му микроскопическое исследование обсемененности воздуха и

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
ДЗЕРЖИНСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ФИЛИАЛ)
Кафедра «Процессы и аппараты химической и пищевой технологии»
МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОБСЕМЕНЕННОСТИ
ВОЗДУХА И ВОДЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
к выполнению лабораторной работы по дисциплине
«Микробиология» для студентов специальности 260602
«Пищевая инженерия малых предприятий»
Нижний Новгород 2006
Составитель: А.А. Перетрутов
УДК 663.11:579.67
Микроскопическое исследование обсемененности воздуха и воды:
метод. указания к выполнению лаб. работы по дисциплине «Микробиология»
для студентов специальности 260602 «Пищевая инженерия малых
предприятий» /НГТУ; Сост.: А.А. Перетрутов. Н.Новгород, 2006. - 17 с.
Приведены общие сведения о микрофлоре воды, воздуха. Изложены
методики исследования и обработки опытных данных по микробиологическим
исследованиям воды и определению общего количества микроорганизмов в
воздухе.
Редактор В.И. Бондарь
Подп. в печать
Формат 60 × 84 1/16. Бумага газетная.
Печать офсетная. Усл.-печ. л. 1,1. Уч.-изд. л. 0.8. Тираж 100 экз. Заказ .
Нижегородский государственный технический университет.
Типография НГТУ. 603600, Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
© Нижегородский государственный
технический университет, 2006
2
1. Цель работы
Цель работы: освоение микробиологических методов исследования
обсемененности воды и воздуха.
2. Краткие сведения из теории
2.1. Микрофлора воды
Вода – естественная среда обитания микроорганизмов. Их больше
находится в прибрежной зоне и на поверхности воды, меньше – вдали от берега
и на глубине. Количество микроорганизмов зависит от содержания
органических веществ, степени загрязнения и местоположения водоёма,
скорости течения, температуры, времени года. Микронаселение воды бывает
собственное (автохтонное), порожденное средой обитания, и аллохтонное –
поступившее извне. На поверхности развивается нейстон, в толще – планктон,
на дне – бентос. Обсеменение воды выражают сапробностью. По содержанию
микроорганизмов в воде выделены 3 зоны:
1. Полисапробная зона – сильно загрязненная вода с большим
количеством легко разлагающихся и легкоусвояемых веществ.
Процессы здесь проходят почти в анаэробных условиях, так как
растворенный кислород быстро поглощается, образуя СН4, Н2S, RS
(меркаптан), при этом появляется неприятный запах. Количество
микробов в 1 мл воды достигает нескольких миллионов.
2. Мезосапробная зона. Микроорганизмы развиваются в среде с меньшим
количеством органического вещества. В воде интенсивно идет
минерализация, окисление и нитрификация. Количество кишечной
палочки уменьшается, общее число микроорганизмов в 1 мл воды
меньше 100 тыс. или равно им.
3. Олигосапробная зона. Микроорганизмы немногочисленны: в 1 мл воды
содержатся десятки или сотни микроорганизмов, кишечная палочка
отсутствует. Органические вещества минерализованы, самоочищение
воды закончилось. В состав микробиоценоза (совокупность
микроорганизмов: ценоз – общий) входят бактерии, водоросли,
простейшие, плесневелые грибы, фаги и др.
Живые водоросли являются антагонистами бактерий, после отмирания
служат пищей микроорганизмам. Хлорелла на свету вызывает гибель кишечной
палочки. Одна инфузория поглощает до 30 тысяч микробных клеток за 1 час.
Патогенные микроорганизмы быстрее погибают в грязной воде, чем в
чистой, так как там могут находиться микроорганизмы-антагонисты, фаги и др.
Такие взаимоотношения способствуют поддержанию равновесия живых
существ в гидросфере.
Вода может быть атмосферная (дождевая, снеговая), поверхностная
(речная, озёрная, прудовая), подземная (грунтовая, колодезная, ключевая).
В атмосферной воде мало минеральных веществ, она мягкая, безвкусная,
служит средой для микроорганизмов, которые в неё попадают из воздуха
вместе с пылью. В 1 мл дождевой воды содержится от 1 до 400 микробов.
3
После нахождения её на поверхности земли количество микроорганизмов в ней
резко возрастает.
В речной воде весной и осенью, в период половодий, дождей, количество
органического вещества и микроорганизмов сильно увеличивается. В такой
воде могут быть сапрофиты и патогенные микроорганизмы – возбудители
заразных болезней, попадающие на луга, пастбища и являющиеся угрозой для
здоровья и жизни животных и человека.
Вода рек в нижнем течении загрязнена сильнее. В Москве-реке в 1 мл воды
содержится от 0,4 до 1,3 миллиона микроорганизмов, в Неве – от 0,2 до 0,6
миллиона. В Волге, вблизи крупных городов, содержится до 13 миллионов
микробов в 1 мл воды.
Озерная вода разная по составу. После дождей количество
микроорганизмов в ней сильно возрастает. Много микроорганизмов находится
на поверхности воды, ещё больше – в иле. Состав их самый разнообразный, в
том числе присутствуют серо- и железобактерии.
В подземных водах меньше микроорганизмов, поскольку в процессе
фильтрации микробы задерживаются почвой. Подземные воды содержат много
солей, они жесткие (Са 2+, Mg 2+). Микроорганизмы попадают в воду по пути
следования наверх или из воздуха. Артезианская и ключевая вода почти не
содержат микроорганизмов. Самоочищение воды происходит под действием
физических, химических и биологических факторов: в процессе оседания
нерастворимых органических и органических веществ с адсорбированными на
них микроорганизмами; действия солнечного света, губительного для
микробов; обеднения среды при минерализации органических веществ. Всё это
создает неблагоприятные условия для развития микроорганизмов.
Биологический путь очищения происходит в результате антагонизма
между группами микроорганизмов. Аллохтонные (внесённые) микроорганизмы
погибают быстрее (в течение суток на 80 – 90 %). Зимой количество
микроорганизмов не уменьшается, а даже возрастает.
В воде могут быть возбудители лептоспироза, сальмонеллеза, туляремии,
бруцеллёза, сибирской язвы и т. д. Выживаемость возбудителей туберкулеза
сохраняется до 150 дней, туляремии – до 92 дней, бруцеллеза – до 72 дней.
В воду попадает кишечная палочка. Её обнаружение служит показателем
фекального загрязнения воды. В практике используются следующие методы
определения загрязнения воды: микробное число, коли-титр и коли-индекс.
Микробное число – количество колоний, выросших в чашках Петри на
МПА (мясопептонный агар) из 1 мл водопроводной или артезианской воды при
температуре 37 °С в течение 24 часов. Согласно ГОСТ 2874 – 82 «Вода
питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством» и СанПиН
2.1.4.559-96 «Питьевая вода и водоснабжение населенных мест» микробное
число питьевой (водопроводной) воды должно быть не более 100, а колодезной
– 300 – 400.
4
Коли-титр – наименьший объем воды в миллилитрах, в котором
обнаруживается кишечная палочка. Коли-титр водопроводной воды – не менее
300, колодезной – не менее 100.
Коли-индекс – количество кишечных палочек в 1 л воды. В водопроводной
воде он должен быть не более 3 , в колодезной – не более 10.
2.2. Микрофлора атмосферы
Наличие
микроорганизмов
в
воздухе
доказал
Луи
Пастер.
Микроорганизмов находится больше в центре города, меньше – на окраинах, в
полях, лесах, над озерами, морями, в горах. Где пыль, грязь, там больше
микроорганизмов, так как микробы адсорбируются на поверхности частиц. У
поверхности Земли (в тропосфере) микроорганизмов больше, чем в
стратосфере.
Микроорганизмы фитопатогенных грибов обнаружены в облаках, выше
84км их нет. В воздух микроорганизмы попадают из почвы, с тел животных, с
поверхности транспорта. Чем интенсивнее движение, тем больше
микроорганизмов в воздухе. В тайге воздух может быть стерильным.
В атмосфере городов встречаются пигментообразующие палочки, кокки,
плесени, споры. В воздухе Москвы находится от 30 до 77 %
пигментообразующих микробов, более 20 % плесневых грибов, от 2 до 25 %
бацилл.
Воздух – это среда, через которую передаются патогенные
микроорганизмы воздушно-капельным или воздушно-пылевым путем.
Воздушным путем передаются возбудители гриппа, туберкулёза, оспы, споры
сибирской язвы, плесневых грибов, ящура, пневмонии, чумы и других
болезней.
Зелёные насаждения в городах задерживают до 90 % пыли, в результате
число микроорганизмов уменьшается в 3 – 9 раз.
3. Правила безопасной работы
При микробиологическом исследовании воды и воздуха следует
соблюдать правила работы в лаборатории микробиологии (см. инструкцию по
работе в лаборатории микробиологии). Работы проводятся в белом халате и
чепчике на индивидуальном рабочем месте. При работе со стеклянными
приборами, пипетками, бюретками, стеклянной посудой соблюдать правила
предосторожности. В случае боя посуды осколки собрать с помощью щетки и
совка в мусорное ведро. При порезах стеклом ранку промыть водой, убедиться
в отсутствии осколков в ранке, продезинфицировать ранку спиртовым
раствором йода из медицинской аптечки и забинтовать.
Особую осторожность следует соблюдать при работе со спиртовками и
горелками. Рукава халатов должны быть застегнуты, при работе не оставлять
рукава над огнем. При фламбировании не прикасаться к стерилизованным
шпателям, петлям, иглам.
5
4. Порядок выполнения работы
4.1. Оборудование и материалы
Стерильные чашки Петри, стерильный расплавленный МПА в колбе,
среда Булижа, Эйкмана или Кесслер с газовками в колбах или пробирках,
стерильный 1%-ный раствор нейтральрота, стерильная бутылка или колба для
взятия проб воды, стерильные пипетки на 100, 50, 10, 5 и 2 см3, чашки Петри со
средами Эндо, Сабуро, МПА, приборы Кротова и Дьяконова,
бактериологические петли, спиртовки, мембранные фильтры.
4.2. Исследование воды
Микробиологическое исследование воды преследует следующие цели:
определение общего количества микробов в 1см3 воды (КОЕ)∗, коли-титра и
коли-индекса.
Для исследования набирают воду в стерильную посуду вместимостью
0,5…1 л с ватными или притертыми стеклянными пробками, которые
закрывают бумажными колпаками и завязывают у горловины. Пробы
хлорированной воды отбирают в склянки, в которые перед стерилизацией в
автоклаве вносят 10 мг гипосульфита натрия на 0,5 л воды. В посуду,
стерилизованную сухим жаром, вносят 2 см3 раствора гипосульфита перед
отбором пробы, причем строго следят за тем, чтобы не произошло загрязнения
пробы из воздуха. Взятая вода должна быть тотчас отдана на исследование.
Если лаборатория находится на большом расстоянии от места взятия пробы,
посуду с пробой воды необходимо сохранять в ведре со льдом или в
холодильнике.
Из открытых водоемов, бассейнов, баков пробы собирают с глубины
10…15 см. Для изучения санитарного состояния водоема воду необходимо
брать выше и ниже каждого населенного пункта, который может являться
источником загрязнения.
При взятии проб воды из водопроводных кранов последние
предварительно стерилизуют, обжигая пламенем паяльной лампы или горящим
тампоном, смоченным спиртом, затем сливают воду из крана в течение 10 мин
и только после этого наполняют посуду. Пробы воды с больших глубин
набирают при помощи батометра (рис.1). Всего воды набирают 350…500 см3.
Воду необходимо исследовать не позднее чем через 2 ч после взятия, при
хранении на леднике – не позднее чем через 6 ч. При отправке проб воды в
лабораторию оформляют сопроводительный документ, в котором указывают
наименование источника, его местонахождение, дату отбора пробы (год, месяц,
число и час), метеорологические условия (температура воздуха, осадки), цель
исследования воды, место службы, должность и подпись лица, направляющего
пробы воды.
∗
КОЕ – колониеобразующие единицы
6
По ГОСТ 2874-82 для
питьевой водопроводной воды,
прошедшей очистку, коли-титр
должен быть не ниже 300, колииндекс – не более 3, общее
количество
микроорганизмов
(КОЕ) – не более 100 в 1 см3.
Для воды из других
источников точные нормы не
установлены, но принято, что в
водопроводной воде г. Москвы
должно быть не более 100
микробных клеток в 1 см3, титр
Рис. 1. Прибор для взятия
кишечной палочки – не менее
проб воды из глубины
500 см3 (не более 2 кишечных
палочек в 1 л). Воды колодцев и родников могут содержать не более 100
микробных клеток в 1 см3 и иметь титр кишечной палочки до 250 см3 (4
кишечные палочки в 1 л воды). Воды открытых водоемов (прудов, озер) с
микробным числом не более 1000, коли-титром не менее 111, коли-индексом не
более 9 могут применяться в пищевых производствах для технических целей
только для очистки и не должны иметь патогенных микроорганизмов.
Определение общего количества микробов в воде (КОЕ)
Сущность метода заключается в определении в 1 см3 воды общего
содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов при
культивировании на МПА при температуре 37 ± 0,5 оС в течение 24 ч.
Определение начинают с приготовления десятичных разведений воды.
Для этого берут несколько пробирок со стерильной водой, налитой по 9 см3. В
первую пробирку стерильной пипеткой добавляют 1 см3 исследуемой воды.
При этом пипетку не следует погружать в стерильную воду, чтобы избежать
смывания микробов с поверхности пипетки. Новой стерильной пипеткой
перемешивают внесенную пробу воды со стерильной водой, после чего этой же
пипеткой набирают 1 см3 приготовленного разведения (1/10) и переносят во
вторую (разведение 1/1000), из второй – в третью и т.д.
Для приготовления каждого разведения пользуются отдельной
стерильной пипеткой. Чем больше загрязнена вода, тем больше готовят
разведений. Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух
разведений объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от
30 до 300 колоний. При использовании водопроводной воды засевают в каждую
из двух чашек по 1 см3 и заливают 10…12 см3 охлажденного до 45 оС МПА.
По истечении 24 ч роста при температуре 37 ± 0,5 оС подсчитывают
число выросших колоний в глубине и на поверхности агара. Если колоний
7
выросло немного или много мелких, то считают с помощью лупы, перевернув
чашку вверх дном, отмечая при этом каждую учтенную колонию чернилами
или карандашом по стеклу. Если выросло большое количество колоний, то дно
чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе. При
очень большом числе выросших колоний пользуются специальной счетной
камерой (рис. 2), которая представляет собой стеклянную пластинку,
разделенную на 144 квадрата, площадь каждого из которых равна 1 см2.
Квадраты, расположенные по
диагонали, в свою очередь разделены
на 9 малых квадратов. Пластинка
укреплена на деревянной подставке.
Общее количество колоний, выросшее
в
чашке
Петри,
определяют
следующим
образом.
Вначале
рассчитывают площадь чашки (πr2),
после этого помещают чашку с
Рис. 2. Камера Вольфгюгеля для
колониями на черное стекло или
счета колоний
бумагу вверх дном и покрывают
счетной пластиной. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см2
каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое число
колоний на 1 см2 и умножают на площадь чашки.
Результаты подсчета колоний в каждой чашке выражают количество
бактерий в 1 см3 анализируемой воды с учетом посеянного объема. За
окончательное количество бактерий принимают среднее арифметическое число
колоний, выросших в двух чашках Петри разных разведений. Результаты
округляют следующим образом:
− если результат находится в пределах от 1 до 100, то записывают числа,
которые получены;
− если результат находится в пределах от 101 до 1000, то округляют до 10;
− если результат находится в пределах от 1001 до 10 000, то округляют
до100 и т.д.
Количество колоний не учитывают в тех чашках, в которых при посеве из
разведения выросло менее 20 или более 300 колоний, а также при сплошном
росте бактерий.
Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества
колоний, когда на обеих чашках отмечен сплошной рост. При этом
подсчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.
Определение количества бактерий группы кишечных палочек в воде
Наибольшую опасность представляет фекальное загрязнение воды, так
как вместе с фекалиями в воду могут попасть патогенные микроорганизмы.
Обнаружить последние в воде бывает чрезвычайно трудно из-за их небольшой
8
концентрации, поэтому о степени загрязнения воды микроорганизмами судят
по косвенным показателям - наличию в воде бактерий группы кишечных
палочек, т.е. по коли-титру и коли-индексу. К этой группе относятся
грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с
образованием кислоты и газа при 37 ± 0,5 оС в течение 18…24 ч или
сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при 37 ± 0,5 оС в
течение 24 ч и не обладающие оксидазной активностью.
Коли-титр показывает наименьшее количество воды, в котором
обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка, коли-индекс – число
кишечных палочек в 1 л воды. Для перевода коли-индекса в коли-титр 1000
делят на число, выражающее коли-индекс.
Количество кишечных палочек (коли-титр) в воде определяют
бродильным методом или методом мембранных фильтров.
Для определения коли-титра бродильным методом высевают
определенные объемы анализируемой воды в среду Эйкмана или Булижа,
культивируют посевы при 37 ± 0,5 оС с последующим посевом бактерий на
плотную среду Эндо, дифференцируют выросшие бактерии и определяют
наиболее вероятное число бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды по
таблицам.
При исследовании воды на этапах очистки и обеззараживания воды
открытых водоемов засевают 100,0; 10,0; 1,0 и 0,1 см3 воды. При анализе
питьевой водопроводной воды засевают три объема по 100 см3 , три объема по
10 см3 и три объема по 1 см3 или засевают 500 см3 в колбы (по 100 см3 в каждую)
с глюкозопептонной или лактозопептонной средой с индикатором, снабженные
поплавками или комочками ваты, погруженными на дно сосуда (среда Булижа
или Эйкмана). Затем отмечают изменение цвета среды, наличие или отсутствие
газа и помутнения. Если среда не изменилась, кишечная палочка в пробе
отсутствует, исследования прекращают. Из пробирок с помутневшей средой и
наличием газа проводят посев на среду Эндо. Микроорганизмы, выращивают
при 37 ± 0,5 оС в течение 16…18 ч. при появлении характерных колоний
готовят мазки, красят их по Граму и ставят оксидазный тест.
Наличие активной оксидазы у всех бактерий, высеянных из колб
(флаконов) или пробирок, свидетельствует об отсутствии кишечных палочек.
При росте оксидазоотрицательных, не окрашивающихся по Граму
палочек делают посев в полужидкую среду с глюкозой и инкубируют в течение
4…5 ч при 37 ± 0,5 оС. Наличие кислоты и газа дает основание утверждать о
присутствии кишечных палочек.
В том случае, когда в пробирках образуется кислота без газа, посевы
термостатируют 24 ч
для окончательного учета: при наличии газа –
положительный результат, при его отсутствии – отрицательный.
Можно в готовую среду Эндо добавить 10 см3 стерильного сырого
молока для учета бактерий, обладающих протеолитической активностью.
Вокруг колоний бактерий с протеолитической активностью образуются зоны
просветления в результате преципитации при выпадении в осадок параказеина.
9
Анализируя питьевую воду, коли-индекс определяют по табл. 1, 2; при
оценке воды на этапах очистки и обеззараживания воды открытых водоемов
коли-индекс устанавливают по табл. 3.
Таблица 1. Определение коли-индекса при исследовании 333 см3 воды
Число положительных результатов
анализа воды из
трех
трех
трех
флаконов
пробирок
пробирок
по 100 см3 по 10 см3
по 1 см3
0
0
0
0
0
1
0
1
0
1
0
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
2
0
2
0
0
2
0
1
2
1
0
2
1
1
2
2
0
2
2
1
2
0
0
3
0
1
3
0
2
3
1
0
3
1
1
3
1
2
3
2
0
3
2
1
3
2
2
3
3
0
3
3
1
3
3
2
3
3
3
Предел коли-индекса
Колииндекс
Коли-титр
нижний
верхний
Менее 3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1100
Более 1100
0,5
0,5
0,5
1
1
3
3
1
3
3
7
4
10
4
7
15
7
14
30
15
30
35
36
71
150
-
9
13
20
21
23
36
36
36
37
44
89
47
140
120
130
370
210
230
380
380
440
470
1300
2400
4800
-
Более 333
333
333
250
143
143
91
91
111
72
67
50
48
36
43
26
16
23
13
8
11
7
5
4
2
0,9
Менее 0,9
При исследовании воды бродильным методом ставят оксидазный тест.
Изолированные 2…3 колонии, выращенные на среде Эндо, снимают петлей и
наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для
опредления оксидазной активности. Если оксидазный тест отрицательный, то
на участке нанесения культуры бумага не изменяет цвета; бумага синеет в
течение 1 мин, если бактерии имеют активную оксидазу.
10
Таблица 2. Определение коли-индекса при исследовании 500 см3 воды
Число
положительных
результатов анализа
воды из пяти
флаконов по 100 см3
0
1
2
3
4
5
Предел коли-индекса
Коли-индекс
Коли-титр
Нижний
верхний
0
0,1
0,5
1,6
3,3
8,0
6
12,6
19,2
29,4
52,9
-
Менее 2
2
5
9
16
Более 16
Более 455
455
196
109
62
Менее 62
Таблица 3. Определение коли-индекса при исследовании воды на этапах
очистки и обеззараживании воды открытых водоемов
100
+
+
+
+
+
+
Объем исследуемой воды, см3
10
0,1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1,0
+
+
Коли-индекс
Коли-титр
Менее 9
9
10
23
94
230
960
2380
Более 2380
Более 111
111
105
43
10
4
1
0,4
Менее 0,4
Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без
него (лактоположительных) колоний свидетельствует о наличии бактерий
группы кишечных палочек.
Оксидазную активность можно определить двумя способами.
Первый способ. На отрезок фильтровальной бумаги наносят несколько
капель 1%-ного раствора дигидрохлорида тетраметил-n-фенилендиамина,
приготовленного в тот же день. Выросшую культуру снимают с поверхности
агаровой среды и наносят её на увлажненную бумагу. Положительная реакция,
то есть наличие оксидазной активности, вызывает развитие фиолетовой или
пурпурной окраски в течение 10 с.
Второй способ. Этот метод менее чувствителен, чем первый, но он более
удобен. Несколько капель смеси (1:1, по об.) 1%-ного α-нафтола,
растворенного в 95 %-ном этаноле, и свежеприготовленного 1%-ного водного
раствора оксалата диметил-n-фенилендиамина наносят на колонии в чашках с
агаром. В другом варианте к жидкой культуре добавляют 0,2 мл α-нафтола и
0,3 мл диметил-n-фенилендиамина и энергично перемешивают. Положительная
11
реакция вызывает окрашивание колоний или бульонной культуры в фиолетовосиний цвет в течение 10-30 с.
При обнаружении бактериального загрязнения свыше допустимых норм
нужно исследовать воду на наличие бактерий – показателей свежего
фекального загрязнения.
Свежее фекальное загрязнение в воде устанавливают, определяя наличие
кишечных палочек (преимущественно E. coli), обладающих способностью
ферментировать лактозу до кислоты и газа при 43 ± 0,5 оС в присутствии
ингибиторов посторонней микрофлоры.
Для определения коли-индекса ускоренным методом используют
мембранные ультрафильтры (кружки диаметром 3…5 см), которые выпускают
под пятью номерами (табл. 4).
Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из
определенного объема анализируемой воды на мембранном фильтре,
выращивании их при температуре 37 ± 0,5оС на среде Эндо с последующим
изучением выросших колоний и подсчетом количества бактерий группы
кишечных палочек в 1 л воды.
Таблица 4. Продолжительность фильтрования воды (500 см3) на разных
фильтрах
Номер фильтра
Размер по фильтрам, мкм
1
0,35
2
0,5
3
0,7
4
0,9
5
1,2
Примечание. В скобках приведено среднее время.
Время фильтрования
6…12 мин (9 мин)
3…6 мин (4,5 мин)
1,5…3 мин (2,5 мин)
45…90 с (70 с)
20…45 с (35 с)
Чем больше размер пор, тем больше номер фильтра и быстрее идет
фильтрация. Для санитарно-бактериологического исследования воды наиболее
пригоден фильтр № 3. Матовая сторона фильтра называется воздушной. При
фильтрации и посеве матовая сторона должна быть обращена вверх, а
блестящая – вниз и соприкасаться с питательной средой.
Перед фильтрованием мембранные фильтры кипятят в течение 10…15 мин
в дистиллированной воде, медленно нагревая и не допуская бурного кипения.
Фильтровальный прибор стерилизуют обжиганием, автоклавированием или
кипячением. В охлажденном аппарате на сетку помещают простерилизованный
кружок фильтровальной бумаги, смоченный стерильной водой, а затем
стерильный фильтр (бумагу используют для предохранения фильтра от
повреждения). По окончании фильтрования мембранные фильтры берут
стерильным пинцетом и укладывают в чашки Эндо.
Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть
обращена вверх. Под фильтром со стороны дна чашки делают надпись с
12
указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. После
суточного роста в термостате из характерных для кишечной палочки колоний
делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, затем вычисляют
коли-индекс. Количество бактерий группы кишечных палочек, выросших при
посеве исследуемого объема воды, умножают на 1000 см3 и делят на весь объем
исследуемой воды. Например, при посеве 333 см3 воды не выросло ни одной
колонии, следовательно, коли-индекс менее 3.
Допустим, что при посеве трех объемов воды по 100 см3 на одном
фильтре выросло 3 колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух
других нет роста. Коли- индекс равен 3 × 1000 : 300 = 10.
При посеве 10 и 100 см3 воды на одном фильтре выросла 1 колония, на
другом - 5 колоний. Коли-индекс равен 6 × 1000 : 110 = 54.
В том случае, если на одном из фильтров обнаружен сплошной рост
бактерий и подсчитать их трудно, коли-индекс вычисляют по тому объему, в
котором на фильтре выросли изолированные колонии. Например, в 100см3
посевного объема на фильтре сплошной рост бактерий, в объеме 10 см3 на
фильтре выросло 12 колоний бактерий группы кишечных палочек, коли-индекс
равен 12 × 1000 : 10 = 1200.
Для подтверждения свежего фекального загрязнения воды проводят
дополнительный посев из колоний темно-красного цвета с металлическим
блеском или без него, обнаруженных на фильтрах, в лактозную среду с борной
кислотой, предварительно нагретую на водяной бане до 43 ± 0,5 оС. Засеянные
пробирки ставят в термостат и инкубируют при температуре 43 ± 0,5 оС в
течение 24 ч.
Помутнение среды и наличие газа указывают на присутствие в воде
бактерий – показателей свежего фекального загрязнения.
Вместо лактозной среды с борной кислотой можно использовать
желточно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым, инкубируя при 44 ±
0,5 оС.
4.3. Исследование воздуха
Микробы попадают в воздух главным образом с поднимающейся пылью
и представляют собой в основном сапрофитные микроорганизмы. Воздух
закрытых помещений иногда содержит и патогенные микробы: споры
возбудителей сибирской язвы, столбняка, туберкулезную полочку, гноеродные
бактерии и др. Выделить патогенные микробы непосредственно из воздуха
очень трудно. Поэтому для санитарной оценки воздуха пользуются
определением общего количества микробов в 1 м3 воздуха, а также количества
гемолитических и зеленящих стрептококков. На предприятиях мясной и
молочной промышленности в отдельных производственных помещениях
исследуют воздух на содержание в нем спор микроскопических грибов и
дрожжей.
13
С этой целью используют различные питательные среды: для
определения общего количества микроорганизмов в воздухе – МПА,
санитарно-показательных микробов – кровяной агар,
патогенных
стафилококков – желточно-солевой или кровяно-солевой агар, спор
микроскопических грибов и дрожжей – сусло-агар или среду Сабуро,
протеолитических бактерий – МПА или молочный агар.
Присутствие в воздухе большого числа микробов указывает на плохую
вентиляцию помещений, а это может привести к загрязнению сырья или
готовых пищевых продуктов, а также к появлению всевозможных заболеваний
человека, в том числе и инфекционных.
Определение общего количества микроорганизмов в воздухе
Для количественного определения микробов пользуются разными
методами.
Седиментационный метод (метод оседания по Коху), наиболее простой,
но наименее точный, основан на оседании микробов. Чашки Петри с
мясопептонным или сусло-агаром (последний для культивирования грибов)
ставят в исследуемое помещение на пол на стерильную бумагу – одну на
середину и четыре по углам помещения. Крышку сдвигают на край чашки, для
того чтобы вся поверхность с агаровой средой была открыта полностью, чашки
оставляют открытыми на 5…10 мин. Вместе с пылью и капельками влаги на
поверхность агара оседают и микробы.
По истечении установленного времени чашки закрывают крышками,
ставят вверх дном и выдерживают при температуре 22 оС в течение 5 суток или
при температуре 30 оС в течение 48 ч (для выращивания грибов в течение пятисеми суток). Затем подсчитывают выросшие колонии непосредственно или с
помощью счетной камеры, полагая, что каждая колония выросла из одной
микробной клетки.
По Омелянскому, на поверхность чашки площадью 100 см2 в течение
5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха.
Для расчета микробного числа воздуха используют следующую формулу:
Х =
а ⋅ 100 ⋅ 1000 ⋅ 5
,
в ⋅ 10 ⋅ t
где Х – количество микробов в 1 м3 воздуха; а – количество колоний в
чашке; в – площадь чашки (см. табл. 5); t – время экспозиции; 5 – время
экспозиции; 10 – объем воздуха, из которого происходит оседание микробов за
5 мин., л; 1000 – искомый объем воздуха, л.
Метод Коха не дает точных показателей количественного содержания
микробов в воздухе, так как на открытых чашках оседают главным образом
крупные пылевые частицы и плохо улавливаются тонкодисперсные фракции
бактериальных капель и пылевых частиц, содержащих в себе микробы. В связи
14
с этим метод Коха используют только при исследовании воздуха закрытых
помещений.
Таблица 5. Площадь чашки в зависимости от диаметра
Диаметр чашки, см
8
9
10
Площадь чашки, см2
50
63
78,5
Аспирационный метод осаждения микробных аэрозолей – ударноприбивное действие струи воздуха с помощью специального прибора Кротова.
В настоящее время это наиболее совершенный метод исследования как воздуха
закрытых помещений, так и наружного атмосферного.
Аспирационный метод заключается
в том, что определенный объем
воздуха пропускают через аппарат
Кротова, который состоит из трех
узлов (рис. 3): узла для отбора проб
воздуха,
микроманометра
и
питающего механизма, помещенного
в футляр. Узел для отбора проб
воздуха
представляет
собой
цилиндрический корпус, к основанию
которого прикреплен электромотор.
На
оси
мотора
укреплен
центробежный
вентилятор.
В
Рис.
Рис.3.3.Аппарат
АппаратКротова
Кротова
аппарате имеется приспособление, на
которое устанавливают чашку Петри с плотной питательной средой, например
МПА. Вентилятор вращается с частотой 4000…5000 об/мин. Воздух, поступая
через клиновидную щель аппарата, ударяется о поверхность питательной
среды, и на ней оседают микробные клетки, находящиеся в воздухе.
Пропускная способность аппарата 25…50 л воздуха в 1 мин. Чашку из аппарата
вынимают и затем помещают в термостат на 24 ч, а дальше подсчитывают
количество колоний микроорганизмов.
Микробиологические показатели воздуха холодильных камер приведены
в табл. 6.
Фильтрационный метод является наиболее точным методом
исследования воздуха. Он основан на прохождении воздуха через
стерилизованную жидкую или плотную (например, МПА, СА) среду,
удерживающую все проходящие через нее взвешенные частицы, в том числе и
микробов.
15
Таблица 6. Санитарная оценка воздуха холодильных камер по степени
загрязнения их плесенями
Санитарная оценка воздуха
Хорошо
Удовлетворительно
Плохо
Хорошо
Удовлетворительно
Плохо
Число колоний (среднее по 5 чашкам)
Общее
Cladosporium, Thamnidium
о
Температура -12 С и ниже
0…10
0
11…50
1…2
Более 50
Более 2
Температура -11,9оС и выше
0…10
0…1
11…100
2…3
Более 100
Более 3
Исследования по фильтрационному методу удобно проводить при
помощи мембранных ультрафильтров. Для этого на сетку обычного
фильтрационного прибора для исследования воды кладут два кружка
стерильной фильтровальной бумаги, а затем мембранный ультрафильтр
(зеркальной стороной вниз). Аппарат завинчивают и пропускают через него
необходимый объем воздуха (50…100 л) со скоростью 5…10 л/мин. После
этого ультрафильтр матовой (воздушной) стороной прикладывают в двух-трех
местах к поверхности агара в чашке Петри и вместе с чашкой помещают на 24 ч
в термостат.
На мембранных фильтрах размножаются разные микроорганизмы. По
количеству колоний определяют число микробов в 1 л пропущенного через
фильтр воздуха (табл. 7). Если необходимо сделать посев на различные среды
(МПА, СА), мембрану отмывают в точно отмеренном объеме стерильного
физиологического раствора и полученную жидкость высевают.
Таблица 7. Содержание микроорганизмов в 1 м3 воздуха
Лето
Воздух
Всего микроорганизмов
Чистый
Загрязненный
1500
2500
Зима
Зеленящий и
Всего
Зеленящий и
гемолитический микроорганизмов гемолитический
стрептококк
стрептококк
16
4500
36
36
7000
124
5. Требования к содержанию отчета
Отчет должен содержать:
- цель работы;
- краткие сведения из теории;
- описание хода выполнения работы;
- опытные результаты и их обсуждение;
- выводы;
16
- список использованной литературы.
6. Контрольные вопросы
1. По каким критериям проводят санитарную оценку воды, воздуха?
2. Какие правила необходимо соблюдать при отправке проб воды в
лабораторию для бактериологического исследования?
3. Как определяют в воде общее количество микроорганизмов?
4. Как определяют в воде коли-индекс и коли-титр воды?
5. Правила отбора проб водопроводной воды, методы посева и
культивирования.
6. Какие требования предъявляют к воде из различных источников?
7. Какую микрофлору включает воздух и какие существуют методы ее
количественного определения?
8. Методы определения микрофлоры воздуха: седиментационный,
аспирационный, фильтрационный.
9. Характеристики питательных сред для микробиологического анализа
воды и воздуха.
7. Список рекомендуемой литературы
1. Асонов, Н.Р. Микробиология / Н.Р. Асонов - 3-е изд., перераб. и доп. –
М.: Колос, 1997. – 352 с.
2. Перетрутов, А.А. Основы микробиологии и санитарно-гигиенического
контроля малых предприятий пищевых производств: учеб. пособие/
А.А. Перетрутов. – Н. Новгород: НГТУ, 2005. – 259 с.
3. Градова, Н.Б., Бабусенко, Е.С., Горнова, И.Б., Гусарова, Н.А.
Лабораторный практикум по общей микробиологии /Н.Б. Градова,
Е.С. Бабусенко, И.Б. Горнова, Н.А. Гусарова. – М.: РХТУ им. Д.И.
Менделеева, 1999. – 130 с.
4. Трушина, Т.П. Микробиология, гигиена и санитария в торговле /
Т.П. Трушина. – Ростов н/Д.: Феникс, 2000. – 320 с.
17