Document 2093654

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«УДМУРТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
На правах рукописи
СЕРГЕЕВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА
РОЛЬ АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА В МЕХАНИЗМАХ
СОПРЯЖЕНИЯ ПРОЦЕССОВ НЕЙРОВОСПАЛЕНИЯ И
НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ В ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ МОЗГА
КРЫС
03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология
Диссертация
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор Чучков В.М.
Ижевск 2014
2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОГЛАВЛЕНИЕ
2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
5
ВВЕДЕНИЕ
6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
14
1.1 Роль альфа-синуклеина в патофизиологических механизмах болезни
Паркинсона
14
1.1.1. Характеристика Болезни Паркинсона и других синуклеопатий
14
1.1.2. Болезнь Паркинсона и мутации в гене aльфа- синуклеина
15
1.1.3. Биохимическая структура альфа-синуклеина
17
1.1.4. Агрегация альфа-синуклеина и нейродегенерация
20
1.2 Клеточные механизмы нейровоспаления
24
1.2.1. Отличительные особенности нейровоспаления
24
1.2.2. Микроглия как ключевой участник нейровоспалительного процесса
26
1.2.3. Роль астроглии в нейровоспалении
29
1.2.4. Реакции клеточных элементов гематоэнцефалического барьера на
35
нейровоспаление
1.2.4.1.. Эндотелий
36
1.2.4.2. Перициты
37
1.2.5 Вовлеченность мигрирующих в нервную ткань лимфоцитов в
41
нейровоспалительные процессы
1.2.6. Концепция нейроваскулярной единицы
47
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
50
2.1. Организация исследования
50
2.2. Введение вирусного вектора, А-син и бактериального эндотоксина в
53
черную субстанцию мозга
2.3. Гистологический анализ
53
2.4. Электронномикроскопический анализ
54
2.5. Иммуногистохимический анализ
55
3
2.6. Подсчет клеток и плотности волокон
56
2.7. Измерение интенсивности флуоресцентного свечения
56
2.8. Биохимический анализ (Вестерн-блоттинг)
56
2.9. Статистический анализ
57
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
58
3.1. Перенос рААВ в ДА-эргические нейроны черной субстанции мозга
58
3.2. Межвидовые различия способности гиперэкспрессированного в ДА-
62
эргических
нейронах
А-син
человека
и
крысы
индуцировать
нейродегенерацию
3.3. Гиперэкспрессия в ДА-эргических нейронах А-син человека и крысы
67
вызывает образование в нейронах агрегатов А-син
3.4. Векторный перенос в ДА нейроны ЧС крыс гена А-син вызывает рост
69
концентрации А-син и падение тирозингидроксилазы в стриатуме
3.5. Индукция повышенной экспрессии А-син в ДА нейронах ЧС
72
вызывает провоспалительную активацию м икроглиоцитов
3.6. Изменение фенотипа активированных микроглиоцитов зависит от
75
интенсивности нейродегенерации
3.7.
Индукция
дофаминергических
повышенной
нейронах
экспрессии
черной
уровней
субстанции
А-син
в
77
вызывает
гиперэкспрессию глиального кислого фибриллярного белка в астроцитах
3.8. Индукция повышенной экспрессии А-син в дофаминергических
80
нейронах черной субстанции сопровождается сосудистой реакцией и
инфильтрацией лимфоцитов в область введения вектора
3.9.
Интраперитонеальное
введение
кортикостерона
снижает
интенсивность гибели дофаминергических нейронов, индуцированной
введением в дофаминергические нейроны рекомбинантного гена А-син
человека, нормализует уровень дофамина в стриатуме, но не влияет на
экспрессию А-син
А-син
альфа-синуклеин
81
4
3.10. Унилатеральное введение ЛПС и А-син в ЧС индуцирует в области
83
введения нейровоспаление (активацию микро- и астроглии, сосудистую
реакцию и инфильтрацию лимфоцитов), но не вызывает выраженной
нейродегенерации
3.11. Унилатеральное введение липополисахарида в ЧС вызывает
95
дисфункцию А-син в ДА нейронах ЧС и дегенерацию синапсов в
стриатуме
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
104
ВЫВОДЫ
107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
108
БП
болезнь Паркинсона
ГФКБ
глиальный фибриллярный кислый белок
ГЭБ
гематоэнцефалический барьер
ДА
дофаминергический
ЗФБ
зеленый флуоресцирующий белок
ЛПС
липополисахарид
рААВ
рекомбинантный аденоассоциированный вирус
ТГ
тирозингидроксилаза
Т-рег
Т-регуляторный лимфоцит
ЧС
черная субстанция
ЦНС
центральная нервная система
ВМАТ
везикулярный моноаминовый транспортер
FITC
флуоресцеин изотиоцианат
GMF
глиальный фактор созревания
ICAM-1
межклеточная молекула адгезии – 1
IFN-γ
интерферон гамма
IL
интерлейкин
МНС
молекула главного комплекса гистосовместимости
MMP
металлопротеаза
5
МРТР
1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин
NGF
ростовой фактор нервов
NO
монооксид азота
TGF-β
трансформирующий фактор роста бета
TLR
толлподобный рецептор
TNF-α
фактор некроза опухоли альфа
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
В настоящее время большое внимание уделяется нейродегенеративным
заболеваниям, одним из которых является болезнь Паркинсона (БП),
характеризующяяся
мышечной
ригидностью,
тремором,
брадикинезией,
нарушением походки, неустойчивостью позы [Lang A.E., Lozano A.M., 1998;
Fernandez H.H., 2012; Singer C., 2012], вегетативной дисфункцией, дисомнией,
депрессией, в ряде случаев снижением интеллекта и памяти вплоть до развития
деменции [Голубев В. Л. и др., 1999; Левин О.С. и др., 2003; Looi J.C. et al., 2005].
Высокое социально-экономическое бремя БП для общества, прогрессирующий
рост числа больных за счет старения популяции [Dorsey E.R. et.al., 2007],
тенденция к более ранним срокам манифестации болезни [Kontakos N., Stokes J.,
1999] и отсутствие эффективных этиотропных схем лечения в силу
недостаточной изученности этиологии и патогенеза этого нейродегенеративного
заболевания [Крыжановский Г.Н. и др., 2002] определяют актуальность
исследований,
посвященных
его
тонким
молекулярным
и
клеточным
механизмам.
Различают редко встречаемую семейную форму БП (не более 10-15% от
числа всех заболевших), вызываемую мутацией генов, кодирующих такие белки
как альфа-синуклеин (SNCA), PARK2, DJ1, LRKK2, PINK1 и ND5 [McInerneyLeo., 2005; Hirsch E.C. et al., 2003; Rappold P.M., Tieu K. 2010; Pan-Montojo F. et
6
al., 2010; Wang H.L. et al., 2011], и спорадическую форму, этиология и многие
аспекты патогенеза которой, остаются до сих пор неизученными [Fernandez H.H.,
2012; Schwartz M., Sabetay S., 2012]. Независимо от формы БП, моторные
нарушения,
характерные
для
этой
болезни,
вызываются
гибелью
дофаминергических (ДА) нейронов компактной части черной субстанции (ЧС)
мозга, проецирующихся в стриатум (полосатое тело) [McGeer P. L. et al., 1988;
Fearnley J.M., Lees A.J., 1991]. Дефицит тормозного дофаминового контроля со
стороны черной субстанции ведет к образованию в стриатуме патологически
усиленного возбуждения и нарушению функциональной организации системы
нейрональных связей между корой и базальными ядрами, ответственной за
планирование движения и регуляцию таких его параметров как направление,
амплитуда и скорость [Alexaner G.E. et al., 1986; Delwaide P.J. et al., 2000].
Гибель дофаминергических нейронов, как при семейной, так и
спорадической формах БП, сопровождается повышением производства и/или
мисфолдингом в них белка альфа-синуклеина (А-син) [Polymeropoulos M.H. et
al., 1997; Krüger R. et al., 1998; Singleton A.B. et al., 2003; Chartier-Harlin M.C. et
al., 2004; Ibanez P. et al., 2004; Yu S. et al., 2005; Farrer M.J., 2006]. Бетаскладчатые амилоидподобные фибриллы агрегированного А-син служат
основой телец Леви [Conway K.A. et al., 2000] – крупных интранейрональных
цитоплазматических включений, наличие которых рассматривается как
основной патоморфологический признак болезни Паркинсона и других
синуклеопатий. В процессе агрегации А-син образуются промежуточные формы
– олигомеры, обладающие ярко выраженной нейротоксичностью [Conway K.A.
et al., 2000; Volles M.J. et al., 2001; Ding T.T. et al., 2002; Volles M.J., Lansbury P.T.,
2002; Fredenburg R.A. et al., 2007].
Несмотря на большой объем свидетельств того, что гиперпродукция или
модификация структуры А-син запускает цепь внутриклеточных событий,
итогом которых становятся повреждение и гибель дофаминергических
нейронов. Причины, ведущие к спонтанным нарушениям гомеостаза А-син в
7
нейронах ЧС, и последовательность молекулярных событий, вызывающих их
гибель, остаются до конца невыясненными.
Работами последнего десятилетия установлено, что индуцирующие БП
нейродегенеративные изменения в ЧС сопровождаются нейровоспалением,
ключевую роль в котором играют активированные микроглиоциты [Block M.L.
et al., 2007; Gao H.M., Hong J.S., 2008; Hirsch E.C., Hunot S., 2009; Liu B., Hong
J.S., 2003; McGeer P.L., McGeer E.G., 2004; Orr C.F. et al., 2002; Hunot S., Hirsch
E.C., 2003]. Секретируемые активированными микроглиальными клетками
провоспалительные факторы, такие как цитокины (интерлейкин-1, фактор
некроза опухоли-альфа), монооксид азота, простагландины, специфические
протеазы и свободнорадикальные производные кислорода [Hunot S. et al., 1996;
Knott P.G. et al., 2000; Arai T. et al., 2006], могут индуцировать окислительный
стресс в нейронах, ведущий к их повреждению и гибели.
Обнаруженный
ранее
факт,
что
гиперпродуцируемый
или
пострансляционно модифицированный А-син может выводиться нейронами
посредством везикулярного экзоцитоза в межклеточную среду вне областей
синаптических контактов [Lee H.J. et al., 2005; Liu J. et al., 2009] и индуцировать
провоспалительную активацию окружающих микроглиоцитов [Zhang W. et al.,
2005; Klegeris A. et al., 2008], позволяет предположить, что этот белок может
играть ключевую роль в патогенетическом механизме сопряжения процессов
нейровоспаления и нейродегенерации.
Мы полагаем, что в основе БП могут лежать два взаимообусловленных
процесса: индукция глиальными провоспалительными факторами нарушений
метаболизма
А-син
в
ДА
нейронах,
который
помимо
инициации
внутриклеточного нейродегенеративного каскада событий секретируется во
внеклеточную
среду
и
активирует
(или
поддерживает
в
активном
провоспалительном состоянии) микроглиальные клетки.
Таким образом, этот
патофизиологический,
может
самоподдерживающийся
цикл
обеспечить
длительное персистирование воспаления в нервной ткани и, как следствие,
постепенно
прогрессирующую
дегенерацию
ДА
нейронов.
Данное
8
предположение не имеет достаточного экспериментального обоснования и
требует проведения дополнительных исследований, которые позволили бы
подтвердить феномен взаимного усиления процессов провоспалительной
активации микроглиоцитов и дисфункции А-син в дофаминергических
нейронах.
В исследовании такого рода важно учитывать, что в механизмы
нейровоспаления помимо микроглиальных клеток вовлечены и другие
клеточные типы: астроциты, эндотелиоциты и перициты кровеносных сосудов,
а также лимфоциты, мигрирующие в нервную ткань. Для формирования более
полного и многостороннего представления о механизмах сопряжения процессов
нейровоспаления и нейродегенерации необходимо учитывать сложность
характера их взаимодействий между собой.
Вышесказанное легло в основу исследования, для которого была
сформулирована следующая цель: выяснить роль альфа-синуклеина в
молекулярных и клеточных механизмах нейровоспаления и нейродегенерации в
экспериментальных моделях синуклеопатий у крыс.
В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. провести
сравнительный
анализ
влияния
гиперпродукции
альфа-
синуклеина в нейронах черной субстанции крыс, вызванной переносом гена
альфа-синуклеина человека или
крысы при помощи рекомбинантного
аденоассоциированного вируса (рААВ), на дегенерацию дофаминергических
нейронов, интенсивность провоспалительной активации глиальных клеток и
интенсивность миграции в нервную ткань лимфоцитов;
2. исследовать
влияние
интраперитонеально
вводимого
ацетата-
кортикостерона на интенсивность гибели дофаминергических нейронов через 8
недель после введения в черную субстанцию рААВ с геном альфа-синуклеина
человека;
3. изучить влияние альфа-синуклеина, вводимого в область черной
субстанции
крыс,
на
интенсивность
нейродегенеративного процессов;
нейровоспалительного
и
9
4. исследовать
влияние
нейровоспаления,
вызываемого
введением
бактериального липополисахарида в область черной субстанции крыс, на
интенсивность экспрессии альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах и
ультраструктурные изменения в нигростриарной системе мозга.
Положения, выносимые на защиту диссертации
1. Дисфункция
альфа-синуклеина
в
дофаминергических
нейронах
и
нейровоспаление взаимно индуцируют и усиливают друг друга. Повышенная
экспрессия альфа-синуклеина в нейронах черной субстанции крыс, вследствие
введения в эту область мозга рекомбинантного вируса, несущего ген альфасинуклеина,
вызывает
гибель
дофаминергических
нейронов,
провоспалительную активацию микроглиоцитов и астроцитов, сосудистую
реакцию и интенсивную миграцию в нервную ткань лимфоцитов. В то же время
провоспалительная активация микроглиальных клеток под воздействием
бактериального эндотоксина вызывает накопление в дофаминергических
нейронах агрегатов А-син и дегенерацию синапсов в области проекций этих
нейронов - стриатуме. Фармакологическое ингибирование нейровоспаления
вызывает достоверное снижение вектор-индуцированной гибели ДА нейронов,
что свидетельствует о значительном вкладе нейровоспалительного процесса в
скорость протекания нейродегенерации.
2. Различия в аминокислотной последовательности молекул А-син человека
и крысы обусловливают различия в интенсивности нейродегенерации ДА
нейронов, вызываемой векторным переносом в них соответствующих генов.
Гиперэкспрессия в ДА нейронах крыс А-син человека вызывает их более
быструю и более массированную гибель по сравнению с индуцированным
гиперпроизводством А-син крыс. Аминокислотные остатки в локусах А-син
человека, отличающиеся от таковых у крысы, могут быть ответственными за
повышенную токсичность
формируемых в цитоплазме нейронов олигомеров,
индуцирующих повреждение и гибель нейронов.
3. Характер межклеточных взаимодействий в функциональном клеточном
модуле ткани мозга, представленном нейроном и ассоциированным с ним
10
локальным микроокружением (микроглиоциты, астроциты, перициты и
эндотелиоциты
кровеносного
кровеносных
русла)
сосудов,
определяет
лимфоциты,
преобладание
мигрирующие
репаративных
из
или
дегенеративных воздействий на нейроны.
Научная новизна работы
В ходе выполнения работы получены оригинальные данные по
характеристике модельной системы синуклеинопатии у трансгенных крыс,
воспроизводящей основные молекулярные и клеточные механизмы патогенеза
БП. Экспериментально подтверждено, что дисфункция А-син в нейронах и
провоспалительная
обусловливая
активация
микроглиоцитов
существование
замкнутого
усиливают
друг
друга,
самоподдерживающегося
патологического цикла, который может лежать в основе хронического
нейровоспаления и прогрессирующей дегенерации ДА нейронов. Тот факт, что
экзогенный А-син, введенный в область черной субстанции, способен
индуцировать хроническое нейровоспаление, свидетельствует о ключевой роли
этого белка в сопряжении процессов нейровоспаления и нейродегенерации.
Расширено представление о функциональной организации мозга, в основе
которой лежит активность функциональных модулей, представленных как
резидентными
(нейроны,
микроглиоциты,
астроциты,
эндотелиоциты,
перициты), так и транзиторными (лимфоциты) элементами, образующими
интегративное единство за счет позитивных и негативных обратных связей.
Основная функция таких элементарных клеточных систем – поддержание
локального тканевого гомеостаза, под которым понимается не только
обеспечение
эффективной
трофики
нейронов,
сохранение
ионного
и
медиаторного баланса, но и обеспечение нейропротекции в условиях действия
повреждающих факторов. Важными элементами такой гомеостатической
единицы являются элементы врожденного и адаптивного иммунитета,
представленные,
соответственно,
микроглиоцитами
мигрирующими в нервную ткань.
Практическая значимость работы
и
лимфоцитами,
11
Использованная модель трансгенного переноса у крыс воспроизводит
ключевые звенья патогенеза синуклеопатии, лежащей в основе БП: дегенерацию
дофаминергических нейронов, образование цитоплазматических включений,
аналогичных тельцам Леви в сохранившихся нейронах черной субстанции мозга,
и нейровоспаление. Таким образом, данная модель переноса в нейроны крыс гена
А-син
посредством
вектора,
сконструированного
на
основе
аденоассоциированного вируса (ААВ), может рассматриваться как наиболее
адекватная из всех известных моделей для изучения молекулярных и клеточных
механизмов развития болезни Паркинсона и может использоваться для
тестирования потенциальных нейропротекторных препаратов.
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что поиск новых
подходов в формировании нейропротективной терапии болезни Паркинсона
должен рассматривать в качестве терапевтической мишени интегральную
нейроглиососудистую
систему.
патофизиологических
процессов
Ключевым
служит
событием
провоспалительная
инициации
активация
микроглиоцитов, которая, в свою очередь, способна стимулировать астроциты,
перициты и эндотелиоциты, провоцируя тем самым сосудистую реакцию и
миграцию в нервную ткань лимфоцитов. Поскольку в основе хронического
нейровоспаления
и
нейродегенерации
лежит
активность
нескольких
патофизиологических самоподдерживающихся циклов, становится очевидным,
что лечение БП должно базироваться на комплексной терапии, учитывающей
подбор фармакологических агентов для каждого из участников этой системы.
Например, фармакологическое ингибирование активности микроглии должно
сопровождаться
применением
средств,
снижающих
провоспалительную
активность клеточных элементов ГЭБ и индуцирующих синтез астроцитами
ростовых факторов или активирующих регуляторное звено адаптивной
иммунной системы.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на II и III международных
симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и
12
патологии»
(Санкт-Петербург,
2009,
2013),
21-м
и
22-м
съездах
Физиологического общества им. И. П. Павлова (Калуга, 2010; Волгоград 2013),
на 7, 8, 9, 10-м Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука
для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2011, 2012, 2013, 2014),
Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в
науке и образовании» (Москва, 2014), Всероссийской научно-практической
конференции «Инновации в науке, технике и технологиях» (Ижевск, 2014), III
Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и
прикладные науки сегодня» (North Charleston, USA, 2014).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, в том числе 12
статей в периодических изданиях, соответствующих перечню ВАК, и 11 работ в
сборниках материалов докладов научных съездов и конференций.
Структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы,
материалов и методов, обсуждения полученных результатов, заключения,
выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 160 страницах и
иллюстрирована 33 рисунками. Список цитируемой литературы включает 460
наименований.
13
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Роль альфа-синуклеина в патофизиологических механизмах
болезни Паркинсона
1.1.1. Характеристика болезни Паркинсона
Болезнь Паркинсона (БП) – это нейродегенеративное заболевание,
занимающее второе место по частоте после болезни Альцгеймера. В
большинстве популяций мира болезнью Паркинсона страдает не менее 1% всех
лиц старше 50 лет [Polymeropoulos M.H. et al., 1996] и 2-4% старше 65 лет [de Rijk
M.C. et al., 1997]. Важно отметить, что в последние десятилетия наблюдается
рост числа больных БП и снижение возраста дебюта заболевания [Kontakos N.,
Stokes J., 1999].
Заболевание
имеет
неуклонно
прогрессирующее
течение
и
характеризуется классической тетрадой симптомов – низкочастотным тремором
в состоянии покоя, ригидностью скелетных мышц конечностей и лица
(пластический
гипертонус),
пониженной
двигательной
активностью
(брадикинезией) и постуральной неустойчивостью [Fahn S., Sulzer D., 2004].
Нарастающая симптоматика приводит к полной обездвиженности пациентов.
Нейродегенеративные изменения наблюдаются в дофаминэргических нейронах
компактной части черной субстанции и, в меньшей степени, базальных ядрах,
покрышке среднего мозга, голубом ядре. На более поздних стадиях развития
заболевания процессы дегенерации распространяются на кору больших
полушарий [Forno
L.S.,
1996].
По
мере
прогрессирования
болезни
патологические изменения этих структур вызывают манифестацию вторичных
симптомов, таких как депрессия, деменция, различные вегетативные и
сенсорные дисфункции.
Независимо от этиологии, моторные симптомы БП коррелируют с гибелью
дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции среднего
мозга, ведущей к резкому снижению концентрации дофамина в стриатуме
(полосатом теле), и появлением в цитоплазме нейронов черной субстанции,
гипоталамуса, гиппокампа, подкорковых ганглиев эозинофильных включений
14
(телец Леви). Гибель нейронов черной субстанции, а так же присутствие в них
телец Леви – это патоморфологические признаки, отличающие болезнь
Паркинсона от других нейродегенеративных заболеваний.
Основная часть случаев БП, за исключением семейных форм, относится к
категории спорадических, мультифакторных нейродегенеративных заболеваний.
Семейная форма болезни Паркинсона впервые была описана в начале двадцатого
века. В настоящее время положительный семейный анамнез наблюдается у 1015% больных [Nussbaum R.L., Polymeropoulos M.H., 1997]. Выявлено около 12
генов, мутации которых вызывают развитие признаков БП [Литвиненко И.В.,
2010]. Различают аутосомно-доминантный (АД) и аутосомно-рецессивный (АР)
типы наследования моногенных форм БП.
Аутосомно-рецессивная ювенильная форма паркинсонизма обусловлена
дефектами гена паркина (локус PARK2) на шестой хромосоме человека в
позиции 6q25.2-q27 [Matsumine H. et al., 1997]. Аутосомно-рецессивная форма
паркинсонизма вызывается дефектами гена DJ-1 (локус PARK7 на 1 хромосоме
человека в позиции 1p36) [Van Duijn C.M. et al., 2001].
Аутосомно-доминантная форма паркинсонизма обусловлена точечной
мутацией в 93 кодоне (ile-met) в гене убиквитин-С-концевой гидролазы L1
(UCH-L1) [Leroy E. et al, 1998; Lincoln S. еt al., 1999], которая является
компонентом телец Леви. Данный фермент участвует в протеолизе белков, а
мутация, нарушая этот процесс, приводит к агрегации протеинов.
1.1.2. Болезнь Паркинсона и мутации в гене aльфа-синуклеина
В 1997 г были публикованы результаты молекулярно-генетического
исследования нескольких семей со специфической аутосомно-доминантной
наследуемой формой болезни Паркинсона, характеризующейся появлением
клинических симптомов в относительно раннем возрасте (от 33-58 лет)
[Polymeropoulos M.H. et al., 1997]. Предыдущий медико-генетический анализ
этих семей показал высокую степень пенетрантности (около 85%), что
свидетельствовало о вероятном моногенном характере наследуемого дефекта.
Был выявлен генетический маркер в области 4q21-q23, сегрегирующий с
15
фенотипическим проявлением заболевания [Nussbaum R.L., Polymeropoulos
M.H., 1997]. Еще более детальный анализ рекомбинаций дополнительных
генетических маркеров в одной из итальянских семей позволил сузить
вероятный локус БП до 6 сМ. YAC-клоны, перекрывающие данный локус,
содержали в том числе и ген, кодирующий альфа-синуклеин (А-син).
Анализ первичной структуры этого гена у страдающих БП и здоровых
членов итальянской семьи показал миссенс-мутацию – точечную нуклеотидную
замену в четвертом экзоне (G209A), приводящую к замене аланина на треонин в
положении 53 кодируемого белка (A53T). Мутация G209A была обнаружена еще
в трех греческих семьях с наследуемой "ранней" формой PD и вновь только у
больных индивидуумов. Ни среди больных спонтанной, ненаследуемой формой
БП, ни среди здоровых людей из тех же средиземноморских популяций, что и
исследованные семьи, такая мутация не обнаружена. Было показано, что
мутантный аллель транскрипционно активен, что предполагает продукцию
мутантного А53Т А-син в нейронах больных данной формой PD [Polymeropoulos
M.H. et al, 1997]. Таким образом, впервые и чрезвычайно убедительно была
показана связь точечной мутации определенного белка с одним из наиболее
распространенных нейродегенеративных заболеваний.
Позднее в гене А-син были обнаружены еще две миссенс мутации - А30Р
в семье из Германии [Krüger R. et al, 1998] и E46K в испанской семье [Zarranz J.J.
et al., 2004]. Но в целом, точечные мутации в гене А-син, как причина болезни
Пакинсона, встречаются крайне редко (в настоящее время описано не более 15
семей с БП, ассоциированной с точечными мутациями SNCA), и в ряде
исследований скрининг большого числа больных с ранней семейной формой
болезни Паркинсона не выявил патогенетически значимых мутаций [Chance P.F.
et al., 1998; Parsian A. et al., 1998; Warner T.T., Schapira A.H., 1998; Vaughan J. et
al., 1998].
Более распространенными среди пациентов с наследственной формой БП
оказались мультипликации гена SNCA, приводящие к развитию аутосомнодоминантной формы заболевания [Singleton A.B. et al., 2003; Farrer M. et al.,
16
2004]. Интересно отметить различия в клинической картине заболевания у
пациентов с дупликацией и трипликацией гена SNCA. Тяжесть заболевания
коррелирует с числом копий гена: у пациентов с дупликацией гена SNCA начало
заболевания приходилось на возраст старше 40 лет и не отличалось от
идиопатической БП [Ibáñez P. et al., 2009]. При наличии трипликации гена SNCA
наблюдается раннее начало БП (до 40 лет) и нередкое развитие более тяжелого
фенотипа
деменции
с
тельцами
Леви.
Мультипликации
гена
SNCA
обнаруживаются у 1,5% пациентов с семейной формой БП [Ibáñez P. et al., 2009;
Nishioka K. et al., 2006].
У пациентов с БП, обусловленной мультипликацией SNCA, в нейронах
черной субстанции наблюдалось повышение уровня мРНК гена SNCA и
увеличение количества растворимого альфа-синуклеина, а также образование
агрегатов этого белка [Chartier-Harlin M.C. et al., 2004; Ahn T.B. et al. 2008].
Аллельные варианты промоторной области гена SNCA, ассоциированные с
повышенной экспрессией гена, повышают риск развития БП [Fuchs J. et al., 2008].
Более того, три независимых исследования по полногеномному сканированию
выявили ассоциацию локуса, содержащего ген SNCA, с повышенным риском БП
[Pankratz N. et al., 2009; Qing H. et al., 2009; Simón-Sánchez J. et al., 2009].
1.1.3. Биохимическая структура и функции альфа-синуклеина
Альфа-синуклеин
(А-син)
–
небольшой
нейрональный
белок,
обнаруживаемый, в основном, в пресинаптических терминалях [Пчелина С.Н.,
2011]. Повышенная экспрессия этого белка отмечена в неокортексе, гиппокампе
и черной субстанции [Cookson M.R., van der Brug M., 2008]. Вместе с тем А-син
обнаруживается и в других клетках головного мозга – астроцитах и
олигодендроглиоцитах. Количество А-син составляет около 1% от общего пула
растворимого белка мозга [Пчелина С.Н., 2011].
Ген, кодирующий белок А-син (SNCA), расположен на четвертой
хромосоме (локус 4q21) и состоит из шести экзонов, пять из которых
транскрибируются. В результате альтернативного сплайсинга образуются три
17
изоформы белка (140 аминокислот, 126 аминокислот и 112 аминокислот), из
которых 140-изоформа является основной [Davidson W.S. et al., 1998].
Первоначально белок, получивший позже название альфа-синуклеин, был
выявлен в электрическом органе ската при скринировании синаптических белков
[Maroteaux L. et al., 1988]. А-син у человека впервые был выделен из амилоидных
скоплений лобной зоны коры людей с типичными клиническими и
нейропатологическими проявлениями болезни Альцгеймера [Ueda K. et al.,
1993]. Позднее было обнаружено, что А-син является основным компонентом
телец Леви при БП [Spillantini M.G. et al., 1997].
Основная изоформа А-син (140 аминокислот, 19 кДа) состоит из
аминоконцевой
области,
содержащей
несколько
повторяющихся
последовательностей аминокислот (KTKEGV), гидрофобной центральной
области, известной как неамилоидный компонент (non-amyloid component,
NAC), и отрицательно заряженной кислой C-концевой области [Bisaglia M., et al.,
2009; Greggio E. et al., 2011]. В C-концевой области располагаются несколько
сайтов фосфорилирования (Tyr-125, -133, -136 и Ser-129), а также домен,
отвечающий за шаперонную активность альфа-синуклеина (основания 125–140).
N-концевая область имеет большое сходство с липид-связывающим доменом
аполипопротеинов, свидетельствуя о том, что альфа-синуклеин может
взаимодействовать с липидным слоем мембран. Показано его взаимодействие с
везикулярной мембраной, содержащей фосфолипиды [Davidson W.S. et al., 1998].
Считается, что небольшая центральная часть (NAC) ответственна за его
фибриллизацию, в то время как C-концевой участок (основания 96–140)
ингибирует образование фибрилл [Giasson B.I. et al., 2001].
Предполагается, что в клетке А-син существует в двух равновесных
состояниях – в нативной и мембрансвязанной формах. В нативной форме он
представляет собой растворимый несвернутый белок, который обладает слабо
упорядоченной или совсем неупорядоченной структурой с отсутствием
определенной пространственной организации. Связывание А-син с мембранами
18
сопровождается конформационным переходом в альфа-спираль [Bisaglia M. et
al., 2009].
Точная функция А-син до конца не выявлена, хотя показано, что этот белок
играет роль молекулярного шаперона и регулирует процесс белок-белковых и
белок-липидных взаимодействий [Kim T.D. et al., 2000]. В число белковпартнеров А-син входят тубулин, тау-белок, синфилин-1, нефосфорилированная
форма тирозингидроксилазы, белок 14-3-3 и связывающиеся с ним белки [Ma
Q.L. et al., 2003].
Локализация А-син в пресинаптических терминалях и его способность
взаимодействовать с мембранами предполагает его участие в регуляции
везикулярного нейронального транспорта. Выявленное у нокаутных по гену
SNCA мышей истощение везикулярного пула в гиппокампальных синапсах
позволило предположить вовлеченность А-син в поддержание резерва
пресинаптического везикулярного пула [Cabin D.E. et al., 2002].
Показано также, что А-син способен влиять на внутриклеточное
содержание
дофамина
путем
прямого
взаимодействия
с
белками,
регулирующими его синтез и обратный захват. Регулируя количество
дофаминового транспортера в плазматической мембране, А-син может
выступать в роли регулятора дофаминовой токсичности путем контроля
выходящего и входящего в клетку дофамина [Kruger R. et al., 1998]. Кроме того,
А-син может влиять на синтез дофамина, являясь ингибитором скоростьлимитирующего фермента синтеза дофамина – тирозингидроксилазы [Perez R. et
al., 2002]. Интересно, что гиперэкспрессия А-син у трансгенных мышей
приводит к снижению выброса дофамина и синаптической дисфункции [Nemani
V.M. et al., 2010].
Изменение структуры А-син в результате миссенс мутаций или увеличение
содержания нормального А-син в клетке при трипликации приводит к
формированию содержащих этот белок протофибрилл, из которых в свою
очередь образуются тельца Леви [Ibanez P. et al., 2004; Yu S. et al., 2005; Farrer
M.J., 2006].
19
1.1.4. Агрегация альфа-синуклеина и нейродегенерация
А-син
относится
к
белкам,
способным
к
агрегации.
Причины,
инициирующие этот процесс остаются до конца не изученными. Сообщается, что
одной из таковых может быть митохондриальная дисфункция, свойственная
болезни Паркинсона [Судаков Н.П. и др., 2010; Бунеева О.А., Медведев А.Е.,
2011]. Вместе с тем, повышение концентрации А-син в растворе может вызвать
образование фибрилл и дискретных сферических структур, подобных тем,
которые присутствуют в тельцах Леви [Conway K.A. et al., 1998].
Как отмечалось выше, мультипликации нормальной последовательности
гена SNCA, приводящей к увеличению внутриклеточного уровня альфасинуклеина, достаточно для развития БП. Возраст начала и тяжесть заболевания
коррелируют с количеством копий гена [Singleton A.B. et al., 2003]. Фибриллы
А-син являются основным ультраструктурным компонентом не только телец
Леви при БП, ассоциированной с мультипликацией SNCA, но также при
спорадической БП и при других синуклеопатиях. В частности, данные белковые
агрегаты были выявлены в тельцах Леви, обнаруживаемых в нейронах пациентов
с деменцией с тельцами Леви и в глиальных цитоплазматических включениях,
которые формируются в олигодендроцитах у пациентов с множественной
системной атрофией [Cookson M.R., van der Brug M., 2008].
Убедительным доказательством нейротоксичности альфа-синуклеина
стало создание трансгенных животных (дрозофила, мышь) на основе
гиперэкспрессии гена SNCA человека, демонстрирующих нейрональные альфасинуклеин-позитивные включения и дегенерацию дофаминергических нейронов
мозга [Feany M.B., Bender W.W., 2000; Masliah E. et al., 2000]. Нейротоксичность
агрегатов А-син была также многократно продемонстрирована in vitro [Bisaglia
M. et al., 2010; Waxman E.A., Giasson B.I., 2010]. Способность А-син к
формированию фибрилл in vitro, напоминающих фибриллы, наблюдаемые в
тельцах Леви, а также тот факт, что мутация А53Т ускоряет образование
фибрилл [Conway K.A. et al., 1998], свидетельствует о том, что полимеризация
А-син может быть непосредственно связана с патогенезом БП. Несмотря на
20
множество данных, указывающих на патогенную роль фибриллярного А-син в
клетке, механизмы токсичности фибрилл остаются неизвестными. В настоящее
время доминирует гипотеза о том, что токсичны не сами фибриллы А-син, а
некие интермедиаты, образующиеся в процессе их формирования, называемые
протофибриллами.
Протофибриллы – небольшие олигомеры, которые содержат β-складчатую
структуру. Всего in vitro наблюдалось несколько видов протофибрилл:
протофибриллы
сферической
либо
кольцеподобной
структуры
и
протофибриллы трубочек [Waxman E.A., Giasson B.I., 2010]. Интересно, что
посттрансляционные модификации А-син (окисление, фосфорилирование,
нитрозилирование) влияют на его способность к агрегации [Cookson M.R., van
der Brug M., 2008]. Показано, что большая часть А-син, входящего в состав телец
Леви, фосфорилирована в положении Ser129 [Anderson J. et al., 2006].
Механизмы нейротоксичности протофибрилл альфа-синуклеина неясны.
Имеется предположение, что протофибриллы могут формировать поры,
способные к встраиванию в мембрану органелл и транспортных везикул,
вследствие чего меняется их проницаемость и клеточный гомеостаз. Целый ряд
теоретических
дегенерируют
моделей
предполагает, что дофаминергические нейроны
вследствие
окислительного
стресса,
вызываемого
высвобождением дофамина в цитоплазму [Lotharius J., Brundin P., 2002a;
Cookson M.R., van der Brug M., 2008]. Получены экспериментальные
подтверждения того, что альфа-синуклеин повышает цитоплазматическую
концентрацию дофамина [Mosharov E.V. et al., 2006]. При нейтральном рН
дофамин быстро окисляется с образованием хинонов, супероксид-радикалов и
перекиси
водорода.
Супероксид-радикалы
преобразуются
супероксиддисмутазой в перекись водорода, которая, в свою очередь, может
генерировать реактивные формы кислорода (РФК) посредством реакций,
катализируемых железом. Важно отметить, что концентрации железа в черной
субстанции относительно выше, чем в других областях мозга. Несколько групп
исследователей показали, что негативные эффекты цитоплазматического
21
дофамина, образующегося при окислении супероксид анионов и перекиси
водорода [Hastings T.G. et al., 1996; Lotharius J., Brundin P., 2002b; Cookson M.R.,
van der Brug M., 2008], нивелируются клеточными механизмами нейтрализации
РФК (реактивных форм кислорода). Система ферментов, нейтрализующих РФК
в дофаминэргических нейронах представлена, в основном, митохондриальной и
цитоплазматической супероксиддисмутазами, которые преобразуют супероксид
в перекись водорода, а также каталазой и глутатион пероксидазой,
конвертирующих перекись до кислорода и воды.
Супероксиды могут также конвертировать дофамин в ортохинон, который,
взаимодействуя с синуклеином, формирует производные дофамина [Lotharius J.,
Brundin P., 2002b], способствующие преобразованию протофибрилл синуклеина
в кольцевые структуры и предотвращающие образование полимерных фибрилл
[Conway K.A. et al., 2001; Cappai R., 2005; Norris E.H. et al., 2005; Mazzulli J.R. et
al., 2006; Mazzulli J.R. et al., 2007]. Высказано предположение, что эти
протофибриллы могут быть токсичными и способными вызывать дегенерацию
ДА нейронов [Conway K.A. et al., 2001]. Тот факт, что А30Р мутанты имеют
низкий уровень формирования фибрилл по сравнению с нативным А-син, но
более высокий уровень образования протофибрилл (как и в случае с другими
мутантами, ассоциированными с болезнью Паркинсона), лег в основу
представления о протофибрилльных кольцах синуклеина, повышающих
проницаемость стенки везикул с дофамином, который выходит в цитоплазму и
вызывает окислительный стресс [Conway K.A. et al., 2000; Volles M.J. et al., 2001;
Ding T.T. et al., 2002; Volles M.J., Lansbury P.T., 2002; Fredenburg R.A. et al., 2007].
Эта модель предполагает, что образование фибрилл и телец Леви, фактически
является протективным механизмом, который связывает в нерастворимую
форму более токсичные растворимые олигомеры [Volles M.J. et al., 2003].
А-син встраивается в стенку синаптических пузырьков, и получены
убедительные доказательства того, что он регулирует объем везикулярного пула
(депонированных везикул) и прямо вовлекается в процессы экзоцитоза и
эндоцитоза [Lotharius J., Brundin P., 2002a; Cookson M.R., van der Brug M., 2008].
22
У PC12 и хромаффинных клеток, гиперэкспрессирующих нормальный и A30P
альфа-синуклеин, снижена частота экзоцитоза и объем выводимого дофамина
[Larsen K.E. et al., 2006]. Добавление в культуру нейронов гиппокампа антител к
А-син редуцирует количество синаптических пузырьков и экспрессию
синапсина. Такие же изменения описаны у мышей, нокаутных по гену А-син
[Murphy D.D., 2000; Cabin D.E., 2002].
Повышенная экспрессия А-син в культивируемых клетках снижает
уровень дофаминового транспортера (DAT), связанного с мембранами и
повышает DAT ассоциированный с микротрубочками [Wersinger C., Sidhu A.,
2005]. Было показано, что А-син прямо связывается с дофаминовым
транспортером [Lee F.J., et al., 2001; Wersinger C., Sidhu A., 2005], а он, в свою
очередь, взаимодействует с синтаксином (Stx1A) [Lee K.H. et al., 2004b]. Кроме
того, септин 4 (Sept4) – мембранный белок, взаимодействующий с дофаминовым
транспортером и синтаксином, так же взаимодействует с альфа-синуклеином.
Экспрессия А53Т мутантных молекул у нокаутных по гену синтаксина мышей
значительно повышает токсичность этого нокаута [Ihara M. et al., 2003]. Кроме
того, взаимодействие с DAT вовлекает А-син в процесс эндоцитоза. Показано,
что стимуляция мускариновых рецепторов ведет к переходу А-син из
цитоплазматической мембраны в мембрану цитоплазматических везикул.
Повышенная экспрессия А-син снижает уровнь везикулярного моноаминового
транспортера, который является первичным белком, транспортирующим
цитоплазматический дофамин внутрь везикул [Lotharius J. et al., 2002].
Экспрессия мутантных форм А-син вызывает стресс эндоплазматической сети и
нарушение метаболизма белков, вовлеченных в формирование везикул (Rab1,
Rab8A, Rab3A) [Cooper A.A. et al., 2006; Gitler A.D. et al., 2008].
Таким образом, А-син вовлекается в процессы везикулярного транспорта,
экзоцитоза или образования везикул (как с участием комплекса Гольджи, так и
цитоплазматической мембраны). Нарушение любого из этих процессов, в
конечном итоге, меняет гомеостаз дофамина и может повысить его
концентрацию в цитоплазме нейронов.
23
Последние данные указывают на прионоподобные свойства А-син [Luk
K.C. et al., 2009]. Показана способность А-син и его агрегатов к секреции с
последующим захватом соседними клетками. Предполагается, что экзогенный
фибриллярный А-син может в дальнейшем служить центром агрегации
растворимого мономерного белка [Waxman E.A., Giasson B.I., 2010]. В сумме
приведенные
данные
подтверждают
гипотезу
о
нейротоксичности
фибриллярных форм А-син и их роли в патогенезе БП, однако точный механизм
нейродегенерации остается до конца невыясненным.
Помимо данных о внутриклеточных механизмах нейродегенерации, в
которые может быть вовлечен избыточный А-син, накапливаются данные о
способности этого белка индуцировать нейровоспаление, усиливающее процесс
нейродегенерации.
1.2. Клеточные механизмы нейровоспаления
1.2.1. Отличительные признаки нейровоспаления
Воспаление – это возникшая в ходе эволюции универсальная реакция
тканей организма на повреждения, гипоксию или метаболический стресс, в
которой имеет место сочетание как патологических, так и защитнофизиологических
реакций
[Черешнев
В.А.
и
др.,
2010].
Воспаление,
возникающее в какой-либо области организма, – это, как правило, местный
процесс, характеризующийся определенными локальными признаками: tumor
(отек), rubor (краснота), kalor (повышение температуры), dolor et functio lesae
(боль и нарушение функции) [Черешнев В.А. и др., 2011]. Многочисленными
клиническими
наблюдениями
последних
десятилетий
выявлены
принципиальные особенности этого типового патологического процесса:
стереотипность
(запрограммированность
типических
проявлений
вне
зависимости от этиологии и органной локализации), аутохтонность (способность
к развитию независимо от продолжения действия его причинного фактора),
универсальность
(представительство
в
разных
органах
и
тканях),
самоограничение (за счет активации механизмов угнетения продукции, секреции
и активности флогогенных факторов), фазовое развитие (последовательное
24
прохождение через характерные патофизиологические стадии) [Черешнев В.А.,
Юшков Б.Г., 2001].
Биологическая роль воспаления заключается в концентрации защитных
клеток и растворимых факторов в зоне повреждения, в блокировании и
ликвидации
там
биологически
агрессивного
материала,
а
также
в
восстановлении структуры и функции поврежденной ткани. Основу воспаления
составляет
сосудисто-мезенхимальная
множественностью
и
разнообразием
реакция,
характеризующаяся
участников,
включая
клетки
мезенхимального происхождения (эндотелиоциты, гладкомышечные клетки
сосудов,
тучные
моноциты/макрофаги,
клетки,
тромбоциты,
лимфоциты,
эозинофилы,
фибробласты),
а
также
нейтрофилы,
локальные
(эйкозаноиды, цитокины, биогенные амины и др.) и циркулирующие (системы
комплимента, гемокоагуляции, каллекреин-кининовая и др.) медиаторы
процесса [Доценко В.Л., 2002; Черешнев В.А., 2005; Кулинский В.И., 2007].
По динамике развития воспаления выделяют несколько последовательных
стадий.
Тканевая
альтерация
инициирует
реакцию
тучных
клеток,
эндотелиальных клеток и системы гемостаза, что в течение нескольких минут
провоцирует развитие экссудативно-сосудистой реакции. При бактериальном
инфицировании вслед за этим начинается миграция и активация нейтрофилов,
сопровождаемая активацией системы комплимента, синтезом белков острой
фазы и некоторых сывороточных факторов. На пике нейтрофилзависимой фазы
начинается миграция мононуклеаров – моноцитов – и лимфоцитов, которые
вскоре становятся доминирующими клеточными элементами инфильтрата. Эта
стадия завершается окончательной стерилизацией очага воспаления, его
очисткой от продуктов тканевого распада. На этой же стадии развиваются
репаративные процессы, а на завершающей – приобретают доминирующее
значение. Вслед за этим в очаг воспаления мигрируют фибробласты, где они
пролиферируют и начинают формировать коллагеновые волокна и другие
составляющие экстраклеточного матрикса. Эта стадия завершается полной
25
регенерацией или рубцеванием поврежденной ткани [Доценко В.Л., 2002;
Черешнев В.А., 2005; Кулинский В.И., 2007].
Мозг, наряду с некоторыми областями организма (передняя камера глаза,
семенник), значительно отличается от других органов и тканей механизмами
воспаления и составом клеточных участников [Harris J.P., Ryan A.F., 1995]. В
силу того, что в них не проявляются классические признаки воспаления и не
обнаруживаются вышеописанные стадии его развития, принято считать их
«иммунопривилегированными»
Иммунопривилегированность
областями
центральной
нервной
организма.
системы
достигается
особым строением гематоэнцефалического барьера, в норме ограничивающего
миграцию иммунокомпетентных клеток [Pachter J.S. et al., 2003], и
иммуносупрессивным клеточным микроокружением [Streilein J.W., 1993; Galea
I. et al., 2007; Saas P., et al., 1997]. Биологический смысл ограничения действия
«классических» воспалительных механизмов в ткани мозга определяется
высокой чувствительностью нервных клеток к повреждающему действию
гуморальных и клеточных воспалительных факторов, что может вызвать потерю
мозгом регуляторных и интегративных функций.
Вместе с тем, в нервной ткани защитная реакция в виде воспаления
сохраняется, но она приобретает уникальные черты, поскольку осуществляется
отличным от «классического» репертуаром клеток и спектром растворимых
факторов. Клеточными участниками нейровоспаления являются глиальные
клетки, клеточные элементы сосудистой стенки (эндотелиоциты и перициты), а
также мигрирующие в область воспаления лимфоциты. Морфофункциональная
характеристика этих клеток и роль, которую они играют в механизмах
воспалительного процесса, описана в последующих разделах главы.
1.2.2. Микроглиоциты как ключевой участник нейровоспалительного
процесса
Ключевую роль в нейровоспалении играют микроглиальные клетки.
Микроглиоциты, составляющие около 10-20% всех глиальных клеток,
образованы из костномозговых предшественников и представляют в нервной
26
ткани первую линию иммунной защиты. В физиологических условиях эти
клетки имеют длинные разветвленные отростки и участвуют в процессах,
обеспечивающих нормальное функционирование нейронов в ЦНС [Nimmerjahn
А. et al., 2005]. Однако под воздействием активирующих субстратов, таких как
клеточные некротические факторы, липополисахарид или провоспалительные
цитокины, микроглиоциты немедленно активируются [Davalos, D., J. et al., 2005].
В ходе активации они быстро пролиферируют и меняют свой фенотип: из клеток
с небольшими клеточными телами и тонкими отростками они превращаются в
клетки с большим объемом сомы и утолщенными и короткими амебоидными
отростками [Пискунов А. К., 2010].
Активированные
микроглиоциты
продуцируют
целый
спектр
провоспалительных факторов, включая монооксид азота (NO) [Hemmer K. et al.,
2001; Iravani M.M. et al., 2002; Liu B. et al., 2002], фактор некроза опухоли альфа
(TNF-α) [Gayle D.A. et al., 2002], интерлейкин-1 бета (IL-1β) [Depino A.M. et al.,
2003], простагландин Е2 (PGE2) [Wang T. et al., 2004] и реактивные формы
кислорода (РФК) [Qin L. et al., 2004]. Гиперпродукция активированными
микроглиоцитами провоспалительных факторов может вызывать гибель
нейронов [Merrill J.E., Benveniste E.N., 1996; Jeohn G.H. et al., 1998].
Кроме того, активированные микроглиальные клетки характеризуются
экспрессией таких маркеров иммунных клеток, как молекулы главного
комплекса гистосовместимости (МНС) и кластеры дифференцировки Т- и Влимфоцитов (CD), обеспечивающих им свойства антигенпрезентирующих
клеток [Wang J. et al., 2002; Chavarria A., Alcocer-Varela J., 2004]. Вместе с тем,
они демонстрируют и способность к секреции ростовых факторов, облегчая тем
самым восстановление тканевого гомеостаза [Kreutzberg G.W., 1996]. Также
обнаружено, что IL-1β микроглиального происхождения оказывает не только
повреждающий эффект. Так было показано, что он способен индуцировать
синтез в Т-клетках IL-10 и ингибировать тем самым провоспалительный ответ
Th1 лимфоцитов [Hebel K. et al., 2011]. Становится очевидным, что профиль
27
цитокинов, синтезируемых микроглиальными клетками и конечный эффект,
оказываемый на нейроны, зависят от степени их активации.
Развитие
воспалительного
процесса
в
нервной
системе,
сопровождающегося нейродегенерацией, в значительной степени усиливается
при периферийных инфекциях грамположительными микроорганизмами,
составной
частью
клеточных
стенок
которых
является
эндотоксин
(липополисахарид, ЛПС) [Cunningham С. et al., 2005]. В распознавании ЛПС
ведущую
роль
играет
молекулярный
комплекс
CD14
(гликозилфосфатидилинозитол - связывающий белок) на плазматической
мембране. Комплекс ЛПС-CD14 транспортируется к Толл-подобному (Toll-like)
рецептору TLR4 с последующей олигомеризацией и запуском сигнального пути,
активирующего ядерный транскрипционный фактор-каппа В (NF-kВ), который,
в свою очередь, вовлечен в стимуляцию синтеза провоспалительных цитокинов
[Laflamme N., Rivest S., 2001; Caso J.R. et al., 2007].
Нарастающее
количество
свидетельств
о
вовлеченности
TLR,
активируемых бактериальными эндотоксинами, в формирование основных
нейродегенеративных заболеваний [Walter S. et al., 2007; Panaro M.A. et al., 2008]
позволяет рассматривать TLR - терапию в качестве возможного подхода к их
коррекции [Parkinson T., 2008; Zeng K.W. et al., 2012].
Показательно, что ингибирование микроглиальной активации [Delgado M.,
Ganea D., 2003] или блокада синтеза в них провоспалительного цитокина TNF-α
[Tran T.A. et al., 2008] уменьшает потерю дофаминергических нейронов,
оказывая, таким образом, нейропротективный эффект.
Помимо того, что микроглиоциты могут активироваться под воздействием
травм, токсинов, бактериальных эндотоксинов, в последнее время появились
сообщения о выраженном стимулирующем эффекте, которое оказывает на них
альфа-синуклеин [Lee S.B. et al., 2009]. Внеклеточные агрегированные формы
альфа-синуклеина активируют микроглиоциты, что ведет к обострению
процесса дегенерации дофаминергических нейронов [Zhang W. et al., 2005].
1.2.3. Роль астроцитов в нейровоспалении
28
Астроциты – наиболее часто встречающиеся в ЦНС клетки – составляют
порядка 50% от количества всех клеток ЦНС. Они обеспечивают структурную,
метаболическую
и
трофическую
поддержку
нейронов,
стабилизируя
микроокружение и синтезируя трофические факторы [Benarroch, E. E., 2005]. Эти
звездчатые по форме клетки имеют клеточные тела диаметром примерно 15-17
мкм и длинные отростки, ориентированные во всех направлениях. Отростки
различных клеток образуют друг с другом щелевые контакты, формируя
трехмерную астроцитарную сеть [Blomstrand F. et al., 1999; Guthrie P.B. et al.,
1999], которая поддерживает нейрональный гомеостаз, поглощая избыток
нейротрансмиттеров и поддерживая содержание ионов во внеклеточной среде
мозга [Verkhratsky A., Steinhäuser C., 2000]. Принято считать, что активность
астроцитов зеркально отражает метаболическую активность нейронов [Haydon
P. G., Carmignoto G., 2006].
Мембраны астроцитов содержат рецепторы и транспортеры для
многочисленных
нейромедиаторов,
что
обусловливает
их
способность
отслеживать и регулировать образование, стабильность и эффективное
функционирование синапсов. Так, они регулируют синаптическую передачу в
ответ на действие сигнальных молекул, таких как АТФ и глутамат,
высвобождаемых из пресинаптического нейрона в ходе синаптической
трансмиссии. Астроциты захватывают глутамат из синаптической щели
посредством мембранных транспортеров или, наоборот, секретируют его через
транспортеры,
актвируемые
вследствие
повышения
концентрации
внутриклеточного Na+. Другие субстанции, такие как d-серин, усиливают
синаптическую передачу, активируя рецепторы NMDA на постсинаптической
мембране, или редуцируют ее, секретируя трансмиттер-связывающие белки
(TBP) [Fields R.D., Stevens-Graham B., 2002].
Астроцитарные отростки окружают синапсы и образуют контакты с
капиллярами. Таким образом, астроциты служат в качестве опосредующих
элементов
между
всеми
видами
клеток
ЦНС,
олигодендроциты, микроглиоциты, эндотелиоциты.
включая
нейроны,
29
Нарушение функций астроцитов характерно для многих неврологических
заболеваний, таких как эпилепсия, амиотрофический латералный склероз,
гепатическая энцефалопатия, инсульт, фокальная церебральная ишемия [Seifert
G. et al., 2006]. Дисфункция часто сопровождается астроцитарной гипертрофией
и повышением количества астроцитов и астроцитарных отростков – комплексом
изменений, называемых астроглиозом [Strömberg I. et al., 1986]. Аналогичные
признаки активации астроцитов обнаруживаются в мозге больных болезнями
Альцгеймера [Xia M.Q. et al., 2000] и Паркинсона [Hirsch E.C. et al., 2003] так же,
как в мозге животных c экспериментальной моделью болезни Паркинсона
[Henning J. et al., 2008].
Выраженный астроглиоз описан в постсмертных пробах мозга пациентов,
страдавших БП [Strömberg I. et al., 1986; Teismann P., Schulz J.B., 2004]. В этих
тканях практически отсутствовали нейротрофины, продуцируемые астроцитами
в норме [Nagatsu T. et al., 2000; Chauhan N.B. et al., 2001]. Основываясь на данных,
полученных in vitro, о том, что астроциты поддерживают и защищают ДА
нейроны [Mena M.A., García de Yébenes J., 2008], логично полагать, что
функциональные нарушения этих клеток вносят существенный вклад в
патологию ЦНС.
Активация астроцитов сопровождается повышением внутриклеточного
кальция (Ca2+). Далее астроциты передают друг другу сигнальную волну
кальция, в результате чего уровень его в соседних клетках повышается [Haydon
P.G., Carmignoto G., 2006]. Кальций связывается с различными молекулярными
мишенями, инициируя или усиливая активность внутриклеточных сигнальных
путей, включая кальций-зависимые фосфолипазы, такие как фосфолипаза С
(PLC) и фосфолипаза А2 (PLA2), и последующие кальций-зависимые элементы
(например, фосфатазы и протеинкиназы), которые, в конечном итоге,
инициируют быструю подвижность и морфологические изменения астроцитов
[Scemes E., 2000]. Кроме того, волны кальция могут также распространяться в
окружающие микроглиоциты [Schipke C.G. et al., 2002].
30
Астроциты участвуют во многих ключевых физиологических процессах,
идущих в головном мозге, в том числе в поддержке глутаматергического
баланса, энергетическом обмене и контроле кровотока. При повреждениях или
травмах головного мозга они секретируют нейротропные факторы, такие как
трансформирующий ростовой фактор-бета (TGF-β) и фактор роста нервов
(NGF).
Эти факторы необходимы для восстановления, пролиферации и
заполнения
глиальным
рубцом
пространства,
которое
не
замещается
регенерирующими клетками [Escartin C., Bonvento G., 2008].
Вместе
с
тем,
астроциты
могут
функционировать
как
иммунокомпетентные клетки [Dong Y., Benveniste E.N., 2001]. В исследованиях
in vitro и in vivo продемонстрирована способность астроцитарной глии
производить целый спектр цитокинов и хемокинов, что обусловливает, по
мнению ряда исследователей, ее важную роль в инициации и развитии
нейровоспалительного процесса, лежащего в основе болезни Альцгеймера и
множественного склероза [Aloisi F. et al., 2000].
На астроцитах больных БП наблюдается повышение уровня экспрессии
межклеточной адгезионной молекулы-1 (ICAM-1), что коррелирует с высокой
экспрессией на поверхности микроглиоцитов соответствующих рецепторов –
антигена, ассоциированного с лимфоцитарной функцией 1 (LFA-1) и Mac-1
(CD11b, CR3). Такая же комбинация молекул экспрессируется в ЧС обезьян,
обработанных МРТР [Miklossy J. et al., 2006]. Возможное объяснение этим
наблюдениям может заключаться в предположении, что ICAM-1-LFA-1 система
ответственна за сохранение воспаления в ЧС и что это воспаление, в свою
очередь, ведет к дегенерации дофаминергических нейронов.
ЛПС способен индуцировать продукцию TNF-α, IL-6 и IL-1 в
микроглиоцитах, но не в астроцитах. Вместе с тем астроциты инициируют синтез
TNF-α и IL-6 под воздействием IL-1, продуцируемого микроглиоцитами [Lee
S.C. et al., 1993].
ЛПС, в зависимости от дозы и длительности действия, может
индуцировать экспрессию в астроцитах как провоспалительных (индуцибильная
31
нитроксидсинтаза (iNOS), фактор некроза опухолей (TNF-α) [Freyer D. et al.,
1996], так и нейропротективных факторов (ростовой фактор глиального
происхождения, GDNF) [Appel E. et al., 1997) и IL-6 [Li X.Z. et al., 2009]. IL-6
при высоких уровнях продукции усиливает воспалительную реакцию и может
быть нейротоксичным [Gadient R.A., Otten U.H., 1997; Wang J. et al., 2002] через
активацию Jak2/Stat1 сигнального внутриклеточного пути, который опосредует
проапоптозное действие провоспалительных цитокинов [Gorina, R.P. et al., 2005].
В экспериментах in vitro обнаружено, что в ответ на воздействие
эндотоксина астроциты интенсифицируют продукцию не только перекиси
водорода, монооксида азота, но и глутамата, т.е. они могут быть вовлечены в
патофизиологические
механизмы
как
окислительного
стресса,
так
и
эксайтотоксичности [McNaught K.S., Jenner P., 2000].
Важно отметить феномен реактивности астроцитов на синтезируемые
микроглиоцитами цитокины. Среди них интерлейкин-1 (IL-1) рассматривается
как ключевой медиатор в системе цитокинового сигнализирования не только изза быстрой секреции в патологических условиях, но и из-за его способности
индуцировать синтез других воспалительных цитокинов, таких как интерлейкин6 (IL-6) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) [John G.R. et al., 2005].
IL-1, производимый в ЦНС, тесно связан с патогенезом различных
заболеваний [Griffin W.S., 2006]. В модели мозговой травмы (повреждение
посредством кортикотомии) маркер IL-1 – позитивных клеток полностью
перекрывался
с
обнаруживался
иммунопозитивным
в
маркером
ГФКБ-иммунореактивных
микроглиоцитов
клетках
и
(астроцитах),
не
что
свидетельствует о том, что микроглиальные клетки являются единственным
источником IL-1 [Herx L.M. et al., 2000; Herx L.M., Yong V.W., 2001].
Повышение
IL-1
наблюдается
в
реактивных
микроглиоцитах,
окружающих амилоидные бляшки, характерные для болезни Альцгеймера
[Shaftel S.S. et al., 2007]. Астроциты пациентов с болезнью Альцгеймера
продуцируют целый ряд провоспалительных цитокинов, таких как IL-1α, IL-1β,
IL-6, и TNF-α [Rubio-Perez J.M., Morillas-Ruiz J.M., 2012]. Интересно, что
32
амилоид-β в сочетании с ЛПС индуцирует выраженную продукцию IL-6 и TNF,
тогда как по отдельности эти вещества такой реакции не вызывают [Forloni G. et
al., 1997].
Продемонстрировано нейропротективное действие антагониста рецептора
IL-1 в модели церебральной ишемии, а делеция генов, кодирующих агонисты IL1α или IL-1β, приводит к редукции ишемического повреждения мозга на 80%
[Boutin H. et al., 2001].
Экзогенное введение или сверхэкспрессия эндогенного IL-1 индуцирует
формирование реактивного астроцитарного фенотипа [John G.R. et al., 2004].
Инъекция в мозг цитокинов, в том числе IL-1, вызывает астроглиоз и повышает
экспрессию глиального кислого фибриллярного белка (ГФКБ) [Balasingam V. et
al., 1994]. Кроме того, введение IL-1 вызывает гипертрофию клеточных ядер в
астроцитах и индукцию экспрессии в этих клетках межклеточной адгезионной
молекулы-1 (ICAM-1) [Albrecht P.J. et al., 2002; Kyrkanides S. et al., 1999]. Нокаут
гена, кодирующего рецепторы к IL-1, значительно редуцирует астроцитарную
реактивность [Herx L.M. et al., 2000]. В то же время агонисты IL-1 индуцируют
производство в астроглиальных клетках NO [Chao C.C. et al., 1996].
IL-1 дозозависимым образом ингибирует поглощение астроцитами
глутамата, что ведет к его накоплению во внеклеточной среде и вызывает
сверхвозбуждение нейронов [Hu S. et al., 2000; Jing T. et al., 2010]. Кроме того,
активированные IL-1 астроциты начинают секретировать свободные радикалы,
под действием которых в нейронах активируются проапоптозные каспазы
[Thornton P. et al., 2006].
Вместе с тем важно отметить, что низкие концентрации IL-1 способны
активировать в астроцитах синтез защитных факторов, таких как NGF и TGF-β,
которые, снижая микроглиальную активность и способствуя восстановлению
ЦНС [Jauneau A.C. et al., 2006], ограничивают воспалением – индуцированную
нейродегенерацию.
Глиальный фактор созревания (GMF), продуцируемый активированными
астроцитами, индуцирует активацию микроглиоцитов, выражающуюся в
33
экспрессии провоспалительных маркеров, таких как МНС-II, IL-1β, and MIP-1β
[Zaheer A. et al., 2007]. Животные с нокдауном гена GMF редуцируют
производство провоспалительных цитокинов и хемокинов, ответственных за
развитие экспериментального энцефаломиелита [Zaheer A. et al., 2007]. В мозге
больных болезнью Альцгеймера отмечается повышенное производство
GMF
[Zaheer S. et al., 2011].
Астроциты продуцируют, захватывают, накапливают и вновь выводят
посредством
экзоцитоза
большой
класс
нейротрофинов,
оказывающих
нейропротективную роль в ходе развития экспериментального энцефеломиелита
[Flügel A. et al., 2001], деменции Альгеймерского типа [Tuszynski M.H., 2000] и
болезни Паркинсона [Hyman C. et al., 1991; Lingor P. et al., 2000]. Так, астроциты
являются основным продуцентом фактора роста нервов (NGF) и нейротрофного
фактора глиального происхождения (GDNF) [Eddleston M., Mucke L., 1993; Appel
E. et al., 1997; Moretto G. et al., 1996]. Важно отметить, что в тканях мозга
пациентов с БП отмечается дефицит GDNF, NGF и нейротрофного фактора
мозгового происхождения (BDNF) [Nagatsu T. et al., 2000; Chauhan N.B. et al.,
2001].
Астроциты рассматриваются в качестве основного клеточного элемента,
защищающего ЦНС от опосредованного Т-лимфоцитами нейровоспаления
[Gimsa U. et al., 2013], в частности, за счет повышения экспрессии Fas лиганда
(FasL) на астроцитах, что индуцирует апоптоз Т-клеток, контактирующих с ними
[Choi C. et al., 1999].
Включения
альфа-синуклеина
обнаруживаются
в
астроцитах
и
олигодендроцитах пациентов с БП [Wakabayashi K. et al., 2000] и
амиотрофическом латеральном склерозе [Mezey E. et al., 1998]. Культивируемые
астроциты человека и клетки астроцитарной линии U251 экспрессируют мРНК
альфа-синуклеина и сам протеин [Tanji K. et al., 2001]. Кроме того, они способны
захватывать внеклеточные тельца Леви [Togo T. et al., 2001].
Добавление к культивируемым астроцитам человека нативной или
мутантной форм неагрегированного альфа-синуклеина повышает экспрессию
34
ими молекул ICAM-1 (СД54) и стимулирует синтез и секрецию Ил-6, причем
мутантные формы оказывают более выраженное стимулирующее действие
[Klegeris A. et al., 2006].
1.2.4. Реакции клеточных элементов гематоэнцефалического барьера
на нейровоспаление
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) выполняет роль физического и
метаболического барьера, который к тому же за счет наличия избирательных
транспортных систем служит средством сообщения между кровью и мозгом.
ГЭБ образован клетками (эндотелиоцитами, перицитами), окончаниями
астроцитов,
образующими
своеобразную
периваскулярную
«муфту»,
и
неклеточной структурой (базальной мембраной). ГЭБ является динамичной
структурой с насыщенной сигнальной функцией, играющей важную роль как в
физиологических, так и патологических условиях.
Изменения
ГЭБ
являются
компонентами
практически
всех
нейродегенеративных заболеваний [Carvey P.M. et al., 2009]. При моделировании
болезней, таких как реперфузионная травма и инсульт, наблюдается двухфазное
открытие ГЭБ, в котором первая фаза является следствием активации
металлопротеазы-2 (MMP-2), а поздняя обеспечивается активацией MMP-9 и
MMP-3 [Rosenberg G.A., 2002; Gasche Y. et al., 2006]. Васкулярные нарушения
ГЭБ играют ключевую роль в развитии нейрональной гибели в ходе инсульта.
Дисфункция барьерных функций ГЭБ вносит свой вклад в патофизиологические
механизмы болезни Альцгеймера [Jaeger L.B. et al., 2009] и БП [Lee H., Pienaar
I.S., 2014]. Экспериментальное нарушение целостности ГЭБ посредством
введения сосудистого эндотелиального ростового фактора (VEGF) вызывает
нейровоспаление и гибель ДА нейронов, сходное с ранними событиями БП [Rite
I. et al., 2007].
Важно отметить, что нарушения барьерной функции наблюдаются не на
всем протяжении сосудистого русла, а в небольших локальных участках внутри
повреждаемых областей мозга. Выявление мест выхода в нервную ткань FITCмеченого альбумина после введения токсинов, повреждающих ДА нейроны,
35
показало, что нарушение целостности ГЭБ и выход альбумина в паренхиму
мозга наблюдается лишь в областях с высоким содержанием нейронов этого типа
[Zhao C. et al., 2007]. Логично полагать, что такой локальный характер
нарушений ГЭБ связан с активным нейровоспалительным процессом, идущим
вблизи сосудов.
1.2.4.1. Эндотелий
Эндотелий
сосудов
мозга
отличается
от
такового
в
сосудах
периферических органов: в них увеличено количество митохондрий [Oldendorf
W.H. et al., 1977], которые делают их высокочувствительными к действию
окислительных стрессоров [Grammas P. et al., 2011]; отсутствуют фенестры
[Fenstermacher J., Kaye T., 1988]; значительно снижена пиноцитозная активность
[Sedlakova R. et al., 1999]. Эндотелиальные клетки соединены между собой
плотными контактами, предупреждающими диффузию молекул через стенку
сосуда [Kniesel U., Wolburg H., 2000].
Известно, что медиаторы воспаления, циркулирующие в крови, способны
дестабилизировать плотные контакты, что ведет к повышению проницаемости
ГЭБ [Li Q. et al., 2009]. Например, ЛПС, который лишь в незначительной степени
способен проходить через интактный ГЭБ [Banks W.A., Robinson S.M., 2010],
связываясь с Толл-подобными рецепторами на эндотелиоцитах сосудов мозга
[Nagyoszi P. et al., 2010] запускает цепь молекулярных событий, ведущих к
разрушению
архитектуры
плотных
контактов.
Активация
RhoA,
транскрипционного ядерного фактора-каппа B, фосфоинозитид-3-киназы,
киназы легкой цепи миозина, протеиновой киназы-С и участников MAPK
сигнального пути вовлечены в этот патофизиологический процесс [Schreibelt G.
et al., 2007; Ullen A. et al., 2013; He F. et al., 2011; Dohgu S. et al., 2011].
Циркулирующие в крови сигналы могут индуцировать синтез цитокинов в
эндотелиальных клетках и последующую их секрецию в паренхиму мозга.
Введение эндотоксина в циркуляцию индуцирует в эндотелии производство
цитокинов,
свободных
радикалов,
металлопротеиназ,
оксида
азота
и
простагландина [Rosenberg G.A., 2002]. В экспериментах in vitro монослой
36
эндотелиальных клеток под воздействием ЛПС синтезировал цитокины (IL-6, IL10, TNF-α) и гранулоцитомакрофагальный колониестимулирующий фактор с
абдоминальной поверхности [Banks W.A., 2006]. Посредством рецепторов к IL6, которые экспрессируются на эндотелиальных клетках, возможна активация
синтеза в них простагландина Е2 и, как следствие, активация окружающих
микроглиоцитов [Gosselin D., Rivest S., 2008]. Эндотелиальные клетки
синтезируют
простагландины
и
оксид
азота
в
ответ
на
системное
инфицирование, что лежит в основе формирования поведения острой фазы
воспаления [Langhans W., 2007].
Важно отметить, что активация
эндотелиоцитов может быть вызвана действием воспалительных факторов по
обе стороны ГЭБ [Verma S. et al., 2006]. Выяснено, в частности, что TNF-α
микроглиоцитарного происхождения способен нарушать целостность барьера
[Zhao C. et al., 2007]. Сформировано представление о том, что воспалительные
сигналы паренхимы мозга повышают экспрессию эндотелиальными клетками
селектинов, которые ответственны за прикрепление моноцитов к выстилке
сосудов и проникновению их в мозг.
1.2.4.2. Перициты
Перициты являются ключевыми компонентами ГЭБ, выполняя роль
интегратора, координатора и эффектора таких нейроваскулярных функций как
регуляция проницаемости ГЭБ [Armulik A. et al., 2010; Hall C.N. et al., 2014],
регуляция скорости кровотока [Peppiatt C.M. et al., 2006; Bell R.D. et al., 2010] и
очистка от токсических клеточных продуктов [Zlokovic B.V., 2008; Díaz-Flores L.
et al., 2009].
Перициты лежат в расщеплении базальной мембраны каппилляров и
венул, ориентируясь своей длинной осью вдоль сосудов. В местах, где
прерывается базальная мембрана, отростки перицитов образуют щелевые
контакты, как правило, с 5-6 эндотелиолоцитами, что предполагает возможность
обмена между этими клетками нутриентами, метаболитами, вторичными
мессенджерами и ионами [Fisher M., 2009; Bobbie M.W. et al., 2010]. Важно
отметить, что эндотелий ЦНС имеет значительно более высокую частоту
37
контактов с перицитами, чем эндотелий периферических тканей [Shepro D.,
Morel N.M., 1993], что свидетельствует о повышенном функциональном
значении перицитов в ЦНС.
Кроме того, перициты могут оказывать паракринное регуляторное
воздействие на клеточное микроокружение [Nakaoke R. et al., 2007].
Перекрестное взаимодействие между перицитами и эндотелиальными клетками
обеспечивается несколькими сигнальными каскадами, которые инициируются
ростовым фактором кровяных пластинок-В (PDGF-B), трансформирующим
ростовым фактором-β (TGF-β), Notch, фосфатом сфингозина-1 и ангиопоэтином
[Gaengel K. et al., 2009].
Обнаружение на перицитах вазоактивных рецепторов свидетельствует о
возможности их участия в регуляции капиллярного тока крови, а наблюдение за
дифференцировкой перицитов в культере ткани обосновало вывод о
вовлеченности этих клеток в ангиогенез [Dore-Duffy P., 2008].
Регуляторная роль перицитов в функционировании ГЭБ подтверждается
данными о прогрессирующей редукции у перицит-дефицитных мышей
ключевых трансмембранных белков плотных контактов эндотелиоцитов, таких
как окклюдин и клаудин 5, адапторный белок зоны окклюденс 1, что с одной
стороны повышает проницаемость стенки сосудов для экзогенных васкулярных
трейсеров, с другой стороны вызывает возраст-зависимую микроваскулярную
дегенерацию [Bell R.D. et al., 2010; Peppiatt C.M. et al., 2006].
Перициты прямо вовлечены в синтез необходимых для внеклеточного
матрикса белков [Díaz-Flores L. et al., 2009; Stratman A.N. et al., 2009; Van Geest
R.J. et al., 2010], включая ламинин, нидоген и фибронектин, а также секретируют
тканевой ингибитор металлопротеиназ 3 (TIMP3), который во время
стабилизации сосудов ингибирует деградацию белков базальной мембраны.
Перициты стимулируют выживание, пролиферацию и дифференцировку
эндотелиоцитов посредством секреции ангиогенных факторов, таких как
эндотелиальный ростовой фактор-А (VEGF-A) [Darland D.C. et al., 2003; Ozerdem
U., Stallcup W.B., 2004].
38
Предполагается, что перициты могут регулировать диаметр капилляра и
скорость кровотока в ответ на синаптическую стимуляцию вазоактивными
медиаторами [Peppiatt C.M. et al., 2006; Bell R.D. et al., 2010]. Они способны
сокращаться
в
ответ
на
активацию
экспрессируемых
рецепторов
к
катехоламинам, эндотелину-1, вазопрессину и ангиотензину-II [Díaz-Flores L. et
al., 2009; Hamilton N.B. et al., 2010]. Изменения в тонусе перицитов зависят от
внеклеточного кальция [Hirase H. et al., 2004; Peppiatt C.M. et al., 2006; Hamilton
N.B. et al., 2010]. Сокращение перицитов играет важную роль в обструкции
капиллярного кровотока во время мозговой ишемии [Yemisci M. et al., 2009].
Периваскулярные клетки вовлекаются в процессы нейровоспаления [Paul
G. et al., 2012; Alcendor D.J. et al., 2012; ElAli A. et al., 2014]. Исследование
функциональных особенностей перицит-дефицитных мышей показало, что
гибель перицитов запускает два параллельных механизма нейродегенерации,
вызываемых нарушением ГЭБ с выходом в паренхиму мозга циркулирующих
белков плазмы, и хронической гипоперфузией и гипоксией. Эти два пути
действуют
синергично,
производя
васкулярно-опосредуемый
вторичный
нейродегенеративный фенотип [Bell R.D. et al., 2010]. Васкулярные повреждения
у описываемой линии мышей предшествуют повреждению нейронов и
нейровоспалению, что может свидетельствовать о том, что нарушения
целостности ГЭБ могут инициировать нейродегенеративные изменения
[Quaegebeur A. et al., 2010].
Перициты занимают ключевое положение в опосредовании механизмов
системного и центрального воспаления [Winkler E.A. et al., 2011]. Так, перициты
сосудов мозга, также как микроглиоциты и астроциты, отвечают на действие
ЛПС и провоспалительных факторов (IFN-γ, TNF-α, IL-1β) повышением синтеза
хемокинов [Jansson D. et al., 2014] и вовлекаются в рекрутирование
циркулирующих иммунных клеток в мозг [Proebst D. et al., 2012; Wang S. et al.,
2012; Stark K. et al., 2013]. Как установлено, инфильтрующие иммунные клетки
усиливают активность микроглиоцитов и повреждение нейронов [Davalos D. et
al., 2012]. Кроме того, обнаружено, что перициты обладают макрофагальной
39
активностью и способны очищать ткани от токсических клеточных побочных
продуктов [Díaz-Flores L. et al., 2009; Bell R.D. et al., 2010].
Выяснена важная роль перицитов в развитии таких нейродегенеративных
заболеваний, как болезнь Альцгеймера. Обнаружен ряд аномалий перицитов у
пациентов с этой болезнью [Farkas E., Luiten P.G., 2001; Zlokovic B.V., 2008].
Амилоидный-β
белок
(A-β),
ключевой
нейроваскулярный
токсин,
обнаруживаемый при болезни Альцгеймера, аккумулируется вблизи или внутри
перицитов [Wisniewski H.M. et al., 1992; Vinters H.V. et al., 1994]. Исследования
in vitro показали, что в высоких концентрациях производные этого белка
вызывают гибель перицитов [Wilhelmus M.M. et al., 2007].
Трансгенные
модели
болезни
Альцгеймера,
основанные
на
гиперпроизводстве A-β, характеризуются редукцией плотности сосудов мозга
[Zlokovic B.V., 2005], нарушениями васкулярной реактивности [Iadecola C. et al.,
1999; Niwa K. et al., 2000] и целостности ГЭБ [Paul J. et al., 2007], которые
предшествуют дегенерации нейронов или накоплению амилоидных бляшек.
ГЭБ ограничивает обмен растворенных веществ между капиллярами и
паренхимой
мозга.
Астроциты
не
образуют
прямых
контактов
с
эндотелиальными клетками, но могут влиять на проницаемость ГЭБ
посредством
секреции
растворимых
факторов,
воздействующих
на
эндотелиальные клетки [Alvarez J.I. et al., 2013]. В качестве таких факторов
идентифицированы эндотелин-1, глутамат, IL-1, IL-6, фактор некроза опухоли
(TNF), макрофагальный воспалительный протеин -2 (MIP-2), монооксид азота
[Abbott N.J., 2002].
1.2.5. Вовлеченность в нейровоспалительные процессы лимфоцитов,
мигрирующих в нервную ткань
Исторически сложившееся представление о том, что мозг является
иммунопревилегированной
областью
в
настоящее
время
значительно
пересмотрено. Получены убедительные доказательства того, что в норме мозг
находится под иммунным надзором, а адаптивный иммунитет играет
существенную роль во всех нейродегенеративных заболеваниях.
40
В отличие от периферии, где мононуклеары мигрируют в ткани через
капиллярное русло, иммунные клетки мигрируют в мозг, главным образом, через
посткапиллярные венулы [Owens T. et al., 2008]. Кроме того, иммунные клетки
могут выходить в ликвор через сосудистое сплетение мозга и посткапиллярные
венулы
поверхности
мягкой
оболочки,
образующей
периваскулярные
пространства Вирхова-Робена (spatia perivascularia).
Трансмиграция моноцитов через ГЭБ представляет собой сложный
процесс, в основе которого лежит активация эндотелиальных и моноцитарных
клеток, и последующее перемещение последних по градиенту хемокинов в
мозговую ткань [Man S. et al., 2007].
Провоспалительные
медиаторы,
включая
цитокины,
активируют
эндотелиальные клетки и индуцируют повышение экспрессии адгезионных
молекул (CAM) из семейства E-селектинов на люминальной поверхности
эндотелия. Эти селектины связываются с гликозилированными лигандами
(интегринами) на моноцитах, в ходе процесса получившего название фазы
ограничения (tethering). Образование такой связи ведет к тому, что моноциты,
вращаясь,
замедляют
физиологических
свое
условиях
движение
вдоль
моноциты
кровеносного
крайне
редко
сосуда.
В
прилипают
к
эндотелиальной выстилке в силу низкого уровня экспрессии селектинов.
Однако, активация моноцитов на периферии или наличие повышенного уровня
хемокинов вблизи сосудов ведет к увеличению экспрессии селектинов и, как
следствие, связыванию моноцитов со стенкой сосудов в той области мозга, где
обнаружен очаг гиперпродукции хемокинов.
Ограничение движения моноцитов не ведет к их непосредственной
трансмиграции, но создает условия для передачи сигналов с интегринов
моноцитов на селектины эндотелия, которые вызывают повышение экспрессии
VCAM, ICAM, и соединяющиеся с фибронектином сегменты (FN-CS-1), которые
формируют кластеры с повышенной способностью связывать моноциты.
Одновременно индуцируются конформационные изменения в моноцитарных
интегринах,
что,
в
конечном
итоге,
повышает
авидность
связи
41
взаимодействующих
белков
до
состояния
двигательного
«ареста»
моноцитарных клеток на люминальной поверхности кровеносных сосудов.
Медленно вращающийся моноцит достигает межклеточного соединения,
где будет осуществлен переход через стенку сосуда (хотя описан и феномен
трансклеточной трансмиграции сквозь эндотелиоцит) [Carman C.V., Springer
T.A., 2004]. В случае достаточного градиента хемокинов моноцит секретирует
протеазы для резорбции базальной мембраны и перемещается в периваскулярное
пространство.
Адаптивная
иммунная
система
вовлечена
в
механизмы
нейродегенаративных заболеваний, и получены убедительные доказательства
того, что периферические иммунные клетки мигрируют в мозг больных БП
[Monahan A.J., Carvey P.M., 2008]. Моделирование БП посредством введения
MРTР химерным мышам, у которых клетки костного мозга экспрессируют
зеленый флуоресцирующий белок, показало, что моноциты костномозгового
происхождения способны мигрировать в черную субстанцию и приобретать
фенотип микроглиоцитов [Rodriguez M. et al., 2007]. Этот эксперимент
свидетельствует о том, что MPTP-индуцированная нейродегенерация ДА
нейронов сопровождается миграцией периферических иммунных клеток в мозг,
что является компонентом реакции врожденной иммунной системы. Более
тонкое исследование фенотипа лимфоцитов, мигрирующих в мозг, в этой модели
БП показало доминирование среди них CD4 и CD8 T-клеток [KurkowskaJastrzebska I. et al., 1999]. Важно отметить, что гибель ДА нейронов в такой
модели значительной редуцировалась у мышей, не имеющих CD4 хелперных Tклеток,
что
свидетельствует
о
вовлеченности
последних
в
процесс
нейродегенерации [Brochard V. et al., 2009].
Следует отметить, что активированные Т-клетки могут пересекать ГЭБ не
только при нейровоспалительных процессах, но и в норме [Hickey W.F. et al.,
1991;
Axtell
R.C.,
Steinman
L.,
2009;
Kawakami
N.
et
al.,
2012].
Инфильтрирующиеся в мозг Т-клетки, в первую очередь, Th1 и цитотоксические
Т-лифоциты
могут
повреждать
нервную
ткань,
поскольку
ряд
42
провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, являются нейротоксичными.
Один из компенсаторных механизмов, который активируется при воспалении,
направлен на элиминацию Т-клеток: астроциты могут индуцировать апоптоз в
этих клетках [Gold R. et al., 1996; Gold R. et al., 1997] посредством экспрессии
FasL (CD95L) [Bechmann I. et al., 1999; Bechmann I. et al., 2000; Bechmann I. et al.,
2002].
C
одной
стороны,
описываемый
механизм
обеспечивает
иммунопривилегированность нервной ткани, но с другой – может иметь
негативный побочный эффект. Так, астроцитомы, которые также экспрессируют
высокие уровни FasL, избегают тем самым действие иммунного контроля
[Ichinose M. et al., 2001]. Кроме индукции проапоптозного каскада в Т-клетках
астроциты могут ингибировать пролиферацию Т-клеток, продуцирование в них
IL-2 и IL-10 и экспрессию цепи рецептора IL-2 (CD25) [Gimsa U. et al., 2004].
Астроцит-Т-клеточные
взаимодействия
вызывают
продукцию
астроцитами ростового фактора нервов (NGF) – одного из представителей
семейства нейротрофинов. Установлено, что NGF поддерживает процессы роста,
дифференцировки и функционально активного состояния периферических и
центральных нейронов [Levi-Montalcini R. et al., 1996]. Кроме того, NGF
ингибирует MHCII-опосредованную активацию микроглиоцитов, ограничивая,
таким образом, презентацию антигена в ЦНС [Neumann H. et al., 1998].
Важно отметить, что в экспериментах in vitro астроциты могут как
супрессировать [Sun D. et al., 1997; Xiao B.G. et al., 1998; Gimsa U. et al., 2004],
так и стимулировать [Aloisi F. et al., 1999; Nair A. et al., 2008] Т-клетки.
Становится очевидным, что астроциты могут ингибировать нейровоспаление, но
в случае хронического характера воспаления, характеризуемого высокими
уровнями IFN-𝛾𝛾, синтезируемого, в частности, Th1-лимфоцитами, они
приобретают
свойства
антигенпрезентирующих
клеток,
провоцирующих
воспаление [Yang J.F. et al., 2012].
Высказано предположение о том, как реагирует адаптивная иммунная
система при БП [Benner E.J. et al., 2008]. Обнаружено, что после обработки MPTP
в ЦНС формируются неоантигены, такие как нитрированный альфа-синуклеин
43
(N-α-syn), которые затем обнаруживаются в лимфатических узлах. Адаптивный
перенос иммунных клеток от мышей, испытавших воздействие N-α-syn,
животным с MPTP-индуцированной БП вызвал более интенсивную гибель ДА
нейронов, в то время как перенос лимфоцитов от мышей SCID с иммунной
недостаточностью, также получавших MPTP, не вызывал гибели нейронов. Это
исследование позволило авторам сделать вывод о том, что реактивные формы
кислорода способны окислять некоторые нейрональные белки, формируя тем
самым неоантигены, индуцирующие иммунный ответ.
Накапливающаяся информация о многочисленных нарушениях иммунных
функций у пациентов, страдающих БП [McGeer P.L. et al., 1988; Fiszer U., 2001]
и у животных в экспериментальных моделях паркинсонизма [KurkowskaJastrzebska I. et al., 1999; Teismann P. et al., 2003] позволяет предположить о
вовлеченности иммунной системы в инициацию и/или развитие БП.
Для области поражения нервной ткани при БП характерно развитие
локального иммунного ответа, сопровождаемое инфильтрацией в поврежденный
район различных типов иммунных клеток, главным образом, Т- лимфоцитов [Bas
J. et al., 2001]. Установлено, что CD4+ T-клетки, мигрирующие в ЧС пациентов
с БП или животных с моделью БП, усиливают микроглиоцитарную активацию и
интенсифицируют дегенерацию ДА нейронов [McGeer P. L. et al., 1988;
Kurkowska-Jastrzebska I. et al., 1999]. Исследования, проведенные на мышах,
нокаутных по гену β-цепи Т-клеточного рецептора, показали, что дефицит Тклеток
ведет
к
существенному
ингибированию
ДА-
эргической
нейродегенерации в модели МРТР- индуцированной БП [Benner E. J. et al., 2008;
Brochard V. et al., 2009]. Дополнительные эксперименты показали, что для
индукции нейродегенерации важно наличие не CD8 +, а CD4 + Т-клеток
[Brochard V. et al., 2009].
Установление факта вовлеченности CD4+ Т-клеток в развитии БП
поставило воспрос о природе активирующих их антигенов. В ряде работ
продемонстрировано стимулирующее воздействие на адаптивную иммунную
систему неоантигена - нитрированного в результате окислительного стресса А-
44
син [Benner E. J. et al., 2008; Reynolds A. D. et al., 2010; Reynolds A. D. et al., 2009].
Важно
отметить,
что
этот
модифицированный
нейрональный
белок
присутствует не только в головном мозге мышей с экспериментальным
повреждением нейронов, но и у пациентов с БП [Giasson B. I. et al., 2000; Benner,
E. J. et al., 2008]. Эти исследования показали, что нитрированный А-син
презентируется в шейных лимфатических узлах антигенпрезентирующими
клетками, мигрирущими сюда из ЦНС. Это индуцирует антиген-специфический
ответ Th1 и Th17 CD4+ лимфоцитов, усиливающих активацию микроглиоцитов
и повреждение нейронов [Benner E. J. et al., 2008; Reynolds A. D. et al., 2009;
Reynolds A. D. et al., 2010]. Вместе с тем показано, что интенсивность
провоспалительного ответа находится под контролем регуляторной популяции
Т-лимфоцитов (Т-рег), угнетающих функцию Th1 и Th17- клеток [Reynolds A. D.
et al., 2007; Reynolds A. D. et al., 2010].
Т-регуляторные
клетки
-
это
фенотипически
и
функционально
отличающаяся от нативных CD4+T-клеток популяция лимфоцитов, которая
конститутивно экспрессирут CD25+ и Foxp3, не отвечает на CD3 стимуляцию и
супрессирует пролиферацию Т-эффекторных клеток [Thornton A. M., Shevach E.
M., 2000]. Активированные Т-рег нейтрализуют или инактивируют другие
эффекторные клетки, такие как Т- или В-лимфоциты, а также супрессируют
антигенпрезентирующие клетки, включая микроглиоциты [Suri-Payer E. et al.,
1998; Thornton A. M., Shevach E. M., 2000; Cederbom L. et al., 2000; Avidan H. et
al., 2004]. Т-рег осуществляют супрессивную функцию посредством прямых
межклеточных контактов и/или секреции IL-10 и TGF-β [Nakamura K. et al., 2001;
Pontoux C. et al., 2002; Nakamura K. et al., 2004; Kryczek I. et al., 2006]. Важно
отметить, что инфузия IL-10 экспериментальным животным защищает от ЛПСиндуцированной и воспалением-опосредованной дегенерации нейронов в ЧС
[Arimoto T. et al., 2006], ингибируя активацию микроглиоцитов и синтез
провоспалительных
цитокинов.
Кроме
того,
TGF-β
также
способен
ингибировать микроглиоцитарную активацию [Kim W.K. et al., 2004]. Другой
механизм, посредством которого Т-рег могут влиять на нейродегенеративный
45
процесс, – взаимодействие с астроцитами, индуцирующее в последних синтез
нейрональных ростовых факторов, таких как BDNF и GDNF [Benner E.J., 2004;
Kipnis J. et al., 2004; Butovsky O. et al., 2006].
Т-рег способны мигрировать в область нейровоспаления и через прямое
взаимодействие с локальной глией снижать нейровоспаление и, таким образом,
оказывать нейропротекцию [Kipnis J. et al., 2004; Reynolds A.D. et al., 2007; Liu J.
et al., 2009; Reynolds A.D. et al., 2009; Reynolds A.D. et al., 2009].
Томографическое и магнитнорезонансное исследования свидетельствуют о том,
что уже через 24 часа после переноса реципиентам обагощенной смеси Т-рег,
последние обнаруживаются в области черной субстанции, где после этого
отмечается нарастание уровней мРНК IL-10, TGF-мРНК, BDNF и GDNF
[Reynolds A.D. et al., 2007].
Следует
отметить,
что
эти
наблюдения,
свидетельствующие
о
нейропротективной функции Т-рег, противоречат гипотезе о протективной роли
аутоиммунных реакций в БП, высказанной другими исследователями [Moalem
G. et al., 1999; Kipnis J. et al., 2004; Shaked I. et al., 2005]. Более того, обнаружено,
что Т-клеточный репертуар в крови у пожилых людей смещен в сторону
преобладания Th2 и Т-рег клеток, что интерпретируется авторами как
свидетельство связи увеличения супрессивной регуляторной активности с
нейродегенеративными состояниями [Rosenkranz D. et al., 2007].
Возможные объяснения этих противоречий могут заключаться в том, что в
старости Т-рег снижают интенсивность миграции в мозг, или в том, что
хроническое воспаление в мозге нарушает функцию Т-рег. О правомочности
таких объяснений говорят данные эксперимента, в которых иммунизация
нитрированным альфа-синуклеином животных, предварительно получивших
нейротоксин
MPTP,
усиливала
нейровоспаление
и
нигростриарную
нейродегенерацию за счет увеличения образования Th17- лимфоцитов на фоне
дисфункции
CD4+CD25+Т-рег
клеток.
Примечательно,
что
введение
натуральных Т-рег таким животным снижало интенсивность нейровоспаления и
оказывало выраженное нейропротективное действие [Reynolds A.D. et al., 2010].
46
О важной роли Т-рег в патогенезе БП свидетельствуют наблюдения об
уменьшении CD4 Т-клеток и смещении баланса в сторону преобладания
провоспалительных иммунных реакций у больных с БП [Bas J. et al., 2001; Baba
Y. et al., 2005].
1.2.6. Концепция нейроваскулярной единицы
Структурная и функциональная целостность мозга зависит от адекватного
обеспечения трофическим субстратом, которое определяется энергетическими
требованиями,
налагаемыми
активностью
нейронов.
Комплексность
церебрально-васкулярных контрольных механизмов обеспечивает получение
адекватного количества крови активными областями мозга, однако природа этих
механизмов все еще не до конца изучена.
Накопленные данные клинических и экспериментальных исследований
свидетельствуют о том, что в контроле мозговой микроциркуляции участвуют
периваскулярные нейроны, глиоваскулярные взаимодействия и интрамуральное
(внутристеночное) васкулярное сигнализирование. Высказана гипотеза о том,
что нейрон, астроциты и сосудистые клетки составляют единый структурнофункциональный комплекс – нейроваскулярную единицу, первостепенной
целью которой является поддержание гомеостаза микроокружения мозга [Park
J.A. et al., 2003; Ward N.L. et al., 2004].
«Нейроваскулярная единица» («neurovascular unit») – функциональный
элемент,
состоящий
из
нейронов,
астроцитов,
гладких
миоцитов
и
эндотелиальных клеток – играет ключевую роль в гемодинамической реакции на
активность
мозга.
Помимо
прямых
контактов
клетки
этой
системы
взаимодейстуют друг с другом посредством секретируемых факторов, что
формирует сложную систему позитивных и негативных петель обратной связи
[Allan S., 2006; Hawkins B.T., Davis T.P., 2005; Lo et al., 2004].
Адекватная
работа
нейроваскулярной
единицы
необходима
для
метаболической оптимизации функционирования отдельных групп нейронов,
позволяющей максимально эффективно использовать их возможности, что на
уровне целого мозга позволяет решать сложные информационные задачи в
47
условиях относительно ограниченного количества энергии и субстратов.
Нарушение взаимодействий внутри нейроваскулярной единицы приводит к
снижению эффективности функционирования мозга, при этом в наибольшей
степени страдают энергетические структуры, в частности, кора и подкорковые
ганглии, а также связи между ними.
Нарушение цереброваскулярной регуляции является не только признаком
церебрально-васкулярной патологии (например, инсульта), но и, как показали
недавние исследования, признаком нейродегенеративных заболеваний, таких,
как
болезнь
Альцгеймера
[Iadecola
C.,
2004].
Кровеносные
сосуды,
изолированные из мозга пациентов с болезнью Альцгеймера, в условиях in vitro
вызывают гибель нейронов дозо- и времязависимым способом как при
непосредственном сокультивировании, так и при добавлении к нейронам
культуральной среды, в которой инкубировались сосуды [Grammas P. et al.,
1999].
Выяснено, что нейродегенеративные изменения, характерные для
амиотрофического латерального склероза (АЛС), во многом обусловлены
нарушением функции стенки кровеносных сосудов. Пациенты, страдающие этой
болезнью, также, как и SOD мутантные мыши, имитирующие эту болезнь,
демонстрируют редуцированные уровни эндотелиального ростового фактора
[Lambrechts D. et al., 2003], а его фармакологическое восстановление защищает
двигательные нейроны от клеточной смерти [Azzouz M. et al., 2004; Storkebaum
E. et al., 2005]. У SOD мышей описано падение экспрессии в эндотелии Glut-1 и
CD146, коррелирующее с повышением пропускной способности ГЭБ в спинном
мозге [Garbuzova-Davis S. et al., 2007]. Этот феномен может быть опосредован
изменениями в экспрессии белков плотного контакта, таких как ZO-1, окклюдин
и
клаудин-5,
ведущими
предшествующими
к
микрогемаррагиям
дегенерации
моторных
и
нейронов
гипоперфузии,
и
развитию
нейровоспаления [Zhong et al., 2008].
Дегенерация ДА нейронов, свойственная БП, вызывает фокальные
нарушения ГЭБ. Одиночная интранигральная инъекция эндотелиального
ростового
фактора
нарушает
ГЭБ
в
среднем
мозге
и
вызывает
48
гистопатологические изменения, характерные для БП: апоптоз ДА нейронов и
активацию микроглиоцитов. На основании этого наблюдения сделан вывод, что
нарушения ГЭБ вносят значительный вклад в патофизиологию БП [Rite I. et al.,
2007].
Несмотря на вышесказанное, следует отметить, что на сегодняшний день
исследования
патофизиологических
механизмов
БП,
учитывающих
комплексный и сложный характер взаимодействия клеток, рассматриваемых как
элементы нейроваскулярной единицы, практически отсутствуют. Между тем,
становится очевидным, что разработка новых подходов к терапии БП должна
рассматривать в качестве терапевтической мишени всю систему межклеточных
связей этого функционального модуля нервной ткани.
49
ГДАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Организация исследования
Для
доказательства
предположения
о
том,
что
микроглиоциты
активируются под воздействием секретируемого нейронами А-син, мы
индуцировали повышение уровня синтеза этого белка в нейронах ЧС
посредством унилатерального стереотаксического введения рекомбинантного
аденоассоциированного
вируса
(рААВ),
переносящего
в
нейроны
ген
человеческого или крысиного А-син (по 12 животных). Контрольная группа (12
животных)
получала
флуоресцирующего
тот
же
белка
вектор,
но
(ЗФБ).
содержащий
ген
зеленого
Нейродегенеративный
эффект
индуцированной гиперэкспрессии А-син оценивали, сравнивая количество ДА
нейронов
в
ЧС
(рассматриваемой
на
в
стороне
качестве
инъекции
вектора
контрольной)
и
стороне
контрлатеральной
мозга,
а
также
количественного определения концентраций А-син и тирозингидроксилазы (ТГ)
в стриатуме (области проекции ДА нейронов ЧС) при помощи Вестернблоттинга.
Сравнение различий в интенсивности дегенерации нейронов, вызываемой
переносом в нейроны рекомбинантных генов А-син человека и крысы, позволило
выявить корреляцию между нейротоксическим потенциалом этих молекул и
различиями в их аминокислотных последовательностях.
Поскольку в данной экспериментальной модели нейродегенерация может
быть вызвана как дисфункцией А-син, инициирующей внутриклеточные
процессы
нейрональной
секретирующих
гибели,
нейротоксические
так
и
активацией
факторы,
вклад
микроглиоцитов,
последних
в
нейродегенеративный процесс оценивали в дополнительном эксперименте с
фармакологическим ингибированием активности микроглиальных клеток.
Животные (6 крыс) с перенесенным в нейроны ЧС геном А-син человека на
протяжении 8 недель с интервалом в три дня получали интраперитонеально
инъекции ацетата-кортикостерона, который, как известно, способен проникать
50
через
гематоэнцефалический
барьер
и
ингибировать
активность
микроглиоцитов. Сравнение количества ДА нейронов в ЧС этих животных и
животных, не получавших гормон, позволил в численной форме выразить
степень вклада нейровоспаления в процесс нейродегенерации.
ДА нейроны идентифицировали при помощи иммуногистохимического
метода, используя антитела к тирозингидроксилазе (ТГ) или везикулярному
моноаминовому транспортеру (ВМАТ). Микроглиальные клетки выявляли при
помощи иммуногистохимического мечения антителами против МНС II. О
провоспалительной
активации
микроглиоцитов
судили
по
увеличению
количества клеток в исследуемой области (микроглиозе), характерным
морфологическим изменениям клеток (приобретению провоспалительного
цитофенотипа) и интенсивности свечения иммунопозитивного сигнала после
окрашивания срезов антителами к МНС II. Поскольку в нейровоспаление
помимо микроглиоцитов вовлечены дополнительные клеточные элементы, для
более полного описания системного ответа изучаемой области мозга в
используемых
нами
экспериментальных
моделях
мы
исследовали
функциональное состояние астроцитарной глии (по интенсивности экспрессии
иммунореактивного глиального фибриллярного кислого белка), а также
сосудистые реакции и интенсивность лимфоцитарной инфильтрации на основе
окраски срезов крезиловым фиолетовым и иммуногистохимического выявления
лимфоцитарного маркера (CD3) и маркера Т-регуляторных клеток (FoxP3).
Для ответа на вопрос – вызывается ли активация микроглии действием
гиперпродуцируемого нейронального А-син или дебрисом, остающимся на
месте погибших нейронов – исследовали провоспалительные эффекты
однократно стереотаксически вводимого унилатерально в область черной
субстанции
экзогенного
А-син
(12
животных).
Об
интенсивности
индуцируемого нейровоспаления судили по вышеописанным изменениям в
количестве и функциональному состоянию микроглии и астроглии.
Для проверки предположения о том, что дисфункция А-син в ДА нейронах
может
быть
вызвана
нейровоспалением,
инъецировали
однократно
51
унилатерально в область ЧС при помощи стереотаксической установки
бактериальный
липополисахарид
(ЛПС)
(12
животных),
исследовали
интенсивность экспрессии в нейронах иммунопозитивного А-син, подсчитывали
количество ДА нейронов, а также методом просвечивающей электронной
микроскопии изучали ультраструктурные изменения тел нервных клеток в ЧС и
синаптических окончаний в области их проекций – медиодорзальной части
стриатума от 0 до 1 мм ростральнее брегмы на стороне введения и
контрлатеральной стороне мозга, которая рассматривалась в качестве контроля.
Контрольной группе животных в область ЧС унилатерально вводили стерильный
физиологический раствор (СФР) (12 крыс).
Методы
В работе использовались следующие методы:
• Рутинная световая микроскопия (окраска крезиловым фиолетовым
криостатных и парафиновых срезов).
• Иммуногистохимия с использованием одинарного, двойного или
тройного мечения.
• Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
• Просвечивающая электронная микроскопия.
• Иммуноблоттинг.
• Экспериментальные
манипуляции
(стереотаксическое
введение
рекомбинантного аденоассоциированного вируса, альфа-синуклеина и
эндотоксина в область черной субстанции мозга).
Животные.
Эксперименты проведены на 78 самцах крыс стоковой линии Вистар,
весом 220-300 гр., которые содержались в стандартных условиях (свободный
доступ к воде и пище, 12-ти часовой световой день, соблюдение основных
параметров микроклимата – температура 18-22ºС, относительная влажность 5065%). В ходе проведения экспериментов соблюдались правила гуманного
обращения с животными. Для этого до проведения хирургических манипуляций
крыс наркотизировали, действие наркоза продолжалось вплоть до окончания
52
эксперимента, после чего крыс переносили в послеоперационное помещение и
отсаживали в отдельную клетку.
2.2. Введение вирусного вектора, А-син и бактериального эндотоксина
в черную субстанцию мозга
Крыс наркотизировали диэтиловым эфиром, освобождали поверхность
черепа от мягких тканей и при помощи бормашины высверливали отверстие по
координатам: 5,2 мм каудальней брегмы и 2 мм латеральней осевого шва
(справа). При помощи стереотаксического аппарата вводили стеклянную
микроканюлю с диаметром кончика 100 мкм на глубину 7,2 мм вентральней
уровня твердой мозговой оболочки. Медленно инъецировали 2 мкл раствора
вектора, А-син (Sigma, USA) в концентрации 15 нгр/мл и липополисахарида
Escherichia Coli (Sigma, USA) в концентрации 0,01мкг/мкл, стерильного
физиологического раствора, оставляли канюлю во введенном положении еще на
пять минут, после чего медленно извлекали ее из мозга.
В работе использовались векторы, сконструированные в лаборатории
молекулярной
и
клеточной
терапии
Университета
Флориды,
любезно
предоставленные для проведения наших экспериментов: рААВ А-син крысы
(1,4х1012 МЕ/мл), рААВ А-син человека (1,4х1012 МЕ/мл), рААВ ЗФБ (1,4х1012
МЕ/мл). Конструктивной особенностью использованных векторов было
включение в них промотера бета-актина курицы в сочетании с энхансером
цитомегаловирусного промотера [Xu et al., 2001].
Крысы дополнительной группы после введения рААВ А-син в область ЧС
получали на протяжении восьми недель интраперитонеальные инъекции ацетата
кортикостерона-21 (Sigma, USA; 2 мг/100 г веса тела), разведенного в 1 мл
стерильного физраствора с интервалом в три дня. Для гистологического и
биохимического анализа мозг животных отбирали через 4 и 8 недель после
введения векторов и через 8 недель после введения А-син или ЛПС.
2.3. Гистологический анализ
Под эфирным наркозом животных перфузировали через восходящую
аорту физиологическим раствором на фосфатном буфере (ЗФР), затем 4%
парафармальдегидом, приготовленном
на забуференном физиологическом
53
растворе (ЗФР) (рН 7,2-7,4). Извлекали мозг, постфиксировали в том же
фиксирующем растворе в течение ночи, отмывали в ЗФР, дегидратировали в
батарее спиртов восходящей концентрации, выдерживали в термостате при 56°С
в растворе хлороформ-парафин, трех сменах парафина (Гистомикс 200) и
заливали в парафиновые блоки. Срезы, полученные на микротоме (Reinchart,
Ger) толщиной 7 мкм наклеивали на предметные стекла, покрытые желатиной, и
окрашивали 1% раствором крезилового фиолетового.
Анализ изображений, полученных в совмещенной с микроскопом Nikon
Eclipse E200 фотоприставке Nikon PowerShut 600, проводили при помощи
морфометрических программ ImagePro Plus 6.0 и ImagePro Insight (Media
Cybernetics, USA) c учетом рекомендаций по оптимизации подсчета клеток
[Хаиндрова В.Г, и др., 2010]. Коррекция цветопередачи и нанесение
пояснительных надписей для используемых в тексте диссертации иллюстраций
проводили при помощи программы Photoshop 6.0 (Adobe, USA).
2.4. Электронномикроскопический анализ
Под эфирным наркозом животных перфузировали через восходящую
аорту физиологическим раствором на фосфатном буфере (ЗФР), затем 2,5%
раствором глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4).
мозг,
изготавливали
срезы,
содержащие
стриатум
Извлекали
толщиной
1
мм,
постфиксировали в том же фиксирующем растворе в течение двух часов и далее
после отмывки в ЗФР выдерживали в 2 % р-ре OsO4 на 0,1 М фосфатном буфере
(pH 7,4) в течение 12 часов при +4°С. После дегидратации в спиртах восходящей
концентрации и абсолютном ацетоне заливали в три смены смеси эпоксидных
смол в ацетоне (Аралдит М + DDSA) с нарастающим содержанием смол.
Финальная заливка осуществлялась с добавлением в смолы катализатора DMP30. Полимеризацию образцов проводили при 60°С в течение трех суток.
Затачивали блоки на центральную область стриатума, получали полутонкие и
ультратонкие срезы на ультрамикротоме (Сумы), монтировали срезы на сеточки,
которые затем контрастировали в уранилацетате и цитрате свинца по
Рейнольдсу. Изучали изображения и получали фотографические снимки в
электронном микроскопе. После оцифровывания фотографий проводили
54
подсчет дегенерированных синапсов на стандартной площадке (1280 мкм2) в
программе ImagePro Insight (Media Cybernetics, USA).
2.5. Иммуногистохимический анализ
Под эфирным наркозом животных перфузировали через восходящую
аорту физиологическим раствором на фосфатном буфере (ЗФР), затем 4%
парафармальдегидом,
приготовленном
на
ЗФР.
Извлеченный
мозг
постфиксировали в том же фиксирующем растворе в течение 2-х часов,
переносили на сутки в 25% раствор сахарозы и замораживали на сухом льду.
При помощи криотома (Shandon Cryotom E; Eng) получали серийные срезы мозга
толщиной 14 мкм и монтировали их на предметных стеклах Superfrost Plus
(Fisher
Scientific,
USA).
Для
иммуногистохимического
окрашивания
использовали антитела против тирозингидроксилазы (мышиные IgG, 1:1000;
Millipore), везикулярного моноаминового транспортера-2 (VMAT-2) (кроличьи
IgG, 1:5000; Chemicon), альфа-синуклеина человека (мышиные IgG, 1:2000;
Sigma), нейронального ядерного маркера (NeuN) (мышиные IgG, 1:2000; Sigma),
белка главного комплекса гистосовместимости второго типа (МНСII) (мышиные
IgG, 1:1000; Abcam), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP)
(мышиные IgG, 1:1000; Abcam), кластера дифференцировки лимфоцитов (CD3)
(мышиные IgG, 1:1000; Abcam), транскрипционного фактора FoxP3 (мышиные
IgG, 1:1000; Abcam). Срезы отмывались в ЗФР трижды после каждого этапа
инкубации. Все инкубационные растворы содержали 0,25% Triton X-100. Перед
окрашиванием срезы выдерживались в течение 10 минут в смеси 3% H2O2/10%
метанол. После отмывки в ЗФР срезы инкубировали 2 часа в 5% растворе
бычьего сывороточного альбумина, затем в первичных антителах в течение
суток при комнатной температуре. Для визуализации первых антител,
связавшихся с тканевыми антигенами, использовали вторые антитела,
конъюгированные либо с пероксидазой хрена, либо с люминесцентным
красителем. В первом случае срезы инкубировали в течение часа при комнатной
температуре в растворах биотинилированных антимышинных антител осла (в
разведении 1:200) (BA2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA) и в течение 20ти минут в растворе, содержащем авидин-биотин-пероксидазный комплекс
55
(ABC Elite; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Для двойной и тройной
флуоресцентной иммуногистохимической окраски в качестве вторых антител
использовали антитела, коньюгированные с FITC, Alexa Fluor 488, 555 и 647
(1:500; Invitrogen). В ряде случаев докрашивали срезы люминесцентными
ядерными красителями DAPI или пропидий йодидом, растворенными в среде для
заключения временных препаратов (Vectashield, CA).
2.6. Подсчет клеток и плотности волокон
Подсчет
общего
количества
дофаминергических
нейронов,
микроглиоцитов, астроглиоцитов и лимфоцитов в ЧС производили при помощи
компьютерной программы ImagePro Insight (Media cybernetics, USA)
Обсчитывался каждый восьмой срез черной субстанции на всем ее
протяжении как на стороне введения исследуемых веществ (справа), так и на
контрлатеральной (контрольной левой) стороне с применением приема
«суммирования фокальных плоскостей» по всей толщине среза. Результат
подсчета представляли в процентном выражении относительно контроля,
количество исследуемых клеток в котором принималось за 100%.
2.7. Измерение интенсивности флуоресцентного свечения
Об
уровне
интенсивности
экспрессии
флуоресцентного
иммунореактивных
свечения
белков
исследуемого
судили
участка
по
мозга
стандартной площади (1 мм2), измеряемой при помощи компьютерной
программы ImagePro Insight после визуализации первых антител вторыми
антителами, конъюгированными с флуорохромами. Обсчитывался каждый
восьмой фронтальный срез, средние значения представлялись в процентном
выражении относительно данных контрольной группы (репрезентативные
участки нервной ткани контрлатеральной стороны мозга), которые принимались
за 100%.
2.8. Биохимический анализ (Вестерн-блоттинг)
Концентрация тканевого ДА и А-син определялась в тканевых пробах
стриатума контрольной и экспериментальных групп.
Фрагменты мозга
суспендировали в 300 мкл буфера для лизиса (50 мМ Трис, рН 7,5; 0,15 М NaCl),
содержащем коктейль протеазных ингибиторов (0,1 мМ PMSF, 0,5 мкг/мл
56
лейпептина, 0,7 мкг/мл пепстатина A) (Roche, USA) и гомогенизировали в
течение 10 секунд. 100 мкл суспензии добавляли в 250 мкл 0,1М HClO4 и хранили
при -80°С. Оставшуюся часть аликвоты доводили до конечной концентрации
раствором из 1% NP-40 и 0,1% SDS, инкубировали на льду в течение 30 мин и
центрифугировали в течение 15 мин при 4°С. Лизаты каждой группы объединяли
и определяли концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Пятьдесят мкг
из каждого пула лизата доводили до равных концентраций белка раствором,
содержащим 2% SDS и 0,1% 2-меркаптоэтанол, в течение 5 мин. инкубировали
при температуре 95°С; затем разделяли в системе для блоттинга Biorad с
использованием 4-20% SDS-PAGE градиентного геля и переносили на мембраны
для вестерн-блоттинга LFP (Amersham). Мембраны окрашивали антителами к Асин (1:250; Santa Cruz Biotechnology), TH (1:5,000 Santa Cruz Biotechnology).
Кроме того, проводили дополнительную окраску мембран моноклональными
антителами к тубулину в качестве внутреннего стандарта.
Денсиметрическое
иммунопозитивных
измерение
бендов
Вестерн
интенсивности
блотов
окрашивания
проводили
при
помощи
компьютерной программы ImagePro Plus 6.0 (Media cybernetics, USA).
2.9. Статистический анализ
Результаты исследований проверяли на нормальность распределения
значений
с
помощью
W-теста
Шапиро-Вилкоксона.
При
нормальном
распределении сравнение выборок проводили, в зависимости от количества
сравниваемых групп, с помощью t-критерия Стьюдента или однофакторного
дисперсионного
анализа
ANOVA.
При
распределении,
отличном
от
нормального, сравнение двух несвязанных выборок проводили с помощью
непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными
при уровне статистической значимости P<0,05. Результаты представляли как
M±m (среднее ± стандартное отклонение). Статистический анализ проводили в
компьютерной программе Statistiсa 6.0.
57
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Перенос
рААВ в ДА-эргические нейроны черной субстанции
мозга
Для исследования эффектов гиперэкспрессии А-син в нейронах черной
субстанции мозга крыс производили однократную инъекцию 2 мкл рААВ
вектора, содержащего гены А-син человека или крысы, унилатерально в область
ЧС. Контрольные животные получали инъекцию идентичного объема рААВ с
геном зеленого флуоресцирующего белка (ЗФБ).
Трансфекция рекомбинантного гена, кодирующего флуоресцентный
белок, при помощи того же вируса и в том же разведении, которые
использовались для переноса генов А-син крыс и человека, позволила, с одной
стороны, подтвердить точность инъецирования векторов в область черной
субстанции мозга и эффективность инфицирования дофаминергических
нейронов, с другой – оценить возможный негативный эффект использования
данного вируса в качестве средства генетического переноса.
Иммуногистохимический анализ срезов мозга через 4 и 8 недель после
векторного переноса свидетельствовал о том, что нейроны, экспрессирующие
ЗФБ локализовались, главным образом, в области компактной и ретикулярной
частей
черной
субстанции,
и,
в
значительно
меньшей
степени,
в
мезенцефалической ретикулярной формации, расположенной дорзально от
черной
субстанции,
и
вентральной
тегментальной
области
(рис.1б).
Иммуногистохимическое окрашивание этих же срезов на тирозингидроксилазу
(ТГ) (рис.1а) продемонстрировало тот факт, что более 94% ДА-эргических (ТГпозитивных)
нейронов
компактной
части
черной
субстанции
мозга
соэкспрессировало ЗФБ (рис.1в).
Вместе с тем, двойное иммуногистохимическое окрашивание на А-син и
нейрональный ядерный маркер NeuN показало, что все клетки, синтезирующие
А-син, были нейронами.
58
Рис.1. Локализация ДА-эргических нейронов в черной субстанции (ЧС) и
вентральной тегментальной области (а, красное окрашивание) и клеток,
экспрессирующих ЗФБ (б, зеленое окрашивание) после унилатерального введения
рААВ с геном ЗФБ в область ЧС. Значительная часть ДА-нейронов
экспрессирует ЗФБ (в, желтое окрашивание). На правой панели – увеличенные
фрагменты выделенных участков ЧС.
ВТО – вентральная тегментальная область; ЧСк - компактная часть
черной субстанции; ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции. Стрелками
выделено несколько нейронов, экспрессирующих обе люминесцентные метки.
Длина линии = 800 мкм.
59
Рис.2. Последовательные срезы среднего мозга на уровне ЧС, меченные
антителами к А-син (а; красное окрашивание), нейрональному ядерному маркеру
NeuN (а; зеленое окроашивание) и тирозингидроксилазе (б) через 8 недель после
унилатерального введения в ЧС рААВ А-син человека. ВТО – вентральная
тегментальная область; ЧСк - компактная часть черной субстанции; ЧСр –
ретикулярная часть черной субстанции. Стрелками обозначена сторона
введения вирусного вектора. Длина линии = 800 мкм.
Унилатеральное стереотаксическое введение рААВ вектора, содержащего
рекомбинантный
ген
альфа-синуклеина
(вне
зависимости
от
видовой
принадлежности), вызывало гиперэкспрессию иммунореактивного белка альфасинуклеина в нейронах и нейрональных отростках ЧС, а также в волокнах,
образующих широкий тракт, восходящий от ЧС в дорзо-латеральном
направлении в той стороне мозга, куда производилось введение вектора (Рис.2а)
на всех исследованных нами сроках эксперимента (4 и 8 недель). Векториндуцированная гиперэкспрессия А-син вызывала целый ряд морфологических
60
изменений
в
области
введения,
вплоть
до
выраженной
гибели
дофаминергических нейронов (рис.2б).
Вышеописанные результаты свидетельствуют об эффективном переносе
гена
альфа-синуклеина
при
помощи
выбранного
серотипа
аденоассоциированного вируса. Метод введения рекомбинантных векторов на
основе аденоассоциированного вируса (рААВ) был разработан для переноса
генов в различные ткани взрослых животных, в том числе и нейроны [Kaplitt
M.G. et al., 1994; McCown T.J. et al., 1996; Flannery J.G. et al., 1997; Xiao X., et al.,
1997].
В экспериментальной практике рААВ векторы используются для
гиперэкспрессии генов [Kirik D. et al., 2002; Kirik D. et al., 2003], «нокдауна»
генной экспрессии индукцией синтеза рибозимов, антисмысловых и малых РНК
[Lewin A.S. et al., 1998; Elbashir S.M. et al., 2001; Fritz J.J. et al., 2002; Haberman
R.P. et al., 2003; Tomar R.S. et al., 2003]. Это делает рААВ векторы удобным
средством для экспериментального моделирования той или иной болезни [Qi X.
et al., 2003] и генной терапии [Flotte T.R. et al., 2003; Flotte T.R. et al., 2004].
Для конструкции рААВ вектора нами был выбран второй серотип
аденоассоциированного вируса (рААВ2), который обладает преимущественным
тропизмом к нервным клеткам. Описано множество областей мозга, в нейроны
которых осуществлен успешный перенос генов посредством рААВ2 [Kaplitt
M.G. et al., 1994; McCown T.J. et al., 1996; Klein R.L. et al., 1998; Glatzel M. et
al., 2000]. Вместе с тем отмечается, что иногда возможен перенос гена и в не
нейрональные клетки [Davidson B.L. et al., 2000; Cucchiarini M. et al.,
2003].
Кроме того, обнаружено, что рААВ2 не трансдуцируется в нейроны
определенного
фенотипа.
Так,
нейроны
CA1–CA3
пирамидных
слоев
гиппокампа оказываются устойчивыми к заражению ААВ2 [Kaspar B.K. et al.,
2002; Passini M.A. et al., 2002; Passini M.A. et al., 2003].
Визуальный анализ полученных нами срезов, не обнаруживших иных
клеток кроме нейронов, экспрессирующих А-син, а также выявление
значительного количества ДА-эргических нейронов, в которых был индуцирован
61
синтез этого белка, свидетельствовал об успешности экспериментального
переноса генов, основанного на эффективном подборе титра и серотипа
вирусного вектора.
Даже функциональный недостаток векторов, сконструированных на
основе рААВ, – относительно небольшой объем нервной ткани, подвергающейся
заражению (для борьбы с которым исследователи вынуждены проводить
множественные инъекции или дополнительно инъецировать маннитол или
гепарин) [Ghodsi A. et al., 1999; Nguyen J.B. et al., 2001; Mastakov M.Y., et al.,
2002], в нашем случае оказывается выигрышным. Низкая диффузия вирусного
вектора в нервную ткань ограничивают его областью черной субстанции,
имеющей сравнительно небольшие объемы, что позволяет говорить о локальной
и специфической гиперпродукции А-син именно в нейронах ЧС.
Таким
образом,
полученные
нами
данные
свидетельствуют
об
эффективности проводимой нами рААВ А-син трансфекции, точности
попадания инъецируемого раствора в ЧС, об ограниченной диффузии вируса в
нервную ткань, окружающую место введения, и выраженном нейротропизме
используемого вектора.
3.2. Межвидовые различия способности гиперэкспрессированного в
ДА-эргических
нейронах
А-син
человека
и
крысы
индуцировать
нейродегенерацию
Через 4 и 8 недель после вирусной инъекции трансгена А-син человека и
крысы в область ЧС в нигростриарной системе наблюдался целый ряд
паталогических изменений. Подсчет ТГ-иммунопозитивных клеток через 4
недели после введения вектора несущего рекомбинантный ген А-син человека
или крысы не обнаружил нейродегенерации ДА-эргических нейронов в группе
животных,
экспрессирующих
А-син
крысы,
в
отличие
от
группы,
экспрессирующей А-син человека, где наблюдалось достоверное уменьшение
количества нейронов в области введения вируса (62,3±13,2% относительно
контрольной стороны) (Р<0,01). Через 8 недель после введения в нейроны ЧС
крыс гена А-син человека количество ДА-нейронов в этой области резко
62
снижалось, составляя, в среднем, 12,6±8,2% (Р<0,001) от количества нейронов на
контрольной стороне мозга (рис.3,4).
Рис.3. Изменение количества ДА-эргических нейронов в ЧС крыс через 4 и
8 недель после унилатерального введения рААВ ЗФР, рААВ А-син человека и
рААВ крысы. Обозначения: ВТО – вентральная тегментальная область; ЧСк компактная часть черной субстанции; ЧСр – ретикулярная часть черной
субстанции. Длина линии = 600 мкм.
Падение количества ДА нейронов, вызванное повышенным производством
в них А-син крысы, было менее выраженным (62,2±12,3% относительно
контроля), но также достигало достоверных отличий (Р<0,01). Разница в
интенсивности гибели ДА нейронов после индукции в них синтеза А-син
человека и А-син крысы (P<0,01) свидетельствует о том, что А-син человека,
гиперпродуцируемый
в
ДА
нейронах,
обладает
более
выраженным
нейротоксическим эффектом, чем А-син крыс. Введение в ЧС рААВ с геном
зеленого флуоресцирующего белка (ЗФР) не приводило к значительной
63
редукции количества ДА-эргических нейронов ни на одном из изученных
сроков.
м
Рис.4. Количество ДА нейронов в компактной части ЧС на разных сроках
после введения в эту область рААВ ЗФР, рААВ А-син человека и рААВ крысы в
процентах от количества нейронов в контрлатеральной стороне относительно
введения вектора (контроль). ***-Р<0,001; **-Р<0,01.
Обнаруженное
межвидовое
различие
нейротоксичности
гиперпродуцированного А-син позволяет предполагать, что оно обусловлено
различиями в аминокислотной последовательности этого белка у крысы и
человека (рис.5). Молекулы А-син различаются по 7 аминокислотным остаткам
в положении 53, 87, 100, 103, 107, 122 и 123.
Оценивая возможную функциональную роль этих локусов в повышении
нейротоксичности
А-син
человека
уместно
вспомнить
структурно-
функциональную организацию этого белка. Установлено, что А-син состоит из
трех доменов: N-терминальный домен (1-61 аминокислотных остатков – а.о.),
центральный гидрофобный домен, содержащий не амилоидный (non-Aβ)
компонент (NAC) (61-95 а.о.), критически важный для агрегации А-син и Стерминальный домен (95-140 а.о.), богатый пролином и имеющий большое
количество кислых остатков. N-конец содержит 6 альфа-спиральных повторов
64
из 11 аминокислот с консервативной центральной последовательностью
KTKEGV; эта область важна для прикрепления А-син к мембранам, после чего
она формирует спирали [Bartels T. et al., 2010].
Рис.5. Аминокислотные последовательности молекул А-син крысы и
человека. Красным цветом выделены различающиеся аминокислотные остатки.
Изолированный NAC-домен формирует амилоидные бета-складчатые
структуры; небольшие делеции в этом домене драматически редуцируют
способность А-син агрегировать в молекулярные комплексы [Rivers R.C. et al.,
2008]. С-терминальный домен содержит последовательности, обеспечивающие
белок-белковые взаимодействия, и изменения в этой части молекулы могут
влиять на агрегацию А-син. Так, укорочение С-конца молекулы, вызывающее
агрегацию А-син, обнаруживается в мозге человека и животных [Li W. et al.,
2005]. Эксперименты in vitro подтвердили, что укороченные по С-концу
молекулы А-син агрегируют с большей скоростью по сравнению с целой
молекулой [Rochet J.C. et al., 2000; Murray I.V. et al., 2003].
Можно
видеть,
что
пять
из
семи
различающихся
аминокислот
локализованы в С-конце молекулы А-син, который как было указано выше,
может быть вовлечен в процессы агрегации А-син. Логично полагать, что
репертуар и последовательность аминокислотных остатков в молекуле А-син
человека
создает
возможность
нейротоксических агрегатов.
для
более
быстрого
образования
65
Особое внимание привлекает аминокислотное различие молекул А-син
крысы и человека по 53-му локусу, так как описанная у человека A53T миссенс
мутация ответственна за индукцию семейной формы БП [Polymeropoulos M.H. et
al., 1997]. Ранее проведенный анализ гидрофобности и склонности к
образованию β-складчатости или α-спиральности мутированных молекул А-син
показал, что A53T мутация уменьшает гидрофобность в непосредственной
близости от локуса замещения, что несколько снижает склонность к
образованию α-спиралей, но повышает предрасположенность к образованию βструктуры [Li J. et al., 2001]. Мутация A53T увеличивает предпочтение
небольшой области молекулы вокруг места мутации в выборе вытянутой
конформации [Bussell R. Jr., Eliezer D. 2001]. Считается, что A53T мутация
стабилизирует межмолекулярные связи β-структур А-син, в результате чего
мутанты демонстрируют быструю скорость фибриллообразования [Li J. et al.,
2001].
Помимо описанных отличий важно также отметить, что отличающийся от
крысиного локус 87 в молекуле А-син человека является одним из пяти сайтов
фосфорилирования, а 122 и 123 аминокислотные остатки пространственно
близки к другим сайтам фосфорилирования, локализованным в 125 и 129
положении. Эксперименты in vitro и in vivo убедительно продемонстрировали
тот факт, что фосфорилирование А-син играет существенную роль в его
агрегации.
Известно, что в молекуле А-син фосфорилированию подвергаются
сериновые и тирозиновые аминокислотные остатки: Ser87, Ser129, Tyr125,
Tyr133, Tyr136 [Okochi M. et al., 2000; Pronin et al., 2000; Fujiwara H. et al., 2002;
Negro A. et al., 2002]. Функциональное значение фосфорилирования тирозина в
А-син остается невыясненным, однако первые исследования этого вопроса не
обнаружили значительных патологических последствий при фосфорилировании
Tyr125, Tyr133 и Tyr136 [Negro A. et al., 2002].
В то же время фосфорилирование Ser129 ускоряет образование полимерных
фибрилл из А-син. Замена же серина в 87 положении на аспартат, имитирующая
66
фосфорилирование этого сайта, наоборот, ингибирует фибриллизацию [Windisch
M. et al., 2007]. Эти исследования свидетельствуют о вовлеченности
фосфорилирования в модуляцию агрегации А-син, но в то же время
демонстрируют сложность взаимодействий между различными сайтами
фосфорилирования.
Межвидовой
анализ
структуры
белка,
обнаруживший
совпадение
локализации в белковой молекуле сайта, который, с одной стороны, различается
у человека и крысы, с другой – является локусом фосфорилирования, позволяет
предполагать наличие связи между возможностью фосфорилирования Ser87 в
молекуле А-син у человека и его более высоким нейротоксическим свойством,
который проявляется при повышенной продукции. Однако для подтверждения
этого предположения требуются дальнейшие исследования.
3.3. Гиперэкспрессия в ДА-эргических нейронах А-син человека и
крысы вызывает образование в нейронах агрегатов А-син
На всех исследованных сроках в цитоплазме переживающих нейронов ЧС
на стороне введения вектора обнаруживались А-син-позитивные гранулярные
включения, отсутствующие на контрольной стороне мозга. Кроме того, в
нейронах ЧС животных экспериментальных групп диффузная или гранулярная
иммунопозитивная окрашенность обнаруживалась и в клеточных ядрах (рис.6).
При визуальной оценке характера грануляции обнаруживалась закономерность
– гранулы агрегированного А-син крыс были многочисленными и имели более
крупные размеры. Иммуногистохимическое исследование нейронов в области
введения вектора с ЗФР не обнаружило различий с нейронами контрольной
стороны. Сопоставление этих фактов с результатами подсчета количества
дегенерирующих нейронов, может свидетельствовать о том, что образование
крупных
агрегатов
из
полимеризованного
А-син
имеет,
вероятно,
нейропротекторную функцию, в то время как высокое содержание в цитоплазме
олигомеров А-син токсично для клеток.
67
Рис.6. Образование гранулярных включений, иммунопозитивных к А-син
(зеленое окрашивание) в цитоплазме и ядрах нейронов ЧС крыс после введения
рААВ кодирующего А-син человека (б), А-син крыс (в), и диффузное
распределение иммунопозитивного А-син в цитоплазме нейронов после введения
рААВ ЗФР (а). Стрелкой выделена иммунопозитивная к А-син гранулярность в
ядрах нейронов, докрашенных пропидий йодидом (красное окрашивание). Длина
линии = 5 мкм.
Логично полагать, что иммунопозитивные агрегаты А-син, наблюдаемые
в цитоплазме нейронов, представляют, как и в случае синуклеопатий, комплексы
полимерных фибрилл этого белка. Известно, что А-син принадлежит к классу
нативно несвернутых белков [Weinreb P.H. et al., 1996]. Однако даже в норме он
представлен в цитоплазме равновесием конформационных форм – нативноразвернутой и частично свернутой. Увеличение производства белка и
повышение его концентрации в цитоплазме увеличивает скорость образования
фибриллярных агрегатов. Аналогичный эффект описан в экспериментах с А-син
in vitro [Uversky V.N. et al., 2001] и у больных БП, вызываемой дупликацией или
трипликацией гена А-син [Singleton A.B. et al., 2003; Singleton A.B. et al., 2004;
Farrer M. Et al., 2004].
До недавнего времени принято было считать, что формируемые фибриллы
А-син являются опасными для нейронов, однако в настоящее время сложилось
мнение о том, что крупные фибриллярные агрегаты не только не являются
токсичными [Tompkins M.M., Hill W.D. 1997], а, напротив, выполняют
68
нейропротективную функцию, связывая излишки олигомеров белка [Arrasate M.
Et al., 2004]. Предполагается, что именно промежуточные, олигомерные формы
А-син, называемые протофибриллами, ответственны за его нейротоксичность
[Lashuel H.A. et al., 2002; Lashuel H.A. et al., 2002; Caughey B., Lansbury P.T. 2003;
Walsh D.M., Selkoe D.J. 2004; Eliezer D. 2006; Sokolov Y. et al., 2006]. Одним из
возможных механизмов цитотоксичности олигомерных интермедиатов А-син
может быть их способность формировать пороподобные структуры, которые
встраиваются в билипидный слой и повышают проницаемость биологических
мембран [Lashuel H.A. et al., 2002; Lashuel H.A. et al., 2002; Caughey B., Lansbury
P.T. 2003; Walsh D.M., Selkoe D.J. 2004; Eliezer D., 2006; Sokolov Y. et al., 2006].
Важно отметить в этой связи, что на гистологических препаратах,
полученных в нашем эксперименте, нейроны ЧС с повышенным производством
А-син крыс содержали более крупные и более многочисленные агрегаты белка,
что коррелировало с менее выраженной интенсивностью гибели ДА нейронов в
этой области. Наши результаты, таким образом, подтверждают гипотезу о
возможной нейропротекторной роли формируемых в нейронах крупных
агрегатов
А-син
и
позволяют
предполагать,
что
аминокислотная
последовательность этого белка у крыс обеспечивает ему облегченную
способность формировать цитоплазматические агрегаты из полимерных форм.
3.4. Векторный перенос в ДА нейроны ЧС крыс гена А-син вызывает
рост концентрации А-син и падение тирозингидроксилазы в стриатуме
Об уровне экспрессии А-син и ТГ в пробах ткани стриатума на различных
сроках после введения векторов в ЧС судили по результатам Вестерн-блотинга,
в котором идентифицировали бенды, окрашенные антителами, перекрестно
связывающимися с А-син крыс и человека, полученными через 4 и 8 недель
после переноса соответствующих генов в нейроны ЧС (рис.7).
69
Рис.7. Иммуноблот уровней ТГ и А-син в стриатуме на стороне введения
(П, правая) рААВ А-син человека и крысы, ЗФБ и неинъецированной стороне (Л,
левая) мозга через 4 и 8 недель после введения вектора в ЧС животным,
получавшим и не получавшим инъекции кортикостерона (КСТ). Интенсивность
окраски бенда, содержащего иммунореактивный тубулин, использована в
качестве
контроля,
относительно
которого
нормализовали
значения
содержания детектируемых белков.
Денсиметрическое
измерение
интенсивности
окрашивания
иммунопозитивных бендов Вестерн блотов, проведенное при помощи
компьютерной программы ImagePro Insight, показало, что экспрессия А-син
человека и крысы на 4 неделе эксперимента на стороне введения не отличалась
значительно друг от друга, достоверно превышая в обоих случаях уровень
эндогенного А-син на противоположной половине мозга примерно в 3,7 раза
(рис.8). Содержание альфа-синуклеина через 8 недель незначительно снижалось,
достоверно превышая теперь в обоих случаях уровень эндогенного А-син на
противоположной половине мозга примерно в 3 раза.
70
Рис.8. Содержание иммунореактивных А-син и ТГ в стриатуме крыс на
стороне введения в ЧС рААВ ЗФР, рААВ А-син человека и рААВ крысы через 4 и
8 недель после инъекции векторов. ***-Р<0,001; *-Р<0,05 относительно
контроля (контрлатерального стриатума).
Через 8 недель после инъекции векторов обнаружены значительные
различия в концентрации ТГ в стриатуме на стороне введения между этими
экспериментальными группами. Векторный перенос гена А-син крысы вызывал
достоверно
меньшее
падение
концентрации
белка
по
сравнению
с
экспериментом по трансдукции в нейроны гена А-син человека (P<0,05).
Наблюдаемое падение уровней А-син и тирозингидроксилазы на 8-й
неделе относительно показателей 4-й недели может быть интерпретировано как
результат описанного нами ранее снижения количества нейронов, которое
вызывает падение продуцируемых белков.
Визуальная оценка содержания иммунореактивной тирозингидроксилазы
в стриатуме на срезах мозга животных этих экспериментальных групп совпадала
с
результатами
иммуноблотинга
(рис.9).
Анализ
полученных
данных
свидетельствует о том, что гиперэкспрессия А-син человека вызывает более
выраженную гибель ТГ-позитивных нейронов ЧС и падение уровня ТГ в
стриатуме на повреждаемой стороне по сравнению с таковыми при повышенном
производстве А-син крысы. Поскольку по данным иммуноблоттинга, уровни
71
экспрессии А-син человека и крысы на вводимой стороне были сходными,
различия в их нейротоксичности могут быть объяснены межвидовыми
различиями в аминокислотной последовательности А-син.
Рис.9.
Экспрессия иммунореактивной ТГ в ипсилатеральном (указан
стрелкой) и контрлатеральном стриатуме относительно стороны введения в
ЧС рААВ А-син крысы (а) и рААВ человека (б) через 8 недель эксперимента.
3.5. Индукция повышенной экспрессии А-син в ДА нейронах ЧС
вызывает провоспалительную активацию микроглиоцитов
Исследование
продемонстрировало
срезов
факт
мозга
крыс
экспериментальных
значительного
увеличения
групп
количества
микроглиоцитов и усиления ими экспрессии иммунореактивного МНС II в ЧС и
прилежащих областях мозга на стороне введения как рААВ А-син человека, так
и рААВ А-син крысы (рис.11). Независимо от того, какая видовая форма А-син
гиперэкспрессировалась в нейронах ЧС, на стороне введения отмечался
трехкратный рост количества микроглиоцитов как через 4, так и через 8 недель
после введения вектора (Рис.10).
Сравнение этих результатов с данными об интенсивности экспрессии Асин
(рис.8)
и
гибели
ДА
нейронов
в
ЧС
(рис.4)
в
аналогичных
экспериментальных условиях позволяет говорить о наличии корреляции между
72
уровнем экспрессии А-син в ДА нейронах и интенсивностью микроглиоза в
области введения вектора. Важно отметить, что увеличение количества
микроглиальных клеток, свойственное для нейровоспалительного процесса,
наблюдалось
до
начала
выраженной
нейродегенерации
ДА
нейронов.
Вышесказанное может свидетельствовать о провоспалительном эффекте
эндогенно гиперэкспрессируемого в нейронах А-син, которое проявляется до
начала нейрональной гибели.
Рис.10. Количество микроглиоцитов в ЧС крыс через 4 и 8 недель после
унилатерального введения рААВ ЗФР, рААВ А-син крысы и рААВ человека. ***Р<0,001 относительно контроля (стороны мозга противоположной стороне
введения).
Морфологические
изменения
микроглиоцитов
и
накопление
провоспалительных факторов в совокупности с дегенерацией ДА нейронов
черной субстанции описаны как у пациентов с БП, так и в различных моделях
паркинсон-подобных состояний у животных [Liberatore G.T. et al., 1999; Sherer
T.B. et al., 2003; McGeer P.L., McGeer E.G., 2006]. Так, в МРТР мышиной модели
БП обнаружено, что воспаление в ЧС является самоподдерживающимся
73
процессом, ведущим к нейродегенерации, а эксперименты с трансгенными
моделями животных, у которых индуцированное повышенное производство Асин вызывало нейродегенерацию и нейровоспаление, позволили предположить,
что нарушение метаболизма этого белка может запускать оба этих процесса
[McGeer P.L., McGeer E.G., 2008]. Является ли микроглиальная активация
следствием секреции аберрантных форм А-син во внеклеточное пространство
[Reynolds A.D. et al., 2009; Wersinger C., Sidhu A., 2006; Zhang W. et al., 2005 или
А-син запускает внутриклеточный каскад событий, ведущий к нейрональной
гибели, и лишь последнее вызывает микроглиальную реакцию, до сих пор
является предметом научных споров.
Сравнение наших данных о падении количества ДА-нейронов у животных
с
рААВ
индуцированным
гипепроизводством
А-син
и
интенсивности
микроглиоза позволяет видеть, что в области введения вектора интенсивный
микроглиоз
и
повышение
экспрессии
МНС
II
глиальными
клетками
предшествует нейродегенерации. Это наблюдение лежит в русле представлений
о способности нейронов секретировать А-син во внеклеточную среду, вероятно,
со скоростью, пропорциональной концентрации продуцируемого белка в
нейронах.
74
Рис.11 Лазерная конфокальная микроскопия ЧС крыс через 8 недель после
унилатерального введения в нее рААВ ЗФБ (контроль), рААВ крысы и рААВ Асин человека. А-син (синее окрашивание), МНС II (красное окрашивание), Длина
линии = 600 мкм.
3.6. Изменение фенотипа активированных микроглиоцитов зависит от
интенсивности нейродегенерации
Иммуногистохимическое исследование срезов мозга продемонстрировало
не только
увеличение
количества
микроглиальных
клеток
в
области
нейрональной гиперпродукции А-син, но и значительные морфологические
изменения в них.
Для покоящейся формы микроглиоцитов (тип А),
локализованной в ЧС контрольной стороны мозга, характерны небольшие
размеры клеточной сомы и тонкие ветвящиеся отростки (рис.12а). В области
мозга с гиперэкспрессией А-син обнаруживались два основных клеточных типа
активированных микроглиоцитов. Первый (тип Б) характеризовался более
интенсивной экспрессией иммунореактивного МHC II, увеличением размеров
тела, укорочением и утолщением отростков (рис.12б). Второй тип (тип В)
75
представлял собой большие неправильной формы клетки, внешне сходные с
фагоцитирующими макрофагами (рис.12в).
Количественный
подсчет
каждого
из
идентифицированных
микроглиальных типов на различных сроках эксперимента (рис.13) и его
сопоставление с результатами подсчета дегенерирующих ДА нейронов (рис.4)
позволяет
говорить
о
наличии
корреляции
между
интенсивностью
нейродегенеративного процесса в ЧС и появлением микроглиоцитов с
«макрофагальным» цитофенотипом. Логично полагать, что предварительно
активированные в результате гиперпродукции А-син микроглиальные клетки
приобретают макрофагальный фенотип и функции при появлении дебриса,
остающегося от погибающих нейронов.
Рис.12.
Конфокальная
лазерная
микроскопия
микроглиоцитов,
экспрессирующих MHC II (зеленое окрашивание) в покое (а), и на разных этапах
активации (типы б и в). Красное окрашивание – иммунопозитивные к
везикулярному моноаминовому транспортеру ДА-эргические нейроны. Длина
линии=10 мкм.
76
Рис.13. Относительное количество различных типов микроглиоцитов в
ЧС через 4 (4н) и 8 (8н) недель после унилатерального введения рААВ ЗФР, рААВ
А-син крысы и рААВ человека в эту область мозга.
3.7.
Индукция
дофаминергических
повышенной
нейронах
экспрессии
черной
уровней
А-син
субстанции
в
вызывает
гиперэкспрессию глиального кислого фибриллярного белка в астроцитах
Введение рААВ А-син человека и рААВ А-син крысы в область ЧС
вызывает увеличение количества астроцитов (рис.14) и усиление экспрессии
ими глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) (рис.15).
Сопоставление этого наблюдения с вышеприведенными данными о
качественных и количественных изменениях микроглиоцитов на разных сроках
эксперимента позволяют говорить о схожем характере реакции астроцитов и
микроглиоцитов ЧС на гиперэкспрессию А-син (глиозе и активации), что может
свидетельствовать
о
вовлеченности
астроцитарной
глии
в
процесс
нейровоспаления.
Вопрос о механизмах активации астроцитов в нашей модели остается
открытым. Есть сообщения о том, что А-син может прямо активировать не
77
только микроглиоциты, но и астроциты, о чем авторы судили по интенсивности
экспрессии ими IL-6 и ICAM-1 [Klegeris A. et al., 2006].
Рис.14. Количество астроцитов в ЧС крыс через 4 и 8 недель после
унилатерального введения рААВ ЗФР, рААВ А-син крысы и рААВ человека. *** Р<0,001 относительно контроля (контрлатеральной стороны мозга).
IL-6 усиливает воспалительную реакцию, стимулируя клетки иммунной
системы
и,
при
соответствующем
микроокружении,
может
быть
нейротоксичным [Gadient R.A., Otten U.H., 1997; Wang J. Et al., 2002]. Вместе с
тем
показано,
что
провоспалительные
цитокины
микроглиального
происхождения, в частности, IL-1, способствует активации астроцитов, ведущей
к астроглиозу [John G.R. et al., 2004]. Кроме того, IL-1 вызывает гипертрофию
клеточных ядер и экспрессию астроцитами межклеточной адгезионной
молекулы-1 (ICAM-1) [Kyrkanides S. et al., 1999; Albrecht P.J. et al., 2002] и ГФКБ
[Balasingam V. et al., 1994; Lee E.J et al., 2010]. Подтверждают это наблюдение
и данные о сниженной астроцитарной реактивности у мышей, лишенных IL-1
рецепторов [Herx L.M. et al., 2000].
Также IL-1 дозозависимым образом ингибирует поглощение астроцитами
глутамата, что ведет к его накоплению во внеклеточной среде и вызывает
78
сверхвозбуждение нейронов [Hu S. et al.,
2000; Balasingam V. et al., 1994].
Вместе с тем показано, что IL-1 активирует в астроцитах защитные механизмы,
например, синтез ими NGF и TGF-β как на генном, так и протеиновом уровне,
которые, как известно, способствуют восстановлению ЦНС [Jauneau A.C. et al.,
2006].
Логично полагать, что наблюдаемый нами астроглиоз является реакцией
на первоначальную активацию со стороны микроглиальных клеток, однако
требуются
дополнительные
исследования,
чтобы
судить
о
про-
или
противовоспалительном характере наблюдаемой астроцитарной реакции.
Рис.15. Лазерная конфокальная микроскопия ЧС крыс через 8 недель после
унилатерального введения в нее рААВ ЗФБ (контроль), рААВ крысы и рААВ Асин человека. А-син (синее окрашивание), ГФКБ (глиальный фибриллярный
кислый белок; красное окрашивание). Длина линии= 600 мкм.
79
3.8.
Индукция
дофаминергических
повышенной
нейронах
экспрессии
черной
уровней
субстанции
А-син
в
сопровождается
сосудистой реакцией и инфильтрацией лимфоцитов в область введения
вектора
Помимо увеличения количества астроцитов в ответ на индуцированную
гиперэкспрессию в нейронах ЧС А-син человека в области введения вектора в
исследованные сроки отмечалось значительное усиление интенсивности
свечения иммунореактивного глиального фибриллярного кислого белка в
отростках астроглиоцитов, контактирующих с кровеносными сосудами (рис.
16а).
Рис.16.
Интенсивное
свечение
иммунореактивного
глиального
фибриллярного кислого белка в отростках астроцитов, контактирующих с
кровеносными сосудами, в ЧС через 8 недель после введения рААВ А-син человека
(а), сочетаемое с накоплением в кровеносных сосудах и периваскулярных
инфильтратах клеток с лимфоцитарным фенотипом (выделены стрелками) на
серийных срезах, окрашенных крезиловым фиолетовым (б). Звездочкой
обозначен просвет сосуда. Длина линии= 100 мкм.
Это
наблюдение
может
свидетельствовать
о
значительных
функциональных изменениях гематоэнцефалического барьера в описываемых
экспериментальных условиях.
Примечательно, что окраска последующих
80
серийных
срезов
мозга
крезиловым
фиолетовым
продемонстрировала
значительные морфологические изменения в таких сосудах. Они отличались
увеличенным диаметром, накоплением в просвете и в непосредственной
близости от стенки небольших клеток с округлым ядром и узким ободком
цитоплазмы, фенотип которых был схож с лимфоцитарным (рис.16б). Ранее
исследователями
было
показано,
что
микроглиальная
активация
в
повреждаемых областях мозга ведет к локальному повышению пропускной
способности ГЭБ и инфильтрации в эти области лимфоцитов [Racke M.K. et al.,
2000]. Значительная лимфоцитарная инфильтрация в ЧС наблюдается и при
гиперэкспрессии в нейронах этой области А-син на стадии, предваряющей
нейродегенерацию [Theodore S. et al., 2008]. Недавние исследования показали,
что инфильтрирующие нервную ткань T-клетки оказывают повреждающее
действие на нейроны посредством экспрессии FasL [Brochard V. et al., 2009].
Основываясь на результатах, показывающих, что FasL запускает продукцию
провоспалительных цитокинов макрофагами [Park D.R. et al., 2003], авторы
полагают, что CD4+ Th FasL-опосредованная активация микроглиоцитов может
участвовать в усилении нейровоспаления и нейродегенерации при БП [Brochard
V. et al., 2009].
Подводя итог описанию морфофункциональных изменений черной
субстанции,
можно
векториндуцированной
сделать
вывод,
дегенерации
что
нейронов,
используемая
более
полно
модель
и
точно
воспроизводит молекулярные механизмы этого заболевания по сравнению с
известными на сегодняшний день [Козина Е.А. и др., 2010].
3.9.
Интраперитонеальное
введение
кортикостерона
снижает
интенсивность гибели дофаминергических нейронов, индуцированной
введением в дофаминергические нейроны рекомбинантного гена А-син
человека.
Подсчет ДА-нейронов в группе животных с трансфецированным геном Асин
человека,
получавших
регулярные
инъекции
кортикостерона,
продемонстрировал его выраженный нейропротективный эффект (рис.17):
81
количество выживших нейронов через 8 недель после переноса увеличивалось
от 12,6±8,2% (у не получавших гормон) до 48,9±12,6% (P<0,01).
Рис.17. ТГ-иммунопозитивные нейроны в ЧС крыс через 8 недель после
инъекции в ЧС рААВ ЗФР (а), рААВ А-син человека (б) и рААВ А-син человека с
интраперитонеальным введением кортикостерона (в). ВТО – вентральная
тегментальная область; ЧСк - компактная часть черной субстанции; ЧСр –
ретикулярная часть черной субстанции. Длина линии=500 мкм.
Гормональная терапия животных с введением в ЧС рААВ А-син человека
через 8 недель эксперимента не приводила к изменению концентрации А-син в
пробах ипсилатерального стриатума по сравнению с животными, не
получавшими инъекции кортикостерона, но вызывала достоверное снижение
падения в них уровня ТГ (рис.6).
Полученные результаты свидетельствуют о нейропротективном эффекте
вводимого глюкокортикоида. Это наблюдение согласуется с результатами
экспериментов, установивших, что кортикостерон оказывает выраженный
нейропротективный эффект, который опосредуется ингибированием активности
микроглиальных клеток [Sugama S. et al., 2009; Sugama S. et al., 2013] за счет
подавления экспрессии ими провоспалительных цитокинов [Sapolsky R.M. et al.,
2000].
Вместе с тем, нельзя отрицать возможности того, что действие
кортикостерона
может
быть
как
ингибирования
провоспалительной
прямым,
в
активности
виде
непосредственного
микроглиоцитов,
так
и
опосредованным через ингибирование клеточного и гуморального ответа
82
иммунной системы и/или снижении реактивных изменений клеток стенки
кровеносных сосудов.
3.10 Унилатеральное введение ЛПС и А-син в ЧС индуцирует в
области
введения
нейровоспаление
(активацию
микроглиоцитов
и
астроцитов, сосудистую реакцию и инфильтрацию лимфоцитов), но не
вызывает выраженной нейродегенерации
Рис.18. Серийные срезы ЧС интактной (контрольной) стороны мозга и
стороны введения ЛПС, меченные антителами к тирозингидроксилазе (ТГ),
альфа-синуклеину (А-син) и окрашенные крезиловым фиолетовым (КФ). ВТО –
вентральная тегментальная область; ЧСк - компактная часть черной
субстанции; ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции. Длина линии=500
мкм.
83
Через 8 недель после инъекции ЛПС (рис.18) и А-син в область ЧС
наблюдалось
уменшение
количества
ДА-нейронов,
не
достигающее
статистически значимого уровня по отношению к контролю (контрлатеральной,
интактной
стороне).
морфофункциональных
Вместе
с
изменений
тем,
мы
нервной
обнаружили
ткани
в
целый
области
ряд
ЧС,
свидетельствующих о провоспалительной активации микроглиоцитов и
нарушениях
обмена
А-син
в
ДА
нейронах.
Введение
стерильного
физиологического раствора не вызывало подобных изменений.
Иммуногистохимическое исследование срезов с использованием антител
против молекул МНС II продемонстрировало увеличение в ЧС количества
клеток, интенсивно экспрессирующих этот маркер (+ 178,2±24,2% (P<0,01)
после введения ЛПС и +168,5±32,3% (P<0,01) после введения А-син
относительно контрольной стороны). Зачастую активированные микроглиоциты
образовывали плотные скопления вблизи ДА нейронов (рис.19).
Рис. 19. Скопление микроглиоцитов, интенсивно экспрессирующих MHC II
(зеленое окрашивание) вблизи ДА-нейронов ЧС (красное окрашивание) через 8
недель после введения ЛПС в ЧС. Длина линии = 50 мкм.
84
Как после введения ЛПС, так и после введения А-син в ЧС увеличивалось
количество
клеток,
интенсивно
экспрессирующих
глиальный
кислый
фибриллярный белок (+255,2±43,2% (P<0,01) после введения ЛПС и +272,2±44%
(P<0,001) после введения А-син), что свидетельствовало о реактивном
астроглиозе, сохраняющемся в нервной ткани через 8 недель после однократной
инъекции растворов (рис. 20).
Рис. 20. Увеличение количества и интенсивности мечения клеток,
иммунореактивных к глиальному фибриллярному кислому белку через 8 недель
после унилатерального введения стерилного физиологического раствора (а) и
ЛПС(б) в ЧС. ЧСк – компактная часть черной субстанции; ЧСр – ретикулярная
часть черной субстанции. Длина линии = 250 мкм.
Хорошо известно, что астроциты ярко реагируют на нарушения гомеостаза
нервной ткани, например, в случаях проникновения инфекции, воспаления,
ишемии, механического повреждения или появления в межклеточной среде Асин [Gu X.L. et al., 2010; Hamby M.E., Sofroniew M.V., 2010; Barreto G.E. et al.,
2011; Xiong X. et al., 2011; Adelson J.D. et al., 2012]. Этот процесс, как в нашем
эксперименте,
сопровождался
характерными
молекулярными
и
морфологическими изменениями, которые включали в себя гипертрофию
клеточных тел и глиальных отростков, повышение экспрессии ГФКБ и других
белков:
виментина,
нестина,
тенасцина-С,
протеогликанов [Alvarez J.I. et al., 2013].
хондроитин
сулфатных
85
Таким образом, можно видеть, что появление в межклеточной среде
экзогенно вводимых эндотоксина и А-син вызывает длительно сохраняющуюся
активацию глиальных клеток. Это наблюдение подтверждает ранее полученные
данные о том, что введение токсинов, таких как А-син, ЛПС, гербициды и
пестициды (ротенон, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) индуцирует
как астроглиоз, так и микроглиоз, которые сопровождаются митохондриальной
дисфункцией и ядерной фрагментацией нейронов и их последующей гибелью
[Langston J.W. et al., 1999; Samantaray S. et al., 2007; Niranjan R. et al., 2010]. Тот
факт, что введение ЛПС в мозг повышает уровень экспрессии микроглиальными
клетками индуцибильной нитроксидсинтазы позволяет предполагать, что
хроническая глиальная активация может вызывать повреждение и гибель
нейронов посредством индукции в них окислительного стресса. Установлено,
что
свободнорадикальный
растворимый
газ
монооксид
азота
легко
диффундирует через нейрональную мембрану, индуцирует окисление липидов,
повреждение ДНК и ингибирует метаболизм митохондрий [Sugaya K. et al., 1998;
Hirsch E.C. et al., 2003; de Oliveira D.M. et al., 2011]. Кроме того, секретируемые
микроглиальными клетками цитокины (TNF-α, IL-1β, IL-6) и интерферон-γ,
связываясь со специфическими рецепторами на нейронах ЧС, способны
активировать каспазы 3 и 8, цитохром-С, которые играют ключевую роль в
проапоптозном сигнализировании [Hirsch E.C. et al., 2003; Rappold P.M., Tieu K.,
2010].
Важно отметить, что активация микроглиоцитов и астроцитов происходит
на
разных
стадиях
нейродегенеративных
заболеваний.
В
модели
экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) микроглиоциты
пролиферирует на начальной стадии, в то время как астроциты начинают
реагировать позже – на стадии восстановления [Matsumoto Y. Et al., 1992]. При
болезни Альцгеймера астроцитарная активация также наблюдается после
активации микроглиоцитов [Gahtan E., Overmier J.B., 1999]. Сходным образом
астроциты активировались вслед за микроглиальными клетками в эксперименте
с введением в мозг крысы типичных для болезни Альцгеймера амилоидных
86
бляшек человека [Frautschy S.A. et al., 1998] и нейротоксина триметилина
[McCown T.J. et al., 1996; Reali C. et al., 2005], а также при моделировании
нейропатической боли [Colburn R.W. et al., 1997]. На основании этих наблюдений
сформировалось
мнение
о
том,
что
активированные
микроглиоциты
способствуют активации астроцитов посредством секреции провоспалительных
цитокинов, среди которых интерлейкин-1 (IL-1) играет ключевую роль [John
G.R. et al., 2005].
Важно отметить, что существуют сложные взаимодействия между
активированными микроглиоцитами и астроцитами. Астроциты играют
двойную роль в процессе нейровоспаления и способны не только усиливать его,
но и оказывать ингибиторное влияние на активированные микроглиальные
клетки (возможно, посредством секреции трансформирующего фактора ростабета (TGF-β) [Ramírez G. et al., 2005]. Остается открытым воспрос о том, как
сосуществуют
два
противоположных
эффекта.
Вероятно,
степень
и
длительность индуцирующей микроглиальной активации играет решающую
роль. Если воспалительные стимулы очень сильны и действуют длительное
время, астроциты теряют способность ингибировать микроглиоциты [von
Bernhardi R., Eugenín J. 2004; von Bernhardi R. et al., 2007]. Этот вывод позволяет
нам предполагать, что наблюдаемая нами через 8 недель эксперимента высокая
астроцитарная активность не только не ингибирует провоспалительную
активность микроглии, но, возможно, и участвует в поддержания такого ее
состояния.
Наше исследование строения нервной ткани в области введения ЛПС или
А-син продемонстрировало наличие характерных для нейровоспалительного
процесса изменений: выраженный глиоз, увеличение диаметра кровеносных
сосудов со значительным содержанием как в просвете, так и в непосредственной
близости от них клеток с лимфоцитарным фенотипом (рис.21).
87
Рис.21. Морфологические изменения ткани ЧС через 8 недель после
введения стерильного физиологического раствора (а) и А-син человека (б).
Стрелками выделены расширенные сосуды, содержащие большое количество
клеток с лимфоцитарным фенотипом. Окраска: крезиловый фиолетовый.
Обозначения: ЧСк – компактная часть черной субстанции; ЧСр – ретикулярная
часть черной субстанции. Длина линии= 100 мкм.
Наблюдаемые реактивные изменения структуры сосудов в области
введения
фармакологических
агентов
сходны
с
ранее
описанными
структурными перестройками, обнаруживаемыми как в мозге страдающих БП,
так и в моделях этой болезни у животных [Winikates J. et al., 2009; Al-Bachari S.
et al., 2013; Sarkar S. et al., 2014; Guan J. et al., 2013]. Высказано предположение
о том, что эти изменения вносят свой негативный вклад в развитие
нейровоспаления и индукцию нарушений функций мозга [Korczyn A.D. 2005].
Наше
иммуногистохимическое
исследование
позволило
выявить
феномен драматического повышения экспрессии в клетках стенки сосудов и
периваскулярной
области
фактора
некроза
опухоли
(TNF-α),
которое
сохранялось в области ЧС через 8 недель после однократной инъекции ЛПС и Асин (рис.22).
88
Рис.22. Экспрессия иммунореактивного фактора некроза опухоли-α в
периваскулярных клетках ЧС через 8 недель после введения в эту область
стерильного физиологического раствора (а) и ЛПС (б). Сплошными тонкими
стрелками выделены клетки сходные с морфологией микроглиоцитов,
контурными стрелками - клетки с морфологией перицитов.
Звездочками
обозначен просвет сосудов. Длина линии = 80 мкм.
Иммунореактивные к фактору некроза опухоли клетки в стенке сосудов
имели вытянутую форму с отростками, ориентированными по окружности
сосуда. Такая форма и тот факт, что они не контактировали с внутренним
просветом сосуда, позволяет предполагать, что данные клетки являлись
перицитами.
Известно, что периваскулярные клетки вовлекаются в процессы
нейровоспаления [Paul G. et al., 2012; Alcendor D.J. et al., 2012; ElAli A. et al.,
2014]. В ответ на инфицирование, стимуляцию ЛПС и цитокинами они сами
начинают синтезировать хемокины, провоспалительные цитокины, в том числе
и TNF-α [Jansson D. et al., 2014; Alcendor D.J. et al., 2012].
Особенно интересным представляется обнаружение вокруг сосудов клеток
с
высокой
экспрессией
TNF-α,
морфология
которых
соответствовала
микроглиальному фенотипу. Как известно, активированные микроглиоциты
способны синтезировать наряду с другими провоспалительными цитокинами и
фактор некроза опухолей [Gayle D.A. et al., 2002]. Тесное пространственное
89
расположение вышеописанных клеточных типов позволяет предполагать
наличие
взаимных
стимулирующих
влияний,
опосредуемых
провоспалительными цитокинами.
Остается открытым вопрос – что вызывает наблюдаемые изменения в
экспрессии TNF-α микроглией и перицитами? В случае введения в черную
субстанцию ЛПС очевидно, что действие эндотоксина на микроглиоциты может
быть
опосредовано
действием
CD14
(гликозилфосфатидилинозитол
-
связывающего белка) на цитоплазматической мембране. Как установлено,
комплекс ЛПС-CD14 транспортируется к Толл-подобному (Toll-like) рецептору
TLR4 с последующей олигомеризацией и запуском сигнального пути,
активирующего ядерный транскрипционный фактор-каппа В (NF-kВ), который,
в свою очередь, вовлечен в стимуляцию синтеза провоспалительных цитокинов
[Laflamme N., Rivest S., 2001; Caso J.R. et al., 2007]. Важно отметить, что
аналогичный
сигнальный
NF-κB
путь
провоспалительного
ответа,
опосредуемый активацией TLR4, описан и в перицитах [Guijarro-Muñoz I. et al.,
2014].
В случае введения в область черной субстанции А-син логично полагать,
что первоначально активируются микроглиальные клетки, которые, синтезируя
провоспалительные цитокины, в свою очередь, индуцируют активацию
перицитов.
В
пользу
экспериментальных
этого
предположения
исследований,
свидетельствуют
показавших
феномен
данные
активации
микроглиальных клеток под воздействием А-син [Zhang W. et al., 2005; Lee S.B.
et al., 2009]. Между тем, в доступной нам литературе мы не обнаружили
свидетельств о возможности прямого стимулирующего воздействия А-син на
перициты. Действие А-син на перициты может быть опосредовано не только
микроглиоцитами, но и эндотелиальными клетками, с которыми перициты
формируют щелевидные контакты. Известно, в частности, что экзогенный А-син
негативно регулирует везикулярный трафик эндотелиальных клеток [Kim K.S. et
al., 2010].
90
Иммуногистохимическое окрашивание срезов на общий лимфоцитарный
маркер (CD3) подтвердило феномен интенсивной миграции лимфоцитов из
циркуляции в ЧС после введения в эту область как ЛПС, так и А-син (рис.23).
При этом инъекция стерильного физиологического раствора не вызывала
подобных лимфоцитарных реакций. Двойная иммуногистохимическая окраска
позволила выявить в ядрах части лимфоцитов, мигрировавших в нервную ткань,
транскрипционный фактор FoxP3, являющийся маркером регуляторной
популяции лимфоцитов (Т-рег), активность которых, как свидетельствуют
данные литературы, направлена на ингибирование воспалительного процесса.
Рис.23
Двойное
иммуногистохимическое
окрашивание
клеток,
экспрессирующих лимфоцитарные маркеры CD3 (красное окрашивание) и FoxP3
(зеленое окрашивание), в области ЧС крыс через 8 недель после введения в нее
ЛПС. Часть клеток демонстрирует солокализацию маркеров (выделены
стрелками). Звездочкой обозначен просвет сосуда. Длина линии = 50 мкм.
Ранее было показано, что Т-рег способны мигрировать в область
нейровоспаления и через прямое взаимодействие с локальной глией снижать
нейровоспаление и, таким образом, оказывать нейропротекцию. В частности, Трег могут супрессировать нейровоспаление, опосредованное микроглиоцитами,
91
посредством снижения производства в них реактивных форм кислорода и
активности NF-κB, а также индуцировать Fas-FasL – опосредованный апоптоз
активированных микроглиоцитов [Kipnis J. et al., 2004; Reynolds A.D. et al., 2007;
Liu J. et al., 2009; Reynolds A.D. et al., 2009; Reynolds A.D. et al., 2009]. На фоне
значительного увеличения количества лимфоцитов, инфильтрирующих нервную
ткань в области введения ЛПС или А-син, относительно интактной стороны
мозга (контроля) нами не было отмечено значительных отличий как в общем
количестве, так и в количестве тканевых FoxP3-иммунопозитивных лимфоцитов
между сравниваемыми экспериментальными группами на всех изученных
сроках эксперимента (рис.24).
Рис.24 Количество клеток, экспрессирующих лимфоцитарный маркер
CD3 в ЧС крыс через 8 недель после унилатерального введения в эту область
стерильного
физиологического
липополисахарида
(ЛПС)
и
раствора
(СФР),
альфа-синуклеина
бактериального
(А-син).
***-Р<0,001
относительно контроля (контрлатеральной стороны мозга).
В этой связи важно отметить, что ранее на МРТР мышиной модели БП
было продемонстрировано, что специфические к А-син регуляторные клетки (Трег),
инфильтрирующиеся
в
нервную
ткань,
ингибируют
активность
аутоагрессивных Т-клеток, и, вероятно, могут снижать интенсивность
нейродегенерации, характерной для БП [Roodveldt C. et al., 2010].
Таким
образом,
свидетельствующие
о
сопоставляя
супрессивном
вышеприведенные
влиянии
Т-рег
на
данные,
участников
92
нейровоспалительного процесса, с результатами нашего эксперимента о том, что
введение А-син и ЛПС не вызывает дегенерацию нейронов, но индуцирует
нейровоспаление,
характеризующееся
повышенным
содержанием
инфильтрирующих нервную ткань регуляторных клеток, можно предположить,
что в наших экспериментальных моделях с введением ЛПС и А-син
регуляторное звено адаптивного иммунитета оказывает существенную роль в
смещении баланса между нейродегенеративными и нейропротекторными
механизмами воспаления в пользу последних.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что введение в ЧС
как ЛПС, так и А-син способно вызывать в этой области длительно
персистирующее нейровоспаление, обеспечиваемое активацией целого ряда
клеточных типов: перицитов, микроглиоцитов и астроцитов.
Важно отметить, что А-син вне зависимости от способа его повышения
(эндогенного или экзогенного) индуцировал нейровоспаление. Известно, что
гиперэкспрессия альфа-синуклеина в культивируемых нейронах сопровождается
его внеклеточным высвобождением [Sung J.Y. et al., 2005]. Получены
убедительные доказательства того, что мономерные и агрегированные молекулы
альфа-синуклеина могут секретироваться нетрадиционным, независимым от
эндоплазматической сети и комплекса Гольджи, экзоцитозным путем [Lee H.J. et
al., 2005]. Такая секреция усиливается при протеосомной и митохондриальной
дисфункции, которые причастны к этиологии БП. Растворимый альфасинуклеин обнаруживается во внеклеточных биологических жидкостях, включая
ликвор и плазму крови [Borghi R. et al., 2000; El-Agnaf O.M. et al., 2003; Lee H.J.
et al., 2005]. Секретированный А-син вызывает микроглиоцитарную активацию
[Zhang W., et al., 2005], которая в этих условиях интенсивно синтезирует IL-6, IL1, ICAM-1, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, O2-, iROS, и PEG2, а также глутамат и
становится нейротоксичной для сокультвируемых ДА-нейронов. [Roodveldt C. et
al., 2008]. Следует отметить, что сведения о провоспалительные эффектах
агрегированных форм А-син получены, главным образом, в культуре
микроглиоцитов [Cookson M.R. 2009; Reynolds A.D. et al., 2009; Thomas M.P. et
93
al., 2007; Zhang W. et al., 2007]. В ходе работ было обнаружено, в частности, что
нитрированный агрегированный А-син, который обнаруживается в тельцах Леви
страдающих БП [Giasson B.I. et al., 2000] имеет более мощное стимулирующее
влияние на микроглиальные клетки, чем нитрированный, но не агрегированный
А-син [Reynolds A.D. et al., 2009]. Однако, имеет ли внеклеточный А-син такие
же модификации, как и полимеризованный белок в тельцах Леви, остается до сих
пор неясным [Lee J.T. et al., 2008].
Следует отметить, что в последнее время появились сообщения о
способности не агрегированного А-син в условиях in vitro модулировать
активность микроглиоцитов [Roodveldt C. et al., 2010; Su X., Federoff H.J. 2009;
Su X. et al., 2008]. Было обнаружено, в частности, что, в отличие от
агрегированной формы, мономерный А-син усиливает фагоцитарную функцию
микроглиоцитов [Park J.Y. et al., 2008] и стимулирует продукцию ими TNF-α и
IL-1β [Lee E.J. et al., 2010]. Более тонкий анализ цитокинового репертуара,
высвобождаемого микроглиальными культурами в ответ на стимуляцию
нативным А-син или его мутантами, обнаруживаемыми у больных БП показал,
что
существуют
значительные
различия
между
ними
в
способности
индуцировать синтез цитокинов (IL-6, IL-1, IL-10) и хемокинов (IP-10/CXCL10,
RANTES/CCL5, MCP-1/CCL2 и MIP-1/CCL3) [Roodveldt C., et al., 2010].
Неагрегированные формы А-син индуцировали провоспалителный ответ в
степени от низкой до умеренной, в то время как A30P и E46K патологические
варианты индуцировали мощное повышение синтеза провоспалительных
цитокинов и хемокинов.
Из приведенных данных следует, что характер микроглиальной активации
в наших экспериментах с эндогенным повышением в нейронах ЧС синтеза А-син
и введением в эту область экзогенного А-син должны различаться.
Действительно, при общем характере наблюдаемых нами воспалительных
реакций, вызываемых эндогенным или экзогенным введением в нервную ткань
А-син, интенсивность проявлений была значительно выше в случае генного
переноса.
Логично
полагать,
что
в
случае
с
вектор-опосредованной
94
гиперпродукцией в нейронах А-син, которая, как известно, сопровождается
окислительным стрессом, пострансляционной модификацией и агрегацией
белка, во внеклеточную среду выводятся, соответственно, агрегированные и
модифицированные
формы
А-син,
обладающие
более
мощным
провоспалительным действием на микроглиалные клетки, нежели его нативная
форма, которую мы вводили экзогенно.
3.11 Унилатеральное введение липополисахарида в ЧС вызывает
дисфункцию А-син в ДА нейронах ЧС и дегенерацию синапсов в стриатуме
Через 8 недель после унилатерального введения ЛПС и А-син в ЧС в ДА
нейронах
достоверно
повышается
интенсивность
экспрессии
иммунопозитивного А-син по сравнению с нейронами контрольной группы с
введением СФР (рис. 26; 27).
Рис.26. Повышение экспрессии А-син в нейронах ЧС через 8 недель после
введения ЛПС (б) по сравнению с нейронами контрольной группы с введением
стерильного физиологического раствора (СФР)(а).
Обозначения: ЧСк –
компактная часть черной субстанции. Длина линии = 200 мкм.
95
Рис.27. Интенсивность свечения иммунореактивного А-син в нейронах ЧС
крыс
через
8
недель
после
унилатерального
введения
стерильного
физиологического раствора (СФР) и липополисахарида (ЛПС) в сравнении с
нейронами контрлатеральной стороны мозга (контроль).
***-Р<0,001
относительно контроля.
Двойная иммуногистохимическая окраска срезов мозга животных с
унилатеральным введением ЛПС в ЧС позволила сделать вывод о том, что
индукция повышенных уровней экспрессии А-син наблюдается, главным
образом, в ДА нейронах ЧС (рис.28).
Рис.28. Экспрессия иммунореактивной тирозингидроксилазы (а; зеленое
окрашивание) и А-син (б; красное окрашивание) в нейронах ЧС через 8 недель
после унилатерального введения ЛПС. Нейроны, в которых выявлена
солокализация маркеров (в), выделены стрелками. В последнем случае препарат
докрашивался DAPI для выявления клеточных ядер (синее окрашивание). Длина
линии = 10 мкм.
96
Электронномикроскопическое исследование показало, что нейроны
черной субстанции имеют небольшие размеры. Диаметр большинства нейронов
варьировал в пределах от 12 до 25 микрометров. Нейроны характеризовались
бледной цитоплазмой и свободно распределенными органеллами. Ядерная
мембрана, как правило, образовывала несколько глубоких инвагинаций.
Ядерный хроматин имел вид пылевидных зерен, не образовывавших крупных
агрегатов.
Отдельные
цистерны
гранулярной
эндоплазматической
сети
случайным образом распределялись по всей цитоплазме. Среди цистерн
гранулярной эндоплазматической сети локализовались в умеренном количестве
лизосомы и овальные митохондрии (рис. 29а).
Введение в черную субстанцию липополисахарида вызывало в нейронах
ряд структурных изменений. Площадь нейрональных тел увеличивалась,
кариоплазма
и
цитоплазма
характеризовалась
плотностью. В цитоплазме мы
обнаруживали
большей
электронной
значительно большее
количество митохондрий и лизосом по сравнению с контрольными животными,
причем лизосомы
на периферии цитоплазмы имели увеличенный объем и
неравномерную окраску содержимого (рис.29б). Параллельно ориентированные
цистерны гранулярной эндоплазматической сети занимали значительные
области в непосредственной близости от ядра. Ядрышки отличались высокой
электронной плотностью и увеличенным диаметром.
В
ряде
случаев
структурные
изменения
нейронов
приобретали
гипертрофированную форму – их характеризовали высокая электронная
плотность кариоплазмы и цитоплазмы, набухшие митохондрии, расширенные
перинуклеарные
пространства,
эндоплазматической сети (рис.30).
расширенные
цистерны
гранулярной
97
Рис.29. Ультраструктурные особенности нейронов черной субстанции
мозга крыс в контроле (а) и через 8 недель после введения в черную субстанцию
липополисахарида (б). Стрелками обозначены аксосоматические синапсы.
Обозначения: а – аксон; д – дендрит; гэс – гранулярная эндоплазматическая
сеть; л – лизосомы; м – митохондрии; мв – миелиновые волокна; я - ядро; яд –
ядрышко. Длина линии = 1 мкм.
98
Рис.30. Электронная микрофотография гипертрофированного нейрона
ЧС через 8 недель после введения в эту область ЛПС. Обозначения: тонкие
стрелки – набухшие митохондрии; толстые стрелки – расширенные
перинуклеарные
пространства;
звездочки
–
расширенные
цистерны
гранулярной эндоплазматической сети. Длина линии = 0,1 мкм.
В цитоплазме части нейронов мы обнаруживали достаточно крупные
цитоплазматические включения. Как правило, в их центре локализовался
аморфный
материал
умеренной
электронной
плотности,
окруженный
электронноплотными фибриллярными структурами (рис.31).
Количество нейронов с подобными включениями
общего числа нейронов черной субстанции.
составило 2,4% от
Важно отметить, что такие
включения не обнаруживались в гипертрофированных нейронах. Описанные
изменения свидетельствуют о том, что через 8 недель после однократного
введения в черную субстанцию эндотоксина нейроны находятся в состоянии
высокой функциональной активности, которая в ряде случаев сопровождается
образованием крупных цитоплазматических включений.
99
Рис.31. Цитоплазматическое включение в нейроне ЧС, обнаруженное
через 8 недель после введения в эту область липополисахарида (выделено
стрелкой). Обозначения: я – ядро; м – митохондрии. Длина линии = 0,3 мкм.
Сопоставление этих результатов с описанием клеточных маркеров
нейровоспалителительного
процесса
воспалительных
вызывает
факторов
позволяет
в
полагать,
нейронах
что
напряженную
действие
работу
синтетического аппарата, что, в ряде случаев, ведет к образованию
цитоплазматических включений.
Нейропиль стриатума в норме содержит значительное количество
небольших
по
диаметру
немиелинизированных
(0,15-0,25
волокон
с
мкм)
миелинизированных
преобладанием
последних.
и
В
пресинаптических окончаниях часто наблюдается большое количество светлых
пузырков, отличающихся разнообразной формой (от почти круглых до
вытянутых) со средним диаметром 500 А (рис. 32).
100
Рис.32.Структура нейропиля стриатума крысы в норме. Стрелками
обозначены синаптические контакты. Обозначения: а – аксон; д – дендрит; м
– митохондрия; мв – миелиновое волокно. Длина линии = 0,5 мкм
В аксональных окончаниях попадались и редкие везикулы с плотным
центром. Аксоны образовывали на дендритах симметричные синапсы, в которых
пре – и постсинаптическая мембраны имели умеренное утолщение (рис.33а).
Анализ состояния синаптических контактов контрольных и экспериментальных
животных показал, что нейровоспаление, индуцированное введением ЛПС в ЧС,
вызывало в стриатуме дегенерацию аксонов по «темному типу» (рис.33б).
Пресинаптические луковицы сжимались в объеме и приобретали неровную
форму.
Набухшие
митохондрии,
синаптические
пузырьки
и
матрикс
окрашивались в темный цвет. Число дегенерирующих аксонов от числа
неизмененных синаптических контактов, подсчитанное на стандартной площади
1280 мкм2, составило, в среднем, 4,8%.
Дегенерирующие аксональные
окончания образовывали синаптические контакты, главным образом, с
проксималными дендритами.
101
Рис. 33. Ультраструктура аксодендритных синапсов в норме (а) и
дегенерирующих
пресинаптических
окончаний
(б)
в
ипсилатеральном
стриатуме через 8 недель после унилатерального введения в черную субстанцию
мозга крыс. Стрелками обозначены синапсы. Обозначения: а – аксон; д –
дендрит; м – митохондрия. Длина линии = 0,5 мкм.
102
Описанные наблюдения позволяют говорить о том, что нейровоспаление,
индуцированное стереотаксическим введением в черную субстанцию ЛПС,
вызывает нейродегенеративные изменения синапсов в области проекции ДА.
Важно отметить, что, по данным литературы, дегенерация аксонов в зоне
проекций ДА нейронов ЧС является характерной особенностью ранней,
"продромальной" стадии болезни Паркинсона у человека [Galvin J.E. et al., 1999].
Последние
исследования
показали,
что
нарушение
аксонального
транспорта и дегенерация аксонов предшествует гибели нейронов и может быть
причиной прогрессирования нейродегенеративных заболеваний, таких как
Болезнь
Альцгеймера,
латеральный
амиотрофический
склероз,
болезнь
Гентингтона [Saha A.R. et al., 2004]. Ранее было показано, что гиперпродукция
А-син еще до манифестации гибели нейронов вызывает дистрофию аксонов,
дисбаланс белков микротрубочек, нейрофиламентов и актиновых филаментов,
участвующих в синаптической передаче и аксональном транспорте [Chung C.Y.
et al., 2009]. Тот факт, что аксонопатии и дефицит аксонального транспорта
наблюдаются в различных моделях БП и других нейродегенеративных
заболеваний [Szebenyi G. Et al., 2003; Stokin G.B. et al., 2005; Morfini G. et al.,
2007] показывает, что нарушение аксонального транспорта является ключевым
компонентом нейродегенеративных процессов. Таким образом, наблюдаемая
нами ЛПС-индуцированная дегенерация синапсов в зоне проецирования ДА
нейронов ЧС может быть следствием нарушения метаболизма синуклеина в
нейронах ЧС.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
103
Полученные нами данные и результаты исследований последних лет дают
основание
считать,
что
объяснение
патофизиологических
механизмов
нейродегенеративных заболеваний невозможно без учета важной роли в них
нейронального микроокружения. Функция и дисфункция мозга являются
результатом сложных сетевых взаимодействий между несколькими типами
клеток, таких как нейроны, астроциты, микроглия, эндотелиоциты и перициты.
Понимание этого в последнее время сместило фокус внимания исследователей
интегративных свойств ЦНС от нейронов и их сетей к функциональной
совокупности
клеток
различной
природы,
получившей
название
«нейроваскулярной единицы».
Эта концепция является логическим продолжением представлений о
влиянии
уровня
активации
нейронов
на
характер
гемодинамики
в
непосредственной близости от нейрона. Считается, что взаимодействие клеток в
описываемой нейроваскулярной единице ведет к адекватному снабжению
мозговой ткани кислородом, энергетическими и трофическими субстратами, при
этом адекватность обеспечения определяется не только и не столько общей
перфузией крови через мозг, сколько изменением кровотока в отдельных
участках мозговой ткани, имеющих в данный момент максимальную нейронную
активность.
Полученные нами данные позволяют расширить представление о
функциональной организации нервной ткани. Активность клеточных элементов
функционального
модуля
ЦНС,
который
логичней
назвать
нейроглиоваскулярной единицей, основывается на ключевой роли глии в
механизмах поддержания нейронального гомеостаза, которые направлены не
только на адекватное трофическое обеспечение жизнедеятельности нейронов, но
и на обеспечение протекции в условиях угрозы повреждения и гибели нейронов.
Помимо прямых контактов клетки такой единицы взаимодействуют друг с
другом посредством секретируемых факторов, формирующих позитивные и
негативные петли обратной связи (рис.34).
104
Рис.34.
Схема
клеточных
взаимодействий,
лежащих
в
основе
физиологических и патофизиологических механизмов нейроглиоваскулярной
единицы (объяснение в тексте).
Важно отметить, что роль каждого из участников и, соответственно,
ингибирующий или стимулирующий характер воздействия на окружающие
клетки не однонаправлены, а определяются степенью клеточной активации. Так,
например, микроглия и астроглия при умеренной активации продуцируют
нейропротективные ростовые факторы, однако, при высоком уровне активности
этих клеток происходит переключение на синтез провоспалительных цитокинов,
ускоряющих повреждение и гибель нейронов. Двухфазный характер реакции
резидентов функциональной микросистемы определяет доминирование про- или
противовоспалительных
клеточных
механизмов,
и,
соответственно,
репаративных или дегенеративных воздействий на нейроны. Следует отметить,
что на характер этих влияний оказывает существенное влияние и баланс
эффекторных (Эфф) и регуляторных (Рег) популяций лимфоцитов, которые
представляют в описываемой клеточной системе транзиторные элементы.
105
Принятие концепции интегральной нейроглиоваскулярной системы
позволяет по-новому взглянуть на патофизиологические механизмы, лежащие в
основе нейродегенеративных заболеваний, таких как БП. Ключевым событием
этих патофизиологических процессов является провоспалительная активация
микроглии. На сегодняшний день выявлен достаточно широкий спектр
факторов, способных инициировать провоспалительную активацию, в числе
которых гербициды, пестициды, наркотики, эндотоксины, психологический
стресс, А-син. Мы впервые показали, что секретируемые микроглиальными
клетками провоспалительные факторы усиливают в нейронах синтез А-син,
повышенный уровень которого обладает нейротоксическим эффектом. В свою
очередь, нейроны, в которых повышена экспрессия А-син, секретируют его в
окружающую
среду
и
активируют
микроглиоциты.
Таким
образом,
нейровоспаление и дисфункция альфа-синуклеина усиливают друг друга в
процессе дегенерации дофаминергических нейронов.
Важно отметить, что помимо этого активированная микроглия способна
стимулировать астроглию, перициты и эндотелиоциты, провоцируя тем самым
сосудистую реакцию и миграцию в нервную ткань мононуклеаров. Перициты,
астроциты и эндотелиальные клетки, в свою очередь, способны синтезировать
хемокины и цитокины, способные поддерживать микроглиоциты в состоянии
провоспалительной
активации.
Накапливаются
свидетельства
того,
что
секретируемый нейронами А-син может непосредственно активировать
астроглию и перициты. Таким образом, наличие нескольких перечисленных
патофизиологических самоподдерживающих циклов обеспечивает хронический
характер нейровоспаления.
Становится очевидным, что поиск новых подходов в формировании
нейропротективной терапии болезни Паркинсона должен рассматривать в
качестве терапевтической мишени интегральную нейро-глиально-сосудистую
систему. В контексте выявленной роли нейровоспаления, как ключевого
компонента нейродегенеративного процесса, это может означать, например,
проведение противовоспалительной терапии, направленной на ингибирование
активности микроглиоцитов и/ или активацию регуляторного звена иммунной
системы, либо активацию синтеза астроцитами ростовых факторов.
106
ВЫВОДЫ
1. Вектор-индуцированный
синтез
альфа-синуклеина
человека
в
дофаминергических нейронах черной субстанции крыс через 8 недель
после переноса соответствующего гена вызывал их гибель (-87,4±8,2%;
Р<0,001, относительно контроля) и нейровоспаление, о котором
свидетельствовало
достоверное увеличение в черной субстанции
количества микроглиоцитов (+210,8±16,3%; Р<0,001) и астроцитов
(+202,9±12,8%; Р<0,001), а также миграция в эту область лимфоцитов из
кровеносного русла.
2. Выявлены видовые различия в нейротоксичности гиперпродуцируемых в
дофаминергических нейронах альфа-синуклеина человека и крысы.
Гибель нейронов через 4 и 8 недель после вектор-опосредованного
переноса в нейроны гена альфа-синуклеина человека была достоверно
более выраженной (на 31,7±14,4%; Р<0,01 и 49,6±10,6%; Р<0,01,
соответственно),
чем
дегенерация
вызываемая
повышенным
производством в них альфа-синуклеина крысы.
3. Интраперитонеальное введение кортикостерона крысам
индуцированной
гибелью
нейропротективный
дофаминергических
эффект,
повышая
нейронов
количество
с
вектор-
оказывало
выживших
дофаминергических нейронов с 12,6±8,2% (у не получавших гормон) до
48,9±12,6% (P<0,01).
4. Экзогенный альфа-синуклеин человека, вводимый в черную субстанцию
крыс, индуцировал нейровоспаление, о котором свидетельствовали
увеличение количества микроглиоцитов и астроцитов (на 168,5±32,3% и
155,2±43,2%,
соответственно),
сосудистая
реакция
и
миграция
лимфоцитов в паренхиму мозга.
5. Нейровоспаление,
индуцированное
введением
липополисахарида
в
область черной субстанции крыс, вызывало достоверное повышение в
дофаминергических нейронах экспрессии иммунопозитивного альфасинуклеина (+98,6±33,4%, P<0,01), накопление в
их цитоплазме
электронноплотных включений и дегенерацию 4,8% синаптических
окончаний в ипсилатеральном стриатуме.
107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Бунеева О.А. , Медведев А.Е. Нарушение функций митохондрий при
болезни паркинсона.// Биомедицинская химия. 2011. Т. 57, № 3. С. 246-281.
2.
Голубев В. Л., Левин Я. И., Вейн A. M. Болезнь Паркинсона и
синдром паркинсонизма. М.: МЕДпресс, 1999. 416 с
3.
Доценко В.Л. Воспаление (глава 4) // Клиническая биохимия:
Учеб.пособие для вузов / Под ред. Акад. В.А.Ткачука. М.: ГЭОТАР- Медиа,
2002. С.232-262.
4.
Козина Е.А., Хаиндрава В.Г., Кудрин В.С.,Кучеряну В.Г., Клодт
П.Д., Бочаров Е.В., Раевский К.С., Крыжановский Г.Н., Угрюмов М.В.
Экспериментальное
моделирование
функциональной
недостаточности
нигростриатной дофаминергической системы у мышей // Российский
Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2010. Т.96, №3. С. 270- 284.
5.
Крыжановский Г.Н., Карабань И. Н., Магаева С. В., Кучеряну В. Г.,
Карабань Н. В. Болезнь Паркинсона (этиология, патогенез, клиника,
диагностика, лечение, профилактика). М.: Медицина, 2002. 336с.
6.
Кулинский В.И. Биохимические аспекты воспаления // Биохимия.
2007. Т.27, вып.6. С.739-746.
7.
Левин О.С., Федорова Н.Ф., Шток В.Н. Дифференциальная
диагностика паркинсонизма // Журн. Неврологии и психиатрии. 2003. Т. 103,
№2. С.54 – 60.
8.
Литвиненко И.В. Болезнь Паркинсона. М.: Миклош, 2010. 216с.
9.
Пискунов А. К. Биомаркеры нейровоспаления. // Нейрохимия. 2010.
Т. 27, № 1. С. 63-73.
10.
Пчелина С.Н. Альфа-синуклеин как биомаркер болезни Паркинсона
// Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2011. Т. 5, № 4. С.46
– 52.
108
11.
Судаков Н.П., Бывальцев В.А. Никифоров С.Б. Дисфункция
митохондрий при нейродегенеративных заболеваниях. // Журнал неврологии
и психиатрии. 2010. №8. С. 87–91.
12.
А.К.,
Хаиндрова В.Г, Ершов П.В., Анциперов В.Е., Обухов Ю.В., Анаев
Угрюмов
дофаминергических
М.В..
Оптимизация
нейронов
в
черной
количественного
субстанции
у
анализа
мышей
при
моделировании болезни Паркинсона. // Цитология. 2010. Т. 52, №6. С. 423430.
13.
Черешнев В.А. Иммунные механизмы воспаления // АДАИР. 2005.
Т.6, №5. С.154-155.
14.
Черешнев В.А., Фролов Б.А., Беляева Н.М., Гусев Е.Ю., Панфилова
Т.В., Черешнева М.В., Юшков Б.Г. Молекулярные механизмы воспаления:
Учебное пособие / Под ред. акад. РАН и РАМН В.А.Черешнева. Екатеринбург:
УрО РАН, 2010. 264с.
15.
Черешнев В.А., Юшков Б.Г. Воспаление // Патофизиология: Учебник
для студентов мед.вузов. М.: ВЕЧЕ, 2001. С.210-235.
16.
Черешнев В.А., Шилов Ю.И., Черешнева М.В., Самоделкин Е.И.,
Гаврилова Т.В., Гусев Е.Ю., Гуляева И.Л. Экспериментальные модели в
патологии: учебник. Пермь: Перм. гос. ун-т, 2011. 267с.
17.
Abbott N.J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier
permeability // J Anat. 2002. Vol. 200, №6. P. 629-638.
18.
Abbott N.J., Ronnback L., Hansson E. Astrocyte-endothelial interactions
at the blood-brain barrier // Nat Rev Neurosci. 2006. Vol.7, №1. P. 41-53.
19.
Adelson J.D., Barreto G.E., Xu L., Kim T., Brott B.K., Ouyang Y.B.,
Naserke T., Djurisic M., Xiong X., Shatz C.J., Giffard R.G. Neuroprotection from
stroke in the absence of MHCI or PirB // Neuron. 2012. Vol.73, №6. P. 1100-1107.
20.
Ahn T.B., Kim S.Y., Kim J.Y., Park S.S., Lee D.S., Min H.J., Kim Y.K.,
Kim S.E., Kim J.M., Kim H.J., Cho J., Jeon B.S alpha-Synuclein gene duplication
is present in sporadic Parkinson disease // Neurology. 2008. Vol. 70, №1. P. 43-49.
109
21.
Al-Bachari S., Parkes L., Vidyasagar R. Clinical phenotypespecific
differences in cerebral haemodynamics in idiopathic Parkinson's disease // J Neurol
Neurosurg Psychiatry. 2013. Vol.84, №11. e2.
22.
Albrecht P.J., Dahl J.P., Stoltzfus O.K., Levenson R., Levison S.W.
Ciliary neurotrophic factor activates spinal cord astrocytes, stimulating their
production and release of fibroblast growth factor-2, to increase motor neuron
survival // Exp Neurol. 2002. Vol.173, №1. P.46-62.
23.
Alcendor D.J., Charest A.M., Zhu W.Q., Vigil H.E., Knobel S.M Infection
and upregulation of proinflammatory cytokines in human brain vascular pericytes
by human cytomegalovirus // J Neuroinflammation. 2012. Vol.9, P.95.
24.
Alexander G.E., DeLong M.R., Strick P.L. Parallel organization of
functionally segregated circuits linking basal ganglia and cortex //Annu Rev
Neurosci. 1986. №9. Р357–381.
25.
Allan S. The neurovascular unit and the key role of astrocytes in the
regulation of cerebral blood flow // Cerebrovasc Dis. 2006. Vol.21, P.137–138.
26.
Aloisi F., Ria F., Columba-Cabezas S., Hess H., Penna G., Adorini L.
Relative efficiency of microglia, astrocytes, dendritic cells and B cells in naive
CD4+ T cell priming and Th1/Th2 cell restimulation // Eur J Immunol. 1999. Vol.29,
№9. P. 2705-2714.
27.
Aloisi F., Ria F., Adorini L. Regulation of T-cell responses by CNS
antigen-presenting cells: different roles for microglia and astrocytes // Immunol
Today. 2000. Vol.21, P.141-147.
28.
Alvarez J.I., Katayama T., Prat A. Glial influence on the blood brain
barrier // Glia. 2013. Vol.61, №12. P.1939-1958.
29.
Anderson J., Walker D.E., Goldstein J.M., Lee M., Diep L, Keim P.S.,
Shen X., Chataway T., Schlossmacher M.G., Seubert P., Schenk D., Sinha S., Gai
W.P., Chilcote T.J. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological
modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease // J.
Biol. Chem. 2006. Vol. 281, Р.29739–29752.
110
30.
Appel E., Kolman O., Kazimirsky G., Blumberg P.M., Brodie C.
Regulation of GDNF expression in cultured astrocytes by inflammatory stimuli //
Neuroreport. 1997. Vol. 8, №15. P.3309-3312.
31.
Appel S.H., Beers D.R., Henkel J.S. T cell-microglial dialogue in
Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis: are we listening? // Trends
Immunol. 2010. Vol.31, №1. P. 7-17.
32.
Arai T., Hasegawa M., Akiyama H., Ikeda K., Nonaka T., Mori H., Mann
D., Tsuchiya K., Yoshida M., Hashizume Y., Oda T. TDP-43 is a com-ponent of
ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and
amyotrophic lateral sclerosis // Biochem Biophys Res Commun. 2006. Vol. 35,
Р.602– 611.
33.
Arimoto T., Choi D.Y., Lu X., Liu M., Nguyen X.V., Zheng N., Stewart
C.A., Kim H.C., Bing G. Interleukin-10 protects against inflammation-mediated
degeneration of dopaminergic neurons in substantia nigra // Neurobiol. Aging. 2006.
Vol.28, P. 894–906.
34.
Armulik A., Genové G., Mäe M., Nisancioglu M.H., Wallgard E., Niaudet
C., He L., Norlin J., Lindblom P., Strittmatter K., Johansson B.R., Betsholtz C.
Pericytes regulate the blood-brain barrier // Nature. 2010. Vol.468, P. 557-561.
35.
Arrasate M., Mitra S., Schweitzer E.S., Segal M.R., Finkbeiner S.
Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of
neuronal death // Nature. 2004. Vol.431, P. 805–810.
36.
Avidan H., Kipnis J., Butovsky O., Caspi R. R., Schwartz M. Vaccination
with autoantigen protects against aggregated amyloid and glutamate toxicity by
controlling microglia: effect of CD4+CD25+ Tcells // Eur. J. Immunol. 2004.
Vol.34, P. 3434–3445.
37.
Axtell R.C., Steinman L. Gaining entry to an uninflamed brain // Nat
Immunol. 2009. Vol.10, №5. P. 453-455.
38.
Azzouz M., Ralph G.S., Storkebaum E., Walmsley L.E., Mitrophanous
K.A., Kingsman S.M., Carmeliet P., Mazarakis N.D. VEGF delivery with
111
retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model //
Nature. 2004. Vol.429, P. 413– 417.
39.
Baba Y., Kuroiwa A., Uitti R.J., Wszolek Z.K., Yamada T. Alterations of
T-lymphocyte populations in Parkinson disease // Parkinsonism Relat. Disord. 2005.
Vol.11, P.493–498.
40.
Balasingam V., Tejada-Berges T., Wright E., Bouckova R., Yong V.W.
Reactive astrogliosis in the neonatal mouse brain and its modulation by cytokines //
J Neurosci. 1994. Vol.14, №2. P.846-856.
41.
Banks W.A. The blood-brain barrier as a regulatory interface in the gut-
brain axes // Physiol Behav.2006. Vol.89, P. 472–476.
42.
Banks W.A., Robinson S.M. Minimal penetration of lipopolysaccharide
across the murine blood-brain barrier // Brain Behav Immun. 2010. Vol. 24, P. 102–
109.
43.
Barcia C., Emborg M.E., Hirsch E.C., Herrero M.T. Blood vessels and
parkinsonism. Front Biosci. 2004. Vol.9, P.277-282.
44.
Barreto G.E., Gonzalez J., Torres Y., Morales L. Astrocytic-neuronal
crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury // Neurosci Res. 2011.
Vol. 71, №2. P.107-113.
45.
Bartels T., Ahlstrom L.S., Leftin A., Kamp F., Haass C., Brown M.F.,
Beyer K. The N-terminus of the intrinsically disordered protein α-synuclein triggers
membrane binding and helix folding // Biophys J. 2010. Vol. 99, №7. Р.2116-2124.
46.
Bas J., Calopa M., Mestre M., Mollevi D. G., Cutillas B., Ambrosio S.,
Buendia E. Lymphocyte populations in Parkinson’s disease and in rat models of
Parkinsonism // J. Neuroimmunol. 2001. Vol.113, P.146–152.
47.
Bechmann I., Mor G., Nilsen J., Eliza M., Nitsch R., Naftolin F. FasL
(CD95L, Apo1L) is expressed in the normal rat and human brain: evidence for the
existence of an immunological brain barrier // Glia. 1999. Vol.27, №1. P. 62-74.
48.
Bechmann I., Lossau S., Steiner B., Mor G., Gimsa U., Nitsch R. Reactive
astrocytes upregulate Fas (CD95) and Fas ligand (CD95L) expression but do not
112
undergo programmed cell death during the course of anterograde degeneration //
Glia. 2000. Vol.32, №1. P. 25-41.
49.
Bechmann I., Steiner B., Gimsa U., Mor G., Wolf S., Beyer M., Nitsch R.,
Zipp F. Astrocyte-induced T cell elimination is CD95 ligand dependent // J
Neuroimmunol. 2002. Vol.132, №1-2. P. 60-65.
50.
Bell R.D., Winkler E.A., Sagare A.P., Singh I., LaRue B., Deane R.,
Zlokovic B.V. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal
phenotype in the adult brain and during brain aging // Neuron. 2010. Vol.68, №3.
P.409-427.
51.
Benarroch E. E. Neuron-astrocyte interactions: partnership for normal
function and disease in the central nervous system // Mayo. Clin. Proc. 2005. Vol.80,
P. 1326-1338.
52.
Benner E.J., Mosley R.L., Destache C.J., Lewis T.B., Jackson-Lewis V.,
Gorantla S., Nemachek C., Green S.R., Przedborski S., Gendelman H.E. Therapeutic
immunization protects dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson's
disease // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. Vol.101, №25. P. 9435-9440.
53.
Benner E.J., Banerjee R., Reynolds A. D., Sherman S., Pisarev V. M.,
Tsiperson V., Nemachek C., Ciborowski P., Przedborski S., Mosley R. L.,
Gendelman H. E. Nitrated α-synuclein immunity accelerates degeneration of nigral
dopaminergic neurons // PLoS ONE. 2008. Vol.3, Р.1376.
54.
Bisaglia M., Mammi S., Bubacco L. Structural insights on physiological
functions and pathological effects of alpha-synuclein // FASEB J. 2009. Vol. 23, Р.
329–340.
55.
Bisaglia M., Greggio E., Maric D., Miller D.W., Cookson M.R., Bubacco
L. Alpha-synuclein overexpression increases dopamine toxicity in BE2-M17 cells //
BMC Neuroscience 2010. №11. Р. 41.
56.
Block M.L., Zecca L., Hong J-S. Microglia-mediated neurotoxicity:
uncovering the molecular mechanisms. // Nature Reviews Neuroscience. 2007. №8.
Р. 57-69.
113
57.
Blomstrand F., Aberg N.D., Eriksson P.S., Hansson E., Rönnbäck L.
Extent of intercellular calcium wave propagation is related to gap junction
permeability and level of connexin-43 expression in astrocytes in primary cultures
from four brain regions // Neuroscience. 1999. Vol.92, №1. P.255-265.
58.
Bobbie M.W., Roy S., Trudeau K., Munger S.J., Simon A.M. Reduced
connexin 43 expression and its effect on the development of vascular lesions in
retinas of diabetic mice // Invest. Ophthalmol. Vis.Sci. 2010. Vol.51, P.3758–3763.
59.
Borghi R., Marchese R., Negro A., Marinelli L., Forloni G., Zaccheo D.,
Abbruzzese G., Tabaton M. Full length alpha-synuclein is present in cerebrospinal
fluid from Parkinson's disease and normal subjects // Neurosci Lett. 2000. Vol.287,
№1. P. 65-67.
60.
Boutin H., LeFeuvre R.A., Horai R., Asano M., Iwakura Y., Rothwell N.J.
Role of IL-1alpha and IL-1beta in ischemic brain damage // J Neurosci. 2001.
Vol.21, №15. P.5528-5534.
61.
Brochard V., Combadiere B., Prigent A., Laouar Y., Perrin A., Beray-
Berthat V., Bonduelle O., Alvarez-Fischer D., Callebert J., Launay J.M., Duyckaerts
C., Flavell R.A., Hirsch E.C., Hunot S. Infiltration of CD4+ lymphocytes into the
brain contributes to neurodegeneration in a mouse model of Parkinson disease // J
Clin Invest. 2009. Vol.119, P.182–192.
62.
Bussell R. Jr., Eliezer D. Residual structure and dynamics in Parkinson’s
disease-associated mutants of alpha-synuclein // J Biol Chem. 2001. Vol.276, P.
45996–46003.
63.
Butovsky O., Ziv Y., Schwartz A., Landa G., Talpalar A.E., Pluchino S.,
Martino G., Schwartz M. Microglia activated by IL-4 or IFN-γ differentially induce
neurogenesis and oligodendrogenesis from adult stem/progenitor cells // Mol. Cell.
Neurosci. 2006. Vol.31, P.149–160.
64.
Cabin D.E., Shimazu K., Murphy D., Cole N.B., Gottschalk W., McIlwain
K.L., Orrison B., Chen A., Ellis C.E., Paylor R., Lu B., Nussbaum R.L. Synaptic
vesicle depletion correlates with attenuated synaptic responses to prolonged
114
repetitive stimulation in mice lacking alpha-synuclein // J Neurosci. 2002. Vol.22,
№ 20. P.8797-8807.
65.
Cappai R., Leck S.L., Tew D.J., Williamson N.A., Smith D.P., Galatis D.,
Sharples R.A., Curtain C.C., Ali F.E., Cherny R.A., Culvenor J.G., Bottomley S.P.,
Masters C.L., Barnham K.J., Hill A.F. Dopamine promotes alphasynuclein
aggregation into SDS-resistant soluble oligomers via a distinct folding pathway //
Faseb J. 2005. Vol. 19, P.1377-1379.
66.
Carman C.V., Springer T.A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis
both through individual vascular endothelial cells and between them // J Cell Biol.
2004. Vol.167, P. 377–388.
67.
Carvey P.M., Hendey B., Monahan A.J. The blood-brain barrier in
neurodegenerative disease: a rhetorical perspective // J Neurochem. 2009. Vol. 111,
№2. P.291-314.
68.
Caso J.R., Pradillo J.M., Hurtado O., Lorenzo P., Moro M.A., Lizasoain
I. Toll-like receptor 4 is involved in brain damage and inflammation after
experimental stroke // Circulation. 2007. Vol.115, №12. P. 1599-1608.
69.
Caughey
B.,
Lansbury
P.T.
Protofibrils,
pores,
fibrils,
and
neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent
bystanders // Annu Rev Neurosci. 2003. Vol.26, P. 267–298.
70.
Cederbom L., Hall H., Ivars F. CD4+CD25+ regulatory T cells down-
regulate co-stimulatory molecules on antigen-presenting cells // Eur. J. Immunol.
2000. Vol.30, P.1538–1543.
71.
Chance P.F., Rabin B.A., Ryan S.G., Ding Y., Scavina M., Crain B.,
Griffin J.W., Cornblath D.R. Linkage of the gene for an autosomal dominant form
of juvenile amuotrophic lateral sclerosis to chromosome 9q34 // Am J Hum Genet.
1998. № 3. Р. 633-640.
72.
Chao C.C., Hu S., Sheng W.S., Bu D., Bukrinsky M.I., Peterson P.K.
Cytokine-stimulated astrocytes damage human neurons via a nitric oxide mechanism
// Glia. 1996. Vol.16, №3. P. 276-84.
115
73.
Chartier-Harlin M.C., Kachergus J., Roumier C., Mouroux V., Douay X.,
Lincoln S., Levecque C., Larvor L., Andrieux J., Hulihan M., Waucquier N.,
Defebvre L., Amouyel P., Farrer M., Destee A. Alpha-synuclein locus duplication
as a cause of familial Parkinson's disease // Lancet. 2004. Vol.364, Р.1167-1169.
74.
Chauhan N.B., Siegel G.J., Lee J.M. Depletion of glial cell line-derived
neurotrophic factor in substantia nigra neurons of Parkinson's disease brain // J Chem
Neuroanat. 2001. Vol.21, №4.P. 277-288.
75.
Chavarria A., Alcocer-Varela J. Is damage in central nervous system due
to inflammation? // Autoimmun Rev. 2004. Vol. 3, №4. P. 251-260.
76.
Choi C., Park J.Y., Lee J., Lim J.H., Shin E.C., Ahn Y.S., Kim C.H., Kim
S.J., Kim J.D., Choi I.S., Choi I.H Fas ligand and Fas are expressed constitutively
in human astrocytes and the expression increases with IL-1, IL-6, TNF-alpha, or
IFN-gamma // J Immunol. 1999. Vol162, №4. P.1889-1895.
77.
Chung C.Y., Koprich J.B., Siddiqi H., Isacson O. Dynamic changes in
presynaptic and axonal transport proteins combined with striatal neuroinflammation
precede dopaminergic neuronal loss in a rat model of AAV alpha-synucleinopathy
// J Neurosci. 2009. Vol.29, №11. P.3365-3373
78.
Colburn R.W., DeLeo J.A., Rickman A.J., Yeager M.P., Kwon P., Hickey
W.F. Dissociation of microglial activation and neuropathic pain behaviors following
peripheral nerve injury in the rat // J Neuroimmunol. 1997. Vol.79, №2. P. 163-175.
79.
Conway K.A., Harper J.D., Lansbury P.T. Accelerated in vitro fibril
formation by a mutant alpha-synuclein linked to early-onset Parkinson disease //
Nat. Med. 1998. № 4. Р.1318–1320.
80.
Conway K.A., Lee S.J., Rochet J.C., Ding T.T., Williamson R.E.,
Lansbury P.T., Jr. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared
property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's
disease: implications for pathogenesis and therapy // Proc Natl Acad Sci U S A.
2000. Vol. 97, P. 571-576.
116
81.
Conway K.A., Rochet J.C., Bieganski R.M., Lansbury P.T., Jr. Kinetic
stabilization of the alpha-synuclein protofibril by a dopamine-alpha-synuclein
adduct // Science. 2001. Vol.294, P.1346-1349.
82.
Cookson M.R., van der Brug M. Cell systems and the toxic mechanism(s)
of alpha-synuclein // Exp Neurol. 2008. Vol.209, P. 5-11.
83.
Cookson M.R. alpha-Synuclein and neuronal cell death // Mol
Neurodegener. 2009. Vol.4, P. 9.
84.
Cooper A.A., Gitler A.D., Cashikar A., Haynes C.M., Hill K.J., Bhullar
B., Liu K., Xu K., Strathearn K.E., Liu F., Cao S., Caldwell K.A., Caldwell G.A.,
Marsischky G., Kolodner R.D., Labaer J., Rochet J.C., Bonini N.M., Lindquist S.
Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in
Parkinson's models // Science. 2006. Vol. 313, P.324-328.
85.
Cucchiarini M., Ren X.L., Perides G., Terwilliger E.F. Selective gene
expression in brain microglia mediated via adeno-associated virus type 2 and type 5
vectors // Gene Ther. 2003. Vol.10, P.657 – 667.
86.
Cunningham С., Wilcockson D.C., Campion S., Lunnon K., Perry V.H.
Central and systemic endotoxin challenges exacerbate the local inflammatory
response and increase neuronal death during chronic neurodegeneration // J
Neurosci. 2005. Vol.25, №40. P. 9275-9284.
87.
Danzer K.M., Ruf W.P., Putcha P., Joyner D., Hashimoto T., Glabe C.,
Hyman B.T., McLean P.J. Heat-shock protein 70 modulates toxic extracellular αsynuclein oligomers and rescues trans-synaptic toxicity // FASEB J. 2011. Vol. 25,
№1. Р.326-36.
88.
Darland D.C., Massingham L.J., Smith S.R., Piek E., Saint-Geniez M.,
D'Amore P.A. Pericyte production of cell-associated VEGF is differentiationdependent and is associated with endothelial survival // Dev Biol. 2003. Vol. 264,
№1. P. 275-288.
89.
Davalos D., Grutzendler J., Yang G., Kim J.V., Zuo Y., Jung S., Littman
D.R., Dustin M.L., Gan W.B. ATP mediates rapid microglial response to local brain
injury in vivo. // Nat Neurosci. 2005. Vol.8, №6. Р. 752-758.
117
90.
Davalos D., Ryu J.K., Merlini M., Baeten K.M., Le Moan N., Petersen
M.A., Deerinck T.J., Smirnoff D.S., Bedard C., Hakozaki H., Gonias Murray S.,
Ling J.B., Lassmann H., Degen J.L., Ellisman M.H., Akassoglou K. Fibrinogeninduced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal
damage in neuroinflammation // Nat Commun. 2012. Vol.11, P.1227.
91.
Davidson W.S., Jonas A.., Clayton D.F., George J.M. Stabilization of
alpha-synuclein secondary structure upon binding to synthetic membranes //J. Biol.
Chem. 1998. Vol.273, P. 9443–9449.
92.
Davidson B.L., Stein C.S., Heth J.A., Martins I., Kotin R.M., Derksen
T.A., Zabner J., Ghodsi A., Chiorini J.A. Recombinant adeno-associated virus type
2, 4, and 5 vectors: transduction of variant cell types and regions in the mammalian
central nervous system // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol.97, №7. P. 3428-3432.
93.
de Oliveira D.M., Barreto G., Galeano P., Romero J.I., Holubiec M.I.,
Badorrey M.S., Capani F., Alvarez L.D. Paullinia cupana Mart. var. Sorbilis protects
human dopaminergic neuroblastoma SH-SY5Y cell line against rotenone-induced
cytotoxicity // Hum Exp Toxicol. 2011. Vol.30, №9. P.1382-1391.
94.
De Rijk, M.C., Tzourio, C., Breteler, M.M., Dartigues, J.F., Amaducci, L.,
Lopez-Pousa, S. et al. Prevalence of parkinsonism and Parkinson's disease in
Europe: the EUROPARKINSON Collaborative Study. European Community
Concerted
Action
on
the
Epidemiology
of
Parkinson's
disease
//
J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry. 1997. Vol.62, P.10-15.
95.
Delgado M., Ganea D. Neuroprotective effect of vasoactive intestinal
peptide (VIP) in a mouse model of Parkinson's disease by blocking microglial
activation // FASEB J. 2003. Vol. 17, №8. P. 944-946.
96.
Delwaide P.J., Pepin J.L., De Pasqua V., de Noordhout A.M. Projections
from basal ganglia to tegmentum: a subcortical route for explaining the
pathophysiology of Parkinson's disease signs? // J Neurol. 2000. Vol.247, Р. 75-81.
97.
Depino A.M., Earl C., Kaczmarczyk E., Ferrari C., Besedovsky H., del
Rey A., Pitossi F.J., Oertel W.H. Microglial activation with atypical
118
proinflammatory cytokine expression in a rat model of Parkinson's disease // Eur J
Neurosci. 2003. Vol.8, №10. P. 2731-2742.
98.
Desai B.S., Monahan A.J., Carvey P.M., Hendey B. Blood-brain barrier
pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy //
Cell Transplant. 2007. Vol.16, №3. P. 285-299.
99.
Díaz-Flores L., Gutiérrez R., Madrid J.F., Varela H., Valladares F., Acosta
E., Martín-Vasallo P., Díaz-Flores L., Jr. Pericytes. Morphofunction, interactions
and pathology in a quiescent and activated mesenchymal cell niche // Histol
Histopathol. 2009. Vol.24, №7. P. 909-969.
100. Ding T.T., Lee S.J., Rochet J.C., Lansbury P.T., Jr. Annular alphasynuclein protofibrils are produced when spherical protofibrils are incubated in
solution or bound to brain-derived membranes // Biochemistry. 2002. Vol. 41,
P.10209-10217.
101. Dohgu S., Fleegal-DeMotta M.A., Banks W.A. Lipopolysaccharide
enhanced transcellular transport of HIV-1 across the blood-brain barrier is mediated
by luminal microvessel IL-6 and GM-CSF // J Neuroinflammation. 2011. Vol.8,
P.167.
102. Dong Y., Benveniste E.N. Immune function of astrocytes // Glia. 2001.
Vol.36, №2. P.180-190.
103. Dore-Duffy P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier // Curr
Pharm Des. 2008. Vol.14, P.1581–1593.
104. Dorsey E.R., Constantinescu R., Thompson J.P., Biglan K.M., Holloway
R.G., Kieburtz K., Marshall F.J., Ravina B.M., Schifitto G., Siderowf A., Tanner
C.M. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous
nations, 2005 through 2030 // Neurology. 2007. Vol.68, №5. Р.384-386.
105. Eddleston M., Mucke L. Molecular profile of reactive astrocytes-implications for their role in neurologic disease // Neuroscience. 1993. Vol.54, №1.
P.15-36.
106. El-Agnaf O.M., Salem S.A., Paleologou K.E., Cooper L.J., Fullwood N.J.,
Gibson M.J., Curran M.D., Court J.A., Mann D.M., Ikeda S., Cookson M.R., Hardy
119
J., Allsop D. Alpha-synuclein implicated in Parkinson's disease is present in
extracellular biological fluids, including human plasma // FASEB J. 2003. Vol.17,
№13. P. 1945-1947.
107. ElAli A., Thériault P., Rivest S. The role of pericytes in neurovascular unit
remodeling in brain disorders // Int J Mol Sci. 2014. Vol. 15, №4. P. 6453-6474.
108. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T.
Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian
cells // Nature. 2001. Vol.411, P.494 – 498.
109. Eliezer D. Amyloid ion channels: a porous argument or a thin excuse? // J
Gen Physiol. 2006. Vol.128. P. 631–633.
110. Engelhardt B. Development of the blood-brain barrier // Cell Tissue Res.
2003. Vol. 314, №1. P.119-129.
111. Escartin C., Bonvento G. Targeted activation of astrocytes: a potential
neuroprotective strategy // Mol Neurobiol. 2008. Vol.38, №3. P.231-241.
112. Fahn S., Sulzer D. Neurodegeneration and neuroprotection in Parkinson
disease // NeuroRx. 2004. Vol.1, №1. P. 139-154.
113. Farkas E., De Jong G.I., de Vos R.A., Jansen Steur E.N., Luiten P.G.
Pathological features of cerebral cortical capillaries are doubled in Alzheimer's
disease and Parkinson's disease // Acta Neuropathol. 2000. Vol.100, №4. P. 395402.
114. Farkas E., Luiten P.G. Cerebral microvascular pathology in aging and
Alzheimer’s disease // Prog. Neurobiol. 2001. Vol.64, P.575–611.
115. Farrer M., Kachergus J., Forno L., Lincoln S., Wang D.S., Hulihan M.,
Maraganore D., Gwinn-Hardy K., Wszolek Z., Dickson D., Langston J.W.
Comparison of kindreds with parkinsonism and alphasynuclein genomic
multiplications // Ann Neurol. 2004. Vol.55, P. 174–179.
116. Farrer M.J. Genetics of Parkinson disease: paradigm shifts and future
prospects. // Nat Rev Genet. 2006. Vol.7, №4. Р.306-318.
117. Feany M.B., Bender W.W. A drosophila model of Parkinson’s disease //
Nature. 2000. Vol. 404, Р. 394–398.
120
118. Fearnley J.M., Lees A.J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra
regional selectivity // Brain. 1991. Vol.114, Р.2283-2301.
119. Fenstermacher J., Kaye T. Drug “diffusion” within the brain // Ann N Y
Acad Sci. 1988. Vol.531, P. 29–39.
120. Fernandez H.H. Updates in the medical management of Parkinson disease
// Cleve Clin J Med. 2012. Vol. 79, №1. P. 28-35.
121. Fields R.D. Stevens-Graham B New insights into neuron-glia
communication // Science. 2002. Vol. 298, P.556-562.
122. Fischer L.R., Culver D.G., Tennant P., Davis A.A., Wang M., CastellanoSanchez A., Khan J., Polak M.A., Glass J.D Amyotrophic lateral sclerosis is a distal
axonopathy: evidence in mice and man // Exp Neurol. 2004. Vol. 185, №2. P. 232240.
123. Fisher M. Pericyte signaling in the neurovascular unit // Stroke. 2009.
Vol.40, Р.13–15.
124. Fiszer U. Does Parkinson's disease have an immunological basis? The
evidence and its therapeutic implications // BioDrugs. 2001. Vol.15, P.351–355.
125. Flannery J.G., Zolotukhin S., Vaquero M.I., LaVail M.M., Muzyczka N.,
Hauswirth W. W. Efficient photoreceptor-targeted gene expression in vivo by
recombinant adeno-associated virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol.94,
P.6916 – 6921.
126. Flotte T.R., Zeitlin P.L., Reynolds T.C., Heald A.E., Pedersen P., Beck S.,
Conrad C.K., Brass-Ernst L., Humphries M., Sullivan K., Wetzel R., Taylor G.,
Carter B.J., Guggino W.B. Phase I trial of intranasal and endobronchial
administration of a recombinant adeno-associated virus serotype 2 (rAAV2)-CFTR
vector in adult cystic fibrosis patients: a two-part clinical study // Hum Gene Ther.
2003. Vol.14, №11. P. 1079-1088.
127. Flotte T.R., Brantly M.L., Spencer L.T., Byrne B.J., Spencer C.T., Baker
D.J., Humphries M. Phase I trial of intramuscular injection of a recombinant adenoassociated virus alpha 1-antitrypsin (rAAV2-CB-hAAT) gene vector to AATdeficient adults // Hum Gene Ther. 2004. Vol.15, №1. P.93-128.
121
128. Flügel A., Matsumuro K., Neumann H., Klinkert W.E., Birnbacher R.,
Lassmann H., Otten U., Wekerle H. Anti-inflammatory activity of nerve growth
factor in experimental autoimmune encephalomyelitis: inhibition of monocyte
transendothelial migration // Eur J Immunol. 2001. Vol.31, №1. P. 11-22.
129. Forloni G., Mangiarotti F., Angeretti N., Lucca E., De Simoni M.G. Betaamyloid fragment potentiates IL-6 and TNF-alpha secretion by LPS in astrocytes
but not in microglia // Cytokine. 1997. Vol.9, №10. P. 759-762.
130. Forno L.S. Neuropathology of Parkinson's disease // J.Neuropathol. Exp.
Neurol. 1996. Vol.55, P. 259-272.
131. Frautschy S.A., Yang F., Irrizarry M., Hyman B., Saido T.C., Hsiao K.,
Cole G.M. Microglial response to amyloid plaques in APPsw transgenic mice // Am
J Pathol. 1998. Vol.152, №1. P. 307-317.
132. Fredenburg R.A., Rospigliosi C., Meray R.K., Kessler J.C., Lashuel H.A.,
Eliezer D., Lansbury P.T., Jr. The impact of the E46K mutation on the properties of
alpha-synuclein in its monomeric and oligomeric states // Biochemistry. 2007.
Vol.46, P.7107-7118.
133. Freyer D., Weih M., Weber J.R., Bürger W., Scholz P., Manz R.,
Ziegenhorn A., Angestwurm K., Dirnagl U. Pneumococcal cell wall components
induce nitric oxide synthase and TNF-alpha in astroglial-enriched cultures // Glia.
1996. Vol.16, №1. P.1-6.
134. Fritz J.J., Lewin A., Hauswirth W., Agarwal A., Grant M., Shaw L.
Development of hammerhead ribozymes to modulate endogenous gene expression
for functional studies // Methods. 2002. Vol.28, P.276 – 285.
135. Fujiwara H., Hasegawa M., Dohmae N., Kawashima A., Masliah E.,
Goldberg M.S., Shen J., Takio K., Iwatsubo T. alpha-Synuclein is phosphorylated
in synucleinopathy lesions // Nat Cell Biol. 2002. Vol. 4, №2. P. 160-164.
136. Gadient R.A., Otten U.H. Interleukin-6 (IL-6)--a molecule with both
beneficial and destructive potentials // Prog Neurobiol. 1997. Vol.52, №5. P. 379390.
122
137. Gaengel K., Genove G., Armulik A., Betsholtz C. Endothelial-mural cell
signaling in vascular development and angiogenesis // Arterioscler. Thromb. Vasc.
Biol. 2009. Vol.29, P. 630–638.
138. Gahtan E., Overmier J.B. Inflammatory pathogenesis in Alzheimer's
disease: biological mechanisms and cognitive sequeli // Neurosci Biobehav Rev.
1999. Vol. 23, №5. P. 615-633.
139. Galea I., Bechmann I., Perry V.H. What is immune privilege (not)?
//Trends Immunol. 2007. Vol.28, №1. P. 12-18.
140. Galvin J.E., Uryu K., Lee V.M., Trojanowski J.Q. Axon pathology in
Parkinson's disease and Lewy body dementia hippocampus contains alpha-, beta-,
and gamma-synuclein // Proc Natl Acad Sci U S A. 1999. Vol. 96, №23. P. 1345013455.
141. Gao H.M., Hong J.S. Why neurodegenerative diseases are progressive:
uncontrolled inflammation drives disease progression // Trends Immunol. 2008.
Vol.29, №8. Р.357-365.
142. Garbuzova-Davis S., Saporta S., Haller E., Kolomey I., Bennett S.P.,
Potter H., Sanberg P.R. Evidence of compromised blood-spinal cord barrier in early
and late symptomatic SOD1 mice modeling ALS // PLoS ONE. 2007. Vol.2. e1205
143. Gasche Y., Soccal P.M., Kanemitsu M., Copin J.C. Matrix
metalloproteinases and diseases of the central nervous system with a special
emphasis on ischemic brain // Front Biosci. 2006. Vol.11, P.1289–1301.
144. Gayle D.A., Ling Z., Tong C., Landers T., Lipton J.W., Carvey P.M.
Lipopolysaccharide (LPS)-induced dopamine cell loss in culture: roles of tumor
necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and nitric oxide // Brain Res Dev Brain Res.
2002. Vol.133, №1. P. 27-35.
145. Ghodsi A., Stein C., Derksen T., Martins I., Anderson R. D., Davidson
B.L. Systemic hyperosmolality improves beta-glucuronidase distribution and
pathology in murine MPS VII brain following intraventricular gene transfer // Exp.
Neurol. 1999. Vol.160, P. 109 – 116.
123
146. Giasson B. I., Duda J. E., Murray I. V., Chen Q., Souza J. M., Hurtig H.
I., Ischiropoulos H., Trojanowski J. Q., Lee V. M. Oxidative damage linked to
neurodegeneration by selective α-synuclein nitration in synucleinopathy lesions //
Science. 2000. Vol.290, P.985–989.
147. Giasson B.I., Murray I.V., Trojanowski J.Q., Lee V.M. A hydrophobic
stretch of 12 amino acid residues in the middle of alpha-synuclein is essential for
filament assembly // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 276, Р. 2380–2386.
148. Gimsa U., Ren A., Pandiyan P., Teichmann D., Bechmann I., Nitsch R.,
Brunner-Weinzierl M.C. Astrocytes protect the CNS: antigen-specific T helper cell
responses are inhibited by astrocyte-induced upregulation of CTLA-4 (CD152) // J
Mol Med (Berl). 2004. Vol.82, №6. P. 364-372.
149. Gimsa U., Mitchison N.A., Brunner-Weinzierl M.C. Immune privilege as
an intrinsic CNS property: astrocytes protect the CNS against T-cell-mediated
neuroinflammation // Mediators Inflamm. 2013. Vol.2013, Р.11.
150. Gitler A.D., Bevis B.J., Shorter J., Strathearn K.E., Hamamichi S., Su L.J.,
Caldwell K.A., Caldwell G.A., Rochet J.C., McCaffery J.M., Barlowe C., Lindquist
S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis
// Proc Natl Acad Sci USA. 2008. Vol.105, P.145-150.
151. Giuliani F., Goodyer C.G., Antel J.P., Yong V.W. Vulnerability of human
neurons to T cell-mediated cytotoxicity // J Immunol. 2003. Vol.171, №1. P. 368379.
152. Glatzel M., Flechsig E., Navarro B., Klein M.A., Paterna J.C., Büeler H.,
Aguzzi A. Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral
nervous system // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol. 97, №1. P. 442-447.
153. Gold R., Schmied M., Tontsch U., Hartung H.P., Wekerle H., Toyka K.V.,
Lassmann H. Antigen presentation by astrocytes primes rat T lymphocytes for
apoptotic cell death. A model for T-cell apoptosis in vivo // Brain. 1996. Vol.119,
№2. P. 651-659.
154. Gold R., Hartung H.P., Lassmann H. T-cell apoptosis in autoimmune
diseases: termination of inflammation in the nervous system and other sites with
124
specialized immune-defense mechanisms // Trends Neurosci. 1997. Vol.20, №9. P.
399-404.
155. Gorina, R.P., Chamorro V., Planas A. AG490 prevents cell death after
exposure of rat astrocytes to hydrogen peroxide or proinflammatory cytokines:
involvement of the Jak2/STAT pathway // J. Neurochem. 2005. Vol.92, P.505-518.
156. Gosselin D., Rivest S. MyD88 signaling in brain endothelial cells is
essential for the neuronal activity and glucocorticoid release during systemic
inflammation // Mol Psychiatry. 2008. Vol.13, P.480–497.
157. Grammas P., Moore P., Weigel P.H. Microvessels from Alzheimer’s
disease brains kill neurons in vitro // Am J Pathol. 1999. Vol.154, P. 337–342.
158. Grammas P., Martinez J., Miller B. Cerebral microvascular endothelium
and the pathogenesis of neurodegenerative diseases // Expert Rev Mol Med. 2011.
Vol.13, Р.19.
159. Greggio E., Bisaglia M., Civiero L., Bubacco L. Leucine-rich repeat
kinase 2 and alpha-synuclein: intersecting pathways in the pathogenesis of
Parkinson's disease? // Mol. Neurodegen. 2011. № 6. Р. 6.
160. Griffin W.S. Inflammation and neurodegenerative diseases // Am J Clin
Nutr. 2006. Vol.83, №2. P. 470-474.
161. Gu X.L., Long C.X., Sun L., Xie C., Lin X., Cai H. Astrocytic expression
of Parkinson's disease-related A53T alpha-synuclein causes neurodegeneration in
mice // Mol Brain. 2010. Vol.3, P.12.
162. Guan J., Pavlovic D., Dalkie N., Waldvogel H.J., O'Carroll S.J., Green
C.R., Nicholson L.F Vascular degeneration in Parkinson's disease // Brain Pathol.
2013. Vol.23, №2. P. 154-164.
163. Guijarro-Muñoz I., Compte M., Álvarez-Cienfuegos A., Álvarez-Vallina
L., Sanz L. Lipopolysaccharide activates Toll-like receptor 4 (TLR4) -mediated NFκB signaling pathway and proinflammatory response in human pericytes // J Biol
Chem. 2014. Vol. 289, №4. P. 2457-2468.
125
164. Guthrie P.B., Knappenberger J., Segal M., Bennett M.V., Charles A.C.,
Kater S.B. ATP released from astrocytes mediates glial calcium waves //J Neurosci.
1999. Jan 15. Vol. 19, №2. P. 520-528.
165. Haberman R.P., Samulski R.J., McCown T.J. Attenuation of seizures and
neuronal death by adeno-associated virus vector galanin expression and secretion //
Nat. Med. 2003. Vol.9, P. 1076 – 1080.
166. Hall C.N., Reynell C., Gesslein B., Hamilton N.B., Mishra A., Sutherland
B.A., O'Farrell F.M., Buchan A.M., Lauritzen M., Attwell D. Capillary pericytes
regulate cerebral blood flow in health and disease // Nature. 2014. Vol.508, P.55-60.
167. Hamby M.E., Sofroniew M.V. Reactive astrocytes as therapeutic targets
for CNS disorders // Neurotherapeutics. 2010. Vol.7, №4. P. 494-506.
168. Hamilton N.B., Attwell D., Hall C.N. Pericyte-mediated regulation of
capillary diameter: a component of neurovascular coupling in health and disease //
Front. Neuroenergetics. 2010. Vol.2, P.5.
169. Harris J.P., Ryan A.F. Fundamental immune mechanisms of the brain and
inner ear // Otolaryngol Head Neck Surg. 1995. Vol. 112, №6. P. 639-653.
170. Hastings T.G., Lewis D.A., Zigmond M.J. Role of oxidation in the
neurotoxic effects of intrastriatal dopamine injections // Proc Natl Acad Sci USA.
1996. Vol. 93, P.1956-1961.
171. Hawkins B.T., Davis T.P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in
health and disease // Pharmacol Rev. 2005. Vol. 57, №2. P. 173-185.
172. Haydon P. G., Carmignoto G. Astrocyte Control of Synaptic Transmission
and Neurovascular Coupling // Physiological Reviews. 2006. Vol.86, №3. P.10091031.
173. He F., Peng J., Deng X.L., Yang L.F., Wu L.W., Zhang C.L., Yin F. RhoA
and NF-kappaB are involved in lipopolysaccharide-induced brain microvascular cell
line hyperpermeability // Neuroscience. 2011. Vol.188, P.35–47.
174. Hebel K., Rudolph M., Kosak B., Chang H.D., Butzmann J., BrunnerWeinzierl M.C. IL-1β and TGF-β act antagonistically in induction and differentially
126
in propagation of human proinflammatory precursor CD4+ T cells // J Immunol.
2011. Vol.187, №11. P. 5627-5635.
175. Hemmer K., Fransen L., Vanderstichele H., Vanmechelen E., Heuschling
P. An in vitro model for the study of microglia-induced neurodegeneration:
involvement of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha // Neurochem Int. 2001.
Vol.38, №7. P.557-565.
176. Henning J., Strauss U., Wree A., Gimsa J., Rolfs A., Benecke R., Gimsa
U. Differential astroglial activation in 6-hydroxydopamine models of Parkinson's
disease // Neurosci Res. 2008. Vol.62, №4. P.246-253.
177. Herx L.M., Rivest S., Yong V.W. Central nervous system-initiated
inflammation and neurotrophism in trauma: IL-1 beta is required for the production
of ciliary neurotrophic factor // J Immunol. 2000. Vol.165, №4. P. 2232-2239.
178. Herx L.M., Yong V.W. Interleukin-1 beta is required for the early
evolution of reactive astrogliosis following CNS lesion // J Neuropathol Exp Neurol.
2001. Vol.60, №10. P.961-971.
179. Hickey W.F., Hsu B.L., Kimura H. T-lymphocyte entry into the central
nervous system // J Neurosci Res. 1991. Vol.28, №2. P.254-260.
180. Hirase H., Creso J., Singleton M., Bartho P., Buzsaki G. Two-photon
imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes // Glia. 2004.
Vol.46, P.95–100.
181. Hirsch E.C., Breidert T., Rousselet E., Hunot S., Hartmann A., Michel
P.P. The role of glial reaction and inflammation in Parkinson's disease // Ann N Y
Acad Sci. 2003. Vol.991, P. 214-228.
182. Hirsch E.C., Hunot S. Neuroinflammation in Parkinson's disease: a target
for neuroprotection? // Lancet Neurol. 2009. Vol. 8, №4. Р.382-397.
183. Hu S., Sheng W.S., Ehrlich L.C., Peterson P.K., Chao C.C Cytokine
effects on glutamate uptake by human astrocytes // Neuroimmunomodulation. 2000.
Vol.7, №3. P. 153-159.
127
184. Hunot S., Boissière F., Faucheux B., Brugg B., Mouatt-Prigent A., Agid
Y., Hirsch E.C. Nitric oxide synthase and neuronal vulnerability in Parkinson's
disease // Neuroscience. 1996. Vol. 72, №2. Р.355-63.
185. Hunot S., Hirsch E.C. Neuroinflammatory processes in Parkinson's
disease // Ann Neurol. 2003. Vol. 53, Р. 49-58.
186. Hyman C., Hofer M., Barde Y.A., Juhasz M., Yancopoulos G.D., Squinto
S.P., Lindsay R.M. BDNF is a neurotrophic factor for dopaminergic neurons of the
substantia nigra // Nature. 1991. Vol.350, P.230-232.
187. Iadecola C., Zhang F., Niwa K., Eckman C., Turner S.K., Fischer E.,
Younkin S., Borchelt D.R., Hsiao K.K., Carlson G.A. SOD1 rescues cerebral
endothelial dysfunction in mice overexpressing amyloid precursor protein // Nat
Neurosci. 1999. Vol.2, №2. P. 157-161.
188. Iadecola C. Neurovascular regulation in the normal brain and in
Alzheimer's disease // Nature Reviews Neuroscience. 2004. Vol.5, № 5. Р. 347 -360.
189. Ibáñez P., Bonnet A.M., Débarges B., Lohmann E., Tison F., Pollak P.,
Agid Y., Dürr A., Brice A. Causal relation between alpha-synuclein gene duplication
and familial Parkinson's disease // Lancet. 2004. Vol.364, №9440. Р.1169-1171.
190. Ibanez P., Lesage S., Janin S., Lohmann E., Durif F., Destee A., Bonnet
A.M., Brefel-Courbon C., Heath S., Zelenika D. et al. Alpha-synuclein gene
rearrangements in dominantly inherited parkinsonism: frequency, phenotype, and
mechanisms // Arch. Neurol. 2009. Vol. 66, Р. 102–108.
191. Ichinose M., Masuoka J., Shiraishi T., Mineta T., Tabuchi K. Fas ligand
expression and depletion of T-cell infiltration in astrocytic tumors // Brain Tumor
Pathol. 2001. Vol.18, №1. P. 37-42.
192. Ihara M., Tomimoto H., Kitayama H., Morioka Y., Akiguchi I., Shibasaki
H., Noda M., Kinoshita M. Association of the cytoskeletal GTP-binding protein
Sept4/H5 with cytoplasmic inclusions found in Parkinson's disease and other
synucleinopathies // J Biol Chem. 2003. Vol. 278, P. 24095-24102.
128
193. Iravani M.M., Kashefi K., Mander P., Rose S., Jenner P. Involvement of
inducible
nitric
oxide
synthase
in
inflammation-induced
dopaminergic
neurodegeneration // Neuroscience. 2002. Vol.110, №1. P. 49-58.
194. Jaeger L.B., Dohgu S., Hwang M.C., Farr S.A., Murphy M.P., FleegalDeMotta M.A., Lynch J.L., Robinson S.M., Niehoff M.L., Johnson S.N., Kumar
V.B., Banks W.A Testing the neurovascular hypothesis of Alzheimer's disease:
LRP-1 antisense reduces blood-brain barrier clearance, increases brain levels of
amyloid-beta protein, and impairs cognition // J Alzheimers Dis. 2009. Vol. 17, №3.
P. 553-570.
195. Jansson D., Rustenhoven J., Feng S., Hurley D., Oldfield R.L., Bergin
P.S., Mee E.W., Faull R.L., Dragunow M. A role for human brain pericytes in
neuroinflammation // J Neuroinflammation. 2014. Vol.11, P.104.
196. Jauneau A.C., Ischenko A., Chatagner A., Benard M., Chan P., Schouft
M.T., Patte C., Vaudry H., Fontaine M. Interleukin-1beta and anaphylatoxins exert
a synergistic effect on NGF expression by astrocytes // J Neuroinflammation. 2006.
Vol.3, P.1-8.
197. Jeohn G.H., Kong L.Y., Wilson B., Hudson P., Hong J.S. Synergistic
neurotoxic effects of combined treatments with cytokines in murine primary mixed
neuron/glia cultures // J Neuroimmunol. 1998. Vol.85, №1. P. 1-10.
198. Jing T., Wu L., Borgmann K., Surendran S., Ghorpade A., Liu J., Xiong
H. Soluble factors from IL-1β-stimulated astrocytes activate NR1a/NR2B receptors:
implications for HIV-1-induced neurodegeneration // Biochem Biophys Res
Commun. 2010. Vol.402, №2. P. 241-246.
199. John G.R., Chen L., Rivieccio M.A., Melendez-Vasquez C.V., Hartley A.,
Brosnan C.F. Interleukin-1beta induces a reactive astroglial phenotype via
deactivation of the Rho GTPase-Rock axis // J Neurosci. 2004. Vol.24, №11. P.
2837-2845.
200. John G.R., Lee S.C., Song X., Rivieccio M., Brosnan C.F. IL-1-regulated
responses in astrocytes: relevance to injury and recovery // Glia. 2005. Vol.49, №2.
P. 161-176.
129
201. Kaplitt M.G., Leone P., Samulski R.J., Xiao X., Pfaff D.W., O'Malley
K.L., During M.J Long-term gene expression and phenotypic correction using
adeno-associated virus vectors in the mammalian brain // Nat Genet. 1994. Vol.8,
№2. P. 148-154.
202. Kaspar B.K., Erickson D., Schaffer D., Hinh L., Gage F.H., Peterson, D.A.
Targeted retrograde gene delivery for neuronal protection // Mol. Ther. 2002. Vol.5,
P. 50 – 56.
203. Kawakami N., Bartholomäus I., Pesic M., Mues M. An autoimmunity
odyssey: how autoreactive T cells infiltrate into the CNS // Immunol Rev. 2012. Vol.
248, №1.P.140-155.
204. Kebir H., Kreymborg K., Ifergan I., Dodelet-Devillers A., Cayrol R.,
Bernard M., Giuliani F., Arbour N., Becher B., Prat A. Human TH17 lymphocytes
promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation //
Nat Med. 2007. Vol. 13, №10. P. 1173-1175.
205. Kim K.S., Park J.Y., Jou I., Park S.M. Regulation of Weibel-Palade body
exocytosis by alpha-synuclein in endothelial cells // J Biol Chem. 2010. Vol.285,
№28. P. 21416-21425.
206. Kim T.D., Paik S.R., Yang C.H., Kim J. Structural changes in alphasynuclein affect its chaperone-like activity in vitro // Protein Sci. 2000. Vol.9, №12.
P. 2489-2496.
207. Kim W.K., Hwang S.Y., Oh E.S., Piao H.Z., Kim K.W., Han I.O. TGFβ1 represses activation and resultant death of microglia via inhibition of
phosphatidylinositol 3-kinase activity // J. Immunol. 2004. Vol.172, P.7015–7023.
208. Kim Y.S., Joh T.H Microglia, major player in the brain inflammation:
their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease // Exp Mol Med. 2006. Vol. 38,
№4. P. 333-347.
209. Kipnis J., Avidan H., Caspi R.R., Schwartz M. Dual effect of
CD4+CD25+ regulatory T cells in neurodegeneration: a dialogue with microglia //
Proc Natl Acad Sci USA. 2004. Vol.101, P.14663– 14669.
130
210. Kirik D., Annett L.E., Burger C., Muzyczka N., Mandel R.J., Bjorklund
A. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated
overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson’s
disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol.100, P.2884 – 2889.
211. Kirik D., Rosenblad C., Burger C., Lundberg C., Johansen T.E.,
Muzyczka N., Mandel R.J., Björklund A. Parkinson-like neurodegeneration induced
by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system // J
Neurosci. 2002. Vol.22, №7. P. 2780-2791.
212. Klegeris A., Giasson B.I., Zhang H., Maguire J., Pelech S., McGeer P.L.
Alpha-synuclein and its disease-causing mutants induce ICAM-1 and IL-6 in human
astrocytes and astrocytoma cells // FASEB J. 2006. Vol. 20, №12. P. 2000-2008.
213. Klegeris A., McGeer E.G., McGeer P.L. Therapeutic approaches to
inflammation in neurodegenerative disease // Curr Opin Neurol. 2007. Vol. 20, №3.
P. 351-357.
214. Klegeris A., Pelech S., Giasson B.I., Maguire J., Zhang H., McGeer E.G.,
McGeer P.L. Alpha-synuclein activates stress signaling protein kinases in THP-1
cells and microglia // Neurobiol Aging. 2008. Vol. 29, №5. Р. 739-752.
215. Klein R.L., Meyer E.M., Peel A.L., Zolotukhin S., Meyers C., Muzyczka
N., King M.A. Neuron-specific transduction in the rat septohippocampal or
nigrostriatal pathway by recombinant adeno-associated virus vectors // Exp Neurol.
1998. Vol. 150, №2. P.183-194.
216. Kniesel U., Wolburg H. Tight junctions of the blood-brain barrier // Cell
Mol Neurobiol. 2000. Vol.20, P.57–76.
217. Knott P.G., Gater P.R., Bertrand C.P. Airway inflammation driven by
antigen-specific resident lung CD4(+) T cells in alphabeta-T cell receptor transgenic
mice // Am J Respir Crit Care Med. 2000. Vol. 161, №4. Р.1340-1348.
218. Kontakos N., Stokes J. Monograph series on aging-related diseases: XII.
Parkinson's disease--recent developments and new directions // Chronic. Dis. Can.
1999. Vol.20, P.58-76.
131
219. Korczyn A.D. The underdiagnosis of the vascular contribution to
dementia // J Neurol Sci. 2005. Vol. 229-230, P. 3-6.
220. Kreutzberg G.W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS
// Trends Neurosci. 1996. Vol.19, №8. P.312-318.
221. Krüger R., Kuhn W., Müller T., Woitalla D., Graeber M., Kösel S.,
Przuntek H., Epplen J.T., Schöls L., Riess O. Ala30Pro mutation in the gene
encoding alphasynuclein in Parkinson’s disease // Nat. Genet. 1998. Vol.18, №2.
Р.106–108.
222. Kryczek I., Wei S., Zou L., Zhu G., Mottram P., Xu H., Chen L., Zou W.
Cutting edge: induction of B7–H4 on APCs through IL-10: novel suppressive mode
for regulatory T cells // J. Immunol. 2006. Vol.177, P.40–44.
223. Kurkowska-Jastrzebska I., Wrońska A., Kohutnicka M., Członkowski A.,
Członkowska A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6tetrahydropyridine intoxication in mouse // Exp. Neurol. 1999. Vol.156, P. 50–61.
224. Kyrkanides S., Olschowka J.A., Williams J.P., Hansen J.T., O'Banion
M.K. TNF alpha and IL-1beta mediate intercellular adhesion molecule-1 induction
via microglia-astrocyte interaction in CNS radiation injury // J Neuroimmunol. 1999.
Vol.95, №1-2. P.95-106.
225. Laflamme N., Rivest S. Toll-like receptor 4: the missing link of the
cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial
cell wall components // FASEB J. 2001. Vol.15, №1. P.155-163.
226. Lambrechts D., Storkebaum E., Morimoto M., Del-Favero J., Desmet F.,et
al. // VEGF is a modifier of amyotrophic lateral sclerosis in mice and humans and
protects motoneurons against ischemic death // Nat Genet. 2003. Vol.34, P. 383–
394.
227. Lang A.E., Lozano A.M. Parkinson's disease: Medical progress part I //
New England Journal of Medicine. 1998. Vol. 339, Р.1044-1053.
228. Langhans W. Signals generating anorexia during acute illness // Proc Nutr
Soc. 2007. Vol.66, P. 321–330.
132
229. Langston J.W., Forno L.S., Tetrud J., Reeves A.G., Kaplan J.A., Karluk
D. Evidence of active nerve cell degeneration in the substantia nigra of humans years
after 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine exposure // Ann Neurol. 1999.
Vol. 46, №4. P. 598-605.
230. Larsen K.E., Schmitz Y., Troyer M.D., Mosharov E., Dietrich P., Quazi
A.Z., Savalle M., Nemani V., Chaudhry F.A., Edwards R.H., Stefanis L., Sulzer D.
Alpha-synuclein
overexpression
in
PC12
and
chromaffin
cells
impairs
catecholamine release by interfering with a late step in exocytosis // J Neurosci.
2006. Vol.26, P.11915-11922.
231. Lashuel H.A., Hartley D., Petre B.M., Walz T., Lansbury P.T. Jr.
Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations // Nature.
2002. Vol.418, P.291.
232. Lashuel H.A., Petre B.M., Wall J., Simon M., Nowak R.J., Walz T.,
Lansbury P.T. Jr. Alpha-synuclein especially the Parkinson’s disease-associated
mutants forms pore-like annular and tubular protofibrils // J Mol Biol. 2002. Vol.
322, P. 1089–1102.
233. Laurie C., Reynolds A., Coskun O., Bowman E., Gendelman H.E., Mosley
R.L. CD4+ T cells from Copolymer-1 immunized mice protect dopaminergic
neurons in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine model of Parkinson's
disease // J Neuroimmunol. 2007. Vol.183, №1-2. P.60-68.
234. Lee E.J., Woo M.S., Moon P.G., Baek M.C., Choi I.Y., Kim W.K., Junn
E., Kim H.S Alpha-synuclein activates microglia by inducing the expressions of
matrix metalloproteinases and the subsequent activation of protease-activated
receptor-1 // J Immunol. 2010. Vol.185, №1. P. 615-623.
235. Lee F.J., Liu F., Pristupa Z.B., Niznik H.B. Direct binding and functional
coupling of alpha-synuclein to the dopamine transporters accelerate dopamineinduced apoptosis // Faseb J. 2001. Vol.15, P. 916-926.
236. Lee F.J., Wang Y.T., Liu F.J. Direct receptor cross-talk can mediate the
modulation of excitatory and inhibitory neurotransmission by dopamine // Mol
Neurosci. 2005. Vol. 26, №2-3. Р.245-52.
133
237. Lee H., Pienaar I.S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's
disease: curse or route to a cure? // Front Biosci. 2014. Vol.19, P.272-280.
238. Lee H.J., Patel S., Lee S.J. Intravesicular localization and exocytosis of
alpha-synuclein and its aggregates // J Neurosci. 2005. Vol.25, №25. P. 6016-6024.
239. Lee J.T., Wheeler T.C., Li L., Chin L.S. Ubiquitination of alpha-synuclein
by Siah-1 promotes alpha-synuclein aggregation and apoptotic cell death // Hum
Mol Genet. 2008. Vol.17, №6. Vol. 906-917.
240. Lee K.H., Kim M.Y., Kim D.H., Lee Y.S. Syntaxin 1A and receptor for
activated C kinase interact with the N-terminal region of human dopamine
transporter // Neurochem Res. 2004b. Vol. 29, P. 1405-1409.
241. Lee S.B., Park S.M., Ahn K.J., Chung K.C., Paik S.R., Kim J.
Identification of the amino acid sequence motif of alpha-synuclein responsible for
macrophage activation // Biochem Biophys Res Commun. 2009. Vol.381, №1. P.3943.
242. Lee S.C., Liu W., Dickson D.W., Brosnan C.F., Berman J.W. Cytokine
production by human fetal microglia and astrocytes. Differential induction by
lipopolysaccharide and IL-1 beta // J Immunol. 1993. Vol.150, №7. P.2659-2667.
243. Leroy E., Borger R., Auburger G. The ubiquitin pathway in Parkinson
disease // Nature. 1998. Vol. 395, P. 451-452.
244. Levi-Montalcini R., Skaper S.D., Dal Toso R., Petrelli L., Leon A. Nerve
growth factor: from neurotrophin to neurokine // Trends Neurosci. 1996. Vol.19,
№11. P. 514-520.
245. Lewin A.S., Drenser K.A., Hauswirth W.W., Nishikawa S., Yasumura D.,
Flannery J.G., LaVail M.M. Ribozyme rescue of photoreceptor cells in a transgenic
rat model of autosomal dominant retinitis pigmentosa // Nat Med. 1998. Vol. 4, №8.
P. 967-971.
246. Li H., Li S.H., Yu Z.X., Shelbourne P., Li X.J. Huntingtin aggregateassociated axonal degeneration is an early pathological event in Huntington's disease
mice //J Neurosci. 2001. Vol.21, №21. P.8473-8481
134
247. Li J., Uversky V.N., Fink A.L. Effect of familial Parkinson’s disease point
mutations A30P and A53T on the structural properties, aggregation, and fibrillation
of human alpha-synuclein // Biochemistry. 2001. Vol.40. P. 11604–11613.
248. Li Q., Zhang Q., Wang C., Liu X., Li N., Li J. Disruption of tight junctions
during polymicrobial sepsis in vivo // J Pathol. 2009. Vol.218, №2. P.210-221.
249. Li W., West N., Colla E., Pletnikova O., Troncoso J.C., Marsh L., Dawson
T.M., Jäkälä P., Hartmann T., Price D.L., Lee M.K. Aggregation promoting Cterminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced
by the familial Parkinson's disease-linked mutations // Proc Natl Acad Sci USA.
2005. Vol.102, №6. Р.2162-2167.
250. Li X.Z., Bai L.M., Yang Y.P., Luo W.F., Hu W.D., Chen J.P., Mao C.J.,
Liu C.F. Effects of IL-6 secreted from astrocytes on the survival of dopaminergic
neurons in lipopolysaccharide-induced inflammation // Neurosci Res. 2009. Nov.
Vol.65, №3. P. 252-258.
251. Liberatore G.T., Jackson-Lewis V., Vukosavic S., Mandir A.S., Vila M.,
McAuliffe W.G., Dawson V.L., Dawson T.M., Przedborski S. Inducible nitric oxide
synthase stimulates dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of
Parkinson disease // Nat Med. 1999. Vol.12, P. 1403-1409.
252. Lincoln S., Vaughan J., Wood N, Low frequency of pathogenic mutations
in the ubiquitin carboxy-terminal hydrolaserin familial Parkinson's disease //
Neuroreprt. 1999. Vol.10, Р. 427-429.
253. Lingor P., Unsicker K., Krieglstein K. GDNF and NT-4 protect midbrain
dopaminergic neurons from toxic damage by iron and nitric oxide // Exp Neurol.
2000. Vol.163, №1. P.55-62.
254. Liu B., Gao H.M., Wang J.Y., Jeohn G.H., Cooper C.L., Hong J.S. Role
of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration // Ann N Y Acad Sci.
2002. Vol.962, P. 318-331.
255. Liu B., Hong J.S. Primary rat mesencephalic neuron-glia, neuronenriched, microglia-enriched, and astroglia-enriched cultures // Methods Mol Med.
2003. Vol. 79, Р. 387-95.
135
256. Liu J., Gong N., Huang X., Reynolds A.D., Mosley R.L., Gendelman H.E.
Neuromodulatory activities of CD4+CD25+ regulatory T cells in a murine model of
HIV-1-associated neurodegeneration // J Immunol. 2009. Vol.182, P.3855–3865.
257. Lo E.H., Broderick J.P., Moskowitz M.A. tPA and proteolysis in the
neurovascular unit // Stroke. 2004. Vol.35. P. 354–356.
258. Looi J.C., Matis M., Ruzich M.J. Conceptualization of depression in
Parkinson's disease // Neuropsychiatr Dis Treat. 2005. Vol.1, №2. P. 135-143.
259. Lotharius J., Barg S., Wiekop P., Lundberg C., Raymon H.K., Brundin P.
Effect of mutant alpha-synuclein on dopamine homeostasis in a new human
mesencephalic cell line // J Biol Chem. 2002. Vol. 277, P. 38884-38894.
260. Lotharius J., Brundin P. Impaired dopamine storage resulting from alphasynuclein mutations may contribute to the pathogenesis of Parkinson's disease //
Hum Mol Genet. 2002a. Vol. 11, P. 2395-2407.
261. Lotharius J., Brundin P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine,
vesicles and alpha-synuclein // Nat Rev Neurosci. 2002b. Vol.3, P.932-942.
262. Luk K.C., Song C., O'Brien P., Stieber A., Branch J.R., Brunden K.R.,
Trojanowski J.Q., Lee V.M. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation
of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells // PNAS. 2009. Vol.106,
Р. 20051–20056.
263. Ma Q.L., Chan P., Yoshii M., Uéda K. Alpha-synuclein aggregation and
neurodegenerative diseases // J Alzheimers Dis. 2003. Vol. 5, №2. P. 139-148.
264. Man S., Ubogu E.E., Ransohoff R.M. Inflammatory cell migration into
the central nervous system: a few new twists on an old tale // Brain Pathol. 2007.
Vol.17, P.243–250.
265. Maroteaux L., Campanelli J.T., Scheller R.H. Synuclein — a
neuronspecific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve-terminal // J.
Neurosci. 1988. Vol.8, Р. 2804–2815.
266. Masliah E., Rockenstein E., Veinbergs I., Mallory M., Hashimoto M.,
Takeda A., Sagara Y., Sisk A., Mucke L. Dopaminergic loss and inclusion body
136
formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders //
Science. 2000. Vol. 287, Р.1265–1269.
267. Mastakov M.Y., Baer K., Kotin R.M., During, M.J. Recombinant
adenoassociated virus serotypes 2- and 5-mediated gene transfer in the mammalian
brain: quantitative analysis of heparin co-infusion // Mol. Ther. 2002. Vol.5, Р.371
– 380.
268. Matsumine H., Saito M., Shimoda-Matsubayashi S., Tanaka H., Ishikawa
A., Nakagawa-Hattori Y., Yokochi M., Kobayashi T., Igarashi S., Takano H., et al.
Localization of a gene for an autosomal recessive form of juvenile Parkinsonism to
chromosome 6q.25-27 // Am.J.Hum.Genet. 1997. Vol.60, P. 588-596.
269. Matsumoto Y., Ohmori K., Fujiwara M. Immune regulation by brain cells
in the central nervous system: microglia but not astrocytes present myelin basic
protein to encephalitogenic T cells under in vivo-mimicking Conditions //
Immunology. 1992. Vol. 76, Р. 209-216.
270. Mazzulli J.R., Mishizen A.J., Giasson B.I., Lynch D.R., Thomas S.A.,
Nakashima A., Nagatsu T., Ota A., Ischiropoulos H. Cytosolic catechols inhibit
alpha-synuclein aggregation and facilitate the formation of intracellular soluble
oligomeric intermediates // J Neurosci. 2006. Vol.26, P.10068-10078.
271. Mazzulli J.R., Armakola M., Dumoulin M., Parastatidis I., Ischiropoulos
H. Cellular oligomerization of alphasynuclein is determined by the interaction of
oxidized catechols with a C-terminal sequence // J Biol Chem. 2007. Vol. 282,
P.31621-31630.
272. McCann M.J., O'Callaghan J.P., Martin P.M., Bertram T., Streit W.J.
Differential activation of microglia and astrocytes following trimethyl tin-induced
neurodegeneration // Neuroscience. 1996. Vol.72, №1. P. 273-281.
273. McCown T.J., Xiao X., Li J., Breese G.R., Samulski R.J. Differential and
persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus
(AAV) vector // Brain Res. 1996. Vol.713, P. 99 – 107.
137
274. McGeer P.L., Itagaki S., Akiyama H., McGeer E.G. Rate of cell death in
parkinsonism indicates active neuropathological process // Ann. Neurol. 1988.
Vol.24, P. 574–576.
275. McGeer P.L., McGeer E.G. Inflammation and neurodegeneration in
Parkinson's disease // Parkinsonism Relat Disord. 2004. Vol.10, Р.3-7.
276. McGeer P.L., McGeer E.G. Glial reactions in Parkinson's disease // Mov
Disord. 2008. Vol.23, №4. P. 474-483.
277. McInerney-Leo. Genetic testing in Parkinson's disease // Mov Disord.
2005. Vol.7, Р. 908-909.
278. McNaught K.S., Jenner P. Extracellular accumulation of nitric oxide,
hydrogen peroxide, and glutamate in astrocytic cultures following glutathione
depletion, complex I inhibition, and/or lipopolysaccharide-induced activation //
Biochem Pharmacol. 2000. Vol.60, №7. P.979-988.
279. Mena M.A., García de Yébenes J. Glial cells as players in parkinsonism:
the "good," the "bad," and the "mysterious" glia // Neuroscientist. 2008. Vol.14, №6.
P. 544-560.
280. Merrill J.E., Benveniste E.N. Cytokines in inflammatory brain lesions:
helpful and harmful // Trends Neurosci. 1996. Vol.19, №8. P. 331-338.
281. Mezey E., Dehejia A.M., Harta G., Tresser N., Suchy S.F., Nussbaum
R.L., Brownstein M.J., Polymeropoulos M.H. Alpha synuclein is present in Lewy
bodies in sporadic Parkinson's disease // Mol Psychiatry. 1998. Vol.3, №6. P. 493499.
282. Miklossy J., Doudet D.D., Schwab C., Yu S., McGeer E.G., McGeer P.L.
Role of ICAM-1 in persisting inflammation in Parkinson disease and MPTP
monkeys // Exp Neurol. 2006. Vol. 197, №2. P. 275-283.
283. Moalem G., Leibowitz-Amit R., Yoles E., Mor F., Cohen I.R., Schwartz
M. Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central
nervous system axotomy // Nat Med. 1999. Vol.5, P. 49–55.
138
284. Monahan A.J., Carvey P.M. Neuroinflammation and Peripheral Immune
Infiltration in Parkinson’s disease: An autoimmune hypothesis // Cell
Transplantation. 2008. Vol.17, P.1–10.
285. Moretto G., Walker D.G., Lanteri P., Taioli F., Zaffagnini S., Xu R.Y.,
Rizzuto N. Expression and regulation of glial-cell-line-derived neurotrophic factor
(GDNF) mRNA in human astrocytes in vitro // Cell Tissue Res. 1996. Vol.286, №2.
P.257-262.
286. Morfini G., Pigino G., Opalach K., Serulle Y., Moreira J.E., Sugimori M.,
Llinás R.R., Brady S.T. 1-Methyl-4-phenylpyridinium affects fast axonal transport
by activation of caspase and protein kinase C // Proc Natl Acad Sci U S A. 2007.
Vol.104, №7. P.2442-2447.
287. Mosharov E.V., Staal R.G., Bove J., Prou D., Hananiya A., Markov D.,
Poulsen N., Larsen K.E., Moore C.M., Troyer M.D., Edwards R.H., Przedborski S.,
Sulzer D. Alpha-synuclein overexpression increases cytosolic catecholamine
concentration // J Neurosci . 2006. Vol.26, P.9304-9311.
288. Mount M.P., Lira A., Grimes D., Smith P.D., Faucher S., Slack R.,
Anisman H., Hayley S., Park D.S. Involvement of interferon-gamma in microglialmediated loss of dopaminergic neurons // J Neurosci. 2007. Vol.27, №12. P. 33283337.
289. Murphy D.D., Rueter S.M., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Synucleins are
developmentally expressed, and alpha-synuclein regulates the size of the presynaptic
vesicular pool in primary hippocampal neurons // J Neurosci. 2000. Vol.20, P.32143220.
290. Murray I.V., Giasson B.I., Quinn S.M., Koppaka V., Axelsen P.H.,
Ischiropoulos H., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Role of alpha-synuclein carboxyterminus on fibril formation in vitro // Biochemistry. 2003. Vol.42, №28. Р. 85308540.
291. Nagatsu T., Mogi M., Ichinose H., Togari A. Changes in cytokines and
neurotrophins in Parkinson's disease // J Neural Transm Suppl. 2000. Vol.60, P. 277290.
139
292. Nagyoszi P., Wilhelm I., Farkas A.E., Fazakas C., Dung N.T., Haskó
J., Krizbai I.A. Expression and regulation of toll-like receptors in cerebral
endothelial cells // Neurochem Int. 2010. Vol.57, P.556–564.
293. Nair A., Frederick T.J., Miller S.D. Astrocytes in multiple sclerosis: a
product of their environment // Cell Mol Life Sci. 2008. Vol. 65, №17. P. 27022720.
294. Nakamura
K.,
Kitani
A.,
Strober
W.
Cell
contact-dependent
immunosuppression by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells is mediated by cell
surface-bound transforming growth factor // J. Exp. Med. 2001. Vol.194, P. 629–
644.
295. Nakamura K., Kitani A., Fuss I., Pedersen A., Harada N., Nawata H.,
Strober W. TGF- β plays an important role in the mechanism of CD4+CD25+
regulatory T cell activity in both humans and mice // J. Immunol. 2004. Vol.172,
P.834–842.
296. Nakaoke R., Verma S., Deli M., Shirabe S., Niwa M., Banks W.A.
Glucose-regulated blood-brain barrier transport of insulin: Pericyte-astrocyteendothelial cell cross talk // International Journal of Neuroprotection and
Neuroregeneration. 2007. Vol.3, P.195–200.
297. Negro A., Brunati A.M., Donella-Deana A., Massimino M.L., Pinna L.A.
Multiple phosphorylation of alpha-synuclein by protein tyrosine kinase Syk prevents
eosin-induced aggregation // FASEB J. 2002. Vol. 16, №2. P. 210-212.
298. Negro A., Brunati A.M., Donella-Deana A., Massimino M.L., Pinna L.A.
Multiple phosphorylation of alpha-synuclein by protein tyrosine kinase Syk prevents
eosin-induced aggregation // FASEB J. 2002. Vol. 16, №2. Р.210-212.
299. Nemani V.M., Lu W., Berge V., Nakamura K., Onoa B., Lee M.K.,
Chaudhry F.A., Nicoll R. A., Edwards R.H. Increased expression of alphasynuclein
reduces neurotransmitter release by inhibiting synaptic vesicle reclustering after
endocytosis // Neuron. 2010. Vol.65, Р. 66–79.
300. Neumann H., Misgeld T., Matsumuro K., Wekerle H. Neurotrophins
inhibit major histocompatibility class II inducibility of microglia: involvement of
140
the p75 neurotrophin receptor // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Vol.95, №10. P.
5779-5784.
301. Nguyen J.B., Sanchez-Pernaute R., Cunningham J., Bankiewicz K.S.
Convection-enhanced delivery of AAV-2 combined with heparin increases TK gene
transfer in the rat brain // Neuroreport. 2001. Vol.12, P.1961 – 1964.
302. Nimmerjahn A., Kirchoff F., Helmeehen F. Resting microglial cells are
highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo // Science. 2005. Vol.308,
Р. 1314-1318.
303. Niranjan R., Nath C., Shukla R. The mechanism of action of MPTPinduced neuroinflammation and its modulation by melatonin in rat astrocytoma
cells, C6 // Free Radic Res. 2010. Vol. 44, №11. P. 1304-1316.
304. Nishioka K., Hayashi S., Farrer M.J., Singleton A.B., Yoshino H., Imai
H., Kitami T., Sato K., Kuroda R., Tomiyama H., Mizoguchi K., Murata M., Toda
T., Imoto I., Inazawa J., Mizuno Y., Hattori N. Clinical heterogeneity of alphasynuclein gene duplication in Parkinson's disease // Ann. Neurol. 2006. Vol. 59, Р.
298–309.
305. Niwa K., Younkin L., Ebeling C., Turner S.K., Westaway D., Younkin S.,
Ashe K.H., Carlson G.A., Iadecola C. Abeta 1-40-related reduction in functional
hyperemia in mouse neocortex during somatosensory activation // Proc Natl Acad
Sci USA. 2000. Vol.97, №17. P. 9735-9740.
306. Norris E.H., Giasson B.I., Hodara R., Xu S., Trojanowski J.Q.,
Ischiropoulos H., Lee V.M. Reversible inhibition of alpha-synuclein fibrillization
by dopaminochrome-mediated conformational alterations // J Biol Chem. 2005. Vol.
280, P. 21212-21219.
307. Nussbaum R.L., Polymeropoulos M.H. Genetics of Parkinson's disease //
Hum Mol Genet. 1997. Vol.6, №10. P. 1687-1691.
308. Okochi M., Walter J., Koyama A., Nakajo S., Baba M., Iwatsubo T.,
Meijer L., Kahle P.J., Haass C. Constitutive phosphorylation of the Parkinson's
disease associated alpha-synuclein // J Biol Chem. 2000. Vol. 275, №1. P. 390-397.
141
309. Oldendorf W.H., Cornford M.E., Brown W.J. The large appent work
capability of the blood-brain barrier: A study of the mitochondrial content of
capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat // Ann Neurol. 1977.
Vol. 1, P. 409–417.
310. Orr C.F., Rowe D.B., Halliday G.M. An inflammatory review of
Parkinson's disease // Prog Neurobiol. 2002. Vol. 68, №5. Р.325-340.
311. Owens T., Bechmann I., Engelhardt B. Perivascular spaces and the two
steps to neuroinflammation // J Neuropathol Exp Neurol. 2008. Vol.67, P.1113–
1121.
312. Ozerdem U., Stallcup W.B. Pathological angiogenesis is reduced by
targeting pericytes via the NG2 proteoglycan // Angiogenesis. 2004. Vol.7, P.269–
276
313. Pachter J.S, de Vries H.E., Fabry Z. The blood-brain barrier and its role in
immune privilege in the central nervous system // J Neuropathol Exp Neurol. 2003.
Vol. 62, №6. P. 593-604.
314. Panaro M.A., Lofrumento D.D., Saponaro C., De Nuccio F., Cianciulli A.,
Mitolo V., Nicolardi G. Expression of TLR4 and CD14 in the central nervous system
(CNS) in a MPTP mouse model of Parkinson's-like disease // Immunopharmacol
Immunotoxicol. 2008. Vol.30, №4. P. 729-740.
315. Pankratz N., Nichols W.C., Elsaesser V.E., Pauciulo M.W., Marek
D.K., Halter C.A., Wojcieszek J., Rudolph A., Pfeiffer R.F., Foroud T. Alphasynuclein and familial Parkinson's disease// Mov. Disord. 2009. Vol. 24, Р.1123–
1125.
316. Pan-Montojo F., Anichtchik O., Dening Y., Knels L., Pursche S., Jung R.,
Jackson S., Gille G., Spillantini M.G., Reichmann H., Funk R.H. Progression of
Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of
rotenone in mice // PLoS One. 2010. Vol.5, №1. e8762.
317. Park D.R., Thomsen A.R., Frevert C.W., Pham U., Skerrett S.J., Kiener
P.A., Liles W.C. Fas (CD95) induces proinflammatory cytokine responses by human
142
monocytes and monocyte-derived macrophages // J Immunol. 2003. Vol.170, №12.
P.6209-6216
318. Park J.A., Choi K.S., Kim S.Y., Kim K.W. Coordinated interaction of the
vascular and nervous systems: from molecule- to cell-based approaches // Biochem
Biophys Res Commun. 2003. Vol.311. P. 247–253.
319. Park J.Y., Paik S.R., Jou I., Park S.M. Microglial phagocytosis is
enhanced by monomeric alpha-synuclein, not aggregated alpha-synuclein:
implications for Parkinson's disease // Glia. 2008. Vol.56, №11. P. 1215-1223.
320. Parkinson T. The future of toll-like receptor therapeutics // Curr Opin Mol
Ther. 2008. Vol.10, №1. P. 21-31.
321. Parsian A., Racette B., Zhang Z.H., Chakraverty S., Rundie M., Goate A.,
Perlmutter J.S. Mutation, sequence analysis, and association studies of alphasynuclein in Parkinson.s disease // Neurology. 1998. Vol. 51, Р.1757-1759.
322. Passini M.A., Lee E.B., Heuer G.G., Wolfe J.H. Distribution of a
lysosomal enzyme in the adult brain by axonal transport and by cells of the rostral
migratory stream // J. Neurosci. 2002. Vol.22, P. 6437 – 6446.
323. Passini M.A., Watson D.J., Vite C.H., Landsburg D.J., Feigenbaum A.L.,
Wolfe J.H. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1)
in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to
AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of betaglucuronidase-deficient mice // J. Virol. 2003. Vol.77, P.7034 – 7040.
324. Paul G., Ozen I., Christophersen N.S., Reinbothe T., Bengzon J., Visse E.,
Jansson K., Dannaeus K., Henriques-Oliveira C., Roybon L., Anisimov S.V.,
Renström E., Svensson M., Haegerstrand A., Brundin P. The adult human brain
harbors multipotent perivascular mesenchymal stem cells // PLoS One. 2012.
Vol.11, Р. 35577.
325. Paul J., Strickland S., Melchor J.P. Fibrin deposition accelerates
neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer’s
disease // J. Exp. Med. 2007. Vol.204, P.1999–2008
143
326. Peppiatt C.M., Howarth C., Mobbs P., Attwell D. Bidirectional control of
CNS capillary diameter by pericytes // Nature. 2006. Vol.443, P.700–704.
327. Perez R., Waymire J.C., Lin E., Guo F, Zigmond M.J. A role for alphasynuclein in the regulation of dopamine biosynthesis // J. Neurosci. 2002. Vol. 22,
Р. 3090–3099.
328. Polymeropoulos M.H., Higgins J.J., Golbe L.I., Johnson W.G.. Ide S.E.,
Di Iorio G., Sanges G., Stenroos E.S., Pho L.T., Schaffer A.A., Lazzarini A.M.,
Nussbaum R.L., Duvoisin R.C. Mapping of a gene for Parkinson’s disease to
chromosome 4q2 - q23 // Science. 1996. Vol.274, P.1197-1199.
329. Polymeropoulos M.H., Lavedan C., Leroy E., Ide S.E., Dehejia A., Dutra
A., Pike B., Root H., Rubenstein J., Boyer R., Stenroos E.S., Chandrasekharappa S.,
Athanassiadou A., Papapetropoulos T., Johnson W.G., Lazzarini A.M., Duvoisin
R.C., Di Iorio G., Golbe L.I., Nussbaum R.L. Mutation in the alpha-synuclein gene
identified in families with Parkinson’s disease // Science. 1997. Vol.276, P.2045–
2047.
330. Pontoux C., Banz A., Papiernik M. Natural CD4 CD25(+) regulatory T
cells control the burst of superantigen-induced cytokine production: the role of IL10 // Int. Immunol. 2002. Vol.14, P.233–239.
331. Proebstl D., Voisin M.B., Woodfin A., Whiteford J., D’Acquisto F., Jones
G.E., Rowe D., Nourshargh S. Pericytes support neutrophil subendothelial cell
crawling and breaching of venular walls in vivo // J Exp Med. 2012. Vol.11, P. 1219–
1234.
332. Pronin A.N., Morris A.J., Surguchov A., Benovic J.L. Synucleins are a
novel class of substrates for G protein-coupled receptor kinases // J Biol Chem.
2000. Vol.275, №34. P.26515-26522.
333. Qi X., Lewin A.S., Hauswirth W.W., Guy J. Optic neuropathy induced by
reductions in mitochondrial superoxide dismutase // Invest. Ophthalmol. Visual Sci.
2003. Vol.44, P. 1088 – 1096.
334. Qin L., Liu Y., Wang T., Wei S.J., Block M.L., Wilson B., Liu B., Hong
J.S. NADPH oxidase mediates lipopolysaccharide-induced neurotoxicity and
144
proinflammatory gene expression in activated microglia // J Biol Chem. 2004 Jan 9.
Vol.279, №2. P.1415-1421.
335. Qing H., Wong W., McGeer E.G., McGeer P.L. Lrrk2 phosphorylates
alphasynuclein at serine 129: Parkinson disease implications // BBRC. 2009.
Vol.387, Р. 149–152.
336. Quaegebeur A., Segura I., Carmeliet P. Pericytes: blood-brain barrier
safeguards against neurodegeneration? // Neuron. 2010. Vol.68, P.321–323.
337. Racke M.K., Ratts R.B., Arredondo L., Perrin P.J., Lovett-Racke A. The
role of costimulation in autoimmune demyelination // J Neuroimmunol. 2000.
Vol.107, №2. P. 205-215.
338. Ramírez G., Toro R., Döbeli H., von Bernhardi R.Protection of rat primary
hippocampal cultures from A beta cytotoxicity by pro-inflammatory molecules is
mediated by astrocytes // Neurobiol Dis. 2005. Vol.19, №1-2. P. 243-254.
339. Rappold P.M., Tieu K. Astrocytes and therapeutics for Parkinson's disease
// Neurotherapeutics. 2010. Vol.7, №4. P. 413-423.
340. Reali C., Scintu F., Pillai R., Donato R., Michetti F., Sogos V. S100b
counteracts effects of the neurotoxicant trimethyltin on astrocytes and microglia //J
Neurosci Res. 2005. Vol. 81, №5. P. 677-686.
341. Rektor I., Goldemund D., Sheardova K., Rektorova I., Michalkova Z.,
Dufek M. Vascular pathology in patients with idiopathic Parkinson's disease //
Parkinsonism Relat Disord. 2009. Vol.15, №1. P. 24-29.
342. Reynolds A.D., Banerjee R., Liu J., Gendelman H.E., Mosley R.L.
Neuroprotective activities of CD4+CD25+ regulatory T cells in an animal model of
Parkinson's disease // J Leukoc Biol. 2007. Vol. 82, №5. P. 1083-1094.
343. Reynolds A.D., Glanzer J.G., Kadiu I., Ricardo-Dukelow M., Chaudhuri
A., Ciborowski P., Cerny R., Gelman B., Thomas M.P., Mosley R.L., Gendelman
H.E. Nitrated alpha-synuclein-activated microglial profiling for Parkinson's disease
// J Neurochem. 2008. Vol.104, №6. P. 1504-1525.
145
344. Reynolds A.D., Stone D.K., Mosley R.L., Gendelman H.E.Nitrated
{alpha}-synuclein-induced alterations in microglial immunity are regulated by
CD4+ T cell subsets // J Immunol. 2009. Vol.182, №7. P. 4137-4149.
345. Reynolds A.D., Stone D.K., Mosley R.L., Gendelman H.E. Proteomic
studies of nitrated alpha-synuclein microglia regulation by CD4+CD25+ T cells // J
Proteome Res. 2009. Vol.8, P. 3497–3511.
346. Reynolds A.D., Stone D.K., Hutter J.A., Benner E.J., Mosley R.L.,
Gendelman H.E. Regulatory T cells attenuate Th17 cell-mediated nigrostriatal
dopaminergic neurodegeneration in a model of Parkinson's disease // J Immunol.
2010. Vol.184, №5. P. 2261-2271.
347. Rite I., Machado A., Cano J., Venero J.L. Blood-brain barrier disruption
induces in vivo degeneration of nigral dopaminergic neurons // J Neurochem. 2007.
Vol.101, P.1567–1582.
348. Rivers R.C., Kumita J.R., Tartaglia G.G., Dedmon M.M., Pawar A.,
Vendruscolo M., Dobson C.M., Christodoulou J. Molecular determinants of the
aggregation behavior of alpha- and beta-synuclein // Protein Sci. 2008. Vol.17, №5.
Р. 887-98.
349. Rochet J.C., Conway K.A., Lansbury P.T., Jr. Inhibition of fibrillization
and accumulation of prefibrillar oligomers in mixtures of human and mouse alphasynuclein // Biochemistry. 2000. Vol.39, №35. Р.10619-10626.
350. Rodriguez M., Alvarez-Erviti L., Blesa F.J., Rodriguez-Oroz M.C., Arina
A., Melero I., Ramos L.I., Obeso J.A. Bone-marrow-derived cell differentiation into
microglia: a study in a progressive mouse model of Parkinson’s disease // Neurobiol
Dis. 2007. Vol.28, P. 316–325.
351. Roodveldt C., Christodoulou J., Dobson C.M. Immunological features of
alpha-synuclein in Parkinson's disease // J Cell Mol Med. 2008. Vol. 12, №5. P.
1820-1829.
352. Roodveldt C., Labrador-Garrido A., Gonzalez-Rey E., FernandezMontesinos R., Caro M., Lachaud C.C., Waudby C.A., Delgado M., Dobson C.M.,
Pozo D. Glial innate immunity generated by non-aggregated alpha-synuclein in
146
mouse: differences between wild-type and Parkinson's disease-linked mutants //
PLoS One. 2010. Vol.5, №10. e13481.
353. Rosenberg G.A. Matrix metalloproteinases in neuroinflammation // Glia.
2002. Vol.39, P.279–291.
354. Rosenkranz D., Weyer S., Tolosa E., Gaenslen A., Berg D., Leyhe T.,
Gasser T., Stoltze L. Higher frequency of regulatory T cells in the elderly and
increased suppressive activity in neurodegeneration // J Neuroimmunol. 2007.
Vol.188, P.117–127.
355. Rubio-Perez J.M., Morillas-Ruiz J.M. A review: inflammatory process in
Alzheimer's disease, role of cytokines // ScientificWorld Journal. 2012. Vol.2012,
Р. 15.
356. Saas P., Walker P.R., Hahne M., Quiquerez A.L., Schnuriger V., Perrin
G., French L., Van Meir E.G., de Tribolet N., Tschopp J., Dietrich P.Y. Fas ligand
expression by astrocytoma in vivo: maintaining immune privilege in the brain? // J
Clin Invest. 1997. Vol.99, №6. P. 1173-1178.
357. Saha A.R., Hill J., Utton M.A., Asuni A.A., Ackerley S., Grierson A.J.,
Miller C.C., Davies A.M., Buchman V.L., Anderton B.H., Hanger D.P.Parkinson's
disease alpha-synuclein mutations exhibit defective axonal transport in cultured
neurons // J Cell Sci. 2004. Vol. 117, №7. Р. 1017-24.
358. Samantaray S., Knaryan V.H., Guyton M.K., Matzelle D.D., Ray S.K.,
Banik N.L. The parkinsonian neurotoxin rotenone activates calpain and caspase-3
leading to motoneuron degeneration in spinal cord of Lewis rats // Neuroscience.
2007. Vol.146, №2. P. 741-755.
359. Sapolsky R.M., Romero L.M., Munck A.U. How do glucocorticoids
influence stress responses? Integrating permissive, suppressive, stimulatory, and
preparative actions // Endocr Rev. 2000. Vol. 21, №1. P. 55-89.
360. Sarkar S., Raymick J., Mann D., Bowyer J.F., Hanig J.P., Schmued L.C.,
Paule M.G., Chigurupati S. Neurovascular changes in acute, sub-acute and chronic
mouse models of Parkinson's disease // Curr Neurovasc Res. 2014. Vol. 11, №1. P.
48-61.
147
361. Scemes E. Components of astrocytic intercellular calcium signaling // Mol
Neurobiol. 2000. Vol.22, №1-3. P. 167-179.
362. Schipke C.G., Boucsein C., Ohlemeyer C., Kirchhoff F., Kettenmann H.
Astrocyte Ca2+ waves trigger responses in microglial cells in brain slices // FASEB
J. 2002. Vol. 16, №2. P. 255-257.
363. Schreibelt G., Kooij G., Reijerkerk A., van Doorn R., Gringhuis S.I., van
der Poll S.M.A., Weksler B.B., Romero I.A., Couraud P.O., Piontek J., Blasig I.E.,
Dijkstra C.D., Ronken E., de Vries H.E. Reactive oxygen species alter brain
endothelial tight junction dynamics via RhoA, PI3 kinase, and PKB signaling //
FASEB J. 2007. Vol.21, P. 3666–3676.
364. Schwartz M., Sabetay S. An approach to the continuous dopaminergic
stimulation in Parkinson's disease // Isr Med Assoc J. 2012. Vol. 14, №3. P. 175179.
365. Sedlakova R., Shivers R.R., Del Maestro R.F. Ultrastructure of the bloodbrain barrier in the rabbit // J Submicrosc Cytol Pathol. 1999. Vol.31, P.149–161.
366. Seifert G., Schilling K., Steinhäuser C. Astrocyte dysfunction in
neurological disorders: a molecular perspective // Nat Rev Neurosci. 2006. Vol.7,
№3. P. 194-206.
367. Shaftel S.S., Kyrkanides S., Olschowka J.A., Miller J.N., Johnson R.E.,
O'Banion M.K. Sustained hippocampal IL-1 beta overexpression mediates chronic
neuroinflammation and ameliorates Alzheimer plaque pathology // J Clin Invest.
2007. Vol.117, №6. P. 1595-1604.
368. Shaked I., Tchoresh D., Gersner R., Meiri G., Mordechai S., Xiao X., Hart
R.P., Schwartz M. Protective autoimmunity: interferon-gamma enables microglia to
remove glutamate without evoking inflammatory mediators // J Neurochem 2005.
Vol.92, P. 997–1009.
369. Shepro D., Morel N.M. Pericyte physiology // FASEB J. 1993. Vol.7, P.
1031–1038.
148
370. Sherer T.B., Betarbet R., Kim J.H., Greenamyre J.T. Selective microglial
activation in the rat rotenone model of Parkinson's disease // Neurosci Lett. 2003.
Vol.341, №2. P. 87-90.
371. Simón-Sánchez J., Schulte C., Bras J.M., Sharma M, Gibbs J.R, Berg D.
Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease
// Nat.Genet. 2009. Vol. 41, Р.1308–1312.
372. Singer C. Managing the patient with newly diagnosed Parkinson disease
// Cleve Clin J Med. 2012. Vol. 79, №2. Р.3-7.
373. Singleton A., Gwinn-Hardy K., Sharabi Y., Li S.T., Holmes C., Dendi R.,
Hardy J., Crawley A., Goldstein D.S. Association between cardiac denervation and
parkinsonism caused by alphasynuclein gene triplication // Brain. 2004. Vol.127, P.
768–772.
374. Singleton A., Gwinn-Hardy K., Sharabi Y., Li S.T., Holmes C., Dendi R.,
Hardy J., Crawley A., Goldstein D.S. Association between cardiac denervation and
parkinsonism caused by alpha-synuclein gene triplication // Brain. 2004. Vol.127,
P.768–772.
375. Singleton A.B., Farrer M., Johnson J., Singleton A., Hague S., Kachergus
J., Hulihan M., Peuralinna T., Dutra A., Nussbaum R., Lincoln S., Crawley A.,
Hanson M., Maraganore D., Adler C., Cookson M.R., Muenter M., Baptista M.,
Miller D., Blancato J., Hardy J., Gwinn-Hardy K. Аlpha-synuclein locus triplication
causes Parkinson’s disease // Science. 2003. Vol.302, P.841- 842.
376. Sokolov Y., Kozak J.A., Kayed R., Chanturiya A., Glabe C., Hall J.E.
Soluble amyloid oligomers increase bilayer conductance by altering dielectric
structure // J Gen Physiol. 2006. Vol.128. P. 637–647.
377. Spillantini M.G., Schmidt M.L., Lee V.M., Trojanowski J.Q., Jakes R.,
Goedert M. Alph-asynuclein in Lewy bodies // Nature. 1997. Vol. 388, Р. 839–840.
378. Stark K., Eckart A., Haidari S., Tirniceriu A., Lorenz M., von Bruhl M.L.,
Gartner F., Khandoga A.G., Legate K.R., Pless R., Hepper I., Lauber K., Walzog B,
Massberg S. Capillary and arteriolar pericytes attract innate leukocytes exiting
149
through venules and ‘instruct’ them with pattern-recognition and motility programs
// Nat Immunol. 2013. Vol.11, P.41–51.
379. Stokin G.B., Lillo C., Falzone T.L., Brusch R.G., Rockenstein E., Mount
S.L., Raman R., Davies P., Masliah E., Williams D.S., Goldstein L.S.Axonopathy
and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease // Science.
2005. Vol.307, №5713. P. 1282-1288.
380. Stone D.K., Reynolds A.D., Mosley R.L., Gendelman H.E. Innate and
adaptive immunity for the pathobiology of Parkinson's disease // Antioxid Redox
Signal. 2009. Vol.11, №9. P. 2151-2166.
381. Storkebaum E., Lambrechts D., Dewerchin M., Moreno-Murciano M.P.,
Appelmans S., Oh H., Van Damme P., Rutten B., Man W.Y., De Mol M., Wyns S.,
Manka D., Vermeulen K., Van Den Bosch L., Mertens N., Schmitz C., Robberecht
W., Conway E.M., Collen D., Moons L., Carmeliet P. Treatment of motoneuron
degeneration by intracerebroventricular delivery of VEGF in a rat model of ALS //
Nat Neurosci. 2005. Vol.8. P. 85–92.
382. Stratman A.N., Malotte K.M., Mahan R.D., Davis M.J., Davis G.E.
Pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly stimulates endothelial
basement membrane matrix formation // Blood. 2009. Vol.114, P.5091–5101.
383. Streilein J.W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and
immunosuppressive microenvironments // Curr Opin Immunol. 1993. Vol.3, P.428432.
384. Strömberg I., Björklund H., Dahl D., Jonsson G., Sundström E., Olson L.
Astrocyte responses to dopaminergic denervations by 6-hydroxydopamine and 1methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine as evidenced by glial fibrillary acidic
protein immunohistochemistry // Brain Res Bull. 1986. Vol.17, №2. P. 225-236.
385. Su X., Maguire-Zeiss K.A., Giuliano R., Prifti L., Venkatesh K., Federoff
H.J. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease // Neurobiol
Aging. 2008. Vol.29, №11. P. 1690-1701.
150
386. Su X., Federoff H.J., Maguire-Zeiss K.A. Mutant alpha-synuclein
overexpression mediates early proinflammatory activity // Neurotox Res. 2009. Vol.
16, №3. P. 238-254.
387. Sugama S., Takenouchi T., Kitani H., Fujita M., Hashimoto M. Microglial
activation is inhibited by corticosterone in dopaminergic neurodegeneration // J
Neuroimmunol. 2009. Vol.208, №1-2. P. 104-114.
388. Sugama S., Takenouchi T., Fujita M., Kitani H., Conti B., Hashimoto M.
Corticosteroids limit microglial activation occurring during acute stress //
Neuroscience. 2013. Vol.232. P. 13-20.
389. Sugaya K., Chou S., Xu S.J., McKinney M. Indicators of glial activation
and brain oxidative stress after intraventricular infusion of endotoxin // Brain Res
Mol Brain Res. 1998. Vol. 58, №1-2. P. 1-9.
390. Sun D., Coleclough C., Whitaker J.N. Nonactivated astrocytes
downregulate T cell receptor expression and reduce antigen-specific proliferation
and cytokine production of myelin basic protein (MBP)-reactive T cells // J
Neuroimmunol. 1997. Vol.78, №1-2. P. 69-78.
391. Sung J.Y., Park S.M., Lee C.H., Um J.W., Lee H.J., Kim J., Oh Y.J., Lee
S.T., Paik S.R., Chung K.C. Proteolytic cleavage of extracellular secreted {alpha}synuclein via matrix metalloproteinases // J Biol Chem. 2005. Vol. 280, №26. P.
25216-25224.
392. Suri-Payer E.., Amar A.Z., Thornton A.M., Shevach E.M. CD4+CD25+
T cells inhibit both the induction and effector function of autoreactive T cells and
represent a unique lineage of immunoregulatory cells // J. Immunol. 1998. Vol.160,
P.1212–1218.
393. Szebenyi G., Morfini G.A., Babcock A., Gould M., Selkoe K., Stenoien
D.L., Young M, Faber P.W., MacDonald M.E., McPhaul M..J, Brady S.T.
Neuropathogenic forms of huntingtin and androgen receptor inhibit fast axonal
transport. // Neuron. 2003. Vol.40, №1. P. 41-52.
394. Togo T., Iseki E., Marui W., Akiyama H., Uéda K., Kosaka K. Glial
involvement in the degeneration process of Lewy body-bearing neurons and the
151
degradation process of Lewy bodies in brains of dementia with Lewy bodies // J
Neurol Sci. 2001. Vol. 184, №1. Р.71-75.
395. Tanji K., Imaizumi T., Yoshida H., Mori F., Yoshimoto M., Satoh K.,
Wakabayashi K. Expression of alpha-synuclein in a human glioma cell line and its
up-regulation by interleukin-1beta // Neuroreport. 2001. Vol.12, №9. P. 1909-1912.
396. Teismann P., Tieu K., Choi D., Wu D., Naini A., Hunot S., Vila M.,
Jackson-Lewis V., Przedborski S. Cyclooxygenase-2 is instrumental in Parkinson's
disease neurodegeneration // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. Vol.100, P.5473–5478.
397. Teismann P., Schulz J.B. Cellular pathology of Parkinson's disease:
astrocytes, microglia and inflammation // Cell Tissue Res. 2004. Vol. 318, №1. P.
149-161.
398. Theodore S., Cao S., McLean P.J., Standaert D.G. Targeted
overexpression of human alpha-synuclein triggers microglial activation and an
adaptive immune response in a mouse model of Parkinson disease // J Neuropathol
Exp Neurol. 2008. Vol. 67, №12. P. 1149-1158.
399. Thomas F.J., Tichopad A., Golub Y., Munz М., Katherine J. Schweitzer
Wolf B., Berg D., Mueller J.C., Gasser Т. Genetic variability in the SNCA gene
influences alpha-synuclein levels in the blood and brain. // FASEB J. 2008. Vol. 22,
Р. 1327–1334.
400. Thomas M.P., Chartrand K., Reynolds A., Vitvitsky V., Banerjee R.,
Gendelman H.E. Ion channel blockade attenuates aggregated alpha synuclein
induction of microglial reactive oxygen species: relevance for the pathogenesis of
Parkinson's disease // J Neurochem. 2007. Vol.100, №2. P. 503-519.
401. Thornton A. M., Shevach E. M. Suppressor effector function of
CD4+CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific // J. Immunol. 2000.
Vol.164, P.183–190.
402. Thornton P., Pinteaux E., Gibson R.M., Allan S.M., Rothwell N.J.
Interleukin-1-induced neurotoxicity is mediated by glia and requires caspase
activation and free radical release // J Neurochem. 2006. Vol.98, №1. P. 258-266.
152
403. Tichauer J., Saud K., von Bernhardi R Modulation by astrocytes of
microglial cell-mediated neuroinflammation: effect on the activation of microglial
signaling pathways // Neuroimmunomodulation. 2007. Vol.14, №3-4. P. 168-174.
404. Tomar R.S., Matta H., Chaudhary P.M. Use of adeno-associated viral
vector for delivery of small interfering RNA // Oncogene. 2003. Vol.22, P. 5712 –
5715.
405. Tompkins M.M., Hill W.D. Contribution of somal Lewy bodies to
neuronal death // Brain Res. 1997. Vol.775. P. 24–29.
406. Tran T.A., McCoy M.K., Sporn M.B., Tansey M.G. The synthetic
triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF
production, and provides dopaminergic neuroprotection // J Neuroinflammation.
2008. Vol.5, P.1-14.
407. Tuszynski M.H. Intraparenchymal NGF infusions rescue degenerating
cholinergic neurons // Cell Transplant. 2000. Vol.9, №5. P. 629-636.
408. Uéda K, Fukushima H, Masliah E, Xia Y, Iwai A, Yoshimoto M, Otero
DA, Kondo J, Ihara Y, Saitoh T. Molecular cloning of cDNA encoding an
unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease // PNAS. 1993. Vol. 90,
Р.11282–11286.
409. Ullen A., Singewald E., Konya V., Fauler G., Reicher H., Nusshold C.,
Hammer A., Kratky D., Heinemann A., Holzer P., Malle E., Sattler W.
Myeloperoxidase-derived oxidants induce blood-brain barrier dysfunction in vitro
and in vivo // PLoS One. 2013. Vol.8, №5. Р. 64034.
410. Uversky V.N., Li J., Fink A.L. Evidence for a partially folded intermediate
in alpha-synuclein fibril formation // J Biol Chem. 2001. Vol. 276, P. 10737–10744.
411. Van Duijn C.M., Dekker T., Bonifati V., Galjaard R.J., HouwingDuistermaat J.J., Snijders P.J.L.M., Testers L., Breedveld G.J., Horstink M.,
Sandkuijl L.A., van Swieten J.C., Oostra B.A., Heutink P. Park7, a novel locus for
autosomal-recessive
early-onset
parkinsinism,
Am.J.Hum.Genet. 2001. Vol. 69, Р. 629-634.
on
chromosome
1p36
//
153
412. Van Geest R.J., Klaassen I., Vogels I.M., Van Noorden C.J.,
Schlingemann R.O. Differential TGF-β signaling in retinal vascular cells: a role in
diabetic retinopathy? // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010. Vol.51, P. 1857–1865.
413. Vaughan J., Durr A., Tassin J., Bereznai B., Gasser T., Bonifati V., De
Michele G., Fabrizio E., Volpe G., Bandmann O., Johnson W.G., Golbe L.I.,
Breteler M., Meco G., Agid Y., Brice A., Marsden C.D., Wood N.W. The alphasynuclein Ala53Thr mutation is not a common cause of familial Parkinson's disease:
a study of 230 European cases. European Consortium on Genetic Susceptibility in
Parkinson's Disease // Ann. Neurol. 1998. Vol.44, Р. 270 – 273.
414. Verkhratsky A., Steinhäuser C. Ion channels in glial cells // Brain Res
Brain Res Rev. 2000. Vol. 32, №2-3. P. 380-412.
415. Verma S., Nakaoke R., Dohgu S., Banks W.A. Release of cytokines by
brain endothelial cells: A polarized response to lipopolysaccharide // Brain Behav
Immun. 2006. Vol. 20, P. 449–455.
416. Verreck F.A., de Boer T., Langenberg D.M., Hoeve M.A., Kramer M.,
Vaisberg E., Kastelein R., Kolk A., de Waal-Malefyt R., Ottenhoff T.H. Human IL23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages
subvert immunity to (myco)bacteria // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. Vol. 101,
№13. Р. 4560-4565.
417. Vinters H.V., Secor D.L., Read S.L., Frazee J.G., Tomiyasu U., Stanley
T.M., Ferreiro J.A., Akers M.A. Microvasculature in brain biopsy specimens from
patients with Alzheimer's disease: an immunohistochemical and ultrastructural study
// Ultrastruct Pathol. 1994. Vol.18, №3. P. 333-348.
418. Volles M.J., Lee S.J., Rochet J.C., Shtilerman M.D., Ding T.T., Kessler
J.C., Lansbury P.T. Vesicle permeabilization by protofibrillar alpha-synuclein:
implications for the pathogenesis and treatment of Parkinson's disease //
Biochemistry. 2001. Vol.40, P.7812-7819.
419. Volles M.J., Lansbury P.T. Vesicle permeabilization by
a-synuclein is sensitive to Parkinson’s disease-linked
protofibrillar
mutations and occurs by a
pore-like mechanism // Biochemistry. 2002. Vol. 41, Р. 4595–4602.
154
420. Volles M.J., Lansbury P.T. Zeroing in on the pathogenic form of alphasynuclein and its mechanism of neurotoxicity in Parkinson's disease // Biochemistry.
2003. Vol.42, P.7871-7878.
421. von Bernhardi R., Eugenín J. Microglial reactivity to beta-amyloid is
modulated by astrocytes and proinflammatory factors // Brain Res. 2004. Vol. 1025,
№1-2. P. 186-193.
422. von Bernhardi R., Ramírez G., Toro R., Eugenín J.Pro-inflammatory
conditions promote neuronal damage mediated by Amyloid Precursor Protein and
decrease its phagocytosis and degradation by microglial cells in culture // Neurobiol
Dis. 2007. Vol. 26, №1. P. 153-164.
423. Wakabayashi K, Hayashi S, Yoshimoto M, Kudo H, Takahashi H.
NACP/alpha-synuclein-positive
filamentous
inclusions
in
astrocytes
and
oligodendrocytes of Parkinson's disease brains // Acta Neuropathol. 2000. Vol. 99,
№1. Р. 14-20.
424. Walsh D.M., Selkoe D.J. Oligomers on the brain: the emerging role of
soluble protein aggregates in neurodegeneration // Protein Pept Lett. 2004. Vol.11,
P. 213–228.
425. Walter S., Letiembre M., Liu Y., Heine H., Penke B., Hao W., Bode B.,
Manietta N., Walter J., Schulz-Schuffer W., Fassbender K. Role of the toll-like
receptor 4 in neuroinflammation in Alzheimer's disease // Cell Physiol Biochem.
2007. Vol.20, №6. P. 947-956.
426. Wang H.L., Chou A.H., Wu A.S., Chen S.Y., Weng Y.H., Kao Y.C., Yeh
T.H., Chu P.J., Lu C.S. PARK6 PINK1 mutants are defective in maintaining
mitochondrial membrane potential and inhibiting ROS formation of substantia nigra
dopaminergic neurons // Biochim Biophys Acta. 2011. Vol.1812, №6. P. 674-684.
427. Wang J., Asensio V.C., Campbell I.L. Cytokines and chemokines as
mediators of protection and injury in the central nervous system assessed in
transgenic mice // Curr Top Microbiol Immunol. 2002. Vol.265, P.23-48.
428. Wang J., Crawford K., Yuan M., Wang H., Gorry P.R., Gabuzda D.
Regulation of CC chemokine receptor 5 and CD4 expression and human
155
immunodeficiency virus type 1 replication in human macrophages and microglia by
T helper type 2 cytokines // J Infect Dis. 2002. Vol. 185, №7. P. 885-897.
429. Wang S., Cao C., Chen Z., Bankaitis V., Tzima E., Sheibani N., Burridge
K. Pericytes regulate vascular basement membrane remodeling and govern
neutrophil extravasation during inflammation // PLoS One. 2012. Vol.11, Р. 45499.
430. Wang T., Qin L., Liu B., Liu Y., Wilson B., Eling T.E., Langenbach R.,
Taniura S., Hong J.S. Role of reactive oxygen species in LPS-induced production of
prostaglandin E2 in microglia // J Neurochem. 2004. Vol.88, №4. P. 939-947.
431. Ward N.L., Lamanna J.C. The neurovascular unit and its growth factors:
coordinated response in the vascular and nervous systems // Neurol Res. 2004.
Vol.26. P. 870–883.
432. Warner T.T., Schapira A.H. The role of the alpha-synuclein gene mutation
in patients with sporadic Parkinson.s disease in the United Kingdom // J. Neurol.
Neurosurg. Psychiatry. 1998. Vol. 65, Р. 378- 379.
433. Waxman E.A., Giasson B.I. A novel, high-efficiency cellular model of
fibrillar alpha-synuclein inclusions and the examination of mutations that inhibit
amyloid formation // J. Neurochem. 2010. Vol.113, Р. 374–388.
434. Weinreb P.H., Zhen W., Poon A.W., Conway K.A., Lansbury P.T. Jr.
NACP a protein implicated in Alzheimer’s disease and learning is natively unfolded
// Biochemistry. 1996. Vol.35, P. 13709–13715.
435. Wersinger C., Sidhu A. Disruption of the interaction of alpha-synuclein
with microtubules enhances cell surface recruitment of the dopamine transporter //
Biochemistry. 2005. Vol.44, P.13612-13624.
436. Wersinger C., Sidhu A. An inflammatory pathomechanism for Parkinson's
disease? // Curr Med Chem. 2006. Vol. 13, №5. P. 591-602.
437. Wilhelmus M.M., Otte-Höller I., van Triel J.J., Veerhuis R., MaatSchieman M.L., Bu G., de Waal R.M., Verbeek M.M. Lipoprotein receptor-related
protein-1 mediates amyloid-beta-mediated cell death of cerebrovascular cells // Am
J Pathol. 2007. Vol.171, №6. P. 1989-1999.
156
438. Windisch M., Wolf H.J., Hutter-Paier B., Hofmeister A., Wronski R. Is
alpha-synuclein pathology a target for treatment of neurodegenerative disorders? //
Curr Alzheimer Res. 2007. Vol. 4, №4. P. 446-457.
439. Winikates J., Jankovic J. Clinical correlates of vascular parkinsonism //
Arch Neurol. 1999. Vol. 56, №1. P. 98-102.
440. Winikates J., Jankovic J. 1999; Rektor I., Goldemund D., Sheardova K.,
Rektorova I., Michalkova Z., Dufek M. Vascular pathology in patients with
idiopathic Parkinson's disease // Parkinsonism Relat Disord. 2009. Vol.15, №1. P.
24-29.
441. Winkler E.A., Bell R.D., Zlokovic B.V. Central nervous system pericytes
in health and disease // Nat Neurosci. 2011. Vol.11, P.1398–1405.
442. Wisniewski H.M., Wegiel J., Wang K.C., Lach B. Ultrastructural studies
of the cells forming amyloid in the cortical vessel wall in Alzheimer’s disease // Acta
Neuropathol. 1992. Vol.84, P.117–127.
443. Xia M.Q., Bacskai B.J., Knowles R.B., Qin S.X., Hyman B.T. Expression
of the chemokine receptor CXCR3 on neurons and the elevated expression of its
ligand IP-10 in reactive astrocytes: in vitro ERK1/2 activation and role in
Alzheimer's disease // J Neuroimmunol. 2000. Vol.108, №1-2. P.227-235.
444. Xiao B.G., Diab A., Zhu J., van der Meide P., Link H. Astrocytes induce
hyporesponses of myelin basic protein-reactive T and B cell function // J
Neuroimmunol. 1998. Vol.89, №1-2. P. 113-121.
445. Xiao X., Li J., McCown T.J., Samulski R.J. Gene transfer by
adenoassociated virus vectors into the central nervous system // Exp. Neurol. 1997.
Vol.144, P. 113 – 124.
446. Xiong X., Barreto G.E., Xu L., Ouyang Y.B., Xie X., Giffard R.G.
Increased brain injury and worsened neurological outcome in interleukin-4 knockout
mice after transient focal cerebral ischemia // Stroke. 2011. Vol.42, №7. P. 20262032.
447. Yang J.F., Tao H.Q., Liu Y.M., Zhan X.X., Liu Y., Wang X.Y., Wang
J.H., Mu L.L., Yang L.L., Gao Z.M., Kong Q.F., Wang G.Y., Han J.H., Sun B., Li
157
H.L. Characterization of the interaction between astrocytes and encephalitogenic
lymphocytes
during
the
development
of
experimental
autoimmune
encephalitomyelitis (EAE) in mice // Clin Exp Immunol. 2012. Vol.170, №3. P. 254265.
448. Yemisci M., Gursoy-Ozdemir Y., Vural A., Can A., Topalkara K.,
Dalkara T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs
capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery // Nat
Med. 2009. Vol. 15, №9. P. 1031-1037.
449. Yu S., Uéda K., Chan P. Alpha-synuclein and dopamine metabolism //
Mol Neurobiol. 2005. Vol. 31, №1-3. Р. 243-54.
450. Zaheer A., Sahu S.K., Wu Y., Zaheer A., Haas J., Lee K., Yang B.
Diminished cytokine and chemokine expression in the central nervous system of
GMF-deficient mice with experimental autoimmune encephalomyelitis // Brain Res.
2007. Vol.1144, P. 239-247.
451. Zaheer A., Zaheer S., Sahu S.K., Knight S., Khosravi H., Mathur S.N.,
Lim R. A novel role of glia maturation factor: induction of granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor and pro-inflammatory cytokines // J Neurochem. 2007.
Vol.101, №2. P. 364-376.
452. Zaheer S., Thangavel R., Sahu S.K., Zaheer A. Augmented expression of
glia maturation factor in Alzheimer's disease // Neuroscience. 2011. Vol.194, P.227233.
453. Zarranz J.J., Alegre J., Gómez-Esteban J.C., Lezcano E., Ros R., Ampuero
I., Vidal L., Hoenicka J., Rodriguez O., Atarés B., Llorens V., Gomez Tortosa E.,
del Ser T., Muñoz D.G., de Yebenes J.G. The new mutation, E46K, of alphasynuclein causes Parkinson and Lewy body dementia // Ann. Neurol. 2004. Vol. 55,
Р. 164-173.
454. Zeng K.W., Zhao M.B., Ma Z.Z., Jiang Y, Tu P.F. Protosappanin A
inhibits oxidative and nitrative stress via interfering the interaction of
transmembrane protein CD14 with Toll-like receptor-4 in lipopolysaccharideinduced BV-2 microglia // Int Immunopharmacol. 2012. Vol.14, №4. Р.558-69.
158
455. Zhang W., Wang T., Pei Z., Miller D.S., Wu X., Block M.L., Wilson B.,
Zhang W., Zhou Y., Hong J.S., Zhang J. Aggregated alpha-synuclein activates
microglia: a process leading to disease progression in Parkinson's disease // FASEB
J. 2005. Vol. 19, №6. P. 533-542.
456. Zhang W., Dallas S., Zhang D., Guo J.P., Pang H., Wilson B., Miller D.S.,
Chen B., Zhang W., McGeer P.L., Hong J.S., Zhang J. Microglial PHOX and Mac1 are essential to the enhanced dopaminergic neurodegeneration elicited by A30P
and A53T mutant alpha-synuclein // Glia. 2007. Vol.55, №11. P. 1178-88.
457. Zhao C., Ling Z., Newman M.B., Bhatia A., Carvey P.M. TNF-alpha
knockout and minocycline treatment attenuates blood-brain barrier leakage in
MPTP-treated mice // Neurobiol Dis. 2007. Vol.26, P. 36–46.
458. Zhong Z., Deane R., Ali Z., Parisi M., Shapovalov Y., O’Banion M.K.,
Stojanovic K., Sagare A., Boillee S., Cleveland D.W., Zlokovic B.V. ALS causing
SOD1 mutants generate vascular changes prior to motor neuron degeneration // Nat
Neurosci. 2008. Vol.11. P. 420–422.
459. Zlokovic
B.V.
Neurovascular
mechanisms
of
Alzheimer’s
neurodegeneration // Trends Neurosci. 2005. Vol.28, P.202–208.
460. Zlokovic B.V. The blood-brain barrier in health and chronic
neurodegenerative disorders // Neuron. 2008. Vol.57, P. 178–201.