Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Пермский национальный исследовательский политехнический университет»
На правах рукописи
БЕЛИК Екатерина Сергеевна
ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА БИОРЕМЕДИАЦИИ
НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ ПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ
БИОСОРБЕНТА НА ОСНОВЕ КАРБОНИЗАТА ИЗБЫТОЧНОГО
АКТИВНОГО ИЛА
03.02.08 – «Экология» (в химии и нефтехимии)
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Научный руководитель –
доктор технических наук,
профессор Рудакова Л.В.
Пермь 2014
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 6
ГЛАВА
1.
КОМПЛЕКСНАЯ
ОЦЕНКА
ВОЗМОЖНОСТИ
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
БИОСОРБЕНТОВ
ПРИ
ВОССТАНОВЛЕНИИ
НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ТЕРРИТОРИЙ ......................................................... 12
1.1. Общая характеристика нефти .................................................................... 12
1.1.1. Физико-химический состав нефти ...................................................... 12
1.1.2. Влияние нефти и нефтепродуктов на почву ...................................... 13
1.1.3. Биологические методы очистки почвы от нефти и нефтепродуктов
........................................................................................................................... 16
1.2. Характеристика нефтяных биосорбентов................................................. 19
1.2.1. Понятие нефтяного биосорбента. Классификация ............................ 19
1.2.2. Преимущества и недостатки использования биосорбентов ............. 22
1.2.3. Обзор биосорбентов в России и в мире ........................................... 24
1.3.Технология получения биосорбентов ........................................................ 27
1.3.1. Носители, используемые для иммобилизации микроорганизмов ... 27
1.3.2. Углеводородокисляющие микроорганизмы – основа нефтяного
биосорбента ..................................................................................................... 30
1.3.3. Формирование микробиоценоза на поверхности носителя ............. 31
1.3.4. Методы иммобилизации микроорганизмов ....................................... 34
1.3.5. Влияние различных факторов на иммобилизацию клеток
микроорганизмов на поверхности носителя ................................................ 40
1.3.6. Способы увеличения эффективности связывания клеток
микроорганизмов с носителем ...................................................................... 41
ГЛАВА 2. ПРОГРАММА, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............ 47
2.1. Методики проведения исследований возможности использования
карбонизата в качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов ... 50
2.1.1. Исследование физико-химических свойств ....................................... 50
2.1.2. Исследование сорбционных свойств носителей ............................... 50
2.2. Методика выделения и получения накопительной культуры
микроорганизмов ............................................................................................... 55
2
2.3. Методика проведения исследований физической иммобилизации
микроорганизмов на пористой поверхности носителей ................................ 56
2.3.1. Подготовка носителя к иммобилизации ............................................. 56
2.3.2. Подготовка накопительной культуры микроорганизмов к
иммобилизации ............................................................................................... 57
2.3.3. Методика проведения исследований физической иммобилизации
микроорганизмов на пористой поверхности носителей ............................. 58
2.4. Методики проведения исследований по изучению процесса деструкции
нефти и нефтепродуктов при использовании биосорбента ........................... 61
2.4.1. Методика проведения исследований по оценке эффективности
биосорбента на основе карбонизата в технологии биоремедиации НЗП . 61
2.4.2. Экспериментальные исследования по определению оптимальной
дозы вносимого биосорбента в технологии биоремедиации
нефтезагрязненной почвы .............................................................................. 65
2.5. Определения условий и сроков хранения полученных биосорбентов .. 65
2.6. Статистическая обработка результатов .................................................... 66
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
КАРБОНИЗАТА И ХАРАКТЕРИСТИКА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ
МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ
ПОЧВ ...................................................................................................................... 67
3.1. Характеристика объекта исследования .................................................. 67
3.2. Исследование возможности использования карбонизата в качестве
носителя для иммобилизации микроорганизмов............................................ 72
3.2.1. Исследование физико-химических свойств носителей .................... 72
3.2.2. Исследование сорбционных свойств носителей ............................... 74
3.2.3. Определение экологической безопасности карбонизата .................. 76
3.2. Характеристика исходной нефтезагрязненной почвы ............................ 78
3.3. Характеристика углеводородокисляющих микроорганизмов,
выделенных из нефтезагрязненной почвы ...................................................... 80
3.3.1. Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов.................. 80
3.3.2. Получение накопительной культуры УВОМ..................................... 82
ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПОЛУЧЕНИЮ
БИОСОРБЕНТА
НА
ОСНОВЕ
КАРБОНИЗАТА
И
ОЦЕНКА
3
ЭФФЕКТИВНОСТИ
ЕГО
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
В
ТЕХНОЛОГИИ
БИОРЕМЕДИАЦИИ НЗП .................................................................................... 87
4.1. Экспериментальные исследования по получению биосорбента на основе
карбонизата ............................................................................................................ 87
4.1.1. Статический способ иммобилизации микроорганизмов без
перемешивания................................................................................................ 88
4.1.2. Статический способ иммобилизации микроорганизмов с
перемешиванием суспензии УВОМ.............................................................. 90
4.1.2.1. Статический способ иммобилизации микроорганизмов с
перемешиванием суспензии УВОМ со скоростью 100 об./мин ........... 91
4.1.2.1. Статический способ иммобилизации микроорганизмов с
перемешиванием суспензии УВОМ со скоростью 400 об./мин ........... 93
4.1.3. Динамический способ иммобилизации микроорганизмов на
поверхности пористых носителей ................................................................. 95
4.1.4. Выбор эффективного метода иммобилизации................................... 97
4.2. Определение технологических параметров при получении биосорбента
динамическим способом ................................................................................... 99
4.2.1. Адсорбционно-адгезионный механизм закрепления
микроорганизмов на поверхности карбонизата........................................... 99
4.2.2. Определение технологических параметров при получении
биосорбента на основе карбонизата методом пропускания суспензии
УВОМ через слой носителя в сорбционной колонке................................ 102
4.2.2.1. Влияние продолжительности иммобилизации на
эффективность процесса ........................................................................ 105
4.2.2.2. Влияние скорости подачи суспензии УВОМ на процесс
иммобилизации........................................................................................ 105
4.2.2.3. Микроорганизмы, выявленные на поверхности биосорбента
................................................................................................................... 106
4.2.2.4. Технологические параметры процесса получения биосорбента
динамическим способом......................................................................... 108
4.3. Экспериментальные исследования по оценке эффективности
биосорбента на основе карбонизата в технологии биоремедиации НЗП .. 112
4.3.1. Результаты экспериментальных исследований использования
биосорбента в технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв .... 113
4
4.3.3. Технология использования биосорбента в технологии
биоремедиации нефтезагрязненной почвы ................................................ 118
4.4. Определения условий и сроков хранения биосорбентов на основе
карбонизата ....................................................................................................... 121
ГЛАВА
5.
РАЗРАБОТКА
ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ
РЕШЕНИЙ
НАПРАВЛЕННЫХ НА СНИЖЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ НА
ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ БИОСОРБЕНТА НА
ОСНОВЕ КАРБОНИЗАТА ................................................................................ 124
5.1. Блок-схема производства биосорбента на основе карбонизата ........... 124
5.2. Материальный баланс процесса производства биосорбента ............... 128
5.3. Расчет и выбор основного технологического оборудования ............... 130
5.4. Охрана окружающей среды при производстве биосорбента ............... 135
5.5. Экономическое обоснование целесообразности применения технологии
получения биосорбента ................................................................................... 136
5.5.1. Расчет капитальных затрат ................................................................ 136
5.5.2. Расчет эксплуатационных затрат ...................................................... 137
5.6. Оценка предотвращенного экологического ущерба в результате
внедрения технологии биоремедиации с использованием биосорбента ... 142
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................. 147
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................... 150
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. В процессах разведки, добычи, транспортировки,
хранения и переработки нефти и нефтепродуктов происходит их попадание в
окружающую среду, вследствие технологических потерь и аварийных
ситуаций, что приводит к деградации природных экосистем, прежде всего,
почвенных.
Для
очистки
технологии,
нефтезагрязненных
отличающиеся
(механические,
оформлению,
экономическим
по
способу
физико-химические,
длительности
затратам.
нефтезагрязненных
почв
различные
деструкции
нефтепродуктов
биологические),
аппаратурному
процесса,
достигаемой
Распространенной
почв
применяются
является
эффективности,
технологией
технология
очистки
биоремедиации,
характеризующаяся длительностью процесса биодеградации углеводородов
нефти (несколько вегетационных сезонов) и зависимостью эффективности
процесса от климатических условий, вследствие чего, интенсификация
данного процесса представляет важную экологическую и технологическую
задачу. Перспективным направлением по интенсификации очистки объектов
окружающей среды от нефти с помощью микроорганизмов является
использование биосорбентов.
В качестве носителя для получения биосорбента используются
различные природные (перлит, керамзит, силикагель, сапропель, торф и т.д.)
и
искусственные
(полипропилен
полиуретан,
тефлон,
фенолформальдегидные пенопласты) материалы. Широко распространены
биосорбенты на основе торфа (Хабибуллина Ф.М., Арчегова И.Б., Козьминых
А.Н., Жучихин И.С.), на основе древесины (Ягафарова Г.Г., Карасева Э.В.,
Самков А.А.) и полимерных материалов (Рязанова Т.В., Федорова О.С.). В
качестве носителей могут быть использованы некоторые промышленные
отходы, отвечающие определенным критериям. Расширение базы вторичных
материалов для получения биосорбентов, позволяет использовать ресурсный
потенциал отходов, получить новые материалы с заданными свойствами,
6
применяемыми
в
природоохранных
технологиях,
и
минимизировать
негативное воздействие отходов на объекты окружающей среды.
На предприятиях нефтехимического комплекса внедряются системы
термического обезвреживания избыточного активного ила, в результате чего
образуется значительное количество (до 7,5 % от исходной массы отходов)
макропористого
материала
–
карбонизата,
размещение
которого
в
окружающей среде в виде отхода нерационально и не решает проблему
сокращения объемов отходов, поступающих на полигоны захоронения. В то
же время по механическим и физико-химическим свойствам карбонизат
может соответствовать требованиям, предъявляемым к носителю для
иммобилизации микроорганизмов.
В литературных источниках отсутствуют данные по использованию
карбонизата на основе избыточного активного ила в качестве носителя для
иммобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов и применения
полученного
биосорбента
для
интенсификации
биоремедиации
нефтезагрязненных почв, в связи с чем исследования в данном направлении
представляют собой актуальную экологическую задачу.
Цель работы: минимизация воздействия объектов нефтехимических
отраслей промышленности на почвенные экосистемы путем повышения
эффективности технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв (НЗП) за
счет использования биосорбента на основе карбонизата, являющегося
отходом процесса пиролиза избыточного активного ила биологических
очистных сооружений предприятий нефтехимического комплекса.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить
следующие задачи:
1.
Провести комплексный анализ технологий биоремедиации НЗП и
способов их интенсификации, в том числе с использованием биосорбентов,
обеспечивающих
достижение
экологически
приемлемых
остаточных
концентраций нефтепродуктов в почвах. Выявить критерии, предъявляемые к
7
носителям, являющимися
отходами производства, для иммобилизации
углеводородокисляющих микроорганизмов.
2.
процесса
Обосновать возможность использования карбонизата - отхода
низкотемпературного
биохимических
предприятия
очистных
-
в
углеводородокисляющих
пиролиза
избыточного
сооружений
качестве
активного
ила
нефтеперерабатывающего
носителя
для
микроорганизмов,
иммобилизации
выделенных
из
нефтезагрязненных почв;
3.
Исследовать механизм иммобилизации УВОМ на поверхности
карбонизата, разработать способ получения биосорбента, основанный на
иммобилизации УВОМ на пористой поверхности карбонизата
4.
Обосновать основные технологические параметры процесса
иммобилизации микроорганизмов на поверхности карбонизата и разработать
принципиальную технологическую схему получения биосорбента на основе
карбонизата для очистки нефтезагрязненных почв.
5.
Оценить эффективность полученного биосорбента в технологии
биоремедиации НЗП, определить условия проведения процесса очистки от
нефтепродуктов;
рассчитать
технико-экономические
параметры
производства биосорбента на основе карбонизата и предотвращенный
экологический ущерб с учетом интенсификации технологии биоремедиации
НЗП за счет применения биосорбента и утилизации вторичного отхода карбонизата.
Научная новизна результатов исследования.
1.
Доказана возможность использования макропористого сорбента
(объем макропор 0,544 см3/г) - карбонизата, отхода низкотемпературного
пиролиза избыточного активного ила биохимических очистных сооружений
предприятий нефтехимического комплекса, в качестве носителя для
иммобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов.
2.
Установлено,
что
закрепление
углеводородокисляющих
микроорганизмов размером 4-5 мкм на поверхности макропор карбонизата
8
осуществляется по адсорбционно-адгезионному механизму. Сила адгезии
составляет 1,4*10-9 г*см2/с, число адгезии – 97,1 %.
3.
Определены параметры процесса физической иммобилизации для
получения биосорбента: биомасса сухих клеток микроорганизмов в исходной
суспензии – не менее 1,0 г/л, общее количество микроорганизмов – не менее
107
КОЕ/мл.
Установлено,
микроорганизмов
–
оптимальное
5,0±0,5
часов,
время
скорость
для
иммобилизации
потока
суспензии
микроорганизмов – 50±10 мл/ч.
4.
Доказана возможность использования биосорбента, полученного
на основе карбонизата, в технологии биоремедиации НЗП и установлено
повышение эффективности очистки НЗП, по сравнению с традиционными
способами биоремедиации, в 1,7 раза.
Практическая значимость.
Предложен способ получения биосорбента на основе карбонизата,
используемого для интенсификации биоремедиации НЗП.
Разработана технология получения биосорбента на основе карбонизата,
отхода
процесса
пиролиза
избыточного
активного
ила
нефтеперерабатывающего предприятия, получены исходные данные для
получения
биосорбента
в
промышленном
масштабе.
Использование
карбонизата в технологическом цикле производства биосорбента позволит
снизить воздействие на окружающую среду за счет уменьшения площади
земель,
занимаемых
размещаемыми
в
окружающей
среде
отходами
производства.
Разработаны технические условия на биосорбент, полученный в результате
иммобилизации УВОМ на карбонизате (ТУ 2162-001-02069065-2014), и
технологический регламент на производство биосорбента на основе карбонизата
и углеводородокисляющих микроорганизмов (ТР 02069065-01-2014).
Результаты
исследований
используются
в
учебном
процессе
подготовки бакалавров и магистров по направлению 280700 «Техносферная
безопасность», профиль «Инженерная защита окружающей среды» в курсах
9
лекций
по
дисциплинам
«Экология»,
«Микробиология
и
основы
биотехнологии», «Биотехнологические методы утилизации и переработки
твердых бытовых и промышленных отходов», «Промышленная экология».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1.
Оценка
физико-химических
и
токсикологических
свойств
карбонизата, образующегося в процессе пиролиза избыточного активного ила
биологических очистных сооружений нефтеперерабатывающего предприятия
и анализ основных направлений его использования.
2.
Результаты
исследования
по
обоснованию
возможности
использования карбонизата, в качестве носителя для иммобилизации
микроорганизмов;
3.
Результаты
исследования
по
иммобилизации
углеводородокисляющих микроорганизмов на поверхности карбонизата;
4.
Основные закономерности и условия получения биосорбента на
основе карбонизата;
5.
Технологии получения биосорбента на основе карбрнизата и его
использования в процессе биоремедиации НЗП с целью интенсификации
процесса. Эколого-экономическая оценка предложенных технологических
решений.
Апробация
работы.
Основные
положения
и
результаты
диссертационной работы докладывались на: Всероссийской конференции
«Экологические проблемы урбанизированнных территорий», г.Пермь, 2011 г.;
ΙΧ, Χ Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов
и молодых ученых «Экология и научно-технический прогресс. Урбанистика»,
г.Пермь, 2011 г., 2012 г.; ХIV Региональной научно-практической конференции
студентов и молодых ученых «Химия. Экология. Биотехнология», г.Пермь,
2012 г.; XII Международной мультидисциплинарной научной Геоконференции
«SGEM
2012»,
София,
Болгария,
2012;
Международной
молодежной
конференции «Экологические проблемы горнопромышленных регионов», г.
Казань, 2012 г.; II Международной конференции «Окончательное захоронение
10
как элемент современного управления отходами», Эспу, Финляндия, 2013;
ΧΙ Международном конгрессе по управлению отходами и природоохранными
технологиями ВэйстТэк-2013 Москва, 2013 г., Международной научнотехнической конференции «Защита окружающей среды от экотоксикантов»,
г.Уфа, 2014 г.
Личный вклад автора заключается в разработке методик проведения
исследований, анализе и обобщении литературных данных и результатов
собственных исследований, в разработке технологической схемы получения
биосорбента на основе карбонизата, оценке эффективности его применения в
технологии биоремедиации НЗП.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных
работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. 2 статьи
опубликовано в журналах, входящих в базу данных Scopus.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, пяти глав, заключения, списка литературы. Основное содержание
изложено на 160 страницах машинописного текста, включающих 36
рисунков
и
44
таблиц.
Библиографический
список
включает
121
наименования цитируемых работ российских и зарубежных авторов.
Автор благодарен коллегам кафедры «Охрана окружающей среды»
ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический
университет»,
в
частности:
научному
руководителю,
профессору
Л.В.Рудаковой за поддержку, наставничество и руководство над подготовкой
работы; профессору Я.И. Вайсману; профессору И.С. Глушанковой;
выпускникам кафедры М.Е. Калашниковой и Г.А. Некрасовой за помощь в
проведении экспериментальных исследований.
Настоящая
работа
выполнена
в
рамках
тематического
плана
Министерства образования и науки Российской Федерации «Исследование
закономерностей
получения сорбентов
и
биосорбентов в
процессах
комплексной переработки углеродсодержащих отходов» (номер гос. рег.НИР
5.3974.2011).
11
ГЛАВА
1.
КОМПЛЕКСНАЯ
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ОЦЕНКА
БИОСОРБЕНТОВ
ПРИ
ВОЗМОЖНОСТИ
ВОССТАНОВЛЕНИИ
НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ТЕРРИТОРИЙ
1.1. Общая характеристика нефти
1.1.1. Физико-химический состав нефти
Нефть – это природная маслянистая жидкость, состоящая в основном
из сложной смеси углеводородов различной молекулярной массы и
некоторых других органических соединений, являющаяся важнейшим
полезным ископаемым [1, 2].
Нефти по своему составу весьма многообразны, поэтому существуют
различные классификации, позволяющие различать их. Наиболее известной
является классификация, в основе которой определяют углеводородный
состав нефти. Нефти подразделяют на 6 типов: метановые, метанонафтеновые, нафтеновые, нафтено-ароматические, ароматико-нафтеновые и
ароматические нефти [3, 4].
Помимо углеводородов в состав нефти входят вещества, содержащие
примесные атомы. Серосодержащие – сероводород, меркаптаны, моно- и
дисульфиды, тиофены и тиофаны, а также полициклические и т.п.;
азотсодержащие – преимущественно гомологи пиридина, хинолина, индола,
карбозола, пиррола; кислородсодержащие – нафтеновые кислоты, фенолы,
смолисто-асфальтеновые
и
др.
вещества
(сосредоточены
обычно
в
высококипящих фракциях). Элементный состав нефти (%):углерод – 82-87,
водород – 11-14,8, азот – 0,001-1,8, сера – 0,01-6, кислород – 0,005-0,35 и
др.Всего в нефти обнаружено более 50 элементов. Так, наряду с выше
перечисленными, в нефти присутствуют ванадий, никель, хлор и т. д. [5].
Нефть – горючая маслянистая жидкость от светло-коричневого до
темно-бурого цвета. Средняя молекулярная масса нефти – 220-400, плотность
нефти зависит от месторождения и колеблется от 0,65до 1,05 г/см3. По
величине плотности нефти условно различают: легкие с плотностью ниже
12
0,83, средние – 0,831-0,860, тяжелые – выше 0,860 г/см3. [6].Начало кипения
нефти обычно выше 28 °С. В зависимости от температуры кипения выделяют
различные фракции нефти (табл.1.1.).
Таблица 1.1 - Фракции нефти и их температуры кипения [7]
Температура кипения, оС
Углеводородные фракции
Ниже 30
Углеводородные газы
(бутан и более легкие)
Бензин(газолин)
Нафта, тяжелый бензин,
бензинолигроиновая фракция
Керосин
Газойль
Остаток (мазут)
30-105
105-160
160-230
230-430
выше 430
Температура застывания колеблется от + 30 до – 60 °С и зависит в
основном от содержания парафина (чем его больше, тем температура
застывания выше). Вязкость изменяется в широких пределах и зависит от
содержания в ней асфальтосмолистых веществ. Температура вспышки нефти
колеблется в широких пределах (от ниже – 35 до 120 °С) и зависит от
фракционного состава и давления насыщенных паров. Нефть растворима в
органических растворителях, в воде при обычных условиях практически
нерастворима, но может образовывать с ней стойкие эмульсии [2, 8].
1.1.2. Влияние нефти и нефтепродуктов на почву
Загрязнение нефтью и нефтепродуктами влияет на морфологические,
физические,
химические,
биологические
свойства
почвы,
которые
определяют ее плодородие и экологические функции. Изменение свойств
почвы при загрязнении нефтью, а также процессы ее миграции, аккумуляции
и метаболизма зависят от физико-химического состава и количества
пролитой нефти, почвенно-климатических и ландшафтных условий, типа
почвы, наличия тех или иных биохимических барьеров, каналов миграции и
диффузии в почвенном профиле [9].
13
При нефтяном загрязнении происходит изменение окраски почвы (в
верхней части профиля – черные, серо-коричневые оттенки, в нижней –
темно-бурые, коричнево-бурые, буро-охристые), увеличивается плотность,
появляются маслянистые и радужные пленки [7, 10].Глубина проникновения
нефти в почвенном профиле зависит от свойств нефти и механического
состава почвы.
Изменение морфологических признаков почвы влечет за собой и
изменение физических свойств, а именно происходит увеличение количества
водопрочных агрегатов, структурных отдельностей размером больше 10 мм,
агрегирование почвенных частиц, а содержание агрономически ценных
структурных отдельностей уменьшается. Вследствие изменения физических
свойств почвы при загрязнении происходит вытеснение воздуха нефтью,
нарушение поступления воды, питательных веществ, что является главной
причиной торможения развития растений и их гибели [9].
Загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами вызывают изменения в
их гумусном состоянии. Поскольку основным элементом, входящим в состав
нефти, является углерод, массовое содержание которого колеблется в
пределах 83-87%, то содержание органического вещества в расчете на общий
углерод и гумус в загрязненных почвах возрастает за счет углерода нефти
[10]. Параллельно с увеличением привнесенного углерода идет процесс
качественного изменения битуминозных веществ и группового состава
гумуса. Эти изменения зависят от физико-химических свойств нефти и
органического вещества почвы.
Одновременно
с
ростом
содержания
привнесённого
углерода
происходит увеличение отношения C:N. При этом изменения содержания
общего азота не значительны. Чем уже отношение C:N, тем выше
подверженность
органического
вещества
минерализации.
Наиболее
благоприятны для микробного гидролиза соединения с величиной C:N от 10
до 20. В нефтезагрязненной почве отношение C:N колеблется от 50 до 400420 в зависимости от количества привнесенного углерода и типа почвы, что
14
приводит к ухудшению азотного режима почв и нарушению корневого
питания растений [11].
Кроме того, в нефтезагрязненных почвах происходит уменьшение
содержания подвижных форм фосфора и калия[10].Изменение кислотности
почв
зависит
от
качества
нефти
и
содержания
в
ней
высокоминерализованных пластовых вод.
Воздействие
нефти
на
комплекс
почвенных
микроорганизмов
неоднозначно. С одной стороны, нефтяное загрязнение стимулирует рост
определенных видов, с другой - ингибирует [12].
Большинство исследований, проведенных в различных климатических
зонах, показало, что при нефтяном загрязнении увеличивается численность и
активность углеводородокисляющих микроорганизмов, осуществляющих
подготовительный этап метаболизма углеводородов [10, 13-17]. Доказано,
что именно они наиболее специфично реагируют на нефтяное загрязнение
почвы.
В результате обволакивания почвенных агрегатов нефтью ухудшается
доступ кислорода, что способствует развитию анаэробных микроорганизмов.
Одной из причин анаэробиозиса может быть интенсивное потребление
кислорода возросшим числом аэробных УВОМ [9].
Влияя на структуру микробного ценоза, нефтяное загрязнение
воздействует и на интенсивность многих биохимических процессов,
осуществляемых в основном ферментами микроорганизмов. Ферментативная
активность почв обусловливается не только различным количеством
микроорганизмов, но и их разнообразием и физиологической активностью.
Поэтому количественные изменения, происходящие в микробном ценозе
загрязненных почв, не всегда отражают
изменение ее активности.
Микробиологическую деградацию нефти обусловливают два фактора:
наличие
сложных
ферментов
-
оксидоредуктаз,
осуществляющих
окислительно-восстановительные процессы всех типов, и наличие в клетках
приспособлений, обеспечивающих поглощение гидрофобного субстрата [12].
15
Окисление нефти начинается сразу после ее попадания в почву.
Выделяют три наиболее общих этапа трансформации нефти в почвах:
1) физико-химическое и частично микробиологическое разложение
алифатических углеводородов;
2) микробиологическое
разложение,
главным
образом
низкомолекулярных структур различных классов, образование смолянистых
веществ;
3) трансформацию
высокомолекулярных
соединений:
смол,
асфальтенов, циклических углеводородов.
Длительность процесса трансформации нефти в разных почвенноклиматических зонах может быть различной – от нескольких месяцев до
нескольких десятков лет [18].
1.1.3. Биологические методы очистки почвы от нефти и
нефтепродуктов
Для восстановления техногенно нарушенных территорий применяются
различные
технологии,
нефтепродуктов
оформлению,
отличающиеся
(физико-химические,
длительности
по
способам
биологические),
процесса,
достигаемой
деструкции
аппаратурному
эффективности,
экономическим затратам.
Выбор технологий очистки и восстановления почв, загрязненных
углеводородами нефти, основан на использовании комплексного экологоэкономического
параметры
критерия,
процесса
и
учитывающего
экологическую
основные
технологические
эффективность
получаемых
результатов.
Одним из главных и приоритетных направлений в области охраны
окружающей
среды
и
рационального
природопользования
являются
разработка и внедрение усовершенствованных технологий восстановления
почв методом биоремедиации, в основе которого заложен принцип
16
самоочищения нефтезагрязненных территорий с участием аборигенной или
привнесенной микрофлоры.
Теоретические основы биоремедиации НЗП
Биоремедиация (bio – жизнь, remedio – лечение) – это способ очистки и
восстановления
поллютантов
НЗП,
основанный
микроорганизмами
на
биологическом
(бактерии,
разложении
микроскопические
грибы,
актиномицеты), в результате различных биохимических реакций и физикохимических процессов, осуществляемых с участием биоты [2, 19].В основе
технологии
биоремедиации
заложен
принцип
самоочищения
нефтезагрязненных территорий с участием аборигенной или привнесенной
микрофлоры.
Активизация аборигенной микрофлоры направлена на создание
оптимальной среды для развития определенных групп микроорганизмов,
использующих нефть в качестве источника питания, что достигается за счет
внесения в почву минеральных удобрений, поддержания оптимальной
температуры, влажности и кислотности среды с помощью агротехнических
приемов [19].
Внесение в почву различных биопрепаратов, в основе которых
заложены определенные культуры микроорганизмов, позволяет повысить
эффективность процесса очистки почвы от нефти и нефтепродуктов за счет
увеличения численности нефтеокисляющих микроорганизмов [20-22].
Биопрепараты
могут
применяться
в
виде:
водных
суспензий
микроорганизмов; обезвоженной микробной биомассы; иммобилизованных
на твердом носителе клеток микроорганизмов [20-22]. Преимущества и
недостатки методов биоремедиации НЗП с помощью биопрепаратов
представлены в табл. 1.2.
17
Таблица 1.2. – Преимущества и недостатки методов биоремедиации
НЗП с помощью биопрепаратов[20-22]
Метод
биоремедиации
Преимущества
НЗП
Водная
суспензия эффективность
микроорганизмов
очистки на начальных
этапах
биоремедиации.
Недостатки
низкое
сродство
к
гидрофобному
нефтезагрязнению,
необходимость
периодически
добавлять
препарат
для
более
эффективной
деструкции
углеводородов нефти,
- трудности хранения и
перевозки препарата.
Обезвоженная
- небольшие объемы низкая
выживаемость
микробная масса
препарата.
микроорганизмов,
необходимость
периодически
добавлять
препарат
для
более
эффективной
деструкции
углеводородов нефти,
- высокие затраты на
производство,
необходимость
предварительной активации
биопрепарата.
Микроорганизмы,
высокая - увеличение объёма (веса)
иммобилизованные концентрация клеток препарата.
на твердом носителе на
поверхности
носителя,
защищенность
клеток от воздействия
негативных факторов.
На основании выше изложенного, в настоящее время большой интерес
представляет использование технологии биоремедиации нефтезагрязненных
почв
с
помощью
иммобилизованных
на
поверхности
носителя
микроорганизмов.
18
1.2. Характеристика нефтяных биосорбентов
1.2.1. Понятие нефтяного биосорбента. Классификация
На основании литературных источников [23], под биосорбентом
понимаются микроорганизмы сами по себе или связанные с инертным
носителем, способные экстрагировать металлы или органические вещества
путем их селективного удерживания.
Нефтяные
биосорбенты
–
это
сорбенты,
иммобилизованные
культурами микроорганизмов, обеспечивающих биологическое разложение
нефти и нефтепродуктов.
Блок-схема производства нефтяных биосорбентов представлена на
рис.1.1.
Рис.1.1. Блок-схема производства биосорбентов
Классифицировать биосорбенты можно по различным признакам, т.к. в
основе лежат сорбционные материалы и микроорганизмы. Классификация
нефтяных биосорбентов представлена в табл.1.3.
19
песок, глины и
т.п.
крупнодисперсные
крошка, гранулы,
хлопья
из природного сырья
растительного и животного
происхождения и отходов их
переработки
органические
синтетические
безразличного смачивания
статический угол смачивания материала
волокнистые
прессованные
тканые и нетканые
плиты или изделия иной
материалы
конфигурации
По характеру смачивания
20
гидрофобные
статический угол смачивания материала сор-
комбинированные
сорбирующие боны, подушки, маты с оболочкой из проницаемого материала
формованные
полипропилен
мох, листва, кора, опилки, солосапропель, сланцы, торф, уголь, графит
полиуретан, тефлон,
ма, шелуха от переработки зернефтешламы
и т.п.
фенолформальдегидн
новых, макулатура
ые пенопласты
По внешнему виду
органоминеральные из каустобиолитов
гидрофильные
статический угол смачивания материала
порошки
мелкодисперсные
перлит, керамзит,
силикагель и т.п.
из естественных
минералов
дисперсные
из искусственных
неорганических
материалов
неорганические
наносимые на поверхность для удаления поверхностных загрязнений загружаемые в фильтры для удаления объемных загрязнений воды и
воды и почвы
воздуха
По преимущественному способу утилизации
Вывоз на свалку Использование в качестве
отмывка
отжим
термическая
для естественного
добавок к асфальту и
биоразложение сжигание
сорбата
регенерация
продукта
отгонка сорбата
разложения
другим композициям
растворителями
По исходному сырью
По назначению
Таблица 1.3. – Классификация нефтяных сорбентов [22, 24-28]
мезопористые
диатомитовые
глины, селикагель,
некоторые виды
активных углей
активные угли из
косточковых
радиус кривизны пор радиус кривизны
1,5- 200 нм
пор менее 1,5 нм
мезопористые
сорбенты из
торфа,
древесины, с/х
отходов
радиус
кривизны пор
меняется в
широком
диапазоне
гетеропористые
отделение фермента с
помощью полупроницаемой
мембраны
использование двухфазной
реакционной среды
бактерии
актиномицеты
грибы
дрожжи
биосорбенты, в состав которых входит несколько штаммов
микроорганизмов
В зависимости от используемых микроорганизмов
ковалентное
связывание
21
сорбенты из
волокнистых
синтетических
или природных
материалов
с анизотропной
пористостью
химическая
иммобилизация
минеральные
сорбенты, сортбенты из угля,
графита, нефтяных остатков,
вспененные
синтетические
сорбенты
с изотропной
пористостью
бента водой больше 900
Биосорбенты на основе штаммов микроорганизмов подразделяются на две основные группы
включение в поры геля
физическая иммобилизация
По способу закрепления микроорганизмов на поверхности носителя
керамзит, перлит,
синтетические
сорбенты, кирпичная
крошка
радиус кривизны пор
более 200 нм
макропористые
сорбента водой примерно равен 900
По пористой структуре
биосорбенты на основе монокультуры
адсорбция
песок, сера
непористые
сорбента водой меньше 900
1.2.2. Преимущества и недостатки использования биосорбентов
Как и любой технологический процесс, применение биосорбентов в
технологии
биоремедиации
нефтезагрязненной
почвы
имеет
свои
преимущества и недостатки.
К основным преимуществам использования иммобилизованных клеток
на поверхности носителя можно отнести [26, 29]:
1. Возможность более длительной эксплуатации свойств клеток в
иммобилизованном состоянии по сравнению с однократным использованием
свободных культур.
2. Увеличение продуктивности в результате увеличения концентрации
биомассы микроорганизмов в единице рабочего объема носителя.
3. Снижение энергозатрат на процесс в целом, т.к. рабочие среды
нередко
содержат
происходит
меньшее
упрощение
количество
процедуры
растворимых
выделения
и
примесей,
очистки
то
конечных
продуктов.
4. Сохранению
клеток
способствует
адсорбция
и
частичная
дезактивация микроорганизмов.
5. Устойчивость клеток к действию различных неблагоприятных
инактивирующих
внешних
факторов
(температура,
кислотность,
концентрация электролитов или токсических веществ и других) в результате
иммобилизации иногда становится возможной еще дополнительная защита
культуры от воздействия патогенной для нее микрофлорой при случайных
нарушениях стерильности биотехнологической системы.
При применении биосорбента происходит активизация природного
самоочищения за счёт природных механизмов, которые без препарата
ингибируются под действием разлитых нефтепродуктов [22].
При внесении биопрепарата в загрязненную нефтепродуктами почву,
численность микроорганизмов начинает расти, используя в качестве питания
углеводороды
нефти.
В
природных
условиях
штаммы
данных
22
микроорганизмов сохраняют свою активность и численность популяции на
время биодеструкции (ликвидации) углеводородов и при уменьшении его
количества уменьшается и их численность. Поэтому, в результате полного
поглощения нефтепродуктов, бактерии теряют питательную среду и
отмирают, создавая на грунте гумус, в воде ил. Микроорганизмы также
гибнут, если находятся отдельно от носителя. Таким образом, исключается
возможность такого явления, как интродукция - микробное загрязнение
природной среды и делает хранение, применение бисорбента безопасным [25,
26, 29].
Практическое применение показало, что биосорбент значительно (на
50-60%) упрощает механический сбор нефти, если гидрологические и
метеорологические условия для этого благоприятны. Обработка нефтяного
пятна биосорбентом препятствует его дальнейшее распространение (эффект
физико-химических бонов), и позволяет собрать более 90 % этого
загрязнителя,
а
не
50-60
%,
как
это
удаётся
в
благоприятных
гидрологических и метеорологических условиях [22].
Несмотря на огромное количество преимуществ использования
биосорбентов в технологиях очистки биоремедиации почв, их применение в
настоящее время ограничено в силу недостаточной селективности, малой
механической прочности; сложной и дорогостоящей регенерации, часто
сопоставимой по затратам с производством сорбента.
Недостаточно исследованы механизмы поглощения и утилизации
токсичных веществ в структуре биосорбента, отсутствуют данные о
динамике
окисления
биосорбентов
перед
нефтепродуктов,
их
нет
использованием
данных
и
об
снижении
активации
активности
биосорбентов в процессе хранения, отсутствуют данные о последствиях
влияния биосорбентов на почву и на генетику растений.
К недостаткам применения биосорбентов, как и к применению
биопрепаратов
на
основе
микроорганизмов
в
целом
(обезвоженная
микробная масса, водная суспензия микроорганизмов), можно отнести
23
температурные условия проведения процесса очистки, т.к. при температуре
ниже 5 °С размножение микроорганизмов практически останавливается.
Кроме того, существует проблема по формированию универсального
штамма деструктора, который эффективен в каждом отдельном случае с
учетом температуры окружающей среды, биосостава почвы, географии
проведения работ, нефтепродукта [24].
В связи с этим исследования, направленные на получение новых видов
биосорбентов и обоснование их использования в качестве альтернативы
традиционным технологиям, представляют собой актуальную экологическую
задачу.
1.2.3. Обзор биосорбентов в России и в мире
В
настоящее
время
разработано
значительное
количество
биосорбентов, отличительной особенностью которых является разнообразие
используемых носителей и иммобилизованных на его поверхности культур
микроорганизмов [30].
Известен способ очистки воды от нефтяных загрязнений с помощью
сорбента
на
основе
гидрофобизированного
силикагеля,
иммобилизированного культурой Candida Intermedia [31].
Сорбент на основе алюмосиликатных носителей, выбранных из ряда:
каолин, перлит, цеолит, предусматривает нанесение микроорганизмов из
ряда: Pseudomonas Aeruginosa, Methanomonas Vetharia, Basterium Aliphaticum,
Basillus Totulicum, Mycobocterium Iagicola и др., и биогенных веществ,
выбранных из ряда: NH4Cl, (NH4)P04, CaC12 и др. [32].
Известен гидрофобный органоминеральный нефтяной биосорбент на
основе сорбента "СОРБОНАФТ". Биосорбент изготовлен с использованием
нефтеокисляющих микроорганизмов, а именно биомассы штамма бактерий
Rhodococcus erythropolis HK-16 или Arthrobacter sp.HK-15 или дрожжевого
гриба Candida lipolytica КБП-3308 или Candida guilliermondii КБП-3175, или
Pichia
guilliermondii
КБП-3205,
или
их
бактериально-дрожжевого
24
консорциума, иммобилизованного в гидрофобный сорбент нефти на основе
торфа путем обрастания сорбента бактериями и/или грибами [33].
Биосорбент
для
очистки
водной
среды
от
загрязнения
нефтепродуктами, который включает отбор гидрофобных нефтеокисляющих
микроорганизмов, наработку их биомассы, иммобилизацию ее на сорбент
"Эколан" в соотношении 5:1 по массе при рН≤7, добавку минеральных
удобрений в концентрации 2-16 г/л в присутствии солей алюминия[34].
Известен биосорбент содержит гидрофобный сорбент нефти на основе
торфа и биомассу штаммов микромицета Fusarium lateritium HK-204 или
Gliocladium deliquescens HK-205 или Gliocladium deliquescens HK-206 или
консорциума этих штаммов, иммобилизованных в гидрофобный сорбент
нефти посредством обрастания сорбента грибами [35].
Биосорбент для очистки водоемов от нефти и нефтепродуктов,
включающий в качестве носителя гидрофобный нефтяной сорбент на основе
торфа и нефтеокисляющие микроорганизмы, иммобилизованные на носителе
в эффективном количестве. В качестве микроорганизмов используют
биомассу штаммов бактериальной культуры Rhodococcus eqvi Р-72-00,
дрожжевой культуры Rhodotorula glutinis 2-4 М и мицелиального гриба
Trichoderma lignorum F-98 [36].
Сравнительная
характеристика
широко
известных
в
России
биосорбентов - аналогов, предназначенных для ликвидации нефтяного
загрязнения на поверхности воды и почвы, представлена в табл.1.4.
25
Матрица
1-5
Порошок
0,2-1
Порошок
3-10
140-500
200-350
100-125
18-25
Размер
гранул,
мм
* зависит от степени загрязненности территории
Алюмосилика
ты (перлит,
вермикулит)
«Биосорбона Гидрофобный
фт»
торфоминерал
ьный
нефтяной
сорбент
«Сорбонафт»
«Эконадин»
Высокосортный
сфагновый
торф
«УнисорбВспененный
полимер
Био»
(карбамид)
«БОС»
Биосорбент
Насыпная
плотность,
кг/м3
30-60
7-8
4-7
Биосорбционная емкость
по нефти, кг
нефти / кг
препарата
6-9
1-20
2-6
Расход
препарата
из расчета
на 1 га
НЗП, т*
1-9
Экологичес
ки
безопасен
Не
требуетс
я
Страна/
город
26
ООО «НПФ Россия/г.К
«Экосорб» расноярск
НПП
Украина/г.
«ЭКОНАД»
Одесса
ООО «НПФ Россия/г.С
«ЭкоанктМаркетинг» Петербург
ЗАО «ЦЭИ Россия/г.К
Пресс-торф»
иров
Способ
Производите
утилизац
ль
ии
Не
требуетс
я
Экологичес Перерабо
ки
тка в
безопасен
топливн
ые
торфобр
икеты
Экологичес
Не
ки
требуетс
безопасен
я
5 класс
Экологичес
кая
безопаснос
ть
Таблица 1.4.– Сравнительная характеристика биосорбентов – аналогов [37-40]
1.3.Технология получения биосорбентов
1.3.1. Носители, используемые для иммобилизации
микроорганизмов
В настоящее время в качестве носителя для получения биосорбента
используются
различные
природные
(перлит,
керамзит,
силикагель,
сапропель, торф и т.д.) и искусственные (полипропилен полиуретан, тефлон,
фенолформальдегидные пенопласты) материалы. Широко распространены
биосорбенты на основе торфа (Хабибуллина Ф.М., Арчегова И.Б.,
Козьминых А.Н., Жучихин И.С.), на основе древесины (Ягафарова Г.Г.,
Карасева Э.В., Самков А.А.) и полимерных материалов (Рязанова Т.В.,
Федорова О.С.) [22, 24-26, 33, 41-43].
В связи с образованием значительных объемов отходов производства и
потребления
наибольший
интерес
представляет
переработка
углеродсодержащих отходов с целью получения матрицы в качестве основы
для производства биосорбентов.
В качестве носителя для микроорганизмов могут быть использованы
отходы
нефтеперерабатывающей,
нефтедобывающей
и
целлюлозно-
бумажной промышленности, лесоперерабатывающих и лесотехнических
производств, отходы полимерных материалов и т.д.
Расширение базы вторичных материалов для получения сорбентов,
позволяет получать материалы с заданными сорбционными свойствами и
требуемыми
техническими
характеристиками:
высокая
стойкость
к
агрессивным средам и воздействию температуры, способность выдерживать
длительные сроки эксплуатации, включая регенерацию и повторное
использование.
Использование
биосорбента
решает
отходов
сразу
в
качестве
несколько
матрицы
задач,
для
получения
во-первых,
позволяет
использовать их материальный потенциал, во-вторых, сократить объемы
складируемых отходов, и, в-третьих, эффективно использовать полученные
биосорбенты
в
природоохранных
технологиях
в
процессах
очистки
27
природных
и
сточных
вод
от
нефтепродуктов
и
биоремедиации
нефтезагрязненных территорий.
Использование отходов возможно, как в готовом виде, например, опил,
так и при модификации отхода, например, илы очистных сооружений,
полимерные материалы и т.д. Использование отходов в готовом виде
значительно
упрощает
способ
получения
биосорбента,
однако,
при
модификации материала можно говорить об экологической безопасности
используемого материала, т.е. отсутствии болезнетворных бактерий, тяжелых
металлов и проч. Под модификацией отходов понимается трансформация
материала различным способом, а именно, механическим, термическим или
химическим. Способ выбирается в зависимости от применяемого отхода.
Огромное количество современных исследований направлено на
получение сорбентов из отходов производства. В работах предлагается
использовать отходы деревообрабатывающей промышленности – стружка,
опилки [44]; сельскохозяйственного производства – шелуха семян пшеницы
и
подсолнечника
[44];
отходы
нефтехимических
предприятий
–
отработанный активный ил [45].
Носитель
должен
отвечать
определенным
требованиям,
характеризующим эффективность применения и целесообразность выбора:
размер пор (микропоры, мезопоры, макропоры), сорбционная ёмкость,
способность сорбировать молекулы и бактериальные клетки разного размера
и массы, насыпная и истинная плотность, прочность сорбента на истирание и
дробление, стоимость и токсичность материала (табл.1.5.).
28
Таблица 1.5. – Основные требования, предъявляемые к носителю [25,
46].
Наименование
показателя
№
Характеристика показателя
1. Экономические требования
1.1
Невысокая
Экономическая выгода при реализации
стоимость
процесса.
2. Технологические требования
2.1.
Размер пор
От размера пор зависит общая площадь,
которая влияет на эффективность работы
сорбента. Чем больше площадь, тем выше
эффективность.
2.2.
Удельная
Чем больше удельная поверхность, тем выше
поверхность
эффективность работы сорбента.
2.3.
Сорбционная
ёмкость
Количество вещества, которое может
поглотить сорбент на единицу своей массы,
соответственно, линейная зависимость.
Чем выше способность матрицы сорбировать
2.4.
Способность
сорбировать разного разного размера и массы молекулы и
бактериальные клетки, тем выше его
размера и массы
эффективность.
молекулы и
бактериальные
клетки
2.5.
Насыпная и
Плотность сорбента влияет на выбор
истинная плотность корпуса для фильтрующей колонны, его
объем и пр.
2.6.
Прочность на
Давление и скорость потока воды,
истирание и
фракционный состав сорбента оказывают
дробление
сильное влияние на параметры прочности,
истирания и раздробления. В зависимости от
показателей
прочности
выбирается
конкретный сорбент.
3. Экологические требования
3.1.
Нетоксичность
Отсутствие токсичных веществ является
одним из критериев для выбора сорбента,
что особенно важно для материалов,
изготовленных из отходов производства и
потребления.
29
1.3.2. Углеводородокисляющие микроорганизмы – основа
нефтяного биосорбента
Углеводородокисляющие
микроорганизмы
(УВОМ)
–
микроорганизмы, способные ассимилировать углерод путем биохимической
трансформации токсичных углеводородов в экологически безвредные
соединения, не представляющие опасности для здоровья человека и
окружающей среды.
В
настоящее
время
известно
более
тысячи
микроорганизмов,
способных перерабатывать углеводороды различных классов. В их числе
бактерии
из
родов
Acinetobacter,
Arthrobacter,
Bacillus,
Cytophaga,
Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Methanobacterium, Micrococcus,
Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Pseudomonas, Vibrio, мицеальные
грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Fusarium, Trichoderma, дрожжи
– Candida, Endomyces, Rhodotorula, Saccharomycer, Torulopsis [47-49].
Биосорбенты на основе штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов
подразделяются на две основные группы:
- биосорбенты на основе монокультуры;
- биосорбенты, в состав которых входит несколько штаммов
микроорганизмов.
Монобактериальные
препараты
характеризуются
более
узкой
специфичностью по отношению к индивидуальным углеводородам, более
узким интервалом рН, оптимальным для активности микроорганизмов, а
также интервалом солености, температуры, концентрации углеводородов.
Полибактериальные препараты имеют более широкие адаптационные и
экологические возможности для использования [47].
Требования,
предъявляемые
к
штаммам
микроорганизмов,
используемым для иммобилизации на поверхности носителя [26]:
1) расти на дешевых субстратах;
2) обладать высокой скоростью роста или давать высокий выход
продукта за короткое время;
30
3) проявлять синтетическую активность, направленную в сторону
получения желаемого продукта, образование побочных продуктов должно
быть низким;
4) образовывать максимально высокую концентрацию целевого
продукта, чтобы затраты на его выделение были экономически оправданы;
5) быть устойчивым к фаговой и другим типам инфекций;
6) быть не токсичным (безвредным) для людей и окружающей среды.
Среди
природных
удовлетворяющий
всем
популяций
обнаружить
перечисленным
выше
микроорганизм,
требованиям
довольно
проблематично. Поэтому в биотехнологии используют специальные способы
«усовершенствования» микроорганизмов, такие как селекция, мутация и
рекомбинация. Замена свободно культивируемых бактериальных клеток на
иммобилизованные микроорганизмы позволяет добиться преимущества не
потому,
что
иммобилизация
микроорганизмов,
а
вследствие
коренным
того,
что
образом
меняет
оптимизируются
свойства
условия
проведения самих технологических процессов.
1.3.3. Формирование микробиоценоза на поверхности носителя
Формирование микробиоценоза на поверхности носителя будет
зависеть от природы носителя и микроорганизмов, используемых при
иммобилизации.
В табл.1.6. приведена зависимость клеточного титра от пористой
структуры и адсорбционных свойств носителя. Под клеточным титром (Тк),
понимается
количество
жизнеспособных
клеток
микроорганизмов,
иммобилизованных на 1 г адсорбента-носителя. Тк определялся по разности
концентраций клеточной суспензии до и после контакта с адсорбентом [5,
26].
31
Таблица 1.6. – Зависимость клеточного титра от пористой структуры и
адсорбционных свойств носителя [5]
WS , см3/г
Образец
Sуд,
м2/г
VS ,
Vма,
по
по
см3/г
Н2О С6Н6
Углеродные и органические зерненые материалы
АГ-ПР
0,26 0,34 900 0,95 0,55
Кокс
0,04 0,03
0,3 0,05 0,02
каменноугольный
Нефтекокс
0,05 0,04 0,03 0,98 0,93
Сансорб
0,24 0,21
2
1,22 0,83
Шунгизит
0,001 0,16
0,4 0,31 0,10
Торф
0,16 0,04 0,03 0,32 0,13
Неорганические зерненые материалы
Керамзит
0,01 0,06 0,04 0,64
0,54
Газобетон
0,12 0,18
28
0,32
0,20
Перлит
0,05 0,003
1
3,21
2,90
Вермикулит
0,07 0,06
2,2 0,92
0,81
Обожженная глина 0,02 0,10
14
0,25
0,15
Лава
0,004 0,004 0,3 0,01
0,01
КСКГ
0,11 0,71 250 1,10
0,65
Бентонит
0,15 0,18
30
0,86
Волокнистые материалы
Нетканая вискоза
0,48 0,08
4
0,23 0,01
Нетканый
углеродный
сорбент
0,29 0,42 1200 0,53 0,28
Вискозная лента
0,33 0,18
3
1,04 0,86
Полипропиленовое
волокно
0,49 0,69 288 0,75 0,06
Лавсан
0,23 0,25
0,6 9,85 9,60
Волокнистый
углеродный
сорбент
0,29 0,53 990 3,36 2,83
Rпор,
нм
Титр для
различных
культур:
Sма,
м2/г
А
В
R
5500
1000
0,22
0,05
103
103
105
104
—
—
5000
800
50
500
0,39
2,10
0,05
0,05
103
105
103
107
104
—
—
—
—
—
—
—
800
25
800
500
6000
200
15
4000
1,35
1,95
7,20
0,36
0,07
0,08
0,43
103
103
105
108
106
103
103
—
—
107
—
107
—
—
107
107
—
—
—
—
—
—
—
—
80
0,10
—
—
8 ´ 107
2500
4000
0,22
0,57
—
—
—
—
6 ´ 107
10 ´ 107
2500
4000
0,05
4,80
—
—
—
—
7 ´ 107
0,5 ´ 107
3500
1,89
—
—
8 ´ 107
На основании представленных данных табл.1.6., можно сделать вывод,
что эффективность закрепления микроорганизмов на поверхности носителя
не зависит от увеличения полной удельной поверхности, а также суммарного
объема пор материала. Это можно объяснить тем, что значение удельной
поверхности и общего объема пор будет зависеть от величины удельной
поверхности и объема макро-, мезо- и микропор носителя, значение которых
будет определять эффективность иммобилизации на носителе.
32
Количество закрепленных на поверхности носителя клеток также
зависит от степени гидрофильности поверхности материала. Влияние именно
гидратационных
эффектов
подтверждается
отсутствием
подобной
зависимости числа иммобилизованных клеток от предельного объема
сорбционного пространства по бензолу. Данную закономерность можно
объяснить
тем,
что
иммобилизация
происходит
в
водной
среде,
следовательно, все клетки находятся в гидратированном состоянии.
Вследствие этого между сильно гидрофобной поверхностью материала и
гидратированной поверхностью клетки начинается отталкивание, что мешает
закреплению
бактериальных
клеток.
Поэтому,
наблюдается
слабая
иммобилизация микроорганизмов на шунгизите, керамзите, обожженной
глине, лаве, перлите, коксах. Напротив, при более высокой степени
гидратации поверхности материала появляется гидратный барьер. Этим
можно объяснить слабую адсорбцию бактериальных клеток на угле АГ-ПР и
сансорбе.
Эффективность иммобилизации будет также определяться свойством
поверхности клетки. Например, Acinetobacter sp. и Bacillus mucilaginosus
являются гидрофильными клетками, а Rhodococcus sp. – более гидрофобны.
Гидрофобные клетки стремятся вести прикрепленный образ жизни, поэтому
они лучше закрепляются на поверхности материала.
Кроме того, на эффективность иммобилизации влияют такие факторы
как заряд поверхности клетки и носителя, а также соотношение размеров
клеток
микроорганизмов
и
размеров
пор.
Например,
отрицательно
заряженные клетки Bacillus mucilaginosus стремятся к иммобилизации на
положительно
заряженных
поверхностях
эффективность
иммобилизации
выше
на
материала.
Поэтому,
положительно
их
заряженных
поверхностях бентонита, газобетона, нефтекокса, чем клеток Acinetobacter
sp., которые стремятся к отрицательно заряженным поверхностям носителя.
Иммобилизация клеток зависит от типа размножения клеток, а также
от
радиуса
пор
носителя.
Для
клеток
размножающихся
делением
33
оптимальный радиус пор носителя в 2–5 раз больше размера клеток. Для
спорообразующих клеток оптимальный радиус пор соизмерим с размером
клетки или в 4 раза больше его.
Если клетки по размеру меньше, чем пора носителя, то закрепление
возможно благодаря морфологическим характеристикам микроорганизмов
(жгутики, мицелии, выросты и т.д.).
Схема прикрепления клеток микроорганизмов к носителю наглядно
представлена на рис.1.2. [5, 50]
Рис.1.2. Схема закрепления клеток микроорганизмов на поверхности
носителя: А – прочное удерживание жгутика клетки порой;
Б – не прочное удерживание вследствие несоответствия размеров поры и
жгутика; В – прочное удерживание за счет размещения клетки
микроорганизма в поре носителя;
Г – плохое удерживание клетки за счет размещения клетки микроорганизма в
широкой поре носителя.
1.3.4. Методы иммобилизации микроорганизмов
Иммобилизация – фиксация микроорганизмов или ферментов на
твердом носителе с целью повышения эффективности их использования [5,
22, 26, 51].
Требования, предъявляемые к процессу иммобилизации [26]:
1. Клетки микроорганизмов достаточно чувствительны к внешним
факторам среды (температура, осмотическое давление и т.д.), поэтому при
проведении
процесса
иммобилизации
необходимо
предотвратить
34
нежелательное воздействие за счет стабилизации условий проведения
процесса.
2. При проведении процесса иммобилизации необходимо свести к
минимуму контакт клеток с токсичными для них веществами.
3. Выбранный
способ
иммобилизации
должен
способствовать
наилучшему закреплению клеток на носителе.
4. Снизить трудоемкость технологических стадий по иммобилизации
микроорганизмов за счет сокращения количества манипуляций с клетками
для сохранения стерильности.
5. Влияние
биологическая
природы
носителя
устойчивость)
(механическая,
на
химическая
стабильность
и
получаемых
иммобилизованных материалов.
6. Необходимым
условием
для
жизнедеятельности
иммобилизованных микроорганизмов снабжение питательными веществами,
доступ кислорода (особенно для аэробных клеток) и возможность отвода
продуктов жизнедеятельности, т.е. материал носителя не должен создавать
значительных диффузионных препятствий массообменным процессам.
7. Выбранный способ иммобилизации должен быть экономически
оправдан, а исходные компоненты иметь высокую доступность.
Существует два основных метода иммобилизации микроорганизмов:
физический и химический [25, 26].
Физические методы иммобилизации микроорганизмов
Существует
четыре
типа
физического
взаимодействия
микроорганизмов с поверхностью носителя: адсорбция на нерастворимых
носителях; включение в поры геля; пространственное отделение бактерий от
остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой
перегородки
(мембраны);
включение
в
двухфазную
среду,
где
микроорганизмы растворимы и могут находиться только в одной из фаз.
35
Способы физической иммобилизации микроорганизмов представлены на
рис.1.3.
Рис.1.3. Способы физической иммобилизации микроорганизмов:
а – адсорбция на нерастворимых носителях; б – включение в поры геля, в –
отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны, г –
использование двухфазной реакционной среды [52]
Методика
адсорбционной
иммобилизации
микроорганизмов
на
поверхности носителя. Иммобилизация путем адсорбции достигается за счет
взаимодействия водной суспензии микроорганизмов с твердой поверхностью
носителя.
Для
микроорганизмов
статический
получения
используют
способ
электроосаждения,
без
адсорбционно-иммобилизованных
следующие
перемешивания,
динамический
метод
технологические
с
методы:
перемешиванием,
нанесения
в
метод
колонке.
Адсорбционный способ достаточно прост и легко осуществим на практике
[25, 26, 52-56].
36
Иммобилизация
путем
включения
в
гели.
Сущность
метода
иммобилизации состоит в том, что микроорганизмы включаются в
трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих
гель. Существует два основных способа иммобилизации микроорганизмов в
гелях – полученных полимеризацией мономеров и полученных из готовых
полимеров [25, 52-54].
Иммобилизация
микроорганизмов
с
помощью
полупроницаемых
мембран. В основе данного метода заложен принцип отделения водного
раствора фермента от водного раствора субстрата полупроницаемой
мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но
представляет собой непреодолимый барьер для больших молекул фермента
[25, 26].
Иммобилизация
микроорганизмов
с
использованием
систем
двухфазного типа. Способ иммобилизации состоит в том, что ограничение
свободы перемещения фермента в объеме системы достигается за счет
способности растворятся только в одной из фаз двухфазной системы, а не за
счет взаимодействия с твердым носителем (сорбентом, гелем или мембраной)
[25].
Преимущества и недостатки физических способов иммобилизации
микроорганизмов представлены в табл.1.7.
Таблица 1.7. – Преимущества и недостатки физических способов
иммобилизации микроорганизмов
Метод
иммобилизации
Адсорбционный
Преимущества
- Простота методики;
Доступность
дешевизна носителей.
Недостатки
- Недостаточно высокая
и прочность связывания;
- При изменении внешних
условий
может
происходит
десорбция
микроорганизмов
с
поверхности носителя;
Отсутствие
общих
рекомендаций при выборе
37
Иммобилизация
- Простота методики;
путем включения в - Возможность создания
гели
препаратов
любой
геометрической формы,
обеспечивая при этом
равномерное
распределение
микроорганизмов
в
объеме носителя;
Большинство
полимерных
гелей
обладают
высокой
химической,
механической и тепловой
стойкостью;
- Высокая степень защиты
от
бактериального
заражения за счет в
следствии невозможности
проникновения
в
мелклпористую
полимерную матрицу.
Простота
и
Иммобилизация
микроорганизмов универсальность метода;
с
помощью - Возможность получать
полупроницаемых биопрепараты с высоким
содержанием
мембран
включенного фермента;
- Сохранение активности
и
стабильности
иммобилизованных
клеток.
Иммобилизация
микроорганизмов
с использованием
систем
двухфазного типа
оптимальных
условий
проведения
процесса
закрепления клеток на
поверхности носителя.
Снижение
эффективности
иммобилизованного
препарата
за
счет
создания
полимерной
матрицей препятствий для
диффузии субстрата к
микроорганизму.
- Способ неприменим,
если в роли субстрата
выступает
высокомолекулярное
соединение.
- Способ неприменим,
если в роли субстрата
выступает
высокомолекулярное
соединение.
38
Химические методы иммобилизации микроорганизмов
Химический
метод
иммобилизации
обеспечивает
прочную
и
необратимую связь клеток микроорганизмов с носителем за счет образования
ковалентных связей [25, 52, 53].
Схема иммобилизации химическим методом на примере фермента
представлена на рис.1.4.[26]. Фермент отделяют от носителя с помощью
вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают
бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин,
сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.).
Рис.1.4. Схема иммобилизации фермента химическим методом
Для осуществления ковалентной иммобилизации микроорганизмов
разработано огромное количество методических приемов. Все методы
химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы
реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с клетками
микроорганизмов.
При химической иммобилизации микроорганизмы связаны с носителем
ковалентными связями, что обеспечивает высокую эффективность и
прочность связывания между ними. Кроме того, при изменении таких
условий,
как
рН
и
температура,
бактерии
микроорганизмов
не
десорбируются со слоя носителя. Однако из-за сложности и дороговизны
процесса химическая иммобилизация является менее привлекательной и
малодоступной для промышленного использования [25].
39
1.3.5. Влияние различных факторов на иммобилизацию клеток
микроорганизмов на поверхности носителя
Протекание процесса закрепления и прочность связывания клеток
микроорганизмов с носителем в значительной степени зависят от условий
проведения процесса иммобилизации. Основными факторами, влияющими
на иммобилизацию микроорганизмов, являются удельная поверхность и
пористость
носителя,
значение
pH
бактериальной
суспензии,
его
концентрация и температура проведения процесса [25, 26].
Удельная поверхность и пористость носителя. Сорбционная емкость
носителя пропорциональна его удельной поверхности. Если поры носителя
настолько малы, что не могут вместить клетки бактерий, то для
микроорганизмов оказывается доступным только часть общей поверхности,
т.е. сорбционная емкость носителя по отношению к клеткам бактерий
небольшая, несмотря на очень большую удельную поверхность. В 1976 г. Р.
Мессинг предложил критерий для определения оптимального размера пор
носителя для иммобилизации ферментов. В соответствии с этим критерием
диаметр пор должен быть приблизительно в два раза больше молекулы
фермента в направлении ее максимального удлинения [25].
Значение pH. Реакция среды оказывает очень сильное влияние на
эффективность сорбции микроорганизмов на поверхности носителя, если
сорбция осуществляется за счет электростатических взаимодействий.
Причина этого влияния состоит в том, что при изменении pH меняется
состояние ионизации ионогенных групп носителя и бактериальной клетки,
ответственных за связывание. Если используемый носитель не является
ионообменником, то максимальное закрепление обычно достигается в
изоэлектрической точке бактериальной клетки [25, 26].
Концентрация бактериальных клеток. При возрастании концентрации
бактериальных клеток в суспензии, из которой происходит сорбция,
количество иммобилизованных на носителе микроорганизмов увеличивается
и
соответственно
растет
удельная
каталитическая
активность
40
иммобилизованного препарата. При дальнейшем повышении концентрации
бактериальной клеток в суспензии может происходить образование поверх
первого слоя адсорбированных клеток второго и последующих слоев.
Наибольшей
каталитической
активностью
обладают
верхние
слои
адсорбированных бактериальных клеток, где ограничения, накладываемые на
скорость реакции диффузией субстрата, минимальны. Поэтому излишняя
«перегрузка» носителя бактериями микроорганизмов приводит к тому, что
более глубоко расположенные слои иммобилизованного биокатализатора
исключаются из сферы реакции, и в результате общая эффективность
использования снижается [25, 26].
Температура. Значение температурного фактора оказывает двоякое
воздействие на иммобилизационные процессы. С одной стороны, повышение
температуры приводит к потере жизнеспособности микроорганизмов
вследствие не функционирования при данных условиях. С другой стороны,
рост
температуры
бактериальных
обычно
клеток
способствуют
благодаря
процессу
повышению
скорости
закрепления
диффузии
микроорганизмов в порах носителя. Следовательно, должна существовать
оптимальная температура для проведения процесса иммобилизации. Точное
значение оптимальной температуры зависит от природы сорбируемых
бактерий и поверхности носителя.
Эффективность иммобилизации микроорганизмов на поверхности
носителя определяется целым рядом факторов. Изменение этих факторов
может привести к резкому ослаблению взаимодействия микроорганизмов с
носителем и, следовательно, привести к десорбции [25].
1.3.6. Способы увеличения эффективности связывания клеток
микроорганизмов с носителем
Иммобилизация на предварительно модифицированных носителях [25].
Предварительная модификация носителя во многих случаях позволяет
41
существенно
повысить
прочность
связывания
адсорбционно-
иммобилизованных бактериальных клеток.
В некоторых случаях модификация носителя не только повышает
эффективность сорбции, но и обеспечивает благоприятное микроокружение
для
иммобилизованных
клеток.
Более
того,
без
предварительной
модификации носителя иногда вообще не удается сохранить каталитическую
активность бактерий при адсорбционной иммобилизации. Например, если
микроорганизмы функционируют в щелочной среде pH, то при их
иммобилизации на кислой поверхности носителя может произойти потеря
каталитической активности.
Адсорбционная
иммобилизация
ферментов
на
предварительно
модифицированных носителях представлена на рис.1.5.
Рис.1.5. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предварительно
модифицированных носителях
Другие способы увеличения прочности связывания микроорганизмов с
носителем. Для предотвращения смывания иммобилизованных клеток
микроорганизмов
поверхность
носителя
дополнительно
обрабатывают
42
сшивающим агентом, в результате на поверхности носителя образуются
сплошная пленка.
К. Мартинеком (1976 г.) был предложен способ, позволяющий
существенно повысить количество иммобилизованного фермента, за счет
использования для иммобилизации нейлоновые волокна, подвергнутые
частичной химической деструкции (рис.1.6.). Волокна помещают в раствор
фермента и подвергают механическому растяжению, в результате чего
размер пор увеличивается (1.6.б). Благодаря этому молекулы фермента
получают возможность проникнуть внутрь пор. Затем растягивающее усилие
снимают, волокно сжимается, поры возвращаются в исходное состояние, а
молекулы фермента оказываются внутри пор (рис.1.6.в) [25].
Рис.1.6. Иммобилизация ферментов путем механического захвата в
порах нейлоновой нити при ее растяжении
На основании выше изложенного, определено, что существуют
различные методы иммобилизации, способы увеличения эффективности
связывания бактериальных клеток с носителем и влияние различных
факторов на процесс иммобилизации в целом.
При изучении литературных данных, стало очевидным, что метод
адсорбционная
иммобилизациимикроорганизмов
на
носителешироко
43
используется для получения современных биосорбентов, что подтверждается
приведенными ниже аналогами.
Известен
нефтяного
способ
получения
биосорбентас
гидрофобного
использованием
органоминерального
нефтеокисляющих
микроорганизмов, иммобилизированных в сорбент "СОРБОНАФТ"на основе
торфа путем обрастания сорбента бактериями и/или грибами [33].
Одним из недостатков данного способа получения является то, что
закрепление микроорганизмов на поверхности сорбента происходит в
течение длительного времени (9 суток). Кроме того, для получения
биосорбента в промышленных масштабах необходимы большие площади.
Для эффективности процесса обрастания сорбента биомассой необходимо
поддерживать определенные условия – температуру, влажность, что также
затрудняет процесс получения биосорбента в производственных условиях.
Известен способ получения биосорбента, используемый для очистки
водной среды от загрязнения нефтепродуктами, где иммобилизация
гидрофобных нефтеокисляющих микроорганизмов на сорбент "Эколан"
осуществляется
в
обычном
смесителе
для
сыпучих
материалов
с
вращающимся корпусом типа бетономешалки в течение не менее 1 часа [34].
Иммобилизация
микроорганизмов
при
обычном
перемешивании
носителя с биомассой не является достаточно эффективным способом.
Перемешивание может отрицательно повлиять на механизм закрепления
микроорганизмов, например, деформировать поры сорбента-носителя. И если
в качестве микроорганизмов применяются грибы или актиномицеты, то
происходит разрыв гифов, они плохо закрепляются в сорбенте.
Известен способ получения биосорбента, в основе производства
которого лежит процесс иммобилизации клеток микроорганизмов в
гидрофобный олеофильный сорбент, включающий смешение двух аэрозолей
до насыщения сорбента микроорганизмами. Первый аэрозоль состоит из
газовой среды, в которой во взвешенном состоянии находятся частицы
сорбента. Второй аэрозоль состоит из газовой среды, в которой во
44
взвешенном состоянии находится смесь, или масла, или нефтепродукт и
культуральная жидкость с биоагентом [41].
Выше описанный способ предусматривает использование носителя
определенного типа с размером частиц 1-3 мм в диаметре. Кроме того, для
его получения его необходимо, чтобы потоки сорбента и эмульсии
подавались с заданной интенсивностью, температурой, давлением, что
затрудняет и усложняет процесс получения биосорбента в производственных
условиях.
Таким образом, можно сделать вывод, что исследования, направленные
на получение новых видов биосорбентов, выбора подходящего носителя,
особенно изготовленного на основе отходов производства и потребления,
подбора соответствующих нефтеокисляющих микроорганизмов, способных
справится
с
биосорбента
нефтяным
в
качестве
загрязнением,
и
альтернативы
обоснование
использования
традиционным
технологиям,
представляют собой актуальную экологическую задачу.
ВЫВОДЫ:
1. Нефть является одним из самых распространенных загрязнителем
окружающей природной среды. По своему составу нефть достаточно
разнообразна и включает в себя более 1000 индивидуальных веществ,
большая часть из которых жидкие углеводороды (80-90 % по массе),
гетероатомные органические соединения (4-5 % по массе), различные
соединения серы, азота, кислорода, а также металлорганические соединения,
вода, минеральные соли и механические примеси.
2. При попадании нефти и нефтепродуктов на почвенные горизонты
происходит
изменение
морфологических,
физических,
химических,
биологических свойств почвы, которые определяют ее плодородие и
экологические функции. Процессы самоочищения почвенных экосистем
занимают довольно длительный промежуток времении составляют от
нескольких месяцев до нескольких десятков лет.
45
3. Биоремедиация – это способ очистки и восстановления НЗП,
основанный на биологическом разложении поллютантов микроорганизмами
(бактерии, микроскопические грибы, актиномицеты), в результате различных
биохимических реакций и физико-химических процессов, осуществляемых с
участием биоты. В основе технологии биоремедиации заложен принцип
самоочищения нефтезагрязненных территорий с участием аборигенной или
привнесенной
представляет
микрофлоры.
В
использование
настоящее
в
время
большой
технологии
интерес
биоремедиации
нефтезагрязненных почв с помощью иммобилизованных на поверхности
носителя микроорганизмов.
4. Нефтяные биосорбенты – это сорбенты с иммобилизованными
культурами
микроорганизмов,
которые
обеспечивают
биологическое
разложение нефти и нефтепродуктов. В настоящее время разработано
значительное
которых
количество
является
биосорбентов,
разнообразие
отличительной
используемых
особенностью
носителей
и
иммобилизованных на его поверхности культур микроорганизмов, а также
способ закрепления микроорганизмов на поверхности носителя.
46
ГЛАВА 2. ПРОГРАММА, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для достижения поставленной цели и решения задач был использован
комплекс
современных
методов
исследований
включающий:
экспериментальные исследования по получению биосорбентов на основе
углеродсодержащих
отходов
производства
и
углеводородокисляющих
микроорганизмов; лабораторные исследования по изучению эффективности
полученных биосорбентов в технологии биоремедиации нефтезагрязненных
почв (НЗП).
Физико-химические и микробиологические исследования выполнялись
на базе аккредитованной лаборатории кафедры охраны окружающей среды
Пермского
национального
исследовательского
политехнического
университета. Полученные результаты обработаны стандартными методами
статистического анализа.
Объектами исследования являлись:
1.
Карбонизат,
полученный
в
результате
низкотемпературного
пиролиза избыточного активного ила биохимических очистных сооружений
предприятий нефтехимического комплекса, и использующийся в качестве
носителя для иммобилизации микроорганизмов;
2. Углеводородокисляющие микроорганизмы (УВОМ), выделенные из
НЗП, образовавшейся в результате технологических потерь при добыче
нефти на территории Оренбургской области;
3. Экспериментально полученный биосорбент на основе карбонизата, с
иммобилизованными на его поверхности УВОМ.
В качестве контроля для биосорбента на основе карбонизата
использовали пористый уголь БАУ-А (ГОСТ 6217-74) [57], для определения
эффективности полученных биосорбентов в технологии биоремедиации –
опил, карбонизат, суспензия УВОМ.
Основные этапы исследований, объекты, определяемые показатели, и
применяемые методики представлены в табл. 2.1.
47
48
Наименование этапа
Объект
Показатели исследований
Применяемые методики
исследования
исследования
1. Исследования физико-химических свойств карбонизата и характеристика углеводородокисляющих микроорганизмов,
выделенных из нефтезагрязненных почв
1.1. Исследование
- Карбонизат;
1. Физико-химические характеристики:
возможности использования
- БАУ-А
- насыпная плотность,
ГОСТ 16190-70 [58]
карбонизата в качестве
(ГОСТ 6217-74).
- элементный состав;
Рентгеноспектральный микроанализ
носителя для иммобилизации
2. Сорбционные характеристики:
микроорганизмов
- удельная поверхность,
- пористость,
Электронная микроскопия
- водопоглощение,
- нефтеемкость.
ТУ 214 – 10942238 -03-95 [59]
3. Токсикометрический показатель:
ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06 [60]
- токсичность.
ФР. 1.39.2001.00283 [61]
1.2. Выделение УВОМ
- НЗП;
Микроскопический анализ [62]
1. Микробиологические
- УВОМ.
1.3. Получение накопительной Суспензия 1. Микробиологические:
культуры УВОМ
УВОМ.
- общее количество микроорганизмов
метод Виноградского-Брида [47, 6266]
2. Экспериментальные исследования по получению биосорбента на основе карбонизата и оценка эффективности его
использования в технологии биоремедиации НЗП
2.1. Исследование физической - Карбонизат;
Определение биомассы
1. Микробиологические:
иммобилизации мо на
- БАУ-А
- биомасса мо;
взвешиванием [47]
пористой поверхности
(ГОСТ 6217-74).
- иммобилизация на поверхности
Электронная микроскопия
сорбентов статическими и
носителя;
динамическими способами
Гравиметрический анализ
2. Механические:
2.2. Определение
Параметры - изменение массы в сухом и влажном
виде,
- // биотехнологических
колоночного
- поглощение суспензии УВОМ,
параметров при получении
реактора;
Таблица 2.1. – Программа исследования
2.4. Определения условий и
сроков хранения полученного
биосорбента
2.3. Оценка эффективности
полученного биосорбента
методом биоремедиации
Наименование этапа
исследования
биосорбента методом
пропускания суспензии УВОМ
через слой карбонизата в
колонке
Показатели исследований
- Биосорбент.
ГОСТ 5180-84 [69]
ГОСТ 26423-85 [70]
РД 52.18.647-2003 [67]
РД 52.18.647-2003 [67]
Граивиметрический анализ
- // -
Применяемые методики
49
Метод Виноградского – Брида [47,
62-66]
Посев на МПА [64]
Посев на ср. Таусона [47, 71]
Метод «почвенных комочков» на тв.
ср. Эшби [64]
Посев на КАА [64]
- актиномицеты,
Посев на Чапека [62]
- микроскопические грибы.
Микроскопический анализ
1. Микробиологические
- общее количество мо,
Метод Виноградского - Брида [47,
- УВОМ,
62-66]
- иммобилизация на поверхности Посев на ср. Таусона [47, 71]
носителя.
Электронная микроскопия
- определение силы и числа адгезии;
3. Гидромеханические:
- скорость потока,
- время контакта суспензии с
носителем;
4. Химические:
- общее содержание нефтепродуктов.
- Исходная НЗП;
1. Физико-химические:
Субстрат, - влажность,
очищаемый
- рН,
опилом,
- общее содержание нефтепродуктов;
карбонизатом,
2. Микробиологические:
суспензией УВОМ - общее количество мо,
и биосорбентом.
- сапрофитные бактерии,
- УВОМ,
- бактерии рода Azotobacter,
Объект
исследования
- Суспензия УВОМ
на входе и выходе
колоночного
реактора;
- Биосорбент.
2.1. Методики проведения исследований возможности
использования карбонизата в качестве носителя для иммобилизации
микроорганизмов
Определение физико-химических и сорбционных свойств карбонизата
определяли по стандартным методикам.
2.1.1. Исследование физико-химических свойств
Методика определения насыпной плотности. Определение насыпной
плотности сыпучих материалов производили засыпкой их в предварительно
взвешенный мерный цилиндр без уплотнения, образовавшуюся над краями
цилиндра горку материала срезали. Объем материала принимают по объему
цилиндра. После этого цилиндр с материалом взвешивали. Насыпную
плотность материала рассчитывали по формуле:
m 2 − m1
V
γ=
(2.1.)
где m1 – масса пустого мерного цилиндра, кг; m2 – масса мерного
цилиндра с материалом, кг; V – объем мерного цилиндра, м3 [58].
Методика
определения
элементного
состава
материала.
Для
определения элементного состава карбонизата использовали Scanning
Electron Microscope S-3400N Hitachi с приставкой для рентгеновского
энергодисперсионного
Рентгеноспектральный
микроанализа
микроанализ
фирмы
карбонизата
был
«Брукер».
проведен
на
нескольких участках изучаемого образца с указанием преобладающих
химических элементов.
2.1.2. Исследование сорбционных свойств носителей
Методика определения удельной поверхности материала. Сущность
метода заключается в высушивании образца на анализаторе влажности MS70 фирмы A&D до постоянной массы при температуре 105±5 оС, затем
отбирали навеску образца, необходимую для анализа и помещали ее в
калиброванную ампулу, которую помещали в станцию подготовки проб
50
«SorbiPrep» [72] для дегазации при температуре 105оС в течение 15 минут.
Затем ампулу с образцом помещали в прибор «Sorbi» [73] и определяли
удельную поверхность по методу БЭТ [74-76].
Удельная поверхность пор – это площадь внутренних поверхностей пор
в единице объема SVуд., м2/м3или в единице массы Smуд., м2/г, пористого
материала. Величины SVуд.и Smуд.связаны соотношением:
SVуд.= Smуд. ρк(1 –П) 106
(2.2.)
гдеρк- плотность компактного материала [74-76].
Методика
определения
пористой
структуры
материала.
Пористость (П) это отношение объема Vп пустот в материале к его полному
объему V. Пористость определяли по одной из формул:
П = Vп/V, или П = (mн – m)/(ρжV)
(2.3.)
где mн – масса насыщенного жидкостью материала.
Пористость материала также можно определить по формуле:
П = 1 - ρ/ρк
(2.4.)
где ρ – плотность пористого тела, ρк – плотность компактного тела.
Поры в материалах разделяют на три вида: открытые (пористость По ),
тупиковые
(пористость Пт )
и
закрытые
(пористость Пз ).
Общая пористость тела слагается из этих трех видов пористости:
П =По + Пз + Пт.
(2.5.)
Открытая пора сообщается с поверхностями пористого тела и
участвует в фильтрации жидкости или газа при наличии градиента давления
на пористом теле.
Закрытая пора не сообщается с поверхностью пористого тела и не
участвует в фильтрации жидкости или газа. Часть пор соединяется только с
одной поверхностью пористого тела, образуя тупиковую пористость.
Тупиковые (полуоткрытые или полузакрытые) поры при фильтрации
частично заполняются жидкостью, но не влияют на проницаемость
пористого материала.
51
Закрытые и тупиковые поры образуются в результате пластической
деформации частиц порошка при высоких давлениях прессования, а также
из-за наличия внутренней пористости частиц.
Доля тупиковой и закрытой пористости при П >0,18 составляет 2–5%
общей пористости материала. При П <0,18 эта доля возрастает. При П =0,070,08 открытая пористость практически исчезает [74-76].
Методика
нефтеемкости
определения
(НЕ),
сорбционной
водопоглощения
(ВП)
емкости.
и
Определение
плавучести
сорбентов
проводили при (20 ± 2) оС по методикам, изложенным в ТУ 214 – 10942238 –
03 – 95 [59]. Сорбционную емкость сорбентов определяли гравиметрическим
методом. В качестве сорбатов использовали нефть Бугурусланского
месторождения, полусинтетическое масло.
2.1.3. Определение токсичности биосорбента на основе карбонизата
Оценка токсичности полученного биосорбента на основе карбонизата
проводилась по двум методикам:
 «Методика определения острой токсичности питьевых, пресных
природных и сточных вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и
отходов по смертности дафний (Daphnia magna Straus). ПНД Ф Т 14.1:2:4.1206 (издание 2011 г.)» [60].
 «Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из
почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению
плодовитости дафний. ФР. 1.39.2001.00283» [61].
Обе методики допущены для целей государственного экологического
контроля.
Сравнительная
характеристика
методик
биотестирования
представлена в табл. 2.2.
52
Таблица 2.2. – Сравнительная характеристика методик биотестирования
Характеристика
ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06
ФР. 1.39.2001.00283
Длительность
эксперимента
48 ч
96 ч
Критерий острой
токсичности
Гибель 50 % и более
Гибель 50 % и более
дафний при условии, что в дафний при условии, что в
контрольном эксперименте контрольном эксперименте
все рачки сохраняют свою гибель не превышает 10 %
жизнеспособность
Необходимый
объем воды
50 мл
100 мл
Кормление дафний
в эксперименте
Не кормят
Кормят ежедневно
Методика ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06. Методика основана на определении
смертности дафний (Daphnia magna Straus) при воздействии токсических
веществ, присутствующих в исследуемой водной среде, по сравнению с
контрольной культурой в пробах, не содержащих токсических веществ
(контроль). Количество живых и мертвых дафний определяется методом
прямого счета.
Острое токсическое действие исследуемой воды или водной вытяжки
из почв, осадков сточных вод и отходов на дафний устанавливается по их
смертности (летальности) за определенный период экспозиции. Критерием
острой токсичности служит гибель 50% и более дафний за 48 часов в
исследуемой воде при условии, что в контрольном эксперименте все рачки
сохраняют свою жизнеспособность.
В химические стаканы объемом 150 - 200 мл поместили навески
биосорбента в следующих количествах: 0,1; 0,3; 0,5; 1 г. В контрольном
опыте биосорбент не использовался. В каждый стакан заполнили 50 мл воды
и посадили пипеткой (с отпиленным и оплавленным концом) объемом 2 мл
по десять дафний в возрасте 6 - 24 ч.
53
Посадку рачков начинали с контрольной серии. В исследуемую среду
дафний помещали, начиная с меньших концентраций загрязняющих веществ
к большим концентрациям.
Стаканы поместили в климатостат с температурой 20 +/- 2 °C
и
освещенностью 500 - 1000 лк.
Кормление дафний произвели до проведения токсикологического
эксперимента, во время опыта не кормили.
Учет смертности дафний в опыте и контроле проводили каждые 24
часа. Неподвижные особи считались погибшими, если не начинали двигаться
в течение 15 секунд после легкого покачивания стакана.
Методика ФР. 1.39.2001.00283. Методика основана на определении
смертности и изменений в плодовитости дафний (Daphnia magna Straus,
Cladocera, Crustacea) при воздействии токсических веществ, присутствующих
в исследуемой водной среде, по сравнению с контрольной культурой в
пробах, не содержащих токсических веществ (контроль).
Острое токсическое действие исследуемой воды или водной вытяжки
из почв, осадков сточных вод и отходов на дафний определяется по их
смертности (летальности) за определенный период экспозиции. Критерием
острой токсичности служит гибель 50% и более дафний за 96 часов в
исследуемой воде при условии, что в контрольном эксперименте гибель не
превышает 10%.
Исследования по данной методике проводили в таких же условиях и с
использованием таких же средств измерения и материалов, как и по методике
ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06.
Кормление дафний произвели до проведения и один раз в середине
токсикологического эксперимента. В качестве корма использовали 0,3 мл
дрожжевой суспензии на 100 мл исследуемой среды.
Учет смертности дафний в опыте и контроле проводили каждые 24
часа. Неподвижные особи считались погибшими, если не начинали двигаться
в течение 15 секунд после легкого покачивания стакана.
54
2.2. Методика выделения и получения накопительной культуры
микроорганизмов
Углеводородокисляющие
микроорганизмы
выделяли
из
нефтезагрязненной почвы. Для этого готовили почвенную суспензию: 10 г
НЗП на 90 мл жидкой питательной среды Таусона [77, 78].
Инокулированную среду выдерживали в термостате при температуре
30° С в течение 7 суток [47, 62], после чего проводили посев на плотную
питательную среду в чашки Петри. В качестве питательной среды также
использовали синтетическую среду Таусона с добавлением нефти в качестве
единственного источника углерода. Через 7-10 дней зафиксировали рост
микроорганизмов.
Наращивание биомассы микроорганизмов проводили в ферментере
Biostat A plus (рис.2.1.) [79], для этого с чашек Петри сделали смыв УВОМ,
добавили 10 мл нефти Бугурусланского месторождения и 2 л синтетической
среды Таусона [47, 62].
Рис.2.1. Ферментер BiostatAplus, используемый для получения
накопительной культуры УВОМ
Культивирование
условиях,
которые
микроорганизмов
в
ферментере
проводили
поддерживались
при
постоянных
автоматически:
55
температура внутренней среды – 28±2 °C, pH – 5,8-6,0, скорость
перемешивания – 100 об/мин. Условия культивирования оптимальны для
жизнедеятельности УВОМ [47].
Для выявления и учета общей численности микроорганизмов в
суспензии УВОМ использовали метод прямого микроскопирования клеток на
фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида) [47, 62] с
использованием микроскопа Zeiss со встроенной видеокамерой. Кроме того,
периодически делали посевы на чашки Петри с агаризованной средой
Таусона.
2.3. Методика проведения исследований физической
иммобилизации микроорганизмов на пористой поверхности носителей
Исследования
пористой
физической
поверхности
иммобилизации
сорбентов
включали
микроорганизмов
в
себя
на
следующие
экспериментальные исследования:
- подготовку носителя и накопительной культуры микроорганизмов к
иммобилизации;
- исследования физической иммобилизации микроорганизмов на
пористой поверхности сорбентов статическим и динамическим способом.
2.3.1. Подготовка носителя к иммобилизации
Для лучшей работы носителя необходимо отмыть сорбент от угольной
пыли, образовавшейся в процессе технологических этапов (изготовления,
хранения, транспортировки и выгрузки). Для этого сухой сорбент помещали
в колбу с чистой водой. Настаивали в горячей воде в течение 0,5-1 часа, в
холодной воде в течение 4-6 часов. После чего сорбент намокал и полностью
оседал на дно посуды [80].
56
2.3.2. Подготовка накопительной культуры микроорганизмов к
иммобилизации
Накопительную
культуру
микроорганизмов,
выращенную
в
ферментере, использовали, когда численность бактерий стала уменьшаться.
Количество
микроорганизмов
определяли
методом
прямого
микроскопирования клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод
Виноградского-Брида) [47, 62] с использованием микроскопа Zeiss со
встроенной видеокамерой, периодически делали посевы на чашки Петри с
агаризованной
средой
Таусона,
а
также
определяли
биомассу
микроорганизмов.
Определение биомассы взвешиванием состоит из трех основных этапов:
доведение массы центрифужных пробирок до постоянного значения,
отделение
клеток
микроорганизмов
от
культуральной
жидкости
и
определение их массы. Бактериальную массу определяют по формуле:
M = ( A − B )1000
V
(2.6.)
где М – сухая биомасса, г/л; А – масса центрифужной пробирки с
осадком, г; В – масса центрифужной пробирки без осадка, г; V – объем
культуральной жидкости, взятой для центрифугирования, мл [47].
Определение нефтепродуктов гравиметрическим методом. В основе
метода лежит экстракция НП из пробы малополярными растворителями
(хлороформ, гексан, четыреххлористый углерод, пентан, петролейный эфир,
фреон). Далее осуществляют очистку экстракта от полярных веществ
пропусканием его через колонку с оксидом алюминия и удаление экстрагента
путем его выпаривания и взвешивания остатка для определения суммы
нефтепродуктов [67].
Культуральная жидкость, состоящая из углеводородокисляющих
микроорганизмов и питательных веществ, в том числе нефти, в дальнейшем
используется для иммобилизации.
57
2.3.3. Методика проведения исследований физической
иммобилизации микроорганизмов на пористой поверхности носителей
Для определения эффективного способа закрепления микроорганизмов
на пористой поверхности материала были проведены исследования по
физической иммобилизации микроорганизмов статическим и динамическим
методом.
Методика
проведения
исследований
по
иммобилизации
микроорганизмов статическими способами. Закрепление микроорганизмов
статическим способом достигается при контакте определенного постоянного
объема суспензии УВОМ с носителем в течение некоторого времени [25, 26]
без перемешивания и с перемешиванием. Перемешивание осуществляли с
помощью магнитной мешалки и ферментационной установки.
Магнитная мешалка. В стерильные лабораторные конические колбы
помещали определенное количество носителя и суспензию УВОМ. В колбы
помещали ферромагнитный миксер в полиэтиленовом покрытии, который и
обеспечивал
перемешивание
жидкости.
Миксер
движется
за
счет
вращающего магнитного поля, которое создается благодаря двигателю с
магнитом, помещенному в корпус прибора [81].
Ферментационная установка. В ферментер Biostat A plus (рис.2.1.) к
готовой культуральной суспензии добавляли определенное количество
носителя. Автоматическое поддержание условий проведения процесса
(перемешивание, температура, pH) с выводом данных на компьютер.
Методика
проведения
исследований
по
иммобилизации
микроорганизмов динамическим способом. Закрепление микроорганизмов
динамическим способом достигается при пропускании суспензии УВОМ
через слой носителя в течение некоторого времени [25].
Сорбционная установка. Сущность метода заключается в том, что
через колонку, заполненную носителем, в направлении сверху вниз,
пропускают суспензию с микроорганизмами (рис.2.2.).
58
Рис.2.2. Физический способ иммобилизации при помощи сорбционной
колонки
Определение насыщения носителя суспензией микроорганизмов при
иммобилизации с помощью сорбционной колонки. Насыщение носителя
суспензией УВОМ при иммобилизации в сорбционной колонке определяли
гравиметрическим
микроорганизмов
методом,
от
объема
строя
зависимость
пропускаемой
значения
жидкости
до
биомассы
момента
уменьшения адсорбционной емкости носителя [25]. Кроме того, у
полученных образцов биосорбента на основе карбонизата определяли
биосинтетическую активность иммобилизованных клеток, силу и число
адгезии [26].
Методика проведения исследований по определению эффективности
иммобилизации
на
поверхности
носителя.
Исследование
состояния
поверхности сорбентов после закрепления микроорганизмов проводили с
помощью Scanning Electron Microscope S-3400N Hitachi с программным
обеспечением.
Определение адсорбционной емкости носителя
Адсорбционную емкость носителя определяли по формуле [82]:
С = (Сисх - Сравн/m) V
(2.7.)
59
где С – адсорбционная емкость носителя (г сухих клеток/г носителя); Сисх–
концентрация клеток в суспензии до иммобилизации (г/мл); Сравн–
концентрация клеток в суспензии после иммобилизации (г/мл); m– масса
носителя (г); V– объем суспензии (мл).
Биосинтетическая активность иммобилизованных клеток
Биосинтетическая активность иммобилизованных клеток выражается
как объемная продуктивность бикатализатора [26]:
P=
C⋅F
V
(2.8.),
где С – концентрация продукта в вытекающей жидкости, г/л, V – объем
катализатора, л,F – скорость потока через реактор, л/ч.
Параметр V (объем катализатора) включает в себя две величины:
количество клеток в единице объема носителя и непосредственно объем,
занимаемый сорбентом в колонке.
Величина адгезии клеток
Величина силы адгезии клеток является важной количественной
характеристикой силы адсорбции (прочности или силы адгезии) клеток на
поверхности адсорбента.
Величину силы адгезии F определяли методом центрифугального
отрыва,
сущность
иммобилизованными
которого
на
нем
заключается
клетками
в
том,
что
микроорганизмов
сорбент
с
подвергали
высокоскоростному центрифугированию, а затем определяли количество
«отпавших» клеток.
Сила адгезии равна силе отрыва клеток [26]:
=
отр
=
(2.9.)
где ν – линейная скорость (см/с); ν = 2πRn/60, где R – расстояние от оси
вращения до осадка адсорбированных клеток (см), n – число оборотов (мин),
m – масса клетки (г).
Адгезия клеток характеризуется также числом адгезии γF (%):
60
=
× 100%
(2.10.)
где N и N0 – число клеток, находившихся на поверхности сорбента до и
после центрифугирования.
2.4. Методики проведения исследований по изучению процесса
деструкции нефти и нефтепродуктов при использовании биосорбента
Изучение
процесса
использовании
деструкции
биосорбентов
нефти
включали
и
в
нефтепродуктов
себя
при
следующие
экспериментальные исследования:
- экспериментальные исследования по определению эффективности
использования
биосорбентовна
основе
карбонизата
в
технологии
биоремедиации нефтезагрязненных почв;
- экспериментальные исследования по определению оптимальной дозы
вносимого биосорбента в технологии биоремедиации нефтезагрязненной
почвы.
2.4.1. Методика проведения исследований по оценке
эффективности биосорбента на основе карбонизата в технологии
биоремедиации НЗП
Эксперимент
по
биоремедиации
нефтезагрязненной
территории
проводили согласно технологическому регламенту на проведение опытнопромышленных работ по ремедиации нефтезагрязненных грунтов на
территории деятельности ООО «ЛУКОЙЛ-ПЕРМНЕФТЬ» [83].
Экспериментальные исследования на протяжении 90 суток проводили
при постоянных условиях: температура воздуха 20 ± 2°С; рН среды 6,0 - 7,0;
освещение - естественное; влажность - 65 - 70%.
В качестве контрольных образцов использовали субстрат на основе
НЗП и опила и субстрат из НЗП с добавлением карбонизата.
61
Расчет
дозы
внесения
биосорбента
провели
по
аналогии
с
применяемыми в промышленных технологиях биосорбентами: «БОС»,
«Биосорбонафт», «Эконадин», «Унисор-Био» [37-40].
Методики проведения анализа нефтезагрязненных почв по физикохимическим показателям
Определение
влажности.
Сущность
метода
заключается
в
высушивании пробы почвы до постоянной массы при температуре 105±5 оС и
определении разницы в массе почвы до и после высушивания [69].
Определение реакции среды рН. Сущность метода заключается в
определении рН суспензии почвы в воде с помощью рН-метра [70].
Определение общего содержания НП. Содержание нефтепродуктов в
НЗП осуществляли гравиметрическим методом [67].
Методики проведения анализа нефтезагрязненных почв по
микробиологическим показателям
Образцы
НЗП
подвергались
микробиологическому
анализу.
Микробиологический контроль осуществляли по следующим показателям:
общее содержание микроорганизмов, численность сапрофитных бактерий,
УВОМ, бактерий рода Azotobacter, олигонитрофилов, актиномицетов и
микроскопических
грибов.
Представленные
физиологические
группы
микроорганизмов играют основную роль в биодеструкции нефтяных
углеводородов [84-87].
Подготовка образцов для микробиологического анализа, посева,
выращивания, подсчета колоний и статистической обработки данных
производили по методикам, приведенным в специальной литературе [47, 6266, 78, 84-87].
Для обнаружения и учета общей численности микроорганизмов в
почвенных образцах использовали методы прямого микроскопирования
клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида)
с использованием микроскопа Zeiss со встроенной видеокамерой [47, 62-66].
62
Расчет количества клеток в 1 г субстрата производили по формуле [47,
88-90]:
N=
a⋅S
⋅n
s ⋅V
(2.11.),
где: а – среднее количество клеток в поле зрения;
s – площадь поля зрения, мм2;
S – площадь мазка, мм2;
V – объем нанесенной на стекло суспензии (мл);
n – коэффициент разведения исследуемого субстрата.
Для
определения
группового
и
частично
родового
состава
микроорганизмов в исследуемых почвенных образцах применяли, широко
используемый в микробиологической практике, метод посева на различные
элективные питательные среды и [47, 62-66, 71, 84-90]. Качественный и
количественный микробиологический состав определяли методом учета
интенсивности роста микроорганизмов в накопительной культуре. В табл.
2.2. представлены основные группы микроорганизмов и состав элективных
питательных сред для их выделения.
Таблица 2.3. – Микробиологические методы исследования [47, 62-66,
71, 84-90]
Физиологическая
группа
микроорганизмов
Сапрофитные
бактерии
УВОМ
Наименование
метода
Мясопептонный
агар (МПА)
Среда
«К»,
источник углерода
– нефть
Состав питательной среды
Порошок МПА – 35 г; дист.
вода - 1л.
KNO3 – 1г, КН2РО4 – 1г,К2НРО4
– 1г, NaCl – 1г, MgS04 – 0,2г,
СаCl2 безвод. – 0,02г, агар – 15г,
дист. вода – 1л.
Среда
Таусона, Са(NO3)2• 4Н2O – 1.0 г; KNO3 –
источник углерода 0.25 г; КН2РО4 – 0.25 г;MgS04 •
7Н2O – 0.25 г;FeS04 • 7Н2O –
– нефть
0.25 г; агар – 15г; дист. вода 1л.
63
Физиологическая
группа
микроорганизмов
Бактерии р.
Azotobacter
Олигонитрофилы
Актиномицеты
Микроскопические
грибы
Посев
Наименование
метода
Состав питательной среды
Метод «почвенных
комочков»
на
твердой
среде
Эшби
K2HPO4 – 0,2г; MgSO4*7Н20 –
0,2г; NaCl – 0,2г; K2SO4– 0,1г;
CaCO3 – 5,0г; маннит или
сахароза – 20г; сухой агар – 15г,
дист. вода– 1л.
Твердая
среда K2HPO4–0,2г;
MgSO4*7Н20–
Эшби
0,2г; NaCl –0,2г; K2SO4–0,1г;
маннит
или
CaCO3–5,0г;
сахароза–20г; сухой агар–15г,
дист. вода – 1л.
Крахмало(NH4)2SO4 –2,0г; K2HPO4–1,0г;
аммиачный
агар MgSO4*7Н2О–1,0г; NaCl–1,0г;
крахмал
CaCO3–3,0г;
(КАА)
растворимый–10г; сухой агар–
15г, водопровод. вода – 1л
Среда Чапека
NaNO3 – 2,0 г; KH2PO4 – 1,0 г;
KCl - 0,5 г; MgSO4·7H2O - 0,5 г;
FeSO4·7H2O - 0,01 г; сахароза –
30 г; агар – 15г; дист. вода – 1л.
микроорганизмов
на
питательные
среды
проводили
из
разведений. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста
подсчитывали через 10 – 15 суток инкубации. Лучшим разведением считали
то, из которого при высеве на чашку Петри вырастало от 30-50 до 100-150
колоний, если число выросших колоний было меньше 10, то эти результаты
для расчета количества клеток в исходном образце не использовали [47].
Проверку
чистоты
культуры
проводили
в
соответствии
с
общепринятыми в микробиологической практике методами. Конечной целью
качественного исследования микроорганизмов являлось определение их
родовой принадлежности. Работы по составлению родовой характеристики
микроорганизмов делилась на три части: изолирование в чистую культуру;
микроскопические приемы исследования; приемы культивирования для
64
наблюдения
культуральных
и
биохимических
признаков.
Родовую
принадлежность выделенных культур устанавливали по определителям
Берджи, Красильникова, Милько и другим источникам литературы [91 - 101].
Все определения проводили в 3-х кратной повторности, параллельно
ставились контрольные пробы (без инокулянта).
2.4.2. Экспериментальные исследования по определению
оптимальной дозы вносимого биосорбента в технологии биоремедиации
нефтезагрязненной почвы
Экспериментальные исследования по определению оптимальной дозы
вносимого биосорбента в технологии биоремедиации нефтезагрязненной
почвы на протяжении 90 суток проводили при постоянных условиях:
температура воздуха 20 ± 2°С; рН среды 6,0 - 7,0; освещение - естественное;
влажность - 65 - 70%.
В качестве контроля использовали нефтезагрязненную почву, не
подвергшейся
обработкой
препаратами,
использующимися
при
биоремедиации НЗП. Доза внесения биосорбента в нефтезагрязненную почву
составила 433:1 и 217:1.
Эффективность очистки почвы от нефтепродуктов определяли по
физико-химическим показателям по стандартным методикам [47, 62-66].
2.5. Определения условий и сроков хранения полученных
биосорбентов
Для определения возможности использования биосорбентов после
длительного хранения:
− исследуют состояние их поверхности с помощью Scanning Electron
Microscope S-3400N Hitachi с программным обеспечением;
− определяют число адгезии [26];
65
− делают посевы из водной вытяжки на чашки Петри с агаризованной
средой Таусона [47, 77, 78].
Данные сравнивали с результатами, полученными в результате оценки
свежеприготовленного биосорбента.
2.6. Статистическая обработка результатов
При
проведении
математическая
аналитических
обработка
результатов
исследований
с
применением
проводилась
стандартных
статистических методов [102-105]. В ходе статистической обработки
проводился расчет среднего значения, стандартного отклонения, ошибки
среднего значения.
1 N
m =  Ci - среднее значение;
N i =1
S=
e=
1 N
 (C i − m ) 2
N − 1 i =1
t α , N −1 S
N
- стандартное отклонение;
- ошибка среднего значения.
(2.12.)
(2.13.)
(2.14.)
где Сi – i-тое наблюдение концентрации примеси;
N – количество наблюдений;
tα,N-1 – коэффициент Стьюдента с уровнем значимости α и количеством
степеней свободы N-1. Расчеты проводились для уровня значимости α = 0,05.
66
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
КАРБОНИЗАТА
И
ХАРАКТЕРИСТИКА
УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ
МИКРООРГАНИЗМОВ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ
3.1.
Пермский
Характеристика объекта исследования
край
перерабатывающих
является
регионов
нефтеперерабатывающего
одним
в
из
России.
комплекса
крупнейших
Типичный
предприятие
нефтегазо-
представитель
топливно-масляного
направления ООО “ЛУКОЙЛ-Пермнефтеоргсинтез”, который ежегодно
перерабатывает около 13 млн.т нефти [106].
В
результате
осуществления
своей
деятельности
на
нефтеперерабатывающем заводе образуется более 80 тыс.м3 сточных вод в
сутки,
состав
которых
зависит
от
технологии
производства,
перерабатываемого сырья, вида выпускаемой продукции и так далее.
Технология
очистки
сточных
вод
состоит
из
следующих
стадий:
механической, механохимической и биохимической [107, 108]. После
биохимической очистки нефтесодержащих сточных вод образуется 779 м3
избыточного активного ила (ИАИ) в сутки. Результаты исследований физикохимического состава образцов обезвоженного избыточного активного ила
представлены в табл. 3.1.
Таблица 3.1. – Усредненный физико-химический состав образцов
обезвоженного активного ила [107]
Показатели
Ед. измерения
Влажность,
Массовая доля органических
веществ,
Массовая доля золы,
Массовая доля общего азота
рН солевой вытяжки
%
% (на сухое вещество)
Значение
показателя
87,15
64,0
% (на сухое вещество)
% (на сухое вещество)
ед. рН
36
2,6
6,9
67
Показатели
Ед. измерения
рН водной вытяжки
Фосфор
Хлорид-ион
ХПК водной вытяжки (1:5)
Содержание подвижной серы
Алюминий
Железо
Кремний
Калий
Кальций
Магний
Натрий
Нефтепродукты
ед. рН
мг/кг
мг/кг
мгО2/л
мг/кг
мг/кг
мг/кг
мг/кг
мг/кг
мг/кг
мг/кг
мг/кг
мг/кг
Обезвоженный
избыточный
активный
Значение
показателя
6,6
6517- 7047
10500
3514
5050
14000±349,4
12000 ±299,5
8900±222,1
3439±85,8
7333±183
2235±55,8
1922±65,7
122943
ил
представляет
собой
суспензию с влажностью 87 %, содержащую высокую концентрацию
нефтепродуктов, тяжелых металлов, хлор- и серосодержащих соединений.
В
дальнейшем
предприятий
ИАИ
биохимических
нефтехимического
очистных
комплекса
сооружений
подвергается
низкотемпературному пиролизу. На рис.3.1. представлена технологическая
схема
утилизации
избыточного
активного
ила,
которая
включает
предварительную детоксикацию кальцийсодержащим реагентом [107].
Избыточный активный ил с влажностью 98 % с биологических
очистных сооружений в количестве 779 м3/сут. илососами поступает в
смеситель, снабженный механическим перемешивающим устройством в
который одновременно подается оксид кальция. После детоксикации ИАИ
поступает на обезвоживание на центрифуги до влажности 40%. Фугат, виде
коллоидного
раствора,
полученный
на
стадии
центрифугирования,
возвращается на очистные сооружения.
68
Рис. 3.1. Технологическая схема утилизации ИАИ с предварительной
детоксикацией: 1 – смеситель; 2 – центрифуга; 3 – сушилка; 4 –
малоинерционная камера сгорания; 5 – печь пиролиза; 6 – циклон; 7 –
башенный охладитель; 8 – камера сгорания;9 – теплообменник [107, 108]
Следующим этапом переработки ИАИ является сушка ИАИ, которая
осуществляется при температуре 150 0С, на барабанной сушилке и позволяет
удалить из ИАИ колойдно-связанную влагу.
Высушенный ИАИ до остаточной влажности 10-20% выгружается из
сушилки и наклонным транспортером подается на дробилку, из которой
сыпучий материал транспортерами поступает на загрузку в барабанную
вращающуюся печь пиролиза с внешним нагревом, где претерпевает
термическое разложение при температуре 450-5500С и выдерживается 30-40
минут [107].
В результате низкотемпературного пиролиза ИАИ был получен
крупнодисперсный гидрофобный карбонизат (рис.3.2.).
69
Рис.3.2. Поверхность карбонизата (увеличение x 9 раз)
Для определения элементного состава карбонизата был проведен
рентгеноспектральный микроанализ карбонизата (рис.3.3.-3.4.) с указанием
преобладающих химических элементов.
Рис.3.3. Рентгеноспектральный микроанализ карбонизата (точка 1)
70
Рис.3.4. Рентгеноспектральный микроанализ карбонизата (точка 2)
Результаты
усредненных
исследований
элементного
состава
карбонизата представлены в табл.3.2.
Таблица 3.2. – Элементный состав карбонизата
№
Химический элемент
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Натрий (Na)
Магний (Mg)
Алюминий (Al)
Кремний (Si)
Фосфор (P)
Сера (S)
Калий (K)
Кальций (Ca)
Хром (Cr)
Железо (Fe)
Никель (Ni)
Титан (Ti)
Марганец (Mn)
Содержание от общего
количества, %
0,7
1,6
2,4
3,4
5,5
1,0
0,5
12,9
0,058
17,0
0,035
0,1
0,2
71
На основании полученных данных, в карбонизате обнаружены: железо
– 17 %, кальций – 12,9 %, фосфор – 5,5%, кремний – 3,4 %, алюминий – 2,4
%, остальные элементы присутствуют в количестве менее 2 %.
Для
определения
физико-химических
свойств
карбонизата
и
возможности использования его в качестве носителя были проведены
дополнительные экспериментальные исследования.
3.2. Исследование возможности использования карбонизата в
качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов
3.2.1. Исследование физико-химических свойств носителей
Для обоснования возможности использования карбонизата в качестве
носителя для иммобилизации микроорганизмов его основные физикохимические и сорбционные свойства были сопоставлены с известным
углеродным сорбентом – БАУ (уголь активный березовый дробленый) [57].
Углеродные сорбенты, которые использовались в качестве носителей
для иммобилизации микроорганизмов, представлены на рис.3.5.
а) поверхность БАУ
72
б) поверхность карбонизата
Рис. 3.5. Углеродные сорбенты, которые использовались в качестве
носителей для иммобилизации микроорганизмов (увеличение × 40 раз)
Характеристика
и
способ
получения
исследуемых
материалов
представлен в табл.3.3.
Таблица 3.3. – Характеристика и способ получения исследуемых
материалов [57, 107]
Исходный
материал
Древесина
березы
Способ переработки
Внешний вид
Зерна черного
Высокотемпературный
цвета без
пиролиз (температура –
800 – 950 ºС) при механических
примесей
воздействии водяного
пара и с последующим
дроблением
Низкотемпературный
Образцы
Избыточный
пиролиз (температура – черного цвета
активный ил
без
биохимических 450-550 ºС)
механических
очистных
примесей
сооружений
предприятий
нефтехимического комплекса
Полученный
материал
Березовый
активный
уголь (БАУ)
Карбонизат
73
Физико-химические
характеристики
углеродных
материалов
представлены в табл.3.4.
Таблица 3.4. – Физико-химические характеристики углеродных
материалов [107, 109]
Показатель
Основная фракция
Содержание
пироуглерода
Минеральная часть
Насыпная плотность
Механическая прочность
на истирание
Единица
измерения
мм
%
%
г/дм3
%
Значение показателя
БАУ-А
Карбонизат
(ГОСТ 6217-74)
1-3,6
5-10
90-95
40-45
240
60
55-60
385
50
На основании представленных данных, по сравнению с БАУ-А,
основная фракция карбонизата в 3-5 раз больше, содержание пироуглерода в
2 раза больше, присутствует минеральная составляющая, насыпная плотность
выше в 1,6 раз, а механическая прочность отличается незначительно.
3.2.2. Исследование сорбционных свойств носителей
БАУ представляет собой пористый материал, состоящий в основном из
углерода. Имеет сильно развитую общую пористость, широкий диапазон пор
и значительную величину удельной поглощающей поверхности. Данные
характеристики дают возможность эффективного использования БАУ-А для
очистки жидких сред от широкого спектра примесей (от мелких,
соизмеримых с молекулами йода до молекул жиров, масел, нефтепродуктов,
хлорорганических соединений и др.) при высоком ресурсе работы [109].
Для определения пористой структуры карбонизата и возможности
использования в качестве носителя для закрепления микроорганизмов были
проведены дополнительные исследования с помощью прибора Сорби-MS для
измерения удельной поверхности дисперсных и пористых материалов.
74
На основании полученных данных, карбонизат имеет макропористую
структуру. Общий объем макропор – 0,559 - 0,544см3/г. Общий объем
мезопор – 0,056см3/г. Мезопоры представлены в основном размерами 3,5 нм
– 24 %, 8,4 нм - 22 % и 15 нм - 21 %.
Для определения эффективности карбонизата как сорбционного
материала были определены его сорбционные свойства: нефтеемкость,
влагоемкость и статическая сорбционная емкость. Оценка эффективности
производилась согласно ТУ 214-10942238-03-95.
В
качестве
сорбатов
использовалась
нефть
Бугурусланского
месторождения (плотность - 866,3 кг/м3, массовая доля воды – 0,14%,
массовая доля механических примесей - 0,0064 %), полусинтетическое масло.
Результаты экспериментальных исследований по определению основных
сорбционных характеристик носителей представлены в табл.3.5.
Таблица 3.5. – Характеристика основных сорбционных свойств
сорбентов [107, 109].
Показатель
Удельная поверхность,
м2 в 1 г угля
Пористость (объем пор),
см3/г, не менее
общая
макропоры
мезопоры
микропоры
Сорбционная емкость,
не менее
влагоемкость, см3/г
нефтеемкость, г/г
маслоемкость, г/г
Значение показателя
БАУ-А
Карбонизат
(ГОСТ 6217-74)
700-800
39,3 ± 0,6
1,1
0,8
0,08
0,22
0,6
0,544
0,056
-
1,6
3,45
2,52
0,6
0,55
0,35
Как видно из табл.3.5. емкость карбонизата уступает емкости
углеродного сорбента, но достаточна для использования в качестве носителя
75
для иммобилизации микроорганизмов. Полученные данные свидетельствуют
о возможности использования карбонизата в качестве носителя для
иммобилизации микроорганизмов.
3.2.3. Определение экологической безопасности карбонизата
Немаловажным значением для материала, полученного из отходов
производства, и использующимся в качестве носителя для микроорганизмов
является значение показателя относительной экологической опасности
отхода, которая устанавливается по степени его возможного негативного
воздействия на окружающую среду.
Исследованиями, проведенными
Э.Х. Сакаевой и
М.С. Дьяковым
[107, 108] установлено, что карбонизат имеет четвертый класс опасности, то
есть практически не опасен для окружающей среды. В этих же
исследованиях определено, что материал не фитотоксичен, следовательно,
учитывая более высокую устойчивость микроорганизмов к неблагоприятным
факторам, можно предположить его нетоксичность по отношению к
микроорганизмам. В Приложение 1 представлено заключение о классе
опасности карбонизата.
Дополнительно были проведены исследования по определению
токсичности биосорбента на основе карбонизата по методикам ПНД Ф Т
14.1:2:4.12-06 (издание 2011 г.) и ФР. 1.39.2001.00283 [60, 61]. Результаты
биотестирования по методике ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06 представлены в табл.
3.6.
76
Таблица 3.6. – Результаты биотестирования по методике ПНД Ф Т
14.1:2:4.12-06
Количество Продолжительность наблюдения, ч
биосорбента, г
24
48
Оценка тестируемого
количества
0
10
10
Не оказывает острое
токсическое действие
0,1
9
9
Не оказывает острое
токсическое действие
0,3
10
10
Не оказывает острое
токсическое действие
0,5
9
9
Не оказывает острое
токсическое действие
1
10
10
Не оказывает острое
токсическое действие
Результаты
биотестирования
по
методике
ФР.
1.39.2001.00283
представлены в табл. 3.7.
Таблица 3.7. – Результаты биотестирования по методике ФР.
1.39.2001.00283
Количество Продолжительность наблюдения, ч
биосорбента, г
24
48
72
96
Оценка тестируемого
количества
0
10
10
9
9
Не оказывает острое
токсическое действие
0,1
10
9
9
9
Не оказывает острое
токсическое действие
0,3
10
10
10
10
Не оказывает острое
токсическое действие
0,5
9
9
9
9
Не оказывает острое
токсическое действие
1
10
10
10
10
Не оказывает острое
токсическое действие
77
Проведенные эксперименты по установлению острого токсического
действия показали, что полученный биосорбент на основе карбонизата
токсическими свойствами не обладает.
На
основании
использовать
проведенных
карбонизат,
исследований,
продукт
было
низкотемпературного
предложено
пиролиза
избыточного активного ила, в качестве носителя для иммобилизации
микроорганизмов.
3.2. Характеристика исходной нефтезагрязненной почвы
Для
проведения
выделения
углеводородокисляющих
лабораторных
исследований
по
микроорганизмов
биоремедиации
и
НЗП
использовали почву, загрязненную нефтью Бугурусланского месторождения
Оренбургской области (плотность - 866,3 кг/м3, массовая доля воды – 0,14%,
массовая доля механических примесей - 0,0064 %). Характеристика нефти
Бугурусланского месторождения представлена в табл. 3.8.
Таблица 3.8. – Характеристика нефти Бугурусланского месторождения
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Наименование показателя
Метод
испытаний
Температура нефти при условиях
измерений объема, °С
Температура нефти при измерении
плотности ареометром, °С
Плотность
нефти,
измеренная ГОСТ 3900
ареометром, кг/м3
Плотность
нефти
при
условиях МИ 2153
измерения объема, кг/м3
Плотность нефти при 20 °С, кгс/м3
ГОСТ 3900
Массовая доля воды, %
Концентрация хлористых солей, мг/дм3
Массовая доля хлористых солей, %
Массовая доля механических примесей,
%
10 Массовая доля балласта всего, %
ГОСТ 2477
ГОСТ 21534
ГОСТ 21534
ГОСТ 6370
Результат
испытаний
33
23
727,7
866,3
874,6
0,14
23
0,0023
0,0064
0,149
78
Протокол испытаний нефти представлен в Приложении 2.
По
принятой
классификации
нефтей,
нефть
месторождения
«Бугурусланнефть» - относится к типу нафтеново-метановых, сернистых.
Характеристика исходной нефтезагрязненной почвы по физикохимическим и микробиологическим показателям представлена в табл.3.9.
Таблица 3.9. – Характеристика исходной нефтезагрязненной почвы,
используемой для экспериментов
Показатель
Единица
измерения
Физико-химические показатели
Влажность
%
Реакция среды
рН
Содержание НП
г/кг
Микробиологические показатели
Общее количество
кл/г
микроорганизмов
Сапрофитные бактерии
КОЕ/г
УВОМ, выросшие на среде К
КОЕ/г
УВОМ, выросшие на среде
КОЕ/г
Таусона
% обрастания
Бактерии р. Azotobacter
комочков
Олигонитрофилы
КОЕ/г
Актиномицеты
КОЕ/г
Микроскопические грибы
КОЕ/г
Значение показателя
18-20
5,8-6
40±5
6,4·105
(5,4 ± 0,7) 107
(4,5 ± 2) 106
(1,65 ± 0,4) 107
85
(1,3 ± 0,11) 109
(1,1 ± 0,3) 109
Не выросло
Микроорганизмы, выделенные на МПА, из нефтезагрязненной почвы
представлены на рис.3.6.
Для исследований использовали почву с высоким содержанием нефти и
нефтепродуктов (40±5 г/кг), в почве присутствуют бактерии и актиномицеты,
отсутствуют микроскопические грибы.
79
Рис.3.6. Микроорганизмы, выделенные на МПА
3.3. Характеристика углеводородокисляющих микроорганизмов,
выделенных из нефтезагрязненной почвы
3.3.1. Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов
Для
выделения
углеводородокисляющих
микроорганизмов
использовали нефтезагрязненный почву с содержанием нефти 26,6±5 г/кг.
Почва черного цвета с характерным запахом нефтепродуктов. В качестве
источника углерода использовали нефть Бугурусланского месторождения.
Углеводородокисляющие микроорганизмы, выделенные из НЗП на среде
Таусона, представлены на рис.3.7.
80
а) Углеводородокисляющие бактерии
б) Гифы актиномицета
Рис.3.7.Углеводородокисляющие микроорганизмы,
выделенные из НЗП на среде Таусона (увеличение x 800 раз)
81
Установлено,
что
структуру
микробиоценоза
в
суспензии
с
микроорганизмами сформировали представители родов: Pseudomonas putida,
Pseudomonas facilis, Rhodococcus ruber, Rhodococcus fasciens, Mortierella sp.
Входящие в состав суспензии микроорганизмы, выделенные из
нефтезагрязненной почвы, опасного воздействия на людей и окружающую
природную среду не оказывают, патогенетического значения для человека и
животных не имеют, фитопатогенами не являются. По изученным
литературным
источникам
представленные
микроорганизмы
широко
распространены и выделяются из природной среды, в том числе почвы и
воды.
В
Приложении
3
представлено
заключение
о
патогенности
микроорганизмов.
3.3.2. Получение накопительной культуры УВОМ
Выращивание УВОМ проводили на среде Таусона с добавлением в
качестве
единственного
источника
углерода
нефти
Бугурусланского
месторождения. Наращивание биомассы микроорганизмов проводили в
ферментере Biostat A plus (рис.2.1.), для этого с чашек Петри сделали смыв
микроорганизмов (общее количество внесенных микроорганизмов составило
8,63*107 КОЕ/мл), добавили 10 мл нефти и 2 л синтетической среды Таусона,
на которой и были получены УВОМ.
Культивирование
условиях,
которые
микроорганизмов
в
ферментере
проводили
при
поддерживались
постоянных
автоматически:
температура среды – 28±2 °C, pH – 5,8-6,0, периодичность работы мешалки –
100 об/мин. Информация о ходе процесса выводилась на монитор (рис. 3.8.).
Для
контроля
углеводородокисляющих
процесса
микроорганизмов
наращивания
в
ферментере
биомассы
проводили
периодические микроскопические исследования и посевы на питательную
среду.
82
Рис. 3.8. Данные определяемые ферментером и выводимые на
компьютер
Динамика численности микроорганизмов в ферментере представлена
на рис. 3.9.
Увеличение численности микроорганизмов, КОЕ/мл
4,50E+06
4,00E+06
3,50E+06
3,00E+06
2,50E+06
2,00E+06
1,50E+06
1,00E+06
5,00E+05
0,00E+00
-5,00E+05
0
5
16
20
26
38
День эксперимента, сут
Количество микроорганизмов, КОЕ/мл
Рис. 3.9. Динамика численности микроорганизмов
83
Первые
три
недели
эксперимента
проходила
адаптация
микроорганизмов к условиям среды, затем численность микроорганизмов
стала стремительно увеличиваться, постепенное снижение численности
бактерий наблюдалось на 38 сутки эксперимента.
Контроль
за
микроскопирования
микроорганизмов.
микроскопирования,
процессом
жидкой
На
рис.
осуществляли
фазы
и
3.10.
(а-г)
свидетельствующие
путем
периодического
идентификации
о
выделенных
представлены
процессах
результаты
адаптации
и
наращивания УВОМ на питательной среде с единственным источником
углерода – углеводородами нефти.
а) 1й день эксперимента
б) 16й день эксперимента
84
в) 26й день эксперимента
г) 38й день эксперимента
Рис.3.10. Микробиологические картины суспензии
углеводородокисляющих микроорганизмов из ферментера
(увеличение x 800 раз)
Суспензию УВОМ использовали для иммобилизации в момент, когда
основная масса клеток микроорганизмов перешла в капли нефти, а
численность микроорганизмов пошла на спад. При этом биомасса сухих
клеток микроорганизмов в суспензии составляла не менее 1,0 г/л.
Обычно, при ферментации нефтеокисляющих микроорганизмов в
ферментере образуется культуральная жидкость, из которой в дальнейшем
85
отделяют
жизнеспособные
микроорганизмы
и
используют
для
иммобилизации. В нашем эксперименте мы отказались от стадии разделения
культуральной жидкости и клеток УВОМ и иммобилизировали полученный
субстрат, для того, чтобы, во-первых, в процессе хранения микроорганизмы
имели питательные вещества для поддержания жизнедеятельности, а вовторых, для наилучшего сорбирования на поверхности макропористого
носителя за счет модификации клеток УВОМ. Это значительно упрощает
биотехнологическую
схему
производства
биосорбента,
что
является
несомненным преимуществом перед другими аналогами.
ВЫВОДЫ
1. Карбонизат,
полученный
в
результате
низкотемпературного
пиролиза избыточного активного ила биохимических очистных сооружений
предприятий нефтехимического комплекса, по своим физико-химическим
(удельная поверхность – 39,3 ± 0,6 м2 в 1 г угля, общий объем макропор –
0,559 - 0,544см3/г) и сорбционным характеристикам (влагоемкость – 0,6 см3/г,
нефтеемкость – 0,55 г/г) является хорошим макропористым материалом.
Карбонизат имеет четвертый класс опасности.
2. Для выделения УВОМ и проведения лабораторных исследований по
биоремедиации
НЗП
использовали
почву
загрязненную
нефтью
Бугурусланского месторождения Оренбургской области (плотность - 866,3
кг/м3, массовая доля воды – 0,14%, массовая доля механических примесей 0,0064 %).
3. Для получения накопительной культуры микроорганизмов были
выделены углеводородокисляющие микроорганизмы, относящиеся к родам
Pseudomonas
sp.,
Rhodococcus
sp.,
Mortierella.
Суспензию
УВОМ
использовали для иммобилизации в момент, когда основная масса клеток
микроорганизмов перешла в капли нефти, а численность микроорганизмов
пошла на спад. При этом биомасса сухих клеток микроорганизмов в
суспензии составляла не менее 1,0 г/л.
86
ГЛАВА
4.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
ПО
ПОЛУЧЕНИЮ БИОСОРБЕНТА НА ОСНОВЕ КАРБОНИЗАТА И
ОЦЕНКА
ЭФФЕКТИВНОСТИ
ЕГО
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
В
ТЕХНОЛОГИИ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЗП
4.1. Экспериментальные исследования по получению биосорбента
на основе карбонизата
Для определения эффективности закрепления микроорганизмов на
пористой поверхности сорбентов были проведены эксперименты по
физической иммобилизации статическими и динамическим способами.
Статический способ иммобилизации микроорганизмов осуществляли с
перемешиванием и без перемешивания. Перемешивание осуществляли с
помощью магнитной мешалки, а также в ферментере.
В
динамических
осуществляли
путем
условиях
пропускания
иммобилизацию
порций
микроорганизмов
суспензии
УВОМ
через
сорбционную колонку.
В качестве носителя использовали углеродные сорбенты: БАУ и
карбонизат,
поверхность
которых
обрабатывали
суспензией
УВОМ,
содержащей питательные вещества для их жизнедеятельности. Условия
проведения экспериментов по иммобилизации микроорганизмов на пористой
поверхности
носителей
в
зависимости
от
применяемого
способа
представлены в табл. 4.1.
Условия
проведения
экспериментальных
исследований
по
иммобилизации микроорганизмов (температура, рН, освещение) были
одинаковые для каждого способа. Существенным отличием является условия
перемешивания жидкости, т.е. были проведены эксперименты в статике без
перемешивания, с перемешиванием и в динамике методом пропускания
суспензии УВОМ через слой носителя.
87
Таблица 4.1. - Условия проведения экспериментов по иммобилизации
микроорганизмов на пористой поверхности носителей в зависимости от
применяемого способа
Перемешивание
Метод иммобилизации микроорганизмов
Динамический
Статический метод
метод
С перемешиванием
Без переПропускание
суспензии УВОМ
мешивания
суспензии УВОМ
суспензии
через слой носи100
400
УВОМ
теля в колонке
об/мин
об/мин
Количество
сорбента, г
Объем суспензии,
мл
Длительность
испытаний, ч
Различные
1
12
1
2,3/8/9,65/10
50
1500
50
500/350
10
2/4/6/10/12
10
8/10/35
способы
иммобилизации
микроорганизмов
позволят
выбрать наиболее эффективный способ получения биосорбента.
4.1.1. Статический способ иммобилизации микроорганизмов без
перемешивания
Иммобилизацию в статических условиях проводили в стерильных
конических колбах, в которые вносили определенную навеску (1 г) носителя
и заданный объем суспензии УВОМ (50 мл), полученную смесь оставили на
некоторое время без перемешивания. Иммобилизация достигается за счет
самопроизвольной
последующей
диффузии
фермента
адсорбцией. Закрепление
к
поверхности
микроорганизмов
носителя
с
статическим
способом без перемешивания представлено на рис.4.1.
При
статическом
способе
иммобилизации
микроорганизмов
на
поверхности сорбентов, закрепление микроорганизмов было зафиксировано
на
поверхности
карбонизата,
на
угле
бактерий
не
обнаружено.
88
Микроорганизмы,
иммобилизованные
на
поверхности
карбонизата,
представляли собой овальные клетки размером 4-5 мкм.
а) поверхность БАУ
(увеличение x 500 раз)
б) поверхность карбонизата
(увеличение x 500 раз)
в) поверхность БАУ
г) поверхность карбонизата
(увеличение x 3000 раз)
(увеличение x 3000 раз)
Рис.4.1. Иммобилизация микроорганизмов статическим
способом без перемешивания
На рис. 4.2. представлена микроскопическая картина суспензии УВОМ
после проведения иммобилизации. Видно, что количество УВОМ в десятки
раз меньше, после пропускания суспензии микроорганизмов через слой
карбонизата, по сравнению с суспензией микроорганизмов пропускаемой
через слой БАУ. Это еще раз подтверждает, тот факт, что карбонизат
оказался пригодным носителем для иммобилизации микроорганизмов.
89
б) Карбонизат
а) БАУ
Рис.4.2. Микроскопическая картина суспензии УВОМ
после проведения иммобилизации статическим способом без перемешивания
(увеличение x 800 раз)
Статический способ закрепления микроорганизмов без перемешивания
является
наиболее
простым
для
осуществления,
не
требующим
дополнительных энерго- и ресурсозатрат. Недостатком метода является то,
что для получения биосорбента с высоким содержанием иммобилизованных
микроорганизмов и равномерного заполнения поверхности носителя,
последний
приходится
выдерживать
в
контакте
с
суспензией
микроорганизмов в течение длительного времени.
4.1.2. Статический способ иммобилизации микроорганизмов с
перемешиванием суспензии УВОМ
Иммобилизация в статических условиях с перемешиванием состоит в
том, что носитель суспендируется в растворе с микроорганизмами и
полученная смесь непрерывно перемешивается с помощью магнитной или
механической мешалки.
90
На основании проведенного литературного обзора, было выявлено, что
степень
иммобилизации
микроорганизмов
на
носителе
выше
при
максимальных скоростях перемешивания, и снижается при уменьшении
скорости перемешивания [49].
В нашем случае была выбрана скорость перемешивания – 100 об./мин,
которая поддерживалась в ферментере Biostat A plus автоматически, и
скорость перемешивания – 400 об./мин, которую поддерживали с помощью
магнитной мешалки серии ММ-5.
4.1.2.1. Статический способ иммобилизации микроорганизмов с
перемешиванием суспензии УВОМ со скоростью 100 об./мин
Закрепление
использовании
микроорганизмов
12
г
носителя
и
в
1500
ферментере
мл
проводили
суспензии
УВОМ,
при
что
обосновывается наименьшим количеством жидкости для оптимальной
работы ферментера, культивирование микроорганизмов проводили при
перемешивании суспензии УВОМ и носителя со скоростью 100 оборотов в
минуту. Рабочие параметры процесса иммобилизации микроорганизмов в
ферментере представлены в табл.4.2.
Таблица
4.2.
–
Рабочие
параметры
процесса
иммобилизации
микроорганизмов в ферментере
Параметр
Объем субстрата
Концентрация субстрата
Масса носителя
Скорость перемешивания
Продолжительность
Единица измерения
Показатель
мл
г/л
г
об./мин
ч
1500
6,9
12
100
2, 4, 6, 12
Изменение технологических параметров при увеличении времени
иммобилизации в ферментере представлены в табл. 4.3.
91
Таблица 4.3. – Изменение технологических параметров при увеличении
времени иммобилизации в ферментере
Продолжительность иммобилизации в ферментере
Значение биомассы после проведения эксперимента,
г/мл
Число адгезии, %
Адсорбционная
емкость, г сух.
кл./г носителя
2 часа
4 часа
6 часов
2,4
2,3
2,3
89,1
95,6
94,3
45
46
46
По истечению 12 часов значение биомассы в ферментере увеличилось,
а не уменьшилось как в предыдущее время определения, что можно
объяснить
вторичным
накоплением
биомассы
при
поддержании
оптимальных условий в ферментере и получения дополнительного питания
клеткам УВОМ, поэтому образцы 12-часовой иммобилизации не были
оценены.
Иммобилизованные микроорганизмы на поверхности карбонизата,
полученные в статике с перемешиванием суспензии УВОМ в ферментере
представлены на рис. 4.3.
а) через 2 часа эксперимента
б) через 4 часа эксперимента
(увеличение x 1,5 тыс.раз)
(увеличение x 1,3 тыс.раз)
Рис. 4.3. Иммобилизованные микроорганизмы на поверхности карбонизата,
полученные в статике с перемешиванием суспензии УВОМ в ферментере
92
Важным параметром эффективного закрепления биомассы является
время
контакта
носителя
с
суспензией
УВОМ.
Экспериментально
установлено, что для карбонизата с увеличением времени взаимодействия от
2 до 12 часов, биомасса закрепленных микроорганизмов увеличивается от 65
до 83 %, и достигает максимума при времени контакта 6 часов. Однако,
количество «отпавших» клеток после центрифугирования увеличивается в
5,5 раз, что свидетельствует о разрушении микробиоценоза на поверхности
носителя вследствие увеличения времени взаимодействия (рис.3.10 б).
4.1.2.1. Статический способ иммобилизации микроорганизмов с
перемешиванием суспензии УВОМ со скоростью 400 об./мин
Для
изучения
влияния
скорости
перемешивания
на
процесс
иммобилизации провели экспериментальные исследования по закреплению
УВОМ статическим способом, изменяя скорости от 100 до 400 оборотов в
минуту.
Закрепление микроорганизмов с помощью магнитной мешалки
проводили в лабораторных конических колбах, в которые вносили
определенную навеску (1 г) носителя и заданный объем суспензии УВОМ (50
мл),
после
чего
проводили
культивирование
микроорганизмов
при
периодическом механическом перемешивании (400 об/мин).
При динамическим способе иммобилизации микроорганизмов на
поверхности сорбентов с перемешиванием жидкости 400 оборотов в минуту,
закрепление
микроорганизмов
было
зафиксировано
на
поверхности
карбонизата, на угле были обнаружены отдельные клетки бактерий, однако в
незначительном
количестве.
Микроорганизмы,
иммобилизованные
на
поверхности карбонизата, представляли собой овальные клетки размером 4-5
мкм.
Иммобилизация микроорганизмов статическим способом (с помощью
магнитной мешалки) представлена на рис.4.4.
93
б) поверхность карбонизата
(увеличение x 3000 раз)
а) поверхность БАУ
(увеличение x 3000 раз)
г) поверхность карбонизата
в) поверхность БАУ
(увеличение x 3000 раз)
(увеличение x 3000 раз)
Рис.4.4. Иммобилизация микроорганизмов динамическим
способом (с помощью магнитной мешалки)
Высокая интенсивность перемешивания (400 об./мин) отрицательно
повлияла
на
иммобилизацию
микроорганизмов.
Образцы
носителей
деформировались, поверхность стала более гладкой. При рассмотрении
образцов под микроскопом явного закрепления микроорганизмов на
поверхности носителей не обнаружено.
Увеличение скорости перемешивания до 400 оборотов в минуту
привело к снижению закрепленной биомассы на поверхности носителя, что
могло быть связано с уменьшением силы адгезии между носителем и
микроорганизмами. Наилучшие результаты по иммобилизации (82 %
94
закрепленной биомассы) были получены в варианте опыты со скоростью
перемешивания 100 оборотов в минуту.
4.1.3. Динамический способ иммобилизации микроорганизмов на
поверхности пористых носителей
Адсорбционную
иммобилизацию
осуществляли
динамическим
способом методом пропускания суспензии УВОМ в направлении сверху вниз
через слой носителя в сорбционной колонке в режиме непрерывной
циркуляции. В качестве контроля использовали сорбент БАУ-А (ГОСТ 621774). Рабочие параметры колоночного биореактора представлены в табл.4.4.
Таблица 4.4. – Рабочие параметры колоночного биореактора
Параметр
Единица измерения
Показатель
Объем колонки
см3
3,925
Высота слоя носителя в
колонке
см
5
Объем субстрата
мл
500
Концентрация субстрата
г/л
1,0
мл/ч
50
ч
10
Скорость подачи субстрата
Продолжительность
Иммобилизация
микроорганизмов
динамическим
способом
представлена на рис.4.5.
При динамическом способе иммобилизации микроорганизмов методом
пропускания суспензии УВОМ через слой носителя на поверхности
сорбентов,
закрепление
микроорганизмов
было
зафиксировано
на
поверхности карбонизата, на угле бактерий не обнаружено.
Микроорганизмы, иммобилизованные на поверхности карбонизата,
представляли собой овальные клетки размером 0,3-5 мкм, палочковидные
бактерии длиной от 3 мкм.
95
а) поверхность БАУ
(увеличение x 3000 раз)
б) поверхность карбонизата
(увеличение x 3000 раз)
в) поверхность БАУ
г) поверхность карбонизата
(увеличение x 3000 раз)
(увеличение x 3000 раз)
Рис.4.5. Иммобилизация микроорганизмов динамическим способом
Микроскопическая
картина
после
проведения
физической
иммобилизации динамическим способом представлена на рис.4.6. После
проведения процесса иммобилизации количество микроорганизмов в
вытекающей из колонки суспензии УВОМ после контакта с носителем БАУ в
десятки раз больше, чем после взаимодействия с карбонизатом. Это еще раз
подтверждает, тот факт, что карбонизат оказался пригодным носителем для
иммобилизации микроорганизмов благодаря своей шероховатой поверхности
и макропористой структуре.
96
а) БАУ
б) Карбонизат
(увеличение x 800 раз)
(увеличение x 800 раз)
Рис.4.6. Микроскопическая картина после проведения физической
иммобилизации динамическим способом
К недостаткам данного метода можно отнести: необходимость
контролировать концентрацию клеток бактерий до образования проскока,
расход больших объемов суспензии бактерий. Несовершенства данного
метода легко отрегулировать и реализовать получение биосорбента на
производственном уровне.
Зная концентрацию клеток бактерий на входе и при поддержании
условий процесса иммобилизации (скорость пропускания суспензии УВОМ
через слой носителя), определить необходимое для иммобилизации
количество
суспензии
микроорганизмов
до
проскока.
Жидкость
с
остаточным количеством микроорганизмов на выходе из колонки можно
обратно вернуть в производственный цикл.
Неоспоримым преимуществом данного метода, по сравнению с
рассмотренными
выше
методами,
является
высокая
эффективность
иммобилизации микроорганизмов на поверхности карбонизата.
4.1.4. Выбор эффективного метода иммобилизации
Результаты
проведенных
исследований
показали
высокую
эффективность закрепления УВОМ на поверхности карбонизата в случае
97
использования двух способов иммобилизации: статический способ путем
иммобилизация суспензии УВОМ в ферментере при времени контакта – 2
часа, а также динамический способ путем пропускания суспензии УВОМ
через колонку с носителем.
К преимуществам иммобилизации суспензии УВОМ в ферментере
можно отнести хороший массообмен и благоприятные условия для
функционирования микроорганизмов. К недостаткам метода можно отнести
истирание носителя, обрастание системы перемешивания и датчиков
контроля микроорганизмами, разрушение мицеллия грибов и актиномицетов,
входящих в состав микробиоценоза, на поверхности карбонизата.
Преимуществом
динамического
способа
иммобилизации
микроорганизмов в колоночном реакторе является простота метода и
отсутствие механического истирания частиц. К недостаткам можно отнести
отсутствие эффективной аэрации, градиент давления и уменьшение площади
соприкосновения носителя с суспензией УВОМ за счет уплотнения в
сорбционной
колонке.
Сравнительная
эффективных
методов
иммобилизации
характеристика
УВОМ
по
исследованных
технологическим
параметрам представлена в табл.4.5.
Таблица 4.5. – Сравнительная характеристика методов иммобилизации
микроорганизмов
Параметр
Количество
адсорбированных
клеток, %
Сила адгезии, г*см2/с
Число адгезии, %
Адсорбционная емкость,
г сух. кл./г носителя
Кол-во
микроорганизмов,
КОЕ/мл
Статический способ
иммобилизации
суспензии УВОМ в
ферментере
Динамический способ
иммобилизации
микроорганизмов в
сорбционной колонке
65-83
62,5-70
1,4*10-9
95,6
1,4*10-9
97,1
50
26,7
(6,85±0,2)*108
(7,1±0,1)*108
98
По основным параметрам - количеству адсорбированных клеток, числу
адгезии, количеству микроорганизмов – выбранные методы иммобилизации
отличаются
незначительно.
Значение
адсорбционной
емкости
при
иммобилизации в ферментере увеличивается в 1,87 раз по сравнению с
иммобилизацией в колонке. Эти значения характерны для процесса
иммобилизации в лабораторных условиях. При получении биосорбента в
ферментере
в
промышленных
условиях
выход
готового
продукта
уменьшится на 30 % по сравнению с иммобилизацией микроорганизмов в
колоночном биореакторе. Кроме того, при получении биосорбента в
биореакторе с перемешиванием появляется дополнительная стадия отделения
готового продукта от суспензии УВОМ.
В связи с изложенным для дальнейших исследований по получению
биосорбента на основе карбонизата был выбран динамический способ
иммобилизации микроорганизмов в колоночном биореакторе.
4.2. Определение технологических параметров при получении
биосорбента динамическим способом
4.2.1. Адсорбционно-адгезионный механизм закрепления
микроорганизмов на поверхности карбонизата
С учетом полученных параметров процесса иммобилизации в
статических условиях было определено оптимальное время взаимодействия
карбонизата с суспензией микроорганизмов (рис.4.7.), которое составляет 2
часа.
99
Адсорбционная емкость, г сух.кл./г
носителя
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Время иммобилизации, ч
Адсорбционная емкость, г сух.кл./ г носителя
Рис.4.7. Кинетика процесса
Далее был построен график зависимости величины адсорбции от
начальной концентрации клеток микроорганизмов в суспензии (рис.4.8.),
характер которого говорит о том, что насыщение носителя клетками
наступает при достижении концентрации суспензии УВОМ не менее 1 г
сухих клеток в 1 л.
40
Адсорбционная емкость, г
сух.клеток*мл/г носителя
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
Начальная концентрация клеток микроорганизмов в
суспензии, г/л
Рис.4.8. Изотерма адсорбции
100
С
целью
доказательства
адгезионного
механизма
закрепления
микроорганизмов определяли величину и число адгезии по формулам 2.9. и
2.10. Сила адгезии составляет 1,4*10-9 г*см2/с, число адгезии – 95,6-97,1 %.
Сравнение силы и числа адгезии с литературными данными
представлено в табл.4.6.
Таблица 4.6. – Параметры адгезии микроорганизмов к поверхности
различных материалов [26]
Сила адгезии, г*см2/с
Материал
Число адгезии, %
Параметры адгезии Aspergillus niger к поверхности полимерных материалов
(по данным Синицына [26])
Полиэтилен
3,3*10-4
55
Целлофан
16*10-4
85
Полиэтилентерефталат
25*10-4
90
Параметры адгезии Pseudomonas fluorescens к поверхности стекла (по
данным Синицына [26])
0,4*10-4
Стекло
8
Параметры адгезии микроорганизмов Pseudomonas sp., Rhodococcus sp.,
Mortierella к поверхности карбонизата (экспериментальные данные)
1,4*10-9
Карбонизат
95,6-97,1
По сравнению с числом адгезии Aspergillus niger к поверхности
полимерных материалов и числом адгезии Pseudomonas
fluorescens к
поверхности стекла число адгезии микроорганизмов Pseudomonas sp.,
Rhodococcus sp., Mortierella к поверхности карбонизата выше.
На основании представленных данных можно утверждать, что
карбонизат
является
хорошим
адсорбентом,
позволяющим
прочно
удерживать клетки на своей поверхности.
101
В результате проведенных экспериментов был доказан адсорбционноадгезионный
механизм
закрепления
углеводородокисляющих
микроорганизмов размером 4-5 мкм на поверхности макропор карбонизата.
4.2.2. Определение технологических параметров при получении
биосорбента на основе карбонизата методом пропускания суспензии
УВОМ через слой носителя в сорбционной колонке
Для
определения
технологических
параметров
при
получении
биосорбента методом пропускания суспензии УВОМ через слой носителя в
сорбционной колонке были проведены несколько экспериментов при
изменяющихся
параметрах:
объем
прокачиваемого
субстрата,
продолжительность контакта носителя с суспензией УВОМ, скорость подачи
субстрата. Основные данные рабочих параметров колоночного биореактора
для каждого эксперимента приведены в табл.4.7.
Таблица 4.7. – Основные данные рабочих параметров колоночного
биореактора для каждого эксперимента
Параметр
Объем колонки,
см3
Высота слоя
носителя в
колонке, см
Масса носителя, г
Объем субстрата,
мл
Концентрация
субстрата, г/л
Скорость подачи
субстрата, мл/ч
Продолжительность, ч
№1
3,925
Эксперимент
№2
№3
15,71
29,045
№4
36,5
5
20
37
46,5
2,3
500
9,65
350
8,00
300
10,0
175
1,0
0,9-1,0
1,1
2,2
50
10-15
37,5
22
10
30
8
8
102
Для определения эффективности иммобилизации определяли биомассу
микроорганизмов на входе и выходе сорбционной колонки. Установлено, что
при проведении иммобилизации более суток исходная биомасса суспензии
УВОМ уменьшается на 20-25% за сутки (рис.3.14.). Это связано с тем, что в
лабораторном
эксперименте
изменяются
условия
содержания
микроорганизмов от условий нахождения микроорганизмов в ферментере, а
именно, температура, pH, перемешивание. В промышленности этот момент
можно избежать за счет непрерывной подачи суспензии УВОМ из
ферментера в адсорбер.
Характер графика зависимости биомассы с микроорганизмами на
выходе из сорбционной колонки от объема прокаченной суспензии УВОМ
говорит о том, что происходит плавное увеличение биомассы, максимальное
значение биомассы при прокаченном объеме 260 мл и постепенное
уменьшение значения биомассы (рис.4.9.).
1,2
Биомасса, г/л
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
30
50
90
120
140
210
230
260
280
300
350
Объем суспензии с микроорганизмами, мл
Рис.4.9. Изменения значения биомассы на входе и выходе
колоночного реактора
Количество
адсорбированных
клеток
определяли
по
разности
биомассы на входе и на выходе колоночного реактора. Представление
103
изменения
процентного
вклада
количества
адсорбированных
микроорганизмов и биомассы с микроорганизмами в вытекающей жидкости
с течением времени представлено на рис.4.10.
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Количество адсорбированных клеток микрооргагнизмов, г/л
Значение биомассы с микроорганизмами в вытекающей жидкости, г/л
Рис.4.10. Изменения процентного вклада количества адсорбированных
микроорганизмов и биомассы с микроорганизмами в вытекающей жидкости
с течением времени
Минимальное
количество
адсорбированных
микроорганизмов
составляет 7,7 % от исходного значения при объеме пропускаемой
суспензии УВОМ 260 мл.
Для определения технологических параметров получения биосорбента
на основе карбонизата динамическим способом с помощью сорбционной
колонки
были
изменяющихся
проведены
параметрах:
эксперименты
объем
по
иммобилизации
прокачиваемого
при
субстрата,
продолжительность контакта носителя с суспензией УВОМ, скорость подачи
субстрата.
104
4.2.2.1. Влияние продолжительности иммобилизации на
эффективность процесса
Для определения необходимого времени иммобилизации УВОМ была
построена кривая зависимости времени иммобилизации от адсорбционной
емкости носителя (рис.4.11.).
Адсорбционная емкость, г сух.клеток*мл/г
носителя
14
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Время иммобилизации, ч
Рис.4.11. Зависимость времени иммобилизации от адсорбционной
емкости носителя
Как видно из графика, значение адсорбционной емкости возрастает в
течение
5
часов,
после
чего
снижается,
что
свидетельствует
о
нецелесообразности увеличения времени контакта и достаточности времени
иммобилизации.
4.2.2.2. Влияние скорости подачи суспензии УВОМ на процесс
иммобилизации
Процесс удерживания микроорганизмов в носителе зависит от
скорости потока суспензии УВОМ пропускаемой через слой адсорбента
(рис.4.12.).
105
90
Удерживание клеток, % от
пропускаемых
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
Скорость потока суспензии УВОМ, мл/ч
70
80
Рис.4.12. Зависимость удерживания клеток от скорости
потока суспензии УВОМ
На основании представленных данных процент удерживание клеток
увеличивается с увеличением скорости потока суспензии УВОМ до 50 мл/ч и
уменьшается при увеличении скорости до 60 мл/ч.
Этот
факт
подтверждается
литературными
данными,
так
при
увеличении скорости подачи суспензии УВОМ между клетками и носителем
пограничный слой жидкости уменьшается, увеличивая вероятность прямого
контакта и иммобилизацию клеток на поверхности носителя. Однако, при
больших скоростях пропускаемой суспензии УВОМ через слой носителя
количество иммобилизованных микроорганизмов будет уменьшаться, что
связано с сокращением времени взаимодействия клеток УВОМ и носителя
[49].
4.2.2.3. Микроорганизмы, выявленные на поверхности биосорбента
Микроорганизмы,
представлены
выявленные
на
поверхности
биосорбента,
углеводородокисляющими
бактериями
(рис.4.13.а),
актиномицетами (рис.4.13.б), грибами (рис.4.13.в), в долевом соотношении
4:2:1 соответственно.
106
Рис.4.13.а. Бактерии, обнаруженные на поверхности биосорбента
Рис.4.13.б. Мицелий актиномицета, выявленный на поверхности
биосорбента
107
Рис.4.13.в. Микроскопический гриб р.Mortierella, обнаруженный на
поверхности биосорбента
Закреплению
микроорганизмов
на
поверхности
карбонизата
способствовало то, что размеры бактериальных клеток совпадали с
размерами пор носителя, а также удерживание осуществлялось за счет
мицелия актиномицетов и грибов.
4.2.2.4. Технологические параметры процесса получения
биосорбента динамическим способом
На основании серии экспериментов по получению биосорбентов
методом пропускания суспензии УВОМ через слой карбонизата были
определены биохимические, механические, гидромеханические параметры.
Основные закономерности процесса получения биосорбента методом
пропускания
суспензии
УВОМ
через
слой
носителя
с
помощью
сорбционного колоночного биореактора обобщены в табл.4.8.
108
Таблица
4.8.
–
Параметры,
выявленные
на
основании
серии
экспериментов по получению биосорбента на основе карбонизата [110, 111]
№
Параметр
Значение
1. Биохимические параметры
1.1.
Стабильность бактерий 0,25±0,05г/л за
микроорганизмов
в
сутки
процессе
работы
реактора и зависимость
инактивации от времени
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.
Оптимальная
концентрация субстрата
на
начало
процесса
иммобилизации
Оптимальная
концентрация субстрата
при
завершении
иммобилизации
Минимальное
и
максимальное
время
контакта субстратом
Образование побочных
продуктов реакции
Чувствительность
к
изменению температуры,
pH
Примечание
Хранение суспензии
УВОМ
в
лабораторной колбе и
постепенном
использовании
при
иммобилизации
происходит линейное
уменьшение
биомассы
микроорганизмов.
не менее
1±0,2 г/л
не менее
0,5±0,1 г/л
Не менее 2
часов и не
более 10 часов
90±2 % от
пропускаемой
суспензии
УВОМ
Не выявлено
Жидкость на выходе
из реактора можно
возвратить в цикл,
т.к. представляет из
себя
суспензию
УВОМ
только
с
меньшей
количеством
микроорганизмов и
концентрацией НП.
Зависит
от
используемых
при
иммобилизации
109
№
1.7.
1.8.
Параметр
2.3.
2.4.
2.5.
Примечание
микроорганизмов.
По
своим
Характеристика потока
Изменений
на выходе (состав, цвет, органолептиче- органолептическим
запах и т.п.).
ских свойств свойствам жидкость
не выявлено
на
выходе
не
изменилась,
что
способствует
возврату жидкости в
производственный
цикл.
Концентрация субстрата
0,1-0,5 г/л
В зависимости от
на выходе
объема
и
концентрации
пропускаемой
жидкости.
2. Механические параметры
2.1.
Размер, форма частиц и
их распределение по
размерам
2.2.
Значение
Общий объем
макропор –
0,559 - 0,544
см3/г. Общий
объем мезопор
– 0,056см3/г.
Мезопоры
представлены в
основном
размерами 3,5
нм – 24 %, 8,4
нм - 22 % и 15
нм - 21 %.
Насыпная масса в сухом
Увеличение
и влажном виде
массы
карбонизата
после
иммобилизаци
и на 35±5 %.
Набухание
Не выявлено
Сжимаемость
Не выявлено
Истирание частиц
Не выявлено
Использование
в
качестве
носителя
макропористого
сорбента позволяет
микроорганизмам с
размерами до 10 мкм
адсорбироваться на
его поверхности.
При иммобилизации
в
колоночном
110
№
Параметр
Значение
Примечание
реакторе
в
лабораторных
условиях истирание
сорбента
не
наблюдалось.
2.6.
Поглощение суспензии
10 % от
УВОМ носителем
пропускаемого
объема
3. Гидромеханические параметры
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
Тип потока
Скорость потока
Уплотнение слоя
Расслаивание
Отношение длины
диаметру
Нисходящий
50±10 мл/ч
Не выявлено
Не выявлено
3.6.
Время
контакта
суспензии с носителем
к
Чем больше общая
длина слоя сорбента в
колонке при прочих
равных условиях, тем
меньше
доля
неотработанной его
части по отношению
ко
всей
массе
сорбента,
выше
коэффициент
его
полезного
использования
и
больше длительность
работы, или время
защитного действия.
Не менее 2
часов и не
более 8 часов
Условия протекания иммобилизации клеток УВОМ на поверхности
карбонизата в сорбционной колонке представлены в табл.4.9.
111
Таблица 4.9. – Условия протекания иммобилизации клеток УВОМ на
поверхности карбонизата в сорбционной колонке
Параметр
Концентрация
клеток
бактерий на входе в
реактор
Концентрация
клеток
бактерий на выходе из
реактора
pH
Температура
Скорость
подачи
суспензии УВОМ
Время контакта суспензии
с носителем
Единица измерения
г/мл
Показатель
не менее 1±0,2
г/мл
0,3-0,5
ед. pH
°C
мл/ч
5,8-6,2
20±2
50±10
ч
5±0,5
Полученные данные являются основой для получения биосорбента на
основе карбонизата в промышленном масштабе.
4.3. Экспериментальные исследования по оценке эффективности
биосорбента на основе карбонизата в технологии биоремедиации НЗП
Экспериментальные
исследования
по
оценке
эффективности
использования полученных биосорбентов на основе карбонизата – продукта
пиролиза избыточных активных илов биохимических очистных сооружений
предприятия нефтехимического комплекса, направлены на определение:
1) степени очистки почвы при использовании биосорбента;
2) оптимальной дозы вносимого биосорбента при различном уровне
загрязнения почвы;
3) обоснования
благоприятных
условий
и
сроков
хранения
полученного биосорбента по истечении времени хранения.
112
4.3.1. Результаты экспериментальных исследований использования
биосорбента в технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв
Эксперимент по биоремедиации нефтезагрязненной почвы проводили
согласно
технологическому
регламенту
на
проведение
опытно-
промышленных работ по ремедиации нефтезагрязненных грунтов на
территории деятельности ООО «ЛУКОЙЛ-ПЕРМНЕФТЬ».
Экспериментальные исследования по биоремедиации НЗП проводили в
лабораторных условиях в контейнерах емкостью 5,0 дм3. В ходе
экспериментальных
исследований
на
протяжении
трех
месяцев
поддерживали постоянные условия: температура воздуха 20 ± 2°С; рН среды
6,0 - 7,0; освещение - естественное; влажность субстрата - 65 - 70%.
Для проведения эксперимента по биоремедиации нефтезагрязненной
почвы с помощью полученного биосорбента необходимо было определить:
количество биосорбента для очистки почвы от загрязнения с известным
содержанием нефтепродуктов дли проведения эффективного процесса
биоремедиации.
На
основе
рассмотренных
рекомендаций
по
применению
существующих биосорбентов – аналогов при очистке почвы, загрязненной
углеводородами нефти, таких как биоокисляющий сорбент «БОС»,
«Биосорбонафт», биодеструктор «Эконадин», сорбент «Унисор-Био».
Определено, что для обработки 1 га нефтезагрязненной территории и
низкой степени загрязнения (до 50 г/кг) необходимо минимум 1-2 т
биосорбента,
либо
0,1-0,2
кг
биосорбента
для
обработки
м2
1
нефтезагрязненной территории, либо 1-2 г для обработки 0,01 м2
нефтезагрязненной территории.
На основании изученных данных по применению биосорбентов
-
аналогов было определено, что для ликвидации загрязнения с содержанием
нефтепродуктов в почве 40±5 г/кг необходимо использовать 2 г биосорбента
из расчета на 0,01 м2 нефтезагрязненной территории.
113
Объектом
исследования
служила
загрязненная
нефтью
Бугурусланского месторождения почва, содержание нефтепродуктов 40±5
г/кг. В качестве контрольных образцов использовали субстрат на основе НЗП
и опила в соотношении 7:3 (вариант 2), субстрат на основе НЗП, опила и
суспензии УВОМ в соотношении 7:3:1 (вариант 3) и субстрат из НЗП с
добавлением карбонизата из расчета 10 г на 1 кг НЗП (вариант 4).
Дополнительно
были
проведены
эксперименты
по
оценке
эффективности очистки почвы с употреблением биосорбента в различном
соотношении (из расчета 10, 20 и 30 г на 1 кг НЗП) и опила, используемого в
качестве структуратора.
Эффективность очистки почвы от нефтепродуктов через 3 месяца от
начала эксперимента в исследуемых вариантах представлена в табл. 4.10.
Как показывают данные, эффективность очистки от нефтепродуктов
составила 59,5 % в варианте 8 (НЗП : биосорбент - 100 : 1), что в 1,7 раза выше
по сравнению с вариантом 2 (НЗП : Опил – 7:3), в 1,4-1,5 раз выше по
сравнению с вариантом 3 (НЗП: Опил : Суспензия УВОМ – соотношение 7:3:1)
и в 1,6 раз выше по сравнению с вариантом 4 (НЗП : Карбонизат - 100 : 1).
При использовании в технологии биоремедиации опила, в качестве
структуратора, вместе с биосорбентом повышает эффективность очистки по
сравнению с вариантом 8 (НЗП : биосорбент - 100 : 1) в 1,5 раза в варианте 5
(НЗП : Опил : Биосорбент – 70:30:1), в 1,9-2,0 раза в варианте 6 (НЗП : Опил :
Биосорбент – 35:15:1), в 2,8-2,9 раза в варианте 7 (НЗП : Опил : Биосорбент –
23:10:1).
Результаты
микробиологического
анализа
исследуемых
субстратов
приведены в табл.4.11.
114
Массовые
соотношения,
доля
Остаточное
содержание НП
через 1,5 месяца,
г/кг
Остаточное
содержание НП
через 3 месяца,
г/кг
Эффективность
очистки, %
Рецептура
7:3
33,9-34,2
25,7-25,9
35,3-35,8
39,8-38,5
37,0-37,8
92,5-94,5
НЗП :
Опил
Исходная
почва
-
№2
№1
40,0 – 43,7
22,5-24,0
32,8-33,2
7:3:1
36,8-37,8
24,9-25,3
34,2-34,8
100:1
40,5-41,0
16,2-16,4
28,2-28,4
70:30:1
29,5-31,0
11,8-12,4
26,2-26,6
35:15:1
20,5-21,3
8,2-8,5
24,1-24,5
23:10:1
115
59,0-59,5
16,2-16,4
28,4-28,8
100 : 1
№3
№4
№5
№6
№7
№8
НЗП:
НЗП:
НЗП:
НЗП:
Опил:
НЗП:
НЗП:
Опил:
Опил:
Опил:
Суспензия Карбонизат
Биосорбент
Биосорбент Биосорбент Биосорбент
УВОМ
Варианты способа очистки НЗП
Таблица 4.10. – Эффективность очистки почвы от нефтепродуктов через 3 месяца эксперимента
(0,5 ± 0,1)
109
95
(1,6 ± 0,1)
108
95
90
(2,1 ± 0,2)
109
(2,5 ± 0,5)
107
(2,9 ±
0,16)108
3,9·105
НЗП:
Карбониза
т
№4
8
(0,5 ± 0,7)
106
8
(0,5 ± 0,1)
106
(8,2 ± 0,9) (3,7±0,6)10
7
107
(1,4±0,3)10 (1,7±0,2)10
(5,2 ± 0,7)
107
(3,3 ±
0,2)108
(5,4 ± 0,7)
107
(2,8±0,2)
108
(9,7 ± 0,9)
107
(1,6 ± 0,1)
108
Отсутству
ют
5,2·105
№3
НЗП:
Опил:
Суспензия
УВОМ
3,8·105
НЗП :
Опил
Исходная
почва
Общее количество
микроорганизмов,
6,4·105
кл/г
Сапрофитные
(5,4 ± 0,7)
бактерии, КОЕ/г
107
УВОМ, выросшие
(4,5 ± 2)
на среде К, КОЕ/г
106
УВОМ, выросшие
(1,65 ± 0,4)
на среде Таусона,
107
КОЕ/г
Бактерии р.
Azotobacter, %
85
обрастания
комочков
Олигонитрофилы, (1,3 ± 0,11)
КОЕ/г
109
Актиномицеты,
(1,1 ± 0,3)
КОЕ/г
109
МикроскопичесОтсутству
кие грибы, КОЕ/г
ют
Рецептура
№2
№1
100
(1,5 ± 0,5)
106
(1,9 ± 0,3)
108
(1,5 ± 0,7)
106
(1,0 ± 0,2)
106
(1,6 ± 0,5)
108
(1,5 ± 0,7)
106
(3,8 ± 0,2)
109
(4,4 ± 0,3)
107
(4,2±0,3)
108
9,2·105
№6
НЗП:
Опил:
Биосорбен
т
100
(3,1 ± 0,7)
109
(3,3 ± 0,5)
107
(3,8±0,1)
108
8,5·105
№5
НЗП:
Опил:
Биосорбен
т
Варианты способа очистки НЗП
Таблица 4.11. – Микробиологический анализ субстратов через 3 месяца
(0,5 ± 0,2)
106
(2,2 ± 0,2)
108
(2,5 ± 0,2)
106
100
(4,3 ± 0,1)
109
(6,4 ± 0,1)
107
(4,8±0,2)
108
9,0·105
№7
НЗП:
Опил:
Биосорбен
т
116
(2,0 ± 1,3)
106
8
(4 ± 1,8)
106
(1,5±0,3)10
100
(3,3 ± 0,2)
109
(3,5 ± 0,6)
107
(4,3±0,18)1
08
9,1·105
НЗП:
Биосорбен
т
№8
По сравнению с исходным субстратом во всех исследуемых вариантах
возросло
количество
УВОМ,
микроскопических
грибов
и
бактерий
р.Azotobacter, а количество олигонитрофилов уменьшилось в десятки раз.
Общее
количество
микроорганизмов
возросло
в
присутствие
биосорбента в вариантах 5, 6, 7 и 8.
По сравнению с исходным субстратом во всех вариантах эксперимента
количество УВОМ увеличилось в десятки раз, появились микроскопические
грибы, что свидетельствует об интенсификации процесса биодеструкции
углеводородов нефти. Появление бактерий р. Azotobacter указывает на
снижение токсичности субстрата.
Микроорганизмы, выделенные из опытных образцов, представлены на
рис.4.14.
а) УВОМ, выделенные на среде
б) Бактерии, выделенные на МПА
Таусона
Рис.4.14. Микроорганизмы, выделенные из опытных образцов
(увеличение x800 раз)
На основании полученных экспериментальных данных рекомендуется
применять не более 2 тонн биосорбента на 1 га нефтезагрязненной площади
при уровне нефтяного загрязнения не более 50 г/кг.
117
Было определено, что содержание металлов в карбонизате составляет:
железо – 17 %, кальций – 12,9 %, фосфор – 5,5%, кремний – 3,4 %, алюминий
– 2,4 %, остальные элементы присутствуют в количестве менее 2 %. Для
химических веществ, для которых установлены нормативы ПДК, было
рассчитано
количество
вносимого
в
почву
вещества
с
учетом
рекомендованной дозы внесения (табл.4.12.). Так, например, содержание
никеля увеличится на 0,035 % и составит 3,5 мг/кг (валовое содержание) при
ПДК 4 мг/кг (валовое содержание).
Таблица 4.12. – Соответствие нормативам ПДК концентрации тяжелых
металлов
№
Химический
элемент
Увеличение
содержания
вещества, %
1
2
3
4
Сера (S)
Хром (Cr)
Никель (Ni)
Марганец (Mn)
1,0
0,058
0,035
0,2
ПДК в-ва
мг/кг
почвы с
учетом
фона [112]
160
6
4
1500
Количества
вещества с
учетом дозы
внесения,
мг/кг
100
5,8
3,5
20
Расчетами установлено, что при рекомендованной дозе внесения
биосорбента концентрация тяжелых металлов в почвах увеличится
незначительно и останется в пределах нормативных требований.
4.3.3. Технология использования биосорбента в технологии
биоремедиации нефтезагрязненной почвы
Полученный
биосорбент
на
основе
карбонизата
рекомендуется
использовать в технологии биоремедиации на специальных технологических
комплексах, которые принимают и очищают нефтезагрязненную почву на
специальных площадках биоремедиации.
Технологическая схема очистки нефтезагрязненной почвы с помощью
биосорбента на основе карбонизата представлена на рис.14.15.
118
Очистки нефтезагрязненной почвы с помощью биосорбента на основе
карбонизата состоит из шести основных этапов: выбор и организация
технологической площадки, доставка НЗП на технологическую площадку,
размещение НЗП на площадке временного хранения, размещение НЗП на
технологической площадке, фиторемедиация и отгрузка очищенной почвы
потребителю.
Соответствие экономическим,
технологическим и
экологическим критериям
1 ЭТАП.
Выбор и организация
технологической площадки
Минеральные удобрения –
С:N:P=100:(1-10):(0,5-1)
Органические удобрения –
0,1 м3/ м3 НЗП
3 ЭТАП.
Размещение НЗП на
площадке временного
хранения
10 г /кг
4 ЭТАП.
Размещение НЗП на
технологической площадке
Смесь различных трав –
не менее 20 кг/га
5 ЭТАП.
Фиторемедиация
Биосорбент – не менее
Природоохранные
мероприятия
Агротехнические и экологоаналитические мероприятия
2 ЭТАП.
Доставка НЗП на ТП
6 ЭТАП.
Отгрузка очищенной почвы
потребителю
Рис.14.15. Технологическая схема очистки нефтезагрязненной почвы с
применением биосорбента на основе карбонизата
Технологическая площадка для проведения очистки нефтезагрязненных
почв
должна
соответствовать
экономическим
(категория
и
целевое
назначение земель, транспортная доступность и т.д.), технологическим
(климатические условия, рельеф и природные особенности территории и т.д.)
119
и экологическим (физико-химические характеристики почвы, отсутствие
загрязнения и т.д.) критериям.
После доставки НЗП на технологическую площадку выполняют ряд
агротехнических
и
эколого-аналитических
работ.
К
агротехническим
мероприятиям относится выравнивание загрязненной почвы по всей
территории (толщина слоя без учета изолирующего слоя не более 30 см),
рыхление, перемешивание и полив. На каждой технологической стадии до
отгрузки
очищенной
нефтепродуктов,
почвы
потребителю
контролируют
проводят
влажность
и
определение
анализируют
микробиологические показатели почвы.
После внесения удобрений по площадке равномерно размещают
биосорбент. На основании полученных экспериментальных данных доза
вносимого
биосорбента
составляет
не
менее
2
тонн
на
1
га
нефтезагрязненной площади при уровне нефтяного загрязнения не более 50
г/кг. При степени загрязнения более 50 г/кг рекомендуется увеличить дозу
вносимого биосорбента.
Основные требования при использовании биосорбента на основе
карбонизата в технологии биоремедиации:
1. Равномерное распределение биосорбента на нефтезагрязненном
участке (рыхление, перемешивание);
2. Обеспечение оптимальных условий процесса очистки: температура
– не менее 5°С, влажность – не менее 60-70 %.
Для интенсификации процесса очистки НЗП необходимо добавлять
минеральные удобрения, содержащие азот и фосфор. В качестве источников
азота могут быть использованы минеральные удобрения: аммиачная селитра
NH4NO3, сульфат аммония (NH4)2SO4, калийная селитра КNO3, мочевина
(NH2)2CO. В качестве фосфорных удобрений используются одно- или
двузамещенные фосфаты калия, аммония или кальция КH2PO4 , NH4H2PO4 ,
Ca(H2PO4)2 , CaHPO4 и др. Для подкисления почвы использовать карбонат
кальция, а для подщелачивания НЗП необходимо добавлять известь.
120
Необходимость дополнительного внесения биосорбента зависит от
степени
загрязнения
почвы
и
должно
регулироваться
в
процессе
мониторинга.
Во
время
биоремедиации
и
фиторемедиации
осуществляют
природоохранные мероприятия, а именно, отведение сточных вод на
специальные установки по очистки воды.
4.4. Определения условий и сроков хранения биосорбентов на
основе карбонизата
Биосорбенты сохраняют свою активность (характеризуется титром
живых клеток) в течение нескольких лет (до 5 лет) при температуре от +2 до
+25°С при хранении в не отапливаемом, сухом помещении, при отсутствии
прямого воздействия воды [26, 113].
Для оценки жизнеспособности УВОМ и пригодности применения
биосорбента в условиях длительного хранения, полученные динамическим
способом иммобилизации микроорганизмов на поверхности карбонизата,
хранились в течение 2х лет.
Условия хранения биосорбента: температура - 20±4 °C, относительная
влажность воздуха - 35±5 %, отсутствие света.
После длительного хранения состояние образцов исследовали под
электронным сканирующим микроскопом, определили число адгезии. По
сравнению
со
свежеприготовленнным
биосорбентом,
число
адгезии
уменьшилось на 20 % и составило 77,8 %.
На рис.4.16. показана поверхность карбонизата с прикрепленными
микроскопическими грибами
р. Mortierella через два года после его
получения.
121
Рис.4.16. Поверхность биосорбента через 2 года после получения
(увеличение x 3 тыс.раз)
Полученные результаты свидетельствуют о возможности сохранения
эксплуатационных свойств биосорбента в течение как минимум 2х лет при
соблюдении условий хранения.
ВЫВОДЫ
1. Полученные в экспериментальных исследованиях результаты
доказали возможность использования карбонизата в качестве носителя для
закрепления УВОМ в силу его пористой структуры (объем макропор 0,544
см3/г) и шероховатой поверхности. Используемый в качестве контроля
высокопористый сорбент – БАУ, близкий по пористой структуре к
карбонизату оказался малопригодным из-за слабой сорбируемости клеток на
поверхности и недостаточной прочности их закрепления.
2. Установлен
адсорбционно-адгезионный
углеводородокисляющих
микроорганизмов
механизм
размером
4-5
закрепления
мкм
на
поверхности макропор карбонизата. Сила адгезии составляет 1,4*10-9 г*см2/с,
число адгезии – 97,1 %.
3. Определены параметры процесса физической иммобилизации для
получения биосорбента: биомасса сухих клеток микроорганизмов в исходной
122
суспензии – не менее 1,0 г/л, общее количество микроорганизмов – не менее
107 КОЕ/мл.
4. Установлено,
оптимальное
время
для
иммобилизации
микроорганизмов методом пропускания суспензии УВОМ через слой
носителя – 5,0±0,5 часов, скорость потока суспензии микроорганизмов –
50±10 мл/ч.
5. Доказана возможность использования биосорбента, полученного на
основе карбонизата, в технологии биоремедиации НЗП и установлено
повышение эффективности очистки НЗП, по сравнению с традиционными
способами биоремедиации, в 1,7 раза через три месяца от начала
эксперимента.
6. На
основании
рекомендуется применять
полученных
экспериментальных
не более 2
тонн
биосорбента
данных
на 1 га
нефтезагрязненной площади при уровне нефтяного загрязнения менее 50
г/кг. При рекомендованной дозе внесения биосорбента концентрация
тяжелых металлов в почвах увеличится незначительно и останется в
пределах нормативных требований.
7. Возможность
использования
биосорбента
и
сохранения
его
эксплуатационных характеристик в течение как минимум 2х лет при
соблюдении условий хранения: температура - 20±4 °C, относительная
влажность воздуха - 35±5 %, отсутствие света.
123
ГЛАВА
5.
РАЗРАБОТКА
ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ
РЕШЕНИЙ
НАПРАВЛЕННЫХ НА СНИЖЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ
НА ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ БИОСОРБЕНТА
НА ОСНОВЕ КАРБОНИЗАТА
Проведенные исследования показали, что наиболее целесообразно
получать биосорбент на основе карбонизата методом пропускания суспензии
УВОМ через слой карбонизата в сорбционной колонке. На основании
проведенных
лабораторных
исследований
были
разработаны
технологические решения по получению биосорбента, определены техникоэкономические параметры производства биосорбента на основе карбонизата,
используемого при биоремедиации нефтезагрязненных почв, сделан расчет
предотвращенного экологического ущерба.
5.1. Блок-схема производства биосорбента на основе карбонизата
Характеристика сырья, материалов и полупродуктов
1. Суспензия
микроорганизмов.
Структуру
микробиоценоза
формируют представители родов: Pseudomonas sp., Rhodococcus sp.,
Micrococcus sp., Mortierella.
2. Карбонизат. В качестве носителя для микроорганизмов использовали
карбонизат, полученный в результате низкотемпературного пиролиза
избыточного
активного
ила
биохимических
очистных
сооружений
предприятий нефтехимического комплекса (удельная поверхность - 39,3 ±
0,6; объем макропор – 0,544 см3/г).
3. Химические вещества. Для приготовления питательной среды
используются следующие химические реактивы: Ca(NO3)2·4H2O; KNO3; KH2PO4;
MgSO4·7H2O; FeSO4·7H2O; дистиллированная вода.
Для поддержания необходимой
применяется NaOH, H2SO4.
величины
рН
в
ферментере
124
Описание технологического процесса
ТП-1.
Приготовление
накопительной
культуры
посевного
материала.
углеводородокисляющих
Для
получения
микроорганизмов
готовится почвенная суспензия. Инокулированную среду выдерживают в
термостате при температуре 30±2 °С в течение 7 суток, после чего
проводится посев на плотную питательную среду в чашки Петри. В качестве
питательной среды используется синтетическая среда Таусона следующего
состава (г/л):Са(NO3)2• 4Н2O – 1.0; KNO3 – 0.25; КН2РО4 – 0.25;MgS04 • 7Н2O
– 0.25;FeS04 • 7Н2O – 0.25; агар – 15 г; дистиллированная вода - 1л. Рост
микроорганизмов длится 7-10 дней.
ТП-2.
Первичная
ферментация.
В
инокулятор
загружают
питательную среду и посевной материал, полученный на ТП-1. Количество
питательной среды в аппарате не должно превышать 60% общего объема.
Количество посевного материала составляет 0,1% объема среды. Для
выделения углеводородокисляющих микроорганизмов используется среда
Таусона. Компонентный состав питательной среды: Ca(NO3)2·4H2O – 1г;
KNO3 – 0,25 г; KH2PO4 – 0,25 г; MgSO4·7H2O – 0,25 г; FeSO4·7H2O – 0,005г;
дистилированная вода – 1 л.
При непрерывном производстве биосорбента стадии ТП-1, ТП-2
упраздняются, начальной стадией становится ТП-3.
ТП-3. Главная ферментация. Для ферментации используется 10-12%
от объема среды посевного материала. Количество среды в ферментере не
должно превышать 70% его общего объема. Качественный состав среды
совпадает с составом среды на стадии приготовления посевного материала.
Ферментация осуществляется в периодическом режиме: загрузка сырья и
посевного материала в аппарат производится единовременно.
Накопление культуры УВОМ происходит в ферментере в течение 38
дней при условиях: рН среды =5,8-6,0; температура (Т)=28±2 °С;
периодичность работы мешалки составляет 100 об/мин.
125
В ферментер помещается посевной материал, питательная среда,
суспензия
микроорганизмов,
после
процесса
иммобилизации.
Для
интенсификации накопления культуры вводится нефть.
ТП-4. Физическая иммобилизация на пористой поверхности
углеродной матрицы выделенных культур.
Физическая иммобилизация производится в динамическом режиме в
адсорбере при скорости пропускания суспензии микроорганизмов 700 л/ч.
В качестве сорбента-носителя используется карбонизат, полученный в
результате низкотемпературного пиролиза избыточного ила биохимических
очистных
Карбонизат
сооружений
загружается
предприятий
в
адсорбер
нефтехимического
насыпным
комплекса.
способом.
Условия
протекания иммобилизации: рН = 5,0-6,0; температура 22 ±2 °С.
ТП-5. Сушка биосорбента. Сущность процесса сушки биосорбента
заключается в удалении воды, при этом происходит снижение влажности на
40 %. Сушка биосорбента происходит нагретым воздухом на ленточной
сушилке, поступающий в сушилку воздух нагрет до температуры 45-48 °С.
ТП-6. Фасовка и упаковка биосорбента. Биосорбент упаковывается в
полипропиленовый тройной мешок. Вес мешка 10-15 кг.
ТП-7. Хранение биосорбента. Биосорбент
хранится в складских
помещениях в штабелях высотой не более 2 м при температуре (-5-+40) °С,
исключается прямое попадание воды. Срок хранения не менее двух лет.
Блок-схема производства биосорбента с указанием материальных
потоков приведена на рис. 5.1.
126
Рис.5.1. Блок-схема производства биосорбента
127
5.2. Материальный баланс процесса производства биосорбента
Материальные балансы последовательных технологических процессов,
применяемых
при
получении
биосорбента
на
основе
карбонизата,
представлены в табл. 5.1. – 5.5.
Таблица 5.1. – Материальный баланс технологической стадии
приготовление посевного материала
№
1
2
Входящий поток
Наименование сырья
Количество
г
%
Почвенная суспензия
Питательная среда:
Ca(NO3)2·4H2O
KNO3
KH2PO4
MgSO4·7H2O
FeSO4·7H2O
Дистиллированная
вода
Агар
Итого
59506,9
238027,6
238
59,5
59,5
59,5
1,2
233267,048
№
20
80
3570,4
297534,5
1
2
100
Выходящий поток
Наименование
Количество
продукта,
г
%
полупродукта
Посевной материал 178520,7 60
Отработанная
119013,8 40
питательная среда
Итого
297534,5
100
Таблица 5.2. – Материальный баланс технологической стадии
первичная ферментация
№
1
2
3
Входящий поток
Наименование
Количество
сырья
г
%
Питательная
1795124,97
среда:
Ca(NO3)2·4H2O
1795,12
KNO3
448,78
KH2PO4
448,78
MgSO4·7H2O
448,78
FeSO4·7H2O
8,97
Дистиллированная 1791974,53
вода
Посевной
178520,7
материал
Нефть
9917,8
Итого
1983563,51
№
90,5
1
9
2
0,5
100
Выходящий поток
Наименование
Количество
продукта,
г
%
полупродукта
Выбросы
178520,71
9
Посевной материал
Итого
1805042,8
91
1983563,51 100
128
Таблица 5.3. – Материальный баланс технологической стадии главная
ферментация
№
1
2
3
4
Входящий поток
Наименование
Количество
сырья
г
%
Суспензия после
иммобилизации
Посевной
материал
Нефть
Питательная
среда:
Ca(NO3)2·4H2O
KNO3
KH2PO4
MgSO4·7H2O
FeSO4·7H2O
Дистиллированная
вода
Итого
14701625,55
82
1805042,8
10
90252,14
1353782,16
0,5
7,5
1263,53
361,0
361,0
361,0
7,22
1350172,1
17950702,75
Выходящий поток
№
Наименование
Количество
продукта,
г
%
полупродукта
1
Суспензия
16335139,5 91
микроорганизмов
2
Выбросы
1615563,25
9
углеводородов
0,007
0,002
0,002
0,002
0,00004
7,48
100
Итого
17950702,75
100
Таблица 5.4. – Материальный баланс технологической стадии
физическая иммобилизация
№
Входящий поток
Наименование
Количество
сырья
г
%
№
1
Суспензия
микроорганизмов
16335139,5
99,2
1
2
Карбонизат
934579,4
0,8
2
16153961,35
100
Итого
Выходящий поток
Наименование
Количество
продукта,
г
%
полупродукта
Биосорбент с
1452335,8
11
влажностью 5565%
Суспензия после 14701625,55 89
иммобилизации
Итого
16153961,35 100
Таблица 5.5. – Материальный баланс технологической стадии сушка
№
1
Входящий поток
Наименование
Количество
сырья
г
%
Биосорбент с
влажностью
55-65%
1452335,8
100
№
1
2
Итого
1452335,8
100
Выходящий поток
Наименование
Количество
продукта,
г
%
полупродукта
Биосорбент с
1000000
69
влажностью 1520%
Пары воды
452335,8
31
Итого
1452335,8
100
129
5.3. Расчет и выбор основного технологического оборудования
На предприятии ООО «ЛУКОЙЛ-Пермнефтеоргсинтез» в сутки
образуется 779 м3 избыточного активного ила, плотностью – 1,0 т/м3,
влажностью – 99,6 %. Годовой объем образующегося ИАИ составляет: 779
м3/сут * 1,0 т/м3 * 365 = 284 335 т/год [107].
При сушке и пиролизе 1 т обезвоженного ИАИ будет образовываться
70-80
кг
твердого
остатка,
органоминеральную
представляющего
композицию
собой
(карбонизат).
макропористую
Годовой
объем
образующегося карбонизата составляет: 284 335 т/год* 0,075 т / 1 т/год =
21325,125 т/год [107, 108].
Известно, что для производства 1 т биосорбента с влажностью 15-20 %
необходимо
0,93
т
карбонизата.
Соответственно,
годовой
объем
производства биосорбента будет составлять: 21325,125 т/год * 1 т /0, 93 т =
22930,25 т/год. Образующиеся объемы карбонизата позволят организовать
производство биосорбента на 20-25 тыс. т/год.
Произведем расчеты для строительства предприятия по получению
биосорбента, производительностью100 т в год.
Данные для расчета:
1. Объем производства биосорбента в год (Q)–100т/г.
2. Количество рабочих дней в году (τ) –249 дней.
Расчет основного оборудования:
1.
ФЕРМЕНТЕР
Необходимое количество ферментеров (N):
N = Q1 * τ1 / Q2 * τ2,
(5.1.)
где Q1 - количество к.ж. в год, м3; τ1 - продолжительность
оборачиваемости ферментера, ч; τ2 - количество рабочих часов в году, ч; Q2 количество к.ж. с 1-ой ферментации.
1)
Для производства 1 т биосорбента необходимо 16 337 л
культуральной жидкости, соответственно, для производства 100 т в год –
1633700 л в год (Q1).
130
2)
Количество культуральной жидкости с одной ферментации при
учете потерь во время ферментации (10%) составит:
Q2 = V × 0,7× 0,9
(5.2.)
где Q2- количество культуральной жидкости с 1-ой ферментации; V полный объем ферментера, л; 0,7 - коэффициент заполнения; 0,9 коэффициент, учитывающий выход культуральной жидкости с учетом 10 %
потерь.
Q2 = V × 0,7 × 0,9 = 2000 × 0,7 × 0,9 = 1260 л
3)
Продолжительность оборачиваемости одного ферментера (τ1).
Полный цикл работы одного ферментера складывается из следующих
величин, которые определены в задании индивидуально: длительность
ферментации (4 ч); слив к. ж. (0,5 ч); мойка ферментера ч (1 ч); проверка
ферментера на герметичность (0,5 ч); стерилизация ферментера (3 ч);
заполнение ферментера питательной средой (2 ч); засев (1 ч). В итоге τ1 = 12
часов.
4)
Количество рабочих часов в году (τ2):
τ2 = τ × 24 ч,
где τ- количество рабочих дней в году.
τ2 = 249 × 24 = 5976 ч
5)
Необходимое количество ферментеров (N):
N = Q1 * τ1 / Q2* τ2= 12 * 1633700 / 5976 * 1260 = 2,6 ≈ 3
Принимаем N ферментеров и 1 запасной.
Таким образом, для производства 100 т биосорбента в год необходимо
4 ферментера.
2.
ИНОКУЛЯТОР.
Количество
инокуляторов
устанавливается
индивидуально к каждому ферментеру, соответственно, необходимо 4
инокулятора.
3.
АДСОРБЕР.
Суточная
производительность
по
готовому
продукту: 100/249 = 0,4 т / день. Достаточно использовать 1 адсорбер и 1
131
запасной. Таким образом, для производства 100 т биосорбента в год
необходимо 2 адсорбера.
4.
ФАСОВКА И УПАКОВКА.
Зная суточную производительность по готовому продукту (0,4 т / день),
определим количество упаковок в сутки:
nуп = Q5 / qф(5.3.)
где qф – количество биосорбента, кг в одну упаковку.
nуп = 400 / 10 = 40 шт
nуп = 400 / 15 = 26 шт
Выбираем
упаковочную
линию,
обеспечивающую
необходимую
производительность [106].
Перечень необходимого оборудования и приборов производства
биосорбента приведен в таблице 5.6.
Таблица 5.6. - Перечень необходимого оборудования и приборов для
производства биосорбентов
Наименование
Количество
Автоклав
2
Инокулятор
4
Материал
Техническая характеристика
Первичная ферментация
Сталь
Автоклав высокого давления NB1100.
Автоматическое
регулирование
нагревания,
вентиляции, давления, стерилизации,
откачки воздуха.
Регулируемое давление на выходе,
клапан с ручным управлением для
пассивной работы. Устройство с
двойной
безопасностью
для
нагревания. Точный электронный
таймер.
Сталь
Liflus SP 70/100 л.
Вертикальный
цилиндрический
сосуд. Рабочий объем – 70 л, общий
объем – 100 л, скорость мешалки –
50-1000 об/мин, Система контроля за
рН, температурой, пеной. Система
аэрации.
132
Наименование
Ферментер
Адсорбер
Сухожаровой шкаф
Фасовочный
аппарат
Фасовочные
столы
Стеллажи
для
хранения
мешков
с
продукцией
Количество
Материал
Техническая характеристика
Главная ферментация
4
НержавеLiflus SP 2000/3000 л.
ющая сталь Вертикальный
цилиндрический
сосуд. Рабочий объем – 2000 л,
скорость мешалки – 50-200 об/мин.
Система
контроля
за
рН,
температурой,
пеной.
Система
аэрации
Физическая иммобилизация микроорганизмов
2
НержавеАдсорбер АДН ЗАО «Турмалин»,
ющая сталь Производительность: до 500-1500
м3/ч.
Аэродинамическое
сопротивление: 200 Па
Сушка
2
НержавеСухожаровой шкаф с естественной
ющая сталь конвекцией,
объем
240
л.
Регулируемый диапазон температур:
от + 5°C выше комнатной до +300°C.
Упаковка и фасовка
1
НержавеАФ-3Э. Фасовка в мешки от 20 до
ющая сталь 50 кг. Производительность 10-13
тонн/час.
3
Нержавеющая сталь
Хранение
3
Дерево
На основании выше изложенного, была разработана принципиальная
технологическая схема производства биосорбента на основе карбонизата
(рис.5.2.).
133
Рис 5.2. Принципиальная технологическая схема производства
биосорбента: 1-инокулятор; 2,5,7,8 – насос, 3,4 – ферментер, 4 –
адсорбер, 5 – сушилка
Параметры технологических процессов, подвергаемые обязательному
контролю при получении биосорбента, представлены в табл. 5.7.
Таблица
5.7.
–
Контролируемые
параметры
на
стадиях
технологического процесса
№ ТП
Стадия производства
ТП-1. Приготовление посевного
материала
ТП-2. Первичная ферментация
ТП-3. Главная ферментация
Контролируемый параметр
Чистота и стерильность питательной
среды
Микробиологические
показатели
(наличие
микроорганизмов,
плотность культуры)
Микробиологические
показатели
(наличие
микроорганизмов,
плотность культуры)
Микробиологические
показатели
(наличие
микроорганизмов,
плотность культуры)
Концентрация нефти
Параметры протекания ферментации
(рН, периодичность работы мешалки,
аэрация, температура)
134
№ ТП
Стадия производства
ТП-4. Физическая
иммобилизация на
пористой поверхности
углеродной матрицы
выделенных культур
ТП-5. Сушка биосорбента.
Контролируемый параметр
Микробиологические показатели на
входе и выходе из адсорбера (наличие
микроорганизмов,
плотность
культуры)
Влажность биосорбента
Температура воздуха, подаваемого
для сушки
Время сушки биосорбента
ТП-6. Фасовка, упаковка.
ТП-7. Хранение.
Соблюдение условий
хранения биосорбента
и
сроков
5.4. Охрана окружающей среды при производстве биосорбента
Процесс
производства
биосорбента
является
замкнутым
и
малоотходным. При производстве и оценке его качества не используются
ядовитые и вредные вещества.
Выбросы в атмосферу:
На стадиях ТП-2, ТП-3 технологического процесса образуются
выбросы,
содержащие
преимущественно
продукты
разложения
углеводородов нефти. На ТП-2 образуется 0,17 т выбросов на тонну
биосорбента, на ТП-3 – 1,61 т. Очистка выбросов от углеводородов
осуществляется термокаталитическим методом (очистка отходящих газов от
углеводородов путем окисления кислородом воздуха при 280 – 300 °C в
присутствии цементсодержащего катализатора следующего химического
состава, мас.%: диоксид марганца - 20 – 40; оксид меди - 20 – 30; оксид
никеля - 10 – 15; талюм – остальное.)
Сточные воды:
При производстве образуются только сточные воды от промывки
оборудования. В состав сточных вод входят: нефтепродукты, остаточные
компоненты питательной среды, микроорганизмы.
Сточные воды образуются на стадиях ТП-1 – ТП-4.
135
Твердые и жидкие отходы:
Твердые и жидкие отходы в процессе производства биосорбента
незначительны.
Твердые
отходы
представлены
остатками
твердых
питательных сред (ТП-1), подвергаются автоклавированию. Жидкие отходы
представлены водами после промывки ферментеров и лабораторной посуды.
Все
жидкие
отходы
перед
сбросом
в
канализацию
подлежат
дезинфицированию.
5.5. Экономическое обоснование целесообразности применения
технологии получения биосорбента
5.5.1. Расчет капитальных затрат
К капитальным затратам относятся издержки на строительство
комплекса по производству биосорбента на основе карбонизата. Раcчет
затрат
на
строительство
действующих
на
производится
момент
на
составления
основании
расчета,
текущих
цен
представленных
информационными интернет-ресурсами.
Перечень и стоимость основного оборудования технологической схемы
получения биосорбента представлены в табл.5.8.
Таблица 5.8. – Перечень и стоимость основного оборудования
технологической схемы получения биосорбента
Наименование
оборудования
Автоклав высокого
давления NB-1100
Инокулятор Liflus SP
70/100 л.
ФерментерLiflus SP
2000/3000 л
Адсорбер АДН
Сухожаровый шкаф
ED 240
Фасовочный аппарат
АФ-1500
Стоимость, руб.
закупка
монтаж
Колво, шт.
Итого затрат,
руб.
300 000,0
60 000,0
2
720 000,0
900 000,0
180 000,0
4
4 320 000,0
1 500 000,0
300 000,0
4
7 200 000,0
698 500,0
70 000,0
2
1 537 000,0
130 000,0
26 000,0
2
312 000,0
400 000,0
80 000,0
1
480 000,0
ИТОГО
14 569 000,0
136
5.5.2. Расчет эксплуатационных затрат
Эксплуатационные расходы включают следующие статьи затрат [115,
116]:
− заработная плата персонала;
− отчисление в социальные фонды;
− амортизационные отчисления;
− аренда производственных площадей;
− материалы и запасные части;
− сырье, необходимое для производства;
− электроэнергия;
− прочие эксплуатационно-хозяйственные расходы.
При
определении
годового
фонда
заработной
платы
(ФЗПгод )
работников исходными данными являются численность работников, их
должностной состав и квалификация, а также месячные оклады. Размер
заработной платы принят по данным Территориального органа федеральной
службы государственной статистики по Пермскому краю как средний по
Пермскому краю – 27 239,0 руб./месяц. Количество работников, занятых в
функционировании технологии составляет 7 человек. Исходя из этого,
годовой фонд заработной платы составил:
ФЗПгод = 27239
руб.
мес. × 7чел.× 12мес. = 2288 076рублейвгод
Отчисления в социальные фонды (CO) производятся в размере 34,1%
от ФЗПгод , т.е. 2 288076руб.× 34,1% = 780233,916рублей.
Итого годовой фонд оплаты труда (ФОТгод ) составил:
ФОТгод = ФЗПгод + СО = 2288076 + 780233,916 = 3 068309,916руб.
Амортизационные
отчисления
(АмО)
определяются
исходя
из
стоимости основных производственных фондов (ОПФ) и нормы линейной
амортизации по формуле:
АмО = ∑ ОПФ × 10% = 14569000,0 × 10% = 1 456900рублей.
137
Расходы на материалы и запасные части принимаются в размере 2,5%
Р = 5693480,0 × 2,5% =
от стоимости оборудования, что составит
364225рублей.
Расходы на сырье, необходимое для производства 1 т биосорбента
представлено в табл.5.9.
Таблица 5.9. – Расчет затрат на сырье для производства 1 т биосорбента
Приготовление посевного материала
Наименование сырья
Количество, кг
Почвенная суспензия
почва
нефть
Питательная среда:
Ca(NO3)2·4H2O
KNO3
KH2PO4
MgSO4·7H2O
FeSO4·7H2O
Дистиллированная вода
Агар
59,5
57,7
1,785
238
0,238
0,06
0,06
0,06
0,0012
233,3
3,6
Цена, руб/кг
Стоимость,
руб.
20
35,7
75
130
125
225
145
0,03
4400
Итого
17,85
7,8
7,5
13,5
0,174
7,0
15840
15 930,0
Первичная ферментация
Наименование сырья
Количество, кг
Цена, руб/кг
Питательная среда:
Ca(NO3)2·4H2O
KNO3
KH2PO4
MgSO4·7H2O
FeSO4·7H2O
Дистиллированная вода
Нефть
1795,124
1,795
0,448
0,448
0,448
0,009
1791,975
9,9
75
130
125
225
145
0,03
20
Итого
Стоимость,
руб.
134,625
58,24
56
100,8
1,3
53,6
198
602,5
Главная ферментация
Наименование сырья
Количество, кг
Цена, руб/кг
Нефть
Питательная среда:
Ca(NO3)2·4H2O
KNO3
KH2PO4
90,252
1353,78
1,263
0,361
0,361
20
Стоимость,
руб.
1805,04
75
130
125
94,7
46,93
45,125
138
MgSO4·7H2O
FeSO4·7H2O
Дистиллированная вода
0,361
0,00722
1350,1721
225
145
0,03
Итого
81,225
1,05
40,5
2 114,6
Физическая иммобилизация
Наименование сырья
Количество, кг
Цена, руб/кг
Карбонизат
934, 6
10
Итого
ИТОГО
Стоимость,
руб.
9346
9346,0
27 993,1
Соответственно, для производства 100 тонн биосорбента, годовые
затраты на сырье составят 2 799 310 рублей.
Расходы на электроэнергию рассчитывается на основании тарифа,
установленного Постановлением Региональной энергетической комиссии
Пермского края для аналогичных по функциям объектов [117], равного
0,79475 руб./кВт*ч. Расчет затрат на электроэнергию представлен в табл.
5.10.
Таблица 5.10. – Расчет затрат на электроэнергию
Наименование
оборудования
Автоклав высокого
давления NB-1100
(Количество
рабочих дней в году
- 249) – 2 шт.
ИнокуляторLiflus
SP
70/100
л.(Количество
рабочих дней в году
– 365) – 4 шт.
ФерментерLiflus SP
2000/3000
л(Количество
рабочих дней в году
- 249) – 4 шт.
Адсорбер
АДН
Мощность,
кВт/час
Кол-во
рабочих
часов в
сутки,
час
Потребляемая
мощность в
год, кВт
Итого
затрат,
руб.
4,5
8
17 928,0
14 248,
278
1,5
24
52 560,0
41 772,06
2,2
24
52 588,8
41
794,949
0,25
24
2 988,0
2 374,713
139
Наименование
оборудования
(Количество
рабочих дней в году
- 249)– 2 шт.
Сухожаровый шкаф
ED 240(Количество
рабочих дней в году
- 249) – 2 шт.
Фасовочный
аппарат
АФ-1500
(Количество
рабочих дней в году
- 249) – 1 шт.
Мощность,
кВт/час
Кол-во
рабочих
часов в
сутки,
час
Потребляемая
мощность в
год, кВт
Итого
затрат,
руб.
2,7
8
10 756,8
8 548,967
1
8
1 992,0
1 583, 142
ИТОГО:
138 813,6
110 332,1
Арендная плата (долгосрочная аренда) рассчитывается с учетом
площади необходимой промышленной площадки, равной 500 м2средней
стоимости аренды, составляющей 300 руб. за м2 в месяц. Таким образом,
годовые затраты на аренду составят:
А = 500 ∗ 300 ∗ 12 = 1800 000рублейвгод
Сводная таблица эксплуатационных затрат представлена в табл. 5.11.
Таблица 5.11. – Эксплуатационные затраты при производстве
биосорбента
№
Объем затрат,
Статья затрат
руб. в год
1.
Фонд заработной платы
2 288 076,0
2.
Отчисления в социальные фонды
780 233,916
3.
Амортизационные отчисления
1 456 900,0
4.
Расходы на материалы и запасные части
5.
Затраты
на
сырье,
необходимое
производства биосорбента
для
364 225,0
2 799 310,0
140
№
Объем затрат,
Статья затрат
руб. в год
6.
Затраты на электроэнергию
110 332,109
7.
Арендная плата
2 400 000,0
ИТОГО:
9 599 077,025
Расчет основных технико-экономических показателей технологии
Таблица 5.12. – Себестоимость 1 тонны готового биосорбента
Наименование
1. Среднегодовые затраты
на обезвреживание
2.
Среднегодовое
количество
получаемого
биосорбента
3.Себестоимость
полученного биосорбента
Единицы измерения
Значение
руб./год
9 599 077,025
т/год
100
руб./т
95 990,8
Себестоимость получения биосорбента на основе карбонизата в ценах
2014 года составит 95 990,8 руб/т при инвестиционных издержках в 14,6
млн.рублей.
В табл.5.13. приведена сравнительная себестоимость биосорбента на
основе карбонизата с другими биосорбентами-аналогами.
Таблица
5.13.
–
Сравнительная
характеристика
себестоимости
различных биосорбентов [37-40]
Биосорбент
«Биосорбонафт»
«Унисорб-Био»
Биосорб
Спец-Сорб-Био
Биосорбент на основе
карбонизата
На
основании
Расход из расчета
на 1 га НЗП, т*
2-6
0,01
Стоимость, руб/кг
Не менее 185
320
138
4 000
1-2
представленных
95,9
данных,
видно,
что
стоимость
биосорбента на основе отхода процесса низкотемпературного пиролиза
141
избыточного активного ила меньше, чем представленные аналоги, и
составляет 95,9 руб./кг.
5.6. Оценка предотвращенного экологического ущерба в
результате внедрения технологии биоремедиации с использованием
биосорбента
В результате внедрения технологии биоремедиации с использованием
биосорбента
на
специальных
технологических
комплексах,
который
принимает и очищает нефтезагрязненную почву на специальных площадках
биоремедиации
(далее
технологический
комплекс)
был
рассчитан
предотвращенный экологический ущерб.
Размер наносимого ущерба, причиненного почвам как объекту охраны
окружающей среды, оценивался в соответствии с Приказом Минприроды
России от 8 июля 2010 г. N 238 [118] по формуле:
УЩ = УЩзагр + УЩотх + УЩпорч, (1)
где: УЩзагр - размер вреда при химическом загрязнении почв (руб.);
УЩотх - размер вреда в результате несанкционированного размещения
отходов производства и потребления (руб.); УЩпорч - размер вреда при
порче
почв
в
результате
самовольного
(незаконного)
перекрытия
поверхности почв, а также почвенного профиля искусственными покрытиями
и (или) линейными объектами (руб.).
В нашем случае размер наносимого ущерба будет равен только размеру
вреда при химическом загрязнении почв:
УЩ = УЩзагр
Оценку величины предотвращенного в результате природоохранной
деятельности экологического ущерба от загрязнения почв химическими
веществами считали по следующей формуле [120]:
УЩзагр = СХВ x S x Kr x Kисх x Тх, (2)
где: УЩзагр - размер вреда (руб.); СХВ - степень химического
загрязнения; S - площадь загрязненного участка (кв. м); Kr - показатель в
142
зависимости от глубины химического загрязнения или порчи почв; Kисх показатель в зависимости от категории земель и целевого назначения, на
которой расположен загрязненный участок; Тх - такса для исчисления
размера вреда, причиненного почвам как объекту окружающей среды, при
химическом загрязнении почв (руб./кв. м).
Степень
химического
загрязнения
зависит
от
соотношения
фактического содержания i-го химического вещества в почве к нормативу
качества окружающей среды для почв.
Соотношение (С) фактического содержания i-го химического вещества
в почве к нормативу качества окружающей среды для почв определяется по
формуле (3):
n
C= Хi / Хн
i =1
, (3)
где: Хi - фактическое содержание i-го химического вещества в почве
(мг/кг); Хн - норматив качества окружающей среды для почв (мг/кг).
При отсутствии установленного норматива качества окружающей
среды для почв для нефтепродуктов для Пермского края в качестве значения
Xн применяется значение концентрации нефтепродуктов на сопредельной
территории аналогичного целевого назначения и вида использования, не
испытывающей негативного воздействия от данного вида нарушения (для
Республики Татарстан – 2900 мг/кг [119]).
Для примера возьмем почву с высоким содержанием нефтепродуктов
50000 мг/кг, соответственно, С = 50000 мг/кг /2900 мг/кг = 17. При значении
С в интервале от более 10 до 20 СХВ принимается равным 3,0.
Площадь участка биоремедиации примем равную 0,5 га или 5000 км2.
Показатель в зависимости от глубины химического загрязнения или
порчи почв (Kr) рассчитывается в соответствии с фактической глубиной
химического загрязнения или порчи почв.
В нашем случае нефтезагрязненная почва вносится на площадку
биоремедиации на глубину 30±10 см, в соответствии с Приказом
143
Минприроды России от 8 июля 2010 г. N 238 [118] при глубине химического
загрязнения до 50 см (Kr) принимается равным 1,3.
Показатель в зависимости от категории земель и целевого назначения
(Kисх) определяется исходя из категории земель и целевого назначения. При
отсутствии сведений точного места расположения площадки биоремедиации
возьмем (Kисх) равное 1,0.
Такса для исчисления размера вреда, причиненного почвам как объекту
окружающей среды, при химическом загрязнении почвы в соответствии с
Приказом Минприроды России от 8 июля 2010 г. N 238 [118] – 400 руб./кв. м.
Тогда, УЩзагр = 3 x 5000 кв. м x 1,3 x 1 x 400 руб./кв. м = 7 800 000
руб.
При реализации технологии биоремедиации с помощью биосорбента на
основе карбонизата предотвращенный экологический ущерб от загрязнения
почв химическими веществами составит 7,8 млн. руб./год.
5.7. Экономическая оценка платы за размещение отходов
Экономическая оценка платы за размещение отходов городских
биологических
очистных
сооружений, проводится
в
соответствии
с
Постановлением Правительства Российской Федерации № 344 от 12 июня
2003 г. «О нормативах платы за выбросы в атмосферный воздух
загрязняющих веществ стационарными и передвижными источниками,
сбросы загрязняющих веществ в поверхностные и подземные водные
объекты,
размещение
отходов
производства
и
потребления»,
Постановлением Правительства Российской Федерации № 632 от 28 августа
1992 г. «Об утверждении порядка определения платы и ее предельных
размеров за загрязнение окружающей природной среды, размещение
отходов, другие виды вредного воздействия» [120, 121].
В результате внедрения производства по получению биосорбента на
основе карбонизата мощностью 100 т/год необходимо ежегодно использовать
1240 т избыточного активного ила для получения карбонизата.
144
Нормативы платы за размещение отходов производства и потребления:
отходы IV класса опасности 248,4 руб./т.
Нормативы платы за размещение отходов производства и потребления
в пределах установленных лимитов применяются с использованием:
коэффициента 0,3 при размещении отходов на специализированных
полигонах и промышленных площадках, оборудованных в соответствии с
установленными требованиями и расположенных в пределах промышленной
зоны источника негативного воздействия. Нормативы платы за негативное
воздействие
на
окружающую
среду,
установленные
Правительством
Российской Федерации в 2003 г., применяются в расчетах платы за
негативное воздействие на окружающую среду за 2014 год с применением
коэффициента 2,33.
Коэффициенты, учитывающие экологические факторы на территории
Уральского экономического района РФ (для почвы) – 1,7.
Плата за размещение отходов (По) определяется по следующей
формуле [79]:
По=∑(Слi × Млi), Мi ≤ Млi
где i – вид отхода;
Слi – ставка платы за размещение 1 т i – ого отхода в пределах
установленных лимитов;
Млi – фактическое размещение i – ого отхода в пределах установленных
лимитов;
Мi – общее количество размещение данного отхода.
Слi = Нблi × Кэ
где Нблi
–
базовый норматив платы за 1 т размещённых отходов в
пределах установленных лимитов, руб.
Кэ
–
коэффициент
экологической
ситуации
и
экологической
значимости почвы в данном регионе, Уральский коэффициент = 1,7.
Платежи за размещение отходов в пределах лимита:
145
По = 1,7 × 248,4 руб./т.× 1240 т/год × 0,3 × 2,33 = 366 015, 4 руб./год
В результате внедрения производства по получению биосорбента на
основе
карбонизата
мощностью
100
т/год,
получаемого
при
низкотемпературном пиролизе избыточного активного ила биохимических
очистных сооружений предприятий нефтехимического комплекса, 1240 т в
год ИАИ не будем размещаться на специализированных полигонах, что
снизит плату за размещение отходов для предприятии на 366 015, 4 руб/год.
ВЫВОДЫ
1. Составлена
блок-схема
производства
биосорбента
на
основе
карбонизата с указанием материальных потоков. Произведен расчет и выбор
основного технологического оборудования, составлена принципиальная
технологическая схема производства биосорбента.
2. Себестоимость получения биосорбента на основе карбонизата в
ценах 2014 года составит 95 990,8 руб/т при инвестиционных издержках в
14,6 млн.рублей.
3. Предотвращенный экологический ущерб в результате эксплуатации
технологического комплекса по приему и переработке НЗП с использованием
биосорбента составит 7,8 млн. руб./год.
4. В результате внедрения производства по получению биосорбента на
основе карбонизата мощностью 100 т/год, нефтехимическое предприятие
снизит плату за размещение отходов на 366 015, 4 руб/год.
146
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. В процессах разведки, добычи, транспортировки, хранения и
переработки
нефти
и
нефтепродуктов
происходит
их
попадание
в
окржающую среду вследствие технологических потерь и аварийных
ситуаций, что приводит к деградации природных экосистем, прежде всего
почвенных. Для очистки нефтезагрязненных почв применяются различные
технологии,
отличающиеся
(механические,
оформлению,
по
способу
физико-химические,
длительности
деструкции
нефтепродуктов
биологические),
аппаратурному
процесса,
достигаемой
эффективности,
экономическим затратам. Перспективным направлением по очистке объектов
окружающей среды от нефти с помощью микроорганизмов является
использование биосорбентов.
2. Расширение
базы
вторичных
материалов
для
получения
биосорбентов, особенно за счет модификации углеродсодержащих отходов
производства с целью получения носителя в качестве основы для
производства биосорбентов, позволит использовать ресурсный потенциал
отходов,
получить
применяемыми
в
новые
материалы
природоохранных
с
заданными
технологиях,
и
свойствами,
минимизировать
негативное воздействие отходов на объекты окружающей среды.
Карбонизат, полученный в результате низкотемпературного пиролиза
избыточного
активного
ила
биохимических
очистных
сооружений
предприятий нефтехимического комплекса, по своим физико-химическим
(удельная поверхность – 39,3 ± 0,6 м2 в 1 г угля, общий объем макропор –
0,559 - 0,544см3/г) и сорбционным характеристикам (влагоемкость – 0,6 см3/г,
нефтеемкость – 0,55 г/г) является хорошим макропористым материалом, что
позволит использовать его в качестве носителя для микроорганизмов.
3. Для получения накопительной культуры микроорганизмов были
выделены УВОМ, относящиеся к родам Pseudomonas sp., Rhodococcus sp.,
Mortierella. Суспензию УВОМ использовали для иммобилизации в момент,
когда основная масса клеток микроорганизмов перешла в капли нефти, а
147
численность микроорганизмов пошла на спад. При этом биомасса сухих
клеток микроорганизмов в суспензии составляла не менее 1,0 г/л.
4. Установлен
адсорбционно-адгезионный
углеводородокисляющих
микроорганизмов
механизм
размером
закрепления
4-5
мкм
на
поверхности макропор карбонизата. Сила адгезии составляет 1,4*10-9 г*см2/с,
число адгезии – 97,1 %.
5. Полученные
в
экспериментальных
исследованиях
результаты
доказали возможность использования карбонизата в качестве носителя для
закрепления УВОМ в силу его пористой структуры (объем макропор 0,544
см3/г) и шероховатой поверхности. Используемый в качестве контроля
высокопористый сорбент – БАУ, близкий по пористой структуре к
карбонизату оказался малопригодным из-за слабой сорбируемости клеток на
поверхности и недостаточной прочности их закрепления.
6. Определены параметры процесса физической иммобилизации для
получения биосорбента: биомасса сухих клеток микроорганизмов в исходной
суспензии – не менее 1,0 г/л, общее количество микроорганизмов – не менее
107 КОЕ/мл.
7. Установлено,
оптимальное
время
для
иммобилизации
микроорганизмов методом пропускания суспензии УВОМ через слой
носителя – 5,0±0,5 часов, скорость потока суспензии микроорганизмов –
50±10 мл/ч.
8. Доказана возможность использования биосорбента, полученного на
основе карбонизата, в технологии биоремедиации НЗП и установлено
повышение эффективности очистки НЗП, по сравнению с традиционными
способами биоремедиации, в 1,7 раза через три месяца от начала
эксперимента.
9. Доза вносимого биосорбента составляет 1-2 тонны на 1 га
нефтезагрязненной
площади
в
зависимости
от
концентрации
нефтепродуктов, но не более 50 г/кг, при этом концентрация тяжелых
металлов в почве не превысит установленных нормативных значений.
148
10. Возможность
использования
биосорбента
и
сохранения
его
эксплуатационных характеристик в течение как минимум 2х лет при
соблюдении условий хранения: температура - 20±4 °C, относительная
влажность воздуха - 35±5 %, отсутствие света.
11. Себестоимость получения биосорбента на основе карбонизата в
ценах 2014 года составит 95 990,8 руб/т при инвестиционных издержках в
14,6 млн.рублей.
12. При
реализации
технологии
биоремедиации
с
помощью
биосорбента на основе карбонизата предотвращенный экологический ущерб
от загрязнения почв химическими веществами составит 7,8 млн. руб./год.
149
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Петров А. А. Углеводороды нефти. – М.: Наука, 1984. – 263 с.
2. Большая энциклопедия нефти и газа. [Электронный ресурс]: URL:
http://www.ngpedia.ru/ (дата обращения: 25.10.2013)
3. Давыдов С. Л., Тарасова В. И. Нефть и нефтепродукты в
окружающей среде. Учеб. Пособие. – М.:РУДН, 2004. – 163 с.
4. Джеймс Г. Спейт Анализ нефти. Справочник. – М.: Профессия,
2010. – 492 с.
5. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты
промышленности органических и неорганических веществ. Часть I – СПб:
«Мир и Семья», 2002. – 988 с.
6. Березин Б. Д., Березин Д. Б. Курс современной органической химии.
Уч. пособие для вузов. – М.: Высшая школа, 1999. – 768 с.
7. Орлов Д. С. Экология и охрана биосферы при химическом
загрязнении: Учеб. пособие / Д. С. Орлов, Л. К. Садовникова, И. Н.
Лозановская. – М.: Высшая школа, 2002. – 334 с.
8. Мановян А. К. Технология первичной переработки нефти и
природногогаза : учеб. пособие для вузов / А. К. Мановян. М.: Химия, 1999.
568 с.: ил.
9. Логинов О.Н. Биотехнологические методы очистки окружающей
среды от техногенных загрязнителей.Уфа:"Реактив", 2000. - 100 с.
10. Шамраев А.В., Шорина Т.С. Влияние нефти и нефтепродуктов на
различные компоненты окружающей среды/А.В. Шамраев, Т.С.Шорина //
Вестник ОГУ. – 2009. – №6. – с.642-643.
11. Габбасова И.М., Абдрахманов Р.Ф., Хабиров И.К., Хазиев Ф.Х.
Изменение свойств почв и состава грунтовых вод при загрязнении нефтью и
нефтепромысловыми сточными водамив Башкирии//Почвоведение.1997.№11.-с.1362-1372.
12. Кожевин П.А.Биотический компонент качества почвы и проблема
устойчивости// Почвоведение.1997.-№4.- с.44-48.
150
13. Плешакова Е.В. Эколого-функциональные аспекты микробной
ремедиации нефтезагрязненных почв: автореф. дис. доктора. биол. наук. –
Саратов, 2010. - 47 с.
14. Оборин А. А., Калачникова И. Г., Масливец Т. А. Биологическая
рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны //
Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. - М.: Наука, 1988.
- с. 140-159.
15. Киреева Н. А. Диагностические критерии самоочищения почвы от
нефти. // Экология и промышленность России, 2001, №12. - с. 34-35.
16. Бузмаков С. А. Техногенные изменения компонентов природной
среды в нефтедобывающих районах Пермской области / С. А. Бузмаков, С.
М. Костарев. – Пермь: Изд-во Перм. ун-та, 2003. – 170 с.
17. Иларионов
С.
А.
Экологические
аспекты
восстановления
нефтезагрязненных почв. – Екатеринбург: УрОРАН, 2004. - 194 с.
18. Солнцева Н. П. Общие закономерности трансформации почв в
районах добычи нефти (формы проявления, основные процессы, модели) //
Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем.
– М.: Наука,
1988. - с. 23-42.
19. Sang-Hwan Lee, Bang-Il Oh, Jeong-gyu Kim. Effect of various
amendments on heavy mineral oil bioremediation and soil microbial activity //
Bioresource Technology 99 (2008), 2578-2587.
20. Куюкина
используемый
М.С.,
Ившина
И.
Б.
Олеофильный
биопрепарат,
для очистки нефтезагрязненной почвы // Экологические
системы и приборы. – 2002, №10.
21. Капокина
Л.Н.,
Морщакова
Г.Н.Способ
очистки
объектов
окружающей среды от углеводородов нефти и масел // Экологические
системы и приборы. – 2001, №7.
22. Каменщиков
Ф.А.,
Богомольный
Е.И.
Нефтяные
сорбенты.
Ижевск:– Москва, – Институт компьютерных исследований. – 2003. – 268 с.
151
23. English-RussianBiotechnologyGlossary.A. F. Valikhov, V. V. Kolotvin,
O. A. Legonkova, I. A. Rogov, Thomas Creamer. 2007.
24. Аренс В.Ж. Нефтяные сорбенты: рекламные иллюзии и реальные
перспективы / В.Ж. Аренс, О.М. Гридин, В.М. Кондрашенко // Нефтегазовая
вертикаль. – 2000. № 9. С. 108.
25. Биотехнология. Учеб.пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С.
Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты / И.В.
Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашев и др. М. – Высш. шк., 1987. – 159 с.
26. Синицын
А.П.,
Райнина
Е.И.,
Лозинский
В.И.,
Спасов
С.Д.Иммобилизованные клетки микроорганизмов. - М.: Изд-воМГУ, 1994. 288 с.
27. Shuguang Deng, Sorbent Technology, Encyclopedia of Chemical
Processing DOI: 10.1081/E-ECHP-120007963 (2006) Р. 2825 – 2845
28. V. VOJTISEK, V. JIRKU, Immobilized Cells, Folia Miсrobiol. 28, Р.
309-- 340 (1983).
29. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. – М.: Изд-во Моск. ун-та,
1987. - 256 с.
30. Marketing Research Agency: HCMG IEW® & EPA Inc. Рынок
сорбентов и фильтров в России. Анализ цен и характеристик по состоянию на
2010 год. USA, NewYork, 2010.
31. Авт. свидетельство №255138. Способ очистки сточных вод от
нефтепродуктов. Бюлл.изобр. №34,1969.
32. Патент США №3843517 кл.СО2 В 9/02,1974
33. Пат. 2318736 Российской Федерации, МПК2 C02F3/34, C12N1/26.
Биосорбент для очистки водоемов от нефтепродуктов на основе штаммов
бактерий и дрожжевых грибов / Хабибулина Ф.М., [и др.]; заявитель и
патентообладатель Институт биологии Коми научного центра Уральского
отделения Российской академии наук.
– заявл. 10.02.2006; опубл. -
10.03.2008.
152
34. Пат. 2311237Российской Федерации, МПК2 B09C1/10,C12N1/26.
Способ микробиологической очистки нефтяных шламов и загрязненного
нефтепродуктами грунта (варианты) / Карасева Э.В., [и др.]; заявитель и
патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего
профессионального образования "Кубанский государственный университет"
(КубГУ). – заявл. 02.05.2006; опубл. - 27.11.2007.
35. Пат. 2299181Российской Федерации, МПК4 C02F3/34, C12N1/26,
C12R1/77, C12R1/645. Биосорбент для очистки водной поверхности от нефти
и нефтепродуктов / Хабибулина Ф.М., [и др.]; заявитель и патентообладатель
Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской
академии наук. – заявл. 10.02.2007; опубл. - 20.05.2007.
36. Пат. 2422587Российской Федерации, МПК4E02B15/04, C02F3/32, C02F3/34, C12N1/26. Комплексный биосорбент на основе штаммов бактерий
и грибов для очистки водных сред от нефти и нефтепродуктов в присутствии
микроводорослей / Шарапова И.Э., [и др.]; заявитель и патентообладатель
Учреждение Российской академии наук Институт биологии Коми научного
центра Уральского отделения РАН. – заявл. 21.12.2009; опубл. - 27.06.2011.
37. Эко-маркетинг. [Электронный ресурс]: URL: http://eko-marketing.ru/
(дата обращения: 15.12.2012).
38. Центр экологических инициатив ПРЕСС-ТОРФ. [Электронный
ресурс]: URL: http://www.press-torf.m-b.ru/ (дата обращения: 25.11.2012).
39. Научно-производственное предприятие «Эконад». [Электронный
ресурс]: URL: http://www.econad.com.ua/ (дата обращения: 17.12.2012).
40. Научно-производственная
фирма
«ЭКОСОРБ».
[Электронный
ресурс]: URL: http://www.ecosorb.su/ (дата обращения: 20.11.2012).
41. Пат. 2420579Российской Федерации, МПК2 C12N11/00, C12N1/26.
Способ иммобилизации клеток микроорганизмов в сорбент, используемый
для очистки нефтезагрязнений / Козьминых А.Н., [и др.]; заявитель и
патентообладатель Закрытое акционерное общество "Маркетинг-Бюро". –
заявл. 11.08.2009; опубл. - 10.06.2011.
153
42. Федорова
Ю.А.
Разработка
способа
рекультивации
нефтезасоленных грунтов: Диссер. канд. техн. наук. - Уфа, 2012.- 131 с.
43. Пат. 2315655Российской Федерации, МПК2 B01J20/26, B01J20/30.
Способ получения полимерных сорбентов / Рязанова Т.В., [и др.]; заявитель и
патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего
профессионального
образования
"Сибирский
государственный
технологический университет",Общество с ограниченной ответственностью
"Научно-производственная фирма" "Экосорб", Рязанова Т.В. – заявл.
20.09.2006; опубл. - 27.01.2008.
44. Собгайда Н.А., Ольшанская Л.Н., Макарова К.Н., Макарова Ю.А.
Использование отходов производства в качестве сорбентов нефтепродуктов //
Экология и промышленность России. - 2009. - № 1. - С. 36-38.
45. Солодкова
технологии
А.Б.,
Собгайда
изготовления
и
Н.А.,
Шайхиев
использования
И.Г.
адсорбента
Разработка
на
основе
отработанного активного ила для очистки сточных вод // Вестник Казанского
технологического университета. - 2012. - Т. 15. № 20. - С. 179-182.
46. Сорбенты для очистки воды. [Электронный ресурс]: URL: www.afilter.ru (дата обращения 20.04.2011).
47. Практикум по микробиологии: Учеб.пособие для студ. высш. учеб.
заведений / А.И. Нетрусов [и др.] – М.: Издательский центр «Академия»,
2005. – 608 с.
48. Ягафарова Г.Г., Сафаров А.Х. Микроорганизмы и окружающая
среда: Учеб. пособие. - Уфа: Изд-во УГНТУ, 2005. - 206с.
49. Серебрянникова М.К. Биодеградация нефтяных углеводородов
иммобилизованными родококками в колоночном биореакторе: Диссер. канд.
биол. наук. – П., 2014. – 159 с.
50. Кац Н.Г. Химическое сопративление материалов и защита
оборудования нефтегазопереработки от коррозии: учебное пособие /Н.Г. Кац,
В.П. Стариков, С.Н.Парфенов. – Москва: Машиностроение, 2011. – 436 с.
154
51. ГОСТ Р 52808-2007 Нетрадиционные технологии. Энергетика
биоотходов. Термины и определения.
52. Биотехнология. [Электронный ресурс]: URL: www.biotechnolog.ru
(дата обращения: 07.02.2011).
53. Жубанова, А.А. Иммобилизированные клетки микроорганизмов
/А.А. Жубанова,М.Х. Шигаева. // Биотехнология. Теория и практика. 1997. №
2.
54. Кощеенко, К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов и их
применение / Пром. микробиология. Уч.пос.для вузов. - М.: Высшая школа.
1989. -216-235 c.
55. B. Katzbauer, M. Narodoslawslo, A. Moser, Classification system for
immobilization techniques, Bioprocess Engineering 12 (1995) Р. I73-179
56. MB Cassidy, H Lee and JT Trevors, Environmental applications of
immobilized microbial cells: a review, Journal of Industrial Microbiology (1996)
16, Р. 79-101.
57. ГОСТ 6217-74. Уголь активный древесный дробленый. Технические
условия.
58. ГОСТ
16190-70.
Сорбенты.
Метод
определения
насыпной
плотности.
59. ТУ 214 – 10942238 -03-95. Оценка эффективности сорбента.
60. ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06 (издание 2011 г.). Методика определения
острой токсичности питьевых, пресных природных и сточных вод, водных
вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по смертности дафний
(Daphnia magna Straus).
61. ФР. 1.39.2001.00283. Методика определения токсичности воды и
водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и
изменению плодовитости дафний.
62. Практикум по микробиологии. Под ред. Егорова Н.С. – М.,1976. 314 с.
155
63. Большой практикум по микробиологии. Под общ. ред. Г.Д.
Селибера. – М.: Высшая школа, 1962. - 464 с.
64. Ежов
Г.И.
Руководство
к
практическим
занятиям
по
сельскохозяйственной микробиологии. Уч. Пособие. – М.: «Высшая школа»,
1974. - 288 с.
65. Мирчик Т.Г. Почвенная микробиология. - М.: Изд-во МГУ, 1988 г.
66. Минеев В.Г., Ремпе Е.Х. Агрономия, биология и экология почвы. –
М.: Росагропромиздат, 1990. – 206 с.
67. РД 52.18.647-2003. Методические указания. Определение массовой
доли
нефтепродуктов
в
почвах.
Методика
выполнения
измерений
гравиметрическим методом.
68. РД 39-0147098-015-90. Инструкция по контролю за состоянием
почв на объектах предприятий миннефтепрома.
69. ГОСТ 5180 – 84. Грунты. Методы лабораторного определения
физических характеристик.
70. ГОСТ 26423 – 85. Почвы. Методы определения удельной
электрической проводимости, рН и плотного остатка водной вытяжки.
71. Ившина И.Б., Пшеничнов Р.А., Оборин А.А., Пропанокисляющие
родококки, Свердловск: УНЦАН СССР, 1987, стр. 125
72. МЕТА.402.00.00.00.
Руководство
по
эксплуатации.
Станция
подготовки образцов «SorbiPrep», Новосибирск, 2010 г. – 12 с.
73. МЕТА.401.00.00.00. Руководство по эксплуатации. Прибор для
измерения удельной поверхности дисперсных и пористых материалов серии
Сорби: модификация Сорби-MS, Новосибирск, 2010 г. – 41 с.
74. Карнаухов А.П. Адсорбция. Текстура дисперсных и пористых
материалов. Новосибирск: Наука, 1999. 469 с.
75. Brunauer S., Emmett P.H., Teller E. // J.Amer.Chem.Soc. – 1938. –
Vol.60 – p.309.
76. Грег С., Синг К. Адсорбция, удельная поверхность, пористость. – 2е изд. – М.:Мир, 1984.
156
77. Ямпольская
Т.Д.,
Шахалай
Т.В.
Биоповреждения
горюче-
смазочных материалов в условиях северных регионов // Известия Самарского
научного центра Российской академии наук, т. 12, №1(5), 2010 г. – С. 12501255.
78. Практикум по биологии почв: Учеб. пособие / Зенова Г.М.,
Степанов А.Л., Лихачева А.А., Манучарова Н. А. - М.: Издательство МГУ,
2002.- 120 с.
79. Biostat A plus. Quick Installation Guide.
80. Типовой технический паспорт на фильтр сорбционный. Фильтр
фильтрационный безнапорный. Тольятти, 2009 г. – 12 с.
81. Лабораторное и аналитическое оборудование для лабораторий,
лабораторная мебель. [Электронный ресурс]: URL: http://www.eurolab.ru/
(дата обращения: 25.07.2013).
82. Иммобилизация уксуснокислых бактерий на углеродных волокнах
и использование их для трансформации тиодигликоля / Н.Г. Медведева, Ю.А.
Гриднева, А.А. Лысенко, В.И. Сухаревич // Биотехнология. 2001. № 5. С. 5157.
83. Технологический регламент на проведение опытно-промышленных
работ
по
ремедиации
нефтезагрязненных
грунтов
на
территории
деятельности ООО «ЛУКОЙЛ-ПЕРМНЕФТЬ». ПЕРМЬ, 2001.
84. Бирштехер Э. «Нефтяная микробиология. - Л.: Гостоптехиздат. 1957
– 314 с.
85. Microbiology of Extreme Soils. Editors Patrice Dion, Chandra Shekhar
Nautiyal. Germany, Springer Berlin Heidelberg, 2008. 357 p.
86. Звягинцев Д.Г., Гузев В.С., Левин С.В. Диагностические признаки
различных уровней загрязнения почвы нефтью //Почвоведение. – 1989, №1. –
с. 72 – 78.
87. Advanced techniques in Soil Microbiology. Eds. Ajit Varma. Germany,
Springer Berlin Heidelberg, 2007. – 415p.
157
88. Омелянский В.Л. Практическое руководство по микробиологии. –
М. – Л.: Изд-во АНСССР, 1940. - 432 с.
89. Бабаева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. – М.: Изд-во МГУ, 1989. 336 с.
90. Мишустин Е.Н., Емцов В.Т. Микробиология. – М.: Наука, 1987. 246 с.
91. Хотянович
А.В.
Методы
культивирования
азотфиксирующих
бактерий, способы получения и применения препаратов. Методические
рекомендации. – Л.: ВНИИСХМ, 1991.
92. Скворцова И.Н. методы идентификации и выделения почвенных
бактерий рода Pseudomonas. – М.: МГУ, 1981. – 78 с.
93. Мишустин Е.Н. Ассоциации почвенных микроорганизмов. – М.:
Наука, 1975. - 198 с.
94. Красильников А.Н. Определитель бактерий и актиномицетов. – М.:
АНСССР, 1949. - 761 с.
95. Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Д. Хоулта. – М.,
1980.
96. Биология
отдельных
групп
актиномицетов.
Под
ред.
А.А,
Красильникова. – М.: Наука, 1965. - 370 с.
97. Милько А.А. Определитель мукоральных грибов. – Киев: Наукова
Думка, 1974. - 303 с.
98. Скворцова И.Н. Идентификация почвенных бактерий. – М., 1983. 295 с.
99. Рубенчик Л.И. Микроорганизмы – биологические индикаторы. –
Киев, 1972.
100. Мотавкина Н.С., Артемкин В.Д. Атлас по микробиологии и
вирусологии. – М.: «Медицина», 1976. - 307 с.
101. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных
и условно патогенных грибов. М.: Мир, 2001. – 486 с.
158
102. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Statistica. Статист. анализ и
обработка данных в среде Windows. – М.: Информационно – изд. дом.
«Филин», 1997 – 608 с.
103. Боровиков В.П. Популярное введение в программу Statistica. –
М.: Компьютер Пресс, 1998 – 267 с.
104. Боровиков
В.П.
Statistica:
искусство
анализа
данных
на
компьютере. Для профессионалов. – С – Пб.: Питер, 2001. – 656 с.
105. Гринин А.С., Орехов Н.А., Новиков В.Н. Математическое
моделирование в экологии: Учеб. пособие для ВУЗов. – М.: ЮНИТИ –
ДАНА, 2003. – 269 с.
106. ООО
«Лукойл-Пермнефтеоргсинтез».[Электронный
ресурс]:
URL: http://www.pnos.lukoil.com/ (дата обращения: 25.04.2014).
107. Дьяков
обезвреживания
М.С.
Разработка
избыточного
технологии
активного
ила
термоэнергетического
нефтеперерабатывающих
предприятий: автореф. дис. …канд. техн. наук. – Пермь, 2009. - 17 с.
108. Вайсман Я.И., Глушанкова И.С., Дьяков М.С., Ходяшев М.Б.
Экологически
безопасный
способ
утилизации
осадков
сточных
вод
биохимических очистных сооружений с получением углеродсодержащих
сорбционных материалов // Всероссийский научно-практический журнал
«Вода: химия и экология». – 2011. - № 3. – С. 14-24.
109. Водоподготовка: Справочник. /Под ред. д.т.н., действительного
члена Академии промышленной экологии С.Е. Беликова. М.: Аква-Терм,
2007. – 240 с.
110. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с
англ. В 2-х частях. Ч. 1. – М.: Мир, 1989. – 692 с., ил.
111. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с
англ. В 2-х частях. Ч. 2. – М.: Мир, 1989. – 590 с., ил.
112. ГН 2.1.7.2041-06 «Предельно допустимые концентрации (ПДК)
химических веществ в почве».
159
113. Технология
очистки
различных
сред
и
поверхностей,
загрязненных углеводородами: Ведомственный руководящий документ ВРД
39-1.13-056-2002. – 2002.
114. Хамнаева М.И., Цыренов В.Ж. Методические рекомендации к
курсовому и дипломному проектированию (часть 2). – Улан-Удэ: Изд-во
ВСГТУ. - 2004. – 36 с.
115. Хаустов А.П., Редина М.М. Экономика природопользования:
диагностика и отчетность предприятий – М.: Изд-во РУДН, 2002. – 216 с.
116. Шевчук
А.В.
Экономика
природопользования
(теория
и
практика). – М.: НИА-Природа, 1999. – 308 с.
117. Постановление Региональной энергетической комиссии № 24-э
от 20.03.2012 г.
118. Приказ Минприроды России от 8 июля 2010 г. N 238 «Об
утверждении
Методики
исчисления
размера
вреда,
причиненного почвам как объекту охраны окружающей среды».
119. Об
утверждении
регионального
норматива
«Допустимое
остаточное содержание нефти и продуктов ее трансформации в почве после
проведения рекультивационных и иных восстановительных работ на
территории Республики Татарстан»: приказ Министерства экологии и
природных ресурсов Республики Татарстан от 22 июля 2009 г. № 786.
120. Постановление Правительства Российской Федерации № 344 от
12 июня 2003 г. «О нормативах платы за выбросы в атмосферный воздух
загрязняющих веществ стационарными и передвижными источниками,
сбросы загрязняющих веществ в поверхностные и подземные водные
объекты, размещение отходов производства и потребления».
121. Постановление Правительства Российской Федерации № 632 от
28 августа 1992 г. «Об утверждении порядка определения платы и ее
предельных размеров за загрязнение окружающей природной среды,
размещение отходов, другие виды вредного воздействия».
160
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ О КЛАССЕ ОПАСНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ НЕФТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
ЗАКЛЮЧЕНИЕ О ПАТОГЕННОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ