Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук На правах рукописи Стефанова Лидия Борисовна «Механизмы устойчивости к гипоксии клеток эстрогеннезависимого рака молочной железы» Специальность 14.01.12 – онкология диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор МОСКВА – 2014 М.А. Красильников 2 Оглавление СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .............................................................................................. 5 1. ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................ 7 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 11 2.1 Регуляция клеточного метаболизма в условиях гипоксии .................................. 11 2.1.1 Механизмы детекции уровня кислорода .................................................... 11 2.1.2 Транскрипционный фактор HIF ................................................................ 14 2.1.3 Структура HIF-1 ........................................................................................ 17 2.1.4 Механизмы регуляции HIF-1 ...................................................................... 19 2.1.5 Изоформы HIF-α ......................................................................................... 26 2.2 2.2.1 2.3 Гипоксия и злокачественные новообразования .................................................... 28 Гипоксия и РМЖ ......................................................................................... 34 Воздействие эстрогенов на клетки-мишени. Рецепторы эстрогенов. ................. 37 2.3.1 Сигнальные пути рецепторов эстрогенов. ................................................ 38 2.3.2 Современные представления о возникновении гормональной резистентности РМЖ. 40 2.4 Гипоксия и гормональная резистентность РМЖ .................................................. 46 2.5 Гипоксия и эпителиально-мезенхимальный переход ........................................... 49 2.5.1 ЭМП и рак ................................................................................................... 49 2.5.2 Гипоксия и индукция ЭМП ......................................................................... 50 2.6 3 ЭМП и гормональная зависимость клеток РМЖ .................................................. 53 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................................... 55 3 Список реактивов и производителей ................................................................................. 55 Оборудование и приборы .................................................................................................... 56 4 3.1 Культивирование клеток ......................................................................................... 57 3.2 МТТ-тест................................................................................................................... 58 3.3 Получение клеточных экстрактов и иммуноблоттинг ......................................... 59 3.4 Транзиентная трансфекция ..................................................................................... 60 3.5 Трансдукция клеток лентивирусной конструкцией ............................................. 63 3.6 Использование специфического ингибитора β-катенина ICG-001 ..................... 63 3.7 Использование активатора β-катенина CHIR 99021............................................. 64 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ......................................................................... 65 4.1 Сравнительный анализ выживаемости в условиях гипоксии клеток эстрогензависимого и эстрогенрезистентного рака молочной железы .......................... 65 4.1.1 Рост клеток MCF-7 и HBL-100 в условиях гипоксии ..................................... 65 4.1.2 Индукция HIF-1 под действием гипоксии ...................................................... 67 4.1.3 Влияние гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ERα68 4.2 Гипоксия и эстрогеннезависимые сигнальные пути................................................... 72 4.2.1 Влияние гипоксии на уровень HER2/Neu ......................................................... 72 4.2.2 Гипоксия и белок Snail1. Значение Snail1 в регуляции выживаемости клеток в условиях гипоксии .................................................................................................... 74 4.2.3. Взаимоотношения между Snail1 и ERα......................................................... 80 4.2.4. Участие кадхерин-катенинового сигнального пути в реакции клеток на гипоксию 82 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................................................................... 88 6 ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 92 4 7 ЛИТЕРАТУРА ......................................................................................................... 95 5 Список сокращений АФК – активные формы кислорода РМЖ – рак молочной железы ЭМП – эпителиально-мезенхимальный переход ARNT - aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (арил-гидрокарбоновый рецепор ядерного транслокатора) CAIX – carbonic anhydrase 9 (угольная ангидраза 9) EGF - epidermal growth factor (эпидермальный фактор роста) EGFR - epidermal growth factor receptor ( рецептор эпидермального фактора роста) ERα – estrogen receptor α (рецептор эстрогена α) FGF – fibroblast growth factor (фактор роста фибробластов) GLUT 1 – glucose transporter 1 (белок-переносчик глюкозы 1) HER2/Neu – human epidermal growth factor receptor 2 (рецептор человеческого эпидермального фактора роста 2) HIF – hypoxia inducible factor (гипоксия-индуцируемый фактор) HRE - hypoxia response elements (гипоксия-зависимые элементы) IGF - insulin-like growth factor (инсулиноподобный фактор роста) IGFR – insulin-like growth factor receptor (рецептор инсулиноподобного фактора роста) LDH – lactate dehydrogenase 5 (лактатдегидрогеназа 5) MAPK - Mitogen-activated protein kinases (митоген-активируемые киназы) mTOR – mammalian target of rapamycin (мишень рапамицина у млекопитающих) NF-kB – nuclear factor kappa B (ядерный фактор каппа B) PI3K - Phosphatidylinositol-3-kinase (фосфатидилинозит-3-киназа) 6 SERM - Selective estrogen receptor modulators (селективные модуляторы рецепторов эстрогенов) SERD – selective estrogen receptor down-regulators (антагонисты рецепторов эстрогенов) VEGF – vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов 7 1. Введение Актуальность проблемы. Рак молочной железы поражает приблизительно каждую девятую женщину и, следовательно, является наиболее распространённым злокачественным заболеванием среди женщин [2, 55, 81, 132]. Несмотря на значительный прогресс в его лечении, достигнутый благодаря увеличению чувствительности диагностических процедур и совершенствованию хирургических и лекарственных методов, уровень смертности от РМЖ остается достаточно высоким [2, 4, 7, 81]. На сегодняшний день известно, что рак молочной железы представлен разными типами злокачественных новообразований, которые имеют определённые отличия в развитии. Некоторые типы РМЖ имеют высокую степень злокачественности, быстро прогрессируют и распространяются, в то время как другие типы РМЖ гораздо менее агрессивны [167]. В этой связи очень важно выделять определённые свойства опухоли, которые говорят о её большей злокачественности. Существует определённый набор морфологических и гистологических критериев, с помощью которых определяют вероятность распространения болезни, но, к сожалению, они не всегда бывают достаточны [99]. Одним из факторов, определяющих высокий уровень смертности больных РМЖ, является развитие резистентности опухоли к различным видам терапии [3, 4, 7]. В этой связи актуально изучение молекулярных механизмов развития резистентности на моделях in vitro и выявление новых клеточных маркеров, характеризующих чувствительность опухоли к лекарственным препаратам in vivo. В настоящее время в клинике для лечения опухолей молочной железы успешно используются гормональные препараты, блокирующие сигнальные пути рецепторов эстрогенов. Однако не во всех случаях опухоль молочной железы обладает высокой чувствительностью к гормональной терапии, что определяет низкий терапевтический 8 эффект лечения. Исследования механизма гормональной резистентности рака молочной железы показали, что стимуляция эстроген-независимого роста связана с активацией ключевых белков митогенного и антиапоптотического ряда, функционирующих независимо от гормона и способных поддерживать автономный рост клеток [38, 173]. На сегодняшний день известно, что одним из ключевых факторов, определяющих развитие опухоли, является гипоксия. Дефицит кислорода в микроокружении раковых клеток способствует развитию устойчивости к противоопухолевой терапии, в том числе к гормональным препаратам, что подтверждается большим количеством клинических данных [67, 68, 195]. Опухолевые клетки способны быстро адаптироваться к гипоксии. Их защитные реакции направлены на активацию ряда внутриклеточных сигнальных путей, поддерживающих рост в условиях гипоксии. В целом опухоли, развивающиеся в условиях гипоксии, характеризуются более высокой степенью злокачественности и выраженной способностью к автономному, нерегулируемому росту. Основной задачей диссертации явилось исследование взаимосвязи между снижением гормональной зависимости и развитием устойчивости к гипоксии опухолей молочной железы. На модели культивируемых in vitro эстроген-зависимых и эстрогеннезависимых клеток рака молочной железы предполагалось исследовать пути регуляции некоторых антиапоптотических сигнальных путей и их значение в развитии толерантности опухолевых клеток к гипоксии. Цели и задачи исследования. Целью данной работы является исследование взаимосвязи между снижением гормональной зависимости и развитием устойчивости к гипоксии опухолей молочной 9 железы, и установление молекулярного механизма толерантности к гипоксии в эстроген-независимых клетках рака молочной железы. Основные задачи работы: 1. Сравнительный анализ выживаемости в условиях гипоксии (1% О2) клеток эстроген-зависимого и эстроген-независимого рака молочной железы 2. Изучение базального и индуцированного гипоксией уровня экспрессии HIF-1α в клетках эстроген-зависимого и эстроген-независимого рака молочной железы 3. Исследование влияния гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ERα 4. Исследование значения Snail1/β-катенин-сигнального пути в регуляции выживаемости клеток рака молочной железы в условиях гипоксии 5. Исследование взаимной регуляции Snail1 и рецептора эстрогенов ERα в клетках рака молочной железы. Новизна темы Несмотря на значительный прогресс в исследовании молекулярного механизма реакции на гипоксию опухолевых клеток, значение аппарата рецепторов эстрогенов в этом процессе остается малоизученным. Судя по результатам отдельных работ, потеря рецепторов эстрогенов может провоцировать увеличение устойчивости клеток рака молочной железы к гипоксии, однако механизм активации протективных белков в гормонрезистентных опухолях РМЖ практически не исследован. В настоящей работе впервые продемонстрирован и исследован механизм толерантности к гипоксии, основанный на активации в клетках эстроген-независимого 10 рака молочной железы Snail1-сигнального пути, установлено значение белков Snail1 и βкатенина в поддержании роста и выживаемости опухолевых клеток в условиях гипоксии. Научно-практическая значимость исследования Получены новые данные о молекулярном механизме развития устойчивости к гипоксии опухолевых клеток и значении гормонального статуса опухолевых клеток в этом процессе. В экспериментах по подавлению экспрессии Snail1 c помощью РНК-интерференции установлено, что выключение этого гена повышает чувствительность клеток к гипоксии. Эти результаты позволяют рассматривать Snail1 в качестве перспективной мишени таргетной противоопухолевой терапии эстроген-независимого рака молочной железы. 11 2. Обзор литературы 2.1 Регуляция клеточного метаболизма в условиях гипоксии 2.1.1 Механизмы детекции уровня кислорода Аэробным живым существам кислород необходим для синтеза АТФ. Организмы периодически сталкиваются с недостатком кислорода в среде – гипоксией – поэтому в течение эволюции у разных живых существ сформировались определённые механизмы, позволяющие детектировать недостаток кислорода и поддерживать энергетический гомеостаз на уровне клетки и на системном уровне в этих условиях. У бактерий описано несколько кислородных детекторов, которые реагируют на О 2зависимый окислительно-восстановительный статус клетки. Например, снижение уровня О2 у E. Coli приводит к активации транскрипционного фактора FNR (fumarate and nitrate reduction) который запускает адаптивную транскрипционную программу. У бактерии Rhizobium meliloti система детекции уровня кислорода состоит из двухкомпонентной сигнальной системы, деоксигенированном включающей состоянии, и FixL, гемопротеинкиназу, транскрипционного фактора активную FixJ, в который активируется при фосфорилировании киназой FixL. Таким образом, в нормоксии содержащая гем киназа оказывается оксигенированной и неактивной, а при снижении уровня кислорода белок деоксигенируется и, находясь в активированном состоянии, способен реагировать с каким-либо транскрипционным фактором, обуславливая передачу гипоксического сигнала. Большое количество кислород-чувствительных систем было описано для эукариот. Например, у дрожжей снижение синтеза стеролов и гема в связи с ограничением O2 влияет на деятельность нескольких транскрипционных факторов, таких как Hap1 и Sre1 [90]. 12 В отличие от одноклеточных организмов, кислородные датчики которых наиболее чувствительны в бескислородных условиях, многоклеточным необходим более градуированной ответ на снижение уровня кислорода, так как концентрация кислорода в разных тканях неоднородна. Например, у млекопитающих нормальное напряжение О2 в легких составляет около 16%, в то время как в других тканях - примерно 2-5%. Кроме того, многоклеточным организмам необходимы также системные адаптации к гипоксии, которые требуют более сложных и чувствительных механизмов детекции O2, нежели простые метаболические адаптации. То есть помимо адаптации на уровне клетки, многоклеточность требует системных адаптаций к гипоксии [32]. Системный ответ на гипоксию в организме млекопитающих осуществляется посредством особых органов – каротидных телец, расположенных в месте бифуркации общих сонных артерий, а также специализированными нейроэпителиальными клетками, чувствительными к уровню кислорода в воздухоносных путях. Основу каротидных телец составляют хеморецепторные клетки, способные определять даже незначительное снижение содержания О2 в крови за счет быстрой деполяризации мембран при ингибировании калиевых каналов в гипоксических условиях, и последующем формировании нервных импульсов, обуславливающих физиологические ответы со стороны дыхательной и сердечно-сосудистой систем [131]. В настоящее время не подвергается сомнению факт, что любая клетка может детектировать изменения в содержании кислорода в окружающей среде. Поддержание концентрации внутриклеточного кислорода в узких пределах необходимо как для предотвращения окислительного повреждения клетки при гипероксии, так и для предупреждения метаболических нарушений в клетке вследствие гипоксии. Поэтому изменение концентрации кислорода во внешней среде является для любой клетки физиологическим стимулом, в ответ на который происходит запуск определенных 13 внутриклеточных механизмов, призванных поддержать концентрацию внутриклеточного кислорода на необходимом уровне и обеспечить функционирование клетки в новых условиях. Эти механизмы обеспечивают как немедленный (например, снижение активности калиевых каналов; увеличение активности ферментов гликолиза), так и замедленный (например, снижение интенсивности синтеза мРНК и белков, формирующих калиевые каналы; увеличение интенсивности синтеза мРНК и белков-ферментов гликолиза) ответы клетки на изменение напряжения посттрансляционной модификации макромолекул счет за кислорода. уже Немедленный синтезированных ответ белков окислительно-восстановительных основан или реакций, на других реакций фосфорилирования-дефосфорилирования и т.д., в то время как отсроченный ответ имеет в своей основе изменение экспрессии генов. В последние годы особое внимание уделяется изучению механизмов, обуславливающих реализацию воздействия гипоксии на клетки, а также исследованию немедленного и отсроченного клеточных ответов при действии острой и хронической гипоксии [117]. Немедленный ответ клеток на острую гипоксию проявляется прежде всего в изменении ионных токов через мембрану. Ионные каналы, чувствительные к уровню кислорода, преимущественно находятся в мембранах возбудимых нейросекреторных клеток (клетки каротидных телец, нейроэпителиальные клетки дыхательной системы), опосредующих немедленные приспособления организма к гипоксии со стороны сердечнососудистой и дыхательной систем, а также в гладкомышечных клетках, опосредующих вазомоторную реакцию на гипоксию. В соответствии с одной из гипотез, кислородный сенсор связан с самим каналом, и окси/деокси состояния молекулы-сенсора обуславливают конформационные изменения канала. Альтернативная точка зрения на 14 функционирование О2-датчика связана с преобразованием О2 в АФК, которые затем изменяют окислительно-восстановительный статус клетки и работу ионных каналов [130]. 2.1.2 Транскрипционный фактор HIF Отсроченный ответ клетки на гипоксию заключается в изменении транскрипции определенных генов. Каким же образом гипоксический сигнал может передаваться на ядро клетки, влияя на экспрессию чувствительных к гипоксии генов? Ещё в середине 80-х было установлено, что чувствительные к кислороду сигнальные пути, лежащие в основе регуляции гена эритропоэтина, работают практически во всех клетках млекопитающих, независимо от их отношения к продукции эритропоэтина, и что они регулируют многие другие гены [140]. В настоящее время установлено, что ведущая роль при ответе клетки на гипоксию осуществляется несколькими тесно связанными транскрипционными факторами, названными hypoxia-inducible factors (HIFs), которые запускают обширный транскрипционный каскад, напрямую или опосредованно контролирующий экспрессию сотен генов в любой клетке в ответ на гипоксию. Установлено, что транскрипционные мишени HIFs играют ключевую роль в стимуляции ангиогенеза и эритропоэза, регуляции вазомоторных функций, клеточной пролиферации, энергетического метаболизма и многих других механизмов ответа на гипоксию как на системном, так и на клеточном уровнях. Таким образом, HIFs являются частью широко распространенного в различных тканях, универсального механизма детекции уровня кислорода [170]. Число известных генов-мишеней HIF постоянно растет. Эти гены кодируют белки, играющие важную роль в адаптации клетки к острой и хронической гипоксии [184, 186, 15 209]. Такие белки обеспечивают различные механизмы приспособления клетки к пониженному содержанию кислорода: Белки, участвующие в анаэробном расщеплении глюкозы: альдолаза А (ALDA), альдолаза С (ALDC), енолаза-1 (ENO1) , глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) , гексокиназа-1 (HK1) , гексокиназа-2 (HK2) , лактатдегидрогеназа А (LDHA), фосфофруктокиназа L (PFKL) , фосфоглицераткиназа-1 (PGK1), пируваткиназа М (PKM) , триозофосфатизомераза (TPI), глюкозофосфатизомераза (GPI) , 6-фосфофрукто-2-киназа/фруктозо-2,6-бифосфатаза 3 (PFKFB3); переносчики глюкозы 1 и 3 (GLUT1/3); регуляторы внутриклеточного рН, например, трансмембранный фермент угольная ангидраза, удаляющая избыток протонов (CA). Белки, обеспечивающие увеличение содержания кислорода в ткани за счет стимуляции эритропоэза, ангиогенеза и регуляции тонуса сосудов: фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецептор VEGF (VEGFR); endocrine glandderived VEGF (EG-VEGF, или PROK1); ингибитор активатора плазминогена (PAI-1); NOсинтаза-2 (NOS-2) (тонус сосудов); гем-оксигеназа-1 (HO-1) (тонус сосудов); эндотелин-1 (тонус сосудов); α-1β адренорецептор (тонус сосудов); адреномедуллин (тонус сосудов); ангиопоэтины (ANGPT1, ANGPT2); эритропоэтин (EPO); церуллоплазмин (окисление железа); трансферрин (транспорт железа, необходимого для синтеза гема); рецептор трансферрина (захват железа клетками). Белки, влияющие на жизнеспособность и пролиферацию клеток: трансформирующие факторы роста TGF-β и TGF-α; p21; проапоптотические белки NIP3, NIX, RTP801; рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR-1, -2, -3); инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF-2), циклин G2; тромбоцитарный фактор роста PDGF-β; лептин; плацентарный фактор роста (PGF); хемокиновый рецептор CXCR4. Белки цитоскелета (кератины 14, 18, 19; виментин) 16 Белки и ферменты внеклеточного матрикса (матриксная металлопротеиназа MMP2; катепсин D; коллаген-пролил-4-гидроксилаза α1, фибронектин 1; α1 субъединица коллагена V) Транскрипционные факторы (ETS1, DEC1, DEC2, CITED2) Активация транскрипционного фактора HIF является универсальным ответом клетки на снижение содержания кислорода во внешней среде. Однако процессы, связывающие изменение содержания кислорода в клетке с индукцией HIF до последнего времени оставались наименее исследованным звеном в цепи передачи гипоксического сигнала в клетке. Ранее было предложено несколько различных, зачастую противоречивых, моделей, детально объясняющих чувствительность клеток к уровню кислорода в окружающей их среде: A) В качестве молекулы-сенсора выступает гем-содержащий белок, который напрямую ингибируется кислородом: в нормоксии содержащая гем молекула оказывается оксигенированной и неактивной, а при снижении уровня кислорода деоксигенируется и, находясь в активированном состоянии, способна взаимодействовать с каким-либо транскрипционным фактором, обуславливая передачу гипоксического сигнала. Такой механизм детекции уровня кислорода существует у бактерий, его работа предполагалась и в клетках млекопитающих [208]. Б) Белок-сенсор в качестве кофактора содержит железосерный кластер, активность которого определяется его окисленным/восстановленным статусом [186]. В) Мембраносвязанная НАДН – оксидаза генерирует АФК в прямой зависимости от концентрации О2; понижение уровня цитозольных АФК сигнализирует о гипоксии. При этом посредническая роль АФК в гипоксии проявляется в их прямом взаимодействии с эффекторными белками, такими как компоненты калиевых каналов или HIF-1, либо в активации определенных киназных каскадов, приводящих к активации 17 эффекторов [186]. Г) Гипоксия ингибирует активность цитохром оксидазы, что приводит к увеличению продукции АФК митохондриями [10, 208]. Основным противоречием между моделями, рассматривающими АФК в качестве триггера при запуске гипоксического сигнала, является то, что одна из них постулирует снижение концентрации АФК в клетке при гипоксии, а другая – увеличение. Однако, обе модели получили свое экспериментальное подтверждение не только при исследовании влияния фармакологичесих агентов-ингибиторов белков, функционирование которых лежит в основе каждой из теорий (НАДФ·Н-оксидоредуктазы или компонентов электронтранспортной цепи), на экспрессию транскрипционного фактора HIF-1 и его геновмишеней в культурах клеток, но и при измерении клеточных АФК с использованием различных флуоресцентных зондов [10, 186, 208]. В настоящее время известно, что активность транскрипционного фактора HIF-1 регулируется кислородом напрямую [47]. 2.1.3 Структура HIF-1 В активном состоянии HIF-1 является гетеродимером, состоящим из двух субъединиц: HIF-1α и HIF-1β, который также известен как ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator). В то время как HIF-1β представлен в клетке при любых кислородных условиях, HIF-1α практически невозможно обнаружить в клетке при нормальном содержании кислорода. И для того, чтобы транскрипционный комплекс HIF-1 заработал, необходимо определённое содержание HIF-1α в клетке. Ген человека HIF-1α расположен на 14 хромосоме (14q21-q24), а ген HIF-1β расположен на 1 хромосоме (1q21). HIF-1α и HIF-1β относительно большие по размеру белки, состоящие из 826 и 789 аминокислот соответственно. Оба белка содержат сигнальную последовательность ядерной локализации и мотив типа «спираль-петля-спираль» (helix-loop-helix motif (bHLH), 18 который имеет домен, состоящий из основных аминокислот и домен «спираль-петляспираль». Основной домен необходим для связывания с ДНК, а домен «спираль-петляспираль» отвечает за димеризацию комплекса. HIF-1α содержит несколько уникальных фрагментов, один из которых – домен кислород зависимой деградации (oxygen-dependent degradation domain (ODD). Этот фрагмент располагается между остатками 401–603. Специфическая деградация HIF-1α в условиях нормоксии запускается через этот домен, что обуславливает крайнюю нестабильность HIF-1α при нормальном содержании кислорода в клетке. HIF-1α также содержит два трансактивационных домена (transactivation domains (TAD), которые отвечают за транскрипционную регуляцию HIF-1зависимых генов. HIF-1α N-концевой TAD заключен между остатками 531–575, а Cконцевой TAD находится на самом конце молекулы между остатками 813–826. Эти TADдомены также обеспечивают связь с коактиваторами HIF-1α, такими как p300/CBP и Ref1, которые необходимы для транскрипционной активации HIF-1 (рис.1). HIF-1β также содержит TAD, но этот домен не является необходимым для транскрипционной активности HIF-1. Несмотря на большие сходства в строении обеих субъединиц, отличия в чувствительности к кислороду и трансактивационные возможности HIF-1α позволяют считать его главным функциональным компонентом комплекса HIF-1 [47]. 19 Рис 1. Структуры HIF1α и HIF1β [47] NLS (Nuclear localization signal) - сигнал ядерной локализации bHLH (basic helix-loop-helix) – домен «спираль-петля-спираль» PAS (Per-ARNT-Sim) – домен Per- aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-Sim ODD (oxygen-dependent degradation domain) - домен кислородной деградации TAD-C (C-terminal transactivation domain) – С-концевой трансактивационный домен TAD-N (N-terminal transactivation domain) - N-концевой трансактивационный домен На рисунке показаны коактиваторы функциональных доменов и сайты гидроксилирования, ацетилирования и фосфорилирования. 2.1.4 Механизмы регуляции HIF-1 Регуляция активности HIF-1α контролируется на нескольких уровнях: через механизмы транскрипции, а также посредством посттранскрипционных и посттрансляционных механизмов [62, 214]. В основном, регуляция HIF-1α осуществляется путём изменения стабильности самой молекулы белка. В условиях нормоксии HIF-1α-крайне нестабильная молекула, 20 деградирующая в течение нескольких минут [47]. Стабильность молекулы контролируется доменом кислород-зависимой деградации [90]. Этот домен содержит определённые аминокислотные остатки – Pro 402 и Pro 564 - которые подвергаются кислородзависимому гидроксилированию. Эта реакция осуществляется тремя гомологичными пролил гидроксилазами (prolyl hydroxylase domain (PHD) 1–3). Эти пролил-гидроксилазы PHD 1–3 являются 2-оксоглутарат-зависимыми ферментами, которым необходим кислород для реакции гидроксилирования. PHD 1–3 содержат атом двухвалентного железа, связывающий молекулярный кислород. Один атом кислорода переносится на остаток пролина, а другой окисляет 2-оксоглутарат, в результате чего получается сукцинат и CO2. Гидроксилирование двух остатков пролина Pro 402 и Pro 564 обеспечивает взаимодействие HIF-1α с белком von Hippel-Lindau, который в комплексе с убиквитин-лигазой делает HIF-1α мишенью убиквитин-зависимой протеасомной деградации [94]. Кроме того, в условиях нормоксии молекула HIF-1α дезактивируется в результате гидроксилирования остатка аспарагина Asn 803 в С-концевом трансактивационном домене (C-TAD). Эта реакция осуществляется аспарагинилгидроксилазой, названной фактором, ингибирующим HIF (factor inhibiting HIF (FIH) [118]. Гидроксилирование этого остатка блокирует взаимодействие HIF-α C-TAD с коактиваторами p300/CBP. Все гидроксилазы HIF являются железо (II)- и 2-оксоглутаратзависимыми диоксигеназами, для работы которых необходим молекулярный кислород. Из этого следует, что в условиях недостатка кислорода гидроксилирование двух остатков пролина и одного остатка аспарагина подавляется, что позволяет HIF-1α, во-первых, избежать связывания с белком von Hippel-Lindau (VHL), и следовательно, протеасомной деградации, во-вторых, взаимодействовать с белками-коактиваторами и запускать транскрипцию гипоксия-зависимых генов. Следует отметить, что гидроксилазам в качестве кофакторов требуются ионы двухвалентного железа. Этим можно объяснить 21 гипоксия-миметический эффект антагонистов железа, который возникает при замене ионов железа в активном центре фермента на другие металлы, такие как кобальт, с поторей каталитической активности [100]. Гидроксилирование остатков пролинов и аспарагина – это только один, хотя и наиболее значимый, способ регуляции функционирования HIF-1α. Многие исследователи отмечают наличие других механизмов контроля HIF-1α, таких как регуляция транскрипции м-РНК HIF-1α, посттранскрипционная модификация м-РНК и регуляция трансляции HIF-1α [214]. Регуляция HIF-1α на уровне транскрипции М-РНК HIF-1α экспрессируется в клетке постоянно как в условиях гипоксии, так и в условиях нормального содержания кислорода. В промоторе гена HIF-1α обнаружено несколько сайтов связывания для факторов, активирующих или подавляющих транскрипцию этого гена. Было показано, что некоторые транскрипционные факторы, например, Sp1 (Specificity Protein 1), обеспечивают постоянную транскрипцию HIF-1α, независимую от условий [145]. В условиях пониженного содержания кислорода уровень транскрипции м-РНК HIF-1α возрастает, в основном, за счёт работы транскрипционных факторов NF-KB и Egr-1 [15, 196]. Egr-1 (Early Growth Response -1) - мультифункциональный транскрипционный фактор, контролирующий огромный спектр клеточных функций, начиная с роста клеток и заканчивая апоптозом. Так, Sperandio и соавт. в экспериментах на культивируемых in vitro клетках рака простаты показали, что гипоксия стимулирует Egr-1 – зависимую транскрипцию HIF-1α. Хотя исследователи предполагают, что этот эффект специфичен для данного типа клеток [196]. Rachida и соавт. исследовали регуляцию м-РНК HIF-1α в ответ на гипоксию в клетках гладкой мускулатуры артерий. Эти эксперименты показали, что гипоксия активирует PI3K- 22 AKT(PKB) сигнальный путь, активирующий Nf-kB, который связывается с промотором гена HIF-1α и запускает его транскрипцию [15]. Кроме того в промоторе гена HIF-1α обнаружены сайты связывания таких факторов, как AP-1 и 2, NF-1 [47]. Интересно, что также в промоторе гена HIF-1α было обнаружено несколько предполагаемых гипоксиязависимых элементов HRE (hypoxia response elements) [145]. Это даёт основания предполагать, что сам HIF регулирует транскрипцию м-РНК HIF-1α. Посттранскрипционные модификации м-РНК HIF-1α До момента трансляции зрелой мРНК на рибосомах, незрелый транскрипт может стать объектом некоторых модификаций, касающихся процессинга, экспорта мРНК в цитоплазму, перемещения в цитоплазме и сохранения стабильности [149].Эти процессы регулируются особыми транс-активационными факторами (trans binding factors), которые взаимодействуют с многочисленными регуляторными элементами мРНК [103]. Эти факторы можно разделить на две категории: РНК-связывающие белки (RNA-binding proteins (RBPs)) и регуляторные некодирующие РНК, такие как микроРНК и антисмысловые РНК (microRNA, antisenseRNA)[8, 139]. РНК-связывающие белки распознают и связываются с определёнными участками в 3’- или 5’ - некодирующих регионах транскриптов, стабилизируя их или способствуя их деградации. Описано два РНК-связывающих белка, которые контролируют стабильность HIF-1α –транскрипта: HuR (human antigen R) и PTB (polypyrimidine tract-binding protein). Так, в экспериментах на культуре клеток HeLa, было показано, что HuR и PTB действуют совместно, стабилизируя HIF-1α –транскрипт в присутствии хлорида кобальта, имитирующего гипоксию in vitro [63]. Стабильность мРНК HIF-1α может также контролироваться антисмысловыми РНК. Антисмысловой транскрипт HIF-1α (aHIF) комплементарен 3’-некодирующему участку 23 HIF-1α мРНК. Было показано, что при продолжительной гипоксии (12 ч., 0,5% О 2) повышается экспрессия aHIF, что приводит к дестабилизации HIF-1α мРНК. Интересно, что промотор aHIF содержит HRЕ (hypoxia-responsive element), что свидетельствует о наличии механизма обратной регуляции антисмыслового транскрипта самим HIF. Механизм, посредством которого aHIF способствует распаду мРНК, до сих пор точно не установлен. Предполагается, что двуцепочечные участки РНК (aHIF-HIF-1α) являются сайтами связывания для дестабилизирующих RBP или маскируют сайты связывания мРНК со стабилизирующими RBP [83, 203]. Таким образом, аHIF РНК приводит к дестабилизации м-РНК HIF-1α, тогда как RBPs, напротив, её стабилизируют. Регуляция трансляции HIF-1α Известно несколько регуляторных механизмов, которые ускоряют или замедляют трансляцию HIF-1α. Некоторые из них являются универсальными механизмами, другие – специфичными для HIF-1α. Хотя в целом уровень трансляции в клетке быстро и сильно снижается в условиях кратковременной гипоксии, трансляция HIF-1α избирательно повышается. В настоящее время известно, что как снижение, так и стимуляция трансляции HIF-1α тонко регулируется [109] . Индукция трансляции HIF-1α Трансляция HIF-1α индуцируется как в условиях гипоксии, так и при нормальном содержании кислорода в клетке. При нормоксии синтез HIF-1α в значительной степени регулируется Сар-зависимым путём главным образом через активацию mTOR (mammalian target of rapamycin) и MAPKs (mitogen activated protein kinases) сигнальных путей. При гипоксии и при некоторых других повреждающих условиях, Сар-зависимая трансляция подавляется, и синтез HIF-1α переходит под контроль Сар-независимых механизмов, которые задействуют специальные последовательности в некодирующих участках транскрипта HIF-1α [214]. 24 Кэп-зависимая регуляция трансляции HIF-1α Кэп (Cap) — один или несколько модифицированных нуклеотидов на 5'- конце транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II. С химической точки зрения, кэп представляет собой 7-метилгуанозин, соединённый 5',5'-трифосфатным мостиком с первым нуклеотидным остатком транскрипта. В узком смысле под кэпом понимают именно 7-метилгуанозин. Кэп способствует эффективному процессингу пре-мРНК, экспорту мРНК из ядра, её трансляции и защите от быстрой деградации [182]. В условиях нормального содержания кислорода в клетке, трансляция HIF-1α строго контролируется, чтобы обеспечить низкий уровень этого белка во всех тканях. Сар- зависимая регуляция трансляции HIF-1α имеет две основные точки контроля. Первая точка – это сборка фактора инициации элонгации eIF4F (elongation initiation factor 4F), который состоит из Сар-связывающего белка eIF4E (Eukaryotic translation initiation factor 4E), вспомогательного белка eIF4G (eukaryotic translation initiation factor 4 gamma) и РНК – хеликазы (eIF4A) [137]. В свою очередь eIF4F определяет вторую точку контроля трансляции – связывание 43S комплекса преинициации, который включает в себя малую субъединицу рибосомы (40S) и тройной комплекс, состоящий из eIF2 (eukaryotic Initiation factor 2), ГТФ и мет-тRNA. При нормоксии ростовые факторы, онкобелки, цитокины могут стимулировать трансляцию HIF-1α двумя основными способами [214, 220]: через PI3K→Akt→mTOR и MAPK (Ras→MEK→ERK) сигнальные пути. Эти сигнальные пути фосфорилируют белки - репрессоры трансляции, такие как 4Е-связывающие белки 1, 2, 3 (Е4-binding protein 1,2,3), инактивируя их, тем самым способствуя сборке фактора инициации элонгации 4F [62, 63, 172, 220]. Кэп-независимая регуляция трансляции HIF-1α 25 Кэп-независимая регуляция трансляции осуществляется через связывание рибосомы с участком внутренней посадки рибосомы IRES (internal ribosomes entry site) особой последовательностью мРНК, расположенной в 5’-некодирующей области. Первоначально обнаруженные в вирусах, последовательности IRES в настоящее время обнаружены в 5’-некодирующих областях многих клеточных мРНК, включая HIF-1α [119, 179, 201]. Предполагается, что HIF-1α IRES стимулируют трансляцию HIF-1α при гипоксии и голодании – условиях, при которых кэп-зависимая трансляция сильно подавляется. Однако недавние исследования ставят под сомнение эту гипотезу, и роль IRES в трансляции в условиях гипоксии остаётся в настоящее время дискуссионной. Некоторые исследователи показывают, что IRES принимает участие в трансляции HIF-1α постоянно, независимо от содержания кислорода в клетке [23, 216][63]. Подавление трансляции HIF-1α Трансляция HIF-1α может подавляться как при нормальном содержании кислорода, так и в условиях гипоксии. Обнаружено несколько факторов, которые взаимодействуют с мРНК и предположительно подавляют её трансляцию. К ним относится РНКсвязывающий белок iron regulatory protein (IRP) [121] и микро-РНК [8]. Таким образом, уровень HIF-1α регулируется множеством сигнальных путей, которые активируются или инактивируются в различных условиях, а также подлежат саморегулированию через обратную связь. В конечном счёте, как и для всех белков, уровень экспрессии HIF-1α определяется балансом между скоростью синтеза (транскрипции и трансляции) и скоростью распада. Механизмы, контролирующие трансляцию HIF-1α остаются пока изученными не в полной мере и требуют дальнейшего исследования. Наличие нескольких путей синтеза и деградации HIF-1α может свидетельствовать о необходимости как немедленного, так и постепенного отсроченного ответов на гипоксию и другие физиологические стимулы. Регулируемая деградация HIF- 26 1α позволяет быстро изменить уровень HIF-1α в клетке, обеспечивая тем самым быстрый ответ на различные стимулы, в то время как регуляция на уровне трансляции может обеспечивать постоянный продолжительный синтез HIF-1α в течение длительных периодов стресса или гипоксии [214]. 2.1.5 Изоформы HIF-α Кроме наиболее распространённого транскрипционного фактора HIF-1α, известны и другие члены этого семейства: HIF-2α и HIF-3α, экспрессия которых была определена в более узком спектре тканей, в отличие от HIF-1α, экспрессирующемся во всех клетках [185]. Эти факторы имеют определённую структурную гомологию и относятся к семейству белков bHLH-PAS (basic helix-loop-helix Per-ARNT-Sim). Функции HIF-2α и 3α изучены не так глубоко, как HIF-1α. Несмотря на похожее строение этих белков, каждый имеет свои уникальные функциональные характеристики. Как и HIF-1α, HIF-2α играет определённую роль в ответе клетки на гипоксию, запуская экспрессию многих генов. Трансактивационные домены обоих факторов во многом совпадают, а следовательно, многие гены являются для них общими мишенями. Известно, что влияние обоих факторов на экспрессию генов-мишеней может отличаться в зависимости от типа клеток. Например, известно, что HIF-1α и -2α обильно экспрессируются в клетках почки, однако было показано, что гиперэкспрессия именно HIF-2α способствует развитию почечной карциномы [108, 135, 175]. Для клеток рака молочной железы было показано, что основной изоформой, необходимой для индукции генов в условиях гипоксии, является HIF-1α [19]. Структура молекулы HIF-3α во многом схожа с другими α-субъдиницами, но в функциональном отношении этот фактор имеет определённые отличия, на что указывают некоторые экспериментальные данные. Так Marc Heidbreder и соавт. изучали уровень м- 27 РНК и содержание в клетках всех трёх HIF-субъединиц и транскрицию их генов-мишеней. Оказалось, что уровень м-РНК HIF-3α в условиях гипоксии быстро возрастает, в отличие от HIF-1α и HIF-2α, уровень м-РНК которых не зависит от гипоксии. В то же время содержание всех HIF-α субъединиц увеличивается в зависимости от продолжительности гипоксии. Уровень м-РНК генов EPO и GLUT1 увеличивается при гипоксии, что служит индикатором активации HIF – системы в целом [84]. А также было показано, что HIF-3α представлен несколькими изоформами, которые являются результатом альтернативного сплайсинга. И некоторые из этих изоформ проявляют себя как ингибиторы HIF, они называются IPAS (inhibitory PAS domain protein). Дело в том, что у этих изоформ отсутствует трансактивационный домен, поэтому они являются естественными антагонистами HIF. Экспериментально было показано, что HIF-3α подавляет экспрессию HIF-зависимых генов [78, 134]. С другой стороны нельзя исключать, что HIF-3α способен индуцировать транскрипцию некоторых генов, обеспечивающих адаптивный ответ на гипоксию, таких как EPO и GLUT1. Таким образом, представляется наиболее вероятным, что HIF-3α – это важный компонент HIF-системы, который быстро активируется на уровне транскрипции и модулирует HIF-ответ на гипоксию [84]. 28 2.2 Гипоксия и злокачественные новообразования Ограниченное снабжение кислородом – общая черта всех солидных опухолей. С одной стороны, нерегулируемый рост ткани ограничивает способность сосудистой системы опухоли адаптироваться к увеличенной потребности в кислороде [22]. С другой стороны, кровеносные сосуды опухоли характеризуются некоторыми функциональными нарушениями по сравнению с сосудами нормальных тканей: искривлениями, случайными перемычками, неправильным распределением и т.д. [95]. В результате опухоли часто содержат области кратковременной или хронической гипоксии [80]. Нет сомнений в том, что доступ кислорода является лимитирующим фактором для роста опухоли, потому что опухолевые клетки, как и все другие клетки, используют кислород для производства энергии и в качестве субстрата для многих фундаментальных биологических процессов, включая синтез макромолекул. Однако, и в некоторой степени вопреки здравому смыслу, большое количество экспериментальных и клинических данных свидетельствует о том, что опухоли с очагами гипоксии быстрее прогрессируют, чем хорошо оксигенированные, что свидетальствует о неблагоприятном прогнозе для пациента. С биологической точки зрения этот кажущийся парадокс можно объяснить следующими соображениями. Вопервых, области с гипоксическими условиями могут выступать как своеобразные инкубаторы по выведению более злокачественных клеток, потому что в этих условиях выживают более агрессивные и устойчивые опухолевые клетки [71]. Во-вторых, гипоксия инициирует адаптационные процессы, которые могут быть выгодны для клеточной прогрессии, например, переключение на анаэробный метаболизм [104], увеличение геномной нестабильности [17], стимуляция ангиогенеза [199], активация инвазивного роста [163] и сохранение стволового состояния [74]. В-третьих, опухолевая гипоксия 29 часто является главным препятствием для радиотерапии и использования некоторых противоопухолевых препаратов [202]. Является ли опухолевая гипоксия лишь побочным продуктом быстрого нарастания клеточной массы или это часть биологической программы, которая приводит опухолевые клетки к потере контактов с соседними клетками, инвазии и в конечном итоге к появлению отдалённых метастазов? Ответ на этот вопрос найти сложно по причине того, что очень трудно производить какие-то манипуляции с клеточным микроокружением в адекватной манере. Дело «включения/выключения» в том, подачи что до кислорода сих пор не существует непосредственно к методов опухоли в экспериментальных системах или пациентах [143]. Некоторое время назад были разработаны косвенные методы, целью которых является снижение опухолевой гипоксии. К ним относятся гипербарическая оксигенация [44] и использование препаратов человеческого рекомбинантного эритропоэтина [52]. Однако оба эти подхода на практике продемонстрировали определённые недостатки. Вопервых, оба метода предполагают обеспечение кислородом всего организма, а не только опухоли. Во-вторых, нет уверенности в том, что системное повышение давления кислорода приведёт к увеличению оксигенации опухоли, характеризующейся дефектной васкуляризацией, а следовательно, плохой доставкой кислорода к клеткам [143]. Недавно Galluzzo и соавт. [64] был разработан метод, который действительно позволил опухоли «дышать». Этот метод основан на определённых генетических манипуляциях и не связан с изменениями опухолевого микроокружения. Суть метода заключается в том, чтобы заставить клетку экспрессировать повышенное количество миоглобина, гемсодержащего белка, близкого по структуре к гемоглобину эритроцитов. Основная масса миоглобина сосредоточена в скелетных мышцах и сердце. Там он связывает поступающий из эритроцитов крови кислород и насыщает им клетки, выполняя одновременно роль 30 "резервуара и буфера", а также выступая в качестве переносчика, облегчая диффузию кислорода [211]. Повышенная экспрессия миоглобина никак не изменила основные функции клетки, но позволила опухоли в условиях гипоксии использовать кислород более эффективно, частично вернуть метаболизм на путь аэробного дыхания. Важно, что гиперэкспрессия миоглобина значительно снизила стабилизацию HIF-1 и следовательно, клеточный ответ на гипоксию. В трёхмерных моделях опухолевых сфероидов, в которые кислород поступал непосредственно из среды, миоглобин способствовал более равномерной их оксигенации и предотвращал формирование областей гипоксии. В исследованиях на мышах гиперэкспрессия миоглобина способствовала снижению опухолевого роста. Другими словами, клеткам, экспрессирующим миоглобин, требуется больше времени для инвазии и дальнейшего роста [70, 189]. Таким образом, экспериментальные данные подтверждают гипотезу о том, что гипоксия – не просто побочный эффект неконтролируемого роста, а ключевой фактор, обеспечивающий дальнейшую экспансию опухоли. Гипоксия, как следствие дисбаланса между поступлением кислорода и его потреблением, является важнейшей составляющей злокачественного процесса. Действительно, гипоксия запускает огромный каскад реакций, которые позволяют клетке выживать и пролиферировать, однако, если дефицит кислорода слишком велик, это в конечном итоге приводит к клеточной смерти, что доказывается наличием во многих опухолях некротических областей, которые являются результатом тяжёлой гипоксии [22]. Этот факт свидетельствует о том, что рост опухоли всё же зависит от количества поступающего к клеткам кислорода и лимитируется расстоянием между клеткой и кровеносным капилляром. Этот предел определяется диффузией кислорода в тканях и составляет несколько миллиметров [46]. На основании этих наблюдений была разработана 31 концепция кровеносных антиангиогенной сосудов терапии, опухоли и, смысл которой следовательно, в предотвращении создании роста гипоксического микроокружения [18]. Боевой клич антиангиогенной терапии таков: "некоторые опухоли могут задерживать дыхание дольше, чем другие, но никто не может задерживать дыхание на неопределенный срок. " [26] Как показывает клиническая практика, эта идея несколько упрощена, потому что рост опухоли зависит не только от способности клетки сжигать топливо, но и во многом от взаимодействия с микроокружением. Поэтому важно различать события, которые запускаются в ответ на гипоксию, внутри клетки и события, связанные с воздействием гипоксии на клеточное окружение [143]. Дефицит кислорода и внутриклеточные процессы Одним из важных отличий опухолевых клеток от нормальных является способ получения ими энергии. Известно, что энергетика опухолевых клеток в большей степени обеспечивается гликолизом, нежели циклом Кребса и дальнейшим окислительным фосфорилированием. Причём опухолевые клетки отдают предпочтение гликолизу даже при нормальном содержании кислорода в среде, потребляя при этом больше глюкозы и получая меньше энергии, чем при окислительном фосфорилировании. Этот феномен был открыт около 70 лет назад немецким биохимиком Отто Варбургом. «За открытие природы и механизма действия дыхательного фермента» Отто Варбург в 1931 г. был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине [16]. Какие преимущества для роста может получать раковая клетка, отдавая предпочтение гликолизу? В настоящее время существует несколько гипотез, объясняющих этот парадокс, но однозначного ответа на этот вопрос до сих пор не существует. Ясно то, что запуск HIF способен индуцировать «эффект Варбурга» с 32 помощью нескольких механизмов, среди которых повышенное усвоение глюкозы клеткой, индукция транскрипции гликолитических ферментов, подавление функций митохондрий [143]. Недавно Parandreou и соавт. [160] показали, что индукция HIF-1 является необходимым и достаточным условием для подавления функций митохондрий. Одним из генов-мишеней является HIF-1 ген PDK1 (Pyruvate dehydrogenase lipoamide kinase isozyme 1) [105, 160]. Этот ген экспрессируется во многих опухолевых клетках в ответ на гипоксию и стабилизацию HIF1. Белковый продукт этого гена – киназа пируватдегидрогеназы – фосфорилирует Е1 субъединицу пируватдегидрогеназы (PDH) митохондрий, инактивируя её. Пируватдегидрогеназа катализирует реакцию распада пирувата до ацетил-КоА и СО2 с восстановлением НАД. Инактивируя PDH, PDK1 блокирует поступление пирувата в митохондрию, и следовательно, в цикл Кребса [174]. Такое ограничение в «топливе» приводит к снижению процесса окислительного фосфорилирования, снижению общего потребления клеткой кислорода и снижению продукции активных форм кислорода [104]. Описан ещё один механизм, который снижает потребность клетки в кислороде, регулируя биогенез митохондрий [217]. Этот механизм срабатывает при длительной стабилизации HIF-1, и проявляется в большей степени в клетках, утративших белок – супрессор опухоли VHL (Von Hippel–Lindau). Результатом является общее снижение количества митохондрий в клетке. Этот эффект связан с инактивацией транскрипционного фактора MYC, который играет определённую роль в биогенезе митохондрий [126]. Ещё один механизм подавления клеточного дыхания основан на изменении активности цитохром С-оксидаз, которая контролируется HIF-1 [60]. Существует несколько гипотез, объясняющих преимущества подавления функции митохондрий в опухолевых клетках. И эти гипотезы не являются взаимоисключающими. Одна из них объясняет преимущества аэробного гликолиза сохранением в клетке 33 большого количества пирувата, который используется как строительный субстрат в большей степени, чем топливо, что актуально для быстро делящихся клеток [46]. Другая гипотеза основана на идее о том, что опухолевые клетки потребляют меньшее количество кислорода с целью его экономии и более равномерного распределения в ткани, что помогает избежать областей с тяжёлой гипоксией [160]. Ещё одна гипотеза основана на том, что подавление реакций дыхательной цепи митохондрий позволяет клетке избежать оксидативного стресса, вызываемого повышенной продукцией АФК, хотя эта точка зрения имеет некоторые противоречия [49, 125, 192] Воздействие гипоксии на микроокружение В то время как роль гипоксии в процессах клеточного роста является дискуссионной, вопросы ангиогенеза и инвазии опухоли при дефиците кислорода описаны более детально. Клетки опухоли в ответ на гипоксию запускают две основные реакции, контролируемые HIF-1. Во-первых, это секреция фактора роста эндотелия сосудов VEGF (Vascular endothelial growth factor), которая приводит к формированию новых кровеносных сосудов. Во-вторых, опухолевые клетки запускают программу инвазивного роста, которая контролируется Met тирозинкиназой. Это приводит к тому, что клетки стремятся покинуть области с нехваткой кислорода в поисках более оксигенированного микроокружения [163]. Таким образом, новые кровеносные сосуды в конечном итоге восстанавливают снабжение определённых участков опухоли кислородом и питательными веществами. А клетки, покинувшие неблагоприятные гипоксические условия, дают вторичные очаги опухолевого роста. Эти реакции клеток объясняют агрессивность и злокачественность опухолей, имеющих области с гипоксией. Таким образом, современные экспериментальные данные свидетельствуют о двоякой роли гипоксии в развитии опухоли. С одной стороны, стремление раковых клеток «экономить» 34 кислород и тот факт, что рост опухоли ограничивается расстоянием диффузии кислорода, говорят о том, что кислород является лимитирующим фактором в развитии опухоли. С другой стороны, многочисленные клинические данные свидетельствуют о том, что гипоксия является ключевым фактором, способствующим развитию более агрессивного фенотипа опухоли [143]. Последующие части этого обзора будут посвящены роли гипоксии в развитии рака молочной железы. 2.2.1 Гипоксия и РМЖ Рак молочной железы является наиболее распространённым злокачественным заболеванием среди женщин во всём мире [132]. В настоящее время выделяют различные молекулярные типы опухоли молочной железы. Клинически они имеют существенно различный риск развития метастазов и требуют различной терапии. Некоторые типы опухолей имеют высокую степень злокачественности, в то время как другие типы гораздо менее агрессивны [166]. В этой связи очень важно выделять определённые свойства опухоли, которые свидетельствуют прогностических о скорости её прогрессии. критериев, с помощью Существует которых некоторое определяют количество вероятность распространения болезни. Хорошо описанными на сегодняшний день критериями являются размер опухоли, присутствие метастазов в лимфатических узлах, степень дифференцировки опухолевых клеток. Степень дифференцировки оценивают по состоянию цитоскелета, наличию ядерных аномалий, особенностям митоза [167]. Наличие метастазов в лимфатических узлах и большой размер опухоли часто свидетельствуют об агрессивном фенотипе опухоли и неблагоприятном исходе болезни. Таким образом, морфологические и гистологические критерии являются важными прогностическими 35 факторами для многих типов опухолей, но, к сожалению, не всегда бывают достаточными для определения дальнейшего развития заболевания [99, 166]. Как уже указывалось выше, одним из ключевых факторов, определяющих развитие опухоли, является гипоксия. Поэтому на практике очень важны показатели, отражающие степень дефицита кислорода в опухоли, так как гипоксический статус опухоли может выступать в качестве маркера дальнейшего течения болезни. Все клетки млекопитающих так или иначе реагируют на изменение содержания кислорода в среде, однако, ответы разных клеток на гипоксию не являются абсолютно универсальными и могут отличаться. Разные клетки человеческого организма имеют разные потребности в энергии, работают в разных микроокружениях, и, как правило, существуют в различных диапазонах концентрации кислорода. Клетки также различаются по своей чувствительности к гипоксии: одни способны выживать даже в условиях полного отсутствия кислорода, другие – гибнут через несколько минут [34]. Разные типы опухолей отвечают на гипоксию по-разному, и прогностическое значение специфических маркеров широко варьирует среди них. Экспериментальные данные показывают, что в клетках рака молочной железы, так же, как и во многих других типах опухолей, основным прогностическим маркёром является HIF-1 α и его генымишени [194]. Гипоксические области довольно часто обнаруживаются в опухолях молочной железы. С использованием HIF-1α в качестве маркёра, было обнаружено, что 25-40 % проб инвазивного рака молочной железы имеют признаки гипоксии [43, 112, 207]. В целом, экспрессия HIF-1α в клетках РМЖ, как правило, связана с большими размерами опухоли, быстрой пролиферацией клеток и потерей гормональной зависимости. Хотя следует отметить, что не всегда гиперэкспрессия HIF-1α коррелирует с размерами опухоли: в небольших опухолях HIF-1α также может присутствовать. Хотя гипоксия и 36 является основным фактором, регулирующим HIF-1α, в некоторых случаях этот белок может активироваться и определёнными ростовыми факторами и продуктами онкогенов. Следовательно, некоторые опухоли, клетки которых экспрессируют HIF-1α, не содержат на самом деле гипоксических участков [207]. Экспрессия генов-мишеней HIF-1α также свидетельствует о развитии более агрессивного фенотипа опухоли. К таким генам-маркерам относятся CAIX (Carbonic anhydrase 9), VEGF (Vascular endothelial growth factor ), GLUT1 (Glucose transporter 1), LDH-5 (Lactate dehydrogenase 5)[54]. Сегодня лечение опухолей молочной железы включает в себя удаление первичной опухоли с последующей радиотерапией и адьювантной эндокринной или химиотерапией. Основными гормональными препаратами для лечения опухолей, экспрессирующих рецептор эстрогена α (ERα), являются антиэстрогены и ингибиторы ароматазы. Но, к сожалению, не все ERα – положительные опухоли отвечают на гормональную терапию, т.к. исходно резистентны к антигормональным препаратам или же приобретают устойчивость к ним в течение лечения [38, 173]. Накопленные к настоящему моменту клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что опухолевые клетки, находящиеся под гнётом дефицита кислорода, проявляют повышенную устойчивость к гормональной терапии и хуже поддаются радиотерапии [147]. 37 2.3 Воздействие эстрогенов на клетки-мишени. Рецепторы эстрогенов. Эстрогены - группа стероидных гормонов, регулирующих формирование и функционирование женских половых органов и молочных желез, развитие вторичных половых признаков и некоторые стороны психофизического состояния организма млекопитающих и человека. В небольших количествах эстрогены производятся также яичками у мужчин и корой надпочечников у обоих полов. Эстрогены играют ключевую роль в морфогенезе матки, яичников, молочных желез и простаты [85]. Кроме того, как у мужчин, так и у женщин, они вызывают широкий спектр биологических эффектов в сердечно-сосудистой, опорно-двигательной, иммунной и центральной нервной системах [73]. В связи с тем, что эстрогены выполняют важную роль в физиологии человека, они вовлечены также и в развитие многих заболеваний, в том числе различных видов опухолей. Важными органами-мишенями для эстрогенов являются молочные железы, в которых эти гормоны вызывают рост и разветвление молочных протоков, развитие долек и альвеолярных ходов, а также размещение жировой ткани. Благодаря способности эстрогенов значительно стимулировать рост клеток молочной железы, эти гормоны играют ключевую роль в развитии рака молочной железы [1, 4, 81]. На сегодняшний день установлено, что биологические эффекты эстрогенов реализуются через высокоаффинные рецепторы, ERα и ERβ, которые кодируются отдельными генами (Esr1 и Esr2 соответственно), расположенными на разных хромосомах. В нормальных тканях молочной железы экспрессируются оба рецептора, но конкретная их локализация изучена недостаточно [28]. Так, Li и соавт. изучали локализацию ERα и ERβ в нормальной ткани молочной железы человека. Образцы тканей, 38 взятые от женщин в период пременопаузы показали, что ERα локализованы преимущественно во внутреннем слое эпителиальных клеток, выстилающих ацинусы и дольковые протоки, а также в миоэпителиальных клетках внешнего слоя дольковых протоков. ERβ же был обнаружен в стромальных, эпителиальных, миоэпителиальных клетках в ацинусах и протоках [127]. Несмотря на то, что ERα присутствует не во всех тканях молочной железы, он вносит более существенный вклад в развитие молочных желез млекопитающих, чем ERβ, что было показано в экспериментах на мышах. У мышей с нокаутом гена ERα развивались только рудиментарные молочные железы, не способные к лактации. У мышей с нокаутом гена ERβ молочные железы развивались нормально [41]. Функциональные особенности ERβ в настоящее время исследованы недостаточно. Предполагают, что ERβ выступает как антагонист ERα, снижая пролиферативный эффект эстрогена [82]. Развитие рака молочной железы во многом связано с наличием и активностью ERα в клетках, что делает его важным прогностическим маркером дальнейшего течения болезни [28]. Многие экспериментальные данные свидетельствуют и об определённом значении ERβ в развитии РМЖ. [21, 193] [138], но всё же его роль как прогностического маркера остаётся неясной. 2.3.1 Сигнальные пути рецепторов эстрогенов. Рецепторы эстрогенов - ядерные транскрипционные факторы, которые участвуют как в геномных, так и в негеномных взаимодействиях [85, 150]. Известно несколько различных путей, посредством которых рецепторы эстрогенов регулируют биологические процессы. Классический геномный путь предполагает активацию рецептора лигандом и прямое связывание рецептора с эстроген- чувствительным элементом в промоторе соответствуюшего гена [77]. Другой вариант геномной регуляции предполагает взаимодействие рецептора с другим 39 транскрипционным фактором (преимущественно с белками семейств Ap-1 и Sp1, NFkB), в этом случае осуществляется непрямой геномный эффект на те гены, в промоторах которых нет эстроген-чувствительных элементов [116, 178]. Третий путь - негеномный – осуществляется посредством рецепторов эстрогенов, локализованных в клеточной мембране или в цитоплазме. Связывание рецептора с лигандом запускает посредством вторичных мессенджеров сигнальный каскад, приводящий к открытию ионных каналов в мембране или увеличению уровня оксида азота в цитоплазме, что вызывает очень быстрый физиологический ответ без участия генной регуляции [191]. Четвёртый путь – лиганд-независимый: ER может быть активирован как звено сигнального каскада, идущего от рецепторов тирозинкиназ, таких как EGFR ( epidermal growth factor receptor), HER2/Neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2), IGFR ( Insulin-like Growth Factor 1 Receptor). В этом случае фосфорилированные ER димеризуются, связываются с ДНК и активируют транскрипцию (рис.2) [101]. Рис.2 Сигнальные пути рецепторов эстрогенов [85] ER (estrogen receptor) – рецептор эстрогенов SM (second messenger) – вторичный посредник TF (transcriptional factor) – транскрипционный фактор 40 GF (growth factor) – фактор роста 2.3.2 Современные представления о возникновении гормональной резистентности РМЖ. Рецепторы эстрогенов играют ведущую роль в развитии РМЖ, поэтому гормональная терапия, блокирующая сигнальные пути рецепторов, успешно используется в клинике. Существует две основные стратегии подавления сигналинга рецепторов эстрогенов в клетках РМЖ: подавление эффекта эстрогена посредством антагонистов рецепторов и снижение выработки эстрогена. К препаратам-антагонистам рецепторов относятся SERM (selective estrogen receptor modulators) и SERD (selective estrogen receptor down-regulators). К препаратам группы SERM относится тамоксифен, который уже более 40 лет является основным препаратом для проведения эндокринной терапии гормонозависимого РМЖ [5-7]. Препараты группы SERM в некоторых тканях, включая молочные железы, ведут себя как антагонисты рецепторов эстрогенов; в других же тканях, например, костях и сердце, проявляют себя как агонисты рецепторов [40, 81, 124]. Препараты группы SERD, в частности, фулвестрант, являются «чистыми» антиэстрогенами, действуя исключительно как антагонисты рецепторов [159]. В качестве препаратов, подавляющих действие эстрогенов, используются также ингибиторы ароматазы, такие как анастрозол (аримидекс) и летрозол. Ароматаза - фермент, превращающий циркулирующие в крови андрогены в эстрогены. Таким образом, ингибиторы ароматазы подавляют синтез эстрогенов в организме, что позволяет достичь противоопухолевого эффекта в случае рака молочной железы [69]. К сожалению, далеко не во всех случаях опухоль молочной железы обладает высокой чувствительностью к терапии антиэстрогенами и ингибиторами ароматазы, что определяет низкий терапевтический эффект лечения. Основной причиной такой 41 неэффективности эндокринной терапии является гормональная резистентность опухоли – устойчивость опухоли к действию гормональных цитостатических препаратов. Гормонорезистентные опухоли возможно разделить на две группы: опухоли с первичной гормонорезистентностью и опухоли с приобретенной гормонорезистентностью. К первой группе относят опухоли, у которых биологический механизм гормональной резистентности сформировался до проведения терапии, то есть de novo. Во вторую группу входят опухоли, утратившие чувствительность к цитостатическому действию антиэстрогенов во время проведения эндокринной терапии. Возникновение у больных РМЖ первичной и приобретенной гормонорезистентности связано с различными молекулярными механизмами, поддерживающими рост злокачественных клеток [38, 173]. Оказалось, что неэффективность тамоксифена во многих случаях не связана с отсутствием или утратой во время терапии основной мишени этого препарата рецепторов эстрогенов. Этот факт подтверждается результатами клинических исследований: только небольшая (от 17 до 28%) группа больных с приобретенной гормонорезистентностью к тамоксифену утрачивает ER [75, 98]; по данным BachleitnerHofmann T. и соавторов около 80% гормонорезистентных опухолей молочной железы (контралатеральный РМЖ) сохраняют ER после проведения курса адъювантной терапии тамоксифеном [12]. Некоторые исследования подтверждают, что ER продолжают регулировать развитие опухоли в большинстве гормонорезистентных случаях; и две трети пациентов, резистентные к тамоксифену, чувствительны к терапии фулвестрантом и ингибиторами ароматазы [25, 91, 158]. Механизмы гормональной резистентности рака молочной железы. В настоящее время описано несколько возможных изменений в метаболизме опухолевых клеток, приводящих к полной или частичной утрате зависимости от эстрогенов [3, 7, 38]. 42 Развитию гормональной резистентности могут способствовать следующие события: Нарушение экспрессии мутации ER, и альтернативные изоформы рецепторов Любые изменения ER на уровне гена или белка могут стать причиной развития гормональной резистентности и более агрессивного фенотипа опухоли. Утрата ER с течением времени происходит примерно у 20% пациентов, получавших гормональную терапию [75]. Подавление или полная утрата ER может обеспечиваться разными механизмами. Один из механизмов связан с тем, что специфические микро-РНК могут регулировать стабильность м-РНК рецептора, подавляя его трансляцию [9]. Мутации в гене ER встречаются очень редко: менее, чем в 1% случаев ER - позитивных опухолей [86]. Но существует большое количество естественных изоформ рецепторов ERα и ERβ, которые являются результатом альтернативного сплайсинга. Недавно было установлено, что экспрессия одной из таких изоформ – укороченного варианта ERα36 – сопряжена с пониженным эндокринным ответом клеток [187]. Уровень ER и его функции могут также регулироваться посредством посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование, метилирование, убиквитинирование. Эти модификации влияют на взаимодействие ER с его корегуляторами и, следовательно, способствуют развитию гормональной резистентности [69, 72]. Нарушение баланса белков-активаторов и белков-супрессоров ER, нарушение взаимодействия ER с белками-активаторами ER влияет на экспрессию генов, связываясь с группой регуляторных белков, которые формируют комплекс инициации транскрипции [155]. Поэтому изменения в белках, формирующих этот комплекс с рецептором, сильно влияют на эффективность гормональной терапии. Дело в том, что экспрессия корепрессоров и коактиваторов ER 43 напрямую контролирует равновесие между антагонистическим и агонистическим действием SERM [188]. Было показано, что повышенная активация транскрипционных факторов AP-1, SP-1 и NFkB, которые играют ведущую роль в осуществлении эндокринного сигнала по неклассическому геномному пути, также приводит к гормональной резистентности [221]. Активация в опухолевой клетке эстроген-независимых сигнальных путей К этой категории относятся сигнальные каскады, которые могут обеспечить выживание и пролиферацию клеток опухоли при ингибировании сигнального пути рецепторов эстрогена: это сигнальные пути различных факторов роста (Epidermal growth factor EGF,Insulin-like growth factor IGF,Fibroblast growth factor FGF,Vascular endothelial growth factor VEGF и др.) [66, 151], сигнальные пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) – фермента, играющего важную роль в регуляции роста, устойчивости к повреждающим факторам и выживаемости опухолевых клеток, MAP-киназные каскады (MAPK), некоторые антиапоптотические белки (Akt,Src и др.)[30, 69, 197] Нарушение регуляции клеточного цикла и апоптоза Ещё одна категория механизмов, приводящих к гормональной резистентности, связана с контролем клеточного цикла. Активация положительных регуляторов клеточного цикла и антипролиферативный эффект подавление негативных регуляторов блокируют гормональной терапии, что приводит к гормональной резистентности. [150]. Например, гиперэкспрессия позитивного регулятора MYC и циклинов E1 and D1 приводит к гормональной устойчивости. Это происходит в результате активации циклин-зависимых киназ, играющих рещающую роль в G1-фазе клеточного цикла, или в результате подавления ингибиторного эффекта негативных регуляторов клеточного цикла p21 and p27 [29, 37, 164]. 44 Возникновение повышенной чувствительности клеток РМЖ к эстрогенам Клинические наблюдения показывают, что длительное лишение клеток эстрадиола может способствовать развитию повышенной чувствительности клеток рака молочной железы к пролиферативному эффекту эстрогена [177]. Длительное отсутствие эстрогена приводит к увеличению количества ERα в клетке в 4-10 раз и увеличению транскрипции некоторых эстроген-зависимых генов. Было установлено, что гиперчувствительность клеток РМЖ к эстрогенам связана с интенсивным использованием клеткой негеномных, опосредованных плазматической мембраной, путей. В результате возрастает уровень активации MAРК, PI3k и mTOR сигнальных путей, что приводит к пролиферации клеток. Эти пути активируют эффекторы, которые напрямую вовлечены в регуляцию клеточного цикла. Предполагается, что у некоторых пациентов будет формироваться устойчивость к тамоксифену как результат развития гиперчувствительности к действию тамоксифена как агониста эстрогена [177]. Таким образом, в развитии гормональной резистентности участвуют многие сигнальные клеточные пути, а высокий уровень пластичности генетического аппарата и гетерогенность опухоли не позволяют точно выявить закономерности в процессах изменения устойчивости опухолевых клеток к антиэстрогенам. Ситуация осложнена как координированной регуляцией факторов, влияющих на рост, резистентность к терапии и выживаемость опухолевых клеток, так и побочными эффектами гормональных препаратов и их активностью как агонистов эстрогенов. 45 Подводя итог вышеизложенному, необходимо отметить, что регуляция роста РМЖ эстрогенами – это сложный механизм передачи сигнала по цепочке сигнальных молекул. На сегодняшний день установлено, что в модуляции действия эстрогенов на клетки опухоли участвует большое количество белков различных сигнальных путей: белки классического геномного пути эстрогенов (ERα, ERβ, белки семейства Hsp и др.), белки неклассического геномного пути эстрогенов (AP-1, SP-1, Fos), «негормональные» сигнальные пути (PI3K, Akt, p90rsk, ERK1, ERK2, p38, IGF1-R и др.). Результатом этих многоступенчатых каскадов является ответ опухолевой клетки на гормон: активация или подавление экспрессии специфических генов-мишеней эстрогенов, изменение активности молекул, регулирующих клеточный цикл и др. Разветвленность и «запутанность» сигнальных сетей эстрогенов определяет во многих случаях неэффективность эндокринной терапии у больных РМЖ: у опухолевой клетки есть много способов преодолеть цитостатическое действие антиэстрогена, то есть стать резистентной. В заключение следует отметить, что помимо внутриклеточных сигнальных путей, вовлеченных в развитие гормональной резистентности, большое влияние на опухолевые клетки оказывают некоторые факторы окружающей их микросреды. К компонентам микроокружения, резистентности, которые относятся могут быть стромальные вовлечены клетки в опухоли, развитие гормональной структурные элементы внеклеточного матрикса, а также такие условия микросреды как повышенная кислотность и гипоксия [24, 57, 67]. 46 2.4 Гипоксия и гормональная резистентность РМЖ Как уже было сказано выше, дефицит кислорода в микроокружении раковых клеток способствует развитию устойчивости к противоопухолевой терапии, в том числе к гормональным препаратам, что подтверждается большим количеством клинических данных. Исследование с участием 187 пациентов с РМЖ, принимающих только эпирубицин (цитостатический препарат) или эпирубицин и тамоксифен в качестве неоадьювантной терапии, показало, что экспрессия HIF-1α и CAIX (Carbonic anhydrase 9) в опухоли ассоциируется с лекарственной устойчивостью и неэффективностью химиотерапии [67]. Другое исследование, с участием 114 пациентов с РМЖ также выявило корреляцию между экспрессией клетками опухоли HIF-1α и лекарственной устойчивостью [68]. Эти данные подтверждают более раннее исследование, в котором опухоли с низким уровнем CAIX были более чувствительны к адьювантной эндокринной и химиотерапии [195]. Ещё одним прогностическим маркёром является GLUT1 (Glucose transporter 1)– один из генов-мишеней HIF1α, который обладает цитопротекторным эффектом, позволяя глюкозе проникать в клетку с большей эффективность. Этот ген часто проявляет повышенную активность в клетках РМЖ. Исследование in vitro, в котором использовались антитела, блокирующие функцию GLUT1, вместе с цитотоксическими агентами, которые обычно используются для лечения РМЖ, показало пониженную пролиферацию раковых клеток, что указывает на важную роль GLUT1 в развитии лекарственной устойчивости [169]. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия VEGF в клетках РМЖ также связана с устойчивостью к гормональным и химиопрепаратам [56]. Ряд исследователей показывают, что клетки, подвергавшиеся влиянию гипоксии, проявляли меньшую чувствительность к тамоксифену [111, 114]. 47 Каким образом гипоксия способствует развитию гормональной резистентности в клетках РМЖ? Некоторые исследователи указывают на взаимодействие сигнальных путей эстрогена и сигнальных путей, вовлечённых в реакцию клетки на гипоксию, в клетках РМЖ [132]. Показано, что в условиях дефицита кислорода содержание ERα снижается. Несколько исследовательских групп отмечают специфическое подавление экспрессии ERα и PR (progesterone receptor) при разных гипоксических условиях (1% и 0.1% О2) [114, 198], а также в присутствии гипоксия-миметических соединений [36]. Подавление функций ERα связано как с усилением его протеасомной деградации, так и с пониженной транскрипцией гена Esr1 в условиях гипоксии [111, 198]. Вероятно, подавление транскрипции ERα в условиях гипоксии контролируется посредством ERK (extracellular regulated kinases) сигнального пути [144] или посредством прямого взаимодействия HIF-1 c промотором гена ESR1. Гипоксия активирует сигнальный путь RAS/RAF/MAPK, что приводит к фосфорилированию ERK1/2 (extracellular regulated kinases, синонимы p42/p44 MAPK). Фосфорилированные ERK1/2 (ERK-p) затем фосфорилируют HIF-1a, повышая его транскрипционную активность [144]. Также установлено, что активированные ERK1/2 фосфорилируют ERα, тем самым стимулируя рецептор лиганд-независимым способом [33]. Гиперэкспрессия рецепторов ростовых факторов и нижестоящих по пути передачи сигнала киназ, таких как HER2, EGFR, RAF-1, MEK-1, в клетках рака молочной железы линии MCF-7 также приводит к активации ERK1/2 и подавлению экспрессии ERα [157]. Результаты некоторых исследований говорят о том, что гипоксия может запускать лиганд-независимую активацию ERa посредством прямого взаимодействия HIF -1a и ERα [35]. Было показано, что гиперактивация MAPK подавляет экспрессию ERα частично посредством фактора NF-kB [89]. Иследователи Ryu et al. предполагают, что эффект подавления транскрипции гена ESR1 при гипоксии 48 является специфичным для клеток РМЖ (эксперименты проводились на линиях T47D и MCF-7), т.к. в клетках аденокарциномы эндометрия человека линии Ishikawa подобного эффекта не наблюдалось [176]. Таким образом, регуляция ERα в условиях гипоксии очень сложна. Несмотря на несколько противоречивые экспериментальные данные, важно учитывать уровень гипоксии в тканях опухоли при оценке ERα-статуса и при создании определённой стратегии лечения РМЖ. Подводя итог вышесказанному, следует отметить, что гормональная зависимость опухоли, безусловно, является динамическим явлением и зависит от особенностей микроокружения клеток и, в частности, содержания в них кислорода. Вышеизложенные факты говорят о том, что недостаток кислорода способствует развитию более агрессивного фенотипа опухоли и, как правило, свидетельствует о плохом прогнозе для пациента. Это связано не только со специфической устойчивостью к противоопухолевым препаратам, но и с развитием способности раковых клеток к инвазии и метастазированию. Следующие части этого обзора посвящены эпителиально-мезенхимальному переходу – ключевому событию опухолевой прогрессии, и его роли в регуляции эстрогеновых и гипоксия-зависимых сигнальных путей. 49 2.5 Гипоксия и эпителиально-мезенхимальный переход Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) - сложный процесс изменения эпителиальными клетками эпителиального фенотипа на мезенхимальный, происходящий в эмбриональном развитии, заживлении ран, а также при патологических процессах, в том числе опухолевой прогрессии [200]. Современные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что важнейшим фактором, индуцирующим ЭМП, является гипоксия [133]. 2.5.1 ЭМП и рак Основным признаком ЭМП считается подавление в клетках экспрессии E- кадхерина, участвующего в образовании плотных контактов между эпителиоцитами. Подавление экспрессии E-кадхерина приводит к потере межклеточных контактов и увеличении уровня β-катенина в ядре [42]. Также признаками ЭМП является подавление синтеза эпителиальных маркеров таких, как десмоплакин и плакоглобин, и индукция синтеза мезенхимельных белков таких, как виментин, фибронектин и гладко-мышечный актин [200]. На сегодняшний момент не подлежит сомнению тот факт, что эпителиальномезенхимальный переход играет ключевую роль в опухолевой прогрессии и метастазировании. Запуск программы перехода даёт клеткам явные преимущества, которые способствуют эффективной инвазии и метастазированию в удалённые органы и ткани. ЭМП является основным, хоть и не единственным механизмом, отвечающим за образование метастазов. Приобретая мезенхимальный фенотип, отдельные раковые клетки получают возможность проникать в окружающие ткани, а также преодолевать барьер эндотелия, поступая в кровеносные или лимфатические сосуды [200]. 50 Когда клетки достигают вторичных очагов роста, они перестают получать сигналы от первичной опухоли и претерпевают обратные изменения, снова приобретая эпителиальный фенотип. Этот обратный процесс получил название мезенхимальноэпителиального перехода [27, 218]. ЭМП запускается и контролируется сигналами клеточного микроокружения, которые регулируют функции определённых генов и запускают цитоплазматические реакции. Описано несколько транскрипционных факторов, которые играют ключевую роль в подавлении эпителиальных белков, таких, как Е-кадхерин и ZO-1 (Zona occludens protein 1). Это транскрипционные факторы типа цинковых пальцев, к которым относятся SNAIL1, SLUG (SNAIL2), TWIST1, ZIB1 (другое название TCF8 и δEF1), SIP1 (другое название ZEB2 и ZFXH1B) и E47 (другое название TCF3) [31, 76, 152, 162, 213]. И гипоксия, и ЭМП рассматриваются как важные события, способствующие инвазии и метастазированию опухоли; известно, что оба эти процесса имеют некоторые общие молекулярные механизмы. В последнее время появляется всё больше экспериментальных свидетельств того, что изменение содержания кислорода в микроокружении опухолевых клеток и активация гипоксического ответа через HIF становятся важными триггерами и модуляторами ЭМП [96]. 2.5.2 Гипоксия и индукция ЭМП Многие исследования последних лет свидетельствуют о том, что HIF контролирует ЭМП, регулируя экспрессию и активность таких транскрипционных факторов как TWIST, SNAIL, SLUG, SIP1 и ZEB1. Индукция ЭМП в условиях гипоксии была продемонстрирована в различных клеточных линиях [88, 107, 133, 148, 219] и проявлялась в изменении содержания в клетках эпителиальных и мезенхимальных маркеров и увеличении способности клеток к инвазии. 51 Транскрипционный фактор TWIST первым был описан как индуктор ЭМП и процессов метастазирования [212]. Гиперэкспрессия TWIST в эпителиальных клетках приводит к подавлению транскрипции E-кадхерина и индукции ЭМП [11]. Исследовательская группа Yang и соавт. [213] показала, что в различных клеточных линиях, включая клетки РМЖ, карциномы лёгких, головы и шеи, под действием гипоксии повышается уровень мРНК и белка TWIST. А снижение содержания HIF-1α в клетках в условиях гипоксии приводит к снижению уровня TWIST до исходного, что свидетельствует о том, что HIF-1α - главный регулятор экспрессии TWIST. Они также показали важную роль TWIST в развитии ЭМП, обусловленного гипоксией. Подавление экспрессии TWIST с помощью siRNA в гипоксии приводило к потере клеткой мезенхимальных маркеров и восстановлению эпителиальных маркеров; а индукция метастатического фенотипа, вызванная гиперэкспрессией HIF-1α, снижалась при подавлении TWIST [212, 213]. Транскрипционные факторы семейства SNAIL (Snail1,Snail2/Slug,Snail3/Smuc), наиболее исследованные эффекторы эпителиально-мезенхимального перехода, играют важную роль в опухолевой прогрессии, способствуя миграции и инвазии опухолевых клеток [153]. Было показано, что Snail напрямую подавляет транскрипцию E-кадхерина, связываясь с последовательностью E-Box в промоторе его гена [14]. Эксперименты, проведённые на клеточных линиях рака яичников показывают, что повышение экспрессии Snail в условиях гипоксии сопровождается снижением уровня E-кадхерина и повышением способности клеток к инвазии [92, 115]. Lester и соавт. было показано, что в условиях 1%-го содержания кислорода в атмосфере в клетках рака молочной железы линии MDA-MB-468 повышается экспрессия виментина, снижается уровень E-кадхерина, а Snail транспортируется в ядро [122]. 52 Известно также, что Snail не только способствует клеточной инвазии, но и делает клетки более устойчивыми к некоторым неблагоприятным факторам, в частности голоданию, блокируя клеточный цикл на уровне G1/S чекпойнта, снижая тем самым клеточную пролиферацию [205]. Некоторые экспериментальные данные указывают на то, что важную роль в осуществлении эпителиально-мезенхимального перехода играет сигнальный путь Wnt/βкатенин. Роль этого сигнального пути в канцерогенезе хорошо изучена и состоит в том, что белок Wnt стабилизирует β-катенин, который является мультифункциональным белком, осуществляющим две независимые функции: стабилизацию клеточных контактов и перенос сигналов в ядро. β-катенин связывается с цитоплазматическим доменом Eкадхерина, соединяя его с белками цитоскелета, тем самым закрепляя в мембране. При подавлении экспрессии E-кадхерина в процессе эпителиально-мезенхимального перехода β-катенин высвобождается из комплекса с E-кадхерином, переходя в цитоплазму, где может стабилизироваться посредством Wnt-сигнала и транспортироваться в ядро. В ядре β-катенин выступает в роли кофактора некоторых транскрипционных факторов, запускающих экспрессию генов контроля клеточного цикла [45, 97, 154]. По данным Iqbal и соавт. в условиях гипоксии β-катенин может напрямую взаимодействовать с HIF, регулируя экспрессию гипоксия-зависимых генов, обеспечивая тем самым протективный эффект для клетки [93]. 53 2.6 ЭМП и гормональная зависимость клеток РМЖ Недавно было установлено, что потеря клетками рака молочной железы гормональной зависимости часто сопровождается повышенной инвазией и появлением признаков мезенхимального фенотипа [133]. Как показывают экспериментальные данные, гормональная регуляция ЭМП крайне сложна и запутанна. Результаты многочисленных исследований, касающихся взаимосвязи между гормональным статусом опухоли и ЭМП, весьма противоречивы. Некоторые исследователи показывают, что гормон-резистентные ERα-негативные клетки рака молочной железы часто утрачивают E-кадхерин, а следовательно межклеточные контакты. В отсутствие ERα, возрастает экспрессия Snail1, что приводит к подавлению синтеза E-кадхерина [59]. Другие исследователи показывают, что в ERα-позитивных опухолях эстроген может подавлять экспрессию E-кадхерина [156]. Результаты, полученные в нашей лаборатории, показывают, что Snail1 подавляет экспрессию ERα в клетках РМЖ, способствуя развитию гормональной резистентности [180]. Существуют данные, свидетельствующие о позитивной [190], негативной [128] или отсутствии корреляции между содержанием E-кадхерина и ERα [161]. Как было показано Fujita и соавт. ERα-позитивные и ERα-негативные опухоли демонстрируют очень разную и иногда противоположную корреляцию между ERα, Eкадхерином, Snail1, and MTA3, что обусловлено определённым балансом между ERα и его кофакторами в различных типах РМЖ [59]. В заключение важно отметить, что недостаток кислорода является общей чертой многих солидных опухолей: кровеносные сосуды не успевают за быстро нарастающей 54 клеточной массой. При этом запускается множество адаптивных процессов в клетках, что позволяет им выживать и пролиферировать в неблагоприятных условиях. При недостатке кислорода изменяются многие аспекты клеточного метаболизма и микроокружения. Следствием этих изменений может стать потеря клетками дифференцированного состояния и развитие эпителиально-мезенхимального перехода, а следовательно, повышенной способности к инвазии и метастазированию. В случае опухолей молочной железы гипоксическое микроокружение может способствовать потере гормональной зависимости клеток, а значит, развитию устойчивости к противоопухолевым гормональным препаратам. Все эти данные подчёркивают важность правильной оценки степени гипоксии в опухоли, а также необходимость более полного изучения экспрессии маркеров гипоксии, что позволит выбирать оптимальную схему терапии в каждом конкретном случае заболевания. 55 3 Материалы и методы Список реактивов и производителей 17β-эстрадиол (10-9 М) («Sigma-Aldrich», США) 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ («Sigma-Aldrich», США); O-нитрофенил-b-D-галактопиранозидаза, ONPG (“ThermoScientific”, США); Triton Х-100 («Sigma-Aldrich», США); β-меркаптоэтанол (“Хеликон», Россия); апротинин («Sigma-Aldrich», США); гентамицин (“ПанЭко», Россия); декстран T-60 («Sigma-Aldrich», США); диметилтиазолдифенилтетразолия бромид, МТТ («Sigma-Aldrich», США); дитиотриетол, DTT («Sigma-Aldrich», США); додецилсульфат натирия, SDS («Gibco», PAA, Австрия); закисленный изопропанол («Sigma Aldrich», США); йодистый пропидий, PI («Sigma Aldrich», США); липофектамин («Life Technologies_BRL», США); натрия ортованадат («Sigma-Aldrich», США); нитроцеллюлозные фильтры («Amersham», Великобритания); нонилфеноксиполиэтоксиэтанол, NP-40 («Sigma-Aldrich», США); обезжиренное молоко («Applichem», Германия); олигонуклеотиды («Синтол», Россия); пероксидаза («Amersham», Великобритания); раствор Ponceau S («Sigma-Aldrich», США); раствор Версена («ПанЭко», Россия); раствор Трипсина («ПанЭко», Россия); среда DMEM для культивирования эукариотических клеток («ПанЭко», Россия); 56 стерильные мембраны с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм («Millipore», США); тетрадеканоилфорболацетат, ТРА («Sigma-Aldrich», США) тетраметиэтилендиамин, ТЕМЕD («Sigma-Aldrich», США); фенилметилсульфонилфторид, PMSF («Sigma-Aldrich», США); фосфатно-солевой буфер PBS в таблетках («ПанЭко», Россия); хемилюминесцентный реагент («Amersham», Великобритания); хлорид натрия, NaCl («Химмед», Россия); цитрат натрия («Applichem», Германия); эмбриональная сыворотка телят («Gibco», PAA, Австрия); Оборудование и приборы - анализатор Великобритания), люминесценции Image Quant Las 4000 («GE Healthcare», - камера для вертикального электрофореза Mini VE SE 300 («Hoefer Scientific Instruments», США), - люминометр Tecan infinite M200 Pro («Tecan», Швейцария), - спектрофотометр Multiscan FC («ThermoScientific», США), - спектрофотометр Ultraspec 2100 pro («Аmersham», Великобритания), - центрифуга Eppendorf Centrifuge 5417R («Eppendorf», Германия) - ультразвуковой дезинтегратор “SoniPrep 150 Plus” («MSE», Великобритания) 57 3.1 Культивирование клеток Клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7, описанной впервые в 1970 году [123], и клетки эпителия молочной железы линии HBL-100, описанные в 1982 году [61], были получены из коллекции Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 5%-ную эмбриональную сыворотку телят («Gibco», PAA, Австрия) и гентамицин (50 ед/мл) («Paneco», Россия) при 370С в атмосфере с 5% СО2. Для моделирования условий гипоксии клетки культивировали в двухгазовом СО 2 инкубаторе («Binder») с поддержанием концентрации О2 в пределах 1%. Для создания гипоксия-миметических условий клетки культивировали в присутствии в среде хлорида кобальта [190] в концентрации 200 µМ. Свойство CoCl2 имитировать гипоксию основано на том, что этот металл заменяет железо в активном центре гидроксилаз HIF-1α. Дело в том, что гидроксилазам в качестве кофакторов требуются ионы двухвалентного железа, поэтому при замене ионов железа в активном центре на кобальт, гидроксилазы теряют свою каталитическую активность, что выражается в активации HIF и, следовательно, имитации условий гипоксии [100]. Получение сублинии MCF-7/LS Сублиния MCF-7/LS была получена в результате культивирования клеток родительской линии MCF-7 в бесстероидной среде в течение 4 мес. Бесстероидную сыворотку получали в результате обработки эмбриональной сыворотки активированным углем, покрытым декстраном T-60 («Sigma-Aldrich», США), по модифицированной методике, описанной в работе Provost PR и соавт. [165]. Для этого 100 мл эмбриональной телячьей сыворотки («Gibco») инкубировали с 1 г активированного угля и 2 мл 5 % водного раствора декстрана T-60 в течение 16 ч. 58 при +4ºС при интенсивном перемешивании. Затем смесь центрифугировали 20 мин, 10000 об/мин при +4С (центрифуга «K-24», Германия) и удаляли осажденный уголь. Повторную инкубацию сыворотки с активированным углем, покрытым декстраном, проводили при 20-25С в течение 2,5 ч, . затем сыворотку дважды центрифугировали (20 мин, 10000 об/мин при +4С) и фильтровали на стерильных мембранах Millipore с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм до полного удаления остатков угля. 3.2 МТТ-тест При определении скорости роста клеток был использован стандартный МТТ-тест [110, 142], основанный на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется на спектрофотометре. Клетки культивировали на 24-х луночных планшетах в стандартной среде. Затем определяли количество клеток с помощью МТТ-теста на 3 сутки роста. Для этого клетки дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (PBS), после чего в среду DMEM (Sigma) добавляли МТТ-реагент до конечной концентрации 0,15 мг/мл и добавляли в каждую лунку по 0,2 мл среды с краской. Клетки инкубировали в течение получаса при 37 0С. По завершении инкубации удаляли среду из лунок, и в каждую лунку добавляли 0,2 мл ДМСО. Клетки с ДМСО инкубировали в течение 10 минут с целью освобождения краски из клеток и определяли оптическую плотность экстракта при длине волны 570 нм на спектрофотометре Thermo scientific Multiscan FC. Оптическая плотность жизнеспособных клеток. экстракта прямо пропорциональна количеству 59 3.3 Получение клеточных экстрактов и иммуноблоттинг Клетки на стадии формирования 80% монослоя промывали физиологическим раствором (10 мM Tris-HCl pH7,5; 0,14 M NaCl), снимали с чашек и ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. Затем полученную суспензию центрифугировали 5 мин. при 3 тыс. об./мин (центрифуга Eppendorf 5417R). Надосадочную жидкость сливали и к осадкам добавляли 50 мМ лизирующий Tris-HCl-буфер (pH=7,4), содержащий 1% натрия додецилсульфат (SDS), 1% Игепал CA-630, 0,25% натрия дезоксихолат, 150 мM натрия хлорид NaCl, 1мM ЭДТА, 1мM фенилметилсульфонилфлорид (PMSF); 1 мкг/мл апротинин, 1 мкг/мл леупептин, 1 мкг/мл пепстатин; 1 мM ортованадат натрия и 1 мM натрия фторид NaF [181]. Осадки суспендировали в лизирующем буфере и оставляли на 30 минут на льду при +40С. гомогенных лизатов их обрабатывали Для получения прозрачных ультразвуком на дезинтеграторе “SoniPrep 150 Plus” (MSE) (5 циклов по 10 сек. с амплитудой 2,4), чтобы разрушить длинные фрагменты ДНК. Затем образцы центрифугировали в течение 15 минут при 14 тыс. об/мин. и +4 0С (центрифуга Eppendorf 5417R). После центрифугирования в полученных клеточных экстрактах измеряли концентрацию белка с помощью метода Брэдфорд [20]. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro при длине волны 595 нм. Клеточные экстракты хранили при -700С до проведения дальнейшего анализа. Иммуноблоттинг Электрофорез образцов, содержавших по 60-80 мкг белка, проводили в 10%-ном SDS-полиакриламидном геле (Sigma) в течение 5 часов [210] при стабилизации по 60 напряжению 90 В. Затем белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры (Amersham BS) методом электропереноса [210]. Для оценки эффективности нанесения экстрактов на нитроцеллюлозные фильтры использовали метод окрашивания фильтров раствором Понсо [20]. Для предотвращения неспецифической сорбции фильтры обрабатывали 5% раствором обезжиренного молока (Nestle), затем инкубировали с первичными антителами в течение 3 ч при комнатной температуре или оставляли на ночь в холодильнике при +40С. Использовали антитела к HIF-1α (Millipore), ERα (Sigma-Aldrich Co), HER2/Neu (Cell Signaling Technology). Антитела к β-actin и α-tubulin (Cell Signaling Technology) использовались для контроля эффективности переноса проб на нитроцеллюлозную мембрану и нормирования. Фильтры отмывали, инкубировали 1,5 ч с соответствующими вторичными антителами α-rabbit (Jackson ImmunoResearch Lab.) или α-mouse (GE HealthCare), конъюгированными с пероксидазой. Детекция сигнала производилась на приборе Image Quant LAS 4000 (GE). 3.4 Транзиентная трансфекция Эксперименты по трансфекции клеток проводили в течение 4 ч. с использованием реагента «Metafectene» (Biontex Laboratories GmbH) при 37°С согласно инструкциям производителя. 1) Определение активности гена-репортёра. Для определения транскрипционной активности ERα проводили трансфекцию клеток плазмидой, содержавшей ген-репортер люциферазы под контролем ER-респонсивного элемента (ERE/Luc), плазмида была любезно предоставлена Dr. G.Reid [171]. Для определения транскрипционной активности HIF1α использовали плазмиду HRE/luc, содержащую ген люциферазы под контролем HIF1α-респонсивного элемента ( плазмида 61 любезно предоставлена Dr. Giovanni Melillo)[141, 168]. Для определения трансрепрессорной активности Snail1 в клетки трансфецировали вектор для экспрессии люциферазы под контролем Snail1-респонсивного участка из промотора Е-cadherin; плазмида была любезно предоставлена Dr.Antonio Garcia de Herreros [206]. Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции применялась котрансфекция клеток плазмидой, содержавшей ген β-галактозидазы. Расчет активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах). Все последующие эксперименты на клетках-трансфектантах выполнялись в течение 72 ч после окончания трансфекции. Клетки снимали в физиологическом растворе, осаждали центрифугированием 5 мин. при 2,5 тыс. об./мин. Затем надосадочную жидкость сливали и к осадкам добавляли лизирующий буфер Promega E153A. Осадки суспендировали в лизирующем буфере и оставляли на 30 минут на льду. Затем образцы центрифугировали в течение 20 минут при 14 тыс. об./мин. и +40С (центрифуга Eppendorf 5417R). После центрифугирования в полученных клеточных экстрактах измеряли активность β-галактозидазы по стандартной методике, основанной на использовании в качестве субстрата β-галактозидазы ONPG (O-нитрофенил-b-D-галактопиранозидазы) – бесцветного вещества, сходного по структуре с лактозой. В присутствии β - галактозидазы ONPG разрушается на галактозу и О-нитрофенол, имеющего желтый цвет, интенсивность окраски которого измеряется спектрофотометрически (длина волны 420 нм). Вкратце, к 10-20 мкл образцов добавляли по 253 мкл смеси, содержащей 200 мкл 0,1 М Na2HPO4 pH=7,5 и 50 мкл ONPG (4 мг/мл), 3 мкл кофактора (1 мл кофактора содержит 315 мкл βмеркаптоэтанола, 90 мкл 1 М MgCl2 и 595 мкл Н2О). Пробы инкубировали при 37°С, затем измеряли интенсивность окраски на спектрофотометре Thermo Scientific 62 Multiscan FC при 420 нм, в качестве контроля использовали смесь с 10-20 мкл лизирующего буфера. Активность люциферазы измерялась по стандартному протоколу (Promega) с использованием люциферазного реагента E1501 на люминометре Tecan infinite M200 Pro. Расчет активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах). Плазмиды для трансфекции выделяли с использованием набора Thermo scientific K0503 согласно инструкциям производителя. 2) Трансфекция клеток геном дикого типа Для трансфекции клеток MCF-7 использовалась плазмида, содержащая дикий ген HER2/Neu, любезно предоставленная Dr. Atanasio Pandiella [53] и плазмида, содержащая дикий ген ERα (предоставлена Dr. Craig Jordan, Georgetown University Medical Center). Трансфекцию клеток проводили в течение 4 ч с использованием реагента «Metafectene» (Biontex Laboratories GmbH) при 37°С. В качестве контрольного вектора использовалась плазмида pcDNA3 (Invitrogen). 3) Трансфекция клеток миРНК Для трансфекции малых интерферирующих РНК использовали олигонуклеотиды следующих последовательностей: CAGUCGCGUUUGCGACUGGdTdT scrambled -3’), Snail1 siRNA siRNA (sense 5’- (sense 5`- AGGCCUUCAACUGCAAAUAdTdT -3`), а также соответствующие антисмысловые олигонуклеотиды («Синтол», Россия). Трансфекцию клеток полученными 63 олигонуклеотидами проводили в течение 4 ч с использованием Metafectene (Biontex Laboratories GmbH) при 37°. Конечная концентрация siRNA составляла 50 nМ. 3.5 Трансдукция клеток лентивирусной конструкцией Для исследования влияния гипоксии на активность β-катенина клетки трансдуцировали лентивирусной конструкцией (TCF/LEF reporter), содержащей ген люциферазы под контролем β-катенин-чувствительного промотора (любезно предоставлена В.В.Татарским). Процедура трансдукции лентивирусной конструкции производилась согласно протоколу производителя - компании Quiagen. В первый день клетки рассеивают на 96-луночное плато (примерное 100 µl суспензии на лунку или 0.5-1×104 клеток); на второй день удаляют среду из лунок и добавляют 20 µl суспензии с вектором, доведя общий объём до 50 µl ростовой средой; на третий день заменяют суспензию с вектором на ростовую среду; далее в течение 2 недель клетки обрабатывают антибиотиком пуромицином в конц. 1 µg/ml, чтобы отобрать клетки со стабильной трансдукцией. 3.6 Использование специфического ингибитора β-катенина ICG-001 Для исследования влияния β-катенина на активность определённых генов использовался специфический низкомолекулярный ингибитор β-катенина ICG-001 в конечной концентрации 5 мкМ [50] (любезно предоставлен В.В. Татарским). Известно, что β-катенин в комплексе с транскрипционным фактором TCF (T-cell factor) контролирует экспрессию определённых генов. Активность этого комплекса обеспечивается присоединением к нему коактиватора транскрипции CBP (cyclic AMP response element-binding protein). Ингибитор ICG-001 избирательно связывается с CBP, 64 препятствуя взаимодействию CBP с β-катенином, а следовательно, блокирует экспрессию генов, находящихся под контролем β-катенина [50]. 3.7 Использование активатора β-катенина CHIR 99021 Для активации транскрипционной активности β-катенина использовался реактив CHIR 99021 в концентрации 2*10 -6 М. CHIR 99021 является высоко специфичным ингибитором киназы-3-гликогенсинтазы (Glycogen Synthase Kinase 3, GSK-3). Известно, что GSK-3 фосфорилирует β-катенин, делая его мишенью для протеосомной деградации. При подавлении активности GSK-3 с помощью специфического ингибитора CHIR 99021 останавливается деградация β-катенина, а значит, возрастает его активность в качестве транскрипционного фактора [10]. 65 4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1 Сравнительный анализ выживаемости в условиях гипоксии клеток эстрогензависимого и эстрогенрезистентного рака молочной железы 4.1.1 Рост клеток MCF-7 и HBL-100 в условиях гипоксии Основной целью данной работы явилось исследование взаимосвязи между снижением гормональной зависимости и развитием устойчивости к гипоксии клеток опухолей молочной железы и установление молекулярного механизма толерантности к гипоксии в эстроген-независимых клетках рака молочной железы (РМЖ). Как уже отмечалось, развитие опухолей молочной железы часто связано с потерей клетками гормональной зависимости и, как следствие, потерей чувствительности к гормональной терапии. Развитие гормональной резистентности связано с более агрессивным ростом опухоли, тенденцией к дедифференцировке и повышенной способностью к инвазии и метастазированию [204]. Быстрый рост приводит к развитию внутри солидных опухолей участков гипоксии, что связано с их недостаточной или дефектной васкуляризацией [132]. Следовательно, клеточный ответ на гипоксию и способность клеток вырабатывать определённые стратегии противостояния гипоксии – важные факторы, определяющие развитие опухоли. Несмотря на значительный прогресс в исследовании молекулярного механизма реакции на гипоксию опухолевых клеток, связь между гормональной зависимостью и чувствительностью к гипоксии остается малоизученной. Эксперименты проводились на эстрогензависимых ERα-позитивных клетках аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 и эстрогеннезависимых, ERαнегативных клетках эпителия молочной железы линии HBL-100. Для исследования реакции на гипоксию клетки культивировали в течение 3 суток при нормоксии и в условиях гипоксии (1% кислорода в атмосфере). Анализ скорости роста с помощью МТТ-теста показал, что в условиях гипоксии происходит резкое 66 снижение пролиферации клеток MCF-7 при сохранении относительно устойчивой пролиферации клеток HBL-100 (рис.1). Количество клеток, % 120 контроль 100 гипоксия, 1%О2 80 60 40 20 0 MCF-7 HBL-100 Рис.1 Чувствительность к гипоксии эстроген-зависимых клеток линии MCF-7 и эстроген-независимых клеток линии HBL-100. Представлены результаты MTT-теста, проведенного на 3 сутки культивирования. Эти результаты позволяют предположить, что в эстрогеннезависимых рецепторнегативных клетках срабатывают определённые механизмы, обеспечивающие их толерантность к гипоксии. Это предположение подтвердилось в экспериментах на культуре клеток MCF-7/LS – сублинии, полученной при длительном культивировании родительских клеток MCF-7 в отсутствие эстрадиола, и характеризующейся частичной инактивацией рецептора эстрогенов ERα, способностью к эстрогеннезависимому росту и высоким уровнем экспрессии рецепторов ростовых факторов [129]. Анализ роста клеток MCF-7 и MCF-7/LS показал, что перевод в гипоксию приводит к существенно меньшему торможению пролиферации в клетках MCF-7/LS по сравнению с родительскими клетками (рис.2). 67 120 контроль Количество клеток, % 100 гипоксия, 1%О2 80 60 40 20 0 MCF-7 MCF-7/LS Рис.2 Сравнительный анализ роста клеток MCF-7 и MCF-7/LS в условиях гипоксии Представлены результаты MTT-теста, проведенного на 3 сут. культивирования. Полученные результаты свидетельствуют о том, что развитие гормональной независимости и, следовательно, исключение ERα из цепи передачи митогенного сигнала, сопровождается существенным повышением устойчивости клеток к гипоксии. Мы предполагаем, что активный рецептор эстрогенов можно рассматривать как один из факторов, определяющих высокую чувствительность эстрогензависимых клеток к гипоксии, в то время как потеря ERα (как в клетках HBL-100) или частичная инактивация ERα-зависимых путей (как в клетках MCF-7/LS) приводит к развитию толерантности к гипоксии. 4.1.2 Индукция HIF-1 под действием гипоксии В настоящее время установлено, что ведущая роль при ответе клетки на гипоксию принадлежит нескольким транскрипционным факторам HIFs, которые запускают обширный транскрипционный каскад, напрямую или опосредованно контролирующий экспрессию сотен генов в любой клетке в ответ на гипоксию. HIFs являются частью широко распространенного в различных тканях, универсального механизма детекции 68 уровня кислорода [170]. По данным Sowter et al. в клетках рака молочной железы, так же, как и во многих других типах опухолей, основным маркёром гипоксии, и следовательно, более агрессивного фенотипа, является HIF-1α и его гены-мишени [194]. Связана ли повышенная устойчивость к гипоксии эстрогеннезависимых клеток с повышенной экспрессией HIF-1α? Наши результаты показали, что несмотря на разницу в чувствительности к гипоксии, определение методом иммуноблотинга уровня HIF-1α после суток культивирования в условиях 1% кислорода не выявило его увеличения в клетках HBL-100 по сравнению с MCF-7 (рис.3). Рис.3 Влияние гипоксии на содержание HIF-1α в клетках MCF-7 и HBL-100. Содержание HIF-1α определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из нескольких независимых экспериментов. Иммуноблоттинг. Таким образом, высокая устойчивость к гипоксии клеток HBL-100 не связана с повышенным уровнем HIF-1α, и обусловлена, скорее всего, действием других факторов, участвующих в развитии реакции клеток на гипоксию. 4.1.3 Влияние гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ERα Каким образом наличие функционирующего рецептора в клетках делает их более чувствительными к гипоксии? Для ответа на этот вопрос необходимо выяснить, что 69 происходит с рецептором в условиях недостатка кислорода. Какую роль играет сам рецептор в клеточной реакции на гипоксию? Мы провели исследование содержания рецептора эстрогенов ERα в клетках MCF-7 в нормальных условиях и в условиях гипоксии – при снижении содержания кислорода в атмосфере до 1%. Результаты, полученные методом иммуноблоттинга, показали выраженную гипоксия-зависимую деградацию ERα через 24 часа культивирования в условиях гипоксии (рис.4). Рис.4 Влияние гипоксии на содержание ERα в клетках линии MCF-7. Содержание ERα определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Сходные данные были получены и при имитации условий гипоксии в присутствии 200 µМ хлорида кобальта (II), добавляемого к клеткам на 24 часа (рис. 5). Рис.5 Влияние CoCl2 на содержание ERα в клетках линии MCF-7. 70 Содержание ERα определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Эти результаты подтвердились при изучении активности ERα методом репортёрного анализа, продемонстрировавшим снижение транскрипционной активности ERα после культивирования клеток в течение 24 часов в условиях гипоксии (рис.6) или в 500 1000 контроль гипоксия, 1%О2 0 активность люциферазы (ERE/Luc), усл.ед. присутствии хлорида кобальта (II)(рис.7). MCF-7 Рис.6 Влияние гипоксии на транскрипционную активность ERα в клетках MCF-7. Клетки культивировались в условиях гипоксии (1% О2) в течение суток после трансфекции. Репортёрный анализ. Активность люциферазы (ERE/Luc) Усл.ед. 1500 контроль 1000 500 0 MCF-7 CoCl2 71 Рис.7 Влияние гипоксия-миметика CoCl2 на транскрипционную активность ERα в клетках MCF-7. Клетки культивировались в присутствии гипоксия-миметика CoCl2 в конц. 200 µM в течение суток после трансфекции. Репортёрный анализ. Полученные нами результаты подтверждают известные данные о возможности деградации рецептора эстрогенов в условиях гипоксии. Так, схожие тенденции были продемонстрированы в работе J. Kurebayashi и соавт. [113] на модели клеточных линий РМЖ ML-20 и KPL-1 [113]. Клетки ML-20 являются субпопуляцией клеточной линии MCF-7, эстроген-зависимой in vitro и in vivo. В противоположность, клеточная линия KPL-1 является эстроген-чувствительной in vitro, но эстроген-резистентной in vivo. Эти авторы показали, что гипоксия значительно снижает экспрессию и активность ERα в зависимости от времени культивирования в условиях 1% О2. Исследования, проведённые M.Stoner [198] на ERα-положительной эстрогенчувствительной клеточной линии РМЖ ZR-75 показали, что снижение активности ERα в условиях гипоксии и при культивировании клеток с хлоридом кобальта связано прежде всего с протеосомной деградацией этого белка. В экспериментах на клеточных линиях MCF-7 и T47D было установлено, что в условиях гипоксии развитие гормональной резистентности связано не только с протеосомной деградацией рецептора, но и с подавлением транскрипции гена Esr1 [176] . По данным клинико-лабораторных исследований, в образцах РМЖ пониженный уровень ERα наблюдается в перинекротических областях опухоли и коррелирует с повышенной экспрессией маркёров гипоксии, таких как CA-IX и Glut-1 [39]. Однако наши данные о снижении активности ERα в гипоксии частично противоречат наблюдениям Yi и соавт. [215]. Авторы этого исследования провели трансфекцию эмбриональных клеток почки человека HEK293 (ERα-) плазмидой с геном ERα дикого типа и репортерной конструкцией с эстроген-чувствительными элементами. 72 Эстрадиол и гипоксия приводили к росту активности ERα в этой модели, а их комбинация вызывала значительный синергетический эффект: обнаружено увеличение активности ERα более чем в 10 раз по сравнению с контрольными клетками. Основываясь на этих данных, авторы делают вывод об активации ERα в условиях гипоксии. В работе Yi et al. также используют линию клеток MCF-7, однако репортерный анализ на этих клетках не проведен, и авторы ограничились лишь анализом уровня белка ERα. По-видимому, снижение активности ERα в гипоксии, продемонстрированное в нашей работе и подтвержденное в ряде исследований [114, 176, 198], является тканеспецифичным и не воспроизводится на клеточных моделях другого генеза с экзогенным ERα. Таким образом, полученные нами результаты, как и данные ряда исследователей, демонстрируют эффект снижения экспрессии и активности рецептора эстрогена ERα в клетках РМЖ в условиях гипоксии, что позволяет рассматривать гипоксия-зависимую деградацию ERα в качестве одного из факторов, определяющих сравнительно высокую чувствительность гормонзависимых опухолей молочной железы к гипоксии. 4.2 Гипоксия и эстрогеннезависимые сигнальные пути 4.2.1 Влияние гипоксии на уровень HER2/Neu В литературе неоднократно отмечалось, что в условиях гипоксии не только не снижается, но может и возрастать активность рецепторов белково-пептидных факторов, в частности EGFR, Her2/Neu, IGFR, контролирующих пролиферацию эстрогеннезависимых клеток [87]. Предполагается, что рецепторы ростовых факторов находятся под позитивным контролем со стороны HIF-1/2 [51, 58, 65, 87], хотя некоторые исследователи указывают также на независимую от HIF активацию трансмембранных рецепторов 73 ростовых факторов в условиях гипоксии [106, 146]. Мы исследовали динамику накопления в клетках Her2/Neu – белка из семейства рецепторов ЭФР. С этой целью была проведена трансфекция клеток MCF-7 плазмидой, содержащей дикий вариант гена Her2/Neu, с последующим определением уровня Her2/Neu в условиях нормоксии и гипоксии. Результаты показали, что в отличие от ERα, уровень Her2/Neu практически не изменяется в условиях гипоксии, оставаясь на прежнем уровне (рис.8). Рис.8 Влияние гипоксии на содержание HER2/Neu в клетках MCF-7. Содержание HER2/Neu определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Вероятно, экспрессия в эстрогеннезависимых клетках подобных тирозинкиназных рецепторов, малочувствительных к гипоксии, может частично поддерживать рост таких клеток в условиях гипоксии – в отличие от эстрогензависимых клеток, пролиферация которых преимущественно регулируется через аппарат рецепторов эстрогенов. Наши данные об устойчивости белка HER2/neu к гипоксическим условиям дополняют результаты Dragowska и соавт. [48] о действии гефитиниба на ER- положительные опухоли с повышенной экспрессией HER2/neu у мышей. Известно, что основной мишенью для гефитиниба являются EGFR-положительные клетки, где этот препарат ингибирует EGFR и частично подавляет активность тирозинкиназы HER2/neu. В экспериментах, проведенных Dragowska и соавт. [48], гефитиниб снижал активность 74 EGFR, HER2/neu и МАP-киназ Erk1/2 и вызывал реоксигенацию опухолевой ткани у мышей. В статье аналогичной тематики Hardee и соавт. [79] предлагается использовать трастузумаб (ингибитор HER2/neu) в качестве индуктора оксигенации опухолевой ткани; ожидается, что повышенный уровень кислорода сенсибилизирует опухоли к химио- и радиотерапии. На моделях in vitro, по-видимому, возникает регуляторная петля: с одной стороны HER2/neu сигнальный путь обеспечивает гипоксию в опухолевой ткани, с другой – гипоксия стимулирует через HIF-1α активность тирозин-киназы HER2/neu. Наличие положительной обратной связи между белками HER2/neu и HIF-1α делает в ряде случаев неэффективной таргетную монотерапию такими препаратами как гефитиниб, эрлотиниб, трастузумаб и др., что может быть преодолено только с помощью мультитаргетных подходов, включающих одновременное ингибирование различных сигнальных мишеней (рецепторных тирозинкиназ, MAP-киназ, PI3K, mTOR, ароматазы и др.). Клинические испытания таких комбинированных схем терапии РМЖ, проведенные за последние годы, показывают перспективность таких подходов [102, 136, 183], [13]). 4.2.2 Гипоксия и белок Snail1. Значение Snail1 в регуляции выживаемости клеток в условиях гипоксии 4.2.2.1 Влияние плотности культивируемых in vitro клеток на чувствительность к гипоксии Недавно было установлено, что потеря клетками рака молочной железы гормональной зависимости часто сопровождается появлением признаков эпителиальномезенхимального перехода, что обеспечивает развитие более агрессивного и устойчивого фенотипа. Fujita и соавт. было показано, что гормон-резистентные ERα-негативные клетки часто утрачивают E-кадхерин, а следовательно, межклеточные контакты, что способствует развитию клеточной мобильности [59]. 75 Задачей следующего этапа эксперимента было выяснить, может ли ослабление клеточных контактов обеспечить устойчивость к гипоксии. Анализ скорости роста клеток после перевода в условия гипоксии показал, что в случае исходно высокой плотности клеток, не менее 60% монослоя, гипоксия приводит к существенному торможению роста клеток. В то же время при низкой плотности культуры, около 30% монослоя, рост-ингибирующий эффект гипоксии становится заметно менее выраженным (рис.9). Рис.9 Влияние плотности посева клеток MCF-7и HBL-100 на чувствительность к гипоксии: рост клеток в условиях гипоксии при высокой и низкой плотности культуры. Представлены результаты МТТ-теста, проведённого на 3 сутки культивирования в условиях 1% О2. Какую роль играют при этом клеточные контакты? Нельзя было исключить, что высокая плотность клеток тормозит их рост не за счет увеличения клеточных контактов, но вследствие истощения культуральной среды и накопления токсических метаболитов. Для исследования роли клеточных контактов в обеспечении реакции на гипоксию были проведены эксперименты по культивированию клеток на специальных вставках (Nunc Cell Culture Inserts), позволяющих в два раза увеличить культуральную поверхность лунок 24луночного планшета при сохранении неизменными общего количества клеток и объема 76 среды. Результаты показали, что снижения плотности клеток с помощью вставок достаточно для увеличения устойчивости к гипоксии, что свидетельствует о ведущем значении межклеточных взаимодействий в регуляции ответа клеток на гипоксию (рис.10). 120 контроль Количество клеток, % 100 гипоксия, 1%О2 80 60 40 20 0 без вставки со вставкой Рис.10 Влияние плотности посева клеток MCF-7 на чувствительность к гипоксии: рост клеток в условиях гипоксии при посеве на дополнительные вставки; Представлены результаты анализа MTT, проведенного на 3 сут. культивирования в условиях 1% О2; 4.2.2.2 Участие Snail1 в регуляции чувствительности клеток к гипоксии (эксперименты проводились совместно с О.Е.Андреевой) Известно, что одним из ключевых факторов развития эпителиально- мезенхимального перехода является белок Snail1. По данным ряда исследователей, Snail1 напрямую подавляет транскрипцию E-кадхерина - основного белка клеточных контактов [14]. Эксперименты, проведённые T. Imai и соавт. и N. Kurrey и соавт. на клеточных линиях рака яичников показывают, что повышение экспрессии Snail1 в условиях гипоксии сопровождается снижением уровня E-кадхерина и повышением способности клеток к инвазии [92, 115]. Предположительно Snail1 вовлечён в развитие гормональной резистентности клеток РМЖ [180]. Также существуют данные о том, что Snail1 не только 77 способствует клеточной инвазии, но и делает клетки более устойчивыми к некоторым неблагоприятным факторам [205]. Ранее мы показали, что эстроген-независимые клетки HBL-100 отличаются высоким содержанием Snail1 по сравнению с эстроген-зависимыми клетками MCF-7. При этом гипоксия не меняет значительно содержание этого белка в клетках (рис 11.), но приводит к значительному повышению трансрепрессорной активности Snail1, что показывает репортёрный анализ (рис. 12). Для определения активности Snail1 использовалась плазмида, содержащая ген люциферазы под контролем Snail1-связывающего участка промотора гена E-кадхерина. Эти результаты позволяют предположить, что Snail1 играет определённую роль при ответе клеток на гипоксию. Рис.11. Влияние гипоксии на содержание Snail1 в клетках MCF-7 и HBL-100. Содержание Snail1 определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты 500 1000 1500 Контроль Гипоксия 1%О2 0 Активность люциферазы E-cad/luc,отн.ед. одного из трёх независимых экспериментов. Иммуноблоттинг. MCF-7 HBL-100 Рис.12 Влияние гипоксии на трансрепрессорную активность Snail1 78 в клетках MCF-7 и HBL-100. Снижение активности люциферазы соответствует повышению трансрепрессорной активности Snail1. Репортёрный анализ. Необходимо было выяснить, насколько устойчивость к гипоксии в клетках HBL-100 связана с повышенным содержанием в них Snail1. Результаты анализа содержания Snail1 методом иммуноблоттинга (рис.13) и определения активности Snail1 методом репортерного анализа (рис.14) показали заметное увеличение экспрессии и активности этого белка при снижении плотности клеток, причём этот эффект в большей степени проявлялся в эстроген-независимых клетках HBL-100. Рис.13 Содержание Snail1 в клетках MCF-7 и HBL-100 при различной плотности посева. Высокая плотность – 1*10 3 клеток/на лунку, средняя плотность – 0,6*10 3 клеток/на лунку, низкая плотность – 0,3*10 3 клеток/на лунку. Содержание Snail1 определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг. 79 100 200 300 400 низкая плотность 0 Активность люциферазы E-cad/luc,отн.ед. 500 высокая плотность MCF-7 HBL-100 Рис.14 Трансрепрессорная активность Snail1 при различной плотности посева: Снижение активности люциферазы соответствует повышению трансрепрессорной активности Snail1. Репортёрный анализ. Мы предположили, что Snail1 в условиях гипоксии проявляет протективный эффект и может являться одним из факторов устойчивости клеток. Для подтверждения протективной роли Snail1 в регуляции ответа клеток на гипоксию была использована методика подавления экспрессии Snail1 с помощью короткой интерферирующей РНК. Было установлено, что подавление Snail1 приводит к увеличению чувствительности клеток HBL-100 к гипоксии, что свидетельствует об участии этого белка в поддержании выживаемости клеток (Рис.15). количество выживших клеток, % контроль гипоксия, 1%О2 100 50 0 si-scrambl si-Snail 80 Рис.15 Влияние трансфекции siRNA Snail1 на чувствительность клеток HBL-100 к гипоксии. Представлены результаты МТТ-теста, проведённого на 3 сутки культивирования клеток в условиях 1% О2. 4.2.3. Взаимоотношения между Snail1 и ERα (Эксперименты проводились совместно с О.Е.Андреевой.) Существует ли взаимосвязь между активностью Snail1 и наличием в клетках функционирующего рецептора эстрогенов? Согласно литературным данным, результаты многочисленных исследований, касающихся взаимосвязи между гормональным статусом опухоли и экспрессией Snail1, довольно противоречивы. Так, Fujita и соавторы показали, что гормон-резистентные ERα-негативные клетки часто утрачивают E-кадхерин, а следовательно, межклеточные контакты. Гормональная регуляция E-кадхерина осуществляется посредством МТА3 (Metastasis-associated protein 3). Известно, что в клетках РМЖ MTA3 подавляет экспрессию Snail1, поддерживая дифференцированный эпителиальный фенотип в клетках РМЖ. Биосинтез MTA3 возможен при наличии в клетке функционирующих рецепторов ERα и эстрогена. Следовательно, в отсутствие ERα, а значит, и MTA3, возрастает экспрессия Snail1, что приводит к подавлению синтеза Eкадхерина, и следовательно, ослаблению межклеточных контактов и развитию ЭМП [59]. Эти данные согласуются с нашими результатами относительно высокой экспрессии Snail1 в рецептор-негативных клетках линии HBL-100. Существуют и противоположные экспериментальные данные, согласно которым эстроген может подавлять экспрессию E-кадхерина в ERα-позитивных опухолях [156]. Некоторые авторы свидетельствуют о позитивной [190], негативной [128] или отсутствии корреляции между содержанием E-кадхерина и ERα [161]. Согласно этим экспериментальным данным, ERα-позитивные и ERα-негативные опухоли демонстрируют 81 очень разную и иногда противоположную корреляцию между активностью ERα, Eкадхерина, Snail1 и MTA3 [59], что обусловлено определённым балансом между ERα и его кофакторами в различных типах РМЖ. Чтобы исследовать влияние ERα на активность Snail1 в нашей экспериментальной модели, мы трансфецировали клетки HBL-100 плазмидой, содержащей ген дикого типа ERα. Результаты показали, что трансфекция ERα приводит к заметному подавлению трансрепрессорной активности Snail1 при отсутствии выраженных изменений в 2000 контроль 500 1000 1500 ER alpha 0 акт-ть люциф. (E-cad/luc), усл.ед. содержании белка, что свидетельствует об участии ERα в негативной регуляции Snail1 на HBL-100 эпигеномном уровне (рис.16,17). Рис.16 Влияние трансфекции клеток HBL-100 плазмидой, содержащей ген дикого типа ERα, на трансрепрессорную активность Snail1. Репортёрный анализ. 82 Рис.17 Влияние трансфекции клеток HBL-100 плазмидой, содержащей ген дикого типа ERα, на экспрессию Snail1. Содержание Snail1 определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг. Представленные данные свидетельствуют о том, что высокий уровень Snail1 является одним из факторов, поддерживающих выживаемость клеток рака молочной железы в условиях гипоксии; при этом активация Snail1 может быть связана, в частности, со снижением активности рецептора эстрогенов (ERα), участвующего в негативной регуляции Snail1. 4.2.4. Участие кадхерин-катенинового сигнального пути в реакции клеток на гипоксию Следующим этапом исследования стало изучение протективной функции Snail1. Важно было установить, какие молекулярные механизмы, опосредуемые Snail1, обеспечивают толерантность рецептор-негативных клеток к гипоксии. Для этого мы провели из анализ содержания в клетках Е-кадхерина – одного основных трансмембранных белков, находящихся под негативным контролем Snail1. Как и ожидалось, уровень Е-кадхерина в клетках HBL-100 оказался резко снижен по сравнению 83 с клетками MCF-7 (рис.18), при этом гипоксия практически не влияла на содержание Екадхерина (рис.19 ). Рис.18 Содержание Е-кадхерина в клетках MCF-7 и HBL-100. Содержание Е-кадхерина определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трёх независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Рис. 19 Влияние гипоксии на содержание Е-кадхерина в клетках MCF-7. Содержание Е-кадхерина определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трёх независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Известно, что Е-кадхерин закрепляется в мембране посредством β-катенина – мультифункционального белка, который помимо стабилизации клеточных контактов, выполняет функцию транскрипционного фактора. β-катенин связывается с цитоплазматическим доменом E-кадхерина, соединяя его с белками цитоскелета, тем самым закрепляя в мембране. При подавлении экспрессии E-кадхерина в процессе эпителиально-мезенхимального перехода β-катенин высвобождается из комплекса с Eкадхерином, переходя в цитоплазму, где может стабилизироваться посредством Wnt- 84 сигнала и транспортироваться в ядро. В ядре β-катенин выступает в роли кофактора некоторых транскрипционных факторов, запускающих экспрессию генов контроля клеточного цикла [45, 97, 154]. Для исследования влияния Snail1-сигналинга на транскрипционную активность βкатенина была проведена трансдукция клеток линии MCF-7 репортёрной конструкцией, содержащей ген люциферазы под контролем β-катенин - чувствительного промотора. Для стимуляции транскрипционной активности β-катенина использовался специфический активатор β-катенина CHIR99021 в концентрации 2*10-6 М. Далее использовалась методика подавления экспрессии Snail1 с помощью коротких интерферирующих РНК. Результаты показали, что снижение активности Snail1 значительно подавляет экспрессию ропортёрного гена в клеточной линии MCF-7, что свидетельствует об участии Snail1сигналинга в позитивной регуляции β-катенина как транскрипционного фактора. (Рис. 4000 8000 si-scramled si-Snail1 0 Активность люциферазы (бета-катенин/Luc), усл.ед. 20). MCF-7 Рис. 20. Влияние трансфекции siRNA Snail1 на транскрипционную активность β-катенина. Репортёрный анализ. 85 В работах некоторых исследователей показано, что в условиях гипоксии β-катенин может напрямую взаимодействовать с HIF1, регулируя экспрессию гипоксия-зависимых генов, обеспечивая тем самым протективный эффект для клетки [93]. Для того, чтобы исследовать влияние гипоксии на активность β-катенина, клетки линии MCF-7, содержащие репортерную конструкцию с геном люциферазы под контролем β-катенин - чувствительного промотора, культивировали в условиях гипоксии. Полученные результаты продемонстрировали выраженное увеличение транскрипционной активности β-катенина через 5-6 ч. культивирования в условиях гипоксии (рис.21), 10000 20000 контроль гипоксия, 1%О2 0 Активность люциферазы (бета-катенин/Luc), усл.ед. 30000 развивающееся параллельно с активацией Snail1. MCF-7 Рис.21. Влияние гипоксии на транскрипционную активность β-катенина. Клетки культивировались в условиях гипоксии (1% О2) 6 часов после трансфекции. Репортёрный анализ. К настоящему времени в литературе описано несколько предполагаемых вариантов участия β-катенина в регуляции ответа клеток на гипоксию. Один из таких путей может заключаться во взаимодействии β-катенина с гипоксия-респонсивным элементом (hypoxia response element, HRE) промоторов HIF-1-зависимых генов [93, 120]. Мы исследовали влияние β-катенина на активность репортерной плазмиды, содержащей ген люциферазы под контролем HRE. Результаты показали, что уровень активации репортерной плазмиды под действием гипоксии существенно ослабляется в присутствии специфического низкомолекулярного ингибитора β-катенина – ICG-001 (рис.22), что свидетельствует о 86 непосредственном участии β-катенина в регуляции HIF-1-зависимых генов в клетках рака 3000 контроль 1000 2000 гипоксия, 1%О2 0 активность люциферазы (HRE/luc), усл.ед. молочной железы. - + ICG-001 Рис.22 Влияние ингибитора β-катенина ICG-001 на активность гипоксияреспонсивного элемента (HRE). Репортерный анализ. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что потеря клетками РМЖ гормональной зависимости может сопровождаться развитием повышенной устойчивости опухолей к гипоксии. В основе этого эффекта лежит целый комплекс факторов, некоторые из которых нам удалось установить. В их числе – активация в эстрогеннезависимых клетках митогенного сигналинга, инициируемого рецепторами ростовых факторов – которые, в отличие от рецепторов эстрогенов, более устойчивы к гипоксии (рис.8). Среди эстрогеннезависимых путей, активируемых в клетках при потере рецептора, выраженный протективный, антигипоксический эффект продемонстрировал Snail/β-катенин-сигнальный путь, обычно находящийся под негативным контролем со стороны рецептора эстрогенов. Мы показали, что протективный эффект Snail1 в эстрогеннезависимых клетках может обеспечиваться активацией β-катенин-сигнального пути, непосредственно регулирующего гипоксия-зависимые гены. Полученные данные свидетельствуют о том, что высокий уровень Snail1 является одним из факторов, 87 поддерживающих выживаемость клеток рака молочной железы в условиях гипоксии, что позволяет рассматривать Snail1 в качестве перспективной мишени таргетной противоопухолевой терапии эстрогеннезависимого рака молочной железы. Мы рассматриваем полученные результаты как базу для дальнейших исследований, целью которых является изучение механизма адаптации опухолевых клеток к гипоксии и разработка на основе полученных данных новых подходов чувствительности злокачественных опухолей к антиангиогенной терапии. к повышению 88 5 Заключение Известно, что общей чертой многих солидных опухолей является ограниченное снабжение кислородом, вызванное недостатком кровеносных сосудов и их дефектной структурой [22]. Гипоксические области довольно часто обнаруживаются и в опухолях молочной железы [43, 112]. В настоящее время для лечения опухолей молочной железы в клинике успешно используется гормональная терапия, однако следует отметить, что гормональная зависимость опухоли является динамическим явлением и зависит от особенностей микроокружения клеток и, в частности, содержания в них кислорода. Накопленные к настоящему моменту клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что опухолевые клетки, находящиеся под давлением гипоксии, проявляют повышенную резистентность к гормональной терапии и хуже поддаются радиотерапии [147], в связи с чем гипоксию рассматривают как один из факторов опухолевой прогрессии и развития лекарственной устойчивости. В настоящей работе мы исследовали сигнальные пути, ответственные за выживаемость клеток РМЖ в условиях гипоксии. Мы показали, что гормон-резистентные клетки РМЖ проявляют повышенную устойчивость к гипоксии по сравнению с гормонзависимыми клетками. Эта устойчивость обеспечивается комплексом факторов, некоторые из которых нам удалось установить. Мы показали, что в условиях гипоксии в эстроген-зависимых клетках довольно быстро деградирует рецептор эстрогенов ERα, при том, что содержание и активность фактора Her2/Neu – белка из семейства рецепторов ЭФР - при гипоксии не снижается. Мы предполагаем, что такая разница в устойчивости этих факторов и определяет большую чувствительность к гипоксии эстроген-зависимых клеток, пролиферация которых опосредована ERα. Дело в том, что быстрая деградация ERα предполагает выключение 89 эстроген-зависимых митогенных сигнальных путей, и, следовательно, остановку пролиферации при гипоксии. Наши результаты позволяют предположить, что рецепторнегативные клетки более устойчивы в этих условиях по причине активации в них эстроген-независимых митогенных сигнальных путей, опосредованных в частности Her2/Neu, который при гипоксии сохраняет свою активность. Наши данные согласуются с данными ряда других исследователей, которые отмечают, что гипоксия не только не снижает, но в некоторых случаях стимулирует активность рецепторов белково- пептидных факторов роста, таких как EGFR, Her2/Neu, IGFR [51, 65, 87] . На следующем этапе работы мы исследовали значение отдельных эстрогеннезависимых сигнальных путей в поддержании роста клеток РМЖ в условиях гипоксии. Известно, что развитие гормональной резистентности в клетках РМЖ часто сопровождается появлением признаков эпителиально-мезенхимального перехода [59]. Одним из ключевых факторов эпителиально-мезенхимального перехода является белок Snail1, содержание которого, по нашим данным, гораздо выше в эстроген-независимых клетках РМЖ. Это согласуется с данными некоторых исследователей, которые отмечают, что ERα участвует в негативной регуляции экспрессии Snail1 [59], а следовательно, в эстроген-независимых клетках при отсутствии рецептора эстрогенов экспрессия Snail1 возрастает. В наших экспериментах подавление активности Snail1 с помощью siRNA приводило к снижению устойчивости эстроген-независимых клеток к гипоксии. Данный эффект указывает на важную роль Snail1 при адаптации клеток к условиям дефицита кислорода. Последующие этапы нашего исследования показали, что протективный эффект Snail1 частично опосредован активацией β-катенин-сигнального пути. Известно, что Snail1 подавляет экспрессию Е-кадхерина - основного белка клеточных контактов [14]. Согласно нашим данным, в эстроген-независимых клетках линии HBL-100 с повышенным 90 содержанием Snail1 уровень Е-кадхерина значительно ниже, чем в эстроген-зависимых клетках линии MCF-7. Е-кадхерин закрепляется в клеточной мембране посредством βкатенина – белка, который помимо стабилизации клеточных контактов, выполняет функцию транскрипционного фактора. При снижении уровня Е-кадхерина в клетках βкатенин высвобождается из комплекса с Е-кадхерином и может транспортироваться в ядро, где выполняет роль траскрипционного фактора, ответственного за регуляцию некоторых генов контроля клеточного цикла [45, 97, 154]. Мы показали, что в условиях гипоксии активность β-катенина в клетках возрастает (рис.18). Согласно литературным данным, β-катенин может контролировать клеточный ответ на гипоксию, взаимодействуя с гипоксия-респонсивными элементами (HRE) промоторов HIF-1-зависимых генов [93, 120]. Полученные нами результаты подтверждают эти данные. Мы исследовали влияние β-катенина на активность репортерной плазмиды, содержавшей ген люциферазы под контролем HRE. Уровень активации репортерной плазмиды под действием гипоксии существенно снижался в присутствии специфического ингибитора β-катенина, что свидетельствует о непосредственном участии β-катенина в регуляции HIF-1-зависимых генов в клетках рака молочной железы. Итак, мы продемонстрировали, что гормональная зависимость клеток РМЖ снижает их шансы на выживание и пролиферацию в условиях гипоксии, в то время как гормональная резистентность обеспечивает относительную устойчивость клеток к гипоксии. Наши экспериментальные данные показали, что этот эффект может быть связан с активацией в клетках транскрипционного фактора Snail1, основного белка эпителиально-мезенхимального перехода, экспрессия которого предположительно негативно регулируется ERα (рис.16). Мы показали, что протективный эффект Snail1 в эстрогеннезависимых клетках может обеспечиваться активацией β-катенин-сигнального пути, непосредственно регулирующего гипоксия-зависимые гены. 91 Обобщая полученные результаты, можно говорить о том, что высокий уровень Snail1 является одним из факторов, поддерживающих выживаемость клеток рака молочной железы в условиях гипоксии. Эти данные позволяют рассматривать Snail1 и β -катенин в качестве перспективных прогностических факторов чувствительности опухолей молочной железы к антиангиогенной терапии, а также – как потенциальные мишени таргетной противоопухолевой терапии рака молочной железы. 92 6 Выводы 1. Эстрогеннезависимые клетки РМЖ линии HBL-100 и сублинии MCF-7/LS проявляют большую жизнеспособность в условиях гипоксии по сравнению с эстрогензависимыми клетками РМЖ линии MCF-7. 2. Несмотря на разницу в чувствительности к гипоксии, содержание фактора HIF-1α через 24 час культивирования в условиях 1% кислорода в клетках линии HBL-100 не возрастает по сравнению с таковым в клетках линии MCF-7. Предположительно, высокая устойчивость к гипоксии клеток HBL-100 не связана с повышенным уровнем HIF-1α и обусловлена действием других факторов, участвующих в развитии реакции клеток на гипоксию. 3. Гипоксия способствует деградации рецептора эстрогенов ERα в эстроген-зависимых клетках линии MCF-7. Наличие в клетках активного ERα можно рассматривать в качестве фактора, определяющего высокую чувствительность к гипоксии эстрогензависимых клеток. 4. Уровень Her2/Neu – одного из основных эстрогеннезависимых митогенных факторов клеток рака молочной железы – не изменяется в условиях гипоксии, свидетельствуя о способности HER2/Neu частично поддерживать рост клеток в условиях гипоксии. 5. Снижение плотности клеток MCF-7 в культуре повышает их устойчивость к гипоксии, что указывает на важную роль клеточных контактов в реакции клеток на пониженное содержание кислорода в среде. 93 6. Относительная устойчивость к гипоксии клеток в низкой плотности, как и толерантность к гипоксии эстрогеннезависимых клеток коррелируют с высоким содержанием Snail1. Подавление Snail1 приводит к увеличению чувствительности клеток к гипоксии, что свидетельствует об участии Snail1 в поддержании выживаемости клеток. 7. Протективный антигипоксический эффект Snail1 предположительно опосредован активацией β-катенин-сигнального пути, непосредственно регулирующего гипоксиязависимые гены. 8. В целом, полученные результаты свидетельствуют, что потеря клетками рака молочной железы гормональной зависимости может сопровождаться повышенной устойчивостью опухолей к гипоксии; при этом выживаемость клеток рака молочной железы в условиях гипоксии регулируется с участием Snail1/бета-катенин-сигнального пути, что позволяет рассматривать эти белки в качестве перспективных прогностических факторов чувствительности опухолей к антиангиогенной терапии. 94 95 7 Литература 1. Берштейн, Л. М. Онкоэндокринология. Традиции, современность и перспективы / Л.М.Берштейн. – СПб.: Наука, 2004. - 340 с. 2. Давыдов,М.А. Злокачественные заболевания в России и странах СНГ / М.И.Давыдов, Е.М.Аксель. – М.: Медицинское информационное агентство. -2004 3. Красильников,М.А. Современные подходы к изучению механизма эстрогеннезависимого роста опухолей молочной железы / М.А.Красильников // Вопросы онкологии.– 2004.-Т. 50, № 4 - С.399-405. 4. Рак молочной железы / ред. Н.Е.Кушлинский, С.М.Портной, К.П.Лактионов. М.: Издательство РАМН, 2005. – 480 с. 5. Клиническая маммология (Практическое руководство) / ред. М.И.Давыдов, В.П.Летягин. – М.: АБВ – пресс, 2010. – 154 с. 6. Летягин, В. П. (2005) Первичные опухоли молочной железы. Практическое руководство по лечению/ В.П.Летягин. - М.: Миклош, 2005. - 332 с. 7. Cancer Medicine / Editors R.C.Bast Jr, D.W.Kufe, R.E.Polloc et al. -London: B.C. Decker Inc., 2000, 2546 p. 8. Posttranscriptional gene regulation by RNA-binding proteins during oxidative stress: implications for cellular senescence / K.Abdelmohsen, Y.Kuwano, H.H.Kim, M.Gorospe // Biol Chem.– 2008.-Vol. 389, № 3 - P.243-255. 9. Adams, B.D. The micro-ribonucleic acid (miRNA) miR-206 targets the human estrogen receptor-alpha (ERalpha) and represses ERalpha messenger RNA and protein expression in breast cancer cell lines / B.D.Adams, H.Furneaux, B.A.White // Mol Endocrinol.– 2007.-Vol. 21, № 5 - P.1132-1147. 10. Discovery of Potent and Highly Selective Inhibitors of GSK3b / W.F.An, A.R.Germain, J.A.Bishop et al. // In Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program, Bethesda (MD). – 2010. 11. Induction of EMT by twist proteins as a collateral effect of tumor-promoting inactivation of premature senescence / S.Ansieau, J.Bastid, A.Doreau et al. // Cancer Cell.– 2008.-Vol. 14, № 1 - P.79-89. 12. Pattern of hormone receptor status of secondary contralateral breast cancers in patients receiving adjuvant tamoxifen / T.Bachleitner-Hofmann, B.Pichler-Gebhard, M.Rudas et al. // Clin Cancer Res.– 2002.-Vol. 8, № 11 - P.3427-3432. 96 13. Everolimus in postmenopausal hormone-receptor-positive advanced breast cancer / J.Baselga, M.Campone, M.Piccart et al. // N Engl J Med.– 2012.-Vol. 366, № 6 - P.520529. 14. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells / E.Batlle, E.Sancho, C.Franci et al. // Nat Cell Biol.– 2000.-Vol. 2, № 2 P.84-89. 15. Hypoxia up-regulates hypoxia-inducible factor-1alpha transcription by involving phosphatidylinositol 3-kinase and nuclear factor kappaB in pulmonary artery smooth muscle cells / R.S.Belaiba, S.Bonello, C.Zahringer et al. // Mol Biol Cell.– 2007.-Vol. 18, № 12 - P.4691-4697. 16. Bensinger, S.J. New aspects of the Warburg effect in cancer cell biology / S.J.Bensinger, H.R.Christofk // Semin Cell Dev Biol.– 2012.-Vol. 23, № 4 - P.352-361. 17. Alterations in DNA repair gene expression under hypoxia: elucidating the mechanisms of hypoxia-induced genetic instability / R.S.Bindra, P.J.Schaffer, A.Meng et al. // Annals of the New York Academy of Sciences.– 2005.-Vol. 1059, P.184-195. 18. Blagosklonny, M. V. Antiangiogenic therapy and tumor progression / M.V.Blagosklonny // Cancer Cell.– 2004.-Vol. 5, № 1 - P.13-17. 19. Relationship of hypoxia-inducible factor HIF-1alpha and HIF-2alpha expression to vascular endothelial growth factor induction and hypoxia survival in human breast cancer cell lines / C.Blancher, J.W.Moore, K.L.Talks et al. // Cancer Res.– 2000.-Vol. 60, № 24 P.7106-7113. 20. Bollag, D. M. Protein methods / D.M.Bollag, S.J.Edelstein. - New York: Wiley-Liss, Inc., 1996. - 432 p. 21. Oestrogen receptors alpha and beta show different associations to clinicopathological parameters and their co-expression might predict a better response to endocrine treatment in breast cancer / S.Borgquist, C.Holm, M.Stendahl et al. // Journal of clinical pathology.– 2008.-Vol. 61, № 2 - P.197-203. 22. Brahimi-Horn, M. C. Hypoxia and cancer / M.C.Brahimi-Horn, J.Chiche, J.Pouyssegur // J Mol Med (Berl).– 2007.-Vol. 85, № 12 - P.1301-1307. 23. A hypoxia-controlled cap-dependent to cap-independent translation switch in breast cancer / S.Braunstein, K.Karpisheva, C.Pola et al. // Mol Cell.– 2007.-Vol. 28, № 3 P.501-512. 97 24. The substrate domain of BCAR1 is essential for anti-estrogen-resistant proliferation of human breast cancer cells / A.Brinkman, D. de Jong, S.Tuinman et al. // Breast cancer research and treatment.– 2010.-Vol. 120, № 2 - P.401-408. 25. Brodie, A. Adaptive changes result in activation of alternate signaling pathways and acquisition of resistance to aromatase inhibitors / A.Brodie, G.Sabnis // Clin Cancer Res.– 2011.-Vol. 17, № 13 - P.4208-4213. 26. Antiangiogenic therapy and p53 / T.Browder, J.Folkman, P.Hahnfeldt et al. // Science.– 2002.-Vol. 297, № 5581 - P.471; discussion 471. 27. Bukholm, I. K. Re-expression of E-cadherin, alpha-catenin and beta-catenin, but not of gamma-catenin, in metastatic tissue from breast cancer patients / I.K.Bukholm, J.M.Nesland, A.L.Borresen-Dale // J Pathol.– 2000.-Vol. 190, № 1 - P.15-19. 28. Burns, K. A. Estrogen receptors and human disease: an update / K.A.Burns, K.S.Korach // Archives of toxicology.– 2012.-Vol. 86, № 10 - P.1491-1504. 29. Cell cycle machinery: links with genesis and treatment of breast cancer / A.J.Butt, C.E.Caldon, C.M.McNeil et al. // Advances in experimental medicine and biology.– 2008.-Vol. 630, № P.189-205. 30. Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT-mediated activation of estrogen receptor alpha: a new model for anti-estrogen resistance / R.A.Campbell, P.Bhat-Nakshatri, N.M.Patel et al. // The Journal of biological chemistry.– 2001.-Vol. 276, № 13 - P.9817-9824. 31. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing Ecadherin expression / A.Cano, M.A.Perez-Moreno, I.Rodrigo et al. // Nat Cell Biol.– 2000.-Vol. 2, № 2 - P.76-83. 32. Cash, T. P. Reactive oxygen species and cellular oxygen sensing / T.P.Cash, Y.Pan, M.C.Simon // Free radical biology & medicine.– 2007.-Vol. 43, № 9 - P.1219-1225. 33. Phosphorylation of human estrogen receptor alpha at serine 118 by two distinct signal transduction pathways revealed by phosphorylation-specific antisera / D.Chen, E.Washbrook, N.Sarwar et al. // Oncogene.– 2002.-Vol. 21, № 32 - P.4921-4931. 34. Gene expression programs in response to hypoxia: cell type specificity and prognostic significance in human cancers / J.T.Chi, Z.Wang, D.S.Nuyten et al. // PLoS Med.– 2006.Vol. 3, № 3 - P.47. 35. Hypoxic activation of unoccupied estrogen-receptor-alpha is mediated by hypoxiainducible factor-1 alpha / J.Cho, J.J.Bahn, M.Park et al. // The Journal of steroid biochemistry and molecular biology.– 2006.-Vol. 100, № 1-3 - P.18-23. 98 36. Cobalt chloride-induced estrogen receptor alpha down-regulation involves hypoxiainducible factor-1alpha in MCF-7 human breast cancer cells / J.Cho, D.Kim, S.Lee, Y.Lee // Mol Endocrinol.– 2005.-Vol. 19, № 5 - P.1191-1199. 37. Chu, I. M. The Cdk inhibitor p27 in human cancer: prognostic potential and relevance to anticancer therapy / I.M.Chu, L.Hengst, J.M.Slingerland // Nature reviews. Cancer.– 2008.-Vol. 8, № 4 - P.253-267. 38. Antiestrogen resistance in breast cancer and the role of estrogen receptor signaling / R.Clarke, M.C.Liu, K.B.Bouker et al. // Oncogene.– 2003.-Vol. 22, № 47 - P.7316-7339. 39. Intermittent hypoxia induces proteasome-dependent down-regulation of estrogen receptor alpha in human breast carcinoma / C.Cooper, G.Y.Liu, Y.L.Niu et al. // Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research.– 2004.Vol. 10, № 24 - P.8720-8727. 40. Cosman, F. Selective estrogen receptor modulators: clinical spectrum / F.Cosman, R.Lindsay // Endocr Rev.– 1999.-Vol. 20, № 3 - P.418-434. 41. Couse, J. F. Estrogen receptor null mice: what have we learned and where will they lead us? / J.F.Couse, K.S.Korach // Endocr Rev.– 1999.-Vol. 20, № 3 - P.358-417. 42. Cowin, P. Cadherins and catenins in breast cancer / P.Cowin, T.M.Rowlands, S.J.Hatsell // Curr Opin Cell Biol.– 2005.-Vol. 17, № 5 - P.499-508. 43. Overexpression of hypoxia-inducible factor HIF-1alpha predicts early relapse in breast cancer: retrospective study in a series of 745 patients / J.P.Dales, S.Garcia, S.MeunierCarpentier et al. // Int J Cancer.– 2005.-Vol. 116, № 5 - P.734-739. 44. Daruwalla, J. Hyperbaric oxygen therapy for malignancy: a review / J.Daruwalla, C.Christophi // World J Surg.– 2006.-Vol. 30, № 12 - P.2112-2131. 45. Snail family regulation and epithelial mesenchymal transitions in breast cancer progression / A.G. de Herreros, S.Peiro, M. Nassour, P.Savagner // J Mammary Gland Biol Neoplasia.– 2010.-Vol. 15, № 2 - P.135-147. 46. Denko, N.C. Hypoxia, HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour / N.C.Denko // Nature reviews. Cancer.– 2008.-Vol. 8, № 9 - P.705-713. 47. Dery, M.A. Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators / M.A.Dery, M.D.Michaud, D.E.Richard // Int J Biochem Cell Biol.– 2005.-Vol. 37, № 3 P.535-540. 48. Decreased levels of hypoxic cells in gefitinib treated ER+ HER-2 overexpressing MCF-7 breast cancer tumors are associated with hyperactivation of the mTOR pathway: therapeutic implications for combination therapy with rapamycin / W.H.Dragowska, 99 M.Verreault, D.T.Yapp et al. // Breast cancer research and treatment.– 2007.-Vol. 106, № 3 - P.319-331. 49. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function / W.Droge // Physiological reviews.– 2002.-Vol. 82, № 1 - P.47-95. 50. ICG-001, a novel small molecule regulator of TCF/beta-catenin transcription / M.Eguchi, C.Nguyen, S.C. Lee, M.Kahn // Med Chem.– 2005.-Vol. 1, № 5 - P.467-472. 51. Notch-1 stimulates survival of lung adenocarcinoma cells during hypoxia by activating the IGF-1R pathway / S.Eliasz, S.Liang, Y.Chen et al. // Oncogene.– 2010.-Vol. 29, № 17 - P.2488-2498. 52. Engert, A. Recombinant human erythropoietin in oncology: current status and further developments / A.Engert // Ann Oncol.– 2005.-Vol. 16, № 10 - P.1584-1595. 53. Synergic antitumoral effect of an IGF-IR inhibitor and trastuzumab on HER2overexpressing breast cancer cells / A.Esparis-Ogando, A.Ocana, R.Rodriguez-Barrueco et al. // Ann Oncol.– 2008.-Vol. 19, № 11 - P.1860-1869. 54. Gene expression and hypoxia in breast cancer / E.Favaro, S.Lord, A.L.Harris, F.M.Buffa // Genome Med.– 2011.-Vol. 3, № 8 - P.55. 55. Ferguson, S. J. Breast cancer: society shapes an epidemic and Kasper / S.J.Ferguson, A.S.Kasper - New York: St. Martin's Press, 2002. – 388 p. 56. High tumor levels of vascular endothelial growth factor predict poor response to systemic therapy in advanced breast cancer / J.A.Foekens, H.A.Peters, N.Grebenchtchikov et al. // Cancer Res.– 2001.-Vol. 61, № 14 - P.5407-5414. 57. Induction of ErbB-3 expression by alpha6beta4 integrin contributes to tamoxifen resistance in ERbeta1-negative breast carcinomas / V.Folgiero, P.Avetrani, G.Bon et al. // PloS one.– 2008.-Vol. 3, № 2 - P.1592. 58. Translational up-regulation of the EGFR by tumor hypoxia provides a nonmutational explanation for its overexpression in human cancer / A.Franovic, L.Gunaratnam, K.Smith et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.– 2007.-Vol. 104, № 32 - P.13092-13097. 59. MTA3, a Mi-2/NuRD complex subunit, regulates an invasive growth pathway in breast cancer / N.Fujita, D.L.Jaye, M.Kajita et al. // Cell.– 2003.-Vol. 113, № 2 - P.207-219. 60. HIF-1 regulates cytochrome oxidase subunits to optimize efficiency of respiration in hypoxic cells / R.Fukuda, H.Zhang, J.W.Kim et al. // Cell.– 2007.-Vol. 129, № 1 - P.111122. 100 61. Gaffney, E. V. A cell line (HBL-100) established from human breast milk / E.V.Gaffney // Cell Tissue Res.– 1982.-Vol. 227, № 3 - P.563-568. 62. Galban, S. Factors interacting with HIF-1alpha mRNA: novel therapeutic targets / S.Galban, M.Gorospe // Curr Pharm Des.– 2009.-Vol. 15, № 33 - P.3853-3860. 63. RNA-binding proteins HuR and PTB promote the translation of hypoxia-inducible factor 1alpha / S.Galban, Y.Kuwano, R. Jr.Pullmann et al. // Mol Cell Biol.– 2008.-Vol. 28, № 1 - P.93-107. 64. Prevention of hypoxia by myoglobin expression in human tumor cells promotes differentiation and inhibits metastasis / M.Galluzzo, S.Pennacchietti, S.Rosano et al. // J Clin Invest.– 2009.-Vol. 119, № 4 - P.865-875. 65. Gariboldi, M. B. The IGFR1 inhibitor NVP-AEW541 disrupts a pro-survival and proangiogenic IGF-STAT3-HIF1 pathway in human glioblastoma cells / M.B.Gariboldi, R.Ravizza, E.Monti // Biochem Pharmacol.– 2010.-Vol. 80, № 4 - P.455-462. 66. The antiepidermal growth factor receptor agent gefitinib (ZD1839/Iressa) improves antihormone response and prevents development of resistance in breast cancer in vitro / J.M.Gee, M.E.Harper, I.R.Hutcheson et al. // Endocrinology.– 2003.-Vol. 144, № 11 P.5105-5117. 67. Hypoxia-inducible factor-1alpha expression predicts a poor response to primary chemoendocrine therapy and disease-free survival in primary human breast cancer / D.Generali, A.Berruti, M.P.Brizzi et al. // Clin Cancer Res.– 2006.-Vol. 12, № 15 P.4562-4568. 68. Phosphorylated ERalpha, HIF-1alpha, and MAPK signaling as predictors of primary endocrine treatment response and resistance in patients with breast cancer / D.Generali, F.M.Buffa, A.Berruti et al. // J Clin Oncol.– 2009.-Vol. 27, № 2 - P.227-234. 69. Biological mechanisms and clinical implications of endocrine resistance in breast cancer / M.Giuliano, R.Schifp, C.K.Osborne, M.V.Trivedi // Breast.– 2011.-Vol. 20 Suppl 3, № P.42-49. 70. Disruption of myoglobin in mice induces multiple compensatory mechanisms / A.Godecke, U.Flogel, K.Zanger et al. // Proc Natl Acad Sci U S A.– 1999.-Vol. 96, № 18 - P.10495-10500. 71. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours / T.G.Graeber, C.Osmanian, T.Jacks et al. // Nature.– 1996.-Vol. 379, № 6560 - P.88-91. 101 72. Novel mechanisms of resistance to endocrine therapy: genomic and nongenomic considerations / A.E.Gururaj, S.K.Rayala, R.K.Vadlamudi, R.Kumar // Clin Cancer Res.– 2006.-Vol. 12, № 3 Pt 2 - P.1001s-1007s. 73. Gustafsson, J. A. What pharmacologists can learn from recent advances in estrogen signalling / J.A.Gustafsson // Trends in pharmacological sciences.– 2003.-Vol. 24, № 9 P.479-485. 74. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state / M.V.Gustafsson, X.Zheng, T.Pereira et al. // Dev Cell.– 2005.-Vol. 9, № 5 - P.617-628. 75. Molecular changes in tamoxifen-resistant breast cancer: relationship between estrogen receptor, HER-2, and p38 mitogen-activated protein kinase / M.C.Gutierrez, S.Detre, S.Johnston et al. // J Clin Oncol.– 2005.-Vol. 23, № 11 - P.2469-2476. 76. Hajra, K. M. The SLUG zinc-finger protein represses E-cadherin in breast cancer / K.M.Hajra, D.Y.Chen, E.R.Fearon // Cancer Res.– 2002.-Vol. 62, № 6 - P.1613-1618. 77. Hall, J. M. The multifaceted mechanisms of estradiol and estrogen receptor signaling / J.M.Hall, J.F.Couse, K.S.Korach // The Journal of biological chemistry.– 2001.-Vol. 276, № 40 - P.36869-36872. 78. Expression and characterization of hypoxia-inducible factor (HIF)-3alpha in human kidney: suppression of HIF-mediated gene expression by HIF-3alpha / S.Hara, J.Hamada, C.Kobayashi et al. // Biochem Biophys Res Commun.– 2001.-Vol. 287, № 4 - P.808-813. 79. Her2/neu signaling blockade improves tumor oxygenation in a multifactorial fashion in Her2/neu+ tumors / M.E.Hardee, R.J.Eapen, Z.N.Rabbani et al. // Cancer Chemother Pharmacol.– 2009.-Vol. 63, № 2 - P.219-228. 80. Harris, A. L. Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth / A.L.Harris // Nature reviews. Cancer.– 2002.-Vol. 2, № 1 - P.38-47. 81. Harris, J. R. Diseases of the breast / Editors J.R.Harris, M.E.Lippman, M.Morrow, S.Hellman. – Philadelphia: Lippincott-Raven, 1996. – 1047 p. 82. Hartman, J. Estrogen receptor beta in breast cancer-diagnostic and therapeutic implications / J.Hartman, A.Strom, J.A.Gustafsson // Steroids.– 2009.-Vol. 74, № 8 P.635-641. 83. The antisense transcriptomes of human cells / Y.He, B.Vogelstein, V.E.Velculescu et al. // Science.– 2008.-Vol. 322, № 5909 - P.1855-1857. 84. Hypoxia rapidly activates HIF-3alpha mRNA expression / M.Heidbreder, F.Frohlich, O.Johren et al. // FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology.– 2003.-Vol. 17, № 11 - P.1541-1543. 102 85. Estrogen receptors: how do they signal and what are their targets / N.Heldring, A.Pike, S.Andersson et al. // Physiological reviews.– 2007.-Vol. 87, № 3 - P.905-931. 86. Herynk, M. H. Estrogen receptor mutations in human disease / M.H.Herynk, S.A.Fuqua // Endocr Rev.– 2004.-Vol. 25, № 6 - P.869-898. 87. Breast cancers with brain metastases are more likely to be estrogen receptor negative, express the basal cytokeratin CK5/6, and overexpress HER2 or EGFR / D.G.Hicks, S.M.Short, N.L.Prescott et al. // Am J Surg Pathol.– 2006.-Vol. 30, № 9 - P.1097-1104. 88. Hill, R. P. Cancer stem cells, hypoxia and metastasis / R.P.Hill, D.T.Marie-Egyptienne, D.W.Hedley // Semin Radiat Oncol.– 2009.-Vol. 19, № 2 - P.106-111. 89. Holloway, J. N. A cytoplasmic substrate of mitogen-activated protein kinase is responsible for estrogen receptor-alpha down-regulation in breast cancer cells: the role of nuclear factor-kappaB / J.N.Holloway, S.Murthy, D.El-Ashry // Mol Endocrinol.– 2004.Vol. 18, № 6 - P.1396-1410. 90. A mechanism of oxygen sensing in yeast. Multiple oxygen-responsive steps in the heme biosynthetic pathway affect Hap1 activity / T.Hon, A.Dodd, R.Dirmeier // The Journal of biological chemistry.– 2003.-Vol. 278, № 50 - P.50771-50780. 91. Comparison of fulvestrant versus tamoxifen for the treatment of advanced breast cancer in postmenopausal women previously untreated with endocrine therapy: a multinational, double-blind, randomized trial / A.Howell, J.F.Robertson, P.Abram et al. // J Clin Oncol.– 2004.-Vol. 22, № 9 - P.1605-1613. 92. Hypoxia attenuates the expression of E-cadherin via up-regulation of SNAIL in ovarian carcinoma cells / T.Imai, A.Horiuchi, C.Wang et al. // Am J Pathol.– 2003.-Vol. 163, № 4 - P.1437-1447. 93. PDGF upregulates Mcl-1 through activation of beta-catenin and HIF-1alpha-dependent signaling in human prostate cancer cells / S.Iqbal, S.Zhang, A.Driss et al. // PloS one.– 2012.-Vol. 7, № 1 - P.e30764. 94. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing / M.Ivan, K.Kondo, H.Yang et al. // Science.– 2001.-Vol. 292, № 5516 P.464-468. 95. Engineering vascularized tissue / R.K.Jain, P.Au, J.Tam et al. // Nat Biotechnol.– 2005.Vol. 23, № 7 - P.821-823. 96. Jiang, J. EMT: a new vision of hypoxia promoting cancer progression / J.Jiang, Y.L.Tang, X.H.Liang // Cancer Biol Ther.– 2011.-Vol. 11, № 8 - P.714-723. 103 97. Role of Wnt/beta-catenin signaling pathway in epithelial-mesenchymal transition of human prostate cancer induced by hypoxia-inducible factor-1alpha / Y.G.Jiang, Y.Luo, D.L.He et al. // Int J Urol.– 2007.-Vol. 14, № 11 - P.1034-1039. 98. Changes in estrogen receptor, progesterone receptor, and p52 expression in tamoxifenresistant human breast cancer / S.R.Johnston, G.Saccani-Jotti, I.E.Smith et al. // Cancer Res.– 1995.-Vol. 55, № 15 - P.3331-3338. 99. Jubb, A. M. Assessment of tumour hypoxia for prediction of response to therapy and cancer prognosis / A.M.Jubb, F.M.Buffa, A.L.Harris // J Cell Mol Med.– 2010.-Vol. 14, № 1-2 - P.18-29. 100.Kaelin, W. G., Jr.The von Hippel-Lindau protein, HIF hydroxylation, and oxygen sensing / W.G.Kaelin, Jr. // Biochem Biophys Res Commun.– 2005.-Vol. 338, № 1 - P.627-638. 101. Activation of the estrogen receptor through phosphorylation by mitogen-activated protein kinase / S.Kato, H.Endoh, Y.Masuhiro et al. // Science.– 1995.-Vol. 270, № 5241 P.1491-1494. 102. Trastuzumab plus anastrozole versus anastrozole alone for the treatment of postmenopausal women with human epidermal growth factor receptor 2-positive, hormone receptor-positive metastatic breast cancer: results from the randomized phase III TAnDEM study / B.Kaufman, J.R.Mackey, M.R.Clemens et al. // Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology.– 2009.-Vol. 27, № 33 - P.5529-5537. 103. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events / J.D.Keene // Nat Rev Genet.– 2007.-Vol. 8, № 7 - P.533-543. 104. Kim, J. W. Cancer's molecular sweet tooth and the Warburg effect / J.W.Kim, C.V.Dang // Cancer Res.– 2006.-Vol. 66, № 18 - P.8927-8930. 105. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia / J.W.Kim, I.Tchernyshyov, G.L.Semenza, C.V.Dang // Cell Metab.– 2006.-Vol. 3, № 3 - P.177-185. 106. Hypoxia-induced SM22alpha in A549 cells activates the IGF1R/PI3K/Akt pathway, conferring cellular resistance against chemo- and radiation therapy / T.R.Kim, E.W.Cho, S.G.Paik, I.G.Kim // FEBS Lett.– 2012.-Vol. 586, № 4 - P.303-309. 107. HIF2alpha cooperates with RAS to promote lung tumorigenesis in mice / W.Y.Kim, S.Perera, B.Zhou et al. // J Clin Invest.– 2009.-Vol. 119, № 8 - P.2160-2170. 108. Inhibition of HIF is necessary for tumor suppression by the von Hippel-Lindau protein / K.Kondo, J.Klco, E.Nakamura et al. // Cancer Cell.– 2002.-Vol. 1, № 3 - P.237-246. 104 109. Kraggerud, S. M. Regulation of protein synthesis in human cells exposed to extreme hypoxia / S.M.Kraggerud, J.A.Sandvik, E.O.Pettersen, E. O. // Anticancer Res.– 1995.Vol. 15, № 3 - P.683-686. 110. The role of phosphatidylinositol 3-kinase in the regulation of cell response to steroid hormones / M.A.Krasil'nikov, V.A.Shatskaya, A.A.Stavrovskaya et al. // Biochim Biophys Acta.– 1999.-Vol. 1450, № 3 - P.434-443. 111. ERK1/2 inhibition increases antiestrogen treatment efficacy by interfering with hypoxia-induced downregulation of ERalpha: a combination therapy potentially targeting hypoxic and dormant tumor cells / A.Kronblad, I.Hedenfalk, E.Nilsson et al. // Oncogene.– 2005.-Vol. 24, № 45 - P.6835-6841. 112. Hypoxia inducible factor-1alpha is a prognostic marker in premenopausal patients with intermediate to highly differentiated breast cancer but not a predictive marker for tamoxifen response / A.Kronblad, K.Jirstrom, L.Ryden et al. // Int J Cancer.– 2006.-Vol. 118, № 10 - P.2609-2616. 113. Hypoxia reduces hormone responsiveness of human breast cancer cells / J.Kurebayashi, T.Otsuki, T.Moriya, H.Sonoo // Jpn J Cancer Res.– 2001.-Vol. 92, № 10 - P.1093-1101. 114. Hypoxia reduces hormone responsiveness of human breast cancer cells / J.Kurebayashi, T.Otsuki, T.Moriya, H.Sonoo // Japanese journal of cancer research : Gann.– 2001.-Vol. 92, № 10 - P.1093-1101. 115. Kurrey NK, K.A. Snail and Slug are major determinants of ovarian cancer invasiveness at the transcription level / K.A.Kurrey NK, S.A.Bapat // Gynecol Oncol.– 2005.-Vol. 97, № 1 - P.155-165. 116. Estrogen receptor pathways to AP-1 / P.J.Kushner, D.A.Agard, G.L.Greene et al. // The Journal of steroid biochemistry and molecular biology.– 2000.-Vol. 74, № 5 - P.311-317. 117. Oxygen sensing in the body / S.Lahiri, A.Roy, S.M.Baby et al. // Progress in biophysics and molecular biology.– 2006.-Vol. 91, № 3 - P.249-286. 118. FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor / D.Lando, D.J.Peet, J.J.Gorman et al. // Genes Dev.– 2002.-Vol. 16, № 12 - P.1466-1471. 119. Lang, K. J. Hypoxia-inducible factor-1alpha mRNA contains an internal ribosome entry site that allows efficient translation during normoxia and hypoxia / K.J.Lang, A.Kappel, G.J.Goodall // Mol Biol Cell.– 2002.-Vol. 13, № 5 - P.1792-1801. 105 120. Wnt-beta-catenin signaling protects against hepatic ischemia and reperfusion injury in mice / N.Lehwald, G.Z.Tao, K.Y.Jang et al. // Gastroenterology.– 2011.-Vol. 141, № 2 P.707-718, 718 e701-705. 121. Leipuviene, R. The family of iron responsive RNA structures regulated by changes in cellular iron and oxygen / R.Leipuviene, E.C.Theil // Cell Mol Life Sci.– 2007.-Vol. 64, № 22 - P.2945-2955. 122. uPAR induces epithelial-mesenchymal transition in hypoxic breast cancer cells / R.D.Lester, M.Jo, V.Montel et al. // J Cell Biol.– 2007.-Vol. 178, № 3 - P.425-436. 123. Levenson, A. S. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line / A.S.Levenson, V.C.Jordan // Cancer Res.– 1997.-Vol. 57, № 15 - P.3071-3078. 124. Lewis, J. S. Selective estrogen receptor modulators (SERMs): mechanisms of anticarcinogenesis and drug resistance / J.S.Lewis, V.C.Jordan // Mutation research.– 2005.-Vol. 591, № 1-2 - P.247-263. 125. Li, C. Reactive species mediated injury of human lung epithelial cells after hypoxiareoxygenation / C.Li, M.M.Wright, R.M.Jackson // Exp Lung Res.– 2002.-Vol. 28, № 5 P.373-389. 126. Myc stimulates nuclearly encoded mitochondrial genes and mitochondrial biogenesis / F.Li, Y.Wang, K.I.Zeller et al. // Mol Cell Biol.– 2005.-Vol. 25, № 14 - P.6225-6234. 127. Immunocytochemical localization of sex steroid hormone receptors in normal human mammary gland / S.Li, B.Han, G.Liu et al. // The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society.– 2010.-Vol. 58, № 6 P.509-515. 128. Expression of E-cadherin (E-CD) as related to other prognostic factors and survival in breast cancer / P.Lipponen, E.Saarelainen, H.Ji et al. // J Pathol.– 1994.-Vol. 174, № 2 P.101-109. 129. Mechanism of estrogen-induced apoptosis in breast cancer cells: role of the NF-kappaB signaling pathway / Y.S.Lobanova, A.M.Scherbakov, V.A.Shatskaya, M.A.Krasil'nikov // Biochemistry (Mosc).– 2007.-Vol. 72, № 3 - P.320-327. 130. Regulation of oxygen sensing by ion channels / J.Lopez-Barneo, R. del Toro, K.L.Levitsky et al. // J Appl Physiol.– 2004.-Vol. 96, № 3 - P.1187-1195. 131. Oxygen sensing in the carotid body / J.Lopez-Barneo, P.Ortega-Saenz, R.Pardal et al. // Annals of the New York Academy of Sciences.– 2009.-Vol. 1177, № P.119-131. 106 132. Lundgren, K. Hypoxia and breast cancer: prognostic and therapeutic implications / K.Lundgren, C.Holm, G.Landberg // Cell Mol Life Sci.– 2007.-Vol. 64, № 24 - P.32333247. 133. Lundgren, K. Hypoxia, Snail and incomplete epithelial-mesenchymal transition in breast cancer / K.Lundgren, B.Nordenskjold, G.Landberg // Br J Cancer.– 2009.-Vol. 101, № 10 - P.1769-1781. 134. Inhibitory PAS domain protein (IPAS) is a hypoxia-inducible splicing variant of the hypoxia-inducible factor-3alpha locus / Y.Makino, A.Kanopka, W.J.Wilson et al. // The Journal of biological chemistry.– 2002.-Vol. 277, № 36 - P.32405-32408. 135. The contribution of VHL substrate binding and HIF1-alpha to the phenotype of VHL loss in renal cell carcinoma / J.K.Maranchie, J.R.Vasselli, J.Riss et al. // Cancer Cell.– 2002.-Vol. 1, № 3 - P.247-255. 136. The combination of letrozole and trastuzumab as first or second-line biological therapy produces durable responses in a subset of HER2 positive and ER positive advanced breast cancers / P.K.Marcom, C.Isaacs, L.Harris et al. // Breast cancer research and treatment.– 2007.-Vol. 102, № 1 - P.43-49. 137. Marcotrigiano, J. Structural biology of eIF4F: mRNA recognition and preparation in eukaryotic translation initiation / J.Marcotrigiano, S.K.Burley // Adv Protein Chem.– 2002.-Vol. 61, № P.269-297. 138. Estrogen receptor-beta expression in invasive breast cancer in relation to molecular phenotype: results from the Nurses' Health Study / J.D.Marotti, L.C.Collins, R.Hu, R.M.Tamimi // Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc.– 2010.-Vol. 23, № 2 - P.197-204. 139. Mattick, J. S. Non-coding RNA / J.S.Mattick, I.V.Makunin, I. V. // Hum Mol Genet.– 2006.-Vol. 15 Spec No 1, № P.R17-29. 140. Identification of the renal erythropoietin-producing cells using transgenic mice / P.H.Maxwell, M.K.Osmond, C.W.Pugh et al. // Kidney international.– 1993.-Vol. 44, № 5 - P.1149-1162. 141. A hypoxia-responsive element mediates a novel pathway of activation of the inducible nitric oxide synthase promoter / G.Melillo, T.Musso, A.Sica et al. // J Exp Med.– 1995.Vol. 182, № 6 - P.1683-1693. 142. MTT assays allow quick and reliable measurement of the response of human tumour cells to photodynamic therapy / J.L.Merlin, S.Azzi, D.Lignon et al. // Eur J Cancer.– 1992.-Vol. 28A, № 8-9 - P.1452-1458. 107 143. Michieli, P. Hypoxia, angiogenesis and cancer therapy: to breathe or not to breathe? / P.Michieli // Cell Cycle.– 2009.-Vol. 8, № 20 - P.3291-3296. 144. ERK activation upon hypoxia: involvement in HIF-1 activation / E.Minet, T.Arnould, G.Michel et al. // FEBS Lett.– 2000.-Vol. 468, № 1 - P.53-58. 145. Hypoxia-induced activation of HIF-1: role of HIF-1alpha-Hsp90 interaction / E.Minet, D.Mottet, G.Michel et al. // FEBS Lett.– 1999.-Vol. 460, № 2 - P.251-256. 146. Mizukami, Y. Hypoxia inducible factor-1 independent pathways in tumor angiogenesis / Y.Mizukami, Y.Kohgo, D.C.Chung // Clin Cancer Res.– 2007.-Vol. 13, № 19 - P.56705674. 147. Moeller, B. J. Hypoxia and radiotherapy: opportunities for improved outcomes in cancer treatment / B.J.Moeller, R.A.Richardson, M.W.Dewhirst // Cancer Metastasis Rev.– 2007.-Vol. 26, № 2 - P.241-248. 148. Hyperoxic treatment induces mesenchymal-to-epithelial transition in a rat adenocarcinoma model / I.Moen, A.M.Oyan, K.H.Kalland et al. // PloS one.– 2009.-Vol. 4, № 7 - P.e6381. 149. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs / M.J.Moore // Science.– 2005.-Vol. 309, № 5740 - P.1514-1518. 150. Musgrove, E. A. Biological determinants of endocrine resistance in breast cancer / E.A.Musgrove, R.L.Sutherland // Nature reviews. Cancer.– 2009.-Vol. 9, № 9 - P.631643. 151. Modulation of epidermal growth factor receptor in endocrine-resistant, oestrogen receptor-positive breast cancer / R.I.Nicholson, I.R.Hutcheson, M.E.Harper et al. // Endocr Relat Cancer.– 2001.-Vol. 8, № 3 - P.175-182. 152. Nieto, M. A. The snail superfamily of zinc-finger transcription factors / M.A.Nieto // Nat Rev Mol Cell Biol.– 2002.-Vol. 3, № 3 - P.155-166. 153. SNAIL induces epithelial-to-mesenchymal transition in a human pancreatic cancer cell line (BxPC3) and promotes distant metastasis and invasiveness in vivo / R.Nishioka, S.Itoh, T.Gui et al. // Exp Mol Pathol.– 2010.-Vol. 89, № 2 - P.149-157. 154. Cell adhesion and the integrin-linked kinase regulate the LEF-1 and beta-catenin signaling pathways / A.Novak, S.C.Hsu, C.Leung-Hagesteijn et al. // Proc Natl Acad Sci U S A.– 1998.-Vol. 95, № 8 - P.4374-4379. 155. O'Malley, B. W. Nuclear receptor coregulators in cancer biology / B.W.O'Malley, R.Kumar // Cancer Res.– 2009.-Vol. 69, № 21 - P.8217-8222. 108 156. Estrogen-mediated down-regulation of E-cadherin in breast cancer cells / S.Oesterreich, W.Deng, S.Jiang et al. // Cancer Res.– 2003.-Vol. 63, № 17 - P.5203-5208. 157. Hyperactivation of MAPK induces loss of ERalpha expression in breast cancer cells / A.S.Oh, L.A.Lorant, J.N.Holloway et al. // Mol Endocrinol.– 2001.-Vol. 15, № 8 P.1344-1359. 158. Osborne, C. K. Aromatase inhibitors in relation to other forms of endocrine therapy for breast cancer / C.K.Osborne // Endocr Relat Cancer.– 1999.-Vol. 6, № 2 - P.271-276. 159. Comparison of the effects of a pure steroidal antiestrogen with those of tamoxifen in a model of human breast cancer / C.K.Osborne, E.B.Coronado-Heinsohn, S.G.Hilsenbeck, et al. // Journal of the National Cancer Institute.– 1995.-Vol. 87, № 10 - P.746-750. 160. HIF-1 mediates adaptation to hypoxia by actively downregulating mitochondrial oxygen consumption / I.Papandreou, R.A.Cairns, L.Fontana et al. // Cell Metab.– 2006.-Vol. 3, № 3 - P.187-197. 161. Expression of S100A4, E-cadherin, alpha- and beta-catenin in breast cancer biopsies / K.B.Pedersen, J.M.Nesland, O.Fodstad, G.M.Maelandsmo // Br J Cancer.– 2002.-Vol. 87, № 11 - P.1281-1286. 162. Peinado, H. Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progression: an alliance against the epithelial phenotype? / H.Peinado, D.Olmeda, A.Cano // Nature reviews. Cancer.– 2007.Vol. 7, № 6 - P.415-428. 163. Hypoxia promotes invasive growth by transcriptional activation of the met protooncogene / S.Pennacchietti, P.Michieli, M.Galluzzo et al. // Cancer Cell.– 2003.-Vol. 3, № 4 - P.347-361. 164. Cytoplasmic p21WAF1/CIP1 correlates with Akt activation and poor response to tamoxifen in breast cancer / G.Perez-Tenorio, F.Berglund, A.Esguerra Merca et al. // International journal of oncology.– 2006.-Vol. 28, № 5 - P.1031-1042. 165. Androgen formation and metabolism in the pulmonary epithelial cell line A549: expression of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 5 and 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase type 3 / P.R.Provost, C.H.Blomquist, C.Godin et al. // Endocrinology.– 2000.-Vol. 141, № 8 - P.2786-2794. 166. Rakha, E. A. Modern classification of breast cancer: should we stick with morphology or convert to molecular profile characteristics / E.A.Rakha, I.O.Ellis // Adv Anat Pathol.– 2011.-Vol. 18, № 4 - P.255-267. 109 167. Prognostic and predictive factors in primary breast cancer and their role in patient management: The Nottingham Breast Team / R.S.Rampaul, S.E.Pinder, C.W.Elston, I.O.Ellis // Eur J Surg Oncol.– 2001.-Vol. 27, № 3 - P.229-238. 168. Topoisomerase I-mediated inhibition of hypoxia-inducible factor 1: mechanism and therapeutic implications / A.Rapisarda, B.Uranchimeg, O.Sordet et al. // Cancer research.– 2004.-Vol. 64, № 4 - P.1475-1482. 169. Glut-1 antibodies induce growth arrest and apoptosis in human cancer cell lines / S.Rastogi, S.Banerjee, S.Chellappan, G.R.Simon // Cancer Lett.– 2007.-Vol. 257, № 2 P.244-251. 170. Ratcliffe, P. J. Understanding hypoxia signalling in cells - a new therapeutic opportunity? / P.J.Ratcliffe // Clin Med.– 2006.-Vol. 6, № 6 - P.573-578. 171. Cyclic, proteasome-mediated turnover of unliganded and liganded ERalpha on responsive promoters is an integral feature of estrogen signaling / G.Reid, M.R.Hubner, R.Metivier et al. // Molecular cell.– 2003.-Vol. 11, № 3 - P.695-707. 172. Reiling, J. H. Stress and mTORture signaling / J.H.Reiling, D.M.Sabatini // Oncogene.– 2006.-Vol. 25, № 48 - P.6373-6383. 173. Ring, A. Mechanisms of tamoxifen resistance / A.Ring, M.Dowsett // Endocr Relat Cancer.– 2004.-Vol. 11, № 4 - P.643-658. 174. Distinct regulatory properties of pyruvate dehydrogenase kinase and phosphatase isoforms / T.E.Roche, J.C.Baker, X.Yan et al. // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.– 2001.Vol. 70, № P.33-75. 175. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha and -2alpha in hypoxic and ischemic rat kidneys / C.Rosenberger, S.Mandriota, J.S.Jurgensen et al. // J Am Soc Nephrol.– 2002.Vol. 13, № 7 - P.1721-1732. 176. Ryu, K. Hypoxia-inducible factor 1 alpha represses the transcription of the estrogen receptor alpha gene in human breast cancer cells / K.Ryu, C.Park, Y.Lee // Biochem Biophys Res Commun.– 2011.-Vol. 407, № 4 - P.831-836. 177. Adaptation to estradiol deprivation causes up-regulation of growth factor pathways and hypersensitivity to estradiol in breast cancer cells / R.J.Santen, R.X.Song, S.Masamura et al. // Advances in experimental medicine and biology.– 2008.-Vol. 630, № P.19-34. 178. Ligand-, cell-, and estrogen receptor subtype (alpha/beta)-dependent activation at GCrich (Sp1) promoter elements / B.Saville, M.Wormke, F.Wang et al. // The Journal of biological chemistry.– 2000.-Vol. 275, № 8 - P.5379-5387. 110 179. The polypyrimidine tract-binding protein stimulates HIF-1alpha IRES-mediated translation during hypoxia / B.Schepens, S.A.Tinton, Y.Bruynooghe et al. // Nucleic Acids Res.– 2005.-Vol. 33, № 21 - P.6884-6894. 180. The relationships between snail1 and estrogen receptor signaling in breast cancer cells / A.M.Scherbakov, O.E.Andreeva, V.A.Shatskaya, M.A.Krasil'nikov // Journal of cellular biochemistry.– 2012.-Vol. 113, № 6 - P.2147-2155. 181. Oestrogen treatment enhances the sensitivity of hormone-resistant breast cancer cells to doxorubicin / A.M.Scherbakov, Y.S.Lobanova, O.E.Andreeva et al. // Biosci Rep.– 2011.Vol. 31, № 2 - P.137-143. 182. Schoenberg, D. R. Re-capping the message / D.R.Schoenberg, L.E.Maquat // Trends Biochem Sci.– 2009.-Vol. 34, № 9 - P.435-442. 183. Lapatinib plus letrozole as first-line therapy for HER-2+ hormone receptor-positive metastatic breast cancer / L.S.Schwartzberg, S.X.Franco, A.Florance et al. // Oncologist.– 2010.-Vol. 15, № 2 - P.122-129. 184. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia / G.L.Semenza // J Appl Physiol.– 2000.-Vol. 88, № 4 - P.1474-1480. 185. Semenza, G. L. Hydroxylation of HIF-1: oxygen sensing at the molecular level / G.L.Semenza // Physiology (Bethesda).– 2004.-Vol. 19, № P.176-182. 186. Semenza, G. L. Regulation of oxygen homeostasis by hypoxia-inducible factor 1 / G.L.Semenza // Physiology (Bethesda).– 2009.-Vol. 24, № P.97-106. 187. Expression of ER-{alpha}36, a novel variant of estrogen receptor {alpha}, and resistance to tamoxifen treatment in breast cancer / L.Shi, B.Dong, Z.Li et al. // J Clin Oncol.– 2009.-Vol. 27, № 21 - P.3423-3429. 188. Mechanisms of tamoxifen resistance: increased estrogen receptor-HER2/neu cross-talk in ER/HER2-positive breast cancer / J.Shou, S.Massarweh, C.K.Osborne et al. // Journal of the National Cancer Institute.– 2004.-Vol. 96, № 12 - P.926-935. 189. Sidell, B. D. When bad things happen to good fish: the loss of hemoglobin and myoglobin expression in Antarctic icefishes / B.D.Sidell, K.M.O'Brien // J Exp Biol.– 2006.-Vol. 209, № Pt 10 - P.1791-1802. 190. Reduced E-cadherin expression is associated with invasiveness and unfavorable prognosis in breast cancer / S.M.Siitonen, J.T.Kononen, H.J.Helin et al. // Am J Clin Pathol.– 1996.-Vol. 105, № 4 - P.394-402. 191. Genomic and non-genomic effects of estrogens on endothelial cells / T.Simoncini, P.Mannella, L.Fornari et al. // Steroids.– 2004.-Vol. 69, № 8-9 - P.537-542. 111 192. Endogenous and endobiotic induced reactive oxygen species formation by isolated hepatocytes / A.G.Siraki, J.Pourahmad, T.S.Chan et al. // Free radical biology & medicine.– 2002.-Vol. 32, № 1 - P.2-10. 193. Expression of oestrogen receptor beta isoforms is regulated by transcriptional and posttranscriptional mechanisms / L.Smith, L.J.Coleman, M.Cummings et al. // The Biochemical journal.– 2010.-Vol. 429, № 2 - P.283-290. 194. Predominant role of hypoxia-inducible transcription factor (Hif)-1alpha versus Hif2alpha in regulation of the transcriptional response to hypoxia / H.M.Sowter, R.R.Raval, J.W.Moore et al. // Cancer Res.– 2003.-Vol. 63, № 19 - P.6130-6134. 195. Carbonic anhydrase-9 expression levels and prognosis in human breast cancer: association with treatment outcome / P.N.Span, J.Bussink, P.Manders et al. // Br J Cancer.– 2003.-Vol. 89, № 2 - P.271-276. 196. The transcription factor Egr1 regulates the HIF-1alpha gene during hypoxia / S.Sperandio, J.Fortin, R.Sasik et al. // Mol Carcinog.– 2009.-Vol. 48, № 1 - P.38-44. 197. Effect of estradiol on estrogen receptor-alpha gene expression and activity can be modulated by the ErbB2/PI 3-K/Akt pathway / G.E.Stoica, T.F.Franke, M.Moroni et al. // Oncogene.– 2003.-Vol. 22, № 39 - P.7998-8011. 198. Hypoxia induces proteasome-dependent degradation of estrogen receptor alpha in ZR75 breast cancer cells / M.Stoner, B.Saville, M.Wormke et al. // Mol Endocrinol.– 2002.Vol. 16, № 10 - P.2231-2242. 199. Loss of HIF-1alpha in endothelial cells disrupts a hypoxia-driven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis / N.Tang, L.Wang, J.Esko et al. // Cancer Cell.– 2004.-Vol. 6, № 5 - P.485-495. 200. Thiery, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions / J.P.Thiery, J.P.Sleeman // Nat Rev Mol Cell Biol.– 2006.-Vol. 7, № 2 - P.131-142. 201. Regulation of the cell-cycle-dependent internal ribosome entry site of the PITSLRE protein kinase: roles of Unr (upstream of N-ras) protein and phosphorylated translation initiation factor eIF-2alpha / S.A.Tinton, B.Schepens, Y.Bruynooghe et al. // The Biochemical journal.– 2005.-Vol. 385, № Pt 1 - P.155-163. 202. Drug resistance and the solid tumor microenvironment / O.Tredan, C.M.Galmarini, K.Patel, I.F.Tannock // Journal of the National Cancer Institute.– 2007.-Vol. 99, № 19 P.1441-1454. 203. Prolonged hypoxia differentially regulates hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha expression in lung epithelial cells: implication of natural antisense HIF-1alpha 112 / T.Uchida, F.Rossignol, M.A.Matthay et al. // The Journal of biological chemistry.– 2004.-Vol. 279, № 15 - P.14871-14878. 204. Relevance of breast cancer antiestrogen resistance genes in human breast cancer progression and tamoxifen resistance / T.van Agthoven, A.M.Sieuwerts, M.E.Meijer-van Gelder et al. // Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology.– 2009.-Vol. 27, № 4 - P.542-549. 205. Snail blocks the cell cycle and confers resistance to cell death / S.Vega, A.V.Morales, O.H.Ocana et al. // Genes Dev.– 2004.-Vol. 18, № 10 - P.1131-1143. 206. A SNAIL1-SMAD3/4 transcriptional repressor complex promotes TGF-beta mediated epithelial-mesenchymal transition / T.Vincent, E.P.Neve, J.R.Johnson et al. // Nature cell biology.– 2009.-Vol. 11, № 8 - P.943-950. 207. Differential prognostic impact of hypoxia induced and diffuse HIF-1alpha expression in invasive breast cancer / M.M.Vleugel, A.E.Greijer, A.Shvarts et al. // Journal of clinical pathology.– 2005.-Vol. 58, № 2 - P.172-177. 208. Wenger, R. H. Mammalian oxygen sensing, signalling and gene regulation / R.H.Wenger // J Exp Biol.– 2000.-Vol. 203, № Pt 8 - P.1253-1263. 209. Wenger, R. H. Cellular adaptation to hypoxia: O2-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and O2-regulated gene expression / R.H.Wenger, // FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology.– 2002.-Vol. 16, № 10 - P.1151-1162. 210. Westermeier, R. Electrophoresis in practice : a guide to methods and applications of DNA and protein separations 3rd ed. / R.Westermeier, N.Barnes. – Chichester: WileyVCH, Weinheim, 2001. 211. Wittenberg, J. B. Myoglobin function reassessed / J.B.Wittenberg, B.A.Wittenberg // J Exp Biol.– 2003.-Vol. 206, № Pt 12 - P.2011-2020. 212. Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis / J.Yang, S.A.Mani, J.L.Donaher et al. // Cell.– 2004.-Vol. 117, № 7 - P.927-939. 213. Yang, M. H. TWIST activation by hypoxia inducible factor-1 (HIF-1): implications in metastasis and development / M.H.Yang, K.J.Wu // Cell Cycle.– 2008.-Vol. 7, № 14 P.2090-2096. 214. Yee Koh, M. HIF-1 regulation: not so easy come, easy go / M.Yee Koh, T.R.SpivakKroizman, G.Powis // Trends Biochem Sci.– 2008.-Vol. 33, № 11 - P.526-534. 113 215. Estrogen and hypoxia regulate estrogen receptor alpha in a synergistic manner / J.M.Yi, H.Y.Kwon, J.Y.Cho, Y.J.Lee // Biochemical and biophysical research communications.– 2009.-Vol. 378, № 4 - P.842-846. 216. Hypoxia-mediated selective mRNA translation by an internal ribosome entry siteindependent mechanism / R.M.Young, S.J.Wang, J.D.Gordan et al. // The Journal of biological chemistry.– 2008.-Vol. 283, № 24 - P.16309-16319. 217. HIF-1 inhibits mitochondrial biogenesis and cellular respiration in VHL-deficient renal cell carcinoma by repression of C-MYC activity / H.Zhang, P.Gao, R.Fukuda et al. // Cancer Cell.– 2007.-Vol. 11, № 5 - P.407-420. 218. The Mesenchymal-Epithelial Transition During In Vitro Decidualization / X.H.Zhang, X.Liang, X.H.Liang et al. // Reprod Sci.– 2013.-Vol., № P. 219. Hypoxia-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition requires mitochondrial ROS and hypoxia-inducible factor 1 / G.Zhou, L.A.Dada, M.Wu et al. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.– 2009.-Vol. 297, № 6 - P.L1120-1130. 220. Cytokines and hormones in the regulation of hypoxia inducible factor-1alpha (HIF1alpha) / Zhou, J., and Brune, B. // Cardiovasc Hematol Agents Med Chem.– 2006.-Vol. 4, № 3 - P.189-197. 221. Enhanced NF kappa B and AP-1 transcriptional activity associated with antiestrogen resistant breast cancer / Y.Zhou, C.Yau, J.W.Gray et al. // BMC cancer.– 2007.-Vol. 7, № P.59.