ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА И ГЛЮКОЗЫ IN VITRO НА

УДК 612.112.94
ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА И ГЛЮКОЗЫ IN VITRO НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ
АКТИВНОСТЬ Т\ХЕЛПЕРОВ\17 ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2\ГО ТИПА
И.В. Кологривова
ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН, Томск
E9mail: ikologrivova@gmail.com
INFLUENCE OF INSULIN AND GLUCOSE ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY
OF T\HELPER\17 IN VITRO IN TYPE 2 DIABETES
I.V. Kologrivova
Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Cardiology” of Siberian Branch
under the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk
Изучали влияние инсулина и глюкозы на функциональную активность Tлимфоцитовхелперов 17го типа (Th17).
Число Th17 ex vivo оценивали у 32 пациентов с сахарным диабетом (СД) 2го типа, 12 пациентов с нарушением
толерантности к углеводам (НТУ) и 24 здоровых добровольцев. Мононуклеары периферической крови пациен
тов с СД 2го типа и здоровых добровольцев культивировали в течение 24 ч в среде, содержащей 5, 10 и
20 ммоль/л глюкозы или следующие сочетания инсулина и глюкозы: 5 ммоль/л глюкозы и 10–10 моль/л инсулина,
5 ммоль/л глюкозы и 10–8 моль/л инсулина, 20 ммоль/л глюкозы и 10–8 моль/л инсулина. Оценивали число актив
ных Th17 в культуре и количество секретированного IL17A. Пациенты с НТУ характеризовались повышенным
содержанием Th17 ex vivo. У пациентов с СД 2го типа мононуклеары внутриклеточно продуцировали больше
IL17 по сравнению со здоровыми добровольцами после культивирования в течение суток при 5 ммоль/л глюко
зы. При 10 ммоль/л глюкозы в среде внутриклеточная продукция IL17 была выше, чем при 5 ммоль/л как у паци
ентов, так и у здоровых добровольцев. У пациентов с СД 2го типа культивирование клеток с 20 ммоль/л глюкозы
приводило к увеличению стимулированной форболмиристатацетатом внутриклеточной продукции IL17 по
99
Сибирский медицинский журнал, 2013, Том 28, № 2
сравнению с 5 ммоль/л глюкозы. Инсулин при всех используемых концентрациях приводил к активации спон
танной внутриклеточной продукции IL17 у пациентов и здоровых добровольцев. Сочетание 20 мммоль/л глюко
зы и 10–8 моль/л инсулина вызывало увеличение количества активных Th17 у здоровых добровольцев. Таким об
разом, мы показали, что метаболические нарушения при СД 2го типа могут ассоциироваться с увеличением фун
кциональной активности Th17 in vitro.
Ключевые слова: сахарный диабет 2го типа, воспаление, Тхелперы 17го типа, инсулин, глюкоза.
Influence of insulin and glucose on functional activity of Th17 in vitro was studied. The study included 11 patients with
diabetes mellitus type 2 (DM2) and 13 nondiabetic volunteers. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured
for 24 hours in the medium containing 5, 10 and 20 mmol/L of glucose; or the following combinations of insulin and
glucose concentrations: 5 mmol/L glucose and 10–10 mol/L insulin, 5 mmol/L glucose and 10–8 mol/L insulin, 20 mmol/L
glucose and 10–8 mol/L insulin. Number of active Th17 in culture and quantity of secreted IL17A were estimated. Percentage
of Th17 ex vivo was studied in 32 patients with DM2, 12 patients with impaired glucose tolerance (IGT), and in 24 non
diabetic healthy volunteers. Patients with IGT were characterized by the elevated number of Th17 ex vivo. PBMC from
patients with DM2 revealed enhanced intracellular production of IL17 compared to PBMC from healthy volunteers when
cultured in medium with 5 mmol/L glucose for 24 hours. Elevation of glucose content in the medium up to 10 mmol/L
caused an increase in spontaneous intracellular production of IL17 both in patients and in healthy volunteers compared
to 5 mmol/L glucose. In patients with DM2, cultivation of PBMC with 20 mmol/L of glucose led to the elevation of PMA
stimulated intracellular production of IL17 compared to 5 mmol/L glucose. Insulin at all the used concentrations stimulated
Th17 in healthy volunteers and in patients with DM2. Intracellular production of IL17 increased in the group of healthy
volunteers when the medium was supplied both with 10–8 mol/L insulin and 20 mmol/L glucose. Our study shows that
metabolic disturbances during DM2 may be accompanied by the increase of the Th17 functional activity in vitro.
Key words: diabetes mellitus type 2, inflammation, Thelper type 17, insulin, glucose.
Введение
Сахарный диабет (СД) 2го типа привлекает все боль
шее внимание исследователей, но механизмы его разви
тия до сих пор изучены недостаточно. При этом заболе
ваемость СД 2го типа и развитие его осложнений оста
ются серьезными проблемами во всем мире [1].
В настоящее время известно, что СД 2го типа ассо
циируется с развитием субклинического воспаления, про
являющегося, в частности, увеличением содержания ин
терлейкина (IL)1β, IL6 и фактора некроза опухолей
(TNF)α в циркуляции [3]. Эти цитокины могут создавать
провоспалительное микроокружение, благоприятное для
активации недавно открытой субпопуляции Тлимфоци
тов – Тхелперов 17го типа (Th17). Несмотря на значи
тельный потенциал Th17 модулировать воспаление, мы
встретили лишь незначительное число работ, посвящен
ных изучению функционирования данных клеток у па
циентов с СД 2го типа [3, 10].
На ранних этапах развития СД 2го типа, как прави
ло, наблюдается гиперинсулинемия [6]. Инсулин может
влиять на функцию Тлимфоцитов, но транспорт глюко
зы в лимфоцитах является независимым от инсулина, т.к.
в норме они не экспрессируют переносчик глюкозы
GLUT4, а несут на своей поверхности GLUT1 и GLUT3
[7, 9].
Известно, что повышенная постпрандиальная концен
трация глюкозы (после приема пищи) является основным
фактором риска развития микро и макрососудистых ос
ложнений при СД 2го типа [8]. Если в норме содержание
глюкозы через 2 ч после приема пищи не превышает
5 ммоль/л, то у пациентов с СД 2го типа постпрандиаль
ная гипергликемия может достигать 20 ммоль/л [2]. На
рушение толерантности к углеводам (НТУ) обычно пред
шествует развитию СД 2го типа. Постпрандиальное со
держание глюкозы при этом патологическом состоянии
является повышенным, но не так выражено, как при СД
2го типа и обычно не превышает 10 ммоль/л [2].
100
Цель исследования: изучение влияния различных кон
центраций инсулина и глюкозы в условиях in vitro на фун
кциональную активность Th17 у пациентов с нарушени
ями углеводного обмена.
Материал и методы
В исследование вошли 32 пациента с СД 2го типа (воз
раст – 45–61 лет; 14 мужчин/18 женщин), 12 пациентов
с НТУ (возраст – 56–61 лет; 5 мужчин/7 женщин) и 24
практически здоровых добровольца (возраст – 40–59 лет;
10 мужчин/14 женщин). У пациентов с СД 2го типа и
НТУ лабораторно было подтверждено наличие гипер
гликемии и гиперинсулинемии. Мононуклеарные клет
ки из гепаринизированной венозной крови, взятой ут
ром натощак, выделяли путем центрифугирования на гра
диенте плотности (Histopaque 1119, SigmaAldrich, США).
Для оценки внутриклеточной продукции IL17A мо
нонуклеары культивировали на среде RPMI 1640, содер
жащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% Lглутами
на и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C, 5% CO2 в
присутствии GolgiPlug (BD Pharmingen, США). Оценива
ли как спонтанную внутриклеточную продукцию IL17,
так и стимулированную форбол12миристат13ацета
том (ФМА; 50 нг/мл, SigmaAldrich, США) с иономицином
(1 мг/мл, SigmaAldrich, США). Через 6 ч 100 мл взвеси
мононуклеаров окрашивали антиCD4 моноклональны
ми антителами, меченными фикоэритриномцианином
5 (PECy5, Becton Dickinson, США), фиксировали, увели
чивали проницаемость клеточных мембран и окрашива
ли антиIL17A моноклональными антителами, меченны
ми фикоэритрином (PE, Becton Dickinson, США). Анализ
клеток проводили на проточном цитометре FACSCalibur
с использованием программы CellQuestPro (BD
Biosciences, США).
У 11 здоровых добровольцев и 13 пациентов с СД
2го типа изучали влияние инсулина и глюкозы на про
дукцию IL17. Для этого 106 клеток культивировали в про
И.В. Кологривова
ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА И ГЛЮКОЗЫ IN VITRO НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ...
бирках емкостью 15 мл в течение 24 ч при 37 °С и 5% CO2
в 1 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бы
чьей сыворотки, 1% Lглутамина и 1% пенициллина/
стрептомицина. В культуральную среду добавляли инсу
лин и Dглюкозу в различных концентрациях (оба реа
гента – Sigma Aldrich, США). Три пробирки имели кон
центрацию Dглюкозы 5, 10 и 20 ммоль/л и не содержа
ли инсулина. В трех пробирках было создано следующее
сочетание концентраций инсулина и Dглюкозы:
5 ммоль/л глюкозы и 10–10 моль/л инсулина; 5 ммоль/л
глюкозы и 10–8 моль/л инсулина; 20 ммоль/л глюкозы и
10–8 моль/л инсулина. In vitro концентрации инсулина и
глюкозы были выбраны таким образом, чтобы соответ
ствовать условиям, которые имеют место in vivo в ходе
развития СД 2го типа. Для контроля осмолярности была
использована пробирка, содержащая 5 ммоль/л Dглю
козы и 15 ммоль/л Dманнитола. Через 24 ч супернатан
ты клеточных культур собирали и хранили при –40 °С
для последующего определения секретированного IL17
методом иммуноферментного анализа (ВекторБЕСТ, Рос
сия). Клетки ресуспендировали в фосфатносолевом бу
ферном растворе и оценивали внутриклеточную продук
цию IL17 методом проточной цитометрии. Для оценки
жизнеспособности клетки окрашивали 7актиноамино
мицином D (7AAD, Becton Dickinson, США). Жизнеспо
собность клеток варьировала от 95 до 98%.
Статистическую обработку данных проводили с ис
пользованием пакета программ SPSS 11.5.0 for Windows
(SPSS Inc., США). Использовали непараметрический
Uкритерий Манна–Уитни и критерий Вилкоксона для
связных выборок. Различия считали статистически зна
чимыми при р<0,05. Результаты представлены в виде ме
дианы и интерквартильного размаха.
Результаты
лось только при концентрации глюкозы в среде 10 ммоль/
л (р=0,044).
Стимуляция ФМА с иономицином мононуклеаров пе
риферической крови у пациентов с СД 2го типа приво
дила к более выраженному увеличению продукции цито
кина при содержании глюкозы в среде 20 ммоль/л по
сравнению с 5 ммоль/л глюкозы (р=0,001; рис. 2 Б). В
группе здоровых добровольцев процент активированных
Th17 после стимуляции ФМА с иономицином достовер
но не различался при различном содержании глюкозы в
среде (рис. 2 А). Инкубация с Dманнитолом не приводи
ла к изменению внутриклеточной продукции IL17 как в
группе пациентов с СД 2го типа, так и в группе здоро
вых добровольцев (рис. 2). Следовательно, наблюдаемое
изменение продукции цитокинов связано именно с воз
действием глюкозы, а не с изменением осмолярности
среды.
Добавление 10–10 и 10–8 моль/л инсулина in vitro при
водило к увеличению содержания IL17продуцирующих
Th17 как в группе здоровых добровольцев, так и в группе
пациентов с СД 2го типа (р=0,005 и р=0,002 соответ
ственно при 10–10 моль/л инсулина; р=0,003 и р=0,047
соответственно при 10–8 моль/л инсулина; рис. 3 А).
В группе здоровых добровольцев процент Th17, внут
риклеточно продуцирующих IL17, после стимуляции
ФМА с иономицином, был выше при содержании в среде
10–10 и 10–8 моль/л инсулина по сравнению со средой без
инсулина (р=0,001 и р=0,007 соответственно; рис. 3 Б).
У пациентов с СД 2го типа количество активирован
ных Th17 не зависело от концентрации инсулина в сре
де, если клетки стимулировали ФМА с иономицином пос
ле 24 ч культивирования. Процент Th17, продуцирующих
IL17, оставался высоким как в отсутствии инсулина, так
и при содержании 10–10 и 10–8 моль/л инсулина в среде
(рис. 3 Б).
Культивирование мононуклеаров здоровых добро
вольцев в среде, содержащей повышенные концентрации
инсулина (10–8 моль/л) и глюкозы (20 ммоль/л), приво
дило к увеличению количества активированных Th17 по
Анализ ex vivo показал, что пациенты с НТУ характе
ризовались большим количеством активных Th17 после
стимуляции ФМА с иономицином по сравнению со здо
ровыми добровольцами и пациентами
с СД 2го типа (р=0,015 и р=0,023 соот
ветственно, рис. 1).
После инкубации клеток в течение
24 ч в среде с содержанием глюкозы
5 ммоль/л процент Тклеток, внутрикле
точно продуцирующих IL17 спонтан
но и после стимуляции ФМА с иономи
цином, был значительно выше у паци
ентов с СД 2го типа по сравнению с
контрольной группой (рис. 2 А).
Инкубация мононуклеаров здоро
вых добровольцев в среде с концентра
цией глюкозы 10 и 20 ммоль/л привела
к увеличению спонтанной внутрикле
точной продукции IL17 по сравнению
с концентрацией глюкозы в среде 5
ммоль/л (р=0,010 и р=0,002 соответ
ственно; рис. 2 А). У пациентов с СД
2го типа увеличение спонтанной внут Рис. 1. Примеры точечных диаграмм, отражающих процент Th17 ex vivo у пациен
и здоровых добровольцев (n=24).
риклеточной продукции IL17 наблюда тов с СД 2го типа (n=32), пациентов с НТУ (n=12)
+
Процент указан от общего количества CD4 лимфоцитов
101
Сибирский медицинский журнал, 2013, Том 28, № 2
сравнению с условиями культивирования без инсулина с
содержанием глюкозы 5 ммоль/л (рис. 3). Данный эф
фект совместного воздействия высоких концентраций
инсулина и глюкозы наблюдался как при стимуляции
ФМА и иономицином (р=0,001), так и в отсутствии сти
муляции (р=0,005).
В мононуклеарах пациентов с СД 2го типа спонтан
ная и стимулированная ФМА с иономицином внутрикле
точная продукция IL17 при сочетанном воздействии
10–8 моль/л инсулина и 20 ммоль/л глюкозы не отлича
лась от условий культивирования без инсулина и остава
лась на высоком уровне (рис. 3).
Содержание секретированного
IL17 после 24 ч культивирования
было относительно низким при всех
концентрациях глюкозы и инсули
на, созданных in vitro в нашем ис
следовании, и граничило с пределом
чувствительности используемого
набора ИФА (2 пг/мл), рисунки 2 В
и 3 В, поэтому мы не смогли сделать
какоголибо заключения о влиянии
инсулина и глюкозы на секрецию IL
17.
тов с СД 2го типа, т.к. клетки уже подвергались воздей
ствию высоких концентраций инсулина и глюкозы in vivo.
Известно, что гипергликемия может приводить к актива
ции протеинкиназы С (PKC) с последующим ингибиро
ванием инсулинового сигналинга [5]. Вероятно, допол
нительная активация данного пути in vitro с помощью
ФМА привела к блокированию внутриклеточного сигна
линга инсулина и вызвала различный ответ на воздей
ствие инсулина в группах пациентов и здоровых добро
вольцев. Необходимы дальнейшие исследования, направ
ленные на выяснение роли PKC в сигналинге инсулина и
глюкозы при синтезе IL17.
Обсуждение
Мы показали увеличение функ
циональной активности Th17 у па
циентов с СД 2го типа, что отража
лось в активации внутриклеточного
синтеза IL17 после культивирова
ния в течение 24 ч. В соответствии с
нашими результатами, активация
Th17 имеет место даже при неболь
шом увеличении концентрации
глюкозы в среде, т.е. отклонение оси
дифференцировки Th17 может
предшествовать развитию СД 2го
типа, что мы наблюдали ex vivo у
пациентов с НТУ.
Несмотря на увеличение внутри
клеточной продукции IL17, мы не
выявили влияния глюкозы и инсули
на на секрецию данного цитокина
in vitro. Вероятно, для интенсивной
секреции IL17 необходимо наличие
дополнительного активационного
сигнала. Так, A. Lenarczyk и соавт. по
казали, что при секреции IL17 важ
ную роль играет митогенная стиму
ляция лимфоцитов [4].
Наши результаты свидетельству
ют о том, что инсулин наряду с глю
козой может стимулировать актива
цию Th17, действуя как сам по себе,
так и в сочетании с глюкозой. Мы
полагаем, что инсулин не оказывал
влияния на стимулированную про
дукцию цитокина в Th17 у пациен
102
Рис. 2. Влияние различных концентраций глюкозы на 24часовую спонтанную внут
риклеточную продукцию IL17 (A), стимулированную ФМА с иономицином внутри
клеточную продукцию IL17 (Б), секрецию IL17 (В) мононуклеарами периферичес
кой крови у пациентов с СД 2го типа (n=13) и здоровых добровольцев (n=11); А и Б
– указан процент клеток от CD4+лимфоцитов, В – концентрация в пг/мл; * – р<0,05
по сравнению с концентрацией глюкозы в среде 5 ммоль/л; # – р<0,05 по сравнению
со здоровыми добровольцами; o – экстремумы.
Рис. 3. Влияние различных концентраций инсулина на 24часовую спонтанную внут
риклеточную продукцию IL17 (A), стимулированную ФМА с иономицином внутри
клеточную продукцию IL17 (Б), секрецию IL17 (В) мононуклеарами периферичес
кой крови у пациентов с СД 2го типа (n=13) и здоровых добровольцев (n=11); А и Б
– указан процент клеток от CD4+лимфоцитов, В – концентрация в пг/мл; * – р<0,05
по сравнению с условиями без инсулина и 5 ммоль/л глюкозы в среде; # – р<0,05 по
сравнению со здоровыми добровольцами; o – экстремумы.
И.В. Кологривова
ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА И ГЛЮКОЗЫ IN VITRO НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ...
Таким образом, в соответствии с нашими данными,
метаболические нарушения при СД 2го типа ассоции
руются с повышенной активацией линии Th17лимфо
цитов, что может значительно увеличивать риск разви
тия воспаления у пациентов и, следовательно, осложне
ний диабета.
Работа выполнена при финансовой поддержке
Федерального агентства по науке и инновациям в
рамках Федеральной целевой научно'технической
программы “Исследования и разработки по приори'
тетным направлениям развития научно'техническо'
го комплекса России на 2007–2012 годы”
(Государственный контракт № 02.527.11.0007
от 30 апреля 2009 г.)
Литература
1. Гарганеева Н.П. Психосоциальные аспекты сахарного диа
бета 2го типа: инновации профилактики // Сибирский ме
дицинский журнал (Томск). – 2011. – Т. 26, № 4. – С. 121–
125.
2. Airola P. Hypoglycemia: a better approach. – Phoenix, Arizona :
Health Plus., 1977. – 191 p.
3. JagannathanBogdan M., McDonnell M.E., Shin H. et al. Elevated
proinflammatory cytokine production by a skewed T cell
compartment requires monocytes and promotes inflammation
in type 2 diabetes // J. Immunol. – 2011. – Vol. 186. – P. 1162–
1172.
4. Lenarczyk A., Helsloot J., Farmer K. et al. Antigeninduced IL17
response in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of
healthy controls // Clin. Exp. Immunol. – 2000. – Vol. 122. –
P. 41–48.
5. Oldenborg P.A., Sehlin J. Hyperglycemia in vitro attenuates
insulinstimulated chemokinesis in normal human neutrophils.
Role of protein kinase C activation // J. Leukoc. Biol. – 1999. –
Vol. 65. – P. 635–640.
6. Shanik M.H., Xu Y., Skrha J. et al. Insulin resistance and
hyperinsulinemia // Diabetes Care. – 2008. – Vol. 31, Suppl. 2.
– P. S262–S268.
7. Szablewski L., SobczykKopciol A., Oleszczak B. et al. GLUT4 is
expressed in circulating lymphocytes of diabetic patients. A
method to detect early prediabetic stages? // Diabetologia
Croatica. – 2007. – Vol. 36. – P. 69–76.
8. TenzerIglesias P., Brunton S. Managing postprandial glucose
levels in patients with diabetes // J. Fam. Pract. Suppl. – 2008. –
Vol. 57, No. 1. – P. S17–S24.
9. Van der Weerd K., Dik W.A., Schrijver B. et al. Morbidly obese
human subjects have increase peripheral blood CD4+ T cells
with skewing toward a Treg and Th2dominated phenotype
// Diabetes. – 2012. – Vol. 61, № 2. – P. 401–408.
10. Zeng C., Shi X., Zhang B. et al. The imbalance of Th17/Th1/
Tregs in patients with type 2 diabetes: relationship with
metabolic factors and complications // J. Mol. Med. (Berl.). –
2012. – Vol. 90, No. 2. – P. 175–186.
Поступила 02.04.2013
Сведения об авторе
Кологривова Ирина Вячеславовна, научный сотруд
ник отделения функциональной и лабораторной ди
агностики ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.
Email: ikologrivova@gmail.com.
103