. G. Nardo // Hum. Fertil. – 2010. – Vol. 13, № 2. – P. 72-78. 70. Moron, F. J. Pharmacogenetics of controlled ovarian hyperstimulation: time to corroborate the clinical utility of FSH receptor genetic 129 markers / F. J. Moron, A. Ruiz // Pharmacogenomics. – 2010. – Vol. 11, № 11. – P. 1613-1618. 71. Oehninger, S. Ovulation induction in IVF / S. Oehninger // Minerva Ginecologica. – 2011. – Vol. 63, № 2. – P. 137-156. 72. Overbeek, A. Pharmacogenomics of ovulation induction: facilitating decisions on who, when and how to treat / A. Overbeek, N. Lambalk // Pharmacogenomics. – 2009. – Vol. 10, № 9. – P. 1377-1379. 73. Overbeek, A. Phenotypic and pharmacogenetic aspects of ovulation induction in WHO II anovulatory women / A. Overbeek, C. B. Lambalk // Gynecol. Endocrinol. – 2009. – Vol. 25, № 4. – P. 222-234. 74. Pharmacogenetics in ovarian stimulation--current concepts / D. Loutradis [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2008. – Vol. 1127. – P. 10-19. 75. Pharmacogenetics of ovarian response / B. Lledo [et al.] // Pharmacogenomics. – 2014. – Vol. 15, № 6. – P. 885-893. 76. Plasminogen activator inhibitor type-1 gene 4G/5G polymorphism and polycystic ovary syndrome / C. Kilicci [et al.] // Genet. Test. Molec. Biomarkers. – 2011. – Vol. 15, № 7-8. – P. 565-567. 77. Plasminogen activator inhibitor-1 -675 4G/5G polymorphism and polycystic ovary syndrome risk: a meta analysis / Y. Liu [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2014. – Vol. 31, № 3. – P. 363-370. 78. Polymorphisms in gonadotropin and gonadotropin receptor genes as markers of ovarian reserve and response in in vitro fertilization / A. La Marca [et al.] // Fertil. Steril. – 2013. - Vol. 99, № 4. – P. 970-978 e971. 79. Polymorphisms of the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor gene: association with maldescended testes and male infertility / M. Simoni [et al.] // Pharmacogenet. Genom. – 2008. – Vol. 18, № 3. – P. 193-200. 130 80. Polymorphisms of VEGF and VEGF receptors are associated with the occurrence of ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS)-a retrospective casecontrol study / K. Nouri [et al.] // J. Ovarian Res. – 2014. – Vol. 7. – P. 54. 81. Polyzos, N. P. A systematic review of randomized trials for the treatment of poor ovarian responders: is there any light at the end of the tunnel? / N. P. Polyzos, P. Devroey // Fertil. Steril. – 2011. – Vol. 96, № 5. – P. 1058-1061 e1057. 82. Poor ovarian response to gonadotropin stimulation is associated with low expression of follicle-stimulating hormone receptor in granulosa cells / J. Cai [et al.] // Fertil. Steril. – 2007. – Vol. 87, № 6. – P. 1350-1356. 83. Poor responders to controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization (IVF) / L. Kamble [et al.] // Hum. Fertil. (Camb). – 2011. – Vol. 14 (4). – P. 230-245. 84. Preconception folic acid use modulates estradiol and follicular responses to ovarian stimulation / J. M. Twigt [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2011. – Vol. 96, № 2. – P. E322-329. 85. Prediction of an excessive response in in vitro fertilization from patient characteristics and ovarian reserve tests and comparison in subgroups: an individual patient data meta-analysis / S. L. Broer [et al.] // Fertil. Steril. – 2013. Vol. 100, № 2. – P. 420-429 e427. 86. Prognostic tests of ovarian reserve in Textbook of Assisted Reproductive Technologies : 3nd ed. / D. Gardner [et al.]. – London : Informa Healthcare, 2009. – 912 p. 87. Regression modelling strategies for improved prognostic prediction / F. E. Harrell Jr. [et al.] // Stat. Med. – 1984. - Vol. 3, № 2. – P. 143-152. 88. Regression models for prognostic prediction: advantages, problems, and suggested solutions / F. E. Harrell Jr. [et al.] // Cancer Treat. Reports. – 1985. – Vol. 69, № 10. – P. 1071-1077. 131 89. Rosenbluth, E. M. Evolving role of assisted reproductive technologies / E. M. Rosenbluth // Clin. Obstet. Gynecol. – 2011. – Vol. 54, № 4. – P. 734-745. 90. Serum anti-Mullerian hormone and estradiol levels as predictors of ovarian hyperstimulation syndrome in assisted reproduction technology cycles / T. H. Lee [et al.] // Hum. Reprod. – 2008. – Vol. 23, № 1. – P. 160-167. 91. Serum anti-Mullerian hormone predicts ovarian response and cycle outcome in IVF patients / C. H.Wu [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2009. – Vol. 26, № 7. – P. 383-389. 92. SNP web resources and their potential applications in personalized medicine / J. Wang [et al.] // Curr. Drug Metab. – 2012. – Vol. 13, № 7. – P. 978990. 93. Study on a possible effect of four longevity candidate genes (ACE, PON1, PPAR-gamma, and APOE) on human fertility / R. M. Corbo [et al.] // Biogerontology. – 2008. – Vol. 9, № 5. – P. 317-323. 94. The International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and the World Health Organization (WHO) Revised Glossary on ART Terminology, 2009 / F. Zegers-Hochschild [et al.] // Hum. Reprod. – 2009. – Vol. 24, № 11. – P. 2683-2687. 95. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting // Hum. Reprod. – 2011. – Vol. 26, № 6. – P. 1270-1283. 96. The predictive accuracy of anti-Mullerian hormone for live birth after assisted conception: a systematic review and meta-analysis of the literature / S. Iliodromiti [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2014. – Vol. 20, № 4. – P. 560-570. 97. The role of antimullerian hormone in prediction of outcome after IVF: comparison with the antral follicle count / S. L. Broer [et al.] // Fertil. Steril. – 2009. – Vol. 91, № 3. – P. 705-714. 98. Using the ovarian sensitivity index to define poor, normal, and high response after controlled ovarian hyperstimulation in the long gonadotropin- 132 releasing hormone-agonist protocol: suggestions for a new principle to solve an old problem / M. Huber [et al.] // Fertil. Steril. – 2013. – Vol. 100, № 5. – P. 12701276. 99. World collaborative report on Assisted Reproductive Technology, 2002 / J. de Mouzon [et al.] // Hum. Reprod. – 2009. – Vol. 24, № 9. – P. 23102320. 100. World Health Organization reference values for human semen characteristics / T. G. Cooper [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2010. – Vol. 16, № 3. – P. 231-245. 101. Zalewski, G. Association of rs6166 polymorphism with FSH receptor transcript variants and steroid production in human granulosa cell cultures / G. Zalewski, S. Wolczynski , L. Chyczewski // Syst. Biol. Reprod. Med. – 2013. – Vol. 59, № 4. - P. 191-198. 102. Zhao, Y. Association of genetic polymorphisms of anti-Müllerian hormone (AMH) and its type II receptor with ovarian hyperstimulation syndrome / Y. Zhao, H. Zhang // J. Reprod. Contracep. – 2013. – Vol. 24 (1). – P. 30-37.
