010409 Область изобретения Предшествующий уровень техники Настоящее изобретение относится к новому применению декстрансульфата.

010409
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новому применению декстрансульфата.
Предшествующий уровень техники
На сегодняшний день около 10 млн людей во всем мире страдают диабетом I типа, который также
называется инсулинозависимым сахарным диабетом. Однако, по приблизительным подсчетам, количество пораженных людей заметно увеличивается и к 2010 году может затронуть до 25 млн человек. В настоящее время проводится исследование, чтобы попытаться достичь долговременной нормогликемии у
пациентов с диабетом I типа путем введения инсулинпродуцирующих β-клеток. Двумя основными методами являлась трансплантация либо васкуляризированных трансплантатов поджелудочной железы, либо
изолированных островков Лангерганса. Хотя был достигнут некоторый успех с васкуляризированными
трансплантатами (целой поджелудочной железой), все же остаются проблемы, главным образом, из-за
хирургического риска и послеоперационных осложнений. Кроме того, также существует проблема нехватки подходящих доноров трансплантатов поджелудочной железы. Напротив, трансплантацию изолированных панкреатических островков традиционно осуществляют путем чреспеченочной инъекции островков в воротную вену, в силу чего островки закупоривают воротное дерево печени.
Новый протокол аллотрансплантации островков, который был недавно представлен Shapiro и коллегами [1], несомненно, будет полезен для целого ряда пациентов с диабетом I типа. Однако даже при
этом новом подходе оказывается, что трансплантации островков поджелудочной железы одного донора
недостаточно для создания нормогликемии у пациента [2]. В результате ожидается, что обеспечение островками человека станет лимитирующим фактором в лечении. В таком случае должны быть найдены
альтернативные источники инсулинпродуцирующих клеток. Одной из возможностей является использование островков, полученных из тканей животных, причем основным кандидатом являются островки,
полученные от свиней.
Одним из основных препятствий, которые необходимо преодолеть до того, как ксенотрансплантация островков станет возможной, является неблагоприятная воспалительная реакция, которую вызывают
свиные островки при воздействии свежей крови человека in vitro и in vivo [3]. Островки человека также
вызывают неблагоприятную воспалительную реакцию при воздействии на них крови пациента, соответствующей по системе АВО, во время интрапортальной трансплантации [4]. Воспалительная реакция характеризуется быстрым расходованием и активацией тромбоцитов, которые прикрепляются к поверхности островка, способствуя активации каскадов коагуляции и комплемента. Кроме того, островки включаются в сгустки и инфильтруются CD11b+ лейкоцитами, что в совокупности приводит к деструкции
морфологии клеток и к потере нормогликемии у пациентов [3-4]. Более того, воспаление может ускорить
следующий клеточно-опосредованный специфический иммунный ответ на более поздней фазе [5-8].
Следовательно, подавление немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (IBMIR, instant
blood-mediated inflammatory reaction), как называют неблагоприятную воспалительную реакцию, оказывается решающим для успеха аллотрансплантации и ксенотрансплантации островков.
Два недавних исследования Buheler et al. [5] и Cantarovich et al. [6] показали, что островки от взрослых свиней сразу же разрушаются при интрапортальной трансплантации в печень нечеловекообразных
приматов даже в условиях традиционной для предшествующего уровня техники широкой иммуносупрессии. В этих исследованиях авторы сделали заключение, что мощный врожденный иммунный ответ,
IBMIR, на который не влияют иммуносупрессивные лекарственные средства, вовлечен в деструкцию
ксеногенных островков.
Fiorante et al. изучали применение декстрансульфата в предупреждении сверхострого отторжения
(HAR) васкуляризированных дискордантных ксенотрансплантатов [9]. В модели ксенотрансплантации
HAR легких свиньи, перфузируемых кровью человека, обработанной цитратом для предотвращения коагуляции, происходило через 30 мин. Однако добавление декстрансульфата в концентрации 2 мг/мл продлило выживание легкого до приблизительно 200 мин. HAR васкуляризированных целых органов опосредовано действием антител в крови человека, которые идентифицируют и связываются с экспонированными антигенами на эндотелиальных клетках кровеносных сосудов трансплантированных органов.
Такая опосредованная антителами HAR реакция усиливается компонентами системы комплемента [8, 10,
11]. Так как известно также, что декстрансульфат подавляет активацию комплемента [9, 12], предполагается, что длительное выживание легкого при применении декстрансульфата в используемой модели ксенотрансплантации происходит в результате такого антикомплементного действия декстрансульфата.
Nakano и сотрудники трансплантировали изолированные сингенные островки в печень мышей с
STZ(стрептозотоцин)-индуцированным диабетом с целью изучения роли фактора роста гепатоцитов
(HGF) в уменьшении интенсивности гипрегликемии [13]. Известно, что декстрансульфат усиливает действие HGF, и поэтому HGF вводили мышам-реципиентам внутрибрюшинно вместе с декстрансульфатом.
Такое введение вызывало нормогликемию у всех мышей, включенных в исследование. Введение одного
декстрансульфата также продемонстрировало некоторый благоприятный эффект у нескольких мышей,
но не в тех случаях, когда местом трансплантации островков было субкапсулярное пространство почек.
Дополнительная обработка анти-HGF антителами мышей, которым вводили декстрансульфат, полностью
аннулировала благоприятный эффект декстрансульфата, это означало, что эффект декстрансульфата в
-1-
010409
этой модели аллогенной трансплантации островков мышам опосредован эндогенным HGF.
Thomas et al. [14] показали, что растворимые производные декстрана подавляют активацию комплемента и опосредованное комплементом повреждение in vitro. Инкубация эндотелиальных клеток аорты свиньи в сыворотке человека приводила к расходованию комплемента и отложению активированных
фрагментов С3, С5 и атакующего мембрану комплекса С5b-9 в эндотелиальных клетках. Добавление
25 мг/мл декстрансульфата CMDB25 подавляло активацию комплемента и отложение цитолитического
комплекса на клетках. Чистый декстран не оказывал подобного действия.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение преодолевает эти и другие недостатки средств предшествующего уровня
техники.
Основной целью настоящего изобретения является предложение лечения немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (IBMIR).
Другой целью изобретения является предложение лечения морфологического разрушения клеточных трансплантатов, вызываемого IBMIR.
Еще одной целью изобретения является предложение лечения отторжения клеточных трансплантатов, вызываемого IBMIR.
Изобретение, как оно определено в прилагаемой формуле изобретения, удовлетворяет этой и другим целям.
Кратко, настоящее изобретение включает применение декстрансульфата и его производных для лечения немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (IBMIR). Эта недавно описанная
форма воспаления инициируется, когда клетки или клеточные кластеры подвергаются действию чужой
крови in vitro и in vivo. Очень важным примером IBMIR является случай, когда аллогенные или ксеногенные клеточные трансплантаты трансплантируют в тело млекопитающего пациента-реципиента, особенно человека. В таком случае IBMIR приводит к морфологическому разрушению и деструкции трансплантируемых клеток или клеточных кластеров, проявляющимся в потере структуры и формы. Кроме
того, IBMIR также обычно приводит к отгоржению клеточных трансплантатов.
Введение декстрансульфата или его производных аннулирует вредное действие IBMIR и эффективно предотвращает отторжение трансплантата и морфологическое разрушение клеточных трансплантатов.
Декстрансульфат по изобретению может иметь молекулярную массу от низкомолекулярного декстрансульфата (LMW-DS), например от нескольких сотен или тысяч дальтон (Да), до высокомолекулярного
декстрансульфата (HMW-DS), обычно с молекулярной массой более 500000 Да, например более 1000000 Да.
Благоприятное действие декстрансульфата особенно заметно для LMW-DS, но положительный эффект
также виден при введении декстрансульфата с более высокой молекулярной массой. Благоприятное действие более крупных молекул декстрансульфата на IBMIR по изобретению может быть усилено путем
увеличения серосодержания, т.е. числа сульфатных групп на гликозильный остаток в цепи декстрана.
LMW-DS, как правило, имеет молекулярную массу ниже 20000 Да, например ниже 10000 Да и например
около 5000 Да. Среднее серосодержание для LMW-DS может составлять от приблизительно 10 до 25%,
например от 15 до 25%, что соответствует приблизительно двум сульфатным группам на гликозильный
остаток. Для декстрансульфата со средней молекулярной массой выше 20000 Да может использоваться
большее серосодержание.
Декстрансульфат или его производные можно вводить для системной доставки к месту IBMIR или
клеточной трансплантации или можно вводить для доставки непосредственно (локально) в это место.
Таким образом, согласно изобретению декстрансульфат или его производные можно вводить перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, защечно, ректально, кожно, назально, трахеально, бронхиально, местно, любым другим парентеральным путем или посредством ингаляции, в виде фармацевтического препарата, содержащего активный ингредиент в фармацевтически приемлемой лекарственной
форме.
При терапевтическом лечении млекопитающих, и особенно человека, декстрансульфат и его производные могут быть введены сами по себе, но, как правило, будут вводиться в виде фармацевтического
препарата в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем, который
может быть выбран с учетом предполагаемого пути введения и общепринятой фармацевтической практики.
Количества декстрансульфата или его производных в препарате будут зависеть от тяжести состояния и от пациента, подлежащего лечению, а также от фактического препарата и используемого способа
введения и могут быть традиционным образом определены специалистом. Концентрация вводимого декстрансульфата или его производных по настоящему изобретению не должна быть слишком высокой,
чтобы минимизировать любые побочные эффекты, связанные с декстрансульфатом. В большинстве клинических ситуаций подходящими дозами декстрансульфата или его производных в терапевтическом
и/или профилактическом лечении пациентов-млекопитающих, особенно человека, являются те дозы, которые обеспечивают среднюю концентрацию в крови менее 5 мг/мл, возможно менее 2 мг/мл и особенно
менее 1 мг/мл. Предпочтительный интервал концентраций находится между 0,01 и 1 мг/мл декстрансульфата, например более 0,05, более 0,08 или более 0,1 мг/мл и/или менее 0,8, менее 0,6, менее 0,4 или
менее 0,2 мг/мл, например в интервале концентраций от 0,01 до 0,2 мг/мл и/или от 0,05 до 0,2 мг/мл.
-2-
010409
Декстрансульфат по настоящему изобретению особенно подходит для предотвращения отторжения
инсулинпродуцирующих β-клеток, трансплантируемых пациентам, страдающим диабетом I типа. Таким
пациентам островки Лангерганса других людей или млекопитающих, предпочтительно островки свиньи,
можно трансплантировать посредством инъекции этих островков в воротную вену пациентов. Однако
при воздействии крови пациента на островки инициируется IBMIR и инсулинрегулирующая функция
островков инсулина ликвидируется, а островки отторгаются. Поэтому, когда осуществляют трансплантацию клеток или клеточных кластеров, предпочтительно достичь терапевтической концентрации декстрансульфата или его производных, по меньшей мере, в месте трансплантации. Этого можно добиться
путем введения декстрансульфата перед фактической трансплантацией. Альтернативно, можно инъецировать островки, разведенные в растворе, содержащем декстрансульфат по настоящему изобретению, с
целью подавить IBMIR и предупредить любое разрушение или отторжение островков, делая возможной
нормогликемию у пациентов. Концентрация декстрансульфата в таком растворе клеток и декстрансульфата предпочтительно является достаточно высокой, так чтобы можно было достичь терапевтической
концентрации декстрансульфата, т.е. предпочтительно менее 5 мг/мл, более предпочтительно от 0,01 до
1,0 мг/мл и особенно от 0,01 до 0,2 мг/мл, по меньшей мере, местно, в месте трансплантации в течение
первых часов после трансплантации. Затем декстрансульфат диффундирует от места трансплантации с
понижением местной концентрации декстрансульфата. В некоторых применениях для подавления
IBMIR, морфологического разрушения и/или отторжения клеточных трансплантатов не требуется дополнительного декстрансульфата, так как терапевтическая концентрация декстрансульфата возможно
требуется только в течение первых 24-48 ч после трансплантации. Однако, когда требуется, может быть
добавлен дополнительный декстрансульфат, например, внутривенно, внутрибрюшинно или каким-либо
другим способом введения. Специалисту очевидно, что введение раствора декстрансульфата, содержащего клетки или клеточные кластеры, подлежащие введению, можно также комбинировать с введением
декстрансульфата или его производных перед фактической трансплантацией.
Декстрансульфат или его производные можно также комбинировать с другими терапевтическими
агентами, которые полезны в лечении отторжения трансплантируемой ткани. Подходящими, но не ограничивающими примерами таких иммуносупрессивных агентов, которые могут быть использованы совместно с декстрансульфатом для лечения отторжения трансплантата, являются циклоспорин, такролимус, кортикостероиды, рапамицин (сиролимус) и микофенолата мофетил. Введение декстрансульфата по
настоящему изобретению может также быть согласовано с введением анти-TF(тканевого фактора) антител и/или фактора VIIa с инактивированным сайтом, которые также в некоторой степени обладают
функцией подавления IBMIR.
Краткое описание графических материалов
Изобретение вместе с его дополнительными объектами и преимуществами легче всего понять, обращаясь к следующему описанию и прилагаемым графическим материалам, где
фиг. 1 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую действие LMW-DS на генерацию С3а во
время перфузии островков свиньи с кровью человека;
фиг. 2 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую действие LMW-DS на генерацию sC5b-9
во время перфузии островков свиньи с кровью человека;
фиг. 3 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую прямое действие LMW-DS на систему
комплемента при инкубации сыворотки в присутствии LMW-DS;
фиг. 4 иллюстрирует распределение лейкоцитов в островках свиньи после перфузии кровью человека, не содержащей LMW-DS;
фиг. 5 иллюстрирует распределение лейкоцитов в островках свиньи после перфузии кровью человека, содержащей 1 мг/мл LMW-DS;
фиг. 6 иллюстрирует распределение тромбоцитов в островках свиньи после перфузии кровью человека, не содержащей LMW-DS;
фиг. 7 иллюстрирует распределение тромбоцитов в островках свиньи после перфузии кровью человека, содержащей 1 мг/мл LMW-DS;
фиг. 8 иллюстрирует экспрессию инсулина в островках свиньи после интрапортальной трансплантации диабетическим бестимусным мышам без обработки LMW-DS;
фиг. 9 иллюстрирует экспрессию инсулина в островках свиньи после интрапортальной трансплантации диабетическим бестимусным мышам с обработкой LMW-DS;
фиг. 10 иллюстрирует распределение лейкоцитов в островках свиньи после интрапортальной
трансплантации диабетическим бестимусным мышам без обработки LMW-DS и
фиг. 11 иллюстрирует распределение лейкоцитов в островках свиньи после интрапортальной
трансплантации диабетическим бестимусным мышам с обработкой LMW-DS.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение, в целом, относится к новому неожиданному действию декстрансульфата на
немедленную воспалительную реакцию, опосредованную кровью (IBMIR), и морфологическое разрушение и отторжение клеточных трансплантатов, вызываемые IBMIR.
IBMIR представляет собой относительно недавно идентифицированную воспалительную реакцию,
-3-
010409
инициируемую при воздействии на клетки или клеточные кластеры или при контакте с ними чужеродной
крови. IBMIR характеризуется экспрессией тканевого фактора на клетках, который инициирует местную
генерацию тромбина. Затем активированные тромбоциты прикрепляются к клеточной поверхности, способствуя активации систем коагуляции и комплемента. Кроме того, накапливаются лейкоциты и происходит инфильтрация клеток. Вместе эти эффекты вызывают разрушение и уничтожение клеточной морфологии в течение первых нескольких часов после контакта с чужеродной кровью. IBMIR также ускоряет последующий клеточно-опосредованный специфический иммунный ответ на более поздней фазе.
Очень важным примером IBMIR является случай, когда клетки или клеточные кластеры трансплантируют в организм предпочтительно млекопитающего пациента, и особенно человека. При контакте с
кровью пациента-реципиента клетки инициируют IBMIR, что приводит к разрушению клеточной морфологии и, как правило, к отторжению клеточного трансплантата. IBMIR была обнаружена как при аллогенной клеточной трансплантации, когда клетки донора с кровью, соответствующей по системе АВО,
трансплантируют пациенту, так и при ксеногенной клеточной трансплантации, включая ксенотрансплантацию клеток и/или клеточных кластеров от свиньи обезьяне и от свиньи человеку.
Выражение "клеточный трансплантат" в общем случае относится в настоящем изобретении к одиночной клетке, нескольким одиночным клеткам или кластеру из многих клеток, трансплантируемым в
организм реципиента, предпочтительно млекопитающего, и особенно человека. Также выражение "клеточный трансплантат" в данном контексте включает более крупные клеточные кластеры неваскуляризированных тканей. Примерами клеточных трансплантатов по настоящему изобретению являются аллогенные или ксеногенные островки Лангерганса, трансплантируемые в воротную вену печени пациентов,
страдающих диабетом I типа. Еще одним примером может являться трансплантация эмбриональной ксеногенной нервной ткани/клеток в полосатое тело пациентов с болезнью Паркинсона.
Как кратко обсуждалось в разделе "Предшествующей уровень техники", перспективной процедурой
для достижения нормогликемии у пациентов с диабетом I типа является трансплантация инсулинпродуцирующих β-клеток, например, в воротную вену. Подходящие инсулинпродуцирующие клетки, например в виде островков Лангерганса, могут быть получены как от аллогенных, так и от ксеногенных доноров. Из-за того, что для достижения нормогликемии требуются островки от нескольких доноров, и из-за
нехватки подходящих доноров-людей могут быть использованы ксеногенные, предпочтительно свиные
островки. Однако как аллогенные, так и ксеногенные островки вызывают IBMIR при воздействии крови
пациента-реципиента. В результате в течение нескольких часов после трансплантации морфология клеток разрушается и уничтожается, что, как правило, проявляется в потере целостности, структуры и формы клеток. Это приводит сначала к сильному увеличению высвобождения инсулина из островков Лангерганса с последующим уменьшением или прекращением высвобождения инсулина. Другими словами,
вскоре за трансплантацией следует потеря нормогликемии. Кроме того, IBMIR также вызывает отторжение клеточных трансплантатов.
Введение традиционных иммуносупрессивных лекарственных средств, которые предотвращают
продуцирование антител и отторжение органов, не оказывает влияния на IBMIR или на отторжение клеточных трансплантатов, вызываемое IBMIR. Это свидетельствует о том, что основные механизмы IBMIR
и отторжения клеточных трансплантатов отличаются от механизма отторжения, обнаруженного в трансплантации целых органов и васкуляризированной ткани.
Далее в описании следует более подробный обзор симптомов IBMIR, и в частности расходования
тромбоцитов, активации коагуляции и комплемента и инфильтрации лейкоцитов. Кроме того, рассматриваются влияния декстрансульфата на соответствующие симптомы. Для более детального обсуждения
таких влияний декстрансульфата сделана ссылка на раздел "Примеры".
Начинаясь с расходования тромбоцитов, IBMIR оказывает влияние на число тромбоцитов в крови,
подвергаемой воздействию аллогенных или ксеногенных клеток или клеточных кластеров. В крови после
контакта кровь-клетка может быть обнаружено значительное снижение свободно циркулирующих тромбоцитов. Тромбоциты активируются и прикрепляются к клеткам, что приводит к агрегации тромбоцитов.
После прикрепления к клеткам тромбоциты высвобождают некоторые вещества, включая фосфолипиды
тромбоцитов, которые важны для образования сгустка и активации системы коагуляции.
Введение эффективного количества декстрансульфата по изобретению подавляет расходование
тромбоцитов, что видно по увеличению количества тромбоцитов в крови, которое возвращается к значению, определенному в крови до воздействия чужеродных клеток или клеточных кластеров. Кроме того,
декстрансульфат значительно уменьшает прикрепление тромбоцитов к клеткам, хотя все-таки могут наблюдаться следовые количества тромбоцитов, окружающих островки. Действие этих оставшихся тромбоцитов, однако, не обязательно является неблагоприятным. Исследования на животных показали, что
после трансплантации проходит по меньшей мере 1 неделя до того, как обнаруживается ангиогенез
[15,16]. Тромбоциты содержат ряд важных факторов роста, таких как тромбоцитарный фактор роста
(PDGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF) [17, 18], которые
могут поддерживать реваскуляризацию и приживление островков в организме пациента. В случае клинической трансплантации островков, когда островки вводят в воротную вену, гирлянда прикрепленных
тромбоцитов может, подобным образом, поддержать их приживление и выживание в ткани печени.
-4-
010409
При контакте с кровью чужеродные клетки активируют систему коагуляции посредством экспрессии тканевых факторов на клетках и посредством высвобождения веществ прикрепленными и агрегирующими тромбоцитами. Кратко, тканевый фактор (TF), продуцируемый клетками, образует комплекс с
фактором коагуляции крови VIIa и энзиматически действует на фактор X с образованием активированного фактора X (FXa). После этого следует каскад активации разных факторов, который, в конечном счете, приводит к образованию тромбина из протромбина. Тромбин, в свою очередь, вызывает полимеризацию молекул фибриногена в фибриновые волокна, образующие фибриновый сгусток вокруг клеток, как
хорошо известно специалистам в данной области. Тромбин также активирует внутренний путь инициации свертывания крови, по которому фактор XII (фактор Хагемана) активируется (FXIIa) и, в свою очередь, энзиматически активирует фактор XI (предшественник тромбопластина) с получением FXIa, активированной формы фактора XI. Этот путь также, в конечном счете, приводит к образованию тромбина из
протромбина, как и по внешнему TF-активируемому пути.
Свертывание крови может ингибировать антитромбин, циркулирующий ингибитор сериновых протеаз, который инактивирует FXIIa, FXIa и тромбин, образуя комплексы фактор XIIa-антитромбин (FXIIaAT), фактор XIa-антитромбин (FXIa-AT) и тромбин-антитромбин (ТАТ). Кроме того, ингибитор С1-эстеразы является известным ингибитором FXIa и FXIIa, образующим комплексы фактор XIa-ингибитор С1эстеразы (FXIa-C1 INH) и фактор XIIa-ингибитор С1-эстеразы (FXIIa-C1 INH).
Образовавшийся вокруг клеток или клеточных кластеров фибриновый сгусток может быть удален
под действием плазмина фибринолитической системы. Плазмин расщепляет фибриновый сгусток до
продуктов расщепления фибрина, таким образом предупреждая дальнейшее свертывание. Однако действие плазмина ингибируется альфа-2-антиплазмином, который связывается со свободным плазмином и
инактивирует его, образуя комплекс плазмин-альфа-2-антиплазмин (РАР).
IBMIR характеризуется образованием фибриновых сгустков вокруг клеток, подвергаемых воздействию чужеродной крови in vitro или in vivo. Кроме того, обнаруживается увеличение FXIa-AT, FXIIaAT, ТАТ и PAP. IBMIR не оказывает влияния ни на количество FXIa-C1 INH, ни на FXIIa-C1 INH. Введение эффективного количества декстрансульфата по изобретению аннулирует влияние IBMIR на активацию коагуляции, что проявляется в снижении количества FXIa-AT, FXIIa-AT, TAT и РАР, обнаруживаемых в крови. Действие декстрансульфата на активацию коагуляции может быть опосредовано системой коагуляции самой по себе, ингибиторным действием декстрансульфата на активацию тромбоцитов
или обоими из них.
За активацией тромбоцитов и коагуляции в IBMIR следует каскад комплемента. Одним из компонентов системы комплемента является С3, который при активации расщепляется на небольшой фрагмент
С3а, пептидный медиатор воспаления, и более крупный фрагмент С3b. С3b, в свою очередь, связывается
с другими компонентами системы комплемента с образованием С5-конвертазы, которая расщепляет С5
на С5а, диффундирующий в сторону, и активную форму С5b, которая прикрепляется к клеточной поверхности. Связанный С5b затем связывается еще с четырьмя компонента комплемента, образуя комплекс атаки мембраны с5b-9. Этот комплекс вытесняет фосфолипиды мембраны, образуя большие
трансмембранные каналы, что разрушает мембрану и дает возможность ионам и маленьким молекулам
свободно диффундировать. Таким образом, клетка не может поддерживать осмотическую стабильность и
лизируется посредством притока воды и потери электролитов.
Большая часть расходования тромбоцитов происходит до того, как могут быть обнаружены опосредованные комплементом влияния IBMIR, это означает, что реакция свертывания может индуцировать активацию комплемента. IBMIR вызывает значительную активацию комплемента, определяемую по увеличению С3а и растворимого комплекса атаки мембран sC5b-9 в крови. Введение эффективного количества декстрансульфата по изобретению снижает количество этих компонентов комплемента в крови дозозависимым образом.
IBMIR также характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в клетки или клеточные кластеры. Инфильтрация CD11b+ полиморфноядерных клеток и моноцитов в клетки ясно обнаруживается иммуногистохимическим окрашиванием. Иммуногистохимические анализы показали, что инфильтрация лейкоцитов полностью подавлялась введением декстрансульфата.
Согласно первому аспекту изобретения предложено применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного в изготовлении лекарства для лечения немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (IBMIR).
Согласно другому аспекту изобретения предложено применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного в изготовлении лекарства для лечения морфологического разрушения трансплантированных клеточных трансплантатов. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного в изготовлении лекарства для лечения отторжения клеточных
трансплантатов также входит в объем настоящего изобретения. Эти два действия, т.е. разрушение клеточной морфологии и отторжение трансплантата, оказываемые на трансплантированные клетки, клеточные кластеры или неваскуляризированную ткань у пациентов-млекопитающих, предпочтительно человека, являются следствием неблагоприятного влияния IBMIR. IBMIR-опосредованное влияние на клеточную трансплантацию имеет место как при трансплантации от человека человеку с донорами, соответст-5-
010409
вующими по системе АВО, так и при использовании в качестве доноров других млекопитающих, предпочтительно свиней. Таким образом, декстрансульфат оказывает благоприятное терапевтическое действие как на аллогенную, так и на ксеногенную клеточную трансплантацию.
Во избежание сомнений, в данном контексте термин "лечение" включает терапевтическое и/или профилактическое лечение IBMIR. "Фармацевтически приемлемые производные" включают соли и сольваты.
Декстрансульфат или его производные, применяемые по изобретению, могут иметь молекулярную
массу от низкомолекулярного декстрансульфата (LMW-DS), например от нескольких сотен или тысяч
дальтон (Да), до высокомолекулярного декстрансульфата (HMW-DS), как правило, с молекулярной массой более 500000 Да, например более 1000000 Да. Полезное действие декстрансульфата особенно заметно у LMW-DS, но положительное действие также наблюдается при введении декстрансульфата с более
высокой молекулярной массой. Однако более крупные молекулы декстрансульфата могут активировать
FXII, вызывая некоторые побочные эффекты, что более подробно обсуждается ниже. Полезное действие
более крупных молекул декстрансульфата, оказываемое на IBMIR, согласно изобретению может быть
усилено увеличением серосодержания, т.е. числа сульфатных групп на гликозильный остаток в цепи декстрана. LMW-DS, как правило, имеет среднюю молекулярную массу ниже 20000 Да, например ниже
10000 Да и например приблизительно 5000 Да. Среднее серосодержание для LMW-DS может составлять
от приблизительно 10 до 25%, например от 15 до 25%, что соответствует приблизительно 2 сульфатным
группам на гликозильный остаток. Для декстрансульфата со средней молекулярной массой выше 20000 Да
может быть применимо большее серосодержание.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ лечения IBMIR, который включает
введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
Другими аспектами изобретения являются способ лечения отторжения клеточных трансплантатов,
который включает введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком лечении, и способ лечения
морфологического разрушения трансплантированных клеточных трансплантатов, который включает
введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
Декстрансульфат или его производные можно вводить для системной доставки в место IBMIR или
клеточной трансплантации или можно вводить для доставки непосредственно (локально) в это место,
используя соответствующие способы введения, известные специалистам.
Таким образом, согласно изобретению декстрансульфат и его производные можно вводить перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, защечно, ректально, кожно, назально, трахеально,
бронхиально, местно, любым другим парентеральным путем или посредством ингаляции, в виде фармацевтического препарата, содержащего активный ингредиент в фармацевтически приемлемой лекарственной форме. В зависимости от вида клеточной трансплантации, места трансплантации и пациента,
подлежащего лечению, а также от способа введения, композиции можно вводить в варьируемых дозах.
При терапевтическом лечении млекопитающих, и особенно человека, декстрансульфат и его производные можно вводить сами по себе, но, как правило, их вводят в виде фармацевтического препарата в
смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем, который может быть
выбран в соответствии с предполагаемым путем введения и общепринятой фармацевтической практикой.
Количества декстрансульфата или его производных в препарате будут зависеть от тяжести состояния и от пациента, подлежащего лечению, а также от фактического препарата и применяемого пути введения и могут быть традиционным образом определены специалистом. Концентрация вводимого декстрансульфата или его производных по настоящему изобретению не должна быть слишком высокой, чтобы
минимизировать любые побочные эффекты, связанные с декстрансульфатом. В большинстве клинических ситуаций подходящими дозами декстрансульфата или его производных в терапевтическом и/или
профилактическом лечении пациентов-млекопитающих, особенно человека, являются те дозы, которые
обеспечивают среднюю концентрацию в крови менее 5, возможно менее 2 мг/мл и особенно менее
1 мг/мл. Предпочтительный интервал концентраций составляет от 0,01 до 1 мг/мл декстрансульфата, например более 0,05, более 0,08 или более 0,1 мг/мл и/или менее 0,8, менее 0,6, менее 0,4 или менее
0,2 мг/мл, например в интервале концентраций от 0,01 до 0,2 мг/мл и/или от 0,05 до 0,2 мг/мл. Доказано,
что эти концентрации достаточно велики для предупреждения или подавления IBMIR и морфологического разрушения и отторжения клеточных трансплантатов, но все же достаточно низки, чтобы минимизировать любые побочные эффекты, обычно связанные с введением декстрансульфата. Кроме того, культивирование островков в LMW-DS не оказывало никаких неблагоприятных эффектов на функцию островков в концентрациях в интервале от 0,01 до 1 мг/мл. В любом случае, врач или специалист способен
определить фактическую дозировку, которая будет наиболее подходящей для отдельного пациента, которая может варьироваться в зависимости от возраста, массы и реакции конкретного пациента. Указанные выше дозировки являются примерами предпочтительных дозировок усредненного случая. Однако
могут иметь место отдельные случаи, когда будут уместными более высокие или более низкие интервалы дозировок, и они также входят в объем данного изобретения.
-6-
010409
На сегодняшний день декстрансульфат уже применялся в клинических исследованиях для противовирусной терапии против ВИЧ (вируса иммунодефицита человека), для лечения острого ишемического
инсульта в комбинации с урокиназой и в антигиперлипидемической терапии, где декстрансульфат связывали с твердой фазой. В двух предшествующих видах исследований скорость инъекции составляла
приблизительно 45 мг/ч, и ее поддерживали в течение 2-3 недель посредством постоянной инъекции декстрансульфата (молекулярная масса (MW) 8000 Да), и обнаруженная концентрация в крови составляла
приблизительно 0,01 мг/мл. У всех этих пациентов после 3 суток обработки наблюдалась тромбоцитопения (иногда объединенная с кровотечением), и сообщалось об алопеции у приблизительно половины пациентов. Однако оба этих эффекта были обратимыми. По приблизительным оценкам, введение декстрансульфата для подавления IBMIR, морфологического разрушения и/или отторжения клеточных трансплантатов обычно осуществляется в течение 1-2 или нескольких суток. Следовательно, указанные выше
побочные эффекты будут очень слабыми в течение такого короткого периода введения (несколько дней
по сравнению с 2-3 неделями).
Давно известно, что декстрансульфат вызывает гипотонию через высвобождение брадикинина в результате активации калликреина плазмы. Однако это наблюдение, главным образом, было сделано, когда
HMW-DS был иммобилизован на колонках для плазмафереза для лечения гиперлипидемии, а не в процессе инъекции декстрансульфата. Этот эффект является результатом прямой активации FXII в FXIIa.
Однако в настоящем документе приведено подтверждение того, что фактор XII не активируется прямо
LMW-DS. Как было упомянуто выше, уровни FXIIa-AT и РАР повышаются при воздействии на клетки
чужеродной крови без LMW-DS. Однако эти высокие уровни нормализуются при добавлении LMW-DS.
Для предупреждения IBMIR после клеточной трансплантации и/или морфологического разрушения
и отторжения клеточных трансплантатов при проведении клеточной трансплантации предпочтительно
достигают терапевтической концентрации декстрансульфата или его производных, по меньшей мере,
местно, в месте трансплантации. Ее можно достичь путем введения декстрансульфата перед фактической
трансплантацией. Альтернативно, клетки или клеточные кластеры, подлежащие трансплантации пациенту, можно инъецировать разведенными в растворе, содержащем декстрансульфат по настоящему изобретению. Концентрация декстрансульфата в таком растворе клеток и декстрансульфата предпочтительно
достаточно высока, чтобы можно было достичь (местно) терапевтической концентрации декстрансульфата, т.е. предпочтительно менее 5 мг/мл и более предпочтительно от 0,01 до 1,0 мг/мл, в месте трансплантации в течение первых часов после трансплантации. Специалисту очевидно, что фактическая концентрация декстрансульфата или его производных временно может быть выше оптимальной концентрации в крови пациента, когда клетки или клеточные кластеры трансплантируют разведенными в растворе
декстрансульфата. Впоследствии декстрансульфат диффундирует от места трансплантации с понижением местной концентрации декстрансульфата. В некоторых применениях не требуется дополнительного
декстрансульфата для подавления IBMIR, морфологического разрушения и/или отторжения клеточных
трансплантатов, так как терапевтическая концентрация декстрансульфата, возможно, будет требоваться
только в течение первых 24-48 ч после трансплантации. Однако при необходимости дополнительный
декстрансульфат может быть добавлен, например, внутривенно, внутрибрюшинно или каким-либо другим способом введения, указанным выше. Специалисту очевидно, что введение раствора декстрансульфата, содержащего клетки или клеточные кластеры, подлежащие трансплантации, можно также объединять с введением декстрансульфата или его производных перед фактической трансплантацией.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложен фармацевтический препарат для применения
в лечении IBMIR, содержащий эффективное количество декстрансульфата или его фармацевтически
приемлемого производного.
Настоящее изобретение также направлено на фармацевтический препарат для применения в лечении отторжения клеточных трансплантатов, содержащий эффективное количество декстрансульфата или
его фармацевтически приемлемого производного, и фармацевтический препарат для применения в лечении морфологического разрушения трансплантированных клеточных трансплантатов, содержащий эффективное количество декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного.
Декстрансульфат или его производные можно также комбинировать с другими терапевтическими
агентами, которые полезны в лечении отторжения трансплантируемой ткани. Подходящими, но не ограничивающими примерами таких иммуносупрессивных агентов, которые можно применять совместно с
декстрансульфатом для лечения отторжения трансплантата, являются циклоспорин, такролимус, кортикостероиды, рапамицин (сиролимус) и микофенолата мофетил. Введение декстрансульфата или его производных по изобретению может быть также согласовано с введением анти-TF антител и/или фактора
VIIa с инактивированным сайтом, которые, как было показано, в некоторой степени обладают функцией
подавления IBMIR.
Примеры
Реагенты.
Низкомолекулярный декстрансульфат (LMW-DS) со средней молекулярной массой 5000 Да и серосодержанием приблизительно 17% был получен от Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA). Высокомолекулярный декстрансульфат (HMW-DS) со средней молекулярной массой более 1000000 Да и серосодер-7-
010409
жанием 16-19% был приобретен в Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden). Низкомолекулярный декстран
(LMW-D; MW 5000 Да) и высокомолекулярный декстран (HMW-D; MW более 1000000 Да) были получены от Fluka Chemical (Buchs, Switzerland) и Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA), соответственно.
Обработка гепарином.
Все материалы, контактировавшие с цельной кровью, обрабатывали гепариновым покрытием Corline
(Corline heparin surface) (Corline Systems AB, Uppsala, Sweden) согласно рекомендации изготовителя. Поверхностная концентрация гепарина составляла 0,5 мкг/см2, что соответствует приблизительно 0,1 Ед./см2,
с антитромбинсвязывающей способностью 2-4 пмоль/см2.
Препарат крови.
Свежую кровь человека, полученную от здоровых добровольцев, которые не принимали лекарства в
течение по меньшей мере 14 дней, собирали в 60-мл шприцы с гепаринизированной поверхностью (18
размер; Microlance; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Канюли шприцов присоединяли к силиконовым
трубкам с гепаринизированной поверхностью. Во время отбора образцов шприцы непрерывно вращали.
Животные.
В качестве реципиентов использовали инбредных самцов бестимусных мышей (nu/nu Black-6, BomMice)
из Bomholt Gaard Breeding and Research Centre, Ltd. (Ry, Denmark), массой 20-25 г. Все животные имели
свободный доступ к стандартной пище и воде.
Выделение островков.
Островки взрослых свиней (API) выделяли из поджелудочной железы 2- или 3-летних свиноматок
породы шведский ландрас (от 200 до 300 кг) посредством процедуры ферментативного и механического
расщепления поджелудочной железы, после которой следовали фильтрация и отделение островков на
градиентах плотности фиколла, как предложено Ricordi et al. [19, 20]. Островки суспендировали в культуральной среде М199 (Gibco, BRL, Life Technologies Ltd., Paisley, Scotland) с добавлением 10% сыворотки свиней (Gibco, BRL), 1 мМ нитрата кальция, 0,02 мкМ селена, 20 мМ никотинамида, 25 мМ HEPES
(гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновой кислоты), фунгизона (500 мкг/л) и гентамицина (50 мг/л) и
культивировали в 250 мл колбах при 37°С в атмосфере 5%-ного СО2 и увлажненного воздуха в течение
от 1 до 4 дней. Культуральную среду меняли в 1 сутки и затем каждые сутки. Объем и чистоту островков
определяли с помощью инвертированного микроскопа после окрашивания дитизоном (Sigma Chemicals,
St. Louis, МО).
Индукция диабета у бестимусных мышей.
У бестимусных мышей индуцировали диабет посредством внутривенной (в/в) инъекции стептозотоцина от Sigma Chemicals (Palo Alto, CA, USA) согласно Wennberg et al. [20]. Доза стептозотоцина для
бестимусных мышей составляла 250 мг/кг массы тела. Животное считалось диабетическим, если уровень
глюкозы в крови (В-глюкозы) превышал 20 ммоль/л (более 360 мг/дл) в течение 2 или более последующих суток.
Трансплантация API диабетическим бестимусным мышам, обработанным LMW-DS или без него.
После культивирования в течение 4 дней 5 мкл API (приблизительно 5000 IEQs (islet equivalent,
островковых эквивалентов) из 5 изолятов трансплантировали в печень через воротную вену 11 инбредных самцов диабетических атимических мышей, которым во время операции проводили анестезию изофлюреном. 5 мышей в/в обрабатывали LMW-DS. 0,15 мг LMW-DS инъецировали за 10 мин до трансплантации и дополнительные 0,3 мг LMW-DS инъецировали через 6 ч после трансплантации. Затем
LMW-DS вводили 2 раза в сутки на 1-2, 3-4 и 5-6 сутки после трансплантации в уменьшающихся дозах 1,
0,5 и 0,25 мг, соответственно. 6 (необработанным) мышам аналогично инъецировали эквивалентный
объем физиологического раствора.
Статистический анализ.
Все величины выражали в виде среднего ±SEM (стандартная ошибка среднего) и сравнивали, используя ANOVA (дисперсионный анализ) Фридмана (табл. 1), парный t-тест Стьюдента (табл. 3), знаково-ранговый тест Вилкоксона (табл. 4) и однофакторный ANOVA после post hoc (ретроспективного) теста Шеффе (табл. 5). В морфологическом исследовании трансплантированных островков частоту образования сгустка и интенсивность инфильтрации лейкоцитов оценивали, используя тест суммы рангов Вилкоксона. Статистическими значимыми считались значения Р менее 0,05.
Качество островков.
В качестве функционального теста для API проводили тест статической стимуляции глюкозой
(SGS). 15 островков отбирали вручную и аккуратно встряхивали в бикарбонатном буфере КребсаРингера, содержащем 1,6 мМ глюкозы при 37°С в течение 60 мин. После этого концентрацию глюкозы
меняли до 16,7 мМ в течение еще 60 мин. Надосадочные жидкости собирали и хранили до анализа при
-20°С. Содержание инсулина в надосадочных жидкостях анализировали при помощи ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) (DAKO Diagnostics, Ltd., Ely, UK). Индекс стимуляции вычисляли как
отношение концентрации инсулина при высоком и низком уровне глюкозы, соответственно. Чистота
API, используемых в данном исследовании, колебалась от 81 до 95% (среднее 88,5±2,2%). Индекс стимуляции в тесте статической стимуляции глюкозой находился между 0,8 и 7,8 (3,4±1,2), и среднее содержа-8-
010409
ние инсулина составляло 85,5±6,2 пмоль/мкг DNA (дезоксирибонуклеиновой кислоты).
Кроме того, для того, чтобы оценить жизнеспособность культивируемых API, измеряли соотношение
ADP/ATP (аденозиндифосфорная кислота/аденозинтрифосфорная кислота), используя набор ApoGlow™
(LumiTech, Ltd., Nottingham, UK). Кратко, 75 островковых эквивалентов (IEQ) API промывали PBS (фосфатным буферным солевым раствором) и затем смешивали с 100 мкл нуклеотидвысвобождающего реагента в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем к раствору добавляли 20 мкл реагента для отслеживания нуклеотидов, и измеряли уровни АТР, используя люминометр (FB 12 Luminometer, Berthold
Detection Systems GmbH, Pforzheim, Germany), и выражали их как число относительных световых единиц
(RLU). Через 10 мин ADP в растворе превращали в АТР путем добавления 20 мкл ADP-конвертирующего реагента и затем измеряли как число RLU. Затем вычисляли соотношение ADP/ATP в API, как предложено Bradbury et al. [21]. Отношение инсулин/DNA в API измеряли согласно Wennberg et al. [22] и выражали в пмоль/мкг. Уровень выживания культивируемых API вычисляли как процент от значений IEQ,
полученных на 3 сутки по сравнению с 0 сутками.
Любую возможную токсичность LMW-DS оценивали, культивируя API из трех различных поджелудочных желез в присутствии (0,01, 0,1 или 1 мг/мл) LMW-DS или в его отсутствие в течение 3 суток.
Результаты по проценту выживания, индексу стимуляции, отношению ADP/ATP и отношению
инсулин/DNA для контрольных образцов и для образцов с тремя различными концентрациями LMW-DS
представлены в табл. 1 ниже. LMW-DS не продемонстрировал никаких вредных эффектов на функцию,
жизнеспособность или процент выживания API в любых исследованных концентрациях. Кроме того, не
было никакой разницы в морфологии API, обработанных LMW-DS, и культивируемых при отсутствии
LMW-DS.
Таблица 1
Время образования сгустка.
Кровь 4 здоровых добровольцев отбирали в пробирки Vacutainer™, содержащие цитрат. Цельную
кровь (980 мкл) инкубировали с 2 мкл API при 37°С в полипропиленовых чашках для образцов в реометре ReoRox™ (Global Haemostasis International, Gothenburg, Sweden). Реакцию коагуляции начинали добавлением 20 мкл 1М CaCl2 в присутствии различных типов декстрана (LMW-DS, HMW-DS, LMW-D и
HMW-D) или при их отсутствии. Каждые 6 с осуществляли свободные крутильные колебания чашки вокруг ее вертикальной оси и регистрировали затухание и частоту колебаний. Время образования сгустка
определяли как точку максимального затухания.
Результаты, полученные из экспериментов по времени образования сгустка, представлены в табл. 2
ниже. API, инкубируемые в цитратной крови человека, быстро индуцировали образование сгустка, в
среднем, через 6,1±0,3 мин после кальцификации. Образование сгустка полностью подавлялось в присутствии LMW-DS во всех испытываемых дозах, в то время как HMW-DS ингибировал образование сгустка только при 0,1 мг/мл. Как LMW-D, так и HMW-D увеличивали время образования сгустка лишь в
незначительной степени по сравнению с контрольными образцами (без добавок). Таким образом, представляется, что сульфатирование DS является ключевым для наблюдаемой ингибиторной способности.
-9-
010409
Таблица 2
Подавление IBMIR с помощью LMW-DS.
В качестве модели для оценки влияния LMW-DS на IBMIR и на ксенотрансплантацию от свиньи к
человеку использовали перфузию островков взрослых свиней в гепаринизированных петлях из поливинилхлоридных трубок (PVC). Этот протокол выполняют, по существу, как описано ранее [4, 23], с некоторыми модификациями. В общих чертах, использовались петли, изготовленные из PVC (диаметр 6,3 мм,
длина 390 мм), внутренняя поверхность которых была обработана иммобилизованным гепарином. Трубки соединяли специально разработанным гепаринизированным соединителем. Замкнутая петля образовывалась, когда концы соединителя плотно вставляли в просвет концов трубок. Для создания потока
крови внутри петель использовали раскачивающий аппарат, помещенный в 37°С инкубатор. Петли раскачивали в условиях, при которых предотвращался контакт крови с соединителями.
Было проведено 7 60-минутных экспериментов с островками с использованием API, выделенных из
4 разных свиней. LMW-DS, растворенный в физиологическом растворе, испытывали при концентрации
0, 0,01, 0,1 и 1 мг/мл (конечная концентрация). В каждый эксперимент в качестве контроля включали
одну петлю, содержащую свежую кровь человека и физиологический раствор без API. В 2 эксперимента
включали одну петлю, содержащую свежую кровь человека и 1 мг/мл LMW-DS без API. Одновременно в
5 экспериментах исследовали преинкубацию крови человека с 1 мг/мл LMW-декстрана, который не был
сульфатирован. В каждом эксперименте к каждой петле добавляли 7 мл свежей крови человека от одного
и того же донора. Петли затем помещали на раскачивающее устройство на 5 мин либо с LMW-DS, либо с
физиологическим раствором. После этого петли открывали и в петли добавляли 100 мкл физиологического раствора с 5 мкл API (приблизительно 5000 IEQ) или без них, после чего следовала другая 60-минутная инкубация на раскачивающем устройстве при 37°С. Уровни глюкозы в крови измеряли глюкометром (Glucometer Elite; Bayer Diagnostics, Leverkusen, Germany) перед перфузией.
После каждой перфузии содержимое петель фильтровали через фильтры с диаметром отверстий 70 мкм
(Filcons, Cuptype; DAKO, Denmark). Как макроскопические сгустки крови, так и ткань, извлеченные с
фильтров, мгновенно замораживали в изопентане для иммуногистохимического окрашивания. Оставшуюся отфильтрованную кровь собирали в 4,1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусную кислоту) (конечная концентрация) и использовали для гематологического анализа (тромбоциты, лимфоциты, моноциты
и гранулоциты) и анализов активации коагуляции (тромбин-антитромбин [ТАТ], комплексы фактор XIaантитромбин [FXIa-AT] и комплексы фактор XIIa-антитромбин [FXIIa-AT]), активации фибринолиза
(комплексы плазмин-альфа-2-антиплазмин [РАР]), активации комплемента (С3а и sC5b-9) и активации ингибитора С1-эстеразы (фактор XIa-ингибитор С1-эстеразы [FXIa-C1 INH], фактор XIIa-ингибитор С1-эстеразы [FXIIa-C1 INH]). Также анализировали образцы, отобранные на 0, 15 и 30 мин. В 0-минутных образцах
кровь не добавляли в трубочные петли, а, вместо этого, немедленно переносили в пробирки, содержащие
EDTA. Образцы крови центрифугировали при 4°С и 3290×g в течение 20 мин и плазму собирали и хранили
при -70°С до анализа. Уровни глюкозы в крови перед перфузией API колебались от 4,8 до 6,2 ммоль/л.
Число тромбоцитов и дифференциальное число лейкоцитов определяли на анализаторе Coulter
ACT-diff (Beckman Coulter, FL, USA), используя кровь, обработанную EDTA. Количество ТАТ и РАР определяли, используя коммерчески доступные наборы для иммуноферментного анализа (EIA) (Enzygnost
TAT, Behringswerke, Marburg, Germany; Imuclone® PAP, American Diagnostica Inc., Greenwich, USA).
FXIa-AT, FXIIa-AT, FXIa-C1 INH и FXIIa-C1 INH анализировали в соответствии со способом Sanchez et
al. [24]. С3а анализировали, как было описано ранее Nilsson Ekdahl et al. [25], и sC5b-9 анализировали,
используя модификацию EIA, описанную Mollnes et al. [25, 26].
В трубочных петлях, содержащих свежую кровь человека без API, числа клеток крови и параметры
коагуляции и комплемента изменялись лишь незначительно, как можно видеть в табл. 3 ниже. Все эти
изменения можно расценивать как нормальные фоновые изменения, возникающие из-за взаимодействия
- 10 -
010409
крови с поверхностью трубок и границей раздела фаз жидкость-воздух.
LMW-DS предотвращал образование макроскопических сгустков, замедлял расходование клеток
крови и снижал активацию как коагуляции, так и комплемента дозозависимым образом (см. табл. 3).
Значительное увеличение тромбоцитов в крови, обработанной LMW-DS, можно видеть при концентрации 0,01 мг/мл LMW-DS, что свидетельствует о восстановлении числа клеток крови почти до нормальных уровней даже при такой низкой концентрации LMW-DS. Продукты активации коагуляции ТАТ,
FXIa-AT, FXIIa-AT подавлялись при 0,01 мг/мл LMW-DS, но FXIa-AT снова немного повышался при
дозах в интервале от 0,1 до 1 мг/мл LMW-DS.
LMW-DS уменьшает активацию комплемента, оцениваемую по генерации С3а и растворимого комплекса атаки мембран sC5b-9, как видно из табл. 3. На фиг. 1 более подробно показано влияние LMW-DS
на генерацию С3а в течение 60 мин перфузии API со свежей кровью человека в модели трубочной петли.
В образцах, в которые добавляли LMW-DS, декстрансульфат предварительно инкубировали со свежей
кровью человека в течение 5 мин перед перфузией API с кровью. Белые кружки соответствуют 0 мг/мл
LMW-DS, черные кружки представляют 0,01 мг/мл LMW-DS, а белые квадраты и черные квадраты соответствуют 0,1 и 1 мг/мл LMW-DS, соответственно. Соответствующая диаграмма влияния LMW-DS на
генерацию sC5b-9 показана на фиг. 2. Как ясно видно из диаграмм на фиг. 1 и 2, основная активация
комплемента происходит через приблизительно 30 мин после перфузии API. Введение 0,1 и 1 мг/мл
LMW-DS полностью ингибирует генерацию как С3а, так и комплекса атаки мембран sC5b-9, в то время
как более низкая концентрация LMW-DS (0,01 мг/мл) значительно уменьшает генерацию С3а.
FXIa-C1 INH не образовывался ни в одной из трубочных петель, исследуемых в течение 60 мин перфузии (данные не показаны). FXIIa-C1 INH не менялся ни в присутствии LMW-DS, ни при его отсутствии.
РАР был увеличен в отсутствие LMW-DS, в то время как концентрация 0,01 мг/мл LMW-DS значительно подавляла его.
Таблица 3
*3начительная разница по сравнению с петлями с API без LMW-DS при использовании t-теста Стьюдента.
- 11 -
010409
Влияние LMW-декстрана на числа клеток в крови, параметры коагуляции и комплемента через 60 мин
после перфузии API со свежей кровью человека исследовали с помощью модели трубочных петель, аналогичной LMW-DS, как обсуждалось выше. Сравнение между влиянием LMW-D и LMW-DS на симптомы IBMIR представлено в табл. 4. LMW-декстран, который не сульфатирован, оказывает лишь незначительное влияние на IBMIR. Эти данные показывают, что сульфатирование, видимо, является ключевым
для подавляющего действия декстрана на IBMIR, инициируемую API.
Таблица 4
*Значительная разница по сравнению с петлями с API с LMW-D при использовании знаково-рангового теста Вилкоксона.
Прямое действие LMW-DS на систему комплемента в сыворотке крови человека.
Прямое влияние LMW-DS на каскад комплемента исследовали посредством инкубации сыворотки
человека в полипропиленовой пробирке. Сыворотку (1 мл) добавляли в каждую пробирку вместе с
LMW-DS в конечной концентрации 0, 0,01, 0,1 или 1 мг/мл. Через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин после инкубации сыворотки при 37°С 100 мкл сыворотки переносили в пробирки, содержащие 10 мМ EDTA. Эти
образцы хранили при -70°С до анализа компонентов комплемента С3а и sC5b-9.
На фиг. 3 показано влияние LMW-DS на присутствие С3а и sC5b-9 системы комплемента в сыворотке крови человека. Значения выражены как процент от количества С3а и sC5b-9 в контрольных образцах (без LMW-DS). Заполненные столбики представляют генерацию С3а, а пустые соответствуют
sC5b-9. При концентрации LMW-DS 0,01 мг/мл усиленная активация комплемента выражалась в усиленной генерации как и С3а, так и sC5b-9, но при 1 мг/мл наблюдался ингибиторный эффект. Хотя нельзя
прямо сравнивать влияния на цельную кровь и сыворотку, LMW-DS сам по себе возможно индуцирует
активацию комплемента при самых низких применяемых дозах LMW-DS. При более высоких концентрациях преобладает подавляющее действие.
Выживание трансплантата у диабетических бестимусных мышей.
Уровни глюкозы в крови определяли в крови, полученной из хвостов реципиентов, используя измеритель глюкозы в крови Glucometer Elite® (Bayer АВ, Gothenburg, Sweden). Измерение проводили ежесуточно до 12 ч дня и выражали в ммоль/л (1 ммоль/л ≈18 мг/дл). Считалось, что произошла потеря функций трансплантата, если уровни глюкозы в крови превышали 11,1 ммоль/л (более 200 мг/дл) в течение 2
или более следующих друг за другом дней.
Длительность посттрансплантационной нормогликемии (менее 200 мг/дл) определяли как период
выживания трансплантата.
Все бестимусные мыши с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, имели тяжелую гипергликемию перед трансплантацией без каких-либо различий в уровнях глюкозы в крови, наблюдаемых среди
различных групп реципиентов. Уровни глюкозы в крови не натощак после трансплантации немедленно
понижались у всех диабетических реципиентов, которым интрапортально имплантировали API. Однако
необработанные мыши сохраняли нормогликемию только в течение ограниченного времени, см. табл. 5.
Уровни глюкозы в крови снова повышались в течение первых 3 суток после трансплантации у 4 из 6 необработанных мышей. В противоположность этому, нормогликемия поддерживалась в течение значительно более длинного периода у мышей, обработанных LMW-DS, по сравнению с необработанными
мышами (8,8±1,9 суток по сравнению с 3,5±1,2 сутками, р=0,045, табл. 5). Было показано, что все API,
используемые в настоящем исследовании, излечивают диабетических бестимусных мышей при трансплантации эквивалентных количеств в субкапсулярное пространство почки (удаление почки, несущей
трансплантат, немедленно приводило к повышенному уровню глюкозы в крови).
- 12 -
010409
Таблица 5
*Значительное среди всех групп.
Иммуногистохимические эксперименты.
Островки и макроскопические сгустки выделяли на фильтрах после 60 мин перфузии с кровью и с
LMW-DS (0,1 и 1 мг/мл) или без LMW-DS (контроль), затем собирали в среду для заливки (Tissue-Tek;
Miles, Eckhart, IN, USA) и мгновенно замораживали в изопентане. Изготавливали срезы островков и затем окрашивали их конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) антителами мыши против CD41a
человека (R&D Systems, Abigdon, UK) и анти-CD11b+ (Clone 2LPM 19с, DAKO, Carpinteria, CA, USA). В
исследовании in vivo печень мышей, содержащую API, через 10 дней после трансплантации извлекали и
мгновенно замораживали в изопентане. Изготавливали срезы образцов и окрашивали антителами морской свинки против инсулина (DAKA, Carpinteria, CA, USA) и антителами крысы против CD11b+ мыши
(Serotec Ltd. Scandinavia, Oslo, Norway).
Через 60 мин было обнаружено, что островки, извлеченные из необработанных контрольных петель, были постоянно включены в сгустки. Иммуногистохимическое окрашивание показало, что островки окружает капсула из фибрина и тромбоцитов. На фиг. 4 показана инфильтрация CD11b+ полиморфноядерных клеток и моноцитов в контрольные островки. В противоположность этому, наблюдались полное
ингибирование образования сгустка и значительное уменьшение числа инфильтрующих CD11b+ клеток
при добавлении во время инкубации 1 мг/мл LMW-DS, как показано на фиг. 5. Аналогичный эффект также наблюдался при 0,1 мг/мл. В контрольных образцах также присутствовал толстый слой тромбоцитов,
прикрепившихся к клеткам, как это видно на фиг. 6. Значительно более тонкий слой тромбоцитов, прикрепившихся к островкам, наблюдался в образцах, обработанных LMW-DS, как показано на фиг. 7. Контрольные островки, не подвергнутые воздействию крови, имели во всех случаях отрицательное окрашивание.
Большинство островков, извлеченных из необработанных мышей, было заключено в сгустки, как
показано на фиг. 8. На фиг. 8 стрелка указывает на образование тромба с захваченными островками свиньи. Однако, как показано на фиг. 9, были захвачены только несколько островков мышей, обработанных
LMW-DS. Иммуногистохимическое окрашивание показало инфильтрацию CD11b+ (MAC-1+) лейкоцитов
в островки, извлеченные из необработанных мышей, как видно на фиг. 10. В противоположность этому,
было значительно меньше инфильтрованных CD11b+ (MAC-1+) клеток у мышей, обработанных LMWDS, как показано на фиг. 11. Частота образования сгустка и интенсивность инфильтрации лейкоцитов
были значительно ниже у реципиентов, обработанных LMW-DS, чем у необработанных реципиентов
(р=0,034). Фиг. 4-9 получены при 200-кратном увеличении, а фиг. 10 и 11 - при 100-кратном увеличении.
Специалисту в данной области очевидно, что могут быть сделаны различные модификации и изменения настоящего изобретения, не выходящие за рамки его объема, который определен прилагаемой
формулой изобретения.
Литературные источники
[1] Shapiro A.M., et al., "Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a
glucocorticoid-free immunosuppressive regimen", N. Engl. J. Med., Vol. 343, No. 4, pp. 230-238 (2000).
[2] Ryan E.A., et al., "Clinical outcomes and insulin secretion after islet transplantation with the Edmonton
protocol", Diabetes, Vol. 50, No. 4, pp. 710-719 (2001).
[3] Bennet W., et al., "Damage to porcine islets of Langerhans after exposure to human blood in vitro, or
after intraportal transplantation to cynomologus monkeys: protective effects of sCR1 and heparin", Transplantation,
Vol. 69, No. 5, pp. 711-719 (2000).
[4] Bennet W., et al., "Incompatibility between human blood and isolated islets of Langerhans: a finding
with implications for clinical intraportal islet transplantation?", Diabetes, Vol. 48, No. 10, pp. 1907-1914 (1999).
[5] Buhler L., et al., "Adult porcine islet transplantation in baboons treated with conventional immunosuppresion
or a non-myeloablative regimen and CD154 blockade", Xenotransplantation, Vol. 9, No. 1, pp. 3-13 (2002).
[6] Cantarovich D., et al., "Rapid failure of pig islet transplantation in non human primates", Xenotransplantation,
- 13 -
010409
Vol. 9, No. 1, pp. 25-35 (2002).
[7] Carroll M.C., and Fischer M.B., "Complement and the immune response", Curr. Opin. Immunol., Vol.
9, No. 1, pp. 64-69 (1997).
[8] Pratt J.R., et al., "Effects of complement inhibition with soluble complement receptor-1 on vascular injury
and inflammation during renal allograft rejection in the rat", Am. J. Pathol., Vol. 149, No. 6, pp. 2055-2066,
(1996).
[9] Fiorante P., et al., "Low molecular weight dextran sulfate prevents complement activation and delays
hyperacute rejection in pig-to-human xenotransplantation models", Xenotransplantation, Vol. 8, No. 1, pp. 24-35
(2001).
[10] Baldwin W.M., et al., "Complement in organ transplantation. Contributions to inflammation, injury,
and rejection", Transplantation, Vol. 59, No. 6, pp. 797-808 (1995).
[11] Brauer R.B., et al., "The contribution of terminal complement components to acute and hyperacute
allograft rejection in the rat", Transplantation, Vol. 59, No. 2, pp. 288-293(1995).
[12] Wulleimin W.A., et al., "Potentiation of C1 inhibitor by glycosaminoglycans: dextran sulfate species
are effective inhibitors of in vitro complement activation in plasma", J. Immunol., Vol. 159, No. 4, pp. 19531960 (1997).
[13] Nakano M., et al., "Hepatocyte growth factor is essential for amelioration of hyperglycemia in
streptozotocin-induced diabetic mice receiving a marginal mass of intrahepatic islet grafts", Transplantation,
Vol. 69, No. 2, pp. 214-221 (2000).
[14] Thomas H., et al., "Sulfonated dextran inhibits complement activation and complement-dependent
cytotoxicity in an in vitro model of hyperacute xenograft rejection", Mol. Immunol., Vol. 33, No. 7-8, pp. 643648 (1996).
[15] Korsgen O., et al., "Angiogenesis and angioarchitecture of transplanted fetal porcine islet-like cell
clusters", Transplantation, Vol. 68, No. 11, pp. 1761-1766 (1999).
[16] Menger M.D., et al., "Revascularization of freely grafted islets of Langerhans", World J. Surg., Vol.
25, No. 4, pp. 509-515 (2001).
[17] Jensen R.L., et al., "Growth factor-mediated angiogenesis in the malignant progression of glial tumors: a
review", Surg. Neurol., Vol. 49, No. 2, pp. 189-195, discussion 196 (1998).
[18] Dunn I.F., et al., "Growth factors in glioma angiogenesis: FGFs, PDGF, EGF, and TGFs", J. Neurooncol.,
Vol. 50, No. 1-2, pp. 121-137 (2000).
[19] Ricordi C., et al., "A method for the mass isolation of islets from the adult pig pancreas", Diabetes,
Vol. 35, No. 6, pp. 649-653 (1986).
[20] Wennberg L., et al., "Diabetic rats transplanted with adult porcine islets and immunosuppressed with
cyclosporine A, mycophenolate mofetii, and leflunomide remain normoglycemic for up to 100 days", Transplantation,
Vol. 71, No. 8, pp. 1024-1033 (2001).
[21] Bradbury D.A., et al., "Measurement of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used
as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis", J. Immunol. Methods, Vol. 240, No. 1-2, pp. 79-92
(2000).
[22] Wennberg L., et al., "Effects of immunosuppressive treatment on host responses against intracerebral
porcine neural tissue xenografts in rats", Transplantation, Vol. 71, No. 12, pp. 1797-1806 (2001).
[23] Gong J., et al., "Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial
and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model", J. Clin. Immunol., Vol.
16, No. 4, pp. 222-229 (1996).
[24] Sanchez J., et al., "Studies of adsorption, activation, and inhibition of factor XII on immobilized heparin", Thromb Res., Vol. 89, No. 1, pp. 41-50 (1998).
[25] Nilsson Ekdahl K., et al., "Generation of iC3 at the interface between blood and gas", Scand. J. Immunol.,
Vol. 35, No. 1, pp. 85-91 (1992).
[26] Mollness T.E., et al., "A new model for evaluation of biocompatibility: combined determination of
neoepitopes in blood and on artificial surfaces demonstrates reduced complement activation by immobilization
of heparin", Artif. Organs, Vol. 19, No. 9, pp. 909-917 (1995).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного для изготовления лекарственного препарата для ингибирования немедленной воспалительной реакции, опосредованной кровью (IBMIR - instant blood-mediated inflammatory reaction), вызванной воздействием крови
на клеточный трансплантат после его трансплантации в чужеродный организм реципиента.
2. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного для изготовления лекарственного препарата для ингибирования морфологического разрушения трансплантированного клеточного трансплантата, вызванного IBMIR.
3. Применение декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного для изготовления лекарственного препарата для ингибирования отторжения клеточного трансплантата, вызван- 14 -
010409
ного IBMIR.
4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанный клеточный трансплантат
трансплантируют в организм реципиента-человека.
5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанный клеточный трансплантат
выбран из
аллогенного клеточного трансплантата или
ксеногенного клеточного трансплантата.
6. Применение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что указанный клеточный трансплантат
выбран из
индивидуальных клеток,
кластера клеток или
неваскуляризованной ткани.
7. Применение по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что указанный клеточный трансплантат
представляет собой островки Лангерганса.
8. Применение по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что указанный декстрансульфат имеет молекулярную массу менее 20000 Да, предпочтительно менее 10000 Да.
9. Применение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что содержание серы в декстрансульфате
составляет 10-25%, предпочтительно 15-20%.
10. Способ ингибирования IBMIR, вызванной воздействием крови на клеточный трансплантат после его трансплантации в чужеродный организм реципиента, включающий введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного реципиенту, нуждающемуся в таком ингибировании.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный реципиент является человеком.
12. Способ ингибирования отторжения клеточного трансплантата, вызванного IBMIR, включающий
введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком ингибировании.
13. Способ ингибирования морфологического разрушения клеточного трансплантата, вызванного
IBMIR, включающий введение терапевтически эффективного количества декстрансульфата или его фармацевтически приемлемого производного пациенту, нуждающемуся в таком ингибировании.
14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что указанный пациент является человеком.
15. Способ по любому из пп.10-14, отличающийся тем, что указанное терапевтически эффективное
количество декстрансульфата обеспечивает концентрацию декстрансульфата в крови указанного реципиента (пациента) менее 5 мг/мл, предпочтительно 0,01-1 мг/мл и более предпочтительно 0,05-0,2 мг/мл.
16. Способ по любому из пп.10-15, отличающийся тем, что декстрансульфат вводят в организм реципиента (пациента) путем инъекции клеточного трансплантата в растворе декстрансульфата.
17. Способ по любому из пп.10-16, отличающийся тем, что декстрансульфат имеет молекулярную
массу менее 20000 Да, предпочтительно менее 10000 Да.
18. Способ по любому из пп.10-17, отличающийся тем, что содержание серы в декстрансульфате
составляет 10-25%, предпочтительно 15-20%.
Фиг. 1
- 15 -
010409
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 16 -
010409
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
- 17 -
010409
Фиг. 9
Фиг. 10
Фиг. 11
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 18 -