основы биотехнологии

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Сыктывкарский лесной институт – филиал
государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования
«Санкт-Петербургская государственная лесотехническая академия имени С. М. Кирова»
КАФЕДРА ЦЕЛЛЮЛОЗНО-БУМАЖНОГО ПРОИЗВОДСТВА,
ЛЕСОХИМИИ И ПРОМЫШЛЕННОЙ ЭКОЛОГИИ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
СБОРНИК ОПИСАНИЙ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ
по дисциплине «Основы биотехнологии» (по выбору)
для подготовки дипломированного специалиста
по направлению 655000 «Химическая технология органических веществ и топлива»
специальности 240406 «Технология химической переработки древесины»
и по направлению бакалавриата 240100 «Химическая технология и биотехнология»
Самостоятельное учебное электронное издание
СЫКТЫВКАР 2010
УДК 60
ББК 28.07
О-75
Обсужден кафедрой ЦБП, ЛХ и ПЭ Сыктывкарского лесного института 14 сентября 2009 г.
(протокол № 1).
Рассмотрен и одобрен советом технологического факультета Сыктывкарского лесного института 29 сентября 2009 г. (протокол № 1).
Составитель: Н. А. Баранкова, старший преподаватель
Отв. редактор: В. А. Дёмин, доктор химических наук, профессор
Рецензент: Т. П. Щербакова, кандидат химических наук
(Институт химии Коми научного центра УрО РАН)
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ [Электронный ресурс] : сборник описаО-75 ний лабораторных работ по дисциплине «Основы биотехнологии» (по выбору)
для подготовки дипломированного специалиста по направлению 655000 «Химическая технология органических веществ и топлива» специальности 240406
«Технология химической переработки древесины» и по направлению бакалавриата 240100 «Химическая технология и биотехнология» : самост. учеб. электрон. текст. изд. / Сыкт. лесн. ин-т ; сост. Н. А. Баранкова. – Электрон. текстовые дан. (1 файл в формате pdf : 0,5 Мб. – Сыктывкар : СЛИ, 2010. – Режим
доступа: http://lib.sfi.komi.com. Доступен также на дискете. – Систем. требования для дискеты: Acrobat Reader (любая версия). – Загл. с экрана.
Издание содержит описания семи лабораторных работ, относящихся к основным разделам дисциплины, каждое из которых включает теоретическую
часть, технологию выполнения задания, вопросы для контроля усвоения необходимых знаний и навыков. Лабораторный курс дает возможность овладеть
навыками работы с живыми объектами, знакомит с основными группами продуцентов и их селекцией, получением и отделением целевых продуктов.
Сборник составлен в соответствии с Государственным образовательным
стандартом высшего профессионального образования по направлению 655000
«Химическая технология органических веществ и топлива», специальности
240406 «Технология химической переработки древесины».
Темплан 2008/09 учеб. г. Изд. № 276
УДК 60
ББК 28.07
© СЛИ, 2010
© Баранкова Н. А., составление, 2010
_____________________________________________________________________________________________
Самостоятельное учебное электронное издание
Составитель: БАРАНКОВА Наталья Александровна
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Электронный формат – pdf. Разрешено к публикации 10.02.10. Объем 2,0 уч.-изд. л.; 0,5 Мб.
Сыктывкарский лесной институт – филиал государственного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная лесотехническая академия
имени С. М. Кирова» (СЛИ), 167982, г. Сыктывкар, ул. Ленина, 39
institut@sfi.komi.com, www.sli.komi.com
Редакционно-издательский отдел СЛИ. Заказ № 23.
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ, ЕЕ МЕСТО В УЧЕБНОМ ПРОЦЕССЕ ...............4
1.1. Цель преподавания дисциплины ...........................................................................................4
1.2. Задачи изучения дисциплины ................................................................................................4
1.3. Перечень дисциплин и тем, усвоение которых студентами необходимо для изучения
данной дисциплины .......................................................................................................................4
1.4. Дополнение к нормам Государственного стандарта 2000 года..........................................5
1.5. Условия и особенности выполнения лабораторных работ .................................................5
1.6. Взаимосвязь с теоретическим материалом дисциплины ....................................................5
1.7. Форма отчетности студентов .................................................................................................6
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПОДГОТОВКЕ
К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ .............................................................................................6
3. ОПИСАНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ...............................................................................7
Лабораторная работа № 1. Знакомство со спецификой работ
(способы стерилизации посуды и сред, правила работы с микроскопом) ...............................7
Лабораторная работа № 2. Морфология микроорганизмов и грибов (приготовление
временных и постоянных препаратов микроорганизмов, способы окраски) ........................11
Лабораторная работа № 3. Специальные методы окраски микроорганизмов .......................14
Лабораторная работа № 4. Получение спирта при сбраживании углеводов дрожжами ......17
Лабораторная работа № 5. Выделение чистых культур микроорганизмов ...........................20
Лабораторная работа № 6. Способы отделения конечных продуктов
и оценка концентрации клеток ...................................................................................................24
Лабораторная работа № 7. Получение уксусной кислоты.......................................................28
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК .......................................................................................30
Основная литература ...................................................................................................................30
Дополнительная литература .......................................................................................................30
3
1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ, ЕЕ МЕСТО В УЧЕБНОМ ПРОЦЕССЕ
1.1. Цель преподавания дисциплины
Одно из перспективных современных направлений науки – использование биологических агентов для получения товарной продукции и переработки отходов производства. Биотехнология – это интегрированное использование биохимии, микробиологии и инженерных
наук с целью достижения технологического (промышленного) применения способностей
микроорганизмов, культур клеток тканей и их частей.
Биотехнология позволяет использовать в качестве сырья широкий спектр соединений, в
том числе отходов производства и получать столь же широкий спектр готовой продукции.
Биотехнология незаменима при очистке сточных вод от промышленных предприятий и городов, переработке отходов. Новые возможности применения биотехнология получила с использованием достижений генной инженерии, позволяющей «конструировать» продуцентов
с заданными свойствами.
Целью преподавания дисциплины «Основы биотехнологии» является формирование у
будущих специалистов по технологии химической переработки древесины знаний в области
организации и ведения биотехнологических процессов в производстве продуктов кормового
и пищевого назначения, использования биотехнологии для утилизации отходов производства, знания об использовании биотехнологии в других отраслях промышленности.
1.2. Задачи изучения дисциплины
Задачами изучения дисциплины являются:
- знакомство с общими принципами селекции продуцентов;
- знакомство с основными способами выделения и очистки готовых продуктов;
- знакомство с основными применяемыми технологическими схемами и оборудованием;
- ознакомление с общими закономерностями и особенностями биотехнологических
процессов получения продуктов технического, пищевого, кормового и медицинского назначения, переработкой отходов;
- приобретение практических навыков работы с культурами микроорганизмов.
1.3. Перечень дисциплин и тем,
усвоение которых студентами необходимо для изучения данной дисциплины
Курс «Основы биотехнологии» базируется на общетеоретических и общетехнических
дисциплинах, изучаемых ранее, и тесно связан с курсами физхимии, органической химии и
биохимии, процессами и аппаратами химической технологии, химией древесины.
Сборник лабораторных работ может быть использован для специальности 240406 «Технология химической переработки древесины» (инженер) и для направления 240100 «Химическая технология и биотехнология» (бакалавр техники и технологии).
В соответствии с рабочей программой для специальности 240406 предусмотрено выполнение всех лабораторных работ (34 часа). Студенты направления 240100 выполняют работы № 2, 4, 6, 7 (16 часов).
4
1.4. Дополнение к нормам Государственного стандарта 2000 года
Трудоемкость по стандарту приведена в таблице ниже.
Форма обучения
Всего часов
Всего аудиторных часов
Лекции
Лабораторные работы
Самостоятельная работа
Контрольная работа
Экзамен
Очная
136
68
34
34
68
1
8 семестр
Заочная
136
18
10
8
118
1
4 курс
Требования к обязательному минимуму содержания основной образовательной программы по направлению подготовки дипломированного специалиста по направлению 655000
«Химическая технология органических веществ и топлива» специальности 240406 «Технология химической переработки древесины»: микробная, растительная и животная клетки – основной объект биотехнологии»; строение и химический состав клеток; ферментативный катализ и основы кинетики биохимических реакций; характеристики, рост и культивирование
микроорганизмов; методы обнаружения и выделения микроорганизмов; основные понятия
генетики; основы биосинтетических процессов; инженерные основы биотехнологии; технологические приемы и аппаратурное оформление процессов выращивания микроорганизмов;
технологические основы получения метаболитов; инженерная энзимология, иммобилизованные ферменты; прикладная генная и клеточная инженерия; биотехнологические производства; типовые схемы промышленных процессов получения: биомассы белка и аминокислот,
ферментов, антибиотиков и продуктов брожения; важнейшие продукты биотехнологии; основные характеристики и потребительские свойства; надежность биотехнологических систем
и проблемы охраны окружающей среды.
Сборник лабораторных работ может быть использован для специальности 260300 «Технология химической переработки древесины» (инженер) и для направления 240100 «Химическая технология и биотехнология» (бакалавр техники и технологии). В соответствии с рабочей программой для специальности 260300 предусмотрено выполнение всех лабораторных
работ (32 часа). Студенты направления 240100 выполняют работы № 2, 4, 6, 7 (16 часов).
1.5. Условия и особенности выполнения лабораторных работ
Для выполнения лабораторных работ необходимо соблюдения асептических условий.
Посуда стерилизуется в сушильном шкафу, питательные среды – кипячением или стерилизацией в автоклаве.
1.6. Взаимосвязь с теоретическим материалом дисциплины
Лабораторные работы связаны с разделами курса.
Работы № 1, 2, 3 относятся к разделу «Химическая технология и биотехнология: микробная, растительная и животная клетки – основной объект биотехнологии». Работа № 5 – к
теме «Основы биосинтетических процессов». Работы № 4, 6, 7 – к разделу «Биотехнологические производства. Типовые схемы промышленных процессов получения: биомассы белка и
аминокислот, ферментов, антибиотиков и продуктов брожения, важнейшие продукты биотехнологии. Основные характеристики и потребительские свойства».
5
1.7. Форма отчетности студентов
Формой отчетности студентов является протокол выполненной лабораторной работы,
который должен включать следующие составляющие:
– название и номер работы;
– цель работы;
– задачи работы;
– теоретическую часть (кратко);
– задание;
– технологию работы;
– выводы.
Протокол выполнения лабораторной работы выполняется в тетради для лабораторных
работ.
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ
Для успешного освоения лабораторной части курса «Основы биотехнологии» студенту
необходимо использовать при самостоятельной подготовке не только материалы настоящего
сборника, но также материал лекций и учебников.
После выполнения и работы студенты оформляют отчет по работе и защищают выполненную работу. В конце каждой приведен список вопросов, на которые студент должен знать
ответ.
Технические средства: микроскопы, бинокулярные лупы, автоклав или сушильный
шкаф, технические весы, термостат.
Техника безопасности (ТБ): обычная для выполнения лабораторных работ (используется инструкция по ТБ, имеющаяся в лаборатории промышленной экологии кафедры общей
и прикладной экологии, на базе которой выполняются лабораторные работы).
6
3. ОПИСАНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ
Лабораторная работа № 1
Знакомство со спецификой работ
(способы стерилизации посуды и сред, правила работы с микроскопом)
4 часа
Цель работы: знакомство со спецификой работы в микробиологической лаборатории и
оборудованием микробиологической лаборатории, стерилизацией оборудования, отбором
проб, отбором образца для микроскопирования, посева.
Задачи работы: знакомство с правилами работы в микробиологической лаборатории, а
именно:
1) узнать способы стерилизации посуды и сред;
2) научиться настраивать микроскоп для микробиологических целей (настройка освещения микроскопа по Келеру);
3) освоить работу с использованием иммерсионного объектива;
4) научиться готовить посуду и среды к стерилизации.
Задания:
1. Освоить настройку микроскопа по Келеру.
2. Освоить микроскопирование с использованием иммерсионного объектива.
3. Подготовить к стерилизации посуду (пробирки, пипетки, чашки Петри).
Требования к отчету:
1. Название и номер работы.
2. Цели и задачи.
3. Записать ход настройки микроскопа.
Обеспечивающие средства: пробки ватно-марлевые (образец); колбы; вата; марля;
нитки; ножницы; спиртовка; пипетки с делениями объемом 1 мл; микропипетки; пипетки
пастеровские; биологические пробирки; бактериологическая петля; чашки Петри; оберточная
бумага. Микроскоп с подсветкой или осветителем, с объективами × 8 (× 10), × 40 («сухие»),
× 90 (× 100) (иммерсионный объектив); иммерсионное масло; ксилол (для удаления иммерсии); салфетка; белая бумага для настройки микроскопа.
Общие сведения
Стерилизация – это полное уничтожение микроорганизмов, их спор и всего живого в
питательных средах, материале, посуде, инструментах и других предметах лабораторного
обихода.
Стерилизация осуществляется различными приемами и является непременным условием успешного осуществления микробиологических анализов, при использовании в работе
питательных сред, инструментов и посуды, свободных от посторонних микроорганизмов.
Наиболее часто применяются химическая и физическая стерилизация.
Химическая стерилизация
Основана на губительном действии химических веществ на микроорганизмы. Она применяется для обработки вакцин, сывороток и других биопрепаратов, консервируемых различными антисептиками (хлороформом, хинозолом, мертиолатом).
Химические вещества применяются также для уничтожения патогенных (болезнетворных) микробов в объектах внешней среды: на рабочем месте в помещениях, в рабочей одежде, на руках и т. д. В этих случаях говорят о дезинфекции; для дезинфекции применяют: 3–
5 % раствор хлорной извести, 0,5–3 % – хлорамина, растворы иода, сулемы, этиловый спирт
и т. д.
7
Физические методы стерилизации
К ним относятся: стерилизация высокой температурой, ультрафиолетовыми лучами,
радиоактивными излучением, ультразвуком, холодная стерилизация через специальные бактериальные фильтры.
Самым надежным и наиболее распространенным методом физической стерилизации
является стерилизация высокой температурой. Она проводится прокаливанием предметов на
пламени горелки (фламбирование), кипячением, сухим жаром (горячим воздухом), прогретым паром под давлением и текучим паром. Стерилизацию проводят под давлением в специальных приборах – автоклавах обычно при давлении 1 атм (сверх нормального атмосферного), что соответствует 126 °С. В отдельных случаях при сильном заспорении материала устойчивыми к температуре формами микроорганизмов стерилизация проводится при повышенном давлении до 2 атм, что соответствует 134,18 °С. Продолжительность стерилизации
зависит от состава стерилизуемого объекта и степени его бактериального загрязнения и колеблется от 30 мин до 1–1,5 ч.
Стерилизуют в автоклаве питательные среды, лабораторную посуду, перевязочный материал, халаты, хирургические инструменты, отработанные культуры.
Питательные среды, в состав которых входят вещества, разлагающиеся при высоких
температурах, могут быть пастеризованы (выдержаны при температуре 60–80 оС), либо профильтрованы через мембранный фильтр с диаметром пор меньшим, чем размер микроорганизмов.
Стерилизация промышленного биотехнологического оборудования и сред
В промышленности для стерилизации рабочих аппаратов часто используют пар с высокой температурой.
Используемые для культивирования среды стерилизуют в зависимости от их состава:
устойчивые к нагреванию – при высоких температурах (нагревание, пар), для нестойких компонентов может быть использовано фильтрование.
Измерительные приборы чаще всего стерилизуют химически, смывая остатки химиката
стерильной водой.
Отбор проб для микробиологического анализа
Отбор проб – это первый этап микробиологических исследований. Правильность отбора проб, соблюдение асептики имеют важное значение для получения правильных результатов. Отбор проб часто ведется в полевых условиях, после чего пробы доставляются в лабораторию, где проводят дальнейшие этапы анализа.
Во избежание загрязнения исследуемого образца несвойственной ему микрофлорой,
пробы для микробиологических анализов отбирают только в стерильную посуду стерильными пробоотборниками, руки обрабатываются спиртом или моются с мылом до и после отбора (скальпели, ложки, ковши или батометры для отбора воды и т. п.). Используют доступные
способы стерилизации: сухой жар, автоклавирование, фламбирование (обжиг открытым
пламенем).
Для исследования плотных образцов (ил очистных сооружений, почва, части растений
и т. п.) берется средний образец (смешиваются равные порции, взятые из различных частей
образца, затем берется проба для анализа). Обычно верхний слой образца, контактирующий с
внешней средой, для анализа не берут.
При отборе проб из промышленных и лабораторных ферментеров пользуются специальными пробоотборниками, вмонтированными в аппарат (во избежание попадания загрязнений из внешней среды). Первые порции жидкости для анализа не используют. Все образцы
снабжаются этикетками с указанием места отбора пробы, времени отбора, условий хранения
и т. п. Пробы желательно обработать как можно быстрее.
8
Хранение проб
Пробы, предназначенные для исследования состояния микроорганизмов, посевов
должны как можно быстрее быть доставлены в лабораторию. Их транспортируют и хранят
при невысокой температуре (4–6 °С). Время хранения – несколько часов, до суток.
Пробы, предназначенные для подсчета общей численности микроорганизмов, можно
зафиксировать (пары формалина, спирта, в жидкую среду добавляется формалин). Фиксированные пробы могут длительно храниться (недели, месяцы), и могут обрабатываться в более
удобное время (отбор проб летом, в экспедиции, лабораторная обработка зимой).
До и после работы с микробиологическими пробами исследователь должен обработать
руки и рабочую поверхность стола дезинфицирующими средствами (мыло, спирт и т. п.).
Микроскопирование, его применение
Изучение микроорганизмов, их морфологии, включений проводится с использованием
световых микроскопов с различной разрешающей способностью. Часто используют методы
наблюдения в темном поле, фазовоконтрастные методы микроскопирования.
Для сложных специальных исследований могут использоваться люминесцентные микроскопы (определение состояния микроорганизмов), электронная микроскопия (внутренняя
структура клеток).
На сегодняшний день наиболее распространенным и доступным способом изучения
морфологии бактериальных клеток является микроскопирование окрашенных препаратов
клеток с использованием светового микроскопа с набором разных объективов (× 8 (× 10),
× 40 («сухие»), × 90 (× 100) (иммерсионный объектив)).
Иммерсионные масла имеют коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла,
поэтому масло и стекло составляют однородную систему. Иммерсионные масла также как
бы «проясняют» микробиологические препараты, высушенные на стекле (мазок) за счет проникновения в окрашенные клетки и покрытия их.
Методами световой микроскопии можно установить форму клеток, агрегированность
клеток, размеры клеток (если имеется объект-микрометр). Морфологические признаки (в
комплексе с другими – использование различных источников питания, особенности роста на
питательных средах и т. п.) используются при определении видовой принадлежности микроорганизмов. Возможен количественный учет микроорганизмов с применением микроскопирования.
Технология выполнения работы
1. Подготовить к стерилизации пипетки (заткнуть кончик ватой, завернуть по одной в
полоски бумаги).
2. Подготовить к стерилизации чашки Петри (сложить, завернуть в бумагу по 2–3 шт.).
3. Приготовить ватно-марлевые пробки для колб и пробирок. Плотно скатать из ваты
заготовку по образцу. Ватная заготовка должна плотно входить в горлышко сосуда и при
вынимании издавать характерный хлопок. Заготовку обернуть марлей, сложенной в 3–4 слоя,
туго перетянуть нитками, излишки марли срезать.
4. Освоение приемов техники отбора исследуемого образца (взвесь микроорганизмов в
воде, почвенная болтушка) для микроскопирования или посева:
4.1. Зажечь спиртовку.
4.2. Колбу с пробой держат в левой руке около пламени спиртовки. Колбу держать наклонно, не допуская смачивания пробки, не переворачивая в вертикальное
положение, если горлышко открыто! Мизинцем правой руки захватить пробку на колбе, вынуть, положить у спиртовки.
4.3. Взять в правую руку петлю, прокалить петлю до красного свечения в верхней
части пламени, внести в колбу и остудить.
9
4.4. Остывшей петлей взять пробу, поместить каплю взвеси на стекло (в пробирку
или чашку Петри со средой).
4.5. Мизинцем захватить пробку, профламбировать пробку в верхней части пламени, обжечь горлышко колбы в пламени и закрыть горлышко колбы пробкой.
Примечание: все манипуляции производятся на расстоянии 3–5 см от пламени
спиртовки, в стерильной зоне.
Настройка освещения микроскопа по Келеру
Для правильного микроскопирования препаратов (особенно при работе с иммерсионными системами) важным моментом является правильная установка освещения. Устанавливают его по методу Келера.
1. Установить микроскоп и осветитель, на предметный столик поместить препарат, поставить объектив на × 8, конденсор поднять до упора, отодвинуть матовое стекло и открыть
диафрагму конденсора, поставить плоское зеркало и закрыть диафрагму осветителя. Включить осветитель и сфокусировать изображение нити спирали на зеркале, положив на зеркало
лист бумаги.
2. Глядя в окуляр, поворачивать зеркало и поймать в поле зрения световое пятно, сфокусировать препарат при таком освещении.
3. Опуская конденсор, добиться четкого изображения отверстия диафрагмы осветителя
и центрировать с помощью зеркала это изображение.
4. Открыть диафрагму осветителя так, чтобы светлый круг занял все поле зрения.
Уменьшить яркость можно при помощи матового стекла, или меняя реостатом силу тока.
После настройки ни осветитель, ни конденсор не двигают!
Препарат смотрят с сухим объективом, и, найдя место для детального исследования,
поднимают тубус микроскопа. Поворотом револьвера устанавливают иммерсионный объектив (с черной полоской).
Работа с иммерсионным объективом
Наносят на препарат каплю иммерсии (стеклянной палочкой), погружают в масло
фронтальную линзу иммерсионного объектива под визуальным контролем (чтобы не раздавить препарат).
Глядя в окуляр, микровинтом поднимают тубус до появления в поле зрения микроскопа
исследуемого объекта. Резкость изображения регулируют микровинтом.
После работы иммерсионное масло тщательно удаляют с объектива (салфеткой,
смоченной ксилолом, протирают сухой чистой салфеткой).
Контрольные вопросы
1. Какие правила следует соблюдать при работе в микробиологической лаборатории?
2. Как правильно взять пробу для микробиологического анализа?
3. Как правильно сохранить пробу, если ее нельзя сразу обработать?
4. Что такое стерилизация?
5. Какие способы стерилизации вы знаете?
6. Как приготовить стеклянную посуду к стерилизации?
7. Как можно простерилизовать среды и воду?
8. Когда применяют дробную стерилизацию?
9. Что такое химическая стерилизация и где ее используют?
10. Когда используется фламбирование?
11. Как настроить освещение микроскопа по Келеру?
12. Как пользоваться иммерсионным объективом?
10
Лабораторная работа № 2
Морфология микроорганизмов и грибов
(приготовление временных и постоянных препаратов микроорганизмов,
способы окраски)
4 часа
Цель работы: знакомство с морфологическим разнообразием бактерий и грибов.
Задачи работы: освоить приготовление временных и постоянных препаратов микроорганизмов, а именно:
1) освоить окраску простым красителем;
2) приготовить по два препарата «раздавленная капля» и два мазка окрашенных различными красителями;
3) просмотреть готовые препараты, ознакомится с морфологией бактерий, грибов.
Задания:
1. Приготовить препараты (временные и постоянные).
2. Просмотреть готовые препараты, используя иммерсионный объектив.
3. Сравнить форму и размер клеток на временных и постоянных препаратах.
4. Ознакомиться морфологическим многообразием микроорганизмов, особенностями
строения клеток дрожжей и мицелиальных грибов (готовые препараты, временные и постоянные препараты, сделанные самостоятельно).
Требование к отчету:
1. Название и номер работы.
2. Цели и задачи работы.
3. Записать правила приготовления и окраски препаратов.
4. Зарисовать основные формы клеток бактерий (с указанием вида препарата, окраски,
увеличения, использованного для просмотра препарата).
5. Зарисовать строение клеток грибов (с указанием вида препарата, окраски, увеличения, использованного для просмотра).
Обеспечивающие средства: микроскоп с подсветкой или осветителем, с объективами
× 8 (× 10), × 40 («сухие»), × 90 (× 100) (иммерсионный объектив); иммерсионное масло; ксилол (для удаления иммерсии); предметные стекла (толщиной 1,4 мм); покровные стекла
(толщиной 0,15–0,17 мм); бактериологическая петля; пастеровские пипетки; готовые препараты микроорганизмов и грибов с разной морфологией клеток (кокки, палочки, сарцины,
спириллы, дрожжевые клетки и т. д.); красители (метиленовый синий, основной фуксин);
спиртовка; промывалка; стерильная водопроводная вода; кювета с мостиком для окраски
препаратов; пробы для приготовления препаратов (культуры микроорганизмов, дрожжи, кислое молоко или другие кисломолочные продукты, заплесневелый хлеб или овощи, листья
растений с признаками поражения грибами или бактериями, активный ил и т. п.).
Общие сведения
Для определения формы и наблюдения за подвижностью микробов, их размножением,
спорообразованием и прорастанием спор пользуются препаратами, приготовленными из живых микроорганизмов. Для этой цели можно пользоваться следующими препаратами: раздавленная капля, висячая капля. Но такие препараты быстро высыхают, либо среда в них
изменяется (используется для дыхания весь кислород, накапливаются метаболиты) и микроорганизмы погибают. Поэтому они еще называются временными препаратами.
Для выявления некоторых морфологических особенностей микробных клеток и количественного учета микроорганизмов, проверки чистоты культуры и т. п., готовят фиксированные окрашенные препараты (мазок). Эти препараты иначе называются постоянными.
11
Микроорганизмы на таких препаратах мертвые, прикрепленные к стеклу (фиксирование). Мазки фиксируют после полного высыхания с целью:
o закрепить микробы на стекле;
o обезвредить культуру;
o облегчить восприятие окраски.
Механизм окраски микробов рассматривают в настоящее время как сложный физикохимический процесс взаимодействия красителя с содержанием бактериальной клетки. Различают простые и сложные, или дифференциальные методы окраски. Простая окраска заключается в нанесении на препарат какой-либо одной анилиновой краски. Чаще всего для этих
целей употребляется или фуксин Пфейффера – красная краска, или щелочной раствор метиленовой синьки – голубая краска (синька Леффлера). Простой окраской пользуются для обнаружения в чистом материале микробов, определения их количества, формы и расположения. Дифференциальные методы окраски позволяют разделить микробные клетки по какомулибо признаку (состав клеточной стенки – при окраске по Граму, продукты обмена – гликоген, липиды и т. п.).
Постоянные препараты могут храниться длительное время, не подвергаясь изменениям.
Такое их свойство позволяет готовить их в больших количествах в полевых условиях, а обрабатывать в удобное время. Но при таком способе приготовления препаратов не всегда верно можно судить о форме и размерах бактериальных клеток, так как применяемые фиксаторы и красители могут деформировать клетки.
Технология выполнения работы
1. Обезжирить предметные и покровные стекла – обработать хозяйственным мылом. Рабочую поверхность стекла натереть мылом, которое затем удалить чистой сухой тканью. При
обработке стекла держат пальцами за ребро.
2. Приготовить препарат «раздавленная капля».
3. На чистое предметное стекло наносится небольшая капля стерильной водопроводной
воды; дистиллированную воду брать не рекомендуется, так как в ней отсутствует необходимая для микробов концентрация солей, что может вызвать изменение формы клеток, потерю
ими способности к движению и т. д.
4. В каплю воды вносится петлей небольшое количество исследуемых микроорганизмов
(см. лабораторную работу № 1 – отбор образца), тщательно размешивается, и полученная слегка опалесцирующая суспензия накрывается покровным стеклом. Рядом с покровным стеклом
наносится небольшое количество красителя. С противоположной стороны покровного стекла
помещают кусочек фильтровальной бумаги и дают краске проникнуть под стекло.
При использовании культур в жидких средах разбавление водой не требуется.
Приготовление мазка
1. На чистое обезжиренное стекло наносится капля воды, в нее вносится петлей немного исследуемого материала, тщательно перемешивается и размазывается тонким слоем на
поверхности стекла. Материал из жидких питательных сред, в том числе и из свернувшегося
молока, берется петлей и не разводится в капле воды.
2. Высушивание мазка. Лучше всего сушить препарат при комнатной температуре на
воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание
мазка происходит медленно, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить
крайне осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.
3. Фиксация мазка в пламени горелки. В пламени горелки мазки фиксируют следующим образом: стекло берут большим и указательным пальцем или пинцетом и троекратно
проводят через верхнюю часть пламени горелки.
12
4. Окрашивание мазка. Техника окраски: хорошо зафиксированный препарат помещают мазком вверх на стеклянный мостик над ванночкой. На поверхность мазка пипеткой или
из капельницы наносят один из красителей. Количество краски должно быть умеренным –
она должна покрывать весь мазок, но не стекать за пределы стекла.
Фуксин выдерживают на мазке 1–2 мин, синьку – 3–5 мин.
Краску с мазка сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой.
Просмотр приготовленных препаратов
Просматривают препарат, используя объектив × 40. На покровное стекло приготовленного препарата «раздавленная капля» наносят капельку иммерсионного масла и микроскопируют объективом × 90 (× 100).
На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, помещают препарат на
предметный столик микроскопа и микроскопируют иммерсионным объективом (× 90).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Контрольные вопросы
Что дает использование иммерсии?
Для наблюдения каких объектов требуется использование иммерсионного объектива?
Какие формы микробных клеток вы знаете?
Назовите известных вам представителей каждого морфологического типа бактериальных
клеток.
В каком случае вы сделаете временный препарат, а для каком – постоянный? Достоинства
и недостатки каждого.
Зачем требуется окрашивание микроорганизмов?
Какие типы окраски вы знаете? Какие красители используются наиболее часто?
Для чего нужна фиксация микроорганизмов при приготовлении постоянных препаратов?
13
Лабораторная работа № 3
Специальные методы окраски микроорганизмов
4 часа
Цель работы: знакомство с методами окраски микроорганизмов, позволяющими выявить особенности внутреннего строения клеток.
Задачи работы:
1. Освоить дифференцирующие методы окраски.
2. Научиться распознавать грам-положительные и грам-отрицательные микроорганизмы.
3. Научиться распознавать внутриклеточные включения.
Задания:
1. Сделать и промикроскопировать два препарата микроорганизмов, окрашенных по Граму.
2. Сделать и промикроскопировать препараты для выявления клеточных включений
(волютин, гликоген, липиды).
3. Сделать и промикроскопировать препарат для выявления спор.
Требования к отчету:
1. Название и номер работы.
2. Цель и задачи работы.
3. Записать способы окраски по Граму.
4. Записать способы окраски клеточных включений.
5. Зарисовать результаты микроскопирования препаратов (с указанием микроорганизмов, условий просмотра препарата, наличия искомого признака).
Обеспечивающие средства: микроскоп с подсветкой или осветителем, с объективами
× 8 (× 10), × 40 («сухие»), × 90 (× 100) (иммерсионный объектив); иммерсионное масло; ксилол (для удаления иммерсии); предметные стекла (толщиной 1,4 мм); покровные стекла
(толщиной 0,15–0,17 мм); бактериологическая петля; пастеровские пипетки; спиртовка; промывалка; стерильная водопроводная вода; кювета с мостиком для окраски препаратов; окраска по Граму: генцианфиолетовый (водный), раствор Люголя, сафранин (водный), спирт; окраска спор по Ожешко: 0,5 % раствор HCl, фильтровальная бумага, пропитанная карболовым
фуксином Циля, 5 % раствор HCl, метиленовый синий; окраска гликогена: раствор I2 в KI;
окраска волютина: карболовый фуксин Циля, 1 % раствор серной кислоты, метиленовый синий (1 : 40 водный раствор); окраска липидов: 5 % раствор формалина, метиленовый синий
(1 : 40 водный раствор), судан III; пробы для приготовления препаратов (культуры микроорганизмов, дрожжи, кислое молоко или другие кисломолочные продукты, заплесневелый хлеб
или овощи, листья растений с признаками поражения грибами или бактериями, активный ил
и т. п.).
Общие сведения
Окраска по Грамму. Это один из наиболее распространенных методов дифференцирующей (разделяющей) окраски. Используется различие в составе клеточной стенки бактерий, проявляющееся в свойстве удерживать комплекс красителя генцианфиолет – йод (грамположительные, Gr+, синяя окраска) и не воспринимающие эту окраску (грамотрицательные, Gr–, окрашиваются в цвет используемого дополнительно красителя). Клеточная стенка грам-положительных бактерий содержит магниевую соль РНК.
Окраска по Граму – обязательный элемент при определении вида микроорганизмов при
проверке чистоты бактериальных культур.
Примеры Gr+ микроорганизмов: все споровые микроорганизмы (Bac. subtilis, Bac. micoides), все виды молочнокислых палочек и стрептококков.
Примеры Gr– микроорганизмов: E. coli, Bac. aerogenes.
14
Окраска спор (по Ожешко). Образование спор при неблагоприятных условиях присуще
не всем микроорганизмам, и поэтому, для подтверждения видовой принадлежности, бывает
необходимо знать, образует ли бактерия споры. Споры можно различить и без специальной
окраски (сильное лучепреломление на препарате в месте нахождения в клетке споры). Способ окраски спор сводится к окраске спор и клеток, отмыванию красителя из клеток с удерживанием его в спорах, и дополнительной окраске клеток контрастирующим красителем.
Клеточные включения. У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в
результате процессов клеточного обмена в цитоплазме образуются отложения различных
веществ (внутриклеточные включения). Способность образовывать внутриклеточные включения часто используется как один из диагностических признаков. Для выявления включений используют специальные методы окраски.
Гликоген. Это полисахарид, подобный крахмалу. Окрашивается йодом.
Волютин или метахроматические зерна. Представляет собой фосфолипидные комплексы. У дрожжей и грибов метахроматические зерна сосредоточены в вакуолях, у бактерий – в цитоплазме. При использовании метода Омелянского волютин окрашивают карболовым фуксином Циля, а цитоплазму докрашивают метиленовым синим.
Липиды. Липиды представляют собой эфиры глицерина и жирных кислот. Липиды
часто встречаются в цитоплазме в виде капелек, служат запасными питательными веществами. Окрашиваются суданом в розовый цвет.
Технология работы
1. Приготовить препараты (мазок) из культур микроорганизмов (см. лабораторную работу № 2).
Окраска по Граму. Используется в качестве дифференцирующего признака различия в
составе клеточной стенки. Вследствие разницы в строение клеточной стенки – наличия у
грам-положительных в клеточной стенке магниевой соли РНК – они способны удерживать
комплекс генцианфиолетового и йода (Gr+), а другие – нет (Gr–). Окраска по Граму – один из
важных признаков, используемый при проверке чистоты культур, определении видовой принадлежности бактерий и т. д.
Приготовление препарата:
- приготовить препарат мазок (см. лабораторную работу № 2);
- на фиксированный мазок нанести генцианфиолет, выдержать краситель 1–2 мин.
Слить краску, препарат водой не промывать;
- нанести на мазок раствор Люголя, выдержать до полного почернения (около 1–2 мин);
- слить раствор Люголя, не промывая мазок;
- погрузить препарат в стаканчик со спиртом на 20–30 с или налить спирт на мазок, как
красители. Обесцвечивание производят до отхождения фиолетовых струек краски;
- препарат тщательно промыть водой, высушить на воздухе;
- докрасить препарат дополнительным красителем (сафранином) в течение 1–2 мин.
Промыть водой, высушить;
- промикроскопировать с иммерсией. На правильно окрашенных препаратах грамположительные микроорганизмы окрашены в синий цвет, а грам-отрицательные в красный.
Окраска спор по Ожешко.
- Приготовить препарат мазок (см. лабораторную работу № 2), но не фиксировать его.
Нанести на препарат 0,5 % раствор соляной кислоты, подогреть на пламени спиртовки в течение 2 мин (до выделения паров).
- Остудить, слить кислоту. Промыть водой, высушить на воздухе, зафиксировать в пламени.
- Фиксированный препарат покрывают полоской фильтровальной бумаги, нанести на
нее фуксин Циля, окрасить при постоянном нагревании до появления паров, добавляя краситель по мере его испарения.
- Остудить препарат, слить краситель, промыть водой.
15
- Погрузить препарат в стаканчик с 5 % соляной кислотой (для обесцвечивания) на несколько секунд, затем промыть его водой.
- Промикроскопировать с иммерсией. Микроорганизмы окрашены в светло-розовый
цвет, споры – в ярко-красный.
Выявление клеточных включений.
- Выявление гликогена.
- Суспензию клеток нанести на предметное стекло, добавить каплю раствора йода в йодистом калии.
- Накрыть покровным стеклом, просмотреть под микроскопом с объективом × 40. Зерна
гликогена окрашиваются в красновато-коричневый цвет.
Окрашивание волютина (метод Омелянского).
- Приготовить мазок (как в лабораторной работе № 2).
- Окрасить фуксином Циля (как при окраске спор по Ожешко, см. выше).
- Промыть стекло, обесцветить в 1 % растворе серной кислоты (около 20–30 мин), промыть водой.
- Докрасить метиленовым синим в течение 5 мин.
- Высушить, промикроскопировать. Цитоплазма клеток должна выглядеть синей, включения волютина – красными (зерна).
Окрашивание липидов.
- На предметное стекло нанести каплю формалина, внести в нее исследуемый материал,
выдержать в течение 5 мин.
- Нанести каплю метиленового синего, выдержать 10 мин.
- Не сливая метиленовый синий, нанести каплю судана III.
- Высушить, промикроскопировать. Цитоплазма клеток должна выглядеть синей, включения липидов – розовыми.
Контрольные вопросы
Какие способы окраски микроорганизмов вы знаете?
В чем отличие между простыми и дифференцирующими методами окрашивания?
На какое отличие в строение клеточной стенке указывает окраска по Граму?
Как выглядят под микроскопом клетки микроорганизмов грам-положительных, а как –
грам-отрицательных?
5. Какие вещества могут находиться в клетках в качестве клеточных включений, какова их
роль?
6. Как можно выявить наличие клеточных включений?
1.
2.
3.
4.
16
Лабораторная работа № 4
Получение спирта при сбраживании углеводов дрожжами
4 часа
Цель работы: оценка интенсивности сбраживания углеродных субстратов дрожжами.
Задачи работы: обнаружить дрожжи (возбудители брожения); провести качественную
реакцию, подтверждающую образование спирта в результате брожения; провести качественную реакцию, подтверждающую образование СО2 в результате брожения.
Задания: собрать бродильную установку; провести определение конечных продуктов
брожения; приготовить и промикроскопировать препарат; оценить интенсивность сбраживания разных субстратов (по скорости наполнения пробирки газом).
Требование к отчету:
1. Название и номер работы.
2. Цель и задачи работы.
3. Зарисовать установку для сбраживания (рис. 1).
4. Краткое описание определения СО2.
5. Краткое описание определение присутствия спирта.
6. Зарисовать клетки дрожжей, обнаруженные при микроскопировании.
7. Сравнить результаты (скорость образования углекислого газа).
7
4
6
5
3
1
2
Рис. 1. Бродильный прибор:
1 – флакон для сбраживания; 2 – дрожжи; 3 – игла; 4 – отвод газа, образующегося
при брожении; 5 – газ; 6 – стакан с водой; 7 – пробирка для сбора СО2
17
Обеспечивающие средства: флаконы с резиновыми пробками и колпачками; газоотводные трубки; стакан с водой; пробирка; водяная баня; термометр; воронка; фильтровальная бумага; стаканчик для сбора фильтрата; раствор сахарозы 10 %; хлебные сухари; пекарские дрожжи (желательно прессованные); 10 % раствор NaOH; лакмусовая бумага; йод кристаллический; баритовая вода (Ва(ОН)2); спиртовка; предметные стекла; метиленовый синий
или фуксин основной.
Общие положения
Спиртовое брожение – процесс анаэробное разложение углеводов до спирта и углекислого газа.
Возбудители спиртового брожения – дрожжи (р. Sacharomyces), некоторые плесневелые грибки, некоторые виды бактерий.
Большинство видов дрожжей хорошо сбраживают моносахариды, а ди- и полисахариды
сбраживаются только после их гидролиза на моносахара под действием ферментов или химического гидролиза.
Превращение глюкозы в этанол протекает согласно уравнению:
С6Н12О6 → С2Н5ОН + СО2
Выход конечного продукта при производстве спирта не превышает 9–12 % от объема
жидкой фазы.
Спирт и биомасса дрожжей могут быть получены на многих видах углеводного сырья,
в том числе широко распространены технологии получения спирта и дрожжей на отходах
переработки древесины (гидролизат древесины), на черном щелоке.
Технология выполнения работы
В подгруппе работа выполняется в 2–3 вариантах – с разными количествами сахарозы.
1. Сбор бродильной установки.
В сывороточный флакон добавляют 50 (100 или 200) мл 10 % раствора сахарозы, 50 г
сухарей и 1 г дрожжей. Флакон закрывают резиновой пробкой, перемешивают содержимое,
закрывают металлическим колпачком. Пробку протыкают иглой и с газоотводной трубкой.
Свободный конец газоотводной трубки опускают в стакан с водой, и надевают на него
пробирку, заполненную водой.
Смонтированный прибор помещают в теплое место (или стакан с теплой водой, по мере
остывания меняют). Температура 28–30 оС, продолжительность брожения 2–3 часа.
Через некоторое время после начала брожения определяют скорость заполнения газом
пробирки. Процедуру повторить 3 раза для каждой концентрации углевода. Рассчитать среднюю скорость заполнения пробирки газом.
2. Определение углекислого газа.
СО2 определяют по реакции с Са(ОН)2, в результате которой образуется осадок – карбонат Са:
СО2 + Са(ОН)2 = СаСО3 + Н2О
В пробирку, заполненную бродильным газом, быстро приливают 1–2 мл раствора гидроокиси кальция. В присутствии углекислого газа выпадает осадок.
3. Определение спирта.
Спирт определяют по образованию с йодом йодоформа. По окончании времени брожение содержимое флакона фильтруют через бумажный фильтр. Отбирают 5 мл фильтрата пипеткой, переносят его в пробирку и подщелачивают 10 % раствором NaOH до слабощелочной реакции (по лакмусовой бумажке). Пробирку нагревают в водяной бане до 60 оС, добав18
ляют 1–2 кристалла йода (около 0,1 г). Пробирку нагревают до полного растворения йода.
Спирт в присутствии щелочи с йодом дает йодоформ, определяемый по характерному
запаху и выпадению при охлаждении желтого осадка.
4. Обнаружение дрожжей.
Фильтрат микроскопируют при небольшом увеличении (препарат «раздавленная капля», см. лабораторную работу № 2). Зарисовать клетки дрожжей.
5. Оценка интенсивности брожения при разных концентрациях углеводов.
Определить, при какой концентрации углеводов средняя скорость заполнения пробирки
была минимальной. Данная концентрация является оптимальной.
Контрольные вопросы
1. Какие организмы могут быть возбудителями спиртового брожения?
2. Где в домашних условиях используется спиртовое брожение?
3. Какие вещества сбраживаются до спирта?
4. Что применяют на практике для того, чтобы сделать доступными для дрожжей полисахариды?
5. Какие конечные продукты спиртового брожения?
19
Лабораторная работа № 5
Выделение чистых культур микроорганизмов
8 часов (2 занятия по 4 часа)
Цель работы: знакомство с техникой выделения чистых культур
Задачи работы: освоить отдельные приемы, применяемые для выделения чистых
культур; знакомство с разными приемами культивирования микроорганизмов; знакомство с
культуральными признаками микроорганизмов
Задания:
занятие 1:
1) освоить приемы поверхностного и глубинного посевов;
2) сделать посев на поверхность косого агара, глубинный посев (в чашку Петри) уколом в толщу агара;
занятие 2:
1) освоить пересев культур (поверхностный посев на скошенный агар);
2) ознакомиться с морфологическими признаками колоний микроорганизмов;
3) сделать по одному мазку, окрашенному по Граму (см. лабораторную работу № 3), из
трех выросших колоний.
Обеспечивающие средства:
занятие 1: стерильные чашки Петри – по 1; стерильные чашки Петри с питательной
средой – по 1; стерильные пробирки питательной средой – по 1; стерильная питательная среда в колбе – 1 на группу; стерильные пипетки; стерильные пробирки с «косячками» – по 1;
шпатели Дригальского; бактериологические петли; спиртовки – по 1; культуры микроорганизмов для посева (можно использовать кислое молоко, почвенную болтушку, дрожжевую
суспензию в стерильной воде, активный ил);
занятие 2: стерильные пробирки с «косячками» – по 1; бактериологические петли;
спиртовки – по 1; стерильная вода; микроскоп; иммерсионное масло; предметные стекла
(по 1); генцианфиолет; раствор Люголя; сафранин; спирт.
Примечание: все манипуляции при посевах производятся на расстоянии 3–5 см от
пламени спиртовки, в стерильной зоне.
Требования к отчету:
1. Название и номер работы.
2. Цель и задачи работы.
3. Заполнить таблицу 1.
4. Описать несколько выросших колоний по приведенной в пункте 2 занятия 2 схеме.
5. Зарисовать результат просмотра мазка, окрашенного по Граму.
6. Записать, какие из колоний состояли из грам-положительных, а какие – из грамотрицательных микроорганизмов.
Таблица 1 – Рост микроорганизмов на различных средах при разных способах посева
Вид
посева
Посевной материал
Инструмент
для выполнения
посева, объем
посевного материала
Питательная
среда
20
Условия культивирования
(температура,
кислород)
Характер роста микроорганизмов (поверхность среды,
в глубине), потребность
организмов в кислороде
Общие сведения
Потребности микроорганизмов в питательных веществах. Микроорганизмы для своего роста нуждаются в различных соединениях. Основные необходимые для роста микроорганизмов химические элементы (макроэлементы): C, O, N, H, S, P, K, Ca, Mg, Fe. В следовых
количествах микроорганизмы нуждаются в наличие микроэлементов Mn, Mo, Cu, Zn, Se, Cl,
Si и др. Кроме того, им могут быть необходимы и дополнительные вещества, которые эти
организмы не могут синтезировать сами (некоторые аминокислоты, витамины и т. д.).
По отношению к источникам углерода и энергии микроорганизмы делят на следующие
виды.
Фотоавторофы – используют солнечную энергию и неорганические
соединения (СО2, Н2S) (водоросли, цианобактерии, серобактерии)
Фототрофы
Фотогетеротрофы – используют солнечную энергию неорганические соединения (СО2, Н2S), и готовую органику (некоторые
цианобактерии, серобактерии)
Хемоавторофы – используют неорганические соединения (NH3,
Н2S, S, соли закисного Fe) (нитрификаторы, серобактерии, железобактерии)
Хемотрофы
Хемогетеротрофы – используют сложные органические соединения (грибы; микроорганизмы, использующие органику живых
организмов – паразиты и отмерших организмов – сапрофиты)
По потребности в кислороде микроорганизмы делятся:
o
на аэробные (для которых необходим кислород);
o
анаэробные (живущие без кислорода).
Аэробные микроорганизмы могут быть облигатными (обязательными) аэробами и факультативными. Многие аэробные бактерии – микроаэрофилы, т. е. нуждающиеся лишь в небольших количествах кислорода. Анаэробы также бывают облигатными, для которых даже
следовые концентрации О2 в среде токсичны. Факультативные анаэробы делятся на аэротолерантные (не используют кислород, но не гибнут в его присутствии – молочнокислые бактерии)
и использующие в зависимости от наличия кислорода механизм дыхания или брожения.
По отношению к температуре, все организмы делятся на следующие виды.
o
Криофильные – оптимальные значения температуры около 0–4 оС.
o
Психрофильные – оптимальные значения температуры около 20 оС.
o
Мезофильные – оптимальные значения температуры около 35–42 оС.
o
Термофильные – оптимальные значения температуры выше 42 оС.
Накопительные культуры. Для их получения необходимо обеспечить условия среды,
при которых нужный организм получает преимущество в росте перед остальными. Засевая
(инокулируя) питательную среду смешанной культурой микроорганизмов, подбирая условия
культивирования (рН среды, источники энергии, концентрацию кислорода, температуру,
концентрацию различных элементов и т. д.), одному из видов обеспечивают наиболее подходящие для роста условия. Для обеспечения преимущественного роста микроорганизмам
нужного вида используется их устойчивость к действиям факторов среды (высокая или низкая температура, рН, Еh), чувствительность к антибиотикам, ингибиторы отдельных обменных процессов и т. п. Путем многократных пересевов в свежую среду того же состава, можно выделить преобладающий («накопленный») штамм микроорганизмов.
21
Для выделения микроорганизмов часто используют материал из тех мест, где есть «естественное обогащение», т. е. данный вид в естественных условиях доминирует. Так, для получения культур микроорганизмов, разлагающих белок, используется вода скотобоен, микроорганизмов, окисляющих углеводороды – из загрязненных нефтью почв и т. п.
Чистые культуры. Чистая культура – это потомство одной клетки (клон). Для выделения чистых культур чаще всего используют посевы, выросшие на твердой питательной среде. Суть метода состоит в отделении отдельных колоний, суспендировании их в жидкой среде, повторные пересевы (нанесением штриха петлей на поверхность среды для аэробов, суспендированием в расплавленном агаре – для анаэробов).
Выделение чистых культур микроорганизмов и поддержание чистоты культур необходимый этап работы при получении продуцентов различных веществ.
Проверку чистоты культуры осуществляют с использованием морфологических особенностей организма (форма клеток, размеры, окраска по Граму, образование спор, клеточные включения и т. д.), культуральных признаков (рост на средах, использование различных
субстратов, образование продуктов обмена, характер образуемых колоний и т. п.).
Смешанные культуры. В естественных условиях, как правило, обитают популяции
микроорганизмов, состоящие из смеси различных видов, взаимодействующих между собой.
На практике широко распространено применение смешанных культур микроорганизмов. Например, кефир (молочнокислые бактерии нескольких видов, дрожжи), чайный гриб
(уксуснокислые бактерии, дрожжи), аэробный и анаэробный активный ил очистных сооружений и др.
Получение культур микроорганизмов. В лабораторных условиях получают культуры
организмов–продуцентов, используемых далее для получения посевного материала. Регулярный пересев культур продуцентов (повторный посев части выросших колоний на свежую
среду) необходим для поддержания культуры, проверки ее чистоты.
Питательные среды. В зависимости от потребностей организма для его выращивания
(культивирования) используют питательные среды различного состава (минеральные, содержащие органические соединения и т. п.).
По агрегатному состоянию среды бывают жидкие и твердые (с отвердителями – агарагаром, желатином, силикагелем и т. п.).
В зависимости от потребностей организма обеспечивают оптимальную рН среды, оптимальную температуру. В зависимости от отношения к кислороду создают аэробные или
анаэробные условия.
В лабораторных условиях используют чашки Петри, пробирки, колбы, планшеты, флаконы, бутыли (для непроточного, периодического культивирования) и различные по конструкции реакторы – ферментеры (для непрерывного культивирования).
Технология работы
Занятие 1 (4 часа). Выполнение посевов
1. Техника глубинного посева культуры микроорганизмов (в чашки Петри).
Посевной материал набирают из колбы, которую держат наклонно и открывают пробку
вблизи пламени спиртовки. Стерильной пипеткой отбирается необходимый объем посевного
материала (обычно 0,5–1,0 мл) и вносится в чашку. При посеве чашку Петри держат левой
рукой. Край чашки обрабатывается в пламени. Крышку поднимают большим, средним и указательным пальцами так, чтобы в образовавшуюся щель свободно могла пройти пипетка
(примерно 1–1,5 см).
После внесения исследуемой культуры, в чашку, соблюдая правила стерильности
(вблизи пламени, обрабатывая край посуды пламенем, держа посуду со средой наклонно)
вносят теплую агаризированную питательную среду (45–50 оС), осторожно круговыми движениями перемешивая с находящейся там культурой микроорганизмов.
22
После остывания агара чашки переворачивают вверх дном (чтобы избежать конденсации влаги на агаре) и помешают в термостат для роста.
Данный метод используется и для количественного учета микроорганизмов, способных
к росту на используемой питательной среде, поскольку известен объем пробы.
2. Посев на поверхность агара в чашке Петри.
Соблюдая правила стерильности, набрать небольшое количество культуры пипеткой,
внести на поверхность твердой питательной среды в чашке. Распределить стерильным шпателем по поверхности. Или петлей захватить небольшое количество посевного материала, и
штриховыми движениями распределить по поверхности среды.
Чашки перевернуть вверх дном, поместить в термостат.
3. Посев на косой агар (в пробирке).
Соблюдая правила стерильности, отбирают небольшое количество посевного материала прокаленной петлей. Петлю вносят в пробирку с косячком среды (скос агара обращен
вверх), опускают на дно пробирки, прикасаются к среде и скользящими движениями по поверхности агара наносят прямую линию или зигзагообразные штрихи. Распределив материал, петлю вынимают, край пробирки обжигают над пламенем спиртовки, закрывают и поворачивают горлышком вверх. Помещают в термостат.
4. Посев уколом.
Пробирку со столбиком питательной среды берут в левую руку, над пламенем вынимают пробку и переворачивают пробирку вверх дном. Петлю с исследуемым материалом
втыкают снизу в центр столбика среды, затем петлю извлекают, пробирку закрывают, переворачивают. Помещают в термостат.
5. Посев на жидкую среду.
Соблюдая стерильность, в пробирку с жидкой питательной средой вносят пипеткой или
петлей каплю культуры, закрывают. Помещают в термостат.
Занятие 2 (4 часа). Изучение выросших колоний. Техника выделения чистых культур
микроорганизмов
1. Охарактеризовать выросшие колонии по отношению к кислороду. Аэробы растут
преимущественно на поверхности среды, анаэробы – на дне.
2. Макроскопическое изучение. Просмотреть выросшие в чашках колонии, охарактеризовать их по схеме: размер, форма, прозрачность, цвет, поверхность, рельеф, консистенция. Для
дальнейшей работы отбираются несколько изолированных колоний (наиболее типичных).
3. Микроскопирование.
Из колонии делается препарат мазок с окраской по Граму (лабораторная работа № 3)
для описания морфологии микроорганизма и чистоты культуры. Мазок просматривают с
иммерсионным объективом. Записывают результаты (форма клеток, грам-положительные
или грам-отрицательные).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Контрольные вопросы
Какие элементы необходимы для роста микроорганизмов?
Как подразделяются микроорганизмы по отношению к источникам углерода и энергии?
Как подразделяются микроорганизмы по отношению к кислороду?
Как подразделяются микроорганизмы по температурному оптимуму?
Что такое накопительная культура? Как можно ее выделить?
Что такое чистая культура? Как можно ее выделить?
Что такое смешанная культура микроорганизмов? Приведите примеры таких культур.
Какие признаки используют для описания выросших колоний?
Как проверить чистоту культуры?
Какие способы посева микроорганизмов вы можете назвать?
23
Лабораторная работа № 6
Способы отделения конечных продуктов и оценка концентрации клеток
4 часа
Цель работы: знакомство с методами, применяемыми для отделения готового продукта.
Задачи работы: отделение продукта (клеточной массы) методом осадочной фильтрации; отделение продукта (клеточной массы) методом мембранной фильтрации; отделение
продукта (клеточной массы) методом центрифугирования.
Задания:
1. Определить количество продукта (клеточной массы) методом осадочной фильтрации.
2. Определить количество продукта (клеточной массы) методом центрифугирования.
3. Определить количество продукта (клеточной массы) методом центрифугирования.
4. Сравнить полученные результаты оценки концентрации клеток в среде. Указать причины различия результатов оценки концентрации.
5. Сравнить методы, сделать вывод об эффективности каждого из них.
Требования к отчету:
1. Название и номер работы.
2. Цель и задачи работы.
3. Заполнить таблицу 1, сделав необходимые расчеты.
4. Записать вывод по эффективности способов отделения клеточной массы от культуральной среды.
5. Записать вывод по сравнению результатов оценки концентрации клеток в среде.
Указать причины различия результатов оценки концентрации.
Обеспечивающие средства: мембранные фильтры; установка для фильтрации; бумажные фильтры; целлюлозное волокно; колба Бунзена; воронка Бюхнера; центрифуга с центрифужными пробирками; мерные цилиндры на 100 см3; стаканы объемом 250 см3; флокулянты
(например, раствор полиакриламида); весы; взвешенные бюксы; образцы разделяемых смесей
(культура дрожжей, смешанная культура микроорганизмов аэробного активного ила).
Таблица 1 – Отделение клеток от субстрата центрифугированием и фильтрацией
Метод
Оценка концентрации
сырой клеточной
биомассы, г/л
Оценка надосадочной
жидкости
Оценка осадка,
легкости его отделения
Общие положения
Биотехнологический процесс получения любого продукта можно схематично представить в виде следующих этапов:
Получение посевного материала
Инокуляция
Ферментация
Отделение и очистка конечного продукта
24
Целью любого биотехнологического процесса, используемого в промышленности, является получение какого-либо продукта. Конечными продуктами биотехнологических процессов может быть, например, клеточная биомасса (производство кормовых дрожжей), белок
(производство дрожжевого и бактериального белка), продукты жизнедеятельности микроорганизмов (органические кислоты, антибиотики, биогаз) и т. д.
В зависимости, что именно является конечной целью биотехнологического процесса,
для отделения конечного продукта используют различные методы. Для концентрирования
конечного продукта используют различные физические и химические свойства частиц и молекул (вес, поверхностное натяжение, растворимость, заряд, температура кипения, способность к диффузии, размеры).
Так, для отделения клеток используют осаждение, фильтрацию (в том числе мембранную), центрифугирование, флотацию. Такие методы используют, например, при разделении
водно-иловой смеси, очистке сточных вод (аэробной и анаэробной), получении клеточной
биомассы (дрожжи) и т. п.
Помимо самих клеток конечными продуктами могут быть внутриклеточные метаболиты или выделившиеся во внешнюю среду внеклеточные метаболиты. В любом случае первым этапом должно быть отделение клеток от среды.
Далее может следовать разрушение отделенных клеток (если требуется отделение
внутриклеточных продуктов). Клетки могут быть разрушены следующими методами:
o физическими (ультразвуком, замораживанием – оттаиванием, прессованием, размолом в шаровых мельницах);
o химическими (лиофилизацией, экстракцией, обработкой детергентами, кислотами);
o биологическими (ферментами, фагами, ингибиторами).
После разрушения клеток или при выделении продукта из культуральной среды для
максимального извлечения продуктов используются методы:
o экстрагирования (используя свойства гидрофильности и гидрофобности);
o хроматографии (адсорбционная, ионообменная, гель-хроматография – вещества
разделяются по молекулярному весу);
o мембранных процессов (ультафильтрация, обратный осмос, диализ);
o кристаллизации и осаждения;
o высушивания (конвективное – в потоке воздуха, контактное – с адсорбентом, сушка после замораживания – лиофилизация).
Фильтрация. Для получения бактериальных клеток из культуральной среды часто используют два типа фильтрации: осадочная и мембранная. Часто для улучшения отделения
клеточной массы от жидкости используют добавление веществ, увеличивающих размеры
бактериальных агрегатов – флокулянтов (например, полиакриламид).
Для осадочной фильтрации используют высокопористые материалы с глубокими и извилистыми порами. Фильтровальная система состоит из подложки фильтра (фильтровальная
бумага или ткань, крупнопористые) и толстого слоя фильтрующего материала (целлюлозы,
диатомовой земли и т. п.). При фильтровании бактерии, по мере их накопления, соскабливают с поверхности фильтра. Такой способ позволяет хорошо очистить фильтрат, но для стерилизации сред неприменим, а биомасса часто оказывается загрязненной фильтрующим материалом.
Мембранная фильтрация основана на задержке бактерий на поверхности фильтра с порами, диаметр которых изменяется в узких пределах. Выбор мембраны зависит от характеристик культуры и, что именно желают получить в качестве продукта – клетки или фильтрат.
Так, при стерилизации фильтрованием, требуется мембрана с диаметром пор менее 0,5
мкм (размеры клеток 1,5–0,5 мкм).
Центрифугирование. Этот способ дает менее полное разделение, чем фильтрация. Но
такой способ дает возможность получить среду и клетки, незагрязненные фильтрующим материалом. Скорость осаждения в процессе центрифугирования зависит от таких факторов,
25
как вязкость среды, размер частиц и разница в плотности между частицами и средой. Все типы центрифуг работают по принципу регулируемого приложения центробежной силы во вращающемся роторе.
Оценка концентрации клеточной биомассы. Отделение клеток от среды является также
составной частью при оценке концентрации клеток в среде. Для подсчета количества микроорганизмов в исследуемом образце существует большое количество методов. Наиболее распространенными методами количественного учета микроорганизмов являются следующие.
1. Методы прямого счета микроорганизмов (в определенном объеме пробы или в навеске). Методы сводятся к подсчету количества клеток микроорганизмов в определенном
объеме микробной суспензии непосредственно под микроскопом, пересчитывая далее численность микроорганизмов на единицу веса или объема (вес – для твердых тел, объем – для
жидкостей и газов). Подсчет клеток ведут на фиксированных окрашенных мазках (почва,
илы, растения и растительные остатки), с использованием мембранных фильтров (вода, воздух), используя световую или электронную микроскопию.
2. Количество микроорганизмов можно рассчитать по количеству органического азота
или углерода. Используется в биотехнологии, при культивировании микроорганизмов там,
где используют чистые культуры.
3. Количество бактерий можно рассчитать по оптической плотности микробной суспензии. Используется в биотехнологии, при культивировании микроорганизмов, в медицине.
4. Метод высева на плотные питательные среды (в чашки Петри). Этим методом учитывается не общее количество микроорганизмов в исследуемом образце, а численность различных физиологических групп микроорганизмов или организмов. В зависимости от используемой питательной среды это могут быть сапрофиты, сульфатредукторы, аммонификаторы,
нитрификаторы, денитрификаторы, железобактерии и т. д. Метод сводиться к приготовлению разведений пробы и посева разведенных образцов на питательные среды различного состава с последующей инкубацией посевов и подсчетом выросших колоний. Условно принимается, что из одной клетки вырастает одна колония.
5. Метод предельных разведений, метод титра. Сущность этого метода состоит в следующем. В пробирки или колбы со средой вносят определенной объем, взятый из различных
разведений исследуемой пробы. После инкубации регистрируют наличие или отсутствие
роста в посевах, результаты обрабатывают статистически с помощью специальных таблиц и
рассчитывают число микроорганизмов, содержащихся в единице веса или объема образца.
Способы оценки численности организмов в среде, используемые в промышленности
позволяют быстро получить результат. Обычно оценивают концентрацию клеток в среде либо оптическими методами (легко автоматизировать), либо прямым подсчетом под микроскопом, либо весовым – аналогично определению концентрации взвешенных веществ в объеме
(по разнице в весе между фильтром с осадком и без). Вес может быть сырым или сухим (после сушки образца) и т. д.
Технология работы
1. Осадочная фильтрация.
Присоединить воронку к колбе Бунзена, соединить колбу с водоструйным насосом. На
воронку положить крупнопористую фильтровальную бумагу, на нее налить суспензию целлюлозного волокна в воде. На фильтре должен получиться ровный слой целлюлозы толщиной 0,5–1 см. Если нет возможности использовать целлюлозное волокно – фильтрация через
бумажный фильтр. Профильтровать 250 мл разделяемой смеси. Оценить (визуально) степень
прозрачности отфильтрованной жидкости. Соскоблить слой осажденных клеток, взвесить, поместив в бюкс.
Рассчитать сырую клеточную массу (г/л) = (Вес бюкса с клетками, г, – Вес пустого
бюкса, г) : Объем жидкости, мл, × 1000 (1000 – пересчет в г/л).
Оценить степень загрязненности клеток фильтрующим материалом (визуально).
26
2. Взвесить мембранный фильтр. Профильтровать через мембранный фильтр 50–100 мл
смеси. Оценить степень прозрачности фильтрата. Взвесить фильтр с осадком.
Рассчитать сырую клеточную массу (г/л) = (Вес фильтра с клетками, г, – Вес пустого
фильтра, г) : Объем жидкости × 1000 мл.
3. Провести разделение осадочным фильтрованием, добавив предварительно к разделяемой смеси полиакриламид (1 мг раствора на 100 мл смеси). Концентрацию сырой биомассы рассчитывать не нужно. Сравнить прозрачность фильтрата, скорость фильтрации с аналогичными без использования полиакриламида.
4. Взвесить две центрифужных пробирки. Измерить объем жидкости, помещающийся в
пробирку. Налить в пробирку разделяемую смесь. Поставить пробирки в центрифугу. Пробирки должны быть одинаково наполненными и попарно уравновешенными. Надеть крышку, завинтить. Закрыть кожух. Выставить время центрифугирования. Включить центрифугу.
До полной остановки центрифуги открывать крышку нельзя!
Разделение центрифугированием выполняется в течение 5 мин в двух вариантах – при
скорости 1000 и 8000 об/мин. Про окончании процесса визуально оценить прозрачность
жидкости, слить надосадочную жидкость. Взвесить пробирку с осадком, рассчитать концентрацию биомассы (г/л).
Рассчитать сырую клеточную массу (г/л) = (Вес пробирки с клетками, г, – Вес пустой
пробирки, г) : Объем жидкости, мл, × 1000 (1000 – пересчет в г/л).
Контрольные вопросы
1. Что может выступать в роли конечных продуктов в биотехнологических процессах?
2. Какие основные этапы в получении биотехнологических продуктов вы можете назвать?
3. Какие свойства используют для отделения конечных продуктов?
4. Какие методы отделения конечных продуктов используют в биотехнологии?
5. Как можно оделить клеточную биомассу от среды?
6. Что используют для выделения конечных продуктов, находящихся в клетках?
7. Какие методы применяют для выделения продуктов, накапливающихся в культуральной
среде?
8. Какие методы оценки концентрации клеток в среде вы знаете?
27
Лабораторная работа № 7
Получение уксусной кислоты
4 часа
Цель работы: знакомство с получением уксусной кислоты.
Задачи работы: отделение продукта (клеточной массы) методом осадочной фильтрации; отделение продукта (клеточной массы) методом мембранной фильтрации; отделение
продукта (клеточной массы) методом центрифугирования.
Задания:
1. Определить количество образующейся уксусной кислоты.
2. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать уксуснокислые бактерии.
Требования к отчету:
1. Название и номер работы.
2. Цель и задачи работы.
3. Записать ход выполнения работы (кратко).
4. Записать расчет количества уксусной кислоты.
5. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать уксуснокислые бактерии.
Обеспечивающие средства: колбы стерильные объемом 0,5–1,0 л с ватно-марлевыми
пробками; предметные и покровные стекла; микроскоп; пипетки на 10 мл, 1 мл; непастеризованное пиво или вино; 6 % уксусная кислота; 0,1 н NaОН; фенолфталеин; бюретка; колбы
конические; мерные цилиндры.
Общие положения
Уксуснокислые бактерии превращают спирт в уксусную кислоту. Окисление спирта
чаще всего осуществляют бактерии родов Gluconobacter (глюконобактер) и Acetobacter (ацетобактер). Уксуснокислые бактерии – строгие аэробы, имеют метаболизм дыхательного типа
(окисление, полное или неполное).
Неполное окисление:
1. С2Н5ОН + ½ О2 = СН3СОН + Н2О
2. СН3СОН + 1/2О2 = СН3СООН + Н2О
Полное окисление:
1. С2Н5ОН + ½ О2 = СН3СОН + Н2О
2. СН3СОН + 1/2О2 = СН3СООН + Н2О
3. СН3СООН + О2 = СО2 + Н2О
Содержание уксусной кислоты при получении ее биотехнологическими способами 6–9 %.
Уксуснокислые бактерии можно обнаружить на фруктах и цветах, в пиве, вине, кефире,
соке сахарного тростника. В сообществе с дрожжами и некоторыми другими бактериями уксуснокислые бактерии образуют смешанную культуру – «чайный гриб».
Уксуснокислые бактерии на поверхности подкисленной среды, содержащей спирт, образуют серовато-белую пленку. Ацетобактер растет на средах с повышенным содержанием
этилового спирта (до 10 %), глюконобактер – на среде с повышенным содержанием сахаров.
Бактерии р. Acetobacter способные к полному окислению спирта до СО2 и Н2О, а бактерии р. Gluconobacter осуществляют неполное окисление (до уксусной кислоты).
Под микроскопом бактерии родов Acetobacter и Gluconobacter выглядят как цепочки из
крупных палочек. Клетки этих бактерий грам-отрицательны?
28
Технология работы
Занятие 1
1. Сбор установки.
В колбу объемом 1 л (0,5 л) отмеряется 500 (250) мл непастеризованного пива или вина,
к которому добавлено 10 или 20 % по объему 6 % уксусной кислоты. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и оставляют до следующего занятия при температуре 20–25 оС.
2. Определение исходного содержания уксусной кислоты.
Отмерить 10 мл подкисленного пива (вина). Добавить несколько капель фенолфталеина. Титровать 0,1 н раствором NaOH до появления розовой окраски.
Записать количество израсходованной щелочи (n1).
Занятие 2
1. Морфология уксуснокислых бактерий.
Образовавшуюся на поверхности пленку уксуснокислых бактерий микроскопируют
(препарат мазок, окраска простым красителем – см. лабораторную работу № 2). Препарат
микроскопируют с иммерсией (см. лабораторную работу № 2). Увиденное зарисовать. Уксуснокислые бактерии видны в виде цепочек из крупных палочек.
2. Определение концентрации накопившейся уксусной кислоты.
Титруем 10 мл пробы после культивирования. Определяем n2 (как и n1, см. занятие 1).
Расчет количества уксусной кислоты в среде, N, г/л:
N = n ⋅ 0.006 ⋅ 100,
где n = n1 – n2 – количество раствора 0,1 н NaOH, пошедшего на титрование 10 мл пробы;
0,006 – коэффициент пересчета.
Записать результат.
1.
2.
3.
4.
5.
Контрольные вопросы
Какие микроорганизмы могут быть продуцентами уксусной кислоты?
При получении уксусной кислоты используется окисление или брожение?
Какое вещество является субстратом при получении уксусной кислоты?
Как определяли количество получившейся уксусной кислоты?
Какие методы можно использовать для выделения уксусной кислоты?
29
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Основная литература
1. Егорова, Т. А. Основы биотехнологии [Текст] : учеб. пособие для студ. пед. вузов
спец. «Биология» / Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина. – М. : ВЛАДОС,
2003. – 208 с.
Дополнительная литература
2. Липунов, И. Н. Основы химии и микробиологии природных и сточных вод [Текст] :
учеб. пособие / И. Н. Липунов. – Екатеринбург, 1995. – 212 с.
3. Федорова, Э. И. Биотехнология [Текст] : учеб. пособие для студ. спец. «Технология
целлюлозно-бумажного производства», «Технология лесохимических производств и
биологически активных веществ» / Э. И. Федорова. – Сыктывкар : СЛИ, 2000. – 156 с.
4. Заварзин, Г. А. Введение в природоведческую микробиологию [Текст] : учеб. пособие
для вузов / Г. А. Заварзин, Н. И. Колотилова. – М. : Изд-во Моск. ун-та, 2001. – 256 с.
5. Гусев, М. В. Микробиология [Текст] : учебник для студ. вузов, обуч. по напр. 510600
«Биология» и биол. спец. / М. В. Гусев, Л. А. Минеева. – М. : Изд-во Моск. ун-та,
2003. – 448 с.
30