Диссертация Абай Гаухар
advertisement
Южно-Казахстанский государственный университет им. М.Ауэзова УДК 636.082.4.612.018 На правах рукописи АБАЙ ГАУХАР Совершенствование биотехнологических методов получения гонадотропных гормонов и их использование в трансплантации эмбрионов у овец 6D070100 - Биотехнология Диссертация на соискание ученой степени доктора философии (РhD) Научные консультанты доктор сельскохозяственных наук, профессор Алибаев Н.Н.; доктор биологических наук, Свитоюс А.Г. (Литва) Республика Казахстан Алматы, 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................ 7 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Гонадотропные гормоны ................................................................................ 12 1.1.1. Функции гонадотропных гормонов .............................................................. 12 1.1.2 Гонадотропин сыворотки жеребых кобыл ................................................... 15 1.1.3 Физико-химические свойства гонадотропных гормонов ........................... 18 1.1.4 Применение гонадотропных гормонов в воспроизводстве сельскохозяйственных животных ................................................................. 21 1.1.5 Способы диагностики жеребости и гонадотропной активности в СЖК .. 24 1.2 Трансплантация эмбрионов ........................................................................... 26 1.2.1 Развитие метода трансплантации эмбрионов ....................................................... 26 1.2.2 Метод трансплантации эмбрионов в животноводстве ...................................... 27 1.2.3 Суперовуляции у сельскохозяйственных животных................................... 30 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .................. 37 2.1 Объекты и материалы исследования ........................................................... 37 2.1.1 Отбор жеребых кобыл и овцематок доноров ............................................... 37 2.1.2 Характеристика лошадей породы «джабе» и их содержание .................... 37 2.2 Методы исследования ................................................................................... 40 2.2.1 Гормональная диагностика жеребости кобыл на половозрелых самцах озерной лягушки ............................................................................................................. 40 2.2.2 Взятие крови от кобыл.................................................................................... 40 2.2.3 Определение соотношения ФСГ/ЛГ гормонов в препарате СЖК и ГСЖК методом «ИФА-ФСГ/ЛГ» ........................................................................................... 41 2.2.4 Определение гонадотропной активности на неполовозрелых самках белых мышей ................................................................................................................... 43 2.3 Получение гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл… ..................... 47 2.3.1. Способ получения гонадотропина............................................................................ 47 2.3.2 Сушка гонадотропина ................................................................................................... 48 2.4 Гормональная индукция суперовуляции ...................................................... 48 2.4.1 Обработка овцематок и извлечение эмбрионов .................................................. 48 2.4.2 Классификация эмбрионов по качеству ....................................................... 51 2.4.3 Стадии развития эмбрионов ........................................................................... 51 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .............................................................. 53 3.1 Отбор кобыл-доноров в качестве продуцентов сыворотки жеребых кобыл ................................................................................................................ 53 3.2 Изучение биологических свойств сыворотки жеребых кобыл ................. 53 3.2.1. Гонадотропная активность сыворотки крови полученных от жеребых кобыл разного возраста и периодов жеребости ........................................... 53 3.2.2 Гормональный статус кобыл-доноров в зависимости от возраста и сроков жеребости .......................................................................................................................... 57 3.2.3 Гормональная активность сыворотки жеребых кобыл ...................................... 59 2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.4 3.4.1 3.4.2 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.6 4. Соотношение фолликулостимулирующих и лютеинизирующих гормонов в сыворотках полученных от жеребых кобыл разного возраста и периодов жеребости .......................................................................................................................... 62 Определение фолликулостимулирующих и лютеинизирующих гормонов .......................................................................................................... 62 Статус кобыл доноров разных возрастов по соотношению ФСГ/ЛГ в образцах крови ............................................................................. 64 Корреляционный и дисперсионный анализ биологического качества сыворотки жеребых кобыл ...................................................................... 66 Использование различных способов получения гонадотропных гормонов из сыворотки жеребых кобыл ...................................................... 68 Осаждение балластных белков с использованием разных методов .......... 68 Биологические качества СЖК после очистки от балластных белков ...... 73 Получение гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл.......................... 79 Получение сырого гонадотропина с использованием разных способов ... 79 Получение сухого гонадотропина ................................................................ 81 Выход гонадотропного гормона из исходного сырья и определение его биологической активности ...................................................................... 83 Результаты получения гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл при использовании разных методов .............................................................. 89 Использование ГСЖК в трансплантации эмбрионов у овец .......................... 90 Экономическая эффективность .................................................................................. 96 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…......................................................................................... 98 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ............................. 101 ПРИЛОЖЕНИЯ .......................................................................................... 114 3 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ В настоящей диссертационной работе использованы ссылки на следующие стандарты: ГОСТ 23275-78 Сыворотка крови жеребых кобыл. Технические условия. Изменения №1 к ГОСТу 23275-78 Сыворотка крови жеребых кобыл Технические условия. Изменения №2 к ГОСТу 23275-78 Сыворотка крови жеребых кобыл. Технические условия. СТ РК 1613-2006 Надлежащая лабораторная практика. 4 ОПРЕДЕЛЕНИЯ В настоящей диссертационной работе применены следующие термины с соответствующими определениями: Гонадотропины подкласс тропных гормонов передней доли гипофиза и плаценты, физиологической функцией которых является регуляция работы половых желёз Гонадотропин сыворотки жеребых кобыл - выделенный из СЖК очищенный от балластных белков гормональный препарат, обладающий как фолликулостимулирующей так и лютеинизирующей активностью Донор – объект, отдающий что-либо называемому реципиенту Лапаротомия – вскрытие брюшной полости для осуществления доступа к органам репродукции другому объекту, Лютеинизирующий – пептидный гормон, секретируемый гонадотропными гормон клетками передней доли гипофиза. Овуляция – процесс выхода ооцита из созревшего фолликула Суперовуляция – состояние, вызванное гормонами, когда в яичниках животных развивается и овулирует в несколько раз больше яйцеклеток Сыворотка жеребых кобыл – биопрепарат гормонального действия, который содержит гонадотропные гормоны, стимулирующие рост, созревание и овуляцию фолликулов Фолликулостимул ирующий гормон - гонадотропный гормон передней доли гипофиза, стимулирующий рост и созревание фолликула Фолликул – соматическая клетка яичника, которая в комплексе обеспечивают развитие ооцита Фибрин – высокомолекулярный, неглобулярный белок, образующийся из фибриногена плазмы крови под действием фермента тромбина; имеет форму гладких или поперечноисчерченных волокон, сгустки которых составляют основу тромба при свёртывании крови Эмбрион - стадия развития организма, начиная со стадии зиготы до рождения или выхода из яйцевых оболочек 5 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ ГСЖК - гонадотропин сыворотки жеребых кобыл; И.Е.- интернациональные единицы; ИФА – иммуноферментный анализ; ЛГ – лютеинизирующий гормон; СЖК – сыворотка жеребых кобыл; ТМБ – тетраметилбензидин; ФАО (FAO) – Продовольственная и сельскохозяйственная организация ФСГ – фолликулостимулирующий гормон; ХГЧ – хорионический гонадотропин; м.е. – мышиные единицы; М – средние статистические значения; m – ошибки среднего статистические значения; n – количество; Р – достоверость разницы; Cv – коэффициент вариации; σ – среднеквадратическое отклонение; h2 – коэффициент наследуемости; r – коэффициент корреляции. 6 ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена к решению актуальной проблемы производства отечественных гормональных биопрепаратов, используемых в воспроизводстве сельскохозяйственных животных. В частности гонадотропному гормону сыворотки жеребых кобыл и гонадотропину сыворотки жеребых кобыл путем совершенствования технологии их получения от кобыл-доноров и эффективному использованию готовой продукции в технологии трансплантации эмбрионов у овец. Актуальность темы исследования. Животноводство – одна из ведущих отраслей аграрного сектора Республики Казахстан [1-3]. В докладе ФАО отмечается, что животноводство - динамичная отрасль, на которую приходится 40% валовой продукции сельского хозяйства и обеспечивает средства к существованию и продовольственную безопасность для миллиардов человек на планете [4]. Одним из ключевых факторов устойчивого развития животноводства является интенсификация ускоренного воспроизводства высокоценных генотипов сельскохозяйственных животных. [5-9]. На сегодняшний день для повышения сохранности поголовья, регулирования процессов размножения и плодовитости сельскохозяйственных животных особо важно применение гормонов и гормонально активных препаратов [10]. Апробированным в производстве биопрепаратом является гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, который эффективно применяется для ускорения темпов воспроизводства сельскохозяйственных животных. [1112]. В настоящее время в Республике Казахстан не производят гормональные препараты для индукции полиовуляции и повышения плодовитости сельскохозяйственных животных. В воспроизводстве сельскохозяйственных животных применяются дорогие, импортные препараты зарубежных фирм. Между тем, в Республике имеются все предпосылки для производства отечественных гормональных препаратов высокого качества альтернативных импортным. Тем более, без них внедрение биотехнологических методов в ускоренном воспроизводстве высокопродуктивных сельскохозяйственных животных невозможно. Следовательно, производство гормональных препаратов для ускоренного воспроизводства сельскохозяйственных животных является актуальным. В свое время, в г. Шымкент функционировала специализированная биолаборатория по выпуску сыворотки жеребых кобыл, где ежегодно производилось 300-500 тысяч овцедоз нативного сыворотки жеребых кобыл, для воспроизводства сельскохозяйственных животных, которая обеспечивала потребности в биопрепаратах. Однако в последующем, в период перехода к рыночной экономике из-за ослабления ресурсов биопродуцентов, производство сыворотки жеребых кобыл прекратилось. 7 На сегодняшний день в Республике Казахстан численность поголовья лошадей достигла 1,5 млн. голов, что дает реальные возможности для возобновления, изготовления и внедрения в производство гормонально активных препаратов для динамичного развития отрасли животноводства. Сегодня по ряду объективных и субъективных обстоятельств наблюдается тенденция к сокращению, а то и исчезновению некоторых высокопродуктивных культурных пород, типов и линий животных, одними из них являются каракульские овцы, которые обладают наиболее важным природным признаком, заключающимся в оригинальности извитости их шерстного покрова в период внутриутробного развития. При этом они продуцируют непревзойденные по красоте, оригинальности, легкости и прочности в носке смушки с благородным блеском, имеют сложную внутрипородную дифференциацию по окраскам, оттенкам, расцветкам и представляют собой источник генетического материала для селекции будущего, что повышает конкурентоспособность этих животных в постоянно меняющихся условиях пушно-мехового рынка [17]. В этой связи сохранение и ускоренное размножение генофонда высокопродуктивных животных с помощью метода трансплантации эмбрионов с применением искусственного вызывания множественной овуляции является актуальным вопросом [18]. Для достижения данных целей необходимо совершенствовать существующие традиционные методы воспроизводства и селекции животных, которые не полностью раскрывают потенциальные возможности племенных животных, что существенно сдерживает генетическое улучшение отечественных пород и создание высокопродуктивных конкурентоспособных животных. Поэтому с целью более масштабного использования их генетического потенциала в современных условиях интенсивного ведения животноводства особую актуальность приобретают биотехнологические приемы и методы получения потомков от высокоценных животных. Наиболее прогрессивным вкладом в решение проблем устойчивого развития животноводства на современном этапе является создание комплексной системы сельскохозяйственной биотехнологии и внедрение их в производство [19-21]. Объекты исследования – кобылы-доноры породы «джабе», овцематкидоноры каракульской породы овец. Предмет исследования - биопрепараты сыворотки жеребых кобыл и гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, эмбрионы каракульских овец. Цель и задачи работы. Целью работы является совершенствование технологии получения гонадотропина сыворотки жеребых кобыл и использование его в трансплантации эмбрионов у овец для увеличения суперовуляции и выхода большего количества качественных эмбрионов. Задачи исследования: - установить жеребость у отобранных кобыл-доноров и получить от них нативные моносыворотки различных серий; 8 определить гонадотропную активность и соотношение фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в полученных образцах моносывороток; - установить оптимально-репродуктивные дни жеребости у отобранных кобыл-доноров разных возрастов; - исследовать выход гонадотропных гормонов из исходного сырья после осаждения от балластных белков; - установить влияние биологических факторов у доноров на активность полученного гонадотропина; - провести экспериментальную оценку реакции яичников овец доноров на полученный гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) нового образца. Методы исследования: Экспериментальные работы были проведены на лошадях казахской породы типа «джабе», а также на овцематках каракульской породы в крестьянском хозяйстве «Жайлау» который расположен в Сузакском районе Южно-Казахстанской области. Лабораторные исследования для определения гормональной диагностики жеребости кобыл на половозрелых самцах озерной лягушки, а также определение соотношения фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в препаратах сыворотки жеребых кобыл и гонадотропина сыворотки жеребых кобыл методом «ИФА-ФСГ/ЛГ», определение гонадотропной активности на неполовозрелых самках белых мышей проводились в лаборатории Юго-Западного научно-исследовательского института животноводства и растениеводства и в ЮКОФ РГП на ПХВ «Республиканская ветеринарная лаборатория». Научная новизна исследований. На основе изучения биологических факторов влияющих на активность моносывороток, получены качественно новые данные, способствующие повышению репродуктивного потенциала кобыл-доноров и получению гонадотропных гормонов с высокой биологической активностью. Впервые установлены оптимальные репродуктивные дни жеребости кобыл-доноров и научно обосновано селективное значение их отбора в качестве продуцентов гонадотропина сыворотки жеребых кобыл; Разработан эффективный способ отбора жеребых кобыл для изготовления нативной сыворотки жеребых кобыл и получения высокоактивных гонадотропных гормонов из исходного сырья с учетом соотношения фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов; Доказана целесообразность внедрения нового способа в технологию получения гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл, с последующим использованием полученного биопрепарата при индукции суперовуляции у овцематок-доноров; Рекомендованы научно-обоснованные предложения по производству, обеспечивающие повышение выхода гонадотропного гормона из исходного 9 сырья и получению большего числа эмбрионов от гормонально обработанных доноров-овцематок. Теоретическая значимость работы. На основе корреляционного и дисперсионного анализа выявлены факторы, влияющие на выход гонадотропных гормонов из сыворотки жеребых кобыл полученных от кобыл разного возраста и с разными сроками жеребости. Практическая ценность работы. Разработанный новый способ получения высокоактивных гонадотропных гормонов на основе выявления наилучших репродуктивных дней жеребости кобыл-доноров, определения гонадотропной активности и выявления оптимального соотношения фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в исследуемых биопрепаратах имеет большое практическое значение и может с успехом применяться для ускоренного воспроизводства и регулирования процессов размножения, плодовитости сельскохозяйственных животных. Данный способ позволяет повысить точность отбора потенциальных жеребых кобыл в качестве доноров продуцентов сыворотки жеребых кобыл, получить гонадотропин сыворотки жеребых кобыл с активностью не менее 300 м.е./мл, с соотношением фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в пределах 3/14/1, повысить выход гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл на 31,7%, выход сухого гонадотропина в расчете на 1 литр сыворотки жеребых кобыл на 17,8%, увеличить число доноров с суперовуляцией на 2-3 раза, повысить число эмбрионов в 1,5 раза. Основные положения, выносимые на защиту 1. Отобраны кобылы породы «джабе» в количестве 16 голов разного возраста от 3-х до 10-ти лет и установлены их сроки жеребости. 2. Исследован биологический потенциал отобранных кобыл-доноров, который позволяет получить моносыворотки с высокой гормональной активностью и оптимальным соотношением фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов. 3. Установлены репродуктивные дни жеребости кобыл-доноров для получения и изготовления биопрепаратов с высокой гонадотропной активностью. 4. Определен выход гонадотропных гормонов из сыворотки жеребых кобыл при осаждении от балластных белков. 5. Изучено влияние биологических факторов у доноров на активность полученного гонадотропина после осаждения от балластных белков; 6. Использование готового биопрепарата в трансплантации эмбрионов у овец увеличивает число доноров с суперовуляцией и обеспечивает повышение числа эмбрионов. Апробация практических результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: - на Международной научно-практической конференции «Современные проблемы формирования конкурентоспособных специалистов в условиях интеграции в мировое образовательное пространство» посвященной к 2010 летию независимости Республики Казахстан и 10-летию Шымкентского университета (Шымкент, Казахстан 2012); - II Европейской конференция по сельскому хозяйству «The First European Conference on Agriculture», (Вена, Австрия 2014); - X международной научно – практической конференции «Бъдещите изследвания-2014» (София, Болгария 2014); - Международной научно - практической конференции «Актуальные проблемы современной науки» (Уфа, Российская Федерация 2014); - Международной научно - практической конференции «Инновационная наука и современное общество», (Уфа, Российская Федерация 2014). Публикации. Основные научные результаты диссертации отражены в 15 научных работах, из них 4 в научных изданиях рекомендованных Комитетом по контролю в сфере образования и науки МОН РК, 2 статьи в научных изданиях входящих в международную базу данных Scopus, 6 работ в материалах международных конференций, в том числе 5 работ в материалах зарубежных конференций, 3 статьи входящих в базу данных РИНЦ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 154 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения и списка использованных источников, который составляет 200 наименований. Работа содержит 34 таблицы, 20 рисунков и 11 приложений. 11 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Гонадотропные гормоны 1.1.1 Функции гонадотропных гормонов Впервые P. Smith, E.Engle в 1927 году, а также B. Zondek в 1930 году открыли соподчиненную взаимосвязь в эндокринной деятельности желез внутренней секреции. Работы B. Zondek и Р. Smith положили начало исследованиям, которые убедительно доказали, что передняя доля гипофиза вырабатывает ряд тропных гормонов, являющиеся веществами белкового происхождения с большим молекулярным весом, оказывающие стимулирующее действие на половую систему. Таким образом, в самом начале разработок важнейших разделов эндокринологии найдено такое важное звено регуляции полового цикла, как гонадотропные гормоны гипофиза [22]. В начале 20-х годов прошлого века B.Aschner, G.Kashing (цит. по Тренделенбургу) описали, что при удалении гипофиза у животных, наблюдается прекращение половых циклов и угасание половой функции, атрофия яичников и полового аппарата [23]. Однако в исследованиях, проведенных в 1929 году H.Evans, M.Simpson а также [24] B.Zondek в 1938 году [25], P.Smith, E.Engle в 1927 году наоборот, обнаружено, что имплантация гипофиза оказывает стимулирующее действие на половую систему нормальных грызунов, и вызывание преждевременного полового созревания: увеличение яичников, разрастание матки, течку, рост фолликулов, овуляцию с образованием желтых тел у инфантильных грызунов [22, с.8-9]. Рисунок 1 - Схема регуляторных взаимосвязей между яичником, гипофизом и средним мозгом [23]. 12 Гипофиз по своим размерам является довольно маленьким органом (средний вес гипофиза голубого песца 70 мг, соболя 17 мг, лисицы 50 мг, коровы 3,8 г, лошади 2,1 г, овцы 0,4 г, свиньи 0,3 г, взрослого человека 0,5-0,7 г), расположен он у основания головного мозга и вырабатывает много важных гормонов, в том числе и гонадотропные, выделяемые передней долей гипофиза (аденогипофизом). Гормоны задней доли (нейрогипофиз) окситоцин и антидиуретический гормон действуют очень быстро, в течение нескольких секунд вызывая заметный эффект, в свою очередь гормоны аденогипофиза действуют медленно: как правило, эффект появляется через несколько часов или дней. При введении в организм животных гормонов передней доли гипофиза изменения вызываются действием их на различные эндокринные железы. Например, эффект гонадотропных гормонов проявляется в увеличении активности половых желез [22, с.9-10]. Гипофиз, регулируя состояние эндокринных желез, «слеп» в отношении состояния внешней среды. Этот регулятор может получать сигналы только о состоянии внутренней среды организма. ЦНС получает информацию из органа чувств, этот сигнал передается в гипоталамус, который в свою очередь, посылает сигнал в гипофиз, а последний – периферические железы внутренней секреции [26]. Гонадотропная активность гипофиза первоначально приписывалась действию одного гормона, но по мере расширения знаний в этой области было установлено, что она обусловлена наличием двух гормонов [22, с.10]. Один из этих гормонов (фактор А) обеспечивал рост и созревание фолликулов, у нормальных инфантильных или у гипофизэктомированных самок и вызывал увеличение веса яичников в результате развития фолликулов и разрастания в них клеток гранулезы и получил название фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) [27-30]. Под действием эстрогенов, выделяющихся из стимулированных фолликулов, возникают вторичные реакции: увеличение матки и ее рогов, разрастание слизистой оболочки матки, типичные для течки изменения во влагалище. Овуляция происходят при совместном действии фолликулостимулирующего фактора с лютеинизирующим гормоном. У нормальных самцов он увеличивает семенники, стимулирует сперматогенез, рост гребня у петушков, простаты у грызунов [23, с.30]. Другой гормон (фактор Б) стимулировал овуляцию, выработку прогестерона в желтом теле и интерстициальной ткани яичников, но не увеличивал их вес [31]. Данный гонадотропин получил название лютеинизирующего гормона. У нормальных и гипофизэктомированных животных гормон вызывал овуляцию, при наличии зрелых фолликулов, развивающихся под действием фолликулостимулирующего гормона. У самцов гормон стимулировал развитие интерстициальной ткани, но не вызывал секрецию андрогена семенниками гипофизэктомированных петушков, не способствовал у них и росту гребня [23, с.30; 32-34]. 13 гипофиза, у самок млекопитающих есть два центра. Расположенный в передней По мнению J.Assenmacher, для регуляции гонадотропной функции лютеинизируюшего гормона [46]. свидетельствовало о нарушении механизма ритмичного выделения гипофизом дней наблюдали непрерывную течку у большинства грызунов, что гипоталамуса взрослых крыс стереотаксическим прибором, по истечении трех L.Desclin, J.Flametn-Durand, W.Gepte уничтожив переднюю долю стимулировал овуляторные процессы в гонадах кроликов [44,45]. секреторную функцию гипоталамуса. Он получил препараты из этой железы и Исследования, проведенные в 1961 году G.Harris подтверждают нейросистему [44]. гонадотропных гормонов, поддерживающих в деятельном состоянии гонадную передней доли гипофиза, возбуждая в базофильных клетках формирование гипоталамусе, поступает через портальную систему в кровь, после к клеткам гипоталамус с гипофизом, т.е. стимулирующее вещество, синтезируемое в доли гипофиза. G.Harris обратил внимание на наличие системы связывающей образуются в гипоталамусе нейросекреторными клетками достигают передней нервным и гуморальным путем [41-43]. Нейрогуморальные агенты, которые осуществляющим свое регуляторное действие на гипофиз одновременно 1930 году дают основание что гипоталамус - особое нейрокринноe образование, Данные о портальной системе гипофиза открытые G.T.Popa, U.Fielding в [40]. фолликулов, в наибольших дозах образование ложных и истинных желтых тел гипофизэктомированных морских свинок в наименьших дозах вызывала рост отмечено что, инъекция лютеинизирующего гонадотропина у В последующих опытах ученых G. Aron, M. Aron, X. Maresco в 1959 году обнаружил увеличение яичников и образование желтых тел [39]. гипофиза. Проведя имплантацию гипофиза у кастрированных самцов, он интерстициальных клеток яичников, атрофированных в результате удаления фолликулов яичника, а лютеинизирующий гормон – нормализацию (хирургическое удаление или разрушение гипофиза) молодых крыс увеличение фолликулостимулирующий гормон вызывает у гипофизэктомированных гипофизарных гонадотропинов L. Desclin установил, что При проведении опытов по изучению физиологической роли разных получил название лютеотропного (ЛТГ) гормона или пролактин [36-38]. поддерживал функции желтого тела в некоторых видах животных. Этот гормон передней доли гипофиза, который стимулировал процессы лактации и ритмической половой циклики, необходимо присутствие третьего гормона самостоятельная железа, вырабатывающая прогестерон, важный для исследований [35]. Однако, для того, чтобы желтое тело функционировало как собой разной антигенностью, что наглядно доказано рядом иммунологических субъединиц, но являются различными веществами, отличающимися между и Оба гормона постоянно сопутствуют, взаимно дополняют и усиливают действия друг-друга, относятся к гликопротеидам, состоящими 14 части гипоталамуса, контролирует секрецию ФСГ гормона, его функция зависит от уровня гонадальных гормонов. Второй расположен в вентральном отделе передней области и обуславливает выделение ЛГ гормона при овуляции. Таким образом, регуляция гипоталамусом гонадотропной функции гипофиза осуществляется нейро-секреторным путем [22, с.11]. По определению С. Генеса, А. Тонких тесные функциональные взаимосвязи между гипофизом и гипоталамусом объединяют их в единую гипоталамо-гипофизарную систему, которая является одним из важных звеньев нейро-гуморальной регуляции [47]. В исследованиях проведенных C. Barraclough, R.Gorski в 1961 году, B.Flerko в 1963 году показано, что способность гипоталамуса стимулировать выделение гонадотропинов, зависит от циклических изменений уровня половых стероидов [48]. По М.М. Завадовскому повышенная функция гипофиза не только активирует деятельность яичника, но и возбуждает обратную реакцию, т.е. вызывает действие яичника на гипофиз, исходя из этого он сформулировал принцип «плюс-минус взаимодействия» который в настоящее время широко известен как механизм обратных связей (feedback mechanism) [49,50], когда гонадотропные гормоны, оказывая влияние на половую деятельность, получают обратную реакцию, т.е. деятельность половых желез влияет на образование гонадотропных гормонов [51,52]. Анализируя многочисленные факты и исследования прошлого столетия, можно сделать вывод, что половые процессы, происходящие в организме животных, являются следствием сложных взаимодействий всей нервногуморальной системы в организме животных, а не результатом не одностороннего гормонального влияния со стороны гипофиза. 1.1.2 Гонадотропин сыворотки жеребых кобыл В 1912 году немецкий ученый W. Schauder в своих работах описал существование необычных структур в оболочке матки беременных кобыл. Это первое известное описание об эндометриальных чашках, которые составляют круг из поднятых, подобных язве выпуклостей в рогах матки кобыл в период ранней жеребости. Каждая из этих выпуклостей была заполнена желтой экзокринной секрецией, которая, могла быть важным компонентом эмбрионального развития (рисунок 2,3). Спустя 15 лет профессор J.C. Ewart при наблюдениях, установил, что, беловатая полоса почти в четверть дюйма, по ширине состоящая из многочисленных тонких сгибов отделенными друг от друга глубокими бороздами, помогает фиксировать эмбрион к матке [53,54]. После оригинального описания W. Schauder эндометриальных чаш в 1930 году профессор Н.Colе и его коллеги из Дэвиса, Калифорния, установили удивительное открытие, что небольшие объемы сыворотки, выделенные от кобыл между 40 и 150 днями жеребости, стимулируют яичники и вызывают увеличение матки и рост фолликулов при введении сыворотки неполовозрелым крысам [55,56]. Посвятив 10 лет интенсивным экспериментальным работам 15 группа из Дэвиса установили, что в крови оплодотворенных кобыл содержатся высокие концентрации гонадотропных гормонов. Эти исследования показали, что гонадотропная активность в сыворотке крови возрастает между 37 и 41 днями после спаривания. Пик гонадотропной активности приходится на 60 и 75 дни жеребости, затем вновь наблюдался спад гормонов, пока полностью не исчезает между 120-150 днями жеребости [57-60]. Факторы, стимулирующие развитие эндометриальных чаш в течение длительного времени оставались не изученными. В 1972 году в своих исследованиях W.R.Allen описал возникновение структур эндометриальных чаш у кобыл и установил, что на концентрацию гонадотропина в сыворотке жеребых кобыл влияет генотип плода. Таким образом, концентрация гонадотропина в сыворотке кобылы несущей муленка очень низкая, и определяется в крови после 80-го дня жеребости. В свою очередь концентрация гонадотропина в сыворотке выше на 5-8 раз у ослицы жеребой лошаком, нежели осленком [61-65]. Как и свои предшественники O. Ginther установил, что источником гонадотропинов являются маточные структуры – эндометриальные чашки, которые являются производными от плода, образуются в несколько недель беременности, и иммунологическим образом уничтожаются спустя 2, 3 месяца. Эндометриальные чашки достигают своего максимального размера от 55го до 70-х дней жеребости, в это время они появляются на поверхности эндометрия в виде бледно, круглой или U-образной формы бляшек. Их размер и форма сильно варьируются, от 1 см до 10 см в длину (рисунок 2). а) в начале жеребости б) на 43-й день жеребости Рисунок 2 - Эндометриальные чаши [53]. В своей статье «Современные методы диагностики беременности кобыл», Л.Лебедева и Г.Дюльгер также описывают, что гонадотропин сыворотки жеребых кобыл производится специфическими образованиями – эндометриальными чашами, которые вырабатываются в матке кобылы примерно к 25 дню жеребости. Вырабатывая гонадотропные гормоны, эндометриальные чаши обеспечивают поддержку жеребости через стимуляцию развития вторичной и третичной волн фолликулов и их последующую 16 овуляцию в яичниках кобылы. Такой механизм обеспечивает поддержание жеребости до полного формирования плаценты (примерно 150 дней), способной вырабатывать прогестины в достаточном количестве на местном уровне. Эндометральные чаши имеют свой «жизненный цикл». Они продолжают увеличиваться в размере и наращивать гонадотропную активность примерно до 70-го дня, после чего начинается их дегенерация вплоть до полного отторжения [66]. Несколько интересных наблюдений относительно эндометриальных чашек были получены при межвидовых скрещиваниях у лошадей. У ослиц, жеребых лошаком, развиваются чашки гораздо большего размера и достигаются более высокие концентрации ГСЖК, чем у ослиц, несущих плод осленка Количество рецепторов в лютеальных клетках к ГСЖК, обращают внимание на то, что число рецепторов уменьшается с увеличением срока беременности и максимально в период ранней беременности, что совпадает с пиком концентрации ГСЖК [15, с.300; 67,68]. Таким образом, гонадотропин продуцируется маточными структурами, известными под названием эндометральные чаши, которые образуются вокруг развивающейся плодной сумки. Эти ограниченные участки децидуальной ткани имеются только у беременных животных; они наиболее развиты до 70 дней жеребости и затем быстро дегенерируют. Генетический аспект возникновения этих структур у кобыл и установленного влияние генотипа плода на концентрацию гонадотропина в сыворотке крови. Так, у кобылы, жеребой муленком она очень низкая и не определяется в крови примерно до 80-го дня после результативного оплодотворения. Большинство из этих беременностей прерывается между 80 и 90 днями. У ослицы, жеребой лошаком, концентрация его, наоборот, в 6-8 раз выше, чем при ее жеребости осленком. И вообще во время жеребости уровень гонадотропина СЖК у ослицы составляет лишь 12 % такового у кобыл. Отмечается также, что плоды мулов и лошаков продуцирует гонадотропин в такой форме, в которой соотношение свойств фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов соответствует таковому у плодов жеребенка и осленка. У гонадотропина полученного от ослиц, в основном появляются ЛГ - свойства, без ФСГ – активности. Гибриды между лошадью и ослом тоже проявляют высокую ЛГ – активность [15, с.301; 67]. По мнению Ю.Д. Клинского, максимальный пик гонадотропинов у жеребых кобыл приходится на 60-й день жеребости и составляет 101-143 ИЕ/мл, у ослицы жеребой осленком – 52-53 ИЕ/мл, у кобылы жеребой муленком на 49–й день жеребости – 17-22 ИЕ/мл, у ослицы жеребой лошаком – 203 ИЕ/мл. Таким образом, в качестве продуцента гонадотропинов ослица жеребая лошаком, предпочтительнее, чем кобыла жеребая муленком [69]. В заключение, первые источники о содержании гонадотропного гормона в крови кобыл с 40 по 130 дни жеребости в зависимости от породы, возраста и условий содержания, подтверждены исследованиями рядом ученых, и установлено, что вскоре после жеребости кобыл, в сыворотке их крови 17 наблюдается накопление высоких концентраций гонадотропных гормонов – гонадотропинов. Особенности накопления гонадотропной активности в сыворотках крови кобыл породы «джабе» в литературных данных отсутствуют. В связи с этим, необходимо проводить дальнейшие исследования для выявления гонадотропной активности в крови кобыл казахских пород используемых для получения высокоактивного сырья в больших объемах, для ускоренного воспроизводства сельскохозяйственных животных. 1.1.3 Физико-химические свойства гонадотропных гормонов Высокая ступень развития в использовании гонадотропных гормонов, наступила тогда, когда B. Zondek и S.Ascheim открыли, что не только гипофиз обладает высокой активностью, но и моча беременных женщин (МБЖ). В их исследованиях из мочи беременных женщин в период с первого по третий месяц было выделено активное вещество – пролан [23, с.29]. В 1943 году G. Wislosky, H. Bennet установили, что данный гормон вырабатывается в клетках трофобласта в базальной пластине плаценты [70]. Таким образом, выделяясь из клеток, покрывающими ворсинки хориона он образуется в плаценте, поэтому, его назвали хорионическим гонадотропином (ХГЧ). Гормон содержит минимальное количество фолликостимулирующего гормона и обладает действием лютеинизирующего [71]. Исследования G.Gey, G.Seeger, J.Helman проведенные в 1938 году подтвердили образование хорионического гонадотропина в тканях плаценты. По исследованию B. Zondek его молекулярный вес равен 5000, но по данным H. Li его молекулярный вес равен 10000 [22, с.10-11]. Позднее в своих исследованиях C.J.Morris указал, что молекулярный вес хорионического гонадотропина равен 25000, углеводы - 22%, лизин - 5,1%, гистидин - 2,8%, аргинин - 6,2%, аспарагин - 10,3%, треонин - 7,6%, серин - 8,6%, глутамин 10,5%, пролин - 9,6%, глицин - 9,1%, аланин - 7,7%, валин - 7,0%, метионин 1,5%, изолейцин - 2,8%, тирозин - 2,0%, фенилаланин - 3,0% [72]. Малые размеры молекул хорионического гонадотропина легко проходят через почечный барьер и выпадают в мочу. Таковы различия в молекулярном весе аналогичных веществ, полученных от разных исследователей, что объясняется высокой лабильностью структуры белковой молекулы и видовыми особенностями синтеза гормонов [23, с.29]. В отличие от хорионического гонадотропина, гонадотропин сыворотки жеребых кобыл образуется в гипофизе. Как было указано выше данный гормон был обнаружен Н.Colе и G.Hart в 1930 году между 45 и 120 днями жеребости в сыворотке жеребых кобыл. Уровень содержания ГСЖК в сыворотке жеребых кобыл превышает в 200 раз, чем в сыворотках крови других животных. Полученные данные ученных, послужили поводом для более детального изучения ГСЖК, его действия на половые функции животных с целью использования его у сельскохозяйственных животных [23, с.273; 73]. Молекулы ГСЖК не проходят через почечный фильтр и не поступают в мочу, так как имеют значительный размер, гормон выделяется только из крови. 18 Как и хорионический гонадотропин, гонадотропин сыворотки жеребых кобыл имеет в составе углеводы и является гликопротеидами. Его углеводная часть составляет 45% и состоит из гексоз, гексозаминов, фруктозы и сиаловой кислоты. В препарате содержится 50% наполнителя – лактозы, 20-25% белка, остальное – углеводы и соли [74]. В своих исследованиях H. Lundgren, S. Gurin, C. Bachman и D.Wilson отметили, что молекулярный вес гонадотропина равен 60000-80000 и содержит до 25% углеводов. В 1940 году H. Li, Simpson I., Evans H., проведя исследования, установили, что молекулярный вес гонадотропина равен 80000, содержание азота - 10,6%, серы - 0,85%, аминоазота - 0,46%, галактозы - 17,6%, гексозамина - 8,4%, тирозина -3,54%, лизина - 8,8%, гистидина - 3,8%, аргинина - 2,1% [75]. Позднее в 1958 и 1961 годах проведенные исследования Leganet-Demare, I.Clauser, M. Lusticz устанавливают молекулярный вес гонадотропина равный 28000 [76,77]. По исследованиям, проведенным в М.В.Меркуловой молекулярный вес сывороточного гонадотропина полученного методом гель-фильтрации равен 58000 дальтон, изоэлектрическая точка равнялось 2,0 - 2,2, что указывает на сильнокислый характер сывороточного гонадотропина жеребых кобыл [78]. Также в исследованиях М.В. Меркуловой был определен аминокислотный состав гонадотропного гормона СЖК: лизина - 29,8; гистидина - 2,4; аргинина 32,4; аспарагиновой кислоты - 23,6; треонина - 45,3; серина - 42,6; глутаминовой кислоты - 44,8; пролина - 68,5; фенилаланина - 22,1; глицина 27,3; аланина - 38,8; цистина - 41,1; валина - 24,5; метионина - 9,72; изолейцина - 25,3; лейцина - 31,1; тирозина - 13,5 [78]. Следовательно, в гонадотропном гормоне СЖК имеется большое количество дикарбоновых аминокислот, а также цистина, треонина и серина. Особенностью аминокислотного состава гонадотропина сыворотки крови жеребых кобыл является высокое содержание пролина по отношению к известным сывороточным белкам. Автором также показаны общее содержание углеводов в ГСЖК, они колеблются от 41,5% до 46,6%. Важно отметить низкое содержание фукозы 0,6%-0,8% по сравнению с известными гликопротеидными гормонами при высоком содержании сиаловой кислоты 10,8%-14,9%. Сочетание больших концентраций кислых дикарбоновых аминокислот и сиаловых кислот, по-видимому, объясняет низкую изозлектрическую точку гормона 1,8-2,2 [78, с. 18-19]. Анализируя многочисленные литературные данные можно придти к выводу, что молекулярный вес сывороточного гонадотропина зависит от степени его очищения. Биологические свойства СЖК имеют различия от хорионического гонадотропина и гипофизарных гормонов. Препараты СЖК изготовленные от различных кобыл, имели разную гормональную активность. В исследованиях проведенных А.И. Лопыриным, Б.М. Завадовским установлено, что инъекция 19 СЖК полученная от различных жеребых кобыл не всегда вызывала полиовуляцию у овец [79]. А.И. Лопыриным и Н.В. Логиновой установлено, что биологические свойства СЖК зависят от многих факторов. При введении овцам моносывороток, полученных от разных кобыл, в их яичниках наблюдалась сильная гиперемия и образование фолликулярных гематом. В данных сыворотках преобладал лютеинизирующий фактор. Многие ученные сошлись во мнении, что гонадотропные гормоны, полученные из сыворотки жеребых кобыл обладают только фолликулостимулирующим действием [80,81], но в исследованиях проведенных H. Evans, R. Penchard, M.Simpson показано, что они обладают и лютеинизирующим действием [82]. Физиологически разные действия этих гормонов подтверждаются многочисленными исследованиями. Проведенные в 1958 году опыты L. Desclen доказывают секрецию гипофизом двух гонадотропных гормонов. У гипозэктомированных крыс увеличение фолликулов наблюдалось при введении фолликулостимулирующего гормона, введение лютеинизирующего гормона вызывало нормализацию интерстициальных клеток яичников, атрофированных в результате эксцизии гипофиза, однако совместное введение двух гормонов вызывало овуляцию и образование желтых тел [46]. Эти два гормона являются различными веществами и отличаются от другдруга разной антигенностью. По химическому составу фоликостимулирующий и лютеинизирующий гормоны являются веществами белковой природы типа глюкопротеидов со сложной молекулярной структурой. По мнению J.Botella, G.Duran, M.Noqales различие гонадотропинов соответственно по количеству глюкопротеидов. По результатам исследователей В.Е.Chon, C.H.Li, M.E.Simpson, H.M.Evans выделенный из гипофиза свиньи молекулярный вес лютеинизирующего гормона равен 100 000, а из гипофиза овцы – 40000, изоэлектрическая точка его – в пределах рН 4,6. Молекулярный вес фолликулостимулирующего гормона от 37000 до 70000, изоэлектрическая точка при рН 4,5. В 1953 году S.Stelman в своих работах описывает химический состав ФСГ/ЛГ гормонов из овечьего гипофиза. Так молекулярный вес ФСГ гормона равен 65000, изоэлектрическая точка выявляется при рН 4,5, содержание азота – 15%, углеводов – 1,2%. Они отличаются высоким содержанием углеводов, составляющих 10 – 13%, из которых на долю моноз приходится до 4,5, гексозамин – до 5,9 %. Эти гормоны характерны тем, что выделяются из гипофиза на протяжении всей жизни животного, а интенсивность выделения их зависит от физиологического состояния, в частности от нервно-гуморального равновесия индивидуума [22, с.10; 83]. Анализируя многочисленные факты и исследования о молекулярных значениях гонадотропных гормонов, можно прийти к выводу, что они имеют 20 небольшие различия, которые объясняются способами очистки и условиями метаболизма. 1.1.4 Применение гонадотропных гормонов в воспроизводстве сельскохозяйственных животных Важнейшим достижением зоотехнической и биологической наук является открытие академиком М.М. Завадовским и докторами биологических наук А.Д.Падучевой и А.И.Лопыриным метода гормонального стимулирования путем использования гормонального препарата СЖК (эликсир многоплодия), который применяется на протяжении многих лет для повышения многоплодия животных и получению от матки не одного, а двух и более животных. [84]. С помощью данного метода можно управлять процессами размножения: регламентировать продолжительность сервис-периода, цикличность, синхронность прихода маток в охоту, сокращать перегулы и получать от каждой матки больше приплода [23, с.5]. Потенциальные возможности плодовитости у сельскохозяйственных животных довольно высокие, и их необходимо полностью реализовывать. Сельскохозяйственных животных можно подразделить на две категории: крупный рогатый скот, лошади, верблюды и маралы относятся к однополым животным, свиньи и кролики в свою очередь к многоплодным. Овцы занимают промежуточное положение. Многочисленные исследования показали, что животные обладают высокой потенциальной многоплодностью, которую стимулирует СЖК. Наиболее эффективным путем интенсификации воспроизводства сельскохозяйственных животных является использование гонадотропных гормонов сыворотки крови жеребых кобыл (СЖК) и гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) стимулирующих функцию половых желез, одновременное развитие в яичниках животных дополнительных фолликулов и выравнивание стадий полового цикла при некоторых формах бесплодия [8587]. У сельскохозяйственных животных СЖК, ГСЖК применяют для индукции суперовуляции и синхронизации охоты. СЖК вызывает наиболее эффективное многоплодие, не препятствует оплодотворению, не увеличивает перегулы и яловость, в отличие от пролана и МБЖ [88]. Разработанный в 1926 - 1938 гг, академиком М.М. Завадовским, гормональный метод повышения плодовитости сельскохозяйственных животных, основан на том, что при введении гонадотропного гормона содержащегося в СЖК в организм животных за 2-3 дня до наступления естественной течки или охоты, усиливается деятельность функции половых желез и наступает множественная овуляция [89]. В последующем гормональный метод повышения плодовитости у сельскохозяйственных животных широко внедрен в практику животноводства как метод борьбы с яловостью и получения как можно большего количества двоен, в особенности у многоплодных животных. 21 На сегодняшний день установлено, что для применения гормональных препаратов СЖК, ГСЖК в животноводстве, необходимо определить их гормональную активность, оптимальные сроки изготовления и соотношение ФСГ/ЛГ гормонов. В наставлении по применению препарата СЖК (прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость светло-желтого иногда с красноватым оттенком цвета) для повышения плодовитости каракульских овец отмечается, что сыворотка крови жеребых кобыл (СЖК), взятая в период от 45 до 90 дней жеребости, содержит гонадотропные гормоны (ФСГ и ЛГ), стимулирующие рост, созревание в яичниках фолликулов и овуляцию [90]. В 1946 г в исследованиях проведенных Б.М. Завадовским показано, что в сыворотке крови полученных от различных кобыл – продуцентов соотношение фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов в среднем равно 10:1, но варьируется в пределах от 40:1 до 1:1 [91]. СЖК с низким соотношением фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов обладает высокой гормональной активностью. Сыворотка может не стимулировать многоплодие и оказывать такое же действие, как хорионический гонадотропин, вызывая одновременно значительное увеличение количества перегулявших и прояловевших маток. Хорионический гонадотропин, обладая лютеинизирующим действием, способствует быстрой овуляции и лютеинизации лопнувших фолликуллов, чем и препятствует созреванию новых фолликулов и тормозит проявление охоты [23,с.27]. По мнению D.R.Lamond соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в сыворотке жеребых кобыл равно 5:1 [92], однако по мнению H.Schmidt-Elmendorff, J.A.Loraine данное соотношение равно 2:1 [93]. В исследованиях Ю.Д.Клинского изучившего 113 сывороток, полученных от кобыл в различные периоды жеребости, показано, что соотношение ФСГ/ЛГ гормонов связаны со сроками жеребости кобыл, в начальном сроке циркуляции гонадотропина в сыворотке, соотношение равнялось в среднем – 3,42:1 – 3,68:1, т.е. повышалось содержание лютеинизирующего гормона. После 80-го дня жеребости соотношение ФСГ/ЛГ гормонов повысилось до 6,64:1, т.е. содержание лютеинизирующего гормона в СЖК пошло на спад [94]. Так, в исследованиях проведенных Н. Алибаевым, Г. Абай выявлены оптимальные дни жеребости кобыл–доноров для получения препарата СЖК с высокой гормональной активностью и оптимальным соотношением ФСГ/ЛГ гормонов. При этом, оптимальным днем для взятия крови от 3-х, 5-ти летних кобыл-доноров считается 65-80 дни жеребости. Для доноров 6-8 лет лучшим сроком считается 60-75 дни жеребости и для старшего возраста 9 и 10 лет от 55го до 65-го дня жеребости, а оптимальным соотношением ФСГ/ЛГ гормонов для биопрепаратов СЖК, ГСЖК считается от 3/1 до 4/1 [95,96]. Одним из важных звеньев полового цикла является охота, без охоты не проявляется оплодотворение и вызванная овуляция теряет смысл. Тем самым в любую стадию полового цикла при введении гонадотропных гормонов может быть вызвана овуляция, но оплодотворения и развития эмбриона не наступает. 22 Поэтому на первых этапах разработки гормонального метода крайне важны исследования, в которых предусматривались бы приемы введения гонадотропинов во время естественной охоты или накануне ее наступления. Такая необходимость продиктована тем, что разрыв увеличенного числа фолликулов в результате действия гормонов собственного гипофиза и экзогенного стимула должен происходить в тех физиологически оптимальных условиях, которые обеспечивают оплодотворение при обычном протекании полового процесса [22, с.25]. Широкое применение метод гормональной обработки нашел и в овцеводстве, в особенности в каракулеводстве, для вызывания охоты не в сезон размножения (в весенне-летний период) с целью получения дополнительной смушковой продукции, главным образом каракульчи, путем однократного подкожного введения СЖК в дозе 1200 м.е. (520 ИЕ) на одно животное [74]. V.Warbritton и F.McKenzie в 1937 году на основании цитологических исследований определили, что для течки и овуляции у овец необходимо значительное преобладание фолликулостимулирующего гормона над лютеинизирующим гормоном [97]. В тот же период X.Fevold, F.Hisaw, K.Greep подтвердили преобладание ФСГ над ЛГ на крысах. И.Ю.Бабаев в своих работах, показал, что 59,7% овцематок эдильбаевской породы оказались многоплодными, при этом их предварительно обработали препаратом СЖК из расчета 26 МЕ на 1 кг живой массы, а овцематки, обработанные СЖК в дозе 1300 м.е. всего 28,1% на одну голову [98]. Позднее проведя серии опытов по изучению влияния сывороток жеребых кобыл с различными соотношениями лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормонов И.Ю.Бабаев установил, что СЖК с соотношением 1:2,5 обуславливает более интенсивные овуляторные процессы, чем 1:8,0 [98,99]. В исследованиях, проведенных Б.Х. Аббасовым, А.Г. Симоновой показано, что среди эдильбаевских овцематок, обработанных СЖК с соотношением ЛГ:ФСГ 1:2,5 и при однократной инъекции 100 мг капроната оксипрогестерона, многоплодными оказались 52,4%, а с соотношением ЛГ:ФСГ 1:8,0 многоплодными оказались 47,6% [100]. В зависимости от породы овец при использовании дозы от 600 и 800 м.е. наблюдается повышение многоплодия, наилучшие результаты установлены в дозах от 1200-1300 м.е. Дальнейшее увеличение дозы препарата до 1500-1600 м.е. приводит к закономерному возрастанию многоплодия за счет увеличения двоен-троен и сокращения одинцов, так и за счет заметного возрастания менее желательных (сверхмногоплодных) многоплодных ягнят [90]. Для стимуляции половой охоты и лечения гипофункции яичников у коров, вводят СЖК с активностью не менее 40 ИЕ однократно внутримышечно в область бедра, соответственно дозах 500-600 ИЕ 900-1000 ИЕ на животное. В случае отсутствия проявления четко выраженной половой охоты или неплодотворного осеменения, препарат следует применять повторно в тех же 23 дозах через 21-23 сутки после предварительного гинекологического обследования животных [90]. Гормональные препараты СЖК, ГСЖК также применяются для стимуляции размножения коз. По мнению М.М. Завадовского инъекцию СЖК необходимо вводить на 17-19-й день эстрального цикла в дозе 2000-2500 м.е. Однако А.И. Жандеркин указывает на 16-17-й день цикла в дозе 1200-1600 м.е. Данная обработка позволяет, получить 141-145% козлят против 114% в контроле [23, с.266; 101]. Применяют гормональные препараты и для стимуляции половой функции и синхронизации охоты у свиней [23, с.267]. С целью стимуляции половой охоты и повышения оплодотворяемости основных свиноматок, при промышленной технологии их содержания, СЖК вводят им внутримышечно в дозе 1000 ИЕ на животное через 24-48 ч после отъема поросят [90]. При комплексном применения гонадотропинов (ГСЖК+ХГ) и осеменении свиноматок в контролируемое время лучшие результаты получены при введении СЖК через 24 ч. после отъема поросят и инъекции ХГ через 56 ч. после СЖК (таблица - опытная группа 2, при осеменении маток через 21 и 40 ч. после ХГ). Оплодотворяемость и многоплодие по этой группе соответственно составили 90,0% и 10,6 поросенка на опорос [102]. Для стимуляции половой охоты и повышения плодовитости у песцов и норок в период года, животным, не пришедших в охоту, вводят подкожно с внутренней стороны бедра СЖК в дозе 50-60 ИЕ на животное [23, с.266]. Также гормональные препараты СЖК, ГСЖК применяют в трансплантации эмбрионов у сельскохозяйственных животных, для повышения индукции суперовуляции, сохранности существующего поголовья, ускоренного воспроизводства ценных генотипов а также для выведения новых высокопродуктивных, устойчивых к стрессовым факторам сельскохозяйственных животных [18, c.7]. Таким образом, начиная c первых исследований Б.М. Завадовского и по сегодняшний день, в практике стимуляции и синхронизации охоты у овец широко используются очищенные от балластных белков гонадотропные препараты СЖК, ГСЖК. Реакции яичников на гонадотропные гормоны у сельскохозяйственных животных имеют большую изменчивость, они зависят от породы и происхождения, живой массы, стадии экстремального цикла, времени введения дозы препарата и возраста животного, а также от соотношения ФСГ/ЛГ гормонов и активности вводимого гормонального препарата. 1.1.5 Способы диагностики жеребости и гонадотропной активности СЖК В настоящее время в целях приготовления биопрепаратов на основе гонадотропина сыворотки жеребых кобыл используются различные методы гормональной диагностики определения ранней жеребости у кобыл. Наиболее известными и часто применяемыми методами, считаются постановка биопробы на разных лабораторных животных[83]. 24 Одним из распространенных методов является проба на половозрелых самцах озерных лягушек. Самцам озерных лягушек длиной 10-17 см подкожно вводят по 2 мл свежей неконцентрированной сыворотки крови жеребой кобылы, в спинной лимфатический мешок. Перед постановкой реакций проверяют, в их моче наличие спермиев. Для этого лягушку обертывают влажной марлей, в клоаку на глубину 0,5 см вводят пастеровскую пипетку и берут каплю мочи. Далее наносят на предметное стекло и накрывают покровным. После чего их помещают в стеклянную посуду, содержат без воды и через 2-4 часа после введения препарата берут мочу и исследуют под микроскопом. Гонадотропин крови жеребых кобыл вызывает появление спермиев в моче самцов лягушек. Реакцию считают положительной, при наличии спермиев у двух из трех самцов, отрицательной, если спермиев не обнаружено, сомнительной при наличии спермиев у одного из трех самцов [83, с 21; 101, с 29]. Диагностику жеребости кобыл также можно определить на петушках в возрасте 30-70 дней, весом 300-500г, с хорошо развитыми листовидными гребешками. Перед постановкой реакции у петушков измеряют высоту гребешка и штангенциркулем длину. Длину измеряют от начала восковицы ноздрей и до наиболее откинутого назад гребня, высоту от основания над глазом до вершины наиболее высокого зубца [83, с 22; 101, с 30]. Уже на следующий день, после введения петушкам 2-5 мл сыворотки в подкрыльцовую впадину, могут быть заметны рост и покраснение гребешка. Жеребость кобылы определяется после контрольных измерений длины и высоты гребешка на 4-5 день после начала опыта. Увеличение длины и высоты гребешка на 6 мм, показывает жеребость кобылы. Его увеличение зависит от гормональной активности исследуемой сыворотки [101, с 30]. Для выявления гонадотропной активности СЖК и определения ранней жеребости кобыл, наиболее широко применяется мышино-маточный тест на неполовозрелых самок белых мышей в возрасте 21-25 дней, весом по 7-8 г. Для диагностики жеребости одной лошади необходимо 5 неполовозрелых самок. Пяти мышам подкожно инъецируют по 0,2 мл сыворотки. Через 76 часов их усыпляют в баночке с хлороформом, после чего вскрывают. Для сравнения вскрывают контрольных мышей. После определяют реакцию. При положительной реакции матка увеличивается в 3-4-7 раз [101, с 30]. Для определения ГСЖК в сыворотке наиболее широко применяется мышинно-маточный тест. Активность сыворотки крови жеребых кобыл измеряют в мышиных единицах. Мышиная единица - минимальное количество гонадотропного гормона, содержащегося в разведенном препарате, способное через 72 ч после подкожного введения вызвать не менее чем у 60% неполовозрелых (инфантильных) самок белых мышей в возрасте 20-28 дней, массой 7-8г трехкратное увеличение рогов матки и открытие влагалища [101, с 28]. Существуют две модификации теста, которые отличаются по количеству инъекций. При первом способе СЖК вводят однократно в количестве 0,2 мл 25 пяти неполовозрелым мышам. Во втором способе применяют 3-5 кратное применение СЖК. После приготовления различных разведений препарата и их введения, через 72 часа при первом способе и 100 часов во втором способе животных усыпляют и вскрывают, устанавливают реакцию. Для сравнения необходимо иметь контрольных мышей того же возраста и веса. Активность соответствует предполагаемому титру лишь в случаях явного увеличения матки. Положительная реакция у трех из пять мышей свидетельствует о гормональной активности препарата [101, с. 46]. Таким образом, для установления ранней жеребости кобыл и определения активности в сыворотках, возможно, использовать широко применяемые различные методы. 1.2 Трансплантация эмбрионов 1.2.1 Развитие метода трансплантации эмбрионов Отцом мировой трансплантации эмбрионов по праву считают профессора W. Heape. Проводя свои работы в Кембриджском университете, он впервые поставил успешный эксперимент на кроликах по изучению явления телегонии. Таким образом, из половых путей чистопородной крольчихи ангорской породы были извлечены два эмбриона на стадии 4-х клеточного деления, которые были успешно трансплантированы в яйцевод крольчих бельгийской породы. В результате проведенных экспериментов спустя месяц он получил два крольчонка ангорской породы.[103, 104]. В 1897 году W. Heape повторил эксперименты по трансплантации зигот кроликов. Продолжение исследований по пересадке ранних эмбрионов домашних животных в конце 40-х и начале 50-х годов начались и в России [105-114]. Большинство из этих экспериментов были проведены на кроликах, с целью подтверждения влияния их организма на наследственные качества потомства трансплантатов. В 1950 году профессор Кваснинцкий одним из первых получил поросяттрансплантатов. В тот же год во ВНИИ овцеводства и козоводства А.И. Лопыриным и Н.В. Логиновой были получены ягнята-трансплантаты [103; 115]. В начале 50-х годов исследования по пересадке ранних эмбрионов домашних животных усиленно проводились и за рубежом. Биологи B.L.Warwick, R.O. Berry, W.R.Hollacher одни из первых американских ученых, которые осуществили успешную трансплантацию зародышей овец и коз. Однако проведенные ими в период длительного времени межвидовые пересадки между овцами и козами не дали положительного эффекта [116]. По данным W.R. Allen, L.E. Rowson в декабре 1950 года E.L.Willet в США хирургическим путем получил первого в мире теленка-трансплантанта, в 1972 году в Англии был получен жеребенок-трансплантант [104, с.55]. Как в США так и в России хирургическим путем был получен первый теленок-трансплантант во Всесоюзном НИИ физиологии, биохимии и питания 26 сельскохозяйственных животных [117], также во Всесоюзном НИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных теленок-трансплантант был получен нехирургическим путем [118] и во Всесоюзном НИИ животноводства получен теленок-трансплантант из замороженного эмбриона [119]. Советскими учеными А.В. Квасницким , Н.А.Мартыненко, А.Г. Близниченко в 50-х годах были разработаны пересадки зародышей у свиней [102, с.65]. С 1965 года в Казахстане под руководством академика ВАСХНИЛ Ф.М. Мухамедгалиева были проведены работы по трансплантации эмбрионов овец [120, 121]. В период с 1964-го по 1966 год сотрудниками Алма-Атинского зооветеринарного института К.Д. Джанабековым, И.О. Бердонгаровой, Р.Б. Абильдиновым было получено пять ягнят-трансплантантов [122, 123]. С начала 1973 года вопросами трансплантации эмбрионов у овец начала заниматься созданная при Институте экспериментальной биологии АН Каз СССР лаборатория трансплантации эмбрионов [115, с. 14]. На сегодняшний день работы, проведенные Б. Даминовым, М. Тойшибековым позволили получить каракульских ягнят-трансплантатов [124]. Однако, в нашей Республике работы по трансплантации эмбрионов с учетом мирового опыта были начаты в последних годах. В настоящее время работы ведутся в западном Казахстане [18, с.5-7]. Сегодня как никогда уделяется важное внимание ускоренному воспроизводству сельскохозяйственных животных, сохранению существующего поголовья, регулированию процессов размножения и плодовитости высокоценных племенных животных, использованию генетических ресурсов животных для выведения новых высокопродуктивных, устойчивых к стрессовым факторам среды пород. Все это необходимо для повышения эффективности методов трансплантации эмбрионов у сельскохозяйственных животных. 1.2.2 Метод трансплантации эмбрионов в животноводстве Трансплантация эмбрионов – один из комплексных биотехнологических методов ускоренного размножения животных с высокой генетической ценностью. Одним из основных технологических процессов данного метода является оценка качества эмбрионов и их жизнеспособности [125]. С помощью данного метода, возможно, ускорить темпы генетического совершенствования племенных животных, создавать высокоценных животных с запрограммированными продуктивными признаками, генетически клонировать их, ускоренно получать рекордисток и целые стада с рекордными удоями, управлять онтогенезом [14,с. 2]. По мнению Л.К.Эрнста метод трансплантации эмбрионов позволяет эффективно использовать генетические ресурсы маточного поголовья. Технология трансплантации эмбрионов включает такие основные звенья как вызывание суперовуляции, искусственное осеменение донора, извлечение 27 эмбрионов, оценка их качества, кратковременное или длительное хранение и пересадка [126]. Многими учеными описано немало работ посвященных методу трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве, их мнении сошлись в том, что совершенствование метода приведут к большим практическим достижениям. В своих работах А.К. Голубеев, Л.К.Эрнст отмечают, что «в дальнейшем метод трансплантации эмбрионов будет значительно упрощен, а эффективность его существенно увеличена, что позволит перейти к его широкому применению примерно в том же масштабе, что и искусственное осеменение. Это откроет большие возможности практического применения новых способов размножения сельскохозяйственных животных» [127]. Академик НАН РК, профессор М.М. Тойшибеков уделяет немаловажную роль в животноводстве - овцеводству. Так же, как и другие отрасли животноводства, овцеводство имеет огромное народнохозяйственное значение и нуждается в реальных путях увеличения их численности и продуктивности, ускорении темпов воспроизводства стада, создании новых пород, которые соответствовали бы по уровню и характеру продуктивности современным требованием интенсификации отрасли [128,129]. Также как и Академик НАН РК, профессор М.М. Тойшибеков, академик НАН РК К. Елемесов утверждает, «состояние овцеводства последних лет характеризуется продолжающимся сокращением поголовья животных и объема производства продукции. В 2000 г. темпы спада несколько замедлились, и в настоящее время численность овец и коз во всех категориях хозяйств по республике составляет 10 млн. голов. В связи со сложившейся ситуацией на рынке считаем необходимым изменить приоритеты развития отрасли, уделяя больше внимания мясному овцеводству, сохранив при этом ценные генофондные стада тонкорунных, полутонкорунных и каракульских пород овец. Тем более что наша Республика обладает всеми природноклиматическими условиями, наличием обширного пастбищного пространства, навыками и традициями сельского населения республики и, наконец, наличие профессионально подготовленных кадров - объективные предпосылки в пользу развития овцеводства» [130]. Генетическая роль самки ограничивается небольшим числом потомков, потенциальные возможности ее генеративного аппарата реализуются в течение жизни далеко не полностью. Например, от одной овцы за период ее хозяйственного использования можно получить 7-8 потомков [131,132]. Однако овцы располагают огромными потенциальными возможностями многоплодия. В их яичниках имеются тысячи фолликулов, которые при соответствующих условиях могут развиваться и овулировать [104, с. 53]. В работах Е.П. Поликарповой и М.В. Невзгодиной отмечается, что в большое количество ооцитов содержится в яичниках новорожденных ягнят, в одном поле зрения микроскопа в яичниках новорожденных каракульских ярок 28 и прекосов число ооцитов варьировалось от 15,1 до 16,4, и от 22,5 до 23,1 у ярок дагестанской горной породы и советского мериноса [104, с. 53; 133]. Эффективность использования генетически ценных овец можно значительно повысить с помощью метода трансплантации эмбрионов. Сущность метода состоит в том, что при обработке высокоценных матокдоноров в биологически оптимальные дни полового цикла гонадотропными гормонами, созревает наибольшее число фолликулов, что способствует значительному увеличению получаемого от них потомства и ускоряет темпы размножения желательных генотипов [134, 135]. Как известно, ранние эмбрионы у овец определенное время находятся в половых путях в свободном состоянии, это позволяет извлечь эмбрионы от доноров и пересадить реципиентам [104, с.53]. По данным W.Green, L. Winters ранние эмбрионы у овец породы «шропшир», как и у каракульских овец находятся в половых путях в свободном состоянии в течение 10 суток, причем зона пеллюцида исчезает только на 8-е сутки развития [136, 137]. R.M.Moor, L.E. Rowson отмечают что, продолжительность доимплантационного периода у овец 12-13 дней. В своих работах они описали оценку качества 602 эмбрионов, полученных от 117 овцематок, в период с 5-го по 14-й день полового цикла и установили три стадии развития эмбрионов. После осеменения в течение 112-128 часов эмбрионы находились на стадии морула, далее от 128 до 228 часов на стадии бластоцисты, на 12-й и 14-й день полового цикла на фазе удлинения. По их данным, эмбрионы овец полученные из половых путей самок, в один и тот же период, находятся на разных стадиях развития [138]. Н.Н. Алибаевым, Г.Абай также оценены стадии развития 356 эмбрионов полученных от 50 овцематок каракульской породы. По результатам их исследований, число эмбрионов на ранних стадиях развития бластомеры 2-12 клеточные составили 3,5±1,5% и 3,7±1,2%; эмбрионы на стадии морулы ранние – 48,9±4,2% и 50,7±3,4; морулы поздние - 36,9±4,0% и 36,7±3,3%; эмбрионы на стадии бластоцисты - 10,6±2,6% и 8,8±1,9% [140]. Из 356 эмбрионов 21,3±3,4% составили хорошего качества - 55,3±4,2%, удовлетворенные качества - 17,7±3,2% и дегенерированные качества- 5,7±1,9% по традиционной технологии и при новом способе получения гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл доля эмбрионов отличного качества составила 30,2±3,1%, удовлетворительные качества – 8,8±1,9 и дегенерированных эмбрионов -2,3±1,0% [141]. Таким образом, метод трансплантации эмбрионов позволяет увеличить уровень воспроизводства высокоценных животных, приумножить существующие поголовья выдающихся животных а также сохранить генофонд исчезающих пород. 29 1.2.3 Суперовуляция у сельскохозяйственных животных В программе трансплантации эмбрионов первоочередным требованием является наличие надежных методов планового обеспечения качественными эмбрионами, пригодными для трансплантации, что обеспечивается гормональным вызыванием множественной овуляции [142]. Важным звеном в технологии трансплантации эмбрионов является суперовуляция животных. Самки млекопитающих рождаются с большим (несколько десятков и даже сотен тысяч) числом половых клеток. Большинство из них постепенно погибают в результате атрезии фолликулов. Только небольшое число примордиальных фолликулов переходят в антральные в процессе роста. Однако практически все растущие фолликулы реагирут на гонадотропную стимуляцию, которая приводит их к конечному созреванию. Обработка самок гонадотропинами в фолликулярной фазе полового цикла или в лютеиной фазе цикла в сочетании с индуцированием регрессии желтого тела простагландином Ф 2 (ПГФ 2 ) и его аналогами приводит к множественной овуляции или так называемой суперовуляции [126, с. 201; 143]. На суперовуляцию и выход качественных эмбрионов влияет используемые гормональные препараты и их схемы введения, сезон года, живая масса, качество кормления и т.д. [18, с.13-14]. В 60-х годах прошлого столетия особое внимание ученых было направлено на изучение вопросов оптимизации дозы и сроков инъекции нативной СЖК при групповом и фронтальном методах их применения [144-148]. Основной их целью исследований было получение оптимального количества овуляций, избегая при этом нежелательных последствий. Таким образом, после практического применения трансплантации эмбрионов для размножения сельскохозяйственных животных, одной из проблем в ее технологии стало гормональное вызывание множественной суперовуляции, что способствовало расширению интереса исследователей к данному вопросу [18, с. 14-15]. Для вызывания суперовуляции в методе трансплантации эмбрионов в основном применяют гонадотропные препараты как ФСГ, СЖК, ГСЖК и др. Наиболее экономически выгодным препаратом является сыворотка жеребых кобыл, которая обладает комплексной ФСГ и ЛГ активностью. Соотношение ФСГ и ЛГ в различных партиях различно, что усиливает вариабельность суперовуляции. Оптимальным же соотношением ФСГ и ЛГ считается 3:1 [18, с.16]. В отличие от СЖК препараты ФСГ вводят многократно, т.к. период полураспада очень короткий (около 5 ч). Общая доза ФСГ – 50 мг. Применение ФСГ с простагландинами имеет ряд преимуществ перед СЖК: увеличивается получение нормальных эмбрионов на донора, повышается оплодотворяемость яйцеклеток, не возникает кистозных изменений в яичниках и не индуцируется выработка антител. Недостаток ФСГ – необходимость многократных инъекций. [149]. 30 С помощью методов гормональной стимуляции, возможно, повысить потенциальные возможности плодовитости у овец. Однако существуют и показатели замедляющие эффективность суперовуляции, один из них непредсказуемость реакции яичников [150]. Это проявляется высокой изменчивостью числа овуляций в ответ на введение в равной мере дозы гонадотропина у овец, свойственным одной породе. Индивидуальная реактивность яичников овец может быть выявлением особенностей маток-доноров и обуславливаться влиянием породы. Тем самым, самки плодовитых пород с высокой овуляцией лучше отзываются на гормональную стимуляцию яичников. Установлено, что количественные и качественные показатели суперовуляторной реакции яичников зависят от дозы гонадотропинов. У овец нет безошибочно установленных норм используемых доз, поскольку доза препарата корректируется относительно вида, породы, [151]. Для вызывания суперовуляции у овец СЖК или ФСГ вводят в конце лютеиновой фазы полового цикла или в лютеиновую фазу цикла совместно с обработкой простагландином. СЖК вводят с расчетом от 20-и до 45 И.Е. на 1 кг массы животного. Проведя обработку СЖК, простагландин вводят между 4 и 13 днем полового цикла. Охота наблюдается в течении 2-4 дней после обработки простагландином. ФСГ вводят в течении двух дней по два раза в день в дозе 6,5-3,2 мг [126, с.202-203]. В исследованиях проведенных Б.Даминовым, Т.Салыкбаевым, М. Тойшибековым установлено, что для гормональной стимуляции суперовуляции эффективно использовать препарат ФСГ. По результатам их исследований получено больше яйцеклеток и зародышей на одного донора, в среднем 8,1 овуляций на донора, установлено, что овцематки-доноры на обработку одинаковой дозой и гонадотропина реагируют сугубо индивидуально[152]. В 1943 году E.Casida, R.K.Megr с целью вызывания суперовуляции у коров применили сыворотку жеребых кобыл (СЖК). Данная схема включала применение СЖК в комбинации с эстрадиолом, хорионическим гонадотропином и простагландинами группой витаминов [153]. Позднее исследования такого типа описаны в работах как зарубежных, так и отечественных исследователей [154, 155]. По результатам проведенных исследований, было показано что, на уровень полиовуляции у маток сельскохозяйственных животных, влияет доза введенных гормональных препаратов. R.P.Elsden, J.F.Hasler, G.E.Seidel применил два способа индукции полиовуляции у коров-доноров. В основе первого способа было внутримышечное введение на 10 день полового цикла СЖК в дозе1800 ИЕ, и на 12 день полового цикла 45 мг простагландина. Второй же способ заключался на введении многократной инъекции фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов в их соотношении 5:1, дважды в день, начиная с 10-го дня полового цикла, в дозе 5,5; 4,4; 3,3; 2,2 мг соответственно в 31 каждый последующий день. Простагландин вводится на 12-й день полового цикла в дозе 45 мг [156]. Для вызывания индукции полиовуляции у овец СЖК вводится в лютеальную фазу цикла в сочетании с обработкой простагландином или по окончании прогестероновой обработки из расчета 20-45 ИЕ на 1 кг массы животного. При такой схеме обработки полиовуляцией в исследованиях Quirke J.F., Hanrahala J.R. на гормональные препараты реагировало около 80% обработанных овец [157]. В исследованиях проведенных Н. Кансеитовой, У. Ахановой и Э.Кансеитовой для определения прихода в охоту казахско-курдючных овец было установлено что через сутки после применения ГСЖК, матки опытной группы начали приходить в охоту. Таким образом, у взрослых 3,5-5,5 летних маток реакция на введение ГСЖК одинаковая. Изучение плодовитости казахских курдючных овец в зависимости от их возраста и длительности охоты показало, что с длительностью охоты у маток связана их плодовитость. Так в среднем по всем 335 маткам при продолжительности охоты 24 часа плодовитость составила 108,8 %, при 72 часов – 242,8 %. Маток с 72 часовой охотой было мало – 7 голов. ГСЖК вводили в дозе 1300 м.е. [158]. В настоящее время используются усовершенствованные методы обработки животных прогестагенами, путем введения внутривлагалищных полиуретановых губок или силиконовых эластичных спиралей, пропитанных определенным количеством прогестерона или его синтетических аналогов. Обычно для этих целей используется флуорогестон ацетат или медроксипрогестерон ацетат [159]. Внутривлагалищные губки и спирали имеют определенное торговое название: «Chronogest», «Veramix», «Ovakron», «Syncrite», «CIDR-G» (Powell e.a., 1996: Romano, 1998; Wieldeus, 1999; Kausar e.a., 2009). Данные приспособления вводятся на период от 9 до 19 дней и применяются в комбинации с СЖК, которая вводится во время удаления приспособлений или за 48 часов до их удаления. Синхронизация эструса наступает у 90 % животных в течение 24-48 часов после удаления губок или спиралей [159, с.5]. Изучение эффективности применения различных дозировок СЖК (300; 450 и 600 ИЕ) при введении внутривлагалищных полиуретановых губок с 40 мг флуорогестон ацетата на 14 дней показало, что оплодотворяемость животных во всех группах составила 81,2-84,3 % по сравнению с 57,5 % в контрольной группе, где не вводили СЖК. Но многоплодие овец было выше в группах, где использовали СЖК в дозе 450 ИЕ (155%) и 600 ИЕ (177%), что подтверждает большую эффективность данных дозировок СЖК [159, с.6]. У коз препарат СЖК вводят из расчета на 1 кг массы тела животного 34-43 ИЕ СЖК, а ФСГ в дозе 16 мг в сочетании с простагландином или по окончании прогестероновой обработки [160]. В методе трансплантации эмбрионов у овец широко применяется гормональная обработка доноров гонадотропином СЖК в сочетании с 32 простагландином, в дозе 1000-1200 МЕ и 1200-1400 МЕ СЖК на 1 голову животного [15, с. 15-16]. Для обработки доноров овец К.Т.Касымов и др. использовали сывороточный гонадотропин (РФ) и Графоллон. Доза препарата составила 1600-1800 ИЕ на единицу животного, а графоллоном 250-300 ИЕ. Сывороточный гонадотропин стимулировал множественную овуляцию у 56-93% матокдоноров, при этом от 1 донора получено по 5,48 штук полноценных эмбрионов. Графоллон, повышая у овцематок степень полиовуляции, обеспечил по 6,14 – 7,33 эмбрионов на 1 донора [161]. Данные о том, что результативность использования гормональных препаратов зависит то сроков их введения подтверждается работами многих исследователей. В своих исследованиях P.Scanlon, J.Srenan, I.Gordon [162] при обработке коров гонадотропином за 4-7 дней до проявления ими полового возбуждения получили наибольшее число овуляций, у овец – за 4-5 дней [153, с.;163]. К.Джанабеков, проведя обработку овцематок казахской тонкорунной породы препаратом СЖК на 13-14 сутки полового цикла, получил по 6 овуляций в обоих яичниках [123, с 18.]. В своих работах Б.Даминов, Ш. Сартаев, М.М. Тойшибеков указали, что введение СЖК в дозе 1200-1450 ИЕ на 10-12-е сутки эстрального цикла является наилучшим для получения множественной овуляций у овец [164 166]. Исследования некоторых ученых направлены на оптимизацию обрабатываемой дозы СЖК на живую массу животного. По мнению А.-Ш.М. Амарбаева, наиболее физиологически оправданной дозой гормональной сыворотки, при средней отарной дозировке следует считать 1300 м.е. для мясосальных, 1200 м.е. для каракульских овец. Более целесообразными дозами на 1 кг живой массы следует считать 23-26 и 22-25 МЕ. [167]. Способ Н.Алибаева, О.Бекетауова и др. гормональной обработки доноров каракульских овец для трансплантации эмбрионов, основанный на оптимизации дозы СЖК на 1 кг живой массы донора 25-26 МЕ, увеличивает овуляцию в среднем на одного донора до 3,8 шт., реакцию суперовуляции – на 25,0% и позволяет получить на 16,1% больше нормальных жизнеспособных эмбрионов по сравнению с известным способом [168]. В трансплантации эмбрионов применение метода индукции суперовуляции приобретает совершенно другой оттенок, потому что отпадает необходимость вынашивания плодов собственными матерями [113, с. 12]. Для индукции суперовуляции каракульских овец Алибаев Н., Абай Г. применили комплексную технологию при получении препарата ГСЖК, которая позволила увеличить число овуляций на донора в 1,4 раза больше, долю овцематок - доноров с суперовуляцией на 20,0% и число эмбрионов на донора 1,5 раза [142, с. 123]. В своих исследованиях L.Averill получив и пересадив 30 эмбрионов от обработанных препаратом СЖК трех овцематок, получил 28 ягнят [169]. 33 Н. Сергеев пришел к выводу, что вызывание суперовуляции лучше всего начинать с 10-11 дня полового цикла. При этом уменьшается число дегенерированных эмбрионов и неполовозрелых яйцеклеток, повышается выход полноценных эмбрионов [139, с. 15]. В начале 80-х годов прошлого столетия с появлением гормонального препарата ФСГ многие исследователи занимающиеся методом трансплантации эмбрионов, начали отказываться от применения нативной СЖК и ГСЖК. Основывая это тем, что при использовании ФСГ проявляется наибольшая суперовуляция, чем при использовании гонадотропинов отечественного производства. По этой причине были проведены значительные сравнительные работы по изучению чувствительности яичников животных-доноров на введение отечественных и импортных гонадотропных препаратов при индукции суперовуляции. По мнению Е.А.Назарова и Н.И.Смыслова фоллитропин и СЖК по своему действию не производил должного эффекта, как типовой препарат ФСГ. При этом между качеством и приживляемостью эмбрионов в группах коров, обработанных ФСГ и фоллитропином, относительных различий не выявлено. Отмечено снижение на 8,0% приживляемости эмбрионов от коров, обработанных СЖК [170]. При индукции полиовуляции у ангорских коз D.T.Armstrong, A.P.Pfitznez, C.M.Warnes, R.F.Seamark заметили что, путем применения препарата ФСГ в дозе 18 мг наблюдается, гораздо большее количество числа овуляций, чем при инъекции СЖК в дозе 750-1000 МЕ [171]. Применение препарата СЖК у каракульских овец М.Тойшибековым, Б.Даминовым позволило выявить число овуляций у овцематок. В среднем число овуляций составило 7,4 при обработке препаратом СЖК и 12,7 при обработке препаратом ФСГ. От обработанных животных получено 6,1 (82,4%) зародышей и яйцеклеток при обработке с СЖК и 10,3 (81,1) при обработке с ФСГ [122, с. 13]. Проведя сравнительные действия препаратов СЖК (фоллигон) и ФСГ (ФСГ-п) на коровах черно-пестрой породы разного возраста и молочной продуктивности. Н.И.Сергеев, Н.И.Смыслов, А.О.Смирнов пришли к выводу, что препарат ФСГ (ФСГ-п) по сравнению с препаратом СЖК (фоллигон) при всех равных условиях имел ряд преимуществ, количество животных, реагировавших суперовуляцией, было увеличено в среднем на 10%, по оплодотворяемости яйцеклеток на 41,7%, выходу нормальных эмбрионов на 22,3%. Препарат СЖК (фоллигон) вводили на 10-12-й день эстрального цикла в дозе 2500 ИЕ, препарат ФСГ – по 50 мг по пятидневной схеме, начиная с восьмого дня цикла. Синхронизацию охоты проводили простагландином в дозе 500 мкг и инъецировали коровам, обработанным СЖК (фоллигон), через 48 часов после его введения, а обработанным ФСГ – на четвертый день [172]. Аналогичные данные зафиксированы и в других работах. С.В.Советкин, Е.А.Назаров, А.И.Долгохацкий и И.С.Прокофьева в своих исследованиях не обнаружили статистически достоверных различий по количеству полученных 34 от коров-доноров эмбрионов, пригодных для пересадки, а также дегенерированных эмбрионов, неоплодотворенных яйцеклеток в зависимости от испытуемых гонадотропных препаратов, т.е. импортным ФСГ и отечественным гонадотропным препаратом (ГСЖК) фоллигона [173]. В работах Б.В.Смолянинова отмечается, что препарат ФСГ менее доступен, чем ГСЖК, так как более дорогостоящее, тем более многократные инъекции ФСГ вызывают у животных беспокойство, в результате чего снижаются удои. Вместе с тем гормональный стресс при использовании ФСГ менее заметен, чем при введении однократных ударных доз ГСЖК [174]. В своих исследованиях Л.С. Малахова для изучения влияния различных экзогенных гонадотропинов на качественные показатели эмбрионов при множественной овуляции использовала гормональные препараты разных производителей. ФСГ-п (США), Фоллитропин (Литва), СЖК-фоллимаг (Россия). В результате исследования хорошие показатели были у овец обработанных препратами ФСГ-п и СЖК-фоллимаг. Так, при применении ФСГ-п полноценными и пригодными к пересадке оказались - 71,8% эмбрионов, а при применении фоллимага 71,4% полноценных эмбрионов. При применении препарата фоллитропин множественной овуляцией ответило только 60% обработанных животных. От них было получено 60% полноценных эмбрионов, что ниже, чем при применении ФСГ-п и препарата фоллимаг, на 11,8 и 11,4% [175] В экспериментах проведенных Б.Р.Даминовым, Т.Н. Салакбаевым, Б.Б. Тойшибековым показано, что при гормональной стимуляции суперовуляции препарат ФСГ проявил свои качества лучше, по сравнению с препаратом СЖК. При использовании ФСГ в среднем получено 8,1 овуляции на донора, при СЖК – 4,6 овуляций [176]. Бекетауовым О., Алибаевым Н. и Адилбековым Н. проведены исследования по совершенствованию методов гормональной стимуляции у овец препаратом СЖК, полученным на 60, 70, 80 дни жеребости кобыл. По окончании исследования своих работ, они установили, что для вызывания гормональной стимуляции у овец препаратом СЖК одним из главных значений является соотношение ФСГ/ЛГ гормонов [177]. Значительное ускорение селекционного процесса в каракулеводстве возможно достичь методом трансплантации эмбрионов. Так, Тойшибеков М. и Даминов Б. в своей работе по трансплантации эмбрионов каракульских овец получили 6,1 яйцеклеток и зародышей при обработке СЖК и 10,3 зародышей и эмбрионов при обработке ФСГ. Полученные эмбрионы персаживали реципиентам. Приживляемость составила 63% [178]. Таким образом, трансплантация эмбрионов это новый биотехнологический прием в селекции сельскохозяйственных животных, основной эффект которого состоит в увеличении количества потомков материнской линии. Важным этапом трансплантации эмбрионов является гормональное вызывание полиовуляции у доноров [18, с.17; 179-184]. 35 Для ускоренного развития животноводства возможно применение различных стимуляторов для повышения воспроизводительной функции сельскохозяйственных животных. Задача науки состоит в том, чтобы совершенствовать существующие технологии получения гормональных препаратов и эффективно применять их в воспроизводстве сельскохозяйственных животных, а также изыскивать новые высокоэффективные средства и разрабатывать методы их наиболее успешного использования. 36 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Объекты и материалы исследования 2.1.1 Отбор жеребых кобыл и овцематок доноров Объектом исследования служили кобылы-доноры породы «джабе» в количестве 16 голов, разного возраста от 3-х до 10-ти лет и в разные периоды жеребости от 40-го по 80-й день. Из отобранных животных сформированы донорские стада из 2-х групп, по 8 кобыл в каждой группе. Также отобраны овцематки каракульской породы в количестве 50 голов. Из отобранных овцематок сформированы 2 группы по 25 голов. Все овцематки были аналогичными по возрасту (2,5 летние). Исследуемые животные были отобраны в частных крестьянских хозяйствах: «Жайлау», который расположен в селе «Жуантобе» Сузакского района Южно-Казахстанской области, образованный в 1997г. и «Жанторе» расположенный на территории Южно-Казахстанской области вдоль Алматинской трассы. Материалом исследования служили: сыворотка жеребых кобыл (СЖК) и гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК), эмбрионы овцематокдоноров каракульской породы. Лабораторные исследования для определения гормональной диагностики жеребости кобыл на половозрелых самцах озерной лягушки, а также определение соотношения фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в препаратах сыворотки жеребых кобыл и гонадотропина сыворотки жеребых кобыл методом «ИФА-ФСГ/ЛГ», определение гонадотропной активности на неполовозрелых самках белых мышей проводились в лаборатории Юго-Западного научно-исследовательского института животноводства и растениеводства и в ЮКОФ РГП на ПХВ «Республиканская ветеринарная лаборатория». 2.1.2 Характеристика лошадей породы «джабе» и их содержание Лучшие представители лошадей центральных районов Казахстана известны под названием «джабе». Считается, что дальним прародителем является азиатская дикая лошадь. Возможно и влияние на тип таких пород, как монгольская, карабаирская, арабская и ахалтекинская. Лошади степного типа породы «джабе» являются одним из самых крупных типом казахской породы. Это невысокие лошади, ростом - около 145 см [185]. Для лошадей типа «джабе» характерна сравнительно грубая голова, с отлично развитой мускулатурой челюсти, широкая в лобной части. Уши малые, загривок от нормального до короткого. Шея умеренной длины, чаще низкого постава, но есть и среднего постава. Мускулистая холка, обычно низкая, прямая спина, широкая, поясница сильная. Грудная клетка достаточно глубокая и широкая, ребра округлые. Лопатка короткая, поставлена круто. Круп короткий, у части свислый, с хорошо развитой мускулатурой. Ноги передние крепкие, с плотным копытом, поставлены правильно, щетки короткие, густые. Лошади 37 типа «джабе» не отличаются высокой резвостью, но они выносливы в поездках на дальние расстояния. Они отличаются отличной приспособленностью к суровым местным зимам с сильными морозами и продолжительными буранами [186]. При пастбищном содержании кобылы типа «джабе» имеют вполне удовлетворительную молочность. Лошади типа «джабе» обладают способностью к быстрому нагулу на пастбище. Лучшие взрослые лошади этого типа после нагула при забое имеют выход мяса и сала в пределах 53—57%, а в некоторых случаях до 60%; вес туши — 230—250 кг, выход всей мясной продукции, включая сбой, — 260—280 кг. Масти разные: гнедая и темнорыжая, реже — саврасая, мышастая, серая и вороная [187]. В вышеуказанных хозяйствах кобылы круглый год содержатся на пастбище. В летнее время применяется свободное и спокойное движение животных на пастбище, которое способствует правильному развитию и укреплению всего организма, пастбищная трава, особенно молодая, отличается высоким содержанием питательных веществ и витаминов. Лишь в очень плохую ненастную погоду и при сильных морозах кобыл содержат в конюшнях, пастбищную траву заменяют сеном многолетних трав, сочными кормами. Научно-исследовательская работа проводилась согласно общей схеме исследования (рисунок 3). 38 Взятие крови и приготовление СЖК Определение гонадотропной активности образцов СЖК на неполовозрелых самках белых мышей Определение соотношения ФСГ/ЛГ (ИФА) Совершенствование биотехнологических методов получения гонадотропных гормонов Осаждения гонадотропина Определение активности и соотношение ФСГ/ЛГ Получение сухого ГСЖК Определение дней жеребости на самцах озерных лягушек От балластных белков Очищение СЖК Отбор доноров Возраст доноров от 3-х до 10-и лет. Высушивание ГСЖК (сублимационная сушка) Выход готового биопрепарата и его расфасовка Готовый биопрепарат с высокой гормональной активностью 39 Рисунок 3 - Схема проведения исследований и практических результатов работы. Стадия развития эмбрионов Качество эмбрионов Число эмбрионов Вымывание эмбрионов Число овуляций Реакция яичников Использование ГСЖК в трансплантации эмбрионов у овец 2.2 Методы исследования 2.2.1 Гормональная диагностика жеребости кобыл на половозрелых самцах озерной лягушки Для определения диагностики жеребости кобыл использовали широко применяемую пробу на половозрелых самцах озерной лягушки. Самцов лягушек длиной 10-17 см отлавливали вдоль реки Бадам, г. Шымкент. Перед постановкой реакций проверили, чтобы в их моче не было спермиев. Для этого самца обернули мокрой марлей, и из клоаки (при легком надавливании), пастеровской пипеткой взяли каплю мочи, нанесли ее на предметное стекло и накрыли покровным стеклом. Отобрали самцов, в моче которых не было спермиев при наблюдении под микроскопом. На каждую кобылу отбирали по 3 лягушки. Отобранным самцам ввели в спинной лимфатический мешок по 2 мл свежей не концентрированной сыворотки крови кобылы, и поместили в стеклянную посуду, держали без воды в течение 4-х часов. По истечении времени также исследовали мочу под микроскопом. Гонадотропные гормоны, находящиеся в крови жеребых кобыл вызывают появление спермиев в моче самцов озерных лягушек. При обнаружении спермиев у двух из трех исследуемых лягушек реакция считается положительной, отрицательная, если спермии отсутствуют у всех трех лягушек. Повторно лягушек использовали по истечении 5-ти дней. 2.2.2 Взятие крови от кобыл До взятия крови кобыл-доноров выдерживали 12 часов без корма, водой не ограничивали. От каждой кобылы донора было в среднем получено по 2 л крови. Взятие крови повторяли через каждые 5 дней с 40-го по 80-й день жеребости. Число полученных моносывороток составило 144 образца. От первой группы доноров было получено 139,1 л крови, от второй группы 139 л., всего получено 278,1 л крови. Для взятия крови от кобыл-доноров использовали полностью герметизированные пленки объемом 10 литров и толщиной 120-150 мкм. Перед взятием крови в один из углов пленки разрезали, куда вставляли стеклянную трубку, смонтированную с резиновой трубкой длиной 120-150 мм. На конце резиновой трубки монтируется стерильная кровопускательная игла с мандреном. Перед взятием крови в полиэтиленовый мешок через разрез шприцом ввели 70 мл (на один литр крови необходимо 35 мл раствора) глюкозно-цитратного раствора в следующем составе: 1) лимоннокислый натрий (3-х замещенный) 10 г 2) глюкоза 2,5 г 3) Сульфацил натрия (растворимый) 5 г 4) Риванол или фурациллин 0,05 г 5) Вода дистиллированная 100 г [188; 189]. Полиэтиленовые емкости вместе с иглами и глюкозно-цитратным раствором облучали ультрафиолетом в течение 20-30 мин. 40 Взятие крови осуществляли в станке, который ежесуточно обрабатывали из пульверизатора 3% раствором карболовой кислоты. Кобылу заводили в станок таким образом, чтобы левая сторона шеи была свободна и хорошо освещалась. Голову лошади в приподнятом состоянии фиксировали к противоположной стенке станка. Выстриженную часть шеи обрабатывали водной настойкой, и у основания шеи накладывали резиновый жгут. Перед взятием крови полость мешка несколько раз смачивали глюкозно-цитратным раствором. После введения иглы в яремную вену поток крови контролировали через стеклянную канюлю. Во время взятия крови перемешивали кровь с цитратом в мешке. По окончанию крововзятия иглу быстро извлекали из яремной вены и сразу же накрывали марлей, смоченной в 3% растворе карболовой кислоты. Отсоединив иглу со шлангом, тщательно завязывали угол мешка с помощью шпагата, при этом оставляли петлю и подвешивали его на стену. По истечении 18-24 ч происходит реакция осаждения эритроцитов. На границе плазмы и эритроцитов с помощью кровопускательной иглы со шлангом из мешка сливали плазму в подготовленные стерильные бутыли Для удаления фибрина из плазмы, бутыль взвешивали и определяли количество плазмы. На литр плазмы добавляли по 1,3 мл 60% раствора CaCl 2 [188]. После добавления CaCl 2 бутыль помещали в специальный шуттель – аппарат для взбалтывания. Через 18-20 минут начинали выпадать хлопья фибрина, а еще через 15 минут шутелирование прекратили. Бутыль с плазмой и выпавшим фибрином помещали на 24 часа в холодильник, после чего слили сыворотку через ватно-марлевый фильтр в другой стерильный бутыль. Полученную сыворотку консервировали 5% раствором карболовой кислоты, из расчета 1 мл на 9 мл сыворотки. Все энергично взбалтывали и затем для отстаивания сыворотки и выпадения тяжелых анафилактогенных белков оставили в течение 2 месяцев в темном прохладном помещении [188]. 2.2.3 Определение соотношения ФСГ/ЛГ гормонов в препарате СЖК и ГСЖК методом «ИФА-ФСГ/ЛГ» Определение соотношения фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов в плазме крови жеребых кобыл проводили на микропланшетном фотометре американского производства «STAT FAXR 2100», предназначенный для иммуноферментного анализа, с помощью набора реагентов «Гонадотропин ИФА-ФСГ/ЛГ», предназначенный для количественного определения концентрации ФСГ и ЛГ гормонов согласно инструкции по применению . Набор состоит из: - двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммунобилизованными на внутренней поверхности лунок многоканальными антителами к ФСГ и ЛГ; - калибровочной пробы на основе сыворотки, содержащие известные количества ФСГ/ЛГ; 41 - конъюгат анти-ФСГ/ЛГ-пероксидаза; - концентрированного буферного раствора для промывки лунок; - раствора тетраметилбензидина (ТМБ); - стоп-реагента; - контрольной сыворотки с известным содержанием ФСГ и ЛГ. Для приготовления реагентов: - использовали готовые калибровочные пробы и контрольную сыворотку. Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыворотки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к пробкам. В каждый флакон внести по 0,5 см дистиллированной воды и закрыть пробки. Выдержать флаконы в течение 10 минут при комнатной температуре, затем аккуратно перемешать содержимое до полного растворения. - стрипы. Перед вскрытием пакет выдержали при комнатной температуре в течение 30 минут. - промывочный буфер. Необходимое количество буфера Р разводили дистиллированной водой в 10 раз тщательно перемешивая, избегая пенообразования. - конъюгат анти-ФСГ/ЛГ-пероксидаза готовы к использованию. - раствор ТМБ и стоп-реагент готовы к использованию. Перед проведением анализа все реагенты были тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры (20-25°С). Составлен протокол маркировки лунок следующим образом: А1, А2 - №1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ: В1, В2 - №2 для калибровочной пробы №1; С1, С2 - №3 для калибровочной пробы №2; D1, D2 - №4 для калибровочной пробы №3; E1, E2 - № 5 для калибровочной пробы №4; F1, F2 - №6 для калибровочной пробы №5 G1, G2 - №7 для калибровочной пробы №6; H1, H2 - № 8 для контрольной сыворотки. 1. Во все лунки, кроме А1 и А2 немедленно внесли по 100 мкл раствора конъюгата анти – ФСГ/ЛГ – пероксидаза. 2. Затем внесли в соответствующие лунки по 50 мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, а в оставшиеся лунки по 50 мкл исследуемой крови в дубликатах. Внесение проб необходимо проводить быстро, в течении 2-3 минут. 3. Инкубировали стрипы в течение 1 часа при встряхивании в термостатируемом шейкере при температуре +370С со скоростью 500-800 об/мин. 4. По окончании инкубации удалили содержимое лунок декантированием и отмыли планшет, промывали лунки 5 раз. 42 5. После чего внесли во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ и инкубировали стрипы в темноте при комнатной температуре в течение 15-30 минут в зависимости от степени развития окраски. 6. Добавили во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор ТМБ, по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивали на шейкере в течение 1-2 минут. 7. Измерили на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм [190,191]. Подсчет результатов концентрации ФСГ и ЛГ производили с помощью многоклонального планшетного спектрометра при длине волны 450 нм. Таблица 1 - Схема проведения анализа Стадия анализа реагенты Конъюгат антиФСГ/ЛГ-пероксидаза, мкл КП №1, мкл КП №2, мкл КП №3, мкл КП №4, мкл КП №5, мкл КП №6, мкл КС, мкл С, мкл Инкубация №1 5-кратная промывка: Промывочный буфер, мкл Раствор ТМБ, мкл Инкубация №2 Стоп-реагент, мкл Перемешивание Измерение ОП р-ров в лунках стрипов Расчет результатов Номер пары лунок в соответствии с маркировкой 1 2 3 - 100 100 4 5 100 100 6 7 8 9-48 100 100 100 100 - 50 50 50 50 50 50 50 50 1 час, термостатируемый шейкер, +37С 5х 5х 5х 5х 5х 5х 5х 5х 5х 300 300 300 300 300 300 300 300 300 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 КТ, темное место, 15-30 мин. 100 100 100 100 100 100 100 100 Шейкер, 1-2 мин. Фотометр, 450 мкл Калькулятор и масштабная бумага либо соответствующая компьютерная программа 2.2.4 Определение гонадотропной активности на неполовозрелых самках белых мышей Определение гонадотропной активности биопрепаратов проводили в Южно-Казахстанском областном филиале РГП на праве хозяйственного 43 ведения «Республиканская ветеринарная лаборатория» в соответствии с СТ РК 1613-2006 Надлежащая лабораторная практика [192]. Активность сыворотки крови жеребых кобыл измеряли в мышиных единицах (м. е.), и определяли по общепринятой методике, разработанной во Всероссийском Институте животноводства (ВИЖ) в 1980г., на инфантильных самках белых мышей [193]. Мышиная единица - минимальное количество гонадотропного гормона, содержащегося в разведенном препарате, способное через 72 часа после подкожного введения вызвать не менее чем у 60% неполовозрелых (инфантильных) самок белых мышей в возрасте 20-28 дней, массой 6-8 г. явное увеличение рогов матки и открытие влагалища [101,с. 46-47]. Гонадотропная активность определялась в моносыворотках и полисыворотках. Для проверки активности каждой серии СЖК были подготовлены различные разведения препарата, согласно таблице 2 и однократно введены подкожно подопытным самкам в область спины по 0,2 мл. Для каждого разведения брали по 5 белых мышей. Мышей содержали при температуре +20-22оС. Таблица 2 - Разведения гормональных препаратов и соответствующая им активность Объем физиологического раствора, который добавляют к 1 мл сырья, мл. 31 35 39 43 47 51 55 59 63 Активность, м.е. в 1 мл 160 180 200 220 240 260 280 300 320 Через 72 часа после введения препарата, животных усыпляли эфиром, затем вскрывали для установления реакции. Явное увеличение матки не менее чем у трех из пяти мышей свидетельствовало о необходимости продолжения исследования. Для сравнения были подготовлены контрольные мыши того же возраста и веса. 44 Рисунок 4 – Введение готового препарата неполовозрелой самке белой мыши Рисунок 5 - Подготовленные для вскрытия неполовозрелые самки белых мышей 45 Рисунок 6 - Вскрытие брюшной полости мышей а) контрольная группа б) увеличенная матка, соответствующая активности 280 м.е. Рисунок 7 - Матки неполовозрелых мышей Для выражения активности в интернациональных единицах (ИЕ/см) показатель гонадотропной активности сыворотки крови жеребых кобыл в мышиных единицах (м.е./см) делят на коэффициент 2,3 и получают активность в интернациональных единицах [193]. 46 2.3 Получение гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл 2.3.1 Способ получения гонадотропина Для получения гонадотропина с оптимальным соотношением фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов, а также повышения выхода целевого продукта после осаждения от балластных белков использовали способ С.В. Советкина и М.И. Прокофьевой [194,195]. Из сыворотки жеребых кобыл осаждали балластные белки путем смешивания с охлажденным до 4-70С этиловым спиртом, разведенным 10М раствором уксусной кислоты (А) и 4М раствором уксуснокислого натрия (Б) в следующем соотношении 1:1 и 1,2:1. Таблица 3 – Состав смеси для осаждения балластных белков Состав смеси Сыворотка жеребых кобыл 10 М уксусная кислота 4 М уксусно-кислого натрия Этиловый спирт Всего смеси Единица измерения л л л л л способы I (1:1) 77,90 15,033 6,779 56,088 155,8 II (1,2:1) 77,73 18,002 8,116 67,162 171,01 Полученную смесь центрифугировали и установили pH 5,9-6,0. Выдерживали 30 минут для осаждения балластных белков. Осажденные балластные белки отделили и центрифугат собрали в емкости для осаждения гонадотропина. Для осаждения сырого гонадотропина использовали два способа. В первом к объему центрифугата, полученного после осаждения балластных белков добавляли охлажденный до 50С этиловый спирт в соотношении 1:1,25. Для осаждения гонадотропина смесь выдерживали в течение 2 часов. Во втором способе к полученному центрифугату добавляли охлажденный до 100С этиловый спирт в соотношении 1:1. Смесь выдерживали в течение 6 часов. Полученные осадки растворяли в физиологическом растворе в коллоидной мельнице из расчета 1,0-1,5 кг сырой массы на 15-20 л. Стабилизировали добавлением 45 г/л аминоуксусной кислоты. Осветляли раствор сепарированием, проводили коррекцию рH до 7,6-7,8. Затем проводили стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание готового препарата. Замораживание гонадотропина проводили по стандартной методике. Раствор препарата сначала фильтровали через асбестовые пластины при давлении, не превышающем 0,05 МПа (0,5 атм.), а затем через трехрамный фильтр с использованием асбестовых пластин в стерильный стеклянный баллон на 20 л. Раствор препарата расфасовывали в боксе по 5 мл во флаконы объемом 20 мл, которые после размещали в металлических кюветах и закрывали четырехслойными марлевыми салфетками (все стерильно). Кассеты с 47 препаратом помещали на 18-20 ч в морозильную камеру при температуре воздуха в холодильной камере -500С до -550С со скоростью охлаждения от 0,1 до 1,50С/мин до формирования структуры льда. Толщина слоя льда составляет от 1 до 2 см. 2.3.2 Сушка гонадотропина Высушивание замороженного гонадотропина проводили методом сублимации в сушильном аппарате Альфа 1-2 LD. Перед началом работы за 5 часов подключали аппарат, пока температура не доходила до -55оС. При высушивании замороженного ГСЖК применяли два способа: 1. сушка в течение 72 часов при вакуумном давлении 0,01 мбар; 2. основная сушка в течение 24 часов при вакуумном давлении 0,01 мбар и постосушение в течение 6 часов при вакуумном давлении 0,120 мбар, температура конденсатора льда не ниже -500С. Процесс сублимационного высушивания проводили до получения сухого порошка белого цвета. 2.4 Гормональная индукция суперовуляции 2.4.1 Обработка овцематок и извлечение эмбрионов Гормональную обработку овцематок, трансплантацию эмбрионов и отбор жизнеспособных эмбрионов осуществляли, по существующим способам. Отобранных 2 группы овцематок каракульской породы обрабатывали полученными традиционным и новым способами биопрепаратами на 11-й день эстрального цикла. 1. группа доноров в количестве 25-ти голов, обработанных ГСЖК полученным традиционным способом. 2. группа доноров в количестве 25-ти голов, обработанных ГСЖК разработанным способом. Таблица 4 - Гормональная обработка доноров каракульских овец День эстрального цикла донора 11-й 13-й последующие дни на 3-4-й день после осеменения Препарат Доза препарата ГСЖК по 26 М.Е./кг простагландин охота и осеменение извлечение эмбрионов Полученные цифровые материалы обрабатывали методом вариационной статистики [196]. Хирургическую операцию по извлечению эмбрионов проводили по общепринятой методике, разработанной в ВНИИЖ «Методические рекомендации по трансплантации эмбрионов у овец» на 3-4 сутки после осеменения овцематок. Перед извлечением эмбрионов маток выдерживали на голодной диете в течение 12 часов. Операцию проводили под местной 48 анестезией. Для анестезии применяли 2% новокаин, вводили подкожно и внутримышечно. Животное фиксировали на операционном столе в дорсальном положении, оперируемый участок тщательно обмывали. Шерстный покров на оперируемом участке удаляли, проводили асептическую обработку операционного поля 80%ным спиртом смесью с йодом, и накладывали стерильную салфетку. Лапаротомию производили по белой линии живота, как можно ближе к вымени. Через разрез длиной 5-7 см. осторожно двумя пальцами извлекали рога матки с яичниками и располагали их на салфетке. При этом устанавливали действие гормонального препарата ГСЖК на основе числа животных с суперовуляцией, при визуальном осмотре на яичниках подсчитывали число желтых тел и определяли стадию их развития, а затем приступали к извлечению эмбрионов. Рисунок 8 – Подготовка донора для лапоратомии Рисунок 9 – Введение 2% новокаина для анестезии 49 Промывка эмбрионов проводилась по общепринятой методике биотехнологии эмбриотрансплантации на 3-4 день цикла средой Дюльбекко с добавлением 2% фетальной сыворотки, с помощью тонкого катетера Фоллея, введенного в яйцевод и закрепленного при помощи зажима или лигатуры. Сначала промывали яйцевод, вводя через катетер 3-6 см3 среды, затем промывали матку через иглу, вставленную в верхушку рога [115, с. 43-44]. Рисунок 10 – Яичник овцематки с множественной овуляцией Рисунок 11 – Процесс вымывания эмбрионов На промывание одного рога матки использовали 100-140 см3 среды. Промывную жидкость, извлеченную из матки через катетер Фоллея, переносили в фильтр для эмбрионов. Аналогично промывали второй рог матки. 50 Полученную среду заливали в чашку Петри, фотографировали с помощью микроскопа МБС-9, таким образом, определяли стадию развития и качество эмбрионов, а также количество дегенерированных эмбрионов и яйцеклеток [197-199]. 2.4.2 Классификация эмбрионов по качеству Характеристика состояния эмбрионов необходима для выявления среди них способных к развитию и пригодных для пересадки реципиенту или криоконсервации. При оценке учитывали стадию развития эмбрионов, соответствие их хронологическому возрасту, определялши морфологическое состояние и исходя из этих критериев, устанавливали его качество и пригодность для дальнейшего использования проводили согласно инструкции по технологии работы по исскуственному осеменению и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных под стереомикроскопом с увеличением в 60-80 раз [200]. Отличный или хороший – эмбрион идеальный, сферический, симметричный, с клетками одного размера, цвета и плотности или имеет незначительные изъяны, такие, как несколько бластомеров, выделившихся из общей массы в перивителлиновое пространство, неправильная форма клеточной массы, несколько вакуолей, стадия соответствует возрасту [125, с 710; 200]; Удовлетворительный – морфологическое строение имеет серьезные замечания; присутствие разрушенных бластомеров, сильная вакуолизация, неоднородное окрашивание, низкая плотность клеточной массы, наличие множества клеток в перивителлиновом пространстве, отставание развития до 24 часов [125, с 7-10; 200]; Плохой – многочисленные вытесненные из общей массы бластомеры, нарушение межклеточных связей, дегенерированные клетки, клетки различного размера, много крупных вакуолей и гранул, отставание развития более 24 часов, частично разрушенная или деформированная зона пеллюцида [143]; Мертвый и/или дегенерировавший – сильные разрушения клеточной массы, связь между бластомерами нарушена, бластомеры разных размеров, несоответствие хронологическому возрасту, сильная вакуолизация и грануляция, разрушена зона пеллюцида [143,с. 120-125; 200]. 2.4.3 Стадии развития эмбрионов Неоплодотворенная яйцеклетка – имеет сферическую форму, окружена прозрачной оболочкой, диаметр составляет 0,14-0,17 мм. Между прозрачной оболочкой и плазматической частью находится перивителлиновое пространство, заполненное жидкостью [143,с. 120-125; 200]. 2-12 – клеточная стадия – имеет сферическую форму и от 2 до 12 клеток (бластомеров). Эмбрион имеет рыхлую структуру, между бластомерами нет прочных контактов [143,с. 120-125; 200]. 51 Ранняя морула – клеточная масса до 32 бластомеров, занимает большую часть перивителлинового пространства, отдельные клетки (бластомеры) хорошо различимы. Перивителлиновое пространство четко выражено. Размер – 0,14-0,17 мм [143,с. 120-125; 200]. Морула – клеточная масса состоит из 33-64 бластомеров, занимает 60-70% перивителлинового пространства, бластомеры образуют компактную массу. Перивителлиновое пространство выражено четко. Размер – 0,14-0,17 мм [143,с. 120-125; 200]. Ранняя бластоциста – клеточная масса состоит из 65-130 бластомеров, занимает 70-80% перивителлинового пространства, в компактной массе бластомеров образуется небольшая наполненная жидкостью асимметрично расположенная полость (бластоцель). Эмбриобласт и трофобласт визуально еще плохо различимы. Перивителлиновое пространство выражено четко. Размер- 0,14-0,17 мм [143,с. 120-125; 200]. Бластоциста – клеточная масса состоит из 65-130 бластомеров, занимает большую часть перивителлинового пространства. Четко выражена дифференциация внешнего слоя трофобласта и более темной и компактной внутренней массы клеток (эмбриобласта). Бластоцель хорошо выражена, перивителлиновое пространство почти полностью вытеснено. Размер – 0,140,20 мм [143,с. 120-125; 200]. Расширенная бластоциста – состоит из 131-200 клеток, внешний диаметр увеличивается в 1,2-1,5 раза. Перивителлиновое пространство полностью исчезает. Прозрачная оболочка растянута и утончена до 1-3 первоначальной величины. Трофобласт в виде уплощенной цепочки располагается непосредственно под прозрачной оболочкой. Эмбриобласт – в виде компактного скопления клеток. Размер – 0,18-0,22 мм [143,с. 120-125; 200]. 52 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ 3.1 Отбор кобыл-доноров в качестве продуцентов сыворотки жеребых кобыл Приготовление сыворотки жеребых кобыл является строго сезонным мероприятием, и должно проводится в сжатые сроки. Для взятия крови от кобыл-доноров, получения из нее сыворотки жеребых кобыл и гонадотропина сыворотки жеребых кобыл, отобрали кобыл, ожеребившихся в феврале месяце в количестве 16 голов (таблица 5). Таблица 5 - Отбор кобыл – доноров № кобыл 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Клички кобыл Порода Возраст кобыл Дата выжеребки Дата случки Определени е жеребости черная темно гнедая светло-серая темно-рыжая белая черная темнокрасная светлокрасная белая белая черная темнокрасная бежевая черная черная бежевая джабе джабе джабе джабе джабе джабе джабе 3 3 4 4 5 5 6 10.02.2012 15.02.2012 08.02.2012 04.02.2012 16.02.2012 25.02.2012 20.02.2012 04.03.2012 10.03.2012 02.03.2012 01.03.2012 10.03.2012 20.03.2012 15.03.2012 14.04.2012 17.04.2012 12.04.2012 11.04.2012 20.03.2012 30.04.2012 25.03.2012 джабе 6 25.02.2012 22.03.2012 02.05.2012 джабе джабе джабе джабе 7 7 8 8 10.02.2012 09.02.2012 27.02.2012 15.02.2012 12.03.2012 03.03.2012 24.03.2012 09.03.2012 22.04.2012 13.03.2012 04.05.2012 19.04.2012 джабе джабе джабе джабе 9 9 10 10 26.02.2012 16.02.2012 24.02.2012 10.02.2012 20.03.2012 09.03.2012 10.03.2012 13.03.2012 30.04.2012 19.04.2012 20.04.2012 23.04.2012 В результате исследования все кобылы доноры после ожеребления пришли в естественную случку через 22-26 дней, т.е. в март месяце. Внешние признаки охоты у кобыл устанавливали при помощи жеребца-пробника. При проведении гормональной диагностики жеребости кобыл на половозрелых самцах лягушек по истечении 40-ка дней все кобылы-доноры были жеребыми. 3.2 Изучение биологических свойств сыворотки жеребых кобыл 3.2.1 Гонадотропная активность сывороток крови полученных от жеребых кобыл разного возраста и периодов жеребости. Исследование биологических свойств СЖК, а также реакции 53 организма сельскохозяйственных животных на гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, позволяют эффективно использовать их в воспроизводстве сельскохозяйственных животных для повышения многоплодия. Важное значение имеет определение гонадотропной активности и содержание ФСГ/ ЛГ гормонов в гонадотропных биопрепаратах. Изучена степень накопления гонадотропной активности в 144-х моносыворотках полученных от кобыл-доноров разного возраста, методом биопробы на мышах. Кровь получали с 40-го по 80-й дни жеребости с периодичностью 5 дней (таблица 6). Таблица 6 – Степень обнаружения сыворотки жеребых кобыл с разной активностью Градация активности СЖК м.е./ мл 300 и более 250 -290 200 -240 150-190 100-140 до 100 Число образцов М±m 14 57 27 18 17 11 9,7±2,47 39,6±4,07 18,8±3,25 12,5±2,75 11,8±2,69 7,6±2,21 В результате экспериментов выявлено: - 11 серий СЖК имели активность от 45 до 90 м.е./мл., в процентном соотношении выраженные как 7,6%±2,21%; - 17 серий СЖК имели активность от 100 до 140 м.е./мл., в процентном соотношении выраженные как 11,8%±2,6%; - 18 серий СЖК имели активность от 150 до 190 м.е./мл., в процентном соотношении выраженные как 12,5%±2,75%; - 27 серий СЖК имели активность от 200 до 240 м.е./мл., в процентном соотношении выраженные как 18,8±3,25; - 57 серий СЖК имели активность от 250 до 290 м.е/мл., в процентном соотношении выраженные как 39,6±4,07; - 14 серий СЖК имели активность от 300 до 320 м.е./мл., в процентном соотношении выраженные как 9,7±2,47. Изученные образцы СЖК по активности отличались очень высокой изменчивостью. Эти результаты указывают о необходимости более детального изучения факторов, влияющих на биологическую активность СЖК. В связи с этим, было изучено наличие концентрации и активности гормонов в СЖК. Учитывалась средняя активность гонадотропного гормона СЖК в каждой возрастной категории. Результаты анализа полученных данных приведены в таблице 7. 54 Таблица 7 - Гормональная активность сыворотки жеребых кобыл полученных от кобыл-доноров разного возраста Возраст доноров 3 4 5 6 7 8 9 10 В среднем Число животных в группе 2 2 2 2 2 2 2 2 16 Число Показатели образцо М±m σ±mr в 18 184,17±18,671 79,17±13,19 18 213,88±16,851 71,45±11,91 18 218,05±17,828 75,59±12,60 18 237,78±16,871 71,53±11,92 18 238,61±15,304 64,89±10,81 18 236,39±15,849 67,20±11,20 18 225,55±14,833 62,89±10,48 18 221,11±14,214 60,26±10,04 144 221,94 ± 5,949 69,20 ± 4,20 Cv±mq 43,0±7,17 33,4±5,17 34,7±5,78 30,1±5,02 27,2±4,53 28,4±4,73 27,9±4,65 27,2±4,53 32,1±1,89 Из данных таблицы можно заметить, что минимальная активность наблюдается в СЖК, полученных от 3-х летних кобыл-доноров и составило 184,17±18,671 м.е./мл, с размахом колебания от 45 м.е./мл до 280 м.е./мл (приложение Г.), а точнее с высоким стандартным отклонением 79,17±13,19% и коэффициентом изменчивости 43,0±7,17. Максимальная активность установлена в СЖК, 6-ти (237,78±16,871), 7-ми (238,61±15,304) и 8-ми (236,39±15,849) летних кобыл-доноров. Достоверность разницы по активности сыворотки жеребых кобыл между 3-х летними и 6-ти, 7-ми и 8-ми летними донорами соответствует первому порогу вероятности (Р<0,05). Между остальными группами животных, по активности гонадотропина в сыворотке, достоверного различия не обнаружено (Р>0,05). В среднем по группам доноров, активность сыворотки составила 221,94±5,949 м.е./мл., с размахом колебания от 45,0 до 320 м.е./мл., высокие стандартные отклонения 71,39±4,20%, коэффициент изменчивости 32,1±1,89. Следует отметить, что с увеличением возраста кобыл-доноров, коэффициенты стандартного отклонения и изменчивость активности гонадотропных гормонов существенно снижаются на 18,9% и 15,8% соответственно. Следовательно, можно сделать вывод, что колебание и изменчивость активности гонадотропина в СЖК стабилизируется с повышением возраста. В ходе проведения экспериментов выявлено, что каждый индивидуум своеобразно продуцирует гонадотропные гормоны в организме (таблица 8). 55 3 Номера доноров Возраст доноров Таблица 8 - Суточное нарастание активности сыворотки жеребых кобыл у кобыл-доноров 1 2 4 3 4 5 5 6 6 7 8 7 9 10 8 11 12 9 13 14 10 15 16 В среднем Начальная Максимальная активность активность СЖК, СЖК, м.е./мл м.е./мл 80 45 50 90 55 100 110 60 60 120 70 140 80 100 100 90 84,4 280 280 300 310 290 320 320 320 310 300 310 290 290 290 280 290 298,7 Дни получения СЖК с высокой активностью 25 35 35 30 35 30 25 25 20 25 25 30 25 25 25 20 26,6 Нарастание активности СЖК в течение суток, м.е./мл 8 6,7 7,1 7,3 6,7 7,3 8,4 10,4 12,5 7,2 9,6 6,0 8,4 9,5 7,2 10,0 8,1 Из приведенных данных таблицы 8 видно, что в СЖК полученной от 6-ти №8, 7-ми №9 и 10-ти летних кобыл-доноров №16 наблюдается высокое среднесуточное нарастание гонадотропной активности, от 10 м.е/мл до 12,5 м.е./мл. При этом, в течение 20-25 дней активность достигла до 290-320 м.е./мл. Медленное накопление гонадотропных гормонов установлены в сыворотках, полученных от 3-х летних кобыл №2, 5-ти летних кобыл №5 и у 8-ми летних кобыл №12, среднесуточное нарастание активности составило от 6,0 до 6,7 м.е./мл, т.е. на 60-65 дни жеребости получены СЖК с активностью 280-290 м.е./мл. У остальных кобыл-доноров данный показатель находился в пределах 7,2-9,6 м.е./мл. Полученные данные позволяют сделать заключение, изменчивость гонадотропной активности в СЖК, полученных даже от одинаковых по возрасту кобыл очень существенна. Поэтому придерживаться строго определенного возраста при изготовлении нативной СЖК будет не всегда эффективным, из-за высокой вариабельности изучаемого признака. 56 Также были изучены степень накопления гонадотропной активности в 144 моносыворотках в зависимости от сроков жеребости. При изучении степени накопления общей гонадотропной активности было выявлено, что минимальная активность гонадотропных гормонов установлена в группе доноров со сроком жеребости 40 дней, активность в среднем составила 83,1 ± 6,67. Образцы крови полученные на 60-75 дни отличались высокой активностью, и в среднем составили от 260,6±9,86 м.е./мл до 284,4±6,31 м.е./мл. Сыворотки жеребых кобыл, полученные на 45-й, 50-й дни жеребости занимали промежуточное положение. В таблице 9 приведены данные по активности СЖК в зависимости от сроков жеребости Таблица 9 - Активность СЖК в зависимости от сроков жеребости № п/п Сроки Число жеребо образ сти цов крови 1 40 16 2 45 16 3 50 16 4 55 16 5 60 16 6 65 16 7 70 16 8 75 16 9 80 16 В среднем 144 М ±m 83,1 ± 6,67 161,9±10,24 198,7±12,98 220,6±10,80 265,0±10,68 284,4± 6,31 273,7± 6,57 260,6± 9,86 249,4± 12,0 221,9± 5,95 Показатели Колебания, σ±mr м.е./мл 45,0-140,0 90,0-220,0 100,0-270,0 120,0-270,0 160,0-310,0 240,0-320,0 230,0-320,0 170,0-300,0 130,0-290,0 45,0 -320,0 26,7±4,71 40,9±7,18 51,9±9,17 43,2±7,63 42,7±7,54 25,2±4,46 26,2±4,63 39,4±6,97 48,0±8,48 71,4±4,20 Cv±mcv 32,1± 5,67 25,3±4,47 26,1±4,61 19,6±3,46 16,1±2,84 8,9±1,57 9,6±1,70 15,1±2,66 19,2±3,39 32,1±1,89 В целом, накопление гонадотропной активности в СЖК повышается до 65го дня жеребости, после чего наблюдается тенденция к постепенному снижению. Следует также отметить, что с повышением концентрации гонадотропных гормонов в СЖК снижаются коэффициенты стандартного отклонения и изменчивость их активности. 3.2.2 Гормональный статус кобыл-доноров в зависимости от возраста и сроков жеребости Гормональный статус кобыл-доноров между собой незначительно отличался (рисунок 12). 57 Гормональная активность СЖК, % 70 60 50 высокая активность СЖК 250-320 м.е. 40 30 средняя активность СЖК 160-240 м.е. 20 низкая активность СЖК 150 м.е. и ниже 10 0 3 4 5 6 7 8 Возраст кобыл-доноров, лет 9 10 Рисунок 12 – Гормональный статус кобыл-доноров разных возрастов Статус СЖК,% Наивысшая гормональная активность проявлена в СЖК полученной от 6ти, 7-ми и 8-ми летних кобыл-доноров. Активность 6-ти (61,5 %), 8-ми (61,5 %) летних кобыл-доноров выше на 5,5 % по активности 7-ми (55,6 %) летних доноров. Высокий гормональный статус 3-х, 5-ти и 10-ти летних кобылдоноров был примерно одинаков, равен - 38,9 %. В сыворотках кобыл полученных от 4-х, 9-ти летних доноров высокий гормональный статус проявили 50,0 % кобыл. Также был определен гормональный статус кобыл-доноров в зависимости от сроков жеребости, который существенно отличался между собой (рисунок13). 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 высокая (250-320 м.е) средняя (160-240 м.е) 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Сроки жеребости кобыл-доноров низкая (150 и ниже м.е.) Рисунок 13 – Гормональный статус кобыл-доноров в зависимости от сроков жеребости 58 При определении гормонального статуса кобыл-доноров в зависимости от сроков жеребости было установлено, что в СЖК полученных на 40-й день жеребости проявлен только низкий статус - 100%. В препаратах, полученных на 45-й день средний статус - 56,2% и низкий статус - 43,8%. Также средним статусом 62,5% и 56,2% обладали СЖК полученные на 50-55 дни. Наиболее высокая активность гормонов наблюдалась в СЖК полученных от доноров в период с 65-го по 80-й дни, от 75,0% до 93,7%. Также высокий гормональный статус 68,8% наблюдался в препаратах, полученных от доноров со сроком жеребости 60 дней. Таким образом, установлено, что на активность гонадотропина в сыворотке крови кобыл - доноров разного возраста существенное влияние оказывает гормональный фон индивидуума и сроки их жеребости. Индивидуальную гормональную особенность необходимо использовать как критерий гормональной характеристики кобыл – донора при взятии крови. При этом максимальный пик активности наблюдался на 60-75 дни жеребости. Возраст жеребых кобыл не оказывает существенного влияния на активность в сыворотке крови, с увеличением возраста наблюдается тенденция к снижению гормональной активности в крови. 3.2.3 Гормональная активность сыворотки жеребых кобыл Учитывая широкий диапазон гормональной активности СЖК полученной от кобыл-доноров разного возраста и периодов жеребости, проведены эксперименты, направленные на выявление оптимальных дней жеребости для получения сывороточного гонадотропина с высокой гонадотропной активностью. Анализ данных таблицы 12 показывает, высокая концентрация гормонов у 3-х летних кобыл-доноров №1 и №2 начинается с 65-го и 70-го дня. У 4-х летних кобыл №3, №4 данный показатель начинается с 65-го и 60-го дня. СЖК 5-ти летних кобыл №7 и №8 проявила гормональную активность на 70-й, 65-й день и продолжалась до 80-го дня жеребости. Синхронная концентрация высокоактивных гормонов установлена у 6-ти, летних, 7-ми летних кобыл №7,№8 и № 9, № 10 на 60-й и 55-й дни жеребости. Асинхронная концентрация высокоактивных гормонов присуще для 8-ми летних кобыл №11 и №12. При этом, у донора №11 высокоактивный препарат получен на 60-й день, а у №12 на 50-й день. У кобылы – донора №15 продуцирующая способность высокоактивного препарата СЖК укороченное, максимальное содержание гонадотропного гормона установлено на 60-65 дни, у донора № 16 между 50-65-ми днями жеребости. Результаты исследования, отражающие концентрацию гонадотропных гормонов в СЖК приведены в таблице 10. 59 Инд. № доноров Возраст доноров Таблица 10 - Концентрации гонадотропных гормонов в сыворотке крови жеребых кобыл в зависимости от их возраста и сроков жеребости Сроки жеребости доноров 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1 3 2 1 3 Н 4 Н 5 Н 6 С 7 С 8 В 9 В 10 В 11 В 4 2 3 4 Н Н Н Н Н Н Н Н С Н С С С С В С В В В В В В В В В В В Н Н С С С С Н Н С С С В Н С С С В В Н С С В В В Н С С В В В Н С С С В В Н Н С С В В Н С В В В В Н С С В В В Н С С В В В Н С С С В В Н С С В В В Н - низкая, С - средняя, В - высокая. В В В В С В В В В С С С В В В В В В В В С В С С В В В В В В С В Н С Н В 5 5 6 6 7 8 7 9 10 8 11 12 9 13 14 10 15 16 Примечание Результаты о высокой вариабельности концентрации гонадотропина в СЖК полученных от кобыл разного возраста и сроков жеребости, характеризируют их индивидуальную особенность и являются информативным показателем их эндокринной характеристики. Информативная ценность полученных эндокринных показателей заключается в том, что их можно использовать в качестве критериев отбора доноров-продуцентов препарата СЖК с различной активностью. Таким образом, результаты лабораторных исследований показали, что изученные образцы сыворотки крови по активности отличались очень высокой изменчивостью. При этом гонадотропная активность нативного СЖК, полученных от кобыл-доноров разных возрастов и с разными сроками жеребости варьировалась от 63,0 м.е/мл до 320м.е/мл. 60 Таблица 11 - Гонадотропная активность сыворотки жеребых кобыл, в м.е./мл. Сроки жеребости 40 45 50 55 60 65 70 75 80 В среднем 3 63,0 105,3 120,4 150,4 180,5 260,5 250,0 275,0 265,2 188,7 4 70,0 115,0 146,7 185,7 249,1 289,6 295,0 295,0 280,0 217,7 5 78,6 129,5 179,0 205,0 225,0 275,0 296,1 295,0 280,0 221,0 Возраст доноров 6 7 88,9 88,6 174,3 199,1 200,9 217,3 236,0 241,3 275,0 305,0 320,0 280,0 285,0 267,5 285,0 280,4 285,0 270,0 243,1 241,0 8 106,7 166,2 219,1 235,0 294,5 300,0 292,5 270,9 241,8 238,3 9 84,2 195,4 255,0 270,0 290,0 285,0 255,0 216,7 173,9 231,4 10 95,0 209,1 255,0 249,1 285,0 280,0 235,4 185,0 197,8 224,3 В результате исследование было установлено, что концентрация гормонов в нативных сыворотках крови, полученных от 3-5 летних кобыл с 65-80-го дня жеребости находилась в пределах от 250м.е/мл до 296,1м.е/мл. Максимальная концентрация гормонов с преобладанием ФСГ гормонов наблюдается в нативных сыворотках крови, полученных от кобыл-доноров в возрасте 6-8 лет между 60-75 днями жеребости. При этом, содержание гормонов в 1 мл. сыворотке составило в пределах от 270 до 320 м.е. Сыворотки крови, полученные от 9-10 летних кобыл-доноров на 55-65 дни жеребости отличались, содержанием высокоактивных фолликулостимулирующих гормоном. При этом, концентрация гонадотропных гормонов находилась в пределах от 249 м.е./мл. до 290 м.е./мл (приложение Г.). В целом, на основе дифференциации жеребых кобыл по концентрации гонадотропных гормонов в сыворотке, позволила выявить оптимальные дни жеребости кобыл–доноров для изготовления препарата СЖК с высокой гонадотропной активностью. При этом, оптимальными днями для взятия крови от 3-5 летних кобыл-доноров считается 65-80 дни. Для доноров 6-8 лет наилучшим сроком считается 60-75 дни и для старшего возраста 9 и 10 лет от 55-го до 65-го дня. 61 3.3 Соотношение фолликулостимулирующих и лютеинизирующих гормонов в сыворотках полученных от жеребых кобыл разного возраста и периодов жеребости 3.3.1 Определение фолликулостимулирующих и лютеинизирующих гормонов Как было указано в литературном обзоре, фолликулостимулирующие и лютеинизирующие гормоны относятся к гонадотропинам, которые стимулируют функцию половых желез и непосредственно участвуют в регуляции воспроизводительной способности у самок сельскохозяйственных животных. Методом иммуноферментного анализа определяли соотношение фолликулостимулирующих и лютеинизирующих гормонов в 144-х моносыворотках полученных от кобыл-доноров разного возраста и периодов жеребости. В таблице 12 приведены данные по частоте встречаемости СЖК с разным соотношением ФСГ/ЛГ гормонов. Таблица 12 - Частота встречаемости СЖК с разным соотношением ФСГ/ЛГ гормонов Градация соотношения ФСГ/ЛГ в сыворотке Число проб М±m 1,1/1 – 1,9/1 20 13,9 ± 2,9 2,0/1 – 2,9/1 35 24,3 ± 3,6 3,0/1 – 3,9/1 33 22,9 ± 3,5 4,0/1 – 4,9/1 28 19,4 ± 3,3 5,0/1 – 5,9/1 12 8,3 ± 2,3 6,0/1 – 6,9/1 7,0/1 – 7,9/1 7 3 4,9 ± 2,3 2,1 ± 1,2 8,0/1 – 8,9/1 9,0/1 – 9,9/1 2 2 1,4 ± 0,9 1,4 ± 0,9 10,0/1 – 10,9/1 11,0/1 – 11,9/1 1 1 0,7 0,7 Соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в 144-х моносыворотках, полученных индивидуально от каждого донора варьируются от 1,1/1 до 11,9/1. При этом, наибольшая частота встречаемости наблюдалась в сыворотках с соотношением ФСГ/ЛГ гормонов: 1,1/1 – 1,9/1 (13,9%); 2,0/1 – 2,9/1 (24,3%); 3,0/1 – 3,9/1 (22,9%); 4,0/1 – 4,9/1 (19,4%). В оставшихся сыворотках соотношение гормонов более высоко, частота встречаемости находится в пределах от 0,7% до 8,3%. 62 Эти данные подчеркивают характерную особенность отобранных жеребых кобыл для опыта в качестве продуцентов СЖК. На основании этого изучено влияние возраста жеребых кобыл на соотношение ФСГ/ЛГ гормонов (таблица 13). Таблица 13 - Соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в образцах крови жеребых кобыл разных возрастов Возраст доноров Число образцов 3 4 5 6 7 8 9 10 Всего 18 18 18 18 18 18 18 18 144 Показатели М +m 3,01±0,266 3,03±0,289 3,36±0,239 3,73±0,359 3,89±0,305 4,10±0,448 5,54±1,019 5,62±1,095 4,04±0,227 колебание 1,11/1-5,19/1 1,28/1-5,61/1 1,37/1-5,80/1 1,55/1-7,17/1 1,40/1-7,61/1 1,70/1-9,16/1 1,34/1-11,35/1 1,23/1-10,04/1 1,11/1-11,35/1 σ+mr 1,13±0,287 1,20±0,268 1,27±0,233 1,52±0,225 1,57±0,215 1,90±0,299 4,32±0,702 4,61±0,773 2,19±0,160 Cv+mcv 37,7±8,983 39,6±7,60 37,8±6,783 40,7±6,183 40,4±5,90 46,3±7,50 77,9±12,850 82,0±14,25 67,2±3,959 Среднее соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в СЖК, взятой от 3-х, 7-ми летних доноров составило 3,4/1 с колебаниями от 1,11/1 до 7,61/1. Сыворотки полученные от 8-ми летних доноров имели соотношение гормонов в среднем 4/1±0,45 с вариациями от 1,7/1 до 9,2/1. В более старшем возрасте 9-10 лет соотношение гормонов ФСГ/ЛГ в среднем 5/1 с высокими колебаниями от 1,3/1 до 11,3/1 (Приложение Д. 1). Следует также отметить, что с возрастом индекс стандартного отклонение и коэффициенты изменчивости соотношений ФСГ/ЛГ гормонов существенно увеличиваются от 1,13 до 4,61 и от 37,7% до 82,0% соответственно. Разность между 3-х, 5-ти летними, 9-ти, 10-ти летними донорами по соотношению ФСГ/ЛГ гормонов в сыворотке крови статически достоверны (Р<0,05), а между остальными группами достоверных различий не обнаружено. Также исследовано содержание ФСГ/ЛГ гормонов в СЖК в зависимости от сроков жеребости доноров (таблица 14). Влияние сроков жеребости кобыл-доноров на соотношение ФСГ/ЛГ гормонов существенны и неодинаковы. Например, соотношение ФСГ/ЛГ гормонов на 40-й день жеребости в среднем составило 1,85/1 с колебаниями в пределах от 1,11/1 до 2,65/1, а на 45-й и 50-й дни жеребости от 2,06/1 до 2,66/1, с колебаниями в пределах от 1,23/1 до 3,39/17, между 55-60-ми днями данный показатель составил 3,4/1 и наблюдались значительные их вариации от 1,69/1 до 4,96/1. Соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в СЖК полученных кобыл-доноров со сроком жеребости 65 дней колебалось незначительно в пределах от 3,1/1 до 4,9/1 со средним соотношением 4,07/1. Высокое соотношение наблюдалось в 63 препаратах, полученных от доноров со сроком жеребости 70-80 дней и в среднем составило от 5,98/1 до 6,87/1 с максимальными колебаниями от 3,30/1 до 16,14/1. Таблица 14 - Вариабельность соотношения ФСГ/ЛГ в зависимости от сроков жеребости Сроки жеребости Число образцов 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Всего 16 16 16 16 16 16 16 16 16 144 Показатели М ±m 1,85/1±0,101 2,06/1±0,130 2,66/1±0,125 3,13/1±0,177 3,73/1±0,222 4,07/1±0,135 6,30/1±1,152 5,98/1±1,795 6,87/1±0,605 3,82±0,154 колебание 1,11/1-2,65/1 1,23/1-3,22/1 1,84/1-3,39/1 1,69/1-4,83/1 2,53/1-4,96/1 3,10/1-4,90/1 3,31/1-19,27/1 3,30/1-11,35/1 4,29/1-16,14/1 1,11/1-11,35/1 Cv± mcv 22,0±3,887 25,4±4,487 18,8±2,138 22,6±3,639 23,8±3,904 13,3±3,215 9,2±1,625 48,8±8,462 35,2±10,388 48,0±3,958 Анализ экспериментальных исследований по изучению биологического качества СЖК, показал большую вариабельность величин соотношений ФСГ/ЛГ гормонов. Таким образом, установлено, что величина соотношения ФСГ/ЛГ гормонов в биологических жидкостях зависит от сроков жеребости, нежели от возраста доноров. 3.3.2 Статус сыворотки жеребых кобыл полученных от доноров разных возрастов по соотношению к ФСГ/ЛГ гормонам Соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в СЖК является важным биологическим критерием при отборе жеребых кобыл в качестве доноров продуцентов. Поэтому, в зависимости от уровня концентрации ФСГ по отношению к ЛГ, полученные препараты были разделены на три группы: с низким 1,1/1 – 1,9/1, средним 2,0/1 – 3,9/1 и высоким 4,0/1 соотношением ФСГ/ЛГ гормонов. В результате исследования выявлено, что статус СЖК полученных от доноров разных возрастов по соотношению к ФСГ/ЛГ гормонов существенно не отличался (рисунок 14). Большинство доноров от 3-х до 7-ми лет имели средний статус 50,061,1%, в группе 8-10 летних кобыл доля доноров с высоким статусом по соотношению к ФСГ/ЛГ гормонам составило в пределах от 44,4 до 50,0%. 64 70 Статус СЖК, % 60 50 40 высокий 4,01 и выше 30 средний 2,0/1-3,0/1 20 10 0 3 4 5 6 7 8 Возраст кобыл-доноров, лет 9 10 Рисунок 14 – Статус СЖК полученных от кобыл-доноров разных возрастов Фолликулостимулирующий статус СЖК полученных от доноров с разными сроками жеребости между собой существенно отличался. Например, фолликулостимулирующий статус у доноров со сроком жеребости 40 дней в основном был низким (62,5%), а число животных, имевших средний статус было больше в группе доноров со сроком жеребости 45-60 дней и составило 62,5 - 81,2% . Доля животных с высоким статусом было больше (56,3 -100%) в группе доноров сроком жеребости 70-80 дней (рисунок 15). Фолликулостимулирующий статус СЖК,% 100 90 80 70 высокий 4,0 и выше средний 2,0/13,9/1 низкий 1,01/11,9/1 60 50 40 30 20 10 0 40 45 50 55 60 65 70 75 Сроки жеребости кобыл-доноров 80 Рисунок 15 - Фолликулостимулирующий статус СЖК полученных от доноров с разными сроками жеребости 65 Следует отметить, что в группе доноров со сроком жеребости 60-80 дней не обнаружены доноры с низким статусом по соотношению к ФСГ/ЛГ гормонам. В среднем в изученных препаратах СЖК 38,9±4,06% имели высокий, 47,2±4,16% средний и 13,9±2,90% низкий фолликулостимулирующий статус. Частота встречаемости СЖК с разными статусами по активности и соотношению ФСГ/ЛГ гормонов (таблица 15). Таблица 15 - Частота встречаемости СЖК с разными статусами по активности СЖК и соотношению ФСГ/ЛГ по активности низкий низкий низкий средний средний средний высокий высокий Статус СЖК по соотношению ФСГ/ЛГ низкий средний высокий низкий средний высокий средний высокий n М±m 17 10 1 3 33 9 24 47 11,8±2,69 6,9 ± 2,1 0,7±0,69 2,1±1,19 22,9±3,50 6,2±2,0 16,7±3,11 32,6±3,91 Материалы таблицы 15 показывают, что наибольшая частота встречаемости была в препаратах СЖК со статусом «средний-средний» и «высокий-высокий» - 22,9±3,50% и 32,6±3,91%. Наименьший процент (0,7%) – «низкий – высокий» и «средний – низкий» 2,1%. Частота встречаемости в остальных препаратах составила: «высокий - средний» - 16,7±3,11%, «низкийнизкий» - 11,8±2,69%, «низкий – средний» - 6,3 ± 2,1% и «средний - высокой» 6,2 ± 2,0%. Приведенные данные позволяют сделать вывод, что эффективность использования сыворотки жеребых кобыл зависит от совместного сочетания активности и соотношения ФСГ/ЛГ гормонов в препарате. Поэтому полученные данные имеют особые значения при разработке комплексных индексов отбора СЖК, сочетающие их биологические качества и соотношения ФСГ/ЛГ гормонов в препаратах, которые необходимы для моделирования технологии производства гонадотропных гормонов. 3.3.3 Корреляционный и дисперсионный анализ биологического качества сыворотки жеребых кобыл Исследование биологического качества СЖК показало, большую вариабельность величин концентрации гонадотропных гормонов. При этом, на разнообразие активности СЖК и соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в сыворотке крови существенное влияние оказывают сроки жеребости кобыл. 66 В связи с этим, на основе корреляционного и дисперсионного анализа определяли связи между варьирующими признаками, а также долю влияния факторов обусловливающих большую вариабельность активности и содержания гормонов в препаратах (таблица 16). Таблица 16 - Уровень корреляции между изученными факторами Коррелирующие признаки Возраст доноров - ФСГ/ЛГ r ± mr 0,270 ±0,072 Р < 0,01 Сроки жеребости доноров - ФСГ/ЛГ 0,622 ± 0,051 < 0,001 Возраст доноров – активность СЖК 0,169 ± 0,081 < 0,05 Сроки жеребости доноров – 0,674 ± 0, 045 активность СЖК Соотношение ФСГ/ЛГ - активность 0,485 ± 0,065 СЖК < 0,001 0,001 Коэффициент корреляции между возрастом доноров и активностью сыворотки жеребых кобыл незначителен и недостоверен 0,169 ± 0,081, Р<0,05, Между возрастом доноров и соотношением ФСГ/ЛГ гормонов в сыворотке крови коэффициент корреляции увеличивается до 0,270±0,072 с достоверностью Р<0,01. Корреляции между соотношением ФСГ/ЛГ и активностью значительны 0,485 ± 0,065, с достоверностью Р<0,001. В целом, полученные положительные и достоверные показатели, характеризирующие коррелятивную связь между учтенными признаками, считаем закономерными. Так как, показатели биологического качества сыворотки жеребых кобыл в зависимости от их возраста и сроков жеребости существенно меняются. Поэтому коррелятивная зависимость учетных признаков кобыл-доноров и препарата СЖК имеют большое значение для корректировки метода отбора жеребых кобыл в качестве продуцентов гонадотропных гормонов. Результаты дисперсионного анализа имеют важное значение при выявлении доли изменчивости, у наблюдаемых биологических объектов. В этой связи изучена доля влияния отдельных факторов на изменчивость биологического признака СЖК путем применения метода дисперсионного анализа. Установлено, что варьирование эндокринных показателей у жеребых кобыл обусловлено действием разных факторов. При этом одни факторы, оказывая влияние на учтенные признаки, изменяют их в сторону повышения, а другие факторы, наоборот приводят к снижению их изменчивости (таблица 17). 67 Таблица 17 - Влияние разных факторов на соотношение ФСГ/ЛГ и активность СЖК Факторы Возраст доноров - ФСГ/ЛГ Сроки жеребости доноров - ФСГ/ЛГ Показатели Доля влияния F 0,107 ±0,046 2,33 0,447 ± 0,033 13,54 Р <0,05 <0,001 Возраст доноров – активность СЖК 0,075 ± 0,047 1,60 >0,05 Сроки жеребых доноров – активность 0,687 ± 0,016 СЖК Соотношение ФСГ/ЛГ - активность 0,684 ± 0,024 СЖК 42,9 <0,001 28,5 <0,001 Данные таблицы 17 свидетельствуют о влиянии возраста жеребых кобыл на соотношение ФСГ/ЛГ в сыворотке крови, что составило 0,107±0,046 с достоверностью на уровне первого порога вероятности Р< 0,05, влияние сроков жеребости доноров на уровень концентрации гонадотропных гормонов в сыворотке достоверно выше при значимости Р<0,001 (0,447 ± 0,033). Доля влияния соотношения ФСГ/ЛГ гормонов и сроков жеребости доноров на гонадотропную активность СЖК составило 0,684 ± 0,024 и 0,687± 0,016 при достоверности разности соответствия от 28,5 до 42,9, что достоверно на уровне третьего порога вероятности Р<0,001. Влияние возраста доноров на уровень активности СЖК было очень низким 0,075 ± 0,047 и статически не достоверно Р> 0,05. В целом, влияние учтенных факторов достоверно, кроме фактора – «возраст доноров – активность СЖК». При этом влияние сроков жеребости доноров на соотношение ФСГ/ЛГ составило не менее 36,6% и не более 51,3%, а на активность СЖК в пределах от 65,5% до 71,9%. Влияние возраста доноров на активность СЖК и на соотношение ФСГ/ЛГ в сыворотке не более 9,9% и 20,4% соответственно, а влияние соотношении ФСГ/ЛГ на активность СЖК не менее 63,6% и не более 73,2%. Таким образом, сроки жеребости кобыл-доноров оказывают прямое воздействие на изменение концентрации гонадотропинов и соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в СЖК. 3.4 Использование различных способов получения гонадотропных гормонов из сыворотки жеребых кобыл 3.4.1 Осаждение балластных белков с использованием разных методов Всего взято 278,1 л крови от кобыл-доноров, из которой получено 155,63 л СЖК. В том числе 77,9 л СЖК от первой и 77,73 л от второй группы доноров. Выход СЖК соответственно составил 56,0% и 55,9%, в среднем 56,0% (таблица 18). 68 Таблица 18 - СЖК и ее биологические показатели Показатели Число полученных моносывороток от жеребых кобыл Всего взято крови Получено СЖК Выход СЖК Активность СЖК Средняя активность Среднее соотношение ФСГ/ЛГ Группа доноров I II ед. изм. Всего шт 72 72 144 л л % тыс.м.е м.е/мл 139,1 77,90 56,0 17021,6 218,51 139,0 77,73 55,9 18335,2 235,88 278,1 155,63 56,0 35356,8 227,18 - 3,67:1 3,97:1 3,82:1 Общая биологическая активность полученных СЖК составила 35356,8 тыс/м.е., со средней активностью 227,8 м.е/мл, с соотношением ФСГ/ЛГ гормонов 3,82/1. В настоящее время в воспроизводстве сельскохозяйственных животных не используется нативная СЖК в качестве стимулятора множественной овуляции, из-за содержания в ней большого количества чужеродных белков, которые могут вызвать аллергические реакции организма самок-доноров. Поэтому биологические качества СЖК во многом зависят от степени ее очищенности. Для осаждения балластных белков из СЖК использовали II способа (таблица 19). Таблица 19 - Результаты осаждения балластных белков из СЖК Состав смеси Сыворотка жеребых кобыл, л 10 М уксусная кислота, л 4 М уксусно-кислого натрия, л Этиловый спирт. л Всего получено смеси. л Получено центрифугата Выход центрифугата Получены балластные белки Выход балластных белков Ед.из. л л л л л л % л % способы I (1:1) II (1,2:1) 77,90 77,73 15,033 18,002 6,779 8,116 56,088 67,162 155,8 171,01 71,865 76,10 46,1 44,5 83,935 94,91 53,9 55,5 Всего 155,63 33,035 14,895 123,25 326,81 147,965 45,3 178,845 54,7 Как видно из таблицы 19, из полученного 326,81 л смеси в среднем получено 147,965 л центрифугата и 178,845 л балластных белков, что составило 45,3% и 54,7%. 69 При этом выход центрифугата: в I способе составил 71,865 л (46,1%), во II способе 76,1 л. (44,5%). Выход балластных белков: в I способе составил 83,935 л.(53,9%), во II способе 94,91 литр (55,5%). В целом между I и II способами осаждения балластных белков из СЖК достоверных различий не наблюдается Р>0,05. Аналогичные не достоверные различия по выходу балластных белков и центрифугата, отмечены в сыворотке крови, полученных от кобыл-доноров разных возрастов и в различные сроки жеребости (Приложение Е) Также было изучено влияние возраста кобыл-доноров на выход балластных белков и центрифугата из СЖК. Так, выход балластных белков из СЖК, полученных от 3-х, 10-ти летних жеребых кобыл в среднем составил от 52,4% до 56,0%, выход центрифугата – от 44,0% до 47,6% (таблица 20). Примерно такие же результаты получены при изучении влияния СЖК, полученных от доноров с разными сроками жеребости. При этом выход центрифугата: в I способе составил от 7,04 л до 8,817 л., во II способе от 6,845 л до 9,304 л (таблица 21). Выход балластных белков: в I способе составил от 8,861 до 9,733 л., во II способе от 9,479 л до 10,861 л. Выход балластных белков и центрифугата из сыворотки крови, полученных от доноров с разными сроками жеребости колебался в пределах от 51,1% до 58,9% и от 41,1% до 48,9% соответственно. Таким образом, использованные способы очищения СЖК не оказывают существенного влияния на выход балластных белков и центрифугата. Однако, наблюдается тенденция повышения выхода объема балластных белков и центрифугата из СЖК, полученных от доноров со сроком жеребости от 55-го по 80-й день в зависимости от их возраста. Но эти различия были незначительными и не достоверными. Эти данные еще раз подтверждают о целесообразности использования двух способов при осаждении балластных белков из СЖК. 70 Возраст доноров Объем смеси, л объем, л Объем смеси, л объем, л Объем смеси, л Таблица 20 - Результаты осаждение балластных белков из сывороток крови полученных от кобыл разного возраста объем, л 3 14,80 6,780 45,8 8,020 54,2 15,686 6,840 43,6 8,846 56,4 30,486 13,620 44,7 16,866 55,3 4 19,40 8,960 46,3 10,420 53,7 21,340 9,030 42,3 12,310 57,7 40,740 18,010 44,2 22,730 55,8 5 20,20 9,562 47,3 10,638 52,7 22,0 9,660 43,9 12,340 56,1 42,20 19,222 45,5 22,978 54,5 6 20,20 9,335 46,2 10,865 53,8 22,880 10,359 45,3 12,521 54,7 43,080 19,694 45,7 23,386 54,3 7 21,0 9,996 47,6 11,004 52,4 22,440 10,494 46,8 11,946 53,2 43,440 20,490 47,2 22,950 52,8 8 20,0 9,361 46,8 10,639 53,2 22,660 10,320 45,5 12,340 54,5 42,660 19,681 46,1 22,979 53,9 9 20,0 8,964 44,8 11,036 55,2 22,0 9,730 44,2 12,270 55,8 42,0 18,694 44,5 23,306 55,5 10 20,2 8,887 44,0 11,313 56,0 22,0 9,663 43,9 12,337 56,1 42,2 18,550 44,0 23,650 56,0 155,8 71,865 46,1 83,935 53,9 171,006 76,096 44,5 94,910 55,5 326,806 147,961 45,3 178,845 54,7 Всего I-способ (1:1) Получено Центрифугат Белок % объем ,л % II-способ (1,2:1) Получено Центрифугат 71 Белок % объем, л % Всего Получено Центрифугат Белок % объем, л % 50 55 60 65 70 75 80 Всего 7,044 47,3 9,076 52,7 7,366 43,9 9,394 7,867 44,7 7,858 Получено Центрифугат Белок объем, л % объем, л % 16,324 6,845 41,9 9,479 58,1 56,1 18,370 7,798 42,4 10,572 9,733 55,3 18,854 8,134 43,1 46,2 9,162 53,8 19,118 8,523 8,422 47,1 9,458 52,9 19,80 8,817 47,6 9,703 52,4 8,426 47,5 9,314 8,039 47,6 8,026 71,865 Получено Центрифугат Белок Объем смеси, л 45 16,1 2 16,7 6 17,6 0 17,0 2 17,8 8 18,5 2 17,7 4 16,8 0 17,2 6 155, 8 Получено Центрифугат Белок объем, % объем, л % л Всего Объем смеси, л 40 II-способ (1,2:1) I-способ 5 (1:1) Объем смеси, л Сроки жеребости доноров Таблица 21 - Результаты осаждения балластных белков из сывороток крови полученных от кобыл с разными сроками жеребости объем, л % объем, л % 32,444 13,889 42,8 18,555 57,2 57,6 35,130 15,164 43,2 19,966 56,8 10,720 56,9 36,454 16,001 43,9 20,453 56,1 44,6 10,595 54,4 36,138 16,381 45,3 19,757 54,7 9,074 45,8 10,726 54,2 37,68 17,496 46,4 20,184 53,6 20,064 9,304 46,4 10,760 53,6 38,584 18,121 47,0 20,463 53,0 52,5 20,086 9,225 45,9 10,861 54,1 37,826 17,651 46,7 20,175 53,3 8,861 52,4 19,448 8,942 46,0 10,506 54,0 36,348 16,981 46,7 19,367 53,3 46,5 9,234 53,5 18,942 8,491 44,8 10,451 55,2 36,202 16,517 45,6 19,685 54,4 46,1 83,935 53,9 171,006 76,096 44,5 94,910 55,5 326,806 147,961 45,3 178,845 54,7 72 3.4.2 Биологические качества СЖК после очистки от балластных белков Биологические качества СЖК главным образом зависят от соотношения ФСГ/ЛГ гормонов и имеют важное значение при ускоренном воспроизводстве сельскохозяйственных животных. В этой связи, изучены изменения биологических свойств СЖК, после очистки от балластных белков. После очищения от балластных белков по I и II способу СЖК проявили существенные изменения по соотношению ФСГ/ЛГ гормонов (таблицы 22, 23). При соотношении объема спиртово-кислого раствора и СЖК 1:1, у 3-х летних кобыл-доноров наблюдается снижение соотношения ФСГ/ЛГ гормонов и колеблется от 4,8% до 2,21%, у 4-х летних кобыл-доноров данный показатель колебался от 6,9% до 45,1%, в серии СЖК 5-ти летних доноров – от 8,0% до 20,1%, у 6-ти летних доноров – от 3,5% до 20,2%, в сыворотке крови у 7-ми и 8-ми летних доноров - от 6,1% до 67,1% и 4,7% до 39,2%, у 9-ти и 10-ми летних доноров – от 8,5% до 56,3% и от 7,6% до 42,1% соответственно. При соотношении объема спиртово-кислого раствора и СЖК 1,2:1, от 3-х, 4-х, 5-ти, 6-ти летних доноров изменение соотношения ФСГ/ЛГ гормонов в сыворотках варьировало от 0,9% до 22,4%; от 11,9% до 42,1%, от 11,7% до 36,7% и от 9,7% до 36,3%. Существенные изменения биологических свойств очищенных препаратов по сравнению с нативными препаратами наблюдались в сывороточных гонадотропинах, полученных от жеребых кобыл в возрасте 7-10 лет. При этом фолликулостимулирующая активность гонадотропина снизилась в сывороточном препарате, полученном от 7-ми летних кобыл-доноров на 10,0%- 37,7%, от 8-ми летних - на 11,5%-32,6%, от 9-ти летних – на 8,8%-62,9% и от 10-ти летних доноров – на 9,2%-57,8% (таблица 23). Идентичная вариабельность соотношения ФСГ/ЛГ гормонов установлена в сывороточном гонадотропине после очистки от балластных белков в зависимости от сроков жеребости кобыл-доноров. Не зависимо от способов очистки балластных белков наиболее минимальное снижение гонадотропных гормонов наблюдается в сыворотке доноров со сроком жеребости от 40 до 55 дней. При этом процент снижения ФСГ гормонов в сыворотке был от 3,5% до 26,9% в первом способе, а во втором способе – от 0,9% до 35,4% (таблицы 22,23). В других группах сыворотки, полученных от доноров со сроком жеребости 60 - 80 дней, вариабельность данного показателя составила в пределах от 5,4% до 67,1% и от 3,2% до 62,9% соответственно в зависимости от способов очищение белков. В целом, результаты проведенных исследований показывают, что использованные способы очищения от балластных белков из СЖК оказали слабое влияние на изменение соотношения ФСГ/ЛГ гормонов. Однако в препаратах с низким содержанием гонадотропных гормонов, после очистки их от белков значительно подверглись к изменению соотношения ФСГ/ЛГ гормонов. 73 Отсюда можно заключить, что возможные изменения в количественном спектре гормонов в СЖК при очистке от балластных белков, происходят, когда увеличивается уровень концентрации фолликулостимулирующего гормона у отдельных индивидуумов в определенные сроки жеребости. Это особенно важно при отборе жеребых кобыл в качестве доноров-продуцентов СЖК. 74 Таблица 22 - Соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в препаратах СЖК, полученных от доноров разного возраста и сроков жеребости после очистки от балластных белков по первому способу % потеря после очистки до очистки 6 летние % потеря после очистки до очистки % потеря после очистки до очистки 4 летние 5 летние Соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в препаратах % потеря после очистки 3 летние до очистки Сроки жеребости доноров Возраст доноров 40 2,1/1 1,83/1 12,8 1,28/1 1,12/1 12,5 1,5/1 1,33/1 11,3 2,2/1 1,86/1 16,8 45 2,16/1 1,84/1 14,8 1,78/1 1,63/1 8,4 1,37/1 1,2/1 8,0 2,26/1 1,92/1 15,0 50 2,8/1 2,6/1 7,1 1,84/1 1,71/1 7,1 2,57/1 2,3/1 10,1 2,28/1 2,20/1 3,5 55 2,73/1 2,6/1 4,8 2,43/1 2,13/1 12,3 2,49/1 2,26/1 9,2 2,64/1 2,37/1 10,2 60 3,17/1 3,0/1 5,4 4,12/1 2,26/1 45,1 2,61/1 2,35/1 10,0 3,7/1 3,43/1 7,3 65 3,48/1 3,1/1 10,9 3,73/1 3,4/1 8,8 3,37/1 3,06/1 9,2 3,86/1 3,4/1 11,9 70 4,09/1 3,3/1 19,1 3,65/1 3,4/1 15,1 3,51/1 3,09/1 12,0 3,44/1 3,0/1 12,8 75 4,23/1 3,42/1 19,1 3,46/1 3,22/1 6,9 4,3/1 3,53/1 7,9 4,49/1 3,63/1 19,2 80 5,19/1 4,09/1 2,21 4,34/1 3,5/1 19,3 4,38/1 3,50/1 20,1 6,72/1 5,36/1 20,2 75 Продолжение таблицы 22 7 летние 8 летние 9 летние 10 летние после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря Соотношение ФСГ/ЛГ в препарате до очистки Сроки жеребости доноров Возраст доноров 40 1,4/1 1,25/1 10,7 1,7/1 1,54/1 9,4 1,76/1 1,61 8,5 1,97/1 1,8/1 8,6 45 2,3/1 2,02/1 12,2 1,88/1 1,77/1 5,8 1,34/1 1,21 9,7 1,23/1 1,12/1 8,9 50 2,82/1 2,11/1 25,2 1,9/1 1,81/1 4,7 3,39/1 2,9/1 14,4 2,42/1 2,15/1 11,2 55 2,79/1 2,04/1 26,9 2,67/1 2,34/1 12,3 4,79/1 4,02/1 16,1 3,64/1 3,18/1 12,6 60 4,57/1 3,8/1 16,8 4,77/1 4,05/1 15,1 4,96/1 4,17 15,9 3,68/1 3,4/1 7,6 65 4,51/1 3,43/1 23,9 4,72/1 3,93/1 16,7 4,80/1 3,98/1 17,1 3,57/1 3,1/1 13,2 70 3,31/1 3,0/1 9,4 5,58/1 3,86/1 30,8 7,08/1 4,13/1 41,7 9,27/1 5,52/1 40,4 75 3,3/1 3,1/1 6,1 6,08/1 4,29/1 29,4 3,13/1 1,72/1 45,0 10,04/1 5,81/1 42,1 80 7,6/1 2,5/1 67,1 9,16/1 5,57/1 39,2 5,52/1 2,41/1 56,3 8,24/1 5,82/1 29,4 76 Возраст доноров 3 летние 4 летние 5 летние 6 летние после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря Соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в препаратах до очистки Сроки жеребости доноров Таблица 23 - Соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в препаратах СЖК, полученных от доноров разного возраста и сроков жеребости после очистки от балластных белков по второму способу 40 1,11/1 1,1/1 0,9 2,18/1 1,92/1 11,9 2,13/1 1,88/1 11,7 1,55/1 1,4/1 9,7 45 1,3/1 1,15/1 11,5 2,24/1 1,87/1 16,5 2,29/1 2,01/1 12,7 2,35/1 2,6/1 12,3 50 1,8/1 1,62/1 10,0 3,12/1 2,6/1 16,7 3,14/1 2,6/1 17,2 3,25/1 2,8/1 13,8 55 1,69/1 1,52/1 10,1 3,2/1 2,7/1 15,6 3,28/1 2,8/1 14,6 3,36/1 2,8/1 16,7 60 2,53/1 2,08/1 17,8 2,55/1 2,4/1 42,3 2,75/1 2,3/1 16,4 3,81/1 3,4/1 10,8 65 3,1/1 3,0/1 3,2 4,27/1 3,59/1 15,9 4,2/1 3,53/1 15,9 4,44/1 3,68/1 17,1 70 3,54/1 3,31/1 6,5 4,24/1 3,63/1 14,4 5,44/1 3,46/1 36,4 4,4/1 3,59/1 18,4 75 4,33/1 3,72/1 14,1 5,42/1 3,74/1 31,0 5,34/1 3,38/1 36,7 5,84/1 3,73/1 36,3 80 4,29/1 3,33/1 22,4 5,6/1 3,25/1 42,1 5,8/1 3,92/1 32,4 7,17/1 5,92 17,4 77 Возраст доноров 7 летние 8 летние 9 летние 10 летние после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря до очистки после очистки % потеря Соотношение ФСГ/ЛГ в препарате до очистки Сроки жеребости доноров Продолжение таблицы 23 40 2,65/1 2,22/1 16,2 2,37/1 2,0/1 15,6 1,93/1 1,76 8,8 1,73/1 1,57/1 9,2 45 3,22/1 2,70/1 16,1 2,5/1 2,22/1 11,2 2,33/1 2,07/1 11,2 2,38/1 2,1/1 11,8 50 2,71/1 2,43/1 10,3 3,33/1 2,8/1 15,9 2,4/1 2,13/1 11,2 2,46/1 2,1/1 14,6 55 2,6/1 2,34/1 10,0 3,4/1 2,9/1 14,7 3,6/1 3,1/1 13,9 4,83/1 3,12/1 35,4 60 3,91/1 3,4/1 13,0 3,84/1 3,4/1 11,5 4,88/1 4,1/1 16,0 4,93/1 4,1/1 16,8 65 4,6/1 3,85/1 16,3 3,84/1 3,4/1 11,5 3,71/1 3,3/1 11,0 4,9/1 4,02/1 17,9 70 5,91/1 3,73/1 36,9 4,69/1 3,71/1 20,9 6,33/1 2,35/1 62,9 6,42/1 2,93/1 54,4 75 5,65/1 3,52/1 37,7 4,66/1 3,67/1 21,2 11,35/1 5,65/1 50,2 5,1/1 2,05/1 57,8 80 6,2/1 4,53/1 26,9 6,8/1 4,58/1 32,6 8,56/1 6,3/1 26,4 6,36/1 3,73/1 41,3 78 3.5 Получение гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл 3.5.1 Получение сырого гонадотропина с использованием разных способов Для осаждения сырого гонадотропина из СЖК по принципу аналогов использовали II способа. I-способ, к объему центрифугата, полученного после очистки от балластных белков добавляли охлажденный до 50С этиловый спирт в соотношении 1:1,2. Смесь выдерживали для осаждения гонадотропина в течение 2 часов. II-способ, к объему центрифугата, полученного после очистки от балластных белков добавляли охлажденный до 100С этиловый спирт в соотношении 1:1. Смесь выдерживали для осаждения гонадотропина в течение 6 часов. Результаты получения сырой массы гонадотропина из СЖК полученного от кобыл разного возраста с использованием двух способов приведены в таблице 24. Таблица 24 - Выход сырого гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл полученных от кобыл разного возраста Возраст доноров 3 4 5 6 7 8 9 10 В среднем I-способ М±m 740,8±25,49 978,2±42,03 104,2±37,61 997,2±55,84 1088,3±28,23 1005,9±42,83 954,9±49,32 933,3±47,33 965,0±18,7 II-способ М±m 706,1±23,3 921,8±36,47 986,0±50,0 1049,6±56,0 1087,0±57,71 1070,8±45,17 965,0±58,58 978,8±52,52 970,6±21,8 Всего М±m 723,4±37,7 950,0±28,6 1003,6±31,5 1023,4±100,0 1087,7±32,1 1038,3±32,0 959,9±38,3 956,0±35,7 967,8±14,2 Выход сырой массы гонадотропина из сывороток, полученных от разных по возрасту кобыл-доноров было относительно равное. В I способе выход составил от 740,8±25,49 мг до 1088±28,23 мг., во II способе от 706,1±23,3 мг до 1087±57,71 мг. Следует отметить, что выход сырого гонадотропина из СЖК 3-х летних кобыл-доноров оказался низким, сыворотки крови 5-ти, 7-ми, 8-ми летних кобыл-доноров показали более высокую результативность. Сыворотки крови оставшихся кобыл-доноров занимали промежуточное положение. Выход сырого гонадотропина из СЖК 3-х летних кобыл-доноров в среднем ниже от 226,6 до 364,3 г по сравнению с другими группами. Разница высокодостоверна Р<0,001. Идентичная тенденция установлена по выходу сырого гонадотропина из сыворотки крови кобыл-доноров с разными сроками жеребости (таблица 25). 79 Таблица 25 - Выход сырого гонадотропина из сыворотки крови полученых от доноров с разными сроками жеребости Возраст доноров 40 45 50 55 60 65 70 75 80 В среднем I-способ М±m 802,6±32,54 851,7±37,03 925,5±40,6 944,5±58,2 1050,4±48,0 1115,5±40,9 1042,5±44,2 992,9±52,9 969,2±44,8 965,0±18,7 II-способ М±m 722,7±36,8 850,2±41,5 911,6±45,3 969,5±46,5 1073,9±61,3 1112,1±52,7 1081,650,0 1041,7±60,2 972,1±51,0 970,6±21,8 Всего М±m 762,7±26,52 851,0±27,85 918,5±30,50 957,0±37,42 1062,1±39,0 1113,8±33,4 1062,1±33,7 1017,3±40,5 970,7±33,95 967,8±14,2 Выход сырого гонадотропина в зависимости от сроков жеребости в I способе составил от 802,6±32,54 мг до 1115,5±40,90 мг., во II способе – от 722,7±36,8 мг до 1112,1±52,7 мг. В целом, между использованными способами получения сырого гонадотропина достоверных отличий не установлено. Однако, следует отметить, значительное влияние на выход сырого гонадотропина оказали сроки жеребости кобыл-доноров. При этом, максимальный выход сырого гонадотропина показали сыворотки, полученные от доноров со сроком жеребости 60-75 дней, а минимальный показатель отмечен в сыворотке у доноров со сроком жеребости 40-45 дней. Различия по выходу сырого гонадотропина между этими группами высокодостоверны Р<0,001. При этом максимальный выход сырого гонадотропина получен из сыворотки 3-х, 5-ти летних кобыл-доноров со сроком жеребости 65-80 дней и не зависимо от способов их получения составил от 1569 мг до 2360 мг, а минимальный выход установлен в сыворотках, полученных от доноров со сроком жеребости 40-45 дней. Выход сырой массы гонадотропина 6-ти, 8-ми летних кобыл-доноров со сроком жеребости 60-70 дней составил от 2204 мг до 2471 мг. Высокий выход сырого гонадотропина показали СЖК, полученные от кобыл-доноров в возрасте 9-10 лет, со сроком жеребости 55-65 дней. Выход сырого гонадотропина колебался от 2021 мг до 2334 мг. В целом, между использованными методами получения сырого гонадотропина достоверных различий не установлено. В среднем всего получено 139,364 г сырой массы гонадотропина. Таким образом, на выход сырого гонадотропина значительное влияние оказали возраст и сроки жеребости кобыл-доноров. 80 3.5.2 Получение сухого гонадотропина Как известно, сублимационная сушка основана на способности льда при определенных условиях испаряться, минуя жидкую фазу. Данная сушка – превосходный метод сохранения различных пищевых продуктов и ингредиентов. Продукт при этом не оттаивает и сохраняет свое качество. Целью сублимационной сушки в данных исследованиях являлось выведение воды из сырого гонадотропина и получение очень легко растворимого сухого препарата ГСЖК. Изучено влияние сырого гонадотропина, выделенного из СЖК полученных от кобыл разного возраста на выход сухого гонадотропина. Полученные результаты показывают, что влияние возраста кобыл-доноров на выход сухого гонадотропина не существенно (таблица 26). Таблица 26 - Выход сухого препарата из сырого гонадотропина в зависимости от возраста доноров Возраст кобыл доноров 3 4 5 6 7 8 9 10 Всего Выход сухого гонадотропина Объем сырого гонадотропина, мг Всего, мг % 13022 17100 18065 18421 19578 18690 17279 17209 139364 6,889 8,964 9,222 9,793 10,143 9,981 9,228 12,191 76,411 0,053 0,032 0,051 0,053 0,052 0,053 0,053 0,071 0,055 М±m 0,383±0,040 0,497±0,049 0,512±0,045 0,544±0,040 0,563±0,033 0,554±0,034 0,513±0,039 0,511±0,028 0,51±0,010 При этом выход сухого гонадотропного гормона после сублимационной сушки колебался от 0,051% до 0,071%. Из сырой массы сыворотки: -3-летних кобыл-доноров получено 6,889 мг сухого гонадотропина, со средним значением 0,383±0,040 мг; - 4-летних кобыл-доноров получено 8,964 мг, в целом 0,497±0,040 мг; - 5-и, 6-и летних кобыл-доноров получено 9,222мг и 9,793 мг, в целом 0,512±0,045 и 0,544±0,040 мг; - 7-и летних кобыл-доноров -10,143 мг, в среднем 4,563±0,033 мг, - 8-и, 9-и летних кобыл-доноров – 9,981 и 9,228 мг - 10-и летних кобыл-доноров 12,191 мг, в среднем 0,511±0,028 мг. 81 Рисунок 16 – Удаление влаги при низкой температуре Рисунок 17 – Удаление из ГСЖК замороженной влаги Более значимое отклонение по выходу сухого гонадотропина наблюдалось в группе сырой продукции, полученной из СЖК с разными сроками жеребости (таблица 27). Выход сухого гонадотропина из объема сырого гонадотропина составил от 0,026% до 0,060%. При этом минимальный объем сухого гонадотропина получен из СЖК кобыл-доноров со сроком жеребости 40 дней, максимальный объем целевого препарата получен из сырого гонадотропина кобыл-доноров со сроком жеребости 60-80дней. 82 Таблица 27 - Выход сухого препарата из сырого гонадотропина в зависимости от сроков жеребости доноров Сроки жеребости доноров 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Всего Объем сырого гонадотропина, мг 12153 13586 14697 15410 16994 17821 16993 16277 15531 139364 Выход сухого гонадотропина Всего, мг % М±m 3,126 6,087 7,509 7,982 9,517 10,220 10,132 9,440 9,388 76,411 0,026 0,045 0,051 0,052 0,056 0,057 0,060 0,058 0,060 0,055 0,195±0,018 0,380±0,030 0,469±0,038 0,499±0,034 0,595±0,021 0,639±0,018 0,633±0,017 0,590±0,026 0,587±0,046 0,510±0,010 Объем сухого гонадотропина после высушивания составил от 9,388 до 10,220 г, в среднем в пределе от 0,587±0,046 до 0,639±0,018 мг. Выход сухого гонадотропина из сырой массы СЖК остальных кобылдоноров занимали промежуточное положение, в среднем составило 0,380±0,020 и 0,490±0,034 мг. Таким образом, на выход сухого гонадотропина значительное влияние оказывает сроки жеребости кобыл-доноров. 3.5.3 Выход гонадотропного гормона из исходного сырья и определение его биологической активности Главным критерием оценки эффективности способов получения гонадотропного гормона из СЖК, является уровень выхода очищенного гонадотропина, сохранения в нем исходной гормональной активности, оптимальное соотношение ФСГ/ЛГ гормонов в получаемом препарате после очищения от балластных белков и сублимационной сушки. Оценивая степень эффективности различных способов получения гонадотропина, изучены влияния сывороток полученных от доноров разного возраста и в различные сроки жеребости на уровень выхода получаемого препарата и его гонадотропную активность (таблица 28). Таблица 28 - Выход гонадотропного препарата при использовании разных методов их получения Показатели Ед. изм Объем нативного СЖК Общая активность СЖК л м.е Способы I 77,9 17024100 83 II 77,73 18335200 Всего 155,63 3535 9300 продолжение таблицы – 28 Объем сухого СЖК Общая активность ГСЖК Выход гонадотропных гормонов м.е 35,8 37,601 73,404 м.е 11498186 12582780 24080966 % 67,5 68,6 68,1 Исследования показали, что при использовании I-способа, выход гонадотропного гормона из СЖК полученных от кобыл-доноров разного возраста, разных сроках жеребости колебался от 12,1% до 83,3%, а во II способе – от 11,8% до 83,8% (приложение Ж). В среднем выход гормонов по гонадотропной активности составил в I способе 67,5% и во II способе 68,6%. В целом, между разными способами получения гонадотропина из СЖК достоверных различий не обнаружено. Приведенные материалы еще раз подтверждают о целесообразности отбора жеребых кобыл по комплексу признаков, в частности учета их возраста и сроков жеребости, для повышения выхода гонадотропного гормона из исходного сырья. В этой связи особый интерес представляют результаты исследования представленные в таблице 29. В таблице приведена эффективность получения гонадотропина из СЖК с учетом возраста и сроков жеребости кобыл-доноров. Высокий выход гонадотропина установлен у 3-х, 5-ти летних кобылдоноров со сроком жеребости 65-80 дней и составил 72,0-80,4%. Аналогичные результаты получены из сыворотках крови от 6-ти, 8-ми летних животных между 60-75 днями жеребости. Повышение выхода гонадотропного гормона из исходной сыворотки крови в данных группах доноров доходила от 70,9% до 82,9%. А эффективный выход гормонов по гонадотропной активности в расчете на использованный объем СЖК более старшего возраста между 55-65 днями жеребости в среднем составил 70,8-78,7%. В остальных группах доноров наблюдается низкий (20,6-49,9%) и средний (52,8-68,3%) выход гонадотропина. Выявленные различия в показателях выхода гормонов из сыворотки крови у генотипически разных животных-продуцентов ГСЖК с разными сроками жеребости могут быть основным фактором, определяющим увеличение выхода гонадотропного гормона из исходного сырья. Следовательно, новым методическим приемом в технологии получения гонадотропина из СЖК. 84 Таблица 29 - Выход гонадотропного гормона из сыворотки жеребых кобыл разного возраста и сроков жеребости Сроки жеребости доноров 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Возраст доноров 3 4 5 6 7 8 9 10 23,5 35,9 38,6 43,5 57,6 79,5 78,1 78,0 72,0 20,6 36,2 48,5 55,2 62,7 80,2 81,0 78,8 75,9 23,0 46,7 52,8 58,4 68,3 75,5 80,4 80,1 75,7 25,1 49,9 57,0 64,8 78,9 82,9 74,6 75,4 62,9 32,9 57,7 60,7 65,5 81,2 79,0 75,7 70,9 65,1 40,2 48,6 55,0 63,5 81,5 81,7 76,1 75,0 66,7 25,8 47,8 59,2 70,8 78,0 77,0 66,5 59,7 49,2 36,8 57,4 66,9 72,8 78,7 74,5 66,1 57,4 57,0 85 Для подтверждения объективности полученных результатов, методом дисперсионного анализа однофакторных и двухфакторных комплексов вычислили долю влияния различных факторов на выход гонадотропного гормона из нативной СЖК. Результаты дисперсионного анализа приведены в таблице 30. Таблица 30 - Доля влияния изученных факторов выхода гонадотропного гормона из СЖК Факторы Способы получения гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл Возраст жеребых кобыл-доноров Сроки жеребости кобыл-доноров Показатели доли влияния факторов Доля влияния Достоверность Порог достоверности 0,113±0,003 F=37,7 P<0,001 0,307±0,23 F=13,3 P<0,001 0,733±0,016 F=45,8 P<0,001 Влияние каждого фактора на выход гонадотропного гормона достоверен, но неодинаков. Например, влияние использованных способов получения гонадотропина из СЖК составило h2 x = 0,0113±0,003; F=37,7; Р<0,001, доля влияние возраста жеребых кобыл-доноров- h2 x = 0,307±0,023, F= 13,3 и Р<0,001. Доля влияние главного фактора - сроков жеребости кобыл-доноров на выход гонадотропина составило h2 x = 0,733±0,016, F= 45,8, Р<0,001. В целом, дисперсионный анализ подтверждает достоверность влияния сроков жеребости на результативность получения гонадотропина из СЖК. При этом, влияние данного фактора на выход гонадотропного гормона из СЖК составило в пределах от 70,0% до 77,0%, а остальных факторов – от 10,0% до 35,0%. 80 =57 75 =57,4 70 =66,1 65 =74,5 60 =78,7 55 =72,8 50 =66,9 45 =57,4 40 =36,8 80 =49,2 75 =59,7 80 =72 75 =78 70 =78,1 65 =79,5 60 =57,6 55 =43,5 50 =38,6 45 =35,9 40 =23,5 60 =62,7 55 =55,2 50 =48,5 40 =20,6 45 =36,2 70 =66,5 65 =77 65 =80,2 70 75 =81=78,8 80 =75,9 60 =78 55 =70,8 45 =47,8 50 =59,2 40 =23 40 =25,8 45 =46,7 50 =52,8 55 =58,4 60 =68,3 80 =66,7 75 =75 70 =76,1 65 =81,7 45 =48,6 40 =40,2 60 =81,550 =55 55 =63,5 40 =32,9 40 =25,1 65 =75,5 45 =49,9 50 =57 55 =64,8 70 =80,4 60 =78,9 45 =57,7 50 =60,7 75 =70,9 70 =75,765 =79 80 =65,1 55 =65,5 60 =81,2 75 =80,1 80 =75,7 65 =82,9 70 =74,6 75 =75,4 80 =62,9 3 лет 4 лет 5 лет 6 лет 7 лет 8 лет 9 лет 10 лет Рисунок 18 - Выход гонадотропных гормонов из СЖК разного возраста и сроков жеребости Одним из главных показателей в технологии получения гонадотропина из СЖК является степень концентрации гонадотропных гормонов по активности после осаждения белков и гонадотропина. В этой связи, изучены влияние технологического процесса получения гонадотропина из сыворотки крови и биологические качества исходного препарата на его гонадотропную активность. В результате исследования установлено, что во всех препаратах содержание гонадотропина и их концентрация не одинакова и имеет значительные колебания. В препарате полученном из сыворотки крови 3-х летних доноров установлена повышенная концентрация гонадотропина в пределах от 7,0% до 33,0% по сравнению до их очистки. от доноров 4 летнего возраста – от 13,0% до 64,0%, у доноров 5 летнего возраста – от 18,0% до 62,0%, у 6 летних доноров – от 7,0 до 50,0%, у 7 летних доноров – от 7,0% до 60,0%, у 8 летних 87 доноров – от 7,0% до 47,0%, у доноров 9 и 10 летнего возраста – от 11,0% до 52,0% и от 9,0% до 67,0% соответственно. Аналогичные данные о повышении концентрации гонадотропина после очистки, наблюдаются в препарате, полученном от доноров с разными сроками жеребости. Так, например, в препарате полученном от доноров со сроком жеребости 40 дней концентрация гормонов больше на 25,0% - 50,0% по сравнению до очистки. Концентрация гонадотропина в препарате, полученном от доноров со сроком жеребости 45 дней выше на 9,0-50,0%, а в препарате, полученные от доноров со сроком жеребости 50-55 дней данный показатель составил в пределах от 7,0% до 67,0%. В препарате, полученном от доноров со сроком жеребости 60-65 дней также отмечено повышенное содержание гонадотропина и находился в пределах от 25,0% до 60,0% и от 11,0% до 54,0% соответственно. Концентрация гормонов в препарате, полученном от доноров со сроком жеребости 70-75-80 дней было больше в пределах от 7,0% до 54,0% по сравнению с неочищенной сывороткой жеребых кобыл. В целом, анализируя полученных результаты можно заметить, что концентрация гонадотропина в препаратах, полученных от доноров со сроком жеребости 55-65 дней несколько выше (от 18,0% до 24,0%) по сравнению с другими препаратами. Изменчивость концентрации гонадотропина, связано с индивидуально - физиологическим состоянием организма животных – доноров и с условием среды. Таким образом, в результате изучения единого комплекса всей технологии получения гонадотропина из СЖК, включающая отбор доноров по возрасту и срокам жеребости, взятие крови, приготовление нативного СЖК, осаждение балластных белков и гонадотропина, определение активности и соотношение ФСГ/ЛГ в препарате, высушивание и получение сухого гонадотропина и учет выхода гормонов по гонадотропной активности, установлено: - различие гормонообразовательной способности организма между разными генотипами жеребых кобыл существенна, даже у одновозрастных кобыл-доноров в разные сроки жеребости концентрация не одинакова; - в зависимости от потребности в гормонах, саморегулятивная функция организма жеребых кобыл в случае необходимости в определенный период повышает или понижает их концентрацию; - высокая вариабельность концентрации гонадотропных гормонов СЖК зависит от доноров разных возрастов и с разными сроками жеребости; - высокая изменчивость соотношения ФСГ ЛГ гормонов в полученных препаратах; - не учет биологического свойства препарата СЖК до и после очистки от балластных белков и осаждения гонадотропина; -не изученность влияния возраста и срока жеребости на выход гонадотропных гормонов; 88 - способы получения гонадотропина из СЖК не оказывают отрицательного влияния на качество и выход гормонов по гонадотропной активности после осаждения балластных веществ и гонадотропина; Наряду с положительной стороной у этих способов имеется отрицательная сторона – вызывает широкий диапазон колебания выхода целевого продукта, что снижает эффективность производства гонадотропных гормонов. Такая высокая изменчивость выхода гонадотропного гормона из исходного сырья объясняется многочисленными факторами, прежде всего от не учета дня взятия сыворотки в период жеребости кобыл-доноров. Учитывая положительные и отрицательные стороны известных способов получения гонадотропина из СЖК, нами разработан новый способ отбора разновозрастных групп животных – доноров по срокам их жеребости. 3.5.4 Результаты получения гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл при использовании разных методов Техническая задача нового способа получения гонадотропина из СЖК, заключается в выявлении продуктивных дней у жеребых кобыл – доноров разного возраста, обеспечивающая высокий выход гормонов с гонадотропной активностью и оптимальным соотношением ФСГ/ЛГ гормонов. Результаты нового способа получения гонадотропина из СЖК основываются на методах осаждения балластных белков и гонадотропинов, определения гормональной активности, соотношение ФСГ/ЛГ гормонов, отличающийся тем, что в качестве продуцентов ГСЖК отбирают 3-5 летних кобыл-доноров со сроком жеребости 65-85 дней, 6-8 летних кобыл-доноров со сроком жеребости 60-75 дней и 9-10 летних доноров со сроком жеребости 55-65 дней. Данная разработка обеспечивает высокий выход гонадотропного гормона из исходного сырья и стабилизирует их изменчивость. Результаты получения гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл при использования разных методов приведены в таблице 31 Таблица 31 - Результаты получения гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл при использования разных методов Показатели Ед.изм. Всего взято крови Получено СЖК Получено после осаждения балластных белков: Белки Центрифугаты л л л л Способы Традиционный Новый 278,1 116,0 155,63 67,71 1,240±0,013 1,029±0,012 89 1,250±0,020 1,114±0,019 Продолжение таблицы 31 Получение сырого гонадотропина после осаждения Получение сухого гонадотропина после сублимационной сушки Выход сухого гонадотропина на один литр СЖК Выход сухого гонадотропина гормона из исходного сырья Гонадотропная активность препарата: до очистки после очистки Соотношение ФСГ/ЛГ: до очистки после очистки г 967,8±14,2 1090,85±17,6 г 73,404 37,614 г 0,472±0,007 0,556±0,014 % 68,1 79,8 м.е/мл м.е/мг 222,2±6,052 296,9±8,466 282,0±3,108 394,5±6,889 3,81/1±0,133 2,94/1±0,091 4,39/1±0,098 3,53/1±0,039 Использование нового способа позволило повысить выход центрифугата после осаждения балластных белков на 8,3%, выход сырого гонадотропина на 12,7%, сухого гонадотропина на один литр СЖК на 17,8%, гонадотропного гормона из исходного сырья на 11,7%, степень концентрации гормонов после очистки на 97,6 ме/мг и уменьшить снижение соотношения ФСГ/ЛГ гормонов после очистки на 5,2% по сравнению с традиционным способом. Полученные разницы между способами в целевых показателях статистически высокодостоверны (Р<0,001), что свидетельствует о высокой эффективности нового способа при получении гонадотропина из СЖК. Таким образом, преимущество нового способа по сравнению с традиционным заключается в следующем: • позволяет максимально сократить низко результативный отбор жеребых кобыл и кратность взятия крови; • повышает точность отбора потенциальных жеребых доноров продуцентов СЖК; • позволяет получить выход сухого гонадотропина с активностью 300-470 м.е/мг и с соотношением ФСГ/ЛГ гормонов в пределах 3,0/1-4,6/1; • повышает выход гонадотропина из СЖК в пределах от 70,7% до 83,8%; • стабилизирует изменчивость выхода гонадотропного гормона из исходного сырья. 3.6 Использование ГСЖК в трансплантации эмбрионов у овец В животноводстве, представляющем собой важный сектор аграрного комплекса, необходимо повысить продуктивность и регулирование 90 воспроизводительной функции сельскохозяйственных животных, сохранить и размножить генофонд животных биотехнологическими методами, в том числе методом трансплантации эмбрионов [18, с.1-3]. Изучено стимулирующее действие сухого гонадотропного гормона, полученного из СЖК с учетом и без учета возраста и сроков жеребости на овуляцию овцематок. I группу овцематок-доноров обрабатывали ГСЖК полученным традиционным способом, II группу ГСЖК полученным новым способом (таблица 32). Таблица 32 - Реакция яичников овцематок на ГСЖК Показатели Ед. изм. 1 2 гол. шт. Число доноров Число овулировавших фолликулов На одного донора Число неовулировавших фолликулов На одного донора в т. ч. доноры с овуляцией 1-3 (низкий) 4-6 (средний) 7-9 (высокий) 10 и более (очень высокий) Доля доноров с суперовуляцией Способ традиционный новый 3 4 25 25 179 264 шт. шт. 7,16±0,71 49 10,56±0,54 42 шт. 1,96±0,31 1,68±0,24 % 24,0±8,5 8,0±5,4 44,0±9,9 24,0±8,5 76,0 4,0±3,9 40,0±9,9 56,0±9,9 100,0 % % % В результате исследования установлено, что овцематки-доноры I группы в среднем имели 7,16±0,71 овуляции на донора, тогда как овцематки-доноры II группы имели 10,56±0,54 овуляции на донора. Число овуляций у овцематок-доноров обработанных ГСЖК, полученным новым способом было достоверно больше (Р<0,001). Также для вызывания суперовуляции, был проведен анализ индивидуальной реакции яичников овцематок-доноров, обработанных ГСЖК, полученным из СЖК новым и традиционным способом. Для установления овуляторного статуса яичников доноров, овцематкидоноры были подразделены на группы: «низкая» – доноры, имеющие в яичнике 1 - 3 овуляций; «средняя» – доноры, имеющие в яичнике 4 - 6 овуляций; «высокая» – доноры, имеющие в яичнике 7 - 9 овуляций; «очень высокая» - доноры, имеющие в яичнике 10 и больше овуляций. 91 Основная масса овцематок-доноров обработанных ГСЖК полученным традиционным способом имели средний статус - 52,0±9,9%, доля животных с низким и очень высоким статусом составило - 24,0±8,5%. У овцематок-доноров, подвергнутых инъекции ГСЖК, полученным новым способом обнаружена высокая тенденция стимулирующего эффекта данного препарата. Так, например, число животных со средней и высокой реакцией яичников, с суперовуляцией составило 40,0±9,9% и 56,0±9,9%. И наоборот, доноры с низкой чувствительностью яичников к новым гонадотропинам были минимальными - 4,0%. В целом, число животных с суперовуляцией яичников было достоверно выше (Р<0,01) во II группе, чем у животных I группы. Таким образом, причиной понижения реакции яичников овцематокдоноров обработанных ГСЖК полученным традиционным способом, является широкая вариабельность гонадотропной активности. Поэтому, установленные индивидуальные различия реакции яичников у овцематок с суперовуляцией на одну и ту же дозу гонадотропина еще раз убедительно свидетельствуют об эффективности учета возраста и сроков жеребости кобыл-доноров при отборе их в качестве продуцента СЖК. В технологии трансплантации эмбрионов главным показателем указывающим эффективность методов индукции суперовуляции является не только оценка чувствительности животных к гормональным препаратам по числу овуляций, но и получение большого числа полноценных эмбрионов. В связи с этим, в процессе исследования проведено промывание рогов матки овцематок-доноров обработанными препаратами ГСЖК полученными традиционным и новым способом (таблица 33). Таблица 33 - Результаты вымывания рогов матки доноров, обработанных разными гормональными препаратами Показатели Ед.изм. Обработано доноров Всего извлечено эмбрионов и яйцеклетки В том числе: гол. Эмбрионы На одного донора Яйцеклетки На одного донора Способ традиционный новый 25 25 шт. 153 238 шт. % шт. шт. % шт. 141 92,2 5,64±0,62 12 7,8 0,48±0,13 215 91,9 8,72±0,27 20 8,4 0,80±0,16 92 Стадии развития эмбрионов,% Как видно из данных таблицы 33, после промывания рогов матки всего извлечено 391 яйцеклеток и эмбрионов. При этом после обработки доноров ГСЖК, полученным новым способом извлечено 215 штук эмбрионов и 20 штук неоплодотворенных яйцеклеток, что составило 91,9% и 8,4%, у овцематок-доноров обработанных ГСЖК, полученным традиционным способом число эмбрионов и яйцеклеток составило 141 штук (92,2%) и 12 штук (7,8%). Среднее число вымытых эмбрионов на одного донора составило 8,72±0,27 штук при новом способе и при базовом – 5,64±0,62 штук, что меньше на 3 эмбриона. Имеющиеся различия по выходу эмбрионов между сравниваемыми способами статистически высокодостоверны Р<0,001. Разница по выходу неоплодотворенных яйцеклеток между сравниваемыми группами статистически недостоверна Р<0,05. При оценке жизнеспособности эмбрионов учитывали стадию развития эмбриона, определяли морфологическое состояние эмбриона и состояние хронологического возраста. Исходя из этих критериев, устанавливали качество эмбриона и его пригодность для дальнейшего использования. В процессе работы были изучены и оценены стадии развития 356 эмбрионов полученных от овцематок-доноров, обработанных ГСЖК полученным традиционным и новым способами. Из 356 эмбрионов 141 шт. получены традиционным способом, 215 шт. новым способом. 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 традиционный новый бластомеры морула ранние морула поздние бластоцисты Стадии развития эмбрионов Рисунок 19 - Развитие эмбрионов у доноров В результате исследования не обнаружено существенного различия на стадиях развития эмбрионов, полученных при индукции суперовуляции разными препаратами. 93 Меньше всего эмбрионов получено на ранних стадиях развития (бластомеры 2-12 клеточные) что составило 3,5±1,5% и 3,7±1,2%; эмбрионы на стадии морулы ранние – 48,9±4,2% и 50,7±3,4; морулы поздние 36,9±4,0% и 36,7±3,3%; на стадии бластоцисты - 10,6±2,6% и 8,8±1,9%. В целом, стадия развития извлеченных из рог матки доноров были в основном морулы ранние и поздние, т.е. соответствуют возрасту эмбрионов. Таким образом эмбрионы полученные после обработки доноров разными препаратами по стадии развития статистически недостоверны Р<0,05. Примерно такая же недостоверная тенденция наблюдается по качеству эмбрионов у доноров обработанных ГСЖК полученным традиционным и новым способами. Идентификацию на основании морфологических признаков уровня развития и степени жизнеспособности эмбрионов проводили по шкале оценки качества. Отличные эмбрионы, хорошие эмбрионы, удовлетворительные эмбрионы, дегенерированные эмбрионы. Биологически полноценными считали зародыши, имеющие шарообразную форму, гомогенную цитоплазму, неповрежденную оболочку, одинакового размера бластомеры. 70,00 60,00 качество эмбрионов,% 50,00 40,00 30,00 традиционный 20,00 новый 10,00 0,00 морфологическая оценка эмбрионов Рисунок 20 - Качество эмбрионов полученных от доноров Исследования по морфологической оценке показали, что из общего числа 356 эмбрионов, овцематки-доноры, обработанные ГСЖК традиционным способом имели 30 эмбрионов отличного качества (21,3±3,4%), хорошего качества 55,3±4,2%, удовлетворительного качества 94 17,7±3,2%, при новом способе 65,1 отличного качества (30,3±3,9%), удовлетворительного качества 8,8±1,9%, дегенерированного качества 2,3±1,0%. Как видно из приведенных данных разница по качеству эмбрионов доноров между сравниваемыми способами незначительна и недостоверна Р>0,05. Овцематки-доноры обработанные ГСЖК полученными традиционными и новыми технологическими методами, с целью вызывания суперовуляции отличались по реактивности яичников после гормональной обработки и по числу эмбрионов на донора. Внедрение нового гонадотропного препарата, полученного из СЖК с учетом возраста и сроков жеребости в технологии трансплантации эмбрионов позволило увеличить число овуляции на 1,4 раза на донора, долю овцематок доноров с суперовуляцией на 20,0% и число эмбрионов на донора 1,5 раза. Таким образом, в результате проведенных исследований по изучению основных этапов технологии получения гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл и использования его в трансплантации эмбрионов у овец был установлен ряд закономерностей, имеющих как теоретическое, так и практическое значение. В целом, результаты проведенных исследований указывают о высокой эффективности разработанного нового приема отбора жеребых кобыл в качестве продуцентов ГСЖК, позволяющий не только повысить выход гонадотропина с оптимальным преобладанием ФСГ из исходного сырья, но и способствующий индукции множественной овуляции и получению максимально большего количества полноценных эмбрионов. 95 4 ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ При определении экономической эффективности нового и традиционного способа получения гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл, а также использования его в трансплантации эмбрионов у овец учитывали затраты, необходимые для достижения целевого продукта (таблица 34). Таблица 34 - Экономическая эффективность исследований Показатели Ед.изм Всего взято крови Затраты на 1 л крови Всего затраты на взятие крови Получено СЖК Расходы на получении СЖК Расход на 1 л СЖК Заработная плата и прочие расходы Командировочные расходы Общая стоимость способов Себестоимость 1 л СЖК Всего приготовлено сухого гонадотропина Расходы на 1г сухого ГСЖК Стоимость 1 мг ГСЖК Расход сухого ГСЖК на дозах Объем 1 овце дозы Стоимость 1 овцедозы Обработка доноров Общий расход доноров Получено эмбрионов Число эмбрионов на донора Себестоимость 1 эмбрион л тенге тенге л тенге тенге Способы традиционные новые 278,1 116 2000 2000 556200 232000 155,53 67,71 278460 121228 1790,40 1790,40 тенге 529243,77 220694,65 тенге тенге тенге 397073,96 1760977,73 11322,43 165579,84 739502,49 10921,61 г 73,414 37,614 тенге тенге ие/мг мг тенге гол. тенге шт шт тенге 23986,95 23,99 1200 9,7 232,7 25 5817,57 141 5,64 41,26 19660,30 19,66 1200 7,3 143,52 25 3587,95 218 8,72 16,46 Экономический анализ производственных затрат из расходованных на получения одного литра СЖК показал, что коэффициент эффективности традиционного способа ниже по сравнению с новым способом. Например, при одинаковым расходе на 1 литр СЖК, себестоимость одного литра СЖК в базовом способе составила 11322,43 тенге, а в новом варианте – 10921,61 тенге, что меньше на 400,82 тенге. Такая ощутимая разница наблюдается при получения сухого гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл. Так, при применения базового способа расходы на один грамм сухого гонадотропина составил 23986,95 96 тенге и в новом варианте получения сухого препарата данный показатель составил 19660,30 тенге. При этом разница расходы на 1 г сухого ГСЖК между сравниваемыми способами существенная и составила 4326,65 тенге. В результате этого себестоимость 1 мг сухого гонадотропина по сравнению с контрольными на 18,0%. Отбор кобыл-доноров с учетом возраста и сроки жеребости в качестве продуцента ГСЖК способствовало повышению гонадотропной активности в приготовленных препаратах и снижению овцедозы при их обработке на 1,3 раза. Полученный гонадотропин СЖК с использованием нового способа при индукции суперовуляции в яичниках у доноров позволила вымыть 218 эмбрионов при затрате 3587,95 тенге, а традиционный способ при затрате 5817,57 тенге – 141 эмбрионов. При этом, в новом способе на получения одного эмбриона в среднем затрачено 41,26 тенге, а при использования препарата нового типа – 16,46 тенге. Экономический эффект от использования гонадотропина нового образца составил 24,80 тенге с каждого эмбриона. 97 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Диссертация работа посвящена решению актуальной проблемы производства остродефицитных отечественных гормональных препаратов, используемых в воспроизводстве сельскохозяйственных животных. В результате исследований разработан эффективный способ получения гонадотропина сыворотки жеребых кобыл с высокой биологической активностью и оптимальными соотношениями фолликулостимулирущих и лютеинизирующих гормонов, способствующий повышению воспроизводительных качеств у высокоценных генотипов каракульских овец. На основе теоретической ценности и практической значимости полученных результатов сделаны следующие выводы: 1. Традиционные способы отбора жеребых кобыл не полностью раскрывают их потенциальные продуцирующие возможности, что является главным фактором повышающим изменчивость выхода гонадотропных гормонов из исходного сырья. В связи с этим, отобраны кобылы-доноры разных возрастов и получены 144 моносыворотки различных серий. 2. У кобыл-доноров разного возраста и в разные периоды жеребости изменчивость содержания гонадотропных гормонов с фолликулостимулирующей активностью очень высокая. При этом колебания активности в сыворотке крови находятся в пределах от 45 м.е/мл до 320 м.е/мл., а соотношение ФСГ/ЛГ в индивидуальных сыворотках – от 1/1 до 11/1. 3. В каждой возрастной группе выявлены репродуктивные дни жеребости кобыл-доноров разного возраста, где концентрация фолликулостимулирующих гонадотропных гормонов достигает до максимума. При этом максимальный период накопления гонадотропного гормона с оптимальным преобладанием фолликулостимулирующего гормона в сыворотках жеребых кобыл установлены у кобыл доноров в возрасте 3-5 лет между 65-80 днями жеребости, у кобыл доноров в возрасте 6-8 лет на 6075 дни жеребости и 9-10 летних кобыл-доноров соответственно на 55-65 день жеребости. 4. Концентрация гонадотропных гормонов СЖК после очистки их от балластных белков повышается на 32,0%, а соотношение ФСГ/ЛГ снижается на 23,0%. Следовательно, для получения в сухом виде очищенного от балластных белков гонадотропина из СЖК следует отбирать кровь с активностью не менее 240 м.е/мл. и с соотношением ФСГ/ЛГ в пределах от 3/1 до 6/1. 5. Средняя получаемая масса сухого гонадотропина в расчете на 1 литр СЖК при использовании нового способа составило 0,556±0,014 г., а при традиционном способе – 0,472±0,007 г. Достоверность различия между сравниваемыми способами по выходу сухого гонадотропина после сублимации высокая (Р<0,001). 98 Выход гормонов по гонадотропной активности в расчете на использованный объем СЖК в новом способе составил в среднем 79,8%, а при базовом способе – 68,1%. Среднее различие статистически достоверно (Р<0,05). 6. Внедрение нового способа в технологию трансплантации эмбрионов позволяет увеличить число доноров с суперовуляцией 1,4 раза и получить на 3 эмбриона больше от каждой овцематки донора. Новый способ при индукции суперовуляции в яичниках у доноров позволил вымыть 218 эмбрионов при затрате 3587,95 тенге, а традиционный способ при затрате 5817,57 тенге – 141 эмбрионов. При этом, традиционным способом на получение одного эмбриона в среднем затрачено 41,26 тенге, а при использования препарата нового типа – 16,46 тенге. Экономический эффект от использования гонадотропина нового образца составил 24,80 тенге с каждого эмбриона или 2,5 раза больше. 99 ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ Для производства гонадотропина сыворотки жеребых кобыл с высокой гормональной активностью предлагается прогрессивный способ, который включает в себя следующие этапы: 1. Отбор крови от кобыл-доноров для получения сыворотки жеребых кобыл проводить в период с 60-го дня по 80-й день жеребости, когда в сыворотке содержится максимальное количество гонадотропных гормонов: - отбор 3-5 летних жеребых кобыл со сроком жеребости 65-80 дней; - отбор 6-8 летних жеребых кобыл со сроком жеребости 60-75 дней; - отбор 9-10 летних жеребых кобыл со сроком жеребости 55-65 дней. 2. Отбирать сыворотку жеребых кобыл с активностью не менее 240 м.е/мл. 3. Для получения гонадотропина отбирать сыворотку жеребых кобыл с оптимальным соотношением фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов 3/1-4/1; 4. Обработка овцематок-доноров для индукции суперовуляции гонадотропным препаратом в расчете 1200 И/Е на донора. 100 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 Парламентские слушания: Актуальные проблемы и перспективы развития животноводства в Республике Казахстан. www.nomad.su 2 Алдашов А., Наурызбаева А. Современное состояние развития продукции аграрного сектора // Вестник КРСУ. - 2010. – Т.10, № 1. – С. 105108. 3 Кушнир В.Г., Бенюх О.А., Скурыгина О.А. Тенденция развития животноводства в Казахстане // Образование и наука XXI века. – 2011. www.rusnauka.com 4 Boettcher P., Gandini G. The Importance of Animal Genetic Resources and Options for their Conservation // FAO Guidelines for the In Vivo Conservation of Animal Genetic Resources. - Switzerland, 2007. - Р. 5-7. 5 Траисов Б.Б., Бозымов К.К., Есенгалиев К.Г. Развитие овцеводства в Западном Казахстане // Овцы, козы, шерстяное дело. – 2013. - №2. - С. 90-94. 6 Джанов Р.А. Возможности для развития животноводства в Казахстане // Международный научно-исследовательский журнал. – 2014. - №8(27). С.16-18 7 Султангалиева Л.С. Развитие конкурентоспособности отрасли мясного животноводства Республики Казахстан // Вестник КазНУ. - 2013. №4(98). - С. 93-99. 8 Сарханов К.А. Пути повышения продуктивности животноводства на основе инновационных технологий // КазНАУ, Исследования и результаты. – 2013. - № 3. - С. 61-67. 9 Голубец Л.В., Дешко А.С., Старовойтова М.П., Стецкевич Е.К., Кысса И.С., Якубец Ю.А., Попов М.В. Использование биотехнологических методов в решении современных проблем репродукции сельскохозяйственных животных. - Гродно: ГГАУ, 2011. - 65 c. 10 Байтлесов Е. У. Биотехнологические методы интенсификации воспроизводства маточного стада в мясном скотоводстве: дис. … докт. вет. наук. - Саратов, 2011. - 294 с. 11 Безин А.Н. Повышение эффективности воспроизводства в мясном скотоводстве // Инновационные технологии в ветеринарии, биологии и экологии: матер. междунар. науч.-практ. конф. - Троицк, 2014, С.15-19. 12 Аятхан М., Лейдинг К., Ноонер Х.-П. Количественное и качественное изучение эмбрионов, полученных от коров-доноров немецкой симментальской породы // Аграрная наука – сельскому хозяйству: матер. междунар. науч.- практ. конф. - Барнаул, 2010. - С. 33-36. 13 Голубец, Л. Результативность применения биотехнологических методов в воспроизводстве КРС // Агроэкономика: Ежемесячный информационный бюллетень по вопросам рыночных отношений. – Бералусь, 2002. - № 7. - С. 21-23. 14 Мороз В.А. Овцеводство и козоводство. - Ставрополь: АГРУС, 2005. 453 c. 101 15 Адилбеков Н.Ч. Отбор каракульских маток-доноров для трансплантации эмбрионов по их гормональному статусу: дис. … канд. сельхоз. наук. - Шымкент, 2007. - 115 с. 16 Омбаев А.М. Селекция и генофонд каракульских овец. – Алматы: Бастау, 2003. – 199 с. 17 Досжанов Т.Н. Зоология // Известия НАН РК. - Алматы, 2011 №2. С.25-38. 18 Мырзахметов Т.М., Оспанова Г.З. Роль биотехнологии в развитии животноводства. Аналит. обзор. – Алматы: НЦНТИ, 2009. – 62 с. 19 Насамбаев Е. Состояние и пути совершенствования скота казахской белоголовой породы в условиях сухих степей Западного Казахстана: дис. … докт. сельхоз. наук. - Оренбург, 2006. - 434 с. 20 Ушачев И.Г. Научное обеспечение государственной программы развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 гг. М, 2013. - 47 с. 21 Указ Президента Республики Казахстан. О Государственной программе по форсированному индустриально-инновационному развитию Республики Казахстан на 2010-2014 годы. http://adilet.zan.kz 22 Амарбаев А.-Ш.М. Гормональные методы повышения плодовитости овец. - Алма-Ата: Наука, 1969. – 187 с. 23 Падучева А.Л., Бойко Д.Ф. Гормональные методы повышения плодовитости сельскохозяйственных животных. – М.: Колос, 1965, - 303 с. 24 Burrows H. Biological actions of sex hormones. Cambridge University press. - 2013. – 526 p. 25 Willey J. & Sons. Bioassay of Anterior Pituitary and Adrenocortical hormones // CIBA Foundation Symposium. - 2009. - Vol.5. - P.52. 26 Кишкун А.А. Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции. Гэотар Медиа, 2008. - 973 с. 27 R.F.Shmidt, G.Thews. Физиология человека: В 3-х томах Т.3 Перевод с английского/ под ред. Р. Шмидта и Г.Тевса.- М.: Мир, 1996. – 928 с. 28 Ноздрачев А.Д., Баженов Ю.И., Баранникова И.А. Начала физиологии. М: Лань, 2002. - 1088 с. 29 Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. – М.: Медицина, 2000. - 544 с. 30 Hays E.E., Stelman S.L. Chemistry of the anterior pituitary hormones in editor pincu.sg // Thiman K.V. The hormones. - 1955. - Vol.2. - P. 201-234. 31 Butt W.T., Crooke A.C., Cuipninjham F.J., Anneliese W. Preparation of an-tisera to human folliclestimulating hormone // Nature Enjl. – 1963. - Vol.197. - P.388-389. 32 Evans J.S., Dutt R.H., Simpson E.C. Breeding perforenance in ewes after synchronic estrus by feeding 6-methyl-17 acetoxyprogesterone // Journal Animal Science. - 1962. - Vol. 21. - P.804-808. 33 Заморина С. А.. Ширшев С. В. Влияние хорионического гонадотропина на продукцию интерлейкина-8 интактными моноцитами роль 102 toll-подобных рецепторов // Вестник Пермского университета. Серия: Биология. - 2012. - № 3. - С.71-75. 34 Чомаев А.М., Хмылов А.Г. Методы нормализации воспроизводительной функции у коров. – М.: Мосагроген, 2005. – 61 с. 35 Благосклонная Я.В., Шляхто Е.В., Бабенко А.Ю. Эндокринология. СПб: СпецЛит, 2007. - №1. - 24 с. 36 Алексеева М.Л., Екимова Е.В., Колодько В.Г., Фанченко Н.Д., Понкратова Т.С. Хорионический гонадотропин. Структура, функция, диагностическая значимость // Проблемы репродукции. - 2006. - №3, - С. 3-8 37 Lecarpentier E., Guibourdenche J., Vieillefosse S., Fournier T., Tsatsaris V. Impact Of shear stress on the endocrine function of human trophoblast // Placenta. -2014. – Vol. 35, Is. 9. – P. A105–A10638 Ермолаев М.В. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1983, - 287 с. 39 Pincus G., K. Thimann. The Hormones V3: Physiology, Chemistry and Application. - Elsevier, 2012. – 1026 p. 40 Карынбаев А.К., Акынбекова Р. Влияние инъекций СЖК на продукцию яйцеклеток каракульских овец // Актуальные проблемы современных наук. Польша, 2013. www.rusnauka.com 41 Popa G. T., Fielding U. A portal circulation from the pituitary to the hipothalamic region // Journal Anatomy. – 1970. - № 65. - P.88-91. 42 Алешин Б.В. О путях и способах осуществления регуляторного влияния гипоталамуса на переднюю долю гипофиза // Успехи современной биологии. - 1960, - Т.50, - вып.2/5. - C. 50-55. 43 Войткевич А.А. Неравнозначность нейросекреторных влияний в отношении долей аденогипофиза // Известия АН СССР – 1965. - №11. – С. 643-646. 44 Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Липатенкова А.К. Современная нейроэндокринология // Вестник РАМН. – 2012. - №8, - С.7-9. 45 Karla S.P., Karla P.S. Neural Regulation of luteinizing hormone secretion in the Rat // Endocrine reviews. – 1983. - Vol.4. – P. 311-351. 46 Desclin L., Flametn-Durand J., Gepte W., A propos de l`activite gonadotrope de l`hypophyse des rats en oestrus permanent resultant de lessions hypotalamiques // Arch anat microse et morphol expte. – 1961. - Vol.50, №3. P.57-60. 47 Генес С.Г. Нервная система и внутренняя секреция. – М.: Медгиз, 1955. – С. 250-256 48 Everaerd W. Development in Adolescence: Psychological, Social and Biological Aspects. – USA: Martinus Nijhoff Publishers, 1983. – 225p. 49 Гончаров Н.П. Значение и роль методов определения гормонов и развития эндокринологии как общебиологической науки // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2012. - №3. - С.43-49. 50 Ярошевский М. Г. Репрессированная наука. Л:Наука,1994. – 317с. 51 Бабичев В.Н. Организация и функционирование нейроэндокринной системы. //Проблемы эндокринологии. - 2013. - 62-69 с. 103 52 Потемкин В.В. Эндокринология. – М.: Медицина, 1986.- 432 с. 53 Antczak D.F., Amanda M.M., Wilsher S. and Allen W.R. The Equine Endometrial Cup Reaction: A Fetomaternal Signal of Significance // Annu. Rev. Anim. Biosci. – 2013. - Vol.1, - P.419–442. 54 Wilsher S., Allewn W. Factors influencing equine chorionic gonadotropin production in the mare // Equine veterinary journal. – 2011. - № 43(4). – P. 430438. 55 Allen W.E. Ovarian changes during early pregnancy in pony mares in relation to PMSG production // J Reprod .fetil. Suppl. – 1975. – Vol.23. - P. 425428 56 Allen W.R. Hormonal control of early pregnancy in the mare // Animal reproduction Science. – 1984. – Vol.7. - P. 283-304. 57 Allen W.R., Wilsher S., A Review of Implantation and Early Placentation in the Mare // Elsevier Placenta. – 2009. - Vol. 30, is. 12. - P. 1005–1015. 60 Cabrera-Sharp V., Jordan E. Richardson S., Alycia A etc. SMAD 1/5 Signaling in the Early Equine Placenta Regulates Trophoblast Differentiation and Chorionic gonadotropin secretion. – 2013, - Vol.155 (8). – P. 3054-3064. 61 Bruce D. Murphy, Susan D., Martinuk. Equine Chorionic Gonadotropin // Equine reviews. – 1931. - Vol. 12 (1). - P.27-44. 62 Hoppen H.O. The equine placenta and equine chorionic gonadotropin // Exp Clin Endocrenol. – 1994. – Vol.102. –P. 235-243. 63 Allen W.R., Moor R.M. The origin of the equine endometrial cups // J. Reprod. Fertil. – 1972. - Vol. 29. – P. 313-316. 64 Wooding F.B.P., Morgan G., Fowden A.L., Allen W.R. A Structural and Immunological Study of Chorionic Gonadotrophin Production by Equine Trophoblast Girdle and Cup Cells // Placenta. – 2001. - Vol.22 (8–9). - P. 749–767. 65 Лебедева Л., Дюльгер Г. Современные методы диагностики беременности кобыл // Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2011. – №4. - С. 35-37. 66 Allen W.R. The influence of fetal genotype upon endometrial cup development and PMSG and progestagen production in equids // J. Reprod. Fert.,Suppl. – 1975. -Vol.23. - P. 405-413 67 Sheldrick, E.L., Wright, P.J., Allen, W.R. & Heap, R.B.Metabolic clearance rate, production rate and source of progesterone in donkeys with fetuses of different genotypes // J. Reprod. Fert. – 1977. - Vol.51. - P. 473-476. 68 Allen W.R., Interspecific and Extraspecific Pregnancies in Equids: Anything Goes // Journal of Heredity. – 1997. - Vol.88 (5). - P. 384-392. 69 Клинский Ю.Д. К вопросу о гормональной активности СЖК // Овцеводство. – М, 1967. - С.10-11. 70 Wislosky G.B., Bennet H.S. The hormones // Americans journal anatomy. - 1943. – Vol.73. - P. 335. 71 Loraine I.A. Human chorionic gonadotropins (HCG) /Academ. Press New York and London // Hormones in blood. – 1961. - P. 285-301. 104 72 Morris C.J. Chemistry of the gonadotrophins // Brit. Medical. Bullet. - 1955. Vol.11. - P.101-104. 73 Lunenfeld B. Historical perspectives in gonadotrophin therapy // Human reproduction update. – 2004. - Vol.10 (6). – P. 453-467. 74 Электронный справочник на основе книги "Г. В. Кирюткина, Б. А. Тимофеева, В. А. Созинова, Справочник ветеринарных препаратов, химиотерапевтические препараты". www.cnshb.ru/AKDiL/0031/default.shtm 75 Medvei V.C. The History of Clinical Endocrinology: A Comprehensive Account of Endocrinology from Earliest Times to the Present Day. USA:CRC Press, 1993, - 576р. 76 Leganet-Demare I., Clauser I., Lusticz M. A. New method for the purificication of the gonadotrophin of PMS // Biochim. Acta. - 1958. - Vol.30. - P. 169-181. 77 Leganet-Demare I., Clauser I., Lusticz M. Purificication of pregnant mare serum gonadotrophin (PMSG) by counter // Bull Soc. Chun. Biol. – 1961. Vol.43. - P. 897. 78 Меркулова М.В. Выделение, очистка гонадотропного гормона и разработка иммуноферментного набора для его определения в СЖК: автореф. дис. … канд.биол. наук. -Дубровцы, 1997. - 28 с. 79 Башмакова Т.Н. Продуктивные и биологические особенности молодняка овец красноярской тонкорунной породы, рожденного в числе одинцов и двоен.: дис….. канд. сельхоз. наук. Красноярск, 1991.- 81 с. 80 Татарчук Т.Ф., Сольский Я.П. Эндокринная гинекология:( клинические очерки ). Киев:Заповит, 2003. – 300с. 81 Lammond D.R., Emmens C.W. The effect of hypophysectomy on the mous uterine respouse to gonadotrophins // Endocrinology. - 1959. - Vol.18. - P. 251. 82 Evans H., Penchard R.G., Simpson M.E. Maintenance and repair reproductive system of hypophisectimized male rats by hypophis synergist, pregnancy prolan and combinators there for // Endocrinology. - 1934. - Vol.18. - P. 607. 83 Логинов Р.О. Влияние различных факторов на биологическую активность гонадотропина сыворотки жеребых кобыл: дис. … канд. сельхоз. наук. – Дубровицы, 2006. - 26 с. 84 Сагалаков Я.М., Усова И.А. Применение стимулирующих препаратов при воспроизводстве овец // Вестник КрасГАУ. – 2014. - №9. - C. 92-95. 85 Steelman S.L, Poley F.M, Florence M. Assay of the FSH based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin // Endocrinology. - 1953. - Vol.53. - P. 604. 86 Алибаев Н.Н., Абай Г., Бекетауов О. Корреляционный и дисперсионный анализ биологического качества сыворотки жеребых кобыл // Исследования, результаты. – 2014. - №3. - С.29-32. 105 87 Алибаев Н.Н., Абай Г. Получение сухого гонадотропина из сырой массы СЖК // Актуальные проблемы современной науки. - Уфа. – 2014. – С.5-7. 88 Шаталов П.И. Гравогормон в животноводстве. – М.: Колос, 1974. – 146 с. 89 Завадовский М.М. Теория и практика гормонального метода стимуляции многоплодия сельскохозяйственных животных. – М.: Сельхозиздат, 1963. - 670 с. 90 Наставление по применению сыворотки крови жеребых кобыл (СЖК) для повышения плодовитости каракульских овец. – М., 1968. – 3 с. 91 Завадовский М.М. Теория гонадостимуляторов и проблемы управления процессами размножения животных // Успехи современной биологии. – 1946. Т.22, вып. 3. – С. 301-318. 92 Lamond D.R. Induction of ovulation with placental gonadotrophins // J. Endocrinol. - 1960. - Vol. 20. - Р. 277-278. 93 Schmidt-Elmendorff H., Loraine J.A. An investigation onto the effect of derivatives of dithiocarbamoyl phydazine on gonadotrophic activity in the body fluide of pregnant mares. Lancet., -1964. - Vol.21. - P.614. 94 Клинский Ю.Д. Состояние и перспективы дальнейшего развития гормонального метода повышения плодовитости сельскохозяйственных животных. – М., 1969, - 68 с. 95 Abay G., Alibayev N. Hormonal activity of pregnant mare serum of different age and pregnancy terms at donors // Life science journal. – 2014. - №11 (6s). - P. 448-455. 96 Abay G., Alibayev N., Svitojus A. Hormonal Status of Bio-Producers and Technology of Receiving Gonadotrophin of Serum Pregnant of Mares // Advances in Environmental Biology. – 2014. – Vol. 8(13). - Р. 330-334. 97 Warbritton V., McKenzi P. The pituitary glands ewes in varios phases of reproduction. - Missouri, – 1937. – 59 р. 98 Бабаев И.Ю. Физиологическая оценка дозирования СЖК по живой массе эдильбаевских овец: cб.науч.тр.института экспериментальной биологии. –Алматы, 1980. - Т.14. - С.169-171. 99 Бабаев И.Ю. Характер многоплодия у эдильбаевских овец при инъекции им СЖК с различными биологическими свойствами: сб.науч.тр. института экспериментальной биологии. – Алматы, 1978. - Т. 13. - С.138-140. 100 Аббасов Б.Х., Симонова А.Г. Некоторые особенности раннего эмбриогенеза мясосальных овец при гормональной стимуляции плодовитости: Сборник научных трудов института экспериментальной биологии. – Алматы, 1980. - Т.14. - С.165-168. 101 Шаталов П.И. Изготовление и применение СЖК, КЖК. – М.: Колос, 1971. – 144 с. 102 Квасницкий А.В., Мартыненко Н.А Влияние материнского организма на приплод // Советская зоотехния. – М.: Сельхозиздат, 1951. №7. С. 63-75 106 103. Мадисон В.В., Л.В. Мадисон, Трансплантация эмбрионов на службе животноводства // Зоотехния. – М.:Колос, 2005. № 5 - C.29-31. 104 Алибаев Н.Н., Бекетауов О. Жумабаев Ш.А., Калгимбаева М.А. Биотехнология в смушковом производстве. - Шымкент, 2012. – 210 с. 105 Саркисян С.М. Влияние переноса (трансплантации) оплодотворенных крольчих яйцеклеток на живой вес развивающихся от них трансплантантов // Известия Академии наук Армянской ССР. – Ашхабад, 1947. - №10. - С.12-15. 106 Соколовская И.И. Проблемы оплодотворения сельскохозяйственных животных. – М.:Сельхозиздат, 1957. – 314 с. 107 Батраков Н. К. Научные основы повышения мясной и молочной продуктивности симментальского скота с использованием специализированных пород в условиях Центрально-Черноземной зоны. дис. … докт. сельхоз. наук. - Каменная Степь, 2004. 301 с. 108Квасницкий А.В., Маньяковская М.Н. О вегетативной гибридизации в животноводстве // -М: Природа, 1949. - №11. - С. 39-43. 109 Квасницкий А.В. Опыт межпородной пересадки яицеклеток // Советская зоотехния. –М.: Сельхозиздат, 1951. - №1. - С. 36-42. 110 Квасницкий А.В., Мартыненко Н.А. Влияние материнскогоорганизма на приплод // Советская зоотехния. – М.: Сельхозиздат, 1951. - №7. - С. 63-75. 111 Курбатов А.Д. Изменение природы животных при межпородных пересадках зигот, гонад и при переливании крови животных другой породы // Вопросы биологии оплодотворения. – Л, 1954. – С. 277-318. 112 Лопырин А.И., Логинова В.Н., Карпов П.Л. Влияние измененных условий на рост и развитие ягнят //Советская зоотехния. –М.:Сельхозиздат, 1951. - №11. - С.83-95. 113 Лопырин А.И., Логинова В.Н., Карпов П.Л. Влияние организма на изменение экстерьера ягнят при межпородных пересадках зародышей // сб.науч.тр. совещания по биологическим основам повышения продуктивности животноводства. –М.: Сельхозиздат, 1952. - C.120-124. 114.Серебряков П.Н., Крашенникова А.И. Опыт межпородной пересадки оплодотворенных яйцеклеток у кроликов // Советская зоотехния. – М.:Сельхозиздат, 1951. - №1. - С.43-49. 115 Калгимбаева М.А., Эмбриопродуктивность каракульских маток при двукратной суперовуляции и криоконсервации эмбрионов: дис. ... канд. сельхоз. наук. – Шымкент, 2007. - 112 с. 116 Warwick B.L., Berry R.O. Enter-genetic and intraspecific embryo transfers // Heredity. - 1949. - Vol. 40. - P. 297-310. 117 Прокофьев М.И., Алиев А.А., Рябых В.П., Малышев В.С., Белевич В.П., Горячев В.С., Беляков С.П., Бескровных П.П. Трансплантация зигот у крупного рогатого скота // Вестник сельскохозяйственных наук Казахстана. Алма-Ата, 1977. - №6. – C. 85-95. 107 118 Эрнст Л.К., Голубеев А.К., Кудрявцев И.В. Перспектива развития и практическая значимость исследований по трансплантации эмбрионов и клонированию млекопитающих // Сельскохозяйственная биология. - М., 1978. - T.3, №5. – C. 659-666. 119 Клинский А.Д., Сергеев Н., Шихов И. Теленок трансплантат // Животноводство. –М.: Колос. - 1980. - №7. - C35. 120 Мухамедгалиев Ф.М., Тойшибеков М.М., Абильдинов Р.Б Бердонгарова О.И., Джанабеков К.Д. Трансплантация зигот и е генетические аспекты.- Алма-Ата: Наука, 1981. – 168 с. 121 Мухамедгалиев Ф.М., Абильдинов Р.Б. Межпородная пересадка зиготы и ее генетические аспекты. – Алма-Ата, 1971. – С. 106. 122 Тойшибеков М.М., Даминов Б. Трансплантация эмбрионов каракульских овец // Научно-теоретический прогресс в пустынном животноводстве и аридном кормпроизводстве: мат. междунар. науч.-теор. конф.. посвящ. 1500 летию г. Туркестан. - Шымкент, 2000. – С. 13-14 123 Джанабеков К. Суперовуляция и межпородная пересадка зародышей овец: автореф. …канд.сельхоз.наук. - Алматы, 1975. – 28 с. 124 Даминов Б.Д. ускоренное размножение ценных и редких генотипов каракульских овец путем трансплантации эмбрионов // Проблемы научного обеспечения сельского хозяйства Республики Казахстан, Сибири и Монголии. Мат. 4-й межд. науч.- практ.конф. Улан-Батор, 2001. –С. 281-282. 125 Голубец Л.В., Кысса И.С., Дешко А.С., Козел А.А., Якубец Ю.А., Старовойтова М.П., Стецкевич Е.К., Нарейко О.А. Оценка качества ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота: учебно-методическое пособие. Гродно, 2011. - 4 с. 126 Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология. –М.: Высшая школа, 2003. – 123-125 с. 127 Голубев А.К., Эрнст Л.К. Трансплантация эмбрионов и перспективы планирования в животноводстве. – М., 1989. – С. 48-57. 128 Тойшибеков М.М. Использование метода транплантации эмбрионов в овцеводстве: сб. науч.тр. КазНИИНТИ. - Алматы, 1988. - C. 68 -70. 129 Амарбаев А.-Ш.М. Биология ягнят многоплодных мясо-сальных овец. - Алма-Ата: Наука, 1975. – 137с. 130 Елемесов К. Овцеводы встревожены состоянием отрасли // Казахстанская правда № 232 (27506) 13.07.2013 kazpravda.softdeco.net/c/1004031323 131 Айбазов М.М., Аксенова П.В. Трансплантация эмбрионов у молочных коз // Culegure de lucrari a Simpozionului stiintific cu participare internationala consacrat aniversarii a 55 de la fondarea Institutului Realizari si perspective in zootehnie, biotechnology si medicina veterinara 6-8 octombrie. Maximovca, 2011. - C. 286-290. 132 Аксенова П.В. Результаты апробации усовершенствованного метода трансплантации эмбрионов у овец: анализ приживляемости зигот, 108 эффективности вынашивания плода и развития ягнят-трансплантантов // Сельскохозяйственные животные. – 2014. - №1.- С.11-13. 133 Поликарпова Е.П., Невзгодина М.В. Породные особенности развития яичников ягнят советского мериноса и дагестанской породы // Сборник научных трудов ИМЖ им. А.Н.Северцова. – М., 1961. - вып.35. - C. 35-42 134 Айбазов М.М., Аксенова П.В. Возможность и перспективы получения первичных трансгенных животных-продуцентов белков человека // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2012. - №3. - C.33-35. 135 Айбазов М.М., Аксенова П.В., Коваленко Д.В. Биотехнологические методы и приемы интенсификации воспроизводства овец и коз // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2012. - №2. - C.35-38. 136 Green W.W., Winters L.M. Prenatal Development of the sheep // Tech. Bull. Minnagric.Exp.sta. -1945. - №169. - P.36 137 Шумкина О.Б. Периодизация ранних стадий развития каракульской овцы // Сборник научных трудов ИМЖ им. А.Н.Северцова. - 1957. - вып.22. C.157-162. 138 Moor R.M., Rowson l.E. Influece of the embryo and uters on literal function in the sheep // Nature. London, - 1964. - Vol.201. - P. 522-523. 139 Абай Г., Алибаев Н.Н., Свитоюс А., Использование гонадотропного гормона в трансплантации эмбрионов у овец. // Информационноаналитический журнал «Актуальные проблемы современной науки». М., 2014. - №5(78). – С. 123-127. 140 Абай Г., Алибаев Н.Н., Адилбеков Н.Ч. Морфологическая оценка эмбрионов полученных от овцематок – доноров // Журнал научных публикаций аспирантов и докторантов. М., 2014. - №8 (98). - C.142-145. 141 Алибаев Н.Н., Бекетауов О. Эффективный способ гормональной обработки доноров каракульских овец в трансплантации эмбрионов: сб. науч. Тр. КазНИИК. - 1993. - №1. – С.90-96. 142 Свитоюс А.Г. Усовершенствование методов вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота: дис. … канд. биол. наук. – Байсогала, 1989. - 106 с. 143 Коростелева Н.И., Громова Т.В., Жукова И.Г. Биотехнология. – Барнаул: Издательство АГАУ, 2006. – 118 с. 144 Бабаев И.Ю. Проблемы вызывания суперовуляции в трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота: сб.научных трудов института экспер. Биологии. – Алма-ата: Кайнар, 1978. - Т. 12. – С.137-140. 145 Бабаева О. Гормональные методы повышения плодовитости каракульских овец в условиях аридной зоны Туркменской ССР. -Ашхабад, - 1981, - 211 с. 146 Каримов Ш. Применение СЖК в мясо-сальном овцеводстве. Вопросы генетики и индивидуального развития сельскохозяйственных животных: сб.науч.тр. института экспериментальной биологии. -Алматы, 1969. - Т.4. - С.104-117. 109 147 Юзликаев Р.Д., Мамин И.К. Некоторые перспективы дальнейшего совершенствования существующих и разработки новых методов повышения плодовитости овец: сб.науч.тр. КазНИИК. - Алматы, 1980. - Т.5. - С.38-39. 148 Юзликаев Р.Д. Повышение эффективности гормонального метода стимуляции плодовитости каракульских овец в условиях Юга Казахстана: сб.науч.тр.КазНИИК. - 1970. - Т.1. - С.76-92. 149.Барышева Л.С., Стрилец О.П., Стрельников Л.С. Проблемы вызывания суперовуляции в транплантации эмбрионов крупного рогатого скота // Современные достижения фармацевтической технологии и биотехнологии НФаУ. - 2014. - С.37-40. 150 Прокофьев М.И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных. – Л.: Наука, 1983. – 262 с. 151 Будевич И.И., Жук Е.Н., Жук Н.Ф. Сравнительный анализ результатов суперовуляции и эмбриопродукции доноров при использовании различных гормональных препаратов // Научные основы развития животноводства в Республике Беларусь. – 1995. – № 26.– C. 41-46 152 Тойшибеков М.М., Ахметова Н.И., Даминов Б.Р., Молжигитов Б.Б., Молдабаев Е.М. Гормональная стимуляция суперовуляции у овец // Изв. НАН РК. - 2013. - №6 -С.38-44. 153 Casida L.E., Merg R.K. Effect of pituitary gonadotropins on the ovaries and the induction of superfecundary in cattle // Amer. J. Vet. Res. – 1943. - №4. Р. 76-78 154 Сергеев Н.И., Дронин А.П., Смыслова Н.И., Мальцева И.В. Методические рекомендации по гормональному вызыванию суперовуляции у коров-доноров при трансплантации эмбрионов. - Дубровцы, 1988. - C. 22. 155 Сергеев Н.И., Мазепкин С.А., Ефремова М.Н. Методические рекомендации по трансплантации. – Дубровицы, 1988. - 44с. 156 Elsden R.P., Hasler J. F., Seidel G.E. Non-surgical recovery of bovine egss. – 1976. - Vol.6, №5. - Р. 523-532. 157 Seidel G.E. Superovulation and embryothansfer // M.Agr.Sci. Thesis, U.C.D. –Dublin, 1981, -№ 211. - P.351-358. 157 Quirke J.F., Hanrahala J.R. Effect of gonadotrophin releasing hormone and human chronic gonadotrophin // J.Reprod.Fert. – 1975. - Vol.43. - P. 167-170. 158 Кансеитова Н., Аханова У., Кансейтова Э. Повышение многоплодия курдючных овец биотехнологическим методом // Овцы, козы, шерстяное дело. – 2011. - № 4. - C. 21-22. 159 Ерохин А.С. Современные методы синхронизации эструса у овец // Овцы, козы, шерстяное дело. – 2011. - № 4. - C.4-6. 160 Tervit H.R., Goold P.G., McKezei R.D., Clarkson D.J., Drummond // J. Embryo transfers in Angora and Saanen goats. – 1985. - Vol.33, №5. - P. 58-80. 161 Касымов К.Т. и др. Трансплантация эмбрионов у овец // Зоотехния, 1994. - №8. - C. 29. 162 Scanlon P., Srenan J., Gordon I. Hormonal indaction of superovulation in cattle. – // J. Agric.Sci. Camb. - 1968. Vol.70. - Р.179-182. 110 163 Мухамедгалиев Ф.М., Тойшибеков М.М., Абильданов Р.Б. и др. Трансплантация зигот в племенном овцеводстве. - Алма-Ата: Наука, 1981. – 168 с. 164 Даминов Б., Сартаев Ш., Тойшибеков М.М. Индуцированная полиовуляция у овец // Генетика и селекция сельскохозяйственных животных: мастер.респ.конф.КазВОГиС. –Алма-ата, 1986. - С.134-136. 165 Тойшибеков М.М., Даминов Б.Р., Ахметова Н.И. Продолжительность половых циклов у некоторых пород овец. // Известия Национальной академии наук Республики Казахстан. - 2013. - C. 44-49. 166 Байтлесов Е. У., Курманалиева С. К. Отбор животных и вызывание суперовуляции в технологии трансплантации эмбрионов в мясном скотоводстве // Наука и образование. - 2011. - № 2. - С. 47-50. 167 Амарбаев А. Ш.М. К дозировке СЖК в овцеводстве // сб.науч.тр. института экспер. биологии. - Алматы, 1966. - С.208-216. 168 Алибаев Н., Бекетауов О. и др. Эффективный способ гормональной обработки доноров каракульских овец в трансплантации эмбрионов: сборник научных трудов КазНИИК. - 1993. - Т.1. - С.90-96. 169 Averil L.R.W. The transfer and of sheep ova // Cong. Reprod. Comb. Section. -1996. - №5. - Р.7-9. 170 Назаров Е.А., Смыслова Н.И. Применение метода трансплантации в программе разведения высокопродуктивных животных в племзаводе «Петровское». - Дубровицы, 1988. - вып.89. - С.11-13. 171 Armstrong D.T., Pfitznes A.P., Warnes C. M., Seamark R.F. Superovulation theatments and embryo transfer in Angora goats. – 1983. - Vol.67. - P.403-410 172 Сергеев Н.И., Смыслова Н.И., Смирнов А.О. Влияние некоторых факторов на уровень суперовуляции и качество эмбрионов у коров-доноров. -Дубровицы, 1987. - вып. 87. - С.38-40. 173 Советкин С.В., Назаров Е.А., Долгохацкий А.И., Прокофьева Е.С. О повышении эффективности трансплантации эмбрионов с помощью гонадотропных препаратов. - Зоотехния, 1989. - № 2. - С.64-65. 174 Смолянинов Б.В. Индукция множественной овуляции у коров при трансплантации эмбрионов //. С.Х.биология. -. 1990. - №2. - С.56-64. 175 Малахова Л.С. Продуктивные и биологические особенности потомства, полученного методом трансплантации эмбрионов у мериноовых овец: автореф. … канд. с.-х. наук. – Ставрополь, 2000. - 22 с. 176 Даминов Р.Б, Салыкбаев Т.Н., Тойшибеков Е.М., Молжигитов Б.Б. Эффективность использования различных препаратов на уровень суперовуляции у овец // Валихановское чтение - 9: тез.док.междун.науч.пркт.конф. – Кокшетау, 2004. – Т. 5. – С. 309-311. 177 Бекетауов О., Алибаев Н., Адилбеков Н. Новое в биотехнологии воспроизводства каракульских овец // Вестник с.-х. наук Казахстана. – 2004. №5. – С. 34-35. 111 178 Тойшибеков М., Даминов Б. Трансплантация эмбрионов каракульских овец // Научно-теоритеческий процесс в пустынном животноводстве и аридном кормопроизводстве: матер.межд.науч.-теор. Конф., посвящ. 150-летию г. Туркестан. - Шымкент, 2000. – С. 13-14. 179 Джамалова Г.А. Биотехнология животных. - Алматы: Агенство "Маматай", 2004. –304 с. 180 Алибаев Н., Бекетауов О.,Калгимбаева М. Трансплантация эмбрионов каракульских овец // Перспективы развития животноводства в аридной зоне Казахстана: мат. межд. науч. конф. – Шымкент, 2005. – С. 76-84 181 Тойшибеков М., Алибаев Н., Бекетауов О., Калгимбаева М. Повторная индукция суперовуляции у доноров с перерывом в один год // Перспективы развития животноводства в аридной зоне Казахстана: мат. межд. науч. конф. – Шымкент, 2005. – С. 84-86. 182 Бекетауов О., Алибаев Н. Новое в биотехнолгии воспроизводства каракульских овец // Вестник с.-х. наук Казахстана. – 2004. - №5. – С. 41-42. 183 Адилбеков Н. Отбор каракульских маток – доноров для трансплантации эмбрионов по их гормональному статусу: автор. к.с.-х. н. – Шымкент, 2004. - 28 с. 184 Әлібаев Н., Бекетауов О., Аділбеков Н. Қаракөл қойын өсіру биотехнологиясында донорлардың гормоналдық статусы // Жаршы. – 2004. №5. – С. 40-41. 185 Кикебаев Н.А. Рост, развитие, формирование мясности казахских лошадей типа джабе в условиях пастбищно-тебеневочного содержания: дис. … канд. сельхоз. наук. – Алма-Ата, 1984. – 169с. 186 Беляев А. И. Методы и результаты улучшения казахской породы типа джабе (опыт работы Эмбенского-Мугоджарского конзавода): автореф. дис. ... канд.с.-х.наук. –М., 1969. – 15 с. 187 Беляев А. И. Казахская лошадь джабе. – Алма-Ата: Кайнар, 1973. – 134 с. 188 Федоров И. В. Динамика гонадотропной активности сыворотки крови жеребых кобыл под влиянием генетических факторов и окружающей среды: дис. … канд. сельхоз. наук. - Дубровицы, 2005. 189 Васин А.Д., Ковалевская Н.К. Изготовление , контроль и применение некоторых биологически активных препаратов в животноводстве и ветеринарии. М:НИИмаш, 1983. -117с. 190 Головаченко В.А., Полынцев Д.Г. Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения лютеинизирующего гормона в сыворотке крови человека (гонадотропин ИФА ЛГ). М. – 2000. 6с. 191 Головаченко В.А. Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения фолликустимулирующего гормона в сыворотке крови. М. – 2000. -6с. 192 СТ РК 1613-2006. Надлежащая лабораторная практика 193 ГОСТ 23275-78 Сыворотка крови жеребых кобыл. Технические условия. 112 194 Патент №1725453. Способ получения гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл. С.В.Советкин, М.И. Прокофьева, А.А. Исмагулова. 195 Патент №1408584. Способ получения гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл. Бехтярев С.И., Школьников Е.Э. и др. 196 Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. – М: МГУ. – 1980. 150 с. 197 Патент №14759. Способ гормональной стимуляции суперовуляции овцематок –доноров каракульской породы овец. Алибаев Н., Бекетауов О. 198 Патент №23605. Отбор жизнеспособных эмбрионов каракульских овец для трансплантации эмбрионов. Алибаев Н., Бекетауов О. 199 Сергеев Н. И., Мазенкин С.А., Ефремова М.Н. Методические рекомендации по трансплантации эмбрионов у овец // ВАСХНИЛ, Всесоюзный научно-исследовательский институт животноводства. – Дубровицы, 1988. – 44 с. 200 Романов А.А., Советкин С.В. Инструкция по технологии работы организаций по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. М., 2003. 100с. 113 ПРИЛОЖЕНИЕ А 114 115 ПРИЛОЖЕНИЕ Б 116 ПРИЛОЖЕНИЕ В 117 118 ПРИЛОЖЕНИЕ Г 119 120 ПРИЛОЖЕНИЕ Д 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 0,76 0,72 0,78 0,75 0,80 0,77 0,81 0,79 0,84 0,80 0,86 0,82 0,87 0,83 0,85 0,84 0,83 0,81 50,7 48,0 52,0 50,0 53,3 51,3 54,0 52,7 56,0 53,3 57,3 54,7 58,0 55,3 56,7 56,0 55,3 54,0 80 45 120 90 140 100 180 120 200 160 280 240 250 250 270 280 280 250 2,1 : 1 1,11: 1 2,16 : 1 1,3 : 1 2,8 : 1 1,80 : 1 2,73 : 1 1,69 : 1 3,17 : 1 2,53 : 1 3,48 : 1 3,1 : 1 4,09 : 1 3,54 : 1 4,23 : 1 4,33 : 1 5,19 : 1 4,29 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 0,147 0,167 0,150 0,174 0,154 0,178 0,156 0,183 0,162 0,185 0,166 0,190 0,168 0,192 0,164 0,194 0,160 0,187 0,066 0,075 0,068 0,078 0,070 0,080 0,071 0,082 0,073 0,084 0,075 0,086 0,076 0,087 0,074 0,088 0,072 0,085 0,547 0,622 0,562 0,648 0,576 0,665 0,583 0,683 0,605 0,691 0,619 0,708 0,626 0,717 0,612 0,726 0,598 0,700 Получено всего смеси, л Состав смеси Соотношен ие объема смеси и СЖК 10 М раствор уксусной кислоты, л 4М раствор уксуснокислого Этиловый спирт, л Соотношен ие ФСГ/ЛГ % СЖК, л Кровь, л 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Активность СЖК м.е./мл Получено Доноры Сроки жеребости доноров Таблица Д.1 - Сыворотка жеребых кобыл полученных от 3-х летних кобыл-доноров в зависимости от возраста и сроков жеребости 1,520 1,584 1,560 1,650 1,60 1,694 1,620 1,738 1,680 1,760 1,720 1,804 1,740 1,826 1,70 1,848 1,660 1,782 55 60 65 70 75 80 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 55,0 50,0 55,0 60,0 55,0 60,0 55,0 55,0 55,0 55,0 55,0 55,0 55,0 50 90 100 130 110 180 170 200 230 270 280 300 280 310 300 290 280 280 1,28 : 1 2,18 : 1 1,78 : 1 2,24 : 1 1,84 : 1 3,12 : 1 2,43 : 1 3,20 : 1 4,12 : 1 2,55 : 1 3,73 : 1 4,27 : 1 3,65 : 1 4,24 : 1 3,46 : 1 5,42 : 1 4,34 : 1 5,61 : 1 122 0,193 0,232 0,193 0,232 0,193 0,255 0,193 0,255 0,232 0,255 0,232 0,255 0,212 0,255 0,212 0,255 0,212 0,255 0,087 0,104 0,087 0,104 0,087 0,115 0,087 0,115 0,104 0,115 0,104 0,115 0,096 0,115 0,096 0,115 0,096 0,115 0,720 0,864 0,720 0,864 0,720 0,950 0,720 0,950 0,864 0,950 0,864 0,950 0,792 0,950 0,792 0,950 0,792 0,950 Получено всего смеси, л 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 Этиловый спирт, л Активность СЖК м.е./мл % СЖК, л 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 1,1 1,2 1,1 1,2 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 4 М раствор уксуснокислого натрия, л 50 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 10 М раствор уксусной кислоты, л 45 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Состав смеси Соотношение объема смеси и СЖК 40 Кровь, л Сроки жеребости доноров Доноры Получено Соотношение ФСГ/ЛГ Продолжение таблицы Д.1 - 4 летние кобылы доноры 2,0 2,2 2,0 2,2 2,0 2,42 2,0 2,42 2,4 2,42 2,4 2,42 2,2 2,42 2,2 2,42 2,2 2,42 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1,1 1,0 1,1 1,0 1,1 1,0 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2 1,2 1,1 1,2 1,2 1,2 1,1 1,2 55,0 50,0 55,0 50,0 55,0 50,0 55,0 55,0 55,0 55,0 60,0 60,0 55,0 60,0 60,0 60,0 55,0 60,0 55 100 120 140 160 200 190 220 210 240 240 310 270 320 290 300 280 280 1,50 : 1 2,13 : 1 1,37 : 1 2,29 : 1 2,57 : 1 3,14 : 1 2,49 : 1 3,28 : 1 2,61 : 1 2,75 : 1 3,37 : 1 4,20 : 1 3,51 : 1 5,44 : 1 4,30 : 1 5,34 : 1 4,38 : 1 5,80 : 1 123 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 0,212 0,232 0,212 0,232 0,212 0,232 0,212 0,255 0,212 0,255 0,232 0,278 0,212 0,278 0,232 0,278 0,212 0,278 0,096 0,104 0,096 0,104 0,096 0,104 0,096 0,115 0,096 0,115 0,104 0,125 0,096 0,125 0,104 0,125 0,096 0,125 0,792 0,864 0,792 0,864 0,792 0,864 0,792 0,950 0,792 0,950 0,864 1,034 0,792 1,034 0,864 1,034 0,792 1,034 Получено всего смеси, л Этиловый спирт, л 4 М раствор уксуснокислого натрия, л Состав смеси 10 М раствор уксусной кислоты, л Соотношение объема смеси и СЖК Соотношение ФСГ/ЛГ % СЖК, л Кровь, л Сроки жеребости доноров Доноры Получено Активность СЖК м.е./мл Продолжение таблицы Д.1 – 5 летние кобылы доноры 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2 2,42 2,2 2,42 2,4 2,64 2,2 2,64 2,4 2,64 2,2 2,64 50 55 60 65 70 75 80 1,1 0,8 1,1 1,2 1,1 1,2 0,8 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 55,0 53,3 55,0 60,0 55,0 60,0 50,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 110 60 190 160 180 220 200 260 260 290 320 320 290 280 280 290 290 280 2,20 : 1 1,55 : 1 2,26 : 1 2,35 : 1 2,68 : 1 3,25 : 1 2,64 : 1 3,36 : 1 2,70 : 1 3,81 : 1 3,86 : 1 4,44 : 1 3,44 : 1 4,40 : 1 4,49 : 1 5,84 : 1 6,72 : 1 7,17 : 1 124 1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 0,212 0,185 0,212 0,278 0,212 0,278 0,154 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,096 0,084 0,096 0,125 0,096 0,125 0,070 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,792 0,691 0,792 1,034 0,792 1,034 0,576 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 Получено всего смеси, л 10 М раствор уксусной кислоты, л Соотношение объема смеси и СЖК Соотношение ФСГ/ЛГ Активность СЖК м.е./мл % СЖК, л Кровь, л 2 1,5 2 2 2 2 1,6 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Этиловый спирт, л 45 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Состав смеси 4 М раствор уксусно-кислого натрия, л 40 Получено Доноры Сроки жеребости доноров Продолжение таблицы Д.1 - 6 летние кобылы доноры 2,200 1,760 2,200 2,640 2,2 2,640 1,6 2,640 2,4 2,640 2,4 2,640 2,4 2,640 2,4 2,640 2,4 2,640 50 55 60 65 70 75 80 1,1 1,0 1,2 1,1 1,2 1,0 1,2 1,1 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,1 1,2 1,1 1,2 55,0 50,0 60,0 55,0 60,0 50,0 60,0 55,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 55,0 60,0 55,0 60,0 60 120 180 220 240 190 270 210 310 300 260 300 240 295 270 290 270 270 1,40 : 1 2,65 : 1 2,30 : 1 3,22 : 1 2,82 : 1 2,71 : 1 2,79 : 1 2,60 : 1 4,57 : 1 3,91 : 1 4,51 : 1 4,60 : 1 3,31 : 1 5,91 : 1 3,30 : 1 5,65 : 1 6,20 : 1 7,61 : 1 125 0,096 0,104 0,104 0,115 0,104 0,104 0,104 0,115 0,104 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,096 0,125 0,096 0,125 0,792 0,864 0,864 0,950 0,864 0,864 0,864 0,950 0,864 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,792 1,034 0,792 1,034 Получено всего смеси, л 0,212 0,232 0,232 0,255 0,232 0,232 0,232 0,235 0,232 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,212 0,278 0,212 0,278 Этиловый спирт, л 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 4 М раствор уксусно-кислого натрия, л Соотношение ФСГ/ЛГ Активность СЖК м.е./мл % СЖК, л Кровь, л 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 10 М раствор уксусной кислоты, л 45 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Состав смеси Соотношение объема смеси и СЖК 40 Получено Доноры Сроки жеребости доноров Продолжение таблицы Д.1 - 7 летние кобылы доноры 2,20 2,20 2,40 2,42 2,40 2,20 2,40 2,42 2,40 2,64 2,40 2,64 2,40 2,64 2,20 2,64 2,20 2,64 55 60 65 70 75 80 70 140 140 190 180 260 200 270 300 290 310 290 300 285 260 280 210 280 1,70 : 1 2,37 : 1 1,88 : 1 2,50 : 1 1,90 : 1 3,33 : 1 2,67 : 1 3,40 : 1 4,77 : 1 3,84 : 1 4,72 : 1 3,84 : 1 5,58 : 1 4,69 : 1 6,08 : 1 4,66 : 1 9,16 : 1 6,80 : 1 126 0,191 0,255 0,191 0,255 0,232 0,255 0,232 0,278 0,191 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,191 0,278 0,232 0,232 0,087 0,115 0,087 0,115 0,104 0,115 0,194 0,125 0,087 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,087 0,125 0,104 0,104 0,720 0,950 0,720 0,950 0,864 0,950 0,864 1,034 0,720 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,720 1,034 0,864 0,864 Получено всего смеси, л 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 Этиловый спирт, л % 50,0 55,0 50,0 55,0 60,0 55,0 60,0 60,0 50,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 50,0 60,0 60,0 50,0 Соотношение ФСГ/ЛГ Кровь, л СЖК, л 1,0 1,1 1,0 1,1 1,2 1,1 1,2 1,2 1,0 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,0 1,2 1,2 1,0 4 М раствор уксуснокислого натрия, л 50 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 10 М раствор уксусной кислоты, л 45 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Состав смеси Соотношение объема смеси и СЖК 40 Доноры Сроки жеребости доноров Получено Активность СЖК м.е./мл Продолжение таблицы Д.1 - 8 летние кобылы доноры 2,0 2,42 2,0 2,42 2,4 2,42 2,4 2,64 2,0 2,64 2,4 2,64 2,4 2,64 2,0 2,64 2,4 2,2 55 60 65 70 75 80 80 100 190 200 240 270 270 270 290 290 290 280 270 240 180 250 155 195 1,76 : 1 1,93 : 1 1,34 : 1 2,33 : 1 3,39 : 1 2,40 : 1 4,79 : 1 3,60 : 1 4,96 : 1 4,88 : 1 4,86 : 1 3,71 : 1 1,08 : 1 6,33 : 1 3,13 : 1 11,35 : 1 5,52 : 1 8,56 : 1 127 0,193 0,185 0,193 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,232 0,278 0,193 0,255 0,193 0,208 0,087 0,084 0,087 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,104 0,125 0,087 0,115 0,087 0,094 0,720 0,691 0,720 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,864 1,034 0,720 0,950 0,720 0,778 Получено всего смеси, л 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 Этиловый спирт, л % 50,0 40,0 50,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 50,0 55,0 50,0 45,0 Активность СЖК м.е./мл Кровь, л СЖК, л 1,0 0,8 1,0 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,0 1,1 1,0 0,9 4 М раствор уксуснокислого натрия, л 50 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 10 М раствор уксусной кислоты, л 45 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Состав смеси Соотношение объема смеси и СЖК 40 Доноры Сроки жеребости доноров Получено Соотношение ФСГ/ЛГ Продолжение таблицы Д.1 - 9 летние кобылы доноры 2,0 1,76 2,0 2,64 2,4 2,64 2,4 2,64 2,4 2,64 2,4 2,64 2,4 2,64 2,0 2,42 2,0 1,98 55 60 65 70 75 80 50,0 50,0 60,0 50,0 60,0 60,0 60,0 50,0 60,0 60,0 60,0 60,0 50,0 60,0 50,0 50,0 55,0 60,0 100 90 200 220 240 270 240 260 280 290 280 280 230 240 200 170 130 260 1,97 : 1 1,73 : 1 1,23 : 1 2,38 : 1 2,42 : 1 2,46 : 1 3,64 : 1 4,83 : 1 3,68 : 1 4,93 : 1 3,57 : 1 4,90 : 1 9,27 : 1 6,42 : 1 10,04 : 1 5,19 : 1 8,24 : 1 6,36 : 1 128 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 1:1 1,2 : 1 0,191 0,232 0,232 0,232 0,232 0,278 0,232 0,232 0,232 0,278 0,232 0,278 0,191 0,278 0,191 0,232 0,212 0,232 0,084 0,104 0,104 0,104 0,104 0,125 0,104 0,104 0,104 0,125 0,104 0,125 0,084 0,125 0,084 0,104 0,96 0,104 Этиловый спирт, л Соотношение ФСГ/ЛГ % Активность СЖК м.е./мл Кровь, л СЖК, л 1,0 1,0 1,2 1,0 1,2 1,2 1,2 1,0 1,2 1,2 1,2 1,2 1,0 1,2 1,0 1,0 1,1 1,2 4 М раствор уксуснокислого натрия, л 50 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 10 М раствор уксусной кислоты, л 45 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Состав смеси Соотношение объема смеси и СЖК 40 Доноры Сроки жеребости доноров Получено 0,720 0,864 0,864 0,864 0,864 1,034 0,864 0,864 0,864 1,034 0,864 1,034 0,720 1,034 0,720 0,864 0,792 1,034 Получено всего смеси, л Продолжение таблицы Д.1 - 10 летние кобылы доноры 2,0 2,2 2,4 2,2 2,4 2,64 2,4 2,2 2,4 2,64 2,4 2,64 2,0 2,64 2,0 2,2 2,2 2,64 ПРИЛОЖЕНИЕ Е 1,520 1,560 1,600 1,620 1,680 1,720 1,740 1,700 1,660 14,80 объем ,л % объем ,л 0,657 0,674 0,728 0,745 0,774 0,802 0,820 0,707 0,785 6,780 43,2 43,2 45,5 46,0 46,1 46,6 47,1 46,9 47,2 45,8 0,863 0,886 0,872 0,875 0,906 0,918 0,920 0,903 0,877 8,020 % 56,8 1,584 56,8 1,650 54,5 1,694 54,0 1,738 53,9 1,760 53,4 1,804 52,9 1,826 53,1 1,848 52,8 1,782 54,2 15,686 II-способ (1,2:1) Получено Центрифугат Белок объем ,л % объе м, л % 0,662 0,693 0,722 0,749 0,764 0,797 0,818 0,830 0,805 6,840 41,8 42,0 42,6 43,1 43,4 44,2 44,8 44,9 45,2 43,6 0,922 0,957 0,972 0,989 0,996 1,007 1,008 1,018 0,977 8,846 58,2 58,0 57,4 56,9 56,6 55,8 55,2 55,1 54,8 56,4 129 Объем смеси, л Объем смеси, л 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Всего I-способ (1:1) Получено Центрифугат Белок Объем смеси, л Сроки жеребости кобыл Таблица Е. 2 - Осаждение белков из сыворотки жеребых кобыл 3 летного возраста Всего Получено Центрифугат Белок объем, л 3,104 1,319 3,210 1,367 3,294 1,450 3,358 1,494 3,440 1,538 3,524 1,599 3,566 1,638 3,548 1,627 3,442 1,588 30,486 13,620 % объем, л 42,5 1,785 42,6 1,843 44,0 1,844 44,5 1,864 44,7 1,902 45,4 1,925 45,9 1,928 45,9 1,921 46,1 1,854 44,7 16,866 % 57,5 57,4 56,0 55,5 55,3 54,6 54,1 54,1 53,9 55,3 2,0 2,0 2,0 2,0 2,4 2,4 2,2 2,2 2,2 19,4 2,2 2,2 2,42 2,42 2,42 2,42 2,42 2,42 2,42 21,34 II-способ (1,2:1) Получено Центрифугат Белок объе объем, % % м, л л 0,882 40,1 1,338 59,9 0,884 40,2 1,316 59,8 1,007 41,6 1,413 58,4 1,023 42,3 1,397 57,7 1,028 42,5 1,392 57,5 1,042 43,1 1,377 56,9 1,045 43,2 1,375 56,7 1,055 43,6 1,365 56,4 1,060 43,8 1,360 56,2 9,026 42,3 12,314 57,7 130 Объем смеси, л Объем смеси, л 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Всего I-способ (1:1) Получено Центрифугат Белок объем, объе % % л м, л 0,892 44,6 1,108 55,4 0,898 44,9 1,102 55,1 0,902 45,1 1,098 54,9 0,914 45,7 1,086 54,3 1,111 46,3 1,289 53,7 1,123 46,8 1,277 53,2 1,041 47,3 1,159 52,7 1,047 47,6 1,153 52,4 1,052 47,8 1,148 52,2 8,98 46,3 10,42 53,7 Объем смеси, л Сроки жеребости кобыл Продолжение таблицы Е.2 - Осаждение белков из сыворотки жеребых кобыл 4 летного возраста 4,2 4,2 4,42 4,42 4,82 4,82 4,62 4,62 4,62 40,74 Всего Получено Центрифугат Белок объем, объем, % % л л 1,774 42,2 2,426 57,8 1,782 42,4 2,418 57,6 1,909 43,2 2,511 56,8 1,937 43,8 2,483 56,2 2,139 44,4 2,681 55,6 2,165 44,9 2,655 55,1 2,088 45,2 2,532 54,8 2,103 45,5 2,517 54,5 2,113 45,7 2,507 54,3 18,010 44,2 22,733 55,8 2,2 2,2 2,2 2,42 2,42 2,64 2,64 2,64 2,64 22,0 II-способ (1,2:1) Получено Центрифугат Белок объем, объем, % % л л 0,980 41,4 1,290 58,6 0,924 42,0 1,276 58,0 0,931 42,3 1,269 57,7 1,033 42,7 1,387 57,3 1,043 43,1 1,377 56,9 1,194 45,2 1,446 54,8 1,201 45,5 1,439 54,5 1,209 45,8 1,431 54,2 1,214 46,0 1,426 54,0 9,659 43,9 12,341 56,1 131 Объем смеси, л Сроки жеребости кобыл Объем смеси, л I-способ (1:1) Получено Центрифугат Белок объем объем, % % ,л л 40 2,2 0,987 44,9 1,213 55,1 45 2,2 0,990 45,0 1,210 55,0 50 2,2 0,994 45,2 1,206 54,8 55 2,2 1,018 46,3 1,182 53,7 60 2,2 1,038 47,2 1,162 52,8 65 2,4 1,176 49,0 1,224 51,0 70 2,2 1,082 49,2 1,118 50,8 75 2,4 1,186 49,4 1,214 50,6 80 2,2 1,091 49,6 1,109 50,4 Всего 20,2 9,562 47,3 10,638 52,7 Объем смеси, л Продолжение таблицы Е.2 - Осаждение белков из сыворотки жеребых кобыл 5 летного возраста 4,4 4,4 4,4 4,62 4,62 5,04 4,84 5,04 4,84 42,2 Всего Получено Центрифугат Белок объем, объем, % % л л 1,897 43,1 2,503 56,9 1,914 43,5 2,486 56,5 1,925 43,7 2,475 56,3 2,051 44,4 2,569 55,6 2,081 45,0 2,539 55,0 2,370 47,0 2,670 53,0 2,283 47,2 2,557 52,8 2,396 47,5 2,644 52,5 2,305 47,6 2,535 52,4 19,222 45,6 22,978 54,4 Центрифугат объе м, л 0,944 0,950 0,968 0,722 1,157 1,162 1,164 1,169 1,099 42,9 43,2 44,0 45,1 48,2 48,4 48,5 48,7 45,8 Всего 20,2 9,335 46,2 40 45 50 55 60 65 70 75 80 2,2 2,2 2,2 1,6 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 % Белок объе м, л 1,256 1,250 1,232 0,878 1,243 1,238 1,236 1,234 1,301 10,86 5 II-способ (1,2:1) Получено Центрифугат 57,1 56,8 56,0 54,9 51,8 51,6 51,5 51,3 54,2 1,76 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 объем, л 0,739 1,117 1,130 1,162 1,249 1,254 1,259 1,265 1,183 53,8 22,88 10,358 % 132 Белок 42,0 42,3 42,8 44,0 47,0 47,5 47,7 47,9 44,8 объем, л 1,021 1,523 1,510 1,478 1,391 1,386 1,381 1,375 1,457 45,3 12,53 % % 58,0 57,7 57,2 56,0 52,7 52,5 52,3 52,1 55,2 Объем смеси, л I-способ (1:1) Получено Объем смеси, л Сроки жеребости кобыл Объем смеси, л Продолжение таблицы Е.2 - Осаждение белков из сыворотки жеребых кобыл 6 летного возраста 3,96 4,84 4,84 4,24 5,04 5,04 5,04 5,04 5,04 Всего Получено Центрифуга Белок т объем, объем, % % л л 1,683 42,5 2,277 57,5 2,067 42,7 2,773 57,3 2,098 43,3 2,742 56,7 1,884 44,4 2,356 55,6 2,406 47,7 2,634 52,3 2,416 47,9 2,624 52,1 2,424 48,1 2,616 51,9 2,434 48,3 2,606 51,7 2,282 45,3 2,758 54,7 54,7 43,08 19,694 45,7 23,386 54,3 2,2 2,42 2,2 2,42 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 II-способ (1,2:1) Получено Центрифугат Белок объем, объем, % % л л 0,966 43,9 1,234 56,1 1,072 44,3 1,348 55,7 0,983 44,7 1,217 55,3 1,108 45,8 1,312 54,2 1,272 48,2 1,368 51,8 1,280 48,5 1,360 51,5 1,286 48,7 1,354 51,3 1,291 48,9 1,349 51,1 1,235 46,8 1,405 53,2 22,44 10,493 133 46,8 11,947 Объем смеси, л Сроки жеребости кобыл Объем смеси, л I-способ (1:1) Получено Центрифугат Белок объем объе % % ,л м, л 40 2,2 1,012 46,0 1,188 54,0 45 2,4 1,113 46,4 1,287 53,6 50 2,4 1,115 46,5 1,285 53,5 55 2,4 1,140 47,5 1,260 52,5 60 2,4 1,157 48,2 1,243 51,8 65 2,4 1,161 48,4 1,239 51,6 70 2,4 1,169 48,7 1,231 51,3 75 2,2 1,078 49,0 1,122 51,0 80 2,2 1,051 48,1 1,149 52,2 11,00 Всего 21,0 9,996 47,6 52,4 4 Объем смеси, л Продолжение таблицы Е.2 - Осаждение белков из сыворотки жеребых кобыл 7 летного возраста 4,4 4,82 4,6 4,82 5,04 5,04 5,04 4,84 4,84 Всего Получено Центрифугат Белок объем, объем % % л ,л 1,978 45,0 2,422 55,0 2,185 45,3 2,635 54,7 2,098 45,6 2,502 54,4 2,248 46,6 2,572 53,4 2,430 48,2 2,610 51,8 2,441 48,4 2,599 51,6 2,455 48,7 2,585 51,3 2,369 48,9 2,471 51,1 2,286 47,2 2,554 52,8 53,2 43,44 20,490 47,2 22,950 52,8 Продолжение таблицы Е.2 - Осаждение белков из сыворотки жеребых кобыл 8 летного возраста Объем смеси, л Объем смеси, л Сроки жеребости кобыл Объем смеси, л I-способ (1:1) II-способ (1,2:1) Всего Получено Получено Получено Центрифугат Белок Центрифугат Белок Центрифугат Белок объе объе объем, объем, объем, объем, % % % % % % м, л м, л л л л л 40 2,0 0,898 44,9 1,102 55,1 2,42 1,060 43,8 1,360 56,2 4,42 1,958 44,3 2,462 55,7 45 2,0 0,904 45,2 1,096 54,8 2,42 1,084 44,8 1,336 55,2 4,42 1,988 45,0 2,432 55,0 50 2,4 1,097 45,7 1,303 54,3 2,42 1,101 45,5 1,319 54,5 4,82 2,198 45,6 2,622 54,4 55 2,4 1,106 46,1 1,294 53,9 2,64 1,212 45,9 1,428 54,1 5,04 2,318 46,0 2,722 54,0 60 2,0 0,960 48,0 1,040 52,0 2,64 1,264 47,9 1,376 52,1 4,64 2,224 47,9 2,416 52,1 65 2,4 1,154 48,1 1,246 51,9 2,64 1,270 48,1 1,370 51,9 5,04 2,424 48,1 2,616 51,9 70 2,4 1,159 48,3 1,241 51,7 2,64 1,275 48,3 1,365 51,7 5,04 2,434 48,3 2,606 51,7 75 2,0 0,972 48,6 1,028 51,4 2,64 1,280 48,5 1,360 51,5 4,64 2,252 48,5 2,388 51,5 80 2,4 1,111 46,3 1,289 53,7 2,20 1,014 46,1 1,186 53,9 4,60 2,125 46,2 2,475 53,8 10,63 Всего 20,0 9,361 46,8 53,2 22,66 10,320 45,5 12,340 54,5 42,66 19,921 46,7 22,739 53,3 9 134 1,76 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,42 1,98 22,0 II-способ (1,2:1) Получено Центрифугат Белок объем, объем, % % л л 0,720 40,9 1,040 59,1 1,096 41,5 1,544 58,5 1,114 42,2 1,526 57,8 1,220 46,2 1,420 53,8 1,225 46,4 1,415 53,6 1,232 46,7 1,408 53,3 1,177 44,6 1,463 55,4 1,075 44,4 1,345 55,6 0,871 44,0 1,109 56,0 9,730 44,21 135 12,27 55,8 3,76 4,64 5,04 5,04 5,04 5,04 5,04 4,42 3,98 Всего Получено Центрифугат Белок объем, объем, % % л л 1,554 41,3 2,206 58,7 1,942 41,9 2,698 58,1 2,160 42,9 2,880 57,1 2,329 46,2 2,711 53,8 2,341 46,4 2,699 53,6 2,358 46,8 2,682 53,2 2,276 45,2 2,764 54,8 1,981 44,8 2,439 55,2 1,753 44,0 2,227 56,0 42,0 18,694 Объем смеси, л Сроки жеребости кобыл Объем смеси, л I-способ (1:1) Получено Центрифугат Белок объе объе % % м, л м, л 40 2,0 0,834 41,7 1,166 58,3 45 2,0 0,846 42,3 1,154 57,7 50 2,4 1,046 43,6 1,354 56,4 55 2,4 1,109 46,2 1,291 53,8 60 2,4 1,116 46,5 1,284 53,5 65 2,4 1,126 46,9 1,274 53,1 70 2,4 1,099 45,8 1,301 54,2 75 2,0 0,906 45,3 1,094 54,7 80 2,0 0,882 44,1 1,118 55,9 11,03 Всего 20,0 8,964 44,8 55,2 6 Объем смеси, л Продолжение таблицы Е.2 - Осаждение белков из сыворотки жеребых кобыл 9 летного возраста 44,5 23,306 55,5 2,20 2,20 2,64 2,2 2,64 2,64 2,64 2,20 2,64 22,0 II-способ (1,2:1) Получено Центрифугат Белок объем, объем, % % л л 0,906 41,2 1,294 58,8 0,928 42,2 1,272 57,8 1,146 43,4 1,494 56,6 1,016 46,2 1,184 53,8 1,228 46,5 1,412 53,5 1,235 46,8 1,405 53,2 1,161 44,0 1,479 56,0 0,935 42,5 1,265 57,5 1,108 42,0 1,532 58,0 9,663 43,9 136 12,337 56,1 4,20 4,60 5,04 4,60 5,04 5,04 4,64 4,20 4,84 Всего Получено Центрифугат Белок объем, объем, % % л л 1,726 41,1 2,474 58,9 1,919 41,7 2,681 58,3 2,163 42,9 2,877 57,1 2,120 46,1 2,480 53,9 2,337 46,4 2,703 53,6 2,348 46,6 2,692 53,4 2,053 44,3 2,587 55,7 1,819 43,3 2,381 56,7 2,065 42,7 2,775 57,3 42,2 18,550 Объем смеси, л Сроки жеребости кобыл Объем смеси, л I-способ (1:1) Получено Центрифугат Белок объе объе % % м, л м, л 40 2,0 0,820 41,0 1,180 59,0 45 2,4 0,991 41,3 1,409 58,7 50 2,4 1,017 42,4 1,383 57,6 55 2,4 1,104 46,0 1,296 54,0 60 2,4 1,109 46,2 1,291 53,8 65 2,4 1,113 46,4 1,287 53,6 70 2,0 0,892 44,6 1,108 55,4 75 2,0 0,884 44,2 1,116 55,8 80 2,2 0,957 43,5 1,243 56,5 11,31 Всего 20,2 8,887 44,0 56,0 3 Объем смеси, л Продолжение таблицы Е.2 - Осаждение белков из сыворотки жеребых кобыл 10 летного возраста 44,0 23,650 56,0 ПРИЛОЖЕНИЕ Ж Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина, % Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина, % ГСЖК Объем, л СЖК II способ Активность м.е. Общая активность м.е. 40 45 50 55 60 65 70 75 80 СЖК I способ ГСЖК Объем, л Сроки жеребости доноров Таблица Ж.3 – Выход гонадотропных гормонов из исходного сырья, 3-х летние кобылы-доноры 0,760 0,780 0,800 0,810 0,840 0,860 0,870 0,850 0,830 80 120 140 180 200 280 250 270 280 0,181 0,285 0,362 0,333 0,420 0,551 0,557 0,562 0,543 100 150 150 220 240 350 300 340 300 18100 42750 54300 73260 100800 192850 167100 174220 162900 29,8 45,7 48,5 50,2 60,0 80,1 76,8 75,9 70,1 45 90 100 120 160 240 250 280 250 93200 161100 189000 240600 296000 437600 425000 464700 434900 0,295 0,422 0,506 0,558 0,837 1,068 1,089 1,150 1,044 60 110 130 140 180 300 310 320 300 21940 57820 73020 104760 170460 347950 332020 362380 313200 11,8 22,3 24,3 33,2 54,4 78,8 79,5 80,0 74,2 60800 93600 112000 145800 168000 240800 217500 229500 232400 137 1,480 1,530 1,570 1,600 1,640 1,680 1,700 1,690 1,640 Продолжение таблицы Ж.3 – 4-х летние кобылы-доноры I способ СЖК II способ СЖК Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина, % Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина, % ГСЖК Сроки жеребости доноров Объем, л ГСЖК 40 45 50 55 60 65 70 75 80 50 100 110 170 230 280 280 300 280 50000 100000 110000 170000 276000 336000 308000 330000 308000 0,168 0,270 0,274 0,365 0,660 0,771 0,702 0,674 0,700 60 150 180 260 260 350 360 400 330 10080 40500 49320 94900 171600 269808 252868 269600 231000 20,2 40,5 44,8 55,8 62,2 80,3 82,1 81,7 75,0 90 130 180 200 270 300 310 290 280 140000 230000 308000 390000 573000 666000 649000 649000 616000 0,156 0,237 0,371 0,389 0,587 0,677 0,650 0,712 0,591120 120 180 270 310 320 390 420 340 400 28800 83160 149490 215490 359440 533838 525868 511680 467400 20,6 36,2 48,5 55,2 62,7 80,2 81,0 78,8 75,9 1,0 1,0 1,0 1,0 1,2 1,2 1,1 1,1 1,1 138 1,0 1,0 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 Продолжение таблицы Ж.3 – 5 летние кобылы-доноры Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% II способ СЖК Сроки жеребости доноров I способ СЖК 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2 1,1 1,2 1,1 55 120 160 190 210 240 270 290 280 60500 132000 176000 209000 231000 288000 297000 348000 308000 0,105 0,274 0,339 0,396 0,522 0,583 0,665 0,680 0,696 70 180 260 290 290 320 360 410 330 7350 48600 88140 114840 151380 186560 235800 278800 229680 12,1 36,8 50,1 54,9 65,5 70,7 79,4 80,1 74,6 100 140 200 220 240 310 320 300 280 165000 272000 376000 451000 495000 660000 681000 708000 644000 0,218 0,310 0,424 0,531 0,644 0,693 0,743 0,720 0,679 140 200 260 280 290 450 420 400 380 37870 110600 198380 263520 338140 498410 547860 566800 487700 23,0 46,7 52,8 58,4 68,3 83,8 80,4 80,1 75,7 ГСЖК 139 1,0 1,0 1,0 1,1 1,1 1,2 1,2 1,2 1,2 ГСЖК Продолжение таблицы Ж.3 – 6 летние кобылы-доноры Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% II способ ГСЖК Сроки жеребости доноров Объем, л I способ ГСЖК 40 45 50 55 60 65 70 75 80 110 190 180 200 260 320 290 280 290 121000 209000 198000 160000 312000 384000 348000 336000 348000 0,208 0,369 0,76 0,386 0,630 0,709 0,643 0,645 0,681 150 250 270 280 380 450 420 400 310 34200 92250 101520 108080 239400 319050 270060 258000 211110 25,8 44,1 51,3 67,5 76,7 83,1 77,6 76,8 60,7 60 160 220 260 290 320 280 290 280 169000 401000 462000 472000 660000 768000 684000 684000 684000 0,140 0,490 0,578 0,660 0,655 0,676 0,600 0,661 0,686 80 220 280 300 430 470 400 390 320 42400 200050 263360 306080 521050 636770 510060 515790 430630 25,1 49,9 57,0 64,8 78,9 82,9 74,6 75,1 62,9 СЖК 1,1 1,1 1,1 0,8 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 СЖК 140 0,8 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 Продолжение таблицы Ж.3 – 7 летние кобылы-доноры Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% II способ СЖК Сроки жеребости доноров I способ СЖК 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1,1 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,1 1,1 60 180 240 270 310 260 240 270 270 66000 216000 288000 324000 372000 312000 288000 297000 297000 0,230 0,505 0,690 0,745 0,665 0,564 0,548 0,563 0,589 90 230 270 290 460 420 370 400 310 20700 116150 186300 216050 305900 236880 202760 225200 182590 31,4 53,8 64,7 66,7 82,2 75,9 70,4 75,8 61,5 120 220 190 210 300 300 295 290 270 186000 458000 478000 555000 732000 672000 642000 645000 621000 0,225 0,569 0,433 0,526 0,656 0,654 0,675 0,614 0,692 180 260 240 280 440 450 420 410 320 61200 264090 290220 363330 594540 531180 486260 476940 404030 32,9 57,7 60,7 65,5 81,2 79,0 75,7 73,9 65,1 ГСЖК 141 1,0 1,1 1,0 1,1 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 ГСЖК Продолжение таблицы Ж.3 – 8 летние кобылы-доноры Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% II способ СЖК Сроки жеребости доноров I способ СЖК 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1,0 1,0 1,2 1,2 1,0 1,2 1,2 1,0 1,2 70 140 180 200 300 310 300 260 210 70000 140000 216000 240000 300000 372000 360000 260000 252000 0,170 0,342 0,422 0,578 0,568 0,732 0,705 0,513 0,615 90 190 250 280 440 420 400 380 270 15300 64980 105500 161840 249920 307440 282000 194940 166050 21,8 46,4 48,8 67,4 83,3 82,6 78,3 75,0 65,9 140 190 260 270 290 290 285 280 280 224000 349000 504000 564000 648000 720000 702000 596000 532000 0,374 0,475 0,592 0,674 0,663 0,668 0,615 0,646 0,629 200 220 290 290 420 420 410 390 300 90100 169480 277180 357300 528380 588000 534150 446880 354750 40,2 48,6 55,0 63,5 81,5 81,7 76,1 75,0 66,7 ГСЖК 142 1,1 1,1 1,1 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,0 ГСЖК Продолжение таблицы Ж.3 – 9 летние кобылы-доноры Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% II способ СЖК Сроки жеребости доноров I способ СЖК 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1,0 1,0 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,0 1,1 80 190 240 270 290 290 270 180 155 80000 190000 288000 324000 348000 348000 324000 180000 155000 0,172 0,354 0,595 0,600 0,628 0,645 0,717 0,360 0,367 100 240 280 380 420 400 300 250 210 17200 84960 166600 228000 263760 258000 215100 90000 77070 21,5 44,7 57,8 70,4 75,8 74,1 66,1 50,0 49,7 100 200 270 270 290 280 240 250 195 160000 430000 612000 648000 696000 684000 612000 455000 330500 0,172 0,464 0,611 0,577 0,650 0,656 0,640 0,648 0,372 140 260 320 400 440 410 300 280 230 41280 205600 362220 458800 549760 526690 407100 271440 162630 25,8 47,8 59,2 70,8 78,0 77,0 66,5 59,7 49,2 ГСЖК 143 0,8 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,1 0,9 ГСЖК Продолжение таблицы Ж.3 – 10 летние кобылы-доноры Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина % Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Объем, л Активность м.е. Общая активность м.е. Выход гонадотропина ,% II способ СЖК Сроки жеребости доноров I способ СЖК 40 45 50 55 60 65 70 75 80 1,0 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,0 1,0 1,1 100 200 240 240 280 280 230 200 130 100000 240000 288000 288000 336000 336000 230000 200000 143000 0,243 0,456 0,604 0,537 0,560 0,560 0,500 0,472 0,401 140 290 310 400 450 450 300 280 180 34020 132240 187240 214800 252000 252000 150000 130160 70180 34,0 55,1 65,0 74,6 75,0 75,0 65,2 66,1 50,5 90 220 270 260 290 280 240 170 260 190000 460000 612000 548000 684000 672000 518000 370000 455000 0,300 0,550 0,694 0,460 0,622 0,564 0,640 0,382 0,646 120 240 320 400 460 440 300 210 290 70020 264240 409320 398800 538800 500600 342300 212380 259520 36,8 57,4 66,9 72,8 78,7 74,5 66,1 57,4 57,0 ГСЖК 144 1,0 1,0 1,2 1,0 1,2 1,2 1,2 1,0 1,2 ГСЖК ПРИЛОЖЕНИЕ К Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ Выход гонадотропина % Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ Выход гонадотропина % Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ II способ Выход гонадотропина % I способ Соотношение ФСГ/ЛГ II способ 4 летние доноры Активность ГСЖК, м.е./мл 40 45 50 55 60 65 70 75 80 I способ 3 летние доноры Выход гонадотропина % Сроки жеребости доноров Таблица К.4 - Биологические качества полученного сухого ГСЖК из сыворотки крови жеребых кобыл. 38.7 45.7 48.5 50.2 60.0 80.0 76.8 75.9 70.1 130 150 150 220 240 350 300 310 300 1.83:1 1.84:1 2.60:1 2.60:1 3.0:1 3.1:1 3.31:1 3.42:1 4.09:1 15.8 22.3 24.3 33.2 54.4 78.8 79.5 80.0 74.2 80 110 130 140 180 300 310 320 300 1.1:1 1.15:1 1.62:1 1.52:1 2.08:1 3.0:1 3.31:1 3.72:1 3.3:1 37.0 40.5 44.8 55.8 62.2 80.3 82.1 81.7 75.0 110 150 180 260 260 350 360 400 330 1.12:1 1.63:1 1.71:1 2.13:1 2.26:1 3.40:1 3.10:1 3.22:1 3.5:1 38.1 47.4 50.6 54.8 63.2 80.0 80.0 75.9 76.8 220 260 270 310 320 390 420 340 400 1.92:1 1.87:1 2.60:1 2.70:1 2.4:1 3.59:1 3.63:1 3.74:1 3.25:1 145 Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ Выход гонадотропина % Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ Выход гонадотропина % Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ II способ Выход гонадотропина % I способ Соотношение ФСГ/ЛГ II способ 6 летние доноры Активность ГСЖК, м.е./мл 40 45 50 55 60 65 70 75 80 I способ 5 летние доноры Выход гонадотропина % Сроки жеребости доноров Продолжение таблицы К.4 31.2 45.7 50.1 54.9 65.5 70.7 79.4 80.1 74.6 180 220 260 290 290 330 360 410 330 1.33:1 1.26:1 2.31:1 2.26:1 2.35:1 3.06:1 3.09:1 3.53:1 3.50:1 34.9 48.7 55.1 61.4 64.8 83.8 81.3 80.0 76.8 160 220 260 280 290 450 420 400 380 1.88:1 2.01:1 2.60:1 2.80:1 2.30:1 3.53:1 3.46:1 3.38:1 3.92:1 34.4 44.1 51.3 67.5 76.7 83.1 77.6 76.8 60.7 200 250 270 280 380 450 420 450 310 1.83:1 1.92:1 2.20:1 2.37:1 3.43:1 3.4:1 3.0:1 3.63:1 5.36:1 35.0 56.1 61.3 63.5 80.9 82.7 71.4 74.1 65.3 120 220 280 300 430 470 400 390 320 1.40:1 2.06:1 2.80:1 2.80:1 3.40:1 3.68:1 3.59:1 3.73:1 5.92:1 146 Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ Выход гонадотропина % Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ Выход гонадотропина % Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ II способ Выход гонадотропина % I способ Соотношение ФСГ/ЛГ II способ 8 летние доноры Активность ГСЖК, м.е./мл 40 45 50 55 60 65 70 75 80 I способ 7 летние доноры Выход гонадотропина % Сроки жеребости доноров Продолжение таблицы К.4 38.3 53.8 64.7 66.7 82.2 75.9 70.4 75.8 61.5 110 230 270 290 460 420 370 400 310 1.25:1 2.02:1 2.11:1 2.04:1 3.80:1 3.43:1 3.00:1 3.10:1 2.50:1 37.5 61.1 54.7 63.7 80.2 81.7 80.1 72.3 68.3 200 260 240 280 440 450 420 410 320 2.22:1 2.70:1 2.43:1 2.34:1 3.4:1 3.85:1 3.73:1 3.52:1 4.53:1 38.8 46.4 48.8 67.4 83.3 82.6 78.3 75.0 65.9 160 190 250 280 440 420 400 380 270 1.33:1 1.26:1 2.31:1 2.26:1 2.35:1 3.06:1 3.09:1 3.53:1 3.50:1 48.6 50.0 60.0 60.3 80.0 80.6 73.7 75.0 67.4 200 220 290 290 420 420 410 390 300 1.33:1 1.26:1 2.31:1 2.26:1 2.35:1 3.06:1 3.09:1 3.53:1 3.50:1 147 Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ Выход гонадотропина % Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ Выход гонадотропина % Активность ГСЖК, м.е./мл Соотношение ФСГ/ЛГ II способ Выход гонадотропина % I способ Соотношение ФСГ/ЛГ II способ 10 летние доноры Активность ГСЖК, м.е./мл 40 45 50 55 60 65 70 75 80 I способ 9 летние доноры Выход гонадотропина % Сроки жеребости доноров Продолжение таблицы К.4 38.7 44.7 57.8 70.4 75.8 74.1 66.4 50.0 49.7 180 240 280 380 420 400 300 250 210 1.61:1 1.21:1 2.9:1 4.02:1 4.17:1 3.98:1 4.13:1 1.72:1 2.41:1 40.8 50.3 60.3 71.2 82.2 80.0 66.7 66.0 48.7 190 260 320 400 440 410 300 280 230 2.0:1 2.22:1 2.8:1 2.9:1 3.4:1 3.4:1 3.71:1 3.67:1 4.58:1 38.9 55.1 65.0 74.6 75.0 75.0 65.2 66.1 50.5 160 290 310 400 450 450 300 280 180 1.8:1 1.12:1 2.15:1 3.18:1 3.40:1 3.1:1 5.52:1 5.81:1 5.82:1 40.0 60.0 68.5 70.8 82.2 74.2 66.8 47.2 60.0 120 240 320 400 460 440 300 210 290 1.57:1 2.1:1 2.1:1 3.12:1 4.1:1 4.02:1 2.93:1 2.05:1 3.73:1 148 ПРИЛОЖЕНИЕ Л Таблица Л. 5 - Выход сухого гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл разных возрастов Возраст доноров 3 4 5 6 7 8 9 10 В среднем М±m 0.422±0.044 0.509±0.065 0.473±0.065 0.516±0.057 0.567±0.046 0.516±0.056 0.493±0.058 0.481±0.034 I-способ σ 0.132 0.222 0.195 0.171 0.139 0.169 0.173 0.103 Сv 31.3 43.6 41.2 33.1 21.5 32.7 35.1 21.4 М±m 0.344±0,064 0,486±0,064 0,551±0,060 0,572±0,084 0,560±0,047 0,593±0,032 0,532±0,052 0,540±0,082 0.497±0.022 0.185 37.2 0,522±0,021 149 II-способ σ 0,191 0,191 0,181 0,252 0,142 0,096 0,157 0,245 0,175 Сv 55,5 39,3 32,8 44,1 24,8 16,2 29,5 45,4 М±m 0,383±0,040 0,497±0,049 0,512±0,045 0,544±0,040 0,563±0,033 0,544±0,034 0,513±0,039 0,511±0,028 Всего σ 0,168 0,207 0,192 0,170 0,141 0,143 0,166 0,118 33,5 0,510±0,010 0,122 Сv 43,9 41,6 37,5 31,2 25,2 25,8 32,3 23,1 23,9 ПРИЛОЖЕНИЕ М Таблица М. 6 - Выход сухого гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл в зависимости сроков жеребости Сроки жеребости доноров 40 45 50 55 60 65 70 75 80 В среднем I-способ Всего II-способ М±m σ Сv М±m σ Сv М±m σ Сv 0,185±0,014 0,357±0,029 0,458±0,050 0,493±0,048 0,582±0,027 0,639±0,029 0,630±0,027 0,559±0,036 0,574±0,085 0,497±0,022 0,040 0,081 0,141 0,136 0,077 0,082 0,078 0,103 0,241 0,185 21,6 22,7 30,8 27,6 13,2 12,8 12,4 18,4 42,0 37,2 0,206±0,032 0,404±0,052 0,481±0,058 0,505±0,049 0,608±0,031 0,638±0,021 0,637±0,020 0,621±0,035 0,600±0,037 0,522±0,021 0,091 0,147 0,164 0,138 0,089 0,059 0,057 0,093 0,104 0,175 44,2 12,9 34,1 27,3 14,6 9,2 8,9 15,9 6,7 33,5 0,195±0,018 0,380±0,030 0,469±0,038 0,499±0,034 0,595±0,021 0,639±0,018 0,633±0,017 0,590±0,026 0,587±0,046 0,510±0,010 0,071 0,121 0,153 0,137 0,084 0,071 0,068 0,106 0,186 0,122 36,4 31,8 32,6 27,4 14,1 11,1 10,7 18,0 31,7 23,9 150 ПРИЛОЖЕНИЕ Н Таблица Н. 7 - Гонадотропная активность сыворотки жеребых кобыл после очистки от балластных белков. Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах II способ после очистки I способ до очистки II способ 4 летние доноры Сроки жеребости доноров I способ 3 летние доноры 40 45 50 55 60 65 70 75 80 80 120 140 180 200 280 250 270 280 100 150 150 220 240 350 300 310 300 1,25 1,25 1,07 1,22 1,2 1,25 1,2 1,15 1,07 45 90 100 120 160 240 250 280 250 60 110 130 140 180 300 310 320 300 1,33 1,22 1,3 1,17 1,12 1,25 1,24 1,14 1,2 50 100 110 170 230 280 280 300 280 60 150 180 260 260 350 360 400 330 1,2 1,5 1,64 1,53 1,13 1,25 1,28 1,33 1,18 90 130 180 200 270 300 310 290 280 120 180 270 310 320 390 420 340 400 1,33 1,38 1,5 1,55 1,18 1,3 1,35 1,17 1,43 151 Продолжение таблицы Н. 7 Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах II способ после очистки I способ до очистки II способ 6 летние доноры Сроки жеребости доноров I способ 5 летние доноры 40 45 50 55 60 65 70 75 80 55 120 160 190 210 240 270 290 280 70 180 260 290 290 320 360 410 330 1,27 1,5 1,62 1,53 1,38 1,33 1,33 1,41 1,18 100 140 200 220 240 310 320 300 280 140 200 260 280 290 450 420 400 380 1,4 1,43 1,3 1,27 1,21 1,45 1,31 1,33 1,36 110 190 180 200 260 320 290 280 290 150 250 270 280 380 450 420 400 310 1,36 1,31 1,5 1,4 1,46 1,41 1,45 1,43 1,07 60 160 220 260 290 320 280 290 280 80 220 280 300 430 470 400 390 320 1,33 1,37 1,27 1,15 1,48 1,47 1,43 1,34 1,14 152 Продолжение таблицы Н. 7 Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах II способ после очистки I способ до очистки II способ 8 летние доноры Сроки жеребости доноров I способ 7 летние доноры 40 45 50 55 60 65 70 75 80 60 180 240 270 310 260 240 270 270 90 230 270 290 460 420 370 400 310 1,5 1,28 1,12 1,07 1,48 1,6 1,54 1,48 1,15 120 220 190 210 300 300 295 290 270 180 260 240 280 440 450 420 410 320 1,5 1,18 1,26 1,33 1,47 1,5 1,42 1,41 1,18 70 140 180 200 300 310 300 260 210 90 190 250 280 440 420 400 380 270 1,28 1,36 1,39 1,4 1,47 1,35 1,33 1,46 1,28 140 190 260 270 290 290 285 280 280 200 220 290 290 420 420 410 390 300 1,43 1,16 1,11 1,07 1,45 1,45 1,44 1,39 1,07 153 Продолжение таблицы Н. 7 Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах до очистки после очистки Степень концентрации, в разах II способ после очистки I способ до очистки II способ 10 летние доноры Сроки жеребости доноров I способ 9 летние доноры 40 45 50 55 60 65 70 75 80 80 190 240 270 290 290 270 180 155 100 240 280 380 420 400 300 250 210 1,25 1,26 1,17 1,41 1,45 1,38 1,11 1,39 1,35 100 200 270 270 290 280 240 250 195 140 260 320 400 440 410 300 280 230 1,4 1,3 1,18 1,48 1,52 1,46 1,25 1,12 1,18 100 200 240 240 280 280 230 200 130 140 290 310 400 450 450 300 280 180 1,4 1,45 1,29 1,67 1,61 1,61 1,3 1,4 1,38 90 220 270 260 290 280 240 170 260 120 240 320 400 460 440 300 210 290 1,33 1,09 1,18 1,54 1,59 1,57 1,25 1,23 1,11 154
