Поиск и выделение новых природных соединений из морских

Вестник ДВО РАН. 2014. № 1
УДК 577.115:593.4+547.996:593.96+547.925:593.793:593.93+547.94:593.4
Т.Н. МАКАРЬЕВА, А.С. СИЛЬЧЕНКО, А.А. КИЧА, Е.Г. ЛЯХОВА,
С.А. КОЛЕСНИКОВА, Л.К. ШУБИНА, Н.В. ИВАНЧИНА
Поиск и выделение
новых природных соединений
из морских беспозвоночных, исследования
их структур и биологических активностей
Обсуждены некоторые результаты поиска и выделения новых морских природных соединений, проведенных
в ТИБОХ ДВО РАН в 2012–2014 гг., установления их строения и изучения их биологических активностей. Главными биологическими источниками таких веществ были морские беспозвоночные. По своей химической природе выделенные биологически активные вещества принадлежат к различным классам соединений: алкалоидам,
стероидам, терпеноидам и др.
Ключевые слова: вторичные метаболиты, гликозиды, алкалоиды, морские губки, голотурии, морские звезды, биологическая активность, биосинтез.
Search and isolation of new natural compounds from marine invertebrates, investigation of their structure
and biological potency. T.N. MAKARIEVA, A.S. SILCHENKO, A.A. KICHA, E.G. LYAKHOVA, S.A. KOLESNIKOVA, L.K. SHUBINA, N.V. IVANCHINA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS,
Vladivostok).
Some results of the search and isolation of new natural compounds, investigation of their structure and biological
potency done in Pacifi c Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS during 2012–2014 are considered. The main biological sources of these substances were proved to be marine invertebrates. As to chemical composition the extracted
biologically active substances belong to various classes of compounds, i.e. alkaloids, steroids, terpenoids etc.
Key words: secondary metabolites, glycosides, alkaloids, marine sponges, sea cucumbers, starfish, biological
potency, biosynthesis.
Для поиска новых физиологически активных веществ в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН в последние годы использовались
сборы морских организмов, в основном выполненные во время экспедиций на НИС «Академик Опарин» в Японском, Охотском и Беринговом морях и у берегов Вьетнама, а также
бактерии и грибы из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН.
В 2010–2013 гг. в лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ
им. Г.Б. Елякова было выделено около 200 индивидуальных вторичных метаболитов из
ряда ранее не изученных химиками-биоорганиками морских беспозвоночных и некоторых дальневосточных наземных растений, а в начале 2014 г. – еще 20 таких соединений.
МАКАРЬЕВА Татьяна Николаевна – доктор химических наук, главный научный сотрудник, СИЛЬЧЕНКО Александра Сергеевна – кандидат химических наук, научный сотрудник, КИЧА Алла Анатольевна – доктор химических наук, ведущий научный сотрудник, ЛЯХОВА Екатерина Геннадьевна – кандидат химических наук, научный
сотрудник, КОЛЕСНИКОВА Софья Александровна – кандидат химических наук, научный сотрудник, ШУБИНА
Лариса Кимовна – кандидат химических наук, старший научный сотрудник, *ИВАНЧИНА Наталья Владимировна – кандидат химических наук, старший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической
химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *E-mail: ivanchina@piboc.dvo.ru
Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и программы ДВО РАН «Дальний Восток» (проект № 12-I-П6-11).
135
Целевые вещества выделяли или очищали методами препаративной колоночной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на прямой и обращенной фазах. Более 100 из выделенных веществ оказались неизвестными, и поэтому
основной целью следующего этапа работ было установление их химического строения.
Структуры новых природных соединений были определены современными методами
ЯМР-спектроскопии, включая 1H, 13C, COSY, NOESY, HSQC, HMBC, TOCSY, и масс-спектрометрии (EI, LSI, ESI, MALDI-TOF), в том числе с применением тандемной масс-спектрометрии. С помощью химических трансформаций были получены производные изучаемых веществ. Абсолютные конфигурации асимметрических центров установлены
различными методами. Например, для определения абсолютной конфигурации моносахаридов анализировали ацетилированные производные (-)-2-октил-гликозидов соответствующих моносахаридов методом газо-жидкостной хроматографии. Относительные и
абсолютные конфигурации асимметрических центров боковых цепей новых стероидов и
терпеноидов были определены с помощью модифицированного метода Мошера.
Новые низкомолекулярные вторичные метаболиты:
структуры, биологическая активность, биосинтез
Приведем примеры исследований некоторых интересных веществ и их свойств.
Из голотурии Eupentacta fraudatrix, собранной на Морской экспериментальной станции
института в бухте Троицы, был выделен новый тритерпеновый тетраозид – кукумариозид A8 с беспрецедентной гидроксильной группой при C-18 и установлена его структура [14]. В отличие от большинства гликозидов этого животного, кукумариозид A8 не
имел лактонного цикла, а наличие гидроксила при C-18 указывало на то, что этот гликозид
является так называемым горячим метаболитом, т.е. предшественником других веществ,
который быстро превращается в организме в основные метаболиты этого беспозвоночного. Его нахождение позволило уточнить некоторые особенности биосинтетических
превращений гликозидов. Биосинтез тритерпеновых гликозидов идет не последовательными превращениями одного вещества в другое, а мозаичным путем, т.е. превращения
происходят параллельно, с различными предшественниками, причем последовательность
этих превращений может быть неодинаковой для трансформируемых промежуточных соединений. В результате формируется сложная сеть реакций взаимосвязанных веществ, из
которых только конечные продукты накапливаются, а большинство промежуточных метаболитов являются минорными и в организме-продуценте, как правило, не сохраняются,
быстро трансформируясь в конечные продукты. Например, параллельно идут удлинение
углеводной цепи до пяти моносахаридных остатков и окислительные трансформации в
неуглеводных фрагментах, в том числе замыкание лактонного цикла (рис. 1).
Следует отметить, что и биосинтез многих других морских природных соединений,
по-видимому, также протекает мозаичным путем. С этим связана сложность смесей родственных метаболитов во многих морских организмах, а следовательно, и трудности в их
разделении и получении индивидуальных веществ.
В последнее время были выделены из разных видов голотурий и структурно изучены
другие тритерпеновые гликозиды, например соответствующие вторичные метаболиты из
антарктической голотурии Staurocucumis liouvillei, содержащие редкий терминальный моносахаридный остаток – 3-О-метил-D-хиновозу [3].
Шесть моносульфатированных тритерпеновых гликозидов, недавно выделенных нами
из голотурии Cucumaria okhotensis, оказались стимуляторами распластывания и активаторами лизосомальной активности мышиных макрофагов. Также они усиливали образование активных форм кислорода в макрофагах, и, следовательно, эти природные соединения
являются стимуляторами клеточного иммунитета [2].
136
OH
HO
H
O
HO
HO
OH
Me
HO
MeO
HO
O
O
O
O
O
O
O HO
O
OH
OH
OH
O
Me
HO
MeO
O
HO
O
OH
O
O
O HO
OH
HO
HO
O
O
H
OH
NaO3SO
HO
OAc
H
H
OAc
O
O
O
OH
Рис. 1. Структуры минорного «горячего» метаболита и одного из основных гликозидных метаболитов из голотурии Eupentacta fraudatrix
Были изучены также гликозиды из собранной у берегов Индии голотурии Actinocucumis
typica [12], антарктической голотурии Staurocucumis turqueti (=Cucumaria spatha) [13] и
некоторых других беспозвоночных класса Holothurioidea.
Метаболиты морских звезд давно привлекают внимание своим структурным разнообразием и широким спектром физиологической активности. Нами выделены новые полярные стероидные соединения из различных видов дальневосточных и вьетнамских морских
звезд. Например, из дальневосточной морской звезды Leptasterias fisheri выделен новый
гликозид, названный фишериозидом А; его строение напоминает структуры некоторых
желчных спиртов человека, в том числе тех, которые накапливаются при заболеваниях
печени [1]. Примечательно, что и в других видах морских звезд найдены вещества, которые, судя по их строению, образуются при действии ферментов, сходных с ферментами
метаболизма желчных кислот и желчных спиртов высших животных (рис. 2).
Рис. 2. Структура фишериозида А
137
Одно из интересных свойств этих соединений из морских звезд – способность стимулировать рост отростков нервных клеток и защищать клетки от гибели в условиях кислородного голодания. Последняя особенность их физиологического действия была открыта
совсем недавно в результате совместной работы наших ученых и сотрудников Института
молекулярной биологии и биофизики СО РАМН. Эта физиологическая активность, присущая целому ряду полярных стероидов из морских звезд, открывает возможности создания
новых лечебных препаратов для лечения заболеваний головного мозга на основе стероидных метаболитов морских звезд [10].
Всего за последние 4 года было установлено строение около 30 новых полярных стероидов, в том числе полигидроксилированных стериновых производных, моно-, би- и тригликозидов и стероидных олигогликозидов (астеросапонинов) из морских звезд. Недавно
мы изучили протекание биосинтеза этих интересных стероидных соединений в морской
звезде Patiria (=Asterina) pectinifera – самом распространенном виде морских звезд, обитающих в дальневосточных водах. Оказалось, что эти вещества образуются из холестерина и других стеринов, которые поступают в организм морских звезд с пищей. Было установлено, какие трансформации происходят в циклах А и В при биосинтезе этих веществ,
и предложена схема первых стадий их биосинтеза [5].
Низкомолекулярные вторичные метаболиты морских губок на протяжении долгих лет
являются предметом исследования ученых многих стран. Изучаются такие соединения
и в ТИБОХ ДВО РАН. Так, из дальневосточной морской губки Monanchora pulchra была
выделена серия новых пентациклических гуанидиновых алкалоидов – монанхоцидин А
(рис. 3) [4], монанхоцидины В–С [8], монанхомикалины и др. [9]. Были предложены гипотетические пути образования этих новых соединений, а также всех других известных
ранее природных пентациклических гуанидиновых алкалоидов. Показано, что некоторые
из полученных нами веществ высокотоксичны по отношению к опухолевым клеткам,
в особенности лейкемическим клеткам человека [9].
Рис. 3. Структура монанхоцидина А
Так, монанхоцидин проявляет высокую цитотоксическую активность в отношении
клеток лейкемии человека и индуцирует необычно высокий ранний апоптоз (60 %), т.е.
программируемую гибель этих опухолевых клеток. Следовательно, он является мощным
проапоптическим агентом. Еще более активны монанхомикалины. Механизм действия
этих алкалоидов пока неизвестен, в настоящее время он изучается с применением методов протеомики.
Из губки Aka coralliphaga было выделено три новых сульфатированных меротерпеноида, содержащих сесквитерпеновую и гидрохиноновую части: сифонодиктиаль А сульфат,
акадисульфат A и акадисульфат B (рис. 4). Установлена антиоксидантная активность этих
соединений [11].
138
Рис. 4. Антиоксиданты из губки Aka coralliphaga
Рис. 5. Новые алкалоиды из губки Penares sp.
Рис. 6. Новые тритерпеновые лактоны из губки Penares sp. и молекулярное строение одного из них, установленное рентгеноструктурным анализом
Из губки рода Penares, собранной во вьетнамских водах (Южно-Китайское море),
были получены два новых необычных алкалоида: 7-бром-1-(6-бром-1H-индол-3-ил)-9Hкарбазол и 3,11-дибром-13H-индоло[3,2-k]фенантридин. Установлено, что выделенные
алкалоиды являются представителями новых структурных типов. Случаи выделения бромированных карбозольных алкалоидов из морских и наземных организмов крайне редки,
а индоло[3,2-k]фенантридины не были ранее известны ни среди природных, ни среди синтетических алкалоидов (рис. 5). Выделенные соединения показали умеренную токсическую активность в отношении опухолевых клеток человека HL-60 и HeLa [7].
Из этой же морской губки были выделены шесть новых тритерпеноидов, а также ранее известные метаболиты губок: пенастерон, ацетилпенастерол и эргоста-4,24(28)-диен3-он. У новых терпеноидов оказались очень неожиданные структуры: во многих из них
имелось лактонное кольцо в необычном положении и эпокси-группа. Выясненная в ходе
экспериментов стереохимия этих природных веществ была подтверждена рентгеноструктурным анализом кристаллов одного из соединений. Строение некоторых из них показано
на рис. 6 [6].
Полученные тритерпеноиды проявили цитотоксичность в отношении клеток лейкемии
человека HL-60, один из них в низкой концентрации (IC50 = 9,7 мкM).
139
Были изучены различные виды физиологической активности полученных соединений
и их синтетических аналогов, прежде всего имеющие отношение к противоопухолевому
или канцер-превентивному эффектам. Кроме того, изучались иммуномодулирующие, антиоксидантные и некоторые другие активности, включая механизмы действия на клеточном и молекулярном уровне. В работе по изучению физиологической активности были
использованы современные методы: мягкого агара, ПЦР, Вестерн-блоттинг, FACS, MTT,
метод автоматического счета клеток с окрашиванием трипановым синим, масс-спектрометрия, некоторые методы протеомики и др. При биотестировании применялась магнитно-резонансная томография. В экспериментах in vitro и in vivo использовались различные
линии опухолевых клеток человека и лабораторные животные.
Таким образом, в последнее время сотрудниками лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН выделено много интересных природных веществ
и изучены различные виды их физиологической активности. Некоторые соединения, например алкалоиды из губки Penares sp., несомненно, станут моделями для органического
синтеза, и можно с уверенностью предсказать, что в ближайшее время будет осуществлен
синтез этих соединений и их аналогов.
Другие вторичные метаболиты должны быть более детально изучены специалистами
как потенциальные фармацевтические вещества. Необходимо дальнейшее изучение механизмов нейритогенного и нейропротекторного действия доступных полярных стероидов
из морских звезд, обитающих в приморских водах.
Алкалоиды из губок, которые в низких концентрациях индуцируют апоптоз в опухолевых клетках и останавливают клеточное деление, представляют определенный интерес
как потенциальные противоопухолевые агенты. Интересны также новые перехватчики
свободных радикалов из иглокожих и губок, а также вещества, тормозящие трансформацию нормальных клеток в опухолевые при действии на клетки канцерогенов и опухолевых промоторов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кича А.А., Иванчина Н.В., Маляренко Т.В., Калиновский А.И., Дмитренок П.С. Фишериозид А – новый
стероидный гликозид из морской звезды Leptasterias fisheri // Химия природ. соединений. 2012. № 5. С. 719–721.
2. Aminin D.L., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stepanov V.G., Kalinin V.I. Immunomodulatory action of monosulfated triterpene glycosides from the sea cucumber Cucumaria okhotensis: stimulation of activity of mouse peritoneal
macrophages // Nat. Prod. Commun. 2010. Vol. 5, N 12. P. 1877–1880.
3. Antonov A.S., Avilov S.A., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Kalinin V.I., Taboada S., Ballesteros M., Avila C.
Triterpene glycosides from Antarctic sea cucumbers. III: Structures of liouvillosides A4 and A5, two minor disulphated
tetraosides containing 3-O-methylquinovose as terminal monosaccharide units from the sea cucumber Staurocucumis
liouvillei (Vaney) // Nat. Prod. Res. 2011. Vol. 24, N 14. P. 1324–1333.
4. Guzii A.G., Makarieva T.N., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Kuzmich A.S., Dyshlovoy S.A., Krasokhin V.B.,
Stonik V.A. Monanchocidin: a new apoptosis-inducing polycyclic guanidine alkaloid from the marine sponge Monanchora pulchra // Org. Lett. 2010. Vol. 12. N 19. P. 4292–4295.
5. Ivanchina N.V., Kicha A.A., Malyarenko T.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Biosynthesis of polar
steroids from the Far Eastern starfish Patiria (=Asterina) pectinifera. Cholesterol and cholesterol sulfate are converted
into polyhydroxylated sterols and monoglycoside asterosaponin P1 in feeding experiments // Steroids. 2013. Vol. 78.
P. 1183–1191.
6. Kolesnikova S.A., Lyakhova E.G., Kalinovsky A.I., Pushilin M.A., Afiyatullov Sh.Sh., Yurchenko E.A.,
Dyshlovoy S.A., Minh Ch.V., Stonik V.A. Isolation, structures, and biological activities of triterpenoids from a Penares
sp. marine sponge // J. Nat. Prod. 2013. Vol. 76, N 9. P. 1746−1752.
7. Lyakhova E.G., Kolesnikova S.A., Kalinovsky A.I., Afiyatullov Sh.Sh., Dyshlovoy S.A., Krasokhin V.B.,
Minh Ch.V., Stonik V.A. Bromine-containing alkaloids from the marine sponge Penares sp. // Tetrahedron Lett. 2012.
Vol. 53, N 45. P. 6119−6122.
8. Makarieva T.N., Tabakmaher K.M., Guzii A. G., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Shubina L.K., Kuzmich A.S.,
Lee H.S., Stonik V.A. Monanchocidins B-E: polycyclic guanidine alkaloids with potent antileukemic activities from the
sponge Monanchora pulchra // J. Nat. Prod. 2011. Vol. 74, N 9. P. 1952–1958.
140
9. Makarieva T.N., Tabakmaher K.M., Guzii A.G., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Kuzmich A.S., Lee H.S.,
Stonik V.A. Monanchomycalins A and B, unusual guanidine alkaloids highly toxic against leukemic cells from the
sponge Monanchora pulchra // Tetrahedron Lett. 2012. Vol. 53, N 32. P. 4228–4231.
10. Palyanova N.V., Pankova T.M., Starostina M.V., Kicha A.A., Ivanchina N.V., Stonik V.A. Neuritogenic and
neuroprotective effects of polar steroids from the far east starfishies Patiria pectinifera and Distolasterias nipon // Marine
Drugs. 2013. Vol. 11, N 5. P. 1440–1455.
11. Shubina L.K., Kalinovsky A.I., Makarieva T.N., Fedorov S.N., Dyshlovoy S.A., Dmitrenok P.S., Kapustina I.I.,
Mollo E., Utkina N.K., Krasokhin V.B., Denisenko V.A., Stonik V.A. New meroterpenoids from the marine sponge Aka
coralliphaga // Nat. Prod. Commun. 2012. Vol. 7, N 4. P. 487–490.
12. Silchenko A.S., Kalinovsky A.I., Avilov S.A., Andryjaschenko P.V., Dmitrenok P.S., Martyyas E.A., Kalinin V.I.,
Jayasandhya P., Rajan G.C., Padmakumar K.P. Structures and biological activities of typicosides A1, A2, B1, C1 and C2,
triterpene glycosides from the sea cucumbers Actinocucumis typica // Nat. Prod. Commun. 2013. Vol. 8, N 3. P. 301–310.
13. Silchenko A.S., Kalinovsky A.I., Avilov S.A., Andryjaschenko P.V., Dmitrenok P.S., Kalinin V.I., Taboada S.,
Avila C. Triterpene glycosides from Antarctic sea cucumbers IV. Turguetoside A, a 3-O-methylquinovose containing
disulfated tetraoside from the sea cucumber Staurocucumis turqueti (Vaney, 1906) (=Cucumaria spatha) // Biochem.
Syst. Ecol. 2013. Vol. 51. P. 45–49.
14. Silchenko A.S., Kalinovsky A.I., Avilov S.A., Andryjashenko P.V., Dmitrenok P.S., Kalinin V.I., Stonik V.A.
3b-O-Glycosylated 16b-acetoxy-9b-H-lanosta-7,24-diene-3b,18,20b-triol, an intermediate metabolite from the sea
cucumber Eupentacta fraudatrix and its biosynthetic significance // Biochem. Syst. Ecol. 2012. Vol. 44. P. 53–60.
141