022817 B1 022817 B1 (11) 022817

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
022817
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2016.03.31
(21)
(51) Int. Cl. C07K 7/08 (2006.01)
C07K 14/47 (2006.01)
Номер заявки
201290322
(22)
Дата подачи заявки
2010.11.09
(54)
ЛЕЧЕНИЕ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ РАССТРОЙСТВ
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Настоящим изобретением обеспечиваются пептиды, которые применимы для лечения желудочнокишечных расстройств. Настоящим изобретением также обеспечиваются композиции и способы
лечения желудочно-кишечных расстройств и фармацевтические композиции для их выполнения.
В некоторых вариантах осуществления эти фармацевтические композиции включают пероральные
лекарственные формы.
Карри Марк Дж., Фретцен Ангелика,
Кесслер Марко, Зиммер Дэниел П.
(US)
Медведев В.Н. (RU)
B1
022817
(56) WO-A2-0180871
WO-A1-2005087797
WO-A2-2007022531
WO-A2-2008151257
022817
(31) 61/259,264
(32) 2009.11.09
(33) US
(43) 2013.01.30
(86) PCT/US2010/056042
(87) WO 2011/057272 2011.05.12
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
АЙРОНВУД ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ,
ИНК. (US)
022817
Область техники
Это изобретение относится к пептидам, композициям и способам для лечения расстройств деятельности верхних отделов желудочно-кишечного тракта.
Притязание на приоритет
Для данной заявки испрашивается приоритет по заявке на патент США с регистрационным №
61/259264, поданной 9 ноября 2009 г. Взятое в целом содержание вышеупомянутой заявки включено сюда посредством ссылки.
Список последовательностей
Эта заявка включает посредством ссылки список последовательностей, озаглавленный
″IW077US_ST25.txt″, в его полном объеме (6,64 килобайтов), который был создан 3 ноября 2010 г. и подан в электронном виде вместе с ней.
Предпосылки создания изобретения
Функциональная диспепсия (FD) и парез желудка (GP) являются расстройствами деятельности
верхних отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которые в совокупности характеризуются симптомами, которые включают вздутие, боль в эпигастральной области (в верхней части брюшной полости) и/или жжение, тошноту, рвоту и быстрое насыщение. Возможные методы лечения пациентов с FD и
GP являются очень ограниченными вследствие как отсутствия эффективности существующей терапии,
так и профилей ее недостаточной безопасности. Диспепсию определяют как наличие одного или более
диспепсических симптомов (боли в эпигастральной области, жжения, тягостного переполнения после
приема пищи и быстрого насыщения), которые, как полагают, возникают из гастродуоденальной области, в отсутствие какого-либо органического, системного или метаболического заболевания, которое будет, вероятно, объяснять симптомы (см. Drossman D.A., ed., Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders, 3rd Ed., McLean, VA: Degnon Associates, Inc., 2006). FD относится к диспепсии, которая не имеет
структурного объяснения после стандартных медицинских исследований, включающих эндоскопию
верхних отделов ЖКТ. Патофизиологические механизмы, которые могут быть вовлечены в FD, включают, среди прочего, замедленное опорожнение желудка, нарушенную желудочную аккомодацию, повышенную чувствительность к растяжению желудка, измененную чувствительность двенадцатиперстной
кишки к липидам или кислоте и анормальную сократительную способность двенадцатиперстной и тощей
кишок. Пролонгированное воздействие кислоты на двенадцатиперстную кишку также обнаруживается у
некоторых пациентов с FD и GP, и это воздействие может замедлять опорожнение желудка и вызывать
FD- или GP-подобные симптомы. Диспепсия является часто встречающимся синдромом, который составляет приблизительно 30% случаев, обнаруживаемых гастроэнтерологами, при этом FD представляет
приблизительно 60% от всех таких случаев диспепсии.
GP относится к анормальной сократительной способности желудка, характеризующейся замедленным опорожнением желудка в отсутствие механической обструкции. GP может быть идиопатическим
или его причинами могут быть различные состояния, включающие сахарный диабет типа I или II, вирусное инфекционное заболевание, склеродермию, расстройства нервной системы, такие как болезнь Паркинсона, метаболические нарушения, такие как гипотиреоз, послеоперационную непроходимость кишечника, и некоторые лекарственные средства, включающие наркотические лекарственные средства от
боли, трициклические антидепрессанты и блокаторы кальциевых каналов. Лечение для рака, включающее химиотерапевтические лекарственные средства и облучение грудной клетки и брюшной полости,
может также вызывать парез желудка либо временно, либо навсегда. Наиболее общими симптомами являются тошнота, рвота, вздутие, боль в эпигастральной области, потеря веса и быстрое насыщение. Парез желудка является хроническим состоянием, которое может приводить к нередкой госпитализации,
сниженному качеству жизни и увеличенной нетрудоспособности, а в тяжелых случаях к повышенной
смертности. Тяжелый, симптоматический GP является часто встречающимся у индивидуумов, страдающих диабетом, поражая 5-10% страдающих диабетом по отношению ко всей популяции пациентов, составляющей 1 млн, только в США.
Традиционные возможные методы лечения FD и GP, а также других расстройств деятельности
верхних отделов желудочно-кишечного тракта имели ограниченную эффективность для многих пациентов. Поэтому остается необходимость в новых соединениях и способах лечения FD, GP и других желудочно-кишечных расстройств.
Краткое изложение сущности изобретения
Отличительными признаками по настоящему изобретению являются пептиды, композиции и связанные с ними способы лечения расстройств деятельности верхних отделов желудочно-кишечного тракта и их состояний (например, диспепсии, GP, непроходимости кишечника после операции на желудке,
нарушения функции пищевода, функционального гастродуоденального нарушения, желудочно-пищеводного рефлюкса (GERD) или язвы двенадцатиперстной кишки или желудка), а также здесь описаны
другие состояния и расстройства. Отличительными признаками композиций являются пептиды, которые
активируют гуанилатциклазу С (GC-C) в верхнем отделе ЖКТ, но намного слабее активируют GC-С в
нижнем отделе ЖКТ или совсем не активируют ее. Без ограничения какой-либо теорией, пептиды по
настоящему изобретению полезны, поскольку они могут облегчать симптомы расстройств деятельности
-1-
022817
верхних отделов ЖКТ (полностью или частично в результате увеличения сократительной способности
верхних отделов ЖКТ и/или ослабления боли в эпигастральной области/дискомфорта и вздутия) без вызова явно выраженных эффектов в нижних отделах ЖКТ (например, ограничивающих дозу изменений
ритма опорожнения кишечника, в том числе диареи) на уровнях доз и при частоте введения доз, достаточных для ослабления симптомов в верхних отделах ЖКТ. Пептиды по настоящему изобретению также
применимы для ослабления боли и уменьшения дискомфорта в желудочно-кишечном тракте.
В одном аспекте по настоящему изобретению предоставлен пептид или его фармацевтически приемлемая соль, причем пептид включает аминокислотную последовательность
или ее фармацевтически приемлемую соль; где
Xaa1 представляет собой Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr,
Asp, D-Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, D-Glu, γ-карбоксилированную Glu, α-аминосубериновую
кислоту (Asu), α-аминоадипиновую кислоту (Aad), α-аминопимелиновую кислоту (Apm) или отсутствует;
Хаа2 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa3 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa4 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa6 представляет собой P-Ser, P-Thr, Р-гомо-Ser, 4-гидроксивалина фосфат, Р-гомо-Thr, P-Cys или
P-Tyr;
Xaa7 представляет собой Tyr, Leu, Phe или Ile;
Xaa8 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa14 представляет собой Thr, Ala или Phe;
Хаах6 представляет собой Cys или D-Cys и
Xaa17 представляет собой Tyr, D-Tyr или отсутствует;
где
если Xaa1 присутствует, Xaa1 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой
кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой;
если Xaa1 отсутствует, а Хаа2 присутствует, то Хаа2 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой
кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой; или
если как Xaa1, так и Хаа2 отсутствуют, то Хаа3 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой.
Во втором аспекте по настоящему изобретению предоставляются фармацевтические композиции,
включающие пептид по настоящему изобретению.
В третьем аспекте по настоящему изобретению предоставляются способы лечения желудочнокишечного расстройства, которые включают введение фармацевтической композиции в соответствии с
настоящим изобретением.
Детализации одного или более вариантов осуществления по настоящему изобретению изложены в
сопроводительном описании.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А иллюстрируется реакция приводимого в качестве примера пептида по настоящему изобретению со щелочной фосфатазой.
На фиг. 1В иллюстрируется гидролиз контрольного п-нитрофенилфосфата фосфатазами.
На фиг. 2 представлен пример, демонстрирующий, что пептид 2 и пептид 4 стимулируют секрецию
сока двенадцатиперстной кишки.
На фиг. 3 представлены результаты исследования устойчивости пептида 2, дефосфо-пептида 2 и
пептида 3 в кишечном соке (соке тощей кишки) мыши.
На фиг. 4 представлены результаты исследования эффекта пептидов 2 и 3 на опорожнение жидкого
содержимого из желудка у крыс с STZ-индуцированным диабетом.
Эти чертежи предоставлены в качестве примера и не предполагают ограничения объема настоящего
изобретения.
Подробное описание настоящего изобретения
Гуанилатциклаза С (GC-C) является трансмембранным рецептором, который локализован на апикальной поверхности эпителиальных клеток в желудке и кишечнике. Рецептор имеет экстраклеточный
лигандсвязывающий домен, один трансмембранный район и С-концевой гуанилилциклазный домен. Когда лиганд связывается с экстраклеточным доменом GC-C, внутриклеточный каталитический домен ка-2-
022817
тализирует продукцию cGMP (цГМФ) из GTP (ГТФ). In vivo это увеличение внутриклеточного cGMP
инициирует каскад событий, который приводит к увеличению секреции хлорида и бикарбоната в просвет
кишки, повышению рН в просвете, снижению поглощения натрия из просвета, увеличению секреции
сока и ускорению прохождения содержимого через кишечник. Также установлено, что cGMP, который
секретируется двунаправлено из эпителия в слизистую оболочку и просвет, ослабляет активацию афферентных С-волокон, что наводит на мысль о возможном механизме наблюдаемых обезболивающих действий агонистов GC-C на висцеральную боль.
Линаклотид, пептидный агонист GC-C, который назначают перорально и в настоящее время подвергается клиническим испытаниям в отношении лечения синдрома разраженной кишки с запором (IBSc) и хроническим запором (СС), оказывает множественные эффекты на физиологию нижних отделов
ЖКТ: (1) ослабление висцеральной боли, (2) уменьшение вздутия и (3) увеличение прохождения содержимого через ЖКТ, которые могут привести к увеличению частоты стула и улучшению консистенции
стула. Назначаемый перорально линаклотид оказывает местное действие в результате активации GC-C
на поверхности просвета; после перорального приема на уровнях терапевтических доз поддающиеся обнаружению уровни линаклотид не выявляются на системном уровне. Таким образом, результаты клинических испытаний линаклотида, а также преклинические исследования, которые были выполнены с использованием линаклотида и родственных пептидов, наводят на мысль о том, что пептидные агонисты
GC-C могут применяться с терапевтической целью.
Было бы полезно иметь агонист GC-C, который мог бы использоваться для облегчения расстройств
деятельности верхних отделов ЖКТ (например, функциональной диспепсии (FD) и пареза желудка (GP))
и их симптомов без стимуляции явно выраженных эффектов на ритмы опорожнения кишечника, которые
могли бы быть следствием стимуляции GC-C в нижних отделах ЖКТ. Такой агонист GC-C мог бы
уменьшить возможность неблагоприятных событий в нижних отделах ЖКТ, включающих изменение
ритмов опорожнения кишечника и понос. Описываемые здесь пептидные агонисты GC-C более активны
в верхних отделах ЖКТ (например, желудке и двенадцатиперстной кишке) и менее активны в нижних
отделах ЖКТ. Такие агонисты могли бы принести пользу пациентам, страдающим расстройствами деятельности верхних отделов ЖКТ (например, FD и GP), в результате (1) ослабления висцеральной боли
посредством увеличения продукции cGMP и/или других механизмов, (2) уменьшения вздутия, (3) увеличения опорожнения желудка и/или прохождения содержимого через верхнюю часть тонкой кишки (например, прохождения содержимого через двенадцатиперстную кишку) и (4) нейтрализации кислоты в
двенадцатиперстной кишке посредством стимуляции секреции бикарбоната. Важно, чтобы эти агонисты,
в силу своей активности, направленной на верхние отделы ЖКТ, были способны облегчать симптомы FD
и GP без вызова явно выраженных эффектов на ритмы опорожнения кишечника (например, которые
могли быть следствием стимуляции GC-C в нижних отделах ЖКТ).
В одном аспекте настоящим изобретением предоставляется новый пептидный агонист GC-C, применимый для лечения желудочно-кишечных расстройств, особенно расстройств деятельности верхних
отделов ЖКТ, таких как FD и GP. Пептидный агонист GC-C, как рассчитано, является активным в верхних отделах ЖКТ, в том числе пищеводе, желудке и верхней части тонкой кишки (двенадцатиперстной
кишке), но менее активным по мере его прохождения через остальную часть тонкой кишки и толстую
кишку. Пептиды по настоящему изобретению также применимы для уменьшения боли в желудочнокишечном тракте и дискомфорта в нем. Пептидный агонист GC-C содержит фосфоаминокислоту, например фосфосерин, с заменой консервативного глутамата или аспартата, обнаруживаемых в других являющихся агонистами GC-C пептидах. Фосфат -ОРО32- фосфоаминокислоты, такой как фосфосерин, способен выполнять функцию биомиметика COO- глутамата или аспартата, так что содержащий фосфоаминокислоты пептид способен к связыванию с GC-C и ее активации. Содержащий фосфоаминокислоты пептид может подвергаться дефосфорилированию под действием щелочных фосфатаз кишечника, что значительно уменьшает связывание с GC-C и агонистическую активность пептида. Щелочные фосфатазы
кишечника обнаруживаются на всем протяжении ЖКТ и наиболее активны в щелочной среде просвета,
включающего просвет тонкой кишки. Содержащий фосфоаминокислоты пептид способен активировать
GC-C в верхних отделах ЖКТ, в том числе кислой среде желудка и в верхних отделах ЖКТ, со стимуляцией секреции сока и бикарбоната. Поскольку пептид стимулирует секрецию сока и бикарбоната в верхних отделах ЖКТ, среда в просвете кишки становится более щелочной, что активирует тем самым активность щелочных фосфатаз. Поэтому в результате действия пептида на GC-C, a также перемещения пептида по кишечнику фосфоаминокислота пептида превращается в дефосфорилированную аминокислоту,
что уменьшает тем самым его активность в качестве агониста GC-C по мере его перемещения из верхних
отделов в нижние отделы ЖКТ.
Как здесь используется, термин ″Р-″, предшествующий аминокислоте или ее трехбуквенному сокращению, относится к фосфоаминокислоте. Например, термины ″P-Ser″, ″P-Thr″, ″P-Tyr″, ″P-Cys″, ″Ргомо-Cys″, ″Р-гомо-Ser″ и ″Р-гомо-Thr″ относятся к фосфосерину, фосфотреонину, фосфотирозину, фосфоцистеину, фосфогомоцистеину, фосфогомосерину и фосфогомотреонину соответственно. Как здесь
используется, фосфоаминокислота относится к эфиру или тиоэфиру аминокислоты и фосфорной кисло-3-
022817
ты; например водород спиртовой или тиольной функциональной группы замещен -P(O)(OH)2. Например,
P-Ser имеет структуру
P-Thr имеет структуру
Р-Tyr имеет структуру
и P-Cys имеет структуру
В одном аспекте по настоящему изобретению предоставляется пептид или его фармацевтически
приемлемая соль, причем пептид включает аминокислотную последовательность
или ее фармацевтически приемлемую соль;
где
Xaa1 представляет собой Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr,
Asp, D-Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, D-Glu, γ-карбоксилированную Glu, α-аминосубериновую
кислоту (Asu), α-аминоадипиновую кислоту (Aad), α-аминопимелиновую кислоту (Apm) или отсутствует;
Хаа2 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa3 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa4 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa6 представляет собой P-Ser, P-Thr, Р-гомо-Ser, 4-гидроксивалина фосфат, Р-гомо-Thr, P-Cys или
P-Tyr;
Xaa7 представляет собой Tyr, Leu, Phe или Ile;
Xaa8 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa14 представляет собой Thr, Ala или Phe;
Xaa16 представляет собой Cys или D-Cys и
Xaa17 представляет собой Tyr, D-Tyr или отсутствует;
где
если Xaa1 присутствует, Xaa1 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой
кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой;
если Xaa1 отсутствует, а Хаа2 присутствует, то Хаа2 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой
кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой; или
если как Xaa1, так и Хаа2 отсутствуют, то Хаа3 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой.
В некоторых вариантах осуществления отсутствуют как Хаа2, так и Хаа3. В других вариантах осуществления Хаа2 представляет собой Asp или Glu, a Хаа3 отсутствует. В еще одних вариантах осуществления Хаа2 представляет собой Asp или Glu, a Хаа3 представляет собой Asp или Glu.
В некоторых вариантах осуществления Хаа7 представляет собой Tyr или Leu.
В некоторых вариантах осуществления Xaa14 представляет собой Thr.
В некоторых вариантах осуществления Xaa17 представляет собой Tyr или отсутствует.
В некоторых вариантах осуществления Xaa1 представляет собой Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, βAla, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu или D-Glu. В дальнейших вариантах осуществления Xaa1 представляет собой Asp, D-Asp, Glu или D-Glu.
-4-
022817
В некоторых вариантах осуществления Хаа6 представляет собой P-Ser или P-Thr. В дальнейших вариантах осуществления Хаа6 представляет собой P-Ser.
В некоторых вариантах осуществления Xaa1, Xaa2 и Хаа3 отсутствуют, а Хаа4 представляет собой DCys или Cys. В дальнейших вариантах осуществления Хаа7 представляет собой Tyr или Leu. В дальнейших вариантах осуществления Xaa14 представляет собой Thr. В дальнейших вариантах осуществления
Xaa17 представляет собой Tyr или отсутствует. В дальнейших вариантах осуществления Хаа6 представляет собой P-Ser.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из Хаа4, Хаа8 или Xaa16 представляет
собой Cys. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два из Хаа4, Xaa8 или Xaa16 представляют собой Cys. В некоторых вариантах осуществления все из Хаа4, Хаа3 или Xaa16 представляют
собой Cys. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из Хаа4, Хаа8 или Хаа16 представляет собой D-Cys. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два из Хаа4, Хаа8 или
Xaa16 представляют собой D-Cys. В некоторых вариантах осуществления все из Xaa4, Xaa8 или Xaa16
представляют собой D-Cys.
В некоторых вариантах осуществления предоставляется пептид или его фармацевтически приемлемая соль, причем пептид включает аминокислотную последовательность
Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Thr14 Gly15 Cys16 Xaa17, где Xaa7 представляет
собой Tyr или Leu.
В некоторых вариантах осуществления предоставляется пептид или его фармацевтически приемлемая соль, причем пептид включает аминокислотную последовательность
В некоторых вариантах осуществления предоставляется пептид или его фармацевтически приемлемая соль, причем пептид включает не более 50, 40, 30 или 20 аминокислот. В дальнейших вариантах
осуществления пептид включает не более 19, 18, 17, 16, 15 или 14 аминокислот.
В другом аспекте настоящим изобретением предоставляется пептид или его фармацевтически приемлемая соль, причем пептид состоит из аминокислотной последовательности
Xaa1 Хаа2 Хаа3 Хаа4 Cys5 Хаа6 Хаа7 Xaa8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Xaa14 Gly15 Xaa16 Хаа17, или ее
фармацевтически приемлемой соли; где
Xaa1 представляет собой Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr,
Asp, D-Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, D-Glu, γ-карбоксилированную Glu, α-аминосубериновую
кислоту (Asu), α-аминоадипиновую кислоту (Aad), α-аминопимелиновую кислоту (Apm) или отсутствует;
Хаа2 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa3 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa4 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa6 представляет собой P-Ser, P-Thr, Р-гомо-Ser, 4-гидроксивалина фосфат, Р-гомо-Thr, P-Cys или
P-Tyr;
Xaa7 представляет собой Tyr, Leu, Phe или Ile;
Xaa8 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa14 представляет собой Thr, Ala или Phe;
Xaa16 представляет собой Cys или D-Cys и
Xaa17 представляет собой Tyr, D-Tyr или отсутствует;
где
если Xaa1 присутствует, Xaa1 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой
кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой;
-5-
022817
если Xaa1 отсутствует, а Хаа2 присутствует, то Хаа2 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой
кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой; или
если как Xaa1, так и Хаа2 отсутствуют, то Хаа3 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой.
В некоторых вариантах осуществления отсутствуют как Хаа2, так и Хаа3. В других вариантах осуществления Хаа2 представляет собой Asp или Glu, a Хаа3 отсутствует. В еще одних вариантах осуществления Хаа2 представляет собой Asp или Glu, a Хаа3 представляет собой Asp или Glu.
В некоторых вариантах осуществления Хаа7 представляет собой Tyr или Leu.
В некоторых вариантах осуществления Xaa14 представляет собой Thr.
В некоторых вариантах осуществления Xaa17 представляет собой Tyr или отсутствует.
В некоторых вариантах осуществления Xaa1 представляет собой Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, βAla, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu или D-Glu. В дальнейших вариантах осуществления Xaa1 представляет собой Asp, D-Asp, Glu или D-Glu.
В некоторых вариантах осуществления Хаа6 представляет собой P-Ser или P-Thr. В дальнейших вариантах осуществления Хаа6 представляет собой P-Ser.
В некоторых вариантах осуществления Xaa1, Xaa2 и Хаа3 отсутствуют, а Хаа4 представляет собой DCys или Cys. В дальнейших вариантах осуществления Хаа7 представляет собой Tyr или Leu. В дальнейших вариантах осуществления Xaa14 представляет собой Thr. В дальнейших вариантах осуществления
Xaa17 представляет собой Tyr или отсутствует. В дальнейших вариантах осуществления Хаа6 представляет собой P-Ser.
В некоторых вариантах осуществления предоставляется пептид или его фармацевтически приемлемая соль, причем пептид состоит из аминокислотной последовательности
Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Thr14 Gly15 Cys16 Xaa17,
где Хаа7 представляет собой Tyr или Leu.
В некоторых вариантах осуществления предоставляется пептид или его фармацевтически приемлемая соль, причем пептид состоит из аминокислотной последовательности
В некоторых случаях пептид является выделенным. В других пептид является очищенным.
В некоторых вариантах осуществления Хаа6 является любой аминокислотой, которая может быть
фосфорилированной.
В некоторых вариантах осуществления предоставляется фармацевтически приемлемая соль пептида. В некоторых случаях фармацевтически приемлемой солью является соль в виде хлорида.
Варианты пептидов
В некоторых случаях может быть желательным лечение пациентов вариантом пептида, который
связывается с рецепторами GC-C в кишечнике и активирует их, но является менее активным или более
активным, чем невариантная форма пептида. Уменьшенная активность может являться результатом сниженного сродства к рецептору или уменьшенной способности к активации рецептора после связывания,
или сниженной устойчивости пептида. Увеличенная активность может являться результатом повышенного сродства к рецептору или увеличенной способности к активации рецептора после связывания, или
повышенной устойчивости пептида.
В некоторых пептидах один или оба члена одной или обеих пар остатков Cys, которые обычно образуют дисульфидную связь, могут быть замещены гомоцистеином, пеницилламином, 3-меркаптопролином (Kolodziej et al. 1996 Int. J. Pept. Protein Res. 48: 274); β,β-диметилцистеином (Hunt et al. 1993 Int. J.
Pept. Protein Res. 42: 249) или диаминопропионовой кислотой (Smith et al. 1978 J. Med. Chem. 21: 117) для
образования альтернативных внутренних сшивок в положениях обычных дисульфидных связей. В других вариантах осуществления дисульфидные связи могут быть заменены углеводными сшивками
(Schafmeister et al. 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 5891, Patgiri et al. 2008 Ace. Chem. Res. 41: 1289, Henchey
-6-
022817
et al. 2008 Curr. Opin. Chem. Biol. 12: 692).
Продукция пептидов
В одном варианте осуществления пептиды или пептиды-предшественники по настоящему изобретению можно продуцировать рекомбинантно в любой известной системе для экспрессии белков, включающей, без ограничения, бактерии (например, Е. coli или Bacillus subtilis), системы с использованием
клеток насекомых (например, системы с использованием клеток Drosophila Sf9), дрожжевые клеточные
системы (например, S. cerevisiae, S. saccharomyces) или системы для экспрессии в мицелиальных грибах,
или системы для экспрессии в клетках животных (например, системы для экспрессии в клетках млекопитающих). Пептиды или пептиды-предшественники по настоящему изобретению можно также химически
синтезировать.
В случае рекомбинантной продукции, например, в Е. coli, пептида или варианта пептида молекула
нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, может также кодировать лидерную последовательность, которая дает возможность зрелому пептиду секретироваться из клетки. Таким образом, кодирующая пептид последовательность может включать препоследовательность и пропоследовательность, например,
встречающего в природе бактериального пептида ST. Секретированный зрелый пептид можно очистить
из культуральной среды.
Последовательность, кодирующую описываемый здесь пептид, можно встроить в вектор, способный доставлять молекулу нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку и поддерживать ее там. Молекулу ДНК можно встроить в автономно реплицирующийся вектор (подходящие векторы включают, например, pGEM3Z и pcDNA3 и их производные). Векторная нуклеиновая кислота может быть бактериальной ДНК или ДНК бактериофага, например бактериофага лямбда или М13 и их производных. За конструированием вектора, содержащего описываемую здесь нуклеиновую кислоту, может следовать
трансформация клетки-хозяина, такой как бактерия. Подходящие бактерии-хозяева включают, но без
ограничения, Е. coli, В. subtilis, Pseudomonas и Salmonella. Генетическая конструкция также включает
помимо кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты элементы, которые делают возможной экспрессию, такие как промотор и регуляторные последовательности. Экспрессионные векторы могут содержать
контролирующие транскрипцию последовательности, которые контролируют инициацию транскрипции,
такие как промотор, энхансер, оператор и последовательности репрессоров. Квалифицированным в данной области техники специалистам хорошо известно множество контролирующих транскрипцию последовательностей. Экспрессионный вектор может также включать регулирующую трансляцию последовательность (например, нетранслируемую 5' последовательность, нетранслируемую 3' последовательность
или участок внутренней посадки рибосомы). Вектор может быть способен к автономной репликации, или
его можно интегрировать в хозяйскую ДНК для обеспечения стабильности во время продукции пептида.
Последовательность, кодирующую белок, который включает описываемый здесь пептид, можно
также слить с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептидную аффинную метку, например глютатион-Sтрансферазу (GST), связывающий мальтозу Е белок, белок А, FLAG-метку, гексагистидин, myc-метку
или метку в виде НА вируса гриппа, для облегчения очистки. В результате слияния с аффинной меткой
или репортером рамка считывания для представляющего интерес пептида соединяется с рамкой считывания гена, кодирующего аффинную метку, так что создается трансляционный гибрид. Экспрессия гибридного гена приводит к трансляции единичного пептида, который включает как представляющий интерес пептид, так и аффинную метку. В некоторых случаях, когда используются аффинные метки, последовательность ДНК, кодирующая сайт распознавания протеазами, будет слита между рамками считывания для аффинной метки и представляющим интерес пептидом.
Для продукции пептидов в биологической системе могут также использоваться генетические конструкции и способы, подходящие для продукции незрелых и зрелых форм описываемых здесь пептидов
и вариантов в системах для экспрессии белков, отличных от бактерий, и хорошо известные квалифицированным в данной области техники специалистам.
Продуцированные рекомбинантно пептиды можно фосфорилировать, используя известные квалифицированным в данной области техники специалистам способы. В некоторых вариантах осуществления
пептид рекомбинантно продуцируют, выделяют из клетки, в которой он был экспрессирован, а затем
фосфорилируют, используя протеинкиназу, например серин/треонинкиназу или тирозинкиназу. Большое
число киназ известно в данной области техники и может использоваться для этой цели. Квалифицированный в данной области техники специалист отдаст себе отчет, что различные киназы обладают различными субстратными специфичностями, и выберет киназу для применения на основе последовательности пептида. В других вариантах осуществления пептид рекомбинантно продуцируют в клетке, которая также экспрессирует серин/треонинкиназу или тирозинкиназу, которая будет фосфорилировать пептид. В других вариантах осуществления пептиды можно рекомбинантно продуцировать при включении
фосфоаминокислоты. Способы модификации тРНК, включающие, но без ограничения, модификацию
антикодона, места присоединения аминокислоты и/или акцепторного стебля, для создания возможности
включения не встречающихся в природе и/или произвольных аминокислот известны в данной области
техники (Biochem. Biophys. Res. Comm. (2008) 372: 480-485; Chem. Biol. (2009) 16: 323-336; Nat. Methods
(2007) 4: 239-244; Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2006) 7: 775-782; Methods (2005) 36: 227-238; Methods (2005)
-7-
022817
36: 270-278; Annu. Rev. Biochem. (2004) 73: 147-176; Nuc. Acids Res. (2004) 32: 6200-6211; Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (2003) 100: 6353-6357; Royal Soc. Chem. (2004) 33: 422-430).
В некоторых вариантах осуществления пептиды можно получить химически. Пептиды можно синтезировать множеством различных способов, включающих синтез в растворе и твердофазный синтез,
используя традиционную ВОС- или FMOC-защиту. Например, пептид можно синтезировать на 2хлортритилхлориде или смоле Ванга, используя соединение аминокислот друг за другом. Могут использоваться следующие защитные группы: флуоренилметилоксикарбонил или трет-бутилоксикарбонил (для
альфа-аминогрупп на N-конце); тритил или трет-бутил (для тиольных групп Cys); трет-бутил (для γкарбоксильной группы глутаминовой кислоты и гидроксильной группы треонина, если присутствует);
тритил (для β-амидной функции боковой цепи аспарагина и фенольной группы тирозина, если присутствует); тритил или трет-бутилдиметилсилил (для гидроксильной группы серина, если присутствует) и
трет-бутилоксикарбонил (для N-конца перед последующими модификациями боковой цепи). Соединение
может быть осуществлено с помощью DIC и HOBt в присутствии третичного амина, и с пептида можно
снять защиту, и его можно отщепить от твердой подложки, используя смесь K (81% трифторуксусной
кислоты, 5% фенола, 5% тиоанизола, 2,5% 1,2-этандитиола, 3% воды, 2% диметилсульфида, 1,5% иодида
аммония в весовом отношении). После удаления трифторуксусной кислоты и других летучих веществ
пептид можно осадить, используя органический растворитель. Дисульфидные связи между остатками
Cys можно создать, используя диметилсульфоксид (Tam et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6657-62) или
используя стратегию окислении кислородом воздуха. Результирующий пептид можно очистить с помощью хроматографии с обращенной фазой и подвергнуть лиофилизации.
Фосфоаминокислоту, например фосфосерин, можно ввести в пептид с помощью любого способа,
известного квалифицированному в данной области техники специалисту (см., например, G.K. Toth et al.
(2007), Current Organic Chemistry 11: 409-426). В некоторых вариантах осуществления в качестве части
сборки пептида на твердой фазе можно ввести защищенный аналог фосфоаминокислоты, например аналог аминокислоты фосфосерина, например, в виде Fmoc-Ser[PO(OBzl)ОН]-ОН (T. Wakamiya et al. (1997),
Bioorganic and Medicinal Chemistry 5: 135-145, 1997) или в виде Fmoc-Ser [PO (OAryl/Alkyl)2]-OH (G.K.
Toth et al. (2007) Current Organic Chemistry, 11: 409-426). В других вариантах осуществления в качестве
части сборки пептида на твердой фазе можно ввести защищенный аналог аминокислоты, например защищенный аналог аминокислоты серина (например, Fmoc-защищенный серин с защитой тритилом для
боковой цепи с гидроксильной группой). После полной сборки пептидной цепи можно избирательно
снять защиту с Ser[Trt] или Ser[SiMe2tBu] и можно ввести фосфатную группу, используя фосфорамидитную/окислительную стратегию (G. Shapiro et al. (1994) Tetrahedron Letters 35: 869-872; P. Hormozdiari et
al. (1996) Tetrahedron Letters, 37: 8227-8230). В других вариантах осуществления химически полученный
пептид можно подвергнуть фосфорилированию, используя серин/треонинкиназу или тирозинкиназу, как
описано выше.
Пептиды можно создать, выделить или использовать либо в форме свободного основания, либо в
виде его фармацевтически приемлемых солей. Примеры солей включают, без ограничения, соли в виде
ацетата, хлорида, сульфата и фосфата пептида.
Композиции пептидов и агонистов рецептора GC-C
В другом аспекте предоставлены композиции, в которых пептиды, отдельно или в комбинации, могут быть объединены с любым фармацевтически приемлемым носителем или средой. Пептиды могут
быть объединены с материалами, которые не вызывают неблагоприятную, аллергическую или нежелательную в ином отношении реакцию после введения пациенту. Используемые носители или среды включают растворители, диспергаторы, покровные вещества, активирующие поглощение вещества, агенты
для контролируемого высвобождения и одно или более инертных формообразующих средств (которые
включают крахмалы, полиолы, средства для гранулирования, микрокристаллическую целлюлозу (например, Celphere, гранулы Celphere), разбавители, смазывающие вещества, связующие вещества, вызывающие дезинтеграцию вещества и т.п.) и т.д. Если желательно, таблетированные дозы описанных композиций можно покрыть с помощью стандартных водных или неводных методов.
Примеры формообразующих средств для применения в качестве фармацевтически приемлемых носителей и фармацевтически приемлемых инертных носителей и вышеупомянутых дополнительных ингредиентов включают, но без ограничения, связующие вещества, наполнители, вызывающие дезинтеграцию агенты, смазывающие вещества, противомикробные средства и покровные вещества.
Используемый здесь термин ″связующее вещество″ относится к любому фармацевтически приемлемому связующему веществу, которое может использоваться при осуществлении на практике по настоящему изобретению. Примеры фармацевтически приемлемых связующих веществ включают, без ограничения, крахмал (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал и предварительно клейстеризованный крахмал (например, STARCH 1500 и STARCH 1500 LM, продаваемые Colorcon, Ltd.) и
другие крахмалы), мальтодекстрин, желатин, природные и синтетические камеди, такие как аравийская
камедь, порошкообразный трагакант, гуаровая смола, целлюлозу и ее производные (например, метилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксиэтилметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу и
гидроксипропилметилцеллюлозу (гипромеллозу), этилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, кальций
-8-
022817
пропилметилцеллюлозу (гипромеллозу), этилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, кальций карбоксиметилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, порошкообразную целлюлозу, сверхизмельченную целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу (например, AVICEL, такую как AVICEL-PH-101, -103 и -105, продаваемые FMC Corporation, Marcus Hook, PA, США)), поливиниловый спирт, поливинилпирролидон (например, поливинилпирролидон К30) и их смеси.
Примеры связующих веществ, которые могут, в частности, использоваться в фармацевтических
композициях, включают поливиниловый спирт, поливинилпирролидон (повидон), крахмал, мальтодекстрин или эфир целлюлозы (такой как, например, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксиэтилметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза).
Используемый здесь термин ″наполнитель″ относится к любому фармацевтически приемлемому
наполнителю, который может использоваться при осуществлении на практике по настоящему изобретению. Примеры фармацевтически приемлемых наполнителей включают, без ограничения, тальк, карбонат
кальция (например, гранулы или порошок), двухосновный фосфат кальция, трехосновный фосфат кальция, сульфат кальция (например, гранулы или порошок), микрокристаллическую целлюлозу (например,
Avicel РН101 или Celphere CP-305), сверхизмельченную целлюлозу, порошкообразную целлюлозу, декстраты, каолин, маннит, кремниевую кислоту, сорбит, крахмал (например, крахмал 1500), предварительно клейстеризованный крахмал, лактозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу,
изомальт, раффинозу, мальтит, мелицитозу, стахиозу, лактит, палатинит, ксилит, миоинозит и их смеси.
Примеры фармацевтически приемлемых наполнителей, которые могут, в частности, использоваться
для покрытия пептидов, включают, без ограничения, тальк, микрокристаллическую целлюлозу (например, Avicel PH101 или Celphere CP-305), порошкообразную целлюлозу, декстраты, каолин, маннит,
кремниевую кислоту, сорбит, крахмал, предварительно клейстеризованный крахмал, лактозу, глюкозу,
фруктозу, галактозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу, изомальт, двухосновный фосфат кальция, раффинозу, мальтит, мелицитозу, стахиозу, лактит, палатинит, ксилит, маннит, миоинозит и их смеси.
Используемый здесь термин ″добавки″ относится к любым фармацевтически приемлемым добавкам. Фармацевтически приемлемые добавки включают, без ограничения, вызывающие дезинтеграцию
агенты, диспергирующие добавки, смазывающие вещества, способствующие скольжению вещества, антиоксиданты, добавки для покрытия, разбавители, поверхностно-активные вещества, корригенты, гигроскопические вещества, активирующие поглощение добавки, добавки для контролируемого высвобождения, добавки для предотвращения слеживания/слипания, противомикробные средства (например, консерванты), красящие вещества, десиканты, пластификаторы и красители. Как здесь используется,
″формообразующее средство″ представляет собой любую фармацевтически приемлемую добавку, наполнитель, связующее вещество или агент.
Композиции по настоящему изобретению могут также необязательно включать другие терапевтические ингредиенты, агенты для предотвращения слеживания/слипания, консерванты, подсластители,
красящие вещества, корригенты, десиканты, пластификаторы, красители, способствующие скольжению
вещества, антиадгезивы, снижающие статический заряд средства, поверхностно-активные вещества
(смачивающие вещества), антиоксиданты, пленкообразователи и т.п. Любой такой необязательный ингредиент должен быть совместим с описываемым здесь соединением для обеспечения устойчивости
композиции. Композиция может содержать по мере необходимости другие добавки, включающие, например, лактозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу, мальтит, мелицитозу, стахиозу, лактит, палатинит, крахмал, ксилит, манит, миоинозит и т.п. и их гидраты, и аминокислоты, например аланин, глицин и бетаин, и пептиды и белки, например альбумин.
Композиции могут включать, например, различные дополнительные растворители, диспергаторы,
покровные вещества, активирующие поглощение добавки, добавки для контролируемого высвобождения
и одну или более инертных добавок (которые включают, например, крахмалы, полиолы, добавки для
гранулирования, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, смазывающие вещества, связующие
вещества, вызывающие дезинтеграцию добавки и т.п.) и т.д. Если желательно, таблетированные дозы
описанных композиций можно покрыть с помощью стандартных водных или неводных методов. Композиции могут также включать, например, добавки для предотвращения слеживания/слипания, консерванты, подсластители, красящие вещества, корригенты, десиканты, пластификаторы, красители и т.п.
Подходящие вызывающие дезинтеграцию агенты включают, например, агар-агар, карбонат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, кроскармеллозу натрия, кросповидон, повидон, полакрилин калия, гликолят крахмал натрия, картофельный или маниоковый крахмал, другие крахмалы, предварительно клейстеризованный крахмал, глины, другие альгины, другие целлюлозы, камеди и их смеси.
Подходящие смазывающие вещества включают, например, стеарат кальция, стеарат магния, минеральное масло, легкое минеральное масло, глицерин, сорбит, маннит, полиэтиленгликоль, другие гликоли, стеариновую кислоту, натрия лаурилсульфат, тальк, гидрогенизированное растительное масло (например, арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло,
кукурузное масло и соевое масло), стеарат цинка, этилолеат, этиллаурат, агар, силикагель силоид (AER-9-
022817
OSIL 200, W.R. Grace Co., Baltimore, MD, США), коагулируемый аэрозоль синтетического кремнезема
(Evonik Degussa Co., Piano, TX USA), пирогенный диоксид кремния (САВ-О-SIL, Cabot Co., Boston, MA,
США) и их смеси.
Подходящие способствующие скольжению вещества включают, например, лейцин, кремния диоксид коллоидный, магния трисиликат, порошкообразную целлюлозу, крахмал, тальк и трехосновный фосфат кальция.
Подходящие добавки для предотвращения слеживания/слипания включают, например, силикат
кальция, силикат магния, кремния диоксид, кремния диоксид коллоидный, тальк и их смеси.
Подходящие противомикробные добавки, которые могут использоваться, например, в качестве консерванта для композиций пептидов, включают, например, бензалкония хлорид, бензетония хлорид, бензойную кислоту, бензиловый спирт, бутилпарабен, цетилпиридиния хлорид, крезол, хлорбутанол, дегидроуксусную кислоту, этилпарабен, метилпарабен, фенол, фенилэтиловый спирт, феноксиэтанол, фенилртути ацетат, фенилртути нитрат, сорбат калия, пропилпарабен, бензоат натрия, дегидроацетат натрия,
пропионат натрия, сорбиновую кислоту, тимерсол, Thymo и их смеси.
Подходящие антиоксиданты включают, например, ВНА (бутилированный гидроксианизол), ВНТ
(бутилированный гидрокситолуол), витамин Е, пропилгаллат, аскорбиновую кислоту и ее соли или
сложные эфиры, токоферол и его сложные эфиры, альфа-липоевую кислоту и бета-каротин.
Подходящие добавки для покрытия включают, например, натрий карбоксиметилцеллюлозу, целлюлозы ацетат-фталат, этилцеллюлозу, желатин, фармацевтическую глазурь, гидроксипропилцеллюлозу,
гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозы фталат, метилцеллюлозу, полиэтиленгликоль, поливинилацетат фталат, шеллак, сахарозу, диоксид титана, карнаубский воск, микрокристаллический воск и их смеси. Подходящие материалы для защитных покрытий включают Aquacoat (например, дисперсию Aquacoat Ethylcellulose Aquaeous Dispersion, 15% в весовом отношении, FMC Biopolymer, ECD-30), Eudragit (например, Eudragit E PO РЕ-EL, Roehm Pharma Polymers) и Opadry (например, дисперсию Opadry AMB, 20% в весовом отношении, Colorcon).
В определенных вариантах осуществления добавки, подходящие для композиции пептидов, включают одно или несколько из следующего: сахарозы, талька, стеарата магния, кросповидона или ВНА.
Композиции по настоящему изобретению могут также включать другие формообразующие средства, агенты и их виды, включающие, но без ограничения, L-гистидин, Pluronic, полоксамеры (такие как
Lutrol и полоксамер 188), аскорбиновую кислоту, глутатион, усилители проникающей способности
(например, липиды, холат натрия, ацилкарнитин, салицилаты, разнородные соли желчной кислоты, мицеллы из жирных кислот, комплексоны, жирную кислоту, поверхностно-активные вещества, среднецепочечные глицериды), ингибиторы протеаз (например, соевый ингибитор трипсина, органические кислоты), снижающие рН агенты и усилители поглощения, эффективные в отношении увеличения биодоступности (включающие, но без ограничения, те, которые описаны в патентах США № 608618 и 5912014),
материалы для жевательных таблеток (вроде декстрозы, фруктозы, моногидрата лактозы, лактозы и аспартама, лактозы и целлюлозы, мальтодекстрина, мальтозы, маннита, микрокристаллической целлюлозы
и гуаровой смолы, сорбита кристаллического); агенты для парентерального введения (вроде маннита и
повидона); пластификаторы (вроде дибутилсебаката, пластификаторов для покрытий, поливинилацетата
фталата); порошковые смазывающие вещества (вроде глицерилбегената); мягкие желатиновые капсулы
(вроде специального раствора сорбита); сферы для покрытия (вроде сахарных сфер); агенты для сферонизации (вроде глицерилбегената и микрокристаллической целлюлозы); суспендирующие/гелеобразующие агенты (вроде каррагенина, геллановой камеди, маннита, микрокристаллической целлюлозы,
повидона, гликолята крахмала натрия, ксантановой камеди); подсластители (вроде аспартама, аспартама
и лактозы, декстрозы, фруктозы, меда, мальтодекстрина, мальтозы, маннита, мелассы, сорбита кристаллического, специального раствора сорбита, сахарозы); агенты для мокрой грануляции (вроде карбоната
кальция, лактозы безводной, моногидрата лактозы, мальтодекстрина, маннита, микрокристаллической
целлюлозы, повидона, крахмала), жженый сахар, натрий карбоксиметилцеллюлозу, ароматизатор
″Вишня со сливками″ и ароматизатор ″Вишня″, лимонную кислоту безводную, лимонную кислоту, сахарную пудру, D&C Red № 33, D&C Yellow № 10 Aluminum Lake, динатрия эдетат, 15% этиловый спирт,
FD&C Yellow № 6 Aluminum Lake, FD&C Blue № 1 Aluminum Lake, FD&C Blue № 1, FD&C blue № 2
Aluminum Lake, FD&C Green № 3, FD&C Red № 40, FD&C Yellow № 6 Aluminum Lake, FD&C Yellow №
6, FD&C Yellow № 10, глицеринпальмитостеарат, глицерилмоностеарат, индигокармин, лецитин, маннит, метил- и пропилпарабены, моноаммония глицирризинат, природный и искусственный ароматизатор
″Апельсин″, фармацевтическую глазурь, полоксамер 188, подидекстрозу, полисорбат 20, полисорбат 80,
поливидон, предварительно клейстеризованный кукурузный крахмал, предварительно клейстеризованный крахмал, красный оксид железа, сахарин натрия, натриевую соль карбоксиметилового эфира, хлорид
натрия, цитрат натрия, фосфат натрия, ароматизатор ″Клубника″, синтетический черный оксид железа,
синтетический красный оксид железа, диоксид титана и белый воск.
В некоторых вариантах осуществления предоставляется фармацевтическая композиция, включающая описываемый здесь пептид и один или более стабилизирующих агентов, выбираемых из Mg2+, Ca2+,
- 10 -
022817
Zn2+, Mn2+, K+, Na+ или Al3+, их комбинации и/или пространственно-затрудненного первичного амина. В
дальнейших вариантах осуществления агентом является Mg2+, Са2+ или Zn2+ или их комбинация. В некоторых вариантах осуществления катион предоставляется в виде, без ограничения, ацетата магния, хлорида магния, фосфата магния, сульфата магния, ацетата кальция, хлорида кальция, фосфата кальция, сульфата кальция, ацетата цинка, хлорида цинка, фосфата цинка, сульфата цинка, ацетата марганца, хлорида
марганца, фосфата марганца, сульфата марганца, ацетата калия, хлорида калия, фосфата калия, сульфата
калия, ацетата натрия, хлорида натрия, фосфата натрия, сульфата натрия, ацетата алюминия, хлорида
алюминия, фосфата алюминия или сульфата алюминия. В дальнейших вариантах осуществления катион
предоставляется в виде хлорида магния, хлорида кальция, фосфата кальция, сульфата кальция, ацетата
цинка, хлорида марганца, хлорида калия, хлорида натрия или хлорида алюминия. В других вариантах
осуществления катион предоставляется в виде хлорида кальция, хлорида магния или ацетата цинка.
В другом варианте осуществления стабилизирующим агентом является пространственнозатрудненный первичный амин. В дальнейшем варианте осуществления пространственно-затрудненным
первичным амином является аминокислота. Кроме того, в дальнейшем варианте осуществления аминокислотой является встречающаяся в природе аминокислота. Во все еще дальнейшем варианте осуществления встречающуюся в природе аминокислоту выбирают из группы, состоящей из гистидина, фенилаланина, аланина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глутамина, лейцина, метионина, аспарагина, тирозина, треонина, изолейцина, триптофана, глицина и валина; более того, встречающейся в
природе аминокислотой является лейцин, изолейцин, аланин или метионин. В другом варианте осуществления пространственно-затрудненным первичным амином является не встречающаяся в природе аминокислота (например, 1-аминоциклогексанкарбоновая кислота). В дальнейшем варианте осуществления
пространственно-затрудненным первичным амином является циклогексиламин, 2-метилбутиламин или
полиамин, такой как хитозан. В другом варианте осуществления один или более пространственнозатрудненных первичных аминов может использоваться в композиции.
В некоторых случаях пространственно-затрудненный первичный амин имеет формулу
где R1, R2 и R3 независимо выбирают из Н, С(О)ОН, C1-C6 алкила, C1-C6 алкилэфира, C1-C6 алкилтиоэфира, C1-C6 алкилкарбоновой кислоты, C1-C6 алкилкарбоксиламида и алкиларила, при этом любая
группа может быть однократно или многократно замещена галогеном или аминогруппой, и при условии,
что не более двух из R1, R2 и R3 представляют собой Н. В другом варианте осуществления не более одного из R1, R2 и R3 независимо является Н.
В других вариантах осуществления предоставляется фармацевтическая композиция, включающая
фармацевтически приемлемый носитель, пептид, катион, выбираемый из Mg2+, Са2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+
или Al3+ или их смеси, и пространственно-затрудненный первичный амин. В одном варианте осуществления катионом является Mg2+, Са2+ или Zn2+ или их смесь. В дальнейшем варианте осуществления фармацевтическая композиция, кроме того, включает фармацевтически приемлемое связующее вещество
и/или фармацевтически приемлемое способствующее скольжению вещество, смазывающее вещества или
добавку, которая выполняет функцию как способствующего скольжению вещества, так и смазывающего
вещества, и/или антиоксидант. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция
вносится в носитель. В некоторых вариантах осуществления носителем является наполнитель.
В некоторых случаях молярное соотношение катион:пространственно-затрудненный первичный
амин:пептид в водном растворе, вносимом в носитель, составляет 5-100:5-50:1. В некоторых случаях молярное соотношение катион:пространственно-затрудненный первичный амин может быть равным или
превышать 2:1 (например, находиться между 5:1 и 2:1). Таким образом, в некоторых случаях молярное
соотношение катион:пространственно-затрудненный первичный амин:пептид в водном растворе, вносимом в носитель, составляет 100:50:1, 100:30:1, 80:40:1, 80:30:1, 80:20:1, 60:30:1, 60:20:1, 50:30:1, 50:20:1,
40:20:1, 20:20:1, 10:10:1, 10:5:1 или 5:10:1. Когда связующее вещество, например метилцеллюлоза, присутствует в растворе являющегося агонистом GC-C пептида, вносимом в носитель, он может присутствовать в количестве, составляющем 0,5-2,5% в весовом отношении (например, 0,7-1,7%, или 0,7-1%, или
1,5%, или 0,7%).
Было установлено, что катион, выбираемый из Mg2+, Са2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ или Al3+, применим
для подавления образования продукта окисления являющихся агонистами рецептора GC-C полипептидов
во время хранения. Также было установлено, что пространственно-затрудненный первичный амин применим для подавления образования аддукта формальдегида и иминов (″продукта присоединения формальдегида к иминам″) являющихся агонистами рецептора GC-C полипептидов во время хранения. Поэтому композиции являющихся агонистами рецептора GC-C полипептидов, включающие катион, выбираемый из Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ или Al3+, например двухвалентный катион, выбираемый из Zn2+,
Mg2+ и Са2+, и/или пространственно-затрудненный первичный амин, такой как аминокислота, имеют срок
хранения (определяемый с помощью хроматографии по степени чистоты и/или с помощью весового ана- 11 -
022817
лиза), достаточный для производства, хранения и распределения лекарственного средства. Кроме того,
хотя присутствие пространственно-затрудненного первичного амина может увеличить образование продукта гидролиза ланаклотида во время хранения, комбинация пространственно-затрудненного первичного амина и катиона, например, но без ограничения, комбинация лейцина и Са2+, подавляет образование
продукта гидролиза являющего агонистом рецептора GC-C полипептида, а также продукта окисления
являющего агонистом рецептора GC-C полипептида во время хранения, приводя к даже большей общей
устойчивости, определяемой с помощью весового анализа или с помощью хроматографии по степени
чистоты.
В дальнейшем варианте осуществления фармацевтическая композиция, кроме того, включает фармацевтически приемлемое связующее вещество или добавку, и/или фармацевтически приемлемое способствующее скольжению вещество, смазывающее вещество или добавку, которая выполняет функцию
как способствующего скольжению вещества, так и смазывающего вещества, и/или антиоксидант.
Подходящие фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением будут, как
правило, включать количество активного соединения(й) вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или формообразующим средством, таким как стерильный водный раствор, для предоставления
диапазона конечных концентрации, в зависимости от намеченного применения. Методы приготовления,
в целом, хорошо известны в данной области техники, как проиллюстрировано в Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, Mack Publishing Company, 1995).
Для лечения желудочно-кишечных расстройств описываемые здесь пептиды предпочтительно вводят перорально, например в виде таблетки, капсулы, саше, содержащего заранее заданное количество
гранул активного ингредиента, геля, пасты, сиропа, болюса, электуария, суспензии, порошка, лиофилизированного порошка, гранул, в виде раствора или суспензии в водном растворе или неводном растворе;
в виде жидкой эмульсии типа ″масло в воде″ или жидкой эмульсии типа ″вода в масле″, через посредство
липосомного препарата (см., например, ЕР 736299) или в некоторой другой форме. Назначаемые перорально композиции могут включать связующие вещества, смазывающие вещества, инертные разбавители, смазывающие, поверхностно-активные или диспергирующие вещества, корригенты и гигроскопические вещества. Назначаемые перорально препараты, такие как таблетки, могут необязательно иметь покрытие или насечку, и их можно составить для обеспечения длительного, замедленного или контролируемого высвобождения содержащего в них активного ингредиента. Пептиды можно вводить вместе с
другими агентами, используемыми для лечения желудочно-кишечных расстройств, включающими, но
без ограничения, описываемые здесь агенты.
В другом аспекте подходящие фармацевтические композиции могут включать один или более других терапевтических средств. Такие терапевтические средства включают, без ограничения, анальгетики;
антисекреторные средства, включающие ингибиторы протонного насоса, антагонисты кислотного насоса, антагонисты рецепторов Н2; ингибиторы PDE5; агонисты GABA-B; усиливающие экскрецию желчной кислоты вещества; прокинетики и стимулирующие опорожнение кишечника средства; антидепрессанты; антибиотики; противорвотные средства и средства для защиты слизистой оболочки.
Способы лечения
В некоторых вариантах осуществления по настоящему изобретению предоставляется способ лечения желудочно-кишечных расстройств.
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является расстройство
деятельности верхних отделов ЖКТ. В дальнейшем варианте осуществления расстройством является GP,
непроходимость кишечника после операции на желудке, нарушение функции пищевода, функциональное гастродуоденальное нарушение, желудочно-пищеводный рефлюкс (GERD), глютеновая болезнь,
воспаление слизистой оболочки или язва двенадцатиперстной кишки или желудка.
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является GP. В дальнейших вариантах осуществления GP является идиопатическим GP, GP, причиной которого является
сахарный диабет, или GP после хирургического вмешательства.
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является непроходимость кишечника после операции на желудке.
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является нарушение
функции пищевода.
В некоторых вариантах осуществления нарушением функции пищевода является функциональная
изжога, функциональная боль в грудной клетке предполагаемого пищеводного происхождения, функциональная дисфагия или истерический комок.
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является функциональное гастродуоденальное нарушение.
В некоторых вариантах осуществления функциональным гастродуоденальным нарушением является FD, расстройство в виде отрыжки, расстройство в виде тошноты или рвоты или синдром руминации. В
дальнейшем варианте осуществления функциональным гастродуоденальным нарушением является FD. В
некоторых вариантах осуществления FD является возникающий после приема пищи дистресс-синдром
или эпигастральный болевой синдром. В некоторых вариантах осуществления расстройством в виде от- 12 -
022817
рыжки является аэрофагия или неуточненная чрезмерно сильная отрыжка. В некоторых вариантах осуществления расстройством в виде тошноты или рвоты является хроническая идиопатическая рвота,
функциональная рвота или синдром циклической рвоты.
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является желудочнопищеводный рефлюкс (GERD).
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является глютеновая
болезнь.
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является воспаление
слизистой оболочки.
В некоторых вариантах осуществления желудочно-кишечным расстройством является язва двенадцатиперстной кишки или желудка.
Описываемые здесь пептиды и агонисты могут использоваться по отдельности или в комбинированной терапии для лечения, предупреждения или ослабления висцеральной боли, связанной с расстройством деятельности верхних отделов желудочно-кишечного тракта, или боли, связанной с другим нарушением, описываемым здесь.
Описываемые здесь агонисты рецептора GC-C могут назначаться в комбинации с другими агентами. Например, пептиды могут назначаться вместе с анальгезирующим пептидом или соединением.
Анальгезирующий пептид или соединение могут быть ковалентно присоединены к описываемому здесь
пептиду, или он может быть отдельным агентом, который назначают вместе или последовательно с описываемым здесь пептидом при комбинированной терапии. Описываемые здесь агонисты рецептора GC-C
могут также назначаться в комбинации с другими агентами, используемыми для лечения расстройств
деятельности верхних отделов ЖКТ, включающими антидепрессанты, стимулирующие опорожнение
кишечника средства или прокинетики, противорвотные средства, антибиотики, ингибиторы протонного
насоса, блокаторы продукции кислоты в желудке (например, антагонисты рецепторов гистамина Н2),
антагонисты кислотного насоса, ингибиторы PDE5, агонисты GABA-B, усиливающие экскрецию желчной кислоты вещества и средства для защиты слизистой оболочки.
В некоторых вариантах осуществления применимые анальгетики, которые могут использоваться
вместе с описываемыми здесь пептидами, включают блокаторы Са каналов (например, зиконотид), антагонисты рецепторов 5НТ (например, антагонисты рецепторов 5НТ3, 5НТ4 и 5НТ1), агонисты 5НТ4 (например, тегасерод (Zelnorm)), мозаприд, метоклопрамид, закоприд, цизаприд, рензаприд, производные
бензимидазола, такие как BIMU 1 и BIMU 8, и лирексаприд), агонисты 5НТ1 (например, суматриптан и
буспирон), агонисты опиоидных рецепторов (например, лоперамид, федотозин, пентапептид энкефалин,
морфин, дифенилоксилат, фракефамид, тримебутин и фентанил), агонисты рецепторов CCK (например,
локсиглумид и декслоксиглумид), антагонисты рецепторов NK1 (например, апрепитант, вофопитант,
эзлопитант, R-673 (Hoffmann-La Roche Ltd), SR-48968 и SR-14033 (Sanofi Synthelabo), CP-122721 (Pfizer,
Inc.), GW679769 (Glaxo Smith Kline) и TAK-637 (Takeda/Abbot)), агонисты рецепторов NK2 (например,
непадутант, саредутант, GW597599 (Glaxo Smith Kline), SR-144190 (Sanofi-Synthelabo) и UK-290795
(Pfizer Inc.)), агонисты рецепторов NK3 (например, осанетант (SR-142801; Sanofi-Synthelabo), SR-241586
и талнетант), ингибиторы обратного захвата норадреналина-серотонина (NSRI) (например, милнаципран), агонисты рецепторов ваниллоидов и каннабаноидов, сиалорфин и родственные сиалорфину пептиды. В литературе описаны анальгетики различных классов.
В некоторых вариантах осуществления одно или более других терапевтических средств может использоваться в комбинации с описываемыми здесь пептидами. Такие средства включают антидепрессанты, стимулирующие опорожнение кишечника средства или прокинетики, противорвотные средства, антибиотики, ингибиторы протонного насоса, блокаторы продукции кислоты в желудке (например, антагонисты рецепторов гистамина Н2), антагонисты кислотного насоса, ингибиторы PDE5, агонисты GABAВ, усиливающие экскрецию желчной кислоты вещества и средства для защиты слизистой оболочки.
Примеры антидепрессантов включают, без ограничения, трициклические антидепрессанты, такие
как амитриптилин (Elavil), дезипрамин (Norpramin), имипрамин (Tofranil), амоксапин (Asendin),
нортриптилин; избирательные ингибиторы повторного захвата серотонина (SSRI), такие как пароксетин
(Paxil), флуоксетин (Prozac), сертралин (Zoloft) и цитралопрам (Celexa); и другие, такие как доксепин (Sinequan) и тразодон (Desyrel).
Примеры стимулирующих опорожнение кишечника средств и прокинетиков включают, без ограничения, итоприд, октреотид, бетанехол, метоклопрамид (Reglan), домперидон (Motilium), эритромицин
(и его производные) и цизаприд (Propulsid). Пример противорвотных средств включает, без ограничения, прохлорперазин.
Примеры антибиотиков, которые могут использоваться, включают те, которые могут использоваться для лечения Heliobacter pylori инфекций, такие как амоксициллин, тетрациклин, метронидазол или
кларитромицин. Другие антибиотики, такие как эритромицин и его производные, могут также использоваться в комбинации с описываемыми здесь пептидами.
Примеры ингибиторов протонного насоса включают, без ограничения, омепразол (Prilosec), эзо- 13 -
022817
мепразол (Nexium), лансопразол (Prevacid), пантопразол (Protonix) и рабепразол (Aciphex). Примеры блокаторов рецепторов Н2 включают, без ограничения, циметидин, ранитидин, фамотидин и низатидин. Примеры антагонистов кислотного насоса включают, без ограничения, ревапразан, CS-S26 (J.
Pharmacol. Exp. Ther. (2007) 323: 308-317), PF-03716556 (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009) 328(2): 671-679) и
YH1885 (Drug Metab. Dispos. (2001) 29(1): 54-59).
Примеры ингибиторов PDE5 включают, без ограничения, аванафил, лоденафил, мироденафил, синденафила цитрат, тадалафил, варденафил и уденафил. Агонисты GABA-B включают, без ограничения,
баклофен и ХР19986 (CAS регистрационный № 847353-30-4). Примеры усиливающих экскрецию желчной кислоты веществ включают, без ограничения, GT102-279, холестирамин, колесевелам, колесевелама
гидрохлорид, урсодезоксихолиевую кислоту, колестипол, колестилан, севеламер, полидиаллиламин,
сшитый с эпихлоргидрином, диалкиламиноалкильные производные сшитого декстрана и N-(циклоалкил)алкиламины. Примеры средств для защиты слизистой оболочки включают, без ограничения, сукральфат (Carafate), тепренон, полапрецинк, цетраксат и висмута субсалицилат.
Комбинированной терапии можно достичь посредством назначения двух или более агентов, например описываемого здесь агониста рецептора GC-C и другого терапевтического пептида или соединения,
каждый из которых составляют и назначают по отдельности, или посредством назначения двух или более агентов в одном препарате. Комбинированная терапия также охватывает другие комбинации. Например, два агента могут быть составлены вместе и назначаться совместно с отдельным препаратом, содержащим третий агент. Хотя два или более агентов при комбинированной терапии могут назначаться одновременно, это может и не быть так. Например, назначение первого агента (или комбинации агентов) может предшествовать назначению второго агента (или комбинации агентов) на минуты, часы, дни или недели. Таким образом, два или более агентов могут назначаться с минутными интервалами друг от друга,
или с 1-, 2-, 3-, 6-, 9-, 12-, 15-, 18- или 24-часовыми интервалами друг от друга, или составляющими 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 дней интервалами друг от друга, и с 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- или 10недельными интервалами друг от друга. В некоторых случаях возможны даже более длинные интервалы.
Хотя во многих случаях желательно, чтобы два или более агентов, используемых в комбинированной
терапии, находились в организме пациента в одно и то же время, это может и не быть так.
Доза
Диапазон доз для взрослых людей может в большинстве случаев составлять от 5 мкг до 100 мг/день
при пероральном назначении описываемого здесь пептидного агониста GC-C. Таблетки, капсулы или
другие формы представления, предоставляемые в дискретных единицах, могут в целях удобства содержать количество описываемого здесь соединения, которое является эффективным в такой дозе, или они
могут назначаться в виде их множества, например множества единиц, содержащих от 25 мкг до 2 мг или
приблизительно от 100 мкг до 1 мг. Определение точного количества соединения, прописываемого пациенту, будет обязанностью лечащего врача. Однако используемая доза будет зависеть от ряда факторов,
включающих возраст и пол пациента, конкретное нарушение, подвергаемое лечению, и его тяжесть.
В различных вариантах осуществления дозированную единицу назначают вместе с пищей в любое
время дня, без пищи в любое время дня, с пищей после воздержание от пищи в течение ночи (например,
вместе с завтраком), после легкой закуски с низким содержанием жира во время, когда пора ложиться
спать. В одном конкретном варианте осуществления дозированную единицу назначают до или после потребления пищи (например, приема пищи). В дальнейшем варианте осуществления дозированную единицу назначают приблизительно за 15 мин-1 ч до потребления пищи. В различных вариантах осуществления дозированную единицу назначают один раз в день, два раза в день, три раза в день, четыре раза в
день, пять раз в день или шесть раз в день. В определенных вариантах осуществления дозированная единица и суточная дозы эквивалентны.
В относящихся к комбинированной терапии вариантах осуществления настоящего изобретения
точное количество каждого из двух или более активных ингредиентов в дозированной единице будет
зависеть от требуемой дозы каждого соединения. Поэтому полезным может быть создание дозированной
единицы, которая будет, при назначении в соответствии с конкретной схемой введения доз (например,
схемой введения доз, в которой задано определенное число единиц и конкретное хронометрирование
введения), доставлять дозу каждого соединения, равную дозе, которая назначалась бы в случае лечения
пациента лишь одним соединением. В других случаях возможно, желательным будет создание дозированной единицы, которая будет доставлять дозу одну или более соединений, которая меньше дозы, которая назначалась бы в случае лечения пациента лишь одним соединением. Наконец, возможно, желательным будет создание дозированной единицы, которая будет доставлять дозу одну или более соединений,
которая превышает дозу, которая назначалась бы в случае лечения пациента лишь одним соединением.
Фармацевтическая композиция может включать дополнительные ингредиенты, включающие, но без
ограничения, описываемые здесь активные ингредиенты и формообразующие средства. В определенных
вариантах осуществления одно или более терапевтических средств дозированной единицы может находиться в препарате с длительным или контролируемым высвобождением, а дополнительные терапевтические средства могут не находиться в препарате с длительным высвобождением. Например, описываемый здесь пептид или агонист может находиться в препарате с контролируемым высвобождением или в
- 14 -
022817
препарате с длительным высвобождением в той же дозированной единице, что и другой агент, который
может находиться или может не находиться в препарате либо с контролируемым высвобождением, либо
с длительным высвобождением. Таким образом, в определенных вариантах осуществления желательным
может быть обеспечение немедленного высвобождения одного или более описываемых здесь агентов и
контролируемого высвобождения одного или более других агентов.
Настоящее изобретение было описано со ссылкой на некоторые приведенные в качестве примеров
варианты его осуществления. Однако квалифицированным в данной области техники специалистам будет видно со всей очевидностью, что возможно воплощение по настоящему изобретению в конкретных
формах, отличных от форм приведенных в качестве примеров вариантов осуществления, описанных выше. Такое воплощение возможно, не выходя за пределы существа по настоящему изобретению. Приведенные в качестве примеров варианты осуществления являются только иллюстративными и не должны
считаться ограничивающими никоим образом. Объем по настоящему изобретению определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами, а не предшествующим описанием.
Примеры
Являющиеся агонистами GC-C пептиды или их фармацевтически приемлемые соли, описываемые
здесь, были приготовлены с помощью химического твердофазного синтеза и природной укладки (окисления кислородом воздуха) American Peptide Company (Sunnyvale, CA). Пептиды и их последовательности представлены ниже (где аминокислотная последовательность представляет собой стандартный однобуквенный код, a ″pS″ означает фосфосерин)
Пример 1. Эффекты щелочной и кислых фосфатаз на являющиеся пептидами субстраты
Для реакций с использованием щелочной фосфатазы исходные растворы пептидов готовили в концентрации 1 мг/мл в 0,1 M Tris-HCl pH 8 и их хранили при -20°С до проведения анализов. Для реакций с
использованием кислых фосфатаз исходные растворы пептидов готовили в концентрации 1 мг/мл в 50
мМ фосфате натрия рН 6 и их хранили при -20°С до проведения анализов.
Реакция с использованием щелочной фосфатазы
Щелочная фосфатаза кишечника теленка (CIP) была получена от New England BioLabs, Ipswich,
MA, каталожный № M0290S. Реакционный раствор с CIP готовили посредством разведения буфером (50
мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl рН 8, 1 мМ MgCl2, 50% глицерина) до 0,5 ед./мкл. Реакционные растворы со
щелочной фосфатазой составляли в общих объемах 20 мкл, содержащих
2 мкл 10Х буфера для CIP (1 М NaCl, 500 мМ Tris-HCl рН 8, 100 мМ MgCl2),
2 мкл исходного раствора пептида (1 мг/мл),
12 мкл H2O,
4 мкл щелочной фосфатазы (0, 0,5 или 2 единицы).
Реакционные растворы осторожно смешивали и инкубировали в течение 90 мин при 37°С. Эти реакционные растворы хранили при -20°С до анализа. Для анализа реакционных растворов 7,5 мкл обработанного CIP пептида разбавляли до 50 мкл с использованием 0,1% муравьиной кислоты в воде до конечной концентрации, равной 10 мкМ. Конечный раствор в объеме 20 мкл затем анализировали с помощью
LCMS (жидкостной хроматомасс-спектрометрии) с использованием условий, представленных в табл. 1
ниже.
Составляли контрольные реакции для ферментативной активности, содержащие 10 мМ пнитрофенилфосфат вместо пептида. После инкубации реакции разбавляли с использованием 0,1 мл 100
мМ боратного буфера рН 9 и считывали оптическую плотность при 405 нм для контролирования появления п-нитрофенола.
Реакции с использованием кислых фосфатаз
Кислая фосфатаза картофеля (РоАР) была получена от Sigma, St. Louis, MS., каталожный № P1146,
а кислая фосфатаза предстательной железы человека (HuPrAP) была получена от MP Biochemicals, Solon,
ОН, каталожный № 153872. Кислые фосфатазы разводили с обеспечением раствора, содержащего 0,5 ед.
АР/мкл, используя 50 мМ ацетат натрия рН 5, 0,2 мМ MgCl2. Реакционные растворы с кислыми фосфатазами составляли в общих объемах 20 мкл, содержащих
2 мкл 10Х буфера для кислой фосфатазы (500 мМ ацетат натрия рН 5,2, 2 мМ MgCl2),
2 мкл исходного раствора пептида (1 мг/мл),
12 мкл Н2О,
4 мкл кислой фосфатазы (0,5 или 2 единицы).
- 15 -
022817
Реакционные растворы осторожно смешивали и инкубировали в течение 90 мин при 37°С. Реакционные растворы хранили при -20°С для анализа позже. Для анализа 7,5 мкл реакций с кислой фосфатазой
разбавляли до 50 мкл с использованием 0,1% муравьиной кислоты в воде до конечной концентрации,
равной 10 мкМ. Конечные реакции в объеме 20 мкл затем анализировали с помощью LCMS с использованием условий, представленных в табл. 1 ниже. Составляли контрольные реакции для ферментативной
активности с разбавлением до 10 мМ п-нитрофенилфосфата вместо пептида. После инкубации реакции
разбавляли с использованием 0,1 мл 100 мМ боратного буфера рН 9 и считывали оптическую плотность
при 405 нм для контролирования появления п-нитрофенола.
Таблица 1. Анализ с помощью LCMS
Табл. 2 и 3 показывают, что в используемых для анализа условиях 0,5 единиц щелочной фосфатазы
кишечника теленка (рН 8) и 0,5 единиц либо кислой фосфатазы картофеля, либо кислой фосфатазы предстательной железы человека (рН 5) эффективно гидролизовали п-нитрофенилфосфат.
Чувствительность пептида 1 и пептида 2 к обработке фосфатазами оценивали посредством анализа
продуктов реакции с помощью LC-MS. Табл. 2 и 3 показывают, что при рН 8 щелочная фосфатаза кишечника теленка эффективно дефосфорилировала пептид 1 и пептид 2. В отличие от щелочной фосфатазы кислые фосфатазы картофеля и предстательной железы человека были очень неэффективными в дефосфорилировании пептида 1 в условиях, в которых они эффективно гидролизовали п-нитрофенилфосфат (табл. 2). Кислая фосфатаза предстательной железы человека была также очень неэффективной в дефосфорилировании пептида 2 (табл. 3).
В качестве отдельного контроля пептид 3 обрабатывали и не обрабатывали щелочной фосфатазой
кишечника теленка, и результирующие реакции анализировали с помощью LC-MS. Обработка CIP не
влияла на пептид 3 (не представленные данные).
Таблица 2. Дефосфорилирование пептида 1
- 16 -
022817
Таблица 3. Дефосфорилирование пептида 2
Пример 2. Аккумулирование cGMP в клетках Т84, используемое для анализа активности GC-C
Для анализа cGMP 4,5×105 клеток Т84/мл выращивали в течение ночи в 24-луночных планшетах
для культивирования тканей. На следующий день клетки Т84 промывали дважды 1 мл DMEM + 20 мМ
MES (рН 5) или DMEM + 50 мМ бикарбонат натрия (рН 8), при этом эти буферы не содержали сыворотку. После второй промывки клетки инкубировали с 450 мкл 1 мМ изобутилметилксантина (IBMX) в буфере либо с рН 5, либо с рН 8 в течение 10 мин при 37°С для ингибирования любой фосфодиэстеразной
активности. Затем пептиды разбавляли буфером либо с рН 5, либо с рН 8 до 10× концентрации. Раствор
пептида в объеме, равном 50 мкл, разбавляли до конечного объема, равного 500 мкл, суспензией клеток
Т84, доводя концентрацию каждого пептида до 1×. Анализ кривых, определяемых одиннадцатью точками, был выполнен для каждого пептида, с использованием конечных концентраций пептидов, исследуемых в каждом анализе, в нМ: 10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1.
Не было контроля для пептидов, используемого для определения эндогенных уровней cGMP. Пептиды инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Через 30 мин удаляли супернатанты, и клетки лизировали с использованием 0,1 M HCl. Клетки лизировали в течение 30 мин на льду. Через 30 мин лизаты отсасывали пипеткой, помещали в 96-луночный планшет для HPLC и центрифугировали при 1000×g в течение 10 мин для удаления любого клеточного дебриса. Супернатанты, полученные в результате предшествующего центрифугирования, удаляли и помещали в новый 96-луночный планшет для HPLC. Образцы
разбавляли равным объемом 1 M ацетата аммония (рН 7) для нейтрализации образцов для лучшей хроматографии. Для построения калибровочной кривой 2× cGMP готовили в 0,1 M HCl и затем разбавляли
равным объемом 1 M ацетата аммония, с получением следующих конечных концентраций в нМ: 1024,
512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1.
Концентрации cGMP определяли в каждом образце, используя представленные в табл. 4 условия
LC-MS и определенную расчетно-калибровочную кривую. Значения EC50 рассчитывали на основе графиков зависимости ответа от концентрации, созданных с помощью программного обеспечения GraphPad
Prism.
Таблица 4. Условия LC-MS
- 17 -
022817
Способность пептида 1 и пептида 2 и их дефосфорилированных форм к стимуляции синтеза cGMP
в клетках Т84 при рН 5 проверяли посредством инкубации этих клеток с пептидами с последующим определением аккумулированного внутриклеточно cGMP с помощью LC-MS. Табл. 5 показывает, что пептид 1 и пептид 2 имеют эффективности, схожие в таковой пептида 3, в стимулировании синтеза cGMP
при рН 5. Однако дефосфорилированные пептид 1 и пептид 2 были менее эффективными в анализе с использованием клеток Т84, чем пептид 3.
Таблица 5. Ответ клеток Т84 в виде синтеза cGMP
Также определяли в двух повторах способом, схожим с описанным выше способом, ответ клеток
Т84 в виде синтеза cGMP на пептид 5 и пептид 6. ЕС50 при рН 5 для пептида 5 равнялась 14,7 нМ, а ЕС50
при рН 5 для пептида 6 равнялась 39,2 нМ.
Пример 3. Конкурентное связывание радиолиганда с клетками Т84
Интактные клетки Т84 человека из Американской коллекции типовых культур (АТСС; Manassas,
VA) использовали для экспериментов по конкурентному связыванию радиолиганда. Клетки Т84 выращивали в монослоях в пластмассовых матрацах Т-150 до 60-70% конфлюэнтности в модифицированной
Дульбекко среде Игла: среде F-1250/50 Хэма (DMEM/F12) + 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS).
Клетки собирали посредством осторожного соскоба с использованием скоба для клеток с последующим
центрифугированием при 2000×g в течение 10 мин при 4°С. Клетки дважды промывали посредством осторожного ресуспендирования в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS) и их сбора с помощью
центрифугирования, как описано выше.
Радиолиганд [125I]-STp готовили посредством растворения 100 мкг NTFYCCELCCNPACAGCY (энтеротоксина STp; Bachem H-6248) в 0,5 мл воды и передавали Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences
(N. Billerica, MA) для йодирования, используя способ с использованием лактопероксидазы, изложенный
в (Marchanolis J.J. "An enzymic method for the trace iodination of immunoglobulins and other proteins", Biocherr J. 1969, 113, 299-305). Perkin-Elmer очистила меченый индикатор с помощью HPLC, используя колонку Waters С-18 µBondapak (25 см), предварительно уравновешенную с использованием 10 мМ ацетата
аммония рН 5,8. К колонке применяли градиент с 0 до 25% ацетонитрила в течение 60 мин с последующим изократическим элюированием с использованием 25% ацетонитрила в течение еще 20 мин. С помощью этого способа разделяли две моноиодированные формы друг от друга и от немеченого предшественника. Второй моноиодированный пик (пик 2), который характеризовался временем элюирования спустя 64 мин и соответствовал йодированию четвертого тирозина, использовали в качестве меченого
индикатора в анализе. Меченый индикатор имел специфическую активность, равную 2200 Ки/ммоль. По
прибытии индикатор хранили в аликвотах при -20°С.
Реакции связывания составляли в двух повторах в общих объемах = 0,2 мл, содержащих 2,5×105
клеток Т84 (0,25 мг белка), 200000 импульсов/мин [125I]-STp (41 фмоль, 200 пМ), 0,1-3000 нМ конкурент
и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Анализы связывания проводили при рН 5,0 в
DMEM/20 мМ 2-(N-морфолино)этансульфокислоте (MES). Анализы связывания при рН 8,0 выполняли в
DMEM/20 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфокислоте (HEPES)/50 мМ бикарбонате натрия.
Контрольные реакции не содержали конкурент (тотальный) или не содержали клетки.
Сначала готовили буферные растворы, затем добавляли не содержащий протеазы BSA до 0,5%. Радиолиганд добавляли до конечной концентрации, равной 0,001 мкКи/мкл. Приготовление исходных растворов пептидов-конкурентов осуществляли посредством растворения пептидов до 1 мг/мл в 50 мМ
фосфате натрия рН 6,0. Концентрации рассчитывали на основе молекулярной массы пептидов, приведенной в сертификате анализа. Разведения конкурента превращали в 50 мМ фосфат натрия рН 6,0, который содержал 20-кратную конечную концентрацию пептида, для исследования в реакции связывания
(20Х конкурент).
Реакции связывания составляли в следующем порядке:
i) радиолиганд и BSA в буферном растворе,
ii) 10 мкл 20Х конкурента,
iii) клетки Т84.
Реакции связывания осторожно смешивали и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Разделение связывающегося с мембраной от не связывающего радиолиганда проводили посредством пропускания реакций связывания через 2,5-см фильтры из стекловолокна Whatman GF/C (предварительно обработанные
1% поливинилпирролидоном в PBS), используя фильтрацию под вакуумом. Фильтры дважды промывали
5 мл холодного как лед буфера PBS и измерения захваченного радиолиганда проводили в сцинтилляционном счетчике. Определение специфического связывания осуществляли посредством вычитания свя- 18 -
022817
занной радиоактивности, исходя из реакции, которая содержала избыточное количество конкурента (1
мкМ), из связанной радиоактивности каждого образца. Построение кривых конкурентного связывания
радиолиганда осуществляли, используя GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA), и данные
анализировали с использованием нелинейной регрессии для расчета концентрации конкурента, которая
приводила к связыванию 50% радиолиганда (IC50). Кажущуюся константу равновесия при диссоциации
(Ki) для каждого конкурента получали, исходя из значений IC50 и предварительно сделанной оценки константы диссоциации для радиолиганда, Kd=15 нМ, используя способ (Cheng and Prusoff, (1973) Biochem.
Pharmacol. 22(23) 3099-3108). Используемая в этих анализах концентрация радиолиганда, равная 200 пМ,
была очень небольшой по сравнению с его константной диссоциации, рассчитанная IC50 и значения Ki
(табл. 5) были в сущности идентичными.
Таблица 6. Анализ конкурентного связывания радиолиганда
Табл. 6 показывает, что пептид 1 и пептид 2 имеют эффективности, схожие с таковой пептида 3, в
связывании при рН 5. Однако дефосфорилированный пептид 1 и пептид 2 имеют более низкое сродство к
GC-C, чем пептид 3 в анализе связывания.
Пример 4. Прохождение содержимого через желудочно-кишечный тракт мышей
Целью этого анализа было исследование эффекта являющихся агонистами гуанилатциклазы С пептидов на in vivo прохождение содержимого через желудочно-кишечный тракт мышей. Установлено, что
агонисты гуанилатциклазы С при пероральном введении доз увеличивают расстояние в %, на которое
перемещается пища с углем у мышей.
Для анализа самок мышей CD-1 (n=10 на группу) весом 25-30 г подвергали голоданию в течение
ночи, и они получали неограниченный доступ к воде. Активированный уголь (20 г; 100 меш; Sigma каталожный № 242276) суспендировали в 200 мл аравийской камеди (100 мг/мл) и перемешивали в течение
по меньшей мере 1 ч. Исследуемые пептиды готовили в носителе - 20 мМ Tris рН 6,9.
Исследуемый пептид и носитель вводили в составляющих 200 мкл дозах посредством кормления
через зонд. Через 7 мин после введения доз исследуемых пептидов вводили посредством кормления через зонд дозу, равную 200 мкл, суспензии угля в аравийской камеди. Спустя 15 мин мышей умерщвляли
с помощью чрезмерной дозы СО2. Извлекали желудочно-кишечный тракт от пищевода до слепой кишки.
Измеряли общую длину тонкой кишки от соединения с привратником желудка до подвздошнослепокишечного соединения. Измеряли расстояние, на которое переместился уголь, от соединения с
привратником желудка до угольного фронта. Расстояние (%), на которое произошло перемещение, определяли как (расстояние, на которое переместился уголь/общую длину тонкой кишки)×100. Данные вводили в программу программного обеспечения GraphPad Prism и анализировали с использованием AOVA
(дисперсионного анализа), используя после этого критерий множественного сравнения Бонферрони. Используя пакет программ GraphPad Prism, были также определены зависимости в виде графиков данных и
ED50.
Были определены эффекты в зависимости от дозы кратковременных назначений пептида 4, пептида
1, пептида 2, дефосфорилированной формы пептида 1 и дефосфорилированной формы пептида 2 на прохождение содержимого через желудочно-кишечный трак самок мышей CD. Расстояние, на которое переместился угольный фронт спустя 7 мин, представленное в виде процента от общей длины тонкой кишки, использовали для расчета значений ED50 (табл. 7).
Таблица 7. Ускорение прохождения содержимого через верхние отделы
желудочно-кишечного тракта мышей
Табл. 7 показывает, что дефосфорилированные формы пептида 1 и пептида 2 проявили уменьшенную эффективность по сравнению с соответствующими им пептидами после перорального назначения в
модели прохождения содержимого через верхние отделы желудочно-кишечного тракта мышей.
Пример 5. Секреция сока в кишечных петлях крыс
Эффект являющихся агонистами GC-C пептидов на секрецию исследовали посредством введения
являющихся агонистами GC-C пептидов, описываемых здесь, непосредственно в изолированную петлю у
крыс дикого типа.
- 19 -
022817
Изоляцию петель осуществляли с помощью перевязки в ходе хирургического вмешательства трех
петель в тонкой кишке крысы. Методология образования перевязанных петель была схожа с той, которая
описана в (London et al., 1997, Am. J. Physiol., p. G93-105). Петли сосредотачивали приблизительно в центре и на расстояниях, составляющих 1-3 см. В петли вводили 200 мкл либо пептида/агониста GC-C (0,1-5
мкг), либо носителя (20 мМ Tris, рН 7,5 или содержащего 10 мМ глюкозу буфера HEPES Клебса-Рингера
(KRGH)). Петли иссекали после составляющего вплоть до 90 мин времени восстановления функции. Регистрировали вес каждой петли до и после удаления содержащегося в них сока. Также регистрировали
длину каждой петли. Для определения эффектов являющихся агонистами GC-C пептидов, описываемых
здесь, на секрецию рассчитывали отношение веса к длине (W/L) для каждой петли. Также определяли
объем сока в петле.
На фиг. 2 и в табл. 8 представлены данные, демонстрирующие увеличение секреции сока, рН и секреции бикарбоната в перевязанных петлях двенадцатиперстной кишки крыс. На фиг. 2 демонстрируется,
что пептид 2 имеет эффективность, схожую с таковой пептида 4, в вызове накопления сока в перевязанных петлях двенадцатиперстной кишки. В табл. 8 представлены результаты, полученные в перевязанных
петлях двенадцатиперстной кишки крыс при использовании 2,5 мкг пептида на петлю.
Таблица 8. Секреция сока, повышение рН и секреция бикарбоната
Пример 6. In vitro метаболизм в соке петли тощей кишки мыши
Целью этого исследования было определение стабильности фосфорилированных пептидов в соке
петли тощей кишки мыши. В этом исследовании использовали пептид 2, дефосфорилированный пептид
2 (дефосфо-пептид 2), пептид 3 и меченный радиоактивными изотопами пептид 2. Меченный радиоактивными изотопами пептид 2 был синтезирован с использованием 13С, 15N-меченных аланина и лейцина
(т.е. с последовательностью CCpS[13С6,15N]LCCNP[13C6,15N]ACTGC).
Каждый пептид был синтезирован American Peptide Company, Inc. и хранился с десикантом при
-20°С. 1 мг/мл раствор каждого из немеченых пептидов готовили в 1 M Tris-HCl ((гидроксиметил) аминометана гидрохлориде) рН 8 непосредственно перед проведением анализа с использованием сока кишечной петли мыши. 500 нг/мл раствор 13С, 15N-меченного пептида 2 готовили в 0,1% муравьиной кислоте в воде и использовали для разведения образцов тощей кишки для анализа с помощью LC-MS/MS
после этого анализа.
Для исследования метаболизма пептида 2, дефосфо-пептида 2 и пептида 3 in vitro пептиды инкубировали в соке тощей кишки мыши, извлеченном из перевязанных в тонкой кишке мыши петель. Для получения сока мышей подвергали голоданию в течение ночи с обеспечением полного доступа к воде. Их
подвергали анестезии с помощью фторированного простого эфира для хирургического вмешательства и
лапаротомии, в ходе которой тонкая кишка была временно выведена на поверхность тела. Образование
петель тощей кишки длиной 3-4 см осуществляли с помощью наложения швов, начинающихся на расстоянии 7 см от сфинктера привратника желудка. После образования петель в них вводили 200 мкл буфера в виде забуференного фосфатом солевого раствора (PBS) (10 мМ, рН 7,4). Брюшную стенку и кожу
животных затем сшивали, и животным позволяли восстановиться в течение 30 мин. После восстановления животных умерщвляли, затем иссекали петли, и находящийся внутри сок извлекали и хранили при
-80°С до использования.
В случае каждого пептида 25 мкл 1 мг/мл исходного раствора пептида добавляли к 25 мкл 1 M TrisHCl и 25 мкл 10× буфера для фосфатазы кишечника теленка (CIP), содержащего 500 мМ Tris-HCl, 1 M
хлорид натрия (NaCl), 0,1 мМ хлорид магния (MgCl2), рН 8. Реакции инициировали посредством добавления 175 мкл сока из петли тощей кишки мыши или 175 мкл 1 M Tris-HCl pH 8 буфера в случае контрольных реакций. Конечная концентрация каждого пептида составляла 100 пг/мл. Реакции постоянно
перемешивали и сохраняли при 37°С на планшетном шейкере. В моменты времени, равные 0, 2, 5, 10, 20,
30, 60, 90 и 120 мин после добавления сока из петли тощей кишки мыши, 25-мкл аликвоты отбирали и
добавляли к 25 мкл 12% трихлоруксусной кислоты при 4°С для остановки реакции. С целью разведения в
эти реакции добавляли еще 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде. Затем эти образцы подвергали
дальнейшему разведению посредством взятия 20 мкл каждого образца и его добавления к 480 мкл 0,1%
муравьиной кислоты в воде, содержащей 500 нг/мл 13С, 15N-меченного пептида 2 в качестве внутреннего
стандарта.
Концентрацию пептида 2, дефосфо-пептида 2 и пептида 3 в образцах определяли с помощью LC- 20 -
022817
MS/MS. Все образцы анализировали, используя тройной квадрупольный масс-спектрометр Applied
Biosystems/MDS SCIEX API 4000, оснащенный системой для жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC). Масс-спектрометр работал в режиме мониторинга множества реакций (MRM) с разрешением, установленным на 1,2 Да. Инструментальные и хроматографические параметры для каждого
соединения суммированы в табл. 9.
Таблица 9. Параметры метода анализа с помощью LC-MS/MS для пептида 2,
дефосфо-пептида 2 и пептида 3 и 13С, 15N-меченного пептида 2
Данные LC-MS/MS обрабатывали, используя программное обеспечение Analyst версию 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS SCIEX). Отношение площадей пиков (отношение площади пика, соответствующего аналиту, к площади пика, соответствующего внутреннему стандарту) использовали для расчета остающейся части в процентах каждого пептида.
На фиг. 3 демонстрируется остающаяся часть в процентах пептида 2 и дефосфо-пептида 2, и пептида 3, определенная в девять моментов времени во время инкубации в течение 120 мин в соке тощей кишки мыши и в контрольной реакции (1 M Tris-HCl) при 37°С. После инкубации в соке из петли тощей
кишки мыши оставалось лишь 5,3% пептида 2 спустя 120 мин. В этой реакции образовывался метаболит,
дефосфо-пептид 2, и его концентрация увеличивалась в течение первых 20 мин, а затем демонстрировала
медленное снижение в течение остального времени. В контрольной реакции пептид 2 не подвергался
метаболизму, и дефосфо-пептид 2 не образовывался. После инкубации в соке тощей кишки мыши оставалось лишь 5,6% дефосфо-пептида 2 спустя 120 мин. В отличие от этого дефосфо-пептид 2 не подвергался метаболизму в контрольной реакции. Пептид 3 быстро метаболизировался и не выявлялся спустя
90 мин в соке тощей кишки мыши. В контрольной реакции пептид 3 не подвергался метаболизму.
Пептид 2, его метаболит - дефосфо-пептид 2 и пептид 3 подвергались метаболизму в соке из петли
тощей кишки мыши. Образование дефосфо-пептида 2 отмечалось, когда пептид 2 инкубировали в соке
из петли тощей кишки мыши при 37°С. Деградация дефосфо-пептида 2 и пептида 3 проходила быстрее
таковой пептида 2.
Пример 7. Опорожнение жидкого содержимого из желудка крыс с индуцированным с использованием стрепозотоцина (STZ) диабетом
Был изучен эффект пептидов 2 и 3, вводимых через посредство кормления через зонд, на опорож- 21 -
022817
нение жидкого содержимого из желудка (LGE) у крыс с индуцированным с использованием стрепозотоцина (STZ) диабетом. Самцов взрослых крыс (Sprague-Dawley; n=60) весом ~300 г (поставляемых
Taconic) помещали в контролируемые условия комнатной температуры (22°С) и цикла свет-темнота
(12:12 ч) со свободным доступом к воде и пище. После составляющего одну неделю адаптационного периода начинали протокол индукции диабета типа I с помощью STZ.
Для индукции диабета типа I у животных экспериментальной группы с использованием STZ (n=50)
им назначали схему внутрибрюшинный инъекций STZ (20 мг/кг), содержащегося в цитратном буфере,
каждый день в течение 5 дней. Контрольная группа получала равный объем носителя (п=10) в рамках той
же схемы инъекций. Всем животным давали 9 недель для развития диабета/восстановления от инъекций.
Уровни глюкозы в крови контролировали спустя 5 дней после инъекции STZ в день 0 (т.е. в день 6) и на
недели 1, 2 и 10 (т.е. в начале недели 10 - день эксперимента). Образцы крови брали из хвостовой вены,
за исключением дня эксперимента по опорожнению жидкого содержимого из желудка (LGE) (начало
недели 10), когда кровь брали непосредственно из сердца.
В процедуру LGE было включено 6 групп (n=10/группу), из которых пять групп страдали диабетом,
а одна группа не страдала диабетом. Перед экспериментом по LGE в пище отказывали в течение ночи,
тогда как в воде отказывали за 2 ч до начала процедуры опорожнения желудка.
Пептид 3 и пептид 2 растворяли по отдельности в носителе - 20% растворе сахарозы, содержащем
0,1 мг/мл фенолового красного. Дозы лекарственных средств в случае используемых соединений составляли (в мг/кг): 0,1 (в случае пептида 2 и 3), 0,3 и 1,0 (в случае лишь пептида 2). Для исследования их эффекта на LGE 0,5-мл объем раствора лекарственного средства доставляли затем через наконечник 18размера зонда для парентерального кормления (длиной 6 см) в желудок либо животных с диабетом, либо
контрольных животных. Каждое животное в страдающей диабетом экспериментальной группе получало
одну дозу лекарственного вещества - соединения Ironwood (пептида 2 или 3). Животным не страдающей
диабетом группы вводили схожий объем лишь раствора носителя. Затем всем животным давали 15 мин,
чтобы произошло опорожнение желудка, после чего животных подвергали эвтаназии с использованием
фторированного простого эфира.
После эвтаназии, посредством лапаротомии получали доступ к желудку и в случае каждого животного накладывали лигатуры на нижний пищеводный сфинктер и сфинктер привратника. Затем благодаря
иссечению диафрагмы обнажали сердце, брали образец крови и определяли уровень глюкозы с помощью
глюкометра. Затем желудок животного иссекали и хранили в течение ночи в 10-мл пробирке, содержащей 95% этанол. Затем ткань гомогенизировали, подвергали центрифугированию (дважды при 40000× g
в течение 30 мин) и проверяли оптическую плотность супернатанта в спектрофотометре (BioMate 3,
Thermospectronic, Inc.) при длине волны = 410 нм. Результаты сравнивали с "нулевым значением", полученным в результате введения раствора сахарозы с феноловым красным в желудок животного, которое
было сразу же умерщвлено, а его желудок извлечен для определения "процента удерживаемого жидкого
содержимого", для каждой группы.
Данные анализировали по показателю среднего значения (± стандартная погрешность среднего значения (SEM)) в процентах жидкого содержимого, удержанного у умерщвленных в момент времени = 15
мин животных. Статистическую значимость определяли, используя ANOVA и после этого критерий
сравнения Стьюдента-Ньюмена-Кейлса. Статистическая значимость была установлена на Р<0,05.
Уровни глюкозы натощак как у животных с STZ-индуцированным диабетом, так и у контрольных
животных составляли >300 мг/дл в день эксперимента по опорожнению желудка. Общий вес животных с
STZ-индуцированным диабетом был ощутимо меньше (приблизительно 150 г в среднем) такового животных без диабета в день эксперимента. Вес в случае обеих групп животных составлял приблизительно
300 г в момент начала подвергания воздействию STZ; вес не подвергнутых воздействию животных возрос в среднем на 130 г в течение 10 недель до процедуры LGE, тогда как вес животных с STZиндуцированным диабетом оставался постоянным (~300 г) до голодания (приблизительно 280 г в среднем).
Были выполнены эксперименты для определения эффекта пептидов 2 и 3 на LGE у крыс с STZиндуцированным диабетом (9 недель). Одна доза пептида 3 (0,1 мг/кг) и три дозы пептида 2 были оценены. Данные (фиг. 4) указывают на то, что крысы с STZ-индуцированным диабетом демонстрировали
значительное замедление опорожнения жидкой пищи из желудка спустя 15 мин после введения носителя
по сравнению с контрольными крысами (88,24+7,12% удержания по сравнению с 45,34+7,1% у контролей).
Это значимое различие между животными с STZ-индуцированным диабетом и контролями также
распространялось на тех животных с диабетом, которым вводили пептид 2 и пептид 3, как рассчитано с
использованием после этого критерия множественного сравнения Стьюдента-Ньюмена-Кейлса. В случае
пептида 2 две более высокие дозы (0,3 и 1,0 мг/кг) значительно увеличивали степень LGE по сравнению
с животными с диабетом, которые получили лишь раствор носителя.
Результаты настоящего исследования показывают, что существовало значительное замедление скорости LGE y животных с STZ-индуцированным диабетом (которым вводили носитель) по сравнению с не
страдающими диабетом контролями. Кроме того, данные однофакторного дисперсионного анализа
- 22 -
022817
(ANOVA) с использованием после этого критерия множественного сравнения (Стьюдента-НьюменаКейлса) указывают на то, что статистически значимые различия в LGE появлялись между животными с
STZ-индуцированным диабетом, которым перорально вводили раствор носителя, и животными, которые
получали пептид 3 (0,1 мг/кг) или пептид 2 (0,3 или 1,0 мг/кг). Однако по сравнению с не страдающими
диабетом контролями, которые получили лишь раствор носителя, эти вышеупомянутые различия не были видимыми.
Эти данные наблюдений демонстрируют, что пептид 3 был эффективен в исследованной дозе (0,1
мг/кг) в восстановлении степеней LGE до таковых, отмечаемых у не страдающих диабетом контролей.
Так же пептид 2 в назначаемых перорально дозах, равных 0,3 и 1,0 мг/кг, восстанавливал LGE у животных с STZ-индуцированным диабетом до LGE y нормальных контролей. В самой низкой дозе (0,1 мг/кг)
пептид 2 не восстанавливал статистически значимо LGE до LGE y нормальных контролей, тем не менее
результаты продемонстрировали видимую тенденцию к уменьшению процента удерживаемой жидкости.
Другие варианты осуществления
Все публикации и патенты, на которые делается ссылка в этом описании, включены сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы было специально и отдельно указано, что каждая отдельная
публикация или заявка на патент включена посредством ссылки. Если значение терминов в любом из
патентов или публикаций, которые включены посредством ссылки, противоречит значению терминов,
используемых в этом описании, значение терминов в этом описании, как предполагается, является доминантным. Кроме того, в вышеприведенном обсуждении раскрыты и описаны только примерные варианты осуществления по настоящему изобретению. Исходя из такого обсуждения и сопроводительных чертежей и формулы изобретения, квалифицированный в данной области техники специалист без труда
поймет, что в нем могут быть осуществлены различные изменения, модификации и вариации, не выходя
за пределы существа и объема по настоящему изобретению, который определяется следующей формулой
изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, где пептид включает аминокислотную последовательность
Хаа1 Хаа2 Хаа3 Хаа4 Cys5 Xaa6 Хаа7 Хаа8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Xaa14 Gly15 Xaa16 Xaa17 или ее
фармацевтически приемлемую соль; где
Xaa1 представляет собой Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr,
Asp, D-Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, D-Glu, γ-карбоксилированную Glu, α-аминосубериновую
кислоту (Asu), α-аминоадипиновую кислоту (Aad), α-аминопимелиновую кислоту (Apm) или отсутствует;
Хаа2 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa3 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa4 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa6 представляет собой P-Ser, P-Thr, Р-гомо-Ser, 4-гидроксивалина фосфат, Р-гомо-Thr, P-Cys или
P-Tyr;
Хаа7 представляет собой Tyr, Leu, Phe или Ile;
Хаа8 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa14 представляет собой Thr, Ala или Phe;
Хаа16 представляет собой Cys или D-Cys и
Хаа17 представляет собой Tyr, D-Tyr или отсутствует;
где
если Хаа1 присутствует, Xaa1 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой
кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой;
если Хаа1 отсутствует, а Хаа2 присутствует, то Хаа2 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой
кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой; или
если как Xaa1, так и Хаа2 отсутствуют, то Хаа3 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой.
2. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, в котором
Хаа2 представляет собой Asp, Glu или отсутствует;
Хаа3 представляет собой Asp, Glu или отсутствует;
Хаа7 представляет собой Tyr или Leu;
Хаа14 представляет собой Thr или
- 23 -
022817
Хаа17 представляет собой Tyr или отсутствует.
3. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, в котором Xaa1 представляет собой
Asp, D-Asp, Glu, D-Glu или отсутствует; и Хаа6 представляет собой P-Ser или P-Thr.
4. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.3, в котором Хаа6 представляет собой PSer.
5. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, в котором Xaa1, Xaa2 и Хаа3 отсутствуют.
6. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, где данный пептид содержит аминокислотную последовательность
Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Thr14 Gly15 Cys16 Xaa17,
где Хаа7 представляет собой Tyr или Leu.
7. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, причем пептид включает аминокислотную последовательность
Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr или
Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.
8. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп.1-7, причем пептид включает
не более 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15 или 14 аминокислот.
9. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, где пептид включает аминокислотную последовательность Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.
10. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность
Хаа1 Хаа2 Хаа3 Хаа4 Cys5 Хаа6 Хаа7 Xaa8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Xaa14 Gly15 Xaa16 Xaa17, или его
фармацевтически приемлемая соль;
где
Хаа1 представляет собой Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr,
Asp, D-Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, D-Glu, γ-карбоксилированную Glu, α-аминосубериновую
кислоту (Asu), α-аминоадипиновую кислоту (Aad), α-аминопимелиновую кислоту (Apm) или отсутствует;
Хаа2 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa3 представляет собой Asp, γ-карбоксилированную Asp, Glu, γ-карбоксилированную Glu, Asu,
Aad, Apm или отсутствует;
Xaa4 представляет собой Cys или D-Cys;
Xaa6 представляет собой P-Ser, P-Thr, Р-гомо-Ser, 4-гидроксивалина фосфат, Р-гомо-Thr, P-Cys или
Р-Tyr;
Хаа7 представляет собой Tyr, Leu, Phe или Ile;
Хаа8 представляет собой Cys или D-Cys;
Хаа14 представляет собой Thr, Ala или Phe;
Хаа16 представляет собой Cys или D-Cys и
Xaa17 представляет собой Tyr, D-Tyr или отсутствует;
где
если Xaa1 присутствует, Xaa1 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой
кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой;
если Xaa1 отсутствует, а Хаа2 присутствует, то Хаа2 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой
кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой; или
если как Хаа1, так и Хаа2 отсутствуют, то Хаа3 может быть модифицированным в своей аминогруппе метилом, этандиовой кислотой, пропандиовой кислотой, бутандиовой кислотой, пентандиовой кислотой, гександиовой кислотой, гептандиовой кислотой или октандиовой кислотой.
11. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.10, где
Хаа2 представляет собой Asp, Glu или отсутствует;
Хаа3 представляет собой Asp, Glu или отсутствует;
Хаа7 представляет собой Tyr или Leu;
Хаа14 представляет собой Thr и
Xaa17 представляет собой Tyr или отсутствует.
- 24 -
022817
12. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.10, где Xaa1 представляет собой Asp, DAsp, Glu, D-Glu или отсутствует; и Хаа6 представляет собой P-Ser или P-Thr.
13. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.12, где Хаа6 представляет собой P-Ser.
14. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.10, где Хаа1, Хаа2 и Хаа3 отсутствуют.
15. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.10, где данный пептид состоит из аминокислотной последовательности
Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Thr14 Gly15 Cys16 Xaa17,
где Хаа7 представляет собой Tyr или Leu.
16. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по п.10, где пептид состоит из аминокислотной последовательности
Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr;
Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys;
Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr или
Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.
17. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, где пептид состоит из аминокислотной последовательности Cys Cys Р-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys.
18. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп.1-17, где пептид или его
фармацевтически приемлемая соль являются выделенными или очищенными.
19. Фармацевтическая композиция, включающая пептид или его фармацевтически приемлемую
соль по любому из пп.1-17.
20. Фармацевтическая композиция по п.19, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель и один или более агентов, выбранных из (i) катиона, выбранного из Mg2+, Са2+, Zn2+,
Mn2+, K+, Na+ или Al3+, или (ii) пространственно-затрудненного первичного амина.
21. Фармацевтическая композиция по п.20, в которой указанный Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, K+, Na+ или
3+
Al предоставлен в виде ацетата магния, хлорида магния, фосфата магния, сульфата магния, ацетата
кальция, хлорида кальция, фосфата кальция, сульфата кальция, ацетата цинка, хлорида цинка, фосфата
цинка, сульфата цинка, ацетата марганца, хлорида марганца, фосфата марганца, сульфата марганца, ацетата калия, хлорида калия, фосфата калия, сульфата калия, ацетата натрия, хлорида натрия, фосфата натрия, сульфата натрия, ацетата алюминия, хлорида алюминия, фосфата алюминия или сульфата алюминия.
22. Фармацевтическая композиция по п.20, в которой пространственно-затрудненным первичным
амином является аминокислота, выбранная из встречающейся в природе аминокислоты, не встречающейся в природе аминокислоты или производного аминокислоты; при этом встречающейся в природе
аминокислотой является гистидин, фенилаланин, аланин, глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота,
глютамин, лейцин, метионин, аспарагин, тирозин, треонин, изолейцин, триптофан или валин, или не
встречающейся в природе аминокислотой является 1-аминоциклогексанкарбоновая кислота, лантанин
или теанин.
23. Фармацевтическая композиция по п.20, в которой пространственно-затрудненный первичный
амин имеет формулу
где R1, R2 и R3 независимо выбраны из Н, С(О)ОН, C1-C6 алкила, C1-C6 алкилэфира, C1-C6 алкилтиоэфира, C1-C6 алкилкарбоновой кислоты, C1-C6 алкилкарбоксиламида и алкиларила, при этом любая группа может быть однократно или многократно замещена галогеном или аминогруппой, и при условии, что
не более одного из R1, R2 и R3 является H.
24. Фармацевтическая композиция по п.20, в которой пространственно-затрудненным первичным
амином является циклогексиламин, 2-метилбутиламин, полиамин или хитозан.
25. Фармацевтическая композиция по любому из пп.19-24, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый антиоксидант, связующее вещество, добавку или наполнитель.
26. Фармацевтическая композиция по п.25, где указанный антиоксидант представляет собой ВНА,
витамин Е или пропилгаллат.
27. Фармацевтическая композиция по п.25, в которой фармацевтически приемлемое связующее вещество или добавка выбраны из поливинилового спирта, поливинилпирролидона (повидона), крахмала,
мальтодекстрина или эфира целлюлозы.
28. Фармацевтическая композиция по п.25, в которой фармацевтически приемлемым связующим
- 25 -
022817
веществом или добавкой является эфир целлюлозы, выбранный из метилцеллюлозы, этилцеллюлозы,
карбоксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксиэтилметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и гидроксипропилметилцеллюлозы.
29. Фармацевтическая композиция по п.25, в которой фармацевтически приемлемым наполнителем
является целлюлоза, изомальт, маннит, лактоза или двухосновный фосфат кальция.
30. Фармацевтическая композиция по п.29, в которой целлюлоза выбрана из сверхизмельченной
целлюлозы и микрокристаллической целлюлозы.
31. Фармацевтическая композиция по любому из пп.19-30, включающая, кроме того, дополнительное терапевтическое средство.
32. Фармацевтическая композиция по п.31, в которой указанное дополнительное терапевтическое
средство выбрано из одного или нескольких из следующих: анальгетика, антидепрессанта, стимулирующего опорожнение кишечника средства или прокинетика, противорвотного средства, антибиотика, ингибитора протонного насоса, блокатора продукции кислоты в желудке, ингибитора PDE5, антагониста кислотного насоса, агониста GABA-B, усиливающего экскрецию желчной кислоты вещества или средства
для защиты слизистой оболочки.
33. Фармацевтическая композиция, включающая пептид или его фармацевтически приемлемую
соль, где пептид содержит аминокислотную последовательность Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala
Cys Thr Gly Cys.
34. Фармацевтическая композиция, включающая пептид или его фармацевтически приемлемую
соль, где пептид состоит из аминокислотной последовательности Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala
Cys Thr Gly Cys.
35. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.19-32 в лечении желудочнокишечного расстройства.
36. Применение по п.35, где указанным желудочно-кишечным расстройством является парез желудка, непроходимость кишечника после операции на желудке, нарушение функции пищевода, функциональное гастродуоденальное нарушение, желудочно-пищеводный рефлюкс (GERD), глютеновая болезнь, воспаление слизистой оболочки или язва двенадцатиперстной кишки или желудка.
37. Применение по п.36, где указанным желудочно-кишечным расстройством является парез желудка, выбранный из идиопатического пареза желудка, диабетического пареза желудка или пареза желудка после хирургического вмешательства.
38. Применение по п.36, где указанным желудочно-кишечным расстройством является нарушение
функции пищевода, выбранное из функциональной изжоги, функциональной боли в грудной клетке
предполагаемого пищеводного происхождения, функциональной дисфагии или истерического комка.
39. Применение по п.36, где указанным желудочно-кишечным расстройством является функциональное гастродуоденальное нарушение, выбранное из функциональной диспепсии, расстройства в виде
отрыжки, расстройства в виде тошноты или рвоты или синдрома руминации.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 26 -
022817
Фиг. 3
Фиг. 4
Список последовательностей
- 27 -
022817
- 28 -
022817
- 29 -
022817
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 30 -