1 - Область техники изобретения Настоящее изобретение

007792
Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к новым пептидам, включая новые антиаритмические пептиды
линейной или циклической структуры с улучшенной стабильностью in vitro и/или in vivo, к химическим
соединениям, включая упомянутые пептиды, и к использованию упомянутых пептидов при приготовлении лекарственных средств. Настоящее изобретение также относится к использованию соединений, которые способствуют межклеточной коммуникации, для приготовления лекарственных средств при лечении целого ряда болезней, характеризующихся нарушением межклеточной коммуникации по щелевому
соединению. Изобретение также относится к способу лечения болезней, например к способу лечения или
профилактики заболевания альвеолярной ткани и бронхиальной ткани, нарушения слуха вследствие заболевания ушной улитки, эндотелиальных поражений, диабетической ретинопатии и диабетической невропатии, ишемии центральной нервной системы и спинного мозга, заболеваний зубных тканей, включая
болезнь пародонта, почечных болезней, типа выделений из околоклубочкового аппарата, что приводит к
артериальной гипертензии, и к способу предотвращения патологий при трансплантации костного мозга.
Предпосылки создания изобретения
Щелевые соединения - специализированные области клеточной мембраны со скоплениями от сотен
до тысяч плотно упакованных канальцев щелевых соединений, которые непосредственно соединяют цитоплазматические камеры двух соседних клеток. Канальцы щелевых соединений состоят из двух полуканальцев (коннексонов), отходящих от каждой из двух соседних клеток. Каждый коннексон состоит из
шести белков, называемых коннексинами (Сх). Коннексины - большое семейство белков, составляющих
основную структуру четырех трансмембранных доменов, двух внеклеточных петель, и цитоплазматической петли. Существует большая вероятность сохранения внеклеточных петель и трансмембранных доменов среди видов и изоформ коннексина. Ввиду того, что длина С-концевых участков существенно меняется, классификация коннексинов выполняется на основе молекулярной массы. Состояние канальца
щелевых соединений может переключаться с открытого на закрытое путем перекручивания. В открытых
состояниях ионы и малые молекулы могут проходить через пору. Через щелевые соединения осуществляется перенос электрического импульса и межклеточная диффузия сигнальных молекул, и поэтому
нормально функционирующие щелевые соединения являются предпосылкой для нормальной межклеточной коммуникации. Нормальная межклеточная коммуникация имеет большое значение для клеточного гомеостаза, пролиферации и дифференцировки.
Между нарушениями в коннексинах и болезнью человека была установлена связь, о чем говорится
в следующих разделах. Одним из примеров является болезнь Чагаса, вызываемая протозойным паразитом Trypanosoma cruzi. Эта болезнь является основной причиной кардиальной дисфункции в Латинской
Америке. В клетках, инфицированных Trypanosoma cruzi, наблюдались изменения распределения Сх43 и
это изменение может включаться в генезис нарушений проводимости, характеризующих болезнь[7].
В многоклеточном организме координация между клетками имеет большое значение. Среди различных средств клеточного взаимодействия, щелевые соединения обеспечивают самый прямой канал
связи. Щелевые соединения являются одним из типов соединительного комплекса, образующегося между соседними клетками, и состоят из агрегированных канальцев, которые напрямую связывают внутриклеточное пространство (цитоплазму) соседних клеток. Щелевые соединения обнаружены в большинстве типов клеток взрослого млекопитающего при одном известном исключении, которым являются элементы циркулирующей крови.
О структуре гена коннексина известно сравнительно мало. Результаты, представленные для Сх43
мыши, показали, что Сх43 содержит два экзона и интрон, расположенные в нетранслированной области
5'. В проксимальном промоторе 5' были идентифицированы несколько предполагаемых сайтов связывания факторов транскрипции. In vitro исследование показало, что проницаемые канальцы могут быть получены из полуканальцев, состоящих из различных пар коннексинов. Например, из Сх43 можно получить функциональные канальцы с Сх32, Сх37, Сх40 и Сх45 и эндогенным Сх овоцитов (Сх38), но не с
Сх26 овоцитов. Однако, очень мало известно об их свойствах, а также о регуляции проницаемости этих
гетероканальцев. Сх экспрессированы в огромном большинстве тканей, и одиночные клетки способны
экспрессировать несколько различных Сх. Проницаемые щелевые соединения могут образовываться между клетками, которые экспрессируют различные типы Сх. Таким образом, межклеточная коммуникация
по щелевому соединению (МКЩС) в тканях, очевидно, является очень важной для сохранения целостности ткани. Очевидно, что несколько генов создают эквивалентные продукты для предотвращения потери
МКЩС вследствие мутации в одном гене.
Как отмечалось, диаметр поры канальца щелевого соединения составлял от 0,8 до 1,4 нм. Щелевые
соединения относительно не избирательны, что позволяет проходить через них молекулам массой приблизительно до 1000 Да. Такими веществами являются, например, ионы, вода, сахара, нуклеотиды, аминокислоты, жирные кислоты, пептиды малой массы, лекарства и канцерогенные вещества. Для прохода
канальца АТФ не требуется и проход осуществляется за счет пассивной диффузии. Этот поток материалов между клетками через канальцы щелевых соединений известен как межклеточная коммуникация по
щелевому соединению (МКЩС), которая играет важную роль в регуляции метаболизма клетки, пролиферации, и межклеточной передаче сигналов. С точки зрения физиологии для МКЩС очень важно, что-1-
007792
бы клетки ткани, купированные с помощью щелевых соединений, были бы не отдельными дискретными
объектами, а были бы объединены со своими соседями. Это свойство способствует гомеостазу и обеспечивает также быструю, прямую передачу вторичных мессенджеров между клетками для координации
клеточных реакций внутри ткани.
Процесс МКЩС регулируется рядом механизмов, которые могут подразделяться на основные категории. При одном типе регуляции количество щелевых соединений клетки регулируется путем влияния
на экспрессию, деградацию, клеточный перенос коннексинов к плазматической мембране или на сборку
коннексинов в функциональные щелевые соединения. Ухудшенная МКЩС, вызванная экспрессией коннексина с пониженной регуляцией, например, в клетках опухоли, является примером этого способа регуляции. Другой тип регуляции вообще не включает никакого изменения клеточных уровней щелевых соединений или коннексинов, но вызывает отпирание или запирание (регуляция запирания канальцев) существующих щелевых соединений. К этому типу регуляции могут привести внеклеточные растворимые
факторы, типа митогенов (например, ДДТ), гормонов (например, катехоламины), обезболивающих
средств (например, галотан), внутриклеточных биомолекул (например, цАМФ) и стресс клетки (например, механический или метаболический стресс). Кроме того, МКЩС регулируется в процессе клеточного
цикла и во время миграции клетки.
Для щелевых соединений, особенно для щелевых соединений, состоящих из Сх43, изучался способ
регуляции МКЩС или регуляция запирания канальцев. Некоторые факторы оказывают свое ингибирующее влияние на МКЩС косвенно, например, путем изменения среды липида и текучести клеточной
мембраны, при этом другие ингибиторы МКЩС включают онкогены, факторы роста и промоторы опухоли, которые вызывают различные модификации Сх43. Для стимуляция определенных биологических
функций последней группы может быть необходимо разрушение проницаемости щелевых соединений.
Эти агенты инициируют сложные сигнальные пути, включающие активацию киназ, фосфатаз и взаимодействие белков. Понимание механизмов действия модуляторов МКЩС не только позволит определить
их соответствующие сигнальные пути, ответственные за регуляцию щелевых соединений, но также предоставит инструментальные средства эксперимента для получения характеристик биологических функций МКЩС и коннексинов.
Изменения цитоплазматического домена карбокси-концевого участка Сх43 при фосфорилировании
специфических сайтов оказываются кардинальными для открытия и закрытия щелевого канальца. Фосфорилирование домена карбокси-концевого участка также может быть важным для процесса переноса
полукомплекса щелевого соединения Сх43 к клеточной мембране, интернализации и деградации. Периоды полураспада коннексинов (часы) намного короче периодов полураспада большинства белков плазматических мембран (сутки), например, период полураспада Сх43 сердца крысы меньше 1,5 ч. Таким образом, регуляция интенсивности метаболизма была бы важным фактором в регуляции МКЩС.
Домен карбокси-концевого участка содержит предположительно сайты фосфорилирования многочисленных протеинкиназ (РКА, РКС, PKG, МАРК, CaMkII и тирозинкиназы). Фосфорилирование этих
сайтов домена карбокси-концевого участка приводит к смыканию канальцев щелевого соединения, и
различные ингибиторы Сх43 канальцев щелевого соединения используют различные сигнальные пути,
чтобы вызвать фосфорилирование домена карбокси-концевого участка. По типу клетки и специфичности
ингибитора определяют, какие сигнальные пути должны использоваться, а тип включенной протеинкиназы указывает на используемую внутриклеточную систему мессенджера. Таким образом, для активации
РКА требуется участие системы вторичного мессенджера цАМФ, в то время как для РКС требуется участие внутриклеточной сигнальной системы фосфоинозитола.
Другие механизмы, регулирующие запирания канальцев, включают внутриклеточные уровни водорода и ионов кальция, транссоединительное напряжение (transjunctional voltage) и свободные радикалы.
Пониженный уровень рН или рСа вызывает закрытие канальца специфическим для клетки и коннексина
образом.
Помимо регуляции роста МКЩС выполняет и другие многочисленные физиологические функции.
Гомеостаз: МКЩС обеспечивает быстрое приведение в равновесие питательных веществ, ионов и жидкости между клетками. Это могло бы быть самой древней, широко распространенной и важной функцией
для этих канальцев. Электрическое купирование: щелевые соединения служат электрическими синапсами в электрически возбудимых клетках типа кардиомиоцит, клеток гладкой мускулатуры и нейронов. В
этих тканях электрическое купирование обеспечивает более быструю межклеточную передачу потенциалов действия, чем химические синапсы. Это обеспечивает синхронное сокращение кардиомиоцитов и
клеток гладкой мускулатуры. Реакция ткани на гормоны: МКЩС может усилить чувствительность тканей к внешним стимулам. Вторичные мессенджеры типа циклических нуклеотидов, кальция и фосфатов
инозитола достаточно малы, чтобы пройти от гормонально активизированных клеток до статических
клеток через канальцы щелевых соединений и активизировать их. Такой эффект может усилить реакцию
ткани на агониста. Регуляция зародышевого развития: щелевые соединения могут служить межклеточными проводящими путями для химиката и/или электрических сигналов развития в эмбрионах и для определения границ групп развития. МКЩС в зародышевых клетках осуществляется определенными спо-2-
007792
собами, и ухудшение МКЩС вызывает аномалии развития и тератогенные эффекты многих химических
веществ.
Межклеточная коммуникация обеспечивает координацию функционирования отдельных клеток и
интегрирует это функционирование в динамику рабочей ткани, обслуживающей организм, в котором она
установлена. Поэтому нет ничего удивительного в том, что многие самые разнообразные патологические
состояния были связаны с ухудшением МКЩС. Как способами in vitro, так и in vivo была установлена
связь между нарушениями в коннексинах и диапазоном болезненных состояний. Одним примером является регуляция коммуникации по щелевым соединениям с помощью провоспалительного цитокина в
эпителии дыхательных путей, где авторы Шансон М., Берклац П.У., Скерри И., Дудец Т., ВернкеДоллрис К., Пицурки Л., Павирани А., Фидлер М.А., Сутер С. (Chanson М., Berclaz P.Y., SCE-rri I., Dudez
Т., Wernke-Dollries К., Pizurki L., Pavirani A., Fiedler M.A., Suter S. (Am J Pathol Май, 2001 г., 158 (5):
1775-84)) обнаружили, что ухудшение межклеточной коммуникации, вызванное TNF-альфа, последовательно приводит к воспалению.
Короче говоря, можно сказать, что существует множество доказательств, связывающих дисфункцию типа затворения или смыкания или даже отсутствия щелевых соединений с повышенным риском
болезни. В настоящее время отсутствуют лекарственные средства для лечения упомянутых болезней,
способствующих межклеточной коммуникации, путем улучшения или усиления функций щелевых соединений. Однако ранее была описана группа пептидов (антиаритмические пептиды), способных увеличивать проводимость щелевых соединений. В документе PCT/DK01/00127, который приводится в данном случае в качестве ссылки, дается ее краткое описание. Краткое описание по настоящему изобретению приводится в USSN 09/792286, поданном 22 февраля 2001 г. USSN 09/792286 приводится в данном
случае в качестве ссылки.
Антиаритмические пептиды представляют из себя группу пептидов, которые проявляют свое влияние на щелевые соединения выборочно и таким образом уменьшают разрыв купирования клеток и также
уменьшают разброс продолжительности действия потенциала. Однако нативные ААР, а также синтетический ААР10, обладают некоторыми нежелательными особенностями типа низкой стабильности, высокой эффективной концентрации и т.д., которые до настоящего времени препятствовали их использованию в качестве лекарств. С использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса авторы Гровер и Деин (Grover and Dhein)[21] получили характеристики двух полуциклических конформаций ААР10,
поэтому, один подход к получению устойчивого антиаритмического пептида мог бы состоять в предусмотрении циклических производных антиаритмических пептидов. В документе DE19707854 описывается явно циклическое соединение CF3C(O)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH и циклическое соединение
CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH, имеющие те же самые антиаритмические свойства как и ААР и
ААР10, но, как утверждается, обладающие повышенной стабильностью в водном растворе и после повторных циклов замораживания и размораживания. Однако экспериментальные состояния, описанные в
документе DE 19707854, недостаточны для приготовления упомянутых циклических соединений, и данные химической идентификации, полученные при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии, не достаточны для идентификации упомянутых циклических соединений. В патенте США
№ 4775743 описано вещество НР5 - производное пептида, состоящее из последовательности N-3-(4гидроксифенил)пропионил-Pro-4Нур-Gly-Ala-Gly-ОН и действующее против агглютинации тромбоцита.
Авторы Деин и Тудика (Dhein и Tudyka)[22] выполнили обзор литературы по пептидам, включая производные пептида, принадлежащие группе антиаритмических пептидов, проявляющих активность, и учли
концентрацию (см. табл. 1), и нашли только 7 соединений, проявляющих активность, и еще 4 химических соединения, проявляющих слабую активность. Однако ни один из этих пептидов или производных
пептида не проявил достаточной стабильности с обеспечением эффективности в режиме терапии.
Пептиды здесь усиливают межклеточную коммуникацию по щелевому соединению (МКЩС) в тканях позвоночных, и специфично, в тканях млекопитающих, и полезны при лечении широкого спектра
болезней, в частности болезней позвоночных типа млекопитающих, вызванных пониженной функцией
межклеточной коммуникации щелевых соединений, что описано ниже.
Таким образом, целью настоящего изобретения является способ профилактики или лечения болезней и болезненных состояний, которые характеризуются ухудшением или ослаблением клеточной коммуникации, например, вызванных ослаблением межклеточной коммуникации по щелевому соединению
или ослаблением купирования, выполненного с помощью щелевого соединения. Примерами болезней и
болезненных состояний являются воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной
ткани, недержание мочи, ослабление слуха вследствие болезни ушной улитки, эндотелиальные поражения, диабетическая ретинопатия и диабетическая невропатия, ишемия центральной нервной системы и
спинного мозга, заболевания ткани зубов, включая болезнь пародонта, болезни почек и патологии при
трансплантации костного мозга, о чем упоминалось выше.
Краткое изложение сущности изобретения
Цель настоящего изобретения достигается с помощью пептидов, включая химические соединения
на основе антиаритмических пептидов.
-3-
007792
В настоящем изобретении предполагаются способы профилактики или лечения болезней, вызванных ослабленной клеточной коммуникацией или ослабленной функцией щелевых соединений. К показательным болезням относятся такие болезни, которые влияют на систему дыхания, кровеносную систему
или нервную систему, зрение и слух, зубы, гладкую мускулатуру и трансплантацию клеток и тканей. Такие способы могут использоваться самостоятельно в качестве терапии или в сочетании с одним или
большим числом других установленных протоколов по лечению специфических болезней или состояний.
Желательно, чтобы лечению подвергались такие млекопитающие как, например, приматы, грызуны
(включая мышей, крыс, хомяков и заячьих, типа кроликов), собаки, свиньи и козы. Среди приматов
предпочтение отдается человеку. Химические соединения, применяемые в способах по настоящему изобретению, характеризются тем, что способствуют МКЩС.
В частности, настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения непролиферативных болезней, вызванных ослаблением функции щелевых соединений, путем поддержания межклеточной коммуникации в патологически измененных клетках и тканях, осуществляемой по щелевому соединению, желательно путем введения пациенту, страдающему от упомянутой болезни, терапевтически
эффективных количеств хотя бы одного химического соединения, которое способствует межклеточной
коммуникации по щелевому соединению.
Все химические соединения, которые могут использоваться в настоящем изобретении, обладают
свойствами поддержания или стимуляции МКЩС в клетках и тканях. Механизмы, с использованием
которых происходит стимулирование МКЩС, могут меняться, так как существует много клеточных механизмов, которые действуют на функционирование коннексина и/или стимулируют функции щелевых
соединений. Эти механизмы включают, например,
регуляцию числа щелевых соединений в клетке путем регуляции или нормализации экспрессии
коннексинов;
ингибирование деградации щелевых соединений и коннексинов, включая регулирование темпа обновления коннексинов путем увеличения периода полураспада;
увеличение клеточного переноса коннексинов к плазматической мембране,
стимулирование сборки коннексинов в функциональные щелевые соединения,
стимулирование открытия существующих щелевых соединений, например, когда они закрыты или
затворены ингибиторами. Этот механизм может быть описан как реверсирование смыкания щелевых
соединений, произведенного ингибиторами МКЩС, действующего через прямой или косвенный механизм, типа, например, гиперфосфорилирования цитоплазматического домена карбокси-концевого участка коннексинов, например, Сх43.
Предположительно домен карбокси-концевого участка содержит сайты фосфорилирования для
многочисленных протеинкиназ (РКА, РКС, PKG, МАРК, СаМкII и тирозинкиназа). Фосфорилирование
этих сайтов домена карбокси-концевого участка приводит к смыканию канальцев щелевого соединения,
и для стимулирования фосфорилирования домена карбокси-концевого участка различные ингибиторы
канальцев щелевого соединения Сх43 используют различные сигнальные пути. По типу клетки и специфичности ингибитора определяют, какие сигнальные пути должны использоваться, а тип включенной
протеинкиназы указывает на используемую внутриклеточную систему мессенджера. Таким образом, для
активации РКА требуется участие системы вторичного мессенджера цАМФ, в то время как для РКС требуется участие внутриклеточной сигнальной системы фосфоинозитола.
Другие механизмы, регулирующие запирание канальцев, включают внутриклеточные уровни водорода и ионы кальция, транссоединительное напряжение (transjunctional voltage), низкий уровень доступного кислорода и глюкозы и свободные радикалы. Пониженный уровень рН или рСа вызывает закрытие
канальца специфическим для клетки и коннексина образом.
Кроме того в настоящем изобретением предлагается использование пептидов, типа антиаритмических пептиды, и предпочтительно пептидов, описанных подробно ниже (описанных в заявках
РСТ/DK01/00127 и USSN 09/792286, обе поданы 22 февраля 2001. Заявка USSN 09/792286 является развитием предварительной заявки США 60/251659, поданной 6 декабря 2000 г., в которой испрашивается
приоритет по отношению к датской заявке на изобретение РА2000 00288, поданной 23 февраля 2000 г. и
РА2000 00738, поданной 4 мая 2000 г. Упомянутые заявки USSN 09/792286, 60/251659 и РА2000 00288 и
РА2000 00738 включены в данном случае в качестве ссылок), которые являются агонистами рецептора
ААР для лечения специфических болезней, включая воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной ткани, раны, эректильную дисфункцию, недержание мочи, слух, ослабленный вследствие болезни ушной улитки, эндотелиальные поражения, диабетическую ретинопатию и диабетическую
невропатию, нервнопатические боли, ишемию центральной нервной системы, поражения спинного мозга, заболевания зубных тканей, включая болезнь пародонта, болезни почек, подострое и хроническое
воспаление, рак и патологии костного мозга и стволовых клеток при трансплантации. Такие болезни или
медицинские состояния характеризуются ослаблением МКЩС, которое является основной причиной
болезни или развития болезни.
В настоящем изобретении используются антиаритмические пептиды, описанные в заявке
PCT/DK01/00127 и ее функциональных аналогах.
-4-
007792
Упомянутые антиаритмические пептиды включают группу пептидов, которые избирательно влияют
на щелевые соединения и таким образом уменьшают разрыв купирования клеток и уменьшают разброс
продолжительности действия потенциала, и их влияние подобно влиянию, описанному выше для антиаритмического пептида ААР10. В настоящее время неизвестна молекулярная цель или рецептор для антиаритмических пептидов, однако структура связующего сайта для ААР10 на предполагаемом рецепторе
была предложена как гипотеза авторами Р. Гровером и Ц. Деином (R. Grover и C. Dhein) (Пептиды 2001,
22 1011-1021). Предполагается, что пептид, который применяется в настоящем изобретении, является
агонистом рецептора для антиаритмического пептида, типа ААР10, и что физиологическое влияние
взаимодействия пептида и рецептора проявляется в виде улучшения купирования клеток с помощью щелевого соединения, или потенцирования, или стимуляции МКЩС. Однако теоретически существует еще
много путей передачи сигналов, которые могут регулировать функции щелевого соединения, и авторы
изобретения не хотят связывать себя теорией, объясняющей биологическое действие модуляции МКЩС.
Вообще, в настоящем изобретении предлагаются способы лечения болезней и нарушений ткани,
вызванных избытком химически активных видов соединений с кислородом и/или свободными радикалами и/или окисью азота. Примером является диабетическая невропатия и раны, в которых свободные радикалы приводят к истощению глутатиона и, следовательно, к сокращению числа щелевых соединений,
или нарушению коммуникации по щелевым соединениям. В ранах с некротической тканью наблюдается
плохое снабжение кислородом и/или высокая концентрация свободных радикалов. При диабете, при артериосклерозе, в хирургических ранах, при отеке, инфекции, при ожоговых ранах и при венозной недостаточности наблюдается ухудшенная коммуникация по щелевым соединениям. Свободные радикалы
играют важную роль при разрушении нервного окончания, при пониженной проводимости, демиелинизации и повышенной воспалительной реакции. Как известно потеря слуха, вызванная шумом, пресбиакузис, связаны с продуцированием свободных радикалов и с замедлением купирования с помощью щелевых соединений. Во время ангиогенеза избыток свободных радикалов может также привести к уменьшению эндотелиальной репарации и росту капилляров.
Например, и в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения предполагаются способы лечения или профилактики воспаления дыхательных путей. В соответствии с предпочтительными способами настоящего изобретения предлагается введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения,
которое способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.
В соответствии с настоящим изобретением предполагаются также способы лечения или профилактики недержания мочи. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения способы включают введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения, которое способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.
В настоящем изобретении предполагаются также способы лечения или профилактики ослабления
слуха, вследствие болезни ушной улитки. Например, и в соответствии с одним вариантом осуществления
настоящего изобретения способы включают введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого
терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения, которое способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.
В частности, изобретение относится к использованию химического соединения, которое способствует клеточной коммуникации, типа межклеточная коммуникация по щелевому соединению, для производства фармацевтического соединения для профилактики или лечения болезней, и предпочтительно
непролиферативных болезней, включая, например, воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной ткани, ран, эректильную дисфункцию, для лечения или профилактики ослабленного
слуха, вследствие болезни ушной улитки, эндотелиальных поражений, диабетической ретинопатии и
диабетической невропатии, нервнопатической боли, ишемии центральной нервной системы, повреждений спинного мозга, заболеваний зубных тканей, включая болезнь пародонта, болезней почек, подострого и хронического воспаления, рака и патологии костного мозга и стволовых клеток при трансплантации.
Подробное описание изобретения
Пептиды, используемые в настоящем изобретении, включают химические соединения по основной
формуле
где пунктирная линия означает, что формула I возможно представляет циклическое соединение, и обозначенные связи представляют ковалентные связи; и где А является химической частью с аминогруппой
(радикал) и карбоксильной группой (радикал), которые образуют часть пептидной связи, соединяющей А
с X и В; В является химической частью с аминогруппой (радикал) и карбоксильной группой (радикал),
которые образуют часть пептидной связи, соединяющей А с В и Y; X является пептидной последовательностью, включающей с 1-го аминокислотного остатка по 3-й, которые независимо друг от друга могут иметь форму L или форму D, если Y является пептидной последовательностью С-концевого участка,
-5-
007792
включающего со 2-го аминокислотного остатка по 5-й, которые могут независимо друг от друга иметь
форму L или форму D; или X является модификацией N-концевого участка группы А-В, если Y является
С-концевой пептидной последовательностью, включающей со 2-го аминокислотного остатка по 5-й, которые могут независимо друг от друга иметь форму L или форму D; или X является пептидной последовательностью, включающей со 2-го аминокислотного остатка по 5-й, которые могут независимо друг от
друга иметь форму L или форму D, если Y является С-концевой пептидной последовательностью, включающей с 1-го аминокислотного остатка по 3-й, которые независимо друг от друга могут иметь форму D
или L; и когда формула I представляет линейный пептид X, претерпевший произвольное химическое
изменение своего N-концевого участка, и L - дополнительная связывающая группа, включающая с 0-го
по 8-й атомы основной цепи; и зеркальное отображение или ретроаналог формулы I, или производное
формулы I, которое является фармацевтически приемлемой солью, алкилом, арилом или сложным эфиром аралкила, амидом, моно- или двузамещенным амидом, где замещающим веществом является алкил,
арил или аралкил, гидразид или спирт;
при условии, что упомянутая общая формула не распространяется на следующие химические соединения
H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-OH,
H-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-4Нур-Gly-А1а-Gly-ОН,
N-3-фенилпропионил-Pro-4Нур-Gly-А1а-Gly-ОН,
N-3-фенилпропил-Pro-4Нур-Gly-А1а-Gly-ОН,
N-3-(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-4Нур-Gly-А1а-ОН,
N-3-(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-4Нур-Gly-ОН,
N-3-(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-4Нур-ОН,
N-3-(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-Pro-Gly-А1а-Gly-ОН,
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-OH,
H-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr (3-I)-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr (3-F)-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-Cl)-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-Br)-NH2,
H-Arg-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Val-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Ala-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-His-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Phe-NH2,
Цикло(CF3C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH),
Цикло(CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH),
CF3C(O)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH и
CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH.
Желательно, чтобы ковалентные связи выбирались из пептидных связей, дисульфидных связей,
эфирных связей, восстановленных амидных связей, алкокси-связей, оксикарбонильных связей и ацилоксиалкокси-связей. В примеры А и В включена формула Z
(Z)
где n - целое число, имеющее значение 3, 4, или 5, и R является дополнительным заместителем, предпочтительно выбираемым из группы, в состав которой входит галогеновая группа, фенильная группа, гидроксигруппа, NH2 и С(1-6)алкил. В предпочтительном варианте по настоящему изобретению как А, так и В
является аминокислотой или производным аминокислоты, имеющим функциональную аминогруппу и
группу карбоновой кислоты. Дальнейшие примеры А и В представлены формулой Za
-6-
007792
где n - целое число, имеющее значение 0, 1, 2 и 3, р - целое число, имеющее значение 0, 1, 2 и 3, Z является О или S, и R представляет дополнительный заместитель, предпочтительно выбираемый из группы, в
состав которой входит галогеновая группа, фенильная группа, гидроксигруппа, NH2 и С(1-6)алкил. Примерами химических соединений по настоящему изобретению, в которых А или В представлены формулой Za, являются
H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr- NH2 Химическое соединение 11;
H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr- NH2 Химическое соединение 12;
H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr- NH2 Химическое соединение 13;
H-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr- NH2 Химическое соединение 14
и их соли.
Примеры А и В включают (но не ограничиваются) N- и С(O)-радикалы следующих химических соединений:
D/L-азетидин-3-карбоновая кислота,
D/L-азетидин-2-карбоновая добавьте,
D/L-Индолин-2-карбоновая кислота,
D/L-1,3-дигидро-изоиндол-1-карбоновая кислота,
D/L-тиазолидин-4- карбоновая кислота,
D/L-пипеколиновая кислота,
D/L- нипекотиновая кислота,
Изо нипекотиновая кислота,
L/D-2-карбоксиморфолин,
L/D-1/2,3,4-тетрагидрохинолин-3-карбоновая кислота,
L/D-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-3-карбоновая кислота и
4-карбокси-4-фенилпиперидин.
Желательно, чтобы как А так и В являлось аминокислотным остатком, имеющим насыщенную карбоциклическую структуру из 4, 5 или 6 членов, включая один или большее число гетероатомов типа N и
S. Упомянутые аминокаслоты включают L и D формы, природные и неприродные аминокислоты и их
производные типа остатка пролина, имеющего один или большее число заместителей в позициях 3, 4 или
5, при этом желательно, чтобы упомянутые заместители выбирались из группы, в состав которой входит
гидроксигруппа, аминогруппа или фенильная группа; и N-замещенные аминокислоты типа саркозина, Nциклогексилглицина и N-фенилглицина. Желательно, чтобы последовательность А-В была представлена
дипептидом, выбираемым из группы, в состав которой входит Sar-Sar, Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Sar, Sar-Pro,
Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro, и Hyp- Hyp, где Pro и Hyp независимо друг от друга могут иметь как форму L,
так и форму D, где циклическая структура Pro и Hyp может произвольно замещаться галогеновой группой, нитрогруппой, метильной группой, аминогруппой или фенильной группой, и Hyp является 3гидроксипролином или 4-гидроксипролином, или один, или оба из аминокислотных остатков А-В являются Sar, или остатком N-циклогексилглицина.
Приведенная выше общая Формула может представлять линейный пептид, при этом упомянутая
химическая модификация N-концевого участка X является ацилированием с произвольно замещенной
С(1-22)алкил-карбоновой кислотой типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты и
других жирных кислот, или произвольно замещенной С(2-22) алкенилкарбоновой кислотой, или арилкарбоновой кислотой, типа бензойной кислоты, где заместитель выбирается из группы, в состав которой
входят гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкил, нитрогруппа или цианогруппа и может располагаться на углеродной цепи или в ароматической части; или алкилированием с произвольно замещенным С(1-22)алкилом, С(2-22)алкенилом, или арил-С(1-22)алкилом, типа метила, этила, пропила, бутила,
фенилпропила, 2-гидроксифенилпропила, и 4-гидроксифенилпропила, где заместитель выбирается из
группы, в состав которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкил, нитрогруппа или
цианогруппа и может располагаться на углеродной цепи или в ароматической части. Лучше, если X выбирается из группы, в состав которой входит L-Tyr и D-Tyr, произвольно ацилируемые С(1-4)карбоновой
кислотой, предпочтительно уксусной кислотой, если Y является пептидной последовательностью Сконцевой пептидной последовательности со 2-го до 5-го аминокислотного остатка, о чем говорилось
выше. Желательно также, чтобы X представлял N-концевую модификацию группы А-В, при этом желательно, чтобы упомянутая модификация выбиралась из группы, в состав которой входит фенилпропионовая кислота и ее производные типа 4НРРА и 2НРРА; фенилуксусная кислота и их производные, типа
-7-
007792
4НРА, 3НРА и 2НРА; феноксиуксусная кислота и их производные, типа 4НРРА, 2НРРА и 4НМРА; бензоилглицин и его производные, типа 4HBG, 3HBG и 2HBG; и фенилглицин и его производные, связанные амидной связью с А.
Желательно выбирать А-В из группы, в состав которой входит Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro и HypHyp, где Pro и Hyp независимо друг от друга могут иметь форму L или форму D и желательно, чтобы
Hyp являлось 4Нур. Желательно, чтобы Y был пептидом из 3 - 5 аминокислотных остатков, или лучше из
3-4 аминокислотных остатков, имея при этом форму L или форму D, и желательно, чтобы на его Сконцевом участке был Sar или Gly, но еще лучше, если Y является пептидной последовательностью, выбираемый из группы, в состав которой входит
Gly-L-Ala-Gly-OH,
Gly-L-Ala-Gly-NH2,
Gly-D-Ala-Gly-OH,
Gly-D-Ala-Gly-NH2 и
Sar-Aib-Sar-OH/NH2, при этом X является одиночной аминокислотой.
Примерами химических соединений с нормальной цепью по формуле I являются
H-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Tyr-OH/NH2
Ac-L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 2)
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (химическое соединение 1)
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-GIy-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-OH,
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH,
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
-8-
007792
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
-9-
007792
4HPA-Sar-D-4Hyp-Gfy-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
- 10 -
007792
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
- 11 -
007792
4HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-AIa-GIy-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
- 12 -
007792
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
- 13 -
007792
4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
- 14 -
007792
4HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-AIa-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Afa-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
- 15 -
007792
4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
- 16 -
007792
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gfy-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
- 17 -
007792
4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-0H/NH2
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4H PP-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
- 18 -
007792
4HBG-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
- 19 -
007792
4HPP-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gfy-OH/NH2
4HPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-Pro-Sar-Aib-GIy-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
- 20 -
007792
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
- 21 -
007792
4HPA-SAR-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
- 22 -
007792
4HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPP-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HMPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
4HBG-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2
- 23 -
007792
и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные, которые выбираются из группы, в
состав которой входят фармацевтически приемлемые соли; сложные эфиры алкила, арила и аралкила;
моно- и двузамещенные амиды, где заместитель выбирается из группы, в состав которой входит алкил,
арил и аралкил; гидразиды; и спирты.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения формула I представляет циклический пептид, при этом А-В выбираются из группы, в состав которой входит Sar-Sar, SarHyp, Hyp-Sar, Pro-Sar, Sar-Pro, Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro и Hyp Hyp, где Pro и Hyp независимо друг от
друга могут иметь форму L или форму D, a Hyp предпочтительно является 4-гидроксипролином. Еще
лучше, чтобы А-В был незамещенным L-Pro-L-4Hyp, L-4Hyp-L-Pro, D-Pro-D-4Нур или D-4Hyp-D-Pro.
X является единичным аминокислотным остатком, предпочтительно L-Tyr или D-Tyr, произвольно
замещаемым галогеновой группой, фенильной группой, гидроксигруппой, NH2, и С(1-6)алкилом, произвольно замещаемым галогеном в его ароматическом кольце, если Y является пептидной последовательностью из 3 или 4 аминокислотных остатков, независимо имеющих форму L или форму D, С-концевой
участок которой предпочтительно включает Asp или Glu, но еще лучше, если Y является пептидной последовательностью, выбираемой из группы, в состав которой входит
Gly-L-Ala-L-Asn,
Gly-D-Ala-L-Asn,
Gly-L-Ala-Gly-L-Asn,
Gly-L-Ala-Gly-D-Asn,
Gly-L-Ala-L-Gln,
Gly-L-Ala-Gly-L-Gln,
Gly-L-Ala-Gly-D-Gln,
Gly-D-Ala-D-Asn,
Gly-D-Ala-Gly-D-Asn,
Gly-D-Ala-Gly-L-Asn,
Gly-D-Ala-D-Gln,
Gly-D-Ala-Gly-D-Gln,
Gly-D-Ala-L-Gln,
Gly-D-Ala-Gly-D-Gln,
Gly-L-Ala-L-Asp,
Gly-D-Ala-L-Asp,
Gly-L-Ala-Gly-L-Asp,
Gly-L-Ala-Gly-D-Asp,
Gly-L-Ala-L-Glu,
Gly-L-Ala-Gly-L-Glu,
Gly-L-Ala-Gly-D-Glu,
Gly-D-Ala-D-Asp,
Gly-D-Ala-Gly-D-Asp,
Gly-D-Ala-Gly-L-Asp,
Gly-D-Ala-D-Glu,
Gly-D-Ala-Gly-D-Glu,
Gly-D-Ala-L-Glu,
Gly-D-Ala-Gly-D-Glu.
Или X является пептидной последовательностью, предпочтительно выбираемой из группы, в состав
которой входит
Gly-L-Ala-L-Asp,
Gly-L-Ala-Gly-L-Asp,
Gly-L-Ala-L-Glu,
Gly-L-Ala-Gly-L-Glu,
Gly-D-Ala-D-Asp,
Gly-D-Ala-Gly-D-Asp,
Gly-D-Ala-D-Glu,
Gly-D-Ala-Gly-D-Glu,
если Y является единичным аминокислотным остатком, предпочтительно L-Tyr или D-Tyr, произвольно
замещаемым галогеном, типа С1, в его ароматическом кольце.
Формула I может представлять циклическую пептидную последовательность, включающую все
L-формы, все D-формы или последовательность смешанных L- и D-форм аминокислотных остатков. На
фиг. 1 показана общая схема семи различных циклических структур в пределах объема настоящего изобретения.
Примерами циклических структур по формуле I являются
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Нур-Gly-L-Ala-L-Asn) (химическое соединение 4),
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-L-Asn),
- 24 -
007792
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Asp),
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asn) (химическое соединение 3),
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asp),
циклоo(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asp),
цикло(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asn),
цикло(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp),
цикло(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp),
цикло(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Asn),
цикло(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-L-Asn),
цикло(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Asp),
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Gln),
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-L-Gln),
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Glu),
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Gln),
цикло(L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Glu),
цикло(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Glu),
цикло(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Gln),
цикло(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu),
цикло(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu),
цикло(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Gln),
цикло(D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-L-Gln),
цикло(D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Glu),
цикло(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-) (химическое соединение 44)
цикло(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn-) (химическое соединение 45)
цикло(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-) (химическое соединение 46)
цикло(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-) (химическое соединение 47)
и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых
солей и амидов.
Другим предпочтительным вариантом формулы I по настоящему изобретению является циклическое соединение, где группы X и Y связаны через аминокарбонильную связь, алкоксисвязь, эфирную
связь, восстановленную амидную связь или дисульфидную связь. Ниже перечислены примеры химических соединений, где X и Y связаны через алкоксисвязь, имеющую линкер L по формуле
где как R' так и R" представляют водород или низший алкил и/или низший арил, предпочтительно метил
и фенил
цикло(O-C(R',R")-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-С(R', R'')-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-CH2-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-С(метил, фенил)-Tyr-Sar-4-Нур-Gly-Аlа-Gly)
включая их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.
Примерами химических соединений, где X и Y связаны через аминокарбонильную связь, имеющую
линкер L по формуле
являются
цикло(HNC(O)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Afa-Gly)
цикло(HNC(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(HNC(O)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
цикло(HNC(O)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(HNC(O)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(HNC(O)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
- 25 -
007792
цикло(HNC(O)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(HNC(O)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(HNC(O)-Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.
Примерами химических соединений, где X и Y связаны через эфирную связь, имеющую линкер L
по формуле
где как R' так и R" представляют водород или большее число низкий алкил и/или большее число низкий
арил, предпочтительно метил и фенил, предпочтительно R' Ф R", являются
цикло(O-C(R',R")C(O)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")C(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")C(O)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")C(O)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-С(R' ,R'' )C(O)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")C(O)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-C(R',R")C(O)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-С(R' ,R'' )C(O)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(O-С(фенил, метил)С(O)-Tyr-Sar-4-Нур-Gly-Ala-Gly)
и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых
солей и амидов.
Когда эфирная связь является частью основы циклических соединений по настоящему изобретению, L может быть получено из оксикарбоновой кислоты, типа гидрокси-С(3-6)алкилкарбоновой кислоты. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения L получено из αгидроксикарбоновой кислоты, общая формула которой имеет следующий вид: НО-C(R1)(R2)-COOH, где
R1 и R2 независимо друг от друга являются Н, С(1-6)-алкилом, С(2-6)-алкенилом, арилом, арил-С(1-4)алкилом, гетероарилом или гетероарил-С(1-4)-алкилом; или R1 и R2 вместе с атомом углерода, с которым они связаны, образуют циклопентильное, циклогексильное, или циклогептильное кольцо; где алкильная или алкенильная группа может замещаться заместителями числом от одного до трех, выбираемыми из группы, в состав которой входит аминогруппа, цианогруппа, галогеновая группа, изоцианогруппа, изотиоцианогруппа, тиоцианогруппа, сульфамильная группа, С(1-4)-алкилтиогруппа, моно- или
ди-С(1-4)-алкиламиногруппа, гидроксигруппа, С(1-4)-алкоксигруппа, арильная группа, гетероарильная
группа,
арилоксигруппа,
карбоксигруппа,
С(1-4)-алкоксикарбонильная
группа,
С(1-4)алкилкарбокнилоксигруппа, аминокарбонильная группа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламинокарбонильная
группа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламиногруппа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламино-С(1-4)-алкильная
группа, С(1-4)-алкилкарбониаминогруппа, сульфоно-, и сульфиногруппа; и где арильная или гетероарильная группа могут замещаться заместителями числом от одного до трех, выбираемыми из группы, в
состав которой входит С(1-4)-алкил, С(2-4)-алкенил, нитрогруппа, аминогруппа, цианогруппа, галогеновая группы, изоцианогруппа, изотиоцианогруппа, тиоцианогруппа, сульфамильная группа, С(1-4)алкилтиогруппа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламиногруппа, гидроксигруппа, С(1-4)-алкоксигруппа, арилоксигруппа, карбоксигруппа, С(1-4)-алкоксикарбонильных, С(1-4)-алкилкарбокнилоксигруппа, аминокарбонил, моно- или ди-С(1-4)-алкиламинокарбонильная группа, моно- или ди-С(1-4)-алкил-амино, моно- или ди-С(1-4)-алкил-амино-С(1-4)-алкил, С(1-4)-алкилкарбониламино, сульфоно-, и сульфиногруппа. В другом варианте по настоящему изобретению L получают из гидроксиарил-С(3-6)-алкилкарбоновой кислоты, или L получают из гидрокси-С(2-6)-алкенилкарбоновой кислоты, или L получают
из гидрокси-С(3-6)алкилкарбоновой кислоты. Желательно, чтобы R1 и R2 представляли различные группы.
В циклических соединениях по настоящему изобретению, где циклизация образуется в виде эфирной связи и количество аминокислотных остатков равно 5, группа А-В выбирается из группы, в состав
которой входит Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro, и Hyp Hyp, где Pro и Hyp независимо друг
от друга могут иметь форму L или форму D, a Hyp предпочтительно является 4-гидроксипролином. Еще
лучше, чтобы А-В было незамещенным соединением L-Pro-L-4Hyp, L-4Hyp-L-Pro, D-Pro-D-4Hyp или D4Hyp-D-Pro.
Примерами химических соединений по настоящему изобретению являются
цикло(O-(CH2)5C(O)-Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) и
цикло(O-(СН2)5С(O)-Tyr-4-Нур-Pro-Gly-А1а-Glу), где L - гидрокси-С(3-6)алкилкарбоновая кислота,
и
цикло(O-(4-гидроксиметилбензоил)С(O)-Tyr-Pro-4-Нур-Gly-Ala-Gly) и
- 26 -
007792
цикло(O-(4-гидроксиметилбензоил)С(O)-Tyr-4-Нур-Pro-Gly-Ala-Gly), где L - арил-С-гидрокси-(1-4)
алкилкарбоновая кислота,
и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.
Циклические соединения по настоящему изобретению, где циклизация формируется серином:
Примерами циклических соединений по настоящему изобретению, имеющих дисульфидную связь,
являются
включая химические соединения, имеющие комбинации из L и D аминокислот, аминокислоты, замещенной Sar и другими N-замещенными природными аминокислотами, и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.
- 27 -
007792
Примерами химических соединений, где X и Y связаны через восстановленную амидную связь,
имеющую линкер L по формуле
являются
цикло(ψCH2NH)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH2NH)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH2NH)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH2NH)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH2NH)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH2NH)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH2NH)-Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные, типа фармацевтически приемлемых
солей и амидов.
Примерами химических соединений, где X и Y связаны через восстановленную амидную связь,
имеющую линкер L по формуле
являются
цикло(ψСН(ОН)NH)-Tyr-Pro-4Нур-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψСН(ОН)NH)-Tyr-4-Нур-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψСН(ОН)NH)-Tyr-4-Нур-4-Нур-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH(OH)NH)-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH(OH)NH)-Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH(OH)NH)-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly)
цикло(ψCH(OH)NH)-Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly)
и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых
солей и амидов.
В частности, изобретение относится к пептидам и производным пептидов по формуле I
представляющей пептидную последовательность, где аминокислотные остатки могут иметь форму D
и/или форму L с N-концевым участком N* и С-концевым участком С* и обладать цикличностью благодаря ковалентной связи между N* и С*, как показано пунктирной линией, или между Rd и С*, как показано пунктирной линией U; и где X является N-концевым участком типа фотозонда, способного связываться с аминоконцевым участком N*, или ацильной группой, полученной из С(2-22)алкилкарбоновой
кислоты, типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот
типа бегеновой кислоты, произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа,
нитрогруппа и цианогруппа; или X является водородом;
R7 является ОН, NH2, NHNH2 или OR8, если связь между N* и С* отсутствует, или R7 отсутствует,
если связь между N* и С* существует;
R8 является Н или прямой или разветвленной С(1-6)алкильной группой, арильной или аралкильной
группой.
- 28 -
007792
Ra является боковой аминокислотной цепью Hyp или Pro;
Rb является боковой аминокислотной цепью Hyp или Pro;
Rc является боковой аминокислотной цепью Gly, Sar, ароматической боковой аминокислотной цепью, произвольно замещаемой одной группой или большим числом гидроксигрупп, галогеновых групп
или нижних алкокси групп в ароматическом кольце или Rc;
Rd является боковой аминокислотной цепью Ala, Gly, Glu, Asp, Dab, Dapa, Lys, Asn, Gln, Orn, или
Cys;
Re является боковой аминокислотной цепью Ala;
Rf является боковой аминокислотной цепью Ala, Sar или Gly;
Rg представляет любую боковую аминокислотную цепь кроме боковой цепи L-4Hyp или части по
Формуле Z или Za;
Rh является боковой аминокислотной цепью Ala, или Rh является частью формулы Z или Za, предпочтительно Pro;
Ri является боковой аминокислотной цепью Gly, или Ri представляет ароматическую аминокислоту,
произвольно замещаемую одной галогенной группой или большим числом галогеновых групп в ароматическом кольце, предпочтительно Tyr, Phe, Trp или Nal;
Rj является Asn, Gln, Asp, Glu, Cys, или Tyr;
и каждый из индексов j, k, i, m, n, p и q независимо друг от друга принимает значение 0 или 1;
и к ретроформам всех форм D, или ретроформам всех форм D пептидной последовательности по
формуле I, и
к их солям и амидам.
В соответствии с предпочтительными вариантами формулы I X выбирается из группы, в состав которой входят фотозонды типа ASAL, произвольно йодированные на позиции 5, типа 2-гидрокси-4-азидо5-йодобензоила, и АВ, и ацильная группа типа Ас. Желательно, чтобы на месте R7 было NH2, а на месте
Ra - боковая аминокислотная цепь Pro, на месте Rb - боковая аминокислотная цепь Hyp, на месте Rc - боковая аминокислотная цепь Gly или Tyr, на месте Rd - боковая аминокислотная цепь Gly, Asp, Glu, Dapa,
или Dab, на месте Re - Ala, на месте Rf - аминокислотная боковая цепь Gly или Ala, на месте Rg - боковая
аминокислотная цепь Asn, Gly, D-4Нур или L-/D-Pro, если формула I представляет линейный пептид, а
если формула I представляет пептид циклизированный между N* и С*, то Rg является боковой аминокислотной цепью L-/D-4Нур или L-/D-Pro. Rh является боковой аминокислотной цепью Ala, если U отсутствует, или Rh является Pro или Hyp, если U присутствует. Ri является Tyr, Phe, Trp, Nal произвольно
замещаемыми в ароматическом кольце одной группой или большим числом гидроксигрупп или галогеновых групп, предпочтительно F или Сl. Желательно, чтобы на месте Rj была боковая аминокислотная
цепь Asp или Glu, а на месте Rg - Н, бензил, трет-бутил или СН3.
Желательно, чтобы j и k принимали значение 0, если U присутствует, и значение 1, если U отсутствует, и формула I представляет циклический пептид, желательно, чтобы m принимало значение 0, если U
отсутствует, р - значение 1, если U присутствует, и q - значение 0, если U присутствует. Желательно,
чтобы нециклические или линейные пептиды по формуле I имели ретроформу всех D форм. Если формула I представляет циклический пептид, то желательно, чтобы пептид состоял из аминокислотных остатков числом от 3 до 9, еще лучше от 3 до 7.
Специалистам ясно, что химические соединения, подобные пептиду, имеющие формулу, сопоставимую с формулой I, но с одним или большим числом пептидных связей, измененных на ковалентную
связь, выбираемую из группы, в состав которой входит, например, дисульфидная связь, эфирная связь,
восстановленная амидная связь, алкоксисвязь, оксикарбонильная связь и ацилоксиалкоксисвязь, были бы
полезны для лечения тех же самых состояний и болезней, как и химические соединения по настоящему
изобретению.
Предпочтительный вариант по настоящему изобретению относится к химическим соединениям, соответствующим общей формуле (II):
X-(G')a - A- G' - (Px)2-(Y')b-R7 (II),
задающей пептидную последовательность, в которой аминокислотные остатки могут иметь форму
L и/или форму D, и где
X является Н или Ас; а если все аминокислотные остатки имеют форму L, то X является Ас;
G' является остатком глицина или аналогом глицина типа Sar, G' является предпочтительно глицином;
А является аланином;
Рх является аминокислотным остатком по формуле Z или Za типа Hyp или Pro, предпочтительно
пролином;
Y' является тирозином или фенилаланином, произвольно замещаемым в фенильном кольце галогеновой группой или гидроксигруппой; желательно, чтобы Y' был тирозином;
а и b - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1;
R7 является ОН, NH2, NHNH2, Asn-NH2, или Gln-NH2;
- 29 -
007792
и к их ретроформам, представленным формулой IIа: X-(Y')b-(Px)2-G'-A-(G')a-R7, где все аминокислотные остатки предпочтительно имеют форму D, и где все символы имеют то же самое значение, что и
в Формуле II;
и к пептидным соединениям по формуле II, где по крайней мере один остаток Рх является
D-аминокислотой, а остальное - L-аминокислотами;
и к циклическим последовательностям по формуле II, где X является Н, R7 является Asn или Gln с
ковалентной связью с Y ', b равно 1, и а равно 1;
и к их солям.
Желательно, чтобы циклическими пептидными соединениями по формуле I были соединения,
имеющие одну из общих формул III или IV:
III
где
X является Н или частью N-концевого участка типа фотозонда, способного образовывать
ковалентную связь с N-концевой аминогруппой или ацильной группой, полученной из С(2-22)алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из
жирных кислот типа бегеновой кислоты, произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа;
R1 является Н или СН3, предпочтительно Н;
R2 и R3 отличаются друг от друга или идентичны, и являются любой возможной боковой аминокислотной цепью, предпочтительно Н или СН3;
---- - возможная связь;
R5 и R4 - любая возможная боковая аминокислотная цепь, или, если существует возможная связь, то
R5 и R4 вместе с присоединенными атомами С и N представляют из себя пролиновое кольцо, которое
произвольно замещается на ОН, предпочтительно в позиции 4, или R5 и R4 вместе с присоединенными
атомами С и N представляют часть формулы Z или Za, приведенной выше, предпочтительно Pro или
Hyp;
R6 является боковой ароматической аминокислотной цепью, предпочтительно бензилом, произвольно замещаемой в фенильном кольце одним или большим числом заместителей, выбираемых из
группы, в состав которой входит галогеновая группа, нитрогруппа и гидроксигруппа, предпочтительно
R6 является Tyr;
р равно 0 или 1;
n равно 1, 2, 3 или 4; предпочтительно n равно 1;
и их соли.
Типичными химическими соединениями по формуле III являются
и их соли.
- 30 -
007792
IV
где R8 соответствует тому, о чем говорилось выше, и предпочтительно является Н;
R6 является Н или СН3, предпочтительно Н;
R4 и R5 отличаются друг от друга или идентичны и являются любой возможной боковой аминокислотной цепью, предпочтительно Gly или Ala;
---- - возможная связь;
R2 и R3 - любая возможная боковая аминокислотная цепь, или, если существует возможная связь, то
R2 и R3 вместе с присоединенными атомами С и N представляют пролиновое кольцо, которое произвольно замещается на ОН, предпочтительно в позиции 4, или R2 и R3 представляют часть формулы Z или Za;
R1 является боковой ароматической аминокислотной цепью, предпочтительно боковой цепью Tyr;
р равно 0 или 1;
n равно 1, 2, 3 или 4; предпочтительно n равно 1;
и их соли.
Типичными химическими соединениями по формуле IV являются
Кроме того, неожиданно было обнаружено, что замещение остатка аспарагина или глутамина на
последовательность Hyp-Pro в ААР10 приводит к образованию нового антиаритмического пептида (химическое соединение 21 из примера 21). Таким образом, предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к пептидному соединению, в котором аминокислотные остатки могут быть формы D
и/или формы L, и быть представлены общей формулой V
где R1 является возможной амидной связью между N-концевым и С-концевым участками пептида, Н или
Ас;
Аа1 является пептидной последовательностью, состоящей предпочтительно из 0-4 аминокислотных
остатков, если Аа1, является пептидной последовательностью из 1-4 аминокислотных остатков, то Аа1,
предпочтительно выбирается из группы, в состав которой входит Ala, Gly-Ala, Gly-Asn-Tyr, и Gly-AsnTyr-Ala;
Аl является аминокислотным остатком, выбираемым из группы, в состав которой входит Gly, бета
Алании и Sar;
Аа2 является аминокислотным остатком, выбираемым из группы, в состав которой входит Asn, Gln,
Gly, Tyr, или химические соединения типа оксикислоты, аминосульфокислоты, фосфорнокислой группы
или углеводородной цепи, соединяющей G и Ar посредством 4 ковалентных связей;
- 31 -
007792
Аr является ароматическим аминокислотным остатком, типа Tyr, Trp, Phe, His, или Nal, произвольно замещаемым одним или большим числом галогенов, типа F, Cl, Br, I, ОН, NO2, NH2, СООН, CONH;
R2 является ОН, NH2 или отсутствует;
и к ретроаналогам, ретроаналогам всех D форм (обратные ретроаналоги) и к их солям.
Типичными химическими соединениями по формуле V являются:
химическое соединение 39 H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2
химическое соединение 44 цикло (-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)
химическое соединение 45 цикло (-Tyr-Ala cepa-Ala-Gly-Asn-)
химическое соединение 46 цикло(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly- Asn-)
химическое соединение 47 цикло(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-)
химическое соединение 40 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2
химическое соединение 41 H-Gly-Asn-Tyr-NH2
химическое соединение 42 Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2
химическое соединение 43 H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 и их соли.
Фото/термолабильные производные пептида
Аффинное мечение - часто используемая методика изучения взаимодействия биологически активных молекул. Для исследования используется фото- или термолабильный аналог химического соединения.
Фотолабильный аналог исследуемого химического соединения, которое устойчиво в темноте, при
освещении преобразуется в химически активное промежуточное химическое соединение, которое может
участвовать в реакциях вставки. Это, путем создания ковалентной связи, стабилизирует взаимодействие,
основанное на биологическом сродстве. Ароматические азиды и устойчивые диазохимические соединения, используемые в качестве фотозондов, при фотолизе производят химически очень активные и неспецифичные промежуточные химические соединения - нитрены и карбены, способные соответственно к
участию в реакциях вставки. Таким образом, фотоаффинное мечение с применением в качестве фотозондов арилазид и устойчивых диазохимических соединений может выполняться на любом связующем сайте, который содержит углерод-водородные связи, и не требует наличия на связующем сайте специфической химически активной функциональной группы. Поэтому специфичность мечения зависит исключительно от специфического связывания лиганда с рецептором, за которым затем следует неспецифичная
реакция, в результате которой образуется ковалентная связь, которая гарантирует мечение связующего
сайта. Фотоаффинные зонды особенно полезны для мечения сайтов рецепторов гормона, где химически
активные функциональные группы не могут присутствовать, но которые, безусловно, содержат углеродводородные связи. Особенно полезны для фотоактивной функциональности азидо, диазирино, α-диазокетоны, тиа- и селенодиазолы, бензофенон, нитрофенил. Процесс мечения с использованием арилазид
включает фотолиз при λех = 300 - 320 нм в течение приблизительно 0,5 -2 ч при комнатной температуре
водного раствора, содержащего фотолабильный аналог пептида и рецептор.
Термолабильное соединение содержит химически активную группу, которая может образовывать
ковалентную связь в тепловой управляемой реакции со специфичностью к амино- или меркаптогруппам.
В качестве термозондов могут использоваться алифатические галогены особенно йод и бром, активные
сложные эфиры типа N-гидроксисукцинимид, кислые хлориды, пиридилдисульфиды, изоцианаты, изотиоцианаты, карбодиимиды и мелеймидо.
Метки для применения in vitro наиболее часто выбираются из радиоактивных изотопов типа йода125 и -131, С-14 и трития, или из флюоресценных зондов, или биотинов, или гаптенов. Для того, чтобы
поддерживать сродство рецепторов необходимо исследовать влияние метки на связывающую активность
лиганда. Йод-125 часто используется в качестве радиоактивной метки для применения in vitro, ввиду того, что период его полураспада составляет 60 дней и ввиду того, что он испускает низкоэнергетические
фотоны. Большой период полураспада обеспечивает возможность приготовления и хранения меченых
светочувствительных аналогов и получаемых меченых белковых продуктов в течение длительного времени перед использованием или анализированием. Йод (I-125) можно легко включить в пептидные лиганды, если, например, в пептидной последовательности присутствует тирозин или гистидин. Для поддержания биологической активности необходимо исследовать влияние мечения пептида на биологическую активность лиганда. Деин (Dhein) и др. в работе WO96/21674 показали, что производное ААР10,
где фенильное кольцо из остатков Tyr содержит заместитель из йода-125, обладает биологической активностью. Однако использование упомянутого ААР10 в качестве аффинного зонда не возможно вследствие обратимого связывания с возможным лигандом или рецептором. Фотоаффинное мечение с использованием арилазид приводит обычно к тому, что 50-60% пептидных лиганд необратимо присоединяется
к целевому протеину (рецептору). Таким образом, целью настоящего изобретения также является получение антиаритмического пептида, соответственно, модифицированного фото- или термо-зондом, а радиоактивная метка, может использоваться в пробах для идентификации возможных лигандов или рецепторов для антиаритмического пептида. Упомянутая цель достигается путем использования химического
соединения по формуле I, II или 9, полученного с помощью одного из вышеупомянутых фотозондов,
- 32 -
007792
предпочтительно 4-азидосалицилоила (ASAL) и АВ (4-азидобензоил). Желательно, чтобы упомянутое
полученное химическое соединение также замещалось радиоактивной меткой типа йода-125.
Типичными химическими соединениями, модифицированными фотозондом, и с радиоактивной
меткой по формуле I, или 9 являются:
химическое соединение 31 ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2,
химическое соединение 32 ASAL (3-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2,
химическое соединение 32а ASAL (6-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2,
химическое соединение 33 AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2,
химическое соединение 34 АВ-Tyr (3,5-ди-I)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2
и их соли (см. примеры синтеза 31-34).
Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидным соединениям, выбираемым из группы
соединений, соответствующих общей формуле:
2: H-GAG-(Pa)2-NH2, где Ра - любой аминокислотный остаток или часть формулы Z или Za; по
крайней мере один из Ра является аминокислотой D; предпочтительно, чтобы Ра являлся Hyp, P, G или
А;
3: H-GAG-(Px)2-Y-NH2, где Рх является частью формулы Z или Za, где один Рх является частью
формулы II, IIа, а другой Рх является Р или Hyp;
4: Ac-Y'-(Px)2-GAG-OH, где Y' является Y или F, а Рх является Р или Hyp;
5: Cys(Acm)-AAP10*-Cys(Acm) или Cys(Acm)-peTpoAAP10*-Cys(Acm), где Acm является ацетамидометиловым радикалом, а ААР10* является последовательностью ААР10 или ее усеченной последовательностью;
6: X-D-Y-(D-Px)2-G-D-A-G-NH2 или его ретроформа, X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-NH2 или X-G-D-A-G(D-Px)2-D-Y-D-(Asn)-NH2, где X является Н или Ас; Рх является частью формулы Z или Za, предпочтительно Hyp или Р; a (Asn) является необязательным, при этом обе формулы произвольно имеют один или
большее число изотопов С или N;
7: H-(Px)n-Y(N/Q)G-AG-(Px)m.-NH2, где Рх является Р, или Hyp, n равно 1 или 2, a m равно 0 или 1,
предпочтительно m = 0, если n = 2, и m = 1, если n = 1;
8: H-G'-A-G'-(Px)2-Y-NH2, где G' является Sar или Gly, и по крайней мере один G' является Sar, а Рх
является Р или Hyp;
9: X-(Y)p-(Px)2-GAG-NH2, где X является ASAL или АВ, р равно 0 или 1, и фенильное кольцо Y
имеет произвольно один или большее число галогеновых заместителей, предпочтительно I, а Рх является
Р или Hyp;
10: цикло(-GAG-(Px)2-Y-N/Q-), где Рх является Р или Hyp;
11: цикло(-Y-(Px)2-GA-(G)q-N/Q-), где q равно 0 или 1, фенильное кольцо Y имеет произвольно один
или большее число галогеновых заместителей, предпочтительно I, а Рх является Р или Hyp;
12: X-Zd-G(N/Q)Y-NH2, где Zd - последовательность из 0, 1 или 2 аминокислотных остатков, выбираемых из П или А, а X является Н или Ас;
и их солям.
К химическим соединениям по настоящему изобретению относятся соединения, имеющие общую
формулу VI
R1: Н, Ас, НАА, ТНАА (тиогидроксиуксусная кислота), Tfa, ароил, ацетил;
R2:H;
R3: боковая цепь G, A, N, К, С;
R4: О, NO2, галоген (F, Cl, Br, I) NH2 или Н;
R5: (4 гидроксифенил, или 4-нитрофенил, или 4-фторфенил, или 4-хлорофенил, или 4-бромофенил,
или 4-йодофенил, или 4-аминофенил, или 4-алкоксифенил, или Н);
R6: ОН, NO2, галоген (F, Cl, Br, I) NH2 или Н;
R7: ОН, NO2, галоген (F, Cl, Br, I) NH2 или Н;
s: 0 или 1;
t: 0 или 1 и их соли.
- 33 -
007792
К химическим соединениям по настоящему изобретению относятся соединения, имеющие общую
формулу VII, которым отдается предпочтение при использовании по способу по настоящему изобретению (VII)
где
R1 является Н или ацетилом (Ас);
R2 является боковой цепью одной из аминокислот G, Y, D-Y, F и D-F;
R3 является О или Н;
R4 является любой аминокислотной боковой цепью;
R5 является О или Н;
R6 является С(1-4)алкильной группой типа СН2, (СН2)2, (СН2)3 и (СН2)4;
R7 является О или Н;
R8 является О или Н;
R9 является боковой цепью одной из аминокислот G, Y, D-Y, F и D-F;
R10 является ОН или NH2 и
S, T, U, V и Z - целые числа, принимающие следующие значения:
S: 0, 1 или 2;
Т: 0, 1 или 2;
U: 0 или 1;
V: 0 или 1;
Z: 0 или 1;
и их соли.
В частности к химическим соединениям по настоящему изобретению относятся соединения, имеющие формулу VIII
R1-X1-X2-X3-R2,
(VIII)
где
X1 равно 0 или является Ala, Gly, р-Ala, Tyr, D-Tyr, Asp, HAA;
X2 равно 0 или является Ala-Gly-T4c-Pro; Ala-Sar-Hyp-Pro; Ala-6-членный цикл-; Ala-Asn; D-Asn-DAla; D-Asn;
γ Abu; Gly, Ala; D-Ala; ; β− Ala; Pamh; Asn; или HAA;
Х3 является Tyr; D-Tyr; Gly, Pamb, или Phe; и
R1 является Н или Ас, при условии, что X1 и Х2 - не оба равны 0;
и их соли.
В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения формулы VII или VIII представляют
следующие специфические химические соединения (таблица 1) и их соли:
Таблица 1. Химические соединения по формулам VII и VIII.
Gly-Ala-(6-членный цикл)-Tyr,
Gly-Ala-Asn-Tyr,
D-Tyr-D-Asn-D-Ala-Gly,
D-Tyr-D-Asn-Gly,
Gly-γAbu-Tyr,
Gly-γAbu-D-Tyr,
Gly-Gly-Tyr,
Gly-Ala-Tyr,
D-Tyr-D-Ala-Gly,
Gly-D-Asn-Tyr,
Gly-βAla-Tyr,
βAla-βAla-Tyr,
Gly-γAbu-Tyr,
βAla-γAbu-Tyr,
βAla-γAbu-D-Tyr,
Gly-βAla-Phe,
Gly-Pamh-Tyr,
Gly-Pamh-D-Tyr,
D-Tyr-Pamh-Gly,
PAla-Pamh-Tyr,
- 34 -
007792
PAla-Pamh-D-Tyr,
Gly-Asn-Phe,
Gly-Ala-Gly-Pamb,
Asn-Tyr,
Ac-Gly-Tyr,
Ac-Ala-Tyr,
AC-HAA-Y,
HAA-NY,
HAA-GY,
AC-HAA-GY,
(восстановленныйGly)-Gly-Tyr(Н2N-СН2-СН2-NН-СН2-С(O)-Tyr),
Химическое соединение Gly-Ala-(6-членный цикл)-Tyr имеет следующую формулу:
Соли
Желательно, чтобы химические соединения по настоящему изобретению использовались в форме
фармацевтически приемлемой соли, сложного алкилового эфира, амида, алкиламида, диалкиламида или
гидразида, образованного функцией С-концевого участка карбоновый кислоты химического соединения
с нормальной цепью или свободной функцией карбоновой кислоты (если имеется) циклического химические соединения. Амиды и нижние алкиламиды соединений с нормальной цепью относятся к тем соединениям по настоящему изобретению, которым отдается предпочтение. Соли включают фармацевтически
приемлемые соли типа кислых солей и основных солей. Примерами кислых солей являются соли хлоргидрата, поваренные соли, соли кальция, калийные соли и т.д. Примерами основных солей являются соли, где катион выбирается из группы, в состав которой входят щелочные металлы типа натрия и калия,
щелочно-земельные металлы типа кальция, и ионы аммония +N(R3)3,R4), где R3 и R4 независимо друг от
друга являются произвольно замещаемым С1-6-алкилом, произвольно замещаемым С2-6-алкенилом, произвольно замещаемым арилом или произвольно замещаемым гетероарилом. Другими примерами фармацевтически приемлемых солей являются, например, соли, описанные в "Фармацевтических Науках Ремингтона" 17-е изд. Редактор Алфонсо Р. Дженнаро, Истон, США, 1985 г. ("Remington's Pharmaceutical
Sciences" 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985) и в более
поздних издания, и в Энциклопедии Фармацевтической Технологии.
Определения
На протяжении всего описания и формулы изобретения для обозначения природных аминокислот
используется трехбуквенный код, а также общепринятые трехбуквенные коды для других α-аминокислот, например саркозин (Sar), α-амино-изобутановая кислота (Aib), нафтилаланин (Nal), включая
1-нафтилаланин (INal) и 2-нафтилаланин (2Nal), фенилглицин Phg, 2,4-диаминобутановая кислота (Dab),
2,3-диаминопропановая кислота (Dapa), и гидроксипролин (Hyp). Там, где нет никаких указаний, Hyp
является 4-гидроксипролином. Природные или основные аминокислоты являются аминокислотами белков. Ароматические аминокислоты - Phe, Tyr, Trp, 1Nal, 2Nal и His. Там, где форма не указана (L или D),
следует понимать, что рассматриваемая аминокислота имеет природную форму L, см. "Фундаментальная
и прикладная химия" (Pure & Appl. Chem.), т. 56 (5) стр. 595-624 (1984 г.). Там, где нет указаний, следует
понимать, что аминокислота С-концевого участка химического соединения по настоящему изобретению
существует в виде свободной карбоновой кислоты, на что может также указывать "-ОН". Аминокислота
С-концевого участка химического соединения по настоящему изобретению может иметь функцию концевого участка "-OH/NH2", что означает, что есть две предпочтительные формы химического соединения: свободная карбоновая кислота и амидированное производное. Соединения гексапептида по настоящему изобретению, включающего последовательность Ala-Gly-Hyp и имеющего NН2-группу на Сконцевом участке, не содержат Phe или Tyr С-концевого участка или их производные с замещением галогена в фенильном кольце.
Под "функциональными аналогами" антиаритмических пептидов понимается любая химическая
структура или любое химическое соединение, которое имеет структурную конформацию и/или свойства
связывания, которые являются достаточно сходными со свойствами эндогенного ААР для обеспечения
одного или большего количества полезных антиаритмических или антитромбических свойств эндогенных ААР.
Термин "гетероарил" является общим для 5- или 6-членных ароматических моноциклических гетероциклических групп, включающих 1-4 гетероатома, которые выбираются из азота, кислорода и серы,
типа пирролила, фурила, пиразолила, имадазолила, оксазолила, изохазолила, тиазолила, изотиазолила,
- 35 -
007792
оксадиазолила, тиадиазолила, триазолила, пиридила и ароматических бициклических гетероциклических
групп, включающих 1-6 гетероатомов, которые выбираются из азота, кислорода и серы, типа хинолинила.
Термин "ретроаналог" означает пептид, последовательность которого обратна последовательности
названного пептида.
Термин "галоген" относится к F, Cl, Br и I, при этом предпочтение отдается F и I.
Термин "алкил" относится к одновалентным группам, полученным из алканов путем удаления атома водорода от любого атома углерода: CnH2n+1. Группы, полученные путем удаления атома водорода от
конечного атома углерода неразветвелнных алканов, образуют подкласс групп нормального алкила (nалкил): Н[СН2]n-. Группы RCH2-, R2CH-(R не равно Н) и R3C-(R не равно Н) являются первичными, вторичными и третичными алкильными группами соответственно. С(1-22)алкил относится к любой алкильной группе с числом атомов углерода от 1 до 22 и включает С(1-6)алкил, типа метила, этила, пропила,
изо-пропила, бутила, пентила и гексила, и все их возможные изомеры. Под термином "нижний алкил"
следует понимать С(1-6)алкил, предпочтительно С(1-4) алкил, еще лучше - метил и этил.
Термин "алкенил" относится к углеводородной группе, содержащей одну или большее число двойных углерод-углеродных связей, с неразветвленной, или разветвленной, или циклической цепью. С(2-22)
алкенил относится к любой алкенильной группе с числом атомов углерода от 1 до 22 и включает С(2-6)
алкенил, винил, аллил, 1-бутенил и т.д.
Термин "аралкил" относится к арил-С(1-22)алкилу, а под термином "арил" следует понимать фенил
или нафтил.
НРР означает гидроксифенилпропионил;
4НРР означает 3- (4 гидроксифенил)пропионил;
2HPP означает 3- (2 гидроксифенил)пропионил;
НАА означает гидроксиуксусную кислоту;
4НРРА означает 4-гидроксифеноксиуксусную кислоту;
2НРРА означает 2-гидроксифеноксиуксусную кислоту;
4НМРА означает 4-(гидроксиметил)феноксиуксусную кислоту;
4НРА означает 4-гидроксифенилуксусную кислоту;
3НРА означает 3-гидроксифенилуксусную кислоту;
2НРА означает 2-гидроксифенилуксусную кислоту;
4HBG означает N-(4-гидроксибензоил)аминоуксусную кислоту;
3HBG означает N-(3-гидроксибензоил)аминоуксусную кислот;
2HBG означает N-(2-гидроксибензоил)аминоуксусную кислоту;
4HPG означает N- (4 гидроксифенил)аминоуксусную кислоту;
Ас означает радикальный ацетил;
Рс или PC означает радикал L-пипеколиновой кислоты;
Tfa означает радикал трифторацетил;
Т4с означает радикал L-тиазолидин-4-карбоновой кислоты;
ASAL означает радикал 4-азидосалицилоила;
АВ означает радикал 4-азидобензоила;
HOBt означает 1-гидроксибензотриазол;
НОAt означает 1-гидрокси-7-азабензотриазол;
Асm означает радикал ацетамидометила;
Pd(PPh3)4 означает тетракис(трифенилфосфии)палладий(0);
DNP означает динитрофенил;
Pamh означает 4-амино-6-метилгептановую кислоту;
Pamb означает 4-аступкуилбензойную кислоту;
DBF означает 2-аминоэтил-6-дибензопропионовую кислоту;
"6-членный цикл " используется для 3-амино-1-карбоксиметилвалеролактама;
γΑbu означает гамма-аминомасляную кислоту.
Под выражением "аминокислотный остаток" следует понимать природную, а также неприродную
единичную аминокислоту, которая здесь обозначается с помощью общепризнанного трехбуквенного
кода, например аминокислота саркозин (Sar), альфа-Амино-изо-бутановая кислота (Aib), нафтилаланин
(Nal), включая 1-нафтилаланин (1Nal) и 2-нафтилаланин (2Nal), фенилглицин Phg, 2,4-диаминобутановая
кислота (Dab), 2,3-диаминопропановая кислота (Dapa) и гидроксипролин (Hyp), и бета-Ala для бетааланина. При этом там, где нет никаких указаний Hyp или 4Нур является 4-гидроксипролином. Природные или эфирные аминокислоты являются аминокислотными составляющими белков и могут обозначаться в виде общепризнанного трехбуквенного кода. Phe, Tyr, Trp, 1Nal, 2Nal и His являются ароматическими аминокислотами. Если не определена форма (L или D), то следует понимать, что рассматриваемая
аминокислота имеет природную форму L (см. "Фундаментальная и прикладная химия" (Pure & Appl.
Chem.), т. 56 (5) стр. 595-624 (1984 г.). Если нет никаких указаний, то следует понимать, что аминокислота С-концевого участка химического соединения по настоящему изобретению существует как свободная
- 36 -
007792
карбоновая кислота и может также обозначаться в виде "-ОН". Можно показать, что аминокислота
С-концевого участка химического соединения по настоящему изобретению выполняет функцию концевого участка "-OH/NH2", что означает, что есть две предпочтительные формы химического соединения:
свободная карбоновая кислота и амидированное производное. Следует понимать, что это определение
аминокислотных остатков включает такие химические соединения, как DBF, T4c, Pc, DNP и 3-амино-1карбоксиметилвалеролактам, который подобен аминокислоте. Функции DNP как гаптена для распознавания антител, и химических составов по настоящему изобретению, которые содержат участок DNP, желательно использовать в качестве инструментальных средства исследования.
Термин "псевдосимметричный пептид" относится как к пептидным химического соединениям, так
и к непептидным. Цель состоит в том, чтобы помимо создания псевдосимметричных пептидов создать
клеточные составы, которые могут заменить основу пептида. Предполагается, что вторичные амидные
связи в пептидах ответственны за неустойчивость и возможно плохие свойства пептида по транспортировке через клеточные мембраны. Соответствующее звено из боковых аминокислотных цепей с адекватными траекториями рассматривается как ключевая тактика проекта в псевдосимметричных пептидах,
обеспечивающая биологическую активность. Модификации основы включают восстановленные амидные связи и алкилированные амидные связи и использование изостерических связей типа тиоамидных
связей, СН2-СН2, СН=СН и т.д.
Термин "пептоид" относится к химическим соединениям, для которых характерно топологическое
подобие структурной формулы пептоида и материнского пептида. Таким образом, пептоид может быть
химическим соединением, состоящим из пептид-подобных аминокислотных цепей с боковыми цепями,
отходящими от базового атома азота, а не от алфа-углерода как в истинных псевдосимметричных пептидах и пептоиды могут содержать единичные аминокислоты с модифицированными боковыми цепями
типа Nal, Dab и Dapa, или они могут содержать D-аминокислоты. В работе авторов Эль-Таяр Н. и др. (El
Tayar, N.) (Аминокислоты (1995 г.) 8: 125-139) описаны различные модификации структуры пептида и
псевдосимметричного пептида.
Термины "химическое соединение, способствующее межклеточной коммуникации", "химическое
соединение, способствующее щелевому соединению", "химическое соединение, способствующее коммуникации по щелевому соединению" и "вещество, открывающее щелевые соединения" и т.д. относятся к
химическому соединению, которое способствует или обеспечивает МКЩС независимо от специфики
механизма, который обеспечивает, в конце концов, улучшенную или нормализованную МКЩС. В частности, термин "вещество, открывающее щелевые соединения" может относиться к веществу, которое
помимо стимуляции клетки, которая экспрессирует коннексины, обеспечивает повышенную проводимость канальца щелевого соединения, что, в свою очередь, приводит к повышенному обмену молекулами, которые могут проходить по щелевому соединению между внеклеточным и внутриклеточным пространствами и/или к улучшенной МКЩС.
Термин "агонист" относится к эндогенному веществу или лекарственному средству, которое может
взаимодействовать с рецептором и инициировать его ответную физиологическую или фармакологическую характеристику (сокращение, расслабление, секреция, активация фермента и т.д.). В зависимости
от определенного биологического механизма независимо от влияния химического соединения "антиаритмический агонист рецептора пептида" или "AAP-R агонист", как используется здесь, может или не
может быть эквивалентом "вещества, открывающего щелевые соединения".
Общие предпосылки по щелевому соединению
В многоклеточном организме координация между клетками имеет важное значение. Среди различных средств клеточного взаимодействия щелевые соединения обеспечивают самый прямой путь. Щелевые соединения являются одним типом соединительного комплекса, образованного между смежными
клетками и состоят из агрегированных канальцев, которые напрямую связывают внутренние объемы
(цитоплазму) соседних клеток. Щелевые соединения найдены в большинстве типов клеток взрослого
млекопитающего за исключением только элементов циркуляции крови.
Структурной единицей канальца щелевого соединения является коннексон или полуканальцев. Каждый коннексон состоит из шести полипептидов коннексина (Сх), которые олигомеризируют с образованием поры с водой, которая перекрывает единственную плазматическую мембрану. С целью образования завершенного канальца щелевого соединения два коннексона смежных клеток совмещаются и стыкуются друг с другом с образованием непрерывного канальца, связывающего цитоплазму этих двух клеток.
Коннексины, образующие каналец щелевого соединения, включают многогенное семейство по
крайней мере с четырнадцатью коннексинами млекопитающего, обнаруженными к настоящему времени.
Экспрессия коннексина является специфичной по отношению к ткани и клетке, при этом некоторые
клетки экспрессируют множественные изоформы коннексина. На основе экспериментальных данных
предполагается, что возможны две различные гибридные конфигурации: гетеротипические межклеточные канальцы, в которых каждый коннексон или полуканалец состоит из специфичной изоформы коннексина; или гетерометрические канальцы, где каждый коннексон является смесью различных изоформ
- 37 -
007792
коннексина, экспрессированных в специфическом типе клетки. Коннексины экспрессируют специфически по отношению к клетке, ткани и развитию.
О структуре гена коннексина известно сравнительно мало. Результаты, представленные для Сх43
мыши, показали, что Сх43 содержит два экзона и интрон, расположенные в нетранслированной области
5'. Дальнейший анализ показал, что транскрипция Сх43 начинается в стартовой точке как в тканях эмбриона, так и взрослого человека. В проксимальном промоторе 5' были идентифицированы несколько
предполагаемых сайтов связывания факторов транскрипции. In vitro исследование показало, что проницаемые канальцы могут быть получены из полуканальцев, состоящих из различных пар коннексинов.
Например, из Сх43 можно получить функциональные канальцы с Сх32, Сх37 и эндогенным Сх овоцитов
(Сх38), но не с Сх26 овоцитов. Однако очень мало известно об их свойствах, а также о регуляции проницаемости этих гетероканальцев. Сх экспрессированы в огромном большинстве тканей, и одиночные
клетки способны экспрессировать несколько различных Сх. Проницаемые щелевые соединения могут
образовываться между клетками, которые экспрессируют различные типы Сх. Таким образом, межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС) в тканях, очевидно, является очень важной для
сохранения целостности ткани. Очевидно, что несколько генов создают эквивалентные продукты для
предотвращения потери МКЩС вследствие мутации в одном гене.
Как отмечалось, диаметр поры канальца щелевого соединения составляет от 0,8 до 1,4 нм. Щелевые
соединения относительно не избирательны и позволяют проходить молекулам массой приблизительно до
1000 Да. Такими веществами являются, например, ионы, вода, сахара, нуклеотиды, аминокислоты, жирные кислоты, пептиды малой массы, лекарства и канцерогенные вещества. Для прохода канальца АТФ не
требуется и проход осуществляется за счет пассивной диффузии. Этот поток материалов между клетками
через канальцы щелевых соединений известен как межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС), которая играет важную роль в регуляции метаболизма клетки, пролиферации и межклеточной передаче сигналов. С точки зрения физиологии для МКЩС очень важно, чтобы клетки ткани,
купированные с помощью щелевых соединений, были бы не отдельными дискретными объектами, а были бы объединены со своими соседями. Это свойство способствует гомеостазу и обеспечивает также быструю, прямую передачу вторичных мессенджеров между клетками для координации клеточных реакций
внутри ткани.
Процесс МКЩС регулируется рядом механизмов, которые могут подразделяться на две основные
категории. При одном типе регуляции количество клеток щелевых соединений регулируется путем влияния на экспрессию, деградацию, клеточный перенос коннексинов к плазматической мембране, или на
сборку коннексинов в функциональные щелевые соединения. Ухудшенная МКЩС, вызванная понижением регуляции экспрессии коннексина, например, в клетках опухоли, является примером этого способа
регуляции. Другой тип регуляции вообще не включает никакого изменения клеточных уровней щелевых
соединений или коннексинов, но вызывает отпирание или запирание (регуляция запирания канальцев)
существующих щелевых соединений. К этому типу регуляции могут привести внеклеточные растворимые факторы, типа митогенов (например, ДДТ), гормонов (например, катехоламины), обезболивающих
средств (например, галотан), внутриклеточных биомолекул (например, цАМФ), и стресс клетки (например, механический или метаболический стресс). Кроме того, МКЩС регулируется в процессе клеточного
цикла и во время миграции клетки.
Для щелевых соединений, особенно для щелевых соединений, состоящих из Сх43 изучался способ
регуляции МКЩС или регуляция запирания канальцев соединений. Некоторые факторы оказывают свое
ингибирующее влияние на МКЩС косвенно, например, путем изменения среды липида и текучести клеточной мембраны, при этом другие ингибиторы МКЩС включают онкогены, факторы роста и промоторы опухоли, которые вызывают различные модификации Сх43. Для стимуляции определенных биологических функций последней группы может быть необходимо разрушение проницаемости щелевых соединений. Эти агенты инициируют сложные сигнальные пути, включающие активацию киназ, фосфатаз и
взаимодействие белков. Понимание механизмов действия модуляторов МКЩС не только позволит определить их соответствующие сигнальные пути, ответственные за регуляцию щелевых соединений, но
также предоставит инструментальные средства эксперимента для получения характеристик биологических функций МКЩС и коннексинов.
Изменения цитоплазматического домена карбоксиконцевого участка Сх43 при фосфорилировании
специфических сайтов оказываются кардинальными для открытия и закрытия щелевого канальца. Фосфорилирование домена карбоксиконцевого участка также может быть важным для процесса переноса
полукомплекса щелевого канальца Сх43 к клеточной мембране, интернализации и деградации. Периоды
полураспада коннексинов (часы) намного короче периодов полураспада большинства белков плазматических мембран (сутки), например период полураспада Сх43 сердца крысы меньше 1,5 ч. Таким образом,
регулирование интенсивности метаболизма было бы важным фактором в регуляции МКЩС.
Домен карбоксиконцевого участка содержит предположительно сайты фосфорилирования многочисленных протеинкиназ (РКА, РКС, PKG, МАРК, CaMkII и тирозинкиназа). Фосфорилирование этих
сайтов домена карбоксиконцевого участка приводит к смыканию канальцев щелевого соединения, и различные ингибиторы Сх43 канальцев щелевого соединения используют различные сигнальные пути, что- 38 -
007792
бы вызвать фосфорилирование домена карбоксиконцевого участка. По типу клетки и специфичности
ингибитора определяют, какие сигнальные пути должны использоваться, а тип включенной протеинкиназы указывает на используемую внутриклеточную систему мессенджера. Таким образом, для активации
РКА требуется участие системы вторичного мессенджера цАМФ, в то время как для РКС требуется участие внутриклеточной сигнальной системы фосфоинозитола.
Другие механизмы, регулирующие запирание канальцев, включают внутриклеточные уровни водорода и ионов кальция, транссоединительное напряжение и свободные радикалы. Пониженный уровень
рН или рСа вызывает закрытие канальца специфическим для клетки и коннексина образом.
Помимо регуляции роста МКЩС выполняет и другие многочисленные физиологические функции.
Гомеостаз: МКЩС обеспечивает быстрое приведение в равновесие питательных веществ, ионов и
жидкости между клетками. Это могло бы быть самой древней, широко распространенной и важной
функцией для этих канальцев.
Электрическое купирование: щелевые соединения служат электрическими синапсами в электрически возбудимых клетках типа кардиомиоцит, клеток гладкой мускулатуры и нейронов. В этих тканях
электрическое купирование обеспечивает более быструю межклеточную передачу потенциалов действия, чем химические синапсы. Это обеспеивает их синхронное сокращение кардиомиоцитов и клеток
гладкой мускулатуры.
Реакция ткани на гормоны: МКЩС может усилить чувствительность тканей к внешним стимулам.
Вторичные мессенджеры типа циклических нуклеотидов, кальция и фосфатов инозитола достаточно малы, чтобы пройти от гормонально активизированных клеток до статических клеток через канальцы щелевых соединений и активизировать их. Такой эффект может усилить реакцию ткани на агониста.
Регуляция зародышевого развития: щелевые соединения могут служить межклеточными проводящими путями для химиката и/или электрических сигналов развития в эмбрионах и для определения границ групп развития. МКЩС в зародышевых клетках осуществляется определенными способами, и
ухудшение МКЩС вызывает аномалии развития и тератогенные эффекты многих химических веществ.
Межклеточная коммуникация обеспечивает координацию функционирования отдельных клеток и
интегрирует это функционирование в динамику рабочей ткани, обслуживающей организм, в котором она
установлена. Поэтому нет ничего удивительного в том, что многие самые разнообразные патологические
состояния были связаны с ухудшением МКЩС.
Фармакология
Кардиальные показания
Как подчеркивалось в предпосылках разработки настоящего изобретения, имеется много данных,
которые говорят о важной роли МКЩС в кардиомиоцитах в нормальных и патологических состояниях.
Ниже рассмотрены специфические кардиальные состояния, связанные с ухудшенной МКЩС, a in vitro и
in vivo данные представлены, чтобы продемонстрировать, что химические соединения, которые усиливают МКЩС в тканях сердца, применяются для профилактики и/или лечения ряда патологических состояний сердца.
Аритмии, вызванные циркуляцией возбуждения
Аритмии сердца вызваны либо патологией в инициировании импульса, либо патологией в проведении импульса. Среди аритмий с патологией в проведении импульса самыми серьезными являются аритмии, вызванные механизмом циркуляции возбуждения.
Циркуляция возбуждения в желудочке
Циркуляция возбуждения является основной причиной стойкой фибрилляции желудочка и смерти
от внезапной остановки сердца. Циркуляция возбуждения происходит, если распространяющийся импульс не затухает после полной активации сердца, но сохраняется, чтобы повторно возбудить сердце
после окончания рефрактерного периода. Индуцирование циркуляции возбуждения упрощается ввиду
замедленной проводимости, повышенной дисперсии реполяризации, неоднородной анизотропии и однонаправленной блокады проводимости. Основной болезнью, ответственной за большинство случаев циркуляции возбуждения в желудочке, является ишемический порок сердца (например, острый инфаркт
миокарда, хронический инфаркт миокарда, устойчивая стенокардия и неустойчивая стенокардия). Во
время острой ишемии канальцы щелевого соединения закрываются, что приводит к рассоединению соседних клеток. Гетерогенные изменения в ионном канальце и изменения функции щелевого соединения
приводят к увеличенной дисперсии продолжительности действия потенциала и эффективного рефрактерного периода особенно в зоне границы, разделяющей область ишемии и нормального миокарда. Как
известно увеличенная дисперсия продолжительности действия потенциала способствует индукции фибрилляции желудочка[23]. Обычно в хорошо соединенных клетках различие в продолжительности действия потенциала сглажено вследствие электрического купирования. Однако рассоединение предотвращает это сглаживание и вносит вклад в обнаружение дисперсии продолжительности действия потенциала и
рефрактерного периода[24]. Если ишемия носит продолжительный характер, то можно наблюдать снижение степени экспрессии Сх43 и измененную структуру распределения. Закрытие канальцев щелевого
соединения во время острой ишемии, а также изменения экспрессии и структуры распределения при
хронической ишемии может приводить к замедленной проводимости, увеличенной дисперсии, неодно- 39 -
007792
родной анизотропии и однонаправленной блокаде проводимости, и таким образом стимулировать аритмии, вызванные циркуляцией возбуждения. Таким образом, экспериментальное исследование показало
корреляцию между сайтом измененной экспрессии коннексина и распределения, и местоположением
контура тахикардии в желудочке при циркуляции возбуждения[25]. Состояния, которые благотворно
влияют на развитие циркуляции возбуждения, то есть обеспечивают развитие медленной проводимости,
увеличенной дисперсии реполяризации, неоднородной анизотропии и однонаправленной блокады проводимости характерны в разной степени для большого количества других сердечных болезней. Таким
образом, при инфекционной или автономной кардиомиопатии воспаление, которое происходит, может
приводить к депонированию волокнистой ткани в миокарде, создавая, таким образом, очаги медленной
проводимости, увеличенной дисперсии и возможно однонаправленной блокады проводимости. Гипертрофическая кардиомиопатия (например, вследствие артериальной гипертензии, аортального стеноза,
врожденных болезней) может приводить к аритмиям, вызываемым циркуляцией возбуждения, вследствие несоответствий между большим количеством миокардиальной ткани и относительно малым количеством проводящей ткани, что может приводить к замедленной проводимости, увеличенной дисперсии и
однонаправленной блокаде проводимости. Врожденные болезни (например, продолжительный QT синдром) и препараты, которые продлевают QT-интервал (например, антиаритмические препараты, антипсихотические препараты, антигистамины, противобактериальные препараты и т.д.) также увеличивают
дисперсию продолжительности действия потенциала возможно вследствие гетерогенности распределения ионных канальцев по различным слоям миокарда и являются основной причиной внезапной смерти
молодых пациентов[26], вызванной циркуляцией возбуждения.
Циркуляция возбуждения в предсердии
Фибрилляция предсердия - самая общая сердечная аритмия - также бывает вызвана механизмом
циркуляции возбуждения. В этом случае через предсердие проходят многократные небольшие волны и
повторно возбуждают ткань, которая больше не является рефрактерной. Фибрилляция предсердия может
сохраняться годами и, в конечном счете, приводить к коррекции предсердий. Важной частью процесса
коррекции являются изменения в распределении щелевых соединений. Таким образом, структура распределения Сх40 становится все более и более гетерогенной.
Продолжительность изменений в распределении и содержании щелевых соединений
Сх40 коррелирует с увеличением стабильности и сложности фибрилляции предсердия и предполагает, что коррекция щелевого соединения Сх40 могла бы включиться в патогенез длительно сохраняющейся фибрилляции предсердия[27]. Кроме того, несколько линий доказательств поддерживают мнение о
том, что во время состояний, связанных с замедленной проводимостью или проводимостью предсердий,
чувствительность к фибрилляции предсердия повышается.
Альтернанс реполяризации
Проявление альтернанса электрокардиографической Т-волны с повышенной частотой сердечных
сокращений или метаболическим инсультом наблюдалось почти в течение столетия. Макроскопический
альтернанс Т-волны часто отмечается как предвестник внезапной смерти от аритмии. В недавней работе
предложен общий механизм, который может связать наличие несогласованного альтернанса реполяризации с инициацией разнообразных аритмий, вызванных циркуляцией возбуждения, в зависимости от анатомии основы[28]. При хронотропном или метаболическом напряжении фаза реполяризации потенциала
действия миокарда приводит к альтернации в морфологии и продолжительности. При дополнительном
напряжении или при наличии структурных барьеров альтернанс реполяризации становится пространственно несогласованным. Несогласованный альтернанс приводит к достаточно большим градиентам реполяризации с получением однонаправленной блокады и циркуляции возбуждения. При отсутствии
структурного барьера циркуляция возбуждения функциональна и проявляется как фибрилляция желудочка или полиморфная тахикардия желудочка. При установке структурного барьера циркуляция возбуждения может закрепиться анатомически, что приводит к мономорфной тахикардии желудочка[29].
Короче говоря, очевидно, что вещество типа химического соединения по настоящему изобретению,
которое увеличивает проводимость щелевого соединения и делает анизотропию более однородной, предотвращает однонаправленную блокаду и аритмии, вызванные циркуляцией возбуждения. Такое вещество будет полезно для пациентов с контурами циркуляции возбуждения как предсердного, так и желудочкового происхождения. Пациенты с альтернантом Т-волны склонны к аритмиям, вызванным циркуляцией возбуждения, и вещество, которое усиливает купирование с помощью щелевого соединения и уменьшает анизотропию, может быть полезно при профилактике летальных исходов в результате желудочковых аритмий у этих пациентов.
Брадиаритмии
Брадиаритмии могут быть вызваны замедленной проводимостью или блокадой проводимости синоаурикулярного узла, предсердно-желудочкового узла, предсердно-желудочкового пучка или правого
или левого ответвления пучка. Основным коннексином, ответственным за проводимость по всей проводящей системе, является Сх40. Гомозиготные мыши с удаленным геном Сх40 имеют значительно более
медленную желудочковую, предсердно-желудочковую проводимость и проводимость Гис-Пуркинье и
- 40 -
007792
подвержены повышенному риску аритмий и блокировки ответвления пучка[4-6]. Таким образом, для поддержания нормального ритма очень важно нормальное функционирование щелевого соединения Сх40.
Вещество, типа химического соединения по настоящему изобретению, которое увеличивает проводимость щелевого соединения, полезно при профилактике и/или лечении замедленной проводимости в
сердце.
Пониженная сокращаемость
Пониженная сокращаемость является общей особенностью многих хронических сердечных болезней. При наихудшем сценарии течения болезни (то есть, сердечная недостаточность на конечной стадии),
сокращаемость понижается до такой точки, в которой фракция выброса настолько низка, что базальные
потребности для перфузии органа больше не могут поддерживаться. Как показывают экспериментальные
данные, а также данные клинических исследований, экспрессия и распределение коннексинов в сердце
пациентов с конечной стадией сердечной недостаточности меняются. Таким образом, регуляция Сх43 в
значительной степени понижена с крайне неравномерным распределением в патологической ткани. Экспрессия Сх45, которая при нормальных условиях очень ограничена, при сердечных недостаточностях
значительно увеличивается; однако, свойства проводимости Сх45 хуже свойств проводимости Сх43 и
поэтому уменьшение количества Сх43 компенсировать нельзя. Как показывают последние данные, некоторые регулирующие ионные канальцы и рецепторы сконцентрированы на сайтах межклеточного соединения, и поэтому очень вероятно, что изменения экспрессии и распределения Сх43 могут повлиять на
связь между сокращением и возбуждением и таким образом на сокращаемость[30]. Сильным свидетельством связи между функцией щелевого соединения и сокращаемостью является тот факт, что у химерных
мышей, которые получены из стволовых зародышевых клеток с нулевыми Сх43, и бластоцистов дикого
вида с экспрессией гетерогенных потерь Сх43 развиваются тяжелые дефекты сокращения.
Мы предполагаем, что вещество, которое увеличивает проводимость щелевого соединения, улучшает межклеточную коммуникацию медиаторов, вовлеченных в связь между сокращением и возбуждением, и таким образом улучшает сокращаемость.
Экспериментальный пример 1.
Влияние химического соединения 2 на МКЩС в кардиомиоцитах
Клеточный препарат: клетки выделялись из сердец морских свинок путем перфузии с использованием коллагеназы согласно способу Лангендорфа. Короче говоря, морские свинки были гепаринизированы интраперитонеальной инъекцией гепарина (1000 Межд. ед./кг). Спустя 30 мин животных умерщвляли ударом по шее, после чего в области шеи разрезался позвоночный столб. Вскрывалась грудная
клетка и в аорту вставлялась канюля. Затем с помощью лигатуры канюля крепилась на аорте и в течение
пары минут выполнялась перфузия с использованием раствора Тиродеса. Состав раствора Тиродеса в
мМ: Na+ - 135,33, K+ - 4, Сl+ - 145, РO4- - 0,33, Mg2+ - 1, Са2+ - 2, раствор Hepes - 10, глюкоза - 10, при
уровне рН 7,4. Через всю среду перфузии пропускался 100%-й кислород. После этого сердце подвергалось перфузии в течение двух минут с использованием раствора Тиродеса без Са2+, после чего в течение
двух минут выполнялась перфузия с использованием раствора с высоким содержанием К+, в состав которого входил, мМ: Na+ - 20, K+ - 120, Сl- - 22, глутамат - 120, Mg2+ -1, Са2+ - 25 мкМ, раствор Hepes -10,
глюкоза - 10, при уровне рН 7,4. Затем сердце подвергалось перфузии с использованием раствора с высоким содержанием K+ с концентрацией коллагеназы 0,6 мг/мл, это выполнялось в течение 10-15 мин.
Предсердия удалялись, желудочки рубились на части, после чего эти части размешивались в растворе
коллагеназы путем пропускания через этот раствор 100%-го кислорода. Затем для отделения освободившихся клеток они пропускались через сито, а коллагеназа удалялась центрифугированием. Затем клетки
повторно суспендировались в растворе Тиродеса без Са2+, а содержание Са2+ постепенно увеличивались
до 0,65 мМ. Клетки хранились в этом растворе при комнатной температуре до отправки в экспериментальную камеру.
Электрофизиология: Покровные стекла устанавливались в открытой камере на столе инвертационного микроскопа, где клетки сливались с забуференным фосфатным соляным раствором Далбека (PBS)
со скоростью 1 мл/мин при 37°С. Раствор содержит, мМ: Na+ -152, K+ - 4,2, Сl- - 141,5, РO43- - 9,5, Са2+ 0,9, Mg2+ - 0,5 при уровне рН 7,2. Пипетки для пэтч-клампа вытягивались из стеклянных капилляров
диаметром 1,5 мм (GC150F-15, прибор Гарварда) на съемнике микроэлектрода Sutter Flaming-Brown P-87
и полировались огнем до сопротивления 4-6 МОм. Пипетки заполнялись раствором, напоминающим
внутриклеточный, с содержанием, мМ: K+ - 145, Na+ - 15, Сl- - 5, глюконата - 153, пирувата - 5, ЭДТК - 1,
раствора Hepes - 5, Са2+ - 0,42 мМ, Mg2+ - 1,6 при уровне рН 7,2. В этот раствор из основного раствора
концентрацией 60 мг/мл (растворитель: диметилсульфоксид) вводился амфотерицин В (240 мкм/мл).
Установка для пэтч-кламп состоит из двух синхронизированных дискретных усилителей (электроника SEC-05LX, NPI) и данные переводятся в цифровую форму с использованием интерфейса INT-10
(электроника NPI) и панели сбора данных РС1200 (National Instruments). Как сигналы тока, так и напряжения фильтруются при 1 кГц с использованием внутренних фильтров усилителей и переводятся в цифровую форму при 10 кГц.
Одна клетка пары приближается к электроду с помощью микроманипулятора Пэтчмэн (PatchMan)
5173 (Эппендорф (Эппендорф (Eppendorf))). При контакте с клеткой (наблюдается в виде внезапного по- 41 -
007792
вышения входного сопротивления) применяется всасывание, пока не установится конфигурация Giga
seal. Затем эта процедура повторяется на другой клетке. Затем мембрана под пипетками разрывается при
кратком всасывании, и потенциал внутреннего объема клетки фиксируется на уровне -70 мВ, что близко
к спонтанному потенциалу мембраны клеток. В течение каждых 10 с каждая из клеток последовательно
гиперполяризуется на 10 мВ в течение 1 с, и конечное изменение тока в другой клетке может использоваться для расчета межклеточной проводимости (Gj) по формуле
где Ip.pulse и Ip.rest представляют ток в пассивной клетке во время импульса и после импульса соответственно, a Up и Ua - напряжения в пассивной и активной клетке. Этот вид экспериментов не позволяет проводить сравнения абсолютных значений Gj ввиду различий в межклеточном контакте и поэтому в количестве функциональных канальцев щелевого соединения. Однако изменение значения Gj в результате стандартного вмешательства, вызванного, например, лекарственным средством, может быть проанализировано путем сравнения относительных изменений значения Gj.
Результаты: на фиг. 2 показаны результаты девяти успешных экспериментов. На этой фигуре относительные значения Gj показаны как функция времени до и во время стимуляции Химическим соединением 2 (10-8 М). Во всех пяти экспериментах, где клетки обрабатывались Химическим соединением 2,
обеспечивалось значительное увеличение значения Gj, которое достигало стационарного уровня приблизительно после 400 с стимуляции (AGj = +120 ± 46%). Проводимость не изменялась у всех четырех препаратов, обработанных носителем (AGj = -3 ± 5%).
Эти результаты хорошо согласуются с экспериментами, о которых сообщалось в литературе, с использованием синтетического ААР - аналога ААР10, что говорит об усиленном электрическом купировании кардиомиоцитов после стимуляции[32]. Однако в исследовании Мюллера[32] проводимость щелевого соединения в условиях контроля не была стабильна. Таким образом, в трех из шести экспериментах
применение ААР10 не приводило к увеличению проводимости, но предотвращало падение проводимости щелевого соединения, и в двух из шести экспериментах проводимость щелевого соединения фактически увеличивалась во время контроля. В представленных здесь экспериментах применение химического соединения 2 приводило к повышению проводимости щелевого соединения в препаратах с устойчивыми условиями контроля.
Экспериментальный пример 2.
Связывание химического соединения 2 с препаратами из ткани мышиного сердца.
Препарат
Сердца мышей иссекались (Balb/cJ, 20 г), дважды ополаскивались в 0,32 М сахарозы на льду (0°С) и
гомогенизировались на льду в 10 объемах сахарозы в гомогенизаторе ультра Турракс (1000 об./мин) в
течение 2 мин. Гомогенизированный состав центрифугировался при 1000 gсредн в течение 10 мин при 4°С,
и супернатант собирался и фильтровался через 4 слоя марли. Затем фильтрат центрифугировался при
50000 gсредн в течение 45 мин при 4°С и капля осадка повторно суспендировалась в 10 объемах влажной
органической фазы ледяной дистиллированной воды и выдерживалась в течение 60 мин при 0 °С, а затем
повторно центрифугировалась при 50000 gсредн в течение 45 мин при 4°С. Полученная таким образом капля осадка повторно суспендировалась в 2 объемах влажной органической фазы PBS (забуференный
фосфатный соляной раствор) и хранилась при - 80°С до использования.
Эксперименты по замещению с использованием химического соединения 240-250 мкг фильтрата
или мембранного материала выдерживалось в растворе D-PBS (забуференный фосфатный соляной раствор Далбека, содержащий 1 г/л MgCl2·6H2O и СаС12) общим объемом 100 мкл с содержанием 0,8 нМ
[125I]ААР10 при возрастающей концентрации испытуемых соединений ААР и химического соединения 2.
При 10 мкМ ААР10 (СЕ-2) наблюдалось неспецифическое связывание.
Расчеты
Данные экспериментов по замещению сведены в уравнение
f = (Total - ns)/(l + s/IC50) + ns,
где Total - общая связанная радиоактивность при концентрации s меченого лиганда, ns неспецифическое связывание, а IС50 - концентрация испытуемого соединения, понижающего специфическое связывание (Total - ns) до 50 % максимального специфического связывания.
Результаты
Таблица 2. Замещение 0,8 нМ [125I]ААР10 из препаратов из ткани мышиных сердец
- 42 -
007792
Значения, представленные в табл. 2, имеют тот же порядок величины (0,2 нМ), что и значения,
представленные для ААР10 авторами Деин (Dhein) и др. [33] при использовании мембран сердец кроликов.
Способ связывания на месте на интактных клетках
Клеточные культуры СНО
СНО клетки высевались в 24-луночные планшеты при плотности 7900 клеток/см2 (~ 15000 клеток
на лунку) и выращивались в течение 3 дней in vitro в 1 мл на лунку питательной смеси F-12К с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки теленка (FCS) и 1000 единиц пенициллина/1000 мкг стрептомицина (пен./стреп.) в атмосфере 5%-ной СO2 и при 100%-ной влажности и при 37°С. Затем плотность
клеток увеличилась до 295000 клеток/см2 (152 пгprot/клетка ~ 85 мкгptor/лунка).
Предварительная обработка
В день анализа клетки извлекались из термостата, и каждая лунка промывалась дважды 2 мл раствора D-PBS, который, в зависимости от эксперимента, либо предварительно нагревался (до 37°С), либо
охлаждался льдом (до 0°С) с целью удаления сыворотки. Важно, чтобы время, в течение которого клетки
оставляют без физиологических растворов, было сведено к минимуму, что позволяет избежать их высыхания во время процедуры промывки. Клетки, промытые холодным раствором, использовались непосредственно для реакции связывания, в то время как клетки, промытые теплым раствором, использовались в экспериментах по исследованию влияния недостатка глюкозы и гипоксии.
Недостаток глюкозы и гипоксия
Клетки выдерживалось в течение 10 мин в атмосфере N2 в растворе D-PBS без глюкозы, (рН 7,2)
предварительно сбалансированном по N2 в течение не менее 10 мин при 37°С. Клетки контрольной группы выдерживались также в течение 10 мин при 37°С только в нормальных атмосферных условиях и в
растворе D-PBS, содержащем глюкозу (6 мМ).
Реакция связывания
Связывание на месте выполняется путем изменения протокола на основе описания Коенига
(Koenig)[34]. Из клеточной культуры удаляется раствор D-PBS и вводится 0,50 мл раствора [125I]AAP10 с
немеченым лигандом или без него, или вводится испытуемый состав. Клетки выдерживаются в течение
ночи при 4°С, что обеспечивает сбалансированность раствора. Затем каждая лунка по очереди быстро
ополаскивается раствором 2x1 мл D-PBS и оставляется сохнуть.
Раствор Тритон-Х-100 объемом 0,25 мл, объемной концентрацией 0,5% вводится в каждую лунку и
клетки оставляются по крайней мере на 1 ч до растворения. Экстракт переливается в счетные ампулы,
лунки ополаскиваются водой (0,25 мл) и промытый экстракт переливается в соответствующие ампулы.
Ампулы считаются в счетчике гамма-квантов.
Таблица 3. Связывание на месте, IС50 (нМ)
Эти результаты демонстрируют высокое аффинное связывание с клетками СНО с помощью нескольких различных веществ по настоящему изобретению в сравнении с пептидами, применяемыми ранее.
Экспериментальный пример 3.
Влияния химического соединения 2 на формировании цАМФ в клетках СНО
Клеточные культуры СНО
СНО клетки высевались в 96-луночные планшеты при плотности 6000 клеток/см2 (~ 2000 клеток на
лунку) и выращивались в течение 4 дней in vitro в среде для выращивания концентрацией 200 мкл на
лунку как описано в предыдущем разделе.
Предварительная обработка
В день анализа клетки извлекались из термостата и промывались дважды 200 мкл предварительно
нагретого (до 37°С) раствора D-PBS (рН 7,2) с целью удаления сыворотки. Клетки выдерживались в течение 10 мин в растворе D-PBS, который не содержал глюкозы и в атмосфере N2, как описано в предыдущем разделе.
Анализ на эффективность цАМФ
СНО клетки выдерживалось при 37°С в растворе D-PBS (рН 7,2), содержащем 6 мМ глюкозы, 2,0
мМ IBМХ (блокатор фосфодиэстераз), 10 мкМ форсколина (стимулирует образование цАМФ) и увеличивающуюся концентрацию испытуемого пептида. Реакция останавливалась через 20 мин путем введения 20 мкл 0,5 М НСl и раствор оставался в течение по крайней мере 20 мин при комнатной температуре.
- 43 -
007792
Содержание цАМФ анализировалось путем подмешивания 20 мкл кислого экстракта из клетки в
лунки ФлэшПлэйт (FlashPlate™) (комплект пробирного анализа NEN SMP001), содержащие 180 мкл раствора индикатора [125I]цАМФ. ФлэшПлэйт выдерживались в течение ночи при 4°С и связанная радиоактивность пластины рассчитывалась в TopCount (Прибор Пакард). Данные рассчитаны, как описано в
предыдущем разделе.
Результаты
Ингибирование форсколин-стимулируемого образования цАМФ ААР-подобных соединений в
клетке СНО указывает на то, что ААР рецепторы отрицательно соединены с системой второго мессенджера цАМФ. Кроме того, это демонстрирует наличие функциональных ААР рецепторов в клетках СНО.
Таблица 4. Ингибирование форсколин-стимулируемого образования цАМФ в клетке СНО
Экспериментальный пример 4.
Анализ фосфоинозитола в первичных кардиомиоцитах крысы
Культура первичного кардиомиоцита
Используются новорожденные крысы Wistar (1-2 дня). Бескальциевый и безмагниевый сбалансированный солевой раствор Хэнка, буферизированный с помощью 10 мМ раствора Hepes, используется для
промывки во время процедуры разделения клеток. Сердца рассекаются, выделяются желудочки и ткань
рассекается на малые части. Миокардиальные клетки выделяются пошаговым ферментативным расщеплением с концентрацией коллагеназы 0,05%, как описано в работе[35]. После повторов центрифугирования и промывки, осажденные клетки повторно суспендировались в культуральной среде M199 с солью
Эрла, 10% NCS, пенициллином (75 ед./мл), и стрептомицином (75 ед./мл) и перед посевом в планшеты
высевались в чашке Петри на 90 мин. Неприкрепленные клетки собирались в культуральной среде и высевались в многочисленные планшеты с плотностью в 2,5-105 клеток на лунку. Культуры хранятся в водонасыщенном СO2-термостате при 37°С. Спустя 6-7 дней культуры кардиомиоцита используются для
анализа.
Анализ метаболизма фосфоинозитола
Для того, чтобы пометить инозитолфосфолипиды культуры кардиомиоцита выдерживались в течение 48 ч в культуральной среде, содержащей 4 мкКи/мл мио[2-3Н]инозитола. В день анализа культуральная среда заменялась буферным раствором, содержащим литий, и выдерживалась при 37°С, как описано
у авторов Мейера (Meier) и других[36]. Не менее чем через пять минут этот буферный раствор заменялся
буферным раствором того же объема, содержащим испытуемый состав и культуры выдерживались в нем
точно в течение 20 мин. Реакция прекращалась путем быстрой замены буферного раствора на хлорную
кислоту (РСА) объемной концентрацией 4% с температурой таяния льда, и культура выдерживалась в
течение не менее 20 мин при 0°С. Экстракт РСА нейтрализовался и [3Н]инозитолфосфаты отделялись с
помощью анионнообменной хроматографии с использованием колонок Ампреп (Amprep™), содержащих
100 мг четверичного амина SAX. [3Н]инозитолмонофосфаты элюировались и радиоактивность во фракции измерялась жидкостным сцинтилляционным счетчиком.
Недостаток глюкозы и гипоксия
Перед введением испытуемых веществ в культуры, клетки обеднялись по глюкозе и кислороду путем их выдержки в N2-атмосфере в литиевом буферном растворе без глюкозы в течение 10 мин при 37°С.
Контрольные клетки выдерживалось точно также только в нормальных атмосферных условиях и в буферном растворе, содержащем глюкозу.
Норадреналин (NA) стимулирует метаболизм фосфоинозитола в культурах кардиомиоцита в зависимости от концентрации. Однако способность норадреналина (300 нМ NA) стимулировать метаболизм
фосфоинозитола в культурах значительно снижается спустя 10 мин после снижения содержания глюкозы
и кислорода, как показано на фиг. 3.
При нормальных атмосферных условиях и условиях питания мы получили значение Еmax, равное
3852 ± 266 импульсов в минуту и значение ЕС50, равное 203 нМ (SDR = 1,2), тогда как в клетках, находящихся в атмосфере N2 и обедненных по глюкозе, значение Еmax равнялось 2248 ± 702 импульсов в минуту, а значение ЕС50, равнялось 303 нМ (SDR = 1,7).
Для исследования влияния веществ по настоящему изобретению на вызванное аттенуированным
норадреналином повышение метаболизма фосфоинозитола во время напряжения в клетке, вызванное
ишемией и глюкозным голоданием, в культуры кардиомиоцита вводилось химическое соединение 2 или
ААР10 (СЕ-2). Оба вещества очень сильно усиливали метаболизм фосфоинозитола, при этом Химическое соединение 2 оказалось самым сильным. Как показано в табл. 5, значение ЕС50 для случая с ААР10
(СЕ-2) было в 200 раз больше во время нормальных условий и в 10 раз больше во время метаболического
- 44 -
007792
напряжения, вызванного гипоксией и снижением содержания глюкозы, чем значение ЕС50 для случая с
химическим соединением 2.
Таблица 5. Повышение метаболизма фосфоинозитола во время метаболического напряжения, вызванного гипоксией и глюкозным голоданием, с помощью химического соединения 2 и ААР10
Введение химического соединения 2 (100 нМ) не имело никакого дополнительного влияния на норадреналин (300 нМ), вызвавший увеличение метаболизма фосфинозитола в кардиомиоцитах новорожденной крысы при контрольных условиях, но в клетках, испытывающих гипоксию и недостаток глюкозы
(метаболическое напряжение), введение химического соединения 2 (100 нМ) + норадреналина (300 нМ)
нормализовало ухудшившийся метаболизм фосфоинозитола, как показано на фигуре 4; было получено
приблизительно 70 % увеличение, по сравнению со случаем, когда применялся только один норадреналин.
Экспериментальный пример 5.
Модель вызванной кальцием аритмии у мышей
Антиаритмическое влияние химических соединений по настоящему изобретению было испытано с
использованием in vivo модели вызванных кальцием аритмий согласно модели Линча (Lynch) и других[37]. Мышам (25-30 г) давался наркоз с помощью нейролептической обезболивающей комбинации
(гипнорм (Hypnorm®) - (фентанилцитрат 0,315 мг/мл и фуанизон 10 мг/мл) + мидазолам (5 мг/мл)). Коммерческие растворы гипнорма и мидазолама разбавлялись в пропорции 1:1 в дистиллированной воде, и
одна часть разбавленного Гипнорма (Hypnorm ®) смешивалась с одной частью разбавленного мидазолама.
Анестезия вводилась подкожно с дозировкой 0,05-0,075 мкл на 10 г массы мыши. В хвостовую вену
вставлялась канюля. Сигнал ЭКГ записывался непрерывно с помощью электродов ЭКГ из нержавеющей
стали, установленных на правой передней конечности и левой задней конечности. Заземленный электрод
устанавливался на правую заднюю конечность. Сигнал усиливался (х 5,000-10,000) и фильтровался (0,1150 Гц) через электронную модель 689 модулей ЭКГ Хьюго Сачса. Аналоговый сигнал переводился в
цифровую форму через панель сбора данных на 12 битов (модель передачи данных DT321) и отбирался
при 1000 Гц с использованием программного обеспечения Notocord НЕМ 3.1 для Windows NT. После 10минутного периода балансировки образец для испытаний лекарственного средства вводился в хвостовую
вену. В качестве контрольных использовались мыши, которым предварительно вводился носитель. Объем инъекции составлял 100 мкл во всех экспериментах. Вливание СаСl (30 мг/мл, 0,1 мл/мин ~ 100
мг/кг/мин (кальциумхлорид-2-гидрат, Riedel-de Haen, Германия)) начиналось 3 мин спустя после внутривенного введения лекарственного средства или носителя.
Время до начала предсердно-желудочковой-блокады 2-ой степени было определено как время от
начала вливания СаСl2 до первого случая аритмии. Случай предсердно-желудочковой-блокады 2-ой степени определялся как прерывистый отказ предсердно-желудочковой проводимости, характерной особенностью которой является Р-волна без сопутствующего комплекса QRS.
Реакции были выражены относительно времени до случая предсердно-желудочковой-блокады 2-ой
степени у мышей с введенным носителем. В Таблице 6 приводятся максимальные эффекты каждого из
испытанных веществ.
- 45 -
007792
Таблица 6. In vivo антиаритмическая активность химических составов по настоящему изобретению.
+++ относится к > 60%-ому увеличению во времени до аритмии; ++ относится к увеличению на 3050% во времени до аритмии; + относится к увеличению на 15-29% во времени до аритмии; (+) относится
к < 15%-ому увеличению во времени до аритмии
- 46 -
007792
- 47 -
007792
- 48 -
007792
Как может быть замечено из результатов, представленных в табл. 6, широкие пределы новых химических соединений по настоящему изобретению говорят о антиаритмической активности в сравнении с
активностью химических соединений ААР, ААР10 и НР5 предшествующего уровня техники.
Экспериментальный пример 6.
Влияние химического соединения 2 на выделенные, подвергнутые перфузии сердца кроликов
Принцип методики Лангендорфа
В методике Лангендорфа предлагается способ соблюдения адекватных метаболических требований
к выделенному сердцу, обеспечивая, таким образом, in vitro эксперимент на сердце целиком в течение
нескольких часов. На установке Лангендорфа сердце подвергается перфузии ретроградно через канюлю,
вставляемую в аорту. Когда раствор перфузии поступает в аорту, давление в аорте закрывает аортальные
клапаны, препятствуя, таким образом, жидкости поступать в отделы сердца. Вместо этого раствор перфузии поступает в коронарное кровообращение, снабжающее сердце. В методике Лангендорфа суммарный поток в аорте равняется, таким образом, коронарному потоку. Эксперименты Лангендорфа выполняются с использованием прибора типа 833 АЙЗОЛЭЙТЕД ХАРТ САЙЗ 5, компании Хьюго Сачс Электроник, Германия. Центральным узлом прибора является аортальный блок, к которому с помощью канюли присоединено сердце. Аортальный блок непосредственно связан с искусственным резистором потока,
регулируемым вращающейся ручкой, что позволяет таким образом регулировать постнагрузку и, следовательно, давление перфузии. Жидкость перфузии подается на вход аортального блока из резервуаратермостата по трубкам, подсоединенным к насосу. Объем, подаваемый насосом, может регулироваться.
Возможны избыточные обратные потоки жидкости от аортального блока в резервуар. Ниже аортального
блока находится отдел сердца (термостатичен), который может быть поднят. Эта установка позволяет
непрерывно регистрировать коронарный поток, давление в левом желудочке (LVP), давление перфузии,
ЭКГ с 12 выводами и 8 однофазных потенциалов действия (MAP'S). Выходные данные этой многократной регистрации анализируются с использованием программного обеспечения NOTOCORD НЕМ 3,3.
Это программное обеспечение обеспечивает расчеты в широких пределах кардиальных электрофизиологических и гемодинамичных параметров.
Методика перфузии и среда перфузии
Эксперименты проводятся в режиме перфузии под постоянным давлением. Насос потока обеспечивает расход 70 мл/мин и постнагрузка установлена на уровне 50 мм рт.ст., что обеспечивает давление
перфузии, равное приблизительно 60 мм рт.ст. Сердца, если не определено иначе, подвергались перфузии с использованием предварительно нагретого (38°С) модифицированного раствора КребсаХенселайта (Krebs-Henseleit) следующего химического состава (ммоль/л): NaCl: 118, КСl: 4,7, СаСl2,
Н2O: 2,52, КН2РO4: 1,18, Mg2SO4, 7H2O: 1,64, пировинограднокислый натрий: 2,0, NaHCO3: 24,88, глюкоза: 5,55. Перед использованием раствор фильтруется через фильтр на горлышке бутылки с размером
ячейки 45 мкм.
Уровень рН приблизительно 7,4 и адекватное содержание кислорода в растворе получали путем непрерывного барботирования с использованием карбогена (95% O2/5% СO2). Объем 2 л или больше позволяет сбалансировать карбоген в течение по крайней мере 20 мин, тогда как объем меньше 1 л позволяют обеспечить баланс в течение 10 мин.
Анестезия, хирургия и экспериментальные процедуры
Использовались самцы кроликов Ssc:CPH (2,5 - 4,0 кг) полученные из компании Хвидестен, Аллерод (Hvidesten, Allerod) Дания. Они успокаивались с помощью внутримышечной инъекции 1,2 мл Гипнорма (Hypnorm®) (фентанилцитрат 0,315 мг/мл и флуанизон 10 мг/мл). Через 10 мин медленно внутривенно вводилось 0,55 мл Дормикума (Dormicum®) (мидазолам 5 мг/мл). Кроме того, для предотвращения
коагуляции внутривенно вводилось 500 IU.
Кроликов укладывали на спину с фиксацией передних лап по бокам, и делался надрез до оголения
трахеи. Выполнялась трахеотомия, и кролики вентилировались кислородом с помощью вентилятора для
грызунов Уго Басил (дыхательный объем: 18 мл, частота: 60 в мин). Вскрывалась брюшная полость от
хвостовой части до мечевидного отростка, и брюшные мускулатуры рассекались с обеих сторон. С целью получения доступа к грудной полости вскрывалась диафрагма за грудиной, и разрез продолжался с
двух сторон вдоль реберного изгиба.
Средостение рассекалось насколько можно ближе к грудине, и ребра рассекались с обеих сторон
паралльно линии грудины, что позволяло поднимать грудную стенку в направлении черепа. Поднятая
стенка грудной клетки фиксировалась над головой кролика для обеспечения полного обзора грудной полости. Вскрывался перикард и открывалась аорта. На аорту накладывалась незатянутая лигатура. Хвостовая полая вена поджималась только краниально к печени, чтобы уменьшить отток к сердцу и к черепной полой вене, и вскрывалась легочная артерия, чтобы уменьшить перегрузку на сердце. Вскрывалась
аорта и для обеспечения искусственной перфузии в аорту сразу же вставлялась канюля, соединенная с
аортальным блоком с помощью надставленной трубки, заполненной жидкостью перфузии. Лигатура затягивалась, и сердце отсекалось и передавалось в аппарат для перфузии. Время от зажима хвостовой полой вены до вставки канюли составило приблизительно 30 с.
- 49 -
007792
После передачи сердца на аппарат в левом предсердии делался надрез для вставки наполненного
жидкостью баллона (размер 12) в левый желудочек для измерений давления в левом желудочке. Объем
баллона регулируется для обеспечения конечного диастолического давления, равного приблизительно 10
мм рт.ст. Электродное кольцо для измерений ЭКГ с помощью 12 выводов размещалось вокруг сердца на
уровне коронарной бороздки с вершиной левого предсердия между 5-ым и 6-ым перикардиальными выводами. 8 электродов MAP размещались в сердце и напрямую контактировали с эпикардом. МАР5 и
МАР6 размещались в правом желудочке, тогда как другие электроды MAP равномерно распределялись
по левому желудочку. Этот способ подобен способу, которым пользовались авторы Забел (Zabel) и др.[38].
Когда все электроды оказывались на месте, отдел сердца поднимался для погружения сердца в любое
время в раствор Кребса-Хенселайта (Krebs-Henseleit) с температурой 38°С.
Перед началом эксперимента лигатура размещалась вокруг главного ответвления огибающей артерии, снабжающей большую часть левого желудочка. Оба конца лигатуры пропускались через небольшую
пластмассовую трубку, обеспечивающую стимуляцию ишемии путем надавливания пластмассовой трубкой на сердце с зажимом концов лигатуры. Перед началом эксперимента всем сердцам дается 15 мин для
того, чтобы прийти в равновесное состояние.
График проведения эксперимента:
1. 15 мин перфузии с нормальным буферным раствором Кребса-Хенселайта (Krebs-Henseleit) (период приведения в равновесие);
2. 15 мин перфузии с введением химического соединения в нормальный буферный раствор КребсаХенселайта (Krebs-Henseleit) (нормокалиемический контрольный период; t=0-15 мин);
3. 15 мин перфузии с введением химического соединения в раствор Кребса-Хенселайта (KrebsHenseleit) с пониженным содержанием К+ (2,5 мМ) (гипокалиемический контрольный период: t=15-30
мин);
4. Стимуляция региональной ишемии с последующей перфузией в течение 30 мин с введением химического соединения в раствор Кребса-Хенселайта (Krebs-Henseleit) с пониженным содержанием К+
(2,5 мМ) (гипокалиемический период ишемии; t=30-60 мин).
В конце эксперимента сердца подвергались перфузии с использованием красителя синий Эванс для
оценки области риска образования инфаркта. Предсердия и правый желудочек отсекались и оставшийся
левый желудочек отделялся в область, окрашенную синим Эвансом, а область, которая не окрашивалась,
являлась областью риска. Эти две области промокались насухо с помощью бумажного полотенца и
взвешивались с целью определения доли области риска образования инфаркта.
Регистрация параметров
Непрерывно регистрировались следующие параметры: коронарный поток, давление в левом желудочке, давление перфузии, ЭКГ с 12 выводами и 8 MAP регистрации. ЭКГ и MAP замерялись при 2000
Гц, а параметры давления и потока при 500 Гц. Средняя продолжительность потенциала действия рассчитывалась по 8 регистрациям MAP как средняя продолжительность от момента времени максимальной
деполяризации (время dV/dt Max) до момента реполяризации 90 %. Эта продолжительность упоминается
как APD90, и дисперсия APD90 измеряется как среднеквадратичное отклонение 8 замеров APD90,
Результаты
Как показано на фигуре 5, были изучены три группы. Сердца кроликов подвергались перфузии либо только с использованием буферного раствора Кребса-Хенселайта (Krebs-Henseleit) (носитель; n = 11
экспериментов), с химическим соединением 2 концентрацией 10-10 моль/л, (n=10 экспериментов), либо с
ААР10 концентрацией 10-10 моль/л (СЕ-2; n=3 эксперимента). Увеличение дисперсии APD90, наблюдаемой во время гипокалиемической, острой миокардиальной ишемии у кроликов, в сердца которых вводился носитель, предотвращалось введением химического соединения 2 концентрацией 10-10 моль/л, но
не ААР10 (СЕ-2) концентрацией 10-10 моль/л. Эти результаты демонстрируют, что химическое соединение 2 предотвращает дисперсию электрического сигнала при ишемии и это дает возможность предположить, что антиаритмические свойства химического соединения 2 связаны с этим механизмом. Предварительно сообщалось, что ААР10 (СЕ-2) способен уменьшить дисперсию эпикардиального интервала восстановления активации и уменьшить изменения эпикардиальных структур активации, вызванных региональной ишемией у кролика с максимальным влиянием при концентрации 10-8 моль/л[39]. В наших экспериментах химическое соединение 2 эффективно предотвращало увеличение дисперсии электрического
сигнала во время ишемии при концентрации 10-10 моль/л, в то время как ААР10 (СЕ-2) при этой же концентрации был неэффективен. Эти различия не обусловлены различиями в размере инфаркта миокарда
потому, что уменьшение коронарного потока во время ишемии и область риска были одинаковы у всех
групп. Эти результаты указывают на то, что химическое соединение 2 действует сильнее, чем ААР10
(СЕ-2).
Экспериментальный пример 7.
Влияние химического соединения 2 на аритмии, вызванные циркуляции возбуждения
в желудочке у собак
Влияние щелевого соединения на аритмии было выяснено в исследованиях влияния коннексина 43
(Сх43) на свойства проводимости желудочка[33]. У гетерозиготных мышей с дефицитом Сх43 в два раза
- 50 -
007792
поднималась частота спонтанных тахикардии желудочка при окклюзии коронарной артерии (САО)[3].
Ишемия регулирует влияние Сх43 после 6 ч у собак с 60%-м уменьшением Сх43 из конца в конец и при
49%-ом уменьшении Сх43 из бока в бок[40], что, вероятно, вторично по отношению к дефосфориляции.
При подострой ишемии у собак эпикардиальная циркуляция возбуждения проще проходит в областях с
пониженным содержанием Сх43[25]. Таким образом, механизмы циркуляции возбуждения могут сильно
зависеть от ишемии, понижающей содержание Сх43 и, возможно, устойчивость щелевых соединений,
что делает однородность восстановления и свойства проводимости предрасположенными к тахикардии
желудочка и фибриляции желудочка.
В исследованиях, описанных ниже, изучалось влияние химического соединения 2 на аритмии, вызванные циркуляцией возбуждения, при миокардиальной ишемии, вызванной окклюзией передней нисходящей коронарной артерии.
Подготовка животных
Исследовались три собаки под наркозом со вскрытой грудной клеткой, что облегчало размещение
электродов для картирования. Сначала α-хлоралоза давалась в виде пилюли (200 мг/кг), а затем в виде
постоянного вливания при 8 мг/кг/ч (растворенная в полиэтиленгликоле, молекулярная масса=200). Бедренная вена и артерия были канюлированы для введения жидкости и препаратов и для измерения давления в восходящей аорте, соответственно.
Методы электрофизиологии
На синусовый узел надевался зажим и в ушке предсердия размещался программируемый стимулятор с выводами постоянного тока на двойное значение диастолическиго порога. Для управления частотой сердечных сокращений частота электростимуляции составляла > 200 ударов в мин. Для стимуляции
желудочка использовался один полюс многополюсной иглы в нормальной зоне анода (из нержавеющей
стали площадью 7 см2) в брюшной мышце. Эндокардиальный эффективный рефрактерный период измерялся по стандартной методике экстрастимуляции. Поздний желудочковый диастолический порог измерялся во время каждого вмешательства; ток стимуляции в четыре раза превышал пороговое значение.
Регистрация электрограммы
Испытательные сайты выбирались вдоль оси 16-полюсных игл (Дж. Кассел, Файетевиль, шт. Северная Каролина, США (J. Kassell, Fayetteville, NC)); каждый полюс полностью окружал ось иглы, что
предотвращало возможность направить иглу для регистрации сигналов смежной жилы Пуркинье. Шесть
биполярных электрограмм (с интервалом 1 мм) были записаны последовательно вниз по оси иглы с усилением до 1000 раз, с фильтрацией в диапазоне 3-1300 Гц и с записью осциллограммы во время стимуляции предсердий. По каждой многополюсной игле записано четыре интрамуральных электрограммы.
Эпикардиальные электрограммы активизировались последними на каждой игле. Использовалась матрица
из 23 многополюсных электродов, при этом 17 электродов устанавливались в зоне риска образования
инфаркта передней нисходящей коронарной артерии, а 6 электродов - в окружающей нормальной зоне,
как описано у авторов Ксинга и Мартинса (Xing и Martins)[41]. Расстояние между иглами, измеренное на
эпикарде, менялось в пределах 6-10 мм у собак с массой 12-16 кг.
Стимуляция аритмии
Эндокард размещался в основной апикальной перегородке и боковой свободной стенке только вне
зоны риска. После определения эффективного рефрактерного периода интервал S1-S2 был продлен на 4
мс > эффективного рефрактерного периода, и S3 добавлялось к протоколу первоначально с S2-S3 интервалом, равным 50 мс > S1-S2. Интервалы были сокращены до отказа при захвате. Если тахикардия желудочка не вызывалась ни на каком сайте стимуляции, то добавлялись третий (S4) и четвертый (S5) внешний стимулы. С целью исключения артефакта тахикардии желудочка, вызванной массой иглы или ишемией вследствие того, что иглы, препятствуют кровотоку, перед окклюзией коронарной артерии выполнялся полный протокол стимуляции тахикардии желудочка. После подтверждения наличия физиологических газов в крови и адекватной анастезии на окклюзию передней нисходящей коронарной артерии
накладывалась лигатура. После 60 мин размер инфаркта составлял почти 75% зоны риска, и дальнейшее
расширение зоны инфаркта было незначительным. Затем по крайней мере дважды перед вмешательствами вызывалась тахикардия желудочка. Каждые 20 мин проводились повторные испытания и продолжались до 3 ч после окклюзии коронарной артерии. При каждом вмешательстве регистрировался эффективный рефрактерный период нормальной кардиальной мускулатуры.
Картрирование аритмии
Эпикардиальное картрирование выполнялось с использованием компьютера на основе системы
компании BARD Electrophysiology Inc. Программное обеспечение принимает 64 канала данных с разрешением 12 битов с частотой опроса 1 кГц/канал. Фильтрование осуществлялось в диапазоне 30-300 Гц.
Восьмисекундное окно запускается от внешнего управления, включая до 8 с данных перед сигналом запуска. Эта система используется, чтобы делать записи от внешних 2-3 эпикардиальных двухполюсников
на каждом электроде регистрации.
Настроенная система программного обеспечения используется для разрешения сигналов Пуркинье
от 3 внутренних двухполюсников на каждом эндокардиальном многополюсном электроде путем опроса
на канале 3 кГц. Фильтры включают частоту Пуркинье (3-1300 Гц). Частота опроса составляла 235 кГц.
- 51 -
007792
ПК был сопряжен с усилителем, состоящим из мультиплексора аналогового сигнала и 64 приборных
схем усиления. У каждой схемы был переключаемый коэффициент усиления (до 1000) и блокировка по
ширине полосы пропускания. Сбор, обработка и визуализация электрофизиологических данных выполнялись программным обеспечением. Быстродействующий сбор данных обеспечивал сбор данных в течение 14 с, включая до 8 с перед сигналом запуска.
Анализ картрирования
Анализ картрирования выполнялся автономно. Компьютер выбирал моменты активации с использованием первого максимума dv/dt. Электрограммы считались неподдающимися толкованию и исключались из карт только, если не воспроизводилась стимуляция; не было никакого исключения, основанного
на напряжении электрограмм. Считается, что потенциалы от электроники или далекие полевые потенциалы присутствуют, если происходят существенные потери напряжения и dv/dt в комплексе с интервалами соединения, продолжительность которых короче невосприимчивости. Изохроны выполнялись
вручную. Механизмы тахикардии желудочка определялись следующим образом. Тахикардия желудочка,
вызванная циркуляцией возбуждения, происходит там, где электрод регистрирует самую раннюю активность, которая происходит после того, как однонаправленная блокировка случается в проксимальной
части близости от сайта последней активации из предыдущего комплекса, и между комплексами регистрируется диастолическая активность. Циркуляция возбуждения в эпикардии чаще всего регистрируется
при острой ишемии, так что наблюдается ретроградная активация (от эпикардиа к эндокардию) стенки.
Протокол эксперимента
После измерений на сердце и одного часа окклюзии коронарной артерии выполнялись протоколы
стимуляции для вызова тахикардии желудочка с целью подтверждения либо воспроизводимой индуцируемости (индуцирование дважды тахикардии желудочка с одинаковой морфологией поверхности) или
невыполнения индуцируемости (стимуляция всех трех сайтов дважды без тахикардии желудочка более
одного часа). У трех собак с реиндуцируемой тахикардией желудочка был идентифицирован механизм
циркуляции возбуждения. Этим трем собакам химическое соединение 2 вводилось внутривенно в виде
болюсного вливания, затем двум из них постоянно в течении 30 мин делалось вливание трехуровневой
дозы, в то время как третьей собаке вводился солевой раствор. Затем испытание внешней стимуляцией
повторялось по всему протоколу на всех сайтах с целью определения наличия тахикардии желудочка.
Химическое соединение 2 применялось внутривенно на трех уровнях дозы для обеспечения концентрации плазмы, равной 10-10 М (болюс: 0,1 мкг/кг; вливание: 2 нг/кг/мин), 10-9 М (болюс: 1,1 мкг/кг; вливание: 21 нг/кг/мин) и 10-8 М (болюс: 11 мкг/кг; вливание; 210 нг/кг/мин) соответственно.
Результаты
Первое животное (фиг. 6-9) было изучено после того, как стимуляция длительно сохраняющейся
мономорфной тахикардии желудочка была вызвана дважды только от бокового сайта стимуляции желудочка с последовательностью через 2 ч и 10 мин и повторилась через 2 ч и 20 мин после окклюзии коронарной артерии. На фиг. 6 представлена карта активации после септальной стимуляции, которая не в состоянии вызвать тахикардию желудочка. Это демонстрирует нормальную структуру активации прямоходячих с ранней активацией сайта стимуляции PURK, активизированного на 6 мс позже стимуляции, и
поздней активацией эпикардиального сайта, активизированного последним на 107 мс. Обратите внимание, что соседние моменты активации на 86 мс непосредственно к востоку и к югу от последней активации на эпикарде представлены кривой E-S на фиг. 7. Эпикардиальная активация первого комплекса тахикардии желудочка, который начинается на- 44 мс до начала поверхности QRS и, который соответствует электрограмме, зарегистрирована как кривая Е-С на фиг. 7.
На фиг. 7 показана длительно сохраняющаяся мономорфная тахикардия желудочка, вызванная стимуляцией на боковом эпикардиальном сайте стимуляции желудочка, и вызывающая циркуляцию возбуждения. Активация возобновляется в двойной петле циркуляци возбуждения с активацией сначала на 17
мс и затем переходит на 57 мс на северо-западной петле. Юго-восточная петля сначала активируется на 2
мс, 31 мс и затем на 57 мс. В соответствии с протоколом, по которому вызывалась тахикардия желудочка: S1-S2=150, S1-S3=280, S1-S4=390, S1-S5=490 мс. На фигуре показаны эпикардиальные (Е-) электрограммы, зарегистрированные с поверхностными выводами ЭКГ II и V5R со второго по пятый преждевременные экстра-стимулы (лучше всего видно на E-L) с обеспечением 4 комплексов тахикардии желудочка. Электрограммы зарегистрированы от боковой пограничной зоны (L) сайтов стимуляции и с востока (Е), севера (N), центра (С), подэпикарда (SE), ниже Е-С, а также с юга (S) и северо-запада (NW), и
юго-запада (SW) от Е-С. Е-С демонстрирует постепенно диссоциированные электрограммы с последним
преждевременным показом блока второго компонента (перпендикулярные линии). Соседняя задержка
проводимости на ES соответствует тому, что проводимость переходит вокруг и идет назад к центральному сайту (ЕС) с циркуляцией возбуждения, продолжающейся между ЕС и ES (прямая линия и линия со
стрелкой).
На фиг. 8 показана карта активации во время эпикардиальной активации первого комплекса тахикардии желудочка, которая начинается на -44 мс перед началом поверхности QRS и, которая соответствует электрограмме, зарегистрированной в Е-С на фиг. 7. Активация продолжается в двойной петле циркуляции возбуждения, с активацией сначала на -17 мс, а затем переходит на 57 мс северо-западной пет- 52 -
007792
ли. Юго-восточная петля активируется сначала на 2 мс, 31 мс, а затем на 57 мс. Эта карта активации также иллюстрирует ретроградную активацию стенки желудочка во время аритмии, вызванной циркуляцией
возбуждения.
Химическое соединение 2 вводилось тремя возрастающими дозами IV, которые не изменяли среднее артериальное давление (MAP = 80 мм рт.ст.). Эффективный рефрактерный период в контроле составлял 150 мс, 154 мс после самой низкой дозы и 148 мс при самой высокой и последней дозе. Тахикардия желудочка, которая была стимулирована, была типичной эпикардиальной циркуляцией возбуждения,
показанной на фиг. 7 и 8. После первой дозы химического соединения 2 (болюс: 0,1 мкг/кг; вливание; 2
нг/кг/мин) тахикардия желудочка больше не стимулировалась несмотря на то, что протоколы стимуляции вызывали тахикардию желудочка до введения химического соединения 2; в соответствии с протоколом, который вызывал тахикардию желудочка до введения лекарственного средства: S1-S2=150, S1S3=280, S1-S4=390, S1-S5=490 мс и в течение вливания химического соединения 2, интервалы составляли 150, 270, 370 и 470 мс, соответственно. Тахикардия желудочка не стимулировалась до полутора часов
после начала вливания самой низкой дозы химического соединения 2. На фиг. 9 показана электрокардиографическая запись после внутривенного введения самой низкой дозы химического соединения 2. Эти
результаты демонстрируют, что химическое соединение 2 эффективно блокировало циркуляцию возбуждения тахикардии желудочка у этой собаки.
У второй собаки стимулировалась тахикардия желудочка, на этот раз от двух сайтов стимуляции
пограничной зоны, расположенных сбоку и септально. Снова химическое соединение 2 не изменило
MAP, которое началось при 90 мм рт.ст. и завершалось при 90 мм рт.ст. Эффективный рефрактерный
период в двух сайтах стимуляции оставался на 163 и 144 мс соответственно во время испытательного
периода химического соединения 2, который начался 85 мин спустя после окклюзии коронарной артерии
и продолжался в течение 2 последующих часов. После самой низкой дозы химического соединения 2
тахикардия желудочка, вызванная от боковой стенки, больше не стимулировалась; механизмом этой тахикардии желудочка была эпикардиальная циркуляция возбуждения, что очень сходно с механизмом,
показанным на фиг. 7-9. До введения химического соединения 2 тахикардия желудочка, вызванная со
стороны септального сайта, была также эпикардиальной циркуляцией возбуждения, но после внутривенного введения химического соединения 2, эпикардиальная циркуляция возбуждения была полностью
блокирована. Таким образом, в этих двух экспериментах тахикардия желудочка, вызванная эпикардиальной циркуляцией возбуждения, стимулировалась до введеня самой низкой дозы химического соединения
2, а после введения вещества циркуляция возбуждения больше не стимулировалась при любой дозе. Наконец, одно дополнительное животное подвергалось электрофизиологическому испытанию в период временного интервала, используемого в двух экспериментах, описанных выше, без введения химического
соединения 2, но с введением солевого раствора. Эпикардиальная циркуляция возбуждения была вызвана спустя один час после окклюзии коронарной артерии, спустя 1½-2½ ч после окклюзии коронарной
артерии вызывалась та же самая морфология тахикардии желудочка и механизм циркуляции возбуждения. Таким образом, воспроизводимость тахикардии желудочка, вызванной циркуляцией возбуждения, в
управляемом эксперименте на этот раз согласуется с химическим соединением 2, которое является эффективным антиаритмическим химическим соединением в условиях аритмий, вызванных циркуляцией
возбуждения.
Эти эксперименты демонстрируют, что химическое соединение 2 эффективно при профилактике
и/или лечении аритмий, вызванных циркуляцией возбуждения, с летальным исходом. Таким образом,
целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных
средств, используемых при профилактике и/или лечении кардиальных аритмий, вызванных циркуляцией
возбуждения, или наджелудочкового или желудочкового происхождения. Эта цель достигается с помощью настоящих пептидных соединений, типа соединений по формулам I-VIII, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в таблицах 1 и 8, в частности химических соединений из примеров
синтеза 1-55.
Экспериментальный пример 8.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на костные клетки.
Предпосылки
Остеобласты, которые являются формирующими кость клетками, и остеоциты хорошо связаны между собой. В срезах кости, исследованных электронной микроскопией[42], были обнаружены связи остеобласт-остеобласт, остеоцит-остеобласт и остеоцит-остеоцит. Так же как и для сердца, самым интересным
коннексином для кости оказался Сх43. В костных клетках экспрессия этих белков связана с экспрессией
некоторых остеобласт-специфичных белков. Кальциотропные гормоны также могут регулировать экспрессию белков щелевого соединения.
Показано, что остеобласты человека (НОВ) и стромальные клетки, выделяющие костный мозг
(BMSC), выделяют Сх43 и Сх45. Они функционально связаны, как продемонстрировано в методике переноса красителя Желтый Люцифер[43]. Линии остеобласта крыс отличаются от первичных культур человека; клетки ROS 17/2,8 экспрессируют только Сх43 и хорошо связаны, тогда как UMR 106-01 преимущественно экспрессирую Сх45 и слабо купированы красителем[44]. Обе линии остеобласта крыс имеют
- 53 -
007792
электрические связи. Трансфекция Сх43 в клетки UMR приводила к получению клеток, хорошо купированных красителем. Таким образом, Сх43 обеспечивает передачу Желтого Люцифера и других еще более
больших молекул, тогда как Сх45 не обеспечивает этого. Напротив, введение Сх45 в клетки экспрессирующие Сх43 уменьшает купирование красителем. При дифференцировке остеобласта, экспрессия Сх43
изменялась; таким образом, чем более зрелый остеобласт, тем сильнее экспрессия Сх43[45].
Исследовалось влияние различных стимулов на костные клетки и их отношение к изменениям коммуникации по щелевому соединению. Известно, что умеренное механическое напряжение в кости увеличивает плотность кости. Для имитации этой ситуации клетки ROS 17/2,8 подвергались циклическому
напряжению, которое приводило к усилению купирования красителем. Циклическое напряжение, приложенное к плохо купированным клеткам UMR 106-01, приводило также к усилению купирования красителем, но не так резко, как в случае с клетками ROS. Не было обнаружено увеличения мРНК для Сх43,
но были обнаружены более фосфорилируемые формы Сх43, что указывает на то, что циклическое напряжение на остеобластах усиливает коммуникацию по щелевому соединению между клетками путем
модуляции внутриклеточной локализации белка Сх43 щелевого соединения. Та же самая группа показала, что трансфекция Сх43 в плохо купированные клетки UMR 106-01 не только усиливает купирование
красителем[46], но также и усиливает экспрессию продуктов зрелых остеобластов, остеокальцина и костного сиалопротеина (BSP). Ухудшает купирование остеобластов (ROS) путем трансфекции Сх45 в клетки уменьшает экспрессию остеокальцина и BSP, генов, ответственных за формирование костной матрицы и кальциноз. Недавнее изучение показало, что у Сх43 нокаутных мышей имеется дефицит остеогенеза и нарушение развития по сравнению с дикими мышами[47]. Таким образом, для полного развития дифференцированного остеобластического фенотипа, а также для нормального остеогенеза и метаболизма
требуется межклеточная сеть связи. Поэтому недостаточная коммуникация по щелевому соединению
может привести к повышенной потере костной ткани.
Показано также, что щелевое соединение должно частично отвечать за распространение межклеточных сигналов кальция в костных клетках. Механическая стимуляция одного остеобласта человека в
монослое в культуре клеток in vitro вызывает импульс кальция, который распространяется ко множеству
окружающих клеток. Распространение этого сигнала включает проход молекулы мессенджера по щелевому соединению с последующей активацией соседних клеток[48-49]. Эти сигналы вероятно распространяются по всей клеточной сети в кости in vivo в ответ на механические стимулы, и могли бы отвечать за
увеличенный остеогенез в ответ на механическую нагрузку на кости.
Коммуникация по щелевому соединению и влияние кальциотропных гормонов связаны между собой. Показано, что стимуляция фибробластов кожи человека с помощью l,25(OH)2витминаD3 усиливает
коммуникацию по щелевому соединению, а также увеличивает уровни белка Сх43 и мРНК[50], но только
в присутствии функциональных рецепторов витамина D (VDR). Показано, что потеря Сх43-экспрессии
уменьшает чувствительность клеток к РТН без какого-либо изменения числа рецепторов РТН или реакции цАМФ[51]. В других случаях РТН и PGE2 усиливают коммуникацию по щелевому соединению в клеточных культурах остеобласта с использованием двух механизмов: начального быстрого перераспределения Сх43 к мембране клетки, и более поздней стимуляции экспрессии гена Сх43[52]. Таким образом,
модуляция межклеточной коммуникации представляет из себя механизм, с помощью которого остеотропные факторы регулируют активность остеогенных клеток.
Межклеточная коммуникация по щелевому соединению может оказаться одним из самых важных
механизмов, с помощью которого костные клетки координируют свои действия и реакцию на механические и гормональные стимулы. Таким образом, если можно было бы фармакологически усилить коммуникацию по щелевому соединению между костными клетками, то можно было бы увеличивать активность остеобласта с усилением остеогенеза in vivo.
Кардиальные миоциты также купированы с помощью щелевого соединения, и также как и в остеобластах преобладающим коннексином является Сх43. Были найдены определенные химические соединения, которые усиливают коммуникацию по щелевому соединению между кардиальными миоцитами, из
которых лучше всего изучен искусственно синтезируемый ААР10 (СЕ-2). Кардиальные миоциты реагируют на ишемию уменьшением купирования клеток. В экспериментах in vitro при введении ААР10 (СЕ2) в кардиальные миоциты, подверженные ишемии, часть потерянных клеточных связей была восстановлена. Если кардиальные миоциты могут реагировать на эту группу химических соединений усилением
купирования с помощью щелевого соединения, то остеобласты могут делать то же самое. В этом случае
очевидно, что увеличение купирования клеток очень хорошо могло бы сопровождаться увеличением
созревания остеобласта и его активности с последующим увеличением остеогенеза. Для изучения этой
гипотезы исследовалось влияние химического соединения 2 на МКЩС в остеобластах человека и клетках остеогенной саркомы крысы. Кроме того, изучалось влияние химического соединения 2 на маркер
(то есть, щелочную фосфатазу) для активности остеобласта человека и остеогенеза.
Способы
Клеточная культура
Остеобласты человека: клетки выделялись из костного мозга человека, путем пункции в задней
подвздошной части позвоночного столба здоровых добровольцев (в возрасте 20-36 лет): 10-15 мл мате- 54 -
007792
риала костного мозга собиралось в 15 мл PBS+Ca, Mg (компания Лайф Технолоджис, Кат. № 14040) с
100 ед./мл гепарина (компания Сигма, Кат. № Н-3149). Мононуклеарная фракция костного мозга выделялась на градиенте Lymphoprep (компания Никомед Фарма (компания Никомед Фарма), Кат. №
1001967) центрифугированием при 2200 об./мин в течение 30 мин. После сбора клеток, мононуклеарная
фракция промывалась один раз в культуральной средой и центрифугировалась при 1800 об./мин в течение 10 мин. Затем клетки считали и высевали в культуральной среде при плотности 8х106 клеток на 100
мм кюветы. Культуральная среда остеобласта человека (все реактивы получены из компании Лайф Технолоджис): MEM w/o (Phenol Red) феноловый красный w/глутамакс (Кат. № 041-93013) с добавлением
10%-ой убитой теплом эмбриональной сыворотки теленка (Кат. № 10106) и 0,1% пенициллина/стрептомицина (Кат. № 15140). Культуральная среда заменялась на следующий день и клетки культивировались при 37°С в среде 5% СO2 с заменой культуральной среды каждые 7 дней. После 3-4 недель
культуры клетки достигли 70%-ой сплошности. Затем в культуральную среду в течение 7 дней добавлялось 100 нМ дексаметазона (компания Сигма, Кат. № D-4902). Затем клетки высевались для экспериментов с видеоизображением: 25 мм #1 стеклянное покровное стекло помещалось в кювету размером 35 мм
(или в каждую лунку кюветы из 6 лунок), клетки высевались с плотностью 2,5x105 клеток на покровное
стекло и культивировались перед использованием в течение 2-3 дней.
Клетки ROS 17/2,8: клетки культивировались в 100 мм кюветах при 37°С в среде 5%-ой СO2, и
культуральная среда заменялась каждые 2-3 дня. Культуральная среда ROS (все реактивы получены из
компании Лайф Технолоджис): MEM (Кат. № 31095) с добавлением 10% убитой теплом сыворотки теленка (Кат. № 16170), 1 % NEAA (Кат. № 11140), 1%-ый натрий пировинограднокислый (Кат. № 11360),
1 % L-глутамин (Кат. № 25030) и 0,1% пенициллин/стрептомицин (Кат. № 15140). Для экспериментов с
видеоизображением клетки высевались на покровные стекла при плотности 2-3x105 клеток на покровное
стекло и культивировались перед использованием в течение 2-3 дней.
Измерение волн кальция
Клетки, культивируемые на покровных стеклах, нагружались 5 мкМ фура-2-АМ (компания молекулар пробе, Кат. № F-1221) в течение 30 мин при 37°С, и выдерживались в свежей культуральной среде в
течение 20 мин. Затем покровные стекла крепились к культуральной камере PDMI-2 (компания Медисал
Системе), хранившейся при 37°С в переохлажденном СO2, на микроскопе Цейс Аксиоверт. Межклеточные волны кальция были вызваны механической стимуляцией единственной клетки с использованием
микро пипетки из боросиликатного стекла, прикрепляемой к микроманипулятору Эппендорф (Eppendorf)
5171. Изображение выполнялось с использованием системы формирования изображения МетаМорф
(MetaMorph) (компания Юниверсал Имаджинг). Свет возбуждения (340 и 380 нм) подавался от монохроматора (компания Фотоникс (T.I.LL. Photonics GmbH)). Изображения захватывались камерой на приборах с зарядовой связью (компания Дэйдж МТИ (Dage MTI)) и переводились в цифровую форму с помощью платы обработки изображения Матрокс МВП (Matrox MVP).
Микроинъекция
Клетки, культивируемые на покровных стеклах, размещались в микроскопе, как описано выше.
Микроинъекции выполнялись с использованием микроманипулятора Эппендорф (Eppendorf) 5171 и системы Эппендорф Трансджектор 5346 (Eppendorf Transjector). В микропипетку загружалось 10 мМ раствора Желтого Люцифера (компания Сигма, Кат. № L-0259). В клетку в мономолекулярном слое в течение 30 с осторожно вводили Желтый Люцифер, микропипетка удалялась из клетки и спустя 30 с считали
количество клеток с измененным цветом. Длина волны света возбуждения для Желтого Люцифера составляла 430 нм, и изображения захватывались, как описано выше.
Анализ щелочной фосфатазы
День 1: клетки высевались на 96-луночные планшеты с концентрацией 8000 клеток на лунку или
3000 клеток на лунку (ROS) в 200 мкл нормальных культуральных сред.
День 2: культуральная среда клеток менялась.
День 4: (день 3 для ROS): клетки промывались 200 мкл MEM, 0,1% BSA (компания Сигма, Кат. №
А-9418). 200 мкл MEM, 0,1 % BSA, содержащие различные концентрации химического соединения 2
добавлялись к клеткам, и культура оставлялась на 4 дня (2 дня для клеток ROS).
День 8: (день 5 для ROS): анализ щелочной фосфатазы (ALP) - колориметрический способ измерения активности фермента выполнялся с использованием Комплекта щелочной фосфатазы (компания
Сигма, Кат. № 104-LL): клетки промывались один раз с помощью 200 мкл PBS+Ca, Mg. 100 мкл щелочного буферного раствора добавлялось в каждую лунку, и планшет засевался при 37°С в течение 10 мин.
100 мкл раствора субстрата добавлялось в каждую лунку, и планшет выдерживался при 37°С в течение
30 мин. 100 мкл 2,0 N NaOH добавлялось в каждую лунку, чтобы остановить реакцию. Поглощение измерялось с использованием считывающего устройства для планшеты при длине волны 405 нм.
Влияние химического соединения 2 на МКЩС
Для оценки способности модификаторов щелевого соединения усиливать коммуникацию по щелевому соединению, по которому распространяются межклеточные сигналы кальция, мономолекулярные
слои остеобласта человека на стеклянных покровных стеклах были нагружены фура-2. Во время изображения в реальном масштабе времени выполнялась механическая стимуляция с помощью стеклянной
- 55 -
007792
микропипетки. Очевидно, что увеличение содержания внутриклеточного кальция происходит с последующим распространением сигнала к окружающим клеткам. Среднее количество клеток в волне составляло 6,5. Затем для десенсибилизации purinergic рецепторов добавлялось 100 мкМ аденозин-трифосфата
(АТФ). После десенсибилизации распространение волн кальция зависит исключительно от МКЩС. После стимуляции АТФ увеличение содержания внутриклеточного кальция было замечено в большинстве
клеток, попавших в поле зрения. Снова одна единственная клетка стимулировалась механически. Теперь
распространение волн было ограничено средним числом, составляющим только 4,5 клетки на волну. К
раствору в ванне добавлялось химическое соединение 2 концентрацией 10-8 моль/л. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция было замечено в большинстве клеток, попавших в поле зрения. После
10 мин выдержки с химическим соединением 2 одна единственная клетка стимулировалась механически.
Снова стимулируемая клетка увеличила внутриклеточную концентрацию кальция с последующим распространением волны. Теперь волна увеличилась в среднем до 6,2 клеток (фиг. 10), что является значительным увеличением по сравнению с состоянием, предшествующим добавлению химического соединения 2.
Для проверки способности химического соединения восстанавливать подавленное купирование
клеток с помощью щелевого соединения, подобные эксперименты выполнялись на линии остеобласта
ROS 17/2,8 (ROS), но после инкубации клеток в течение 48 ч в гипоксических условиях только с 3-6% O2,
что, как известно, ухудшает купирование клеток. Клетки ROS в мономолекулярных слоях нагружались
фура-2, и при тех же самых рассмотренных выше условиях выполнялась механическая стимуляция. Поскольку клетки ROS не экспрессируют purinergic рецепторы, предварительная обработка с использованием АТФ не проводилась. После стимуляции внутриклеточная концентрация кальция в стимулируемой
клетке увеличилась, и инициировалась волна, распространяющаяся в среднем на 2,2 клетки (n=18). Затем
химическое соединение 2 добавлялось к раствору в ванне с конечной концентрацией 10-8 М. Спутя 10
мин механическая стимуляция повторялась. Теперь добавлялась волна, распространяемая в среднем на
5,4 клетки (n=18) (фиг. 11), что является значительным увеличением по сравнению с предыдущим химическим соединением. Таким образом, химическое соединение 2 эффективно увеличивает межклеточные
волны кальция, которые проходят по щелевому соединению.
Для оценки влияния химического соединения на прямую клеточную связь выполнялись эксперименты по микроинъекции способом, описанным выше. Краситель Желтый Люцифер вводился в один
единственный остеобласт человека в мономолекулярном слое. Спустя 30 с оценивалось количество клеток, содержащих краситель. При физиологических условиях краситель распространился в среднем на 14
клеток (n=19). Для подавления купирования клеток они теперь выдерживалось при гипоксии (3-6% O2) в
течение 48 ч. Затем купирование клеток оценивалась повторно с помощью микроинъекции Желтого Люцифера, и в этот момент краситель передавался в среднем только на 7 клеток (n=10). Химическое соединение 2 добавлялось к культуральной среде и спустя 10 мин купирование красителем оценивалось снова.
Уже после 10 мин выдержки с химическим соединением 2 купирование клеток усиливалось переносом
красителя на 9 клеток (n = 11).
Подобные эксперименты выполнялись с клетками ROS. Основная связь при физиологическом состоянии в клетках ROS составляла 12 клеток (n=19). После выдержки в течение 48 ч в среде, содержащей
3-6% O2, было отмечено сокращение передачи красителя до 9 клеток (n=27). Опять химическое соединение 2 добавлялось к раствору в ванне и купирование клеток фактически восстанавливалось до предгипоксического уровня со средней передачей красителя до 12 клеток (n=27), (фиг. 12). Таким образом, химическое соединение 2 способно увеличивать коммуникацию по щелевому соединению и восстанавливать стимулируемые гипоксией сокращения купирования клеток.
Известно, что метаболическое напряжение, вызванное гипогликемией, ухудшает коммуникацию по
щелевому соединению. Поэтому мы хотели оценить, может ли химическое соединение 2 направить в
обратную сторону процесс ухудшения купирования клеток, вызванный гипогликемией. Остеобласты
человека культивировались в мономолекулярных слоях на стеклянных покровных стеклах и нагружались
фура-2. После АТФ-десенсибилизации, описанной выше, одна единственная клетка стимулировалась
механически, и регистрировалось количество клеток в волне. В этой серии экспериментов протяженность волны составляла в среднем 3,2 клетки (n=19). Культуральная среда менялась на культуральную
среду без глюкозы, и спустя 8 мин выполнялась другая механическая стимуляция. Теперь волна была
почти блокирована с распространением волны только из 1,4 клеток (n=20). Химическое соединение 2
добавлялось к культуральной среде с конечной концентрацией 10-8 М. Выполнялась заключительная
стимуляция, и теперь волна была почти восстановлена со средней протяженностью до 2,9 клеток (n=18),
(фигура 13). Таким образом, химическое соединение 2 способно восстанавливать стимулированный гипогликемией разрыв купирования клеток.
Наконец, чтобы оценить влияние химического соединения 2 на остеогенез и активность остеобласта, мы измерили влияние химического соединения на клеточную активность, вызванную щелочной
фосфатазой (ALP). Остеобласты человека стимулировались химическим соединением 2 различных концентраций от 1х10-13 до 1x10-6, и сравнивались с необработанными контрольными группами. При нормальном состоянии культуры химическое соединение 2 повышало ALP-активность при большинстве
- 56 -
007792
испытанных концентраций, за исключением самой высокой концентрации (10-6 моль/л), которая может
вызывать токсикоз (фиг. 14). Кроме того, проверялось влияние химического соединения на ALPактивность при гипоксических состояниях. Остеобласты человека культивировались в течение четырех
дней в 5%-ом O2. Культуральная среда обогащалась химическим соединением 2 разной концентрации, и
сравнивалась с реакцией при нормальном состоянии. При гипоксии стимуляция ALP-активности, вызванная химическим соединением 2, была приблизительно на 15% больше, чем при нормальных условиях и всех концентрациях в диапазоне от 10-11 до 10-8 моль/л (фиг. 15).
Короче говоря, эти результаты демонстрируют, что химическое соединение 2 способно нормализовать ослабленную МКЩС между остеобластами человека при гипоксии. Кроме того, химическое соединение 2 стимулирует выработку щелочной фосфатазы, при этом следует исходить из предположения, что
химическое соединение 2 способно стимулировать активность остеобластов, и поэтому остеогенез. Таким образом, химическое соединение 2 может быть полезно при лечении костных болезней с нарушенным остеогенезом относительно резорбции кости. Исходя из влияния химического соединения 2 на купирование клеток при гипоксии можно предположить, что вещества по настоящему изобретению могут
использоваться при лечении и/или профилактике костных болезней, связанных с недостаточной васкуляризацией, гипоксией и ишемией костной ткани.
По результатам этих экспериментов можно сделать вывод, что вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС, могут использоваться при подготовке лекарственных средств для профилактики и/или лечения остеопороза. В некоторых случаях, остеопороз является проявлением другой
болезни типа синдрома Кушинга или несовершенного костеобразования. Однако в большинстве случаев
остеопороза не появляются никакие другие болезни. Одна форма встречается у детей или молодежи обоих полов и с нормальной функцией гонад и часто называется идиопатическим остеопорозом, хотя патогенез большинства других форм также неизвестен. Остеопороз типа 1 встречается у женщин в период
после менопаузы в возрасте от 51 года до 75 лет и характеризуется ускоренной и непропорциональной
потерей массы зрелой костной ткани. Общими осложнениями в этих случаях являются трещины в позвонках и дистальном участке предплечья. Пониженная функция паращитовидной железы может быть
результатом компенсации повышенной резорбции кости. Остеопороз типа II встречается у женщин и
мужчин в возрасте 70 лет и связан с трещинами шейки бедренной кости, проксимальной части плечевой
кости, проксимальной части большой берцовой кости, и таза, участков, которые содержат как корковую,
так и трабекулярную кость. Помимо остеопороза, вещества, которые усиливают МКЩС, могут также
усиливать остеогенез при нарушении обмена веществ в костной ткани типа рахита и остеомаляции и при
остеопорозе вследствие постоянного приема глюкокортикоида или при хронической почечной недостаточности. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике и/или лечении остеопороза. Эта цель
достигается при использовании существующих пептидных соединений типа химических соединений по
формулам I-VIII, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности
химических соединений из примеров синтеза 1-55.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на хрящ
Суставный хрящ - ткань, предназначенная для работы на сжатие во время движения сустава и in
vivo подвергается в широких пределах воздействию механических нагрузок. Было продемонстрировано,
что чувствительность к воздействию механических нагрузок влияет на метаболизм хондроцита и гомеостаз хряща. В клетках многих типов механическое стимулирование вызывает увеличение концентрации
цитозольного Са2+, которая распространяется от клетки к клетке как межклеточная волна Са2+. Межклеточная коммуникация по щелевому соединению лежит в основе координации метаболизма и чувствительности ткани к внеклеточным стимулам: проницаемость щелевого соединения для внутриклеточных
вторичных мессенджеров позволяет нескольким клеткам пользоваться одними и теми же канальцами
передачи сигналов, что, в конечном счете, приводит к скоординированным реакциям ткани. Механически-индуцируемая передача сигналов Са2+ исследовалась в хондроцитах, и было продемонстрировано,
что коммуникация по щелевому соединению является важной для механически-индуцируемой передачи
сигналов Са2+ в хондроцитах[53]. Кроме того, механическая стимуляция активизирует фосфолипазу С,
обеспечивая, таким образом, увеличение содержания внутриклеточного инозитол-1,4,5-трисфосфата.
При проникновении вторичного мессенджера в щелевое соединение происходит стимуляция выхода
внутриклеточного Са2+ в соседние клетки, и эта система считается очень важной для скоординированной
передачи сигналов в хондроцитах во время механической деформации, и это может обеспечить механизм
координации метаболической активности при метаболических напряжениях в хондроцитах[53,54]. Преобладающим коннексином хряща является Сх43 и в дополнение к его роли в межклеточной регуляции метаболизма и передаче сигналов Сх43 важен также и для нормального хондрогенеза[47-55].
Кроме того, цитоархитектура менисковых клеток частично зависит от коммуникации по щелевому
соединению. Волокнистый хрящ мениска, а также структура волокнистого хрящя сухожилий зависит от
межклеточной коммуникации. При ранениях вещества открывающие щелевые соединения увеличивают
скорость репарации.
- 57 -
007792
Таким образом, очевидно, что вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС,
могут использоваться для профилактики и/или лечения болезней суставов, которые включают нарушенное купирование клеток. Как было продемонстрировано с остеобластами человека, мы предполагаем, что
вещества, которые усиливают МКЩС, могут использоваться для профилактики и/или лечения болезней
суставов, которые включают метаболическое напряжение. Они включают любую форму артрита, связанного со сниженной васкуляризацией или заживлением треснутой ткани хряща. Влияние химического
соединения 2 и химического соединения 40 на ослабление коммуникации по щелевому соединению, вызванной ДДТ в хондроцитах человека, будет проверено точно ниже также, как описано для остеобласта.
Испытуемые химические соединения будут использоваться в диапазоне концентрации от 10-10 до 10-6
моль/кг, и ожидается, что испытуемые химические соединения направят в другую сторону уменьшение
коммуникации по щелевому соединению, вызванное промотором опухоли ДДТ. Таким образом, целью
настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств,
применяемых при профилактике и/или лечении болезней суставов, включая артрит. Эта цель достигается
путем использования существующих пептидных соединений, типа химических соединений по формулам
I - VIII, формулам 2 - 12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55.
Вводиться соединения будут перорально, парентерально или внутрисуставно.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на рак
Проницаемость щелевого соединения и регуляция МКЩС происходят в клетке на разных уровнях.
Ухудшение или отсутствие МКЩС могут быть результатом изменений экспрессии Сх во время транскрипции и трансляции, альтерации посттрансляционного процессинга и альтерации сборки коннексона и
вставки в плазматическую мембрану. Необычной особенностью Сх является их короткий период полураспада по сравнению с другими мембранными белками. Оказалось, что коннексины обладают быстрым
метаболизмом, который составляет от 1,5 до 2 ч. Было показано, что деградация Сх зависит от фосфорилирования, которое ведет к дестабилизации некоторых подтипов коннексинов. Быстрый метаболизм
обеспечивает дополнительный механизм, по которому МКЩС может быстро регулироваться веществами, влияющими на период полураспада мРНК Сх, трансляцию, внутриклеточный перенос и сборку Сх в
щелевое соединение. Другим способом регуляции проницаемости щелевого соединения является полное
или частичное закрытие канальцев щелевого соединения при некоторых обстоятельствах путем механического скручивания шести субъединиц коннексона. Известно, что на регуляцию запирания щелевых
соединений влияют коканцерогенные факторы, которые ухудшают МКЩС. Коканцерогенные факторы
это средства, которые усиливают или ускоряют онкогенез, если их давать неоднократно после начала
образования опухоли. Механизмы, с помощью которых коканцерогенные факторы модулируют МКЩС,
полностью не понятны, но есть данные в поддержку того, что коканцерогенные факторы могут воздействовать на МКЩС альтерацией фосфорилирования Сх и/или ингибирования экспрессии Сх и их сборки.
Недавние результаты показали, что опосредованный ретровирусом генный in vivo перенос коннексина 43
в злокачественных образованиях с низкой пропускной способностью МКЩС значительно уменьшала
онкогенность[56]. Показано, что еще одной поддержкой важной роли нормальной МКЩС в профилактике
рака является то, что мыши с дефицитом Сх32 имеют очень высокую частоту спонтанных опухолей печени и повышенную чувствительность к развитию стимулированной химическими веществами опухоли
печени[57]. Кроме того, для активности фенобарбитала по развитию опухоли требуется функциональный
Сх32, обеспечивающий развитие опухоли[58]. Из этого следует предположение, что для онкогенной активности фенобарбитала[58] важен разрыв МКЩС.
Карценогенез характеризуется прогрессирующим нарушением механизмов регуляции роста, в которые вовлечены факторы роста, онкогены и гены-подавители опухоли. Так как альтерация МКЩС могла бы привести к альтерации регуляции роста, влияние факторов роста и онкогенов на МКЩС могло бы
быть критическим для онкогенеза. Было показано, что несколько онкогенов участвуют в низкоуровневой
регуляции МКЩС[59]. Показано, что pp60v-src участвует в закрытии щелевого соединения Сх43 через шаровой и цепочный механизм, который включает фосфориляцию остатка серина С-концевого участка с
помощью MAP киназы[59]. Интересно, что в некоторых случаях клетки, трансфицированные онкогеном,
могут связываться друг с другом, но испытывают недостаток гетерологичной коммуникации с соседними
нормальными клетками.
Проницаемость щелевых соединений в клетках опухоли при использовании анализа передачи красителя была ниже, чем МКЩС в окружающей ткани печени. Интересно, что много опухолей заключены
в матрицеподобную внеклеточную структуру и физически отделены от нормальной ткани.
Малигнизация в нормальных тканях человека происходит в результате накопления генетических
изменений. Однако общая проблема карциногенеза и онкогенеза - низкоуровневая регуляция МКЩС.
Экспрессия различных коннексинов тканеспецифична. Сх43, Сх26, Сх32 были обнаружены в нормальной ткани груди. Был проанализирован ряд случаев рака груди человека для уровня экспрессии Сх43.
Щелевые соединения Сх43 не наблюдались в карциномах из эпителия протоков по месту, инфильтрирующих карциномах из эпителия протоков, и инфильтрирующих лобулярных карциномах, и, как оказалось, они независимы от состояния эстрогена, прогестерона и erbB2 рецептора. Напротив, линии клеток
- 58 -
007792
рака груди человека и ткани карциномы молочной железы грызунов показали низкоуровневую регуляцию Сх43 и оказалось, что они находятся на уровне мРНК, предполагая наличие транскрипционного механизма для уменьшения белка Сх43 при раке груди[60]. Другим примером связи между раком и МКЩС
является гепатоцеллюлярная карцинома, у которой выбывание коннексина 32 говорит о специфичности
типа рака[57]. Исследование с овальными клетками показало, что они могут дифференцировать в гепатоциты и что неопластические производные овальных клеток могут вырабатывать как гепатоцеллюлярные
неоплазмы, так и неоплазмы желчных путей. Специфичный коннексин, экспрессируемый дифференцирующейся овальной клеткой, определяет, устанавливается ли коммуникация между клеткой и гепатоцитами или эпителиальными клетками желчных путей. Эта коммуникация может быть необходимой для
дальнейшей дифференцировки и регулируемого роста дифференцирующихся овальных клеток, а ухудшение МКЩС может внести свой вклад в формирование гепатоцеллюлярных и холангоцеллюлярных
неоплазм. Таким образом, МКЩС может быть ключевым фактором при дифференцировке овальных клеток, и блокированная МКЩС может поддержать их малигнизацию. Кроме того, in vitro анализ инвазии
опухоли в эндотелиальные клетки легкого крысы, обработанные малотилатом, показал, что малотилат
поддерживал развитие межклеточной адгезии посредством щелевого соединения, что приводило к ингибированию инвазии клеток опухоли[61]. Взятые вместе, эти результаты хорошо поддерживают гипотезу о
том, что альтерация МКЩС является критическим случаем в онкогенезе, и что вещества по настоящему
изобретению, которые усиливают МКЩС, могли бы быть полезны при терапии рака. Поэтому, еще одной целью настоящего изобретения являются новые химические соединения, которые усиливают
МКЩС. Мы предполагаем, что пептидные соединения по формулам I-VIII, формулам 2-12, и химические
соединения, представленные в табл. 1 и 8, могут быть особенно полезны в качестве лекарственных
средств при лечении рака вследствие их низкой эффективной концентрации и, следовательно, низкой
токсичности.
Пептиды применяются при следующих состояниях, связанных с раком: прогрессирование опухоли:
во время онкогенеза прерывание физиологического взаимодействия нормальных элементов с их соседними клетками, и потеря особенностей дифференцировки являются общим знаменателем в прогрессировании опухоли. Как полагают, альтерация коммуникации щелевого соединения относится к самым ранним изменениям при онкогенезе клетки; в работах авторов: Волбург X., Ролманн А. "Международный
обзор цитологии" (Wolburg H, Rohlmann A. Int Rev. Cytol.) 1995; 157: 315-73; Клаунинг Дж.Е., Руч Р.Дж.
(Klaunig JE, Ruch RJ.) 1990; 135-46; Кюнг-Сан Канг, Джан-Вон Юн, БьюнгСу Юун, Юун-Кю Лим и ЮнгСун Ли (Kyung-Sun Kang, Jun-Won Yun, В youngSu Y oon, Yoon-Kyu Lim и Yong-Soon Lee) (Письма о
Раке (Cancer Letters)) 166 (2001) 147-153, показано, что предварительная и совместная инкубация с GeO2
в эпителиальных клетках печени крыс, обработанных ТРА, исключает низкоуровневую регуляцию
МКЩС с помощью ТРА, при этом предполагается, что вещество, которое восстанавливает ингибирование МКЩС, может использоваться при профилактике или ингибировании активации опухоли. Авторы
Сузуки Дж., На Х.-К., Упам Б.Л., Чанг С.С. и Троско Дж.Е. (Suzuki J, Na H-K, Upham BL, Chang C.C и
Trosko JE) в работе "Питание и Рак", т. 36 № 1, стр. 122-128 показали, что пищевая добавка лямбдакарагена замедляет МКЩС в эпителиальных клетках печени крысы, подобно тому, как это делает хорошо известный сложный эфир форбола промотора опухоли (ТРА), и поэтому может играть роль в карциногенезе как средство активирующее опухоль. Таким образом, химические соединения по настоящему
изобретению могут использоваться при профилактике или лечении рака, вызванного промоторами опухоли, типа ТРА и лямбда-карагена.
Устойчивость к чувствительности к лекарственным средствам: улучшенная коммуникация по щелевому соединению улучшает микросреду в опухолях (Каристинос Г.Д., Алаой-джамали М.А., Фиппс
Дж., Иен Л., Батист Г. (Carystinos GD, Alaou-jamali MA, Phlpps J, Yen L, Batist G)). Метастаз: потеря межклеточной коммуникации по щелевому соединению связана с высоким метастатическим потенциалом у
всех видов рака с метастатическими потенциалами. (Саундерс М.М., Серай М.Дж., Ли 3., Жоу 3., Уинтер
СР., Уелч Д.Р., Донахью Х.Дж. (Saunders мМ, Seraj MJ, Li Z, Zhou Z., Winter CR, Welch DR, Donahue HJ.)
"Исследование рака" (Cancer Res.), 2001 г.; 61: 1765-1767), Николсон Г.И., Дулски К.М., Троско Дж.Е.,
(Nicolson GI, Dulski KM, Trosko ГС. Труды Академии Наук США (Proс. Natl. Acad. USA, 1988 г.; 85: 4736)). Профилактика метастаз выполняется обработкой веществом, открывающим щелевые соединения,
которое сохраняет коммуникацию по щелевому соединению в опухолях.
Обработка является дополнением к обычной химиотерапии.
Экспериментальный пример 9.
Влияние химического соединении 2 на ухудшение коммуникации по щелевому соединению, вызванное
ДДТ в остеобластах человека
Протокол и результаты
Химическое соединение 1,1-бис(р-хлорофенил)-2,2,2-трихлорэтан, известное также как инсектицид
ДДТ, является ингибитором коммуникации по щелевому соединению и обладает способностью активировать опухоль. Оно замедляет межклеточную коммуникацию, путем уменьшения числа и размеров щелевых соединений, а также с помощью пониженных клеточных уровней фосфорилируемых (активных)
форм белка Сх43 щелевого соединения, и эти действия считаются стержневыми для онкогенных свойств
- 59 -
007792
химических соединений [62-64]. Таким образом, химические соединения со способностью предотвращать
ухудшение МКЩС, вызванное промотором опухоли, могут быть потенциальными кандидатами на использование при защите от активации опухоли и при лечении рака[65]. Для исследования способности
веществ по настоящему изобретению предотвращать ухудшение МКЩС, вызванное промотором опухоли, было исследовано влияние Химического соединения 2 на нарушение купирования остеобластов человека, вызванное ДДТ.
Способы
Клеточная культура
Остеобласты человека: клетки выделялись из костного мозга человека, путем пункции в задней
подвздошной части позвоночного столба здоровых добровольцев (В возрасте 20-36 лет): 10-15 мл материала костного мозга собиралось в 15 мл PBS+Ca, Mg (компания Лайф Технолоджис, Кат. № 14040) с
100 ед./мл гепарина (компания Сигма, Кат. № Н-3149). Мононуклеарная фракция костного мозга выделялась на градиенте Lymphoprep (компания Никомед Фарма, Кат. № 1001967) центрифугированием при
2200 об./мин в течение 30 мин. После сбора клеток, мононуклеарная фракция промывалась один раз в
культуральной среде и центрифугировалась при 1800 об./мин в течение 10 мин. Затем клетки считали и
высевали в культуральной среде при плотности 8х106 клеток на 100 мм кюветы. Культуральная среда
остеобласта человека (все реактивы получены из компании Лайф Технолоджис): MEM w/o феноловый
красный w/глутамакс (Кат. № 041-93013) с добавлением 10%-ой убитой теплом эмбриональной сыворотки теленка (Кат. № 10106) и 0,1% пенициллина/стрептомицина (Кат. № 15140). Культуральная среда заменялась на следующий день и клетки культивировались при 37°С в среде 5% СO2 с заменой культуральной среды каждые 7 дней. После 3-4 недель культуры клетки достигли 70%-ой сплошности. Затем в
культуральную среду в течение 7 дней добавлялось 100 нМ дексаметазона (компания Сигма, Кат. № D4902). Затем клетки высевались для экспериментов с видеоизображением: 25 мм #1 стеклянное покровное стекло помещалось в кювету размером 35 мм (или в каждую лунку кюветы из 6 лунок), клетки высевались с плотностью 2,5x105 клеток на покровное стекло и культивировались в течение 2-3 дней перед
использованием.
Микроинъекция
Клетки культивировались на покровных стеклах и прикреплались к культуральной камере PDMI-2
(компания медикал Системе), хранившейся при 37°С в переохлажденном СO2, на микроскопе Цейс Аксиоверт. Микроинъекции выполнялись с использованием микроманипулятора Эппендорф (Eppendorf)
5171 и системы Эппендорф Трансджектор (Eppendorf Transjector) 5346. В микропипетку загружались 10
мМ раствора Желтый Люцифер (компания Сигма, кат. № L-0259). В клетку в мономолекулярном слое
осторожно вводился Желтый Люцифер в течение 30 с; микропипетка удалялась из клетки и спустя 30 с
считалось количество клеток, которые демонстрировали передачу красителя. Свет возбуждения (340 и
380 нм) подавался от монохроматора (компания Фотоникс (T.I.LL. Photonics GmbH)). Изображения захватывались камерой на приборах с зарядовой связью (компания Дэйдж МТИ (Dage MTI)) и переводились в цифровую форму с помощью платы обработки изображения Матрокс МВП (Matrox MVP) при
использовании программного обеспечения для обработки изображения MetaMorph (компания Универсал
Имаджинг).
Результаты
Для оценки способности модификаторов щелевого соединения предотвращать активацию опухоли,
мы хотели проверить, могут ли модификаторы щелевого соединения направить в обратную сторону процесс ухудшения коммуникации по щелевому соединению, вызванный хорошо известным средством активации опухоли ДДТ. Для этого мономолекулярные слои остеобласта человека выдерживалось на стеклянных покровных стеклах при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5%-ую СO2. ДДТ добавлялось к культуральной среде с конечной концентрацией 13 мкМ и оставлялось на 60 мин.
Для оценки влияния химического соединения 2 на прямое купирование клеток после обработки с
использованием ДДТ выполнялись эксперименты по микроинъекции согласно способу, описанному выше. Краситель Желтый Люцифер вводился в один единственный в мономолекулярном слое остеобласт
человека. Спустя 30 с оценивалось количество клеток, содержащих краситель. В контрольных условиях
(без обработки ДДТ) краситель распространялся в среднем на 14,5 клеток (n=12). Тот же самый эксперимент выполнялся с клетками, обработанными ДДТ. Эти клетки показали ухудшение купирования клеток
в среднем до 7 (n=13). Химическое соединение 2 добавлялось к раствору в ванне до конечной концентрации 10-8 моль/л и после 10 мин выполнялась еще одна микроинъекция. Химическое соединение 2
обеспечивает усиление межклеточной передачи красителя в среднем до 8,3 клеток (фиг. 15). Это увеличение очень важно при выполнении непараметрического статистического испытания Уилконсона (Wilcoxon) с р <0,01. Таким образом, вещества, открывающие щелевые соединения, способны направить в
обратную сторону процесс ухудшения купирования клеток, связанный с активацией опухоли, из чего
можно стелать предположение, что вещества по настоящему изобретению могут использоваться в химиопрофилактике и/или лечении рака. Химические соединения по настоящему изобретению полезны при
приготовлении лекарственных средств при химиопрофилактике и/или лечении рака. Химические соединения по настоящему изобретению могут также использоваться в комбинированной терапии с другими
- 60 -
007792
противораковыми средствами. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике и/или лечении
рака. Эта цель достигается путем использования пептидных соединений по настоящему изобретению
типа химических соединений по формулам I-VIII, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55.
Другие фармакологические способы
Полезность пептидов, рассмотренных при описании способов терапевтического лечения, будет ясна
из дополнительных примеров.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на заживление ран
Рана является нарушением нормальной анатомии, включая кожу, и может быть хирургической или
травматической, или она может быть вторичной относительно некоторых болезней типа диабета, атеросклероза, неправильного питания и т.д. Нормальное заживление раны является системным процессом,
который осуществляется пошагово и включают гемостаз и воспаление. За этими процессами следует
коррекция, которая может длиться в течение многих лет и отвечает за формирование рубцовой ткани.
Гемостаз с фибрином отвечают за поверхность, ниже которой происходят перемещения и движения края
раны. Сразу начинаются эпителизация, фиброплазия и капиллярная пролиферация в заживающую рану.
Ангиогенные капиллярные ростки вторгаются в сгусток фибрина раны, и в течение нескольких дней организуются в капиллярную сеть по всей грануляционной ткани, также состоящей из лейкоцитов и фагоцитарных одноядерных клеток. Между различными компонентами ткани, вовлеченными в процесс заживления раны, происходит очень динамичное взаимодействие. Для успешного заживления раны очень
важен ангиогенный процесс. Межклеточная коммуникация по щелевому соединению важна для создания
фибробластов и пролиферации капиллярной сети. Для роста различных компонентов ткани необходимо
нормальное распределение коннексина 43.
Некоторые местные факторы, часто наблюдаемые при патологических состояниях, типа отека, ишемии, низкого кислородного потенциала и инфекции, могут задерживать процесс заживления раны. Заживление раны включает взаимодействия многих типов клеток, и, как полагают, межклеточная коммуникация, осуществляемая по щелевому соединению, играет важную роль в координации клеточного метаболизма во время роста и развития тканей и органов [66-68].
Мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС, могут
использоваться при лечении ран и, в частности, ускорять заживление ран. С учетом экспериментов на
ткани сердца и костной ткани можно предположить, что эти вещества обладают повышенной эффективностью при метаболических напряжениях (например, гипогликемии, гипоксии, ишемии), и можно сделать вывод, что эти вещества могут быть особенно полезны при лечении ишемических язв. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных
средств, применяемых при лечении ран и специфических ишемических язв. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам
I-VIII, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических
соединений из примеров синтеза 1-55.
Ранозаживляющие процессы
Процессы заживления - это ряд перекрывающих друг друга фаз, начинающихся с гемостаза (коагуляция). Второй фазой процесса заживления является каскад воспалительных реакций, в которых микробактериофаги накапливаются на стороне раны, и начинается образование грануляционной ткани, включая, помимо других компонентов, фибробласт и лимфоциты. Затем от границы раны с захватом всей
площади начинается миграция эпителиальных клеток. Для доставки питательных веществ, кислорода и
различных клеток происходит также прорастание капилляров из нормальной ткани в рану. Все клетки и
капиллярные клетки эндотелия имеют живую межклеточную коммуникацию через щелевые соединения
(Абдулла К.М., Лутра Г., Билски Дж.Дж., Абдулла С.А., Рейнолдс Л.П., Гразул-Билска А.Т. (Abdullah
K.M., Luthra Г., Bilski D., Abdullah S.A., Ryenolds L.P., Grazul-Bilska В.), эндокринология. 1999 г.; 10: 3541). В областях с плохим снабжением кислорода и/или высокой концентрацией свободных радикалов,
наблюдаемых в ранах с некротической тканью при диабете, при артериосклерозе, в хирургических ранах,
при отеке, инфекции, ожоговых ранах и при венозной недостаточности, происходит ухудшение коммуникации по щелевому соединению (Наги Дж.И., Хоссайн М.З., Линн Б.Д., Куперн Г.Е., Янг С., Турлей
Е.А. (Nagy Л., Hossain M.Z., Lynn B.D., Cupern G.E., Yang S., Turley E.A.) Дифференциация роста клетки.
1996 г.; 7: 745-51)).
Влияние вещества, открывающего щелевые соединения, проверялось in vitro в культуре фибробласта. Фибробласт отбирался из десны человека как описано у авторов Арора К.К., Ли у., МкКуллок С.
(Arora KK, Lee W, McCullock С.) "Американский журнал физиологии. Физиология клетки", 2000 г.; 279:
147-57. Клеточная культура подвергалась воздействию 10-10-10-8 нМ вещества, открывающего щелевые
соединения, и при этом наблюдался значительно более быстрый рост клеток. Рост клеток проверялся
обычными способами, с помощью измерения включения ядром тимидина во времени.
До и после воздействия химического соединения изучалась стимуляция роста эндотелиальных клеток и формирования эндотелиальной трубы с помощью веществ, открывающих щелевые соединения, как
- 61 -
007792
описано у авторов: Аштон А.У., Йокота Р., Джон Г., Жао С., Суадикани С.О., Спрей Д.С. Уаре Дж.А.
(Ashton A.W., Yokota R., John G., Zhao S., Suadicani S.O., Spray D.C., Ware J.A.) Биохимический журнал (J
Biol Chem.) 1999 г.; 274: 35562-70).
Вещества, открывающие щелевые соединения, стимулируют процессы заживления ран в слизистой
оболочке рта. Авторы Хара А. (Harа А) и другие. (Журнал гастроэнтерологии (J. Gastroenterol), февраль
1999 г., 34:1-6) идентифицировали коннексины 26 и 32 в слизистой оболочке рта человека как показатели
наличия щелевых соединений в этой ткане. Однако иммунофлюоресцентные исследования не выявили
никаких значительных различий в экспрессии коннексинов у пациентов с афтозным стоматитом и пациентов контрольных групп. Ирзогладин малеат, который усиливает межклеточную коммуникацию по щелевому соединению in vitro, был эффективен при лечении транзитарного и рецидивирующего афтозного
стоматита, а также симптоматического и лекарственного афтозного стоматита. Он также оказался полезен для профилактики эпизодов рецидивирующего афтозного стоматита с ежедневным введением препарата, предотвращающего рецидив стоматита. Таким же образом пептиды по настоящему изобретению
могут использоваться для ускорения процесса заживление раны в слизистой оболочке рта путем усиления межклеточной коммуникации по щелевому соединению в клетках слизистой оболочки рта; и пептиды по настоящему изобретению также полезны при лечении и профилактике афтозного стоматита.
Для обследования раны, заживающей in vivo, мышам от двух до четырех раз в день местно (диапазон концентраций 10-9-10-6 моль/л в водном геле) и парентерально (10-10-10-6 моль/кг) вводилось химическое соединение 2 и химическое соединение 40. Ниже panniculus carnosus с помощью 6-мм пункционной
биопсии на коже спины каждой мыши выполнялись две круглые эксцизиционные раны. После 5-дневной
обработки химическим соединением 2 и химическим соединением 40 с помощью микроскопии биопсий
производилась гистологическая оценка воздействия препаратов на кожу, и путем измерения диаметра
раны ежедневно измерялось заживление раны. Мы считаем, что химическое соединение 2 и химическое
соединение 40 по одиночке не воздействуют на структуру кожи, но оба химических соединения вместе
ускоряют заживление ран после биопсий.
Мы полагаем, что обработка с помощью вещества, открывающего щелевые соединения, обеспечит
наилучшую коммуникацию по щелевому соединению между различными клетками, и будет играть важную роль в сложном процессе репарации, и таким образом улучшит заживление раны. Химическое соединение будет применяться парентерально, местно, системно или перорально.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на заживление язвы желудка и язвы
двенадцатиперсной кишки
Щелевые соединения также играют важную роль в межклеточной коммуникации, пролиферации и
дифференцировке клеток слизистой оболочки желудка. Вещество, открывающее щелевые соединения,
будет стимулировать регенеративные процессы после образования поражения (Эндо К., Ватанабе С.,
Нагахара А., Хиросе М., Сато Т. (Endo К., Watanabe S., Nagahara A., Hirose M., Sato N.), Журнал Гастроэнтерологии и Гепатологии (J Gastroenterol Hepatol), 1995 г.; 10: 589-94).
Авторы Майн (Main) и другие продемонстрировали, что нормальная слизистая оболочка желудка
человека содержит и коннексин 32 и коннексин 43[69;70]. Напротив, слизистая оболочка желудка, вокруг
хронических язвенных поражений желудка, содержит меньшее количество коннексина 32 и коннексина
43. В работе Майна и других исследовалась зависимость между появлением коннексинов и заживлением
язвы. При наблюдении за заживлением язвы было отмечено, что количество коннексинов 32 и 43, которое уменьшалось на активной фазе язвы, почти вернулось на уровень, характерный для нормальной слизистой оболочки желудка. Эти данные говорят о том, что исчезновение как коннексина 32, так и коннексина 43 тесно связано с этапом поражений, вызванных хронической язвой желудка. Кроме того, при использовании модели хронической язвы желудка крысы, вызванной уксусной кислотой, та же группа исследователей продемонстрировала, что клиническое влияние циметидина, как противоязвенного лекарственного средства, тесно связано с повторным появлением коннексина 32[69].
Щелевые соединения играют важную роль в системе защиты слизистой оболочки желудка и реституции от поражения, вызванного кислотой. Согласно работе авторов: Такахаши Н., Джо Т., Йокояма И.,
Сено К., Номура Т., Охара X., Уеда Ф., Ито М. (Takahashi N., Joh T., Yokoyama Y., Seno К., Nomura T.,
Ohara H., Ueda F., Itoh M.), "Журнал лабораторной и клинической медицины" (J Lab Clin Med) 2000 г.;
136 (2):93-9, по мере накопления данных, становилось очевидно, что межклеточная коммуникация по
щелевому соединению (МКЩС) определяла возможность участия МКЩС в процессе реституции в слизистой оболочке желудка. Мужских особей крыс (Спраг-Долей - Sprague Dawley) не кормили и держали
под наркозом. Поражение желудка вызывалось перфузией раствором люминала с 0,2N HCl в течение 10
мин. Целостность слизистой оболочки желудка непрерывно контролировалась путем измерения выведения этилендиаминэтетрауксусной кислоты, меченой хромом-51, которая использовалась для анализа восстановления при повреждении. Перфузия 0,25% октанолом (ОСТ; ингибитор МКЩС) начиналась после
поражения кислотой с целью оценки его влияния на реституцию. Исследовалось также влияние ирзогладина (1 г; активатор МКЩС). МКЩС в слизистой оболочке желудка оценивалась иммуногистохимически с помощью моноклонального антитела белка щелевого соединения (коннексин 32). Восстановление
после поражения слизистой оболочки кислотой происходило быстро, если прекращалась перфузия ки- 62 -
007792
слотой (приблизительно в течение 60 мин). Октанол, который не вызывал никакого поражения нормальной слизистой оболочки желудка, значительно замедлял реституцию. IG менял направление процесса
ингибирования на обратное в зависимости от введенной дозы. В иммуногистохимическом исследовании
было продемонстрировано вызванное октанолом поражение щелевого соединения, но не после предварительной обработки IG. Исходя из этих данных можно предположить, что МКЩС может играть критическую роль в реституции в слизистой оболочке желудка крыс, и пептиды по настоящему изобретению
полезны при лечении язв, типа язвы желудка и двенадцатиперсной кишки. Для обоснования этого утверждения можно провести эксперименты на крысах с использованием общего экспериментального проекта
Такахаши Н. (Takahashi N) и других 2000-го года, на который ссылались выше, в котором крысам вводилось химическое соединение 2 и химическое соединение 40, которые были стабильны в кислом растворе
при концентрациях в диапазоне 10-11-10-7 М. Как ожидается, эти эксперименты покажут содействующее
влияние химического соединения 2 и химического соединения 40 на купирование клеток с помощью щелевого соединения и противодействие влиянию церулеина, что приводит к заживлению язвы желудка.
Вводиться пептиды будут перорально или парентерально, например внутривенно.
Поэтому вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС, могут содействовать
заживлению язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при
лечении язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки. Эта цель достигается с помощью пептидных
соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам I-VIII, формулам 212, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из
примеров синтеза 1-55.
Роль щелевых соединений в сосудистой биологии
Координация клеточных реакций на границе эндотелия между кровью и подлежащими тканями
опосредована множественными механизмами передачи сигналов, включая прямую межклеточную коммуникацию по щелевому соединению. Среди функций, в которые вовлечена эндотелиальная межклеточная коммуникация по щелевому соединению, - миграционное поведение эндотелиальных клеток после
поражения, ангиогенеза, эндотелиального роста и старения, и координация вазомоторной реакции[71].
Регуляция кровотока в широком динамическом диапазоне требует скоординированных реакций резистентности и питающих артерий. Такая координация между сосудами может быть достигнута с помощью сосудистых эффектов касательного напряжения, вызываемого кровотоком, или с помощью прохождения вазомоторных сигналов по клеткам сосудистой стенки. В действительности, местное применение
некоторых вазоактивных химических соединений типа ацетилхолина (ACh) или норэпинефрина (NE)
вызывало не только местное расширение или сужение, но также и вазомоторные реакции в нескольких
миллиметрах выше и ниже по течению[71]. Вазомоторные реакции могут также проходить от капилляров
до артериол и, могут вносить свой вклад в баланс между потребностью ткани и кровоснабжением. Это
было продемонстрировано следующим образом: когда отдельные волокна мускулатуры стимулировались на сокращение, артериолы выше по течению капилляров, снабжающие эти волокна, расширялись[72].
Высокая скорость проводимости совместима с электронной передачей сигнала по стенке сосуда.
Фактически было продемонстрировано, что локально вызванная гиперполяризация и деполяризация,
проходили в нескольких миллиметрах выше по течению в эндотелиальных клетках и сосудистых клетках
гладкой мускулатуры. Для прохождения электрического сигнала требуется купирование клеток сосудов
посредством щелевых соединений, которые создают каналы низкого электрического сопротивления между клетками. Сосудистая ткань экспрессирует не менее трех различных коннексинов (Сх) белков (Сх37,
Сх40 и Сх43), которые образуют щелевые соединения. Очевидно, что Сх40 является преобладающей
изоформой коннексина в аортальных эндотелиальных клетках, тогда как гладкая мускулатура в изобилии
экспрессирует Сх43.
Исследование мышей с дефицитом Сх40 (Сх40-/-) продемонстрировало, что распространение вазодилации, вызванной местным применением ацетилхолина или брадикинина, сильно ослаблено у животных с Сх40-/- по сравнению с нормальными дикими животными (Сх+/+)[73]. Кроме того, у животных с
Сх40-/- значительно повышено внутриартериальное кровяное давление по сравнению с давлением у нормальных диких мышей (Сх+/+). Эти результаты подтверждают, что Сх40 играет важную роль в сосудистой межклеточной коммуникации, и показывают, что нарушенная коммуникация по щелевому соединению в стенке сосуда связана с ухудшенной передачей зависимой от эндотелия реакции на сосудорасширяющие лекарственные средства, которые, в свою очередь, усиливают резистентность сосудов и вызывают артериальную гипертензию. Недавние in vivo исследования показали, что для регуляции кровяного
давления[74] чрезвычайно важны нормальные колебания давления в почке. Таким образом, вазомоторные
реакции, ослабленные вследствие слабого купирования клеток, могут вносить свой вклад в развитие артериальной гипертензии у животных с дефицитом Сх40.
Низкоуровневая регуляция уровня Сх43 мРНК и содержания белка в стареющих эндотелиальных
клетках предполагает, что нарушенная межклеточная коммуникация по щелевому соединению могла бы
играть определенную роль в процессе старения сосудов[75].
- 63 -
007792
Исходя из доступной информации относительно роли щелевых соединений в реакциях сосудов
можно предположить, что фармакологический состав, который улучшает купирование клеток с помощью щелевого соединения в стенке сосуда, может способствовать проводимым реакциям сосудов и
улучшать кровоснабжение при состояниях, для которых требуется усиленный обмен веществ (например,
физические упражнения, тахикардия) и при ишемии. Кроме того, такое вещество, вероятно, предотвратит и/или излечит артериальную гипертензию. Поэтому другой целью настоящего изобретения являются
химические соединения, которые увеличивают купирования клеток с помощью щелевого соединения
и/или МКЩС в стенке сосуда и, таким образом, полезны для профилактики или лечения артериальной
гипертензии. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа
химических соединений по формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных
в Таблицах 1 и 8, в частности химических соединений из примеров синтеза 1-55.
Экспериментальная методика
Во всех экспериментах по изолированной резистентности использовались артерии (внутренний
диаметр приблизительно 200 мм) брыжеечки крыс. Это артерии 3-го порядка ветвления брыжеечной артерии были вырезаны из брыжеечки 14-18-недельных мужских особей крыс Wistar. Артерии установлялись в миографе для измерений изометрической силы и пассивно натягивались с целью получения максимальных усилий. Ванночка с тканью была разделена на две части и артерия устанавливалась в каждой
из этих двух половин. Артерии находились в физиологическом забуференном бикарбонатном солевом
растворе и, если не оговаривалось иначе, в атмосфере 5% СO2 при 21% O2.
Для оценки сосудодвигательной реакции артерии активизировались с помощью норадреналина с
концентрацией близкой к максимальной. Это делалось после удаления эндотелия и с увеличивающимися
концентрациями цГМФ, который, как известно, усиливает сосудодвигательную реакцию и межклеточную коммуникацию.
Для оценки эндотелиальной функции артерии активизировались норадреналином с концентрацией
близкой к максимальной, и релаксировали в присутствии норадреналина с увеличивающимися концентрациями ацетилхолина, который, как известно, расслабляет артерии с участием эндотелия в этих артериях, при частичном участии NO и при частичном участии EDHF.
Влияние химического соединения 2 и химического соединения 40 концентрацией 10-8 М и 10-6 М
оценивалось по сосудодвигательной реакции и по реакциям на ацетилхолин. В случае присутствия лекарственного средства применялась предварительная выдержка в течение не менее 5 мин.
При оценке сосудодвигательной реакции одна артерия в ванночке с тканью является контрольной, а
другая артерия обрабатывается либо химическим соединением 2, либо химическим соединением 40.
В экспериментах с гипоксией ткани перед экспериментом подвергались воздействию 5% СО2 в N2 в
течение не менее 5 мин. Эта процедура снижает давление РО2 в ванночке приблизительно до 5 мм рт.ст.
Мы ожидаем, что химические соединения по настоящему изобретению усилят вазодилацию и сосудодвигательную реакцию, вызванные ацетилхолином. Следовательно, эти вещества будут полезны при
лечении артериальной гипертензии и сосудистых болезней, связанных с вазоконстрикцией. Способ введения будет пероральный или парентеральный.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на нервную ткань
Центральная нервная система экспрессирует восемь различных коннексинов (Сх 26, 30, 32, 37, 40,
43, 45, 46). Кроме того, Сх36 очевидно преимущественно экспрессируется в нейронах. Различные коннексины обеспечивают коммуникацию между разными совокупностями клеток или выделяются клетками в изолированные группы согласно их структуре экспрессии коннексина. Границы групп, в которых
гетеротипическая связь могло бы иметь функциональную актуальность, проходит между олигодендроцитами (Сх32, Сх45) и астроцитами (Сх43, Сх45, Сх40, Сх30) или нейронами (Сх26, Сх32, Сх43)[76].
Возможно, что определенные наборы коннексинов обеспечивают функциональное преимущество в
специфических группах мозга; то есть более высокая или более низкая единичная проводимость могла
бы функционально облегчать или ограничивать синхронизацию невральных входов или скорость проводимости.
В незрелых нейробластах и постнатальных нейронах было зарегистрировано[76; 77] расширенное купирование клеток с помощью щелевого соединения. Постнатальное увеличение нейронных щелевых соединений и их корковая организация заставляют задуматься о важной роли этих соединений в морфогенетических событиях, лежащих в основе критической фазы кортикогенеза. Участие щелевых соединений
в нейронном переносе усилено тем фактом, что нейромедиаторы способны модифицировать купирование с помощью щелевого соединения.
Поэтому, мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые, как известно, усиливают МКЩС, могут ускорять репарацию после поражения нерва или при пересадке незрелых клеток
(клеток предшественника) в ткань мозга. Среди технологий, которые в настоящее время проходят экспериментальную оценку для клеточной репарации в центральной нервной системе, имеется пересадка клеток предшественника, эмбриональной ткани, и вирусных векторов, которые используются для лечения
болезней типа болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и других нейродегенеративных болезней мозга.
- 64 -
007792
Повреждение аксона быстро активизирует микроглиальные и астроглиальные клетки близкие аксотомизированным нейронам. После поражения двигательного аксона, астроциты повышали регуляцию
коннексина-43 щелевого соединения в течение часа (часов) и в течение одного дня глиального фибриллярного кислого белка (GFAP). Одновременно, микроглиальные клетки распространяются и мигрируют
к аксотомизированным нейронам перикарионов. Гипотетическая схема активации глиальных клеток при
поражении аксона подразумевает, что сначала поврежденные нейроны посредством МКЩС взаимодействуют с соседними астроцитами. Затем актвизируются соседние покоящиеся микроглиальные клетки.
Эти глиальные реакции усиливаются паракринными и аутокринными механизмами, в которых цитокины, очевидно, являются важными посредниками. Специфические функциональные свойства активизированных глиальных клеток определяют их влияние на выживание нейронов, регенерацию аксона, и синаптическую пластичность. Поэтому управление индукцией и ходом этих реакций, вероятно, является критическим для исхода, например, при травме нервной системы, ишемии мозга и хронических нейродегенеративных болезнах[78].
Как полагают, щелевые соединения обеспечивают молекулярную связь для скоординированной
долгосрочной передачи сигналов среди отдельных членов глиальной группы. Точно также, астроциты
идеально подходят для метаболической поддержки нейронов, так как они функционально поляризованы
и их один край касается сосудистого слоя, а другой полюс подходит к нейронной паренхиме[76]. Таким
образом, неправильное функционирование таких поддерживающих механизмов может явиться причиной
неправильного функционирования объединенных проводящих путей нейронов и таким образом результатом болезней центральной нервной системы. Поэтому, мы предполагаем, что вещества по настоящему
изобретению, которые, как было продемонстрировано, усиливают МКЩС, могут предотвращать ишемическое поражение мозга путем увеличения метаболического обеспечения между глиальными клетками и
нейронами. Кроме того, вещества по настоящему изобретению могут иметь большое значение для больных с органическими психозами, которые могут проявляться в виде депрессии, беспокойства, нарушений
обучаемости и памяти, фобий и галлюцинаций. Таким образом, целью настоящего изобретения являются
химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике
ишемического поражения мозга и при лечении органических психозов, включая депрессию, беспокойство, нарушения обучаемости и памяти, фобии и галлюцинации. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению, если они выбираются или составляются с таким расчетом,
чтобы быть доступными для центральной нервной системы.
Нервная ткань
Известно, что микроглия является основным иммунным эффектором центральной нервной системы, и что она активизируюется в ответ на широкий диапазон повреждений, которые вызывают мозговые
воспалительные реакции, включая черепно-мозговую травму и ишемию, нейродегенеративные болезни,
аутоиммунные болезни, инфекционные болезни, прионные болезни, и опухоли мозга. Активизированная
микроглия мигрирует к пораженным областям центральной нервной системы, где клетки делятся и постепенно удаляют осколки клеток. Авторы Юдженин (Eugenin) и др. показали, что клетки микроглии
могут связываться друг с другом по щелевым соединениям, которые индуцируются воспалительными
цитокинами (Юдженин Е.А., экардт Д., Теис М., Уиллеке К., Беннетт М.В.Л. и Саез Дж.С. (Eugenin E.A.,
Eckardt D, Theis M., Willecke K., Bennett, M.V.L. и Saez, J.С.), "Микроглия в мозговых колотых ранах
экспрессирует коннексин 43 и in vitro формирует функциональные щелевые соединения после обработки
гамма интерфероном и альфа-фактором некроза опухоли", Труды Академии Наук США (Proс. Natl. Acad.
Sci. USA, т. 98, 4190-4195, 2001 г.). Это было продемонстрировано в следующих экспериментах. В мозговых колотых ранах микроглия прогрессивно накапливалась в течение нескольких дней и формировала
агрегаты, которые часто показывали иммунореактивность Сх43 на границах клеток. В первичной культуре микроглия показывала низкие уровни Сх43, определяемые вестерн-блоттингом, диффузную внутриклеточную иммунореактивность Сх43, и низкую частоту купирования красителем. Обработка только
иммуностимулирующим бактериальным липополисахаридом (LPS) или только гамма интерфероном цитокинов (INF-гамма) или только альфа-фактором некроза опухоли (TNF-альфа) не увеличивала частоту
купирования красителем. Однако микроглия, обработанная INF-гамма совместно с LPS показала драматическое усиление купирования красителем, которое предотвращалось при совместном применении антитела против TNF-альфа, что предполагало высвобождение и аутокринное действие TNF-альфа. Совместная обработка с помощью INF-гамма и TNF-альфа также значительно увеличила частоту купирования
красителем и уровни Сх43 с транслокацией Сх43 к межклеточным контактам. Индуцированное цитокином купирование красителем снова ингибировались с помощью 18-глицирретиновой кислоты - блокатором щелевого соединения. Культивируемая микроглия мыши также экспрессировала Сх43 и показывала
купирование красителем после обработки цитокинами, но микроглия от гомозиготных Сх43-дефицитных
мышей не проявляла значительного купирования красителем после совместной обработки либо INFгамма и LPS, либо INF-гамма и TNF-альфа.
Вследствие активации коммуникации по щелевому соединению с помощью химического соединения 2 и химического соединения 40 ожидается, что эти химические соединения будут способствовать
межклеточной коммуникации микроглии и таким образом увеличат или ускорят процессы "заживления"
- 65 -
007792
при вышеупомянутых болезнях (воспалительные реакции мозга, включая черепно-мозговую травму и
ишемию, нейродегенеративные болезни, аутоиммунные болезни, инфекционные болезни, прионные болезни и опухоли мозга).
Для обоснования этого утверждения можно провести эксперименты на культурах микроглии с применением общего экспериментального проекта Юдженина (Eugenin) и др., 2001 г., рассмотренного выше,
с введением в поврежденную микроглию химического соединения 2 и химического соединения 40 в концентрациях 10-11 - 10-8 М. Как ожидается, эти эксперименты покажут, что химическое соединение 2 и
химическое соединение 40 способствуют купированию с помощью щелевого соединения и противодействуют влиянию 18-альфа-глицирретиновой кислоты. Соединения по настоящему изобретению могут
также использоваться в модели in vitro, описанной авторами Наги Дж.И. (Nagy Л.) и Ли У.И. (Li W.E.)
"Европейский журнал евронауки" (Eur J Neurosci), декабрь 2000 г.; 12 (12):4567-72, для изучения, например, действия ишемии на регуляцию астроцитароного щелевого соединения.
Легочная ткань - альвеолярные клетки
Альвеолярная межклеточная коммуникация по щелевому соединению между альвеолярными клетками важна для осуществления ионного переноса, механохимической передачи сигнала, регуляции роста
клеток и выделения фактора поверхностно-активного вещества (Ашино Ю., Инг X., Доббс Л.Г., Баттачаря Дж. (Ashino Y, Ying X, Dobbs LG, Bhattacharya J.) "Американский журнал физиологии легкого и молекулярной физиологии" (Am J Physiol Lung Mol Physiol)2000 г.; 279: L5-L13). In vivo репарация после острого и хронического воспалительного поражения альвеолярной области легкого включает формирование
фибронектина как части внеклеточной матрицы (Чараш У.Е., винсент П.А., Саба Т.М., Миннеар Ф.Л.,
Мк-Кеоун-Лонго П.Дж., Миглиоззи Дж.А., Льюис Е., Гиунта С. (Charash WE, Vincent PA, Saba TM,
Minnеar FL, Mc-Keown-Longo PJ, Migliozzi JA, Lewis E, Giunta С. "Американское обозрение респираторных болезней" (Am Rev Respir Dis) 1993 г.; 148: 467-476) и Ториката С, виллигер Б., Чарлес Кун И.,
МкДональд Дж.А. (Torikata С; Villiger В, Charles Kuhn I, McDonald JA) "Лабораторные исследования"
(Lab Invest) 1985 г.; 52: 399-408). Исследование альвеолярной эпителиальной клеточной культуры продемонстрировало увеличение количества щелевых соединений параллельно увеличению внеклеточной
концентрации фибронектина (Алфорд А.И., Раннелс Д.Е. (Alford AI, Rannels DE) "Американский журнал
физиологии легкого и молекулярной физиологии", 2001 г.; 280:L680-L688). При in vivo исследованиях на
животных было обнаружено уменьшение количества щелевых соединений после тяжелого воспаления
легких, стимулированного двуокисью азота, как в альвеолярной ткани, стенках оконечных бронхиол,
альвеолярных каналах, так и в перибронхиолярных альвеолах. Эти результаты зависели от дозы. Однако
предварительное введение таурина предотвращало эту потерю щелевых соединений и уменьшало воспалительные реакции. После облучения легкого крысы и после обработки химиотерапевтическим соединением (Блеомицином) были получены одинаковые результаты.
Таким образом, сохранение коммуникации по щелевому соединению в ткани легкого, очевидно,
важно для предотвращения фиброза легкого, и пониженное количество коннексинов наблюдается как
реакция на воспалительные процессы, на различные токсические стимулы, типа газовой ингаляции, деструктивных веществ, переносимых по воздуху, и на радиацию. Предварительная обработка химическим
соединением, которое способствует открытию щелевого соединения или коммуникации по щелевому
соединению, будет показана до терапевтического облучения легких, например при раке легкого, при лечении рака груди, щитовидной железы и желудка.
В способах лечения по настоящему изобретению может использоваться одно или большее число
химических соединений, описанных здесь, как единственное активное средство. Желательно использовать одно из химических соединений. При желании такие химические соединения могут использоваться
для профилактики, то есть, для предотвращения специфических проявлений или состояний или для
уменьшения степени их проявления. В другом случае эти химические соединения могут использоваться
в сочетании с признанным терапевтическим подходом. При использовании облучения желательно, чтобы
такой способ лечения был дополнительным, то есть, сочетался с признанной терапией для лечения данного состояния. Такие дополнительные способы лечения по настоящему изобретению могут применяться при необходимости одновременно с признанной терапией или в разное с ней время. Принятые терапевтические подходы для ряда болезней и болезненных состояний были описаны, например, в работах
Принципы Харрисона при лечении внутренних органов "Harrison's Principles of Internal Medicine" (1991
г.) 12 издание; издательство МкГро-Хилл (McGraw-Hill, Inc.) и Фармакологическое основание терапии
(1996 г.) Гудман, Луи С. 9-е издание, Пергаммон Пресс, которые включены в данном случае в качестве
ссылок.
Обработка химическим соединением, которое способствует открытию щелевого соединения или
участвует в нем, предотвращает дальнейшее ухудшение функции легкого при эмфиземе, асбестозе, силикозе, фиброзе легкого, пневмониях, фиброзе легкого, вызванном лекарственным средством и у больных,
подвергаемых воздействию токсичных для легких газов типа диоксида азота. Желательно, чтобы такая
обработка была дополнением к обычному лечению этих состояний.
Химические соединения могут быть проверены in vitro в клеточной культуре альвеолярного эпителия, выделяемой из легкого крысы (Раннелс СР., Раннелс Д.Е. (Rannels S.R., Rannels D.E.) (Цитобиология
- 66 -
007792
клетки. Лабораторный справочний, редактор Селис Дж.Е. (Celis JE) Сан-Диего, шт. Калифорния, США,:
издательство "Академик", 1994 г., стр. 116-123), Абрахам В., Чоу М.Л., Деболт К.М., Ковал М. (Abraham
V., Chou М.Л., DeBolt K.M., Koval M. (Американский журнал физиологии легкого и молекулярной физиологии 1999 г.; 276: L825-L834)) или из коммерчески доступной линии клеток человека. Клетки могут
культивироваться в стандартной покрытой коллагеном пластиковой чашке с культуральной тканью в
минимально эссенцифальной среде Эрла, содержащей антибиотики и эмбриональную бычую сыворотку.
Клетки растут до образования сплошного слоя. Коммуникация по щелевому соединению измеряется непосредственно с помощью 4% раствора Желтый Люцифер при введении 150 мМ LiCl в клетку с помощью микроинъекции. Флуоресцентный индикатор заполняет клетки посредством простой диффузии в
течение 3 мин. После инъекции пипетка удаляется и считается количество флуоресцентных клеток. Количество флуоресцентных клеток считается при действии различных ингибиторов щелевых соединений
при обработке различными дозами (или без таковой) веществ (пептидов), способствующих коммуникации по щелевому соединению в диапазоне 10-10-10-7 М.
Предпочтительное в данном случае вещество, открывающее щелевые соединения типа Химического соединения 2, будет также испытываться in vivo на экспериментальных животных во время фиброза
легких, вызванного лекарственным средством, и фиброза легких, вызванного облучением. Животные
подвергаются действию индуктора, и результат оценивается и сравнивается с результатом, полученным
на животных, предварительно обработанных химическим соединением 2. Дозировки будут находиться в
диапазоне 10-10 до 10-7 моль/кг в зависимости от биологической кинетики химического соединения, например, как определено при модельной аритмии, вызванной хлоридом кальция. Химическое соединение
может применяться перорально, парентерально, через нос или как ингаляция в легкие.
Гладкая мускулатура
Сосудистая система. Межклеточная коммуникация через канальцы щелевого соединения играет
фундаментальную роль в регуляции и модуляции тонуса миоцита сосудов по всему сосудистому дереву
(Крист Г.Л., Спрей Д.С., Мор Л.К., Эль-Саббан М.Е., Бринк П.Р., (Christ G.L., Sprey D.C., Moore L.K., ElSabban M.E., Brink P.R.) "Исследование кровообращения" (Circ Res), 1996 г.; 79: 631-646). Другая важная
роль, которую играет коммуникация по щелевому соединению состоит в распространении гиперполяризации среди клеток гладкой мускулатуры, участвующих в реакции расслабления сосудов (Бенни Дж.Л.,
Пайца С. (Benny J.L., Paicca С.) "Американский журнал физиологии; Физиология сердечно-сосудистой
системы" 1994 г.; 266: Н1465-72). Для обеспечения специализированных функций эндотелия необходима
межклеточная коммуникация по щелевому соединению между клетками эндотелия в пределах мономолекулярного слоя и между эндотелием и другими клетками стенки сосуда. В нескольких исследованиях
была зарегистрирована коммуникация по щелевому соединению между этими различными типами клеток в коронарных капиллярах, а также во всех других сосудах. Было также продемонстрировано участие
в адаптивном артериогенезе (Цаи У-Дж., Котлаи С, Коцис Е., Сколц Д., Шапер У., Шапер Дж. (Cai W-J,
Koltai С, Kocsis E, Scholz D, Shaper W, Schaper J) "Журнал молекулярной и клеточной кардиологии", (J
Mol Cell Cardiol)2001 г.; 33: 957-67), Ванг, Х.-З., Дэй Н., Валцис М., Хси К., Серелс С, Бринк П.Р. Крист
Г.Дж. (Wang H-Z, Day N, Valcic M., Hsieh К, Serels С, Brink PR, Christ GJ) "Американский журнал физиологии; Физиология клетки", 2001 г.; 281: С75-88, Шустер А., Ойши X., Бенни Дж.-Л., Стергиопулос Н.,
Мейсатер Дж.-Дж. (Schuster A, Oishi H, Benny J-L, Stergiopulos N, Meisater J-J) "Американский журнал
физиологии; Физиология сердечно-сосудистой системы", 2001 г.; 280: H1088-96).
В различных патофизиологических ситуациях с разрывом эндотелиального мономолекулярного
слоя сосудов в результате гиперхолестеринемических поражений, вызванных питанием, коммуникация
по щелевому соединению гладкой мускулатуры сосудов ухудшается (Полацек Д., Бех Ф., МкКинзи
Дж.Ф., Давис П.Ф. (Polacek D, Bech F, McKinsey IF, Davies PF) "Журнал сосудистых исследований" (J
Vase Res), 1997 г.; 34: 19-30). Во время венозного застоя и при развитии тромбофлебита наблюдалось
повреждение клеточного слоя эндотелия. Авторы Квак Б.Р., Пеппер М.С., Грос Д.Б., Меда П. (Kwak BR,
Pepper MS, Gros DB, Meda P) "(Молекулярная биология клетки" (Mol Biol Cell), 2001 г.; 12: 831-845, продемонстрировали, что коммуникация по щелевому соединению служит для координации клетки во время
миграции в процессе эндотелиальной репарации, а также играет важную роль для прорастания капилляров во время ангиогенеза.
Обработка химическими соединениями, которые способствуют коммуникации по щелевому соединению, улучшает нарушенную внутриклеточную коммуникацию в поврежденных сосудистых областях,
и особенно полезна при ишемии органа, например claudicatio intermittens и инфаркте миокарда.
Однако после повреждений баллонным катетером сонной артерии крысы процесс заживления сосуда характеризуется улучшенной коммуникацией по щелевому соединению - Ие Х.И., Лупу Ф., Дюпон Е.,
Северс Н.Дж. (Yeh HI, Lupu F, Dupont E, Severs NJ) "Артериосклероз, тромбоцитоз, сосудистая биология", 1997 г.; 17:3174-84. Химическое соединение вводится перед вмешательством с применением баллона и предпочтительно является дополнительной терапией к обычному лечению этого состояния. Состав
вводится парентерально.
Это влияние будет проверяться на ткани, отбираемой до и через разное время после повреждения
баллонным катетером. Более быстрое заживление эндотелиальной поверхности будет наблюдаться с по- 67 -
007792
мощью обычного микроскопа. Будет наблюдаться также усиление коммуникации по щелевому соединению.
("Артериосклероз, тромбоцитоз, сосудистая биология", 1997 г.; 17:3174-84). Обработка веществами,
открывающими щелевое соединение, ускоряет процесс заживления.
Профилактическое влияние обработки веществом, открывающим щелевые соединения, например,
Химическим соединением 2 и химическим соединением 40, будет проверяться на экспериментальной
установке, как описано у авторов: Ие Х.И., Лупу Ф., Дюпон Е., Северс Н.Дж. (Yeh H.I., Lupu F., Dupont
E., Severs N.J.) "Артериосклероз, тромбоцитоз, сосудистая биология", 1997 г.; 17:3174-84. Химическое
соединение 2 или химическое соединение 40 будет применяться перед вмешательством с использованием баллона с дозировкой в диапазоне от 10-11 до 10-8 в зависимости от биологической кинетики химического соединения как определено, например, в модели аритмии, вызванной хлоридом кальция, описанной выше. Ткань отбирается до и в разное время после поражения балонным катетером. Более быстрое
заживление эндотелиальной поверхности будет наблюдаться с помощью обычного микроскопа. Будет
наблюдаться также усиление коммуникации по щелевому соединению.
Химическое соединение будет вводиться, например, парентерально.
При другом заболевании нарушается коммуникация по щелевому соединению между клетками
гладкой мускулатуры. При Corpus cavernosum посредством щелевого соединения образуется синцитальная клеточная сеть, которая критична к эректильной функции, и отвечает за то, чтобы корпоральные и
артериальные клетки гладкой мускулатуры полового члена реагировали одинаково и скоординированно:
Крист Г.Дж. (Christ GJ) "Международный журнал исследований половой слабости" (Int J Impot Res), 2000
г.; 12 приложение 4: S15-25; Мелман А., Крист Г.Дж. (Melman A, Christ GJ) "Урологическая клиника Северной Америки" (Urolog Clin North America), 2001 г.; 28: 217-31. Нарушение эректильной функции замечено при диабете, артериосклерозе, различных неврологических болезнях и многих хронических болезнях. Исходя из исследований при диабете можно сделать вывод, что обратная корреляция между иннервацией нервов и купированием клеток указывает на потенциальную функциональную пластичность
корпоральной среды, хотя не устанавливает функциональную межклеточную коммуникацию по щелевому соединению.
Обработка химическим соединением, которое способствует открытию щелевого соединения, улучшает коммуникацию по щелевому соединению и таким образом подвергает нормализации сложную координацию между клетками гладкой мускулатуры в corpus cavernosum и сосудах. Корпоративные гладкие клетки, которые брались у крыс, устанавливались как описано у авторов: Крист Г.Дж., Морено А.П.,
Мелман А., Спрей Д.С. (Chist GJ, Moreno АР, Melman A, Spray DC) "Американский журнал физиологии"
(Am J Physiol), 1992 г.; 263: С373-83. Коммуникация по щелевому соединению измеряется с помощью
Желтого Люцифера, или с помощью микроинъекции другого флуоресцентного красителя, как описано
выше, или способа FACS, описанного Джаал М.Х. (Juul MH) и др. "Коммуникация при клеточной адгезии" (Cell Adhes Cornmun), 2000 г.; 7 (6); 501-12. Количество флуоресцентных клеток считается при действии различных ингибиторов щелевых соединений при обработке различными дозами (или без таковой)
веществ, открывающих щелевые соединения, например, с помощью Химического соединения 2 или Химического соединения 40 в диапазоне 10-10-10-8 нМ. После воздействия веществами, открывающими щелевые соединения, упомянутой концентрации идентифицируется улучшение коммуникации по щелевому
соединению более чем на 25-50%.
In vivo фармакологическое испытание влияния химических соединений на эректильную функцию
крыс (8 недель) будет проводиться спустя 10 недель после диабета, стимулированного срептозотоцином
(35 мг/кг внутрибрюшинно), как описано у авторов: Реман Дж., Чевен Е., Бринк П., Петерсеон В., Уалкотт Б., Уен Ю.П., Мелман А., Крист Г. (Rehman J, Cheven E, Brink P, Peterseon В, Walcott В, Wen YP,
Melman A, Christ G) "Журнал физиологии", 1997 г.; 272: H1960-71. Рефлексы полового члена и давление
внутри каверн измерялись при местном и системном введении различных доз различных веществ, открывающих щелевые соединения, способами, описанными той же самой группой исследователей. Будет
наблюдаться усиление рефлексов полового члена и давления внутри каверн на 25% или выше.
Лечение эректильной дисфункции может применяться или локально в пещеристое тело полового
члена, в виде подкожной инъекции, или перорально. Лечение будет проводиться либо как монотерапия,
либо в виде дополнительного к обычному лечению этого состояния.
Диабетическая ретинопатия может быть диагностирована на очень раннем этапе после начала болезни путем идентификации изменения в скорости кровотока (Бурселл С.-В., Клермон А.С., Шиба Т.,
Кинг Г.Л. (Bursell S-V, Clermont AC, Shiba T, King GL) "Исследования по офтальмологии" (Curr Eye Res),
1992 г.; 11; 287-95), идентификации распада гематоретинального барьера (Чунха-Ваз Дж.Г., Фариа де
Абру Дж.Р., Кампос А.Дж., Фиго Г.М. (Cunha-Vaz JG, Faria de Abru JR, Campos AJ, Figo GM) "Британский журнал офтальмологии" (Br J Ophthalmol), 1975 г.; 59: 649-56), Кармо А., Рамос П., Райc А., Проенца Р., Кунха-Ваз Дж.Г. (Carmo A, Ramos P, Reis A, Proenca R, Cunha-Vaz JG) "Экспериментальные исследования по офтальмологии" (Exp Eye Res), 1998 г.; 67; 569-75), и/или идентификации потери саморегуляции (Конер Е.М., Пател В., Рассам С.М.Б. (Kohner EM, Patel V, Rassam SMB), "Диабет" (Diabetes), 1995
г.; 44: 603-607). Как при использовании медода переноса индикатора, так и метода фиксации потенциала
- 68 -
007792
двойных клеток (пэтч-кламп) авторы Оку X., Кода Т., Сакагами К., Пуро Д.Г. (Oku H, Koda T, Sakagami
К, Puro DG), "Офтальмологические исследования. Наука о зрении" (Invest Ophthalmol Vis Sci), 2001 г.;
42: 1915-1920, продемонстрировали наличие обширного купирования клеток. Закрытие канальцев щелевого соединения разрывает многоклеточную организацию микрососуда сетчатки и вносить вклад в диабетическую дисфункцию сосудов сетчатки. Авторы Жоу З.И., Сугавара К., Хаши Р., Муратомо К., Маватари К., Мацукава Т., Лиу З.У., Девадас М., Като С. (Zhou Z.Y., Sugawara K., Hashi R., Muramoto K.,
Mawatari K., Matsukawa T., Liu Z.W., Devadas M., Kato S.), "Невронаука" (Neurosience), 2001 г.; 102: 95967, также продемонстрировали, что химически активный кислород участвует в разрыве купирования
клеток с помощью щелевого соединения в сетчатке и при повторном купировании при поступлении глютатиона.
Будет изучаться in vitro влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на диабетическую
ретинопатию модельных крыс с диабетом, вызываемым стрептозотоцином. Только что выделенный ретинальный микрососуд (Сакагами К., By Д.М., Пуро Д.Г. (Sakagami K., Wu D.M., Puro D.G.), "Журнал
физиологии" (J Physiol) (Лондон), 1999 г.; 521: 637-50) помещается на покровное стекло, как описано у
авторов: Оку X., Кода Т., Сакагами К., Пуро Д.Г. (Oku H, Koda T, Sakagami К, Puro DG) "Офтальмологические исследования" (Invest Ophtalmol Vis Sci), 2001 г.; 42: 1915-1920. Межклеточная коммуникация
между клетками стенки сосуда будет измеряться либо с помощью красителя, либо радиоактивным индикатором. Будет исследоваться влияние различных концентраций веществ, открывающих щелевые соединения (Химическое соединение 2 или Химическое соединение 40) в диапазоне 10-10-10-7 М, и в диабетической сетчатке будет наблюдаться значительное усиление межклеточной коммуникации по сравнению с
базовой. Подобные улучшения будут наблюдаться и при сравнении с контрольной группой (здоровые
животные). Лечение с помощью вещества, открывающего щелевые соединения, остановит или замедлит
развитие этого состояния. Лечение будет системно, локально или перорально. Желательно, чтобы данная
терапия была дополнением к обычному антидиабетическому лечению.
При обработке веществом, открывающим щелевые соединения, улучшения касаются не только
диабетической ретинопатии, но также и других сосудистых нарушений в сетчатке, например, артериосклероза. Было продемонстрировано, что щелевое соединение купирует горизонтальные клетки и отвечает за электрическое купирование нейронов (Равиола Е., Гилула Н.Б. (Raviola E, Gilula N.B.), "Труды
Академии естественных наук США" (Proc Natl Acad Sci USA), 1975 г.; 65: 192-222; Равиола Е., Даше Р.Ф.
(Raviola E., Dacheux R.F.), "Журнал нейроцитологии" (J Neurocytol), 1990 г.; 19: 731-36; Шневайс Д.М.,
Шнапф Дж.Л. (Schneeweis D.M., Schnapf J.L.), "Наука" (Science), 1995 г.; 268: 1053-56). Кроме того, показана передача скотопических сигналов между палочками и колбочками по щелевому соединению (Блафильд С.А., Даше Р.Ф. (Bloofield SA, Dacheux RF), "Исследование сетчатки глаза" (Retinal Eye Res), 2001
г.; 20: 351-384). Поэтому вещество, открывающее щелевые соединения, не только усиливает коммуникацию между нейронами, но способно также и обходить менее витальные палочки или колбочки и все еще
переносить скотопический сигнал к глазному нерву.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на артериосклеротическую ретинопатию,
стимулированную диетой, будет изучен in vitro с использованием модели крысы (недиабетической), как
описано выше. Межклеточная коммуникация между клетками в стенке сосуда измеряется либо с помощью способа переноса красителя Желтый Люцифер после микроинъекции, либо с помощью способа
FACS. Будут испытываться различные концентрации веществ, открывающих щелевые соединения - химического соединения 2 или химического соединения 40, в диапазоне 10-10-10-7М, и будет наблюдаться
значительное усиление межклеточной коммуникации по сравнению с базовой. Подобное улучшение наблюдается и при сравнении с контрольной группой (здоровые животные).
Химическое соединение будет применяться парентерально.
Гладкая мускулатура мочевого пузыря характеризуется фазовыми сокращениями и демонстрирует
спонтанные фазовые сокращения. Однако мочевой пузырь, находящийся в здоровом состоянии, способен
вмещать несколько сотен миллилитров мочи, не проявляя при этом роста давления внутри пузаря. В отличие от нормального мочевого пузыря неустойчивые мочевые пузыри проявляют спонтанный рост давления внутри пузыря, что связано с недержанием мочи (Тернер У.Х., Брэйдинг А.Ф. (Turner WH, Brading
AF), "Фармакология и терапия" (Pharmacol Therap), 1997 г.; 75; 77-110). В отличие от желудочнокишечной гладкой мускулатурой, гладкая мускулатуры мочевого пузыря спонтанно не генерирует скоординированные сокращения (Стевенс Р.Дж., Уайнерт Дж.С, Паблковер Н.Г. (Stevens RJ, Weinert JS,
Publcover NG), "Американский журнал физиологии" (Am J Physiol), 199; 2777: C448-60; Хашитани X.,
Фукута X., Такано X., Клемм М.Ф., Сузуки X. (Hashitani H, Fukuta H, Takano H, Klemm MF, Suzuki H),
"Журнал физиологии" (J Physiol), 2001 г.; 530; 273-86). Недавно были продемонстрированы как электрические, так и морфологические коммуникации по щелевому соединению между клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря (Хашитани X., Фукута X., Такано X., Клемм М.Ф., Сузуки X. (Hashitani H,
Fukuta H, Takano H, Klemm MF, Suzuki H), "Журнал физиологии" (J Physiol), 2001 г.; 530; 273-86), Уанг
Х.-З., Ли С.У., Дэй Н.С., Крист Г.Дж. (Wang H.Z., Lee S.W., Day N.S., Christ G.J.), "Урология" (Urology),
2001 г.; приложение 6А: 111). Важность этих щелевых соединений была продемонстрирована специфическим ингибированием коммуникации. По щелевому соединению распространяются волны спонтанно- 69 -
007792
го возбуждения гладкой мускулатуры мочевого пузыря. Поэтому неконтролируемое недержание мочи
регулируется путем обработки веществом, открывающим щелевые соединения.
Улучшение коммуникации по щелевому соединению после обработки веществом, открывающим
щелевые соединения, изучается на примере клеточной культуры гладкой мускулатуры, полученной из
мочевого пузыря с использованием анализа FACS. Химическое соединение будет подаваться дозированно с концентрацией в пределах от 10-10 до 10-7 М, и значительное усиление коммуникации будет обнаружено в клеточной культуре при низком содержании кислорода или кислородном напряжении.
Давление внутри мочевого пузыря будет измеряться после предварительной обработки и текущей
обработки веществом, открывающим щелевые соединения, предпочтительно химическим соединением 2
или химическим соединением 40, нормальных морских свинок и животных с экспериментально нарушенной функцией мочевого пузыря. Животные находятся под наркозом, введенным фенобарбиталом, а
мочевой пузырь катетеризован как мочевым катетером, позволяющим воде входить и выходить, так и
катетером с датчиком на конце. Вещество, открывающее щелевые соединения, не будет изменять нормальное соотношение объем/давление по мере того как это соотношение будет нормализоваться в возмущенном мочевом пузыре.
Вещество будет вводиться парентерально, перорально или в мочевой пузырь. Вещество будет вводиться дополнительно к лечению препаратами, предназначенными для нормализации сокращений мускулатуры мочевого пузыря.
Миоэпителиальные клетки, находящиеся в протоках подчелюстных желез, в мочеиспускательном
канале, в протоках желчного пузыря, панкреатических протоках, протоках слез связаны с щелевыми соединениями, и межклеточная коммуникация важна для синхронизации функции сжатия миоэпителиальных клеток (Таугнер Р., Шиллер A. (Taugner R, Schiller A.) "Исследование клеточной ткани" (Cell Tissue
Res), 1980 г.; 206: 65-72). Нарушение сокращаемости этих проток может быть нормализовано обработкой
веществом, открывающим щелевые соединения, вводимым либо парентерально, либо перорально.
В кардиотоническом атриовентикулярном узле межклеточная коммуникация поддерживается с помощью щелевых соединений. Понижение функции приводит к снижению проводимости и может приводить к общей атриовентикулярной блокаде. Атриовентикулярная блокада наблюдается при остром инфаркте миокарда, при ишемической болезни сердца, дигиталисной интоксикации, интоксикации блокатором кальциевых каналов, и вещество, открывающее щелевые соединения, улучшает атриовентикулярную проводимость.
Внутривенное вливание СаСl2 (100 мг/кг/мин) мышам после нейролептанестезии, вызывало атриовентикулярную блокаду 2-й степени. В случае предварительной обработки веществом, открывающим
щелевые соединения, вводимым внутривенно в дозах 10-11-10-6 моль/кг, доза СаСl2 значительно увеличивалась до наступления атриовентикулярной блокировки. Другим средством влияния было увеличение
нехватки времени на 30-65 %, до тех пор, пока СаСl2 не вызывал атриовентикулярную блокаду 2-й степени. Введение атриовентикулярной блокады с помощью СаСl2 описано в работе авторов: Ронсберг М.,
Саундерс Т.К., Чан П.С., Червони П. (Ronsberg M., Saunders TK, Chan PS, Cervoni P), "Медицинская наука" (Med Sci), 1986 г.; 14; 350-51.
Изменение степени атриовентикулярной блокады, что усиливает коммуникацию по щелевому соединению, нормализует атриовентикулярную проводимость и восстанавливает нормальный синусовый
ритм.
Введение вещества, открывающего щелевые соединения, должно выполняться либо парентерально,
либо перорально.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на катаракту
Хрусталик глаза позвоночных -это твердый пузырь из клеток, который растет в течение всей жизни
путем дополнения новых клеток на поверхности. Старшие клетки, захороненные под более новыми поколениями, дифференцируются в длинные, призматические волокна, теряя свои клеточные органеллы и
наполняя свои цитоплазмы растворимыми белками, кристаллинами, высоких концентраций. Долговечные волокна хрусталика связаны посредством щелевых соединений как друг с другом, так и с предшествующим слоем простых кубовидных эпителиальных клеток на поверхности хрусталиков. Эта сеть щелевых соединений соединяет клетки хрусталика в соклетие относительно малых молекул, обеспечивающих
метаболическую кооперацию: межклеточная диффузия ионов, метаболитов и воды. В контакте с питательными веществами на поверхности хрусталиков эпителиальные клетки удерживают свои клеточные
органеллы и способны предоставлять свою энергию метаболизма для сохранения правильных концентраций ионов и метаболитов в пределах цитоплазм волокон хрусталиков так, что кристаллины остаются
в растворе и не агрегируют (катаракта). В хрусталике присутствуют три вида коннексинов: Сх43, Сх46 и
Сх50 и мутации в каждом из этих белков щелевого соединения связаны с катарактой[79-81]. Эти результаты демонстрируют, что МКЩС играет существенную роль в нормальном метаболизме и функции хрусталика. Поэтому мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые, как известно,
усиливают МКЩС, могут использоваться при профилактике и/или лечении катаракты.
Канальцы щелевых соединений, которые формируются коннексинами Сх46 и Сх50, обеспечивают
проводящие пути коммуникации между волоконными клетками в нормальном прозрачном хрусталике. У
- 70 -
007792
нокаутных мышей, которые лишены этих коннексинов, развиваются ядерные катаракты, которые связаны с протеолизом кристаллинов. Это исследование установило важность щелевых соединений в поддержании нормальной прозрачности хрусталика путем предоставления межклеточного канала передачи сигналов или структурного компонента для соответствующей организации мембран хрусталиков и цитоплазматических белков (Гонг (Gonr) и др. "Клетка" (Cell), 1997 г., 12 декабря; 91 (6):833-43). Повышенная внутриклеточная концентрация кальция - главный стимул для активации кальций-зависимой протеазы цистеина Lp82, которая является ключевым инициатором процесса катарактогенеза (Баруч (Baruch) и
др., "Журнал биологической химии" (J Biol Chem), 2001 г.; 276 (31); 28999-9006). Для исследования способности Химических соединений 2 и 40 по настоящему изобретению предотвращать катаракту, проверялось влияние упомянутых соединений (10-10-10-6 моль/л) на модельные культивируемые клетки хрусталика овцы, описанные Черчиллем (Churchill) и др. "Журнал науки о клетке" (J Cell Sci), 1996 г.; 109
(часть 2):355-65. Короче говоря, с использованием Са(2+)-репортера-красителя фура-2 и флюоресценной
микроскопии исследовалась межклеточная передача сигналов Са2+ в первичных культурах эпителиальных клеток овцы. Механическая стимуляция отдельной клетки микропипеткой инициирует распространяемое увеличение цитозольного свободного Са2+, который распространяется от стимулируемой клетки
через 2-8 уровней окружающих клеток. Мы ожидаем, что химические соединения 2 и 40 по настоящему
изобретению усилят купирование волоконных клеток хрусталика и предотвратят катаракту.
Вводиться состав будет местно.
Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике и/или лечении катаракты. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по
формулам I-VIII, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности
химических соединений из примеров синтеза 1-55.
Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на болезни ушей
Было обнаружено много различных мутаций Сх32 при наследственном Х-сцепленном синдроме периферической невропатической глухоты Шарко-Мари-Тут (Charcot-Marie-Tooth), и несколько мутаций
Сх26 и Сх31 были обнаружены при глухоте[80]. Таким образом, мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые, как известно, усиливают МКЩС, могут использоваться при профилактике и/или лечении некоторых видов глухоты, которые связаны с ухудшенной МКЩС в ухе. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных
средств, применяемых при профилактике и/или лечении глухоты, связанной с ухудшенной МКЩС. Эта
цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам I-VIII, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в
частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55 и химических соединений из табл. 8,
табл. 1 и по фор. I-VIII.
Роль веществ, открывающих щелевые соединения, в кишечнике
Стенка тонкой кишки[82] экспрессирует как Сх43, так и Сх45. Предполагается, что клетки, экспресирующие Сх45 вдоль глубокого мышечного сплетения тонкой кишки, вероятно, действуют как составляющая системы кардиостимулятора, которая может включать систему проводимости путем формирования клеточной сети, работающей через определенные типы щелевых соединений. В тонком кишечнике и
в толстом кишечнике интерстициоциты Cajal (ИС) являются клетками кардиостимулятора, расположенными между гладкой мускулатурой кишечника; они генерируют спонтанные медленные волны слоев
гладкой мускулатуры и участвуют в нейропередаче. Трехмерная клеточная сеть ИС образует связи с помощью щелевых соединений Сх43 как между ИС, так и между ИС и клетками гладкой мускулатуры[83]. У
больных с болезнью Хиршспранга отсутствие экспрессии Сх43 в аганглиозной кишке предполагает, что
ослабленная межклеточная коммуникация между ИС и клетками гладкой мускулатуры может частично
быть ответственна за дисфункцию подвижности при этом заболевании[83]. У пациентов с болезнью Чагаса (вследствие инфекции трипаносомы Cruzii) отмечено сокращение экспрессии Сх, которая, как считают, отвечает как за кардиомиопатию, так и за сильно расширенный мегаколон, наблюдаемый у этих пациентов[7]. Таким образом, нормальная коммуникация по щелевому соединению между ИС и между ИС
и клетками гладкой мускулатуры считается важной для нормальной подвижности тонкого кишечника и
толстого кишечника. Поэтому другой целью настоящего изобретения является вещество, которое увеличивает проводимость щелевого соединения в кишечнике и поэтому может быть полезно при лечении
нарушений двигательной активности желудочно-кишечного тракта.
Репродуктивные органы и щелевое соединение
Яичники
Щелевые соединения между зернистыми клетками и между яйцеклеткой и окружающими зернистыми клетками играют важную роль при развитии фолликула яичника. При рождении, яичник содержит
первичные фолликулы, состоящие из мейотически взвешенных яйцеклеток, окруженных отдельным слоем поддерживающих (зернистых) клеток. Периодически субпопуляции первиных фолликулов проходят
дальнейшее развитие, во время которого яйцеклетка увеличивается в размере, и зернистые клетки распространяются, слоятся и развиваются в заполненный жидкостью антральный отдел желудка. После ову- 71 -
007792
ляции, яйцеклетки возобновляют мейоз и зернистые клетки, сохраненные в фолликуле, дифференцируются в стероидогенные клетки, формируя таким образом corpus luteum (желтое тело).
Щелевые соединения напрямую соединяют смежные клетки, обеспечивая тем самым диффузионное
движение ионов, метаболитов, и других важных молекул, передающих сигналы о потенциале, для регуляции овариального цикла и фертильности женщины. В поддержку важной роли щелевых соединений
для обеспечения нормальной функции яичника, было продемонстрировано, что незрелые фолликулы
мышей с дефицитом Сх37 (Graafian) не могут овулировать и формировать многочисленные неадекватные
желтые тела. Кроме того, обеспечена блокировка развития яйцеклетки перед мейотической компетентностью. Таким образом, межклеточная передача сигналов через межклеточные канальцы критически регулирует высоко скоординированный набор клеточных взаимодействий, необходимых для успешного овогенеза и овуляции[84].
Фолликулстимулирующий гормон (FSH) является главным регулятором роста и развития овариального фолликула. Помимо воздействия на созревание фолликул FSH улучшает купирование зернистых
клеток, и это усиливает экспрессию гена Сх43 и, возможно, формирование новых щелевых соединений[85]. С другой стороны, лютеинизирующий гормон (LH) прерывает межклеточную коммуникацию в
пределах овариального фолликула, что приводит к уменьшению концентраций цАМФ внутри яйцеклетки, после чего следует возобновление мейоза[86].
Эти данные иллюстрируют, что наличие нормальной коммуникации по щелевому соединению через Сх37 и Сх43 является существенным для нормального фолликулярного роста и овуляции. Таким образом, вероятно, что некоторые формы женского бесплодия являются следствием недостаточного купирования клеток в яичниках. Поэтому вещество, которое увеличивает купирование клеток, может использоваться для лечения женского бесплодия у женщин с ослабленной экспрессией и/или нарушенным регуляции овариальной функции щелевого соединения. Химические соединения по настоящему изобретению, способные усиливать МКЩС, полезны при лечении женского бесплодия, которое является следствием ослабленного купирования клеток в яичниках.
Матка
Мощные синхронные сокращения матки при родах зависят от электрического купирования клеток
гладкой мускулатуры миометрия с помощью щелевого соединения. У людей и других млекопитающих в
миометрии небеременной матки находится недостатоное количество щелевых соединений, но их число
становится обильным к сроку и/или с началом родов. Преобладающим белком щелевого соединения,
экспрессируемым клетками гладкой мускулатуры миометрита человека, является Сх43, но в миометрии[87-88] человека были также идентифицированы и Сх26, Сх40 и Сх45.
Вследствие того, что при родах очень важно, чтобы сокращения мускулатуры были скоординированными, другой целью настоящего изобретения является вещество, которое усиливает купирование клеток в миометрии, что, как ожидается, будет иметь положительное влияние на синхронизацию сокращений мускулатуры, и упомянутое вещество может использоваться наряду с окситоцином для стимуляции
и облегчения родов. Упомянутая цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему
изобретению типа химических соединений по формулам I-VIII, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55 и химических соединений из табл. 8, табл. 1, и по формулам I-VIII, и настоящее изобретение также относится
к использованию пептидных соединений по настоящему изобретению для приготовления лекарственных
средств для стимуляции и облегчения родов.
Авторы Хуидобро-Торо Дж.П., Гонзалез Р., Варас Дж.А., Рамер А., Гонзалез P. (Huidobro-Toro JP,
Gonzalez R, Varas JA, Rahmer A, Gonzalez R), "Обозрение детской медицины" (Rev Med Chil), октябрь
2001 г.; 129 (10):1105-12, оценили существование механизмов кардиостимулятора, связанных с ритмичной моторной активностью плацентарных кровеносных сосудов человека, и обнаружили, что блокада
щелевых соединений снижает частоту и амплитуду спонтанных сокращений. Они заключили, что ритмичные сокращения в кольцевом слое хориального и пупочного сосудов запускаются клетками кардиостимулятора, расположенными в кольцевом слое гладкой мускулатуры кровеносных сосудов и распространяются по щелевому соединению; они, вероятно, вносят вклад в регуляции кровотока. Таким образом, другой целью настоящего изобретения является вещество, которое усиливает купирование клеток в
плацентарных кровеносных сосудах, что, как ожидается, будет иметь положительное влияние на плацентарное кровообращение и развитие плода. Упомянутая цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам I-VIII, формулам 2-12, и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров
синтеза 1-55 и химических соединений из табл.8, табл. 1 и по формулам I-VII и настоящее изобретение
также относится к использованию пептидных соединений по настоящему изобретению для приготовления лекарственных средств, используемых при лечении ослабленного плацентарного кровообращения.
Мужские репродуктивные органы
Сх43-самый обильный коннексин в яичке, и интересно, что крыса с пониженной экспрессией Сх43
обладает ослабленным сперматогенезом (ebo/ebo, jun-d-/-, Cx43 +/-mice)[89]. Кроме того, в ранних работах
выдвигалось предположение, что у пациентов, страдающих гипосперматогенезом или аспермией, коли- 72 -
007792
чество щелевых соединений в яичках уменьшено[90]. Эти данные поддерживают предложение, что ухудшенное купирование клеток в яичках может приводить к мужскому бесплодию, и поэтому другой целью
настоящего изобретения является вещество, которое усиливает купирование клеток и, таким образом,
может быть полезно при лечении мужского бесплодия, связанного с ухудшенным купированием клеток.
Роль щелевых соединений поджелудочной железы
Канальцы щелевых соединений, выполненные из Сх43, функционально соединяют чувствительные
к глюкозе клетки панкреатических островков и линии клеток инсулиномы крысы[91]. Напротив, клетки
нескольких клеточных линий, выделяющих инсулин неправильно, не экспрессируют Сх43, имеют немного щелевых соединений, и плохо купированы. После исправления этих дефектов стабильной трансфекцией Сх43 цДНК, клетки, экспрессирующие умеренные уровни Сх43 и связи, как наблюдалось в нативных бета-клетках, показали экспрессию гена инсулина и содержание инсулина, которые заметно выше уровня, наблюдаемого как у клеток дикого типа (с нарушенной связью), так и у трансфицированных
клеток, экспрессирующих повышенное количество Сх43. Эти результаты показывают, что соответствующее купирование Сх43 необходимо для соответствующего производства и хранения инсулина[91].
Кроме того, in vivo стимуляция высвобождения инсулина глибенкламидом связана с повышенной экспрессией Сх43 и усиленным купированием соседних β-клеток в пределах панкреатического островка[92].
Для исследования влияния химического соединения 2 и химического соединения 40 на инсулиннезависимый сахарный диабет используется 6-16-недельный db/db. Животные (3 мыши на клетку) находились в контролируемых условиях окружающей среды (20°С, влажность 55-75%) с циклом освещение/затемнение (12/12 ч) с включением света в 6 ч утра. Животные находились на стандартной диете Алтромин № 1324 со свободным доступом к водопроводной воде. Все животные акклиматизировались в
течение по крайней мере одной недели и использовались ежедневно в течение двух дней до первого испытания на переносимость глюкозы, вводимой перорально. Кроме того, для снижения резкого увеличения содержания глюкозы, вызванного стрессом, животные подвергнались по крайней мере одному испытанию на переносимость глюкозы, вводимой перорально, без химического соединения как описано ниже
до эксперимента.
Пептиды растворялись в забуференном фосфатном соляном растворе (PBS) концентрацией 0,1 М с
0,1% бычего альбумина, с уровнем рН, доводимым до 7,4, путем добавления 5 М NaOH. Все растворы
приготавливались свежими с утра непосредственно перед экспериментом. Химические соединения вводятся парентерально в дозах 10-10-10-6 моль/кг. Животным, которым давался носитель, PBS давался только с одним альбумином, концентрацией 0,1%.
Животным не давали есть в течение 17 ч перед испытанием на переносимость глюкозы. Начиная с
9.00 ч из конца хвоста бралась кровь (t = -15 мин) и измерялось содержание глюкозы в крови. Способом
иммобилизированной оксидазы глюкозы анализировалась концентрация глюкозы в цельной крови (мМ)
(<5 мл, автоанализатор Элит, компания Байер, Дания). Животные с очень высокой концентрацией глюкозы в крови утром в день эксперимента (> 10,5 мМ) исключались из эксперимента. Сразу же после взятия
начальной пробы крови животным внутрибрюшинно вводилась инъекция носителя или различных доз
химического соединения. Спустя пятнадцать мин после внутрибрюшинного введения вещества в воде
(200 мл на 50 массы тела) растворялась доза глюкозы концентрацией 1 г/кг и вводилась перорально или
внутрибрюшинно и животные возвращались в свои домашние клетки (t = 0). Уровни содержания глюкозы в крови измерялись через t=30 мин, t=60 мин, t=120 мин и t=240 мин. Животным не давали есть в течение всего периода наблюдения.
Для анализа влияния химических соединений на переносимость глюкозы рассчитывалась абсолютная и относительная разница в содержании глюкозы в крови относительно базового уровня (t=0) для каждого момента времени после нагрузки глюкозой. Область под кривой (AUC) для целого эксперимента
(AUC0-240 мин) определялась с использованием способа трапеций. Таким образом, получаем два набора
со значением AUC0-240 мин: один на основе абсолютных значений содержания глюкозы в крови (единица: мМ х мин), а другой на основе относительного изменения содержания глюкозы в крови (единица:
% х мин).
Мы предсказываем, что химические соединения 2 и 40 по настоящему изобретению снизят повышенный уровень глюкозы в крови в ответ на нагрузку глюкозой у мышей db/db.
Вводиться соединения будут перорально или парентерально.
В этих наблюдениях показана важная роль купирования панкреатических островных β-клеток с помощью щелевого соединения для продуцирования и высвобождения инсулина. Таким образом, еще одна
цель настоящего изобретения состоит в получении вещества, которое усиливает межклеточную коммуникацию по щелевому соединению и/или электрическую проводимость щелевых соединений и, таким
образом, улучшает переносимость глюкозы у субъектов с инсулиннезависимым сахарным диабетом.
Упомянутая цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению, типа химических соединений по формулам I-VIII, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в
таблицах 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55.
- 73 -
007792
Кроме того, авторы Ито Т., Огоши К., Нагано И., Уеда Ф., Сакаи X., Кинджо М., Навата X. (Ito T,
Ogoshi К, Nakano I, Ueda F, Sakai H, Kinjo M, Nawata H), "Поджелудочная железа" (Pancreas), октябрь
1997 г., 15:297-303, обнаружили влияние ирзогладина на щелевые соединения при остром панкреатите у
крыс, вызванном церулеином. Была обнаружена способность нормальных панкреатических гроздевидных клеток к межклеточной коммуникации по щелевому соединению, и исследована роль межклеточной
коммуникации при остром панкреатите у крыс, вызванном церулеином (Cn), при использовании ирзогладина в качестве усиливающего агента межклеточной коммуникации по щелевому соединению. Острый
отечный панкреатит вызывался у крыс двумя внутрибрюшинными инъекциями 40 мкг Cn на 1 кг массы.
Крысы получали различные дозы (25, 50, или 100 мг на 1 кг массы тела) ирзогладина перорально за 15 и
2 ч до первой инъекции Cn. Нормальная контрольная группа получала только носитель. Степень тяжести
панкреатита оценивалась ферментативными и гистологическими исследованиями через 5 ч после первой
инъекции Cn. При остром панкреатите, вызванном Cn, ирзогладин значительно понижал уровень амилазы сыворотки крови, массу поджелудочной железы в сыром виде и содержание амилазы и ДНК в поджелудочной железе в зависимости от дозы. В частности, содержание амилазы стало приближено к уровню
амилазы у нормальных животных контрольных групп. Как показали гистологические исследования, степень тяжести панкреатита была значительно снижена при применении ирзогладина, и в группе, с применением ирзогладина концентрацией 100 мг на 1 кг массы, не было замечено различий в вакуолизации.
Иммунофлуоресцентное окрашивание поджелудочной железы антителом против коннексина 32 (Сх32;
белок щелевого соединения) показало, что панкреатические доли были диффузно позитивны к Сх32 в
контрольной группе, но количество позитивных к Сх32 зерен в группе с панкреатитом заметно уменьшилось до 19%. При применении ирзогладина концентрацией 100 мг на 1 кг массы количество зерен
Сх32 было восстановлено до 70% от нормального значения в контрольных группах. Эти результаты показывают, что межклеточная коммуникация по щелевому соединению при панкреатите, вызванном Cn,
нарушается, что может привести к распаду гомеостаза ткани и прогрессированию острого панкреатита.
Таким образом, описанные здесь пептиды полезны при лечении панкреатита. Для обоснования этого утверждения можно выполнить эксперименты на крысах с использованием упомянутого выше общего
экспериментального проекта авторов Ито Т. (Ito T) и др., 2001 г., с введением крысам химического соединения 2 и химического соединения 40 концентрацией в диапазоне 10-11-10-8М. Как ожидается, эти
эксперименты покажут, что химическое соединение 2 и химическое соединение 40 способствуют купированию клеток с помощью щелевого соединения и противодействуют влиянию церулеина.
Пептиды вводятся внутривенно.
Влияние веществ (антиаритмических пептидов), открывающих щелевые соединения, при тромбозе
Ранее было показано, что два пептида, обладающих антиаритмической активностью, и тесно связанных с веществами по настоящему изобретению, обладают также и антитромбической активностью.
Таким образом, авторы Дикшит (Dikshit) и др.[15] обнаружили, что пептиды Gly-Pro-Prp-Gly-Ala-Gly и
Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly предотвращали развитие легочной эмболии у мышей, при внутривенном введении дозы коллагена и адреналина. В патенте США № 4775743 описан НР5, производное пептида от ААР
с последовательностью N-3-(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-4Нур-Gly-Ala-Gly-OH, обладающий активностью против агглютинации тромбоцитов. Химические соединения по настоящему изобретению
очень похожи на них, и вероятно, что они также могут демонстрировать подобное влияние на тромбоз.
Таким образом, вещества по настоящему изобретению могут использоваться при профилактике тромбоза.
Иммунология
Межклеточные взаимодействия являются критическими для созревания и активации лимфоцитов.
Широкий диапазон мембранных молекул гарантирует межклеточную спайку и обеспечивает передачу
сигналов между клетками во время миграции и активации клетки в иммунной системе. Циркулирующие
лимфоциты Т, В и NK человека экспрессируют Сх43 и с использованием описаных выше способов окрашивания было показано наличие активных щелевых соединений между клетками. Было также продемонстрировано, что ухудшение купирования клеток с помощью щелевого соединения заметно уменьшает выделение IgM, IgG и IgA, что указывает на то, что межклеточная передача сигналов по щелевому
соединению являются важной составляющей механизмов, лежащих в основе метаболической кооперации
в иммунной системе (Овиедо-Орта Е., Хоу Т., Эванс У.Х. (Oviedo-Orta E, Hoy T, Evans WH), "Иммунология" (Immunology), 2000 г.; 99: 578-90), Овиедо-Орта Е., Гаск П., Эванс У.Х. (Oviedo-Orta E, Gasque P,
Evans WH) (FASEB. 2001 г.; 15:768-774).
Независимо от этиологии при подостром или хроническом воспалении желательно местное увеличение синтеза иммуноглобулина. Воспаленная ткань часто отличается от нормальной здоровой ткани и
низкий кислородный потенциал приводит к разрыву межклеточной коммуникации по щелевому соединению. Исходя из предположения, что кислородный потенциал является универсальным регулятором
МКЩС для нескольких различных систем клеток было продемонстрировано, что низкое содержание кислорода имеет существенное значение для нарушения купирования с помощью МКЩС.
При нормальных атмосферных условиях и условиях питания снижение содержания кислорода и
глюкозы в первичных культурах кардиомиоцитов желудочков новорожденной крысы приводит к сниже- 74 -
007792
нию вызываемой норадреналином стимуляции метаболизма фосфоинозитола приблизительно до уровня
50%. Было показано, что модификатор щелевых соединений - химическое соединение 2, нормализует эту
нарушенную, вызываемую норадреналином стимуляцию метаболизма фосфоинозитола при снижении
содержания кислорода и глюкозы, и повышает метаболизм фосфоинозитола приблизительно до 90% от
нормального уровня. Кроме того, было показано, что химическое соединение 2 не изменяет вызываемый
норадреналином уровень метаболизма фосфоинозитола при нормальных атмосферных условиях и нормальном питании (Майер Е., Бек М.М. (Meier, E и Beck, M M): ZS42-0123 усиливает вызываемую норэпинефрином метаболизм фосфоинозитола в культивируемых кардиомиоцитах при метаболическом
стрессе. Международная Конференция по щелевым соединениям, 4-9 августа 2001, Гавайи, США, реферат № 132). Как в культивируемых культурах остеобласта человека, так и в линии клеток остеогенной
саркомы крысы, гипоксия приводит к снижению распространения волн кальция внутри клеток, что было
получено измерением переноса красителя после инъекции Желтого Люцифера. Это снижение могло быть
полностью изменено на повышение путем обработки химическим соединением 2 (Тиелман С.С., Хенриксен З., Майер Е., Петерсен Дж.С, Соренсен О.Х., и Йорденсен Н.Р. (Teilmann, С С, Henriksen, Z,
Meier, Е, Petersen, J С, Sorensen, О Н и Jorgensen, N R): вещество, открывающее щелевые соединения ZS42-0123, усиливает межклеточную коммуникацию в остеобластах. Международная Конференция по
щелевым соединениям, 4-9 августа 2001, Гавайи, США, реферат № 176).
Вследствие разрыва купирования клеток при воспалении вещество, открывающее щелевые соединения, улучшает синтез иммуноглобулинов при воспалении.
In vitro испытание влияния веществ, открывающих щелевые соединения, на синтез иммуноглобулинов будет проводиться на стимулируемых и не стимулируемых Т- и В-лимфоцитах, выделяемых из
миндалин человека и очищаемых, как описано у авторов: Овиедо-Орта Е., Гаск П., Эванс У.Х. (OviedoOrta E, Gasque P, Evans WH), (FASEB. 2001 г.; 15:768-774). Содержание иммуноглобулинов будет измеряться по методике ELISA, а щелевые соединения будут изучены с помощью анализа FACS. Вещества,
открывающие щелевые соединения, будут испытаны при концентрациях от 10-10 до 10-7 М. In vivo фармакологические испытания будут выполняться на экспериментальных воспалительных моделях с использованием как не инфицированных, так и инфицированных моделей. In vivo фармакологические испытания могут выполняться экспериментально на целом ряде животных моделей: 1) ингибирование отека задней лапы крысы, вызванного каррагеном (объем лапы), 2) ослабление рекрутмента клеток, вызванного каррагеном, в воздушном мешочке крыс (рекрутмент лейкоцитов и экссудаты объема), 3) ослабление вызванных стенкой клеток стрептококков артритов предплюсневого большеберцового сустава крыс
(припухлость голеностопного сустава), и 4) ослабление прогрессирования вызванных коллагеном артритов у крыс (клинические признаки и припухлость сустава).
Авторы Ие П., Чаппл С.С, Кумар Р.К. и Хюнтер Н (Ye P, Chapple CC, Kumar RK, и Hunter Н),
"Журнал патологии", (J Pathol), 192:58; 2000 г., сентябрь, показали, что наблюдалось сильное сокращение
числа коннексинов 26 и 43 в покрове эпителия воспаленной десны, что поддерживает идею о том, что
способность эпителия функционировать в качестве эффективного барьера против микробов в тканях
сильно скомпрометирована при периодонтите. Таким образом, обработка воспаленной десны веществом,
открывающим щелевые соединения, например, в сочетании с антибиотиком, может быть полезной при
восстановлении МКЩС и заживлении эпителия.
Периферическая невропатия и нервнопатическая боль
Сообщалось, что периферическая невропатия и боль, наблюдаемые при диабете, во время диализа,
при циррозе печени и многих других состояниях, относятся как к соматическим, так и к вегетативным
нервам. Точные механизмы поражения периферических нервов при разных состояниях являются все еще
гипотетическими, но разрушение нервного окончания, пониженная проводимость, демиелинизация и
повышенная воспалительная реакция были описаны. Общим для различных состояний в экспериментах
является увеличение числа свободных радикалов, увеличение содержания оксида азота, кислородный
стресс и отсутствие акцепторов свободных радикалов, и сокращение коммуникации по щелевому соединению (Питре Д.А., Сайферт Дж.Л., Бауэр Дж.А. (Pitre D.A., Seifert J.L., Bauer J.A.), "Письма по нейронауке" (Neurosci Lett), 2001 г.; 303: 67-71), Боланос Дж.П., Медина Дж.М. (Bolanos J.P., Medina J.M.),
"Журнал нейрохимии", (J Neurochem), 1996 г.; 66: 2019-9, Ло П.А, Никандер К.К. (Low PA, Nickander,
KK), "Диабет" (Diabetes), 1991 г.; 40; 873-7, Леви Д., Хоук А., Зочоне Д.У. (Levy D, Hoke A, Zochone
DW), "Письма по нейронауке" (Neurosci Lett), 1999 г.; 260: 207-9, Бруззоне Р., Рессот С. (Bruzzone R, Ressot С), "Журнал европейской нейронауки", (J Eur Neurosci), 1997 г.; 9: 1-6).
In vitro исследования будут выполняться с использованием культур астроцитов крысы или швановских клеток и вещества, открывающие щелевые соединения, типа Химического соединения 2 и химического соединения 40, будут испытываться в клетках, нагруженных оксидом азота, как описано у авторов:
Боланос Дж.П., Медина Дж.М. (Bolanos JP, Medina JM), "Журнал нейрохимии", (J Neurochem), 1996 г.;
66: 2019-9; с использованием нитропруссида в качестве донора на основе оксида азота (Бласитс С, Мауне
С, Сантос-Сакки Л. (Blasits S, Maune S, Santos-Sacchi L.) (J Phlugers Arch), 2000 г.; 440; 710-12). Концентрации химических соединений будут в диапазоне 10-10 - 10-7 М, и зависимое от дозы открытие щелевых
соединений будет измеряться с использованием анализа FACS.
- 75 -
007792
Вводиться соединения будут парентерально.
Дефект слуха
Как известно, связаные с продуцированием свободных радикалов потеря слуха, пресбиакузис, вызванные шумом, связаны с замедлением купирования клеток Хенсена (Hensen) и клеток Дайтерса (Deiters) из спирального органа улитки с помощью щелевого соединения (Тодт И., Нгезахайо А., Эрнст А.,
Колб Х.А. (Todt I, Ngezahayo A, Ernst A, Kolb H-A), "Журнал биологии мембран" (J Membrane Biol), 2001
г.; 181: 107-114), (Бласитс С, Мауне С, Сантос-Сакки Дж. (Blasits S, Maune S, Santos-Sacchi L.), (J Phlugers Arch), 2000 г.; 440; 710-12), Лагостенка Л., Ашморе Дж.Ф., Качар Б. (Lagostena L, Ashmore JF, Kachar
В), "Журнал физиологии" (J Physiol), 2001 г.; 531: 693-707). Коммуникация по щелевому соединению
между этими поддерживающими клетками улитки обеспечивает важный гомеостаз для сенсорных клеток
и, таким образом, нормальную нейронную активность внешних волосковых сенсорных клеток (Джонстоун Б.М., Пантуцци Р., Сика Дж., Сикова Е. (Johnstone BM, Pantuzzi R, Syka J, Sykova E), "Журнал физиологии" (J Physiol), 1989 г.; 408: 77-92). Эта коммуникация разрывается при окислительном стрессе
(Тодт И., Нгезахайо А., Эрнст А., Колб Х.А. (Todt I, Ngezahayo A, Ernst A, Kolb H-A), "Журнал биологии
мембран" (J Membrane Biol), 2001 г.; 181: 107-114). Приобретенная или возрастная потеря слуха предотвращается при обработке химическим соединением, которое может сохранить коммуникацию по щелевому соединению в якорных клетках.
In vitro испытание веществ, открывающих щелевые соединения, будет выполняться в клетках Хенсена (Hensen) морских свинок как описано у авторов Тодт И., Нгезахайо А., Эрнст А., Колб Х.А. (Todt I,
Ngezahayo A., Ernst A., Kolb H.A.), "Журнал биологии мембран" (J Membrane Biol), 2001 г.; 181:107-114).
Будут исследованы Химическое соединение 2 или химическое соединение 40 в диапазоне концентрации
10-10-10-8 М, а также их влияние на состояния, связанные с кислородным стрессом и механическим стрессом. Химическое соединение будет значительно противодействовать потере купирования клеток с помощью щелевого соединения.
Крысы, получившие внутривенно вливание химического соединения 2, подвергались испытаниям
DPOAE (distortion product otoacoustic emissions - отоакустические эмиссии искажений). Два тона гармонических колебаний близкие по частоте (f1 и f2) подавались к уху одновременно. Звук, испускаемый
внутренним ухом, состоит из искажений, производимых внешними волосковыми сенсорными клетками.
Частота самых сильных из этих искажений обычно составляет 2f1-f2. Например, если частота используемых тонов составляет 1000 Гц (fl) и 1200 Гц (f2), то частота самого сильного искажения будет составлять 2x1000 - 1200, или 800 Гц. Для оценки целостности внешних волосковых сенсорных клеток может
использоваться относительная интенсивность искажения (кГц), получаемая при сравнении с этими двумя
гармоническими колебаниями.
Химическое соединение будет применяться парентерально.
Меланоциты в области клеток темноты вестибулярного аппарата сообщаются в тяжелых условиях
по щелевому соединению и могут играть определенную роль в транспортировке материи между эндолимфой и перилимфой, и также могут играть важную роль в поддержании гомеостаза микросреды во
внутреннем ухе (Масуда М., Усами СИ., Ямазаки К., Такуми И., Шинкава X., Курашима К. (Masuda M.,
Usami S-I, Yamazaki К, Takumi Y, Shinkawa H, Kurashlma К),
"Анатомические исследования" (Anat Rec), 2001 г.; 262; 137-146). Эндолимфатическая водянка связана с различными клиническими состояниями, характеризующимися головокружением и ухудшением
слуха Пониженный потенциал коммуникации по щелевому соединению может оказаться важным при
регуляции трансмембранного переноса нескольких веществ, выделяемых первично или выделяемых через определенные типы переносчиков.
Возрастная анемия и трансплантация костного мозга
Существование функциональных щелевых соединений между кроветворными клетками предшественника и стромальными клетками кроветворной микросреды было в течение многих лет спорным, но
теперь экспериментальным путем доказало существование коммуникации по щелевому соединению у
человека (Розендаль М, Греган А., Грин С. (Rosendaal M., Gregan A, Green С), "Клетка Ткани" (Tissue
Cell), 1991 г.; 23: 457-470), Дюриг Дж., Розенталь С, Халмайер К., Виеманн М, Новотны Дж., Бингманн
Д., Дюрзен У., Ширмахер К), Durig J, Rosenthat С, Halfmeyer К, Wiemann М., Novotny J, Bingmann D,
Dursen U, Schirrmacher К), "Британский журнал гематологии" (Brit J3 Haematol), 2000 г.; 111: 416-25).
Было также продемонстрировано, что коммуникация является двунаправленной и соответствует гипотезе
о том, что стромальные клетки управляют пролиферативным поведением кроветворных клеток предшественника, и к тому же их функциональный статус может регулироваться незрелыми кроветворными
клетками (Гупта П., Блазар Б., Гупта К., Верфайллие С. (Gupta P, Blazar В, Gupta К, Verfaillie С), "Кровь"
(Blood), 1998 г.; 91: 3724-3733).
С возрастом функциональность кроветворных тканей снижается и у пожилых людей часто наблюдается анемия.
Пониженный потенциал кроветворных тканей также наблюдался в кроветворных злокачественных
образованиях и после химиотерапии. Для предотвращения панцитопении используется трансплантация
костного мозга донора.
- 76 -
007792
Влияние химического соединения, которое способствует коммуникации по щелевому соединению,
будет изучаться на крысах, которым предварительно вводились большие дозы циклофосфамида. У этих
животных костный мозг больше не производил зрелые кроветворные клетки. Количество ретикулоцитов
в различные моменты времени после введения циклофосфамида будет значительно более высоким у животных, которым предварительно вводились вещества, открывающие щелевые соединения - химическое
соединение 2, в дозах приблизительно 100 мкл концентрацией 10-10 М-10-8 М по сравнению с животными, которым предварительно не вводилось химическое соединение 2.
Лекарственное средство вводится парентерально.
Гипофиз и гипофункция гипоталамуса
Гормоны из передней доли гипофиза показывают циркадное изменение секреции в пределах минут,
часов, дней и сезонов. Часть нервной системы, ответственная за циркадный ритм, ограничена парой
структур в гипоталамусе, известных как супрахиазмальное ядро. В этом центре индивидуальным клеткам
присущи биологические часы. Однако через коммуникацию по щелевому соединению соседним клеткам
передается скоординированная электрическая активность (Колуэлл Ц.С. (Colwell CS), "Журнал нейробиологии" (J Neurobiol), 2000 г.; 43: 379-88)). Поскольку также передняя доля гипофиза не имеет прямых
иннервации, межклеточная коммуникация по щелевому соединению в пределах железы должна быть
обязательной для адекватной межклеточной координации и синхронизации, что необходимо для обеспечения соответствующей и своевременной секреции гормонов (Витале М.Л., Кардин Дж., Гилула Н.Б.,
Карбаджал М.Е., Пеллетиер Р.-М. (Vitale МЛ, Cardin J, Gilula NB, Carbajal ME, Pelletier R-M), "Доклады
по биологии" (Biol Reporo), 2001 г.; 64: 625-633). Герин H.C., Боннефонт X., Стоекел Л., Моллард П.
(Guerlneau NC, Bonnefont X, Stoeckel L, Mollard P), "Журнал биологической химии" (J Biol Chem), 1998
г.; 273: 10389-95) пришли к заключению, что проявляющие спонтанную активность эндокринные клетки
являются либо одиночными нейронами, либо организованы в синхронизированные, связанные по щелевым соединениям, упорядоченные структуры, рассеянные по передней доле гипофиза. Синхронизация
спонтанно возбудимых клеток может помочь формированию структуры базальной секреции. Под контролем гормонов, стимулирующих гипоталамус, из передней доли гипофиза синтезируется гормон роста,
пролактин, гормон коры надпочечников, гормон щитовидной железы, и гормоны гонадотропина. Поэтому один из механизмов аритмии сложных гипоталамических-гипофизных-эндокринных желез в пределах
одной из осей также связан с ухудшенной коммуникацией по щелевым соединениям. Болезни бессимптомный диабет, гипогонадотропный гипогонадизм, микседема, адренокортикоидная гипофункция и карликовость. Обработка веществом, открывающим щелевые соединения, улучшает симптомы.
Кроме того, нейроны в супрахиазмальном ядре гипоталамуса зависят от оптимальной коммуникации по щелевому соединению. На оси, упомянутой выше, вещество, открывающее щелевые соединения,
способное действовать в этой области, также полезно пациентам с нарушенным циркадным ритмом
(Шинозара К., Фунабаси Т., Мицишиба Д., Кимура Ф. (Shinohara К, Funabashi T, Mitsishiba D, Kimura F),
"Письма по нейронауке" (Neurosci Lett), 2000 г.; 286: 107-10).
Вазоренальная гипертензия и нефротоксичность
Специфичные щелевые соединения в почках и эндотелии, которые широко распределены в почке,
обнаружены в гломеруле, каналах и сосудистой сети, включая внутригломерулярные капилляры и юкстагломерулярные артериолы (Хаефлигер Дж.-А., Демотц С., Браиссант О., Сутер Е. (Haefliger J-A, Demotz С., Braissant О., Suter E.), "Почка" (Kidney Int), 2001 г.; 60; 190-201). В этом исследовании авторы
продемонстрировали наличие щелевых соединений, связывающих выделяющие ренин клетки афферентной артериолы. Щелевые соединения могли бы внести вклад в обнаружение и распространение переносимых кровью сигналов, например, сигналов, вызываемых повышенным кровяным давлением. В пределах почки, такие сигналы должны быть преобразованы эндотелиальными клетками афферентной артериолы в аутокринные, паракринные и эндокринные стимулы и переданы выделяющим ренин клеткам.
Коммуникация по щелевому соединению играет, таким образом, важную роль в формировании взаимосвязанного юкстагломерулярного аппарата. Быстрый переход канальцев щелевых соединений от открытого к закрытому состоянию также подразумевает быструю реакцию на местные изменения в сосудах,
что обеспечивает, таким образом, непрерывную обратную связь, необходимую для согласования гломерулярной и трубчатой функции, а также секреции ренина с физиологическими потребностями. Болезни,
характеризующиеся ослабленной почечной коммуникацией по щелевым соединениям, выиграют от применения специфичного вещества, открывающего щелевые соединения, вводимого либо перорально, либо
парентерально. Тяжелые металлы являются нефротоксичными и вызывают поражение почек. Было продемонстрировано, что токсичные металлы, например, кадмий (Фукумото М, Куджираока Т., Хара М.,
Шибасаки Т., Хосоя Т., Йошида М. (Fukumoto M., Kujiraoka Т, Hara М., Shibasaki T., Hosoya T., Yoshida
M.), "Науки о жизни" (Life Sciences), 2001 г.; 69:247-54), а также ртуть (Йошида М, Куджираока Т., Хара
М., Наказавас X., Суми И. (Yoshida M., Kujiraoka Т., Hara М., Nakazawas H., Sumi Y.), "Достижения токсикологии", (Arch Toxicol), 1998 г.; 72: 192-96) в первичных клеточных культурах проксимальных каналов крысы нарушают купирование клеток с помощью щелевого соединения и было сделано предположение, что дисфункция почек в обоих случаях связана с ухудшением межклеточной коммуникации.
- 77 -
007792
В случае отравления тяжелыми металлами обработка веществами, открывающими щелевые соединения, восстанавливает поврежденную ткань и предотвращают прогрессивную девастацию ткани.
На клеточных культурах из клеток канальцев будут проводиться in vitro исследования по предотвращению с помощью химических соединений (химического соединения 2 или химического соединения
40 концентрацией приблизительно 10-10-10-7 М) нарушения купирования клеток с помощью щелевого
соединения в случае воздействия тяжелыми металлами. Коммуникация по щелевому соединению будет
проверена способом окрашивания Желтым Люцифером, как описано выше.
После системного введения тяжелого металла экспериментальным животным (крысам) почечная
функция измерялась с помощью 3Н-инсулина в качестве клиренс-маркера скорости клубочковой фильтрации, с помощью меченого 14С тетраэтиламмония в качестве клиренс-маркера почечного плазменного
потока, и лития в качестве клиренс-маркера проксимальной тубулярной функции (Петерсен Дж.С., Шалми М., Лам Х.Р., Кристенсен С. (Petersen JS, Schalmi M., Lam HR, Christensen С), "Журнал фармакологии
и специальной терапии" (J. Pharmacol. Esp. Ther.), 1991 г., 258:1-7) в различные моменты времени до и
после длительной обработки тяжелыми металлами. Длительная обработка специфическим веществом,
открывающим щелевые соединения, типа химического соединения 2, начинается, когда скомпрометирована почечная функция и будет наблюдаться значительное улучшение почечных функциональных параметров (скорость клубочковой фильтрации и кровяное давление) после обработки.
Состав будет вводиться парентерально.
Неинфекционное воспаление, а также инфекции с различными микробами вызывают значительные
неспецифические хронические изменения почечной функции, характеризующиеся также снижением скорости клубочковой фильтрации, снижением выделения электролитов и воды, и изменемиями кровяного
давления. Некоторые из этих симптомов будут также лечиться с использованием специфического вещества, открывающего щелевые соединения, и симптомы уменьшаться.
Развитие и коррекция зубов
Авторы Муракуми С. и Мурамацу Т. (Murakami S и Muramatsu T), "Анатомия эмбриологии" (Anat
Embryol), 2001 г; 203; 367-374, подтвердили, что между одонтобластами существует коммуникация по
щелевому соединению, и что через эти межклеточные мосты координируется клеточная активность
(Игучи И., Ямамура Т., Ичикава Т., Хашомот О.С., Хоуриучи Т., Шимоно М. (Iguchi Y, Yamamura T,
Ichikawa T, Hashomot ОС, Houriuchi T, Shimono М), "Достижения биологии рта", (Arch Oral Biol), 1984 г.;
29: 489-497), но в своих последних исследованиях они также продемонстрировали, что эти коммуникации по щелевому соединению существуют на ранней стадии развития зубов (предодонтобласт), а также в
одонтобластах молодого и старого возраста. Кроме того, щелевые соединения имеются в клетках пульпы, лежащих под одонтобластами. Эти результаты показывают, что межклеточная коммуникация по щелевому соединению важна и во время развития зубов и в течение всей жизни, когда зубы корректируются.
Обработка веществом, открывающим щелевые соединения, нормализует нарушенное развитие зубов. Такая обработка также способствует коррекции зубов и делает зубы более устойчивыми к кариесу.
Химические соединения по настоящему изобретению, способствующие щелевому соединению, типа химического соединения 2, могут анализироваться in vitro для определения их влияния на межклеточную коммуникацию одонтобластов, что сопоставимо с описанным здесь анализом остеобласта.
Стволовые клетки
Авторы Лумельски (Lumelsky) и др. (2001 г.) из стволовых зародышевых клеток мыши получили
клетки, экспрессирующие инсулин и другие панкреатические эндокринные гормоны (Надя Лумельски,
Оливье Блондел, паскаль Лаенг, Иван Валеско, Pea Равин, Рон МкКей (Nadya Lumelsky, Olivier Blondel,
Pascal Laeng, Ivan Valesco, Rea Ravin, Ron McKay), "Дифференцировка зародышевых стволовых клеток в
сторону структур, выделяющих инсулин, подобным панкреатическим островкам", "Наука" (Science),
292,1389-1394, 2001 г.). Клетки сами собираются в трехмерные кластеры, топология которых напоминает
нормальные панкреатические островки, в которых панкреатические типы клеток сильно напоминают
нейроны. Глюкозой с помощью механизмов, подобных механизмам, применяемым in vivo, инициируется
высвобождение инсулина из этих кластеров. При иъекции мышам с диабетом клетки, производящие инсулин, переносят быструю васкуляризацию и сохраняют кластерную, островковую организацию.
В клиническом контексте эта система на основе зародышевых стволовых клеток может позволить
одновременную генерацию и сборку клеток, выделяющих инсулин, и других островковых клеток, которые, как известно, играют важную роль в регуляции выделения инсулина в функциональные структурные единицы. Эти единицы могли бы предоставить материал для оптимизации продуцирования инсулина и анализа точной регуляции гомеостаза глюкозы. Зародышевые стволовые клетки идеальны для такого исследования, потому что генетические инструментальные средства могут использоваться для определения молекулярного основания развития островка и функции. Это привлекательная возможность для
терапий на основе клетки для применения с использованием зародышевых стволовых клеток, и зародышевых половых клеток человека и нечеловека. Ткань взрослых индивидуумов может быть также полезным источником функциональных панкреатических клеток. Описанная здесь система дифференцировки
может обеспечить источник функциональных панкреатических островков для лечения диабета. Насколь- 78 -
007792
ко нам известно, это первый отчет, в котором показано, что из зародышевых стволовых клеток in vitro
может быть получено несколько типов клеток эндокринной поджелудочной железы. Хотя панкреатические островки, полученные из трупов, могут функционировать в печени после прививки, проблемы отторжения ткани и эффективности остаются нерешенными. Ясно, что разработка зародышевых стволовых
клеток для получения обильного источника иммуносовместимой ткани для трансплантации обязывает
преодолеть эту и другие проблемы, связанные с диабетом.
Инфаркт миокарда ведет к потере ткани и ухудшению работы сердца. Оставшиеся миоциты не способны перестроить некротическую ткань, и сердце после инфаркта со временем работает все хуже. Повреждение целевого органа ощущается отдаленными стволовыми клетками, которые мигрируют к сайту
поражения и переносят альтернирующую дифференцировку стволовых клеток; эти события поддерживают структурную и функциональную репарацию. Эта высокая степень пластичности стволовой клетки
подсказала авторам Орлику (Orlic) и др. (Орлик В., Кайстура Дж., Чименти С., Яконюк И., Андерсон
СМ., Ли Б, Пикел Дж., МкКей Р., Надал-Гинард Б., Бодине Д.М., Лери А и Анверса П. (Orlic D., Kajstura
J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson S.M., Li B., Pickel J., McKay R., Nadal-Ginard J., Bodine D. M., Leri А.
и Anversa P.): "Клетки костного мозга восстанавливают миокард после миокарда", "Природа", (Nature),
410, 701-705 (2001 г.)), проверить, можно ли восстановить мертвый миокард путем пересадки клеток костного мозга у мышей, перенесших инфаркт.
Они сортировали линейно-негативные (Lin-)клетки костного мозга трансгенных мышей, экспрессирующих усиленный зеленый флуоресцентный белок путем активизированной флюоресценцией сортировки клеток на основе c-kit экспрессии. Вскоре после перевязки коронарной артерии, клетки Lin-ckitPOS вводились инъекцией в сокращающуюся стенку на границе с инфарктом. Было обнаружено, что
спустя 9 дней после пересадки клеток костного мозга недавно сформированный миокард занимал 68%
части желудочка, перенесшего инфаркт. Развивающаяся ткань включала распространяющиеся миоциты
и сосудистые структуры. Их исследование показывает, что локально введенные клетки костного мозга
могут воспроизводить de novo миокард, улучшая, таким образом, исход болезни коронарной артерии.
Для получения свойств этих миоцитов измерялась экспрессия коннексина 43. Этот белок отвечает
за купирование клеток и электрическое купирование путем генерации канальцев плазматической мембранны между миоцитами; очевидно коннексин 43 был в цитоплазме клетки и на поверхности близко
расположенных дифференцирующихся клеток. Эти результаты были совместимы с ожидаемой функциональной компетентностью фенотипа сердечной мышцы.
Так как функциональные клетки произведены от зародышевых стволовых клеток, и так как коннексины действительно экспрессированы этими клетками в сердечной ткани, перенесшей инфаркт, мы утверждаем, что это будет иметь место и в случае с другими клетками, дифференцированными из зародышевых стволовых клеток. Так как коннексины играют доминирующую роль в функции этих тканей
(включая панкреатические бета-клетки и клетки сердечной мышцы) мы также утверждаем, что химическое соединение подобное химическому соединению 2 и химическому соединению 40 путем усиления
купирования клеток с помощью щелевого соединения усиливает пролиферацию зародышевых стволовых
клеток в функциональные клетки в тех органах, куда были имплантированы стволовые клетки.
Таким образом, мы утверждаем, что вещества, открывающие щелевые соединения, подобные химическому соединению 2 и химическому соединению 40, будут стимулировать переход стволовых клеток в
функциональные клетки в пересаженных органах типа поджелудочной железы для лечения сахарного
диабета, сердца для лечения инфаркта сердца, и базальных ганглий мозга для лечения болезни Паркинсона.
Для обоснования этого утверждения, можно выполнить эксперименты по общему проекту изучения
инфаркта миокарда, как описано выше у авторов Орлик (Orlic) и др. "Природа" (Nature), 410, 701 - 705
(2001 г.)), с введением химического соединения 2 и химического соединения 40 неоднократно в течение
процесса пролиферации. Как ожидается, эти эксперименты покажут увеличение экспрессии коннексина
43 с помощью химического соединения 2 и химического соединения 40 или более быстрое заживление.
Болезнь, вызванная табаком
Авторы МкКарнс С.Ц., Дулитл Д.Дж. (McKarns SC, Doolittle DJ), "Применение фармакологии в
токсикологии" (Toxicol AppI Pharmacol), октябрь 1991 г., 111:58-68, изучали влияние конденсата дыма
сигареты на межклеточную коммуникацию. Цель исследования состояла в том, чтобы дать количественную оценку и сравнить активность конденсата дыма сигареты от нагрева и сжигания табака, влияющих
как на скорость, так и на общий объем межклеточной коммуникации in vitro. Для оценки токсичности
плазматической мембраны использовались пробы поглощения и выделения лактатдегидрогеназы Желтого Люцифера. Межклетоная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС) определялась путем количественной оценки перераспределения флюоресценции после фотоотбеливания (FRAP), которая проводилась после воздействия в течение 1 ч конденсата дыма сигареты таких концентраций, которые не
были токсичны для плазматической мембраны. Давалась количественная оценка МКЩС в клетках эпителия печени крысы (клетки WB) и фибробластах кожи человека (MSU-2 клетки), синхронизированных
по фазе G1 клеточного цикла. В каждом из испытуемых типов клетки конденсат дыма сигареты от нагрева табака не замедлял МКЩС при таких концентрациях, когда конденсат дыма сигареты от сжигания
- 79 -
007792
табака значительно замедлял как общий объем, так и скорость МКЩС. Таким образом, мы утверждаем,
что вещества, открывающие щелевые соединения, подобные химическому соединению 2 и химическому
соединению 40 или пептиды по формулам I-VIII, и из табл. 1 и 8, предотвращают или смягчают ингибирование МКЩС, вызванное конденсатом дыма сигареты. Болезнь, вызванная табаком, в результате разрыва купирования клеток с помощью щелевого соединения, включает ухудшенное заживление ран, особенно после операции и старения кожи.
Цель настоящего изобретения состоит в получении способов лечения или предотвращения одного
или большего числа описанных здесь медицинских признаков или состояний. Обычно такие способы
включают введение, по крайней мере, одного из предыдущих химических соединений, предпочтительно
того же самого, в количестве, достаточном для лечения, предотвращения, или снижения степени тяжести
признаков или состояний. Cпецифические стратегии введения будут очевидны для специалистов и зависят, например, от пола, массы, общего состояния здоровья и определенных признаков или состояний,
которые необходимо вылечить или предотвратить. Как уже обсуждалось, в способах по настоящему изобретению описанные здесь химические соединения могут вводиться как единственное активное средство. В другом случае они могут использоваться в качестве дополнительной терапии. Желательно, чтобы
признаки или состояния, которые необходимо вылечить или предотвратить в соответствии с настоящим
изобретениемм были связаны с ухудшенной клеточной коммуникацией или ослабленной функцией щелевого соединения. Более специфические признаки и состояния, касающиеся изобретения, были обсуждены выше.
Было бы хорошо лечить болезни, связанные с нарушением клеточной коммуникации или ухудшением МКЩС, с помощью вещества, которое, в частности, воздействует на функцию щелевого соединения, типа агониста рецептора ААР, который, как ожидается, способствует МКЩС посредством передачи
сигнала от рецептора ААР, или вещества или химического соединения, которое по другому способствует
выполнению нормальной функции коннексинов и щелевых соединений.
В соответствии с предпочтительными вариантами настоящего изобретения химическое соединение,
которое способствует межклеточной коммуникации, выбирается из группы, в состав которой входят
группы химических соединений по формуле I
(I)
представляющей пептидную последовательность, где аминокислотные остатки могут иметь форму D
и/или форму L с N-концевым участком N* и С-концевым участком С*, и обладать цикличностью благодаря ковалентной связи между N* и С*, как показано пунктирной линией, или между Rd и С*, как показано пунктирной линией U; и где пунктирная линия между N* и С*, которая если имеется, то исключает
связь U, представляет дополнительную ковалентную связь, и если упомянутой связи нет, то тогда N*
связано с атомом водорода; когда дополнительная ковалентная связь U между Rd и С* имеется, то тогда
R7 отсутствует, и наличие R7 исключает связь U; и
где X является N-концевым участком типа фотозонда, способного связываться с аминоконцевым
участком N*, или ацильной группой, полученной из С(2-22)алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной
кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот типа бегеновой кислоты,
произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав
которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа; или X является водородом;
R7 является ОН, NH2, NHNH2 или OR8, если связь между N* и С* отсутствует, или R7 отсутствует,
если связь между N* и С* существует;
R8 является Н или прямой или разветвленной С(1-6)алкильной группой, арильной или аралкильной
группой.
Ra является боковой аминокислотной цепью Hyp или Pro;
Rb является боковой аминокислотной цепью Hyp или Pro;
Rc является боковой аминокислотной цепью Gly, Sar, ароматической боковой аминокислотной цепью, произвольно замещеаемой одной группой или большим числом гидроксигрупп, галогеновых групп
или нижних алкоксигрупп в ароматическом кольце или Rc;
- 80 -
007792
Rd является боковой аминокислотной цепью Ala, Gly, Glu, Asp, Dab, Dapa, Lys, Asn, Gln, Orn, Thr,
Ser или Cys;
Re является боковой аминокислотной цепью Ala;
Rf является боковой аминокислотной цепью Ala, Sar или Gly;
Rg представляет любую боковую аминокислотную цепь кроме боковой цепи L-4Hyp или части по
Формуле Z или Za;
Rh является боковой аминокислотной цепью Ala, или Rh является частью Формулы Z или Za;
Ri является боковой аминокислотной цепью Gly, или Rj представляет ароматическую аминокислоту,
произвольно замещаемую одной галогенной группой или большим числом галогеновых групп в ароматическом кольце;
Rj является боковой аминокислотной цепью Asn, Gln, Asp, Glu, Cys, или Tyr;
и каждый из индексов j, k, i, m, n, p и q независимо друг от друга принимает значение 0 или 1;
и ретроформы всех форм D или ретроформы всех D форм пептидной последовательности по формуле I,
и их соли и амиды.
В химических соединениях по формуле I желательно, чтобы R7 было представлено в виде NH2, Ra
было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Pro, Rb было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Hyp, Rc было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Gly или Tyr, Rd выбиралось из группы, в состав которой входит боковая аминокислотная цепь Gly, Asp или Glu, Dapa и
Dab, Rf было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Ala или Gly, Rg было представлено в
виде боковой аминокислотной цепи Pro, Asn или Gly, Rg было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Asn, Gly, D-Hyp или L-/D-Pro, если формула I представляет линейный пептид, или, если
формула I представляет пептид циклизированный между N*, и С* тогда Rg является боковой аминокислотной цепью L-/D-4Hyp или L-/D-Pro, Rh было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Ala,
если U отсутствует, или Rh было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Pro или Hyp, если U
присутствует, предпочтительно, чтобы Ri было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Tyr,
Phe, Trp, Nal произвольно замещаемых одной гидроксигруппой или большим числом гидроксигрупп, F
или Сl, в ароматическом кольце, Rj выбиралось из группы, в состав которой входит боковая аминокислотная цепь Asp, Glu, и Tyr и линейный пептид по формуле I, который является ретроформой всех форм
D.
Желательно также, чтобы соединение пептида по формуле I состояло из аминокислотных остатков
числом от 3 до 9, еще лучше, чтобы оно состояло из аминокислотных остатков числом от 3 до 7, при
этом желательно, чтобы j и k - равнялись 0, если имеется U, чтобы j и k равнялись 1, если U отсутствует;
формула I представляет циклический пептид, при этом желательно, чтобы М равнялось 0, если U отсутствует, чтобы р равнялось 1, если имеется U, и чтобы q равнялось 0, если имеется U.
Предпочтительный вариант по настоящему изобретению относится к химическим соединениям, соответствующим общей формуле (II)
X-(G')a-A-G'-(Px)2-(Y')b-R7(II),
задающей пептидную последовательность, в которой аминокислотные остатки могут иметь форму
L и/или форму D, и где
X является Н или Ас;
G' является остатком глицина или аналогом глицина типа Sar;
А является аланином;
Рх является аминокислотным остатком по формуле Z или Za типа Hyp или Pro;
Y' является тирозином или фенилаланином, произвольно замещаемым в фенильном кольце галогеновой группой или гидроксигруппой;
а и b - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1,
R7 является ОН, NH2, NHNH2, Asn-NH2, или Gln-NH2;
и к их ретроформам, и их солям, при этом желательно, чтобы
X являлось Ас и все аминокислоты имели бы форму L, чтобы G' являлось глицином, чтобы Рх являлось Pro, чтобы Y' являлось тиразином, чтобы R7 являлось NH2;
чтобы формула II для ретросоединений имела следующий вид: X-(Y')b-(Px)2-G'-A-(G')a-R-7, где все
аминокислотные остатки имеют форму D, и где все символы имеют то же самое значение, что и в формуле II;
и к пептидным соединениям по формуле II, где по крайней мере один остаток Рх является Dаминокислотой, а остальное - L-аминокислотами;
и к циклическим последовательностям по формуле II, где X является Н, R7 является Asn или Gln с
ковалентной связью с Y ', b равно 1 и а равно 1.
Химическое соединение по формуле 2:
H-GAG - (Pa)2-NH2 типа
H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2,
- 81 -
007792
H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH2,
или его соль.
Химическое соединение по формуле 3:
H-GAG - (Px)2-Y-NH2, типа
H-Gly-Ala-Gfy-NCG-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-GIy-T4C-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Gly-Pc-Pro-Tyr-NH2,
и его фармацевтически приемлемые соли.
Химическое соединение по формуле 8:
H-G'A-G'-(Px)2-Y-NH2, типа
H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2,
и его фармацевтически приемлемые соли.
Химическое соединение по формуле 6:
X-D-Y-(D-Px) Z-G-D-A-G-NH2 или его ретроформа
X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-NH2 или
X-G-D-A-G-(D-Px)2-D-Y-D-(Asn)-NH2,типа
H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH2,
H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asp-OH,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2,
и его фармацевтически приемлемые соли.
Химическое соединение по формуле 10:
цикло(-GAG - (Px)2-Y-N/Q-), типа
цикло(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln-),
цикло(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-),
цикло(-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-),
и его фармацевтически приемлемые соли.
Химическое соединение по формуле 11:
цикло(-Y-(Рх)2-А-(G) q-N/Q-), типа
цикло(-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn-),
цикло(-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Asn-),
цикло(-Tyr (3-I, 5-I)-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn),
и его фармацевтически приемлемые соли.
химическое соединение по формуле 12:
X-Zd-G (N/Q) Y-NH2, типа
H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2,
Ac-Gly-Asn-Tyr-NH, H-Gly-Asn-Tyr-NH2,
Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2,
H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2,
и его фармацевтически приемлемые соли.
К циклическим пептидным соединениям по формуле I относятся соединения, имеющие общую
формулу III:
(III)
- 82 -
007792
где X является Н или частью N-концевого участка типа фотозонда, способного образовывать ковалентную связь с N-концевой аминогруппой или ацильной группой, полученной из С(2-22) алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот типа бегеновой кислоты, произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит гидрокси-группа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа;
R1 является Н или СН3, предпочтительно Н;
R2 и R3 отличаются друг от друга или идентичны, и являются любой возможной боковой аминокислотной цепью;
---- - возможная связь;
R5 и R4 - любая возможная боковая аминокислотная цепь, или, если существует возможная связь, то
R5 и R4 вместе с присоединенными атомами С и N представляют пролиновое кольцо, которое произвольно замещается на ОН, предпочтительно в позиции 4, или R5 и R4 вместе с присоединенными атомами С и
N представляют часть формулы Z или Za, приведенной выше;
R6 является боковой ароматической аминокислотной цепью, произвольно замещаемой в фенильном
кольце одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит галогеновая группа, нитро-группа и гидроксигруппа;
р равно 0 или 1;
n равно 1, 2, 3 или 4;
а также их соли, желательно, чтобы R являлся Н, чтобы R2 и R3 отличались друг от друга или были
идентины, являлись бы Н или СН3, чтобы R5 и R4 вместе с присоединенными атомами С и N были бы Pro
или Hyp, а р равнялось бы 1, и n равнялось бы 1.
Типичными химическими соединениями по формуле III являются:
и их фармацевтически приемлемые соли.
К числу предпочтительных химических соединений по формуле I относятся соединения, имеющие
общую формулу IV:
(IV)
где R8 является Н или С(1-6)алкилгруппой;
- 83 -
007792
R6 является Н или СН3;
R4 и R5 отличаются друг от друга или идентичны, и являются любой возможной боковой аминокислотной цепью;
---- - возможная связь;
R2 и R3 - любая возможная боковая аминокислотная цепь, или, если существует возможная связь, то
R2 и R3 вместе с присоединенными атомами С и N представляют из себя пролиновое кольцо, которое
произвольно замещается на ОН, предпочтительно в позиции 4, или R2 и R3 представляют часть формулы
Z или Za;
R1 является боковой ароматической аминокислотной цепью;
р равно 0 или 1;
n равно 1, 2, 3 или 4;
и их соли.
Типичными химическими соединениями по формуле IV являются
и их фармацевтически приемлемые соли.
Другими предпочтительными химическими соединениями являются пептидные соединения, у которых аминокислотные остатки могут быть формы L и/или формы D, с общей формулой V
где R1 является возможной амидной связью между N-концевым и С-концевым участками пептида,
Н или Ас;
Aa1 является пептидной последовательностью, состоящей предпочтительно из 0-4 аминокислотных
остатков;
Аl является аминокислотным остатком, выбираемым из группы, в состав которой входит Gly, бета
аланин и Sar;
Аа2 является аминокислотным остатком, выбираемым из группы, в состав которой входит Asn, Gln,
Gly, Tyr, или химические соединения типа оксикислоты, аминосульфокислоты, фосфорнокислой группы
или углеводородной цепи, соединяющей Аl и Ar посредством 4 ковалентных связей;
Ar является ароматическим аминокислотным остатком, типа Tyr, Trp, Phe, His, или Nal, произвольно замещаемым одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в
состав которой входит галоген, типа F, Cl, Вr, I, ОН, NO2, NH2, COOH, CONH;
R2 является ОН, NH2 или отсутствует;
и их ретроаналоги, ретроаналоги всех D форм (обратные ретроаналоги) и их соли, и желательно,
чтобы Аа1 выбиралось из группы, в состав которой входит Ala, Gly-Ala, Gly-Asn-Tyr и Gly-Asn-Tyr-Ala,
при этом Аl является Gly или Sar, Аа2 является Asn или Gln, а Ar является Tyr или Phe, поизвольно замещаемым одним или большим числом галогенов, например I, a R2 является NH2, если химическое соединение не является циклическим, или R2 отсутствует, если химическое соединение является циклическим.
Типичными химическими соединениями по формуле V являются
H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2,
цикло(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-),
- 84 -
007792
цикло(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-),
цикло(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-),
цкло(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-),
Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2,
H-Gly-Asn-Tyr-NH2,
Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2,
H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2, и их фармацевтически приемлемые соли.
Другими химическими соединениями, которые используются в способе по настоящему изобретению, являются антиаритмические пептиды и их функциональные аналоги, типа ААР, ААР10,
[Pro4]AAP10-NH2, HP5 и новые конъюгаты пептидов
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2,
3(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-Нур-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-ОН и
3(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-Нур-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2.
Стабильность
Стабильность химических составов по настоящему изобретению
Помимо всего прочего химические соединения по настоящему изобретению характеризуются устойчивостью к ферментативному расщеплению, и/или устойчивостью к распаду в плазме, и/или более
продолжительным периодом полураспада in vivo. Желательно, чтобы химические соединения, включая
антиаритмические химические соединения по настоящему изобретению, были устойчивы к ферментативному расщеплению и/или устойчивыми в плазме.
Различные производные и химические модификации нативной пептидной последовательности ААР
по настоящему изобретению, полученные, например, амидированием или эстерификацией С-концевого
участка, при применении D-аминокислот и производных природных аминокислот, модификаций Nконцевого участка, и циклических аналогов, каждый из которых представляет модификации, предназначены для повышения стабильности при сохранении существенных антиаритмических и/или антитромбических свойств нативного ААР.
Пептиды обычно очень легко разлагаются протеолитическими ферментами желудочно-кишечной
системы, и живыми тканями, и жидкостями организма. Поэтому, в данном случае желательно использовать пептиды, которые были модифицированы и стали обладать повышенной стабильностью. Желательно, чтобы химические соединения, включая антиаритмические химические соединения по настоящему
изобретению, были устойчивыми к ферментативному расщеплению и/или устойчивыми в плазме. Желательно, чтобы период полураспада пептидов, применяемых в способе по настоящему изобретению, в
растворе при измерениях с применением стандартного анализа стабильности составлял более 50 мин, но
желательно, чтобы период полураспада пептидов превышал 4 ч. Как показано в табл. 7 и 8 целый ряд
пептидов по настоящему изобретению имеют период полураспада, вызванный расщеплением, превышающий 5 ч при измерениях с применением стандартного анализа стабильности. Для представленных
здесь пептидов стабильность является важным параметром, определяющим эффективность лекарственного средства и длительность периода полураспада, и желательно, чтобы Т1/2 превышал 300 мин. Стандартный анализ стабильности относится к in vitro анализу стабильности плазмы, описанному ниже.
Способ анализа стабильности плазмы in vitro
Стабильность пептидов анализировалась в сыворотке и плазме. Пептиды выдерживались в плазме
или сыворотке при 37°С и 9 проб, отобранных приблизительно через равные интервалы времени в период от t=0 до t=156 мин, анализировались методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для того, чтобы не совпадали времена удержания максимума лекарственного средства и максимумов плазмы оценивались соответствующие условия высокоэффективной жидкостной хроматографии
(колонка, растворитель, градиент, и температура). Для этого выполнялись последовательные инъекции
лекарственного средства, плазмы и совместная инъекция лекарственного средства и плазмы, после чего
следовала оптимизация параметров метода жидкостной хроматографии, пока не было получено удовлетворительного разделения. Для каждого типа плазмы выполнялось три параллельных эксперимента. 100
мл пептида смешивалось с 900 мл плазмы в момент времени t=0 и выдерживалось при 37°С (концентрация смеси лекарственного средства в плазме составляла 0,1 мг/мл). Через равные интервалы времени
отбирались образцы смеси плазмы и лекарственного средства емкостью 100 мл и распад останавливался
осаждением образца с помощью 10 мл MeCN:TFA объемной концентрацией 50:50. Отбирался также контрольный образец плазмы без лекарственного средства, обработанный таким же образом. Образцы плазмы центрифугировались в течение 15 мин при 12000 об./мин (центрифуга Эппендорфа (Eppendorf)) и при
температуре окружающей среды. Получаемый раствор супернатанта подавался в пробирки автоматического пробоотборника емкостью 300 мл и анализировался методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии. Образцы анализировались следующим образом: контрольная проба, пептид концентрацией 0,1 мг/мл, плазма без пептида, три параллельных пробы для момента времени t=0, три параллельных пробы для момента времени t=5 мин, три параллельных пробы для момента времени t=10 мин, и т.д.
И, наконец, три параллельных пробы для момента времени t=0 анализировались повторно для того, что- 85 -
007792
бы удостовериться, что во время исследований не было никакого распада или другого сбоя. Концентрации образцов (высота пика сигнала в mAU) откладывались на графике как функция времени и получали
эмпирическую функцию, описывающую кривую моно экспоненциального затухания. Периоды полураспада (Т1/2) (мин) различных химических соединений по настоящему изобретению в сравнении с периодами полураспада ААР10, ААР и НР5 в плазме человека представлены в табл. 7 как среднее (n=3) ±
среднеквадратичное отклонение. Химические соединения 2, 3, 27, 48 и 49 по настоящему изобретению
значительно более стабильны в плазме и сыворотке чем ААР10, период полураспада которого меньше 10
мин, и чем НР5, период полураспада которого меньше 12 мин.
Таблица 7. Результаты in vitro испытания на стабильность в плазме и сыворотке, Т1/2, мин и ч
В представленной ниже табл. 8 показана активность химических соединений у моделей с аритмией,
вызванной хлористым кальцием, и периоды полураспада.
- 86 -
007792
- 87 -
007792
Период полураспада в плазме человека, измеренный в ЭДТК плазмы, НРР относительно радикала
3(4-гидроксифенил)пропионила
- 88 -
007792
- 89 -
007792
- 90 -
007792
Желательно, чтобы химические соединения, используемые в способе по настоящему изобретению,
были бы непептидами, которые способствуют МКЩС, как сообщалось в литературе, типа ресвератрола
(транс-3,5,4'-тригидроксистилбен и цис-3,5,4'-тригидроксистилбен), включая различные димеры, тримеры, тетрамеры и их производные и структурно связанное с ним химическое соединение - фенилэтиловый
сложного эфира кофейной кислоты и его производные; и апорфиноидные алкалоиды болдин и таспин.
Влияние ресвератола на МКЩС было исследовано in vivo на модели с предсердно-желудочковой блокадой, вызываемой СаСl2. Ресвератрол концентрацией 100 нмоль/кг, вводимый внутривенно (n=6 мышей),
увеличивал время до вводимой кальцием блокады у животных, которым вводился носитель (n=7 мышей),
(136+9% против 100±7%;р<0,01).
Патент США № 6008260 относится к использованию ресвератрола, вводимого млекопитающим как
профилактическое средство против рака, вызываемого химическими средствами (см. также работу авторов Нильсен М., Руч Р.Дж., Ванг О. (Nielsen M., Ruch RJ, Vang О), "Исследование по биохимии и биофизике", (Biochem Biophys Res Commun), 2000 г., сентябрь 7; 275 (3):804-9), где показано, что ресвератрол,
который является природным стильбеном/алексином, и особенно транс-ресвератрол (транс-3,5,4'тригидроксистильбен) меняет направление процесса ингибирования межклеточной коммуникации по
щелевому соединению, вызванное активатором опухоли, на обратное и предлагает использовать его как
средство профилактики рака. Исследование влияния ресвератрола на межклеточную коммуникацию по
щелевому соединению (МКЩС) в эпителиальных клетках печени крысы WB-F344 проводилось по причине того, что ингибирование МКЩС является важным механизмом активации опухоли. От 17 до 50
мкМ ресвератрола улучшали МКЩС в 1,3 раза по сравнению с контрольными группами, которым вводился стандартный растворитель-носитель, когда клетки WB-F344 обрабатывались ресвератролом в течение 6 ч. Большинство активаторов опухоли, включая сложный эфир форбола ТРА и инсектицид ДДТ,
блокирует МКЩС. Ресвератрол в количестве 17-50 мкМ также предотвращал низкоуровневую регуляцию МКЩС с помощью ТРА и ДДТ в 2,7 и 1,8 раза соответственно. Это восстановление МКЩС после
ингибирования с использованием ТРА частично коррелировалось затрудненным гиперфосфорилированием Сх43. Наконец, было обнаружено, что ресвератрол усиливает МКЩС и противодействует влиянию
активаторов опухоли на МКЩС, и этот механизм, вероятно, вносит свой вклад в антиканцерогенные
свойства ресвератрола.
В патенте WO 0059466 (LVMH Recherche) описано использование экстракта липида из Skeletonema
costatum, который содержит алкалоид болдин, в косметическом составе для улучшения симптомов при
старении кожи. Упомянутые экстракт липида и соединение болдина улучшают межклеточную коммуникацию по щелевому соединению в кератиноцитах, фибробластах и преадипоцитах. В изобретении показано, что в зависимости от дозы обработка болдином в целом увеличивает содержание коннексина 43 в
кератиноцитах пациентов среднего и пожилого возраста до содержания кератиноцитов у молодых людей, при оптимальной концентрации болдина, равной 50 нМ. Так как увеличение содержания коннексина
43 в клетке должно вносить свой вклад в улучшение межклеточной коммуникации по щелевому соединению, то соединение болдина может быть полезено для настоящего изобретения.
Таким образом, целью настоящего изобретения являются способ уменьшения симптомов при старении кожи, целлюлите и при морщинах, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого терапевтически эффективного количества хотя бы одного пептида по формулам I-VIII или из
таблиц 1-8, которое улучшает межклеточную коммуникацию.
Другие химические соединения, в которых также используется структура болдина, включают апорфиноидные алкалоиды, типа таспина, о котором сообщалось в патенте США № 5,156,847, изданном 20
октября 1992 г., для применения при лечении ран.
Химические составы и химические соединения
Химические составы, содержащие описываемые здесь химические соединения для лечения вышеупомянутых болезней и состояний, могут быть любой подходящей формы, и вводиться при необходимости медицинским персоналом или пациентом. Примерами могут служить химические составы для внутривенной инъекции, химические составы для перорального приема, включая таблетки и капсулы, и свечи. Химические соединения по настоящему изобретению могут вводиться в качестве независимого лекарственного средства или в сочетании с другими лекарственного средствами, подходящими для лечения
определенной болезни. Описываемые здесь химические соединения являются пептидами сравнительно
небольшой молекулрной массы, с относительно низким бионакоплением во рту, если предпочтительными являются составы не для перорального применения, например химические составы для инъекции, или
для введения через носовой, или ректальный эпителий, или через кожу, то дополнительно можно применять, например, ионтофорез.
В терапевтических способах по настоящему изобретению, химическое соединение для лечения может вводиться субъекту любым из нескольких способов, включая внутркорпоральное введение, или местное. Кроме того, желательно, чтобы соединения по настоящему изобретению, например, химическое
соединение 3, химическое соединение 2, химическое соединение 40, вводились в качестве профилактического средства с целью предотвращения начала целевого состояния или уменьшения степени его тяже- 91 -
007792
сти. В другом случае такие предпочтительные химические соединения могут вводиться в течение целевого состояния, например, для облегчения симптомов.
Химическое соединение для лечения вводится субъекту либо одно, либо в сочетании с одним или
большим числом терапевтических средств в качестве фармацевтического соединения в смеси с обычным
инертным наполнителем, то есть, фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим веществом-носителем, подходящим для парентерального, энтерального или интраназального применения,
которое не дает вредной реакции на активные химические соединения и не вредно для его реципиента. К
числу подходящих фармацевтически приемлемых носителей, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, можно отнести воду, солевые растворы, спирт, растительные
масла, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремневую кислоту, вязкий
парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, петроэтральные сложные
эфиры жирной кислоты, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.д. Фармацевтические препараты могут стерилизоваться и при необходимости смешиваться со вспомогательными средствами, например, со смазкой, консервирующими средствами, стабилизирующими средствами, смачивающими
веществами, эмульгаторами, солями для того, чтобы влиять на осмотическое давление, буферные вещества, красители, вкусовые добавки и/или ароматизаторы и т.п., которые не дают вредной реакции при
взаимодействии с активными химическими соединениями.
Такие химические соединения могут готовиться для введения парентерально, особенно в форме
жидких растворов или суспензий; для перорального приема, особенно в форме таблеток или капсул; интраназально, особенно в форме порошков, носовых капель, или аэрозолей; вагинально; местно, например, в форме крема; ректально, например в виде свечей; и т.д.
Фармацевтические средства могут удобно вводиться в единичной дозировке и могут готовиться
любым известным в фармацевтике способом, например, как описано в "Фармацевтических Науках Ремингтона" 17-е изд. Редактор Алфонсо Р. Дженнаро, Истон, США, 1985 г. ("Remington's Pharmaceutical
Sciences" 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985). Химические соединения для парентерального введения могут содержать общие инертные наполнители типа стерилизованной воды или соляных растворов, полиалкиленгликоли типа полиэтиленгликоля, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и т.п. В частности, биологически совместимый, разлагаемый микроорганизмами полимер лактида, сополимер лактида и гликолида, или сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена могут использоваться в качестве инертных наполнителей для
контроля за выделением некоторых химических соединений по настоящему изобретению и, в частонсти,
химического соединения 3, химического соединения 2, химического соединения 40 и т.д.
Другие потенциально используемые парентеральные системы включают частицы сополимера этилена и винилацетата, осмотические насосы, имплантируемые системы вливания, и липосомы. Химические составы для ингаляции содержат в качестве инертных наполнителей, например, лактозу, или могут
быть водными растворами, содержащими, например, эфир полиоксиэтилен-9-лаурила, гликохолат и деоксихолат, или масляные растворы для введения в форме носовых капель, или в виде геля, который будет вводиться назально. Химические составы для парентерального введения могут также включить гликохолат для трансбуккального введения, метокисалицилат для ректального введения, или лимонную кислоту для вагинального введения. Другие системы доставки лекарственных средств вводят терапевтическое средство (средства) непосредственно во время хирургической операции, например при помощи
стентов.
Концентрация одного или большего числа химических соединений в терапевтической композиции
для лечения сильно зависит от множества факторов, включая дозировку вводимого химического соединения по настоящему изобретению, химические характеристики (например, гидрофобность), применяемого химического соединения, и планируемую форму и способ введения. В общем, одно или больше чем
одно из химических соединений по настоящему изобретению и желательно по крайней мере одно из таких соединений, как химическое соединение 3, химическое соединение 2, химическое соединение 40,
может вводиться парентерально в составе водного физиологического буферного раствора, содержащего
приблизительно от 0,1 до 10% химического соединения в отношении массы к объему.
Следует понимать, что фактические количества активных химических соединений, используемых в
данной терапии, будут меняться согласно, например, определенному используемому составляемому химическому соединению, способу введения и характеристикам субъекта, например, в зависимости от вида, к которому относится субъект, его пола, массы, общего состояния здоровья и возраста. Оптимальная
интенсивность введения для данного протокола введения может быть установлена специалистами с использованием обычных испытаний по определению дозировки, проводимых относительно предшествующих нормативов. Соответствующие диапазоны дозы могут меняться приблизительно от 1 мг/кг приблизительно до 100 мг/кг массы тела в сутки.
Терапевтические соединения по настоящему изобретению, соответственно, применяются в протонированной и водорастворимой форме, например, в виде фармацевтически приемлемой соли, обычно
кислой соли типа неорганической кислой соли, например хлоргидрата, сульфата или фосфорнокислой
соли, или в виде органической кислой соли типа ацетата, малеата, фумарата, тартрата, или соли лимон- 92 -
007792
ной кислоты. Фармацевтически приемлемые соли терапевтических соединений по настоящему изобретению также могут включить соли металла, особенно соли щелочного металла типа поваренной соли или
калийной соли; соли щелочно-земельных металлов типа магния или соли кальция; соли аммония типа
аммония или тетраметиламмония; или соли аминокислоты типа лизина, аминоуксусной кислоты, или
соли фенилаланина.
Составы
Изобретение также относится к химическим соединениям, включающим фармакологически активный антиаритмический пептид по настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым
носителем и/или разбавителем. Такие составы могут быть в форме, адаптируемой к пероральному, подкожному, парентеральному (внутривенному, интраперитонеальному), внутримышечному, ректальному,
эпидуральному, эндотрахеальному, интраназальному, кожному, вагинальному, трансбуккальному, окулярному, прямому в мозг или легочному введению, предпочтительно в форме, адаптируемой к подкожному, внутривенному или пероральному введению, и такие составы могут готовиться известными способами, например, как описано в "Фармацевтических Науках Ремингтона" 17-е изд. Редактор Алфонсо Р.
Дженнаро, Истон, США, 1985 г. ("Remington's Pharmaceutical Sciences" 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.),
Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985) и в более недавних изданиях и монографиях Марселя
Деккера серии "Лекарственные препараты и фармацевтические науки" (Drugs and Pharmaceutical Sciences, Marcel Dekker). Составы могут быть обычных форм, например, в виде растворов и суспензий для
инъекции, включая концентраты для вливания внутривенно, капсулы и таблетки, предпочтительно в
форме энтеральных составов, например, как описано в патенте США № 5350741 для перорального приема.
В качестве фармацевтического носителя или растворителя может использоваться обычный твердый
или жидкий носитель. Примерами твердых носителей являются лактоза, фарфоровая глина, сахароза,
циклодекстрин, тальк, желатин, агар-агар, пектин, акация, стеарат магния, стеариновая кислота или низшие алкильные эфиры целлюлозы. Примерами жидких носителей являются сироп, арахисное масло,
оливковое масло, фосфолипиды, жирные кислоты, амины жирной кислоты, полиоксиэтилен и вода.
Точно так же носитель или растворитель могут включить любой один известный материал длительного высвобождения типа глицерилмоностеарата или глицерилдистеарата, или же данный материал,
смешанный с воском.
Если используется твердый носитель для перорального приема, препарат может быть таблетирован,
помещен в виде порошка или пилюли в твердую желатиновую капсулу, или может быть в форме пастилки или лепешки. Масса твердого носителя может меняться в широких пределах, но обычно составляет
приблизительно от 25 мг до 1 г.
Типичная таблетка, которая может быть приготовлена обычными способами изготовления таблеток, может содержать:
Ядро: активное химическое соединение (в виде свободного химического соединения или его соли) 100 мг; коллоидный диоксид кремния (Аэросил) - 1,5 мг; целлюлоза микрокристаллическая (Авицел) - 70
мг; модифицированная целлюлозная смола (Ac-Di-Sol) - 7,5 мг; стеарат магния.
Оболочка: НРМС приблизительно 9 мг; *Mywacett 9-40T приблизительно 0,9 мг; *ацелированный
моноглицерид, используемый как пластификатор для пленочного покрытия.
Если используется жидкий носитель, то препарат может быть в форме сиропа, эмульсии, мягкой
желатиновой капсулы или стерильной жидкости для инъекции типа водной или неводной жидкой суспензии или раствора.
Состав может также быть в форме, подходящей для местной или системной инъекции или вливания, и может также состоять из стерилизованной воды, или изотонического солевого раствора, или раствора глюкозы. Составы могут стерилизоваться обычными известными способами стерилизации. Готовые водные растворы могут быть упакованы для применения или отфильтрованы в стерильных условиях
и лиофилизированны; перед введением лиофилизированный препарат соединяется со стерильным водным раствором. Состав может содержать необходимые фармацевтически приемлемые вспомогательные
вещества, которые приближают свойства его к физиологическому состоянию, типа средств буферизации,
средств регуляции тонуса и т.п., например, уксуснокислый натрий, молочнокислый натрий, хлористый
натрий, хлористый калий, хлористый кальций и т.д.
Пептидные композиции для внутривенной инъекции
Многодозовые композиции могут быть приготовлены в виде раствора химического соединения по
настоящему изобретению в стерильном, изотоническом соляном растворе, который хранится в закрытых
пробирках, и в случае необходимости к нему добавляются консервирующие средства (например, бензоаты). Фиксированные дозы композиций могут быть приготовлены в виде раствора химического соединения в стерильном, изотоническом соляном растворе, который хранится в стеклянных пробирках, и в случае необходимости заполняется инертным газом. Каждая доза химического соединения хранится в сухом
виде в ампулах или закрытых пробирках и в случае необходимости заполняется инертным газом. Для
многодозовых композиций требуется самая высокая степень стабильности химического соединения. Ес- 93 -
007792
ли стабильность химического соединения низка могут использоваться композиции фиксированной дозы.
Пептид может также готовиться как концентрат для внутривенного вливания.
В случае назального введения препарат может содержать химическое соединение по настоящему
изобретению, растворенное или взвешенное в жидком носителе, в частности в водном носителе, для
применения в виде аэрозоля. Носитель может содержать добавки типа растворителей, например, пропиленгликоль, поверхностно-активные вещества типа соли желчной кислоты или полиоксиэтилен, высшие
спиртовые эфиры, усилители поглощения типа лецитина (фосфатидилхолина) или циклодекстрина, или
консервирующие средства типа парабина.
Кроме того, небольшая масса пептидных соединений по настоящему изобретению может явиться
преимуществом для перорального и назального введения, так как относительно быстрое поглощение через слизистую оболочку, по сравнению с пептидами большей массы, минимизирует ферментативное
расщепление, особенно в двенадцатиперстной кишке и подвздошной кишке.
Приготовление энтеральных таблеток, содержащих химическое соединение 2 400 мг L-винной кислоты и 40 мг касторового масла, полученного гидрогенизацией полиэтиленгликоля, растворяли в 5 мл
метанола. Раствор помещали в ступку, предварительно нагретую до 30°С. К раствору добавляли 1,5 мг
химического соединения 2. Сразу же после добавления химического соединения 2 смесь перемешивалась
пестиком под струей горячего воздуха, нагретого до 40°С, и затем помещалась в эксикатор под вакуумом
на ночь для удаления растворителя. Получаемая твердая масса превращалась пестиком в порошок и растиралась с 30 мг бикарбоната натрия и небольшого количества 70%-ого этилового спирта. Затем смесь
делилась на части и формировалась в таблетки и сушилась. Высушенные таблетки покрывались гидроксипропилметилцеллюлозфталатом с полчением энтеральной таблетки.
Изобретение также относится к фармакологически активному антиаритмическому пептиду или
производному пептида, или к его функциональному аналогу и применяется в терапии, и для получения
фармацевтического соединения для применения в терапии, например, при лечении аритмий и тромбического осложнения при сердечно-сосудистых заболеваниях типа острой ишемической болезни сердца (например, в случае устойчивой стенокардии, нестабильной стенокардии, острого инфаркта миокарда), застойной сердечной недостаточности (например, систолической, диастолической, гиперсистолической,
гипосистолической, левосторонней или правосторонней сердечной недостаточности), врожденного порока сердца, "легочного" сердца, кардиомиопатии, миокардита, гипертонической болезни сердца и при
коронарной реваскуляризации.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения для лечения и/или предотвращения брадиаритмий (например, вследствие заболевания синусового узла, предсердно-желудочкового
узла, предсердно-желудочкового пучка, левой или правой ветви предсердно-желудочкового пучка) и тахиаритмий, связанных с циркуляцией возбуждения (например, предсердные экстрасистолы, атриовентрикулярные комплексы, желудочковые экстрасистолы, фибрилляция предсердий, трепетание предсердий, пароксимальная наджелудочковая тахикардия, синусовая узловая пароксимальная тахикардия циркуляции возбуждения; предсердно-желудочковая узловая пароксимальная тахикардия циркуляции возбуждения и неустойчивая желудочковая тахикардия) может использоваться либо только один антиаритмический пептид, либо антиаритмический пептид в сочетании с другими антиаритмическими химическими соединениями типа средств класса I (например, лидокаин), средств класса II (например, метопролол или пропранолол), средств класса III (например, амиодарон или соталол) или средств класса IV (например, верапамил).
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения для предотвращения тромбозов
у больных с заболеваниями стенки сосуда (например, атеросклероз) при повышенном продуцировании
тромбоцитов (универсальный эеритроцитоз) и/или пониженном кровотоке (порок сердца, сосудистое
заболевание) антиаритмический пептид по настоящему изобретению может использоваться либо один,
либо в сочетании с такими ингибиторами как GP IIb/IIIa (например, с7Е3 Fab; абциксимаб), циклооксигеназа (например, аспирин), антагонисты тромбоксана А2, производные кумадина (например, варфарин),
или синтетический пептид интегрилин.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вследствие влияния на межклеточные канальцы щелевых соединений антиаритмический пептид по настоящему изобретению может
использоваться для лечения и/или предотвращения потери костной ткани и усиления заживляемости переломов костей[93]; для лечения и/или предотвращения заболеваний в тканях хряща и суставах с плохой
васкуляризацией [94]; для лечения и/или предотвращения катаракты[81]; для лечения и/или предотвращения васкуляризации роговицы при болезненных состояниях с недостаточным питанием роговицы и для
улучшения заживляемости роговицы в случае ее повреждения[95]; для лечения и/или предотвращения
роста и распространения по поверхности раковых клеток, типа раковых клеток линий эпителиальных
клеток[96]; для лечения и/или предотвращения артериальной гипертензии путем увеличения сосудодвигательной реакции[74]; для предотвращения отторжения организмом имплантатов типа клеток и органов.
- 94 -
007792
Синтез пептидов
Ниже описана процедура по предпочтительному варианту настоящего изобретения. Однако более
детальные описания синтеза твердофазных пептидов можно найти в документе W098/11125, который
полностью включен в описание настоящего изобретения.
Оборудование и стратегия синтеза
Синтез пептидов осуществлялся партиями в полиэтиленовом сосуде, оборудованном для фильтрации полипропиленовым фильтром с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонила (Fmoc) в качестве
N-α-аминоблокирующей группы и подходящих общих блокирующих групп для функциональных групп
боковых цепей.
Растворители
Растворитель DMF (N,N-диметилформамид, Ридель де-Хаен (Riedel de-Haen), Франкфурт, Германия) очищался путем пропускания через колонку с насадкой, содержащей сильную катионообменную
смолу (сильная кислота Lewatit S 100 МВ/Н, Байер AG Леверкузен, Германия), и анализировался перед
использованием на наличие свободных аминов путем введения 3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3бензотриазина (Dhbt-OH) до пожелтения (Dhbt-ОН-анион) при наличии свободных аминов. Растворитель
DCM (дихлорметан, аналитическая марка, Ридель де-Хаен (Riedel de-Haen), Франкфурт, Германия) использовался без очистки. Ацетонитрил (марка для метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, Лаб-Скан, Дублин, Ирландия) использовалась без очистки.
Аминокислоты
Аминокислоты с защитой боковых цепей, блокирующие Fmoc, закупались в компании Эдвансед
КемТек (Advanced ChemTech). По-другому защищенные аминокислоты (Fmoc-Glu(OH)-OAllyl; FmocAsp(OH)-OAllyl закупались в компании НоваБиокем (NovaBiochem) (Швейцария), а аминокислота Fmoc4-Hyp(OtBu)-OH закупалась в компании Бакем (Bachem) (Швейцария).
Факторы сопряжения
Фактор сопряжения диизопропилкарбодиимид закупался в компании Ридель де-Хаен (Riedel deHaen), Франкфурт, Германия, а фактор сопряжения РуВор закупался в компании Эдвансед КемТек (Advanced ChemTech).
Линкеры
(4-гидроксиметилфенокси)уксусная кислота (НМРА) закупалась в компании НоваБиокем (NovaBiochem), Швейцария; и присоединялась к смоле в виде преформированного сложного эфира 1гидроксибензотриазола (HOBt), произведенного с помощью диизопропилкарбодиимида.
Твердые подложки
Пептиды синтезировали согласно Fmoc-стратегии на смолах TentaGel S - 0,22-0,31 ммоль/г
(TentaGel-S-NH2; TentaGel S-Ram, TentaGel RAM-Lys(Boc)Fmoc; производство компании "Рапп полимер"
(Rapp polymere), Германия);
Катализаторы и другие реактивы
Дилсопропилэтиламин (ДИЕА) закупался в компании Алдрих (Aldrich), Германия, а этилендиамин
в компании Флука (Fluka), Швейцария, пиперидин и пиридин в компании Ридель де-Хаен (Riedel deHaen), Франкфурт, Германия. 4-(N,N-диметиламино)пиридин (DMAP) закупался в компании Флука
(Fluka), Швейцария, и использовался как катализатор в реакциях сопряжения, включающих симметрические ангидриды. Этандитиол закупался в компании Ридель де-Хаен (Riedel de-Haen), Франкфурт, Германия. 3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (Dhbt-ОН), 1-гидроксибензотриазол (HOBt)
(НОAt) были получены из компании Флука (Fluka), Швейцария.
Методика сопряжения
Первая аминокислота была получена сопряжением как симметричный ангидрид в DMF, произведенном от соответствующей N-α-блокированной аминокислоты и диизопропилкарбодиимида. Следующие аминокислоты сопрягались как полученные на месте сложные эфиры HOBt или HOAt, выполненные
из соответствующих N-α-блокированных аминокислот и HOBt или HOAt посредством диизопропилкарбодиимида в DMF. Ацилирование было проверено с помощью нингидриновой реакции, проведенной при
80°С для предотвращения разблокировки Fmoc во время испытания[97].
Разблокировка N-α-аминоблокирующей группы (Fmoc)
Разблокировка Fmoc группы выполнялась обработкой 20 %-м пиперидином в DMF (1x5 и 1x10
мин), после чего следовала промывка с использованием DMF (5x15 мл, по 5 мин каждый раз), пока не
обнаруживался желтый цвет после добавления Dhbt-OH к слитому DMF.
Разблокировка Аллила
Раствор из 3 экв. Pd(PPh3)4, растворенных в 15-20 мл СНСl3, АсОН, NMM (37:2:1), добавлялся к
пептидной смоле. Обработка продолжалась в течение трех часов при комнатной температуре и сопровождалась пропусканием потока N2 через смесь.
Сопряжение HOBt-сложных-эфиров
3 экв. N-α-аминоблокированной аминокислоты растворялись в DMF вместе с 3 экв. HOBt и 3 экв.
диизопропилкарбодиимида и затем добавлялись к смоле.
- 95 -
007792
Подготовленный симметричный ангидрид
6 экв. N-α-аминоблокированной аминокислоты растворялись в DCM и охлаждались до 0°С. Добавлялся диизопропилкарбодиимид (3 экв.) и реакция продолжалась в течение 10 мин. Растворитель удалялся в вакууме и осадок растворялся в DMF. Раствор сразу же добавлялся к смоле, после чего вводился
DMAP в количестве 0,1 экв.
Циклизация пептида на смоле
1,5 экв. РуВор растворялись в DMF вместе с 1,5 экв. HOBt и 3 экв. NMM добавлялись к пептидной
смоле. Реакция продолжалась всю ночь.
Отщепление пептида от смолы кислотой
Пептиды отщеплялись от смол путем обработки 95%-м раствором трифторуксусной кислоты (ТФК,
Ридель де-Хаен (Riedel de-Haen), Франкфурт, Германия) в воде (в объемном отношении) или 95%-м раствором ТФК и 5%-м раствором этандитиола (в объемном отношении) при комнатной температуре в течение 2 ч. Отфильтрованные смолы промывались 95%-м раствором ТФК в воде и фильтраты выпаривались при пониженном давлении. Остаток промывался эфиром и проходил лиофильную сушку с отделением раствора уксусной кислоты в воде. Сырой (неочищенный) прошедший лиофильную сушку продукт
анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и идентифицировался ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением .
Синтез пептидов партиями на смоле TentaGel (PEG-PS)
Смола TentaGel (1 г, 0,22-0,31 ммоль/г) помещались в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для
фильтрации полипропиленовым фильтром. Смола набухала в DMF (15 мл), и обрабатывалась 20%-ым
раствором пиперидина в DMF для обеспечения присутствия непротонированных аминогрупп на смоле.
Смола сливалась и промывалась DMF до тех пор, пока нельзя было обнаружить желтый цвет после добавки Dhbt-OH к слитому DMF. HMPA (3 экв.) сопрягался как преформированный сложный эфир HOBt
(как описано выше), и сопряжение продолжалось в течение 24 ч. Смола сливалась и промывалась DMF
(5x5 мл, по 5 мин каждый раз) и ацилирование проверялось нингидриновой реакцией. Первая аминокислота сопрягалась как преформированный симметричный ангидрид, как описано выше. Следующие аминокислоты согласно последовательности сопрягались как преформированные Fmoc-блокированные
сложные эфиры HOBt (3 экв.), как описано выше. Сопряжения продолжались в течение 2 ч, если не оговаривалось иначе. Смола сливалась и промывалась DMF (5x15 мл, по 5 мин каждый раз) с целью удаления избыточного реагента. Все ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при
80°С. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 5 мин каждый раз), DCM
(3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и, наконец, диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Условия для высокоэффективной жидкостной хроматографии
Градиент высокоэффективной жидкостной хроматографии анализировался с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии Hewlett Packard 1100, состоящей из четырехступенчатых насосов HP 1100, автоматических пробоотборников HP 1100, колонковых термостатов HP 1100
и многочисленных спектральных датчиков HP 1100, Для инструментального контроля и сбора данных
использовалась Hewlett Packard Chemstation с программным обеспечением LC (редакция 06.01).
Использовались следующие колонки и буферная система высокоэффективной жидкостной хроматографии:
Колонка
Kromasil, Phenomenex OOF-3033-EO, 329889 (новая); 5 мкм С-18, 100А 150 х 4,6 мМ;
Партия №5243-10,
Буферная система: А: 0,1% ТФК в MQV; В: 0,085% ТФК, 10% MQV, 90% MeCN.
Градиент:
1-1,5 мин 25% В
1,5-13,5 мин 25-50% В
13,5-14,5 мин 50-100% В
14,5-15,5 мин 100% В
15,5-17,5 мин 100-25% В
17,5-20 мин 25% В
Расход 1,5 мл/мин
Температура в сушильном шкафу 40°С
Детектирование в ультрафиолетовом спектре: λ = 215 нм
Cпектры масс были получены на приборе LCT для микромасс.
Вышеупомянутое детальное описание изобретения приводится в заявке USSN 09/792,286, поданной
22 февраля 2001 г.
Обращаясь к настоящему изобретению можно сказать, что оно может применяться для лечения или
профилактики болезней, связанных с ухудшенной или нарушенной межклеточной коммуникацией.
Межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС) очень важна для нормального функ- 96 -
007792
ционирования клеток и тканей млекопитающих, и закрытие или вентильные действия щелевых соединений часто коррелируют с болезненным состоянием. В литературе приводятся примеры ухудшенной межклеточной коммуникации по щелевому соединению, связанной с болезненным состоянием. В то время
как вещества, которые блокируют щелевое соединение, известны, отчеты относительно использования
химических соединений, которые способствуют или участвуют в коммуникации по щелевому соединению или усиливают МКЩС при лечении непролиферативных болезней ограничены использованием ирзогладина (6-(2,5-дихлорофенил)-2,4-диамино-1,3,5-триазин), который, как сообщают, активизирует
межклеточную коммуникацию по щелевому соединению посредством мускариноподобного рецептора
ацетилхолина, при этом МКЩС замедлялась, но только один ирзогладин концентрацией от 10(-10) до 10(-6)
М не воздействовал на МКЩС (авторы Уеда Ф. (Ueda, F) и др., "Журнал фармакологии и экспериментальной терапии", (J Pharmacol Exp Ther), август 1995 г.; 274 (2): 815-9).
Поэтому настоящее изобретение относится также к химическому соединению, способствующему
межклеточной коммуникации, используемому для приготовления лекарства и, в частности, к агонисту
рецептора ААР предпочтительно по формулам I-VI. К числу дополнительных ингредиентов этого лекарства относится фармацевтически приемлемый носитель или инертный наполнитель выбираемый, например, из упомянутых выше носителей и наполнителей.
Синтез отдельных пептидов
Пример Синтеза 1. Синтез пептида Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (Химическое соединение 1) на
смоле TentaGel-S-NH-2; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Первая партия: сухая смола TentaGel-S-NH2 (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого Тирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл DMF, ацетилировалась аминогруппа N-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование
проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза
пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый
раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Сырой (неочищенный) прошедший лиофильную сушку продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, и было обнаружено, что чистота продукта составляла более 70%, и идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с
электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 619,24, расчетная величина МН+ составляла 619,26). Выход сырого (неочищенного) материала составлял 137,7 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как
описано выше, было собрано 58 мг пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида
составлял 35%.
Вторая партия: сухая смола TentaGel-S-NH2 (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого Тирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл DMF, ацетилировалась аминогруппа N-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование
проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза
пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый
раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Сырой (неочищенный) прошедший лиофильную сушку продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, и было обнаружено, что чистота продукта составляла более 70%, и идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с
электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 619,25, расчетная величина МН+ составляла 619,26). Выход сырого (неочищенного) материала составлял 137,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как
описано выше, было собрано 27,9 мг пептида чистотой выше 91%. Полный выход очищенного пептида
составлял 15,5%.
Пример синтеза 2. Синтез пептида Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 2) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Первая партия: сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого DТирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc ангидридом
уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл DMF, ацетили- 97 -
007792
ровалась аминогруппа N-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование
проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза
пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый
раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого, прошедшего лиофильную сушку продукта составлял 119,7 мг. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 618,25, расчетная величина МН+ составляла 618,28).
После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 42 мг пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного
пептида составлял 30%.
Вторая партия: сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого DТирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc ангидридом
уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл DMF, ацетилировалась аминогруппа N-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование
проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза
пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый
раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного), прошедшего лиофильную сушку продукта составлял
119,7 мг. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 618,29, расчетная величина МН+ составляла 618,28). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 100 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 71%.
Пример синтеза 3. Синтез пептида цикло(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (химическое соединение
3) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Первая партия: сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll
присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого
Тирозина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в
качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После полного
синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин
каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты; выход продукта составлял 57 мг. После очистки с использованием препаративного
метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 2,7 мг циклического пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 1,3%. Идентичность
пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально
полученная величина МН+ составляла 673,32, расчетная величина МН+ составляла 673,28).
Вторая партия: сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)OAH присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце
концов, после расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого
Тирозина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в
качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного
синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин
каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты; выход продукта составлял 57 мг. После очистки с использованием препаративного
метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 10 мг цикли- 98 -
007792
ческого пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 7%. Идентичность
пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально
полученная величина МН+ составляла 673,30, расчетная величина МН+ составляла 673,29).
Пример синтеза 4. Синтез пептида Цикло(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Asn) (Химическое соединение 4) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Первая партия: сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel".
Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной
(Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого Тирозина следовала процедура, описанная как "синтез
пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки
группы Fmoc и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80 °С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1
мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый
раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты с выходом сырого продукта. После очистки с использованием препаративного метода
высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, циклический пептид собирался.
Вторая партия: Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll
присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого
Тирозина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в
качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного
синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин
каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты с выходом сырого продукта 58,6 мг.
После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 5,7 мг циклического пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 4,4%. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной массспектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 616,25,
расчетная величина МН+ составляла 616,27).
Пример синтеза 5. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение 5) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 46,6 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял
28,6%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 576,27, расчетная величина МН+ составляла
576,26).
Пример синтеза 6. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение 6) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром обрабатывалась, как описано выше, при "периодическом синтезе пептида на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого Глицина. Сопряжения
продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при
- 99 -
007792
80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная смола
промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым
эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 26 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 16,3%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 560,25, расчетная величина МН+ составляла
560,28).
Пример синтеза 7. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2 (химическое соединение 7) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 18,9 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял
12,2%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 534,25, расчетная величина МН+ составляла
534,26).
Пример синтеза 8. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение 8) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого Глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 130 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 70,1 мг пептида чистотой выше 94%. Полный выход очищенного пептида составлял 48,2%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 520,25, расчетная величина МН+ составляла
520,56).
Пример синтеза 9. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH2 (химическое соединение 9) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого Глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 131 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 72,4 мг пептида чистотой выше 92%.
Полный выход очищенного пептида составлял 49%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 550,28, расчетная величина МН+ составляла
550,59).
Пример синтеза 10. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение
10) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
- 100 -
007792
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 150,8 мг. После очистки с использованием препаративного метода
высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 93,1 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 58%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 576,63, расчетная величина МН+ составляла 576,63).
Пример синтеза 11. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение 11)
на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 24,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 10,2 мг пептида чистотой выше 91%. Полный выход очищенного пептида составлял 4%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 602,23, расчетная величина МН+ составляла
602,32).
Пример синтеза 12. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение 12) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 29,9 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 19 мг пептида чистотой
выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 50%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 578,18, расчетная величина МН+ составляла
578,23).
Пример синтеза 13. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение 13)
на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина, сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялись нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 27,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 12,7 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 34%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 546,28, расчетная величина МН+ составляла
546,55).
Пример синтеза 14. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение 14) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
- 101 -
007792
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 23,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 13,5 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 34,6%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 574,32, расчетная величина МН+ составляла
574,29).
Пример синтеза 15. Синтез пептида Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 15)
на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого тиразина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка
ацетилировалась ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл DMF. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. После разблокировки группы Fmoc, Nконцевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF(3xl5 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15
мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 89,9 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 80,1 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 58,9%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 618,30, расчетная величина МН+ составляла
618,28).
Пример синтеза 16. Синтез пептида H-Cys(Acm)-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH2 (химическое соединение 16) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere),
Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого цистина (Acm). Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы,
как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого
(неочищенного) материала составлял 47,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода
высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 29,1 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 12,9%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 924,50, расчетная величина МН+ составляла
924,36).
Пример синтеза 17. Синтез пептида H-Cys (Acm)-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys (Acm)-NH2 (химическое соединение 17) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого цистина (Acm). Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз),
диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого
- 102 -
007792
(неочищенного) материала составлял 45,67 мг. После очистки с использованием препаративного метода
высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 29,15 мг пептида чистотой выше 94%. Полный выход очищенного пептида составлял 14,9%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 796,25, расчетная величина МН+ составляла
796,30).
Пример синтеза 18. Синтез пептида H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys(Acm)-NH2 (химическое соединение 18) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere),
Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого цистина (Acm). Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы,
как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Сырой (неочищенный) прошедший лиофильную сушку продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, затем очищался и так же, как и в случае с химическим соединением 17 снимались
его характеристики.
Пример синтеза 19. Синтез пептида H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-NH2 (химическое соединение 19) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого цистина (Acm). Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы,
как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с
использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано
выше, было собрано 2,76 мг пептида чистотой выше 94%. Полный выход очищенного пептида составлял
17,9 %.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 796,25, расчетная величина МН+ составляла
796,30).
Пример синтеза 20. Синтез пептида.
(химическое соединение 20)
19 мг пептида H-Cys-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys-NH2 окислялось путем растворения пептида в 1,5 мл
(5%-ая уксусная кислота в воде и диметилсульфоксиде 4:1 (в объемном отношении) рН ~6). Смесь помещалась в морозильник на 6 дней.
После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 91 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного
пептида составлял 47%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 652,29, расчетная величина МН+ составляла
652,21)
Пример синтеза 21. Синтез пептида.
(химическое соединение 21).
32 мг пептида H-Cys-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-Cys-NH2 окислялось путем растворения пептида в 1,5 мл
(5%-ая уксусная кислота в воде и диметилсульфоксиде 4:1 (в объемном отношении) рН ~6). Смесь помещалась в морозильник на 6 дней.
После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 6,13 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 3%.
- 103 -
007792
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МH+ составляла 652,23, расчетная величина МН+ составляла
652,21).
Пример синтеза 22. Синтез пептида H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH2 (химическое соединение 22) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 47 мг пептида чистотой выше 94%. Полный выход очищенного пептида составлял
30%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 576,26, расчетная величина МН+ составляла
576,26).
Пример синтеза 23. Синтез пептида H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asn-OH (химическое
соединение 23) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 93,7 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 60,7 мг пептида чистотой выше 93%.
Полный выход очищенного пептида составлял 47,5%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 690,32, расчетная величина МН+ составляла
690,30).
Пример синтеза 24. Синтез пептида Ac-D-Tyr(3,5-ди-I)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 24).
40,6 мг (64 мкмоль) пептида (химическое соединение 2) растворялось в 10 мл 0,1 М забуференного
фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).
75,6 мг KI (400 мкмоль) растворялось в 10 мл забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 и добавлялось 120 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, N-хлоробензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; PIERCE, 28665ZZ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).
Растворы А и В объединялись и осторожно перемешивались в течение 15 мин. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной
хроматографии, как описано выше; было собрано 39,5 мг пептида чистотой выше 90%. Идентичность
пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально
полученная величина МН+ составляла 870,09, расчетная величина МН+ составляла 870,08).
Пример синтеза 25. Синтез пептида Ac-D-Tyr(моно-йодо)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 25).
40,6 мг (64 мкмоль) пептида (химическое соединение 2) растворялось в 10 мл 0,1М забуференного
фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).
75,6 мг KI (400 мкмоль) растворялось в 10 мл забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 и добавлялось 120 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, N-хлоробензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; PIERCE, 28665ZZ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).
Растворы А и В объединялись и осторожно перемешивались в течение 15 мин. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной
хроматографии, как описано выше; было собрано 3,3 мг пептида чистотой выше 90%. Идентичность пеп- 104 -
007792
тида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально
полученная величина МН+ составляла 744,19, расчетная величина МН+ составляла 744,18).
Пример синтеза 26. Синтез пептида Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-(1,213C,15N-Gly)-D-Ala-(1,213C,15NGly)-NH2 (химическое соединение 26) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер"
(Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого D-тирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc ангидридом уксусной кислоты
(1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл DMF, ацетилировалась аминогруппа N-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола
промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым
эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 142,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 79,7 мг пептида чистотой выше
99 %. Полный выход очищенного пептида составлял 50%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МH+ составляла 624,25, расчетная величина МН+ составляла
624,26).
Пример синтеза 27. Синтез пептида H-Pro-Tyr-Asn-Gly-AlB-Gly-Hyp-NH2 (химическое соединение
27) на смоле TentaGel-S-Ram; Производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл /1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 135,7 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял
82,7%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 690,38, расчетная величина МН+ составляла
690,31).
Пример синтеза 28. Синтез пептида H-Hyp-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение
28) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) Помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого 4-гидрокси-пролина.
Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз),
диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 127 мг пептида чистотой выше 98%. Полный
выход очищенного пептида составлял 69,8%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 690,25, расчетная величина МН+ составляла
690,31).
Пример синтеза 29. Синтез пептида H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (Химическое соединение 29) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого Саркозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
- 105 -
007792
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 150 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 85,5 мг пептида чистотой выше 93%. Полный выход очищенного пептида составлял 57%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МH+ составляла 604,33, расчетная величина МН+ составляла
604,30).
Пример синтеза 30. Синтез пептида H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (Химическое соединение 30) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 124 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 64,8 мг пептида чистотой выше 96%. Полный выход очищенного пептида составлял 41,6%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 590,19, расчетная величина МН+ составляла
590,29).
Пример синтеза 31. Синтез пептида ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 31) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка
ацетилировалась азидосалициловой кислотой с использованием стандартной процедуры сопряжения, как
описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой
реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром
(3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 15,9 мг пептида чистотой выше 94%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 575,23, расчетная величина МН+ составляла
575,56).
Пример синтеза 32. Синтез пептида ASAL(моно-йодо)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 32).
10,3 мг пептида (Химическое соединение 31) растворялось в 2,5 мл 0,1М забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).
18,9 мг KI (100 мкмоль) растворялось в 2,5 мл забуференного фосфатного соляного раствора с
уровнем рН 6,5 и добавлялось 30 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, N-хлоро-бензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; PIERCE, 28665ZZ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).
Растворы А и В объединяли и осторожно перемешивали в течение 1 ч. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше; было собрано 4,4 мг пептида чистотой выше 99%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 701,13, расчетная величина МН+ составляла
701,46).
Пример синтеза 33. Синтез пептида AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 33)
на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого тирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка
ацетилировалась Азидобензойной кислотой с использованием стандартной процедуры сопряжения, как
описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой
- 106 -
007792
реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром
(3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 20,5 мг пептида чистотой выше 90%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 721,28, расчетная величина МН+ составляла
721,26).
Пример синтеза 34. Синтез пептида АВ-Tyr(3,5-ди-йодо)-Pro-Нур-Gly-Ala-Gly-NН2 (химическое соединение 34).
10,3 мг пептида (химическое соединение 34) растворялось в 2,5 мл 0,1М забуференного фосфатного
соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).
18,9 мг KI (100 мкмоль) растворялось в 2,5 мл забуференного фосфатного соляного раствора с
уровнем рН 6,5 и добавлялось 30 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, N-хлоро-бензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; PIERCE, 28665ZZ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).
Растворы А и В объединяли и осторожно перемешивали в течение 1 ч. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше; было собрано 1,2 мг пептида чистотой выше 90 %. Идентичность пептида
подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 973,08, расчетная величина МН+ составляла 973,46).
Пример синтеза 35. Синтез пептида цикло(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln-) (химическое соединение
35) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Glu(OH)-OAll присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после
расщепления становится амидированной (Gln). Затем до полного сопряжения N-концевого Глицина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы Аллила (согласно описанной выше
процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 135,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 19,1 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял
6,6%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 687,38, расчетная величина МН+ составляла
687,32).
Пример синтеза 36. Синтез пептида цикло(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-) (Химическое соединение
36) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещался в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после
расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого глицина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы аллила (согласно описанной выше
процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 63,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 13,2 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 6,2%.
- 107 -
007792
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 673,38, расчетная величина МН+ составляла
673,30).
Пример синтеза 37. Синтез пептида цикло(-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-) (химическое соединение
37) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещался в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после
расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого Глицина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы аллила (согласно описанной выше
процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 85,1 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 9,8 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 3,5%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 657,38, расчетная величина МН+ составляла
657,31).
Пример синтеза 38. Синтез пептида цикло(Tyr(3,5-дийодо)-Pro-4Нур-Gly-Ala-Gly-Asn) (химическое
соединение 38).
10,8 мг пептида (химическое соединение 3) растворялось в 2,5 мл 0,1М забуференного фосфатного
соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).
18,9 мг KI (400 мкмоль) растворялось в 2,5 мл забуференного фосфатного соляного раствора с
уровнем рН 6,5 и добавлялось 30 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, N-хлоро-бензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; PIERCE, 28665ZZ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).
Растворы А и В объединяли и осторожно перемешивали в течение 2 ч. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше; было собрано 9,8 мг пептида чистотой выше 95%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 925,10, расчетная величина МН+ составляла
925,30).
Пример синтеза 39. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 (химическое соединение 39) на
смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 124 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 26,5 мг пептида чистотой выше 96%. Полный выход очищенного пептида составлял 20,5%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 480,24, расчетная величина МН+ составляла
480,50).
Пример синтеза 40. Синтез пептида Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 (химическое соединение 40) на смоле
TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка ацетилировалась ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл DMF. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как
- 108 -
007792
описано выше. После ацилирования аминогруппы N-концевого участка пептидная смола промывалась
DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15
мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 90,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 63,4 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 65,1%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 394,16, расчетная величина МН+ составляла
394,20).
Пример синтеза 41. Синтез пептида H-Gly-Asn-Tyr-NH2 (химическое соединение 41) на смоле
TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 91,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 62,1 мг пептида чистотой выше 95 %. Полный выход очищенного пептида составлял 54,5 %.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 352,16, расчетная величина МН+ составляла
352,18).
Пример синтеза 42. Синтез пептида Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 (химическое соединение 42) на смоле
TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого аланина. После разблокировки группы Fmoc ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина,
растворенного в 2 мл DMF, ацетилировалась аминогруппа N-концевого участка Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как
описано выше. После ацилирования аминогруппы N-концевого участка пептидная смола промывалась
DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15
мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 105 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 52 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 45%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 465,22, расчетная величина МН+ составляла
465,30).
Пример синтеза 43. Синтез пептида H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 (химическое соединение 43) на смоле
TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого Аланина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 104,5 мг. После очистки с использованием препаративного метода
высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 77,8 мг пептида чистотой выше 96%. Полный выход очищенного пептида составлял 58,8%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 423,19, расчетная величина МН+ составляла
423,28).
Пример синтеза 44. Синтез пептида цикло(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-) (химическое соединение 44)
на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
- 109 -
007792
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после
расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого тирозина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы аллила (согласно описанной выше
процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 60,2 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 5,0 мг пептида чистотой выше 87%. Полный выход очищенного пептида составлял 4,3 %.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 564,25, расчетная величина МН+ составляла
564,57).
Пример синтеза 45. Синтез пептида цикло(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn-) (химическое соединение 45)
на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после
расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого тирозина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы аллила (согласно описанной выше
процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 79,1 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 20 мг пептида чистотой выше 90%. Полный выход очищенного пептида составлял 14,0%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 569,25, расчетная величина МН+ составляла
569,67).
Пример синтеза 46. Синтез пептида цикло(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-) (химическое соединение
46) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после
расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого тирозина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы аллила (согласно описанной выше
процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 58,9 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 15,9 мг пептида чистотой выше 98 %. Полный выход очищенного пептида составлял 11%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 740,31, расчетная величина МН+ составляла
740,75).
- 110 -
007792
Пример синтеза 47. Синтез пептида цикло(-Tyr-val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-) (химическое соединение
47) на смоле Tent;iGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAH присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после
расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого тирозина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы аллила (согласно описанной выше
процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз),
диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 54,1 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше,
было собрано 19,6 мг пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 15%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 649,10, расчетная величина МН+ составляла
649,68).
Пример синтеза 48. Синтез пептида H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (химическое соединение СЕ-1)
на смоле TentaGel-S-NH-2; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-NH-2 (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжении продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 16,9 мг пептида чистотой выше 92%. Полный
выход очищенного пептида составлял 10,1%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 471,22, расчетная величина МН+ составляла
471,21).
Пример синтеза 49. Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (химическое соединение СЕ-2)
на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до окончания связи N-концевого участка Глицин. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 159 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 101 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 60%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МH+ составляла 576,26, расчетная величина МН+ составляла
576,26).
Пример синтеза 50. Синтез пептида 3-(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-Нур-Gly-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение СE-3) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp
polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка
ацетилировалась 3-(4-гидроксифенил)пропионовой кислотой с использованием стандартной процедуры
сопряжения, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось
- 111 -
007792
нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в гакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как
описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 143 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 73,7 мг пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 50%.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 561,30, расчетная величина МН+ составляла
561,24).
Синтез химических соединений по настоящему изобретения
Пример 51. Синтез удлиненных пептидов К6.
Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH (химическое соединение
48) на смоле TentaGel-S-NH2; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-NH2 (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи и проверялись нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как
описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром
(3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 1344,7, расчетная величина МН+ составляла
1344.82). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 121 мг пептида чистотой выше 99%.
Синтез пептида 3(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-Нур-Gly-Ala-Gly-L.ys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH
(химическое соединение 49) на смоле TentaGel-S-NH2; производство компании "Рапп полимер" (Rapp
polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-NH2 (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка
ацетилировалась 3-(4-гидроксифенил)-пропионовой кислотой с использованием стандартной процедуры,
как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по I мин каждый раз), диэтиловым эфиром
(3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше,
и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 1329,88, расчетная величина МH+ составляла 1329.81). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной
хроматографии, как описано выше, было собрано 99,7 мг пептида чистотой выше 98%.
Синтез пептида H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 (химическое соединение
50) на смоле ТеntaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряженп
продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при
80°С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc, N-концевой аминогруппы пептидная смола
промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым
эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 1343,6, расчетная величина МН+ составляла
1343.84). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 84,7 мг пептида чистотой выше 98%.
Синтез пептида 3(4-гидроксифенил)пропионил-Pro-Нур-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
(химическое соединение 51) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp
polymere), Германия.
- 112 -
007792
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка
ацетилировалась 3-(4-гидроксифенил)-пропионовой кислотой с использованием стандартной процедуры,
как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, 1 мМ каждый), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15
мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Выход сырого, прошедшего лиофильную сушку продукта составлял 299 мг.
Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 1328,9, расчетная величина МН+ составляла
1329,1). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной роматографии, как описано выше, было собрано 155 мг пептида чистотой выше 94%.
Пример 52. Синтез H-Gly-ψ(CH2-NH)-Asn-Tyr-OH xTFA (химическое соединение 52).
1) Boc-Asn-Tyr (tBu)-OtBu.
Boc-Asn-OH (3,5 г, 15 ммоль) растворялся в дихлорметане (100 мл амилена, стабилизированного без
спирта) и к нему добавлялся HOBt (2,24 г в сухом виде, 16,5 ммоль). Смесь охлаждалась при температуре
таяния льда, и к ней добавлялся диизопропилкарбодиимид (2,45 мл, 16 ммоль). Смесь реагировала в течение 20 мин. HOBt в придонной области вступает в реакцию, и образуется осадок DIU (в верхней части). H-Tyr (tBu)-OtBu x HCl (5,1 г, 15,4 ммоль) растворяется в DMF (30 мл в сухом виде). Смесь дихлорметана, содержащая активизированный сложный эфир, отделяется на фильтре от DIU и направляется
непосредственно в раствор DMF. Объединенная смесь охлаждается мри температуре таяния льда, и к ней
добавляется NMM (1,75мл, 15,8 ммоль). Смесь реагирует в течение ночи. Растворители удаляются в вакууме. Добавляется 200 мл этилацетата и удаляется осадок и раствор промывается лимонной кислотой
(2x50 мл, 10%), кислым карбонатом натрий (2x50 мл, насыщенный раствор) и соляным раствором (2x50
мл). Раствор сушится сульфатом магния, и растворитель удаляется в вакууме при давлении 0,2 мбар в
течение 30 мин. Сырой (неочищенный) продукт суспендируется в пентане (40 мл) и и отфильтровывается от осадка DIU. Пентан удаляется в вакууме с выходом всего химического соединения.
2) Asn-Tyr х ТФК.
Boc-Asn-Tyr (tBu)-OtBu (7,1 г, 14 ммоль) растворялся в ТФК/EDT 19/1 (30 мл) и оставлялся на 2 ч.
ТФК удалялась в вакууме и для осаждения продукта добавлялся эфир (200 мл). Эфир отделялся декантацией от продукта, который промывался эфиром (3x100 мл). Затем изделие сушится в вакууме с выходом
продукта, который может использоваться без дальнейшей очистки.
3) Boc-Gly-ψ(CH2-NH)-Asn-Tyr-OH.
Asn-Tyr x ТФК (5,6 г, 13,7 ммоль) и уксусная кислота (1 мл) растворялись в метаноле (100 мл сухой) и к расвору добавлялся Вос-глицинал (2,72 г, 17 ммоль). Смесь перемешивалась в течение 10 мин,
затем добавлялся цианоборогидрид натрия (2,15 г) более чем на 30 мин. Смесь перемешивалась еще в
течение 2 ч. Большая часть метанола удалялась в вакууме. Добавлялся этилацетат (200 мл), и комплекс
бора гидролизовался встряхиванием с насыщенным раствором бикарбоната натрия (100 мл) в течение 15
мин. Этилацетат промывался насыщенным раствором бикарбоната натрия (100 мл). С помощью этилацетата (100 мл) извлекались смешанные водные фазы. Смешанные органические фазы промывались соляным раствором (2x50 мл) и просушивались сульфатом магния. Этилацетат удалялся в вакууме с выходом
необходимого продукта.
4) H-Gly-ψ(CH2-NH)-Asn-Tyr-OH x ТФК.
Также как и в случае 2) все начинается с Boc-Gly-ψ(CH2-NH)-Asn-Tyr-OH (5,20 г, 11,9 ммоль). Выход (ожидаемый) готового продукта составляет приблизительно 5,37 г (100%). Аналитически чистый
образец получают путем очистки 1 г сырого продукта методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ожидаемый выход составляет приблизительно 90 %. Чистота> 98%.
Пример 53. Твердофазный синтез Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 (химическое соединение 53), цикло(Tyr-Pro4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (химическое соединение 54), Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (химическое соединение 55), Ac-Asn-Tyr-NH2 (химическое соединение 56), Ас-Gly-Tyr-NH2 (химическое соединение 57), гидроксиацетил-Asn-Tyr-NН2 (химическое соединение 58), H-Gly(YCH2NH)-Gly-Tyr-NH2
(Химическое соединение 59) и H-Gly-Asn-Phe(pNO2)-NH2 (химическое соединение 60).
Об общих способах твердофазного синтеза сообщалось в заявке PCT/US01/19113 озаглавленной
Новые конъюгаты пептидов, авторы Ларсен (Larsen, B.D.) и др.
Синтез пептида цикло(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (химическое соединение 54) на смоле
TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
- 113 -
007792
Первая партия: сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel".
Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной
(Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого Тирозина следовала процедура, описанная как "синтез
пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки
группы Fmoc и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80 °С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1
мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый
раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты; выход продукта составлял 57 мг. После очистки с использованием препаративного
метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 2,7 мг циклического пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 1,3%. Идентичность
пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально
полученная величина МН+ составляла 673,32, расчетная величина МН+ составляла 673,28).
Вторая партия: Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями на смоле TentaGel". Первая аминокислота Fmoc-Asp(OH)-OAll
присоединялась к смоле TentaGel-S-Ram через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Asn). Затем до полного сопряжения N-концевого
Тирозина следовала процедура, описанная как "синтез пептидов партиями на смоле TentaGel". Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Fmoc и группы аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в
качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После полного
синтеза пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин
каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты; выход продукта составлял 57 мг. После очистки с использованием препаративного
метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 10 мг циклического пептида чистотой выше 99 %. Полный выход очищенного пептида составлял 7%. Идентичность
пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально
полученная величина МН+ составляла 673,30, расчетная величина МН+ составляла 673,29).
Синтез пептида Ac-Asn-Tyr-NH2 (химическое соединение 56) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp ро1утеге), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого аспарагина. После
разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка ацетилировалась ангидридом уксусной
кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мл пиридина, растворенного в 2 мл DMF. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как
описано выше. После ацилирования N-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF (3x15
мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин
каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты.
Синтез пептида Ac-Gly-Tyr-NH2 (химическое соединение 57) на смоле TentaGel-S-Ram; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка ацетилировалась ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мл пиридина, растворенного в 2 мл DMF. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как
описано выше. После ацилирования N-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась DMF (3x15
мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин
каждый раз) и сушилась в вакууме.
- 114 -
007792
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты.
Синтез пептида гидроксиацетил-Asn-Tyr-NН2 (химическое соединение 58) на смоле TentaGel-SRam; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого аспарагина. После
разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка ацетилировалась гидроксиуксусной кислотой с использованием стандартной процедуры сопряжения, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как
описано выше. После ацилирования аминогруппы N-концевого участка пептидная смола промывалась
DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15
мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты.
Синтез пептида H-Gly(YCH2NH)-Gly-Tyr-NH2 (химическое соединение 59) на смоле TentaGel-SRam; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения С-концевого тирозина. После разблокировки группы Fmoc аминогруппа N-концевого участка ацетилировалась бромуксусной кислотой с
использованием стандартной процедуры сопряжения, как описано выше. Сопряжение продолжалось в
течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано
выше. После ацилирования аминогруппы N-концевого участка пептидная смола обрабатывалась избыточным количеством этилендиамина, растворенного в DMF. Реакция продолжалась в течение ночи. Затем пептидная смола промывалась DMF (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты.
Синтез пептида H-Gly-Asn-Phe(pNO2)-NH2 (химическое соединение 60) на смоле TentaGel-S-Ram;
производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-Ram (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой
при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Fmoc пептидная смола промывалась DMF
(3x15 мл, по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по
1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты.
Пример 54. Синтез пептида Gly-(DBF)-Tyr-NH2 x ТФК (химическое соединение 61).
Общие способы твердофазного синтеза рассмотрены в заявке PCT/US01/19113 озаглавленной Новые конъюгаты пептидов, авторы Ларсен Б.Д. (Larsen, B.D.) и др. при следующих изменениях.
Синтез пептидов партиями на смоле TentaGel-S-RAM (PEG-PS)
Смола TentaGel (1 г, 0,22-0,31 ммоль/г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для
фильтрации полипропиленовым фильтром. Смола набухала в DMF (15мл), и удалялась группа Fmoc (см.
разблокировку N-α-аминоблокирующей группы (Fmoc)). Следующие аминокислоты согласно последовательности сопрягались как преформированные Fmoc-блокированные сложные эфиры HOBt (3 экв.), как
описано выше. Сопряжения продолжались в течение 2 ч, если не оговаривалось иначе. Смола сливалась
и промывалась DMF (5x15 мл, по 5 мин каждый раз) с целью удаления избыточных реактивов. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С. После полного синтеза пептидная
смола промывалась DMF (3x15 мл, по 5 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и, наконец, диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Аминокислота
4-(Fmoc-2-аминоэтил)-6-дибензофуранпропионовая кислота (Fmoc-DBF-OH) закупалась в компании Неосистем (Neosystem), Страсбург, Франция.
Аналитический метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
Колонка: VYDAC 238TP5415 150x4,6 мм мономерный RP C18 5 мкм 300 Å
Расход: 1,00 мл/мин
Температура: 40°С
Детектирование 215 нм
- 115 -
007792
Градиент 1:
0-1,5 мин
1,5-25 мин
25-30 мин
30-35 мин
35-40 мин
40-45 мин
А
Линейный градиент до 50% В
Линейный градиент до 100% В
В
Линейный градиент до А
А
Отщепление пептида от смолы кислотой
Пептиды отщеплялись от смол путем обработки 95%-м раствором трифторуксусной кислоты (ТФК,
Ридель де-Хаен (Riedel de-Haen), Франкфурт, Германия) в воде (в объемном отношении) или 95%-м раствором ТФК и 5%-м раствором этандитиола (в объемном отношении) при комнатной температуре в течение 2 ч. Отфильтрованные смолы промывались ТФК. Фильтраты и детергенты выпаривались до 5-10%
объема при пониженном давлении. Для осаждения пептида к остатку добавлялся эфир в десятикратном
количестве; пептид промывался отфильтрованным на фильтре из пористого стекла, промывался эфиром
и сушился в вакууме в эксикаторе в P2O5. Сырой (неочищенный) продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и идентифицировался ионизационной масс-спектрометрией
с электрораспылением.
Синтез пептида Gly-(DBF)-Tyr-NH2xTFA (химическое соединение 61) Смола TentaGel-S-RAMFMOC (0,23 ммоль/г, 1,02 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях "синтеза пептида патриями
на смоле TentaGel-S-RAM" до полного сопряжения N-концевого Глицина. Сопряжения продолжались в
течение ночи. Fmoc-DBF-OH плохо растворим в DMF, и суспензия этой защищенной аминокислоты и
HOBt в DMF нагревылись до 50°С и перед реакцией с диизопропилкарбодиимидом добавлялось 10%
NMP. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше с выходом 101,3 мг (70 %). Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии показал 93%-ую чистоту.
Очистка выполнялась с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на
Biocad с автоматизированным сбором фракций.
Колонка: Kromasil RP C8; К 100-10-С8 250x50,8 мм.
Температура окружающей среды, приблизительно 20°С.
Расход: 35 мл/мин.
Детектирование: ультрафиолетовый диапазон при 215 нм и 280 нм.
Буфер А: 0,10% ТФК в воде. Буфер В: 0,10% ТФК, 9,9% воды, 90% ацетонитрила.
Градиент: Начало чистого А. Крутой градиент до 20% В через 5 мин, затем градиент до 60% В через 50 мин. Фракции, содержащие чистый продукт, объединялись и проходили лиофильную сушку с выходом 79,4 мг (55% загрузки по смоле) белого материала чистотой 99% согласно методу высокоэффективной жидкостной хроматографии. Время удержания 10,2 мин (Аналитический градиент 1). Массспектрометрия показала ожидаемую моноизотопную массу, равную 502,21.
Химическое соединение представлено следующей формулой:
Описание PCT/US01/19113 дается в данном случае в качестве ссылки.
Пример 55. Синтез пептида Gly-Dapa-Gly-Hyp-Pro-Tyr (химическое соединение 62) на смоле
TentaGel-S-NH2; производство компании "Рапп полимер" (Rapp polymere), Германия.
Сухая смола TentaGel-S-NH2 (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях
"синтеза пептида патриями на смоле TentaGel" до полного сопряжения N-концевого Fmoc-глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась DMF(3x15 мл,
- 116 -
007792
по 1 мин каждый раз), DCM (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.
Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от
уксусной кислоты. Fmoc-защищенный пептид растворялся в DMF и циклизировался с использованием
РуВОР® (бензотриазол-1-илоки-трисфосфониумгексафторфосфат) как фактора сопряжения, как описано
выше. Циклизация продолжалась в течение ночи. Циклизированный пептид осаждался после введения
эфира и выделялся фильтрацией. Сырой циклизированный пептид промывался эфиром (трижды) и затем
растворялся в 20%-ом растворе пиперидина в DMF (в объемном отношении) с целью удаления Nконцевой Fmoc-группы. После введения эфира сырой разблокированный пептид выделялся фильтрацией.
Осадок растворялся в уксусной кислоте и проходил лиофильную сушку. Сырой пептид очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше.
Список литературы
[1.] А. Л. Уалдо, А. Дж. Камм, X. деРеутер, П. Л. Фридман, Д. Дж. МакНайл, Дж. Ф. Паулс, Б. Питт,
Ц.М. Пратт, П. Дж. Шварц, Е. П. Велтри, Ланцет 1996, 348 7-12.
(A. L. Waldo, A. J. Camm, H. deRuyter, P. L. Friedman, D. J. MacNeil, J. F. Pauls, B. Pitt, С. М. Pratt, P.
J. Schwartz, E. P. Veltri, Lancet 1996, 348 7-12).
[2.] П. А. Гуерреро, Р. Б. Шуесслер, Л.М. Давис, Е. С. Бейер, Ц.М. Джонсон, К. А. Йамада, Дж. Е.
Саффиц. "Журнал клинических исследований" 1997, 99 1991-1998.
(P. A. Guerrero, R. В. Schuessler, L M. Davis, Е. С. Beyer, С. М. Johnson, К. A. Yamada, J. E. Saffitz, J
Clin Invest 1997, 99 1991-1998).
[3.] Д.Л. Лернер, К. А. Йамада, Р. Б. Шуесслер, Дж. Б. Саффиц. "Кровообращение" 2000, 101 547552.
(D. L. Lerner, К. A. Yamada, R. В. Schuessler, J. В. Saffitz, Circulation 2000,101 547-552).
[4.] А. Хагендорф, Б. Шумахер, С. Кирхоф, Б. Лудериц, К. Виллеке. "Кровообращение" 1999,99
1508-1515.
(A. Hagendorff, В. Schumacher, S. К irchhoff, В. Luderitz, К. Willecke, Circulation 1999, 99 1508-1515).
[5.] С. Кирхоф, Е. Неллес, А. Хагендорф, О. Крюгер, О. Трауб, К. Виллеке. "Современная биология"
1998, 8 299-302.
(S. Kirchhoff, E. Nelles, A. Hagendorff, О. Kruger, О. Traub, К. Willecke, Curr Biol 1998, 8 299-302).
[6.] A. M. Симон, Д. А. Гудэнаф, Д. Л. Паул, "Современная биология" 1998, 8 295-298. (А. М. Simon,
D. A. Goodenough, D. L. Paul, Curr Biol 1998, 8 295-298).
[7.] А. С. де Карвало, М. О. Масуда, X. Б. Танвиц, М. Виттнер, Р. С. Голденберг, Д. С. Cnрей, "Журнал сердечно-сосудистой электрофизиологии" 1994, 5 686-698.
(А. С. de Carvalho, М. О. Masuda, Н. В. Tanowitz, M. Wittner, R. С. Goldenberg, D. С. Spray, J Cardlovasc Electrophysiol 1994, 5 686-698).
[8.] P. P. Каприлиан, М. Гуннинг, Е. Дюпон, М. Н. Шеппард, С. М. Ротери, Р. Андевуд, Д.
Дж. Пеннел, К. Фокс, Дж. Пеппер, П. А. Пуль-Уилсон, Н. Дж. Северс, "Кровообращение " 1998, 97
651-660.
(R. R. Kaprielian, M. Gunning, E. Dupont, M. N. Sheppard, S. M. Rothery, R. Underwood, D. J. Pennell,
К. Fox, J. Pepper, P. A. Poole-Wilson, N. J. Severs, Circulation 1998, 97 651-660).
[9.] H. С. Петерс, С. Р. Грин, П. А. Пуль-Уилсон, Н. Дж. Севере, "Кровообращение " 1993, 88 864875.
(N. S. Peters, С. R. Green, P. A. Poole-Wilson, N. J. Severs, Circulation 1993,88 864-875).
[10.] Дж. Е. Саффиц, Р. Б. Шуесслер, К. А. Йамада, "Сердечно-сосудистые исследования" 1999,42
309-317.
(J. E. Saffitz, R. В. Schuessler, К. A. Yamada, Cardiovasc Res 1999, 42 309-317).
[11.] С. Аонума, Й. Коама, К. Акай, Й. Комияма, С. Накайама, М. Вакабайаши, Т. Макино. "Бюллетень по химической фармакологии" (Токио) 1980, 28 3332-3339.
(S. Aonuma, Y. Kohama, К. Akai, Y. Komiyama, S. Nakajima, M. Wakabayashi, T. Makino, Chem Pharm
Bull (Tokyo) 1980, 28 3332-3339).
[12.] С. Аонума, Й. Коама, К. Акай, С. Ивасаки. "Бюллетень по химической фармакологии" (Токио)
1980, 28 3340-3346.
(S. Aonuma, Y. Kohama, К. Akai, S. Iwasaki, Chem Pharm Bull (Tokyo) 1980, 28 3340-3346).
[13.] С. Аонума, Й. Коама, Т. Макино, Й. Фуйсава, "Журнал фармакобиодинамики" 1982, 5 40-48.
(S. Aonuma, Y. Kohama, Т. Makino, Y. Fujisawa, J Phannacoblodyn 1982, 5 40-48).
[14.] M. А. Ронсберг, Т. К. Саундерс, П. С. Чан, П. Червони. "Медицинская наука" 86 А.Д., 14 350351.
(М. A. Ronsberg, Т. К. Saunders, P. S. Chan, P. Cervoni, Med Sci 86 A.D., 14 350-351).
[15.] М. Дикшит, Р. Шривастава, Б. Кунду, К. Б. Матур, К. Кар. "Индийский журнал экспериментальной биологии" 1988, 26 874-876.
(М. Dikshit, R. Srivastava, В. Kundu, К. В. Mathur, К. Kar, Indian J Exp Biol 1988, 26 874-876).
- 117 -
007792
[16.] Й. Коама, Н. Оклмото, Т. Минура, С. Фукая, М. Ватанабе, К. Йокояма. "Бюллетень по химической фармакологии " (Токио) 1987, 35 3928-3930.
(Y. Kohama, N. Oklmoto, Т. Mimura, С. Fukaya, M. Watanabe, К. Yokoyama. Chem Pharm Bull (Tokyo)
1987, 35 3928-3930).
[17.] Й. Коама, С. Куваара, К. Йамамото, М. Окабе, Т. Минура, С. Фукая, М. Ватанабе, К. Йокояма.
"Бюллетень по химической фармакологии" (Токио) 1988, 36 4597-4599.
(Y. Kohama, S. Kuwahara, К. Yamamoto, M. Okabe, Т. Mimura, С. Fukaya, M. Watanabe, К. Yokoyama,
Chem Pharm Bull (Tokyo) 1988, 36 4597-4599).
[18.] С. Деин, Н. Маниконе, А. Мюллер, Р. Гервин, У. Жисковен, А. Иранхаи, С. Минке, У. Клаус.
"Достижения в фармакологии" 1994,350 174-184.
(S. Dhein, N. Manicone, A. Muller, R. Gerwin, U. Ziskoven, A. Irankhahi, C. Minke, W. Klaus, Naunyn
Schmledebergs Arch Pharmacol 1994,350 174-184).
[19.] Т. Аргентиери, Е. Кантор, Дж. Р. Уиггинс. "Эксперимент" 1989, 45 737-738. (Т. Argentieri, E.
Cantor, J. R. Wiggins, Experientia 1989, 45 737-738).
[20.] А. Мюллер, М. Готвальд, Т. Тудика, У. Линке, У. Клаус, С. Деин. "Европейский журнал фармакологии" 1997, 327 65-72.
(A. Muller, M. Gottwald, Т. Tudyka, W. Linke, W. Klaus, S, Dhein, Eur J Pharmacol 1997, 327 65-72).
[21.] P. Гровер, С. Деин. "Пептиды" 1998,19 1725-1729. (R. Grover, S. Dhein, Peptides 1998, 19 17251729).
[22.] С. Деин, Т. Тудика. "Лекарства" 1995, 49 851-855. (S. Dhein, T. Tudyka, Drugs 1995, 49 851855).
[23.] С. С. Куо, К. Мунаката, С. П. Редди, Б. Шуравич. "Кровообращение" 1983, 671356-1367.
(С. S. Kuo, К. Munakata, С. P. Reddy, B. Surawicz, Circulation 1983, 671356-1367).
[24.] С. Деин, К. Крусеманн, Т. Шафер. "Британский журнал фармакологии" 1999, 128 1375-1384.
(S. Dhein, К. Krusemann, Т. Schaefer, Br J Pharmacol 1999,128 1375-1384).
[25.] H. С. Петере, Дж. Коромилас, Н. Дж. Северс, А. Л. Вит. "Кровообращение" 1997, 95 988-996.
(N. S. Peters, J. Coromilas, N. J. Severs, A. L. Wit, Circulation 1997, 95 988-996., [26.] D. W. Liu, С
Antzelevitch, Circ Res 1995, 76 351-365).
[26.] Д. У. Лью, С. Анцелевич. "Исследования кровообращения" 1995, 76 351-365. (D. W. Liu, С.
Antzelevitch, Circ Res 1995, 76 351-365).
[27.] Канагаратнам П., Севере Н. Дж. и Петере Н. С. Связь между проводимостью, типом возбуждения и качеством иммунореактивного коннексина при хронической фибриляции предсердия у человека.
"Кровообращение" 102[18], II-485. 2000. Тип сноски: Реферат.
(Kanagaratnam P., Severs N. J., and Peters N. S. The Relationship between Conduction, Activation pattern
and Quantity of Immunoreactive Connexin in Chronic Human Atrial Fibrillation. Circulation 102[18], II-485.
2000. Ref Type: Abstract).
[28.] Дж. М. Пастор, Д. С. Розенбаум. "Исследования кровообращения" 2000, 87 1157-1163. (J. M.
Pastore, D. S. Rosenbaum, Circulation Research 2000, 87 1157-1163).
[29.] P. Д. Бергер. "Исследования кровообращения" 2000, 87 1083-1084. (R. D. Berger, Circulation Research 2000, 87 1083-1084).
[30.] Дж. Е. Саффиц, К. А. Йамада. "Кровообращение" 1998, 97 630-632. (J. E. Saffitz, К. A . Yamada,
Circulation 1998, 97 630-632).
[31.] Гутштайн Д. Е., Морли Г. Е., Тамаддон Хоуман С, Вайдя Д., Шнайдер М. Д., Чен Дж., Чин К,
Р., Штульманн X., и Фишман Г.И. Генетическая манипуляция экспрессией коннексина 43 в сердце: установление роли коррекции щелевого соединения при аритмогенезе и вентикулярной дисфункции. "Кровообращение" 102[18], Н-15. 2001. Тип сноски: Реферат.
(Gutstein D. E., Morley G. E., Tamaddon Houman S., Vaidya D., Schneider M. D., Chen J., Chien K, R.,
Stuhlmann H., and Fishman G. I. Genetic Manipulation of Connexin 43 Expression in the Heart: Establishing a
Rote for Gap Junction Remodeling in Arrhythmogenesis and Ventricular Dysfunction. Circulation 102[18], H15. 2001. RefType: Abstract).
[32.] А. Мюллер, Т. Шафер У., Линке Т. Тудика М. Готвальд У. Клаус, С. Деин. "Достижения в
фармакологии " 1997, 356 76-82.
(A. Muller, Т. Schaefer, W. Linke Т. Tudyka M. Gottwald W. Klaus, S. Dhein, Naunyn Schmiedebergs
Arch.Pbarmacol. 1997, 356 76-82).
[33.] С. Деин, Р. Гровер, А. Мюллер, М. Лаувен, П. Поеппель, Т. Шафер. "Кровообращение"
1999,100 1-426.
(S. Dhein, R. Grover A. Muller M. Lauven P. Poeppel, T. Schaefer, Circulation 1999, 100 1-426).
[34.] Коениг Дж. И. Связывание радиолигандов в интактных клетках. Кин, М. [106], 89-98. 1999.
Тотова, NJ, издательство "Хъюман пресс". "Методы молекулярной биологии". Тип сноски: Серия (Книга,
Монография).
(Koenig J. I. Radioligand binding in intact cells. Keen M. [106], 89-98. 1999. Totowa, NJ, Humana Press
Inc. Methods in Molecular Biology. RefType: Serial (Book, Monograph)).
- 118 -
007792
[35.] К. Вассерманн, К. Молгаард, Е. Штайнес. "Химиотерапия и фармакология рака". 1985, 15 244252.
(K. Wassermann, K. MOlgaard, E. Steiness, Cancer Chemother. Pharmacol. 1985, 15 244-252).
[36.] E. Майер, K. Фредериксен, М. Нильсен, X. Л. Лембол, X. Педерсен, Дж. Хиттел. "Разработка и
иссследование лекарств" 1997,40 1-16.
(Е. Meier, K. Frederiksen, M. Nielsen, H. L. Lembol, H. Pedersen, J. Hyttel, Drug Development Research
1997, 40 1-16).
[37.] Дж. Дж. Линч, Р. Г. Раван, Д. Т. Витиак. "Журнал сердечно-сосудистой фармакологии" 1981, 3
49-60.
(J. J. Lynch, R. G. Rahwan, D. Т. Witiak, J Cardiovasc-Pharmacol. 1981, 3 49-60).
[38.] M. Забель, С. X. Хонлосер, С. Беренс, Р. Л. Вулси, М. Р. Франц. "Журнал сердечно-сосудистой
электрофизиологии" 1997, 8 1239-1245.
(M. Zabel S. H. Hohnloser, S. Behrens R. L. Woosley M. R. Franz, J Cardiovasc. Electrophysiol. 1997, 8
1239-1245).
[39.] С. Деин, Н. Маниконе, А. Мюллер, Р. Гервин, У. Жисковен, А. Иранхаи, С. Минке, У. Клаус.
"Достижения в фармакологии" 1994, 350 174-184.
(S. Dhein, N. Manicone, A. Muller, R. Gerwin, U. Ziskoven, A. Irankhahi, С Minke, W. Klaus, Naunyn
Schmiedebergs Arch Pharmacol 1994, 350 174-184).
[40.] X. Д. Хуанг, Г. Е. Сандуски, Д. П. Зипес. "Журнал сердечно-сосудистой электрофизиологии "
1999, 10 79-91.
(X. D. Huang, G. E. Sandusky, D. P. Zipes, J Cardiovasc. Electrophysiol. 1999, 10 79-91).
[41.] Д. Ксинг, Дж. Б. Мартине. "Американский журнал физиологии. Физиология сердечнососудистой системы " 2001, 280 Н684-Н692.
(D. Xing, J. В. Martins, Am J Physiol Heart Circ. Physiol 2001, 280 H684-H692).
[42.] Ф. Шапиро. "Обызвествление тканей" 1997, 61 285-293. (F. Shapiro, Calcif Tissue Int 1997, 61
285-293).
[43.] P. Сивитейли, Е. С. Бейер, П. М. Уарлоу, А. Дж. Робертсон, С. Т. Гейст, Т. X. Штайнберг.
"Журнал клинических исследований" 1993, 91 1888-1896.
(R. Civiteili, E. С. Beyer, P. M. Warlow, A. J. Robertson, S. Т. Geist, Т. Н. Steinberg, J.Clin.Jnvest.
1993,97 1888-1896).
[44.] Т. X. Штайнберг, Р. Сивитейли, С. Т. Гейст, А. Дж. Робертсон, Е. Хик, Р. Д. Веенстра, X. З.
Ванг, П. М. Уарлоу, Е. М. Вестфале, Дж. Г. Лаинг, a. et, ЕМВОДж. 1994, 13 744-750.
(Т. Н. Steinberg, R. Civiteili, S. Т. Geist, A. J. Robertson, E. Hick, R. D. Veenstra, H. Z. Wang, P. M.
Warlow, E. M. Westphale, J. G. Laing, a. et, EMBO J. 1994, 13 744-750).
[45.] X. Чиба, Н. Савада, М. Ойамада, Т. Койима, С. Номура, С. Ишии, М. Мори, "Структура и
функционирование клетки" 1993, 18 419-426.
(Н. Chiba, N. Sawada, M. Oyamada, Т. Kojima, S. Nomura, S. Ishii, M. Mori, Cell Struct.Funct. 1993, 18
419-426).
[46.] Ф. Лесанда, Д. A. Towler, К. Зиамбарас, С. Л. Ченг, М. Коваль, Т. X. Штайнберг, Р. Сивитейли.
"Молекулярная биология клетки" 1998, 9 2249-2258.
(F. Lecanda, D. A. Towler, К. Ziambaras, S. L. Cheng, M. Koval, Т. Н. Steinberg, R. Civitelli, Mot Biol
Cell 1998, 9 2249-2258).
[47.] Ф. Лесанда, П. М. Уарлоу, С. Шайх, Ф. Фурлан, Т. X. Штайнберг, Р. Сивитейли. "Журнал биологии клетки" 2000, 151 931-943.
(F. Lecanda, P. M. Warlow, S. Sheikh, F. Furlan, T. H. Steinberg, R. Civitelli, J. Cell Biol 2000, 151 931943).
[48.] H. P. Йоргенсен, С. Т. Гейст, Р. Сивитейли, Т. X. Штайнберг. "Журнал биологии клетки" 1997,
139 497-506.
(N. R. Jorgensen, S. Т. Geist, R. Civiteili, Т. Н. Steinberg, J. Cell Biol. 1997, 139 497-506).
[49.] H. P. Йоргенсен, З. Хенриксен, С. Брот, Е. Ф. Эриксен, О. X. Соренсен, Р. Сивитейли, Т. X.
Штайнберг. "Журнал исследований минерализации костей", 2000, 15 1024-1032.
(N. R. Jorgensen, Z. Henriksen, С. Brot, Е. F. Eriksen, О. Н. Sorensen, R. Civitelli, Т. Н. Steinberg, J Bone
Miner.Res. 2000, 75 1024-1032).
[50.] А. Клермон, Д. Тессман, А. Шток, С. Николаи, У. Штаи, X. Сиес. "Карценогенез" 1996,
171389-1391.
(A. Clairmont, D. Tessman, A. Stock, S. Nicolai, W. Stahi, H. Sies, Carcinogenesis 1996, 171389-1391).
[51.] M. А. Ван дер Молен, С. Т; Рубин, К. Дж. МкЛеод, Л. К. МкКаулей, X. Дж. Донахью, "Журнал
биологической химии", 1996, 27712165-12171.
(М. A. Van der Molen, С. Т; Rubin, К. J. McLeod, L. К. McCauley, H. J. Donahue, J.Biol.Chem. 1996,
27712165-12171).
[52.] P. Сивитейли, К. Зиамбарас, П. М. Уарлоу, Ф. Лесанда, Т. Нельсон, Дж. Харлей, Н. Атаи, Е. С.
Бейер, Т. X. Штайнберг. "Журнал биохимии клетки" 1998, 68 8-21.
- 119 -
007792
(R. Civiteili, К. Ziambaras, P. M. Warlow, F. Lecanda, Т. Nelson, J. Harley, N. Atai, E. C. Beyer, Т. Н.
Steinberg, J. Cell Biochem. 1998, 68 8-21).
[53.] П. Д'Андреа, А. Калабрезе, И. Капоцци, М. Грандольфо, Р. Тонон, Ф. Виттур. "Биореология"
2000, 37 75-83.
(P. D'Andrea, A. Calabrese, I. Capozzi, M. Grandolfo, R. Tonon, F. Vittur, Biorheology 2000, 37 75-83).
[54.] П. Д'Андреа, Ф. Виттур. "Клеточный кальций" 1996, 20 389-397. (P. D'Andrea, F. Vittur, Cell
Calcium 1996, 20 389-397).
[55.] С. Лоту, С. Фоли, Н. Форест, Дж. Сотьер. "Достижения в биологии рта" 2000, 45 843-856.
(S. Loty, С. Foli, N. Forest, J. Sautier, Arch.Oral Biol. 2000, 45 843-856).
[56.] H. Сиреней, Б. М. Коломбо, М. Меслин, С. Бенедетти, X. Йамасаки, Г. Финочаро. "Генная терапия" 1998, 5 1221-1226.
(N. Cirenei, В. М. Colombo, M. Mesnil, S. Benedetti, H. Yamasaki, G. Finocchiaro, Gene Ther. 1998, 5
1221-1226).
[57.] О. Мённикес, А. Бушманн, К. Виллеке, O. Трауб, М. Шварц. "Гепатология" 2000, 32 501-506.
(О. Moennikes, A. Buchmann, К. Willecke, О. Traub, M. Schwarz, Hepatology 2000, 32 501-506).
[58.] О. Мённикес, А. Бушманн, А. Ромуалди, Т. Отт, Дж. Веррингоер, К. Виллеке, М. Шварц. "Исследования рака" 2000, 50 5087-5091.
(О. Moennikes, A. Buchmann, A. Romualdl, Т. Ott, J. Werringloer, К. Willecke, M. Schwarz, Cancer Res.
2000, 50 5087-5091).
[59.] Л. Жоу, Е. М. Касперек, Б. Дж. Николсон. "Журнал биологии клетки" 1999, 144 1033-1045.
(L. Zhou, E. M. Kasperek, В. J. Nicholson, J Cell Biol. 1999, 144 1033-1045).
[60.] Д. У. Лаирд, П. Фистоурис, Г. Батист, Л. Алперт, X. Т. Хюн, Г. Д. Каристинос, М. А. АлойДжамали. "Исследования рака" 1999, 59 4104-4110.
(D. W. Laird, P. Fistouris, G. Batist, L. Alpert, H. Т. Huynh, G. D. Carystinos, M. A. Alaoui-Jamali, Cancer Res. 1999, 59 4104-4110).
[61.] Т. Шибата, X. Нагаяси, Дж. Хамада, С. Конака, М. Хосокава, Т. Кавано, X. Китайо, М. Арлсу.
"Биология опухоли" 2000, 21 299-308.
(Т. Shibata, H. Nagayasu, J. Hamada, S. Konaka, M. Hosokawa, T. Kawano, H. Kitajo, M. Arlsue, Tumour.Biol. 2000, 21 299-308).
[62.] X. Гуан, Р. Дж. Руч. "Карценогенез" 1996, 17 1791-1798. (X. Guan, R. J. Ruch, Carcinogenesis
1996, 17 1791-1798).
[63.] P. Дж. Руч, У. Дж. Бонни, К. Сиглер, X. Гуан, Д. Матесик, Л. Д. Шафер, Е. Дюпон, Дж. Е. Троско. "Карценогенез" 1994, 15 301-306.
(R. J. Ruch, W. J. Bonney, К. Sigler, X. Guan, D. Matesic, L. D. Schafer, E. Dupont, J. E. Trosko, Carcinogenesis 1994, 15 301-306).
[64.] Б. В. Мадукар, X. Л. Файтер-Рупп, Дж. Е. Троско. "Письма о раке" 1996,106 117-123. (В. V.
Madhukar, H. L. Feijter-Rupp, J. E. Trosko, Cancer Lett. 1996,106 117-123).
[65.] У. К. Хонг, М. Б. Cnорн, "Наука" 1997, 278 1073-1077. (W. К. Hong, M. В. Sporn, Science 1997,
278 1073-1077).
[66.] К. М. Абдулла, Г. Лутра, Дж. Дж. Билски, С. А. Абдулла, Л. П. Рейнолдс, Д. А. Редмер, А. Т.
Гразул-Билска, "Эндокринология". 1999,10 35-41.
(К. М. Abdullah, G. Luthra, J. J. Bilski, S. A. Abdullah, L. P. Reynolds, D. A. Redmer, A. T. GrazulBilska, Endocrine. 1999, 70 35-41).
[67.] M. Саито, М. Ойамада, Й. Ойамада, Т. Каку, М. Мори. "Карценогенез" 1997,18 1319-1328.
(М. Saitoh, M. Oyamada, Y. Oyamada, Т. Kaku, M. Mori, Carcinogenesis 1997, 18 1319-1328).
[68.] Дж. А. Голигер, Д. Л. Паул. "Молекулярная биология клетки" 1995, 6 1491-1501. (J. A. Goliger,
D. L. Paul, Mol.Biol.Cell 1995, 6 1491-1501).
[69.] Т. Мине, Р. Кушима, Т. Фуйита. "Журнал клинической гастроэнтерологии" 1997, 25 Приложение 1 S111-S115.
(Т. Mine, R. Kushima, Т. Fujita, J Clin. Gastroenterol. 1997, 25 Suppll S111-S115).
[70.] Т. Мине, X. Юсида, А. Катаока, А. Тайима, Дж. Нагасава, Т. Такано. "Журнал клинической гастроэнтерологии" 1995, 21 Приложение 1 S104-S107.
(Т. Mine, H. Yusuda, A. Kataoka, A. Tajima, J. Nagasawa, Т. Takano, J Clin. Gastroenterol. 1995, 21
Suppl 1 S104-S107).
[71.] Г. Дж. Крист, П. Р. Бринк. "Бразильский журнал медикобиологических исследований" 2000, 33
423-429.
(J. Christ, P. R. Brink, Braz J Med Biol. Res. 2000, 33 423-429).
[72.] Б. Р. Берг, К. Д. Коен, И. X. Сарельюис. "Американский журнал физиологии" 1997, 272 Н2693Н2700.
(В. R. Berg, К. D. Cohen, I. H. Sarelius, Am J Physiol 1997, 272 H2693-H2700).
[73.] С. де Вит, Ф. Рус, С. С. Болц, S, Кирхоф, О. Крюгер, К. Виллеке, У. Пол. "Исследования кровообращения" 2000,86 649-655.
- 120 -
007792
(С. de Wit, F. Roos, S. S. Bolz, S, Kirchhoff, O. Kruger, K. Willecke, U. Pohl, Circulation Research
2000,86 649-655).
[74.] Б. Нафз, Дж. Стегеманн, М. X. Бестле, Н. Рихтер, Е. Селигер, И. Шимке, X. У. Райнхард, П. Б.
Перссон. "Кровообращение" 2000, 101 553-557.
(В. Nafz, J. Stegemann, M. H. Bestle, N. Richter, E. Seeliger, I. Schimke, H. W. Reinhardt, P. B. Persson,
Circulation 2000, 101 553-557).
[75.] X. Ky. Ксие, В. У. Ху. "Экспериментальные исследования клетки" 1994, 214 172-176. (Н. Q.
Xie, V. W. Hu, Exp. Cell Res. 1994, 214 172-176).
[76.] Р. Дермицел. "Исследования мозга. Обозрение исследований мозга" 1998, 26 176-183. (R. Dermietzel, Brain Res Brain Res Rev 1998, 26 176-183).
[77.] P. Розенталь, М. Шринивас, С. Гохан, М. Урбан, Р. Дермицел, Дж. А. Кесслер, Д. С. Спрей, М.
Ф. Мелер. "Исследования мозга. Обозрение исследований мозга " 2000, 32 57-71.
(R. Rozental, M. Srinivas, S. Gokhan, M. Urban, R. Dermietzel, J. A. Kessler, D. С Spray, M. F. Mehler,
Brain Res. Brain Res. Rev. 2000, 32 57-71).
[78.] X. Альдског, Е. Н. Козлова. "Прогресс в нейробиологии" 1998, 55 1-26. (Н. Aldskogius, E. N.
Kozlova, Prog. Neurobiol. 1998, 55 1-26).
[79.] Дж. Д. Пал, X. Лью, Д. Макей, А. Шилс, В. М. Бертуд, Е. С. Бейер, Л. Эбиара. "Американский
журнал физиологии. Физиолгия клетки" 2000, 279 С596-С602.
(J. D. Pal, X. Liu, D. Mackay, A. Shiels, V. M. Berthoud, E. С Beyer, L. Ebihara, Am J Physiot Cell
Physiol 2000, 279 C596-C602).
[80. ] В. Крутовских, X. Йамасаки. "Исследования мутаций" 2000, 462 197-207. (V. Krutovskikh, H.
Yamasaki, Mutat. Res. 2000,462 197-207).
[81.] Д. Маккей, А. Ионидес, З. Кибар, Г. Ролью, В. Берри, А. Мор, А. Шилс, С. Баттачаря. "Американский журнал генетики человека" 1999, 64 1357-1364.
(D. Mackay, A. Ionides, Z. Kibar, G. Rouleau, V. Berry, A. Moore, A. Shiels, S. Bhattacharya, Am J
Hum.Genet. 1999, 64 1357-1364).
[82.] К. Накамура, И. Шибата. "Клетки тканей и органов" 1999,165 16-21. (К. Nakamura, Y. Shibata,
Cells Tissues. Organs 1999,165 16-21).
[83.] Л. Немет, С. Маддур, П. Пури."Журнал педиатрической хирургии" 2000, 35 823-828. (L.
Nemeth, S. Maddur, P. Puri, J Pedlatr.Surg. 2000, 35 823-828).
[84.] A. M. Симон, Д. А. Гудэнаф, Е. Ли, Д. Л. Паул. "Природа" 1997, 385 525-529. (А. М. Simon, D.
A. Goodenough, E. Li, D. L. Paul, Nature 1997, 385 525-529).
[85.] Б. Соммерсберг, А. Буллинг, У. Салзер, У. Фролих, Р. Е. Гарфельд, А. Амстердам, А. Майерхофер, "Биология репродукции" 2000,53 1661-1668.
(В. Sommersberg, A. Bulling, U. Salzer, U. Frohlich, R. E. Garfield, A. Amsterdam, A. Mayerhofer. Biol.
Reprod. 2000, 53 1661-1668).
[86.] И. Гранот, Н. Декель, "Репродукция человека" 1998, 13 Приложение I 4 85-97. (I. Granot, N.
Dekel, Hum. Reprod. 1998,13 SuppI 4 85-97).
[87.] У. М. Киларски, Е. Дюпон, С. Коппен, X. И. Йе, С. Воцци, Р. Г. Горди, М. Резапур, У. Улмстен, Г. М. Рооманс, Н. Дж. Северс. "Европейский журнал биологии клетки" 1998, 75 1-8.
(W. M. Kilarski, E. Dupont, S. Coppen, H. I. Yeh, С. Vozzi, R. G. Gourdie, M. Rezapour, U. Ulmsten, G.
M. Roomans, N. J. Severs, Eur. J Cell Biol. 1998, 75 1-8).
[88.] X. H. Сирэй, X. Фу, М. Оловссон, Г. Алсен, С. Шуман, Б. Ундблом, У. Улмсте. "Американский
журнал акушерства и гинекологии". 2000, 182 926-930.
(Н. N. Ciray, X. Fu, M. Olovsson, G. Ahlsen, C. Shuman, В. Undblom, U. Ulmsten, Am J Obstet. Gynecol. 2000, 182 926-930).
[89.] С. Батиас, Н. Дефами, А. Лаблак, Д. Тепот, П. Фенишел, Д. Сегретайн, Г. Поинтис. "Исследования клеток тканей". 1999,298 113-121.
(С. Batias, N. Defamie, A. Lablack, D. Thepot, P. Fenichel, D. Segretain, G. Pointis, Cell Tissue Res.
1999, 298 113-121).
[90.] E. Шлайермахер, "Генетика человека" 1980, 54 391-404. (E. Schleiermacher, Hum. Genet. 1980,
54 391-404).
[91.] С. Воцци, С. Уллрих, А. Чаролаис, Дж. Филипп, Л. Орчи, П. Меда. "Журнал биологии клетки"
1995, 131 1561-1572.
(С. Vozzi, S. Ullrich, A. Charollais, J. Philippe, L. Orci, P. Meda, J Cell Biol. 1995, 131 1561-1572).
[92.] П. Меда, М. Чансон, М. Пеппер, Е. Джордано, Д. Баско, О. Трауб, К. Виллеке, А. эль Аумари,
Д. Грос, Е. С. Бейер. "Экспериментальные исследования клетки" 1991,192 469-480.
(P. Meda, M. Chanson, M. Pepper, E. Giordano, D. Bosco, О. Traub, K. Willecke, A. el Aoumari, D. Gros,
E. С Beyer, Exp. Cell Res. 1991, 192 469-480).
[93.] К. Зиамбарас, Ф. Лесанда, Т. X. Штайнберг, Р. Сивитейли. "Журнал исследований минерализации костей" 1998,13 218-228.
(К. Ziambaras, F. Lecanda, Т. Н. Steinberg, R. Civiteili, J. Bone Wner. Res. 1998, 13 218-228).
- 121 -
007792
[94.] И. Капоцци, Р. Тонон, П. Д'Андреа. "Биохимический журнал" 1999, 344 Pt 2 545-553. (I. Capozzi, R. Tonon, P. D'Andrea, Blochem J1999, 344 Pt 2 545-553).
[95.] С. Г. Cnанакис, С. Петридоу, С. К. Мазур. "Офтальмологические исследования. Наука о зрении" 1998, 39 1320-1328.
(S. G. Spanakis, S. Petridou, S. К. Masur, Invest Ophthalmol. Vis.Scl. 1998, 39 1320-1328).
[96.] X. Йамасаки, В. Крутовских, М. Меслин, Т. Танака, Д. М. Заидан, Й. Омори. "Клинические исследования Академии Наук ". II. 1999, 322 151-159.
(Н. Yamasaki, V. Krutovskikh, M. Mesnil, Т. Tanaka, D. M. Zaidan, Y. Omori, C.R.Acad.Sci. III. 1999,
322 151-159).
[97.] Б. Д. Ларсен, А. Холм. "Международный журнал по исследованиям пептидов и белка". 1994,
43 1-9.
(В. D. Larsen, A. Holm, Int J Pept. Protein Res. 1994, 43 1-9).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства.
2. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для лечения
аритмии.
3. Применение по предыдущему пункту, где упомянутая аритмия является аритмией, вызванной
циркуляцией возбуждения, либо предсердного, либо желудочкового происхождения, включая аритмию,
вызванную альтернансом реполяризации, когда и наджелудочковые и желудочковые тахиаритмии могут
проявляться в виде тахикардии, трепетания или фибрилляции.
4. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения замедленной проводимости в сердце.
5. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для улучшения сокращаемости сердца.
6. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для лечения
болезненных состояний, связанных с ухудшенной МКЩС во время метаболического стресса, включая
недостаток глюкозы и гипоксию.
7. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для антитромбического лечения.
8. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении остеопороза.
9. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении болезней суставов, включая артрит.
10. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении заболеваний в тканях хряща и суставах с плохой васкуляризацией.
11. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении потери костной ткани и для усиления заживляемости переломов костей.
12. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении васкуляризации роговицы при болезненных состояниях с недостаточным питанием роговицы и для улучшения заживляемости роговицы в случае ее повреждения.
13. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при лечении ран и, в частности, ишемических язв.
14. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при лечении язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки.
15. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, которое усиливает купирование клеток с помо- 122 -
007792
щью щелевого соединения и/или МКЩС в стенке сосуда в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения артериальной гипертензии.
16. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственных средств, применяемых
при профилактике ишемического поражения мозга и для лечения органических психозов, которые могут
проявляться в виде депрессии, беспокойства, нарушений обучаемости и памяти, фобий и галлюцинаций.
17. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении катаракты.
18. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении глухоты, связанной с ухудшенной МКЩС.
19. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении нарушения двигательной активности желудочно-кишечного тракта.
20. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при лечении женского бесплодия, которое является следствием плохого купирования клеток в яичниках.
21. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого вместе с окситоцином, для стимуляции и облегчения родов.
22. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при лечении мужского бесплодия, связанного с ухудшенным купированием клеток.
23. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого для улучшения переносимости глюкозы у субъекта с инсулиннезависимым сахарным диабетом, вызванным ухудшенной МКЩС между β-клетками.
24. Способ лечения аритмии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII,
формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
25. Способ лечения согласно предыдущему пункту, отличающийся тем, что упомянутая аритмия
является аритмией, вызываемой циркуляцией возбуждения, либо предсердного, либо желудочкового
происхождения, включая аритмию, вызванную альтернансом реполяризации, когда и наджелудочковые,
и желудочковые тахиаритмии могут проявляться в виде тахикардии, трепетания или фибрилляции, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества
химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
26. Способ усиления межклеточной коммуникации по щелевому соединению клеток млекопитающих, испытывающих недостаток глюкозы и/или гипоксию, включающий введение эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
27. Способ антитромбического лечения, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком
лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
28. Способ лечения остеопороза, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении,
терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам
I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
29. Способ лечения или профилактики потери костной ткани и усиления заживляемости переломов
костей, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного
количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических
соединений, представленных в табл. 1 и 8.
30. Способ лечения болезней суставов, включая артрит, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей
формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
31. Способ лечения рака в ткани эндодермального, мезодермального или эктодермального происхождения, включая виды рака и гепатоцеллюлярные и холангоцеллюлярных неоплазмы и рак кости,
включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
- 123 -
007792
32. Способ лечения ран и, в частности, ишемических язв, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
33. Способ лечения ран или кожных поражений, включающий введение пациенту, нуждающемуся в
таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I,
формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
34. Способ лечения ран или поражений слизистой оболочки рта, включающий введение пациенту,
нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по
общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и
8.
35. Способ лечения язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в
табл. 1 и 8.
36. Способ лечения или профилактики артериальной гипертензии путем усиления купирования клеток с помощью щелевого соединения и/или МКЩС в стенке сосуда, включающий введение пациенту,
нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по
общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и
8.
37. Способ профилактики ишемического поражения мозга и лечения органических психозов, которые могут проявляться в виде депрессии, беспокойства, нарушений обучаемости и памяти, фобий и галлюцинаций, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и
химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
38. Способ лечения глухоты, связанной с ухудшенной МКЩС, включающий введение пациенту,
нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по
общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и
8.
39. Способ лечения нарушений двигательной активности желудочно-кишечного тракта, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений,
представленных в табл. 1 и 8.
40. Способ лечения женского бесплодия, которое является следствием ослабления купирования
клеток в яичниках, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически
эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12
и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
41. Способ стимуляции и облегчения родов, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, вместе с окситоцином терапевтически эффективного количества химического соединения
по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл.
1 и 8.
42. Способ лечения мужского бесплодия, связанного с ухудшенным купированием клеток, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества
химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
43. Способ улучшения переносимости глюкозы у субъекта с инсулиннезависимым сахарным диабетом, вызванным ухудшенной МКЩС между β-клетками, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей
формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
44. Способ лечения или профилактики заболеваний в тканях хряща и суставах с плохой васкуляризацией, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного
количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических
соединений, представленных в табл. 1 и 8.
45. Способ по предыдущему пункту, отличающийся тем, что упомянутое заболевание является артритом.
46. Способ лечения или профилактики катаракты, включающий введение пациенту, нуждающемуся
в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле
I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
47. Способ лечения или профилактики васкуляризации роговицы при болезненных состояниях с недостаточным питанием роговицы и для улучшения заживляемости роговицы в случае ее повреждения,
включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
- 124 -
007792
48. Способ лечения или профилактики роста и распространения по поверхности раковых клеток,
типа раковых клеток линий эпителиальных клеток, включающий введение пациенту, нуждающемуся в
таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I,
формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
49. Способ лечения панкреатита у пациента, страдающего от него, включающий введение пациенту,
нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по
общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и
8.
50. Способ лечения недостатка глюкозы и/или гипоксии клеток, ткани, органа пациента, страдающего недостатком глюкозы и/или гипоксией, включающий введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VIII, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
51. Способ по предыдущему пункту, отличающийся тем, что упомянутым органом является сердце.
52. Способ профилактики или лечения непролиферативной болезни, включающий введение терапевтически эффективного количества химического соединения, которое способствует межклеточной
коммуникации, что было выявлено на модели мыши с аритмией, вызванной СаСl2.
53. Способ по п.52, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение имеет индекс для
упомянутой модели мыши, который равен 2 или 3.
54. Способ по п.52, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.
55. Способ по пп.52-54, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение является агонистом антиаритмического рецептора пептида.
56. Способ по пп.52-55, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из
группы, в состав которой входит ресвератрол, включая различные изомеры, димеры, тримеры, тетрамеры
и их производные.
57. Способ по п.56, отличающийся тем, что химическим соединением является транс-ресвератрол
(транс-3,5,4'-тригидроксистильбен).
58. Способ по пп.52-54, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из
группы, в состав которой входит ирзогладин или (6-(2,5-дихлорофенил)-2,4-диамино-1,3,5-триазин) и его
производные.
59. Способ по пп.52-54, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из
группы, в состав которой входят апорфиноидные алкалоиды, предпочтительно болдин и таспин, и их
производные.
60. Способ профилактики или лечения болезни, характеризующейся ухудшенной МКЩС в патологически измененной ткани, включающий введение терапевтически эффективного количества химического соединения, которое способствует внутриклеточной коммуникации, что было выявлено на модели
мыши с аритмией, вызванной хлористым кальцием, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из группы химических соединений по формуле I
представляющей пептидную последовательность,
где аминокислотные остатки могут иметь форму D и/или форму L с N-концевым участком N* и Сконцевым участком С*, и обладать цикличностью благодаря ковалентной связи между N* и С*, как показано пунктирной линией, или между Rd и С*, как показано пунктирной линией U; и
где пунктирная линия между N* и С*, которая если имеется, то исключает связь U, представляет
дополнительнуй ковалентную связь, и если упомянутой связи нет, то тогда N* связан с атомом водорода;
когда дополнительная ковалентная связь U между Rd и С* имеется, то тогда R7 отсутствует, и наличие R7
исключает связь U; и
- 125 -
007792
где X является N-концевым участком типа фотозонда, способного связываться с аминоконцевым
участком N*, или ацильной группой, полученной из С(2-22)алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной
кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот типа бегеновой кислоты,
произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав
которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа; или X является водородом;
R7 является ОН, NH2, NHNH2 или OR8, если связь между N* и С* отсутствует, или R7 отсутствует,
если связь между N* и С* существует;
R8 является Н или прямой или разветвленной С(1-6)алкильной группой, арильной или аралкильной
группой.
Ra является боковой аминокислотной цепью Hyp или Pro;
Rb является боковой аминокислотной цепью Hyp или Pro;
Rc является боковой аминокислотной цепью Gly, Sar, ароматической боковой аминокислотной цепью, произвольно замещаемой одной группой или большим числом гидроксигрупп, галогеновых групп,
нитрогрупп, цианогрупп, азидогрупп, аминогрупп, бензоильных групп или нижних алкоксигрупп или
тиоалкоксигрупп в ароматическом кольце;
Rd является боковой аминокислотной цепью Ala, Gly, Glu, Asp, Dab, Dapa, Lys, Asn, Gln, Orn, Thr,
Ser или Cys;
Re является боковой аминокислотной цепью Ala;
Rf является боковой аминокислотной цепью Ala, Sar или Gly;
Rg представляет любую боковую аминокислотную цепь кроме боковой цепи L-4Hyp или части по
формуле Z или Za;
Rh является боковой аминокислотной цепью Ala, или Rh является частью формулы Z или Za;
Ri является боковой аминокислотной цепью Gly, или Ri представляет ароматическую аминокислоту,
произвольно замещаемой одной группой или большим числом гидроксигрупп, галогеновых групп, нитрогрупп, цианогрупп, азидогрупп, аминогрупп, бензоильных групп или нижних алкоксигрупп или тиоалкоксигрупп в ароматическом кольце;
Rj является боковой аминокислотной цепью Asn, Gln, Asp, Glu, Cys, или Tyr;
и каждый из индексов j, k, i, m, n, p и q независимо друг от друга принимает значение 0 или 1;
и их ретроформ, всех форм D, или ретроформ всех D форм пептидной последовательности по формуле I,
и их солей и амидов.
61. Способ по п.60, отличающийся тем, что под болезнью понимается любая из описанных здесь
болезней или любое из состояний, предпочтительно воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной ткани, раны, эректильная дисфункция, недержание мочи, нарушение слуха, ослабленного вследствии болезни ушной улитки, эндотелиальные поражения, диабетическая ретинопатия и диабетическая невропатия, нервнопатическая боль, ишемия центральной нервной системы, повреждения
спинного мозга, заболевания зубных тканей, включая болезнь пародонта, болезни почек, подострое и
хроническое воспаление, рак и патологии костного мозга и стволовых клеток при трансплантации.
62. Способ по пп.52-61, отличающийся тем, что химическое соединение представлено любой из
следующих формул:
(VII)
где R1 является Н или ацетилом (Ас),
R2 является боковой цепью одной из аминокислот G, Y, D-Y, F и D-F,
R3 является О или Н,
R4 является любой аминокислотной боковой цепью,
R5 является О или Н,
R6 является С(1-4)алкильной группой типа СН2, (СН2)2, (СН2)3 и (СН2)4,
R7 является О или Н,
R8 является О или Н,
R9 является боковой цепью одной из аминокислот G, Y, D-Y, F и D-F,
R10 является ОН или NH2,
и S, T, U, V и Z - целые числа, принимающие следующие значения:
S - 0, 1 или 2,
Т - 0, 1 или 2,
U - 0 или 1,
- 126 -
007792
V - 0 или 1,
Z - 0 или 1, или
R1-X1-X2-X3-R2 (VIII),
где X1 равно 0 или является Ala, Gly, β-Ala, Tyr, D-Tyr, Asp, HAA,
X2 равно 0 или является Ala-Gly-T4c-Pro; Ala-Sar-Hyp-Pro; Ala-(6-членный цикл)-; Ala-Asn; D-AsnD-Ala; D-Asn;
γΑbu; Gly, Αla; D-Ala; β-Αla; Pamh; Αsn или HAA;
Х3 является Tyr; D-Tyr; Gly, Pamb или Phe; и
R1 является Н или Ас, при условии, что X1 и Х2 - не оба равны 0;
и их солями.
63. Способ по пп.52-61, отличающийся тем, что период полураспада химического соединения, полученный при измерениях с применением стандартного анализа стабильности составлял более 50 мин, но
желательно, чтобы период полураспада химического соединения превышал 5 ч.
64. Способ по пп.52-61, отличающийся тем, что период полураспада химического соединения, полученный при измерениях с применением стандартного анализа стабильности превышает 5 ч.
65. Способ лечения воспаления эпителия дыхательных путей, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического
соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
66. Способ лечения повреждений, которые вызывают мозговые воспалительные реакции, включая
черепно-мозговую травму и ишемию, нейродегенеративные болезни, включая болезнь Паркинсона, аутоиммунные болезни, инфекционные болезни, прионные болезни, и опухоли мозга, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
67. Способ лечения реактивного глиоза, вызванного ударом, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
68. Способ лечения или профилактики развития глиальных неоплазм, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной
коммуникации.
69. Способ лечения нейронных и мышечных симптомов, связанных с аксотомией спинного мозга,
включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое
способствует межклеточной коммуникации.
70. Способ профилактики или лечения диабетической ретинопатии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной
коммуникации.
71. Способ лечения сосудистых заболеваний сетчатки, например, артериосклероза, включающий
введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы
одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует
межклеточной коммуникации.
72. Способ лечения ишемии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации, в количестве, эффективном для обеспечения роста капилляров.
73. Способ ускорения процесса заживления сосудов после поражения балонным катетером сонной
артерии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
74. Способ лечения эректильной дисфункции, включающий введение пациенту, нуждающемуся в
таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из
описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
75. Способ лечения недержания мочи, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных
здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
76. Способ лечения раны, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
- 127 -
007792
77. Способ лечения подострого или хронического воспаления путем обеспечения местного увеличения синтеза иммуноглобулинов, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении,
терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь
химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
78. Способ лечения периферической невропатии и нервнопатической боли, включающий введение
пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного
химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
79. Способ профилактики или лечения приобретенной или возрастной потери слуха, включающий
введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы
одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует
межклеточной коммуникации.
80. Способ лечения пониженного потенциала кроветворных тканей, например, в кроветворных злокачественных образованиях и после химиотерапии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в
таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из
описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
81. Способ профилактики или лечения болезни, характеризующейся расстройством почечной коммуникации по щелевому соединению, вызванным отравлением тяжелыми металлами, неинфекционным
воспалением или микробной инфекцией, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных
здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
82. Способ лечения нарушенной секреции гормона из передней доли гипофиза, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
83. Способ профилактики или лечения нарушенного развития зубов, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной
коммуникации.
84. Способ уменьшения симптомов при старении кожи, целлюлите и при морщинах, включающий
введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы
одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует
межклеточной коммуникации.
85. Способ лечения болезни, вызванной табаком, связанной с разрывом купирования клеток с помощью щелевого соединения, например, плохое заживление раны и старение кожи у пациента, страдающего этим заболеванием, включающий введение упомянутому пациенту эффективного количества хотя
бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует
межклеточной коммуникации.
86. Способ по пп.52-85, отличающийся тем, что вводимым химическим соединением является химическое соединение по любому из пп.52-62.
87. Способ по пп.52-86, отличающийся тем, что вводимым химическим соединением является хотя
бы одно из следующих химических соединений:
НРР-5-К6-ОН,
Н-ААР-10-К6-ОН,
цикло(ретро-ААР-10-Asn),
Ас-ретро(ААР-10)-(все D)-NH2,
Ас-ретро (ААР-10)-ОН,
HPP-5-K6-NH2,
H-[D-Hyp4]AAP-10-NH2,
H-[D-Pro4, Ala5]AAP-10-NH2,
AAP-10-K6-NH2,
H-C(Acm)GAGHypPYC(Acm)-NH2,
H-AAP-10-Asn-NH2,
цикло(AAP-10-Asn),
цикло(AAP-10-Gln),
H-HypPYNGAG-NH2,
H-GAG-T4c-PY-NH2,
H-GA-Sar-Hyp-PY-NH2,
H-Sar-A-Sar-Hyp-PY-NH2,
H-GAG-PC-PY-NH2,
H-GAGGPY-NH2,
H-GAG-DHypAY-NH2,
- 128 -
007792
H-GAG-DHyp-DProY-NH2,
дес-Нур4-[Asn5]AAP-10-NH2,
AcGNY,
GNY,
H-GANY-NH2,
H-DY-DN-G-NH2,
H-YNG-NH2,
H-GGY-NH2,
H-G-DN-Y-NH2,
H-Y-DN-G-OH,
Ac-Y- DN-G-OH,
Ac-G-D-N-Y-NH2,
Ac-Y-D-N-G-NH2 и
H-GK(DNP)Y-NH2
и их соли.
88. Способ по пп.52-86, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из
группы, в состав которой входит ресвератрол и его изомеры и полимеры.
89. Способ по пп.52-86, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из
группы, в состав которой входят апорфиноидные алкалоиды, предпочтительно болдин и таспин и их
производные.
90. Фармацевтический состав, включающий химическое соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений по формулам I-VIII, формулам 2-12, соединений, представленных в табл. 1 и 8,
либо соединений, используемых в способах по пп.24-89, и фармацевтически приемлемый носитель или
растворитель.
91. Фармацевтический состав согласно предыдущему пункту, который является энтеральной таблеткой.
92. Фармацевтический состав по п.90, который является препаратом для инъекции.
Фиг. 1
- 129 -
007792
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 130 -
007792
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
- 131 -
007792
Фиг. 8
Фиг. 9
Фиг. 10
- 132 -
007792
Фиг. 11
Фиг. 12
Фиг. 13
- 133 -
007792
Фиг. 14
Фиг. 15
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 134 -