016038 B1 016038 B1 (11) 016038

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(12)
(45)
016038
(13)
B1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
Дата публикации и выдачи патента
2012.01.30
(21)
(11)
Номер заявки
(51) Int. Cl. C07K 16/22 (2006.01)
G01N 33/68 (2006.01)
G01N 33/577 (2006.01)
200702278
(22)
Дата подачи заявки
2006.04.20
(54)
АНТИТЕЛО К TGF-БЕТА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
B1
Изобретатель:
(74)
Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A2-2005010049
WO-A-0066631
"Monoclonal anti-TGF-b1 antibody", R&D
SYSTEM ORDERING INFORMATION, no.
mab2401, 29 January 2003 (2003-01-29),
XP002313281, the whole document
LUCAS C. ET AL.: "THE AUTOCRINE
PRODUCTION OF TRANSFORMING GROWTH
(57)
016038
Дэвис Джулиан, Дикинсон Крейг
Дуэйн, Хуан Лихуа, Джонс Брайан
Эдвард, Маркис Дэвид Мэттью,
Роулинсон Скотт Уилльям, Тан Ин,
Вайлланкур Питер Эдвард, Уоткинс
Джеффри Дин (US)
Изобретение относится к области иммунологии и медицины. Предлагается антитело к TGF-бета
или его антигенсвязывающий фрагмент, композиция на основе этого антитела или его фрагмента,
а также применение их в качестве лекарственного средства для лечения фиброзного заболевания,
хронического заболевания почек и рака. Антитела или их фрагменты включают специфические
участки, за счет которых они более специфично и/или селективно связываются со зрелым TGFбета 1 по сравнению со зрелым TGF-бета 2 и/или зрелым TGF-бета 3, и нейтрализуют зрелый TGFбета 1.
B1
(72)
FACTOR-BETA1
DURING
LUMPHOCYTE
ACTIVATION A STUDY WITH A MONOCLONAL
ANTIBODY-BASED ELISA", JOURNAL OF
IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS
CO. BALTIMORE, US, vol. 145, 1 September
1990 (1990-09-01), pages 1415-1422, XP000917385,
ISSN: 0022-1767, page 1416, column 1, paragraph 1
- column 2, paragraph 6, page 1417, column 2, lines
6-28; table 1, page 1418; table 2
SHEHATA MEDHAT ET AL.: "TGFbetal induces bone marrow reticulin fibrosis in
hairy cell leukemia," JOURNAL OF CLINICAL
INVESTIGATION, vol. 113, no. 5, March 2004
(2004-03), pages 676-685, XP002406208, ISSN:
0021-9738, page 677, column 2, paragraph 3 - page
678, column 1, paragraph 3
FLANDERS
K.
C.
ET
AL.:
"ANTIBODIES TO PEPTIDE DETERMINANTS
IN TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA
AND THEIR APPLICATIONS", BIOCHEMISTRY,
AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, EASTON, PA,
US, vol. 27, 1988, pages 739-746, XP002044723,
ISSN: 0006-2960, page 741, column 2, paragraph 2;
table 1
CHENG JINGFEI ET AL.: "Transforming
growth factor-beta signal transduction and progressive
renal disease," EXPERIMENTAL BIOLOGY
AND MEDICINE (MAYWOOD), vol. 227, no.
11, December 2002 (2002-12), pages 943-956,
XP002406209, ISSN: 1535-3702, the whole document
016038
(31) 60/674,082
(32) 2005.04.22
(33) US
(43) 2008.08.29
(86) PCT/US2006/014943
(87) WO 2006/116002 2006.11.02
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US)
016038
Область изобретения
Изобретение, в общем, относится к композициям для связывания с белками TGF-бета 1. В частности, изобретение предлагает очищенные композиции для связывания и сопутствующие реактивы, пригодные, например для диагностики, лечения и профилактики расстройств, связанных с клеточной пролиферацией, аутоиммунных/воспалительных, сердечно-сосудистых и фиброзных расстройств, а также для
оценки влияния экзогенных смесей на экспрессию нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей таких белков.
Предпосылки изобретения
Первый член суперсемейства секретируемых полипептидных факторов трансформирующего фактора роста-бета (TGF-бета), TGF-бета 1, был обнаружен приблизительно двадцать лет тому назад. Впоследствии семейство значительно расширилось и на сегодняшний день включает свыше тридцати членов
среди позвоночных и около дюжины структурно и функционально родственных белков у беспозвоночных, например червей и мух (см., например, Attisano & Lee-Hoeflich, 2001 Gen. Biol. 2, обзор 30101;
Moustakas, et al., 2001 J. Cell Sci. 114:4359; Wrana, 2000 Cell 100:189). Члены семейства TGF-бета управляют многими клеточными функциями, и их активность является критической для регулирования многочисленных процессов, связанных с развитием и гомеостазом. Эксперименты показали, что консервативный сигнальный путь TGF-бета существует у позвоночных животных, червей и мух.
Один из членов данного семейства, TGF-бета 1 принимает участие в разнообразных клеточных
процессах, например, таких как пролиферация и дифференциация клеток, миграция, дифференциация,
апоптоз, эмбриональное развитие, образование внеклеточного матрикса, развитие кости, заживление ран,
гемопоэз, а также иммунные и воспалительные реакции (см., например, Roberts, & Sporn 1990 Peptide
Growth Factors и Their Receptors, pp. 419-72, Springer-Verlag, Heidelberg, Germany; Massagué, J. 1998 Annu.
Rev. Biochem 67:753).
Кроме того, доклинические и клинические данные указывают на то, что TGF-бета 1 вносит основной вклад в отложение белка в матриксе при интерстициальном фиброзе и принимает участие в инициации и прогрессировании целого ряда сопутствующих фиброзному заболеванию состояний, включая фиброз почек, который обычно встречается при всех формах хронического заболевания почек (ХЗП). Степень фиброза почек положительно коррелирует с прогрессом до хронической почечной недостаточности
(ХПН, также известной как терминальная стадия заболевания почек (ESRD)) и может приводить к смерти, потребовать хронического диализа или трансплантации почки.
TGF-бета связан с ХПН посредством комплексных и разнообразных феноменов, которые воздействуют на большинство почечных клеток (Bottinger, 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13:2600). Эти явления, в конечном счете, приводят как к тубулоинтерстициальному фиброзу, так и к гломерулосклерозу, который
ведет к снижению функции нефрона и, в конечном счете, к хронической почечной недостаточности. Из
трех изоформ TGF-бета, по-видимому, TGF-бета 1 является доминирующим в опосредовании прогресса
хронического почечного заболевания, не только в качестве наиболее доминантно экспрессирующейся
изоформы, но также и потому, что TGF-бета 2 и, по-видимому, TGF-бета 3 опосредуют свое воздействие
посредством регулирования вверх экспрессии TGF-бета 1 (Yu, 2003, Kid. Int. 64, 844). Таким образом,
существует потребность в модуляции экспрессии TGF-бета 1, чтобы воспрепятствовать вредному действию таких расстройств, как ХЗП.
Соответственно, создание новых композиций для связывания TGF-бета 1 удовлетворяет существующую в уровне техники потребность, предлагая композиции, которые пригодны для диагностики,
профилактики и лечения фиброзных расстройств, таких как хроническое заболевание почек.
Краткое описание изобретения
Изобретение частично основано на создании композиций для связывания с улучшенными свойствами, которые специфично и/или селективно связываются со зрелым TGF-бета 1 по сравнению со зрелым TGF-бета 2 и/или зрелым TGF-бета 3 и которые нейтрализуют зрелый TGF-бета 1.
Такие композиции для связывания включают:
a) первую часть, содержащую как минимум одну из следующих последовательностей:
GYRX1X2X3Y [SEQ ID NO: 4]; где X1 представляет собой W или A; X2 представляет собой F или L и X3
представляет собой A, E или Y;
b) GYX1FX2DYNX3X4 [SEQ ID NO: 2]; где X1 представляет собой T или D; X2 представляет собой T,
E или F; X3 представляет собой M, I, L или V и X4 представляет собой H, V или A; или
c) X1X2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS [SEQ ID NO: 3]; где X1 представляет собой Y, Q или S; X2 представляет собой I или V; X3 представляет собой D или E; X4 представляет собой Y, T, H или L; X5 представляет собой Q, K, P или S и X6 представляет собой F или Y; и/или
b) вторую часть, содержащую как минимум одну из следующих последовательностей:
X1QWDX2X3X4PA [SEQ ID NO: 7]; где X1 представляет собой Q или S; X2 представляет собой L, D или P;
X3 представляет собой N или R; и X4 представляет собой P, F, Y или R; X1AX2X3X4VX5YMH [SEQ ID
NO: 5]; где X1 представляет собой R, Y, Е или Q; X2 представляет собой S или T; X3 представляет собой
S, V или A; X4 представляет собой S или L; X5 представляет собой S, P, L или Y; или ATSNX1AX2 [SEQ
ID NO: 6]; где X1 представляет собой L, N или P и X2 представляет собой S, K, Y, L, M, F, E, Q, R или H;
-1-
016038
композиция для связывания также может содержать:
a) указанную первую часть, которая включает как минимум две указанные последовательности;
b) указанную первую часть, которая включает три указанные последовательности;
c) указанную вторую часть, которая включает как минимум две указанные последовательности;
d) указанную вторую часть, которая включает три указанные последовательности;
e) указанную первую часть, которая включает как минимум две указанные последовательности и
указанную вторую часть, которая включает три указанные последовательности;
f) указанную вторую часть, которая включает как минимум две указанные последовательности, и
указанную первую часть, которая включает три указанные последовательности; или
g) указанную первую часть, которая включает три указанные последовательности, и указанную вторую часть, которая включает три указанные последовательности; где сайт связывания композиции для
связывания: обладает специфичной иммунореактивностю в отношении полипептида человеческого TGFбета 1; обладает специфичной иммунореактивностю в отношении полипептида мышиного TGF-бета 1;
направлен против очищенного или продуцированного рекомбинантным способом человеческого белка
TGF-бета 1 или его фрагмента; расположен в моноклональном антителе, Fab, Fv, scFv, F(ab)2 или вариабельном участке антитела; содержит как минимум одну, две или три консервативные замены или находится в каркасе человеческого или гуманизированного антитела; где композиция для связывания: представляет собой молекулу антитела; представляет собой молекулу моноклонального антитела; представляет собой молекулу димерного антитела; представляет собой молекулу тримерного антитела; представляет собой молекулу тетрамерного антитела; представляет собой молекулу миниантитела; представляет
собой моноклональную антисыворотку; содержит поддающуюся обнаружению метку; является лиофилизированной, стерильной; или находится в буферизованной композиции; где композиция для связывания представляет собой моноклональное антитело с улучшенными свойствами.
Описание фигуры
На фиг. 1 показан эффект действия антител по изобретению на уровень белков в моче у крыс. Крысам вводили в/в 2,5 мг/кг mAB α-Thy1.1, затем через 30 мин вводили 1 мг герцетина (контрольное mAB),
mAB 21D1 и mAB DM4. Вторую дозу герцетина, mAB 21D1 и mAB DM4, вводили на день 7. Животных
умерщвляли на день 14. mAB 21D1, также как и mAB DM4, понижали уровни белка в моче (снижение
протеиноурии) дозозависимо.
Подробное описание предпочтительных вариантов
I. Общая информация.
Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными композициями, способами и методами, описанными в данном описании, поскольку такие композиции, способы и методы могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном описании, предназначена для описания только конкретных вариантов и не должна ограничивать объем притязаний изобретения, который определен формулой изобретения.
В данном описании, в том числе и в формуле изобретения, единственные формы слов включают,
например, соответствующие множественные формы, если только в контексте четко не указано иное. Таким образом, например, ссылка на ″организм″ включает, например, один или больше различных организмов, ссылка на ″клетку″ включает, например, одну или больше таких клеток, и ссылки на ″способ″
включают, например, ссылку на равноценные стадии и способы, известные среднему специалисту в данной области, и т.п.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании,
имеют такое же значение, как их обычно понимает средний специалист в области, к которой относится
данное изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или равноценные описанным в данном описании, могут использоваться, чтобы выполнять или проверять изобретение, ниже описаны пригодные
материалы и методы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, обсуждаемые в данном описании, приведены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в
данном описании не должно интерпретироваться как допущение, что данное изобретение имеет возможность быть предвиденным из-за более ранних раскрытий. Все публикации, патентные заявки, патенты и
другие ссылки, упомянутые в данном описании, включены путем ссылки во всей их полноте для указаний, в отношении которых они процитированы (как четко обусловливает контекст), включая все рисунки, диаграммы, изображения, графики, гиперссылки и другую форму кода, исполняемого программойбраузером.
II. Определения.
"Композиция для связывания" представляет собой молекулярный объект со сродством селективного
и/или конкретного связывания как минимум с одним другим молекулярным объектом или партнером по
связыванию. Обычно ассоциация будет состоять в естественном физиологически уместном взаимодействии, ковалентном или нековалентном, и может включать компоненты полипротеинового комплекса, в
том числе, не ограничиваясь ими, соединения-носители, партнеров для димеризации или мультимеризации. Композиция для связывания может быть получена естественным образом (например, путем выделе-2-
016038
ния и/или очистки) или синтетическим путем, в целом или в ее части. Обычно композиция для связывания содержит как минимум один участок, такой как, в качестве не ограничивающего примера, область
поверхности, форма (например, впадина, трещина, щель или выступ), молекулярное строение или пространственная конфигурация, который специфично и/или селективно ″соответствует″, ″связывается с″
или ″является комплементарной к″ конкретной пространственной и/или полярной организации области
или участка на партнере связывания. Таким образом, например, если композиция для связывания находится достаточно близко к потенциальному партнеру связывания, композиция для связывания и партнер
специфично и/или селективно связываются друг с другом. Неограничивающие примеры композиции для
связывания, спаренной с партнером по связыванию, включают антиген-антитело и гаптенсвязывающий
сайт. Неограничивающие примеры композиций для связывания антитела включают: антитела, димерные
антитела, тримерные антитела, тетрамерные антитела, миниантитела, Fab фрагменты (в том числе, например, димерные или тримерные Fab), фрагменты Fv, фрагменты scFv, фрагменты F(ab)2 и т.п. (см.,
например, Hudson & Souriau 2003 Nature Medicine 9:129-34 относительно неограничивающих примеров
композиций для связывания антитела, охватываемых изобретением). Композиция для связывания в форме моноклонального антитела является моноклональной в том смысле, что она получена из популяции в
существенной мере однородных антител (т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются в существенной мере идентичными (например, они могут происходить из клона единого типа
клеток)). Однако это не подразумевается как ограничивающее их конкретным происхождением. Такое
антитело может легко быть получено в клетках, которые обычно не производят антител, таких как клетки
CHO, NSO или COS. Кроме того, такое антитело может быть продуцировано в других видах клеток, особенно клетках млекопитающих и даже растительных клетках, путем получения средствами генной инженерии таких клеток, которые экспрессируют и собирают легкие и тяжелые цепи полипептида, образующие продукт-антитело. Кроме того, такие цепи могут быть химически синтезированы, но, поскольку они
были бы специфичными для данной антигенной детерминанты, все еще составляют ″моноклональное″
антитело в пределах концепции, в которой данный термин используется в данном описании. Таким образом, в данном описании, термин ″моноклональное антитело″ предназначен для обозначения в большей
степени специфичности и чистоты молекул антитела, чем механизма, который используется для получения указанных антител.
"Сайт связывания" представляет собой конкретный участок, область или конфигурацию молекулярного объекта, который принимает участие в конкретном и/или селективном связывании с другим молекулярным объектом. Неограничивающий пример сайта связывания представляет собой последовательность смежных аминокислот, содержащую определяющий комплементарность участок (CDR) антитела.
В одном варианте сайт связывания по изобретению содержит последовательность формулы, показанной
в табл. 1. В другом неограничивающем варианте сайт связывания содержит комбинацию последовательностей табл. 1. Другой неограничивающий пример представляет собой сайт связывания, образованный
на основе трехмерной конфигурации и пространственной организации аминокислотных последовательностей, содержащих шесть CDR петель тяжелых и легких вариабельных цепей в RIM восьмицепочечного бета бочкообразного фрагмента Fab (см., например, Chothia & Lesk, 1987 J. Mol. Biol.
196:901-17). Раскрытый CDR по изобретению может быть объединен/встроен в каркасную область или
молекулярную структуру, например, как это делается при пересадке CDR. В одном варианте структура,
несущая CDR по изобретению, в целом будет представлять собой последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или его существенной части, где CDR размещен в положении, соответствующем CDR
природных VH и VL вариабельных участков антитела, кодируемых перегруппированными генами иммуноглобулина. Структура и расположение вариабельных участков иммуноглобулина могут быть определены ссылкой (Kabat, et al., 1987 Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Ed. US Department of
Health and Human Services, и ее обновленными версиями, на сегодняшний день доступными по Интернетадресу (http://immuno.b-me.nwu.edu). CDR в общем являются такими, как определено Kabat, но также
могут соответствовать определениям Chothia (J. Mol. Biol. 196:901-17) и/или MacCallum (J. Mol. Biol.
262:732-45). Специалисты в данной области могут шаблонно определить, какие остатки составляют конкретный CDR, представленный аминокислотной последовательностью вариабельного участка, в которую
он встроен. Дополнительно, в ходе пересадки CDR могут быть пересажены остатки петли, определенные
Chothia, смежно с Kabat VH CDR1.
В одном варианте последовательности CDR по изобретению могут быть введены в репертуар вариабельных участков, где отсутствуют участки CDR, с использованием технологии рекомбинации ДНК.
Например, Marks et al. (1992 BioTechnology 10:779-83) описывают способы создания репертуаров переменных участков антитела, в которых консенсусные праймеры направлены на или являются смежными с
5'-концом области вариабельного участка, используются в соединении с консенсусными праймерами к
третьему участку структуры генов человеческих VH для обеспечения репертуара вариабельных участков
VH, где отсутствует CDR3. Marks et al. дополнительно описывают, как данный репертуар может быть
объединен с CDR3 конкретного антитела (такого, как описано в данном описании). Используя аналогичные методы, последовательности CDR3 по данному изобретению, могут быть ″перетасованы″ с репер-3-
016038
туарами участков VH или VL, где отсутствует CDR3, и ″перетасованные″ полные участки VH или VL
объединены с родственным участком VL или VH, чтобы обеспечить компоненты композиции для специфического связывания по изобретению. Альтернативно, последовательности CDR3 могут быть объединены с другими CDR по изобретению с использованием подобной стратегии. Далее репертуар может
быть показан в системе подходящего хозяина, такой как система фагового дисплея WO92/01047, таким
образом, что могут быть выбраны пригодные конкретные компоненты для связывания.
Композиция для связывания: комплекс TGF-бета 1.
Термин ″композиция для связывания:комплекс TGF-бета 1″ в данном описании обозначает комплекс композиции для связывания и белка TGF-бета 1, образованный путем специфичного и/или селективного связывания композиции для связывания с белком TGF-бета 1. В предпочтительном варианте
TGF-бета 1 в тексте данного описания означает ″зрелый″ белок TGF-бета 1 приматов. В более предпочтительном варианте TGF-бета 1 в тексте данного описания означает зрелый человеческий белок TGFбета 1 (см., например, NCBI номер доступа P01137, который описывает аминокислотную последовательность прекурсора человеческого трансформирующего фактора роста-бета 1 (TGF-бета 1) и его зрелую
часть). В каждом случае TGF-бета 1 в тексте данного описания означает TGF-бета 1 в его зрелой, биологически активной форме [(TGF-бета 1 высвобождается из клеток в виде неактивного ″латентного″ комплекса, содержащего гомодимер TGF-бета 1 в виде нековалентного комплекса с двумя просегментами, с
которым часто связан один из нескольких TGF латентных бета-1 белков связывания (см., например, Annes, et al., 2003 J. Cell Science 116:217-24; Miyazono, et al., 1993 Growth Factors 8:11-22; Munger, et al., 1997
Kidney Int. 51:1376-82; Oklu & Hesketh 2000 Biochem. J. 352:601-10). Данный латентный комплекс TGFбета 1 представляет собой важную гарантию против ″неумышленной″ активации и может стабилизировать и связывать латентный TGF-бета 1 с внеклеточным матриксом, если он изолирован (Taipale, et al.
1998 Adv. Cancer Res. 75:87-134). Внеклеточный матрикс, таким образом, действует как резервуар, из
которого TGF-бета 1 может быть легко активирован без необходимости его синтеза клеткой. Секреция
TGF-бета 1 в форме латентного комплекса обуславливает существование регулируемого процесса активации, который, вероятнее всего, опосредуется через активность протеаз, которые предпочтительно разлагают просегменты TGF-бета 1 и, таким образом, высвобождают чрезвычайно стабильную, зрелую, активную димерную форму TGF-бета 1.)].
Специфическое связывание композиции для связывания означает, что композиция для связывания
содержит сайт связывания, который распознает участок TGF-бета 1, обычно в его природной, активной
конформации. Например, антитела, направленные против TGF-бета 1 и распознающие эпитоп TGF-бета
1, способны образовывать комплекс ″композиция для связывания:комплекс TGF-бета 1″ путем конкретного связывания. Обычно образование белкового комплекса ″композиция для связывания:комплекс TGFбета 1″ позволяет измерить TGF-бета 1 в биологическом образце, например, в смеси с другими белками и
биологическими веществами. Эпитоп композиции для связывания по изобретению может быть определен с использованием методов, описанных в данном описании или в уровне техники (см., например, G.
Tribbick 2002 Journal of Immunological Methods 267:27-35; Woods & Hamuro 2001 Journal of Cellular Biochemistry Supplement 37:89-98) и/или с помощью конкурентного связывания, как описано в данном описании. В предпочтительном варианте эпитоп композиции для связывания по изобретению включает аминокислотные остатки YYVGRK [SEQ ID NO: 136] SEQ ID NO: 1; в другом варианте эпитоп композиций
для связывания по изобретению включает аминокислотные остатки YYVGRK [SEQ ID NO: 136] SEQ ID
NO: 1 и YSKV SEQ ID NO:1; в дополнительном варианте эпитоп композиции для связывания по изобретению включает как минимум 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остатков (смежных или не смежных) из YYVGRK [SEQ
ID NO: 136] SEQ ID NO: 1 и/или как минимум 1, 2, 3 или 4 остатка (смежных или не смежных) из YSKV
SEQ ID NO: 1 (такой вариант включен, чтобы охватить любые и все комбинации, например, но не ограничиваясь ими: YYVGRK [SEQ ID NO: 136] и KV SEQ ID NO: 1; или YVGRK [SEQ ID NO: 137], а также
Y и KV SEQ ID NO: 1 (все такие комбинации доступны только с использованием компьютерного алгоритма и хорошо известных математических формул для перестановок и комбинаций). В другом предпочтительном варианте эпитоп по изобретению определен функционально, например, способностью композиции для связывания по изобретению препятствовать образованию последующего комплекса связывания, конкурируя с композициями для связывания за один и тот же антиген, например, TGF-бета 1 (такое
конкурентное связывание описано в данном описании).
Термин "специфичное связывание" в данном описании обозначает ситуацию, в которой один член
пары конкретного связывания не будет демонстрировать значимого связывания с молекулами, кроме его
конкретного(их) партнера(ов) по связыванию. Термин также применим в случаях, когда, например, участок связывания антигена является специфичным для конкретного эпитопа, который несет целый ряд
антигенов, когда конкретный член связывания, несущий участок связывания антигена, будет способен
связываться с различными антигенами, несущими эпитоп. Соответственно, композиция для связывания,
специфичная для зрелого TGF-бета 1, ″не будет демонстрировать значимого связывания с молекулами,
кроме ее конкретного(их) партнера(ов) по связыванию", то есть зрелого TGF-бета 1.
Фразы ″специфично связывает(ся) ″ или ″специфично иммунореактивный в отношении″ относи-4-
016038
тельно композиции для связывания означают реакцию связывания, которая является определяющей для
присутствия композиции для связывания в присутствии гетерогенной популяции белков и других биологических компонентов. Таким образом, в указанных условиях иммуноанализа указанная композиция для
связывания связывает конкретный белок и в существенной мере не связывает другие белки, присутствующие в образце. Специфичное связывание с композицией для связывания в таких условиях может потребовать композиции для связывания, выбранной за ее специфичность в отношении конкретного белка.
Например, композиция для связывания, такая как антитело, может быть направлена против активной
димерной формы человеческого TGF-бета 1, зрелый мономер аминокислотной последовательности которого показан в [SEQ ID NO: 1], и выбрана для получения антител, обладающих специфичной иммунореактивностью в отношении указанного белка TGF-бета 1, но не других белков. Такая композиция для связывания могла бы дифференцировать белки, в высокой степени гомологичные с человеческим белком
TGF-бета 1, например другие изоформы человеческого TGF-бета (например, человеческий TGF-бета 2
или человеческий TGF-бета 3). В предпочтительном варианте специфичность композиции для связывания по изобретению в отношении зрелого TGF-бета 1 равна или превышает в 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0,
4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 300,
400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000,
7500, 8000, 8500, 9000, 9500 или 10 000 раз его специфичность в отношении зрелого TGF-бета 2 и/или
зрелого TGF-бета 3. В другом предпочтительном варианте специфичность композиции по изобретению
может иметь конкретное значение специфичности в отношении человеческого TGF-бета 2 из приведенного выше списка и другое значение специфичности в отношении человеческого TGF-бета 3, например
специфичности в отношении зрелого TGF-бета 1, которая равна или более чем в 100 раз превышает его
специфичность в отношении зрелого TGF-бета 2, и равна или более чем в 900 раз превышает его специфичность в отношении зрелого TGF-бета 3. Любые такие комбинации находятся в рамках данного изобретения.
Композиция для связывания по изобретению предпочтительно нейтрализует TGF-бета 1 и демонстрирует константу диссоциации (kd) для TGF-бета 1 предпочтительно меньше чем приблизительно: 100,
95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 пМ;
более предпочтительно меньше, чем приблизительно: 10, 9,9, 9,8, 9,7, 9,6, 9,5, 9,4, 9,3, 9,2, 9,1, 9,0,
8,9, 8,8, 8,7, 8,6, 8,5, 8,4, 8,3, 8,2, 8,1, 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4,
6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1 или 5,0 пМ;
даже более предпочтительно меньше, чем приблизительно 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1
4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5,
1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0 пМ; и
даже более предпочтительно 9,9, 9,8, 9,7, 9,6, 9,5, 9,4, 9,3, 9,2, 9,1, 9,0, 8,9, 8,8, 8,7, 8,6, 8,5, 8,4, 8,3,
8,2, 8,1 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7,
5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2,
3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6,
0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 или 0,01 пМ. Константа диссоциации (Kd) композиции для связывания может быть
определена с использованием любого способа из уровня техники, например BIACore™ с адаптированным способом Karlsson et al., 1991 J. Immunol. Methods 145, 299-340. Другие описания см. в Jonsson, et al.
1993 Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, et al. 1991 Biotechniques 11:620-7; Johnsson, et al. 1995 J. Mol. Recognit. 8:125-31; и Johnnson, et al. 1991 Anal. Biochem. 198:268-77.
Термин ″kon″ в данном описании обозначает ассоциацию или константу скорости или скорость конкретной реакции, процесса или комплексообразования, измеренную в единицах: M-1c-1. Термин ″koff″ в
данном описании обозначает диссоциацию или константу скорости диссоциации или конкретную скорость реакции для диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген, измеренную в единицах 1/с.
Термин ″Kd″ в данном описании обозначает константу диссоциации специфического взаимодействия
антиген/антитело. Ее вычисляют по формуле koff/kon=Kd. Сродство композиции для связывания часто
коррелирует с более низкой koff, чем с более высокой kon, однако не привязываясь к теории, варианты как
с улучшенной koff, так и с улучшенной kon находятся в рамках данного изобретения. В более предпочтительном варианте композиции для связывания по настоящему изобретению представляют собой высоко
активные антитела или их фрагменты, в общем демонстрирующие низкие значения koff. Даже в более
предпочтительном варианте константа скорости kon для варианта Fab по изобретению демонстрирует как
минимум в 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3 или 2,4 раза улучшенную скорость kon, чем для Fab сравнения, например, mAb2471, описанного в PCT/US2004/018921; US60/485820. В другом варианте композиция по изобретению обладает улучшенной скоростью koff, которая как минимум в 10, 20, 30, 40, 50, 60,
70, 80, 90, 100, 125, 130, 150, 195, 200, 225, 250, 260, 270, 280, 290 или 300 раз лучше, чем у сравнимой
композиции связывания (например, такой как Fab или mAb).
Предпочтительно композиция для связывания антитела специфично и/или селективно связывается с
TGF-бета 1 по сравнению с TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3; более предпочтительно композиция для связывания антитела специфично и/или селективно связывается с человеческим TGF-бета 1 по сравнению с
-5-
016038
человеческим TGF-бета 2 и/или человеческим TGF-бета 3. Предпочтительно такое антитело обладает
менее чем приблизительно 20% перекрестной реактивности с TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3 (измеренной
по соотношению констант диссоциации), более предпочтительно менее чем приблизительно 15% перекрестной реактивности и даже более предпочтительно обладает менее чем приблизительно 10% перекрестной реактивности, и даже более предпочтительно обладает менее чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3,
2 или 1% перекрестной реактивности.
Кроме того, композиция для связывания антитела более предпочтительно распознает активную, но
не латентную форму TGF-бета 1, более предпочтительно активную, но не латентную форму человеческого TGF-бета 1.
Нейтрализация
Термин ″нейтрализовать″ или ″проявлять антагонизм″ в отношении композиции для связывания означает ситуацию, в которой специфичное и/или селективное связывание композиции для связывания с
другим молекулярным объектом приводит к прекращению или ингибированию биологической эффекторной функции молекулярного объекта, связанного композицией для связывания. В отношении TGFбета 1 термин ″нейтрализовать″ или ″проявлять антагонизм″ обозначает композицию для связывания,
связывание или взаимодействие которой с TGF-бета 1 приводит к ингибированию биологической активности, индуцированной TGF-бета 1. Ингибирование биологической активности TGF-бета 1 может быть
оценено путем измерения одного или больше in vitro или in vivo индикаторов биологической активности
TGF-бета 1, в том числе, например, но не ограничиваясь ими, ингибирование связывания с рецептором,
ингибирование фиброза, ингибирование хемотаксиса или ингибирование преобразования сигнала в анализе связывания TGF-бета 1 (см., например, EP 0945464 относительно неограничивающих примеров анализов нейтрализации, включенных в данное изобретение). В неограничивающем варианте способность
композиции для связывания нейтрализовать или проявлять антагонизм в отношении активности TGFбета 1 оценена с использованием анализа, описанного в примере данного описания.
″Нейтрализующая активность″ композиции для связывания, например варианта антитела, может
быть исследована общепризнанным в уровне техники методом. В неограничивающем примере исследование проводят, адаптируя/модифицируя анализ TGF Randall et al. (1993) J. Immunol Methods 164, 61-67.
Данное испытание основано на способности TGF-бета 1 и TGF-бета 2 ингибировать индуцированную
интерлейкином-5 (IL-5) пролиферацию клеточной линии эритролейкемии TF1 и на способности обращать ингибирование TGF-бета композициями для специфического связывания. Сообщалось, что анализ
является быстрым, воспроизводимым и чувствительным к концентрациям менее 500 фг/мл TGF-бета 1 и
5-10 пг/мл TGF-бета 2. Также сообщалось, что анализ в 100-1000 раз менее чувствителен к другим ингибиторным молекулам, таким как бета интерферон, гамма интерферон и опухолевый некротический фактор-альфа (TNF-альфа). Также сообщалось, что анализ может быть сделан специфичным для TGF-бета 1
или TGF-бета 2 путем включения конкретных нейтрализирующих антител к TGF-бета 1 или TGF-бета 2
и для распознавания всех легкодоступных рекомбинантных молекулярных разновидностей данных молекул, а также природных белков, полученных из человеческих и бычьих тромбоцитов, и для обнаружения TGF-бета в образцах сыворотки.
Другие анализы, раскрытые в данном описании или известные из уровня техники, также находятся
в рамках данного изобретения. Например, крысиная модель анти-Thy1.1 представляет собой общепризнанную модель мезангиопролиферативного гломерулонефрита (см., например, Morita, et al., 1998 Am J
Kidney Dis 31:559-73; Bagchus, et al., 1986 Lab. Invest. 55:680-7 и Yamamoto & Wilson 1987 Kidney Int.
32:514-25), в которой инъекция антитела, направленного против антигена Thy, локализованного на поверхности мезангиальных клеток, индуцирует мезангиолиз с последующей фазой сверхкомпенсаторной
пролиферации мезангиальных клеток, что приводит к повышению уровней белка в моче (протеинурия).
Модель нефрита анти-Thy1.1 во многих аспектах имеет сходство с нефритом IgA у человека или пурпурой Хенош-Шонлейна (O'Donoghue, et al., 1991 J. Clin Invest 88:1522-30) и применяется для исследования
потенциальных терапевтических подходов к заболеванию почек путем определения способности исследуемых тестовых композиций вызывать коррелирующее с дозой уменьшение протеинурии (см., например, Burg, et al., 1997 Lab Invest 76:505-16; Johnson, et al., 1995 Kidney Int 47:62-9). В предпочтительном
варианте композиция для связывания по изобретению уменьшает протеинурию на такой модели на 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80% или больше. Кроме того, изобретение включает варианты, содержащие интервал снижения протеинурии (на такой модели) между какими-либо двумя из указанных
значений, причем данный интервал может включать или не включать одно или оба цифровых значения,
соответствующие конечным точкам интервала (например, интервал >12% и ≤42%).
Дополнительно, можно принять любой анализ Sharma (см., например, 2000 PNAS 97:8015-20) на
модели диабетических мышей db/db, демонстрируя, что хроническое ингибирование биологического
действия TGF-бета в почке эффективно предупреждает почечную недостаточность, которая является
обычным результатом диабета, или можно принять модель на мышах со стрептозотоциновым диабетом
-6-
016038
Sharma (1996 Diabetes 45, 522-30) для анализа способности композиции для связывания облегчать или
предупреждать диабетическую нефропатию. В дальнейшем, Ueberham et al., 2003 Hepatology 37(5):106778, описали регулируемую тетрациклином систему генной экспрессии на модели дважды трансгенной
мыши с фиброзом печени, где экспрессия TGF-бета 1 регулируется добавлением или удалением гидрохлорида доксициклина к питьевой воде, таким образом позволяя инициацию или прекращение экспрессии TGF-бета 1 по желанию. Повышение экспрессии TGF-бета 1 в печени таких животных ведет к состояниям фиброзного заболевания, которые являются обратимыми при прекращении экспрессии TGFбета 1, даже после того, как масса печени снижена на 59%. Использование данной модели позволяет
оценивать воздействие композиций для связывания по изобретению на ингибирование биологических
функций TGF-бета 1, сравнивая композицию для связывания по изобретению с воздействиями гидрохлорида доксициклина, который прекращает экспрессию TGF-бета 1. В конкретном варианте с использованием анализа пролиферации клеток HT-2 (как описано в данном описании) заявители предпочтительно
включают варианты композиции для связывания с IC50, улучшенным как минимум в 50, 60, 70, 80, 90,
100, 105, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425 или 450 раз или больше, по сравнению со значением IC50, полученным с использованием подобной композиции для связывания, например,
такой как mAb2471 (описана в PCT/US2004/018921; США 60/485820), в таких же или подобных условиях
анализа. Кроме того, изобретение включает варианты, демонстрирующие интервал улучшения IC50 (как
определяется выше) двух таких значений, которые могут включать или не включать любую или обе конечные точки (например, улучшение IC50 в интервале >80 раз и ≤100 раз по сравнению, например, с
mAb2471).
Антитела
Композиции для связывания антитела по изобретению включают, например, но не ограничиваясь
ими, поликлональные, моноклональные, мультиспецифичные, человеческие, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab'), фрагменты, продуцированные библиотекой экспрессии Fab, антиидиотипические (анти-Id) антитела (в том числе, например,
анти-Id антитела к антителам по изобретению) и фрагмент связывания эпитопа любого из упомянутого
выше.
Термин ″антитело″ в данном описании означает композиции иммуноглобулина и иммунологически
активные части композиций иммуноглобулина, например молекула композиции для связывания, которая
содержит сайт связывания, который специфично и/или селективно связывается с антигеном. Композиция
иммуноглобулина по изобретению может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY),
класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.
Предпочтительно антитело представляет собой фрагмент человеческого антигенсвязывающего антитела по изобретению, например, но не ограничиваясь ими, Fab, Fab' и F(ab')2, Fc, одноцепочечный Fvs
(scFv), одноцепочечные антитела, связанный с дисульфидом Fvs (sdFv), а также фрагменты, содержащие
участок VL или VH. Фрагменты антигенсвязывающего антитела, в том числе одноцепочечные антитела,
могут включать вариабельный(ые) участок(ки) только отдельно или в комбинации с полной длиной или
частью следующего: шарнирная область, CH1, CH2 или область CH3 или их комбинации. Изобретение
также включает, например, но не ограничиваясь ими, антигенсвязывающий фрагмент, который также
может содержать любую комбинацию вариабельного(ых) участка(ов) с шарнирной областью, например,
такой как область CH1, CH2 или CH3 или их комбинации. Антитело по изобретению может происходить
из любого животного, в том числе птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела являются человеческими, антителами приматов, мышиными (например, мышь и крыса), ослиными, кроличьими, козьими,
антителами морской свинки, верблюда, лошади или курицы.
В данном описании фраза ″человеческие антитела″ включает, например, но не ограничиваясь ими,
антитела, содержащие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, в том
числе, например, но не ограничиваясь ими, антитело, выделенное из библиотеки человеческого иммуноглобулина (например, библиотеки зародышевой линии человека) или из трансгенного животного, которое не экспрессирует эндогенных иммуноглобулинов, для одного или больше человеческих иммуноглобулинов, как описано в данном описании или как описано в патенте США № 5939598.
Композиция для связывания может быть моноспецифичной, обладать двойной специфичностью,
тройной специфичностью или мультиспецифичностью. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными в отношении различных эпитопов целевого белка, полипептида (или его фрагмента) или могут быть специфичными в отношении как TGF-бета 1, так и гетерологичного эпитопа, такого как гетерологичная изоформа TGF-бета или твердый материал подложки (см., например, WO 2093/17715; WO
92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; патенты США №№
4474893; 4714681; 4925648; 5573920 или 5601819; или Kostelny, et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553).
Композиция для связывания может быть описана или указана в терминах эпитопа(ов) или части(ей)
белка TGF-бета 1 (или его фрагмента), который она распознает или с которым селективно и/или специфично связывается. Эпитоп(ы) или часть(и) полипептида могут быть указаны, как описано в данном описании, например, по N-концевым и C-концевым положениям, по размеру в смежных аминокислотных
-7-
016038
остатках, или как перечислено в приложенной таблице и/или на фигуре, или как описано в данном описании. Дополнительно, антитело, которое специфично связывается с эпитопом, полипептидом, белком
или фрагментом полипептида или белка, также может быть специфично исключенным из данного изобретения. Например, заявители оставляют за собой право на условие исключения любого антитела, которое специфично связывается с эпитопом, полипептидом, белком или фрагментом полипептида или белка.
Соответственно, изобретение может включать первое (или другое) антитело, которое специфично связывается с полипептидом или белком или его фрагментом, и, в то же время, из изобретения может быть
исключено второе (или другое) антитело, которое также может селективно связываться с тем же белком
или полипептидом или его фрагментом, например, путем связывания другого эпитопа. В предпочтительном варианте заявители оговаривают композицию для связывания, которая специфично и/или селективно связывается с изоформой TGF-бета 1 по сравнению с TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3 и которая нейтрализует TGF-бета 1, содержащую как минимум один сайт связывания, содержащий как минимум: четыре
смежные аминокислоты из QQWNGNPPA [SEQ ID NO: 126]; как минимум шесть смежных аминокислот
из QQWDSNPPA [SEQ ID NO: 127]; как минимум пять смежных аминокислот из YIYPYNGDTGYNQKFKS [SEQ ID NO: 128] (где одна из указанных как минимум пяти смежных аминокислот представляет собой D); или как минимум пять смежных аминокислот из GYTFTDYTMH [SEQ ID
NO: 129].
Антитела по изобретению также могут быть описаны или определены единицами их перекрестной
реактивности. Изобретение включает антитела, которые не связываются с любым другим аналогом, ортологом, паралогом или гомологом целевого белка, полипептида (или его фрагмента).
Изобретение дополнительно включает антитело, которое селективно связывается с полипептидом, который кодируется полинуклеотидом, который стабильно гибридизуется, в условиях строгой гибридизации (как
описано в данном описании), с человеческой последовательностью полинуклеотида TGF-бета 1.
Композиция для связывания также может быть описана или определена единицами сродства связывания с белком или полипептидом (его фрагментом), или эпитопом. В другом варианте предпочтительное сродство связывания композиции для связывания, например, антитела или антителосвязывающего
фрагмента включает, например, сродство связывания (с использованием описанного в данном описании
анализа), которое демонстрирует константу диссоциации или Kd менее (или в интервале между двумя
числами, определенными ниже, причем данный интервал может включать или не включать любую или
обе конечные точки): 5×10-2 М, 10-2 М, 5×10-3 М, 10-3 М, 5×10-4 М, 10-4 М, 5×10-5 М, 10-5 М, 5×10-6 М, 10-6
М, 5×10-7 М, 10-7 М, 5×10-8 М, 10-8 М, 5×10-9 М, 10-9 М, 5×10-10 М, 10-10 М, 5×10-11 М, 10-11 М, 5×10-12 М,
4,9×10-12 М, 4,8×10-12 М, 4,7×10-12 М, 4,6×10-12 М, 4,5×10-12 М, 4,4×10-12 М, 4,3×10-12 М, 4,2×10-12 М,
4,1×10-12 М, 4,0×10-12 М, 3,9×10-12 М, 3,8×10-12 М, 3,7×10-12 М, 3,6×10-12 М, 3,5×10-12 М, 3,4×10-12 М,
3,3×10-12 М, 3,2×10-12 М, 3,1×10-12 М, 3,0×10-12 М, 2,9×10-12 М, 2,8×10-12 М, 2,7×10-12 М, 2,6×10-12 М,
2,5×10-12 М, 2,4×10-12 М, 2,3×10-12 М, 2,2×10-12 М, 2,1×10-12 М, 2,0×10-12 М, 1,9×10-12 М, 1,8×10-12 М,
1,7×10-12 М, 1,6×10-12 М, 1,5×10-12 М, 1,4×10-12 М, 1,3×10-12 М, 1,2×10-12 М, 1,1×10-12 М, 1,0×10-12 М,
0,9×10-12 М, 0,8×10-12 М, 0,7×10-12 М, 0,6×10-12 М, 0,5×10-12 М, 0,4×10-12 М, 0,3×10-12 М, 0,2×10-12 М,
0,1×10-12 М, 10-12 М, 5×10-13 М, 10-13 М, 5×10-14 М, 10-14 М, 5×10-15 М или 10-15 М.
Изобретение также включает антитела, которые конкурентно ингибируют связывание композиции
для связывания с эпитопом TGF-бета 1, что определяется любым из известных в уровне техники способов для определения конкурентного связывания, например иммуноанализ, описанный в данном описании или в процитированной публикации. В предпочтительных вариантах антитело конкурентно препятствует связыванию с эпитопом как минимум 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92 или 91%, как минимум 90, 89,
88, 87, 86%; как минимум 85%, как минимум 80%, как минимум 75%, как минимум 70%, как минимум
60% или как минимум 50% (или в интервале между двумя такими значениями, причем интервал может
включать или не включать любую или обе конечные точки).
Антитела по изобретению могут действовать как антагонисты TGF-бета 1 (или его фрагмента). Например, антитело или композиция для связывания по изобретению может нарушать, например, взаимодействие, частично или полностью, TGF-бета 1 с родственным рецептором/лигандом. Предпочтительно
антитела по изобретению связываются с антигенным эпитопом TGF-бета 1 или его частью.
Подобным образом изобретение включает антитела, которые связываются с лигандом и препятствуют его связыванию с рецептором (например, путем создания стерических помех). Также изобретение
включает лигандсвязывающие антитела, которые препятствуют активации рецептора без ингибирования
связывания с рецептором.
Антитела по изобретению могут применяться, например, но не ограничиваясь ими, для очистки,
обнаружения или атаки TGF-бета 1 (или его фрагмента), например, в диагностических и/или терапевтических способах in vitro и/или in vivo. Например, антитела используются в иммуноанализах для качественного и/или количественного измерения уровней TGF-бета 1 (или его фрагмента) по изобретению в
биологическом образце (см., например, Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1999).
Композиция для связывания может применяться отдельно или в комбинации с другими компози-8-
016038
циями. Кроме того, композиция для связывания, такая как антитело, может быть рекомбинантным способом объединена с гетерологичным полипептидом на N- или C-конце или химически конъюгирована (в
том числе ковалентные и нековалентные конъюгаты) с полипептидом или другими композициями. Например, антитела по изобретению могут быть рекомбинантным способом объединены или конъюгированы с молекулами, пригодными в качестве меток в анализах по обнаружению, и с эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства, радионуклиды или токсины
(см., например, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США № 5314995 и EP 396387).
Композиция для связывания включает, например, производные, которые модифицированы, например, ковалентным присоединением молекулы какого-либо типа, например, антитела, таким образом, ковалентно присоединенный фрагмент не препятствует антителу генерировать анти-идиотипическую реакцию. Например, производное антитела включает, не ограничиваясь ими, антитела, модифицированные,
например, гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическим расщеплением, присоединением к клеточному лиганду или другому белку и т.п. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена известными способами, в том числе, например, но не
ограничиваясь ими, специфичным химическим расщеплением, ацетилированием, подбором состава, метаболическим синтезом туникамицина и т.п. Дополнительно, производное может содержать одну или
больше неклассических аминокислот. Композиция для связывания может быть сгенерирована любым
пригодным способом, известным из уровня техники. Например, моноклональные антитела могут быть
получены с использованием любой техники, известной из уровня техники, например Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Breitling & Dubel 1999 Recombinant
Antibodies (John Wiley & Sons, New York); H. Zola, Monoclonal Antibodies (Garland Press) и James W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press).
Термин ″моноклональное антитело″ в данном описании не ограничен антителами, полученными с
помощью конкретной техники (например, технологии гибридомы). Способы получения и скрининга
конкретных антител с использованием технологии гибридомы являются шаблонными и известны из
уровня техники. Термин ″моноклональное антитело″ означает антитело, полученное из единого клона, в
том числе любого эукариотного, прокариотного или фагового клона, а не способ, которым оно получено.
Фрагменты антитела, которые распознают специфические эпитопы, могут быть получены известными способами. Например, Fab и F(ab')2 фрагменты по изобретению могут быть продуцированы протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина с использованием ферментов, таких как папаин
(для получения Fab фрагментов) или пепсин (для получения фрагментов F(ab')2). Фрагменты F(ab')2 содержат вариабельный участок, константный участок легкий цепи и область CH1 легкой цепи. Например,
композиция для связывания также может быть получена с использованием различных способов фагового
дисплея, известных из уровня техники, в которых функциональные области антитела показаны на поверхности частиц фага, которые несут кодирующую их последовательность полинуклеотида.
В конкретном варианте способ фагового дисплея используется, чтобы показать участки связывания
антигена, экспрессированные из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человеческих или мышиных). Фаг, который экспрессирует антигенсвязывающий участок, который связывается
с целевым антигеном, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например с использованием меченого антигена или антигена, связанного или захваченного твердой поверхностью или
гранулой. После выделения фага антитело, кодирующее участки фага, выделяют и используют для генерации целых антител, в том числе человеческих антител или любого другого целевого антигенсвязывающего фрагмента, и экспрессируют в любом желательном хозяине, включая клетки млекопитающих,
клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий, например, как описано в данном описании или
в литературе.
Рекомбинантные техники получения Fab, Fab' и F(ab')2 фрагментов также могут применяться с использованием известных из уровня техники способов, например, WO 92/122324; Mullinax, et al., BioTechniques 1992 12(6): 864-9; и Sawai, et al., 1995 AJRI 34:26-34; и Better, et al., 1988 Science 240:1041-3. Примеры получения одноцепочечного Fvs и антител включают, например, патенты США №№ 4946778 и
5258498; Huston, et al., 1991 Methods in Enzymology 203:46-88; Shu, et al., 1993 PNAS USA 90:7995-9; и
Skerra, et al., 1988 Science 240:1038-40. Для некоторых видов применения, в том числе in vivo применения
антител у человека и анализах по обнаружению in vitro, может быть предпочтительным применять гуманизированные или человеческие антитела, полученные по известным из уровня техники способам.
Гуманизированные антитела в данном описании представляют собой композиции для связывания,
которые связываются с целевым антигеном, содержащим один или больше определяющих комплементарность участков (CDR), описанных в данном описании, встроенных в каркасную область, которая с
меньшей вероятностью будет вызывать вредную реакцию иммуногенности in vivo при введении в систему хозяина-человека (например, после парентерального введения). Часто участки CDR донора подходящим образом встраиваются в человеческие каркасные области, чтобы улучшить связывание с антигеном
-9-
016038
и/или уменьшить иммуногенность. Пригодные каркасные области могут быть идентифицированы с использованием известных из уровня техники способов, например (1) моделированием взаимодействия
CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания с антигеном;
(2) сравнением последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных
положениях (см., например, патент США № 5585089, Riechmann, et al., Nature 332:323 (1988); или (3)
эмпирически.
В табл. 1 (а и b) ниже показаны определяющие комплементарность участки (CDR) вариабельной
тяжелой и легкой цепей конкретных вариантов моноклонального антитела композиции для связывания
по изобретению. Участки CDR показаны с использованием стандартного однобуквенного кода аминокислот и стандартной нумерации CDR (т.е. с увеличением цифрового значения CDR в соответствии с
увеличивающейся близостью к постоянному участку типичной структуры тяжелой или легкой цепи IgG;
например, VH CDR3 является в большей степени проксимальным по отношению к области CH1, чем VH
CDR1).
Конкретные варианты CDR представлены в общем виде с использованием формул аминокислот,
чтобы описать род CDR (опять с использованием стандартного однобуквенного кода аминокислот с допускающими замещение остатками аминокислоты, показанными буквой ″X″, и указанием расположения
остатка в пределах конкретного CDR цифровым индексом, значение которого возрастает от самого низкого (наивысший амино) до самого высокого (наивысший карбокси) остатка в CDR (например, X1 в
VHCDR2 представляет собой наивысший амино остаток CDR, в то время как карбоксильный остаток, в
наибольшей мере допускающий замещение, представляет собой X6). С использованием таких общих
формул средний специалист в данной области способен определить все варианты CDR, возможные при
каждом обозначенном положении в вариабельном участке тяжелой или легкой цепи (VL или VH), включенном в изобретение. Любой конкретный экземпляр возможной аминокислотной последовательности
определяется исключительно путем генерации всех возможных замен в каждом конкретном X остатке в
пределах конкретной формулы CDR с использованием кода аминокислот. Все такие варианты включены
в данное изобретение). Кроме того, изобретение в равной степени включает все возможные VL или VH
варианты возможных комбинаций CDR (например, с использованием приведенной информации можно
легко вычислить, что существуют 72 возможных VHCDR1; 384 возможных VHCDR2 и 12 возможных
VHCDR3, которые позволяют получить общее количество 72×384×12 возможных комбинаций VH CDR в
пределах конкретного варианта вариабельной тяжелой цепи антитела композиции для связывания по
изобретению. Изобретение также включает все такие комбинации. Подобный подход применяется к любому VL CDR и ко всем возможным комбинациям, включенным в вариабельный участок VL легкой цепи. Например, существуют 192 возможных VLCDR1; 12 возможных VLCDR2 и 48 возможных VLCDR3,
которые позволяют генерировать общее количество 192×12×48 возможных комбинаций VL CDR в пределах конкретного варианта вариабельной легкой цепи антитела композиции для связывания по изобретению). Подобным образом, изобретение также включает все возможные комбинации парного сочетания
VH и VL в пределах конкретного варианта композиции для связывания.
Таблица 1a. Формула CDR тяжелой цепи композиций для связывания
* В случае VHCDR1: X1 представляет собой T или D; X2 представляет собой T, E или F; X3 представляет собой M, I, L или V и X4 представляет собой H, V или A.
** В случае VHCDR2: X1 представляет собой Y, Q или S; X2 представляет собой I или V; X3 представляет собой D или E; X4 представляет собой Y, T, H или L; X5 представляет собой Q, K, P или S и X6
представляет собой F или Y.
*** В случае VHCDR3: X1 представляет собой W или A; X2 представляет собой или F или L и X3
представляет собой A, E или Y.
Таблица 1b. Формула CDR легкой цепи композиций для связывания
* В случае VHCDR1: X1 представляет собой R, Y, E или Q; X2 представляет собой S или T; X3 представляет собой S, V или A; X4 представляет собой S или L; X5 представляет собой S, P, L или Y.
- 10 -
016038
** В случае VLCDR2: X1 представляет собой L, N или P и X2 представляет собой S, K, Y, L, M, F, E,
Q, R или H.
*** В случае VLCDR3: X1 представляет собой Q или S; X2 представляет собой L, D или P; X3 представляет собой N или R и X4 представляет собой P, F, Y или R.
Далее, изобретение включает композиции для связывания антитела с использованием CDR, включенных в данное описание, которые встроены (в подходящей ориентации) или их несут каркасные области человеческого антитела, чтобы дать возможность композиции для связывания специфично и/или селективно связываться со зрелым TGF-бета 1, зрелым TGF-бета 2 и/или зрелым TGF-бета 3 и нейтрализовать зрелый TGF-бета 1. Известные из уровня техники способы могут использоваться для того, чтобы
встроить или разместить конкретные CDR в пределах подходящих каркасных областях. Вариабельные
участки, используемые в изобретении, могут происходить из какой-либо зародышевой линии или реорганизованного человеческого вариабельного участка или могут представлять собой синтетический вариабельный участок, основанный на консенсусных последовательностях известных человеческих вариабельных участков.
Предпочтительными вариабельными участками каркасной области являются те, которые не воздействуют в значительной мере на биологические свойства варианта композиции для связывания антитела
анти-TGF-бета 1, то есть способность специфично и/или селективно связываться и нейтрализовать зрелый TGF-бета 1 по сравнению со зрелым TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3. Более предпочтительными являются каркасные области, которые дополнительно не вызывают значительных иммуногенных реакций
при введении субъекту-человеку (например, парентеральном).
Предпочтительные каркасные последовательности могут быть последовательностями природных
человеческих антител или консенсусными последовательностями нескольких человеческих антител. Неограничивающие примеры последовательностей каркасной области для вариабельного участка вариантов
тяжелой цепи антитела по изобретению включают VH сегмент DP-5 (Tomlinson, et al. 1992 J. Mol. Biol.
227:776-98) и J сегмент JH4, JH1 или JH5 (Ravetch, et al. 1981 Cell 27:583-91). Vk сегмент L1 (Cox, et al.
1994 Eur. J. Immunol. 24:827-36) и J сегмент Jk4 (Hieter, et al. 1982 J. Biol. Chem. 10:1516-22) представляют собой неограничивающие примеры последовательностей каркасных областей для вариабельного участка легкой цепи. В предпочтительном варианте каркасная область HCVR FR1 включает
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS [SEQ ID NO: 8]; каркасная область HCVR FR2 включает
WVRQAPGQGLEWMG [SEQ ID NO: 9]; каркасная область HCVR FR3 включает RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR [SEQ ID NO: 10] и каркасная область HCVR FR4 включает WGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO: 11]. В другом предпочтительном варианте каркасная область LCVR FR1 включает
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC [SEQ ID NO: 12]; каркасная область LCVR FR2 включает последовательность, выбранную из: [SEQ ID NO: 13-36], каркасная область LCVR FR3 включает
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC [SEQ ID NO: 37] и каркасная область LCVR FR4 включает
FGQGTKLEIK [SEQ ID NO: 38]. В более предпочтительном варианте такие каркасные области могут
содержать сдвиги, делеции, добавления, замены или какую-либо их комбинацию. Более того, каркасные
области, в которых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот заменены, удалены или добавлены в какуюлибо комбинацию, также являются предпочтительными.
В одном варианте предпочтительный постоянный участок тяжелой цепи для встраивания в композицию для связывания антитела CDR по изобретению включает, например, постоянный участок IgG. В
более предпочтительном варианте постоянный участок IgG представляет собой постоянный участок
IgG1 или постоянный участок IgG4, как показано ниже:
- 11 -
016038
Предпочтительная последовательность постоянного участка легкой цепи по изобретению представляет собой постоянный участок цепи каппа, показанный ниже:
В другом предпочтительном варианте антитело композиций для связывания содержит постоянный
участок тяжелой цепни IgG1 или постоянный участок тяжелой цепни IgG4 и постоянный участок легкой
цепи каппа.
С использованием информации, предоставленной в данном описании, средний специалист мог бы
создать вариант mAb по изобретению, например, такой как № 46P-L1-6, в состав которого входила бы
легкая цепь, содержащая:
где
каркас LCVR FR1 = DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC [SEQ ID NO: 12];
VL CDR1 = EASSSVSYMH [SEQ ID NO: 138]
формулы X1AX2X3X4VX5YMH [SEQ ID NO: 5], где X1 представляет собой R, Y, E или Q; X2 представляет собой S или T; X3 структура S, V или A; X4 представляет собой S или L и X5 представляет собой
S, P, L или Y;
каркас LCVR FR2 = WYQQKPGKAPKPLIY [SEQ ID NO: 13];
VL CDR2 = ATSNLAS [SEQ ID NO: 139]
формулы ATSNX1AX2 [SEQ ID NO: 6], где X1 представляет собой L, N или P и X2 представляет собой S, K, Y, L, M, F, E, Q, R или H;
каркас LCVR FR3 = GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC [SEQ ID NO: 37];
VL CDR3 = QQWDLNPPA [SEQ ID NO: 140]
формулы X1QWDX2X3X4PA [SEQ ID NO: 7], где X1 представляет собой Q или S; X2 представляет
собой L, D или P; X3 представляет собой N или R и X4 представляет собой P, F, Y или R;
каркас LCVR FR4 = FGQGTKLEIK [SEQ ID NO: 38]; и
постоянный участок легкой цепи =
и тяжелая цепь, содержащая:
- 12 -
016038
где
каркас HCVR FR1 = QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS [SEQ ID NO: 8];
VH CDR1 = GYTFTDYNMH [SEQ ID NO: 141]
формулы GYX1FX2DYNX3X4 GYTFTDYNMH [SEQ ID NO: 2]; X1 представляет собой T или D; X2
представляет собой T, E или F; X3 представляет собой M, I, L или V и X4 есть H, V или A;
каркас HCVR FR2 = WVRQAPGQGLEWMG GYTFTDYNMH [SEQ ID NO: 9];
VH CDR2 = YIYPYDGDTGYNQKFKS GYTFTDYNMH [SEQ ID NO: 142]
формулы X1X2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS [SEQ ID NO: 3]; X1 представляет собой Y, Q или S; X2
представляет собой I или V; X3 представляет собой D или E; X4 представляет собой Y, T, H или L; X5
представляет собой Q, K, P или S и X6 представляет собой F или Y;
каркас HCVR FR3 = RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARYIYPYDGDTGYNQKFKS
GYTFTDYNMH [SEQ ID NO: 10];
VH CDR3 = GYRWFAY [SEQ ID NO: 143] формулы GYRX1X2X3Y [SEQ ID NO: 4]; где X1 представляет собой W или A; X2 представляет собой F или L и X3 представляет собой A, E или Y;
каркас HCVR FR4 = WGQGTLVTVSS [SEQ ID NO: 11]; и
постоянный участок тяжелой цепи =
Полинуклеотиды, кодирующие антитела
Изобретение дополнительно включает молекулы нуклеиновых кислот, содержащие полинуклеотидные последовательности, которые кодируют композицию для связывания (или ее фрагмент) или последовательность полипептида по изобретению. Полинуклеотиды могут быть получены, и нуклеотидная
последовательность полинуклеотидов определена любым способом, известным из уровня техники, например, если последовательность полипептида (например, антитела или его фрагмента) известна, полинуклеотид, кодирующий полипептид, может быть определен просто с использованием вырождения генетического кода в каком-либо компьютерном алгоритме, и информация о полученной последовательности
может использоваться для сборки, например, химически синтезированных олигонуклеотидов (например,
как описано в Kutmeier, et al., (1994) BioTechniques 17:242), которая, в двух словах, включает синтез частично перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей последовательность полипептида, отжиг и лигирование полученных олигонуклеотидов с последующей амплификацией лигированных олигонуклеотидов в ходе полимеразной цепной реакции.
Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий последовательность полипептида по изобретению,
может быть сгенерирован из нуклеиновой кислоты из какого-либо подходящего источника. Если клон,
содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую конкретное антитело, недоступен, но последовательность молекулы антитела известна, то нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин, может быть химически синтезирована или получена из подходящего источника. Например, источником
может быть антитело кДНК библиотеки или кДНК библиотека, генерируемая из поли A+РНК, выделенных из какой-либо ткани или клетки, экспрессирующей целевое антитело, например клеток гибридомы,
выбранных для экспрессии антитела по изобретению, ПЦР амплификацией с использованием синтетических праймеров, которые гибридизуются с 3' и 5' концами последовательности целевого полинуклеотида,
или клонированием с использованием олигонуклеотидного зонда, специфичного для конкретной последовательности гена, для идентификации, например, кДНК клона из кДНК библиотеки, который кодирует
антитело, может быть сгенерирована молекула нуклеиновой кислоты для антитела.
Амплифицированные нуклеиновые кислоты могут быть клонированы в способные к репликации
векторы клонирования с использованием какого-либо известного из уровня техники способа. Как только
- 13 -
016038
нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательность антитела определены, уклеотидной последовательностью антитела можно манипулировать с использованием какого-либо известного из
уровня техники способа, например, методов рекомбинации ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и
т.п., чтобы генерировать антитела, содержащие другую аминокислотную последовательность, с целью
создания замен, делеций и/или вставок аминокислот (см., например, Sambrook, et al., and Ausubel, et al.,
eds., cur. ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
В конкретном варианте аминокислотная последовательность вариабельных участков тяжелой и/или
легкой цепи может быть проинспектирована для идентификации последовательностей определяющих
комплементарность участков (CDR) известными способами, например, сравнивая известные аминокислотные последовательности других вариабельных участков тяжелой и легкой цепей для определения
участков гипервариабельности последовательности. С использованием шаблонных методов рекомбинации ДНК один или больше CDR, описанные в данном описании, могут быть вставлены в подходящие
каркасные области, например в человеческие каркасные области для снижения иммуногенности. Каркасные области могут представлять собой природные или консенсусные каркасные области (или как описано в данном описании) и предпочтительно представляют собой человеческие каркасные области (перечень человеческих каркасных областей см., например, в Chothia, et al. 1998 J. Mol. Biol. 278:457-79). Вообще говоря, чтобы идентифицировать остатки в пределах человеческих каркасных областей, которые,
вероятно, влияют на целостность антигенсвязывающего сайта и, таким образом, на связывание с антигеном, как донорная, так и отобранные человеческие акцепторные последовательности могут быть выровнены с несколькими шаблонами последовательности, происходящими из репертуаров антитела. Идентифицированы ″инвариантные остатки″ (Kabat et al., 1991) и ″ключевые остатки″ (Chothia et al., 1989) назначения канонического класса петель связывания донорного антигена L1-L3, H1 и H2, соответственно,
определяются путем экранирования оследовательности против шаблонов последовательности (Martin &
Thornton, 1996 Mol. Biol. 263:800-15 по адресу ttp://www.bioinf.org.uk/). Кроме того, остатки в интерфейсе
VH/VL (Chothia et al., 1985) и остатках, которые известны как структурно консервативные в основных
сайтах (Chothia et al., 1998), сравнивают с соответствующими донорными и акцепторными остатками.
Несоответствующие остатки донора и каркасной области акцептора в этих сайтах анализируют на основе
информации от других антител известной структуры из Protein Data Bank (Berman, et al., 2000 Nucl. Кислоты Res. 28(1):235-42). Выделение человеческих каркасных областей для использования в качестве
шаблонов с целью гуманизации чужеродных V участков может определить последующие решения, относительно каких остатков осуществлять гуманизацию. Выбор гомологичных шаблонов из антител с известной кристаллической структурой, из зародышевой линии, незародышевой линии или консенсусной
последовательности, полученной из доступных баз данных, представляет собой варианты (обзор см. в
Routledge et al. (Routledge, et al., 1993 in Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and
Therapeutic Applications in Man (Clark, M., ed) pp. 14-44, Academic Titles, Nottingham, UK; и B. Lo, 2004
Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press)). Другая стратегия гуманизации антител состоит в выборе наиболее близкой человеческой последовательности (Tomlinson et al., 1992) зародышевой
линии в качестве каркасного участка для получения донора CDR. Данный подход зародышевой линии
основан на том же обосновании, что и стратегия наилучшего соответствия, но поиск в базах данных
осуществляют только по последовательностям зародышевой линии (см., например, V BASE, которые
являются всеобъемлющим каталогом всех оследовательностей вариабельного участка человеческой ародышевой линии, скомпилированных из свыше тысячи опубликованных последовательностей, в том числе в текущих редакциях библиотек данных Genbank и EMBL. База данных V BASE разрабатывалась в
течение нескольких лет в MRC Center for Protein Engineering (Cambridge, Великобритания), как продолжение работы по установлению последовательности и картированию генов человеческих антител и как
удобный в применении инструмент для их анализа). Способ каркасной области зародышевой линии является наиболее пригодным, поскольку последовательность человеческой зародышевой линии не представляет соматических гипермутаций, которые являются потенциально иммуногенными. CDR также могут быть пересажены или встроены в человеческие каркасные области с использованием стратегии консенсусной человеческой зародышевой линии, в которой одна из человеческих подгрупп используется в
качестве каркасной области (см., например, Presta et al., 1993 J. Immunol 151:2623-32; Couto et al., 1994
Hybridoma, 13:215-9; Couto et al., 1995 Cancer Res. (Suppl.), 55, 5973s-7s; Werther et al., 1996 J. Immunol.,
157:4986-95; O'Connor et al., 1998 Protein Engng 11:321-8).
Предпочтительно полинуклеотид, генерируемый комбинацией участков каркасной области и CDR,
кодирует антитело (или его фрагмент), который специфично и/или селективно связывается с TGF-бета 1
(или его эпитопом). Предпочтительно, как обсуждается в данном описании, одна или больше замен аминокислот могут быть сделаны в каркасных областях, чтобы улучшить связывание антитела с целевым
антигеном.
Кроме того, такие способы могут применяться с целью создания замен или делеций аминокислот в
одном или больше вариабельных участков, остатков цистеина, участвующих в образовании внутрицепочечных дисульфидных связей для того, чтобы генерировать молекулы антитела, где одна или больше
внутрицепочечных дисульфидных связей отсутствуют. Другие изменения полинуклеотида включены в
- 14 -
016038
данное изобретение и находятся в рамках навыков среднего специалиста в данной области, такого как
молекулярный биолог.
Альтернативно, способы могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител (см.,
например, патент США № 4946778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston, et al., PNAS 85:5879-5883
(1988); and Ward, et al., Nature 334:544-54 (1989)). Одноцепочечные антитела образуют путем связывания
фрагментов тяжелых и легких цепей участка Fv через аминокислотный мостик с образованием одноцепочечного полипептида. Также могут применяться методы сборки ункциональных Fv фрагментов в E.
coli (Skerra, et al. (1988) Science 242: 1038- 1041).
Фрагменты полипептида
Изобретение также включает фрагменты композиции для связывания. ″Фрагмент полипептида или
сегмент" включает аминокисло, или частью последовательности полипептида SEQ ID NO. Белок и/или
фрагменты полипептида или сегменты могут ″существовать отдельно″ или они могут включать часть
полипептида больших размеров или белка, из которого фрагмент или сегмент образует часть или участок, например единый непрерывный участок SEQ ID NO: в данном описании соединен в слитом белке.
Предпочтительно сегмент полипептида может содержать участок смежных аминокислот, длина которого составляет как минимум приблизительно 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,
38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96,
98, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 смежных аминокислот. В данном контексте ″приблизительно″ включает, например, специфически заявленные интервалы или значения, описанные в данном описании, и он
также включает значения, которые отличаются от этих заявленных значений несколькими аминокислотными остатками (например, ± 5, ± 4, ± 3, ± 2 или ± 1 аминокислотный остаток) на одном или обоих концах фрагмента. Полинуклеотиды, кодирующие такой фрагмент полипептида, также включены в изобретение.
Кроме того, изобретение включает белки или полипептиды, содержащие множество указанных
аминокислотных сегментов или фрагментов, например, не перекрывающихся частично, сегменты указанной длины. Обычно, множество будет представлено как минимум двумя, более обычно как минимум
тремя и более предпочтительно как минимум четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или
больше. В то время как минимальные значения длины сегмента приведены, максимальные значения длины различных размеров также включены для любого конкретного множества сегментов, например, множества трех сегментов in toto могло бы содержать один сегмент длиной 7 смежных аминокислот, и два
дополнительных не перекрывающихся частично сегментов, каждый из которых имеет длину 12.
Также предпочтительными являются фрагменты или сегменты полипептида (и соответствующие
фрагменты полинуклеотида), которые характеризуют структурные или функциональные области, такие
как фрагменты или их комбинации, которые включают, например, определяющие комплементарность
участки (CDR, такие как VL или VH: CDR1, CDR2 или CDR3), вариабельные участки (например, тяжелых или легких цепей, VL или VH), участки каркасной области (FH1, 2, 3 или 4), участки D или J, постоянные участки (такие как CL, CH1, CH2 или CH3), шарнирные области, участки связывания гамма рецептора Fc, альфа-спираль и образующие альфа-спираль участки, бета-лист и образующие бета-лист участки, изгиб и образующие изгиб участки, кольцо и образующие кольцо участки, гидрофильные участки,
гидрофобные участки, альфа-амфифильные участки, бета-амфифильные участки, гибкие участки, петлевые участки, области шпильки, мотивы бета-альфа-бета, пучки спиралей, альфа/бета бочкообразные,
вверх и вниз бета бочкообразные, ″рулет с вареньем″ или мотивы ″рулета с вареньем″, трансмембранные
участки, формирующие поверхность участки, участки связывания с субстратом, трансмембранные участки, линкеры, иммуногенные участки, участки эпитопов, а также участки с высоким антигенным индексом. Кроме того, в изобретение также включены полинуклеотиды, кодирующие эти области.
Другие предпочтительные сегменты полипептида представляют собой биологически активные
фрагменты. Биологически активные фрагменты представляют собой такие, которые демонстрируют подобную, но не обязательно идентичную активность с активностью полипептида композиции для связывания (или его фрагмента), например Fab, Fv, scFv или F(ab)2. В изобретение также включены полинуклеотиды, кодирующие эти фрагменты полипептида.
Предпочтительно фрагменты полинуклеотида кодируют полипептид, который демонстрирует функциональную активность. Фраза ″функциональная активность" включает сегмент полипептида, который
может проявлять один или больше известных видов функциональной активности. Такие виды функциональной активности включают, например, но не ограничиваясь ими, биологическую активность, антигенность [способность связываться (или конкурировать с полипептидом за связывание) с композицией
для связывания антитела с полипептидом по изобретению], иммуногенность (способность генерировать
антитело, которое связывается с полипептидом по изобретению), способность образовывать мультимеры
с полипептидом по изобретению, а также способности связываться с рецептором или лигандом полипептида, описанного в данном описании.
Функциональная активность полипептида (в том числе его фрагментов, вариантов, производных и
аналогов) может быть исследована различными способами. Например, для исследования способности
- 15 -
016038
связываться или конкурировать с полипептидом полной длины по изобретению за связывания с антителом полипептида по изобретению могут применяться различные иммуноанализы, известные из уровня
техники, в том числе, например, но не граничиваясь ими, конкурентные и неконкурентные системы анализа с использованием таких методов, как радиоиммуноанализ, ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), ″сэндвичевый″ иммуноанализ, иммунорадиометрические анализы, реакции реципитации
диффузией в геле, иммунодиффузионные анализы, иммуноанализы in situ (например, с использованием
коллоидных золотых, ферментных или радиоизотопных меток), вестерн-блоттинг, реакции образования
осадка, анализы агглютинации (например, анализы агглютинации в геле, анализы гемагглютинации, анализы фиксации комплемента, анализы иммунофлуоресценции, анализы протеина A, анализы иммуноэлектрофореза и т.п.).
В другом варианте связывание антитела достигается путем обнаружения метки на исходном антителе. В другом варианте исходное антитело обнаруживают путем выявления связывания вторичного антитела или реактива с исходным антителом. Еще в одном варианте вторичное антитело несет на себе
метку. Из уровня техники известно множество средств для обнаружения связывания в иммуноанализе, и
они находятся в рамках данного изобретения.
В другом варианте, где идентифицируют лиганд или оценивают способность фрагмента, варианта
или производного полипептида по изобретению мультимеризоваться, связывание может быть проанализировано, например, с восстанавливающей и не восстанавливающей гель-хроматографией, хроматографией сродства белка и блоттинга сродства (в общем см. Phizicky, et al. (1995) Microbial. Rev. 59:94-123).
В другом варианте физиологические корреляции со связыванием полипептида с его субстратами (преобразование сигнала) могут быть проанализированы с помощью общих методов. Кроме того, анализы, описанные в данном описании (см., например, раздел заявки ″Примеры″) или иным образом известные из
уровня техники, могут быть шаблонно применены для измерения способности композиции для связывания (ее фрагментов, производных вариантов и аналогов) модулировать родственную биологическую активность TGF-бета 1 (in vitro или in vivo).
Способы получения антител
Композиция для связывания антитела может быть получена с использованием любого известного из
уровня техники способа, в частности химическим синтезом или более предпочтительно методами рекомбинантной экспрессии.
Рекомбинантная экспрессия композиции для связывания или ее фрагмента, производного или аналога (например, тяжелая или легкая цепь антитела по изобретению или одноцепочечное антитело по изобретению) требует конструирования вектора экспрессии, содержащего последовательность полинуклеотида, которая кодирует антитело. Как только последовательность полинуклеотида, кодирующая молекулу антитела или тяжелую или легкую цепь антитела, или их части (предпочтительно содержащая вариабельный участок тяжелой или легкой цепи) по изобретению, получена, вектор для выработки молекулы
антитела может быть получен известными способами рекомбинации ДНК.
Известные из уровня техники способы могут применяться для конструирования векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие композицию для связывания, и подходящие транскрипциональные и трансляциональные контрольные сигналы. Эти способы включают, например, но не
ограничиваясь ими, методы рекомбинации ДНК in vitro, синтетические методы и генетическую рекомбинацию in vivo. Изобретение, таким образом, включает способные к репликации векторы, содержащие
нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по изобретению (или его фрагмент) или его
тяжелую или легкую цепь, или вариабельный участок тяжелой или легкой цепи, или CDR, функционально связанный с промотором. Такие векторы могут содержать, например, нуклеотидную последовательность, одирующую постоянный участок молекулы антитела (см., например, WO 86/05807; WO 89/01036;
или патент США № 5122464) и вариабельный участок антитела может быть клонирован в такой вектор
для экспрессии полной тяжелой или легкой цепи или какой-либо ее части.
В целом, вектор экспрессии переносят в клетку-хозяина обычными методами, и трансфицированные клетки затем культивируют для получения антитела или его части. Таким образом, изобретение также включает, например, клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело по изобретению или его тяжелую или легкую цепь или одноцепочечное антитело по изобретению, функционально
связанный с гетерологичным ромотором. В предпочтительных вариантах для экспрессии двухцепочечных антител векторы, кодирующие как тяжелые, так и легкие цепи, могут быть соэкспрессированы в
клетке-хозяине для экспрессии полной молекулы иммуноглобулина, как подробно описано в данном
описании или известно из уровня техники.
Разнообразные системы ″хозяин-вектор экспрессии″ могут использоваться для экспрессии молекул
антитела по изобретению. Такие системы ″хозяин-вектор экспрессии″ представляют носители, с помощью которых любая целевая кодирующая последовательность может быть получена и впоследствии
очищена. Однако преобразованные или трансфицированные подходящей кодирующей нуклеотидной
последовательностью клетки системы ″хозяин-вектор экспрессии″ также могут представлять молекулу
антитела по изобретению in situ. Такие клетки включают, например, но не ограничиваясь ими, микроор- 16 -
016038
ганизмы, такие как бактерии (например, E. coli, B. subtilis), преобразованные с помощью рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или векторов экспрессии космидной ДНК, содержащих последовательности, кодирующие антитело; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia), преобразованные с
помощью рекомбинантных векторов экспрессии дрожжей, содержащие последовательности, кодирующие антитело; системы клеток насекомого, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами
экспрессии (например, бакуловирус), содержащими последовательности, кодирующие антитело; системы растительных клеток, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса мозаики табака, TMV) или преобразованные с помощью рекомбинантных плазмидных векторов экспрессии (например, плазмида Ti), содержащими последовательности, кодирующие антитело; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS,
CHO, BHK, 293, 3T3), укрывающие рекомбинантные конструкты экспрессии, содержащие промоторы,
происходящие из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов
млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор вируса коровьей оспы 7.5 K).
Предпочтительно для экспрессии рекомбинантной молекулы антитела используют бактериальные
клетки, такие как Escherichia coli, и более предпочтительно эукариотные клетки. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка (CHO), в соединении с вектором, таким как
главный промежуточный ранний элемент промотора гена из цитомегаловируса человека, представляют
собой эффективную систему экспрессии антител (Foecking, et al. (1986) Gene 45:101; Cockett, et al. (1990)
Bio/Technology 8:2).
В бактериальных системах целый ряд векторов экспрессии может быть преимущественно выбран в
зависимости от предусмотренного использования экспрессированной молекулы антитела. Например,
если должно быть получено большое количество белка, например, для изготовления фармацевтических
композиций молекулы антитела, то могут быть желательными векторы, которые направляют экспрессию
высоких уровней продуктов слитого белка, которые можно легко очистить. Такие векторы включают,
например, но не ограничиваясь ими, вектор экспрессии E. coli pUR278 (Ruther, et al., EMBO J. 2:1791
(1983)), в котором антитело, кодирующее последовательность, может быть лигировано индивидуально в
вектор каркасе с кодирующим участком lac Z, таким образом, что продуцируется слитый белок; векторы
pIN (Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3 101-3 109 (1985); Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem.
24:5503-5509 (1989)); и т.п. Векторы pGEX также могут использоваться для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион S-трансферазой (GST).
В целом, такие слитые белки обладают растворимостью и могут быть легко очищены от лизированных клеток адсорбцией и связыванием с матричными гранулами глутатиона-агарозы с последующей
элюацией в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX разработаны для включения, например,
тромбина или сайтов расщепления протеазой фактора Xa, таким образом, что клонированный продукт
целевого гена может высвобождаться из фрагмента GST. Одна из систем насекомого, которая используется в качестве вектора для экспрессии чужеродного гена, представляет собой систему вируса ядерного
полиэдроз Autographa californica (AcNPV). Вирус AcNPV размножается в клетках Spodopteru frugiperda.
Последовательность, кодирующая антитело, может быть клонирована индивидуально в несущественные
участки вируса (например, ген полиэдрина) и размещена под контролем промотора AcNPV (например,
промотор полиэдрин).
В клетках-хозяевах млекопитающих может использоваться целый ряд систем экспрессии на основе
вирусов. В случаях, где аденовирус используется в качестве вектора экспрессии, целевая последовательность, кодирующая антитело, может быть лигирована с комплексом контроля транскрипции/трансляции
аденовируса, например поздний промотор и тройственная лидерная последовательность. Данный химерный ген далее может быть вставлен в геном аденовируса с использованием рекомбинации in vitro или in
vivo. Вставка в несущественный участок вирусного генома (например, участок E1 или E3) приводит к
образованию рекомбинантного вируса, который жизнеспособен и способен экспрессировать молекулу
антитела в инфицированных хозяевах (см., например, Logan & Shenk, 1984 PNAS 8 1:355-9). Специфические сигналы инициации могут потребоваться для эффективной трансляции вставленных последовательностей, кодирующих антитело. Такие сигналы включают, например, кодон инициации ATG и смежные
последовательности. Кроме того, кодон инициации должен находиться в фазе с рамкой считывания целевой кодирующей последовательности, чтобы гарантировать надлежащую трансляцию вставки целиком. Такие экзогенные сигналы контроля трансляции и кодоны инициации могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое.
Эффективность экспрессии может быть повышена включением подходящих элементов-энхансеров
транскрипции, терминаторов транскрипции и т.п. (см., например, Bittner, et al., 1987 Methods in Enzymol.
153:5 1-4). Кроме того, может быть выбран штамм клеток-хозяев, который модулирует экспрессию
вставленной последовательности или изменяет и обрабатывает генный продукт специфическим желательным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функционирования белка.
Различные клетки-хозяева содержат характерные и специфические механизмы посттрансляциональной обработки и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или сис- 17 -
016038
темы хозяев могут быть выбраны таким образом, чтобы гарантировать правильную модификацию и обработку экспрессированного чужеродного белка. С этой точки зрения могут быть использованы эукариотные клетки-хозяева, клетки которых снабжены механизмами для соответствующей обработки исходного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования. Такие клетки-хозяева, происходящие из млекопитающих, включают, например, но не ограничиваясь ими, CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK,
293, 3T3, W138 и, в частности, клеточные линии рака молочной железы, например, BT483, Hs578T,
HTB2, BT20 и T47D, и клеточные линии нормальной молочной железы, например, CRL7030 и Hs578Bst.
Изобретение включает антитела, слитые рекомбинантными средствами или химически конъюгированные (в том числе как ковалентно, так и нековалентно конъюгированные) с полипептидом (или его
частью, более предпочтительно содержащий как минимум 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 смежных аминокислот полипептида) для получения слитых белков. Слияние не обязательно должно быть
прямым, но может происходить посредством линкерных последовательностей.
Антитела, слитые или конъюгированные с полипептидом, также могут применяться в иммуноанализах in vitro и в способах очищения с применением известных из уровня техники способов (см., например, Harbor, et al., выше, и WO 9312 1232; EP 439095; Naramura et al. (1994) Immunol. Lett. 39:9 1-9; патент США № 5474981; Gillies, et al. 1992 PNAS 89:1428-32; Fell, et al. 1991 J. Immunol. 146:2446-52).
Изобретение дополнительно включает композиции, содержащие полипептид (или его фрагмент),
слитый или конъюгированный с участком антитела, кроме вариабельного участка. Например, полипептид по изобретению (или его фрагмент) может быть слитым или конъюгированным с постоянным участком антитела, участком D или J, участком Fc или частью указанных фрагментов. Часть антитела, которая
слита с полипептидом по изобретению (или его фрагментом), может включать постоянный участок,
шарнирную область, область CH1, область CH2 и/или область CH3 или какую-либо комбинацию участков в целом или их частей. Полипептид (или его фрагмент) также может быть слитым или конъюгированным с частью антитела, описанной в данном описании, с целью образования мультимеров. Например,
части Fc, слитые с полипептидом по изобретению (или его фрагментом), могут образовывать димеры
посредством образования дисульфидной связи между частями Fc. Мультимерные формы более высоких
классов могут быть получены путем влияния полипептидов с частями IgA и IgM. Способы слияния или
конъюгации полипептида по изобретению (или его фрагмента) с частью антитела известны из уровня
техники (см., например, патенты США №№ 5336603; 5622929; 5359046; 5349053; 5447851; 5112946; EP
307434; EP 367166; WO 96/04388; WO9106570; Ashkenazi, et al. (1991) PNAS 88:10535-10539; Zheng, et al.
(1995) J. Immunol. 154:5590-5600; и Vie, et al. (1992) PNAS 89:11337-11341).
Как обсуждено в данном описании, полипептид, фрагмент полипептида может быть слитым или
конъюгированным с частью антитела, описанной в данном описании или известной из уровня техники, с
целью увеличения периода полувыведения in vivo. В дальнейшем, полипептид, фрагмент полипептида,
может быть слитым или конъюгированным с частью антитела для облегчения очистки. В одном примере
используются химерные белки, содержащие первые два домена человеческого CD4-полипептида и различные области постоянных участков тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов млекопитающих
(см., например, EP 394827; Traunecker, et al. (1988) Nature 33 1:84-86).
Во многих случаях часть Fc слитого белка дает преимущество в лечении и диагностике и, таким образом, может приводить, например, к улучшению фармакокинетических свойств (см., например, EP
A232, 262). Альтернативно, может отдаваться предпочтение удалению части Fc после того, как слитый
белок экспрессирован, обнаружен и очищен. Например, часть Fc может препятствовать осуществлению
лечения и диагностики, если слитый белок используется в качестве антигена для иммунизации. При разработке лекарственных средств, например, человеческие белки, такие как hIL-5, сливали с частями Fc
для обеспечения высокой производительности скрининговых анализов для идентификации антагонистов
ML-5 (см., например, Bennett, et al. (1995) J. Molecular Recognition 8:52-58; Johanson, et al. (1995) J. Biol.
Chem. 270:9459-9471).
Кроме того, композиция для связывания (или ее фрагмент) может быть слита с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения очистки. В предпочтительных вариантах аминокислотная последовательность маркер представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, в
векторе pQE (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), многие из которых, в том числе, являются коммерчески
доступными. Гексагистидин предусмотрен для традиционной очистки слитого белка (Gentz, et al. (1989)
PNAS 86:821-824). Другие пептидные метки, пригодные для очистки, включают, например, метку ″HA″,
которая соответствует эпитопу, происходящему из белка гемагглютинина гриппа (Wilson, et al. (1984)
Cell 37:767), и метку ″flag″.
Изобретение дополнительно включает антитела или их фрагменты, конъюгированные с диагностическим или терапевтическим агентом. Антитела могут применяться с диагностической целью, например,
для отслеживания развития или прогрессирования опухоли как части клинической процедуры обследования для определения эффективности схемы лечения. Обнаружение может быть облегчено путем соединения антитела с субстанцией, которая поддается обнаружению. Примеры субстанций, которые поддаются обнаружению, включают, например, различные ферменты, простетические группы, флуорес- 18 -
016038
центные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, испускающие позитрон металлы с применением различных видов позитрон-эмиссионной томографии, а также ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов. Субстанция, которая поддается обнаружению, может быть связана или конъюгирована непосредственно с антителом (или его фрагментом)
или косвенно, через промежуточное соединение (например, известный из уровня техники линкер) с применением признанных методов (см., например, патент США № 4741900 относительно металлических
ионов, которые могут конъюгироваться с антителами для применения в диагностике по изобретению).
Примеры подходящих ферментов включают, не ограничиваясь ими, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры комплексов подходящих простетических
групп включают, не ограничиваясь ими, стрептавидин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают, не ограничиваясь ими, умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, флуоресцеин дихлортриазиниламин, данзил хлорид или фикоэритрин; примеры
люминесцентного материала включают, не ограничиваясь ими, люминол; примеры биолюминесцентных
материалов включают, не ограничиваясь ими, люциферазу, люциферин и экворин; и примеры подходящего радиоактивного материала включают, например, I125, I131, I111 или Tc99.
Композиция для связывания по изобретению также может быть присоединена к твердым подложкам, которые особенно пригодны для иммуноанализов или очищения целевого антигена. Такие твердые
поддержки включают, например, но не ограничиваясь ими, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон,
полистрол, поливинилхлорид или полипропилен. Способы конъюгации терапевтического фрагмента с
антителом известны, см., например, Amon, et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In
Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld, et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R.
Liss, Inc.1985); Hellstrom, et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson, et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In
Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies `84: Biological And Clinical Applications, Pinchera, et
al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin, et
al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe, et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of
Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).
B. Иммуноанализы.
Содержание конкретного белка, такого как TGF-бета 1, может быть измерено с помощью различных методов иммуноанализа, например, но не ограничиваясь ими, систем конкурентного и неконкурентного анализа с использованием таких методов, как, не ограничиваясь ими, вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализы, ELISA (твердофазный иммуносорбентный анализ), ″сэндвичевые″ иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, реакции осаждения преципитирующим антителом, реакции осаждения преципитирующим антителом путем диффузии в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы фиксации добавления, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы и иммуноанализы с использованием протеина A. Обзоры иммунологических методов и методик иммуноанализа в целом см. Stites and Terr (eds.) (1991) Basic and Clinical Immunology (7th ed.). Более того, иммуноанализы по изобретению могут осуществляться во многих конфигурациях, которые обширно рассматриваются в Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Gosling J P 2000 Immunoassays: A Practical Approach (Practical Approach Series) Oxford Univ Press; Diamandis & Christopoulus,
1996 Immunoassay Academic Press, San Diego, CA; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; Wild, D. (Ed.), 2001 The Immunoassay Handbook (2nd edition) Nature Pub Group; James T. Wu, 2000
Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting, and Clinical Application, Amer Assn for Clinical Chemistry, Brousseau & Beaudet (Eds.) Manual of Immunological Methods CRC
Press Boca Raton, Florida; and Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, выше. См. также Chan
(ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price and Newman (eds.) (1991)
Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; and Ngo (ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays
Plenum Press, NY.
Иммуноанализы для измерения могут выполняться разнообразными способами, известными из
уровня техники. Если коротко, иммуноанализы для измерения содержания белка могут представлять собой анализы конкурентного или неконкурентного связывания. В конкурентных анализах связывания
подлежащий анализу образец конкурирует с меченым анализируемым веществом за конкретные сайты
связывания на улавливающем агенте, связанном с твердой поверхностью. Предпочтительно улавливающий агент представляет собой антитело, которое специфично реагирует с белком TGF-бета 1, как описано в данном описании. Концентрация меченого анализируемого вещества, связанного с улавливающим
агентом, является обратно пропорциональной количеству свободного анализируемого вещества, присутствующего в образце.
В иммуноанализе конкурентного связывания целевой белок, присутствующий в образце, конкурирует с меченым белком за связывание с конкретной композицией для связывания, например композицией для связывания, такой как антитело, которая специфично и/или селективно реагирует с целевым бел- 19 -
016038
ком. Композиция для связывания может быть связана с твердой поверхностью для осуществления отделения связанного меченого белка от несвязанного меченого белка. Альтернативно, анализ конкурентного
связывания может проводиться в жидкой фазе, и разнообразные методы, известные из уровня техники,
могут применяться для отделения связанного меченого белка от свободного меченого белка. После отделения определяют количество несвязанного меченого белка. Количество белка, присутствующее в образце, обратно пропорционально количеству связанного меченого белка.
Альтернативно, может быть осуществлен гомогенный иммуноанализ, где нет необходимости в стадии отделения. В таких иммуноанализах метка на белке изменяется при связывании белка со специфичной композицией для связывания. Такое изменение меченого белка приводит к уменьшению или увеличению сигнала, испускаемого меткой, таким образом, что измерение метки в конце иммуноанализа позволяет осуществить обнаружение или количественную оценку белка.
Конкурентные анализы также особенно пригодны, если клетки контактируют и инкубируются с меченым партнером по связыванию или антителом, обладающим известным сродством связывания к белку,
таким как 125I-антитело, и исследуемым образцом, для которого подлежит измерению сродство связывания с композицией для связывания. Затем связанную и свободную меченые композиции для связывания
отделяют, чтобы оценить степень связывания белка. Количество связанного исследуемого соединения
обратно пропорционально количеству меченого партнера по связывания, связанного с известным источником. Любой из многочисленных методов может использоваться для отделения связанного от свободного белка, чтобы оценить степень связывания белка. Данная стадия отделения обычно может включать
такие процедуры, как адгезия к фильтрам с последующим промыванием, адгезия к пластику с последующим промыванием или центрифугированием клеточных мембран. Жизнеспособные клетки также
могли бы использоваться для скрининга на предмет влияния лекарственных средств на опосредованную
белком TGF-бета функцию (например, уровни вторичного мессенджера, например, пролиферация клеток; изменения пула инозитола фосфата, транскрипция с использованием анализа по типу люциферазы; и
другие). Некоторые способы обнаружения позволяют устранить стадию отделения, например чувствительная к близости система обнаружения.
Качественный или количественный анализ белков также может осуществляться различными неконкурентными методами иммуноанализа. Например, может применяться двухсайтовый твердофазный сэндвичевый иммуноанализ. В данном виде анализов композиция для связывания белка, например антитело,
присоединена к твердой подложке. Вторая композиция для связывания белка, которая также может представлять собой антитело и которая связывается с белком на другом сайте, содержит метку. После того
как произошло связывание на обоих сайтах белка, свободную меченую композицию для связывания удаляют и измеряют количество меченой композиции для связывания, связанной с твердой фазой. Количество связанной меченой композиции для связывания является прямо пропорциональным количеству белка в образце.
В описанных выше форматах иммуноанализа используют меченые компоненты анализы. Метка
может быть связана прямо или косвенно с целевым компонентом анализа в соответствии со способами,
хорошо известными из уровня техники. Могут использоваться разнообразные метки и способы. Традиционно, используют радиоактивную метку с инкорпорированным 3H, 125I, 35S, 14C или 32P. Нерадиоактивные метки включают белки, которые связаны с мечеными антителами, флюорофорами, хемилюминесцентными агентами, ферментами и антителами, которые могут выступать в роли парных членов специфического связывания для меченого белка. Выбор метки зависит от необходимой чувствительности, легкости конъюгирования с соединением, требований стабильности и доступных инструментов. Обзор различных меток или систем генерации сигнала, которые могут быть использованы, см. в патенте США №
4391904.
Композиции для связывания антитела, которые реагируют с конкретным белком, также могут быть
измерены разнообразными методами иммуноанализа. Обзор иммунологических методов и методик иммуноанализа, пригодных для измерения антител методами иммуноанализа, см. в Stites and Terr (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.), выше; Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, выше; и Harlow and Lane
Using Antibodies, A Laboratory Manual, выше.
Если коротко, иммуноанализы для измерения антисывороток, реагирующих с целевым белком, могут представлять собой анализы конкурентного или неконкурентного связывания. В анализах конкурентного связывания образец анализируемого вещества конкурирует с меченым анализируемым веществом
за специфические сайты связывания на улавливающем агенте, связанном с твердой поверхностью. Предпочтительно улавливающий агент представляет собой очищенный рекомбинантный белок. Также могут
использоваться другие источники белков, в том числе изолированный или частично очищенный природный белок. Неконкурентные анализы включают сэндвичевые анализы, в которых образец анализируемого вещества связывается двумя специфическими для анализируемого вещества реактивами связывания.
Одна из композиций для связывания используется в качестве улавливающего агента и связана с твердой
поверхностью. Вторая композиция для связывания содержит метку и используется для измерения или
обнаружения образующегося комплекса визуальными или инструментальными средствами. Может использоваться ряд комбинаций улавливающего агента и меченой композиции для связывания. Множество
- 20 -
016038
различных форматов иммуноанализа, методов отделения и меток может использоваться подобно описанному выше для измерения белка.
Способность целевого антитела к иммунопреципитации конкретного антигена может быть оценена,
например, с помощью вестерн-блоттинга. Среднему специалисту в данной области хорошо известны параметры, которые могут быть модифицированы, чтобы увеличить связывание антитела с антигеном и
уменьшить фон (например, перед осветлением лизата клеток с гранулами сефарозы). Дальнейшее обсуждение протоколов иммунопреципитации может быть найдено, например, в Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York.
Анализ ELISA включает подготовку антигена, покрытие лунки 96-луночного планшета для микротитрования антигеном, добавление целевого антитела интереса, конъюгированного с поддающимся обнаружению соединением, таким как субстрат фермента (например, пероксидаза хрена или щелочная
фосфатаза), в лунку, инкубация в течение периода времени и обнаружение присутствия антигена. В анализах ELISA целевое антитело не должно быть конъюгировано с поддающимся обнаружению соединением; вместо этого второе антитело (которое распознает целевое антитело), конъюгированное с поддающимся обнаружению соединением, может быть добавлено в лунку. Кроме того, вместо покрытия лунки
антигеном, она может быть покрыта антителом. В данном случае может быть добавлено второе антитело,
конъюгированное с поддающимся обнаружению соединением, с последующим добавлением целевого
антигена к покрытой лунке. Средний специалист может определить без лишнего экспериментирования,
какие параметры модифицировать, например, чтобы увеличить сигнал, а также какие другие вариации
метода ELISA необходимо использовать (см., например, Ausubel, et al., eds., 1994, Current Protocols in
Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York).
Сродство связывания антитела с антигеном, а также скорость ассоциации и диссоциации в ходе
взаимодействия антиген/антитело может быть определена, например, с использованием анализа конкурентного связывания. Неограничивающий пример представляет собой радиоиммуноанализ, включающий
инкубацию меченого антигена (например, с использованием H или I) с целевым антителом в присутствии
повышенных количеств немеченого антигена, с последующим обнаружением количества антитела, связанного с меченым антигеном. Сродство целевого антитела к конкретному антигену и скорость диссоциации могут быть определены на основе данных, например анализ графика Скатчерда (Scatchard). Конкуренция со вторым антителом также может быть определена с использованием, например, радиоиммуноанализа. В данном случае антиген инкубируют с целевым антителом, конъюгированным с меченым
соединением (например, 3H или 125I) в присутствии повышенного количества немеченого второго антитела.
Физические варианты
Изобретение также включает полипептидные последовательности, обладающие значительным
сходством и/или идентичностью с аминокислотными последовательностями, описанными в данном описании. Сходство или идентичность аминокислотных последовательностей определяют, оптимизируя остаточные пары. Оно изменяется, если рассматривать консервативные замены как пары. Консервативные
замены обычно включают замены в пределах следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; а также фенилаланин, тирозин. См. также Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et
al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison
Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; а также пакеты программного обеспечения IntelliGenetics,
Mountain View, CA; и University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.
Изобретение включает, но не ограничиваясь ими, полипептидные последовательности, которые
функционально связаны с полипептидом, который кодируется конкретным идентификатором последовательности в соответствии с данной заявкой. Функционально связанные полипептиды включают любой
полипептид, разделяющий функциональную характеристику с композицией для связывания (например,
способность селективно и/или специфично связываться с TGF-бета 1 и не связываться с TGF-бета 2
и/или TGF-бета 3). Такие функционально связанные полипептиды включают, но не ограничиваясь ими,
вставки или замены аминокислотных остатков в пределах аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностями, описанными в данном описании; особенно те, которые приводят к «молчащему» изменению, таким образом, образуя функционально равноценный полипептид. Замены аминокислот могут быть сделаны на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности,
гидрофильности и/или амфифильной природы вовлеченных остатков.
Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин,
пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин,
серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты
включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.
Кроме того, неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот могут быть заменены или добавлены в последовательность полипептида. Неклассические аминокислоты включают, например, но не ограничиваясь ими, D-изомеры распространенных аминокислот; 2,4-диаминомасляную
- 21 -
016038
кислоту; α-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, Abu, 2-аминомасляную кислоту, gAbu, e-Ahx, гексановую аминокислоту, Aid, 2-аминомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту,
орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллиновую кислоту, гомоцитруллин,
цистиновую кислоту, t-бутилглицин, t-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, b-аланин, аминокислоты, такие как β-метиловые фторированные аминокислоты, конструированные аминокислоты, такие
как b-метиламинокислоты, Ca-метиловые аминокислоты, Na-метиловые аминокислоты, а также аналоги
аминокислот в целом. Кроме того, аминокислота может быть правовращающей (D) или левовращающей
(L).
Вставки пептидных фрагментов с целью удобства обращения представляют собой известные из
уровня техники шаблонные методы. Кроме того, композиция для связывания (в том числе какой-либо ее
фрагмент, и, конкретно, эпитоп) может быть объединена с частями постоянного домена иммуноглобулина, например (IgA, IgE, IgG, IgM), его частями (CH1, CH2, CH3) и любой их комбинацией, включая как
участки целиком, так и их части), с образованием химерного полипептида. Такие слитые белки могут
облегчить очистку и часто пригодны для увеличения периода полувыведения белка in vivo. Например,
это продемонстрировано для химерных белков, содержащих два первых домена человеческого полипептида CD4 и различные домены постоянных участков тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов млекопитающих (EP 394827; Traunecker, et al., 1988 Science 331:84-6). Слитые белки со связанной дисульфидными связями димерной структурой (за счет домена IgG) также могут быть более эффективны с точки зрения связывания и нейтрализации других молекул, чем секретированный мономерный белок или
отдельный фрагмент белка (Fountoulakis, et al. 1995 J. Biochem.15 270:3958-64). Увеличенная доставка
антигена сквозь эпителиальный барьер в иммунную систему продемонстрирована для антигенов (например, инсулина), конъюгированных с партнером по связыванию Fey, таким как фрагменты IgG или Fc
(см., например, WO 96/22024 и WO 99/104813).
Дополнительно, слитый белок может включать различные части постоянного участка молекулы
иммуноглобулина вместе с человеческим белком (или его частью). Во многих случаях часть Fc в слитом
белке дает преимущество в лечении и диагностике и, таким образом, может приводить, например, к
улучшенным фармакокинетическим свойствам. Альтернативно, может быть желательным удаление части Fc после того, как слитый белок экспрессирован, обнаружен и очищен. Например, часть Fc может
препятствовать лечению и/или диагностике, если слитый белок используется в качестве иммуногенного
средства для иммунизации. При разработке лекарственных средств, например, человеческие белки сливали с частями Fc для обеспечения высокой производительности скрининговых анализов для идентификации антагонистов.
Кроме того, новые конструкции могут быть изготовлены путем сочетания сходных функциональных доменов из других белков. Например, связывающие белок или другие сегменты могут быть ″переставлены″ между различными новыми слитыми полипептидами или фрагментами. Таким образом, новые
химерные полипептиды, проявляющие новые комбинации специфичности, будут получены в результате
функционального соединения специфичности связывания белка и других функциональных участков.
Дополнительно, слитые конструкции могут быть генерированы посредством методов ″перетасовки″ генов, ″перетасовки″ мотивов, ″перетасовки″ экзонов и/или ″перетасовки″ кодонов.
″В существенной мере чистый″ означает нуклеиновую кислоту, белок или полипептид, которые извлечены из их естественного окружения и изолированы и/или отделены от других загрязняющих белков,
нуклеиновых кислот и другого биологического материала. Чистота или ″выделение″ может быть проанализирована стандартными способами и обычно будет составлять как минимум приблизительно 50%, более обычно как минимум приблизительно 60%, в общем как минимум приблизительно 70%, более в общем как минимум приблизительно 80%, часто как минимум приблизительно 85%, чаще как минимум
приблизительно 90%, более предпочтительно как минимум приблизительно 95%, более предпочтительно
как минимум приблизительно 98% и в большинстве предпочтительных вариантов как минимум 99%.
Подобные понятия применяют, например, к композициям для связывания, например, таким как антитела
по изобретению. Например, это может быть желательным для очистки полипептида от рекомбинантных
клеточных белков или полипептидов.
″Растворимость″ белка или полипептида отображается осаждением, измеренным в единицах Сведберга, которые являются мерой скорости осаждения молекулы в конкретных условиях. Определение скорости осаждения классически выполняли в аналитической ультрацентрифуге, но на сегодняшний день
его обычно проводят в стандартной ультрацентрифуге (см., Freifelder 1982 _Physical Biochemistry_ (2d
Ed.) W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; and Cantor and Schimmel (1980) Biophysical Chemistry parts 13, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA). Для приблизительного определения образец, содержащий
предполагаемый растворимый полипептид, центрифугируют в стандартной полноразмерной ультрацентрифуге приблизительно при 50 тыс. об./мин в течение приблизительно 10 мин, и растворимые молекулы
остаются в супернатанте. Растворимая частица или полипептид типично будет составлять меньше приблизительно 30S, более типично меньше приблизительно 15S, обычно меньше приблизительно 10S, более обычно меньше приблизительно 6S и, в конкретных вариантах, предпочтительно меньше приблизи- 22 -
016038
тельно 4S, и более предпочтительно меньше приблизительно 3S. Растворимость полипептида или фрагмента зависит от среды и полипептида. На растворимость полипептида воздействует много параметров, в
том числе температура, электролитное окружение, размер и молекулярные характеристики полипептида,
а также природа растворителя. Обычно, температура, при которой используется полипептид, варьирует
от приблизительно 4°C до приблизительно 65°C. Обычно температура использования составляет больше
приблизительно 18°C и обычнее больше приблизительно 22°C. В случае диагностических целей температура обычно будет комнатной или теплее, но ниже температуры денатурирования компонентов в анализе. В случае терапевтических целей температура обычно будет являться температурой тела человека,
обычно приблизительно 37°C, однако в конкретных ситуациях температура может быть выше или ниже
in situ или in vitro. Размер и структура полипептида в целом должны находиться в существенной мере в
устойчивом состоянии и обычно не в денатурированном состоянии. Полипептид может быть связан с
другими полипептидами в четвертичной структуре, например, для обеспечения растворимости, или связан с липидами или детергентами способом, который приближает его к природным липидным двухслойным взаимодействиям.
Растворитель обычно будет представлять собой биологически совместимый буфер типа, используемого для сохранения биологической активности, и обычно будет приближаться к физиологическому
растворителю. Обычно растворитель будет иметь нейтральное значение рН, обычно приблизительно в
интервале 5-10 и более предпочтительно приблизительно 7,5. В некоторых случаях будет добавляться
детергент, обычно мягкий не денатурирующий детергент, например CHS (гемисукцинат холестерина)
или CHAPS (3-[3-хлорамидопропил)-диметиламмоний]-1-пропан сульфонат), или в достаточно низкой
концентрации во избежание существенного нарушения структурных или физиологических свойств белка. В предпочтительном варианте растворимость композиции для связывания по изобретению (pH 5,0-6,0
и 150 мМ NaCl) превышает 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 мг/мл; в более предпочтительном варианте превышает 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 мг/мл; в еще более предпочтительном варианте превышает 51,
52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 мг/мл, в даже более предпочтительном варианте превышает 65, 70, 7 5,
80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 или 150 мг/мл (или в интервале между любыми
двумя из указанных значений, причем интервал может включать или не включать одну или обе конечные
точки).
Варианты
Изобретение направлено на полипептиды, которые включают или, альтернативно, состоят из аминокислотной последовательности, которая является как минимум на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% идентичной, например, последовательности полипептида по изобретению (или его фрагментов). Определение
того, проявляет ли конкретная последовательность идентичность по отношению к последовательности
композиции для связывания, может быть осуществлено с использованием известных из уровня техники
способов.
Обычно, при таком сравнении последовательностей одна последовательность выполняет роль справочной последовательности, с которой сравнивают исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемые и справочные последовательности вводят в
компьютер, при необходимости присваивают последовательные координаты и указывают параметры
алгоритма программы последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет
процентную идентичность исследуемой(ых) последовательности(ей) относительно справочной(ых) последовательности(ей) на основании параметров обозначенной программы.
Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может осуществляться, например,
с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, алгоритма гомологии выравнивания Needlman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, поиском по методу сходства Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444, компьютерной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group, 575 Science Dr., Madison, WI), набора для биоинформатических расчетов LASERGENE, производимого DNASTAR (Мэдисон, Висконсин), способов выравнивания множественных последовательностей, разработанных Notredame, et al. (например, 3Dcoffee или Tcoffee, например, в Nucleic Acids Res.
2004:32(Web Server issue):W37-40; Nucleic Acids Res. 2003 Jul 1;31 (13): 3503-6; или Pharmacogenomics.
2002 Jan;3(1):131-4); или визуальной проверкой (в общем, см. Ausubel, et al., выше). Хорошо известны
другие способы сравнения нуклеотидных или аминокислотных последовательностей путем определения
оптимального выравнивания (см., например, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools
for Genumic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu, et al. (eds.), "Information Superhighway and
Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", в Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC
Press, Inc. 1997); или Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc.
1998)).
Полипептид, демонстрирующий или содержащий как минимум приблизительно, например, 95%
″идентичности последовательности″ с другой аминокислотной последовательностью, может включать,
например, до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот подряд исследуемой аминокис- 23 -
016038
лотной последовательности. Другими словами, первая аминокислотная последовательность, которая является как минимум на 95% идентичной второй аминокислотной последовательности, может содержать
до 5% от общего количества аминокислотных остатков, отличающихся от второй последовательности,
например, вставкой, делецией или заменой аминокислотного остатка. Изменения в аминокислотных остатках последовательности полипептида могут происходить, например, в амино- или карбоксиконцевых
положениях или в любом месте между этими концевыми положениями, вставлены в промежутки вразброс или отдельно среди остатков в последовательности или в одном или больше остатков, частей или
фрагментов из смежных аминокислот в пределах последовательности. На практике, демонстрирует ли
какая-либо конкретная последовательность полипептида как минимум приблизительно 80, 85, 90, 95, 96,
97, 98 или 99% сходство с другой последовательностью, например, такой как показано в табл. в данном
описании, может быть определено с использованием известных из уровня техники способов.
Варианты, включенные в изобретение, могут содержать изменения в кодирующих участках, не кодирующих участках или обоих. Кроме того, варианты, в которых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот заменены, удалены или добавлены в какую-либо комбинацию, также являются предпочтительными.
Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены методами мутагенеза или прямым синтезом
с использованием известных способов инженерии белка и технологии рекомбинации ДНК. Такие варианты могут быть получены для того, чтобы улучшить или изменить характеристики полипептида композиции для связывания (или его фрагмента). Например, одна или больше аминокислот может быть удалена с N-конца или C-конца выделенного полипептида по изобретению (или его фрагмента) без значительного снижения биологической функции. Например, Ron, et al. 1993 J. Biol. Chem. 268:2984-8, сообщают о
различных белках KGF, обладающих гепарин-связывающей активностью даже после удаление 3, 8 или
27 аминоконцевых аминокислотных остатков. Например, антигенность и/или иммуногенность может
сохраняться (например, способность варианта с делецией индуцировать и/или связываться с антителами,
которые распознают зрелую форму полипептида), когда меньше, чем большинство остатков секретированной формы удалены с N-конца или C-конца. Сохраняет ли полипептид, в котором удалены Nконцевые или C-концевые остатки белка, такую активность, может быть легко определено шаблонными
способами, описанными в данном описании или известными из уровня техники. Таким образом, изобретение также включает, например, варианты полипептида, которые демонстрируют биологическую активность, например иммуногенность или антигенность. Такие варианты включают, например, делеции,
вставки, инверсии, повторения и замены, выбранные таким образом, чтобы оказывать незначительное
влияние на активность, с использованием общих правил, известных из уровня техники. Например, указания по созданию фенотипически ″молчащих″ замен аминокислот предложены, например, в Bowie, et al.
(1990) Science 247: 1306-1310.
Помимо использования консервативных замен аминокислот, другие варианты по изобретению
включают, например, но не ограничиваясь ими, (i) замены с одним или больше неконсервативных аминокислотных остатков, где замененные аминокислотные остатки могут или не быть такими, которые кодируются генетическим кодом, или (ii) замены одного или больше аминокислотных остатков, содержащих группу заместителя, или (iii) слияние зрелого полипептида с другим соединением, таким как соединение с повышенной стабильностью и/или растворимостью полипептида (например, полиэтиленгликоль), или (iv) слияние полипептида с дополнительными аминокислотами, например пептид со слитым
участком Fc IgG, или лидерной или секреторной последовательностью или последовательностью, которая облегчает очистку. Все такие варианты находятся в пределах навыков специалистов в данной области молекулярной биологии, приведенных в данном описании указаний заявителя, например, конкретизации уникальных последовательностей полинуклеотида и полипептида.
Например, варианты полипептида, содержащие замены заряженных аминокислот на другие заряженные или нейтральные аминокислоты, могут давать полипептиды с улучшенными характеристиками,
например меньшей агрегацией. Агрегация фармацевтических препаратов как снижает активность, так и
повышает клиренс за счет иммуногенной активности агрегата (Pinckard, et al. (1967) Clin. Exp. Immunol.
2:331-340; Robbins, et al. (1987) Diabetes 36:838-845; Cleland, et al. (1993) Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377). В предпочтительном варианте композиция для связывания по изобретению,
введенная в подходящую систему pH/буфер (как описано в данном описании или известно из уровня
техники), не демонстрирует значительной агрегации после инкубации как минимум в течение 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8 или 9 месяцев в температурных условиях в интервале 1-10°C, более предпочтительно 2-8°C, даже
более предпочтительно 3-7°C и даже более предпочтительно 5-6°C.
Другой вариант изобретения включает композицию, которая содержит аминокислотную последовательность по изобретению, содержащую как минимум одну замену аминокислоты, но не более чем 50
замен аминокислот, даже более предпочтительно не более чем 40 замен аминокислот, все еще более
предпочтительно не более 30 замен аминокислот и все еще даже более предпочтительно не более 20 замен аминокислот и не более 15 замен аминокислот. Конечно, в порядке увеличения предпочтительности,
для пептида или полипептида чрезвычайно предпочтительно содержать аминокислотную последовательность, которая включает аминокислотную последовательность по изобретению, которая содержит как
- 24 -
016038
минимум: одну, но не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен аминокислот. В конкретных вариантах
число вставок, замен и/или делеций в последовательности полипептида по изобретению или его фрагментов составляет как минимум: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 10-50 или 50-150; где консервативные замены аминокислот являются более предпочтительными,
чем неконсервативные замены.
Терапевтическое применение
Данное изобретение также обеспечивает реагенты, пригодные для применения с терапевтической
целью. Терапевтические композиции для связывания по изобретению включают, например, но не ограничиваясь ими, композиции для связывания антитела по изобретению (в том числе их фрагменты, аналоги и производные, как описано в данном описании) и кодирующие их молекулы нуклеиновых кислот (в
том числе их фрагменты, аналоги и производные, а также анти-идиотипические антитела, как описано в
данном описании). Такое антитело может применяться для модуляции, лечения, регрессии, облегчения
или предупреждения заболевания, расстройства или состояния, связанных с аномальной экспрессией
и/или активностью TGF-бета 1 (или его фрагмента), в том числе, например, но не ограничиваясь ими,
одно или больше заболеваний, расстройств, синдромов или состояний, описанных в данном описании.
Лечение, облегчение и/или предотвращение заболеваний, расстройств или состояний, связанных с аномальной экспрессией и/или активностью TGF-бета 1, включают, например, но не ограничиваясь ими,
облегчение симптомов, связанных с такими заболеваниями, расстройствами или состояниями.
Например, заболевание или расстройство, связанное с аномальной экспрессией или аномальным
проведением сигнала TGF-бета 1, представляет собой мишень для антагониста TGF-бета 1, такого как
композиция для связывания по изобретению. Изобретение включает терапии на основе композиций для
связывания, которые включают введение композиции для связывания животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно примату (например, человеку) с целью модулирования, лечения, регрессии, влияния или облегчения одного или больше раскрытых заболеваний, расстройств или
состояний, описанных в данном описании. Например, не привязываясь к теории, показано, что специфичные в отношении человеческого TGF-бета антитела являются эффективными на животных моделях с
точки зрения лечения заболеваний, при которых наблюдается чрезмерная экспрессия рецептора TGF
(TGFR). Показано, что антисыворотка против TGF-бета является эффективной с точки зрения лечения
гломерулонефрита (Border, et al. 1990 Nature 346:371-4) и фиброза легкого (Giri, et al. 1993 Thorax 48:95966). Таким образом, новые композиции для связывания по изобретению с улучшенными характеристиками также были бы эффективны для облегчения расстройств, состояний или заболеваний, например
фиброзных заболеваний и состояний, связанных с TGF-бета 1.
Рекомбинантные и/или изолированные композиции для связывания по изобретению, например антитела, могут быть очищены и введены субъекту для лечения. Эти реактивы могут сочетаться для применения с дополнительными активными или инертными ингредиентами, например, в традиционных
фармацевтически приемлемых носителях или наполнителях, например иммуногенных адъювантах, наряду с физиологически инертными стабилизаторами и вспомогательными веществами. Такие комбинации
могут быть стерилизованы фильтрацией и введены в лекарственные формы как путем лиофилизации в
однодозовых флаконах или хранения в стабилизированных водных препаратах. Данное изобретение также включает применение антител или их связывающихся фрагментов, в том числе форм, которые не связывают комплемент. Другой терапевтический подход, который находится в рамках данного изобретения,
включает прямое введение субъекту реактивов, препаратов или композиций какими-либо традиционными способами введения (например, но не ограничиваясь ими, местной инъекцией, ингаляцией или системным введением). Изобретение также предлагает фармацевтический пакет или набор, содержащий
один или больше контейнеров, наполненных одним или больше ингредиентов композиций по изобретению, и инструкции, например, по применению (обычно в форме, предписанной правительственным органом, который регулирует производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или
биологических продуктов). Способы введения включают внутривенное, внутрибрюшное или внутримышечное введение, трансдермальную диффузию и т.д. Фармацевтически приемлемые носители включают
воду, солевой раствор, буферы и другие описанные смеси, например, в Merck Index, Merck & Co.,
Rahway, NJ.
Другие аномальные состояния развития, включенные в данное описание, известны для типов клеток, для которых с помощью нозерн-блоттинга показано наличие TGF-бета 1 мРНК (см., например, Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn et al. Harrison's
Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; and Rich (ed.) Clinical Immunology; Principles and Practice, Mosby, St. Louis (cur. ed.); и ниже). Аномалии развития или функциональные аномалии (например,
нейронной, иммунной или гемопоэтической системы) вызывают существенные с медицинской точки
зрения отклонения и состояния, которые могут быть восприимчивыми к профилактике или лечению с
применением композиций, предложенных в данном описании.
Другой терапевтический подход, который находится в рамках изобретения, включает прямое введение реактивов, препаратов или композиций любыми традиционными способами введения (например,
но не ограничиваясь ими, местной инъекцией, ингаляцией или систематическим введением) субъекту.
- 25 -
016038
Включенные реактивы, препараты или композиции могут быть получены любым способом, описанным в
данном описании или известным из уровня техники. Фактическая дозировка реактива, препарата или
композиции, которая модулирует заболевание, расстройство, состояние, синдром и т.п., зависит от многих факторов, в том числе размера и состояния здоровья организма, однако средний специалист в данной
области может использовать следующие указания, описывающие способы и методы определения клинической дозировки (см., например, Spilker (1984) Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven
Press Books, Ltd., New York, pp. 7-13, 54-60; Spilker (1991) Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York,
pp. 93-101; Craig and Stitzel (eds. 1986) Modern Pharmacology, 2d ed., Little, Brown and Co., Boston, pp. 127-33;
Speight (ed. 1987) Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3d
ed., Williams and Wilkins, Baltimore, pp. 50-56; Tallarida, et al. (1988) Principles in General Pharmacology,
Springer-Verlag, New York, pp. 18-20; и патенты США №№ 4657760; 5206344; или 5225212). В целом, конечная концентрация в интервале приблизительно от 0,5 фг/мл до 500 мкг/мл в сутки вводится взрослому человеку в каком-либо фармацевтически приемлемом носителе. Кроме того, эксперименты на животных обеспечивают надежное руководство для определения эффективных доз в лечении человека. Межвидовое масштабирование эффективных доз может выполняться в соответствии с известными из уровня техники принципами
(например, см. Mordenti and Chappell (1989) "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics", in Toxicokinetics
and New Drug Development; Yacobi, et al. (eds.) Pergamon Press, NY).
Эффективные дозы также могут быть экстраполированы с использованием кривых ″доза-реакция″,
полученных на основе экспериментов in vitro или на животных моделях. Например, для антител дозировка обычно составляет от 0,1 до 100 мг/кг массы тела реципиента. Предпочтительно дозировка составляет от 0,1 до 20 мг/кг массы тела реципиента, более предпочтительно от 1 до 10 мг/кг массы тела реципиента. В общем, гомоспецифические антитела демонстрируют более длинный период полувыведения,
чем гетероспецифические антитела (например, человеческие антитела дольше остаются в организме хозяина-человека, чем антитела других видов, например, таких как мышь, вероятно, из-за иммунной реакции хозяина на чужеродную композицию). Таким образом, часто дозы человеческих антител могут быть
ниже с большими промежутками времени между введением отдельных доз, если антитела вводят субъекту-человеку. Кроме того, дозы и частота введения антител по изобретению могут быть уменьшены при
увеличении захвата и проникновения в ткани (например, в мозг) с использованием модификации, например липидирования.
Изобретение также предлагает фармацевтический пакет или набор, содержащий один или больше
контейнеров, наполненных одним или больше ингредиентов композиций по изобретению, и инструкции,
например, по применению (обычно в форме, предписанной правительственным органом, который регулирует производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов).
Количества реактивов, необходимых для эффективного лечения, будут зависеть от множества факторов, в том числе способа введения, целевой области, физиологического состояния больного и сопутствующего введения других лекарственных средств. Таким образом, дозы для лечения следует титровать
для оптимизации безопасности и эффективности. Обычно дозы, применяемые in vitro, могут обеспечить
полезные указания относительно количеств этих реактивов, пригодных для введения in situ. Проверка
эффективных доз для лечения конкретных расстройств на животных обеспечит дальнейшие прогностические указания в отношении доз для человека. Различные соображения описаны, например, в Gilman, et
al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press;
и (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. Способы введения
обсуждаются в данном описании, здесь и ниже, например, для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного или внутримышечного введения, трансдермальной диффузии и др.
Фармацевтически приемлемые носители включают воду, солевой раствор, буферы и другие описанные смеси, например, в Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ. Обычно ожидается, что интервалы доз
находятся в пределах ниже концентрации 1 мМ, обычно меньше концентрации приблизительно 10 мкм,
обычно меньше приблизительно 100 нМ, предпочтительно меньше приблизительно 10 пМ (пикомоль) и
наиболее предпочтительно меньше приблизительно 1 фМ (фемтомоль) с подходящим носителем. Препараты замедленного высвобождения или устройства для замедленного высвобождения часто применяются
для непрерывного длительного введения.
Композиции для связывания могут вводиться непосредственно хозяину, который подлежит лечению, или, в зависимости от размера соединений, может быть желательным перед введением конъюгировать их с белками-носителями, такими как яичный белок или альбумин сыворотки. Терапевтические
препараты могут быть введены в любой традиционной лекарственной форме. Хотя активный ингредиент
можно вводить отдельно, предпочтительно ввести его в лекарственную форму. Препараты обычно включают как минимум один активный ингредиент, как определено в данном описании, вместе с одним или
больше приемлемыми для него носителями. Каждый носитель должен быть как фармацевтически, так и
физиологически приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами и безвредности для
пациента. Препараты включают пригодные для перорального, ректального, назального или парентерального введения (в том числе подкожного, внутримышечного, внутривенного и внутрикожного). Препара- 26 -
016038
ты могут быть представлены в форме дозированных лекарственных форм и могут быть изготовлены любыми способами, хорошо известными из уровня техники в фармацевтической области. См., например,
Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press; and (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA;
Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al.
(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; и Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. Лечение по данному изобретению может быть комбинированным или сопутствующим с другими терапевтическими агентами, например ингибиторами АПФ.
Изобретение также предлагает фармацевтическую композицию. Такая композиция включает, например, терапевтически эффективное количество композиции по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе. В данном описании термин ″фармацевтически приемлемый носитель″ подразумевает
носитель, одобренный федеральным регуляторным органом Соединенных Штатов Америки или контролирующим/административным органом правительства штата Соединенных штатов, или носитель, который описан в Фармакопее США или другой фармакопее; который общепризнан в уровне техники для
применения у животного, например, млекопитающего, и, более конкретно, у примата, например гуманоидного примата.
Термин ″носитель″ в данном описании означает разбавитель, адъювант, вспомогательное вещество
или носитель, который вводят с композицией по изобретению. Фармацевтический носитель обычно может представлять собой стерильную жидкость, такую как вода или масла (в том числе из нефти, а также
животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п.). Обычно, если фармацевтическую композицию вводят
внутривенно, предпочтительным носителем является стерильная вода. Солевые растворы и водные растворы глюкозы и глицерина также могут использоваться как жидкие носители, особенно для инъекционных растворов.
Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают, например, но не ограничиваясь ими, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, натрия стеарат, моностеарат глицерина, тальк, натрия хлорид, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль,
воду, этанол и т.п. При желании композиция по изобретению может также содержать незначительные
количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или буферных агентов для коррекции pH.
Композиция по изобретению может находиться в растворе, суспензии, эмульсии, таблетке, пилюле,
капсуле, порошке, препарате замедленного высвобождения и т.п., или она может иметь форму суппозитория (с традиционными связующими агентами и/или носителями, например, такими как триглицериды).
Дополнительные примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в действующем издании
Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin. Такие препараты будут содержать терапевтически
эффективное количество композиции по изобретению, предпочтительно в очищенной форме, вместе с
подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить надлежащее введение субъекту. Традиционно
препарат соответствует способу введения.
В предпочтительном варианте композицию вводят в лекарственную форму в соответствии с шаблонными процедурами как фармацевтическую композицию, адаптированную для внутривенного введения, например, человеку. Обычно композиции для внутривенного введения представляет собой растворы
в стерильном изотоническом водном буферном растворе. При необходимости композиция также может
включать, например, солюбилизирующий агент и местно-анестезирующее средство, такое как лидокаин,
чтобы обеспечить комфорт в месте инъекции. В целом, ингредиенты поставляются или отдельно, или
смешанными в дозированной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметически запечатанном контейнере (таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента). Если композиция предназначена для инфузионного введения, она может отпускаться с бутылью для инфузий, содержащей стерильную воду или солевой раствор фармацевтической категории. Если композиция предназначена для инъекционного введения,
ампула стерильной воды для инъекций или солевого раствора может прилагаться таким образом, что
ингредиенты могут быть смешаны перед введением.
Композиции по изобретению могут иметь нейтральную форму или форму солей. Фармацевтически
приемлемые соли включают, например, но не ограничиваясь ими, анионные соли (такие как соли хлористо-водородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислоты и т.п.) и катионные соли (например,
такие как соли натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина,
этанол-2-этиламина, гистидина, прокаина и т.д).
Фиброзные заболевания, расстройства или состояния
Композиция для связывания, например, такая как антитело, пригодна лечения состояний, связанных
с фиброзными заболеваниями. Аккумуляция компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) или замещение нормального клеточного материала компонентами ВКМ в многочисленных типах клеток, тканей и
органов может приводить к вызывающему заболевание фиброзу. Прогрессирующий фиброз может быть
смертельным и приводит к терминальной недостаточности множества органов, например почек. Как
- 27 -
016038
доклинические, так и клинические данные указывают на то, что TGF-бета 1 вносит основной вклад в отложение матричного белка при интерстициальном фиброзе и принимает участие в инициации и прогрессировании целого ряда сопутствующих фиброзному заболеванию состояний, включая фиброз почек, который обычно встречается во всех формах хронического заболевания почек (ХЗП). Степень фиброза почек положительно коррелирует с прогрессом до хронической почечной недостаточности (ХПН, также
известной как терминальная стадия заболевания почек (ESRD)) и может приводить к смерти, потребовать хронического диализа или трансплантации почки. TGF-бета 1 представляет собой цитокин, который
наиболее систематически связан как по результатам экспериментов, так и ассоциацией в клинических
исследованиях и экспериментах на животных с такими фиброзными процессами.
Фундаментальное воздействие TGF-бета 1 на ВКМ, включая его роль в стимулировании синтеза и
торможении деградации компонентов внеклеточного матрикса, является темой многочисленных обзоров
(см., например, Rocco & Ziyadeh 1991 in Contemporary Issues in Nephrology v.23, "Hormones, autocoids and
the kidney" Ed. Jay Stein, Churchill Livingston, New York pp.391-410; Roberts, et al. 1988 Rec. Prog. Hormone
Res. 44:157-97). TGF-бета 1 может индуцировать аккумуляцию ВКМ во множественных и кооперативных путях, например, TGF-бета 1 стимулирует экспрессию мРНК и продукцию белка ключевых компонентов ВКМ, в том числе коллагена типа I, коллагена типа IV, фибронектина и ламинина (Sharma & Ziyadeh 1997 Semin Nephrol 17:80-92). В то же время TGF-бета 1 препятствует разложению ВКМ, ингибируя выработку протеаз (например, активатора плазминогена, коллагеназы, эластазы и стромелизина),
которые осуществляют ферментное расщепление матрикса, и активируя ингибиторы таких протеаз, например тканевые ингибиторы металлопротеиназ и ингибитора 1 активатора плазминогена (Sharma & Ziyadeh 1995 Kidney Int 51:S34-6). TGF-бета 1 также регулирует вверх интегрины и рецепторы поверхности
клетки для ВКМ, таким образом, усиливая способность клеток взаимодействовать со специфическими
белками ВКМ (Heino, et al. 1989 J. Biol Chem 264:380-8). Дополнительно, TGF-бета 1 обладает мощным
хемотаксическим свойством привлекать клетки ВКМ, такие как фибробласты и фагоцитарные клетки
(Reibman, et al. 1991 PNAS 88:6805-9). Кроме того, TGF-бета 1 обладает особенной способностью индуцировать свою собственную экспрессию, потенциально приумножая аномальные фиброзные процессы
(Kim, et al. 1990 Mol Cell Biol 10:1492-7).
TGF-бета 1 принимает участие в следующих заболеваниях, синдромах и/или состояниях:
Заболевание почек, например хроническое заболевание почек (ХЗП); хроническая почечная недостаточность (ХПН); терминальная стадия заболевания почек (ESRD); гломерулонефрит (ГН), в том числе,
например, мезангиальный пролиферативный ГН, мезангиокапиллярный ГН, мембранный ГН, очаговый и
сегментарный ГН, иммунный ГН и суставной (crescentic) ГН; гломерулосклероз; нефросклероз, мембранная нефропатия, связанная с иммуноглобулином A (IgA) нефропатия; почечный интерстициальный
фиброз; очаговый сегментарный гломерулосклероз, фиброз почек у пациентов, получающих циклоспорин после трансплантации; хроническое отторжение почечного трансплантата; связанная с ВИЧ нефропатия; гипертрофия почечных клеток; тубулоинтерстициальный фиброз, сопровождающий хронические
заболевания почек, в том числе являющийся результатом обструкции мочевых путей, или связанная с
терапией обезболивающими средствами нефропатия или после приступа острой почечной недостаточности, такой как острая почечная недостаточность вследствие ишемии почек (Spurgeon et al. Am. J Physiol
Renal Physiol 288:F568-F577, 2005); почечная тромботическая микроангиопатия, например, связанная с
повреждением эндотелиальных клеток клубочков или другими микрососудистыми повреждениями эндотелиальных клеток, например, связанными с предэклампсией, эндотоксемией и радиационным облучением; почечный васкулит; очаговый некротизирующий гломерулонефрит; диабетическая нефропатия
[TGF-бета 1 связан с ХПН посредством сложных и разнообразных феноменов, которые влияют на большинство клеток почки (Bottinger, 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13, 2600). Эти события, в конечном счете,
приводят как к тубулоинтерстициальному фиброзу, так и гломерулосклерозу, результатом чего является
снижение функции нефрона и, в конечном итоге, хроническая почечная недостаточность.
Из трех изоформ TGF-бета TGF-бета 1, по-видимому, является доминирующим в опосредовании
прогресса хронического почечного заболевания, не только в качестве наиболее доминантно экспрессирующейся изоформы, но также TGF-бета 2 и, по-видимому, TGF-бета 3 опосредуют свое воздействия
через регулирование вверх экспрессии TGF-бета 1 (Yu, 2003, Kid. Int. 64, 844). Как in vitro, так и in vivo
исследования связывают TGF-бета 1 с патогенезом диабетического почечного заболевания, в том числе
осложнений, связанных с сахарным диабетом типа 1 или типа 2, например гломерулосклерозом и тубулоинтерстициальным фиброзом (Ziyadeh 1998 Cur. Pract. Med. 1:87-9). Антисыворотка против TGF-бета
эффективна в лечении гломерулонефрита (Border et al. 1990 Nature 346:371-4)]; фиброзного заболевания
почек [TGF-бета 1 опосредует гипертрофию почечных клеток, другую характеристику диабетической
нефропатии, препятствуя нормальному регулированию клеточного цикла, индуцируя циклинзависимые
ингибиторы киназы, такие как p27Kipl и p21Cipl (Wolf & Ziyadeh 1999 Kidney Int 56:393-405). Уровни
этих ингибиторов также повышены при высоком содержании глюкозы в крови и диабетическом состоянии (Wolf, et al. 2001 Am J Pathol; 158:1091-1100; Wolf, et al. 1999 Diabetologia 42:1425-32; Wolf, et al.
1997 Am J Physiol 273:F348-56). Они угнетают активность циклинзависимых киназ, в основном циклинзависимой киназы 2/циклин E киназы (Liu & Preisig 1999 Am J Physiol 277:F186-94), таким образом, ин- 28 -
016038
гибируя фосфорилирование белка ретинобластомы и останавливая клетку в поздней G1 фазе. Клетка
входит в период синтеза белка без репликации ДНК, и возникает гипертрофия. Таким образом, TGF-бета
1 вызывает изменения на клеточном уровне, которые переходят в патофизиологические особенности
диабетической нефропатии]; экспериментальная диабетическая нефропатия; гипертонический нефросклероз [Поскольку структура и фильтрационные свойства клубочка в значительной степени определяются
составом внеклеточного матрикса мезангия и клубочковой мембраной, неудивительно, что TGF-бета 1
оказывает существенное влияние на почку. TGF-бета 1 опосредует патологические изменения при диабетическом заболевании почек (Ziyadeh 1998 Cur Prac Med 1:87-89). Аккумуляция мезангиального матрикса при пролиферативном гломерулонефрите (Border, et al. 1990 Kidney Int. 37:689-695) и диабетической
нефропатии (Mauer, et al. (1984) J. Clin. Invest. 74:1143-1155) представляют собой четкие и доминирующие патологические особенности заболеваний. Уровни TGF-бета 1 всегда повышены при диабетическом
гломерулосклерозе у человека (поздние стадии нейропатии) (Yamamoto, et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci.
90:1814-1818). Также обнаружено, что TGF-бета 1 является важным посредником в генезе почечного
фиброза на многих животных моделях (Phan, et al. 1990 Kidney Int. 37:426; Okuda, et al. 1990 J. Clin.
Invest. 86:453). Продемонстрировано подавление экспериментально индуцированного гломерулонефрита
у крыс с применением антисыворотки против TGF-бета (Border, et al. 1990 Nature 346:371) и белка внеклеточного матрикса, декорина, который может связываться с TGF-бета 1 (Border, et al. 1992 Nature
360:361-363; see, also, e.g., Border & Noble 1994 N. Engl. J. Med. 331:1286-92; Border, et al. 1989 Semin.
Nephrol. 9:307-17; Han, et al. 2000 Am J Physiol Renal Physiol 278:F628-34; и Ziyadeh, et al. 2000 PNAS
97:8015-20)]. Таким образом, композиция для связывания по изобретению была бы пригодной для лечения, облегчения, модулирования, диагностики и/или подавления заболевания, расстройства, синдрома
и/или состояния, описанного выше.
Заболевание печени, например цирроз; печеночный фиброз; [Печеночный фиброз представляет собой распространенную реакцию на гепатоцеллюлярный некроз или повреждение, которое может быть
вызвано разнообразными агентами, например, каким-либо процессом, нарушающим печеночный гомеостаз (особенно воспалением, повреждением токсинами или изменением печеночного кровотока) и инфекциями печени (вирусными, бактериальными, грибковыми и паразитарными). Многочисленные расстройства хранения (накопления) вследствие врожденных ошибок метаболизма часто сопровождаются
фиброзом, в том числе аномалии липидного обмена (болезнь Гоше); заболевания, связанные с хранением
гликогена (особенно тип III, IV, VI, IX, и X); дефицит 1-антитрипсина; накопление экзогенных субстанций, как это наблюдается при синдромах перегрузки железом (гемохроматоз), заболеваниях, связанных с
накоплением меди (болезнь Вильсона); накоплением токсичных метаболитов (например, при тирозинемии, фруктоземии и галактоземии); и пероксисомальные расстройства (синдром Зеллвегера). Многочисленные химические вещества и лекарственные средства вызывают фиброз, особенно спирт, метотрексат,
изониазид, оксифенизатин, метилдопа, хлорпромазин, толбутамид и амиодарон. К фиброзу могут приводить нарушения печеночного кровообращения (например, хроническая сердечная недостаточность, синдром Бадда-Чиари, веноокклюзивное заболевание, тромбоз портальной вены) и хроническая обструкция
желчных путей. Наконец, врожденный печеночный фиброз представляет собой аутосомальный рецессивный порок.
У большинства людей в мире присутствует хронический вирусный гепатит печени или стеатогепатит, связанный с алкоголем или ожирением, но другие индуцирующие фиброз повреждающие факторы
включают, например, паразитарное заболевание (например, шистозомиаз), аутоиммунную атаку на гепатоциты или эпителии желчевыводящих путей, заболевание печени у новорожденного, метаболические
расстройства, включая гемохроматоз Вильсона и разнообразные заболевания, связанные с хранением,
хронические воспалительные состояния (например, саркоидоз), токсичность лекарственных средств (например, метотрексат или гипервитаминоз), а также дисфункции сосудов, врожденные или приобретенные.
Звездообразные клетки печени (ЗКП) представляют собой важный клеточный источник ВКМ при
фиброзе печени (Li & Friedman 1999 J. Gastroenterol. Hepatol. 14:618-33). ЗКП локализованы в перисинусоидальном пространстве Диссе, которое отделяет гепатоциты от синусоидального эпителия. Повреждающие печень факторы активируют в норме неподвижные ЗКП, что ведет к их последующей пролиферации и активации. Активизированные ЗКП далее подвергаются фенотипической трансдифференциации
до сократительных миофибробластов (МФБ), которые экспрессируют актин гладких мышц и избыток
молекул ВКМ, который наблюдается при фиброзе печени. Трансдифференциация ЗКП до МФБ является
результатом чрезмерной экспрессии TGF-бета 1 в его роли ключевого регулятора фиброзной реакции
печени на стресс и повреждение (Gressner, et al. 2002 Front Biosci. 7: d.793-807). TGF-бета 1 представляет
собой наиболее сильный из известных индукторов фиброгенеза в эффекторных клетках печеночного
фиброза (Schuppan, et al. 2003 Cell Death Differ. 10 Supl 1:S59-67). Соответственно, уровни активного
TGF-бета 1 в тканях и сыворотки при фиброзе печени повышаются, и показано, что чрезмерная экспрессия TGF-бета 1 у трансгенных мышей и применение экзогенного TGF-бета 1 индуцируют фиброз органа
(Kanzler, et al. 1999 J. Physiol. 276:G1059-68; Sanderson, et al. 1995 PNAS 2572-76). Кроме того, экспериментальный фиброз может ингибироваться лечением анти-TGF-бета 1, например, нейтрализующими ан- 29 -
016038
тителами или растворимыми TGF рецепторами (George, et al. 1999 PNAS 12719-24; Qi, et al. 1999 PNAS
2345-49). Наблюдаемая экспрессия TGF-бета 1 активированными ЗКП/МФБ, мощность TGF-бета 1 по
регуляции вверх экспрессии ВКМ и экспрессия рецепторов TGF на ЗКП привели к созданию общепризнанной модели, в которой постоянная ауто/паракринная стимуляция активированных ЗКП/МФБ TGFбета 1 представляет собой ключевую фиброгенную реакцию в прогрессировании фиброза органа. Таким
образом, предсказывается, что снижение уровня TGF-бета 1 будет уменьшать фиброгенез в печени (Wu
& Zern 2000 J. Gastroenterol. 35:665-72)];
Заболевание легкого, например фиброз легкого (Giri et al. Thorax 48, 959-966, 1993); идиопатический фиброз легкого; синдром респираторного дистресса у взрослых; криптогенная пневмония, облитерирующий бронхиолит (ОБ), облитерирующий бронхиолит (связанный с трансплантацией); вызванное
лекарственным средством заболевание легкого; вызванное облучением заболевание легкого; локализованный фиброз около дыхательных путей при астме и эмфиземе; пневмонит гиперчувствительности;
криптогенная пневмония (СОР); хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ); острый интерстициальный пневмонит (AIP); асбестоз; интерстициальный фиброз легкого, связанный с аутоиммунными расстройствами, такими как системная красная волчанка и склеродермия, химический контакт или
аллергия; астма; хроническое заболевание легкого у новорожденного (CLD) [Нерегулируемая экспрессия
TGF-бета 1 играет важную роль в патогенезе аномального развития дыхательных путей при многих хронических заболеваниях легкого, включая астму, фиброз легкого и хроническое заболевание легкого у
новорожденного (CLD) (Holgate, et al. 2001 Int Arch Allergy Immunol 124 1-3:253-8; Khalil, et al. 2001 Thorax 56 12:907-15; Lecart, et al. 2000 Biol Neonate 77 4:217-23; Pulleyn, et al., 2001 Hum Genet 109 6:623-7;
Sagara, et al. 2002 J Allergy Clin Immunol 110 2:249-54; Sheppard, 2001 Chest 120 1 Suppl:49S-53S; Strieter,
2001 Chest 120 1 Supp: 77S-85S; Toti, et al. 1997 Pediatr Pulmonol 24 1:22-8). Чрезмерная экспрессия активного TGF-бета 1 вдоль альвеолярных поверхностей у мышей ведет к сильной фиброзной реакции, а
сдерживание TGF-бета 1 антителами или приманками отменяет индуцированный блеомицином фиброз
(Kelly, et al. 2003 Cur. Pharm. Des. 9:3949). Кроме того, анализ микромассива цельных легочных мРНК
показал, что большинство известных генов, которые индуцирует TGF-бета 1, регулируются вверх в ходе
экспериментально индуцированного фиброза (Kaminski, et al. 2000 PNAS 97:1778-83)];
Сердечно-сосудистое заболевание - атеросклероз; [TGF-бета связан с атеросклерозом (см., например, Т.A. McCaffrey: 2000 "TGF-бета and TGF-бета Receptors in Atherosclerosis" Cytokine and Growth Factor Reviews 11:103-114)]; гипертрофическое увеличение сердца (Schultz, et al. 2002 J Clin Invest. 109 (6) :
787-96; Brand & Schneider 1995 J. Mol. Cell Cardiol. 27:518); прогрессирующий системный склероз [параллельно с возрастанием уровней TGF-бета 1 при старении сосудистой системы наблюдается возрастание уровней фибронектина (Li et al. 1999). Такие изменения, несомненно, содействуют сдвигу от эластичного к фиброзному/жесткому сосуду]; механически-индуцированный микрососудистый фиброз;
саркоидоз; вентрикулярный фиброз; индуцированное излучением ишемическое заболевание сердца [сообщалось о приблизительно значительно более высоком риске смерти вследствие ишемического заболевания сердца для больных, которые получали радиотерапию болезни Ходжкинса и рака молочной железы. Некоторые цитокины и факторы роста, такие как TGF-бета 1, могут стимулировать индуцированную
излучением пролиферацию эндотелия, пролиферацию фибробластов, отложение коллагена и фиброз,
ведущий к поздним стадия атеросклеротических повреждений]; повреждение артерий (Wolf, et al. 1994 J.
Clin. Invest. 93, 1172-8); хроническая венозная недостаточность (CVI); рестенозирующее повреждение
после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики (PTCA) или шунтирования; синдром
Германси-Пудлак; полимиозит; склеродермия; дерматомиозит; эозинофильный фасциит; очаговая склеродермия или заболевания, связанные с развитием синдрома Рейно; периваскулярный фиброз, развивающийся в пределах системы коронарных сосудов не пораженного инфарктом миокарда; индуцированная повреждением гиперплазия, например рестеноз; атеросклеротический фиброз с коллагенозным сосудистым заболеванием [TGF-бета 1 может быть фактором прогрессирующего утолщения артериальной
стенки, которое является результатом пролиферации клеток гладких мышц и отложения внеклеточного
матрикса в артерии после баллонной ангиопластики. Диаметр рестенозирующей артерии может существенно уменьшаться (до 90%) в результате такого утолщения, и поскольку большая часть уменьшения
диаметра является результатом скорее внеклеточного матрикса, а не тел гладкомышечных клеток, может
быть возможным открыть такие сосуды (до 50%), просто сокращая обширное отложение внеклеточного
матрикса. В неповрежденных артериях свиньи, трансфицированных in vivo геном TGF-бета 1, экспрессия
гена TGF-бета 1 сопровождалась как синтезом внеклеточного матрикса, так и гиперплазией (Nabel, et al.
1993 PNAS 90:10759-63)]; гистиоцитоз X (эозинофильная гранулема);
Фиброзы мягких тканей - (Border & Ruoslahti 1992 J Clin Inv 90:1-7; Border & Noble 1994 N Engl J
Med 331:1286-91); эректильная дисфункция (Moreland, R. 1998 Int J Impot Res 10:113-20); ревматоидный
артрит (Wahl, et al 1993 J. Exp. Medicine 177, 225-30);
Заживание ран - рубцевание кожи; ожоговые повреждения; гипертрофическое рубцевание; образование келоидов; рубцевание конъюнктивы (Cordeiro MF, 2003 Clin Sci (Lond). 104(2): 181-7) [Лечение
ран эмбриона различными концентрациями TGF-бета 1 вызывало заметное рубцевание таких ран, показывая непосредственное участие TGF-бета 1 в образовании рубцов кожи (Sullivan, et al. 1995 J Pediatr
- 30 -
016038
Surg 30:198-203). Нейтрализация антител TGF-бета 1, инъекционно введенных в края заживающих ран у
крыс, препятствовала рубцеванию без замедления скорости заживления ран или предела прочности раны. В то же время наблюдался сниженный ангиогенез, уменьшенное количество макрофагов и моноцитов в ране, а также сниженное отложение дезорганизованных коллагеновых волокон в ткани рубца (Shah,
et al. 1992 Lancet 339:213-4; Shah et al. 1994 J. Cell Science 107:1137-57; Shah et al. 1995 J Cell Sci. 108:9851002). Уменьшение реакции рубцевания происходило в ранах мыши, местно леченных антисмысловым
TGF-бета 1 (Choi, et al. 1996 Immunol Cell Biol 74:144-50). Местное нанесение синтетического антагониста TGF-бета 1 уменьшало образование рубцов при ожогах и иссеченных ранах у свиней, а также при
иссечении кожи у кроликов (Huang, et al. 2002 FASEB J 16:1269-70; Werner & Grose 2003 Physiol Rev
83(3): 835-70)];
Воспалительное заболевание - воспалительное заболевание кишечника (IBD), например болезнь
Крона (CD) и язвенный колит (UC) [воспаление кишечника зависит от баланса между воспалительными
цитокинами, особенно активности IFN-γ и TGF-бета 1 (Strober, et al. 1997 Immunol. Сегодня 18:61-4;
Neurath, et al. 1996 J. Exp. Med. 183, 2605-16; Ludviksson, et al. 1997 J. Immunol. 159; Boirivant, et al. 1998
J. Exp. Med. 188, 1929-39; Powrie, et al. 1996 J. Exp. Med. 183, 2669-74). Иммунологически опосредованное повреждение ткани в кишечнике связано с повышенной выработкой провоспалительных, которые
активируют фактор транскрипции NF каппа-B в разнообразных типах клеток; ревматоидный артрит
(PA); синовиальная гиперплазия [уровни TGF-бета 1 в синовиальной жидкости повышены при ревматоидном артрите у человека (Lotz, et al. 1990 J. Immunol. 144:4189-94). Избыток TGF-бета 1 приводит к
чрезмерному болезненному росту кости и суставов с образованием так называемых остеофитов (van Beuningen, et al. 1994 Lab. Invest. 71:279-90), синовиальная гиперплазия и воспаление при PA (Hamilton, et
al. 1991 PNAS 88:7180-4). Ингибирование эндогенного TGF-бета 1 на модели артрита у мышей приводит
к предотвращению образования остеофитов и ослабляет восстановление хряща, указывая на его роль в
этих патологических явлениях (Scharstuhl, et al. 2002 Immunol. 169:507-14)];
Заболевания, связанные с клеточной пролиферацией.
Многочисленные данные демонстрируют, что TGF-бета 1 не только обладает потенциалом преобразования, но и может управлять прогрессированием до злокачественного новообразования, инвазией и
метастазами, как in vitro, так и in vivo (Derynck, et al. 2001 Nat. Genet 29:117-29; Cui, et al. 1996 Cell
86:531-42). Примеры гиперпролиферативных заболеваний, расстройств, синдромов и/или состояний
включают, но не ограничиваясь ими, новообразования ободочной кишки, брюшной полости, кости, молочной железы, пищеварительной системы, печени, поджелудочной железы, брюшины, эндокринной
системы (например, надпочечника, околощитовидной железы, гипофиза, яичка, яичника, тимуса или щитовидной железа), глаза, головы, шеи, нервной системы (центральной или периферической), лимфатической системы, таза, кожи, селезенки, грудной клетки и мочеполовой системы. Другие гиперпролиферативные состояния также включают, но не ограничиваясь ими, гипергаммаглобулинемию, лимфопролиферативные состояния, парапротеинемии, пурпуру, саркоидоз, гамартома, синдром Сезари, макроглобулинемию Валденстрона, синдром болезни Гоше, гистиоцитоз и другие гиперпролиферативные состояния.
Несмотря на активность супрессора опухоли, которая присуща TGF-бета 1, клетки опухоли часто
демонстрируют повышенную выработку данного фактора роста (Derynck, et al. 1987 Cancer Res. 47:70712; Dickson, et al. 1987 PNAS 84:837-41), и существуют значимые факты его роли в прогрессе опухоли
посредством воздействия на инвазию опухолевых клеток и изменение в микроокружении опухоли. Сейчас ясно, что TGF-бета 1 может действовать как в качестве супрессора опухоли, так и в качестве ощутимого стимулятора прогрессирования опухоли, инвазии и метастазирования. На ранних стадиях генеза
опухоли, например, когда опухоль еще является доброкачественной, TGF-бета воздействует непосредственно на раковую клетку для угнетения естественного развития опухоли. Однако по мере прогрессирования опухоли генетические и/или биохимические изменения позволяют TGF-бета 1 стимулировать прогрессирование опухоли его плейотропной активностью как на раковую клетку по сути, так и на незлокачественные типы стромальных клеток опухоли. Стимулирование TGF-бета 1 инвазии и метастазирования
может иметь большие клинические последствия, чем его роль супрессора опухоли, поскольку большинство опухолей человека сохраняют функциональный путь проведения сигнала TGF-бета (Akhurst &
Derynck 2001 Trends Cell Biol. 11:S44-51).
Существует значительный массив доказательств того, что дополнительная выработка TGF-бета 1
при заболеваниях, связанных с пролиферацией клеток, связана с плохим прогнозом (Tsushima et al. 1996
Gastroenterology 110:375-82; Adler et al. 1999 J. Urol. 161:182-7). Существует несколько видов рака, при
которых продуцированный опухолью TGF-бета 1 может быть вредным. Клетки рака предстательной железы крысы MATLyLu (Steiner & Barrack 1992 Mol. Endocrinol 6:15-25) и клетки рака молочной железы
человека MCF-7 (Arteaga, et al. 1993 Cell Growth and Differ. 4:193-201) становятся более канцерогенными,
и выраженность метастазирования увеличивается после трансфекции вектора экспрессии TGF-бета 1
мыши. TGF-бета 1 связан с ангиогенезом, метастазированием и плохим прогнозом при раке предстательной железы и на поздних стадиях рака желудка у человека (Wikstrom, P., et al. (1998) Prostate 37:19-29;
Saito, H. et al. (1999) Cancer 86: 1455-62). При раке молочной железы плохой прогноз связан с повышен- 31 -
016038
ными уровнями TGF-бета 1 (Dickson, et al. 1987 PNAS 84:837-41; Kasid, et al. 1987; Cancer Res. 47:5733-8;
Daly, et al. 1990 J. Cell Biochem. 43:199-211; Barrett-Lee, et al. 1990 Br. J Cancer 61:612-7; King, et al. 1989
J. Steroid Biochem. 34:133-8; Welch, et al. 1990 PNAS 87:7678-82; Walker, et al. 1992 Eur. J. Cancer 238:6414) и идуцированием TGF-бета 1 лечением тамоксифеном (Butta, et al. 1992 Cancer Res. 52:4261-4), что
связано с безуспешным лечением рака молочной железы тамоксифеном (Thompson, et al. 1991 Br. J. Cancer 63:609-14). Анти-TGF-бета 2 антитела препятствуют росту клеток рака молочной железы человека
MDA-231 у бестимусных мышей (Arteaga, et al. 1993 J. Clin. Invest. 92:2569-76), лечение которого коррелирует с повышением активности природных клеток-киллеров селезенки. Клетки CHO, трансфицированые латентным TGF-бета 1, также продемонстрировали снижение активности NK и интенсификацию
роста опухоли у голых мышей (Wallick, et al. 1990 J. Exp. Med. 172:1777-84). Таким образом, TGF-бета 1,
выделяемый опухолями молочной железы, может вызывать эндокринное угнетение иммунитета. Высокие концентрации TGF-бета 1 в плазме указывают на плохой прогноз для больных с поздними стадиями
рака молочной железы (Anscher, et al. 1993 N. Engl. J. Med. 328:1592-8). Больные с высокими уровнями
TGF-бета 1 в кровотоке перед химиотерапией высокими дозами и пересадкой аутологичного костного
мозга подвергаются высокому риску веноокклюзивного заболевания печени (15-50% всех больных со
смертностью до 50%) и идиопатического интерстициального пневмонита (40-60% всех пациентов). Значение полученных данных состоит в том, что повышенные уровни TGF-бета 1 в плазме могут указывать
на пациентов с высоким уровнем риска, и что снижение уровней TGF-бета 1 могло бы уменьшить болезненность и смертность при применении таких схем лечения у больных раком молочной железы.
Многие клетки злокачественных новообразований выделяют TGF-бета 1, что свидетельствует о
приблизительно возможной роли выработки TGF-бета 1 как защитного механизма клеток опухоли от
иммунного надзора хозяина. Образование субпопуляции лейкоцитов с нарушенным проведением сигнала TGF-бета 1 в несущем опухоль хозяине предлагает потенциальные средства иммунотерапии рака. Модель на трансгенных животных с нарушенным проведением сигнала TGF-бета 1 в клетках T дает возможность эрадикации обычно смертельной, чрезмерно экспрессирующей TGF-бета 1 опухоли лимфомы,
EL4 (Gorelik & Flavell, 2001 Nature Medicine 7 (10):1118-22). Регулирование вниз секреции TGF-бета 1 в
клетках опухоли приводит к восстановлению иммуногенности хозяина, в то время как нечувствительность T-клетки к TGF-бета 1 приводит к ускоренной дифференциации и аутоиммунной реакции, элементы которой могут потребоваться для борьбы с опухолями, которые экспрессируют антиген в хозяине,
который обладает толерантностью. Иммуносупрессивное действие TGF-бета 1 также играет роль в субпопуляции больных ВИЧ с иммунной реакцией ниже предсказанной на основе подсчетов клеток
CD4/CD8 T (Garba, et al. 2002 J. Immunology 168:2247-54). Антитело, нейтрализующее TGF-бета 1, было
способным изменять эффект в культуре, указывая на то, что другие ингибиторы антитела TGF-бета 1
могут быть пригодными для обращения угнетения иммунитета, присутствующего в данном подмножестве ВИЧ-пациентов.
Двойственная роль супрессора/промотора TGF-бета 1 четко проявляется в трансгенной системе с
чрезмерной экспрессией TGF-бета 1 в кератиноцитах. Хотя трансгенные животные были более устойчивы к образованию доброкачественных поражений кожи, скорость метастатического превращения у
трансгенных животных была резко увеличена (Cui, et al. 1996 Cell 86(4): 531-42). Выработка TGF-бета 1
злокачественными клетками в первичных опухолях возрастает с прогрессом до следующих стадий развития опухоли. Исследования в области большинства из ведущих типов рака эпителия свидетельствуют
приблизительно о том, что повышение выработки TGF-бета 1 злокачественными новообразованиями у
человека происходит как относительно позднее событие в ходе прогрессирования опухоли. Далее, сопровождающий опухоль TGF-бета 1 обеспечивает клетки опухоли селективным преимуществом и способствует прогрессированию опухоли. Влияние TGF-бета 1 на взаимодействия клетка/клетка и клетка/строма приводит к повышению способности к инвазии и метастазированию. Сопровождающий опухоль TGF-бета 1 может позволять клеткам опухоли избежать иммунного надзора, так как он является
мощным ингибитором клональной экспансии активированных лимфоцитов, что наблюдали, например, у
пациентов с агрессивными опухолями мозга или молочной железы (Arteaga, et al. 1993 J. Clin. Invest.
92:2569-76). TGF-бета 1 препятствует выработке ангиостатина. Схемы лечения рака, такие как радиотерапия и химиотерапия, индуцируют выработку активированного TGF-бета 1 в опухоли и, таким образом,
селекцию для естественного развития злокачественных клеток, устойчивых к тормозящему рост воздействию TGF-бета 1. Таким образом, указанные схемы противораковой терапии повышают риск и форсируют развитие злокачественной опухоли. Агенты, предупреждающие опосредованное TGF-бета 1 преобразование сигнала, могли бы представлять собой наиболее эффективную терапевтическую стратегию в
таких ситуациях. Устойчивость клеток опухоли к TGF-бета 1 сводит на нет многие цитотоксические эффекты радиотерапии и химиотерапии, а зависящая от лечения активация TGF-бета 1 в строме может
быть даже вредной, так как это может сделать микроокружение более благоприятным для прогрессирования опухоли и способствует повреждению ткани, ведущему к фиброзу. Клетки рака предстательной
железы экспрессируют высокие уровни TGF-бета 1, которые, по-видимому, усиливают рост рака предстательной железы и метастазов, стимулируя ангиогенез и препятствуя иммунным реакциям, направленным против клеток опухоли. Клетки рака предстательной железы часто утрачивают свои рецепторы
- 32 -
016038
TGF-бета и приобретают устойчивость к антипролиферативному и проапоптотическому воздействию
TGF-бета 1. Соответственно, высокий уровень экспрессии TGF-бета 1 и прекращение экспрессии рецепторов TGF-бета ассоциируются с особенно плохим прогнозом у пациентов-людей с раком предстательной железы (Wikstrom, et al. 2000 Scand J Urol Nephrol. 34 (2):85-94). При гепатоцеллюлярной карциноме
(ГЦК) индукция экспрессии TGF-бета 1 с сопутствующей утратой экспрессии рецептора TGF-бета в очагах и узлах печени изменяет выход гепатоцитов из-под индуцированного TGF-бета 1 апоптоза, таким
образом, предоставляя измененным гепатоцитам преимущество роста в ходе гепатоканцерогенеза (Lim
2003 Mech Ageing Dev. 124 (5):697-708). При плоскоклеточных карциномах головы и шеи чрезмерная
экспрессия TGF-бета 1 на ранних стадиях обеспечивает опухоль благоприятным микроокружением (Lu,
et al. 2004 Cancer Res 64(13):4405-10); композиция для связывания может использоваться, чтобы модулировать, облегчать, лечить, предупреждать и/или диагностировать гиперпролиферативное заболевание,
состояние, расстройство или синдром (например, новообразование) путем прямого или опосредованного
взаимодействия. Например, предупреждая ингибирование пролиферации клеток, что, в свою очередь,
модулирует гиперпролиферативное состояние (например, TGF-бета 1 препятствует пролиферации и
функциональной дифференциации T-лимфоцитов, активированных лимфокинами клеток-киллеров, клеток-природных киллеров, нейтрофилов, макрофагов и B-клеток (Letterio & Roberts 1998 "Regulation of the
immune response by TGF Beta" Ann Rev Immunol 16:137-61); или путем повышения иммунной реакции
(например, увеличивая антигенность белка, вовлеченного в гиперпролиферативное состояние); или вызывая пролиферацию, дифференциацию или мобилизацию клеток конкретного типа (например, Tклеток). Целевое воздействие с применением композиции по изобретению может также достигаться, например, путем увеличения существующей иммунной реакции или инициации новой иммунной реакции.
Альтернативно, достижению желательного результата может помешать, например, снижение или блокирование существующей иммунной реакции, или предупреждая инициацию новой иммунной реакции.
Местное введение в область аномально пролиферирующей клетки может быть осуществлено с помощью
любого известного из уровня техники способа или техники, обсуждаемой в данном описании, в том числе, например, но не ограничиваясь ими, трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией клеток, или в
носителе, таком как липосома, липофектин или непокрытый полинуклеотид. "Пролиферативное состояние клетки" обозначает какое-либо заболевание, синдром, расстройство или состояние у человека или
животного, которое поражает любую клетку, ткань, участок или любую комбинацию органов, тканей или
частей тела, которое характеризуется однократной или многократной местной аномальной пролиферацией клеток, группы клеток или тканей, доброкачественной или злокачественной];
Заболевания нервных клеток - рубцевание нервов (Logan et al. 1994 Eur. J. Neurosci. 6:355-63); цереброваскулярные аномалии; болезнь Альцгеймера (Masliah, et al. 2001 Neurochemistry International
39:393-400) [Уровни мРНК TGF-бета 1 в извилинах головного мозга в области середины лба положительно коррелируют с относительной степенью цереброваскулярных амилоидных отложений в данном
участке мозга, указывая на возможную роль TGF-бета 1 в цереброваскулярных аномалиях у человека. У
трансгенных мышей, которые чрезмерно экспрессируют TGF-бета 1 в астроцитах, развиваются сходные
с болезнью Альцгеймера (БА) цереброваскулярные аномалии, в том числе периваскулярный астроцитоз,
утолщение микрососудистого основания мембраны и аккумуляция тиофлавин S-позитивного амилоида в
отсутствие паренхиматозной дегенерации. Хроническая чрезмерная выработка TGF-бета 1 в мозге приводит к структурным и функциональным повреждениям, напоминающим повреждения в случаях БА с
амилоидной ангиопатией (Buckwalter, et al. 2002 Anna N Y Acad Sci. 977:87-95]; пролиферативная ретинопатия (Chaturvedi, et al. 2002 Diabetes Care 25:2320-7)); другие заболевания глаз, связанные с фибропролиферативным состоянием, связанным с чрезмерной выработкой TGF-бета 1, включают сопровождающую хирургические вмешательства по реплантации сетчатки пролиферативную витреоретинопатию;
экстракцию катаракты с внутриглазной имплантацией линзы и пост-глаукоматозный хирургический дренаж;
Гемопоэтические состояния - [В природном балансе между эндогенными стимуляторами и ингибиторами ангиогенеза обычно преобладает ингибирующее влияние (см., например, Rastinejad, et al., Cell
56345-355 (1989)). Когда неоваскуляризация происходит в нормальных физиологических состояниях,
таких как заживление ран, регенерация органа, эмбриональное развитие и репродуктивные процессы в
организме женщины, ангиогенез строго регулируется и отграничивается в пространстве и времени. При
патологическом ангиогенезе, например в ходе образования солидной опухоли, такой регуляторный контроль нарушается, и нерегулируемый ангиогенез может стать патологическим, способствуя прогрессу
многих заболеваний неопластической и другой природы. Целый ряд серьезных заболеваний превалирует
по аномальной неоваскуляризации (в том числе, например, рост солидной опухоли и метастазов, артрит,
некоторые виды заболеваний глаза и псориаз; см., например, обзоры Moses, et al., 1991 Biotech. 9630-634;
Folkman, et al., 1995 N. Engl. J. Med., 333:1757-63; Auerbach, et al., 1985 J. Microvasc. Res. 29:401-11;
Folkman, "Advances in Cancer Research", Eds. Klein and Weinhouse, Academic Press, New York, pp. 175-203
(1985); Patz, 1982 Am. J. Opthalmol. 94:715-43; и Folkman, et al., 1983 Science 221:719-25. Ангиогенез опухоли является критическим для роста опухоли и инвазии, поскольку кровеносные сосуды доставляют
питательные вещества и кислород к клеткам опухоли и позволяют им проникать в систему кровотока,
- 33 -
016038
что приводит к образованию метастаза. TGF-бета 1 действует как мощный индуктор ангиогенеза в нескольких видах анализов (Roberts, et al. 1986 PNAS 83:4167-71; Madri, et al. 1988 J. Cell Biol. 106:1375-84;
Yang & Moses 1990 J. Cell Biol. 111:731-74; Gajdusek, et al. 1993 J. Cell. Physiol. 157:133-44; Choi &
Ballermann 1995 J. Biol. Chem. 270:21144-50), и моделей на мышах, у которых присутствуют дефекты в
компоненты проведения сигнала TGF, указывая на важность TGF-1 для нормального развития сосудов.
Кроме того, TGF-бета 1 и его рецепторы ALK-5 и ALK-1 принимают участие в фазе созревания сосуда в
ходе ангиогенеза (см., например, Bull Acad Natl Med. 2000; 184 (3):537-44). При различных патологических состояниях ангиогенез способствует развитию заболевания, например, аккумулирован значительный массив данных, свидетельствующих приблизительно о том, что образование солидной опухоли зависит от ангиогенеза (см., например, Folkman & Klagsbrun 1987 Science 235:442-7). В другом варианте по
изобретению введение композиции для связывания обеспечивает лечение, облегчение, модулирование,
диагностику и/или сдерживание заболевания, расстройства, синдрома и/или состояния, связанного с неоваскуляризацией или экспансией гематопоэтических клеток. Злокачественные и метастатические состояния, на которые можно влиять целевым образом с использованием композиции для связывания,
включают, например, но не ограничиваясь ими, злокачественное новообразование, солидную опухоль и
рак, как описано в данном описании или известно из уровня техники (обзор таких расстройств, синдромов и т.п. см., например, Fishman, et al., Medicine, Current Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia 2002). Например, виды рака, на которые можно воздействовать таким способом с применением композиции по
изобретению, включают, например, но не ограничиваясь ими, солидную опухоль, в том числе, предстательной железы, легкого, молочной железы, яичника, желудка, поджелудочной железы, гортани, пищевода, яичек, печени, околоушной железы, желчевыводящих путей, ободочной кишки, прямой кишки,
шейки матки, матки, эндометрия, почки, мочевого пузыря, рак щитовидной железы; первичные опухоли
и метастазы; меланому; глиобластому; саркому Капоши; лейомиосаркому; немелкоклеточный рак легкого; рак колоноректальной области; поздние стадии злокачественных новообразований; а также опухоли
кроветворной системы, такие как лейкемия];
Инфекции - сепсис; [протекание лейшманиозной инфекции у мышей значительно изменяется под
действием TGF-бета 1. Генетически устойчивые мыши стали восприимчивыми к лейшманиозной инфекции после введения TGF-бета 1. TGF-бета 1 обостряет заболевание, тогда как антитела к TGF-бета 1 останавливают развитие заболевания (Barral-Netto, et al. 1992 Science 257:545-7)];.
Выпадение волос - алопеция; выпадение полос [нейтрализующее антитело анти-TGF-бета 1 дозозависимым образом обращало вызванное андрогенами ингибирование роста кератиноцитов, указывая на
то, что индуцируемый андрогенами TGF-бета 1 из клеток кожного сосочка области облысения опосредует подавление роста волос при андрогенной алопеции и таким образом, возможно, играет роль в паттерне
плешивости у человека (Inui, et al. 2002 FASEB J. 16(14): 1967-9)]; таким образом, изобретение предлагает способ модулирования, лечения, предупреждения и/или диагностики связанного с ангиогенезом заболевания и/или расстройства, который включает введение субъекту, нуждающемся в этом, эффективного
количества композиции для связывания.
Широкий контекст данного изобретения будет лучше понятен с помощью ссылки на следующие
примеры, которые не предназначены для ограничения изобретения конкретными вариантами.
Примеры
Общие способы.
Многие из стандартных методов, описанных в данном описании, описаны или процитированы, например, в Sambrook, et al. (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor Press, NY; и связанный веб-сайт: (www.MolecularCloning.com); Ausubel, et al., Biology
Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; или Ausubel, et al. (1987 и дополнения) Current Protocols in
Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Bartlett & Stirling (2003) PCR Protocols: Methods in Molecular Biology
Vol. 226 Humana Press, NJ. Способы очистки белка включают такие способы, как осаждение аммония
сульфатом, колоночная хроматография, электрофорез, центрифугирование, кристаллизация и другие;
см., например, Ausubel, et al. (1987 и периодические добавления); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology vol. 182, и другие тома данной серии: Coligan, et al. (1995 и добавления)
Current Protocols in Protein Science John Wiley and Sons, New York, NY; Matsudaira (ed.) (1993) A Practical
Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Academic Press, San Diego, CA; и публикации
производителя по применению продуктов очистки белка, например Pharmacia, Piscataway, NJ, или BioRad, Richmond, CA. Сочетание с рекомбинантными методами позволяет осуществить слияние с соответствующими сегментами (метки эпитопов), например с последовательностью FLAG или эквивалентной,
которая может быть слита, например, посредством последовательности, которая может быть удалена
протеазой. См., например, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods
12:87-98, Plenum Press, NY; и Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression and Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.
Стандартные иммунологические методы описаны, например в Hertzenberg, et al. (eds.) 5th ed. 1996
Weir's Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Bierer, et al., Eds. (2004) Current
- 34 -
016038
Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; и Methods in Enzymology тома: 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116,
121, 132, 150, 162 и 163 Elsevier, США.
Пример 1. Конструирование и скрининг фрагментов FAB с использованием CDR и каркасных областей человека.
Применяются стандартные подходы к описанию и синтезу библиотек CDR одиночных мутаций вариабельного участка антитела (см., например, Wu et al., 1998 PNAS 95:6037-42). Библиотеки конструируют в векторах экспрессии бактериофага M13, содержащих гены легкой цепи и тяжелой цепи антитела,
состоящие из последовательностей человеческого постоянного участка и каркасной области вариабельного участка, описанных в данном описании, вместе с последовательностями CDR по изобретению. В
некоторых случаях целевой CDR удаляют сразу, до отжига нуклеотидов. Применяется базирующийся на
кодонах мутагенез для синтеза олигонуклеотида для получения последовательностей CDR по изобретению.
Изначально осуществляют скрининг библиотек путем capture lift для идентификации вариантов с
самым высоким сродством. Методика capture lift (Watkins, 2002 Methods Mol. Biol. 178:187-93) известна
из уровня техники и описана в WO/0164751 и US2002/0098189. Желательные клоны дополнительно характеризуют титрованием на иммобилизированном антигене в анализе ELISA и анализом активности
клеточной пролиферации, как описано в данном описании. После такого скрининга для целевого клона
определяли значения константы диссоциации (Kd), скорости ассоциации (Kon) и скорости диссоциации
(Koff).
Для идентификации потенциальных композиций для связывания антитела, содержащего встроенные CDR донора по изобретению, библиотеки синтетических CDR вставляют в шаблон делеции, как
описано в данном описании или известно из уровня техники. Применяются стандартные методы мутагенеза (Kunkel, 1985 PNAS 82:488-92) для замены конкретного CDR с использованием пула мутагенных
олигонуклеотидов. Обычно CDR размещают в пределах каркасной области с применением системы, определенной Kabat, за исключением CDRH1, который представляет собой сумму определений Kabat и
Chothia. Мутагенные олигонуклеотиды отжигают до уридинилированного шаблона фага, в котором удален соответствующий CDR.
Отжиг осуществляют путем инкубации реакционной смеси при 85°C в течение 5 мин с последующим медленным охлаждением до 20°C на протяжении 45 мин. Отожженные образцы помещают на лед,
добавляют T4 ДНК полимеразу и T4 ДНК лигазу, чтобы генерировать двухцепочечную ДНК, и реакционную смесь инкубируют в течение 5 мин при 4°C с последующей инкубацией в течение 90 мин при
37°C. Реакционную смесь экстрагируют фенолом, осаждают этанолом и полученную ДНК электропорируют в клетки DH10B. Клетки XLOLR добавляют к реакционной смеси, чтобы позволить амплификацию
фага до того, как библиотеки будут нанесены на планшеты. Запасы фага готовят добавлением 8 мл среды
для культивирования на планшеты с последующей инкубацией при 4°C в течение минимум 4 ч. Содержащую фаг среду собирают и проясняют центрифугированием; в качестве консерванта добавляют натрия азид (0,02%).
Начальный скрининг библиотек производят с помощью методики plaque lift, как описано в Watkins,
et al. 1998 Anal Biochem 256: 169-77; и Watkins, 2002 Methods Mol. Biol., 178:187-93. Фильтры, содержащие экспрессированные Fab из индивидуальных бляшек, связанные с иммобилизированным античеловеческим каппа антителом, последовательно инкубируют с биотинилированным TGF-бета 1 (биоTGF-бета 1) и нейтравидин-щелочной фосфатазой (NA-АР), с коротким промыванием между циклами
инкубирования. Целевые клоны секвестрируют и затем описывают с помощью ELISA. Обычно используемые в анализе ELISA планшеты для микротитрования Costar 3366 покрывают 0,4 мкг/мл TGF-бета 1,
TGF-бета 2 или TGF-бета 3 на протяжении ночи при 4°C. Планшеты последовательно промывают 2× раза
до добавления 100 мкл блокирующего раствора (10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в буфере
для промывания) в каждую лунку. Разведения Fab инкубируют в покрытых лунках в течение 1,5 ч при
22°C. После промывания добавляют конъюгат ″античеловеческий каппа-щелочная фосфатаза″ и инкубируют в течение 1 ч при 22°C. После интенсивного промывания добавляют колориметрический субстрат и
измеряют оптическую плотность при A560, чтобы идентифицировать позитивные клоны.
Анализ Fab по методу ELISA
В одном неограничивающем примере применяют анализ ELISA с использованием планшетов для
микротитрования Costar 3366, покрытые 0,4 мкг/мл TGF-бета 1, TGF-бета 2 или TGF-бета 3 (TGF-бета 1
R&D Systems, кат. № 240-B/CF, 239 мкг/мл), TGF-бета-2 (RDI, кат. № RDI-1035, 50 мкг/мл) и TGF-бета-3
(RDI, кат. № RDI-1036/CF, 50 мкг/мл), разбавленные до 0,4 мкг/мл в буфере для нанесения покрытия) на
протяжении ночи при 4°C. Планшет последовательно промывают (2×) перед добавлением 100 мкл блокирующего раствора (10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в буфере для промывания) в каждую
лунку. Разведения Fab по изобретению инкубируют в покрытых лунках (1,5 ч при 22°C). После промывания добавляют конъюгат ″античеловеческий каппа-щелочная фосфатаза″ и инкубируют (1 ч при 22°C).
После интенсивного промывания добавляют колориметрический субстрат и измеряют оптическую плотность при A560, чтобы идентифицировать позитивные клоны.
- 35 -
016038
В другом примере композиции для связывания по изобретению исследовали в конкурентном анализе ELISA. Обычно анализ проводят в фазе раствора, где соединение, которое может конкурировать с антигеном за связывание с композицией для связывания, такой как антитело, сначала объединяют с антителом в фазе раствора, после чего измеряют степень связывания антитела с антигеном.
Материалы
Карбонатный буфер для нанесения покрытия состоит из 50 мМ раствора натрия карбоната, pH 9,6.
Антигены представляют собой TGF-бета 1 (R&D Systems, кат. № 240-B/CF, 239 мкг/мл), TGF-бета 2
(RDI, кат. № RDI-1035, 50 мкг/мл) и TGF-бета 3 (RDI, кат. № RDI-1036/CF, 50 мкг/мл), разбавленные до
0,4 мкг/мл в буфере для нанесения покрытия. Буфер для промывания состоит из 0,02 М Tris (pH 7,4), 0,15
М NaCl, 0,1% Твина 20 и блокирующего раствора 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (Sigma A4503), растворенного в буфере для промывания. Белки, используемые в качестве средств позитивного
контроля, представляют собой мышиный античеловеческий TGF-бета 1, 2 или 3 (R&D Systems, кат. №
1D11), мышиный античеловеческий TGF-бета 2 (R&D Systems, кат. № BAF302) и мышиный античеловеческий TGF-бета 3 (R&D Systems, кат. № BAF243), разбавленные до 1 мкг/мл в блокирующем буфере. Конъюгат антитела, используемый для обнаружения, представляет собой конъюгат ″антимышиный каппа-пероксидаза″ (Southern Biotech, кат. № 1050-05) с рабочей концентрацией 1:2000 в блокирующем растворе. Субстрат, используемый для цветной реакции, представляет собой таблетки (Sigma
кат. № Р-6912) O-фенилендиамина (OPD), растворенные в буфере субстрата: 0,1 М Na2HPO4, pH доведен
до 5,0 с помощью 0,05 М лимонной кислоты. Рабочий раствор субстрата OPD (т.е. объем для одного 196луночного планшета) используют свежеприготовленным для обработки каждого планшета, растворяя 1
таблетку ×5 мг OPD в 12,5 мл буфера субстрата с последующим добавлением 5 мкл 30% H2O2.
Протокол
Один 96-луночный планшет покрывают антигеном (TGF-бета 1, 2 или 3 с концентрацией 0,4 мкг/мл
и вносят по 50 мкл на лунку), а затем опечатывают липкой лентой перед хранением (16-20 ч при 4°C).
Планшет последовательно промывают (2×) в буфере для промывания (описан выше) перед добавлением
100 мкл блокирующего раствора (10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в буфере для промывания)
в каждую лунку. После инкубации (приблизительно 1 ч при 22°C) планшет промывают (2×) буфером для
промывания. Далее 100 мкл образца (разбавленного буферным раствором) или контроля (разбавленного
фосфатным буферным раствором) добавляют в каждую лунку и инкубируют (1,5 ч при 22°C). После инкубации планшет промывают (6×) буфером для промывания перед добавлением 100 мкл на лунку конъюгата ″антимышиный каппа-пероксидаза″ (разбавленный 1:2000 блокирующим раствором) или SA-HRP
(разбавленный 1:10000 в блокирующем растворе). Исследуемые образцы инкубируют (1 ч при 22°C) перед добавлением 100 мкл субстрата OPD в каждую лунку. После образования окрашивания (приблизительно 10 мин) оптическую плотность для 96-луночного планшета измеряют на длине волны 490 нм.
Успешные результаты в таких условиях представляют собой варианты Fab, которые дают оптическую плотность больше 1,6 единиц на длине волны 490 нм для TGF-бета 1, но демонстрируют в существенной степени более низкие значения для TGF-бета 2 и TGF-бета 3, таким образом, демонстрируя специфичное и/или селективное связывание с TGF-бета 1.
Исследование mAbs в клеточном анализе
Для изучения способности композиции для связывания по изобретению нейтрализовать биологическую активность TGF-бета и нейтрализовать конкретную изоформу TGF-бета можно адаптировать анализ пролиферации клеток HT-2 Tsang, et al., (1995 Cytokine 7:389-97). Анализ пролиферации клеток HT-2
применяют, чтобы определить in vitro потенциал композиций Fab и mAb. Если коротко, клетки HT-2
пролиферируют в присутствии IL-4, но подвергаются апоптозу в присутствии TGF-бета. Индуцированную TGF-бета гибель клеток предупреждают добавлением нейтрализующих TGF-бета 1 Fab или mAb.
Линия клеток HT-2 человека размножается в ответ на IL-4, но индуцированная IL-4 пролиферация
ингибируется TGF-бета 1, TGF-бета 2 или TGF-бета 3. Следовательно, композиция для связывания, которая является специфической и/или селективной для TGF-бета 1, демонстрирует нейтрализующий эффект, если она предупреждает нормальное ингибирующее воздействие TGF-бета 1 на индуцированные
IL-4 клетки HT-2. Соответственно, индуцированная IL-4 пролиферация клеток должна продолжаться
неограниченно, если к смеси клеток HT-2, содержащих TGF-бета 1, добавлено достаточное количество
композиции, специфически связывающей TGF-бета 1. Таким образом, дозозависимую нейтрализующую
способность композиций для связывания по изобретению оценивают с применением анализа HT-2 в присутствии конкретных изоформ TGF и сигнала пролиферации IL-4. Степень пролиферации клеток оценивают с применением коммерческого способа колориметрического измерения степени пролиферации клеток (например, CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay от Promega).
Клетки HT-2 содержат в среде RPMI 1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки,
пенициллина/стрептомицина в концентрации 100 Ед/мл и 100 мкг/мл, соответственно, 50 мкМ бетамеркаптоэтанола и 10 нг/мл человеческого IL-2 (R&D Systems). Клетки центрифугируют при 1000
об./мин в центрифуге Jouan CR422 и ресуспендируют в фосфатном буферном растворе. После двукратного промывания фосфатным буферным раствором клетки окончательно ресуспендируют (0,15×106 кле- 36 -
016038
ток/мл) в среде анализа, которые состоят из свободной RPMI 1640 без фенольного красного, но с добавлением 2% телячьей эмбриональной сыворотки, пенициллина/стрептомицина в концентрации 100 Ед/мл
и 100 мкг/мл, соответственно, и 50 мкМ бета-меркаптоэтанола. В каждую лунку 96-луночного планшета
добавляют 50 мкл клеток в среде анализа. Перед добавлением исследуемых mAbs к биологическому анализу клеток различные концентрации mAb предварительно инкубируют с 300 пг/мл TGF-бета 1, TGFбета 2 или TGF-бета 3 (в среде анализа). После инкубации в течение 30 мин к клеткам добавляют 50 мкл
смеси TGF-бета/Fab, после чего немедленно добавляют 50 мкл среды анализа, содержащей 45 нг/мл мышиного IL-4 (конечная концентрация 15 нг/мл). После инкубации в течение 20-48 ч добавляют 35 мкл
водного раствора CellTiter 96 (Promega Corp). После дальнейшей инкубация в течение 2-3 ч (37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2) проводят количественное определение анализом на устройстве для считывания планшетов ELISA на длине волны 490 нм с применением колориметрического анализа CellTiter 96® (количество формазанового продукта, сгенерированное и измеренное по оптической
плотности на длине волны 490 нм, является прямо пропорциональным количеству живых клеток в культуре). Средние примерные данные приведены в табл. 2.
Таблица 2
Табл. 2. Биологический анализ in vitro на основе клеток HT-2
Анализ пролиферации клеток HT-2 используется, чтобы определить мощность Fab и mAb композиций для связывания по изобретению in vitro. Клетки HT-2 пролиферируют в присутствии IL-4, но подвергаются апоптозу в присутствии TGF-бета. Индуцированная TGF-бета гибель клеток предотвращается
добавлением композиции, нейтрализующей TGF-бета (например, Fab или mAb по изобретению). В сравнении с мышиным IgG1 Fab #2471 композиции для связывания по изобретению демонстрируют улучшение как минимум больше, чем в 100 раз или более нейтрализующей мощности с точки зрения предупреждения индуцированной TGF-бета гибели клеток. Значения IC50 для ряда композиций mAb варьируют в
интервале приблизительно 0,1-1,0 нг/мл (IC50 mAb 2471 составляет приблизительно 0,1 мкг/мл).
Измерение кинетических констант для Fab
Для измерения кинетики связывания используют инструмент KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.). Если коротко, антиген ковалентно связывается с гранулами алкактона, и связывание свободной композиции
для связывания Fab по изобретению с гранулами обнаруживают с помощью инструмента. Для измерения
Kd отдельные пробирки, содержащие 20 пМ Fab (200 пМ для mAb) с серийным уменьшением концентрации антигена (0-250 нМ), инкубируют в течение 1-6 дней при 25°C в фосфатном буферном растворе,
содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,02% азида и 0,01% Твина 20. После инкубации
свободный Fab в каждом уравновешенном образце определяют с помощью KinExA 3000 в соответствии с
инструкциям производителя. Значения Kd определяют с использованием программного обеспечения
KinExA 3000.
Для измерения kon отдельные Fab в концентрации 2 нМ смешивают с 0-2 40 нМ антигена с использованием инъекционного способа в соответствии с инструкциями производителя и обнаруживают несвязанный Fab. Полученные данные используют для вычисления kon с помощью программного обеспечения
KinExA 3000. koff вычисляют по формуле Kd=koff/kon.
Измерение кинетических констант для Mab
Известны альтернативные способы измерения кинетических констант, например: сродство композиции для связывания с человеческим TGF-бета 1 (R&D Systems, кат. № 240-B/CF), TGF-бета 2 (RDI, кат.
№ RDI-1035) и TGF-бета 3 (RDI, кат. № RDI-1036/CF) измеряют с помощью инструмента BIAcore®
2000. BIAcore® использует оптические свойства внешнего резонанса плазмон для обнаружения изменений концентрации белка взаимодействующих молекул в пределах декстрановой матрицы биодатчика.
Если не указано иное, все реактивы и материалы приобретены у BIAcore® AB (Upsala, Швеция). Все измерения выполняются при комнатной температуре. Образцы растворяют в буфере HBS-EP (150 мМ хлорид натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,01% (мас./об.) сурфактанта P-20 и 10 мМ HEPES, pH 7,4). Рекомбинантный
протеин A иммобилизируют на всех четырех проточных кюветах матрицы датчика CM4 на уровне 400450 единиц реакции (RU), с использованием набора для сочетания амина.
Связывание оценивают с применением множественных циклов анализа. Каждый цикл выполняют
со скоростью потока 50 мкл/мин, и цикл состоит из следующих шагов: инъекция 12 мкл композиции для
связывания антитела с концентрацией 0,5 мкг/мл, инъекция 250 мкл TGF-бета 1 (начинают с 5 нМ и ис- 37 -
016038
пользуют серийные двукратные разведения до 0,13 нМ для каждого цикла, с двумя инъекциями для каждой концентрации) с последующей короткой (5 минут) или длинной (120 мин) задержкой для диссоциации, и регенерацией с использованием двух инъекций по 50 мкл 10 мМ глицина гидрохлорида, pH 1,5.
Скорость ассоциации и диссоциации для каждого цикла определяют, экстраполируя данные биодатчика,
используя модель простой ассоциации с применением ClampXP (Center for Biomolecular Interaction
Analysis, Университет Юты), чтобы получить константы скорости kon и koff; константу равновесия связывания Kd вычисляют с применением взаимоотношения Kd=koff/kon. Средние примерные данные для композиций по изобретению приведены в табл. 3, показанной ниже.
Таблица 3
Таблица 3. Сродство связывания и данные кинетики для Fab и mAb по изобретению. Параметры
равновесия (Kd) и кинетики (kon) связывания определены с применением Kinexa (koff вычислена на основе
Kd и kon). Равновесие и кинетические свойства связывания mAb определяют с применением Biacore. Константа равновесия связывания Kd вычислена на основе определенных kon и koff. Сравнение осуществляют
с мышиным IgG1 Fab #2471. В результате очень медленной диссоциации koff для 21D1 и DM7 представляет собой верхний предел обнаружения и, вероятно, намного медленнее; таким образом, вычисленные
значения Kd также представляют собой верхние пределы. Значения представляют собой средние величины повторных измерений (n=3-4).
Определение специфичности Mab
Методы BIAcore применяют, чтобы определить способность композиций mAb по изобретению связываться с другими объектами, конкретно, с латентной формой TGF-бета 1 или TGF-бета 3. Все измерения выполняют при комнатной температуре. Образцы растворяют в буфере HBS-EP (150 мМ хлорид натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,01% (мас./об.) сурфактанта P-20 и 10 мМ HEPES, pH 7,4). Рекомбинантный протеин
A иммобилизируют на всех четырех проточных кюветах матрицы датчика CM4 на уровне 400-450 единиц реакции (RU), с использованием набора для сочетания амина.
Связывание оценивают с применением множественных циклов анализа. Каждый цикл выполняют
со скоростью потока 100 мкл/мин, и цикл состоит из следующих шагов: инъекция 15 мкл композиции
для связывание антитела с концентрацией 1 мкг/мл, инъекция 250 мкл 5 нМ TGF-бета 1, 5 нМ латентного
TGF-бета 1 или 5 нМ TGF-бета 3 с последующей короткой (5 мин) задержкой для диссоциации, и регенерацией с использованием двух инъекций по 50 мкл 10 мМ глицина гидрохлорида, pH 1,5. Уровень сигнала после улавливания сначала Mab, а затем лиганда, определен с применением инструмента под контролем программного обеспечения. Поскольку сигнал пропорционален количеству захваченного белка,
легко можно вычислить стехиометрическое количество захваченного лиганда (табл. 4).
- 38 -
016038
Таблица 4
Таблица 4. Связывание TGF-бета 1, латентного TGF-бета 1 и TGF-бета 3 с Mab (исследован с концентрацией лиганда 5 нМ)
Специфичность в отношении TGF-бета 1.
Методы BIAcore применяют, чтобы определить сродство композиции mAb в отношении TGF-бета
3. Все измерения выполняют при комнатной температуре. Образцы растворяют в буфере HBS-EP (150
мМ хлорид натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,01% (мас./об.) сурфактанта P-20 и 10 мМ HEPES, pH 7,4). Рекомбинантный протеин A иммобилизируют на всех четырех проточных кюветах матрицы датчика CM4 на
уровне 400-450 единиц реакции (RU), с использованием набора для сочетания амина. Связывание оценивают с применением множественных циклов анализа. Каждый цикл выполняют со скоростью потока 100
мкл/мин, и цикл состоит из следующих шагов: инъекция 15 мкл композиции для связывание антитела с
концентрацией 0,5 мкг/мл, инъекция 250 мкл TGF-бета 3 (начиная с 5 нМ с использованием серийных
двукратных разведений до 0,13 нМ для каждого цикла, с двумя инъекциями для каждой концентрации) с
последующей короткой (5 мин) задержкой для диссоциации, и регенерацией с использованием двух инъекций по 50 мкл 10 мМ глицина гидрохлорида, pH 1,5.
Сродство определяют на основе сигнала равновесия, которое достигается при различных концентрациях TGF-бета 3 путем измерения среднего сигнала в ходе последних 10 с инъекций TGF-бета 3 с
последующей экстраполяцией полученных сигналов при всех концентрациях TGF-бета 3 на простую
модель равновесия связывания в SCRUBBER (Center for Biomolecular Interaction Analysis, Университет
Юты). Примеры данных, определенных для исследуемой композиции mAb по изобретению Kd и специфичности, рассчитан делением Kd для связывания TGF-бета 3 на Kd для связывания TGF-бета 1 (в данном
описании), показаны ниже в табл. 5.
Таблица 5
Таблица 5. Сродство и относительная специфичность исследованной композиции для связывания
mAb в отношении связывания с TGF-бета 3. Ошибки, там, где они показаны, представляют среднее квадратичное отклонение многократных повторных измерений (n=3).
Пример 2. Модель печеночного фиброза в результате перевязки желчного протока in vivo.
Используют модель перевязки желчного протока по способу, сходному с описанным Arias et al.
(BMC Gastroenterology 3(29), 2003), для оценки in vivo эффективности анти-TGF-бета 1 терапии. Если
коротко, осуществляли анестезию крыс-самцов Спрег-Доули (250-300 г) ингаляцией изофлурана (2-3%)
до достижения эффекта. Брюхо выбривали и промывали бетадином и 70% этиловым спиртом. В стерильных условиях производили надрез (∼4 см) по серединной линии и общий желчный проток изолировали и перевязывали 6-0 хирургическим шелком в двух положениях, с интервалом приблизительно 1 см,
после чего производили поперечный разрез между лигатурами. Стенку брюшной полости зашивали шелковой нитью 4-0 и кожу сшивали скобами. Введение анти-TGF-бета 1 композиции и контрольного изотипа мышиного mAb (IgG) осуществляют в день хирургического вмешательства и каждые 7 дней в дальнейшем. Через 4 и 12 дней после хирургического вмешательства крыс умерщвляют и определяют печеночные ферменты в сыворотке, полную формулу крови, а также анализируют гистологию печени (окрашивание трихромом и H&E), чтобы определить влияние введения.
Пример 3. Модель фиброза легкого in vivo.
Целый ряд моделей доступны для оценки эффективности in vivo композиций анти-TGF-бета при
- 39 -
016038
фиброзе легкого. Например, блеомициновая модель в форме, описанной Pittet, et al. (JCI 107, 1537-1544,
(2001), используется для оценки облегчения в подходе анти-TGF-бета. Другая модель представляет собой модель респираторного реовируса 1/L (см., например, Bellum et al., Am. J. Pathol, 150, 2243; или London et al., Clin. Immunol. 103, 284; и London et al., Exp. Mol. Pathol, 72, 24-36). Если коротко, используют
мышей, которым в день 1 вводят интраназально реовирус 1/L, 1×107 бляшкообразующих единиц (всего
30 мкл), и далее в дни 3, 7, 12 вводят различные концентрации композиции для связывания анти-TGFбета по изобретению или контрольного изотипа mAb, как описано в данном описании или известно из
уровня техники. Животных контролируют в ходе лечения на предмет признаков респираторного дистресса, потери массы и смертности. В день 14 после начала лечения животных умерщвляют, и образцы
легкого готовят для гистопатологического исследования (H/E), чтобы оценить развитие и/или прогресс
заболевания легкого (для оценки фиброза используют содержание гидроксипролина).
Пример 4. Модель анти-Thy1.1 гломерулонефрита in vivo.
Модель анти-Thy1.1 на крысах представляет собой общепризнанную модель мезангиопролиферативного гломерулонефрита (см., например, Morita, et al., 1998 Am J Kidney Dis 31:559-73; Bagchus, et al.,
1986 Lab. Invest. 55:680-7 и Yamamoto & Wilson 1987 Kidney Int. 32:514-25), где инъекция антитела, направленного против антигена Thy, локализованного на поверхности мезангиальных клеток, индуцирует
мезангиолиз с последующей фазой сверхкомпенсаторной пролиферации мезангиальных клеток, что приводит к повышению уровней белка в моче (протеинурия). Модель анти-Thy1.1 нефрита во многих аспектах имеет сходство с IgA нефритом у человека или пурпурой Хенош-Шонлейна (O'Donoghue, et al., 1991
J Clin Invest 88:1522-30), и ее применяют, чтобы проверить потенциальные терапевтические подходы к
заболеванию почек путем определения способности исследуемых композиций вызывать дозозависимое
уменьшение протеинурии (см., например, Burg, et al., 1997 Lab Invest 76:505-16; Johnson, et al., 1995 Kidney Int 47:62-9).
Чтобы исследовать композиции для связывания по изобретению на такой индивидуально обозначенной модели, крыс-самцов Спрег-Доули (200-260 г; в возрасте приблизительно 9 недель) акклиматизируют в течение пяти дней до лечения со свободным доступом к пище и воде на стандартном рационе.
Определение белка перед мочеиспусканием проводят на день 5 до лечения. Крысам наносят индивидуальную маркировку, помечая хвост цветным маркером, а также нанося метку на ухо перед ретроорбитальным забором образца крови, и случайным образом распределяют в 5 групп на основе массы тела
в день 1.
Изучение проводят вслепую относительно групп лечения и раскрывают код в конце исследования.
Группы получают 1,25 мг анти-Thy1.1 mAb или фосфатный буферный раствор в качестве контрольной
инъекции через вену пениса в день 0. Композиции для связывания готовят и очищают в стандартных условиях или как описано в данном описании. Контрольный мышиный IgG1 mAb (11513) представляет
собой очищенный материал протеина A, ресуспендированный в фосфатном буферном растворе с pH 7,2,
приобретенный у Harlan Bioproducts for Science, Indianapolis, IN 46229-0176.
Мышиный анти-Thy 1.1 получают в культурах 2×10 л гибридомы мыши. Кондиционированные среды объединяют, упаривают до 18X и затем очищают. Приблизительно 764 мл концентрированного супернатанта смешивают с 1,5 М глицина/3,0 М NaCl (pH 8,9) и наносят на свежую колонку со 137 мл протеина A Сефарозы, заранее уравновешенную в 1,5 М глицина/3,0 М NaCl (pH 8,9). Далее колонку с протеином A ISHED 1,5 М глицина/3,0 М NaCl (рН 8,9). Колонку элюируют 100 мМ раствора лимонной кислоты (рН 3,0). Отобранные фракции элюата, которые соответствуют IgG, объединяют, доводят pH до 7,4
с помощью 1 М NaOH и наносят на колонку 318 мл Pharmacia Superdex 200, уравновешенную в буферизованном фосфатом растворе (pH 7,4) хлорида натрия. Пики, по размеру соответствующие IgG, объединяют, отбирают аликвоты и хранят при -20°C.
Через час после введения анти-Thy1.1 mAb животным вводят подкожно изотип или композиции антитела анти-TGF-бета 1 по изобретению. Антитела опять снова вводят в день 7, животных изучают в
следующих четырех группах лечения:
1) ложное лечение; инъекция фосфатного буферного раствора;
2) анти-Thy1.1 с изотипом контрольного антитела в дозе ∼12,5 мг/кг или 2,5 мг/дозу;
3) анти-Thy1.1 с антителом DM4 в дозе ∼5 мг/кг или 1 мг/дозу;
4) анти-Thy1.1 с антителом DM7 в дозе ∼12,5 мг/кг или 2,5 мг/дозу;
5) анти-Thy1.1 с антителом C27 в дозе ∼12,5 мг/кг или 2,5 мг/дозу.
Крыс размещают в метаболических клетках на 24-часовый период времени в дни -5 и 13. В день 14
крыс умерщвляют CO2 и осуществляют забор крови для анализа пункцией сердца. Левую почку фиксируют в 4% параформальдегиде в фосфатном буферном растворе и хранят в 70% этаноле для последующего гистологического анализа. Если какая-либо крыса становится умирающей, ее умерщвляют (CO2) и
проводят анализ белка в моче и концентраций азота мочевины в крови. Белок в моче и концентрации
азота мочевины в крови (BUN) анализируют на автоматическом анализаторе HITACHI 911 со средствами
контроля от Biorad в соответствии с инструкциями производителей.
Пример данных в табл. 6 ниже показывает, что композиции для связывания по изобретению обла- 40 -
016038
дают существенной способностью облегчать повреждение почек in vivo и уменьшать протеинурию, связанную с индуцированным анти-Thy1.1 mAb повреждением почек.
Таблица 6
Таблица 6. Крысам вводят в/в 2,5 мг/кг α-Thy1.1 mAb и через 30 мин вводят 1 мг герцептина для
исследования 21D1 и DM4. Вторую дозу анти-TGF-бета 1 и контрольное mAb вводят на день 7, и животных умерщвляют на день 14. Как 21D1, так и DM4 mAb композиции для связывания снижают уровни
белка в моче (протеинурию) дозозависимым способом.
Пример 5. Картирование эпитопа композиций для связывания TGF-бета 1.
Сочетание H/Dex и химической метки используют для картирования эпитопов композиций для связывания TGF-бета 1 по изобретению, например антител. Как обмен H/D, так и химическая модификация
зависят от доступа растворителя к аминокислотным остаткам, изменения в доступности растворителя
после образования комплекса ″композиция для связывания:TGF-бета 1″ могут использоваться, чтобы
идентифицировать остатки, принимающие участие в связывании с антителом. После обмена H/D или
химической модификации протеолитическое расщепление на фрагменты расщепления пептида ранее
связанного антигена позволяет осуществить сравнение молекулярной массы между фрагментами (с применением ЖХ/МС) и определить, какие аминокислотные остатки блокированы в результате обмена H/D
или химической модификации после образования комплекса связывания.
Введение химической метки на поверхности белка
Аликвоты по 15 мкг 1 мг/мл TGF-бета 1 в 4 мМ растворе HCl переносят в пластиковые флаконы, в
которые добавлено 180 мкг контроля или композиции TGF-бета 1 антитела по изобретению (TGF-бета
1/антитело = 1/2 в молярном соотношении). Буферизованный фосфатом солевой раствор (фосфатный буферный раствор) добавляют в каждый флакон до конечного объема 150 мкл и растворы инкубируют
(чтобы создать условия для образования комплекса связывания) при температуре окружающей среды как
минимум в течение 10 мин перед введением метки поверхности белка. В случае химического введения
метки 7,5 мкл раствора гидроксилсукцинимидного эфира уксусной кислоты (AHSE) добавляют в каждый
флакон с комплексом и смеси инкубируют при температуре окружающей среды (AHSE/антитело = 200/1
в молярном соотношении). Через различные периоды времени (например, 10, 20 и 60 мин) 50 мкл смеси
гасят смешиванием 50 мкл 1 мг/мл К в трис-буфере 0,1 М, pH 8,0. Раствор непосредственно анализируют
с помощью ЖХ/МС (как описано в данном описании). Оставшийся раствор каждого образца обрабатывают 3-5 мкл раствора 50 мг/мл ДТТ при 37°C (10-15 мин), чтобы уменьшить количество дисульфидных
связей в зрелом TGF-бета 1.
Восстановленный раствор белка далее обрабатывают 3 мкл раствора химотрипсина 0,1 мг/мл при
37°C в течение 2-3 ч, после чего обрабатывают 1 мкл раствора Glu-C 0,25 мг/мл при 37°C еще в течение
2-3 ч. Эту реакцию гасят добавлением 0,5 мкл ледяной уксусной кислоты, а затем анализируют с помощью ЖХ/МС с помощью ВЭЖХ Waters 2795 и масс-спектрометра Micromass LTC Premier Mass. В методе ВЭЖХ используют колонку Zorbax, SB C18, 2,1×50 мм при температуре окружающей среды; белки и
пептиды элюируют ацетонитрилом с градиентом в 0,15% муравьиной кислоте; продолжительность хроматографирования 14 мин используется для интактного белка и продолжительность хроматографирования 75 мин используется для протеолитических гидролизатов.
Для остатков лизина (K) на поверхности TGF-бета 1 или в пределах эпитопа или поблизости от него
со структурной точки зрения ацетилирование аминогруппы K блокируется (частично или полностью)
после того, как исследуемая композиция связывается с TGF-бета 1. Сравнение степени ацетилирования
пептида из образца комплекса (TGF-бета 1 + антитело, которое связывает TGF-бета 1) или образца без
образования комплекса (TGF-бета 1 + контрольное антитело, которое не связывает TGF-бета 1) позволя- 41 -
016038
ет идентифицировать аминокислотные остатки, ацетилирование которых блокировано образованием
комплекса связывания. Ниже приведен пример данных ацетилирования, полученных в условиях такого
анализа с помощью ЖХ/МС (табл. 7).
Таблица 7
Представленный пример данных, различия между комплексами ″TGF-бета 1:антитело″ и контрольными являются различимыми для нескольких пептидных фрагментов TGF-бета 1, тем более, как показано для коротких периодов ацетилирования (например, 10 мин). Фрагменты, содержащие остатки 31-39,
33-43, 53-62 и 91-112, демонстрируют такие явные отличия. Как фрагменты 31-39, так и 33-43 содержат
остаток K37. Фрагмент 22-32, который содержит K26 и K31, не демонстрирует существенной разницы по
сравнению с контролем, поэтому различия в ацетилировании фрагмента 31-39 отнесены на счет блокирования ацетилирования K37 после образования комплекса ″антиген:антитело″.
Фрагменты 53-62 и 91-112 демонстрируют систематические отличия в пределах исследованного
интервала и для каждого исследованного антитела. Фрагмент 53-62 демонстрирует уменьшение отличий
в верхнем интервале ацетилирования (60 мин), однако в условиях более низкого соотношения
AHSE/антитело такие отличия остаются неизмененными на протяжении всего интервала. Не привязываясь к теории, одна интерпретация таких данных состоит в том, что K60 не участвует непосредственно в
связывании ″антиген:антитело″, но его близость к комплексу связывания является достаточной для блокирования доступности AHSE для остатка K60, и, таким образом, он блокирует ацетилирование. Однако,
альтернативно, K60 может включить эпитоп, который определяется исследуемым антителом.
Фрагмент 91-112 показывает отличия ацетилирования на протяжении исследованного интервала,
указывая на то, что как минимум один из трех остатков лизина в данном фрагменте (K95, K97 или K110)
участвует в комплексе связывания ″композиция:TGF-бета 1″. Чтобы идентифицировать соответствующий(ие) остаток(ки) лизина, химотрипсиновый гидролизат дополнительно обрабатывают Glu-C с получением двух дополнительных фрагментов - 91-99 и 100-112. Последний (фрагмент 100-112) содержит
K110, однако он не показывает существенного отличия в ацетилировании, указывая на то, что он недоступен для растворителя или для химической модификации.
Первый (фрагмент 91-99), содержащий K95 и K97, дополнительно исследуют с применением не
связанного в комплекс TGF-бета 1, обработанного AHSE и проанализированного с помощью MC/MC для
определения времени элюации ацетилированного по одному остатку вида, а также для количественного
определения степени ацетилирования K95 или K97 (пример данных, полученых в таких условиях, приведен в табл. 8). Такие данные показывают, что ацетилирование K97 не изменяется при образовании комплекса или без него, однако присутствие композиции антитела по изобретению в существенной мере
воздействует на ацетилирование K95, указывая на то, что K95 непосредственно участвует в образовании
комплекса связывания.
- 42 -
016038
Таблица 8
Обмен H/D.
В ходе картирования эпитопа техника обмена дейтерия/водорода (H/D) имеет сходство с введением
метки на поверхность белка/MC, однако обмен H/D не является специфичным для остатка и, таким образом, может обнаружить изменения в любом аминокислотном остатке. При сравнении комплекса ″композиция для связывания:TGF-бета 1″ с несвязанным зрелым белком TGF-бета 1 молекулярная масса связанного белка составляет приблизительно на 20 Да (или на 30 Да в 100% D2O) меньше, чем масса несвязанного TGF-бета 1, поэтому вычисляя различия массы D2O между связанным и несвязанным TGF-бета
1, можно показать, что приблизительно тридцать аминокислотных остатков в зрелом димере TGF-бета 1
могут участвовать в образовании комплекса связывания по изобретению.
Аликвоты 120 мкг (~140 или 280 мкл) растворов антитела повергаются буферному обмену в фосфатном буферном растворе путем последовательной концентрации и разбавления с использованием
ультрафильтрационного концентратора белка Microcon (30 kD) (Millipore). После двух последовательных
циклов концентрации и разбавления фосфатным буферным раствором растворы антитела концентрируют, извлекают, доводят до конечного объема 70 мкл с помощью фосфатного буферного раствора. Затем в
каждый флакон с антителом добавляют 10 мкл 1 мг/мл TGF-бета 1 в 4 мМ растворе HCl и 2 мкл трисбуфера 1 М, pH 8,0, в каждый флакон с антителами, для образования комплекса ″TGF-бета 1:антитело″.
Контрольный образец TGF-бета 1 готовят, смешивая 70 мкл 1×ФБР, 20 мкл TGF-бета 1 в 4 мМ растворе
HCl и 2 мкл трис-буфера 1 М (рН 8,0). Затем 9 мкл TGF-бет 1 или комплекса ″TGF-бета 1:антитело″ переносят в пластиковый микрофлакон, после чего добавляют 21 мкл 100% D2O для образования 70% раствора D2O. Раствор инкубируют при температуре окружающей среды в течение 10 мин, а затем при 0°C в
течение 1 мин.
После инкубации обмен H/D гасят и гидролизуют белок, добавляя 15 мкл 1% раствора муравьиной
кислоты (при 0°C) и 4 мкл раствора пепсина 2 мг/мл (при 0°C), а затем инкубируют при 0°C в течение 5
мин. Гидролизат немедленно вручную вносят на колонку для анализа ЖХ/МС (как описано выше, за исключением того, что трубки и колонку ВЭЖХ погружают в баню, содержащую смесь воды со льдом).
Зрелый TGF-бета 1 сопротивляется расщеплению пепсином при низких значениях pH (∼2,5) и низкой температуре (0°C) за счет образования дисульфидных связей. В результате образуются несколько
отщепленных пептидов, и большая часть TGF-бета 1 остается интактной, несмотря на более длительное
время переваривания и более высокие концентрации фермента:белка. Поддающиеся идентификации протеолитические фрагменты TGF-бета 1 обычно образуются на C-концевых и средних участках белка (например, фрагменты 58-64 или 61-64). Пример данных для изменения массы (дельта массы) после применения обмена D/H с использованием таких фрагментов показан ниже в табл. 9. Дельта массы для фрагмента 61-64 представляет собой приблизительно нуль, в то время как дельта массы для фрагмента 58-64
составляет около 1 Да, указывая на то, что участок, защищенный в результате обмена дейтерия - после
образования комплекса с композицией связывания по изобретению, - включает аминокислотные остатки
58-61.
- 43 -
016038
Таблица 9. Дельта массы идентифицированного пепсинового пептида TGF-бета 1 после обмена D/H.
TGF бета, мутагенез
Чтобы дополнительно определить эпитопы для композиций для связывания по изобретению, используются традиционные методы мутагенеза для идентификации остатков TGF-бета 1, критических для
образования комплексов связывания с композициями по изобретению. Кристаллическая структура комплекса TGF-бета 3/TGF-бета RII (2002 Nat Struct Biol. 3:203-8) используется в качестве модели для определения существенных сайтов мутагенеза белка TGF-бета 1 - R25K, K26R, V33I, P87Т, V89L и K95Т (показаны выше).
Способность связываться с мутеином TGF-бета 1 исследовали с применением композиций для связывания, специфичных в отношении изоформ TGF-бета, и коммерчески доступных mAb (1D11 и 240;
R&D Systems), которые препятствуют связыванию TGF-бета 1 с его родственным рецептором (TGF-бета
RII). Исследование проводят с помощью анализа индуцированной лазером десорбции/ионизационной
масс-спектрометрии времени пробега. Тест mAb, например, mAb 3821 и 2411, которые специфично связываются с TGF-бета 1 (раскрытый в PCT/US2004/018 921; США 60/485820), и контроль, например, mAb
1D11, который связывается со всеми тремя изоформами TGF-бета, смешивают (создавая условия для
образования комплекса с белком TGF-бета 1 (мутеин или дикий тип)), иммобилизируют на пластинах
для обнаружения, обрабатывают лазером и затем анализируют с применением стандартизированного
программного обеспечения в производственных условиях (Ciphergen Diagnostics).
Пример результатов показывает, что четкое подмножество аминокислотных остатков в интерфейсе
связывания TGF-бета 1/TGF-бета RII отличается от других изоформ TGF-бета (TGF-бета 2 и TGF-бета 3).
Тест mAb #2471 (со специфичным родством связывания в отношении TGF-бета 1) связывается с TGFбета 1 дикого типа со скоростью в 5 раз выше скорости связывания с мутеином TGF-бета 1, тогда как
mAbs 3821 и 1D11 связываются с TGF-бета 1 мутеином со скоростью, которая в 2,5 раза ниже скорости
для TGF-бета 1 дикого типа.
Описание перечня последовательностей
SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность зрелого TGF-бета 1 homo
sapiens.
SEQ ID NO: 2 и 141 представляют собой аминокислотную последовательность искусственного
VHCDR1.
SEQ ID NO: 3 и 142 представляют собой аминокислотную последовательность искусственного
VHCDR2.
SEQ ID NO: 4 и 143 представляют собой аминокислотную последовательность искусственного
VHCDR3.
SEQ ID NO: 5 и 138 представляют собой аминокислотную последовательность искусственного
VLCDR1.
SEQ ID NO: 6 и 139 представляют собой аминокислотную последовательность искусственного
- 44 -
016038
VLCDR2.
SEQ ID NO: 7 и 140 представляют собой аминокислотную последовательность искусственного
VLCDR3.
SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность каркаса HCVR FR1 homo
sapiens.
SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность каркаса HCVR FR2 homo
sapiens.
SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность каркаса HCVR FR3 homo
sapiens.
SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность каркаса HCVR FR4 homo
sapiens.
SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность каркаса LCVR FR1 homo
sapiens.
SEQ ID NO: 13-36 представляют собой аминокислотные последовательности каркаса LCVR FR2
homo sapiens.
SEQ ID NO: 37 представляет собой аминокислотную последовательность каркаса LCVR FR3 homo
sapiens.
SEQ ID NO: 38 представляет собой аминокислотную последовательность каркаса LCVR FR4 homo
sapiens.
SEQ ID NO: 39 представляет собой аминокислотную последовательность постоянного участка тяжелой цепи IgG1 homo sapiens.
SEQ ID NO: 40 представляет собой аминокислотную последовательность постоянного участка тяжелой цепи IgG4 homo sapiens.
SEQ ID NO: 41 представляет собой аминокислотную последовательность постоянного участка цепи
каппа homo sapiens.
SEQ ID NO: 42-86 представляют собой аминокислотные последовательности вариабельного участка
легкой цепи.
SEQ ID NO: 87-125 представляют собой аминокислотные последовательности искусственного
HCVR.
SEQ ID NO: 136 и 137 представляют собой аминокислотные последовательности эпитопов mAbs
homo sapiens по изобретению.
SEQ ID NO: 144 представляет собой аминокислотную последовательность искусственного TGFбета 1.
- 45 -
016038
Измененный список последовательностей
- 46 -
016038
- 47 -
016038
- 48 -
016038
- 49 -
016038
- 50 -
016038
- 51 -
016038
- 52 -
016038
- 53 -
016038
- 54 -
016038
- 55 -
016038
- 56 -
016038
- 57 -
016038
- 58 -
016038
- 59 -
016038
- 60 -
016038
- 61 -
016038
- 62 -
016038
- 63 -
016038
- 64 -
016038
- 65 -
016038
- 66 -
016038
- 67 -
016038
- 68 -
016038
- 69 -
016038
- 70 -
016038
- 71 -
016038
- 72 -
016038
- 73 -
016038
- 74 -
016038
- 75 -
016038
- 76 -
016038
- 77 -
016038
- 78 -
016038
- 79 -
016038
- 80 -
016038
- 81 -
016038
- 82 -
016038
- 83 -
016038
- 84 -
016038
- 85 -
016038
- 86 -
016038
- 87 -
016038
- 88 -
016038
- 89 -
016038
- 90 -
016038
- 91 -
016038
- 92 -
016038
- 93 -
016038
- 94 -
016038
- 95 -
016038
- 96 -
016038
- 97 -
016038
- 98 -
016038
- 99 -
016038
- 100 -
016038
- 101 -
016038
- 102 -
016038
- 103 -
016038
- 104 -
016038
- 105 -
016038
- 106 -
016038
- 107 -
016038
- 108 -
016038
- 109 -
016038
- 110 -
016038
- 111 -
016038
- 112 -
016038
- 113 -
016038
- 114 -
016038
- 115 -
016038
- 116 -
016038
- 117 -
016038
- 118 -
016038
- 119 -
016038
- 120 -
016038
- 121 -
016038
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые нейтрализуют человеческий TGF-бета
и обладают Kd меньше 40 пМ для человеческого TGF-бета 1, отличающиеся тем, что содержат:
a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий:
i) CDR1, включающий аминокислотную последовательность GYX1FX2DYNX3X4 (SEQ ID NO: 2),
где X1 представляет собой T или D; X2 представляет собой T, E или F; X3 представляет собой M, I, L или
V и X4 представляет собой H, V или A;
ii) CDR2, включающий аминокислотную последовательность X1X2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS (SEQ
ID NO: 3), где X1 представляет собой Y, Q или S; X2 представляет собой I или V; X3 представляет собой
D или E; X4 представляет собой Y, T, H или L; X5 представляет собой Q, K, P или S и X6 представляет
собой F или Y;
iii) CDR3, включающий аминокислотную последовательность GYRX1X2X3Y (SEQ ID NO: 4), где X1
представляет собой W или A; X2 представляет собой F или L и X3 представляет собой A или E; и
- 122 -
016038
b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий:
i) CDR1, включающий аминокислотную последовательность X1AX2X3X4VX5YMH (SEQ ID NO: 5),
где X1 представляет собой R, Y, E или Q; X2 представляет собой S или T; X3 представляет собой S, V или
A; X4 представляет собой S или L; X5 представляет собой S, P, L или Y;
ii) CDR2, включающий аминокислотную последовательность ATSNX1AX2 (SEQ ID NO: 6), где X1
представляет собой L, N или P и X2 представляет собой S, K, Y, L, M, F, E, Q, R или H;
iii) CDR3, содержащий аминокислотную последовательность X1QWDX2X3X4PA (SEQ ID NO: 7), где
X1 представляет собой Q или S; X2 представляет собой L, D или P; X3 представляет собой N или R и X4
представляет собой P, F, Y или R.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что обладают перекрестной реактивностью с человеческим TGF-бета 2 и/или TGF-бета 3 менее 20%.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что Kd для человеческого TGF-бета 1 находится в интервале от 35 до 0,1 пМ.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что дополнительно
содержат четыре каркасные области тяжелой цепи и четыре каркасные области легкой цепи, где
каркасная область 1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
каркасная область 2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;
каркасная область 3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;
каркасная область 4 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;
каркасная область 1 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;
каркасная область 2 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;
каркасная область 3 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 и
каркасная область 4 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, отличающиеся тем, что дополнительно
содержат констатный участок IgG4 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 и констатный участок цепи каппа с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что содержат вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из:
i) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 90, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43;
ii) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID
NO: 92, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 42;
iii) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 107, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность
SEQ ID NO: 57; и
iv) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 119, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность
SEQ ID NO: 73.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.6, отличающиеся тем, что содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90, и
вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, отличающиеся тем, что дополнительно
содержат константный участок IgG4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40,
и константный участок цепи каппа, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по
любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 для применения в качестве лекарственного средства для лечения фиброзного заболевания.
11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 для применения в качестве лекарственного средства для лечения хронического заболевания почек.
12. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 для производства лекарственного средства для лечения фиброзного заболевания у человека.
13. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 для производства лекарственного средства для лечения хронического заболевания почек у человека.
14. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 для производства лекарственного средства для применения в комбинированной терапии фиброзного заболевания у
субъекта-человека, где указанное лекарственное средство должно вводиться в комбинации с ингибитором АПФ.
15. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 для производ- 123 -
016038
ства лекарственного средства для применения в комбинированной терапии для лечения хронического
заболевания почек у человека, где указанное лекарственное средство должно вводиться в комбинации с
ингибитором АПФ.
16. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 для лечения
рака.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 124 -