Божков А. И. 6566 - XII Всероссийское совещание по проблемам

6566
УДК 574.352.3
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ
МОДЕЛИРОВАНИЕ
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ
А.И. Божков
НИИ биологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина
Украина, 61022, Харьков, Свободы пл., 4
E-mail: bozhkov@univer.kharkov.ua
Ю.В. Никитченко
НИИ биологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина
Украина, 61022, Харьков, Свободы пл., 4
E-mail: yunikitchenko@mail.ru
Е.М. Климова
Кафедра молекулярной биологии и биотехнологии
Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина
Украина, 61022, Харьков, Свободы пл., 4
E-mail: klimova_elena@list.ru
С.В. Львов
НИИ биологии Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина
Украина, 61022, Харьков, Свободы пл., 4
E-mail: lvovser@rambler.ru
Ключевые слова: продолжительность жизни, активность ферментов, температура тела,
про- и антиоксидантная система
Аннотация: На моделях увеличения и уменьшения средней продолжительности жизни
обнаружена взаимосвязь между температурой тела и продолжительностью жизни у крыс.
Показано, что экспериментальное моделирование продолжительности жизни в этом случае сопряжено с изменением окислительного фосфорилирования и активностью проантиоксидантной системы в организме.
1. Введение
Основная цель биологических исследований направлена на разработку систем
управления: продуктивностью (агробиотехнологии), метаболизма (здравоохранение и
животноводства) и наконец, продолжительностью жизни (геронтология). Без знаний
закономерности и принципов биологической регуляции эти цели не могут быть достигнутыми. В изучении систем биорегуляции особое место занимает процесс моделирования. С одной стороны – моделирование – это проверка экспериментальных данных и
подтверждение эмпирических гипотез, а, с другой – это получение новых знаний о
принципах функционирования биологических систем.
Однако моделирование биологических процессов сопряжено с целым рядом объективных и субъективных ограничений и трудностей. Так, в настоящее время накоплен
XII ВСЕРОССИЙСКОЕ СОВЕЩАНИЕ ПО ПРОБЛЕМАМ УПРАВЛЕНИЯ
ВСПУ-2014
Москва 16-19 июня 2014 г.
6567
огромный массив экспериментальных и клинических данных, однако эти данные не
всегда могут быть объединены и использованы для построения обобщающих моделей.
Это связано, прежде всего с тем, что биологи в своих исследованиях практически не
используют системный подход. Поэтому мы мало знаем о механизмах взаимосвязи молекулярного уровня с клеточным и особенно организменным уровнем, что необходимо
для построения математических моделей.
Так, исследуя механизмы продолжительности жизни, мы владеем знаниями о молекулярных возрастзависимых изменениях метаболизма, однако мало знаем, как эти
изменения интегрируются в данную систему и формируют механизмы, непосредственно влияющие на продолжительность жизни. В связи с этим, разработка подходов к моделированию биологических процессов является актуальной задачей.
В этом направлении уже получены интересные результаты в ряде лабораторий, и
сегодня можно говорить о геронтологии in silico [1, 2].
Для дальнейшего развития этого перспективного подхода нам необходимо знать,
существуют ли метаболические состояния, которые обеспечивают значительную продолжительность жизни, какова характеристика этих состояний, которые сопряжены с
увеличением и, напротив, с уменьшением продолжительности жизни. Решение этих насущных задач, по сути, есть разработка имитационного моделирования, которое использует множество правил, определяющих в какое состояние, перейдет система в будущем из заданного текущего состояния [3].
Решение этих задач может быть основано на экспериментальном моделировании
продолжительности жизни. Наиболее изученной и широко используемой моделью увеличения продолжительности жизни является калорийно ограниченная диета (КОД) [4].
Наряду с этим, имеются данные, указывающие на то, что снижение температуры тела у
насекомых сопровождается увеличением продолжительности жизни [4]. Однако эта
модель работает пока только для насекомых. В 1986 г. Оока показал, что гипертиреоз
сопровождался сокращением продолжительности жизни крыс [5].
В связи с этим, целью настоящей работы было исследование взаимосвязи между
температурой тела, состоянием эпигенотипа, отражающего проантиоксидантную активность и продолжительностью жизни. Этот подход может позволить определить
взаимосвязь текущего состояния эпигенотипа с предстоящей продолжительностью
жизни и ответить на вопрос о системоорганизующей роли температуры тела млекопитающих. Для решения этих задач были использованы две экспериментальные модели:
калорийно ограниченная диета и модель индуцированного гипертиреоза (ИГ).
2. Методы исследования
Модель КОД разработана в НИИ биологии акад. АН Украины В.Н. Никитиным и
описана в работе [4]. Для получения модели крыс с гипертиреозом взрослые крысы получали тироксин с питьевой водой в дозе 0,1 мг/100 г ежедневно на протяжении двух
месяцев.
У экспериментальных животных определяли массу тела, температуру тела, продолжительность жизни. Для определения эпигенотипа, обеспечивающего проантиоксидантную активность, определяли содержание тироксина и трийодтиронина в
сыворотке крови, активность антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы,
глутатионтрансферазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и др.), как описано в работе
[6].
6568
О функциональной активности митохондрий судили по скорости окислительного
фосфорилирования [6]. Активность прооксидантной системы оценивали по содержанию ТБК-активных продуктов. Результаты обрабатывали статистически.
3. Результаты исследования
3.1. Связь продолжительности жизни,
тиреоидного статуса и термогенеза
Перевод одномесячных крыс на калорийно ограниченную диету (КОД), сопровождалось увеличением продолжительности жизни (рис. 1).
Необходимо отметить, что ректальная температура в онтогенезе крыс незначительно снижалась (рис.1). Однако у крыс, находящихся на КОД она была достоверно ниже
контрольного уровня на всех этапах онтогенеза (рис. 1).
1.0
37.0
B
D
C
E
36.5
survival rate
36.0
0.6
35.5
0.4
35.0
34.5
0.2
body temperature, C
0.8
34.0
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
age, month
Рис. 1. Продолжительность жизни крыс контрольной группы (1) и группы на КОД (2).
Температура тела контрольной группы (□) и группы на КОД (■).
Снижение температуры тела у животных, находящихся на КОД, происходило на
фоне достоверного снижения содержания тироксина на 35-39 % и трийодтиронина на
50 % (рис. 2). Следовательно, между содержанием тиреоидных гормонов, температурой
тела и продолжительностью жизни у животных, находящихся на КОД, существует тесная взаимосвязь.
Ранее было показано, что, регулярное потребление тироксина с питьевой водой сопровождалось развитием гипертиреоза и сокращением средней продолжительности
жизни крыс [5].
В наших экспериментах двухмесячное потребление Т4 с питьевой водой начиная с
17 мес. возраста сопровождалось увеличением тироксина в сыворотке крови почти в 2
раза, при этом у них увеличивалось и содержание трийодтиронина на 48 % (табл. 1).
Это свидетельствует об эффективной конверсии Т4 в Т3, в которой принимает участие
селензависимая монодейодиназа.
Температура тела у крыс с индуцированным гипертиреозом (ИГ) была почти на
2 °С выше средней температуры тела контрольных крыс (таблица 1).
6569
Таблица 1. Среднее значение температуры тела, содержания тироксина и трийодтиронина в сыворотке крови контрольных 19-ти мес. крыс и крыс с 2-х месячным гипертиреозом в возрасте 19 месяцев. Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05.
Показатель
Содержание тироксина, нмоль/л
Содержание трийодтиронина, нмоль/л
Ректальная температура, °С
Контроль
30,98 ± 2,03
0,66 ± 0,04
36,3 ± 0,3
Гипертиреоз
60,18 ± 7,02*
0,98 ± 0,11*
38,2 ± 0,3*
Следовательно, между содержанием тироксина в крови, ректальной температурой
животных и продолжительностью их жизни существует взаимосвязь не только на модели КОД, но и в случае длительного потребления тироксина.
Как известно, изменение температуры тела отражает баланс между теплопродукцией и теплообменом. В случае тироксина мы наблюдали увеличение теплопродукции, а
это, в свою очередь, может сопровождаться и изменением морфологических и весовых
характеристик таких животных.
Масса 19 мес. крыс с экспериментальным 2-х месячным гипертиреозом была
меньше контрольных животных на 36 % (табл. 2).
Таблица 2. Изменение массы животного, массы печени и митохондриальной фракции
19-ти месячных крыс с 2-х месячным гипертиреозом. Средние значения из 5-9 повторностей при Р< 0,05 по сравнению с контрольным вариантом.
Показатель
Масса животного, г
Масса печени, г
Соотношение массы животного к массе печени г/г × 10-2
19-ти месячные крысы
Контроль
Гипертиреоз
407,5 ± 7,5
264,0 ± 6,0*
9,3 ± 0,36
10,9 ± 0,76
2,3 ± 0,10
4,2 ± 0,2*
Уменьшение массы крыс на фоне стабильного повышения температуры тела убедительно свидетельствует об увеличении теплопродукции у этих животных. В таком
случае можно ожидать увеличения функциональной нагрузки на печень как одного из
органов энергетического обмена организма.
Оказалось, что масса печени у крыс с ИГ была несколько увеличенной, а с учетом
массы тела, относительная масса этого органа была почти в 2 раза больше контрольных
животных (таблица 2). Можно ожидать, что увеличение относительной массы печени
будет сопровождаться увеличением количества митохондрий в расчете на единицу массы животного.
3.2. Функциональная активность митохондрий печени
гипертиреоидных крыс
Скорость нефосфорилирующего окисления сукцината (V2) в изолированных митохондриях печени крыс с ИГ была увеличенной на 57,2 %, а скорость фосфорилирующего окисления (V3) на 16 % по сравнению с контрольными животными (таблица 3). Показатель степени сопряжения (ДК) у опытных крыс был снижен на 24 % (таблица 3),
что указывает на проявление эффекта разобщения.
6570
Таблица 3. Скорость потребления кислорода, дыхательный контроль (ДК) в митохондриях печени крыс. Представлены средние значения из 5-9 опытов. Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05.
Параметр
Контроль
Опыт
Субстрат окисления – сукцинат
V2, наноатом О/мин.мг белка
41,82 ± 2,04
65,74 ± 6,48*
V3 наноатом О/мин.мг белка
ДК
157,6 ± 9,38
3,78 ± 0,20
183,6 ± 15,50
2,86 ± 0,31*
Известно, что существуют две формы малатдегидрогеназы, одна локализована в
митохондриях, а вторая в цитоплазме и соотношение активности этих форм различно в
разных органах. Представляло интерес определить соотношение активности митохондриальной и цитоплазматической малатдегидрогеназы в печени контрольных и крыс с
гипертиреоидизмом.
Оказалось, что активность малатдегидрогеназы в цитоплазме печени в несколько
раз выше по сравнению с митохондриальной, а в цитоплазме клеток печени крыс с гипертиреозом она была выше по сравнению с таковой контроля в 6,8 раз (рис. 3).
400
100
300
2
1
*
200
10
*
100
*
нМ/мин на 1 мг белка
нМ/мин на 1 мг белка
*
0
1
МТ
ГП
МТ
ГП
Клеточные фракции
Рис. 3. Активность малатдегидрогеназы (1) и изоцитратдегидрогеназы (2) в митохондриях (МТ) и цитозоле печени (ГП) контрольной группы (□) и крыс с 2-х месячным гипертиреозом (■). Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р
<0,05.
При этом активность изоцитратдегидрогеназы в цитозоле клеток печени крыс с гипертиреоидизмом была как и в митохондриях в 1,4 раза ниже контроля (рис. 3).
Соотношение активности малатдегидрогеназы в митохондриях/цитоплазме клеток
печени у контрольных животных составляла 4,7, а у крыс с гипертиреоидизмом 19,6.
Следовательно, увеличенное содержание тироксина индуцировало разобщение
окислительного фосфорилирования, выражающееся в изменении в соотношении активности ферментов, в частности малат и изоцитратдегидрогеназ, что позволяет предположить формирование отличного от контроля паттерна ферментативной активности.
3.3. Интенсивность свободнорадикальных процессов в
митохондриях и микросомах печени крыс с гипертиреозом
Свободнорадикальная гипотеза старения по-прежнему остается одной из наиболее
активно обсуждаемых [7]. Представляло интерес определить некоторые ее характери-
6571
нмоль кислорода/мин.мг белка
стики у гипертиреоидных крыс, которые характеризовались «сокращенной» продолжительностью жизни.
Генерация супероксидных радикалов в митохондриях печени ГК была увеличена
по сравнению с контрольной группой на 50 % (рис. 4). Как известно, наряду с митохондриями еще одним «индуктором» генерации активных форм кислорода являются NAD
(P)H-зависимые редокс-цепи эндоплазматического ретикулума [12].
Оказалось, что скорость образования супероксидных радикалов и во фракции микросом крыс с ИГ увеличена на 55 % по сравнению с 19-ти мес. крысами того же возраста с нормальным тиреоидным статусом (рис. 4).
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
контроль
гипертиреоз
митохондрии
микросомы
Фракции печени
Рис. 4. Интенсивность генерации супероксидного радикала во фракциях митохондрий и
микросом печени контрольных 19-ти мес. крыс и крыс с гипертиреозом. Представлены
средние из 5-ти экспериментов.
Столь значительное увеличение генерации супероксидных радикалов в митохондриях и микросомах печени крыс с ИГ должно сопровождаться и увеличением содержания продуктов ПОЛ. Было обнаружено, что содержание ТБК-активных продуктов, о
котором судили по количеству МДА, у них было увеличено как и в митохондриях (на
48 %), так и в микросомах (на 31 %, рис. 5).
нмоль МДА/мг белка
0,4
0,35
0,3
контроль
0,25
гипертиреоз
0,2
0,15
0,1
0,05
0
митохондрии
микросомы
Фракции печени
Рис. 5. Содержание ТБК-активных продуктов (нмоль МДА/мг белка) во фракциях митохондрий и микросом у контрольных и крыс с 2-х месячным гипертиреозом. Средние
значения из 5-7-ми опытов.
Следовательно, увеличение теплопродукции в митохондриях ГК сопровождалось и
увеличением интенсивности свободнорадикальных процессов, как в митохондриях печени крыс с ИГ, так и в микросомах. По этому показателю крысы с ИГ «старше» по
сравнению с животными такого же календарного возраста.
6572
Основная идея свободнорадикальной концепции основана на потере функциональной активности окисленных макромолекул. Вместе с тем, негативные эффекты могут
быть устранены антиоксидантной системой.
3.4. Активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты
В инактивации гидроперекисей и других токсических соединений принимают участие ферменты семейства глутатионпероксидаз, которые имеют разную клеточную локализацию и субстратную специфичность. Глутатионпероксидазы специфичные к перекиси водорода и гидроперекиси кумола, локализованные в митохондриях животных с
гипертиреозом, не отличались по активности от этих ферментов в митохондриях контрольных животных (таблица 4).
Таблица 4. Активность некоторых ферментов системы антиоксидантной защиты в митохондриях печени контрольных животных и животных с 2-х месячным гипертиреозом
(ГК). Представлены средние значения из 5-7 опытов. Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05.
Ферменты
Глутатионпероксидаза с гидроперекисью кумола
Глутатионредуктаза
Глутатион-S-трансфераза
Контрольная группа
123,3± 20,4
26,1±1,6
164,4±11,0
Группа с
гипертиреозом
102,4±23,2*
29,5±1,9
96,3±4,1*
Активность глутатионредуктазы, которая участвует в реакции восстановления глутатиона, также не отличалась от митохондрий контрольных животных (таблица 4).
Активность глутатионтрансферазы, которая использует восстановленный глутатион в метаболизме разнообразных гидрофобных ксенобиотиков, включая и альдегиды,
напротив, была снижена в 1,7 раза по сравнению с контролем (таблица 4).
Как известно, наибольшее количество глутатионпероксидазы локализуется в цитоплазме клеток. Определение активности глутатионпероксидазы в цитоплазме показало,
что у крыс с гипертиреозом обе исследуемые формы глутатионперокисдазы были менее активными на 30 % по сравнению с контрольными животными (таблица 5).
Таблица 5. Активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты клеток печени
контрольных животных и животных с 2-х месячным гипертиреозом (ГК). Представлены
средние значения из 5-7 опытов. Примечание. * – достоверная разница по сравнению с
контролем при Р <0,05.
Ферменты
Глутатионпероксидаза, индуцированная
перекисью водорода
Глутатионпероксидаза, индуцированная
гидроперекисью кумола
Глутатионредуктаза
Глутатион-S-трансфераза
Глутатион-6-фосфатдегидрогеназа
Контрольная группа
Группа с
гипертиреозом
100,9± 6,4
77,4±6,7*
254,7±11,8
185,8±15,0*
40,6±1,3
745,3±59,0
22,8±2,7
38,0±1,3
354,8±26,2*
66,1±8,1*
При этом глутатионредуктаза оставалась неизменной по сравнению с контрольным
уровнем, а глутатионтрансфераза была в 2 раза менее активной по сравнению с контрольным уровнем (таблица 5).
6573
При этом активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, которая обеспечивает образование НАДФ-Н и поддержание уровня восстановленного глутатиона, у животных с
гипертиреоидизмом была увеличена в 2,8 раза по сравнению с контролем (таблица 5).
4. Обсуждение
На моделях КОД и ИГ выявлена взаимосвязь между содержанием тироксина в сыворотке крови, температурой тела и средней продолжительностью жизни. Так если при
КОД температура тела была снижена на 1,5-2°С по сравнению с контролем и увеличена
продолжительность жизни, то при ИГ напротив, была повышена температура тела на
2 °С и сокращена продолжительность жизни. Эти результаты позволяют заключить, что
температура тела, в регуляции которой принимает участие тироксин, выполняя функцию разобщителя дыхания и фосфорилирования, является системообразующим фактором в изменении метаболизма.
Результаты работы показали, что на модели ИГ имеют место системные изменения
показателей про- и антиоксидантной системы. При этом формируются иные, отличные
от контроля соотношения между исследуемыми показателями в митохондриях и цитозоле, т. е. формируются специфические паттерны метаболических показателей, или
эпигенотипы [8]. Необходимо отметить, что тироксин в организме выполняет многообразные функции, т.е. полифункционален. Разнообразные функции выполняют и продукты свободнорадикальных реакций. Такая полифункциональность и многовариантность ответа на воздействия обеспечивает высокую адаптивность и метаболическую
память, которая имеет прямое отношение к продолжительности жизни биологических
систем.
Вместе с тем, существующая общебиологическая парадигма исследований основана на редукционизме и логическом рационализме, которая не дает возможности выявить интегративные механизмы функционирования биологических систем.
Эффективным методом преодоления существующих ограничений в биологических
исследованиях может стать метод моделирования. В настоящее время ведется активная
работа по разработке математических подходов моделирования динамичных, нелинейных систем [9]. Мы считаем, что подобные подходы должны состоять из двух элементов. Эмпирического – экспериментального моделирования биологических процессов и
в частности продолжительности жизни и имитационного (математическикомпьютерного) моделирования. Такой единый, интегральный подход позволит перейти от эмпирического экспериментального моделирования к прогностическому экспериментальному моделированию.
Список литературы
1.
2.
3.
4.
5.
Новосельцев В.Н., Михальский А.И. Математическое моделирование и старение: программа научных исследований // Успехи геронтологии. 2009. Т. 22, № 1. С. 117-128.
Геронтология in silico: становление новой дисциплины / Ред. Г.И. Марчук, В.Н. Анисимов; А.А. Романюха, А.И. Яшин: М.: Бином, 2007. С. 80-113.
Павловский Ю.Н., Белотелов Н.В., Бродский Ю.И. Имитационное моделирование. М.: Академия,
2008. 236 с.
Божков А.И. Низкокалорийная диета как модель увеличения продолжительности жизни и исследования механизмов старения // Успехи геронтологии. 2001. Вып. 8. С. 89-99.
Ooka H., Shinkai T. Effect of chronic hypertheroidism in the lifespan of the rat // Mechanisms of Ageing
and Development. 1986. Vol. 33. P. 275-282.
6574
6.
7.
8.
9.
Bozhkov A. I., Nikitchenko Yu. V. Caloric Restriction Diet Induces Specific Epigenotypes Associated with
Life Span Extension // Journal of Nutritional Therapeutics. 2013. Vol. 2, No 1. P. 30-39.
Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб: Наука, 2008. Т. 1. С.
161-191.
Божков А.И. Эпигенотип, принципы временной организации метаболизма и старение // Проблемы
старения и долголетия. 2010. Т. 19, № 3. С. 223-224.
Терехин А.Т., Будалова Е.В. Сетевые механизмы физиологической регуляции // Математика и реальность: конфронтация строгости и сложности. М.: Солитон, 2012. С. 224-257.