ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НА ПОВЕРХНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА
advertisement
На правах рукописи АЛЕКСИНСКАЯ Марина Анатольевна ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НА ПОВЕРХНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ НАРУШЕНИЯХ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2006 Работа выполнена на Факультете Фундаментальной Медицины Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат медицинских наук, доктор биологических наук кандидат биологических наук С.М. Данилов М.А. Николаева Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор М.А. Стенина В.С. Репин Ведущая организация Государственный Научный Центр “Институт иммунологии Федерального медикобиологического агентства” Защита состоится «25» декабря 2006 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1 С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1 Автореферат разослан « » ноября 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ В последнее время все больше внимания уделяется молекулярным механизмам репродукции и характеристике поверхностных структур сперматозоидов, определяющих способность клеток к оплодотворению. Изучение роли поверхностных белков важно для понимания механизмов фертилизации, причин бесплодия и для поиска адекватных способов коррекции нарушений репродуктивной функции. Наиболее современным подходом к исследованию молекулярных механизмов взаимодействия клеток является использование моноклональных антител (МАТ). Получение МАТ к определенным антигенам (АГ) сперматозоидов позволяет изучать роль этих АГ в процессе оплодотворения. Исследуется возможность использования МАТ к АГ сперматозоидов при разработке новых способов иммуноконтрацепции (McCauley T.C. et al., 2002, Domagala A. et al., 2004). Одним из белков, специфичных для сперматозоидов и привлекающих внимание исследователей, является тестикулярная изоформа ангиотензин-превращающего фермента, впервые описанная El-Dorry с соавторами (El-Dorry H.A. et al., 1982). Ангиотензин-превращающий фермент (EC 3.4.15.1, CD143) – гликопротеин, расположенный на мембране клеток, выявляемый во многих тканях и жидкостях млекопитающих и имеющий широкий спектр действий. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) играет ключевую роль в ренин-ангиотензин-альдостероновой (РААС) и каликреин-кининовой системах, регулируя давление крови и гомеостаз электролитов (Hooper N.M., 1991, Corvol P. et al., 2004). АПФ – цинк-зависимая пептидил-дипептидаза, удаляющая C-концевой дипептид His-Leu, и осуществляющая превращение ангиотензина I в ангиотензин II (вазопрессор) и инактивацию брадикинина (вазодилятатор). АПФ может участвовать в метаболизме ряда других физиологически активных пептидов: вещества Р, энкефалинов, нейротензина, гонадотропин-релизинг гормона. Экспрессия АПФ была выявлена на поверхности эндотелиальных клеток легких, эпителиальных клеток кишечника, почек, нейроэпителиальных клеток мозга (Ryan J.W. et al., 1975, Danilov S.M. et al., 1987). О важности РААС для процессов оплодотворения может свидетельствовать высокая концентрация АПФ в cеменной жидкости (СЖ), которая в 50 раз превышает концентрацию этого фермента в плазме крови (Depierre D. et al., 1978, Krassnigg F. et al., 1989). В 1982 году было описано наличие двух изоформ АПФ (El-Dorry H.A. et al., 1982), одна из которых, тестикулярная, расположена на поверхности сперматозоидов. Было показано, что самцы мышей, у которых выключен (нокаутирован) ген АПФ, стерильны (Krege J.H. et al., 1995, Esther C.R. et al., 1997). В тоже время, при возобновлении экспрессии тестикулярной изоформы АПФ (тАПФ), но не соматической изоформы АПФ (сАПФ), фертильность у самцов мышей восстанавливается (Hagaman J.R. et al., 1998, Ramaraj P. et al., 1998, Kessler S.P. et al., 2000). При попытках выявить связь между уровнем тАПФ и морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов были получены противоречивые результаты. В работе Kaneko с соавторами была отмечена позитивная корреляция между активностью АПФ и подвижностью сперматозоидов человека (Kaneko S. et al., 1984) и крупного рогатого скота. Однако, в более поздних работах выявлена негативная корреляция между активностью фермента и подвижностью сперматозоидов свиньи и человека (Siems W.E. et al., 1991, Köhn F.-M. et al., 1998, Shibahara H. et al., 2001). В то же время, Köhn с соавторами (Köhn F.-M. et al., 1998) выявили отсутствие зависимости между уровнем активности АПФ и концентрацией/морфологией сперматозоидов. Использование фармакологических ингибиторов АПФ не оказывало влияния на подвижность сперматозоидов (Heder G. et al., 1994), но негативно отражалось на результатах взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки (Foresta C. et al., 1991, Köhn F.-M. et al., 1998). Было показано, что тАПФ высвобождается с поверхности сперматозоидов во время капацитации и акросомальной реакции (Köhn F.-M. et al., 1995, 1998), тогда как ингибирование АПФ предотвращает акросомальную реакцию и проникновение сперматозоидов в яйцеклетку (Foresta C. et al., 1991). Несмотря на то, что исследования в этой области идут уже не один десяток лет, механизм влияния тАПФ на фертильность до сих пор не изучен. Анализ ферментативной активности и использование поликлональных АТ не позволяют выявлять тАПФ, а оценивают суммарную активность/экспрессию как тестикулярной АПФ, экспрессирующейся на поверхности сперматозоидов, так и соматической АПФ, сорбируемой клетками из семенной жидкости. Таким образом, основной проблемой, связанной с определением роли тАПФ in vivo, является отсутствие адекватных методов количественной оценки экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов. Следовательно, получение МАТ к тАПФ и изучение роли АПФ в репродукции является актуальной задачей. 4 ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценка экспрессии ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции, с помощью моноклональных антител. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Получить и охарактеризовать моноклональные антитела к тестикулярной изоформе ангиотензин-превращающего фермента. 2. Разработать метод количественной оценки ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов с помощью моноклональных антител. 3. Определить зависимость между экспрессией тестикулярной изоформы ангиотензинпревращающего фермента и морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов. 4. Количественно оценить экспрессию тестикулярной изоформы ангиотензин- превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции. 5. Определить возможность продукции антител к АПФ у мужчин с иммунным фактором бесплодия. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Впервые получены моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к нативной конформации тестикулярной изоформы АПФ человека. Показано, что слущивание тАПФ с поверхности живых патологически измененных сперматозоидов в ходе экспериментальных манипуляций приводит к ложнонегативным результатам при выявлении АПФ на поверхности клеток. Разработан способ количественной оценки тАПФ на поверхности сперматозоидов человека с помощью моноклональных антител 1Е10 с использованием метода проточной цитометрии. Уровень тАПФ на поверхности сперматозоидов зависит от морфо- функциональных характеристик клеток. Максимальный уровень экспрессии тАПФ выявляется на поверхности морфологически измененных сперматозоидов и функционально-активных сперматозоидов с нормальной морфологией. Снижение функциональной активности морфологически-нормальных сперматозоидов – уменьшение скорости поступательного движения и увеличение вероятности спонтанной АР, сопровождается снижением экспрессии тАПФ на их поверхности. 5 Обнаружено что на поверхности морфологически нормальных сперматозоидов тАПФ локализуется в постакросомальной области головки, на шейке и средней части хвоста сперматозоидов. У сперматозоидов с патологически измененной морфологией головки тАПФ экспрессируется на всей поверхности головки клеток. Аутоантитела к АПФ в семенной жидкости фертильных доноров и пациентов с бесплодием иммунного и неиммунного генеза не выявлены. Показано, что уровень экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров выше, чем в группах пациентов с астенозооспермией и с бесплодием неясного генеза. РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ Результаты исследования и основные рекомендации внедрены в программу лекций кафедры иммунологии ГОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования Росздрава, и в практическую работу лаборатории клинической иммунологии ГУ НЦ Акушерства, Гинекологии и Перинатологии РАМН. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения и результаты исследования представлены и обсуждены на Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", "Ломоносов-2005" и "Ломоносов-2006" (Москва, 2004, 2005, 2006), Международной пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2004), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), VIII, IX и X Всероссийских научных форумах "Дни иммунологии в СанктПетербурге" (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006), 15 и 16 Европейской студенческой конференции будущих врачей и молодых ученых (Берлин, Германия, 2004, 2005), Республиканской научной конференции "Иммунология репродукции" (Иваново, 2005), 13 Международном студенческом конгрессе медицинских наук (Гронинген, Нидерланды, 2006), на апробационной комиссии МГУ им. М.В.Ломоносова 17 октября 2006 года. Диссертация обсуждена на межклинической конференции ГУ НЦ АГиП РАМН 30 октября 2006 года. ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 15 работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированного 35 рисунками, 5 таблицами. Указатель литературы включает в себя 153 источника отечественной и зарубежной литературы. 6 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на базе Государственного Учреждения Научного Центра Акушерства, Гинекологии и Перинатологии РАМН (директор - академик РАМН, д.м.н., профессор Кулаков В.И.) в лаборатории клинической иммунологии (зав. лабораторией академик РАМН, д.м.н., профессор Сухих Г.Т.). Получение и характеристика моноклональных антител к нативной и денатурированной формам тАПФ осуществлялось совместно с профессором Даниловым С.М. и Балясниковой И.В. (Исследовательский Центр Анестезиологии Университета Иллиноиса, Чикаго, США). Компьютерный анализ подвижности сперматозоидов проводился сотрудником лаборатории клинической эмбриологии Левчук Т.Н. (зав. лабораторией заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Кузьмичев Л.Н.). Было проведено клинико-лабораторное обследование 10 фертильных доноров и 92 пациентов, состоящих в бесплодном браке. Специальные методы исследования включали: выявление тАПФ методами проточной цитофлуорометрии (ПЦМ), флуоресцентной микроскопии и иммуноферментного анализа, характеристику движения сперматозоидов с помощью автоматического анализатора спермы, оценку акросомальной реакции сперматозоидов методом проточной цитофлуорометрии, определение уровня генерации свободных радикалов в эякуляте с помощью метода хемилюминесценции, выявление антиспермальных антител на поверхности сперматозоидов прямым тестом реакции смешанной агглютинации, выявление антител к АПФ в семенной жидкости методами иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблоттинга. Для оценки уровня экспрессии антигенов методом проточной цитометрии в каждом образце определяли: процент клеток, на поверхности которых выявлялись антитела к антигенам (ПЦМ%) и относительную интенсивность флуоресценции (ОИФ), отражающую количество антител на поверхности клеток. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение моноклональных антител к ангиотензин-превращающему ферменту и характеристика их специфичности С помощью гибридомной технологии были получены МАТ (1B3, 1B8, 1E10, 1D8, 2B11, 2H9, 3F10, 3F11, 4E3), узнающие С-домен ангиотензин-превращающего фермента человека. 7 Сравнительный анализ полученных МАТ, был проведен методом клеточного ИФА. С помощью трансформированных клеток яичника китайского хомячка (cells hamster ovary – CHO), экспрессирующих тестикулярную (СНО-тАПФ) и соматическую (СНО-сАПФ) изоформы АПФ определяли специфичность МАТ и их концентрацию в растворе, необходимую для связывания с ферментом. На основе полученных данных была выбрана насыщающая концентрация белка равная 10 мкг/мл, а из всей панели МАТ, отобраны МАТ 1E10 и 4E3, как наиболее эффективно распознающие нативную конформацию тАПФ. Оценку специфичности выбранных МАТ (1E10 и 4E3) проводили также с помощью метода проточной цитофлуорометрии (рис. 1) Рисунок 1. Количественная оценка связывания МАТ с поверхностью трансформированных клеток яичника китайского хомячка, экспрессирующих соматическую (А) или тестикулярную (Б) изоформы АПФ методом ПЦМ. В качестве изотипического контроля использовались неимунные IgG мыши (гистограммы серого цвета). МАТ i2H5+9B91 взаимодействовали практически со всеми СНО-сАПФ (рис. 1А) (ПЦМ% = 99,9%), как и МАТ 4E3 (ПЦМ% = 98,2%), при этом уровень связывания МАТ был очень высоким (ОИФ = 25,1 и 16,7, соответственно). В тоже время, уровень связывания МАТ 1Е10 с СНО-сАПФ (ОИФ = 1,9) был в 13 и 8 раз ниже, по сравнению с МАТ i2H5+9B9 и 4E3, соответственно. При использовании СНО-тАПФ (рис. 1Б) был выявлен высокий уровень связывания как МАТ 4Е3, так и МАТ 1Е10 с клетками (ПЦМ% = 99,7% и 98,2%, ОИФ = 24,6 и 23,9, соответственно). МАТ i2H5+9B9 с СНО-тАПФ практически не связывались (ПЦМ% = 0,6%, ОИФ = 0,9). Методом клеточного ИФА были получены аналогичные результаты. В качестве АТ специфичных к сАПФ использовали смесь МАТ i2H5 и 9B9, полученных и охарактеризованных ранее (Danilov S.M. et al., 1994). 1 8 Специфичность связывания антител к сАПФ и тАПФ была подтверждена при анализе связывания МАТ с поверхностью нативных клеток человека - эндотелиальных клеток пупочной вены (экспрессирующих только сАПФ) и сперматозоидов (экспрессирующих только тАПФ) (рис. 2). В эксперименте была использована фракция активно-подвижных сперматозоидов, полученных методом флотации. Рисунок 2. Количественная оценка связывания МАТ к АПФ (серые гистограммы) с поверхностью сперматозоидов и эндотелиальных клеток пупочной вены человека методом проточной цитометрии. В качестве изотипического контроля использовались неимунные IgG мыши (неокрашенные гистограммы). МАТ анти-CD59 использовали в качестве положительного контроля. МАТ 4E3, как и МАТ 1E10 взаимодействовали практически со всеми сперматозоидами (ПЦМ% = 93,1% и 93,4%, соответственно). В тоже время, связывание МАТ i2H5+9B9 со сперматозоидами практически не выявлялось (ПЦМ% = 6,1%). Уровень связывания МАТ 4Е3 и 1Е10 со сперматозоидами был практически одинаков (ОИФ = 16,1 и 17,0, соответственно), в то время как МАТ 1Е10 с эндотелиальными клетками связывались в 15 раз слабее, по сравнению с МАТ 4Е3 (ОИФ = 1,4 и 20,5, соответственно). Таким образом, получены моноклональные антитела к нативной форме ангиотензин-превращающего фермента, которые могут быть использованы для оценки экспрессии тАПФ методом проточной цитофлуорометрии. МАТ 1E10 специфичны к 9 тестикулярной АПФ, в то время как МАТ 4Е3 взаимодействуют как с тестикулярной, так и с соматической изоформами фермента. Aнализ экспрессии АПФ на живых сперматозоидах нативной спермы и активноподвижных клетках, полученных методом флотации, показал, что все образцы спермы содержали тАПФ-позитивные сперматозоиды, в то же время сАПФ на поверхности сперматозоидов практически не выявлялась (рис. 3). Рисунок 3. Количественная оценка экспрессии АПФ на поверхности всех сперматозоидов, присутствующих в эякуляте ( ) и активно-подвижных клетках, полученных методом флотации ( ). Несмотря на то, что семенная жидкость содержит большое количество сАПФ, которая может неспецифически сорбироваться на поверхности сперматозоидов, пять отмывок, используемых нами в процессе приготовления и окраски суспензии клеток, является достаточным для удаления сАПФ с поверхности сперматозоидов. Процент тАПФ-позитивных сперматозоидов, выявленных с помощью МАТ 1Е10, был значительно выше во фракции, полученной методом флотации, чем в эякуляте. Эта же особенность экспрессии тАПФ наблюдалась и при использовании МАТ 4Е3. Таким образом, МАТ 4E3 и 1E10 позволяют количественно определять экспрессию тестикулярной изоформы АПФ на поверхности сперматозоидов в нативной сперме, содержащей большое количество соматической АПФ. 10 С помощью иммунофлуоресцентного анализа живых, морфологически нормальных, сперматозоидов, полученных методом флотации, с использованием МАТ 1Е10, тАПФ была выявлена на поверхности шейки, постакросомальной области головки и средней части хвоста сперматозоидов (рис. 4А,Б), причем на поверхности большинства сперматозоидов наблюдалось образование кластеров разных размеров и локализации (рис. 4Б). Флуоресценция на поверхности всей головки наблюдалась у 2–5% сперматозоидов (рис. 4В,Г). Для того чтобы исключить возможность агрегации и слущивания комплексов АГ-АТ, мы провели анализ локализации тАПФ на поверхности фиксированных сперматозоидов. Фиксация не приводила к изменению локализации фермента – гомогенное распределение флюоресценции наблюдалось в средней части хвоста, на шейке и в постакросомальной области головки сперматозоидов (рис. 4Д,Е). Рисунок 4. Результаты фазово-контрастной (А, В и Д) и флуоресцентной (Б, Г и Е) микроскопии живых (А–Г) и фиксированных метанолом (Д и Е) сперматозоидов, полученных методом флотации, инкубированных с МАТ 1Е10. Увеличение × 1000 . Для выявления особенностей экспрессии тАПФ на поверхности клеток с разными морфо-функциональными характеристиками было получено две фракции сперматозоидов с помощью градиента Перколла: фракция 1, содержащая большой процент как активноподвижных клеток, так и клеток с нормальной морфологией и фракция 2, содержащая преимущественно малоподвижные и патологически измененные сперматозоиды (рис. 5). Во второй фракции процент тАПФ-позитивных сперматозоидов был значительно меньше по сравнению с первой фракцией, в тоже время количество тАПФ на поверхности клеток было выше, чем в первой фракции. 11 Тестикулярная изоформа АПФ на поверхности живых сперматозоидов с нарушенной морфологией при окрашивании МАТ 1Е10 была выявлена в области шейки и всей поверхности головки клеток, в то же время на поверхности 40-50% сперматозоидов тАПФ обнаружено не было (рис. 5А). Мы предположили, что причиной таких результатов может быть шеддинг (англ. shedding - слущивание) фермента с поверхности патологически измененных клеток в результате экспериментальных манипуляций и, как следствие, уменьшение процента тАПФ-позитивных сперматозоидов во второй фракции. Рисунок 5. Количественная оценка экспрессии и локализации тАПФ на поверхности сперматозоидов, содержащихся в разных фракциях, полученных с помощью градиента Перколла. МАТ 1Е10 (серые гистограммы). В качестве изотипического контроля использовались неимунные IgG мыши (неокрашенные гистограммы). Результат одного из трех экспериментов. Для того чтобы исключить влияние агрегации поверхностных иммунных комплексов и шеддинга на выявление тАПФ, была использована фиксация клеток метанолом. Было показано, что фиксация метанолом приводила к резкому увеличению числа тАПФ-позитивных сперматозоидов во второй фракции (рис. 6). В процессе выявления тАПФ наблюдался полный шеддинг фермента с поверхности 38% живых патологически измененных сперматозоидов. В то же время, не было обнаружено влияния шеддинга на результаты выявления тАПФ на поверхности активно-подвижных сперматозоидов с нормальной морфологией. 12 Соматическая изоформа АПФ практически не выявлялась на поверхности живых сперматозоидов ни в первой, ни во второй фракциях. Фиксация метанолом приводила к резкому увеличению процента сАПФ-позитивных сперматозоидов, как в первой, так и во второй фракции (35,8% и 25,7% соответственно). Это еще раз подтверждает необходимость контроля присутствия сАПФ на поверхности сперматозоидов, особенно при оценке экспрессии тАПФ с использованием поликлональных антител и при анализе активности фермента. Рисунок 6. Количественная оценка АПФ на поверхности сперматозоидов, разделенных в градиенте Перколла (n=5). Фракция 1 = Перколл 90-100%, и фракция 2 = Перколл 40-55%. Анализировали уровень АПФ на живых (светлые столбцы) и фиксированных (темные столбцы) сперматозоидах. Данные представлены в виде средних значений и стандартных отклонений. , , P < 0,01. Известно, что при фиксации метанолом могут выявляться как поверхностные, так и внутриклеточные структуры. Нами было показано, что фиксация сперматозоидов метанолом не приводила к выявлению дополнительного количества АПФ, то есть фиксация метанолом позволяет выявлять поверхностно локализованную тАПФ. Таким образом, для количественного анализа уровня тАПФ на поверхности патологически измененных сперматозоидов, необходимым условием является фиксация клеток, предотвращающая шеддинг тАПФ. Обнаруженный нами факт специфического связывания MAT 1D8 и 1Е10 с фиксированными сперматозоидами позволяет проводить количественную оценку 13 экспрессии тАПФ, используя фиксированные препараты сперматозоидов, которые могут храниться в течение длительного времени. Это значительно расширяет возможности данного метода. В то же время, при фиксации функционально-активных, морфологически нормальных сперматозоидов был отмечен более низкий уровень тАПФ, по сравнению с таковым на поверхности живых клеток. Это говорит о целесообразности использования живых сперматозоидов при анализе экспрессии тАПФ, если клетки имеют нормальные морфо-функциональные характеристики. Зависимость между экспрессией тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности клеток и морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов При использовании фиксированных сперматозоидов нативной спермы было показано, что уровень экспрессии тАПФ на поверхности клеток зависит как от количества сперматозоидов с патологически измененной морфологией (рис. 7А), так и от процента неподвижных сперматозоидов (рис. 7Б). Рисунок 7. Оценка зависимости между уровнем экспрессии тАПФ (МАТ 1Е10) на поверхности тАПФ-позитивных фиксированных сперматозоидов нативной спермы (n=30) и процентом клеток с патологически измененной морфологией (А) и процентом неподвижных сперматозоидов (Б). Увеличение процента патологически измененных сперматозоидов и клеток со сниженной подвижностью сопровождалось увеличением экспрессии тАПФ. Какой из параметров в наибольшей степени связан с экспрессией тАПФ, оставалось неясным, так 14 как была выявлена положительная корреляция между процентом клеток с патологически измененной морфологией и содержанием неподвижных сперматозоидов в нативной сперме (r=0,549, p<0,0001). Для того чтобы исключить влияние морфологического фактора и проанализировать зависимость между уровнем экспрессии тАПФ и скоростью движения сперматозоидов, методом флотации была получена фракция активно-подвижных сперматозоидов, содержащая не менее 85% морфологически нормальных клеток. Был проведен компьютерный анализ характера движения этих сперматозоидов и выявлена позитивная корреляция между процентом тАПФ-позитивных сперматозоидов и скоростью их движения (рис. 8). Рисунок 8. Оценка зависимости между процентом живых сперматозоидов, полученных методом флотации, экспрессирующих тАПФ на своей поверхности, и путевой (А) и прямолинейной (Б) скоростями движения этих клеток (n=16). Следовательно, активно-подвижные сперматозоиды с высокой скоростью поступательного движения характеризуются более высоким уровнем экспрессии тАПФ, чем клетки, двигающиеся с низкой скоростью. Одной из важнейших функций, играющих ключевую роль в проникновении сперматозоидов через оболочки яйцеклетки, является акросомальная реакция (АР). Акросомальная реакция in vivo происходит благодаря активации и высвобождению протеолитических ферментов при взаимодействии рецепторов сперматозоида и яйцеклетки. Описано 2 типа нарушений АР: спонтанная АР, происходящая до контакта 15 сперматозоида с яйцеклеткой и отсутствие индукции АР, когда не происходит выброса протеолитических ферментов после взаимодействия гамет. Было показано, что АР, индуцируемая ионофором А23187 in vitro, отражает способность сперматозоидов к индукции АР при их взаимодействии с оболочками яйцеклетки, и процент АР, индуцируемой ионофором, коррелирует с оплодотворяющей способностью сперматозоидов in vivo. Была исследована зависимость экспрессии тАПФ от акросомального статуса сперматозоидов, который определяли как процент спонтанной АР и процент АР, индуцированной ионофором А23187. Выявлена отрицательная зависимость между процентом сперматозоидов с завершенной спонтанной АР и уровнем экспрессии тАПФ (рис. 9). Рисунок 9. Оценка зависимости между уровнем экспрессии тАПФ на поверхности фиксированных сперматозоидов, полученных методом флотации, и процентом сперматозоидов с завершенной спонтанной акросомальной реакцией (n=34). Следовательно, присутствие тАПФ на поверхности сперматозоидов снижает вероятность спонтанной АР. В то же время нами не было выявлено зависимости между акросомальной реакцией и морфологией/подвижностью сперматозоидов. Поэтому спонтанная АР представляет собой самостоятельную функциональную характеристику сперматозоидов, связанную с экспрессией АПФ, но не зависящую от морфологии/подвижности клеток. Таким образом, максимальный уровень экспрессии тАПФ выявлялся на поверхности морфологически измененных сперматозоидов и функционально-активных сперматозоидов с нормальной морфологией. Снижение функциональной активности морфологически-нормальных сперматозоидов – уменьшение скорости поступательного 16 движения и увеличение вероятности спонтанной АР, сопровождалось снижением экспрессии тАПФ на их поверхности. Особенности экспрессии тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов пациентов с иммунным фактором бесплодия Известно, что наличие антиспермальных антител (АСАТ) в сыворотке и секретах репродуктивного тракта приводит к снижению подвижности, агглютинации и агрегации сперматозоидов или блокирует взаимодействие гамет, что увеличивает вероятность бесплодия. К группе пациентов с иммунным фактором бесплодия относятся те пациенты, в эякуляте которых уровень АСАТ, выявляемый с помощью MAR(mixed agglutination reaction)-теста, превышает 50% (ВОЗ, 1999). Мы предположили, что у пациентов с иммунным фактором бесплодия могут вырабатываться антитела и к тАПФ. Наличие аутоантител к тАПФ определяли в СЖ 15 пациентов с иммунным фактором бесплодия (MAR>65%) и у 19 бесплодных пациентов, СЖ которых практически не содержала АСАТ (MAR<8%). Среди АСАТ-негативных образцов аутоантитела к тАПФ были выявлены в 6 из 19 (32%) протестированных образцов. Среди АСАТ-позитивных образцов аутоантитела к тАПФ были выявлены в 6 из 15 (40%) протестированных образцов. Достоверных различий в частоте выявления аутоантител к тАПФ в АСАТ-негативных и АСАТпозитивных образцах обнаружено не было (р = 0,99). Необходимо отметить, что, несмотря на достоверные отличия между средними значениями оптических плотностей тестируемых и контрольных образцов в ИФА, разница между ними была невелика. Так, средний уровень относительного содержания антител к тАПФ составлял 1,15 (разбросы значений от 1,05 до 1,29). Сходные результаты были получены и при анализе антител к сАПФ. Таким образом, высокая частота выявления аутоантител к АПФ, низкий уровень сигнала в позитивных образцах и отсутствие достоверных различий в частоте выявления антител к АПФ в АСАТ-позитивных и АСАТ-негативных СЖ позволили нам предположить, что позитивные сигналы, полученные методом ИФА, являются ложнопозитивными результатами, обусловленными пассивной сорбцией белков, содержащихся в СЖ. Было проведено дополнительное тестирование СЖ, содержащих антитела к АПФ, с помощью иммуноблоттинга. С помощью предварительного скрининга методом ИФА для иммуноблотинга были выбраны образцы СЖ (n=3) в которых выявлялся высокий 17 уровень АТ как к нативной, так и к денатурированной форме тАПФ. Уровень сигнала в ИФА-позитивных образцах, по сравнению с контролем, был в 1,6 раза выше. В качестве негативного контроля были выбраны СЖ, не содержащие, согласно результатам ИФА, антител к тАПФ. В качестве позитивного контроля использовались МАТ 1D8. Ни в одном из образцов СЖ не было выявлено антител к тАПФ. Методом проточной цитофлуорометрии было проведено сравнение уровня экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров (n=10) и пациентов с иммунным фактором бесплодия (n=11). Различий в экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров и пациентов с бесплодием иммунного генеза также не было выявлено (рис. 10). Рисунок 10. Сравнение экспрессии тАПФ (МАТ 1Е10) на поверхности фиксированных сперматозоидов нативной спермы (А) и активно-подвижных сперматозоидов, полученных методом флотации (Б) фертильных доноров (1), пациентов с иммунным фактором бесплодия (2), пациентов с астенозооспермией (3) и пациентов с бесплодием неясного генеза (4). Таким образом, уровень экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов у пациентов с иммунным фактором бесплодия не отличается от такового для фертильных доноров. Аутонтитела к ангиотензин-превращающему ферменту в семенных жидкостях пациентов с бесплодием иммунного генеза не выявлены. 18 Оценка уровня тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента у фертильных мужчин, бесплодных пациентов с астенозооспермией и пациентов с бесплодием неясного генеза Было проведено исследование уровня экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров и бесплодных пациентов с астенозооспермией (астенозооспермия – снижение подвижности сперматозоидов ниже нормы, ВОЗ, 1999г.). Процент тАПФ-позитивных сперматозоидов в группе фертильных доноров был в 1,3 раза выше, чем в группе бесплодных пациентов (р<0,001) (рис. 10А). Эти данные подтверждают выявленную ранее зависимость между морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов и экспрессией тАПФ. При сравнении фракции активно-подвижных сперматозоидов было показано, что количество экспрессируемых молекул тАПФ на сперматозоидах бесплодных пациентов снижено в 2 раза (р<0,05) (рис. 10Б). Эти данные свидетельствуют о том, что у бесплодных пациентов с астенозооспермией патологические изменения, связанные с экспрессией поверхностных молекул, могут наблюдаться не только на поверхности патологически измененных клеток, но и на поверхности морфологически нормальных активно-подвижных сперматозоидов. Согласно статистике каждая пятая супружеская пара страдает бесплодием, которое может быть связано с различными нарушениями как в женском, так и в мужском организмах. В 10-20% случаев причины бесплодия выяснить не удается и ставится диагноз «бесплодие неясного генеза». Мы предположили, что у пациентов с бесплодием неясного генеза могут выявляться нарушения экспрессии тАПФ. Было проведено исследование уровня экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров и пациентов с бесплодием неясного генеза, имеющих нормальные показатели спермограммы. Акросомальный статус сперматозоидов фертильных и бесплодных пациентов также был одинаковым. Практически все сперматозоиды фертильных пациентов экспрессировали тАПФ (93,6%), в то время как при бесплодии неясного генеза тАПФ выявлялась на поверхности лишь 78,1% сперматозоидов (р<0,005) (рис. 10А). При сравнении фракции активно-подвижных сперматозоидов было показано, что количество экспрессируемых молекул тАПФ на сперматозоидах пациентов с бесплодием неясного генеза снижено в 1,4 раза (р<0,02) (рис. 10Б). Эти данные свидетельствуют о том, что у пациентов с бесплодием неясного генеза наблюдаются патологические изменения, связанные с экспрессией поверхностных 19 молекул на поверхности морфологически нормальных активно-подвижных сперматозоидов. Важнейшими характеристиками показателей, определяющими их клиническое значение, то есть возможность их использования для диагностики заболевания, являются специфичность, чувствительность и диагностическая ценность теста. Возможную клиническую значимость теста определяли, используя данные об уровне тАПФ на поверхности фиксированных сперматозоидов нативной спермы, а также фиксированных клеток, полученных методом флотации у фертильных доноров и пациентов с бесплодием неясного генеза (рис. 11), используя графический способ построения характеристических кривых (Zweig M.H. et al., 1993). 1 чувствительность – 100% специфичность – 90% пороговое значение 90,5% 2 чувствительность – 100% специфичность – 90% пороговое значение 9,3 усл.ед. фиксированные сперматозоиды нативной спермы фиксированные активно-подвижные сперматозоиды Рисунок 11. Оценка клинической значимости выявления тАПФ на поверхности сперматозоидов при диагностике бесплодия. А – процент тАПФ-позитивных сперматозоидов (ПЦМ %), Б – количество тАПФ на поверхности сперматозоидов. Среди пациентов с бесплодием неясного генеза, имеющих нормальные показатели спермограммы, с чувствительностью 100% и специфичностью 90% мы можем обнаруживать наличие мужского фактора бесплодия, если процент тАПФ-позитивных сперматозоидов меньше 90,5% и уровень тАПФ на поверхности этих клеток ниже 9,3 условных единиц. Для того, чтобы определить, является ли нарушение экспрессии тАПФ самостоятельным патогенетическим фактором или маркером функциональных изменений сперматозоидов, требуются дополнительные исследования. То, что максимальная чувствительность и специфичность теста найдены именно для фиксированных сперматозоидов нативной спермы, не может не радовать, так как это позволяет анализировать образцы без дополнительных манипуляций (получения фракции активно-подвижных сперматозоидов) и в любое удобное время (при условии фиксации и 20 хранения сперматозоидов при 200С). То есть можно планировать время проведения анализа и проводить одновременный скрининг большого числа образцов. Единственным параметром спермограммы, используемым в настоящее время для оценки фертильности, является процент морфологически нормальных сперматозоидов, оцениваемых с помощью критерия Крюгера. Оценка этого параметра, является достаточно чувствительным (63%) и специфичным (86%) тестом, но включает в себя множество морфометрических характеристик для каждого сперматозоида, что делает метод субъективным и трудоемким (Kruger T.F. et al., 1986, 1988). Еще одним, недавно обнаруженным критерием, обладающим высокой чувствительностью (97%) и специфичностью (89%) при выявлении различий между спермой фертильных и бесплодных доноров является оценка степени фрагментации ДНК сперматозоидов (Sergerie M. et al., 2005). Полученные нами значения основаны на оценке уровня экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных и бесплодных пациентов с помощью стандартизированных методов получения нативной спермы, ее фиксации и окрашивания. Метод проточной цитофлуорометрии является также объективным методом, позволяющим проводить анализ 5000 клеток одного образца и минимизировать ошибку метода при оценке уровня АПФ на поверхности клеток. Таким образом, своевременная диагностика нарушений экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов с помощью предлагаемых нами методов может стать важным звеном обследования и выбора оптимальных способов репродуктивной функции у пациентов с бесплодием неясного генеза. 21 коррекции ВЫВОДЫ 1. Получены моноклональные антитела к нативной форме ангиотензин-превращающего фермента человека. Моноклональные антитела 1E10 специфичны к тестикулярной АПФ, моноклональные антитела 4Е3 взаимодействуют как с тестикулярной, так и с соматической изоформами фермента. 2. Разработан способ количественной оценки экспрессии ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов с помощью моноклональных антител и метода проточной цитометрии. 3. Уровень тестикулярной изоформы АПФ на поверхности сперматозоидов зависит от морфо-функциональных особенностей клеток. Максимальный уровень экспрессии тестикулярной изоформы АПФ выявляется на поверхности патологических форм сперматозоидов и функционально-активных сперматозоидов с нормальной морфологией. Снижение экспрессии тестикулярной изоформы АПФ на поверхности морфологически нормальных сперматозоидов сопровождается снижением их функциональной активности: уменьшением скорости поступательного движения и увеличением вероятности спонтанной акросомальной реакции. 4. На поверхности большинства сперматозоидов с нормальной морфологией тестикулярная изоформа АПФ выявлена в постакросомальной области головки, на шейке и средней части хвоста клеток. У сперматозоидов с дефектами головки тестикулярная изоформа АПФ экспрессируется на всей поверхности головки клеток. 5. Уровень экспрессии тестикулярной изоформы АПФ на поверхности сперматозоидов пациентов с иммунным фактором бесплодия не отличается от такового у фертильных доноров. При этом аутоантитела к ангиотензин-превращающему ферменту в семенных жидкостях пациентов не обнаружены. 6. Выявлены нарушения экспрессии тестикулярной изоформы АПФ на поверхности сперматозоидов у пациентов с бесплодием неясного генеза и у бесплодных пациентов с астенозооспермией: количество тестикулярной изоформы АПФ на поверхности сперматозоидов пациентов с бесплодием было значительно ниже, чем на поверхности сперматозоидов фертильных доноров. 22 Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Алексинская М.А., Николаева М.А., Елистратова О.С., Сухих Г.Т., Данилов С.М. Оценка экспрессии тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека. Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", 2004, Москва, т.1, с.348. 2. Алексинская М.А., Николаева М.А., Елистратова О.С., Сухих Г.Т., Данилов С.М. Тестикулярная изоформа ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека. Сборник тезисов 8-ой Международной пущинской школыконференции молодых ученых "Биология-наука XXI века", 2004, Пущино, с.43. 3. Alexinskaya M.A., Nikolaeva M.A., Balyasnikova I.V., Sukhikh G.T., Danilov S.M. Testicular isoform of angiotensin-converting enzyme on the surface of spermatozoa from normozoospermic men. Abstracts from The European Congress of Reproductive Immunology, 2004, Pilsen, Czech Republic, American Journal of Reproductive Immunology, Vol.51, N.6, p.481. 4. Николаева М.А., Алексинская М.А., Елистратова О.С., Сухих Г.Т., Данилов С.М. Экспрессия тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека. Материалы VIII Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге "Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии" 2004, Санкт-Петербург, Медицинская иммунология, т.6, № 3-5, с.384385. 5. Aleksinskaya M.A. Expression testicular isoform of angiotensin-converting enzyme on the surface of human ejaculated spermatozoa. Abstracts from the 15th european students' conference for future doctors and young scientists, 2004, Berlin, Germany, Abstractbook, p.318. 6. Алексинская М.А., Николаева М.А., Елистратова О.С., Сухих Г.Т., Данилов С.М. Особенности выявления тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека. Тезисы Республиканской научной конференции "Иммунология репродукции", 2005, Иваново, Russian Journal of Immunology, Vol.9, supplement 2, p.187. 7. Алексинская М.А., Николаева М.А., Елистратова О.С., Сухих Г.Т., Данилов С.М. Особенности выявления тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека. Сборник тезисов XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", Международный молодежный научный Форум "Ломоносов-2005", 2005, Москва, т.2, с.416. 8. Алексинская М.А., Николаева М.А., Елистратова О.С., Сухих Г.Т., Данилов С.М. Особенности выявления тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека. Материалы IX Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге "Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии" 2005, Санкт-Петербург, Медицинская иммунология, т.7, № 2-3, с.179-180. 23 9. Aleksinskaya M.A., Nikolaeva M.A., Balyasnikova I.V., Sukhikh G.T., Danilov S.M. Quantification of the testicular isoform of angiotensin I-converting enzyme on human spermatozoa with monoclonal antibodies. Abstracts from the 16th european students' conference promissing medical scientists willing to look beyond, 2005, Berlin, Germany, Abstractbook, p.59. 10. Nikolaeva M.A., Balyasnikova I.V., Alexinskaya M.A., Metzger R., Franke F.E., Albrecht R.F.II, Kulakov V.I., Sukhikh G.T., Danilov S.M. Testicular isoform of angiotensin I-converting enzyme (ACE, CD143) on the surface of human spermatozoa: revelation and quantification using monoclonal antibodies. American Journal of Reproductive Immunology, 2006, Vol.55, Issue 1, p.54-68. 11. Алексинская М.А., Николаева М.А., Данилов С.М., Елистратова О.С., Сухих Г.Т. Количественная оценка тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2006, Т.141, N.1, с. 41-44. 12. Алексинская М.А., Николаева М.А., Данилов С.М., Кузьмичев Л.Н., Левчук Т.Н., Елистратова О.С., Сухих Г.Т. Зависимость скорости движения сперматозоидов от экспрессии тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на их поверхности. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2006, Т.141, N.2, с.198-201. 13. Алексинская М.А., Николаева М.А., Сухих Г.Т., Данилов С.М. Экспрессия тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности живых сперматозоидов. Сборник тезисов XIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", Международный молодежный научный Форум "Ломоносов-2006", 2006, Москва, т.4, с.484-485. 14. Алексинская М.А., Николаева М.А., Сухих Г.Т., Данилов С.М. Экспрессия тестикулярной изоформы ангиотензин-превращающего фермента на поверхности живых сперматозоидов. Материалы X Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе Дни иммунологии в СанктПетербурге "Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии" 2006, Санкт-Петербург, Медицинская иммунология, т.8, № 2-3, с.304. 15. Aleksinskaya M.A., M.A. Nikolaeva, I.V. Balyasnikova, G.T. Sukhikh, S.M. Danilov. Expression of the testicular isoform of angiotensin I-converting enzyme on the surface of live spermatozoa and sperm functions. Abstracts from the 13th International Student Congress of Medical Sciences, 2006, University Medical Center Groningen, The Netherlands, Book of Abstracts, p.151. 24