1. Диссертация Шушанов С.С
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Шушанов Саин Сакенович Инсулиноподобный фактор роста 1 типа (IGF-1) и его рецептор IGF-1R в регуляции дифференцировки и выживания нормальных и опухолевых клеток 14.01.12 – онкология диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Ставровская Алла Александровна МОСКВА 2015 2 Оглавление Введение……………………….………………………………………..………….......6 Глава 1.Обзор литературы……………………………………….…….... .. ..............23 1.1. Общая характеристика системы IGF/инсулин…………..….….…………....…23 1.2. Инсулиноподобный фактор роста 1 типа (IGF-1)….….….………………........28 1.3. Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1R)…...….......…....36 1.3.1. Регуляция экспрессии гена IGF-1R…………………………………… .…..36 1.3.2. Сигнальная трансдукция, опосредуемая IGF-1R…………………………..39 1.4. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в канцерогенезе……….……….... ……...45 1.4.1. Эпидемиологические исследования взаимосвязи между экспрессией IGF-1 и IGF-1R и злокачественной трансформацией……………..….…....45 1.4.2. Молекулярно-генетические исследования взаимосвязи между экспрессией IGF-1 и IGF-1R и злокачественной трансформацией….…....46 1.5. Развитие молочной железы мыши…..…………………….………………….…55 1.6. Рак молочной железы, индуцированный гиперэкспрессией Wnt1 .… …...…..60 1.7. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в прогрессии множественной миеломы человека.……………………………………..………………………...65 1.7.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в селективной локализации клеток миеломы в костном мозге………………………………...………....67 1.7.2. Роль IGF-1 в регуляции пролиферации клеток множественной миеломы………….…………...………………………….……………………71 1.7.3. Роль IGF-1 в регуляции остеолизиса……………………………….……… 73 1.8. Возникновение МЛУ является существенным фактором в прогрессии множественной миеломы………..……………………………………...…...…...74 1.8.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции механизмов возникновения МЛУ при ММ человека………….…………………......…..82 1.8.2. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в выживании опухолевых клеток при множественной миеломе……..………..…………………...……..….…85 1.9. Роль IGF-1 в регуляции апоптоза, индуцируемого IL-1β……….…..……...….97 3 1.9.1. Про-апоптотические цитокины IL-1α и IL-1β……….……………………..98 Глава 2. Материалы и методы исследования…………………….…….….…….....101 2.1. Трансгенные линии мышей…………………………………………...…...…...101 2.2. Генотипирование…………………………………………….……………….....102 2.3. Приготовление препаратов молочной железы…………….……………….…102 2.3.1. Приготовление тотального препарата молочной железы…….……….....103 2.3.2. Окрашивание гематоксилин-эозином………..……………………...…….104 2.3.3. Исследование пролиферации клеток эпителия молочной железы с использованием бромдезоксиуридина (BrdU)……………….………....104 2.4. Получение первичной культуры клеток эпителия молочной железы мыши…………………….…………………………….……105 2.4.1. Процедура покрытия чашки матригелем…….……………………….…...107 2.4.2. Исследование экспрессии казеинов в первичной культуре клеток эпителия молочной железы in vitro…………..…………………… ………108 2.4.3. Отделение первичных клеток эпителия молочной железы от матригеля……………………………………..……………………….……..108 2.5. Исследование экспрессия бета казеина в линии клеток эпителия молочной железы мыши НС11…………………………..………………….......109 2.6. Выделение белка из ткани молочной железы мыши…………… …………...110 2.7. Вестерн - блот гибридизация……………………………………..………..…...110 2.8. Иммунопреципитация…………………………………………….……..….…..111 2.9. Проточная цитометрия……………….………………………………..………..112 2.10. Клинический материал и выделение РНК из клеток костного мозга…....…113 2.11. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)…..... 114 2.12. Исследование активности эффекторных каспаз 3 и 7……………….…...… 115 2.13. Линии клеток множественной миеломы……………………….………..…. .116 2.14. Оценка выживаемости клеток ММ колориметрическим методом (МТТ) и методом подсчета………………………………...........… 116 2.15. Статистическая обработка результатов……………...…............................... 117 Глава 3. Результаты исследования……………..………….…..……………..……..119 4 3.1. Исследование роли IGF-1R в дифференцировке на модели молочной железы мыши……………………………………………..….……………..…..119 3.1.1. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором…..…………………………………..…………………...…...121 3.1.2. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором……..……………………………………………………….....129 3.1.3. Исследование роли IGF-1R - зависимого сигнального пути в канцерогенезе молочной железы, опосредуемом Wnt1…….…………….140 3.1.4. Исследование роли IGF-1 и IGF-2 в функциональной дифференцировке клеток молочной железы НC11……..……..…..….…..148 3.2. Исследование роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ при множественной миеломе человека…………….……………………........152 3.2.1. Исследование экспрессии мРНК IGF-1 и мРНК генов, отвественных за возникновение МЛУ в клиническом материале............152 3.2.2. Зависимость общей выживаемости пациентов с ММ от уровня экспресссии гена IGF-1……………………………………………………..165 3.2.3. Исследование роли IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ на моделях линий культур клеток множественной миеломы человека…………………..………………………….…….……..168 3.3. Исследование роли IGF-1 в регуляции выживаемости нормальных и опухолевых клеток…………………………………………….………….........174 3.3.1.Исследование IGF-1- зависимой регуляции активности каспаз 3 и 7……………………………………………………….…............174 3.3.2. Исследование влияния IGF-1 на выживаемость клеток множественной миеломы человека…….……….…….……..………….….178 3.3.2.1. Экспрессия мРНК генов системы IGF/инсулин в линиях клеток множественной миеломы человека……...………….…….…...178 3.3.2.2. Исследование влияния фактора роста IGF-1 на выживаемость линий клеток множественной миеломы человека методом МТТ...….180 3.3.2.3. Исследование выживаемости линий клеток множественной 5 миеломы человека методом подсчета………...….….…………..….........182 3.3.2.4. Исследование влияния фактора роста IGF-1 на динамику выживаемости линий клеток множественной миеломы человека…....185 3.3.2.5. Исследование экспрессии мРНК генов CycB1 и CycD1 и мРНК генов, принадлежащих семействам Bcl-2 и IAP……..………..….…….188 Глава 4. Осуждение результатов……………………...………………………..…...193 4.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции дифференцировки молочной железы…….………………….…………………………...…..….....193 4.1.1. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором………………………………………………….…...194 4.1.2. Экспрессии казеинов в первичной культуре клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, и в линии клеток молочной железы HC11………………………..……………………………………….198 4.1.3. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором………………………….………………….……...200 4.2. Роль IGF-1R - зависимого сигнала в канцерогенезе молочной железы, опосредуемом Wnt1……………………………………………………….…….205 4.3. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ при множественной миеломе человека……………………………….…...…..211 4.4. Влияние IGF-1 на выживаемость клеток множественной миеломы человека…………………………………………………………...……………..215 4.5. IGF-1- зависимая регуляция активности каспаз 3 и 7………...……….……...220 Заключение…………….……………………………………………………….....….224 Выводы……….…………………………………………….…..……………....…….229 Список сокращений и условных обозначений…………….…………..…………..231 Приложение………….…………….………….……………………...………….…..233 Список литературы………….……….…....…………….………………...…...…....234 6 Введение Актуальность темы исследования Злокачественные новообразования (ЗН) – одна из основных причин смертности населения России. При этом показатели заболеваемости ЗН с течением времени возрастают [2]. Настоятельно необходимы и, несомненно, актуальны поиски новых подходов к лечению и диагностике ЗН. Для поиска таких новых подходов необходимо тщательное изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и опухолевой прогрессии. Одним определяющих возникновение и развитие ЗН, из основных нарушений, является способность клеток поддерживать устойчивые сигналы для пролиферации [4, 219]. Эти сигналы клетки получают от факторов роста, которые связываются с соответствующими рецепторами на поверхности клетки и активируют сеть внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих вхождение клетки в очередной клеточный цикл. Часто эти сигналы влияют и на другие свойства опухолевых клеток такие как: рост, выживаемость, дифференцировку, возникновение лекарственной устойчивости, активацию онкогенных сигнальных путей, энергетический обмен и другие [216]. Поэтому исследование роли факторов роста и их рецепторов в молекулярных механизмах злокачественной прогрессии является на сегодня актуальным. В настоящее время одной из наиболее широко изучаемой в онкологии является система инсулиноподобных факторов роста (система IGF) [222, 310, 469]. Роль этой системы в прогрессии ряда злокачественных новообразований человека является доказанной. Повышенная экспрессия компонентов этой системы в злокачественных опухолях является плохим прогностическим показателем выживаемости больных. Для таких опухолей характерен послеоперационный рецидив, они являются инвазивными и дают отдаленные метастазы [189, 402, 403, 476, 492]. Однако, молекулярные механизмы, определяющие влияние инсулиноподобных факторов роста на прогрессию опухолей остаются не раскрытыми и проведение фундаментальных исследований 7 в этом направлении является актуальным. Наша работа посвящена детальному исследованию роли инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1) и его рецептора IGF-1R в регуляции молекулярных механизмов выживания нормальных и опухолевых клеток, а также дифференцировки и канцерогенеза. Недавно было обнаружено, что гиперэкспрессия гена Wnt1 в эпителии молочной железы вызывает раннюю и обширную гиперплазию протоков [310, 482, 534]. Также показано, что активация сигнального пути, опосредованного Wnt1 характерна для базальноподобного рака молочной железы (РМЖ) человека [264], и что она ассоциируется с метастазированием в легкие и головной мозг [139]. Базальноподобный РМЖ по гистологическому строению принадлежит к низкодифференцированному протоковому раку с высокой метастатической активностью, низкой степенью дифференцировки [7, 75, 426, 430]. Он, попрежнему, остается одним из наиболее сложных для лечения подтипов РМЖ из-за агрессивного характера течения и отсутствия эффективных методов лечения [7, 303, 385, 446]. Для этого типа РМЖ характерна экспрессия преимущественно маркеров базальных клеток, обогащенных стволовыми клетками и предшественниками базальных клеток [225, 313, 426, 446]. Одной из причин агрессивного течения базальноподобного РМЖ является его происхождение из наименее дифференцированных (возможно даже, стволовых) клеток [7]. Поэтому на сегодня актуальным является сосредоточение усилий на выявлении сигнальных путей, активированных при этом типе РМЖ [303]. Недавно было показано, что для базальноподобного РМЖ характерна активация IGF-1R зависимого сигнального пути [124, 322]. Однако детального исследования молекулярных механизмов, свидетельствующих об участии этого сигнального пути в канцерогенезе молочной железы, не проводилось и исследования в этом направлении являются актуальными. Эти исследования вошли в нашу работу (раздел 3.1.). Недавно появились данные о том, что в низкодифференцированной карциноме молочной железы протокового и долькового происхождения уровень 8 экспрессии IGF-1R резко снижается и это корреллирует с усилением пролиферации опухолевых клеток и потерей экспрессии рецептора эстрогена (ER) [473]. Вместе с тем молекулярные механизмы, свидетельствующие о взаимосвязи между экспрессией IGF-1R и дифференцировкой молочной железы, не изучены. Очевидно, что понимание роли IGF-1R в дифференцировке молочной железы является важным для оценки его значимости в злокачественной прогрессии. Поэтому исследования в этом направлении, предпринятые нами, являются актуальными (выполнены в разделе 3.1.). Одним из свойств злокачественных клеток, позволяющих им выживать и размножаться в условиях противоопухолевой терапии, является приобретение ими, в ходе длительного лечения, устойчивости к разным химиопрепаратам, различающимся и по химической структуре, и по механизму действия. Иными словами, возникает множественная лекарственная устойчивость (МЛУ). МЛУ относится к ключевым факторам прогрессии опухоли. Одним из хорошо охарактеризованных молекулярных механизмов МЛУ является активность белка Р-гликопротеина (Pgp), кодируемого в клетках человека геном MDR1/ABCB1. Белок Pgp является трансмембранным белком, который, используя энергию АТФ, выбрасывает из клетки лекарственные препараты. Увеличение количества мРНК MDR1/ABCB1 и Pgp часто служит фактором устойчивости многих типов опухолей к лечению. Наряду с Pgp, в МЛУ вовлечены также и другие белки: АТФ-зависимые транспортеры MRP1/ABCC1, BCRP/ABCG2, а также белок LRP/MVP [6, 129, 491]. Возникновение МЛУ является одной из главных проблем на пути к успешному лечению онкобольных. Несмотря на то, что созданы различные классы ингибиторов, которые являются конкурентами субстратов перечисленных выше белков-транспортеров, их действие в преодолении МЛУ пока недостаточно эффективно. Поэтому, наряду с дальнейшим поиском новых ингибиторов МЛУ, актуальным является исследование регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ. В последнее время стали появляться данные о влиянии инсулиноподобных факторов роста на возникновение МЛУ [205, 474, 487], однако детального исследования молекулярных механизмов участия 9 инсулиноподобных факторов роста и их рецепторов в возникновении МЛУ проведено не было, поэтому исследования в этом направлении являются актуальными (выполнены в разделе 3.2.) Известно, что во многих типах злокачественных клеток нарушен механизм, регулирующий запрограммированную клеточную гибель – апоптоз [125]. В результате опухолевые клетки становятся менее чувствительными, по сравнению с окружающими их нормальными клетками, к различным стрессовым воздействиям, таким как, недостаточность факторов роста, поломки ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, тепловой шок, действие противоопухолевых препаратов, направленных на активацию апоптоза в опухолевых клетках [262]. Иными словами, менее чувствительные к апоптозу опухолевые клетки получают преимущество в борьбе за выживание, что является важным шагом на пути к злокачественной прогрессии [364]. Известно, что инсулиноподобные факторы роста в некоторых типах опухолей могут иметь антиапоптотические функции [126, 514, 525]. Однако молекулярные механизмы, посредством которых инсулиноподобные факторы роста участвуют в регуляции апоптоза, изучены недостаточно. Поэтому исследования в этом направлении являются актуальными (выполнены в разделе 3.3.) Таким образом, тема исследования, которой посвящена диссертационная работа, является актуальной и вносит вклад в развитие представлений о роли инсулиноподобных факторов роста и их рецепторов в регуляции процессов, связанных со злокачественной прогрессией: множественной лекарственной устойчивости, апоптоза, дифференцировки и канцерогенеза. Степень разработанности темы исследования В литературе имеются работы, позволяющие с уверенностью говорить о том, что активация сигнального пути, опосредуемого IGF-1R, является общей чертой ряда опухолей, однако клиническая и прогностическая значимость активации этого сигнального пути остается не ясной. Что касается РМЖ, то работ, посвященных исследованию роли IGF-1R – зависимого сигнала при РМЖ 10 достаточно много, но, данные, полученные в ходе этих работ являются противоречивыми и спорными [63, 251, 270, 414, 429, 495, 549, 596]. В одних из них доказывается, что гиперэкспрессия IGF-1R не коррелирует ни с прогнозом течения заболевания, ни с клинико-патологическими параметрами РМЖ, а в других - экспрессия IGF-1R идентифицирована как убедительный прогностический фактор при РМЖ. Содержания этих работ более подробно изложены в разделе «Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в канцерогенезе». Особо следует отметить, что в литературе имеются работы, в которых обнаружена ассоциация между экспрессией IGF-1R, дифференцировкой и опухолевой прогрессией [479]. Роль IGF-1R в нормальном развитии и в нормальном функционировании молочной железы не изучена. В настоящее время исследования в этом направлении ведутся, и о некоторых из них будет подробно говориться в разделе диссертации, посвященном дифференцировке молочной железы. Очевидно, что понимание роли IGF-1 и IGF-1R в нормальном развитии молочной железы может помочь правильно оценить их важность и значимость при злокачественной трансформации и прогрессии. В своей работе мы исследовали роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в дифференцировке молочной железы. С этой целью были получены трансгенные мыши, несущие человеческий мутантный IGF-1R у которого в тирозинкиназном домене остаток лизина в положении 1003 заменен на аргинин (KR мутация). Такой доминантнонегативный IGF-1R (dnIGF-1R), димеризуясь с нормальным мышиным IGF-1R ингибирует его аутофосфорилирование и последующую передачу сигнала внутрь клетки. Нами исследованы 4 линии мышей, у которых указанный мутантный рецептор экспрессировался в клетках эпителия протоков молочной железы под MMTV промотором, и 6 линий мышей, у которых этот рецептор экспрессировался под промотором кислого сывороточного белка WAP. В указанных линиях мышей нами впервые была изучена роль генов IGF-1 и IGF-1R в третичном разветвлении и росте протоков молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши, а также в дифференцировке альвеол и регуляции экспрессии казеинов - белков молока, в период беременности и 11 лактации. В ходе исследования впервые было показано, что IGF-1R действительно играет важную роль в дифференцировке и функционировании нормальной молочной железы. К началу диссертационной работы абсолютно неизученным оставался вопрос, касающийся роли IGF-1R в модуляции действия онкогенов в ходе трансформации и инициации роста опухоли. В диссертационной работе это направление впервые разработано на примере взаимодействия IGF-1R и онкогена Wnt1 в молочной железе мыши. Для иследования роли IGF-1R - зависимого сигнального пути в Wnt1-индуцируемом канцерогенезе путем скрещивания линии мышей MMTV-dnIGF-1R, у которой IGF-1R - опосредуемый сигнал подавлен, с линией мышей MMTV-Wnt1, у которой гиперэксспрессирован ген Wnt1, была получена линия Wnt1//dnIGF-1R, у которой под MMTV промотором в молочной железе одновременно экспрессируются два трансгена. Сравнение времени возникновения опухолей в молочной железе у MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt1/dnIGF1R мышей показало, что у мышей, экспрессирующих одновременно два трансгена, опухоли молочной железы возникают гораздо раньше, чем у мышей экспрессирующих только MMTV-Wnt1. Более того, у MMTV-Wnt1/dnIGF-1R мышей в молочной железе одновременно возникало большее количество опухолей, чем у MMTV-Wnt1 мышей. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в Wnt1индуцированном канцерогенезе: ослабление IGF-1R сигнализации в контексте с гиперэкспрессией Wnt1 ускоряет канцерогенез и увеличивает количество возникающих опухолевых узлов. Таким образом, в диссертационной работе впервые было показано, что IGF1R может участвовать, как в регуляции нормального развития молочной железы, так и в Wnt1- опосредованном канцерогенезе. Учитывая, что ослабление сигнала через IGF-1R одновременно приводит к ухудшению дифференцировки и усилению Wnt1-опосредованного возникновения опухолей, в более широком смысле, это может служить примером взаимосвязи между ухудшением дифференцировки и развитием злокачественной опухоли. 12 На сегодня в литературе мало работ, посвященных исследованию роли IGF1R – зависимого сигнального пути в регуляции механизмов возникновения множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Показано, что в клетках рака толстой кишки мыши линии MCLM и в линии Т-лимфобластов человека CCRFCEM IGF-I индуцирует экспрессию гена MDR1 и значительно ингибирует гибель клеток от цитотоксических препаратов [208, 480]. В работе J. Ge и соавт. методом иммуногистохимии проведено исследование экспрессии IGF-1R и MRP1 в 102 образцах больных раком желудка и обнаружено, что IGF-1R экспрессируется в 75,2 % случаев, а MRP1 – в 69 % случаев. Такая высокая степень корреляции в экспрессии этих генов, несмотря на химиотерапию, ассоциируется с плохим прогнозом у больных раком желудка [183]. Также показано, что ингибирование IGF-1R в клетках колоректального рака человека ассоциируется с повышением чувствительности этих клеток к противоопухолевым препаратам и с супрессией экспрессии MRP-2 [494]. Таким образом, в литературе накапливаются данные, свидетельствующие в пользу того, что IGF-1R – опосредуемый сигнал может участвовать в возникновении МЛУ. Также эти данные свидетельствуют в пользу того, что исследования в этом направлении являются актуальными и своевременными. Что касается участия IGF-1 в возникновении МЛУ при множественной миеломе (ММ) в литературе данных нет. Вместе с тем, имеются основания предполагать, что IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнальный путь может иметь отношение к возникновению МЛУ при ММ человека. Например, показано, что взаимодействие клеток ММ с клетками стромы костного мозга активирует в последних транскрипцию и секрецию цитокинов и ростовых факторов, в том числе и инсулиноподобного фактора роста 1-го типа (IGF-1) [229]. Также было показано, что клетки ММ, взаимодействуя с эндотелием кровеносных сосудов, окружающих костный мозг, экспрессируют на своей поверхности рецептор IGF1R [229]. Увеличение количества IGF-1R на поверхности клеток ММ приводит к большему количеству IGF-1/IGF-1R взаимодействий и последующей активации нижележащих сигнальных путей в клетке, которые могут оказаться важными для злокачественной прогрессии ММ, в том числе и для возникновения МЛУ. 13 Известно, что для пациентов с ММ характерна приобретенная МЛУ, которая возникает противоопухолевыми при повторном цитостатиками. и/или длительном Становление лечении приобретенной МЛУ происходит через отбор и последующее размножение тех опухолевых клеток, в которых гены, ответственные за возникновение МЛУ гиперэкспрессируются и такие клетки приобретают МЛУ [196]. Приобретенная МЛУ является одной из самых существенных проблем при лечении больных ММ и длительность жизни больных ММ в основном зависит от чувствительности к лечению противоопухолевыми препаратами. В литературе имеются работы, посвященные исследованию роли белков – транспортеров в возникновении МЛУ при ММ человека. Так, например, показано, что у нелеченных больных ММ экспрессия Pgp обнаруживается только в 1-2% образцов биопсий, тогда как у леченных больных, у которых возник рецидив и они стали нечувствительными к химиопрепаратам, экспрессия Pgp обнаруживается в 40-80% случаев [509]. В другой работе показано, что у 6 % пациентов с ММ до лечения обнаруживается экспрессия Pgp, тогда как после лечения до 85% резистентных к лечению пациентов становятся Pgp позитивными [342]. Еще в одной работе было установлено, что высокий уровень экспрессии мРНК MDR1 в плазматических клетках костного мозга больных ММ может прогнозировать плохую чувствительность к химиотерапии [321]. По литературным данным ген LRP экспрессирован приблизительно у 50% больных ММ и его экспрессия ассоциирована с плохим ответом на лечение больных мелфаланом и, в целом, с более короткой продолжительностью жизни больных ММ [441]. Считается, что LRP может быть использован в качестве важного генетического маркёра для предсказания слабого терапевтического ответа при множественной миеломе. Было показано, что LRP экспрессируется чаще у больных с делецией гена р53 и при повышенной экспрессии Pgp [441]. В отношении гена BCRP известно, что его экспрессия обнаружена в клеточных линиях множественной миеломы, где он является функциональным, а также в образцах костного мозга, полученных от больных множественной миеломой. Предполагается, что BCRP может 14 содействовать возникновению лекарственной устойчивости при множественной миеломе [383, 482]. В литературе также представлены работы, в которых исследовалась экспрессия мРНК MRP1 в образцах костного мозга больных ММ [383, 482]. Данные, полученные в этих работах являются противоречивыми и исследования роли гена MRP1 в возникновении МЛУ при ММ продолжаются. В наших исследованиях мы использовали образцы, полученные от леченных больных ММ, и, действительно, экспрессия мРНК генов, ответственных за возникновение МЛУ, обнаруживается в подавляющем большинстве случаев. Поэтому ММ является тем типом опухоли, которая наиболее подходит для исследования роли IGF-1 в регуляции механизмов возникновения МЛУ при лечении. В диссертационной работе впервые исследована роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ, при ММ человека с использованием клинического материала (аспиратов костного мозга больных ММ) и линий культур клеток ММ. Впервые установлено, что экспрессия мРНК генов МЛУ - MDR1, MRP1, LRP, BCRP в подавляющем большинстве случаев является высокой в образцах аспиратов, в которых обнаруживается умеренная или высокая экспрессия мРНК IGF-1, и наоборот, экспрессия генов МЛУ слабая в образцах, в которых экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что ген IGF-1 и гены МЛУ при ММ по меньшей мере коэкспрессируются [14]. Также мы впервые исследовали роль IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ в трех линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. Мы впервые показали, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1 ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A и это приводит к ингибированию экспрессии мРНК MRP1 и LRP [17]. При исследовании клинического материала было установлено, что для пациентов с ММ, у которых наблюдается высокий уровень экспрессии гена IGF-1, характерно уменьшение общей выживаемости и, наоборот, когда экспрессия гена IGF-1 слабая или отсутствует, наблюдается увеличение общей выживаемости. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что высокая экспрессия гена IGF-1 15 может являться плохим прогностическим фактором при ММ. Однозначно объяснить механизм причинно-следственной взаимосвязи между усилением экспрессии гена IGF-1 и уменьшением общей выживаемости больных ММ сложно. Тем не менее, можно предположить, что причиной уменьшения общей выживаемости больных ММ может быть приобретение МЛУ, и, как результат, пациенты перестают отвечать на химиотерапию и погибают. Другой причиной уменьшения общей выживаемости больных ММ может оказаться повышение жизнеспособности клеток ММ вследствие потери ими чувствительности к апоптозу. Известно, что во многих типах злокачественных клеток нарушен механизм, регулирующий запрограммированную клеточную гибель – апоптоз [125]. В результате опухолевые клетки становятся менее чувствительными по сравнению с окружающими их нормальными клетками к различным стрессовым воздействиям, таким как недостаточность факторов роста, поломки ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, тепловой шок, действие противоопухолевых препаратов, направленных на активацию апоптоза в опухолевых клетках [262]. Иными словами, менее чувствительные к апоптозу опухолевые клетки получают преимущество в борьбе за выживание, что является важным шагом на пути к злокачественной прогрессии [364]. В регуляции апоптоза участвуют про-апопототичекие и анти-апоптотические белки семейства Bcl-2, а также семейство ингибиторов белков апоптоза IAPs (inhibitors of apoptosis proteins) [125, 551]. Наряду с изменением активности этих белков, за счет их фосфорилирования или дефосфорилирования, важным фактором, регулирующим апоптоз, является количественное соотношение этих белков [94, 579]. Говоря иными словами, судьба клетки может решаться на уровне регуляции экспрессии белков, участвующих в апоптозе. Это подтверждается в ряде экспериментов [370, 497, 558]. При ММ было показано, что высокий уровень экспрессии некоторых генов семейства Bcl-2 и IAP ассоциируется с малигнизированным фенотипом клеток ММ [513], с их лекарственной устойчивостью к доксорубицину, дексаметазону и этопозиду [182, 543, 544], а также с усилением их выживаемости [32]. Предварительные исследования показали, что в регуляции экспрессии генов 16 семейства Bcl-2 и IAP может участвовать IGF-1/IGF-1R - опосредуемый сигнальный путь. Однако, имеющиеся в литературе данные, являются противоречивыми и исследования в этом направлении в настоящем остаются актуальными. В диссертационной работе было показано, что IGF-1 является фактором, усиливающим выживаемость клеток ММ человека и, что IGF-1/IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в регуляции апоптоза: в линии клеток ММ человека RPMI8226 регулирует экспрессию антиапоптотичеких генов: Bcl-2 и HIAP-1; В линии клеток RGC-5 IGF-1R – опосредованные сигналы подавляет активность эффекторных каспаз 3 и 7. Эти данные являются основанием для объяснения механизмов, объясняющих связь между повышением экспрессии гена IGF-1 и общей выживаемостью пациентов с ММ. Возможно, что и в микроокружении костного мозга активация IGF-1/IGF-1R – зависимого сигнала может усилить в клетках ММ анти-апоптотический эффект, придавая злокачественным клеткам преимущество в борьбе за выживание. Цели и задачи исследования Цель исследования: Установить роль инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1) и его рецептора IGF-1R в регуляции молекулярных механизмов основных компонентов прогрессии злокачественных новообразований: множественной лекарственной устойчивости, дифференцировки и апоптоза. Задачи исследования: 1. Исследовать роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции дифференцировки и канцерогенеза на модели трансгенных линий мышей и линии клеток молочной железы мыши HC11 1.1. Исследовать роль доминантно-негативного IGF-1R (dnIGF-1R), экспрессирующегося в клетках эпителия молочной железы мыши под промотором кислого сывороточного белка WAP, в регуляции экспрессии казеинов – белков молока и регуляции роста альвеол. 17 1.2. Исследовать роль dnIGF-1R, экспрессирующегося в клетках эпителия молочной железы мыши под MMTV промотором, в регуляции третичного разветвления и роста протоков молочной железы. 1.3. Исследовать роль IGF-1 в регуляции экспрессии казеинов в линии клеток молочной железы мыши HC11 и в первичной культуре клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором. 1.4. Исследовать роль IGF-1R в Wnt1-опосредованном канцерогенезе молочной железы. 2. Исследовать роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции множественной лекарственной устойчивости при множественной миеломе человека 2.1. В аспиратах костного мозга, полученных от больных множественной миеломой (ММ) исследовать экспрессию мРНК гена IGF-1 и мРНК генов, ответственных за множественную лекарственную устойчивость (МЛУ): MDR1, MRP1, LRP, BCRP. 2.2. На моделях линий культур клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9 исследовать IGF-1- зависимую регуляцию экспрессии мРНК генов, ответственных за МЛУ: MDR1, MRP1, LRP, BCRP. 2.3. Провести корреляционный анализ между экспрессий гена IGF-1 и общей выживаемостью пациентов с ММ. 3. Исследовать роль IGF-1 в выживаемости и регуляции апоптоза на моделях линий клеток множественной миеломы человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9 и нейронных клеток сетчатки глаза RGC-5 3.1. На модели линий клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9 исследовать роль IGF-1 в выживаемости злокачественных клеток и регуляции экспрессии генов семейства Bcl-2 и IAP. 18 3.2. На модели нейронных клеток сетчатки глаза крысы RGC-5 исследовать IGF1- зависимую регуляцию активности эффекторных каспаз 3 и 7, индуцированных удалением сыворотки из культивируемой среды или воздействием IL-1β. Научная новизна В ходе диссертационной работы получены оригинальные результаты, опубликованные в зарубежной и отечественной научной литературе. Впервые показано, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в Wnt1 – опосредованном канцерогенезе молочной железы: ослабление IGF-1R сигнала в контексте с гиперэкспрессией Wnt1 сокращает время возникновения опухолей молочной железы и увеличивает количество возникающих опухолевых узлов. Впервые показано, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в дифференцировке молочной железы: регулирует размеры альвеол и экспрессию казеинов (, , , ) и белка WAP в период беременности и лактации, и регулирует третичное разветвлении и рост протоков молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши. Впервые показано, что IGF-1R - опосредуемый сигнал регулирует соотношение стволовых/базальных клеток и предшественников люминальных клеток. Регуляция популяции предшественников люминальных клеток происходит через активацию Notch сигнального пути. Впервые показно, что IGF-1R - опосредуемый сигнальный путь в молочной железе участвует в регуляции пролиферации клеток эпителия протоков. Впервые установлено, что фактор роста IGF-1 и его рецептор IGF-1R могут участвовать в регуляции механизмов возникновения МЛУ при множественной миеломе человека: в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных множественной миеломой экспрессия гена IGF-1 ассоциируется с экспрессией генов множественной лекарственной устойчивости: MDR1/ABCB1, LRP/MVP, MRP1/ABCC1, BCRP/ ABCG2. В линии клеток множественной миеломы 19 человека RPMI8226 регулирует экспрессию генов множественной лекарственной устойчивости: MRP1/ABCC1 и LRP/MVP. Впервые показано, что гиперэкспрессия гена IGF-1 при множественной миеломе может являться плохим прогностическим фактором: высокий уровень экспрессии гена IGF-1 у пациентов с множественной миеломой ассоциируется с уменьшением общей выживаемости больных. Впервые показано, что IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнал усиливает выживаемость линий клеток множественной миеломы человека и участвует в регуляции апоптоза: регулирует экспрессию антиапоптотичеких генов: Bcl-2 и HIAP-1 и подавляет активацию эффекторных каспаз 3 и 7. Теоретическая и практическая значимость работы В диссертационной работе впервые показано, что ослабление IGF-1Rзависимого сигнала одновременно приводит к ухудшению дифференцировки и к усилению Wnt1 - опосредованного канцерогенеза молочной железы, что, в более широком смысле, может служить примером взаимосвязи между ухудшением дифференцировки и развитием злокачественной опухоли. Выявленная впервые кооперация между геном IGF-1R и онкогеном Wnt1 может служить прогностическим маркером прогрессии РМЖ. В более широком понимании эта кооперация может иметь место и в случае с другими известными онкогенами. Поэтому в клинической практике, наряду с исследованием экспрессии в опухолях известных онкогенов, мы рекомендуем дополнительно исследовать активность IGF-1R-зависимого сигнала, что позволит выбрать правильную стратегию лечения онкобольных. В диссертационной работе впервые показано, что IGF-1R - опосредуемый сигнальный путь может участвовать в регуляции механизмов возникновения МЛУ и этот сигнальный путь может усиливать выживаемость клеток множественной миеломы. Эти данные служат основанием для разработки новых подходов в лечении множественной миеломы, в которых, наряду с применением традиционной противоопухолевой химиотерапии одновременно могли бы 20 использоваться блокаторы IGF-1/IGF-1R сигнального пути с применением специфических ингибиторов IGF-1R и моноклональных антител. Представляется, что такая комбинированная терапия будет более эффективной, чем, если бы применялась только одна химиотерапия. Также наше исследование свидетельствует о том, что повышенная экспрессия гена IGF-1 может являться плохим прогностическим фактором общей выживаемости пациентов, у которых диагностирована множественная миелома. Методология и методы исследования В диссертационной работе были использованы трансгенные линии мышей, клинический материал, полученный от больных множественной миеломой и линии культур клеток. Методы исследования включали: получение первичной культуры клеток эпителия молочной железы мыши, генотипирование, приготовление тотального препарата молочной железы, окраска срезов гематоксилин-эозином, исследование пролиферации клеток эпителия молочной железы с использованием бромдезоксиуридина (BrdU), проточная цитометрия, индукция экспрессии казеинов в первичной культуре молочной железы, выделение белка из ткани молочной железы мыши, вестерн-блоттинг, иммунопреципитация, выделение РНК из клеток костного мозга, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), исследование активности каспаз 3 и 7 в клетках, оценка выживаемости клеток колориметрическим методом (МТТ) и другие. Положения, выносимые на защиту 1. IGF-1R играет важную роль в регуляции дифференцировки молочной железы: регулирует рост и разветвление протоков молочной железы, и регулирует размеры альвеол и экспрессию казеинов - белков молока. 2. IGF-1R - опосредуемый сигнал в молочной железе регулирует соотношение стволовых/базальных клеток и предшественников люминальных клеток, и регулирует пролиферацию клеток эпителия протоков. 21 3. IGF-1/IGF-1R - зависимый сигнальный путь регулирует Wnt1 - опосредуемый канцерогенез молочной железы: ослабление IGF-1R сигнализации в контексте с гиперэкспрессией Wnt1 сокращает время возникновения опухолей молочной железы и увеличивает количество возникающих опухолевых узлов. 4. IGF-1/IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в регуляции механизмов МЛУ при множественной миеломе путем регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ: MDR1/ABCB1, LRP/MVP, MRP1/ABCC1, BCRP/ ABCG2. 5. IGF-1 является фактором, усиливающим выживаемость линий клеток ММ человека. Повышение уровня экспрессии гена у IGF-1 пациентов с множественной миеломой ассоциируется с уменьшением общей выживаемости больных. 6. IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнальный путь участвует в механизмах апоптоза: регулирует экспрессию антиапоптотичеких генов Bcl-2 и HIAP-1; ингибирует активацию эффекторных каспаз 3 и 7. Степень достоверности и апробация результатов В работе использованы уникальные модели in в vivo, которых дифференцировка исследована в разные периоды органогенеза. Для исследований получен доминантно-негативный регулируется в организме мутант мыши IGF-1R, экспрессия транскрипционными которого факторами, функционирующими в зависимости от гормонального статуса. Такой подход обеспечивает адекватность модели задачам исследования. Про-онкогенная роль IGF-1R - опосредуемого сигнального пути была показана на культурах опухолевых клеток и биоптатах нативных опухолей. Диссертационная работа выполнена с применением современных методов, на разнообразных объектах. По результатам исследований опубликованы статьи в отечественных и международных журналах, таких как: Cancer Res (2014 г.); Endocrinology (2011 г.); Investigative Ophthalmology and Visual Science (2008 г.); Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (2010 - 2014 г.г.); Клиническая Онкогематология (2010 - 2014 г.г.); Российский Биотерапевтический Журнал 22 (2010 - 2014 г.г.). Всего по итогам исследования опубликованы 25 печатных научных работ, из них 15 статей в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Также были сделаны доклады на научных конференциях в НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России и в ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского». Диссертация апробирована 21 апреля 2015 г. на совместной научной конференции лабораторий: химического канцерогенеза, генетики опухолевых механизмов гибели клеток, механизмов опухолевых клеток, цитогенетики, молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. 23 Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика системы IGF/инсулин Система IGF/инсулин является на сегодня одной из наиболее важных и широко изучаемых в онкологии. Ее роль в прогрессии злокачественных новообразований является доказанной во многих типах опухолей человека и на различных моделях животных. Система IGF/инсулин (Рисунок 1) включает Рисунок 1 – Схема взаимодействия между IGF-1, IGF-2, инсулина с их рецепторами и IGF-связывающими белками. Взаимодействия, указанные жирными стрелками, имеют наибольшую аффинность, прерывистые стрелки соответствуют слабой аффинности. Адаптировано из: LeRoith D. и Roberts C.T., 2003 инсулин и ростовые факторы IGF-1, IGF-2, шесть типов IGF - связывающих и регулирующих белков (IGFBPs) и их протеаз, а также различные изоформы и комбинации их общих рецепторов: IGF-1R, IGF-1R/IR-A, IGF-1R/IR-B, IR-A, IRB, активация которых опосредует сигналы, играющие различные роли в физиологии клетки, такие как: развитие, рост, дифференцировка, регуляция метаболизма, подвижность, опухолеродность чувствительность к апоптозу, ангиогенез, экспрессия молекул адгезии [222, 310, 469]. 24 Аминокислотные последовательности IGF-1 и IGF-2 гомологичны на 62% [598], а с инсулином - приблизительно на 50% [266]. Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1R) – рецепторная тирозинкиназа, гетеротетрамер, состоящий из двух внеклеточных α-субъединиц, связывающихся с лигандом, и двух внутриклеточных β-субъединиц, содержащих тирозинкиназный домен. IGF-1R и рецептор инсулина (IR), который также является рецепторной тирозинкиназой, имеют 84% гомологию в аминокислотной последовательности их тирозинкиназных доменов [28]. Рецептор инсулиноподобного фактора роста 2-го типа (IGF-2R) не имеет тирозинкиназной активности и, как предполагается, служит для удаления IGF-2 из экстраклеточного окружения, путем связывания его на поверхности клетки [158, 269]. Аффинность связывания IGF-1 с IGF-1R превышает аффинность связывания IGF-2 с IGF-1R от 2-х до 15 раз [255] (Таблица 1). Таблица 1 – Аффинность связывания лигандов системы IGF/инсулин с их рецепторами (IC50 nM). Адаптировано из: Rowzee A.M. et al., 2008 Рецепторы IGF-IR IR-A IR-B Гибридный IGF-1R/IR-A Гибридный IGF-1R/IR-B IGF2R Инсулин IGF-1 IGF-2 Ссылки >30 0.2 0.6 [397] 3.8 0.019 [505] >1 μM 0.5 [55] 0.9 41 [589] 0.2 >30 0.9 [397] 0.3 9 2.2 [55] 1.6 390 0.3 >30 11 [397] 0.5 90 10 [55] 3.7 0.3 0.6 [397] 2.6 0.017 0.18 [505] 70 0.5 0.7 [55] >100 2.5 15 [397] 2.8 0.012 0.19 [505] 76 0.3 0.3 [55] не определяется 0.4 μM 0.2–1.0 [269] [532] [589] 25 Инсулин связывается с IGF-1R от 100 до 1000 раз слабее, чем IGF-I [132]. Однако, учитывая, что количество циркулирующего в крови IGF-1 приблизительно в 100 раз превышает количество инсулина, было показано, что IGF-1 связывается и активирует IR [331]. IGF-2R связывает IGF-2 в 500 раз сильнее, чем IGF-1 и совсем не свявывает инсулин [266]. IGF-1 связывается с одинаковой аффинностью с двумя изоформами рецептора исулина IR-A и IR-B, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга мРНК [167, 590]. Также имеются гибридные рецепторы, гетеродимеры: IGF-1R/IR-A, IGF-1R/IR-B [371]. Сообщается, что в зависимости от присутствия той или иной изоформы рецептора инсулина, указанные гибридные рецепторы индуцируют различные сигналы и имеют разные биологические функции [397]. Вместе с тем, роль и значимость такого перекрестного многообразия взаимодействий указанных ростовых факторов и их рецепторов для клетки остаются недостаточно выясненными и спорными. В литературе обсуждаются вопросы относительно селективности сигналов, поступающих после активации перечисленных рецепторов, и их роли в биологии клетки. Имеются данные о том, что связывание IGF-2 с изоформой IR-A опосредует пролиферативные эффекты, тогда как связывание с изоформой IR-B опосредует метаболические эффекты [167, 307]. Большая часть циркулирующих в кровотоке инсулиноподобных факторов роста продуцируется в печени (Рисунок 2). Ключевым стимулятором производства IGF1 является гормон роста (growth hormone, GH), который вырабатывается в гипофизе под контролем факторов гипаталамуса: гормона выработки гормона роста (growthhormone-releasing hormone, GHRH) и соматостатина (SMS). GH, тем не менее, не оказывает регуляторного воздействия на продукцию IGF-2 и главный регулятор транскипции гена IGF-2 в печени остается не установленным [255, 418]. Инсулиноподобные факторы роста также могут продуцироваться локально в органах, где важны паракринные и аутокриные механизмы действия IGF-1 [418]. Таким образом, IGF-1 и IGF-2 могут оказывать эндокринное, паракринное и аутокриное действие на клетки-мишени в различных органах. Большая часть 26 циркулирующих в кровотоке IGFs находятся в связанном состоянии с IGF связывающими белками (IGFBPs). У млекопитающих существует 6 типов таких белков: IGFBP1 – IGFBP6. Они имеют высокое сродство к IGF-1 и IGF-2 и участвуют в транспортировке инсулиноподобных факторов роста из печени в различные органы и являются их стабилизаторами в ходе траспортировки (Рисунок 2). Рисунок 2 – Продукция инсулиноподобных факторов роста в печени. Адаптировано из: Pollak M.N. et al., 2004 Примерно 90 % циркулирующего в крови IGF-1 связывает IGFBP-3 [391]. IGFBPs участвуют в регуляции взаимодействия IGF-1 и IGF-2 с рецептором IGF1R, то есть являются модуляторами активности инсулиноподобных факторов, действуя, как в качестве их ингибиторов, так и усилителей [469]. Таким образом, IGFBPs играют три основные роли: транспортировка IGFs, защита от деградации, и регуляция взаимодействия IGFs с IGF-1R. Вместе с тем, IGFBPs могут и сами, независимо от их IGF-связывающих функций, участвовать в биологических 27 процессах, например, в адгезии и миграции клеток [105, 255, 264]. Однако, рецепторы, с которыми связываются IGFBPs на поверхности клеток, пока не выявлены [418]. IGFBPs продуцируются, как в печени, так и локально в органах [418]. Регуляция транскрипции генов является IGFBPs сложной и тканеспецифичной. В ней участвует ряд гормонов в том числе: эстрогены, глюкокортикоиды, паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон (FSH), GH, тиреоидные гормоны, инсулин, витамин D, и кортизол [105, 106, 175, 194, 204, 264, 304, 457]. В регуляцию экспрессии IGBPs также вовлечены факторы роста, такие как: FGF, EGF, TGF-β, PDGF и сами IGFs, ретиноевая кислота [83, 176, 194, 346, 390, 614], а также IL-1 и TNFα [394]. Как было сказано выше, большая часть циркулирующих в кровотке IGFs находятся в связанном с IGFBPs состоянии. Переход IGFs из “связанного” в ”свободное” состояние, и последующее взаимодействие с IGF-1R, регулируется протеолизом IGFBPs или фосфорилированием (только в случае с IGFBP1) [98, 105, 255, 264]. В целом, регуляция протеолиза IGFBPs является сложным процессом и пока остается до конца не изученной. Необходимым условием протеолиза IGFBPs или фосфорилирования (в случае с IGFBP1) является связывание IGFBPs c специфическими рецепторами на поверхности клетки или прикрепление к экстроклеточному матриксу, что приводит к ослаблению аффинности их связывания с IGFs [98, 105, 255, 264]. Протеолиз IGFBPs осуществляют различные протеазы, в том числе: простат-специфический антиген (PSA) [102, 105], фактор роста нервов γ [430], катепсин D [68, 97, 343], металлопротеиназы [105, 165, 284, 340], плазмин, тромбин, ассоциированный с беременностью плазматический белок-А [292, 298, 611]. Было показано, что на активность протеаз влияет инсулин [43, 56], GH [503] и эстрогены [285]. Также было показано, что IGFs и сами могут модулировать протеолиз IGFBPs, что предполагает наличие аутокринной регуляторной петли, позволяющей контролировать собственную активность [35]. Таким образом, многокомпонетной система IGF/инсулин является сложной и и еще потребуется достаточно много времени, чтобы 28 окончательно изучить внутрисистемные взаимодействия и регуляцию. Поскольку основными объектами данного исследования являются IGF-1 и его рецептор IGF1R, далее подробно остановимся на их характеристиках. 1.2. Инсулиноподобный фактор роста 1 типа (IGF-1) IGF-1 был открыт Salmon W.D. и Daughaday W.H. в 1957 году и изначально этот фактор был идентифицирован как “фактор сульфатирования” (“sulfation factor”). В экспериментах по изучению роли фактора роста GH было показано, что сыворотка, полученная от нормальных крыс, могла стимулировать in vitro включение радиоактивного сульфата в хрящи крысы, а сыворотка от гипофизэктомированных крыс, не производящих GH, теряла этот эффект. Вместе с тем, добавление только одного GH к хрящам также не стимулировало включение сульфата. Это позволило предположить, что стимулятором включения сульфата является не сам GH, а некий другой фактор, который присутствует в сыворотке и его присутствие зависит от GH [467] Параллельно E.R. Froesch и др. в 1962 году описали растворимый компонет сыворотки, который имел функциональные свойства похожие на свойства инсулина (стимулировал вход глюкозы в изолированные крысиные клетки адипоциты), и в то же время антитела к инсулину не ингибировали этот эффект. То есть этот фактор проявлял не подавляемую инсулиноподобную активность (non-suppressible insulin-like activity, NSILA) [169]. В 1972 году Daughaday и др. обнаружили, что “фактор сульфатирования” и “фактор c не подавляемой инсулиноподобной активностью” были идентичны по молекулярному весу и, более того, оба оказались важнейшими эндокринными посредниками действия соматотропного гормона (СТГ) в ткани, поэтому было предложено назвать эти две молекулы: соматомедин А и соматомедин С [122]. Наконец в 1978 году Rinderknecht E. and Humbel R.E. показали, что обе эти молекулы имеют идентичные аминокислотные последовательности и являются высоко гомологичными с аминокислотными последовательностями проинсулина, и, тогда, этот фактор окончательно был назван инсулиноподобным фактором 1 типа (IGF-1) [442]. Вместе с тем, 29 параллельно с названием IGF-1 сегодня можно встретить и более раннее его название соматомедин А. IGF-1 - это одноцепочечный полипептид с молекулярным весом 7.5 kD. Он состоит из 70 аминокислот, соединенных тремя дисульфидными мостиками. Аминокислотная последовательность IGF-1 человека и IGF-1 различных видов животных имеет чрезвычайно высокую гомологию. Так, например, IGF-1 человека, свиньи, быка и барана являются идентичными, а аминокислотная последовательность IGF-1 человека и крысы, человека и мыши имеют 96% и 94% гомологию соответственно [242]. Таким образом, IGF-1 является высоко консервативным белком. Ген IGF-1 находится на 12 хромосоме и состоит из 6 экзонов и 5 интронов [69, 129] (Рисунок 3). Экзоны 1 и 2 кодируют нетранслируемые альтернативные сигнальные пептиды, экзоны 3 и 4 кодируют зрелые пептидные домены: A, B, C и D, а экзоны 5 и 6 кодируют альтернативный Е пептид [593]. Транскрипция мРНК гена IGF-1 инициируется с двух промоторов – с основного промотора P1, который является активным во всех тканях и регулирует транскрипцию мРНК IGF-1, содержащий экзон 1, и со второго промотора Р2, регулирующего транскрипцию мРНК IGF-1, который содержит экзон 2 и экспрессируется главным образом в печени [27, 216] (Рисунок 3). Рисунок 3 – Схема гена IGF-1. Адаптировано из: McCall G.E. et al., 2003 Промотор Р1 содержит четыре сайта инициации транскрипции, а промотор Р2 содержит два сайта инициации транскрипции. Оба промотора активируются GH, и было продемонстрировано, что GH индуцирует изменения в структуре хроматина во втором интроне с одним HS регионом (HS7), который появляется перед транскрипцией гена IGF-1 [531]. Дальнейшие исследования выявили в 30 регионе HS7 два сайта, связывающих активатор транскрипции Stat5b с высокой и низкой аффинностью. Было показано, что GН индуцирует связывание Stat5b с регионом HS7 непосредственно перед инициацией транскрипции гена IGF-1 с обоих промоторов [453]. Дальнейшие исследования выявили в промоторах гена IGF-1 несколько сайтов для связывания Stat5b [90, 157]. Таким образом, Stat5b идентифицирован как важный инициатор транскрипции гена IGF-1. В литературе описаны две изоформы мРНК IGF-1 (IGF-1A и IGF-1B), которые образуются в результате альтернативного сплайсинга, при этом обе изоформы сохраняют нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерный пептид IGF-1, а С-концевые нуклеотидные последовальности этих двух изоформ кодируют два различных пептида, EA и EB (Рисунок 4). Рисунок 4 – Схема изоформ мРНК IGF-1 (IGF-1A и IGF-1B). Адаптировано из: Barton E.R. et al., 2006 Функциональные значения изоформ мРНК IGF-1A и IGF-1B до конца неизвестны и в настоящее время исследуются. Установлено, что про-IGF-1A пептид выделяется из клетки в межклеточное пространство, а про-IGF-1B пептид является активной внутриклеточной изоформой и обнаруживается в ядре клетки и, по-видимому, имеет регуляторную функцию [564]. Предполагается, что количественное соотношение этих изоформ может являться одним из факторов, определяющих дальнейшую судьбу клетки, т.е. в случае преобладания одной изоформы клетка будет пролиферировать, а другой – дифференцироваться [49]. Уже на начальных стадиях исследования было установлено, что основным 31 местом продукции IGF-1 является печень и на ее долю приходится примерно 75% циркулирующего в кровотоке IGF-1 [170, 391, 502]. Главным модулятором его экспрессии в печени является GH, который продуцируется соматотрофами в гипофизе. Но более поздние исследования показали, что IGF-1 может экспрессироваться и секретироваться в различных органах, где важны паракринные и аутокриные механизмы действия IGF-1 [418] и, что его экспрессия может регулироваться различными гормонами и факторами роста. К таким гормонам и факторам роста относятся: эстрогены, адренокортикотропный гормон, тиреотропный гормон, лютеинизирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон (FSH), и хорионический гонадотропин человека, а также факторы роста, такие как: фактор роста тромбоцитов (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF). Питание также может влиять на уровень циркулирующего в кровотоке IGF-I [123, 471]. В печени GH индуцирует транскрипцию мРНК гена IGF-1 активно и быстро. Основной механизм, индукции транскрипции IGF-1 следующий: GH связывается со своим рецептором на поверхности гепатоцитов, это приводит к активации JAK2 сигнального пути и последующему фосфорилированию Stat5b [447]. С другой стороны, сам IGF-1 ингибирует секрецию GH, действуя на гипофиз через посредство двух механизмов обратной связи, при этом: во-первых, ингибируя экспрессию гена GH [186] и, во-вторых, стимулируя секрецию соматостатина в гипоталамусе [57, 59], который в свою очередь ингибирует производство GH в гипофизе (Рисунок 5). Хотя GH является основным регулятором экспрессии гена IGF-1, на периферии синтез пептида IGF-1, как было сказано выше, также регулируется другими гормонами и факторами роста. Например, в остеобластах, главным регулятором экспрессии IGF-1 является паратиреоидный гормон (PTH), который инициирует синтез IGF-1 через сАМР [193, 351]. Известно, что эстрогены усиливают экспрессию IGF-1 в различных областях головного мозга. Недавние исследования установили, что у мышей в фаллопиевых трубах продукция IGF-1 регулируется через рецептор Е2α [491]. Более того Venken и др. показали, что 32 эстроген может повысить синтез IGF-1 в печени независимо от GH, и это стимулирует рост скелета мыши в период половой зрелости [559]. Также было показано, что в различных областях головного мозга эмбрионов мыши тиреоидные гормоны, такие как Т3 и TSH по-разному влияют на экспрессию гена IGF-1, а именно, Т3 увеличивает, а TSH – значительно уменьшает экспрессию гена IGF-1 [156]. Что касается PDGF и FGF, то выявлено, что оба эти фактора роста усиливают экспрессию IGF-I. Пищевой статус значительно влияет на уровень IGF-I в плазме. Примечательно, что истощение энергии или белковый голод снижают уровень циркулирующего IGF-I. При этом изменение в секреции IGF-I во время голодания не зависит от изменения секреции GH гипофизом, а, скорее всего, это результат уменьшения уровня экспрессии рецептора GH в печени, и, как следствие, ослабление передачи внутриклеточного сигнала. При голодании также наблюдались изменения в фармокинетике IGF-1 и связывающих его IGFBPs [529]. Таким образом, очевидно одно, что регуляция экспрессии гена IGF-1 в организме является многофакторным и сложным процессом. Уровень IGF-1 в плазме меняется в течение жизни. При рождении он низкий, затем медленно поднимается и достигает своего пика непосредственно перед половой зрелостью, и далее снова уменьшается с возрастом [215]. Послеродовые возрастные изменения уровня IGF-1 как в плазме, так и в тканях, главным образом, зависят от возрастных изменений секреции GH и чувствительности к GH [101], а также от изменения других гормонов, в том числе и стероидных. У эмбриона мыши уровень IGF-1 в сыворотке довольно низкий и поднимается лишь в конце третьего триместра, и его концентрация не зависит от GH гипофиза, а ассоциируется с GH, продуцирующимся в плаценте [487]. IGF-1 играет важную роль в росте и развитии эмбриона [26, 103, 123] (Рисунок 5). Его экспрессия значительно варьирует среди различных органов. Например, в печени, почках и сердце эмбриона IGF-1 экспрессируется очень слабо и возрастает только после рождения. И наоборот, его экспрессия в легких, мышцах и желудке у эмбриона выше, чем после рождения [26]. Было показано, что мутация в гене IGF-1, в 33 результате чего этот белок теряет свою активность, приводит к значительному уменьшению размера и веса новорожденных мышат. Такой же эффект наблюдается в том случае, если в результате мутации инактивируется IGF-1R [25, 42, 324, 332, 582, 619]. Эти данные говорят о том, что IGF-1/IGF-1R - зависимый сигнальный путь в клетке является важным регулятором внутриутробного роста эмбриона. Интересным является тот факт, что в эмбриогенезе GH не является фактором, регулирующим экспрессию IGF-1 [474, 475, 578, 615]. IGF-1 является важным регулятором развития центральной нервной системы (Рисунок 5). Рисунок 5 – Роль IGF-1 в развитии и функционировании различных органов. Адаптировано из: Puche J. E. и Castilla-Cortázar I., 2012 34 Он играет нейропротекторную роль – является главным фактором, регулирующим восстановление митохондриальной дисфункции при старении за счет увеличения потенциала митохондриальной мембраны, уменьшая потребление кислорода и увеличивая синтез ATP. В свою очередь это минимизирует выход цитохрома С из митохондрий в цитоплазму и, следовательно, содействует выживаемости нейронов, уменьшая апопотоз, индуцированный каспазой-9 и другими каспазами. IGF-1 участвует в регуляции миелинизации нервных волокон [178, 421]. IGF-1 может промотировать пролиферацию и/или выживаемость олигодендроцитов и их предшественников, он также вовлечен в модулирование проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [327]. Также IGF-1 играет важную роль на различных стадиях развития фолликул: на первой стадии IGF-1 инициирует рост примордиальных фолликул, на второй стадии - индуцирует экспрессию рецептора фолликулостимулирующего гормона (FSH-R) в гранулезных клетках, важного гормона для дифференцировки, а также усиливает жизнеспособность клеток внешней оболочки фолликулы [136, 609, 610, 612]. В антральной стадии развития фолликул IGF-1 усиливает чувствительность к гонадотропину, активирует созревание яйцеклетки, а также индуцирует экспрессию рецептора лютеинизиирующего гормона (LH-R) в гранулезных клетках и в клетках наружной оболочки фолликулы [192, 337, 368, 539, 600]. Имеются данные, свидетельствующие в пользу того, что IGF-1 участвует в регуляции развития почек и их нормальном функционировании [40, 427]. Было показано, что IGF-1 необходим для поддержания целостности почечных клубочков, в частности для защиты от разрушения подоцитов и базальной мембраны клубочков. Введение IGF-1 крысам приводит к увеличению почечного кровотока и скорости клубочковой фильтрации, что свидетельствует об его участии в регуляции функции почек [40, 233, 345]. IGF-1 участвует в регуляции функции яичек. Известно, что функция яичек контролируется главным образом гонадотропинами: лютеинизирующим гормоном LH и фолликулостимулирующим гормоном FSH [454]. В клетках 35 Сертоли и Лейдига было показано, что LH и FSH активируют экспрессию IGF-1 [72, 378]. IGF-1 в свою очередь активирует рецептор IGF-1R на поверхности этих клеток, и такая аутокринная регуляция необходима для дифференцировки и поддержания нормальной функции этих клеток [466]. Роль IGF-1 в развитии и функции клеток Лейдига также была исследована в эксперименте с IGF-1 нокаутированными мышами. У этих мышей клетки Лейдига оказались значительно меньше в размере, чем в норме, и это коррелировало с уменьшением уровня тестостерона в плазме [41]. Как было сказано выше, печень является главным источником циркулирующего в кровотоке IGF-1, который оказывает эндокринное действие на отдаленные органы. Вместе с тем IGF-1, продуцированный в печени, оказывает и локальное действие на саму печень, регулируя рост печени в период после рождения и ее регенерацию при повреждении [502, 588]. Он стимулирует синтез ДНК и усиливает пролиферацию гепатоцитов [138, 405]. Также показано, что IGF-1 стимулирует продукцию фактора роста гепатоцитов (HGF) в звездчатых клетках печени [504]. Показано, что IGF-1 участвует в регуляции сердечно сосудистой системы и ее защите. Установлено, что IGF-1 и его рецептор экспрессируются в миокарде, в клетках гладкой мышцы аорты, а также в клетках эндотелия [118, 134, 207, 572]. Исследования показали, что IGF-I является мощным сосудорасширяющим фактором [408] и, что этот эффект может быть частично опосредован высвобождением NO из эндотелия [108, 562]. Недостаточный уровень экспрессии IGF-I является причиной возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, таких как: атеросклероз и рестеноз [135]. Известно, что IGF-1 играет важную роль в развитии и функционировании тимуса, участвует в регуляции процесса кроветворения и восстановления иммунной системы [128, 373, 374, 538]. Показано, что IGF-1 участвует в развитии и функции Т-лимфоцитов. В частности, он увеличивает число CD4 + CD8 + незрелых Т-клеток в тимусе и селезенке у крыс [232], способствует выживанию Тклеток [563], пролиферации, хемотаксису и созреванию, а также блокирует 36 спонтанную и индуцированную запрограммированную гибель Т-клеток [541, 563]. Также IGF-1 участвует в регуляции дифференцировки В-клеток, усиливает IL-7 зависимую пролиферацию В-клеток [187], увеличивает популяцию зрелых Вклеток в селезенке [96, 252] и влияет на экспрессию антител плазматическими клетками [444]. Дефицит IGF-1, его рецептора IGF-1R и/или нарушение IGF1/IGF-1R зависимой передачи сигнала могут являться причиной возникновения ряда заболеваний. Например, синдрома Ларона (LS) [293, 294, 475], цирроза печени [85]. Падение уровня циркулирующего в кровотоке IGF-1 ассоциируется с возникновением ишемической болезни сердца [296, 511]. Резкое снижение IGF-1 при старении может быть причиной различных цереброваскулярных заболеваний таких как: болезнь Альцгеймера (AD) [79, 181, 535], сосудистая деменция (VD) [79, 181, 535], амиотрофический латеральный склероз (ALS) [64, 291]. Таким образом, из сказанного выше следует, что IGF-1 является фактором, который играет исключительно важную роль, как в нормальном развитии и функционировании различных органов, так и при развитии некоторых типов патологий. Роль IGF-1 и его рецептора в дифференцировке молочной железы, а также роль в опухолевой прогрессии будут рассмотрены более подробно в следующих разделах этой главы. ` 1.3. Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1R) 1.3.1. Регуляция экспрессии гена IGF-1R IGF-1 оказывает свой биологический эффект через связывание и активацию его рецептора IGF-1R. Экспрессия гена IGF-1R главным образом регулируется на уровне транскрипции (Рисунок 6) [569]. Промоторная область гена IGF-1R содержит GC-богатый участок и не имеет канонических ТАТА и СААТ мотивов, двух регуляторных элементов, которые необходимы для эффективной инициации транскрипции большинства генов у эукариот [107, 245, 567]. Транскрипция гена IGF-1R начинается с “инициатора” (INR), последовательности из 17 пар 37 оснований, которая служит местом узнавания TBP (ТАТА-связывающего белка) и последующей сборки инициирующего комплекса [472, 507, 569] (Рисунок 6). Рисунок 6 – Схема позитивной регуляция экспрессии гена IGF-1R. Адаптировано из: Werner H., 2012 Ключевым трансактиватором гена IGF-1R является ядерный белок SP1, который обычно стимулирует транскрипцию с РНК-полимераза II – зависимых промоторов. Sp1 принадлежит к семейству транскрипционных факторов Sp/KLF (specificity protein/krüppel-like factor). Этот белок имеет структурный мотив “цинковый палец”, позволяющий напрямую связываться с ДНК и усиливать уровень транскрипции генов. Sp1 чрезвычайно широко экспрессирован в организме и регулирует множество генов. Специфическими сайтами связывания для SP1 являются GC-последовательности в проксимальном регионе промотора гена IGF-1R. Кроме SP1 трансактиваторами гена IGF-1R являются также KLF6 и E2F1 [463, 477]. Негативная регуляция транскрипции гена IGF-1R осуществляется опухолевыми супрессорами (антионкогенами) такими, как: p53, BRCA1, VHL и WT1 [23, 245, 300, 375, 568, 570, 601] (Рисунок 7). Хотя точный механизм ингибирования транскрипции гена IGF-1R перечисленными супрессорами пока не выявлен, однако, на основании предварительных исследований было предположено, что p53, BRCA1 и VHL взаимодействуют с TBP, и тем самым 38 предотвращают связывание этого белка с INR и последующее образование функционального инициирующего комплекса. Другой механизм действия этих супрессоров предполагает белок-белковое взаимодействие с трансактиватором Sp1, в результате которого Sp1 теряет свою способность трансактивировать транскрипцию гена IGF-1R (Рисунок 7). Рисунок 7 – Схема негативной регуляции экспрессии гена IGF-1R. Адаптировано из: Werner H., 2012 Механизм ингибирования экспрессии гена IGF-1R с участием WT1 отличается от p53, BRCA1 и VHL – зависимых механизмов ингибирования. WT1 обладает способностью напрямую связываться со специфическими для WT1 респонсивными элементами в проксимальной части промотора IGF-1R и, тем самым, супрессировать экспрессию IGF-1R. В случае, если перечисленные опухолевые супрессоры несут мутацию, то они теряют способность ингибировать экспрессию гена IGF-1R. В то время как некоторые опухолевые супрессоры негативно регулируют экспрессию гена IGF-1R, было показано, что некоторые онкогены, наоборот, позитивно регулируют экспрессию гена IGF-1R и/или усиливают активность IGF-1R рецептора за счет его фосфорилирования. Так, например, pp60src, белок, кодируемый геном src, стимулирует фосфорилирование 39 тирозинов в тирозин киназном домене IGF-1R [409]. Другой онкоген c-myb трансактивирует траскрипцию гена IGF-1R [436, 536]. Также показано, что Х белок вируса гипатита В может трансактивировать транскрипцию гена IGF-1R [272]. Из сказанного выше напрашивается предположение о том, что для злокачественной трансформации клетки, как для клеточных, так и для вирусных онкогенов, независимо от их конкретного механизма действия, необходим активированный IGF-1R –зависимый сигнальный путь. Наряду с классическими опухолевыми супрессорами и онкогенами экспрессию гена IGF-1R также могут регулировать микро РНК (miRs) [236]. Микро РНК – это маленькие некодирующие РНК, которые контролируют экспрессию гена/генов на посттранскрипционном уровне [603]. Относительно недавно было показано, что мРНК гена IGF-1R является потенциальной мишенью для miR-7 и ее гиперэкспрессия в клетках плоскоклеточной карциномы языка приводит к значительному уменьшению экспрессии IGF-1R как на уровне мРНК, так и белка [253]. Также в регуляции экспрессии мРНК IGF-1R может участвовать IGF-1. Например, в экспериментах in vitro в мышечных клетках мыши C2C12 и в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y было показано, что IGF-1 негативно регулирует экспрессию мРНК IGF-1R на уровне транскрипции и не влияет на стабильность мРНК IGF-1R. Вместе с тем, IGF-1 респонсивные элементы в промоторной области гена IGF-1R не выявлены. Кроме того, было показано, что в регуляцию экспрессии IGF-1R вовлечены стероидные гормоны (например, эстрогены и андрогены), а также факторы роста (например, FGF и PDGF), которые повышают уровень экспрессии IGF-1R [227, 341, 398]. Таким образом, экспрессии гена IGF-1R определяется балансом между позитивными и негативными регуляторами транскрипции. 1.3.2. Сигнальная трансдукция, опосредуемая IGF-1R IGF-1R является рецепторной тирозинкиназой, гетеротетрамером, состоящим из двух внеклеточных α-субъединиц (130-135 kDa), связывающихся с одной молекулой лиганда IGF-1, и двух внутриклеточных β-субъединиц (90- 40 95kDa). Эти субъединицы связываются несколькими α-α и α-β дисульфидными мостиками и образуют тетрамер [180, 348, 550] (Рисунок 8). Рисунок 8 – Схема образования гетеродимеров IGF-1R/IR-A и IGF-1R/IR-B, и гомодимера IGF-1R/IGF-1R. Адаптировано из:Brahmkhatri V.P. et al., 2014 Внутриклеточная β-субъединица IGF-1R состоит из трех доменов: околомембранного домена, тирозинкиназного домена и С-концевого домена. В околомембранном домене важным является тирозин в положении 950, который служит сайтом связывания для фосфорилированных субстратов [71], которые передают сигнал от IGF-1R внутрь клетки посредством активирования целого ряда нижележащих эффекторов. В тирозинкиназном домене важным является кластер из трех тирозинов в положениях 1131; 1135 и 1136, которые необходимы для аутофосфорилирования аутофосфорилирования IGF-1R является [469]. присутствие Также в необходимым тирозинкиназном для домене каталитического региона, содержащего ATP-связывающий мотив (Gly-XXX-GlyXXX-XXX-Gly) в позиции 976-981 и каталитический Lys в положении 1003, который является сайтом связывания ATP [469]. IGF-1R и рецептор инсулина (IR), который также является рецепторной тирозинкиназой, имеют 84% гомологию в аминокислотной последовательности их тирозинкиназных доменов [28]. IGF-1 может связываться и активировать изоформу А рецептора инсулина (IR-A) [465], а также гибридный рецептор IGF-1R/IR-A [505, 510]. 41 В С-концевом домене имеются тирозины в положениях 1250; 1251 и 1316, а также серины в положениях 1280–1283, которые фосфорилируются [469], но их значимость в регуляции активности IGF-1R ни в нормальных, ни в злокачественных клетках до конца не изучена и иследования в этом направлении в настоящее время продолжаются. После связывания с лигандом индуцируется конформационное изменение в трансмембранной части рецептора и активируется внутренняя тирозин киназа IGF-1R и это, в свою очередь, приводит к трансаутофосфорилированию тирозинов внутриклеточной β-субъединицы. Фосфорилированный тирозин в положении 950, как было сказано выше, служит сайтом связывания для различных субстратов, включающих IRS(1-4), Shc, JAK-1, Jak-2 [71, 468]. Эти субстраты инициируют каскад фосфорилирований, служащих для передачи сигнала от IGF-1R (Рисунок 9). Например, фосфорилированный IRS1 активирует p85 субъединицу PI-3K. Это приводит к активации различных нижележащих субстратов, включая киназу p70S6 и протеин киназу В (Akt) [190]. Фосфорилирование Akt, в свою очередь, усиливает синтез белка через активацию mTOR и запускает антиапоптотическое действие IGF-1R через фосфорилирование и инактивацию Bad [410]. Параллельно с Akt – зависимым сигнальным путем в клетке, фосфорилированный IRS-1 или Shc активируют Raf-1/MEK/ERK сигнальный путь через активацию Grb2/SOS и Ras, что, в конечном счете, приводит к активации нижележащих ядерных факторов и индукции пролиферации клеток [201, 226]. В некоторых типах клеток IGF-1R может напрямую фосфорилировать JAK-1 и JAK-2, которые вовлечены в цитокин опосредуемый сигналинг. JAK белки, в свою очередь, могут фосфорилировать IRS-1 [203]. Фосфорилирование фофорилированию/активированию JAK белков белков впоследствии сигнальных приводит трансдукторов к и активаторов транскрипции (STAT). Фосфорилирование STAT-3, в частности, является важной для трансформирующей активности IGF-1R [616, 617]. Другими эффекторами, лежащими ниже IGF-1R, являются Src [484], киназа фокальной адгезии pp125, которая напрямую фофорилируется IGF-1R [48], протоонкогены сCrkII и CrkL [52, 281], которые связывают IGF-1R c интегринами и цитоскелетом 42 через p130Cas и паксиллин. Этот сигнальный путь важен для регуляции формы и подвижности клеток [48, 80] (Рисунок 9). Рисунок 9 – Схема IGF-1R –зависимой сигнальной трансдукции. Адаптировано из: Samani A.A., 2007 Также показано, что в ответ на активацию IGF-1/IGF-1R - сигнального пути увеличивается уровень внутриклеточного кальция, поэтому предполагается, что в этот сигнальный путь косвенно вовлечена фосфолипаза С-γ через его продукты инозитол 1,4,5-трифосфат и 1,2 диацилглицерол [86, 99, 460]. В клетках рака молочной железы MCF-7 активация IGF-1R индуцирует активацию MAPKp38 и сJun N-терминальной киназы JNK [268, 369]. JNK, в свою очередь, опосредует 43 фосфорилирование IRS-1 по серину, и тем самым, ослабляет IGF-1R - зависимую сигнализацию [339]. Таким образом, этот случай является примером обратной регуляции активности IGF-1R. Важность для жизни клеток перечисленных выше путей сигнальной трансдукции, зависимых от IGF-1R, и участие в них эффекторов, находится пока в стадии предположений и требует дополнительных уточнений. IGF-IR участвует в регуляции клеточного цикла (Рисунок 10). Рисунок 10 – Схема IGF-1R – зависимой регуляции клеточного цикла. Адаптировано из: Samani A.A., 2007 В частности он участвует в регуляции перехода G0-G1, через активацию p70 S6K, которая фосфорилирует рибосомный белок S6, что приводит к увеличению 44 рибосомного пула, необходимого для входа в клеточный цикл [153]. Также IGFIR промотирует переход G1-S, активируя экспрессию генов циклина D1 и CDK4. Это приводит к фосфорилированию белка ретинобластомы pRB и освобождению транскрипционного фактор E2F и синтезу циклина Е [152, 448]. Синтез циклина D1, индуцированный IGF-1R, регулируется через следующие альтернативные механизмамы: через ERK - зависимую регуляцию транкрипции мРНК циклина D1 [297], через PI3-K/Akt - зависимое увеличение стабильности мРНК циклина D1 [217] (Рисунок 10). PI3-K/Akt сигнальный путь может также регулировать увеличение уровня циклина D1 через mTOR – опосредуемую трансляцию белка опосредованное фосфорилирование или через ингибирование GSK-3β - циклина D1 (так как фосфорилирование циклина D1 по треонину в положении 286 у карбоксильного конца позитивно регулирует протеасомную деградацию циклина D1 [143, 217, 372]. IGF-1R негативно регулирует транскрипцию ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKI) p27KIP1 и/или изменяет его процессинг и ядерную локализацию через PI3-K/Akt и PTEN –зависимые механизмы [100]. IGF-IR также участвует в регуляции перехода G2-M через увеличение синтеза циклинов А и В, а также циклин-зависимой киназы Сdc2 [174]. Из сказанного выше следует, что IGF-IR принимает участие в позитивной регуляции различных фаз клеточного цикла, но наиболее важную роль он играет в регуляции перехода G1-S, и это опосредуется через активацию двух сигнальных путей: IGF-IR/PI3-K/Akt и IGF-IR/ERK. В заключение следует подчеркнуть, что прогрессия клеточного цикла и пролиферация клеток регулируются сложной сетью, как внутренних факторов, так и внешних сигналов, опосредуемых факторами роста. Факторы роста подразделяются на две подгруппы, а именно: факторы “компетентности” такие, как PDGF и FGF, которые позволяют клеткам войти в G1 фазу клеточного цикла, и факторы "прогрессии", которые необходимы для регуляции перехода G1-S и, в конечном счете, деления клеток [113, 401]. IGF-1, будучи фактором “прогрессии”, необходим для прогрессии клеточного цикла, однако его действие вступает в силу 45 только после того, как на клетку уже окажут свое воздействие факторы “компетентности” и клетки войдут в G1 фазу [113, 401]. 1.4. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в канцерогенезе 1.4.1. Эпидемиологические исследования взаимосвязи между экспрессией IGF-1 и IGF-1R и злокачественной трансформацией Первое сообщение о взаимосвязи между IGF-1 и злокачественной трансформацией появилось в 1998 году (т.е. 16 лет назад). Первыми авторами этого сообщения были: Hankinson, S.E. и др., и Chan, J.M. и др., которые показали, что существует связь между уровнем IGF-1 в сыворотке крови людей и риском возникновения рака молочной железы и простаты [84, 220]. Эта информация имела огромное влияние на последующие события, связанные с началом изучения роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в канцерогенезе многими группами ученых. В результате дальнейших эпидемиологических исследований было установлено, что повышение концентрации IGF-1 в сыворотке, и/или понижение уровня IGFBPs (что приводит к увеличению свободного IGF-1 в сыворотке) ассоциируется с повышением риска возникновения различных опухолей в том числе: карциномы молочной железы в период пременапаузы [31, 533], карциномы простаты [517], рака легких [599] карциномы толстой кишки [333, 396, 419], рака эндометрия [411] и рака мочевого пузыря [608]. Кроме того, с высоким уровнем циркулирующего IGF-1 ассоциируются частые случаи возникновения предраковых аденом толстой кишки [191] и предопухолевых поражений плоскоклеточного эпителия шейки матки [584], что наводит на мысль о том, что IGF-1 может играть важную роль на ранних стадиях злокачественной трансформации. Эти данные легли в основу представления об эндокринном воздействии IGF-1 на развитие опухоли. Среди ранних работ наиболее интересным является работа Laron и его сотрудников, которые в 2004 году проанализировали взаимосвязь между эндокринным IGF-1 и риском возникновения опухолей у людей, страдающих синдромом Ларона (LS). LS – это 46 наследственное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования разновидность карликовости (низкорослости), причиной которого является мутация в гене рецептора GH [293]. Характерной особенностью этого синдрома является нечувствительность к GH и, как следствие, у таких больных возникает врожденный дефицит IGF-1 (такой, что IGF-1 не определяется в сыворотке). В результате опроса 230 больных с синдромом Ларона было выявлено, что ни у одного из них в течение жизни (по крайней мере, до 85 лет) не развивались злокачественные опухоли [521]. В другой работе в течение 22 лет наблюдали за 99 пациентами из Эквадора, у которых была мутация в гене рецептора GH и, которым также был характерен дефицит IGF-1. Среди таких пациентов злокачественная опухоль возникла только в одном случае (1%), тогда как в контрольной группе за это время были обнаружены опухоли у 17% людей [206]. Таким образом, перечисленные выше работы являются яркими и убедительными эпидемиологическими наблюдениями за связью между уровнем циркулирующего IGF-1 и риском возникновения опухолей. В литературе имеются и другие работы, представляющие аналогичные наблюдения, однако о них мы поговорим позже. Наряду с определением уровеня IGF-1 в сыворотке, также были проведены исследования экспрессии IGF-1 в ряде злокачественных опухолей. Увеличения уровня экспрессии IGF-I были зарегистрированы в различных злокачественных опухолях, включая: медуллобластомы глиобластомы, [221], нейробластомы, аденокарциномы молочной менингиомы железы [583], [406, 407], карциномы толстой кишки, карциномы поджелудочной железы и рак яичников [469]. 1.4.2. Молекулярно-генетические исследования взаимосвязи между экспрессией IGF-1 и IGF-1R и злокачественной трансформацией Исследования, проведенные на лабораторных мышах, показали, что повышение экспрессии IGF-1 может привести к инициации злокачественных новообразований. Например, у трансгенных мышей гиперэкспрессия гена IGF-1 человека в базальных клетках эпителия простаты приводила к гиперэкспрессии 47 IGF-1R в этих же клетках, и у таких трансгенных мышей развивалась ранняя стадия рака простаты [144]. Гиперэкспрессия IGF-I в эпидермальных клетках трансгенных мышей повышала их чувствительность к индукции опухоли опухолевым промотором 12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетатом [573]. Также было показано, что у трансгенных мышей гиперэкспрессия IGF-1 человека под промотором кератина-5 индуцировала гиперплазию эпидермиса и, в конечном счете, приводила к формированию рака кожи [574]. IGF-1 оказывает свой биологический эффект через связывание и активацию его рецептора IGF-1R. Одним из важных открытий является то, что мышиные эмбриональные клетки с нокаутированным геном IGF-1R -\- (эта мутация приводит к летальному исходу) не подвергаются опухолевой трансформации при их трансфекции плазмидами, экспрессирующими различные онкогены, например, такими как: большой Т антиген SV40 [485, 486]. Таким образом, эти ранние исследования согласуются с представлением о том, что экспрессия и/или активация IGF-1R являются фундаментальными предпосылками для развития злокачественной опухоли. На основании клинических и экспериментальных исследований, проводимых с конца 90-х годов, были получены доказательства того факта, что для некоторых опухолей действительно характерно увеличение экспрессии IGF1R. Например, в работе Hakam и сотр. методом иммуногистохимического анализа на парафиновых срезах с использованием антител была исследована экспрессия белка IGF-1R на различных стадиях развития карциномы толстой кишки человека, а именно: в нормальной слизистой оболочке толстой кишки, далее в аденоме ободочной кишки, затем в первичной аденокарциноме и в метастазах. В результате исследования было выявлено, что в нормальной слизистой оболочке IGF-1R не выявлялся совсем, в аденомах его экспрессия была низкой, а в аденокарциномах и в метастазах экспрессия IGF-1R была высокой [214]. В другой работе Brady и сотр. с использованием метода полуколичественной ОТ-ПЦР, вестерн иммуноблотинга и иммуногистохимического анализа сравнили экспрессию IGF-1R в линиях клеток плоскоклеточного рака полости рта и в линии 48 нормальных клеток эпителия полости рта, а также в ткани плоскоклеточной карциномы и нормальной ткани полости рта. Оказалось, что, и мРНК, и белок IGF-1R в линиях клеток плоскоклеточного рака и в ткани плоскоклеточной карциномы полости рта экспрессировались сильнее, чем в нормальных клетках и в нормальной ткани полости рта [67]. Значительное повышение экспрессия IGF1R на уровне мРНК и белка наблюдается в первичном раке простаты по сравнению с его экспрессией в эпителии доброкачественной опухоли простаты [224]. Также в работе Kanter-Lewensohn иммуногистохимического анализа, и L было сотр. показано, c использованием что переход от доброкачественной родинки к злокачественной меланоме сопровождается увеличением экспрессии IGF-1R [259]. Исследования механизмов, лежащих в основе развития гепатоцеллюлярной карциномы, показали, что увеличение экспрессии IGF-1R является одним из ранних событий в развитии этого заболевания [29]. В качестве примера можно привести и другие работы, в которых показано, что увеличение экспрессии IGF-1R ассоциируется со злокачественной трансформацией клеток [295, 363, 387, 566]. Исследования, подтвердили, что проведенные IGF-1R на может лабораторных играть важную животных, роль в также инициации злокачественных новообразований. Например, в одном из экспериментов, были получены мыши, которые экспрессировали химерный белок CD8α-IGF-IR под MMTV промотором. Экстраклеточная часть этого белка CD8α могла димеризоваться за счет формирования дисульфидных мостиков, в результате чего конститутивно, независимо от связывания с лигандом, активировалась внутриклеточная часть IGF-1R. В ходе наблюдения было выявлено, что у таких мышей уже через 6 недель после рождения развиваются аденокарциномы слюнных и молочных желез [76]. Интересным является тот факт, что мутации в гене IGF-1R являются крайне редким событием, и более того, они, как правило, не ассоциируются с неоплазией, а скорее всего, приводят к задержке роста животного [275, 276, 283, 561]. 49 Таким образом, приведенные выше примеры позволяют предположить, что избыточная экспрессия IGF-1R является общей чертой многих опухолей и, что повышение экспрессии IGF-1R связано со злокачественной трансформацией. Однако для некоторых видов злокачественных опухолей человека клиническая и прогностическая значимость повышения экспрессии IGF-1R остается не ясной. К таким опухолям относятся рак простаты и рак молочной железы (РМЖ). Например, при исследовании экспрессии IGF-IR в 23 парах образцов доброкачественной и злокачественной опухоли простаты никакой корреляции в пользу повышения экспрессии IGF-IR в злокачественных опухолях по сравнению с доброкачественными не проанализирована экспрессия доброкачественной опухоли выявлено мРНК простаты, [164]. В IGF-1R в другой в образцах работе образцах была эпителия внутриэпителиальной неоплазии высокой степени (high-grade prostate intraepithelial neoplasia, PIN) и образцах аденокарциномы простаты. При сравнении экспрессии IGF-1R оказалось, что она обратно коррелирует со злокачественной прогрессией, а именно: IGF-1R наиболее высоко экспрессировался в ткани доброкачественной опухоли, при неоплазии ее экспрессия снизилась на 42%, а при аденокарциноме на 35% [528]. Еще в одной работе была исследована экспрессии IGF-1R в ходе прогрессии от доброкачественной опухоли и до стадии метастазирования, и в этом ряду также наблюдалось заметное снижение уровня IGF-1R [417]. Тем не менее, эти данные были оспорены результатами, полученными в ходе другого исследования, которое продемонстрировало значительное повышение экспрессии, и мРНК, и белка IGF-1R в первичном раке простаты и в метастазах, по сравнению с экспрессией в эпителии доброкачественной опухоли простаты [224]. Что касается молочной железы, то хочется особо подчеркнуть, что работ, посвященных исследованию роли IGF-1R при раке молочной железы, в литературе накопилось достаточно много. Полученные данные, как и в случае с раком простаты, являются противоречивыми и спорными. Так, например, в работе, проведенной японскими учеными с использованием метода иммуногистохимической окраски парафиновых срезов ткани первичного РМЖ, 50 полученных от 210 больных, было показано, что IGF-1R гиперэкспрессировался в 43.8% случаев опухолей. Такая гиперэкспрессия не коррелировала ни с прогнозом течения заболевания, ни с клинико-патологическими параметрами РМЖ такими, как: возраст, размер опухоли, узловой статус (узловые формы, диффузные формы, атипические формы), гистологический класс (инфильтрирующая карцинома, неинфильтрирующая карцинома, особые гистологические варианты), статус гормональных рецепторов (экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона), статус эпидермального фактора роста 2 типа (EGF2) [495]. В других работах, проделанных французскими учеными, экспрессия IGF-1R идентифицирована как убедительный прогностический фактор при РМЖ. Например, в одной работе из 35 образцов доброкачественной опухоли молочной железы в 43% случаев была обнаружена экспрессия IGF-1R, в то время как в нормальной ткани экспрессия IGF-1R не определялась [414]. В другой работе этих же исследователей было показано, что из 76 случаев РМЖ человека почти все опухоли молочной железы (в 93% случаях) экспрессируют IGF-1R [413]. Эти данные предполагают, что повышение экспрессии IGF-1R может быть маркером развития РМЖ [414]. В своих последующих работах эти же авторы заключают, что экспрессия IGF-1R может иметь прогностичекое значение для РМЖ [63, 251]. В работе Railo и сотр. было исследовано 126 образцов, полученных от больных РМЖ, и установлено, что 49 пациентов (39%) из них были IGF-IR-положительными. Экспрессия IGF-1R коррелировала с экспрессией рецептора эстрогена (ER) и не коррелировала с экспрессией рецептора прогестерона (PR). Также не обнаруживалась корреляция между экспрессией IGF-1R и узловым статусом опухоли. И в заключении, это исследование показало, что ER отрицательные, но IGF-1R позитивные пациенты имели худший прогноз, чем ER и IGF-1R отрицательные [429]. Еще в одной работе японских ученых c использованием иммуногистохимического анализа были исследованы 150 образцов первичного рака молочной железы и в 71 образце (47% случаев) была обнаружена гиперэкспрессия IGF-1R, которая коррелировала с экспрессией рецепторов ER и/или PR [549]. В своей работе Kim и сотр., используя метод иммуногистохимического анализа, проанализировали 51 экспрессию IGF-1R в 460 случаях первичного инвазивного РМЖ и сопоставили с выживаемостью онкобольных. Оказалось, что экспрессия IGF-1R в первичном раке молочной железы является независимым благоприятным прогностическим фактором выживаемости больных. Также это исследование показало, что экспрессия IGF-1R позитивно коррелирует с экспрессией ER, PR и Bcl-2 [270]. В другой работе была исследована экспрессия IGF-1R у 2871 женщин с РМЖ I-III стадий. В результате исследования было выявлено, что высокий уровень экспрессии IGF-1R в ткани опухоли характерен примерно половине женщин. Для IGF-1R положительных больных была характерна более высокая выживаемость. Также было установлено, что среди пациентов с ранними стадиями РМЖ высокая экспрессия IGF-1R коррелирует с повышенной экспрессией благоприятных прогностических маркеров Bcl-2 и p27, а также с присутствием ER и отсутствием HER2 [596]. Таким образом, достаточно много работ, посвященных исследованию роли IGF-1 и IGF-1R при раке молочной железы и данные, полученные в ходе этих работ, в ряде случаев являются противоречивыми. Особо хочется подчеркнуть, что в литературе имеется работа, в которой выявлена связь между уровнем экспрессии IGF-1R, степенью дифференцировки РМЖ и опухолевой прогрессией. Эта работа Schnarr и сотр., [479] в которой, с использованием метода иммуногистохимической окраски парафиновых срезов и вестерн блотинга, была исследована экспрессия IGF-1R в 69 образцах ткани первичного РМЖ, из них: в 56 образцах протокового происхождения, в 7 образцах долькового происхождения и в 6 образцах смешанного (протоково-долькового) происхождения. В качестве контроля исследовали экспрессию IGF-1R в нормальной ткани молочной железы. Среди перечисленных карцином молочной железы были 3 высокодифференцированные (I-СЗ), 37 умереннодифференцированные (II-СЗ) и 29 низкодифференцированные (III-СЗ). (Кратко напомню, что данная система градации по степеням злокачественности (СЗ) опирается на степень структурного и клеточного атипизма, а также на выраженность пролиферативных процессов, определяемую по числу фигур митоза в 10 полях зрения при увеличении х40. Выделены: I-СЗ 52 (высокодифференцированные РМЖ), при которой 5- и 10-летняя выживаемость составляет 75% и 45% соответственно. II-СЗ (умереннодифференцированные РМЖ), для нее характерна 53% и 27% выживаемость. III-СЗ (низкодифференцированные РМЖ) с выживаемостью в 31% и 18%. Таким образом, СЗ более четко связана с прогностическими аспектами РМЖ, чем гистологическая форма. Особенно это касается группы больных с опухолями небольших размеров без метастазов в лимфатических узлах [3]). В результате проведенных исследований Schnarr и сотр. показали, что IGF-1R экспрессируется на высоком уровне в нормальной ткани молочной железы и в высоко или умеренно дифференцированной карциноме молочной железы, тогда как в низкодифференцированной карциноме протокового и долькового происхождения уровень экспрессии IGF-1R чрезвычайно низкий. Также было показано, что уменьшение экспрессии IGF-1R в низкодифференцированной карциноме молочной железы корреллирует с усилением пролиферации опухолевых клеток и потерей экспрессии рецептора эстрогена (ER). Таким образом, наблюдается корреляция между уменьшением уровня экспрессии IGF-1R, ухудшением дифференцировки и злокачественной прогрессией [479]. Причина слабой экспрессии IGF-1R в низко дифференцированной карциноме молочной железы остается не ясной. Вместе с тем известно, что для большинства типов новообразований характерно нарушение клеточной дифференцировки. В некоторых случаях, менее дифференцированные опухолевые клетки, потерявшие способность синтезировать белки дифференцировочного репертуара, становятся более агрессивными. И то, что обнаруживается слабая экспрессия IGF-1R в низко дифференцированной карциноме молочной железы, может говорить об участии IGF-1R в дифференцировке молочной железы. Действительно, в данной диссертационной работе это будет впервые доказано. Проведенные нами исследования на мышиной модели впервые показали, что ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигналинга приводит к ухудшению дифференцировки молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши (ингибируется третичное разветвление и рост протоков молочной железы, уменьшается 53 количество альвеолярных почек), а также нарушается нормальное функционирование молочной железы в период беременности и лактации (уменьшается экспрессии казеинов - белков молока). Эти данные впервые свидетельствуют в пользу того, что IGF-1/IGF-1R – опосредуемый сигналинг является чрезвычайно важным в дифференцировке молочной железы. Очевидно, что понимание роли IGF-1 и IGF-1R в нормальном развитии молочной железы может помочь правильно оценить их значимость при злокачественной трансформации и прогрессии опухолей. Полученные нами данные, могут служить обяснением взаимосвязи между слабой экспрессии IGF-1R и ухудшением дифференцировки при карциноме молочной железы, которая обнаружена в работе Schnarr и сотр. [479]. Далее мы попытались найти взаимосвязь между ослаблением активности IGF-1R и канцерогенезом молочной железы. Для этого было установлено наблюдение за мышами, у которых IGF-1/IGF-1R – опосредуемый сигналинг в клетках эпителия молочной железы был подавлен. Наши наблюдения (в течение одного года) не выявили образование опухолей, что говорит об отсутствии прямой связи между подавлением активноси IGF-1R и канцерогенезом молочной железы. Возможно, что слабый IGF-1R – опосредуемый сигналинг при аденокарциноме молочной железы может играть роль уже после инициации злокачественного роста, то есть в ходе злокачественной прогрессии? Также можно предположить, что ослабление IGF-1R – опосредуемого сигналинга в нормальных клетках эпителия молочной может изменить состояние клеток так, что они станут более восприимчивыми к химическому канцерогенезу или канцерогенезу, индуцированному вирусом? Мы считаем, что эти предположения заслуживают серьезного внимания и они требуют научных подтверждений. Также к началу нашей работы оставался абсолютно неизученным вопрос, касающийся роли IGF-1R в модуляции действия онкогенов в ходе трансформации и инициации роста опухоли. В диссертационной работе это направление впервые разработано на примере взаимодействия IGF-1R и онкогена Wnt1 в молочной железе мыши. Известно, что гиперэкспрессия Wnt1 вызывает раннюю и обширную гиперплазию 54 протоков молочной железы и является причиной появления аденокарцином молочной железы примерно в 50% случаев у мышей в возрасте 6 месяцев, а к концу года аденокарцинома развивается у всех остальных мышей [313, 488, 540]. В ходе наших исследований мы впервые показали, что IGF-1R - зависимый сигналинг участвует в канцерогенезе, опосредуемом Wnt1, таким образом, что ослабление IGF-1R сигнализации в контексте с гиперэкспрессией Wnt-1 ускоряет опухолеродность и увеличивает количество возникающих опухолевых узлов. В ходе дальнейших исследований, направленных на выявление механизма, который лежит в основе такой кооперации между IGF-1R и Wn1, мы показали, что ослабление IGF-1R сигнализации изменяет нормальное развитие молочной железы таким образом, что увеличивается количество предшественников люминальных клеток. А из литературы известно, что именно предшественники люминальных клеток являются мишенями Wnt1 - зависимого канцерогенеза [271, 314, 323]. Таким образом, мы впервые показали, что увеличение предшественников люминальных клеток вследствие ослабления IGF-1R – зависимой сигнализации может привести к увеличению восприимчивости к Wnt1 - зависимой трансформации и инициации роста опухоли. Эти данные являются оригинальными и отражены в нашей статье [451]. В заключение этой главы отметим: в диссертационной работе впервые было показано, что IGF-1R может участвовать, как в дифференцировке молочной железы, так и в канцерогенезе, опосредованном Wnt1. Учитывая, что ослабление сигнала через IGF-1R одновременно приводит к ухудшению дифференцировки и усилению Wnt1 индуцируемого возникновения опухолей, в более широком смысле, это может служить примером взаимосвязи между ухудшением дифференцировки и развитием злокачественной опухоли. В последующих главах мы предлагаем ознакомиться с тем, как происходит нормальное развитием молочной железы и, каков механизм Wnt1 - индуцированного канцерогенеза в молочной железе мыши. Полученные в этих главах знания будут необходимы для более легкого восприятия хода работы, а также позволят оценить значимость данной диссертационной работы в целом. 55 1.5. Развитие молочной железы мыши Роль IGF-1 и IGF-1R в дифференцировке мы исследовали на модели молочной железы мыши. Молочная железа мыши проходит две основные стадии развития: эмбриональную и послеродовую. Эмбриональная стадия начинается на 10-11 день развития зародыша и заканчивается на 17 день с образованием рудиментарного дерева, состоящего из нескольких ветвящихся каналов (зачатки будущих протоков), находящихся в окружении жировой ткани (Рисунок 11, А и D). Рисунок 11 – I ФАЗА. Рост и разветвление протоков молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши. Адаптировано из: Richert M.M. et al., 2000 Просвет ветвящихся каналов выстлан одним слоем клеток эпителия (люминальными клетками), и эти каналы с одной стороны сходятся в направление к соску [438]. У новорожденных мышат зачаточная структура протоков молочной железы остается в покоящемся состоянии примерно до трех недельного возраста пока яичники не начнут секретировать гормоны. 56 Послеродовая стадия развития является основной и состоит из двух фаз. I фаза охватывает период от рождения и до взрослой половозрелой мыши, а II фаза включает период беременности и лактации. На I фазе, примерно с трехнедельного возраста, когда яичники начинают секретировать гормоны, в частности эстроген, на концах зачаточных протоков появляются терминальные концевые почки (TEB) (Рисунок 11, B и E). ТЕВ состоят из множества слоев пролиферирующих клеток эпителия (body клеток), которые впоследствии дифференцируются в клетки эпителия, выстилающие просвет протока изнутри, и миоэпителиальные клетки, находящиеся снаружи эпителиальных клеток (Рисунок 12). Рисунок 12 – Схема терминальной концевой почки. Адаптировано из: Sternlicht M.D., 2006 По фронту body клетки покрыты одним слоем клеток эпителия активного края (cap клетками). Cap клетки - это высоко пролиферирующие, недифференцированные, плюрипотентные стволовые клетки, так называемые покрывающие клетки, которые сидят на базальной пластинке. Вокруг cap клеток отсутствует строма из соединительной ткани, что позволяет пролиферирующим cap клеткам мигрировать в жировую ткань и удлинять проток. Таким образом, с появлением TEB начинается процесс удлинения и разветвления протоков 57 молочной железы, который продолжается примерно до 10-12 недельного возраста пока TEB не достигнут границ жировой ткани молочной железы и не подвергнутся регрессии [438, 520] (Рисунок 11, С и F). С началом эстрального цикла в период полового созревания вдоль протоков молочной железы начинается третичное разветвление протоков и формируются альвеолярные почки - зачатки будущих альвеол (эпителиальных структур, секретирующих молоко в период лактации) (Рисунок 11, F). С каждым очередным астральным циклом количество третичного разветвления протоков и альвеолярных почек увеличивается. На II фазе, которая длится 19 - 21 день и охватывает период беременности, под воздействием гормонов, в основном прогестерона и пролактина, альвеолярные почки полностью дифференцируются в альвеолы (Рисунок 13). Рисунок 13 - II ФАЗА. Дифференцировка альвеол в период беременности и лактации. Адаптировано из: Richert M.M. et al., 2000 Альвеола имеет сферическую полость, которая выстлана изнутри дифференцированными клетками эпителия, секретирующими молоко (Рисунок 14 и Рисунок 15). Секретирующееся молоко собирается в полость альвеолы, а затем поступает в протоки и далее к соскам. Клетки эпителия альвеол начинают продуцировать белки молока (казеины) и липиды на 18 день беременности. После родов альвеолы начинают обильную секрецию молока, которая продолжается около трех недель. По истечении этого времени мышат отнимают от груди и рассаживают в разные клетки (братьев отдельно, сестер отдельно). 58 Рисунок 14 – Схема альвеолы. Автор схемы Шушанов С.С. Рисунок 15 – Альвелы на второй день лактации. Адаптировано из собственных результатов. 59 На 18 день беременности альвеолы заполняют большую часть жировой ткани молочной железы, а при лактации жировая ткань между альвеолами практически будет невидима (Рисунок 13, I). Регуляция послеродовой стадии развития молочной железы осуществляется не только гормонами (эстрогеном, прогестероном и пролактином). В регуляции роста и дифференцировки молочной железы также участвуют факторы роста такие, как: EGF, FGF и TGF-β [248, 256, 586]. Что касается IGF-1, к началу данной работы было показано, что он является митогеном и фактором выживания, как для нормальных, так и для опухолевых клеток эпителия молочной железы, культивируемых in vitro [37, 133, 246]. Было показано, что IGF-1, имплантированный в молочную железу мыши или крысы, промотирует рост молочных протоков, а у крыс, у которых хирургически удалены гипофиз и яичники, IGF-1 в синергическом действии с эстрогеном промотирует формирование TEB и удлинение протоков [277, 278, 458]. Также было показано, что во время роста протоков (в период полового созревания) мРНК, и IGF-1, и IGF-1R экспрессируются в высоко пролиферирующих TEB. После полового созревания и в период беременности IGF-1R продолжает экспрессироваться на высоком уровне в клетках эпителия протоков. Что же касается IGF-1, то в период полового созревания или после него, в протоках молочной железы уровень экспрессии мРНК IGF-1 является низким или совсем не определяется. В период же поздней беременности уровень экспрессии IGF-1 повышается во всех клетках эпителия альвеол [439, 455, 580, 581, 595]. Также изучали роль IGF-1 в регуляции развития молочной железы, изменяя уровень экспрессии IGF-1. Так, например, у трансгенных мышей гиперэкспрессия IGF-1 под MMTV промотором приводила к преждевременному развитию альвеолярных почек [455, 565, 595]. У трансгенных мышей гиперэкспрессия IGF-1 под промотором кислого белка сыворотки молока WAP приводила к уменьшению апоптотической гибели клеток эпителия и замедляла инволюцию молочной железы [210, 379]. Также следует отметить, что гиперэкспрессия IGF-1 в молочной железе в течение долгого времени, или в течение множественной беременности приводила к 60 образованию опухолей [211]. У мышей с нокаутированным геном IGF-1 (IGF-1 -/- мыши) не формировались TEB и наблюдались различные дефекты в росте протоков [279, 459]. Мыши же с нокаутированным рецептором IGF-1R погибали (полная перинатальная летальность) [42, 324]. К началу данной работы не была известна роль IGF-1 и IGF-1R в третичном разветвлении и росте протоков молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши. Также не была известна роль IGF-1 и IGF-1R в дифференцировке альвеол и регуляции экспрессии казеинов - белков молока, в период беременности и лактации. Хотя молочная железа мыши и человека имеют некоторые отличия [237] тем не менее, в целом, в их развитии наблюдаются аналогичные морфологические и гистологические последовательные изменения, которые регулируются комбинацией аналогичных гормонов и локально продуцируемых факторов роста. Более того, гены, идентифицированные, как важные в злокачественной трансформации молочной железы человека экспрессируются в нормальной ткани молочной железы человека, и эти же гены, во многих случаях, играют важную роль, как в нормальном развитии, так и в злокачественной трансформации молочной железы мыши. Поэтому данные, полученные при исследовании роли гена IGF-1 и гена IGF-1R на модели молочной железы мыши могут быть полезными для представления их роли, как в нормальном развитии, так и злокачественной трансформации молочной железы человека. 1.6. Рак молочной железы, индуцированный гиперэкспрессией Wnt1 Тройной негативный рак молочной железы (triple negative breast cancers, TNBCs), который классифицируется, как негативный по экспрессии рецептора эстрогена (ER-), по экспрессии рецептора прогестерона (PgR-) и по амплификации HER-2/neu (-), по-прежнему остается одним из наиболее сложных для лечения подтипов РМЖ из-за агрессивного характера течения и отсутствия эффективных методов лечения [9, 306, 388, 451]. Поэтому на сегодня актуальным 61 является сосредоточение усилий на выявлении рецепторов и сигнальных путей, активированных при TNBC [306]. Ряд проведенных недавно исследований показал, что имеется значительная гетерогенность в этом подтипе РМЖ, и, что, приблизительно 50% TNBC классифицируется как базальноподобный РМЖ [306, 451]. Базальноподобный РМЖ по гистологическому строению в большинстве случаев принадлежит к низкодифференцированному протоковому раку с высокой метастатической активностью, низкой степенью дифференцировки (степень 3), высоким митотическим потенциалом, наличием центрального некроза или фиброза и лимфоцитарной инфильтрации [9, 77, 431, Гистогенетически 435]. базальноподобный РМЖ связан с базальным эпителием, который в ткани здоровой молочной железы составляет наружный, прилежащий к базальной мембране слой, выстилающий протоки и дольки. Это морфологически и иммунофенотипически гетерогенная популяция, имеющая черты эпителиальных и гладкомышечных клеток, что нашло отражение в их названии – миоэпителиальные. В основе агрессивного фенотипа базальноподобных опухолей лежит соответствующий генотип, свидетельствующий о происхождении из наименее дифференцированных (возможно даже, стволовых) клеток [9]. В настоящей работе мы использовали мышиную модель MMTV-Wnt1, для которой характерна гиперэкспрессия онкогена Wnt1 в молочной железе под МMTV промотором. Известно, что гиперэкспрессия Wnt1 вызывает раннюю и обширную гиперплазию протоков молочной железы и является причиной появления аденокарцином молочной железы примерно в 50% случаев у мышей в возрасте 6 месяцев, а к концу года аденокарцинома развивается у всех остальных мышей [313, 488, 540]. Более того таким опухолям была характерна экспрессия преимущественно маркеров базальных клеток, обогащенных стволовыми клетками и предшественниками базальных клеток [228, 316, 431, 451]. В работе Tsukamoto и сотр., было показано, что гиперэкспрессия Wnt1 в эпителии молочной железы мыши достаточна для возникновения опухоли [540]. В 2010 году Khramtsov и сотр. обнаружили, что активация Wnt1 сигналинга также 62 характерна для базальноподобного РМЖ человека [267]. А в 2013 году Dey и сотр. показали, что активация Wnt1 сигналинга у пациентов с TNBC ассоциируется с метастазированием в легкие и головной мозг [141]. Эти литературные данные свидетельствуют в пользу того, что исследования сигнальных путей и рецепторов, активированных при базальноподобном РМЖ на мышиной модели могут быть полезными и для понимания механизма Wnt1опосредованного канцерогенеза при РМЖ человека. Wnt1 впервые идентифицирован в опухолях молочной железы мыши, как протоонкоген, активируемый при встраивании вируса. Трансгенная экспрессия этого гена, при использовании LTR вируса молочной железы мыши (MMTV), вызывает раннюю и обширную гиперплазию протоков и является причиной появления аденокарцином молочной железы примерно в 50% случаев у мышей в возрасте 6 месяцев [313]. Инфицирование различных линий мышей, в том числе и линии C3H, вирусом рака молочной железы мыши (MMTV) с высокой частотой приводит к возникновению опухолей молочной железы [385]. В результате обширного поиска сайтов встраивания провируса, с целью обнаружения генов, дерегуляция которых приводит к канцерогенезу, в опухоли молочной железы мыши был клонирован протоонкоген Wnt1, который активировался после встраивания вируса [386]. Поскольку этот ген оказался гомологичным гену дрозофилы Wingless (Wg) изначально он был назван int-1, а впоследствии переименован на Wnt1 [385]. Наблюдения показали, что в линии мышей C3H, которая хронически инфицирована этим вирусом, активация гена Wnt1 наблюдается приблизительно в 70% случаев [386]. Впоследствии были клонированы еще два протоонкогена: Wnt3 [445] и Wnt10b [303], которые также могли активироваться при встраивании вируса. В настоящее время у млекопитающих обнаружено целое семейство Wnt, которое насчитывает 18 различных членов [386]. В норме, у мышей Wnt1 экспрессируется исключительно в центральной нервной системе [250, 489, 575] и необходим для развития мозжечка [354, 530] 63 Главным предназначением Wnt1–опосредуемого сигнального пути является стабилизация и увеличение уровня β–катенина в цитозоле (Рисунок 16). β-катенин – многофункциональный белок, который ассоциируется со связанным с мембраной Е-кадхерином и с транскипционным фактором Lef/TCF [273]. Гетеродимер, состоящий из бета-катенина и Lef/TCF перемещается в ядро и трансактивирует ряд генов, в том числе: с-myc [223], циклин D1 [498], WISPs [404] и циклооксигеназу-2 [238] (Рисунок 16). Рисунок 16 – Схема Wnt1 - опосредованного сигнального пути. Адаптировано из: Li Y. et al., 2000 Для семейства Wnt идентифицирован целый класс рецепторов, состоящий из семи трансмембранных белков, известных как, Frizzled (Fz) [60]. После связывания лиганда Wnt1 c рецептором Fz, этот рецептор активируется и передает сигнал (через пока еще неустановленный механизм) цитоплазматическим фосфопротеинам семейства disheveled (Dvl). Dvl ингибирует конститутивную киназную активность GSK3, которая в норме фосфорилирует бета - катенин и 64 приводит к ее деградации. Уровень бета-катенина в цитозоле также регулируется при участии APС и большого белка Axin, которые участвуют в протеосомной деградации бета-катенина, и, таким образом, ингибируют Wnt1 - опосредованный сигнал [313]. Гиперэкспрессия некоторых членов семейства Wnt приводит к трансформации культивируемых клеток. Например, гиперэкспресия Wnt1, Wnt2, Wnt3 и Wnt3a (но не Wnt4, Wnt5a, Wnt5b) ведет к морфологической трансформации клеток эпителия молочной железы С57MG [70, 496]. Для становления Wnt1 – индуцированного трансформированного фенотипа необходима длительная гиперэкспрессия Wnt1 [315, 347]. Wnt1 обычно не экспрессируется в нормальной ткани молочной железы и не вовлечен напрямую в канцерогенез молочной железы человека. Вместе с тем, экспрессия некоторых других членов семейства Wnt все же обнаруживается в нормальной ткани молочной железы, и более того, среди этих членов есть такие, которые гиперэкспрессируются в опухолях молочной железы [313]. Кроме того показано, что гены, кодирующие компоненты, участвующие в регуляции Wnt - опосредуемого сигналинга, включая: бета-катенин, APC, Е-кадхерин, циклин D1, c-myc и WISP мутированы или дерегулированы в различных типах опухолей человека, таких как: рак молочной железы [61], рак толстой кишки [223], меланома [440, 461], гепатоцеллюлярная карцинома [127]. Для исследования онкогенности Wnt1 были получены трансгенные мыши, экспрессирующие Wnt1 под MMTV промотором (MMTV-Wnt1 мыши). У трансгенных мышей эктопическая экспрессия Wnt1 оказывала мощный митогенный эффект на клетки эпителия молочной железы, а также вызывала заметную гиперплазию концевых почек протоков на 18 день беременности [116], и, особенно выраженную гиперплазию через 2 недели после рождения мышат [318]. Примерно у 50% Wnt1 трансгенных мышей ранее не приносивших потомство (virgin mice), в течение 6 месяцев развивалась аденокарцинома, а к концу года аденокарцинома развивалась у всех остальных мышей [488, 540]. 65 Опухоли, возникающие у таких мышей, как правило, являются умереннодифференцированными и возникают из многослойного эпителия протоков молочной железы. [313]. Им характерна экспрессия преимущественно маркеров базальных клеток и, такие опухоли обогащены стволовыми клетками и предшественниками базальных клеток [431]. Несмотря на интенсивные исследования в данной области оставалось не ясным, участвует ли IGF-1R и опосредуемый им сигнал в регуляции онкогенного пути, в котором участвует Wnt1. Так существуют данные, которые свидетельствуют о возможном пересечении сигнальных путей с их участием. Как было показано выше, для рака молочной железы, который классифицируется, как негативный по экспрессии рецептора эстрогена, по экспрессии рецептора прогестерона и по амплификации HER-2, характерна гиперэкспрессия Wnt1 [141, 388]. Для таких типов опухолей молочной железы также характерна активация IGF-1R – зависимого сигнального пути, который промотирует пролиферацию и выживаемость клеток TNBC [124, 322]. Поэтому исследование взаимного влияния этих двух сигнальных путей при базальноподобном РМЖ является актуальным и может оказаться очень важным для раскрытия новых механизмов опухолевой прогрессии при базальноподобном РМЖ, который продолжает оставаться очень агрессивным и неподдающимся лечению типом РМЖ. 1.7. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в прогрессии множественной миеломы человека Ранее уже было сказано, что роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в прогрессии злокачественных новообразований является доказанной для нескольких типов опухолей человека и животных. Вместе с тем, для ряда злокачественных новообразований, таких как: рак простаты, множественная миелома и некоторые другие злокачественные заболевания крови роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R остается мало изученной, и исследование этой роли в прогрессии перечисленных типов опухолей является на сегодня актуальной. Данные, имеющиеся на сегодня в литературе, свидетельствуют в пользу того, что система IGF/инсулин занимает 66 особо важное место в биологии ММ. IGF-1 в высокой концентрации присутствует в микроокружении костного мозга и может являться одним из важных факторов, участвующих в прогрессии ММ. Изучение роли системы IGF/инсулин при миеломе на сегодня является одним из приоритетных направлений экспериментальной онкологии, способствующих более глубокому пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе прогрессии ММ. К началу данной работы оставалось не ясным, участвуют ли IGF-1 и его рецептор IGF-1R в регуляции механизмов множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) при ММ. Также не была выяснена роль IGF-1 в поддержании жизнеспособности линий клеток ММ и не исследована связь между гиперэкспрессией IGF-1 и общей выживаемостью пациентов ММ. Множественная заболевание, миелома злокачественное - характеризующееся инфильтрацией лимфопролиферативное костного мозга плазматическими клетками, наличием моноклонального иммуноглобулина в сыворотке крови и/или моче и остеолитическими поражениями костей [1]. В соответствии с классификацией ВОЗ 2008 года множественная миелома (ММ) относится к периферическим В-клеточным лимфоидным опухолям [75]. ММ составляет 1% от всех онкологических заболеваний и 13% от всех гемобластозов (неопластических заболеваний кроветворной и лимфатической ткани) [426]. Причины развития ММ у человека остаются неясными. Веских аргументов в пользу индуцирующего влияния ионизирующей радиации и токсических веществ не получено [1, 58]. В настоящее время большинство ведущих исследователей считают, что опухолевая трансформация В-лимфоцитов при ММ происходит в герминальном центре периферических лимфоидных органов после соматических гипермутаций реаранжированных генов иммуноглобулинов и изотипического переключения синтеза антител [1, 149]. Предполагают, что во время созревания нормальной В-клетки происходят ошибки, которые приводят к хромосомным транслокациям с вовлечением генов иммуноглобулинов, в частности локуса Нцепи (IgH) на хромосоме 14 в области 4q32 [577]. Результаты изучения наиболее типичных хромосомных транслокаций с вовлечением локусов генов 67 иммуноглобулинов позволили идентифицировать ряд потенциальных онкогенов, которые играют важную роль в патогенезе этого заболевания [150]. В дальнейшем плазмобласты (предшественники плазматических клеток) и клетки памяти, претерпевшие опухолевую трансформацию, как и нормальные аналогичные клетки, возвращаются в костный мозг. В костном мозге при взаимодействии с элементами костномозгового окружения (фибробластами, белками внеклеточного матрикса) трансформированные плазмобласты проходят окончательный этап созревания до плазматических клеток - получают соответствующие сигналы для выживания и пролиферации, формируют опухолевый клон, секретируют моноклональный иммуноглобулин (M-белок), активируют остеокласты, которые впоследствии индуцируют остеолитическое поражения кости [73, 329, 356]. Одним из злокачественных свойств клеток ММ является их способность мигрировать и локализоваться в костном мозге, где они пролиферируют и секретируют моноклональный иммуноглобулин (M-белок), а также активируют остеокласты, которые разрушают костную ткань [1, 146]. В продолжение вышесказанного далее поговорим подробнее о том, что на сегодня известно о роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R при ММ человека. А в заключении отметим, на какие новые и важные направления были нацелены наши исследования, посвященные роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в прогрессии ММ человека. 1.7.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в селективной локализации клеток миеломы в костном мозге Одним из ключевых свойств клеток миеломы является их селективное возвращение в костный мозг (“хоуминг”). Этот процесс является многоступенчатым и, прежде чем попасть в микроокружение костного мозга, мигрирующие по кровеносному руслу клетки миеломы на первом этапе под воздействием специфических хемоатрактантов должны притянуться к поверхности эндотелия, закрепиться на ее поверхности, далее активироваться и 68 трансмигрировать через стенки каппиляров, а затем, разрушив базальную мембрану, инвазировать во внеклеточный матрикс. [356] (Рисунок 17). Рисунок 17 – Схема многоступенчатого селективного возвращения клеток множественной миеломы в микроокружение костного мозга. Адаптировано из: Шушанов С.С., 2012 Одним из идентифицированных хемоатрактантов для клеток ММ является IGF-1, который экспрессируется клетками стромы (фибробластами), а также остеобластами [51, 89] и в высокой концентрации присутствует в микроокружении костного мозга [20, 255, 299]. Роль IGF-1 в хемотаксисе была доказана в ряде экспериментов in vitro как на линиях клеток миеломы человека [425, 526], так и на клетках миеломы мыши, а также in vivo на мышах. Например было показано, что миеломные клетки мыши активно мигрируют в направлении кондиционированной среды от фибробластов, полученных из стромы костного 69 мозга. Когда в такую кондиционированную среду добавляли антитела к IGF-1, то миграция миеломных клеток заметно уменьшалась [356, 357]. В другом эксперименте было показано, что миеломные клетки мыши линий 5Т2ММ и 5T33MM, экспрессирующие на своей поверхности IGF-1R, мигрируют в направлении экзогенного IGF-1. Напротив, миеломные клетки линии 5T33MMvt, которые не экспрессируют IGF-1R, не мигрируют в направлении IGF-1 [553, 554]. Однако, если клетки 5T33MMvt инъецировать в мышь, то они начинают экспрессировать на своей поверхности IGF-1R и это коррелирует с их способностью мигрировать в напралении IGF-1[556]. В дальнейших экспериментах in vitro было установлено, что экспрессия IGF-1R активируется после взаимодействия клеток 5T33MMvt с эндотелием костного мозга [38]. Если клетки 5T33MMvt вернуть в условия культивирования без эндотелия костного мозга, то экспрессия IGF-1R прекращается через 10 дней [38]. Также было показано, что клетки миеломы мыши 5Т2, инъецированные в мышь и обнаруженные через 18 часов в микроокружении костного мозга, сильнее экспрессируют на своей поверхности IGF-1R чем до инъекции [553]. Таким образом можно предположить, что миеломные клетки, экспрессирующие на своей поверхности пусть даже небольшое количество IGF-1R, при взаимодействии с эндотелием костного мозга увеличивают экспрессию IGF-1R, что, в свою очередь, усиливает их дальнейшую трансмиграцию через стенки капилляров и базальную мембрану в направление IGF-1, который, как было сказано выше, в высокой концентрации присутствует в микроокружении костного мозга. Как только клетки миеломы, под воздействием IGF-1 притягиваются и взаимодействуют с эндотелием сосудов, окружающих костный мозг, они активируются и экспрессируют адгезионные молекулы, чтобы закрепиться на поверхности эндотелия. Некоторые из этих адгезинных молекул являются необходимыми на последующих стадиях «хоуминга», чтобы связаться с белками внеклеточного матрикса и с фибробластами в строме костного мозга. Одной из таких адгезионых молекул, экспрессирующихся при взаимодействии миеломных клеток с эндотелием, является интегрин β4α1 (VLA-4). Показано, что для клеток 70 миеломы человека интегрин β4α1 является важным адгезионным рецептором, который опосредует связывание опухолевой клетки с фибронектином и адгезионными молекулами кровеносного сосуда и его экспрессия регулируется IGF-1 [526]. Также показано, что IGF-1 индуцирует локализацию IGF-1R и интегрина β4α1 на активном крае плазматической мембраны миеломных клеток [526]. Поскольку связывание миеломных клеток с фибронектином коррелировало с активацией PI3-K, Akt/PKB киназы, фосфорилированием FAK и паксиллина, было предположено, что этот сигнальный путь вовлечен в процесс миграции клеток миеломы [526]. Позднее было установлено, что в регулировании IGF-1 опосредуемой миграции и инвазии клеток миеломы человека участвуют PI3K/PKCμ и PI3-K/RhoA - зависимые сигнальные пути [425]. На следующем этапе «хоуминга», закрепившиеся на поверхности эндотелии сосудов клетки миеломы инвазируют в микроокружение костного мозга через стенки кровеносных сосудов и базальную мембрану. Этот процесс осуществляется благодаря участию семейства матриксных металлопротеиназ (ММP) и активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), экспрессируемых клетками миеломы и деградирующих различные компоненты внеклеточного матрикса и базальной мембраны [117, 265, 382]. Было показано, что клетки миеломы человека продуцируют металлопротеиназы ММP-2, MMP-7 и MMP-9 [46, 47, 309]. В литературе имеются данные о том, что IGF-1 может регулировать экспрессию ММP-9, которая является желатиназой и коллагеназой IV типа [361]. Как специфический хемоатрактант, продуцируемый клетками стромы костного мозга, IGF-1 притягивает миеломные клетки и после разрушения компонентов внеклеточного матрикса и базальной мембраны способствует их трансмиграции через стенки каппиляров и базальную мембрану. Как только клетки миеломы оказываются в микроокружении костного мозга, они подвергаются прямому воздействию IGF-1, который является для клеток миеломы фактором выживания и стимулирует клетки миеломы к пролиферации. Прежде чем попасть в микроокружение костного мозга, мигрирующие по кровеносному руслу клетки 71 миеломы под воздействием IGF-1 притягиваются к поверхности эндотелия (хемотаксис), закрепляются на ее поверхности (адгезия), далее активируются и трансмигрируют через стенки каппиляров в микроокружение костного мозга (инвазия). В микроокружении костного мозга IGF-1 активирует в клетках ММ анти-апоптотические механизмы, придавая злокачественным клеткам преимущество в борьбе за выживание, а также стимулирует их к пролиферации. Взаимодействие RANKL, экспрессирующихся на поверхности клеток миеломы, с RANK, экспрессирующимся на поверхности предшественников остеокластов, приводит к дифференцировке предшественников остеокластов в остеокласты, которые активируются и разрушают костную ткань. 1.7.2. Роль IGF-1 в регуляции пролиферации клеток ММ Роль IGF -1 в прогрессии клеточного цикла впервые была исследована Baserga и др. еще 1993 году [50, 460]. Эта группа показала, что в большинстве типов клеток взаимодействие между IGF-1 и IGF-1R достаточно, чтобы клетки вошли в клеточный цикл и начали делиться. Экспрессия IGF-1R является решающим фактором, который переключает клетку из состояния “не митогенная” в состояние “митогенная”. В согласии с этой гипотезой клетки Balb/c-3T3 стабильно трансфицированные вектором, кодирующим IGF-1R, могли расти в присутсвии IGF-1 лиганда. Если клетки экспрессировали одновременно и фактор роста IGF-1, и его рецептор IGF-1R , то они могли расти в отсутствии каких-либо других экзогенных факторов роста [415]. IGF-1 оказывает выраженный митогенный эффект и на многие типы злокачественных клеток [598], в том числе и на линии клеток ММ [168, 185, 381]. Этот эффект, по-видимому, опосредуется главным образом через IGF-1R, однако, другой рецептор IRA, который имеет высокую аффиность к IGF-2, также участвует в активации пролиферации опухолевых клеток [483]. Инсулин, известный как фактор, регулирующий метаболизм глюкозы, также может оказывать достаточно сильный митогенный эффект на опухолевые клетки. Возможно, что в этом случае его эффект 72 проявляется в результате связывания с IGF-1R. Также имеются данные, свидетельствущие в пользу того, что инсулин может оказывать митогенный эффект, связываясь и со своим собственным рецептором [53, 198]. Недавно Sprynski и др. показали, что инсулин в физиологических концентрациях является для клеток ММ таким же митогеном, как и IGF-1, и стимулирует рост клеток ММ, содержащих IGF-1R/IR гибридный рецептор. В таких гибридных рецепторах инсулин индуцирует фосфорилирование как IGF-1R, так и IR [515]. Эта же группа исследователей установила, что IR экспрессируется в клетках ММ в 203/206 случаях вновь диагностированных больных ММ [515]. Однако, оставалось не выясненным, как экспресируются две изоформы мРНК IR. Мы показали, что в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных множественной миеломой экспрессия мРНК IR-А обнаруживается у 100% больных, а экспрессия мРНК IR-B - у 32% больных [6]. Возможно, что Aизоформа IR действительно играет важную роль как в пролиферации, так и в биологии клеток ММ в целом, однако однозначного ответа на этот вопрос пока нет и исследования в этом направлении продолжаются. На фибробластах мыши недавно было установлено, что не только инсулин и IGF-2 связываются с IR-A, но и IGF-1 может связываться с IR-A, и, хотя в меньшей степени, активирует его аутфосфорилирование по сравнению с IGF-2, тем не менее, достаточно заметно индуцирует нижележащий от IR-A сигнальный путь внутри клетки [465]. В литературе накопилось много работ, посвященных изучению сигнальных путей, активируемых в результате различных лиганд-рецепторных взаимодействий между инсулином, IGF-1, IGF-2, IGFBP и их рецепторами IGF-1R, IR, однако, на сегодня, еще многое остается неизученным в этой области экспериментальной онкологии [177]. Считается, что пролиферация клеток ММ находится под контролем RAS-MAPK сигнального пути, в то время, как PI3-K/Akt сигнальный путь ассоциируется с анти-апоптотическими функциями [184]. Вместе с тем было показано, что в миеломных клетках RPMI8226 RAS-MAPK сигнальный путь не участвует в пролиферации [604]. 73 Особый интерес представляет тот факт, что IGF-1 может проявлять свои функции во взаимодействии с другими факторами. Например, он индуцирует деление клетки во взаимодействии с эпидермальным фактором роста (EGF) и тромбоцитарным ростовым фактором (PDGF) [109, 132]. В других работах было показано, что PDGF и основной фактор роста фибробластов (bFGF) активируют экспрессию IGF-1R [227, 462]. Что касается PDGF и bFGF, то они, как было показано, могут продуцироваться самими клетками миеломы в костном мозге [554]. Также было показано, что IGF-1 стимулирует пролиферацию как IL-6 зависимых, так и, IL-6 независимых линий миеломных клеток человека, воздействуя на клетки синергически с IL-6 и, активируя при этом, IL-6 независимый путь сигнальной трансдукции [160, 185, 424]. Таким образом, IGF-1 регулирует пролиферацию клеток ММ, воздействуя на них как независимо, так и совместно с другими факторами, и, такая взаимная кооперация усиливает действие каждого фактора в отдельности, и является важным в прогрессии ММ в целом. 1.7.3. Роль IGF-1 в регуляции остеолизиса Еще одним важным клиническим аспектом множественной миеломы является остеолизис. Известно, что в нормальной костной ткани поддерживается баланс между активностью остеобластов, участвующих в формировании костной ткани, и остеокластов, участвующих в резорбции костной ткани. При множественной миеломе этот баланс нарушен: количество и активность остеокластов выше, чем в норме, что приводит к резорбции кости. При исследовании молекулярных механизмов, лежащих в основе остеолизиса, были выявлены различные молекулы, участвующие в этом процессе. Одним из них, например, является воспалительный белок макрофага (МIP-1α), который стимулирует хемотаксис предшественников остеокластов и участвует в созревании остеокластов, что связано с последующим остеолизисом[287, 355]. Другим, наиболее исследованным участником остеолизиса при ММ является 74 система RANK-RANKL [356]. RANK, рецептор активатора NF-kB, экспрессируется на поверхности предшественников остеокластов. RANKL, который является лигандом для RANK, экспрессируется на поверхности остеобластов, клеток стромы костного мозга, а также клетками миеломы [356]. В результате связывания RANKL с рецептором RANK предшественники остеокластов дифференцируются в остеокласты, которые затем активируются и разрушают костную ткань (Рисунок 17). При ММ, миеломные клетки, экспрессирующие на своей поверхности RANKL, могут непосредственно стимулировать созревание остеокластов в своем ближайшем окружении в костном мозге. Зрелые остеокласты, в процессе костной резорбции, экспрессируют IGF-1, который, в свою очередь, активирует размножение миеломных клеток [1]. Таким образом, образуется порочный круг, в котором, чем больше миеломных клеток, тем больше остеокластов, разрушающих кость, а чем больше остеокластов, тем больше IGF-1, который стимулирует размножение миеломных клеток. Также имеется растворимая форма рецептора RANKL, остеопротегерин (OPG), который связывается с RANKL и, тем самым, негативно регулирует дифференцировку остеокластов и предотвращает резорбцию кости [115, 290, 499]. В экспериментах на мышах, больных множественной миеломой, было показано, что введение рекомбинантного OPG ингибирует дифференцировку остеокластов, предотвращает развитие остеолизиса и продлевает жизнь больным мышам [114, 555]. При ММ, наблюдается супрессия продукции OPG, что приводит к дисбалансу между регуляторами физиологической костной резорбции OPG/RANKL [1][356]. 1.8. Возникновение МЛУ является существенным фактором прогрессии множественной миеломы Длительность жизни больных ММ в основном зависит от чувствительности миеломных клеток к лечению противоопухолевыми препаратами, среди которых алкилирующие соединения (мелфалан, циклофосмамид, хлорбутин и другие), 75 доксорубицин, кортикостероиды (преднизолон, дексаметазон), бортезомиб (Велкейд) [6, 33, 519]. Со временем у многих больных ММ развивается устойчивость к самым разным химиопрепаратам, различающимся и по химической структуре, и по механизму действия. Иными словами, возникает множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) [7, 8, 519]. МЛУ - клинически неблагоприятный феномен, и его возникновение является одним из главных проблем на пути к эффективному лечению онкобольных, в том числе и больных ММ, для которых химиотерапия является основным видом лечения. В ходе исследования молекулярных механизмов возникновения МЛУ было установлено, что факторами, определяющими наличие у клетки феномена МЛУ, являются белки из семейства АВС-транспортеров (ATP Binding Cassette transporters, АТФ-зависимые транспортеры) [91, 130, 131, 231, 308]. Это семейство объединяет трансмембранные (ТM) белки, связывающие АТФ и использующие энергию для транспортировки некоторых молекул через все виды клеточных мембран. Белки классифицируются как ABC - транспортеры на основе последовательности и организации их АТФ - связывающих доменов, которые также называются нуклеотид - связывающими складками (nucleotidebinding folds, NBFs). NBFs содержат характерные мотивы (“Walker A” и “ Walker B”), разделенные приблизительно 90-120 аминокислотными последовательностями, которые обнаруживаются у всех АТФ – связывающих белков (Рисунок 18). Гены ABC - транспортеров также содержат дополнительный элемент, так называемый “С мотив”, локализованный выше сайта “Walker B” [243]. Функциональный ABC - транспортер обычно содержит два NBFs домена и два ТМ домена. ТМ домены содержат 6-11 трансмембранных α-спиралей и обеспечивают специфичность по отношению к субстрату. NBFs домены расположены в цитоплазме и преобразуют энергию, которая высвобождается при связывании с АТФ, в энергию для транспортировки субстрата через клеточную мембрану. ABC – транспортеры работают как насосы и, в основном, переносят субстраты в одном направлении - из цитоплазмы за пределы клетки (Рисунок 18). 76 Рисунок 18 – Схема типичного ABC-транспортера. А. Желтым показана билипидная мембрана, синим – ТМ домены, красным – NBF домены. В. Схема NBF домена, содержащего мотивы “Walker A” и “Walker B”, а также “мотив С”. Над схемой указаны наиболее общие аминокислотные последовательности характерные этим мотивам. Адаптировано из: Dean M. et al., 2001 Гены, кодирующие АВС – белки, организованы таким образом, что кодируют либо целый транспортер, содержащий два NBFs домена и два ТМ домена, либо половину транспортера, содержащий один NBFs домен и один ТМ домен [243] (Рисунок 19). Рисунок 19 – Схема гена, кодирующего либо целый ABC – транспортер, содержащий два NBFs домена и два ТМ домена, либо половину транспортера, содержащего один NBFs домен и один ТМ домен. Адаптировано из: Dean M. et al., 2001 В последнем случае, после трансляции, две половинки транспортеров формируют гомодимеры или гетеродимеры и образуют функциональный транспортер. В геноме эукариот гены ABC – транспортеров являются высоко консервативными у разных видов, что указывает на существование этих генов с 77 начала эволюции эукариот. На основе сходства в структуре гена (кодирование половины или полного транспортера) и гомологии в последовательностях NBFs и ТМ, гены, кодирующие ABC – транспортеры подразделяются на подсемейства. У млекопитающих существует семь подсемейств генов, кодирующих ABC – транспортеры: A, B, C, D, E, F, и G [131]. Характерной особенностью феномена МЛУ является гиперэкспрессия генов некоторых ABC – транспортеров в опухолевых клетках, и, как следствие, усиление вывода за пределы клетки и уменьшение внутриклеточной концентрации противоопухолевых лекарственных препаратов. На сегодня установлено, что в развитии феномена МЛУ важнейшее значение имеют три гена, кодирующих ABC – транспортеры. Такими генами являются: ABCB1/PGP/MDR1, ABCC1/ MRP1 и ABCG2/MXR/BCRP. Об этих генах далее поговорим подробнее. Впервые связь мембранных белковтранспортеров с феноменом МЛУ была показана в исследованиях Victor Ling и сотр. при изучении белка с молекулярной массой 170 кД, названного Ргликопротеином (Pgp), который обладал способностью уменьшать внутриклеточное накопление и цитотоксичность структурно и функционально различных цитостатиков [443]. Белок Pgp кодируется геном MDR1 (относится к семейству В, современное международное название АВСВ1), расположенным на длинном плече хромосомы 7 (7q21). Молекула этого белка имеет внутри- и внеклеточный компонент и 12 раз пересекает цитоплазматическую мембрану (Рисунок 20). Состоит из двух структурно гомологичных половинок, каждая из которых имеет один АТФ связывающий сайт и два высоко консервативных мотива: “Walker A” и “Walker B” [432]. Эти две половинки кодируются дуплицированными генами MDR1 [87]. Сайты гликолизирования, находящиеся во внеклеточной части, играют важную роль в стабилизации белка. Также эти сайты могут служить антигенами для моноклональных антител [478]. Функцией Pgp является энергозависимый транспорт за пределы клетки (эффлюкс) и, это приводит к уменьшению внутриклеточной концентрации большого числа ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов. Pgp демонстрирует широкую специфичность к 78 веществам с различной структурой и соответственно определяет устойчивость клеток к большому числу препаратов, таких как винка-алкалоиды, антрациклины, эпиподофиллотоксины, таксаны, актиномицин D и др. [7, 8, 205, 519, 552]. Рисунок 20 – Схема Р-гликопротеина (Pgp). Адаптировано из: Hatok J. et al., 2006 Экспрессия белка Pgp регулируется на уровне транскрипции мРНК гена MDR1. Транскрипция может происходить с двух промоторов – дистального и проксимального [92, 548]. Функциональная роль дистального промотора невелика: даже в ситуациях, когда этот промотор активен, он инициирует транскрипцию лишь небольшого количества мРНК [92]. Подавляющее количество мРНК MDR1 транскрибируется с проксимального промотора, который расположен в экзоне 1 и не имеет TATA – бокса [336]. В промоторах этого класса важнейшими участками, “организующими” формирование комплекса инициации транскрипции, является сайт 5’-CCAAT-3” [506]. В промоторной области гена MDR1 обнаружены GC-богатые участки, которые служат сайтами связывания транскипционных факторов из семейства Sp1 (specifity factor 1) и Egr-1 (early growth response 1) [352, 353]. Экспрессия белка Pgp также регулируется и на посттранскрипционном уровне, за счет стабилизации мРНК гена MDR1. По данным Chin и соавт., время полужизни мРНК MDR1 составляет около 60 минут [93]. О механизмах 79 стабилизации эукариотических мРНК известно гораздо меньше, чем об активации транскрипции генов. Основное внимание исследователей привлекает поли-AU область в нетранслируемой части 3’- конца транскрипта, который имеется в первичном транскрипте MDR1 [420]. Можно предполагать, что эта область позволяет мРНК MDR1 быстро деградировать, как это происходит, например, у транскриптов генов Myc, Fos и ряда лимфокинов [88, 344, 493]. Причина нестабильности транскрипта в том, что поли-AU последовательность могут узнавать белки, взаимодействие которых с РНК является сигналом для привлечения РНК-азы и гидролиза транскрипта [607]. Таким образом, из вышесказанного следует, что МЛУ, опосредованная Pгликопротеином, способна развиваться в клетках млекопитающих в ответ на химиопрепараты, применяемые для терапии опухолей. Становление МЛУ связано с активацией гена MDR1. Регуляция становления МЛУ – сложный процесс, включающий ряд путей передачи сигналов, направленных на инициацию транскрипции и/или стабилизацию мРНК MDR1. Говоря иными словами, количество белка Pgp в мембране опухолевой клетки зависит от накопления в цитоплазме мРНК MDR1. То есть, чем большее количество мРНК MDR1, тем транслируется большее количество Pgp, и, как следствие, из опухолевой клетки выводится большее количество лекарственных препаратов. Поэтому, определение (измерение) количества мРНК MDR1 является одним из методов оценки становления МЛУ при лечении онкобольных . Для этой цели обычно используют полуколичественный РТ-ПЦР - высокочувствительный, быстрый и недорогой метод для определения количества мРНК MDR1, который был использован нами в диссертационной работе. Ген MDR1 гиперэкспрессируется в различных солидных опухолях и при различных злокачественных заболеваниях крови. Увеличение количества мРНК MDR1 и Pgp часто служит фактором устойчивости многих типов опухолей к лечению и, следовательно, связано с клинической агрессивностью заболевания [36, 65, 95, 142, 151, 155, 209, 305, 320, 358, 470, 518, 545]. 80 МЛУ может быть первичной (intrinsic) и приобретенной (acquired, secondary). Первичная МЛУ обусловлена предсуществующей тканеспецифической резистентностью опухоли [519]. То есть, клеткам некоторых тканей характерна изначальная высокая экспрессия гена MDR1. А в ходе трансформации и злокачественной прогрессии, опухолевые клетки, произошедшие из этой ткани, продолжают сохранять признаки резистентности, которые обнаруживаются еще во время диагностирования опухоли. Примерами высокой экспрессии MDR1 служат: секреторный эпителий надпочечников, гепатоциты, эпителий почечных клубочков, эпителий толстой кишки, и соответственно, в карциномах толстой кишки, карциномах надпочечников, гепатомах обнаруживается высокая экспрессия гена MDR1 [195, 519]. В ходе наблюдений было установлено, что у пациентов, которые ранее были лечены противоопухолевыми цитостатиками ген MDR1 в опухолевых клетках часто гиперэкспрессируется [200]. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу того, что при повторном и/или длительном лечении онкобольных цитостатиками может произойти отбор и последующее размножение тех опухолевых клеток, в которых ген MDR1 гиперэкспрессируется и такие клетки приобретают МЛУ [196]. Приобретенная МЛУ характерна некоторым злокачественным заболеваниям крови. Так, например, при острой миелодной лейкемии после проведенного курса химиотерапии у пациентов, становящихся устойчивыми к лечению, обнаруживается повышение экспрессии Pgp [342]. Также хорошим примером становления приобретенной МЛУ является МЛУ, возникающая при лечении пациентов с множественной миеломой. Всего лишь у 6 % пациентов с ММ до лечения обнаруживается экспрессия Pgp, тогда как после лечения (особенно по схеме VAD: винкристин+доксорубицин+дексаметазон) до 85% резистентных к лечению пациентов становятся Pgp позитивными [342]. Имеются еще две работы, в которых показано, что для ММ характерна приобретенная МЛУ [321, 509]. В наших исследованиях мы использовали образцы, полученные от леченных больных ММ, и, действительно, экспрессия мРНК гена MDR1 обнаруживается в подавляющем большинстве случаев. Поэтому, выбранная нами модель ММ 81 является обоснованной для исследования роли IGF-1 в регуляции механизмов возникновения МЛУ при лечении. MRP1/ABCC1 (multidrug resistance-associated protein) был открыт S.P. Cole и соавт. в 1992 году в клеточной линии мелкоклеточного рака легкого [104]. Известно, что MPR1 обеспечивает резистентность примерно к тому же кругу химиопрепаратов, что и Pgp. Этот белок имеет молекулярную массу ~ 190 кД и кодируется геном MRP1/ABCC1, расположенным на хромосоме 16 (регион 16р13.1). Он функционирует, как энергозависимый (АТФ - зависимый) насос, выводящий токсичные вещества из клетки, и также как Pgp, принадлежит к семейству АВС транспортеров [328]. В отличие от Pgp, для функциональной активности MRP1, в качестве насоса для выведения лекарственных препаратов за пределы клетки, необходим клеточный глутатион. Он транспортирует отрицательно заряженные ионы, конъюгированные с молекулой глутатиона и является так называемым GS-X насосом [328]. В норме белок MRP1 широко распространен в органах и тканях организма, включая клетки гемопоэтической системы. Признано его участие в развитии феномена МЛУ при раке легкого, толстой кишки, молочной железы, мочевого пузыря и простаты, а также при лейкозах [104]. BCRP/ABCG2 (breast cancer resistance protein) – белок индуцирует резистентность к даунорубицину, топотекану и митоксантрону, при сохранении чувствительности клеток к цисплатину, паклитакселу и винкаалкалоидам. Кодируется геном BCRP/ABCG2. В литературе встречаются синонимичные обозначения MXR (mitoxantrone resistance protein) и ABCP (placental ABC transporter) [148]. Помимо вышеописанных белков из семейства АВС- транспортеров, в развитии феномена МЛУ участвует белок, названный белком устойчивости рака легкого – LRP/MVP (lung resistance protein), не принадлежащим к семейству АВС - транспортеров. Кодируется геном LRP/MVP. Исследования показали, что в отличие от АВС-белков он локализован не на клеточной мембране, а в цитоплазме и ассоциирован с везикулами и лизосомами, что позволяет считать его участником ядерно-цитоплазматического транспорта. 82 При культивировании клеток, экспрессирующих LRP, с антрациклинами эти препараты обнаруживаются внутри везикул и выводятся из клетки путем экзоцитоза. Белок LRP обнаруживается в клетках различных злокачественных опухолей при отсутствии экспрессии Pgp и MRP1, что ассоциируется с резистентностью к доксорубицину, винкристину, цисплатину и мелфалану [7, 8]. 1.8.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции механизмов возникновения МЛУ при ММ человека В литературе вышеописанных имеются белков – работы, посвященные транспортеров в исследованию возникновении роли МЛУ при множественной миеломе. Так, например, показано, что у нелеченных больных ММ экспрессия Pgp обнаруживается только в 1-2% образцов биопсий, тогда как у леченных больных, у которых возник рецидив и они стали нечувствительными к химиопрепаратам, экспрессия Pgp обнаруживается в 40-80% случаев [509]. В другой работе показано, что у 6 % пациентов с ММ до лечения обнаруживается экспрессия Pgp, тогда как после лечения (особенно по схеме VAD: винкристин+доксорубицин+дексаметазон) до 85% резистентных к лечению пациентов становятся Pgp позитивными [342]. Еще в одной работе было установлено, что высокий уровень экспрессии мРНК MDR1 в плазматических клетках костного мозга больных ММ может прогнозировать плохую чувствительность к химиотерапии [321]. По литературным данным ген LRP экспрессирован приблизительно у 50% больных ММ и его экспрессия ассоциирована с плохим ответом на лечение больных мелфаланом и, в целом, с более короткой продолжительностью жизни больных ММ [441]. Считается, что LRP может быть использован в качестве важного генетического маркёра для предсказания слабого терапевтического ответа при множественной миеломе. Было показано, что LRP экспрессируется чаще у больных с делецией гена р53 и при повышенной экспрессии Pgp [441]. В отношении гена BCRP известно, что его экспрессия обнаружена в клеточных линиях множественной миеломы, где он является функциональным, а 83 также в образцах костного мозга, полученных от больных множественной миеломой. Предполагается, что BCRP может содействовать возникновению лекарственной устойчивости при множественной миеломе [383, 482]. В литературе также представлены работы, в которых исследовалась экспрессия мРНК MRP1 в образцах костного мозга больных ММ [383, 482]. Данные, полученные в этих работах являются противоречивыми и исследования роли гена MRP1 в возникновении МЛУ при ММ продолжаются. Несмотря на то, что сегодня созданы различные классы ингибиторов, которые в основном являются конкурентами субстратов перечисленных выше белков-транспортеров, их действие в преодолении МЛУ пока недостаточно эффективно и, чаще всего, такие ингибиторы вызывают сильные негативные побочные эффекты [620]. Поэтому наряду с дальнейшим совершенствованием уже имеющихся ингибиторов требуется поиск новых классов и типов ингибиторов МЛУ, которые были бы, с одной стороны, более эффективными, а с другой – универсальными для всех белков–траснпортеров и не имели бы негативных побочных эффектов. Вместе с тем, необходимо параллельно проводить фундаментальные исследования молекулярных механизмов регуляции экспрессии и активации самих белков МЛУ. Учитывая, что имеется несколько видов белков-транспортеров, не исключено, что они регулируются различным образом, и, возможно, что в их регуляции участвуют межклеточные взаимодействия, различные факторы роста, их рецепторы и активируемые ими сигнальные пути, мишенями которых являются промоторные и другие регуляторные регионы генов, кодирующих белки-траспортеры, участвующие в возникновении МЛУ. Предварительные экспериментальные данные позволяют высказать гипотезу о том, что лекарственная устойчивость клеток ММ может возникать при взаимодействии между В – клеточным опухолевым клоном и микроокружением костного мозга, которое состоит из экстраклеточного матрикса и клеток стромы. Показано, что взаимодействие клеток ММ с клетками стромы костного мозга активирует в последних транскрипцию и секрецию цитокинов и ростовых факторов, в том числе и инсулиноподобного фактора роста 1-го типа 84 (IGF-1), который, как было установлено, не только усиливает рост, выживание и миграцию клеток ММ, но также может иметь прямое отношение к возникновению резистентности к общепринятым химиопрепаратам [229]. Также было показано, что клетки ММ, взаимодействуя с эндотелием кровеносных сосудов, окружающих костный мозг, экспрессируют на своей поверхности рецептор IGF-1 (IGF-1R) [229]. Увеличение количества IGF-1R на поверхности клеток ММ приводит к большему количеству IGF-1/IGF-1R взаимодействий и последующей активации нижележащих сигнальных путей в клетке. На сегодня в литературе имеется не так много работ, посвященных исследованию роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ. Было показано, что в клетках рака толстой кишки мыши линии MCLM и в Т-лимфобластных клетках человека линии CCRF-CEM IGF-I индуцировал экспрессию гена MDR1 и значительно ингибировал гибель клеток от цитотоксических препаратов [208, 480]. В работе J. Ge и соавт. методом иммуногистохимии исследовали экспрессию IGF-1R и MRP1 в 102 образцах от больных раком желудка и обнаружили, что IGF-1R экспрессировался в 75,2 % случаев, а MRP1 – в 69 % случаев. Такая высокая степень корреляции в экспрессии этих генов, несмотря на химиотерапию, ассоциировалась с плохим прогнозом у больных раком желудка [183]. Недавно было показано, что ингибирование IGF-1R в клетках колоректального рака человека ассоциировалось с повышением чувствительности этих клеток к противоопухолевым препаратам и с супрессией экспрессии MRP-2 [494]. В 2013 году Benabbou N., и соавт. показали, что IGF-1 регулирует экспрессию генов МЛУ в линии клеток рака яичника [54]. Таким образом, в литературе накапливаются данные, свидетельствующие в пользу того, что IGF-1 и IGF-1R могут участвовать в возникновении лекарственной устойчивости и эти данные еще раз подтверждают актуальность и своевременность нашего исследования. Участие IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции возникновения МЛУ при ММ на сегодня не изучено. Поэтому в нашей работе мы исследовали роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции 85 экспрессии генов, ответственных за МЛУ на модели множественной миеломы человека (с использованием клинического материала и линий культур клеток ММ). 1.8.2. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в выживании опухолевых клеток при множественной миеломе Одним из свойств клеток ММ является их способность мигрировать и локализоваться в костном мозге [1, 12]. В микроокружении костного мозга клетки ММ взаимодействуют с клетками стромы костного мозга и активируют в них транскрипцию и секрецию различных цитокинов и факторов роста: IL-6 (интерлейкин-6), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), TNF-α (фактор некроза опухоли - альфа), TGFβ (трансформирующий фактор роста бета), SDF-1α (фактор стромальных клеток - 1α), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1 типа) и другие цитокины и факторы роста [229, 514]. Воздействие этих факторов на миеломные клетки может придать им более агрессивные свойства – усилить выживаемость, активировать механизмы возникновения лекарственной устойчивости и другие. Поэтому исследование роли цитокинов и факторов роста в злокачественной прогрессии ММ является на сегодня одним из актуальных направлений в экспериментальной онкологии и этому посвящено немало работ. Среди публикаций имеется работа, в которой исследовалось влияние на выживаемость СD45+ и CD45- миеломных клеток комбинации нескольких факторов роста: IL-6, IGF-1, HGF (фактор роста гепатоцитов), HB-EGF (эпидермальный фактор роста, связывающий гепарин), APRIL (лиганд, индуцирующий пролиферацию). В этой работе было показано, что IGF-1 может являться фактором, повышающим жизнеспособность клеток ММ [514]. Исследование механизмов регуляции жизнеспособности опухолевой клетки является одним из актуальных направлений в экспериментальной онкологии. Известно, что во многих типах злокачественных клеток нарушен механизм, регулирующий запрограммированную клеточную гибель – апоптоз [125]. В результате опухолевые клетки становятся менее чувствительными по сравнению с 86 окружающими их нормальными клетками к различным стрессовым воздействиям, таким как недостаточность ионизирующей радиацией, факторов тепловой роста, шок, поломки действию ДНК, вызванные противоопухолевых препаратов, направленных на активацию апоптоза в опухолевых клетках [262]. Иными словами, менее чувствительные к апоптозу опухолевые клетки получают преимущество в борьбе за выживание, что является важным шагом на пути к злокачественной прогрессии [364]. На сегодня известны различные цитокины и факторы роста, участвующие в регуляции апоптоза, и одними из них могут быть IGF-1 и его рецептор IGF-1R [469]. В литературе имеются работы, в которых показано, что при ММ IGF-1 и его рецептор IGF-1R, могут проявлять антиапоптотические функции. Например, в линиях клеток ММ человека IGF-1/IGF-1R – опосредуемый сигнальный путь ингибирует апоптоз, индуцированный культивированием клеток в среде без сыворотки [185] или добавлением в культуральную среду дексаметазона [381, 389, 587]. Некоторые линии клеток ММ, как, например, Karpas 707, сами экспрессируют IGF-1, который аутокринным образом активирует IGF-1R на поверхности клеток [185]. Если в клетках Karpas 707 инактивировать IGF-1R антителами αIR3, то аутокринная стимуляция IGF-1R прекратится, и тогда активируется каспаза 3, последняя в цепи цистеиновых протеиназ, которая индуцирует апоптоз. Таким образом, аутокринная стимуляция IGF-1R в клетках Karpas 707 является непрерывной и вполне достаточной для ингибирования апоптоза, зависимого от каспазы 3. В обычной культуральной среде, содержащей сыворотку, непрерывная аутокринная стимуляция IGF-1R приводит к невысокому, однако достаточно хорошо заметному, так называемому базальному уровню фосфорилирования Аkt по сериновому остатку в положении 473. Вместе с тем, если к клеткам Karpas 707 добавить экзогенный IGF-1, то уровень фосфорилирования Аkt заметно возрастет [185]. Учитывая тот факт, что IGF-1 в большом количестве присутствует в сыворотке, а также в микроокружении костного мозга, где он продуцируется различными типами клеток, в том числе фибробластами и остеобластами, можно предположить, что in vivo, клетки ММ получают от IGF-1 дополнительную 87 паракринную стимуляцию. Подтверждением этого сценария был недавно выявленный факт, что для выживания клеток ММ, полученных от больных, необходима экзогенная активация IGF-1/IGF-1R сигнального пути [1]. Известно, что в регуляции апоптоза участвуют различные сигнальные пути. Например, имеются сведения о роли PI3-K/Akt зависимой киназы GSK-3β в регуляции апоптоза [234, 399, 508]. Cубстратами GSK-3β являются: гликоген синтаза, циклин D1, эукариотический фактор иниациации eIF2B, tau (белок ассоциированный с микротрубочками), а также транскрипционные факторы: сjun, c-myc, β-catenin NF-kB [166, 202]. В отличие от большинства киназ, GSK-3β является конститутивно активированной киназой и его активность ингибируется различными факторами роста, в том числе инсулином и IGF-1 в рультате Aktзависимого фосфорилирования по остатку серина в положении 21 и/или 9 [112]. В миеломных клетках Karpas 707 IGF-1R/PI3-K/Akt сигнальный путь конститутивно активирован и, в соответствии с этим, отмечается невысокий, однако достаточно хорошо заметный, так называемый базальный уровень фосфорилирования GSK3β по сериновому остатку в положении 9. Добавление к клеткам Karpas 707 экзогенного IGF-1 увеличивает степень фосфорилирования GSK-3β по этому сайту. Вместе с тем, использование ингибиторов GSK-3β, например LiCl или SB415286, только частично уменьшает апоптотический эффект, вызванный дексаметазоном, в присутствии или без αIR3, или ингибиторов PI3-K, что свидетельствует о частичном участии GSK-3β в анти-апоптотическом сигнальном пути, активируемом IGF-1R/PI3-K/Akt. Также показано, что в линии клеток миеломы человека U266 апоптотический эффект наблюдался в результате конститутивной активации JAK/STAT сигнального пути, при котором Stat-3 ингибировал экспрессию bcl-xL, и как, следствие, индуцировался апоптоз [81]. Кроме того было показано, что Stat-3 конститутивно активирован в мононуклеарных клетках костного мозга, полученных от больных ММ, а также в линиях клеток ММ, устойчивых к апоптозу, индуцированному Fas [512]. Таким образом, JAK/STAT сигнальный путь также вовлекается в выживаемость клеток ММ. 88 Среди известных сигнальных путей, регулирующих апопотоз клеток ММ, выделяют три типа сигнальных путей (Рисунок 21). Это PI3-K/Akt сигнальный путь, который, как предполагается является наиболее важным в регуляции выживаемости клеток ММ [230, 239]. Потенциальными активаторами этого пути являются: EGF, bFGF, M-CSF [120], HGF [585], IL-6 [230, 542], а также IGF-1 [185]. Вторым сигнальным путем, вовлеченным в регуляцию выживания клеток МM является сигнальный путь с участием Ras/MAPK (Рисунок 21). Рисунок 21 – Схема IGF-1R – опосредованных анти-апоптотических сигнальных путей. Адаптировано из: de Almagro M.C. et al., 2012 Однако, как было показано в ряде экспериментов с использованием различных ингибиторов, этот сигнальный путь оказался менее эффективным для выживания клеток ММ, чем PI3-K/Akt путь сигнальной трансдукции [160, 184, 89 230, 542]. Третьим сигнальным путем, участвующим в регуляции выживания клеток ММ, является 14-3-3 зависимый сигнальный путь [349]. 14-3-3 – это семейство высоко гомологичных белков, состоящее из 7 известных изоформ [171]. Активация 14-3-3-опосредуемого сигнального пути приводит к транслокации Raf в митохондрии и последующему фосфорилированию Bad, и, в конечном итоге, ингибированию апоптоза [377] (Рисунок 21). Как видно из схемы, важной особенностью этих трех сигнальных путей является то, что они сходятся на про-апоптотическом белке BAD, который в нефосфорилированном состоянии является промотором митохондриального сигнального пути апоптоза. Главное звено в митохондриальном пути апоптоза занимает митохондрия. Различные белки, взаимодействуя с внешней мембраной митохондрии, могут изменять ее проницаемость. Существуют два типа белков: про-апоптотические, которые усиливают проницаемость митохондриальной мембраны, и антиапоптотические, которые, наоборот, уменьшают проницаемость митохондриальной мембраны. Эти два типа белков принадлежат к большому семейству Bcl-2 (B-cell leukaemia-2). К про-апопототичеким белкам семейства Bcl-2 относятся: BAD, Bax, Bid, Bik, Bim, Hrk. К анти-апоптотическим белкам семейства Bcl-2 относятся: Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Bfl-1, Bag-1, Mcl-1, A1 [121, 591]. Все эти белки являются гомологичными Bcl-2 и отличаются тканеспецифичностью их экспрессии. Bcl-2 и Bcl-xL могут димеризоваться с различными членами семейства Bcl-2 и, таким образом, решать судьбу клетки – индуцировать в ней апоптоз или защитить ее от гибели [395, 473, 592, 597]. Как про-апоптотические, так и анти-апоптотические белки семейства Bcl-2 проявляют свои функции на наружной мембране митохондрий [319, 434]. Главной особенностью про-апоптотических белков является их способность усиливать проницаемость мембраны митохондрии, что приводит к выходу из митохондрии цитохрома С и активации каспаз. А анти-апоптотические белки, наоборот, блокируют действия про-апоптотических белков, и тем самым останавливают выход цитохрома С из митохондрии, то есть ингибируют апоптоз [225]. На рисунке 22 дан пример активации апоптоза с участием про-апоптотических 90 белков Bid, Bax и Bak. После индукции апоптоза посредством активации “рецепторов смерти” лигандом FasL, или TNFα (фактором некроза опухолей α), или TRAIL (цитокином из семейства факторов некроза опухоли) активируется каспаза 8, которая разрезает белок Bim с образованием усеченной активной формой tBim (truncated) [94, 319, 571]. Затем tBim взаимодействует с проапоптотическими белками Bax и Bak, находящимися в цитоплазме, и активирует их (Рисунок 22). Рисунок 22 – Схема взаимодействия между PI3-K/Akt/BAD сигнальным путем выживания и нижележащими белками из семейств Bcl-2 и IAP, которые ассоциированы с апоптозом. Автор схемы Шушанов С.С. В свою очередь, активированные Bax и Bim олигомерезуются и встраиваются во внешнюю мембрану митохондрий и, образуя поры, усиливают ее проницаемость, вследствии чего из межмембранного пространства митохондрии 91 выходят цитохром С и проапоптозные белки [94, 319, 571]. Выделяясь из митохондрии, цитохром С включается в состав апоптосомы. Апоптосома - это комплекс, состоящий из Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor 1) – фактор 1, активирующий апоптотическую протеазу, прокаспазы 9 и цитохрома С. Этот комплекс, в присутствии АТФ или дАТФ, активирует про-каспазу 9. Активированная каспаза 9, в свою очередь, активирует эффекторные каспазы 3,6,7 [94] (Рисунок 22). Каспазы (cysteine-dependent aspartate specific protease) семейство цистеиновых протеаз, расщепляющих белки исключительно после аспартата. Каспазы играют важную роль в процессе апоптоза. Они подразделяются на инициаторные и эффекторные. В данном примере каспаза 9 является инициаторной, а каспазы 3,6,7 – эффекторные [350]. После активации эффекторных каспаз запускается необратимый процесс программой смерти клетки [94, 350]. Ранее мы уже говорили о том, что белок BAD является важным белком, на котором сходятся три сигнальных пути, активация которых приводит к фосфорилированию BAD. В нефосфорилированном состоянии этот белок связывается с Bcl-2 или Bcl-xL (с образованием гетеродимеров) и ингибирует их анти-апоптотическую активность. Когда BAD фосфорилируется посредством Akt, то он образует комплекс с белком 14-3-3 и теряет способность связываться с Bcl-2 или Bcl-xL [121]. Свободные Bcl-2 или Bcl-xL образуют гетеродимеры с проапоптотическими белками Bах и Bak и ингибируют их активность. Ингибирование Bах и Bak приводит к резкому уменьшению проницаемости митохонриальных пор, вследствии чего предотвращается выделение цитохрома С из митохондрии в цитоплазму [94, 311, 319, 576]. Таким образом, подавляется апоптоз. В подавлении апоптоза также участвуют семейство ингибиторов белков апоптоза IAPs (inhibitors of apoptosis proteins) для которых характерно присутствие от одного до нескольких N-концевых BIR – доменов (baculoviruses inhibitor of apoptosis repeat domains) [125, 551] и C-концевых RING - доменов (really interesting new gene) [254]. Семейство IAP состоит из 8 членов: NAIP, HIAP-1, HIAP-2, XIAP, survivin, Apollon/Bruce, livin и ILP-2 [125]. Среди этих 92 белков непосредственно в подавление митохондриального сигнального пути апоптоза вовлечены: HIAP-1, HIAP-2, XIAP, livin, survivin [125, 289, 557]. Остальные IAP белки участвуют в регуляции выживания клеток посредством контроля клеточного цикла или при воспалении [125]. IAP белки, участвующие в подавлении митохондриального сигнального пути апоптоза, ингибируют каспазу-3, каспазу-7, каспазу-9 [140]. При этом, BIR-домены IAP белков специфически связываются с каспазами и блокируют их активные сайты [241], а С-концевой RING-домен обеспечивает деградацию каспаз [594] за счет убиквитинлигазной активности [254]. IAP ингибиторы каспаз сами подвержены отрицательной регуляции. Как было сказано ранее, при увеличении проницаемости наружной мембраны митохондрии, наряду с цитохромом С из митохондрии в цитоплазму выходит белок Smac/DIABLO (direct IAP-binding protein with low pi) [82]. После выхода из митохондрии белок Smac/DIABLO связывается с IAP и нарушает их связывание с каспазами [516], ускоряя, таким образом, их активацию [380]. Вместе с тем, имеются данные о том, что, XIAP, HIAP-1 и HIAP-2 способны противостоять ингибирующему действию Smac/DIABLO, присоединяя к нему убиквитин [172, 240]. Одна из изоформ Smac/DIABLO, Smac3 , в свою очередь стимулирует присоединение убиквитина к XIAP [139]. Также при сверхэкспрессии каспаза-3 и каспаза-7 могут сами расщеплять XIAP [334]. Таким образом, видно, что регуляция механизма митохондриального сигнального пути апоптоза является сложной, многофакторной и еще не до конца изученной [319] . Наряду с изменением активности анти-апоптотических и про- апоптотических белков за счет их фосфорилирования или дефосфорилирования, одним из важных факторов, регулирующих апоптоз, является количественное соотношение этих белков [94, 579]. Говоря иными словами, судьба клетки может решаться на уровне регуляции экспрессии белков, участвующих в апоптозе. Это подтверждается в ряде экспериментов. Например, делеции у мышей генов, кодирующих анти-апоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL, привели к усилению апоптоза лимфоидных клеток и незрелых гемопоэтических клеток. И, наоборот, 93 делеция гена, кодирующего про-апоптотичекий белок Bax, привела к блокированию апоптоза незрелых нейронов [370, 497, 558]. Также было показано, что опухолевый супрессор p53, который является прямым транскрипционным активатором гена про-апоптотичекого белка Bax, приводит к гиперэкспрессии Bax, и как результат, усиливается апоптоз [365]. Кроме p53 в регуляции экспрессии генов, кодирующих белки, участвующие в апоптозе, также участвует NF-kB. Показано, что он усиливает экспрессию генов ингибиторов апоптоза HIAP1 и HIAP2 [289]. Количественное соотношение белков, участвующих в регуляции апоптоза, играет важную роль и в злокачественной прогрессии [579] (Рисунок 23). Рисунок 23 – Схема регуляции выживаемости клеток при изменении баланса экспрессии анти-апоптотических и про-апоптотических белков. Автор схемы Шушанов С.С. Мы уже говорили о том, что одной из причин высокой выживаемости раковых клеток является потеря ими чувствительности к индукции апоптоза, и, тогда, стратегия лечения опухолей путем индукции апоптоза не приводит к желаемому результату [125, 262, 330]. Исследования показали, что одной из причин потери чувствительности к апоптозу является нарушение баланса между 94 количеством анти-апоптотических и про-апоптотических белков (Рисунок 23). В литературе имеется ряд работ, в которых показана связь между изменением экспрессии белков, участвующих в регуляции апоптоза и злокачественной прогрессией. Например, было показано, что гиперэкспрессия Bcl-2 в линиях клеток рака простаты, нейробластомы, глиобластомы и рака молочной железы приводит к ингибированию апоптоза, индуцированного TRAIL [173, 428]. Также показано, что опухолевые клетки, полученные от пациента с хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ), имеют анти-апоптотичекий фенотип с высоким уровнем экспрессии белка Bcl-2 и низким уровнем экспрессии белка Bax [199]. Гиперэкспрессия гена Bcl-2 является ранним событием при канцерогенезе толстой кишки [501]. При раке толстой кишки с микросателлитной нестабильностью частым событием является мутация гена Bax, причиной которой является сдвиг рамки считывания. Такая мутация приводит к тому, что опухолевые клетки толстой кишки становятся устойчивыми к противоопухолевым препаратам [360]. При раке толстой кишки также выявлена гиперэкспрессия белков IAP (XIAP, HIAP1, HIAP2 и survivin) и это является плохим прогностическим маркером [364]. Гиперэкспрессия XIAP выявлена при раке молочной железы, меланоме (на стадии метастазирования) и карциноме почек [249, 280]. В одной из работ была исследована экспрессия XIAP у 78 нелеченных пациентов с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ). Оказалось, что у пациентов с низким уровнем экспрессии XIAP подолжительность жизни значительно дольше и наблюдается тенденция к большей продолжительности ремиссии, чем у пациентов с высоким уровнем экспрессии XIAP [527]. Гипрэкспрессия HIAP2 при раке шейки матки ассоциируется с возникновением резистентности к радиотерапии [247]. Белок livin гиперэкспрессируется в меланомах и при немелкоклеточном раке легких, в результате чего указанные опухоли становятся резистентными к апоптозу и ассоциируется с плохим прогнозом [111, 197, 613]. Также показано, что гиперэкспрессия белка survivin при раке толстой кишки ассоциируется с плохим прогнозом [423]. Интересным является тот факт, что кроме ингибирования апоптоза анти-апоптотичекие белки, принадлежащие семейству IAP, участвуют в 95 позитивной регуляции NF-kB и MAPK - опосредуемых сигнальных путей, которые активируют пролиферацию опухолевых клеток [125]. Таким образом, приведенные из литературы примеры показывают, что, действительно, нарушение баланса между экспрессией анти-апоптотических и про-апоптотических белков играет важную роль в злокачественной прогрессии (Рисунок 23). Гиперэкспрессия в опухолях анти-апоптотических белков приводит не только к блокированию апоптоза, но и к возникновению лекарственной устойчивости к препаратам, направленным на индукцию апоптоза, а также к возникновению МЛУ и к усилению пролиферации. Одним из основных направлений нашей работы является исследование роли IGF-1 и IGF-1R в выживании клеток ММ. В связи с этим сначала поговорим о том, какова же роль количественного изменения анти-апоптотических и проапоптотических белков в выживании клеток ММ человека? Это первое. И второе какова же роль IGF-1 в регуляции экспрессии анти-апоптотических и проапоптотических белков в клетках ММ? Из литературы известно, что в злокачественной прогрессии клеток ММ участвуют гены семейства Bcl-2 и гены семейства ингибиторов апоптоза IAP. Показано, что высокий уровень экспрессии некоторых генов из этих семейств ассоциируется с их лекарственной устойчивостью к доксорубицину, дексаметазону и этопозиду [182, 543, 544], а также с повышением их выживаемости [32]. Повышение уровня экспрессии Mcl1 и, наоборот, снижение уроня экспрессии Bax ассоциируется с малигнизированным фенотипом клеток ММ [513]. IL-6 - опосредуемое усиление выживаемости клеток ММ коррелирует с гиперэкспрессией генов Bcl-xL и Mcl-1 [257, 258, 422, 481], и не коррелирует с гиперэкспрессией гена Bcl-2 [422, 481]. Также имеются данные, свидетельствующие о том, что Mcl-1 - опосредуемая выживаемость клеток ММ может и не зависеть от присутствия IL-6 [605]. Показано, что у пациентов с ММ, у которых в ходе лечения возникает МЛУ, за счет гиперэкспрессии генов MDR1 и LRP, и одновременно гиперэкспрессируются белки IAP: survivin, HIAP1, HIAP2 и XIAP прогноз хуже, чем у пациентов, у которых возникает только МЛУ [376]. Таким образом, приведенные выше 96 примеры указывают на то, что при ММ повышение экспрессии некоторых генов и белков семейства Bcl-2 и IAP ассоциируется с усилением выживаемости клеток ММ. Ранее мы уже говорили о том, что в регуляции экспрессии белков семейства Bcl-2 и IAP участвуют p53 и NF-kB [289, 365]. Также мы приводили примеры того, что при ММ экспрессию анти-апоптотических и про-апоптотических белков могут регулировать IL-6 и TNF-α [257, 258, 422, 481, 513, 605]. Что же касается роли IGF-1 в регуляции экспрессии белков семейства Bcl-2 и IAP, то литературные данные на эту тему являются противоречивыми. Так, например, Gourdan M. и соавт. в 11 линиях клеток ММ исследовали регуляцию экспрессии анти-апоптотических и про-апоптотических белков семейства Bcl-2 в присутствии IL-6, TNF-α и IGF-1 [257]. В то время, как экспрессия белков Bcl-xL и Mcl-1 повышалась в присутствии IL-6 и TNF-α, ни в одной из исследованных линий экспрессия апоптотических белков не изменялась в присутствии IGF-1 [257]. В другой работе Xu, F. и соавт. показали, что IGF-1 – опосредованная устойчивость к апоптозу, индуцированному дексаметазоном, не приводит к изменению экспрессии ни Bcl-2, ни Bax, ни Bcl-xL [587]. Вместе с тем в первичной культуре клеток ММ в присутствии дексаметазона блокирование IGF-1R с использованием антител приводило к уменьшению экспрессии Bcl-xL [389]. А в более ранней работе было показано, что экспрессия этого белка регулируется IGF-1 на уровне транскрипции [500]. Таким образом, имеющиеся в литературе данные относительно роли IGF-1 в регуляции экспрессии анти-апоптотических и проапоптотических белков, являются противоречивыми и не доконца исследованными. В своей работе мы исследовали роль IGF-1 в регуляции выживаемости клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. В этих клетках мы также исследовали роль IGF-1/IGF-1R-опосредуемой регуляции экспрессии мРНК генов семейства Bcl-2 и генов семейства ингибиторов апоптоза IAP, участвующих в апоптозе: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, XIAP, HIAP-1, HIAP-2, survivin, NAIP, livin. 97 1.9. Роль IGF-1 в регуляции апоптоза, индуцируемого IL-1β Роль IGF-1 в регуляции апоптоза мы исследовали на модели клеток нейронов сетчатки глаза RGC-5. Выбор именно этой модели объясняется тем, что предшествующие исследования показали, что еще на начальных стадиях диабетической ретинопатии (дегенерации сетчатки глаза, характеризующейся ускоренной потерей нейронов), как у человека, так и у крысы, клетки нейронов в сетчатке подвергаются апоптозу [44, 218, 366]. Известно, что инсулин, IGF-1 и их рецепторы экспрессируются в большом количестве в сетчатке глаза, особенно во внутреннем плексиформном слое, который в основном формируется из нейронных отростков [244]. Также показано, что рецепторы инсулина и IGF-1 в сетчатке проявляют повышенную тирозинкиназную активность [437], что позволяет высказать предположение о важной роли IGF/инсулин зависимых сигналов для нормальной жизнедеятельности нейронов сетчатки. Вместе с тем известно, что у больных сахарным диабетом в ряде тканей IGF/инсулин сигнальный путь нарушен [433]. Является ли это нарушение одной из причин гибели нейронов сетчатки глаза до нашей работы было неизвестным. Также было показано, что диабетическая ретинопатия имеет различные характеристики хронического воспалительного заболевания. В жидкости стекловидного тела пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией, а также в сетчатке крыс с диабетом, индуцированным стрептозоцином, определяются повышенные уровни про-воспалительных цитокинов, таких как: IL-1β, IL-6 и IL-8 [24, 78, 602]. Другие исследования показали, что цитокин TNFα, его растворимый рецептор и IL-1β увеличиваются в сыворотке пациентов, страдающих диабетом [147, 288, 317]. Вместе с тем, роль перечисленных цитокинов в патогенезе диабетической ретинопатии остается не до конца изученной. Таким образом, исходя из вышесказанного, было предположено, что апоптоз нейронов сетчатки является следствием: 1 – нарушения IGF/инсулин зависимых сигналов выживания при диабете; 98 2 – хронического воспалительного заболевания, индуцируемого про- воспалительными цитокинами: IL-1β (интерлейкин-1β), IL-6 (интерлейкин-6), IL-8 (интерлейкин-8) и TNF-α (фактора некроза опухоли - альфа), повышенные уровни, которых определяются в жидкости стекловидного тела, а также в сыворотке пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией. 1.9.1. Про-апоптотические цитокины IL-1α и IL-1β Белки IL-1 (IL-1α апоптотическими и IL-1β) цитокинами, нейродегенеративных являются про-восполительными которые играют заболеваниях. Экспрессия и ключевую этих про- роль цитокинов в быстро повышается в ответ на инфекцию в центральной нервной системе (ЦНС), а также в ответ на травмы и нейротоксичекие воздействия, и, как результат, они приводят к разрушению нейронов [30, 188]. IL-1α и IL-1β продуцируются в ответ на гипоксию или активацию толлподобного рецептора (TLR) (Рисунок 24). Затем IL-1α и IL-1β связываются с рецептором IL-1R1, и такой комплекс узнается вспомогательным белкомрецептором (accessory protein) IL-1RAcP. IL-1RAcP связывается с IL-1R1, с образованием рецептора-гетеромера IL-1R1/IL-1RAcP и с этого момента инициацируется внутриклеточный сигналинг, приводящий к транскрипции генов: IL-1 (интерлейкина-1), IL-6 (интерлейкина-6) и TNF-α (фактора некроза опухоли альфа). В транскрипции участвует транскрипционный фактор NF-kB [449] (Рисунок 24). Негативная регуляция этого сигнального пути происходит следующим образом: эндогенный антогонист-лиганд IL-1RA связывается с IL-1R1 субъединицей с более высокой аффинностью, чем IL-1α и IL-1β, и блокирует образование комплекса IL-1R1/IL-1RAcP, и, как результат, ингибируется инициация внутриклеточного сигнала [145]. Показано, что потеря экспрессии антогониста IL-1RA вызывает у мышей драматическое усиление апоптоза нейронов [416]. 99 Также показано, что IL-1RA защищает нейроны от апоптоза, индуцированного при активации NMDA-рецептора (ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий N-метил-D-аспартат [213]. Рисунок 24 – IL-1α и IL-1β – опосредуемые сигнальные пути. Адаптировано из: J. M. Rosenzweig J. M., 2014 Повышение экспрессии IL-1β наблюдается и при заболеваниях, которые сопровождаются апоптозом нейронов сетчатки глаза, в частности, при диабетической ретинопатии [137]. Таким образом, эти данные свидетельствуют в пользу того, что IL-1β - опосредованный сигнальный путь может вызывать гибель клеток нейронов путем индукции в них апоптоза. Ранее в 2008 году нами было показано, что причиной IL-1β - опосредуемого апоптоза является истощениие внутриклеточного АТФ и потеря трансмембранного потенциала митохондрий [21]. Поскольку повышение экспрессии IL-1β при диабетической ретинопатии ассоциируется с гибелью нейронов сетчатки, мы поставили перед собой вопрос: может ли IL-1β напрямую вызывать апоптоз клеток нейронов? Чтобы проверить 100 наши предположения на модели нейронных клеток сетчатки глаза крысы RGC-5 мы исследовали IGF-1 - зависимую регуляцию активностей каспаз 3 и 7, индуцированных удалением сыворотки из культивируемой среды или воздействием IL-1β (см. главу 3.3). В заключение подчеркнем, что наши исследования на модели нейронных клеток сетчатки глаза и линиях клеток ММ впервые показали, что IGF-1 является фактором, повышающим выживаемость нормальных и опухолевых клеток. Он блокирует активности эффекторных каспаз 3 и 7 и регулирует экспрессию антиапоптотических генов Bcl-2 и HIAP-1, принадлежащих семейству Bcl-2 и IAP. 101 Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1.Трансгенные линии мышей В работе использовали инбредную линию мышей FVB, которая является одной из наиболее подходящих линий для исследования нормального роста и развития молочной железы, а также для изучения механизмов онкогенеза молочной железы. К началу данной работы уже были получены трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий мутантный IGF-1R, у которого в тирозинкиназном домене остаток лизина в положении 1003 заменен на аргинин (KR мутация). Такой доминантно-негативный человеческий IGF-1R (dnIGF-1R), димеризуясь с нормальным мышиным IGF-1R, ингибирует его аутофосфорилирование и последующую передачу сигнала внутрь клетки. Конструкция мутантного человеческого IGF-1R, использованная для получения трансгенных мышей, описана в статьях [161, 260]. Эта конструкция была успешно использована и в более ранних работах для ингибирования IGF-1R - зависимого сигнала в экспериментах in vitro и in vivo, включая трансгенных мышей [161, 162, 260, 261, 560]. В диссертационной работе были исследованы 4 трансгенные линии мышей, гемизиготных по dnIGF-1R, у которых этот мутантный рецептор экспрессировался в клетках эпителия протоков молочной железы под MMTV промотором. И 6 трансгенных линий мышей, также гемизиготных по dnIGF-1R, у которых этот рецептор экспрессировался под промотором кислого сывороточного белка WAP (acidic whey protein, кислый белок сыворотки). Экспрессия dnIGF-1R под MMTV промотором позволяла исследовать роль изучаемого рецептора в дифференцировке молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши. А экспрессия dnIGF-1R под WAP промотором - в период беременности и лактации. Для исследования роли IGF-1R в канцерогенезе молочной железы, опосредованной гиперэкспрессией Wnt1 использована линия мышей, которая одновременно экспрессировала под MMTV промотором два трансгена (бигенная линия): MMTV-Wnt1/MMTV-dnIGF-1R. Эта бигенная линия получена путем 102 скрещивания мужской линии гемизиготной по MMTV-Wnt1 с женской линией гомозиготной по MMTV-dnIGF-1R [450]. Молочные железы мышей, экспрессирующих Wnt1, и бигенной линии мышей пальпировали каждые пять дней, начиная с трехнедельного возраста. Когда обнаруженная опухоль молочной железы достигала в размере 1 см, животных подвергали эвтаназии методом ингаляции СО2 . 2.2. Генотипирование Геномную ДНК для генотипирования выделяли из кончиков хвоста 3 - 4 недельных мышей согласно стандартному протоколу: «HotSHOT genomic DNA isolation» [537] Вкратце: в эппендорф с кончиком хвоста мыши (длиной примерно 2 мм) добавляли 75 мкл лизирующего шелочного раствора (25мМ NaOH, 0.2мМ EDTA (~pН 12). Затем нагревали при 950С в течение 20 минут и помещали на лед. Далее вносили 75мкл нейтрализующего раствора (40mM Трис-HCl (~pH5). Тщательно перемешивали. Далее для ПЦР брали по 2 - 5 мкл геномной ДНК. Присутствие ПЦР продукта, соответствующего ДНК доминантно-негативного IGF-1R человека, определяли с использованием пары праймеров - прямой: 5’AGACAGCCATCAGTCACTTGC-3’; и обратный: 5’-CGGAGCCAGACTTCATTC CTT-3’. Всего проводили 32 цикла амплификации по следующей схеме: денатурация – 94°С, 1мин; отжиг – 55oС, 45 сек; синтез – 72°С, 2мин. Среди потомства перечисленных линий мышей после генотипирования были отобраны мыши, которые экспрессировали dnIGF-1R, то есть трансгенные мыши (Tg+). Мыши, которые не экспрессировали dnIGF-1R, то есть (Tg-), использовались в качестве контроля. 2.3. Приготовление препаратов молочной железы В экспериментах по изучению дифференцировки молочной железы использовали девственных самок мышей в возрасте 10 недель. Первый день беременности считался как день 0,5. Отобранных Tg+ мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP или MMTV промотороми во второй день лактации (L2), а 103 также Tg+ девственных мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором в возрасте 21 недель, подвергали эвтаназии методом ингаляции СО2 [19]. После усыпления мыши удаляли обе ее паховые (№4) молочные железы и использовали их для приготовления тотального препарата молочной железы, парафиновых срезов, получения первичной культуры молочной железы, а также для выделения белка для анализа методом вестерн блоттинга. 2.3.1. Приготовление тотального препарата молочной железы Тотальный препарат молочной железы готовили согласно протоколу, описанному в статье [524]. Мышь подвергали эвтаназии и удаляли обе паховые молочные железы. Одну железу замораживали в жидком азоте и хранили для выделения белка. А другую железу переносили на предметное стекло и аккуратно расправляли. Далее фиксировали в фиксаторе Карнуа (Carnoy's fixative) в течение 2 - 4 часов при комнатной температуре. (Фиксатор Карнуа состоит из: 6 частей 100% EtOH, 3 частей хлороформа и 1 части ледяной уксусной кислоты). Затем отмывали поочередно по 15 мин в нисходящей концентрации EtOH (100%, 95%, 90%, 70%). Далее ополаскивали в 1xPBS и в дистиллированной воде. Затем красили в квасцовом кармине (carmine alum) в течение ночи, при комнатной температуре. (Состав квасцового кармина: 1г кармина (Sigma C1022), 2.5г калийалюминий сульфата (Sigma A7167), перемешивали и растворяли в 500мл дистиллированной воды. Кипятили в течение 20 мин, затем доводили конечный объем до 500мл дистиллированной водой и профильтровали. Добавляли кристаллы тимола и хранили в холодильнике. Этот краситель можно использовать в течение нескольких месяцев, до изменения первоначального цвета). После окраски в квасцовом кармине мыли поочередно по 15 мин в возрастающей концентрации EtOH (70%, 90%, 95%, 100%). Далее обесцвечивали в ксилоле в течение ночи, при комнатной температуре. Затем наносили Permount (SP15-100, Fisher Scientific) или Cytoseal XYL на основе ксилола (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI). Накрывали сверху предметным стеклом и оставляли сохнуть при комнатной температуре в течение ночи. После фотографирования тотальный 104 препарат молочной железы можно залить в парафин и использовать для получения срезов и последующего окрашивания гематоксилин-эозином. 2.3.2. Окрашивание гематоксилин-эозином Слайды погружали в ксилол. (Xylenes histological grade, X3P–1GAL, UN1307, Fisher Scientific). Освобождали от заливки (Cytoseal XYL). Дважды сменяли ксилол (через15 мин). Дважды переносили в ксилол - парафин (в соотношение 1:1) при 600С на 15 минут. Заливали в парафин. Затем готовили срезы толщиной 5 мкм и использовали для окрашивания гематоксилин-эозином. Удаление парафина из срезов: Переносили парафиновый срез в ксилол на 3 минуты. Повторяли 3 раза. Затем переносили в ксилол + 100% EtOH (в соотношение 1:1) на 3 минуты. Далее отмывали поочередно по 3 мин в нисходящей концентрации EtOH (100%, 95%, 90%, 70%, 50%). Перенесли в дистиллированную воду на 5 мин. Окрашивание среза гематоксилином и эозином: Окрашивали срез гематоксилином в течение 5 минут. Затем промывали в дистиллированной воде 5 минут и окрашивали эозином в течение 20 секунд. Далее мыли поочередно по 3 минуты 3 раза в возрастающей концентрации EtOH (95%, 100%). Далее вносили в ксилол на 3 минуты. Повторяли 3 раза. Затем наносили Cytoseal XYL на основе ксилола (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) и накрывали покровным стеклом. 2.3.3. Исследование пролиферации клеток эпителия молочной железы с использованием бромдезоксиуридина (BrdU) За два часа до удаления молочной железы мыши вводили внутрибрюшинно BrdU (Amersham #RPN 201) из расчета 0,3 мг BrdU на 10 г веса тела мыши. Через 2 часа мышь усыпляли, удаляли паховую молочную железу и фиксировали ее в 4% параформальдегиде в течение 2 часов при температуре 4 0С. Далее заливали в парафин и готовили срезы толщиной 5мкм. Удаление парафина и регидратация срезов: 105 Переносили срез в ксилол 3 раза по 3 минуты. Далее отмывали поочередно по 2 мин в нисходящей концентрации EtOH (100%, 95%, 90%, 70%). Затем 1 раз отмывали в течение 5 минут в 1х PBS. Восстановление (демаскировка) антигена: Вставляли слайды в стеклянную раму для слайдов и, если оставались свободные места в раме, заполняли их предметными стеклами. Ставили раму со слайдами в стеклянный стакан (объем 500мл) и наполняли 10 мМ цитратом натрия (pH 6; 100 mM сток). Стакан со слайдами помещали в микроволновку. Включали микроволновку на 20 минут. (Через 10 мин, ввиду испарения, доливали цитрат натрия). Остужали в течение 20 минут. Промывали 3 раза по 5 минут в бидистиллированной H2O. Промывали в течение 5 минут в 1 х PBS. Стряхивали излишек PBS и обводили срез гидрофобным карандашом, избегая пересушивания среза. Затем вносили на каждый срез по 200 мкл буфера для блокирования (5% BSA/0,5% Tween-20 в PBS). Инкубировали 1-4 часа при комнатной температуре во влажной камере. Далее разводили 1:10 антитела к BrdU, конъюгированные с FITC (Anti- BrdU FITC, Becton-Dickinson) в буфере для блокирования. Вносили на каждый слайд по 80 мкл разведенных антител и инкубировали в темном месте в течение ночи при комнатной температуре во влажной камере. Отбирали первичные антитела и промывали 3 раза по 10 мин в 1 х PBS. Далее разводили вторичные антитела (goat α-rabbit Texas Red) 1:1000 в 1 х PBS. Вносили на каждый срез по 200 мкл и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре во влажной камере. Затем отбирали вторичные антитела и промывали слайды 3 раза по 10 мин в 1 х PBS. Наносили на срез Vectashield-DAPI в соотношение 3:1 (Vector Labs). Накрывали покровным стеклом и запечатывали по периметру прозрачным лаком для ногтей. 2.4. Получение первичной культуры клеток эпителия молочной железы мыши Первичную культуру клеток эпителия молочной железы мыши получали согласно протоколу, описанному в статье [456]. Первичную культуру клеток 106 эпителия получали из молочных желез беременных мышей (на 12-14 день беременности), которые экспрессировали dnIGF-1R под MMTV промотором. Те мыши, которые не экспрессировали dnIGF-1R (Tg- мыши) использовались в качестве контроля. (При описании методики учесть, что все действия, касающиеся получения первичной культуры из молочной железы Tg+ и Tgконтрольных мышей выполнялись параллельно). Все 10 молочных желез, удаленных от трех Tg+ мышей помещали в чашку петри в 10 мл среды M199 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA), отделяли лимфатические узлы и, оставшуюся ткань молочной железы тщательно измельчали с использованием двух скальпелей. Измельченную ткань переносили в 50 мл коническую пробирку в 45 мл среды M199 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащую L-глутамин, 5 мкг/мл инсулина (Sigma), 1 мкг/мл Амфотерицина В (Gibco/Invitrogen), 1 х пенициллин/стрептомицин (Gibco/Invitrogen), 0,2 мг/мл BSA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Затем вносили коллагеназу третьего типа (Worthington) до конечной концентрации 0,1%. Коллагеназа готовилась заранее в той же среде, в которой измельчали ткань, и хранилась при -800С. Затем крышку пробирки с измельченной тканью обматывали парафильмом и помещали в гнезда качалки и качали со скоростью 200 rpm в течение 5 часов при 370C. (В некоторых случаях для окончательного переваривания измельченной ткани молочной железы достаточно было и 4 часов, в зависимости от ферментативной активности коллагеназы). Полученную после окончательного переваривания суспензию концентрировали при 1000 rpm (Beckman CS-6KR) в течение 5 мин. Осадок дважды промывали в 10 мл 10% FBS/PBS и далее проводили обогащение (концентрирование) клеток эпителия молочной железы методом центрифугирования в градиенте плотности перколла согласно протоколу. Вкратце: заранее с вечера или во время переваривания ткани молочной железы готовили градиент перколла (Amersham Biosciences). Для этого в каждую поликарбонатную пробирку с округлым дном (объемом 45 мл) вносили 10,8 мл перколла и 16 мл среды М199, в которой измельчали ткань молочной железы. Затем тщательно перемешивали встряхиванием. Далее центрифугировали в 107 роторе с фиксированным углом при 20,000 x g в течение 1 часа при комнатной температуре. Был использован ротор JA-17 и центрифугирование произведено при скорости вращения 14,125 rpm. Приготовленный таким образом градиент перколла может храниться в течение 1 месяца. Далее наносили на поверхность градиента перколла ресузпендированный в 1,5 мл 10% FBS/PBS осадок первичных клеток молочной железы. Общее количество клеток у обычно не превышало 3 х 107 клеток, что позволяло получать хорошее разделение и согласовалось с требованием протоколом. Затем центрифугировали при 800 х g в течение 20 минут при комнатной температуре. Далее отбирали слой (кольцо) эпителиальных клеток пипеткой предварительно промытой БСА, для уменьшения прилипания клеток. Промывали дважды в среде М199. Затем осадок клеток после второй промывки и центрифугирования ресуспендировали в среде для культивирования: DMEM/F12 (Gibco BRL), содержащей 2% FBS, 1 мкг/мл амфотерицина В, 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина, 5 мкг/мл инсулина (Sigma), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF, BD), L-глутамин и бычий сывороточный альбумин (BSA, 5 нг/мл, Sigma). Затем ресуспендированные клетки эпителия молочной железы высевали в указанную выше среду для культивирования в 60 мм пластиковую чашку, предварительно покрытую тонким слоем (50 мкл/см2) матригеля, обедненного факторами роста (Growth Factor Reduced MatrigelTM Matrix, BD Bioscience). 2.4.1. Процедура покрытия чашки матригелем Матригель, обедненный факторами роста (Growth Factor Reduced MatrigelTM Matrix, BD Bioscience) рекомендован для исследования дифференцировки клеток эпителия молочной железы мыши in vitro [62, 312]. Покрытие матригеля проводилось тонким слоем согласно протоколу производителя. Вкратце: матригель переносили из -200С и оставляли для постепенного оттаивания на льду при 40С в течение ночи. Затем помещали 60 мм чашку для культивирования клеток на лед и вносили в нее 980 мкл матригеля (из расчета 50мкл/см2). Затем помещали чашку с матригелем на 30 минут в термостат на 370С. 108 2.4.2. Исследование экспрессии казеинов в первичной культуре клеток эпителия молочной железы in vitro Первичные клетки эпителия молочной железы, посаженные на матригеле, культивировали в среде DMEM/F12 (Gibco BRL), содержащей L-глутамин, 2% FBS, 1 мкг/мл амфотерицина В, 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина, 5 мкг/мл инсулина (Sigma), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF, BD) в течение 72 часов (чтобы клетки прикрепились к матригелю и распластались). Через 72 часа среду для культивирования меняли на лактогенную среду, которая не содержала ни сыворотки, ни EGF и состояла из: DMEM/F12 (Gibco BRL), L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл инсулина, 2 мкг/мл гидрокортизона и 5 мкг/мл пролактина (Sigma). В лактогенной среде первичную культуру клеток эпителия молочной железы культивировали в течение 10 дней. Лактогенную среду меняли ежедневно. Через 10 дней первичные клетки эпителия отделяли от матригеля. 2.4.3. Отделение первичных клеток эпителия молочной железы от матригеля После 10 дней культивирования в лактогенной среде первичную культуру клеток эпителия отделяли от матригеля с помощью ферментативного расщепления с использованием раствора для восстановления клеток (Cell Recovery Solution, BD Biosciences). Процесс отделения проводился согласно протоколу производителя: удаляли лактогенную среду и три раза ополаскивали клетки холодным PBS. Затем вносили 4 мл раствора для восстановления. Далее соскабливали матригель вместе с прикрепленными к ним клетками в 50 мл коничеcкую пробирку (BD FalconTM), установленную на лед. Ополаскивали чашку 4 мл раствора для восстановления и также сливали в коническую пробирку, находящуюся на льду, и закручивали крышку. Затем, несколько раз переворачивали коническую пробирку и оставляли на льду в течение 1 часа для растворения матригеля. Время от времени покачивали пробирку для ускорения процесса растворения. Через 1 час центрифугировали при 200-300 х g при температуре 2-80С. Затем дважды промывали клетки, мягко ресуспендируя в 109 холодном PBS, и осаждали центрифугированием при 2-80С. Из полученного осадка первичных клеток эпителия молочной железы выделяли белок и исследовали экспрессию казеинов. 2.5. Исследование экспрессия бета казеина в линии клеток эпителия молочной железы мыши НС11 Для исследование экспрессии бета казеина, маркера функциональной дифференцировки in vitro, использовали линию клеток эпителия молочной железы мыши НС11, которая была клонирована из линии клеток эпителия молочной железы COMMA-1D, полученной от BALB/c мыши [119]. Клетки растили до монослоя в среде для культивирования RPMI 1640 содержащей: Lглутамин, 10% эмбриональной сыворотки теленка (ЭТС), 5мкг/мл инсулина, 10 нг/мл эпидермального фактора роста и 50 мкг/мл гентамицина. Затем отбирали среду для культивирования, клетки ополаскивали в фосфатно-солевом буфере и добавляли контрольную среду для дифференцировки, содержащую RPMI 1640 без сыворотки, 5мкг/мл инсулина (Sigma, I6634), 2мкг/мл гидрокортизона (Sigma, H0888), 5мкг/мл пролактина (Sigma, L-6520), 50 мкг/мл гентамицина и 10 мкг/мл ламинина. Для исследования роли IGF-1 и IGF-2 в функциональной дифференцировке клеток HC11, инсулин заменяли на 20нг/мл IGF-1 (Millipore, 01-208) или 28нг/мл IGF-2 (Millipore, 01-142). В качестве дополнительных контролей были использованы среды, содержащие только инсулин, или IGF-1, или IGF-2, или совместно гидрокартизон и пролактин. Затем клетки культивировали в течение 5 дней, отбирали среду, ополаскивали в фосфатносолевом буфере и лизировали в течение 30 минут во льду в лизирующем буфере, содержащем ингибиторы протеиназ (40 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 276 мМ NaCl, 20% глицерол, 2% NP-40, 4 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 20 мМ флуорида натрия, 2 мМ ортованадата натрия, 40 мкг/мл фенилметилсульфонил флуорида, 50 мг/мл апротинина, 50 мкг/мл леупептина). Лизаты обрабатывали ультразвуком, примерно 10-15 сек, измеряли в ней концентрацию белка, делили на аликвоты и хранили при -800 С. 110 2.6. Выделение белка из ткани молочной железы мыши Выделение белка из ткани молочной железы проводилось согласно протоколу, описанному в статье [325] с незначительной модификацией. Вкратце: молочные железы, хранившиеся на -800C, нарезанная фольга для обертывания молочной железы, 2 металлических плато, молоток, пинцет и металлический шпатель помещались на поверхность сухого льда. Рядом в обычный лед помещались подписанные эппендорфы (объемом 2 мл). В стеклянные пробирки для гомогенизации вносили по 2мл лизирующего буфера, содержащего ингибиторы протеаз (40 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 276 мМ NaCl, 20% глицерол, 2% NP-40, 4 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 20 мМ флуорида натрия, 2 мМ ортованадата натрия, 40 мкг/мл фенилметилсульфонил флуорида, 50 мг/мл апротинина, 50 мкг/мл леупептина) и ставили пробирки для гомогенизации в обычный лед. Затем молочную железу заворачивали в фольгу, заключали между двумя охлажденными металличекими плато и ударами молотка размельчали. Далее разворачивали фольгу и шпателем соскребали измельченную молочную железу в пробирку для гомогенизации, содержащую 2 мл лизирующего буфера с ингибиторами протеиназ, и гомогенизировали, поддерживая пробирки в стакане со льдом. Затем гомогенат переливали в соответствующий подписанный эппендорф (объемом 2 мл) и ставили в лед. После того, как все молочные железы поочередно были таким образом подготовлены, центрифугировали при 40С, 10000 rpm в течение 15 мин. После центрифугирования отбирали супернатант, переносили в чистый эппендорф и измеряли концентрацию белка. 2.7. Вестерн - блот гибридизация Вестерн-блот гибридизацию проводили как описано в статьях [450, 456, 524]. Вкратце: для вестерн-блот гибридизации были использованы 40 мкг тотального белка. Образцы прогревали 5 минут при 95°C и немедленно охлаждали во льду. Затем их центрифугировали и наносили на 4-12% бис-трис денатурирующий гель и проводили электрофорез. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и блокировали в TBS/0.1% Tween 20 с 5% 111 молоком. Далее мембраны инкубировали с первичными антителами. В работе использовали антитела к: IGF-1Rβ (Cell Signaling Technology), IRβ (Santa Cruz Biotechnology), β казеину (Santa Сruz, sc-17969), циклину D1 (Сell Signaling, 2926), Akt (9272, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), P-Akt (Ser473, 3787, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), P-тирозину (9411, Cell Signaling Technology), RAM/MSP (антитела, специфичные к белкам молока мыши, Nordic Immunology), β катенину (Santa Cruz Biotechnology), P-Erk 1/2 (Thr 202 and Tyr 204) и Erk (Cell Signaling Technology). Перечисленные первичные антитела разбавляли 1:1000 в TBS/0.1% Tween 20 с 5% молоком и мембраны инкубировали на качалке при 4°C в течение ночи. Для определения экспрессии бета актина (внутреннего контроля) мембраны инкубировали с антителами к бета актину (Sigma, A5441) разбавленными 1:5000 в TBS/0.1%Tween 20 с 5% молоком при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубирования с первичными антителами мембраны промывали в TBS/0.1%Tween 20 и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с HRP, разбавленными 1:5000 в TBS/0.1%Tween 20 с 5% молоком, в течение 1 часа при комнатной температуре. Для детекции вторичных антител, связанных с HRP, использовали Enhanced chemiluminescence plus (Perkin Elmer Life science, Boston, MA) и фотографировали, используя UtraLum imaging system (Ultra-Lum, Inc., Claremont, CA 91711). Интенсивность полос оценивали денситометрированием с использованием компьютерной программы Scion Image. Числовые значения, соответствующие величине экспрессии исследуемых белков, представлены на графиках как соотношения числового значения экспрессии каждого из указанных белков к числовому значению экспрессии белка бета актина, который был использован в качестве внутреннего контроля. 2.8. Иммунопреципитация Иммунопреципитацию проводили согласно протоколу, описанному в статьях [325, 524]. Вкратце: в эппендорфы вносили 2,5 мг белка и объем доводили до 500 мкл лизирующим буфером, содержащим ингибиторы протеаз и фосфатаз (40 мМ 112 Трис-HCl, pH 8.0, 276 мМ NaCl, 20% глицерол, 2% NP-40, 4 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 20 мМ флуорида натрия, 2 мМ ортованадата натрия, 40 мкг/мл фенилметилсульфонил флуорида, 50 мг/мл апротинина, 50 мкг/мл леупептина, 10 мМ пирофосфат натрия). Затем в соответствующий эппендорф вносили по 10 мкл (разведение 1:50) поликлональных антител к IGF-1Rβ (Cell Signaling Technology) или IRβ (Santa Cruz Biotechnology) и инкубировали при вращении, в течение ночи, при 40 С. Далее в соответствующий эппендорф вносили по 60 мкл 50% суспензии Protein A/G Agarose beads (Thermo Scientific; Rockford, IL), закрывали плотно крышки, заматывали парафильмом и инкубировали 4 часа, при 4 0С, при мягком вращении. Затем центрифугировали 3000 х g, в течение 5 мин, при 40С. Далее осадок промывали дважды в 500 мкл холодного лизирующего буфера и использовали в вестерн блоттинге. 2.9. Проточная цитометрия Проточная цитометрия проводилась согласно протоколу, описанному в статье [451]. Вкратце: первичные клетки эпителия молочной железы были выделены из грудных и паховых молочных желез, как описано выше. Из суспензии первичных клеток эпителия молочной железы с помощью метода сортировки клеток с активированной флуоресценцией (fluorescence-activated cell sorting, FACS) и с использованием антител к поверхностным антигенам клеток были исключены клетки эндотелия сосудов (CD31+), гематопоэтические клетки (CD45+ и TER 119+) и стромальные клетки (CD140a+, Gr-1+, CD11c+). Для этой цели были использованы антитела, конъюгированные с фикоэритрином: CD45, CD140a, Gr-1, TER119, CD31 и CD11c (Biolegend). Для FACS антитела и эпителиальные клетки ресуспендировали в FACS буфере: 106 клеток /мл в PBS с 2% BSA и 2% козьей сывороткой, как описано в статье [451]. После сортировки, была получена очищенная популяция клеток эпителия молочной железы Lin-. В полученной популяции клеток Lin- с помощью проточной цитометрии был исследован популяционный состав клеток эпителия молочной железы мышей дикого типа и мышей, экспрессирующих dnIGF-1R. Для этой цели были 113 использованы антитела, конъюгированные с флуорохромом: к CD29 Alexa Fluor 647 (1:280, Biolegend), к CD24 Alexa Fluor 488 (1:250, Biolegend) и к CD61 Biotin (1:200, BD Pharmingen). Анализ клеточно-ассоциированной флуоресценции проводили с использованием BD FACS Calibur цитометра и TreeStar Inc. FlowJo software. 2.10. Клинический материал и выделение РНК из клеток костного мозга Всего в работе было исследовано 35 образцов, полученных от 26 пациентов с множественной миеломой - 14 мужчин и 12 женщин. У нескольких резистентных больных исследование экспрессии изучаемых генов в ходе лечения повторяли несколько раз. У всех пациентов была диагностирована множественная миелома III стадии. Возраст пациентов составлял от 52 до 72 лет. Диагноз множественной миеломы устанавливался на основании плазмоклеточной инфильтрации костного мозга, иммунохимического исследования сыворотки крови и мочи, рентгенологических данных. Стадирование на момент диагностики проводили по общепринятой системе B.G.M. Durie и S.E. Salmon [154]. Мононуклеарная фракция костного мозга содержала более 70% опухолевых плазматических клеток. Иммунохимическим исследованием установлено, что у 8 пациентов плазматические клетки секретировали PIg (патологический иммуноглобулин) G kappa (Gκ), у 3 пациентов – PIg G lambda (Gλ), у 5 пациентов – PIg G kappa + Bj kappa (Gκ +BJκ), у 1 пациента – PIg Bj А lambda (BJ/Аλ), у 4 пациентов – PIgА kappa (Аκ), у 2 пациентов была определена секреция PIg М kappa (Мκ), у одного пациента BJ и у 2 пациентов PIg не определяли. Все пациенты получали лечение алкилирующими агентами по схемам CSVP и M2 (алкеран, циклофосфан, винкристин, ломустин, преднизолон). Для исследования экспрессии генов от больных получали костно-мозговой пунктат (аспират), из которого в дальнейшем выделяли РНК. С этой целью клетки костного мозга наслаивали на 3 мл Ficoll и центрифугировали при 1500 об/мин 30 мин., после чего на границе раздела фаз отбирали мононуклеарную фракцию клеток костного мозга, содержащую плазматические клетки. Далее отобранные 114 клетки переносили в пробирку с 8 мл раствора Эрла и переосаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин и отмывали в 2-3 мл раствора Эрла. К осадку клеток добавляли 1 мл тризола (Trizol, “Sigma”, США). Процедуру выделения РНК проводили согласно стандартному протоколу. Электрофорез выделенной РНК проводили в 1% агарозном геле при напряжении 100 Вольт в течение 30-40 мин. Качество выделенной РНК оценивали по наличию полос рибосомальной РНК. Концентрацию РНК определяли по оптическому поглощению при длине волны 260 нм. 2.11. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) Экспрессию мРНК исследуемых генов определяли полуколичественным методом ОТ-ПЦР. Реакционная смесь для синтеза кДНК содержала 2 мкг тотальной клеточной РНК, 4 мкл “случайных” праймеров (гексануклеотиды) (фирма “Литех”, Россия), 2 мМ смеси dNTP (“MBI Fermentas”), 2-4 ед. ингибитора РНКаз (“MBI Fermentas”), 100 ед. обратной транскриптазы M-MuLV (“MBI Fermentas”). Объем смеси составлял 25 мкл. Синтез кДНК с матрицы РНК проводили на амплификаторе “Терцик” (“ДНК-технология”, Россия) со следующими параметрами: обратная транскрипция – 42°С, 50 мин; денатурация – 94°С, 5 сек. Для наработки продуктов ПЦР составляли реакционную смесь, содержащую: 1 мкл раствора кДНК; 20 пкмоль каждого из праймеров; 2мМ смеси dNTP (“MBI Fermentas”); 2,5 мкл 10-кратного буфера с (NH4)2SO4 (“MBI Fermentas”), 25 мМ MgCl2; 1 ед. Taq-ДНК полимеразы; Н2О до конечного объема 25 мкл; минерального масла – 30 мкл. Нуклеотидные последовательности, использованных специфических праймеров приведены в таблице 2 (см. в приложении). Реакцию амплификации проводили на амплификаторе “Терцик” (“ДНК-технология”, Россия). ПЦР проводили в линейном диапазоне. Значения температуры отжига и количество циклов ПЦР для каждого из генов приведены в таблице 1 (см. в приложении). В качестве внутреннего контроля определяли экспрессию мРНК гена GAPDH (глицеральдегид -3-фосфат дегидрогеназа). 115 Продукты реакции ОТ-ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Гель фотографировали при ультрафиолетовом возбуждении с помощью цифровой камеры “Samsung CCTV LENZ”. Размеры фрагментов оценивали в соответствии с расположением полос маркерной ДНК, а их интенсивность оценивали денситометрированием с использованием компьютерной программы Scion Image. Числовые значения, соответствующие величине экспрессии мРНК каждого из исследуемых генов, представляли как соотношения числового значения экспрессии мРНК каждого гена к числовому значению экспрессии мРНК гена GAPDH. 2.12. Исследование активности эффекторных каспаз 3 и 7 Для исследования активности каспаз 3 и 7 использовали культуру клеток RGC-5, которая является клоном трансформированных вирусом psi2E1A клеток сетчатки глаза крысы, изолированных в первый послеродовой день [21]. Для исследования активности каспаз 3 и 7 безсывороточной средой и ее ингибирования воздействием инсулина и IGF-1 клетки RGC-5 засевали с плотностью 1,8 х105 клеток/см2 в 96 луночные чашки (Corning Incorporated, Corning, NY14831) и инкубировали 24 часа в среде Dulbecco’s модифицированной Eagles (Cellgro, Mediatech) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой. После 24 часов клетки ополаскивали в фосфатно-солевом буфере и в лунки добавляли по 50 мкл свежей среды без сыворотки, либо среду без сыворотки, содержащую 10нM инсулина или 10нг/мл IGF-1, или совместно инсулин и IGF-1. В контрольные клетки добавляли обычную среду, содержащую 10% сыворотки. Далее клетки культивировали в течение следующих 4 часов и измеряли активности каспаз 3 и 7. Для измерения активности каспаз 3 и 7 был использован Apo-ONE™ Homogeneous Caspase-3/7 Assay Kit (Promega). Активность каспаз 3 и 7 определялась измерением расщепления флуорегенного субстрата, специфичного для каспаз 3 и 7, родамина 110, (Z-DEVD-R110). Измерение флуоресценции каждой лунки производилось с использованием многорядного счетчика Wallac 116 1420 (Perkin Elmer) при возбуждающей длине волны 485 нм и излучающей длине волны 530 нм . Для исследования активности каспаз 3 и 7 в присутствии цитокинов: IL-1β , IL-6 и TNF-α клетки RGC-5 инкубировали в среде Dulbecco’s модифицированной Eagles (Cellgro, Mediatech) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой в течение 20 часов, ополаскивали в фосфатно-солевом буфере и добавляли 50 мкл среды с 10% сывороткой, содержащей 5нг/мл, 15нг/мл и 50нг/мл каждого цитокина и инкубировали следующие 4 часа, а затем измеряли активности каспаз 3 и 7. 2.13. Линии клеток множественной миеломы В работе были использованы три типа суспензионных линий клеток множественной миеломы человека, экспрессирующих на своей поверхности указанные в скобках маркеры дифференцировки: IM-9 (CD138+, CD38-, CD45+, CD56-, CD19+), RPMI 8226 (CD138+, CD38+, CD45-, CD56±, CD19-), RPMI 1640 (CD138+, CD38+, CD45-, CD56±, CD19-) [618]. Происхождение указанных линий клеток: человек, костный мозг, миелома. Способ культивирования: суспензионный в среде RPMI1640 с 10 %-ной ТЭС при 37 °C, 5 % CO2. 2.14. Оценка выживаемости клеток ММ колориметрическим методом (МТТ) и методом подсчета Исследование влияния IGF-1 на выживаемость линий клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, IM9 проводили методом МТТ и методом подсчета. Для этого клетки засевали в 96-луночные планшеты по 2 × 104 клеток на лунку в 150 мкл среды без сыворотки и без IGF-1 (контроль) или без сыворотки, но содержащей человеческий рекомбинантный IGF-1 (Millipore) в концентрации 20 нг/мл. (На каждую линию клеток в присутствии и отсутствии IGF-1 использовали не менее трех лунок). Клетки инкубировали в течение 72 ч в атмосфере с 5% СО2. Через 72 ч в лунки вносили МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5- дифенилтетразолия бромид, исходная концентрация МТТ 5 мг/мл) в объеме 25 мкл на 2–3 ч. Затем удаляли среду и добавляли по 60 мкл диметилсульфоксида 117 (ДМСО). Для гомогенного распределения красителя качали на шейкере в течение 3 мин при 300 об/мин. Анализ проводили на цитофотометре «Унискан» (Фирма «Пикон», Россия) при фильтре 595 нм. Для исследования влияния IGF-1 на выживаемость клеток ММ ставили не менее трех независимых экспериментов. Для исследования влияния IGF-1 на выживаемость клеток ММ методом подсчета указанные клетки были посажены в количестве 1,5×106 клеток на чашку и культивировали в среде без сыворотки в течение 72 ч в присутствии и отсутствии IGF-1 в концентрации 20 нг/мл (также как и в случае использования метода МТТ). Через 72 ч подсчитывали среднее количество клеток (из трех чашек на культуру) каждой культуры и сравнивали полученные результаты. Для исследования влияния IGF-1 на динамику выживаемости указанные клетки были посажены в количестве 7×104 клеток на лунку в 1мл среды без сыворотки в присутствии и отсутствии IGF-1 в концентрации 20 нг/мл. Далее их количество подсчитывали через каждые 24 ч в течение 96 ч. Затем по полученным после подсчета средним (из 6 лунок на культуру) результатам строили кривые выживаемости. Статистическая обработка результатов Все клеточные эксперименты и эксперименты in vivo проводили в трех независимых повторах. Для статистического анализа полученных данных использовалась программа GraphPad Prizm 5.02 (GraphPad Software Inc). Нормальность распределения проверялась по тесту Колмогорова – Смирнова. При нормальном распределении для определения значимых различий в случае сравнения двух выборок применялся t-критерий Стьюдента для сравнения двух групп. Различия считали достоверными при p<0,05. Для оценки корреляционной зависимости между экспрессией исследуемых генов использовали метод линейной корреляции Пирсона (r). При распределении отличном от нормального, для оценки значимых различий между двумя выборками применялся U-критерий Манна-Уитни (U). Анализ общей выживаемости пациентов с множественной 118 миеломой проводили методом Каплана-Майера. Для сравнения маленьких выборок применялся точный тест Фишера. 119 Глава 3. Результаты исследования 3.1. Исследование роли IGF-1R в дифференцировке на модели молочной железы мыши Мы исследовали роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции дифференцировки молочной железы на модели трансгенных линий мышей и линии клеток молочной железы мыши HC11. В работе использовали инбредную линию мышей FVB, которая обычно используется для исследования нормального роста и развития молочной железы, а также для изучения механизмов канцерогенеза в молочной железе. К началу данной работы уже были получены трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий мутантный IGF-1R, у которого в тирозинкиназном домене остаток лизина в положении 1003 заменен на аргинин (KR мутация). Такой доминантно-негативный IGF-1R (dnIGF-1R), димеризуясь с нормальным мышиным IGF-1R, ингибирует его аутофосфорилирование и последующую передачу сигнала внутрь клетки. Этот мутантный человеческий IGF-1R ранее использовался и в других работах для ингибирования IGF-1R - зависимого сигнала в экспериментах in vitro и in vivo, включая трансгенных мышей [162, 260, 261]. В работе мы поставили перед собой три основные задачи: 1.Исследовать роль доминантно-негативного IGF-1R (dnIGF-1R), экспрессирующегося в клетках эпителия молочной железы мыши под промотором кислого сывороточного белка WAP, в регуляции экспрессии казеинов – белков молока и регуляции роста альвеол. 2.Исследовать роль dnIGF-1R, экспрессирующегося в клетках эпителия молочной железы мыши под MMTV промотором, в регуляции третичного разветвления, роста протоков молочной железы и альвеол. 3.Исследовать роль IGF-1 в регуляции экспрессии маркеров функциональной дифференцировки - казеинов на модели линии клеток молочной железы мыши HC11 и в первичной культуре клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором. 120 В соответствии с поставленными задачами были исследованы 4 трансгенные линии мышей, у которых указанный мутантный рецептор экспрессировался в клетках эпителия протоков молочной железы под MMTV промотором, и 6 трансгенных линий мышей, у которых этот рецептор экспрессировался под промотором кислого сывороточного белка WAP (acidic whey protein) (Рисунок 25). Рисунок 25 – Линии трансгенных мышей, экспрессирующих dnIGF-1R, использованные в работе. Экспрессия под MMTV промотором позволяла исследовать роль изучаемого рецептора в дифференцировке молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши. А экспрессия под WAP промотором - в период беременности и лактации. Среди потомства мышей перечисленных линий, после генотипирования были отобраны те животные, которые экспрессировали dnIGF-1R, то есть трансгенные мыши (Tg+). Затем отобранных Tg+ мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором во второй день лактации (L2), и Tg+ мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором (в возрасте 11 недель) усыпляли и удаляли одну паховую молочную железу и выделяли белок. Затем с использованием вестерн блот анализа, 121 определяли общий уровень экспрессии IGF-1R, включающий, как человеческий dnIGF-1R, так и мышиный IGF-1R (Рисунок 26). Рисунок 26 – Денситометрический анализ экспрессии IGF-1R в молочной железе различных линий мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором во второй день лактации (L2) и мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором. В качестве контроля приведена экспрессия IGF-1R у dnIGF-1R негативных мышей (Tg-). 3.1.1. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором После определения уровня экспрессии IGF-1R в молочной железе трансгенных мышей для дальнейших экспериментов были отобраны линия W1 и линия F2, для которых был характерен более высокий уровень экспрессии IGF-1R по сравнению с контрольными мышами, не экспрессирующими dnIGF-1R, то есть не трансгенными мышами (Tg-). Далее, используя вестерн блот анализ, был определен уровень экспрессии IGF-1R в молочной железе группы Tg+ мышей линии W1 на второй день лактации (W1L2). В качестве контроля определяли уровень экспрессии IGF-1R в молочной железе группы Tg- мышей W1L2. При сравнении уровня экспрессии IGF-1R в этих двух группах мышей было установлено, что у Tg+ мышей 122 экспрессия IGF-1R заметно выше, чем у Tg- мышей (Рисунок 27). Таким образом, у трансгенных мышей в линии W1 на второй день лактации экспрессия IGF-1R увеличивается. Уровень средней экспрессии IGF-1R в группах Tg+ и Tg- мышей показан на графике (Рисунок 28). Разница в экспрессии IGF-1R между двумя группами является статистичеcки достоверной (p<0,05). Рисунок 27 – Вестерн блот анализ экспрессии IGF-IR в молочной железе пяти Tg+ и шести Tg- мышей линии W1 на второй день лактации. Рисунок 28 – Денситометрический анализ уровня экспрессии IGF-IR в молочной железе пяти Tg+ и шести Tg- мышей. *, p< 0,05 Как было сказано выше, IGF-1R в клетках может существовать в виде гомодимера IGF-1R/IGF-1R и/или в виде гетеродимера IGF-1R/IR (IR-рецептор 123 инсулина). Что касается клеток эпителия молочной железы, присутствие в них гетеродимера IGF-1R/IR ранее не было показано. Поэтому в этой части работы мы исследовали экспрессию гибридного рецептора IGF-1R/IR в молочной железе мышей дикого типа на второй день лактации (Рисунок 29). Рисунок 29 – Вестерн блот анализ экспрессия гибридного рецептора IGF-1R/IR в молочной железе мышей дикого типа на второй день лактации. В период лактации в молочной железе мыши IGF-1R ассоциируется с IR. Слева: IP и вестерн блоттинг c антителами к IGF-1R (трек 1). IGF-1R отсутствует в супернатанте (трек 2). Справа: IP c антителами к IGF-1R и вестерн-блоттинг c антителами к IR (трек 1). IR и его предшественник присутствуют в супернатанте (трек 2). Результаты показывают, что в молочной железе мыши на второй день лактации наряду с гомодимером IGF-1R/IGF-1R присутствует гибридный рецептор IGF-1R/IR. Используя метод иммунопреципитации с антителами к IGF-1R, а затем вестерн-блоттинг с антителами к IGF-1R и IR было установлено, что в первом случае, когда, и в иммунопреципитации и в вестерн-блоттинге использовались 124 антитела только к IGF-1R, выявление IGF-1R является закономерным (Рисунок 29). Во втором случае, когда в иммунопреципитации использовались антитела к IGF-1R, а в вестерн-блоттинге использовались антитела к IR, и при этом выявлялся IR, то это свидетельствует о том, что IR ко-преципитируется с IGF-1R. Таким образом, эти данные подтверждают присутствие гибридного рецептора IGF-1R/IR в молочной железе нормальных мышей на второй день лактации. Присутствие в молочной железе гибридного рецептора IGF-1R/IR наряду с гомодимером IGF-1R/IGF-1R у мышей на второй день лактации, по-видимому, является важным и необходимым для передачи IGF-1 – зависимых сигналов в ходе нормального развития и дифференцировки молочной железы. В этом эксперименте антитела к IGF-1R преципитируют полностью весь IGF-1R, и это подтверждается отсутствием IGF-1R в супернатанте. Вместе с тем антитела к IGF1R не преципитируют весь IR, что говорит о присутствии IR, который не связан с IGF-1R. Также видно, что в супернатанте присутствует предшественник IR (200 kDa), который не преципитируется с IGF-1R. Далее, используя метод иммунопреципитации с антителами к IGF-1R и IR и метод вестерн-блоттинга с антителами к фосфотирозину (pTyr), был определен уровень фосфорилирования IGF-1R и IR у Tg+ и Tg- мышей линии W1 на второй день лактации (L2) (Рисунок 30). Результаты показали, что у Tg+ мышей фосфорилирование, и IGF-1R, и IR заметно ниже, чем фосфорилирование IGF-1R и IR у Tg- мышей. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что dnIGF-1R формирует гетеродимер, как с IGF-1R, так и с IR мыши и это приводит к заметному ослаблению активации, и IGF-1R, и IR. Как следствие, у Tg+ мышей от этих двух рецепторов к нижележащим эффекторам в цепи передачи сигналов будет поступать более слабый сигнал, чем у Tg- мышей. Видно, что уровень экспрессии dnIGF-1R недостаточный, чтобы полностью блокировать сигналы через IGF-1R и IR (Рисунок 30). Полное же блокирование сигналов, скорее всего, привело бы к гибели мышей. 125 Рисунок 30 – Вестерн блот анализ фосфорилирования IGF-1R и IR в молочной железе Tg+ и Tg- мышей линии W1 на второй день лактации. Тотальный белок, выделенный из молочной железы мышей линии W1 на второй день лактации, использовали для иммунопреципитации (IP) с антителами к IGF-1R или IR. Затем, с использованием вестерн блот анализа с антителами к фосфо-тирозину (p-Tyr), исследовали уровень экспрессии фосфорилированого IGF-1R и IR. Далее блоты отмывали и, с иcпользованием соответствующих антител, определяли тотальный уровень экспрессии этих рецепторов. Результаты исследования показывают, что экспрессия dnIGF-1R в молочной железе лактирующей мыши приводит к заметному ингибированию фосфорилирования (активации), и IGF-1R, и IR. На следующем этапе, используя вестерн-блоттинг, мы определили экспрессию казеинов (белков молока) у Tg+ и Tg- мышей линии W1L2 (Рисунок 31). Оказалось, что у мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором на второй день лактации (L2) уровень экспрессии различных типов казеинов (, , , ) и WAP ниже, чем уровень экспрессии этих казеинов у Tg- мышей (Рисунок 31). Уровень средней экспрессии казеинов в группах Tg+ и Tg- мышей показан на графике (Рисунок 32). Разница в экспрессии казеинов между двумя группами является статистичеcки достоверной (p<0,05). 126 Рисунок 31 – Вестерн блот анализ экспрессии казеинов - белков молока в молочной железе мышей линии W1 на второй день лактации, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором (Tg+), и, не экспрессирующих трансген (Tg- ). Рисунок 32 – Денситометрический анализ уровня экспрессии казеинов - белков молока в молочной железе Tg+ и Tg- мышей линии W1 на второй день лактации. *, p < 0,05 между Tg+ и Tg-. 127 Окрашивание парафиновых срезов молочной железы Tg+ и Tg- W1L2 мышей гематоксилином и эозином показало, что у Tg+ мышей наблюдается уменьшение размеров альвеол по сравнению с контрольными Tg- мышами (Рисунок 33). Рисунок 33 – Окрашивание парафиновых срезов молочной железы Tg+ и Tgмышей линии W1L2 гематоксилином и эозином. На рисунке показано, что у мышей Tg+ наблюдается уменьшение размеров альвеол по сравнению с контрольными мышами Tg-. Наряду с экспрессий казеинов и увеличением размеров альвеол, еще одним характерным маркером дифференцировки молочной железы является формирование и секреция липидных капель дифференцированными клетками эпителия альвеол [34]. Маркером же липидных капель является адипофилин (ADPH), который участвует в метаболизме липидов и присутствует в молоке 128 мыши во время лактации исключительно во фракции секретируемых липидных капель [464]. Иммуноокрашивание срезов молочной железы на второй день лактации антителами к ADPH и окрашивание гематоксилином и эозином показало, что у Tg- мышей на апикальной поверхности клеток эпителия альвеол наблюдается равномерное распределение маленьких липидных капель, что свидетельствует об активной секреции молока (Рисунок 34). Рисунок 34 – Анализ формирования липидных капель в клетках эпителия альвеол у Tg- и Tg+ мышей на второй день лактации. Иммуноокрашивание срезов молочной железы с антителами к ADPH (А и B) (иммунофлюоресценция, красный цвет) и окрашивание гематоксилином и эозином (C и D). Указан масштаб 10 мкм. Для окрашивания ядер клеток эпителия альвеол был использован DAPI (синий цвет) (А и В). 129 Напротив, у мышей, экспрессирующих dnIGF-1R, в цитоплазме клеток эпителия альвеол наблюдается скопление больших липидных капель, что очень напоминает морфологию альвеол мышей дикого типа на 17,5 день беременности (Рисунок 34). Эти данные дают основание предположить о том, что у мышей, экспрессирующих dnIGF-1R, дифференцировка альвеол замедлена. Таким образом, исследование молочной железы мышей линии W1 на второй день лактации, экспрессирующих dnIGF-1R человека под WAP промотором, показало, что экспрессия dnIGF-1R человека ингибирует активацию, и IGF-1R и IR мыши. У таких мышей уменьшается уровень экспрессии различных типов казеинов (, , , , WAP), уменьшаются размеры альвеол, и нарушается формирование липидных капель. Говоря иными словами, исследование характерных маркеров дифференцировки молочной железы показало, что IGF-1R играет важную роль в функциональной дифференцировке молочной железы. 3.1.2. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором На следующем этапе работы мы исследовали отобранные F2 и F3 линий мышей, у которых dnIGF-1R человека экспрессируется в клетках эпителия протоков молочной железы под MMTV промотором. Экспрессия под промотором MMTV позволяет исследовать роль изучаемого рецептора в дифференцировке молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши. Выше было показано, что у мышей на второй день лактации в молочной железе экспрессируется, как гибридный рецептор IGF-1R/IR, так и гомодимер IGF1R/IGF-1R. Однако, что касается взрослых половозрелых, но еще не рожавших мышей, экспрессия этих форм рецепторов может оказаться иной. Чтобы убедиться в том, что экспрессия гомодимера и гетородимера не зависит от стадии дифференцировки молочной железы, мы исследовали их экспрессию у не рожавших и не лактирующих мышей MMTV. Для этого, как и в предыдущем случае, мы использовали метод иммунопреципитации с антителами к IGF-1R и IR (рецептору инсулина), а затем вестерн-блоттинг с антителами к IGF-1R. Было 130 установлено, что в обоих случаях выявляется экспрессия IGF-1R (Рисунок 35). В первом случае, когда, и в иммунопреципитации, и в вестерн блотинге использовались антитела только к IGF-1R, выявление экспрессии IGF-1R является закономерным. Рисунок 35 – Иммунопреципитация и вестерн блот анализ экспрессии IGF-1R и IR. Слева: иммунопреципитация (IP) и вестерн-блоттинг (WB) c антителами к IGF-1R. Справа: IP c антителами к IR и WB c антителами к IGF-1R. Результаты показывают, что в молочной железе MMTV мышей наряду с IGF-1R/IGF-1R гомодимером присутствует IGF-1R/IR гибридный рецептор. Также видно, что уровень экспрессии IGF-1R у MMTV Tg+ мышей заметно выше, чем у Tgмышей. Во втором случае, когда в иммунопреципитации использовались антитела к IR, а в вестерн-блоттинге использовались антитела к IGF-1R, и при этом выявлялась экспрессия IGF-1R, то это свидетельствует о том, что иммунопреципитат содержал гибридный рецептор IGF-1R/IR. То есть антитела к IR, связываясь с IR, осаждали и связанный с ним IGF-1R. Таким образом, было выявлено, что в клетках эпителия протоков молочной железы экспрессируются не 131 только гомодимеры: IGF-1R/IGF-1R и IR/IR, но и гетеродимер IGF-1R/IR, то есть гибридный рецептор. А это в свою очередь свидетельствует в пользу того, что dnIGF-1R человека может димеризоваться не только с IGF-1R мыши, но и с IR мыши и, тем самым может ингибировать активацию, как IGF-1R, так и IR. Кроме того, результаты иммунопреципитации и последующего вестерн блотинга показали, что уровень экспрессии IGF-1R у Tg+ мышей заметно выше, чем у Tg- мышей. Эта разница является свидетельством того, что у Tg+ мышей экспрессируется, как IGF-1R мыши, так и dnIGF-1R человека. То есть, - это суммарный уровень экспрессии IGF-1R. Также этот эксперимент показывает, что экспрессия гомодимера IGF-1R/IGF-1R и гетородимера IGF-1R/IGF-1R не зависят от стадии дифференцировки молочной железы. Далее у мышей линий F2 и F3 на второй день лактации (L2) мы исследовали уровень экспрессии различных типов казеинов (, , , ) и WAP. Наши исследования не показали каких - либо различий в уровне экспрессии перечисленных казеинов у Tg+ и Tg- мышей. Тогда была получена первичная культура клеток эпителия молочной железы от Tg+ и Tg- мышей линии F3 на 13,5-15,5 день беременности и в условии дифференцировки in vitro в этой первичной культуре, с использованием вестерн-блоттинга, была исследована экспрессия казеинов. Исследования показали, что в первичной культуре Tg+ клеток эпителия молочной железы уровень экспрессии казеинов: , и WAP заметно ниже, чем уровень их экспрессии в первичной культуре Tg- клеток эпителия молочной железы (Рисунок 36). На следующем этапе in vitro в клетках эпителия молочной железы MMTV Tg+ и MMTV Tg- мышей исследовали активацию IGF-1/IGF-1R/Akt – зависимого сигнального пути. Для этого были получены первичные культуры клеток эпителия молочной железы от Tg+ и Tg- мышей в возрасте 21 недели, ранее не приносивших потомство (late virgin). Затем в эти культуры вносили на 15 минут экзогенный IGF-1(50nM). Далее выделяли белок и с использованием вестерн блот анализа исследовали уровень экспрессии фосфо-Akt (pAkt) и фосфо-Erk 1/2 (pErk 1/2). 132 Рисунок 36 – Слева вестерн блот анализ экспрессии казеинов - белков молока в первичных эпителиальных клетках молочной железы, выделенных из молочной железы трех MMTV Tg+ и трех MMTV Tg- мышей на 13.5-15.5 день беременности и культивированных в течение 10 дней в лактогенной среде (см. раздел материалы и методы). Справа денситометрический анализ экспрессии казеинов. На рисунке представлен один из трех независимых экспериментов. Исследование показало, что в клетках эпителия молочной железы, экспрессирующих dnIGF-1R, уровень экспрессии pAkt ниже, чем в Tg- клетках (Рисунок 37). В клетках эпителия молочной железы, экспрессирующих dnIGF-1R, уровень экспрессии pErk 1/2 ниже, чем в Tg- клетках (Рисунок 38). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что экспрессия рецептора dnIGF-1R в клетках эпителия молочной железы под MMTV промотором частично ингибирует IGF-1- зависимую активацию IGF-1R/Akt сигнального пути и IGF-1- зависимую активацию IGF-1R/Erk сигнального пути. 133 Рисунок 37 – Денситометрический анализ экспрессии фосфорилированной формы Akt в первичной культуре клеток эпителия молочной железы при воздействии IGF-1 (на графиках приведены значения отношений фосфорилированной Akt к тотатальной Akt). 1 - контроль, первичная культура клеток эпителия молочной железы, полученная от Tg- мышей, и культивированная без воздействия экзогенного IGF-1. 2 и 3 - первичные культуры клеток эпителия молочной железы, полученные, соответственно, от Tg- и Tg+ мышей и культивированные в течение 15 минут при 370С в присутствии 50нМ экзогенного IGF-1. Эксперимент повторяли трижды (n=3). *, p<0,001 между 1 и 2. **, р<0,01 между 2 и 3. Результаты показывают, что экспрессия dnIGF-1R под промотором MMTV частично ингибирует IGF-1- зависимую активацию IGF1R/Akt сигнального пути. Рисунок 38 – Денситометрический анализ сравнения экспрессии фосфорилированной формы Erk в первичной культуре клеток эпителия молочной железы при воздействии IGF-1 (на графиках приведены значения отношений фосфорилированной Erk 1/2 к тотатальной Erk 1/2). 1- контроль, первичная культура клеток эпителия молочной железы, полученная от Tg- мышей, и культивированная без воздействия экзогенного IGF-1. 2 и 3 - первичные культуры 134 клеток эпителия молочной железы, полученные, соответственно, от Tg- и Tg+ мышей и культивированные в течение 15 минут при 37 0С в присутствии 50нМ экзогенного IGF-1. Эксперимент повторяли трижды (n=3). *, p<0,001 между 1 и 2. **, р<0,01 между 2 и 3. Результаты показывают, что экспрессия dnIGF-1R под промотором MMTV частично ингибирует IGF-1- зависимую активацию IGF1R/Erk сигнального пути. На следующем этапе у Tg+ MMTV и Tg- мышей в возрасте 21 недели, ранее не приносивших потомство (late virgin, LV), было исследовано третичное разветвление, рост протоков молочной железы и формирование альвеолярных почек. Как было сказано ранее, с началом эстрального цикла, в период полового созревания, вдоль протоков молочной железы начинается третичное разветвление протоков и формируются альвеолярные почки - зачатки будущих альвеол. С каждым очередным эстральным циклом количество третичного разветвления протоков, их рост и количество альвеолярных почек увеличиваются. Поэтому в работе были исследованы 21-недельные мыши, у которых за этот период прошло достаточно много эстральных циклов и это позволило бы сравнить третичное разветвление протоков, их рост и формирование альвеолярных почек у Tg+ и Tgмышей. Действительно, при сравнении было выявлено, что у 21-недельных Tgмышей, у которых не ингибируется активация IGF-1R, молочная железа выглядит, как нормально развивающаяся, с большим количеством третичных разветвлений и альвеолярных почек (Рисунок 39 и Рисунок 40). У Tg+ мышей, у которых доминантно-негативный IGF-1R димеризуется с IGF-1R мыши и ингибирует его активацию уменьшается и последующую третичное передачу разветвление, сигнала рост внутрь протоков клетки, и заметно формирование альвеолярных почек (Рисунок 39 и Рисунок 40). Такая фенотипическая разница наблюдается во всех исследованных образцах молочных желез двух независимых линий мышей F2 и F3. Таким образом, в ходе исследования было выявлено, что у Tg+ мышей заметно уменьшается третичное разветвление, уменьшается количество протоков и не формируются альвеолярные почки. 135 На следующем этапе у Tg+ MMTV и Tg- мышей в возрасте 21 недели, ранее не приносивших потомство (late virgin, LV), была исследована пролиферация клеток эпителия протоков молочной железы. С этой целью мышам в брюшину был инъецирован бромодезоксиуридин (BrdU), затем через 48 часов удаляли молочную железу, и готовили парафиновые срезы. Рисунок 39 – Тотальный препарат паховой молочной железы 21 недельной мыши. Окраска кармином красным. У Tg+ мышей линии F2, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, заметно уменьшается третичное разветвление, рост протоков и количество альвеолярных почек по сравнению с Tg- мышами. 136 Рисунок 40 – Тотальный препарат паховой молочной железы 21 недельной мыши. Окраска кармином красным. У Tg+ мышей линии F3, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, заметно уменьшается третичное разветвление, рост протоков и количество альвеолярных почек по сравнению с Tg- мышами. Далее на этих срезах, с использованием антител к BrdU, оценивали включение BrdU в ДНК делящихся клеток эпителия протоков. Чем большее количество клеток эпителия протоков делится, тем большее количество BrdU включается в ДНК этих клеток. Исследование показало, что у Tg+ MMTV мышей (линий F2 и F3) включение BrdU в ДНК клеток эпителия заметно слабее, чем у Tg- мышей (Рисунок 41). Говоря иными словами, у Tg+ мышей ингибирование активации IGF-1R приводит к уменьшению пролиферации клеток эпителия 137 протоков молочной железы, и как следствие, это приводит к уменьшению их разветвления, роста и формирования альвеолярных почек (Рисунок 41). Рисунок 41 – Включение BrdU в ДНК клеток эпителия молочной железы Tg+ и Tg- мышей. Розовый цвет показывает включение BrdU в ДНК, синий – окрашивание ядер клеток эпителия протоков DAPI. У мышей линий F2 и F3, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, включение BrdU в ДНК клеток эпителия заметно слабее, чем у Tg- мышей. Мы предположили, что причиной ухудшения третичного разветвления протоков молочной железы у 21-недельных Tg+ мышей, у которых заингибирован IGF-1R - опосредованный сигналинг также может быть изменение в соотношении различных типов клеток, составляющих эпителий протоков. Кратко напомню, что в молочной железе имеются два типа клеток эпителия: 1) миоэпителиальные или базальные (наружные) клетки протоков и альвеол; 2) люминальные клетки 138 (внутренней) выстилки протоков и альвеол. Долгое время лишь предполагалось, что миоэпителиальные и люминальные клетки происходят от общего предшественника [5, 490]. И только в 2006 году Shackleton М. и сотр. идентифицировали субпопуляцию клеток эпителия молочной железы, несущих на своей поверхности маркеры Lin-CD29hiCD24+, и эта субпопуляция была высоко обогащена стволовыми клетками (стволовые/базальные клетки) [5, 490]. Трансплантация клеток с указанным фенотипом в очищенную от эндогенного эпителия паховую молочную железу 3-недельной мыши (cleared mammary fat pads) способствует формированию полноценной функциональной молочной железы с нормальным развитием дифференцированных миоэпителиальных и люминальных клеток [490] . В диссертационной работе был поставлен вопрос, может ли ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигнала у Tg+ мышей привести к уменьшению количества стволовых клеток? Если да, тогда причина уменьшения роста и разветвления протоков молочной железы может быть объяснена. Чтобы ответить на поставленный вопрос, из суспензии свежеизолированных первичных клеток молочной железы, с помощью метода сортировки клеток с активированной флуоресценцией, (fluorescence-activated cell sorting, FACS) и с использованием антител к поверхностным антигенам клеток мы исключили клетки эндотелия сосудов (CD31+), гематопоэтические клетки (CD45+ и TER 119+) и стромальные клетки (CD140a+, Gr-1+, CD11c+). А оставшаяся популяция клеток была обозначена как Lin- (CD31-, CD45-, TER119-, CD140a-, Gr-1-, CD11c-). То есть, Lin- - это популяция клеток эпителия молочной железы, очищенная от клеток эндотелия сосудов, гематопоэтических и стромальных клеток. Далее в полученной популяции Lin- с помощью проточной цитометрии с использованием антител к антигенам CD24 (heat-stable antigen) и CD29 (β1-integrin) мы проанализировали, как изменяется популяция стволовых/базальных клеток в молочной железе у Tg+ мышей по сравнению с Tg- контрольными мышами. Наш анализ показал, что у Tg+ мышей количество стволовых/базальных клеток с 139 фенотипом CD24+CD29hi Lin- составляет 10%, а у контрольных мышей -25% (Рисунок 42). Рисунок 42 – Проточная цитометрия. Анализ популяции стволовых/базальных клеток в молочной железе у Tg+ и Tg- мышей. Показано, что у Tg+ мышей количество стволовых/базальных клеток с фенотипом CD24+CD29hi Linсоставляет 10%, а у контрольных мышей - 25% . **, р< 0,001 (n = 4 независимых анализа). То есть ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигналинга в молочной железе мыши приводит к более чем 2-х кратному уменьшению популяции стволовых клеток. Эти данные получены нами впервые и они выявляют механизмы ослабления роста и разветвления протоков молочной у 21-недельных Tg+ мышей. Наше утверждение выглядит более убедительным на фоне данных, полученных в работе Macias H. и сотр, которые показали, что уменьшение стволовых/базальных клеток приводит к уменьшению боковых ответвлений протоков молочной железы [335]. Указанная на рисунке популяция клеток с фенотипом Lin-CD29loCD24+ соответствует люминальным эпителиальным клеткам, выстилающим протоки и железистые образования молочной железы (Рисунок 42). Как видно из рисунка их количество у Tg+ мышей несколько выросло и составило 77%, тогда как в контроле она составляла 60%. Таким образом, в ходе наших исследований впервые показано, что при ингибировании IGF-1R - опосредуемого сигнала в клетках эпителия молочной 140 железы мыши происходит нарушение нормальной дифференцировки молочной железы – ухудшается рост и третичное разветвление протоков молочной железы, не формируются альвеолярные почки и уменьшается количество пролиферирующих клеток эпителия протоков молочной железы. IGF-1R зависимый сигнальный путь в эпителии молочной железы реализуется через активацию гомодимера IGF-1R/IGF-1R и гетеродимера IGF-1R/IR и активацию Akt и Erk 1/2 киназ. Анализ популяционного состава клеток молочной железы показал, что причиной, лежащней в основе вышеуказанных нарушений может являться уменьшение популяции стволовых/базальных клеток, вызванное блокированием функции IGF-1R. Полученные данные являются оригинальными и отражены в нашей статье, опубликованой в журнале Cancer Research в 2014 году [451]. 3.1.3. Исследование роли IGF-1R - зависимого сигнального пути в канцерогенезе молочной железы, опосредуемом Wnt1 В нашей работе мы попытались найти взаимосвязь между ослаблением IGF1R - опосредуемого сигнала и канцерогенезом молочной железы. Для этого было установлено наблюдение за Tg+ мышами, у которых IGF-1R – зависимый сигнал в клетках эпителия молочной железы был подавлен. Наши наблюдения (в течение одного года) не выявили образование опухолей у Tg+ мышей, что говорит об отсутствии прямой связи между подавлением активности IGF-1R и канцерогенезом молочной железы. К началу нашей работы оставался абсолютно неизученным вопрос, касающийся роли IGF-1R в модуляции действия онкогенов в ходе трансформации и инициации роста опухоли. В диссертационной работе это направление впервые разработано на примере взаимодействия IGF-1R и онкогена Wnt1 в молочной железе мыши. Основанием для исследования этих генов послужили данные, которые свидетельствуют о возможном пересечении сигнальных путей с их участием. Недавно было показано, что для рака молочной железы, который классифицируется, как негативный по экспрессии рецептора эстрогена, рецептора прогестерона и амплификации HER-2/neu (triple negative 141 breast cancers,TNBCs), характерна гиперэкспрессия Wnt1 [141, 388] и, что для таких типов опухолей молочной железы также характерна активация IGF-1R зависимого сигнального пути, который промотирует пролиферацию и выживаемость клеток TNBCs [124, 322]. Для иследования роли IGF-1R - зависимого сигнального пути в Wnt1 опосредуемом канцерогенезе путем скрещивания линий мышей MMTV-dnIGF-1R и MMTV-Wnt1 были получены мыши MMTV-Wnt1/dnIGF-1R, у которых под MMTV промотором в молочной железе одновременно экспрессировались два трансгена. Сравнение времени возникновения опухолей в молочной железе у MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt1/dnIGF-1R мышей показало, что у мышей, экспрессирующих одновременно два трансгена, опухоли молочной железы возникают гораздо раньше и у большего количества, чем у мышей экспрессирующих только MMTV-Wnt1 (Рисунок 43). Рисунок 43 – Время возникновения опухолей молочной железы в зависимости от генотипа MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt1/dnIGF-1R. *, p<0,05 Более того, у 12 из 16 MMTV-Wnt1/dnIGF-1R мышей (т.е. у 75% мышей) в молочной железе возникли две и более опухоли, и, для сравнения, только у 1 из 142 13 MMTV-Wnt1 мышей (т.е. у 8% мышей) число возникших опухолей было больше 1 (Таблица 3). Анализ, проведенный с использованием точного теста Фишера (для маленьких выборок), показал, что разница является статистически значимой (р=0,03). Таблица 3 – Частота возникновения опухолей молочной железы у мышей с генотипами MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt1/dnIGF-1R. *, р<0,05 Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в Wnt1 - опосредуемом канцерогенезе. Учитывая, что экспрессия dnIGF-1R подавляет активацию IGF-1R, можно утверждать, что ослабление IGF-1R сигнализации в контексте с гиперэкспрессией Wnt1 ускоряет канцерогенез и увеличивает количество возникших опухолей. Естественно, возникает вопрос: каким образом ингибирование IGF-1R сигналинга усиливает канцерогенез в молочной железе, опосредованный гиперэкспрессией Wnt1? Возможно, что блокирование IGF-1R опосредуемого сигнала изменяет нормальное развитие клеток эпителия молочной железы таким образом, что они становятся более восприимчивыми к Wnt1 опосредованной инициации роста опухоли. В предыдущей главе мы показали, что в результате ингибирования IGF-1R опосредуемого сигнального пути в клетках эпителия молочной железы мыши происходит нарушение нормальной дифференцировки молочной железы. Возможно ли, что в ходе нарушения дифференцировки происходит изменение в соотношении различных типов клеток, составляющих эпителий протоков молочной железы: стволовых, миоэпителиальных, люминальных и их 143 предшественников? Обратившись к литературе, мы обнаружили, что мишенями Wnt1 - зависимого канцерогенеза являются предшественники люминальных клеток [271, 314, 323]. Эта информация сподвигла нас проанализировать как изменяется популяция предшественников люминальных клеток в молочной железе у Tg+ мышей по сравнению с Tg- контрольными мышами. Для этого из суспензии свежеизолированных первичных клеток молочной железы, с помощью метода сортировки клеток с активированной флуоресценцией, (fluorescenceactivated cell sorting, FACS) и с использованием антител к поверхностным антигенам клеток мы исключили клетки эндотелия сосудов, гематопоэтические и стромальные клетки, то есть получили популяцию клеток Lin-. Далее в полученной популяции Lin- с помощью проточной цитометрии с использованием антител к антигенам: CD24 (heat-stable antigen), CD29 (β1-integrin) и CD61 (β3 integrin) мы проанализировали как изменяется популяция предшественников люминальных клеток в молочной железе у Tg+ мышей по сравнению с Tgконтрольными мышами (Рисунок 44). Рисунок 44 – Проточная цитометрия. Анализ популяции предшественников люминальных клеток в молочной железе у Tg+ и Tg- мышей. Показано, что у Tg+ мышей количество клеток с фенотипом CD24+CD29loCD61+Lin- составляет 20%, а у контрольных мышей -10%. **, р< 0,001 (n = 4 независимых анализа). Наш анализ показал, что у Tg+ мышей количество клеток с фенотипом CD24+CD29loCD61+Lin- составляет 20%, а у контрольных мышей -10% (Рисунок 144 44). То есть ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигнала в молочной железе мыши приводит к 2-х кратному увеличению популяции предшественников люминальных клеток, которые являются мишенью для Wnt1. Эти данные получены нами впервые и они раскрывают механизм, объясняющий, как блокирование IGF-1R усиливает канцерогенез, опосредованный гиперэкспрессией Wnt1. Более подробно об этом будет говориться в главе “Обсуждение”. Полученные данные являются оригинальными и отражены в нашей статье, опубликованой в журнале Cancer Research в 2014 году [451]. Таким образом, мы впервые показали, что блокирование IGF-1R – зависимой сигнализации приводит к увеличению популяции предшественников люминальных клеток и это может являться основной причиной усиления восприимчивости к Wnt1 опосредуемой трансформации и инициации роста опухоли молочной железы. Чтобы подтвердить, что наше заключение является верным, мы исследовали влияние блокирования IGF-1R – зависимого сигнала на активацию сигнальных путей, регулирующих популяцию предшественников люминальных клеток. Одним из кандидатов на это исследование являлся Notch сигнальный путь. Известно, что конститутивная активация Notch сигнализации промотирует увеличение популяции недифференцированных предшественников люминальных клеток [66]. Мы исследовали как изменится Notch – завимый сигнал у Tg+ мышей, у которых блокирован IGF-1R, по сравнению с Tg- контрольными мышами (дикий тип). Для этого мы получили первичную культуру клеток эпителия, от Tg+ мышей и от Tg- контрольных мышей и с помощью ПЦР в реальном времени исследовали экспрессию гена Hey1 (Рисунок 45), который является мишенью Notch, а также экспрессию другого гена Dll4 (Рисунок 46), который является лигандом Notch. Наше исследование показало, что оба этих гена гиперэкспрессируются в первичных клетках эпителия молочной железы, полученных от Tg+ мышей, у которых блокирован IGF-1R. Эти данные говорят о том, что действительно, в клетках эпителия молочной железы блокирование IGF1R приводит к активации Notch сигнального пути, который промотирует 145 увеличение популяции недифференцированных предшественников люминальных клеток. Рисунок 45 – ПЦР в реальном времени. Исследование экспрессии гена Hey1 в первичной культуре клеток эпителия, полученнх от 10 недельных контрольных мышей дикокого типа (1) и от 10 недельных MMTV-dnIGF-1R мышей (2). *, p =0,05 Рисунок 46 – ПЦР в реальном времени. Исследование экспрессии гена DLL в первичной культуре клеток эпителия, полученнх от 10 недельных контрольных мышей дикокого типа (1) и от 10 недельных MMTV-dnIGF-1R мышей (2). *, p < 0,05 В главе “Обзор литературы” мы говорили, что главным предназначением Wnt1 – опосредуемого сигнала является стабилизация и увеличение уровня βкатенина в цитозоле. Гетеродимер, состоящий из β-катенина и Lef/TCF 146 трансактивирует ряд генов, в том числе: с-myc, циклин D1, WISPs и циклооксигеназу-2 [223, 238, 404, 498]. Таким образом, еще одним механизмом ускорения канцерогенеза и увеличения количества возникших опухолей у мышей, одновременно экспрессирующих dnIGF-1R и Wnt1, может являться усиление стабилизации β-катенина в предшественниках люминальных клеток вследствии ослабления IGF-1R – зависимого сигнала. С помощью вестерн-блоттинга мы исследовали уровень экспрессии β-катенина в опухолях молочной железы мышей MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt1/dnIGF-1R (Рисунок 47а и Рисунок 47б). Полученные нами данные показали, что у мышей, одновременно экспрессирующих в молочной железе, и Wnt1, и dnIGF-1R уровень β-катенина выше чем у мышей, экспрессирующих только Wnt1. Рисунок 47a – Вестерн блот анализ экспрессии β-катенина в опухолях молочной железы трех мышей MMTV-Wnt1 и трех мышей MMTV-Wnt1/dnIGF-1R. Эти данные впервые свидетельствуют о том, что IGF-1R - опосредуемый сигнальный путь перекрещивается с Wnt1 - опосредуемым сигнальным путем и участвует в стабилизации β-катенина и объясняют, как блокирование IGF-1R зависимого сигнала может усилить Wnt1 - опосредуемый канцерогенез молочной железы. 147 Рисунок 47б – Денситометрический анализ экспрессии β-катенина в опухолях молочной железы трех мышей MMTV-Wnt1 и трех мышей MMTV-Wnt1/dnIGF1R.*, p<0,05 Таким образом, наши данные впервые показали, что IGF-1R участвует в Wnt1 - опосредованном канцерогенезе молочной железы двумя путями. Блокирование IGF-1R сигнала, во-первых, приводит к увеличению популяции недифференцированных предшественников люминальных клеток, которые являются мишенью для Wnt1 - опосредованного канцерогенеза, а во-вторых, усиливает стабилизацию β-катенина, что приводит к большей активации Wnt1 – опосредованного сигнального пути. Таким образом, мы впервые показали, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь может одновременно участвовать, как в регуляции нормального развития молочной железы, так и в Wnt1 - опосредованном канцерогенезе. Учитывая, что ослабление сигнала через IGF-1R одновременно приводит к ухудшению дифференцировки и усилению Wnt1опосредованного возникновения опухолей, в более широком смысле, это может служить примером взаимосвязи между ухудшением дифференцировки и возникновением опухоли. Данные, полученные в этой части работы легли в основу зарубежных и отечественных статей 2008-2014 годов [11, 451, 524]. 148 3.1.4. Исследование роли IGF-1 и IGF-2 в функциональной дифференцировке клеток молочной железы HC11 С целью дополнить данные, полученные на мышах, и подтвердить, что IGF1R – опосредуемый сигнальный путь участвует в регуляции функциональной дифференцировки молочной железы мыши, мы провели эксперименты на линии клеток эпителия молочной железы мыши HC11. Эта линия является наиболее часто используемой в качестве модели для изучения молекулярных механизмов дифференцировки молочной железы in vitro. Одним из наиболее общепринятых маркеров функциональной дифференцировки клеток эпителия молочной железы мыши in vitro является бета казеин. Экспрессия бета казеина достигается при одновременном присутствии в культуральной среде инсулина и лактогенных гормонов - гидрокартизона и пролактина [534]. Гидрокартизон, в присутствии инсулина, способствует непрерывному накоплению и поддержанию шероховатого эндоплазматического ретикулума, органеллы, которая является чрезвычайно важной для синтеза казеинов - белков молока [359, 392, 393]. Пролактин, в присутствии инсулина, индуцирует транскрипцию с промоторов генов различных казеинов, в том числе, бета казеина [546, 547]. Инсулин стимулирует недифференцированные клетки эпителия к синтезу ДНК и, впоследствии, к делению [522, 547]. В нашем эксперименте вместо традиционно используемого инсулина, мы использовали IGF-1 и IGF-2 и, в присутствии лактогенных гормонов, исследовали экспрессию бета казеина. Как было сказано ранее, IGF-1 и IGF-2 имеют 62% гомологию в аминокислотной последовательности и оба этих фактора связываются с рецептором IGF-1R и активируют его [469]. Также мы говорили о том, что IGF-1/IGF-1R и IGF-2/IGF-1R опосредуемые сигналы участвуют в делении клеток, а именно, промотируют переход G1–S в клеточном цикле [152, 469]. Добавление в культуральную среду только инсулина, или IGF-1, или IGF-2 не активирует в клетках HC11 экспрессию бета казеина (Рисунок 48, треки: 1, 2, 3; Рисунок 49). Гидрокортизон и пролактин, при отсутствии инсулина, или IGF-1 149 или IGF-2, несущественно активируют экспрессию бета казеина (Рисунок 48, трек 4; Рисунок 49). Напротив, в контроле, одновременное присутствие инсулина, гидрокортизона и пролактина сильно активируют экспрессию бета казеина (Рисунок 48, трек 5; Рисунок 49). Одновременное присутствие в культуральной среде IGF-1, гидрокортизона и пролактина также заметно активируют экспрессию бета казеина (Рисунок 48, трек 6; Рисунок 49). Рисунок 48 – Вестерн блот анализ экспрессии бета казеина в клетках HC11 в присутствии: 1 - инсулина (5мкг/мл); 2 – IGF-1 (20нг/мл); 3 – IGF-2 (28нг/мл); 4 – пролактина (5мкг/мл) + гидрокортизона (2мкг/мл); 5 - инсулина + пролактина + гидрокортизона; 6 – IGF-1 + пролактина + гидрокортизона; 7 – IGF-2 + пролактина + гидрокортизона; Бета казеин существенно экспрессируется и в присутствии IGF-2, пролактина и гидрокартизона (Рисунок 48, трек 7; Рисунок 49). Во всех этих случаях разница в экспрессии бета казеина по сравнению с ее экспрессией в присутствии только гидрокортизона и пролактина является статистически достоверной (Рисунок 49). Таким образом, очевидно, что, и IGF-1, и IGF2 в присутствии лактогенных гормонов, могут активировать экспрессию бета казеина. Используемые концентрации IGF-1 и IGF-2 были 20нг/мл и 28нг/мл, соответственно. Известно, что такие концентрации активируют исключительно IGF-1R и опосредуемые ими сигнальные пути в клетке и не активируют рецептор инсулина. 150 Рисунок 49 – Денситометрический анализ сравнения экспрессии бета казеина. П – пролактин. Г-гидрокортизон. **, p< 0,001; ***, p<0,0001 по сравнению с П+Г. В данном эксперименте экспрессия бета казеина в присутствии инсулина, гидрокортизона и пролактина взята в качестве контроля. Таким образом, данные полученные на клетках HC11 дополняют и подтверждают данные, полученные нами в экспериментах на мышах, и свидетельствуют в пользу того, что, действительно, факторы роста IGF-1 и IGF-2, которые связываются и активируют IGF-1R, могут участвовать в регуляции молекулярных механизмов функциональной дифференцировки молочной железы – продуцировании белков молока. Одним из необходимых условий функциональной дифференцировки молочной железы у мышей является экспрессия в клетках эпителия циклина D1. Было показано, что Сyl-1 -/- мыши, которые не экспрессировали циклин D1 медленнее росли и достигали меньших размеров по сравнению с нормальными мышами, однако, были вполне жизнеспособными, могли достигать половозрелого возраста и давать потомство, но не могли их вскармливать из-за неспособности продуцировать молоко [159]. Учитывая тот факт, что IGF-1/IGF-1R сигнальный путь участвует в регуляции синтеза циклина D1, мы исследовали экспрессию данного циклина при IGF-1 зависимой дифференцировке клеток эпителия молочной железы мыши HC11 с тем, чтобы подтвердить in vitro присутствие 151 взаимосвязи между IGF-1 зависимой экспрессией бета казеина и экспрессией циклина D1. Известно, что циклин D1 гиперэкспрессируется в делящихся клетках и промотирует G1–S переход в клеточном цикле [152, 469]. В нашем эксперименте клетки HC11 находились в плотном монослое, не делились в течение более чем 5 дней и, как следствие, при отсутствии факторов роста, экспрессия циклина D1 была слабой (Рисунок 50, трек 1; Рисунок 51). Рисунок 50 – Вестерн блот анализ экспрессии циклина D1 в клетках HC11 в присутствии: 1 - без сыворотки; 2 – пролактина (5мкг/мл) + гидрокортизона (2мкг/мл); 3 – инсулина (5мкг/мл) + пролактина + гидрокортизона; 4 – IGF-1 (20нг/мл) + пролактина + гидрокортизона; 5 – IGF-2 (28нг/мл) + пролактина + гидрокортизона; В качестве внутреннего контроля оценивали экспрессию бета актина. Рисунок 51 – Денситометрический анализ сравнения экспрессии циклина D1. П – пролактин. Г-гидрокортизон. *, p<0,05; **, p< 0,001 по сравнению с П+Г. При добавлении в среду пролактина и гидрокартизона количество циклина D1 не увеличилось (Рисунок 50, трек 2; Рисунок 51). Вместе с тем, одновременное присутствие инсулина, пролактина и гидрокартизона сильно активировали 152 экспрессию циклина D1 (Рисунок 50, трек 3; Рисунок 51). Замена инсулина на IGF-1 или IGF-2 в присутствии пролактина и гидрокартизона также заметно повысили экспрессию циклина D1 (Рисунок 50, треки: 4 и 5; Рисунок 51). Во всех этих случаях разница в экспрессии циклина D1 по сравнению с ее экспрессией в среде без факторов роста или в присутствии только гидрокортизона и пролактина является статистически достоверной (Рисунок 51). Таким образом, экспрессия циклина D1 в клетках HC11 связана с присутствием или инсулина, или IGF-1, или IGF-2. При сравнении экспрессии циклина D1 и бета казеина оказалось, что в ходе функциональной дифференцировки клеток HC11 in vitro, циклин D1 и бета казеин коэкспрессируются (Рисунок 48 и Рисунок 50). Наши исследования показали, что вопреки общепринятому пониманию о исключительно важной роли циклина D1 для деления клеток, оказалось, что в присутствии IGF-1 или IGF-2, циклин D1 может гиперэкспрессироваться в неделящихся, функционально дифференцированных клетках эпителия молочной железы HC11 и его экспрессия ассоциируется с экспрессией бета казеина. Таким образом, результаты проведенных исследований подтверждают наши данные, полученные ранее в экспериментах in vivo, на мышах, и свидельствуют в пользу того, что факторы роста IGF-1 и IGF-2 могут участвовать в функциональной дифференцировке молочной железы - регулируют экспрессию бета казеина. Также нами выявлено, что экспрессия бета казеина сопровождается IGF-1- и IGF-2 -зависимой коэкспрессией циклина D1 . 3.2. Исследование роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ при множественной миеломе человека 3.2.1. Исследование экспрессии мРНК IGF-1 и мРНК генов, ответственных за возникновение МЛУ в клиническом материале В ходе длительного лечения у многих больных ММ развивается множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), которая становится основной причиной потери ответа на лечение и, как следствие, причиной смертности. Ранее мы 153 говорили о том, что в МЛУ вовлечены АТФ-зависимые транспортеры MDR1, MRP1, BCRP, а также белок LRP [7, 8, 620]. Предварительные исследования показали, что в микроокружении костного мозга в высокой концентрации присутствует IGF-1. Он экспрессируется клетками стромы (фибробластами) и остеобластами. Одновременно в микроокружении костного мозга на поверхности клеток ММ повышается экспрессия IGF-1R. В связи с этим было предположено, что IGF-1 может иметь отношение к возникновению МЛУ [229]. Вместе с тем, роль IGF-1 и его рецептора в регуляции экспрессии MDR1 и других генов, ответственных за МЛУ при ММ, на сегодня не изучена. Поэтому в данной работе мы поставили задачу в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных ММ исследовать, с одной стороны, экспрессию мРНК гена IGF-1, а с другой - мРНК генов, ответственных за МЛУ: MDR1, MRP1, LRP, BCRP и провести корреляционный анализ их коэкспрессии. Для выполнения этой задачи из костно-мозговых пунктатов, полученных от больных, была выделена тотальная РНК и методом полуколичественной ОТ-ПЦР исследована экспрессия мРНК перечисленных генов (Рисунки: 52, 53, 54, 55, 56, 57). Рисунок 52 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК гена IGF-1 в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных ММ. Рисунок 53 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК гена MDR1 в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных ММ. 154 Рисунок 54 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК гена MRP1 в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных ММ. Рисунок 55 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК гена BCRP в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных ММ. Рисунок 56 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК гена LRP в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных ММ. Рисунок 57 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК гена GAPDH в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных ММ. Всего в работе было исследовано 35 образцов, полученных от 26 больных 14 мужчин и 12 женщин. У всех пациентов была диагностирована множественная миелома III стадии. Возраст пациентов составлял от 52 до 72 лет. Диагноз множественной миеломы устанавливался на основании плазмоклеточной 155 инфильтрации костного мозга, иммунохимического исследования сыворотки крови и мочи, рентгенологических данных. Стадирование на момент диагностики проводили по общепринятой системе B.G.M. Durie и S.E. Salmon [154]. Мононуклеарная фракция костного мозга содержала более 70% опухолевых плазматических клеток. Иммунохимическим исследованием установлено, что у 8 пациентов плазматические клетки секретировали PIg (патологический иммуноглобулин) G kappa (Gκ), у 3 пациентов – PIg G lambda (Gλ), у 5 пациентов – PIg G kappa + Bj kappa (Gκ +BJκ), у 1 пациента – PIg Bj А lambda (BJ/Аλ), у 4 пациентов – PIgА kappa (Аκ), у 2 пациентов была определена секреция PIg М kappa (Мκ), у одного пациента BJ и у 2 пациентов PIg не определяли. На момент исследования у всех пациентов была зарегистрирована клиническая резистентность к схемам химиотерапии, содержащим алкилирующие агенты: схема CSVP (циклофосфан, сарколизин, винкристин, преднизолон) и схема M2 (мелфалан, циклофосфан, ломустин, винкристин, преднизолон). Как было сказано выше, всего было исследовано 35 образцов, полученных от 26 больных. У нескольких больных исследование экспрессии изучаемых генов в ходе лечения повторяли несколько раз. В данной работе мы не ставили перед собой цель исследовать динамику изменения экспрессии изучаемых генов в ходе лечения. Тем не менее, все эти повторные и дополнительные исследования могли служить контролем для изучения связи между экспрессией гена IGF-1 и генов МЛУ. Поскольку в ходе лечения экспрессия одних из исследуемых генов могла меняться, а других нет, то можно было оценить существование взаимосвязи между ними. В качестве внутреннего контроля для оценки количества взятой в реакцию РНК определяли экспрессию мРНК гена GAPDH (глицеральдегид -3фосфат дегидрогеназа) (Рисунок 57). Интенсивность свечения продуктов реакции ОТ-ПЦР оценивали денситометрированием. Относительные величины экспрессии мРНК исследуемых генов, то есть отношения числовых значений экспрессии мРНК исследуемых генов к числовому значению экспрессии мРНК гена GAPDH представлены в таблицах: 4, 5, 6, 7. 156 Таблица 4 – Экспрессия мРНК IGF-I и MDR1 у больных ММ Уровень № образца, IGF-I/GAPDH IGF-I/GAPDH MDR1/GAPDH MDR1/GAPDH “+” и “-“ Значения в цифрах “+” и “ –“ Значения в цифрах 27 +++++++ 6,75 +++++ 4,50 46 +++ 2,89 +++++++ 7,38 +++ 2,75 ++ 1,91 4 +++ 2,56 ++ 1,73 66 +++ 2,52 ++ 2,11 1 ++ 2,34 ++ 1,86 5 ++ 2,21 ++ 1,57 49 ++ 2,02 ++ 1,77 43 ++ 1,65 ++ 1,84 68 ++ 1,71 ++ 1,49 36 ++ 1,50 +++ 2,99 79 + 1,39 + 1,41 41 + 1,04 ++ 2,08 22 + 1,00 +/- 0,23 58 + 0,93 ++ 2,02 35 + 0,64 ++ 1,89 88 +/- 0,48 + 0,68 62 +/- 0,48 + 0,54 64 +/- 0,40 + 0,65 65 +/- 0,38 + 0,52 23 +/- 0,37 + 0,65 20 +/- 0,34 + 0,71 89 +/- 0,34 + 0,62 34 +/- 0,35 +/- 0,31 57 +/- 0,29 +/- 0,46 +/- 0,20 +/- 0,44 59 +/- 0,14 +/- 0,40 24 +/- 0,12 + 0,70 21 - 0,00 + 1,38 29 - 0,00 + 1,23 18 - 0,00 + 1,17 26 - 0,00 + 1,09 81 - 0,00 + 0,95 33 - 0,00 + 1,00 22э - 0,00 +/- 0,42 экспрессии полученного от Группа В. Экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует. Группа А. Экспрессия мРНК IGF-1 умеренная или повышенная. мРНК больного ММ 41 27 э э 157 Таблица 5 – Экспрессия мРНК IGF-I и MRP1 у больных ММ Уровень № образца, IGF-I/GAPDH IGF-I/GAPDH MRP1/GAPDH MRP1/GAPDH “+” и “-“ Значения в цифрах “+” и “ –“ Значения в цифрах 27 +++++++ 6,75 ++++++ 6,48 46 +++ 2,89 +++ 2,60 41э +++ 2,75 +++ 2,62 4 +++ 2,56 + 0,80 66 +++ 2,52 ++++ 4,43 1 ++ 2,34 + 1,26 5 ++ 2,21 + 1,06 49 ++ 2,02 + 1,25 43 ++ 1,65 + 1,16 68 ++ 1,71 ++ 2,03 36 ++ 1,50 +++ 3,48 79 + 1,39 ++++ 3,71 41 + 1,04 ++ 1,5 22 + 1,00 + 0,98 58 + 0,93 +++ 2,7 35 + 0,64 + 1,28 88 +/- 0,48 + 0,78 62 +/- 0,48 + 0,65 64 +/- 0,40 + 0,77 65 +/- 0,38 + 0,65 23 +/- 0,37 + 0,93 20 +/- 0,34 + 0,88 89 +/- 0,34 + 0,84 34 +/- 0,35 - 0,00 57 +/- 0,29 + 0,61 27э +/- 0,20 + 0,62 59 +/- 0,14 + 0,52 24 +/- 0,12 + 0,85 21 - 0,00 ++ 1,70 29 - 0,00 ++ 2,21 18 - 0,00 + 1,09 26 - 0,00 + 1,00 81 - 0,00 + 1,27 33 - 0,00 + 1,19 - 0,00 + 0,56 экспрессии полученного от Группа В. Экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует. Группа А. Экспрессия мРНК IGF-1 умеренная или повышенная. мРНК больного ММ 22 э 158 Таблица 6 – Экспрессия мРНК IGF-I и BCRP у больных ММ № образца, экспрессии полученного от мРНК больного ММ Группа В. Экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует. Группа А. Экспрессия мРНК IGF-1 умеренная или повышенная. Уровень IGF-I/GAPDH IGF-I/GAPDH BCRP/GAPDH BCRP/GAPDH “+” и “-“ Значения в цифрах “+” и “ –“ Значения в цифрах 27 +++++++ 6,75 +++++ 4,73 46 +++ 2,89 ++++ 3,68 +++ 2,75 +++ 2,72 4 +++ 2,56 + 1,12 66 +++ 2,52 +++ 2,70 1 ++ 2,34 + 1,34 5 ++ 2,21 + 1,33 49 ++ 2,02 + 1,12 43 ++ 1,65 ++ 1,71 68 ++ 1,71 ++ 1,68 36 ++ 1,50 ++ 2,44 79 + 1,39 ++++ 3,9 41 + 1,04 ++ 1,49 22 + 1,00 ++ 1,57 58 + 0,93 ++ 2,36 35 + 0,64 + 1,04 88 +/- 0,48 + 0,56 62 +/- 0,48 + 0,63 64 +/- 0,40 + 0,75 65 +/- 0,38 + 0,61 23 +/- 0,37 + 0,83 20 +/- 0,34 + 0,62 89 +/- 0,34 + 0,82 34 +/- 0,35 +/- 0,40 57 +/- 0,29 + 0,62 27э +/- 0,20 +/- 0,37 59 +/- 0,14 +/- 0,47 24 +/- 0,12 + 0,55 21 - 0,00 + 1,34 29 - 0,00 +++ 2,79 18 - 0,00 + 1,00 26 - 0,00 + 1,00 81 - 0,00 + 1,10 33 - 0,00 + 1,14 - 0,00 + 0,50 41 22 э э 159 Таблица 7 – Экспрессия мРНК IGF-I и LRP у больных ММ № образца, экспрессии полученного от мРНК больного ММ Группа В. Экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует. Группа А. Экспрессия мРНК IGF-1 умеренная или повыенная. Уровень IGF-I/GAPDH IGF-I/GAPDH LRP/GAPDH LRP/GAPDH “+” и “-“ Значения в цифрах “+” и “ –“ Значения в цифрах 27 +++++++ 6,75 ++ 1,99 46 +++ 2,89 + 1,33 +++ 2,75 ++ 2,22 4 +++ 2,56 ++++ 3,77 66 +++ 2,52 +++ 2,70 1 ++ 2,34 ++++ 3,59 5 ++ 2,21 ++++ 3,83 49 ++ 2,02 ++ 1,75 43 ++ 1,65 ++ 1,51 68 ++ 1,71 ++ 1,56 36 ++ 1,50 +++ 2,75 79 + 1,39 ++ 1,82 41 + 1,04 + 1,33 22 + 1,00 +/- 0,27 58 + 0,93 ++ 1,59 35 + 0,64 ++ 2,02 88 +/- 0,48 + 0,60 62 +/- 0,48 +/- 0,47 64 +/- 0,40 + 0,56 65 +/- 0,38 +/- 0,47 23 +/- 0,37 + 0,61 20 +/- 0,34 + 0,58 89 +/- 0,34 +/- 0,49 34 +/- 0,35 +/- 0,34 57 +/- 0,29 +/- 0,39 27э +/- 0,20 +/- 0,47 59 +/- 0,14 +/- 0,39 24 +/- 0,12 + 0,65 21 - 0,00 + 1,00 29 - 0,00 +/- 0,25 18 - 0,00 + 1,00 26 - 0,00 + 1,00 81 - 0,00 + 0,91 33 - 0,00 + 1,42 - 0,00 +/- 0,38 41 22 э э 160 Также для наглядности использованы знаки «+» и «-». При этом, «-» означает, что экспрессия гена отсутствует; «+/–» - экспрессия гена очень слабая, в цифровом зачении в интервале (0,5<d); «+» - экспрессия гена выглядит, как отчётливо видимая полоска в агарозном геле, в цифровом значении в интервале (0,5≤ d<1,5); «++» - экспрессия гена повышена в 2 раза в интервале (1,5≤ d <2,5) ; «+++» - экспрессия гена повышена в 3 раза, в интервале (2,5≤ d< 3,5) и т. д, где d – относительная экспрессия исследуемого гена. С целью сопоставить экспрессию мРНК гена IGF-1 и мРНК генов МЛУ были определены две группы образцов A и B (Таблицы: 4, 5, 6, 7). В группу A вошли образцы, в которых уровень экспрессии мРНК гена IGF-1 был умеренный или высокий, а в группу B вошли образцы, в которых уровень экспрессии мРНК гена IGF-1 был низкий или мРНК IGF-1 вовсе отсутствовала. Затем в группах A и B была оценена степень экспрессии мРНК генов МЛУ: MDR1, MRP, LRP, BCRP. Экспрессия мРНК IGF-1 была выявлены в 28/35 (80%) образцах ММ. В 7/35 (20%) образцах мРНК IGF-1 не экспрессировалась. В целом, экспрессия IGF1 была гетерогенной. Умеренная или высокая экспрессия наблюдалась в 16 образцах (группа А) (Таблица 4). Слабая экспрессия или отсутствие экспрессии выявлена в 19 образцах (группа В) (Таблица 4). На рисунке 58 представлены средние значения экспрессии мРНК гена IGF-1 в группах A и B. (Поскольку мы преднамеренно распределили в две группы значения экспрессии мРНК гена IGF1, то между полученными двумя выборками мы не определяли значимые различия). Экспрессия мРНК MDR1 была выявлена в 35/35 (100%) образцах ММ. Она была гетерогенной и различалась в разных образцах в два и более раз (Таблица 4). При сопоставлении экспрессии мРНК IGF-1 и экспрессии мРНК MDR1 было обнаружено, что экспрессия мРНК MDR1 высокая преимущественно в тех образцах, где регистрируется умеренная или высокая экспрессия IGF-1 (группа А) и, напротив, MDR1 экспрессируется слабее в образцах, где уровень экспрессии мРНК гена IGF-1 слабый или отсутствует (группа В). На рисунке 59 представлены средние значения экспрессии мРНК гена MDR1 в группах A и B. 161 Разница в экспрессии мРНК MDR1 в этих группах является статистически значимой (p < 0,001). Рисунок 58 – На графике представлены средние значения экспрессии мРНК IGF-1 в группах А и В. Рисунок 59 – На графике представлены средние значения экспрессии мРНК MDR1 в группах А и В. **, р < 0,001 162 Экспрессия мРНК MRP1 была выявлена в 34/35 (97%) образцах ММ. Она была гетерогенной и отличалась в два и более раз (Таблица 5). При сопоставлении экспрессии мРНК IGF-1 и мРНК MRP1 было обнаружено, что экспрессия мРНК MRP1 высокая преимущественно в тех образцах, где умеренная или высокая экспрессия IGF-1 (группа А) и, напротив, MRP1 экспрессируется слабее в образцах, где уровень экспрессии мРНК гена IGF-1 слабый или отсутствует (за исключением № 21 и № 29) (группа В) (Таблица 5). На рисунке 60 представлены средние значения экспрессии мРНК гена MRP1 в группах А и B. Разница в экспрессии мРНК MRP1 в этих группах является статистически значимой (p < 0,001). Рисунок 60 – На графике представлены средние значения экспрессии мРНК MRP1 в группах А и В. **, р < 0,001 Экспрессия мРНК BCRP была выявлена в 35/35 (100%) образцах ММ. Она была гетерогенной и отличалась в два и более раз (Таблица 6). При сопоставлении экспрессии мРНК IGF-1 и мРНК BCRP1 было обнаружено, что экспрессия мРНК BCRP высокая преимущественно в тех образцах, где регистрируется умеренная или высокая экспрессия IGF-1 (группа А) и, напротив, BCRP экспрессируются слабее в образцах, где уровень экспрессии мРНК гена IGF-1 слабый или отсутствует (за исключением № 29) (группа В). На рисунке 61 представлены 163 средние значения экспрессии мРНК гена BCRP в группах А и B. Разница в экспрессии мРНК BCRP в этих группах является статистически значимой (p < 0,0001). Рисунок 61 – На графике представлены средние значения экспрессии мРНК BCRP в группах А и В. ***, р < 0,0001 Экспрессия мРНК LRP была выявлена в 35/35 (100%) образцах ММ. Экспрессия мРНК LRP была гетерогенной и отличалась в два и более раз (Таблица 7). При сопоставлении экспрессии мРНК IGF-1 и мРНК LRP было обнаружено, что экспрессия мРНК LRP высокая преимущественно в тех образцах, где умеренная или высокая экспрессия IGF-1 (за исключением № 22) (группа А) и, напротив, LRP экспрессируется слабее в образцах, где уровень экспрессии мРНК гена IGF-1 слабый или отсутствует (группа В). На рисунке 62 представлены средние значения экспрессии мРНК гена LRP в группах A и B. Разница в экспрессии мРНК LRP в этих группах является статистически значимой (p < 0,0001). Как было сказано выше, у трех резистентных больных исследование экспрессии изучаемых генов в ходе лечения повторяли несколько раз в связи с изменением схемы лечения. (Исследуемый клеточный субстрат в ходе лечения не менялся. Наличие плазматических клеток в количестве более 70% подтверждалось цитологическими исследованиями аспиратов костного мозга). 164 Рисунок 62 – На графике представлены средние значения экспрессии мРНК LRP в группах А и В. ***, р < 0,0001 У первого пациента исследование повторяли 3 раза (образцы №: 5, 59, 62). Как видно из таблиц: 4, 5, 6, 7 экспрессия гена IGF-1 в ходе лечения уменьшалась, при этом также уменьшалась экспрессия генов MDR1, BCRP и LRP. Экспрессия гена MRP1 не менялась. У второго пациента исследование экспрессии изучаемых генов повторяли дважды (образцы №: 20 и 36). Как видно, в ходе лечения экспрессия гена IGF-1 у этого пациента увеличивалась, при этом также увеличивалась экспрессия генов MDR1, MRP1, BCRP и LRP. У третьего пациента исследование экспрессии изучаемых генов также повторяли дважды (образцы №: 88 и 89). Из таблиц: 4, 5, 6, 7 видно, что экспрессия гена IGF-1 в ходе лечения не менялась, при этом также не менялась экспрессия генов MDR1, MRP1, BCRP и LRP. Еще у троих больных экспрессию изучаемых генов определяли в неагрегированных (отдельно плавающих в питательной среде) и в кластерах мононуклеарных клеток, содержащих плазматическик клетки в количестве более 70% (образцы №: 57 и 58, 66 и 68, 23 и 24). Из таблиц видно, что во всех случаях, где была повышена экспрессия гена IGF-1 наблюдалась повышенная экспрессия генов МЛУ, и наоборот, где экспрессия IGF-1 была понижена наблюдалась 165 пониженная экспрессия генов МЛУ. Таким образом, приведенные повторные и дополнительные исследования показывают, что в подавляющем большинстве случаев наблюдается и сохраняется корреляция между экспрессией гена IGF-1 и экспрессией генов МЛУ - MDR1, MRP1, BCRP и LRP. Также для оценки корреляционной зависимости между экспрессией исследуемых генов использовали метод Проведенный анализ показал, что линейной корреляции экспрессия мРНК Пирсона (r). IGF-1 достоверно коррелирует с экспрессией мРНК всех исследованных генов МЛУ: IGF-1 и MDR1 r = 0,69 (p<0.0001), IGF-1 и MRP1 r = 0.74 (p<0.0001), IGF-1 и BCRP r = 0.72 (p<0.0001), IGF-1 и LRP r = 0.60 (p<0.0001). В заключение этой части работы отметим, что в образцах, полученных от больных ММ, экспрессия мРНК IGF-1 и экспрессия мРНК генов МЛУ коррелируют. Такая корреляция установлена впервые и позволяет сделать предположение о том, что, возможно, фактор роста IGF-1 участвует в регуляции экспрессии генов МЛУ. В пользу такого предположения свидетельствует то, что в промоторной области гена MDR1 и LRP есть сайт связывания с транскрипционным фактором NF-kB, экспрессия которого регулируется IGF-1. Что касается генов MRP1 и BCRP, то в промоторном регионе они имеют явно отличающиеся от генов MDR1 и LRP регуляторные мотивы, и пока неясно, какие именно сайты связывания и какие транскрипционные факторы важны в IGF-1 – зависимой регуляции экспрессии этих генов. Наше предположение о том, что фактор роста IGF-1 участвует в регуляции экспрессии генов МЛУ основано на корреляционных данных, поэтому, дальнейшие исследования в этом направлении мы выполнили на культурах клеток множественной миеломы (см. главу 3.2.3). 3.2.2. Зависимость общей выживаемости пациентов с ММ от уровня экспресссии гена IGF-1 Мы сопоставили полученные данные по экспрессии мРНК гена IGF-1 с общей выживаемостью больных ММ в группах A и B (Таблица 8). Общая 166 выживаемость – это длительность жизни от момента постановки диагноза до летального исхода (конца наблюдения). Таблица 8 – Общая выживаемость больных ММ № образца, IGF-I/GAPDH Общая выживаемость “+” и “-“ (месяцы) 27 +++++++ 19 46 +++ 34 41э +++ 24 4 +++ 19 1 ++ 79 5 ++ 36 49 ++ 6 43 ++ 32 36 ++ 18 79 + 35 41 + 56 22 + 96 35 + 63 64 +/- 61 65 +/- 43 23 +/- 29 89 +/- 69 34 +/- 34 27э +/- 93 21 - 63 29 - 60 18 - 72 26 - 94 81 - 12 33 - 79 22э - н.о. полученного от экспрессии мРНК больного ММ Группа В. Экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует. Группа А. Экспрессия мРНК IGF-1 умеренная или повышенная. Уровень 167 На графике (Рисунок 63) представлена зависимость общей выживаемости пациентов с ММ от уровня экспресссии мРНК IGF-1 в группах А и Б. Как видно из графика (Рисунок 63) к 60-ти месяцам наблюдения в группе с умеренной или повышенной экспрессией гена IGF-1 остаются в живых немногим более 20% пациентов, тогда как в группе, где экспрессия этого гена слабая или отсутствует за это же время в живых остаются 60% пациентов. Рисунок 63 – Общая выживаемость пациентов с ММ в группе А (экспрессия мРНК IGF-1 умеренная или повышенная) и группе Б (экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует). Тем не менее к 100 месяцам наблюдения все исследованные пациенты погибают. Медиана общей выживаемости в группе пациентов со слабой экспрессией или с отсутствием экспрессии гена IGF-1 составляет более 5-ти лет (62 мес.), а в группе с умеренной и повышенной экспрессией гена IGF-1 медиана составляет менее 3-х лет (34 месяца) (Рисунок 63). Расчет U-критерия МаннаУитни показал, что разница между медианами общей выживаемости этих групп является статистически значимой (р<0,05). Таким образом, если оценивать выживаемость по медианам общей выживаемости, то можно утверждать, что, чем 168 выше экспрессия гена IGF-1, тем хуже выживаемость пациентов с ММ. Вместе с тем, тест Каплана-Майера не показал достоверных различий между группами ( p=0,2). Отсутствие достоверных отличий между общей выживаемостью больных в группах может быть связана с тем, что все пациенты к 100 месяцам погибают и кривые на графике после 60 месяцев начинают сходиться. Другая причина отсутствия достоверных отличий может быть связана с небольшим количеством пациентов в выборке. Таким образом, в ходе исследования нами выявлена обратная корреляция между уровнем экспрессии гена IGF-1 и общей выживаемостью пациентов с ММ - у пациентов с высоким уровнем экспрессии IGF-1 уменьшается общая выживаемость. Однозначно объяснить механизм причинно-следственной взаимосвязи между усилением экспрессии гена IGF-1 и уменьшением общей выживаемости больных ММ сложно. Тем не менее, можно предположить, что причиной уменьшения общей выживаемости больных ММ может быть возникновение МЛУ, ведущей к потере чувствительности к химиотерапии. Другой причиной уменьшения общей выживаемости больных ММ может быть связана с IGF-1 – зависимым повышением жизнеспособности клеток ММ, например, вследствие потери ими чувствительности к апоптозу. В связи с этим мы исследовали роль IGF-1 в регуляции выживаемости клеток ММ на культурах клеток ММ человека. Об этих экспериментах будет говориться в главе, посвященном исследованию роли IGF-1 в выживаемости нормальных и опухолевых клеток. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что высокая экспрессия гена IGF-1 может являться плохим прогностическим фактором при ММ. 3.2.3.Исследование роли IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ на моделях линий культур клеток множественной миеломы человека В продолжение работы, выполненной на клиническом материале, полученном от больных ММ, мы поставили перед собой цель исследовать роль экзогенного IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов: MDR1, MRP1, BCRP, 169 LRP, ответственных за МЛУ в трех линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. В первой части работы методом полуколичественной ОТ-ПЦР мы охарактеризовали экспрессию мРНК генов MDR1, MRP1, LRP и BCRP (Рисунок 64). Мы показали, что мРНК перечисленных генов экспрессируются во всех трех линиях культур клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. Рисунок 64 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК генов, обуславливающих МЛУ, в линиях культур клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, IM9 в среде с 10%-ной ТЭС. Уровень экспрессии мРНК гена MDR1 является высоким только в линии клеток IM-9, а в клетках RPMI1640 и RPMI8226 экспрессия мРНК гена MDR1 является чрезвычайно слабой, практически на уровне чувствительности метода ОТ-ПЦР. В то же время, в линии клеток IM9 мРНК генов LRP и BCRP экспрессируются слабее, чем в линиях клеток RPMI1640 и RPMI8226. Экспрессия мРНК гена MRP1 во всех перечисленных линиях культур клеток примерно одинакова. Таким образом, две линии клеток ММ: RPMI1640 и RPMI8226 являются сходными по экспрессии мРНК генов: MDR1, MRP1, LRP и BCRP и 170 отличаются от линии клеток IM9, в которых наблюдается очень высокая экспрессия мРНК MDR1 и низкая, по сравнению с клетками RPMI1640 и RPMI8226, экспрессия мРНК LRP и BCRP (Рисунок 64). В следующей части работы в линиях клеток ММ человека RPMI1640, RPMI8226 и IM9 мы исследовали роль экзогенного IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов: MDR1, MRP1, LRP и BCRP (Рисунок 65). Рисунок 65 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК генов, обуславливающих МЛУ, в линиях культур клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, IM9 в среде без сыворотки, в присутствии и в отсутствии экзогенного IGF-1. С этой целью указанные линии клеток ММ культивировали в течение 72 ч в среде без сыворотки в присутствии и отсутствии IGF-1 в концентрации 20 нг/мл. При такой концентрация IGF-1 активируется только IGF-1R и не активируется рецептор инсулина (IR-A). В ходе эксперимента мы обнаружили, что в линии клеток RPMI8226 присутствие экзогенного IGF-1 приводит к выраженному ингибированию экспрессии мРНК генов LRP и MRP1, а в линии клеток RPMI1640 – к незначительному ингибированию экспрессии мРНК MRP1 (Рисунок 65). В линии клеток IM9 IGF-1 не изменяет экспрессию мРНК исследованных генов 171 МЛУ. Полученные данные, на первый взгляд, не подтверждают данные, полученные при исследовании клинических образцов от больных ММ, а наоборот, противоречат им. Мы ожидали, что добавление экзогенного IGF-1 в исследуемые культуры клеток ММ увеличит уровень экпрессии мРНК генов МЛУ в соответствии с нашими предположениями, основанными на клиническом материале. В этом случае мы решили проверить изменение экспрессии рецепторов IGF-1 в присутствии экзогенного IGF-1. Ранее мы уже говорили о том, что IGF-1 оказывает свой биологический эффект через связывание и активацию его рецептора IGF-1R, который является рецепторной тирозин киназой. IGF-1 также может связываться и активировать изоформу А рецептора инсулина (IR-A) [465], а также гибридный рецептор IGF1R/IR-A [505, 510]. С этой целью, сначала мы исследовали экспрессию мРНК IGF-1R, IR-A и IR-B (А и B изоформы рецептора инсулина) в трех линиях культур клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, IM-9 (Рисунок 66). Рисунок 66 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A в линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, IM9 в среде с 10%-ной ТЭС. Экспрессия мРНК IGF-1R была выраженной во всех трех линиях клеток ММ. Экспрессия мРНК IR-A была высокой в линиях клеток RPMI1640 и RPMI8226, а в линии клеток IM9 – слабой. мРНК IR-B не выявлялась ни в одной из трех линий клеток ММ. Таким образом, во всех трех линиях клеток ММ 172 экспрессировались мРНК IGF-1R и мРНК IR-A, и не экспрессировалась мРНК IRB. На следующем этапе в указанных линиях клеток ММ мы исследовали экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A в присутствии и отсутствии IGF-1 (Рисунок 67). Рисунок 67 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A в линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, IM9 в среде без сыворотки, в присутствии и в отсутствии экзогенного IGF-1. Мы обнаружили, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1 ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A (Рисунок 67), и это четко коррелирует с заметным уменьшением в этой линии клеток количества мРНК генов LRP и MRP1 (Рисунок 65). В линии клеток RPMI1640 экзогенный IGF-1 также ингибирует экспрессию мРНК IR-A и незначительно ингибирует экспрессию мРНК IGF-1R (Рисунок 67), что коррелирует с незначительным уменьшением экспрессии мРНК MRP1 (Рисунок 65). В линии клеток IM9 экзогенный IGF-1 не ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A, и экспрессия мРНК исследованных генов МЛУ также не изменяется. IGF-1-зависимая негативная регуляция экспрессии мРНК IGF-1R была описана в литературе ранее. Например, в экспериментах in vitro в 173 мышечных клетках мыши C2C12 и в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y было показано, что IGF-1 негативно регулирует экспрессию мРНК IGF-1R на уровне транскрипции и не влияет на стабильность мРНК IGF-1R. Вместе с тем, IGF-1 респонсивные элементы в промоторной области гена IGF-1R не выявлены [227]. В нашей работе мы впервые показали, что в линии клеток ММ человека RPMI8226 экзогенный IGF-1 негативно регулирует экспрессию мРНК IGF-1R и мРНК IR-A, а в линии клеток RPMI1640 экзогенный IGF-1 негативно регулирует экспрессию мРНК IR-A. Таким образом, из трех взятых линий клеток ММ человека, две линии: RPMI1640 и RPMI8226 оказались чувствительными к IGF-1, и присутствие этого фактора приводит к ингибированию экспрессии мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A. Это в свою очередь коррелирует с ингибированием экспрессии мРНК MRP1 и LRP. Полученные нами данные предполагают следующую последовательность событий: в клетках RPMI8226 и RPMI1640 экзогенный IGF-1 ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A, в результате этого уменьшается количество рецепторов IGF-1R и IR-A на поверхности клеток ММ, что приводит к уменьшению числа IGF-1/IGF-1R и IGF-1/IR-A взаимодействий и, как следствие, это приводит к инактивации нижележащих сигнальных путей в клетке, которые участвуют в регуляции экспрессии мРНК гена LRP и MRP1. Учитывая тот факт, что ингибирование экспрессии мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A (в клетках RPMI8226) приводит к выраженному ингибированию экспрессии мРНК LRP и MRP1, а ингибирование экспрессии мРНК рецептора IR-A (в клетках RPMI1640) – к незначительному ингибированию экспрессии мРНК MRP1, можно предположить, что в регуляции экспрессии мРНК LRP и MRP1 участвует IGF1/IGF-1R сигнальный путь, а IGF-1/IRA сигнальный путь не является решающим. Ни в одной из трех линий клеток ММ экспрессия мРНК BCRP и мРНК MDR1 в присутствии IGF-1 не изменялась. Экспрессия мРНК гена MDR1 в клетках RPMI1640 и RPMI8226 является изначально чрезвычайно слабой (Рисунок 64), поэтому судить о роли экзогенного IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК гена MDR1 в этих клетках не представляется возможным. Мы предполагаем, что 174 уменьшение количества рецепторов IGF-1R и IR-A на поверхности клеток ММ приводит к уменьшению IGF-1/IGF-1R и IGF-1/IR-A взаимодействий и, как следствие, это приводит к инактивации нижележащих сигнальных путей в клетке, которые участвуют в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ. Таким образом, исследования роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ на модели ММ человека (с использованием клинического материала и линий культур клеток ММ) показали, что IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнальный путь может участвовать в регуляции экспрессии генов МЛУ. Изучения роли IGF-1/IGF-1R и IGF-1/IR-A-зависимых сигнальных путей в регуляции экспрессии генов МЛУ при ММ, а также функциональной активности белков МЛУ в будущем нами будут продолжены. 3.3. Исследование роли IGF-1 в регуляции выживаемости нормальных и опухолевых клеток 3.3.1. Исследование IGF-1- зависимой регуляции активности каспаз 3 и 7 Как было сказано ранее, при диабетической ретинопатии (дегенерации сетчатки глаза) наблюдается ускоренная потеря нейронов сетчатки вследствие их апоптотической гибели. Нами было предположено, что апоптоз нейронов сетчатки является следствием: 1 - нарушения IGF/ инсулин зависимых сигналов выживания при диабете; 2 - хронического воспалительного заболевания, индуцируемого про- воспалительными цитокинами: IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-α. Чтобы подтвердить наши предположения на модели нейронных клеток сетчатки глаза крысы RGC-5 мы исследовали воздействие инсулина, IGF-1 и их комбинации на регуляцию суммарной активности каспаз 3 и 7. Для измерения активности каспаз 3 и 7 нами был использован Apo-ONE™ Homogeneous Caspase3/7 Assay Kit (Promega). Активности каспаз 3 и 7 определялись измерением расщепления флуорегенного субстрата, специфичного для каспаз 3 и 7, родамина 110, (Z-DEVD-R110). Полученные нами данные показывают, что при 175 культивировании клеток RGC-5 в среде без сыворотки активности каспаз 3 и 7 резко увеличиваются по сравнению с их активностью в клетках, растущих в среде, содержащей сыворотку (Рисунок 68). При добавлении в среду без сыворотки инсулина и IGF-1 активности каспаз 3 и 7 заметно подавляются (Рисунок 68). Совместные воздействия инсулина и IGF-1 также подавляют активности каспаз 3 и 7. Различия между активностями каспаз 3 и 7 в среде без сыворотки и в среде, где присутствует инсулин или IGF-1, или совместно инсулин и IGF-1 являются статистически достоверными. Также видно, что инсулин, IGF-1 или их совместное воздействие подавляют активности каспаз 3 и 7 примерно одинаково. Рисунок 68 – Инсулин, IGF-1 и их совместное воздействие подавляют активности каспаз 3 и 7, индуцированные в клетках RGC-5 при культивировании в среде без сыворотки. Клетки RGC-5 растили в среде без сыворотки в течение 4 часов в присутствии 10нм инсулина или 10нг/мл IGF-1, или их совместной комбинации, затем измеряли активности каспаз 3 и 7; С+ (контроль), активности каспаз 3 и 7 в присутствии сыворотки в культуральной среде; С- - (контроль), активности каспаз 3 и 7 в отсутствии сыворотки в культуральной среде; , р < 0,01 и , р < 0,001 в среде без сыворотки (С-) и в присутствии инсулина или IGF-1. На рисунке представлены усредненные данные трех экспериментов. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что инсулин, IGF-1, и /или их совместное воздействие негативно регулируют активности каспаз 176 3 и 7 и являются факторами, усиливающими выживаемость клеток RGC-5. Таким образом, инсулин, IGF-1, и /или их совместное воздействие действительно могут играть защитную роль от апоптоза в нейронных клетках сетчатки глаза. Далее мы исследовали влияние про-воспалительных цитокинов: IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-α на активацию каспаз 3 и 7 в клетках сетчатки глаза RGC-5. С этой целью мы инкубировали клетки RGC-5 в среде, содержащей сыворотку в присутствии 5нг/мл, 15нг/мл и 50нг/мл IL-6 или TNF, или IL-1 (Рисунок 69). Рисунок 69 – IL-1 активирует каспазы 3 и 7 в клетках RGC-5. Клетки RGC-5 культивировали в течение 4 часов в среде с сывороткой, содержащей 5нг/мл, 15 нг/мл и 50нг/мл IL-6 или TNFa, или IL-1, затем измеряли активности каспаз 3 и 7; С+ - (контроль), активности каспаз 3 и 7 в клетках RGC-5 в среде, содержащей сыворотку; , р < 0.05 и , р < 0.01 достоверность разницы активации каспаз 3 и 7 в клетках RGC-5 в среде с сывороткой (С+) и в присутствии IL-1. На рисунке представлены усредненные данные пяти экспериментов. В ходе этих экспериментов было выявлено, что IL-1 с высокой специфичностью активирует каспазы 3 и 7 по сравнению с IL-6 или TNF. Максимальный эффект IL-1 проявляется при концентрации 5нг/мл (Рисунок 177 69). IL-6 и TNF не показали статистически различимого воздействия на активацию каспаз 3 и 7. Таким образом, данный эксперимент подтверждает предположение о том, активировать каспазы 3 что про-воспалительный и 7, цитокин IL-1 может и, следовательно, может участвовать в индуцировании апоптоза и последующей гибели нейронных клеток сетчатки глаза. В следующей части работы мы исследовали влияние инсулина, IGF-1, и их комбинации на ингибирование активности каспаз 3 и 7 в клетках RGC-5, культивированных в присутствии 5нг/мл IL-1β. Полученные нами результаты показывают, что инсулин, IGF-1 и/или комбинация инсулина с IGF-1 значительно уменьшают активности каспаз 3 и 7, индуцированные в присутствии IL-1 (Рисунок 70). Рисунок 70 – Инсулин, IGF-1 и их совместное воздействие подавляют активности каспаз 3 и 7, индуцированные в клетках RGC-5 при культивировании в среде, содержащей IL-1. Клетки RGC-5 культивировали в течение 4 часов в среде с сывороткой, содержащей 5нг/мл IL-1 или 5нг/мл IL-1 в присутствии 10нм инсулина, 10нг/мл IGF-1 или совместно инсулина и IGF-1, затем измеряли активности каспаз 3 и 7; С+ - (контроль), активности каспаз 3 и 7 в обычной культуральной среде с сывороткой; , р < 0.05 и , р < 0.01 - достоверность разницы активации каспаз 3 и 7 в клетках RGC-5 в среде с IL-1 и в среде с IL-1 в присутствии инсулина, IGF-1 или совместно инсулина и IGF-1. На рисунке представлены усредненные данные трех экспериментов. 178 Таким образом, наши данные показывают, что воспалительный цитокин IL1ß специфически индуцирует активации каспаз 3 и 7 в нейронных клетках сетчатки глаза крысы RGC-5. Инсулин и IGF-1, а также их комбинация значительно ингибируют активации каспазы 3 и 7, индуцированные средой без сыворотки или IL-1ß, и, следовательно, защищают нейронные клетки сетчатки глаза от апоптоза. 3.3.2. Исследование влияния IGF-1 на выживаемость клеток множественной миеломы человека 3.3.2.1. Экспрессия мРНК генов системы IGF/инсулин в линиях клеток множественной миеломы человека Как было сказано ранее, одним из факторов роста, присутствующим в большом количестве в микроокружении костного мозга, является IGF-1. Он продуцируется фибробластами и остеобластами и, как предполагается, воздействует на клетки ММ и может усилить их выживаемость. В первой части исследования, используя метод полуколичественной ОТ-ПЦР, в указанных линиях клеток ММ, мы охарактеризовали экспрессию мРНК генов системы IGF/инсулин: IGF-1, IGF-2, IGF-1R, IR-A, IR-B (Рисунок 71). Нами было показано, что мРНК IGF-1 экспрессируется во всех трех линиях клеток ММ. Причем, в линиях клеток RPMI8226 и IM9 экспрессия мРНК IGF-1 примерно одинаковая и выраженная, а в линии клеток RPMI1640 – очень слабая (Рисунок 71). Экспрессия мРНК гена IGF-2 является выраженной только в линии клеток RPMI8226, а в двух других линиях клеток – RPMI1640 и IM9 – ее экспрессия чрезвычайно слабая, практически на уровне чувствительности метода ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК IGF1R выражена во всех трех линиях клеток ММ. Уровень экспрессии мРНК IR-A является высоким в линиях клеток RPMI1640 и RPMI8226, а в линии клеток IM9 – слабым. МРНК IR-B не выявляется ни в одной из трех линий клеток ММ. Таким образом, наши исследования показали, что в трех линиях клеток ММ экспрессия мРНК генов, принадлежащих системе IGF/инсулин, отличается. Как 179 было сказано ранее IGF-1 может связываться и активировать рецепторы IGF-1R и IR-A, а также гибридный рецептор IGF-1R/IR-A [331, 465]. С этими же рецепторами: IGF-1R и IR-A также связывается и IGF-2 [167, 590], который является высоко гомологичным IGF-1 [598]. Учитывая присутствие или отсутствие коэкспрессии лигандов и их рецепторов, принадлежащих системе IGF/инсулин, можно полагать, что в линии клеток IM9 экспрессируются мРНК IGF-1, IGF-1R, IRA, и возможно, что активными являются сигнальные пути, активируемые тремя лиганд-рецепторными аутокринными взаимодействиями: IGF-1/IGF-1R, IGF-1/IGF-1R/IRA, IGF-1/IRA (Рисунок 71). Рисунок 71 – ОТ-ПЦР. Экспрессия мРНК генов: IGF-1, IGF-2, IGF-1R, IR-A в линиях клеток ММ человека. В клетках RPMI1640 вследствие очень слабой экспрессии мРНК IGF-1 и чрезвычайно низкой экспрессии мРНК IGF-2 (Рисунок 71) не исключено, что слабо активируются все внутриклеточные сигнальные пути, активируемые при любой возможной комбинации аутокринного взаимодействия лигандов и рецепторов системы IGF/инсулин. Линия клеток RPMI8226 отличается от двух других исследованных линий клеток RPMI1640 и IM9 по экспрессии мРНК генов 180 системы IGF/инсулин. Эта линия характеризуется выраженной экспрессией, и мРНК IGF-1, и мРНК IGF-2 и всех их рецепторов, и поэтому в линии клеток RPMI8226, возможно, активны сигнальные пути, активируемые пятью лигандрецепторными аутокринными взаимодействиями: IGF-1/IGF-1R, IGF-1/IRA, IGF1/IGF-1R/IRA, IGF-2/IGF-1R и IGF-2/IRA. В связи с этим не исключено, что в предстоящих экспериментах, воздействие IGF-1 на клетки RPMI8226 может подругому повлиять на их выживаемость и пролиферацию, чем на выживаемость и пролиферацию клеток RPMI1640 и IM9. 3.3.2.2. Исследование влияния фактора роста IGF-1 на выживаемость линий клеток множественной миеломы человека методом МТТ Выживаемость клеток ММ человека исследовали методом МТТ (Рисунки: 72, 73, 74). Клетки культивировали в течение 72 ч в бессывороточной среде в присутствии и в отсутствии IGF-1 в концентрации 20 нг/мл. При такой концентрации IGF-1 активирует только IGF-1R и не активирует IR-А. В этих условиях, с одной стороны исключены все факторы роста, присутствующие в сыворотке, которые могли бы кооперировать c IGF-1 и тем самым оказывать дополнительное влияние на выживаемость клеток ММ. C другой стороны, физиологические концентрации IGF-1 позволяют определять биологические эффекты, которые являлись бы следствием активации только IGF-1/IGF-1Rопосредуемой сигнальной трансдукции. В результате исследования мы выявили, что IGF-1 повышает выживаемость клеток RPMI1640 (Рисунок 72) и IM9 (Рисунок 73), и не влияет на выживаемость клеток RPMI8226 (Рисунок 74). Несмотря на то, что иммунофенотип (экспрессия маркеров дифференцировки) клеток RPMI1640 (CD138+, CD38+, CD45-, CD56±, CD19-) и клеток RPMI8226 (CD138+, CD38+, CD45-, CD56±, CD19-) является одинаковым, и эти клетки морфологически выглядят очень похожими, оказалось, что они по-разному отвечают на воздействие IGF-1. Возможно, что одним из решающих факторов такого различия в выживаемости исследуемых линий клеток ММ является различие в экспрессии генов системы IGF/инсулин. 181 Рисунок 72 – Выживаемость клеток RPMI1640 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1 (МТТ-тест). *, р < 0,05 Рисунок 73 – Выживаемость клеток IM9 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1 (МТТ-тест). ***, р < 0,0001 182 Рисунок 74 – Выживаемость клеток RPMI8226 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1 (МТТ-тест). Линия клеток RPMI8226 отличается от двух других исследованных линий клеток RPMI1640 и IM9 по экспрессии мРНК генов системы IGF/инсулин. В клетках RPMI8226 наблюдается выраженная экспрессия IGF-1 и IGF-2 и всех их общих рецепторов, что, возможно, позволяет аутокринным образом регулировать выживание и пролиферацию этих клеток в условиях культивирования без сыворотки. Внесение экзогенного IGF-1 существенно не изменяет существующую аутокринную лиганд-рецепторную регуляцию. Данная гипотеза в будущем будет проверяться в экспериментах в присутствии специфических ингибиторов IGF-1R и IRА. 3.3.2.3. Исследование выживаемости линий клеток множественной миеломы человека методом подсчета клеток В эксперименте клетки RPMI1640, RPMI8226, IM-9 сажали в количестве 1,5×106 на чашку и культивировали в среде без сыворотки в течение 72 ч в присутствии/отсутствии IGF-1 в концентрации 20 нг/мл (также как и в случае 183 использования МТТ метода). Через 72 ч подсчитывали среднее количество клеток (из трех чашек на культуру) каждой культуры и сравнили полученные результаты. Было установлено, что в присутствии IGF-1 через 72 ч количество клеток RPMI1640 и IM9 выросло (Рисунок 75 и Рисунок 76). Рисунок 75 – Выживаемость клеток RPMI1640, в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1 (подсчет клеток). **, р < 0,001 Рисунок 76 – Выживаемость клеток IM9 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1 (подсчет клеток). *, р < 0,05 184 Рисунок 77 – Выживаемость клеток RPMI8226 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1 (подсчет клеток). И, наоборот, в среде без IGF-1 клетки RPMI1640 не только не росли, но их количество уменьшилось (Рисунок 75), а количество клеток IM9, без сыворотки не увеличилось (Рисунок 76). Таким образом, данные, полученные в результате подсчета клеток ММ в присутствии и отсутствии IGF-1, как и в случае исследования выживаемости клеток ММ методом МТТ, показали, что экзогенный IGF-1 является фактором, регулирующим выживаемость клеток RPMI1640 и IM9, а также является фактором, регулирующим пролиферацию клеток ММ. Вместе с тем, экзогенный IGF-1 не влияет на выживаемость и пролиферацию клеток RPMI8226. Количество клеток RPMI8226, независимо от присутствия или отсутствия в среде IGF-1, за 72 часа выросло вдвое (Рисунок 77). В клетках RPMI8226 наблюдается выраженная экспрессия IGF-1 и IGF-2 и всех их рецепторов, что, возможно, позволяет аутокринно регулировать выживание и пролиферацию этих клеток в условиях культивирования без сыворотки, и добавление экзогенного IGF-1 решительно не влияет на выживаемость и рост клеток RPMI8226. Данную гипотезу мы планируем проверить в экспериментах, в которых будем использовать ингибиторы и siRNA IGF-1R и IR c тем, чтобы разомкнуть цепи сигнальной трансдукции, идущие от этих рецепторов и понять, 185 действительно ли в среде без сыворотки экспрессия лигандов IGF-1 и IGF-2, и их рецепторов IGF-1R и IR достаточна для поддержания аутокринной регуляции пролиферации и выживаемости клеток RPMI8226. Полученные данные полностью подтвердили данные результаты метода МТТ, а именно то, что IGF-1 усиливает выживаемость клеток RPMI1640 и IM9, и не влияет на выживаемость клеток RPMI8226. 3.3.2.4. Исследование влияния фактора роста IGF-1 на динамику выживаемости линий клеток ММ человека В следующей части работы мы исследовали влияние фактора роста IGF-1 на динамику выживаемости культур клеток RPMI1640, RPMI82260 и IM-9 в течение 96 часов (Рисунки: 78, 79, 80). Клетки указанных культур были посажены в количестве 7×104 клеток на лунку в 1мл среды без сыворотки в присутствии и отсутствии IGF-1, и их количество подсчитывали через каждые 24 ч в течение 96 ч. По полученным после подсчета средним результатам строили кривые, характеризующие выживаемости исследуемых линий клеток. Количество клеток RPMI1640 в присутствии IGF-1 через 72 ч незначительно выросло и достигло 7,5×104 клеток на лунку (Рисунок 78). Напротив, при отсутствии IGF-1 количество клеток RPMI1640 начало уменьшаться уже через 24 ч, а через 72 ч их количество уменьшилось примерно до 5,5×104 клеток в лунке. Вместе с тем, и в присутствии и в отсутствии IGF-1 через 96 ч количество клеток RPMI1640 уменьшилось и достигло в случае присутствия IGF-1 6×104 клеток в лунке, а в случае отсутствия – 4×104 клеток в лунке. Количество клеток IM9 в присутствии IGF-1 в течение 72 ч увеличилось примерно до 11×104 клеток в лунке, а в отсутствии IGF-1 увеличилось до 8×104 клеток в лунке (Рисунок 79). Через 96 ч количество клеток IM9 и в присутствии и в отсутствии IGF-1 уменьшилось и достигло в случае присутствия IGF-1 6×104 клеток в лунке, а в случае отсутствия – 3,5×104 клеток в лунке. 186 Рисунок 78 – Исследование динамики выживаемости клеток RPMI1640 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1(подсчет клеток): *р < 0,05 Рисунок 79 – Исследование динамики выживаемости клеток IM9 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1(подсчет клеток).**, р < 0,001 187 Рисунок 80 – Исследование динамики выживаемости клеток RPMI8226 в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1(подсчет клеток). Клетки RPMI8226 продолжали расти и в присутствии и в отсутствии IGF-1, и через 72 ч их количество достигло в случае присутствия IGF-1 12×104 клеток в лунке, а в случае отсутствия – 11×104 клеток в лунке (Рисунок 80). Вместе с тем через 96 ч количество клеток RPMI8226 и в присутствии, и в отсутствии IGF-1 незначительно уменьшилось (Рисунок 80). Таким образом, среди исследованных линий клеток ММ чувствительными к IGF-1 оказались клетки RPMI1640 и IM9, которые в присутствии IGF-1 начиная с 24 ч насчитывали большее количество клеток, чем в случае, когда IGF-1 отсутствовал (Рисунок 78 и Рисунок 79). Очевидно, что в этих двух линиях клеток IGF-1 является фактором, поддерживающим выживаемость, а для клеток линии IM-9 IGF-1 оказывает стимулирующий пролиферацию эффект. Напротив, клетки RPMI8226 оказались практически нечувствительными к IGF-1, хотя присутствует очень незначительный стимулирующий пролиферацию эффект через 72 ч, однако его величина является чрезвычайно малой (Рисунок 80). Таким образом, очевидно, что данные, полученные методом МТТ, методом подсчета клеток и методом исследования динамики выживаемости клеток линий 188 ММ человека RPMI1640, RPMI8226, IM9, взаимно дополняемы и показывают, что IGF-1 является фактором выживаемости и фактором роста для клеток RPMI1640 и IM9, и, что он не влияет на выживаемость и рост клеток RPMI8226. Мы объясняем это тем фактом, что в клетках RPMI8226 наблюдается выраженная экспрессия и IGF-1, и IGF-2, и всех их рецепторов, что, возможно, позволяет аутокринно регулировать выживание и пролиферацию этих клеток в условиях культивирования без сыворотки, и добавление экзогенного IGF-1 не влияет на выживаемость и рост этих клеток. 3.3.2.5. Исследование экспрессии мРНК генов CycB1 и CycD1 и мРНК генов, принадлежащих семействам Bcl-2 и IAP Мы исследовали экспрессию мРНК генов CycB1 и CycD1 в линиях клеток ММ человека RPMI1640, RPMI8226 и IM-9 в среде без сыворотки, в присутствии и отсутствии IGF-1 (Рисунок 81). Рисунок 81 – Экспрессия мРНК генов CycB1 и CycD1 в линиях клеток ММ человека в среде без ТЭС в присутствии и отсутствии IGF-1. Известно, что эти гены экспрессируются при пролиферации клеток. Показано, что в клеточном цикле IGF-1/IGF-1R сигнальный путь индуцирует синтез CycD1 и промотирует переход G1–S [469]. Этот сигнальный путь также может индуцировать экспрессию СусА и СусВ и промотировать переход G2–M 189 [469, 523]. Наши исследования показали, что экспрессия мРНК генов CycB1 и CycD1 во всех указанных линиях клеток является выраженной и не изменяется в присутствии IGF-1 (Рисунок 81). Несмотря на то, что данные полученные методом МТТ-теста, подсчета клеток и исследования динамики выживаемости клеток ММ человека, свидетельствуют в пользу того, что IGF-1 является фактором выживаемости и фактором роста для клеток RPMI1640 и IM-9, тем не менее, экспрессия мРНК генов CycB1 и CycD1 в указанных клетках в присутствии IGF-1 не изменяется. Таким образом этот эффект не зависит от циклинов, что может являться интересным направлением будущих исследований. Известно, что выживаемость клеток ММ могут регулировать гены семейства Bcl-2 и гены семейства ингибиторов апоптоза IAP. Предварительные исследования показали, что в регуляции экспрессии генов семейств Bcl-2 и IAP может участвовать IGF-1/IGF-1R-опосредуемый сигнальный путь. Однако имеющиеся в литературе данные, являются противоречивыми. Мы исследовали роль экзогенного IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов семейства Bcl-2, участвующих в апоптозе: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 в трех линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9 (Рисунок 82 и Рисунок 83). Экспрессия мРНК генов: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 выявляется во всех трех линиях клеток ММ как в присутствии, так и в отсутствии экзогенного IGF-1 (Рисунок 82). В линии клеток RPMI1640 добавление экзогенного IGF-1 не влияет на изменение экспрессии мРНК генов Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1. В линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1 сильно подавляет экспрессию мРНК Bcl-2 и не влияет на изменение экспрессии мРНК генов Bcl-xL и Mcl-1. В линии клеток IM9 IGF-1 увеличивает экспрессию мРНК гена Mcl-1 и не влияет на экспрессию мРНК генов Bcl-2, Bcl-xL. Таким образом наши данные показывают, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1 заметно подавляет экспрессию мРНК Bcl-2 и не влияет на изменение экспрессии мРНК генов Bcl-xL и Mcl-1. В линии клеток IM9 экзогенный IGF-1 увеличивает экспрессию мРНК гена Mcl-1 и не влияет на экспрессию мРНК генов Bcl-2, Bcl-xL (Рисунок 82). На следующем этапе мы исследовали IGF-1 – зависимую экспрессию мРНК генов, принадлежащих к 190 семейству ингибиторов апоптоза IAP: HIAP-1, HIAP-2, NAIP, Livin – в линиях клеток ММ человека RPMI1640, RPMI8226, IM9 (Рисунок 83). Рисунок 82 – Экспрессия мРНК генов семейства Bcl-2: Mcl-1, Bcl-xL, Bcl-2 в линиях клеток ММ человека в среде без ТЭС, в присутствии и отсутствии IGF-1. Рисунок 83 – Экспрессия мРНК генов семейства ингибиторов апоптоза IAP: HIAP-1, HIAP-2, NAIP в линиях клеток ММ человека в среде без ТЭС, в присутствии и отсутствии IGF-1. 191 Экспрессия мРНК HIAP-1, HIAP-2, NAIP выявляется во всех трех линиях клеток ММ как в присутствии, так и в отсутствие IGF-1, а экспрессия мРНК Livin не обнаруживается ни в одной из исследуемых линий (Рисунок 83). В клетках RPMI1640 и IM9 добавление экзогенного IGF-1 не влияет на изменение экспрессии мРНК генов HIAP-1, HIAP-2, NAIP. В линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1 сильно подавляет экспрессию мРНК HIAP-1 и не влияет на изменение экспрессии мРНК генов HIAP-2 и NAIP. Таким образом, мы установили, что в исследованных нами клетках ММ экспрессия мРНК гена HIAP1, является IGF-1/IGF-1R зависимой, в то время как экспрессия мРНК генов HIAP2, NAIP не зависит от активации сигнального пути IGF-1/IGF-1R. В результате исследований мы установили, что в линиях клеток множественной миеломы человека RPMI1640, RPMI8226, IM-9 экспрессия мРНК генов Bcl-2, Mcl-1, HIAP-1 является IGF-1/IGF-1R зависимой, в то время как экспрессия мРНК генов Bcl-xL, HIAP-2, NAIP, CycB1, CycD1 не зависит от активации IGF-1/IGF-1R сигнального пути. Таким образом, в своей работе мы исследовали роль IGF-1 в выживаемости на моделях культур клеток ММ человека RPMI1640, RPMI8226 и IM9. Данные, полученные методом МТТ-теста, подсчета клеток и исследования динамики выживаемости показали, что IGF-1 является фактором, повышающим выживаемость клеток ММ. Данные полученные в результате исследования роли IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов, участвующих в апоптозе, показали, что IGF-1 может усиливать выживаемость клеток ММ через регуляцию механизмов апоптоза. Ранее (см. главу 3.2.2) в ходе исследования нами выявлена обратная корреляция между уровнем экспрессии гена IGF-1 и общей выживаемостью пациентов с ММ - у пациентов с высоким уровнем экспрессии IGF-1 уменьшается общая выживаемость. Наши экспериментальные данные, полученные на моделях культур клеток ММ человека свидетельствуют в пользу того, что одной из причин уменьшения общей выживаемости больных ММ может быть связана с IGF-1 – зависимым повышением выживаемости клеток ММ. Таким 192 образом, высокая экспрессия гена IGF-1 может являться плохим прогностическим фактором при ММ. 193 Глава 4. Обсуждение результатов В диссертационной работе впервые исследована роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции процессов, связанных со злокачественной прогрессией. В ходе работы были получены новые, ранее неизвестные данные, способствующие развитию представлений о роли фактора роста IGF-1 и его рецептора IGF-1R в онкологии. Впервые показано, что IGF-1R – опосредуемый сигнальный путь участвует в регуляции: дифференцировки, канцерогенеза, множественной лекарственной устойчивости и апоптоза. Приведенные ниже главы посвящены более подробному обсуждению данных, полученных в ходе диссертационной работы. 4.1. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции дифференцировки молочной железы Мы впервые исследовали роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции дифференцировки молочной железы на модели трансгенных линий мышей и линии клеток молочной железы мыши HC11. Для изучения роли IGF-1R в дифференцировке молочной железы были получены трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий мутантный IGF-1R, у которого в тирозинкиназном домене остаток лизина в положении 1003 заменен на аргинин (KR мутация). Такой доминантно-негативный IGF-1R (dnIGF-1R), димеризуясь с нормальным мышиным IGF-1R, блокирует его аутофосфорилирование и последующую передачу сигнала внутрь клетки. В ходе работе были исследованы трансгенные линии мышей, у которых указанный мутантный рецептор экспрессировался в клетках эпителия протоков молочной железы под MMTV промотором и под промотором кислого сывороточного белка WAP (acidic whey protein). Экспрессия под MMTV промотором позволяла исследовать роль изучаемого рецептора в дифференцировке молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши. А экспрессия под WAP промотором - в период беременности и лактации. 194 4.1.1. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором В работе впервые было выявлено, что у мышей, экспрессирующих dnIGF1R под WAP промотором, на второй день лактации наблюдается заметное уменьшение экспрессии различных типов казеинов (, , , ) и WAP и уменьшается формирование липидных капель. У таких мышей впервые обнаружено уменьшение размеров альвеол по сравнению с контрольными мышами. Исследования роли IGF-1R в дифференцировке молочной железы нами проводились и в других работах. Так, например, в нашей предыдущей работе, которая вышла в 2011 году в журнале Endocrinology [524], мы показали, что и на более ранних стадиях беременности – на 14,5 и на 17,5 день, у мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором, в молочной железе наблюдается уменьшение роста альвеол. Исследование экспрессии СК8 - маркера клеток эпителия показало, что у dnIGF-1R мышей этот маркер в молочной железе экспрессируется заметно слабее, чем у мышей дикого типа. Чтобы понять связано ли уменьшение количества клеток эпителия альвеол у dnIGF-1R мышей с уменьшением пролиферации, а не с увеличением апоптоза этих клеток, мы исследовали экспрессию маркера клеточной пролиферации Ki67 и выявили, что, и на 14.5, и на 17.5 день беременности число Ki67 позитивных клеток эпителия альвеол у dnIGF-1R мышей заметно меньше, чем у мышей дикого типа [524]. Кроме того, у мышей дикого типа наблюдается большое количество митотических эпителиальных клеток, тогда как у dnIGF-1R мышей их очень мало. Далее у dnIGF-1R мышей и мышей дикого типа в клетках эпителия мы исследовали уровень расщепленной каспазы 3 и не обнаружили никакой разницы. Таким образом, наши предыдущие исследования доказывают, что в период беременности у dnIGF-1R мышей уменьшение количества клеток эпителия, выстилающих просветы альвеол, в первую очередь является следствием уменьшения пролиферации этих клеток, а не увеличения апоптоза [524]. Эти наши ранние данные, полученные в ходе исследования беременных мышей, 195 подтверждают и дополняют наши данные, полученные при исследовании мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором на второй день лактации. Таким образом, экспрессия dnIGF-1R приводит к уменьшению размера растущих и дифференцирующихся альвеолярных почек уже во второй половине беременности, и, альвеолы продолжают оставаться меньших размеров по сравнению с альвеолами мышей дикого типа на второй день лактации, когда альвеолы являются полностью дифференцированными и продуцируют молоко. Более того, мы показали, что на второй день лактации не только уменьшаются размеры альвеол, но и уменьшается экспрессия казеинов и формирование липидных капель, которые, наряду с размерами альвеол, также являются характерными маркерами дифференцировки молочной железы. В ходе исследования мы показали, что у мышей на второй день лактации IGF-1R - зависимый сигнальный путь в эпителии молочной железы реализуется через активацию гомодимера IGF-1R/IGF-1R и гетеродимера IGF-1R/IR. Что касается взрослых половозрелых, но еще не рожавших мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, экспрессия этих форм рецепторов также сохраняется. Это свидетельствует о том, что экспрессия гомодимера и гетородимера не зависит от стадии дифференцировки молочной железы и является важной и необходимым для передачи IGF-1 – зависимых сигналов в ходе нормального развития и дифференцировки молочной железы. Также наши исследования показали, что экспрессия dnIGF-1R в молочной железе лактирующей мыши приводит к заметному ингибированию фосфорилирования (активации), и IGF-1R, и IR. В предыдущей нашей работе мы также исследовали IGF-1 - зависимую активацию IGF-1R и Akt в первичных культурах клеток эпителия молочной железы, полученных от dnIGF-1R позитивных и dnIGF-1R негативных мышей на 14,5 и 17,5 день беременности [524]. Наши исследования показали, что в эти сроки беременности при кратковременном воздействии экзогенного IGF-1 фосфорилирование, и IGF-1R, и Akt слабее в первичных культурах клеток эпителия, экспрессирующих dnIGF-1R. Однако, статистически достоверной эта разница была только на 17,5 день беременности, когда 196 наблюдается самый высокий уровень экспрессии dnIGF-1R под WAP промотором и начинается секреция молока клетками эпителия альвеол [524]. Полученные нами данные согласуются с данными других авторов, которые показали, что внутривенная инъекция мыши IGF-1 активирует экспрессию p-Akt в молочной железе животного [212, 301]. Также мы исследовали фосфорилирование субстратов рецептора инсулина один и два (IRS-1 и IRS-2), которые в цепи передачи сигнала от IGF-1R находятся выше Akt [524]. Наши исследования не выявили никакой разницы в фосфорилировании этих медиаторов сигнальной трансдукции. Однако, уровень экспрессии, и белка, и мРНК IRS-1 и IRS-2 у dnIGF-1R позитивных мышей на 14,5 день беременности заметно ниже, чем у dnIGF-1R негативных мышей. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что сигналы, поступающие через IGF-1R, регулируют экспрессию мРНК IRS-1 и IRS2. Ранее, в работах других авторов было показано, что уровень экспрессии IRS-1/2 в молочной железе заметно увеличивается в период беременности и лактации и быстро падает в ходе инволюции [302]. Также было показано, что в молочной железе мышей с нокаутированным геном IRS-1 заметно уменьшается IGF-1 зависимая активация Akt [356]. Таким образом, полученные нами результаты в совокупности с результатами других авторов свидетельствуют в пользу того, что IRS-1 и IRS-2 участвуют в регуляции дифференцировки молочной железы в период беременности и лактации и их участие координируется через IGF-1R. В предыдущей работе мы также исследовали фосфорилирование Erk1/2 в первичных культурах клеток эпителия молочной железы, полученных от dnIGF1R позитивных и dnIGF-1R негативных мышей на 14,5 и 17,5 день беременности. Мы не обнаружили статистически достоверной разницы в экспрессии p-Erk1/2 у dnIGF-1R позитивных и dnIGF-1R негативных мышей [524]. Возможно, что в регуляции экспрессии казеинов этот сигнальный значимость. Для сравнения, путь имеет меньшую в диссертационной работе нами показано, что в первичной культуре клеток эпителия, полученной из молочной железы мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, IGF-1-опосредуемая активация (фосфорилирование) и Akt, и Erk1/2 снижены по сравнению с 197 фосфорилированием Akt и Erk 1/2 в первичной культуре клеток эпителия дикого типа. Таким образом, суммируя наши предыдущие данные и, данные, полученные в диссертационной работе, можно с большой вероятностью утверждать, что экспрессия dnIGF-1R подавляет активацию IGF-1/IGF-1R/Akt сигнального пути, начиная с поздней стадии беременности и включительно до 2-го дня лактации. В диссертационной работе было показано, что у мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором, на второй день лактации наблюдается заметное уменьшение экспрессии различных типов казеинов (, , , ) и WAP. В нашей ранней работе на этих же мышах мы также показали, что уже на 14,5 день беременности экспрессия казеина у dnIGF-1R позитивных мышей уменьшается [524]. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что IGF-1R регулирует экспрессию белков молока - казеинов в период беременности и лактации. Известно, что основным регулятором экспрессии генов казеинов является STAT5 [263, 325, 326, 446]. Мы проанализировали экспрессию мРНК STAT5A и STAT5B и показали, что у dnIGF-1R позитивных мышей на 14,5 день беременности экспрессия мРНК STAT5A заметно слабее, чем у dnIGF-1R негативных мышей, а экспрессия мРНК STAT5В не меняется [524]. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что IGF-1R регулирует экспрессию казеинов через STAT5A. Таким образом, данные, полученные в диссертационной работе, совместно с данными, полученными в предыдущей демонстрируют, что IGF-1R играет важную нашей работе, впервые роль в функциональной дифференцировке альвеол в период беременности и лактации. В частности, сигналы, поступающие через этот рецептор, необходимы для пролиферации клеток эпителия альвеол, роста альвеол, экспрессии казеинов и формирования липидных капель - характерных маркеров дифференцировки молочной железы. Также мы показали, что IGF-1R - зависимая дифференцировка опосредуется через Akt - зависимый сигнальный путь и, что в дифференцировке могут участвовать медиаторы сигнальной трансдукции IRS-1 и IRS-2. 198 4.1.2. Экспрессии казеинов в первичной культуре клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, и в линии клеток молочной железы HC11 Мы исследовали экспрессию казеинов на второй день лактации у мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором (также как и в случае с мышами, экспрессирующими dnIGF-1R под WAP промотором). У исследованных мышей, мы не обнаружили каких - либо различий в уровне экспрессии перечисленных выше казеинов. Возможно, что для исследования экспрессии белков молока важно, под каким промотором экспрессируется dnIGF-1R. И, повидимому, наиболее приемлемым для исследования экспрессии казеинов является промотор WAP (промотор кислого сывороточного белка), активация которого связана с началом секреции молока. Показано, что самый высокий уровень экспрессии dnIGF-1R под WAP промотором наблюдается на 17,5 день беременности мыши и это время совпадает с началом секреции молока клетками эпителия альвеол [524]. Также возможно, что для регуляции экспрессии казеинов необходима большая активация IGF-1R – зависимого сигнала, которая, могла бы быть достигнута в экспериментах in vitro. Поэтому нами была получена первичная культура клеток эпителия молочной железы от беременных мышей, экспрессирующих dnIGF-1R и контрольных беременных мышей, и в условии дифференцировки in vitro (см. раздел «Результаты») в этой первичной культуре была исследована экспрессия казеинов. Наши исследования показали, что в первичной культуре клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, уровень экспрессии казеинов: , и WAP значительно ниже, чем уровень их экспрессии в первичной культуре клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей дикого типа. С целью подтвердить наши данные, полученные in vivo, свидетельствующие в пользу того, что IGF-1R - опосредуемый сигнальный путь является важным для функциональной дифференцировки молочной железы мыши, мы провели эксперименты на линии клеток эпителия молочной железы мыши HC11. Эта линия клеток является наиболее часто используемой в качестве модели для 199 изучения молекулярных механизмов дифференцировки молочной железы in vitro. В ходе работы мы впервые установили, что IGF-1 и IGF-2 в присутствии пролактина и гидрокортизона активируют экспрессию бета казеина в клетках молочной железы мыши HC11. Мы уже говорили о том, что и IGF-1, и IGF-2 связываются с рецептором IGF-1R и активируют его [469]. В наших экспериментах мы использовали физиологические концентрации IGF-1 и IGF-2, при которых эти факторы активируют исключительно IGF-1R и не активируют рецептор инсулина. Таким образом, данные полученные в экспериментах in vitro на первичных клетках эпителия молочной железы и клетках молочной железы мыши HC11 дополняют и подтверждают данные, полученные в экспериментах на мышах, экспрессирующих dnIGF-1R под WAP промотором и свидельствуют в пользу того, что, действительно, IGF-1R - опосредуемый сигналинг участвует в регулировании молекулярных механизмов функциональной дифференцировки молочной железы - продуцировании белков молока. Эти данные получены впервые, и они являются оригинальными. Одним из необходимых условий функциональной дифференцировки молочной железы у мышей является экспрессия в клетках эпителия циклина D1. Было показано, что Сyl-1 -/- мыши, которые не экспрессировали циклин D1, медленнее росли и достигали меньших размеров по сравнению с нормальными мышами, однако, были вполне жизнеспособными, могли достигать половозрелого возраста и давать потомство, но не могли его вскармливать из-за неспособности продуцировать молоко [159]. Учитывая тот факт, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в регуляции синтеза циклина D1, мы исследовали экспрессиию данного циклина при IGF-1 зависимой дифференцировке клеток эпителия молочной железы мыши HC11 с тем, чтобы подтвердить in vitro присутствие взаимосвязи между IGF-1 зависимой экспрессией бета казеина и экспрессией циклина D1. При сравнении экспрессии циклина D1 и бета казеина оказалось, что в ходе функциональной дифференцировки клеток HC11 in vitro, циклин D1 и бета казеин коэкспрессируются. Наши исследования показали, что 200 вопреки общепринятому пониманию об исключительно важной роли циклина D1 для деления клеток, оказалось, что в присутствии IGF-1 или IGF-2, циклин D1 может гиперэкспрессироваться в неделящихся, функционально дифференцированных клетках эпителия молочной железы HC11 и его экспрессия ассоциируется с экспрессией бета казеина. Таким образом, результаты данной работы, проведенной in vitro, свидетельствуют о том, что механизм регуляции экспрессии казеинов аналогичен механизму регуляции экспрессии казеинов in vivo. 4.1.3. Исследование мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором Мы показали, что у мышей, экспрессия dnIGF-1R под MMTV промотором приводит к ингибированию IGF-1R - опосредуемого сигнала в эпителии молочной железы. В первичной культуре клеток эпителия, полученной из молочной железы мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, IGF-1- опосредуемая активация (фосфорилирование) и Akt, и Erk1/2 снижены по сравнению с фосфорилированием Akt и Erk 1/2 в первичной культуре клеток эпителия дикого типа. Ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигнала в эпителии молочной железы ассоциируется с уменьшением третичного разветвления протоков, замедлением их роста и нарушением формирования альвеолярных почек. В экспериментах с включением BrdU в ДНК мы показали, что одной из причин нарушения третичного разветвления протоков и замедления их роста может быть уменьшение пролиферации клеток эпителия. Анализ с помощью проточной цитометрии популяции первичных клеток эпителия молочной железы, полученных от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R под MMTV промотором, показал, что блокирование IGF-1R - опосредуемого сигнального пути в эпителии молочной железы приводит к сокращению в 2,5 раза популяции стволовых/базальных клеток с иммунофенотипом (CD24+CD29hi Lin-) и, наоборот, к увеличению популяции люминальных клеток с иммунофенотипом (CD24+/CD29loLin-) [451]. Таким образом, следуя в направлении от фенотипических внешних изменений протоков молочной железы к изменениям 201 популяционного состава клеток, происходящих в эпителии протоков, можно сделать заключение, что основная причина уменьшения роста и третичного разветвления протоков молочной железы и уменьшения пролиферации клеток эпителия у мышей с нарушенным IGF-1R – зависимым сигналом является уменьшение числа стволовых/базальных клеток эпителия. В пользу такого предположения свидетельствуют данные и других авторов. Например, Macias и др., в 2011году показали, что соотношение базальных и люминальных клеток регулирует разветвление протоков. При этом уменьшение количества базальных клеток приводит к уменьшению бокового ветвления [335]. Наше исследование роли IGF-1R в дифференцировке молочной железы впервые установило, что IGF-1R - опосредуемый сигнал участвует в регуляции и поддержании популяции стволовых/базальных клеток эпителия молочной железы. Механизмы, объясняющие, каким образом это происходит, на сегодня неизвестны и в будущем будут исследоваться. Пока ясно одно, что IGF-1R участвует в регуляции дифференцировки молочной железы посредством регуляции популяции стволовых/базальных клеток. В 2012 году появилась работа нашей коллеги Rota и сотр., в которой с использованием метода сфера лимитирующих разведений (sphere limiting dilution analysis, SLDA) была произведена индивидуализация плюрипотентной стволовой клетки, которая в полужидкой среде формирует вокруг себя сферу из клетокпотомков [452]. Для проведения SLDA первичные клетки эпителия молочной железы, полученные от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R, и первичные клетки эпителия молочной железы, полученные от мышей дикого типа, после серий многочисленных разведений высевали в 96 луночное плато в диапазоне плотности от высокой к низкой. Затем в течение 7 дней клетки находились в лунке и формировали вокруг себя сферы. По истечении 7 дней подсчитывали количество сфер, образованных первичными клетками эпителия молочной железы, полученными от мышей, экспрессирующих dnIGF-1R и, соответственно, первичными клетками эпителия дикого типа. Оказалось, что только 1 из 256 посаженных первичных клеток эпителия молочной железы, полученных от 202 мышей, экспрессирующих dnIGF-1R, способна формировать сферу, тогда как первичные клетки эпителия молочной железы, полученные от мышей дикого типа, могли формировать сферы с частотой 1 из 127 клеток. В заключении, авторы этой работы предположили, что блокирование IGF-1R сигнала в клетках эпителия молочной железы приводит к уменьшению количества стволовых/базальных клеток [452]. Таким образом, приведенная работа является пока единственным, но очень серьезным подтверждением полученных нами результатов. В главе “Обзор литературы” упоминалась работа Schnarr и сотр., в которой впервые была выявлена связь между уровнем экспрессии IGF-1R, степенью дифференцировки РМЖ и опухолевой прогрессией. Авторы показали, что IGF-1R экспрессируется на высоком уровне в нормальной ткани молочной железы, в высоко (I-СЗ) и умеренно дифференцированной (II-СЗ) карциноме молочной железы протокового и низкодифференцированной долькового (III-СЗ) происхождения, карциноме протокового тогда как в и долькового происхождения уровень экспрессии IGF-1R чрезвычайно низкий. Уменьшение экспрессии IGF-1R в низкодифференцированной карциноме молочной железы корреллирует с усилением пролиферации опухолевых клеток и потерей экспрессии рецептора эстрогена (ER). Таким образом, наблюдается корреляция между уменьшением уровня экспрессии IGF-1R, ухудшением дифференцировки и злокачественной прогрессией [479]. Вместе с тем причина слабой экспрессии IGF1R в низко дифференцированной карциноме молочной железы и механизмы такой корреляции в работе этих авторов не были раскрыты и только предполагалось участие IGF-1R в дифференцировке молочной железы. Возвращаясь к данным, полученным в нашей работе, можно с уверенностью утверждать о том, что мы впервые показали, что IGF-1R действительно участвует в дифференцировке молочной железы. Наши данные объясняют корреляционную взаимосвязь между блокированием IGF-1R – опосредуемой передачи сигнала и ухудшением дифференцировки молочной железы. Указанная выше система градации по степеням злокачественности (СЗ) опирается на степень структурного и 203 клеточного атипизма, а также на выраженность пролиферативных процессов, определяемую по числу фигур митоза в 10 полях зрения при увеличении х40 [3]. Наши гистологические морфологических блокированием исследования изменений сигнала, не выявили нормальных клеток опосредованного IGF-1R. никаких эпителия Мы в внешних связи обнаружили, с что нарушение IGF-1R - зависимого сигнала в эпителии молочной железы приводит к количественному сдвигу популяции стволовых/базальных клеток и с этим ассоциируется ухудшение дифференцировки. В работе Schnarr и сотр. говорится не только о связи между уровнем экспрессии IGF-1R и степенью дифференцировки РМЖ, но, что очень важно, слабая экспрессия IGF-1R ассоциировалась также и с опухолевой прогрессией [479]. Перед нами встал вопрос, приведет ли обнаруженное нами нарушение дифференцировки к канцерогенезу клеток эпителия протоков или альвеол с течением времени? С этой целью нами было установлено наблюдение за Tg+ мышами, у которых IGF-1R – опосредуемый сигнал в клетках эпителия молочной железы был подавлен. Наши наблюдения (в течение одного года) не выявили образование опухолей у Tg+ мышей, что говорит об отсутствии прямой связи между ухудшением дифференцировки и канцерогенезом молочной железы. То есть подавление сигнала, опосредованного IGF-1R, в клетках эпителия молочной железы приводит только к ухудшению дифференцировки, но не имеет прямого отношения к канцерогенезу. Таким образом, проведенные нами исследования с использованием трансгенных мышей впервые показали, что ингибирование IGF1R - зависимого сигнального пути приводит к ухудшению дифференцировки молочной железы в период от рождения и до взрослой половозрелой мыши (ингибируется третичное разветвление и рост протоков молочной железы, уменьшается количество альвеолярных почек), а также нарушается нормальное функционирование молочной железы в период беременности и лактации (уменьшается экспрессии казеинов - белков молока). Основная причина уменьшения роста и третичного разветвления протоков молочной железы и уменьшения пролиферации клеток эпителия у мышей с блокированным IGF-1R – 204 зависимым сигналом является сокращение в 2,5 раза числа стволовых/базальных клеток эпителия. Наши данные впервые свидетельствуют в пользу того, что IGF1/IGF-1R – опосредуемый сигнальный путь является чрезвычайно важным в дифференцировке молочной железы. Данные, полученные в ходе диссертационной работы по исследованию роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в дифференцировке молочной железы, были опубликованы в зарубежных и отечественных журналах [11, 451, 524] Одним из важных выводов, который следует подчеркнуть, исходя из полученных нами данных, и, который очень принципиален в отношении опухолевой прогрессии является то, что IGF-1R – зависимый сигнальный путь позитивно регулирует количество стволовых/базальных клеток эпителия молочной железы, и, что этот сигнальный путь регулирует пролиферацию клеток эпителия молочной железы. Эти данные являются оригинальными и получены впервые. Ранее мы уж говорили о том, что в некоторых типах опухолей IGF-1R гиперэкспрессируется и с этим ассоциируется усиление пролиферации злокачественных клеток, и мы приводили примеры таких опухолей. Если в этих случаях опухолевые клетки произошли из стволовых клеток, в результате их злокачественной трансформации, то, не исключено, что причиной усиления пролиферации может являться повышенная активность сигнала, опосредованного IGF-1R. Обнаруженная в работе Schnarr и сотр. связь между низким уровнем экспрессии IGF-1R при РМЖ и опухолевой прогрессией оставалась для нас загадкой. Возможно, что слабый IGF-1R – опосредуемый сигнал при аденокарциноме молочной железы может играть роль уже после инициации злокачественного роста, то есть в ходе злокачественной прогрессии? И нарушение IGF-1R – зависимого сигнала по-разному может влиять на дифференцировку. Одно дело в ходе нормального развития молочной железы, когда речь идет о дифференцировке нормальных клеток, а другое, – когда речь идет об изменении дифференцировки опухолевых клеток при РМЖ. Наша работа показала, что не следует ожидать, что ослабление сигнала, опосредованного IGF-1R, в эпителии 205 молочной железы сначала приведет к ухудшению дифференцировки, а потом, как следствие, произойдет злокачественная трансформация клеток эпителия. Не исключено, что этот процесс происходит наоборот, то есть, сначала наступает трансформация клетки, а затем, уже трансформированная клетка меняет степень деффиренцировки в зависимости от активности сигнала, опосредуемого IGF-1R. 4.2. Роль IGF-1R – зависимого сигнала в канцерогенезе молочной железы, опосредуемом Wnt1 Одним из совершенно не изученных к началу нашей работы, оставался вопрос, касающийся роли IGF-1R в модуляции действия онкогенов в ходе трансформации и инициации роста опухоли. В диссертационной работе это направление впервые разработано на примере взаимодействия IGF-1R и онкогена Wnt1 в молочной железе мыши. Нами впервые показано, что блокирование IGF1R - зависимого сигнала может значитительно ускорить канцерогенез молочной железы, опосредуемый Wnt1. Активация Wnt1 сигнала характерна для базальноподобного РМЖ человека [267], который относится к тройному негативному раку молочной железы (triple negative breast cancers, TNBCs). Этот подтип РМЖ, по-прежнему остается одним из наиболее сложных для лечения изза агрессивного характера течения и отсутствия эффективных методов лечения [9, 306, 388, 451]. И поэтому в нашей работе мы провели исследования, направленные на поиск и выявление новых сигнальных путей, активированных при TNBC. Базальноподобный РМЖ по гистологическому строению в большинстве случаев принадлежит к низкодифференцированному протоковому раку [9, 77, 431, базальноподобного 435]. РМЖ И одной является из его причин агрессивного происхождение из течения наименее дифференцированных (возможно даже, стволовых) клеток [9]. Обнаруженное нами ухудшение дифференцировки молочной железы, вызванное блокированием IGF-1R - зависимого сигнала с одной стороны, и активацией Wnt1 опосредуемого сигнала в низкодифференцируемом РМЖ с другой, явилось для нас первой предпосылкой исследовать роль IGF-1R - зависимого сигнального 206 пути в канцерогенезе, опосредуемом Wnt1. Также важной предпосылкой для наших исследований была информация о том, что для базальноподобного РМЖ характерна активация IGF-1R - зависимого сигнала, который промотирует пролиферацию и выживаемость клеток TNBC [124, 322]. И к началу наших исследований в литературе не было работ, посвященных изучению взаимодействия этих двух сигнальных путей при базальноподобном РМЖ. В нашей работе мы впервые исследовали роль IGF-1R - зависимого сигнального пути в канцерогенезе молочной железы, индуцируемом Wnt1. Для этого исследования путем скрещивания линии мышей MMTV-dnIGF-1R, у которой IGF1R - опосредуемый сигнал подавлен, с линией мышей MMTV-Wnt1, у которой гиперэксспрессирован ген Wnt1, была получена линия Wnt1/dnIGF-1R, у которой под MMTV промотором в молочной железе одновременно экспрессируются два трансгена. Сравнение времени возникновения опухолей в молочной железе у MMTV-Wnt1 и MMTV-Wnt1/dnIGF-1R мышей показало, что у мышей, несущих одновременно два трансгена, опухоли молочной железы возникают гораздо раньше, чем у мышей экспрессирующих только MMTV-Wnt1. Более того, у MMTV-Wnt1/dnIGF-1R мышей в молочной железе одновременно возникало большее количество опухолей, чем у MMTV-Wnt1 мышей. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в канцерогенезе, индуцированном Wnt1. Таким образом, в диссертационной работе мы впервые показали, что ослабление IGF-1R – зависимого сигнала в контексте с гиперэкспрессией Wnt1 ускоряет канцерогенез и увеличивает количество возникших опухолей. Эти данные являются оригинальными и отражены в нашей статье [451]. Учитывая, что экспрессия dnIGF-1R подавляет активацию IGF-1R, можно считать, что ослабление сигнала, опосредованного IGF-1R, в контексте гиперэкспрессии Wnt1 ускоряет канцерогенез и увеличивает опухолевую множественность – т.е. число возникающих опухолевых узлов. Однако, на первый взгляд, это не совсем привычно для восприятия, ибо считается, что гиперэкспрессия IGF-1R ассоциируется с возникновением опухолей во многих типах тканей, включая 207 эпителий молочной железы (cм. главу «Обзор литературы»). Тем не менее, наши результаты показали, что именно понижение уровня экспрессии IGF-1R и ослабление его фосфорилирования имеют противоположный эффект в контексте гиперэкспрессии Wnt1. Проведенные нами исследования на трансгенных мышах показали, что ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигнала приводит к ухудшению дифференцировки молочной железы (ингибируется третичное разветвление и рост протоков молочной железы, уменьшается количество альвеолярных почек). И было установлено, что основной причиной является сокращение числа стволовых/базальных клеток эпителия. Перед нами встал вопрос: может ли у таких мышей произойти, в ходе нарушения дифференцировки, изменение в соотношении других типов клеток, составляющих эпителий протоков молочной железы, например: миоэпитнелиальных, люминальных и их предшественников? И если да, то количественное изменение, каких именно типов клеток, может привести к усилению восприимчивости к Wnt1 - опосредованной инициации роста опухоли? Обратившись к литературе, мы обнаружили, что мишенями Wnt1 зависимого канцерогенеза являются предшественники клеток эпителия молочной железы [271, 314, 323], включая популяцию предшественников люминальных клеток [271, 314, 323]. Также в 2010 году в работе Molyneux и сотр. было показано, что BRCA1 - опосредованный базальнободобный РМЖ происходит из предшественников люминальных клеток, а не из базальных стволовых клеток [367]. Эта информация сподвигла нас проанализировать как изменяется популяция предшественников люминальных клеток в молочной железе у Tg+ мышей по сравнению с Tg- контрольными мышами. Наш анализ показал, что, действительно, у Tg+ мышей ингибирование IGF-1R – опосредуемого сигнала в молочной железе мыши приводит к 2-х кратному увеличению популяции предшественников люминальных клеток, с фенотипом CD24+CD29loCD61+Lin-. Таким образом, мы впервые показали, что ингибирование IGF-1R – зависимой сигнализации приводит к увеличению популяции предшественников люминальных клеток и это может являться главной причиной усиления 208 восприимчивости к трансформации, опосредуемой Wnt1, и инициации роста опухоли молочной железы. Чтобы подтвердить, что наше заключение является верным, мы исследовали влияние блокирования IGF-1R – зависимого сигнала на активацию сигнальных путей, регулирующих популяцию предшественников люминальных клеток. Одним из кандидатов на это исследование являлся Notch сигнальный путь. Известно, что конститутивная активация Notch – зависимого сигнального пути промотирует увеличение популяции недиффернцированных предшественников люминальных клеток [66]. Более того, Notch – зависимый сигнальный путь участвует в Wnt1 - опосоредуемом канцерогенезе в клетках эпителия молочной железы человека [39]. Мы исследовали как изменится Notch – зависимый сигнал у Tg+ мышей, у которых блокирован IGF-1R, по сравнению с Tg- контрольными мышами (дикий тип). Для этого мы получили первичную культуру клеток эпителия, от Tg+ мышей и от Tg- контрольных мышей и с помощью ПЦР в реальном времени исследовали экспрессию гена Hey1, который является мишенью Notch. А также другого гена Dll4, который является лигандом Notch. Наше исследование показало, что оба этих гена гиперэкспрессируются первичных клетках эпителия молочной полученных от Tg+ мышей, у которых блокирован IGF-1R. Эти данные говорят о том, что действительно, в клетках эпителия молочной железы блокирование IGF-1R приводит к активации Notch сигнального пути, который промотирует увеличение популяции недиффернцированных предшественников люминальных клеток. Наши данные получены впервые, и они раскрывают механизм, объясняющий, как блокирование IGF-1R усиливает канцерогенез, опосредованный гиперэкспрессией гена Wnt1. В диссертационной работе также впервые было показано, что у Wnt1/dnIGF1R мышей, у которых под MMTV промотором в молочной железе одновременно экспрессируются два трансгена, блокирование IGF-1R приводит к гиперэкспрессии β-катенина. Главным предназначением Wnt1 - опосредуемого сигнала является стабилизация и увеличение уровня β-катенина в цитозоле. Гетеродимер, состоящий из бета-катенина и Lef/TCF трансактивирует ряд генов, в том числе: с-myc, циклин D1, WISPs и циклооксигеназу-2 [223, 238, 404, 498], 209 которые дерегулированы в различных типах опухолей человека, включая РМЖ [61, 127, 223, 440, 461]. Таким образом, еще одним механизмом ускорения канцерогенеза и увеличения количества возникших опухолей у мышей, одновременно экспрессирующих dnIGF-1R и Wnt1, может являться усиление стабилизации β-катенина в предшественниках люминальных клеток вследствии ослабления IGF-1R - зависимого сигнала. Эти данные впервые свидетельствуют о том, что IGF-1R - опосредуемый сигнальный путь перекрещивается с Wnt1 опосредуемым сигнальным путем и участвует в стабилизации β-катенина. И объясняют, как блокирование сигнала, опосредуемого IGF-1R, может усилить Wnt1 - индуцируемый канцерогенез молочной железы. Таким образом, наши данные впервые показали, что IGF-1R участвует в канцерогенезе молочной железы, индуцированном гиперэкспрессией Wnt1, двумя путями. Блокирование IGF-1R сигнала, во-первых, приводит к увеличению популяции недифференцированных предшественников люминальных клеток, которые являются мишенью для Wnt1 - опосредованного канцерогенеза, а вовторых, стабилизирует β-катенин, что приводит к активации сигнала, опосредованного Wnt1. К началу нашей работы вопрос, касающийся роли IGF-1R в модуляции действия онкогенов в ходе трансформации и инициации роста опухоли оставался абсолютно неизученным. В диссертационной работе это направление впервые разработано на примере взаимодействия IGF-1R и онкогена Wnt1 в молочной железе мыши. Проведенные нами исследования на мышиной модели начались с изучения роли IGF-1R в ходе нормальной дифференцировки и развития молочной железы. Эти исследования впервые показали, что IGF-1R - опосредуемый сигнальный путь является принципиально важным для нормального развития молочной железы. Наши данные свидетельствуют о том, что IGF-1R играет комплексную роль в развитии молочной железы. Нарушение IGF-1R сигнала приводит к нарушению дифференцировки, в основе которой лежит сдвиг популяционного состава стволовых/базальных клеток и предшественников 210 люминальных клеток. И последнее оказалось очень важным для усиления Wnt1 опосредованного канцерогенеза молочной железы. Выше говорилось о том, что активация Wnt1 - зависимого сигнала характерна для базальноподобного РМЖ человека [267]. Гистогенетически базальноподобный РМЖ связан с базальным эпителием, который в ткани здоровой молочной железы составляет наружный, прилежащий к базальной мембране слой, выстилающий протоки и дольки. Это морфологически и иммунофенотипически гетерогенная популяция, содержащая как стволовые, так и недифференцированные предшественники люминальных клеток. Очевидно, что понимание роли IGF-1R в нормальном развитии молочной железы может помочь правильно оценить их значимость при злокачественной трансформации и прогрессии опухолей, и наша работа является прямым подтверждением правильности этого высказывания. Только благодаря исследованию роли IGF-1R зависимого сигнального пути в нормальной дифференцировке, мы обнаружили, что нарушение IGF-1R сигнала является причиной сдвига популяционного состава с одной стороны, стволовых/базальных клеток, а, с другой, предшественников люминальных клеток. И, как мы показали, количественное увеличение последних оказалось важным для Wnt1 - опосредованного канцерогенеза молочной железы. Вместе с тем, наши исследования не выявили изменения размеров стволовых/базальных клеток и недифференцированных предшественников люминальных клеток, или их атипичности. Полученные нами данные, могут служить объяснением взаимосвязи между слабой экспрессией IGF-1R и ухудшением дифференцировки при карциноме молочной железы, которая обнаружена в работе Schnarr и сотр. [479]. Таким образом, в диссертационной работе впервые было показано, что IGF1R может одновременно участвовать, как в регуляции нормальной дифференцировки молочной железы, так и в канцерогенезе, опосредованном Wnt1. В ходе нашей работы мы впервые установили, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь может быть причастным к возникновению базальноподобного РМЖ, который, по-прежнему, остается одним из наиболее сложных для лечения 211 из-за агрессивного характера течения (поскольку происходит из наименее дифференцированных клеток [9]) и отсутствия эффективных методов лечения [9, 306, 388, 451]. Это подчеркивает актуальность нашей работы и, проведенные нами исследования, направленные на поиск и выявление новых рецепторов и сигнальных путей, активированных при базальноподобном РМЖ, оказались своевременными и полезными. Полученный нами данные, показывающие, что ослабление сигнала, опосредованного IGF-1R, с одной стороны приводит к ухудшению дифференцировки, а с другой - к усилению Wnt1 - зависимого канцерогенеза, можно рассматривать как яркий пример взаимосвязи между ухудшением дифференцировки и развитием злокачественной опухоли. 4.3. Роль IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ при множественной миеломе человека Мы впервые исследовали связь между экспрессией гена IGF-1 и генов, ответственных за множественную лекарственную устойчивость (МЛУ): MDR1, MRP1, LRP, BCRP в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга, полученных от больных множественной миеломой (ММ). В ходе исследования впервые было установлено, что экспрессия мРНК генов МЛУ в подавляющем большинстве случаев является высокой в тех образцах аспиратов костного мозга, в которых регистрируется умеренная или высокая экспрессия мРНК IGF-1, и наоборот, экспрессия генов МЛУ слабая в тех образцах, в которых экспрессия мРНК IGF-1 слабая или отсутствует. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что при ММ существует взаимосвязь между экспрессией гена IGF-1 и экспрессией генов, ответственных за МЛУ [14]. Также в работе впервые была исследована роль IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ в трех линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. Впервые было показано, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1, добавленный в культуральную среду, ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A и это приводит к ингибированию экспрессии мРНК MRP1 и LRP [17]. В другой линии клеток RPMI1640 экзогенный IGF-1 также ингибирует экспрессию мРНК IR-A и 212 незначительно ингибирует экспрессию мРНК IGF-1R, что приводит к незначительному уменьшению экспрессии мРНК MRP1. В линии клеток IM9 экзогенный IGF-1 не влияет на экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A и, соответственно, в присутствии IGF-1 экспрессия мРНК исследованных генов МЛУ не изменяется. Таким образом, из трех исследованных линий клеток ММ человека две: RPMI1640 и RPMI8226 оказались чувствительными к IGF-1, и присутствие этого фактора приводило к ингибированию экспрессии мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A, и это в свою очередь ассоциировалось с ингибированием экспрессии мРНК MRP1 и LRP. Мы предполагаем, что уменьшение количества рецепторов IGF-1R и IR-A на поверхности клеток ММ приводит к уменьшению числа IGF-1/IGF-1R и IGF-1/IR-A взаимодействий и, как следствие, это приводит к инактивации нижележащих сигнальных путей в клетке, которые участвуют в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ. Таким образом, с одной стороны корреляция между экспрессией гена IGF-1 и генов МЛУ у больных ММ, а с другой – подавление экспрессии генов МЛУ при подавлении экспрессии IGF-1R дает основание предполагать, что фактор роста IGF-1 и его рецептор IGF-1R могут участвовать в регуляции экспрессии генов, ответственных за возникновение МЛУ. В пользу такого предположения также свидетельствует и то, что в промоторной области гена MDR1 и LRP есть сайт связывания с транскрипционным фактором NF-kB, экспрессия которого регулируется IGF-1 [14]. Что касается генов MRP1 и BCRP, то в промоторном регионе они имеют явно отличающиеся от генов MDR1 и LRP регуляторные мотивы [14], и пока неясно, какие именно сайты связывания и какие транскрипционные факторы важны в IGF-1 – зависимой регуляции экспрессии этих генов. На сегодня в литературе имеется не так много работ, посвященных исследованию роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ в опухолях человека. Было показано, что в клетках рака толстой кишки мыши линии MCLM и в Т-лимфобластных клетках линии человека CCRF-CEM IGF-I индуцировал экспрессию гена MDR1 и значительно 213 ингибировал гибель клеток от цитотоксических препаратов [208, 480]. В работе J. Ge и соавт. методом иммуногистохимии исследовали экспрессию IGF-1R и MRP1 в 102 образцах больных раком желудка и обнаружили, что IGF-1R экспрессировался в 75,2 % случаев, а MRP1 – в 69 % случаев. Такая высокая степень корреляции в экспрессии этих генов, несмотря на химиотерапию, ассоциировалась с плохим прогнозом у больных раком желудка [183]. Недавно было показано, что ингибирование IGF-1R в клетках колоректального рака человека ассоциировалось с повышением чувствительности этих клеток к противоопухолевым препаратам и с супрессией экспрессии MRP-2 [494]. Другие авторы в более ранней работе показали, что в клетках млекопитающих промоторы генов IGF-1 и MRP2 содержат сайты связывания с гепатоцитарными ядерными факторами HNF-1 и HNF-1. Эти данные позволяют предположить, что экспрессия мРНК указанных генов может корегулироваться [274]. Совсем недавно, в 2013 году, Benabbou N., и соавт. показали, что IGF-1 регулирует экспрессию генов МЛУ в линии клеток рака яичника [54]. Также в литературе имеются несколько работ, посвященных взаимосвязи между IGF-1 и возникновением лекарственной устойчивости к некоторым химиопрепаратам при ММ. Так, например, в работе P. Maiso и соавт. показано, что ингибирование тирозин киназной активности IGF-1R усиливает действие леналидомида, дексаметазона, мелфалана и бортезомиба, а использование ингибитора тирозин киназной активности IGF-1R совместно с дексаметазоном и бортезомибом заметно подавляет рост клеток ММ in vitro [338]. Недавно было показано, что в линиях клеток ММ, резистентных к бортезомибу, и в клинических образцах, полученных от больных ММ, которые были не чувствительны к бортезомибу, обнаруживается высокий уровень IGF-1 и активирован IGF-1/IGF-1R - зависимый сигнальный путь. Блокирование этого сигнального пути усилило гибель клеток ММ от воздействия бортезомиба [22, 286]. Таким образом, в литературе накапливаются данные, свидетельствующие в пользу того, что IGF-1 и IGF-1R могут участвовать в возникновении лекарственной устойчивости. Также эти данные свидетельствуют в пользу того, что исследования в этом направлении 214 являются актуальными и своевременными. Что касается участия IGF-1 в возникновении МЛУ за счет регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ при ММ, в литературе данных нет и, выполненная нами работа является одной из первых. Ранее мы уже показали, что преимущественно экспрессируемыми у больных ММ являются рецепторы IGF-1R и IR-A, тогда, как IR-B практически не экспрессируется [14]. Эти результаты подтвердились и на культурах клеток ММ [17]. Необходимо подчеркнуть, что при ММ регуляция экспрессии генов, ответственных за МЛУ может зависеть и от свойств самих клеток ММ. Например, в одной из наших работ, мы показали, что клетки RPMI8226, в отличие от двух других линий клеток RPMI1640 и IM9, хорошо выживали и быстрее размножались в среде без сыворотки. Эти клетки отличались от двух других линий клеток тем, что экспрессировали IGF-2 (инсулиноподобный фактор роста 2 типа), который также может взаимодействовать и с IGF-1R, и с IR-A. Ранее было показано, что IGF-2 активирует размножение клеток [167, 307]. Вместе с тем, роль IGF-2 в регуляции экспрессии генов МЛУ не исследовалась, и способность этого фактора активировать те же рецепторы, что и IGF-1, осложняет общую картину событий, связанных с регуляцией МЛУ. В заключение следует подчеркнуть, что значимость нашей работы заключается в том, что при исследовании роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции МЛУ при ММ человека (с использованием клинического материала и линий культур клеток ММ) мы впервые показали, что IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнальный путь может участвовать в регуляции экспрессии генов МЛУ. Очевидно, что изучение молекулярных механизмов, участвующих в регуляции активации экспрессии генов МЛУ и функций белков МЛУ является актуальной для экспериментальной онкологии. Поэтому изучение роли IGF-1/IGF-1R и IGF1/IR-A-зависимых сигнальных путей в регуляции экспрессии генов МЛУ при ММ, а также функциональной активности белков МЛУ в будущем нами будут продолжены. 215 Данные, полученные в этой части работы легли в основу 3 отечественных статей [10, 14, 17]. Также написана одна обзорная статья [12]. 4.4. Влияние IGF-1 на выживаемость клеток множественной миеломы человека Мы исследовали влияние IGF-1 на выживаемость и рост трех линий клеток множественной миеломы человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. В указанных линиях клеток также была исследована роль IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов, участвующих в апоптозе. Данные, полученные методом МТТ-теста, подсчета клеток и исследования динамики выживаемости клеток показали, что IGF-1 усиливает выживаемость и рост клеток RPMI1640 и IM-9, и не влияет на выживаемость и рост клеток RPMI8226. Эти данные согласуются с нашими результатами, полученными на клиничеком материале. Нами был проведен анализ общей выживаемости больных ММ в связи с экспрессией мРНК гена IGF1. Хотя все больные ММ были лечены, и у всех пациентов была диагностирована множественная миелома III стадии, экспрессия мРНК IGF-1 была гетерогенной и отличалась в два и более раз. Мы обнаружили, что в группе больных с умеренной или повышенной экспрессией гена IGF-1 к 60-ти месяцам наблюдения остаются в живых немногим более 20% пациентов, тогда как в группе, где экспрессия этого гена слабая или отсутствует за это же время в живых остаются 60% пациентов. Медиана наблюдения в группе пациентов со слабой экспрессией или с отсутсвием экспрессии гена IGF-1 составляет более 5 лет (62 месяца), а в группе с умеренной и повышенной экспрессией этого гена медиана составляет менее 3 лет (34 месяца). Таким образом, сопоставляя экспериментальные данные, полученные на культурах клеток ММ, и данные, полученные на клиническом материале, можно сказать, что повышенная экспрессия IGF-1 в клетках множественной миеломы может приводить к увеличению их жизнеспособности и уменьшению общей выживаемости больных ММ. Исходя из вышесказанного следует, что высокая экспрессия IGF-1 может служить плохим прогностическим фактором при ММ. 216 В литературе имеются работы, в которых исследовалась роль IGF-1 в выживаемости клеток множественной миеломы. В 2009 г Sprynski и др. исследовали влияние различных факторов роста на выживаемость 9 линий миеломных клеток (XG-N) в среде без сыворотки. Среди этих 9 линий сначала были отобраны те, которые могли расти 4 дня в среде без сыворотки. Таковыми оказались 3 линии клеток: XG-5, XG-7 и XG-20. Ингибирование киназной активности IGF-1R в этих линиях приводило к резкому уменьшению их выживаемости [514]. В этой работе также было показано, что экзогенный IGF-1 является фактором, в разной степени, усиливающим пролиферацию большинства исследованных линий клеток. Strömberg и др. показали, что ингибирование киназной активности IGF-1R в линии клеток RPMI8226 увеличило чувствительность этих клеток к доксорубицину, мелфалану и дексаметазону [523]. Относительно недавно в работе Tagoug I. и др. было исследовано совместное действие AS602868, ингибитора NF-kb сигнального пути, и моноклональных антител против IGF-1R в четырех линиях клеток ММ человека: RPMI8226, LP1, MM.1S и U266. Исследования показали, что в двух из четырех линий клеток – RPMI8226 и LP1 комбинация указанного ингибитора и антител против IGF-1R усиливала апоптоз [525]. В другой работе было показано, что в мышиных клетках 5T33MMvv и в клетках ММ человека Karpas707 и OPM-2, экзогенный IGF-1 негативно регулировал экспрессию проапоптотического гена Bim, и это коррелировало с усилением выживаемости этих клеток [126]. В отличие от методических подходов, примененных в перечисленных работах, мы не использовали ингибиторы киназной активности IGF-1R. Этот подход приемлем для исследования роли IGF-1 только в тех случаях, когда клетки ММ могут расти некоторое время без сыворотки. Также мы не использовали, как авторы указанных выше статей, высокие (в пять раз превышающие нормы) концентрации экзогенного IGF-1. Концентрация IGF-1 в наших экспериментах соответствовала физиологической, т.е. той, в которой IGF-1 присутствует в сыворотке крови, и при которой этот фактор in vivo взаимодействует только со своим рецептором IGF-1R и не взаимодействует с рецептором инсулина. 217 Полученные нами результаты убедительно показали, что IGF-1 может являться фактором, усиливающим выживаемость клеток ММ. Однако следует отметить, что не для всех клеток ММ IGF-1 является фактором выживаемости. Как показали результаты наших экспериментов, IGF-1 является фактором выживаемости для клеток ММ чувствительных к сыворотке, как в случае с клетками RPMI1640 и IM9, и не является фактором выживаемости для клеток менее чувствительных к сыворотке, как в случае с клетками RPMI8226. Эта линия отличается от двух других исследованных линий клеток RPMI1640 и IM9 по экспрессии мРНК генов системы IGF/инсулин. Она характеризуется выраженной экспрессией и мРНК IGF-1, и мРНК IGF-2, и всех их рецепторов, и поэтому в этой линии, возможно, появляются дополнительные лиганд - рецепторные аутокриные взаимодействия (за счет взаимодействия IGF-2 с IGF-1R и IR-A), что возможно и усиливает выживание и пролиферацию этих клеток в условиях культивирования без сыворотки. Наши исследования показали, что все исследуемые линии клеток ММ экспрессируют мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A, тогда как мРНК IR-B не экспрессирeccируется ни в одной линии. Эти данные полностью совпадают с нашими данными полученными ранее, в которых мы показали, что во всех образцах, полученных от больных ММ экспрессируется только мРНК IR-A [14]. Эти данные позволяют предположить, что активация IR-B – зависимых сигналов не характерна для клеток ММ человека и этот сигнальный путь не вовлечен в регуляцию выживаемости клеток ММ. Также необходимо отметить, что влияние IGF-1 на выживаемость клеток ММ не зависит от их дифференцировки. Например, в нашем случае и RPMI1640, и RPMI8226 экспрессируют на своей поверхности одинаковые маркеры дифференцировки, CD138+, CD38+, CD45-, CD56±, CD19- [618], однако по-разному отвечают на экзогенный IGF-1. Также следует подчеркнуть, что влияние IGF-1 на выживаемость клеток ММ не зависит от экспрессии IGF-1R. Как показали наши эксперименты, все три линии исследуемых клеток ММ экспрессировали IGF-1R, но их реакции на экзогенный IGF-1 отличались. 218 В ходе исследований, проведенных на линиях клеток ММ человека с использованием метода полуколичественной ОТ-ПЦР, нами было установлено, что экспрессия мРНК генов: Bcl-2, Mcl-1 и HIAP-1 является IGF-1/IGF-1R зависимой, в то время как экспрессия мРНК генов Bcl-xL, HIAP-2, NAIP, CycB1, CycD1 не зависит от активации IGF-1/IGF-1R сигнального пути. В литературе также имеются работы, посвященные исследованию экспрессии мРНК генов, принадлежащих семейству Bcl-2: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 при множественной миеломе. В ходе исследований было показано, что уровень экспрессии Bcl-2 при ММ достаточно высокий, но, в тоже время, вариабильный [412, 544]. Высокий уровень экспресси Mcl-1, как было показано, ассоциируется с малигнизированным фенотипом клеток ММ [513]. Повышенная экспрессия Bcl-2 и Bcl-xL ассоциируется с лекарственной устойчивостью к доксорубицину, дексаметазону и этопозиду [182, 543, 544]. Защитный эффект экзогенного IGF-1 против дексаметазон-индуцированного апоптоза не коррелировал с изменением экспрессии Bcl-2 и Bcl-xL [257, 587]. Тем не менее, совместное добавление дексаметазона и αIR3, антитела, блокирующего активацию IGF-1R, приводило к уменьшению уровня экспрессии Bcl-xL в линиях клеток ММ [389]. В другой работе было показано, что IGF-1 - опосредуемое выживание клеток ММ коррелировало с повышением уровня экспрессии Bcl-xL на уровне транскрипции [500]. Таким образом, литературные данные являются противоречивыми, вместе с тем, очевидно, что гены семейства Bcl-2 участвуют в молекулярных механизмах злокачественной прогрессии ММ, что свидетельствует о необходимости продолжения изучения регуляции их экспрессии при ММ, в том числе и участия в этой регуляции факторов роста и их рецепторов, принадлежащих системе IGF/инсулин. Мы впервые показали, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1 регулирует экспрессию мРНК Bcl-2 и не влияет на изменение экспрессии мРНК генов Bcl-xL и Mcl-1. В линии клеток IM9 экзогенный IGF-1 увеличивает экспрессию мРНК гена Mcl-1 и не влияет на экспрессию мРНК генов Bcl-2, Bcl-xL. Изучение роли генов, принадлежащих к семейству ингибиторов апоптоза IAP, в злокачественной прогрессии опухолей человека является на сегодня 219 актуальной. Работ, посвященных их роли при ММ, не так много. Что касается регуляции их экспрессии, показано, что в клетках ММ IGF-1 повышает экспрессию HIAP-2 и XIAP [362]. Другой член семейства IAP сурвивин (survivin), как было показано, экспрессируется во многих трансформированных линиях клеток и в злокачественных опухолях [289]. В некоторых линиях клеток ММ IGF1 усиливал экспрессию сурвивина [362]. Также было показано, что экспрессия рекомбинантного сурвивина в пре-В линии клеток увеличивала выживаемость этих клеток в среде без сыворотки [32]. Имеются и другие работы, посвященные роли генов, принадлежащих к семейству ингибиторов апоптоза IAP, в злокачественной прогрессии опухолей человека. Вместе с тем в этих работах недостаточно уделено внимания роли IGF-1/IGF-1R опосредованной регуляции экспрессии генов, принадлежащих к семейству ингибиторов апоптоза IAP. Мы впервые установили, что в исследованных нами клетках ММ экспрессия мРНК гена HIAP-1, является IGF-1/IGF-1R зависимой, в то время как экспрессия мРНК генов HIAP-2, NAIP не зависит от активации IGF-1/IGF-1R сигнального пути. Таким образом, в результате исследований мы установили, что в линиях клеток множественной миеломы человека RPMI1640, RPMI8226, IM-9 экспрессия мРНК генов Bcl-2, Mcl-1, HIAP-1 является IGF-1/IGF-1R зависимой, в то время как экспрессия мРНК генов Bcl-xL, HIAP-2, NAIP не зависит от активации IGF-1/IGF1R сигнального пути. Подводя итоги обсуждения, отметим, что в данной части диссертационной работы нами впервые показано, что IGF-1 регулирует экспрессию некоторых генов семейства Bcl-2 и генов семейства ингибиторов апоптоза IAP, которые ассоциируются с малигнизированным фенотипом миеломных клеток, с их лекарственной устойчивостью, а также с усилением выживаемости клеток ММ. Данные, полученные в этой части работы легли в основу 2 отечественных и одной зарубежной статей [15, 18, 21]. 220 4.5. IGF-1- зависимая регуляция активности каспаз 3 и 7 Еще на начальных стадиях диабета у человека клетки нейронов сетчатки подвергаются апоптозу, однако причины апоптотической гибели нейронов сетчатки до начала нашей работы не были ясны [44, 218, 366]. Мы предположили, что апоптоз нейронов сетчатки является следствием нарушения IGF/инсулин зависимых сигналов выживания при диабете и/или следствием хронического воспалительного заболевания, индуцируемого про-воспалительными цитокинами: IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-α повышенные уровни, которых определяются в жидкости стекловидного тела, а также в сыворотке пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией [24, 78, 147, 288, 317, 602]. На модели нейронных клеток сетчатки глаза крысы RGC-5 мы исследовали воздействие IGF-1, инсулина и их комбинации на регуляцию активности каспаз 3 и 7 и впервые показали, что IGF-1, инсулин и их совместное воздействие подавляют активности каспаз 3 и 7. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что IGF-1 и инсулин, действительно, могут защищать от апоптоза нейронные клетки сетчатки глаза и, следовательно, могут служить факторами, усиливающими выживаемость нейронных клеток сетчатки. Наши данные согласуются с данными, полученными Barber и сотр., которые на другой линии нейронных клеток сетчатки глаза крысы R28 показали, что IGF-I и инсулин защищают нейронные клетки сетчатки от апоптоза [45]. Эта группа для анализа апоптоза применила иммуноцитохимический метод исследования, при котором они считали под микроскопом количество пикнотических клеток. В наших же исследованиях активность каспаз 3 и 7 определялась измерением количества флуоресцентного продукта, порожденного ферментативной активностью каспаз 3 и 7. Такой методический подход позволил нам определить влияние IGF-1 и инсулина на активность каспаз 3 и 7 более количественно, по сравнению с иммуноцитохимическим методом. Ранее мы также показали, что в линии R28 IGF-1 заметно уменьшает активность каспаз 3 и 7 (эти данные не приведены в диссертации). Таким образом, два независимых исследования, проведенных двумя группами исследователей на разных линиях нейронных 221 клеток сетчатки, и, выполненные с использованием разных методических подходов, подтверждают, что, действительно, IGF-I и инсулин защищают нейронные клетки сетчатки от апоптоза. Также мы исследовали влияния про-воспалительных цитокинов: IL-1β, IL-6 и TNF-α на активность каспаз 3 и 7 в клетках RGC-5 и впервые выявили, что IL-1 с высокой специфичностью активирует каспазы 3 и 7 по сравнению с IL-6 или TNF. Эти данные подтверждают наше предположение о том, что IL-1 может участвовать в индукции апоптоза. В другой работе мы также показали, что и в линии нейронных клеток сетчатки глаза крысы R28 цитокин IL-1 активирует каспазы 3 и 7 [21]. То, что IL-1 является выраженным внутриокулярным воспалительным цитокином было показано ранее. Например, в одном из экспериментов крысам и кроликам внутриокулярно вводили IL-1 и выявили, что довольно скоро после введения IL-1 в сетчатке наблюдается рост численности лейкоцитов, моноцитов и нейтрофилов [235]. Диабетическая ретинопатия имеет различные характеристики хронического воспалительного заболевания. В жидкости стекловидного тела пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией, а также в сетчатке крыс с диабетом, индуцированным стрептозоцином определяются повышенные уровни IL-1β и это ассоциируется с гибелью нейронов сетчатки [137, 179, 282]. Одним из сильных индукторов экспрессии IL-1 при диабетической ретинопатии является хроническая гипергликемия (увеличение содержания глюкозы в сыворотке при сахарном диабете) [282]. Хотя повышенные уровни IL-1β ассоциируются с гибелью нейронов сетчатки, механизм, по которому IL-1 приводит к гибели нейроны сетчатки до нашей работы не был известен. Мы впервые показали, что IL-1 активирует каспазы 3 и 7 и, таким образом, участвует в индукции апоптоза клеток и их последующей гибели. Далее мы исследовали влияние инсулина и IGF-1 на ингибирование активностей каспаз 3 и 7 в клетках RGC-5, культивированных в присутствие IL1β. В ходе этого исследования мы впервые показали, что инсулин и IGF-1 222 значительно подавляют активности каспаз 3 и 7. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что IGF-1 и инсулин могут блокировать апоптоз, вызванный IL-1β. Таким образом, наши данные впервые свидетельствуют о том, что у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией гибель нейронов сетчатки является следствием апоптоза. Апоптоз, с одной стороны, является следствием гиперэкспрессии IL-1, которая индуцируется гипергликемией, а с другой - следствием ослабления IGF/инсулин зависимых сигналов. Наши последующие исследования показали, что IL-1 не только индуцирует апоптоз, но и ингибирует энергетический метаболизм в митохондриях нейронных клеток сетчатки глаза [21]. В диссертационной работе мы не приводим результаты этих исследований, а лишь кратко упоминаем об этом, чтобы указать на то, что IL-1 является цитокином, специфически индуцирующим гибель нейронов сетчатки глаза, причем, механизмы его действия могут отличаться. Таким образом, на примере нейронных клеток сетчатки глаза RGC-5 мы впервые получили данные, свидетельствующие в пользу того, что инсулин, IGF-1 и их совместное воздействие ингибируют активности каспаз 3 и 7 и являются факторами, усиливающими выживаемость клеток. Эти данные позволяют предположить, что инсулин и IGF-1 также могут усиливать выживаемость опухолевых клеток путем ингибирования механизмов апоптоза и таким образом участвовать в опухолевой прогрессии. Особо хочется подчеркнуть значимость инсулина, который, являясь анти-апоптотическим фактором, может оказаться важным регулятором злокачественной прогрессии. В литературе имеются работы, в которых сообщается о роли инсулина при развитии онкологических заболеваний. Так, например, в результате эпидемиологических исследований было выявлено, что люди, страдающие ожирением и сахарным диабетом 2 типа, имеют более высокий риск умереть от различных видов злокачественных опухолей по сравнению с людьми, имеющими нормальный вес и не страдающими диабетом [74, 110]. У больных сахарным диабетом 2 типа в ряде тканей: мышцах, печени и в жировой ткани возникает резистентность к инсулину и развивается компенсаторная гиперинсулинемия [433]. Было показано, что для некоторых 223 типов опухолей характерна гиперэкспрессия рецептора инсулина (IR) условии гиперинсулинемии, такие опухоли демонстрируют и, в повышенную активацию IR - зависимого сигнального пути в клетках [384, 400]. Вместе с тем, блокирование тирозинкиназной активности IR или ингибирование экспрессии мРНК IR в результате применения специфической shRNA приводят к уменьшению пролиферации клеток опухоли, замедлению ангиогенеза, лимфоангиогенеза и метастазирования [163, 384, 606]. Мы уже говорили о том, что существуют две изоформы рецептора исулина: IR-A (A изоформа) и IR-B (B изоформа), которые образуются в результате альтернативного сплайсинга мРНК [167, 590]. В литературе обсуждаются вопросы относительно селективности сигналов, поступающих после активации перечисленных рецепторов, и их роли в биологии клетки. Имеются данные о том, что активация IR-A опосредует пролиферативные эффекты, тогда как активация IR-B опосредует метаболические эффекты [167, 590]. Недавно, в нашей работе, мы исследовали экспрессию мРНК IR-A и IR-B в аспиратах костного мозга, полученных от леченных больных, у которых была диагностирована множественная миелома (ММ) III стадии. Мы установили, что в исследованных образцах преимущественно экспрессируется мРНК IR-A – в 100% случаев, а экспрессия мРНК IR-B наблюдается только у 32% больных ММ [14]. Эти данные наводят на мысль, что IR-A – зависимый сигнальный путь может являться важным в биологии клеток ММ, что может являться интересным направлением будущих исследований, посвященных изучению роли инсулин - опосредуемого сигналинга в прогрессии ММ. Наши предварительные данные уже показали, что инсулин в присутствии сыворотки может усиливать пролиферацию клеток ММ [13], но не влияет на цитотоксическое действие доксорубицина [16]. Изучение роли сигналинга продолжены. опосредуемого инсулином в прогрессии ММ нами будут 224 Заключение Таким образом, в диссертационной работе нами впервые исследована роль сигнального пути, опосредованного инсулиноподобным фактором роста 1типа (IGF-1) и его рецептором IGF-1R, в регуляции важнейших биологических процессов, лежащих в основе образования и развития опухолей - дифференцировки, пролиферации, множественной лекарственной устойчивости и выживаемости злокачественных клеток. В ходе работы были получены ранее неизвестные данные, позволившие сформулировать положения о важной роли фактора роста IGF-1 и его рецептора IGF-1R в канцерогенезе и опухолевой прогрессии. Впервые показано, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь модулирует канцерогенез молочной железы, опосредованный Wnt1, таким образом, что ослабление сигнала, опосредованного IGF-1R, в контексте с гиперэкспрессией Wnt1 существенно сокращает время возникновения опухолей молочной железы и увеличивает количество возникающих опухолевых узлов. Механизм, объясняющий IGF-1R - зависимое усиление Wnt1 - опосредованного канцерогенеза молочной железы стал ясным благодаря исследованиям роли IGF1R в нормальной дифференцировке молочной железы. Эти исследования показали, что IGF-1R - зависимый сигнальный путь участвует в дифференцировке молочной железы: регулирует размеры альвеол, экспрессию казеинов, рост и третичное разветвление протоков молочной железы. Также этот сигнальный путь участвует в регуляции пролиферации клеток эпителия протоков, регулирует соотношение стволовых/базальных клеток и предшественников люминальных клеток. Регуляция популяции предшественников люминальных клеток происходит через активацию Notch сигнального пути. Нарушение IGF-1R – зависимого сигнала, недифференцированных во-первых, приводит предшественников к увеличению люминальных популяции клеток, которые являются мишенью для Wnt1 - опосредованного канцерогенеза, а, во-вторых, стабилизирует β-катенин, что приводит к активации Wnt1 – опосредуемого сигнала. Таким образом, в диссертационной работе впервые было показано, что 225 IGF-1R может участвовать, как в регуляции нормального развития молочной железы, так и в канцерогенезе, опосредованном Wnt1. Учитывая, что ослабление сигнала через IGF-1R одновременно приводит к ухудшению дифференцировки и к усилению Wnt1 - опосредованного возникновения опухолей, в более широком смысле, это может служить моделью взаимосвязи между нарушением дифференцировки и развитием злокачественной опухоли молочной железы. Хотелось бы особо отметить, что взаимодействие IGF-1R с другими известными онкогенами, важными в злокачественной прогрессии рака молочной железы на сегодня не изучены. Может случиться так, что к прогрессии опухоли приведет не понижение экспрессии IGF-1R, а наоборот, ее повышение в комбинации с экспрессией других онкогенов, отличных от Wnt-1. В этом смысле полученные нами данные открывают новое направление в изучении молекулярных механизмов злокачественной прогрессии, основанное на взаимодействии между IGF-1R – зависимым сигнальным путем и известными на сегодня онкогенными сигнальными путями, активированными в злокачественных клетках. Поэтому, основываясь на данных настоящей диссертационной работы, мы рекомендуем при исследовании экспрессии онкогенов у больных раком молочной железы параллельно исследовать их коэкспрессию с геном IGF-1R, а также исследовать активность IGF-1R - зависимого сигнала в опухолях. Впоследствии это может оказаться одним из важных прогностических маркеров и подходов к лечению не только при раке молочной железы, но и для опухолей различного гистогенеза. Комбинированное лечение злокачественных опухолей с использованием блокаторов IGF-1R считается многообещающим и исследования в этом направлении в настоящем начаты. Однако следует подчеркнуть, что использование блокаторов IGF-1R без понимания роли взаимосвязи IGF-1R с каждым из учитывающихся онкогенов может привести к ухудшению течения болезни. В диссертационной работе также было показано, что IGF-1R – опосредуемый сигнал может не только кооперировать с онкогенами, но и усиливать опухолевую прогрессию через регуляцию экспрессии генов, 226 ответственных за возникновение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Мы говорили о том, что при повторном и/или длительном лечении онкобольных цитостатиками может произойти отбор и последующее размножение тех опухолевых клеток, в которых гены, ответственные за возникновение МЛУ гиперэкспрессируется и такие клетки приобретают МЛУ. Одним из хороших примеров становления приобретенной МЛУ является МЛУ, возникающая при лечении пациентов с множественной миеломой (ММ). В наших исследованиях мы использовали образцы, полученные от длительно леченных больных ММ, и, действительно, экспрессия мРНК генов, ответственных за возникновение МЛУ, обнаруживается в подавляющем большинстве случаев. Наши исследования показали, что экспрессия мРНК гена IGF-1 в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных ММ ассоциируется с экспрессией генов МЛУ: MDR1/ABCB1, LRP/MVP, MRP1/ABCC1, BCRP/ ABCG2. Также было показано, что IGF-1R - опосредуемый сигналинг в линии клеток множественной миеломы человека RPMI8226 регулирует экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости: MRP1/ABCC1 и LRP/MVP. Таким образом, в ходе исследования (с использованием клинического материала, и линий культур клеток ММ) мы впервые получили данные, которые свидетельствуют в пользу того, что IGF-1/IGF-1R – зависимый сигнальный путь может участвовать в регуляции экспрессии мРНК генов, ответственных за МЛУ, и, тем самым, может участвовать в регуляции механизмов возникновения МЛУ при ММ. Вместе с тем, пока мы не можем точно сказать, является ли регуляция экспрессии мРНК генов МЛУ на уровне транскрипции или регуляция является посттранскрипционной (стабилизация мРНК). Также требуется изучить роль IGF1/IGF-1R – зависимого сигнального пути в регуляции синтеза и функционирования белков МЛУ. Необходимо выявить нижележащие эффекторы IGF-1/IGF-1R - зависимого сигнального пути, участвующие в передаче сигнала в ходе регуляции экспрессии мРНК и белков МЛУ. Это имеет принципиальный практический помощью аспект. Блокирование фармакологических и/или выявленных генетических эффекторов-мишеней воздействий с позволит 227 предотвратить развитие МЛУ в процессе химиотерапии. Также необходимо исследовать IGF-1/IGF-1R - зависимую регуляцию других, известных на сегодня механизмов лекарственной устойчивости, отличных от МЛУ. Таким образом, начатая нами тема исследования имеет перспективу дальнейшей разработки. Наши исследования, проведенные на клиническом материале впервые выявили, что для пациентов с ММ, у которых высокий уровень экспрессии гена IGF-1 характерно уменьшение общей выживаемости. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что высокая экспрессия гена IGF-1 может являться плохим прогностическим фактором при ММ. Однозначно объяснить механизм причинно-следственной взаимосвязи между усилением экспрессии гена IGF-1 и уменьшением общей выживаемости больных ММ сложно. Тем не менее, исходя из полученных нами данных, можно предположить, что одной из причин уменьшения общей выживаемости больных ММ может быть возникновение МЛУ, в результате чего пациенты перестают отвечать на химиотерапию. В свою очередь, возникновение МЛУ, как мы показали, может быть из-за IGF-1 опосредуемой активации экспрессии генов, ответственных за МЛУ. Другой причиной уменьшения общей выживаемости больных ММ может оказаться повышение жизнеспособности клеток ММ. Основанием для такого предположения служат полученные нами данные, свидетельствующие о том, что IGF-1 усиливает жизнеспособность линий клеток ММ человека RPMI1640 и IM9. Также мы показали, что IGF-1R – зависимый сигнал участвует в регуляции апоптоза: в линии клеток ММ человека RPMI8226 регулирует экспрессию антиапоптотичеких генов: Bcl-2 и HIAP-1; В линии клеток RGC-5 IGF-1 блокирует активацию каспаз 3 и 7, индуцированную удалением сыворотки из культивируемой среды или воздействием IL-1β. Эти данные являются основанием для объяснения механизмов, объясняющих связь между повышением экспрессии гена IGF-1 и общей выживаемостью пациентов с ММ. IGF-1 в высокой концентрации присутствует в микроокружении костного мозга и, возможно, что он является одним из важных факторов, участвующих в прогрессии ММ. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу этого предположения. В 228 экспериментах на in vitro на линиях клеток мы показали, что IGF-1R – опосредуемый сигнал регулирует экспрессию антиапоптотичеких генов и блокирует активацию каспаз 3 и 7. Возможно, что и в микроокружении костного мозга IGF-1 может проявлять в клетках ММ анти-апоптотический эффект, придавая злокачественным клеткам преимущество в борьбе за выживание, а также стимулирует их к пролиферации. Также не исключено, что IGF-1 в сочетании с другими цитокинами и факторами роста может влиять на прогрессию ММ, что может проявляться в усилении пролиферации, выживаемости и возникновении лекарственной устойчивости клеток ММ. Изучение роли IGF-1 при ММ на сегодня является одним из приоритетных направлений экспериментальной онкологии, способствующих более глубокому пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе прогрессии ММ. 229 Выводы 1. IGF-1R–зависимый сигнальный путь в клетках эпителия молочной железы реализуется через активацию гомодимера IGF-1R/IGF-1R и гетеродимера IGF1R/IR с последующей активацией Akt и Erk1/2 киназ. 2. Дифференцировка молочной железы происходит с участием IGF-1R– зависимого сигнального пути: IGF-1R регулирует размеры альвеол и экспрессию казеинов (, , , ), белка WAP в период беременности и лактации; регулирует третичное разветвлении и рост протоков молочной железы в период постнатального развития. 3. IGF-1R в молочной железе регулирует пролиферацию клеток эпителия протоков и регулирует предшественников предшественников соотношение люминальных люминальных стволовых/базальных клеток. клеток Регуляция происходит через клеток и популяции активацию сигнального пути Notch. 4. Подавление IGF-1R – зависимого сигнала одновременно с активацией Wnt1 – зависимого сигнала усиливает опухолеобразование в молочной железе: сокращает время возникновения опухолей и увеличивает количество возникающих опухолевых узлов. 5. IGF-1R участвует в регуляции множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) при множественной миеломе человека: в мононуклеарной фракции клеток аспиратов костного мозга больных множественной миеломой экспрессия гена IGF-1 ассоциируется с экспрессией генов МЛУ: MDR1/ABCB1, LRP/MVP, MRP1/ABCC1, BCRP/ ABCG2; в клетках множественной миеломы человека линии RPMI8226 IGF-1R регулирует экспрессию генов МЛУ: MRP1/ABCC1 и LRP/MVP. 230 6. Гиперэкспрессия гена IGF-1 и генов МЛУ при множественной миеломе является плохим прогностическим фактором: высокий уровень экспрессии гена IGF-1 и генов МЛУ у пациентов с множественной миеломой ассоциируется с уменьшением общей выживаемости больных. 7. IGF-1/IGF-1R–сигнальный путь стимулирует выживаемость клеток множественной миеломы человека и участвует в регуляции апоптоза, усиливая экспрессию антиапоптотичеких генов Bcl-2 и HIAP-1 и подавляя активацию эффекторных каспаз 3 и 7. 231 Список сокращений и условных обозначений АТФ аденозинтрифосфат ММ множественная миелома МЛУ множественная лекарственная устойчивость IGF-1 инсулиноподобный фактор роста 1 типа IGF-1R рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 типа MDR1/ABCB1 ген, кодирующий белок множественной лекарственной устойчивости 1/ Pgp (multidrug resistance 1) MRP1/ABCC1 ген, кодирующий белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью 1 (multidrug resistance-associated protein 1) BCRP/ABCG2 ген, кодирующий белок устойчивости рака молочной железы (breast cancer resistance protein) LRP/ MVP ген, кодирующий белок устойчивости рака легкого (lung resistance protein) ПЦР полимеразная цепная реакция; ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией Erk1/2 киназа, регулируемая внеклеточным факторами 1/2 (Extracellular signal-Regulated Kinase 1/2) РМЖ рак молочной железы JNK c-Jun N-концевые киназы (c-Jun N-terminal Kinase) МТТ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (dimethyl Tuiasolyl diphenyl Tetrazolium salt) MAPK киназа, активируемая митогенами (Mitogen-Activated Protein Kinase) mTOR мишень рапамицина млекапитающих (mammalian Target Of Rapamycin) NFkB ядерный фактор энхансера к легкой полипептидной цепи в В-клетках (Nuclear Factor of kappa light polypeptide gene 232 enhancer in B-cells) p38 белок 38 кДа стресс-активируемая киназа (38-kDa stressactivated kinase protein) PI3-K фосфо-инозитол-3-киназа (Phospho-Inositol-3-Kinase) PKB протеиновая киназа В (Protein Kinase B) PKC протеиновая киназа С (Protein Kinase C) S6K1 S6 киназа 1 40S рибосомального белка (40S ribosomal protein S6 Kinase 1) STAT белок, участвующий в передаче сигнала и активации транскрипции (Signal Transducer and Activator of Transcription) TGF трансформирующий фактор роста (Transforming Growth Factor) TNFα фактор некроза опухолей α (Tumor Necrosis Factor α) TRAIL лиганд сходный с TNF, индуцирующий апоптоз (TNFRelated Apoptosis-Inducing Ligand) uPA урокиназаподобный активатор плазминогена (urokinasetype Plasminogen Activator) uPAR рецептор урокиназаподобного активатора плазминогена (urokinase-type Plasminogen Activator Receptor) GH гормон роста (Growth Hormone) GHRH гормона выработки гормона роста (growthhormonereleasing hormone) Apaf-1 фактор 1, активирующий апоптотическую протеазу (Apoptotic protease activating factor 1) IAPs ингибиторы белков апоптоза (inhibitors of apoptosis proteins) IL-1β интерлейкин-1β (interleukin-1β) 233 Приложение Таблица 2 – Нуклеотидные последовательности специфичных праймеров к генам, размер продукта, температура отжига праймеров, используемых в ПЦР. 234 Список литературы 1. Вотякова, О.М. Множественная миелома. Клиническая Онкогематология. Руководство для врачей под редакцией профессора Волковой М.А. / О.М. Вотякова, Е.А. Демина // Издание второе, переработанное и дополненное Москва “Медицина”. –– 2007. –– С. 847-873. 2. Давыдов, М.И. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 году / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель // Издательская группа РОНЦ. –– М. : [б. и.], 2014. — 226 с. 3. Ермилова, В.Д. Роль современной патоморфологии в характеристике рака молочной железы / В.Д. Ермилова // Практическая онкология. –– 2002. –– Т. 3, № 1. –– С. 15-20. 4. Копнин, Б. П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения / Б. П. Копнин // Канцерогенез. Руководство под редакцией члена-корресподента РАМН Д. Г. Заридзе. Москва "Медицина". –– 2004. –– С. 86-102. 5. Пак, Д.Д. Подтипы рака молочной железы / Д.Д. Пак, Е.А. Рассказова, Т.В. Данилова // Маммология. –– 2012. –– № 3 –– С. 13-18. 6. Панищева, Л.А. Влияние ингибитора протеасом бортезомиба на экспрессию и активность АВС транспортеров в опухолевых клетках / Л.А. Панищева, Е.С. Какпакова, Е.Ю. Рыбалкина и др. // Биологические мембраны. –– 2010. – – Т. 27, № 2. –– С. 1-7. 7. Ставровская, А.А. Опухолевая клетка в обороне / А.А. Ставровская // Соровский образовательный журнал. –– 2001. –– Т. 7, № 7. –– С. 17-23. 8. Ставровская, А.А. Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная активностью транспортных белков клетки: некоторые новые факты и перспективы исследований / А.А. Ставровская // Биологические мембраны. –– 2003. –– Т. 20, № 3. — С. 196-205. 235 9. Тюляндин, C.A. Тройной негативный рак молочной железы / C.A. Тюляндин, M.Б. Стенина, М.А. Фролова // Практическая Онкология. –– 2010. –– Т. 11, № 4. — С. 247-252. 10. Черных, Ю.Б. Исследование уровня экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости у резистентных пациентов с множественной миеломой / Ю.Б. Черных, С.С. Шушанов, Е.Ю. Рыбалкина // Вестник Гематологии. –– 2013. –– Т. IX, № 2. — С. 54-55. 11. Шушанов, C.C. Инсулиноподобные факторы роста 1-го и 2-го типов регулируют экспрессию бета казеина in vitro в клетках эпителия молочной железы мыши / C.C. Шушанов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2011. –– Т. 152, № 8. — С. 162-165. 12. Шушанов, C.C. Роль инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1) и некоторых других членов системы IGF/инсулин в прогрессии множественной миеломы / C.C. Шушанов // Российский Биотерапевтический Журнал. –– 2012. –– Т. 11, № 3. — С. 71-80. 13. Шушанов, C.C. Влияние инсулина на выживаемость клеток множественной миеломы человека / C.C. Шушанов, Т.А. Кравцова, Ю.Б. Черных и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –– 2015. –– Т. 159, № 2. — С. 224 - 228. 14. Шушанов, C.C. Коэкспрессия мРНК генов систем IGF/инсулин и множественной лекарственной устойчивости у больных множественной миеломой / C.C. Шушанов, Л.Г. Марьина, Ю.Б. Черных и др. // Клиническая Онкогематология 2010. –– Т. 3, № 2. — С. 105-113. 15. Шушанов, С.С. Инсулиноподобный фактор роста 1-го типа и инсулин подавляют активацию каспазы -3/7, индуцированную интерлейкином - 1β в линии нейронных клеток сетчатки глаза крысы / С.С. Шушанов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –– 2010. –– Т. 150, № 7. — С. 4850. 16. Шушанов, С.С. Цитотоксическое действие доксорубицина in vitro на клетки множественной миеломы человека / С.С. Шушанов, Т.А. Кравцова // 236 Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –– 2013. –– Т. 155, № 2. — С. 195-200. 17. Шушанов, С.С. IGF-1- зависимая экспрессия мРНК гена MRP1 и LRP в линиях клеток множественной миеломы человека / С.С. Шушанов, Т.А. Кравцова, А.А. Ставровская // Российский Биотерапевтический Журнал. –– 2013. –– Т. 12, № 1. — С. 17-22. 18. Шушанов, С.С. Влияние инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1) на выживаемость клеток множественной миеломы человека / С.С. Шушанов, Кравцова Т.А. Кравцова, Ю.Б. Черных // Российский Биотерапевтический Журнал. –– 2013. –– Т. 12, № 3. — С. 29-38. 19. Abаnd, G.F. 2000 Report of the AVMA Panel on Euthanasia / G.F. Aband // J Am Vet Med Assoc. –– 2001. –– Vol. 218, N 5. — P. 669-696. 20. Abboud, S.L. Secretion of insulinlike growth factor I and insulinlike growth factorbinding proteins by murine bone marrow stromal cells / S.L. Abboud, C.R. Bethel, D.C. Aron // J Clin Invest. –– 1991. –– Vol. 88, N 2. — P. 470-475. 21. Abcouwer, S.F. Effect of IL-1beta on survival and energy metabolism of R28 and RGC-5 retinal neurons / S.F. Abcouwer, S. Shanmugam, P.F. Gomez et al. // Invest Ophthalmol Vis Sci. –– 2008. –– Vol. 49, N 12. — P. 5581-5592. 22. Abdi, J. Drug resistance in multiple myeloma: latest findings and new concepts on molecular mechanisms / J. Abdi, G. Chen, H. Chang // Oncotarget. –– 2013. –– Vol. 4, N 12. — P. 2186-2207. 23. Abramovitch, S. BRCA1-Sp1 interactions in transcriptional regulation of the IGFIR gene / S. Abramovitch, T. Glaser, T. Ouchi et al. // FEBS Lett. –– 2003. –– Vol. 541, N 1-3. — P. 149-154. 24. Abu el Asrar, A.M. Cytokines in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy / A.M. Abu el Asrar, D. Maimone, P.H. Morse et al. // Am J Ophthalmol. –– 1992. –– Vol. 114, N 6. —P. 731-736. 25. Abuzzahab, M.J. IGF-I receptor mutations resulting in intrauterine and postnatal growth retardation / M.J. Abuzzahab, A. Schneider, A. Goddard et al. // N Engl J Med. –– 2003. Vol. 349, N 23. — P. 2211-2222. 237 26. Adamo, M. Insulin-like growth factor I messenger ribonucleic acids with alternative 5'-untranslated regions are differentially expressed during development of the rat / M. Adamo, W.L. Jr. Lowe, D. LeRoith et al. // Endocrinology. –– 1989. –– Vol. 124, N 6. — P. 2737-2744. 27. Adamo, M.L. Regulation of start site usage in the leader exons of the rat insulinlike growth factor-I gene by development, fasting, and diabetes / M.L. Adamo, H. Ben-Hur, C.T. Jr. Roberts et al. // Mol Endocrinol. –– 1991. –– Vol. 5, N 11. — P. 1677-1686. 28. Adams, T.E. Structure and function of the type 1 insulin-like growth factor receptor / T.E. Adams, V.C. Epa, T.P. Garrett et al. // Cell Mol Life Sci. –– 2000. – – Vol. 57, N 7. — P. 1050-1093. 29. Aleem, E. Upregulation of the insulin receptor and type I insulin-like growth factor receptor are early events in hepatocarcinogenesis / E. Aleem, D. Nehrbass, F. Klimek et al. // Toxicol Pathol. –– 2011. –– Vol. 39, N 3. — P. 524-543. 30. Allan, S.M. Interleukin-1 and neuronal injury / S.M. Allan, P.J. Tyrrell, N.J. Rothwell // Nat Rev Immunol. –– 2005. –– Vol. 5, N 8. — P. 629-640. 31. Allen, N.E. A prospective study of serum insulin-like growth factor-I (IGF-I), IGFII, IGF-binding protein-3 and breast cancer risk / N.E. Allen, A.W. Roddam, D.S. Allen et al. // Br J Cancer. –– 2005. –– Vol. 92, N 7. — P. 1283-1287. 32. Ambrosini, G. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma / G. Ambrosini, C. Adida, D.C. Altieri // Nat Med. –– 1997. –– Vol. 3, N 8. — P. 917-921. 33. Anderson, K.C. Multiple Myeloma: New Insights and Therapeutic Approaches / K.C. Anderson, R.A. Kyle, W.S. Dalton et al. // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. –– 2000. ––Vol. 2000, N1. — P. 147-165. 34. Anderson, S.M. Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: it's not just about milk protein synthesis / S.M. Anderson, M.C. Rudolph, J.L. McManaman et al. // Breast Cancer Res. –– 2007. –– Vol. 9, N 1. — P. 204-217. 238 35. Angelloz-Nicoud, P. Autocrine regulation of cell proliferation by the insulin-like growth factor (IGF) and IGF binding protein-3 protease system in a human prostate carcinoma cell line (PC-3) / P. Angelloz-Nicoud, M. Binoux // Endocrinology. –– 1995. Vol. 136, N 12. — P. 5485-5492. 36. Arceci, R.J. Clinical significance of P-glycoprotein in multidrug resistance malignancies / R.J. Arceci // Blood. –– 1993. –– Vol. 81, N 9. — P. 2215-2222. 37. Arteaga, C.L. Growth inhibition of human breast cancer cells in vitro with an antibody against the type I somatomedin receptor / C.L. Arteaga, C.K. Osborne // Cancer Res. –– 1989. –– Vol. 49, N 22. — P. 6237-6241. 38. Asosingh, K. In vivo induction of insulin-like growth factor-I receptor and CD44v6 confers homing and adhesion to murine multiple myeloma cells / K. Asosingh, U. Gunthert, M.H. Bakkus et al. // Cancer Res. –– 2000. –– Vol. 60, N 11. — P. 3096-3104. 39. Ayyanan, A. Increased Wnt signaling triggers oncogenic conversion of human breast epithelial cells by a Notch-dependent mechanism / A. Ayyanan, G. Civenni, L. Ciarloni et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. –– Vol. 103, N 10. — P. 3799-3804. 40. Bach, L.A. The insulin-like growth factor system in kidney disease and hypertension / L.A. Bach // Curr Opin Nephrol Hypertens. –– 2012. –– Vol. 21, N 1. — P. 86-91. 41. Baker, J. Effects of an Igf1 gene null mutation on mouse reproduction / J. Baker, M.P. Hardy, J. Zhou et al. // Mol Endocrinol. –– 1996. –– Vol. 10, N 7. — P. 903918. 42. Baker, J. Role of insulin-like growth factors in embryonic and postnatal growth / J. Baker, J.P. Liu, E.J. Robertson et al. // Cell. 1993. –– Vol. 75, N 1. — P. 73-82. 43. Bang, P. Postoperative induction of insulin-like growth factor binding protein-3 proteolytic activity: relation to insulin and insulin sensitivity / P. Bang, J. Nygren, C. Carlsson-Skwirut et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 1998. –– Vol. 83, N 7. — P. 2509-2515. 239 44. Barber, A.J. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin / A.J. Barber, E. Lieth, S.A. Khin et al. // J Clin Invest. –– 1998. –– Vol. 102, N 4. — P. 783-791. 45. Barber, A.J. Insulin rescues retinal neurons from apoptosis by a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-mediated mechanism that reduces the activation of caspase-3 / A.J. Barber, M. Nakamura, E.B. Wolpert et al. // J Biol Chem. –– 2001. –– Vol. –– 276, N 35. — P. 32814-32821. 46. Barille, S. Metalloproteinases in multiple myeloma: production of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), activation of proMMP-2, and induction of MMP-1 by myeloma cells / S. Barille, C. Akhoundi, M. Collette et al. // Blood. –– 1997. –– Vol. 90, N4. — P. 1649-1655. 47. Barille, S. Production of metalloproteinase-7 (matrilysin) by human myeloma cells and its potential involvement in metalloproteinase-2 activation / S. Barille, R. Bataille, M.J. Rapp et al. // J Immunol. 1999. –– Vol. 163, N 10. — P. 5723-5728. 48. Baron, V. p125Fak focal adhesion kinase is a substrate for the insulin and insulinlike growth factor-I tyrosine kinase receptors / V. Baron, V. Calleja, P. Ferrari et al. // J Biol Chem. –– 1998. –– Vol. 273, N 12. — P. 7162-7168. 49. Barton, E.R. The ABCs of IGF-I isoforms: impact on muscle hypertrophy and implications for repair / E.R. Barton // Appl Physiol Nutr Metab. –– 2006. –– Vol. 31, N 6. — P. 791-797. 50. Baserga, R. Cell cycle and growth control / R. Baserga, R. Rubin // Crit Rev Eukaryot Gene Expr. –– 1993. –– Vol. 3, N 1. — P. 47-61. 51. Baylink, D.J. Growth factors to stimulate bone formation / D.J. Baylink, R.D. Finkelman, S. Mohan // J Bone Miner Res. –– 1993. –– Vol. 8, Suppl 2 — P. S565-572. 52. Beitner-Johnson, D. Insulin-like growth factor-I stimulates tyrosine phosphorylation of endogenous c-Crk / D. Beitner-Johnson, D. LeRoith // J Biol Chem. –– 1995. –– Vol. 270, N 10. — P. 5187-5190. 240 53. Bellacosa, A. A retroviral oncogene, akt, encoding a serine-threonine kinase containing an SH2-like region / A. Bellacosa, J.R. Testa, S.P. Staal et al. // Science. –– 1991. –– Vol. 254, N 5029. — P. 274-277. 54. Benabbou, N. Hospicells promote upregulation of the ATP-binding cassette genes by insulin-like growth factor-I via the JAK2/STAT3 signaling pathway in an ovarian cancer cell line / N. Benabbou, P. Mirshahi, M. Cadillon et al. // Int J Oncol. –– 2013. –– Vol. 43, N 3. — P. 685-694. 55. Benyoucef, S. Characterization of insulin/IGF hybrid receptors: contributions of the insulin receptor L2 and Fn1 domains and the alternatively spliced exon 11 sequence to ligand binding and receptor activation / S. Benyoucef, K.H. Surinya, D. Hadaschik et al. // Biochem J. 2007. –– Vol. 403, N 3. — P. 603-613. 56. Bereket, A. Insulin-like growth factor binding protein-3 proteolysis in children with insulin-dependent diabetes mellitus: a possible role for insulin in the regulation of IGFBP-3 protease activity / A. Bereket, C.H. Lang, S.L. Blethen et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 1995. –– Vol. 80, N 8. — P. 2282-2288. 57. Berelowitz, M. Somatomedin-C mediates growth hormone negative feedback by effects on both the hypothalamus and the pituitary / M. Berelowitz, M. Szabo, L.A. Frohman et al. // Science. –– 1981. –– Vol. 212, N 4500. — P. 1279-1281. 58. Bergsagel, D.E. Benzene and multiple myeloma: appraisal of the scientific evidence / D.E. Bergsagel, O. Wong, P.L. Bergsagel et al. // Blood. –– 1999. –– Vol. 94, N 4. — P. 1174-1182. 59. Bertherat, J. Neuroendocrine regulation of growth hormone / J. Bertherat, M.T. Bluet-Pajot, J. Epelbaum // Eur J Endocrinol. –– 1995. –– Vol. 132, N 1. — P. 1224. 60. Bhanot, P. A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a Wingless receptor / P. Bhanot, M. Brink, C.H. Samos et al. // Nature. –– 1996. –– Vol. 382, N 6588. — P. 225-230. 61. Bieche, I. Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay / I. Bieche, I. Laurendeau, S. Tozlu et al. // Cancer Res. –– 1999. –– Vol. 59, N 12. — P. 2759-2765. 241 62. Bissell, D.M. Support of cultured hepatocytes by a laminin-rich gel. Evidence for a functionally significant subendothelial matrix in normal rat liver / D.M. Bissell, D.M. Arenson, J.J. Maher et al. // J Clin Invest. –– 1987. –– Vol. 79, N 3. — P. 801-812. 63. Bonneterre, J. Prognostic significance of insulin-like growth factor 1 receptors in human breast cancer / J. Bonneterre, J.P. Peyrat, R. Beuscart et al. // Cancer Res. – – 1990. –– Vol. 50, N 21. — P. 6931-6935. 64. Borasio, G.D. A placebo-controlled trial of insulin-like growth factor-I in amyotrophic lateral sclerosis. European ALS/IGF-I Study Group / G.D. Borasio, W. Robberecht, P.N. Leigh et al. // Neurology. –– 1998. –– Vol. 51, N 2. — P. 583-586. 65. Borg, A.G. Overexpression of lung-resistance protein and increased P-glycoprotein function in acute myeloid leukaemia cells predict a poor response to chemotherapy and reduced patient survival / A.G. Borg, R. Burgess, L.M. Green et al. // Br J Haematol. –– 1998. –– Vol. 103, N4. — P. 1083-1091. 66. Bouras, T. Notch signaling regulates mammary stem cell function and luminal cell-fate commitment / T. Bouras, B. Pal, F. Vaillant et al. // Cell Stem Cell. –– 2008. –– Vol. 3, N 4. — P. 429-441. 67. Brady, G. Upregulation of IGF-2 and IGF-1 receptor expression in oral cancer cell lines / G. Brady, S.J. Crean, P. Naik et al. // Int J Oncol. –– 2007. –– Vol. 31, N 4. — P. 875-881. 68. Braulke, T. Proteolysis of IGFBPs by cathepsin D in vitro and in cathepsin Ddeficient mice / T. Braulke, M. Claussen, P. Saftig et al. // Prog Growth Factor Res. –– 1995. ––Vol. 6, N 2-4. — P. 265-271. 69. Brissenden, J.E. Human chromosomal mapping of genes for insulin-like growth factors I and II and epidermal growth factor / J.E. Brissenden, A. Ullrich, U. Francke // Nature. –– 1984. –– Vol. 310, N 5980. — P. 781-784. 70. Brown, A.M. A retrovirus vector expressing the putative mammary oncogene int-1 causes partial transformation of a mammary epithelial cell line / A.M. Brown, R.S. Wildin, T.J. Prendergast et al. // Cell. –– 1986. –– Vol. 46, N 7. — P. 1001-1009. 242 71. Butler, A.A. Insulin-like growth factor-I receptor signal transduction: at the interface between physiology and cell biology / A.A. Butler, S. Yakar, I.H. Gewolb et al. // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. –– 1998. –– Vol. 121, N 1. — P. 19-26. 72. Cailleau, J. Independent control of the production of insulin-like growth factor I and its binding protein by cultured testicular cells / J. Cailleau, S. Vermeire, G. Verhoeven // Mol Cell Endocrinol. –– 1990. –– Vol. 69, N 1. — P. 79-89. 73. Caligaris-Cappio, F. 'Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma / F. Caligaris-Cappio, L. Bergui, M.G. Gregoretti et al. // Blood. –– 1991. –– Vol. 77, N 12. — P. 2688-2693. 74. Calle, E.E. Overweight, obesity, and mortality from cancer in a prospectively studied cohort of U.S. adults / E.E. Calle, C. Rodriguez, K. Walker-Thurmond et al. // N Engl J Med. –– 2003. –– Vol. 348, N 17. — P. 1625-1638. 75. Campo, E. The 2008 WHO classification of lymphoid neoplasms and beyond: evolving concepts and practical applications / E. Campo, S.H. Swerdlow, N.L. Harris et al. // Blood. –– 2011. –– Vol. 117, N 19. — P. 5019-5032. 76. Carboni, J.M. Tumor development by transgenic expression of a constitutively active insulin-like growth factor I receptor / J.M. Carboni, A.V. Lee, D.L. Hadsell et al. // Cancer Res. –– 2005. –– Vol. 65, N 9. — P. 3781-3787. 77. Carey, L. Triple-negative breast cancer: disease entity or title of convenience? / L. Carey, E. Winer, G. Viale et al. // Nat Rev Clin Oncol. –– 2010. –– Vol. 7, N 12. — P. 683-692. 78. Carmo, A. L-arginine transport in retinas from streptozotocin diabetic rats: correlation with the level of IL-1 beta and NO synthase activity / A. Carmo, J.G. Cunha-Vaz, A.P. Carvalho et al. // Vision Res. –– 1999. –– Vol. 39, N 23. — P. 3817-3823. 79. Carro, E. Serum insulin-like growth factor I regulates brain amyloid-beta levels / E. Carro, J.L. Trejo, T. Gomez-Isla et al. // Nat Med. –– 2002. –– Vol. 8, N 12. — P. 1390-1397. 243 80. Casamassima, A. Insulin-like growth factor I stimulates tyrosine phosphorylation of p130(Cas), focal adhesion kinase, and paxillin. Role of phosphatidylinositol 3'kinase and formation of a p130(Cas).Crk complex / A. Casamassima, E. Rozengurt // J Biol Chem. ––1998. –– Vol. 273, N 40. — P. 26149-26156. 81. Catlett-Falcone, R. Constitutive activation of Stat3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells / R. Catlett-Falcone, T.H. Landowski, M.M. Oshiro et al. // Immunity. –– 1999. –– Vol. 10, N 1. — P. 105-115. 82. Chai, J. Structural and biochemical basis of apoptotic activation by Smac/DIABLO / J. Chai, C. Du, J.W. Wu et al. // Nature. –– 2000. –– Vol. 406, N 6798. — P. 855862. 83. Chambery, D. Retinoic acid stimulates IGF binding protein (IGFBP)-6 and depresses IGFBP-2 and IGFBP-4 in SK-N-SH human neuroblastoma cells / D. Chambery, B. de Galle, S. Babajko // J Endocrinol. –– 1998. –– Vol. 159, N 2. — P. 227-232. 84. Chan, J.M. Plasma insulin-like growth factor-I and prostate cancer risk: a prospective study / J.M. Chan, M.J. Stampfer, E. Giovannucci et al. // Science. –– 1998. –– Vol. 279, N 5350. — P. 563-566. 85. Chang, T.C. Absence of growth-hormone receptor in hepatocellular carcinoma and cirrhotic liver / T.C. Chang, J.J. Lin, S.C. Yu et al. // Hepatology. –– 1990. –– Vol. 11, N 1. — P. 123-126. 86. Chattopadhyay, A. PLC-gamma1 is required for IGF-I protection from cell death induced by loss of extracellular matrix adhesion / A. Chattopadhyay, G. Carpenter // J Cell Sci. –– 2002. –– Vol. 115, N 10. — P. 2233-2239. 87. Chen, C.J. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells / C.J. Chen, J.E. Chin, K. Ueda et al. // Cell. –– 1986. –– Vol. 47, N 3. — P. 381-389. 88. Chen, C.Y. Selective degradation of early-response-gene mRNAs: functional analyses of sequence features of the AU-rich elements / C.Y. Chen, A.B. Shyu // Mol Cell Biol. –– 1994. –– Vol. 14, N 12. — P. 8471-8482. 244 89. Chenu, C. Insulin like growth factor I hormonal regulation by growth hormone and by 1,25(OH)2D3 and activity on human osteoblast-like cells in short-term cultures / C. Chenu, A. Valentin-Opran, P. Chavassieux et al. // Bone. –– 1990. –– Vol. 11, N 2. — P. 81-86. 90. Chia, D.J. Characterization of distinct Stat5b binding sites that mediate growth hormone-stimulated IGF-I gene transcription / D.J. Chia, M. Ono, J. Woelfle et al. // J Biol Chem. –– 2006. –– Vol. 281, N 6. — P. 3190-3197. 91. Childs, S. The MDR superfamily of genes and its biological implications / S. Childs, V. Ling // Important Adv Oncol. –– 1994. –– P. 21-36. 92. Chin, J.E. Structure and expression of the human MDR (P-glycoprotein) gene family / J.E. Chin, R. Soffir, K.E. Noonan et al. // Mol Cell Biol. –– 1989. –– Vol. 9, N 9. — P. 3808-3820. 93. Chin, K.V. Heat shock and arsenite increase expression of the multidrug resistance (MDR1) gene in human renal carcinoma cells / K.V. Chin, S. Tanaka, G. Darlington et al. // J Biol Chem. –– 1990. –– Vol. 265, N 1. — P. 221-226. 94. Chipuk, J.E. How do BCL-2 proteins induce mitochondrial outer membrane permeabilization? / J.E. Chipuk, D.R. Green // Trends Cell Biol. –– 2008. –– Vol. 18, N 4. — P. 157-164. 95. Chou, P.M. Multidrug resistance gene expression in childhood medulloblastoma: correlation with clinical outcome and DNA ploidy in 29 patients / P.M. Chou, M. Reyes-Mugica, N. Barquin et al. // Pediatr Neurosurg. –– 1995. –– Vol. 23, N 6. — P. 283-291. 96. Clark, R. The somatogenic hormones and insulin-like growth factor-1: stimulators of lymphopoiesis and immune function / R. Clark // Endocr Rev. –– 1997. –– Vol. 18, N 2. — С. 157-179. 97. Claussen, M. Proteolysis of insulin-like growth factors (IGF) and IGF binding proteins by cathepsin D / M. Claussen, B. Kubler, M. Wendland et al. // Endocrinology. –– 1997. –– Vol. 138, N 9. — P. 3797-3803. 245 98. Clemmons, D.R. Insulin-like growth factor binding proteins and their role in controlling IGF actions / D.R. Clemmons // Cytokine Growth Factor Rev. –– 1997. –– Vol. 8, N 1. — P. 45-62. 99. Clemmons, D.R. Role of insulin-like growth factor binding proteins in controlling IGF actions / D.R. Clemmons // Mol Cell Endocrinol. –– 1998. ––Vol.140, N 1-2. — P. 19-24. 100. Coats, S. Requirement of p27Kip1 for restriction point control of the fibroblast cell cycle / S. Coats, W.M. Flanagan, J. Nourse et al. // Science. –– 1996. –– Vol. 272, N 5263. — P. 877-880. 101. Cohen, P. Overview of the IGF-I system / Cohen, P. // Horm Res. –– 2006. –– Vol. 65, Suppl 1. — P. 3-8. 102. Cohen, P. Prostate-specific antigen (PSA) is an insulin-like growth factor binding protein-3 protease found in seminal plasma / P. Cohen, H.C. Graves, D.M. Peehl et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 1992. –– Vol. 75, N 4. — P. 1046-1053. 103. Cohick, W.S. The insulin-like growth factors / W.S. Cohick, D.R. Clemmons // Annu Rev Physiol. –– 1993. –– N 55. — P. 131-153. 104. Cole, S.P. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line / S.P. Cole, G. Bhardwaj, J.H. Gerlach et al. // Science. –– 1992. –– Vol. 258, N 5088. — P. 1650-1654. 105. Collett-Solberg, P.F. The role of the insulin-like growth factor binding proteins and the IGFBP proteases in modulating IGF action / P.F. Collett-Solberg, P. Cohen // Endocrinol Metab Clin North Am. –– 1996. –– Vol. 25, N 3. — P. 591-614. 106. Colston, K.W. Growth inhibition of both MCF-7 and Hs578T human breast cancer cell lines by vitamin D analogues is associated with increased expression of insulin-like growth factor binding protein-3 / K.W. Colston, C.M. Perks, S.P. Xie et al. // J Mol Endocrinol. –– 1998. –– Vol. 20, N 1. — P. 157-162. 107. Cooke, D.W. Analysis of the human type I insulin-like growth factor receptor promoter region / D.W. Cooke, L.A. Bankert, C.T.Jr. Roberts et al. // Biochem Biophys Res Commun. –– 1991. –– Vol. 177, N 3. — P. 1113-1120. 246 108. Copeland, K.C. Recombinant human insulin-like growth factor-I increases forearm blood flow / K.C. Copeland, K.S. Nair // J Clin Endocrinol Metab. –– 1994. –– Vol. 79, N 1. — P. 230-232. 109. Coppola, D. A functional insulin-like growth factor I receptor is required for the mitogenic and transforming activities of the epidermal growth factor receptor / D. Coppola, A. Ferber, M. Miura et al. // Mol Cell Biol. –– 1994. –– Vol. 14, N 7. — P. 4588-4595. 110. Coughlin, S.S. Diabetes mellitus as a predictor of cancer mortality in a large cohort of US adults / S.S. Coughlin, E.E. Calle, L.R. Teras et al. // Am J Epidemiol. –– 2004. ––Vol. 159, N 12. — P. 1160-1167. 111. Crnkovic-Mertens, I. The anti-apoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of non-small cell lung cancer cells / I. Crnkovic-Mertens, T. Muley, M. Meister et al. // Lung Cancer. –– 2006. –– Vol. 54, № 2. — P. 135142. 112. Cross, D.A. The inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin or insulin-like growth factor 1 in the rat skeletal muscle cell line L6 is blocked by wortmannin, but not by rapamycin: evidence that wortmannin blocks activation of the mitogenactivated protein kinase pathway in L6 cells between Ras and Raf / D.A. Cross, D.R. Alessi, J.R. Vandenheede et al. // Biochem J. –– 1994. –– Vol. 303, N 1. — P. 21-26. 113. Cross, M. Growth factors in development, transformation, and tumorigenesis / M. Cross, T.M. Dexter // Cell. –– 1991. –– Vol. 64, N 2. — P. 271-280. 114. Croucher, P.I. Zoledronic acid treatment of 5T2MM-bearing mice inhibits the development of myeloma bone disease: evidence for decreased osteolysis, tumor burden and angiogenesis, and increased survival / P.I. Croucher, R. De Hendrik, M.J. Perry et al. // J Bone Miner Res. –– 2003. –– Vol. –– 18, N 3. — P. 482-492. 115. Croucher, P.I. Osteoprotegerin inhibits the development of osteolytic bone disease in multiple myeloma / P.I. Croucher, C.M. Shipman, J. Lippitt et al. // Blood. –– 2001. –– Vol. 98, N 13. — P. 3534-3540. 247 116. Cunha, G.R. Role of mesenchymal-epithelial interactions in mammary gland development / G.R. Cunha, Y.K. Hom // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 1996. –– Vol. 1, N 1. — P. 21-35. 117. Curran, S. Matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis / S. Curran, G.I. Murray // J Pathol. –– 1999. –– Vol. 189, N 3. — P. 300-308. 118. D'Ercole, A.J. Tissue concentrations of somatomedin C: further evidence for multiple sites of synthesis and paracrine or autocrine mechanisms of action / A.J. D'Ercole, A.D. Stiles, L.E. Underwood // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1984. –– Vol. 81, N 3. — P. 935-939. 119. Danielson, K.G. Epithelial mouse mammary cell line exhibiting normal morphogenesis in vivo and functional differentiation in vitro / K.G. Danielson, C.J. Oborn, E.M. Durban et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1984. –– Vol. 81, N 12. — P. 3756-3760. 120. Datta, S.R. Cellular survival: a play in three Akts / S.R. Datta, A. Brunet, M.E. Greenberg // Genes Dev. –– 1999. –– Vol. 13, N 22. — P. 2905-2927. 121. Datta, S.R. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cellintrinsic death machinery / S.R. Datta, H. Dudek, X. Tao et al. // Cell. –– 1997. –– Vol. 91, N 2. — P. 231-241. 122. Daughaday, W.H. Somatomedin: proposed designation for sulphation factor / W.H. Daughaday, K. Hall, M.S. Raben et al. // Nature. –– 1972. –– Vol. 235, N 5333. — P. 107. 123. Daughaday, W.H. Insulin-like growth factors I and II. Peptide, messenger ribonucleic acid and gene structures, serum, and tissue concentrations / W.H. Daughaday, P. Rotwein // Endocr Rev. –– 1989. –– Vol. 10, N 1. — P. 68-91. 124. Davison, Z. Insulin-like growth factor-dependent proliferation and survival of triple-negative breast cancer cells: implications for therapy / Z. Davison, G.E. de Blacquiere, B.R. Westley et al. // Neoplasia. –– 2011. –– Vol. 13, N 6. — P. 504515. 248 125. de Almagro, M.C. The inhibitor of apoptosis (IAP) proteins are critical regulators of signaling pathways and targets for anti-cancer therapy / M.C. de Almagro, D. Vucic // Exp Oncol. –– 2012. –– Vol. 34, N 3. — P. 200-211. 126. De Bruyne, E. IGF-1 suppresses Bim expression in multiple myeloma via epigenetic and posttranslational mechanisms / E. De Bruyne, T.J. Bos, F. Schuit et al. // Blood. –– 2010. –– Vol. 115, N 12. — P. 2430-2440. 127. De La Coste, A. Somatic mutations of the beta-catenin gene are frequent in mouse and human hepatocellular carcinomas / A. De La Coste, B. Romagnolo, P. Billuart et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1998. –– Vol. 95, N 15. — P. 8847-8851. 128. De Mello-Coelho, V. Pituitary hormones modulate cell-cell interactions between thymocytes and thymic epithelial cells / V. De Mello-Coelho, D.M. Villa-Verde, M. Dardenne et al. // J Neuroimmunol. –– 1997. –– Vol. 76, N 1-2. — P. 39-49. 129. De Pagter-Holthuizen, P. Organization of the human genes for insulin-like growth factors I and II / P. De Pagter-Holthuizen, F.M. van Schaik, G.M. Verduijn et al. // FEBS Lett. –– 1986. –– Vol. 195, N 1-2. — P. 179-184. 130. Dean, M. Evolution of ATP-binding cassette transporter genes / M. Dean, R. Allikmets // Curr Opin Genet Dev. –– 1995. –– Vol. 5, N 6. — P. 779-785. 131. Dean, M. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily / M. Dean, A. Rzhetsky, R. Allikmets // Genome Res. –– 2001. –– Vol. 11, N 7. — P. 1156-1166. 132. DeAngelis, T. Insulin-like growth factor I receptor is required for the mitogenic and transforming activities of the platelet-derived growth factor receptor / T. DeAngelis, A. Ferber, R. Baserga // J Cell Physiol. –– 1995. –– Vol. 164, N 1. — P. 214-221. 133. Deeks, S. Maintenance of normal rat mammary epithelial cells by insulin and insulin-like growth factor 1 / S. Deeks, J. Richards, S. Nandi // Exp Cell Res. –– 1988. –– Vol. 174, N 2. — P. 448-460. 134. Delafontaine, P. Insulin-like growth factor I gene expression in vascular cells / P. Delafontaine, K.E. Bernstein, R.W. Alexander // Hypertension. –– 1991. –– Vol. 17, N 5. — P. 693-699. 249 135. Delafontaine, P. Expression, regulation, and function of IGF-1, IGF-1R, and IGF-1 binding proteins in blood vessels / P. Delafontaine, Y.H. Song, Y. Li // Arterioscler Thromb Vasc Biol. –– 2004. –– Vol. 24, N 3. — P. 435-444. 136. Demeestere, I. Effect of insulin-like growth factor-I during preantral follicular culture on steroidogenesis, in vitro oocyte maturation, and embryo development in mice / I. Demeestere, C. Gervy, J. Centner et al. // Biol Reprod. –– 2004. –– Vol. 70, N 6. — P. 1664-1669. 137. Demircan, N. Determination of vitreous interleukin-1 (IL-1) and tumour necrosis factor (TNF) levels in proliferative diabetic retinopathy / N. Demircan, B.G. Safran, M. Soylu et al. // Eye (Lond). –– 2006. –– Vol. 20, N 12. — P. 1366-1369. 138. Desbois-Mouthon, C. Hepatocyte proliferation during liver regeneration is impaired in mice with liver-specific IGF-1R knockout / C. Desbois-Mouthon, D. Wendum, A. Cadoret et al. // Faseb J. –– 2006. –– Vol. 20, N 6. — P. 773-775. 139. Deveraux, Q.L. Cleavage of human inhibitor of apoptosis protein XIAP results in fragments with distinct specificities for caspases / Q.L. Deveraux, E. Leo, H.R. Stennicke et al. // Embo J. –– 1999. –– Vol. 18, N 19. — P. 5242-5251. 140. Deveraux, Q.L. X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases / Q.L. Deveraux, R. Takahashi, G.S. Salvesen et al. // Nature. –– 1997. –– Vol. 388, N 6639. — P. 300-304. 141. Dey, N. Wnt signaling in triple negative breast cancer is associated with metastasis / N. Dey, B.G. Barwick, C.S. Moreno et al. // BMC Cancer. –– 2013. –– N. 13. — P. 537-551. 142. Dhooge, C.R. Expression of the MDR1 gene product P-glycoprotein in childhood neuroblastoma / C.R. Dhooge, B.M. De Moerloose, Y.C. Benoit et al. // Cancer. –– 1997. –– Vol. 80, N 7. — P. 1250-1257. 143. Diehl, J.A. Glycogen synthase kinase-3beta regulates cyclin D1 proteolysis and subcellular localization / J.A. Diehl, M. Cheng, M.F. Roussel et al. // Genes Dev. – –1998. –– Vol. 12, N 22. — P. 3499-3511. 144. DiGiovanni, J. Deregulated expression of insulin-like growth factor 1 in prostate epithelium leads to neoplasia in transgenic mice / J. DiGiovanni, K. Kiguchi, A. 250 Frijhoff et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 2000. –– Vol. 97, N 7. — P. 34553460. 145. Dinarello, C.A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future / C.A. Dinarello // Cell. –– 2010. –– Vol.140, N 6. — P. 935-950. 146. Dispenzieri, A. Multiple myeloma: clinical features and indications for therapy / A. Dispenzieri, R.A. Kyle // Best Pract Res Clin Haematol. –– 2005. –– Vol. 18, N 4. — P. 553-568. 147. Doganay, S. Comparison of serum NO, TNF-alpha, IL-1beta, sIL-2R, IL-6 and IL8 levels with grades of retinopathy in patients with diabetes mellitus / S. Doganay, C. Evereklioglu, H. Er et al. // Eye (Lond). –– 2002. –– Vol. 16, N 2. — P. 163170. 148. Doyle, L.A. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells / L.A. Doyle, W. Yang, L.V. Abruzzo et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1998. –– Vol. 95, N 26. — P. 15665-15670. 149. Drach, J. Presence of a p53 gene deletion in patients with multiple myeloma predicts for short survival after conventional-dose chemotherapy / J. Drach, J. Ackermann, E. Fritz et al. // Blood. –– 1998. –– Vol. 92, N 3. — P. 802-809. 150. Drach, J. New developments and treatment in multiple myeloma: new insights on molecular biology / J. Drach, H. Kaufmann // Ann Oncol. 2002. –– Vol. 13, Suppl 4 — P. 43-47. 151. Drenou, B. Multidrug resistance in aggressive lymphoproliferative disorders of T and natural-killer origin / B. Drenou, L. Amiot, T. Lamy et al. // Leuk Lymphoma. –– 1998. –– Vol. 30, N 3-4. — P. 381-387. 152. Dupont, J. The potentiation of estrogen on insulin-like growth factor I action in MCF-7 human breast cancer cells includes cell cycle components / J. Dupont, M. Karas, D. LeRoith // J Biol Chem. –– 2000. –– Vol. 275, N 46. — P. 35893-35901. 153. Dupont, J. The insulin-like growth factor axis in cell cycle progression / J. Dupont, A. Pierre, P. Froment et al. // Horm Metab Res. –– 2003. –– Vol. 35, N 11-12. — P. 740-750. 251 154. Durie, B.G. A clinical staging system for multiple myeloma. Correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, response to treatment, and survival / B.G. Durie, S.E. Salmon // Cancer. –– 1975. –– Vol. 36, N 3. — P. 842-854. 155. Eid, H. Drug resistance and sensitivity of germ cell testicular tumors: evaluation of clinical relevance of MDR1/Pgp, p53, and metallothionein (MT) proteins / H. Eid, L. Geczi, A. Magori et al. // Anticancer Res. –– 1998. –– Vol. 18, N 4. — P. 30593064. 156. Elder, D.A. Effects of hypothyroidism on insulin-like growth factor-I expression during brain development in mice / D.A. Elder, A.F. Karayal, A.J. D'Ercole et al. // Neurosci Lett. 2000. –– Vol. 293, N 2. — P. 99-102. 157. Eleswarapu, S. Growth hormone regulation of insulin-like growth factor-I gene expression may be mediated by multiple distal signal transducer and activator of transcription 5 binding sites / S. Eleswarapu, Z. Gu, H. Jiang // Endocrinology. –– 2008. –– Vol. 149, N 5. — P. 2230-2240. 158. Ellis, M.J. Affinity for the insulin-like growth factor-II (IGF-II) receptor inhibits autocrine IGF-II activity in MCF-7 breast cancer cells / M.J. Ellis, B.A. Leav, Z. Yang et al. // Mol Endocrinol. –– 1996. –– Vol.10, N 3. — P. 286-297. 159. Fantl, V. Mice lacking cyclin D1 are small and show defects in eye and mammary gland development / V. Fantl, G. Stamp, A. Andrews et al. // Genes Dev. –– 1995. –– Vol. 9, N 19. — P. 2364-2372. 160. Ferlin, M. Insulin-like growth factor induces the survival and proliferation of myeloma cells through an interleukin-6-independent transduction pathway / M. Ferlin, N. Noraz, C. Hertogh et al. // Br J Haematol. –– 2000. –– Vol. 111, N 2. — P. 626-634. 161. Fernandez, A.M. Muscle-specific inactivation of the IGF-I receptor induces compensatory hyperplasia in skeletal muscle / A.M. Fernandez, J. Dupont, R.P. Farrar et al. // J Clin Invest. –– 2002. –– Vol. 109, N 3. — P. 347-355. 252 162. Fernandez, A.M. Functional inactivation of the IGF-I and insulin receptors in skeletal muscle causes type 2 diabetes / A.M. Fernandez, J.K. Kim, S. Yakar et al. // Genes Dev. 2001. –– Vol. 15, N 15. — P. 1926-1934. 163. Fierz, Y. Insulin-sensitizing therapy attenuates type 2 diabetes-mediated mammary tumor progression / Y. Fierz, R. Novosyadlyy, A. Vijayakumar et al. // Diabetes. – – 2010. –– Vol. 59, N 3. — P. 686-693. 164. Figueroa, J.A. Gene expression of insulin-like growth factors and receptors in neoplastic prostate tissues: correlation with clinico-pathological parameters / J.A. Figueroa, S. De Raad, V.O. Speights et al. // Cancer Invest. 2001. –– Vol. 19, N 1. — P. 28-34. 165. Fowlkes, J.L. Matrix metalloproteinases degrade insulin-like growth factor-binding protein-3 in dermal fibroblast cultures / J.L. Fowlkes, J.J. Enghild, K. Suzuki et al. // J Biol Chem. –– 1994. –– Vol. 269, N 41. — P. 25742-25746. 166. Frame, S. GSK3 takes centre stage more than 20 years after its discovery / S. Frame, P. Cohen // Biochem J. –– 2001. –– Vol. 359, N 1. — P. 1-16. 167. Frasca, F. Insulin receptor isoform A, a newly recognized, high-affinity insulinlike growth factor II receptor in fetal and cancer cells / F. Frasca, G. Pandini, P. Scalia et al. // Mol Cell Biol. –– 1999. –– Vol. 19, N 5. — P. 3278-3288. 168. Freund, G.G. Insulin and IGF-1 increase mitogenesis and glucose metabolism in the multiple myeloma cell line, RPMI 8226 / G.G. Freund, D.T. Kulas, R.A. Mooney // J Immunol. –– 1993. –– Vol.151, N 4. — P. 1811-1820. 169. Froesch, E.R. Antibody-Suppressible and Nonsuppressible Insulin-Like Activities in Human Serum and Their Physiologic Significance. An Insulin Assay with Adipose Tissue of Increased Precision and Specificity / E.R. Froesch, H. Buergi, E.B. Ramseier et al. // J Clin Invest. –– 1963. –– N 42. — P. 1816-1834. 170. Froesch, E.R. Actions of insulin-like growth factors / E.R. Froesch, C. Schmid, J. Schwander et al. // Annu Rev Physiol. –– 1985. –– N 47. — P. 443-467. 171. Fu, H. 14-3-3 proteins: structure, function, and regulation / H. Fu, R.R. Subramanian, S.C. Masters // Annu Rev Pharmacol Toxicol. –– 2000. –– N. 40. — С. 617-647. 253 172. Fu, J. Smac3, a novel Smac/DIABLO splicing variant, attenuates the stability and apoptosis-inhibiting activity of X-linked inhibitor of apoptosis protein / J. Fu, Y. Jin, L.J. Arend // J Biol Chem. 2003. –– Vol. 278, N 52. — P. 52660-52672. 173. Fulda, S. Inhibition of TRAIL-induced apoptosis by Bcl-2 overexpression / S. Fulda, E. Meyer, K.M. Debatin // Oncogene. –– 2002. –– Vol. 21, N 15. — P. 2283-2294. 174. Furlanetto, R.W. Insulin-like growth factor-I induces cyclin-D1 expression in MG63 human osteosarcoma cells in vitro / R.W. Furlanetto, S.E. Harwell, K.K. Frick // Mol Endocrinol. –– 1994. –– Vol. 8, N 4. — P. 510-517. 175. Gabbitas, B. Cortisol enhances the transcription of insulin-like growth factorbinding protein-6 in cultured osteoblasts / B. Gabbitas, E. Canalis // Endocrinology. 1996. –– Vol. 137, N 5. — P. 1687-1692. 176. Gabbitas, B. Growth factor regulation of insulin-like growth factor binding protein-6 expression in osteoblasts / B. Gabbitas, E. Canalis // J Cell Biochem. –– 1997. –– Vol. 66, N 1. — P. 77-86. 177. Gallagher, E.J. Minireview: IGF, Insulin, and Cancer / Gallagher, E.J., LeRoith D. // Endocrinology. –– 2011. –– Vol. 152, N 7. — P. 2546-2551. 178. Garcia-Fernandez, M. Low doses of insulin-like growth factor I improve insulin resistance, lipid metabolism, and oxidative damage in aging rats / M. GarciaFernandez, DG. elgado, J.E. Puche et al. // Endocrinology. –– 2008. ––Vol. 149, N 5. — P. 2433-2442. 179. Gardner, T.W. New insights into the pathophysiology of diabetic retinopathy: potential cell-specific therapeutic targets / T.W. Gardner, D.A. Antonetti, A.J. Barber et al. // Diabetes Technol Ther. –– 2000. –– Vol. 2, N 4. — P. 601-608. 180. Garrett, T.P. Crystal structure of the first three domains of the type-1 insulin-like growth factor receptor / T.P. Garrett, N.M. McKern, M. Lou et al. // Nature. –– 1998. ––Vol. 394, N 6691. — P. 395-399. 181. Gasperi, M. Growth hormone/insulin-like growth factor I axis in neurodegenerative diseases / M. Gasperi, A.E. Castellano // J Endocrinol Invest. –– 2010. ––Vol. 33, N 8. — P. 587-591. 254 182. Gazitt, Y. Bcl-2 overexpression is associated with resistance to dexamethasone, but not melphalan, in multiple myeloma cells / Y. Gazitt, V. Fey, C. Thomas et al. // Int J Oncol. –– 1998. –– Т. 13, N 2. — P. 397-405. 183. Ge, J. Expression levels of insulin-like growth factor-1 and multidrug resistanceassociated protein-1 indicate poor prognosis in patients with gastric cancer / J. Ge, Z. Chen, S. Wu et al. // Digestion. 2009. –– Vol. 80, N 3. — P. 148-158. 184. Ge, N.L. Insulin-like growth factor I is a dual effector of multiple myeloma cell growth / N.L. Ge, S. Rudikoff // Blood. 2000. –– Vol. 96, N 8. — P. 2856-2861. 185. Georgii-Hemming, P. Insulin-like growth factor I is a growth and survival factor in human multiple myeloma cell lines / P. Georgii-Hemming, H.J. Wiklund, O. Ljunggren et al. // Blood. –– 1996. –– Vol. 88, N 6. — P. 2250-2258. 186. Ghigo, M.C. Effects of GH and IGF-I administration on GHRH and somatostatin mRNA levels: I. A study on ad libitum fed and starved adult male rats / M.C. Ghigo, A. Torsello, R. Grilli et al. // J Endocrinol Invest. –– 1997. –– Vol. 20, N 3. — P. 144-150. 187. Gibson, L.F. Insulin-like growth factor-1 potentiates expansion of interleukin-7dependent pro-B cells / Gibson, L.F., Piktel D., Landreth K.S. // Blood. –– 1993. – – Vol. 82, N 10. — P. 3005-3011. 188. Gibson, R.M. CNS injury: the role of the cytokine IL-1 / R.M. Gibson, N.J. Rothwell, R.A. Le Feuvre // Vet J. –– 2004. –– Vol. 168, N 3. — P. 230-237. 189. Gicquel, C. Molecular markers and long-term recurrences in a large cohort of patients with sporadic adrenocortical tumors / C. Gicquel, X. Bertagna, V. Gaston et al. // Cancer Res. –– 2001. –– Vol. 61, N 18. — P. 6762-6767. 190. Giorgetti, S. The insulin and insulin-like growth factor-I receptor substrate IRS-1 associates with and activates phosphatidylinositol 3-kinase in vitro / S. Giorgetti, R. Ballotti, A. Kowalski-Chauvel et al. // J Biol Chem. –– 1993. –– Vol. 268, N 10. — P. 7358-7364. 191. Giovannucci, E. A prospective study of plasma insulin-like growth factor-1 and binding protein-3 and risk of colorectal neoplasia in women / E. Giovannucci, 255 M.N. Pollak, E.A. Platz et al. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. –– 2000. –– Vol. 9, N 4. — P. 345-349. 192. Giudice, L.C. Insulin-like growth factors and ovarian follicular development / L.C. Giudice // Endocr Rev. –– 1992. –– Vol. 13, N 4. — P. 641-669. 193. Giustina, A. Growth hormone, insulin-like growth factors, and the skeleton / A. Giustina, G. Mazziotti, E. Canalis // Endocr Rev. –– 2008. –– Vol. 29, N 5. — P. 535-559. 194. Glantschnig, H. Thyroid hormone and retinoic acid induce the synthesis of insulinlike growth factor-binding protein-4 in mouse osteoblastic cells / H. Glantschnig, F. Varga, K. Klaushofer // Endocrinology. –– 1996. –– Vol. 137, N 1. — P. 281286. 195. Goldstein, L.J. MDR1 gene expression in solid tumours / L.J. Goldstein // Eur J Cancer. –– 1996. –– Vol. 32A, N 6. — P. 1039-1050. 196. Goldstein, L.J. Expression of a multidrug resistance gene in human cancers / L.J. Goldstein, H. Galski, A. Fojo et al. // J Natl Cancer Inst. 1989. –– Vol. 81, N 2. — P. 116-124. 197. Gong, J. Melanoma inhibitor of apoptosis protein is expressed differentially in melanoma and melanocytic naevus, but similarly in primary and metastatic melanomas / J. Gong, N. Chen, Q. Zhou et al. // J Clin Pathol. –– 2005. –– Vol. 58, N 10. — P. 1081-1085. 198. Goodwin, P.J. Fasting insulin and outcome in early-stage breast cancer: results of a prospective cohort study / P.J. Goodwin, M. Ennis, K.I. Pritchard et al. // J Clin Oncol. –– 2002. –– Vol. 20, N 1. — P. 42-51. 199. Goolsby, C. Bcl-2 regulatory pathway is functional in chronic lymphocytic leukemia / C. Goolsby, M. Paniagua, M. Tallman et al. // Cytometry B Clin Cytom. –– 2005. –– Vol. 63, N 1. — P. 36-46. 200. Gottesman, M.M. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters / M.M. Gottesman, T. Fojo, S.E. Bates // Nat Rev Cancer. – 2002. –– Vol. 2, N 1. — P. 48-58. 256 201. Grey, A. Parallel phosphatidylinositol-3 kinase and p42/44 mitogen-activated protein kinase signaling pathways subserve the mitogenic and antiapoptotic actions of insulin-like growth factor I in osteoblastic cells / A. Grey, Q. Chen, X. Xu et al. // Endocrinology. –– 2003. –– Vol. 144, N 11. — P. 4886-4893. 202. Grimes, C.A. The multifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in cellular signaling / C.A. Grimes, R.S. Jope // Prog Neurobiol. –– 2001. –– Vol. –– 65, N 4. — P. 391-426. 203. Gual, P. Interaction of Janus kinases JAK-1 and JAK-2 with the insulin receptor and the insulin-like growth factor-1 receptor / P. Gual, V. Baron, V. Lequoy et al. // Endocrinology. –– 1998. –– Vol. 139, N 3. — P. 884-893. 204. Gucev, Z.S. Evidence for insulin-like growth factor (IGF)-independent transcriptional regulation of IGF binding protein-3 by growth hormone in SKHEP1 human hepatocarcinoma cells / Z.S. Gucev, Y. Oh, K.M. Kelley et al. // Endocrinology. –– 1997. –– Vol. 138, N 4. — P. 1464-1470. 205. Guerci, A. Predictive value for treatment outcome in acute myeloid leukemia of cellular daunorubicin accumulation and P-glycoprotein expression simultaneously determined by flow cytometry / A. Guerci, J.L. Merlin, N. Missoum et al. // Blood. –– 1995. –– Vol. 85, N 8. — P. 2147-2153. 206. Guevara-Aguirre, J. Growth hormone receptor deficiency is associated with a major reduction in pro-aging signaling, cancer, and diabetes in humans / J. Guevara-Aguirre, P. Balasubramanian, M. Guevara-Aguirre et al. // Sci Transl Med. –– 2011. –– Vol. 3, N 70. — P. 70ra13. 207. Guler, H.P. Recombinant human insulin-like growth factor I stimulates growth and has distinct effects on organ size in hypophysectomized rats / H.P. Guler, J. Zapf, E. Scheiwiller et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1988. –– Vol. 85, N 13. — P. 4889-4893. 208. Guo, Y.S. Insulin-like growth factor-I promotes multidrug resistance in MCLM colon cancer cells / Y.S. Guo, G.F. Jin, C.W. Houston et al. // J Cell Physiol. –– 1998. –– Vol. 175, N 2. — P. 141-148. 257 209. Haber, M. The prognostic value of MDR1 gene expression in primary untreated neuroblastoma / M. Haber, S.B. Bordow, P.S. Haber et al. // Eur J Cancer. –– 1997. ––Vol. 33, N 12. — P. 2031-2036. 210. Hadsell, D.L. Targeted expression of des(1-3) human insulin-like growth factor I in transgenic mice influences mammary gland development and IGF-binding protein expression / D.L. Hadsell, N.M. Greenberg, J.M. Fligger et al. // Endocrinology. –– 1996. –– Vol. 137, N 1. — P. 321-330. 211. Hadsell, D.L. Cooperative interaction between mutant p53 and des (1-3) IGF-I accelerates mammary tumorigenesis / D.L. Hadsell, K.L. Murphy, S.G. Bonnette et al. // Oncogene. –– 2000. –– Vol. 19, N 7. — P. 889-898. 212. Hadsell, D.L. Decreased lactation capacity and altered milk composition in insulin receptor substrate null mice is associated with decreased maternal body mass and reduced insulin-dependent phosphorylation of mammary Akt / D.L. Hadsell, W. Olea, N. Lawrence et al. // J Endocrinol. –– 2007. –– Vol. 194, N 2. — P. 327-336. 213. Hailer, N.P. Interleukin-1beta exacerbates and interleukin-1 receptor antagonist attenuates neuronal injury and microglial activation after excitotoxic damage in organotypic hippocampal slice cultures / N.P. Hailer, C. Vogt, H.W. Korf et al. // Eur J Neurosci. –– 2005. –– Vol. 21, N 9. — P. 2347-2360. 214. Hakam, A. Expression of insulin-like growth factor-1 receptor in human colorectal cancer / A. Hakam, T.J. Yeatman, L. Lu et al. // Hum Pathol. –– 1999. –– Vol. 30, N 10. — P. 1128-1133. 215. Hall, K. Somatomedin levels in childhood, adolescence and adult life / K. Hall, V.R. Sara // Clin Endocrinol Metab. –– 1984. –– Vol. 13, N 1. — P. 91-112. 216. Hall, L.J. Functional analysis of the rat insulin-like growth factor I gene and identification of an IGF-I gene promoter / L.J. Hall, Y. Kajimoto, D. Bichell et al. // DNA Cell Biol. –– 1992. –– Vol. 11, N 4. — P. 301-313. 217. Hamelers, I.H. Insulin-like growth factor I triggers nuclear accumulation of cyclin D1 in MCF-7S breast cancer cells / I.H. Hamelers, R.F. van Schaik, J. Sipkema et al. // J Biol Chem. –– 2002. –– Vol. 277, N 49. — P. 47645-47652. 258 218. Hammes, H.P. Nerve growth factor prevents both neuroretinal programmed cell death and capillary pathology in experimental diabetes / H.P. Hammes, H.J. Federoff, M. Brownlee // Mol Med. –– 1995. –– Vol. 1, N 5. — P. 527-534. 219. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: the next generation / D. Hanahan, R.A. Weinberg // Cell. –– 2011. –– Vol. 144, N 5. — P. 646-674. 220. Hankinson, S.E. Circulating concentrations of insulin-like growth factor-I and risk of breast cancer / S.E. Hankinson, W.C. Willett, G.A. Colditz et al. // Lancet. –– 1998. ––Vol. 351, N 9113. — P. 1393-1396. 221. Hartmann, W. Insulin-like growth factor II is involved in the proliferation control of medulloblastoma and its cerebellar precursor cells / W. Hartmann, A. Koch, H. Brune et al. // Am J Pathol. –– 2005. –– Vol. 166, N 4. — P. 1153-1162. 222. Hartog, H. The insulin-like growth factor 1 receptor in cancer: old focus, new future / H. Hartog, J. Wesseling, H.M. Boezen et al. // Eur J Cancer. 2007. –– Vol. 43, N 13. — P. 1895-1904. 223. He, T.C. Identification of c-MYC as a target of the APC pathway / T.C. He, A.B. Sparks, C. Rago et al. // Science. –– 1998. –– Vol. 281, N 5382. — P. 1509-1512. 224. Hellawell, G.O. Expression of the type 1 insulin-like growth factor receptor is upregulated in primary prostate cancer and commonly persists in metastatic disease / G.O. Hellawell, G.D. Turner, D.R. Davies et al. // Cancer Res. –– 2002. –– Vol. 62, N 10. — P. 2942-2950. 225. Hengartner, M.O. The biochemistry of apoptosis / M.O. Hengartner // Nature. –– 2000. –– Vol. 407, N 6805. — P. 770-776. 226. Hermanto, U. Inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase selectively inhibits cell proliferation in human breast cancer cells displaying enhanced insulinlike growth factor I-mediated mitogen-activated protein kinase activation / U. Hermanto, C.S. Zong, L.H. Wang // Cell Growth Differ. –– 2000. –– Vol. 11, N 12. — P. 655-664. 227. Hernandez-Sanchez, C. Differential regulation of insulin-like growth factor-I (IGFI) receptor gene expression by IGF-I and basic fibroblastic growth factor / C. 259 Hernandez-Sanchez, H. Werner, C.T. Jr.Roberts, et al. // J Biol Chem. –– 1997. –– Vol. 272, N 8. — P. 4663-4670. 228. Herschkowitz, J.I. Identification of conserved gene expression features between murine mammary carcinoma models and human breast tumors / J.I. Herschkowitz, K. Simin, V.J. Weigman et al. // Genome Biol. –– 2007. –– Vol. 8, N 5. — P. R76. 229. Hideshima, T. Advances in biology of multiple myeloma: clinical applications / T. Hideshima, P.L. Bergsagel, W.M. Kuehl et al. // Blood. –– 2004. –– Vol. 104, N 3. — P. 607-618. 230. Hideshima, T. Biologic sequelae of interleukin-6 induced PI3-K/Akt signaling in multiple myeloma / T. Hideshima, N. Nakamura, D. Chauhan et al. // Oncogene. – – 2001. –– Vol. 20, N 42. — P. 5991-6000. 231. Higgins, C.F. ABC transporters: from microorganisms to man / C.F. Higgins // Annu Rev Cell Biol. –– 1992. –– N 8. — P. 67-113. 232. Hinton, P.S. IGF-I alters lymphocyte survival and regeneration in thymus and spleen after dexamethasone treatment / P.S. Hinton, C.A. Peterson, E.M. Dahly et al. // Am J Physiol. –– 1998. –– Vol. 274, N 4, Pt 2. — P. R912-920. 233. Hirschberg, R. Insulin-like growth factor I in the kidney / R. Hirschberg // Miner Electrolyte Metab. –– 1996. ––Vol. 22, N 1-3. — P. 128-132. 234. Hoeflich, K.P. Requirement for glycogen synthase kinase-3beta in cell survival and NF-kappaB activation / K.P. Hoeflich, J. Luo, E.A. Rubie et al. // Nature. –– 2000. –– Vol. 406, N 6791. — P. 86-90. 235. Hoekzema, R. Cytokines and intraocular inflammation / R. Hoekzema, P.I. Murray, A. Kijlstra // Curr Eye Res. –– 1990. –– N. 9. — P. 207-211. 236. Hornstein, E. Canalization of development by microRNAs / E. Hornstein, N. Shomron // Nat Genet. –– 2006. –– N. 38. — P. S20-24. 237. Howard, B.A. Human breast development / B.A. Howard, B.A. Gusterson // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 2000. –– Vol. 5, N 2. — P. 119-137. 238. Howe, L.R. Transcriptional activation of cyclooxygenase-2 in Wnt-1-transformed mouse mammary epithelial cells / L.R. Howe, K. Subbaramaiah, W.J. Chung et al. // Cancer Res. –– 1999. –– Vol. 59, N 7. — P. 1572-1577. 260 239. Hsu, J.H. Role of the AKT kinase in expansion of multiple myeloma clones: effects on cytokine-dependent proliferative and survival responses / J.H. Hsu, Y. Shi, L. Hu et al. // Oncogene. –– 2002. –– Vol. 21, N 9. — P. 1391-1400. 240. Hu, S. Cellular inhibitor of apoptosis 1 and 2 are ubiquitin ligases for the apoptosis inducer Smac/DIABLO / S. Hu, X. Yang // J Biol Chem. –– 2003. –– Vol. 278, N 12. — P. 10055-10060. 241. Huang, Y. Structural basis of caspase inhibition by XIAP: differential roles of the linker versus the BIR domain / Y. Huang, Y.C. Park, R.L. Rich et al. // Cell. –– 2001. –– Vol. 104, N 5. — P. 781-790. 242. Humbel, R.E. Insulin-like growth factors I and II / R.E. Humbel // Eur J Biochem. –– 1990. –– Vol. 190, N 3. — P. 445-462. 243. Hyde, S.C. Structural model of ATP-binding proteins associated with cystic fibrosis, multidrug resistance and bacterial transport / S.C. Hyde, P. Emsley, M.J. Hartshorn et al. // Nature. –– 1990. ––Vol. 346, N 6282. — P. 362-365. 244. Hyndman, A.G. Identification of a population of amacrine cells rich in insulin receptors / A.G. Hyndman // Brain Res Dev Brain Res. –– 1993. –– Vol. 75, N 2. — P. 289-292. 245. Idelman, G. WT1-p53 interactions in insulin-like growth factor-I receptor gene regulation / G. Idelman, T. Glaser, C.T. Jr. Roberts et al. // J Biol Chem. ––2003. – – Vol. 278, N 5. — P. 3474-3482. 246. Imagawa, W. Somatomedin-C substitutes for insulin for the growth of mammary epithelial cells from normal virgin mice in serum-free collagen gel cell culture / W. Imagawa, E.M. Spencer, L. Larson et al. // Endocrinology. –– 1986. –– Vol. 119, N 6. — P. 2695-2699. 247. Imoto, I., Tsuda H., Hirasawa A. et al. Expression of cIAP1, a target for 11q22 amplification, correlates with resistance of cervical cancers to radiotherapy / I. Imoto, H. Tsuda, A. Hirasawa et al. // Cancer Res. –– 2002. –– Vol. 62, N 17. — P. 4860-4866. 261 248. Jackson, D. Fibroblast growth factor receptor signalling has a role in lobuloalveolar development of the mammary gland / D. Jackson, J. Bresnick, I. Rosewell et al. // J Cell Sci. –– 1997. –– № 110. — P. 1261-1268. 249. Jaffer, S. Immunohistochemical detection of antiapoptotic protein X-linked inhibitor of apoptosis in mammary carcinoma / S. Jaffer, L. Orta, S. Sunkara et al. // Hum Pathol. –– 2007. –– Vol. 38, N 6. — P. 864-870. 250. Jakobovits, A. Two proto-oncogenes implicated in mammary carcinogenesis, int-1 and int-2, are independently regulated during mouse development / A. Jakobovits, G.M. Shackleford, H.E. Varmus et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1986. –– Vol. 83, N 20. — P. 7806-7810. 251. Jammes, H. Insulin-like growth factor 1 receptors in human breast tumour: localisation and quantification by histo-autoradiographic analysis / H. Jammes, J.P. Peyrat, E. Ban et al. // Br J Cancer. –– 1992. –– Vol. 66, N 2. — P. 248-253. 252. Jardieu, P. In vivo administration of insulin-like growth factor-I stimulates primary B lymphopoiesis and enhances lymphocyte recovery after bone marrow transplantation / P. Jardieu, R. Clark, D. Mortensen et al. // J Immunol. –– 1994. –– Vol. 152, N 9. — P. 4320-4327. 253. Jiang, L. MicroRNA-7 targets IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor) in tongue squamous cell carcinoma cells / L. Jiang, X. Liu, Z. Chen et al. // Biochem J. –– 2010. –– Vol. 432, N 1. — P. 199-205. 254. Joazeiro, C.A. RING finger proteins: mediators of ubiquitin ligase activity / C.A. Joazeiro, A.M. Weissman // Cell. –– 2000. –– Vol. 102, N 5. — P. 549-552. 255. Jones, J.I. Insulin-like growth factors and their binding proteins: biological actions / J.I. Jones, D.R. Clemmons // Endocr Rev. –– 1995. –– Vol. 16, N 1. — P. 3-34. 256. Joseph, H. Overexpression of a kinase-deficient transforming growth factor-beta type II receptor in mouse mammary stroma results in increased epithelial branching / H. Joseph, A.E. Gorska, P. Sohn et al. // Mol Biol Cell. –– 1999. –– Vol. 10, N 4. — P. 1221-1234. 257. Jourdan, M. Regulation of Bcl-2-family proteins in myeloma cells by three myeloma survival factors: interleukin-6, interferon-alpha and insulin-like growth 262 factor 1 / M. Jourdan, J. De Vos, N. Mechti et al. // Cell Death Differ. –– 2000. –– Vol. 7, N 12. — P. 1244-1252. 258. Jourdan, M. A major role for Mcl-1 antiapoptotic protein in the IL-6-induced survival of human myeloma cells / M. Jourdan, J.L. Veyrune, J. De Vos et al. // Oncogene. –– 2003. –– Vol. 22, N 19. — P. 2950-2959. 259. Kanter-Lewensohn, L. Expression of insulin-like growth factor-1 receptor (IGF1R) and p27Kip1 in melanocytic tumors: a potential regulatory role of IGF-1 pathway in distribution of p27Kip1 between different cyclins / L. KanterLewensohn, A. Dricu, L. Girnita et al. // Growth Factors. –– 2000. –– Vol. 17, N 3. — P. 193-202. 260. Kato, H. Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR-3) / H. Kato, T.N. Faria, B. Stannard et al. // J Biol Chem. –– 1993. –– Vol. 268, N 4. — P. 26552661. 261. Kato, H. Essential role of tyrosine residues 1131, 1135, and 1136 of the insulinlike growth factor-I (IGF-I) receptor in IGF-I action / H. Kato, T.N. Faria, B. Stannard et al. // Mol Endocrinol. –– 1994. –– Vol. 8, N1. — P. 40-50. 262. Kaufmann, S.H. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy / S.H. Kaufmann, W.C. Earnshaw // Exp Cell Res. –– 2000. –– Vol. 256, N 1. — P. 42-49. 263. Kazansky, A.V. Regulation of mammary gland factor/Stat5a during mammary gland development / A.V. Kazansky, B. Raught, S.M. Lindsey et al. // Mol Endocrinol. –– 1995. –– Vol. 9, N 11. — P. 1598-1609. 264. Kelley, K.M. Insulin-like growth factor-binding proteins (IGFBPs) and their regulatory dynamics / K.M. Kelley, Y. Oh, S.E. Gargosky et al. // Int J Biochem Cell Biol. –– 1996. –– Vol. 28, N 6. — P. 619-637. 265. Kelly, T. Matrix metalloproteinases in multiple myeloma / T. Kelly, M. Borset, E. Abe et al. // Leuk Lymphoma. –– 2000. –– Vol. 37, N 3-4. — P. 273-281. 263 266. Khandwala, H.M. The effects of insulin-like growth factors on tumorigenesis and neoplastic growth / H.M. Khandwala, I.E. McCutcheon, A. Flyvbjerg et al. // Endocr Rev. –– 2000. –– Vol. 21, N 3. — P. 215-244. 267. Khramtsov, A.I. Wnt/beta-catenin pathway activation is enriched in basal-like breast cancers and predicts poor outcome / A.I. Khramtsov, G.F. Khramtsova, M. Tretiakova et al. // Am J Pathol. –– 2010. –– Vol. 176, N 6. — P. 2911-2920. 268. Kiely, P.A. RACK1 is an insulin-like growth factor 1 (IGF-1) receptor-interacting protein that can regulate IGF-1-mediated Akt activation and protection from cell death / P.A. Kiely, A. Sant, R. O'Connor // J Biol Chem. –– 2002. –– Vol. 277, N 25. — P. 22581-22589. 269. Kiess, W. Biochemical evidence that the type II insulin-like growth factor receptor is identical to the cation-independent mannose 6-phosphate receptor / W. Kiess, G.D. Blickenstaff, M.M. Sklar et al. // J Biol Chem. –– 1988. –– Vol. 263, N 19. — P. 9339-9344. 270. Kim, J.H. Prognostic significance of insulin growth factor-I receptor and insulin growth factor binding protein-3 expression in primary breast cancer / J.H. Kim, Y.H. Cho, Y.L. Park et al. // Oncol Rep. –– 2010. –– Vol. 23, N 4. — P. 989-995. 271. Kim, S. Differentiation generates paracrine cell pairs that maintain basaloid mouse mammary tumors: proof of concept / S. Kim, S. Goel, C.M. Alexander // PLoS One. –– 2011. –– Vol. 6, N 4. — P. e19310. 272. Kim, S.O. Increased expression of the insulin-like growth factor I (IGF-I) receptor gene in hepatocellular carcinoma cell lines: implications of IGF-I receptor gene activation by hepatitis B virus X gene product / S.O. Kim, J.G. Park, Y.I. Lee // Cancer Res. –– 1996. –– Vol. 56, N 16. — P. 3831-3836. 273. Kinzler, K.W. Lessons from hereditary colorectal cancer / K.W. Kinzler, B. Vogelstein // Cell. –– 1996. –– Vol. –– 87, N 2. — P. 159-170. 274. Kitanaka, S. Regulation of human insulin, IGF-I, and multidrug resistance protein 2 promoter activity by hepatocyte nuclear factor (HNF)-1beta and HNF-1alpha and the abnormality of HNF-1beta mutants / S. Kitanaka, U. Sato, T. Igarashi // J Endocrinol. –– 2007. –– Vol. 192, N 1. — P. 141-147. 264 275. Klammt, J. IGF1R mutations as cause of SGA / J. Klammt, W. Kiess, R. Pfaffle // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. –– 2011. –– Vol. 25, N 1. — P. 191-206. 276. Klammt, J. IGF signaling defects as causes of growth failure and IUGR / J. Klammt, R. Pfaffle, H. Werner et al. // Trends Endocrinol Metab. –– 2008. –– Vol. 19, N 6. — P. 197-205. 277. Kleinberg, D.L. Early mammary development: growth hormone and IGF-1 / D.L. Kleinberg // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 1997. –– Vol. 2, N 1. — P. 4957. 278. Kleinberg, D.L. Role of IGF-I in normal mammary development / D.L. Kleinberg // Breast Cancer Res Treat. –– 1998. –– Vol. 47, N 3. — P. 201-208. 279. Kleinberg, D.L. IGF-I: an essential factor in terminal end bud formation and ductal morphogenesis / D.L. Kleinberg, M. Feldman, W. Ruan // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 2000. –– Vol. 5, N 1. — P. 7-17. 280. Kluger, H.M. The X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) is up-regulated in metastatic melanoma, and XIAP cleavage by Phenoxodiol is associated with Carboplatin sensitization / H.M. Kluger, M.M. McCarthy, A.B. Alvero et al. // J Transl Med. –– 2007. –– Vol. 5, N. — P. 6. 281. Koval, A.P. Interplay of the proto-oncogene proteins CrkL and CrkII in insulinlike growth factor-I receptor-mediated signal transduction / A.P. Koval, M. Karas, Y. Zick et al. // J Biol Chem. –– 1998. –– Vol. 273, N 24. — P. 14780-14787. 282. Kowluru, R.A. Role of interleukin-1beta in the pathogenesis of diabetic retinopathy / R.A. Kowluru, S. Odenbach // Br J Ophthalmol. –– 2004. –– Vol. 88, N 10. — P. 1343-1347. 283. Kruis, T. Heterozygous mutation within a kinase-conserved motif of the insulinlike growth factor I receptor causes intrauterine and postnatal growth retardation / T. Kruis, J. Klammt, A. Galli-Tsinopoulou et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 2010. –– Vol. 95, N 3. — P. 1137-1142. 284. Kubler, B. Proteolysis of insulin-like growth factor binding proteins by a novel 50kilodalton metalloproteinase in human pregnancy serum / B. Kubler, S. Cowell, J. Zapf et al. // Endocrinology. –– 1998. –– Vol. 139, N 4. — P. 1556-1563. 265 285. Kudo, Y. Regulation of insulin-like growth factor-binding protein-4 protease activity by estrogen and parathyroid hormone in SaOS-2 cells: implications for the pathogenesis of postmenopausal osteoporosis / Y. Kudo, M. Iwashita, S. Itatsu et al. // J Endocrinol. –– 1996. –– Vol. 150, N 2. — N. 223-229. 286. Kuhn, D.J. Targeting the insulin-like growth factor-1 receptor to overcome bortezomib resistance in preclinical models of multiple myeloma / D.J. Kuhn, Z. Berkova, R.J. Jones et al. // Blood. –– 2012. –– Vol. 120, N 16. — P. 3260-3270. 287. Kukita, T. Macrophage inflammatory protein-1 alpha (LD78) expressed in human bone marrow: its role in regulation of hematopoiesis and osteoclast recruitment / T. Kukita, H. Nomiyama, Y. Ohmoto et al. // Lab Invest. –– 1997. –– Vol. 76, N 3. — P. 399-406. 288. Kulseng, B. Soluble tumor necrosis factor receptors in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus: relations to duration and complications of disease / B. Kulseng, L. Vatten, T. Espevik // Acta Diabetol. –– 1999. –– Vol. 36, N 1-2. — P. 99-105. 289. LaCasse, E.C. The inhibitors of apoptosis (IAPs) and their emerging role in cancer / E.C. LaCasse, S. Baird, R.G. Korneluk et al. // Oncogene. –– 1998. –– Vol. 17, N 25. — P. 3247-3259. 290. Lacey, D.L. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation / D.L. Lacey, E. Timms, H.L. Tan et al. // Cell. –– 1998. –– Vol. 93, N 2. — P. 165-176. 291. Lai, E.C. Effect of recombinant human insulin-like growth factor-I on progression of ALS. A placebo-controlled study. The North America ALS/IGF-I Study Group / E.C. Lai, K.J. Felice, B.W. Festoff et al. // Neurology. –– 1997. –– Vol. 49, N 6. — P. 1621-1630. 292. Lalou, C. Interactions between insulin-like growth factor-I (IGF-I) and the system of plasminogen activators and their inhibitors in the control of IGF-binding protein-3 production and proteolysis in human osteosarcoma cells / C. Lalou, C. Silve, R. Rosato et al. // Endocrinology. –– 1994. –– Vol. 135, N 6. — P. 23182326. 266 293. Laron, Z. Laron syndrome (primary growth hormone resistance or insensitivity): the personal experience 1958-2003 / Z. Laron // J Clin Endocrinol Metab. –– 2004. –– Vol. 89, N 3. — P. 1031-1044. 294. Laron, Z. Genetic pituitary dwarfism with high serum concentation of growth hormone--a new inborn error of metabolism? / Z. Laron, A. Pertzelan, S. Mannheimer // Isr J Med Sci. –– 1966. –– Vol. 2, N 2. — P. 152-155. 295. Larsson, O. Role of insulin-like growth factor 1 receptor signalling in cancer / O. Larsson, A. Girnita, L. Girnita // Br J Cancer. –– 2005. –– Vol. 92, N 12. — P. 2097-2101. 296. Laughlin, G.A. The prospective association of serum insulin-like growth factor I (IGF-I) and IGF-binding protein-1 levels with all cause and cardiovascular disease mortality in older adults: the Rancho Bernardo Study / G.A. Laughlin, E. BarrettConnor, M.H. Criqui et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 2004. –– Vol. 89, N 1. — P. 114-120. 297. Lavoie, J.N. Cyclin D1 expression is regulated positively by the p42/p44MAPK and negatively by the p38/HOGMAPK pathway / J.N. Lavoie, G. L'Allemain, A. Brunet et al. // J Biol Chem. –– 1996. –– Vol. 271, N 34. — P. 20608-20616. 298. Lawrence, J.B. The insulin-like growth factor (IGF)-dependent IGF binding protein-4 protease secreted by human fibroblasts is pregnancy-associated plasma protein-A / J.B. Lawrence, C. Oxvig, M.T. Overgaard et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1999. –– Vol. 96, N 6. — P. 3149-3153. 299. Le Roith, D. The somatomedin hypothesis: 2001 / D. Le Roith, C. Bondy, S. Yakar et al. // Endocr Rev. –– 2001. –– Vol. 22, N 1. — P. 53-74. 300. Lee, A.V. Enhancement of insulin-like growth factor signaling in human breast cancer: estrogen regulation of insulin receptor substrate-1 expression in vitro and in vivo / A.V. Lee, J.G. Jackson, J.L. Gooch et al. // Mol Endocrinol. –– 1999. –– Vol. 13, N 5. — P. 787-796. 301. Lee, A.V. Rapid induction of IGF-IR signaling in normal and tumor tissue following intravenous injection of IGF-I in mice / A.V. Lee, S.T. Taylor, J. Greenall et al. // Horm Metab Res. –– 2003. –– Vol. 35, N 11-12. — P. 651-655. 267 302. Lee, A.V. Developmental and hormonal signals dramatically alter the localization and abundance of insulin receptor substrate proteins in the mammary gland / A.V. Lee, P. Zhang, M. Ivanova et al. // Endocrinology. –– 2003. –– Vol. 144, N 6. — P. 2683-2694. 303. Lee, F.S. Insertional mutagenesis identifies a member of the Wnt gene family as a candidate oncogene in the mammary epithelium of int-2/Fgf-3 transgenic mice / F.S. Lee, T.F. Lane, A. Kuo et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1995. –– Vol. 92, N 6. — P. 2268-2272. 304. Lee, P.D. Insulin-like growth factor binding protein-1: recent findings and new directions / P.D. Lee, L.C. Giudice, C.A. Conover et al. // Proc Soc Exp Biol Med. –– 1997. –– Vol. 216, N 3. — P. 319-357. 305. Legrand, O. Adult biphenotypic acute leukaemia: an entity with poor prognosis which is related to unfavourable cytogenetics and P-glycoprotein over-expression / O. Legrand, J.Y. Perrot, G. Simonin et al. // Br J Haematol. –– 1998. –– Vol. 100, N 1. — P. 147-155. 306. Lehmann, B.D. Identification and use of biomarkers in treatment strategies for triple-negative breast cancer subtypes / B.D. Lehmann, J.A. Pietenpol // J Pathol. – – 2014. –– Vol. 232, N 2. — P. 142-150. 307. Leibiger, B. Selective insulin signaling through A and B insulin receptors regulates transcription of insulin and glucokinase genes in pancreatic beta cells / B. Leibiger, I.B. Leibiger, T. Moede et al. // Mol Cell. –– 2001. –– Vol. 7, N 3. — P. 559-570. 308. Leonard, G.D. The role of ABC transporters in clinical practice / G.D. Leonard, T. Fojo, S.E. Bates // Oncologist. –– 2003. –– Vol. 8, N 5. — P. 411-424. 309. Leppert, D. T cell gelatinases mediate basement membrane transmigration in vitro / D. Leppert, E. Waubant, R. Galardy et al. // J Immunol. –– 1995. –– Vol. 154, N 9. — P. 4379-4389. 310. LeRoith, D. The insulin-like growth factor system and cancer / D. LeRoith, C.T. Jr. Roberts // Cancer Lett. –– 2003. –– Vol. 195, N 2. — P. 127-137. 268 311. Letai, A. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics / A. Letai, M.C. Bassik, L.D. Walensky et al. // Cancer Cell. –– 2002. –– Vol. 2, N 3. — P. 183-192. 312. Li, M.L. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells / M.L. Li, J. Aggeler, D.A. Farson et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1987. –– Vol. 84, N 1. — P. 136-140. 313. Li, Y. Use of MMTV-Wnt-1 transgenic mice for studying the genetic basis of breast cancer / Y. Li, W.P. Hively, H.E. Varmus // Oncogene. –– 2000. ––Vol. 19, N 8. — P. 1002-1009. 314. Li, Y. Evidence that transgenes encoding components of the Wnt signaling pathway preferentially induce mammary cancers from progenitor cells / Y. Li, B. Welm, K. Podsypanina et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 2003. –– Vol. 100, N 26. — P. 15853-15858. 315. Li, Y.X. Antisense downregulation of a mouse mammary tumor virus activated protooncogene in mouse mammary tumor cells reverses the malignant phenotype / Y.X. Li, J. Papkoff, N.H. Sarkar // Virology. –– 1999. –– Vol. 255, N 1. — P. 138-149. 316. Lim, E. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers / E. Lim, F. Vaillant, D. Wu et al. // Nat Med. –– 2009. –– Vol. 15, N 8. — P. 907-913. 317. Limb, G.A. Evidence for control of tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) activity by TNF receptors in patients with proliferative diabetic retinopathy / G.A. Limb, H. Soomro, S. Janikoun et al. // Clin Exp Immunol. –– 1999. –– Vol. 115, N 3. — P. 409-414. 318. Lin, T.P. Role of endocrine, autocrine, and paracrine interactions in the development of mammary hyperplasia in Wnt-1 transgenic mice / T.P. Lin, R.C. Guzman, R.C. Osborn et al. // Cancer Res. –– 1992. –– Vol. 52, N 16. — P. 44134419. 269 319. Lindsay, J. Bcl-2 proteins and mitochondria - specificity in membrane targeting for death / J. Lindsay, M.D. Esposti, A.P. Gilmore // Biochim Biophys Acta. –– 2011. –– Vol. 1813, N 4. — P. 532-539. 320. Linn, S.C. Prognostic relevance of P-glycoprotein expression in breast cancer / S.C. Linn, G. Giaccone, P.J. van Diest et al. // Ann Oncol. –– 1995. –– Vol. 6, N 7. — P. 679-685. 321. Linsenmeyer, M.E. Levels of expression of the mdr1 gene and glutathione Stransferase genes 2 and 3 and response to chemotherapy in multiple myeloma / M.E. Linsenmeyer, S. Jefferson, M. Wolf et al. // Br J Cancer. –– 1992. –– Vol. 65, N 3. — P. 471-475. 322. Litzenburger, B.C. High IGF-IR activity in triple-negative breast cancer cell lines and tumorgrafts correlates with sensitivity to anti-IGF-IR therapy / B.C. Litzenburger, C.J. Creighton, A. Tsimelzon et al. // Clin Cancer Res. –– 2011. –– Vol. 17, N 8. — P. 2314-2327. 323. Liu, B.Y. Mammary gland development requires syndecan-1 to create a betacatenin/TCF-responsive mammary epithelial subpopulation / B.Y. Liu, Y.C. Kim, V. Leatherberry et al. // Oncogene. –– 2003. –– Vol. 22, N 58. — P. 9243-9253. 324. Liu, J.P. Mice carrying null mutations of the genes encoding insulin-like growth factor I (Igf-1) and type 1 IGF receptor (Igf1r) / J.P. Liu, J. Baker, A.S. Perkins et al. // Cell. –– 1993. –– Vol. 75, N 1. — P. 59-72. 325. Liu, X. Activation of Stat5a and Stat5b by tyrosine phosphorylation is tightly linked to mammary gland differentiation / X. Liu, G.W. Robinson, L. Hennighausen // Mol Endocrinol. –– 1996. –– Vol.10, N 12. — P. 1496-1506. 326. Liu, X. Stat5a is mandatory for adult mammary gland development and lactogenesis / X. Liu, G.W. Robinson, K.U. Wagner et al. // Genes Dev. –– 1997. – – Vol. 11, N 2. — P. 179-186. 327. Liu, X. Insulin-like growth factor I treatment reduces clinical deficits and lesion severity in acute demyelinating experimental autoimmune encephalomyelitis / X. Liu, D.L. Yao, H. Webster // Mult Scler. –– 1995. –– Vol. 1, N 1. — P. 2-9. 270 328. Loe, D.W. Biology of the multidrug resistance-associated protein, MRP / D.W. Loe, R.G. Deeley, S.P. Cole // Eur J Cancer. –– 1996. –– Vol. 32A, N 6. — P. 945957. 329. Lokhorst, H.M. Primary tumor cells of myeloma patients induce interleukin-6 secretion in long-term bone marrow cultures / H.M. Lokhorst, T. Lamme, M. de Smet et al. // Blood. –– 1994. –– Vol. 84, N 7. — P. 2269-2277. 330. Lowe, S.W. Apoptosis in cancer / S.W. Lowe, A.W. Lin // Carcinogenesis. –– 2000. ––Vol. 21, N 3. — P. 485-495. 331. Ludwig, T. Mouse mutants lacking the type 2 IGF receptor (IGF2R) are rescued from perinatal lethality in Igf2 and Igf1r null backgrounds / T. Ludwig, J. Eggenschwiler, P. Fisher et al. // Dev Biol. –– 1996. –– Vol. 177, N 2. — P. 517535. 332. Lupu, F. Roles of growth hormone and insulin-like growth factor 1 in mouse postnatal growth / F. Lupu, J.D. Terwilliger, K. Lee et al. // Dev Biol. –– 2001. –– Vol. 229, N 1. — P. 141-162. 333. Ma, J. Prospective study of colorectal cancer risk in men and plasma levels of insulin-like growth factor (IGF)-I and IGF-binding protein-3 / J. Ma, M.N. Pollak, E. Giovannucci et al. // J Natl Cancer Inst. –– 1999. –– Vol. 91, N 7. — P. 620625. 334. MacFarlane, M. Proteasome-mediated degradation of Smac during apoptosis: XIAP promotes Smac ubiquitination in vitro / M. MacFarlane, W. Merrison, S.B. Bratton et al. // J Biol Chem. –– 2002. –– Vol. 277, N 39. — P. 36611-36616. 335. Macias, H. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number / H. Macias, A. Moran, Y. Samara et al. // Dev Cell. –– 2011.–– Vol. 20, N 6. — P. 827-840. 336. Madden, M.J. Identification of 5' and 3' sequences involved in the regulation of transcription of the human mdr1 gene in vivo / M.J. Madden, C.S. Morrow, M. Nakagawa et al. // J Biol Chem. –– 1993. –– Vol. 268, N 11. — P. 8290-8297. 337. Magoffin, D.A. Insulin-like growth factor-I regulation of luteinizing hormone (LH) receptor messenger ribonucleic acid expression and LH-stimulated signal 271 transduction in rat ovarian theca-interstitial cells / D.A. Magoffin, S.R. Weitsman // Biol Reprod. –– 1994. –– Vol. 51, N 4. — P. 766-775. 338. Maiso, P. The insulin-like growth factor-I receptor inhibitor NVP-AEW541 provokes cell cycle arrest and apoptosis in multiple myeloma cells / P. Maiso, E.M. Ocio, M. Garayoa et al. // Br J Haematol. –– 2008. –– Vol. 141, N 4. — P. 470-482. 339. Mamay, C.L. An inhibitory function for JNK in the regulation of IGF-I signaling in breast cancer / C.L. Mamay, A.M. Mingo-Sion, D.M. Wolf et al. // Oncogene. – – 2003. –– Vol. 22, N 4. — P. 602-614. 340. Manes, S. The matrix metalloproteinase-9 regulates the insulin-like growth factortriggered autocrine response in DU-145 carcinoma cells / S. Manes, M. Llorente, R.A. Lacalle et al. // J Biol Chem. –– 1999. –– Vol. 274, N 11. — P. 6935-6945. 341. Maor, S. Estrogen receptor regulates insulin-like growth factor-I receptor gene expression in breast tumor cells: involvement of transcription factor Sp1 / S. Maor, D. Mayer, R.I. Yarden et al. // J Endocrinol. –– 2006. –– Vol. 191, N 3. — P. 605612. 342. Marie, J.P. MDR1/P-glycoprotein in haematological neoplasms / J.P. Marie, D.C. Zhou, S. Gurbuxani et al. // Eur J Cancer. –– 1996. –– Vol. 32A, N 6. — P. 10341038. 343. Marinaro, J.A. HaCaT human keratinocytes express IGF-II, IGFBP-6, and an acidactivated protease with activity against IGFBP-6 / J.A. Marinaro, E.C. Hendrich, K.S. Leeding et al. // Am J Physiol. –– 1999. –– Vol. 276, N 3. — P. E536-542. 344. Marino, P.A. Regulation of the multidrug resistance gene in regenerating rat liver / P.A. Marino, M.M. Gottesman, I. Pastan // Cell Growth Differ. –– 1990. –– Vol. 1, N 2. — P. 57-62. 345. Martin, A.A. IGF-I and its variant, des-(1-3)IGF-I, enhance growth in rats with reduced renal mass / A.A. Martin, F.M. Tomas, P.C. Owens et al. // Am J Physiol. –– 1991. ––Vol. 261, N 4 Pt 2. — P. F626-633. 346. Martin, J.L. Insulin-like growth factor-binding protein-3 production by MCF-7 breast cancer cells: stimulation by retinoic acid and cyclic adenosine 272 monophosphate and differential effects of estradiol / J.L. Martin, J.A. Coverley, S.T. Pattison et al. // Endocrinology. –– 1995. –– Vol. 136, N 3. — P. 1219-1226. 347. Mason, J.O. Mutational analysis of mouse Wnt-1 identifies two temperaturesensitive alleles and attributes of Wnt-1 protein essential for transformation of a mammary cell line / J.O. Mason, J. Kitajewski, H.E. Varmus // Mol Biol Cell. –– 1992. –– Vol. 3, N 5. — P. 521-533. 348. Massague, J. The subunit structures of two distinct receptors for insulin-like growth factors I and II and their relationship to the insulin receptor / J. Massague, M.P. Czech // J Biol Chem. –– 1982. –– Vol. 257, N 9. — P. 5038-5045. 349. Masters, S.C. 14-3-3 proteins mediate an essential anti-apoptotic signal / S.C. Masters, H. Fu // J Biol Chem. –– 2001. –– Vol. 276, N 48. — P. 45193-45200. 350. McCarthy, N.J. Inhibition of Ced-3/ICE-related proteases does not prevent cell death induced by oncogenes, DNA damage, or the Bcl-2 homologue Bak / N.J. McCarthy, M.K. Whyte, C.S. Gilbert et al. // J Cell Biol. –– 1997. –– Vol. 136, N 1. — P. 215-227. 351. McCarthy, T.L. Cyclic AMP induces insulin-like growth factor I synthesis in osteoblast-enriched cultures / T.L. McCarthy, M. Centrella, E. Canalis // J Biol Chem. –– 1990. –– Vol. 265, N 26. — P. 15353-15356. 352. McCoy, C. The Wilms' tumor suppressor, WT1, inhibits 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate activation of the multidrug resistance-1 promoter / C. McCoy, S.B. McGee, M.M. Cornwell // Cell Growth Differ. –– 1999. –– Vol. 10, N 6. — P. 377-386. 353. McCoy, C. 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate activation of the MDR1 promoter is mediated by EGR1 / C. McCoy, D.E. Smith, M.M. Cornwell // Mol Cell Biol. –– 1995. –– Vol. 15, N 11. — P. 6100-6108. 354. McMahon, A.P. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain / A.P. McMahon, A. Bradley // Cell. –– 1990. –– Vol. 62, N 6. — P. 1073-1085. 355. Menten, P. Macrophage inflammatory protein-1 / P. Menten, A. Wuyts, J. Van Damme // Cytokine Growth Factor Rev. –– 2002. –– Vol. 13, N 6. — P. 455-481. 273 356. Menu, E. Myeloma cells (5TMM) and their interactions with the marrow microenvironment / E. Menu, K. Asosingh, I. Van Riet et al. // Blood Cells Mol Dis. –– 2004. –– Vol. 33, N 2. — P. 111-119. 357. Menu, E. The F-actin content of multiple myeloma cells as a measure of their migration / E. Menu, F. Braet, M. Timmers et al. // Ann N Y Acad Sci. –– 2002. –– Vol. 973, N — P. 124-136. 358. Michieli, M. P-glycoprotein, lung resistance-related protein and multidrug resistance associated protein in de novo acute non-lymphocytic leukaemias: biological and clinical implications / M. Michieli, D. Damiani, A. Ermacora et al. // Br J Haematol. –– 1999. –– Vol. 104, N 2. — P. 328-335. 359. Mills, E.S. Mammary alveolar epithelial cells: effect of hydrocortisone on ultrastructure / E.S. Mills, Y.J. Topper // Science. –– 1969. –– Vol. 165, N 3898. — P. 1127-1128. 360. Miquel, C. Role of bax mutations in apoptosis in colorectal cancers with microsatellite instability / C. Miquel, F. Borrini, S. Grandjouan et al. // Am J Clin Pathol. –– 2005. ––Vol. 123, N 4. — P. 562-570. 361. Mira, E. Insulin-like growth factor I-triggered cell migration and invasion are mediated by matrix metalloproteinase-9 / E. Mira, S. Manes, R.A. Lacalle et al. // Endocrinology. –– 1999. –– Vol. 140, N 4. — P. 1657-1664. 362. Mitsiades, C.S. Activation of NF-kappaB and upregulation of intracellular antiapoptotic proteins via the IGF-1/Akt signaling in human multiple myeloma cells: therapeutic implications / C.S. Mitsiades, N. Mitsiades, V. Poulaki et al. // Oncogene.–– 2002. –– Vol. 21, N 37. — P. 5673-5683. 363. Mitsiades, C.S. Inhibition of the insulin-like growth factor receptor-1 tyrosine kinase activity as a therapeutic strategy for multiple myeloma, other hematologic malignancies, and solid tumors / C.S. Mitsiades, N.S. Mitsiades, C.J. McMullan et al. // Cancer Cell. –– 2004. –– Vol. 5, N 3. — P. 221-230. 364. Miura, K. Inhibitor of apoptosis protein family as diagnostic markers and therapeutic targets of colorectal cancer / K. Miura, W. Fujibuchi, K. Ishida et al. // Surg Today. –– 2011. –– Vol. 41, N 2. — P. 175-182. 274 365. Miyashita, T. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene / T. Miyashita, J.C. Reed // Cell. –– 1995. –– Vol. 80, N 2. — P. 293-299. 366. Mohr, S. Caspase activation in retinas of diabetic and galactosemic mice and diabetic patients / S. Mohr, X. Xi, J. Tang et al. // Diabetes. –– 2002. –– Vol. 51, N 4. — P. 1172-1179. 367. Molyneux, G. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells / G. Molyneux, F.C. Geyer, F.A. Magnay et al. // Cell Stem Cell. –– 2010. –– Vol. 7, N 3. — P. 403-417. 368. Monget, P. Regulation of ovarian folliculogenesis by IGF and BMP system in domestic animals / P. Monget, S. Fabre, P. Mulsant et al. // Domest Anim Endocrinol. –– 2002. –– Vol. 23, N 1-2. — P. 139-154. 369. Monno, S. Insulin-like growth factor I activates c-Jun N-terminal kinase in MCF-7 breast cancer cells / S. Monno, M.V. Newman, M. Cook et al. // Endocrinology. –– 2000. –– Vol. 141, N 2. — P. 544-550. 370. Motoyama, N. Massive cell death of immature hematopoietic cells and neurons in Bcl-x-deficient mice / N. Motoyama, F. Wang, K.A. Roth et al. // Science. –– 1995. –– Vol. 267, N 5203. — P. 1506-1510. 371. Moxham, C.P. Insulin-like growth factor I receptor beta-subunit heterogeneity. Evidence for hybrid tetramers composed of insulin-like growth factor I and insulin receptor heterodimers / C.P. Moxham, V. Duronio, S. Jacobs // J Biol Chem. –– 1989. –– Vol. 264, N 22. — P. 13238-13244. 372. Muise-Helmericks, R.C. Cyclin D expression is controlled post-transcriptionally via a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent pathway / R.C. MuiseHelmericks, H.L. Grimes, A. Bellacosa et al. // J Biol Chem. 1998. –– Vol. 273, N 45. — P. 29864-29872. 373. Murphy, W.J. Human growth hormone promotes engraftment of murine or human T cells in severe combined immunodeficient mice / W.J. Murphy, S.K. Durum, D.L. Longo // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1992. ––Vol. 89, N 10. — P. 44814485. 275 374. Murphy, W.J. Role of neuroendocrine hormones in murine T cell development. Growth hormone exerts thymopoietic effects in vivo / W.J. Murphy, S.K. Durum, D.L. Longo // J Immunol. –– 1992. ––Vol. 149, N 12. — P. 3851-3857. 375. Nahor, I. The p53-family members p63 and p73 inhibit insulin-like growth factor-I receptor gene expression in colon cancer cells / I. Nahor, S. Abramovitch, K. Engeland et al. // Growth Horm IGF Res. –– 2005. –– Vol. 15, N 6. — P. 388-396. 376. Nakagawa, Y. IAP family protein expression correlates with poor outcome of multiple myeloma patients in association with chemotherapy-induced overexpression of multidrug resistance genes / Y. Nakagawa, S. Abe, M. Kurata et al. // Am J Hematol. –– 2006. –– Vol. 81, N 11. — P. 824-831. 377. Navarro, M. Limited redundancy of survival signals from the type 1 insulin-like growth factor receptor / M. Navarro, R. Baserga // Endocrinology. –– 2001. –– Vol. 142, N 3. — P. 1073-1081. 378. Naville, D. Control of production of insulin-like growth factor I by pig Leydig and Sertoli cells cultured alone or together. Cell-cell interactions / D. Naville, P.G. Chatelain, O. Avallet et al. // Mol Cell Endocrinol. –– 1990. –– Vol. 70, N 3. — P. 217-224. 379. Neuenschwander, S. Involution of the lactating mammary gland is inhibited by the IGF system in a transgenic mouse model / S. Neuenschwander, A. Schwartz, T.L. Wood et al. // J Clin Invest. –– 1996. –– Vol. 97, N 10. — P. 2225-2232. 380. Nicholson, D.W. Apoptosis. Baiting death inhibitors / D.W. Nicholson // Nature. – – 2001. –– Vol. 410, N 6824. — P. 33-34. 381. Nilsson, K. The control of proliferation, survival and apoptosis in human multiple myeloma cells in vitro / K. Nilsson, P. Georgii-Hemming, H. Spets et al. // Curr Top Microbiol Immunol. –– 1999. –– N. 246. — P. 325-333. 382. Noel, A. Emerging roles for proteinases in cancer / A. Noel, C. Gilles, K. Bajou et al. // Invasion Metastasis. –– 1997. –– Vol. 17, N 5. — P. 221-239. 383. Nooter, K. Multidrug resistance-associated protein (MRP) in haematological malignancies / K. Nooter, H. Burger, G. Stoter // Leuk Lymphoma. –– 1996. –– Vol. 20, N 5-6. — P. 381-387. 276 384. Novosyadlyy, R. Insulin-mediated acceleration of breast cancer development and progression in a nonobese model of type 2 diabetes / R. Novosyadlyy, D.E. Lann, A. Vijayakumar et al. // Cancer Res. –– 2010. –– Vol. 70, N 2. — P. 741-751. 385. Nusse, R. A new nomenclature for int-1 and related genes: the Wnt gene family / R. Nusse, A. Brown, J. Papkoff et al. // Cell. –– 1991. –– Vol. 64, N 2. — P. 231. 386. Nusse, R. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome / R. Nusse, H.E. Varmus // Cell. –– 1982. –– Vol. 31, N 1. — P. 99-109. 387. O'Connor, R. Regulation of IGF-I receptor signaling in tumor cells / R. O'Connor // Horm Metab Res. –– 2003. ––Vol. 35, N 11-12. — P. 771-777. 388. O'Toole, S.A. Therapeutic targets in triple negative breast cancer / S.A. O'Toole, J.M. Beith, E.K. Millar et al. // J Clin Pathol. –– 2013. –– Vol. 66, N 6. — P. 530542. 389. Ogawa, M. Cytokines prevent dexamethasone-induced apoptosis via the activation of mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways in a new multiple myeloma cell line / M. Ogawa, T. Nishiura, K. Oritani et al. // Cancer Res. –– 2000. –– Vol. 60, N15. — P. 4262-4269. 390. Oh, Y. Transforming growth factor-beta-induced cell growth inhibition in human breast cancer cells is mediated through insulin-like growth factor-binding protein-3 action / Y. Oh, H.L. Muller, L. Ng et al. // J Biol Chem. –– 1995. –– Vol. 270, N 23. — P. 13589-13592. 391. Ohlsson, C. The role of liver-derived insulin-like growth factor-I / C. Ohlsson, S. Mohan, K. Sjogren et al. // Endocr Rev. –– 2009. –– Vol. 30, N 5. — P. 494-535. 392. Oka, T. Studies on the function of glucocorticoid in mouse mammary epithelial cell differentiation in vitro. Stimulation of glucose 6-phosphate dehydrogenase / T. Oka, J.W. Perry // J Biol Chem. –– 1974. –– Vol. 249, N 11. — P. 3586-3591. 393. Oka, T. Hormone-dependent accumulation of rough endoplasmic reticulum in mouse mammary epithelial cells in vitro / T. Oka, Y.J. Topper // J Biol Chem. –– 1971. –– Vol. 246, N 24. — P. 7701-7707. 277 394. Olney, R.C. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha increase insulin-like growth factor-binding protein-3 (IGFBP-3) production and IGFBP-3 protease activity in human articular chondrocytes / R.C. Olney, D.M. Wilson, M. Mohtai et al. // J Endocrinol. ––1995. –– Vol. 146, N 2. — P. 279-286. 395. Oltvai, Z.N. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death / Z.N. Oltvai, C.L. Milliman, S.J. Korsmeyer // Cell. –– 1993. –– Vol. 74, N 4. — P. 609-619. 396. Palmqvist, R. Plasma insulin-like growth factor 1, insulin-like growth factor binding protein 3, and risk of colorectal cancer: a prospective study in northern Sweden / R. Palmqvist, G. Hallmans, S. Rinaldi et al. // Gut. –– 2002. –– Vol. 50, N 5. — P. 642-646. 397. Pandini, G. Insulin/insulin-like growth factor I hybrid receptors have different biological characteristics depending on the insulin receptor isoform involved / G. Pandini, F. Frasca, R. Mineo et al. // J Biol Chem. –– 2002. –– Vol. 277, N 42. — P. 39684-39695. 398. Pandini, G. Androgens up-regulate the insulin-like growth factor-I receptor in prostate cancer cells / G. Pandini, R. Mineo, F. Frasca et al. // Cancer Res. –– 2005. –– Vol. 65, N 5. — P. 1849-1857. 399. Pap, M. Role of glycogen synthase kinase-3 in the phosphatidylinositol 3Kinase/Akt cell survival pathway / M. Pap, G.M. Cooper // J Biol Chem. –– 1998. –– Vol. 273, N 32. — P. 19929-19932. 400. Papa, V. Elevated insulin receptor content in human breast cancer / V. Papa, V. Pezzino, A. Costantino et al. // J Clin Invest. –– 1990. –– Vol. 86, N 5. — P. 15031510. 401. Pardee, A.B. G1 events and regulation of cell proliferation / A.B. Pardee // Science. –– 1989. –– Vol. 246, N 4930. — P. 603-608. 402. Parker, A. Expression of insulin-like growth factor I receptor and survival in patients with clear cell renal cell carcinoma / A. Parker, J.C. Cheville, C. Lohse et al. // J Urol. –– 2003. –– Vol. 170, N 2. — P. 420-424. 278 403. Parker, A.S. High expression levels of insulin-like growth factor-I receptor predict poor survival among women with clear-cell renal cell carcinomas / A.S. Parker, J.C. Cheville, C.A. Janney et al. // Hum Pathol. –– 2002. –– Vol. 33, N 8. — P. 801-805. 404. Pennica, D. WISP genes are members of the connective tissue growth factor family that are up-regulated in wnt-1-transformed cells and aberrantly expressed in human colon tumors / D. Pennica, T.A. Swanson, J.W. Welsh et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1998. –– Vol. 95, N 25. — P. 14717-14722. 405. Pennisi, P.A. Role of growth hormone (GH) in liver regeneration / P.A. Pennisi, J.J. Kopchick, S. Thorgeirsson et al. // Endocrinology. –– 2004. –– Vol. 145, N 10. — P. 4748-4755. 406. Perks, C.M. IGFBPs and breast cancer / C.M. Perks, J.M. Holly // Breast Dis. –– 2003. –– N. 17. — P. 91-104. 407. Perks, C.M. The insulin-like growth factor (IGF) family and breast cancer / C.M. Perks, J.M. Holly // Breast Dis. –– 2003. –– N. 18. — P. 45-60. 408. Pete, G. Insulin-like growth factor-I decreases mean blood pressure and selectively increases regional blood flow in normal rats / G. Pete, Y. Hu, M. Walsh et al. // Proc Soc Exp Biol Med. –– 1996. –– Vol. 213, N 2. — P. 187-192. 409. Peterson, J.E. Phosphorylation and activation of the IGF-I receptor in srctransformed cells / J.E. Peterson, T. Jelinek, M. Kaleko et al. // J Biol Chem. –– 1994. –– Vol. 269, N 44. — P. 27315-27321. 410. Petley, T. Variation among cell types in the signaling pathways by which IGF-I stimulates specific cellular responses / T. Petley, K. Graff, W. Jiang et al. // Horm Metab Res. –– 1999. –– Vol. 31, N 2-3. — P. 70-76. 411. Petridou, E. Endometrial cancer and the IGF system: a case-control study in Greece / E. Petridou, P. Koukoulomatis, D.M. Alexe et al. // Oncology. –– 2003. – – Vol. 64, N 4. — P. 341-345. 412. Pettersson, M. Expression of the bcl-2 gene in human multiple myeloma cell lines and normal plasma cells / M. Pettersson, H. Jernberg-Wiklund, L.G. Larsson et al. // Blood. –– 1992. –– Vol. 79, N 2. — P. 495-502. 279 413. Peyrat, J.P. Insulin-like growth factor 1 receptors in human breast cancer and their relation to estradiol and progesterone receptors / J.P. Peyrat, J. Bonneterre, R. Beuscart et al. // Cancer Res. –– 1988. –– Vol. 48, N 22. — P. 6429-6433. 414. Peyrat, J.P. Presence and characterization of insulin-like growth factor 1 receptors in human benign breast disease / J.P. Peyrat, J. Bonneterre, J.C. Laurent et al. // Eur J Cancer Clin Oncol. –– 1988. –– Vol. 24, N 9. — P. 1425-1431. 415. Pietrzkowski, Z. Constitutive expression of insulin-like growth factor 1 and insulin-like growth factor 1 receptor abrogates all requirements for exogenous growth factors / Z. Pietrzkowski, R. Lammers, G. Carpenter et al. // Cell Growth Differ. –– 1992. –– Vol. 3, N 4. — P. 199-205. 416. Pinteaux, E. Neuroprotective actions of endogenous interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) are mediated by glia / E. Pinteaux, N.J. Rothwell, H. Boutin // Glia. –– 2006. –– Vol. 53, N 5. — P. 551-556. 417. Plymate, S.R. Reexpression of the type 1 insulin-like growth factor receptor inhibits the malignant phenotype of simian virus 40 T antigen immortalized human prostate epithelial cells / S.R. Plymate, V.L. Bae, L. Maddison et al. // Endocrinology. –– 1997. -- Vol. 138, N 4. — P. 1728-1735. 418. Pollak, M.N. Insulin-like growth factors and neoplasia / M.N. Pollak, E.S. Schernhammer, S.E. Hankinson // Nat Rev Cancer. –– 2004. –– Vol. 4, N 7. — P. 505-518. 419. Probst-Hensch, N.M. IGF-1, IGF-2 and IGFBP-3 in prediagnostic serum: association with colorectal cancer in a cohort of Chinese men in Shanghai / N.M. Probst-Hensch, J.M. Yuan, F.Z. Stanczyk et al. // Br J Cancer. –– 2001. –– Vol. 85, N 11. — P. 1695-1699. 420. Prokipcak, R.D. The AU-rich 3' untranslated region of human MDR1 mRNA is an inefficient mRNA destabilizer / R.D. Prokipcak, A. Raouf, C. Lee // Biochem Biophys Res Commun. –– 1999. ––Vol. 261, N 3. — P. 627-634. 421. Puche, J.E. Low doses of insulin-like growth factor-I induce mitochondrial protection in aging rats / J.E. Puche, M. Garcia-Fernandez, J. Muntane et al. // Endocrinology. –– 2008. –– Vol. 149, N 5. — P. 2620-2627. 280 422. Puthier, D. Mcl-1 and Bcl-xL are co-regulated by IL-6 in human myeloma cells / D. Puthier, S. Derenne, S. Barille et al. // Br J Haematol. –– 1999. –– Vol. 107, N 2. — P. 392-395. 423. Qi, G. Intracellular localization of survivin determines biological behavior in colorectal cancer / G. Qi, H. Tuncel, E. Aoki et al. // Oncol Rep. –– 2009. –– Vol. 22, N 3. — P. 557-562. 424. Qiang, Y.W. Insulinlike growth factor-I signaling in multiple myeloma: downstream elements, functional correlates, and pathway cross-talk / Y.W. Qiang, E. Kopantzev, S. Rudikoff // Blood. –– 2002. ––Vol. 99, N 11. — P. 4138-4146. 425. Qiang, Y.W. Insulin-like growth factor I induces migration and invasion of human multiple myeloma cells / Y.W. Qiang, L. Yao, G. Tosato et al. // Blood. –– 2004. – – Vol. 103, N 1. — P. 301-308. 426. Raab, M.S. Multiple myeloma / M.S. Raab, K. Podar, I. Breitkreutz et al. // Lancet. 2009. –– Vol. 374, N 9686. — P. 324-339. 427. Rabkin, R. New concepts: growth hormone, insulin-like growth factor-I and the kidney / R. Rabkin, F. Schaefer // Growth Horm IGF Res. –– 2004. –– Vol. 14, N 4. — P. 270-276. 428. Raffo, A.J. Overexpression of bcl-2 protects prostate cancer cells from apoptosis in vitro and confers resistance to androgen depletion in vivo / A.J. Raffo, H. Perlman, M.W. Chen et al. // Cancer Res. –– 1995. –– Vol. 55, N 19. — P. 4438-4445. 429. Railo, M.J. The prognostic value of insulin-like growth factor-I in breast cancer patients. Results of a follow-up study on 126 patients / M.J. Railo, K. von Smitten, F. Pekonen // Eur J Cancer. –– 1994. –– Vol. 30A, N 3. — P. 307-311. 430. Rajah, R. 7S nerve growth factor is an insulin-like growth factor-binding protein protease / R. Rajah, A. Bhala, S.E. Nunn et al. // Endocrinology. –– 1996. –– Vol. 137, N 7. — P. 2676-2682. 431. Rakha, E.A. Basal-like breast cancer: a critical review / E.A. Rakha, J.S. ReisFilho, I.O. Ellis // J Clin Oncol. –– 2008. –– Vol. 26, N 15. — P. 2568-2581. 432. Ramachandra, M. Functional characterization of a glycine 185-to-valine substitution in human P-glycoprotein by using a vaccinia-based transient 281 expression system / M. Ramachandra, S.V. Ambudkar, M.M. Gottesman et al. // Mol Biol Cell. –– 1996. –– Vol. 7, N 10. — P. 1485-1498. 433. Reaven, G.M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease / G.M. Reaven // Physiol Rev. –– 1995. –– Vol. 75, N 3. — P. 473-486. 434. Reed, J.C. Bcl-2 family proteins / J.C. Reed // Oncogene. –– 1998. –– Vol. 17, N 25. — P. 3225-3236. 435. Reis-Filho, J.S. Triple negative tumours: a critical review / J.S. Reis-Filho, A.N. Tutt // Histopathology. –– 2008. –– Vol. 52, N 1. — P. 108-118. 436. Reiss, K. The protooncogene c-myb increases the expression of insulin-like growth factor 1 and insulin-like growth factor 1 receptor messenger RNAs by a transcriptional mechanism / K. Reiss, A. Ferber, S. Travali et al. // Cancer Res. –– 1991. –– Vol. 51, N 21. — P. 5997-6000. 437. Reiter, C.E. Characterization of insulin signaling in rat retina in vivo and ex vivo / C.E. Reiter, L. Sandirasegarane, E.B. Wolpert et al. // Am J Physiol Endocrinol Metab. –– 2003. –– Vol. 285, N 4. — P. E763-774. 438. Richert, M.M. An atlas of mouse mammary gland development / M.M. Richert, K.L. Schwertfeger, J.W. Ryder et al. // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 2000. ––Vol. 5, N 2. — P. 227-241. 439. Richert, M.M. The insulin-like growth factors (IGF) and IGF type I receptor during postnatal growth of the murine mammary gland: sites of messenger ribonucleic acid expression and potential functions / M.M. Richert, T.L. Wood // Endocrinology. ––1999. –– Vol. 140, N 1. — P. 454-461. 440. Rimm, D.L. Frequent nuclear/cytoplasmic localization of beta-catenin without exon 3 mutations in malignant melanoma / D.L. Rimm, K. Caca, G. Hu et al. // Am J Pathol. 1999. –– Vol. 154, N 2. — P. 325-329. 441. Rimsza, L.M. The major vault protein (MVP), a new multidrug resistance associated protein, is frequently expressed in multiple myeloma / L.M. Rimsza, K. Campbell, W.S. Dalton et al. // Leuk Lymphoma. –– 1999. –– Vol. 34, N 3-4. — P. 315-324. 282 442. Rinderknecht, E. The amino acid sequence of human insulin-like growth factor I and its structural homology with proinsulin / E. Rinderknecht, R.E. Humbel // J Biol Chem.–– 1978. –– Vol. 253, N 8. — P. 2769-2776. 443. Riordan, J.R. Purification of P-glycoprotein from plasma membrane vesicles of Chinese hamster ovary cell mutants with reduced colchicine permeability / J.R. Riordan, V. Ling // J Biol Chem. –– 1979. –– Vol. 254, N 24. — P. 12701-12705. 444. Robbins, K. Immunological effects of insulin-like growth factor-I--enhancement of immunoglobulin synthesis / K. Robbins, S. McCabe, T. Scheiner et al. // Clin Exp Immunol. –– 1994. –– Vol. 95, N 2. — P. 337-342. 445. Roelink, H. Wnt-3, a gene activated by proviral insertion in mouse mammary tumors, is homologous to int-1/Wnt-1 and is normally expressed in mouse embryos and adult brain / H. Roelink, E. Wagenaar, S. Lopes da Silva et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1990. –– Vol. 87, N 12. — P. 4519-4523. 446. Rosen, J.M. Regulation of milk protein gene expression / J.M. Rosen, S.L. Wyszomierski, D. Hadsell // Annu Rev Nutr. –– 1999. –– N. 19. — P. 407-436. 447. Rosenfeld, R.G. The growth hormone cascade and its role in mammalian growth / R.G. Rosenfeld, V. Hwa // Horm Res. –– 2009. –– Vol. 71 Suppl 2 — P. 36-40. 448. Rosenthal, S.M. Opposing early and late effects of insulin-like growth factor I on differentiation and the cell cycle regulatory retinoblastoma protein in skeletal myoblasts / S.M. Rosenthal, Z.Q. Cheng // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1995. –– Vol. 92, N 22. — P. 10307-10311. 449. Rosenzweig, J.M. Interleukin-1 receptor blockade in perinatal brain injury / J.M. Rosenzweig, J. Lei, I. Burd // Front Pediatr. –– 2014. –– N 2. — P. 108. 450. Rota, L.M. IGF1R Inhibition in Mammary Epithelia Promotes Canonical Wnt Signaling and Wnt1-Driven Tumors / L.M. Rota, L. Albanito, M.E. Shin et al. // Cancer Res.–– 2014. –– Vol. 74, № 19. — P. 5668-5679. 451. Rota, L.M. IGF1R inhibition in mammary epithelia promotes canonical Wnt signaling and Wnt1-driven tumors L.M. / Rota, L. Albanito, M.E. Shin et al. // Cancer Res. ––2014. –– Vol. 74, N 19. — P. 5668-5679. 283 452. Rota, L.M. Determining mammosphere-forming potential: application of the limiting dilution analysis / L.M. Rota, D.A. Lazzarino, A.N. Ziegler et al. // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 2012. –– Vol. 17, N 2. — P. 119-123. 453. Rotwein, P. Gene regulation by growth hormone / P. Rotwein, D.J. Chia // Pediatr Nephrol. –– 2010. –– Vol. 25, N 4. — P. 651-658. 454. Rouiller-Fabre, V. Expression and effect of insulin-like growth factor I on rat fetal Leydig cell function and differentiation / V. Rouiller-Fabre, L. Lecref, C. Gautier et al. // Endocrinology. –– 1998. –– Vol. 139, N 6. — P. 2926-2934. 455. Rowzee, A.M. IGF ligand and receptor regulation of mammary development / A.M. Rowzee, D.A. Lazzarino, L. Rota et al. // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 2008. –– Vol. 13, N 4. — P. 361-370. 456. Rowzee, A.M. Insulin-like growth factor type 1 receptor and insulin receptor isoform expression and signaling in mammary epithelial cells / A.M. Rowzee, D.L. Ludwig, T.L. Wood // Endocrinology. –– 2009. –– Vol. 150, N 8. — P. 3611-3619. 457. Rozen, F. Antiproliferative action of vitamin D-related compounds and insulin-like growth factor-binding protein 5 accumulation / F. Rozen, X.F. Yang, H. Huynh et al. // J Natl Cancer Inst. –– 1997. –– Vol. 89, N 9. — P. 652-656. 458. Ruan, W. Estradiol enhances the stimulatory effect of insulin-like growth factor-I (IGF-I) on mammary development and growth hormone-induced IGF-I messenger ribonucleic acid / W. Ruan, V. Catanese, R. Wieczorek et al. // Endocrinology. –– 1995.–– Vol. 136, N 3. — P. 1296-1302. 459. Ruan, W. Insulin-like growth factor I is essential for terminal end bud formation and ductal morphogenesis during mammary development / W. Ruan, D.L. Kleinberg // Endocrinology. –– 1999. –– Vol. 140, N 11. — P. 5075-5081. 460. Rubin, R. Insulin-like growth factor-I receptor. Its role in cell proliferation, apoptosis, and tumorigenicity / R. Rubin, R. Baserga // Lab Invest. –– 1995. –– Vol. 73, N 3. — P. 311-331. 461. Rubinfeld, B. Stabilization of beta-catenin by genetic defects in melanoma cell lines / B. Rubinfeld, P. Robbins, M. El-Gamil et al. // Science. –– 1997. –– Vol. 275, N 5307. — P. 1790-1792. 284 462. Rubini, M. Platelet-derived growth factor increases the activity of the promoter of the insulin-like growth factor-1 (IGF-1) receptor gene / M. Rubini, H. Werner, E. Gandini et al. // Exp Cell Res. –– 1994. –– Vol. 211, N 2. — P. 374-379. 463. Rubinstein, M. Transcriptional activation of the insulin-like growth factor I receptor gene by the Kruppel-like factor 6 (KLF6) tumor suppressor protein: potential interactions between KLF6 and p53 / M. Rubinstein, G. Idelman, S.R. Plymate et al. // Endocrinology. –– 2004. –– Vol. 145, N 8. — P. 3769-3777. 464. Russell, T.D. Cytoplasmic lipid droplet accumulation in developing mammary epithelial cells: roles of adipophilin and lipid metabolism / T.D. Russell, C.A. Palmer, D.J. Orlicky et al. // J Lipid Res. –– 2007. –– Vol. 48, N 7. — P. 14631475. 465. Sacco, A. Differential signaling activation by insulin and insulin-like growth factors I and II upon binding to insulin receptor isoform A / A. Sacco, A. Morcavallo, G. Pandini et al. // Endocrinology. –– 2009. ––Vol. 150, N 8. — P. 3594-3602. 466. Saez, J.M. Leydig cells: endocrine, paracrine, and autocrine regulation / J.M. Saez // Endocr Rev. –– 1994. –– Vol. 15, N 5. — P. 574-626. 467. Salmon, W.D. A hormonally controlled serum factor which stimulates sulfate incorporation by cartilage in vitro / W.D. Salmon, W.H. Jr., Daughaday // J Lab Clin Med. –– 1957. –– Vol. 49, N 6. — P. 825-836. 468. Samani, A.A. The receptor for the type I insulin-like growth factor and its ligands regulate multiple cellular functions that impact on metastasis / A.A. Samani, P. Brodt // Surg Oncol Clin N Am. –– 2001. –– Vol. 10, N 2. — P. 289-312. 469. Samani, A.A. The role of the IGF system in cancer growth and metastasis: overview and recent insights / A.A. Samani, S. Yakar, D. LeRoith et al. // Endocr Rev. –– 2007. –– Vol. 28, N 1. — P. 20-47. 470. Samdani, A. Cytogenetics and P-glycoprotein (PGP) are independent predictors of treatment outcome in acute myeloid leukemia (AML) / A. Samdani, U. Vijapurkar, M.A. Grimm et al. // Leuk Res. –– 1996. –– Vol. 20, N 2. — P. 175180. 285 471. Sara, V.R. Insulin-like growth factors and their binding proteins / V.R. Sara, K. Hall // Physiol Rev. –– 1990. –– Vol. 70, N 3. — P. 591-614. 472. Sarfstein, R. Identification of Insulin-Like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR) Gene Promoter-Binding Proteins in Estrogen Receptor (ER)-Positive and ERDepleted Breast Cancer Cells / R. Sarfstein, A. Belfiore, H. Werner // Cancers (Basel). –– 2010. –– Vol. 2, N 2. — P. 233-261. 473. Sato, T. Interactions among members of the Bcl-2 protein family analyzed with a yeast two-hybrid system / T. Sato, M. Hanada, S. Bodrug et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1994. –– Vol. 91, N 20. — P. 9238-9242. 474. Savage, M.O. Clinical features and endocrine status in patients with growth hormone insensitivity (Laron syndrome) / M.O. Savage, W.F. Blum, M.B. Ranke et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 1993. –– Vol. 77, N 6. — P. 1465-1471. 475. Savage, M.O. Growth hormone insensitivity: pathophysiology, diagnosis, clinical variation and future perspectives / M.O. Savage, C.P. Burren, J.C. Blair et al. // Horm Res. –– 2001. –– Vol. 55 Suppl 2. — P. 32-35. 476. Sayer, R.A. High insulin-like growth factor-2 (IGF-2) gene expression is an independent predictor of poor survival for patients with advanced stage serous epithelial ovarian cancer / R.A. Sayer, J.M. Lancaster, J. Pittman et al. // Gynecol Oncol. –– 2005. –– Vol. 96, N2. — P. 355-361. 477. Schayek, H. Transcription factor E2F1 is a potent transactivator of the insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) gene / H. Schayek, I. Bentov, I. Rotem et al. // Growth Horm IGF Res. –– 2010. –– Vol. 20, N 1. — P. 68-72. 478. Schinkel, A.H. N-glycosylation and deletion mutants of the human MDR1 Pglycoprotein / A.H. Schinkel, S. Kemp, M. Dolle et al. // J Biol Chem. –– 1993. –– Vol. 268, N 10. — P. 7474-7481. 479. Schnarr, B. Down-regulation of insulin-like growth factor-I receptor and insulin receptor substrate-1 expression in advanced human breast cancer / B. Schnarr, K. Strunz, J. Ohsam et al. // Int J Cancer. –– 2000. –– Vol. 89, N 6. — P. 506-513. 286 480. Schwarze, C.P. Influence of IGF-I and cell density on MDR1 expression in the Tlymphoblastoid cell line CCRF-CEM / C.P. Schwarze, S. Neu, J. Beck et al. // Horm Res. –– 1999. –– Vol. 52, N 4. — P. 192-199. 481. Schwarze, M.M. Prevention of myeloma cell apoptosis by ectopic bcl-2 expression or interleukin 6-mediated up-regulation of bcl-xL / M.M. Schwarze, R.G. Hawley // Cancer Res. –– 1995. –– Vol. 55, N 11. — P. 2262-2265. 482. Schwarzenbach, H. Expression of MDR1/P-glycoprotein, the multidrug resistance protein MRP, and the lung-resistance protein LRP in multiple myeloma / H. Schwarzenbach // Med Oncol. –– 2002. –– Vol. 19, N 2. — P. 87-104. 483. Sciacca, L. Insulin receptor activation by IGF-II in breast cancers: evidence for a new autocrine/paracrine mechanism / L. Sciacca, A. Costantino, G. Pandini et al. // Oncogene. –– 1999. –– Vol. 18, N 15. — P. 2471-2479. 484. Sekharam, M. Insulin-like growth factor 1 receptor activates c-SRC and modifies transformation and motility of colon cancer in vitro / M. Sekharam, A. Nasir, H.E. Kaiser et al. // Anticancer Res. –– 2003. –– Vol. 23, N 2B. — P. 1517-1524. 485. Sell, C. Effect of a null mutation of the insulin-like growth factor I receptor gene on growth and transformation of mouse embryo fibroblasts / C. Sell, G. Dumenil, C. Deveaud et al. // Mol Cell Biol. –– 1994. –– Vol. 14, N 6. — P. 3604-3612. 486. Sell, C. Simian virus 40 large tumor antigen is unable to transform mouse embryonic fibroblasts lacking type 1 insulin-like growth factor receptor / C. Sell, M. Rubini, R. Rubin et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1993. –– Vol. 90, N 23. — P. 11217-11221. 487. Setia, S. Changes in GH/IGF-1 axis in intrauterine growth retardation: consequences of fetal programming? / S. Setia, M.G. Sridhar // Horm Metab Res. – – 2009. –– Vol. 41, N 11. — P. 791-798. 488. Shackleford, G.M. Mouse mammary tumor virus infection accelerates mammary carcinogenesis in Wnt-1 transgenic mice by insertional activation of int-2/Fgf-3 and hst/Fgf-4 / G.M. Shackleford, C.A. MacArthur, H.C. Kwan et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1993. –– Vol. 90, N 2. — P. 740-744. 287 489. Shackleford, G.M. Expression of the proto-oncogene int-1 is restricted to postmeiotic male germ cells and the neural tube of mid-gestational embryos / G.M. Shackleford, H.E. Varmus // Cell. –– 1987. –– Vol. 50, N 1. — P. 89-95. 490. Shackleton, M. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell / M. Shackleton, F. Vaillant, K.J. Simpson et al. // Nature. –– 2006. –– Vol. 439, N 7072. — P. 84-88. 491. Shao, R. Dynamic regulation of estrogen receptor-alpha isoform expression in the mouse fallopian tube: mechanistic insight into estrogen-dependent production and secretion of insulin-like growth factors / R. Shao, E. Egecioglu, B. Weijdegard et al. // Am J Physiol Endocrinol Metab. –– 2007. –– Vol. 293, N 5. — P. 1430-1442. 492. Shariat, S.F. Correlation of preoperative levels of IGF-I and IGFBP-3 with pathologic parameters and clinical outcome in patients with bladder cancer / S.F. Shariat, J. Kim, C. Nguyen et al. // Urology. –– 2003. –– Vol. 61, N 2. — P. 359364. 493. Shaw, G. A conserved AU sequence from the 3' untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation / G. Shaw, R. Kamen // Cell. –– 1986. –– Vol. 46, N 5. — P. 659-667. 494. Shen, K. Inhibition of IGF-IR increases chemosensitivity in human colorectal cancer cells through MRP-2 promoter suppression / K. Shen, D. Cui, L. Sun et al. // J Cell Biochem. –– 2012. –– Vol. 113, N 6. — P. 2086-2097. 495. Shimizu, C. Expression of insulin-like growth factor 1 receptor in primary breast cancer: immunohistochemical analysis / C. Shimizu, T. Hasegawa, Y. Tani et al. // Hum Pathol. –– 2004. –– Vol. 35, N 12. — P. 1537-1542. 496. Shimizu, H. Transformation by Wnt family proteins correlates with regulation of beta-catenin / H. Shimizu, M.A. Julius, M. Giarre et al. // Cell Growth Differ. –– 1997. –– Vol. 8, N 12. — P. 1349-1358. 497. Shindler, K.S. Bax deficiency prevents the increased cell death of immature neurons in bcl-x-deficient mice / K.S. Shindler, C.B. Latham, K.A. Roth // J Neurosci. –– 1997. –– Vol. 17, N 9. — P. 3112-3119. 288 498. Shtutman, M. The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway / M. Shtutman, J. Zhurinsky, I. Simcha et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1999. –– Vol. 96, N 10. — P. 5522-5527. 499. Simonet, W.S. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density / W.S. Simonet, D.L. Lacey, C.R. Dunstan et al. // Cell. –– 1997. – – Vol. 89, N 2. — P. 309-319. 500. Singleton, J.R. Type I insulin-like growth factor receptor activation regulates apoptotic proteins / J.R. Singleton, V.M. Dixit, E.L. Feldman // J Biol Chem. –– 1996. –– Vol. 271, N 50. — P. 31791-31794. 501. Sinicrope, F.A. Bcl-2 and p53 oncoprotein expression during colorectal tumorigenesis / F.A. Sinicrope, S.B. Ruan, K.R. Cleary et al. // Cancer Res. –– 1995. –– Vol. 55, N 2. — P. 237-241. 502. Sjogren, K. Liver-derived insulin-like growth factor I (IGF-I) is the principal source of IGF-I in blood but is not required for postnatal body growth in mice / K. Sjogren, J.L. Liu, K. Blad et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1999. –– Vol. 96, N 12. — P. 7088-7092. 503. Skjaerbaek, C. No effect of growth hormone on serum insulin-like growth factor binding protein-3 proteolysis / C. Skjaerbaek, A. Kaal, J. Moller et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 1998. –– Vol. 83, N 4. — P. 1206-1210. 504. Skrtic, S. Insulin-like growth factors stimulate expression of hepatocyte growth factor but not transforming growth factor beta1 in cultured hepatic stellate cells / S. Skrtic, V. Wallenius, S. Ekberg et al. // Endocrinology. –– 1997. –– Vol. 138, N 11. — P. 4683-4689. 505. Slaaby, R. Hybrid receptors formed by insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor I receptor (IGF-IR) have low insulin and high IGF-1 affinity irrespective of the IR splice variant / R. Slaaby, L. Schaffer, I. Lautrup-Larsen et al. // J Biol Chem. –– 2006. –– Т. 281, N 36. — P. 25869-25874. 506. Smale, S.T. Transcription initiation from TATA-less promoters within eukaryotic protein-coding genes / S.T. Smale // Biochim Biophys Acta. –– 1997. –– Vol. 1351, N 1-2. — P. 73-88. 289 507. Smale, S.T. The "initiator" as a transcription control element / S.T. Smale, D. Baltimore // Cell. –– 1989. –– Vol. 57, N 1. — P. 103-113. 508. Somervaille, T.C. Growth factor withdrawal from primary human erythroid progenitors induces apoptosis through a pathway involving glycogen synthase kinase-3 and Bax / T.C. Somervaille, D.C. Linch, A. Khwaja // Blood. –– 2001. –– Vol. 98, N 5. — P. 1374-1381. 509. Sonneveld, P. Multidrug resistance in haematological malignancies / P. Sonneveld // J Intern Med. –– 2000. ––Vol. 247, N 5. — P. 521-534. 510. Soos, M.A. Purified hybrid insulin/insulin-like growth factor-I receptors bind insulin-like growth factor-I, but not insulin, with high affinity / M.A. Soos, C.E. Field, K. Siddle // Biochem J. –– 1993. –– Vol. 290, № Pt 2. — P. 419-426. 511. Spallarossa, P. Insulin-like growth factor-I and angiographically documented coronary artery disease / P. Spallarossa, C. Brunelli, F. Minuto et al. // Am J Cardiol. –– 1996. ––Vol. 77, N 2. — P. 200-202. 512. Spets, H. Fas/APO-1 (CD95)-mediated apoptosis is activated by interferon-gamma and interferon- in interleukin-6 (IL-6)-dependent and IL-6-independent multiple myeloma cell lines / H. Spets, P. Georgii-Hemming, J. Siljason et al. // Blood. –– 1998. –– Vol. 92, N 8. — P. 2914-2923. 513. Spets, H. Expression of the bcl-2 family of pro- and anti-apoptotic genes in multiple myeloma and normal plasma cells: regulation during interleukin-6(IL-6)induced growth and survival / H. Spets, T. Stromberg, P. Georgii-Hemming et al. // Eur J Haematol. –– 2002. –– Vol. 69, N 2. — P. 76-89. 514. Sprynski, A.C. The role of IGF-1 as a major growth factor for myeloma cell lines and the prognostic relevance of the expression of its receptor / A.C. Sprynski, D. Hose, L. Caillot et al. // Blood. –– 2009. –– Vol. 113, N 19. — P. 4614-4626. 515. Sprynski, A.C. Insulin is a potent myeloma cell growth factor through insulin/IGF1 hybrid receptor activation / A.C. Sprynski, D. Hose, A. Kassambara et al. // Leukemia. –– 2010. –– Vol. 24, N 11. — P. 1940-1950. 290 516. Srinivasula, S.M. A conserved XIAP-interaction motif in caspase-9 and Smac/DIABLO regulates caspase activity and apoptosis / S.M. Srinivasula, R. Hegde, A. Saleh et al. // Nature. –– 2001. –– Vol. 410, N 6824. — P. 112-116. 517. Stattin, P. Plasma insulin-like growth factor-I, insulin-like growth factor-binding proteins, and prostate cancer risk: a prospective study / P. Stattin, A. Bylund, S. Rinaldi et al. // J Natl Cancer Inst. –– 2000. –– Vol. 92, N 23. — P. 1910-1917. 518. Stavrovskaya, A. Prognostic value of P-glycoprotein and leukocyte differentiation antigens in chronic myeloid leukemia / A. Stavrovskaya, A. Turkina, N. Sedyakhina et al. // Leuk Lymphoma. –– 1998. –– Vol. 28, N 5-6. — P. 469-482. 519. Stavrovskaya, A.A. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells / A.A. Stavrovskaya // Biochemistry (Mosc). –– 2000. –– Vol. 65, N 1. — P. 95106. 520. Sternlicht, M.D. Hormonal and local control of mammary branching morphogenesis / M.D. Sternlicht, H. Kouros-Mehr, P. Lu et al. // Differentiation. – – 2006. –– Vol. 74, N 7. — P. 365-381. 521. Steuerman, R. Congenital IGF1 deficiency tends to confer protection against postnatal development of malignancies / R. Steuerman, O. Shevah, Z. Laron // Eur J Endocrinol. –– 2011. –– Vol. 164, N 4. — P. 485-489. 522. Stockdale, F.E. The role of DNA synthesis and mitosis in hormone-dependent differentiation / F.E. Stockdale, Y.J. Topper // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1966. –– Vol. 56, N 4. — P. 1283-1289. 523. Stromberg, T. IGF-1 receptor tyrosine kinase inhibition by the cyclolignan PPP induces G2/M-phase accumulation and apoptosis in multiple myeloma cells / T. Stromberg, S. Ekman, L. Girnita et al. // Blood. –– 2006. –– Vol. 107, N 2. — P. 669-678. 524. Sun, Z. Decreased IGF type 1 receptor signaling in mammary epithelium during pregnancy leads to reduced proliferation, alveolar differentiation, and expression of insulin receptor substrate (IRS)-1 and IRS-2 / Z. Sun, S. Shushanov, D. LeRoith et al. // Endocrinology. –– 2011. –– Vol. 152, N 8. — P. 3233-3245. 291 525. Tagoug, I. Inhibition of IGF-1 signalling enhances the apoptotic effect of AS602868, an IKK2 inhibitor, in multiple myeloma cell lines / I. Tagoug, A. Sauty De Chalon, C. Dumontet // PLoS One. –– 2011. –– Vol. 6, N 7. — P. e22641. 526. Tai, Y.T. Insulin-like growth factor-1 induces adhesion and migration in human multiple myeloma cells via activation of beta1-integrin and phosphatidylinositol 3'kinase/AKT signaling / Y.T. Tai, K. Podar, L. Catley et al. // Cancer Res. –– 2003. ––Vol. 63, N 18. — P. 5850-5858. 527. Tamm, I. Expression and prognostic significance of IAP-family genes in human cancers and myeloid leukemias / I. Tamm, S.M. Kornblau, H. Segall et al. // Clin Cancer Res. –– 2000. –– Vol. 6, N 5. — P. 1796-1803. 528. Tennant, M.K. Protein and messenger ribonucleic acid (mRNA) for the type 1 insulin-like growth factor (IGF) receptor is decreased and IGF-II mRNA is increased in human prostate carcinoma compared to benign prostate epithelium / M.K. Tennant, J.B. Thrasher, P.A. Twomey et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 1996. –– Vol. 81, N 10. — P. 3774-3782. 529. Thissen, J.P. Nutritional regulation of the insulin-like growth factors / J.P. Thissen, J.M. Ketelslegers, L.E. Underwood // Endocr Rev. –– 1994. –– Vol. 15, N 1. — P. 80-101. 530. Thomas, K.R. Targeted disruption of the murine int-1 proto-oncogene resulting in severe abnormalities in midbrain and cerebellar development / K.R. Thomas, M.R. Capecchi // Nature. –– 1990. –– Vol. 346, N 6287. — P. 847-850. 531. Thomas, M.J. Characterization of deoxyribonucleic acid-protein interactions at a growth hormone-inducible nuclease hypersensitive site in the rat insulin-like growth factor-I gene / M.J. Thomas, K. Kikuchi, D.P. Bichell et al. // Endocrinology. –– 1995. –– Vol. 136, N 2. — P. 562-569. 532. Tong, P.Y. The cation-independent mannose 6-phosphate receptor binds insulinlike growth factor II / P.Y. Tong, S.E. Tollefsen, S. Kornfeld // J Biol Chem. –– 1988. –– Vol. 263, N 6. — P. 2585-2588. 292 533. Toniolo, P. Serum insulin-like growth factor-I and breast cancer / P. Toniolo, P.F. Bruning, A. Akhmedkhanov et al. // Int J Cancer. –– 2000. –– Vol. 88, N 5. — P. 828-832. 534. Topper, Y.J. Multiple hormone interactions in the development of mammary gland in vitro / Y.J. Topper // Recent Prog Horm Res. –– 1970. –– N 26. — P. 287-308. 535. Torres-Aleman, I. Targeting insulin-like growth factor-1 to treat Alzheimer's disease / I. Torres-Aleman // Expert Opin Ther Targets. –– 2007. –– Vol. 11, N 12. — P. 1535-1542. 536. Travali, S. Constitutively expressed c-myb abrogates the requirement for insulinlike growth factor 1 in 3T3 fibroblasts / S. Travali, K. Reiss, A. Ferber et al. // Mol Cell Biol. –– 1991. –– Vol. 11, N 2. — P. 731-736. 537. Truett, G.E. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT) / G.E. Truett, P. Heeger, R.L. Mynatt et al. // Biotechniques. –– 2000. –– Vol. 29, N 1. — P. 52, 54. 538. Tsarfaty, G. Human insulin-like growth factor I exerts hematopoietic growthpromoting effects after in vivo administration / G. Tsarfaty, D.L. Longo, W.J. Murphy // Exp Hematol. –– 1994. –– Vol. 22, N 13. — P. 1273-1277. 539. Tsuchiya, M. Control of the expression of luteinizing hormone receptor by local factors in rat granulosa cells / M. Tsuchiya, T. Minegishi, H. Kishi et al. // Arch Biochem Biophys. –– 1999. –– Vol. 367, N 2. — P. 185-192. 540. Tsukamoto, A.S. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice / A.S. Tsukamoto, R. Grosschedl, R.C. Guzman et al. // Cell. –– 1988. –– Vol. 55, N 4. — P. 619-625. 541. Tu, W. Insulin-like growth factor 1 promotes cord blood T cell maturation and inhibits its spontaneous and phytohemagglutinin-induced apoptosis through different mechanisms / W. Tu, P.T. Cheung, Y.L. Lau // J Immunol. –– 2000. –– Vol. –– 165, N 3. — P. 1331-1336. 542. Tu, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase/AKT kinase pathway in multiple myeloma plasma cells: roles in cytokine-dependent survival and proliferative 293 responses / Y. Tu, A. Gardner, A. Lichtenstein // Cancer Res. –– 2000. –– Vol. 60, N 23. — P. 6763-6770. 543. Tu, Y. BCL-X expression in multiple myeloma: possible indicator of chemoresistance / Y. Tu, S. Renner, F. Xu et al. // Cancer Res. –– 1998. –– Vol. 58, N 2. — P. 256-262. 544. Tu, Y. Upregulated expression of BCL-2 in multiple myeloma cells induced by exposure to doxorubicin, etoposide, and hydrogen peroxide / Y. Tu, F.H. Xu, J. Liu et al. // Blood. –– 1996. –– Vol. 88, N 5. — P. 1805-1812. 545. Turkina, A.G. Studies of some mechanisms of drug resistance in chronic myeloid leukemia (CML) / A.G. Turkina, N.P. Logacheva, T.P. Stromskaya et al. // Adv Exp Med Biol. –– 1999. –– N 457. — P. 477-488. 546. Turkington, R.W. The hormonal control of lactose synthetase in the developing mouse mammary gland / R.W. Turkington, K. Brew, T.C. Vanaman et al. // J Biol Chem. –– 1968. –– Vol. 243, N 12. — P. 3382-3387. 547. Turkington, R.W. Hormone-dependent phosphorylation of nuclear proteins during mammary gland differentiation in vitro / R.W. Turkington, M. Riddle // J Biol Chem. –– 1969. –– Vol. 244, N 21. — P. 6040-6046. 548. Ueda, K. The human multidrug resistance (mdr1) gene. cDNA cloning and transcription initiation / K. Ueda, D.P. Clark, C.J. Chen et al. // J Biol Chem. –– 1987. –– Vol. 262, N 2. — P. 505-508. 549. Ueda, S. Alternative tyrosine phosphorylation of signaling kinases according to hormone receptor status in breast cancer overexpressing the insulin-like growth factor receptor type 1 / S. Ueda, H. Tsuda, K. Sato et al. // Cancer Sci. –– 2006. –– Vol. 97, N 7. — P. 597-604. 550. Ullrich, A. Insulin-like growth factor I receptor primary structure: comparison with insulin receptor suggests structural determinants that define functional specificity / A. Ullrich, A. Gray, A.W. Tam et al. // Embo J. –– 1986. –– VolТ. 5, N 10. — P. 2503-2512. 551. Uren, A.G. Cloning and expression of apoptosis inhibitory protein homologs that function to inhibit apoptosis and/or bind tumor necrosis factor receptor-associated 294 factors / A.G. Uren, M. Pakusch, C.J. Hawkins et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1996. –– Vol. 93, N 10. — P. 4974-4978. 552. Van der Kolk, D.M. P-glycoprotein and multidrug resistance protein activities in relation to treatment outcome in acute myeloid leukemia / D.M. van der Kolk, E.G. de Vries, W.J. van Putten et al. // Clin Cancer Res. –– 2000. –– Vol. 6, N 8. — P. 3205-3214. 553. Vanderkerken, K. Insulin-like growth factor-1 acts as a chemoattractant factor for 5T2 multiple myeloma cells / K. Vanderkerken, K. Asosingh, F. Braet et al. // Blood. –– 1999. –– Vol. 93, N 1. — P. 235-241. 554. Vanderkerken, K. Selective initial in vivo homing pattern of 5T2 multiple myeloma cells in the C57BL/KalwRij mouse / K. Vanderkerken, C. De Greef, K. Asosingh et al. // Br J Cancer. –– 2000. –– Vol. 82, N 4. — P. 953-959. 555. Vanderkerken, K. Recombinant osteoprotegerin decreases tumor burden and increases survival in a murine model of multiple myeloma / K. Vanderkerken, E. De Leenheer, C. Shipman et al. // Cancer Res. –– 2003. –– Vol. 63, N 2. — P. 287289. 556. Vanderkerken, K. Organ involvement and phenotypic adhesion profile of 5T2 and 5T33 myeloma cells in the C57BL/KaLwRij mouse / K. Vanderkerken, H. De Raeve, E. Goes et al. // Br J Cancer. –– 1997. –– Vol. 76, N 4. — P. 451-460. 557. Vaux, D.L. Mammalian mitochondrial IAP binding proteins / D.L. Vaux, J. Silke // Biochem Biophys Res Commun. –– 2003. –– Vol. 304, N 3. — P. 499-504. 558. Veis, D.J. Bcl-2-deficient mice demonstrate fulminant lymphoid apoptosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair / D.J. Veis, C.M. Sorenson, J.R. Shutter et al. // Cell.–– 1993.–– Vol. 75, N 2. — P. 229-240. 559. Venken, K. Growth without growth hormone receptor: estradiol is a major growth hormone-independent regulator of hepatic IGF-I synthesis / K. Venken, F. Schuit, L. Van Lommel et al. // J Bone Miner Res. – 2005. – Vol. 20, N 12. — P. 21382149. 295 560. Wagner, K.U. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland / K.U. Wagner, R.J. Wall, L. St-Onge et al. // Nucleic Acids Res. –– 1997. –– Vol. 25, N 21. — P. 4323-4330. 561. Wallborn, T. A heterozygous mutation of the insulin-like growth factor-I receptor causes retention of the nascent protein in the endoplasmic reticulum and results in intrauterine and postnatal growth retardation / T. Wallborn, S. Wuller, J. Klammt et al. // J Clin Endocrinol Metab. –– 2010. –– Vol. 95, N 5. — P. 2316-2324. 562. Walsh, M.F. Insulin-like growth factor I diminishes in vivo and in vitro vascular contractility: role of vascular nitric oxide / M.F. Walsh, M. Barazi, G. Pete et al. // Endocrinology. –– 1996. –– Vol. 137, N 5. — P. 1798-1803. 563. Walsh, P.T. Insulin-like growth factor-1 activates Akt and Jun N-terminal kinases (JNKs) in promoting the survival of T lymphocytes / P.T. Walsh, L.M. Smith, R. O'Connor // Immunology. –– 2002. –– Vol. 107, N 4. — P. 461-471. 564. Weber, J.D. Cooperative signals governing ARF-mdm2 interaction and nucleolar localization of the complex / J.D. Weber, M.L. Kuo, B. Bothner et al. // Mol Cell Biol.–– 2000. –– BothneVol. 20, N 7. — P. 2517-2528. 565. Weber, M.S. Expression of ovine insulin-like growth factor-1 (IGF-1) stimulates alveolar bud development in mammary glands of transgenic mice / M.S. Weber, P.L. Boyle, B.A. Corl et al. // Endocrine. –– 1998. –– Vol. 8, N 3. — P. 251-259. 566. Werner, H. For debate: the pathophysiological significance of IGF-I receptor overexpression: new insights / H. Werner // Pediatr Endocrinol Rev. –– 2009. –– Vol. 7, N 1. — P. 2-5. 567. Werner, H. Structural and functional analysis of the insulin-like growth factor I receptor gene promoter / H. Werner, M.A. Bach, B. Stannard et al. // Mol Endocrinol. –– 1992.–– Vol. 6, N 10. — P. 1545-1558. 568. Werner, H. Wild-type and mutant p53 differentially regulate transcription of the insulin-like growth factor I receptor gene / H. Werner, E. Karnieli, F.J. Rauscher et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1996. –– Vol. 93, N 16. — P. 8318-8323. 296 569. Werner, H. The insulin-like growth factor-I receptor gene: a downstream target for oncogene and tumor suppressor action / H. Werner, S. Maor // Trends Endocrinol Metab. –– 2006. –– Vol. 17, N 6. — P. 236-242. 570. Werner, H. Increased expression of the insulin-like growth factor I receptor gene, IGF1R, in Wilms tumor is correlated with modulation of IGF1R promoter activity by the WT1 Wilms tumor gene product / H. Werner, G.G. Re, I.A. Drummond et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1993. –– Vol. 90, N 12. — P. 5828-5832. 571. Westphal, D. Molecular biology of Bax and Bak activation and action / D. Westphal, G. Dewson, P.E. Czabotar et al. // Biochim Biophys Acta. –– 2011. –– Vol. 1813, N 4. — P. 521-531. 572. Wickman, A. Inhibition of nitric oxide in rats. Regulation of cardiovascular structure and expression of insulin-like growth factor I and its receptor messenger RNA / A. Wickman, J. Isgaard, M.A. Adams et al. // J Hypertens. –– 1997. ––Vol. 15, N 7. — P. 751-759. 573. Wilker, E. Enhancement of susceptibility to diverse skin tumor promoters by activation of the insulin-like growth factor-1 receptor in the epidermis of transgenic mice / E. Wilker, D. Bol, K. Kiguchi et al. // Mol Carcinog. –– 1999. –– Vol. 25, N 2. — P. 122-131. 574. Wilker, E. Role of PI3K/Akt signaling in insulin-like growth factor-1 (IGF-1) skin tumor promotion / E. Wilker, J. Lu, O. Rho et al. // Mol Carcinog. –– 2005. –– Vol. 44, N 2. — P. 137-145. 575. Wilkinson, D.G. Expression of the proto-oncogene int-1 is restricted to specific neural cells in the developing mouse embryo / D.G. Wilkinson, J.A. Bailes, A.P. McMahon // Cell. –– 1987. –– Vol. 50, N 1. — P. 79-88. 576. Willis, S.N. Proapoptotic Bak is sequestered by Mcl-1 and Bcl-xL, but not Bcl-2, until displaced by BH3-only proteins / S.N. Willis, L. Chen, G. Dewson et al. // Genes Dev. –– 2005. –– Vol. 19, N 11. — P. 1294-1305. 577. Willis, T.G. The role of immunoglobulin translocations in the pathogenesis of Bcell malignancies / T.G. Willis, M.J. Dyer // Blood. –– 2000. –– Vol. 96, N 3. — P. 808-822. 297 578. Wit, J.M. Growth of infants with neonatal growth hormone deficiency / J.M. Wit, H. van Unen // Arch Dis Child. –– 1992. –– Vol. 67, N 7. — P. 920-924. 579. Wong, R.S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment / R.S. Wong // J Exp Clin Cancer Res. –– 2011. –– Vol. 30, N. — P. 87. 580. Wood, T.L. The insulin-like growth factors (IGFs) and IGF binding proteins in postnatal development of murine mammary glands / T.L. Wood, M.M. Richert, M.A. Stull et al. // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 2000. –– Vol. 5, N 1. — P. 31-42. 581. Wood, T.L. Introduction: IGFs and IGFBPs in the normal mammary gland and in breast cancer / T.L. Wood, D. Yee // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 2000. – – Vol. 5, N 1. — P. 1-5. 582. Woods, K.A. Intrauterine growth retardation and postnatal growth failure associated with deletion of the insulin-like growth factor I gene / K.A. Woods, C. Camacho-Hubner, M.O. Savage et al. // N Engl J Med. –– 1996. –– Vol. 335, N 18. — P. 1363-1367. 583. Wrobel, G. Microarray-based gene expression profiling of benign, atypical and anaplastic meningiomas identifies novel genes associated with meningioma progression / G. Wrobel, P. Roerig, F. Kokocinski et al. // Int J Cancer. –– 2005. – – Vol. 114, N 2. — P. 249-256. 584. Wu, X. Serum levels of insulin-like growth factor I and risk of squamous intraepithelial lesions of the cervix / X. Wu, G. Tortolero-Luna, H. Zhao et al. // Clin Cancer Res. ––2003. –– Vol. 9, N 9. — P. 3356-3361. 585. Xiao, G.H. Anti-apoptotic signaling by hepatocyte growth factor/Met via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase pathways / G.H. Xiao, M. Jeffers, A. Bellacosa et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 2001. –– Vol. 98, N 1. — P. 247-252. 586. Xie, W. Targeted expression of a dominant negative epidermal growth factor receptor in the mammary gland of transgenic mice inhibits pubertal mammary duct development / W. Xie, A.J. Paterson, E. Chin et al. // Mol Endocrinol. –– 1997. –– Vol. 11, N 12. — P. 1766-1781. 298 587. Xu, F. Multiple myeloma cells are protected against dexamethasone-induced apoptosis by insulin-like growth factors / F. Xu, A. Gardner, Y. Tu et al. // Br J Haematol. ––1997. –– Vol. 97, N 2. — P. 429-440. 588. Yakar, S. Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I / S. Yakar, J.L. Liu, B. Stannard et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. –– 1999. –– Vol. 96, N 13. — P. 7324-7329. 589. Yamaguchi, Y. Ligand-binding properties of the two isoforms of the human insulin receptor / Y. Yamaguchi, J.S. Flier, H. Benecke et al. // Endocrinology. –– 1993. – – Vol. 132, N 3. — P. 1132-1138. 590. Yamaguchi, Y. Functional properties of two naturally occurring isoforms of the human insulin receptor in Chinese hamster ovary cells / Y. Yamaguchi, J.S. Flier, A. Yokota et al. // Endocrinology. –– 1991. –– Vol. 129, N 4. — P. 2058-2066. 591. Yang, E. Molecular thanatopsis: a discourse on the BCL2 family and cell death / E. Yang, S.J. Korsmeyer // Blood. –– 1996. –– Vol. 88, N 2. — P. 386-401. 592. Yang, E. Bad, a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death / E. Yang, J. Zha, J. Jockel et al. // Cell. –– 1995. –– Vol. 80, N 2. — P. 285-291. 593. Yang, S. Cloning and characterization of an IGF-1 isoform expressed in skeletal muscle subjected to stretch / S. Yang, M. Alnaqeeb, H. Simpson et al. // J Muscle Res Cell Motil. –– 1996. –– Vol. 17, N 4. — P. 487-495. 594. Yang, Y. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way / Y. Yang, X. Yu // Faseb J. –– 2003. –– Т. 17, N 8. — P. 790-799. 595. Yee, D. The IGF system in mammary development and breast cancer. Preface / D. Yee, T.L. Wood // J Mammary Gland Biol Neoplasia. –– 2008. –– Vol. 13, N 4. — P. 351-352. 596. Yerushalmi, R. Insulin-like growth factor receptor (IGF-1R) in breast cancer subtypes / R. Yerushalmi, K.A. Gelmon, S. Leung et al. // Breast Cancer Res Treat. –– 2012. –– Vol. 132, N 1. — P. 131-142. 299 597. Yin, X.M. BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax / X.M. Yin, Z.N. Oltvai, S.J. Korsmeyer // Nature. –– 1994. –– Vol. 369, N 6478. — P. 321-323. 598. Yu, H. Role of the insulin-like growth factor family in cancer development and progression / H. Yu, T. Rohan // J Natl Cancer Inst. –– 2000. –– Vol. 92, N 18. — P. 1472-1489. 599. Yu, H. Plasma levels of insulin-like growth factor-I and lung cancer risk: a casecontrol analysis / H. Yu, M.R. Spitz, J. Mistry et al. // J Natl Cancer Inst. –– 1999. –– Vol. 91, N 2. — P. 151-156. 600. Yu, Y. Effects of combined epidermal growth factor, brain-derived neurotrophic factor and insulin-like growth factor-1 on human oocyte maturation and early fertilized and cloned embryo development / Y. Yu, J. Yan, M. Li et al. // Hum Reprod. –– 2012. ––Vol. 27, N 7. — P. 2146-2159. 601. Yuen, J.S. The VHL tumor suppressor inhibits expression of the IGF1R and its loss induces IGF1R upregulation in human clear cell renal carcinoma / J.S. Yuen, M.E. Cockman, M. Sullivan et al. // Oncogene. –– 2007. –– Vol. 26, N 45. — P. 6499-6508. 602. Yuuki, T. Inflammatory cytokines in vitreous fluid and serum of patients with diabetic vitreoretinopathy / T. Yuuki, T. Kanda, Y. Kimura et al. // J Diabetes Complications. –– 2001. –– Vol. 15, N 5. — P. 257-259. 603. Zalts, H. The impact of microRNAs on endocrinology / H. Zalts, N. Shomron // Pediatr Endocrinol Rev. –– 2011. –– Vol. 8, N 4. — P. 354-362. 604. Zhang, B. Proliferation of IL-6-independent multiple myeloma does not require the activity of extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2) / B. Zhang, R.G. Fenton // J Cell Physiol. –– 2002. –– Vol. 193, N 1. — P. 42-54. 605. Zhang, B. IL-6-independent expression of Mcl-1 in human multiple myeloma / B. Zhang, V. Potyagaylo, R.G. Fenton // Oncogene. –– 2003. ––Vol. 22, N 12. — P. 1848-1859. 300 606. Zhang, H. Inhibition of cancer cell proliferation and metastasis by insulin receptor downregulation / H. Zhang, D.H. Fagan, X. Zeng et al. // Oncogene. –– 2010. –– Vol. 29, N 17. — P. 2517-2527. 607. Zhang, W. Purification, characterization, and cDNA cloning of an AU-rich element RNA-binding protein, AUF1 / W. Zhang, B.J. Wagner, K. Ehrenman et al. // Mol Cell Biol. –– 1993. –– Vol. 13, N 12. — P. 7652-7665. 608. Zhao, H. Plasma levels of insulin-like growth factor-1 and binding protein-3, and their association with bladder cancer risk / H. Zhao, H.B. Grossman, M.R. Spitz et al. // J Urol. –– 2003. ––Vol. 169, N 2. — P. 714-717. 609. Zhao, J. Insulin-like growth factor-I (IGF-I) stimulates the development of cultured rat pre-antral follicles / J. Zhao, M.A. Taverne, G.C. Van Der Weijden et al. // Mol Reprod Dev. –– 2001. –– Vol. 58, N 3. — P. 287-296. 610. Zhao, J. Immunohistochemical localisation of growth hormone (GH), GH receptor (GHR), insulin-like growth factor I (IGF-I) and type I IGF-I receptor, and gene expression of GH and GHR in rat pre-antral follicles / J. Zhao, M.A. Taverne, G.C. van der Weijden et al. // Zygote. –– 2002. –– Vol. 10, N 1. — P. 85-94. 611. Zheng, B. Insulin-like growth factor-binding protein-5 is cleaved by physiological concentrations of thrombin / B. Zheng, J.B. Clarke, W.H. Busby et al. // Endocrinology.–– 1998. –– Vol. 139, N 4. — P. 1708-1714. 612. Zhou, J. Insulin-like growth factor I regulates gonadotropin responsiveness in the murine ovary / J. Zhou, T.R. Kumar, M.M. Matzuk et al. // Mol Endocrinol. –– 1997. –– Vol. 11, N 13. — P. 1924-1933. 613. Zhou, J. Immunity to the melanoma inhibitor of apoptosis protein (ML-IAP; livin) in patients with malignant melanoma / J. Zhou, N.K. Yuen, Q. Zhan et al. // Cancer Immunol Immunother. –– 2012. –– Vol. 61, N 5. — P. 655-665. 614. Zhou, Y. Retinoic acid regulates insulin-like growth factor-binding protein expression in human osteoblast cells / Y. Zhou, S Mohan., T.A. Linkhart et al. // Endocrinology. –– 1996. –– Vol. 137, N 3. — P. 975-983. 615. Zhou, Y. A mammalian model for Laron syndrome produced by targeted disruption of the mouse growth hormone receptor/binding protein gene (the Laron 301 mouse) / Y. Zhou, B.C. Xu, H.G. Maheshwari et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. – – 1997. –– Vol. 94, N 24. — P. 13215-13220. 616. Zong, C.S. Mechanism of STAT3 activation by insulin-like growth factor I receptor / C.S. Zong, J. Chan, D.E. Levy et al. // J Biol Chem. –– 2000. –– Vol. 275, N 20. — P. 15099-15105. 617. Zong, C.S. Stat3 plays an important role in oncogenic Ros- and insulin-like growth factor I receptor-induced anchorage-independent growth / C.S., Zong, L. Zeng, Y. Jiang et al. // J Biol Chem. –– 1998. –– Vol. 273, N 43. — P. 28065-28072.