011866 Заявка на данное изобретение является частичным ... 10 октября 2002 г., и международной заявки PCT/US 02/32613, поданной...

011866
Заявка на данное изобретение является частичным продолжением заявки US 10/269805, поданной
10 октября 2002 г., и международной заявки PCT/US 02/32613, поданной 11 октября 2002 г., испрашивающих приоритет предварительной заявки US 60/328604, поданной 11 октября 2001 г.; все эти
документы включены в заявку на изобретение путем ссылки. Заявка также испрашивает приоритет предварительной заявки US 60/620161, поданной 19 октября 2004 г., и заявки US 10/982440, поданной
4 ноября 2004 г., которые включены в заявку путем ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к специфическим связывающим агентам, которые распознают и
связывают ангиопоэтин-2 (Ang-2). Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению,
применению в диагностике и применению в лечении моноклональных и поликлональных антител и их
фрагментов, которые специфически связываются Ang-2.
Уровень техники
Ангиогенез, т.е. образование новых кровеносных сосудов из уже существующих, лежит в основе
многих физиологических и патологических процессов. В норме ангиогенез строго регулируется про- и
антиангиогенными факторами, но в случае заболеваний, таких как рак, болезни, связанные с неоваскуляризацией глаз, артриты и псориаз, регуляция может нарушаться (Folkman - J. Nat. Med., 1995, 1: 27-31).
Существует множество заболеваний, известных как связанные с нарушением регуляции ангиогенеза или с нежелательным ангиогенезом. Перечень этих заболеваний включает, не ограничиваясь указанным, неоваскуляризацию глаз, в частности ретинопатии (в том числе диабетическую ретинопатию), возрастную макулодегенерацию; псориаз, гемангиобластому, гемангиому, артериосклероз, воспалительные
заболевания, такие как ревматоидные или ревматические воспалительные заболевания, в частности артрит (в том числе ревматоидный артрит), или другие хронические воспалительные расстройства, такие как
хроническая астма, артериальный или посттрансплантационный атеросклероз, эндометриоз и новообразования, например так называемые солидные опухоли и жидкие (или гематопоэтические) опухоли (такие
как лейкемии и лимфомы). Прочие заболевания, связанные с нежелательным ангиогенезом, хорошо известны специалистам в области техники.
В регуляцию ангиогенеза вовлечены многие системы передачи сигнала, однако одной из самых
изученных и наиболее избирательных в отношении эндотелиальных клеток является система с участием
Tie-2 - рецептора тирозинкиназы (известного как Tie-2 или Tie-2R, а также ORK; Tie-2 мыши известен
также как tek) и его лигандов, т.е. ангиопоэтинов (Gale N.W., Yancopoulos G.D. - Genes Dev., 1999, 13:
1055-1066). Известны четыре ангиопоэтина: ангиопоэтин-1 (Ang-1)-ангиопоэтин-4 (Ang-4). Эти ангиопоэтины называют ещё лигандами Tie-2 (Davis S. et al. - Cell, 1996, 87: 1161-1169; Grosios K. et al. - Cytogenet. Cell Genet., 1999, 84, 118-120; Holiash J. et al. - Investigative Ophthalmology&Visual Science, 1999, 32,
1617-1625; Koblizek T.I. et al. - Current Biology, 1998, 8, 529-532; Lin P. et al. - Proc. Natl. Acad. Sci. США,
1998, 95, 8829-8834; Maisonpierre P.C. et al. - Science, 1887, 277, 55-60; Papapetropoulos A. et al. - Lab.
Invest, 1999, 79, 213-223; Sato T.N. et al. - Nature, 1998, 375, 70-74; Shyu K.G. et al. - Circulation, 1998, 98,
2081-2087; Suri C. et al. - Cell, 1996, 87, 1171-1180; Suri С. et al. - Science, 1998, 282, 468-471; Valenzuela.
M. et al. - Proc. Natl. Acad. Sci. США, 1999, 96, 1904-1909; Witzenbichler B. et al. - J. Biol. Chem., 1998, 273,
18514 -18521). При том что связывание ангиопоэтина-1 с Tie-2 стимулирует фосфорилирование рецептора в культуре эндотелиальных клеток, было замечено, Ang-2 может выступать как агонист и как антагонист фосфорилирования рецептора Tie-2 (Davis S. et al. - см. выше; Maisonpierre P.C. et al. - см. выше;
Kim I., Kim J.H. et al. - Oncogene, 2000, 19 (39), 4549-4552; Teichert-Kuliszewska K., Maisonpierre P.C.
et al. - Cardiovascular Research, 2001, 49 (3), 659-670).
Фенотипы мышей с нокаутом генов Tie-2 и Ang-1 сходны между собой и позволяют предполагать,
что фосфорилирование Tie-2, вызванное Ang-1, опосредует перестройку и стабилизацию развивающихся
сосудов в утробе посредством поддержания адгезии эндотелиальных клеток, поддерживающих эндотелий (Dumont D.J. et al. - Genes&Development, 1994, 8, 1897-1909; Sato T.N. et al. - Nature, 1995, 376, 70-74;
Suri C. et al., 1996 - см. выше). Предположительно, роль Ang-1 в стабилизации сосудов сохраняется и во
взрослом организме, где он широко и конститутивно экспрессируется (Handahan D. - Science, 1997, 277,
48-50; Zagzag D. et al. - Experimental Neurology, 1999, 159, 391-400). Напротив, экспрессия Ang-2 исходно
ограничена участками перестройки сосудов, где он, по-видимому, блокирует функцию Ang-1, тем самым
вызывая состояние сосудистой пластичности, приводящей к ангиогенензу (Hanahan D., 1997 - см. выше;
Holash J. et al. - Science, 1999, 284, 1994-1998; Maisonpierre P.C. et al., 1997 - см. выше).
В сущности, многочисленные опубликованные исследования доказали ангиоселективность экспрессии Ang-2 при болезненных состояниях, связанных с ангиогенезом. Такие патологические состояния
включают, например, псориаз, макулодегенерацию и рак (Bunone G. et al. - Am. J. Pathol., 1999, 155,
1967-1976; Etoh T. et al. - Cancer Res., 2001, 61, 2145-2153; Hangai M. et al. - Investigative ophthalmology&Visual Sci., 2001, 42, 1617-1625; Holash J. et al., 1999 - см. выше; Kuroda K. et al. - J. Investigative
Dermatology, 2001, 116, 713-720; Otani A. et al. - Investigative Ophthalmology&Visual Sci., 1999, 40, 19121920; Stratmann A. et al. - Am. J. Pathol., 1998, 153, 1459-1466; Tanaka S. et al. - J. Clin. Invest, 1999, 103,
34-345; Yoshida Y. et al. - International J. Oncol., 1999, 15, 1221-1225; Yuan K. et al. - J. Perodontal Res.,
2000, 35, 165-171; Zagzag D. et al., 1999 - см. выше). Большая часть этих исследований сосредоточена на
-1-
011866
проблеме рака, поскольку многие типы опухолей, как оказалось, проявляют экспрессию Ang-2 в сосудах.
В противоположность экспрессии Ang-2 при патологическом ангиогенезе его экспрессия в нормальных
тканях чрезвычайно ограничена (Maisonpierre P. et al., 1997 - см. выше; Mezquita J. et al. - Biochem. Biophys. Res. Commun, 1999, 260, 492-498). В норме у взрослых существует три основных участка ангиогенеза: яичники, плацента и матка; это первые нормальные (т.е. не раковые) ткани, в которых была выявлена мРНК Ang-2.
Некоторые функциональные исследования позволяют предполагать, что Ang-2 может быть вовлечён в опухолевый ангиогенез. Ahmad et al. (Ahmad et al. - Cancer Res., 2001, 61, 1255-1259) описывают
сверхэкспрессию Ang-2 и показывают, что она в значительной степени связана с увеличением роста опухоли на модели гетеротрансплантанта у мышей. См. также Etoh et al. и Tanaka et al. (см. выше), где представлены данные о существенной связи сверхэкспрессии Ang-2 с гиперваскуляризацией опухолей. Однако Yu et al. (Yu et al. - Am. J. Pathol., 2001, 158, 563-570), напротив, приводят данные, показывающие, что
повышенная экспрессия Ang-2 в клетках лёгочной карциномы Льюиса и карциномы молочной железы
ТА3 существенно продлевала срок жизни мышей, которым была сделана инъекция соответствующих
трансфектантов.
В последние несколько лет в различных публикациях Ang-1, Ang-2 и/или Tie-2 рассматривались как
возможные мишени для противоопухолевой терапии. Например, в патентах US 6166185, US 5650490 и
US 5814464 раскрывается концепция антител к лигандам Tie-2 и рецепторных тел. Lin и др. (Lin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. США, 1998, 95, 8829-8834) вводили мышам аденовирус, экспрессирующий растворимую форму Tie-2; Растворимый Tie-2 существенно снижал количество и размер развивающихся у мышей опухолей. В исследовании, связанном с предыдущим (Lin et al. - J. Clin. Invest., 1997, 100, 20722078), крысам вводили растворимую форму Tie-2; это вещество существенно снижало размеры опухолей
у этих крыс. Siemeister и др. (Siemeister et al. - Cancer res. 1999, 59, 3185-3189) создали линии клеток меланомы человека, экспрессирующие внеклеточный домен Tie-2, вводили эти клеточные линии голым
мышам и выяснили, что растворимый Tie-2 приводит к "значительному ингибированию" роста опухолей
и ангиогенеза в них. Принимая во внимание эти данные, а также тот факт, что как Ang-1, так и Ang-2
связываются с Tie-2, из этих исследований неясно, Ang-1, Ang-2 или же Tie-2 могут представлять собой
перспективную мишень для противоопухолевой терапии.
Конъюгация некоторых пептидов со стабильными белками плазмы, такими как константная область
иммуноглобулинов, для увеличения периода полужизни этих молекул описана, например, в РСТ публикации WO 00/24782, опубликованной 4 мая 2000 г.
Конъюгация белка или фрагмента белка со стабильными белками плазмы, такими как константная
область иммуноглобулинов, для увеличения периода полужизни этих молекул неоднократно описана
(см., например, патент US 5480981; Zheng et al. - J. Immunol., 1995, 154, 5590-5600; Fisher et al. - N. Engl.
J. Med., 1996, 334, 1697-1702; Van Zee K. et al. - J. Immunol., 1996, 156, 2221-2230; патент США 5808029
от 15.09.1998; Capon et al. - Nature, 1989, 337, 525-531; Harvill et al. - Immunotech., 1995, 1, 95-105;
WO 97/23614 от 03.07.1997; PCT/US 97/23283, поданная 11.12.1997; Linsley - J. Exp. Med., 1991, 174, 561569; WO 95/21258 от 10.8.1995).
Эффективная терапия анти-Ang-2 могла бы оказаться полезной для широкой группы раковых больных, поскольку многим солидным опухолям для того, чтобы дорасти до диаметра, превышающего
1-2 мм, необходима неоваскуляризация. Такая терапия могла бы иметь и более широкое применение при
других расстройствах, связанных с ангиогенезом, таких как ретинопатии, артрит и псориаз.
Существует не удовлетворенная имеющимися разработками необходимость идентификации новых
агентов, специфически распознающих и связывающих Ang-2. Такие агенты были бы полезны для диагностического скрининга и терапевтического вмешательства при болезненных состояниях, связанных с
активностью Ang-2.
В соответствии с этим целью настоящего изобретения является получение агентов, специфически
связывающих Ang-2 и, тем самым, модулирующих активность Ang-2.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены антитела, включающие тяжёлую цепь и лёгкую
цепь, в которых указанная тяжёлая цепь содержит вариабельную область тяжёлой цепи, выбранную из
следующей группы:
526 НС (SEQ ID NO: 1); 528 НС (SEQ ID NO: 3); 531 НС (SEQ ID NO: 5); 533 НС (SEQ ID NO: 7);
535 HC (SEQ ID NO: 9); 536 HC (SEQ ID NO: 11); 537 HC (SEQ ID NO: 13); 540 HC (SEQ ID NO: 15);
543 HC (SEQ ID NO: 17); 544 HC (SEQ ID NO: 19); 545 HC (SEQ ID NO: 21); 546 HC (SEQ ID NO: 23);
551 HC (SEQ ID NO: 25); 553 HC (SEQ ID NO: 27); 555 HC (SEQ ID NO: 29); 558 HC (SEQ ID NO: 31);
559 HC (SEQ ID NO: 33); 565 HC (SEQ ID NO: 35); F1-C6 HC (SEQ ID NO: 37); FB1-A7 HC
(SEQ ID NO: 39); FD-B2 HC (SEQ ID NO: 41); FE-B7 HC (SEQ ID NO: 43); FJ-G11 HC (SEQ ID NO: 45);
FK-E3 HC (SEQ ID NO: 47); G1D4 HC (SEQ ID NO: 49); GC1E8 HC (SEQ ID NO: 51); H1C12 HC
(SEQ ID NO: 53); IA1-1E7HC (SEQ ID NO: 55); IF-1C10 HC (SEQ ID NO: 57); IK-2E2 HC
(SEQ ID NO: 59); IP-2C11 HC (SEQ ID NO: 61) и
антигенсвязывающие фрагменты указанной области;
-2-
011866
а указанная лёгкая цепь содержит вариабельную область лёгкой цепи, выбранную из следующей
группы:
526 каппа (SEQ ID NO: 2); 536 (THW) каппа (SEQ ID NO: 12); 536 (LQT) каппа (SEQ ID NO: 210);
543 каппа (SEQ ID NO: 18); 544 каппа (SEQ ID NO: 20); 551 каппа (SEQ ID NO: 26); 553 каппа
(SEQ ID NO: 28); 555 5 каппа (SEQ ID NO: 30); 558 каппа (SEQ ID NO: 32); 565 каппа (SEQ ID NO: 36);
FE-B7 каппа (SEQ ID NO: 44); FJ-G11 каппа (SEQ ID NO: 46); FK-E3 каппа (SEQ ID NO: 48); IA1-1E7
каппа (SEQ ID NO: 56); EP-2C11 каппа (SEQ ID NO: 62); 528 лямбда (SEQ ID NO: 4); 531 лямбда
(SEQ ID NO: 6); 533 лямбда (SEQ ID NO: 8); 535 лямбда (SEQ ID NO: 10); 537 лямбда (SEQ ID NO: 14);
540 лямбда (SEQ ID NO: 16); 545 лямбда (SEQ ID NO: 22); 546 лямбда (SEQ ID NO: 24); 559 лямбда
(SEQ ID NO: 34); F1-C6 лямбда (SEQ ID NO: 38); FB1-A7 лямбда (SEQ ID NO: 40); FD-B2 лямбда
(SEQ ID NO: 42); G1D4 лямбда (SEQ ID NO: 50); GC1E8 лямбда (SEQ ID NO: 52); H1C12 лямбда
(SEQ ID NO: 54); IF-1C10 лямбда (SEQ ID NO: 58); IK-2E2 лямбда (SEQ ID NO: 60) и
антигенсвязывающие фрагменты указанной области.
Согласно настоящему изобретению также предложен специфический связывающий агент, содержащий по меньшей мере один пептид, выбранный из следующей группы:
SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11;
SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23;
SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35;
SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47;
SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59;
SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 26;
SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46;
SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8;
SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 34;
SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54;
SEQ ID NO: 58; и SEQ ID NO: 60 и
их фрагменты.
Следует понимать, что специфический связывающий агент может представлять собой, например,
антитело, такое как поликлональное, моноклональное, химерное, гуманизированное или полностью человеческое антитело. Антитело может также представлять собой одноцепочечное антитело. Настоящее
изобретение также относится к гибридоме, продуцирующей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению.
Также следует понимать, что настоящее изобретение относится к конъюгатам, описанным ниже.
Конъюгат может представлять собой, например, специфический связывающий агент (такой как антитело), соответствующий настоящему изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим специфические связывающие агенты (такие как антитело), соответствующие настоящему изобретению, а
также к вектору, содержащему такую молекулу нуклеиновой кислоты, равно как и к клетке-хозяину, содержащей такой вектор. В дополнение к сказанному, согласно настоящему изобретению также предложен способ приготовления специфического связывающего агента, включающий:
а) трансформацию клетки-хозяина по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей специфический связывающий агент по п.1 формулы изобретения;
б) экспрессию указанной молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине и
в) выделение указанного специфического связывающего агента.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ приготовления антител, включающий:
а) трансформацию клетки-хозяина по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, соответствующее настоящему изобретению;
б) экспрессию указанной молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине и
в) выделение указанного специфического связывающего агента.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих посредством введения терапевтически эффективной дозы специфического
связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению
также предложен способ лечения раковых заболеваний у млекопитающих путём введения терапевтически эффективной дозы специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения
раковых заболеваний у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению.
Следует понимать, что настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям,
содержащим специфический связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению, и фарма-3-
011866
цевтически приемлемое вспомогательное вещество. Указанная фармацевтическая композиция может
содержать антитело, соответствующее настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2 путем введения одного или более специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению. Согласно изобретению также предложен способ модуляции или
ингибирования активности ангиопоэтина-2 путем введения антитела, соответствующего настоящему
изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции сосудистой проницаемости или протекания плазмы у млекопитающих, или того и другого, включающему введение терапевтически эффективной дозы специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению. Изобретение также относится к способу лечения по меньшей мере одного из следующих состояний: неоваскуляризация глаза, тучность, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительное заболевание, воспалительные нарушения, атеросклероз, эндометриоз, неоплазия, заболевание, связанное с костью, или псориаз у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективной дозы специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен способ модуляции сосудистой проницаемости или протекания плазмы у млекопитающего, или того и другого, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению. Изобретение также относится к способу лечения по меньшей мере одного из следующих состояний: неоваскуляризация глаза, тучность, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительное заболевание,
воспалительные нарушения, атеросклероз, эндометриоз, неоплазия, заболевание, связанное с костями,
или псориаз у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению, и химиотерапевтического агента. Специалистам понятно, что
специфический связывающий агент и химиотерапевтический агент не обязательно вводить одновременно.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему
изобретению, и химиотерапевтического агента. Специфический связывающий агент и химиотерапевтический агент не обязательно вводить одновременно.
Согласно настоящему изобретению также предложен специфический связывающий агент, содержащий любой участок, определяющий комплементарность 1, выбранный из:
526 НС (SEQ ID NO: 1); 528 НС (SEQ ID NO: 3); 531 НС (SEQ ID NO: 5); 533 НС (SEQ ID NO: 7);
535 НС (SEQ ID NO: 9); 536 НС (SEQ ID NO: 11); 537 НС (SEQ ID NO: 13); 540 НС (SEQ ID NO: 15);
543 НС (SEQ ID NO: 17); 544 НС (SEQ ID NO: 19); 545 НС (SEQ ID NO: 21); 546 НС (SEQ ID NO: 23);
551 НС (SEQ ID NO: 25); 553 НС (SEQ ID NO: 27); 555 НС (SEQ ID NO: 29); 558 НС (SEQ ID NO: 31);
559 НС (SEQ ID NO: 33); 565 НС (SEQ ID NO: 35); F1-C6 НС (SEQ ID NO: 37); FB1-A7 НС
(SEQ ID NO: 39); FD-B2 НС (SEQ ID NO: 41); FE-B7 НС (SEQ ID NO: 43); FJ-G11 HC (SEQ ID NO: 45);
FK-E3 HC (SEQ ID NO: 47); 20 G1D4 HC (SEQ ID NO: 49); GC1E8 HC (SEQ ID NO: 51); H1C12 HC
(SEQ ID NO: 53); IA1-1E7 HC (SEQ ID NO: 55); IF-1C10 HC (SEQ ID NO: 57); IK-2E2 HC
(SEQ ID NO: 59); IP-2C11 HC (SEQ ID NO: 61); 526 каппа (SEQ ID NO: 2); 536 (THW) каппа
(SEQ ID NO: 12); 536 (LQT) каппа (SEQ ID NO: 210); 543 каппа (SEQ ID NO: 18); 544 каппа
(SEQ ID NO: 20); 551 каппа (SEQ ID NO: 26); 553 каппа (SEQ ID NO: 28); 555 каппа (SEQ ID NO: 30);
558 каппа (SEQ ID NO: 32); 565 каппа (SEQ ID NO: 36); FE-B7 каппа (SEQ ID NO: 44); FJ-G11 каппа
(SEQ ID NO: 46); FK-E3 каппа (SEQ ID NO: 48); IA1-1E7 каппа (SEQ ID NO: 56); IP-2C11 каппа
(SEQ ID NO: 62); 528 лямбда (SEQ ID NO: 4); 531 лямбда (SEQ ID NO: 6); 533 лямбда (SEQ ID NO: 8);
535 лямбда (SEQ ID NO: 10); 537 лямбда (SEQ ID NO: 14); 540 лямбда (SEQ ID NO: 16); 545 лямбда
(SEQ ID NO: 22); 546 лямбда (SEQ ID NO: 24); 559 лямбда (SEQ ID NO: 34); F1-C6 лямбда
(SEQ ID NO: 38); FB1-A7 лямбда (SEQ ID NO: 40); FD-B2 лямбда (SEQ ID NO: 42); G1D4 лямбда
(SEQ ID NO: 50); GC1E8 лямбда (SEQ ID NO: 52); H1C12 лямбда (SEQ ID NO: 54); IF-1C10 лямбда 5
(SEQ ID NO: 58) и IK-2E2 лямбда (SEQ ID NO: 60).
Настоящее изобретение, кроме того, относится к специфическому связывающему агенту, содержащему любой участок, определяющий комплементарность 2, выбранный из:
526 HC (SEQ ID NO: 1); 528 HC (SEQ ID NO: 3); 531 HC (SEQ ID NO: 5); 533 HC (SEQ ID NO: 7);
535 HC (SEQ ID NO: 9); 536 НС (SEQ ID NO: 11); 537 НС (SEQ ID NO: 13); 540 HC (SEQ ID NO: 15);
543 НС (SEQ ID NO: 17); 544 НС (SEQ ID NO: 19); 545 HC (SEQ ID NO: 21); 546 HC (SEQ ID NO: 23);
551 HC (SEQ ID NO: 25); 553 HC (SEQ ID NO: 27); 555 HC (SEQ ID NO: 29); 558 HC (SEQ ID NO: 31);
559 HC (SEQ ID NO: 33); 565 HC (SEQ ID NO: 35); F1-C6 HC (SEQ ID NO: 37); FB1-A7 HC
(SEQ ID NO: 39); FD-B2 HC (SEQ ID NO: 41); FE-B7 HC (SEQ ID NO: 43); FJ-G11 HC (SEQ ID NO: 45);
FK-E3 HC (SEQ ID NO: 47); G1D4 HC (SEQ ID NO: 49); GC1E8 HC (SEQ ID NO: 51); H1C12 HC
-4-
011866
(SEQ ID NO: 53); IA1-1E7 HC (SEQ ID NO: 55); IF-1C10 HC (SEQ ID NO: 57); IK-2E2 HC
(SEQ ID NO: 59); EP-2C11 HC (SEQ ID NO: 61); 526 каппа (SEQ ID NO: 2); 536 (THW) каппа
(SEQ ID NO: 12); 536 (LQT) каппа (SEQ ID NO: 210); 543 каппа (SEQ ID NO: 18); 544 каппа
(SEQ ID NO: 20); 551 каппа (SEQ ID NO: 26); 553 каппа (SEQ ID NO: 28); 555 каппа (SEQ ID NO: 30);
558 каппа (SEQ ID NO: 32); 565 каппа (SEQ ID NO: 36); FE-B7 каппа (SEQ ID NO: 44); FJ-G11 каппа
(SEQ ID NO: 46); FK-E3 каппа (SEQ ID NO: 48); IA1-1E7 каппа (SEQ ID NO: 56); EP-2C11 каппа
(SEQ ID NO: 62); 528 лямбда (SEQ ID NO: 4); 531 лямбда (SEQ ID NO: 6); 533 лямбда (SEQ ID NO: 8);
535 лямбда (SEQ ID NO: 10); 537 лямбда (SEQ ID NO: 14); 540 лямбда (SEQ ID NO: 16); 545 лямбда
(SEQ ID NO: 22); 546 лямбда (SEQ ID NO: 24); 559 лямбда (SEQ ID NO: 34); F1-C6 лямбда
(SEQ ID NO: 38); FB1-A7 лямбда (SEQ ID NO: 40); FD-B2 лямбда (SEQ ID NO: 42); G1D4 лямбда
(SEQ ID NO: 50); GC1E8 лямбда (SEQ ID NO: 52); H1C12 лямбда (SEQ ID NO: 54); IF-1C10 лямбда
(SEQ ID NO: 58) и IK-2Е2 лямбда (SEQ ID NO: 60).
Настоящее изобретение также относится к специфическому связывающему агенту, содержащему
любой участок, определяющий комплементарность 3, выбранный из:
526 НС (SEQ ID NO: 1); 528 НС (SEQ ID NO: 3); 531 НС (SEQ ID NO: 5); 533 HC (SEQ ID NO: 7);
535 HC (SEQ ID NO: 9); 536 HC (SEQ ID NO: 11); 537 HC (SEQ ID NO: 13); 540 HC (SEQ ID NO: 15);
543 HC (SEQ ID NO: 17); 544 HC (SEQ ID NO: 19); 545 HC (SEQ ID NO: 21); 546 HC (SEQ ID NO: 23);
551 HC (SEQ ID NO: 25); 553 HC (SEQ ID NO: 27); 555 HC (SEQ ID NO: 29); 558 HC (SEQ ID NO: 31);
559 HC (SEQ ID NO: 33); 565 HC (SEQ ID NO: 35); F1-C6 HC (SEQ ID NO: 37); FB1-A7 HC
(SEQ ID NO: 39); FD-B2 HC (SEQ ID NO: 41); FE-B7 HC (SEQ ID NO: 43); FJ-G11 HC (SEQ ID NO: 45);
FK-E3 HC (SEQ ID NO: 47); G1D4 HC (SEQ ID NO: 49); GC1E8 HC (SEQ ID NO: 51); H1C12 HC
(SEQ ID NO: 53); IA1-1E7 HC (SEQ ID NO: 55); IF-1C10 HC (SEQ ID NO: 57); EK-2E2 HC
(SEQ ID NO: 59); EP-2C11 HC (SEQ ID NO: 61); 526 каппа (SEQ ID NO: 2); 536 (THW) каппа
(SEQ ID NO: 12); 536 (LQT) каппа (SEQ ID NO: 210) 543 каппа (SEQ ID NO: 18); 544 каппа
(SEQ ID NO: 20); 551 каппа (SEQ ID NO: 26); 553 каппа (SEQ ID NO: 28); 555 каппа (SEQ ID NO: 30);
558 каппа (SEQ ID NO: 32); 565 каппа (SEQ ID NO: 36); FE-B7 каппа (SEQ ID NO: 44); FJ-G11 каппа
(SEQ ID NO: 46); FK-E3 каппа (SEQ ID NO: 48); IA1-1E7 каппа (SEQ ID NO: 56); EP-2C11 каппа
(SEQ ID NO: 62); 528 лямбда (SEQ ID NO: 4); 531 лямбда (SEQ ID NO: 6); 533 лямбда (SEQ ID NO: 8);
535 лямбда (SEQ ID NO: 10); 537 лямбда (SEQ ID NO: 14); 540 лямбда (SEQ ID NO: 16); 545 лямбда
(SEQ ID NO: 22); 546 лямбда (SEQ ID NO: 24); 559 лямбда (SEQ ID NO: 34); F1-C6 лямбда
(SEQ ID NO: 38); FB1-A7 лямбда (SEQ ID NO: 40); FD-B2 лямбда (SEQ ID NO: 42); G1D4 лямбда
(SEQ ID NO: 50); GC1E8 лямбда (SEQ ID NO: 52); H1C12 лямбда (SEQ ID NO: 54); IF-1C10 лямбда
(SEQ ID NO: 58) и IK-2E2 лямбда (SEQ ID NO: 60).
Согласно настоящему изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая специфический связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению.
Кроме того, изобретение относится к способу определения уровня эритропоэтина-2 в биологическом образце путём а) приведения специфического связывающего агента, соответствующего настоящему
изобретению, в контакт с образцом и б) определения уровня связывания специфического связывающего
агента с образцом. Изобретение также относится к способу определения уровня эритропоэтина-2 в биологическом образце путём а) приведения антитела, соответствующего настоящему изобретению, в контакт с образцом и б) определения уровня связывания антитела с образцом.
Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у
млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или
фармацевтической композиции, описанных здесь. Изобретение также относится к способу модуляции
ангиогенеза у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или фармацевтической композиции, как здесь описано. Кроме того, изобретение относится к
способу ингибирования роста опухолей, связанного с нежелательным ангиогенезом, у млекопитающих,
включающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или фармацевтической
композиции, описанных здесь. Также изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или фармацевтической композиции, описанных здесь, и химиотерапевтического агента. В предпочтительном воплощении химиотерапевтический
агент представляет собой по меньшей мере один агент из следующего ряда: 5-FU, СРТ-11 или Таксотер.
Однако понятно, что можно применять также другие химиотерапевтические агенты, а также другие виды
терапии рака.
Понятно, что специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению,
можно применять для лечения множества заболеваний, связанных с нарушением регуляции ангиогенеза
или с нежелательным ангиогенезом. Список этих заболеваний включает без ограничения, такие заболевания, как неоваскуляризация глаза, такая как ретинопатия (включая диабетическую ретинопатию и
старческую макулодегенерацию), псориаз, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительные заболевания, такие как ревматоидные или ревматические воспаления, в особенности артрит (включая ревматоидный артрит), или другие хронические воспалительные расстройства, такие как хроническая
астма, артериальный или посттрансплантационный атеросклероз, эндометриоз и неоплазии, например
-5-
011866
так называемые солидные опухоли и жидкие опухоли (такие как лейкемии). Специалистам в данной области очевидны и другие заболевания, которые можно лечить введением специфических связывающих
агентов. Эти другие заболевания включают, без ограничения, тучность, сосудистую проницаемость, протекание плазмы и заболевания скелета, такие как остеопороз. Таким образом, настоящее изобретение
также относится к способам лечения этих заболеваний, связанных с нарушением регуляции ангиогенеза
или нежелательным ангиогенезом.
Другие воплощения настоящего изобретения станут ясны из приведенного здесь раскрытия.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен график зависимости размера опухоли (ось ординат) от времени (ось абсцисс)
у мышей, которым вводили антитело к Ang-2 (клоны 533, 537 или 544), соответствующее настоящему
изобретению, контрольное антитело или физиологический фосфатно-буферный раствор (PBS - phosphate
buffered saline). Подробности изложены в примерах.
На фиг. 2а-2в представлены данные картирования эпитопов (O.D. 370) для полного человеческого
Ang-2 (hAng-2) полной длины на N-конце hAng-2 и на С-конце hAng-2 соответственно при помощи антигенсвязывающих пептидов TN8-Con-4-C, L1-7-N и 12-9-3-С, соответствующих настоящему изобретению,
а также с помощью контрольных антигенсвязывающих пептидов (пептидных антител) Tie-2Fc, C2B8 или
5В12. Подробности изложены в примерах.
Подробное описание изобретения
Заголовки разделов используются здесь только с целью структурирования текста и ни в коей мере
не ограничивают описанные объекты.
Для получения рекомбинантных молекул ДНК, белков и антител, а также клеточных культур и для
трансформации клеток могут быть использованы общепринятые методы. Ферментативные реакции и
способы очистки, как правило, осуществлялись в соответствии с указаниями производителей или при
помощи принятых в данной области широко распространённых процедур, описанных, например, в руководстве Sambrook и др. (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. - Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. - 1989) или так, как описано здесь. Если не указано специально,
используемая номенклатура, а также лабораторные процедуры и методики из области аналитической
химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, приведённые здесь, хорошо известны и широко применяются в данной области знания. Для химического синтеза, химического
анализа, приготовления лекарственных средств, фармацевтических композиций, а также введения пациентам и лечения пациентов могут применяться стандартные процедуры.
Определения
Используемые в соответствии с настоящим описанием следующие термины, если не указано иначе,
должны пониматься как имеющие следующие значения.
Термин "Ang-2" относится к полипептиду, приведенному на фиг. 6 патента US 6166185
(Tie-2 ligand-2/лиганд-2 рецептора Tie-2), или его фрагментам, а также к родственным полипептидам,
включающим аллельные варианты, варианты сплайсинга, производные, варианты с заменами, делениями
и/или вставками, слитые пептиды или полипептиды и гомологи других видов животных. Полипептид
Ang-2 может включать или не включать дополнительные концевые аминокислотные остатки, например
лидерные последовательности, направляющие последовательности, N-концевой остаток метионина,
N-концевые остатки метионина и лизина и/или дополнительные либо слитые белковые последовательности, в зависимости от способа его получения.
Термин "биологически активный", используемый в отношении Ang-2 или специфического агента,
связывающего Ang-2, относится к пептиду или полипептиду, обладающему хотя бы одной активностью,
характерной для Ang-2 или специфического агента, связывающего Ang-2. Специфический агент, связывающий Ang-2, может обладать агонистической, антагонистической, нейтрализующей или блокирующей
активностью в отношении по меньшей мере одной биологической активности Ang-2.
Термин "специфический связывающий агент" относится к молекуле, предпочтительно к молекуле
белковой природы, которая связывает Ang-2 (а также варианты и производные Ang-2, описанные здесь),
обнаруживая к последнему большее сродство, нежели к прочим ангиопоэтинам. Специфическим связывающим агентом могут быть белок, пептид, нуклеиновая кислота, углевод, липид или низкомолекулярное вещество, которые предпочтительно связываются с Ang-2. В предпочтительном воплощении специфический связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению, представляет собой антитело, такое как поликлональное антитело, моноклональное антитело (mAB - monoclonal antibody), химерное антитело, антитело, конъюгированное с участком, определяющим комплементарность
(CDR - complimentarity determining region), полиспецифическое антитело, биспецифическое антитело,
каталитическое антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, антиидиотипическое антитело, антитела, которые могут быть мечеными в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, варианты или производные, сами по себе или в сочетании с другими аминокислотными последовательностями, получаемые посредством известных методик. Эти методики включают, без ограничения,
ферментативное расщепление, химическое расщепление, синтез пептидов или рекомбинантные методики. Специфические агенты, связывающие Ang-2, соответствующие настоящему изобретению, способны
-6-
011866
связывать области Ang-2, которые модулируют, т.е. ингибируют или стимулируют, биологическую активность Ang-2 и/или другие активности, связанные с Ang-2.
Термин "поликлональное антитело" относится к гетерогенной смеси антител, которые распознают и
связывают различные эпитопы одного и того же антигена. Поликлональные антитела могут быть получены из препаратов неочищенной сыворотки или же могут быть очищены при помощи, например, антигенно-аффинной хроматографии или аффинной хроматографии с белком А/белком G.
Термин "моноклональные антитела" относится к семейству антител, кодируемых одной и той же
молекулой нуклеиновой кислоты, которые могут вырабатываться отдельной гибридомой или другой линией клеток, либо трансгенным млекопитающим, так что каждая молекула моноклонального антитела
обычно распознаёт один и тот же эпитоп на антигене. Термин "моноклональный" не ограничивается каким-либо конкретным способом приготовления антител и, кроме того, не ограничивается антителами,
получаемыми на каком-либо конкретном виде животных, например на мышах, крысах и пр.
Термин "химерные антитела" относится к антителам, в которых какая-либо область тяжёлой и/или
лёгкой цепи тождественна или гомологична соответствующей последовательности антитела, происходящего из какого-либо конкретного вида животных или принадлежащего к какому-либо конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) тождественна или гомологична
соответствующей последовательности в молекуле антитела, происходящего из другого вида или принадлежащего к другому классу или подклассу антител. Сюда же включаются и фрагменты таких антител,
как проявляющие желаемую биологическую активность (т.е. способность специфически связывать
Ang-2) (см. патент US 4816567 и Morrison et al. - Proc. Natl. Acad. Sci. США 1985, 81, 6851-6855).
Термин "антитело, конъюгированное с CDR" относится к антителу, в молекуле которого участок,
определяющий комплементарность (CDR) одного антитела какого-либо конкретного вида либо изотипа
при помощи рекомбинантных методов, вставлен в каркасную область антитела того же или иного вида
либо изотипа.
Термин "полиспецифическое антитело" относится к антителу, обладающему вариабельными областями, распознающими более чем один эпитоп в составе одного или нескольких антигенов. Подклассом
этого типа антител являются "биспецифические антитела", которые распознают два различных эпитопа в
составе одного или нескольких антигенов.
Термин "каталитическое" относится к антителам, где направляющий связывающий агент конъюгирован с одним или более цитотоксическим или, в более общем виде, биологически активным остатком.
Термин "гуманизированное антитело" относится к особому типу антител, конъюгированных с CDR,
где каркасная область антитела происходит из человеческого организма, однако каждый CDR заменен на
CDR другого вида, например CDR мыши. Термин "CDR" определён ниже.
Термин "полностью человеческое" антитело относится к антителу, в котором как CDR, так и каркасная область кодируются одной или несколькими молекулами ДНК человека.
Термин "антиидиотипическое" антитело относится к любому антителу, которое специфически связываются с другим антителом, распознающим антиген. Антиидиотипические антитела могут быть получены любым из описанных здесь способов получения антител, специфических к Ang-2, за исключением
того, что эти антитела получают, например, посредством иммунизации животного антителом, специфическим к Ang-2, или его фрагментом, связывающим Ang-2, а не посредством иммунизации самим полипептидом Ang-2 или его фрагментом.
Термин "варианты" включает полипептиды, в которых имеются вставки, делеции или замены аминокислотных остатков встречающейся в природе (или, по меньшей мере, известной) аминокислотной
последовательности связывающего агента. Этот термин охватывает, в частности, конъюгированные белки, описанные ниже.
Термин "производные" включает связывающие агенты, претерпевшие какие-либо химические модификации, отличные от вставок, делеций или замен.
Термин "специфически связывает Ang-2" относится к способности какого-либо специфического
связывающего агента (такого как антитело или его фрагмент), соответствующего настоящему изобретению, распознавать и связывать зрелый или непроцессированный полипептид Ang-2, или его фрагмент,
или его ортолог, обнаруживая при этом сродство (определяемое, например, при помощи анализа ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ) на сродство или анализа
с помощью системы BIAcore, описанных здесь) либо нейтрализующую способность (определяемую, например, при помощи анализа ELISA на нейтрализацию, описанного здесь, или других подобных анализов), превышающие по меньшей мере в 10 раз, однако в ряде случаев и в 50 раз, в 100, 200, 500 либо даже
в 1000 раз их же сродство, или нейтрализующую способность по отношению к любому другому ангиопоэтину либо иному пептиду или полипептиду.
Термины "антигенсвязывающий домен" или "антигенсвязывающий участок" относятся к области
специфического связывающего агента (такого как молекула антитела), которая содержит аминокислотные остатки этого специфического связывающего агента (или другие структуры), которые взаимодействуют с антигеном и сообщают связывающему агенту специфичность и сродство к антигену. Антигенсвязывающий домен антитела принято называть "участком, определяющим комплементарность"
-7-
011866
(CDR - complementarity determining region).
Термин "эпитоп" относится к области любой молекулы, обладающей способностью быть
распознанной и связанной специфическим связывающим агентом, например антителом, при помощи одного или нескольких антигенсвязывающих участков указанного специфического связывающего агента.
Обыкновенно эпитопы представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул,
таких как, например, аминокислоты или боковые цепи углеводородов, и обладают особыми трёхмерными структурными характеристиками, а также специфическим зарядом. Эпитопы, как их следует понимать здесь, могут быть смежными и не смежными. Кроме того, эпитопы могут быть миметическими, под
которыми следует понимать трёхмерные структуры, идентичные структуре эпитопов, использованных
для выработки антител, однако не содержащие ни одного или содержащие лишь некоторые аминокислотные остатки, входящие в состав Ang-2, использованного для стимуляции иммунного ответа с выработкой антител.
Термин "ингибирующий и/или нейтрализующий эпитоп" обозначает эпитоп, который, будучи связан со специфическим связывающим агентом, таким как антитело, приводит к потере (или, по меньшей
мере, к снижению) биологической активности молекулы, клетки или организма, содержащих такой эпитоп, in vitro, in vivo или in situ. В контексте настоящего изобретения нейтрализующий эпитоп расположен
в биологически активной области Ang-2 либо ассоциирован с ней. В противоположность сказанному под
"активирующим эпитопом" следует понимать эпитоп, который, будучи связан со специфическим связывающим агентом, соответствующим настоящему изобретению, таким как антитело, приводит к активации или, по меньшей мере, к поддержанию биологически активной конформации
Ang-2.
Термин "фрагмент антитела" относится к пептиду или полипептиду, содержащему участок, меньший, чем полная интактная молекула антитела. Полные молекулы антител содержат две функционально
независимые части или фрагмента: антигенсвязывающий фрагмент, известный как Fab (от англ. Fragment antigen binding) и С-концевой кристаллизуемый фрагмент, известный как Fc (от англ. - Fragment
crystallizable). Фрагмент Fab включает первый константный домен как тяжёлой (СН - constant heavy), так
и лёгкой (CL - constant light) цепей (CH1 и CL1) совместно с вариабельными участками обеих названных
цепей, которые связывают специфический антиген. Вариабельные участки как тяжёлой, так и лёгкой цепей содержат по три участка, определяющих комплементарность (CDR), и аминокислотные остатки каркаса, которые разделяют отдельные CDR. Участок Fc содержит второй и третий константные участки
тяжёлой цепи (СН2 и СН3) и вовлечён в эффекторные функции, такие как активация комплемента и атака фагоцитов. В некоторых антителах участки Fab и Fc разделены "шарнирным участком" и в зависимости от того, как полная молекула антитела расщеплена протеолитически, шарнирный участок может
быть связан как с Fab, так и с Fc-фрагментами. Например, при расщеплении антитела протеазой папаином шарнирный участок остаётся связанным с фрагментом Fc, тогда как при расщеплении протеазой
пепсином получается фрагмент, где шарнир остаётся связанным сразу с обоими фрагментами Fab. Поскольку оба Fab фактически оказываются ковалентно связанными в результате расщепления пепсином,
получаемый при этом фрагмент обозначается термином F(ab')2.
Домен Fc может обладать сравнительно долгим периодом полужизни в сыворотке крови, тогда как
Fab является короткоживущим (Capon et al. - Nature, 1989, 337, 525-531). Если же домен Fc экспрессируется как часть слитого белка, это может обеспечивать более долгий период полужизни указанного фрагмента или наделять его такими функциями, как связывание рецептора Fc, связывание белка А, связывание комплемента и, возможно, даже проникновение через плаценту при помощи белка, с которым он
конъюгирован. Участок Fc может представлять собой участок Fc, встречающийся в природе, либо может
быть модифицирован для улучшения некоторых свойств, таких как терапевтические свойства или время
существования в крови.
Термин "вариабельный участок", или "вариабельный домен" относится к области лёгкой и/или тяжёлой цепей молекулы антитела, обычно содержащей приблизительно 120-130 N-концевых аминокислот
тяжёлой цепи и около 100-110 N-концевых аминокислот лёгкой цепи. Обычно вариабельные области
существенно отличаются от аминокислотной последовательности даже среди антител одного и того же
вида. Вариабельная область антител обыкновенно определяет связывание и специфичность каждого конкретного антитела по отношению к специфичному для него антигену. Изменчивость последовательности
сосредоточена в участках, называемых участками, определяющими комплементарность, тогда как более
консервативные участки в составе вариабельных доменов называются каркасными участками. CDR лёгкой и тяжёлой цепей содержат в своём составе аминокислоты, которые в наибольшей степени ответственны за прямое взаимодействие антитела с антигеном, однако аминокислоты каркасного участка могут
существенно влиять на связывание/распознавание антигена, как это обсуждается ниже.
Термин "лёгкая цепь", применяемый по отношению к антителам, одновременно относится к двум
различным типам полипептидных цепей, называемых каппа (κ) или лямбда (λ) на основании полипептидной последовательности константных областей.
-8-
011866
Термин "тяжёлая цепь"", применяемый по отношению к антителам, одновременно относится к пяти
различным типам полипептидных цепей, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, на основании
аминокислотной последовательности константной области тяжёлой цепи. Сочетание тяжёлой и лёгкой
цепей даёт пять известных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно, включая четыре
известных подкласса IgG, обозначаемых как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Термин "встречающийся в природе", применяемый по отношению к биологическим объектам, таким как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к таким биологическим объектам, которые обнаружены в природе и не модифицированы человеком.
Термин "выделенный", употребляемый применительно к Ang-2 или агенту, специфически связывающему Ang-2, относится к соединению, которое не содержит хотя бы от одного из загрязняющих его
полипептидов или соединений, обнаруживающихся в его природном окружении, предпочтительно, по
существу, не содержит никаких других загрязняющих его полипептидов млекопитающих, которые могли
бы помешать его использованию в терапии или диагностике.
Термин "зрелый"", употребляемый применительно к Ang-2, антителам к Ang-2 либо любому другому агенту белковой природы, специфически связывающему Ang-2, относится к пептиду или полипептиду, в котором отсутствует лидерная или сигнальная последовательность. Если связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению, экспрессируется, например, в прокариотической клетке, то "зрелый" пептид или полипептид может содержать и дополнительные аминокислотные остатки (но всё равно
не иметь лидерной последовательности), такие как N-концевой метионин либо один или несколько остатков метионина и лизина. Пептид или полипептид, полученный таким образом, может применяться с
этими дополнительными аминокислотными остатками или без них, которые в таком случае подлежат
удалению.
Термины "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" применительно
к агенту, специфически связывающему Ang-2, относятся к количеству специфического связывающего
агента, которое способствует или необходимо для обеспечения заметного изменения уровня одного или
нескольких видов биологической активности Ang-2. Указанное изменение может состоять в повышении
или понижении уровня активности Ang-2. Предпочтительно указанное изменение состоит в понижении
активности Ang-2.
Специфические связывающие агенты и антитела.
Используемый здесь термин "специфический связывающий агент" относится к молекуле, которая
обладает специфичностью в отношении распознавания и связывания Ang-2, как описано здесь. Приемлемые специфические связывающие агенты включают, без ограничения, антитела и их производные, полипептиды и низкомолекулярные вещества. Приемлемые специфические связывающие агенты могут
быть получены способами, известными в данной области техники. Титичный агент, связывающий полипептид Ang-2, соответствующий настоящему изобретению, способен связывать какую-либо область полипептида Ang-2 и предпочтительно модулировать активность или функцию полипептида Ang-2.
Специфические связывающие агенты, такие как антитела или фрагменты антител, которые специфически связывают полипептиды Ang-2, подпадают в объем настоящего изобретения. Антитела могут
быть поликлональными, в том числе моноспецифическими поликлональными; моноклональными
(mAbs от Monoclonal antibodies), рекомбинантными, химерными, гуманизированными, например
CDR-конъюгированными, человеческими, одноцепочечными, каталитическими, полиспецифическими
и/или биспецифическими, а также их фрагментами, вариантами и/или производными.
Поликлональные антитела к полипепиду Ang-2 обыкновенно получают у животных (например,
кроликах, хомяках, козах, овцах, лошадях, свиньях, крысах, песчанках, морских свинках, мышах или
других подходящих млекопитающих, а также в других видах животных, не принадлежащих к млекопитающим) посредством множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций полипептида Ang-2
или его фрагмента с адъювантом или без него. Такие адьюванты включают, без ограничения, полный или
неполный адъюванты Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, и поверхностноактивные вещества, такие как лизолецитин, многоатомные спирты Плюроник (Pluronic), полианионы,
пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин морского блюдечка и динитрофенол. BCG (bacilli CalmetteGuerin - палочки Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum являются потенциально приемлемыми
адъювантами для человека. Может быть полезно конъюгировать антигенный полипепид с белкомносителем, иммуногенным для иммунизируемого вида животных, таким как гемоцианин морского блюдечка, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор трипсина из соевых бобов. Кроме
того, для усиления иммунного ответа применяются агрегирующие вещества, такие как квасцы. После
иммунизации у животных осуществляют забор крови и в сыворотке крови определяют титр антител к
полипептиду Ang-2, например, так, как описано в разделе "Примеры". Поликлональные антитела могут
использоваться в виде сыворотки, в составе которой они обнаружены, или же могут быть очищены, например, посредством аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным антигеном либо белком А или G.
-9-
011866
Моноклональные антитела к полипептидам Ang-2 могут быть получены в качестве неограничивающего примера традиционным "гибридомным" способом или более новым способом "фаговой экспрессии". Моноклональные антитела, соответствующие настоящему изобретению, могут, например,
быть получены гибридомным способом, как описано в статье Kohler et al. - Nature, 1975, 256, 495;
способом с получением гибридомы из человеческих лимфоцитов В (Kosbor et al. - Immunol. Today, 1983,
4, 72; Cote et al. - Proc. Natl. Acad. Sci. (США), 1983, 80, 2026-2030ZA; Brodeur et al. - в кн.: Monoclonal
Antibody Production: Technique and Application.- Marcel Decker Inc., NY. - 1987. - p. 51-63), и
EBV-гибридомным способом (Cote et al. - в кн.: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. - Alan R. Liss
Inc., NY. - 1985. - p. 77-96). Согласно изобретению также предложены гибридомные клеточные линии,
которые вырабатывают моноклональные антитела, реагирующие с полипептидами Ang-2.
В случае применения гибридомной методики могут быть использованы клеточные линии миеломы.
Такие клеточные линии, применяемые в процедурах слияния клеток для получения гибридом, предпочтительно не производят антител, обладают высокой эффективностью при слиянии клеток и недостатком
ряда ферментов, что делает их не способными расти в некоторых селективных средах, которые поддерживают рост только желательных слитых клеток (гибридом). Для слияния используются, например, такие клеточные линии мышей, как Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4.1, Sp210-Ag14, FO,
NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 b S194/5XX0 Bul; такие клеточные линии крыс, как R210.RCY3,
Y3-Ag 1.2.3, IR983F и 4В210. Другими клеточными линиями, используемыми для слияния клеток, являются U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 и UC729-6. Гибридомы и другие клеточные линии, вырабатывающие моноклональные антитела, рассматриваются как новые композиции, соответствующие настоящему изобретению.
Для получения моноклональных антител ряда видов животных может применяться и метод фаговой
экспрессии. Этот метод предпочтительно используют для получения полностью человеческих моноклональных антител, в которых полинуклеотид, кодирующий одиночный фрагмент Fab или Fv, экспрессирован на поверхности фаговой частицы (Hoogenboom et al. - J. Mol. Biol., 1991, 227, 381; Marks et al. - J.
Mol. Biol., 1991, 222, 581; см. также патент США № 5885793). Каждый фаг может быть подвергнут скринингу с использованием тестов на связывание, описанных здесь, для выявления фрагментов антител,
имеющих сродство к Ang-2. Этот процесс имитирует иммунный отбор посредством экспрессии фрагмента антител на поверхности нитевидного бактериофага с последующим отбором фагов по их связыванию
с Ang-2. Одна из таких процедур описана в международной заявке PCT/US98/17364, поданной от имени
Adams и др., которая описывает выделение высокоаффинных и функциональных агонистических фрагментов антител к рецепторов MPL и msk с применением такого методического подхода. При таком подходе полная библиотека генов человеческих антител может быть создана посредством клонирования
природных комбинаций вариабельных генов из лимфоцитов периферической крови, как это было описано ранее (Mullinax et al. - Proc. Natl. Acad. Sci. (США), 1990, 87, 8095-8099).
После выявления полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют каждую из цепей
полной молекулы моноклональных антител либо фрагментов Fab или Fv, для экспрессии полинуклеотидов моноклональных антител могут быть использованы прокариотические или эукариотические клеткихозяева с применением рекомбинантных методик, хорошо известных и широко применяемых в данной
области техники. В другом случае получают трансгенных животных, где полинуклеотид, кодирующий
требуемый специфический связывающий агент, вводят в геном животного-реципиента, такого как, например, мышь, кролик, коза или корова, способом, позволяющим осуществить экспрессию полинуклеотидных молекул, кодирующих моноклональное антитело или другой специфический связывающий агент.
В соответствии с одним из аспектов полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело или другой
специфический связывающий агент, могут лигировать с регуляторными последовательностями, специфичными для молочной железы, и такие химерные полинуклеотиды могут быть введены в клетки зародышевого пути животного-мишени. Полученное трансгенное животное при этом продуцирует требуемое
антитело с молоком (Pollok et al. - J. Immunol. Meth., 1999, 231, 147-157; Little et al. - Immunol. Today,
2000, 8, 364-370). В дополнение к сказанному, для экспрессии и производства агентов, специфически
связывающих Ang-2, таких как моноклональные антитела, могут использоваться растения посредством
трансфекции подходящих растений полинуклеотидами, кодирующими моноклональные антитела либо
другие специфические связывающие агенты.
В другом воплощении настоящего изобретения моноклональные или поликлональные антитела либо их фрагменты, происходящие не из человеческого организма, могут быть "гуманизированными" или
"химеризованными". Способы гуманизирования нечеловеческих антител хорошо известны в данной области техники (см. патенты США № 5585089 и 5693762). Гуманизирование осуществляют, например,
способами, описанными в литературе (Jones et al. - Nature, 1986, 321, 522-525; Riechmann et al. - Nature,
1988, 332, 323-327; Verhoeyen et al. - Science, 1988, 239, 1534-1536), посредством замещения по меньшей
мере части участков, определяющих комплементарность (CDR), например, грызунов, соответствующими
участками человеческих антител. Согласно настоящему изобретению также предложены варианты и
производные этих человеческих антител, как это обсуждается здесь и известно в области техники.
- 10 -
011866
Настоящее изобретение охватывает также полностью человеческие антитела, которые связывают
полипептиды Ang-2, а также фрагменты, варианты и/или их производные. Такие антитела могут быть
получены способом фаговой экспрессии, описанным выше. В ином варианте для выработки таких антител могут быть использованы трансгенные животные (например, мыши), способные производить спектр
человеческих антител, не вырабатывая собственных антител. Это может быть осуществлено путём иммунизации животного антигеном Ang-2 или его фрагментами с аминокислотной последовательностью,
уникальной для Ang-2. Такие иммуногены, при желании, могут быть конъюгированными с носителем
(см., например, Jakobovits et al. - Proc. Natl. Acad. Sci. (США), 1993, 90, 2551-2555; Jakobovits et al. - Nature, 1993, 362, 255-258; Bruggermann et al. - Year in Immuno, 1993, 7, 33). Согласно одному из способов
таких трансгенных животных получают путём выведения из строя собственных участков генома, кодирующих тяжёлые и лёгкие цепи иммуноглобулинов, и введения участков, кодирующих человеческие
белки тяжёлых и лёгких цепей в этот геном. Частично модифицированных животных, несущих неполный
набор таких изменений генома, далее скрещивают между собой для получения животных, имеющих все
требуемые изменения в иммунной системе. При введении иммуногена такие животные способны вырабатывать антитела с человеческими вариабельными участками, включающими человеческие (а не, например, мышиные) аминокислотные последовательности, иммуноспецифичные по отношению к выбранному антигену (см. международные заявки PCT/US96/05928 и PCT/US93/06926). Дополнительные
способы описаны в патенте US 5545807, международных заявках PCT/US91/245 и PCT/GB89/01207, а
также в патентах ЕР 546073В1 и ЕР 546073А1. Человеческие антитела могут быть также получены посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или путём экспрессии в клетках гибридом, как здесь описано.
Трансгенез осуществляют множеством различных способов (см., например, Bruggeman et al. - Immunol. Today, 1996, 17, 391-397). При одном из подходов минилокус конструируют таким образом, чтобы
участки генов в конфигурации зародышевого пути искусственным образом были сближены друг с другом. Ввиду ограничений по размерам (обычно он содержит менее 30 тыс. пар нуклеотидов) полученный
минилокус будет содержать ограниченное число различных генетических фрагментов, но, тем не менее,
способен вырабатывать широкий спектр антител. Минилокусы, содержащие только последовательности
человеческой ДНК, в том числе промоторы и энхансеры, полностью функциональны в трансгенных мышах.
При желании ввести в трансгенное животное большее количество генетических фрагментов используют искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - yeast artificial chromosomes). Размер таких хромосом варьирует от нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов до миллиона, и вводят их в геном мыши
(или другого подходящего животного) путём микроинъекции прямо в яйцеклетку либо посредством введения YAC в линии эмбриональных стволовых клеток. Обычно искусственные дрожжевые хромосомы
вводят в эмбриональные стволовые клетки путём липофекции очищенной ДНК либо посредством слияния их с дрожжевыми сферопластами, в составе которых очищенная ДНК заключена в мицеллы, при
этом слияние осуществляют способом, напоминающим процедуру слияния гибридомы. Отбор желаемых
эмбриональных стволовых клеток после переноса ДНК осуществляют, включая в состав искусственной
дрожжевой хромосомы любого из селективных маркёров, известных в данной области техники.
В другом варианте используют векторы на основе бактериофага Р1, который размножают в клетках
Е.coli. Поскольку такие векторы обычно несут меньше вставочной ДНК, чем искусственные YAC, клоны
выращивают в больших количествах, достаточных для эффективной микроинъекции в яйцеклетку мыши.
Было показано, что использование смеси различных векторов на основе Р1 приводит к высокому уровню
гомологической рекомбинации.
После выявления подходящей трансгенной мыши (или другого подходящего животного) при помощи любой из известных в данной области техники методик определения уровня обращающихся антител в сыворотке крови (например, твердофазный иммуноферментный анализ) трансгенное животное
скрещивают с мышью, у которой нарушен собственный участок генома, кодирующий иммуноглобулины. В результате получается потомство, у которого все лимфоциты В экспрессируют человеческие антитела.
Как ещё один вариант локус животного, кодирующий иммуноглобулины, полностью замещают аналогичным участком человеческого генома, при этом полученные животные экспрессируют только человеческие антитела. При другом подходе части локуса животного замещают соответствующими частями
человеческого локуса. В некоторых случаях животные, получаемые в итоге такой процедуры, могут экспрессировать химерные антитела, а не полностью человеческие антитела, в зависимости от природы замены в участке генома мыши, кодирующем иммуноглобулины.
Человеческие антитела можно получить и при предъявлении антигена человеческим спленоцитам
(лимфоцитам В и Т) in vitro, после чего эти клетки вводят в селезёнку мыши, у которой нарушена иммунная система, например SCID или nod/SCID (см. Brams et al. - J. Immunol., 1998, 160, 2051-2058;
Carballido et al. - Nat. Med., 2000, 6, 103-106). При одном из подходов имплантация человеческой зародышевой ткани к мыши линии SCID (SCID-hu) приводит к длительному гематопоэзу и развитию человеческих Т-лимфоцитов (McCune et al. - Science, 1998, 241, 1532-1539; Ifversen et al. - Sem. Immuniol., 1996,
8, 243-248). Любой гуморальный иммунный ответ у таких химерных мышей полностью зависит от одно- 11 -
011866
временного развития Т-клеток (Martensson et al. - Immunol., 1994, 83, 1271-1279). При другом подходе
лимфоциты из периферической крови человека внутрибрюшинно (или иным путём) пересаживают мыши
линии SCID (Moiser et al. - Nature, 1988, 335, 256-259). Если пересаживаемые клетки обрабатывают активирующим агентом, таким как энтеротоксин А стафилококка (SEA - Staphylococcal Enterotoxin A)
(Martensson et al. - Immunol., 1995, 84, 224-230) или моноклональными антителами человеческого CD40
(Murphy et al. - Blood, 1995, 86, 1946-1953), то наблюдается более высокий уровень образования
В-клеток.
В другом варианте из неизмененных фрагментов гена V создают набор полностью синтетических
человеческих тяжёлых цепей путём соединения каждого участка VH человека с фрагментами D со случайной последовательностью нуклеотидов и с фрагментом J человека (Hoogenboom et al. - J. Mol. Biol.,
1992, 227, 381-388). Сходным образом, набор лёгких цепей конструируют путём комбинирования каждого человеческого фрагмента V с фрагментом J (Griffits et al. - EMBO J., 1994, 13, 3245-3260). Нуклеотиды,
кодирующие полную молекулу антител (т.е. обе цепи: тяжёлую и лёгкую), сцепляют в одноцепочечный
фрагмент Fv и такой полинуклеотид лигируют с полинуклеотидом, кодирующим малый белок оболочки
нитевидного фага. Когда такой слитый белок экспрессируется на поверхности фага, полинуклеотид, кодирующий специфические антитела, выявляется посредством отбора на иммобилизованном антигене.
Ещё один методический подход состоит в том, что фрагменты антител компонуют в виде двух
фрагментов Fab посредством слияния в одну цепь с белком фага и секреции последнего в периплазму
бактерии (Hoogenboom et al. - Nucl. Acids Res., 1991, 19, 4133-4137; Barbas et al. - Proc. Natl. Acad. Sci.
(США), 1991, 88, 7978-7982).
В больших масштабах получение химерных, гуманизированных, CDR-конъюгированных и полностью человеческих антител или их фрагментов обыкновенно осуществляют рекомбинантными способами. Молекулы полинуклеотидов, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепи каждого из антител, или их фрагментов, могут быть введены в клетки-хозяева и могут вызывать их экспрессию с применением средств и
процедур, описанных здесь. В предпочтительном воплощении продукцию антител осуществляют в клетках-хозяевах млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО - china hamster
ovary). Подробности получения антител таким способом описаны ниже.
Конъюгационные партнёры специфических связывающих агентов.
В другом воплощении настоящего изобретения полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность вариабельных доменов антител к Ang-2, такие как вариабельный участок тяжёлой цепи, с
аминокислотой последовательностью, такой, как описана здесь, или вариабельный участок лёгкой цепи,
с аминокислотой последовательностью, такой, как описана здесь, могут быть конъюгированы либо с
N-концом, либо с С-концом одного или более доменов участка Fc человеческого IgG. В конструкции, где
он содержится вместе с терапевтическим белком, таким как Fab или антитело, специфичное к Ang-2, домен Fc может сообщать ей больший период полураспада или придавать такие функции, как связывание
рецептора Fc, связывание белка А, связывание комплемента, а возможно, и проницаемость через плацентарный барьер. (Capon et al. - Nature, 1989, 37, 525-531).
В одном из примеров шарнирная область антител, участок СН2 и участок СН3 могут быть конъюгированы с N-концом либо с С-концом полипептидных молекул специфических связывающих агентов,
таких как Fab или Fv, специфичных к Ang-2 (полученные, например, из библиотеки фаговой экспрессии)
способами, известными специалисту в области техники. Полученный слитый белок может быть очищен
аффинной хроматографией на колонке с иммобилизованным белком А или белком G. Обнаружено, что
пептиды и белки, конъюгированные с участком Fc, обладали значительно большим периодом полураспада in vivo, чем их неконъюгированные эквиваленты. К тому же конъюгация с участком Fc даёт возможность димеризации/мультимеризации слитого полипептида. Участок Fc может быть природным участком Fc или же может быть модифицирован для улучшения некоторых свойств, таких как терапевтические свойства, время обращения в кровеносном русле, для уменьшения проблемы агрегации и т.д. Другие примеры, известные в области техники, включают такие, в которых участок Fc, человеческий или
другого вида животных, или же синтетический, конъюгирует с N-концом CD30L для лечения болезни
Ходжкина, анапластической лимфомы или Т-клеточной лейкемии (патент US 5480981); участок Fc
конъюгирует с рецептором ФНО (фактора некроза опухоли) для лечения септического шока (Fisher et al.,
N Eng. J. Med, 334: 1697-1702 (1996)) или же участок Fc конъюгирует с рецептором Cd4 для лечения
СПИД (Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)).
Каталитические антитела являются другим типом конъюгатов и представляют собой антитела, в составе которых одна или несколько цитотоксических или, в более общем виде, биологически активных
субъединиц прикреплены к специфическому связывающему агенту (см., например, Rader et al., Chem.
Eur. J. 12: 2091-2095 (2000)). Цитотоксические агенты такого типа повышают цитотоксичность, опосредуемую антителами, и включают такие фрагменты, как цитокины, напрямую или опосредованно вызывающие гибель клеток, радиоизотопы, химиотерапевтические лекарства (в том числе пролекарства), бактериальные токсины (например, эндотоксин псевдомонады, дифтерийный токсин и т.п.), растительные
яды (например, рицин, гелонин и т.п.), химические конъюгаты (например, майтансиноидный токсин,
калехемицин и т.п.), радиоконъюгаты, конъюгаты ферментов (конъюгаты РНКазы, фермент- 12 -
011866
ная/пролекарственная терапия, направляемая антителами (ADEPT - antibody directed ferment/prodrug therapy), и т.п. В одном из аспектов цитотоксический агент может быть "прикреплен" к одному из компонентов биспецифических или полиспецифических антител посредством связывания такого агента с одним из
альтернативных антигенраспознающих участков таких антител. В ином варианте цитотоксины белковой
природы могут экспрессироваться как слитые белки со специфическим связывающим агентом после лигирования полинуклеотида, кодирующего токсин, с полинуклеотидом, кодирующим связывающий агент.
Ещё в одном варианте специфический связывающий агент может быть ковалентно модифицирован для
включения требуемого цитотоксина.
Примерами таких слитых белков являются иммуногенные полипептиды, белки с длительным периодом полураспада в кровяном русле, такие как константные области иммуноглобулинов, белки-метки,
белки или полипептиды, облегчающие очистку требуемого специфического связывающего полипептидного агента, и полипептидные последовательности, способствующие образованию мультимерных белков
(такие как мотивы "лейциновая застёжка", способствующие образованию и устойчивости димеров).
Этот тип инсерции обыкновенно подразумевает связывание целой нативной молекулы или значительной её части с целым вторым полипептидом или его частью. Например, слитые белки часто содержат лидерные последовательности других видов животных для обеспечения рекомбинантной экспрессии
белка в гетерологичном хозяине. Другой полезный вариант слитых белков включает в себя дополнительный иммунологически активный домен, такой как эпитоп антитела, для облегчения очистки слитого белка. Включение участка расщепления в участке конъюгации или рядом с ним позволит удалить чужеродный белок после очистки. Другие полезные варианты конъюгации включают связывание с функциональными доменами, такими как активные участки ферментов, участки гликозилирования, сигнальные группировки для клеток-мишеней или трансмембранные области.
Различные системы экспрессии конъюгированных белков, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, поступают в продажу. Особенно пригодные системы включают, без ограничения,
систему глутатион-S-трансферазы (GST) (Pharmacia), систему с белком, связывающим мальтозу (NEB,
Beverley, MA), систему FLAG 5 (IBI, New Haven, CT) и систему 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Эти системы способны производить рекомбинантные полипептиды с очень небольшим количеством дополнительных аминокислот, где последние практически не влияют на антигенные свойства рекомбинантного
полипептида. Например, и система FLAG, и система 6xHis добавляют лишь короткие последовательности, обе из которых слабо антигенны и не оказывают неблгоприятного влияния на укладку полипептида
в нативную конформацию. Другой перспективный вариант N-концевой конъюгации представляет собой
конъюгацию дипептида метионин-лизин к N-концу белка или пептида. Это может благоприятно влиять
на экспрессию или активность белка.
Особенно полезной конъюгационной конструкцией может являться такая, в которой пептид специфического связывающего агента объединён с гаптеном для усиления иммуногенности такой конструкции, что полезно, например, для получения антиидиотипических антител, соответствующих настоящему
изобретению. Такие слитые конструкции с увеличенной иммуногенностью хорошо знакомы специалистам, например конъюгация специфического связывающего агента с антигеном-помощником, таким как
hsp70, или пептидные последовательности, например, из дифтерийного токсина, или цитокины, например интерлейкин-2, будет полезной для стимуляции иммунного ответа. В ином варианте осуществления
может быть создана слитая конструкция, которая способствовала бы направленному воздействию специфического связывающего агента на какой-либо орган или тип клеток.
Предложены также и другие слитые конструкции, включающие гетерологичные полипептиды с
требуемыми свойствами, например константный участок иммуноглобулина для продления периода полужизни в крови или антитело или его фрагмент для обеспечения направленности действия. В других
системах конъюгации получают гибридные полипептиды, где требуется отщепить от нужного полипептида конъюгированный с ним другой полипептид. В одном из вариантов осуществления полипептид,
подлежащий удалению, соединён с рекомбинантным специфическим связывающим агентом полипептидной последовательностью, содержащей специфический участок, распознаваемый протеазой. Примерами подходящих последовательностей могут служить последовательности, распознаваемые протеазой
вируса табачной мозаики (Life Technologies, Gaithersburg, MD) или фактором Xa (New England Biolabs,
Beverley, MA).
Согласно настоящему изобретению предложены также слитые белки, содержащие вариабельный
домен антитела к Ang-2 или его фрагмент, например вариабельный участок тяжёлой цепи с аминокислотной последовательностью, описанной здесь, или вариабельный участок лёгкой цепи с аминокислотной последовательностью, описанной здесь, в сочетании с усечённым тканевым фактором (tTF - truncated
tissue factor), агент сосудистой направленности, представляющий собой усечённую форму человеческого
белка-индуктора коагуляции, действующего как опухолевый агент, вызывающий коагуляцию крови в
сосудах. Конъюгация tTF с антителами к Ang-2 или их фрагментами может облегчить доставку специфического связывающего агента к клеткам-мишеням.
- 13 -
011866
Варианты специфических связывающих агентов.
Варианты специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, представляют собой варианты с вставками, делециями и/или заменами. В одном из аспектов настоящего изобретения предложены варианты со вставками, где один или несколько аминокислотных остатков дополняют аминокислотную последовательность специфического связывающего агента. Вставки могут быть
расположены как на одном из концов белка или на обоих сразу, так и во внутренних областях аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Варианты со вставками дополнительных аминокислотных остатков на одном из концов белка или на обоих сразу могут представлять собой,
например, конъюгированные белки либо белки, содержащие аминокислотные хвосты или метки. Варианты со вставками включают в себя и полипептиды специфических связывающих агентов, где к аминокислотной последовательности специфического связывающего агента или его фрагмента добавлены один
или несколько аминокислотных остатков.
Вариантами продуктов, соответствующих настоящему изобретению, также являются зрелые продукты на основе специфических связывающих агентов. У таких продуктов удалена лидерная или сигнальная последовательности, однако конечный продукт всё же содержит дополнительные аминокислотные остатки на N-конце по сравнению с полипепидом Ang-2 дикого типа. Дополнительные N-концевые
остатки могут происходить из другого белка либо могут представлять собой один или несколько аминокислотных остатков, которые не могут быть идентифицированы как производные ни одного из известных белков. Также изобретением предложены продукты на основе специфических связывающих агентов,
несущие дополнительный остаток метионина в положении -1 (Мет-1-специфический связывающий
агент), а также продукты на основе специфических связывающих агентов с дополнительными остатками
метионина и лизина в положениях -2 и -1 (Мет-2-Лиз-1-специфический связывающий агент). Варианты
специфических связывающих агентов, несущих дополнительные остатки Мет, Мет-Лиз, Лиз (либо один
или несколько основных остатков вообще), полезны, в частности, для повышения выработки рекомбинантого белка в бактериальных клетках-хозяевах.
Настоящим изобретением охватываются также варианты специфических связывающих агентов с
дополнительными аминокислотными остатками, добавленными в результате использования особых систем экспрессии. Например, при использовании имеющихся в продаже векторов, которые экспрессируют
нужный белок в виде конъюгата с глутатион-S-трансферазой (GST - glutathione-S-transferase), получается
требуемый полипептид с дополнительным остатком глицина в положении -1 после отщепления GST от
конечного продукта. Также предложены варианты, являющиеся результатом экспрессии в других векторных системах, в том числе с полигистидиновым хвостом, включённым в аминокислотную последовательность, обычно на С- или N-конце последовательности.
Варианты со вставками подразумевают и слитые белки, описанные выше, в которых N- и/или
С-конец полипептидной последовательности специфического связывающего агента конъюгирован с другим полипептидом, его фрагментом или последовательностями, которые не могут быть идентифицированы как часть последовательности какого-либо известного белка.
В другом аспекте настоящего изобретения предложены варианты с делециями, в которых один или
более аминокислотных остатков удалены из аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Делеции могут быть осуществлены на одном или на обоих концах аминокислотной
последовательности полипептида специфического связывающего агент, либо при удалении одного или
нескольких аминокислотных остатков внутри аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Варианты с делециями необходимым образом включают все фрагменты аминокислотной последовательности специфического связывающего агента.
Фрагменты антител включают такие части молекулы антитела, которые связываются с эпитопом
или полипептидным антигеном. Примерами таких фрагментов могут служить Fab или F(ab')2, полученные, например, при ферментативном или химическом расщеплении полной молекулы антитела. Другими
связывающими фрагментами являются, например, те, что получены рекомбинантным способом, таким
как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую
вариабельные области антител.
Настоящее изобретение охватывает также полипептидные фрагменты агента, связывающего Ang-2,
которые сохраняют свойство специфически связывать полипептид Ang-2. При этом подразумеваются
фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более последовательно
расположенных аминокислот пептида или полипептида, соответствующего настоящему изобретению.
Предпочтительные полипептидные фрагменты проявляют исключительные или специфические иммунологические свойства, характерные для антигенсвязывающего агента, соответствующего настоящему изобретению. Фрагменты, соответствующие настоящему изобретению, обладающие нужными иммунологическими свойствами, могут быть получены любым из способов, хорошо известных и широко применяемых в данной области техники.
Ещё в одном аспекте изобретения предложены варианты специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, с заменами.
- 14 -
011866
Варианты с заменами обыкновенно рассматриваются как "сходные" с исходным полипептидом или
как имеющие определённый "процент идентичности" с исходным полипептидом и включают полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков были удалены и замещены другими остатками. В одном аспекте природные замены являются консервативными, однако настоящее изобретение
охватывает и неконсервативные замены.
Идентичность или сходство соответствующих полипептидов могут быть рассчитаны известными
способами. В качестве неограничивающего примера некоторые из таких способов описаны в книгах:
Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of
Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence
Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov,
M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991) и Carillo et al., SIAMJ. Applied Math., 48:
1073 (1988).
Предпочтительные способы определения соответствия или процента идентичности двух полипептидов разработаны так, что обеспечивают возможно более широкое сличение исследуемых последовательностей. Способы определения идентичности представлены в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программы определения идентичности между двумя последовательностями включают, без ограничения, программный пакет GCG, содержащий GAP (Devereux et
al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI,
BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)). Программа BLASTX
общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) и других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD
20894; Altschul et al., supra (1990)). Широко известный алгоритм Смита-Ватермана также может использоваться для определения идентичности.
Некоторые схемы выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут приводить к
сличению лишь короткой области обеих последовательностей, и в такой малой выравненной области
может выявляться очень высокая степень тождественности, даже если не существует значительного родства между двумя полными последовательностями. Соответственно, в некоторых осуществлениях выбранный способ выравнивания (программа GAP) приведёт к выравниванию, которое охватывает по
меньшей мере 10% полной длины полипептида, подлежащего сравнению, т.е. по меньшей мере 40 сопряжённых аминокислотных остатков, если сравниваются последовательности длиной по меньшей мере
в 400 аминокислот, 30 сопряжённых аминокислотных остатков, если сравниваются последовательности
длиной по меньшей мере от 300 до приблизительно 400 аминокислот; по меньшей мере 20 сопряжённых
аминокислотных остатков, если сравниваются последовательности длиной от 200 до приблизительно 300
аминокислот, и по меньшей мере 10 сопряжённых аминокислотных остатков, если сравниваются последовательности длиной приблизительно от 100 до 200 аминокислот.
Например, при использовании компьютерного алгоритма GAP (Genetics Computer Group, University
of Wisconsin, Madison, WI) два полипептида, для которых нужно определить процент идентичности последовательности, выравниваются по наибольшему совпадению соответствующих аминокислот ("участки соответствия"). В некоторых вариантах осуществления в сочетании с названным применяются алгоритмы начисления штрафа за наличие пропуска (обычно рассчитываемого как 3Х средняя диагональ;
средняя диагональ - это среднее диагонали используемой матрицы сравнения; диагональ - это доля или
количество, определённые для каждого точного совпадения аминокислот частной матрицей сравнения),
штрафа за ширину пропуска (составляющего обычно 1/10 от количества баллов за наличие пропуска), а
также матрицы сравнения, такие как РАМ 250 или BLOSUM 62. В некоторых воплощениях в этом алгоритме используется и стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and
Structure, 5(3), (1978) - для матрицы сравнения РАМ 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. США, 89:
10915-10919 (1992) - для матрицы сравнения BLOSUM 62).
В некоторых воплощениях параметры сравнения полипептидных последовательностей включают
следующее:
алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970);
матрица сравнения: BLOSUM 62, из Henikoff et al., см. выше (1992);
штраф за наличие пропуска: 12;
штраф за ширину пропуска: 4;
порог сходства: 0.
Программа GAP может быть пригодной при использовании вышеприведённых параметров. В некоторых воплощениях вышеуказанные параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения
полипептидов (без штрафов за пропуски на концах) при помощи алгоритма GAP.
- 15 -
011866
В некоторых воплощениях параметры сравнения последовательностей молекул полинуклеотидов
включают следующее:
алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970);
матрица сравнения: совпадения = +10, несовпадение = 0;
штраф за наличие пропуска: 50;
штраф за ширину пропуска: 3.
Программа GAP может быть также пригодной и при использовании других параметров. Вышеприведённые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения полинуклеотидных молекул.
Могут применяться и другие стандартные алгоритмы, такие как штрафы за наличие пропуска,
штрафы за ширину пропуска, матрицы сравнения, порог сходства и т.п., в том числе изложенные в руководстве Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997. Выбор той или иной программы
не представит затруднений для специалистов в области техники и будет зависеть от особенностей задач
сравнения, т.е. сравнивается ли ДНК с ДНК, белок с белком, белок с ДНК; а также от того, сравниваются
ли пары последовательностей (в этом случае обыкновенно предпочитают GAP или BestFit) или же отдельная последовательность с целой базой данных о последовательностях (в этом случае предпочтительны FASTA или BLASTA).
При использовании здесь 20 обычных аминокислот и их общепринятые сокращения применяются,
как обычно (см. Immunology - A Synthesis. - 2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates,
Sunderland, Mass. 10 (1991)), издание включено сюда путем ссылки для любой цели.
Аминокислоты могут быть представлены в стереоконфигурации L или D (за исключением глицина,
который не имеет L- и D-изомеров), и полипептиды, а также их сочетания, соответствующие настоящему
изобретению, могут представлять собой сочетания стереоизомеров. Однако L-изомеры являются предпочтительными. Изобретением предусматриваются также реверсивные молекулы, у которых последовательность аминокислот от N- до С-конца обращена. Например, по отношению к молекуле с обычной последовательностью Х1-Х2-Х3 реверсивной является молекула Х3-Х2-Х1. Предусмотрены настоящим изобретением и ретрореверсивные молекулы, в которых последовательность аминокислот обращена, как
значится выше, и аминокислотные остатки, которые обычно являются L-энантиомерами, заменены
D-стереоизомерами.
Приемлемыми составляющими полипептидов, соответствующих настоящему изобретению, могут
являться также стереоизомеры (например, D-аминокислоты) всех 20 обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α-, α-двузамещённые аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная
кислота и другие нестандартные аминокислоты. Примеры нестандартных аминокислот включают, без
ограничения, аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, бета-аминопропионовую кислоту, аминомасляную кислоту, пиперидиновую кислоту, аминокаприловую кислоту, аминогептановую кислоту, аминоизомасляную кислоту, аминопимелиновую кислоту, диаминомасляную кислоту, десмозин, диаминопимелиновую кислоту, диаминопропионовую кислоту, N-этилглицин, N-этиласпарагин, оксилизин, аллооксилизин, оксипролин, изодесмозин, аллоизолейцин, N-метилглицин, саркозин, N-метилизолейцин,
N-метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин, 4-оксипролин, гамма-карбоксиглутамат, ε-N,N,Nтриметиллизин, ε-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин,
σ-N-метиларгинин и прочие подобные аминокислоты и аминокислоты (например, 4-оксипролин).
Сходным образом, если не указано иначе, левый конец однонитевой полинуклеотидной последовательности представляет собой 5'-конец; направление влево на двунитевой полинуклеотидной последовательности представляет собой направление в сторону 5'-конца. Направление 5'-3' при удлинении нативной РНК при транскрипции называется здесь направлением транскрипции; последовательности областей
ДНК, совпадающие с последовательностью РНК, у которых 5'-конец совпадает с 5'-концом транскрибируемой РНК, называется "последовательностями, расположенными выше", последовательности же областей ДНК, совпадающие с РНК, в которых 3'-конец совпадает с 3'-концом транскрибированной РНК,
называем "последовательностями, расположенными ниже".
Среди консервативных аминокислотных замен могут иметь место не встречающиеся в природе
аминокислотные остатки, которые характерны для пептидов, синтезированных химически, в отличие от
пептидов, синтезируемых в биологических системах. Среди них пептидомиметики и другие реверсивные
или инверсивные формы аминокислотных остатков.
Встречающиеся в природе аминокислотные остатки можно разделить на классы по химическим
свойствам 20 боковых цепей:
1) гидрофобные: Мет, Ала, Вал, Лей, Иле;
2) нейтральные гидрофильные: Цис, Сер, Тре, Асн, Глн;
3) кислые: Асп, Глу;
4) основные: Гис, Лиз, Арг;
5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Гли, Про; и
6) ароматические: Три, Тир, Фен.
- 16 -
011866
При неконсервативных заменах может, например, иметь место замещение члена одного из этих
классов на член другого класса. Такие аминокислотные замены можно осуществить в участках человеческих антител, гомологичных участкам антител иного происхождения, либо в негомологичных областях
молекулы.
При осуществлении таких замен, в соответствии с некоторыми вариантами их осуществления, может быть оценен гидропатический показатель аминокислот. Каждой аминокислоте присвоен гидропатический показатель на основе характеристик гидрофобности и заряда. Эти показатели таковы: Иле (+4.5);
Вал (+4.2); Лей (+3.8); Фен (+2.8); Цис/цистин (+2.5); Мет (+1.9); Ала (+1.8); Гли (-0.4); Тре (-0.7);
Сер (-0.8); Трп (-0.9); Тир (-1.3); Про (-1.6); Гис (-3.2); Глу (-3.5); Глн (-3.5); Асп (-3.5); Асн (-3.5); Лиз
(-3.9); Арг (-4.5).
Важность гидропатического показателя аминокислот для придания белку интерактивной биологической функции хорошо понятна в данной области техники (Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982)).
Известно, что некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами с близким гидропатическим показателем, и при этом будет сохраняться сходная биологическая активность. В некоторых воплощениях при внесении изменений на основе гидропатического показателя осуществляют замены аминокислот, гидропатические показатели которых находятся в пределах ±2, в некоторых воплощениях они находятся в пределах ±1 и в некоторых воплощениях они находятся в пределах ±0,5.
Понятно в данной области техники и то, что замена аминокислот может осуществляться на основании их гидрофобности, в частности, тогда, когда создаваемый при этом биологически функциональный
белок или пептид предназначен для применения в воплощениях, относящихся к иммунологии, как в данном случае. В некоторых воплощениях наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, определяющаяся гидрофильностью смежных аминокислот, коррелирует с иммуногенностью и антигенностью,
т.е. с биологическими свойствами данного белка.
Аминокислотным остаткам присвоены следующие значения гидрофильности: Арг (+3.0); Лиз
(+3.0); Асп (+3.0±1); Глу (+3.0±1); Сер (+0.3); Асн (+0.2); Глн (+0.2); Гли (0); Тре (-0.4); Про (-0.5±1);
Ала (-0.5); Гис (-0.5); Цис (-1.0); Мет (-1.3); Вал (-1.5); Лей (-1.8); Иле (-1.8); Тир (-2.3); Фен (-2.5);
Трп (-3.4). В некоторых воплощениях при внесении изменений на основе близких величин гидрофильности осуществляют замены аминокислот, гидропатические показатели которых находятся в пределах ±2, в
некоторых воплощениях они находятся в пределах ±1 и в некоторых воплощениях они находятся в пределах ±0,5. На основе гидрофобности можно также выявить эпитопы в первичной аминокислотной последовательности. Эти участки также обозначаются как "участки сердцевины эпитопа".
Примеры замен аминокислот приведены в табл. 1.
Таблица 1
Аминокислотные замены
- 17 -
011866
Специалист в данной области способен определить приемлемые варианты полипептида в соответствии с приведёнными здесь описаниями и хорошо известными методиками. В некоторых воплощениях
специалист может выявить подходящие области белковой молекулы, которые можно изменить, не нарушая активности, нацеливая изменения на участки, которые предположительно не влияют на активность.
В некоторых воплощениях можно определить остатки и области молекулы, которые являются консервативными среди родственных полипептидов. В некоторых воплощениях даже те области, которые могут
быть важны для биологической активности или структуры, могут быть подвергнуты консервативным
аминокислотным заменам без нарушения биологической активности или без неблагоприятного влияния
на структуру полипептида.
Кроме того, специалист в данной области может просмотреть структурно-функциональные исследования, где выявляются остатки в сходных полипептидах, которые являются важными для активности
или структуры. На основании такого сравнения можно предсказать важность тех аминокислотных остатков в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, важным для активности или структуры
сходных белков. Специалист может сделать выбор в пользу химически сходных аминокислотных замен
для аминокислотных остатков, предсказанных, таким образом, как важные.
Специалист в данной области может также проанализировать трёхмерную структуру и аминокислотную последовательность в сравнении с такой же структурой сходных полипептидов. На основании
полученных сведений специалист может предсказать расположение аминокислотных остатков в молекуле антител в соответствии с её трёхмерной структурой. В ряде случаев специалист может отказаться от
радикальных изменений аминокислотных остатков, для которых предсказано, что они расположены на
поверхности белка, поскольку такие остатки могут участвовать в важных взаимодействиях с другими
молекулами. Кроме того, специалист может разработать тестовые варианты, содержащие по одной аминокислотной замене на каждый из желательных аминокислотных остатков. Далее варианты могут быть
подвергнуты скринингу при помощи тестов на активность, известных специалистам. Такие варианты
можно использовать для сбора сведений о приемлемых вариантах. Например, если обнаружено, что та
или иная аминокислотная замена приводит к нарушению, нежелательному уменьшению активности или
к неприемлемой активности, далее можно избегать вариантов с такой заменой. Иными словами, на основании сведений, полученных в результате таких рутинных экспериментов, специалист может успешно
выявить аминокислотные остатки, которые не следует заменять, сами ли по себе или в сочетании с другими мутациями.
Предсказанию вторичной структуры посвящено множество научных публикаций (см. Moult J., Curr.
Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47: 45-148 (1978); Chou et al.,
Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 и Chou et al., Biophys. 1, 26: 367-384 (1979)).
Кроме того, в настоящее время доступны компьютерные программы, помогающие в предсказании
вторичной структуры. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на гомологическом
моделировании. Например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность аминокислотных
последовательностей более 30% или сходство более 40%, часто имеют сходную структурную топологию.
В последнее время рост базы данных о структурах белков способствует лучшему предсказанию вторичной структуры, в ряде случаев включая возможность предсказания третичной структуры полипептида
или белка (см. Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999)). Высказано мнение (Brenner et al., Curr.
Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)), что существует ограниченное количество вариантов укладки данного полипептида или белка и что после того, как будет установлено некоторое пороговое количество
структур, структурные предсказания станут значительно точнее.
- 18 -
011866
Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают "протягивание" (Jones, D.,
Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-19 (1996)), "профильный анализ"
(Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov et
al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987)) и "эволюционное сцепление" (Holm, см. выше (1999), и
Brenner, см. выше (1997)).
В некоторых воплощениях варианты антител включают гликозилированные варианты, в которых
число и/или тип участков гликозилирования изменены по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного полипептида. В некоторых случаях варианты белков содержат большее или меньшее
количество участков N-гликозилирования, чем нативный белок. Для участка N-гликозилирования характерна последовательность Асн-Х-Сер или Асн-Х-Тре, где аминокислотный остаток, обозначенный как X,
может быть любым, кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания такой последовательности приводит к образованию нового потенциального сайта для добавления N-связанной углеводной цепи. Напротив, замены, которые удаляют такую последовательность, приводят к удалению существующей N-связанной углеводной цепи. Предусматривается и перестановка N-связанных углеводных цепей, при которой один или несколько сайтов N-гликозилирования (обычно существующих в природе)
удаляются и создаётся один или несколько новых участков N-гликозилирования. Другие предпочтительные антитела включают цистеиновые варианты, в которых один или несколько остатков цистеина удалены либо заменены другими аминокислотами (например, серином), по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью. Цистеиновые варианты могут быть полезны, когда необходимо изменить
конформацию антител с получением биологически активной конформации, например после удаления
нерастворимых молекул включения. Обыкновенно цистеиновые варианты содержат меньше остатков
цистеина, нежели исходный белок, и обычно чётное их число для сведения к минимуму взаимодействий,
обусловленных неспаренными остатками цистеина.
В некоторых воплощениях аминокислотные замены представляют собой такие, которые:
(1) уменьшают подверженность протеолизу;
(2) уменьшают подверженность окислению;
(3) изменяют сродство связывания для формирования белковых комплексов;
(4) изменяют сродство в отношении связывания различных молекул и/или
(5) видоизменяют другие свойства таких полипептидов или придают им новые.
В ряде случаев одиночные или множественные аминокислотные замены (в частности, консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны в аминокислотной последовательности, встречающейся в природе (в частности, в той части полипептида, которая расположена вне доменов, участвующих в
межмолекулярных контактах).
В некоторых случаях консервативные аминокислотные замены обычно не могут существенно изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не
должна способствовать разрушению спирали, имеющейся в исходной молекуле, или нарушению других
типов вторичной структуры, характерных для исходной последовательности). Примеры известных в области техники вторичной и третичной структур полипептидов описаны в кн.: Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein
Structure (C. Branden and J. Tooze, eds. Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) и в статье Thornton et at.
Nature 354: 105 (1991).
В молекулах специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению,
которые являются вариантами полипептидов или пептидов с заменами, приблизительно до 10-12% исходной аминокислотной последовательности может быть заменено. В вариантах антител тяжёлая цепь
может содержать 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26,
25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещённую аминокислоту, тогда как лёгкая цепь может содержать 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8,
7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещённую аминокислоту.
Производные специфических связывающих агентов.
Согласно изобретению также предложены производные полипептидных молекул специфических
связывающих агентов. Производные включают полипептиды специфических связывающих агентов, несущие иные модификации, нежели вставки, делеции или замены аминокислотных остатков. Предпочтительно модификации являются ковалентными по своей природе и включают, например, химическую
связь с полимерами, липидами и другими органическими и неорганическими молекулами. Производные,
соответствующие настоящему изобретению, могут быть получены для повышения периода полужизни
специфического связывающего агента в кровяном русле или же могут иметь цель - улучшение направленности действия полипептида в отношении тех или иных клеток, тканей или органов.
Кроме того, настоящее изобретение охватывает производные связывающих агентов, ковалентно
модифицированных включением одной или нескольких водорастворимых группировок, таких как полиэтиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, как описано в патентах
US № 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. Другие подходящие полимеры, известные
специалистам, включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие полимеры на
- 19 -
011866
основе углеводов, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, кополимер окиси пропилена и окиси этилена, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и
поливиниловый спирт, а также смеси названных полимеров. Особо предпочтительны производные специфического связывающего агента, ковалентно модифицированные субъединицами полиэтиленгликоля
(ПЭГ). Водорастворимые полимеры могут быть прикреплены в особых положениях, например на
N-конце специфического связывающего агента, либо случайным образом связаны с одним или несколькими боковыми радикалами полипептида. Применение ПЭГ для улучшения терапевтических свойств
специфического связывающего агента, в частности гуманизированных антител, описано в патенте
US 6133429 (Gonzales et al.), выданного 17.10.2000.
Сайты-мишени для мутагенеза антител.
Для манипулирования специфическими свойствами антител к Ang-2, такими как сродство антител к
их мишени, могут применяться различные стратегии. Эти стратегии включают сайтспецифический или
случайный мутагенез полинуклеотидной молекулы, кодирующей антитело, для создания вариантов антител с последующим скринингом для выявления вариантов антител, проявляющих изменение свойств в
нужную сторону, например повышение или снижение сродства.
Аминокислотные остатки, на которые чаще всего направлены стратегии мутагенеза, представляют
собой остатки внутри CDR. Как описано выше, в этих областях содержатся остатки, которые непосредственным образом взаимодействуют с Ang-2, и другие аминокислотные остатки, влияющие на пространственное расположение первых. Тем не менее, было показано, что аминокислотные остатки каркасных
участков вариабельных доменов за CDR также вносят значительный вклад в антигенсвязывающие свойства антител и на них также могут быть нацелены действия по манипуляции этими свойствами (см.
Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9: 395-402 (1999) и ссылки в этой статье).
Меньшие по объёму и библиотеки вариантов антител, которые можно более эффективно подвергать
скринингу, можно получить путём сосредоточения случайного или сайтнаправленного мутагенеза в
CDR, соответствующих областям, подверженным "гипермутациям" в процессе соматического созревания
сродства антител (см. Chowdhury and Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) и ссылки в этой статье).
Различные типы элементов ДНК, о которых известно, что они определяют такие участки гипермутаций,
включают такие, как обращенные повторы, некоторые консенсусные последовательности, вторичные
структуры и палиндромы. Консенсусные последовательности ДНК включают, в частности, четырёхнуклеотидные последовательности пурин-Г-пиримидин-А/Т (т.е А или Г-Г-Ц или Т-А или Т) или сериновый
кодон АГY (где Y может представлять собой Ц или Т).
Таким образом, одно из воплощений настоящего изобретения включает мутагенные стратегии с целью повышения сродства антител к их мишени. Эти стратегии состоят, в частности, в мутагенезе всей
вариабельной области тяжёлой и лёгкой цепей, мутагенезе только внутри CDR, мутагенезе в консенсусных участках гипермутаций в составе участков, определяющих комплементарность; мутагенезе в несущих областях или в любом сочетании этих подходов ("мутагенез" в этом контексте может быть случайным или сайтспецифическим).
Окончательное разграничение CDR и выявление аминокислотных остатков, составляющих участок
связывания антител, могут быть выполнены посредством определения структуры такой молекулы антител и комплекса антиген-антитело способами, известными специалистам, такими как рентгеновская кристаллография. Различные методы, основанные на анализе и характеризации такой кристаллической
структуры антитела, известны специалистам и могут применяться, не являясь, однако, окончательными
для приблизительного выявления CDR. Примерами таких широко применяемых методов являются, в
частности, методы Kabat, Clothia, AbM и определение контактов.
Методика определения Kabat основана на изменчивости последовательности и является наиболее
широко применяемой методикой предсказания участков CDR (Johnson, Wu, Nucleic Acids Res, 28: 214-8
(2000)). Способ Clothia основан на выявлении расположения областей структурных петель (Chothia et al.,
J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)). Способ AbM является компромиссным между способами Кабат и Клотии. Этот способ интегрирован в программы моделирования
структуры антител, выпускаемые Оксфордской молекулярной группой (Oxford Molecular Group (Martin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (США), 86: 9268-9272 (1989))); Rees et al., ABM™, a computer program for modeling variable regions of antibodies, Oxford, Великобритания; Oxford Molecular, Ltd.). Комплект AbM моделирует третичную структуру антител, исходя из первичной последовательности, при помощи сочетания
баз данных и методов ab initio. Недавно был создан ещё один способ, известный как определение контактов (MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5: 732-45 (1996)). Этот способ основан на анализе доступных кристаллических структур комплексов.
CDR тяжёлых цепей условно обозначены как H1, H2 и Н3, будучи пронумерованными последовательно от N-конца к С-концу. Аналогичные области лёгких цепей условно обозначены как L1, L2 и L3,
будучи пронумерованными последовательно от N-конца к С-концу.
CDR-H1 имеет длину от 10 до 12 аминокислотных остатков и обыкновенно начинается через 4 остатка после Цис согласно определению способами Clothia и AbM или обычно через 5 остатков после Цис
согласно определению способом Kabat. После H1 обычно следует Трп, чаще всего Трп-Вал, но также и
- 20 -
011866
Трп-Иле и Трп-Ала. Длина H1 составляет около 10-12 остатков в соответствии с определением по способу AbM, тогда как определение по способу Clothia исключает последние 4 остатка.
CDR-H2 обычно начинается на расстоянии 15 аминокислотных остатков от конца H1 согласно
определению по способам Kabat и AbM. Предшествует Н2 обыкновенно последовательность
Лей-Глу-Трп-Иле-Гли, но существует и множество вариаций. После Н2 обычно следует последовательность Лиз/Арг-Лей/Иле/Вал1/Фен/Тре/Ала-Тре/Сер/Иле/Ала. При определении длины Н2 способом Kabat она составляет от 16 до 19 аминокислотных остатков, тогда как способ AbM обычно предсказывает
длину в 9-12 остатков.
CDR-H3 начинается обычно на расстоянии 33 аминокислотных остатков от Н2, и ей обыкновенно
предшествует аминокислотная последовательность Цис-Ала-Арг. После Н3 обычно следует Гли. Длина
Н3 может составлять от 3 до 25 остатков.
CDR-L1 обычно начинается примерно на расстоянии 24 остатков и обычно следует за Цис. Аминокислотный остаток, следующий за L1, всегда является Трп и обычно начинает последовательность
Трп-Тир-Глн, Трп-Лей-Глн, Трп-Фен-Глн или Трп-Тир-Лей. Длина L1 приблизительно 10-17 аминокислотных остатков. Штрафной CDR-L1 для антител, соответствующих настоящему изобретению, в точности следует этому правилу, и за Цис следуют 15 аминокислотных остатков и далее Трп-Тир-Глн.
CDR-L2 начинается примерно на расстоянии 16 остатков после конца L1. За ней обычно следуют
Иле-Тир, Вал-Тир, Иле-Лиз или Иле-Фен. Длина этой области около 7 остатков.
CDR-L3 обычно начинается на расстоянии 33 аминокислотных остатков после конца L2 и обычно
следует за Цис. После L3 обычно следует последовательность Фен-Гли-ХХХ-Гли. Длина L3 составляет
примерно 7-11 аминокислотных остатков.
Были описаны различные способы модифицирования антител. Так, патент US 5530101 (Queen et al.,
от 25.06.1996) описывает способы получения гуманизированных антител, в которых каркас гуманизированного вариабельного участка тяжёлых цепей на 65-95% идентичен последовательности донорного каркаса вариабельных участков тяжёлых цепей. Каждая гуманизированная тяжёлая цепь иммуноглобулина
обычно содержит, кроме CDR, аминокислоты донорного иммуноглобулинового каркаса, которые, например, способны взаимодействовать с CDR, влияя на сродство связывания; имеются в виду, например,
одна или несколько аминокислот, непосредственно примыкающих к CDR в донорном иммуноглобулине,
или аминокислоты, расположенные на расстоянии до 3 ангстрем от такой области в соответствии с предсказанием на основе молекулярного моделирования. И тяжёлые, и лёгкие цепи могут быть сконструированы с использованием одного или всех возможных позиционных критериев. Будучи скомбинированными с интактным антителом, гуманизированные области иммуноглобулинов в значительной степени неиммуногенны в человеческом организме и сохраняют практически то же сродство, что и донорный иммуноглобулин, к антигену, такому как белок или другое соединение, содержащее эпитоп (см. также соответствующие способы в патенте US 5693761 (Queen et al., от 02.12.1997) "Polynucleotides encoding improved humanized immunoglobulins"; патенте США № 5585089 (Queen et al., от 17.12.1996) "Humanized
immunoglobulins").
В одном из примеров (патент US 5565332 (Hoogenboom et al. от 15.10.1996) "Production of chimeric
antibodies - a combinatorial approach") описаны способы получения антител и их фрагментов, которые
обладают сходной специфичностью связывания с исходными антителами, но в которых увеличены человеческие характеристики. Гуманизированные антитела получают путём перетасовки цепей, используя,
например, технологию фаговой экспрессии, и полипептид, содержащий вариабельные домены тяжёлой и
лёгкой цепей нечеловеческих антител, специфичных к интересующему антигену, комбинируют с набором вариабельных доменов комплементарной (лёгкой или тяжёлой) человеческой цепи. Затем выявляют
гибриды, специфичные к интересующему антигену, и человеческие цепи в составе отобранных гибридов
комбинируют с набором человеческих комплементарных вариабельных доменов лёгкой или тяжёлой
цепи. В другом воплощении компонент CDR из нечеловеческих антител комбинировали с набором компонентов CDR человеческих антител. Из полученной при этом библиотеки полипептидных иммуноглобулиновых димеров отбирали гибриды и использовали их на второй стадии перетасовки цепей при гуманизации. В других случаях, если гибрид уже обладал достаточными человеческими характеристиками
для терапевтического использования, вторую стадию опускали. Способы модификации антител для повышения их человеческих характеристик описаны и в других работах (см. Winter, FEBS Letts, 430: 92-92
(1998)).
В качестве другого примера приводится патент US 6054297 (Carter et al., от 25.04.2000), который
описывает способ получения гуманизированных антител путём замены аминокислотной последовательности CDR аминокислотной последовательностью соответствующего человеческого CDR и/или замены
аминокислотной последовательности каркасного участка соответствующей аминокислотной последовательностью человеческого каркасного участка.
В качестве еще одного примера приводится патент US 5766886 (Studnicka et al., от 16.06.98) "Modified antibody variable domains", описывающий способы выявления аминокислотных остатков в вариабельном домене антител, которые могут быть модифицированными без снижения нативного сродства
антигенсвязывающего домена, но при этом со снижением иммуногенности таких антител в отношении
- 21 -
011866
гетерологичных видов, а также способы получения таких модифицированных вариабельных доменов
антител, которые приемлемы для назначения введения видам (см. также патент US 5869619 (Studnicka et
al.) от 09.02.1999).
Как уже обсуждалось, модификации антител любым из методов, известных в данной области техники, обыкновенно направлены на повышение сродства связывания с антигеном и/или снижение иммуногенности антител в организме-реципиенте. Так, при одном из подходов гуманизированные антитела
модифицируют посредством удаления участков гликозилирования с целью повышения сродства антител
к их основному антигену (Co et al., Mol. Immunol. 30: 1361-1367 (1993)). С помощью таких методик, как
"реструктурирование", "гиперхимеризация" и "модификация поверхности/восстановление поверхности",
получают гуманизированные антитела с повышенным терапевтическим потенциалом (Vaswami et al.,
Annals of Allergy, Asthma&Immunol. 81: 105 (1998); Roguska et al., Prot Engineer, 9: 895-904 (1996); см.
также патент США № 6072035 (Hardman et al.) от 06.06.2000, где описаны способы восстановления реструктурирования антител). Хотя такие методики снижают иммуногенность антител, сокращая число чужеродных аминокислотных остатков, они не предотвращают антиидиотипического и антиаллотипического иммунного ответа при повторном введении таких антител. В литературе описаны и альтернативы
этим способам снижения иммуногенности (Gilliland et al., J. Immunol. 62(6): 3663-71 (1999)).
Во многих случаях при гуманизации антител снижается антигенсвязывающая способность. Поэтому желательно бывает провести "обратную мутацию" в гуманизированных антителах посредством введения в них одного или нескольких аминокислотных остатков, наличествующих в исходных антителах
(чаще всего, в антителах грызунов), для того, чтобы постараться восстановить исходное сродство таких
антител (см., например, Saldanha et al., Mol. Immunol. 36: 709-19 (1999)).
Непептидные аналоги специфических связывающих агентов/белковые миметики.
Также предложены непептидные аналоги специфических связывающих агентов, которые проявляют более стабильную структуру и пониженную биодеградацию. Аналоги, проявляющие свойства пептидных специфических связывающих агентов, могут быть получены посредством замены одного или
нескольких аминокислотных остатков непептидными субъединицами. Предпочтительно непептидные
субъединицы позволяют пептиду сохранить его природную конформацию или стабилизировать предпочтительную, например биоактивную, конформацию с сохранением способности распознавать и связывать
Ang-2. В одном из аспектов получаемый при этом аналог/миметик проявляет повышенную аффинность
связывания по отношению к Ang-2. Один из примеров способов получения непептидных миметических
аналогов из пептидов специфических связывающих агентов описан Нахманом и др. (Nachman et al.,
Regul. Pept. 57: 359-370 (1995)). При желании, пептиды специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, могут быть модифицированы, например посредством гликозилирования, амидирования, карбоксилирования или фосфорилироания либо посредством превращения кислотных группировок в соли, амиды, сложные эфиры, в частности С-концевые сложные эфиры; а также образования N-ацилпроизводных пептидов, соответствующих настоящему изобретению. Пептиды специфических связывающих агентов могут также быть модифицированы путём получения пептидных производных посредством образования ковалентных или нековалентных комплексов с другими субъединицами. Ковалентно-связанные комплексы можно получить, присоединив химические группировки к функциональным группам или боковым радикалам аминокислот специфического связывающего агента либо к
его N- или С-концам.
В частности, известно, что пептиды специфических связывающих агентов могут быть конъюгированы с репортерной группой, включающей, без ограничения, радиоактивную метку, флуоресцентную
метку, фермент (например, катализирующий реакцию, поддающуюся флуориметрическому или колориметрическому анализу), субстратотвёрдый матрикс или носитель (например, авидин или биотин). Соответственно, согласно изобретению предложена молекула, включающая молекулу антитела и предпочтительно дополнительно содержащая репортёрную группу, выбранную из радиоактивной метки, флуоресцентной метки, фермента, субстрата, твёрдого матрикса или носителя. Такие метки хорошо известны
специалистам, в частности особенно распространены биотиновые метки. Применение таких меток хорошо известно специалистам и описано, например, в патентах US 3817837, 3850752, 3996345 и 4277437.
Другие приемлемые метки включают, без ограничения, радиоактивные, флуоресцентные и хемолюминесцентные метки. Применение таких меток описано, например, в патентах US 3817837, 3850752,
3939350 и 3996345. Любой из пептидов, соответствующих настоящему изобретению, может содержать
одну, две или несколько любых из названных меток.
Способы получения специфических связывающих агентов.
Специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению и являющиеся
белками, могут быть получены путём химического синтеза в растворе или на твёрдом носителе в соответствии с общепринятыми способами. В настоящее время для твёрдофазного синтеза небольших пептидов часто может применяться химическое линирование с целью получения полипептидов полной длины.
В продаже имеются различные автоматические синтезаторы, которые могут использоваться в соответствии с известными протоколами (см., например, Stewart, Young. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed.,
Pierce Chemical Co., (1984); Tarn et al., J. Am. Chem. Soc., 105: 6442, (1983); Merrifield, Science, 232: 341- 22 -
011866
347 (1986); Barany, Merrifield. The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284;
Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1987) и патент US 5424398), каждый из которых
включен сюда путем ссылки.
В твердофазных способах синтеза пептидов применяют сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий 0,1-1,0 ммоль аминогрупп на 1 г полимера. В этих способах пептидного синтеза применяют
защиту альфа-аминогрупп трет-бутилоксикарбонилом (т-БОК) или 9-фторметилоксикарбонилом
(ФМОК). Оба способа включают постадийный синтез, при котором на каждой стадии добавляется одиночная аминокислота, начиная от С-конца пептида (см. Coligan et al., Current Protocols in Immunology,
Wiley Interscience, 1991, Unit 9). По завершении химического синтеза с синтетического пептида могут
снимать защиту, т.е. удалять т-БОК или ФМОК, отщеплять его от полимера путём обработки кислотой
при пониженной температуре (например, жидкий HF - 10% анизол примерно от 0,25 до примерно 1 ч при
0°С). После отгонки реагентов пептиды специфического связывающего агента отделяют от полимера
1%-ным раствором уксусной кислоты, которую затем отгоняют при пониженном давлении с получением
неочищенного продукта, который обычно может быть очищен такими способами, как гель-фильтрация
на Сефадексе (Sephadex) G-15 с применением 5%-ной уксусной кислоты в качестве растворителя. Лиофилизация соответствующих фракций, собранных с колонки, даёт гомогеный пептид специфического
связывающего агента или его производные, которые могут быть далее подвергнуты анализу при помощи
таких стандартных процедур, как аминокислотный анализ, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, ультрафиолетовая спектроскопия, определение молярного вращения
и растворимости и расщепление по Эдману с количественной оценкой на твёрдой фазе.
При химическом синтезе антител к Ang-2, их производных, вариантов и фрагментов, а также других
агентов пептидной природы, связывающих Ang-2, возможно включение в состав агента аминокислот, не
встречающихся в природе.
Способы на основе рекомбинантных ДНК также приемлемы для получения антител полной длины
и широкого набора других специфических связывающих агентов белковой природы, соответствующих
настоящему изобретению, или их фрагментов. Молекулу кДНК, кодирующую антитело или его фрагмент, могут вставлять в вектор для экспрессии, который, в свою очередь, могут вводить в клетку-хозяина
для выработки антитела или его фрагмента. Разумеется, кДНК, кодирующая такие антитела, может быть
модифицирована и отличаться от "исходной" кДНК (транслированной с мРНК) с целью исключения нежелательных кодонов или, наоборот, включения предпочтительного кодона для экспрессии в различных
клетках-хозяевах.
Обычно молекулу ДНК, кодирующую антитела, можно получить при помощи процедур, описанных
в разделе "Примеры". При необходимости получить молекулы Fab или CDR, родственные исходной молекуле антител, могут осуществлять скрининг подходящей библиотеки (библиотеки фаговой экспрессии,
библиотеки лимфоцитов и т.п.) при помощи стандартных процедур, чтобы выявить и клонировать соответствующие Fab или CDR. Зонды, применяемые для такого скрининга, могут кодировать антитела полной длины или быть усеченными Fab-зондами, кодирующими субъединицу Fab исходных антител, либо
иными подходящими зондами. Если в качестве зондов применяют фрагменты ДНК, типичными условиями гибридизации являются описанные Ausubel и др. (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular
Biology, Current Protocols Press (1994)).
После гибридизации обработанный зондом блот может быть отмыт в условиях подходящей жёсткости, зависящих от таких факторов, как размер зонда, ожидаемая гомология пробы с клоном, типа библиотеки, подвергаемой скринингу, и количества клонов, подвергаемых скринингу. Примерами скрининга
высокой точности могут служить 0,1X буфер SSC (хорид натрия + цитрат натрия) и 0,1% SDS (додецилсульфат натрия) при температуре 50-65°С.
Для включения и экспрессии полинуклеотидных молекул, кодирующих полипептиды специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, могут применять разнообразные системы вектор/хозяин. Эти системы включают, без ограничения, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным вектором для экспрессии ДНК на основе бактериофагов,
плазмид или космид; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные
системы насекомых, инфицированные векторами для экспрессии на основе вирусов (например, бакуловирусов); растительные клеточные системы, трансфицированные векторами для экспрессии на основе
вирусов (например, вирусов мозаики цветной капусты (CaMV), вирусов табачной мозаики (TMV)), или
трансформированные бактериальными экспрессионными векторами (например, плазмидами Ti или
pBR322); клеточные системы животных.
Клетки млекопитающих, которые также применимы для получения рекомбинантного
белка -специфического связывающего агента, включают, без ограничения, клетки VERO, HeLa, линии
клеток яичника китайского хомячка (СНО), клетки COS (такие как COS-7), W138, BHK, HepG2, 3Т3,
RIN, MDCK, A549, РС12, K562 и 293, а также гибридомные клеточные линии, описанные здесь. Клетки
млекопитающих предпочтительны для получения таких специфических связывающих агентов, например
антител и их фрагментов, которые обычно гликозилированы и требуют корректной укладки для проявления активности. Предпочтительными клетками млекопитающих являются, в частности, СНО, гибри- 23 -
011866
домы и миелоидные клетки.
Ниже приведены для примера некоторые протоколы для рекомбинантной экспрессии белков - специфических связывающих агентов.
Термин "экспрессионный вектор", или "вектор для экспрессии", относится к плазмиде, фагу, вирусу
или вектору, используемому для экспрессии полипептида исходя из последовательности ДНК (РНК).
Экспрессионный вектор может содержать транскрипционный модуль, включающий:
1) генетический элемент или элементы, играющие регуляторную роль в экспрессии генов, например
промоторы или энхансеры;
2) последовательность, кодирующую связывающий агент, который транскрибируется в виде мРНК
и транслируется в виде белка; и
3) подходящие последовательности, инициирующие и терминирующие транскрипцию.
Структурные модули, предназначенные для применения в дрожжевых или других эукариотических
экспрессионных системах, предпочтительно включают лидерную последовательность, способствующую
секреции транслированного белка клеткой-хозяином. В противном случае, если рекомбинантный специфический связывающий агент экспрессируется без лидирующей последовательности, он может содержать на N-конце остаток метионина. Этот остаток может быть затем отщеплён от экспрессированного
рекомбинантного белка с получением конечного продукта - специфического связывающего агента - или
не подвергаться отщеплению.
В частности, в дрожжах специфический связывающий агент может быть рекомбинантно экспрессирован с помощью систем, поступающих в продажу, например с помощью системы экспрессии Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), в соответствии с инструкциями производителя. Эта система также использует
последовательности Про-Про-альфа для прямой секреции, но транскрипция вставки направляется промотором алкогольоксидазы, индуцируемым метанолом.
Секретированный пептид специфического связывающего агента очищают от среды для роста
дрожжей, например, с помощью способов, применяемых для очистки пептида из надосадочной жидкости
клеток бактерий или млекопитающих.
Кроме того, кДНК, кодирующую пептид специфического связывающего агента, могут клонировать
в экспрессионном векторе pVL1393 на основе бакуловируса (PharMingen, San Diego, CA). Вектор могут
использовать в соответствии с инструкциями производителя для инфицирования клеток Spodoptera
frugiperda в безбелковой среде sF9 для получения рекомбинантного белка. Специфический связывающий
агент могут очищать и концентрировать из среды с помощью колонки с гепарин-сефарозой (Pharmacia).
Кроме того, можно осуществлять экспрессию в системе клеток насекомых. Системы клеток насекомых для экспрессии белков хорошо известны специалистам. В одной из таких систем в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или Trichoplusia larvae применяют
вирус полиэдроза ядер Autographa californica (AcNPV). Последовательность, кодирующая специфический связывающий агент, может быть клонирована в маловажной области вируса, такой как ген полиэдрина, и помещена под контроль промотора гена полиэдрина. Удачная вставка полинуклеотида специфического связывающего агента делает ген полиэдрина неактивным и приводит к образованию рекомбинантного вируса, лишённого белка оболочки. Рекомбинантный вирус можно применять для инфицирования клеток S.frugiperda или Trichoplusia larvae, в которых и будет экспрессироваться требуемый полипептид (Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (США), 91: 3224-7
(1994)).
В другом примере последовательность ДНК, кодирующую специфический связывающий агент, могут амплифицировать при помощи ПЦР и клонировать в подходящем векторе, например pGEX-3X
(Pharmacia). Этот вектор разработан для получения конъюгированного белка, состоящего из глутатион-Sтрансферазы (GST), кодируемой вектором, и специфического связывающего агента, кодируемого фрагментом ДНК, вставленным в участок клонирования в составе вектора. Праймеры для ПЦР могут быть
сконструированы так, чтобы содержать подходящий сайт рестрикции. Если фрагмент, конъюгированный
со специфическим связывающим агентом, применяют только для облегчения экспрессии или наличие его
в качестве дополнительного фрагмента интересующего полипептида нежелательно по каким-либо другим причинам, рекомбинантный специфический связывающий агент могут отщеплять от области GST
белкового конъюгата. Полипептидной конструкцией pGEX-3Х/специфический связывающий агент
трансформируют клетки Е.coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA), индивидуальные трансформанты выделяют и выращивают. Плазмидная ДНК из индивидуальных трансформантов может быть очищена и
частично секвенирована при помощи автоматического секвенатора для подтверждения присутствия требуемой вставки нуклеотидной последовательности, кодирующей специфический связывающий агент, в
правильном положении.
Экспрессия полинуклеотидов, кодирующих антитела к Ang-2 и их фрагменты при помощи рекомбинантных систем, описанных выше, может приводить к выработке антител и их фрагментов, которые
следует подвергнуть "рефолдингу" (чтобы должным образом создать дисульфидные мостики) для достижения биологической активности. Типичные процедуры рефолдинга таких антител изложены в разделе "Примеры", а также в нижеследующем разделе.
- 24 -
011866
Специфические связывающие агенты, полученные в бактериях, могут вырабатываться в виде нерастворимых включений в бактериальной клетке, и их могут очищать следующим образом. Клеткихозяева можно убить центрифугированием, промыть раствором 0,15 М NaCl, 10 мМ, Трис, рН 8, 1 мМ
ЭДТА и обработать лизоцимом в концентрации 0,1 мг/мл (Sigma, St. Louis, МО) в течение 15 мин при
комнатной температуре. Лизат можно осветлить обработкой ультразвуком и осадить обрывки клеток
центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g. Осадок, содержащий специфический связывающий
агент, можно ресуспендировать в растворе 50 мМ, Трис, рН 8, 10 мМ ЭДТА, наслоить на 50%-ный глицерин и центрифугировать 30 мин при 6000 g. Осадок далее можно ресуспендировать в стандартном физиологическом фосфатно-буферном растворе (PBS), свободном от Са++ и Mg++. Затем специфический
связывающий агент можно очищать фракционированием ресуспендированного осадка в денатурирующем полиакриламидном геле, содержащем SDS (Sambrook et al., см. выше). Гель можно вымачивать в
0,4 М KCl для визуализации белка, который можно вырезать и элюировать электрофоретически в электродном буфере без SDS. Если требуемый белок, конъюгированный с GST, был получен в бактериях, его
далее можно очистить при помощи модуля очистки от GST (GST Purification Module, Pharmacia).
Системы на основе клеток-хозяев из млекопитающих для экспрессии рекомбинантных белков хорошо известны специалистам. Штаммы клеток-хозяев можно отобрать по особой способности к специфическому ограниченному посттрансляционному протеолизу и к формированию посттрансляционных
модификаций, которые могут быть полезны для обеспечения активности белка. Такими модификациями,
в частности, являются ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование, ацилирование и др.
В различных клетках-хозяевах, таких как СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38, а также гибридомные клеточные линии и т.п., протекают различные внутриклеточные процессы и имеются различные характерные механизмы такой посттрансляционной активности, поэтому следует делать правильный выбор для
обеспечения требуемых модификаций и требуемого ограниченного протеолиза введённого в них чужеродного белка.
Для выявления клеток, трансформированных для выработки рекомбинантного белка, может быть
использовано множество селективных систем. Такими селективными системами, в частности, являются
гены тимидинкиназы вируса простого герпеса, гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы в клетках tk, hgprt или aprt соответственно. Антиметаболитная устойчивость
также может лежать в основе отбора на дигидрофолатредуктазу (ДГФР), которая сообщает устойчивость
к метотрексату; глутамат-пируваттрансаминазу (gpt), которая обеспечивает устойчивость к микофеноловой кислоте; neo, который обеспечивает устойчивость к аминогликозиду G418 и хлорсульфурону; и
hygro, который сообщает устойчивость к гигромицину. Другими селективными генами, которые могут
оказаться полезными, являются trpB, позволяющий клеткам использовать индол вместо триптофана, или
hisD, позволяющий клеткам использовать гистинол вместо гистидина. Маркёры, которые позволяют зрительно выявить наличие трансформации, включают антоцианины, бета-глюкуронидазу и её субстрат
(GUS), а также люциферазу и её субстрат люциферин.
Очистка и рефолдинг специфических связывающих агентов.
В некоторых случаях специфический связывающий агент, полученный при помощи вышеописанных процедур, следует подвергнуть "рефолдингу" и окислить с образованием правильной третичной
структуры с образованием дисульфидных связей для достижения биологической активности. Восстановление третичной структуры можно осуществлять при помощи различных процедур, хорошо известных в
данной области техники. Среди таких способов, например, - обработка растворённого полипептидного
агента хаотропным агентом в среде с рН больше 7. Выбор хаотропа здесь сходен с выбором хаотропа при
солюбилизации нерастворимых включений в клетках бактерий, однако здесь хаотроп обычно применяют
в меньшей концентрации. К примеру, таким хаотропным агентом является гуанидин. В большинстве
случаев раствор для рефолдинга/окисления содержит также восстановитель совместно с его окисленной
формой в особом соотношении для создания необходимого окислительно-восстановительного потенциала, позволяющего реаранжировку дисульфидных связей для образования цистеиновых мостиков.
Вот некоторые широко применяемые окислительно-восстановительные пары: цистеин/цистамин,
глутатион/дитио-бис-глутатион, хлористая медь, дитиотреитол (ДТТ)/дитиан (ДТТ) и 2-меркаптоэтанол
(2-МЭ)/дитио-2-МЭ. Во многих случаях для повышения эффективности восстановления третичной
структуры используются сорастворители. Среди широко применяемых сорастворителей - глицерин, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы и аргинин.
Весьма желательно получить белки специфических связывающих агентов или их варианты, соответствующие настоящему изобретению, в чистом виде. Методики очистки белков хорошо знакомы специалистам. Эти методики состоят, на первом уровне, в грубом фракционировании полипептидных и неполипептидных фракций. После отделения полипепида специфического связывающего агента от других
белков интересующий полипептид можно дополнительно очищать при помощи хроматографических или
электрофоретических методик для достижения частичной или полной очистки (или очистки до гомогенности). Аналитическими методами, особенно подходящими для получения чистого полипептида сецифического связывающего агента, являются ионообменная хроматография, гель-проникающая хромато- 25 -
011866
графия, электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирование. Особенно эффективным методом очистки пептидов является жидкостная экспресс-хроматография белков или же высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
Некоторые аспекты настоящего изобретения касаются очистки, а в некоторых воплощениях и, по
существу, полной очистки кодируемого белка или пептида специфического связывающего агента. Термин "очищенный белок или пептид специфического связывающего агента", как он употребляется здесь,
относится к смеси, которую можно отделить от других составляющих и в которой белок или пептид специфического связывающего агента очищен в любой степени по отношению к тому виду, в котором он
доступен в природе. Очищенный специфический связывающий агент, следовательно, имеет также отношение к специфическому связывающему агенту - белку или пептиду, - свободному от окружения, в котором он может встречаться в природе.
Обычно термин "очищенный" относится к смеси, содержащей специфический связывающий агент,
которая была подвергнута фракционированию для удаления различных других составляющих, такая
смесь в значительной степени сохраняет исходную биологическую активность. При применении термина
"по существу, очищенный" подразумевают композицию, содержащую специфический связывающий
агент, в которой специфический связывающий агент - белок или пептид - представляет собой главную
составную часть композиции, например около 50, около 60, около 70, около 80, около 90, около 95% или
более по отношению к другим белкам композиции.
Различные способы оценки степени очистки специфического связывающего агента окажутся известными специалистам в свете настоящего раскрытия. Среди них, например, определение специфической связывающей активности активной фракции или определение количества полипептидов специфического связывающего агента в той или иной фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле
в присутствии SDS. Предпочтительным способом определения чистоты фракции, содержащей специфический связывающий агент, является расчёт связывающей активности фракции в сравнении со связывающей активостью первоначального экстракта, и таким образом определяется степень очистки, которая
обозначается, как "кратный номер очистки". Конкретные единицы, применяемые для представления величины связывающей активности, будут, разумеется, зависеть от конкретной методики анализа, выбранной после очистки, а также от того, проявляет ли экспрессированный полипептид специфического связывающего агента обнаружимую связывающую активность или нет.
Различные процедуры, применимые для очистки полипептида специфического связывающего
агента, окажутся известны специалистам. Среди них, например, осаждение сульфатом аммония,
полиэтиленгликолем, антителами (иммунопреципитация) и т.п. или же тепловая денатурация с последующим центрифугированием, хроматографические стадии, такие как аффинная хроматография (например, на сефарозе с иммобилизованным белком А), ионообменная, обратно-фазная, хроматография на
гидроксиапатите и аффинная хроматография; изоэлектрофокусирование, гель-электрофорез и сочетания
этих и других методик. Как хорошо известно в данной области техники, полагают, что порядок проведения различных стадий очистки может быть изменён либо некоторые стадии могут быть опущены и тем
не менее способ будет приемлем для приготовления, по существу, очищенного специфического связывающего агента.
Не во всех случаях специфический связывающий агент должен быть представлен в особенно чистом виде. В самом деле, в некоторых случаях могут найти применение специфические связывающие
агенты меньшей степени очистки. Частичную очистку можно осуществить меньшим числом стадий очистки или при использовании различных форм той же общей схемы очистки. Например, отметим, что при
использовании для катионообменной хроматографии системы ВЭЖХ достигается более высокая степень
очистки, чем при хроматографии низкого давления. Способы с более низкой степенью относительной
очистки могут иметь преимущества при восстановлении белковой структуры специфического связывающего агента или для поддержания связывающей активности экспрессирующегося белка специфического связывающего агента.
Известно, что подвижность полипептида может варьировать, иногда значительно, при различных
условиях электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (Capaldi et al., Biochem Biophys
Res. Comm., 76: 425 (1977)). Следовательно, следует обратить внимание на то, что при различных условиях электрофореза определяемая молекулярная масса очищенных или частично очищенных рекомбинантных специфических связывающих агентов может изменяться.
Анализы связывания.
В иммунологических анализах связывания применяют захватывающие агенты для специфического
связывания и, зачастую, иммобилизации анализируемого антигена. Захватывающий агент - это вещество,
специфически связывающееся с анализируемым антигеном. В одном из воплощений настоящего изобретения захватывающий агент представляет собой антитело или его фрагмент, специфически связывающий
Ang-2. Такие иммунологические анализы связывания хорошо известны специалистам (см. Asai, ed.,
Methods in Cell Biology, vol. 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)).
В иммунологическом анализе связывания часто применяют вещества-метки, сигнализирующие о
наличии связанного комплекса, образованного из захватывающего агента и антигена. Меченым агентом
- 26 -
011866
может быть одна из молекул, входящих в связанный комплекс: например, меченым может быть специфический связывающий агент или антитела к специфическому связывающему агенту. Кроме того, веществом-меткой может служить третья молекула, обычно молекула еще одного антитела, связывающегося с
иммунным комплексом. Так, меченым агентом могут быть, например, антитела к специфическому связыващему агенту, несущие метку. Вторичное антитело, специфичное к иммунному комплексу, может и
не иметь метки, но при этом связываться четвёртой молекулой, специфичной к тому виду антител, к которой принадлежат вторичные антитела. Например, вторичное антитело может быть модифицировано
выявляемым фрагментом, таким как биотин, который далее может быть связан четвёртой молекулой,
такой как ферментативно-меченый стрептавидин. В качестве меченого агента могут использоваться и
другие белки, специфически связывающиеся с константными областями иммуноглобулинов, такие как
белок А или белок G. Эти связывающие белки являются нормальными составляющим клеточной стенки
стафилококков и проявляют сильную неиммуногенную реактивность по отношению к константным областям иммуноглобулинов различных видов животных (см. Akerstrom, J. Immunol., 135: 2589-2542 (1985)
и Chaubert, Mod. Pathol., 10: 585-591 (1997)).
Во всех указанных анализах могут потребоваться стадии инкубации и/или промывки после каждого
сочетания реагентов. Стадии инкубации могут варьировать от приблизительно 5 с до нескольких часов,
предпочтительно от 5 мин до суток. Однако время инкубации будет зависеть от формата анализа, анализируемого вещества, объёма раствора, концентраций и т.п. Обычно подобные анализы проводят при
температуре окружающей среды, хотя можно выполнять их в широком диапазоне температур.
А. Неконкурентные анализы связывания.
Иммунологические анализы связывания могут быть неконкурентного типа. В этих анализах количество связываемого анализируемого вещества измеряют напрямую. Например, в одном из предпочтительных анализов (типа "Сэндвич") захватывающий агент (антитело) может быть связан прямо с твёрдой
подложкой, где он иммобилизуется. Эти иммобилизованные антитела далее захватывают (связывают)
антиген, представленный в тестируемом образце. Иммобилизованный таким образом белок связывается
затем с веществом-меткой, например с антителами, несущими метку. В другом предпочтительном анализе типа "Сэндвич" вторичные антитела не несут метки, однако связываются мечеными антителами, специфичными к антителам того вида животных, из которого происходят вторичные антитела. Вторичные
антитела также могут быть модифицированы выявляемым фрагментом, таким как биотин, с которым
специфически связывается третья меченая молекула, например стрептавидин (см. Harlow, Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch. 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988)), включенный здесь путем
ссылки.
Б. Конкурентные анализы связывания.
Иммунологические анализы связывания могут быть и конкурентного типа. При этом количество
анализируемого вещества в образце определяют косвенно, посредством измерения количества анализируемого вещества, сместившегося или вытесненного от захватывающего агента анализируемым веществом, присутствующим в пробе. В одном из предпочтительных конкурентных анализов связывания к образцу добавляют известное количество анализируемого вещества, обычно меченого, и затем образец
приводят в контакт с антителами (захватывающим агентом). Количество меченого анализируемого вещества, связавшегося с антителами, обратно пропорционально концентрации анализируемого вещества в
пробе (см. Harlow, Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch. 14, p. 579-583, см. выше).
В другом предпочтительном конкурентном анализе связывания антитело иммобилизовано на твёрдой подложке. Количество белка, связавшегося с антителами, может быть выявлено либо путём измерения количества белка, присутствующего в комплексе белок-антитело, либо же посредством измерения
количества оставшегося белка, не входящего в комплекс. Количество белка может быть измерено получением меченого белка (см. Harlow, Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, см. выше).
Ещё в одном предпочтительном конкурентном тесте на связывание применяется гаптенное ингибирование. В этом случае известное количество анализируемого вещества иммобилизируют на твёрдой
подложке. К тестируемому образцу добавляют известное количество антител и образец вводят в контакт
с иммобилизованным анализируемым веществом. Количество антител, связавшееся с иммобилизованным антигеном, обратно пропорционально количеству анализируемого вещества, присутствующего в
образце. Количество иммобилизованных антител можно выявить либо посредством определения иммобилизованной фракции антител или фракции, оставшейся в растворе. Определение может быть прямым,
если антитела меченые, или непрямым, с последующим добавлением меченого вещества, специфически
связывающегося с антителами, как описано выше.
В. Применение конкурентных анализов связывания.
Конкурентные анализы связывания можно применять при определении перекрёстной реактивности,
что позволит опытному специалисту выявить, является ли белок или ферментный комплекс, распознаваемый специфическим связывающим агентом, соответствующим настоящему изобретению, требуемым
белком, а не перекрёстно реагирующей молекулой, либо определить, являются ли антитела специфичными к данному антигену и не связываются ли они с неродственными антигенами. В анализах такого
типа антиген может быть иммобилизован на твёрдой подложке и к нему добавляют смесь неизвестных
- 27 -
011866
белков, конкурирующую с иммобилизованным белком за связывание со специфическим связывающим
агентом. Конкурирующая молекула также связывает один или несколько антигенов, неродственных указанному антигену. Способность белков конкурировать с иммобилизованным антигеном за связывание со
специфическим связывающим агентом сравнивается с тем же белком, иммобилизованным на твёрдой
подложке, для выявления перекрёстной реактивности белковой смеси.
Г. Другие анализы связывания.
Настоящим изобретением предложены также способы вестерн-блоттинга для выявления или для
определения количества Ang-2, присутствующего в образце. Методика обычно включает разделение
белков образца посредством гель-электрофореза по их молекулярной массе и перенос белков на подходящую твёрдую подложку, такую как нитроцеллюлозный фильтр, нейлоновый фильтр или химически
модифицированный нейлоновый фильтр. Образец инкубируют с антителами или их фрагментами, которые специфически связывают Ang-2, после чего выявляют образованный при этом комплекс. Антитела
могут быть мечены напрямую или же могут быть обнаружены при помощи меченых антител, специфически связывающихся с вышеуказанными антителами.
Анализы связывания для определения таких агентов, специфически связывающих Ang-2, которые
разрывают связь Ang-2 с его рецептором, изложены в разделе "Примеры".
Диагностические анализы.
Антитела и их фрагменты, соответствующие настоящему изобретению, применимы для диагностики состояний или заболеваний, для которых характерна экспрессия Ang-2 или его субъединиц, или в анализах для мониторинга пациентов, подвергавшихся лечению индукторами Ang-2, его фрагментами, агонистами или ингибиторами активности Ang-2. Диагностические анализы Ang-2 включают способы с использованием специфического связывающего агента и метки для выявления Ang-2 в жидкостях человеческого организма или в экстрактах клеток или тканей. Специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению, могут быть использованы с модификациями или без таковых. В предпочтительном диагностическом анализе специфические связывающие агенты являются мечеными с помощью присоединения к ним, например, метки или репортерной молекулы. Известно большое разнообразие меток и обнаруживаемых молекул, некоторые из которых уже были здесь описаны. В частности,
настоящее изобретение применимо для диагностики заболеваний человека.
Специалистам известны разнообразные протоколы измерения количества Ang-2 при помощи моноклональных или поликлональных антител, специфичных к этому белку. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (РИА) и цитофлуорометрию. Предпочтительным является двухэпитопный иммунологический анализ на основе моноклональных антител с использованием моноклональных антител, реактивных к двум неперекрывающимся эпитопам; однако может применяться и конкурентный анализ связывания. Эти анализы описаны, например, в статье Maddox
et al., J. Exp. Med., 158: 1211 (1983).
Для обеспечения базы для диагностики обычно определяют нормальные или стандартные значения
экспрессии Ang-2 у человека. Это определение должно осуществляться путём сочетания жидкостей тела
или клеточных экстрактов нормальных субъектов, предпочтительно людей, со специфическим связывающим агентом, например антителами к Ang-2, в условиях, приемлемых для образования комплекса,
хорошо известных специалистам. Величину стандартного образования комплекса можно количественно
оценить путём сравнения величины связывания специфического связывающего агента с известными количествами белка Ang-2 в присутствии образцов, соответствующих норме и патологии. Затем стандартные величины, полученные для нормальных образцов, можно сравнить с величинами, полученными для
образцов от пациентов, поражённых заболеванием. Различие между полученными величинами в норме и
патологи говорит о роли Ang-2 в болезненном состоянии.
В воплощениях специфический связывающий агент для диагностических нужд может быть мечен
выявляемым фрагментом. Выявляемым фрагментом может быть любой, способный прямо или опосредованно подать выявляемый сигнал. Например, выявляемым фрагментом может быть радиоизотоп, такой
как 3Н, 14С, 32Р, 35S или 125I, флуоресцентное или хемилюминесцентное вещество, такое как флуоресцеинизотиоцианат, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза или пероксидаза хрена (Bayer et al., Meth. Enz., 184: 138-163 (1990)).
Заболевания.
Согласно настоящему изобретению предложен специфический связывающий агент, который связывает Ang-2 и пригоден для лечения человеческих заболеваний и патологических состояний. Агенты, модулирующие активность связывания Ang-2 или другую клеточную активность, можно применять в сочетании с другими терапевтическими агентами для повышения их терапевтического эффекта или снижения
возможных побочных эффектов.
В одном из аспектов настоящего изобретения предложены реагенты и способы, пригодные для лечения заболеваний и состояний, характеризующихся нежелательным или отклоняющимся уровнем активности Ang-2 в клетке. Среди этих заболеваний - раковые заболевания и другие гиперпролиферативные состояния, такие как гиперплазия, псориаз, контактный дерматит, иммунологические расстройства
или бесплодие.
- 28 -
011866
Согласно настоящему изобретению также предложены способы лечения рака у животных, включая
человека, включающие введение животному эффективной дозы специфического связывающего агента,
который ингибирует или снижает активность Ang-2. Кроме того, согласно изобретению предложены
способы ингибирования роста раковых клеток, включая процессы клеточной пролиферации, инвазивность и метастазирование в биологических системах. Среди этих способов - применение соединения,
соответствующего настоящему изобретению, в качестве ингибитора роста раковых клеток. Предпочтительно эти способы применяют для подавления или уменьшения роста раковых клеток, инвазивности,
метастазирования или уменьшения опухоли у животных, таких как млекопитающие. Способы, соответствующие настоящему изобретению, можно легко приспособить и для применения в тестовых системах,
например, выявляющих рост раковых клеток и его характеристики, а также выявляющих вещества, которые влияют на рост раковых клеток.
Раковые заболевания, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, предпочтительно встречаются у млекопитающих. Млекопитающими являются, например, люди и другие приматы,
а также домашние животные, такие как собаки и кошки; лабораторные животные, такие как крысы, мыши и кролики; и сельскохозяйственные животные, такие как лошади, свиньи, овцы и крупный рогатый
скот.
Опухоли, или неоплазии, представляют собой, в частности, разрастания клеток в тканях, при которых увеличение числа клеток является бесконтрольным и прогрессирующим. Некоторые из таких разрастаний доброкачественны, однако другие, называемые злокачественными, могут привести к смерти
организма. Злокачественные неоплазии, или раковые опухоли, отличаются от доброкачественных тем,
что, кроме проявления агрессивной клеточной пролиферации, они могут внедряться в окружающие ткани и метастазировать. Кроме того, злокачественные неоплазии отличаются тем, что проявляют меньший
уровень дифференциации (большую дедифференциацию) и меньшую степень организации по сравнению
с любой из окружающих их тканей. Это свойство также называется "анаплазией".
Разновидностями неоплазий, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, являются солидные опухоли, например карциномы и саркомы. Карциномы включают те злокачественные
неоплазии, происходящие из эпителиальных клеток, которые инфильтрируют (проникают) в окружающие ткани и приводят к возникновению метастазов. Аденокарциномы - это карциномы, происходящие из
железистой ткани или образующие различимые железоподобные структуры. Другая широкая категория
раковых заболеваний включает саркомы, представляющие собой опухоли, клетки которых окружены
волокнистым или гомогенным межклеточным веществом, подобным эмбриональной соединительной
ткани. Настоящее изобретение делает возможным и лечение раковых заболеваний лимфоидной и миелоидной систем, в том числе лейкемий, лимфом и других раковых заболеваний, которые обычно не представлены опухолевой массой, а рассредоточены в сосудистой или лимфатической системах.
Перечень разновидностей раковых заболеваний, поддающихся лечению в соответствии с настоящим изобретением, включает, например, опухоль, вырабатывающую аденокортикотропный гормон; острую лимфоцитарную лейкемию, острую нелимфоцитарную лейкемию, рак коры надпочечников, рак мочевого пузыря, рак мозга, рак груди, рак шейки матки, хроническую лейкоцитарную лейкемию, хроническую миелоцитарную лейкемию, рак толстой и прямой кишки, Т-клеточную лимфому кожи, рак эндометрия, рак пищевода, саркому Эвингса, рак желчного пузыря, лейкемию волосяных клеток, рак головы
и шеи, лимфому Ходжкина, саркому Капоши, рак почки, рак печени, рак лёгкого (мелкоклеточный и немелкоклеточный), злокачественный перитонеальный выпот, злокачественный плевральный выпот, меланому, мезотелиому, множественную миелому, нейробластому, глиому, неходжкинову лимфому, саркому
кости, рак яичника, рак зародышевых клеток яичника, рак поджелудочной железы, рак полового члена,
рак предстательной железы, ретинобластому, рак кожи, саркому мягких тканей, плоскоклеточные карциномы, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, трофобластические неоплазии, рак матки, рак
влагалища, рак преддверия влагалища и опухоль Вильмса.
Настоящее изобретение частично проиллюстрировано здесь в отношении лечения некоторых типов
экспериментальных опухолей. Для такого иллюстративного лечения были использованы стандартные
современные модели in vitro и in vivo. Такими методами можно выявить агент, в отношении которого
можно ожидать, что он будет эффективен при лечении in vivo. Однако следует понимать, что способ по
настоящему изобретению не ограничивается лечением указанных типов опухолей, а распространяется на
любую солидную опухоль, происходящую из любой ткани. Раковые заболевания, инвазивность или метастазирование которых связано с экспрессией Ang-2 или с его активностью, особенно чувствительны к
ингибированию и даже могут быть индуцированы к обратному развитию средствами, предложенными
согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение можно также осуществлять на практике, применяя специфический связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению, такой как антитело, в сочетании с другим
противоопухолевым химиотерапевтическим агентом, таким как любой из обычных химиотерапевтических агентов. Сочетание специфического связывающего агента с другими агентами такого рода может
увеличить эффективность химиотерапевтического протокола. Опытный практикующий врач знает множество химиотерапевтических протоколов, которые могут войти как составная часть в способ, соответ- 29 -
011866
ствующий настоящему изобретению. При этом можно применять любые химиотерапевтические агенты,
такие как алкилирующие средства, антиметаболиты, гормоны и их антагонисты, радиоизотопы, а также
природные продукты. Например, соединение, соответствующее настоящему изобретению, можно назначать с антибиотиками, такими как доксорубицин и другие аналоги антрациклина, азотистые иприты, такие как циклофосфамид, аналоги пиримидина, такие как 5-фторурацил; цисплатин, оксимочевина, таксол
и его натуральные и синтетические производные и т.п. Как другой пример, в случае опухолей смешанного типа, таких как аденокарцинома груди, где опухоль состоит из гонадотропинзависимых и гонадотропиннезависимых клеток, соединение можно вводить в сочетании с лейпролидом или гозерелином (синтетическими пептидными аналогами релизинг-фактора лютеинизирующего гормона). Другие антинеопластические протоколы включают, например, применение соединений тетрациклинового ряда вместе с
иными методами терапии, например хирургией, радиацией и т.п., которые называются здесь "сопряжёнными антинеопластическими методами терапии". Таким образом, способ по настоящему изобретению
можно применять совместно с обычными режимами лечения для снижения побочных эффектов и повышения эффективности лечения.
Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции и
способы, применимые для лечения широкого спектра раковых заболеваний, в том числе солидных опухолей и лейкемий. Типы раковых заболеваний, которые могут подвергаться лечению в соответствии с
настоящим изобретением, включают, без ограничения, следующее: аденокарцинома груди, предстательной железы и толстой кишки; все формы бронхогенной карциномы лёгкого, миелоид, меланома, гепатома, нейробластома, папиллома, апудома, хористома, бранхиома, злокачественный карциноидный синдром, карциноидная болезнь сердца, различные карциномы (например, Волкера, базально-клеточная,
Брауна-Пирса, карцинома из эпителия протоков, опухоль Эрлиха, Кребса 2, клеток Меркеля, слизеобразующая, немелкоклеточная лёгкого, овсяноклеточная, папиллярная, фиброзная, бронхиол, бронхогенная,
плоскоклеточная и переходно-клеточная), гистиоцитарные расстройства, лейкемия, злокачественный
гистиоцитоз, болезнь Ходжкина, иммунопролиферативная мелкоклеточная карцинома лёгкого, неходжкинова лимфома, плазмоцитома, ретикулоэндотелиоз, меланома, хондробластома, хондрома, хондросаркома, фиброма, фибросаркома, гигантоклеточные опухоли, гистиоцитома, липома, липосаркома, мезотелиома, миксома, миксосаркома, остеома остеосаркома, хордома, краниофарингиома, дисгерминома,
гамартома, мезенхимома, мезонефрома, миосаркома, амелобластома, цементома, одонтома, тератома,
тимома, трофобластическая опухоль и др. Кроме того, также можно лечить следующие типы раковых
заболеваний: аденома, холангиома, холестеатома, цилиндрома, цистаденокарцинома, цистаденома, аденома граафовых пузырьков, гинандробластома, гепатома, гидраденома, инсулома, опухоль из клеток
Лейдига, папиллома, опухоль из сертолиевых клеток, текома, лейомиома, лейомиосаркома, миобластома,
миома, миосаркома, рабдомиома, рабдомиосаркома, эпендимома, англионеврома, глиома, медуллобластома, менингиома, нейрилеммома, нейробластома, нейроэпителиома, нейрофиброма, нейрома, параганглиома, нехромаффинная параганглиома, ангиокератома, ангиолимфоидная гиперплазия с эозинофилией, склерозирующая ангиома, ангиоматоз, гломангиома, гемангиоэндотелиома, гемангиома, гемангиоперицитома, гемангиосаркома, лимфангиома, лимфангаомиома, лимфангиосаркома, пинеалома, карциносаркома, хондросаркома, листовидная цистосаркома, фибросаркома, гемангиосаркома, лейомиосаркома, лейкосаркома, липсаркома, лимфангиосаркома, миосаркома, миксосаркома, карцинома яичника, рабдомиосаркома, саркома, новообразования, нейрофиброматоз и цервикальная дисплазия.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой использование материалов и способов,
соответствующих настоящему изобретению, для профилактики или лечения любых гиперпролиферативных состояний кожи, в том числе псориаза и контактного дерматита или других гиперпролиферативных
заболеваний. Как было обнаружено, у пациентов с псориазом и контактным дерматитом повышен уровень активности Ang-2 в области поражения (Ogoshi et al., J. Inv. Dermatol., 110: 818-23 (1998)). Предпочтительно специфические связывающие агенты, специфичные к Ang-2, следует применять в сочетании с
другими фармацевтическими агентами для лечения людей, у которых выражены эти клинические симптомы. Специфические связывающие агенты могут доставлять при помощи любого из разнообразных
носителей с помощью способов введения, описанных здесь, и других, хорошо известных специалистам.
Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложено лечение различных ретинопатий (в
том числе диабетической ретинопатии и старческой макулодеградации), в патологии которых задействован ангиогенез, а также нарушений/заболеваний женских половых путей, таких как эндометриоз, фиброиды матки и другие подобные состояния, связанные с дисфункцией пролиферации сосудов (в том числе рост капиллярной сети в эндометрии), в ходе репродуктивного цикла у женщин.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к лечению аномального роста сосудов, в том
числе артериовенозных аномалий в мозге, повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного
тракта и их восстановление, изъязвления слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки у пациентов с
язвенной болезнью этих органов в анамнезе, ишемического инсульта, широкого спектра сосудистых нарушений в лёгких, заболеваний печени и портальной гипертензии у пациентов с негепатогенной портальной гипертензией.
- 30 -
011866
Ещё одним из аспектов настоящего изобретения является профилактика раковых заболеваний фармацевтическими композициями и способами, предусмотренными настоящим изобретением. Такие композиции включают в себя специфические связывающие агенты к Ang-2.
Фармацевтические композиции.
В объем настоящего изобретения входят фармацевтические композиции, содержащие агенты, специфически связывающие Ang-2. Фармацевтические композиции, содержащие антитела, подробно описаны, например, в патенте US 6171586 (Lam et al.) от 09.01.2001. Такие композиции содержат терапевтически или профилактически эффективное количество специфического связывающего агента, такого как
антитело или его фрагмент, вариант, производное или конъюгат, как описано здесь, с примесью фармацевтически приемлемого агента. В предпочтительном воплощении фармацевтические композиции содержат антагонистические специфические связывающие агенты, которые частично или полностью модулируют по меньшей мере одну из биологических активностей Ang-2, в смеси с фармацевтически приемлемым агентом. Обычно специфические связывающие агенты являются достаточно очищеными, чтобы
их можно было вводить животному.
Фармацевтическая композиция может содержать компоненты состава, служащие для изменения,
поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, отношения растворимости или высвобождения, адсорбции или
проницаемости состава. Приемлемыми компонентами состава являются, например, аминокислоты, такие
как Гли, Глн, Асн, Арг или Лиз, противомикробные агенты, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или бисульфит натрия), буферные агенты (такие как борат, бикарбонат, Трис-HCl,
цитраты, фосфаиты, другие органические кислоты), агенты, увеличивающие объём (такие как маннит
или глицин), хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)), комплексообразователи (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или оксипропил-бетациклодекстрин), наполнители, моносахариды. дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красители, отдушки и разбавители, эмульгаторы, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон),
полипептиды низкого молекулярного веса, солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты (такие как хлористый бензалконий, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенэтиловый
спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (такие как
маннит или сорбит), вещества, стабилизирующие взвеси; сурфактанты или увлажнители (Плюроник, полиэтиленгликоль, сорбитановые эфиры, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, Тритон,
трометамин, лецитин, хорестерин, тилоксапал), стабилизаторы (сахароза или сорбит), вещества, повышающие ионную силу (такие как галогениды щелочных металлов, предпочтительно хлористый натрий
или калий, маннит, сорбит), основы, растворители, неактивные наполнители и/или адъюванты (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).
Оптимальная фармацевтическая композиция будет подбираться специалистом в зависимости, например, от предполагаемого пути введения, формата доставки и желаемой дозировки (например, Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo специфического связывающего
агента.
Первичная основа или носитель в фармацевтической композиции может иметь водную или неводную природу. Например, подходящей основой или носителем может быть вода для инъекций, физиологический солевой раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, возможно, с добавлением
других веществ, обычных для фармацевтических композиций парентерального применения. Другими
примерами лекарственных основ могут служить нейтрально-буферный физиологический раствор или
физиологический раствор с добавлением сывороточного альбумина. Другие примеры фармацевтических
композиций содержат Трис-буфер с рН в области 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН в области 4,0-5,5,
который может дополнительно содержать сорбит или приемлемый его заменитель. В одном из воплощений настоящего изобретения фармацевтические композиции, содержащие связывающий агент, могут
быть приготовлены для хранения путём смешения выбранного вещества с нужной степенью очистки с
дополнительными неактивными наполнителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше) в виде
лиофилизированной массы или водного раствора. Кроме того, связывающий агент может быть представлен в лиофилизированном виде при использовании подходящих наполнителей, таких как сахароза.
Могут быть выбраны фармацевтические композиции для парентерального введения. Также могут
быть выбраны композиции для ингаляций или для приёма внутрь через рот, ухо, глаз, прямую кишку или
влагалище. Приготовление таких фармацевтических композиций находится в компетенции специалистов.
Компоненты фармацевтических композиций берут в концентрациях, приемлемых для выбранного
способа введения. Например, буферные вещества используются для поддержания в лекарственном составе физиологического или слегка пониженного рН, обычно в диапазоне от 5 до 8.
- 31 -
011866
В случае выбора парентерального способа введения фармацевтические композиции для применения
в соответствии с настоящим изобретением могут быть представлены в виде апирогенного парентерально-приемлемого водного раствора, содержащего требуемый специфический связывающий агент и фармацевтически приемлемую основу. Особенно подходящей основой для парентерального введения является стерильная дистиллированная вода, в которой связывающий агент представлен в виде стерильного
изотонического раствора, должным образом законсервированного. В другом препарате активный компонент может быть представлен в виде состава, включающего требуемую молекулу и агент, такой как микросферы для инъекций, биоразрушаемые частицы, полимерные соединения (полимолочная кислота, полигликолевая кислота), гранулы, липосомы, в результате чего достигается контролируемое или замедленное высвобождение продукта, который таким образом можно доставлять с помощью инъекции замедленного всасывания. Может использоваться и гиалуроновая кислота, при этом может достигаться
эффект длительного пребывания в кровотоке. Другими подходящими средствами для введения требуемой молекулы являются имплантируемые устройства для доставки лекарств.
В другом аспекте фармацевтические композиции, приемлемые для парентерального введения, могут находиться в составе водных растворов, предпочительно в физиологически совместимых буферах,
таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический буферный солевой раствор. Суспензии
для инъекций на водной основе могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как
натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии действующего вещества
могут быть приготовлены в виде приемлемых масляных инъекционных суспензий. Приемлемыме липофильные растворители или основы включают жирные масла, такие как кунжутное масло; или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат; триглицериды или липосомы. Для доставки препарата
могут использоваться и нелипидные поликатионные аминополимеры. Если желательно, суспензия может
содержать также подходящие стабилизаторы или вещества, повышающие растворимость соединений,
позволяющие изготавливать высококонцентрированные растворы.
Ещё в одном воплощении фармацевтическая композиция может иметь состав, пригодный для ингаляций. Например, связывающий агент может быть представлен в виде сухого порошка для ингаляций.
Растворы полипептидов или молекул нуклеиновых кислот для ингаляций могут быть иметь состав,
включающий пропеллент для доставки в виде аэрозоля. Ещё в одном воплощении растворы могут подлежать распылению. Введение через лёгкие рассмотрено также в международной заявке
PCT/US94/001875, которая описывает введение химически модифицированных белков через лёгкие.
Согласно изобретению также предложены фармацевтические композиции, вводимые перорально. В
одном из воплощений настоящего изобретения молекулы связывающего агента, вводимые таким путём,
могут быть представлены в сочетании с носителями, обычно применяющимися в компаундировании
твёрдых дозированных форм, таких как таблетки или капсулы, или без таковых носителей. Например,
капсулы могут быть разработаны так, чтобы высвобождать активную часть состава в такой точке пищеварительного тракта, в которой биодоступность максимальна, а пресистемное разрушение минимально.
Для облегчения всасывания молекулы связывающего агента могут применяться дополнительные вещества. Могут использоваться также разбавители, вкусовые добавки, легкоплавкие воски, растительные масла, скользящие вещества, суспендирующие агенты; дезинтегрирующие агенты и связующие вещества.
Фармацевтические композиции для перорального введения могут также быть составлены с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных специалистам, в дозировках, подходящих для перорального применения. Такие носители дают возможность создавать такие лекарственные формы, как таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, суспензии и т.п., которые
могут проглатываться пациентом.
Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены посредством сочетания действующих веществ с твёрдыми неактивными наполнителями и получения гранул из этой
смеси (при необходимости, после измельчения) для получения таблеток или сердцевин драже. При желании, могут быть добавлены подходящие вспомогательные вещества. Приемлемые неактивные наполнители включают углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, сои, риса, картофеля или других растений; целлюлозу,
например
метилцеллюлозу,
гидроксипропилметилцеллюлозу
или
натрийкарбоксиметилцеллюлозу; камеди, в том числе гуммиарабик или трагакантовая камедь; и белки, такие
как желатин или колаген. При желании, могут быть добавлены дезинтегрирующие или солюбилизирующие агенты, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар-агар или альгиновая кислота либо
её соль, такая как альгинат натрия.
Сердцевина драже может применяться в сочетании с приемлемыми оболочками, такими как концентрированные растворы сахаров, которые могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль и/или двуокись титана, лаковые растворы и подходящие органические растворители и их смеси. В оболочки драже можно также добавлять красители и пигменты для
иденификации продукта или для обозначения количества действующего вещества, т.е. дозировки.
- 32 -
011866
Фармацевтические препараты для перорального назначения также включают капсулы из желатина с
плотной насадкой, а также мягкие герметичные капсулы из желатина и покрытия, такого как глицерин
или сорбит. Капсулы с плотной насадкой могут содержать действующее вещество в смеси с наполнителями или связующими веществами, такими как лактоза или крахмалы, скользящие вещества, такие как
тальк, стеарат магния, и при необходимости, стабилизаторы. В мягких капсулах действующие вещества
могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как растительные масла,
жидкость или жидкий полиэтиленгликоль со стабилизаторами или без таковых.
Другие фармацевтические композиции могут содержать эффективное количество связывающего
агента в смеси с нетоксичными наполнителями, пригодными для производства таблеток. При растворении таблеток в стерильной воде или другой подходящей основе могут быть получены растворы в виде
единицы дозы. Приемлемые неактивные наполнители включают, например, инертные разбавители, такие
как углекислый кальций, углекислый или двууглекислый натрий, лактоза или фосфорно-кислый кальций;
или связующие вещества, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик; либо скользящие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Прочие фармацевтичекие композиции будут очевидны специалистам, включая композиции, в состав которых молекулы связывающего агента входят вместе с веществами, обеспечивающими замедленное или контролируемое высвобождение. Методики создания различных других средств для замедленного или контролируемого высвобождения действующего вещества, таких как липосомные носители, биоразлагаемые микрочастицы или пористые гранулы и инъекции замедленного всасывания, также известны специалистам (см., например, PCT/US93/00829, в которой описывается контролируемое высвобожднение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций). Дополнительные примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые полимерные матрицы, имеющие различную форму, например плёнки или микрокапсулы. Матрицами замедленного высвобождения могут являться, например, полиэфиры, гидрогели, полиактиды (патенты US 3773919,
ЕР 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman et al., Biopolymers,
22: 547-556 (1983)), поли(2-оксиэтилметакрилат) (Langer et al., J. Biomed. Mater Res, 15: 167-277 (1981) и
Langer et al., Chem. Tech., 12: 98-105(1982)), этилен-винилацетат (Langer et al., см. выше) или поли-D(-)-3оксимасляная кислота (ЕР 133988). Композиции с замедленным высвобождением также могут включать
липосомы, которые могут быть приготовлены любым из нескольких методов, известных специалистам
(см., например, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (США), 82: 3688-3692 (1985); ЕР 36676; ЕР 88046;
ЕР 143949).
Фармацевтическая композиция, предназначенная для применения in vivo, как правило, должна быть
стерильной. Это может достигаться благодаря фильтрации через стерильные мембраны. Если композиция является лиофилизованной, то стерилизацию с использованием этого способа можно осуществлять
либо до лиофилизации, либо после растворения. Композицию для парентерального введения могут хранить в лиофилизированном виде или в растворе. Кроме того, композиции для парентерального введения
обыкновенно помещают в ёмкость со стерильным входным отверстием, например в мешок для внутривенного применения или в пузырёк с пробкой, протыкаемой иглой для подкожных инъекций.
После приготовления фармацевтической композиции ее могут хранить в стерильных аптечных пузырьках в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твёрдого вещества или обезвоженного либо лиофилизированного порошка. Такие составы могут храниться в форме, готовой к употреблению, либо в форме
(например, лиофилизованной), требующей растворения перед введением.
В конкретном воплощении настоящее изобретение предусматривает наборы для создания формы
для введения единицы дозы. Каждый из таких наборов может включать первую емкость с высушенным
белком и вторую емкость с водной основой. В объем изобретения также включены наборы, состоящие из
предварительно заполненных одиночных и многокамерных шприцев (например, шприцы с жидкостью
или шприцы с лиофилизированным порошком).
Эффективная доза фармацевтической композиции для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтических обстоятельств и целей. Специалисту понятно, что подходящая дозировка при лечении будет, таким образом, изменяться в зависимости, с одной стороны, от действующего
вещества, для которого здесь используется обозначение "специфический связывающий агент", способа
введения, размеров (масса тела, поверхность тела или размер органа) и состояния (возраст и общее состояние здоровья) пациента. Соответственно, клиницист может изменить дозировку или способ введения
для достижения оптимального лечебного эффекта. Обычно дозировки могут варьировать в пределах
приблизительно от 0,1 до приблизительно 100 мг/кг, или от 1 до приблизительно 100 мг/кг, или же от 5
до приблизительно 100 мг/кг.
Терапевтически эффективная доза любого соединения может быть изначально оценена либо в анализах на клеточной культуре, либо на модели на животных, таких как мыши, крысы, кролики, собаки или
свиньи. Модель на животных может также применяться для определения приемлемого диапазона концентраций и способа введения. Такие сведения могут быть затем использованы для определения приемлемых доз и способов введения для людей.
- 33 -
011866
Точная дозировка должна быть определена с учетом факторов, связанных с пациентом, подлежащим лечению. Дозы и способ назначения подбирают для достижения достаточных уровней действующего вещества или для поддержания желаемого эффекта. Факторами, которые могут быть приняты во внимание, являются тяжесть заболевания, общие показатели здоровья пациента, возраст, вес и пол пациента,
длительность и частота введения, сочетания лекарств, чувствительность к препарату и ответ на лечение.
Фармацевтические композиции длительного действия можно вводить каждые 3 или 4 дня, еженедельно
или раз в две недели, в зависимости от периода полураспада или полувыведения конкретного состава.
Частота введения будет зависеть от фармакокинетических параметров молекул связывающего агента в данной фармацевтической композиции. Обычно фармацевтическую композицию вводят до тех пор,
пока лекарство не возымеет желательного действия. Таким образом, состав можно вводить в виде однократной дозы или в несколько приёмов (в одной и той же или в различных дозировках) в течение некоторого времени либо же в виде непрерывного вливания. Дальнейшая корректировка дозировки является
рутинной процедурой. Приемлемые дозировки могут быть определены при использовании подходящих
данных типа доза-ответ.
Фармацевтические композиции вводят различными путями в соответствии с известными способами, например перорально, в виде внутривенных инъекций, внутрибрюшинно, внутрь мозга (интрапаренхимально), в мозговые желудочки, внутримышечно, в глаз, внутриартериально, внутрипортально, через
поврежденные ткани, интрамедуллярно, интратекально, интравентрикулярно, чрескожно, подкожно,
внутрибрюшинно, в нос, местно, под язык, через уретру, влагалище или прямую кишку, в системах длительного высвобождения или через имплантируемые устройства. Если желательно, фармацевтические
композиции можно также вводить посредством болюсной инъекции или непрерывно путём вливания или
с помощью имлантируемого устройства.
Альтернативно или дополнительно композицию можно вводить локально путём имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором требуемые молекулы сорбированы или
инкапсулированы. При применении такого имплантируемого устройства оно может быть имплантировано в любую подходящую ткань или орган, и высвобождение действующего вещества может происходить
путём диффузии, болюсов с определенным временем высвобождения или непрерывного введения.
В некоторых случаях может оказаться желательным применение фармацевтических композиций
ex vivo. В таком случае клетки, ткани или органы, которые были удалены у пациента, подвергают воздействию фармацевтических композиций, после чего указанные клетки, ткани и/или органы имлантируют назад в организм пациента.
В других случаях специфический связывающий агент, который является полипептидом, можно вводить пациенту посредством имплантации определенных клеток, которые подверглись генетической инженерии при помощи методов, некоторые из которых описаны здесь, для обеспечения экспрессии и секреции данного полипептида. Такими клетками могут быть клетки животных или человека, и они могут
быть аналогичными, гомологичными или чужеродными. При необходимости клетки могут быть иммортализованы. Для снижения вероятности иммунного ответа клетки могут быть инкапсулированы с целью
избежания инфильтрации в окружающие ткани. Материалы для инкапсулирования, как правило, являются биосовместимыми полупроницаемыми полимерными чехлами или мембранами, которые позволяют
выход белковых продуктов, но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или
другими разрушающими факторами окружающих тканей.
Комбинированная терапия.
Специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению, можно применять в сочетании с другими терапевтическими средствами при лечении патологий, связанных с Ang-2.
Эти другие терапевтические средства включают радиоактивное облучение, химиотерапию и направленное терапевтическое воздействие, как описывается ниже. Другие виды комбинационной терапии, не перечисленные здесь особо, также попадают в объем настоящего изобретения.
Таким образом, настоящим изобретением охватывается введение одного или более специфических
связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, в сочетании с введением тому же
самому пациенту одного или более дополнительного подходящего агента, причем каждый назначается
согласно соответствующему данному медикаменту режиму. При этом, в частности, подразумевается, по
существу, одновременное введение специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению, и одного или нескольких других подходящих агентов.
Под "неодновременным" введением здесь понимается введение одного или нескольких специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, и одного или нескольких дополнительных подходящих агентов в различное время, в различном порядке, причем их действие может
перекрываться или не перекрываться. При этом, без ограничения, включено последовательное лечение
(такое как премедикация, постмедикация или перекрывающееся лечение) компонентами комбинации, а
также режимы чередования лекарств или же случаи, когда одно средство вводится в течение долгого
времени, а другое (другие) - периодически. Компоненты могут входить в одну или в отдельные композиции, и способы их введения могут быть одинаковыми или же разными.
- 34 -
011866
В некоторых воплощениях комбинированная терапия включает специфический связывающий
агент, способный связывать Ang-2, в сочетании по меньшей мере с одним антиангиогенным препаратом.
Эти препараты влючают, без ограничения, синтезированные in vitro химические композиции, анитела,
антигенсвязывающие области, радионуклиды, их сочетания и конъюгаты и др. В некоторых воплощениях такой препарат может действовать как агонист, антагонист, аллостерический модулятор или токсин. В
некоторых воплощениях действие препарата может заключаться в ингибировании или стимуляции его
мишени (например, в активации или ингибировании рецептора или фермента) и в результате этого - в
стимуляции клеточной смерти или остановке клеточного роста.
В химиотерапевтическом лечении могут быть задействованы антинеопластические агенты, такие
как азотистые иприты, например мехлоретамин, циклофосфамид, ифосфамид, мефалан и хлорамбуцил;
производные нитрозомочевины, например кармустин (BCNU), ломустин (CCNU) и семустин (метилCCNU); этиленимины/метилмеламид, такие как триэтиленмеламин (ТЕМ), триэтилентиофосфамид (тиотефа) гексаметилмеламин (ГММ, альтретамин); алкилсульфонаты, такие как бусульфан; триазины, такие
как дакарбазин (DTIC); антиметаболиты, включая аналоги фолиевой кислоты, такие как метатрексат и
триметрексат; аналоги пиримидиновых оснований, такие как 5-фторурацил, фтордезоксиуридин, гемцитабин, цитозин-арабинозид (AraC, цитарабин), 5-азацитидин, 2,2'-дифтордезоксицитидин; аналоги пуриновых оснований, такие как 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, азатиоприн, 2'-дезоксикоформицин (пентостатин), эритрогидроксинониладенин (ЭГНА), флударабина фосфат и 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин, 2-CdA); природные препараты, включая антимитотические средства, такие как паклитаксел; алкалоиды барвинка, такие как винбластин (VLB), винкристин и винорелбин, таксотер, эстрамустин и эстрамустина фосфат; токсины ноголистника, такие как этопозид и тенипозид; антибиотики, такие как актиномицин D, дауномицин (рубидомицин), доксорубицин, митоксантрон, идарубицин, блеомицины, пликамицин (митрамицин), митомицин С и актиномицин; ферменты, такие как L-аспарагиназа; модуляторы
биологического ответа, такие как альфа-интерферон, IL-2, G-CSF и GM-CSF; разные средства, в том числе координированные комплексы платины, такие как цисплатин и карбоплатин; анрацендионы, такие как
митоксантрон; замещённые мочевины, такие как гидроксимочевина; производные метилгидразина, в том
числе N-метилгидразин (N-МГ) и прокарбазин; супрессоры коры надпочечников, такие как митотан (o,p'DDD) и аминоглутетимид; гормоны и их антагонисты, в том числе адренокортикостероидные антагонисты, такие как преднизон и его эквиваленты, дексаметазон и аминоглутетимид; прогестины, такие как
гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерона ацетат и мегестрола ацетат; эсторгены, такие как
диэтилстильбестрол, и эквиваленты этинилэстрадиола; антиэстрогены, такие как тамоксифен; андрогены, в том числе тестостерона пропионат и эквиваленты флуоксиместерона; антиандрогены, такие как
флутамид, аналоги гонадолиберина и лейпролид; нестероидные антиандрогены, такие как флутамид.
Противораковая терапия, которая может применяться вместе со специфическим агентом, связывающим Ang-2, также включает, без оганичения, направленную терапию, как описано здесь. Неограничивающим примером направленной терапии является применение терапевтических антител. Неограничивающим примером терапевтических антител могут служить антитела мышиные, химерные мышиночеловеческие, с пересаженными участками, определяющими комплементарность; гуманизированные и
полностью человеческие антитела, а также синтетические антитела, в том числе, например, выбранные
при скрининге библиотек антител, и др. Неограничивающими примерами антител могут являться антитела, связывающие белки клеточной поверхности Her2, CDC20, CDC33, муциноподобный гликопротеид
и рецептор фактора роста эпидермиса (РФРЭ), представленные на поверхности опухолевых клеток, и в
ряде случаев оказывающие цитостатический и/или цитотоксичский эффект на опухолевые клетки, несущие эти белки. Примерами антител также могут служить Херцептин™ (трастузумаб), который может
применяться при лечении рака груди и других форм рака, и Ритуксан™ (ритуксумаб), Зевалин™ (ибритумомаб, тиуксетан), Гливек™ и Лимфоцид™ (эпратузумаб), применимые при лечении неходжкиновой
лимфомы и других форм рака. Некоторые примеры антител также включают Эрбитукс™ (IMC-C225);
Иресса™ (эртинолиб); Бексар™ (йод-131-тоситумомаб); ингибиторы рецептора киназного домена (РКД);
антитела к фактору роста эндотелия сосудов (ФРЭС) и его антагонисты (например, Авастин™ и VEGFTRAP (Ловушка ФРЭС)); антитела к рецептору ФРЭС и их антигенсвязывающие области; антитела к
Ang-1 и их антигенсвязывающие области; антитела к Tie-2 и другим рецепторам Ang-1 и Ang-2; лиганды
Tie-2; антитела к ингибиторам Tie-2-киназы; а также Кампат® (алемтузумаб). В некоторых осуществлениях препаратами для лечения рака являются полипептиды, селективно индуцирующие апоптоз в опухолевых клетках, в том числе родственные ФНО полипептиды, такие как TRAIL (Tumor Necrosis Facror
Receptor Apoptosis-Inducing Ligand - лиганд рецептора ФНО, индуцирующий апоптоз).
В некоторых воплощениях подходящие агенты для лечения рака известны как антиангиогенные
агенты. Некоторые такие агенты включают, без ограничения, IL-8 (интерлейкин-8); Campath™, В-ФРФ
(фактор роста фибробластов В); антагонисты ФРФ; антагонисты Tek (Cerretti et al., публикация
US 2003/0162712; Cerretti et al., патент US 6413932, Cerretti et al., патент US 6521424, каждый из этих документов включен здесь в качестве ссылки для любой цели); агенты против TWEAK (среди которых,
например, антитела, антигенсвязывающие области и др.); антагонисты растворимого рецептора TWEAK
- 35 -
011866
(Wiley, патент US 6727225); дизинтегрины ADAM (или их домены-антагонисты связывания интегрина с
его лигандами (Fanslow et al. - публикация US 2002/0042368)); антитела к рецептору eph и к эфрину, их
антигенсвязывающие области (патенты US 5981245; US 5728813; US 5969110; US 6596852; US 6232447;
US 6057124 и другие члены этого семейства патентов); агенты против ФРЭС, как описано здесь (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связывают ФРЭС или растворимые рецепторы ФРЭС, или лиганды, связывающие его области), такие как Авастин™ или VEGFTRAP™, и агенты против рецептора ФРЭС (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ним), агенты, подавляющие РФРЭ (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ним), такие как панитумумаб, Иресса™
(гефитиниб), Тарцева™ (эрлотиниб), агенты против Ang-1 и против Ang-2 (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ними или с их рецепторами, например
Tie-2/TEK), и агенты, подавляющие Tie-2-киназу (например, антитела или антигенсвязывающие области,
которые специфически связываются и подавляют активность факторов роста, такие как антагонисты фактора роста гепатоцитов (ФРГ, также известного как фактор Скаттера)), антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связывают его рецептор "с-Мет"; антагонисты ФРТ-ВВ (фактора
роста тромбоцитов-ВВ); антитела или антигенсвязывающие области к лигандам ФРТ-ВВ и ингибиторы
киназы рецептора ФРТ.
В некоторых воплощениях подходящие агенты для терапии рака известны как ингибиторы ангиогенеза. Некоторыми из таких ингибиторов являются SD-7784 (Pfizer, США); циленгитид (Merck KGaA,
Германия, ЕРО 770622); октанатрия пегаптаниб (Gilead Sciences, США); альфастатин (BioActa, Великобритания); M-PGA (Celgene, США, US 5712291); иломастат (Arriva, США, US 5892112); семаксаниб
(Pfizer, США, US 5792783); ваталаниб (Novartis, Швейцария); 2-метоксиэстрадиол (EntreMed, США);
TLC ELL-12 (Elan, Ирландия); анекортава ацетат (Alcon, США); альфа-D148 Mab (Amgen, США);
CEP-7055 (Cephalon, США); анти-Vn Mab (Crucell, Нидерланды); DAC:antiangiogenic (ConjuChem, Канада); ангиоцидин (InKine Pharmaceutical, США); KM-2550 (Kyowa Hakko, Япония); SU-0879 (Pfizer,
США); CGP-79787 (Novartis, Швейцария, ЕР 970070); технология АРГЕНТ (Ariad, США); YIGSR-Stealth,
(Johnson&Johnson, США); Е-фрагмент фибриногена (BioActa, Великобритания); ингибитор ангиогенеза
(Trigen, Великобритания); ТВС-1635 (Encysive Pharmaceuticals, США); SC-236 (Pfizer, США); АВТ-567
(Abbott, США); метастатин (EntreMed, США); ингибитор ангиогенеза (Tripep, Швеция); маспин (Sosei,
Япония); 2-метоксиэстрадиол (Oncology Sciences Corporation, США); ER-68203-00 (IVAX, США); бенефин (Lane Labs, США); Tz-93 (Tsumura, Япония); TAN-1120 (Takeda, Япония); FR-111142 (Fujisawa,
Япония, JP 02233610); фактор роста тромбоцитов 4 (RepliGen, США, ЕР 407122); антагонист фактора
роста эндотелия сосудов (Borean, Дания); cancer therapy (средство от рака) (University of South Carolina,
США); бевацизумаб (pINN) (Genentech, США); ингибиторы ангиогенеза (SUGEN, США); XL 784 (Exelixis, США); XL 647 (Exelixis, США); моноклональные антитела к альфа5 бета3-интегрину второго поколения (Applied Molecular Evolution, США и Medlmmune, США); генетическая терапия, ретинопатия
(Oxford BioMedica, Великобритания); энзастаурина гидрохлорид (USAN) (Lilly, США); СЕР 7055 (Cephalon, США и Sanofi-Synthelabo, Франция); ВС 1 (Генуэзский институт раковых исследований, Италия);
ингибитор ангиогенеза (Alchemia, Австралия); антагонист ФРЭС (Regeneron, США); rBPI 21 и BPIпроизводные антиангиогенные средства (ХОМА, США); PI 88 (Progen, Австралия); циленгитид (pINN)
(Merck KGaA; Мюнхенский технический университет, Германия, и Клиника и исследовательский фонд
Скриппса, США); цетуксимаб (INN) (Aventis, Франция); AVE 8062 (Ajinomoto, Япония); AS 1404 (Лаборатория раковых исследований, Новая Зеландия); SG 292 (Telios, США); эндостатин (Бостонский детский госпиталь, США); ATN 161 (Attenuon, США); ангиостатин (Бостонский детский госпиталь, США);
2-метоксиэстрадиол (Бостонский детский госпиталь, США); ZD 6474 (AstraZeneca, Великобритания);
ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals, Великобритания); PPI 2458 (Praecis, США); AZD 9935 (AstraZeneca
Великобритания); AZD 2171 (AstraZeneca, Великобритания); ваталаниб (pINN) (Novartis, Швейцария и
Schering AG, Germany); ингибиторы обмена тканевых факторов (EntreMed, США); пегаптаниб (Pinn)
(Gilead Sciences, США); ксанторризол (Университет Ёнсей, Южная Корея); генетически-основанная вакцина ФРЭС-2 (Клиника и исследовательский фонд Скриппса, США); SPV5.2 (Supratek, Канада); SDX 103
(Университет Калифорнии в Сан-Диего, США); РХ 478 (ProlX, США); метастатин (EntreMed, США);
тропонин I (Гарвардский университет, США); SU 6668 (SUGEN, США); OXI 4503 (OXIGENE, США);
о-гуанидины (Dimensional Pharmaceuticals, США); мотупорамин С (Университет Британской Колумбии,
Канада); CDP 791 (Celltech Group, Великобритания); атипримод (pINN) (GlaxoSmithKline, Великобритания); Е 7820, (Eisai, Япония); CYC 381 (Гарвардский университет, США); АЕ 941 (Aeterna, Канада);
vaccine, angiogenesis (вакцина против ангиогенеза) (EntreMed, США); ингибитор активатора плазминогена урокиназы (Dendreon, США); оглуфанид (pINN) (Melmotte, США); ингибиторы HIF-1альфа (Xenova,
Великобритания); СЕР 5214 (Cephalon, США); BAY RES 2622 (Bayer, Германия); ангиоцидин (InKine,
США); А6 (Angstrom, США); KR 31372 (Корейский исследовательский институт химической технологии, Южная Корея); GW 2286 (GlaxoSmithKline, Великобритания); ЕНТ 0101 (ExonHit, Франция);
СР 868596 (Pfizer, США); СР 564959 (OSI, США); СР 547632 (Pfizer, США); 786034 (GlaxoSmithKline,
- 36 -
011866
Великобритания); KRN 633 (Kirin Brewery, Япония); 2-метоксиэстрадиол и интраокулярная система введения лекарств (EntreMed, США); ангинекс (Университет Маастрихта, Нидерланды и Университет Миннесоты, США); АВТ 510 (Abbott, США); AAL 993 (Novartis, Швейцария); VEGI (ProteomTech, США);
ингибиторы фактора некроза опухолей-альфа (Национальный институт старения США); SU 11248
(Pfizer, США, и SUGEN, США); АВТ 518 (Abbott, США); YH16 (Yantai Rongchang, Китай); S-3APG (Бостонский детский госпиталь, США, и EntreMed, США); MAb, КДР (киназа рецепторного домена) (ImClone
Systems, США); MAb, альфа5 бета1 (Protein Design, США); ингибитор киназы КДР (Celltech Group, Великобритания и Johnson&Johnson, США); GFB 116 (Университет Южной Флориды, США, и Йельский
университет, США); CS 706 (Sankyo, Япония); пролекарство комбретастатин А4р (Университет штата
Аризона, США); хондроитиназа AC (IBEX, Канада); BAY RES 2690 (Bayer, Германия); AGM 1470 (Гарвардский университет, США, Takeda, Япония, и ТАР, США); AG 13925 (Agouron, США); тетратиомолибдат (Университет Мичигана, США); GCS 100 (Университет штата Вэйн, США); CV 247 (Ivy Medical,
Великобритания); CKD 732 (Chong Kun Dang, Южная Корея); моноклональные антитела к фактору роста
эндотелия сосудов (Xenova, Великобритания); ирсогладин (INN) (Nippon Shinyaku, Япония); RG 13577
(Aventis, Франция); WX 360 (Wilex, Германия); скваламин (pINN) (Genaera, США); RPI4610 (Sirna,
США); cancer therapy (лекарство от рака) (Marinova, Австралия); ингибиторы гепараназы (InSight, Израиль); KL 3106 (Kolon, Южная Корея); Гонокиол (Университет Эмори, США); ZK CDK (Schering AG,
Германия); ZK Angio (Schering AG, Германия); ZK 229561 (Novartis, Швейцария, и Schering AG, Германия); XMP 300 (XOMA, США); VGA 1102 (Taisho, Япония); модуляторы рецептора ФРЭС (Pharmacopeia,
США); антагонисты VE-кадерина-2 (ImClone Systems, США); вазостатин (Национальные институты здоровья, США); вакцина Flk-1 (ImClone Systems, США); TZ 93 (Tsumura, Япония); TumStatin (Госпиталь
Бэйт-Исраэль, США); усечённая растворимая форма FLT 1 (рецептора фактора роста сосудистого эндотелия-1) (Merck&Co., США); лиганды Tie-2 (Regeneron, США); ингибитор тромбоспондина 1 (Фонд образования и исследований Allegheny Health, США); 2-бензолсульфонамид-4-(5-(4-хлорфенил)-3(трифторметил)-1Н-пиразол-1-ил)-; Arriva и С-Мет. AVE 8062 ((2S)-2-амино-3-окси-N-[2-метокси-5[(1Z)-2-(3,4,5-триметоксифенил)этенил]фенил]пропанамида моногидрохлорид); метелимумаб (pINN)
(иммуноглобулин G4 к человеческому трансформирующему фактору роста бета1 (человеческие моноклональные CAT, цепь гамма4), дисульфидный димер с каппа-цепью человеческих моноклональных
CAT 192); лиганд Flt3; лиганд CD40; интерлейкин-2; интерлейкин-12; лиганд 4-1ВВ; антитела к 4-1ВВ;
антагонисты ФНО и антагонисты рецептора ФНО, в том числе рецептор ФНО/Fc, антагонисты TWEAK и
антагонисты TWEAK-R, в том числе TWEAK-R/Fc; TRAIL; антагонисты ФРЭС, в том числе антитела к
ФРЭС; антагонисты рецептора ФРЭС (в том числе ФРЭС-R1 и ФРЭС-R2, известные также, как Flt1 и
Flk1 или КДР); агонисты CD 148 (известного нам также как DEP-1, ECRTP и PTPRJ, см. Takahashi et al.,
J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2135-45 (1999), включено здесь путем ссылки); ингибитор тромбоспондина 1, а
также ингибиторы одного или обоих лигандов Tie-2 или Tie-2 (таких как Ang-2). Специалистам известно
множество ингибиторов Ang-2, в том числе некоторые антитела к Ang-2, описанные в опубликованной
патентной заявке US 20030124129 (соответствующей международной заявке WO 03/030833) и в патенте
US 6166185, содержание которых полностью включено в описание путем ссылки. Кроме того, пептидные
антитела к Ang-2 также известны специалистам, сведения о них опубликованы, например, в заявке
US 20030229023 (соответствующей международной заявке WO 03/057134) и в заявке US 20030236193,
содержание которых полностью включено здесь путем ссылки.
Некоторыми средствами лечения рака являются, например, талидомид и его аналоги
(N-(2,6-диоксо-3-пиперидил)фталимид); текогалан-натрий (сульфированный полисахарид пептидогликан); TAN 1120 (8-ацетил-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-10-[[октагидро-5-гидрокси2-(2-5-гидроксипропил)-4,10-диметилпирано[3,4-d]-1,3,6-диоксазоцин-8-ил]окси]-5,12-нафтациндион);
сурадиста (7,7'-[карбонил-бис-[имино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1H-пиррол4,2-диил)карбонилимино]]-бис-1,3-нафталиндисульфоновой кислоты четырёхнариевая соль); SU 302;
SU 301; SU 1498 ((Е)-2-циано-3-[4-гидрокси-3,5-бис-(1-метилэтил)фенил]-N-(3-фенилпропил)-2пропенамид); SU 1433 (4-(6,7-диметил-2-хиноксалинил)-1,2-бензолдиол); ST 1514; SR 25989; растворимый Tie-2; производные селективного модулятора рецептора экстрогена, Фармос; семаксаниб (pINN)
(3-[(3,5-диметил-1Н-пиррол-2-ил)метилен]-1,3-дигидро-2Н-индол-2-он); S 836; RG 8803; рестин; R 440
(3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-(1-метил-6-нитро-1Н-индол-3-ил)-1Н-пиррол-2,5-дион);
R
123942
(1-[6-(1,2,4-тиадиазол-5-ил)-3-пиридазинил]-N-[3-(трифторметил)фенил]-4-пиперидинамин); ингибитор
пропилгидроксилазы; гены повышенной прогрессии; приномастат (INN) ((S)-2,2-диметил-4-[[п-(4пиридилокси)фенил]сульфонил]-3-тиоморфолинкарбогидроксамовая кислота); NV 1030; NM 3
(8-гидрокси-6-метокси-альфа-метил-1-оксо-1H-2-бензопиран-3-уксусная кислота); NF 681; NF 050; MIG;
МЭТ 2; МЭТ 1; манассантин В (альфа-[1-[4-[5-[4-[2-(3,4-диметоксифенил)-2-гидрокси-1-метилэтокси]-3метоксифенил]тетрагидро-3,4-диметил-2-фуранил]-2-метоксифенокси]этил]-1,3-бензодиоксол-5метанол); моноклональные антитела к РДК (рецептору киназного домена); антитела против альфа5бета3интегрина; LY 290293 (2-амино-4-(3-пиридинил)-4Н-нафто[1,2-b]пиран-3-карбонитрил); KP 0201448;
KM 2550; интегринспецифические пептиды; INGN 401; GYKI 66475; GYKI 66462; гринстатин (101-354плазминоген (человеческий)); генная терапия ревматоидного артрита, рака предстательной железы, рака
- 37 -
011866
яичника, глиомы, рака прямой и толстой кишки, эндостатин, ATF BTPI, гены против ангиогенеза, ингибитор ангиогенеза; ингибитор желатиназы, FR 111142 (4,5-дигидрокси-2-гексеновой кислоты 5-метокси4-[2-метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксиранил]-1-оксаспиро[2.5]окт-6-иловый эфир); форфенимекс (pINN)
((S)-альфа-амино-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)бензолуксусная кислота); антагонист фибронектина
(1-ацетил-L-пролил-L-гистидил-L-серил-L-цистеинил-L-аспартамид); ингибитор рецептора фактора роста фибробластов; антагонист фактора роста фибробластов; FCE 27164 (7,7'-[карбонил-бис-[имино(1метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1H-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]]-бис-1,3,5нафталинтрисульфоновой кислоты шестинатриевая соль); FCE 26752 (8,8'-[карбонил-бис-[имино(1метил-1Н-пиррол-4,2-(диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]]-бис-1,3,6нафталинтрисульфоновая кислота); полипептид, активирующий эндотелиальные моноциты II; антисенсолигонуклеотид рецептора ФРЭС; антиангиогенный и трофический факторы; ангиостатический агент
ANCHOR; эндостатин; ангиогенный белок Del-1; CT 3577; контортростатин; CM 101; хондроитиназа AC;
CDP 845; CanStatin; BST 2002; BST 2001; BLS 0597; BIBF 1000; аррестин; апомигрен (1304-1388коллаген типа XV (человеческий ген предшественника COL15A1 альфа-1-цепи)); ангиоингибин; aaATIII;
А 36; 9альфа-фтормедроксипрогестерона ацетат ((6-альфа)-17-(ацетилокси)-9-фтор-6-метил-прегн-4-ен3,20-дион); 2-метил-2-фталимидиноглутаровая кислота (2-(1,3-дигидро-1-оксо-2Н-изоиндол-2-ил)-2метилпентандиовая кислота); моноклональные антитела ВС-1, меченые иттрием-90; Семаксаниб (3-(4,5диметилпиррол-2-илметилен)индолин-2-он) (C15H14N2O); PI 88 (фосфоманнопентозы сульфат); альвоцидиб (4Н-1-бензопиран-4-он), 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-(3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил)цис-(-)-)(C21H20ClNO5); E 7820; SU 11248 (5-[3-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-(3Z)-илиденметил]-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоксикислоты (2-диэтиламиноэтил)амид) (C22H27FN4O2); скваламин (холестан7,24-диол, 3-[3-[(4-аминобутил)аминопропил]амино]-, 24-(гидросульфат), (3бета,5альфа,7альфа)-)
(C34H65N3O5S); эриохром чёрный Т; AGM 1470 (карбаминовой кислоты (хлорацетил)-, 5-метокси-4-[2метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксиранил]-1-оксаспиро[2,5]окт-6-иловый эфир, [3R-[3альфа,4альфа(2R,
3R),5бета,6бета]]) (C19H28ClNO6); AZD 9935; BIBF 1000; AZD 2171; АВТ 828; KS-интерлейкин-2;
утероглобин; А 6; NSC 639366 (1-[3-(диэтиламино)-2-гидроксипропиламино]-4-(оксиран-2илметиламино)антрахинона фумарат) (C24H29N3O4⋅C4H4O4); ISV 616; конъюгированные белки против EDB; HUI 77; тропонин I; моноклональные антитела ВС-1; SPV 5.2; ER 68203; CKD 731
(3-(3,4,5-триметоксифенил)-2(Е)-пропеновой кислоты (3R,4S,5S,6R)-4-[2(R)-метил-3(R)-3(R)-(3-метил-2бутенил)оксиран-2-ил]-5-метокси-1-оксаспиро[2.5]окт-6-иловый эфир) (C28H38O8); IMC-1C11; aaATIII;
SC 7; СМ 101; ангиокол; Kringle 5; CKD 732 (3-[4-[2-(диметиламино)этокси]фенил]-2(Е)-пропеновая кислота) (C29H41NO6); U 995; канстатин; SQ 885; CT 2584 (1-[1-(додециламино)-10-гидроксиундецил]-3,7диметилксантин) (C30H55N5O3); сальмостин; ЕМАР II; ТХ 1920 (1-(4-метилпиперазино)-2-(2-нитро-1Н-1имидазолил)-1-этанон) (C10H15N5O3); ингибитор альфа-v бета-х; CHIR 11509 (N-(1-пропинил)глицил-[N(2-нафтил)]глицил-[N-(карбамоилметил)]глицин-бис-(4-метоксифенил)метиламид)
(C36H37N5O6);
BST 2002; BST 2001; В 0829; FR 111142; 4,5-дигидрокси-2(Е)-гексеновой кислоты (3R,4S,5S,6R)-4[1(R),2(R)-эпокси-1,5-диметил-4-гексенил]-5-метокси-1-оксаспиро[2.5]октан-6-иловый эфир (C22H34O7) и
ингибиторы киназ, в том числе, например, N-(4-хлорфенил)-4-(4-пиридинилметил)-1-фталазинамин;
4-[4-[[[[4-хлор-3-(трифторметил)фенил]амино]карбонил]амино]фенокси]-N-метил-2-пиридинкарбоксамид;
N-[2-(диэтиламино)этил]-5-[(5-фтор-1,2-дигидро-2-оксо-3Н-индол-3-илиден)метил]-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоксамид;
3-[(4-бромо-2,6-дифторфенил)метокси]-5-[[[[4-(1-пирролидинил)бутил]амино]карбонил]амино]-4-изотиазолкарбоксамид; N-(4-бром-2-фторфенил)-6-метокси-7-[(1-метил4-пиперидинил)метокси]-4-хиназолинамин; 3-[5,6,7,13-тетрагидро-9-[(1-метилэтокси)метил]-5-оксо-12Ниндено[2,1-а]пирроло[3,4-с]карбазол-12-ил]пропиловый эфир N,N-диметилглицина; N-[5-[[[5-(1,1диметилэтил)-2-оксазолил]метил]тио]-2-тиазолил]-4-пиперидинкарбоксамид;
N-[3-хлор-4-[(3фторфенил)метокси]фенил]-6-[5-[[[2-(метилсульфонил)этил]амино]метил]-2-фуранил]-4-хиназолинамин;
4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамид; N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропокси]-4-хиназолинамин; N-(3этинилфенил)-6,7-бис-(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин;
N-(3-((((2R)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((3-(1,3-оксазол-5-ил)фенил)амино)-3-пиридинкарбоксамид;
2-(((4-фторфенил)метил)амино)-N-(3-((((2R)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; N-[3-(азетидин-3-илметокси)-5-трифторметилфенил]-2-(4-фторбензиламино)никотинамид;
6-фтор-N-(4-(1-метилэтил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид;
2-((4-5-пиридинилметил)амино)-N-(3-(((2S)-2-пирролидинилметил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3-(1,1-диметилэтил)-1Н-пиразол-5-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3,3-диметил-2,3-дигидро-1-бензофуран-6-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид;
N-(3-((((2S)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-((4-пиридинилметил)амино)-N-(3-((2-(1пирролидинил)этил)окси)-4-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3,3-диметил-2,3-дигидро1Н-индол-6-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(4-(пентафторэтил)-3-(((2S)-2пирролидинилметил)окси)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид;
N-(3-((3-азетидинилметил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид;
- 38 -
011866
N-(3-(4-пиперидинилокси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((2-(3-пиридинил)этил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(4,4-диметил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид;
2-(1Н-индазол-6-иламино)-N-[3-(1-метилпирролидин-2-илметокси)-5-трифторметилфенил]никотинамид;
N-[1-(2-диметиламиноацетил)-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил]-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид; 2-(1Н-индазол-6-иламино)-N-[3-(пирролидин-2-илметокси)-5-трифторметилфенил]никотинамид;
N-(1-ацетил-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид;
N-(4,4-диметил-1-оксо-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид;
N-[4-(трет-бутил)-3-(3-пиперидилпропил)фенил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид;
N-[5-(трет-бутил)изоксазол-3-ил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид
и
N-[4-(третбутил)фенил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид и ингибиторы киназ, описанные в патентах US 6258812; US 6235764; US 6630500; US 6515004; US 6713485; US 5521184; US 5770599;
US 5747498; US 5990141 и патентных заявках US 20030105091, WO 01/37820; WO 01/32651;
WO 02/68406; WO 02/66470; WO 02/55501; WO 04/05279; WO 04/07481; WO 04/07458; WO 04/09784;
WO 02/59110; WO 99/45009; WO 98/35958; WO 00/59509; WO 99/61422; WO 00/12089 и WO 00/02871,
каждая из них включена здесь путем ссылки для любой цели.
В сочетанной терапии с факторами роста могут применяться цитокины, лимфокины, факторы роста
или другие факторы гематопоэза, такие как МКСФ (макрофагоколониестимулирующий фактор),
ГМКСФ (гранулоцитомакрофагоколониестимулирующий фактор), ФНО, IL-1 (интерлейкин-1), IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, интерферон, ФНО0, ФНО1, ФНО2, ГКСФ (гранулоцитоколониестимулирующий фактор), МегКСФ (мегакариоцитоколониестимулирующий фактор), ГМКСФ, тромбопоэтин, фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Среди других веществ могут иметь место известные ангиопоэтины, такие как Ang-1, -2, -4, -Y,
и/или человеческий Ang-подобный полипептид, и/или фактор роста сосудистого эндотелия (ФРЭС).
Факторами роста являются ангиогенин, костный морфогенный белок-1, костный морфогенный белок-2,
костный морфогенный белок-3, костный морфогенный белок-4, костный морфогенный белок-5, костный
морфогенный белок-6, костный морфогенный белок-7, костный морфогенный белок-8, костный морфогенный белок-9, костный морфогенный белок-10, костный морфогенный белок-11, костный морфогенный белок-12, костный морфогенный белок-13, костный морфогенный белок-14, костный морфогенный
белок-15, рецептор костного морфогенного белка-1А, рецептор костного морфогенного белка-1В, нейротрофный фактор мозгового происхождения, ресничный нейротрофный фактор, рецептор ресничного
нейротрофного фактора, индуцируемый цитокинами фактор хемотаксиса нейтрофилов-1, индуцируемый
цитокинами фактор хемотаксиса нейтрофилов-2, фактор роста эндотелиальных клеток, эндотелии-1,
фактор роста эпидермиса, аттрактант нейтрофилов эпителиального происхождения, фактор роста фибробластов-4, фактор роста фибробластов-5, фактор роста фибробластов-6, фактор роста фибробластов-7,
фактор роста фибробластов-8, фактор роста фибробластов-8b, фактор роста фибробластов-8с, фактор
роста фибробластов-9, фактор роста фибробластов-10, кислый фактор роста фибробластов, основный
фактор роста фибробластов, рецептор нейротрофного фактора из линии глиальных клеток-1, рецептор
нейротрофного фактора из линии глиальных клеток-2, белок, связанный с ростом; белок, связанный с
ростом-2, белок, связанный с ростом-3; гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста, фактор роста
гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста-1, рецептор инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобный фактор роста-II, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста; фактор роста кератоцитов, фактор, подавляющий лейкемию; рецептор фактора, подавляющего лейкемию-1; фактор роста нервов и его рецептор, нейротрофин-3, нейротрофин-4, плацентарный фактор роста, плацентарный фактор роста-2, фактор роста эндотелиальных клеток из кровяных
пластинок, фактор роста из кровяных пластинок, фактор роста из кровяных пластинок цепь А, фактор
роста из кровяных пластинок АА, фактор роста из кровяных пластинок АВ, фактор роста из кровяных
пластинок цепь В, фактор роста из кровяных пластинок ВВ, рецептор фактора роста из кровяных пластинок-1, рецептор фактора роста из кровяных пластинок-2, фактор стимуляции роста предшественников
В-клеток, фактор стволовых клеток, рецептор фактора стволовых клеток, трансформирующий фактор
роста-1, трансформирующий фактор роста-2, трансформирующий фактор роста-3, трансформирующий
фактор роста-4, трансформирующий фактор роста-5, латентный трансформирующий фактор роста-1,
белок I, связывающий трансформирующий фактор роста-1; белок II, связывающий трансформирующий
фактор роста-1; белок III, связывающий трансформирующий фактор роста-1; рецептор фактора некроза
опухолей 1 типа (ФНО-Р1), рецептор фактора некроза опухолей 2 типа (ФНО-Р2), рецептор активатора
плазминогена урокиназного типа, фактор роста эндотелия сосудов, а также химерные белки и биологически или иммунологически активные их фрагменты.
Очевидно, что специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению,
можно вводить с одним или несколькими противовоспалительными агентами. Под противовоспалительным агентом здесь понимается любое вещество, которое снижает воспаление или опухание у пациента.
Здесь приводится множество примеров противовоспалительных агентов, однако следует понимать, что
могут существовать и другие приемлемые противовоспалительные агенты, которые не указаны здесь
конкретно, но которые, тем не менее, охватываются настоящим изобретением.
- 39 -
011866
Противовоспалительным агентом может являться, например, соединение, которое подавляет взаимодействие противовоспалительных цитокинов с их рецепторами. Примерами ингибиторов цитокинов,
применимых в сочетании со специфическими связывающими агентами, соответствующими настоящему
изобретению, являются, например, антагонисты (такие как антитела) ТРФ-бета, а также антагонисты (такие как антитела), направленные против интерлейкинов, вовлечённых в воспалительный процесс. Такими интерлейкинами, описанными здесь, предпочтительно являются, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 и др. (см. Feghali, et al., Frontiers in Biosci., 2: 12-26
(1997)).
Специфические связывающие агенты по настоящему изобретению можно также вводить в сочетании с ингибиторами протеинкиназы А типа I для усиления пролиферации Т-клеток у ВИЧинфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию.
Факторы роста нервов (ФРН) также можно комбинировать со специфическими связывающими
агентами, соответствующими настоящему изобретению, при лечении определённых состояний. Такими
состояниями являются нейродегенеративные заболевания, повреждения спинного мозга и множественный склероз. Другими состояниями, котрые можно лечить такой комбинацией, являются глаукома и диабет.
Предпочтительный вариант комбинированной терапии относится к специфическому связывающему
агенту, соответствующему настоящему изобретению, вводящемуся пациенту в сочетании с одним или
несколькими приемлемыми ингибиторами IL-1 (интерлейкина-1). Ингибиторами IL-1 являются, например, рецепторсвязывающие пептидные фрагменты IL-1, антитела к IL-1 или IL-1-бета или рецептора
IL-1 типа 1 и рекомбинантные белки, содержащие целиком или частично молекулы рецепторов IL-1 или
их модифицированные варианты, в том числе генетически модифицированные мутеины, олигомерные
формы и составы с замедленным высвобождением. Специфическими антагонистами являются полипептиды IL-1ra, ингибиторы IL-1-бета-превращающего фермента, антагонистические антитела κ-рецептора
IL-1 типа 1, формы рецепторов IL-1 типа 1 и типа 2, связывающие IL-1; антитела к IL-1, в том числе к
IL-1 альфа и IL-1 бета и другим членам семейства IL-1, а также средство, известное как ловушка IL-1
(Regeneron). Полипептиды IL-1ra являются формами IL-1ra, описанными в патенте US 5075222, а также
модифицированными формами и вариантами, в том числе описанными в US 5922573, WO 91/17184,
WO 92/16221 WO 96/09323. Ингибиторами IL-1-бета-превращающего фермента (ICE - IL-1-beta converting enzyme) являются пептидильный и низкомолекулярный ингибиторы, в том числе описанные в международных заявках WO 91/15577; WO 93/05071; WO 93/09135; WO 93/14777 и WO 93/16710, а также в
заявке на европейский патент ЕР 0547699. Непептидильные соединения включают описанные в международной заявке WO 95/26958, патенте US 5552400, патенте US 6121266 и в статье Dolle et al., J. Med.
Chem., 39, p. 2438-2440 (1996). Другие ингибиторы ICE описаны в патентах US 6162790, US 6204261,
US 6136787, US 6103711, US 6025147, US 6008217, US 5973111, US 5874424, US 5847135, US 5843904,
US 5756466, US 5656627, US 5716929. IL-1-связывающие формы рецепторов IL-1 типов I и II описаны в
патентах US 4968607, US 4968607, US 5081228, US Re 35450, US 5319071 и US 5350683. Другие подходящие антагонисты IL-1 включают, без ограничения, пептиды, происходящие из IL-1, которые способны
конкурентно связываться с сигнальным рецептором IL-1 (IL-1 R типа I). Дополнительные сведения по
различным антагонистам IL-1 (и других цитокинов) можно найти в патенте US 6472179.
Кроме того, подходящими являются ингибиторы ФНО, которые включают, без ограничения, рецепторсвязывающие пептидные фрагменты ФНОα, противосмысловые олигонуклеотиды и рибозимы, подавляющие выработку ФНОα, антитела к ФНОα и рекомбинантные белки, несущие рецепторы ФНОα,
целиком или частями, а также их модифицированные формы, в том числе генетически модифицированные мутеины, олигомерные формы и составы с длительным высвобождением. Пригодными являются
также ингибиторы ТАСЕ (Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme - ФНОα-превращающий фермент),
такие как TAPI (Tumor Necrosis Factor-α Protease Inhibitor - ингибитор протеазы ФНОα) (Immunex Corp.)
и GW-3333X (Glaxo Wellcome Inc.). Пригодны и молекулы, подавляющие образование комплекса
IgA-α1AT, например пептиды, описанные в ЕР 0614464 В, либо антитела к этому комплексу. Другими
пригодными молекулами являются, например, ФНОα-ингибирующие дисахариды, сульфатированные
производные глюкозамина или другие сходные углеводы, описанные в патенте US 6020323. Кроме того,
пригодными молекулами являются пептидные ингибиторы ФНОα, описанные в патентах US 5641751 и
US 5519000, а также пептиды, содержащие D-аминокислоты, описанные в патенте US 5753628. Сверх
того, пригодны также ингибиторы ФНОα-превращающего фермента. WO 01/03719 описывает и другие
средства, которые могут найти применение в сочетании, соответствующем настоящему изобретению.
Другими подходящими средствами являются, например, низкомолекулярные вещества, такие как
талидомид и его аналоги, пентоксифиллин или ингибиторы матриксной металлопротеазы (ММП), а также другие низкомолекулярные вещества. Подходящими ингибиторами ММП для этих целей являются,
например, описанные в патентах US 5883131, US 5863949 и US 5861510, а также меркаптоалкилпептидильные соединения, описанные в патенте US 5872146. Другими низкомолекулярными веществами, способными снижать продукцию ФНОα, являются, например, описанные в патентах US 5508300,
- 40 -
011866
US 5596013 и US 5563143. Другими пригодными низкомолекулярными веществами являются, без ограничения, ингибиторы ММП, описанные в патентах US 5747514 и US 5691382, и производные гидроксамовой кислоты, такие как описанные в US 5821262. Прочие подходящие молекулы представляют собой,
к примеру, низкомолекулярные соединения, которые ингибируют выработку фосфодиэстеразы IV и
ФНОα, такие как замещённые производные оксимов (WO 96/00215), хинолинсульфонамиды (патент
US 5834485), производные арилфурана (WO 99/18095) и гетероциклические производные (WO 96/01825;
GB 2291422 А). Пригодны и производные тиазола, ингибирующие ФНОα и интерферон-γ
(WO 99/15524), а также ксантиновые производные, ингибирующие ФНОα и другие провоспалительные
цитокины (см., например, патенты US 5118500, US 5096906 и US 5196430). Дополнительные низкомолекулярные вещества, применимые в лечении описанных здесь состояний, представляют собой соединения, описанные в патенте US 5547979.
Другими примерами лекарств и типов лекарств, которые можно вводить в рамках комбинированной
терапии, включают, без ограничения, антивирусные средства, антибиотики, анальгетики (например, ацетаминофен кодеин, пропоксифен напсилат, оксикодона гидрохлорид, гидрокодона битартрат, трамадол),
кортикостероиды, антагонисты провоспалительных цитокинов, противоревматические препараты, модифицирующие заболевание (DMARD - Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug), нестероидные противовоспалительные средства (NSAID - Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug), антиревматические средства
медленного действия (SAARD -Slow-Acting Anti-Rheumatic Drugs) и др.
Примеры противоревматических препаратов, модифицирующих заболевание, (DMARD) включают,
без ограничения, Реуматекс™ (метотрексат); Энбрел® (этанерцепт); Ремикад® (инфликсимаб); Химура™ (адалимумаб); Сегард® (афелимомаб); Арава™ (лефлумомид); Кинерет™ (анакинра); Арава™ (лефлуномид); D-пеницилламин; Миохризин; Плакенил; Ridaura™ (ауранофин); солганал; ленерцепт
(Hoffman-La Roche); CDP870 (Celltech); CDP571 (Celltech), а также антитела, описанные в ЕР 0516785 B1,
US 5656272, ЕР 0492448 А1; онерцепт (Serono; CAS reg. no. 199685-57-9); MRA (Chugai); Имуран™ (азатиоприн); ингибиторы ядерного фактора κ-В; Цитоксан™ (циклофосфамид); циклоспорин; оксихлорохина сульфат; миноциклин; сульфасалазин и соединения золота, такие как пероральное золото, золотонатрия тиомалат и ауротиоглюкоза.
Далее, пригодными молекулами являются, например, растворимые рецепторы ФНО, происходящие
из внеклеточных доменов молекул рецептора ФНОα, отличных от рецепторов ФНО р55 и р75, такие как,
например, рецепторы ФНО, описанные в WO 99/04001, в том числе слитые белки рецептор
ФНО-иммуноглобулин, производные от этого рецептора ФНО. Другие приемлемые ингибиторы ФНОα
тоже подходят для применения, как описано здесь. При этом подразумевается использование не только
антител к ФНОα или рецептору ФНО, как это описано здесь, но и производного от ФНОα пептида, который может действовать как конкурентный ингибитор ФНОα (US 5795859 или US 6107273), конъюгаты
рецептор ФНО-иммуноглобулин G, например, содержащие экстрацеллюлярный домен рецептора ФНОα
р55, растворимый рецептор фНОα, отличный от конъюгата с IgG, либо другие молекулы, которые могут
понизить эндогенный уровень ФНОα, такие как ингибиторы ФНОα-превращающего фермента (см., например, US 5594106), либо низкомолекулярные вещества или ингибиторы ФНОα, множество которых
было описано здесь.
В отношении антител к ФНО, хотя их доза оптимальным образом будет определяться опытным
специалистом в области здравоохранения в соответствии с конкретными нуждами пациента, предпочтительный диапазон дозы антител к ФНОα составляет от 0,1 до 20 мг/кг, более предпочтительно 1-10 мг/кг.
Другой предпочтительный интервал доз для антител к ФНОα составляет от 0,75 до 7,5 мг/кг массы тела.
В рамках настоящего изобретения можно применять специфический связывающий агент и одно или
несколько нестероидных противовоспалительных средств (НСПВС). Противовоспалительное действие
НСПВС обусловлено, по меньшей мере частично, ингибированием синтеза простагландинов (Goodman,
Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan 7th Edition (1985)). НСПВС можно разделить
на 9 групп:
1) производные салициловой кислоты,
2) производные пропионовой кислоты,
3) производные уксусной кислоты,
4) производные фенаминовой кислоты,
5) производные карбокислоты,
6) производные масляной кислоты,
7) оксикамы,
8) пиразолы,
9) пиразолоны.
Неограничивающими примерами НСПВС являются, в частности, Анапрокс™, Анапрокс Ds™ (напроксен-натрий); Ансаид™ (флурбипрофен); Артротек™ (диклофенак натрия+мизопростил); Катафлам/Вольтарен (диклофенак калия); Клинорил (сулиндак); Дейпро™ (оксапрозин); Дисальцид™ (сальса- 41 -
011866
лат); Долобид™ (дифлунизал); ЕС Напросин™ (напроксен-натрий); Фельден™ (пироксикам); Индоцин™,
Индоцин SR™ (индометацин); Лодин™, Лодин XL™ (этодолак); Мотрин™ (ибупрофен); Напрелан™
(напроксен); Напросин™ (напроксен); Орудис™ (кетопрофен); Оруваил™ (кетопрофен); Релафен™ (набуметон); Толектин™, (тольметин-натрий); Трилисат™ (холина-магния трисалицилат); ингибиторы Сох1; ингибиторы Сох-2, такие как Виокс™ (рофекоксиб); Аркоксия™ (эторикоксиб), Целебрекс™ (целекоксиб); Мобик™ (мелоксикам); Бекстра™ (вальдекоксиб), Династал™ (паракоксиб-натрий); Прексиж™
(люмиракоксиб) инамбуметон.
Другие пригодные НСПВП включают, без ограничения, следующее: эпсилон-ацетамидокапроновая
кислота, S-аденозилметионин, 3-амино-4-оксимасляная кислота, амиксетрин, анитразафен, антрафеин,
бендазак, бендазак лизинат, бензидамин, бепрозин, броперамол, буколом, буфезолак, ципроквазон, клоксимат, дазидамин, дебоксамет, детомидин, дифенпирамид, дифисаламин, дитазол, эморфазон, фанетизол
мезилат, фенфлумизол, флоктафенин, флумизол, флуниксин, флупроквазон, фопиртолин, фосфосал,
гваймесал, гвайзолин, изониксирн, лефетамин-HCl, лефлуномид, лофемизол, лотифазол, лизинклониксинат, мезеклазон, набуметон, никтиндол, нимесулид, орготеин, опраноксин, оксацепрольм, оксападол, паранилин, перизоксал, перизоксала цитрат, пифоксим, пипроксен, пиразолак, пирфенидон, проквазон, проксазол, тиелавин В, тифламизол, тимегадин, толектин, тольпадол, триптамид и вещества, обозначенные фирменным кодовым номером, в частности 480156S, АА861, AD1590, AFP802, AFP860,
AI77B, АР504, AU8001, ВРРС, BW540C, CHINOIN 127, CN100, ЕВ382, EL508, F1044, FK-506, GV3658,
ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830,
RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, ТА60, TAI-901 (4-бензоил-1индакарбоксикислота), TVX2706, U60257, UR2301 и WY41770. Структурно-родственные НСПВП, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, что и НСПВП, также охватываются этой группой.
Пригодные SAARD или DMARD включают, без ограничения, аллокупреид натрия, ауранофин,
ауротиоглюкоза, ауротиогликанид, азатиоприн, брекинар-натрий, буцилламин, кальция 3-ауротио-2пропанол-1-сульфонат, хлорамбуцил, хлорохин, клобузарит, купроксолин, циклофосфамид, циклоспорин, дапсон, 15-дезоксиспергуалин, диацереин, глюкозамин, соли золота (например, циклохина золотая
соль, золота-натрия тиомалат, золота-натрия тиосульфат), гидроксихлорохин, гидроксимочевина, кебузон, левамизол, лобензарит, мелиттин, 6-меркаптопурин, метотрексат, мизорибин, микофенолят мофетил, миорал, азотные аналоги иприта, D-пеницилламин, пиридинол, имидазолы, такие как SKNF86002 и
SB203580, рапамицин, тиолы, тимопоэтин и винкристин. Подразумевается, что структурно-родственные
SAARD и DMARD, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами,
также охватываются этой группой.
Ингибиторы киназ в сигнальных каскадах также являются пригодными агентами для комбинирования со специфическими связывающими агентами, соответствующими настоящему изобретению. Среди
них, например, вещества, способные ингибировать Р-38 (также известные как "RK" или "SAPK-2", Lee et
al., Nature, 372: 739 (1994)). P-38 описан как сериновая/треониновая киназа (см. Han et al., Biochimica Biophysica Acta, 1265: 224-227 (1995)). Было показано, что ингибиторы Р-38 учатвуют в событиях, происходящих между внеклеточной стимуляцией и секрецией клеткой IL-1 и ФНОα, блокируя передачу сигнала
посредством ингибирования киназы, участвующей в пути передачи сигнала.
Пригодны также ингибиторы MK2 и tpl-2. Кроме того, пригодными являются также ингибиторы
Т-клеток, включающие, например, ctla-4, 30 CsA, Fk-506, OX40, OX40R-Fc, антитела к ОХ40, лиганд
ОХ40, антитела к лиганду ОХ40, lck и ZAP70. Пригодны также ретиноиды, в том числе для перорального
применения, а также антагонисты TGF-бета.
Кроме того, пригодные агенты для комбинирования со специфическими связывающими агентами,
соответствующими настоящему изобретению, включают, например, любое производное или несколько
производных салициловой кислоты либо их сложные эфиры-пролекарства или же их фармацевтически
приемлемые соли. Такие производные салициловой кислоты, пролекарственные сложные эфиры и фармацевтически приемлемые соли салициловой кислоты включают, например, ацетаминосалол, алоксиприн, аспирин, бенорилат, бромосалигенин, ацетилсалицилат кальция, холина-магния трисалицилат,
дифлусинал, этерсалат, фендосал, гентизиновая кислота, гликольсалицилат, имидазолсалицилат, лизина
ацетилсалицилат, месаламин, морфолинсалицилат, 1-нафтилсалицилат, ольсалазин, парсалмид, фенилацетилсалицилат, фенилсалицилат, салацетамид, салициламид-O-уксусная кислота, сальсалат и сульфасалазин. Подразумевается, что структурно-родственные производные салициловой кислоты, обладающие
сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Среди прочих пригодных агентов, например, производные пропионовой кислоты, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются альминопрофен, беноксапрофен, буклоксовая кислота, карпрофен, дексиндопрофен, фенопрофен, флуноксапрофен,
флупрофен, флурбипрофен, фурклопрофен, ибупрофен, ибупрофен-алюминий, ибупроксам, индопрофен,
иопрофен, кетопрофен, локсопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пикетопрофен, пимепрофен,
пирпрофен, пранопрофен, протизиновая кислота, пиридоксипрофен, супрофен, тиапрофеновая кислота и
- 42 -
011866
тиоксапрофен. Подразумевается, что структурно-родственные производные пропионовой кислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой
группой. Пригодными для применения являются также производные уксусной кислоты, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются ацеметацин,
алклофенак, амфенак, буфексамак, цинметацин, клопирак, дельметацин, диклофенак-натрий, этодолак,
фельбинак, фенклофенак, фенклорак, фенклозовая кислота, фентиазак, флурофенак, глукаметацин, ибуфенак, индометацин, изофезолак, изоксепак, лоназолак, метиазиновая кислота, оксаметацин, оксипинак,
пиметацин, проглуметацин, сулиндак, тальметацин, тиарамид, тиопинак, тольметин, зидометацин и зомепирак. Подразумевается, что структурно-родственные производные уксусной кислоты, обладающие
сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Пригодными для применения являются также производные фенаминовой кислоты, их сложные
эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются энфенаминовая кислота, этофенамат, флуфенаминовая кислота, изониксин, меклофенаминовая кислота, меклофенамат натрия, медофенаминовая кислота, мефанаминовая кислота, нифлумовая кислота, тальнифлумат,
терофенамат, толфенаминовая кислота и уфенамат. Подразумевается, что структурно-родственные производные фенаминовой кислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными
свойсвами, также охватываются этой группой.
Пригодными для применения являются также производные карбокислоты, их сложные эфирыпролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются клиданак, дифлунисал, флуфенисал, иноридин, кеторолак и финоридин. Подразумевается, что структурно-родственные
производные карбокислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными
свойсвами, также охватываются этой группой. Пригодными для применения являются также производные масляной кислоты, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются бумадизон, бутибуфен, фенбуфен и ксенбуцин. Подразумевается, что структурно-родственные производные масляной кислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойсвами, также охватываются этой группой. Оксикамы, их сложные эфирыпролекарства и фармацевтически приемлемые соли также являются пригодными для применения. Среди
них: дроксикам, эноликам, изоксикам, пироксикам, судоксикам, теноксикам и 4-гидрокси-1,2бензотиазин-1,1-диоксид 4-(N-фенил)карбоксамид. Подразумевается, что структурно-родственные оксикамы, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Пиразолы, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли
также являются пригодными для применения. Среди них: дифенамизол и эпиризол. Подразумевается,
что структурно-родственные пиразолы, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Кроме того, пиразолоны, их сложные эфирыпролекарства и фармацевтически приемлемые соли также являются пригодными для применения. Среди
них: апазон, азапропазон, бензпиперилон, фепразон, мофебутазон, моразон, оксифенбутазон, фенилбутазон, пипебузон, пропилфеназон, рамифеназон, суксибузон и тиазолинобутазон. Подразумевается, что
структурно-родственные пиразолоны, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой.
Пригодными для лечения заболеваний, опосредованных ФНО, являются сложные эфирыпролекарства и фармацевтически приемлемые соли. Кортикостероиды, их сложные эфиры-пролекарства
и фармацевтически приемлемые соли включают гидрокортизон и производные гидрокортизона, такие
как 21-ацетоксипрегненолон, акломеразон, альгестон, амцинонид, беклометазон, бета-метазон, бетаметазона валерат, будесонид, хлорпреднизон, клобетазол, клобетазола пропионат, клобетазон, клобетазона
бутират, клокорталон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол, дефлазакон, десонид, дезоксимеразон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, эноксолон, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флуметазона пивалат, флунизолид, флуцинолона ацетонид, флуоцинонид, флуороцинолона ацетонид, бутилфлуокортин, флуорокортолон, флуорокортолона гексаноат, дифлукортолона валерат, флуорометолон, флуперолона ацетат, флупреднидена ацетат, флупреднизолон, флуранденолид,
формокортал, гальцинонид, галометазон, галопредона ацетат, гидрокортамат, гидрокортизон, гидрокортизона ацетат, гидрокортизона бутират, гидрокортизона фосфат, гидрокортизона 21-натрия сукцинат,
гидрокортизона тебутат, мазипредон, медризон, мепреднизон, метилпредниколон, мометазона фуроат,
параметазон, предникарбат, преднизолон, преднизолон 21-диэдриаминоацетат, преднизолон-натрий
фосфат, преднизолон-натрий сукцинат, преднизолон-натрий 21-м-сульфобензоат, преднизолон- натрий
21-стеарогликолят, преднизолона тебутат, преднизолон 21-триметилацетат, преднизон, преднивал, преднилиден, преднилиден 21-диэтиламиноацетат, тиксокортол, триамцинолон, триамцинолона ацетонид,
триамцинолона бенетонид и триамцинолона гексацетонид. Подразумевается, что структурнородственные кортикостероиды, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными
свойствами, также охватываются этой группой.
Пригодными для комбинированного применения в соответствии с приведёнными описаниями являются также противомикробные средства, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли. Пригодные антимикробные средства, в частности, включают ампициллин, амоксициллин,
- 43 -
011866
ауреомицин, бацитрацин, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим, цефахлор, цефалексин, цефрадин, ципрофлоксацин, клавулановая кислота, клоксациллин, диклоксациллан, эритромицин, флуклоксациллан,
гентамицин, грамицидин, метициллан, неомицин, оксациллан, пенициллин и ванкомицин. Подразумевается, что структурно-родственные противомикробные средства, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой.
Прочие пригодные соединения включают, без ограничения, BN 50730; тенидап; Е 5531; тиапафант
РСА 4248; нимесулид; панавир; ролипрам; RP 73401; пептид Т; MDL 201,449А; (1R,3S)-цис-1-[9-(2,6диаминопуринил)]-3-окси-4-15-циклопентена гидрохлорид; (1R,3R)-транс-1-[9-(2,6-диамино)пурин]-3ацетоксициклопентан; (1R,3R)-транс-1-(9-аденил)-3-азидоциклопентана гидрохлорид и (1R,3R)-транс-1(6-гидроксипурин-9-ил)-3-азидоциклопентан.
Было показано, что интерлейкин-4 (IL-4) может вызывать воспалительный эффект в некоторых
случаях, таких как астма, при которой сверхэкспрессия IL-4 в лёгких приводит к гипертрофии эпителиальных клеток и скоплению лимфоцитов, эозинофилов и нейтрофилов. Такой ответ является одной из
основных особенностей провоспалительного ответа, вызванного другими цитокинами Th2. Следовательно, как отмечено выше, ингибиторы IL-4 также применимы в соответствии с настоящим изобретением.
Кроме того, следует понимать, что в лечении артритов также могут применяться некоторые иммунодепрессанты, например ингибиторы индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS - inductible nitric oxide synthase), ингибиторы 5-липоксигеназы и др.
Было показано, что определёнными противовоспалительными свойствами обладает имбирь, следовательно, и он применим в качестве противовоспалительного агента в соответствии с настоящим изобретением, как и хондроитин.
В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Ang-2, можно вводить перед, одновременно и после лечения агентом для противораковой терапии. Неограничивающими примерами раковых заболеваний являются, в частности, рак груди, рак толстой и прямой кишки, карцинома желудка,
глиома, плоскоклеточный рак головы и шеи, наследственная или спорадическая папиллярная карцинома
почки, лейкемия, лимфома, синдром Ли-Фраумени, злокачественная плевральная мезотелиома, меланома
множественная миелома, немелкоклеточная карцинома лёгкого, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак лёгкого, синовиальная саркома, тироидная карцинома и переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря.
В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Ang-2, можно применять отдельно
или совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом для лечения рака. В
некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Ang-2, применяют в сочетании с терапевтически эффективной дозой дополнительного терапевтического агента. Неограничивающими примерами
терапевтических агентов, которые можно вводить вместе с агентом, специфически связывающим Ang-2,
могут служить члены гелданамицинового семейства антибиотиков анизамицинового ряда, Про-HGF;
NK2; с-Мет-пептидный ингибитор, антагонист Grb2 Src гомологии 2; модулятор Gabl; доминантнонегативный Src; ингибитор фон Гиппеля-Ландау, включая, без ограничения, вортманнин; ингибиторы
киназы Р13, другие антирецепторные средства, анти-РФРЭ, ингибитор СОХ-2, Целебрекс™, Виокс™;
фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС), модулятор ФРЭС, фактор роста фибробластов (ФРФ), модулятор ФРФ, фактор роста эпидермиса (ФРЭ); модулятор ФРЭ, фактор роста кератиноцитов (ФРК), молекула, родственная ФРК, модулятор ФРК, модулятор металлопротеазы матрикса.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение направлено на лекарственные средства, включающие агент, специфически связывающий Ang-2, и по меньшей мере один ингибитор сериновых протеаз, а также способы лечения с использованием таких лекарственных средств. В некоторых осуществлениях средство содержит агент, специфически связывающий Ang-2, и ингибитор сериновых протеаз, а
также по меньшей мере одну описанную здесь дополнительную молекулу.
В некоторых случаях нарушение баланса протеаза/ингибитор протеазы может привести к разрушению ткани, опосредованному протеазой, которое, в частности, может привести к инвазии опухоли в нормальную ткань, что приводит к метастазированию.
В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Ang-2, можно применять по меньшей мере с одним провоспалительным терапевтическим агентом. В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Ang-2, можно применять по меньшей мере с одним агентом, нарушающим работу иммунной системы. Неограничивающими примерами провоспалительных агентов и агентов, нарушающих работу иммунной системы, могут служить ингибиторы циклооксигеназы типа 1 (СОХ-1) и типа
2 (СОХ-2), низкомолекулярные модуляторы митогенактивируемой протеинкиназы (MAPK - mytogen
activated protein kynase) с молекулярной массой 38 кДа (р38-MAPK), низкомолекулярные модуляторы
внутриклеточных молекул, задействованных в воспалительных путях, которые внутриклеточные молекулы включают, без ограничения, jnk, IKK, NF-κВ, ZAP70, lck и др. Некоторые примеры провоспалительных лекарственных средств описаны, например, в кн.: С.А. Dinarello, L.L. Moldawer Proinflammatory
and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians Third Edition (2001) Amgen
Inc. Thousand Oaks, CA.
- 44 -
011866
В некоторых воплощениях настоящего изобретения фармацевтические композиции могут содержать более одного агента, специфически связывающего Ang-2. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции могут содержать более одного агента, специфически связывающего Ang-2, при этом
агент, специфически связывающий Ang-2, связывает более одного эпитопа.
Иммунотерапевтические средства.
Иммунотерапевтические средства обычно основываются на применении эффекторных клеток и молекул иммунной системы для направленного разрушения раковых клеток. Иммунными эффекторами
могут быть, например, антитела, соответствующие настоящему изобретению, распознающие некоторые
маркёры на поверхности клетки-мишени. Антитела сами по себе могут служить эффекторами в терапии
опухолей или же могут задействовать другие клетки, убивающие клетки-мишени. Антитела могут также
быть конъюгированы с лекарством или токсином (химиотерапевтическим средством, радионуклидом,
цепью А рицина, токсином холеры, токсином коклюша и т.п.) и, таким образом, служить попросту в качестве направляющего агента.
В соответствии с настоящим изобретением мутантные формы Ang-2 могут служить мишенью для
иммунотерапии при помощи антител или конъюгатов антител, соответствующих настоящему изобретению. В частности, предлагается вариант, при котором фармацевтические композиции, содержащие антитела, соответствующие настоящему изобретению, можно применять в комбинированной терапии, сопряжённом с терапией, нацеленной на Ang-2.
Было доказано, что пассивная иммунотерапия чрезвычайно эффективна в отношении ряда раковых
заболеваний (см., например, WO 98/39027).
Нижеследующие примеры приведены только с иллюстративной целью и ни в коей мере не ограничивают объем настоящего изобретения.
Пример 1. Экспрессия Ang-2 в патологической и нормальной ткани.
Экспрессию Ang-2 исследовали в нормальной и патологической ткани при помощи гибридизации in
situ. Фрагменты человеческой (Genbank, номер доступа AF004327, нуклеотиды 1274-1726) и мышиной
(Genbank, номер доступа: AF004326, нуклеотиды 1135-1588) последовательностей Ang-2 амплифицировали способом ПЦР с обратной транскриптазой на основе человеческой или мышиной кДНК эмрионального лёгкого, клонировали в плазмиде pGEM-T и проверяли секвенированием. Образцы антисмысловой
РНК, меченые фосфором-33, были транскрибированы с матриц линеаризованных плазмид с применением 33Р-УТФ и РНК-полимеразы. Блоки тканей, фиксированных формалином и залитых парафином, резали на микротоме с толщиной срезов 5 мкм и собирали на обработанных предметных стёклах. Перед гибридизацией in situ ткани пермеабилизовали 0,2 М HCl с последующей обработкой протеиназой K и ацетилированием триэтаниламином на уксусном ангидриде. Срезы гибридизовали с радиоактивно меченым
зондом в течение ночи при 55°С, затем подвергали обработке РНКазой и тщательно отмывали в 0,1X
SSC при 55°С. Срезы обмакивали в эмульсии Kodak NTB2, выдерживали при 4°С в течение 2-4 недель,
проявляли и окрашивали. Такие срезы изучали в тёмном поле и при обычном освещении для одновременной оценки морфологии ткани и сигнала от гибридизации.
Результаты показали, что в нормальном постнатальном человеческом организме экспрессия Ang-2
ограничена немногими тканями, имеющими значительное содержание сосудов, таких как яичник, плацента и матка. Экспрессия Ang-2 не выявлялась в норме в сердце, мозге, почках, печени, лёгких, поджелудочной железе, селезёнке, мышцах, миндалинах, тимусе, аппендиксе, лимфоузлах, желчном пузыре,
предстательной железе и семенниках взрослого человека. У мышей в возрасте 5 недель (но не у взрослых
обезьян или людей) почки проявляли значительный уровень экспрессии Ang-2 в прямых сосудах. Для
выявления, не является ли эта экспрессия остаточной после эмбрионального развития, этот же опыт повторяли на почках мышей различного возраста, вплоть до одного года, с использованием мышиного зонда Ang-2 и условий, описанных выше. Было отмечено, что экспрессия Ang-2 уменьшалась в ходе постнатального развития, однако всё же была выражена в почках годовалых мышей.
Экспрессия Ang-2 была также выявлена практически во всех протестированных типах опухолей, в
том числе в первичных опухолях человека, таких как карцинома толстой кишки (5 случаев), карцинома
груди (10 случаев), карцинома лёгкого (8 случаев), глиобластома (1 случай), в метастазирующих опухолях человека, таких как карцинома груди (2 случая), карцинома лёгкого (2 случая), карцинома яичника (2
случая), с метастазами в мозг, а также на модели опухолей грызунов, таких как С6 (глиома крысы), НТ29
(карцинома толстой кишки человека), Colo-205 (карцинома толстой кишки человека), НСТ116 (карцинома толстой кишки человека), А431 (человеческая эпидермоидная карцинома), А673 (рабдомиосаркома
человека), НТ1080 (фибросаркома человека), РС-3 (карцинома предстательной железы человека), B16F10
(меланома мыши), MethA (саркома мыши), и в метастазах лёгочной карциномы Льюиса, кроме того, экспрессия Ang-2 была выявлена в новообразованных сосудах, прорастающих в матригелевую пробку в ответ на ФРЭС, а также в мышиной гипоксической модели ретинопатии и преждевременного созревания.
- 45 -
011866
Пример 2. Получение рекомбинантного белка mAng-2 и кроличьей поликлональной антисыворотки
к Ang-2.
Молекулу мышиной кДНК Ang-2 полной длины с гистидиновым хвостом получили способом ПЦР
(Clontech Advantage PCR Kit, Cat. # K1905-01) из библиотеки кДНК 15-дневного мышиного эмбриона
(Marathon-Ready-cDNA, Cat. # 7459-1, Clonetech, Inc.) с применением праймеров для ПЦР для человеческого Ang-2 полной длины. Продукт ПЦР лигировали с вектором для экспрессии, содержащим промотор
CMV, и полученной плазмидой трансформировали клетки человеческой фибросаркомы НТ1080 (полученные в АТСС) при помощи трансфицирующего агента (Roche, Cat. # 1814443). Стабильные клоны были изолированы селекцией на G418. Для скрининга клонов, экспрессирующих mAng-2-Гис, использовали
твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с антителами к гистидиновому хвосту и иммуноблоттинг.
Рекомбинантный полипептид mAng-2 очищали от среды и от клеточного материала. Кондиционированную среду, содержащую mAng-2-Гис, очищали двустадийной хроматографией. Вкратце, рН среды
подводили до 8,9 добавлением трис-буфера с рН 9,5 до конечной концентрации около 20 мМ. Кроме того, добавляли детергент CHAPS до конечной концентрации около 5 мМ.
Далее среду напрямую наносили на анионообменную колонку с Q-сефарозой ff (Pharmacia). Затем
колонку промывали 10 мМ Трис рН 8,0, содержащим 50 мМ NaCl. Рекомбинантный mAng-2-Гис смывали в одну стадию при помощи 10 мМ трис рН 8,0, содержащего 350 мМ NaCl и около 5 мМ CHAPS.
К элюату с колонки Q-сефарозы добавляли имидазол до конечной концентрации 4 мМ и наносили
его на аффинную колонку с иммобилизованным металлом (Ni-NTA superflow (Qiagen)). Связавшийся
белок элюировали при помощи PBS, содержащего около 5 мМ CHAPS и около 100 мМ имидазола. Далее
элюат концентрировали до конечной концентрации около 1,0 мг/мл с последующим диализом против
PBS. Чистота mAng-2-Гис была более 90%, как было определено электрофорезом с SDS с последующим
окрашиванием Кумасси.
Для получеия антител кроликов иммунизировали приблизительно mAng-2 в количестве 0,2 мг на
инъекцию. Кроликам вводили около 1 мл Hunter's TiterMax® (Sigma) и mAng-2 в соотношении 1:1. 4 недели спустя кроликам делали повторную инъекцию или подкрепляющую иммунизацию, через 2 недели
после этого проводили ещё одну иммунизацию, а на 7-ю неделю забирали сыворотку и оценивали в ней
титр антител к mAng-2. Если титр оказывался достаточно высоким, в течение 6 последующих недель у
животных отбирали по 50 мл крови. Однако, если титр оказывался низким, кроликам делали ещё одну
покрепляющую иммунизацию и затем у них еженедельно в течение 6 недель отбирали по 50 мл крови
начиная с 9-й недели. После осуществления 6 последовательных заборов крови животному давали отдых
в течение 6 недель. Если требовалось больше сыворотки, кроликам давали подкрепляющую иммунизацию через месяц после последнего отбора крови.
При помощи анализа ELISA на нейтрализацию (описан ниже) обнаружили, что поликлональные антисыворотки от двух кроликов, 5254 и 5255, подавляли взаимодействие mAng-2 с Tie-2.
Пример 3. Молекулярные анализы для оценки антител к Ang-2.
Были разработаны молекулярные анализы (ELISA на сродство, ELISA на нейтрализацию и BIAcore)
для оценки связывания антител с Ang-2 и родственными белками этого семейства, а также воздействия
антител на взаимодействие Ang-2 с Tie-2. Эти анализы, осуществляемые in vitro и на клеточном уровне,
описываются ниже.
А. Анализ ELISA на сродство.
Для начального скрининга "кандидатов" на антитела к Ang-2 применяли очищенный человеческий
Ang-2 (R and D Systems, Inc.; Cat. # 623-AN; Ang-2 поставляется как смесь двух усечённых версий) или
мышиный Ang-2 (полученный, как описано выше). Для подтверждающего анализа на связывание человеческий Ang-2 получали из среды человеческих клеток 293Т, трансфицированных человеческой ДНК
Ang-2 полной длины и культивированных в бессывороточной среде Дульбекко, модифицированной Иглом (DMEM - Dulbecco modified Eagle's medium), содержащей около 50 мкг/мл бычьего сывороточного
альбумина (БСА).
На планшетах для микротитрования в каждую лунку добавляли по 100 мкл Ang-2 и планшеты выдерживали около 2 ч, после чего четырежды промывали физиологическим фосфатно-буферным раствором (PBS), содержащим 0,1% Твин-20. Затем лунки блокировали примерно 250 мкл 5%-ного БСА на PBS
на каждую лунку и планшеты выдерживали при комнатной температуре около 2 ч. После этого избыток
блокированного раствора удаляли и в каждую лунку добавляли около 100 мкл "кандидатов" на антитела
к Ang-2, растворённых в PBS с добавлением около 1% БСА, в серии четырёхкратных разведений, начиная примерно с 40-нМ концентрации. Планшеты выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. По окончании инкубации планшеты четырежды промывали PBS, содержащим 0,1% Твин-20, затем в
лунки добавляли по 100 мкл козьих антител к Fc-фрагменту человеческих IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена (Pierce Chemical Co., Cat. # 31416), предварительно разведённых 1:5000 на PBS, содержащем 1% БСА. Планшеты выдерживали около 1 ч при комнатной температуре, после чего пятикратно
промывали PBS, содержащим 0,1% Твина-20. Затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл раствора
субстрата тетраметилбензидина (ТМБ; 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine Liquid Substrate System; Sigma
- 46 -
011866
chemical Company, St. Louis, MO, catalog number T8665) и планшеты инкубировали 5-15 мин до развития
окрашивания синего цвета.
Оптическое поглощение определяли на спектрофотометре при длине волны около 370 нм.
В. Анализ ELISA на нейтрализацию.
Планшеты для микротитрования с сорбированным на них Ang-2 получали, как описано для теста
ELISA на сродство. "Кандидаты" на антитела к Ang-2 готовили в серии разведений, как описано выше
для анализа ELISA на аффинность, в PBS, содержащем около 1% БСА и около 1 нМ Tie-2 (полученного
как молекула Tie-2-Fc, в которой часть, соответствующая Tie-2, представляет собой только растворимую
внеклеточную часть молекулы; R and D Systems, Cat. # 313-TI).
После того как в каждую лунку добавили по 100 мкл смеси антител с Tie-2, планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, а затем пятикратно промывали в PBS, содержащем около
0,1% Твин-20. После промывки в лунки планшета добавляли по 100 мкл антител к Tie-2 (Pharmingen Inc.,
Cat. # 557039) в концентрации около 1 мкг/мл и планшеты выдерживали в течение 1 ч при комнатной
температуре. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл козьих антител к IgG мыши, меченых пероксидазой хрена (Pierce Chemical CO., Cat. # 31432) в разведении 1:10,000 в PBS, содержащем около 1%
БСА. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего пятикратно промывали PBS, содержащим 0,1% Твин-20. Затем в лунки добавляли по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, как указано выше, и оставляли для развития окрашивания. Оптическое поглощение определяли на
спектрофотометре при длине волны около 370 нм.
С. Тест BIAcore на сродство.
Анализ сродства каждого "кандидата" на антитела к Ang-2 осуществляли также при помощи системы BIAcore®2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) с PBS и 0,005% сурфактантом Р20 (BIAcore, Inc.) в качестве рабочего буфера. Рекомбинантный белок G (Repligen, Needham, MA) иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 для исследовательской работы (BIAcore, Inc.) через первичные аминогруппы с помощью
набора Amine Coupling Kit (BIAcore, Inc.) в соответствии с протоколом, рекомендуемым производителем.
Опыт по связыванию осуществляли, прежде всего, посредством связывания около 100 Ru каждого
"кандидата" на антитела к Ang-2 с иммобилизованным белком G, после чего на поверхность связанных
антител впрыскивали различные концентрации (0-100 нМ) человеческого или мышиного Ang-2 со скоростью около 50 мкл/мин в течение около 3 мин.
Кинетические характеристики связывания антител, в том числе ka (коэффициент связывания), kd
(коэффициент диссоциации) и KD (равновесный коэффициент диссоциации) определяли при помощи
компьютерной программы BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.). Более низкий равновесный коэффициент
диссоциации указывал на большее сродство данных антител к Ang-2.
Пример 4. Получение полностью человеческих антител к Ang-2 путём фаговой экспрессии.
Полностью человеческие антитела к Ang-2 получали при помощи "пэннинга" генетической библиотеки Target Quest Phage Display Fab library (Target Quest, Inc.) с помощью человеческого полипептида
Ang-2 (R and D Systems Inc., Cat. # 623-AN) в соответствии с нижеследующим протоколом.
Человеческий Ang-2 иммобилизировали на поверхности полистирольных магнитных гранул двумя
способами:
1) прямое связывание Ang-2 в концентрации 50 мкг/мл при 4°С в течение ночи и
2) непрямой захват Ang-2 козьими антителами к Ang-2 (50 мкг/мл в течение ночи при 4°С).
Поверхность гранул блокировали 2%-ным молоком на PBS (MPBS - Milk PBS). Фаговую библиотеку человеческих Fab подвергали предварительному отбору для удаления фаговых клонов, реагирующих
с магнитными гранулами без покрытия или с козьими антителами к Ang-2. Магнитные гранулы, покрытые Ang-2, инкубировали затем с фаговой библиотекой при комнатной температуре в продолжение
1,5 ч. По окончании стадии связывания фагов поверхность шестикратно промывали MPBS, содержащим
около 0,1% Твин-20, затем шестикратно же PBS, содержащим около 0,1% Твин-20, затем два раза PBS.
Связанные фаговые частицы элюировали сначала с помощью человеческого Tie-2-Fc (R and D Systems,
Minneapolis, MN) в концентрации 100 мкг/мл, затем приблизительно 100 мМ триэтаноламина. Элюированные фаги использовали для инфицирования клетки Е.coli TGI, фаги амплифицировали и восстанавливали для следующей стадии отсева. Давление селекции с каждой новой стадией повышали путём применения всё более жёстких отмывок и сокращения количества вводимого фага.
После трёх стадий селекции выявили 18 уникальных Fab-клонов, связывающих Ang-2, все из которых распознаваали человеческий, мышиный и крысиный Ang-2, как это было показано в тесте ELISA на
аффинность, описанном выше. Приблизительно 10% этих фагов связывали также человеческий Ang-1.
Эти клоны были превращены в антитела IgG1, как описано ниже.
Для получения других уникальных фагов проводили новый скрининг той же самой библиотеки, но
по несколько изменённому протоколу. По этому протоколу человеческим Ang-2 в буфере NaHCO3 при
рН 9,6 покрывали иммунные трубки Nunc maxisorp при 4°C в течение ночи. Ang-2 сорбировали в концентрации около 1,5; 0,74 и 0,3 мкг/мл для покрытия кругов 1, 2 и 3 соответственно. Поверхность иммунных трубок блокировали при помощи приблизительно 2%-ного молока на PBS (MPBS), после чего их
- 47 -
011866
инкубировали с приблизительно двумя триллионами фаговых частиц (около 50 копий каждого уникального фага в библиотеке) из той же самой библиотеки фаговой экспрессии, на которую авторы ссылались
выше (Target Quest), примерно в 4 мл 2% MPBS. После окончания инкубации с фагами поверхность промывали 20 раз в PBS, содержащем около 0,1% Твин-20, затем ещё 20 раз в PBS.
Связавшиеся фаговые частицы смывали при помощи 1 мкМ человеческого Ang-2 или 1 мкМ человеческого Tie-2 (R and D Systems, описаны выше). Элюированными фагами инфицировали клетки Е.coli
TGI (поставляемые вместе с фаговой библиотекой), фаги амплифицировали и восстанавливали для следующей стадии скрининга. 16 уникальных Fab-клонов, связывающих Ang-2, выявили путём ПЦРамплификации каждого из фагов, с которыми связывались человеческие Ang-2 или Tie-2, и эти клоны
анализировали рестрикцией. ДНК каждого клона секвенировали. Последовательность, кодирующую вариабельный участок каждой тяжёлой цепи в каждом из фагов, амплифицировали при помощи комплементарных праймеров. Праймеры разрабатывали так, чтобы они включали сайты рестрикции Hind111,
Xbal, последовательность Козака и сигнальную последовательность (транслируемый пептид представляет собой MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC; SEQ ID NO: 202) на 5'-конце вариабельной области, тогда
как сайт рестрикции BsmBI добавляли на 3'-конце продукта ПЦР. В качестве примера клонирования тяжёлых цепей шаблонную ДНК фага для клона 544 (SEQ ID NO: 19) амплифицировали с применением
праймеров 2248-21 (GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCA GGT CCA GCT GGT GCA G;
SEQ ID NO: 203), которые добавляли 7 последних аминокислот к сигнальной последовательности, и
2502-31 (ATT ACG TCT CAC AGT TCG TTT GAT CTC CAC; SEQ ID NO: 204), которые добавляли сайт
для BsmBI на конце вариабельной области. Полученный продукт амплифицировали с праймерами 214898 (CCG СТС AGC ТСС TGG GGC ТСС TGC TAT TGT GGT TGA GAG GTG CCA GAT;
SEQ ID NO: 205), которые добавляли 9 аминокислот к сигнальному пептиду (AQLLGLLLL;
SEQ ID NO: 206), и 2502-31, а затем 2489-36 (CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG
GGT CCC CGC TCA GCT CCT GGG; SEQ ID NO: 207) и 2502-31. Праймеры 2489-36 добавляли от 5'- к
3'-концу, сайт для Hind111, для Xbal, последовательность Козака и 6 первых аминокислот сигнальной
последовательности. Продукты ПЦР расщепяли Xbal и BsmBI, а затем клонировали в экспрессионном
векторе для млекопитающих, содержащем константную область человеческого IgG1. Этот вектор содержит промотор SV40 и подвергается селекции по дигидрофолатредуктазе (ДГФР).
Лёгкие цепи из каждого фага относились к классу каппа или лямбда. Для каждой лёгкой цепи конструировали комплементарные праймеры, добавляющие в направлении 5'-3' сайт рестрикции Hind111,
сайт рестрикции Xbal, последовательность Козака и сигнальную последовательность (как изложено выше). Эти цепи, содержащие участки безошибочного кодирования, клонировали как продукты полной
длины. В качестве примера лёгкие цепи из фагов клона 536 (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 210) амплифицировали, как кодирующие области полной длины, используя праймеры 2627-69 (GTG GTT GAG AGG
TGC CAG ATG TGA CAT TGT GAT GAC TCA GTC TCC; SEQ ID NO: 208), которые добавляли последние 7 аминокислот сигнальной последовательности, и праймер 2458-54 (CTT GTC GAC TTA TTA ACA
CTC TCC CCT GTT G; SEQ ID NO: 209), которые добавляли участок Sall после стоп-кодона. Полученный продукт затем амплифицировали, как описано выше, с дополнительными праймерами на 5'-конце:
2148-98 и 2489-36 соответственно, спаренными с праймером 2458-54 для завершения добавления сигнальной последовательности и участков клонирования. Лёгкие цепи полной длины клонировали как
фрагменты Xbal-Sall в экспрессионном векторе млекопитающих, как описано выше.
Некоторые клоны лямбда-цепей имели ошибки в константных участках по сравнению с природной
последовательностью константных участков человека. Для исправления этих несоответствий осуществляли перекрывающуюся ПЦР с использованием ДНК, кодирующей безошибочную последовательность
константной области лямбда и вариабельный участок, происходящий из фага. Эти ДНК также клонировали как фрагменты Xbal-Sall, как изложено выше.
Если вариабельные области каппа клонировали отдельно от их константных областей, к 3'-концу
продукта ПЦР добавляли сайт, распознаваемый BsmBI. После отщепления продукта ПЦР рестриктазами
Xbal и BsmBI вариабельный участок каппа-цепи клонировали в экспрессионном векторе, содержащем
константный участок человеческой каппа-цепи. Конструкции со спаренными лёгкой и тяжёлой цепями
из каждого переоборудованного фага котрансфицировали в клетки яичников китайского хомячка (СНО)
при помощи набора для трансфекции с фосфорно-кислым кальцием (Calcium Phosphate Transfection Kit,
Invitrogen Corp.) в основном в соответствии с протоколом, рекомендуемым производителем. Среды меняли через 14-16 ч после трансфекции и клетки пересевали на чашки для клеточных культур для селекции примерно через 48 ч в соответствии с рекомендациями производителя. Трансфицированные клетки
отделяли путём селекции на гипоксантин-гимидин в течение около 3 недель, после чего колонии трансфицированных клеток СНО обрабатывали трипсином и переводили их в состояние взвеси.
Среды малого объёма собирали через двое суток и испытывали на наличие антител иммуноблоттингом с помощью антител к человеческим Fc, каппа- или лямбда-участкам. Отобранные популяции клеток затем пересевали в селективных условиях при помощи стандартных стерильных процедур для клеточных культур до получения достаточного количества клеток, чтобы засеять четыре бутыли по 850 см2,
каждая, на 2×107 жизнеспособных клеток и приготовить замороженные маточные линии клеток с исполь- 48 -
011866
зованием ДМСО. После высевания клетки содержались в цилиндрических бутылях приблизительно с
10%-ной сывороткой, содержащей среду DMEM (Gibco/BRL, Inc.), дополненную глутамином и заменимыми аминокислотами. Клетки поддерживали в культуре 2-3 дня до достижения степени слияния клеток
примерно 80%. На этой стадии среду в бутыли заменяли на бессывороточную (50% DMEM, 50% F12,
Gibco), дополненную глутамином и заменимыми аминокислотами. Кондиционированную среду собирали через 7 дней и заменяли свежей бессывороточной средой для осуществления ещё одного или двух
сборов конечного продукта.
Антитела очищали аффинной хроматографией на белке G прямо из собранной среды с применением стандартных процедур. Элюцию с колонки с иммобилизованным белком G осуществляли буфером с
низким рН (около 3), после чего смытые с колонки антитела нейтрализовали при помощи 1 М Трис, рН
8,5 и затем концентрировали центрифугированием через ультрафильтр, удерживающий вещества с молекулярной массой более 10 кДа. Концентрированный раствор антител далее переносили в PBS с помощью
буферного обмена.
Таким образом, получили 31 разновидность антител, каждое из которых состояло из двух тяжёлых
цепей и двух лёгких цепей (каппа или лямбда), как указано в табл. 2.
Таблица 2
- 49 -
011866
*Испытано на связывание с человеческим Ang-2, мышиным Ang2 и человеческим Ang-1, как здесь описано.
Некоторые константные области лёгких цепей лямбда оказываются химерами, состоящими более
чем из одного гена зародышевой линии константной области лямбда. Указан самый близкий ген зародышевой линии константной области вместе с аминокислотами, составляющими отличие от гена этой
зародышевой линии, пронумерованными в соответствии с системой Kabat.
В следующих четырех таблицах представлены последовательности и идентификационые номера
последовательностей тяжёлых и лёгких (каппа и лямбда) цепей 31 антитела к Ang-2, реконструированных из фага в IgG1 полной длины. Участки, определяющие комплементарность (CDR) моноклональных
антител, были предсказаны с помощью базы данных VBASE, которая использует методику, описанную
Кабатом и др. (Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH Publication No. 91-3242;
U.S. Dept. Health and Human Services, 5th ed.)). Области Fab были выровнены с последовательностями из
базы данных с ближайшей последовательностью зародышевой линии при помощи средств, доступных в
Центре белковой инженерии MRC, Кембридж, Великобритания, а затем зрительно сопоставлены с такими последовательностями. CDR каждой вариабельной области (тяжёлой и лёгкой цепей) приведены в
табл. 7.
- 50 -
011866
Таблица 3
Вариабельные участки тяжёлых цепей
- 51 -
011866
- 52 -
011866
- 53 -
011866
Таблица 4
Вариабельные участки каппа-цепей
- 54 -
011866
Таблица 5
Вариабельные участки лямбда-цепей
- 55 -
011866
- 56 -
011866
Таблица 6
Человеческие константные участки (CR)
- 57 -
011866
Таблица 7
Участки, определяющие комплементарность (CDR) тяжёлых цепей (НС)
и лёгких цепей (LC) антител (Ab) к Ang-2
- 58 -
011866
- 59 -
011866
- 60 -
011866
- 61 -
011866
- 62 -
011866
17 антител и негативный контроль IgG1 протестировали при помощи анализов ELISA на сродство и
нейтрализацию (как изложено выше в примере 3), а также анализа BIAcore на нейтрализацию для определения их сродства, способности к нейтрализации и специфичности. Результаты, рассчитанные стандартными процедурами, приведены в табл. 8.
Таблица 8
Антитела к Ang-2 EC50s и IC50s
Два антитела, клон 536 и клон 545, охарактеризовали при помощи анализа BIAcore, описанного
выше. Связывание антител определяли, как изложено выше для анализа BIAcore, причём более низкое
значение KDS указывало на большее сродство. Результаты изложены в табл. 9.
- 63 -
011866
Таблица 9
Сродство антител к человеческому и мышиному Ang-2
Клон 536, анализ которого приведен выше, представлял собой смесь двух вариантов антител, которые приведены в табл. 4 как SEQ ID NO: 12 (536 каппа THW) и SEQ ID NO: 210 (536 каппа LQT). Эти
два варианта 536 были разделены и их активность анализировали раздельно с помощью анализов ELISA
и гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF - homogenous time resolved fluorescence).
Для анализа ELISA 96-луночные планшеты для микротитрования покрывали рекомбинантными ангиопоэтинами в составе культуральной среды, собранной с клеток 293 Т (DMEM/50 мкг/мл BSA) при 37°С в
течение 1 ч. Среды, собранные с культур рекомбинантных клеток, использовали при концентрациях ангиопоэтинов, обеспечивающих степень связывания 80% от максимально возможной с 1 нМ hTie-2-Fc
(R&D Systems, Cat. # 313-TI). Планшеты промывали при помощи PBS/0,1% Твин-20 и затем блокировали
в продолжение 2 ч при комнатной температуре с помощью PBS/5% БСА. Ангиопоэтин-нейтрализующие
агенты в серии разведений от 100 нМ до 0,4 пМ раствором PBS/1% БСА/1 нМ Tie-2 добавляли в планшеты с сорбированными на них ангиопоэтинами, выдерживали в течение ночи при комнатной температуре
и промывали PBS/0,1% Твин-20. Мышиные антитела к Tie-2 (BD Pharmingen Inc., Cat. # 557039) добавляли затем в каждый планшет в концентрации 1 мкг/мл и выдерживали 1 ч при комнатной температуре.
Далее планшеты промывали в PBS/0,1% Твин-20 и добавляли в них козьи антитела к мышиным IgG, меченые пероксидазой хрена (Pierce, Cat. # 31432) в разведении 1:10000 на PBS/1% БСА с последующей
инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты затем промывали несколько раз
PBS/0,1% Твин-20 и добавляли раствор субстрата - тетраметилбензидина (Sigma, Cat. # T8665). После
развития окрашивания измеряли оптическое поглощение при длине волны 370 нм и определяли степень
нейтрализации ангиопоэтина: Tie-2 сравнением со стандартной кривой Tie-2.
Для анализа HTRF подготавливали 96-луночный планшет для микротитрования, добавляя в каждую
лунку буфера HTRF (50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 100 мМ NaCl, 0,.05% Твин-20, 0,1% БСА), содержащего
0,8 нМ стрептавидина, конъюгированного с европием (PERKIN ELMER LIFE SCIENCES INC.,
Cat. # AD0062) и 4,0 нМ биотинилированного человеческого ангиопоэтина 1 (R&D Systems) либо ангиопоэтина 2 (Amgen Inc.). В отдельном планшете для микротитрования готовили серию разведений ангиопоэтин-нейтрализующих агентов от 400 нМ до 20 пМ в буфере для HTRF и по 50 мкл полученных разведений переносили в лунки планшета с иммобилизованным комплексом стрептавидин-Eu-ангиопоэтин.
Планшет встряхивали затем на шейкере при комнатной температуре в продолжение 1 ч. После этого по
20 мкл из каждой лунки этого планшета переносили в лунки другого планшета, содержащие по 20 мкл
10 нМ человеческого Tie-2-Fc, конъюгированного с человеческим аллофикоцианином на буфере для
HTRF. Этот планшет встряхивали 2 ч при комнатной температуре. Конечные концентрации веществ в
последнем планшете были таковы: 1,0 нМ ангиопоэтин, 5,0 нМ человеческий Tie-2-Fc и от 100 нМ до
5,0 пМ серийно-разведённых ангиопоэтин-нейтрализующих агентов. Планшеты анализировали при помощи спектрофотометра для планшетов Rubystar (BMG Labtechnologies, Offenberg, Germany). Уровень
нейтрализации ангиопоэтин/Tie-2 определяли, рассчитывая процент ингибирования в каждом разведении
ангиопоэтин-нейтрализующего агента относительно контроля, не содержащего такого агента (нулевое
ингибирование), и контроля, не содержащего ангиопоэтина (полное ингибирование). Далее на основе
анализа процента ингибирования рассчитывали значения IC50 при помощи программы GRAFIT 5.0
(Erithacus Software Ltd.).
Полученные результаты представляли как кривые IC50, рассчитанные для проб, каждая из которых
тестировалась дважды, при помощи нижеприведённой формулы. Значения IC50, отражающие данные
ингибирования в двухпараметрическом уравнении, варьировали от 0 (с учётом коррекции фона) до 100
(по ранжированной шкале).
В этом уравнении s представляет собой фактор наклона. Уравнение подразумевает, что у снижается
при возрастании х. Это уравнение используется в программном обеспечении GRAFIT 5.0 (Erithacus Soft- 64 -
011866
ware Limited).
Результаты приведены в табл. 10 и 11.
Таблица 10
Значения IC50 при анализе ELISA для варианта антител Ab536
Таблица 11
Значения IC50 при анализе HTRF для варианта антител Ab536
Пример 5. Исследование терапевтической эффективности при использовании антител к Ang-2.
Фармакокинетику поликлональных кроличьих антител к Ang-2, очищенных на иммобилизованном
белке G, изучали на мышах. 24 мышам вводили кроличьи поликлональные антитела к Ang-2 (1 мг на
мышь). По четыре мыши, получавших антитела, убивали в каждый из указанных сроков после введения
антител: 1 ч, 6 ч, 1 день, 3 дня, 7 дней и 14 дней.
Полученные результаты показали, что для общего кроличьего IgG характерен период полужизни в
сыворотке приблизительно 19 дней, тогда как составляющая общего IgG, специфичная к Ang-2, обладала
периодом полужизни около 8 дней.
Для оценки терапевтической эффективности мышам (по 10 животных на группу) с пересаженной
им опухолью А431 вводили внутрибрюшинно по 10 доз (одна доза составляла около 10 мг IgG на мышь)
поликлональных кроличьих антител к мышиному Ang-2, очищенных на иммобилизованном белке G, на
1, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 и 18-й день после пересадки опухоли. Размеры опухоли измеряли на 7, 12, 15,
19 и 21-й день. Массу тела измеряли на 0, 7, 15 и 21-й день и, как оказалось, лечение на неё не влияло.
Результаты показали, что поликлональные антитела к Ang-2 подавляли рост пересаженной опухоли А431
приблизительно на 50% с р=0,008 по сравнению с контролем, представлявшим собой очищенную неиммунную поликлональную сыворотку (единичная доза также составляла 10 мг IgG на мышь), и плацебо
(PBS), как это было определено дисперсионным анализом каждого измерения.
Для оценки эффективности in vivo полностью человеческих моноклональных антител к Ang-2 мышам (по 10 животных на группу) с пересаженной им опухолью А431 вводили внутрибрюшинно либо
клоны 533, 537 или 544 антител к Ang-2, либо отрицательные контроли в виде PBS или человеческого
IgG1-каппа. Дозировка составляла около 420 мкг белка на одну мышь в качестве первой дозы, около
140 мкг белка на мышь в качестве каждой из трёх последующих доз и около 55 мкг белка на мышь в качестве каждой последующей дозы, всего одной мыши вводили 8 доз антител. Объём опухоли и массу
тела измеряли дважды в неделю. По окончании исследования животных забивали и собирали у них сыворотку крови для измерения уровня антител с помощью анализа ELISA. Опухоли и ряд нормальных
тканей собирали у каждой группы.
Были обнаружены значительные различия в росте опухолей у группы, получавшей антитела к
Ang-2, и контрольными группами, как показано на фиг. 1. Все три клона антител подавляли рост опухолей по сравнению с контролями (р<0,005 по сравнению с контролем на основе человеческих IgG1 для
всех клонов антител, по данным дисперсионного анализа каждого измерения для всех 3 антител). Напротив, опухоли в контрольных группах продолжали расти с гораздо большей скоростью.
Пример 6. Картирование эпитопов.
Человеческий белок Ang-2 полной длины (аминокислоты 1-495), его N-концевой фрагмент (аминокислоты 1-254) и С-концевой фрагмент (аминокислоты 255-495) клонировали в экспрессионном векторе
млекопитающих на основе цитомегаловируса с С-концевыми хвостами 6xHis. Три полученные конструкции и контрольный вектор были в течение недолгого периода экспрессированы в клетках 293Т. Культивационные среды затем собирали с трансфицированных клеток и способом ELISA или иммуноблоттингом при помощи антител к гистидиновым хвостам оценивали уровень экспрессии Ang-2 в среде.
Эпитопы связывания антител к Ang-2 и их фрагментов определяли по их способности связывать
три варианта человеческого hAng-2 при помощи теста ELISA в соответствии со следующим протоколом.
В 96-луночных планшетах с высокой связывающей способностью сорбировали среду, собранную с кле- 65 -
011866
точных культур, добавляя последнюю по 100 мкл на лунку с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 ч. Среду отсасывали и планшет блокировали 5%-ным БСА на PBS в количестве 200 мкл на лунку
при комнатной температуре в течение 1 ч. Блокирующий раствор отсасывали, в лунки добавляли по
100 мкл антител, их фагментов или Tie-2-Fc в концентрации 1 мкг/мл в 1% БСА на PBS и планшеты выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Далее лунки промывали 4 раза 200 мкл 0,1% Твин-20 на PBS
и добавляли в них по 100 мкл козьих антител к IgG человека или к IgG мыши, меченых пероксидазой
хрена, и выдерживали 45 мин при комнатной температуре. Затем лунки четырежды промывали 200 мкл
0,1% Твин-20 на PBS и добавляли по 100 мкл на лунку раствора субстрата тетраметилбензидина. Оптическое поглощение измеряли при длине волны 370 нм. Резуьтаты представлены на фиг. 2а-2в.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенный полипептид, специфически связывающий ангиопоэтин-2, где полипептид включает
по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (CDR), причём CDR представляет
собой:
а) участок CDR1, включающий аминокислотную последовательность формулы
где X1 представляет собой R, S, T, G, E, D;
X2 представляет собой S, G, A, R, N, T, Y, Н;
X3 представляет собой S, D, N, Q, T, Y, A, G, Е;
X4 представляет собой Q, K, S, N, A, G, I, M, W, L;
X5 представляет собой S, L, G, A, M, H, N;
X6 представляет собой L, G, N, Р, V, D, W, S, Т, I или отсутствует;
X7 представляет собой L, Y, I, K, S, N, V или отсутствует;
X8 представляет собой Н, Т, G, Q, S, A, D или отсутствует;
X9 представляет собой S, Y, N, A, T, E, G, F или отсутствует;
X10 представляет собой N, T, A, G, S, Y, K, D, F, L или отсутствует;
X11 представляет собой G, S, Y, F, L, P, A, F, D, N или отсутствует;
X12 представляет собой Y, V, D, A, F, G, N или отсутствует;
X13 представляет собой N, S, V, Н, Q, K, Т или отсутствует;
X14 представляет собой Y, H, S, Т или отсутствует;
X15 представляет собой L, Y или отсутствует;
X16 представляет собой D, N, L или отсутствует;
X17 представляет собой D или отсутствует;
б) участок CDR2, включающий аминокислотную последовательность формулы
где X1 представляет собой L, Q, D, N, K, G, H, A, Y, E, T, R, V, W;
X2 представляет собой G, D, N, А, V, Т, I, F, М;
X3 представляет собой S, F, N, H, G, D, K, Т, I, W, Y, R;
X4 представляет собой N, K, Е, L, S, Q, H, T, G, P, Y, А;
X5 представляет собой R, V, L, S, I, D, G, E, Y, T, N;
X6 представляет собой А, Р, Т, F, G, L, N, H, S;
X7 представляет собой S, T, G, K;
X8 представляет собой S, T, I, N, E, W или отсутствует;
X9 представляет собой Т, А, I, K, N, Y, D или отсутствует;
X10 представляет собой Y, N, K, F, I, S, G или отсутствует;
X11 представляет собой Y, N, D, А или отсутствует;
X12 представляет собой A, S, P, Y, D или отсутствует;
X13 представляет собой D, Q, S, A, F или отсутствует;
X14 представляет собой S, K, L, V или отсутствует;
X15 представляет собой V, F, K, S, L или отсутствует;
X16 представляет собой K, Q, S, L, F, G или отсутствует;
X17 представляет собой G, R или отсутствует;
X18 представляет собой G или отсутствует; или
в) участок CDR3, включающий аминокислотную последовательность формулы
где X1 представляет собой D, M, G, Q, F, A, P, E, S;
X2 представляет собой L, Q, V, A, R, T, S, Y, E, P, H, G, I;
X3 представляет собой L, А, V, W, E, P, G, S, Y, I, D, T, Q, F, R;
X4 представляет собой D, L, G, F, T, S, W, V, Y, P, N, H, I, E;
X5 представляет собой Y, Q, D, S, T, H, A, F, W, G, M, R, N;
X6 представляет собой D, T, F, A, S, E, W, R, G, Y, I, M, N, L;
- 66 -
011866
X7 представляет собой I, P, D, T, M, L, S, V, G, H, Y, W, A, N, R;
X8 представляет собой L, P, W, А, V, S, D, G, F, N, Y, I, R, Е, Т;
X9 представляет собой Т, L, V, F, A, G, P, D, S, H, N, M, Y или отсутствует;
X10 представляет собой G, S, V, N, F, A, M, D, Y, L, W, I, T или отсутствует;
X11 представляет собой Р, F, Y, W, D, E, I, G, А, V, L, S, М или отсутствует;
X12 представляет собой Y, F, V, G, I, V, М, A, D или отсутствует;
X13 представляет собой A, D, Y, V, F, H, I, G или отсутствует;
X14 представляет собой Y, V, D, I, S, F, М или отсутствует;
X15 представляет собой I, D или отсутствует;
X16 представляет собой А, I, V или отсутствует;
X17 представляет собой F или отсутствует;
X18 представляет собой D или отсутствует, и
X19 представляет собой I или отсутствует.
2. Полипептид по п.1, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность,
выбранную из SEQ ID NO: 69-104 и SEQ ID NO: 213.
3. Полипептид по п.1, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность,
выбранную из SEQ ID NO: 105-143 и SEQ ID NO: 214.
4. Полипептид по п.1, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность,
выбранную из SEQ ID NO: 144-198, SEQ ID NO: 212 и SEQ ID NO: 215.
5. Выделенный полипептид по п.1, представляющий собой антитело.
6. Антитело по п.5, представляющее собой поликлональное, моноклональное, химерное, гуманизированное или полностью человеческое антитело.
7. Антитело по п.6, представляющее собой одноцепочечное антитело.
8. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело по п.6.
9. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по п.1.
10. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.9.
11. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.10.
12. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по пп.5, 6 или 7.
13. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.12.
14. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.13.
15. Способ получения антител, включающий:
(а) трансформацию клетки-хозяина по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по пп.5, 6 или 7;
(б) экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине и
(в) выделение указанного специфического связывающего агента.
16. Способ ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающего, включающий введение
терапевтически эффективного количества выделенного полипептида по п.1.
17. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного
количества выделенного полипептида по п.1.
18. Способ ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающего, включающий введение
терапевтически эффективного количества антитела по пп.5, 6 или 7.
19. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного
количества антитела по пп.5, 6 или 7.
20. Фармацевтическая композиция, включающая выделенный полипептид по п.1 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
21. Фармацевтическая композиция, включающая антитело по пп.5, 6 или 7 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
22. Способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2, включающий введение пациенту выделенного полипептида по п.1.
23. Способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2, включающий введение пациенту антитела по пп.5, 6 или 7.
24. Способ модуляции сосудистой проницаемости или протекания плазмы или того и другого у
млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества
выделенного полипептида по п.1.
25. Способ лечения по меньшей мере одного из следующих состояний: неоваскуляризация глаза,
тучность, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительное заболевание, воспалительные
нарушения, атеросклероз, эндометриоз, неопластическое заболевание, заболевание, связанное с костью,
или псориаз у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного полипептида по п.1.
26. Способ модуляции сосудистой проницаемости или протекания плазмы или того и другого у
млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества
антитела по пп.5, 6 или 7.
- 67 -
011866
27. Способ лечения по меньшей мере одного из следующих состояний: неоваскуляризация глаза,
тучность, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительное заболевание, воспалительные
нарушения, атеросклероз, эндометриоз, неопластическое заболевание, заболевание, связанное с костью,
или псориаз у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела по пп.5, 6 или 7.
28. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного
количества выделенного полипептида по п.1 и химиотерапевтического агента.
29. Способ по п.28, при котором выделенный полипептид и химиотерапевтический агент вводят одновременно.
30. Способ по п.28, при котором выделенный полипептид и химиотерапевтический агент не вводят
одновременно.
31. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного
количества антитела по пп.5, 6 или 7 и химиотерапевтического агента.
32. Выделенное антитело, связывающее ангиопоэтин-2, включающее CDR1, который включает
аминокислотную последовательность, указанную в любом из SEQ ID NO: 69-104 или SEQ ID NO: 213.
33. Выделенное антитело, связывающее ангиопоэтин-2, включающее CDR2, который включает
аминокислотную последовательность, указанную в любом из SEQ ID NO: 105-143 или SEQ ID NO: 214.
34. Выделенное антитело, связывающее ангиопоэтин-2, включающее CDR3, который включает
аминокислотную последовательность, указанную в любом из SEQ ID NO: 144-198, SEQ ID NO: 212 или
SEQ ID NO: 215.
35. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по пп.32, 33 или 34.
36. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.35.
37. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.36.
38. Способ определения уровня ангиопоэтина-2 в биологическом образце, включающий:
(а) приведение выделенного полипептида по п.1 в контакт с указанным образцом и
(б) определение степени связывания специфического связывающего агента с указанным образцом.
39. Способ определения уровня ангиопоэтина-2 в биологическом образце, включающий:
(а) приведение антитела по пп.32, 33 или 34 в контакт с указанным образцом и
(б) определение степени связывания антитела с указанным образцом.
40. Антитело, включающее тяжёлую цепь и лёгкую цепь, где указанная тяжёлая цепь включает вариабельный участок тяжёлой цепи, выбранный из:
SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID
NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25;
SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID
NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51;
SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61,
и их антигенсвязывающих фрагментов;
а указанная лёгкая цепь включает вариабельный участок лёгкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 210 или SEQ ID NO: 211, или ее антигенсвязывающий фрагмент.
41. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.40.
42. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.41.
43. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.42.
44. Антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, включающее тяжёлую цепь и лёгкую
цепь, где лёгкая цепь включает вариабельный участок лёгкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 210 или SEQ ID NO: 211, или ее антигенсвязывающий
фрагмент.
45. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.44.
46. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.45.
47. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.46.
48. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающее ангиопоэтин-2, включающее тяжёлую цепь и лёгкую цепь, где тяжёлая цепь включает каркасные области
тяжёлой цепи и вариабельную область тяжёлой цепи, где вариабельная область тяжёлой цепи включает
CDR1 (SEQ ID NO: 69), CDR2 (SEQ ID NO: 111) и CDR3 (SEQ ID NO: 150) и лёгкая цепь включает каркасные области лёгкой цепи и вариабельную область лёгкой цепи, где вариабельная область лёгкой цепи
включает CDR1 (SEQ ID NO: 70), CDR2 (SEQ ID NO: 106) и CDR3 (SEQ ID NO: 212).
49. Выделенное антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, включающее тяжёлую цепь и
лёгкую цепь, где лёгкая цепь включает вариабельную область лёгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210, или ее антигенсвязывающий фрагмент.
50. Выделенное антитело, включающее тяжёлую цепь и лёгкую цепь, где указанная тяжёлая цепь
включает вариабельную область тяжёлой цепи последовательности SEQ ID NO: 11 или ее антигенсвязывающий фрагмент, а указанная лёгкая цепь включает вариабельную область лёгкой цепи, содержащую
- 68 -
011866
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210, или ее антигенсвязывающий фрагмент.
51. Антигенсвязывающий фрагмент антитела по п.7, содержащий одноцепочечное Fv антитело.
52. Антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.48-50, содержащий Fab антитело.
53. Антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.48-50, содержащий F(ab')2 антитело.
54. Антитело по любому из пп.48-50, которое представляет собой IgG1 антитело.
Фиг. 1
Картирование эпитопов
Фиг. 2а
- 69 -
011866
Картирование эпитопов
Фиг. 2б
Картирование эпитопов
Фиг. 2в
- 70 -
011866
Перечень последовательностей
- 71 -
011866
- 72 -
011866
- 73 -
011866
- 74 -
011866
- 75 -
011866
- 76 -
011866
- 77 -
011866
- 78 -
011866
- 79 -
011866
- 80 -
011866
- 81 -
011866
- 82 -
011866
- 83 -
011866
- 84 -
011866
- 85 -
011866
- 86 -
011866
- 87 -
011866
- 88 -
011866
- 89 -
011866
- 90 -
011866
- 91 -
011866
- 92 -
011866
- 93 -
011866
- 94 -
011866
- 95 -
011866
- 96 -
011866
- 97 -
011866
- 98 -
011866
- 99 -
011866
- 100 -
011866
- 101 -
011866
- 102 -
011866
- 103 -
011866
- 104 -
011866
- 105 -
011866
- 106 -
011866
- 107 -
011866
- 108 -
011866
- 109 -
011866
- 110 -
011866
- 111 -
011866
- 112 -
011866
- 113 -
011866
- 114 -
011866
- 115 -
011866
- 116 -
011866
- 117 -
011866
- 118 -
011866
- 119 -
011866
- 120 -
011866
- 121 -
011866
- 122 -
011866
- 123 -
011866
- 124 -
011866
- 125 -
011866
- 126 -
011866
- 127 -
011866
- 128 -
011866
- 129 -
011866
- 130 -
011866
- 131 -
011866
- 132 -
011866
- 133 -
011866
- 134 -
011866
- 135 -
011866
- 136 -
011866
- 137 -
011866
- 138 -
011866
- 139 -
011866
- 140 -
011866
- 141 -
011866
- 142 -
011866
- 143 -
011866
- 144 -
011866
- 145 -
011866
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 146 -