Изучение генетической предрасположенности к глюкокортикоид

Чучалин А.Г., Баранова И.А., Москаленко М.В., Путилин А.М., Асеев М.В.,
Иващенко Т.Э., Дёмин Н.В., Гораб Д.Н. Изучение генетической предрасположенности к глюкокортикоидиндуцированному остеопорозу у больных тяжёлой бронхиальной астмой
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ
К ГЛЮКОКОРТИКОИД-ИНДУЦИРОВАННОМУ ОСТЕОПОРОЗУ
У БОЛЬНЫХ ТЯЖЁЛОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
А.Г. Чучалин, И.А. Баранова, М.В. Москаленко, А.М. Путилин,
М.В. Асеев, Т.Э. Иващенко, Н.В. Дёмин, Д.Н. Гораб
Кафедра госпитальной терапии педиатрического факультета
ГОУ ВПО РГМУ Росздрава
(зав. кафедрой – акад. РАМН проф. А.Г. Чучалин)
ФГУ НИИ пульмонологии Росздрава, Москва
(директор НИИ – акад. РАМН проф. А.Г. Чучалин)
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург
(директор НИИ – акад. РАМН проф. Э.К. Айламазян)
НИИ ревматологии РАМН, Москва
(директор НИИ – чл.-кор. РАМН проф. Е.Л. Насонов)
Остеопороз является полигенным, мультифакториальным заболеванием, в развитии которого играют роль как генетические, так и средовые факторы с преимущественным преобладанием первых. Согласно обобщенным данным
эпидемических исследований, роль внешних
факторов в развитии остеопороза составляет
около 15–25%, тогда как на долю генетических
причин заболевания приходится 75–85% [1].
При
глюкокортикоид-индуцированном
(ГИ) остеопорозе нивелируется значение многих известных факторов риска. Он развивается у
людей любого возраста и пола. Попытка определить минимальную («пороговую») дозу системных глюкокортикоидов (CГК), при превышении
которой возрастает риск развития переломов и
требуются неотложные диагностические и лечебные мероприятия, не увенчалась успехом. В
большинстве ранее опубликованных данных и
рекомендаций такой пороговой дозой считалась
7,5 мг/сут. и выше в преднизолоновом эквиваленте. Дальнейшие исследования показали, что
дозы менее 7,5 мг/сут. также приводят к высокому риску развития переломов [4]. Таким образом,
исчезло представление о безопасных дозах СГК.
Оценка риска переломов стала обязательной для
всех больных, принимающих эти препараты. К
сожалению, в последние годы появились данные
о том, что применение ингаляционных глюко-
кортикоидов также сопровождается снижением
минеральной плотности костной ткани (МПКТ)
[4], у пациентов пожилого и старческого возраста отмечено увеличение относительного риска
развития остеопоротических переломов [6, 8].
Известно, что низкие показатели МПКТ
являются одним из наиболее важных факторов
риска развития остеопоротических переломов.
Согласно рекомендациям ВОЗ, разработанным первоначально для постменопаузального,
а в последующем перенесенным на остеопороз
других этиологий, критическим уровнем, сигнализирующим о высоком риске развития переломов, является –2,5 SD по критерию Т [9]. Однако переломы при ГИ остеопорозе происходят
при более высоких показателях МПКТ, чем при
постменопаузальном. Учитывая это, в современных рекомендациях по ГИ остеопорозу пороговое значение МПКТ, требующее проведения
лечебных мероприятий, увеличено до –1,5 SD и
даже до –1 SD [4]. При этом подчеркивается, что
риск переломов при использовании СГК значительно выше, чем можно было бы ожидать при
измерении МПКТ [4].
Отсутствие четких рекомендаций для оценки риска развития ГИ остеопороза заставляет искать новые маркеры диагностики, в том числе и
генетические. Одним из перспективных направлений является анализ ассоциаций полиморфиз-
39
Вестник РГМУ, 2006, №4 /51/
ма «кандидатных» генов метаболизма костной
ткани с показателями МПКТ, с риском возникновения переломов и развитием остеопороза.
Целью настоящей работы является изучение ассоциации аллелей гена рецептора витамина D (VDR), гена коллагена I типа (Col1a1) с
показателями минеральной плотности костной
ткани и развитием переломов осевого и периферического скелета у больных тяжелой бронхиальной астмой, длительно принимающих СГК.
Пациенты и методы исследования. В исследование вошли 72 пациента в возрасте от 25
до 50 лет, обоего пола (женщины в пременопаузе), страдающие тяжелой бронхиальной астмой
[1], принимавшие СГК не менее 6 мес. Пациенты ранее не получали лекарственных препаратов
для лечения остеопороза.
Критериями исключения из исследования
явились наличие у пациентов патологии органов
дыхания, отличной от бронхиальной астмы, наличие заболеваний и состояний, вызывающих
развитие вторичного остеопороза другой этиологии, наличие у пациенток беременности или
лактации во время обследования, отсутствие согласия на участие в исследовании.
Анкетирование проводилось для отбора больных и оценки факторов, влияющих на
МПКТ и риск развития переломов. В перечень
вопросов вошли следующие пункты: возраст,
наличие сопутствующих заболеваний и состояний, гинекологический статус женщины, курение, степень физической активности, возраст
начала заболевания бронхиальной астмой и ее
длительность, длительность приема СГК, суточная и кумулятивная доза СГК, переломы на
фоне приема СГК. Учитывались только переломы, произошедшие без видимых причин или
при воздействии минимальной нагрузки (падение с высоты, не превышающей собственный
рост, неловкое движение). Был измерен рост и
вес пациента, оценен индекс массы тела. Суточное потребление кальция с продуктами питания
рассчитывалось по дневнику пациента в соответствии с диетическими таблицами [3].
Измерение МПКТ. Использовался метод
двуэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (аппарат «Hologic QDR-4500A»). МПКТ
(г/см2, Т- и Z-критерии) была оценена в поясничном отделе позвоночника (L1 – L4), проксимальном отделе бедра в целом и в его двух точках
40
(шейка бедра и большой вертел). Согласно рекомендациям ВОЗ, снижение МПКТ на 1–2,5 стандартных отклонения (SD) от пиковой костной
массы (Т-критерий) соответствует остеопении,
более чем на 2,5 SD – остеопорозу, а наличие
при этом одного и более переломов осевого или
центрального скелета соответствует тяжелому
остеопорозу [9].
Рентгенография. Всем больным проводилось классическое рентгенологическое исследование позвоночника в двух проекциях для обнаружения осложнений остеопороза и проведения
дифференциальной диагностики остеопороза
с различными патологическими состояниями,
способными приводить к снижению содержания
минеральных веществ в костной ткани.
Молекулярно-генетический анализ. Методом ПДРФ анализа (анализа полиморфизма
длин рестрикционных фрагментов) изучены Т→
С полиморфизм (TaqI полиморфизм) в экзоне 9
гена рецептора витамина D (VDR) и G→Т полиморфизм (Sp1 полиморфизм) в регуляторной
области гена Сol1а1 (1 интрон) в сайте узнавания фактора транскрипции Sp1. Амплификацию
изучаемых участков генов проводили согласно
предложенным условиям в работе [6]. Для амплификации использовали термоциклер фирмы
«Perkin Elmer Cetus» (США). Качество амплификации оценивали по результатам электрофореза в 7% полиакриламидном геле. Продукты
амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции: АраI
– для гена Col1a1 (полученные фрагменты 255
п.о. = 235 п.о. + 20 п.о.), TaqI – для гена VDR
(полученные фрагменты 360 п.о. = 248 п.о. +
112 п.о.). Расщепление ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя (ООО
«СибЭнзим», г. Новосибирск). Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза
в 6% полиакриламидном геле с последующей
окраской этидиумбромидом и визуализацией в
проходящем УФ свете, при этом аллель S гена
Col1a1 соответствует наличию сайта рестрикции для эндонуклеазы ApaI, аллель s – его отсутствию, а аллель t гена VDR соответствует наличию сайта рестрикции для эндонуклеазы TaqI,
аллель Т – его отсутствию.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась при помощи
методов непараметрической статистики с ис-
Чучалин А.Г., Баранова И.А., Москаленко М.В., Путилин А.М., Асеев М.В.,
Иващенко Т.Э., Дёмин Н.В., Гораб Д.Н. Изучение генетической предрасположенности к глюкокортикоидиндуцированному остеопорозу у больных тяжёлой бронхиальной астмой
пользованием пакета прикладных программ
Statistica 6. Мерой центральной тенденции и
рассеяния служила медиана/интерквартильный
размах. Для оценки различий категориальных
переменных в подгруппах использовался χ2. При
сравнении средних значений или медиан в двух
независимых группах применялся критерий
Манна – Уитни, в трех независимых группах
– ANOVA по Краскелу – Уоллису.
Результаты исследования. Обследовано
72 пациента (19 мужчин и 53 женщины) в возрасте 42/12 лет. Длительность заболевания составила 14,5/13,3 года, суточная доза СГК – 10/10
мг/сут., длительность приема СГК – 6,0/6,8 года,
кумулятивная доза – 21,9/40,8 г.
Анализ Sp1 полиморфизма Col1a1 гена не
выявил ассоциацию между генотипами по данному гену (SS – 49 пациентов, Ss – 21, ss – 2) и
показателями МПКТ, частотой переломов. Статистически значимые результаты были получены только при исследовании TaqI полиморфизма
гена VDR. После проведения молекулярно-генетических исследований пациенты были распределены в соответствии с генотипом по гену VDR
на группы: 29 пациентов явились носителями
генотипа ТТ, 31 – Tt и 12 – tt. В группе пациентов
с генотипом TT максимальное число больных
имели нормальные значения МПКТ, у большинства пациентов с генотипом Tt диагностирована
остеопения, а у пациентов с генотипом tt – остеопороз (χ2=0,004) (рис.1). При сравнении показателей МПКТ поясничного отдела позвоночника,
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
шейки бедра, области большого вертела и проксимального отдела бедренной кости в целом с
поправкой на возраст, пол, индекс массы тела,
кумулятивную дозу СГК, суточное потребление
кальция с продуктами питания выявлены статистически значимые различия между тремя группами (p<0,05). Пациенты с tt генотипом имели
более низкую МПКТ по сравнению с носителями генотипа Tt или TT (p<0,05). МПКТ больных
– носителей генотипов TT и Tt – не различалась.
Максимальное число случаев переломов осевого и периферического скелета имели больные с
генотипом tt, в меньшей степени – с генотипом
Tt (рис. 2), различия между группами статистически достоверны (χ2=0,001).
Обсуждение. Интерес к исследованию
Sp1 полиморфизма гена Col1a1 у больных, принимающих глюкокортикоиды (ГК), не случаен. Наиболее важным эффектом ГК является
подавление костного формирования, которое
включает несколько механизмов и в том числе
модуляцию транскрипции генов, ответственных
за синтез остеобластами компонентов костного
матрикса, основным белком которого является
коллаген I типа [4]. При поиске в информационных системах нами не обнаружены данные об
исследовании гена Сol1а1 при ГИ остеопорозе.
Результаты собственного анализа не выявили
ассоциацию аллелей Sp1 полиморфизма гена
Col1a1 с МПКТ и частотой переломов. Возможно, из-за средней выраженности эффекта данного полиморфизма на костный метаболизм его
остеопороз
остеопения
норма
TT
Tt
tt
Рис. 1. Распределение пациентов с нормальной МПКТ, остеопенией и остеопорозом
в зависимости от их генотипа (TT, Tt или tt).
41
Вестник РГМУ, 2006, №4 /51/
100%
80%
60%
переломы
норма
40%
20%
0%
TT
Tt
tt
Рис. 2. Распределение пациентов с переломами осевого и периферического скелета и без
переломов в зависимости от их генотипа (TT, Tt или tt).
взаимосвязь с костными фенотипами может легко искажаться или даже маскироваться такими
факторами, как раса, возраст, эстрогеновый статус и питание. Следовательно, предсказательная
сила анализа Sp1 полиморфизма в развитии ГИ
остеопороза и переломов в действительности
может быть ограниченной.
В патогенезе ГИ остеопороза значительную
роль играет нарушение абсорбции кальция в кишечнике, обусловленное как снижением образования в печени 25–(ОН)D3, так и замедленным
превращением его в кальцитриол из-за торможения активности 1α-гидроксилазы почек. Кроме того, ГК нарушают экспрессию рецепторов
витамина D, связывание с ними кальцитриола и
другие их функции [2]. Поскольку полиморфизм
гена VDR может быть ассоциирован с МПКТ и
абсорбцией кальция в кишечнике, несомненно,
возникает вопрос, может ли пациент с определенным генотипом VDR иметь повышенный
или пониженный риск развития остеопороза.
Попытки исследовать ассоциацию генотипов VDR и МПКТ у пациентов, принимающих CГК, предпринимались и ранее. В 1999 г.
Y.V.Ho et al. описали результаты исследования
193 женщин (150 – в пременопаузе, 43 – в постменопаузе) и 70 мужчин австралийской когорты, страдавших ревматоидным артритом, обструктивными заболеваниями легких и другими заболеваниями, в лечении которых используются CГК [5]. Кумулятивная доза составила
>1,8 г/год в преднизолоновом эквиваленте.
Авторами не выявлено значительной разницы МПКТ поясничного отдела позвоночника
и проксимального отдела бедренной кости у
42
больных с различными VDR-генотипами (варианты BsmI- и TaqI-фрагментов рестрикции).
Результаты второго исследования были опубликованы Y. Li et al. в 2002 г. [7]. Ассоциация
BsmI полиморфизма гена VDR с МПКТ оценена у 71 больного ревматическими заболеваниями, длительно принимавших СГК. Группы не
различались по возрасту, полу, длительности и
форме заболевания, длительности приема СГК
и их кумулятивной дозе. Несмотря на то что
показатели МПКТ не были одинаковы у больных с различными генотипами, статистических
различий не было выявлено.
В отличие от данных работ наше исследование было проведено со строгим ограничением
возрастных рамок (больные до 50 лет, женщины
в пременопаузе). Кроме бронхиальной астмы,
пациенты не имели иных заболеваний и состояний, которые могли бы привести к развитию вторичного остеопороза другой этиологии и таким
образом повлиять на результаты исследования.
В исследование были включены пациенты обоих полов, поскольку развитию ГИ остеопороза
подвержены как мужчины, так и женщины. При
сравнении пациентов с различными генотипами
выяснилось, что носители генотипа tt по гену
VDR имели наиболее низкую МПКТ и чаще
переносили переломы, чем больные с генотипами TT и Tt. Мы не смогли проследить изменения
МПКТ в динамике, поскольку всем больным,
принимавшим СГК, должны быть назначены
профилактические и лечебные мероприятия, которые, безусловно, влияют на показатели МПКТ.
На данный момент полученные результаты имеют значение при идентификации паци-
Чучалин А.Г., Баранова И.А., Москаленко М.В., Путилин А.М., Асеев М.В.,
Иващенко Т.Э., Дёмин Н.В., Гораб Д.Н. Изучение генетической предрасположенности к глюкокортикоидиндуцированному остеопорозу у больных тяжёлой бронхиальной астмой
ентов высокого риска развития остеопороза, не
только принимающих СГК. Данный вид лечения в последнее время назначается как «терапия отчаяния» при тяжелом течении бронхиальной астмы. В связи с увеличением числа
сообщений о влиянии ингаляционных ГК на
уровень МПКТ, исследование полиморфизма
гена VDR, возможно, позволит выявить группу
высокого риска среди больных, принимающих
эти препараты. Вероятно, что таким больным
потребуется не только подбор рациональной
терапии бронхиальной астмы, но и своевременное назначение препаратов для профилактики
остеопороза в совокупности с мероприятиями
динамического наблюдения. Нет сомнения в
том, что дальнейшие молекулярно-генетические исследования других генов метаболизма
костной ткани у пациентов с ГИ остеопорозом
дадут возможность получить более объективную информацию о природе и механизмах действия наследственных и экзогенных факторов,
определяющих предрасположенность к развитию остеопороза.
Таким образом, у больных, длительно принимающих системные глюкокортикостероиды
по поводу тяжелой бронхиальной астмы, выявлена достоверная ассоциация МПКТ и риска
развития переломов с генотипами по гену VDR.
У больных с низкими значениями МПКТ и высоким риском переломов выявлена ассоциация с
функционально неполноценным генотипом tt и
аллелью t гена VDR.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мякоткин В.А., Беневоленская Л.И. Генетические аспекты остеопороза. – В кн.:
Руководство по остеопорозу. – М.: Бином,
2003. – С. 105–130.
2. Рожинская Л.Я. Кальций и витамин D в
профилактике и лечении остеопороза. –
В кн.: Руководство по остеопорозу. – М.:
Бином, 2003. – С. 261–287.
3. Химический состав пищевых продуктов /
Под ред. А.А. Покровского. – М.: Медицина, 1976.
4. Glucocorticoid-induced osteoporosis: guidelines for prevention and treatment. – London:
Royal College of Physicians, 2002.
5. Ho Y.V., Briganti E.M., Duan Y. et al. // Osteoporos. Int. – 1999. – V. 9. – №2. – Р. 134–
138.
6. Hubbard R.B., Smith C.J.P., Smeeth L. et al.
// Resp. Crit. Care Med. – 2002. – V.166. –
Р. 1563–1566.
7. Li Y., Xu L., Shen L., Chen L. //J. Huazhong.
Univ. Technolog. Med. Sci. – 2002. – V. 22.
– № 4. – Р. 317–323.
8. Suissa S., Baltzan M., Kremer R., Ernst P.
//Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2004. –
V.169. – №1. – P. 83–88.
9. WHO Study Group «Assesment of fracture
risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis». – Geneva: World
Health Organization, 1994.
STUDY OF GLUCOCORTICOID-INDUCED OSTEOPOROSIS PREDISPOSITION
IN PATIENTS WITH SEVERE ASTHMA
A.G. Chuchalin, I.A. Baranova, M.V. Moskalenko, А.М. Putilin,
M.V. Aseev, T.E. Ivaschenko, N.V. Demin, D.N. Gorab
Department of hospital therapy of pediatric faculty, RSMU
Pulmonology Research Institute, Moscow
Ott’s Institute of Obstetrics and Gynecology RAMS, St-Petersburg
Institute of Rheumatology, Moscow
For estimation of prognosis of glucocorticoid-induced osteoporosis development it is possible to use genetic testing. This work is devoted to study of association of TaqI polymorphism of the vitamin D receptor (VDR) gene, Sp1
polymorphism of the collagen type I α1 gene with BMD parameters and the development of vertebral and non-vertebral
fractures in patients with severe asthma who were treated by long-term systemic glucocorticoid therapy (SGC).
Studies of Co1la1 gene did not reveal significant association between any genotypes, different parameters of BMD
and bone fractures. Patients with tt genotype VDR gene had lower BMD and more often fractures as compared to careers
of TT and Tt genotypes (p<0,001) independently from age, BMI, cumulative doses od SGC and dietary calcium intake.
We suggest that VDR gene polymorphism testing will improve possibilities for identification of patients with greater risk
of glucocorticoid-induced osteoporosis development.
43