синтез и исследование биологических свойств аналогов

Санкт-Петербургский государственный университет
На правах рукописи
Фидаров Алан Фидарович
СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
АНАЛОГОВ СТЕРОИДНЫХ ЭСТРОГЕНОВ,
СОДЕРЖАЩИХ ФТОР В КОЛЬЦЕ А
02.00.10 – Биоорганическая химия
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Научный руководитель:
д.х.н., проф. Шавва А.Г.
Санкт-Петербург
2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................ 7
1.1. Поиск новых лекарственных препаратов на основе стероидных
эстрогенов ................................................................................................................ 7
1.1.1. Эстрогены как кардиопротекторы ..................................................... 7
1.1.1.1. Антиоксиданты на основе эстрогенов........................................... 8
1.1.1.2. Липопротеины высокой плотности. Антиатерогенные
свойства и способы коррекции их уровня .................................................. 15
1.1.1.3. Геномные пути кардиопротекторного действия эстрогенов.
Участие эстрогенов в вазодилатации посредством путем NO ............. 17
1.1.1.4. Влияние эстрогенов на белки теплового шока ............................. 18
1.2. Побочные эффекты действия эстрогенов и пути их устранения .............. 20
1.2.1. Эстрогены и гормональный канцерогенез ....................................... 20
1.2.2. Поиск противоопухолевых препаратов на основе
модифицированных эстрогенов .................................................................. 28
1.2.3. Аналоги эстрогенов, не обладающие канцерогенными
свойствами ..................................................................................................... 34
1.3. Методы синтеза аналогов стероидных эстрогенов, содержащих фтор в
положении 2 ............................................................................................................ 40
Глава 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................................................. 44
2.1. Постановка задачи .......................................................................................... 44
2.2. Выбор пути синтеза целевых соединений. Синтез 6-гидрокси-7-фтор-1тетралона ................................................................................................................. 50
2.3. Синтез 16,16-диметил-2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен17а-она (8) .............................................................................................................. 53
2.4. Синтез 17аβ-ацетокси-3-метокси- 2-фтор-D-гомо-1,3,5(10)-эстратриена (10)............................................................................................................... 56
2.5. Синтез 16-метил-2-фтор-13α-эстра-1,3,5(10),8,15-пентаен-17-она (11) .... 58
3
2.6. Синтез 8α-аналогов стероидных эстрогенов, содержащих фтор в
положении 2 и свободную гидроксильную группу в положении 3.................. 62
2.7. Синтез 18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-она (18)......... 66
2.8. Синтез сульфаматов аналогов эстрогенов, содержащих фтор
в положении 2 ........................................................................................................ 67
2.9. Исследование возможности синтеза целевых соединений фторированием
субстратов со сформированным стероидным скелетом .................................. 68
2.10. Исследование антиоксидантной активности модифицированных
эстрогенов .............................................................................................................. 70
Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .......................................................... 75
3.1. Синтез целевых соединений .......................................................................... 75
3.2. Исследование биологических свойств ....................................................... 101
ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................... 109
ПРИЛОЖЕНИЕ ...................................................................................................... 120
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Многочисленные исследования биологических
свойств стероидных эстрогенов с использованием различных моделей на животных привели к заключению о целесообразности использования этой группы
веществ для заместительной гормональной терапии. Предполагалось, что это
приведет к снижению риска возникновения сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний, остеопороза, устранение различных постменопаузальных синдромов. Однако клинические исследования подтвердили только
остеопротекторное действие эстрогенов и специфических модуляторов их ядерных рецепторов. Вместе с тем при использовании заместительной гормональной терапии обнаружена повышенная вероятность возникновения злокачественных новообразований, таких как рак молочной железы, рак эндометрия и
рак яичников. Важно отметить, что есть корреляция между активацией лекарственными препаратами α-рецепторов эстрогенов и их канцерогенностью, хотя
характер этой зависимости не абсолютен. В первую очередь следует указать на
отсутствие способности индуцировать опухолеобразование у 2-фторэстрадиола,
обнаруженное еще в 80-х годах прошлого века, хотя это соединение обладает
заметной гормональной активностью. Вторым исключением является 17α-этинилэстрадиол. Сказанное выше послужило основанием для поиска новых аналогов эстрогенов с благоприятными биологическими свойствами, в первую очередь в ряду стероидов, содержащих фтор в положении 2. В литературе предложен только один вариант введения фтора в положение 2 эстрогенов с удовлетворительным выходом [1], однако воспроизвести эти результаты в широком
масштабе авторам не удалось. В настоящее время эстрогены, содержащие 18F в
различных положениях, используются только для диагностики.
Поэтому актуальным является поиск аналогов половых гормонов с пониженной или отсутствующей гормональной активностью, которая реализуется
главным образом через их ядерные рецепторы. Выбор модификаций в структуре модельных соединений для решения этой задачи частично можно осущест-
5
вить на основании их докинга в лиганд-связывающие карманы рецепторов
эстрогенов, построенные по данным РСА рецепторов с лигандами.
До недавнего времени основное внимание при поиске модифицированных
аналогов эстрогенов проводили в ряду соединений с природным сочленением
колец, и только сравнительно недавно обратили внимание на 8α-аналоги [2] и
13α-аналоги [3]. Интерес к этой группе веществ вызван возможностью иного
направления их метаболизма и, следовательно, большей потенциальной
безопасностью при длительном применении.
Целью настоящей работы является поиск модифицированных 8α-аналогов эстрогенов с пониженной утеротропной активностью и обладающих улучшенными биологическими свойствами, в частности кардиопротекторной
активностью, антиоксидантной активностью.
Научная новизна. Синтезированы новые 8α- и 13α-аналоги стероидных эстрогенов, изучены их структура и некоторые биологические свойства. Впервые
показано, что 2-фтор-8α-аналоги стероидных эстрогенов могут обладать высокой антиоксидантной активностью.
Практическая ценность. Найдено соединение, препятствующее развитию экспериментального остеопороза и гиперхолестеринемии при пониженной
утеротропной активности. Получены вещества с пониженной гормональной активностью, препятствующие развитию гиперхолестеринемии и не обладающие
гипертриглицеридемическим действием. Синтезирован стероид, под действием
которого повышается содержание липопротеинов высокой плотности. Такие
стероиды перспективны при поиске потенциальных лекарственных препаратов
для лечения и профилактики атеросклероза.
Положения и результаты, выносимые на защиту:
1. Усовершенствование некоторых стадий в схеме полного синтеза 6метокси-7-фтортетралона-1.
2. Создание 2-фтор-8α-аналогов стероидных эстрогенов, обладающих высоким антиоксидантным действием при пониженной гормональной активности.
6
3. Создание 2-фтораналогов стероидных эстрогенов, обладающих высоким
кардиопротекторным действием при пониженной гормональной активности.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 статьи.
Получено решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности о
выдаче патента на изобретение по заявке на патент РФ 2013104829, приоритет
от 05.02.2013.
Результаты исследований представлены на Congress on Steroid Research,
2011, March 27-29, Chicago, USA; 7th International Meeting STEROIDS AND
NERVOUS SYATEM. Torino-Orbassano (TO), Italy. February 16-20 2013; 2-nd
Congress on Steroid Research. Chicago, March 10-12, 2013; Первой Российской
конференции по медицинской химии (MedChem Russia-2013) с международным
участием.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 стр. и состоит
из обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитированной литературы и приложения.
В обзоре литературы рассмотрены наиболее важные работы по поиску
новых биологически активных эстрогенов, включающие пути модификаций,
позволяющие избежать неблагоприятных побочных эффектов.
В главе «Обсуждение результатов» обоснован выбор модельных соединений, необходимых для решения поставленных задач, рассматриваются схемы
их синтеза, обсуждаются данные по биологическим свойствам и определению
пространственной структуры полученных веществ.
Диссертация содержит 29 схем, 29 рисунков и 11 таблиц, список
литературы состоит из 125 наименований.
7
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.
Поиск новых лекарственных препаратов на основе стероидных
эстрогенов
1.1.1. Эстрогены как кардиопротекторы
Смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в развитых странах
увеличилась с начала XX века в несколько раз и продолжает расти, составляя с
1980 года более 50% от всех случаев смерти [4]. Клинические и эпидемиологические исследования позволили установить отличия в уровнях смертности от
ишемической болезни сердца (ИБС) и частоты перенесенного инфаркта миокарда (ИМ) у мужчин и женщин, причем соотношение больных в зависимости
от пола составляет от 2:1 до 4:1 соответственно [5]. Более низкий риск возникновения ССЗ у женщин сохраняется лишь до определенного возраста, по достижении которого это различие по половому признаку постепенно исчезает.
Переломным моментом между периодами с относительно низкой и высокой
вероятностью появления коронарных сердечных заболеваний в жизни женщины является наступление менопаузы - прекращение функции яичников [6].
Это позволило предположить, что эстрогены являются протекторами от
сердечно-сосудистых болезней [7]. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о более низкой частоте сердечно-сосудистых заболеваний у женщин в период пременопаузы по сравнению с мужчинами того же возраста [8],
однако физиологическая основа защитного эффекта эстрогенов недостаточно
изучена.
С наступлением менопаузы риск коронарного атеросклероза и ишемии
можно свести к минимуму, поддерживая гормональный фон с помощью заместительной гормональной терапии [9]. Пути реализации этого влияния становятся понятными при объяснении механизмов защитного действия эстрогенов на
ССС, которые могут быть разделены на группы:
1) влияние на метаболизм липидов и липопротеинов;
8
2) прямое действие на стенку сосудов по геномному механизму с
выработкой оксида азота NO, вызывающего вазолидацию;
3) выработка белков теплового шока.
Концепция кардиопротекторного влияния эстрогенных лекарственных
препаратов основана, как уже отмечалось, на большом клиническом материале, свидетельствующем о способности эстрогенов предотвращать и задерживать развитие ИБС, артериальной гипертонии, пароксизмальных форм
нарушения сердечного ритма (НРС), атеросклероза [7].
1.1.1.1. Антиоксиданты на основе эстрогенов
Свободные радикалы в условиях человеческого организма могут проявлять достаточно большую реакционную способность и повреждать множество
мишеней, включая липиды, нуклеиновые кислоты и белки, что объясняет их
участие в ряде заболеваний, таких как атеросклероз [10–12], рак [13] и нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера) [14].
Атеросклероз является основной причиной возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, его возникновение в основном обусловлено процессами
свободно-радикального окисления липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в
крови с их последующим отложением на стенках аорт (Рисунок 1.1) [15].
Эстрогены являются мощными антиоксидантами, которые могут действовать независимо от их связывания с рецепторами эстрогенов и гормональной
функции [16–19]. 17β-Эстрадиол (Е2) ингибирует активность микросомальной
пероксидазы и тормозит процессы перекисного окисления мембранных липидов в концентрациях, близких к физиологическим.
9
Рисунок 1.1. Окисление липопротеинов низкой плотности как основная
причина развития атеросклероза. Макрофаги, подвергаясь воздействию
модифицирован-ных
ЛПНП,
экспрессируют
на
своей
поверхности
специфические сквенжер-ре-цепторы, которые связывают частицы ЛПНП.
Макрофаг, по мере переполнения его цитозоля холестерином, приобретает
гистологические характеристики так называемой пенистой пленки. Пенистые
клетки подвергаются апоптозу и нек-розу, в конечном счете, способствуя
формированию
и
прогрессированию
некротической
сердцевины
атеросклеротических бляшек [20].
Исследования, направленные на детальное изучение взаимодействия эстрона и 17-бутилового эфира Е2 с гидроксильным радикалом, привели к открытию циклического механизма антиоксидантного действия эстрогенов (схема
1.1), который включает следующие стадии:
1) нейтрализацию гидроксильного или перекисных радикалов стероидами
с ароматическим кольцом А, сопровождаемую образованием феноксильных радикалов и дальнейшим превращением последних в неароматические п-хиноны;
2) НАД(Ф)Н-зависимую восстановительную ароматизацию хинонов, фактически представляющую собой регенерацию фенольных соединений [21].
10
Схема 1.1
Липофильные стероиды, в отличие от многих низкомолекулярных антиоксидантов, избирательно проникают в гидрофобные области клеточных мембран, где и проявляют защитный эффект, ингибируя процессы свободнорадикального окисления ферментов, ионных каналов, структурных белков и липидов. В связи с этим лекарственные средства на основе модифицированных эстрогенов могут найти применение для профилактики и лечения различных заболеваний, в том числе ишемических и реперфузионных повреждений органов,
дегенеративных заболеваний ЦНС, атеросклероза, рассеянного склероза,
ревматоидного артрита, вирусного гепатита, аллергических реакций и др.
J. Perrella c коллегами проводили исследования антиоксидантной активности эстрогенов, сульфаты которых являются (за исключением эстра-1,3,5(10),8тетраен-17β-диола) компонентами эстроген-заместительного препарата СEE
(conjugated equine estrogens; Premarin, Wyeth Pharmacuuticals, PA, USA)
(Рисунок 1.2) [22].
11
Рисунок 1.2. Структуры соединений, исследованных в работе [22].
Было показано, что исследованные эстрогены защищают липопротеины
высокой плотности (ЛПВП) от окисления, причем эквиленин, 17β-дигидроэквиленин, и 17α-дигидроэквиленин оказались наиболее эффективными: при наличии ненасыщенного B-кольца в 2.54 раза увеличивается способность ингибировать окисление ЛПВП по сравнению с 17β-эстрадиолом (Рисунок 1.3).
Рисунок 1.3. Антиоксидантная активность соединений, исследованных в
ра-боте [22], выраженная в виде отношения к антиоксидантной активности 17βэстрадиола.
Производные природных эстрогенов Е2 (I), Е1 (II) и Е3 (III), предлагаемые
12
для профилактики и терапии свободнорадикальных патологий, включают большую группу соединений, содержащих различные заместители в кольцах A-D
стероидного скелета и/или дополнительные двойные связи. Ниже показаны
структуры некоторых модифицированных эстрогенов, а также приведены результаты опытов in vitro по определению их антиоксидантной активности и относительной конкурентной активности (ОКА) к рецепторам эстрогенов из
матки кролика (табл. 1.1) [23].
(I) R1 = R3 = α-H; R2 = β-H;
R4 = β-CH3; R5 = β-OH
(IV): R1 = R3 = β-H; R2 = α-H;
R4 = α-CH3; R5 = α-OH
(V): R1, R2 = Δ8,9; R3 = α-H;
R4 = β-CH3; R5 = β-OH
(VI): R1 = α-H; R2 = β-H
(VII): R1, R2 = Δ8,9
(VIII): R1 = α-H; R2 = β-H
(IX): R1, R2 = Δ8,9
(III): R1 = R2 = α-H; R3 = β-H
(X): R1, R2 = Δ9,11; R3 = H
(XI): R1 = R2 = α-H; R3 = β-H
(XII): R1, R2 = Δ9,11; R3 = H
(II): R1 = α-H; R2 = β-H
13
Таблица 1.1
Антиоксидантная активность соединений I-XIV
Ингибиро
-вание
ПОЛ:
IC50, μM
12.4
Соединение
(I) E2
Ингибирование окисления ОКА к РЭ
ЛПНП (5 μM исследуемо- из матки
го вещества): пролонгация кролика,
лаг-фазы, мин
%
110
100
(IV) ent-E2
8.8
120
6.7
(V) 8(9)-дегидро-E2
1.0
120
59.6
(VI) 17α-E2
8.9
(VII) 8(9)-дегидро-17α-Е2
4.1
(VIII) 14α,15α-метиленЕ2
(IX) 14α,15α-метилен8(9)-дегидро-Е2
22.8
5-10
0.9
(III) E3
122.5
(X) 9(11)-дегидро-Е3
10.6
(XI) 3-гидрокси-1,3,5(10)
эстратриен-17Sспирооксиран
(XII) 3-гидрокси1,3,5(10),9(11)-эстратетраен-17S-спирооксиран
45
10.3
7.5
4.11
170
0.81
210
132.0
α-Токоферол
U-78517F
1.8
70
Как видно из данных таблицы 1.1, соединения с ненасыщенным кольцом B
обладают большей антиоксидантной активностью. По мнению авторов работы
[22], подобное влияние дополнительных двойных связей, сопряженных с
ароматическим кольцом А, обусловлено дополнительной резонансной стабилизацией фенольного радикала.
В ряде работ указывается на важность фенольной гидроксильной группы
[18,24]. В работе [25] исследована связь структура-антиоксидантная активность
в ряду производных эстрогенов (Рисунок 1.4). Показано, что соединения, не
содержащие фенольную гидроксильную группу, не влияют на процесс
окисления
ЛПНП
и
ЛПВП
ионами
Сu2+.
Также
показано,
что
14
электронодонорные группы положительно влияют на
антиоксидантную активность. Так, введение метоксильной группы в положение 2 и/или 4 приводит к многократному
увеличению
(Рисунок
1.4).
несколько
антиоксидантной
Однако,
соединения,
гидрок-сильных
дигидроксиэстрадиол
групп
XIII)
активности
содержащие
(например,
2,4-
антиоксидантной
активностью не обладают, что объясняется низким
сродством этих соединений к час-тицам липопротеинов,
обусловленным повышенной гид-рофильностью данных стероидов. В случае 6оксоаналога XIV также наблю-далось отсутствие антиоксидантных свойств,
связанное,
по
мнению
авторов,
с
отрицательным
влиянием
электроноакцепторной кето-группы на стабильность феноксильного радикала.
Рисунок 1.4. Влияние производных эстрогенов на процесс окисления
ЛПНП и ЛПВП ионами Cu2+.
15
1.1.1.2.
Липопротеины
высокой
плотности.
Антиатерогенные
свойства и способы коррекции их уровня
Между содержанием ЛПНП и риском развития ишемической болезни сердца (ИБС) существует строгая линейная зависимость, не имеющая отношения к
другим важным факторам риска ИБС. Клинические исследования по коррекции уровня содержания ЛПНП показали снижение частоты ИБС вне зависимости от вида вмешательства и терапии (диета, частичное шунтирование
тонкого кишечника, медикаментозная терапия) [26].
В отличие от ЛПНП, липопротеины высокой плотности (ЛПВП) усиливают
антиатеросклеротические эффекты, включая обратный транспорт холестерина
из сосудов [27–29] и антиоксидантные механизмы в стенке сосудов [30,31].
В процессе накопления холестерина в макрофагах, из которых образуются
пенистые клетки, происходит накопление липидов и увеличение объема клетки
вплоть до ее гибели. ЛПВП стимулируют процесс обратного транспорта
холестерина (Рисунок 1.5) [32].
Обратный транспорт холестерина под влиянием ЛПВП считают наиболее
значимым антиатерогенным фактором [33]. В связи с этим разработка новых
препаратов и открытие биологических молекул, под влиянием которых повышается содержание ЛПВП, находятся в центре внимания фармакологов. Терапевтические возможности имеющихся препаратов с указанным действием
представлены в таблице 1.2. Статины, фибраты и никотиновая кислота снижают показатели смертности от сердечно-сосудистых заболеваний среди пациентов с пониженным содержанием ЛПВП [34–37], однако реальный вклад этих
препаратов в повышение содержания ЛПВП в целом не определён.
16
Рисунок 1.5. Метаболические пути обратного транспорта холестерина.
Макро-фаги превращаются в пенистые клетки, так как усиленно захватывают
модифи-цированные частицы ЛПНП. При этом макрофаги не могут
метаболизировать холестерин и выводить побочные продукты. Основной
функциональный апо-протеин ЛПВП – Апо AI с рецептором АBCA-1 и
индуцирует мобилизацию холестерина из внутриклеточного липидного пула
[38].
Таблица 1.2
Ожидаемое повышение уровня ЛПВП в ответ
на различные
фармакологические препараты [26]
Препарат
Повышение содержания ЛПВП, %
Статины
3-15
Фибраты
10-15
Никотиновая кислота
10-30
Тиазолидинедионы
5-24
Эстрогены
10-25
17
Введение эстрогенов может приводить к повышению уровня ЛПВП путем
стимулирования секреции Апо АI в печени и снижения активности печеночной
липазы [39,40]. Однако постменопаузальная терапия эстрогенами не применяется для снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний у женщин при пониженном уровне ЛПВП, что обусловлено высокой частотой развития тяжелых
побочных эффектов.
1.1.1.3. Геномные пути кардиопротекторного действия эстрогенов.
Участие эстрогенов в вазодилатации посредством путем NO
Сосудистый эндотелий играет важнейшую роль в регуляции сосудистого
гомеостаза благодаря контролю за тонусом сосудов, процессов коагуляции и
воспаления. Эти эффекты осуществляются при помощи эндотелиальных факторов, таких как оксид азота (NO), простациклины, факторы гиперполяризации
эндотелия и т.д. Экспериментальные исследования указывают на то, что эстрадиол может оказывать модулирующее влияние на продукцию вышеприведенных эндотелиальных факторов (Рисунок 1.6) [41].
Согласно имеющимся в литературе данным, 17β-эстрадиол значительно
повышает уровень секреции NO клетками эндотелия сосудов [42], что служит
еще одним доказательством вазодилатирующего эффекта эстрадиола. Показано,
что Е2 активирует эндотелиальную NO-синтазу (NOS, еNOS) в культуре эндотелиальных клеток, которая увеличивает синтез NO и активирует гуанилатциклазу в гладкомышечных клетках [43]. Этот эффект блокируется ингибитором
NOS - метиловым эфиром L-нитроаргинина, что подтверждает данный механизм действия [44]. Геномный характер процесса подтверждается тем, что эффект полностью блокируется классическим блокатором ER тамоксифеном [45].
Кроме того, эффект стимуляции eNOS 17β-эстрадиолом увеличивался при чрезмерной экспрессии ER. Молекулярные механизмы этого процесса не известны
и требуют дальнейших исследований.
18
Рисунок 1.6. Кардиопротекторные сигнальные пути, опосредованные ER.
(1) Экспрессия генов, регулируемая комплексом ERβ. (2) Активация фермента
PI3K/Akt. Сигнальные функции NO способствуют увеличению содержания Sнитрозированных белков, включая митохондриальную F1F0-АТФазу (F1F0),
аконитазу (Ac), цитохром c оксидазу (Cyto c ox), белки теплового шока
(HSP27/60/70), креатинкиназу (CK), и малатдегидрогеназу (MD). (3) Комплекс
белка G с рецептором эстрогенов GPR30 или GPER способствует кардиопротекции по PI3K/Akt пути. Активация фермента PI3K/Akt и сигнальные функции
NO приводят к увеличению продолжительности жизни клетки [7].
1.1.1.4. Влияние эстрогенов на белки теплового шока
Белки теплового шока (HSP) являются важным семейством эндогенных
протекторных протеинов. Наиболее изучен белок HSP72, кардиопротектор при
ишемии. Работы по изучению влияния концентрации эстрогена на экспрессию
HSP72 позволили обнаружить в два раза большую концентрацию HSP72 у
самок по сравнению с самцами. Овариэктомия снижает уровень HSP72 в сердце
самок, что можно предотвратить эстроген-заместительной терапией. Эти
19
данные указывают на то, что большая экспрессия HSP72 у самок обусловлена
эстрогенами [46].
Цитопротекторные свойства белков класса HSP70 были показаны на различных моделях ишемических нарушений in vitro и in vivo [47]. Ранее эта защита объяснялась действием HSP как шаперонов (поддержанием правильного
свертывания белков и предотвращением их агрегации), но затем выяснилось,
что HSP70 могут напрямую воздействовать на апоптоз и некроз.
Как видно из рисунка 1.7, церебральная ишемия индуцирует апоптоз разными способами, а HSP70 уменьшает действие их всех. "Внутренний" путь апоптоза состоит в выделении проапоптозных митохондриальных веществ, открытии митохондриальной поры и активации каспаз [48]. Другой ("внешний") путь
связан с активацией рецепторов плазматической мембраны (Fas и TNFR), индуцирующих апоптоз через каспазу-8, используя фактор TRAF. Кроме того,
известны механизмы каспаз-независимого апоптоза [49].
Рисунок 1.7. Белки теплового шока при ишемии
20
Белки HSP70 могут ингибировать процесс образования цитохрома с (cyt c)
из митохондрий и транслокацию индуцирующего апоптоз фактора AIF в ядро,
уменьшая ишемическое повреждение мозга [50], а также ингибировать
освобождение проапоптозного белка Smac/DIABLO из митохондрий миоцитов.
Показано, что белки класса HSP70 ингибируют дефосфорилирование киназы JNK (c-Jun N-terminal kinase), которая играет существенную роль в нейрональном апоптозе и является одной из мишеней для терапии инсультов [51].
Кроме того, белки HSP взаимодействуют с топоизомеразой 1 (регулятором
апоптоза) и являются эффекторами антиапоптозной киназы Akt/PKB [52]. Значительная активация белками теплового шока глутатион-пероксидазы и глутатионредуктазы является существенным элементом в механизме цитопротекторного действия HSP при ишемии.
1.2.
Побочные эффекты действия эстрогенов и пути их устранения
1.2.1. Эстрогены и гормональный канцерогенез
Согласно современным представлениям, существует два основных пути
канцерогенеза, индуцируемых эстрогенами – физиологический (промоторный)
и генотоксический (Рисунок 1.8) [53].
Первый вариант связывают с усиленной пролиферацией клеток органовмишеней для эстрогенов. Установлено, что продолжительность действия эстрогенами прямо пропорциональна риску возникновения злокачественных новообразований (прежде всего в молочной железе). Это действие реализуется путем активации генов, подконтрольных рецептору эстрогенов ERα [54,55]. Эта
зависимость не абсолютна, но некоторые исследователи связывают гормональную активность эстрогенов именно с развитием опухолей, а причину возникновения злокачественных образований - со способностью эстрогенов повреждать ДНК (генотоксический механизм), вызывая точечные мутации [56].
Таким образом, концепция генотоксического канцерогенеза, не отрицая
важности усиленной пролиферации, придает особое значение действию эстрогенов как таковых, фактически приравнивая их к истинным канцерогенам [56].
21
Прежде всего это относиться к продуктам метаболизма эстрогенов. В настоящее время, основное внимание исследователей уделяется генотоксическому
канцерогенезу, который считается наиболее важным в развитии злокачественных опухолей.
Эстрогены
Физиологический путь
канцерогенеза
Генотоксический путь
канцерогенеза
E2
↓
эстроген-рецепторный
комплекс (ER)
↓
активация генов
пролиферации
↓
деление клеток
↓
мутации
E2
↓
4-OHE2
↓
E2 3,4-хинон
↓
аденин/гуанин –
хиноновые коньюгаты
↓
депуринизация ДНК
↓
нарушение репарации
ДНК
↓
мутации
Рак молочной железы
Рисунок 1.8. Два пути гормонального канцерогенеза
17β-Эстрадиол (Е2, I) и эстрон (Е1, II) способны к взаимопревращениям и
к образованию значительного числа метаболитов (Рисунок 1.9). Установлено,
что генотоксический канцерогенез протекает по пути через необратимого
гидрок-силирования в кольцах А и D c последующим образованием хинонов,
обла-дающих способностью необратимо повреждать ДНК (Рисунок 1.9) [57,58].
22
Рисунок 1.9. Механизм генотоксического канцерогенеза.
По современным представлениям, ферментативное гидроксилирование
может происходить, как минимум, при 10 углеродных атомах молекул эстрадиола (I) и эстрона (II) [8]. Однако наиболее важными продуктами гидроксилирования в процессе канцерогенеза являются метаболиты XV, XVI, XVII
(схема 1.2).
Схема 1.2
23
Гидроксилирование стероидных эстрогенов в ароматическое кольцо приводит к образованию катехолэстрогенов XVI и XVII [59,60], а по положению
16α - к образованию 16α-гидроксиэстрогенов (например, 16αОНЕ1, XV), которые могут алкилировать аминокислотные остатки белков. Однако мнения исследователей относительно канцерогенных свойств 16αОНЕ1 (XV) разделяются. Одни считают его потенциально опасным, другие полагают, что как индуктор опухолевых заболеваний, он гораздо слабее 4-гидроксиэстрона (4-ОНЕ1,
XVII) [61]. Несмотря на отсутствие единства взглядов, некоторыми исследовательскими группами была установлена роль усиленного 16α-гидроксилирования эстрона (II) в трансформации эпителия молочных желез. Повышенная экскреция данного метаболита была выявлена у больных раком молочной, предстательной железы и у мышей со спонтанными опухолями молочных желез
[62]. Другие исследования показывают, что концентрации 16α-метаболита (XV)
в матке у женщин «с» и «без» рака молочной железы различаются незначительно, тогда как увеличенное содержание 2-ОНЕ1 (XVI) было отмечено в группе
женщин с раком молочной железы [63]. Также заслуживает внимания факт, что
в микросомах из клеточной линии опухоли молочной железы MCF-7 скорость
образования катехолэстрогенов (XVI, XVII) достаточно велика, в отличие образцов из нормальной ткани молочной железы [64]. Эти факты приводят к выводу, что образование катехолэстрогенов (XVI, XVII) является определяющим
фактором риска возникновения рака молочной железы.
Согласно исследованиям, проведенным в работе [65], 4-OHE1 (XVII) обладает канцерогенностью, в то время как у 2-ОНЕ1 (XVI) она отсутствует [65],
вероятно потому, что 4-OHE1 (XVII) медленнее дезактивируется путем О-метилирования [66], приводя к образованию стабильных не канцерогенных метиловых эфиров. Таким образом, непосредственная роль 2-гидроксиэстрогенов типа
(XVI) как индукторов канцерогенеза ставится под сомнение. Такому заключению способствуют и некоторые известные свойства 2-гидроксиэстрогенов типа
(XVI). Помимо интенсивной метаболической дезактивации путем образования
метиловых эфиров, к числу этих особенностей относят слабое связывание с ре-
24
цептором эстрогенов ERα, очень умеренную эстрогенную активность и практически полное отсутствие способности вызывать опухоли при использовании
распространенных эстрогензависимых экспериментальных моделей [67]. Тем
не менее, вовлечение 2-гидроксипроизводных (XVI) в дальнейший метаболический редокс цикл делает их важным звеном в цепи реакций, приводящих к
гормон-индуцированному повреждению ДНК, как существенному элементу
гормонального канцерогенеза.
Помимо О-метилирования катехолэстрогенов, возможно также их окисление до соответствующих хинонов (XVIII, XIX). Образующиеся о-хиноны более
электрофильны, чем п-хиноны. Они активно реагируют с серусодержащими
нуклеофилами, такими как GSH (XX), с
образованием конъюгатов глутатионила
[68]. GSH (глутатион) - это трипептид γглутамилцистеинилглицин. Важность глутатиона в клетке определяется его антиоксидантными свойствами. Фактически глутатион не только защищает клетку от свободных радикалов, но и определяет редокс-статус внутриклеточной
среды в целом. 17β-эстрадиол (I) вызывает уменьшение содержания клеточного
GSH без образования GSSG, что связывают с образованием продуктов
присоединения о-хинонов к GSH [69].
Хиноны (например, XIX) могут вступать в окислительно-восстановительный цикл с соответствующими семихинон-радикалами (XXI) в присутствии Р450 редуктазы, образуя супероксид радикалы (О2-.) (схема 3).
Схема 1.3
25
Хиноны могут также вступать в двухэлектронное восстановление с образованием катехолэстрогенов, катализируемое DT-диафоразой (схема 1.3). DT-диафораза известна, прежде всего, своей способностью катализировать восста-новление хинонов (типа XIX) до гидрохинонов (XVII) в присутствии NADP или
NADPH [70]. Повышенное содержание DT-диафоразы обнаружено в опухолях
молочной железы.
8-Гидрокси-2’-деоксигуанозин (8-OHdG, XXII) считают
биомаркером окислительного повреждения ДНК [71]. ROS,
образующиеся в результате окислительно-восстановительного цикла между о-хинонами (типа XIX) и их радикалами
(типа XXI) (схема 2), могут вызывать окислительное расщепление сложноэфирной связи фосфат-сахар и окисление
пуринового/пиримидинового остатка ДНК [72]. Основные процессы, ведущие к
повреждению ДНК – это реакции гидроксилирования и раскрытия кольца пуриновых оснований под действием ROS, образующихся в результате окислительно-восстановительного цикла катехолэстрогенов [73].
Образование продуктов ковалентного присоединения к ДНК in vivo обычно рассматривают как начальное событие в канцерогенном процессе [74] (схема
1.4). о-Хинон (XVIII) сначала быстро изомеризуется в хинонметид (XXIII), который затем реагирует по положению 6 с экзоциклической аминогруппой dA
или dG (схема 1.4а), давая стабильные продукты присоединения (типа XXIV),
которые могут быть восстановлены с помощью различных репараз. В случае же
о-хинона XIX продукты присоединения XXV и XXVI (схема 1.4б) крайне нестабильны и происходит «депуринизация» ДНК (Рисунок 1.10), приводящая к
различным мутациям [57,75,76] (Рисунок 1.11).
26
Схема 1.4
Рисунок 1.10. Механизм депуринизации [57]
27
Рисунок 1.11. Возможная схема индукции A→T мутации, вызванной
депуринизацией [57]
1.2.2.
Поиск
противоопухолевых
препаратов
на
основе
модифицированных эстрогенов
На рисунке 1.12 изображены две основные стратегии проведения
гормональной терапии рака молочной железы [77].
Первая стратегия (A) заключается в блокировании ERα антиэстрогенами
или селективными модуляторами рецептора эстрогенов (SERM) [78]. В основе
второй стратегии (B) – блокирование ключевой стадии биосинтеза наиболее
важного эстрогена - эстрадиола под действием ингибитора стероидогенного
фермента [79–81]. Эта стратегия находит применение в клинической практике
[82].
28
Рисунок 1.12. Две основные стратегии (А и B) для проведения гормональной
тера-пии рака молочной железы. Стероидогенные ферменты: сульфатаза (1),
3β-гид-роксистероид дегидрогеназа (2), ароматаза (3) и 17β-гидроксистероид
дегидро-геназа (4), DHEAS – сульфат дегидроэпиандростерона, E1S – сульфат
эстрона.
К настоящему времени получено несколько поколений активных и высокоселективных ингибиторов ароматазы [83]. Однако клинические исследования
показали весьма незначительный эффект применения этих ингибиторов. Наиболее вероятное объяснение этого – наличие другого пути накопления
эстрогенов в опухоли.
Известно, что эстрогены циркулируют по крови в неактивной форме в виде
сульфатов (XXVIII). Таким образом, они не связываются с рецепторами эстрогенов, а значит и не опасны. Под действием сульфатазы открывается «сульфатазный путь», по которому сульфат эстрона E1S трансформируется в эстрон E1
[84]. Содержание эстрогенов в опухолевых тканях у постменопаузальных женщин в десятки раз превышает содержание их в плазме крови, что объясняют образованием эстрогенов in situ из сульфата эстрона (XXVIII) под действием
сульфатазы (схема 1.5).
29
Схема 1.5
Одним из наиболее общих требований к ингибиторам сульфатазы является
наличие фенольной гидроксильной группы с присоединенной к ней полярной
электроно-акцепторной группой. В качестве таковой может выступать как сульфогруппа, так и ее аналоги. Таким образом, сульфаматы стероидных эстрогенов
могут быть ингибиторами сульфатазы эстрона и могут применяться при лечении гормонозависимых опухолей [85].
Возможность создания ингибиторов сульфатазы, содержащих сульфаматную группу была показана группой профессора Майкла Рида на примере
сульфамата эстрона (EMATE, XXIX) - первого конкурентного необратимого ингибитора с время- и концентрационно- зависимым
действием. Он принят эталоном при создании новых ингибиторов сульфатазы
эстрона со стероидным скелетом. Найдено, что при концентрации 10 μM
ЕМАТЕ ингибирует активность сульфатазы эстрона на плацентарных микросомальных клетках на 99%, имея IC50 = 80 pМ [86].
На рисунке 1.13 представлен результат докинга EMATE в качестве лиганда с использованием модели с гидратированной формой формилглицина [85].
30
Рисунок 1.13. EMATE показан зеленым цветом. Остатки в активной
области: His136, His290, Lys134, Lys368, Asp35, Asp36, Asp342, Glu343, FG75
(ион магния показан светло-зеленым цветом)
Высокое сродство к сульфатазе эстрона обусловлено наличием следующих
групп, которые способны связываться с аминокислотными остатками в активной области фермента (Рисунок 1.14):
Рисунок 1.14. Предполагаемая структура кармана связывания сульфатазы
эст-рона
[85].
(1)-
Кислородный
анион
или
незаряженный,
но
электроотрицатель-ный заместитель у центрального атома сложного эфира,
31
доступный для ионных взаимодействий; (2) - кислородный атом или
сложноэфирный фрагмент, спосо-бный образовать водородные связи; (3)
большой углеродный скелет, подобный стероидной структуре, который может
давать гидрофобные взаимодействия; и (4) карбонильная группа при С 17 для
образования водородных связей [87,88].
Процесс ингибирования сульфатазы эстрона фенольными соединениями необратим, результатом является перенос сульфаматной группы к остатку в активном центре фермента или нуклеофильная атака сульфаматной группы на
остаток формилглицина в активном центре фермента (схема 1.6).
Схема 1.6. Предполагаемый механизм необратимого ингибирования
cульфатазы эстрона сульфаматами.
В работе [89] изучены свойства ряда потенциальных ингибиторов сульфатазы эстрона (cхема 1.7). Показано, что соединение XXXIV обладает ингибирующей активностью, сравнимой с EMATE (табл. 1.3).
32
Схема 1.7. Поиск ингибиторов сульфатазы эстрона
Таблица 1.3
Ингибирующая активность соединений XXX-XXXVII
Cоединение
IC50 [μM]
EMATE
0.056
XXX
˃50
XXXI
˃50
XXXII
˃50
XXXIII
˃50
XXXIV
0.42
XXXV
˃50
XXXVI
˃50
XXXVII
˃50
Сульфамоилированные аналоги 2-метоксиэстрадиола (2-MeOE2 XXXVIII,
такие как 3,17-бисульфамат 2-метоксиэстрадиола (XL) и 3,17-бисульфамат 2-
33
этилэстрадиола (XLI) являются потенциальными ингибиторами сульфатазы
эстрона (STS, IC50 XL и XLI равны 38 nM и 1 μM соответственно) и роста
раковых клеток, потенциальными препаратами для лечения гормонозависимого
рака молочной железы [90].
1.2.3.
Аналоги
эстрогенов,
не
обладающие
канцерогенными
свойствами
2-Фторэстрадиол (28) не проявляет канцерогенной активности в опытах на
почках грызунов, а 4-фторэстрадиол вызывает мутации клеток только после более длительного периода инкубации по сравнению с эстрадиолом (табл. 1.4)
[91].
Авторы работы [91] предположили, что отсутствие канцерогенных
свойств у 2-фторэстрадиола – это следствие прочности связи C-F, которая не
разрывается при действии цитохром-оксидазы.
34
Таблица 1.4
Определение канцерогенной активности соединений XLII и XLIII
Количество животных с
опухолью (количество
проверенных животных).
224 дня 279 дней 345дней
Число
животных
в опыте
Число
умерших
животных
Эстрадиол (I)
18
5
4 (4)
5 (5)
0 (4)
2-Фторэстрадиол (XLII)
15
3
0 (4)
0 (4)
0 (3)
4-Фторэстрадиол (XLIII)
15
2
1 (4)
3 (6)
0 (3)
Контрольный опыт
10
0
0 (3)
0 (3)
0 (4)
Соединение
Авторы статьи [92] изучали метаболизм 2-фторэстрадиола (2-FE2, XLII), 4фторэстрадиола (4-FE2, XLIII) и эстрадиола (E2, I), идентифицируя метаболиты, обнаруженные в желчи и моче мужских особей хомяков. Стероиды были
мечены тритием по 6,7 положениям. Для анализа метаболитов, желчь и мочу
инкубировали с β-глюкуронидазой, свободные стероиды экстрагировали эфиром и разделяли методом ВЭЖХ. Содержание меченых метаболитов определяли непрерывно радиодетектором.
35
Структуры метаболитов стероидов E2 (I), 2-FE2 (XLII), 4-FE2 (XLIII),
обнаруженные в желчи хомяков через 4 ч после внутривенного введения стероидов, представлены в таблице 1.5.
Таблица 1.5
Метаболиты стероидов E2 (1), 2-FE2 (XLII), 4-FE2 (XLIII) в желчи хомяков
Доза соединений
Стероиды и их
метаболиты
0,1 µмоль/кг
50 µмоль/кг
3
H, %
7.6±2.7
10.9±3.6
2-OHE2 (XLIV)
60.0±19.6
62.4±8.3
2-MeOE2 (XLV)
4.6±4.0
2.4±0.6
E1 (II) и ∆9,11E1 (XLVI)
8.3±2.7
1.3±0.8
2-OHE1 (XVI)
4.3±1.5
15.0±12.4
2-OMeE1 (XLVII)
9.9±8.3
2.2±0.6
30.7±2.4
61.6±9.5
2-FE1 (XLVIII)
43.8±6.5
25.1±3.6
2-F-14OHE1 (XLIX)
10.3±3.5
-
2-F-xOHE1 (L)
5.0±2.5
-
22.8±3.4
28.8±1.0
4-F-2OHE2 (LI)
27.8±5.5
43.2±8.2
4-FE1 (LII)
44.0±5.4
23.4±6.3
4-F-2OHE1 (LIII)
1.6±0.5
3.9±2.8
E2 (I)
2-FE2 (XLII)
4-FE2 (XLIII)
Метаболиты стероидов E2 (I), 2-FE2 (XLII), 4-FE2 (XLIII), обнаруженные
в моче хомяков через 4 ч после внутривенного введения стероидов
представлены в таблице 1.6.
36
Таблица 1.6
Метаболиты стероидов E2 (1), 2-FE2 (XLII), 4-FE2 (XLIII) в моче хомяков
Доза соединений
Стероиды и их
0.1 µмоль/кг
50 µмоль/кг
метаболиты
3
H, %
8.9±7.4
13.8±3.8
63.3±20.6
30.9±5.4
E1 (II)
7.3±1.6
5.5±0.8
2-OHE1 (XVI)
5.2±3.1
16.5±6.1
2-OMeE1 (XLVII)
3.9±2.8
5.5±1.0
2.8±2.2
26.8±9.8
2-FE1 (XLVIII)
27.8±11.2
24.5±7.5
2-F-14OHE1 (XLIX)
14.0±3.6
11.5±5.7
2-F-xOHE1 (L)
33.7±13.0
13.0±9.6
4.3±2.4
20.1±7.0
4-F-2OHE2 (LI)
10.3±1.7
13.9±1.7
4-FE1 (LII)
56.4±4.6
54.2±3.5
4-F-2OHE1 (LIII)
3.4±1.0
2.4±1.0
E2 (1)
2-OHE2 (XLIV)
2-FE2 (XLII)
4-FE2 (XLIII)
Е2 (1). 2-OHE2 (XLIV)– основной метаболит эстрадиола (I) в желчи и в
моче. Гидроксилирование эстрадиола (I) по второму положению протекает легче, чем у эстрона (II). О-метилирование образующихся 2-OHE1 (XVI) и 2-OHE2
(XLIV) – незначительно (приблизительно 5-20%).
2-FE2 (XLII). 2-FE2 (XLII) не подвержен окислительному дефторированию: ни 2-OHE1, (XVI) ни 2-OHE2 (XLIV) не были обнаружены среди метаболитов. В отличие от эстрадиола (I), были обнаружены в больших количествах
продукты дегидрирования (XLVIII) и дальнейшего алициклического гидроксилирования (XLIX, L).
4-FE2 (XLIII). 4-FE2 (XLIII) также не подвержен окислительному дефторированию: ни 4-OHE1 (XVII), ни 4-OHE2 (LIV) не были обнаружены среди ме-
37
таболитов. Были выделены продукты дегидрирования (LII) и гидроксилирования по положению 2 (LI, LIII). По аналогии с эстрадиолом (I), 4-FE2 (XLIII) является лучшим субстратом для гидроксилирования по С-2, чем продукт его дегидрирования (LII). Однако С-2 гидроксилирование у 4-FE2 (XLIII) протекает
сложнее, чем у нефторированного аналога (I).
Из табличных данных видно, что введение атома фтора во второе или четвёртое положение сильно влияет на метаболизм стероидов у мужских особей
сирийских хомяков. Полученные данные согласуются со способностью замещенных эстрогенов индуцировать опухоли в почках. Так, в случае с 4-FE2
(XLIII), обладающим бóльшим периодом индукции, чем Е2 (I), в моче и в желчи обнаружено меньше катехолэстрогенов, чем в случае с Е2 (I). Не канцерогенный 2-FE2 (XLII) не подвержен окислительному дефторированию и заметному
гидроксилированию по С-4.
Исследования in vitro отчасти подтверждают полученные авторами результаты: быстрое гидроксилирование в положение 2 эстрадиола (I) в микросомах печени и медленное О-метилирование катехолэстрогенов в печени хомяков
и красных кровяных тельцах [93]. Однако отмечены несоответствия, касающиеся окислительного дефторирования и гидроксилирования незамещённых ароматических положений in vitro. Так, 2- и 4- ОНЕ2 (XLIV, LIV) быстро образуются
в микросомах печени хомяков из 2- и 4-FE2 (XLII, XLIII) соответственно. Е2 (I)
и 4-FE2 (XLIII) – хорошие субстраты для гидроксилирования по С-4 в почечных микросомах, гидроксилирование по С-2 в микросомах обоих органов заметно увеличено при введении атома фтора в положение 4. Гидроксилирование по
С-4 в почечных микросомах также увеличивается при введении фтора в положение 2. Ни один из этих путей метаболизма и эффектов заместителя не наблюдается в исследованиях in vivo, описанных ранее. Следовательно, для того
чтобы найти взаимосвязь структура-метаболизм-канцерогенность у Е2 (I) и его
фторированных аналогов (XLII, XLIII), следует провести дополнительные исследования метаболического и гормонального действия, чтобы выяснить причины несоответствия между образованием катехолэстрогенов в экспериментах
38
in vitro и почечной канцерогенностью. Попытка объяснить противоречия сделана в работе [93]. При сравнении относительных скоростей гидроксилирования\метилирования обнаружено, что для не канцерогенного 2-фторэстрадиола
(XLII) наряду с относительно низкими скоростями гидроксилирования характерны высокие скорости метилирования соответствующих катехолэстрогенов
(3.8 нмоль /(мг белка×мин) для 2-F-4OHE2 (LV) и 3.0 нмоль/мг белка×мин для
2-ОНЕ2). Таким образом, несмотря на заметную степень конверсии 2-фторэстрадиола в катехолэстрогены, постоянная концентрация последних поддерживается на очень низком уровне. Иная картина наблюдается у 4-фторэстрадиола
(XLIII), для которого низкие скорости метилирования катехолэстрогенов (1.7 и
0.5 нмоль/мг белка×мин) для 4-F-2-OHE2 (LI) и 4-ОНЕ2 (LIV) соответственно) в
сочетании с высокими скоростями их образования приводит к высоким стационарным концентрациям катехолэстрогенов, что считается основой канцерогенности 4-FE2 (LI), хотя и с большим периодом индукции.
Гормональная активность 2-фторэстрадиола (XLII) немного ниже, а 4фторэстрадиола (XLII) выше активности эстрадиола (I) [91]. Авторами статьи
[94] показано, что 2-фтоэстрадиол (XLII) влияет на метаболизм липидов у овариэктомированных крыс аналогично эстрадиолу (I), то есть снижает концентрацию холестерина в плазме крови, уменьшает объем бурых жировых клеток и
т.д.
Аналоги стероидных эстрогенов, содержащие фтор в положении 2, являются перспективными соединениями для создания лекарственных препаратов
ввиду их относительно высокой гормональной активности и относительно высокого сродства к рецепторам эстрогенов; также они обладают гиполипидемическими и остеопротекторными свойствами [95]. 2-Фторэстрадиол (XLII) является одним из немногих примеров в ряду эстрогенов с природным сочленением
колец, у которого отмечено высокое сродство к рецептору при полном
отсутствии канцерогенных свойств в условиях эксперимента.
39
1.3.
Методы синтеза аналогов стероидных эстрогенов, содержащих
фтор в положении 2.
Прямое фторирование ароматических соединений трудно осуществимо
ввиду чрезвычайной активности этого галогена; большинство соединений при
действии фтора подвергаются разложению, полимеризации или превращаются
в насыщенные циклические фториды. Несмотря на широкое применение фторорганических соединений, их получение остается весьма трудоемким, поскольку газообразный фтор и другие фторирующие реагенты чрезвычайно реакционноспособны, требуется специальная аппаратура для хранения и использования, а реакции с их участием трудно контролировать.
В работе [1] синтез 2-фторзамещённого метилового эфира эстрона (LX)
был осуществлён по реакции Шимана из соответствующего аминопроизводного LVIII, полученного, в свою очередь, восстановлением продукта нитрования
LVII метилового эфира эстрона LVI (схема 1.8).
Схема 1.8
Однако авторы [1] указывают на невоспроизводимость результатов по этой
схеме синтеза в большом масштабе. Вероятно, это явилось главной при-чиной
того, что 2-фторэстрадиол не используется в клинической практике.
Атом фтора можно селективно ввести в ароматическое кольцо действием
ацетилгипофторита на продукт взаимодействия соединения LXI с трифторацетатом ртути [96] (схема 1.9).
40
Схема 1.9
Недостатком метода является нестабильность CF3COOF, поэтому его получают непосредственно перед реакцией продуванием смеси 18% F2/N2 через
раствор ацетата натрия в уксусной кислоте и фреоне-11 при -800С.
Широкое распространение в качестве фторирующих агентов получили соли N-фторпиридиния, в частности трифлат N-фторпиридиния [97] (схема 1.10).
Схема 1.10
Продукт фторирования эстрона выделяют в виде ацетата LXIV после
флэш-хроматографии и дробной кристаллизации.
Другим реагентом, содержащим связь N-F, является N-фтордибензол-сульфонимид, который реагирует с 3,17β-бис(тетрагидропиран-2-илокси)-8β-винилэстра-1,3,5(10)-триеном (LXV) при -780С в ТГФ в присутствии бутиллития,
приводя к образованию продукта LXVI, который без дополнительной очистки
вводится в следующую стадию [98] (схема 1.11).
41
Схема 1.11
Еще одним реагентом для селективного введения фтора служит фтор-сульфат цезия. 17β-Эстрадиол I реагирует с фторсульфатом цезия с образованием 2фтор-17β-эстрадиола (XLII) [99] (схема 1.11).
Схема 1.12
Фторсульфат цезия получают, пропуская небольшой избыток 20% F2/N2
через раствор сульфата цезия (II) [100]. Кристаллический фторсульфат цезия
от-носительно стабилен, однако в растворе постепенно гидролизуется:
SO4F + H2O
HSO4
+ HF + 1/2 O2
В последние годы широкое развитие получили реакции,
проводимые в ионных жидкостях. Так, например, эстрадиол (I)
реагирует с SelectfluorTM (4-фтор-1-хлорметил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан бис-(тетрафторборат), (LXVIII) в ионной
жидкости [bmim][BF4] (1-бутил-3-метилимидазил тетрафторборат, LXIX) и метаноле (1:1) в качестве со-растворителя [101]
(схема 1.13).
42
Схема 1.13
Высокая электроотрицательность фтора не позволяет создать на его основе
реагенты, подходящие для использования в классических реакциях электрофильного замещения. Поэтому фторирующие реагенты должны содержать
хорошую уходящую группу, расположенную рядом с атомом фтора [102].
Таким образом, в литературе отсутствуют способы получения 2-F аналогов
стероидных эстрогенов, соответствующие следующим критериям:
 возможность синтеза различных аналогов стероидных эстрогенов,
содержащих фтор в положении 2, из единого предшественника для возможности получения модифицированных аналогов;
 масштабируемость синтеза;
 устойчивость промежуточных соединений и реагентов.
Заключение
Один из наиболее важных выводов, который можно сделать из работ по
изучению биологических свойств эстрогенов и поиску на их основе лекарственных препаратов, сводится к следующему.
Несмотря на то, что использование эстрогенов в ЗГТ может снижать у
женщин частоту сердечно-сосудистых заболеваний и оказывать лечебное воздействие при болезни Альцгеймера и ряда нейродегенеративных расстройств,
длительное применение эстрогенов приводит к повышению риска онкологических заболеваний, таких как рак молочной железы. В связи с этим поиск безопасных лекарственных средств на основе аналогов стероидных эстрогенов,
является актуальной проблемой.
43
Подводя итог обзора литературы по канцерогенности стероидных эстрогенов, можно сделать вывод, что согласно генотоксическому механизму канцерогенности, опасность представляют не собственно эстрогены, а их естественные метаболиты. Таким образом, при создании новых лекарственных препаратов на основе эстрогенов, надо учитывать и, по возможности, блокировать образование 2- и 4-гидроксипроизводных. Стоит учитывать также 16α-гидроксилирование, роль которого в гормональном канцерогенезе до конца не изучена.
2-Фторэстрадиол является одним из немногих примеров в ряду эстрогенов, для которого отмечено высокое сродство к рецептору при полном отсутствии канцерогенных свойств в условиях эксперимента. Аналоги стероидных эстрогенов, содержащие фтор в положении 2, являются перспективными соединениями для создания лекарственных препаратов ввиду их относительно высокого сродства к рецепторам эстрогенов, а также гиполипидемических и остеопротекторных свойств.
44
Глава 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1. Постановка задачи
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смертности в России и во всем мире [4]. Стенокардия, инфаркт миокарда, нарушения
мозгового кровообращения – заболевания, обусловленные атеросклерозом, у
женщин до определенного возраста возникают значительно реже, чем у мужчин, затем частота этих заболеваний, также же, как и частота смертности от
них, выравниваются и происходит это при прекращении выработки организмом
эстрогенов, что демонстрирует защитное действие данной группы гормонов на
сердце и сосуды.
В эстрогенодефицитных состояниях (в частности, у женщин в постменопаузальный период) заместительная гормональная терапия (ЗГТ) может служить одним из путей профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы,
остеопороза, болезни Альцгеймера. Многочисленные исследования биологических свойств стероидных эстрогенов с использованием различных моделей
на животных привели к заключению о целесообразности использования этой
группы веществ для ЗГТ. Однако отношение клиницистов к данному виду терапии остается настороженным, поскольку при длительном применении эстрогенов была обнаружена повышенная вероятность возникновения злокачественных новообразований, таких как рак молочной железы и рак эндометрия.
Согласно современным представлениям, существует два основных типа
гормонального канцерогенеза – физиологический (или промоторный), при котором под влиянием гормонов создаются, в частности, условия для увеличения
числа опухолевых клеток, и генотоксический, который считается наиболее важным в развитии злокачественных опухолей. Как было показано в обзоре литературы, генотоксический канцерогенеза обусловлен метаболическим гидроксилированием в кольцо А с последующим образованием хинонов, вызывающих
необратимое повреждение ДНК [53].
45
Низкая метаболическая стабильность является проблемой многих проектов
по созданию лекарственных препаратов. Липофильные соединения могут окисляться под действием энзимов печени, в частности, цитохрома Р450. Существует несколько способов решения этой проблемы, наиболее очевидный из которых – увеличение полярности молекулы лекарственного соединения. Однако
применительно к аналогам эстрогенов такой подход может привести к снижению биологической активности. Известно, например, что введение дополнительной гидроксильной группы в кольцо А эстрадиола приводит к потере
антиоксидантной активности стероида [25].
Более перспективной представляется альтернативная стратегия – блокирование метаболически лабильного сайта молекулы, в частности, путем введения
атома фтора. Такая модификация, как правило, не создает дополнительных стерических препятствий и не влияет на процесс образования лиганд-рецепторного комплекса. Эффективность данной стратегии демонстрируется рядом примеров. Так, путем блокирования двух метаболически лабильных сайтов молекулы
соединения SCH 48461 был получен препарат Ezetimib (SCH58235), недавно
одобренный FDA [103].
SCH 48461
ED50 (хомяки)=2.2 мг/кг
Ezetimib (SCH 48461)
ED50 (хомяки)=0.4 мг/кг
Первый ингибитор
COX II
t1/2 до 220 ч.
Celecoxib
t1/2 = 3.5 ч.
Другим примером, демонстрирующим влияние атома фтора на метаболическую стабильность препарата, является открытие ингибитора циклооксигеназы 2 (COX 2) - соединения Celecoxib [104]. В данном случае замена атома
фтора первого ингибитора на метильную группу приводит к сильному
снижению периода полувыведения.
46
Применительно к стероидным эстрогенам, стратегия повышения метаболической стабильности путем
введения фтора в кольцо А также может приводить к
снижению канцерогенности. Еще в 80-х годах прошлого
века было показано отсутствие способности индуцировать опухолеобразование
у 2-фторэстрадиола (5) [91], хотя это соединение обладает заметной гормональной активностью.
Сказанное выше послужило основанием для поиска новых аналогов эстрогенов с благоприятными биологическими свойствами, в первую очередь в ряду
стероидов, содержащих фтор в положении 2.
До недавнего времени основное внимание при поиске модифицированных
аналогов эстрогенов проводили в ряду соединений с природным сочленением
колец, и только сравнительно недавно обратили внимание на представителей
других стереохимических рядов - 8α-аналоги [105] и 13α-аналоги [3], кото-рые
могут обладать улучшенными биологическими свойствами. Оказалось, что
некоторые 8α-аналоги эстрогенов обладают остеопротекторным и гипохолестеринемическим
действием
при
значительно
сниженной
гормональной
активности.
В литературе предложен только один вариант введения фтора в положение
2 с удовлетворительным выходом, однако воспроизвести эти результаты в широком масштабе, как мы уже отмечали, авторам не удалось. В настоящее время
фторированные эстрогены, содержащие
18
F в различных положениях, исполь-
зуются только для диагностики.
Ранее на кафедре химии природных соединений была разработана полная
схема синтеза аналогов эстрогенов, содержащих фтор в положении 2 [95], однако невысокие выходы на отдельных стадиях свидетельствуют о необходимости
оптимизации указанной схемы.
В соответствии с вышесказанным задача диссертационной работы может
быть сформулирована следующим образом:
47
1) улучшить некоторые стадии получения промежуточных соединений в
предложенной ранее схеме полного синтеза по Торгову-Ананченко аналогов
стероидных эстрогенов, содержащих фтор в положении 2;
2) синтезировать и исследовать биологические свойства 8α-аналогов
стероидных эстрогенов, содержащих фтор в положении 2;
3) разработать метод синтеза и исследовать некоторые биологические
свойства 13α-аналога стероидных эстрогенов, содержащего фтор в положении
2;
4)
исследовать
антиоксидантные
свойства
аналогов
стероидных
эстрогенов, содержащих фтор в положении 2.
Выбор модельных соединений
Известно, что 16,16-диметил-D-гомо-8α-аналоги стероидных эстрогенов
типа 6 проявляют гиполипидимеческую активность в опытах на самцах крыс,
морских свинках и кроликах [106], обладая низкой гормональной активностью.
Ранее на кафедре химии природных соединений был синтезирован соответствующий
фторированный
аналог
7,
обладающий
кардиопротекторной
активностью.
Однако более перспективным могло оказаться соединение 8, поскольку наличие свободной гидроксильной группы должно способствовать проявлению
кардиопротекторных свойств при меньшей дозе препарата - его синтез стал одной из задач данной работы. Кроме того, наличие свободной гидроксильной
группы при С-3 позволит в перспективе синтезировать на основе стероида 8
соединения с более избирательными свойствами.
Известно также, что 17аβ-ацетокси-3-метокси-D-гомо-1,3,5(10)-эстратриен
(9) проявляет гиполипидемическую активность при отсутствии утеротропного
48
действия [107]. Представлялось интересным модифицировать его структуру путем введения атома фтора в положение 2 (с целью снижения канцерогенности)
и исследовать кардиопротекторные свойства соединения 10.
Соединения 13α-ряда, имеющие цис-сочленение колец C и D, могут иметь
высокое сродство к рецепторам эстрогенов ввиду почти одинакового с природным эстроном расстояния между функциональными группами в положениях 3
и 17 [108]. Это повышает вероятность появления ряда полезных биологических
свойств. В связи с этим данное направление также стало одной из задач
исследования. При планировании схемы синтеза
целевого аналога 13α-ряда было решено ввести
метильную группу в положение 16 с целью
снижения вероятности метаболического гидроксилирования в это положение (стероид 11).
Синтезированные ранее на кафедре химии природных соединений ацетат
метилового эфира 2-фтор-8α-эстрадиола (12) и метиловый эфир 18-метил-2фтор-8α-эстрона (13) обладают заметным остеопротекторным действием и
высокой гипохолестеринемической активностью при пониженном утеротропном действии [95].
Представлялось интересным синтезировать аналоги эстрогенов 8α-ряда 1416, содержащие фтор в положении 2 и свободную гидроксильную группу в
положении 3, для получения информации об их биологических свойствах.
49
Выбор этих модельных соединений обусловлен теми же причинами, что и
случае соединения 8: атом фтора во втором положении может снижать канцерогенность таких соединений, а наличие свободной гидроксильной группы
необходимо для использования веществ при более низких концентрациях.
Эквиленин (17) - один из компонентов средств заместительной гормональной терапии, однако, как и другие эстрогены, может подвергаться метаболическому гидроксилированию в положение 4 с последующим образованием канцерогенных хинонов. Известно, что введение атома фтора в положение 4
блокирует этот путь метаболизма без потери гормональной активности [109], а
о влиянии атома фтора положении 2 эквилениновых соединений и о методах
синтеза таких соединений данных в литературе нет. В связи с этим, мы решили
синтезировать аналог эквиленина 18, содержащий фтор в положении 2, с целью
изучения его биологических свойств.
Мы уже отмечали, что сульфатаза эстрона превращает гормонально неактивные сульфаты эстрогенов в гормонально активную свободную форму.
Сульфаматы стероидных эстрогенов могут ингибировать этот процесс, замедляя тем самым рост опухоли, опосредованной эстрогенами. Процесс ингибирования – необратимый, и протекает с образованием свободных эстрогенов. В
связи с этим при разработке ингибиторов сульфатазы эстрона следует учитывать гормональную активность и метаболизм стероидных эстрогенов. Очевидно, что модифицированные аналоги эстрогенов, гормональная активность кото-
50
рых в значительной степени снижена по сравнению с природными эстрогенами,
защищенные от метаболического гидроксилирования в кольцо А несомненно,
являются перспективными.
В связи с этим мы решили синтезировать сульфаматы 19-21, выбор
которых продиктован описанными выше соображениями.
2.2. Выбор пути синтеза целевых соединений. Синтез 6-гидрокси-7фтор-1-тетралона
Ввиду труднодоступности для нас реагентов и немасштабируемости синтеза целевых соединений из субстратов с уже сформированным стероидным
скелетом для решения поставленных синтетических задач мы избрали вариант
полного синтеза.
Исходным соединением для получения 2-фтораналогов служил 6-метокси7-фтортетралин (30), синтезированный по цепочке, предложенной В.Ю. Дудкиным и В.Н. Беловым в 1997 г. (схема 2.1). Такая схема удовлетворяла требованию доступности исходных соединений и позволила избежать применения
дорогостоящих реактивов и аппаратуры.
51
Схема 2.1
В соответствии с известной схемой синтеза, β-нафтол (22) гидрировали
под давлением на никеле Ренея, получая смесь продуктов 23 и 24 в почти
равном соотношении. Требуемый изомер 23 выделяли щелочной экстракцией. По предложенной ранее методике нитрование проходит селективнее,
если предварительно «защитить» 5-е положение бромированием с получением соединения 25. Метилирование 5-бром-6-гидрокси-7-нитротетралина 26
диметилсульфатом в щелочном растворе проходит почти количественно, если использовать большой избыток диметилсульфата. Гидрирование 5-бром6-метокси-7-нитротетралина 27 над Pd/C приводит к восстановлению нитрогруппы с одновременным дебромированием. Амин 28 вводили в реакцию
Шимана, получая соль борфторида диазония 29, которую разлагали в инертной атмосфере. Фтортетралин 30 отделяли от других продуктов вакуумной
перегонкой.
По сравнению с предыдущими работами нам удалось несколько увеличить выход на стадии термического разложения диазониевой соли с 29 до
36%, создав более эффективную ловушку продукта диазотирования. Кроме
того, мы исследовали возможность синтеза гексафтордиазониевой соли 29а и
52
её разложения по реакции Шимана, что позволило получить целевой продукт
с выходом до 41%.
Ввиду трудоемкости синтеза тетралина 30 по схеме 2.1 мы разработали
альтернативный путь (схема 2.2) с использованием коммерчески доступного
о-фторанизола в качестве исходного соединения.
Схема 2.2
о-Фторанизол (31) ацилировали по Фриделю-Крафтсу янтарным ангидридом [110]. Каталитическим гидрированием полученного соединения 32 в присутствии хлорной кислоты селективно восстанавливали бензильную кето-группу, а полученное соединение без очистки вводили в реакцию циклоконденсации в смеси метансульфокислоты и трифторуксусной кислоты. Ключевой стадией явилось восстановление тетралона 33. В условиях, аналогичных условиям
реакции восстановления соединения 32, образовывалась смесь целевого тетралина 30 и гидроксипроизводного 34 в соотношении 1:1. Лучшими вариантом
оказалось проведение ионного гидрирования: тетралин 30 был выделен с
выходом 77%.
Синтез 2-фтораналогов эстрогенов со свободной гидроксильной группой
путем снятия метильной защиты с соответствующих метоксипроизводных в общем случае не приводит к получению целевых соединений. Поэтому для решения этой задачи мы избрали синтез целевых соединений из фтортетралона со
свободной гидроксильной группой. Окислением тетралина 30 реактивом Джон-
53
са был синтезирован метокситетралон 35, кислотным гидролизом которого был
получен целевой гидрокситетралон 36 с неожиданно высоким выходом 94%
(схема 2.3).
Схема 2.3
2.3. Синтез 16,16-диметил-2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17аона (8)
Целевое соединение 8 было получено деблокированием гидроксильной
группы соединения 7 (схема 2.4) действием HBr в уксусной кислоте. Следует
отметить, что это единственный удавшийся случай снятия метильной защиты в
ряду 2-фтор аналогов. Так, снятие метильной защиты с соединения 13 в
различных условиях приводит к образованию большого количества побочных
продуктов с невозможностью выделения целевого соединения [111]. Таким
образом, неожиданно высокий выход соединения 8 обусловлен отсутствием
побочных процессов, что, вероятно, связано с более низкой реакционной
способностью стероидов в реакциях с участием шестичленного кольца D по
сравнению с пятичленным [112].
Схема 2.4
Соединения 8 охарактеризовано данными масс-спектрометрии, демонстрирующие основные закономерности распада молекул этого класса соединений.
Известно, что высокая интенсивность осколка, соответствующего фрагменту
типа 37, характерна для стероидов с цис-сочленением колец B и С. В масс-спек-
54
тре соединения 8 интенсивность фрагмента (37) составляет 45% от интенсивности молекулярного иона. Наличие осколка, соответствующего фрагменту
(38), также характерно для соединений данного класса [113].
Были исследованы биологические свойства синтезированного стероида 8
(таблица 2.1).
Таблица 2.1.
Гиполипидемическое действие соединения 8 в опытах на крысах-самцах,
получавших гиперхолестеринемическую диету
Группа
животных
Холестерин
в сыворотке
крови,
ммоль/л
Интактные
1.79  0.12**
3.89 
0.22**
1.65  0.07*
57.5  5.5**
7.9 0.6*
4.34  0.45
10.12  0.82
1.92  0.11
88.7  8.2
10.9  0.8
2.92  0.24** 7.12  0.31* 1.62  0.09*
69.4 4.4*
9.2  0.5
Интактные,
получавшие
диету
Интактные,
получавшие
диету и
стероид (8)
Холестерин Холестерин
в печени,
в аорте,
мг/г
мг/г
Триглицериды
в сыворотке
крови, мг/дл
Триглицериды в
печени,
мг/г
** р  0.01; * р  0.05 по сравнению с группой животных, получавших
гиперхолестеринемическую диету. Стероид вводили per os в дозе 5 мг/кг веса тела в
день.
Найдено, что стероид 8 снижает уровень холестерина в сыворотке крови у
интактных крыс-самцов, получавших диету и стероид, по сравнению с группой
животных, получавших гиперхолестеринемическую диету. Наиболее значимым
является тот факт, что у животных, получавших вместе с гиперхолестеринемической диетой стероид 8, не происходило отложений избыточных количеств хо-
55
лестерина в аорте. Повышенное содержание триглицеридов в крови считается
независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, поэтому гипотриглицеридемическое действие стероида 8 также свидетельствует его положительное влиянии на сердечно-сосудистую систему.
Методом определения активности люциферазы в тестах на клеточной линии «MELN» нами было показано, что соединение 8 обладает гормональной активностью в 104 -105 раз более низкой, чем эстрадиол (Рисунок 2.1).
Рисунок 2.1. Определение гормональной активности стероида 8 в тестах на
«MELN» клетках
В тестах на пролиферативную активность на клеточной линии «MCF-7»
показано, что на уровне физиологических концентраций стероид 8 не оказывает
влияния на процесс деления клеток МСF-7 (Рисунок 2.2).
Высокая гиполипидимическая активность наряду с низкой эстрогенной и
пролиферативной активностью демонстрирует перспективность соединения 8
как базового стероида для создания на его основе кардиопротекторных
лекарственных препаратов.
56
Рисунок 2.2. Определение пролиферативной активности стероида 8 в тестах на
клетках «MCF-7»
2.4. Синтез 17аβ-ацетокси-3-метокси-2-фтор-D-гомо-1,3,5(10)эстратриена (10)
Путь синтеза целевого стероида 10 показан на схеме 2.5. Эстрапентаен 41
синтезирован по схеме Торгова-Ананченко в модификации Вендлера. Восстановлением кетогруппы с последующим ацилированием получен ацетат 42. Для
формирования структуры с природным сочленением колец восстановление системы сопряженных двойных связей проводили в два этапа: двойную связь
14(15) восстанавливали каталитическим гидрированием, после чего восстанавливали двойную связь 8(9) ионным гидрированием в системе Et3SiH/CF3COOH.
57
Схема 2.5
Исследование биологических свойств в опытах на крысах показало, что
под действием стероида 10 снижается уровень холестерина в сыворотке крови,
но вместе с этим повышается содержание триглицеридов в крови, что является фактором риска возникновения
сердечно-сосудистых
заболеваний.
Однако при комбинированном действии стероида
10 и урсоловой кислоты (43) нежелательного повышения уровня триглицеридов не происходит, тогда как гипохолестеринемическое действие соединения 10 сохраняется (таб. 2.2). Целесообразность комбинированного использования стероида 10 и урсоловой кислоты (43) обусловлена
также тем, что последняя обладает рядом полезных биологических свойств. Известны её антимикробные, гепатопротекторные, противовоспалительные, антиаллергические, противовирусные, цитотоксические, противоопухолевые свойства [114–117]. Следует также отметить доступность урсоловой кислоты: она
обнаружена более, чем в сотне растений [118–120].
58
Таблица 2.2
Биологические свойства стероида 10
Утеротропная активность
Группа
животных
Интактные
Овариэктомирован
ные
Овариэктомирован
ные, получавшие
ЕЕ
Овариэктомирован
ные, получавшие
препарат 10
Овариэктомирован
ные, получавшие
препарат 10 и урсоловую кислоту
Содержание липидов в
сыворотке крови
Вес матки
(мг)/100 г веса
тела
Содержание
рецепторов
прогестерона,
фмоль/100 мг
белка
Холестерин
, мг/дл
Триглицерид
ы,
мг/дл
163.6±16.9**
62.2±2.6**
47.7±2.5*
58.2±3.6*
35.2±1.9
18.6±1.6
68.8±2.6
49.4±3.9
197.2±8.8**
102.5±10.4**
27.9±2.6**
112.0±15.3**
74.4±3.7**
69.9±3.0**
39.5±3.5**
69.4±3.8*
69.8±3.8**
70.9±4.2**
28.8±4.8**
52.5±4.2
2.5. Синтез 16-метил-2-фтор-13α-эстра-1,3,5(10),8,15-пентаен-17-она
(11)
Реакция 6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона (36) с винилмагнийбромидом в
обычных условиях привела к получению винилкарбинола 44, который без дальнейшей очистки использовали для получения секосоединения 46 конденсацией
с 2,4-диметил-1,3-циклопентандионом (45) (дикетон 45 получен конденсацией
2-метилянтарной кислоты с пропионилхлоридом в присутствии безводного
AlCl3 [121]). Выход на 2 стадии составил 50%.
Ключевая стадия - циклодегидратация секосоединения 46 с образованием
соединения 11. Такое направление реакции, а именно образование не «торговского» эстрапентаена, а его изомера, обусловлено дополнительной стабилизацией двойной связи 15(16) метильной группой при С-16.
Наличие соответствующего кросс-пика на спектре NOESY соединения 11
(Рисунок 2.3) свидетельствует о пространственной близости протона при С-14 и
59
протонами метильной группы в положении 13 и подтверждает цис-сочленение
колец С и D.
Схема 2.6
Рисунок 2.3. Спектр NOESY аналога 11
Исследование биологических свойств в опытах на крысах показало, что
под действием соединения 11 повышается содержание липопротеинов высокой
60
плотности (ЛПВП) в крови. Поскольку под влиянием ЛПВП активируется «обратный транспорт» холестерина из пораженных сосудов, что предотвращает
развитие атеросклероза, этот результат представляет особый интерес.
Мы уже указывали, что под действием типичных эстрогенов повышается
содержание триглицеридов в крови, и это рассматривается как независимый
фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний. У 3-гидрокси-16-метил-2фтор-13-эстра-1,3,5(10),8(9),15-пентаен-17-она (11) этого негативного эффекта
нет (таб. 2.3).
Таблица 2.3
Кардиопротекторные свойства соединения 11
Условия
опыта
Триглицериды
(ммоль/л)
Общий холестерин
(ммоль/л)
Холестерин
ЛПВП
(ммоль/л)
Контроль
0.747±0.035
2.03±0.17
1.41±0.10
Препарат
(2 мг/кг)
0.719±0.037
Р>0.05
2.10±0.13
Р>0.05
1.75±0.09
Р<0.05
Методом определения активности люциферазы в тестах на клеточной линии «MELN» было показано, что соединение 11 не проявляет гормональную активность при концентрации стероида 1-10 nM (Рисунок 2.4.), а при
концентрации 100 nM его гормональная активность сравнима с активностью
17β-эстрадиола в концентрации 1 pM. Важно, что в диапазоне концентраций 1100 nM стероид 11 не влияет на процесс пролиферации клеток MCF-7 (Рисунок
2.5).
Докинг в лиганд-связывающий карман ERα аналога 11 (рис 2.7) указывал
на возможность связывания с рецептором. Методом вестерн-блоттинга мы подтвердили это предположение (Рисунок 2.6).
61
Рисунок 2.4. Определение гормональной активности стероида 11 в тестах на
клетках MELN
Рисунок 2.5. Определение пролиферативной активности стероида 11 в тестах
на клетках MCF-7
Рисунок 2.6. Определение сродства соединения 11 (обозначено как S5) к
рецептору эстрогенов методом вестерн-блоттинга
62
Рисунок 2.7. Результат докинга стероида 11 в лиганд-связывающий карман
ERα (AutoDock)
Таким образом, можно предположить, соединение 11, является частичным
агонистом рецепторов эстрогенов, что проявляется в пониженной гормональной активности.
2.6. Синтез 8α-аналогов стероидных эстрогенов, содержащих фтор в
положении 2 и свободную гидроксильную группу в положении 3
Реакция 6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона (36) с винилмагнийбромидом в
обычных условиях привела к получению винилкарбинола 44, который без дальнейшей очистки использовали для получения секосоединения 48 путем конденсации с 2-этилциклопентан-1,3-дионом в щелочной среде. Выход на 2 стадии
составил 62% (схема 2.7).
Схема 2.7
63
Нами был осуществлен подбор условий циклодегидратации соединения 48
в эстрапентаен 49 (схема 2.8, табл. 2.4).
Схема 2.8
Таблица 2.4
Подбор условий циклодегидратации соединения 48
Условия циклодегидратации соединения 48
TsOН/толуолΔ
HCl/MeOH
65оС
HCl/MeOH
20оС
93
85
57
Выход соединения
49, %
Таким образом, лучшими условиями циклодегидратации секосоединения
48 является использование п-толуолсульфокислоты в толуоле, в данных условиях время реакции составляет 20 мин, за это время не происходит осмоления
реакционной смеси, что мы наблюдали при проведении реакции в других
приведенных условиях.
Принципиальной задачей являлся подбор условий каталитического гидрирования. Традиционно в химии стероидов для увеличения селективности каталитического гидрирования системы сопряжённых связей предварительно восстанавливают кетогруппу в положении 17 с последующим ацетилированием
уксусным ангидридом в пиридине (схема 2.9):
Схема 2.9
С целью сокращения числа стадий синтеза мы исследовали возможность
каталитического гидрирования непосредственно эстрапентаена 49.
64
Основным продуктом гидрирования эстрапентаена 49 в тетрагидрофуране
оказалось производное эквиленина 53. Об ароматизации кольца B свидетельствует наличие сигналов двух ароматических протонов на спектре ЯМР 1H (схема
8.6
8.4
8.2
8.0
7.8
7.6
7.4
7.2
(ppm)
7.0
6.8005
6.7702
0.9697
6.9542
6.9130
1.0000
7.3694
7.3391
7.3077
0.7843
Integral
7.6418
7.5982
7.5703
2.10).
6.8
6.6
6.4
Схема 2.10
Применение в качестве растворителя бензола также не привело к получению целевого продукта: из реакционной смеси было выделено только исходное
соединение 49.
Положительного результата удалось достичь при гидрировании в метаноле (схема 2.10). Целевой 18-метил-2-фтор-8α-эстрон (14) был выделен из
реакционной смеси кристаллизацией из метанола. Небольшой выход продукта
(30%) несколько компенсируется тем, что применявшуюся ранее схему удалось
сократить на 4 стадии.
Аналогично осуществлен полный синтез соединений 15 и 16 (схема 6).
6.2
65
Схема 2.11
Интересно отметить, что гидрирование «торговских» эстрапентаенов 49,
55 и 57 в метаноле проходило аномально быстро, время реакции не превышало
2 ч (мониторинг реакции гидрирования проводился методом ТСХ каждые 10-15
мин).
Строение полученных соединений 14-16 доказывали методами спектроскопии ЯМР 1Н и
13
С. Сигнал 9α- протона находится в области 2.59-2.64 м.д., в
случае его β-ориентации он находился бы в районе 3.0-3.2 м.д.. Полученные
стероиды 14-16 не относятся к природному ряду (8β, 9α, 14α), так как в случае
природного сочленения колец величина ХС протона при С-1 выше на 0.2 м.д.
Также был проведен рентгеноструктурный анализ (РСА) соединения 15
(Рисунок 2.8).
Рис 2.8. Молекулярная структура 2-фтор-8α-эстрона (15) по данным РСА
Стероиды 14-16 обладают значительно большей гормональной активностью, чем соединения 8 и 11. Так, в тестах на клеточной линии «MELN» бы-
66
ло показано, что соединение 15 проявляет гормональную активность во всем
исследованном диапазоне концентраций: 1nM-10μM (Рисунок 2.9), а в
диапазоне концентраций 10nM-1μM усиливает пролиферацию клеток MCF-7
(Рисунок 2.10).
Рисунок 2.9. Определение гормональной активности стероида 15 в тестах на
клетках MELN
Рисунок 2.10. Определение пролиферативной активности стероида 15 в тестах
на клетках MCF-7
67
2.7. Синтез 18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-она (18)
Путь синтеза целевого стероида 18 представлен на схеме 2.12.
Схема 2.12
В качестве исходного соединения использовали стероид 58. Щелочным
гидролизом сложноэфирной связи получили соответствующий спирт, который
окисляли до кетона 60 с помощью DMP (Dess-Martine Periodinane). Необходимость столь избирательного окислительного реагента связана с легкой окисляемостью нафталиного фрагмента при применении в качестве окислителя, например, стандартного реактива Саретта (СrO3/Рy). Использование DMP не только
позволяет избежать применения токсичных реагентов, коими являются
пиридин и соединения хрома, но и приводит к значительному повышению
выхода целевого стероида.
2.8. Синтез сульфаматов аналогов эстрогенов, содержащих фтор в
положении 2
Сульфаматы аналогов стероидных гормонов 19-21 получали по методу
Окада, действуя сульфамоилхлоридом на соответствующие фенолы в N,Nдиметилацетамиде (схема 2.13).
68
Схема 2.13
Получены первые данные исследования сульфаматов 19-21 на клетках рака
молочной железы линии MCF-7. Наиболее интересные свойства у соединения
21: ингибирование пролиферации клеток MCF-7 наблюдается при концентрации 20 мкг/мл, тогда как блокирование роста здоровых клеток (кожные фибробласты человека) происходит при более высокой концентрации субстрата 50
мкг/мл. Очевидно, что применение таких соединений вряд ли перспективно,
хотя исключением может оказаться направленный транспорт в органы-мишени.
2.9. Исследование возможности синтеза целевых соединений
фторированием субстратов со сформированным стероидным скелетом
В литературе описан эффективный метод введения атома фтора в
положение 2 молекулы эстрадиола с помощью фторирующего агента
SelectfluorTM (Схема 2.14) [101].
69
Схема 2.14
Мы попытались воспроизвести данную методику, однако вместо ожидаемого 2-фторэстрадиола (5) был получен продукт фторирования в положение 10
стероидного скелета 64 с выходом 64%, а ожидаемые продукты 5 и 63 получены в виде трудноразделимой смеси с суммарным выходом 6% (схема 2.15).
Схема 2.15
Рисунок 2.11. Фрагмент спектра ЯМР 1Н соединения 64
70
Структура соединения 64 была подтверждена РСА (Рисунок 2.12).
Показано, что атом фтора при С-10 имеет β-ориентацию.
Рисунок 2.12. Молекулярная структура соединения 64
Таким образом, строение продуктов реакции определено автором статьи
ошибочно, получение 2-фтор аналогов эстрогенов данным методом вряд ли
возможно.
2.10. Исследование антиоксидантной активности модифицированных
эстрогенов
Как показано в обзоре литературы, эстрогены являются эффективными антиоксидантами и препятствуют развитию атеросклероза, являющегося одной из
наиболее часто встречающихся причин смертности в Европе и возникающего в
основном в результате окисления липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в
кровеносных сосудах.
При поиске новых антиоксидантов весьма необходимо проведение серийных экспериментов in vitro с целью определения взаимосвязи «структура-активность». Однако для широкого ряда синтетических аналогов эстрогенов исследований подобного рода не проводились, в отличие от природных эстрогенов и
их производных. Важно отметить, что антиоксидантные свойства фторированных аналогов эстрогенов практически не изучены.
71
Мы протестировали группу аналогов эстрогенов с различными модификациями молекулы методом «Lag-time» – методом определения диеновых коньюгатов, образующихся при окислении ЛПНП под действием ионов Cu2+
(Рисунок 2.13). Важно, что метод «Lag time» хорошо воспроизводит среду
живого
организма,
позволяя
проводить
тестирование
при
низких
концентрациях окислителя (1.66 μM) и осуществлять длительный мониторинг
(10 ч) [122].
Рисунок 2.13. Оценка антиоксидантной активности стероида 16 методом
определения лаг-фазы.
Структуры исследованных соединений представлены на схеме 2.16,
сравнение их антиоксидантной активности представлено на рисунке 2.14:
72
Схема 2.16
- соединения с 3-ОН группой
- соединения с 3-OR группой
- 2-F соединения с 3-OH группой
Рисунок 2.14. Антиоксидантная активность исследованных соединений
(активность представлена в виде отношения к соответствующей величине в
контрольном эксперименте).
Оказалось, что целевые соединения, содержащие фтор в положении 2, обладают довольно высокой антиоксидантной активностью, сравнимой с антиоксидантсной активностью 17β-эстрадиола, а эквилениновый аналог 18 продлевает лаг-фазу сильнее, чем 17β-эстрадиол.
73
Полученный набор экспериментальных данных был использован для молекулярного 3D моделирования взаимосвязи «структура-активность». Ниже приводятся основные этапы построения модели (Рисунок 2.15).
1) Построение трехмерных структур аналогов эстрогенов с различными заместителями, сочленениями колец В, С, D и степенями их ненасыщенности
2) Выравнивание структур, минимизация энергии молекул, моделирование
распределения зарядов в молекулах.
3) Построение расчетных моделей HQSAR и COMFA по стерическим и
электростатическим параметрам.
2
1
R1: F, Ac, H; R2: H, CH3, Ac,
R3: O, OAc; R4: H, CH3; R5-9: H,
CH3, X: С, O; n=1, 2;
3
Рисунок
2.15.
Построение
расчетной
модели
для
предсказания
антиоксидантных свойств.
Наряду с хорошей корреляцией расчетных величин с экспериментальными
данными статистические параметры моделей (q2=0.48-0.55) также удовлетворяют критериям достоверности расчетной модели (q2≥0.2). Таким образом, подобные расчеты могут быть использованы на стадии выбора модельных соединений с целью создания антиоксидантов на основе аналогов эстрогенов.
74
Таблица 2.5
Сравнение расчётной антиоксидантной активности с
Расчёт
экспериментальными данными
HQSAR
поляр. Н
111
110
118
147
113
HQSAR
все H
101
119
130
155
116
HQSAR
без H
111
117
127
147
118
COMFA
все H
109
137
139
154
145
COMFA
без H
104
144
146
157
141
115
118
131
152
194
Эксп. данные, %
75
Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Синтез целевых соединений
Все синтезированные соединения (за исключением соединения 64) рацемические.
Полноту протекания реакций и индивидуальность соединений проверяли, используя тонкослойную хроматографию (ТСХ) на пластинах Silufol UV254
фирмы Kavalier и Alugram SIL G/UV254 фирмы Machereynagel в системах растворителей гексан/петролейный эфир 40-70 – этилацетат в различном соотношении. Детектирование проводили в ультрафиолетовом свете (λмах=254 нм), адсорбцией паров йода или при реакции с серной кислотой в метаноле (3:1) при
нагревании.
Для очистки веществ колоночной хроматографией использовали силикагель 60 (0.035 – 0.070 мм; 0.060-0.200 мм) фирмы Acros Organics.
Спектры ЯМР 1H и
13
C снимали в CDCl3 (если не оговорено особо) на
приборе Bruker DPX-300 соответственно на частотах 300.130 и 75.468 МГц для
ядер 1H и
13
C соответственно при 298 К. Для спектров ЯМР 1Н использовали
растворы 10-15 мг вещества в 0.6 мл CDCl3, а для ЯМР 13С - 30-50 мг в том же
объеме. Химические сдвиги измеряли по отношению к тетраметилсилану, присвоив сигналу растворителя (CDCl3/CHCl3=99.9/0.1) значения: 7.26 м.д. (1H) и
77.16 м.д. (13C).
Масс-спектрометрические исследования проведены с использованием
оборудования ресурсного центра СПбГУ "Методы анализа состава вещества "
Рентгеновские исследования проведены в ресурсном центре СПбГУ
«Рентгено-дифракционные методы исследования».
Растворители готовили к работе следующим образом:
Тетрагидрофуран. Наличие перекисей устанавливали по образованию
йода при добавлении пробы ТГФ к раствору иодида калия в смеси уксусная
кислота-вода. Перекиси разрушали добавлением SnCl2•5H2O. Затем растворитель перегоняли над щелочью, дополнительно перегоняли над натрием.
76
Диэтиловый эфир и диоксан обрабатывали аналогично тетрагидрофурану.
Уксусный ангидрид перегоняли над P2O5 (5 г/л).
Хлороформ и хлористый метилен высушивали кипячением с обратным
холодильником 5 ч в присутствии безводного CaCl2 (20 г/л), затем перегоняли.
Этилацетат перегоняли над безводным хлоридом кальция.
Гексан и петролейный эфир (фракция 40-700С) обрабатывали аналогично
этилацетату.
Бензол для удаления воды кипятили с насадкой Дина-Старка 4 ч,
добавляли 1-2 г натрия на литр растворителя, еще раз кипятили с обратным
холодильником и отгоняли при атмосферном давлении.
Ацетон для удаления воды кипятили с обратным холодильником 2 ч в
присутствии P2O5 (10 г/л) и перегоняли при атмосферном давлении.
Уксусную кислоту очищали вымораживанием при +5°С.
Для высушивания растворов использовали прокаленный сульфат натрия и
прокаленный сульфат магния.
6-Гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин (23)
В стальной автоклав ёмкостью 270 мл помещали 150 г (1.04 моль) 2-нафтола (22), 120 мл изопропилового спирта, 10 мл AcOH и 8 г никеля Ренея. Гидрирование вели при температуре 110-1400С и давлении 100-150 атм до полного
прекращения поглощения водорода. Катализатор отфильтровывали, растворители отгоняли на ротационном испарителе, чёрный маслянистый остаток растворяли в 1 л Et2O и экстрагировали 4 л 1.4 М раствора NaOH, водный слой реэкстрагировали Et2O (1 л), подкисляли до рН 1.0, экстрагировали 1 л Et2O.
Эфирную вытяжку промывали водой до нейтральной реакции промывных вод,
сушили над Na2SO4, растворитель отгоняли на ротационном испарителе, остаток кристаллизовали из петролейного эфира.
Получено 89.8 г (58%) 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталина (23), т. пл.
60-62оС (т. пл. 60-62оС [95]).
77
Аналогичным образом получено 710 г продукта 23. Диапазон выходов: 4558%.
5-Бром-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин (25)
К раствору 160 г (1.08 моль) 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталина (23)
в 1 л CCl4 добавляли по каплям при перемешивании и охлаждении в бане со
льдом раствор 60 мл брома (1.16 моль) в 500 мл CCl4. Реакционную смесь выливали в 4 л воды, отделяли органический слой, водный экстрагировали CHCl3.
Органические слои объединяли, промывали водой до нейтральной реакции промывных вод, сушили над Na2SO4, растворитель отгоняли на ротационном испарителе, остаток кристаллизовали из петролейного эфира.
Получали 220.1 г (90%) 5-бром-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафта-лина
(25), т. пл. 53-55оС (т. пл. 52-530С [95]).
Аналогичным образом получали 805 г продукта 25. Диапазон выходов:
76-90%.
5-Бром-6-гидрокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидронафталин (26)
К раствору 80 г (0.35моль) бромпроизводного 25 в 620 мл ледяной AcOH
при перемешивании и охлаждении добавляли по каплям 27 мл HNO3 (d=1.36,
0.35 моль). Перемешивание продолжали 1 ч при комнатной темпера-туре и
оставляли на ночь. Выпавший жёлтый осадок отфильтровывали и сушили.
Получали 49.1 г продукта 26, т. пл. 132-1330С (т. пл. 133оС [95]). Фильтрат
выливали в воду, получая жёлто-коричневую смолу, которую кристаллизовали из этилацетата. Получили еще 6.1 г 5-бром-6-гидрокси-7-нитро1,2,3,4-тетрагидронафталина (т. пл. 131-133оС).
Всего получено 55.2 г продукта 26 (58%).
Аналогичным образом было получено 505 г продукта 26. Диапазон
выходов: 47-58%.
Полученное соединение плавилось без депрессии температуры плавления
в пробе смешения с заведомо известным препаратом.
78
5-Бром-6-метокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидронафталин (27)
75 г (0.28 моль) 5-бром-6-гидрокси-7-нитро-1,2,3,4-тетрагидронафтали-на
(26) растворяли в смеси 20 г гидроксида натрия (0.52 моль), 400 мл дистиллированной воды и 80 мл 1,4-диоксана. К полученному раствору при комнатной температуре и интенсивном перемешивании прикапывали 30 мл (0.32
моль) диметилсульфата. Затем реакционную смесь нагревали до 45оС и прикапывали ещё 30 мл диметилсульфата, поддерживая слабощелочную реакцию
раствора, при необходимости добавляя концентрированный раствор NaOH.
Перемешивание и добавление диметилсульфата продолжали до тех пор, пока
кислотность среды не перестала меняться. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и выливали при перемешивании в 200 мл
25% раствора аммиака и оставляли на ночь. Утром отфильтровывали
выпавший осадок и кристаллизовали из метанола.
Получено 77.3 г продукта 27 (98%), т. пл. 63-64 оС (т. пл. 64 оС [95]).
Аналогичным образом получено 480 г продукта 27. Диапазон выходов:
85-98%.
Полученное соединение плавилось без депрессии температуры плавления
в пробе смешения с заведомо известным препаратом.
7-Амино-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин (28)
В стальной автоклав ёмкостью 270 мл помещали 16.2 г (0.057 моль) тетралина 27, 2.3 г 5% Pd/C, 135 мл тетрагидрофурана и 135 мл метанола. Гидрировали при комнатной температуре и давлении 5-10 атм до прекращения интенсивного поглощения водорода, после чего нагревали до 50оС и продолжали гидрирование при этой температуре и давлении 8-10 атм до полного прекращения
поглощения водорода.
Катализатор отфильтровывали, растворитель отгоняли досуха на ротационном испарителе, оставшуюся кристаллическую соль промывали Et2O, сушили, обрабатывали 5% раствором соды и перекристаллизовывали из MeOH.
Получено 7.8 г (78%) амина 28, т. пл. 84-86оС (т. пл. 86оС [95]).
79
Полученное соединение плавилось без депрессии температуры плавления в пробе смешения с заведомо известным препаратом.
Аналогичным образом получено 189 г продукта 28. Диапазон выходов:
40-78%.
7-Диазоний-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин
тетрафторборат
(29)
21.1 г мелко растертого амина 28 (0.12 моль) переносили в стакан, добавляли 50 мл 6 М (0.27 моль) HCl. Перемешивали до получения однородной массы, которую охлаждали до -5оС. К ней при перемешивании добавляли раствор 9
г (0.13 моль) нитрита натрия в 30 мл дистиллированной воды, следя за тем, чтобы температура реакционной смеси не поднималась выше 0 оС. К полученному
раствору диазониевой соли добавляли раствор 40 г тетрафторбората натрия в 60
мл дистиллированной воды. Перемешивание продолжали 30 мин, осадок отфильтровывали, промывали этанолом, затем абсолютным Et2O, сушили в
эксикаторе над P2O5.
Получено 32.6 г (98%) соли 29, т. пл. 1230С (разл.) (т. пл. 1250С [95]).
Целевое соединение плавилось без депрессии температуры плавления в
пробе смешения с заведомо известным препаратом.
Аналогичным образом получено 192 г соли 29. Диапазон выходов: 9098%.
7-Диазоний-6-метокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин
гексафторфосфат
(29а)
6.53 г амина 28 (0.037 моль) растирали в ступке, переносили в стакан и
заливали 15 мл 6 М (0.087 моль) HCl. Перемешивали до получения однородной массы, которую охлаждали до -5оС, и при перемешивании добавляли раствор 2.8 г (0.04 моль) NaNO2 в 7 мл дистиллированной H2O, следя за тем, чтобы
температура реакционной смеси не поднималась выше 0оС. К полученному раствору диазониевой соли добавляли раствор 7.34 г гексафторфосфата аммония в
80
12 мл дистиллированной воды. Перемешивание продолжали 30 мин, осадок
отфильтровывали, промывали холодной водой, абс. Et2O, MeOH, сушили в
эксикаторе над P2O5. Получали 11.6 г (94 %) соли 29а, т. пл. 137оС.
Полученное соединение плавилось без депрессии температуры плавления
в пробе смешения с заведомо известным препаратом.
Аналогичным образом получено 13.8 г соединения 29а. Диапазон выходов:
90-94%.
6-Метокси-7-фтор-1,2,3,4-тетрагидронафталин (30)
а) В 2-х горлую колбу, снабжённую подводом аргона, магнитной мешалкой и обратным холодильником, помещали 42 г (0.15 моль) соли диазония 29.
Нагревали на масляной бане в токе аргона до температуры 130 оС.
Образовавшееся чёрное масло перемешивали при этой температуре до
прекращения выделения белого дыма. Затем реакционную смесь охлаждали и
растворяли в 1 л Et2O, промывали 0.5 л 25% раствора NaOH, дистиллированной
водой до pH 7, сушили над Na2SO4. Эфир отгоняли на ротационном испарителе,
полученное темно-коричневое масло перегоняли в вакууме.
Получали 10 г (36%) фторида 30 в виде бесцветной жидкости с т. кип. 120130°C (5 мм рт. ст.) (т. кип. 122-125°C (5 мм рт. ст.) [95]).
Аналогичным образом получали 39 г продукта 30. Диапазон выходов: 2836%.
б) В 2-х горлую колбу, снабжённую подводом аргона, магнитной мешалкой и обратным холодильником помещали 25.4 г (0.076 моль) соли диазония
(29а). Нагревали на масляной бане в токе аргона до температуры 130оС. Образовавшееся чёрное масло перемешивали при этой температуре 1.5 ч, реакционную смесь охлаждали и растворяли в Et2O (0.7 л), промывали 25% NaOH (0.5 л),
дистиллированной водой до pH=7, сушили над Na2SO4. Et2O отгоняли на ротационном испарителе, полученное густое оранжевое масло перегоняли в вакууме. Получали 5.6 г (41%) фторида 30 в виде бесцветной жидкости с т. кип.
120-130°C (5 мм рт. ст.).
81
3-(4-Mетокси-3-фтор-бензоил)-пропионовая кислота (32)
К перемешивае-мой смеси 16 г (0.127 моль) 2-фторанизола (31) в 100 мл
1,2-дихлорэтана и 14 г янтарного ангидрида (0.142 моль) порциями добавляли
безводный AlCl3 (42 г, 0.314 моль) при охлаждении так, чтобы температура
смеси не поднималась вы-ше 10оС. Реакционную смесь нагревали на масляной
бане до 65оС, перемеши-вали при этой температуре 20 мин, охлаждали до
комнатной температуры и вы-ливали в смесь 200 г льда и 70 мл 12М HCl.
Полученный осадок отфильтровы-вали и сушили. Перекристаллизацией из
EtOH получали 22.0 г соединения 32 (77%), т. пл. 168оС (т. пл. 168-170оС [110]).
Спектр ЯМР 1Н (СD3OD, , м.д.): 7.86 дд (J=8.5, 1.1 Гц, 1H), 7.72 дт
(J=12.1, 4.3, 1.1 Гц, 1H), 7.20 т (J=8.5 Гц, 1H), 3.97 с (3H), 3.31-3.25 м (2H), 2.712.66 м (2H).
7-Метокси-6-фтор-1-тетралон (33)
22.0 г (0.1 моль) соединения 32 растворяли в смеси 200 мл EtOH, 60 мл
AcOH и 3 мл 10% HClO4, добавляли 3.0 г 10% Pd/C, полученную смесь
помещали в автоклав. Гидрирование проводили 3.5 ч. при комнатной
температуре и давлении 5 атм. Катализатор отфильтровывали, до-бавлением
ацетата натрия, доводили pH фильтрата до 5, растворители отгоняли на
ротационном испарителе. Полученный остаток выливали в воду, экстрагировали смесь этилацетатом, органический слой промывали насыщенным раствором NaCl, сушили над Na2SO4, растворитель удаляли в вакууме. Полученную
маслообразную 4-(4-метокси-3-фтор-фенил)-бутановую кислоту растворяли в
100 мл CF3COOH и 30 мл CH3SO3H. Смесь перемешивали 45 мин при 100оС,
охлаждали до комнатной температуры, выливали в 500 мл смеси льда и воды и
экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу промывали последовательно
водой, насыщенным раствором NaHCO3, насыщенным раствором NaCl, сушили
над MgSO4, растворитель отгоняли на ротационном испарителе. Полученное
82
кристаллическое вещество кристаллизовали из MeOH. Получали 10.0 г (60%)
соединения 33, т. пл. 95оС (т. пл. 93-95оС [110]).
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 7.63 д (J=8.9 Гц, 1H), 7.72 д (J=11.3 Гц,
1H), 3.92 с (3H), 2.90 т (J=6.1 Гц, 2H), 2.64 т (J=6.3 Гц, 2H), 2.1 м (2Н).
Спектр ЯМР
C (СDCl3, , м.д.): 23.4, 29.0, 38.6 (СН2); 56.2 (CH3O-); 111.2,
13
116.0 (С-Н аром.), 129.1, 138.8, 146.7, 153.3, 156.9 (С-аром), 197.0 (С=О).
6-Метокси-7-фтор-1,2,3,4-тетрагидронафталин (30)
К 5.0 г 7-метокси-6-фтор-1-тетралона (33) в 30 мл CF3COOH по каплям
добавляли Et3SiH (0.66 г, 0.9 мл), реакционную смесь перемешивали 2.5 ч
(контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ). После
окончания реакции смесь выливали в 10% NaHCO3 (200 мл), экстрагировали
Et2O и сушили над MgSO4, растворители от-гоняли на ротационном испарителе,
полученное бесцветное масло перегоняли в вакууме. Получали 3.6 г (77%)
фторида 30 в виде бесцветной жидкости с т. кип. 120-130°C (5 мм рт. ст.) (т.
кип. 122-125°C (5 мм. рт. ст.) [95]).
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 6.78 д (J=12.1 Гц, 1H), 6.65 д (J=8.7 Гц,
1H), 3.86 с (3H), 2.70 м (4H), 1.78 м (4H).
6-Метокси-7-фтор-1-тетралон (35)
К охлажденному до -10оС раствору 9.7 г (0.054 моль) соединения 30 в 50
мл ацетона прибавляли, при энергичном перемешивании, по каплям раствор 10
г (0.097 моль) CrO3 в смеси 40 мл дист. воды и 10 мл конц. H2SO4 с такой
скоростью, чтобы температура реакционной смеси не поднималась выше –5оС.
Перемешивание продолжали при этой температуре 4.5 ч, реакционную смесь
оставляли при комнатной температуре на 14 ч. Ацетоновый слой отделяли от
водного, водный слой разбавляли водой до растворения осадка и экстрагировали этилацетатом (450 мл). Объединенный экстракт промывали последовательно водой, 5%-ным раствором соды, насыщенным раствором NaCl и сушили над
83
Na2SO4. Твердый остаток, полученный после удаления растворителей, кристаллизовали из гексана, затем из MeOH.
Получали 4.8 г 6-метокси-7-фтор-1-тетралона (35). Оставшийся маточ-ный
раствор концентрировали, остаток хроматографировали при элюировании
смесью гексан–диэтиловый эфир (5:2) получали 1.5 г исходного соединения 30.
Суммарный выход целевого соединения 35 5.0 г (55% в расчете на вступившее
в реакцию исходное вещество), т. пл. 102-104 оС (т. пл. 104-106 оС [76]).
Полученное соединение плавилось без депрессии температуры плавления в пробе смешения с заведомо известным препаратом.
Аналогичным образом получено 23 г тетралона (35). Диапазон выходов:
41-60%.
6-Гидрокси-7-фтор-1-тетралон (36)
К 4.65 г (0.024 моль) соединения 35 в 170 мл уксусной кислоты добавляли
45 мл 48% HBr и при перемешивании кипятили с обратным холодильником 40
ч. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли
100 мл Et2O, экстрагировали 0.5 л 10% раствора NaOH, водный слой реэкстрагировали 100 мл Et2O. Органический слой сушили над Na2SO4, после отгонки
растворителя на ротационном испарителе получали 0.15 г исходного
соединения 35. Водный слой подкисляли до рН 0, экстрагировали Et2O.
Эфирную вытяжку сушили над Na2SO4, растворитель отгоняли на ротационном
испарителе. Получали 3.95 г (94% в расчете на вступившее в реакцию исходное
вещество) 6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона (36), т. пл. 175-176оС. Аналогичным
образом получен 21 г соединения 36. Диапазон выходов: 80-96%.
Спектр ЯМР 1Н ((CD3)2SO, , м.д.): 1.93-2.01 м (2Н, H3), 2.80 т (2Н, H2,
JHH=5.8 Гц), 3.30-3.50 м (2Н), 6.87 д (1Н, Н5, 4JHF =8.0 Гц), 7.50 д (1Н, Н8, 3JHF
=11.6 Гц), 10.98 уш. с (1H, ОН).
Спектр ЯМР
13
C ((CD3)2SO, , м.д.): 23.8 (CH2), 29.2 (CH2), 38.7 (CH2),
114.1 д (С8, J=17.0 Гц), 117.5, 125.2, 143.40, 150.0 д (С6, J=13.0 Гц), 150.8 д (С7,
J=242.3 Гц), 196.4 (С=О).
84
Масс-спектр, m/z (Iотн, %): 180.1 (83), 152.0 (100), 124 (81), 98 (18), 75.0
(17), 51.0 (16).
16,16-Диметил-2-фтор-D-гомо-8α-эстрон (8)
80 мг (0.23 ммоль) 16,16-диметил-3-метокси-2-фтор-D-гомо-8α-эстра1,3,5(10)-триен-17а-она (7) растворяли в 1.5 мл AcOH, добавляли 0.5 мл HBr,
кипятили с обратным холодильником 15 ч. Контроль за протеканием реакции
проводили методом ТСХ в системе гексан-этилацетат (5:1) с последующим
проявлением в растворе H2SO4 в MeOH при нагревании. По окончании реакции
реакционную смесь выливали в 50 мл воды, экстрагировали этилацетатом (3х25
мл). Органи-ческие фазы объединяли, промывали 5% раствором соды, водой,
насыщенным раствором NaCl, сушили над Na2SO4. Растворитель отгоняли на
ротационном испарителе, полученный твердый остаток кристаллизовали из
MeOH. Получали 50 мг (65%) 16,16-диметил-2-фтор-D-гомо-8α-эстрона (8), т.
пл. 201-203оС. Опыт повторили: из 120 мг соединения (7), получили 103 мг
(90%) 16,16-диметил-2-фтор-D-гомо-8α-эстрона (8).
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 0.94 с (3Н), 1.13 с (6Н), 1.20-1.27 м (1Н),
1.58-2.10 м (10Н), 2.51-2.60 м (3Н), 2.72-2.78 м (1Н), 5.45 уш. с (1Н, ОH), 6.69 д
(1Н, Н4, J=9.4 Гц), 6.82 д (1Н, Н1, J=11.6 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 19.0, 21.7 (CH2), 26.9, 28.5 (CH2), 31.2
(CH2), 33.0 (2 х CH2), 35.5 (C), 39.9 (CH2), 41.0, 41.6, 42.7, 47.3, 51.3 (CH2), 115.6
д (С1, J=17.0 Гц), 117.1, 132.8, 134.4, 141.6 д (С3, J=15.0 Гц), 149.9 д (С2, J=236.4
Гц), 216.0 (С=О).
Масс спектр, m/z (Iотн, %): 330.2 (100), 245.2 (26), 231.2 (40), 217.2 (43),
203.1 (20), 164.1 (40), 151.1 (26), 139.1 (17).
Найдено, %: С 76.00; Н 8.11. С21Н27FО2. Вычислено, %: С 76.33; Н 8.24.
18-Метил-2-фтор-8α-эстрон (14)
а) 80 мг (0.26 ммоль) метилового эфира 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (13)
раст-воряли в 1.5 мл AcOH, добавили 0.5 мл HBr, кипятили с обратным
холодиль-ником 15 ч. Контроль за протеканием реакции проводили методом
85
ТСХ в сис-теме гексан-этилацетат (5:1) с последующим проявлением в
растворе H2SO4 в MeOH при нагревании. По окончании реакции реакционную
смесь выливали в 50 мл воды, экстрагировали этилацетатом (3х25 мл).
Органические фазы объ-единяли, промывали 5% раствором соды, водой,
насыщенным раствором NaCl, сушили над Na2SO4. Растворитель отгоняли на
ротационном испарителе, получая оста-ток в виде масла. Целевое соединение
14 выделить не удалось.
б) 70 мг (0.23 ммоль) метилового эфира 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (13)
рас-творяли в 15 мл дихлорметана, добавили 2 мл BBr3, кипятили с обратным
холо-дильником 2 ч. Контроль за протеканием реакции проводили методом
ТСХ в системе гексан-этилацетат (4:1) с последующим проявлением в растворе
H2SO4 в MeOH при нагревании. По окончании реакции реакционную смесь
выливали в 50 мл воды, экстрагировали хлороформом (3х20 мл). Органические
фазы объ-единяли, промывали 5% раствором соды, водой, насыщенным
раствором NaCl, сушили над Na2SO4. Растворитель отгоняли на ротационном
испарителе, получая остаток в виде масла масла. Целевое соединение 14
выделить не удалось.
в) 70 мг (0.23 ммоль) метилового эфира 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (13)
рас-творили в 2 мл нитробензола и 0.1 мл уксусного ангидрида. Раствор
охладили до 0оС, добавили раствор 240 мг безводного хлорида алюминия в 2 мл
нитро-бензола, перемешивали 30 мин оставили на ночь в холодильнике. Утром
реак-ционную смесь вылили в смесь льда с HClразб. Азеотроп воды с
нитробензолом отогнали на ротационном испарителе, оставшуюся смесь
экстрагировали хло-роформом (3х25 мл), промывали водой, сушили над
Na2SO4. Растворитель отгоняли на ротационном испарителе, получая остаток в
виде масла. Целевое соединение 14 выделить не удалось.
Ацетат 2-(6-метокси-7-фтор-тетралин-1-иден)-этилизотиурония (39)
В 3-х горлую колбу, снабжённую термометром, обратным холодильником
и капельной воронкой, помещали 2.53 г (0.105 моль) магния. При
86
перемешивании добавляли 23 мл абсолютного ТГФ, 1 каплю дибромэтана и
раствор 11.5 мл ви-нилбромида в 18 мл ТГФ с такой скоростью, чтобы
температура реакционной смеси не превышала 38оС. После добавления всего
винилбромида реакционную смесь перемешивали на водяной бане при 35оС 1 ч.
К полученному раствору винилмагнийбромида, охлаждённому до -10оС,
медленно прикапывали раствор 5.0 г (0.025 моль) тетралона 35 в 35 мл ТГФ так,
чтобы температура реакцион-ной смеси не поднималась выше -10оС.
Перемешивание продолжали 3 ч при этой температуре и оставляли на ночь.
Утром реакционную смесь нагревали 1 ч при 40оС, охлаждали до 10оС и
выливали порциями в смесь 250 г льда, 6 г NH4Cl и 50 мл воды. Через 30 мин
водный слой экстрагировали Et2O (450 мл), органический слой промывали 2
раза водой, насыщенным раствором NaCl, сушили над Na2SO4. Растворитель
удаляли на ротационном испарителе при тем-пературе бани не выше 20оС. К
полученному винилкарбинолу добавляли 1.12 г (0.016 моль) мелкорастертой
тиомочевины и 70 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор перемешивали 5 ч,
добавляли 300 мл абсолютного Et2O. Через 1 ч вы-павший белый осадок
отфильтровывали и промывали Et2O. Получали 3.35 г (55%) изотиурониевой
соли 39, т. пл. 136-138оС (т. пл. 137-138оС [95]).
Синтезированное соединение плавилось без депрессии температуры
плавле-ния в пробе смешения с заведомо известным препаратом.
3-Метокси-2-фтор-D-гомо-8,14-секоэстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен-14,17адион (40)
К раствору 1.5 г (4.4 ммоль) изотиурониевой соли (39) в 80 мл смеси вода/этанол (1:1) присыпали при перемешивании 2-метил-1,3-циклогександиона
(0.83 г, 6.7 ммоль), перемешивание продолжали 7 суток. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали холодным раствором H2O/EtOH (1:1). Получали 0.8
г (57%) секосоединения 40, т.пл. 110ºС. Аналогичным образом дополнительно
был получен 1 г соединения 40.
87
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 1.29 с (3Н, СН3), 1.77-1.81 м (2Н), 1.862.02 м (2Н), 2.44 с (2Н), 2.65-2.74 м (8Н), 3.85 с (3Н, -OCH3), 5.53 т (1Н, Н11,
J=7.0 Гц), 6.63 д (1Н, H4, JHF=8.7 Гц), 7.17 д (1H, H1, JHF=13.3 Гц).
Спектр ЯМР 13C (СDCl3, , м.д.): 17.9, 23.5, 26.6, 30.5, 36.1, 38.7 (х2) (СН2);
20.6 (С-11), 56.6 (СН3О); 65.5 (C), 77.5 (С), 111.3, 111.6 (C-Н аром.), 113.6, 116.7
(С-Н аром.), 129.0, 133.8, 136.9, 147.1, 149.8, 153.0 (С); 210.8 (2хС=О).
17аβ-Ацетокси-3-метокси-2-фтор-D-гомо-эстра-1,3,5(10),8,14-пентаен
(42)
Соединение 40 (800 мг, 2.5 ммоль) растворяли в 60 мл толуола, добавляли
мо-ногидрат п-толуолсульфокислоты (50 мг), реакционную смесь кипятили 30
мин, затем охлаждали до комнатной температуры, промывали последовательно
5% раствором NaHCO3, водой, насыщенным раствором NaCl. Толуол отгоняли
на ротационном испарителе, к полученному эстрапентаену 41 добавляли 30 мл
этанола и выдерживали 5 мин на ультразвуковой бане. Полученную смесь охлаждали до -5 оС, добавляли небольшими порциями при перемешивании 0.2 г
боргидрида натрия и оставляли при комнатной температуре на 24 ч. Избыток
восстановителя разлагали, медленно прибавляя при перемешивании уксусную
кислоту, затем отгоняли растворители на ротационном испарителе, остаток
выливали в воду, экстрагировали этилацететом (450 мл), органический слой
промывали последовательно 5% раствором NaHCO3, водой, насыщенным
раствором NaCl. Растворитель удаляли на ротационном испарителе, остаток
растворяли в 5 мл пиридина, добавляли 5 мл уксусного ангидрида,
реакционную смесь оставляли на 24 ч при 40оС. Далее реакционную смесь
выливали в воду, экстрагировали этилацететом (430 мл), органический слой
промывали последовательно 5% раствором NaHCO3, водой, насыщенным
раствором NaCl, сушили над Na2SO4. Растворитель удаляли на ротационном
испарителе. Продукт ацетилирования очищали хроматографией на колонке с
силикагелем,
элюируя
смесью
гексан-диэтиловый
эфир
(3:1).
После
88
кристаллизации из смеси хлороформ-метанол (1:5) получали 640 мг (74%)
ацетата 42, т. пл. 138-140 оС.
Найдено, %: С 74.07; Н 6.88. С22Н25FО3. Вычислено, %: С 74.13; Н 7.07.
17аβ-Ацетокси-3-метокси-2-фтор-D-гомо-эстра-1,3,5(10)-триен (10)
К раствору 0.3 г ацетата 42 в 20 мл ТГФ добавляли 200 мг 10%-ого
Pd/CaCO3, гидрирование проводили при комнатной температуре до поглощения
водорода, необходимого для насыщения одной двойной связи. Катализатор отфильтровывали и промывали метанолом, растворы объединяли, растворители
удаляли на ротационном испарителе. К полученному остатку добавляли 0.3 мл
триэтилсилана, 7.5 мл безводного хлористого метилена и затем при 0 оС при
перемешивании – 2.5 мл трифторуксусной кислоты. Смесь оставляли при
комнатной температуре на 4 суток, а затем выливали в лед. Продукты реакции
экстрагировали эфиром (3х50 мл), объединенные органические слои промывали
последовательно 5% раствором NaHCO3, несколько раз водой, насыщенным
раствором NaCl, сушили над Na2SO4. Растворитель удаляли на ротационном
испарителе, остаток кристаллизовали из смеси метанол-хлороформ (10:1).
Выход целевого стероида 10 составил 160 мг (53%), т. пл. 164-166оС, после
дополнительной очистки методом ВЭЖХ т. пл. 168-169 оС.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 0.92 с (3Н, С18Н3), 2.02 с (3Н, CH3C=O),
3.82 с (3Н, СН3О), 4.54 дд (1Н, С17аН, J=4.6, 11.4 Гц), 6.63 д (1Н, С4Н, 4JHF=8.6
Гц), 6.96 д (1Н, С1Н, 3JHF=13.2 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 11.7 (С18), 21.1 (СН3СО), 22.9 (С16), 23.9
(С15), 25.9 (С17), 26.4 (С7 или С11), 26.6 (С7 или С11), 29.5 (С6), 36.9 (С12), 38.1 (С8
и С13), 43.2 (С9), 48.7 (С14), 56.3 (СН3О), 81.3 (С17а), 112.9 д (С1, 2JCF 17.5 Гц),
113.5 (С4), 133.4 (С5), 142.5 (С3, 2JCF =11.0 Гц), 150.8 д (С2, 1JCF =240 Гц), 170.9
(СН3СО).
Найдено, %: С 73.04; Н 8.22. С22Н29FO3. Вычислено, %: С 73.31; Н 8.11.
2,4-Диметилциклопентан-1,3-дион (45)
89
К 30 мл нитробензола при перемешивании порциями добавляли 30 г
безводного
AlCl3. Затем небольшими порциями добавляли 10 г 2-метил-янтарной
кислоты так, чтобы температура реакционной смеси не поднималась выше
400С. Затем добавляли 20 мл пропионилхлорида и перемешивали реакционную
смесь 3 ч при 80оС. Затем реакционную смесь выливали в 220 г мелкорасколотого льда и оставляли на ночь в холодильнике. Утром осадок
отфильтровывали, промывали 10%-ным водным раствором NaCl, затем
бензолом. Фильтрат экстрагировали этилацетатом (3х50 мл). Объединенные
органические фазы сушили над Na2SO4. Растворитель удаляли на ротационном
испарителе, получали твердый остаток целевого продукта. Суммарно получали
3.4 г 2,4-диметилциклопентан-1,3-диона (36%) (45), т.пл. 129-132 оС. Спектр
ЯМР 1Н (СDCl3, δ, м.д.): 1.27 д (3Н, J=7.2 Гц, СН3 при С5); 1.68 c (1Н, СН3 при С2);
2.19 д (1Н, J=18 Гц, С5Н); 2.77 м (2Н, С4 -Н); в обл. 9 у.с. (1Н, С3 -ОН).
16-Метил-2-фтор-8,14-секоэстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен-14,17-дион (46)
К винилкарбинолу 44 (синтез соединения 44 описан в методике получе-ния
соединения 48) добавляли 1.5 г (0.012 моль) 2,4-диметил-1,3-циклопентандиона (45), 170 мг КОН, 45 мл МеОН, кипятили с обратным холодильником 4 ч.
Растворитель удаляли на ротационном испарителе, полученную смесь выливали в 100 мл дистиллированной воды, подкисляли 2% раствором Н2SO4 до слабокислой среды, экстрагировали эфиром (3х50 мл). Объединенные органические фазы промывали 2 раза водой, насыщенным раствором соды, сушили над
Na2SO4. Растворитель отгоняли на ротационном испарителе, остаток кристаллизовали из смеси этилацетат/петролейный эфир (1:4). Получали 1.1 г (50% в
расчете на 2 стадии) секосоединения 46, т.пл. 173-175оС.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 1.18-1.29 м (7Н), 1.70-1.79 м (2Н), 2.202.30 м (1Н), 2.33-2.67 м (5Н), 2.82-2.91 м (1Н), 2.97-3.08 м (1Н), 5.56 т (1Н, H11,
J=8.0 Гц), 6.11 уш. с (1Н, OH), 6.70 д (1Н, H4, 4JHF=9.5 Гц), 7.17 д (1Н, H1,
3
JHF=12.4 Гц).
90
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 15. 5, 20.8, 23.5 (СН2), 26.5 (СН2), 30.2
(СН2), 34.6, 41.6, 45.1 (СН2), 57.5, 110.7 д (С1, J=18.4 Гц), 116.0, 117.4, 128.7 д
(С10, J=5.4 Гц), 134.8, 137.5, 143.2 д (С3, J=15.1 Гц), 150.2 д (С2, J=234.8 Гц),
217.3 (С=О), 219.8 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н22FО3 (М+Н)+: 317.1548; найдено:
317.1569.
Найдено, %: С 70.63; Н 6.61. С19Н21FО3 х1/3H2O. Вычислено, %: С 70.79; Н
6.77.
16-Метил-2-фтор-13α-эстра-1,3,5(10),8,15-пентаен-17-он (11)
220 мг (0.67 ммоль) секосоединения 46 растворяли в 20 мл толуола,
добавляли 20 мг моногидрата п-толуолсульфокислоты. Реакционную смесь
кипятили с об-ратным холодильником 4 ч, оставляли на ночь при комнатной
температуре. Контроль за протеканием реакции проводили методом ТСХ в
системе гексан-этилацетат (2:1). Утром реакционную смесь промывали 5%
раствором соды, водой, насыщенным раствором NaCl. Толуол отгоняли на
ротационном испарителе. Получали 176 мг (85%) эстрапентаена 11, т. пл. 170172оС.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 1.20 c (3H, H18), 1.18-1.32 м (1Н), 1.56-1.66
м (1H), 1.80 c (3H), 1.88-1.97 м (1Н), 2.01-2.11 м (1Н), 2.18-2.31 м (1Н), 2.37-2.50
м (1 Н), 2.66-2.80 м (2H), 3.04 c (1H, H14), 5.69 уш. с (1H, OH), 6.80 д (1H, H4,
JHF=8.7 Гц), 6.87 д (1H, H1, JHF=12.3 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 10.8, 22.8 (СН2), 23.3, 27.91 (СН2), 28.1
(СН2), 30.1 (СН2), 32.0 (СН2), 47.5, 53.8, 110.3 д (С1, J=19.1 Гц), 116.6, 128.7,
129.3 д (С10, J=5.3 Гц), 131.0, 131.9, 138.76, 142.0 д (С3, J=13.7 Гц), 150.2 д (С2,
J=234.1 Гц), 214.8 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н20FО2 (М+Н)+: 299.1442; найдено:
299.1456.
91
3-Гидрокси-18-метил-2-фтор-8,14-секо-эстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен14,17-дион (48)
В
трёхгорлую
колбу
объемом
250
мл,
снабженную
обратным
холодильником, капельной воронкой и термометром, помещали 4.2 г Mg, 40 мл
абс. ТГФ, 2 кап-ли 1,2-дибромэтана и медленно прикапывали раствор 18 мл
винилбромида в 30 мл ТГФ так, чтобы температура не поднималась выше 38 оС.
Далее
раствор
пе-ремешивали
1
ч
35-38оС.
при
винилмагнийбромиду, охлажден-ному до -14
о
К
полученному
С, медленно прикапывали
раствор 4.0 г (0.022 моль) 6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона (36) в 30 мл ТГФ так,
чтобы температура не поднималась вы-ше -10 оС. Затем перемешивали еще 2 ч
при этой температуре и оставляли на ночь.
На следующий день перемешивали реакционную смесь 1 ч при 40 оС ,
выливали в смесь 0.5 кг льда, 10 г NH4Cl, 100 мл Н2О, экстрагировали эфиром.
Эфирную вытяжку промывали дважды водой, сушили Na2SO4, растворитель
отгоняли на ротационном испарителе при температуре бани не выше 25 оС. К
полученному винилкарбинолу 44 добавляли 4.15 г (0.033 моль) 2-этил-1,3циклопентандиона, 530 мг КОН, 130 мл МеОН, кипятили с обратным
холодильником 4 ч. Раство-ритель удаляли на ротационном испарителе,
полученную смесь выливали в 100 мл дистиллированной воды, подкисляли 2%
раствором Н2SO4 до слабокислой сре-ды, экстрагировали эфиром (3х50 мл).
Объединенные органические фазы промывали 2 раза водой, насыщенным
раствором соды. Водные фракции объединяли, подкисляли до pH 0,
экстрагировали диэтиловым эфиром, сушили над Na2SO4, растворитель удаляли
на ротационном испарителе, получали 530 мг исходного тетралона 36.
Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, растворитель отгоняли
на
ротационном
испарителе,
остаток
кристаллизовали
из
смеси
этилацетат/петролейный эфир. Получали 3.98 г (62% в расчете на вступившее в
реакцию исходное вещество) секосоединения 48, т. пл. 145-146 оС.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 0.81 т (3Н, H18а, J=8.0 Гц), 1.71-1.81 м (4Н),
2.41 т (2Н, H8, J=5.8 Гц), 2.57 д (2Н, H12, J=8.0 Гц), 2.64-2.70 м (6Н), 5.58 т (1Н,
92
H11, J=8.0 Гц), 6.23 д (1H, OH, J=14.5 Гц), 6.71 д (1Н, H4, 4JHF=9.4 Гц), 7.19 д (1Н,
H1, 3JHF=13.1 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 9.6, 23.5 (СН2), 26.5 (СН2), 28.8 (СН2),
30.1 (СН2), 34.4 (СН2), 37.0 (2хСН2), 62.6, 110.8 д (С1, J=17.0 Гц), 115.3, 117.4,
128.7 д (С10, J= 5.0 Гц), 134.9, 137.7, 143.3 д (С3, J=15.0 Гц), 150.2 д (С2, J=235.0
Гц), 215.8 (2хС=О).
Масс спектр, m/z (Iотн, %): 190.1 (100), 175.1 (88), 162.0 (27), 146.0 (24),
133.0 (21), 115.1 (28).
Найдено, %: С 72.18; Н 6.80. С19Н21FО3. Вычислено, %: С 72.13; Н 6.69.
3-Гидрокси-18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),8,14-пентаен-17-он (49)
а) 800 мг (0.0025 моль) секосоединения 48 растворяли в 60 мл толуола,
добавляли 65 мг моногидрата п-толуолсульфокислоты. Кипятили 20 мин, затем
реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, промывали 5% раствором соды, водой, насыщенным раствором NaCl. Толуол отгоняли на
ротационном испарителе. Получали 700 мг (93%) эстрапентаена 49, т. пл. 125126 оС.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 0.86 т (3H, H18а, J=7.3 Гц), 1.54-1.72 м (4H,
H12,18), 2.15-2.20 м (1H), 2.31-2.37 м (1H), 2.52-2.78 м (5H), 2.96 д (1H, H16,
J=23.0 Гц ), 3.18 д (1H, H16, J=23.0 Гц ), 5.63 уш. с (1H, OH), 5.98 с (1H, H15),
6.82 д (1H, H4, JHF=8.7 Гц), 7.02 д (1H, H1, JHF=12.4 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 8.7, 23.3 (СН2), 23.4 (СН2), 26.1 (СН2),
26.9 (СН2), 27.9 (СН2), 44.1 (СН2), 53.4, 110.8 д (С1, J=20.0 Гц), 116.7, 116.9,
126.9, 129.2 д (С10, J=5.9 Гц), 129.4, 133.4, 142.4 д (С3, J=13.9 Гц), 146.1, 150.1 д
(С2, J=233.4 Гц), 216.3 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н20FО2 (М+Н)+: 299.1442; найдено:
299.1439.
Найдено, %: С 76.01; Н 6.64. С19Н19FО2. Вычислено, %: С 76.49; Н 6.42.
б) 200 мг (0.63 ммоль) секосоединения 48 растворяли в 4 мл метанола, добавляли 1 мл HCl, смесь кипятили 1 ч на водяной бане. Затем реакционную
93
смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду и экстрагировали CHCl3 (3х30 мл). Органические слои промывали водой, сушили над Na2SO4.
Растворитель отгоняли на ротационном испарителе. Получили 160 мг (85%)
эстрапентаена 49, т. пл. 123-125оС.
в) 200 мг (0.63 ммоль) секосоединения 48 растворяли в 4 мл метанола,
добав-ляли 1 мл соляной кислоты и перемешивали при комнатной температуре
трое суток. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры,
выли-вали в воду и экстрагировали CHCl3 (3х30 мл). Органические слои
промывали водой, сушили над Na2SO4. Растворитель отгоняли на ротационном
испарителе. Получали 105 мг (57%) эстрапентаена 49. Т. пл. 121-123оС.
18-Метил-2-фтор-8α-эстрон (14)
340 мг (1.14 ммоль) эстрапентаена 49 растворяли в 20 мл абсолютного
метано-ла, добавляли 120 мг 10% Pd/C. Через раствор пропускали водород в
течение двух часов. Контроль за протеканием реакции проводили методом ТСХ
в сис-теме гексан-этилацетат (2:1) с последующим проявлением в растворе
H2SO4 в MeOH при нагревании. По окончании реакции катализатор
отфильтровывали, промывали CHCl3. Растворители отгоняли на ротационном
испарителе, полученный твердый остаток кристаллизовали из метанола.
Получали 105 мг (30%) 18-метил-2-фтор-8α-эстрона 14, т. пл. 205-206оС.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 0.76 т (3Н, H18а, J=7.3 Гц), 1.24-1.32 м (1Н),
1.20-2.25 м (13Н), 2.41-2.46 м (1Н), 2.59-2.64 м (2Н), 2.72-2.77 м (1H), 5.69 уш. с
(1Н, OH), 6.70 д (1Н, H4, 4JHF=9.4 Гц), 6.84 д (1Н, H1, 3JHF=9.6 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 9.2, 20.3 (СН2), 21.2 (СН2), 22.7 (СН2),
28.6 (2 х СН2), 31.0 (СН2), 36.1 (СН2), 39.0, 41.7, 49.7, 51.3, 115.9 д (С1, J=16.9
Гц), 117.2 (С4), 133.1 (С5), 133.8 д (С10, J=5.0 Гц), 141.8 д (С3, J=14.0 Гц), 149.9 д
(С2, J=236.3 Гц), 219.0 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н24FО2 (М+Н)+: 303.1755; найдено:
303.1755.
94
Найдено, %: С 74.04; Н 8.02. С19Н23FО2*1/3H2O. Вычислено, %: С 74.00; Н
7.74.
3-Гидрокси-2-фтор-8,14-секо-эстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен-14,17-дион
(54)
К полученному по
вышеописанной
методике
винилкарбинолу
44
добавляли 2.74 г (0.024 моль) 2-метил-1,3-циклопентандиона, 340 мг КОН, 90
мл МеОН, смесь кипятили с обратным холодильником 4 ч. Растворитель
удаляли на ротационном испарителе, полученную смесь выливали в 200 мл
дист. H2O, подкисляли 2% раствором Н2SO4 до слабокислой среды,
экстрагировали Et2O (3х50 мл). Объединенные органические фазы промывали 2
раза водой, насы-щенным раствором соды, сушили над Na2SO4. Растворитель
отгоняли на ротацион-ном испарителе, остаток кристаллизовали из смеси
этилацетат/петролейный эфир (1:5). Получали 1.52 г (40% в расчете на 2
стадии) секосоединения 54, т. пл. 150-152 оС.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 1.19 c (3Н, H18), 1.71-1.79 м (2Н), 2.41 т
(2Н, H8, J=5.8 Гц), 2.57 д (2Н, H12, J=8.0 Гц), 2.64-2.77 м (6Н), 5.60 т (1Н, H11,
J=8.0 Гц), 6.18 уш. с (1Н, OH), 6.70 д (1Н, H4, 4JHF=9.5 Гц), 7.20 д (1Н, H1,
3
JHF=12.4 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 19.5, 23.5 (СН2), 26.5 (СН2), 30.1 (СН2),
35.2 (СН2), 36.0 (2 х СН2), 57.6, 110.9 д (С1, J=18.4 Гц), 115.2, 117.4, 128.6 д (С10,
J=5.4 Гц), 134.9, 137.9, 143.3 д (С3, J=15.1 Гц), 150.2 д (С2, J=235.9 Гц), 217.8 (2 х
С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С18Н20FО3 (М+Н)+: 303.1391; найдено:
303.1431.
Найдено, %: С 71.67; Н 6.38. С18Н19FО3. Вычислено, %: С 71.51; Н 6.33.
3-Гидрокси-2-фтор-эстра-1,3,5(10),8,14-пентаен-17-он (55)
400 мг (0.0013 моль) секосоединения 54 растворяли в 30 мл толуола, добавляли 35 мг моногидрата п-толуолсульфокислоты. Кипятили 20 мин, реакци-
95
онную смесь охлаждали до комнатной температуры, промывали 5% раствором
соды, водой, насыщенным раствором NaCl. Толуол отгоняли на ротационном
испарителе. Получено 370 мг (98%) эстрапентаена 55, т. пл. 217-218оС. Опыт
повторили: из 600 мг соединения 54, получили 530 мг (96%) эстрапентаена 55.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 1.16 c (3H, H18), 1.56-1.66 м (1H), 2.03-2.90
м (1H), 2.28-2.38 м (1H), 2.53-2.79 м (5H), 2.97 д (1H, H16, J=23.3 Гц ), 3.35 д (1H,
H16, J=23.3 Гц ), 5.47 уш.с (1H, OH), 5.91 уш. с (1H, H15), 6.83 д (1H, H4, JHF=8.8
Гц), 7.04 д (1H, H1, JHF=12.4 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 21.0, 23.2 (СН2), 23.4 (СН2), 27.6 (СН2),
27.9 (СН2), 42.4 (СН2), 49.5, 110.9 д (С1, J=19.5 Гц), 115.9, 116.7, 126.7, 128.6,
129.3 д (С10, J= 5.4 Гц), 133.5, 142.4 д (С3, J=15.1 Гц), 147.0, 150.1 д (С2, J=234.8
Гц), 220.7 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С18Н18FО2 (М+Н)+: 285.1286; найдено:
285.1279.
Найдено, %: С 75.65; Н 6.02. С18Н17FО2. Вычислено, %: С 76.04; Н 6.02.
2-Фтор-8α-эстрон (15)
300 мг (1.06 ммоль) эстрапентаена 55 растворяли в 20 мл абсолютного
метано-ла, добавляли 100 мг 10% Pd/C. Через раствор пропускали водород в
течение 2 ч. Контроль за протеканием реакции проводили методом ТСХ в
системе гексан-этилацетат (2:1) с последующим проявлением в растворе H2SO4
в
MeOH
при
на-гревании.
По
окончании
реакции
катализатор
отфильтровывали, промывали CHCl3. Растворители отгоняли на ротационном
испарителе, полученный твердый остаток кристаллизовали из MeOH.
Выход 2-фтор-8α-эстрона 15 95 мг (31%), т. пл. 220-222оС. Опыт
повторили: из 400 мг эстрапентаена 55 получили 110 мг (27%) 2-фтор-8αэстрона 15.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, , м.д.): 1.02 с (3Н, H18), 1.22-1.30 м (1Н), 1.39-1.49
м (1H), 1.60-1.70 м (3Н), 1.79-1.93 м (5Н), 1.97-2.07 м (1Н), 2.14-2.26 м (2Н),
96
2.45-2.55 м (1Н), 2.59-2.68 м (1Н), 2.73-2.82 м (1H), 5.06 уш. с (1Н, OH), 6.71 д
(1Н, H4, 4JHF=8.7 Гц), 6.85 д (1Н, H1, 3JHF=12.4 Гц).
Спектр ЯМР
13
C (СDCl3, , м.д.): 16.7, 21.8 (СН2), 21.9 (СН2), 28.8 (СН2),
30.9 (СН2), 32.8 (СН2), 36.1 (СН2), 38.8, 41.2, 47.3, 48.6, 116.6 д (С1, J=17.3 Гц),
117.9 (С4), 132.9, 133.3 д (С10, J= 5.3 Гц), 143.2 д (С3, J=12.6 Гц), 150.2 д (С2,
J=239.1 Гц), 220.4 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С18Н22FО2 (М+Н)+: 289.1598; найдено:
289.1602.
Найдено, %: С 74.85; Н 7.29. С18Н21FО2. Вычислено, %: С 74.97; Н 7.34.
3-Гидрокси-2-фтор-D-гомо-8,14-секоэстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен14,17а-дион (56)
К полученному по
вышеописанной
методике
винилкарбинолу
44
добавляли 2.37 г (0.019 моль) 2-метил-1,3-циклогександиона, 270 мг КОН, 70
мл МеОН, кипятили с обратным холодильником 4 ч. Раствор концентрировали,
остаток выливали в 100 мл дистиллированной воды, подкисляли 2% раствором
Н2SO4 до слабокислой среды, экстрагировали эфиром (3х50 мл). Объединенные
орга-нические фазы промывали 2 раза водой, насыщенным раствором соды,
сушили над Na2SO4. Растворитель отгоняли на ротационном испарителе,
остаток кристалли-зовали из смеси этилацетат/петролейный эфир (1:4).
Получали 1.0 г (40% в расчете на 2 стадии) секосоединения 56, т.пл. 173-175оС.
Спектр ЯМР 1Н ((CD3)2SO, , м.д.): 1.13 c (3Н, H18), 1.65-1.98 м (6Н), 2.272.39 м (3Н), 2.42-2.62 м (3Н), 2.75-2.83 м (2Н), 5.40-5.53 м (1Н), 6.63 д (1Н, H4,
4
JHF=9.5 Гц), 7.18 д (1Н, H1, 3JHF=13.1 Гц), 9.82 c (1Н, OH).
Спектр ЯМР
13
C ((CD3)2SO, , м.д.): 18.1 (СН2), 19.3, 23.6 (СН2), 26.6 (СН2),
30.0 (СН2), 36.0 (СН2), 38.3 (2хСН2), 65.8, 111.5 д (С1, J=18.0 Гц), 116.8, 118.0,
127.7 д (С10, J=5.3 Гц), 134.2, 136.4, 144.7 д (С3, J=12.7 Гц), 150.7 д (С2, J=238.4
Гц), 210.9 (2хС=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н22FО3 (М+Н)+: 317.1548; найдено:
317.1544.
97
Найдено, %: С 72.08; Н 6.67. С19Н21FО3. Вычислено, %: С 72.13; Н 6.69.
3-Гидрокси-2-фтор-D-гомо-эстра-1,3,5(10),8,14-пентаен-17а-он (57)
500 мг (1.58 ммоль) секосоединения 56 растворяли в 40 мл толуола, добавляли 40 мг моногидрата п-толуолсульфокислоты. Кипятили 20 мин, после
чего реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, промывали 5%
раствором соды, водой, насыщенным раствором NaCl. Толуол отгоняли на
ротационном испарителе. Получено 460 мг (98%) эстрапентаена 57. Т. пл. 200202оС. Опыт повторили: из 430 мг соединения 56, получили 370 мг (91%)
эстрапентаена 57.
Спектр ЯМР 1Н ((CD3)2SO, , м.д.): 1.11 c (3H, H18), 1.41-1.54 м (1H), 1.912.25 м (4H), 2.39-2.77 м (7Н), 6.06 уш. с (1H, H15), 6.74 д (1H, H4, JHF=8.7 Гц),
7.06 д (1H, H1, JHF=13.1 Гц), 9.83 уш. с (1H, OH).
Спектр ЯМР
13
C ((CD3)2SO, , м.д.): 22.5 (СН2), 22.6, 24.1 (СН2), 24.5 (СН2),
28.0 (СН2), 29.5 (СН2), 35.6 (СН2), 39.5, 45.6, 111.7 д (С1, J=19.1 Гц), 117.2, 120.7,
128.1, 128.3 д (С10, J= 6.3 Гц), 132.8, 140.6, 144.0 д (С3, J=12.7 Гц), 150.5 д (С2,
J=236.3 Гц), 215.3 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н20FО2 (М+Н)+: 299.1442; найдено:
299.1444.
Найдено, %: С 76.01; Н 6.66. С19Н19FО2. Вычислено, %: С 75.98; Н 7.05.
2-Фтор-D-гомо-8α-эстрон (16)
350 мг (1.17 ммоль) эстрапентаена 57 растворяли в 20 мл абсолютного метанола, добавляли 100 мг 10% Pd/C. Через раствор пропускали водород в течение 2 ч. Контроль за протеканием реакции проводили методом ТСХ в системе
гексан-этилацетат (2:1) с последующим проявлением в растворе H2SO4 в MeOH
при нагревании. По окончании реакции катализатор отфильтровывали, промывали CHCl3. Растворители удаляли на ротационном испарителе, твердый
остаток кристаллизовали из метанола.
Получено 105 мг (30%) 2-фтор-D-гомо-8α-эстрона (16), т. пл. 218-220оС.
98
Спектр ЯМР 1Н ((CD3)2SO, , м.д.): 1.06 с (3Н, H18), 1.31-1.41 м (1Н), 1.462.08 м (14Н), 2.58-2.68 м (2Н), 6.57 д (1Н, H4, 4JHF=8.8 Гц), 6.84 д (1Н, H1,
3
JHF=12.4 Гц), 9.46 с (1Н, OH).
Спектр ЯМР 13C ((CD3)2SO, , м.д.): 19.3, 21.8 (CH2), 25.9 (CH2), 26.8 (CH2),
28.4 (CH2), 31.1 (CH2), 33.7 (CH2), 38.2 (CH2), 39.5, 40.2, 48.0, 48.2, 116.42 д (С1,
J=17.0 Гц), 117.8, 132.6, 133.3 д (С4, J=5.3 Гц), 143.2 д (С3, J=12.7 Гц), 150.3 д
(С2, J=238.4 Гц), 215.2 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н24FО2 (М+Н)+: 303.1755; найдено:
303.1758.
Найдено, %: С 75.41; Н 7.56. С19Н23FО2. Вычислено, %: С 75.45; Н 7.67.
18-Метил-3-метокси-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-ол (59)
К 262 мг (0.736 ммоль) ацетата 18-метил-3-метокси-2-фтор-эстра1,3,5(10),6,8(9)-пентаена-17-ола (58) добавляли 300 мг NaOH в 9 мл MeOH и
10 мл бензола. Реакционную смесь кипятили 2 ч, охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду. Избыток щелочи нейтрализовали уксусной кислотой, смесь экстрагировали этилацетатом (3х50 мл). Объединенный органический слой промывали последовательно водой (2х50 мл), сушили над Na2SO4,
растворитель отгоняли в вакууме. Получали 219.5 мг (95%) 18-метил-3-метокси-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-ола (59), который без дополнительной очистки использовали в дальнейших реакциях.
3-Гидрокси-18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-он (18)
К раствору 219.5 мг (0.7 ммоль) соединения 59 в 2 мл хлористого метилена добавляли 290 мг DMP, реакционную смесь перемешивали при комнатной
температуре 2 ч, выливали в воду, экстрагировали этилацетатом (3х50 мл), последовательно промывали водой (2х50 мл), насыщенным раствором NaCl (2х50
мл), сушили над Na2SO4. Растворители удаляли в вакууме, хроматографировали на колонке с силикагелем, элюировали смесью петролейный эфирэтилацетат 8:1. Полученные 120 мг (55%) 18-метил-3-метокси-2-фтор-эстра-
99
1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-она (60) растворяли в 1 мл HBr и 3 мл AcOH, реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 6 ч, выливали в воду, экстрагировали этилацетатом (3х20 мл). Объединенный органический слой промывали последовательно 5% раствором Na2CO3 (3х20 мл), водой (2х30 мл), насыщенным раствором NaCl (1х30 мл), сушили над Na2SO4, растворитель
удаляли в вакууме. Перекристаллизацией из метанола получали 60 мг (52%)
соединения 18, т. пл. 220оС.
Спектр ЯМР 1Н ((CD3)2SO, δ, м.д.): 0.73 т (3Н, J= 6.9 Гц, С18-СН3), 1.04-1.10
м (1Н), 1.22-1.27 м (1Н), 1.60-1.68 м (1Н), 1.92-1.98 м (1Н), 2.19-2.33 м (2Н),
2.40-2.67 (2Н), 2.93-3.02 м (1Н), 3.11-3.23 м (2Н), 7.19 д (1Н, J=8.1 Гц), 7.28 д
(1Н, J= 9.2 Гц), 7.57-7.63 м (2Н), 10.19 с (1Н, -ОН).
Спектр ЯМР
13
С ((CD3)2SO, δ, м.д): 8.0, 17.3, 21.3, 23.9, 25.0, 36.6, 47.1,
50.3, 108.7 д (J=18.5 Гц), 113.1, 123.9, 125.0, 126.4 д (J=7.7 Гц), 130.3, 130.8 д (J=
5.4 Гц), 133.0, 144.5 д (С3, J= 14.6 Гц), 152.3 д (С2, J= 245.8 Гц), 218.1 (С=О).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н19FО2 (М+Н)+: 299.1442; найдено:
299.1440.
Сульфамат 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (19)
К 100 мг (0.33 ммоль) 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (14) добавляли 80 мг
(6.72 ммоль) сульфамоилхлорида в 1.0 мл диметилацетамида. Реакционную
смесь перемешивали при комнатной температуре (протекание реакции контролровали методом ТСХ), выливали в воду, экстрагировали этилацетатом (3х20
мл), объединенный органический слой промывали последовательно водой
(2х15 мл), насыщенным раствором NaCl (1х15 мл), сушили над Na2SO4,
растворитель отгоняли на ротационном испарителе. Перекристаллизацией из
метанола получали 69 мг (55%) соединения 19, т. пл. 185-187оС.
Спектр ЯМР 1Н ((CD3)2SO, δ, м.д.): 0.64 т (3Н, J= 7.3 Гц, С18-СН3), 1.10-1.25
м (2Н), 1.45-1.95 м (9Н), 1.96-2.15 м (3Н), 2.30-2.40 м (1Н), 2.55-2.85 м (3Н),
7.11 д (1Н, J= 8.0 Гц), 7.21 д (1Н, J= 11.6 Гц), 8.16 с (2Н, -NH2).
100
Сульфамат 2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (20)
К 50 мг (0.17 ммоль) 3-гидрокси-2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен17а-она (16) добавляли 40 мг (3.36 ммоль) сульфамоилхлорида в 1.0 мл диметилацетамида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре
(протекание реакции контролировали методом ТСХ), выливали в воду, экстрагировали этилацетатом (3х10 мл), объединенный органический слой промывали
последовательно водой (2х15 мл), насыщенным раствором NaCl (1х15 мл), сушили над Na2SO4, растворитель отгоняли на ротационном испарителе. Перекристаллизацией из метанола получали 52 мг (80%) соединения 20, т. пл. 221222 оС.
Спектр ЯМР 1Н ((CD3)2SO, δ, м.д.): 0.99 с (3Н), 1.01-1.07 м (1Н), 1.43-1.69
м (3Н), 1.84-2.43 м (11Н), 2.53-2.83 м (1Н), 2.75-2.77 м (3Н), 6.68 д (1Н, J= 8.9
Гц), 6.92 д (1Н, J= 13.0 Гц), 9.66 с (2Н, -NH2).
Сульфамат 18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-она (21)
К 50 мг (0.17 ммоль) 3-гидрокси-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17она (18) добавляли 40 мг (3.36 ммоль) сульфамоилхлорида в 1.0 мл диметилацетамида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре
(протекание реакции контролировали методом ТСХ), выливали в воду, экстрагировали этилацетатом (3х10 мл), объединенный органический слой промывали последовательно водой (2х15 мл), насыщенным раствором NaCl (1х15 мл),
сушили над Na2SO4, растворитель отгоняли на ротационном испарителе.
Перекристаллизацией из метанола получали 52 мг (81%) соединения 21, т. пл.
245-2470С.
Спектр ЯМР 1Н ((CD3)2SO, δ, м.д.): 0.73 т (3Н, J= 7.3 Гц, С18-СН3), 1.01-1.07
м (1Н), 1.23-1.32 м (1Н), 1.67-1.75 м (1Н), 1.95-2.02 м (1Н), 2.21-2.37 м (3Н),
2.59-2.67 м (2Н), 3.01-3.10 м (1Н), 3.20-3.26 м (1Н), 7.37 д (1Н, J= 8.5 Гц), 7.84 с
(1Н), 7.87 д (1Н, J= 5.5 Гц), 7.96 д (1Н, J= 8.2 Гц), 8.29 с (2Н, -NH2).
HRMS (ESI-TOF), вычислено для С19Н20FNО4S (М+NН4)+: 395.1435;
найдено: 395.1445.
101
10β-фторэстра-1,4-диен-3-он-17β-ол (64)
К 137 мг (0.5 ммоль) эстрадиола (61) добавляли 195 мг (0.55 ммоль) соединения «Selectfluor», 0.5 мл метанола и 500 мг ионной жидкости «bmimBF4». Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 10 ч, выливали в
воду, экстрагировали Et2O (3х20 мл), органический слой последовательно промывали водой, насыщенным раствором NaCl, сушили над Na2SO4, растворители
удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем,
элюируя смесью гексан-этилацетат (4:1).
Получали 89 мг (64%) 10β-фторэстра-1,4-диен-3-он-17β-ола (64), т.пл. 151153oC.
Спектр ЯМР 1Н (СDCl3, δ, м.д.): 0.86 с (3H, CH3-18), 0.96-1.56 м (8H), 1.601.69 м (1H), 1.76-1.85 м (1H), 1.84-2.04 м (4H), 2.04-2.15, 2.40-2.47 м (1H), 2.632.75 м (1H), 3.66 т (J=8.5 Гц, H-17), 6.04 с (1H, H-4), 6.24 д (J=10.2 Гц), 7.09 дд
(7.6 Гц, J=10.4 Гц).
Спектр ЯМР 13С (СDCl3, δ, м.д.): 10.9 (CH3), 22.6, 23.5, 30.3, 31.8, 32.6, 35.8,
36.1, 43.1, 49.7, 54.2 д (JC,F=25.0 Гц, C-9), 81.4, 89.2 д (JC,F=168.0 Гц, C-10), 123.6
д (JC,F=4.4 Гц), 129.4 д (JC,F=8.1 Гц), 145.1 д (JC,F=24.2 Гц), 160.3 д (JC,F=19.1 Гц),
185.1 д (JC,F=4.4 Гц).
HRMS (ESI-TOF), Вычислено для [M+H]+, [С18Н23FО2]+: 291.1755, найдено:
291.1743.
3.2. Исследование биологических свойств
Исследования соединений in vitro на культурах раковых клеток MCF7 и
MELN проводились нами в Германском центре онкологических исследований
(German Cancer Research Center, DKFZ) под руководством проф. Doris Mayer.
Изучение антиоксидантных свойств соединений проводились нами в
Биомедицинском центре университета Хельсинки (Biomedicum Helsinki) под
руководством проф. Matti J. Tikkanen-а.
102
Культуральные среды и растворы
M2 (phenol-red free DMEM or RPMI)
Penicillin/Streptomycin
100 U/ml resp. 100 μg/ml
FCS (эмбриональной сыворотки теленка)
10 %
sodium pyruvate
1 mM
L-glutamine
2 mM
DCC solution
Tris-HCl (pH 8.0)
0.01 M
Charcoal Norrit A
0.25 % (w/v)
Dextran 60
0.0025 % (w/v) in distilled H2O
M3
phenol-red free DMEM or RPMI
100 U/ml resp. 100 μg/ml
Penicillin/Streptomycin
dextran-coated charcoal-treated FCS (DCC-FCS) 10 %
sodium pyruvate
1 mM
L-glutamine
2 mM
M4
phenol-red free DMEM or RPMI
Penicillin/Streptomycin
100 U/ml resp. 100 μg/ml
sodium pyruvate
1 mM
L-glutamine
2 mM
Cell lysis buffer (made in distilled H2O)
HEPES (pH 7.6)
50 mM
NaCl
150 mM
MgCl2
1.5 mM
Na4P2O7 x 10 H2O
10 mM
EDTA
2 mM
Glycerol
10 % (v/v)
Triton X-100
1.5 % (v/v)
Na-Fluoride
100 mM
103
Na-Orthovanadate (Na3VO4)
2.7 mM
Protease Inhibitor Cocktail Tablet
1 (/10 ml)
EDTA
1 % (w/v) in PBS
Trypsin/EDTA
0.05 %/0.02 % (w/v) in PBS
PBS (10 x)
NaCl
0.86M
Na2HPO4
0.58M
NaH2PO4xddH2O
0.17M
TBS (10 x)
Tris-HCl (pH 7.6)
0.1 M
NaCl
1.5 M
TBS-T
TBS
1x
Tween
0.1 %
SDS-PAGE gel (10 %, 2 mini gels)
H2O
4.02 ml
30 % acrylamide solution
3.3 ml
1.5 M Tris (pH 8.8)
2.5 ml
10 % SDS
100 μl
10 % Ammonium Persulfat
50 μl
Temed
30 μl
Клетки культуры MCF-7 и MELN выращивали в среде DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium) c добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (FBS). За три дня до эксперимента клетки культивировали в чашках Петри в
среде с добавлением 10% DCC-FBS (приготовлена по методу Migliaccio et al.
(1993)) при 37ºС в атмосфере 5% СО2
Культивирование клеток MCF7 и MELN
104
Удаляли культуральную среду из чашки Петри, клетки промывали 2 мл рра EDTA 3-4 мин. После этого клетки инкубировали с 3-4 мл р-ра трипсин/
EDTA в течение 5 мин. Процесс останавливали добавлением равного объема
среды M3. Далее переносили клетки в 15мл/50мл пробирку Фалькона (Falcon
tubes) и центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, после чего среду удаляли,
клетки ресуспензировали в культуральной среде. Число клеток в клеточной
суспензии определяли подсчетом с помощью гемацитометра Нойбауэра. Далее
помещали необходимое число клеток в лунки необходимого для эксперимента
планшета.
Оценка гормональной активности соединений методом определения
активности люциферазы (luciferase assay)
Помещали MELN-клетки в 6-луночный планшет в количестве 3 x 105 клеток на лунку в среде с добавлением 10% DCC-FBS (M3, 2 мл на лунку). Через
24 ч клетки помещали на следующие 24 ч в среду, содержащую 2% DCC-FBS.
Далее клетки стимулировали исследуемым соединением. По истечению инкубационного периода (16 ч.) отмывали клетки от культуральной среды 100 мкл
PBS, лизировали в течение 30 мин при 0°C инкубированием со 150 мкл лизирующего буфера. Затем собрали клетки скребком, ресуспендировали лизаты и
переносили их в промаркированные микропробирки Эппендорфа. Далее центрифугировали лизаты в течение 10 мин при 4°C. Для избавления от осадка лизаты переносили в новые микропробирки Эппендорфа. Смешивали в кювете
100 мкл реагента «luciferase assay reagent» (Promega, Mannheim, Germany) с 20
мкл полученного лизата клеток и измеряли люминесценцию в течение 1 минуты на люминометре Luminometer Biolumat LB9505, Berthold, Bad Wildbad, Germany. Люциферазную активность (cpm/mg белка) расчитывали нормированием
люминесценции (выраженную в количестве в минуту) к концентрации белка в
лизате.
105
Определение пролиферативной активности соединений (Proliferation
assay)
Помещали MCF-7 клетки в 96-луночный планшет в количестве 104 клеток
на лунку в среде с добавлением 10% DCC-FBS (M3). Через 24 ч клетки
помещали на следующие 24 ч в среду, содержащую 1% DCC-FBS. Далее клетки
стимулировали исследуемым соединением. По истечению инкубационного
периода (72 ч) клетки промывали 100 мкл PBS, фиксировали в течение 5 мин
100 мкл 3% р-ра параформальдегида в PBS и окрашивали в течение 10 мин 100
мкл 1%-ного р-ра красителя crystal violet, растворенного в 10%-ном этаноле.
Избыток красителя crystal violet удаляли из лунок, после чего планшет
тщательно промывали водой для удаления остатков красителя. После сушки на
воздухе осевший на поверхности краситель растворяли в 100 мкл 10%-ной
уксусной кислоты. Оптическую плотность определяли при длине волны 595 нм
с помощью прибора Multiscan MX, Thermo, Dreieich, Germany.
Вестерн Блоттинг
Концентрацию белка в лизате клеток определяли с помощью набора «BioRad DC Protein Assay». Градировочный график строили по данным измерения
значений абсорбции (750 нм) образцов с известными концентрациями белков
(от 0,25 до 2 мг/мл)
Помещали MCF-7 клетки в 6-луночные планшеты в количестве 3 x 105
клеток на лунку в среде M3. Через 30 ч. стимулировали клетки исследуемым
соединением. По истечению инкубационного периода (16 ч.) клетки дважды
промывали PBS и лизировали 100 мкл буфера для лизиса содержащего
ингибиторы протеазы. Далее проводили количественный анализ содержания
белка в исследуемых растворах и подготавливали пробы для электрофореза на
полиакриламидном геле SDS. Через 24 ч. наносили по 5 мкг каждого образца на
два 10% геля полиакриламида и разделяли смесь белков электрофорезом при
напряжении 100 вольт. После сепарации осуществляли блоттинг гелей на
мембраны PVDF (Immobilon-P, Millipore, Eschwege, Germany) в течение 3 ч.
106
После блоттинга мембраны промывали в Western-промывочном буфере (TBS-T,
с содержанием 0,1% Tween-20), блокировали в течение 1 ч в 5% BSA (бычий
сывороточный альбумин), растворенном в TBS-T. Мембраны обрезали на
уровне, соответствующем 55 кДа. Верхние половинки инкубировали в течение
ночи при 4°С с ER-α антителами, растворенными в TBS-T, содержащем 5%
BSA. Нижние половинки инкубировали с бета-актин-антителами в качестве
контроля (уровень экспрессии бета-актина не меняется в течение инкубации с
E2 и исследуемым соединением). Через 24 ч мембраны промывали 3 раза в
течение 15 мин раствором TBS-T, а затем инкубировали в течение 1 ч со
вторичными антителами, коньюгированными с HRP (horse radish peroxidaseпероксидаза хрена).
После этого мембраны снова промывали и детектировали методом ECL
(усиление хемилюминесценции), используя рентгеновскую пленку на системе
«ECL-plus» (GE Healthcare Biotech, Freiburg, Germany).
Выделение липопротеинов низкой плотности
Пробы крови брали у здоровых мужчин (N = 5) с помощью ЭДТА-содержащих вакуумных пробирок. Плазму отделяли центрифугированием в течение
15 мин при 4оС при 2500g. Липопротеины плазмы крови выделяли путем последовательного ультрацентрифугирования [123] с помощью ультрацентрифуги
Beckman Optima LE-80K в «Ti 50,4» роторе. Липопротеины очень низкой
плотности (ЛПОНП) выделяли при плотности d = 1.006 г/мл (270000g, 3.5 ч,
+10◦С), после чего выделяли липопротеины низкой плотности (ЛПНП) в диапазоне плотностей 1.019-1.063 г/мл (160000g, 17 ч, +10°С). Фракции ЛПНП хранили в защищенном от света месте при -70°С. Исследование было одобрено
этическим комитетом Центральной больницы Хельсинкского университета, и
согласие субъектов было также получено.
Эксклюзионная хроматография. Выделенные ЛПНП очищали гель-хроматографией на колонке Sephadex G25 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). 2
мл образца наносили на колонку (размер колонки 1 см × 20 см, BioRad). ЛПНП
107
элюировали фосфатным буфером (PBS, рН 7.4), определяли концентрацию белков [124]. Фракции, содержащие липопротеины, объединяли и использовали в
экспериментах.
Окисление ЛПНП. Антиоксидантная активность аналогов эстрогенов определялась путем непрерывного мониторинга кинетики формирования диеновых коньюгатов методом Эстербауера [125]. Исследуемый стероид растворяли
в этаноле и добавили к ЛПНП (концентрация белка 0,10 мг/мл в PBS). Контрольные эксперименты без добавления эстрогенов были сделаны с добавлением
того же количества этанола. Каждый эксперимент включал две серии с 17β-эстрадиолом, концентрации 17β-E2, добавленного к ЛПНП, составляли 0,1
мкмоль/л и 1 мкмоль/л. Далее липопротеиды подвергались окислению ионами
Cu2+ путем добавления 1,66 мкМ раствора сульфата меди (II). Оптическую
плотность измеряли на УФ-спектрофотометре (Safire, TECAN, Австрия
Ges.m.b.H) при длине волны 234 нм каждые 3 мин в течение 10 ч при постоянной температуре 28°С. Управление прибором осуществлялось с помощью
программного обеспечения «Magellan» (TECAN, Австрия Ges.m.b.H).
Анализ кинетики окисления. Время, в течение которого антиоксиданты
предотвращают окисление ЛПНП и образование диеновых коньюгатов называется лаг-фазой (lag time). Лаг-фаза была рассчитана по методу, описанному в
[25]. Для каждой концентрации исследуемого стероида рассчитывали приращение значение лаг-фазы по формуле: (лаг-фаза ЛПНП с добавлением стероида/лаг-фаза ЛПНП с растворителем) х 100%. Результаты выражали в виде
«среднее ± стандартное отклонение в параллельных экспериментах». Статистические сравнения были сделаны с помощью программного обеспечения «SPSS
Statistics 19.0». Предел достоверности:
Р <0,05.
108
ВЫВОДЫ
1. С целью поиска модифицированных эстрогенов с кардиопротекторным
действием, не опосредованном ядерным α-рецептором эстрогенов, синтезирован 16,16-диметил-2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-он, обладающий указанными свойствами. Это открывает принципиальную возможность
получения нового класса кардиопротекторов.
2. Улучшены некоторые стадии полного синтеза аналогов стероидных
эстрогенов, содержащих фтор в положении 2. Предложен альтернативный путь
синтеза
промежуточного
6-метокси-7-фтор-тетралина,
позволяющий
значительно сократить схему синтеза.
3. Стереоселективность каталитического гидрирования торговских эстрапентаенов, содержащих фтор в положении 2 и гидроксильную группу в положении 3, сильно зависит от условий реакции. При гидрировании в МеОН в присутствии Pd/C схема получения аналогов 8α-ряда сокращается с 4 стадий до 1.
4. Предложен способ синтеза 2-фтораналогов стероидных эстрогенов с
цис-сочленением колец С и D.
5. При комбинированном действии 17аβ-ацетокси-3-метокси- 2-фтор-Dгомо-1,3,5(10)-эстратриена и урсоловой кислоты не происходит повышения
уровня триглицеридов при сохранении гипохолестеринимического действия.
6. Показано, что аналоги эстрогенов, содержащие фтор в положении 2 и
свободную гидроксильную группу в положении 3, обладают высокой антиоксидантной активностью, сравнимой с антиоксидантсной активностью природного эстрадиола. На основе экспериментальных данных построена 3D-QSAR
модель c хорошей предсказательной силой.
109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Utne T., Jobson R.B., Babson R.D. Synthesis of 2-and 4-fluoroestradiol // J. Org.
Chem. – 1968. – Vol. 33. – № 6. – P. 2469–2473.
2.
Шавва А.Г., Селиванов С.И., Старова Г.Л., Бороноева Т.Р., Ищенко И.В.,
Глуздиков И.А., Шарецкий А.Н., Исаева В.Г., Суринов Б.П. Cинтез и
исследование ß-нop-8-изоаналогов стероидных эстрогенов // Биоорганическая
химия – 2002. – Vol. 28. – № 3. – P. 242–250.
3.
Wölfling J., Mernyák E., Frank É., Falkay G., Márki Á., Minorics R., Schneider G.
Synthesis and receptor-binding examinations of the normal and 13- epi-Dhomoestrones and their 3-methyl ethers // Steroids – 2003. – Vol. 68. – № 3. – P.
277–288.
4.
Roger V.L., Go A.S., Lloyd-Jones D.M., Benjamin E.J., Berry J.D., Borden W.B.,
Bravata D.M., Dai S., Ford E.S., Fox C.S. Executive Summary: Heart Disease and
Stroke Statistics—2012 Update A Report From the American Heart Association //
Circulation – 2012. – Vol. 125. – № 1. – P. 188–197.
5.
Mendelsohn M.E., Karas R.H. Molecular and cellular basis of cardiovascular gender
differences // Science (80-. ). – 2005. – Vol. 308. – № 5728. – P. 1583–1587.
6.
Turgeon J.L., McDonnell D.P., Martin K.A., Wise P.M. Hormone therapy:
physiological complexity belies therapeutic simplicity // Science (80-. ). – 2004. –
Vol. 304. – № 5675. – P. 1269–1273.
7.
Deschamps A.M., Murphy E., Sun J. Estrogen receptor activation and
cardioprotection in ischemia reperfusion injury // Trends Cardiovasc. Med. – 2010. –
Vol. 20. – № 3. – P. 73–78.
8.
Jousilahti P., Vartiainen E., Tuomilehto J., Puska P. Sex, age, cardiovascular risk
factors, and coronary heart disease A prospective follow-up study of 14 786 middleaged men and women in Finland // Circulation – 1999. – Vol. 99. – № 9. – P. 1165–
1172.
9.
Bush T.L., Barrett-Connor E., Cowan L.D., Criqui M.H., Wallace R.B., Suchindran
C.M., Tyroler H.A., Rifkind B.M. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use
of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up
Study. // Circulation – 1987. – Vol. 75. – № 6. – P. 1102–1109.
10.
Stocker R., Keaney J.F. Role of oxidative modifications in atherosclerosis // Physiol.
Rev. – 2004. – Vol. 84. – № 4. – P. 1381–1478.
11.
Bertoia M.L., Pai J.K., Lee J.-H., Taleb A., Joosten M.M., Mittleman M.A., Yang X.,
Witztum J.L., Rimm E.B., Tsimikas S. Oxidation-specific biomarkers and risk of
peripheral artery disease // J. Am. Coll. Cardiol. – 2013. – Vol. 61. – № 21. – P.
2169–2179.
110
12.
Lönn M.E., Dennis J.M., Stocker R. Actions of “antioxidants” in the protection
against atherosclerosis // Free Radic. Biol. Med. – 2012. – Vol. 53. – № 4. – P. 863–
884.
13.
Vera-Ramirez L., Ramirez-Tortosa Mc., Perez-Lopez P., Granados-Principal S.,
Battino M., Quiles J.L. Long-term effects of systemic cancer treatment on DNA
oxidative damage: the potential for targeted therapies // Cancer Lett. – 2012. – Vol.
327. – № 1. – P. 134–141.
14.
Prokai L., Simpkins J.W. Structure-nongenomic neuroprotection relationship of
estrogens and estrogen-derived compounds. // Pharmacol. Ther. – 2007. – Vol. 114. –
№ 1. – P. 1–12.
15.
Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update // J. Lipid
Res. – 2009. – Vol. 50. – № Supplement. – P. S376–S381.
16.
Prokai L., Prokai-Tatrai K., Perjesi P., Zharikova A.D., Perez E.J., Liu R., Simpkins
J.W. Quinol-based cyclic antioxidant mechanism in estrogen neuroprotection // Proc.
Natl. Acad. Sci. – 2003. – Vol. 100. – № 20. – P. 11741–11746.
17.
Prokai L., Simpkins J.W. Structure–nongenomic neuroprotection relationship of
estrogens and estrogen-derived compounds // Pharmacol. Ther. – 2007. – Vol. 114. –
№ 1. – P. 1–12.
18.
Abplanalp W., Scheiber M.D., Moon K., Kessel B., Liu J.H., Subbiah M.T. Evidence
for the role of high density lipoproteins in mediating the antioxidant effect of
estrogens // Eur. J. Endocrinol. – 2000. – Vol. 142. – № 1. – P. 79–83.
19.
Subbiah M.T., Kessel B., Agrawal M., Rajan R., Abplanalp W., Rymaszewski Z.
Antioxidant potential of specific estrogens on lipid peroxidation. // J. Clin.
Endocrinol. Metab. – 1993. – Vol. 77. – № 4. – P. 1095–1097.
20.
Libby P. Inflammation in atherosclerosis. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2012.
– Vol. 32. – № 9. – P. 2045–2051.
21.
Prokai-Tatrai K., Perjesi P., Rivera-Portalatin N.M., Simpkins J.W., Prokai L.
Mechanistic investigations on the antioxidant action of a neuroprotective estrogen
derivative // Steroids – 2008. – Vol. 73. – № 3. – P. 280–288.
22.
Perrella J., Berco M., Cecutti A., Gerulath A., Bhavnani B.R. Potential role of the
interaction between equine estrogens, low-density lipoprotein (LDL) and high-density
lipoprotein (HDL) in the prevention of coronary heart and neurodegenerative diseases
in postmenopausal women // Lipids Health Dis. – 2003. – Vol. 2. – № 1. – P. 4.
23.
Droescher P., Menzenbach B., Roemer W., Schneider B., Elger W., Kaufmann G.
Non-estrogenic estradiol derivative compounds with anti-oxidative activity //
US6436917 – 2002.
111
24.
Mazière C., Auclair M., Ronveaux M.-F., Salmon S., Santus R., Maziere J.-C.
Estrogens inhibit copper and cell-mediated modification of low density lipoprotein //
Atherosclerosis – 1991. – Vol. 89. – № 2. – P. 175–182.
25.
Badeau M., Adlercreutz H., Kaihovaara P., Tikkanen M.J. Estrogen A-ring structure
and antioxidative effect on lipoproteins // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2005. –
Vol. 96. – № 3-4. – P. 271–278.
26.
Expert Panel on Detection E. Executive summary of the third report of the National
Cholesterol Education Program (NCEP) expert panel on Detection, Evaluation, and
Treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III). // JAMA J.
Am. Med. Assoc. – 2001. – Vol. 285. – № 19. – P. 2486.
27.
Tall A.R. Cholesterol efflux pathways and other potential mechanisms involved in the
athero‐protective effect of high density lipoproteins // J. Intern. Med. – 2008. – Vol.
263. – № 3. – P. 256–273.
28.
Sacks F.M., Rudel L.L., Conner A., Akeefe H., Kostner G., Baki T., Rothblat G., de
la Llera-Moya M., Asztalos B., Perlman T. Selective delipidation of plasma HDL
enhances reverse cholesterol transport in vivo // J. Lipid Res. – 2009. – Vol. 50. – №
5. – P. 894–907.
29.
Shah P.K. The yin and yang of cholesteryl ester transfer protein in cardiovascular
disease // Circulation – 2009. – Vol. 120. – № 24. – P. 2408–2410.
30.
Hasselwander O., McEneny J., McMaster D., Fogarty D.G., Nicholls D.P., Maxwell
A.P., Young I.S. HDL composition and HDL antioxidant capacity in patients on
regular haemodialysis // Atherosclerosis – 1999. – Vol. 143. – № 1. – P. 125–133.
31.
Moradi H., Pahl M. V, Elahimehr R., Vaziri N.D. Impaired antioxidant activity of
high-density lipoprotein in chronic kidney disease // Transl. Res. – 2009. – Vol. 153.
– № 2. – P. 77–85.
32.
Toth P.P., Maki K. Practical lipid management: concepts and controversies // John
Wiley Sons – 2008.
33.
Assmann G., Gotto A.M. HDL cholesterol and protective factors in atherosclerosis //
Circulation – 2004. – Vol. 109. – № 23 suppl 1. – P. III–8.
34.
Jones P.H., Davidson M.H., Stein E.A., Bays H.E., McKenney J.M., Miller E., Cain
V.A., Blasetto J.W. Comparison of the efficacy and safety of rosuvastatin versus
atorvastatin, simvastatin, and pravastatin across doses // Am. J. Cardiol. – 2003. –
Vol. 92. – № 2. – P. 152–160.
35.
Nissen S.E., Nicholls S.J., Sipahi I., Libby P., Raichlen J.S., Ballantyne C.M.,
Davignon J., Erbel R., Fruchart J.C., Tardif J.-C. Effect of very high-intensity statin
therapy on regression of coronary atherosclerosis: the ASTEROID trial // Jama –
2006. – Vol. 295. – № 13. – P. 1556–1565.
112
36.
Manninen V., Elo M.O., Frick M.H., Haapa K., Heinonen O.P., Heinsalmi P., Helo P.,
Huttunen J.K., Kaitaniemi P., Koskinen P. Lipid alterations and decline in the
incidence of coronary heart disease in the Helsinki Heart Study // Jama – 1988. – Vol.
260. – № 5. – P. 641–651.
37.
Rubic T., Trottmann M., Lorenz R.L. Stimulation of CD36 and the key effector of
reverse cholesterol transport ATP-binding cassette A1 in monocytoid cells by niacin //
Biochem. Pharmacol. – 2004. – Vol. 67. – № 3. – P. 411–419.
38.
Toth P.P. Torcetrapib and atherosclerosis: what happened and where do we go from
here? // Futur. Med. – 2007. – Vol. 2. – № 3. – P. 277–284.
39.
Tikkanen M.J., Nikkila E.A., Kuusi T., Sipinen S. High density lipoprotein-2 and
hepatic lipase: Reciprocal changes produced by estrogen and Norgestrel // J. Clin.
Endocrinol. Metab. – 1982. – Vol. 54. – № 6. – P. 1113–1117.
40.
Jin F.-Y., Kamanna V.S., Kashyap M.L. Estradiol stimulates apolipoprotein AI–but
not A-II–containing particle synthesis and secretion by stimulating mRNA
transcription rate in Hep G2 cells // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 1998. – Vol.
18. – № 6. – P. 999–1006.
41.
Villar I.C., Hobbs A.J., Ahluwalia A. Sex differences in vascular function:
implication of endothelium-derived hyperpolarizing factor // J. Endocrinol. – 2008. –
Vol. 197. – № 3. – P. 447–462.
42.
Rosselli M., Imthurn B., Keller P.J., Jackson E.K., Dubey R.K. Circulating Nitric
Oxide (Nitrite/Nitrate) Levels in Postmenopausal Women Substituted With 17βEstradiol and Norethisterone Acetate A Two-Year Follow-up Study // Hypertension –
1995. – Vol. 25. – № 4. – P. 848–853.
43.
Mendelsohn M.E. Genomic and nongenomic effects of estrogen in the vasculature //
Am. J. Cardiol. – 2002. – Vol. 90. – № 1. – P. F3–F4.
44.
Rosenfeld C.R., Cox B.E., Roy T., Magness R.R. Nitric oxide contributes to estrogeninduced vasodilation of the ovine uterine circulation. // J. Clin. Invest. – 1996. – Vol.
98. – № 9. – P. 2158.
45.
Lantin-Hermoso R.L., Rosenfeld C.R., Yuhanna I.S., German Z., Chen Z., Shaul P.W.
Estrogen acutely stimulates nitric oxide synthase activity in fetal pulmonary artery
endothelium // Am. J. Physiol. Cell. Mol. Physiol. – 1997. – Vol. 17. – № 1. – P. 119–
126.
46.
Voss M.R., Stallone J.N., Li M., Cornelussen R.N.M., Knuefermann P., Knowlton
A.A. Gender differences in the expression of heat shock proteins: the effect of
estrogen // Am. J. Physiol. Circ. Physiol. – 2003. – Vol. 285. – № 2. – P. H687–H692.
47.
Van der Weerd L., Lythgoe M.F., Badin R.A., Valentim L.M., Akbar M.T., de
Belleroche J.S., Latchman D.S., Gadian D.G. Neuroprotective effects of HSP70
113
overexpression after cerebral ischaemia—an MRI study // Exp. Neurol. – 2005. – Vol.
195. – № 1. – P. 257–266.
48.
Gogvadze V., Orrenius S. Mitochondrial regulation of apoptotic cell death // Chem.
Biol. Interact. – 2006. – Vol. 163. – № 1. – P. 4–14.
49.
Kroemer G., Martin S.J. Caspase-independent cell death // Nat. Med. – 2005. – Vol.
11. – № 7. – P. 725–730.
50.
Matsumori Y., Hong S.M., Aoyama K., Fan Y., Kayama T., Sheldon R.A., Vexler
Z.S., Ferriero D.M., Weinstein P.R., Liu J. Hsp70 overexpression sequesters AIF and
reduces neonatal hypoxic/ischemic brain injury // J. Cereb. Blood Flow Metab. –
2005. – Vol. 25. – № 7. – P. 899–910.
51.
Kuan C.-Y., Burke R.E. Targeting the JNK signaling pathway for stroke and
Parkinson’s diseases therapy // Curr. Drug Targets-CNS Neurol. Disord. – 2005. –
Vol. 4. – № 1. – P. 63–67.
52.
Barati M.T., Rane M.J., Klein J.B., McLeish K.R. A proteomic screen identified
stress-induced chaperone proteins as targets of Akt phosphorylation in mesangial cells
// J. Proteome Res. – 2006. – Vol. 5. – № 7. – P. 1636–1646.
53.
Yue W., Santen R.., Wang J.-P., Li Y., Verderame M.., Bocchinfuso W.., Korach K..,
Devanesan P., Todorovic R., Rogan E.., et al. Genotoxic metabolites of estradiol in
breast: potential mechanism of estradiol induced carcinogenesis // J. Steroid Biochem.
Mol. Biol. – 2003. – Vol. 86. – № 3-5. – P. 477–486.
54.
Santen R.J. To block estrogen’s synthesis or action: that is the question // J. Clin.
Endocrinol. Metab. – 2002. – Vol. 87. – № 7. – P. 3007–3012.
55.
Preston-Martin S., Pike M.C., Ross R.K., Jones P.A., Henderson B.E. Increased cell
division as a cause of human cancer // Cancer Res. – 1990. – Vol. 50. – № 23. – P.
7415–7421.
56.
Liehr J.G. Is Estradiol a Genotoxic Mutagenic Carcinogen? 1 // Endocr. Rev. – 2000.
– Vol. 21. – № 1. – P. 40–54.
57.
Cavalieri E., Frenkel K., Liehr J.G., Rogan E., Roy D. Estrogens as endogenous
genotoxic agents—DNA adducts and mutations // JNCI Monogr. – 2000. – Vol. 2000.
– № 27. – P. 75–94.
58.
Lu F., Zahid M., Wang C., Saeed M., Cavalieri E.L., Rogan E.G. Resveratrol prevents
estrogen-DNA adduct formation and neoplastic transformation in MCF-10F cells //
Cancer Prev. Res. – 2008. – Vol. 1. – № 2. – P. 135–145.
59.
Maclusky N.J., Naftolin F., Krey L.C., Franks S. The catechol estrogens // J. Steroid
Biochem. – 1981. – Vol. 15. – P. 111–124.
114
60.
Fishman J. Aromatic hydroxylation of estrogens // Annu. Rev. Physiol. – 1983. – Vol.
45. – № 1. – P. 61–72.
61.
Nebert D.W. Elevated estrogen 16α-hydroxylase activity: is this a genotoxic or
nongenotoxic biomarker in human breast cancer risk? // J. Natl. Cancer Inst. – 1993. –
Vol. 85. – № 23. – P. 1888–1891.
62.
Muti P., Westerlind K., Wu T., Grimaldi T., Schünemann H., Freudenheim J.L., Hill
H., Carruba G., Bradlow L. Urinary estrogen metabolites and prostate cancer: a case–
control study in the United States // Cancer Causes Control – 2002. – Vol. 13. – № 10.
– P. 947–955.
63.
Adlercreutz H., Fotsis T., Bannwart C., Hämäläinen E., Bloigu S., Ollus A. Urinary
estrogen profile determination in young Finnish vegetarian and omnivorous women //
J. Steroid Biochem. – 1986. – Vol. 24. – № 1. – P. 289–296.
64.
Hoffman A.R., Paul S.M., Axelrod J. Catecholestrogen synthesis and metabolism by
human breast tumors in vitro // Cancer Res. – 1979. – Vol. 39. – № 11. – P. 4584–
4587.
65.
Liehr J.G., Wan-Fen F., Sirbasku D.A., Ari-Ulubelen A. Carcinogenicity of catechol
estrogens in Syrian hamsters // J. Steroid Biochem. – 1986. – Vol. 24. – № 1. – P.
353–356.
66.
Li S.A., Purdy R.H., Li J.J. Variations in catechol O-methyltransferase activity in
rodent tissues: possible role in estrogen carcinogenicity // Carcinogenesis – 1989. –
Vol. 10. – № 1. – P. 63–67.
67.
Bradlow H.L., Telang N.T., Sepkovic D.W., Osborne M.P. 2-hydroxyestrone:
the’good'estrogen // J. Endocrinol. – 1996. – Vol. 150. – № 3 Suppl. – P. S259–S265.
68.
Butterworth M., Lau S.S., Monks T.J. Formation of catechol estrogen glutathione
conjugates and gamma-glutamyl transpeptidase-dependent nephrotoxicity of 17betaestradiol in the golden Syrian hamster. // Carcinogenesis – 1997. – Vol. 18. – № 3. –
P. 561–567.
69.
Monks T.J., Lau S.S. Biological reactivity of polyphenolic-glutathione conjugates //
Chem. Res. Toxicol. – 1997. – Vol. 10. – № 12. – P. 1296–1313.
70.
Beall H.D., Liu Y., Siegel D., Bolton E.M., Gibson N.W., Ross D. Role of NAD (P)
H: quinone oxidoreductase (DT-diaphorase) in cytotoxicity and induction of DNA
damage by streptonigrin // Biochem. Pharmacol. – 1996. – Vol. 51. – № 5. – P. 645–
652.
71.
Floyd R.A. The role of 8-hydroxyguanine in carcinogenesis // Carcinogenesis – 1990.
– Vol. 11. – № 9. – P. 1447–1450.
72.
Monks T.J., Hanzlik R.P., Cohen G.M., Ross D., Graham D.G. Quinone chemistry
and toxicity // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1992. – Vol. 112. – № 1. – P. 2–16.
115
73.
Bolton J.L., Pisha E., Zhang F., Qiu S. Role of quinoids in estrogen carcinogenesis //
Chem. Res. Toxicol. – 1998. – Vol. 11. – № 10. – P. 1113–1127.
74.
Klaassen C.D. Casarett and Doull’s Toxicology: the basic science of poisons // New
York Macmillan Publ. – 2013.
75.
Singer B., Hang B. What structural features determine repair enzyme specificity and
mechanism in chemically modified DNA? // Chem. Res. Toxicol. – 1997. – Vol. 10. –
№ 7. – P. 713–732.
76.
Loeb L.A., Preston B.D. Mutagenesis by apurinic/apyrimidinic sites // Annu. Rev.
Genet. – 1986. – Vol. 20. – № 1. – P. 201–230.
77.
Fournier D., Poirier D. Estradiol dimers as a new class of steroid sulfatase reversible
inhibitors // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2009. – Vol. 19. – № 3. – P. 693–696.
78.
Jensen E. V, Jordan V.C. The estrogen receptor a model for molecular medicine //
Clin. Cancer Res. – 2003. – Vol. 9. – № 6. – P. 1980–1989.
79.
Poirier D. New cancer drugs targeting the biosynthesis of estrogens and androgens //
Drug Dev. Res. – 2008. – Vol. 69. – № 6. – P. 304–318.
80.
Poirier D., Maltais R. Solid-phase organic synthesis (SPOS) of modulators of
estrogenic and androgenic action // Mini Rev. Med. Chem. – 2006. – Vol. 6. – № 1. –
P. 37–52.
81.
Pasqualini J.R. The selective estrogen enzyme modulators in breast cancer: a review //
Biochim. Biophys. Acta (BBA)-Reviews Cancer – 2004. – Vol. 1654. – № 2. – P.
123–143.
82.
Eisen A., Trudeau M., Shelley W., Messersmith H., Pritchard K.I. Aromatase
inhibitors in adjuvant therapy for hormone receptor positive breast cancer: a
systematic review // Cancer Treat. Rev. – 2008. – Vol. 34. – № 2. – P. 157–174.
83.
Subramanian A., Salhab M., Mokbel K. Oestrogen producing enzymes and mammary
carcinogenesis: a review // Breast Cancer Res. Treat. – 2008. – Vol. 111. – № 2. – P.
191–202.
84.
Suzuki T., Miki Y., Nakata T., Shiotsu Y., Akinaga S., Inoue K., Ishida T., Kimura
M., Moriya T., Sasano H. Steroid sulfatase and estrogen sulfotransferase in normal
human tissue and breast carcinoma // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2003. – Vol.
86. – № 3. – P. 449–454.
85.
Howarth N.M., Purohit A., Robinson J.J., Vicker N., Reed M.J., Potter B.V.L.
Estrone 3-sulfate mimics, inhibitors of estrone sulfatase activity: homology model
construction and docking studies // Biochemistry – 2002. – Vol. 41. – № 50. – P.
14801–14814.
116
86.
Purohit A., Williams G.J., Howarth N.M., Potter B.V.L., Reed M.J. Inactivation of
steroid sulfatase by an active site-directed inhibitor, estrone-3-O-sulfamate //
Biochemistry – 1995. – Vol. 34. – № 36. – P. 11508–11514.
87.
Li P.K., Pillai R., Dibbelt L. Estrone sulfate analogs as estrone sulfatase inhibitors //
Steroids – 1995. – Vol. 60. – № 3. – P. 299–306.
88.
Woo L.W., Lightowler M., Purohit A., Reed M.J., Potter B.V.L. Heteroatomsubstituted analogues of the active-site directed inhibitor estra-1, 3, 5 (10)-trien-17one-3-sulphamate inhibit estrone sulphatase by a different mechanism // J. Steroid
Biochem. Mol. Biol. – 1996. – Vol. 57. – № 1. – P. 79–88.
89.
Schreiner E.P., Billich A. Estrone formate: a novel type of irreversible inhibitor of
human steroid sulfatase // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2004. – Vol. 14. – № 19. – P.
4999–5002.
90.
Bubert C., Leese M.P., Mahon M.F., Ferrandis E., Regis-Lydi S., Kasprzyk P.G.,
Newman S.P., Ho Y.T., Purohit A., Reed M.J. 3, 17-Disubstituted 2-alkylestra-1, 3, 5
(10)-trien-3-ol derivatives: synthesis, in vitro and in vivo anticancer activity // J. Med.
Chem. – 2007. – Vol. 50. – № 18. – P. 4431–4443.
91.
Liehr J.G. 2-Fluoroestradiol. Separation of estrogenicity from carcinogenicity. // Mol.
Pharmacol. – 1983. – Vol. 23. – № 2. – P. 278–281.
92.
Stalford A.C., Maggs J.L., Gilchrist T.L., Park B.K. Catecholestrogens as mediators
of carcinogenesis: correlation of aromatic hydroxylation of estradiol and its
fluorinated analogs with tumor induction in Syrian hamsters. // Mol. Pharmacol. –
1994. – Vol. 45. – № 6. – P. 1259–1267.
93.
Ashburn S.P., Han X., Liehr J.G. Microsomal hydroxylation of 2-and 4fluoroestradiol to catechol metabolites and their conversion to methyl ethers: catechol
estrogens as possible mediators of hormonal carcinogenesis. // Mol. Pharmacol. –
1993. – Vol. 43. – № 4. – P. 534–541.
94.
Valette A., Meignen J.M., Mercier L., Liehr J.G., Boyer J. Effects of 2-fluoroestradiol
on lipid metabolism in the ovariectomized rat // J. Steroid Biochem. – 1986. – Vol.
25. – № 4. – P. 575–578.
95.
Belov V.N., Dudkin V.Y., Urusova E. a., Starova G.L., Selivanov S.I., Nikolaev S.
V., Eshchenko N.D., Morozkina S.N., Shavva a. G. Synthesis, structure, and
biological properties of some 8α analogues of steroid estrogens with fluorine in
position 2 // Russ. J. Bioorganic Chem. – 2007. – Vol. 33. – № 3. – P. 293–301.
96.
Jones C.D., Ward J.S. Method of preparing 2-fluoro-17β-estradiol // патент США
4522758 – 1985.
97.
Bulman Page P.C., Hussain F., Maggs Paul Morgan J.L., Kevin Park B. Efficient
regioselective A-ring functionalization of oestrogens // Tetrahedron – 1990. – Vol. 46.
– № 6. – P. 2059–2068.
117
98.
Elger W., Fritzemeier K.H., Hegele-Hartung C., Hillisch A., Kollenkirchen U.,
Patchev V., Peters O., Thieme I. 8ss-hydrocarbyl-substituted estratrienes for use as
selective estrogens // WO2001077139A1 – 2001.
99.
Patrick T.B., Darling D.L. Fluorination of activated aromatic systems with cesium
fluoroxysulfate // J. Org. Chem. – 1986. – Vol. 51. – № 16. – P. 3242–3244.
100. Appelman E.H., Basile L.J., Thompson R.C. Fluoroxysulfate: a powerful new oxidant
and fluorinating agent // J. Am. Chem. Soc. – 1979. – Vol. 101. – № 12. – P. 3384–
3385.
101. Heravi M.R.P. Fluorination of activated aromatic systems with SelectfluorTM FTEDA-BF4 in ionic liquids // J. Fluor. Chem. – 2008. – Vol. 129. – № 3. – P. 217–
221.
102. Роэ А. Органические реакции // М. ИЛ – 1951. – Vol. 5. – P. 155–191.
103. Clader J.W. The discovery of ezetimibe: a view from outside the receptor // J. Med.
Chem. – 2004. – Vol. 47. – № 1. – P. 1–9.
104. Penning T.D., Talley J.J., Bertenshaw S.R., Carter J.S., Collins P.W., Docter S.,
Graneto M.J., Lee L.F., Malecha J.W., Miyashiro J.M. Synthesis and biological
evaluation of the 1, 5-diarylpyrazole class of cyclooxygenase-2 inhibitors:
identification of 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1 H-pyrazol-1-yl]
benzenesulfonamide (SC-58635, celecoxib) // J. Med. Chem. – 1997. – Vol. 40. – №
9. – P. 1347–1365.
105. Шавва А.Г., Морозкина С.Н., Антимонова О.И., Суринов Б.П. 17,17-Диметил-Dгомо-B-нор-8α-эстрон, обладающий гиполипидемической и
кардиопротекторной активностью // RU 2391351 C1 – 2008.
106. Ryzhenkov V.E., Prokop’ev A.A., Nersisian G.G., Kameneva Ii., Shavva A.G.
Hypolipidemic action of the racemic methyl ester of 16, 16-dimethyl-D-homo-8isoestrone // Vopr. Med. Khim. – 1986. – Vol. 33. – № 2. – P. 65–68.
107. Егоров М.С., Зорина А.Д., Балыкина Л.В., Селиванов С.И., Шавва А.Г. _.
Синтез 8-альфа аналогов стероидных эстрогенов // Вестник СПбГУ – 2000. –
Vol. 4. – № 4. – P. 99.
108. Ayan D., Roy J., Maltais R., Poirier D. Impact of estradiol structural modifications
(18-methyl and/or 17-hydroxy inversion of configuration) on the in vivo and in vitro
estrogenic activity // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2011. – Vol. 127. – № 3. – P.
324–330.
109. Liu X., Zhang F., Liu H., Burdette J.E., Li Y., Overk C.R., Pisha E., Yao J., van
Breemen R.B., Swanson S.M. Effect of halogenated substituents on the metabolism
and estrogenic effects of the equine estrogen, equilenin // Chem. Res. Toxicol. – 2003.
– Vol. 16. – № 6. – P. 741–749.
118
110. Buu-Hoi N.P., Xuong N.D., Rips R. New Fluorine-containing Aromatics as Potential
Carcinostats // J. Org. Chem. – 1957. – Vol. 22. – № 2. – P. 193–197.
111. Фидаров А.Ф. Синтез аналогов стероидных эстрогенов, содержащих фтор в
положении 2: дипломная работа // Санкт-Петербургский государственный
университет, Санкт-Петербург – 2011.
112. Nickolson R.C., Kerb U., Wiechert R. D-homo steroids // US4033995 – 1977.
113. Байгозин Д.В. Синтез аналогов стероидных эстрогенов с потенциальных
иммуносупрессивной активностью: дипломная работа // Санкт-Петербургский
государственный университет, Санкт-Петербург – 2006. –.
114. Sultana N. Clinically useful anticancer, antitumor, and antiwrinkle agent, ursolic acid
and related derivatives as medicinally important natural product // J. Enzyme Inhib.
Med. Chem. – 2011. – Vol. 26. – № 5. – P. 616–642.
115. Murakami S., Takashima H., Sato-Watanabe M., Chonan S., Yamamoto K., Saitoh
M., Saito S., Yoshimura H., Sugawara K., Yang J. Ursolic acid, an antagonist for
transforming growth factor (TGF)-β1 // FEBS Lett. – 2004. – Vol. 566. – № 1. – P.
55–59.
116. Kassi E., Papoutsi Z., Pratsinis H., Aligiannis N., Manoussakis M., Moutsatsou P.
Ursolic acid, a naturally occurring triterpenoid, demonstrates anticancer activity on
human prostate cancer cells // J. Cancer Res. Clin. Oncol. – 2007. – Vol. 133. – № 7.
– P. 493–500.
117. Ovesná Z., Kozics K., Slameňová D. Protective effects of ursolic acid and oleanolic
acid in leukemic cells // Mutat. Res. Mol. Mech. Mutagen. – 2006. – Vol. 600. – № 1.
– P. 131–137.
118. Szakiel A., Mroczek A. Distribution of triterpene acids and their derivatives in organs
of cowberry (Vaccinium vitis-idaea L.) plant // ACTA Biochim. Pol. Ed. – 2007. –
Vol. 54. – № 4. – P. 733.
119. Tin-Wa M., Farnsworth N.R., Fong H.H., Trojanek J. Catharanthus alkaloids. XXV.
Isolation of leurosine and ursolic acid from C. pusillus. // Lloydia – 1970. – Vol. 33. –
№ 2. – P. 261.
120. Cucu V., Roşca M., Grecu L., Cioacă C. Isolation of ursolic acid from Viburnum
latana L // Pharmazie – 1977. – Vol. 32. – № 8-9. – P. 542.
121. Misirlioglu H., Stevens R., Meikle T. Synthesis of dihydrochalcones of Myrica gale //
Phytochemistry – 1978. – Vol. 17. – № 11. – P. 2015–2019.
122. Pinchuk I., Shoval H., Dotan Y., Lichtenberg D. Evaluation of antioxidants: scope,
limitations and relevance of assays. // Chem. Phys. Lipids – 2012. – Vol. 165. – № 6.
– P. 638–647.
119
123. Havel R.J., Eder H.A., Bragdon J.H. The distribution and chemical composition of
ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum // J. Clin. Invest. – 1955. –
Vol. 34. – № 9. – P. 1345.
124. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the
Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – Vol. 193. – № 1. – P. 265–275.
125. Esterbauer H., Striegl G., Puhl H., Rotheneder M. Continuous Monitoring of in Vitro
Oxidation of Human Low Density Lipoprotein // Free Radic. Res. – 1989. – Vol. 6. –
№ 1. – P. 67–75.
120
ПРИЛОЖЕНИЕ
11
10
9
8
7
6
Chemical Shift (ppm)
5
Спектр ЯМР 1Н 6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона (36)
4
3
2.02
2.01
3.45
2.82
2.80
2.78
2.50
2.46
2.01
1.99
1.97
1.93
6.88
6.85
0.98
1.00
0.66
7.52
7.48
10.98
121
2
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
Chemical Shift (ppm)
3.0
2.5
2.0
1.5
Спектр ЯМР 1Н 16,16-диметил-2-фтор-8α-D-гомо-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (8)
3.06
6.07
10.29
3.02
1.03
2.73
2.72
2.60
2.59
2.56
2.10
2.05
2.01
1.96
1.89
1.86
1.76
1.72
1.71
1.69
1.68
1.24
1.20
1.13
0.94
5.45
0.93
1.00
1.02
6.84
6.80
6.70
6.67
7.28
122
1.0
200
180
160
140
51.33
47.31
42.74
41.63
40.97
39.90
35.46
33.04
31.15
28.54
26.91
21.73
19.01
120
100
Chemical Shift (ppm)
77.85
77.43
77.01
117.08
115.77
115.54
151.46
148.33
141.72
141.52
134.39
132.80
216.03
123
80
60
40
20
Спектр ЯМР 13С 16,16-диметил-2-фтор-8α-D-гомо-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (8)
0
128
120
112
104
96
88
80
72
64
Chemical Shift (ppm)
56
48
40
32
19.01
33.04
31.15
28.52
26.91
42.74
41.62
40.96
39.89
51.33
117.08
115.77
115.54
124
24
Спектр ЯМР 13С DEPT 16,16-диметил-2-фтор-8α-D-гомо-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (8)
16
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
7.02
2.04
1.06
5.38
1.01
1.00
5.59
5.56
5.54
0.98
3.05
3.02
2.99
2.67
2.65
2.63
2.59
2.56
2.54
2.44
2.42
2.40
2.20
1.77
1.74
1.72
1.29
1.27
1.23
1.20
1.18
6.11
6.71
6.68
0.98
1.01
1.00
7.28
7.22
7.19
7.17
7.15
125
1.5
1.0
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-16-метил-2-фтор-8,14-секоэстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен-14,17-диона (46)
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-16-метил-2-фтор-13α-эстра-1,3,5(10),8,15-пентаен-17-она (11)
4.94
1.05
1.00
1.05
2.96
1.39
1.10
2.00
0.98
3.04
2.78
2.75
2.72
2.69
2.43
2.29
2.26
2.23
2.07
1.92
1.90
1.88
1.80
1.62
1.60
1.59
1.27
1.20
5.69
0.85
1.98
6.89
6.85
6.81
6.78
7.28
126
220
200
180
160
140
120
100
Chemical Shift (ppm)
80
60
32.00
30.09
28.08
27.91
23.26
22.80
10.75
47.50
53.83
77.85
77.43
77.01
110.42
110.16
156.68
151.67
148.56
142.06
141.88
138.76
131.93
130.97
129.36
128.72
116.59
214.75
127
40
20
Спектр ЯМР 13С –гидрокси-16-метил-2-фтор-13α-эстра-1,3,5(10),8,15-пентаен-17-она (11)
0
160
150
140
130
120
110
100
90
80
Chemical Shift (ppm)
70
60
50
40
30
20
10.75
32.00
30.10
28.08
23.26
22.80
53.82
110.42
110.16
116.59
156.74
128
10
Спектр ЯМР 13С DEPT 3-гидрокси-16-метил-2-фтор-13α-эстра-1,3,5(10),8,15-пентаен-17-она (11)
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
Chemical Shift (ppm)
3.0
2.5
2.0
0.83
0.81
3.23
4.19
2.04
2.10
2.72
2.68
2.66
2.64
2.58
2.55
2.41
2.39
1.81
1.79
1.77
1.75
1.73
1.71
5.61
5.58
5.55
1.02
6.25
6.20
1.01
6.72
6.69
1.06
1.07
7.28
7.21
7.17
129
1.5
1.0
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-18-метил-2-фтор-8,14-секоэстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен-14,17-диона (48)
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
Chemical Shift (ppm)
3.0
2.5
2.0
1.5
Спектр ЯМР 1Н 18-метил-2-фторэстра-1,3,5(10),8,14-пентаен-17-она (49)
3.10
4.03
1.06
1.03
5.17
1.01
1.01
5.63
0.92
1.0
0.88
0.86
0.83
3.21
3.14
3.00
2.99
2.78
2.75
2.72
2.62
2.59
2.57
2.53
2.52
2.16
1.67
1.64
1.62
1.60
1.58
1.56
1.54
1.27
5.98
1.00
1.04
1.00
7.28
7.04
7.00
6.83
6.80
6.69
130
0.5
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
Chemical Shift (ppm)
3.0
2.5
Спектр ЯМР 1Н 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (14)
2.0
1.5
2.94
1.08
13.18
0.98
2.00
1.01
0.94
0.98
0.97
2.77
2.72
2.64
2.61
2.59
2.19
2.16
2.15
2.13
1.89
1.80
1.76
1.74
1.70
1.67
1.64
1.57
1.29
1.28
0.78
0.76
0.73
5.69
6.86
6.82
6.71
6.68
7.28
131
1.0
0.5
200
180
160
140
120
100
Chemical Shift (ppm)
80
60
Спектр ЯМР 13С 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (14)
40
20
9.15
51.25
49.68
41.70
39.00
36.13
31.03
28.62
22.66
21.20
20.26
77.85
77.63
77.43
77.01
117.22
116.02
115.79
151.42
148.29
141.80
141.62
133.78
133.12
132
0
200
180
160
140
120
100
Chemical Shift (ppm)
80
60
Спектр ЯМР 13С DEPT 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (14)
40
20
9.15
51.24
49.67
41.69
39.00
36.13
31.03
28.60
22.66
21.19
20.26
117.25
116.03
115.81
133
0
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.19
3.07
2.12
2.11
2.03
6.25
2.81
2.77
2.76
2.71
2.66
2.64
2.58
2.56
2.43
2.41
2.40
1.79
1.77
1.75
1.73
1.71
5.63
5.60
5.57
1.04
6.18
0.96
6.72
6.69
1.04
1.02
7.28
7.22
7.18
134
1.5
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-2-фтор-8,14-секоэстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен-14,17-диона (54)
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-2-фторэстра-1,3,5(10),8,14-пентаен-17-она (55)
1.5
3.13
1.11
1.08
1.21
5.26
1.07
1.00
0.72
1.02
1.05
1.02
3.39
3.31
3.01
2.94
2.93
2.78
2.75
2.73
2.66
2.63
2.58
2.37
2.33
2.09
2.08
2.04
2.03
1.64
1.62
1.60
1.27
1.22
1.16
5.47
5.91
7.06
7.02
6.84
6.81
7.28
135
1.0
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)
3.5
3.0
Спектр ЯМР 1Н 2-фтор-8α-эстрона (15)
2.5
2.0
1.5
2.97
1.21
0.98
2.98
5.04
1.10
1.97
1.08
1.26
1.05
0.89
0.99
1.01
2.75
2.62
2.61
2.49
2.46
2.20
2.17
2.07
1.91
1.89
1.88
1.87
1.86
1.82
1.81
1.70
1.66
1.27
1.02
5.06
5.04
6.87
6.84
6.73
6.70
7.28
136
1.0
220
200
180
160
140
120
100
Chemical Shift (ppm)
48.64
47.25
41.22
41.11
40.84
40.56
40.29
40.02
39.73
39.45
36.10
21.78
16.67
117.91
116.76
116.54
132.86
151.81
148.64
143.28
143.11
220.38
137
80
Спектр ЯМР 13С 2-фтор-8α-эстрона (15)
60
40
20
128
120
112
104
96
88
80
72
64
Chemical Shift (ppm)
56
48
Спектр ЯМР 13С DEPT 2-фтор-8α-эстрона (15)
40
32
24
16.66
21.80
48.65
41.22
41.10
40.83
40.55
40.27
39.99
38.75
36.11
32.80
30.88
28.79
117.92
116.77
116.55
138
16
10
9
8
7
6
5
Chemical Shift (ppm)
4
3
2
3.00
6.10
3.10
2.02
3.44
2.80
2.78
2.76
2.75
2.73
2.57
2.50
2.34
1.93
1.91
1.80
1.79
1.77
1.65
1.13
5.47
5.45
1.06
6.64
6.61
1.02
7.20
7.16
1.02
1.06
9.82
139
1
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-2-фтор-D-гомо-8,14-секоэстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен-14,17а-диона (56)
10
9
8
7
6
5
Chemical Shift (ppm)
4
3
3.23
1.11
1.12
3.00
1.03
1.02
1.01
0.98
2.68
2.64
2.62
2.61
2.59
2.56
2.50
2.45
2.31
2.28
1.95
1.91
1.51
1.47
1.11
3.43
6.06
7.08
7.03
6.76
6.73
9.83
140
2
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-2-фтор-D-гомо-эстра-1,3,5(10),8,14-пентаен-17а-она (57)
1
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
Chemical Shift (ppm)
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (16)
1.5
1.06
3.08
1.06
2.16
14.16
2.65
2.61
2.50
2.05
2.01
1.97
1.75
1.61
1.60
1.57
1.56
1.51
3.44
1.00
6.86
6.82
6.58
6.55
1.00
0.99
9.46
141
220
200
180
160
140
120
100
Chemical Shift (ppm)
48.15
48.01
41.10
40.85
40.57
40.29
40.00
39.72
39.46
33.71
26.75
25.92
21.79
19.28
117.78
116.53
116.30
151.87
148.71
143.23
143.07
133.29
133.22
132.59
215.21
142
80
60
40
20
Спектр ЯМР 13С 3-гидрокси-2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (16)
0
120
112
104
96
88
80
72
64
Chemical Shift (ppm)
56
48
40
32
21.78
19.27
41.08
40.88
40.52
40.24
39.95
38.21
33.70
31.05
28.40
26.75
25.91
48.00
117.78
116.53
116.31
143
24
Спектр ЯМР 13С DEPT 3-гидрокси-2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она (16)
16
10
9
8
7
6
5
Chemical Shift (ppm)
4
3
2
3.05
1.05
1.01
0.98
1.00
12.96
2.20
2.10
1.05
0.7431
0.7256
0.7084
3.3435
3.2284
3.1269
3.1098
2.6094
2.5843
2.5618
2.5000
2.3112
2.2636
2.2407
2.2216
2.2079
1.9402
1.6546
1.2362
1.0802
7.6287
7.5933
7.5708
7.2950
7.2722
7.2009
7.1806
10.1887
SVM_517001r
2.00
1.98
0.97
144
1
Спектр ЯМР 1Н 3-гидрокси-18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-она (18)
.esp
200
180
160
140
120
100
Chemical Shift (ppm)
50.2778
47.1067
40.6268
40.4123
40.2055
39.9987
39.7919
39.5774
39.3706
36.5979
24.9554
23.9060
21.3324
17.3265
8.0278
153.5588
151.1154
144.6125
144.4669
132.9776
130.8483
130.7947
130.2892
126.4364
124.9811
123.9547
113.0935
108.7736
108.5897
218.0750
145
80
60
40
Спектр ЯМР 13С 3-гидрокси-18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-она (18)
20
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
Спектр ЯМР 1Н сульфамата 18-метил-2-фтор-8α-эстрона (19)
1.5
2.77
2.03
8.98
3.28
2.8143
2.7586
2.7175
2.5020
2.4124
2.3786
2.0953
2.0711
2.0469
2.0275
1.9065
1.8750
1.8266
1.5942
1.5724
1.5433
1.4949
1.2334
0.6597
0.6354
7.2375
7.1987
7.1213
7.0946
8.1599
636001.1R
1.23
3.37
1.11
1.00
1.98
146
Water
1.0
10
9
8
7
6
5
Chemical Shift (ppm)
4
3
Спектр ЯМР 1Н сульфамата 2-фтор-В-D-гомо-8α-эстрона (20)
2
3.23
Water
3.35
2.7729
2.7519
2.5552
2.3882
2.2484
2.2274
2.1965
2.1099
2.0530
2.0196
1.9775
1.9478
1.5334
1.4914
1.4654
0.9929
6.9354
6.8921
6.7028
6.6732
9.6605
757001.1R
11.26
1.46
1.77
1.09
1.00
2.22
147
DMSO
1
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
3.26
1.12
1.19
1.07
1.38
2.80
1.98
1.32
1.14
1.2625
1.0459
1.0276
0.7515
0.7332
2.6647
2.6602
2.5889
2.5183
2.5137
2.5000
2.4958
2.4916
2.3448
2.3223
2.2312
1.9833
1.9509
3.3310
7.3839
7.3625
8.2881
7.9735
7.9529
7.8728
7.8591
7.8400
518001r.esp
1.00
3.08
1.92
148
1.0
Спектр ЯМР 1Н сульфамата 18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-она (21)
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
Спектр ЯМР 1Н 10β-фтор-эстра-1,4-диен-3-он-17β-ола (64)
1.5
3.10
9.05
1.07
4.21
1.09
1.04
1.04
1.03
1.00
1.01
1.04
351 - 10F_E2.001.1r.esp
1.3956
1.3819
1.1172
0.8579
2.7132
2.6929
2.6804
2.6602
2.4496
2.0855
1.9867
1.9756
1.9432
1.9325
1.9264
1.9177
1.9020
1.8952
1.8105
3.6795
3.6585
3.6368
6.2540
6.2284
6.0396
7.2840
7.1177
7.0986
7.0918
7.0727
149
1.0
351 - 10F_E2.351.001.1R.esp
180
160
140
120
100
80
Chemical Shift (ppm)
60
40
Спектр ЯМР 13С 10β-фтор-эстра-1,4-диен-3-он-17β-ола (64)
20
10.9046
43.1029
36.0741
35.7824
32.6472
31.8014
30.3358
23.5258
22.6217
54.4554
54.2075
49.7379
90.0222
88.3525
81.4185
77.3208
77.0000
76.6865
129.4316
123.6059
123.5621
145.2974
145.0568
160.4924
160.3029
185.0859
185.0421
150
0
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
Chemical Shift (ppm)
60
50
40
30
20
Спектр ЯМР 13С DEPT 10β-фтор-эстра-1,4-диен-3-он-17β-ола (64)
10.9317
36.1012
35.8095
32.6743
31.8285
30.3630
23.5529
22.6488
49.7578
54.4825
54.2346
81.4456
129.4587
129.3785
123.6330
351D.001.1R.esp
145.3245
145.0839
151
10
0
-10
152
Сравнение
антиоксидантной
активности
исследуемых
аналогов
эстрогенов с активностью эстрадиола методом определения лаг-фазы:
153
154
155
156
157
158
159
160