2 1 АП? t9S3 НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ТЕМПЕРАТУРНОГО ГОМЕОСТАЗА

2 1 АП? t9S3
На правах рукописи
ГОРБАЧЕВА Любовь Руфэльевна
НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
ТЕМПЕРАТУРНОГО ГОМЕОСТАЗА
У БЕЛЫХ КРЫС ПРИ АДАПТАЦИИ К ХОЛОДУ
03.00.13 — физиология человека и животных
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Тверь—1Й9Й
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и жи­
вотных Ивановского государственного университета и в фи­
зико-химической лаборатории биомембран МГУ им.М. В.Ло­
моносова.
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор, з. д. н. РФ
Ю. И. Баженов
кандидат биологических наук, ст. науч. сотр. В. Б. Ритов
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, чл.-корр. РАЕН
Ю. Ф. Пастухов
кандидат биологических наук, доцент В. Н. Напоров
В е д у щ а я о р г а н и з а ц и я — Петрозаводский
ситет
госуннвер-
Защита диссертации состоится'^^^ ciHJi-e^Jc
iggg ^о^уй.
в 1^ часов на заседании Диссертационного совета К 063.97.09
при Тверском государственном университете (170002 г.Тверь,
пр. Чайковского, 70а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Твер­
ского государственного университета (г. Тверь, ул. Володар­
ского, 44а).
Автореферат разослан «"т-^. »
и.л-4:^гг1,=9
Ученый секретарь
специализированного совета,
кандидат биологических наук, доцент
199с5'года.
А. Н. ПАНКРУШИНА
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблема адаптации организма к низким
температурам среды является одной из центральных в экологической фи­
зиологии. 3TCJ вызвано активным освоением человеком зоны высоких ши­
рот, районов Крайнего Севера и Сибири. Более того, вопрос адаптации
организма к холоду тесно связан с проблемой защиты от кратковременно­
го воздействия низкой температуры. Подобные явления встречаются в экс­
тремальных ситуациях, способных привести к переохлаждению и необра­
тимым последствиям.
]
На данный момент имеется значительное количество работ, посвя­
щенных терморегуляции н изменениям функций различных органов н си­
стем при адаптации к холоду (Сломим, 1979; Пастухов, 1980; Баженов,
1981; Медведев, 1984; Якименко, 1984; Хочачка, 1988; Иванов, 1990; Лупандин с соавт., 1995; и др.). Вместе с тем ряд проблем этой области рас­
крыты недостаточно.
Учитывая всю сложность и многогранность исследуемого вопроса,
требуется его комплексное изучение, начиная со звена регуляции процес­
сов теплопродукции, общих механизмов перестройки функциональных си­
стем и заканчивая формированием адекватной физиологичной реакции
организма на температурное воздействие. Очевидно, что раскрытие топких
процессов, лежащих в основе терморегуляционных реакций, требуют ис­
пользования современных биохимических методов исследования.
Не вызывает сомнения, что одним из основных веществ, регулирую­
щих процессы теплопродукции является норадреналин ( Якименко, 1971;
Пастухов, 1974; Bligh, 1973, 1985 и др.). В настоящее время имеется доста­
точное количество работ, позволяющих охарактеризовать роль различных
отделов центральной нервной системы в терморегуляции ( Дымникова,
1969; Cordon е.а., 1985 и др.). Вместе с тем, роль центральных норадренергических структур мозга в поддержании температурного гомеостаза орга­
низма в различных температурных условиях не совсем ясна. Следует отме­
тить, что исследование возможности коррекции териорегуляционных ре­
акций с помощью интравентрикулярного введения экзогенного 1юрадреналина, позволило бы полнее раскрыть механизмы формирования процес­
сов теплопродукции в условиях низких температур. В свою очередь подоб­
ные научные изыскания создают основу для разработки методов защиты
организма от переохлаждения и своевременной активации теплопроду7<ции различных органов.
Известно, что реакция целостного организма на различные внешние
воздействия представляет собой комплексный ответ, включающий в себя
изменение функционирования всех органов и систем. Имеющиеся обособ­
ленные исследования основных термогенных органов - мышц и бурой жи­
ровой ткани (Баженов, 1981; Якименко, 1982; Иванов, 1989; Himms-Hagcn,
1970; Nickols е.а., 1984; и др.), не дают четкой картины их взанмодсйсзвия в
терморегуляции. Не исключено, что основой функциональной взаимосвязи
этих органов выступают биохимические реакции, успешное протекание
которых зависит от состояния ферментных комплексов, контролируемых
сложной системой как внутренних, так и внешних факторов.
Таким образом, несмотря на достаточно большое количество работ о
терморегуляционной роли норадрсналнна, бурой жировой ткани и мышц,
дальнейшее разностороннее исследование их функций не только на физио­
логическом, но и на биохимическом уровне является необходимым и
имеет как теоретическое, так и практическое значение.
Цель II задачи исследования. Основная цель исследования состояла в
изучении влияния адаптации к холоду на норадренергический контроль
температурных реакций бурой жировой ткани и скелетных мышц.
В исследовашш ставились следующие задачи:
1) определение роли интравен1рикулярных инъекции норадреналина в
контроле температурного гомеостаза белых крыс после холодовой адап­
тации и в условиях кратковременного охлаждения;
2) изучение влияния адаптащш к холоду и интравентрпкулярных инъекций
экзогенного норадреналина на окислительный метаболизм бурого жира
и скелетных мышц;
3) определение влияния длительной адаптации к холоду на некоторые био­
химические параметры скелетной мышцы т . triceps surae белых крыс.
Научнаи новизна полученных данных. Результаты исследования по­
зволили установить, что адаптация к холоду приводит к изменению чув­
ствительности адренорецепторов мозга к экзогенному норадреналину.
Предварительное введение в боковые желудочки мозга обзидаиаблокатора бета-адренорецепторов, существенно изменяло температурную
реакцию организма крыс на интравентрикулярные инъекции норадрена­
лина. Данный факт позволяет говорить о том, что наибольшее значение в
реализации эффекта инъекций норадреналина приобретают центральные
бста-адрсгюрецепторы.
Полученные данные конкретизируют картину перестройки как регу­
ляции термогенеза со стороны центральной нервной системы, так и основ­
ных органов терморегуляции. Обнаруженное изменение некоторых пока­
зателей липидного обмена в скелетной мышце при адаптации к холоду на
фоне повышешш активности термогенеза в бурой жировой ткани, позво­
ляет предположить наличие взаимосвязи этих процессов. Более того, ре­
зультаты биохимических исследований мышечной ткани могут послужить
основой для разработки вопроса о наличии зависимости активности каль­
ций-транспортной системы, а следователь'-о и сократительной функции
мышцы от состояния ЛИПИД1ЮГ0 обмена при длителыюй холодовой адап­
тации. Для определения удельной активности митохондриальной NADHоксидазы и FoFi-ATFa3bi был использован метод, основанный на примене­
нии каналообразующего антибиотика аламетицина для обеспечения сво­
бодного прохождения NADH и АТФ через внутреннюю мембрану митоХОШфИЙ.
Основные положения, выносимые на запнп7. Адаптация к холоду
приводит к развитию резистентности гомойотсрмного организма к охлаж­
дению.
Интравентрикуляриые инъекции 1юрадреналима повышают актив­
ность окислительных процессов в бурой жировой ткани и мышцах. Осо­
бую роль в опосредовании данного процесса ифают бета-алреиергические
рецепторы, о чем свидетельствуют резу.1ьтаты, полученные при изучении
температурного эффекта экзогенного норадреналина в условиях предвари­
тельного введения бета-адреноблокатора обзидана. Длительная холодовая
адаптация приводит к повышению чувствительности адренорецептороп
мозга к экзогенному норадреиалину.
Продолжительное воздействие низких температур вызывает повыше­
ние amiiBHocTH окислительных процессов в бурой ясировой ткани и изме­
нение общего содержания липидов и свободных жирных кислот в мышцах
белых крыс.
Увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот в скелетных
мышцах при адаптации к холоду сопровождается изменением активности
некоторых митохонлриальных ферментов и транспортных функций саркоплазматического ретикулума. В результате при длительной холодовой
адаптации происходит возрастание активности FfjFi-АТФазы н снижение
эффективности работы кальциевого насоса в гомогенате мышечной ткани.
Теоретическая п практическая значимость работы. Полученные ре­
зультаты позволили обобщить ряд теоретических вопросов, касающихся
механизмов регуляции теплообразования и энергетики мышечной ткани в
условиях длительного воздействия низких температур.
Да1тые о влиянии интравентрикулярных инъекций экзогенного но­
радреналина на температурный гОмеостаз в условиях .холодовой адапта­
ции и кратковременного охлаждения углубляют существутощие представ­
ления о центральных механизмах приспособления гомойотсрмного орга­
низма к различным факторам окружающей среды.
Исследования, проведенные на скелетных мышцах позволили оце­
нить некоторые аспекты биохимических изменений в мышечной ткани при
адаптации к холоду.
Более полное познание центральных .механизмов формирования .хо­
лодовой адаптации создает практические предпосылки для направленного
поиска путей управления адаптационным процессом. В частности, выводы
о co4etaHHo.M влиянии адаптации, кратковременного охлаждения и интра­
вентрикулярных инъекц1н1 норадреналина на изменение терморегуляции
могут быть применены в медико-биологических исследованиях по изуче­
нию механизмов приспособления человека и животных к экстремальным
факторам среды. Более того, наблюдаемые изменения липидного обмена,
активности ферментных и транспортных систем в мышечной ткат! при
адаптации к холоду, могут служить основой дальнейшей расшифровки ме­
ханизма из.менения теплопродукции скелетных мьшщ. Следует учитывать
возможность влияния липидного обмена на сократительньн"! аппарат NH.Iшечной ткани. В результате созданы предпосылки для поиска путей кор-
рекции уровня теплопродукции и функциональных изменений в скелетных
мышцах.
Апробация работы. Материалы. диссертации представлены на науч­
ных конференциях Ивановского госуниверситета (Иваново, 1989, 1990,
1996, 1997), на 111-ей и IV-ой областных конференциях молодых ученых и
специалистов ( Иваново, 1989, 1990), на 3-й Международной и 6-й Всерос­
сийской научно-практической конференции "Экология и охрана окру­
жающей среды" (Владимир, 1996), на И1-ем съезде физиологов Сибири и
Дальнего Востока (Новосибирск, 1997).
Данные, полученные в ходе проведенного исследования, используют­
ся при чтении спецкурсов ("Физиология терморегуляции", "Биофизика" и
др.) для студентов кафедры физиологии человека и животных Ивановского
госунивсрснтета.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в
том числе в Физиологическом.журнале им. И.М. Сеченова и в журнале
"Биохимия".
Объем и crpyKiypa диссертации. Работа состоит из введения , пяти
глав, заключения, выводов и списка литературы. Её объем составляет 146
страниц, в том числе 10 таблиц, 19 рисунков. Список литературы включает
152 отечественных и 134 зарубежных источников.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились на белых беспородных крысах-самцах,
которые подразделялись на две группы. Контрольная группа содержалась
в условиях вивария (20''-22''С), а опытная группа животных - в течение 4-х
недель в специальной камере с автоматически регулируемым освещением и
температурой воздуха 4-6"С.
В первой серии опытов исследовалось изменение температурных по­
казателей у обеих групп животных при интравентрикулярном введении
изотонического раствора, норадреналина (доза 20 мкг) и обзидана (доза 10
мкг), в расчете на каждую особь, в условиях термонейтральной зоны (22"25''С) и изотонического раствора и норадреналина ( в дозе 10 и 20 мкг) при
30-минутном , охлаждении (0''-+4''С). Блокаду центральных бетаадренорецепторов осуществляли инъекцией обзидана за 15 мин до введе­
ния норадреналина. Общий объем вводимых фармакологических препара­
тов для каждого животного составлял 20 мкл. Дозы использованных в ра­
боте препаратов согласуются с исследован' ми по изучению температур­
ного гомеостаза у белых крыс (Турин, 1986).
Характер воздействия фармакологических веществ на температур­
ный гомеостаз организма определяли по изменению показателей: потреб­
ления кислорода животными и температуре: ректальной, мозга, бурой жи­
ровой ткани, скелетной мышцы. Регистрация температурных показателей
осуществлялась в течение 60 мин. с момента инъекции препаратов. Темпе­
ратура животных измерялась с помощью медно-константановых термопар.
Величину потребления кислорода животными определяли по методу Холдена.
Введение фармакологических веществ осуществлялось через заранее
вживленные в область боковых желудочков мозга канюли. Для проведения
стерсотакснчсских операций использовали координаты из атласа Фифковон и Маршала (I960) AP1.5L2H3.
Во второй серим эксперимента изучалось изменение биохимических
показателей скелетных мышц т . triceps surae белых крыс при адаптации к
холоду. Для проведения биохимических исследопапий мышечную ткань
гомогенизировали по ранее разрабо1ан110й методике (Рнтов, Мурзахметова, 1985). Экстракцию липидов осуществляли следующим образом: образец
мышечной ткани (1г) гомогенезировали при 4"С в 10 мл мета1юла, затем
добавляли 20 мл хлороформа и полученную смесь оставляли на 1 ч для экс­
тракции, периодически встряхивая. Экстракт фильтровали через широкопористьи"! бумажный фильтр, смешивали с 6 мл 0,1 М NaCl и после рас­
слаивания отбирали органическую фазу, которую выпаривали на ротор­
ном испарителе и определяли общее содержание липидов методом взвеши­
вания и выражали в мг на грамм сырой ткаш!. Липилы растворяли в 1 мл
хлороформа, содержащего ионол (0,1 мг/мл) н использовали для анализа
методом ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) на ко­
лонке с нормальной фазой. Качественный анализ жирных кислот осу­
ществляли методом хро%1атографии на бумаге (Левачев и др., 1965).
Скорость гидролиза АТФ измеряли рН-метрически при 37 "С, ис­
пользуя стеклянный электрод в 4 мл среды, содержащей 100 мМ NaCl, 4
мМ MgCl 2, 2 мМ АТФ, 0,25 мМ ЭГТА, 2,5 мМ нмидазол (рН 7,0), 20 мкМ
ApsA и аламетгипш ( 10 мкг/ мл). Данный метод основан на освобождении
при гидролизе АТФ ионов Н'^. Для регистрации изменения рН использо­
вали стеклянный электрод ЭСЛ-41 Г-04. В качестве электрода сравнения хлорсеребрянный электрод, соединенный через агаровый КС1-насыщеннын
мостик с измерительным прибором "Иономер универсальный ЭВ - 74". За­
пись проводили с помощью электронного потенциометра КСП-4 с чув­
ствительностью 10 мВ на всю шкалу или 0,1 рН. Для пересчета Н+ в коли­
чество накопившегося в процессе гидролиза АТФ неорганического фосфа­
та использовали величину сдвига на шкале самописца при добавлении в
инкубационн\то смесь титроващюго раствора КН2РО4. Активность Са^+АТФазы оценивали по разности АТФазных активностей в среде с ионами
кальция и без них и выражали в нмолях неорганического фосфата (Pi) в
минуту на 1 .мг белка (Ритов, 1977).
Активность FoFi-АТФазьг оценивали по раз1юсти активностей в от­
сутствие и в присутствии в среде инкубации 5мМ азида натрия или олигомицина(1мкг/мл).
Скорость окисления NADH измеряли с помощью спектрофотометра.
Для лучшего прохождения NADH во внутреннее пространство митохон­
дрий был использован каналообразующий антибиотик аламстицин, кото­
рый применяется для повышения проницаемости мембранных везикул.
Под действием аламетицииа наблюдается активация окисления NADU.
Аламетицин-индуцированное окисление NADH полностью подавляется
ротеноиои. Реакционная смесь содержала 0,1М сахарозу, 75мМ КС1, 2,6
мМ MgCb, 5мМ HEPES, рН 7,4, бычий сывороточный альбумин (0,5
мг/мл), 0,1мМ ЭГТА, 0,125мМ NADH, цитохром с (83 мкг/мл), аламетицин
(20 мкг/мл) при 25 или 37"С. Активность ротснон-чувствитсльного окисле­
ния NADH определяли по разности измерения активностей в отсутствие и
в присутствии 1,5 мкМ ротенона.
Транспорт кальция измеряли с помощью Са-селективного электрода
(электрод "Орион 92-20") в тсрмостатирусмой ячейке с перемешиванием.
Непрерывную запись потенциала Са^^-элсктрода осуществляли с помощью
ионометра И-120 с присоединенным к нему самописцем TZ4221. Инкуба­
ционная смесь объемом 4 мл содержала 100 мМ КС), 15 мМ оксалата Na, 4
мМ MgCb, 2 мМ АТФ, 5 мМ NaNs, 2,5 мМ имндазол, 10 мМ Hepes, рН 7,0
при 37''С. В реакционную смесь дважды вводили добавку СаСЬ 25 нмоль,
которая использовалась также для калибровки электрода, и затем ишщиировали реакцию введением 10 мкл гомогсната (160-210 мкг белка в зависи­
мости от пробы). Скорость аккумуляции оцсннва.чи по максимальному
значению в начальном прямолине1н10м участке кривой транспорта каль­
ция для каждой отдельной пробы.
Показатель Са/АТФ для каждого препарата определяли с использо­
ванием графика , где по оси орднна! откладывали Са/АТФ'зксп для ряда
сред с разной концентрацией оксалата, по оси абсцисс - концентрации
свободных ионов кальция внутри везикул (данные брали из специальной
таблицы соотношения концентрация ионизировашюго кальция внутри ве­
зикул при различных концентрациях оксалата (Болдырев, 1977)). Точка
пересечения линии этого графика с осью ординат соответствует величине
Са/АТФ, наблюдающейся при нулевой концентрации кальция вну1ри ве­
зикул, т.е. в условиях нулевого выхо^;а кальция (Болдырев, 1977).
Для получения липосом "нагруженных кальцием" 10 мг липида до­
бавляли к 5 мг холата натрия растворяли в спирте и высушивали на ротор­
ном испарителе. Затем к лнпнду добавляли 5 мл среды, содержащей 10%
глицерина, 0,1 М КС1, 10 мМ трис НС1, 10 мМ СаСЬ, рН 7,5 при 25 "С. Для
получения везикул данный раствор пропускали через колонку со смолой
(Дауэкс). Затем, используя метод ультрафнльтрации липосомы отмывали и
концентрировали (Марголис и др., 1986).
, Утечку ионов кальция из липосом измеряли по флюоресценции
quin2 методом спектрофлюориметрии в среде инкубации, содержащей 100
мМ КС1, 10 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCh, рН 6,? при 28 «С (Меньшикова и др.,
1989).
Содержание белка в пробе определяли по биуретовой реакции. К 100
мкл суспензии образца добавляли 0,9 мл 1%-ного дезоксихолата натрия и 4
мл биуретового реактива. Через 30 мин измеряли оптическую плотность с
помощью спектрофотометра при 540 нм. В качестве стандарта использова­
ли сывороточный альбумин человека. Количество белка в пробе оцени­
вали по заранее построенной калибровочной кривой для данного раствора
биуретового реактива (Кочетов, 1971).
Результаты экспериментов подвергались статистической обработке с
использованием t-критерия Стыодента.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
I, Влия1Н1е адаптации к холоду и интрапентрнкуляриых инъекции норад­
реналина на температурный гомеостаз белых крыс в термонейтральных
условиях (22°-IS'C) и при охлаждении (0"-+4"С).
Использование 30-тн минутного охлаждения при температуре 0''-+4''С
показало, что выбранный режим холодовой адаптации обеспечивает рези­
стентность организма белых крыс к воздействию низких температур.
Данный процесс осуществляется, вероятно, за счет сохранения теп­
лопродукции скелетных мышц на более высоком уровне, о чем можно су­
дить по незначительному изменению температуры у адаптированных к хо­
лоду животных по сравнению с контролем при используемом охлаждении
(0''-+4''С) (рис. I). Температура остальных исследуемых органов также сни­
жается в меньшей степени у предварительно адаптированных белых крыс.
^
2
3
J»
Факт
интенсификации
о,-,
;.„..„„.^,..,
f^..^^
^ с х о ^ н ы и ^ ^ ^ ь метаболизма у белых
крыс после адаптации к
-1
холоду при охлаждении
-2
подтверждается
и
-3
большим повьпиением
-4
потребления кислорода
-5
у адаптированных крыс
по сравнению с кон­
П контроль
о адаптация к холоду
трольными животными
Рис.1. Изменение температурных реакций у контрольных ^ ' '
и адаптированных к холоду белых крыс при 30-тп минут- Д-'^^ исследования соченом охпаждеиии (0<'-+4»С). (По оси ординат - изменение тайного влияния краттенпературы к исходному уровнюСАЧГ). За нулевую от- ковременного охлаждеметху принята исходная температура для каждого пока- ннд ц экзогенного нозателя; 1-температура мозга (38,4» и 38,7°С, соответствен- падоепалина на темпено для контрольных и адаптированных ;и1вотных); 2- бусрой жировой ткани (39,3» и 38,7»Q,- З-рскталы^ая темпе- ратурныи гомеостаз оература (38,3» и 37,9»С); 4-температ>ра мышцы (35,7» и лых крыс изучали изме36,1 °С); *-различия достоверны по отношению к контро- ряемые параметры при
люР<.0,05).
интравентрикулярных
инъекщьчх норадреналина при температуре 0-+4''С.
У контрольной группы животр1ых норадреналин сдерживал развитие
гипотермии, вероятно, за счет активации теплопродукции бурого нира и
скелетных мышц, на что указывают изменения температурных показателей
(табл. 1) и величины потребления кислорода животными при рхлазкдении и
введении норадреналина (рис. 2). Вместе с тем, у адаптированных к холоду
крыс норадреналин в дозе 10 мкг при интравеитрнкулярном введении
обеспечивает еще большую устойчивость температурного гомеостаза к
10
охлаждению, тогда как увеличение дозы в два раза как бы нивелировало
приобретенную в процессе адаптации резистентность организма к охлаж­
дению (табл. 1).
ТАБЛИЦА 1.
Влияние интравентрикулярных инъекций норадреналина на температурные реакции
контрольных и адаптированных к холоду белых крыс в условиях охлаждения (0"-+4"С)
Исследуемая
температура
(°С)
бурого жира
ректальная
мышцы
бурого жира
ректальная
мышцы
бурого жира
ректальная
мьпицы
Контроль (п= 15)
Исходная
Опытная
Адаптация к холоду(п= 14)
Опытная
Исходная
Введение изотонического раствора
34,8+1,0*
39,3+0,3
38,7+0,2
33,9+1,1*
38,3+0,7
37,9+0,6
31,3+0,9*
35,7+0,1
36,1+0,2
Введение норадреналина в дозе 10 мкг
36,4+1,1*
39,2+0,3
38,8+0,2
38,2+0,6
• 34,3+0,5*
38,2+0,2
32,7+0,1*
35,7+0,2
36,3+0,1
Введение норадреналина в дозе 20 мкг
39,0+0,3
36,7+0,4*
39,1+0,1
37,7+0,2
35,7±0,6*
37,6+0,7
35,5+0,3
30,8+0,2*
36,0+0,2
36,7+0,5*
36,1 + 1,0*
35,8+0,1
38,3+0,3
37,7+0,6
35,9+0,1*
36,3+0,4*
34,0+0,8*
31,5+0,1*
Примечание: *) • различия достоверны (при р<0,05) по отношению к исходным показаниям.
35
Термонейтральная
зона (22'-25'С)
Охлаждение
30 +
П Контроль
Ш Адаптация к холоду
Рис. 2. Влияние норадреналина и обзидана на потребление кис­
лорода у белых крыс в различных температурных условиях.
Нулевая отметка соответствует исходным показаниям для каж­
дой группы животных 25,9+1,8 мл/кг.мин - для контрольных и
30,8+1,2 мл/кг,мин - ддя адаптированных животных (1-введение
употоиичсского раствора; 2-введение норадреналина в дозе 10
мкг; 3-введение норадреналина в дозе 20 мкг; 4-введепие обзида­
на и норадреналина; * - различия достоверны по отношению к
контролю Р< 0,05)
Следует отметить,
что дозозависимая реакция на
интравентрикулярное введение но­
радреналина
в
условиях охлаж­
дения наблюдает­
ся лишь у адапти­
рованных к холо­
ду крыс, тогда
как у контроль­
ной группы жи­
вотных введение
норадреналина в
дозах 10 и 20 мкг
вызывали одно­
направленные ре­
акции - сдержи­
вание снижения
темпера гурных
показателей
по
сравнению с ре-
зультатамн, полученными при введении изотонического раствора в тех же
условиях.
Таким образом, активация адреиорецепторов мозга инъекциями норадреиалшш в дозе 10 мкг у адаптированных к холоду животных при тем­
пературе 0*'-+4"С сдерживала снижение температурных показателей по от­
ношению к данным термометрии в отсутствие инъекций. Вместе с тем, на­
блюдаемое 1Н1велирование у крыс резистентности к охлаждению при интравентрикулярпых инъекциях этого медиатора в дозе 20 мкг в аналогич­
ных условиях (температурные показатели в этом случае снижались в боль­
шей степени, чем при воздействии только охлаждения), позволяет говорить
о повышении чувствительности центральных адреиорецепторов к экзоген­
ному норадреналину при длительной холодовон адаптацпи. Очевидно, что
в отличие от контрольной группы животных доза иорадреналина в 20 мкг
для адаптированных к холоду крыс является сверхпороговой н вызывает
угнетение процессов теплообразования и ведет к развитию гипотермии.
Проявление калорнгенного эффекта внутрижелудочковых инъекций
иорадреналина при охлаждении, вероятно, в большей степени связано с
активацией через норалренергические структуры мозга симпатических во­
локон бурой жировой ткани. Экзогенный норадреналин сдерживал сниже­
ние температуры этого органа в условиях охлаждения у контрольной
группы при дозе 10 и 20 мкг, а у адаптированной только при 10 мкг ве­
щества.
Исследования действия иорадреналина в термонентральных условиях
(22''-25<'С) указывают на двухфазпость температурных реакций. Так у бе­
лых крыс норадреналин, введенный в боковые желудочки мозга, приводил
к снижению (на 30-он мин) ристальнон температуры, которое в последую-
• Контроль
(изотонический
раствор)
• Дцаптация к холоду
(изотонический
раствор)
• Контроль
(норадреналин)
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
• Адаптация к холоду
(норадреналин)
Время (мин)
Рис. 3. Динамика изменений ректальной температуры у белых крыс при интравентрикулярном введении норадреиалгаш в термонейтральных условиях l22''-25''C).
Нулевая отметка соответствует исходным показаниям температуры у контрольных iS.l+OA'C, у адаптированных к холоду животных - 38,1+0,3"С (* - различия достоверны
по отношению к контролю при р<0,05).
щем (на 60-ой мин) сменялось повышением (рис. 3).
Предварительная адаптация к холоду усиливала ответную реакцию
организма на иорадреналин: отмечалось более выраженное снижение рек­
тальной температуры у адаптированных к холоду крыс, по сравнению с
контролем (рис. 3).
Температура в бурой жировой ткани изменялась в противоположном
направле1Н1и. На 20-25-й мин после введения отмечалось максимальное
повыше1П1е температуры бурой жировой ткани (у контрольных на 0,4 "С и
у
адаптированных
к
холоду
животных
на
1,4°С)(рнс.4).
• Контроль
(изотонический
раствор)
• Адаптация к холоду
(изотонический
раствор)
- Контроль
(иорадреналин)
• Адаптация к холоду
(иорадреналин)
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Время (мин)
Рис. '4. Динамика изменений температуры бурой жировой ткани у белых крыс при иитравентрпкулярном введении норадреналнна в терыонейтральных условиях (гг^-ЗЗ^С).
Нулевая отметка соответствует исходным показателям температуры для контрольных 37,5+0,3°С, для адаптированных животных - 38,0+0,2"С ( • - различия достоверны по
отношению к контролю при р<0,05).
Достоверные изменения температуры скелетных мышц наблюдались
лишь у адаптированных белых крыс. Данный показатель при введении
норадреналина повышался на 0,8"С по сравнению с исходным уровнем
(табл. 2).
ТАБЛИЦА 2.
Изменение температурных реакций у контрольных и адаптированных белых крыс при
интравентрикулярном введении норадреналина в условиях термонентральной зоны
(22°-25''С).
Исследуемая
Контроль
Адаптация к холоду
температура
п=12
п=10
("С)
Исходная
Опытная
Исходная
Опытная
бурого жира
37,5+0,3
37,9+0,1
38,0+0,2
39,4+0,2*
ректальная
. 38,2+0,4
37,9+0,2
38,1+0,3
37,6+0,3
мышцы
35,5±0,1
36,5+0,1*
35,8+0,2
35,7+0,2
Примечание: *) - различия достоверны (при р£0,05) по отношению к исходным показа­
ниям.
Возрастание температуры бурого жира, могло бы быть свидетель­
ством стимуляция окислительных процессов в бурой жировой ткаш! под
влиянием интравентрикулярных инъекций норадреналина, что подтверж­
дается и повышением потребления кислорода животными после холодопои
адаптации (рис. 2). Очевидно, что норадрсналин активирует окислтсльные процессы в организме не только при периферическом (Зыков, 1982;
Плотников, 1982; Соболев с соавт., 1994; Lafrance е.а., 1980), но и при интравентрикуляриом введении.
Наблюдаемое понижс1П1е ректальной температуры связано с давно
установле1Н1ым фактом стимуляции вазодилатации поверхнослных сосудов
при введении норадреналина в боковые желудочки мозга (Бань с соавт.,
1978; Гурин, 1980; Пастухов, 1980).
Для изуче1П1Я участия бета-адренергнческих рецепторов мозга в тер­
морегуляционных эффектах норадреналина осуществлялась их блокада
введением обзидана. Обнаружено, что при этом существенно изменяется
термогенное действие норадреналина. Полученные результаты указывают
на отсутствие повышения потребления кислорода, температуры бурой жи­
ровой ткани и скелетных мышц; наблюдается также снижение ректальной
темперазуры у контрольной группы животных (рис. 2, табл. 3).
ТАБЛИЦА 3.
Влияние совместных пнтравенгрнкулярных инъекций обзидана п норадреналина на
температурные реакции у контрольных и адаптированных к холоду белых крыс в условиях термонейгральном зоны (22"-25"С).
Исследуемая
температура
(°С)
бурого жира
ректальная
мышцы
Контроль
п=12
Исходная
Опытная
37,3+0,2
37,2+0,2
38,3+0,1
37,9+0,2*
35,3±0,1
35,7+0,3
Адаптация к холоду
п=10
Опытная
Исходная
37,2+0,1*
37,8+0,2
38,0+0,2
37,2+0,3*
36,1+0,1
35,5+0,2*
Примечание: *) • различия достоверны (при р<0,05) по отношению к исходным показа­
ниям.
Исследования участия центральных бета-адренорецепторов в термогенезе при адаптации к холоду показали, что после адаптации к холоду
центральное влияние норадреналина на термогенез осуществляется пре­
имущественно через бета-адренорецепторы.
Очевидно, что введение норадреналина в боковые желудочки мозга
вызывает у адаптированных к холоду белых крыс более выраженный тем­
пературный ответ, чем у неадаптированных (например температура бурого
жира и скелетных мышц у адаптированных к холоду животных повышает­
ся на FC и О.З^С (соответственно) выше, чем у контрольных (рис. 4, табл.
2). Данное различие проявляется и в условиях блокады
бетаадренергических рецепторов мозга: температура бурого жира, ректальная
н скелетных мышц снижается на О.ЗОС, 0,4''С и 0,2''С(соогветственно) боль­
ше у адаптированных белых крыс, в сравнении с контрольными (табл. 3).
На основании полученных результатов, указывающих на различие
температ>рного эффекта норадрен;1лина при охлаждении (0''-+4''С) и в
условиях термоненгральной зоны (22''-25''С): в первом случае происходит
удержание температурного гомеостазиса, несмотря на охлаждение, на бо­
лее высоком уровне по сравнению с данными без использования инъекций
норадреналнна (табл, I); а во втором - сьнгжение ректальной температуры
(рис.3); можно предположить, что у адаптированных к холоду крыс влия­
ние норадреналипа при интравеитрикулярном введении зависит от темпе­
ратуры окружающей среды, что также подтверждается и имеющимися ли­
тературными данными (Пастухов, Ерошенко, 1982; Bligh е.а., 1979).
Таким образом, обнаруженный у адаптированных белых крыс дозоsaBHCHNH.!» эффект норадреналнна при охлаждешн! (0'^-+4''С) , а также бо­
лее значительные изменения температурного гомеостаза по сравнению с
контролем в термонентральных условиях (22''-25''С), позволяют говорить о
повышении, в результате адаптащп! к холоду, чувствительности адреноре-.
цепторов мозга к экзогенному норадреналину.
2. Влияние адаптацнн к холоду на общее содержание липпдов и свободных
жирных кислот в скелетных мышцах белых крыс.
Изменение температурных реакций бурого жира и скелетных мышц
после адаптации к холоду в ответ на охлаждение и нитравентрикулярное
введение норадреналнна (табл. 1,2), могло бы свидетельствовать о возрас­
тании окислительного метаболизма в этих органах и повышении их тегшопродукцин, что и проявляется в изменении температурных показателей.
Имеются доказательства, что жирные кислоты н липиды способны
влиять на процессы ресинтеза макроэргнческих соединений в митохондри­
ях и играют существеги1ую роль в адаптивных изменениях термогенеза
(Северин с соавт., 1960; Осадчая с соавт., 1983; Скулачсв, 1989).
ТАБЛИЦА 4 .
Общее содфжание липидов и свободных жирных кислот в скелетных мышцах белых
крыс в контроле и при адаптации к холоду
Контрольная группа живот­ Адаптированные к холоду
Исследуемый
ных
животные
показатель
(п=9)
(п = 11)
Общее содержание липидов
(мг/ г сырой ткани')
10,28 + 0,07
8,20 + 0,04*
Содержание свободных
жирных кислот
92,25+0,06*
88,92+0,12
(мкг/г сырой ткани)
Примечание: •) - различия достоверны (при р<0,05) по отношению к контролю.
На зависимость обмена липидов от длительного воздействия низких
температур указывают и данные нашего исследования.
При адаптации к низкой температуре среды происходит снижение
общего содержания липидов в мышцах на 21,4% по сравнению с контро-
лем. Данный процесс сопровождается достоверным повышением уровня
свободных жирных кислот (табл. 4).
Адаптация к холоду приводит к изменению спектра свободных жир­
ных кислот, которое свидетельствует о перераспределении соотношения
между насыщенными и нснасьицс1И1ыми жирными кислотами при холодовой адаптации в сторону повышения количества исиасьпце1шых свобод­
ных жирных кислот (рис. 5). Значимое увеличение отмечено лпя олеиновой
(20,22%) и линолевой (8,21%) кислот.
Полученные результаты позволяют
говорить
как о качественном, так и о
70 т
количественном изменении липидного пула скелетных мьмнц при
адаптации к холоду. Снижение об­
щего содержания липидов может
происходить под действием различ­
ных факторов. Одними из них могут
быть:
1)активиза1и1Я
некоторых
фосфолипаз при темпсратур)1ых воз­
действиях (Брустовецкий с соавт.,
1989; Алматов с соавт., 1995); 2) ак­
тивация фермснтов-десатураз, регу­
лирующих вязкость мембраны за
счет повышения доли нснасьиценных
липидов (Хочачка, Сомеро, 1988).
П адаптация к
Q контроль
Этот процесс мог бы в определе1нюй
холоду
мере обеспечить и повьппенный уро­
вень свободных жирных кислот на­
Рнс. 5. Содержание жирных кислот в гомо
генате скелетных мышц (в % к общему со блюдаемый в гомогеиате скелетных
держанию свободных жирных кислот в мышц исследуемых животных.
контроле). Условные обозначения: 1-пальКоличественный и качественмитиновая; 2 - стеариновая; 3 - олеиновая; ^,^^„-, ^^„^^^„3 свободных жирных кисб-неидентифицированные кислоты; * - раз лот в скелетных мышцах выявил
линия достоверны по отношению к кон увеличение содержания в липидной фракции пула ненасыщенных
тролю при р< 0,05.
жирных кислот.
Данный факт можно объяснить возрастанием энергетической функции
скелетных мышц у белых крыс после адаптации к холоду, о чем свидетельствутот ряд литературных данных (Ткаченко с соавт., 1976; Иванов, 1990).
Известно, что свободные жирные кислоты выступают как 1) суб­
страты окисления; 2) как разобщители дыхания и фосфорилирования; 3)
регуляторы функиш"! ( в частности, транспортной) мембран. В скелетных
мышцах адаптационное повышение теплопродукции на отдельный сокра­
тительный акт связано с увеличением теплопотери в отставленной фазе ресинтезе АТФ ( Хаскин, 1976; Алюхин, 1987; Jakimenko, 1975). Данный
процесс, возможно, обеспечивается действием свободных жирных кислот
на ферментные системы мышечной клетки.
3. Влияние адаптации к холоду на активность ферментных систем скелет­
ных мышц белых крыс.
Повышенное выделение тепла при мышечном сокращении может
быть следствием высокой чувствительности к норадреналнну тех метабо­
лических процессов в мышце, которые обеспечивают рссинтез АТФ.
Известно, что тепловая мощность мышцы должна зависеть от коли­
чества функционально-активных редокс-цепсй на I г ткани. Для количе­
ственной оценки данного показателя в скелетных мышцах крыс нами был
применен, новый методический подход, основанный на определении ак­
тивности ротепон-чувствитсльной NADH-оксидазы в мышечном гомоге­
нате. Такое определение стало возможным в результате применения каналообразующего антибиотика аламетицина, формирутошего во внутренней
митохондриальной мембране поры, проницаемые д-тя NADH.
Нами обнаружено, что скорость ротснон-чувствительного окисления
NADH на 1 мг белка гомогената не меняется при длительной холодовой
адаптации (табл. 5). Это позволяет заключить, что у крыс длительная холодовая адаптация не оказывает влияния на содержание митохондриальных редокс-цепей в скелетных мышцах со смешанным типом волокон.
Определение влияния длительной холодовой адаптации на соотно­
шение активностей ротенон-чувствителыюй NADH-оксидазы и FoFiАТФазы в гомогенате скелетных мышц показало, что адаптация к холоду
не изменяет активность NADH-оксидазы, о то время как активность FoFiАТФазы возрастает почти в 3 раза (табл. 5). Митохондриальная Н*АТФаза обеспечивает два процесса: гидролиз и синтез АТФ. Можно пред­
положить, что увеличение гидролитической активности Н*-АТФсинтетазного комплекса без соответствующего увеличения NADHокс1щазнон активности связано с дополнительным «штезом или, что более
вероятно, со структурно-функциональной модификацией молекул Н+АТФ-С1П1тетазы, затрагивающей механизмы контроля гидролитической
активности.
Сократительная деятельность скелетной мускулатуры остается мощ­
ным источником тепла и после адаптации к холоду (Якименко с соавт.,
1971; Ткаченко с соавт., 1976; Баженов, 1973; Иванов, Пчеленко, 1978;
Иванов, 1989, 1990). Возможно, что при этом изменяется весь цшсл фер­
ментативных реакций, обеспечивающих процесс мышечного сокращения,
особую роль в которых играют ионы кальция.
Исследования активности кальций-зависимой-АТФазы и скорости
аккумуляции ионов кальция везикулами гомогената при адаптации к хо­
лоду показали, что активность данной АТФ-азы не изменяется, в то время
как скорость аккумуляции ионов кальция резко снижается после длитель­
ной холодовой адаптации (табл. 5).
Наблюдаемое значительное снижение показателя Са/АТФ, свиде­
тельствует о том, что в скелетных мышцах белых крыс при адаптации к хо­
лоду происходит снижение эффективности работы кальциевого насоса.
ТАБЛИЦА 5.
Влияние адаптации к холоду на активность некоторых митохондрнальных ферментов и
кальций-транспортные функции саркоплазматического ретикулума скелетных мышц
белых крыс.
Скорость
окисления
NADH
(нмоль
NADH/ 1мг
белка за мин)
Активность
FoF,АТФазы
(нмоль
Pi/
1мг белка за
мин)
Контроль
п=25
12,7±4.5
31,8±7,4
Адаптация к
холоду
п=28
12,4+4,4
93,1±14,3*
Исследуемый
показатель
Активность
Са2*АТФазы
(нмоль
Pi/
1 мг белка за
мин)
138,4+15.2
142,0±16,3
Скорость ак­
кумуляции
Са-* (нмоль Са/АТФ
Ca^VlMr бел­
ка за мин)
269,8+8,1
1.95+0,21
145.5+7,4*
1.02±0,12*
Примечание: *) - различия достоверны (при р<0,05) по отношению к контролю.
Согласно литературным данным способностью транспортировать
ионы кальция обладают некоторые жирные кислоты (Осадчая с соавт.,
1983;Messineoe.a., 1984).
На примере липосом "нафуженных кальцием" мы исследовали проницас\1ость липидного бислоя для ионов кальция в присутствии жир­
ных
кислот ( пальмитиновой, стеариновой,
олеиновой). Проницаемость для каль­
ция через липидный бислой увеличи­
вает лишь олеиновая кислота. Вероят­
но, ненасыщенная алифатическая цепь
этой кислоты способна изменять вы­
свобождение ионов кальция за счет
"разрыва" мембранных структур и по­
средством этого увеличивать кальцие­
вую проницаемость (Messineo е.а.,
Рис. 6. Влияние жирных кислот на про­ 1984).
ницаемость билнпидного слоя для ионов
В связи с этим, жирные кислоты
кальция.(приведены кривые записи можно рассматривать не только как
спектрофлуоримегра: 0-6ез кислот; 1пальмитиновая;
2-стеариновая; 3- главный субстрат окисления на холоде
олеиновая кислоты; стрелкой обозначе- Ч как разобщитель окислительного
на добавка: Л-суспензии липосом; К- фосфорилировгния, но и как физнолокислоты; Са2+-1мМ CaCh для калибров- гический регулятор транспорта ионов
кп; АЛМ-антибиотика аламетицина).
кальция В мембранах саркоплазмати­
ческого ретикулума.
Таким образом, адаптация к холоду приводит к изменению как неко­
торых показателей липидного обмена, так и активности ряда мнтохондриальных ферментов и кальций-транспортной системы в скелетных мышцах
белых крыс. Предполагаегся, что ненасыщсн}1ые свободные жирные кис-
лоты могут быть одной из причин наблюдаемого снижения скорости ак­
кумуляции ионов кальция везикулами гомогената скелетных мышц после
холодовой адаптации.
ВЫВОДЫ
1. Длительная холодовая адаптация повышает чувствительность
центральных адрснорецепторов белых крыс к экзогенному норадреналину.
Терморегуляционные реакции на ннтравентрикулярное введение норадреналина у .адаптированных к холоду животных носят более выраженный
характер относительно контрольных.
2. Интравентрикуляриыс инъекции норадреналнна при охлаждении
повышают устойчивость организма к низкой температуре среды, а в тер­
монейтральных условиях, наоборот, происходит снижение ректальной
температуры у животных. Таким образом, терморегуляционный эффект
интравентрикулярных инъекций норадреналнна у белых крыс зависит от
температуры окружающей среды.
3. Адаптация к холоду повышает эффективность температ\риых ре­
акций в бурой жировой ткани и скелетных мышцах белых крыс в ответ на
охлаждение, вследствие чего происходит развитпе резистентности к низ­
ким темпсрат^фам. Данный процесс свидетельствует об увеличении актив­
ности окислительных метаболических процессов в этих органах. Интравентрнкулярные инъекции норадреналина стимулировали наблюдаемые
изменения, предварительная блокада центральных бета-адренорецепторов
элиминировала действие норадреналина, что позволяет предположить на­
личие преимущества центральных бета адрснорецепторов в опосредование
норадренергического эффекта.
4. Длительное холодовое воздействие изменяет некоторые показатели
липидного состава скелетных мышц белых крыс. Существенно возрастает
содержание ненасыщенных свободных жирных кислот: олеиновой и линолевой; си лжается общее содержание липидов на 21,4%.
5. У белых крыс адаптация к холоду повышает активность FoFiАТФазы в ~3 раза и уменьшает в 1,85 раза скорость аккумуляции кальция
в мышце ш. triceps surae, что вероятно свидетельствует о снижении эффек­
тивности работы кальций транспортной системы в результате длительной
холодовой адаптации. Одной из причин изменение активности ферментов
и транспорта кальция, может быть увеличение содержания ненасыщенных
свободных жирных кислот в мышечной ткани.
6. Предполагается, что адаптация к холоду повышает норадренергический контроль сопряжения терморегуляционных процессов в бурой жи­
ровой ткани и скелетных мышцах, что обеспечивает эффективное поддер­
жание температурного гомеостаза организма.
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Михайлова Л.Р. Норадренергический контроль температурного
гомеостаза при адаптации к холоду // Тезисы докладов П1 обл. конф. мо­
лодых ученых и спсц-тов по актуальн. общсполит. и науч. техн. пробле­
мам. Иваново, 1989. Т. 1. С. 15.
2. Михайлова Л.Р. Участие центральных норадренергических струк­
тур мозга в регуляции температурного гомеостаза белых крыс при адапта­
ции к холоду // Тезисы докл. 1Y обл. конф. молод, ученых и спец-топ по ак­
туальн. пробл. 11-12 мая, Иваново, 1990. Т. 1. С. 83.
3. Баженов Ю.И., Михайлова Л.Р. Участие норадренергических
структур мозга в терморегуляции при адаптации к холоду // Физиол. ж.
СССР. 1990. Т. 76, Хэ 4. С. 523-527.
4. Рнтов В.В., Горбачева Л.Р., Твердислова И.Л., Лейкин Ю.Н., Ба­
женов Ю.И. Ротенон-чувствительное окисление NADH и активность FoFiАТРазы в гомогенате скелетных мышц крысы при термоадаптации // Био­
химия. 1993. Т. 58, вып. 11. С. 1779-1787.
5. Горбачева Л.Р., Корми.шцына И.К. Влияние адаптации к холоду
на некоторые биохимические показатели плазмы крови и скелетных мышц
белых крыс // Тезисы докл. 3-й Междунар. и 6-й Всеросс. научно-практ.
конф. "Экология и охрана окружающей среды" , Владимир, 1996. С. 119120.
6. Горбачева Л.Р., Баженов Ю.И. Лнпидный обмен и кальцийтранспортная система в скелетных мышцах белых крыс при адаптации к
холоду // Тез. докл. 1П-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока.
Новосибирск, 1997. С.44.
7. Горбачева Л.Р., Кормилицына Н.К. Соотношение липндного об­
мена и транспорта кальция скелетных мышц белых крыс при длительном
холодовом воздействии // Мат.конф. " Молекулярно-клеточные основы
кислотно-основного
и
температурного
гомеостаза:
физиология.биохимия.клиника". Сыктывкар, 1997. С.73-77.
8. Баженов Ю.И., Горбачева Л.Р., Ритов В.Б. Влияние адаптации к
холоду на лнпидный обмен и транспортые функции мембран скелетных
мышц белых крыс // Росс, физиол. ж. им. И.М. Сеченова. 1998. № 1-2. С. 96102.
щ^^'^
Подписано к печати 27.03.98г. Формат издания 60x841/16,
Печ.л.1,25. Усл.п.л. 1,16. Заказ 893/р. Тираж ЮОэкз.
Типография ГУ ШК,г.Иваново,ул.Ермака,41.