диссертация (размещена 16.10.2015)
advertisement
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» На правах рукописи Шатских Оксана Алексеевна МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТИМУСА В УСЛОВИЯХ ПОСТУПЛЕНИЯ МЕЛАТОНИНА Специальность 03.03.04. – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Сергеева В. Е. Чебоксары – 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ Введение ………………………………………………………………………… 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………..... 12 1.1. Современные представления о структуре и функциях тимуса.................. 12 1.1.1. Гуморальная регуляция функционирования тимуса……………… 22 1.1.2. Клеточный состав тимуса и нейромедиаторные биогенные амины ………………………………………………………………………. 24 1.2. Роль мелатонина в организме………………………………………..……. 28 1.2.1. Физиологическая роль мелатонина……………………….…..….... 28 1.2.2. Применение мелатонина в клинической практике……………...... 32 1.2.3. Иммуномодулирующее действие мелатонина ………….....……… 33 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ……………........... 38 2.1. Организация эксперимента …………………………………………... 38 2.2. Гистологические методы исследования ………………………………... 40 2.3. Люминесцентно-гистохимические методы исследования ……........ 40 2.4. Иммуногистохимические методы исследования ……………………… 42 2.5. Метод морфометрии ……………………..…………………………….. 43 2.6. Математические методы исследования ………………………………... 43 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ …………. 45 Структурно-функциональное состояние тимуса мышей при поступлении мелатонина в различных световых условиях ...........…………………………. 45 3.1. Морфологическая характеристика тимуса ………………….…………… 45 3.2. CD1а-позитивные клетки тимуса ………………………………………… 51 3.3. CD3-позитивные клетки тимуса …………………………………………. 54 3.4. CD57-позитивные клетки тимуса ………………………………………… 59 3.5. CD68-позитивные клетки тимуса ………………………………………… 63 3 3.6. Тучные клетки тимуса ……………………………………………….......... 68 3.7. Морфофункциональная реакция биоаминсодержащих структур тимуса экспериментальных животных…………………………………………………. 80 3.7.1. Гистаминсодержащие клетки тимуса …………………………………... 81 3.7.2. Серотонинсодержащие клетки тимуса …………………………………. 88 3.7.3. Катехоламинсодержащие клетки тимуса ………………………………. 95 3.7.4. Взаимосвязь биогенных аминов в клетках тимуса экспериментальных мышей…………………………………………………….. 99 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ……………………….. 109 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………. 121 ВЫВОДЫ ……………………………………………………………………….. 123 РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………………………………… 125 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ …………………………………………………….. 126 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………………………… 127 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА ………………………....... 168 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования В последние годы в связи с увеличением количества различных видов патологий, связанных с недостаточно эффективной работой иммунной системы человека ввиду ухудшения экологии, стрессовых воздействий, алиментарных причин [32, 106, 144], к центральным органам иммунной защиты приковано внимание исследователей [156, 199]. В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы, связанные с функционированием тимуса. Актуальность любых исследований этого органа обусловлена, как высокой встречаемостью разных видов патологий, связанных с разнообразными нарушениями работы тимуса [53], так и явной недостаточностью изученности клеточных основ различных нарушений в вилочковой железе. Одним из наименее исследованных аспектов функционирования тимуса является гуморальная регуляция деятельности различных клеток этого органа. Несмотря на кажущуюся хорошую изученность действия различных регуляторных факторов на вилочковую железу, эта проблема далека от разрешения. Тимус изучали при воздействии ряда гормонов: соматотропного [81], адренокортикотропного [62], глюкокортикостероидов [38], хорионического гонадотропина [95, 96], вместе с тем влияние одного из важнейших гуморальных факторов организма – мелатонина – на различные клеточные типы тимуса практически не исследовано. На сегодняшний день мелатонин находит всё более широкое применение в клинике, как адаптоген при смене часовых поясов, при инсомнии [65, 210], в терапии патологии сердечно-сосудистой системы [211] и желудочно-кишечного тракта [17], климактерического синдрома [5], дегенеративных заболеваний 5 нервной системы [309], а также вводится в схемы противоопухолевого лечения при некоторых видах рака [80]. Широкое клиническое применение мелатонина требует детального изучения всех его биологических функций, особенно эффектов на различные органы иммунной системы, тем более, что в некоторых клетках тимуса, селезенки, костного мозга и лимфатических узлов обнаружены рецепторы к мелатонину [146]. В ряде работ показано модулирующее и синхронизирующее влияние мелатонина на деятельность Т-лимфоцитов in vivo и in vitro в культуре клеток и в тимусе [59, 60, 141, 236, 293], однако влияние мелатонина на различные структурно-функциональные характеристики тимуса мало изучено. В создании микроокружения лимфоцитов тимуса важное место занимают NK-клетки, макрофаги и тучные клетки [12, 18, 196]. Уже известно, что экзогенный мелатонин увеличивает количество NK-клеток и моноцитов, как в костном мозге, так и в селезенке [158], однако таких данных для тимуса в литературе нам не встретилось. В работе Ozkanlar S. с соавт. (2015) показано снижение количества положительных на эстеразу тучных клеток в тимусе у крыс после введения мелатонина. Вместе с тем мы не обнаружили данные о том, как изменяются различные характеристики тучных клеток в тимусе при введении этого эпифизарного гормона. Недостаточная изученность различных типов клеток в тимусе во многом обусловлена низкой информативностью классических морфологических подходов, но методы иммуногистохимии позволяют корректно их идентифицировать. Так, для выявления кортикальных (дубль-позитивных) тимоцитов используется маркер CD1a [45], макрофагов – CD68 [338], натуральных киллеров – CD57 [246, 314]. Высокоспецифичным маркером Тлимфоцитов является CD3 антиген, мембранное его расположение характерно для зрелых Т-лимфоцитов, а цитоплазматическая локализация – для незрелых тимоцитов [51]. Биогенные амины, такие как гистамин, серотонин и катехоламины, также играют важную роль в процессах функционарования любых клеток [36, 77, 115, 184, 285]. Изменение содержания биогенных аминов в люминесцирующих 6 клетках тимуса напрямую связано с модуляцией их функций в иммунных реакциях [66], Так, например, избыточное содержание гистамина и серотонина подавляет функции Т-лимфоцитов [62, 129]. Поэтому изучение изменений содержания биогенных аминов в структурах тимуса под действием мелатонина представляет несомненный интерес, ввиду того, что возможная роль влияния эпифизарного гормона на их содержание и секрецию клетками тимуса не исследована. Характер освещения напрямую связан с работой эпифиза, и также оказывает влияние на состояние иммунной системы. Так, в ряде работ показано угнетающее действие постоянного освещения на иммунокомпетентные клетки [19, 58], ввиду подавления в организме синтеза мелатонина. Пребывание в постоянной темноте индуцирует эпифизарную гиперфункцию [13, 341]. Однако возможное влияние световой депривации на структурно-функциональные характеристики тимуса практически не изучено [258]. В связи с этим изучение влияния мелатонина на тимус при различных режимах освещения является важным и актуальным в практическом и теоретическом аспектах. Цель работы Изучить морфологическую и иммуногистохимическую характеристику тимуса лабораторных мышей при поступлении мелатонина с питьевой водой в течение двух или четырех недель в зависимости от условий освещения. Задачи исследования 1. Изучить морфометрические характеристики тимуса: площади коркового и мозгового веществ дольки при ежедневном поступлении мелатонина с питьевой водой в концентрации 4 мг/литр в течение двух или четырех недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения. 7 2. Исследовать количественное распределение CD1а-позитивных, CD3- позитивных клеток во всех зонах долек в тимусе мышей в моделируемых условиях эксперимента. 3. Определить особенности локализации и количественного распределения CD57-позитивных и CD68-позитивных клеток во всех зонах долек в тимусе животных, получавших мелатонин в различных световых условиях в течение двух или четырех недель. 4. Сравнить количество тучных клеток, степень их метахромазии и дегрануляции в соединительнотканных корковых перегородках и паренхиме тимуса мышей при поступлении мелатонина в течение двух или четырех недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения. 5. Исследовать содержание биогенных аминов (гистамина, серотонина и катехоламинов) в структурах тимусной дольки лабораторных мышей в моделируемых условиях эксперимента. Научная новизна Впервые выявлено, что мелатонин, поступающий ежедневно с питьевой водой в концентрации 4 мг/литр в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения оказывает иммуномодулирующее действие на тимус, сопровождающееся уменьшением площади коркового вещества и увеличением площади мозгового вещества долек, увеличением количества макрофагов и натуральных киллеров в корковом и мозговом веществе долек тимуса. При этом изменения количественных показателей натуральных киллеров более выражены в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, а макрофагов – в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения. Показано, что CD3-позитивные клетки чувствительны, а CD1а-позитивные клетки резистентны к ежедневному поступлению мелатонина в течение 2 или 4 недель в концентрации 4 мг/литр независимо от условий освещения. 8 Установлено, что количество тучных клеток в соединительнотканных корковых перегородках и паренхиме тимуса под влиянием мелатонина увеличивается, что сопровождается увеличением доли тучных клеток без признаков дегрануляции, и эти изменения более выражены в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянной темноты. Выявлено, что при поступлении мелатонина независимо от длительности и условий освещения происходит снижение содержания гистамина в биоаминсодержащих клетках дольки, и эти изменения носят более выраженный характер в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение месяца. Содержание серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках долек после 4 недель поступления мелатонина увеличивается в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения, и снижается – в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения. Впервые показано, что в условиях поступления экзогенного мелатонина большую чувствительность к постоянному затемнению проявляют в тимусе макрофаги, NK-клетки и тучные клетки, но не Т-лимфоциты. Теоретическое и практическое значение Результаты проведенных исследований – один из примеров эндокринной регуляции нейроиммунных взаимодействий в тимусе. Они демонстрируют ответную реакцию иммунокомпетентных клеток при непосредственном участии нейромедиаторных биогенных аминов на экзогенный мелатонин, что позволяет расширить представления о роли гормона в деятельности иммунной системы. Выводы и научные положения диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе вузов медико-биологического профиля при изучении дисциплин «Гистология», «Иммунология», «Эндокринология». Полученные результаты относятся к области фундаментальных исследований и расширяют представления о закономерностях нейрогуморального обеспечения иммунного гомеостаза. Это может быть учтено при создании 9 методов моделирования иммунного ответа с применением гормонов, в частности мелатонина. Реализация результатов исследования Научные положения, выводы и фотоматериалы диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова», в работе бюджетного учреждения «Республиканская клиническая больница» МЗСР ЧР, автономного учреждения Чувашской Республики «Институт усовершенствования врачей» МЗСР ЧР. Степень достоверности и апробация результатов Для обработки (гистологические полученного препараты, в цифровые ходе эксперимента данные) было материала использовано сертифицированное оборудование. Клеточные маркеры CD1a, CD3, CD57, CD68 широко используются в клинике. Достоверность полученных результатов в ходе исследования была обеспечена с помощью подбора адекватных иммуногистохимических и люминесцентно-гистохимических методов, последующей статистической обработки. Основные научные положения, выводы и результаты доложены и обсуждены на 8-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Москва, 2011), Всероссийском молодежном научного семинаре «Наука и инновации – 2012» (Йошкар-Ола, 2012), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Морфология в теории и практике», посвященной 90-летию со дня рождения Д. С. Гордон (Чебоксары, 2012), 86–й Всероссийской научной конференции памяти академика АН РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 2012), XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Дубай, 2012), V Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2013» (СанктПетербург, 2013), Научно-практической конференции, посвященной 40-летию 10 кафедры патофизиологии «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Чебоксары, 2014), Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Современные проблемы естественно-научных исследований» (Чебоксары, 2014), 89-й Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2015), Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 2015). Научные положения, выносимые на защиту 1. Поступление мелатонина в организм лабораторных мышей в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения приводит к снижению площади коркового вещества и увеличению площади мозгового вещества долек тимуса. Одновременно наблюдается уменьшение численности CD3-позитивных клеток и увеличение количества макрофагов, натуральных киллеров в корковом веществе долек тимуса; уменьшение количества CD3-позитивных клеток и увеличение количества макрофагов, натуральных киллеров в мозговом веществе долек тимуса, что сопровождается снижением содержания гистамина в люминесцирующих клетках долек и увеличением количества тучных клеток без признаков дегрануляции в тимусе. 2. В условиях поступления экзогенного мелатонина большая зависимость от световых условий в тимусе проявляется в содержании макрофагов, тучных клеток и натуральных киллеров, но не Т-лимфоцитов. Публикации Основные положения диссертации отражены в 12 опубликованных работах, 8 из них (3 статьи и 5 публикаций с тезисами докладов) – в центральных периодических журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. 11 Структура и объем диссертации Диссертационный материал изложен на 172 страницах компьютерного исполнения и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы, списка сокращений, списка иллюстративного материала. Работа включает 10 таблиц и 40 рисунков, из которых 20 – диаграммы и 20 – микрофотографии. Список литературы содержит 101 отечественный и 268 иностранных источников. Личное участие автора Автором лично осуществлялся выбор экспериментальных животных, разработка схемы эксперимента, условий и сроков воздействия, дозировки мелатонина, выведение животных из эксперимента, приготовление криостатных срезов, постановка люминесцентно-гистохимических реакций по методам Кросса, Эвена, Роста и Фалька-Хилларпа, цитоспектрофлуориметрия, выбор иммуногистохимических маркеров, микроскопия препаратов, фотографирование, статистическая обработка данных. Написание глав диссертационного исследования, подготовка материалов к публикации проводились автором самостоятельно. 12 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Современные представления о структуре и функциях тимуса Тимус – центральный орган лимфопоэза и иммуногенеза. В нем осуществляется антигеннезависимая дифференцировка клеток в Т-лимфоциты из костномозговых реакции предшественников, клеточного иммунитета разновидности и регулируют которых обеспечивают реакции гуморального иммунитета, в связи с чем находятся на ключевых позициях в иммунных реакциях. [75, 99, 160, 262, 368]. Тимус находится в переднем средостении и состоит из двух ассиметричных долей, разделенных не полностью на дольки. Топография и строение тимуса сходны у большинства млекопитающих и человека, в том числе у мышей и человека [29, 88]. Снаружи тимус покрыт соединительнотканной капсулой. От нее внутрь органа отходят перегородки, которые делят железу на дольки. В каждой дольке выделяют корковое и мозговое вещество [18]. В основе органа находится эпителиальная ткань, состоящая из отростчатых клеток (эпителиоретикулоцитов) и клеток моноцитарного происхождения, между которыми лежат дифференцирующиеся Т-лимфоциты. Для всех эпителиоретикулоцитов свойственно наличие десмосом, тонофиламентов и белков кератинов, продуктов главного комплекса гистосовместимости на своих мембранах. Периферические части долек гуще заполнены лимфоцитами и образуют корковое вещество. Центральные части долек имеют меньшее количество лимфоцитов – это мозговое вещество долек органа. Стромальные клетки. Основа коркового и мозгового вещества долек представлена отростчатыми эпителиоретикулоцитами. Эпителиоциты формируют трехмерную сеть, которая образует каркас органа, секретируют ряд биологически активных веществ: цитокины, тимические гормоны, молекулы компонентов 13 экстрацеллюлярного матрикса, синтезируют и презентируют тканеспецифические антигены [6, 100, 110, 160, 267, 319]. На мембранах эпителиоретикулоцитов присутствуют антигены главного комплекса гистосовместимости MHC-I и MHCII. По ультрамикроскопическим признакам выделяют 6 типов эпителиальных клеток: I тип – клетки располагаются под капсулой, ограничивают перегородки и периваскулярные пространства капилляров коркового вещества; клетки типа II и III типы – занимают наружную и внутреннюю кортикальную зоны; IV тип – формируют кортико-медуллярную зону; V тип – представляют собой неспециализированные эпителиальные клетки мозгового вещества долек; VI тип – формируют основную популяцию клеток мозгового вещества и участвуют в образовании телец Гассаля [21, 90]. На основе результатов иммуногистохимических исследований [18, 209] разделяют четыре основных типа эпителиальных клеток: субкапсулярные (парасептальные, периваскулярные), кортикальные, медуллярные и клетки телец Гассаля. Ucar A. с соавт. (2014) выделяют две основные субпопуляции тимусных эпителиальных клеток: кортикальные и медуллярные. Общепринято разделение тимуса на следующие структурно- функциональные зоны: 1) субкапсулярная зона, где проходит пролиферация и дифференцировка предшественников Т-лимфоцитов; 2) внутренняя кортикальная зона, где происходит созревание и дальнейшая антигеннезависимая дифференцировка Т-лимфоцитов; 3) мозговое вещество долек, в котором лежат рециркулирующие зрелые Тлимфоциты; 4) внутридольковые периваскулярные пространства коркового и мозгового вещества [90, 113, 149, 212, 226]. Субкапсулярная зона. Субкапсулярная зона находится непосредственно под базальной мембраной долек и составляет примерно 1/4 часть ширины коркового вещества долек. Зона состоит из сети светлых эпителиальных клеток, в 14 ячейках которых лежат лимфоидные клетки, представленные пре-Т-лимфоцитами (ранними тимоцитами) и лимфобластами, а также немногочисленные макрофаги. В данной зоне различают следующие клетки: крупные эпителиальные клетки, которые участвуют в формировании гемато-тимического барьера [23], клетки «няньки», которые впервые выделены из коры тимуса мыши и описаны Wekerle H., Ketelson V. (1980). Позднее эти клетки были найдены и в тимусе человека [303], крыс, свиней, овец, лягушек и кур [287]. Клетки-«няньки» характеризуются более крупными размерами, у них может содержаться в цитоплазме от 50 до 200 лимфоцитов [205, 288], из которых 30 – 50% находятся в фазе митоза. Эпителиальные клетки субкапсулярной зоны тимуса содержат тимусные гормоны, экспрессируют цитокератин, нейрофилин-1, слабо экспрессируют или вообще не экспрессируют антигены главного комплекса гистосовместимости [18, 231, 237]. Около 95% лимфоцитов тимуса находятся в корковом веществе долек. Это физиологически незрелые клетки, которые слабо рециркулируют, малоподвижны и имеют способность к активации митогенами [99]. Лимфоциты субкапсулярной зоны составляют 0,5 – 5% всего пула тимоцитов. Это первые мигранты из костного мозга – пре-Т-клетки – лимфобласты, которые имеют определенный набор поверхностных молекул, но лишены основных маркеров дифференцировки: CD4 и CD8. Отсюда идет их название – «двойные негативы» [92, 99]. Тимоцитарные бласты субкапсулярной области, которые находятся в тесном контакте с клетками-«няньками», активно делятся и заканчивают свой путь развития в данной зоне умеренной экспрессией корецепторов CD4 и CD8 и бета-цепи TCR [247]. CD1а – это мембранный гликопротеин, маркер кортикальных тимоцитов (70%), клеток Лангерганса кожи, незрелых дендритных клеток [39, 45, 51, 97, 138, 207, 244, 290]. CD1а маркер экспрессируется на большинстве CD4+CD8+ тимоцитов и небольшой части CD4-CD8+ и CD4+CD8- клеток. Так как этот маркер не присутствует на зрелых периферических Т-клетках, то, следовательно, CD1апозитивные тимоциты являются незрелыми [302]. Показано, что CD1а 15 презентирует антигены на клеточную поверхность для распознавания их Тклетками [194]. В дальнейшем тимоциты с фенотипом СD4+CD8+бетаTCR+ мигрируют во внутренний кортикальный слой. Факт прохождения положительной селекции в коре указывает дальнейшую дифференцировку на субпопуляции CD4+CD8- и CD4-CD8+, которая обеспечивается, в основном, на границе коркового и мозгового вещества долек под влиянием взаимодействия с дендритными клетками и макрофагами [193]. Здесь же идет и отрицательная селекция тимоцитов [330]. В процесса селекции тимоцитов также принимают участие натуральные киллеры [196]. NK-клетки несут на своей мембране маркеры CD16, CD56, CD57. CD57 (HNK-1) – мембранный антиген натуральных киллеров, рецептор адгезии, олигосахарид. Антиген экспрессируется на 60% NK-клеток, Т-клетках, 15 – 20% мононуклеаров периферической крови, некоторых В-лимфоцитах, клетках нейроэктодермального происхождения [51, 74, 246, 351]. CD57 является маркером терминальной дифференцировки NK-клеток [123, 246, 314, 356, 361, 365], что характеризуется снижением способности пролиферировать и вырабатывать γ-INF по сравнению с неэкспрессирующими данный антиген NK-клетками. CD57позитивные NK-клетки более чувствительны к стимуляции через CD16 рецепторы, но в меньшей степени реагируют на IL-12 и IL-18. Ввиду этого NKклетки, несущие CD57 маркер, продуцируют больше γ-INF при стимуляции CD16 рецепторов и при воздействии IL-2. Однако естественная цитотоксичность NKклеток в ходе терминальной дифференцировки существенно не меняется, и CD57позитивные NK-клетки являются более мощными эффекторами антителозависимой клеточной цитотоксичности, нежели не несущие данный антиген NK-клетки [147, 246]. Чувствительность к индуцированной активацией смерти клеток не отличается у CD57-позитивных и CD57-негативных NK-клеток [246]. В работе Sanno N. и др. (1997) указывается на возможность паракринной роли клеток, несущих NK-1 антиген. В результате прошедших дифференцировочных событий в медуллярной области скапливаются клетки с фенотипом CD4+CD8-TCR+ (T-хелперы) и CD4- 16 CD8+TCR+ (T-киллеры), часть из которых мигрирует в периферические органы иммуногенеза [55]. Внутренняя кортикальная зона. Эпителиальный остов внутренней кортикальной зоны представлен как светлыми, так и темными эпителиальными клетками, по своей ультраструктуре соответствующими III и IV типам по классификации Г. А. Галил-Оглы и соавт. (1988). Клеток-«нянек» в этой зоне нет. Темные клетки лежат ближе к мозговому веществу долек. Отростки клеток соединяются между собой и формируют широкопетлистую сеть, в ячейках которой находятся лимфоциты. При этом есть участки с относительно густой сетью эпителиальных клеток и участки, где эпителиальных клеток практически нет. Такие участки называют «резервуарами» для Т-лимфоцитов коркового вещества [171]. Эпителиальные клетки внутренней кортикальной зоны не содержат тимусных гормонов, слабо экспрессируют цитокератин и сильно экспрессируют антигены II класса МНС [18]. Большая часть лимфоцитов экспрессирует антигены CD2, CD7, CD1, CD4 и CD8 («двойные позитивные» CD4+ и CD8+), «двойные негативные» (CD4- и CD8-) лимфоциты, а также лимфоциты, характеристика которых сходна с характеристикой лимфоцитов субкапсулярной зоны, и зрелые лимфоциты с антигенами либо CD4 (Т-хелперы), либо CD8 (Т-киллеры). Эти зрелые лимфоциты в большинстве своем имеют хоминг-рецепторы для миграции в Тзависимые зоны периферических лимфоидных органов [98, 212, 297, 316]. Такие рецепторы экспрессируются у 1 – 3% Т-лимфоцитов тимуса, причем 70% из них – это зрелые лимфоциты внутренней кортикальной и медуллярной зон долек. Важной особенностью дифференцировки лимфоцитов в этой зоне является формирование у них Т-клеточного рецептора к антигену [108, 165]. Функциональное значение внутренней кортикальной зоны состоит в обеспечивании дифференцировки поступающих из субкапсулярной зоны ранних тимоцитов. Предполагается, что здесь происходит: 1) отбор и гибель аутоагрессивных Т-лимфоцитов; 2) отбор лимфоцитов, имеющих рецепторы к белкам MHC (позитивная селекция). Созревшие аутотолерантные лимфоциты 17 либо мигрируют в области кортико-медуллярной границы, либо переходят в мозговое вещество [212]. Новые генерации лимфоцитов образуются в тимусе каждые 6 – 9 часов. В экспериментах на мышах показано, что в сутки в тимус поступает 0, 01% от общего числа всех ее лимфоцитов, «рождается» в ней 30%, подвергается элиминации в коре путем апоптоза 29% и эмигрирует 1% [143, 315]. Так как тимус не имеет самообновляющейся популяции гемопоэтических клеток, ввиду этого тимопоэз быстро угнетается из-за отсутствия притока новых клетокпредшественников. L. Calderon и T. Boehm (2011) обнаружили, что основным механизмом, обеспечивающим миграцию клеток в орган, является хемотаксис, который опосредуется через хемокиновые рецепторы Cсr9, Ccr7 и Cxcr4. Макрофаги тимуса имеют костномозговое происхождение, одной из главных функций которых является элиминация поврежденных лимфоцитов. Макрофаги синтезируют IL-1, IL-6 и фактор некроза опухолей (ФНО), а также простагландины Е, ограничивающие процессы пролиферации в тимусе. Макрофаги тимуса представлены гетерогенной популяцей, которая отличается морфологически, фенотипически и по функциональным способностям. Иммунофенотипические исследования обнаруживают в тимусе ED1+ и ED2+ макрофаги. Первые являются активно фагоцитирующими, локализуются во всех зонах тимуса, демонстрируют высокую активность кислой фосфатазы и экспрессируют на поверхности антигены II класса МНС. Их функция сводится к утилизации лимфоцитов, погибающих в результате негативной селекции [335]. С другой стороны, эти клетки входят в систему гистосовместимости, могут презентировать тимоцитам антигены II класса МНС и, следовательно, принимать прямое участие в процессах позитивной и негативной селекции Т-лимфоцитов. ED2+ макрофаги являются нефагоцитирующими. Сигналом к пролиферативной активации Т-лимфоцитов является IL-1, который продуцируют макрофаги. Популяция ED2+ клеток может восполняться как за счет дифференцировки ED1+ клеток, так и за счет поступления циркулирующих моноцитов, которые мигрируют в тимус через посткапиллярные венулы и периваскулярные пространства [18]. 18 Широко распространенным в гистологии маркером для выявления макрофагов является антиген CD68 [131, 259]. CD68 (макросиалин) – скавенджеррецептор [272, 326], антиген клеток моноцитарно/макрофагальной линии, входит в семейство лизосом-ассоциированных мембранных гликопротеинов [114, 338]. Кортико-медуллярная зона. Кортико-медуллярная зона содержит клетки стромы костномозгового происхождения, в первую очередь дендритные клетки [128]. В данной зоне происходит выход лимфоцитов на периферию и в мозговое вещество. Дендритные клетки ответственны за Т-клеточную негативную селекцию [111, 249, 262]. Дендритные клетки представляют уникальную клеточную популяцию тимуса, которая экспрессирует молекулы МНС класса I и II в высоких концентрациях [224, 346]. Эти клетки обладают способностью захватывать, процессировать и презентировать ауто- и аллогенные антигены в контексте молекул МНС [181, 206, 249]. Кроме того, дендритные клетки продуцируют дополнительные сигналы, решающие в конечном итоге, подвергнется ли клетка клональной делеции или продолжит созревание [107]. Мозговое вещество долек. Мозговое вещество долек представлено густой сетью крупных эпителиальных клеток, образующих небольшие ячейки. Количество Т-лимфоцитов здесь меньше, чем в корковом веществе долек, но эта зона характеризуется большим числом клеток мезенхимального происхождения и наличием эпителиальных тимических телец (тельца Гассаля). Медуллярные эпителиальные клетки содержат тимусные гормоны, экспрессируют цитокератины, но не экспрессируют антигены МНС [18]. В мозговом веществе долек выявляются более крупные светлые эпителиальные клетки, формирующие тимические тельца. Клетки тимических телец, как и субкапсулярные, относятся к светлым, эктодермального генеза. Согласно объединенной теории центральной иммунотолерантности, эпителиальные клетки телец Гассаля играют особую роль в поддержании иммунологического гомеостаза: презентируют тканеспецифические антигены для элиминации аутореактивных лимфоцитов, синтезируют хемокины, влияющие на миграцию лимфоцитов [14, 15, 16]. 19 В настоящее время выявлено существование специфической популяции эпителиальных клеток мозгового вещества тимуса, обеспечивающих уникальные свойства в процессах иммуногенеза. Клетки характеризуются активностью гена Aire, кодирующего белковый транскрипционный фактор, вызывающий транскрипцию эктопических тканеспецифических белков [264]. С помощью Aire происходит синтез белков различных тканей в эпителиальных клетках тимуса, создавая в нем как бы иммунологический образ всего организма. Поэтому Aire+ клетки являются своеобразными «транскрипционными машинами» по созданию тканеспецифических антигенов, которые важны для элиминации аутореактивных лимфоцитов, а значит, для создания и поддержания иммунологического гомеостаза в организме [221]. В настоящее время доказано, что Aire+ эпителиальные клетки подвергаются ступенчатому процессу дифференцировки, характеризующемуся изменением экспрессии определенных поверхностных маркеров. Конечной стадией этого процесса, при которой клетки достигают наибольшего развития, есть формирование телец Гассаля. Окончательное функциональное созревание Aire+ эпителиальных клеток мозгового вещества происходит только тогда, когда они организуются в тельца Гассаля, что подтверждается многочисленными работами [127], доказывающими специфические свойства клеток телец Гассаля. Гибель этих клеток в результате аутофагии приводит к освобождению растворимых тканеспецифических антигенов, которые используются дендритными клетками для процессов селекции в тимусе [221]. Т-регуляторные клетки (Treg) имеют важное значение для поддержания иммунологической толерантности [152, 263, 331]. Различают следующие подвиды CD4+ Т-лимфоцитов с регуляторными свойствами: тимические CD4+CD25+ [307], происходящие из естественных Treg, вторичные супрессорные Т-клетки, в том числе Th3-клетки [353] и Tr1-клетки, индуцибельные на периферии [304]. Супрессируя иммунный ответ, Т-регуляторные клетки продуцируют цитокины IL-10, γ-IFN, IL-35, а также экспрессируют на своей поверхности рецептор CTLA4 [352]. Супрессия обеспечивается при непосредственном контакте клеток – 20 прямой способ, и на расстоянии – дистантный способ. Целью Т-регуляторных клеток становятся Т-эффекторы и дендритные клетки. При дистантном способе супрессии цитокины взаимодействуют с рецепторами на поверхности мембран Тэффекторных клеток и подавляют их активность, супрессируя иммунный ответ. С помощью CD25 происходит захват IL-2, который является основным аутокринным стимулирующим фактором. При прямом механизме супрессии Treg секретируют гранзим B, который при помощи перфоринов приводит к гибели активных Т-лимфоцитов путем апоптоза. Недавние исследования показали, что Th17 клетки и Tregs имеют общий индуцированный путь, и нарушение баланса Th17/Treg может быть причиной аутоиммунных заболеваний [362]. При этом популяция Th17 лимфоцитов находится под контролем действия мелатонина, так как внутриклеточный рецептор для эпифизарного гормона является фактором дифференцировки для Th17-клеток [24]. Т-лимфоциты мозгового вещества долек составляют 15–20% всех лимфоцитов тимуса. Зрелые медуллярные тимоциты несут маркеры CD3, CD5, CD4, CD8 и антигены HLA 1-го и 2-го классов. CD3 – высокоспецифичный маркер субпопуляции Т-лимфоцитов [45, 49, 148, 172, 350]. Это пан Т-клеточный антиген, состоящий из 5 полипептидных цепей, которые ковалентно связываются с Т-клеточным рецептором (TCR), вместе с которым обеспечивают передачу внутриклеточного сигнала при активации Т-клеток [51]. Отличительной особенностью Т-клеточного развития в тимусе является жестко контролируемая экспрессия TCR и CD3 комплекса, которая значительна на CD4-CD8+ и CD4+CD8- клетках, и низкая на CD4+CD8+ лимфоцитах [350]. В незрелых Т-клетках CD3 имеет цитоплазматическую локализацию, а у зрелых Т-лимфоцитов имеет мембранное расположение [51]. Полагают, что в мозговом веществе долек накапливаются созревшие Тлимфоциты из коркового вещества, они кортизол- и радиорезистентны и могут рециркулировать. Согласно другим гипотезам, Т-лимфоциты мозгового вещества представляют собой либо рециркулирующие Т-лимфоциты, поступающие из 21 крови, либо – отдельную субпопуляцию. В любом случае, они рециркулируют, и миграция их происходит в области кортико-медуллярной границы через внутридольковые периваскулярные пространства [171, 212]. Значение мозгового вещества – обеспечение через микроокружение полного созревания Т-лимфоцитов, которое обеспечивается благодаря тимическим гормонам эпителиальных клеток, прямыми контактами с интердигитирующими клетками и влиянием интерлейкинов. Главным отличием тимических гормонов мозгового вещества является то, что они дальнодействующие, так как секретируются в кровь, тогда как тимические гормоны коры оказывают лишь местное воздействие [212]. Внутридольковые периваскулярные пространства. Внутридольковые периваскулярные пространства представлены идущими вглубь паренхимы тимуса узкими или более широкими ответвлениями междольковых септ, внутри которых расположены кровеносные сосуды. С одной стороны внутридольковые периваскулярные пространства отграничены базальной мембраной сосудов, с другой – базальной мембраной эпителиальных клеток собственно паренхимы тимуса. Внутридольковые периваскулярные пространства коркового вещества узкие, характеризуются утолщенными базальными мембранами, непрерывным слоем эпителиальных клеток и черепицеобразным расположением эндотелия капилляров. Такое строение является морфологическим эквивалентом гематотимического барьера [212]. Концепция гематотимического барьера долгое время была незыблемой. Корковое вещество тимуса рассматривалось как среда, свободная от антигенов, в которой идет созревание Т-лимфоцитов. Однако в литературе постоянно появляются данные, противоречащие данной концепции. В серии работ [22, 67, 121] было показано, что антигены, циркулирующие в крови, могут обходить гематотимический барьер и проникать в тимус транскапсулярным путем. Поскольку кровеносные капилляры капсулы тимуса фенестрированы, то антигены из крови могут попадать в соединительнотканную строму, достигая лимфоцитов тимуса. Пассаж молекул антигенов идет в том же направлении, в котором 22 двигаются созревающие тимоциты – от субкапсулярной зоны к мозговому веществу. Поэтому аутоантигены могут нести определенную роль в процессах созревания Т-лимфоцитов. Результаты этих экспериментов составили основу гипотезы о связи лимфоидной паренхимы тимуса с внутренней средой организма, участии аутоантигенов во внутритимической дифференцировке Т-лимфоцитов и новой теории становления иммунологической толерантности. Авторы признают, что классический гематотимический барьер, по-видимому, существует, но функциональное значение его остается не совсем ясным [116, 130]. 1.1.1. Гуморальная регуляция функционирования тимуса Физиологические функции тимуса находятся под контролем ряда гормонов, которые оказывают влияние на пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз развивающихся тимоцитов. Так, в тимусе обнаружены рецепторы к глюкокортикостероидам [366], соматотропному гормону, тиреоидным гормонам, половым стероидам, хорионическому гонадотропному гормону [43], мелатонину [146]. Известно, что глюкокортикостероиды вызывают апоптоз тимоцитов [313], которые экспрессируют рецепторы к гормону в ядре и цитоплазме [43]. Терапия глюкокортикостероидами приводит к атрофии тимуса, что сопровождается снижением количества митозов, снижением площади коркового вещества долек, инверсией коркового и мозгового веществ, массовой миграцией клеток в кровоток [37]. Однако эффект глюкокортикостероидов находится в зависимости от дозы: низкие концентрации стимулируют иммунные процессы, а высокие – подавляют [233]. Выявлен синтез глюкокортикоидов в самом тимусе эпителиальными клетками. Внутритимусные глюкокортикоиды оказывают локальную регуляцию дифференцировки тимоцитов, а также участвуют в возрастной инволюции органа [337]. Глюкокортикоиды играют ключевую роль в развитии стресс-реакций, которые приводят к инволюции органа [44]. Так, в первой стадии отмечается усиление процессов пролиферации лимфобластов субкапсулярной зоны 23 коркового вещества дольки тимуса, при этом масса органа увеличивается. Во второй фазе в корковом веществе долек увеличивается количество лимфоцитов и кровенаполнение органа. В третью фазу гибель Т-лимфоцитов начинает нарастать и снижается секреция тимусных полипептидов. В четвертую стадию гибель тимоцитов приводит к опустошению мозгового вещества, а в пятую стадию нарастает коллагенизация стромы, склерозируются сосуды, начинается жировое перерождение тимуса [44]. Известно, что гормон роста и пролактин усиливают пролиферацию и миграцию тимоцитов [313], стимулируют выработку тимулина эпителиальными клеткам тимуса [266]. Инъекции соматотропного гормона увеличивают клеточность тимуса у старых мышей. Гипоплазия тимуса, наблюдаемая у карликовых мышей, устраняется введением гормона роста [266]. В работе Спирина И. В. (2007) продемонстрировано иммуностимулирующее действие соматотропного гормона на тимус, что сопровождалось увеличением площади коркового вещества долек тимуса, повышением числа дендритных клеток и макрофагов. Содержание иммуносупрессорных биогенных аминов (гистамина и серотонина) при этом снижалось, а иммуностимулирующих катехоловых аминов – повышалось. Тиреоидные гормоны увеличивают продукцию тимулина эпителиальными клетками. Так, в работе Chang W.-P. (2005) продемонстрировано повышение синтеза тимулина при одновременном увеличении плазменного уровня тиреоидных гормонов. Трийодтиронин активирует экспрессию рецепторов и лигандов во внеклеточном матриксе (фибронектин, ламинин) [160], ускоряет выход тимоцитов из клеток «нянек» и из тимуса на периферию [43]. Модулирующее действие хорионического гонадотропина на тимус сопровождается снижением пролиферативных процессов в органе, запускает процессы дифференцировки Т-лимфоцитов, усиливает дегрануляцию тучных клеток и приводит к увеличению содержания гистамина в структурах тимуса [95, 96]. Заморина С. А. (2000) в исследовании показала, что хорионический 24 гонадотропин оказывает депрессивный эффект на фагоцитарную активность гранулоцитов и модулирует секреторную активность лимфоцитов. Половые гормоны оказывают влияние на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз иммунных клеток. Действие гормонов опосредуется через мембранные и ядерные рецепторы [43]. Известно, что тестостерон, оказывая модулирующее действие на иммунную систему, повышает восприимчивость к протозойным, грибковым, бактериальным и вирусным инфекциям [222]. В работе Сариловой И. Л. (2009) показано, что тестэктомия стимулирует иммунные процессы, что сопровождается увеличением количества антигенпредставляющих клеток, повышением содержания катехоламинов в тимоцитарной паренхиме при одновременном снижении депрессорного моноамина серотонина. Кастрация самок и самцов вызывает увеличение веса и клеточности тимуса, усиление пролиферации Т-хелперов и Т-киллеров [43]. 1.1.2. Клеточный состав тимуса и нейромедиаторные биогенные амины Клетки микроокружения тимоцитов, обеспечивающие регуляцию функций тимуса, продуцируют большое количество сигнальных молекул, таких как биогенные амины, нейропептиды, цитокины и другие биологически активные вещества, обеспечивающие нейроиммуноэндокринные взаимодействия [8, 69]. C помощью люминесцентно-гистохимических методов в тимусе обнаруживаются люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК), обладающие функцией синтеза и накопления и секреции биогенных аминов: ЛГК между корковым и мозговым веществом (премедуллярные ЛГК) и ЛГК коркового вещества (субкапсулярные ЛГК) [78]. Среди люминесцирующих гранулярных клеток тимуса определяют следующие группы клеток: клетки APUD–серии, макрофаги [28], дендритные клетки [28, 84]. Любое воздействие на организм, например, введение гормонов [81, 95], иммуномодуляторов [85], поступление солей кальция и кремния в организм [34, 35, 25], антигенная стимуляция [78], плацентарная недостаточность [79], 25 тестэктомия [76], канцерогенез [33] и многое другое приводит к перераспределению содержания биогенных аминов между ЛГК и тимоцитами. Изменение содержания биогенных аминов в люминесцирующих клетках тимуса напрямую связано с модуляцией их функций в иммунных реакциях [66]. Известно, что гранулярные люминесцирующие клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки способны к синтезу биогенных аминов: серотонина и катехоламинов. В субкапсулярной зоне люминесцирующие клетки являются аминопоглотителями, неспособными к синтезу биоаминов и относящимися к типичным макрофагам, лимфоцитарная паренхима тимуса также проявляет функции биоаминопоглотителей [18, 78] и свойством связывать нейромедиаторы [36]. Показано, что увеличение содержания катехоламинов в гранулярных люминесцирующих функциональной клетках активности, тимуса а свидетельствует увеличение о содержания повышении их катехоламинов в лимфоцитарной паренхиме – усилению их пролиферации [76]. Катехоламины путем стимуляции адренорецепторов оказывают воздействие на миграцию, циркуляцию и пролиферацию лимфоцитов, определяют синтез цитокинов и активность клеток лимфоидного ряда [37]. β2-адренорецепторы обнаруживаются на всех иммунных клетках, кроме Th-2 клона лимфоцитов [311]. Уменьшение числа экспрессированных β-адренорецепторов совпадало с пиками пролиферации лимфоцитов [163]. Мембранные α2-адренорецепторы были обнаружены на макрофагах [327]. В исследованиях Zoukos Y. et al. (1994) и Heijnen C. J. et al. (1996) α1-адренорецепторы экспрессировались на лимфоцитах у лиц с ревматоидным артритом и рассеянным склерозом. Катехоламины оказывают регулирующее влияние на продукцию моноцитами/макрофагами провоспалительных веществ [168, 232]. Так, норадреналин и адреналин ингибируют секрецию ФНО [174], IL-12 [145], γ-INF, вырабатывающиеся антигенпрезентирующими клетками, но в тоже время способствуют усилению продукции IL-6 [125], IL-10 и трансформирующего фактора роста [168]. Катехоламины проявляют свойства ингибирования активности натуральных 26 киллеров, фагоцитарной активности нейтрофилов, продукции супероксида и активных радикалов лейкоцитами [145]. В тоже время норадреналин стимулирует продукцию в тимусных эпителиальных клетках IL-6, которым крайне важен для дифференцировки лимфоцитов [285]. Серотонин является нейромедиатором в центральной нервной системе, вазоактивным биоамином и иммуномодулятором в периферических тканях [105, 277]. Известно, что избыток серотонина свидетельствует об иммуносупрессии [2]. Высокие дозы серотонина подавляют цитотоксическую функцию аллоиммуных эффекторных Т-лимфоцитов и лимфокинактивированных клеток-киллеров [230, 234]. Серотонин ингибирует обратный захват норадреналина нервными окончаниями. При нехватке гистамина, последний может замещаться серотонином [155]. В работах Kut J. L. et al. (1992) и Young M. R. et al. (1993) показали дозозависимый эффект экзогенного серотонина: низкие дозы обеспечивали активирующее влияние на Тлимфоциты, в то время как высокие концентрации подавляли функции клеток. Эффект серотонина распространяется и на клетки неспецифической иммунной защиты. В частности, вводимый биоамин в присутствии IL-2 усиливает цитотоксичность натуральных киллеров [202, 203]. В работе Лузиковой Е. Л. (2008) показано, что значительное повышение содержания серотонина и гистамина в люминесцирующих гранулярных клетках тимуса указывает на подавление их функций, а тимоцит с высоким содержанием серотонина может рассматриваться как клетка-супрессор. Повышение содержания серотонина в лимфоцитарной паренхиме приводит к снижению пролиферации Тлимфоцитов. Гистамин оказывает широкое влияние на различные процессы в организме: развитие аллергических реакций, процессы ранозаживления, онкологии, сердечно-сосудистые заболевания и функции иммунокомпетентных клеток [279]. Биоамин проявляет иммуномодулирующие свойства, которые определяются его концентрацией и типом активированного рецептора. Клетки врожденного и приобретенного иммунитета чувствительны к действию гистамина [175, 280]. Гистамин участвует в регуляции функций дендритных клеток [323], контролирует 27 выработку провоспалительных цитокинов, экспрессию молекул адгезии и миграцию иммунокомпетентных клеток, таких как эозинофилы, дендритные клетки, NK-клетки, Т-лимфоциты, путем связывания со специфическими рецепторами [161, 198]. Избыточное содержание гистамина носит иммуносупрессивный эффект [204]: ингибирует функции Т-лимфоцитов [129], подавляет синтез IL-4 и γ-INF [223], снижает продукцию тимулина эпителиальными клетками тимуса [200]. Под действием гистамина Т-супрессоры выделяют гистамин-индуцированный супрессорный фактор, который подавляет функции NK-клеток [275]. В тоже время гистамин защищает NK-клетки от ингибирующего действия моноцитарных активных форм кислорода [274]. Гистамин оказывают эффект на регуляцию Т-клеточного ответа: стимулирует Th2 путь, и подавляет Th1 ответ [283]. Основным источником гистамина являются тучные клетки [324, 343]. Тучные клетки – гетероморфная популяция клеток, которые характеризуются наличием в цитоплазме гранул, проявляющих метахроматические свойства при окрашивании красителями тиазинового ряда [94]. Имеют широкое распространение и обнаружены практически во всех органах [150, 292]. Тучные клетки принимают активное участие не только в реакциях врожденного и приобретенного иммунного ответа, гомеостаза, но и ангиогенезе, ремоделировании тканей, опухолевых процессах [54, 270, 355]. Тучные клетки наряду с моноцитами и дендритными клетками являются одними из первых звеньев иммунной системы, которые взаимодействуют с антигенами внешней и внутренней среды [344]. Тучные клетки могут функционировать как эффекторные, так и иммунорегуляторные клетки [102, 162, 182]. Тучные клетки обладают способностью регулировать переход от врожденного к приобретенному иммунному ответу посредством влияния на пролиферацию, дифференцировку, миграцию и функционирование иммунокомпетентных клеток: макрофагов, натуральных киллеров, В- и Т-лимфоцитов и др. [162, 182, 183, 344]. Выделяя гистамин, тучные клетки снижают супрессорную активность Т-регуляторных клеток [133]. 28 Созревание тучных клеток, их фенотип и функции находятся в непосредственной зависимости от микроокружения, которое оказывает выраженное влияние на их способность к распознаванию и реагированию на различные стимулы путем выброса ряда биологически активных медиаторов [261]. Изменение общего количества клеток, выброс гранул с медиаторами – это стереотипная реакция тучных клеток на различные воздействия. В норме полностью дегранулированные тучные клетки сохраняют свою жизнеспособность, и через некоторое время восстанавливают пул медиаторов, а при патологии любого генеза характерно снижение общего числа тучных клеток, их дегрануляция, а в тяжелых случаях возможно замещение нормальной популяции тучных клеток незрелыми клетками с совершенно другими цитофизиологическими признаками [47]. Таким образом, биогенные амины и тучные клетки играют важную роль в модуляции функций иммунокомпетентных клеток, участвуя в регуляции процессов нейроиммунноэндокринной системы. 1.2. Роль мелатонина в организме 1.2.1. Физиологическая роль мелатонина Мелатонин (N–ацетил–5–метокситриптамин) представляет собой производное биогенного амина серотонина, который образуется, главным образом, в эпифизе у большинства млекопитающих и человека [139, 328]. Эпифиз (шишковидное тело, пинеальная железа) – небольшое овальное железистое образование, которое относится к промежуточному мозгу и располагается в неглубокой борозде между верхними холмиками среднего мозга и над таламусом [5]. В шишковидной железе серотонин превращается в мелатонин через двухступенчатый ферментативный процесс, захватывающий N-ацетилирование с последующим О-метилированием [220]. Мелатонин характеризуется высокой растворимостью в воде и липидах, что обеспечивает легкое его прохождение через мембраны клеток [284]. Гормон обнаруживается в слюне, моче, спинномозговой жидкости, преовуляторных 29 фолликулах, сперме, околоплодных водах и грудном молоке. Плазменная концентрация гормона четко отражает секретирующую функцию эпифиза [298]. Мелатонин секретируется преимущественно в темноте, ночью [145], независимо от суточной активности животного, естественного или искусственного ритма [364]. На свету, в утренние и дневные часы выработка мелатонина резко угнетается. Яркий свет мгновенно подавляет синтез гормона, в то время как в постоянной темноте сохраняется суточный ритм выброса, который поддерживается периодической активностью супрахиазматического ядра (СХЯ). В связи с этим максимальный уровень содержания мелатонина в эпифизе и в крови человека выявляется в ночные часы, а минимальный – в утренние и дневные [5, 10, 11, 177]. Циклические изменения уровня мелатонина в крови определяют циркадные и сезонные ритмы организма. Было доказано, что мелатонин действует на органы и ткани как эндогенный синхронизатор, который универсален для всех животных [289] и растений [119, 137]. Известно, что нахождение в условиях постоянного освещения, приводит к десинхронозу, из-за подавления синтеза мелатонина [19]. В условиях постоянной темноты синтез мелатонина эпифизом усиливается, однако световая депривация индуцирует стрессовое состояние организма [40, 124]. В работе Узенбаевой Л. Б. и др. (2006) продемонстрировано раннее возрастное снижение количества лимфоцитов и увеличение количества нейтрофилов в крови крыс, длительно находившихся в условиях постоянной темноты. В то же время в ряде исследований показано положительное действие световой депривации на эстральную функцию [57] и канцерогенез [4], что обусловлено гиперпродукцией мелатонина. Информацию об освещенности эпифиз получает по сложному нервному пути, ключевая роль в котором принадлежит супрахиазматическим ядрам гипоталамуса. Световые сигналы от сетчатки через зрительный нерв попадают в СХЯ, затем они идут через гипоталамус по проводящим путям вдоль ствола головного мозга в шейный отдел спинного мозга, откуда через нервы верхнего 30 шейного симпатического ганглия идут к эпифизу [269]. В темноте, когда большинство нейронов СХЯ не проявляет активности, эти нервные окончания выделяют норадреналин, который через b1-адренорецепторы инициирует в клетках эпифиза синтез ферментов, необходимых для образования мелатонина [333]. Также продукция гормона зависит от содержания триптофана [367], фолиевой кислоты [179], пиридоксина [248]. Основным источником синтеза мелатонина является эпифиз. Однако, выявлены экстрапинеальные источники синтеза гормона в тимусе, желудочнокишечном тракте, гонадах, соединительной ткани [3, 11, 65] сетчатке, коже, тромбоцитах, тучных клетках, эозинофилах, натуральных киллерах [157, 260], костном мозге [132, 140, 242, 332]. Считается, что синтез экстрапинеального мелатонина определяется самим эпифизом и не имеет собственной фотопериодичности [17]. Количество мелатонина имеет тенденцию к изменению в течение всей жизни. Секреция гормона начинается на 3-м месяце развития ребенка, и его концентрация достигает максимума в первые годы жизни – до 5 лет. До половой зрелости синтез мелатонина сохраняется на постоянном и высоком уровне, затем его количество резко уменьшается и продолжает снижаться еще в течение 5 лет. После этого изменений в синтезе гормона не происходит до 40–45 лет, а затем его количество начинает неуклонно уменьшаться, что совпадает по времени с наступлением менопаузы, и в дальнейшем этот процесс продолжается до конца жизни человека [65]. У млекопитающих, в том числе и человека, действие мелатонина опосредуется через специфические высокоафинные рецепторы – МТ1, МТ2, МТ3 [146, 301]. Два клона рецепторов мелатонина М1 и М2 являются мембранными, имеют 7 мембранных доменов и относятся к суперсемейству рецепторов ассоциированных с G-белками [167]. Эти рецепторы передают хронобиологические сигналы от СХЯ, МТ1 рецепторы подавляют нейрональную передачу, а МТ2 – индуцируют её. МТ1 и МТ2 рецепторы экспрессируются также на периферических органах и клетках: сетчатке, позвоночных и периферических 31 артериях, почках, поджелудочной железе, коре надпочечников, яичках, желудочно-кишечном тракте, клетках иммунной системы [17, 166]. Мелатонин через рецепторы воздействует на эффекторную систему, которая включает в себя аденилатциклазу, фосфолипазу С, фосфолипазу А2, калиевые каналы и гуанилатциклазу [190]. Первоначально описанный как МТ3 рецептор представляет собой хиноновую редуктазу 2 [278], которая обеспечивает защиту от окислительного стресса путем предотвращения реакций переноса электронов с хинонов [178]. Известно, что мелатонин является сильным антиоксидантом [99, 169]. Действует гормон повсеместно, так как проникает через все биологические барьеры и обнаруживается во всех структурах клеток, в том числе в митохондриях [300] и ядре [46]. В исследованиях было показано, что мелатонин обладает большей антиоксидантной активностью в защите от процессов перекисного окисления липидов и инактивации активных свободных радикалов, чем известные антиоксиданты [188], существенным протективным эффектом в отношении свободно-радикального повреждения, возникающего при воздействии ионизирующей радиации [217, 227, 320, 321, 322, 347], ультрафиолетового облучения [192], сезонного окислительного стресса [197], при диабете [215]. Мелатонин также проявляет онкостатические свойства. Действие гормона опосредуется через увеличение уровня глутатиона [126], а также запуска апоптоза в опухолевых клетках [310]. В ряде исследований мелатонин показал своё онкостатическое действие в отношении различных опухолей: рака яичников [286], карциномы эндометрия [216, 240], рака молочной железы [219], увеальной меланомы [208], рака простаты [189], плоскоклеточного рака полости рта [159] и опухолях кишечника [104, 240], глиомы [363]. Известна роль гормона в регуляции репродуктивной функции млекопитающих, которая опосредуется путем подавления синтеза половых гормонов [5]. Гормон циклически регулирует экспрессию генов гонадотропинрилизинг гормона, оказывая свое действие через МТ1 и МТ2 рецепторы [305]. Обнаружение мелатониновых рецепторов в репродуктивных органах [180, 325], а 32 также рецепторов к половым гормонам в эпифизе [308] говорит о важной взаимосвязи мелатонина и половых стероидов. 1.2.2. Применение мелатонина в клинической практике Одним из основных свойств мелатонина является снотворный эффект, ввиду чего гормон получил широкое распространение. Прием мелатонина восстанавливает ночной сон и препятствует инсомнии [65, 210], причем чем грубее были нарушения сна, тем выраженее эффект гормона [5]. В клинических исследованиях Я. И. Левина (2005) выявлена высокая эффективность мелатонина (препарат «Мелаксен») у больных с нарушениями сна, возникшими в острейший и острый периоды инсульта. Мелатонин улучшает процессы восприятия, в работах Арушаняна Э. Б. и Ованесова К. Б. (1999) показано, что двухнедельный прием гормона оптимизирует свето- и цветоразличительную способность глаза. Показано положительное влияние мелатонина на сон и когнитивные функции мозга у пациентов с болезнью Альцгеймера [117, 348]. Мелатонин вводится в схемы терапии онкологических заболеваний. Так, одновременное применение мелатонина (20 мг/сут в вечернее время) с комбинацией Этопозид + Цисплатин увеличивало выживаемость и качество жизни у пациентов с метастатической формой немелкоклеточного рака легкого [241], комбинация мелатонина (20 мг/день) с радиотерапией (60 Грей) увеличивала однолетнюю выживаемость у пациентов с мультиформной глиобластомой [238]. Так же в исследованиях показано, что мелатонин снижает миелотоксическое и лимфоцитопеническое действие цитостатиков [80]. В ряде работ продемонстрировано выраженное антидепрессивное действие мелатонина [295]. Мелатонин назначают как седативное, анксиолитическое [103] и анальгетическое средство [329]. Исследования, проведенные на людях, показывают влияние мелатонина на сердечно-сосудистую систему [336]. Гормон снижает артериальное давление у лиц с гипертензией, что подтверждается рядом исследований [211]. Также гормон 33 проявляет способность регулировать частоту сердечных сокращений и снижать агрегацию тромбоцитов [118]. Мелатонин находит также применении в лечении заболеваний желудочнокишечного тракта. Гормон успешно вводится в схемы терапии язвенной болезни и синдрома раздраженной кишки [17]. 1.2.3. Иммуномодулирующее действие мелатонина Большое внимание уделяется вопросам взаимодействия между мелатонином и иммунной системой [170, 256, 318, 358]. Мелатонин оказывает двойственное влияние на иммунную систему [112]. Гормон может как угнетать, так и стимулировать иммунный ответ, поэтому речь идет об иммуномодулирующей роли мелатонина [17, 235]. В основе иммуномодуляции лежит несколько механизмов: прямое воздействие на мелатониновые рецепторы МТ1, МТ2, МТ3 и на функцию клеток лимфоидных органов и крови [120], опосредованное воздействие через опиоидные механизмы, а также модификацию продукции кортикостероидных гормонов надпочечников [17, 271]. Мелатониновые рецепторы обнаружены на лимфоцитах [135], моноцитах [187] и нейтрофилах человека [245], и лимфоцитах, нейтрофилах и иммунокомпетентных клетках тимуса и селезенки лабораторных и диких животных [294] и Т-хелперах костного мозга крыс (Мaestroni G. J., 1995). В иммунных органах мышей МТ1 и МТ2 рецепторы обнаружены только в тимусе, также МТ1 рецепторы выявляются на гранулоцитах. МТ3 рецепторы идентифицируются в тимусе, селезенке, костном мозге, лимфатических узлах, макрофагах, дендритных клетках, гранулоцитах [146]. В селезенке кур обнаруживаются рецепторы к мелатонину 1-го типа: МТ1а и MT1c в красной пульпе, МТ1b – периартериолярных лимфоидных муфтах [195]. Мелатонина оказывает влияние на неспецифическую иммунную защиту человека: моноциты-макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, тучные клетки и естественные киллеры [157]. Так, гормон, взаимодействуя с рецепторами клеток моноцитарно-макрофагального 34 происхождения, стимулирует деление клеток-предшественниц гранулоцитов и макрофагов КОЕ-ГМ [253, 254, 255, 282]. Влияние мелатонина на деление моноцитов может быть частично обусловлено его прямым действием на мелатониновые рецепторы или, возможно, за счет увеличения чувствительности моноцитов к стимуляторам, таким как IL-3, IL-4, IL-6 или к КОЕ-ГМ [158, 253]. В исследованиях на грызунах было выявлено повышение активности моноцитов/макрофагов при введении мелатонина [218]. Гормон восстанавливает сниженное общее количество лейкоцитов у пинеалэктомированных животных [296]. Экзогенный мелатонин увеличивает количество NK-клеток и моноцитов как в костном мозге, так и в селезенке через 7 и 14 дней введения [158]. Хроническое введение мелатонина увеличивает количество циркулирующих NK-клеток и их спонтанную активность, что частично опосредовано увеличением продукции цитокинов (IL-2, IL-6, IL-12 и γ-IFN) Тхелперами под действием гормона [158, 185, 186, 240]. Активируя моноциты, мелатонин увеличивает продукцию IL-1, IL-6, IL-12, альфа-ФНО и активных форм кислорода [273]. Повторная стимуляция Т-хелперов в присутствии IL-12 приводит к дифференцировке их в Th-1 клетки, которые вырабатывают IL-2 и γIFN, что особенно эффективно в иммунных реакциях с участием макрофагов и других фагоцитов. Мелатонин увеличивает продукцию γ-IFN Th-1 клетками [186], а непосредственно сам γ-IFN стимулирует синтез и секрецию мелатонина в моноцитах и макрофагах периферической крови [176], и в эпифизе [357]. Напротив, в других работах показано снижение выработки γ-IFN и IL-2 Th-1 клетками [317], γ-IFN активированными макрофагами [293] при введении мелатонина. Причем вводимый в культуру клеток мелатонин в дозе 12-50 мкг/мл приводил к максимуму пролиферативного потенциала Т-клеток, а более высокие дозы уже оказывали супрессирующее действие. Максимальное подавление продукции γ-IFN наблюдалось при дозе вводимого мышам мелатонина 50 мг/кг. Wang H. с соавт. (2005) продемонстрировали, что мелатонин снижает выработку провоспалительных цитокинов клетками Купфера крыс, таких как IL-1β и γ- IFN. 35 Интраперитонеальное введение крысам мелатонина ежедневно в дозе 50 мг/кг подавляло экспрессию мРНК IL-6, IL-1β и γ-IFN [214]. В работе Ozkanlar S. с соавт. (2015) показано снижение плазменного уровня IL-1β, общего количества лейкоцитов, соотношения площади коркового вещества к площади мозгового вещества в тимусе, количества положительных на эстеразу тучных клеток в селезенке, тимусе и лимфатических узлах крыс, страдающих диабетом, после внутрибрюшинного введения мелатонина в дозе 10 мг/кг в течение 15 дней. В ряде работ выявлено, что введение мелатонина приводит к увеличению выработки антител как у здоровых, так и ослабленных мышей [256], а пинеалэктомия вызывает угнетение синтеза антител лимфоцитами [191]. В неонатальном периоде пинеалэктомия приводит к значительному снижению количества эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов, а также увеличивает риск инфицирования мозга золотистым стафилококком [122]. В экспериментах, где мышей содержали при постоянном освещении или вводили бета-адреноблокатор, произошло снижение массы и клеточности селезенки и тимуса [250, 251]. У старых мышей введение мелатонина приводит к увеличению количества тимоцитов [340] за счет подавления синтеза глюкокортикоидов [339, 342]. Yu Q. и другие (2000) показали, что мелатонин, вводимый перорально, способствует выживанию предшественников В-лимфоцитов в костном мозге. Castrillon P. и др. (2000) продемонстрировали в своей работе увеличение количества CD4-позитивных и снижение CD8-позитивных лимфоцитов в подчелюстных лимфатических узлах под влиянием мелатонина. Остается пока не до конца выясненным, влияет ли мелатонин только на Th-1 клетки, или также на Th-2 клетки, баланс соотношения которых (Th-1/Th-2) имеет большое значение для иммунных реакций [256]. По данным Raghavendra V. и др. (2001) мелатонин поддерживает продукцию анти-CD3 антител только в присутствии антигенпрезентирующих клеток и цитокинов, вырабатываемых Th2-клетками. В тоже время, ряд исследований показывает, что экзогенный мелатонин может не иметь влияния на клетки иммунной защиты. Так, длительное введение мелатонина не оказывало влияния на количество NK-клеток у крыс с опухолями 36 молочных желез [306]. В работе Provinciali M. с соавт. (1997) мелатонин вводился мышам с возраста 17-18 месяцев в дозе 40-50 мкг/сут на животное в течение 8 месяцев. Гормон не восстанавливал ни эндогенную, ни IL-2-индуцированную активность NK-клеток старых мышей, не влиял на их количество, а также не оказывал влияния на сниженную возрастную пролиферативную активность лимфоцитов селезенки. При гиперчувствительности иммунный ответ за счет мелатонин снижения ингибирует выработки Th1-зависимый γ-IFN и IL-12 антигенпрезентирующими клетками [257]. Длительное введение мелатонина (6 недель) в дозе 10 мг на 100 мл питьевой воды крысам со спонтанной гипертензией снижает на 40-60% инфильтрацию почечной ткани лимфоцитами и макрофагами [276]. Konakchieva R. (1995) с соавт. сообщили, что мелатонин ингибирует конканавалин А-индуцированные включения в лимфоцитах миндалин и периферической крови человека. Основываясь на иммуносупрессивных свойствах мелатонина, гормон исследовался как пролонгатор выживаемости трансплантатов островков поджелудочной железы. У мышей, получавших мелатонин ежедневно в дозе 200 мг/кг, среднее время выживаемости островков увеличилось с 7 до 17 дней, что сопровождалось сокращением числа Th1-клеток, снижением пролиферации Тклеток и спленоцитов, увеличением продукции иммуносупрессивного цитокина IL-10 [235]. В работе Jung F. J. c соавт. (2004) сердечный аллотрансплантат пересаживали крысам. Мелатонин вводили в дозе 20 мг/кг/сут и 200 мг/кг/сут. Было показано, что введение высоких доз мелатонина (200 мг/кг/сут) значительно продлевает жизнь трансплантата, снижает уровень аллоиммунных IgM и пролиферативную активность лимфоцитов. Вводимый мелатонин в дозе 20 мг/кг/сут значительно не продлевал срок жизни трансплантата, а на 10-е сутки введения отмечалось повышение аллоиммунных IgM. Таким образом, анализ научной литературы показывает, что в последние десятилетия объем экспериментальных и клинических исследований, посвященных вопросам метаболизма, физиологической активности, а также 37 иммуномодулирующим свойствам мелатонина значительно возрос. Это обусловлено тем, что действие гормона на иммунную систему не является однозначным в связи с локализацией различных типов рецепторов к нему на многих видах клеток, а также с зависимостью синтеза этого гормона от таких компонентов нейроиммуноэндокринной системы, как биогенные амины, вегетативные нервные волокна, состояние центральных органов иммунной системы. Иммуномодулирующее действие мелатонина зависит от исходного состояния организма, дозы, длительности введения и условий освещения. Поэтому необходимы дальнейшие исследования гормона на экспериментальных моделях перед широким применением в клинике. 38 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Организация эксперимента Научные опыты были проведены в 2008 – 2015 гг. в лаборатории кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» согласно государственному плану по теме «Гистохимия биогенных аминов в морфофункциональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте (№ 0120.0851887 от 10.09.2008 г.)». Эксперименты проводились в осенне-зимний период – с ноября по январь. Все исследования проводились при одобрении этического комитета медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И. Н. Ульянова. Объектом гистологического исследования служил тимус 160 половозрелых белых нелинейных мышей-самцов 2-х месячного возраста и одинаковой массы (20-22 г). Животные были распределены на 8 групп: 1-я контрольная (n = 20) – животные, которые содержались в течение 2 недель эксперимента в обычных условиях вивария (естественное освещение; продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день – до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс; свободный доступ к питьевой воде и корму); 1-я опытная (n = 20) – животные получали препарат мелаксен (синтезированный мелатонин, Unipharm, Inc., США) в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой течение 2 недель и находились в условиях естественного освещения (продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день – до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс); 39 2-я контрольная (n = 20) – животные находились в условиях постоянного затемнения (клетки затемнялись черной тканью, непропускающей свет, освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс) в течение 2 недель и получали питьевую воду и корм без ограничений; 2-я опытная (n = 20) – животные получали препарат мелаксен в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой в течение 2 недель и находились в условиях постоянного затемнения (клетки затемнялись черной тканью, непропускающей свет, освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс); 3-я контрольная (n = 20) – животные, которые содержались в обычных условиях вивария в течение 4 недель эксперимента (естественное освещение; продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день – до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс; свободный доступ к питьевой воде и корму); 3-я опытная (n = 20) – животные получали препарат мелаксен в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой в течение 4 недель и находились в условиях естественного освещения (продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 люкс, днем в пасмурный день – до 500 люкс, в ясный день – до 1000 люкс, вечером 100 – 200 люкс; влажность воздуха 50 – 70%); 4-я контрольная (n = 20) – животные находились в условиях постоянного затемнения (освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс) в течение 4 недель и получали питьевую воду и корм без ограничений; 4-я опытная (n = 20) – животные получали препарат мелаксен в концентрации 4 мг/литр с питьевой водой в течение 4 недель и находились в условиях постоянного затемнения (освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 люкс). Поскольку других источников жидкости опытные животные не имели, они потребляли воду с мелатонином, что фиксировалось. В среднем одна мышь 40 потребляла 6 мл воды в сутки, что в пересчете составило 25 мкг мелатонина в день на одно животное. Тимус у животных забирался после декапитации на 14-е и 28-е сутки эксперимента во второй половине дня (1500 – 1700). Все действия, предусматривавшие контакт с лабораторными животными, осуществлялись с учетом требований «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» («Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 г. №267) и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях». 2.2. Гистологические методы исследования В ходе проведения исследования были применены следующие методы окраски: 1) окраска срезов гематоксилином и эозином для проведения общегистологической характеристики структур тимуса [71]; 2) окраска полихромным толуидиновым синим по Унна – для контроля состояния тканевых мукополисахаридов и гепарина в тучных клетках [20, 26]. Голубую α-ортохромную окраску гранул дает несульфатированный (незрелый) гепарин; β-метахроматичную (чернильно-фиолетовую) – более сульфатированный (созревающий); γ-метахроматичную (пурпурную) – сульфатированный (зрелый) гепарин [26, 101]. 2.3. Люминесцентно-гистохимические методы исследования 1) метод Фалька-Хилларпа в модификации Е. М. Крохиной применялся для избирательного выявления катехоламинов и серотонина [52, 173]. Срезы исследуемых органов инкубировались в параформальдегидной камере в течение 60 минут при температуре 80оС. Метод основан на конденсации моноаминов с формальдегидом с образованием флуоресцирующих соединений, при котором происходит цепь химических реакций: сначала катехоламины превращаются в 6,7-диокси-1,2,3,4-тетраизогидрохинон и 4,5,6-триокси-тетрагидроизохинолин, которые в результате дегидрирования превращаются в 3,4-дигидроизохинолины. Кето-таутомеры продуктов реакции образуют люминесцирующий комплекс, 41 дающий изумрудно-зеленую флюоресценцию при облучении видимым синефиолетовым светом. 3,4–дигидро–β–карболин, который в подобных реакциях образуется из серотонина, дает желтое свечение. Полученные препараты рассматривались под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ–4 с длиной волны возбуждающего света 360 нм. Интенсивность люминесценции катехоламинов и серотонина замерялась с одного поля зрения, но с использованием разных светофильтров. 2) метод Кросса, Эвена, Роста для выявления гистаминсодержащих структур [153]. Метод определения гистамина в тканях основан на реакции паров ортофталевого альдегида с гистамином, в ходе которой образуются флюоресцирующие производные имидазолилэтиламина. По мнению авторов данного метода, при исследовании срезов под люминесцентным микроскопом образующийся комплексный продукт дает при большом содержании лимонножелтое, при среднем – зеленное, при малом – голубое свечение. Срезы обрабатывались в предварительно разогретой камере парами ортофталевого альдегида в термостате при температуре 100оС в течение 10 секунд. Затем срезы при той же температуре на 2 минуты помещались в другую камеру, содержащую пары воды. Далее срезы высушивались в термостате при температуре 70оС в течение 5 минут. Полученные препараты рассматривались под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ–4А с длиной волны возбуждающего света 360 нм. 3) метод цитоспектрофлуориметрии для идентификации и количественного измерения содержания катехоламинов, серотонина и гистамина в исследуемых структурах тимуса [41]. Для этого на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ–4 была установлена дополнительная насадка ФМЭЛ-1А с выходным напряжением 900 В. Для определения серотонина использовался светофильтр №8 с длиной волны 525 нм, для гистамина – №7 с длиной волны 515 нм и для катехоламинов – фильтр №6 с длиной волны 480 нм. Показания снимались с табло усилителя У-5 в условных единицах флюоресценции (у. е.). 42 2.4. Иммуногистохимические методы исследования 1) метод выявления CD57-позитивных клеток, 2) метод выявления CD68-позитивных клеток. Для проведения исследования были использованы anti-CD57 и моноклональные антитела [228]. Исследование проводилось anti-CD68 на базе Республиканского центра МЗРТ «Современные технологии в морфологической диагностике» с применением МКАТ и реактивов согласно рекомендации фирмыизготовителя «Дако» (Дания). После фиксации в 10% растворе нейтрального формалина материал обезвоживали в этаноле постепенно возрастающей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовились на парафиновом ротаторном микротоме МПС-2 и после депарафинирования и регидратации в этаноле нисходящей концентрации срезы органов погружали в восстанавливающий цитратный буфер (pH 6,0). Затем проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 90 – 95ºС в течении 30 минут с целью демаскировки искомых антигенов в тканях. После ингибирования эндогенной пероксидазы 3% раствором перекиси водорода на метаноле проводили иммуногистохимическую реакцию методом трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных моноклональных антител (МКАТ) к гликопротеину CD57 (Clone NK-1) и к антигенному маркеру CD68 (Clone KP1) в разведении 1:50 согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Dako, Дания). Визуализацию связавшихся первичных МКАТ проводили стандартным биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System Peroxidase) [48]. Для оценки специфичности иммунного окрашивания в каждом случае делали отрицательный контроль (обработка вместо первичных моноклональных антител контрольными антителами), результатом чего было отсутствие специфического иммунного окрашивания. 3) метод выявления CD1а-позитивных клеток, 4) метод выявления CD3-позитивных клеток. 43 Исследование проводилось на базе БУ «Республиканский клинический онкологический диспансер» МСЗР и ЧР. Использовались поликлональные антитела к CD1а и CD3 клеточным мембранным маркерам [164, 265], иммуногистохимическая реакция ставилась в соответствии рекомендациями фирмы-изготовителя (Santa Cruz, USA). Парафиновые срезы толщиной 5 мкм наносились на предметные стекла, которые были предварительно обработаны L-polysine. В последующем срезы органа подвергались сушке при комнатной температуре в течение 24 часов. Окраска препаратов происходила с помощью иммуногистохимических автоконтейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия). После ингибирования эндогенной пероксидазы охлажденным 3% раствором перекиси водорода в течение 10 минут, проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 95ºС в течение 20 минут в 0,01 М цитратном буфере (pH 6,0) с целью восстановления антигенов в тканях. Инкубация с первичными антителами (анти-CD1a и анти-CD3) производилась при комнатной температуре в течение 60 минут. Визуализацию связавшихся продуктов реакции проводили биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB+Kit, HRP [48], диаминобензидин. Для в качестве фонового красящего окрашивания вещества использовали применяли гематоксилин. Отрицательным контролем служили срезы, при окраске которых исключались первичные антитела. 2.5. Метод морфометрии Производился подсчет клеток в 50 полях зрения микроскопа Микмед-5 (ОАО Ломо, Россия) при увеличении 400 и 1000 с помощью программы «Image G». Измерение площадей коркового и мозгового вещества долек тимуса производилось с применением демо-версии программы «Sigma Scan Pro 5.0». 2. 6. Математические методы исследования 1) корреляционный анализ применялся для выявления достоверной взаимосвязи между интенсивностью люминесценции биогенных аминов в структурах 44 тимуса. Корреляционным анализом взаимосвязь между показателями считали достоверой при критерии значимости менее 0,05. Коэффициент корреляции рассчитывался по программе SPSS Statistics 17.0 (2008). Связь между количествами клеток считали слабой при значении коэффициента корреляции r = менее 0,3, умеренной при значении коэффициента корреляции r = 0,31 – 0,69 и сильной при значении коэффициента корреляции r = 0,7 – 1,0 [50, 91]. 2) статистический анализ обработки полученных цифровых данных проводился с использованием пакета программ Microsoft Оffice® Excel 2007 и SPSS Statistics 17.0 (2008) [68]. В случае нормального распределения данных использовали параметрический критерий – t-критерий Стьюдента для независимых выборок. Если распределение отличалось от нормального, то использовали тест Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считались значимыми при критерии p < 0,05 [64]. 45 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Структурно-функциональное состояние тимуса мышей при поступлении мелатонина в различных световых условиях 3.1. Морфологическая характеристика тимуса В связи с тем, что в нашем исследовании рассматриваются разные сроки воздействия при неодинаковых условиях поступления гормона в организм мышей, нами был определен следующий порядок изложения фактического экспериментального материала: сравнение результатов при поступлении мелатонина в течение 2-х недель в условиях естественного освещения и постоянного затемнения, сравнение результатов при поступлении мелатонина в течение 4-х недель в условиях естественного освещения и искусственного затемнения, сравнение результатов для разных световых условий и сроков воздействия мелатонина на тимус мышей. При окраске гематоксилином и эозином гистологических срезов тимуса мышей контрольных и опытных групп хорошо визуализируется окружающая его соединительнотканная капсула, от которой отходят тонковолокнистые перегородки, не полностью разделяющие ткань органа. В тимусе определяются дольки с темным корковым веществом и более светлым мозговым веществом, в котором выявляются тельца Гассаля. У экспериментальных животных всех контрольных групп, а также мышей, получавших мелатонин в течение 2 недель в различных световых условиях, визуально корковое вещество долек тимуса значительно преобладает над мозговым веществом. При просмотре препаратов тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель и находившихся в условиях естественного освещения или постоянного затемнения, отмечается увеличение площади мозгового вещества долек (Рисунок 1). 46 а б в г Рисунок 1 – Тимус экспериментальных мышей. Окраска гематоксилином и эозином. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. а – тимус мыши контрольной группы, находившейся 4 недели в условиях естественного освещения, б – тимус мыши, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения, в – тимус мыши контрольной группы, находившейся 4 недели в условиях постоянного затемнения, г – тимус мыши, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения. 1 – мозговое вещество дольки, 2 – корковое вещество дольки. 47 Анализируя результаты морфометрических показателей тимусной дольки контрольных мышей, содержавшихся в условиях затемнения в течение 2 недель, не отмечено статистически значимых отличий площади коркового вещества и мозгового вещества, общей площади дольки по сравнению с контрольной группой животных, находившейся в условиях естественного освещения. Однако наблюдается незначительная тенденция к снижению соотношения Sк.в./Sм.в. с 4,81±0,12 до 4,41±0,08 (p < 0,05). Условия постоянного затемнения в течение 4 недель способствуют незначительному уменьшению общей площади дольки тимуса контрольных животных с 0,29±0,02 до 0,25±0,02 мм2 (p < 0,05) и площади коркового вещества с 0,24±0,01 до 0,21±0,01 (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой мышей, содержавшейся в естественных световых условиях в течение 4 недель. Соотношение Sк.в./Sм.в. при этом увеличилось до 5,11±0,12 (против 4,74±0,14, p < 0,05). Поступление мелатонина лабораторным мышам в условиях естественного освещения или постоянного затемнения в течение 2 недель не отражается на морфологических показателях тимусной дольки (Таблица 1). Однако эффекты мелатонина, вводимого в течение 2 недель, проявляются в снижении соотношения площади коркового вещества к площади мозгового вещества по сравнению с контрольными группами (3,84±0,11 и 4,81±0,12, p < 0,001, в условиях естественного освещения, 3,35±0,10 и 4,41±0,08, p < 0,001, в условиях постоянного затемнения). Изменение этого параметра напрямую связано с тенденцией к угнетению площади коркового вещества дольки под воздействием мелатонина. Морфометрические показатели тимуса экспериментальных мышей при поступлении в различных световых условиях мелатонина в течение 4 недель приведены в таблице 2. Обращает на себя внимание существенное увеличение площади мозгового вещества долек тимуса при поступлении мелатонина в течение месяца, независимо от условий освещения. 48 Таблица 1 – Морфометрические показатели тимуса экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 2 недель в различных световых условиях (M±m) Группы экспериментальных мышей Параметры Площадь дольки, мм2 Условия естественного освещения Условия постоянного затемнения 1-я контрольная группа 1-я опытная группа (мелатонин) 2-я контрольная группа 2-я опытная группа (мелатонин) 0,30±0,02 0,26±0,02 0,28±0,02 0,27±0,03 0,05±0,01 0,05±0,01 0,05±0,01 0,06±0,01 0,25±0,02 0,21±0,01 0,23±0,02 0,21±0,02 4,81±0,12 3,84±0,11** 4,41±0,08 3,35±0,10** 17,59±0,33 21,27±0,53 18,82±0,37 23,63±0,47 82,40±0,29 78,73±0,55 81,18±0,37 76,37±0,42 Площадь мозгового вещества дольки, мм2 Площадь коркового вещества дольки, мм2 Sк.в./Sм.в. Доля мозгового вещества дольки, % Доля коркового вещества дольки, % * – p < 0,05, ** – p < 0,001 49 Таблица 2 – Морфометрические показатели тимуса экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 4 недель в различных световых условиях (M±m) Группы экспериментальных мышей Условия естественного освещения Параметры Условия постоянного затемнения 3-я контрольная группа 3-я опытная группа (мелатонин) 4-я контрольная группа 4-я опытная группа (мелатонин) 0,29±0,02 0,26±0,02 0,25±0,02 0,24±0,02 0,05±0,01 0,10±0,01** 0,04±0,01 0,09±0,01** 0,24±0,01 0,16±0,01** 0,21±0,01 0,15±0,01** 4,74±0,14 1,77±0,07** 5,11±0,12 1,83±0,10** 17,77±0,41 37,16±0,76** 16,76±0,41 37,10±0,94** 83,03±0,61 62,84±0,68** 83,24±0,71 62,90±0,99** Площадь дольки, мм2 Площадь мозгового вещества дольки, мм2 Площадь коркового вещества дольки, мм2 Sк.в./Sм.в. Доля мозгового вещества дольки, % Доля коркового вещества дольки, % ** – p < 0,001 50 Так, у мышей, получавших гормон в условиях естественного освещения, площадь мозгового вещества долек тимуса увеличивается в 2,0 раза (p < 0,001), а в условиях постоянного затемнения – в 2,3 раза (p < 0,001). Кроме того, у опытных групп (срок эксперимента 4 недели) значительно уменьшается площадь коркового вещества долек тимуса по сравнению с животными контрольных групп: в 1,5 раза (p < 0,001) в условиях естественного освещения, и в 1,4 раза (p < 0,001) в условиях постоянного затемнения. В связи с этим изменяется и показатель соотношения площадей коркового и мозгового вещества долек тимуса. Он составляет 4,74±0,14 и 5,11±0,12 у мышей контрольных групп в условиях естественного освещения и условиях постоянного затемнения соответственно, а у мышей, получавших мелатонин, 1,77±0,07 (p < 0,001) и 1,83±0,10 (p < 0,001) соответственно. В тимусе доля мозгового вещества и коркового вещества по отношению к общей площади дольки составляет 37,16±0,76% (p < 0,001) и 62,84±0,67% (p < 0,001) у мышей, получавших мелатонин в течение месяца в условиях естественного освещения, а у контрольных мышей – 17,77±0,41% и 83,03±0,61%. У животных, получавших гормон в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, также отмечается увеличение доли мозгового вещества до 37,10±0,94% (против 16,76±0,41% у контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, p < 0,001) и снижение доли коркового вещества до 62,90±0,99% (против 83,24±0,71%, p < 0,001). Анализируя полученные данные, необходимо отметить, что изменение площади коркового вещества и площади мозгового вещества в дольках тимуса экспериментальных мышей, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения, напрямую связано со сроками поступления мелатонина и более выражено через 4 недели поступления гормона. Световые условия не оказывают значимого влияния на абсолютные и относительные значения площади коркового вещества и площади мозгового вещества долек тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель в различных световых условиях. 51 Отметим, что более длительное поступление в организм мышей мелатонина приводит к значимым изменениям нескольких морфометрических параметров. Если после 2 недель поступления мелатонина, независимо от условий освещения, значимо изменялось только соотношение площадей коркового и мозгового вещества долек тимуса, то после 4 недель поступления гормона наблюдается и статистически значимое снижение абсолютной и относительной площади коркового вещества, увеличивается абсолютная и относительная площадь мозгового вещества. Таким образом, поступление мелатонина в организм экспериментальных мышей отражается на морфометрических параметрах долек тимуса, и эти изменения более выражены при поступлении гормона в течение 4 недель. Кроме того, условия освещения не оказывают дополнительного влияния на эффект действия мелатонина. 3.2. CD1а-позитивные клетки тимуса CD1а – мембранный маркер кортикальных тимоцитов (дубль-позитивных лимфоцитов), отсутствует на зрелых Т-клетках, необходим для развития Тлимфоцитов [244]. При анализе гистологических препаратов тимуса мышей опытных и контрольных групп, обработанных моноклональными антителами к маркеру CD1а, клетки, экспрессирующие данный антиген имеют коричневую окраску цитоплазматических мембран. Клетки, не несущие данный маркер, окрашиваются в сине-голубой цвет. CD1а-позитивные клетки имеют округлую или овальную форму и располагаются в корковом веществе долек тимуса непосредственно под капсулой органа (Рисунки 2, 3). 52 а б Рисунок 2 – Тимус мышей, находившихся в условиях естественного освещения. Иммуногистохимическая реакция к CD1а. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD1a-позитивные клетки. в г Рисунок 3 – Тимус мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения. Иммуногистохимическая реакция к CD1а. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD1a-позитивные клетки. 53 Изменение количества CD1а-позитивных клеток в поле зрения (при увеличении 1000) в корковом веществе дольки тимуса опытных мышей под влиянием гормона и различных условий освещения представлено в Таблице 3. Таблица 3 – Количество CD1а-позитивных клеток в корковом веществе долек тимуса мышей опытных (поступление мелатонина) и контрольных групп Группы экспериментальных мышей Срок эксперимента 2 недели Условия естественного Условия постоянного освещения затемнения Параметры Количество CD1апозитивных клеток 1-я контрольная группа 1-я опытная группа (мелатонин) 2-я контрольная группа 2-я опытная группа (мелатонин) 47,46±2,74 46,80±1,60 41,50±1,97 43,20±2,36 Параметры Срок эксперимента 4 недели Условия естественного освещения Количество CD1апозитивных 3-я контрольная группа клеток 46,68±2,54 Условия постоянного затемнения 3-я опытная группа (мелатонин) 4-я контрольная группа 4-я опытная группа (мелатонин) 51,60±2,09 40,16±2,49 44,30±2,47 * – p < 0,05 Полученные данные демонстрируют, что поступление мелатонина в различных световых условиях не вызывает статистически значимых изменений по количеству CD1а-позитивных клеток в тимусе, что составляет при содержании животных в условиях естественного освещения 47,46±2,74 и 46,68±2,54 клеток в поле зрения у контрольных, 46,80±1,60 и 51,60±2,09 клеток в поле зрения у опытных мышей (2 и 4 недели эксперимента соответственно). Содержание мышей в условиях постоянного затемнения и поступление мелатонина на этом фоне также не вызывает статистически значимых различий по количеству CD1апозитивных клеток, что составляет 41,50±1,97 и 40,16±2,49 клеток в поле зрения у контрольных, 43,20±2,36 и 44,30±2,47 клеток в поле зрения у опытных мышей (2 и 4 недели эксперимента соответственно). 54 Таким образом, ни поступление мелатонина (в течение 2 или 4 недель), ни световые условия не оказывают влияния на количественные показатели CD1апозитивных клеток коркового вещества дольки тимуса экспериментальных животных. 3.3. CD3-позитивные клетки тимуса CD3 – это высокоспецифичный маркер Т-лимфоцитов [45, 154, 350]. При обработке срезов тимуса мышей контрольных и опытных групп, обработанных моноклональными антителами к маркеру CD3, клетки, несущие данный антиген имеют коричневую окраску цитоплазматических мембран. Окружающие клетки, не несущие данный маркер, окрашиваются в сине-голубой цвет. CD3-позитивные клетки имеют округлую или овальную форму и располагаются во всех морфофункциональных зонах дольки тимуса, с более плотным распределением в корковом веществе (Рисунки 4 – 7). а б Рисунок 4 – CD3-позитивные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 55 а б Рисунок 5 – CD3-позитивные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). а б Рисунок 6 – CD3-позитивные клетки мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 56 а б Рисунок 7 – CD3-позитивные клетки мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). Визуально, при просмотре препаратов тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения и постоянного затемнения, отмечается снижение плотности CD3-позитивных клеток в корковом и мозговом веществе дольки по сравнению с контрольными животными. Представление о количественном распределении CD3-позитивных клеток дает подсчет их в поле зрения при увеличении 1000 (Таблица 4). Как видно из таблицы, стистически значимых различий по количеству CD3позитивных клеток в различных зонах долек тимуса контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель, по отношению к данным показателям естественного освещения, не выявлено. мышей, находившихся в условиях 57 Таблица 4 – Количество CD3-позитивных клеток в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей (в поле зрения при увеличении 1000) Параметры Корковое вещество долек Мозговое вещество долек Граница коркового и мозгового вещества Группы экспериментальных мышей Срок эксперимента 2 недели Условия естественного Условия постоянного освещения затемнения 1-я контрольная группа 1-я опытная группа (мелатонин) 2-я контрольная группа 2-я опытная группа (мелатонин) 548,06±11,79 415,02±9,24** 516,12±8,20 426,96±13,07** 414,18±10,20 357,30±6,49** 390,12±8,16 334,40±8,26** 166,20±2,78 128,16±3,10** 149,02±4,29 132,76±4,17* Срок эксперимента 4 недели Параметры Условия естественного освещения 3-я контрольная группа 3-я опытная группа (мелатонин) Корковое вещество 536,88±10,77 305,52±11,77** долек Мозговое вещество 421,36±9,81 254,82±9,63** долек Граница коркового и 158,72±2,13 110,72±2,78** мозгового вещества * – p < 0,05, ** – p < 0,001 Условия постоянного затемнения 4-я контрольная группа 4-я опытная группа (мелатонин) 521,14±12,75 320,84±8,97** 403,30±12,38 237,20±6,49** 152,32±2,86 107,76±2,52** 58 Поступление гормона в течение 2 недель в условиях естественного освещения и искусственного затемнения приводит к снижению количества CD3позитивных клеток, что составляет в корковом веществе дольки 415,02±9,24 (против 548,06±11,79 клеток у мышей 1-й контрольной группы, p < 0,001) и 426,96±13,07 (против 516,12±8,20 клеток у мышей 2-й контрольной группы, p < 0,001) клетки в поле зрения соответственно, в мозговом веществе дольки 357,30±6,49 (против 414,18±10,20 клеток у мышей 1-й контрольной группы, p < 0,001) и 334,40±8,26 (против 390,12±8,16 клеток у мышей 1-й контрольной группы, p < 0,001) клетки в поле зрения соответственно. На границе коркового и мозгового вещества дольки также отмечается снижение плотности расположения CD3-позитивных клеток после 2-х недельного поступления мелатонина с водой в условиях естественного освещения с 166,20±2,78 до 128,16±3,10 клеток в поле зрения (p < 0,001), в условиях постоянного затемнения с 149,02±4,29 до 132,76±4,17 клеток в поле зрения (p < 0,05). При поступлении гормона в течение 4 недель в различных условиях освещения, изменения количественных показателей CD3-позитивных клеток начинают носить более выраженный характер. Так, у мышей, получавших мелатонин в условиях естественного освещения, количество клеток в поле зрения снизилось в корковом веществе дольки в 1,8 раза (p < 0,001), в мозговом веществе дольки – в 1,7 раза (p < 0,001), на границе коркового и мозгового вещества – в 1,4 раза (p < 0,001). В условиях постоянного затемнения поступление мелатонина также приводит к снижению CD3позитивных клеток в поле зрения в корковом веществе в 1,6 раза (p < 0,001), в мозговом веществе дольки – в 1,7 раза (p < 0,001), на границе коркового и мозгового вещества – в 1,4 раза (p < 0,001). Таким образом, поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в организм опытных мышей независимо от условий освещения снижает количество CD3-позитивных клеток в корковом и мозговом веществе дольки тимуса, на границе коркового и мозгового вещества. Наиболее выраженное снижение 59 количества CD3-позитивных клеток необходимо отметить у животных, получавших гормон в течение 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения. 3.4. CD57-позитивные клетки тимуса По данным ряда авторов CD57 – это мембранный антиген, который является маркером терминальной дифференцировки NK-клеток [314, 356, 365]. При обработке срезов тимуса мышей опытных и контрольных групп моноклональными антителами к маркеру CD57, клетки, экспрессирующие этот антиген имеют яркую красно-коричневую окраску цитоплазматических мембран, контрастируя на сине-голубом фоне клеток, не экспрессирующих данный антиген. CD57-позитивные клетки имеют различную форму (округлую, овальную, вытянутую) и располагаются во всех морфофункциональных зонах дольки тимуса, преимущественно в корковом веществе (Рисунки 8, 9). а б Рисунок 8 – Корковое вещество дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD57. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD57-позитивные клетки. 60 а б Рисунок 9 – Корковое вещество дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD57. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD57-позитивные клетки. Подсчет CD57-позитивных клеток при увеличении 1000 дает представление об их количестве в поле зрения (Таблица 5). Как видно из таблицы, пребывание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения приводит к изменению количественных показателей CD57-позитивных клеток, в зонах тимусной дольки. Так, у контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 2 недель, в мозговом веществе дольки отмечается увеличение количества CD57-позитивных клеток в 2 раза (p < 0,05), а у мышей, находившихся в условиях постоянной темноты в течение 4 недель, количество CD57-позитивных клеток в мозговом веществе дольки увеличивается в 1,7 раза (p < 0,05) по сравнению с контрольными мышами, находившимися в естественном световом режиме. У мышей 1-й опытной группы, получавших мелатонин в течение 2 недель в условиях естественного освещения, максимальная плотность CD57-позитивных клеток, наблюдаемая в корковом веществе долек тимуса, составляет 9,54±0,89 штук в поле зрения, что в 4,7 раза превышает количество этих клеток у мышей 1-й контрольной группы (p < 0,001). 61 Таблица 5 – Количество CD57+ клеток в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей (в поле зрения при увеличении 1000) Параметры Корковое вещество долек Мозговое вещество долек Граница коркового и мозгового вещества Параметры Группы экспериментальных мышей Срок эксперимента 2 недели Условия естественного Условия постоянного освещения затемнения 1-я 1-я опытная 2-я 2-я опытная контрольная группа контрольная группа группа (мелатонин) группа (мелатонин) 2,04±0,42 9,54±0,89** 2,68±0,28 16,40±1,81** 0,20±0,06 0,92±0,18** 0,40±0,07 3,26±0,61** 0,30±0,07 1,00±0,22* 0,54±0,09 2,24±0,24** Срок эксперимента 4 недели Условия естественного Условия постоянного освещения затемнения 3-я 3-я опытная 4-я 4-я опытная контрольная группа контрольная группа (мелатонин) группа (мелатонин) группа Корковое вещество 2,18±0,25 долек Мозговое вещество 0,30±0,08 долек Граница коркового и 0,40±0,08 мозгового вещества * – p ≤ 0,05, ** – p ≤ 0,001 7,78±0,87** 2,60±0,25 16,70±1,47** 1,52±0,27** 0,50±0,07 3,76±0,44** 1,76±0,23** 0,58±0,09 3,84±0,51** 62 В мозговом веществе дольки тимуса количество CD57-позитивных клеток составляет 0,96±0,18 штук в поле зрения, что в 5 раз выше показателя 1-й контрольной группы животных (p < 0,001). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса отмечается трехкратное увеличение количества CD57позитивных клеток в поле зрения (p < 0,05) по сравнению с таковым показателем у мышей, находившихся в течение 2 недель в условиях естественного освещения. Поступление мелатонина в организм мышей, находившихся в течение 2 недель в условиях постоянного затемнения, вызывает изменения сходного характера. Количество CD57-позитивных клеток в корковом веществе долек составляет 16,40±1,81 клеток в поле зрения, что в 6 раз больше, чем у мышей 2-й контрольной группы (p < 0,001). В мозговом веществе дольки тимуса количество CD57-позитивных клеток составляет 3,26±0,61 штук в поле зрения, что в 8 раз выше показателя 2-й контрольной группы животных (p < 0,001). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса отмечается четырехкратное увеличение (p < 0,001) количества CD57-позитивных клеток в поле зрения по сравнению с мышами 2-й контрольной группы, находившимися в течение 2 недель в условиях постоянного затемнения. При поступлении мелатонина в течение 4 недель в условиях естественного освещения количество CD57-позитивных клеток в корковом веществе составляет 7,78±0,87 клеток в поле зрения, что в 3,5 раза больше, чем у мышей 3-й контрольной группы (p < 0,001). В мозговом веществе дольки тимуса количество CD57-позитивных клеток составляет 1,52±0,27 штук в поле зрения, что в 5 раз превышает показатель 3-й контрольной группы животных (p < 0,001). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса отмечается четырехкратное увеличение количества CD57-позитивных клеток до 1,76±0,23 в поле зрения (p < 0,001) по сравнению с контрольными мышами, находившимися 4 недели в условиях естественного освещения. При микроскопии срезов тимуса мышей 4-й опытной группы, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, CD57- 63 позитивные клетки в неравномерном количестве выявляются во всех зонах дольки тимуса, концентрируясь в корковом веществе дольки. Количество CD57позитивных клеток в корковом веществе долек составляет 16,70±1,47 штук в поле зрения, что в 6,4 раза больше, чем у мышей 4-й контрольной группы (p < 0,001). В мозговом веществе дольки тимуса количество CD57-позитивных клеток составляет 3,76±0,44 штук в поле зрения, что в 7,5 раз выше показателя 4-й контрольной группы животных (p < 0,001). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса отмечается шестикратное увеличение (p < 0,001) количества CD57-позитивных клеток по сравнению с мышами 4-й контрольной группы, находившимися в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, и составляет 3,84±0,51 клеток в поле зрения. Итак, поступление в организм экспериментальных мышей мелатонина независимо от длительности (в течение 2 или 4 недель) и условий освещения, значительно увеличивает количество CD57-позитивных клеток в корковом и мозговом веществе дольки тимуса, на границе между корковым и мозговым веществом, Наиболее выраженное увеличение количества CD57-позитивных клеток отмечается у животных, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель в условиях постоянного затемнения. 3.5. CD68-позитивные клетки тимуса CD68 – это скавенджер-рецептор [272, 326], маркер клеток моноцитарно/макрофагальной линии, лизосом-ассоциированный мембранный гликопротеин [114, 338]. При обработке гистологических срезов тимуса экспериментальных мышей моноклональными антителами к маркеру CD68, выявлялись макрофаги. CD68позитивные клетки располагались во всех морфофункциональных зонах дольки тимуса: в корковом и мозговом веществе, на границе коркового и мозгового вещества дольки. Наибольшая плотность расположения CD68-позитивных клеток определялась в корковом веществе дольки (Рисунки 10, 11). 64 а б Рисунок 10 – Корковое вещество дольки тимуса мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD68. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD68позитивные клетки. а б Рисунок 11 – Корковое вещество дольки тимуса мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD68. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы (поступление мелатонина). 1 – CD68позитивные клетки. 65 Клетки, экспрессирующие маркер CD68, имеют морфологию, характерную для макрофагов: они большего размера, нежели окружающие их лимфоциты, имеют преимущественно полигональную форму, однако встречаются клетки округлой и овальной формы. В цитоплазме CD68-позитивных клеток определяются яркие красно-коричневые гранулы, имеющие вариабельное количество и размеры. Окружающие клетки тимусной дольки, не экспрессирующие данный антиген, были окрашены в сине-голубой цвет. При увеличении х1000 был произведен подсчет CD68-позитивных клеток в поле зрения во всех морфофункциональных зонах долек тимуса для каждой группы экспериментальных мышей, данные представлены в Таблице 6. Как видно из таблицы, пребывание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения приводит к изменению количественных показателей макрофагов в зонах тимусной дольки. Так, у контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель, в корковом веществе дольки отмечается увеличение количества CD68-позитивных клеток в 1,5 раза (p < 0,05), на границе коркового и мозгового вещества дольки – в 2 раза (p < 0,05), а также в 2 раза (p < 0,05) мозговом веществе дольки (срок эксперимента 4 недели) по сравнению с контрольными животными, находившимися в условиях естественного освещения. При поступлении мелатонина в естественных условиях освещения в течение 2 недель количество CD68-позитивных клеток в корковом веществе долек тимуса опытных мышей составляет 12,80±0,94 в поле зрения, что в 5,7 раза больше, чем у мышей 1-й контрольной группы (p < 0,001). В мозговом веществе долек тимуса количество CD68-позитивных клеток составляет 2,02±0,33 в поле зрения, что в 3,5 раза больше, чем показатель 1-й контрольной группы животных (p < 0,001). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса отмечается увеличение количества CD68-позитивных клеток в 4,7 раза (p < 0,001) по сравнению с мышами 1-й контрольной группы, и составляет 1,80±0,22 клетки в поле зрения. 66 Таблица 6 – Количество CD68-позитивных клеток в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей (в поле зрения при увеличении 1000) Группы экспериментальных мышей Срок эксперимента 2 недели Параметры Корковое вещество долек Мозговое вещество долек Граница коркового и мозгового вещества Условия естественного освещения Условия постоянного затемнения 1-я контрольная группа 1-я опытная группа (мелатонин) 2-я контрольная группа 2-я опытная группа (мелатонин) 2,22±0,41 12,80±0,94** 3,76±0,48 16,80±1,64** 0,58±0,12 2,02±0,33** 0,94±0,15 1,98±0,23** 0,38±0,01 1,80±0,22** 0,86±0,15 2,20±0,23** Срок эксперимента 4 недели Параметры Условия естественного освещения 3-я контрольная группа Корковое вещество 2,76±0,52 долек Мозговое 0,50±0,08 вещество долек Граница коркового и 0,46±0,09 мозгового вещества * – p < 0,05, ** – p < 0,001 Условия постоянного затемнения 3-я опытная группа (мелатонин) 4-я контрольная группа 4-я опытная группа (мелатонин) 15,00±1,40** 4,04±0,51 17,02±1,65** 1,94±0,26** 1,10±0,18 2,36±0,45* 2,20±0,32** 0,98±0,18 3,62±0,38** 67 У мышей, получавших мелатонин в течение 2 недель в условиях постоянного затемнения, количество CD68-позитивных клеток в корковом веществе долек составляет 16,80±1,64 клеток в поле зрения, что в 4,5 раза превышает этот показатель у мышей 2-й контрольной группы (p < 0,001). В мозговом веществе дольки тимуса количество CD68-позитивных клеток двукратно превышает этот показатель у мышей 2-й контрольной группы, и составляет 1,98±0,23 в поле зрения (p < 0,001). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса количество исследуемых клеток имеет тенденцию к увеличению в 2,5 раза (p < 0,001) по отношению к животным 2-й контрольной группы и составляет 2,20±0,23 клеток в поле зрения. Поступление мелатонина в течение 4 недель в условиях естественного освещения, приводит к визуальному увеличению количества CD68-позитивных клеток в корковом и мозговом веществе тимусных долек. Максимальная плотность CD68-позитивных клеток в морфофункциональных зонах тимуса обнаруживается в корковом веществе долек и составляет 15,00±1,40 клеток в поле зрения, что в 5,4 раза выше значения мышей 3-й контрольной группы (p < 0,001). В мозговом веществе дольки тимуса количество макрофагов составляет 1,94±0,26 клеток в поле зрения, что в 3,9 раз превышает показатель 3-й контрольной группы животных (p < 0,001). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса отмечается пятикратное увеличение количества CD68-позитивных клеток до 2,20±0,32 в поле зрения (p < 0,001) по сравнению с контрольными мышами, содержащимися в течение 4 недель в условиях естественного освещения. При микроскопическом исследовании срезов тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, количество макрофагов в корковом веществе долек увеличивается в 4,2 раза (p < 0,001) по сравнению с животными 4-й контрольной группы и составляет 17,02±1,65 клеток в поле зрения. В мозговом веществе дольки тимуса количество CD68-позитивных клеток составляет 2,36±0,45 в поле зрения, что в 2,1 раза выше показателя 4-й контрольной группы животных (p < 0,05). На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса выявляется четырехкратное увеличение (p < 0,001) 68 количества CD68-позитивных клеток по сравнению с мышами 4-й контрольной группы, находившимися в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, что составляет 3,62±0,38 клеток в поле зрения. Несмотря на то, что под действием мелатонина количество макрофагов увеличивается во всех морфофункциональных зонах, самые значительные изменения происходят в корковом веществе долек тимуса. Таким образом, поступление мелатонина в организм экспериментальных мышей в течение 2 или 4 недель независимо от условий освещения, приводит к увеличению плотности расположения CD68-позитивных клеток во всех морфофункциональных зонах тимусной дольки. И эти изменения более выражены в дольках тимуса мышей, получавших мелатонин в условиях естественного светового режима. 3.6. Тучные клетки тимуса Для изучения особенностей влияния мелатонина в естественных условиях освещения и условиях постоянного затемнения на тучные клетки срезы тимуса экспериментальных мышей окрашивались полихромным толуидиновым синим по Унна. Метод основан на использовании спиртового раствора двух красителей – метиленового синего и полихромного толуидинового синего. Сочетание этих двух красителей позволяет одномоментно и оценить количественное распределение тучных клеток по зонам тимусной дольки, и получить представление о степени сульфатированности кислых мукополисахаридов в гранулах тучных клеток. По состоянию мукополисахаридов тучные клетки оценивались следующим образом [26]: α-ортохромные тучные клетки с голубой окраской цитоплазмы; β1-метахроматичные тучные клетки с гранулами темно-синего цвета; β2-метахроматичные тучные клетки, имеющие фиолетовую окраску гранул; β3-метахроматичные тучные клетки с красно-фиолетовыми гранулами. 69 По степени дегрануляции, согласно классификации Линднер Д. П. (1989) и Стручко Г. Ю. (1999), выделяют следующие формы тучных клеток: То формы – гранулы расположены плотно в цитоплазме, ядро клетки визуально не определяется; Т1 формы – ядро просматривается хорошо, гранулы располагаются внутри клетки, за пределы цитоплазматической мембраны не выходят; Т2 формы – гранулы частично выходят за пределы неповрежденной цитоплазматической мембраны; Т3 формы – полностью дегранулированные, опустошенные клетки, либо с разорванной цитоплазматической мембраной. В тимусе экспериментальных мышей тучные клетки определялись и в соединительнотканных корковых перегородках, и в паренхиме коркового вещества долек. У мышей, не получавших мелатонин, тучные клетки имеют преимущественно неправильную форму, в них четко видны отдельные гранулы и слабо окрашенное ядро (Рисунок 12 а, б). Отличительной визуальной особенностью тучных клеток мышей, получавших мелатонин, является их округло-овальная форма, ядра в части клеток не просматриваются (Рисунок 12 в, г). Обращает на себя внимание, что в поле зрения при увеличении х400 количество тучных клеток под воздействием мелатонина, независимо от срока воздействия и условий освещения, претерпевает определенные изменения (Таблица 7). Обращает на себя внимание факт наличия статистически значимых различий по количеству тучных клеток в поле зрения между двумя контрольными группами, одна из которых находилась в условиях постоянного затемнения, а другая в естественных условиях освещения (срок эксперимента 4 недели). Так, в соединительнотканных корковых перегородках количество тучных клеток в условиях постоянного затемнения выросло в 1,6 раза (p < 0,001), а в паренхиме – в 1,5 раза (p < 0,05). 70 а б в г Рисунок 12 – Тучные клетки тимуса экспериментальных мышей. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. а, б – тимус мыши контрольной группы, находившейся в течение 4 недель в условиях естественного освещения и постоянного затемнения соответственно, в, г – тимус мыши опытной группы, получавшей мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения и постоянного затемнения соответственно. 1 – тучные клетки. 71 Таблица 7 – Количество тучных клеток в тимусе (в поле зрения при увеличении х400) экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в различных световых условиях (M±m) Группы экспериментальных мышей Срок эксперимента 2 недели Условия естественного Условия постоянного освещения затемнения Параметры 1-я 1-я опытная 2-я 2-я опытная контрольная группа контрольная группа группа (мелатонин) группа (мелатонин) 2,64±0,22 3,14±0,20 2,48±0,21 3,50±0,22* 1,80±0,24 2,24±0,22 2,04±0,18 2,58±0,20* Корковые перегородки тимуса Паренхима тимуса Срок эксперимента 4 недели Параметры Условия естественного Условия постоянного освещения затемнения 3-я 3-я опытная 4-я 4-я опытная контрольная группа контрольная группа группа (мелатонин) группа (мелатонин) 2,78±0,18 3,68±0,29* 4,42±0,25 6,42±0,22** 1,88±0,19 2,58±0,21* 2,86±0,24 3,60±0,22* Корковые перегородки тимуса Паренхима тимуса * – p < 0,05, ** – p < 0,001 72 Поступление мелатонина в течение 2 недель в условиях естественного освещения не вызываетстатистически значимых изменений общего количества тучных клеток в соединительнотканных корковых перегородках и паренхиме тимуса опытных мышей. У первой контрольной группы мышей общее число тучных клеток составило 2,64±0,22 штуки в поле зрения в корковых перегородках и 1,80±0,24 штуки в поле зрения в паренхиме тимуса, а у мышей опытной группы – 3,14±0,20 штук и 2,24±0,22 штук в поле зрения соответственно. На фоне поступления мелатонина в организм мышей 2-й опытной группы в условиях постоянного затемнения в течение 2 недель наблюдается тенденция к незначительному увеличению общего количества тучных клеток в паренхиме тимуса до 2,58±0,20 штук (против 2,04±0,18 штук у животных 2-й контрольной группы, p < 0,05) и в корковых перегородках до 3,50±0,22 штук (против 2,48±0,21 штук у мышей 2-й контрольной группы, p < 0,05). В тимусе мышей 3-й опытной группы поступление мелатонина в течение 4 недель в условиях естественного освещения приводит к увеличению количества тучных клеток в корковых перегородках с 2,78±0,18 до 3,68±0,29 штук (p < 0,05), в паренхиме органа с 1,88±0,19 до 2,58±0,21 штук в поле зрения (p < 0,05). Поступление мелатонина в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения приводит к увеличению количества тучных клеток в корковых перегородках тимуса в 1,5 раза, что составляет 6,42±0,22 клеток в поле зрения (против 4,42±0,25 клеток в поле зрения у четвертой контрольной группы, p < 0,001). На характер распределения тучных клеток между корковыми перегородками и паренхимой тимуса ни поступление мелатонина, ни световые условия влияния не оказывают. Распределение тучных клеток по характеру метахромазии в соединительнотканных корковых перегородках и в паренхиме тимуса на сроке воздействия гормона в течение 2 недель приведено на Рисунке 13. Содержание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения в течение 2 недель не оказывает влияние на степень метахромазии тучных клеток. 73 контроль, естественное освещение 39 мелатонин, естественное освещение 57 29 4 53 18* β1 β2 контроль, постоянное затемнение 38 мелатонин, постоянное затемнение 54 18* 0% 70 20% 40% β3 8 12 60% 80% 100% а контроль, естественное освещение 49 мелатонин, естественное освещение 48 32 3 53 15* β1 β2 контроль, постоянное затемнение 40 мелатонин, постоянное затемнение 58 22 0% 2 67 20% 40% 60% β3 11* 80% 100% б Рисунок 13 – Характеристика тучных клеток по степени метахромазии в тимусе экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 2 недель в различных световых условиях, %: а – в соединительнотканных корковых перегородках, б – в паренхиме тимуса. * – p < 0,05. 74 Поступление мелатонина в течение 2 недель животным, содержавшимся в режиме естественного освещения, приводит к увеличению степени метахромазии в тучных клетках тимуса. Так, преимущественно преобладают клетки с β2метахромазией (53% в корковых перегородках и 53% паренхиме), увеличивается доля клеток с β3-метахромазией, что составляет 15% в паренхиме органа и 18% в корковых перегородках (против 3% и 4% соответственно у мышей 1-й контрольной группы, p < 0,05). В условиях постоянного затемнения под действием мелатонина у мышей 2й опытной группы в корковых перегородках уменьшается доля тучных клеток с β1-метахромазией с 38% до 18% (p < 0,05), а в паренхиме тимуса увеличивается доля клеток с β3-метахромазией с 2% до 11% (p < 0,05). Распределение тучных клеток по характеру метахромазии в соединительнотканных корковых перегородках и в паренхиме тимуса на сроке воздействия в течение 4 недель приведено на рисунке 14. Поступление мелатонина в течение 4 недель в условиях естественного освещения в организм экспериментальных животных приводит к увеличению степени метахромазии тучных клеток. В корковых перегородках происходит увеличение доли тучных клеток с β2-метахромазией до 79% (против 49% животных 3-й контрольной группы, p < 0,001) за счет уменьшения доли β1метахроматичных клеток до 9% (против 44% у животных 3-й контрольной группы, p < 0,001). В паренхиме тимуса также отмечается снижение доли β1метахроматичных тучных клеток до 9% (против 48% у животных 3-й контрольной группы, p < 0,001) за счет увеличения доли клеток с β2 и β3 степенью метахромазии до 71% (p < 0,05) и 20% (p < 0,001) соответственно. Экзогенный мелатонин, поступающий в течение 4 недель, способствует увеличению числа метахроматичных тучных клеток в условиях постоянного затемнения. Так, в корковых перегородках доля β1-метахроматичных клеток имела тенденцию к уменьшению и составила 5% (против 29% у мышей четвертой контрольной группы, p < 0,001). 75 контроль, естественное освещение 44 мелатонин, естественное освещение 49 9** 7 79** 12 β1 β2 контроль, постоянное затемнение 29 63 мелатонин, постоянное 5** затемнение 0% 82* 20% 40% β3 8 13 60% 80% 100% а контроль, естественное освещение 48 мелатонин, естественное освещение 9** 50 2 71* 20** β1 β2 контроль, постоянное затемнение 37 мелатонин, постоянное затемнение 60 12** 0% 3 69 20% 40% β3 19 60% 80% 100% б Рисунок 14 – Характеристика тучных клеток по степени метахромазии в тимусе экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 4 недель в различных световых условиях, %: а – в соединительнотканных корковых перегородках, б – в паренхиме тимуса. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 76 Доля β2-метахроматичных тучных клеток напротив имела тенденцию к увеличению и достигла 82% (против 63% у животных четвертой контрольной группы, p < 0,05), доля тучных клеток с β3-метахромазией составила 13%. В паренхиме тимуса также отмечается снижение доли β1-метахроматичных тучных клеток до 12% (против 37% у мышей 4-й контрольной группы, p < 0,001), доля клеток с β2- и β3-метахромазией составляет 69% и 19% соответственно. Примечательно, что тучные клетки тимуса контрольных мышей, находящихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель реагируют на изменение световых условий независимо от поступления мелатонина. Так, в соединительнотканных корковых перегородках доля β1, β2 и β3-метахроматичных тучных клеток составляет 44%, 49% и 7%, в то время как у мышей, пребывавших в условиях постоянного затемнения эта доля составляет 29%, 63% и 8%. В паренхиме тимуса эти показатели равны 48%, 50% и 2%, и 37%, 60% и 3% соответственно. Таким образом, поступление мелатонина в организм лабораторных мышей приводит к увеличению доли тучных клеток с β2 и β3 степенью метахромазии. Распределение тучных клеток по степени дегрануляции в зависимости от условий освещения при поступлении мелатонина в течение 2 недель представлено на рисунке 15. Нахождение контрольных мышей в условиях постоянного затемнения в течение 2 недель не отражается на степени дегрануляции тучных клеток. На сроке эксперимента 2 недели при условиях естественного освещения под влиянием мелатонина обнаруживается тенденция к увеличению доли Т0 форм тучных клеток до 23% в корковых перегородках (против 9% у мышей 1-й контрольной группы, p < 0,05) и 24% в паренхиме тимуса (против 13% у мышей 1-й контрольной группы, p < 0,05). Доля Т3 форм клеток имела обратную тенденцию и снизилась до 10% в корковых перегородках (против 24% у мышей 1й контрольной группы, p < 0,05) и 6% в паренхиме тимуса (против 21% у животных 1-й контрольной группы, p < 0,05). 77 контроль, естественное освещение 9 мелатонин, естественное освещение контроль, постоянное затемнение 35 32 23 24 42 25 10* Т0 Т1 Т2 4 27 мелатонин, постоянное затемнение 29 34** 0% 40 17 20% 25 40% Т3 24 60% 80% 100% а контроль, естественное освещение 13 мелатонин, естественное освещение 37 29 24 21 46 24 6* Т0 Т1 Т2 контроль, постоянное затемнение 7 мелатонин, постоянное затемнение 35 20 39** 0% 20% 38 23 40% 19 60% Т3 19** 80% 100% б Рисунок 15 – Характеристика тучных клеток по степени дегрануляции в тимусе экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 2 недель в различных световых условиях, %: а – в соединительнотканных корковых перегородках, б – в паренхиме тимуса. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 78 Сходные результаты наблюдаются на этом сроке при поступлении мелатонина и в условиях постоянного затемнения. У мышей 2-й опытной группы доля Т0 форм тучных клеток составляет в корковых перегородках 34% (против 4% у мышей 2-й контрольной группы, p < 0,001), в паренхиме тимуса 39% (против 7% у животных 2-й контрольной группы, p < 0,001). Доля Т1 форм в корковых перегородках не превышала 17%, доля Т2 и Т3 форм составляет 25% и 24% соответственно. В паренхиме отмечается тенденция к уменьшению доли Т3 форм тучных клеток до 19% (против 38% у мышей 2-й контрольной группы, p < 0,05). Доля Т1 и Т2 форм составляется 23% и 19% соответственно. Под действием мелатонина, поступающего в течение 4 недель в условиях естественного освещения, отмечается тенденция к увеличению доли Т0 форм тучных клеток, что составляет в корковых перегородках 28% (против 11% у животных 3-й контрольной группы, p < 0,05), в паренхиме тимуса 20%. Доля Т1 форм в корковых перегородках не превышала 21%, Т2 и Т3 формы составили 24% и 27% соответственно. В паренхиме доля Т1 форм составляет 26%, Т2 и Т3 формы - 23% и 31% соответственно. Распределение тучных клеток по степени дегрануляции под влиянием мелатонина (срок эксперимента 4 недели) и в зависимости от условий освещения приведено на рисунке 16. Особенностью распределения тучных клеток тимуса контрольных мышей, находящихся в условиях постоянного затемнения, по степени дегрануляции является значительное увеличение доли Т3-форм. После двух недель в условиях постоянного затемнения доля Т3-форм тучных клеток по сравнению с контрольной группой, находившейся при естественном освещении, составляет для соединительнотканных корковых перегородок 40% и 24%, а для паренхимы 38% (p < 0,05) и 21% соответственно. После 4 недель пребывания в условиях постоянного затемнения эти показатели составляют 68% (p < 0,001) и 28% в корковых перегородках, и 59% (p < 0,001) и 26% в паренхиме тимуса соответственно. 79 контроль, естественное освещение 11 32 мелатонин, естественное освещение 29 28* 21 28 24 Т0 27 Т1 Т2 контроль, постоянное 1 6 затемнение 25 мелатонин, постоянное затемнение 68 33** 0% 26* 20% Т3 20 40% 60% 21** 80% 100% а контроль, естественное освещение 12 мелатонин, естественное освещение контроль, постоянное затемнение 34 20 28 26 26 23 31 Т0 Т1 Т2 5 мелатонин, постоянное затемнение 14 22 59 36** 0% 20% 40* 40% 60% Т3 13 80% 11** 100% б Рисунок 16 – Характеристика тучных клеток по степени дегрануляции в тимусе экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 4 недель в различных световых условиях, %: а – в соединительнотканных корковых перегородках, б – в паренхиме тимуса. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 80 Поступление мелатонина в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения вызывает увеличение доли Т0 и Т1 форм тучных клеток в корковых перегородках до 33% (против 1% у мышей четвертой контрольной группы, p < 0,001) и 26% (против 6% у животных четвертой контрольной группы, p < 0,05) соответственно. Доля Т3 форм тучных клеток, в тимусе мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, снизилась до 21% (против 68% у мышей 4-й контрольной группы, p < 0,001), доля Т2 форм не превышала 20%. В паренхиме тимуса наблюдается схожая картина. Отмечается увеличение доли Т0 форм клеток до 36% (против 5% в 4-й контрольной группе, p < 0,001), доля Т1 форм клеток достигает 40% (против 14% в четвертой контрольной группе, p < 0,001), доля Т3 форм снижается до 11% (против 59% в четвертой контрольной группе, p < 0,001), доля Т2 форм составляет 13%. Таким образом, поступление мелатонина в организм мышей в течение 2 или 4 недель в различных условиях освещения вызывает изменение качественных и количественных характеристик тучных клеток, что проявляется небольшим увеличением степени сульфатированности кислых мукополисахаридов гранул тучных клеток тимуса и значительным повышением доли клеток без признаков дегрануляции. В то время как у контрольных мышей, содержавшихся в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель, увеличивается степень дегрануляции тучных клеток в тимусе. 3.7. Морфофункциональная реакция биоаминсодержащих структур тимуса экспериментальных животных Для понимания вопросов взаимодействия биоаминсодержащих структур тимуса при поступлении мелатонина в различных световых условиях был использован люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста [153] и люминесцентно-гистохимический модификации Е. М. Крохиной [52, 173]. метод Фалька-Хилларпа в 81 3.7.1. Гистаминсодержащие клетки тимуса Люминесцентно-гистохимических метод Кросса, Эвена, Роста позволил выявить клетки, содержащие гистамин в тимусе экспериментальных мышей. На границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса располагаются в один – два ряда люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек), которые окружают мозговое вещество долек непрерывным ободком. Клетки крупные, полигональной формы, содержат желтые гранулы различной величины. В данных клетках четко прослеживаются межгранулярные пространства (Рисунки 17, 18). По периферии коркового вещества долек видны беспорядочно располагающиеся люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК коркового вещества долек) с мелкими гранулами желтого свечения в цитоплазме. По размерам данные клетки меньше, чем люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества долек (Рисунки 19, 20). Ядра выявляемых клеток не люминесцируют. Между ярко светящимися гранулярными клетками тимуса располагаются тимоциты коркового и мозгового вещества долек. а б Рисунок 17 – Люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях естественного освещения. Метод Кросса, Эвена, Роста. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы, получавшей мелатонин. 1 – люминесцирующие гранулярные клетки. 82 а б Рисунок 18 – Люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса животных, находившихся в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения. Метод Кросса, Эвена, Роста. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы, получавшей мелатонин. 1 – люминесцирующие гранулярные клетки а б Рисунок 19 – Люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в течение 4 недель в условиях естественного освещения. Метод Кросса, Эвена, Роста. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы, получавшей мелатонин. 1 – люминесцирующие гранулярные клетки. 83 а б Рисунок 20 – Люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения. Метод Кросса, Эвена, Роста. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы, получавшей мелатонин. 1 – люминесцирующие гранулярные клетки. Нами были построены графики, отражающие интенсивность свечения гистамина в ЛГК коркового вещества долек тимуса на разных сроках эксперимента при различных световых условиях (Рисунок 21) . 18 16 14 12 10 ** ** * ** 8 контроль мелатонин 6 4 2 0 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 21 – Интенсивность люминесценции гистамина в ЛГК коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 84 Примечательно, что имеются различия между интенсивностью свечения гистамина в ЛГК коркового вещества дольки тимуса контрольных групп животных, содержавшихся в различных световых условиях. Так, у мышей, которые пребывали в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель наблюдается увеличение интенсивности свечения гистамина в 1,3 раза (p < 0,001) по сравнению с контрольными животными, которые содержались в условиях естественного освещения. Как видно из приведенных графиков, поступление мелатонина независимо от длительности и условий освещения, приводит к снижению интенсивности люминесценции гистамина в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества долек тимуса. Так, у мышей 1-й (срок эксперимента 2 недели в условиях естественного освещения) и 4-й (срок эксперимента 4 недели в условиях постоянного затемнения) опытных групп фиксируются минимальные значения интенсивности свечения гистамина в ЛГК коркового вещества дольки, они составляют 9,00±0,40 усл. ед. (11,60±0,51 усл. ед. – у мышей 1-й контрольной группы, p < 0,001) и 9,00±0,41 усл. ед. (15,50±0,77 усл. ед. – у мышей 4-й контрольной группы, p < 0,001). У мышей 2-й опытной группы (срок эксперимента 2 недели в условиях постоянного затемнения) данный показатель составляет 10,90±0,37 усл. ед. (14,80±0,40 усл. ед. – у мышей 2-й контрольной группы, p < 0,001), у животных 3й опытной группы – 10,20±0,46 усл. ед. (11,70±0,48 усл. ед. – у мышей 3-й контрольной группы, p < 0,05). Изменение интенсивности люминесценции гистамина в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса на разных сроках эксперимента приведено на соответствующих графиках (Рисунок 22). 85 18 16 14 12 10 ** * ** 8 контроль мелатонин 6 4 2 0 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 22 – Интенсивность люминесценции гистамина в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. Необходимо отметить, что нахождение двух контрольных групп мышей в условиях постоянного затемнения приводит к увеличению свечения гистамина в исследуемых клетках в 1,3 (p < 0,001) по сравнению с контрольными животными, содержавшимися в условиях естественного освещения. Поступление мелатонина в течение 2 недель в условиях естественного освещения приводит к снижению интенсивности люминесценции гистамина в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса мышей в 1,2 раза (p < 0,05), а в условиях постоянного затемнения – в 1,3 раза (p < 0,001). Более значительные изменения интенсивности свечения гистамина отмечаются в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса мышей, получавших мелатонин в течение месяца в условиях постоянного затемнения, где значения изучаемого параметра снижаются в 1,6 (p < 0,001) по сравнению с мышами 4-й контрольной группы. Таким образом, ЛГК тимуса, независимо от их расположения, реагируют на поступление мелатонина в различных световых условиях снижением интенсивности свечения в них гистамина. ЛГК дольки тимуса контрольных 86 мышей на условия постоянного затемнения реагируют увеличением в них гистамина. В лимфоцитах коркового и мозгового вещества дольки тимуса поступление мелатонина, независимо от сроков и условий освещения, приводит к снижению интенсивности свечения гистамина (Рисунки 23, 24). В лимфоцитах коркового вещества дольки естественного тимуса освещения, мышей, получавших выявляется снижение мелатонин в условиях интенсивности свечения гистамина в 2 раза (p < 0,001) на сроке 2 недель эксперимента, в 1,7 раза – на 4-й неделе поступления гормона (p < 0,001) по отношению к контрольным животным. У мышей, получавших гормон в условиях постоянного затемнения в течение 2 недель, наблюдается схожая картина, где уровень интенсивности свечения гистамина снизился в 1,7 раза (p < 0,001) по сравнению со 2-й контрольной группой. Более выраженное снижение интенсивности люминесценции гистамина в лимфоцитах коркового вещества дольки выявляется на 4 неделе поступления гормона в условиях постоянного затемнения, где он достигает 3,90±0,38 усл. ед., что в 3 раза ниже (p < 0,001), чем показатель контрольных мышей. Двухнедельное введение гормона опытным мышам в различных условиях освещения снижает интенсивность люминесценции гистамина в лимфоцитах мозгового вещества дольки 1,7 раза (p < 0,001), а четырехнедельное введение гормона в условиях затемнения – в 3 раза (p < 0,001) по сравнению с контрольными животными. У мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения, уровень интенсивности гистамина в лимфоцитах мозгового вещества дольки снизился до 4,60±0,27 усл. ед. против 6,00±0,40 усл. ед. у контрольных животных (p < 0,05). Необходимо отметить, что содержание контрольных животных в условиях постоянного затемнения приводит к увеличению интенсивности свечения гистамина в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса в 1,7 раза (срок эксперимента 2 недели, p < 0,001) и в 1,5 раза (срок эксперимента 4 недели, p < 0,001) по сравнению с экспериментальными мышами, находившимися в условиях 87 естественного освещения, а в лимфоцитах коркового вещества долек тимуса – в 1,3 раза (p < 0,001) соответственно. 14 12 10 8 ** 6 ** 4 контроль ** ** мелатонин 2 0 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 23 – Интенсивность люминесценции гистамина в лимфоцитах коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. ** – p < 0,001. 12 10 8 ** 6 контроль * ** 4 ** мелатонин 2 0 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 24 – Интенсивность люминесценции гистамина в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 88 Таким образом, поступление мелатонина в организм лабораторных мышей, независимо от сроков и условий освещения, приводит к снижению интенсивности свечения гистамина во всех содержащих его клетках дольки тимуса: ЛГК коркового вещества, ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек, лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек. Пребывание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения отражается на гистаминсодержащих клетках тимуса (ЛГК коркового вещества, ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек, лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек) противоположным образом: в них интенсивность свечения гистамина возрастает вне зависимости от длительности условий затемнения. 3.7.2. Серотонинсодержащие клетки тимуса Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа в модификации Е. М. Крохиной позволил выявить клетки, содержащие серотонин и катехоламины, в тимусе мышей опытных и контрольных групп. На границе коркового и мозгового вещества долек располагаются в один – два ряда люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек), которые окружают мозговое вещество долек тимуса непрерывным ободком (Рисунки 25, 26). Клетки имеют крупные размеры и полигональную форму, содержат желтовато-белые гранулы различной величины, содержащие катехоламины, серотонин [78]. По периферии коркового вещества долек тимуса видны небольшие беспорядочно располагающиеся люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК коркового вещества) с мелкими гранулами зеленовато-желтого свечения в цитоплазме (Рисунок 27, 28). Между ярко светящимися люминесцирующими гранулярными клетками располагаются лимфоциты коркового и мозгового вещества долек. тимуса 89 а б Рисунок 25 – Люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях естественного освещения. Метод Фалька-Хилларпа. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы, получавшая мелатонин. 1 – люминесцирующие гранулярные клетки. Рисунок 26 – Люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения. Метод Фалька-Хилларпа. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы, получавшая мелатонин. 1 – люминесцирующие гранулярные клетки. 90 Рисунок 27 – Люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях естественного освещения. Метод Фалька-Хилларпа. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы, получавшая мелатонин. 1 – люминесцирующие гранулярные клетки. Рисунок 28 – Люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения. Метод Фалька-Хилларпа. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об. 100. Ок. 10. а – мышь контрольной группы, б – мышь опытной группы, получавшая мелатонин. 1 – люминесцирующие гранулярные клетки. 91 Изменение интенсивности свечения серотонина в ЛГК коркового вещества и ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса под влиянием мелатонина в различных условиях освещения представлены соответсвующими диаграммами (Рисунки 29, 30). У контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, воздействие мелатонина в течение месяца проявляется в снижении интенсивности свечения серотонина в 1,4 (p < 0,001) в ЛГК коркового вещества дольки по сравнению с контрольными животными, а в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества дольки менее значительно – в 1,1 раза (p < 0,05) по сравнению с мышами 4-й контрольной группы. Поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения, приводит к увеличению интенсивности свечения серотонина в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества в 1,5 раза (p < 0,001) на каждом сроке эксперимента по сравнению с контрольными животными. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** ** ** контроль мелатонин 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 29 – Интенсивность люминесценции серотонина в ЛГК коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. ** – p < 0,001. 92 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** * * контроль мелатонин 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 30 – Интенсивность люминесценции серотонина в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. Содержание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения в течение 2 и 4 недель приводит к увеличению интенсивности свечения серотонина в ЛГК коркового вещества дольки (p < 0,001), что составило 7,60±0,29 и 7,00±0,21 усл. ед. против 4,60±0,26 и 5,30±0,25 усл. ед. соответственно по сравнению с показателями свечения серотонина у мышей, которые пребывали в условиях естественного освещения. В люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества дольки отмечается тенденция к увеличению интенсивности люминесценции серотонина у мышей, получавших мелатонин в течение 2 недель в условиях постоянного затемнения, что составляет 8,40±0,40 усл. ед. (6,40±0,26 усл. ед., p < 0,001 у контрольных животных), и у мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения, до 9,00±0,52 усл. ед. (7,30±0,40 усл. ед., p < 0,05 у контрольных животных). Итак, сходные реакции ЛГК коркового вещества и ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса на поступление мелатонина заключаются в увеличении интенсивности свечения в этих клетках серотонина при введении мелатонина в течение 2 недель в условиях постоянного затемнения и в течение 4 недель в условиях естественного освещения, а также в уменьшении 93 интенсивности люминесценции в них серотонина при поступлении мелатонина в течение месяца в условиях постоянного затемнения. Изменения интенсивности свечения серотонина в лимфоцитах коркового и мозгового вещества тимусной дольки экспериментальных мышей представлены на рисунках 31, 32. Пребывание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения практически не отражается на интенсивности люминесценции серотонина в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса. Как видно из приведенных графиков, поступление мелатонина в течение 2 недель в условиях постоянного затемнения и в течение 4 недель в условиях естественного освещения вызывает увеличение интенсивности свечения серотонина в лимфоцитах коркового вещества дольки, что составляет 2,00±0,11 и 2,50±0,14 усл. ед. соответственно, против 1,70±0,10 и 2,00±0,15 усл. ед. у контрольных мышей (p < 0,05). 3 * 2,5 * 2 контроль 1,5 мелатонин 1 0,5 0 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 31 – Интенсивность люминесценции серотонина в лимфоцитах коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05. 94 2,5 ** ** ** 2 1,5 контроль мелатонин 1 0,5 0 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 32 – Интенсивность люминесценции серотонина в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. ** – p < 0,001. В лимфоцитах мозгового вещества дольки в большей степени увеличивается интенсивности свечения серотонина у мышей, получавших гормон в течение 4 недель в условиях естественного освещения, и независимо от длительности в условиях постоянного затемнения, что составляет 1,80±0,12 (p < 0,001), 2,10±0,15 (p < 0,001) и 1,90±0,12 усл. ед. (p < 0,001) соответственно, у контрольных животных – 1,14±0,05, 1,20±0,06 и 1,20±0,06 усл. ед. соответственно. Необходимо отметить, что показатели интенсивности люминесценции серотонина в ЛГК долек тимуса в 2-3 раза выше, чем в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса как у контрольных, так и у опытных мышей, что свидетельствует о том, что при поступлении мелатонина у ЛГК сохраняется функция депонирования этого нейромедиаторного биогенного амина. Итак, более выраженная реакция лимфоцитов мозгового вещества, нежели лимфоцитов коркового вещества долек тимуса на поступление мелатонина заключаются в увеличении интенсивности свечения в них серотонина при поступлении в течение 4 недель в условиях естественного освещения, и в течение 2 или 4 недель в условиях постоянного затемнения. 95 3.7.3. Катехоламинсодержащие клетки тимуса Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хиларпа в модификации Е. М. Крохиной позволил выявить клетки, содержащие катехоламины, в тимусе мышей опытных и контрольных групп. Измерение интенсивности люминесценции катехоламинов и серотонина производилось с одного поля зрения, но с использованием разных фильтров. Поэтому иллюстративный материал серотонин- и катехоламинсодержащих структур представлен на одном изображении. На границе коркового и мозгового вещества долек располагаются в один – два ряда люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек. Рисунки 25, 26). По периферии коркового вещества долек тимуса видны небольшие беспорядочно располагающиеся люминесцирующие гранулярные клетки (ЛГК коркового вещества) (Рисунок 27, 28). Между ярко светящимися люминесцирующими гранулярными клетками тимуса располагаются лимфоциты коркового и мозгового вещества долек. Изменение интенсивности свечения катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества дольки тимуса при поступлении мелатонина в различных световых условиях представлено на рисунке 33. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** ** ** контроль мелатонин 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 33 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в ЛГК коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. ** – p < 0,001. 96 Имеются различия в показателях люминесценции катехоламинов в ГЛК коркового вещества дольки контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, где отмечается увеличение интенсивности свечения биоаминов в 1,8 раз (срок эксперимента 2 недели, p < 0,001) и 1,4 раза (срок эксперимента 4 недели, p < 0,05) по сравнению с мышами, пребывавшими в условиях естественного освещения. Как видно из графиков, поступление мелатонина в организм мышей, независимо от длительности, в условиях естественного освещения приводит к увеличению интенсивности люминесценции катехоламинов в ЛГК коркового вещества дольки в 1,4 раза (срок эксперимента 2 недели, p < 0,001) и 1,5 раза (срок эксперимента 4 недели, p < 0,001) по сравнению с животными контрольных групп. Обратная тенденция наблюдается у мышей, получавших гормон в течение месяца в условиях постоянного затемнения, где выявляется снижение интенсивности свечения катехоламинов в 1,4 раза в ЛГК коркового вещества (p < 0,001) по сравнению с контрольными мышами. На рисунке 34 показана динамика изменения интенсивности свечения катехоламинов в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса контрольных и опытных мышей. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** * ** контроль мелатонин 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 34 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 97 Содержание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель не оказывает влияния на уровень катехоламинов в ЛГК на границе корковго и мозгового вещества дольки. Анализ графиков показывает, что у мышей, получавших мелатонин в течение 2 недель в условиях постоянного затемнения, происходит увеличение интенсивности люминесценции катехоламинов в 1,3 раза (p < 0,001) по сравнению с контрольными животными, и в 1,2 раза (p < 0,05) у мышей, получавших гормон в условиях естестве нного освещения в течение 4 недель, по сравнению с контрольными животными. Снижение интенсивности люминесценции катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса регистрируется у мышей, пребывавших в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения и получавших мелатонин, что составляет 6,44±0,23 усл. ед. (у контрольных мышей – 8,00±0,36 усл. ед., p < 0,001). Итак, люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества долек тимуса более чувствительны к изменению световых условий, и в большей степени проявляются при поступлении мелатонина в течение 4 недель в различных световых условиях. Изменение интенсивности люминесценции катехоламинов в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек экспериментальных мышей представлено на рисунках 35, 36. Содержание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель не оказывает влияния на уровень катехоламинов в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек. Как видно из графиков, статистически значимое увеличение интенсивности свечения катехоламинов в лимфоцитах коркового вещества дольки тимуса отмечается лишь у мышей, получавших гормон в течение 2 недель в условиях естественного освещения, что составляет 1,92±0,10 усл. ед. против 2,50±0,15 у контрольных животных (p < 0,05). 98 3 2,5 2 * контроль 1,5 мелатонин 1 0,5 0 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 35 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в лимфоцитах коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05. 2,5 ** 2 ** ** 1,5 контроль мелатонин 1 0,5 0 2 недели естественное освещение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 36 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. ** – p < 0,001. 99 В лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса животных, получавших мелатонин в условиях постоянного затемнения независимо от длительности поступления гормона, регистрируется увеличение интенсивности свечения катехоламинов в 1,6 раза (p < 0,001) по сравнению с контрольными мышами, и в 1,7 раза (p < 0,001) у мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения. Итак, интенсивность свечения катехоламинов в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса мышей не зависит от условий освещения, в которых содержались животные. Поступление мелатонина в большей мере отражается на изменении интенсивности люминесценции катехоламинов в лимфоцитах мозгового вещества дольки (в сторону увеличения). 3.7.4. Взаимосвязь биогенных аминов в клетках тимуса экспериментальных мышей Для оценки динамики изменений интенсивности люминесценции гистамина, серотонина и катехоламинов в биоаминсодержащих структурах дольки тимуса экспериментальных мышей были построены следующие графики (Рисунки 37 – 40). Как видно из графиков, доминирующим биогенным амином в тимусе контрольных животных является гистамин. Поступление мелатонина на всех сроках эксперимента и независимо от световых условий приводит к снижению интенсивности свечения гистамина в структурах тимуса мышей, но при этом его уровень продолжает превалировать над интенсивностью свечения серотонина и катехоламинов. Колебания интенсивности свечения катехоламинов и серотонина в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества, люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества дольки на 4-й неделе поступления гормона носят разнонапрвленный характер. Так, в условиях естественного освещения содержание серотонина и 100 катехоламинов в данных стркутрах увеличивается, а в условиях затемнения, наоборот, снижается. Естественное освещение 14 12 ** 10 8 * ** ** ** ** 6 4 2 0 2 нед, контроль 2 нед, мелатонин 4 нед, контроль Г С 4 нед, мелатонин КА а Постоянное затемнение 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 ** ** ** ** 2 нед, контроль 2 нед, мелатонин 4 нед, контроль Г С 4 нед, мелатонин КА б Рисунок 37 – Интенсивность люминесценции гистамина, серотонина, катехоламинов в ЛГК коркового вещества дольки тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. Г – гистамин, С – серотонин, КА – катехоламины. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 101 Естественное освещение 14 12 * 10 * * 8 6 4 2 0 2 нед, контроль 2 нед, мелатонин 4 нед, контроль Г С 4 нед, мелатонин КА а Постоянное затемнение 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 ** ** ** ** 2 нед, контроль * 2 нед, мелатонин 4 нед, контроль Г С ** 4 нед, мелатонин КА б Рисунок 38 – Интенсивность люминесценции гистамина, серотонина, катехоламинов в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. Г – гистамин, С – серотонин, КА – катехоламины. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 102 Естественное освещение 10 8 6 ** ** 4 * * 2 0 2 нед, контроль 2 нед, мелатонин 4 нед, контроль Г С 4 нед, мелатонин КА а Постоянное затемнение 14 12 10 ** 8 6 ** 4 * 2 0 2 нед, контроль 2 нед, мелатонин 4 нед, контроль Г С 4 нед, мелатонин КА б Рисунок 39 катехоламинов – Интенсивность в лимфоцитах люминесценции коркового гистамина, вещества серотонина, дольки тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. Г – гистамин, С – серотонин, КА – катехоламины. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 103 Естественное освещение 7 6 * 5 4 ** 3 ** ** 2 1 0 2 нед, контроль 2 нед, мелатонин Г 4 нед, контроль С 4 нед, мелатонин КА а Постоянное затемнение 10 8 ** 6 ** 4 ** ** 2 ** ** 0 2 нед, контроль 2 нед, мелатонин 4 нед, контроль Г С 4 нед, мелатонин КА б Рисунок 40 катехоламинов – Интенсивность в лимфоцитах люминесценции мозгового гистамина, вещества серотонина, дольки тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. Г – гистамин, С – серотонин, КА – катехоламины. * – p < 0,05, ** – p < 0,001. 104 Был определен серотониновый индекс (JС/КА) для понятия особенностей распределения биогенных аминов в различных клетках тимуса. Серотониновый индекс больше 1 свидетельствует о преобладании в клетке серотонина, что связано с его интенсивным синтезом или накоплением а меньше 1 – о преобладании в клетке катехоламинов, что обусловлено сниженным синтезом серотонина или усиленным его катаболизмом [62]. Данные, приведенные в таблицах 8, 9, свидетельствуют об отсутствии резких колебаний серотонинового индекса в клетках тимической дольки мышей, получавших мелатонин в различных световых условиях в течение 2 или 4 недель. У мышей, находившихся в условиях естественного освещения, в течение 2 или 4 недель значение серотонинового индекса колеблется от 0,72 до 1,00. У контрольных групп мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, серотониновый индекс колеблется в интервале от 0,73 до 1,03. Отмечается незначительное преобладание серотонина над катехоламинами в лимфоцитах коркового и мозгового вещества дольки на 4-й неделе поступления гормона в различных световых условиях. Больше единицы серотониновый индекс фиксируется в ЛГК коркового вещества долек мышей, получавших мелатонин независимо от длительности в условиях естественного освещения, и в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения. В ЛГК на границе коркового и мозгового вещества серотониновый индекс больше единицы определяется у животных, получавших гормон в течение 4 недель независимо от условий освещения, и в течение 2 недель в условиях постоянного затемнения. 105 Таблица 8 – Результаты анализа значений серотонинового индекса (JС/КА) клетках тимуса экспериментальных мышей (срок эксперимента 2 недели) Группы экспериментальных мышей Естественное освещение Клетки ЛГК коркового вещества долек ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек Лимфоциты коркового вещества долек Лимфоциты мозгового вещества долек Постоянное затемнение 1-я контрольная группа 1-я опытная группа (мелатонин) 2-я контрольная группа 2-я опытная группа (мелатонин) 0,99 1,11 0,88 1,00 0,99 0,98 1,03 1,01 0,72 0,88 0,73 0,95 1,00 0,85 0,98 0,95 в 106 Таблица 9 – Результаты анализа значений серотонинового индекса (JС/КА) в клетках тимуса экспериментальных мышей (срок эксперимента 4 недели) Группы экспериментальных мышей Естественное освещение Клетки ЛГК коркового вещества долек ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек Лимфоциты коркового вещества долек Лимфоциты мозгового вещества долек Постоянное затемнение 3-я контрольная группа 3-я опытная группа (мелатонин) 4-я контрольная группа 4-я опытная группа (мелатонин) 0,98 1,01 1,01 1,03 0,97 1,01 0,93 1,01 0,95 1,03 0,83 1,04 1,00 1,02 1,00 1,01 Итак, поступление мелатонина не вызывает резких колебаний значения серотонинового индекса в клетках тимусной дольки мышей, получавших мелатонин в различных световых условиях. Результаты корреляционного анализа биоаминобеспеченности структур тимуса мышей опытных и контрольных групп представлены в Таблице 10. Анализ конкурентных взаимоотношений между серотонином и катехоламинами контрольных животных, находившихся в условиях естественного освещения в течение 2 или 4 недель, показал наличие прямых сильных корреляционных связей в ЛГК коркового вещества дольки (r=0,80 и r=0,87 соответственно, p < 0,05), прямой умеренной и сильной связи в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества (r=0,52 и r=0,83 соответственно, p < 0,05), 107 умеренных прямых корреляционных связей в лимфоцитах коркового вещества дольки (r=0,33 и r=0,48 соответственно, p < 0,05) и лимфоцитах мозгового вещества дольки (r=0,35, p < 0,05). Таблица 10 – Результаты корреляционного анализа в паре серотонинкатехоламины в структурах тимуса экспериментальных мышей Корреляционные пары ЛГК коркового вещества дольки Коэффициент корреляции 1-к 1-о 2-к 2-о 3-к 3-о 4-к 4-о 0,80* 0,85* 0,95* 0,90* 0,87* 0,86* 0,76* 0,89* 0,83* 0,21 0,89* 0,83* 0,95* 0,93* 0,74* 0,37* 0,20 0,35* 0,48* 0,50* 0,59* 0,55* 0,60* 0,14 0,48* 0,35* 0,56* 0,10 0,46* ЛГК на границе коркового и 0,52* мозгового вещества дольки Лимфоциты коркового 0,33* вещества дольки Лимфоциты мозгового 0,35* вещества дольки * – p < 0,05 У мышей, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель в естественных световых условиях, в ЛГК коркового вещества дольки также определяются сильные прямые корреляционные связи в паре серотонин-катехоламины (r=0,85 и r=0,86 соответственно, p < 0,05), сильные прямые связи в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества дольки (r=0,83 и r=0,95 соответственно, p < 0,05), умеренные прямые корреляционные связи в лимфоцитах коркового вещества (r=0,37 и r=0,50 соответственно, p < 0,05) и в лимфоцитах мозгового вещества дольки (r=0,60 и r=0,56 соответственно, p < 0,05). У контрольных мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 2 недель, корреляционная связь сохраняется лишь в ЛГК коркового вещества дольки, и является сильной прямой (r=0,95, p < 0,05). На 4-й неделе постоянного затемнения у контрольных животных появляется сильная прямая 108 корреляционная связь в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества дольки (r=0,93, p < 0,05) и умеренная прямая связь в лимфоцитах коркового вещества (r=0,59, p < 0,05), в ЛГК коркового вещества дольки корреляционная связь продолжает сохраняться прямой и сильной, и составляет (r=0,76, p < 0,05). Поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в условиях затемнения вызывает появление умеренных прямых корреляционных связей в лимфоцитах мозгового вещества дольки (r=0,48 и r=0,46 соответственно, p < 0,05) и в лимфоцитах коркового вещества дольки (r=0,35 и r=0,46 соответственно, p < 0,05). В ЛГК коркового вещества, ЛГК на границе коркового и мозгового вещества дольки регистрируются прямые сильные корреляционные связи r=0,90 (p < 0,05) и r=0,89 (p < 0,05), r=0,89 (p < 0,05) и r=0,74 (p < 0,05) соответственно для 2 и 4 недель эксперимента. Итак, характер корреляционных связей по содержанию серотонина и катехоламинов в структурах тимуса при поступлении мелатонина в различных световых условиях в 2 или 4 недель в организм лабораторных мышей отражает тесную сопряженность уровней свечения данных биоаминов между собой. 109 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В последние годы накоплено значительное количество материала, показывающего связь между нервной, эндокринной и иммунной системами [1, 73, 334]. В рамках этого, на данный момент мелатонин считается одним из членов нейроиммунноэндокринного взаимодействия, так как ряд in vivo и in vitro исследований подтверждает нейроиммуномодуляторные свойства эпифизарного гормона [157]. Характер иммуномодулирующего действия мелатонина находится в зависимости от дозировки, длительности введения, исходного состояния организма [141] а также условий светового режима. Так, в работе Литвиненко Г. И. с соавт. (2015) ежедневные вечерние инъекции мелатонина крысам в условиях естественного освещения приводят к снижению процентного содержания CD4+8+спленоцитов и CD4-8+-тимоцитов. Однако в условиях круглосуточного освещения (модель гипомелатонинемии) под действием гормона в селезенке возрастает количество CD4+8+-клеток, снижается количество CD4-8+-спленоцитов, а в тимусе увеличивается количество CD4-8+-лимфоцитов. Настоящее исследование позволило обнаружить ряд изменений, включающих морфологические характеристики долек тимуса лабораторных мышей, количественные изменения CD1a-, CD3-, CD57- и CD68-позитивных клеток, качественные и количественные изменения тучных клеток в зависимости от длительности поступления мелатонина и условий освещения, в которых находились экспериментальные группы животных. Отличительной чертой нашей работы представляется интенсивности определение люминесценции взаимосвязи гистамина, между серотонина, показателями катехоламинов и морфологических изменений в тимусе в моделируемых условиях эксперимента. Поступление мелатонина в различных световых условиях экспериментальным животным приводит к изменениям морфометрических 110 параметров долек тимуса. Уже на 2-й неделе поступления гормона в организм лабораторных мышей снижается соотношение Sк.в./Sм.в. по отношению к данному показателю у контрольных животных (3,84±0,11 и 4,81±0,12, в естественных условиях освещения, 3,35±0,10 и 4,41±0,08, p < 0,001, в условиях постоянного затемнения). На 4-й неделе поступления гормона в различных световых условиях структурные изменения начинают носить более выраженный характер, что проявляется снижением площади коркового вещества (в 1,5 раза в естественных условиях освещения, в 1,4 раза в условиях постоянного затемнения, p < 0,001), параллельным увеличением площади мозгового вещества дольки (в 2,0 раза в условиях естественного освещения, в 2,3 раза в условиях постоянного затемнения, p < 0,001), снижением соотношения Sк.в./Sм.в. (с 4,74±0,14 до 1,77±0,07 в естественных световых условиях, с 5,11±0,12 до 1,83±0,10, p < 0,001, в условиях постоянного затемнения). В работе Ozkanlar S. с соавт. (2015) также показано снижение соотношения площади коркового вещества к площади мозгового вещества в тимусе крыс, страдающих диабетом, после ежедневных внутрибрюшинных инъекций мелатонина в дозе 10 мг/кг в течение 15 дней. Структурные преобразования тимусной дольки в ответ на различные агенты сопровождаются изменением клеточного состава органа [85]. Для оценки состояния тимопоэза на различных его стадиях нами были использованы CD1a и CD3 маркеры. Цифровые данные, полученные в ходе изучения CD1а-позитивных клеток в корковом веществе тимуса, демонстрируют, что ни световые условия, ни поступление мелатонина не приводят к статистически значимым изменениям количественных показателей кортикальных тимоцитов. Так как CD1а маркер отсутствует на зрелых Т-лимфоцитах [244], но экспрессируется на CD4+CD8+клетках [45], то можно заключить, что поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или искусственного затемнения не оказывает тимоцитов. влияние на пролиферацию кортикальных (дубль-позитивных) 111 CD3 антиген является высокоспецифичным маркером субпопуляции Тлимфоцитов [154]. Обработка препаратов тимуса экспериментальных мышей антителами к CD3 маркеру демонстрирует статистически значимое снижение количества Т-лимфоцитов в дольках, степень выраженности которого напрямую зависит от длительности поступления гормона и практически не зависит от условий освещения. Так, в корковом веществе долек количество CD3-позитивных клеток снижается в 1,3 раза (p < 0,001) на 2-й неделе эксперимента и в 1,8 раза (p < 0,001) на 4-й неделе эксперимента при содержании животных в условиях естественного освещения. Сходная тенденция наблюдается в тимусе мышей, содержавшихся в условиях постоянного затемнения, где количество CD3позитивных клеток снижается в 1,2 раза (p < 0,001) на 2-й неделе эксперимента и в 1,6 раза (p < 0,001) на 4-й неделе эксперимента. В мозговом веществе долек количество CD3-позитивных клеток снижается у животных, содержавшихся в условиях естественного освещения и постоянного затемнения, при поступлении мелатонина в течение 2 недель в 1,2 раза (p < 0,001), в течение 4 недель – в 1,7 раза (p < 0,001). На границе коркового и мозгового вещества долек количество CD3-позитивных клеток снижается на 2-й неделе эксперимента в 1,3 раза (условия естественного освещения, p < 0,001) и в 1,1 раза (условия постоянного затемнения, p < 0,05), а на 4-й неделе – в 1,4 раза (условия естественного освещения и постоянного затемнения, p < 0,001). Наблюдаемая нами морфологическая картина тимуса, сопровождающаяся снижением количества CD3-позитивных клеток в корковом и мозговом веществе долек, вызванная поступлением мелатонина в течение 2 или 4 недель в различных световых условиях, может быть связана с усиленной миграцией CD3-позитивных клеток в кровоток. Так, в работе Литвиненко Г. И. (2010) автор также подчеркивает возможность влияния экзогенного мелатонина на процессы миграции Т-лимфоцитов. NK-клетки имеют большое значение для созревания претимоцитов и тимоцитов, регулируют процессы пролиферации, дифференцировки и элиминации клеток [12, 196]. CD57 – это мембранный антиген NK-клеток, 112 рецептор адгезии, который в норме экспрессируется на 60% NK-клеток [51, 246, 351]. По данным ряда авторов CD57 является маркером терминальной дифференцировки NK-клеток [123, 246, 314, 356, 361; 365], которые проявляют более мощные свойства эффекторов антителозависимой клеточной цитотоксичности, нежели не несущие данный антиген NK-клетки [147, 246]. Поступление мелатонина, вне зависимости от длительности и условий освещения, приводит к увеличению плотности расположения CD57-позитивных клеток в различных морфофункциональных зонах тимуса. Наиболее выраженная реакция наблюдается у мышей, получавших гормон в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель, где количество NK-клеток увеличивается в корковом веществе долек в 6 – 6,4 раза (p < 0,001), а в мозговом веществе долек – в 7,5 – 8 раз (p < 0,001). В тимусе лабораторных мышей, находившихся в условиях естественного освещения, после поступления мелатонина в течение 2 и 4 недель плотность расположения CD57-позитивных клеток в корковом веществе долек увеличивается в 3,5 – 4,7 раза (p < 0,001), в мозговом веществе долек – в 5 раз (p < 0,001). Известно, что мелатонин увеличивает выработку IL-2 и IL-12 [185, 186], которые по данным Farag S. S. с соавт. (2006) стимулируют дифференцировку, активацию и увеличивают выживаемость зрелых NK-клеток. В ряде работ было продемонстрировано увеличение количества NK-клеток в костном мозге и в селезенке через 7 и 14 дней после введения экзогенного мелатонина [158]. Инъекции мелатонина как здоровым, так и лейкозным мышам приводят к увеличению количества, и усилению функций натуральных киллеров. Эти изменения отчасти связаны с увеличением продукции цитокинов Т-хелперами, которые активно отвечают на вводимый мелатонин [158, 186, 239]. По данным Pozo D. с соавт. (2004) известно, что натуральные киллеры несут на себе рецепторы к мелатонину. Наше исследование также подтверждает, что ежедневное поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в различных условиях освещения, вызывает выраженную реакцию CD57-позитивных клеток в тимусе, которые активно 113 реагируют на экзогенный гормон увеличением своего количества, особенно в мозговом веществе долек. Причем наибольшее увеличение плотности расположения натуральных киллеров отмечается в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения. Как известно, макрофаги являются обязательными участниками процессов дифференцировки лимфоцитов [18] и негативной селекции в тимусе [268]. По данным Moore K. J. с соавт. (2006) и Song L. с соавт. (2011) CD68 – это скавенджеррецептор, антиген клеток моноцитарно/макрофагальной линии. При оценке гистологических срезов тимуса контрольных животных, обработанных моноклональными антителами к антигену CD68, исследуемые клетки в небольшом количестве выявляются во всех морфофункциональных зонах тимусной дольки. Схожие результаты были получены в работе Стручко Г. Ю. и соавт. (2012) при обработке срезов тимуса интактных крыс моноклональными антителами к маркеру CD68. При поступлении мелатонина, вне зависимости от длительности и условий освещения, плотность расположения макрофагов увеличивается во всех морфофункциональных зонах тимуса, особенно значительны изменения в корковом веществе дольки. Так, у мышей, получавших гормон в течение 2 и 4 недель в условиях постоянного затемнения, количество клеток в поле зрения, экспрессирующих маркер CD68, в корковом веществе дольки тимуса увеличивается в 4,2 – 4,5 раза (p < 0,001), а у животных, получавших гормон в течение 2 и 4 недель в условиях естественного освещения, количество макрофагов возрастает в 5,4 – 5,7 раз (p < 0,001). В мозговом веществе количество макрофагов в тимусе лабораторных мышей, содержавшихся в условиях постоянного затемнения, увеличивается в 2 раза (p < 0,001), а при содержании в условиях естественного освещения – в 3,5 и 3,9 раза (p < 0,001) при поступлении мелатонина в течение 2 и 4 недель. В работе Currier N. L. с соавт. (2000) также подтверждается увеличение количества макрофагов в костном мозге и селезенке. Повышение количества макрофагов под действием мелатонина может быть частично связано с его прямым воздействием на мелатониновые рецепторы [120] или за счет возможного усиления 114 чувствительности к интерлейкинам или колониестимулирующим факторам [158, 252, 253]. В работах Kaur C., Ling E. A. (1999) было отмечено повышение активности моноцитов/макрофагов при введении мелатонина. Parihar A. с соавт. (2010) сообщили, что в обычном состоянии моноциты циркулируют непродолжительный период времени и подвергаются спонтанному апоптозу. Есть данные, что мелатонин защищает моноциты от апоптоза. Так, в работе Luchetti F. и соавт. (2006) мелатонин предотвращал апоптоз, индуцированный ультрафиолетовым облучением клеток, который был опосредован путем защиты митохондрий. Как известно, основной функцией макрофагов в тимусе является контроль прохождения позитивной и негативной селекции в органе, фагоцитоз погибших Тлимфоцитов [42, 61]. Также макрофаги активно участвуют в процессах пролиферации и миграции тимоцитов, путем секреции интерлейкинов и биогенных аминов [77]. В нашем исследовании значительное увеличение количества CD68-позитивных клеток в корковом веществе тимусной дольки может указывать на большую вовлеченность макрофагов в процессы селекции и миграции Т-клеток. Наблюдаемое нами значительное увеличение площади мозгового вещества долек тимуса мышей, получавших мелатонина в течение 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения, по сравнению с животными контрольной группы, может быть обусловлено увеличением количества CD57- и CD68-позитивных клеток, и, возможно, В-лимфоцитов. В работе Лузиковой Е. М. с соавт. (2014) показано девятикратное увеличение количества MHC-II-позитивных клеток в мозговом веществе долек тимуса мышей, получавших мелатонин ежедневно в дозе 0,03 мг на животное в сутки в течение месяца. Авторы связывают значительное увеличение количества данных клеток с миграцией В-лимфоцитов и макрофагов из кровотока. Тучные клетки наряду с моноцитами – одни из первых звеньев иммунной системы, которые взаимодействуют с антигенами внешней и внутренней среды [344]. Тучные клетки могут функционировать и как эффекторные, и как иммунорегуляторные клетки [102, 162, 182, 183]. Тучные клетки обладают способностью регулировать переход от врожденного к приобретенному 115 иммунному ответу посредством влияния на пролиферацию, дифференцировку, миграцию и функционирование иммунокомпетентных клеток: макрофагов, натуральных киллеров, В- и Т-лимфоцитов [162, 182, 183, 344]. Изменение общего количества клеток, выброс гранул с медиаторами – это стереотипная реакция тучных клеток на различные воздействия. В норме полностью дегранулированные тучные клетки сохраняют свою жизнеспособность [47]. На гистологических препаратах тимуса экспериментальных животных тучные клетки были выявлены преимущественно в пределах капсулы, корковых перегородок, коркового вещества тимусной дольки. Сходные результаты по локализации тучных клеток были получены в работах Гордон Д. С. (1982), Гусельниковой В. В. с соавт. (2013) в тимусе нелинейных мышей. Известно, что источниками иннервации тимуса является блуждающий нерв и симпатические нервы, идущие от верхнего шейного и звездчатого ганглиев [70]. При этом отмечается обильная иннервация капсулы, корковых перегородок, соединительной ткани по ходу сосудов, прежде всего коркового вещества тимусной дольки, в то время как мозговое вещество иннервировано слабо [243]. В тимусе мышей тучные клетки локализуются около окончаний нервных волокон, часть из которых является адренергическими [31], ввиду чего клетки активно участвуют в формировании адаптативных реакций организма в ответ на действие различных факторов [7]. Как видно из результатов исследования, содержание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель приводит к увеличению количества тучных клеток и их активации (увеличивается количество секретирующих и полностью дегранулированных клеток), что свидетельствует об усиленном вовлечении исследуемых клеток в метаболические процессы, несущие компенсаторно-приспособительный характер к измененному световому режиму. Известно, что световая депривация индуцирует стрессовое состояние организма [40, 124]. Происходящая при этом активация гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой системы, сопровождающаяся повышенным синтеза гормонов 116 надпочечников, приводит к дегрануляции тучных клеток в тканях и усилению их миграции [7]. Поступление мелатонина в различных условиях освещения в течение 2 или 4 недель, по нашему мнению, приводит к стабилизации мембран клеток (увеличивается количество клеток с плотным расположением гранул в цитоплазме). При этом наиболее выраженное мембраностабилизирующее действие мелатонина отмечается в тимусе мышей, получавших гормон в условиях постоянного затемнения. Факт увеличения количества тучных клеток с плотным расположением гранул в цитоплазме можно объяснить цитопротективным действием фармакологических доз мелатонина на тучные клетки [260]. Цитопротекция мелатонина может быть опосредована как за счет накопления гормона в гранулах, так и за счет ингибирования клеток через рецепторы МТ1 и МТ2 [260, 299]. Таким образом, клетка становится защищенной от избыточной активации на раздражители различного генеза. В исследовании Cikler E. и соавт. (2005) также показано снижение количества дегранулирующих форм тучных клеток под действием мелатонина. Тучные клетки способны поглощать мелатонин из межклеточного пространства и крови, и переносить его к участкам, где гормон реализует свои эффекты [260]. Возможно, этим объясняется увеличение количества тучных клеток в тимусе, что также сопряжено с повышением плотности расположения макрофагов и натуральных киллеров, несущих на себе рецепторы к мелатонину [187]. При этом увеличение количества тучных клеток может являться следствием как усиления пролиферации клеток в самом тимусе [30], так и миграцией их из других органов [93]. Необходимо отметить, на четвертой неделе поступления мелатонина, независимо от условий освещения, отмечается тенденция к увеличению степени сульфатированности кислых мукополисахаридов гранул тучных клеток в тимусе, что более выражено у опытных животных, находящихся в условиях естественного освещения. Усиление степени метахромазии указывает на увеличение содержания 117 в тучных клетках гепарина, количество которого прямо пропорционально количеству гистамина [27, 34, 47]. В формировании местного гомеостаза, регуляции процессов пролиферации и апоптоза иммунных клеток большое значение играют биогенные амины, такие как гистамин, серотонин и катехоламины [72, 82]. Максимальная интенсивность люминесценции биоаминов выявляется в гранулярных люминесцирующих клетках на границе коркового и мозгового вещества, гранулярных люминесцирующих клетках коркового вещества дольки тимуса. Гранулярные люминесцирующие клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки имеют макрофагальную природу и способны к синтезу биогенных аминов: серотонина и катехоламинов. В субкапсулярной зоне люминесцирующие клетки являются аминопоглотителями, неспособными к синтезу биоаминов и относящимися к типичным макрофагам, лимфоцитарная паренхима тимуса также проявляет функции биоаминопоглотителей [18, 78] и свойством связывать нейромедиаторы [36]. То есть данные клетки принимают активное участие в создании фона биогенных аминов в тимусе. Преобладающим биогенным амином, как у контрольных животных, так и мышей, получавших мелатонин, является гистамин. Гистамин проявляет иммуномодулирующие свойства, которые определяются его концентрацией и типом активированного рецептора. Клетки врожденного и приобретенного иммунитета чувствительны к действию гистамина [175, 280]. Избыточное содержание данного биоамина носит иммуносупрессивный эффект [204, 223], Гистамин оказывают эффект на регуляцию Т-клеточного ответа: стимулирует Th2 путь, и подавляет Th-1 ответ [283]. Поступление мелатонина, независимо от длительности и условий освещения, приводит к уменьшению свечения гистамина в биоаминсодержащих клетках тимусной дольки, что наиболее выражено при постоянном затемнении. Факт снижения содержания гистамина указывает на ослабление его иммуносупрессорного действия на клетки тимуса. Основным источником гистамина в организме являются тучные клетки [324, 343]. Снижение содержания 118 данного биоамина в иммунокомпетентных клетках тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель в условиях различного освещения, может быть связано со снижением дегрануляции тучных клеток. Пребывание контрольных мышей в условиях постоянного затемнения отражается на гистаминсодержащих клетках тимуса противоположным образом, то есть в них интенсивность свечения гистамина возрастает, что связано с усиленной дегрануляцией тучных клеток и выходом биогенного амина, что подтверждается в нашем исследовании. Серотонин в большом количестве определяется в тимусе, особенно в макрофагах на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса [78]. Серотонин проявляет митогенное действие и регулирует пролиферативную активность эпителиальных, эндотелиальных и лимфоидных клеток [87]. Известно, что избыток серотонина свидетельствует об иммуносупрессии [2], высокие концентрации данного биоамина подавляют пролиферативную активность Т-лимфоцитов [83]. В работах Kut J. L. et al. (1992) и Young M. R. et al. (1993) показали дозозависимый эффект экзогенного серотонина: низкие дозы обеспечивали активирующее влияние на Т-лимфоциты, в то время как высокие концентрации подавляли функции клеток. Катехоламины обладают модулирующим действием на иммунную систему. Путем стимуляции адренорецепторов катехоламины оказывают воздействие на миграцию, циркуляцию и пролиферацию лимфоцитов, определяют синтез цитокинов и активность клеток лимфоидного ряда [37]. В нашем исследовании изменение содержания серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества, а также коркового вещества тимусной дольки носит однонаправленный характер, вектор которого зависит от длительности поступления гормона и световых условий, в которых содержались животные. Однонаправленное изменение уровней свечения серотонина и катехоламинов в люминесцирующих структурах тимуса наблюдалось в серии экспериментов Сергеевой В. Е., Гордон Д. С. (1992) как реакция на введение асцитной опухоли и при хроническом введении АКТГ1-24 [62]. 119 В нашем исследовании однонаправленность изменений свечения серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках тимуса также подтверждается установившимися прямыми сильными корреляционным связями между интенсивностью свечения данных биоаминов. Показатели интенсивности люминесценции серотонина в люминесцирующих гранулярных клетках долек в 2-3 раза выше, чем в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса, как у контрольных, так и у опытных мышей, что свидетельствует о том, что при поступлении мелатонина у люминесцирующих гранулярных клеток сохраняется функция депонирования этого нейромедиаторного биогенного амина. Поступление мелатонина в течение 4 недель в условиях естественного освещения приводит к увеличению люминесценции серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества и на границе коркового и мозгового вещества дольки, а поступление в условиях постоянного затемнения – к снижению свечения данных биоаминов. Известно, что при нехватке гистамина, последний может замещаться серотонином [155], чем также может обусловливаться повышение уровня свечения серотонина в гранулярных люминесцирующих клетках коркового вещества и на границе коркового и мозгового вещества дольки мышей, получавших мелатонин в условиях естественного освещения в течение 4 недель. В лимфоцитах мозгового вещества, гранулярных люминесцирующих клетках коркового вещества и на границе коркового и мозгового вещества дольки мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях естественного освещения, регистрируется сопряженное с серотонином увеличение свечения катехоламинов. Повышение обеспеченности структур тимуса катехоламинами можно рассматривать как стимуляцию иммунных процессов, так как известно, что катехоламины способны усиливать пролиферативную активность лимфоцитов [83]. Наблюдаемое в нашем исследовании снижение свечения серотонина и катехоламинов в гранулярных люминесцирующих клетках коркового вещества и гранулярных люминесцирующих клетках на границе коркового и мозгового вещества 120 дольки мышей, получавших мелатонин в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения, возможно, связано с постепенным снижением функции аминопродукции люминесцирующими клетками или повышенной утилизацией серотонина клеткамипродуцентами экстрапинеального мелатонина (тучные клетки, натуральные киллеры), количество которых значительно больше в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, по сравнению с количеством данных клеток в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения. Результаты, полученные в ходе эксперимента, показывают, что изменение условий светового режима оказывает влияние на иммунные клетки тимуса поразному. В условиях поступления экзогенного мелатонина характер световых условий оказывает более выраженное действие на клетки тимуса, ответственные за осуществление реакций врожденного иммунитета (макрофаги, натуральные киллеры, тучные клетки), чем на клетки, отвечающие за формирование адаптивного иммунитета (CD1а- и CD3-позитивные клетки). Как известно, основной мишенью мелатонина являются Т-лимфоциты, которые проявляют зависимость от гормона в большей степени, нежели Влимфоциты, макрофаги. Предполагается, что различные клетки иммунной системы имеют разные нейроэндокринные синхронизаторы [58]. Этим может объясняться большая степень влияния световых условий на макрофаги, натуральные киллеры и тучные клетки, чем на Т-лимфоциты, биоритмы которых находятся в четкой зависимости от экзогенного мелатонина. И мы это продемонстрировали. 121 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В проведенном исследовании на лабораторных мышах установлено, что поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения оказывает иммуномодулирующее действие на тимус, которое сопровождается структурно-функциональными изменениями в органе. Под действием экзогенного мелатонина наблюдается снижение соотношения площади коркового вещества долек к площади мозгового вещества долек, уменьшение количества CD3-позитивных клеток и увеличение численности макрофагов и натуральных киллеров в корковом веществе долек тимуса, снижение количества CD3-позитивных клеток и увеличение численности макрофагов и натуральных киллеров в мозговом веществе долек тимуса. При этом количество кортикальных тимоцитов (CD1а-позитивных клеток) под влиянием мелатонина не изменяется. Мелатонин реализует свое иммуномодулирующее действие на тучные клетки тимуса, количество которых под действием гормона увеличивается, а степень их дегрануляция снижается. Содержание гистамина при этом уменьшается во всех биоаминсодержащих клетках тимуса под влиянием мелатонина, что, вероятно, приводит к ослаблению иммуносупрессивного действия данного биоамина и повышению функциональной активности иммунных клеток тимуса. Ввиду разных нейроэндокринных синхронизаторов различных типов иммунных клеток, в условиях поступления экзогенного мелатонина большую зависимость от условий освещения проявляют клетки тимуса, ответственные за осуществление реакций врожденного иммунитета (макрофаги, натуральные киллеры, тучные клетки), но не клетки, отвечающие за формирование адаптивного иммунитета (CD1а- и CD3-позитивные клетки), биоритмы которых находятся в выраженной зависимости от экзогенного мелатонина. 122 Наше исследование в очередной раз демонстрирует, что в тимусе присутствуют тесные клеточные взаимосвязи между нервной, эндокринной и иммунной системами, что обеспечивает адаптацию живого организма в ответ на внешние и внутренние изменения. 123 ВЫВОДЫ: 1. Поступление мелатонина с питьевой водой в концентрации 4 мг/литр в течение 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения вызывает снижение площади коркового вещества и увеличение площади мозгового вещества долек тимуса мышей. 2. Количество CD3-позитивных клеток в тимусе мышей, получавших мелатонин: а) снижается в корковом веществе долек в 1,3 раза и в 1,8 раза (p < 0,001) для сроков 2 и 4 недели соответственно в условиях естественного освещения; б) снижается в корковом веществе долек в 1,2 и 1,6 раз (p < 0,001) для сроков 2 и 4 недели соответственно в условиях постоянного затемнения; в) в мозговом веществе долек тимуса, независимо от условий освещения, количество CD3-позитивных клеток уменьшается в 1,2 и в 1,7 раз (p < 0,001) для сроков две и четыре недели соответственно. Количество CD1а-позитивных клеток не претерпевает значимых изменений. 3. Поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в различных условиях освещения приводит к увеличению количества CD57- и CD68позитивных клеток во всех зонах долек тимуса с достижением максимальных показателей на 4-й неделе. Изменение содержания CD57-позитивных клеток более выражено при поступлении гормона в условиях постоянного затемнения, а CD68-позитивных клеток – в условиях естественного освещения. 4. Постоянное затемнение приводит к увеличению количества тучных клеток и усилению их дегрануляции в тимусе, что наиболее выражено на четвертой неделе эксперимента. Поступление мелатонина на сроках 2 или 4 недели увеличивает долю недегранулирующих форм тучных клеток при увеличении их общего количества, что более выражено в тимусе мышей при постоянном затемнении. 124 5. Содержание гистамина во всех клетках тимуса: а) при постоянном затемнении увеличивается; б) под влиянием мелатонина снижается, что более значительно в тимусе мышей в условиях постоянного затемнения. 6. Содержание катехоламинов и серотонина в гранулярных люминесцирующих клетках дольки на 4 неделе поступления гормона: а) увеличивается в тимусе мышей при естественном освещении; б) снижается в тимусе мышей при постоянном затемнении. 7. Характер освещения при поступлении мелатонина более значим в тимусе для макрофагов, натуральных киллеров, тучных клеток, чем для Тлимфоцитов. 125 РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При проведении практических занятий по биологии, гистологии, иммунологии, эндокринологии в образовательных учреждениях медицинского профиля необходимо выделять роль взаимосвязей между нервной, эндокринной и иммунной системами в адаптационных процессах организма к действию факторов внешней и внутренней среды. 2. Полученные данные об особенностях иммуномодулирующего действия мелатонина в зависимости от световых условий необходимо учитывать в клинических подходах к терапии этим эпифизарным гормоном. 3. Учитывать морфологических полученные изменениях в результаты тимусе, настоящей сопровождающихся работы о изменением количества Т-лимфоцитов, макрофагов, натуральных киллеров, тучных клеток и уровней люминесценции биоаминов после поступления мелатонина в различных световых условиях при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах гистологии медицинских и биологических факультетах Вузов. 126 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВПВ – внутридольковые периваскулярные пространства; Г – гистамин; КА – катехоламины; КОЕ-ГМ – колониеобразующая единица гранулоцитов и макрофагов; ЛГК – люминесцирующие гранулярные клетки; МКАТ – моноклональные антитела; РНК – рибонуклеиновая кислота; С – серотонин; СХЯ – супрахиазматическое ядро; ФНО – фактор некроза опухолей; CD (cluster of differentiation) – кластер дифференцировки; HLA (Human Leucocyte Antigens) – человеческий лейкоцитарный антиген; Ig – иммуноглобулин; IL – интерлейкин; INF – интерферон; MHC (major histocompaltibility complex) – главный комплекс гистосовместимости; МТ1, МТ2, МТ3 – рецепторы к мелатонину; NK – натуральные киллеры; TCR – Т-клеточный рецептор; Th (T helper) – Т-хелпер; Treg – регуляторные Т-клетки. 127 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Акмаев, И. Г. От нейроэндокринологии к нейроиммуноэндокринологии / И. Г. Акмаев, В. В. Гриневич // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 2000. – Т. 131, № 1. – С. 22 – 32. 2. Альперина, Е. Л. Центральные механизмы допаминергической иммуномодуляции: автореф. дис. ... докт. мед. наук: 14.00.17 / Альперина Елизавета Лазеровна. – Москва, 1998. – 34 с. 3. Анисимов, В. Н. Мелатонин и его место в современной медицине / В. Н. Анисимов // Человек и лекарство. – 2006. – Т. 14, № 4. – С. 269 – 273. 4. Анисимов, В. Н. Световой режим, риск возникновения рака. Противоопухолевое действие мелатонина / В. Н. Анисимов // Русский медицинский журнал. – 2007. – № 25. – С. 1915 – 1918. 5. Анисимов, В. Н. Старение женской репродуктивной системы и мелатонин / В. Н. Анисимов, И. А. Виноградова. – СПб.: Издательство «Система», 2008. – 44с. 6. Арион, В. Я. Иммунобиологические свойства и клиническое применение тимозинов и других препаратов тимуса / В. Я. Арион, И. В. Зимина, С. Н. Москвина // Иммунопатология, аллергология и инфектология. – 2008. – № 1. – С. 26 – 40. 7. Арташян, О. С. Морфологические аспекты участия тучных клеток в формировании общего адаптационного синдрома / О. С. Арташян, Б. Г. Юшков, Ю. С. Храмцова // Таврический медико-биологический вестник. – 2012. – Т. 15, № 3. – Ч. 1. – С. 22 – 25. 8. Артемьева, И. Л. Морфофункциональная характеристика структур тимуса при экспериментальной тестэктомии / И. Л. Артемьева, В. Е. Сергеева. – Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 2012. – 96 с. 128 9. Арушанян, Э. Б. Мелатонин снижает порог светочувствительности сетчатки глаза человека / Э. Б. Арушанян, К. Б. Ованесов // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 1999. – Т. 62, № 2. – С. 58 – 60. 10.Арушанян, Э. Б. Гормон эпифиза мелатонин и его лечебные возможности / Э. Б. Арушанян // Русский медицинский журнал. – 2005. – № 26. – С. 1755 – 1760. 11.Арушанян, Э. Б. Гормон мозговой железы эпифиза мелатонин универсальный естественный адаптоген / Э. Б. Арушанян, Э. В. Бейер // Успехи физиологических наук. – 2012. – № 3. – С . 82 – 100. 12.Ахматова, Н. К. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противоинфекционный / Н. К. Ахматова, М. В. Киселевский. – М.: Практическая медицина, 2008. – 256 с. 13.Батурин, Д. А. Эффект световой депривации на гомеостаз, продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей у трансгенных мышей HeR2/neu / Д. А. Батурин, И. Н. Алимова, И. Г. Попович // Вопр. онкол. – 2004. – Т. 50. – С. 332 – 338. 14.Беловешкин, А. Г. Морфология постклеточных структур телец Гассаля тимуса человека в норме / А. Г. Беловешкин, Т. М. Студеникина // Медицинский журнал. – 2010. – № 4. – С. 26 – 28. 15.Беловешкин, А. Г. Роль телец Гассаля тимуса человека в позитивной и негативной селекции тимоцитов / А. Г. Беловешкин // Молодой ученый. – 2012. – № 7. – С. 334 – 338. 16.Беловешкин, А. Г. Ультраструктурная характеристика процессов аутофагии в эпителиальных клетках мозгового вещества и телец Гассаля тимуса человека / А. Г. Беловешкин // Молодой ученый. – 2012. – № 7. – С. 338 – 340. 17.Беспятых, А. Ю. Мелатонин: теория и практика / А. Ю. Беспятых, В. Я. Бродский, О. В. Бурлакова и др.; под ред. С. И. Рапопорта, В. А. Голиченкова. – М. : ИД «МЕДПРАКТИКА-М», 2009. – 100 с. 18.Бибик, Е. Ю. Современные представления о морфогенезе первичного лимфоидного органа / Е. Ю. Бибик, А. Ю. Берест // Украинский морфологический альманах. – 2011. – Т. 9, № 3. – С. 43 – 47. 129 19.Бородин, Ю. И. Структурно-временная организация печени, лимфатической, иммунной, эндокринной систем при нарушении светового режима и введении мелатонина / Бородин, В. А. Труфакин, С. В. Мичурина, А. В. Шурлыгина. – Новосибирск: Издательский дом «Манускрипт», 2012. – 208 с. 20.Бочкарев, В. А. Сравнение гистохимических свойств различных популяций (перитонеальных и мезентериальных) тучных клеток в условиях дисбаланса биогенных аминов (экспериментальное люминесцентно-гистохимическое исследование): автореф. дис. … канд. мед. наук: 03.00.11 / Бочкарев Владимир Арнольдович. – Москва, 1988. – 16 с. 21.Валькович, Э. И. Морфологические особенности тимического эпителия / Э. И. Валькович, Т. Д. Батюто, Е. А. Олейник // Вопросы морфологии XXI века. – 2008. – Вып. 1. – С. 75 – 78. 22.Волошин, Н. А. Эпителиальные канальцы вилочковой железы - тимозинзависимые структуры / Н. А. Волошин, В. А. Малыжев, А. Г. Яхница // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1991. – Т. 111, № 3. – С. 327 – 330. 23.Галил-Оглы, Г. А., Сравнительная ультраструктурная характеристика эпителиальных клеток вилочковой железы и тимом / Г. А. Галил-Оглы, Я. Х. Ингберман, A. M. Берщанская // Архив патологии. – 1988. – № 9. – С.51 – 60. 24.Глебездина, Н.С. Мелатонин-зависимая регуляция активности Th17 / Н. С. Глебездина, Е. М. Куклина // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2014. – Т. 3, № 49. – С. 21 – 22. 25.Гордова, В. С. Структурно-функциональное состояние лимфоидных органов лабораторных крыс при длительном поступлении соединения кремния с питьевой водой: дис. … канд. мед. наук: 03.03.04 / Гордова Валентина Сергеевна. – Саранск, 2014. – 164 с. 26.Гордон, Д. С. Тучные клетки в эксперименте: Метод. указания // Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 1982. – 29 с. 130 27.Гордон, Б. М. Цитобиоаминная система тимуса и адаптация / Б. М. Гордон. – Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 2000. – 242 с. 28. Гордон, Д. С. Идентификация люминесцирующих гранулярных клеток тимуса с дендритными макрофагами / Д. С. Гордон, В. Е. Сергеева, А. Т. Смородченко и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – М.: Изд-во РАМН, 2001. – Т. 132, № 7. – С. 118–120. 29.Горынина, Е. Н. Сравнительная гистология тканей внутренней среды с основами иммунологии / Е. Н. Горынина, О. Ю. Чага. – Л.: Изд – во ЛГУ, 1990. – 320 с. 30.Гусельникова, В. В. Происхождение тучных клеток: современное состояние проблемы / В. В. Гусельникова, А. П. Пронина, П. Г. Назаров, А. В. Полевщиков // Вопросы морфологии XXI века. – 2010. – Вып. 2. – C. 108 – 115. 31.Гусельникова, В. В. Тучные клетки тимуса как посредники в системе нейроиммунных взаимодействий / В. В. Гусельникова, Е. Г. Сухорукова, Д. Э. Коржевский, А. В. Полевщиков // Медицинский академический журнал. – 2013. – Т. 13, № 3. – С. 53 – 63. 32.Долгих, О. В. Модификация клеточной регуляции иммунной системы ванадием / О. В. Долгих, Н. В. Зайцева, Д. Г. Дианова // Вестник НГУ. – 2012. – Т. 10, № 4. – С. 112 – 115. 33.Драндрова, Е. Г. Люминесцируюие гранулярные клетки тимуса при развитии экспериметальной опухоли толстой кишки / Е. Г. Драндрова, Г. Ю. Стручко, О. Ю. Кострова и др. // Здоровье и образование в XXI веке. – 2011. – Т. 13, № 1. – С. 14 – 17. 34.Дьячкова, И. М. Исследование популяции тучных клеток тимуса при длительном воздействии соединений кремния и кальция / И. М. Дьячкова, В. Е. Сергеева, С. П. Сапожников // Вестн. Чуваш. гос. пед. ун-та им. И. Я. Яковлева. – 2010. – № 4 (68). – С. 50 – 55. 35.Дьячкова, И. М. Структурно-функциональное состояние тимуса лабораторных крыс, употребляющих питьевую воду с добавлением соединений кальция и 131 кремния / И. М. Дьячкова // Здравоохранение Чувашии. – 2011. – № 3. – С. 48 – 52. 36.Елисеева, Л. С. Специфическое связывание серотонина клетками интактных и иммунизированных мышей / Л. С. Елисеева, Л. Е. Стефанович, В. С. Попова // Регуляция иммунного гомеостаза. – 1982. – С. 139 – 140. 37.Забродский, реализации П. Ф. Роль основных активации иммунных симпатико-адреналовойсистемы реакций при острой в интоксикации фосфорорганическими соединениями / П. Ф. Забродский, B. Г. Германчук // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 2001. – Т. 132, № 10. – С. 413 – 415. 38.Засеева, М. Д. Изменения гистологической структуры тимуса мыши и митотической активности тимоцитов в ходе акцидентальной трансформации и иммунного ответа: дис. … канд. биол. наук: 03.03.04 / Засеева Майя Давидовна. – Санкт-Петербург, 2015. – 124 с. 39.Калинин, Д. В. Патоморфология аденоидных вегетаций в возрастном аспекте (морфометрическое и иммуногистохимическое исследование): автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.03.02 / Калинин Дмитрий Валерьевич. – Москва, 2013. – 20 с. 40.Карелина, Л. Н. Морфолого-метаболическое обоснование применения малоновой кислоты в промышленном птицеводстве: автореф. дис. … докт. биол. наук: 06.02.01 / Карелина Любовь Николаевна. – Иркутск, 2012. – 43 с. 41.Карнаухов, В. Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки / строении тимуса / В. Н. Карнаухов. – М.: Наука, 1978. – 208 с. 42.Кащенко, С. А. Современные представления о С. А. Кащенко, А. А. Захаров // Перспективи медицини та бioлогii. – 2010. – Т. 2, № 1. – С. 22 – 32. 43.Кветной, И. М. Нейроиммуноэндокринология тимуса / И. М. Кветной, А. А. Ярилин, В. О. Полякова, И. В. Князькин. СПб.: ДЕАН, 2005. – 160 с. 44.Киселева, Н. М. Возможная роль тимуса в работе стресс-лимитирующей системы / Н. М. Киселева, А. Н. Иноземцев // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2010. – № 2. – С. 13 – 20. 132 45.Ковальчук, Л. В. Антигенные маркёры клеток иммунной системы человека. CD (Cluster Differentiation) система. / Л. В. Ковальчук. М.: РГМУ МЗ и СР РФ, 2005. – 82 с. 46.Комаров, Ф. И. Мелатонин в норме и патологии / Ф. И. Комаров, С. И. Рапопорт, Н. К. Малиновская, В. Н. Анисимов. – М.: ИД Медпрактика-М, 2004. – 308 с. 47.Кондрашевская, М. В. Тучные клетки и гепарин – ключевые звенья в адаптативых и патологических процессах / М. В. Кондрашевская // Вестник РАМН. – 2010. – № 6. – С. 49 – 54. 48.Коржевский, Д. Э. Основы гистологической техники / Д. Э. Коржевский, А. В. Гиляров. – СПб.: СпецЛит, 2010. – 95 с. 49.Кострова, О. Ю. Акцидентальная инволюция тимуса крыс на фоне развития аденокарциномы толстой кишки, вызванной введением канцерогена в различной дозировке / О. Ю. Кострова // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 3. – С. 321 – 324. 50.Кремер, Н. Ш. Математическая статистика / Н. Ш. Кремер. ВЗФЭИ. – М.: Экономическое образование, 1992. – 112 с. 51.Криволапов, Ю. А. Морфологическая диагностика лимфом / Ю. А. Криволапов, Е. Е. Леенман. – СПб.: КОСТА, 2006. – 208 с. 52.Крохина, Е. М. Симпатический (адренергический) компонент эффективной иннервации сердечной мышцы / Е. М. Крохина, П. Н. Александров // Кардиология. – 1969. – Т. 9, № 3. – С. 97 – 102. 53.Кулагина, Н. Н. Вилочковая железа у детей раннего возраста в норме и при патологических состояниях по данным ультразвукового исследования: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.19, 14.00.09 / Кулагина Нина Николаевна. – Москва, 2007. – 23 с. 54.Лазарев, А. Ф. Тучные клетки и опухолевый рост / А. Ф. Лазарев, И. П. Бобров, Т. М. Черданцева, В. В. Климачев, В. М. Брюханов, А. М. Авдалян // Сибирский онкологиеский журнал. – 2011. – № 4. – Вып. 46. – С. 59 – 63. 133 55.Лебединская, О. В. Анализ изменений количества стромальных клетокпредшественников в тимусе и селезенке животных различных возрастных групп / О. В. Лебединская, Ю. Ф. Горская, Е. Ю. Шуклина и др. // Морфология. – 2005. – Т. 127, № 3. – С. 41 – 44. 56.Левин Я. И. Мелатонин (мелаксен) в терапии инсомний / Я. И. Левин // РМЖ. – 2005. – № 7. – С. 1 – 3. 57.Линде, В. А. Световая депривация в коррекции климактерических нарушений / В. А. Линде, О. П. Заводнов, Т. Л. Боташева, В. В. Авруцкая // Таврический медико-биологический вестник. – 2012. – Т. 15, № 2. – Ч. 2. – С. 129 – 133. 58.Литвиненко, Г. И. Хронофармакологические свойства мелатонина / Г. И. Литвиненко // Бюллетень со РАМН. – 2010. – Т. 30, № 6. – С. 82 – 88. 59.Литвиненко, Г. И. Морфофункциональные изменения в клетках иммунной системы при нарушении светового режима и иммунопатологии: автореф. дис. … докт. мед. наук: 03.03.04, 14.03.09 / Литвиненко Галина Ивановна. – Новосибирск, 2011. – 42 с. 60.Литвиненко, Г. И. Влияние мелатонина на морфофункциональные показатели эпифиза и органов иммунной системы у крыс при естественном световом режиме и круглосуточном освещении / Г. И. Литвиненко, А. В. Шурлыгина, О. Б. Грицык и др. // Бюлл. экспер. биол. – 2015. – Т. 3, № 6. – С. 704 – 707. 61.Луговцова, П. А. Изучение локализации CD68-положительных макрофагов в тимусе человека в норме // П. А. Луговцова, Н. А. Луговцов, А. Н. Платонов / Время смотреть в будущее: тез. докл. 51-й итоговой студ. науч. конф. с междунар. участием. – Владикавказ. – 2012. – С. 71–72. 62.Лузикова, Е. М. Морфо-физиологическая реакция аминосодержащих структуртимуса на введение АКТГ 1–24: учеб. пособие / Е. М. Лузикова, В. Е. Сергеева, Чебоксары: Изд-в Чуваш. ун-та, 2008. – 124 с. 63.Лузикова, Е. М. Морфофункциональная реакция антигенпрезентирующих клеток тимуса на введение мелатонина и препарата «Эндорфаин» / Е. М. Лузикова, И. Л. Сарилова, В. Е. Сергеева // Вестник Чувашского университета. – 2014. – № 2. – С. 286 – 290. 134 64.Медик, В. А. Статистика в медицине и биологии. Том 1. – Теоретическая статистика / В. А. Медик, М. С. Токмачев, Б. Б. Фишман // М.: Медицина, 2000. – 412 с. 65.Мендель, В. Э. Мелатонин: роль в организме и терапевтические возможности. Опыт применения препарата Мелаксен в российской медицинской практике / В. Э. Мендель, О. И. Мендель // Человек и лекарство. Часть 2. – 2010. – T. 18, № 6. – C. 336 – 342. 66.Михайлова, М. Н.. Морфофункциональные изменения тимуса и показателей крови после введения циклофосфана, имунофана и их комбинации: дис. … канд. мед. наук: 03.00.25 / Михайлова Марина Николаевна. – Москва, 2004. – 118 с. 67.Мотуляк, А. П. Гетерогенність епітеліоцитів тимуса після впливу низьких доз гамма-випромінення / А. П. Мотуляк, В. А. Левицький, Н. М. Толоконнікова, О. В. Ткач-Мотуляк // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. – 2006. – Т. 5, № 2. – С. 45. 68.Плеханов, А. В. Математико-статистические методы обработки информации с применением программы SPSS / А. В. Плеханов. – СПб.: Изд-во СПбГУЭФ, 2010. – 96 с. 69.Полякова, В. О. Тимус и старение. Нейроиммуноэндокринные механизмы / В. О. Полякова, И. М. Кветной. – СПб.: Система, 2004. – 102 с. 70. Пуговкин, А. П. нейрогуморальной Морфофункциональные регуляции функций основы иммунной обеспечения системы. Иммунофизиология / А. П. Пуговкин; под общ. ред. Е. А. Корневой. – СПб.: Наука, 1993. – 684 с. 71.Роймес, Б. Микроскопическая техника / Б. Роймес. – Москва, 1954. – 490 с. 72.Репина, В. П. Влияние различных концентраций катехоламинов на функционирование иммунокомпетентных клеток / В. П. Репина // Экология человека. – 2008. – № 2. – С. 30–33. 73.Ресненко, А. Б. Роль интерлейкина (ИЛ) -lß и ИЛ-6 в регуляции гипоталамогипофизарно-адренокортикальной системы при длительном воспалении у крыс 135 / А. Б. Ресненко, Е. Б. Лискина, A. B. Мишарин и др. // Физиология и патология иммунной системы. – 2003. – Т. 5. – С. 173 – 174. 74. Сайнога, Т. В. Иммуногистохимические маркеры CD56 и CD57 в диагностике нейроэндокринных опухолей легких / Т. В. Сайнога, А. А. Славинский // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2011. – № 10. – С. 68 – 69. 75.Сапин, М. Р. Иммунная система человека / М. Р. Сапин, Л. Е. Этинген – М.: Медицина, 1996. – 324 с. 76.Сарилова, И. Л. Морфофункциональная характеристика структур тимуса при тестэктомии: автореф. дис. … канд. мед. наук: 03.00.25 / Сарилова Ирина Леонидова. – Саранск, 2009. – 26 с. 77.Сарилова, И. Л. Пример нейроиммуноэндокринных взаимодействий в тимусе / И. Л. Сарилова, В. Е. Сергеева // Вестник ЧГУ. – Чебоксары. – 2012. – № 3. – С. 480 – 482. 78. Сергеева, В. Е. Люминесцентно-гистохимическая характеристика ранней реакции моноаминсодержащих структур тимуса на антигенные воздействия / В. Е. Сергеева, Д. С. Гордон. Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 1992. – 352 с 79.Смирнова, Т. Л. Биоаминсодержащие структуры тимуса при экспериментальном моделировании плацентарной недостаточности / Т. Л. Смирнова, В. Е. Сергеева // Сборник научных трудов «Актуальные вопросы клинической и кспериментальной медицины». – Чебоксары. – 2007. – С.153 – 155. 80. Сорочан, П. П. Применение мелатонина в онкологической практике / П. П. Сорочан, И. С. Громакова, Н. Э. Прохач, И. А. Громакова, М. О. Иваненко // Международный медицинский журнал. – 2012. – № 3. – С. 68 – 73. 81.Спирин, И. В. Морфофункциональная характеристика биоаминсодержащих структур тимуса при введении соматотропного гормона: дис. … канд. мед. наук: 03.00.25/ Спирин Игорь Васильевич. – Саранск, 2007. – 136 с. 136 82.Ставинская, О. А. Серотониновая депривация как фактор регуляции иммунологической реактивности / О. А. Ставинская // Экология человека. – 2008. – № 1.– С. 22 – 25. 83.Ставинская, О. А. Взаимосвязь процессов апоптоза, пролиферации лимфоцитов и уровней гормонов у практически здоровых мужчин / О. А. Ставинская, В. П. Репина // Экология человека. – 2009. – № 7. – С. 47 – 50. 84.Стручко, Г. Ю. Морфофункциональное иммунобиохимических показателей крови исследование после тимуса и спленэктомии и иммунокоррекции: дис. … докт. мед. наук: 03.00.25/ Стручко Глеб Юрьевич. Саранск, 2003. – 236 с. 85.Стручко, Г. Ю. Морфологические изменения тимуса после применния полиоксидония / Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, Е. В. Москвичев, О. Ю. Кострова // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 5. – С. 198 – 202. 86.Стручко, Г. Ю. Реакция биоаминсодержащих структур тимуса на введение растворимого антигена: монография / Г. Ю. Стручко, В. Е. Сергеева. – Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 1999. – 128 с. 87. Трофимов, А. В. Гормоны, синтезируемые в желудочно-кишечном тракте, и их физиологичесие эффекты / А. В. Трофимов, И. В. Князькин, И. М. Кветной // Нейроэндокринные клетки желудочно-кишечного тракта в моделях преждевременного старения. – СПб., 2005. – С. 52 – 64. 88.Трухачев, В. И. Морфофункциональный статус новорожденных ягнят в зависимости от плацентарных условий развития / В. И. Трухачев, Т. И. Лапина. – Ставрополь, 2007. – 211 с. 89.Узенбаева, Л. Б. Возрастные изменения лейкоцитарнй формулы и морфометрических параметров больших гранулярных лимфоцитов крови крыс при различных режимах освещения / Л. Б. Узенбаева, Виноградова И. А., А. Г. Голубева, А. В. Чуров, В. А. Илюха // Успехи геронтологии. – 2006. – Вып. 19. – С. 79 – 84. 137 90.Харченко, В. П. Болезни вилочковой железы / В. П. Харченко, Д. С. Саркисов, П. С. Ветшев и др. – Триада-Х, 1998. – 252 стр. 91.Хафизьянова, Р. Х. Математическая статистика в экспериментальной и клинической фармакологии: монография / Р. Х. Хафизьянова, И. М. Бурыкин, Г. Н. Алеева. – Казань: Медицина, 2006. – 373 с. 92.Цейликман, О. Б. Активация апоптоза как механизм развития инволюции вилочковой железы при повторных иммоболизациях / О. Б. Цейликман, С. В. Сибиряк, В. Э. Цейликман и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 2005. – Т. 139, № 1. – С. 38 – 39. 93.Юшков, Б. Г. Тучные клетки: физиология и патофизиология / Б. Г. Юшков, В. А. Черешнев, В. Г. Климин, О. С. Арташян. – М.: Медицина, 2011. – 237 с. 94.Яглова, Н. В. Тучные клетки и врожденный иммунитет / Н. В Яглова / Иммунология. – 2009. – № 2. – С. 139 – 143. 95.Ялалетдинова, Л. Р. Гистохимические исследования популяции тучных клеток тимуса и яичников при введении гонадотропина / Л. Р. Ялалетдинова, С. А. Ястребова // Сборник тезисов по материалам 86-ой Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл.-корр. АН РТ, проф. И.Г. Салихова и 15-й Всероссийской медико-исторической конференции, посвященной 200-летию клинического медицинского образования в Казани. – Казань: Изд-во Казанского государственного медицинского университета, 2012. – С.241 – 242. 96.Ялалетдинова, Л. Р. Эффект хорионического гонадотропина на СД8позитивные структуры вилочковой железы / Л. Р. Ялалетдинова, В. Е. Сергеева, С. А. Ястребова // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 7 (ч. 5). – С. 1075 – 1079. 97.Яременко, С. В. Маркерные иммунофенотипические признаки бластов при Тклеточном остром лимфобластном лейкозе у детей / С. В. Яременко, В. А. Нагорная // Онкология. – 2000. – Т. 2, № 3. – С. 172 – 174. 98.Ярилин, А. А. Исследование миграции предшественников Т-лимфоцитов в тимус и факторов, влияющих на этот процесс / А. А. Ярилин, И. В. 138 Мирошниченко, И. Д. Рябинина, А. В. Филатов // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 1986. – № 10. – С. 447 – 449. 99.Ярилин, А. А., Структура тимуса и дифференцировка Т-лимфоцитов / А. А. Ярилин, В. Г. Пинчук, О. А. Гриневич. – Киев.: Наукова думка, 1991. – 248 с. 100. Ярилин, А. А. Цитокины в тимусе. Рецепция и выработка цитокинов / А. А. Ярилин // Цитокины и воспаление. – 2003. – Т. 2, № 1. – С. 3 – 13. 101. Ястребова, С. А. Изучение морфологических параметров структур тимуса, селезенки и яичников под воздействием иммуномодуляторов и гормонов / С. А. Ястребова, Е. М. Лузикова, В. Е. Сергеева, Л. Р. Аюпова, А. В. Викторова, К. А. Фролова // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2010. – № 1. – С. 61. 102. Abraham, S. N. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens / S. N. Abraham, A. L. St. John // Nat. Rev. Immunol. – 2010. – Vol. 10. – P. 440 – 452. 103. Acil, M. Perioperative effects of melatonin and midazolam premedication on sedation, orientation, anxiety scores and psychomotor performance / M. Acil, E. Basgul, V. Celiker et al. // European journal of anaesthesiology. – 2004. – Vol. 21, № 7. – P. 553 – 557. 104. Adamczyk-Sowa, M. Melatonin Acts as Antioxidant and Improves Sleep in MS Patients / M. Adamczyk-Sowa, K. Pierzchala, P. Sowa et al. // Neurochemical research. – 2014. – Vol. 39, № 8. – Р. 1585 – 1593. 105. Ader, R. Interactions between the brain and the immune system / R. Ader, D. Felten, N. Cohen // Annu. Ret. Pharmacol. Toxicol. – 1990. – № 30. – P. 561 – 602. 106. Amato, G. D. Meteorological conditions, climate change, new emerging factors, and asthma and related allergic disorders. A statement of the World Allergy Organization / G. D. Amato, S. T. Holgate, R. Pawankar et al. // World Allergy Organ J. – 2015. – Vol. 8, № 1. – P. 25. 107. Amsen, D. Thymocyte selection: not by TCR alone / D. Amsen, A. M. Kruisbeek // Immunol. Rev. – 1998. – № 165. – Р. 209 – 229. 139 108. Anderson, G. Cellular interactions in thymocyte development / G. Anderson, N. C. Moore, J. J. Owen // Annual Review of Immunology. – 1996. – Vol. 14. – P. 73 – 99. 109. Anisimov, V. N. Melatonin and colon carcinogenesis. III. Effect of melatonin on proliferative activity and apoptosis in colon mucosa and colon tumors induced by 1,2-dimethylhydrazine in rats / V. N. Anisimov, I. G. Popovich, A. V. Shtylik et al. // Experimental and toxicologic pathology. – 2000. – Vol. 52. – P. 71 – 76. 110. Annunziano, F. Chemokines and lymphopoiesis in human thymus / F. Annunziano, P. Romagnani, L. Cosmi et al. // Trends Immunol. – 2001. – Vol. 22. – P. 277 – 281. 111. Ardavin, C. Thymic dendritic cels / С. Ardavin // Immunology today. – 1997. – Vol. 18, № 7. – Р. 350 – 361. 112. Аrushanyan, E. B. Immunological properties pineal melatonin / E. B. Аrushanyan, E. V. Beier // Experimental and clinical farmacologia. – 2002. – Vol. 65, № 5. – Р. 73 – 80. 113. Arya, S. The Thymus / S. Arya, E. Gilbert, R. Hong, B. Bloodworth // Endocrine pathology, general and surgical. – 1982. – 2 cd. – P. 767 –833. 114. Ashley, J. W. Genetic Ablation of CD68 Results in Mice with Increased Bone and Dysfunctional Osteoclasts [Электронный ресурс] / J. W. Ashley, Z. Shi, H. Zhao et al. // PLoS One. – 2011. – Vol. 6, № 10. – Режим доступа: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone. 0025838. 115. Arrella, R. Immunomodulatory Effects Mediated by Serotonin / R. Arreola, E. Becerril-Villanueva, C. Cruz-Fuentes et al. [Электронный ресурс] // Journal of Immunological research. – 2015. – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4417587/. Режим доступа: 140 116. Atibalentja, D. F. Thymus–blood protein interactions are highly effective in negative selection and regulatory T cell induction / D. F. Atibalentja, C. A. Byersdorfer, E. R. Unanue // J Immunol. – 2009. – Vol. 183, № 12. – P. 7909 – 7918. 117. Bahna, S. G. Regional upregulation of hippocampal melatonin MT2 receptors by valproic acid: therapeutic implications for Alzheimer's disease [Электронный ресурс] / S. G. Bahna, A. Sathiyapalan, J. A. Foster, L. P. Niles // Neuroscience letters. – 2014. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24909617. 118. Baksheev, V. I. Melatonin: its role in the system of neurohumoral regulation in man. Part 2 / V. I. Baksheev, N. M. Kolomoets // Klinicheskaia meditsina. – 2011. – Vol. 89,– № 2. – Р. 8 – 13. 119. Balzer, I. Melatonin in algae and higher plants – possible new roles as a phytohormone and antioxidant / I. Balzer, R. Hardeland // Botanica Acta. – 1996. – Vol. 109. – P. 180 – 183. 120. Barjavel, M. J. Differential Expression of the Melatonin Receptor in Human Monocytes1 / M. J. Barjavel, Z. Mamdouh, N. Raghbate, O. Bakouche // The Journal of Immunology. – 1998. – Vol. 160. – P. 1191 – 1197. 121. Benin, S. Extracellular matrix of the human thymus: immunofluores-cence studies on frozen sections and cultured epithelial cells / S. Benin, W. Savino, S. Cohen // J. Histochem.Cytochem. – 1985. – Vol. 33. – P. 655 – 664. 122. Beskonakli, E. Effect of pinealectomy on immune parameters in rats with Staphylococcus aureus infection / E. Beskonakli, S. Palaoglu, S. Aksaray et al. // Neurosurgical review. – 2001. – Vol. 24, № 1. – Р. 26 – 30. 123. Bjorkstrom, N. K. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education / N. K. Bjorkstrom, P. Riese, F. Heuts // Blood. – 2010. – Vol. 116. – P. 3853 – 3864. 124. Bishnupuri, K. S. Impact of photoperiodic exposures during late gestation and lactation periods on the pineal and reproductive physiology of the Indian palm squirrel, Funambulus pennanti / K. S. Bishnupuri, C. Haldar // Journal of Reproduction and Fertility. – 2000. – Vol. 118. – Р. 295 – 301. 141 125. Black, P. H. Stress and inflammatory response: a rewiew of neurogenic inflammation / P. H. Black // Brain, Behavior and Immunity. – 2002. – № 16. – P. 622 – 653. 126. Blask, D. E. Putting cancer to sleep at night: the neuroendocrine ⁄circadian melatonin signal / D. E. Blask, R. T. Dauchy, L. A. Sauer // Endocrine. – 2005. – Vol. 27. – P. 179 – 188. 127. Bodey, B. Immunological aspects of neoplasia. The role of the thymus / B. Bodey, S. E. Siegel // Springer Science. – 2004. – P. 567. 128. Bodi, L. A novel aspect of the structure of the avian thymic medulla / L. Bodi, K. Minko, D. Molnar et al. // Cell Tissue Res. – 2015. – Vol. 359, № 2. – P. 489 – 501. 129. Brostoff, S. Histamine Suppression of Lymphocyte Activation / S. Brostoff, S. Pack, P. Zydgard // Clin. Exp. Immunol. – 1980. – Vol. 39, № 4. – P. 739 – 745. 130. Bruijnts, J. P. Epithelium-free area in the thymic cortex of rats / J. P. Bruijnts, C. F. Kuper, J. E. Robinson // Develop. Immunol. – 1993. – Vol. 3, № 2. – P. 113 – 122. 131. Bruun, J. M. Diet and exercise reduce low-grade inflammation and macrophage infiltration in adipose tissue but not in skeletal muscle in severely obese subjects / J. M. Bruun, J. W. Helge, B. Richelsen, B. Stallknecht // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. – 2006. – Vol. 290. – P. 961 – 967. 132. Bubenik, G. A. Gastrointestinal melatonin: localization, function, and clinical relevance / G. A. Bubenik // Dig Dis Sci. – 2002. – Vol. 47. – P. 2336 – 2348. 133. Bulfone-Paus, S. Mast cells as regulators of T cell responses // S. Bulfone-Paus, R. Bahri [Электронный ресурс] // Front Immunol. – 2015. – Vol. 6. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26300882. 134. Calderon L. Three chemokine receptors cooperatively regulate homing of hematopoietic progenitors to the embryonic mouse thymus / L. Calderon, T. Boehm // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. – 2011. – Vol. 108, № 18. – P. 7517 – 7522. 142 135. Сalvo, J. R. Immunomodulatory role of melatonin: specific binding sites in human and rodent lymphoid cells / J. R. Сalvo, M. Raffi-El-Indrissi, D. Pozo, J. M. Guerrero // Journal of Pineal research. – 1995. – Vol. 18. – P. 119 – 126. 136. Chang, W.-P. The effects of dietary vitamin E selenium deficiencies on plasma thyroid and thymic hormone concentrations in the chicken / W.-P. Chang, G. F. Combs, C. G. Scanes, J. A. Marsh // Dev. Comp. Immunol. – 2005. – Vol. 29, № 3. – P. 265 – 273. 137. Caniato, R. Melatonin in plants / R. Caniato, R. Filippini, A. Piovan et al. // Advances in Experimental Medicine and Biology. – 2003. – Vol. 527, P. 593 – 597. 138. Cappello, F. CD1a expression by Barrett's metaplasia of gastric type may help to predict its evolution towards cancer / F. Cappello, F. Rappa, R. Anzalone, G. La Rocca, G. Zummo // Br J Cancer. – 2005. – Vol. 92, № 5. – P. 888 – 890. 139. Cardinali, D. P. Basic aspects of melatonin action / D. P. Cardinali, P. Pevet // Sleep Med. Rev. – 1998. – Vol. 2. – P. 175 – 190. 140. Cardinali, D. P. Melatonin effects on bone: experimental facts and clinical perspectives / D. P. Cardinali, M. G. Ladizesky, V. Boggio // Journal of Pineal Research. – 2003. – Vol. 34. – P. 81 – 87. 141. Carrillo-Vico, A. Melatonin: Buffering the Immune System / A. Carrillo-Vico, P. J. Lardone, N. Alvarez-Sanchez et al. // International Journal of Molecular Sciences. – 2013. – V. 14. – P. 8638 – 8683. 142. Castrillon, P. The effect of melatonin treatment on 24 hr variations in response to mitogens and lymphocyte subpopulations in rat submaxillary lymph nodes / P. Castrillon, A. I. Esquifino, A. Varas et al. // Journal of Neuroendocrinology. – 2000. – Vol. 12. – P. 758 – 765. 143. Chen, W. – F. The size of functional T-lymphocyte pool within thymic medullary and cortical cell subscts / W. – F. Chen, R. Scollay, J. Clark-Levis, K. Shortman // Thymus. – 1983. – № 5. – P. 179 – 197. 144. Chinen, J. Immunodeficiency due to congenital, metabolic, infectious, surgical and environmental factors / J. Chinen, W. T. Shearer // Clinical Immunology. – 2008. – P. 585 – 593. 143 145. Chrousus, G. P. The stress response and immune function: clinical implication / G. P. Chrousus // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2000. – Vol. 917. – P. 38 – 67. 146. Cernysiov, V. Expression of melatonin receptors in the cells of immune system / V. Cernysiov, R. Bozaite, M. Mauricas, I. Girkontaite // Immunology. – 2012. – Vol. 137, № 1. – P. 296. 147. Chattopadhyay, P. K. The cytolytic enzymes granyzme A, granzyme B, and perforin: expression patterns, cell distribution, and their relationship to cell maturity and bright CD57 expression / P. K. Chattopadhyay, M. R. Betts, D. A. Price et al. // J. Leukoc. Biol. – 2009. – Vol. 85. – P. 88 – 97. 148. Cikler, E. The protective effects of melatonin against water avoidance stressinduced mast cell degranulation in dermis / E. Cikler, F. Ercan, S. Cetinel // Acta Histochem. – 2005. – Vol. 106. – P. 467 – 475. 149. Clark S. The thymus in mice of strain 129/9 studicn with the electron microscope / S. Clark //Amcr. J. Anat. – 1963. – № 112. – Р. 1 – 33. 150. Crivellato, E. The mast cell: a multifunctional effector cell / E. Crivellato, D. Ribatti, F. Mallardi, C. A. Beltrami // Adv. Clin. Path. – 2003. - Vol. 7, № 1. – P. 13 – 26. 151. Claustrat, B. Melatonin: Physiological effects in humans / B. Claustrat, J. Leston // Neurochirurgie. – 2015. – Vol. 61, № 2-3. – P. 77 – 84. 152. Cobbold, S. P. Regulatory T cells in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance / S. P. Cobbold, L. Graca, C. Y. Lin et al. // Transpl. Int. – 2003. – Vol. 16. – P. 66 – 75. 153. Cross, S. A. A study of methods available for cytochemical localization of histamine by fluorescence induced with o-phtaldehyde or acetaldehyde / S. A. Cross, S. W. Ewen, F. W. Rost // Hystochem. J. – 1971. – Vol. 3, N 6. – P. 471 – 476. 154. Cruz, J. de la Basal and Antigen-Induced Exposure of the Proline-Rich Sequence in CD3 [Электронный ресурс] / J. de la Cruz, T. Kruger, C. A. Parks et al. // J Immunol. – 2011. – Vol. 186, № 4. – Режим http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Basal+and+AntigenInduced+Exposure+of+ the+Proline-Rich+Sequence+in+CD3. доступа: 144 155. Csaba, G. Serotonin content is elevated in the immune cells of histidine decarboxylase gene knock-out (HDCKO) mice. Focus on mast cells / G. Csaba, P. Kovacs, E. Buzas // Inflamm. Res. – 2007. – Vol. 56, № 2. – P. 89 – 92. 156. Cui, W. Vanadium toxicity in the thymic development [Электронный ресурс] / W. Cui, H. Guo, H. Cui // Oncotarget. – 2015. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26416460. 157. Calvo, J. R. The role of melatonin in the cells of the innate immunity: a review / J. R. Calvo, C. Gonzales-Yanes, M. D. Maldonado // Journal of Pineal research. – 2013. – Vol. 55, № 2. – Р. 103 – 120. 158. Currier, N. L. Exogenous melatonin: quantitative enhancement in vivo of cells mediating non-specific immunity / N. L. Currier, L. Z. Sun, S. C. Miller // Journal of neuroimmunology. – 2000. – Vol. 104. – P. 101 – 108. 159. Cutando, A. Action of melatonin on squamous cell carcinoma and other tumors of the oral cavity (Review) / A. Cutando, A. Lopez-Valverde, J. D. E. Vicente et al. // Oncology letters. – 2014. – Vol. 7, № 4. – Р. 923 – 926. 160. Dabrowski, M. P. The thymus in neuro-endocrine-immune network / M. P. Dabrowski, M. I. Dabrowski, W. Stankiewicz // Central European Journal of Immunology. – 2011. – Vol. 36, № 3. – P. 188 – 192. 161. Damaj, B. B. Functional expression of H4 histamine receptor in human natural killer cells, monocytes, and dendritic cells / B. B. Damaj, C. B. Becerra, H. J. Esber et al. // Journal of Immunology. – 2007. – Vol. 179, № 11. – P. 7907 – 7915. 162. Dawicki, W. New and emerging roles for mast cells in host defence / W. Dawicki, J. S. Marshall // Curr. Opin. Immunol. – 2007. – Vol. 19. – P. 31 – 38. 163. De Blasi, A. Regulation of G protein- couplet receptor kinase subtypes in activared t-lymphocytes. Selective increase of [beta]-adrenergic receptor kinase 1 and 2 / А. De Blasi, G. Parruti, M. Sallese // J. Clin. Invest. – 1995. – Vol. 95. – P. 203 – 210. 164. DeFord-Watts, L. M. The Cytoplasmic Tail of the T Cell Receptor CD3 Subunit Contains a Phospholipid-Binding Motif that Regulates T Cell Functions / L. M. 145 DeFord-Watts, T. C. Tassin, A. M. Becker et al. // Journal of Immunology. – 2009. – Vol. 183, № 2. – P. 1055 – 1064. 165. D’Orsogna, L. J. TCR cross-reactivity and allorecognition: new insights into the immunogenetics / L. J. D’Orsogna, D. L. Roelen, I. I. N. Doxiadis, F. H. J. Class // Immunogenetics. – 2012. – Vol. 64, № 2. – P. 77 – 85. 166. Dubocovich, M. L. Functional MT1 and MT2 melatonin receptors in mammals / M. L. Dubocovich, M. Markowska. – Endocrine. – 2005. – Vol. 27. – P. 101 – 110. 167. Dudocovich, M. L. Melatonin receptors. In the IUPHAR Compendium of Receptor Characterization and Classification / M. L. Dudocovich, D. P. Cardinali, P. Delagrange et al.. – 2nd edition. – London : IUPHAR Media, 2000. – p. 221 – 227. 168. Elenkov, I. J. The sympathetic nerve an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system / I. J. Elenkov, R. L. Wilder, G. P. Chrousos, E. S. Vizi // Pharmacol. Rev. – 2000. – Vol. 52, № 4. – P. 595 – 638. 169. Espino, J. Oxidative Stress and Immunosenescence: Therapeutic Effects of Melatonin [Электронный ресурс] / J. Espino, J. Pariente, A. B. Rodriguez // Oxidative medicine and cellular longevity. – 2012. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3549369/. 170. Esquifino, A. I. Circadian organization of the immune response: A role for melatonin / A. I. Esquifino, S. R. Pandi-Perumal, D. P. Cardinali // Clinical and Applied Immunology Reviews. – 2004. – Vol. 4. – P. 423 – 433. 171. Ewijk, V. W. Immunohistology of lymphoid and non-lymphoid cells in the thymus in relation to lymphocyte differcntion / V. W. Ewijk // Amcr. J. Anat. – 1984. – № 70. – Р. 643 – 644. 172. Facchetti, F. Linker for Activation of T Cells (LAT), a Novel Immunohistochemical Marker for T Cells, NK Cells, Mast Cells, and Megakaryocytes. Evaluation in Normal and Pathological Conditions / F. Facchetti, J. K. C. Chen, W. Zhang et al. // Am J Pathol. – 1999. – Vol. 154, № 4. – P. 1037 – 1046. 146 173. Falk, В. Fluorescence of catecholamines and related compounds condensed with formaldehyde / В. Falk, N. A. Hillarp, G. Thieme, A. Torp. // J. Histochem. Cytochem. – 1962. – Vol. 10. – P. 348 – 354. 174. Feldman, A. M. The role of tumor necrosis factor in the pathophysiology of heart failure / A. M. Feldman, A. Combes, D. Wagner // J. Am. Coll. Cardiol. – 2000. – № 35. – P. 537 – 544. 175. Ferstl, R. Histamine regulation of innate and adaptive immunity / R. Ferstl, C. A. Akdis, L. O'Mahony // Front. Biosci. – 2012. – Vol. 17. – P. 40 – 53. 176. Finocchiaro, L. E. Melatonin biosynthesis and metabolism in peripheral blood mononuclear leucocytes / L. E. Finocchiaro, E. Nahmod, J. M. Launay // Biochen. J. – 1991. – Vol. 280. – P. 727 – 732. 177. Follenius, M. Distinct modes of melatonin secretion in normal men / M. Follenius, L. Weibel, G. Brandenberger // Journal Pineal Res. – 1995. – Vol. 18. – P. 135 – 140. 178. Foster, C. E. Structures of mammalian cytosolic quinine reductases / C. E. Foster, M. A. Bianchet, P. Talalay et al. // Free Radical Biology and Medicine. – 2000. – Vol. 29. – P. 241 – 245. 179. Fournier, I. Folate deficiency alters melatonin secretion in rats / I. Fournier, F. Ploye, J. M. Cottet-Emard et al. // Journal of Nutrition. – 2002. – Vol. 132. – Р. 2781 – 2784. 180. Frungieri, M. B. Direct effect of melatonin on Syrian hamster testes: melatonin subtype 1a receptors, inhibition of androgen production, and interaction with the local corticotropin releasing hormone system / M. B. Frungieri, A. Mayerhofer, K. Zitta et al. // Endocrinology. – 2005. – Vol. 146. – P. 1541 – 1552. 181. Gallegos, A. M. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation / A. M. Gallegos, M. J. Bevan // Journal of Experimental Medicine. – 2004. – Vol. 200, № 8. – P. 1039 – 1049. 182. Galli, S. J. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances / S. J. Galli, J. Kalesnikoff, M. A. Grimbaldeston // Annu Rev. Immunol. – 2005. – Vol. 23. – P. 749 – 786. 147 183. Galli, S. J. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity / S. J. Galli, M. A. Grimbaldeston, M. Tsai // Nat Rev Immunol. – 2008. – Vol. 8. – P. 478 – 486. 184. Garcia, M. G. R. The Importance of the Nurse Cells and Regulatory Cells in the Control of T Lymphocyte Responses [Электронный ресурс] / M. G. R. Garcia, F. G. Tamayo // Biomed Res Int. – 2013. – Режим доступа: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3591132. 185. Garcia-Maurino, S. Melatonin enhances il-2, il-6, and ifn-gamma production by human circulating cd4+ cells: A possible nuclear receptor-mediated mechanism involving t helper type 1 lymphocytes and monocytes / S. Garcia-Maurino, M. G. Gonzalez-Haba, M. Rafii-El-Idrissi et al. // J. Immunol. – 1997. – Vol. 159. – Р. 574 – 581. 186. Garcia-Maurino, S. Melatonin activates Th1 lymphocytes by increasing IL-12 production / S. Garcia-Maurino, D. Pozo, A. Carrillo-Vico et al. // Life Science. – 1999. – Vol. 65. – P. 2143 – 2150. 187. Garcia-Maurino, S. Correlation between nuclear melatonin receptor expression and enhanced cytokine production in human lymphocytic and monocytic cell lines / S. Garcia-Maurino, D. Pozo, J. R. Calvo, J. M. Guerrero // Journal of Pineal Research. – 2000. – Vol. 29. – P. 129 – 137. 188. Garcia, J. J. Protective effects of melatonin in reducing oxidative stress and in preserving the fluidity of biological membranes: a review / J. J. Garcia, L. LopezPingarron, P. Almeida-Souza et al. // Journal of Pineal Research. – 2014. – Vol. 56, № 3. – P. 225 – 237. 189. Gilad, E. Melatonin receptors in PC3 human prostate tumor cells / E. Gilad, M. Laufer, H. Matzkin, N. Zisapel // Journal of Pineal Research. – 1999. – Vol. 26. – P. 211 – 220. 190. Gillette, М. U. Сircadian actions of melatonin at suprachiasmatic nucleus / M. U. Gillette, A. J. Mcarthur // Behavioural Brain Research. – 1995. – Vol. 73. – P. 135 – 139. 148 191. Gobbo, V. Pinealectomy inhibits interleukin-2 production and natural killer activity in mice / V. Gobbo, V. Libri, N. Villani et al. // International journal of immunopharmacology. – 1989. – Vol. 11, № 5. – Р. 567 – 573. 192. Goswami, S. CUVB irradiation severely induces systemic tissue injury by augmenting oxidative load in a tropical rodent: efficacy of melatonin as an antioxidant / S. Goswami, C. J. Haldar // Photochem Photobiol B. – 2014. – Vol. 141. – P. 84 – 92. 193. Guerder, S. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells / S. Guerder, C. Viret, H. Luche et al. // Curr Opin Immunol. – 2012. – Vol. 24, № 1. – P. 99 – 104. 194. Gumperz, J. E. The ins and outs of CD1 molecules: bringing lipids under mmunological surveillance / J. E. Gumperz // Traffic. – 2006. – Vol. 7, № 1. – P. 2 – 13. 195. Guo, Q. Developmental changes of melatonin receptor expression in the spleen of the chicken, Gallus domesticus / Q. Guo, Y. Dong, J. Cao et al. // Acta Histochem. – 2015. – Vol. 117, № 6. – P. 559 – 565. 196. Gupta, S. Death of lymphocytes: A clue to immune deficiency in human aging / S. Gupta // Discovery medicine. – 2005. – Vol. 5, № 27. – P. 298 – 302. 197. Gupta, S. Photoperiodic regulation of nuclear melatonin receptor RORα in lymphoid organs of a tropical rodent Funambulus pennanti: role in seasonal oxidative stress / S. Gupta, C. Haldar, R. J. Ahmad // Photochem Photobiol B. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. – 2015. – Vol. 142. – P. 141 – 153. 198. Gutzmer, R. Histamine H4 receptor stimulation suppresses IL-12p70 production and mediates chemotaxis in human monocyte-derived dendritic cells / R. Gutzmer, C. Diestel, S. Mommert et al. // Journal of Immunology. – 2005. – Vol. 174, № 9. – P. 5224 – 5232. 199. Hanson, M. L. Prenatal cadmium exposure dysregulates sonic hedgehog and Wnt/β-catenin signaling in the thymus resulting in altered thymocyte development / M. L. Hanson, K. M. Brundage, R. Schafer et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2010. – Vol. 242, № 2. – P. 136 – 145. 149 200. Head, G. M. Neuropeptides exert direct effects on rat thymic epithelial cells in culture / G. M. Head, R. Mentlein, В. von Patay, J.E. Downing, M. D. Kendall // Dev. Immunol. – 1998. – Vol. 6, № 1-2. – P. 95 – 104. 201. Heijnen, C. J. Functional α1-adrenergic receptors on leukocytes of patients with polyarticular juvenile rheumatoid arthritis / C. J. Heijnen, R. van der Voort et al. // J. Neuroimmunol. – 1996. – Vol. 71. – P. 223 – 226. 202. Hellstrand, K. Enhancement of human natural killer cell cytotoxicity by serotonin: role of non-T/CD16+NK cells, accessory monocytes, and 5-HTIA receptors / K. Hellstrand, S. Hermodsson // Immunology. – 1990. – Vol. 127. – P. 199. 203. Hellstrand, K. Monocyte-mediated suppression of I L-2-induced NK-cell activation / K. Hellstrand, S. Hermodsson // Scand. J. Immunol. – 1990. – Vol. 32. – P. 183. 204. Hellstrand, K. Serotonergic 5-HT1A receptors regulate a cell contact-mediated interaction between natural killer cells and monocytes / K. Hellstrand, S. Hermodsson // Scand. J. Immunol. – 1993. – Vol. 13. – P. 33 – 38. 205. Hendrix, T. M. Thymic nurse cells exhibit epithelial progenitor phenotype and create unique extra-cytoplasmic membrane space for thymocyte selection / T. M. Hendrix, R. V. Chilukuri, M. Martinez et al. // Cell Immunology. – 2010. – Vol. 261, № 2. – P. 81 – 92. 206. Hennies, C. M. Quantitating MHC class II trafficking in primary dendritic cells using imaging flow cytometry / C. M. Hennies, M. A. Lehn, E. M. Janssen // J Immunol Methods. – 2015. – Vol. 423. – P. 18 – 28. 207. Howson, L. J. Identification of dendritic cells, B cell and T cell subsets in Tasmanian devil lymphoid tissue; evidence for poor immune cell infiltration into devil facial tumors / L. J. Howson, K. M. Morris, T. Kobayashi et al. // Anal Rec. – 2014. – Vol. 297, № 5. – P. 925 – 938. 208. Hu, D. N. Effects of melatonin, its precursors and derivatives on the growth of cultured human uveal melanoma cells / D. N. Hu, S. A. McCormick, J. E. Roberts // Melanoma Research. – 1998. – Vol. 8. – P. 205 – 210. 150 209. Ileana, P. Regeneration of the adult thymus is preceded by the expansion of K5+K8+ epithelial cell progenitors and by increased expression of Trp63, cMyc and Tcf3 transcription factors in the thymic stroma / Ileana P., Zubkova I., Medvedovic M. // International Immunology. – 2008. – Vol. 19. – Р. 1249 – 1260. 210. Innominato P. F. Clemons M. et al. The effect of melatonin on sleep and quality of life in patients with advanced breast cancer [Электронный ресурс] / P. F. Innominato, A. S. Lim, O. Palesh // Support Care Cancer. – 2015. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26260726. 211. Inoue, Y. Anti-hypertensive action of melatoninergic compounds / Y. Inoue // Nihon Rinshō. – 2014. – Vol. 72, № 8. – Р. 1386 – 1394. 212. Janossy, G. Cellular differentiation of lymphoid subpopulations and their microinviron / G. Janossy, M. Bofill, L. Tredosiewicz // Springer Verlag. – 1986. – Р. 89 – 127. 213. Jung, F. J. Melatonin in ivo prolongs cardiac allograft survival in rats / F. J. Jung, L. Yang, L. Harter et al. // Journal of pineal research. – 2004. – Vol. 37, № 1. – P. 36 – 41. 214. Jung, K. H. Melatonin downregulates nuclear erythroid 2-related factor 2 and nuclear factor-kappaB during prevention of oxidative liver injury in a dimethylnitrosamine model / K. H. Jung, S. W. Hohg, H. M. Zheng et al. // J Pineal Res. – 2009. – Vol. 47, № 2. – P. 173 – 183. 215. Kahya, M. C. Melatonin and selenium reduce plasma cytokine and brain oxidative stress levels in diabetic rats / M. C. Kahya, M. Naziroglu, B. Cig // Brain Injury. – 2015. – Vol. 5. – P. 1 – 7. 216. Kanishi, Y. Differential growth inhibitory effect of melatonin on two endometrial cancer cell lines / Y. Kanishi, Y. Kobayashi, S. Noda et al. // Journal of Pineal Research. – 2000. – Vol. 28. – P. 227 – 233. 217. Karbownik, М. Antioxidative effects of melatonin in protection against cellular damage caused by ionizing radiation / M. Karbownik, R. J. Reiter // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. – 2000. – Vol. 225, № 1. – Р. 9 – 22. 151 218. Kaur, C. Effects of melatonin on macrophages/microglia in postnatal rat brain / C. Kaur, E. A. Ling // Journal of pineal research. – 1999. – Vol. 26. – P. 158 – 168. 219. Kiefer, T. Melatonin inhibits estrogen receptor transactivation and cAMP levels in breast cancer cells / T. Kiefer, P. T. Ram, L. Yuan, S. M. Hill // Breast cancer research and treatment. – 2002. – Vol. 71. – P. 37 – 45. 220. Klein, D. C. Pineal N-acetyltransferase and hydroxyindole-o-methyltrans-ferase: control by the retinohypothalamic tract and the suprachiasmatic nucleus / D. C. Klein, R. Y. Moore // Brain Res. – 1979. – Vol. 174. – P. 245 – 262. 221. Klein, L. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction / L. Klein // Nature Reviews Immunology. – 2009. – Vol. 9. – P. 833 – 844. 222. Klein, S. L. The effects of hormones on sex differences in infection: from genes to behavior / S. L. Klein // Neurosci Biobehav Rev. – 2000. – Vol. 24, № 6. – P. 627 – 638. 223. Kmiecik, T. T lymphocytes as a target of histamine action / T. Kmiecik, A. Otocka-Kmiecik, M. Gorska-Ciebiada, M. Ciebiada // Arch. Med. Sci. – 2012. – Vol. 8, № 1. – P. 154 – 161. 224. Koble, C. The thymic medulla: a unique microenvironment for intercellular selfantigen transfer / C. Koble, B. Kyewski // Journal of Experimental Medicine. – 2009. – Vol. 206, № 7. – P. 1505 – 1513. 225. Konakchieva, R. Selective effect of methoxyindoles on the lymphocyte proliferation and melatonin binding to activated human lymphoid cells / R. Konakchieva, S. Kyurkchiev, I. Kehayov et al. // J Neuroimmunol. – 1995. – Vol. 63, № 2. – P. 125 – 132. 226. Kristin, H. The Thymus – What's new? / H. Kristin // Histopathology. – l989. – № 14. – Р. 537 – 548. 227. Kumar, A. Sesamol attenuates genotoxicity in bone marrow cells of whole-body γirradiated mice / A. Kumar, T. G. Selvan, A. M. Tripathi et al. // Mutagenesis. – 2015. – V. 30, № 5. – P. 651 – 661. 152 228. Kumar, G. L. Иммуногистохимические методы: руководство / G. L. Kumar, L. Rudbeck: Dako / пер. с англ. под ред. Г. А. Франка, П. Г. Малькова. – М., 2011. – 224 с. 229. Kut, J. L. Regulation of murine T-lymphocyte function by spleen cell-derived and exogenous serotonin / J. L. Kut, M. R. Young, J. W. Crayton et al. // Immunopharmacology and immunotoxicology. – 1992. – Vol. 14, № 4. – P. 783 – 796. 230. Lefever, A. Role of K+ion channels in lymphokine-activated killer (LAK) cell lytic function / A. Lefever, A. Liepins, R. Truitt // Immunopharmacol. Immunotoxicol. – 1989. – Vol. 11. – P. 571. 231. Lepelletier, Y. Control of human thymocyte migration by Neuropilin1/Semaphorin-3A-mediated interactions / Y. Lepelletier, S. Smaniotto, R. HadjSlimane et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2007. – Vol. 104, № 13. – P. 5545 – 5550. 232. Li, C-Y. Adrenaline inhibits lipopolysac-charide-induced macrophage inflammatory protein-1 in human monocytes: the role of B-adrenergic receptors / CY. Li, T-C. Chou, C-H. Lee // Anesth. Analg. – 2003. – № 96. – P. 518 – 523. 233. Liberman, A. C. The activated glucocorticoid receptor inhibits the transcription factor T-bet by direct protein-protein interaction / A. C. Liberman, D. Refojo, J. Druker // FASEB J. – 2007. – № 21. – P. 1177 – 1188. 234. Liepins, A. Serotonin modulated Ca++ dependent K+ channels in alloimmune effector cell lytic function / A. Liepins, A. Lefever, R. Truitt // Immunopharmacol. Immunotoxicol. – 1989. – Vol. 11. – P. 165. 235. Lin, G. L. Melatonin prolongs islet graft survival in diabetic NOD mice / G. L. Lin, S. H. Huang, Y. W. Chen et al. // Journal of pineal research. – 2009. – Vol. 47, № 3. – P. 284 – 292. 236. Lin, G-J. Modulation by Melatonin of the Pathogenesis of Inflammatory Autoimmune Diseases / G-J. Lin, S-H Huang, S-J Chen et al. // Int J Mol Sci. – 2013. – Vol. 14, № 6. – P. 11742 – 11766. 153 237. Lind, E. F. Mapping precursor movement through the postnatal thymus reveals specific microenvironments supporting defined stages of early lymphoid development / E. F. Lind, S. E. Prockop, H. E. Porritt, H. T. Petrie // Journal of experimental medicine. – 2001. – Vol. 194, № 2. – P. 127 – 134. 238. Lissoni, P. Increased survival time in brain glioblastomas by a radioneuroendocrine strategy with radiotherapy plus melatonin compared to radiotherapy alone / Р. Lissoni, S Meregalli, L. Nosetto et al. // Oncology. – 1996. – Vol. 53, № 1. – Р. 43 – 46. 239. Lissoni, P. Circadian secretions of IL-2, IL-12, IL-6 and IL-10 in relation to the light/dark rhythm of the pineal hormone melatonin in healthy humans / Р. Lissoni, F. Rovelli, F. Brivio, O. Brivio, L. Fumagalli // Nature immunology. – 1998. – Vol. 16. – P. 1 – 5. 240. Lissoni, P. Is there a role for melatonin in supportive care? / P. Lissoni // Support Care Cancer. – 2002. – Vol. 10, № 2. – Р. 110 – 116. 241. Lissoni, P. Five years survival in metastatic non-small cell lung cancer patients treated with chemotherapy alone or chemotherapy and melatonin: a randomized trial / P. Lissoni, M. Chilelli, S. Villa et al. // Journal of Pineal Research. – 2003. – Vol. 35. – P. 12 – 15. 242. Liu, C. Localization of Aa-nat mRNA in the rat retina by fluorescence in situ hybridization and laser capture microdissection / C. Liu, C. Fukuhara, J. H. Wessel // Cell Tissue Research. – 2004. – Vol. 315. – P. 197 – 201. 243. Livnat, S. Involvement of peripheral and central catecholamine systems in neuralimmune interactions / S. Livnat, S, Y. Felten, S. L. Carlson // J. Neuroimmunol. – 1985. – Vol. 10, № 1. – P. 5 – 30. 244. Lockridge, J. L. Analysis of the CD1 Antigen Presenting System in Humanized SCID Mice [Электронный ресурс] / J. L. Lockridge, X. Chen, Y. Zhou et al. // PLoS One. – 2011. – Vol. 6, № 6. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Analysis+of+the+CD1+Antigen+Prese nting+System+in+Humanized+SCID+Mice. 154 245. Lopez-Gonzalez, M. A. Specific binding of 2-[125I]melatonin by partially purified membranes of rat thymus / M. A. Lopez-Gonzalez, A. Мartin-Cacao, R. J. Reiter et al. // Journal of Neuroimmunology. – 1993. – Vol. 45, № 1–2. – P. 121 – 126. 246. Lopez-Verges, S. CD57 defines a functionally distinct population of mature NK cells in the human CD56dimCD16+ NK-cell subset / S. Lopez-Verges, J. M. Milush, S. Pandey // Blood. – 2010. – Vol. 116. – P. 3865 – 3874. 247. Love, P. E. Signal integration and crosstalk during thymocyte migration and emigration / P. E. Love, A. Bhandoola // Nat Rev Immunol. – 2011. – Vol. 1, № 7. – P. 469 – 477. 248. Luboshitzky, R. The effect of pyridoxine administration on melatonin secretion in normal men / R. Luboshitzky, U. Ophir, R. Nave // Neuroendocrinology letter. – 2002. – Vol. 23. – Р. 213 – 217. 249. Ludewig, B. Dendritic cell homeostasis in the regulation of self-reactivity / B. Ludewig, P. Krebs, T. Junt, G. Bocharov // Curr. Pharm. Des. – 2003. – Vol. 9, № 3. – Р. 221 – 231. 250. Maestroni, G. J. Role of the pineal gland in immunity: II. Melatonin enhances the antibody response via an opiatergic mechanism / G. J. Maestroni, A. Conti, W. Pierpaoli // Clinical and experimental immunology. – 1987. – Vol. 68. – P. 384 – 391. 251. Maestroni, G. J. Role of the pineal gland in immunity. III. Melatonin antagonizes the immunosuppressive effect of acute stress via an opiatergic mechanism / G. J. Maestroni, A. Conti, W. Pierpaoli // Immunology. – 1988. – Vol. 63. – P. 465 – 469. 252. Maestroni, G. J. Colony-stimulating activity and hematopoietic rescue from cancer chemotherapy compounds are induced by melatonin via endogenous interleukin 4 / G. J. Maestroni, A. Conti, P. Lissoni // Cancer Research. – 1994. – Vol. 54. – P. 4740 – 4743. 253. Maestroni, G. J. Hematopoietic rescue via T-cell dependent, endogenous granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induced by the pineal 155 neurohormone melatonin in tumor-bearing mice / G. J. Maestroni, V. Covacci, A. Conti // Cancer Research. – 1994. – Vol. 54. – P. 2429 – 2432. 254. Maestroni, G. J. Melatonin and the immune-hematopoietic system therapeutic and adverse pharmacological correlates / G. J. Maestroni, A. Conti // Neuroimmunomodulation. – 1996. – Vol. 3. – P. 325 – 332. 255. Maestroni, G. J. The photoperiod transducer melatonin and the immune hematopoietic system / G. J. Maestroni // Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. – 1998. – Vol. 43. – P. 186 – 192. 256. Maestroni, G. J. The immunotherapeutic potential of melatonin / Expert Opinion on Investigational Drugs. – 2001. – Vol. 10. – P. 467 – 476. 257. Maiewska, M. Influence of melatonin and its precursor L-tryptophan on Th1 dependent contact hypersensitivity / M. Maiewska, K. Zaiac, M. Zemelka, M. Szczepanik // Journal of physiology and pharmacology. – 2007. – Vol. 58, № 6. – P. 125 – 132. 258. Mahmoud, I. Continuous darkness and continuous light induce structural changes in the rat thymus / I. Mahmoud, S. S. Salman, A. Al-Khateeb // J.Anat. – 1994. – Vol. 185. – P. 143 – 149. 259. Mäkitie, T. Tumor-infiltrating macrophages (CD68(+) cells) and prognosis in malignant uveal melanoma / T. Mäkitie, P. Summanen, A. Tarkkanen, T. Kivelä // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2001. – Vol. 42. – P. 1414 – 1421. 260. Maldonado, M. D. Evidence of melatonin synthesis and release by mast cells. Possible modulatory role in inflammation / M. D. Maldonado, M. Mora Santos, L. Naji et al. // Pharmacol. Res. – 2010. – Vol. 62, № 3. – P. 282 – 287. 261. Marcelino da Silva, E. Z. Mast Cell Function. A New Vision of an Old Cell / E. Z. Marcelino da Silva, M. C. Jamur, C. Oliver // J. Histochem. Cytochem. – 2014. – Vol. 62, № 10. – P. 698 – 738. 262. Marley N. R. Structure and function of the thymic microenvironment / N. R. Marley, E. R. Richie, C. C. Blackburn et al. // Frontiers in Bioscience. – 2011. – Vol. 16. – P. 2461 – 2477. 263. Matavele, C. R. CD4(+)CD25(High) Treg cells in HIV/HTLV Co-infected 156 patients with neuropathy: high expression of Alpha4 integrin and lower expression of Foxp3 transcription factor / C. R. Martavele, S. D. Silva-Barbosa, A. Augusto et al. // BMC Immunol. – 2015. – Vol. 16, № 1. – P. 52. 264. Mathis, D. Decade of AIRE / D. Mathis, C. Benoist // Nature Reviews Immunology. – 2007. – Vol. 7. – P. 645 – 650. 265. McClory, S. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil / S. McClory, T. Hughes, A. G. Freud et al. // J Clin Invest. – 2012. – Vol. 122, № 4. – P. 1403 – 1415. 266. Mello-Coelho, V. Role of Prolactin and Growth Hormone on Thymus Physiology / V. Mello-Coelho, W. Savino, M.-C. Postel-Vinay, M. Dardenne // Dev Immunol. – 1998. – Vol. 6, № 3-4. – P. 317 – 323. 267. Milicevic, N. M. Activation of cortical and inhibited differentiation of medullary epithelial cells in the thymus of limphotoxin-betta receptor-deficient mice: ultrastructural study / N. M. Milicevic, K. Nohroudi, Z. Milićević, J. Westermann // J. Anatomy. – 2008. – Vol. 212. – Р. 114 –124. 268. Milicevic, N. M. Metallophilic macrophages of the rodent thymus / N. M. Milicevic, Z. Milicevic. – Prog Histochem Cytochem. – 2013. – Vol. 48, № 1. – P. 1 – 46. 269. Moller, M. The anatomy and innervation of the mammalian pineal gland / M. Moller, F. M. M. Baeres // Cell Tissue Res. – 2002 – Vol. 309. – Р. 139 – 150. 270. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function / T. C. Moon, C. D. St. Laurent, K. E. Morris et al. // Mucosal Immunol. – 2010. – Vol. 3, № 2. – P. 111 – 128. 271. Moore, C. B. Melatonin enhances cellular and humoral immune responses in the Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) via an opiatergic mechanism / C. B. Moore, T. D. Siopes // General and comparative endocrinology. – 2003. – Vol. 131. – P. 258 – 263. 272. Moore, K. J. Scavenger receptors in atherosclerosis: beyond lipid uptake / K. J. Moore, M. W. Freeman // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2006. – Vol. 26, № 8. – P. 1702 – 1711. 157 273. Morrey, K. M. Activation of human monocytes by the pineal hormone melatonin / K. M. Morrey, J. A. McLachlan, C. D. Serkin, O. Bakouche // Journal of Immunology. – 1994. – Vol. 153. – P. 2671 – 2680. 274. Nagai, Y. Histamine reduces susceptibility to natural killer cells via downregulation of NKG2D ligands on human monocytic leukaemia THP-1 cells / Y. Nagai, Y. Tanaka, T. Kuroishi et al. // Immunology. – 2012. – Vol. 136, № 1. – P. 103 – 114. 275. Nair, M. P. Histamine-Induced Suppressor Factor Inhibition of NK Cells: Reversal with Interferon and Interleukin 2 / M. P. Nair, J. M. Cilik, S. A. Schwarts // The Journal of Immunology. – 1986. – Vol. 136, № 7. – P. 2456 – 2462. 276. Nava, M. Melatonin reduces renal interstitial inflammation and improves hypertension in spontaneously hypertensive rats / M. Nava, Y. Quiroz, N. Vaziri, B. Rodriquez-Iturbe // Am J Physiol Renal Physiol. – 2003. – Vol. 284, № 3. – P. 447 – 454. 277. Neveu, P. J. Physiological basis for neuroimmunomodulation / P. J. Neveu, M. Le Moal // Fundam. Clin. Pharmacol. – 1990. – Vol. 4. – P. 281. 278. Nosjean, O. Identification of the melatonin binding site MT3 as the quinone reductase 2 / O. Nosjean, M. Ferro, F. Coge et al. // Journal of Biological Chemistry. – 2000. – Vol. 275. – P. 31311 – 31317. 279. Ohtsu, H. Pathophysiologic role of histamine: evidence clarified by histidine decarboxylase gene knockout mice / H. Ohtsu // Int. Arch. Allergy Immunolology. – 2012. – Vol. 158, № 1. – P. 2 – 6. 280. O'Mahony, L. Regulation of the immune response and inflammation by histamine and histamine receptors / L. O'Mahony, M. Akdis, C. A. Akdis // J. Allergy Clin. Immunol. – 2011. – Vol. 128. – P. 1153 – 1162. 281. Ozkanlar, S. Melatonin Modulates the Immune System Response and Inflammation in Diabetic Rats Experimentally-Induced by Alloxan / S. Ozkanlar, A. Kara, E. Sengul et al. // Horm Metab Res. – 2015. – Vol. 47. – P. 1 – 8. 282. Pacini, N. Action of melatonin on bone marrow depression induced by cyclophosphamide in acute toxicity phase / N. Pacini, F. Borziani // Neuro 158 endocrinology letters. – 2009. – Vol. 30, № 5. – Р. 582 – 591. 283. Packard, K. A. Effects of histamine on Th1/Th2 cytokine balance / K. A. Packard, M. M. Khan // International immunopharmacology. – 2003. – Vol. 3, № 7. – P. 909 – 920. 284. Pardridge, W. M. Transport of albumin-bound melatonin through the blood-brain barrier / W. M. Pardridge, L. J. Mietus // Journal of Neurochemistry. – 1980. – Vol. 34. – P. 1761 – 1763. 285. Patay, B. Effect of transmitters and cotransmitters of the sympathetic nervous system on interleukin-6 synthesis in thimic epithelial cells / B. Patay, B. Kurz, R. Mentlein // Neuroimmunomodulation. – 1999. – Vol. 6, № 1-2. – P. 45 – 50. 286. Petranka, J. The oncostatic action of melatonin in an ovarian carcinoma cell line / J. Petranka, W. Baldwin, J. Biermann et al. // Journal of Pineal Research. – 1999. – Vol. 26. – P. 129 – 136. 287. Pezzano, M. Questionable thymic nurse cell / M. Pezzano, M. Samms, M. Martinez, J. Guyden // Microbiol Mol Biol Rev. – 2001. – Vol. 65, № 3. – P. 390 – 403. 288. Philp, D. The binding, internalization, and release of thymocytes by thymic nurse cells / D. Philp, M. Pezzano, Y. Li et al. // Cell Immunology. – 1993. – Vol. 148, № 2. – P. 301 – 315. 289. Poeggeler, B. Pineal hormone melatonin oscillates also in the dinoflagellate Gonyaulax polyedra / B. Poeggeler, I. Balzer, R. Harderland, A. Lerchl // Naturwissenschaften. – 1991. – Vol. 78. – P. 268 – 269. 290. Proshutinskaya, D. V. On the role of dendritic cells in the pathogenesis of vitiligo / D. V. Proshutinskaya, V. A. Volnukhin, O. R. Katunina, A. V. Rezaikina // Vestn Dermatol Venerol. – 2010. – Vol. 4. – P. 28 – 32. 291. Provinciali, M. Long-term melatonin supplementation does not recover the impairment of natural killer cell activity and lymphocyte proliferation in aging mice / M. Provinciali, S. G. Di, D. Bulian // Life Sci. – 1997. – Vol. 61. – P. 857 – 864. 159 292. Puxeddu, I. Mast cell in allergy and beyond / I. Puxeddu, A. M. Piliponsky, I. Bachelet, F. Levi-Schaffer // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2003. – Vol. 35, № 12. – P. 1601 – 1607. 293. Raghavendra, V. Melatonin provides signal 3 to unprimed CD4+ T cells but failed to stimulate LPS primed B cells / V. Raghavendra, V. Singh, A. V. Shaji et al. // Clin Exp Immunol. – 2001. – Vol. 124, № 3. – P. 414 – 422. 294. Raffi-El-Idrissi, M. Specific binding of 2-(125J) iodmelatonin by rat splenacytes: characterization and its role of regulation of cyclic AMP production / M. Raffi-ElIdrissi, D. Pozo, J. R. Calvo // Journal of Neuroimmunology. – 1995. – Vol.57. – P. 171 – 178. 295. Rahman, S. A. Antidepressant action of melatonin in the treatment of Delayed Sleep Phase Syndrome / S. A. Rahman, L. Kayumov, C. M. Shapiro // Sleep Med. – 2010. – Vol. 11, № 2. – Р. 131 – 136. 296. Rai, S. Pineal control of immune status and hematological changes in blood and bone marrow of male squirrels (Funambulus pennanti) during their reproductively active phase / S. Rai, C. Haldar // Comparative biochemistry and physiology. Part C. Toxicology, Pharmacology. – 2003. – Vol. 136. – P. 319 – 328. 297. Reichert, В. Phenotypic analysis of thymocytes that express homing receptors for peripherial lymph nodcs / В. Reichert, J. Weissman, E. Buncher // J. Immunol. – 1986. – 136. – Р. 3521 – 3529. 298. Reiter, R. J. Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological interactions / R. J. Reiter / Endocrine Reviews. – 1991. – Vol. 12. – Р. 151 – 180. 299. Reiter, R. J. Actions of melatonin in the reduction of oxidative stress: a review / R. J. Reiter, D. X. Tan, C. Osuna, E. Gitto // Journal of Biomedical Science. – 2000. – Vol. 7. – P. 444 – 458. 300. Reiter, R. J. Melatinin combats molecular terrorism at the mitochondrial level / R. J. Reiter, S. D. Paredes et al. // Interdisc Toxicol. – 2008. – Vol. 1, № 2. – Р. 137 – 149. 160 301. Reppert, S. M. Melatonin receptors step into the light: cloning and classification of subtypes / S. M. Reppert, D. R. Weaver, C. Godson // Trends in Pharmacological Sciences. – 1996. – Vol. 17, № 3. – Р. 100 – 102. 302. Res, P. Downregulation of CD1 Marks Acquisition of Functional Maturation of Human Thymocytes and Defines a Control Point in Late Stages of Human T Cell Development / P. Res, B. Blom, T. Hori et al. // J Exp Med. – 1997. – Vol. 185, № 1. – P. 141 – 152. 303. Ritter, M. The human thymus microenvironments: in vivo identification of thymic nurse cells and other antigenically distinct subpopulations of epithelial cells / M. Ritter, C. Sauvage, S. Cotmore // Immunol. – 1981. – Vol. 44. – Р. 439 – 416. 304. Roncarolo, M. G. Type 1 T regulatory cells / M. G. Roncarolo, R. Bacchetta, C. Bordignon et al. // Immunol. Rev. – 2001. – Vol. 182. – P. 68 – 79. 305. Roy, D. Melatonin receptor activation regulates GnRH gene expression and secretion in GT1-7 GnRH neurons: Signal transduction mechanisms / D. Roy, D. D. Belsham // Journal of chemical biology. – 2001. – Vol. 277. – P. 251 – 258. 306. Saez, M. C. Melatonin increases the survival time of animals with untreated mammary tumours: neuroendocrine stabilization / M. C. Saez, C. Barriga, J. J. Garcia // Mol. Cell. Biochem. – 2005. – Vol. 278. – P. 15 – 20. 307. Sakaguchi, S. Immunologic tolerance maintained by CD25+CD4+ regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunity, tumor immunity, and transplantation tolerance / S. Sakaguchi, M. Itoh, Y. Kuniyasu et al. // Immunol. Rev. – 2001. – Vol. 182. – P. 18 – 32. 308. Sanchez, J. J. Estrogen modulation of adrenoceptor responsiveness in the female rat pineal gland: differential expression of intracellular estrogen receptors / J. J. Sanchez, P. Abreu, T. Gonzalez-Hernandez et al. // Journal of Pineal Research. – 2004. – Vol. 37. – P. 26 – 35. 309. Sanchez-Barcelo, E. J. Clinical uses of melatonin: evaluation of human trials / E. J. Sanchez-Barcelo, M. D. Mediavilla, D. X. Tan, R. J. Reiter // Current medicinal chemistry. – 2010. – Vol. 17, № 19. – P. 2070 – 2095. 161 310. Sanchez-Hidalgo, M. Melatonin, a natural programmed cell death inducer in cancer / M. Sanchez-Hidalgo, J. M. Guerrero, I. Villegas et al. // Current medicinal chemistry. – 2012. – Vol. 19, № 8. – Р. 3805 – 3821. 311. Sanders, V. M. Differential expression of the β2-adrenaergic receptor by Th1 and Th2 clones / V. M. Sanders, R. A. Baker, D.S. Ramer-Quinn et al. // Journal of Immunology. – 1997. – Vol. 158. – P. 4200 – 4210. 312. Sanno, N. Immunohistochemical detection of human natural killer cell like immunoreactivity in human pituitary adenomas, using monoclonal antibody NK-1 / N. Sanno, J. Itoh, A. Teramoto, Y. Itoh et al. // J. Neurooncol. – 1997. – Vol. 35, № 1. – P. 29 – 38. 313. Savino, W. Hormonal control of T-cell development in health and disease / W. Savino, D. A. Mendes-da-Cruz, A. Lepletier, M. Dardenne [Электронный ресурс] // Nat. Rev. Endocrinol. – 2015. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hormonal+control+of+Tcell+development+in+health+and+disease. 314. Scheiter, M. Proteome analysis of distinct developmental stages of human natural killer (NK) cells / M. Scheiter, U. Lau, M. van Ham et al. // Mol. Cell Proteomics. – 2013. – Vol. 12, № 5. – P. 1099 – 1114. 315. Scollay, R. Thymus cell migration: cells migratting from thymus to perip herial lymphoid organs have a «mature» phenotype / R. Scollay // J .Immunol. – 1982. – № 128. – Р. 1566 – 1570. 316. Sebzda, E. Transcription factor KLF2 regulates the migration of naive T cells by restricting chemokine receptor expression patterns / E. Sebzda, Z. Zhiying, S. L. John et al. // Nature immunology. – 2008. – Vol. 9, № 3. – P. 292 – 300. 317. Shaji, A. V. Regulation of secretion of IL-4 and IgG1 isotype by melatoninstimulated ovalbumin-specific T cells / A. V. Shaji, S. K. Kulkami, J. N. Agrewala // Clin Exp Immunology. – 1998. – Vol. 111, № 1. – Р. 181 – 185. 162 318. Shandra, O. O. Effect of deltaran and melatonin on immune system in rats with experimental contact dermatitis / O. O. Shandra // Frontiers in Bioscience. – 2014. – Vol. 60, № 1. – Р. 78 – 83. 319. Shezen, E. Cytokeratin expression in human thymus: immunohistoehemical mapping / E. Shezen, O. Elimelech // Cell Tissue Research. – 1995. – Vol. 279. – P. 221 – 231. 320. Shirazi, A. A radiobiological review on melatonin: a novel radioprotector / A. Shirazi, G. Ghobadi, M. Ghazi-Khansari // Journal of radiation research. – 2007. – Vol. 48, № 4. – Р. 263 – 272. 321. Shirazi, A. Radio-protective effects of melatonin against irradiation-induced oxidative damage in rat peripheral blood / A. Shirazi, E. Mihandoost, M. Mohseni et al. // Medical Physics. – 2011. – Vol. 29, № 1. – Р. 65 – 74. 322. Shirazi, А. Evaluation of Radio-Protective Effect of Melatonin on Whole Body Irradiation Induced Liver Tissue Damage / А. Shirazi, E. Mihandoost, М. Ghazikhansari // Cell journal. – 2013. – Vol. 14, № 4. – Р. 292 – 297. 323. Simon, T. Impact of histamine on dendritic cell functions / T. Simon, V. László, A. Falus // Cell Biol. Int. – 2011. – Vol. 35, № 10. – P. 997 – 1000. 324. Smolinska, S. Histamine and gut mucosal immune regulation / S. Smolinska, M. Jutel, R. Crameri, L. O'Mahony // Allergy. – 2014. – Vol. 69, № 3. – P. 273 – 281. 325. Soares, J. M. Jr. Functional melatonin receptors in rat ovaries at various stages of the estrous cycle / J. M. Jr. Soares, M. I. Masana, C. Ersahin, M. L. Dubocovich // The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. – 2003. – Vol. 306. – P. 694 – 702. 326. Song, L. Deletion of the murine scavenger receptor CD68 / L. Song, C. Lee, C. Schindler // J. Lipid. Res. – 2011. – Vol. 52, № 8. – P.1542 – 1550. 327. Spengler, R. N. Stimulation of alpha adrenergic receptor augments the production of macrophage-derived tumor necrosis factor / R. N. Spengler, R. M. Allen, D. G. Remick et al. // J. Immunol. – 1990. – Vol. 145. – P. 1430 – 1434. 163 328. Srinivasan, V. Melatonin, immune function and aging [Электронный ресурс] / V. Srinivasan, G. J. M. Maestroni, D. P. Cardinali et al. // Immunity & Ageing. – 2005. – Vol. 2. – Режим доступа: http://www.immunityageing.com/content/2/1/17. 329. Srinivasan, V. Potential use of melatonergic drugs in analgesia: mechanisms of action / V. Srinivasan, S. R. Pandi-Perumal, D. W. Spence et al. // Brain research bulletin. – 2010. – Vol. 81, № 4-5. – P. 362 – 371. 330. Starr, T. K. Hogquist: Positive and negative selection of T cells / T. K. Starr, S. C. Jameson, K. A. Hogquist // Annual Review of Immunology. – 2003. – Vol. 21. – P. 139 – 176. 331. Stassen, M. Human CD25+ regulatory T cells: two subsets defined by the integrins confer distinct suppressive properties upon CD4+T helper cells / M. Stassen, S. Fondel, T. Bopp et al. // Eur. J. Immunol. – 2004. – Vol. 34. – P. 1303 – 1311. 332. Stefulj, J. Gene expression of the key enzymes of melatonin synthesis in extrapineal tissues of the rat / J. Stefulj, M. Hortner, M. Ghosh // Journal of Pineal Research. – 2001. – Vol. 30. – P. 243 – 247. 333. Stehle, J. H. Adrenergic signals direct rhythmic expression of transcriptional repressor CREM in the pineal gland / J. H. Stehle, N. S. Foulkes, C. A. Molina et al. // Nature. – 1993. – Vol. 365. – Р. 314 – 320. 334. Straub, R. H. Interaction of the endocrine system with inflammation: a function of energy and volume regulation / R. H. Straub // Arthritis Res Ther. – 2014. – Vol. 16, № 1. – P. 203. 335. Surh, C. D. T-cell apoptosis detected in situ during positive and negative selection in the thymus / C. D. Surh, J. Sprent // Nature. – 1994. – Vol. 372. – P. 100 – 103. 336. Tain, Y. L. Melatonin attenuates prenatal dexamethasone-induced blood pressure increase in a rat model / Y. L. Tain, C. C. Chen, J. M. Sheen et al. // J Am Soc Hypertens. – 2014. – Vol. 8, № 4. – Р. 216 – 226. 337. Talaber, G. Local glucocorticoid production in the thymus / G. Talaber, M. Jondal, S. Okret [Электронный ресурс] // Steroids. – 2015. – Режим доступа: 164 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26102271. 338. Taylor, P. R. Macrophage receptors and immune recognition / P. R. Taylor, L. Martinez-Pomares, M. Stacey et al. // Annu. Rev. Immunol. – 2005. – Vol. 23. – P. 901 – 944. 339. Tian, Y. M. Rejuvenation of degenerative thymus by oral melatonin administration and the antagonistic action of melatonin against hydroxyl radicalinduced apoptosis of cultured thymocytes in mice / Y. M. Tian, P. P. Li, X. F. Jiang et al. // Journal of Pineal Research. – 2001. – Vol. 31. – P. 214 – 221. 340. Tian, Y. M. Melatonin rejuvenates degenerated thymus and redresses peripheral immune functions in aged mice / M. Tian, X. F. Jiang, Y. R. Dai // Immunology Letters. – 2003. – Vol. 88. – P. 101 – 104. 341. Timofei, O. V. Changes in morphometric indices of medial small cell subnuclei neurons of paraventricular nuclei in rats/ hypothalamus under the condition of light deprivation / O. V. Timofei, R. Y. Bulyk, Y. V. Lomakina, E. V. Vlasova // Health & education millennium. – 2013. – Vol. 15, № 1-4. – P. 237 – 240. 342. Torres-Farfan, C. MT1 Melatonin receptor in the primate adrenal gland: inhibition of adrenocorticotropin-stimulated cortisol production by melatonin / C. TorresFarfan, H. G. Richter, P. Rojas-García et al. // J Clin Endocrinol Metab. – 2003. – Vol. 88, № 1. – P. 450 – 458. 343. Truta-Feles, K. Histamine modulates γδ-T lymphocyte migration and cytotoxicity, via Gi and Gs protein-coupled signalling pathways / K. Truta-Feles, M. Lagadari, K. Lehmann et al. // Journal of Pharmacology. – 2010. – Vol. 161, № 6. – P. 1291 – 1300. 344. Tsai, M. Mast cells and immunoregulation/ immunomodulation / M. Tsai, M. Grimbaldeston, S. J. Galli // Adv. Exp. Med. Biol. – 2011. – Vol. 716. – P. 186 – 211. 345. Ucar, A. Adult Thymus Contains FoxN1− Epithelial Stem Cells that Are Bipotent for Medullary and Cortical Thymic Epithelial Lineages / A. Ucar, O. Ucar, P. Klug et al. // Immunity. – 2014. – Vol. 41, № 2. – P. 257 – 269. 346. Villadangos, J. A. Intrinsic and cooperative antigen-presenting functions 165 of dendritic-cell subsets in vivo / J. A. Villadangos, P. Schnorrer // Nat Rev Immunol. – 2007. – Vol. 7, № 7. – P. 543 – 555. 347. Vijayalaxmi, D. R. Melatonin as a radioprotective agent: a review / D. R. Vijayalaxmi, R. J. Reiter, D. X. Tan et al. // International journal of radiation oncology, biology, physics. – 2004. – Vol. 59, № 3. – Р. 639 – 653. 348. Wade, A. G. Add-on prolonged-release melatonin for cognitive function and sleep in mild to moderate Alzheimer's disease: a 6-month, randomized, placebocontrolled, multicenter trial [Электронный ресурс] / A. G. Wade, M. Farmer, G. Harari et al. // Clinical interventions in aging. – 2014. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24971004. 349. Wang, H. Melatonin ameliorates carbon tetrachloride-induced hepatic fibrogenesis in rats via inhibition of oxidative stress / H. Wang, W. Wei, N. P. Wang et al. // Life Sci. – 2005. – Vol. 77, № 15. – P. 1902 – 1915. 350. Wang, H. Tonic ubiquitylation controls T-cell receptor:CD3 complex expression during T-cell development / H. Wang, J. Holst, S.-R. Woo et al. // EMBO. – 2010. – Vol. 29, № 7. – P. 1285 – 1298. 351. Wangerin, H. CD57 expression in incidental, clinically manifest, and metastatic carcinoma of the prostate [Электронный ресурс] / H. Wangerin, G. Kristiansen, T. Schlomm et al. // BioMed research international. – 2014. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24977150. 352. Wei, T. Increased expression of immunosuppressive molecules on intratumoral and circulating regulatory T cells in non-small-cell lung cancer patients / T. Wei, J. Zhang, Y. Wu et al. // Am J Cancer Res. – 2015. – Vol. 5, № 7. – P. 2190 – 2201. 353. Weiner, H. L. Induction and mechanism of action of transforming growth factorg-secreting Th3 regulatory cells / H. L. Weiner // Immunol. Rev. – 2001. – Vol. 182. – P. 207 – 214. 354. Wekerle, H. Thymic nurse cells.Ia-bearing epithelium invol ved in T-lymphocyte differentiation / H. Wekerle, V. Ketelson // Nature. – 1980. – № 283. – Р. 402 – 404. 166 355. Weller, C. L. Mast cells in health and disease / C. L. Weller, S. J. Collington, T. Williams, J. R. Lamb // Clin Sci (Lond). – 2011. – Vol. 120, № 11. – P. 473 – 484. 356. White, M. G. Differential activation of CD57-defined natural killer cell subsets during recall responses to vaccine antigens / M. G. White, C. M. Nielsen, R. H. C. McGregor et al. // Immunology. – 2014. – Vol. 142, № 1. – Р. 140 – 150. 357. Withyachumnarnkul, B. Interferon-gamma modulates melatonin production in rat pineal gland in organ culture / B. Withyachumnarnkul, K. O. Nonaka, C. Santana // J. Interferon Rev. – 1990. – Vol. 10. – P. 403 – 411. 358. Yadav, S. K. Experimentally induced stress, oxidative load and changes in immunity in a tropical wild bird, Perdicula asiatica: involvement of melatonin and glucocorticoid receptors / S. K. Yadav, C. Haldar // Zoology. – 2014. – Vol. 117, № 4. – P. 261 – 268. 359. Young, M. R. Stimulation of splenic T-lymphocyte function by endogenous serotonin and by low-dose exogenous serotonin / M. R. Young, J. L. Kut, M. P. Coogan et al. // Immunology. – 1993. – Vol. 80, № 3. – P. 395 – 400. 360. Yu, Q. Melatonin inhibits apoptosis during early B cell development in mouse bone marrow / Q. Yu, S. C. Miller, D. G. Osmond // Journal of Pineal research. – 2000. – Vol. 29. – P. 86 – 93. 361. Yu, J. CD94 surface density identifies a functional intermediary between the CD56bright and CD56dim human NK-cell subsets / J. Yu, H. C. Mao, M. Wei // Blood. – 2010. – Vol. 115. – P. 274 – 281. 362. Yuan, L.-F. Rapamycin ameliorates experimental autoimmune uveoretinitis by inhibiting Th1/Th2/Th17 cells and upregulating CD4+CD25+ Foxp3 regulatory T cells / L.-F. Yuan, G.-D. Li, X.-J. Ren et al. // Int J Ophthalmol. – 2015. – Vol. 8, № 4. – З. 659 – 664. 363. Zamfir Chiru, A. A. Melatonin and cancer / A. A. Zamfir Chiru, C. R. Popescu, D. C. Gheorghe // J Med Life. – 2014. – Vol. 7, № 3. – P. 373 – 374. 167 364. Zawilska, J. B. Regulatory mechanisms in melatonin biosynthesis in retina / J. B. Zawilska, J. Z. Nowak // Neurochemistry International. – 1992. – Vol. 20. – P. 23 – 36. 365. Zhao, X. Y. Expression and function of killer immunologublin receptor and CD57 of natural killer cells / X. Y. Zhao, X. S. Zhao, Y. Z. Wang et al. // Beijing Da Xue Xue Bao. – 2014. – Vol. 46, № 1. – P. 115 – 119. 366. Zilberman, Y. The glucocorticoid receptor mediates the thymic epithelial cellinduced apoptosis of CD4+8+ thymic lymphoma cells / Y. Zilberman, E. Zafrir, H. Ovadia et al. // Cellular Immunology. – 2004. – Vol. 227, № 1. – P. 12 – 23. 367. Zimmermann, R. C. Effects of acute tryptophan depletion on nocturnal melatonin secretion in humans / R. C. Zimmermann, C. J. Mc Dougle, M. Schumacher et al. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. – 1993. – Vol. 76. – Р. 1160 – 1164. 368. Zinkernagel, R. M. On the role of thymus epithelium vs. bone marrow – derived cells in repertoire selection of T-cells / R. M. Zinkernagel, A. Althage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – № 96. – Р. 8092 – 8097. 369. Zoukos, Y. Increased expression of high affinity IL-2 receptors and βadrenoceptors on peripheral blood mononuclear cells is associated with clinical and MRI activity in multiple sclerosis / Y. Zoukos, D. Kidd, M. N. Woodroofe at al. // Brain. – 1994. – Vol. 117. – P. 307 – 315. 168 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА Рисунок 1 – Тимус экспериментальных мышей. Окраска гематоксилином и эозином………………………………………………………. 46 Таблица 1 – Морфометрические показатели тимуса экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 2 недель в различных световых условиях (M±m)…………………………........................ 48 Таблица 2 – Морфометрические показатели тимуса экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 4 недель в различных световых условиях (M±m)…………………………........................ 49 Рисунок 2 – Тимус мышей, находившихся в условиях естественного освещения…………………………………………………………………………. 52 Рисунок 3 – Тимус мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения………………………………………………………………………… 52 Таблица 3 – Количество CD1а-позитивных клеток в корковом веществе долек тимуса мышей опытных (поступление мелатонина) и контрольных групп……………………………………………………………….. 53 Рисунок 4 – CD3-позитивные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель…………………………………………………………………... 54 Рисунок 5 – CD3-позитивные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель……………………………………………………………………………. 55 Рисунок 6 – CD3-позитивные клетки мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель…………………………………………………………………... 55 Рисунок 7 – CD3-позитивные клетки мозгового вещества дольки 169 тимуса мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель……………………………………………………………………………. 56 Таблица 4 – Количество CD3-позитивных клеток в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей (в поле зрения при увеличении 1000)……………………………………………… 57 Рисунок 8 – Корковое вещество дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель………………………………………………………………………............ 59 Рисунок 9 – Корковое вещество дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель………………………………………………………………………............ 60 Таблица 5 – Количество CD57+ клеток в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей (в поле зрения при увеличении 1000)…………………………………………………………….............................. Рисунок 10 – Корковое вещество дольки тимуса 61 мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция к CD68……………………………………… 64 Рисунок 11 – Корковое вещество дольки тимуса мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель……… 64 Таблица 6 – Количество CD68-позитивных клеток в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей (в поле зрения при увеличении 1000)………………………………………………. 66 Рисунок 12 – Тучные клетки тимуса экспериментальных мышей. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна………………………... 70 Таблица 7 – Количество тучных клеток в тимусе (в поле зрения при увеличении х400) экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в различных световых условиях (M±m)………………………………………… 71 Рисунок 13 – Характеристика тучных клеток по степени метахромазии в тимусе экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 170 2 недель в различных световых условиях………………………………………. 73 Рисунок 14 – Характеристика тучных клеток по степени метахромазии в тимусе экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 4 недель в различных световых условиях………………………………………. 75 Рисунок 15 – Характеристика тучных клеток по степени дегрануляции в тимусе экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 2 недель в различных световых условиях………………………………………. 77 Рисунок 16 – Характеристика тучных клеток по степени дегрануляции в тимусе экспериментальных мышей при поступлении мелатонина в течение 4 недель в различных световых условиях………………………………………. 79 Рисунок 17 – Люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях естественного освещения……………………….. 81 Рисунок 18 – Люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса животных, находившихся в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения………………………… 82 Рисунок 19 – Люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в течение 4 недель в условиях естественного освещения……………………….. 82 Рисунок 20 – Люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества дольки тимуса экспериментальных животных, находившихся в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения………………………… 83 Рисунок 21 – Интенсивность люминесценции гистамина в ЛГК коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей………………. 83 Рисунок 22 – Интенсивность люминесценции гистамина в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей……………………………………………………………………………… 85 Рисунок 23 – Интенсивность люминесценции гистамина в лимфоцитах коркового вещества долек тимуса экспериментальных 171 мышей……………………………………………………………………………… 87 Рисунок 24 – Интенсивность люминесценции гистамина в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей……………………………………………………………………………… 87 Рисунок 25 – Люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях естественного освещения……………………….. 89 Рисунок 26 – Люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения……………………........ 89 Рисунок 27 – Люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях естественного освещения……………………………………………... 90 Рисунок 28 – Люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества дольки тимуса мышей, находившихся в течение 4 недель в условиях постоянного затемнения. Метод Фалька-Хилларпа………………… 90 Рисунок 29 – Интенсивность люминесценции серотонина в ЛГК коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей………………. 91 Рисунок 30 – Интенсивность люминесценции серотонина в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей……………………………………………………………………………… 92 Рисунок 31 – Интенсивность люминесценции серотонина в лимфоцитах коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей... Рисунок 32 – Интенсивность люминесценции серотонина 93 в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей… 94 Рисунок 33 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в ЛГК коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей………………. Рисунок 34 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса экспериментальных 95 172 мышей……………………………………………………………………………… 96 Рисунок 35 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в лимфоцитах коркового вещества долек тимуса экспериментальных мышей... 98 Рисунок 36 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в лимфоцитах мозгового вещества долек тимуса экспериментальных мышей… 98 Рисунок 37 – Интенсивность люминесценции гистамина, серотонина, катехоламинов в ЛГК коркового вещества дольки тимуса экспериментальных мышей……………………………………………………… 100 Рисунок 38 – Интенсивность люминесценции гистамина, серотонина, катехоламинов в ЛГК на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса экспериментальных мышей……………………………………………... 101 Рисунок 39 – Интенсивность люминесценции гистамина, серотонина, катехоламинов в лимфоцитах коркового вещества дольки тимуса экспериментальных мышей……………………………………………………… 102 Рисунок 40 – Интенсивность люминесценции гистамина, серотонина, катехоламинов в лимфоцитах мозгового вещества дольки тимуса экспериментальных мышей……………………………………………………… 103 Таблица 8 – Результаты анализа значений серотонинового индекса (JС/КА) в клетках тимуса экспериментальных мышей (срок эксперимента 2 недели)....................................................................................................................... 105 Таблица 9 – Результаты анализа значений серотонинового индекса (JС/КА) в клетках тимуса экспериментальных мышей (срок эксперимента 4 106 недели)…………………………………………………………………………….. Таблица 10 – Результаты корреляционного анализа в паре серотонинкатехоламины в структурах тимуса экспериментальных мышей…………….. 107
