Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Общество биотехнологов России

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
Институт биоорганической химии
им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Общество биотехнологов России
им. Ю.А. Овчинникова
Научная конференция
по биоорганической химии и биотехнологии
“X чтения памяти академика
Юрия Анатольевича Овчинникова”
14 – 17 ноября 2011 г.
Сборник тезисов
Том 1. Устные доклады и стендовые сообщения
Москва – Пущино
1
Конференция проводится при поддержке:
Российского фонда фундаментальных исследований
Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова
Целевой программы Президиума РАН “Поддержка молодых
ученых”
Редакторы сборника
д.х.н. Т.В. Овчинникова, к.б.н. Л.И. Петрова
2
ОТ АЦИЛДОФАМИНОВ К ПРОСТАМИДАМ: ЛИПИДНАЯ
ВСЕЛЕННАЯ ПРОДОЛЖАЕТ РАСШИРЯТЬСЯ
Акимов М.Г., Грецкая Н.М., Бобров М.Ю., Зинченко Г.Н., Безуглов В.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: vvbez@ibch.ru
Тел.: (495) 330-65-92
С момента открытия первых простагландинов суперсемейство
биоэффекторных липидов продолжает неуклонно расширяться: растёт как
количество новых молекул в каждом семействе, так и число самих семейств
биоэффекторных липидов. Существенного пересмотра представлений о
функционировании липидных биорегуляторов потребовало открытие в 1992 г.
анандамида (этаноламида арахидоновой кислоты), являющегося эндогенным
лигандом каннабиноидных рецепторов и, в отличие от других липидных
эффекторов, не имеющего асимметрических центров в молекуле. Вопрос о
механизмах специфичности узнавания таких соединений до сих пор не решен.
Амиды дофамина и полиеновых жирных кислот, синтезированные нами
вначале как представители семейства искусственно функционализированных
жирных кислот, в настоящее время можно выделить в отдельное семейство
биогенных ацилдофаминов, входящих в более широкую группу
биоэффекторных липидов – нейролипинов. Нам удалось выяснить некоторые
аспекты биосинтеза и метаболизма этих соединений, а также показать
наличие докозагексаеноилдофамина в тканях пресноводной гидры.
Ацилдофамины обладают широким спектром биологической активности,
который включает в себя ингибирование агрегации тромбоцитов человека,
увеличение мозгового кровообращения, защиту нейронов от действия
токсических факторов, цитотоксичность по отношению к
трансформированным клеткам. Эти эффекты лишь частично опосредованы
взаимодействием ацилдофаминов с каннабиноидными и ванилоидными
рецепторами. С помощью ингибиторного анализа показано, что для разных
ацилдофаминов существует свой набор внутриклеточных киназ,
участвующих в реализации нейрозащитного эффекта. Соединениями,
заполняющими промежуток между окислительным и неокислительным
путями метаболизма полиеновых жирных кислот, являются
циклооксигеназные производные нейролипинов – простамиды; они
включают в себя как этаноламиды простагландинов (циклооксигеназные
производные анандамида), так и другие амиды простаноидов. Оказалось,
что простамид E2 оказывает выраженное нейрозащитное действие, но, в
отличие от анандамида, не обладает способностью угнетать клетки глиомы
C6, тогда как дофаминамид простагландина E2 является цитотоксическим
агентом для этих клеток. Можно предположить, что клетки глиомы в
состоянии до некоторой степени защищаться от токсического действия
анандамида превращением его в простамиды, но не могут противостоять
ацилдофаминам.
Работа частично поддержана грантом РФФИ (проект № 09-04-00317а).
3
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ КОНЪЮГАТОВ Т- И
В-ЭПИТОПОВ БЕЛКОВ С ОЛИГОСАХАРИДАМИ ХИТОЗАНА
Алексеева Л.Г., Решетов П.Д., Филиппов И.В., Назаров К.С.,
Дементьева Д.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адресl: luda.alekseeva@mail.ru
Тел.: (495) 335-61-77
В данной работе изучалась возможность использования олигосахаридов
хитозана (Ch) в качестве носителя для доставки пептидов с целью индукции
иммунного ответа против смыслового пептида. Хитозан, [(1-4)-2-амино-2дезокси--D-глюкан)], является водорастворимым биосовместимым и
биодеградируемым полимером, благодаря чему находит широкое применение
в медицине. Для синтеза конъюгатов использовали В-клеточные (Asp f 2 4758, Asp f 2 254-268, Asp f 3 1-15 и Asp f 3 47-61) и Т-клеточные (Asp f 2 235249 и Der p 2 21-35) эпитопы белков-аллергенов из грибов Aspergillus
fumigatus и клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus, а также
фракцию олигосахаридов хитозана с М.м. 23 кДа и степенью
дезацетилирования 85%. Для получения матрицы с оптимальными
свойствами олигосахариды предварительно частично ацилировали
сукциноилангидридом. Пептиды присоединяли к хитозану через N-концевые
аминогруппы, предварительно активируя карбоксильные группы на матрице
с помощью водорастворимого карбодиимида. Содержание пептидов в
полученных конъюгатах определяли методом протонного ЯМР. Способность
свободных пептидов и их конъюгатов с хитозаном стимулировать образование
антител была изучена на мышах линии BALB/c. Мышей 5-кратно
иммунизировали либо подкожно, либо интраназально указанными
соединениями в ФФР. Продукцию антител оценивали методом ИФА с
использованием в качестве подложки исходных пептидов. Анализ
антительного ответа показал, что иммунизация данными конъюгатами
приводила к избирательному синтезу противопептидных IgG1 антител.
Встраивание в конъюгат дополнительного Т-эпитопа одновременно с
В-эпитопом также приводило к усилению иммунного ответа на целевой
В-эпитоп. Таким образом, конъюгаты пептидов с низкомолекулярными
фрагментами хитозана представляют собой интересные с иммунологической
точки зрения соединения, способные формировать избирательный иммунный
ответ, и в дальнейшем могут быть использованы как компоненты антигенспецифичных вакцин.
4
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТОКСИНА VSTx1 С
ВОЛЬТ-СЕНСОРНЫМ ДОМЕНОМ ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО
К+ КАНАЛА KvAP МЕТОДАМИ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ
Алтухов Д.А.1,2, Парамонов А.С.1, Шенкарев З.О.1, Люкманова Е.Н.1,
Шингарова Л.Н.1, Арсеньев А.С.1, Овчинникова Т.В.1
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
2
Московский физико-технический институт, Москва
Электронный адрес: altuhovd@mail.ru, zakhar-shenkarev@yandex.ru
Тел.: (916) 533-17-65
В настоящей работе представлены результаты исследования
взаимодействия токсина VSTx1 с вольт-сенсорным доменом К+ канала KvAP
методами ЯМР-спектроскопии. KvAP – потенциал-зависимый K+ канал из
термофильной архебактерии Aeropyrum pernix, имеющий высокую степень
гомологии с фармакологически важными каналами эукариот. В структуру
канала входит каноническая К+ пора, окруженная четырьмя вольтсенсорными доменами (ВСД-KvAP), которые состоят из четырех спиральных
трансмембранных сегментов. VSTx1 – токсин паука Grammostola spatulata,
ингибирующий канал KvAP, с молекулярной массой 4 кДа и содержащий 34
аминокислотных остатка. Пространственная структура пептида имеет два
антипараллельных -тяжа и три дисульфидных связи. Согласно литературным
данным, пора не является мишенью подобных токсинов, взаимодействие
VSTx1 происходит именно с ВСД-KvAP.
На основании данных ЯМР было получено отнесение сигналов VSTx1
в водном растворе и в мицеллах смеси детергентов DPC/LDAO при значении
pH 5.0. С помощью гидрофобных спиновых зондов был определен способ
взаимодействия пептида с мицеллой: установлены участки молекулы VSTx1,
заглубленные внутрь мицеллы и находящиеся на поверхности. В результате
исследования топологии взаимодействия VSTx1 и ВСД-KvAP в окружении
мицелл DPC/LDAO было установлено, что остатки вольт-сенсора,
локализованные в обрасти S1-S2 шпильки и на S4+ спирали, вероятно,
образуют сайт связывания вольт-сенсора с токсином. Сайт связывания на
молекуле VSTx1 был определен с использованием спин-меченого мутантного
(Cys51) варианта ВСД-KvAP. С помощью ковалентно присоединенных
парамагнитных спиновых меток была исследована динамика N-концевого
фрагмента ВСД-KvAP. Показано, что этот участок домена может совершать
движения с амплитудой 7-10 Å.
5
ПОЛИПЕПТИДЫ С АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ИЗ
МОРСКОЙ АНЕМОНЫ HETERACTIS CRISPA
Андреев Я.А., Королькова Ю.В., Гришин Е.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: ay@land.ru
Тел. (495) 336-40-22
Рецептор TRPV1 – это молекулярный сенсор болезненных химических
и тепловых стимулов, который играет важную роль в инициации
нейрогенного воспаления. Поскольку этот рецептор играет ключевую роль в
восприятии боли и является интегратором различных стимулов на
чувствительных нейронах, он представляет собой исключительно
интересную мишень для создания фармакологических препаратов для
лечения боли, воспаления и других патологических состояний.
В яде морской анемоны Heteractis crispa был обнаружен полипептид
АРНС1, который частично блокирует капсаицин-индуцируемую активацию
TRPV1. В результате анализа транскриптома яда H. crispa было обнаружено
большое количество мРНК гомологичных полипептидов, отличающихся друг
от друга единичными заменами аминокислотных остатков. Также оказалось,
что два полипептида, названные АРНС2 и АРНС3, обладают способностью
ингибировать TRPV1. Для того чтобы обеспечить дальнейшие
полномасштабные исследования, были получены рекомбинантные
полипептиды АРНС1-3. Показано, что эти пептиды обладают уникальной
особенностью: каждый из них по-разному влияет на различные типы
активации TRPV1. В тестах in vivo (горячая пластина, CFA-тест,
формалиновый тест и т.д.) была выявлена значительная анальгетическая
активность полипептидов АРНС1-3. Причем эффективность каждого
полипептида в конкретной in vivo модели боли или воспаления зависела от
его ингибирующего влияния на определенный тип активации TRPV1. Таким
образом, набор полипептидов с различными свойствами может послужить
основой для создания антагонистов TRPV1 с нужными свойствами.
6
УДОБНЫЙ МЕТОД СИНТЕЗА ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ
ДНК-МИМЕТИКОВ НА ОСНОВЕ 4-ГИДРОКСИПИРРОЛИДИН-2ФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ
Аралов А.В., Чахмахчева О.Г., Ефимов В.А.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: Baruh238@mail.ru
Тел.: (495) 336-42-00
В последние годы усилия нескольких групп ученых были направлены
на разработку и совершенствование физико-химических и биологических
свойств аналогов и миметиков нуклеиновых кислот (НК). Одна из очевидных
сфер применения этих соединений, основанная на их способности узнавать
и специфически связываться с комплементарными последовательностями
НК, – это диагностика и медицина. В качестве кандидатов для разработки
диагностических и лекарственных средств нового поколения внимание
исследователей на протяжении ряда лет привлекают пептидо-нуклеиновые
кислоты (PNA) и родственные им соединения, а также
морфолинофосфородиамидные миметики НК (MO).
Разработана новая схема синтеза отрицательно заряженных миметиков
ДНК. Схема включает получение универсального промежуточного
соединения, исходя из N-Fmoc-транс-4-гидрокси-L-пролина, к которому
присоединяется гетероциклическое основание или флуоресцентная группа,
а затем O-нуклеофильная каталитическая 4-метокси-1-оксидо-2-пиколильная
фосфонат-защитная группа. Полученные таким образом мономеры были с
успехом использованы для твердофазного синтеза олигомеров-миметиков
ДНК.
7
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АМИНОКОНЦА
МЕТАКРИЛАТРЕДУКТАЗЫ АНАЭРОБНОЙ БАКТЕРИИ
GEOBACTER SULFURREDUCENS AM-1
Архипова О.В.1, Микулинская Г.В.2
1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина
РАН, Пущино, Московская обл.
2
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: aroksan@gmail.com
Тел.: (4967) 31-86-52
Интерес к представителям рода Geobacter (-Proteobacteria) связан с их
значимостью в глобальных круговоротах металлов и углерода и процессах
биоремедиации радиоактивных металлов. Geobacter sulfurreducens АМ-1
уникален тем, что способен использовать синтетическое соединение
метакрилат (2-метилпропеноат) в качестве конечного акцептора
восстановительных эквивалентов редуктазной цепи. У очищенной
терминальной периплазматической цитохром с-метакрилат-оксидоредуктазы
(50 кДа) была определена аминокислотная последовательность N-конца.
Целью работы было проанализировать распространение данной
последовательности у бактерий разных таксонов, что могло бы привести к
предположению о роли и происхождении подобных белков.
Сравнительный анализ 27-миаминокислотной последовательности
N-конца метакрилатредуктазы обнаружил выраженное (Е10-6) сходство с
участками более 200 аминокислотных последовательностей. В основном это
флавоцитохромы с и флавинсодержащие сукцинат- и фумаратредуктазы
анаэробных и аэробных представителей домена Bacteria, относящихся к 4
классам отдела Proteobacteria (11 родов), классу Actinobacteria отдела
Actinobacteria (4 рода), отделу Deferribacteres (Denitrovibrio), отделу Firmicutes
(Desulfitobacterium), отделу Spirochaetes (Spirochaeta), и представителя домена
Archaea, относящегося к отделу Euryarchaeota (Haloterrigena turkmenica).
Среди 12 известных геномов бактерий рода Geobacter только у способного к
"хлородыханию" G. lovleyi SZ был обнаружен подобный флавоцитохром с.
Выраженная гомология флавинсодержащих белков, очевидно,
обусловлена их консервативностью и эволюционно ранним происхождением.
Показательно, что большая часть представителей данного семейства белков
обнаруживается у видов бактерий, способных использовать широкий спектр
субстратов в качестве терминальных акцепторов восстановительных
эквивалентов и обладающих соответствующим множеством редокс систем.
8
НЕОБХОДИМОСТЬ (p)ppGpp ДЛЯ ВЫЖИВАНИЯ ESCHERICHIA
COLI ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИНГИБИТОРОВ АМИНОАЦИЛтРНК-СИНТЕТАЗ
Асеев Л.В., Былинкина Н.С., Бони И.В.
Институт биооpганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: leroymail@gmail.com
Тел.: (495) 330-63-29
Аминоацил-тРНК-синтетазы (АРСазы) – ферменты, осуществляющие
присоединение аминокислоты к соответствующей тРНК. Бактериальные
АРСазы рассматриваются как перспективные мишени для
противомикробных препаратов. Микроцин С (МсС) и альбомицин (Amc) –
природные антибиотики-ингибиторы аспартил- и серил-АРСаз,
соответственно. Они проникают в клетку в виде предшественников, используя
транспортные системы клетки, а затем процессируются клеточными
пептидазами с образованием ингибиторов АРСаз. В результате происходит
прекращение синтеза белка и клеточного роста. Теоретически, обработка
клеток МсС и Amc должна имитировать голодание клеток по Asp и Ser и
включать механизмы "строгого ответа". При "строгом ответе" в клетке
накапливаются сигнальные нуклеотиды (p)ppGpp, синтезируемые связанным
с рибосомой белком RelA в ответ на появление незаряженной тРНК в А-сайте
рибосомы. Повышение уровня (p)ppGpp вызывает многочисленные
изменения в экспрессии генов, прежде всего в транскрипции.
В данной работе мы впервые исследовали способность МсС и Amc
вызывать "строгий ответ" у E.coli. Методом ОТ-ПЦР оценивали изменение
уровня транскрипции с различных (p)ppGpp-чувствительных промоторов при
обработке клеток МсС или Amc. Результаты показали, что МсС и Amc
вызывают "строгий ответ", изменяя профиль транскрипции в E.coli дикого
типа, тогда как в мутантах, не способных синтезировать (p)ppGpp (ppGpp0)
или его кофактор DksA, подобные изменения не наблюдались. Чтобы оценить
выживаемость, из культур клеток до и после обработки антибиотиком
готовили серии 10-кратных разведений, аликвоты которых наносили на чашки
с агаризованной средой LB. Показано, что хотя МсС и Amc вызывают
быструю остановку роста всех штаммов, клетки, способные синтезировать
ppGpp, обладают 100% выживаемостью, тогда как для мутанта ppGpp0
выживаемость падает на 6 порядков. Таким образом, бактериостатики МсС
и Amc могут проявлять бактерицидный эффект, но только при отсутствии
синтеза (p)ppGpp. При внесении в штамм ppGpp0 мутации по гену rpoD,
снижающей способность 70 (D) конкурировать за кор-РНКполимеразу с
альтернативными сигма факторами, наблюдалось полное восстановление
выживаемости. Это позволяет сделать вывод, что основной причиной гибели
клеток под воздействием МсС или Amc в ppGpp 0 штамме является
невозможность переключения транскрипции на промоторы генов,
необходимых для выживания при голодании.
9
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКПРЕССИЯ ГЕНА
L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ RHODOSPORIDIUM
TORULOIDES В E. COLI
Бабич О.О.
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования "Кемеровский технологический
институт пищевой промышленности", Кемерово
Электронный адрес: olich.43@rambler.ru
Тел.: (3842) 39-68-74
L-Фенилаланин-аммоний-лиаза (PAL, КФ 4.3.1.5) катализирует реакцию
обратимого дезаминирования аминокислоты L-фенилаланина с образованием
транс-коричной кислоты и аммиака. Фермент представляет интерес в качестве
терапевтического средства для лечения фенилкетонурии и может быть
использован как для прямой терапии заболевания, так и для производства
полноценных продуктов питания, не содержащих фенилаланин.
Целью работы была оптимизация параметров получения
L-фенилаланин-аммоний-лиазы Rhodosporidium toruloides в E. coli. Был
синтезирован ген, кодирующий L-фенилаланин-аммоний-лиазу,
соответствующей последовательности гена pal, выделенного из
Rhodosporidium toruloides, встроен в эффективную систему экспрессии, на
основе которой получен продуцент фермента с уровнем экспрессии (после
индукции) до 40% общего белка клетки.
Поскольку полученный белок имеет His-Tag на С-конце, очистку
проводили на колонке с Ni-NTA агарозой. При этом выход целевого белка
при одностадийной очистке составляет приблизительно 130 мг/л. Средняя
удельная активность фермента – 3,3 ед/мг. Подобраны оптимальные условия
очистки препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Схема включает дробное
осаждение сульфатом аммония и две хроматографические стадии:
металлохелатную и гидрофобную. Выход фермента в результате очистки по
разработанной схеме составляет около 60%. Исследованы биохимические
свойства рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Фермент
наиболее активен при рН 8.5, при этом он стабилен в широком диапазоне
значений рН от 7.0 до 11.0. Температурный оптимум активности PAL
составляет 50°С. При 30°С фермент сохраняет более 90% активности после
трех суток инкубации. Определены кинетические константы для фермента:
Vmax = 3.97 мкмоль мин-1мг-1 и Km = 0.49 мМ.
10
СТРУКТУРА ГЕНА CYP21A2, КОДИРУЮЩЕГО 21-ГИДРОКСИЛАЗУ, У
ПАЦИЕНТОК С ПРИЗНАКАМИ ГИПЕРАНДРОГЕНИИ: ВОЗМОЖНАЯ
РОЛЬ ГАПЛОТИПОВ ГЕНА В РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО
ФЕНОТИПА
Баранник А.П.1, Колтунова А.А.2, Озолиня Л.А.2, Лаврова Н.В.3, Шилов И.А.3,
Патрушев Л.И.1
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
2
Российский государственный медицинский университет, Москва
3
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва
Электронный адрес: abarannik@mx.ibch.ru
Тел.: (499) 793-46-11
Гиперандрогения представляет собой патологическое состояние,
характеризующееся повышенным уровнем мужских половых гормонов (андрогенов)
в организме женщины. Одной из основных причин гиперандрогении является
адреногенитальный синдром, связанный с врожденной гиперплазией коры
надпочечников (ВГКН). Более 90% всех случаев этого заболевания, наследуемого по
аутосомно рецессивному типу, является следствием дефицита фермента 21гидроксилазы (P450c21), кодируемого геном CYP21A2. Поскольку ВГКН является
широко распространенным генетическим заболеванием человека, изучение и
своевременное выявление ассоциированных с ним мутаций является важной задачей
современной медицинской генетики. Ранее нами была разработана основанная на
ПЦР в реальном времени система выявления восьми наиболее распространенных в
гене CYP21 мутаций, вызывающих ВГКН, и 43 пациента с клиническими и
биохимическими признаками гиперандрогении были обследованы на их наличие. В
результате были обнаружены только две гетерозиготные мутации у двух разных
индивидуумов: нонсенс-мутация-318GlnX и миссенс-мутация V281L. Для прояснения
механизмов возникновения гиперандрогении нами было предпринято дальнейшее
исследование генов вышеупомянутых пациенток. Методом Сэнгера были полностью
секвенированы 15 генов CYP21A2 у пациенток с исследуемой патологией.
Электрофоретическое разделение продуктов секвенирования проводили с помощью
автоматического секвенатора Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems, США).
Установлено, что все исследованные гены не содержат новых миссенс- или нонсенсмутаций. Ген оказался высокополиморфным. Обнаружены в общей сложности 26
SNP, из которых только один не был описан в базе данных dbSNP NCBI. В
соответствии с базой данных все эти SNP отнесены к "нормальным" вариантам гена.
Новый SNP представлял собой синонимическую замену CT в положении 3793
экзона 8, которая не изменяла смысла соответствующего кодона. Более того, оказалось,
что каждая пара аллельных вариантов исследованных генов обладает уникальным
набором SNP. На этом основании мы предположили, что определенные наборы
"нормальных" SNP в гаплотипах аллельных вариантов генов могут оказывать влияние
на экспрессию генов путем модификации вторичной и(или) третичной структуры
РНК с последующим изменением эффективности ее процессинга или трансляции, а
также через изменение ее стабильности. С учетом этого, дальнейшие исследования
были нами продолжены в направлении определения гаплотипов секвенированных
аллельных вариантов генов. Для этого с помощью аллель-специфической ПЦР были
определены гаплотипы пяти пациенток, и полученные данные в настоящее время
используются для исследования их возможного влияния на вторичную структуру
первичных транскриптов гена CYP21A2.
11
ДЕГРАДАЦИЯ И ПРЕЗЕНТАЦИЯ ОСНОВНОГО БЕЛКА
МИЕЛИНА ПРИ АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЯХ
Белогуров А.А., Габибов А.Г.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: belogurov@mx.ibch.ru
Тел.: (495) 727-38-60
Принципиальным вопросом современной иммунологии, протеомики и
медицины является функциональная роль пептидов, образующихся при
протеолитической деградации аутоантигенов, а также изменение
качественной и количественной составляющих процесса расщепления при
переходе от нормы к патологии. Предметом настоящей работы является
сравнительное исследование механизмов деградации одного из основных
нейроантигенов при рассеянном склерозе (РС), основного белка миелина
(ОБМ), аутоантителами, протеиназами, активируемыми при развитии
патологического демиелинизирующего процесса, а также протеасомой,
изолированной из центральной нервной системы (ЦНС). Нами было
показано, что ОБМ эффективно подвергается протеолизу не только
протеиназами, но и изолированными из пациентов с РС специфическими
аутоантителами с амидазной активностью. С использованием "эпитопной"
библиотеки фрагментов ОБМ были определены его фрагменты,
иммунодоминантные по В-клеточному ответу. Данное наблюдение создало
предпосылки к созданию эффективных биомаркеров и системы
дифференциальной диагностики РС. На основе полученных результатов
удалось создать первый отечественный потенциальный препарат для лечения
РС, в настоящий момент проходящий первую фазу клинических испытаний
в РФ, а также проведены работы по созданию высокоселективных и
эффективных иммунотоксинов для направленной элиминации
аутореактивных В-клеток. С применением фаг-дисплейной библиотеки
одноцепочечных фрагментов антител, созданной на базе репертуара
иммуноглобулинов пациентов с РС, нам удалось продемонстрировать
кроссреактивность аутоантител к ОБМ по отношению к латентному
мембранному белку вируса Эпштейн-Барр LMP1. Данное наблюдение вносит
значительный вклад в поддержку гипотезы о вирусной этиологии РС.
Сравнение протеасомального и ферментативного гидролиза выявило
уникальность характера гидролиза ОБМ 26S протеасомой, не имеющего
аналога среди протеиназ. Показано, что основной белок миелина эффективно
процессируется под действием протеасомы из мозга мышей, развивающих
экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ), при этом, по
сравнению с действием протеасомы, изолированной из ЦНС здровых особей,
образуется повышенное количество иммуногенного пептида ОБМ83-90
ENPVVHFF. Подобный эффект объясняется значительным сдвигом в сторону
образования иммунопротеасомы в ЦНС мышей с EAE. Специфический
ингибитор субъединицы LMP2 иммунопротеасомы эффективно блокирует
in vivo развитие EAE в мышах линии SJL. Комплекс изложенных продходов
позволяет говорить о появлении новых перспектив и направлений в лечении
аутоиммунных патологий.
12
NK-ЛИЗИН-ПОДОБНЫЙ ПЕПТИД ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕСЦА
ALOPEX LAGOPUS
Богомолова Е.Г., Берлов М.Н., Дубровский Я.А., Кокряков В.Н.
НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, С.-Петербург
Электронный адрес: kokryak@yandex.ru
Тел.: (812) 234-07-64
Антимикробные белки и пептиды являются важными молекулярными
факторами врожденного иммунитета животных и рассматриваются как
перспективные молекулы для создания на их основе нового класса
антибиотиков. Для большинства исследованных видов млекопитающих
характерен уникальный набор антимикробных пептидов и белков, что
представляет значительный интерес сравнительно-эволюционного изучения
данной группы соединений.
В ходе нашей работы из лейкоцитов крови голубого песца Alopex lagopus
был выделен антимикробный пептид, который по своим физико-химическим
свойствам напоминает пептиды группы NK-лизинов. Методом радиальной
диффузии были определены минимальные ингибирующие концентрации
очищенного пептида по отношению к грамположительной бактерии Listeria
monocytogenes, штамм EGD (0,27 мкМ) и грамотрицательной бактерии
Escherichia coli, штамм ML-35р (0,19 мкМ).
Молекулярная масса пептида (определена масс-спектрометрией MALDITOF) – 9035 Да, что близко к значениям молекулярной массы NK-лизинов
из других видовых источников. В результате восстановления дисульфидных
связей дитиотреитолом с последующим окислением сульфгидрильных групп
иодацетамидом происходит, по данным масс-спектрометрии, увеличение
молекулярной массы на 348 Да, что соответствует наличию в нативной
молекуле трех дисульфидных связей, характерных для большинства
известных NK-лизинов. В спектре поглощения пептида отсутствует
характерный для молекул белковой природы максимум при 280 нм, что
говорит об отсутствии остатков триптофана и тирозина в составе пептида. В
то же время, NK-лизины и родственные им гранулизины содержат, как
правило, незначительное количество остатков данных аминокислот или не
содержат их вовсе. Полученные данные позволяют предположить, что
выделенный нами пептид родственен NK-лизинам.
В отличие от большинства известных антимикробных пептидов,
NK-лизины и гранулизины содержатся не в гранулах фагоцитов, а в гранулах
лимфоцитов – NK-клеток, цитотоксических T-лимфоцитов. Уточнение
клеточной локализации выделенного нами пептида будет предметом
дальнейших исследований. В полученном экстракте данный пептид
представляет собой мажорную фракцию, и именно с ним ассоциирована
основная антимикробная активность экстракта, что позволяет предполагать
его важную роль в противоинфекционной защите у песцов. Ранее NK-лизины
или гранулизины у представителей отряда хищных (Carnivora) описаны не
были.
13
ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ РАСТЕНИЙ НОВОГО
ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ
Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Лебедева А.А.,
Пиголева С.В., Пучко Е.Н.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: buryanov@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 73-09-21
Современное поколение применяемых на практике трансгенных
растений имеет серьёзный недостаток: присутствие в их клетках
нежелательных и даже опасных селективных генов устойчивости к
антибиотикам или гербицидам. В традиционном методе отбора
трансформантов в клетку переносится не только целевой, но и селективный
ген (обычно ген устойчивости к антибиотику или гербициду). После отбора
трансформантов эти селективные маркеры уже не нужны, но они остаются и
экспрессируются в растениях. Существует потенциальная угроза переноса
этого "генетического мусора" в окружающую среду с образованием
устойчивых к гербицидам "суперсорняков" и устойчивых к антибиотикам
патогенных микроорганизмов. В настоящее время прогнозируется выход на
рынок трансгенных растений нового поколения - безмаркерных (marker-free).
Нами разработаны новые методы создания безмаркерных трансгенных
растений с повышенной биобезопасностью на основе прямой детекции
синтезируемых целевых продуктов по их биологической активности или с
помощью различных приемов иммунологического анализа. Преимуществами
новых методов являются простота их применения, сокращение времени
получения безмаркерных растений, повышение эффективности
трансформации и возможность выявления трансгенных растений с
максимально экспрессируемыми целевыми генами прямо на этапе скрининга
трансформантов.
Получены безмаркерные растения томата и картофеля с геном
поверхностного антигена вируса гепатита B. Исследуется перспективность
использования полученных растений в качестве безопасной субстанции для
производства съедобной вакцины против вируса гепатита В. Получены
экологически безопасные безмаркерные растения картофеля, рапса и томата
с искусственным геном зрелой формы антимикробного пептида цекропина
Р1. Растения показали устойчивость к болезням, вызываемым
фитопатогенными бактериями и грибами, и сохранение способности к
ассоциации с полезной микрофлорой. Таким образом, экспрессия гена
цекропина Р1 в полученных растениях не имеет отрицательных эффектов на
их взаимодействие с полезными колонизирующими микроорганизмами, а
сами растения удовлетворяют требованиям экологической безопасности при
их выращивании в полевых условиях.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 07-0400235, № 08-08-00406, № 10-04-00037, № 11-08-00413).
14
ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ
СТРУКТУРЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩИХ
БЕЛКОВ ЧЕЧЕВИЦЫ
Гизатуллина А.К.2, Богданов И.В.1, Минеев К.С.1, Шенкарёв З.О.1,
Мельникова Д.Н.1, Финкина Е.И.1, Баландин С.В.1, Арсеньев А.С.1,
Овчинникова Т.В.1
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
2
Московский физико-технический институт, Москва
Электронный адрес: ovch@ibch.ru
Тел.: (495) 336-44-44
В проращённых семенах чечевицы Lens culinaris нами было обнаружено
семейство из восьми новых липид-транспортирующих белков Lc-LTP1-8,
подавляющих рост фитопатогенных микроорганизмов. Представители данного класса
белков, характеризующихся способностью неспецифически связывать и переносить
липиды, выполняют разнообразные функции в растениях и обладают антимикробной
активностью. Изучение пространственной структуры липид-транспортирующих
белков чечевицы как в свободном состоянии, так и в комплексе с липидными
молекулами, позволит приблизиться к пониманию механизма антибиотического
действия и биологической функции данных белков.
Для проведения сравнительных структурно-функциональных исследований
были созданы системы для гетерологической экспрессии трёх изоформ липидтранспортирующего белка чечевицы (Lc-LTP1,2,3) в клетках Е. coli BL21(DE3) под
контролем промотора Т7 с тиоредоксином в качестве белка-партнера. Полученные
гибридные белки выделяли, используя металлохелатную хроматографию, и
расщепляли бромцианом. Выделение и очистку целевых белков проводили с помощью
повторной аффинной хроматографии в денатурирующих условиях и обращеннофазовой ВЭЖХ. Гомогенность полученных препаратов и идентичность
рекомбинантных аналогов природным липид-транспортирующим белкам
подтверждали с помощью электрофореза в ПААГ, МАЛДИ-времяпролётной массспектрометрии и автоматического секвенирования по методу Эдмана.
Используя 15N-меченый рекомбинантный аналог, методом ЯМР-спектроскопии
была определена пространственная структура липид-транспортирующего белка
Lc-LTP2 в водном растворе при рН 5,5. Структура белка, стабилизированная 4
дисульфидными и 32 внутримолекулярными водородными связями, представляет
собой связку из четырех -спиралей (S1-S4) и включает в себя отдельные витки
310-спирали, а также длинную неупорядоченную петлю, расположенную в С-концевом
фрагменте молекулы. Неполярные аминокислотные остатки Lc-LTP2 формируют
характерную для всех липид-транспортирующих белков гидрофобную полость, в
которой локализован сайт связывания липидных молекул. Показано, что Lc-LTP2 в
водном растворе представлен двумя конформациями, соотношение заселенностей
которых составляет 1:3. При образовании комплекса Lc-LTP2 с липидной молекулой
DMPG происходит стабилизация структуры белка и изменяется конформация
С-концевой петли, а также спиралей S2 и S3, формирующих "канал связывания" с
липидами.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в
рамках реализации ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России" на 2009-2013 годы (госконтракт П1159).
15
ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ МИНИМАЛЬНЫХ
СТРУКТУРО-ФОРМИРУЮЩИХ ЭЛЕМЕНТОВ (SF-IU) БЕЛКОВ
Гилажев А.И.1, Червоненкис А.Я.2, Некрасов А.Н.3
1
Московский физико-технический институт, Москва
2
Институт проблем управления имени В.А. Трапезникова РАН, Москва
3
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: aidar.gilazhev@gmail.com
РОЛЬ АУТОКРИННОГО ФАКТОРА ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ
Т-ЛИМФОЦИТОВ В РЕГУЛЯЦИИ ГЛИКОЛИЗА ПРИ
ГИПОКСИИ
Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г., Луценко Г.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: marygrec@mail.ru
Тел.: (495) 330-40-11
Использование метода анализа информационной структуры (ANIS)
позволяет представить последовательность исследуемых белков как системы
иерархически организованных элементов, в основании которых лежат
структуро-формирующие элементы – короткие фрагменты полипептидной
цепи. Естественным образом возникает задача классификации таких
элементов – структуро-формирующих информационных единиц (SF-IU).
Целью работы являлась кластеризация SF-IU на основе физико-химических
параметров аминокислотных остатков с последующим анализом структуры
полученных кластеров.
В работе было проведено снижение размерности пространства физикохимических параметров аминокислотных остатков методом главных
компонент и кластеризация набора SF-IU, полученных при анализе полного
протеома E. coli. Кластеризация SF-IU выполнялась путем построения
минимального покрывающего дерева с помощью алгоритма Прима с
последующим удалением ребер с наибольшим весом. Метрика Евклида
использовалась для расчета расстояний между отдельными SF-IU в
пространстве физико-химических параметров. Получены следующие
результаты:
- методом главных компонент снижена размерность пространства
физико-химических параметров и получены 20 обобщенных параметров
вместо исходных 535;
- c использованием Евклидовой метрики построено минимальное
покрывающее дерево на совокупность SF-IU в пространстве обобщенных
параметров;
- путем "разрезания" по самым длинным ребрам в покрывающем дереве
выделены 5 крупных кластеров SF-IU, содержащих от 200 до 600 элементов.
В дальнейшем планируется детальный анализ структуры кластеров –
выявление общих закономерностей элементов, формирующих кластеры, по
различным статистическим, информационным и физико-химическим
параметрам.
В многоклеточном организме выживание и энергетический метаболизм
клеток находятся под контролем множества цитокинов различной природы.
Наряду с паракринными факторами, которые клетка получает от клеток
других типов, в контроле энергетического метаболизма и выживания клеток
могут принимать участие аутокринные факторы (АФ), которые клетка
секретирует сама и получает от клеток того же типа. Ранее нами было
установлено, что АФ осуществляют контроль выживания Т-лимфоцитов
через регуляцию уровня внутриклеточного АТФ. Целью настоящей работы
было исследование действия АФ на клетки цитотоксической линии Т-ряда
CTLL-2 в условиях гипоксии, а также определение физико-химических
характеристик этих молекул. В качестве модели гипоксии клеток в культуре
использовали так называемую "химическую гипоксию", которая создавалась
внесением 10 мМ NaN3 в культуральную среду. В этих условиях содержание
АТФ в клетках CTLL-2 снижалось до уровня 36-42% от исходного значения.
Добавление 50% кондиционированной среды (КС) клеток CTLL-2,
содержащей АФ, предотвращало снижение уровня АТФ в клетках за счет
интенсификации анаэробного гликолиза. Для того чтобы охарактеризовать
АФ, содержащиеся в КС, была проведена гель-фильтрация КС на колонке с
носителем"Bio-gel P-10". В результате гель-фильтрации была получена
активная фракция, внесение которой в культуру в условиях химической
гипоксии приводило к восстановлению уровня АТФ в клетках. Трицин-ДСН
электрофорез активной фракции в полиакриламидном геле показал, что она
является гомогенной и содержит один вид молекул. Масса молекул из этой
фракции находится в интервале 3,5-6,3 кДа. Для уточнения значения
молекулярной массы активного АФ был использован хроматографический
метод на носителе "Bio-Gel P-10". Определенная с использованием метода
линейной регрессии масса активного АФ составила 4,9 кДа, что согласуется
с оценкой, полученной методом электрофореза. Таким образом, в данной
работе обнаружен аутокринный протеиновый фактор с молекулярной массой
4,9 кДа, который секретируется клетками линии CTLL-2 и в условиях
гипоксии способствует восстановлению уровня АТФ в клетках посредством
активации анаэробного гликолиза.
16
17
МОДУЛИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ МУРАМИЛ ДИПЕПТИДА ПРИ
АЛЛЕРГИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
Гурьянова С.В., Шевченко М.А., Андронова Т.М.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: svgur@mail.ru
Тел.: (495) 335-61-77
N-Ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил дипептид (ГМДП) –
иммуномодулирующий препарат, обладающий противовирусным и
противобактериальным действием. В данном исследовании было проведено
сравнение эффективности воздействия ГМДП на характер аллергического
воспаления дыхательных путей при введении на стадии сенсибилизации или
ингаляции аллергена.
Были использованы две модели аллергического воспаления дыхательных
путей – стандартная овальбумин-индуцированная модель астмы и модель
воспаления, вызванного множественными ингаляциями гриба A. fumigatus.
ГМДП вводили внутрибрюшинно за два дня до инъекций аллергена. Эффект
воздействия ГМДП оценивали путем подсчета общего и дифференциального
количества клеток в бронхоальвеолярном лаваже мышей, определением
сывороточных иммуноглобулинов и цитокинов лаважной жидкости.
Двукратное снижение уровня общего сывороточного IgE в лаважной
жидкости по сравнению с уровнем, наблюдаемым у мышей с овальбумининдуцированной астмой, было обнаружено при введении ГМДП на стадии
сенсибилизации; при этом достоверного снижения уровня эозинофилов в
дыхательных путях не наблюдалось. При введении ГМДП на стадии
ингаляции аллергена – на этапе формировании локального воспаления в
дыхательных путях, наблюдалось значительное снижение не только уровня
эозинофилов, но и ассоциированного с аллергическим воспалением цитокина
IL-13, а также аллерген-специфического IgA в лаважных жидкостях.
Повышение уровня нейтрофилов в бронхоальвеолярных лаважах и IgG2a в
сыворотке периферической крови мышей, получавших инъекции ГМДП на
стадии ингаляции аллергена, свидетельствовало об ингибировании Th2опосредованного иммунного ответа. Снижение проаллергических
показателей наблюдалось и при использовании ГМДП в ингаляционной
модели аллергического воспаления, вызываемого грибом A. fumigatus.
Таким образом, превентивная иммунизация ГМДП на стадии
формирования аллергической реакции непосредственно в дыхательных путях
предотвращала воспаление и ослабляла Th2-опосредованный
проаллергический ответ.
18
СТРУКТУРА И УЛЬТРАСТРУКТУРА МИКРО- И НАНОЧАСТИЦ
КОНДЕНСИРОВАННОЙ ДНК, ОБРАЗУЮЩИХСЯ В ПЦР
Данилевич В.Н.1, Артемов В.В.2, Гайнутдинов Р.В.2
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
2
Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва
Электронный адрес: dan@ibch.ru
Тел.: (495) 336-40-22
Ранее нами описан феномен образования конденсированных форм ДНК
(микро- и наночастиц) в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Микрои наночастицы образуются на поздних стадиях ПЦР, в которой используются
генспецифические или неполностью комплементарные олигонуклеотидные
праймеры, а матрицей служат геномная ДНК микроорганизмов или
плазмидные ДНК. С помощью просвечивающей ЭМ были выявлены
различные морфотипы микрочастиц (около десяти), образующихся при ПЦРамплификации нескольких ампликонов. В настоящей работе была изучена
морфология микрочастиц с помощью сканирующей электронной
микроскопии (РЭМ). Были исследованы микро- и наночастицы, полученные
в различных условиях: в ходе стандартной и асимметричной ПЦР, в
присутствии добавок катионов Mn 2+ , Co2+ и т.д. При электронном
сканировании образцов показано, что микрочастицы имеют фрактальную
структуру, они состоят из большого числа дисков и сегментов дисков
нанометровой толщины, определенным образом организованных в
трехмерные частицы в форме сфер или эллипсоидов. У части образцов
выявлено большое количество одиночных дисков (овалов) микронного
диаметра и нанометровой толщины. Образцы конденсированной ДНК,
содержащие диски (овалы), были изучены с помощью атомно-силовой
микроскопии (АСМ). В этих образцах, помимо дисков, было обнаружено
значительное количество нанонитей (филаментов) длиной до нескольких
микрон и множество мельчайших наночастиц – нанодисков с латеральными
размерами от 10 до 20 нм. При этом толщина нанодисков составляла ~1 или
~2 нм. По всей видимости, нанодиски представляют собой элементарные
наночастицы – продукты Mg 2+ -опосредованной внутримолекулярной
конденсации одноцепочечных молекул ДНК. Из данных АСМ следует, что
нанодиски являются строительными кирпичиками, из которых состоят диски
микронного диаметра. При зондовом сканировании филаментов показано,
что последние представляют собой ленты, состоящие из нескольких (до
десяти) плоских нанофибрилл шириной 10-15 нм и толщиной ~1 нм или
~2 нм. Предположено, что нанофибриллы являются продуктами
межмолекулярной Mg 2+ -опосредованной латеральной конденсации
одноцепочечных молекул ДНК. Обсуждаются возможности практического
использования микро- и наночастиц.
19
О СПОСОБЕ КЛАССИФИКАЦИИ ПЕРВИЧНЫХ СТРУКТУР
ПОЛИПЕПТИДОВ
Данилкович А.В., Удовиченко И.П., Липкин В.М.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Пущинский государственный университет, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: danilkovich@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 73-08-93
Основные характеристики молекул полипептидов определяются
свойствами аминокислотных (АК) остатков, их последовательностью и
внешними факторами среды. Образование макробиологических комплексов
с участием протеинов можно рассматривать в качестве характерного признака
живых систем. В то же время, разработка подходов к изучению и управлению
порядком взаимодействия самоорганизующихся структур является важным
фактором, позволяющим оптимизировать процесс создания искусственных
наноматериалов-биомиметиков для использования в регенеративной
медицине и тканевой инженерии, а также поиск агентов, блокирующих
накопление в клетках и тканях организма амилоидных отложений.
Определённые участки амилоидогенных и структурно нестабильных белков
(core-elements), представленные сравнительно короткими пептидами,
способны к самоорганизации in vitro с образованием филаментов. Феномен
самоорганизующихся пептидов известен несколько десятилетий, и к
настоящему времени об амилоидоподобных полипептидах известно не мало.
Тем не менее, единственная схема классификации АК-последовательностей,
предложенная ранее, позволяет описывать только ионные пептиды, имеющие
регулярно-чередующуюся последовательность заряженных и гидрофобных
АК-остатков.
Цель данной работы – представить способ и систему классификации
первичных структур пептидов таким образом, чтобы основные особенности
последовательности АК-остатков можно было формализовать в числовой
форме.
Результаты: на первом этапе анализа первичной структуры пептида
определяется наличие повторяющегося мотива аминокислотных остатков и
осуществляется
преобразование
формы
представления
АК-последовательности таким образом: символ "+" обозначает АК-остатки,
несущие положительный заряд (Arg, Lys, His); "–" - отрицательно-заряженные
АК-остатки (Asp, Glu); "Х" обозначает незаряженные гидрофильные
АК-остатки (Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr), а также специальный случай – остаток
Gly. Буквой "d" обозначим гидрофобные АК-остатки (Ala, Pro, Cys, Met, Leu,
Trp, Phe, Ile, Val). Заметим, что структура модельного пептида
H-LKLLKKLLKLLKKL-OH содержит два повторяющихся сегмента
последовательности (LKLLKKL) 2 , каждый из которых может быть
представлен в символьном виде как (d+dd++d). Соответственно, для
определения типа последовательности АК-остатков данного пептида
необходимо вычислить значения, составляющие: 1) сумму гидрофильных
20
{X,+, –} АК-остатков в сегменте (d+dd++d), равную 3; 2) сумму гидрофобных
{d} АК-остатков в сегменте (d+dd++d), равную 4; 3) сумму гидрофобных
АК-остатков на флангах сегмента (d+dd++d), равную 2. Найденные величины
представляют значения трёх регистров, которые последовательно формируют
тип пептидной последовательности. В случае модельной структуры пептида
(LKLLKKL)2 эта величина составляет 3.4.2. Следует заметить, что значения
регистров каждого типа последовательности могут использоваться для
формирования соответствующей библиотеки возможных структур пептидных
аналогов для сравнительного изучения их свойств.
Заключение и выводы: 1) предложен унифицированный подход к
классификации аминокислотных последовательностей пептидов; 2) методика
анализа повторяющихся сегментов в составе мотивов АК-остатков позволяет
классифицировать самоорганизующиеся и амилоидогенные полипептиды
произвольного состава, в том числе – циклические пептиды, и структуры,
содержащие сегменты полиглицинов; 3) система классификации позволяет
осуществлять сравнительный анализ АК-последовательностей пептидов всех
известных типов, что может быть использовано для использования метода
рационального дизайна при создании библиотек пептидных структур и
последующего сравнительного анализа их свойств.
Работа поддержана грантами Министерства образования и науки
Российской Федерации № 02.740.11.5224, № 14.740.11.0170 и
№ 16.512.11.2066 и Программой Российской академии наук по молекулярной
и клеточной биологии.
21
ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ MESEMBRYANTHEMUM
CRYSTALLINUM, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ EcoRII
Дьяченко О.В.1, Шевчук Т.В.1, Тарлачков С.В.2, Захарченко Н.С.1,
Бурьянов Я.И.1
1
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Пущинский государственный университет, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: ovdyachenko@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 33-09-70
Растения имеют интегральную молекулярно-генетическую систему
ответов на стресс, однако, применяемые в последнее время подходы к
созданию устойчивых к абиотическому стрессу растений малоэффективны,
поскольку направлены на изменение только одного из многочисленных
звеньев метаболитного защитного ответа растений. Энзиматическое
метилирование генома играет ключевую роль в регуляции механизмов
адаптации растений к неблагоприятным условиям окружающей среды, таким
как водный и солевой стресс. В настоящее время имеются предпосылки
искусственной активации комплексных защитных программ растений.
Факультативные галофитные растения Mesembryanthemum crystallinum
отвечают на солевой стресс переключением С3-фотосинтеза на САМметаболизм и увеличением уровня CpHpG-метилирования (H=A, T, C)
повторяющихся последовательностей ядерного генома.
На примере M. crystallinum предложена стратегия создания модельных
растений с трансген-индуцированной эпигенетической активацией
генетических программ защиты от абиотических и биотических стрессов.
Разработаны методы регенерации и трансформации растений M. crystallinum.
Получена
специализированная
конструкция,
содержащая
модифицированный ген метилазы EcoRII под контролем промотора 35S РНК
вируса мозаики цветной капусты. Полученной конструкцией с помощью
агробактериальной инфильтрации проведена трансформация M. crystallinum,
получены трансгенные растения первого поколения. Рестрикционным
анализом генома полученных трансформантов показана защита их геномной
ДНК от гидролиза специфичными метилчувствительными эндонуклеазами,
что свидетельтствует о функциональной активности трансгена.
Трансформированные растения фенотипически отличались от контрольных.
Предложенный подход позволит выявить связь между
гиперметилированием специфических последовательностей в геноме
M. crystallinum и адаптацией этих растений к солевому стрессу и водному
дефициту при переключении комплексных метаболитных программ
защитного ответа.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №09-0800687 и №10-08-00037).
22
СОЗДАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ НА ОСНОВЕ
ЭКСПРЕССИОННЫХ ИНТЕИНОВЫХ СИСТЕМ
Есипов Р.С.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: esipov@mx.ibch.ru
Получение полипептидов с использованием экспрессии в бактериях
давно применяется в молекулярной биотехнологии. Как правило, чтобы
избежать протеолитического расщепления in vivo, целевой полипептид
получают в составе гибридного белка, что значительно увеличивает затраты
из-за добавления стадии протеолитического расщепления. Альтернативный
подход заключается в создании и использовании генетических конструкций,
в состав которых входит белок интеин, способный к управляемому
автокаталитическому расщеплению.
Преимуществом данного подхода является исключение стадии
ферментативного расщепления гибридного белка, что значительно упрощает
и удешевляет процесс получения целевых продуктов. При этом интеиновые
системы обладают и рядом существенных ограничений: частичное или
полное автокаталитическое расщепление, в зависимости от первых
аминокислот целевого белка, происходит непосредственно на стадии
культивирования штамма-продуцента; узкая область рН (6.5-7.3), в которой
эффективность автокаталитического расщепления высокая. В ряде случаев
такие факторы, как температура и солевой состав, не только влияют на
эффективность автокаталитического процесса, но и на его специфичность,
что приводит к образованию побочных трудноотделимых от целевого
полипептида продуктов. Разработке различных подходов, позволяющих
увеличить эффективность получения целевых рекомбинантных полипептидов
с использованием экспрессионных систем на основе интеинов, и посвящена
работа, проводимая в лаборатории биотехнологии.
В своей работе мы использовали несколько экспрессионных векторов,
включающих последовательности интеинов из различных источников для
получения целого ряда фармакологически значимых рекомбинантных
полипептидов. В результате проделанной работы были созданы лабораторные
регламенты и получены опытные образцы следующих полипептидов
медицинского назначения: тимозина альфа1, экстендина-4, глюкагона
человека, оксинтомодулина человека, гирудина и его аналогов,
эпидермального фактора роста человека, фрагмента фактора
дифференцировки пигментного эпителия (44-77) человека.
23
ПЛАЗМИДА pST-S1 ТЕРМОАЦИДОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ ПРИ
ЭКСТРЕМАЛЬНО ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ ЦИНКА В
СРЕДЕ
Журавлева А.Е., Летарова М.А.
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Электронный адрес: zhuravleva-inmi@mail.ru
Тел.: (499) 135-65-96
Sulfobacillus thermotolerans Kr1 T – термоацидофильная
грамположительная факультативно анаэробная бактерия, использующая Fe2+,
S0/S2-, сульфиды металлов и органические соединения в качестве источников
энергии и доноров электронов в оптимальных условиях интенсивной аэрации.
Бактерия доминировала в микробном сообществе в процессе
биовыщелачивания/окисления флотоконцентрата пирротиновой пиритноарсенопиритной золотосодержащей руды Олимпиадинского месторождения.
Изучение штаммового полиморфизма плазмидных профилей
сульфобацилл выявило взаимосвязь между составом и количеством плазмид
и источником углерода, энергетического субстрата, присутствия в среде ионов
тяжелых металлов – Fe3+, Cu2+, Zn2+, Ni2+, As3+, Pb2+, Ag+. В клетках штамма
Kr1, выращенного на среде с рудным концентратом, богатым ZnS, CuFeS2,
PbS и Ag+, обнаружены 3 низкокопийные плазмиды. Культивирование штамма
Kr1 в присутствии экстремально высоких концентраций Zn2+ (до 800 мМ),
что в 10-ки раз выше, чем для всех известных хемолитотрофов, индуцировало
отбор клеток, содержащих одну из 3-х плазмид – pST-S1. Репликация pST-S1
ингибировалась лишь концентрациями Zn2+ 800 мМ. При содержании Zn2+
200 мМ большинство клеток в популяции плазмид не имели. Оптимизированы
режимы культивирования штамма и подготовки биомассы, обеспечивающие
максимальный выход плазмидной ДНК, пригодной для дальнейшей очистки.
Установлены оптимальные концентрации в среде минерального (60 мМ Fe2+)
и органических (1.1 мМ глюкозы и 0.02% дрожжевого экстракта) субстратов
и Zn2+ – 400-600 мМ. Подобраны и модифицированы методики лизиса клеток
(в связи с особенностями строения их поверхностных структур),
препаративного выделения и очистки плазмиды для последующего
определения ее нуклеотидной последовательности. Изучение роли плазмид
в эффективности биоокисления сульфидных минералов имеет приоритетное
значение в совершенствовании биотехнологий получения цветных и
благородных металлов.
Работа проведена на средства Гранта Президента Российской Федерации
для государственной поддержки молодых ученых – кандидатов наук № МК3737.2011.4.
24
ЗАВИСИМОСТЬ АНТИАРИТМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПРОИЗВОДНЫХ ДИТЕРПЕНОВОГО АЛКАЛОИДА АТИЗИНА –
15-ГИДРОКСИАЗОМЕТИН АТИЗИНА И
15-АЦЕТОКСИАЗОМЕТИН АТИЗИНА ОТ ИХ СТРУКТУРЫ
Зайнобиддинов А.Э.1, Хушматов Ш.С.1, Усманов П.Б.1, Cалимов Б.Т.2
1
Институт физиологии и биофизики АН РУз, Ташкент, Узбекистан
2
Институт химии растительных веществ им. акад. С.Ю. Юнусова АН РУз,
Ташкент, Узбекистан
Электронный адрес: shunqorhsh@mail.ru
Тел.: (99871) 246-94-12
Известно, что разработка нового поколения высокоэффективных
антиаритмических средств, лишенных побочных эффектов, является
актуальной и важной задачей современной фармакологии и кардиологии. В
Институте химии растительных веществ АН РУз из растений рода Aconitum
zeravshanicum выделен целый ряд дитерпеновых алкалоидов, которые
обладают различной антиаритмической активностью в зависимости от их
структуры. В частности, показано, что замена в атизиновом скелете
15-гидроксиазометин атизина ОН-группы у атома углерода С15 на СН3Огруппу приводит к заметному повышению антиаритмической активности
15-ацетоксиазаметин атизина. С целью дальнейшей характеристики
взаимосвязи между структурой и антиаритмической активностью алкалоидов
нами были изучены особенности инотропных эффектов15-гидроксиазометин
атизина и 15-ацетоксиазаметин атизина.
Результаты наших экспериментов показали, что 15-гидроксиазометин
атизина при всех использованных концентрациях (5-30 мкМ) и частотах
стимуляции (0,1-4 Гц) проявлял более выраженный (ED50-8,7 мкМ) и только
отрицательный инотропный эффект, в то время как 15-ацетоксиазаметин
атизина при низких концентрациях (3-8 мкМ) и низких частотах стимуляции
(0,1-1Гц) проявлял положительный (ED 50-16,7 мкМ), а при высоких
концентрациях – отрицательный инотропный эффект. Результаты анализа
влияния алкалоидов на пост-рест потенциацию свидительствуют о том, что
положительный инотропный эффект, вызываемый 15-ацетоксиазаметин
атизином, обусловлен увеличением [Ca 2+ ] i в основном за счет их
высвобождения из саркоплазматического ретикулума (СР).
Отрицательный инотропный эффект, вызываемый 15-ацетоксиазаметин
атизином и 15-гидроксиазометин атизином, зависит от [Ca2+]o и частично
подавляется нифедипином, что свидетельствует о том, что этот эффект, в
основном, обусловлен уменьшением [Ca 2+ ]i в результате подавления их
поступления по Са2+-каналам и через Na+/Ca2+-обменник. Более выраженная
инотропная активность у 15-гидроксиазометин атизина и способность
15-ацетоксиазаметин атизина вызывать наряду с отрицательным инотропным
эффектом, также положительный инотропный эффект, по-видимому,
объясняется природой заместителей у углеродного атома С15 в их структуре.
При этом способность 15-ацетоксиазаметин атизина одновременно вызывать
положительный и отрицательный инотропный эффекты возможно
обеспечивает данному соединению более выраженную антиаритмическую
активность.
25
ДЕЙСТВИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО АЛКАЛОИДА
15-АЦЕТОКСИАЗОМЕТИН АТИЗИНА НА ТРАНСПОРТ Са2+
В САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОМ РЕТИКУЛУМЕ
КАРДИОМИОЦИТОВ КРЫСЫ
Зайнобиддинов А.Э.1, Хушматов Ш.С.1, Усманов П.Б.1, Cалимов Б.Т.2
1
Институт физиологии и биофизики АН РУз, Ташкент, Узбекистан
2
Институт химии растительных веществ им. акад. С.Ю. Юнусова АН РУз,
Ташкент, Узбекистан
Электронный адрес: shunqorhsh@mail.ru
Тел.: (99871) 246-94-12
Известно, что выяснение способов фармакологической модуляции
активности Ca2+-транспортирующих систем кардиомиоцитов является крайне
важной задачей для разработки новых терапевтических подходов
профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
В связи с этим целью данной работы было изучение влияния
дитерпеноидного алкалоида 15-ацетоксиазометин атизина, выделенного из
растений рода Aconitum zeravshanicum, на динамику транспорта Ca2+ в
саркоплазматическом ретикулуме (СР) кардиомиоцитов. Сократительную
активность папиллярной мышцы сердца крысы изучали в изометрическом
режиме с помощью механотрона F30 (Hugo Sachs; Германия) при стимуляции
импульсами длительностью 10 мс и амплитудой, превышающей пороговую
на 20%. Пост-рест потенциацию оценивали по увеличению силы первого
сократительного ответа после определенного периода покоя (5-120 сек).
Как показали эксперименты, прерывание стимуляции мыщцы на
определенные периоды покоя (5-120 сек), приводит к увеличению силы
первого сократительного ответа после возобновления стимуляции с исходной
частотой (0,1 Гц). При этом установлено, что потенцирующий эффект покоя
возрастает с увеличением длительности покоя и достигает максимума
(46,2±2,6%) по сравнению с контролем при 30 сек покоя. Добавление в
омывающий раствор 15-ацетоксиазометин атизина (3-8 мкМ) приводило к
дополнительному увеличению силы сокращения препарата на 15,6±2,8%.
Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что положительный
инотропный эффект 15-ацетоксиазометин атизина связан с его влиянием на
динамику транспорта ионов Са2+ из СР.
Вместе с тем было обнаружено, что наличие в среде 15-ацетоксиазометин
атизина увеличивает скорость расслабления папиллярных мышц (-dF/dtmax)
на 20±3,4% по сравнению с контролем. Резкое повышение скорости
расслабления папиллярных мышц (-dF/dtmax) по сравнению с контролем под
влиянием 15-ацетоксиазометин атизина, выявленное на основе проведенных
экспериментов, можно объяснить накапливанием ионов Са2+ в СР за счёт
усиления функции Са 2+ -АТФазы. Полученные данные дополнительно
свидетельствуют о том, что положительный инотропный эффект
15-ацетоксиазометин атизина реализуется на уровне Са2+-каналов СР.
26
QS СИСТЕМА LuxI/LuxR ТИПА У SERRATIA PROTEAMACULANS 94
Зайцева Ю.В., Хмель И.А.
Институт молекулярной генетики РАН, Москва
Электронный адрес: khmel@img.ras.ru
Тел.: (499) 196-00-16, факс: (499) 196-02-21
Quorum Sensing (QS) регуляция – это особый тип регуляции экспрессии генов
бактерий, зависящей от плотности их популяции. QS системы включают
низкомолекулярные сигнальные молекулы, названные аутоиндукторами (АИ),
легко диффундирующие через клеточную стенку, и регуляторные рецепторные
белки, с которыми связываются аутоиндукторы. QS системы являются ключевыми
факторами регуляции большого количества клеточных процессов.
Настоящая работа посвящена изучению QS систем у бактерии Serratia
proteamaculans, регуляции функционирования этих систем и их роли в контроле
клеточных процессов.
С помощью АГЛ-биосенсоров, ТСХ и масс-спектрометрического анализа
было показано, что штамм S. proteamaculans 94 продуцирует два основных типа
АГЛ: 3-оксо-гексаноил-гомосеринлактон и 3-гидроксо-гексаноилгомосеринлактон. Идентифицированы, клонированы и секвенированы гены QS
системы: sprI, кодирующий синтазу АГЛ, и ген sprR, кодирующий рецепторный
белок. Показано, что эти гены частично перекрываются и транскрибируются с
противоположных цепей ДНК навстречу друг другу. При анализе промоторной
области был обнаружен lux-бокс перед геном R-белка, т.е. сайт, с которым в других
QS системах связываются регуляторные рецепторные белки LuxR-типа.
Последовательность lux-бокса перекрывается с вероятным сайтом -10 в промоторе
гена R-белка, т.е. связывание этого белка в lux-боксе может ингибировать
инициацию транскрипции гена R белка.
Получены мутанты с нокаутированными генами синтазы АГЛ (sprI::Gmr) и
рецепторного белка (sprR::Gmr). Для определения роли QS-систем в регуляции
метаболических процессов S. proteamaculans 94 сравнивали активности различных
ферментов в клетках мутантных штаммов и штамма дикого типа. Было показано,
что клетки S. proteamaculans 94 обнаруживали внеклеточную протеолитическую,
липазную и хитиназную активности, такой же уровень активности этих ферментов
наблюдался в случае sprR::Gmr мутанта. Мутант sprI::Gmr обнаруживал резко
сниженные уровни ферментативных активностей. Кроме того, мутантные штаммы
не обладали способностью мигрировать в полужидкой среде по типу "свимминга",
в 2 раза снижался уровень образования биопленок. Хромато-массспектрометрический анализ состава жирных кислот S. proteamaculans 94, многие
из которых входят в состав ЛПС наружной мембраны, показал значительные
изменения в составе оболочек клеток мутантных штаммов по сравнению с диким
типом.
27
СТРЕСС СТИМУЛИРУЕТ ЭКЗОЦИТОЗ БТШ70 В
ПОПУЛЯЦИЯХ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
Зяблицин А.В., Алекперов Э.А., Бойко А.А., Клинкова А.В.,
Троянова Н.И., Сапожников А.М.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: amsap@mx.ibch.ru
Тел.: (495) 330-40-11
Белки теплового шока (БТШ) образуют большое семейство стрессиндуцируемых протеинов, одна из основных функций которых направлена
на обеспечение жизнеспособности клеток в неблагоприятных условиях.
Интенсивность синтеза БТШ значительно увеличивается под действием
широкого спектра повреждающих клетки факторов. Известно, что стресс
существенно влияет на активность иммунной системы, однако в литературе
не охарактеризована возможная взаимосвязь этого влияния с модуляцией
продукции БТШ иммунокомпетентными клетками. В настоящее время
известно, что БТШ, экспрессирующиеся как во внутриклеточном
пространстве, так и на клеточной поверхности, а также присутствующие в
межклеточном пространстве, играют существенную роль в иммунных
процессах. С целью проверки возможного влияния факторов стресса на
интенсивность синтеза клетками иммунной системы БТШ70 мы
проанализировали изменение содержание этих протеинов в нескольких
разновидностях популяций иммунокомпетентных клеток мыши под
действием различных стрессирующих агентов, а именно, ЛПС, ФМА и Н2О2.
В результате было обнаружено, что через 30-60 минут после внесения в
культуры клеток костного мозга ЛПС или ФМА уровень внутриклеточных
БТШ70 значительно снижался, возвращаясь к норме через 2-3 часа.
Аналогичный парадоксальный феномен снижения внутриклеточного
содержания БТШ70 на начальной стадии реакции клеток на стрессирующее
воздействие был обнаружен также в опытах с клетками лимфомы EL-4,
обработанных Н2О2. Выявленные изменения внутриклеточного содержания
БТШ70 у клеток, подвергнутых действию стресса, отличаются от
общепринятых представлений, предполагающих колоколообразную кинетику
индуцированного стрессом изменения концентрации внутриклеточных
БТШ70. Мы связываем зарегистрированное снижение внутриклеточного
содержания БТШ70 с выбросом части цитоплазматического пула этих
протеинов во внеклеточное пространство. Стресс-индуцированная секреция
БТШ70 может быть связана с защитной реакцией клеточной популяции,
направленной на защиту от стресса той части клеточного сообщества, которая
обладает сниженным протективным потенциалом. Существенно, что такое
предположение позволяет рассматривать лейкоциты как один из источников
циркулирующего в организме внеклеточного сывороточного пула БТШ70,
значительно увеличивающегося в условиях стресса.
28
ПОИСК НЕИЗВЕСТНОГО САЙТА СВЯЗЫВАНИЯ – ДОКИНГ
ПРИХОДИТ НА ПОМОЩЬ QSAR
Карлинский Д.М., Попов М.Е.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: karlinskyd@gmail.com
Тел.: (926) 317-95-05
Разработанный нами метод поиска неизвестного сайта связывания с
помощью молекулярного докинга эффективно дополняет метод поиска
количественных соотношений структура-свойство (QSAR - Quantitative StructureActivity Relationships), позволяя точнее предсказывать ингибирующую активность
соединений, схожих по формальным характеристикам. QSAR не требует знания
структуры лиганд-связывающего центра и позволяет быстро оценить активность
широкого ряда сильно отличающихся друг от друга соединений. Однако QSAR
теряет предсказательную силу при сравнении соединений, близких по таким
характеристикам, как геометрические размеры, гидрофобность и т.д.
Алгоритм разработанного метода:
1. Поиск возможных сайтов связывания на поверхности рецептора/
фермента.
2. Определение сайта связывания, для которого теоретическая оценка
свободной энергии связывания ряда лигандов лучше всего коррелирует с
экспериментальными данными.
3. Предсказание на основе найденного сайта связывания констант
взаимодействия для новых лигандов.
Работу метода и его преимущества по сравнению с QSAR иллюстрирует
исследование связывания низкомолекулярных лигандов с первым компонентом
системы комплемента C1q. Ингибирующие свойства демонстрируют лиганды с
гидрофобным ядром и отрицательными зарядами, разнесенными на расстояние
d, предположительно соответствующее расстояниям между положительно
заряженными группами Lys и Arg на поверхности глобулы C1q. При значениях d
от 2Å до 14Å наблюдается отчетливая зависимость логарифма ингибирующей
концентрации lnIC50 от расстояния между зарядами: R2=0,3. Однако, при сужении
наблюдаемого диапазона до интервала 7-13 Å, в котором наблюдается наибольшая
ингибирующая активность, зависимость пропадает – R2 уменьшается до 0,04
[1]. При применении разработанного нами метода с использованием докинга на
том же интервале 7-13 Å наблюдается сильная корреляция (R 2=0,7) между
оценочной энергией связывания и экспериментальными значениями lnIC50.
Таким образом, при широком разбросе свойств соединений, которые
отбираются в качестве перспективных ингибиторов, целесообразно использовать
метод QSAR, не требующий больших вычислительных затрат. При ограничении
отбираемых соединений близкими свойствами целесообразно использовать более
ресурсоемкий метод предсказания свободной энергии связывания с помощью
докинга.
Литература
Андия-Правдивый Ю.Э. Исследование механизма ингибирования гемолиза
заряженными субстанциями. // Диссертация на соискание ученой степени
кандидата химических наук. 2004. МИТХТ
29
ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОДУКЦИЯ ГОМОЛОГА
ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ ИЗ ТЕРМОФИЛЬНОЙ ЭУБАКТЕРИИ
TRUEPERA RADIOVITRIX
Клинова К.И.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: korn@mail.ibch.ru
Тел.: (495) 330-65-56
Большинство известных геномов животных, но не растений и грибов,
содержат от одного до пяти генов лизилоксидазы, что подчеркивает ее важную
роль для животных организмов. В подавляющем большинстве
прокариотических геномов гены лизилоксидазы отсутствуют, но тем
интереснее наличие истинных гомологов лизилоксидазы у некоторых
бактерий. Это отражает уникальную историю этого своеобразного фермента
– очевидно, что ген лизилоксидазы претерпевал неоднократный
горизонтальный перенос и в настоящее время часто встречается у
актиномицетов, изредка – у других эубактерий и очень редко – среди
архебактерий. Данный аспект представляет чрезвычайный интерес не только
с филогенетической точки зрения, но также и для возможных
биотехнологических приложений, поскольку дальнеродственные ферменты
могут иметь интересные свойства. Поэтому мы, используя синтез гена,
осуществили продукцию рекомбинантной лизилоксидазы термофильной
радиорезистентной эубактерии Truepera radiovitrix и приступили к
исследованию ее каталитических свойств. Поскольку лизилоксидаза
T. radiovitrix по своей структуре больше всех удалена от лизилоксидазы
животных, то неудивительно, что спектр субстратных предпочтений
лизилоксидазы T. radiovitrix оказался совершенно иным.
30
ИНГИБИТОРЫ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ
Ковалевская Ж.И.1, Чулин А.Н.2, Солонин А.С.1
1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино,
Московская обл.
Электронный адрес: hemolysin@rambler.ru
Тел.: (4967) 31-86-61
2
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: pepsylab@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 73-54-42
Цитолитические пороформирующие токсины, продуцируемые
микроорганизмами внутри организма хозяина, играют главенствующую роль
в развитии заболеваний. Один из цитолитических порообразующих токсинов
Bacillus cereus – гемолизин II (HlyII) представляет особый интерес, так как
он широко распространен среди бацилл цереусной группы. Ген гемолизина II
обнаружен не только в B. cereus, который может вызывать диарейный и
эметический синдромы, заболевания глаз, маститы и другие болезни, но и в
клетках B. thuringiensis, который является патогенным для насекомых и
используется для производства инсектицидных препаратов, а также в клетках
B. anthracis, чьи отёчный и летальный токсины участвуют в развитии
инфекционного процесса при сибирской язве. Гемолизин II продуцируется
бактерией в окружающую среду в форме мономера и, взаимодействуя с
клеточными мембранами, олигомеризуется с образованием открытых
трансмембранных структур – нанопор, что ведет в итоге к лизису клетки, т.е.
к ее гибели. При заражении макроорганизма бактерией, продуцирующей
гемолизин II, может происходить лизис множества клеток, что приводит к
нарушению функционирования атакуемых органов и гибели организма
хозяина. Таким образом, цитолитическое патогенное действие HlyII на разные
клетки и макроорганизмы обусловлено образованием ионпроводящих
каналов в клеточных мембранах. Цитолитические токсины являются
основными факторами патогенности и, таким образом, их исследование имеет
выраженный медицинский аспект. В настоящее время отсутствуют
эффективные пути защиты организма от действия гемолизина Bacillus cereus.
Чтобы нейтрализовать действие гемолизина II и подобных
пороформирующих токсинов, мы провели поиск веществ-ингибиторов
(блокаторов) действия уже секретированного токсина в организм хозяина.
Нами отобраны вещества, с разной эффективностью нейтрализующие
действие порофомирующего токсина гемолизина II и подобных ему токсинов
на эритроциты человека, – ПЭГи (600-6000) и циклодекстрины. -, - и
-Циклодекстрины ингибируют гемолиз эритроцитов, вызванный действием
гемолизина II, с разной эффективностью, максимальной для последнего (на
20%). Внешний диаметр поры -циклодекстрина 15,3 Å, диаметр
гептамерной поры гемолизина II, полученный из анализа осмотической
протекции на основе электронных микрофотографий и 3D гомологичного
моделирования, составляет около 2 нм при входе в пору, 1.2 нм - при начале
31
трансмембранного стебля и от 1 нм до 1.6 нм вдоль остального стебля. Исходя
из этого, можно предположить, что циклодекстрин должен хорошо
размещаться внутри кэп домена, тем самым уменьшая проход поры и вызывая
ингибирование гемолиза эритроцитов. Химически синтезированные
производные циклодекстринов протестированы на способность
предотвращать гемолиз (лизис) человеческих эритроцитов, вызываемый
пороформирующими токсинами. Синтезированные производные циклодекстрина (пер-6-[(Вос-L-Orn)амино]--циклодекстрин, пер-6-[(Н2NSer(OBn))амино]--циклодекстрин, пер-6-[(Boc-Cys(Bn))амино]-циклодекстрин, пер-6-[(N-Вос-L-Lys)амино]--циклодекстрин, пер-6-[(NZ-Lys)амино]--циклодекстрин, пер-6-[(N  -Eoc-L-Lys)амино]-циклодекстрин, пер-6-[(Ahx)амино]--циклодекстрин, пер-6-[(N-Вос-LArg)амино]--циклодекстрин, пер-6-[(TcBoc-L-Orn)амино]--циклодекстрин,
пер-6-[(Boc-L-Orn)]--циклодекстрин, пер-6-[(Ahx)амино]--циклодекстрин)
с разной эффективностью закрывают пору, и, как следствие, вызывают до
100% ингибирование гемолиза эритроцитов. Таким образом, подобраны
вещества, способные с разной эффективностью нейтрализовывать действие
порофомирующего токсина гемолизина II и подобных ему токсинов.
Работа поддержана ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России" на 2009-2013 годы.
32
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА NK-КЛЕТОК
ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ПРОТОЧНОЙ
ЦИТОМЕТРИИ
Коваленко Е.И., Каневский Л.М.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: lenkovalen@mail.ru
Тел.: (495) 330-40-50
Отсутствие NK-специфичных поверхностных маркеров, а также
перекрывание общих маркеров и функциональных свойств усложняет
отделение натуральных киллеров от некоторых других клеточных популяций,
в частности, миелоидного происхождения. NK-клетки экспрессируют
типичные для дендритных клеток костимулирующие молекулы. Часть NKклеток экспонирует белки MHC класса II HLA-DR, экспрессию которых, как
правило, связывают с профессиональными антиген-представляющими
клетками. В настоящее время общепринятым способом идентификации NKклеток человека является детекция CD3/CD14/CD19-негативных
лимфоцитов, экспрессирующих молекулы клеточной адгезии CD56. Однако,
не исключено существование иных клеточных популяций, которые также
могут экспрессировать CD56. Присутствие редких популяций дендритных
клеток в клеточной культуре выделенных NK-клеток может влиять на их
функционирование за счет контактных взаимодействий либо продуцируемых
дендритными клетками цитокинов. С использованием многоцветной
цитометрии нами была проанализирована экспрессия HLA-DR в популяции
CD56-позитивных мононуклеаров, выделенных из донорской крови человека.
Были выявлены две основные популяции с разным уровнем экспрессии HLADR. Низкая экспрессия HLA-DR регистрировалась в NK-клетках. Было
предположено, что популяцию с высоким уровнем экспрессии HLA-DR
составляют дендритные клетки. Уровень экспрессии HLA-DR на NK-клетках
отличался у разных доноров и составлял от 1% до 30% от общей популяции.
Субпопуляции CD56dim и CD56bright различались по экспрессии HLA-DR, в
большей степени этот белок был экспонирован на поверхности клеток
CD56bright. Доля экспрессирующих HLA-DR NK-клеток увеличивалась в
условиях их стимуляции IL-2. Для дальнейшего анализа NK-клетки
обогащали с помощью магнитной сепарации, доля CD3–CD56+-клеток в
полученной популяции составляла 95-99%. Для окраски клеток использовали
комбинации, включающие антитела к поверхностным маркерам дендритных
клеток; при цитометрическом измерении в образцах анализировали не менее
7х10 5 событий. По крайней мере, часть CD56 + HLA-DR bright -клеток
представляла собой субпопуляцию миелоидных дендритных клеток с
фенотипом CD141+TLR4–. Таким образом, дополнительным способом
идентифицировать NK-клетки может служить оценка экспрессии молекул
HLA-DR, низкий уровень которой выявляет индивидуальную субпопуляцию
NK-клеток. При этом корректное определение NK-клеток будет включать
детекцию клеток с фенотипом CD3–CD14–CD19–CD56–HLA-DRdim/neg.
33
МАТРИЦИД У CAENORHABDITIS ELEGANS КАК ПРИМЕР
ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ ЖИВОТНОГО ОРГАНИЗМА:
РОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Корнеенко Т.В., Шахпаронов М.И., Пестов Н.Б.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: korn@mail.ibch.ru
Тел.: (495) 330-65-56
АСИММЕТРИЯ ГИДРОФОБНЫХ СВОЙСТВ ПОВЕРХНОСТИ
-ТОКСИНОВ СКОРПИОНОВ
Коромыслова А.Д.1, Василевский А.А.2, Полянский А.А.2, Чугунов А.О.2,
Ефремов Р.Г.2
1
Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Электронный адрес: anna.koromyslova@gmail.com
2
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова, РАН, Москва
Круглые черви Caenorhabditis elegans – широко распространенная
модель для изучения генетических и молекулярных механизмов регуляции
продолжительности жизни. Однако некоторые механизмы до сих пор
остаются слабоизученными. В данной работе мы изучили матрицид –
жизненную программу взрослых гермафродитов C. elegans, альтернативную
старению. Выбор между этими двумя стратегиями производится в
зависимости от доступности пищи. Мы решили проверить гипотезу о том,
что в соответствии с теорией феноптоза окислительный стресс повышает
вероятность программируемой смерти организма. Сравнение частот
матрицида у червей дикого типа и мутантов с пониженным антиоксидантным
потенциалом митохондрий (nnt) в присутствии высоких концентраций
параквата указывает на то, что сильный митохондриальный стресс
действительно повышает склонность к матрициду. С другой стороны, с
учетом того, что необходимые для проявления этого явления концентрации
параквата токсичны для потомства, следует заключить, что окислительный
стресс не является ключевым инициирующим механизмом матрицида в
нормальных условиях.
Потенциал-чувствительные Na+-каналы (ПЧНК) – это интегральные
белки мембраны клеток, селективно пропускающие ионы натрия и
участвующие в проведении нервного импульса. ПЧНК – одна из главных
мишеней животных ядов и нейротоксинов, в частности, токсинов скорпионов,
модифицирующих активность каналов и потенциал на мембране. -Токсины
скорпионов действуют на т.н. третий рецепторный сайт на поверхности
канала (S3-S4 петля домена IV -субъеденицы ПЧНК) и оказывают -эффект
– значительное замедление быстрой инактивации ПЧНК. -Токсины из яда
скорпионов разделяют по селективности действия на три группы: первые
действуют на каналы млекопитающих ("млекотоксины"), другие – на каналы
насекомых ("инсектотоксины"), третьи действуют сразу на обе группы
животных ("-подобные токсины"). Выяснение механизма этой
селективности важно как для фундаментальных нейробиологических
исследований, так и разработки новых инсектицидов на основе
инсектотоксинов ядов скорпионов.
-Токсины образованы двумя "доменами": консервативной
"сердцевиной", включающей -мотив, и подвижным RC-доменом,
состоящим из петли в области N-конца и С-концевого участка токсина. В
данной работе методами молекулярной динамики и молекулярного
гидрофобного потенциала были исследованы гидрофобные свойства
поверхности -токсинов скорпионов и их конформационная подвижность.
Выяснено, что RC- и Core-домены конформационно независимы и
перемещаются относительно друг друга, что было показано в ходе анализа
нормальных мод. RC-домены "млекотоксинов" заметно более гидрофильны
и динамически подвижны, чем "сердцевина" молекулы, консервативная для
всех трех групп токсинов. Основанный на аминокислотной
последовательности анализ гидрофобных свойств петель ПЧНК насекомых
и млекопитающих показывает сходную консервативную организацию петель
I,III и IV доменов, связывающих -токсины, однако гидрофобность петель в
домене II (он содержит сайт связывания -токсинов) существенно отличается.
Гидрофобные и динамические свойства токсинов скорпионов отражают
особенности организации сайтов связывания на рецепторной поверхности
и связаны с селективностью их действия.
34
35
ПОЛУЧЕНИЕ GoLocoI ФРАГМЕНТА БЕЛКА Pins ИЗ
ДРОЗОФИЛЫ
Костарева О.С., Тин У.Ф., Тищенко С.В., Гарбер М.Б.
Институт белка РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: zelle@rambler.ru
Тел.: (4967) 31-82-56
Гетеротримерные G-белки участвуют в системе переноса сигнала от
рецепторов, расположенных на поверхности клеток, к эффекторным
молекулам в цитоплазме. G-Белки состоят из трех субъединиц: G, G и G.
При взаимодействии с сигнальными рецепторами мембраны эукариотической
клетки G субъединица связывается с ГТФ, субъединицы диссоциируют и
взаимодействуют с эффекторными белками для передачи сигнала.
При исследовании асимметричного клеточного деления в нейробластах
дрозофилы был идентифицирован белок Pins, содержащий GoLoco мотивы
и относящийся группе рецептор-независимых регуляторных белков. Недавно
были получены данные, свидетельствующие о том, что Pins может служить
мишенью в процессе передачи сигнала от связанных с G-белками рецепторов.
Такие белки, как правило, взаимодействуют с Gо/ГДФ (неактивной формой
белка) и управляют активацией G-белков. Однако в клетках дрозофилы белок
Pins может связываться как с Gо/ГДФ формой белка, так и с Gо/ГТФ
(активная форма). Необходимым и достаточным для взаимодействия Gо и
Pins является GoLocoI фрагмент белка Pins. Определение кристаллической
структуры Gо/ГДФ, Gо/ГТФ из дрозофилы в свободном состоянии и в
комплексе с GoLocoI доменом белка Pins позволило бы определить
молекулярные основы этого взаимодействия.
В целях получения кристаллизуемого препарата нами были получены
мутантные формы белка Gо, лишённые N-концевых аминокислотных
остатков. Мы клонировали ген фрагмента Pins из дрозофилы (36
аминокислотных остатков), содержащего GoLocoI домен, в вектор,
используемый в IMPACT Protein Purification System. Данная система
позволяет экспрессировать белок с протеиназой интеин и хитинсвязывающим доменом на С-конце. В настоящее время ведётся работа по
оптимизации процессов получения и очистки комплекса Gо с GoLocoI
доменом белка Pins.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда
фундаментальных исследований (грант № 11-04-00859) и Программы
Президиума МКБ РАН.
36
НОВАЯ СИСТЕМА ПОИСКА ЛИГАНДОВ КАЛИЕВОГО
КАНАЛА Kv1.3
Кудряшова К.С.1, Кузьменков А.И.2, Василевский А.А.2, Некрасова О.В.2,
Феофанов А.В.1,2
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
2
Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Электронный адрес: rekamoskva@mail.ru
Тел.: (965) 339-15-25
Потенциал-зависимый калиевый канал человека Kv1.3 – представитель
каналов типа Shaker, является гомотетрамером, каждая субъединица которого
содержит 6 трансмембранных сегментов, 4 из которых образуют потенциалчувствительный домен, а 2 других участвуют в формировании селективной
ионной поры. В большом количестве каналы Кv1.3 входят в состав мембран
T-лимфоцитов. Благодаря способности ингибировать Т-клеточную
пролиферацию блокаторы канала Кv1.3 рассматривают как потенциальные
иммунодепрессанты для лечения таких аутоиммунных заболеваний, как
рассеянный склероз, ревматоидный артрит и псориаз. В настоящее время
известно несколько десятков блокаторов канала Kv1.3, однако продолжается
активный поиск новых высокоаффинных лигандов, изучается вопрос их
применения с точки зрения медицины.
В настоящей работе предложена новая система поиска лигандов канала
Kv1.3, основанная на высокоэффективной экспрессии в мембране бактерий
Escherichia coli химерного белка KcsA-Kv1.3. Гибрид KcsA-Kv1.3 был
получен путем встраивания внеклеточных петель калиевого канала человека
Kv1.3 в гомологичный участок бактериального канала KcsA. Показано, что
гибридный канал сохраняет способность связывать поровые блокаторы Kv1.3.
С применением метода конфокальной микроскопии нами разработана
методика измерения количественных характеристик образования комплексов
между флуоресцентно-меченым блокатором калиевых каналов агитоксином-2
(AgTx2) и лиганд-связывающим участком Kv1.3 на поверхности клеток
E. coli, экспрессирующих KcsA-Kv1.3. Измерены константы диссоциации
комплексов Kv1.3 с различными лигандами по их способности конкурировать
с AgTx2 за связывание с KcsA-Kv1.3. На примере нескольких ядов животных
продемонстрирована возможность быстрого обнаружения и прицельного
выделения новых блокаторов канала Kv1.3 из состава многокомпонентных
смесей.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты №№ 09-04-01475,
10-04-90460)
37
АНТИАНГИОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ
ЛИПОСОМ С ЛИПОФИЛЬНЫМИ ПРОЛЕКАРСТВАМИ И
УГЛЕВОДНЫМ ЛИГАНДОМ СЕЛЕКТИНОВ
Кузнецова Н.Р.1, Степанова Е.В.2, Болдырев И.А.1, Бовин Н.В.1,
Молотковский Ю.Г.1, Водовозова Е.Л.1
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
2
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН,
Москва
Электронный адрес: natalia@lipids.ibch.ru
Тел.: (495) 330-66-10
С целью улучшения фармакологических свойств нами предложено
включать липофильные пролекарства (ЛП; сложноэфирные конъюгаты
липид-лекарство) химиотерапевтических препаратов в мембрану 100-нмлипосом (L), сконструированных на основе природных фосфолипидов,
образующих жидкий липидный бислой. Ранее, на модели рака молочной
железы мышей показано, что противоопухолевый эффект L с ЛП сарколизина
резко усиливается при их оснащении тетрасахаридным лигандом селектинов
сиалил Льюис X (SiaLeX) [Vodovozova et al. Eur. J. Cancer 2000]. Сходный
эффект показали L с ЛП метотрексата при лечении лимфолейкоза мышей
[Moiseeva et al. Anticancer Res., in press]. Селектины – углевод-связывающие
адгезионные белки – экспрессируются на активированных лейкоцитах,
тромбоцитах и эндотелиальных клетках.
В данной работе исследовано влияние SiaLeX-L с ЛП мелфалана на
микрососуды опухоли на модели карциномы легкого Льюис. Экструзионные
L состава лецитин яичный / фосфатидилинозит из S. cerevisiae / 1,2диолеоилглицерид мелфалана / конъюгат SiaLe X с ПЭГ(8-15)-1,2диолеоилглицерином, 8:1:1:0.2 (мол), L без SiaLeX, мелфалан в экв. дозе
(7 мг/кг) или физраствор вводили в/в (v. caudalis) на 3 и 7 дни после
трансплантации опухоли мышам гибридов первого поколения BDF1
(C57B/6*DBA/2) (n=10 в группе). По данным гистологического исследования
срезов опухолей, окрашенных гематоксилином и эозином, после двукратного
введения SiaLeX-L наблюдалось специфическое повреждение опухолевых
сосудов: дилатация, полнокровие, некрозы (9 день, n=3). Оценка количества
микрососудов в опухоли стандартным иммуногистохимическим методом с
использованием анти-CD31 антител показала торможение роста сосудов под
действием мелфалана, L или SiaLeX-L на 29, 60 и 72%, соответственно
(15 день, n=3). По данным конфокальной флуоресцентной микроскопии
срезов опухолей через 30 мин после введения липосом, меченных BODIPYфосфатидилхолином, наблюдалась колокализация SiaLeX-L и маркера
сосудистого эндотелия CD31, тогда как L без SiaLeX накапливались во
внеклеточном пространстве периваскулярной зоны опухолевой ткани за счет
экстравазации. Следовательно, введение SiaLeX-конъюгата в состав липосом
обеспечивает их активный транспорт к эндотелию сосудов опухоли.
Вероятно, механизм противоопухолевого действия цитотоксических SiaLeXлипосом связан именно с их антиангиогенным эффектом.
Работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-01021.
38
ВЛИЯНИЕ СИГНАЛОВ ПРОТЕАСОМНОГО ПРОЦЕССИНГА НА
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НЕСТРУКТУРНОГО БЕЛКА NS1 ВИРУСА
КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В КЛЕТКЕ
Кузьменко Ю.В., Стародубова Е.С., Тимофеев А.В., Карпов В.Л.
Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва
Электронный адрес: kuzmenko-yulia@mail.ru
Тел.: (495) 135-98-01
Путь процессинга белка-антигена и его презентация молекулами MHC
определяют тип иммунного ответа. Направление антигена по протеасомному
пути протеолиза может привести к увеличению презентации его эпитопов в
составе МНС-I и усилению Тh1-иммунного ответа. Неструктурный белок
NS1 вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) распределяется внутри клетки в
области эндоплазматического ретикулума (ЭПР), а также на поверхности
клетки. Мы предположили, что удаление последовательности из 25 а.к.
оболочечного белка Е с N-конца NS1, ответственной за транспорт из клетки,
приведет к накоплению белка в цитоплазме и усилению его деградации на
протеасоме, что увеличит эффективность его представления в составе
комплекса МНС-I. В наших экспериментах была показана ко-локализация
такого белка с белком-маркером ЭПР (калретикулином), а экспонирование
его на клеточной поверхности не наблюдалось. Также для повышения
эффективности деградации на протеасоме были созданы химерные
конструкции обоих вариантов белка NS1 со специфическими протеасомными
сигналами - полноразмерной орнитиндекарбоксилазой мыши (ODC) или ее
фрагментом (ODCsig). Иммуноокрашивание клеток показало отсутствие
химерных белков с ODC на клеточной поверхности. Локализация таких
белков в клетке носила смешанных характер с частичной ко-локализацией в
ЭПР. Таким образом, слияние полноразмерного белка ODC или его
сигнальной последовательности (ODCsig) с неструктурным белком NS1
приводит к блокированию транспорта химерных белков из клетки. В
результате этого происходит частичное перераспределение белков в
цитоплазме клетки, что приводит к значительному ускорению деградации
химер на протеасоме, и, как следствие, может привести к увеличению
презентации эпитопов этих белов на поверхности клеток и повышению
уровня Тh1-иммунного ответа. В дальнейшем мы планируем проверить, как
усиление деградации неструктурного белка NS1 повлияет на его
иммуногенность при ДНК-вакцинации.
39
ФРАГМЕНТЫ ГЕНОВ PRV-1 И Jak-2 В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПРИ
МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (МПЗ)
Кузьмичев С.А.1, Аксенова Е.В.1,2, Кесаева Л.А.2, Мисюрин А.В.1,2,
Румянцев А.Г.1
1
ФГУ "ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии"
Минздравсоцразвития
2
ФГБУ "ФНКЦ ГМЦ" Минздравсоцразвития, Москва
Тел.: (495) 937-50-24
Современные методы ранней онкодиагностики основаны на
генетическом анализе циркулирующих в плазме крови нуклеиновых кислот,
что позволяет неинвазивно установить наличие опухолей, даже когда по
другим показателям – содержанию некоторых гормонов в крови или при
биопсии тканей заболевание не обнаруживается [1,2]. Использование таких
показателей, как уровень мутаций в циркулирующей ДНК (цДНК) некоторых
онкогенов и онкосупрессоров, может иметь перспективы для мониторинга
канцерогенеза и эффективности лечения [2], в тоже время диагностика МПЗ
на основе ДНК из плазмы крови мало разработана. Поэтому нами были
проведены исследования цДНК в плазме у здоровых доноров и пациентов с
МПЗ с целью выявить некоторые гены, которые используются для первичной
и дифференцированной диагностики полицитемии (ИП) и миелолейкоза: Jak2, кодирующий janus киназу, PRV-1, кодирующий CD177 рецептор [3] и
химерный ген BCR-ABL, характерный для хронического миелолейкоза
(ХМЛ). Для разделения фрагментов проводили ПЦР на амплификаторе
"Терцик", отжиг праймеров для последовательностей химерного гена BCRABL, кодирующего белок p210, был при 65o,30 сек, для амплификации
фрагмента PRV-1, 99bp – при 65o,60 сек, элонгация 30 циклов. ПЦР в реальном
времени (ПЦР r-t) проводили в 25 мкл реакционной смеси, используя Tag
DNA полимеразу и праймеры, позволяющие получить фрагменты гена PRV-1
в 99 bp (прямой 5'-GCTGTCCACCAAAAT-GAGCAT-3' и обратный праймеры
– 5'-TTCTCACGCGCAGAGAAGATC-3') и генов Jak-2 (wt и mut G1849T) в
92 bp (прямой 5'-AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT-3' и обратный
праймеры 5'-AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT-3'). Условия при
проведении ПЦР r-t были следующими: ген BCR-ABL и ген PRV-1 –
денатурация 95o, отжиг и элонгация 60o, 50 циклов; гены Jak-2 (wt и mut) –
денатурация 95o, отжиг 54o и элонгация 60o, 40-45 циклов. ПЦР r-t проводили
на Corbett Rotor-Gene, для генов BCR-ABL, PRV-1 и Jak-2 (wt) использовались
зонды с флуорофором FAM, а Jak-2 (mut) – с JOE. В качестве стандарта
использовался клонирующий вектор на основе pGEM-T Easy Vector System
(www.promega.com). Концентрацию цДНК, выделенной методом фенолхлороформной экстракции [4] с модификацией из плазмы, измеряли на
спектрофотометре при 260 нм. Сравнение результатов показало, что у лиц,
несущих мутации, характерные для ИП и ХМЛ, и получавших лечение, или
имеющих небольшой уровень экспрессии мутантных генов (для BCR-ABL
из лейкоцитов, оцененный с помощью ПЦР r-t, он составлял 0,007-1,87%), и
здоровых доноров концентрация ДНК в плазме крови статистически не
40
различается. ПЦР с последующим разделением фрагментов в 6% ПАГ
показала наличие в плазме крови у нескольких пациентов с МПЗ
последовательности гена PRV-1, но не обнаружила BCR-ABL. С помощью
ПЦР r-t ген BCR-ABL в плазме у этих пациентов тоже не обнаружен.
Сравнительный анализ показал, что у пациентов количество копий гена Jak2 было больше, чем у здоровых доноров, и уровень флуоресценции при
амплификации достигал порогового значения (0,03) раньше, чем у доноров
(p<0,05). При амплификации Jak-2 образцы цДНК, полученные из плазмы
крови здоровых доноров, можно отличить от пациентов с МПЗ на 32-35 цикле
ПЦР r-t (p < 0,05) при пороговом уровне 0,03, и кривая флуоресценции Jak-2
mut пересекает пороговый уровень позже (на 37-39 цикле), чем от Jak-2 wt.
Кривая флуоресценции при амплификации PRV-1 у пациентов пересекает
пороговое значение на 35-36 цикле. Уровень флуоресценции при
амплификации гена PRV-1 из плазмы крови пациентов в наших исследованиях
достигал 0,2, а гена Jak-2 – 0,25.
Полученные нами результаты впервые показали, что амплификация в
течение 40-50 циклов последовательностей генов Jak-2 и PRV-1, полученных
из цДНК в плазме крови, позволяет обнаружить повышение их экспрессии
на ранних стадиях развития МПЗ или в ходе их лечения. Дальнейшие
исследования, в том числе и особенностей метилирования промоторов этих
генов, необходимы для разработки прецизионных методов диагностики
возникновения МПЗ и их ремиссии.
Литература
1. Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактивнов П.П. Циркулирующие ДНК в крови
и их использование в медицинской диагностике. Молекул. биология. (2008).
42 (2), 12-23.
2. Goebel G., Zitt M., Zitt M., Muller H.M. Circulating nucleic acids in plasma or
serum (CNAPS) as prognostic and predictive markers in patients with solid
neoplasias. Disease Markers. (2005). 21, 105-120.
3. Tutaeva V, Misurin A.V., Michiels J.J., Rozenberg J.M., Sokolova M.A., Ivanova
V.L., Kolosheinova T.I., Manakova T.E., Levina A.A., Semenova E.A.,
Khoroshko N.D. Application of PRV-1 mRNA expression level and JAK2V617F
mutation for the differentiating between polycytemia vera and secondary
erythrocytosis and assessment of treatment by interferon or hydroxyurea.
Hematology. (2007). 6, 473-479.
4. Маниатис, Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.
Молекулярное клонирование. (1984). М., Мир. 357.
41
ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ НА СОСТОЯНИЕ ТКАНЕЙ МЫШЕЙ
ЛИНИЙ SAMR И SAMP, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ РАЗНЫМИ
ТЕМПАМИ СТАРЕНИЯ
Куликова О.И.1, Рихирева Г.Т.2, Трунова О.А.3, Шарыгин В.В.2,
Стволинский С.Л.3, Маклецова М.Г.3
1
Российский университет дружбы народов, экологический факультет,
Москва
2
Институт химической физики имени Н.Н. Семенова РАН, Москва
3
Научный центр неврологии РАМН, Москва
Электронный адрес: posibilidad@mail.ru
Тел.: (495)-490-24-09
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕПТИДНОГО
МИМЕТИКА ГМДП. ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНЫХ МИШЕНЕЙ
Сравнение влияния гипобарической гипоксии на быстростареющих
мышей линий SAMP (Senescence accelerated mice prone) и характеризующихся
нормальным физиологическим темпом старения SAMR (Senescence
accelerated mice resistance) показало, что по времени наступления остановки
дыхания первые обнаруживают большую чувствительность к гипоксии.
Изучение молекулярно-клеточных процессов в мозге и крови с помощью
метода низкотемпературной ЭПР-спектроскопии выявило ряд процессов,
которые включаются в механизмы поражающего действия гипоксии. Прежде
всего, это существенное увеличение концентрации метгемоглобина (на 62%)
в крови быстростареющих мышей через 1 час после гипоксического
воздействия. Этот феномен сопровождает переход из состояния острого
гипоксического эпизода в более длительную вторичную гемическую
тканевую гипоксию.
Отсутствие эффекта накопления метгемоглобина в эти сроки в крови
мышей линии SAMR, вероятно, свидетельствует о том, что в их организме
достаточно эффективно работают компенсаторно-восстановительные
реакции. Обнаруженные в печени и мозге изменения сигналов протонной
релаксации Т1 и Т2, а также убыль в мозге быстростареющих мышей
полиаминов путресцина и спермидина (по сравнению с контролем на 78% и
20%, соответственно) являются косвенным указанием на возможность отека
мозга и увеличения обводненности печени у этих животных после
гипоксического воздействия.
Таким образом, сравнительные физико-химические исследования
влияния гипоксии на мышей SAMP и SAMR (с ускоренным и нормальным
темпом старения, соответственно) показали различия в эффективности
механизмов адаптации этих линий.
Работа поддержана грантами РФФИ №№ 09-04-00507, 10-04-01461 и
11-04-01603.
Молекулярные механизмы естественного иммунитета, развитие адаптационного
иммунитета, генерирование антиген-специфических клеток памяти – области
иммунологии, представляющие значительный интерес. Большую роль в регуляции
вышеперечисленных процессов играют природные лиганды патогенассоциированных рецепторов. В ФИБХ проводятся работы по созданию на основе
ГМДП новых более эффективных препаратов и инструментов изучения активации
неспецифического иммунитета. Был обнаружен 15-мерный пептид, названный RN,
проявляющий адъювантную активность в молярных концентрациях, почти в 100 раз
меньших, чем ГМДП, при этом пирогенный эффект отсутствует. Последнее позволило
предположить, что ГМДП и RN-пептид могут активировать биосинтез разных
лимфокинов. Показано, что RN-пептид стимулирует синтез гамма-интерферона,
интерлейкина-1 (Ил-1), интерлейкина-4 (Ил-4) и, в меньшей степени, фактора некроза
опухоли альфа (ФНО-альфа). В дозе 2 нг/животное индукция синтеза ФНО-альфа
была минимальной и через 48 часов ФНО-альфа не обнаруживался. ГМДП
индуцировал значительную продукцию ФНО-альфа и Ил-10 и в меньшей степени
ИЛ-1. RN-Пептид Ил-10 не индуцировал.
Поиск минимального фрагмента и изучение роли отдельных аминокислотных
остатков в адъювантной активности RN-пептида показали, что размер минимального
пептида, взаимодействующего с антителами против ГМДП, составляет семь
аминокислотных остатков; по адъювантной активности этот аналог был близок к
ГМДП, но значительно уступал исходному RN-пептиду. Важным является вопрос
молекулярной мишени: какой белок является рецептором ГМДП. Для поиска
молекулярных мишеней ГМДП и RN-пептида из клеток моноцитарномакрофагальной линии WEHI 3, высокочувствительных к ГМДП и RN-пептиду,
выделили полисомы, которые иммунохимически обогащали на иммобилизованном
RN-пептиде. Полученную РНК использовали для синтеза кДНК. Фрагменты ДНК
были лигированы с вектором pHEN1 и клонированы в штамме E.coli TG1. Определена
нуклеотидная последовательность клона, дающего положительный сигнал.
Установлено, что белок гомологичен Y-box-связывающим белкам (YB-1), при этом
гомология - более 90. Константа диссоциации RN-пептида с YB-1 составила 4*10-9М.
Проделанная работа и полученные результаты создают предпосылки для
дальнейшего и успешного изучения молекулярных механизмов рецепции и
трансдукции сигнала мурамилпептидов и их структурных аналогов.
42
43
Ламан А.Г.1, Савинов Г.В.1, Шепеляковская А.О.1, Бозиев Х.М.1, Бровко Ф.А.1,
Родионов И.Л.1, Чулин А.Н.1, Елисеева И.А.3, Ким Е.Р.3, Гурьянов С.Г.3,
Овчинников Л.П.3, Лябин Д.Н.3, Иванов В.Т.2
1
Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
3
Институт белка РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: brovko@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 73-08-53
НОВЫЙ ЦИТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД РЕГИСТРАЦИИ
АПОПТОЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРОФОРА
10-N-НОНИЛ-АКРИДИНОВОГО ОРАНЖЕВОГО
Луценко Г.В., Коваленко Е.И., Сапожников А.М.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: gvlut@mx.ibch.ru
Тел.: (495) 330-40-11
Недавно было показано, что в процессе апоптоза наблюдаются
окислительно-восстановительные каталитические взаимодействия
цитохрома c с кардиолипином, фосфолипидом внутренней мембраны
митохондрий, и последующее его окисление. Окисление кардиолипина
сопровождается высвобождением цитохрома c из митохондрий в цитоплазму,
что является ключевым событием в развитии апоптоза. Флуорофор 10-Nнонил-акридиновый оранжевый (НАО), который с высокой аффинностью
связывается с нативным кардиолипином в митохондриях и практически не
связывается с окисленной его формой, может быть использован для
цитометрического анализа этого эффекта. Показано, что при инкубации
клеток линии CTLL-2 с добавлением 7% этанола (90 мин) последующее их
окрашивание НАО выявляет популяцию клеток с низкой интенсивностью
флуоресценции. При сравнении этих результатов с данными, полученными
общепринятым цитометрическим методом регистрации апоптоза аннексином
V, меченным флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), и йодистым пропидием
(ПИ), выявлено точное соответствие процента апоптозных клеток проценту
клеток с низкой интенсивностью флуоресценции НАО. Далее проводили
индукцию апоптоза и его тестирование в клетках трех линий: CTLL-2, Jurkat
и Raji. Сравнение результатов определения апоптоза и некроза в клетках
исследованных линий с использованием общепринятого метода "аннексин
V-ФИТЦ/ПИ" и предлагаемого метода "НАО/ПИ" продемонстрировало их
хорошее совпадение. Выявлена высокая корреляции между данными,
получаемыми этими методами (0.953, p<0.0001). Цитометрический анализ
клеток с тремя флуоресцентными зондами – НАО, аннексином V, меченным
алексой флуор 647 (АФ647), и ПИ также показал, что НАО-негативные клетки
совпадают с популяцией апоптозных аннексин V-АФ647-позитивных клеток.
Таким образом, цитометрический способ обнаружения апоптоза с
использованием НАО находится в хорошем соответствии с традиционным
методом (аннексин V-ФИТЦ/ПИ) и может быть использован в качестве нового
методического инструмента для анализа процессов программированной
клеточной гибели.
44
ЭНДОЛИЗИН БАКТЕРИОФАГА Т5: НОВАЯ
МЕТАЛЛОПЕПТИДАЗА СЕМЕЙСТВА М15
Микулинская Г.В.1, Одинокова И.В.2, Зимин А.А.3, Лысанская В.Я.3,
Феофанов С.А.1, Степная О.А.3
1
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино,
Московская обл.
3
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино,
Московская обл.
Электронный адрес mikulinskaya@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 73-17-80
Вирулентный колифаг Т5, как многие другие вирулентные бактериофаги,
для выхода фагового потомства из клетки-хозяина имеет двухбелковую
систему лизиса, состоящую из эндолизина (обеспечивающего гидролиз
пептидогликана клеточной стенки) и холина (обеспечивающего
проникновение эндолизина через внутреннюю плазматическую мембрану).
Гены обоих белков находятся под контролем общего промотора в ранней
области С генома бактериофага. Ген lys бактериофага Т5, кодирующий
эндолизин, был клонирован в клетки E.coli. Белок был очищен до состояния
электрофоретической гомогенности с высоким выходом (около 80% по
активности) посредством двух последовательных хроматографий на DEAEToyopearl 650M и фосфоцеллюлозе. Показано, что продукт гена lys не
является гликозилгидролазой, а гидролизует связь между L-аланином и Dглутаминовой кислотой пептидных мостиков. L-аланоил-Dглутаматпептидаза проявляет максимальную активность в разбавленных
буферах с ионной силой 25-50 мМ при pH 8.5. Фермент не ингибируется
1,10-фенантролином (обладающим высоким сродством к Zn 2+ ), строго
ингибируется EDTA (комплексообразователь широкого спектра) и BAPTA
(1,2-бис-(O-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота –
специфический хелатор Ca2+); полностью реактивируется при добавлении
Ca2+ либо Mn2+. Было показано, что пептидаза бактериофага Т5 способна
гидролизовать пептидогликаны ряда других грамотрицательных
микроорганизмов (Pectobacterium carotovorum, Pseudomonas putida, Proteus
vulgaris, Proteus mirabilis), то есть пептидогликаны типа А1.
Исследованный эндолизин – первая L-аланоил-D-глутаматпептидаза,
обнаруженная у вирулентного бактериофага, инфицирующего
грамотрицательные бактерии. Однако анализ белковых баз данных
показывает обилие сходных с данным белком аминокислотных
последовательностей и, следовательно, широкое распространение
эндолитических L-аланоил-D-глутаматпептидаз среди бактериофагов и
бактерий. Анализ аминокислотной последовательности L-аланоил-Dглутаматпептидазы бактериофага Т5 выявил наличие консервативных
аминокислот His66, Asp73, Asp130 и His133, участвующих в связывании иона
металла и катализе, что позволило отнести фермент к металлопептидазам
подсемейства С семейства М15 клана MD.
45
ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ АКТИВНОГО ЦЕНТРА
ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДМОНОФОСФАТКИНАЗЫ
БАКТЕРИОФАГА Т5 МЕТОДОМ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО
МУТАГЕНЕЗА
Микулинская Г.В.1, Таран С.А.1, Скоблов Ю.С.2, Феофанов С.А.1
1
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес mikulinskaya@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 73-17-80
Выделены электрофоретически гомогенные препараты 13 мутантных
форм дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5,
полученные методом сайт-направленного мутагенеза гена фермента и
содержащие единичные замены консервативных аминокислот активного
центра – S13A, D16N, T17N, T17S, R130K, K131E, Q134A, G137A, T138A,
W150F, D170N, R172I, E176Q. Удельная активность мутантных форм
фермента была исследована на природных акцепторах фосфорильной группы
(dAMP, dCMP, dGMP, dTMP).
Показано, что замены заряженных аминокислот dNMP-связывающего
домена – R130, R172, D170 и E176 – приводят к практически полной потере
ферментативной активности. Можно заключить, что эти заряженные
аминокислоты абсолютно необходимы для связывания и фосфорилирования
всех четырех канонических dNMPs. Аргинины, вероятно, участвуют в
связывании -фосфата донора и - и -фосфатов акцептора фосфорила.
Аминокислотные замены G137A, T138A и T17N ведут к резкому
снижению активности на трех субстратах с сохранением достаточно высокой
активности на четвертом (в случае треониновых мутантов – dAMP, а в случае
G137A – dCMP). У мутанта Q134A сохраняется активность на dAMP и dCMP.
Замены в АТP-связывающем сайте (S13A, D16N) приводят к значительному
снижению активности лишь на одном из субстратов: в случае S13A это dGMP,
а в случае D16N – dTMP. Замены W150F, K131E, T17S не приводят к
значительному изменению активности ни на одном из субстратов.
Таким образом, падение ферментативной активности на различных
акцепторах фосфорильной группы в результате мутагенеза происходит
неодинаково. Следовательно, несмотря на наличие одного сайта связывания
субстрата, тип азотистого основания оказывает влияние на катализ.
Наибольшее влияние мутации оказывают на активность фермента в
отношении dТMP. Этот факт интересен потому, что именно
тимидилаткиназная
активность
лимитирует
биосинтез
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в клетках бактерий и высших животных,
а также является мишенью регуляции этого биосинтеза.
46
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ПШЕНИЦА: СОСТОЯНИЕ И
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СОВРЕМЕННОМ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ
Мирошниченко Д.Н., Долгов С.В.
Станция искусственного климата "Биотрон" Филиала Института
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: miroshnichenko@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 73-17-79
Пшеница исторически является важнейшей зерновой культурой не
только в России, но и во всем мире. Несмотря на многовековую историю ее
совершенствования с использованием методов классической селекции,
отдаленной гибридизации и мутагенеза получить современные сорта,
одновременно обладающие высокой урожайностью и устойчивостью к
стрессовым факторам, затруднительно вследствие сложной генетической
природы этих признаков. Альтернативный путь – это создание
биотехнологической пшеницы с заданными свойствами на основе
существующих сортов с привлечением генов других видов растений. В
течение последних десяти лет на станции искусственного климата "Биотрон"
разрабатывается эффективная система генетической трансформации
пшеницы, которая включает все этапы работ от создания векторных
конструкций и переноса генетического материала в клетки пшеницы до
полевых испытаний полученных трансгенных гомозиготных популяций.
Разработанная нами технология позволяет значительно сократить время и
затраты на создание биотехнологических форм. В настоящий момент
получено более 200 независимых трансгенных линий нескольких сортов
мягкой пшеницы с генами устойчивости к биотическим и абиотическим
стрессам. Наиболее перспективные линии успешно прошли испытания в
условиях зимних теплиц, а также в условиях поля (впервые в России). В
результате были отобраны биотех-формы пшеницы, устойчивые к гербицидам
и солевому стрессу. Большое внимание в наших исследованиях уделяется
вопросам биобезопасности возделывания генномодифицированных форм
пшеницы, в частности анализу дрейфа трансгенов. Изучение различных
факторов (сезонность, климатические характеристики, удаленность растенийреципиентов и др.) позволило проанализировать вероятность вертикального
переноса трансгенов в условиях поля и оценить перспективы внедрения
биотехнологической пшеницы в широкую практику.
47
УЧАСТИЕ ГЕНОВ, ГОМОЛОГИЧНЫХ АРETALA1, В
РЕГУЛЯЦИИ ИНИЦИАЦИИ ЦВЕТЕНИЯ У АСТРОВЫХ
Митюшкина Т.Ю.1, Шульга О.А.2, Щенникова А.В.2, Скрябин К.Г.2,
Долгов С.В.1
1
Станция искусственного климата "Биотрон" Филиала Института
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Центр "Биоинженерия" РАН, Москва
Электронный адрес: mitiouchkina@rambler.ru
Тел.: (496) 773-17-79
Исследование механизмов генетической регуляции инициации цветения
на примере модельных растений Arabidopsis thaliana выявило существование
нескольких сигнальных путей, которые передают сигналы внешней среды и
внутреннего состояния организма, запуская транскрипцию генов LEAFY,
APETALA1, FRUITFUL и CAULIFLOWER, переключающих вегетативную
стадию развития на репродуктивную. Изучение процессов онтогенеза в
других растениях показало консервативность ключевых моментов
генетической регуляции у растений разных видов с одновременным наличием
особенностей проявления действия отдельных генов. Ранее нами были
клонированы кДНК генов, гомологичных АРETALA1, из представителей
астровых, одного из крупнейших семейств цветковых растений, –
подсолнечника (Helianthus annuus) и хризантемы (Chrysanthemum morifolium).
Мы предположили, что эти гены (CDM111, HAM75, HAM92) участвуют в
дифференцировке околоцветника, плодолистиков и определяют время
цветения. Было показано, что при гетерологичной эктопической экспрессии
этих генов в A. thaliana функциональная активность кодируемых ими белков
аналогична АРETALA1. Для того чтобы определить роль факторов CDM111,
HAM75 и HAM92 непосредственно в растениях хризантемы, нами было
получено 80 трансгенных линий C. morifolium с конститутивной экспрессией
соответствующих генов астровых. Во всех растениях были подтверждены
наличие трансгена и его экспрессия. Так как хризантема является растением
короткого дня, влияние экспрессии введенных генов на развитие трансгенных
растений хризантемы изучалось как в условиях индукции цветения (короткий
день), так и без цветения (длинный день). Было показано, что в последнем
случае развитие трансгенных и контрольных линий не отличается. В условиях
же индукции трансгенные хризантемы зацветали на 2 недели раньше
контрольных, при этом быстрее формировались соцветия. В результате
полностью открытое соцветие формировалось на три недели раньше, чем в
контроле. В то же время изменений морфологии не наблюдалось, и все
сортовые характеристики сохранялись. Таким образом, мы полагаем, что гены
CDM111, HAM75, HAM92 астровых регулируют цветение, активируя (ускоряя)
процесс закладки и формирования соцветия.
48
ПРОБЛЕМЫ ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ
ПРОТЕИНАЗ ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ. ВИДОВАЯ
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ
Михайлова А.Г.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: anna.mikhailova@.ibch.ru
Высокоспецифические протеиназы, такие как энтеропептидаза и
олигопептидаза В из различных источников, представляют большой интерес
с точки зрения как фундаментальных, так и прикладных исследований. Наши
исследования продемонстрировали тонкую регуляциию их каталитической
эффективности как с помощью дистальных участков этих белковых молекул,
так и дополнительных эффекторов – ионов кальция и высоких концентраций
субстратов. Установлено, что уникальные свойства энтеропептидазы
обусловлены существованием трех субстрат-связывающих центров. Легкая
цепь энтеропептидазы содержит классический трипсиноподобный
первичный субстрат-связывающий центр (S1) и вторичный субстратсвязывающий центр (S2), придающий ферменту присущую ему высокую
специфичность. Вторичный субстрат-связывающий центр, расположенный
на удаленном от каталитического центра участке 118-465 тяжелой цепи (SII),
обеспечивает высокую эффективность энтеропептидазы по отношению к ее
природному субстрату – трипсиногену. Ион кальция при этом выступает в
роли дополнительного эффектора.
Такая тонкая дополнительная регуляция гидролиза субстратов разного
типа с помощью как ионов кальция, так и субстратного ингибирования, в
высокой степени характерна и для олигопептидаз В, в том числе для
обнаруженного нами нового представителя этих ферментов – олигопептидазы
В из Serratia proteamaculans.
Проведен сравнительный кинетический анализ эффективности четырех
вариантов энтеропептидазы: природной энтеропептидазы быка, ее
рекомбинантной легкой цепи, а также полноразмерной энтеропептидазы
человека и ее легкой цепи по отношению к модельным пептидным
субстратам, в том числе фрагментам PAR1 и PAR4, а также к природному
субстрату этого фермента – трипсиногену. Полученные нами результаты
демонстрируют ярко выраженный видовой характер специфичности
энтеропептидаз из разных источников.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 0804-00886-а и 10-04-01381-а).
49
ОСОБЕННОСТИ НОВОЙ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ
ПАРАДИГМЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
ИММУНООНКОЛОГИИ: КОНЦЕПЦИЯ "3С"
Моисеева Е.В.1, Семушина С.Г.1, Боженко В.К.2
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
2
Российский научный центр рентгенорадиологии, Москва
Электронный адрес: evmoise@gmail.com
Тел.: (905) 528-74-75
Нами были разработаны оригинальные методы тестирования
противоопухолевой активности иммуномодуляторов с использованием
своеобразного комплекса (коллекции) линий мышей с различной (от низкой
до высокой) частотой возникновения спонтанных рака молочной железы
(РМЖ), рака яичника/матки и лимфомы/лейкемии. Отличительной
особенностью нашей практики являются поэтапное тестирование препарата
(включая выявление отдаленных эффектов) и своеобразные подходы к
обработке индивидуальных экспериментальных данных (каждая мышь
прослеживается персонально в течение её жизни как пациент). Накопленный
таким образом опыт (E. Moiseeva. "Anti-breast cancer drug testing. Original
approaches. Novel set of mouse models", 2009) позволил сформулировать ряд
положений на пути к разработке новой персонализированной парадигмы
экспериментальной иммуноонкологии, особенности которой описываются
тремя "С":
1. Сет (или комплекс) взаимодополняющих мышиных моделей с
различной частотой естественно возникающих воспалительных и опухолевых
процессов, адекватный РМЖ человека.
2. Стадии проведения исследования, начиная с тестирования препарата
(подхода) на опухолевых и иммунных клетках опухоленосителя in vitro; далее
– in vivo на перевиваемых и спонтанных моделях; и наконец, – тестирование
профилактических режимов применения.
3. Стратификация, как при формировании экспериментальных групп
(подгрупп с определенными параметрами), так и при обработке полученных
данных (выделение "успешных" и "неуспешных" по сравнению с
соответствующими контрольными подгруппами).
Сформулированные методологические положения новой парадигмы в
экспериментальной науке являются необходимым инструментом для
разработки принципов тестирования препаратов в соответствии с
современной концепцией "3П" в медицине (персонализация,
прогнозирование, профилактика). Для иллюстрации: использование
описанных приемов позволило выявить среди рутинных лабораторных
показателей и параметров биоэлементного статуса ряд информативных
биомаркеров для предсказания (1) длительности субклинического периода
РМЖ мышей (времени проявления перевиваемого и спонтанного РМЖ) и
(2) как позитивного, так и негативного эффекта иммунотерапии при
локальном применении интерлейкина-2 для лечения РМЖ мышей.
50
ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ
СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ИНДОЛИЦИДИНА
Мушинская Е.В., Щепинов Ф.Б., Орлов Д.С.
НИИ Экспериментальной медицины СЗО РАМН
Электронный адрес: iem@iemrams.ru
Тел.: (812) 234-68-68
Антимикробные пептиды (АМП) системы врожденного иммунитета
обладают антибактериальной активностью в отношении широкого спектра
микроорганизмов, включая патогенные устойчивые к существующим
антибиотикам штаммы. АМП присуща противогрибковая, противовирусная
активность и способность подавлять рост опухолевых клеток. Совокупность
защитных свойств АМП позволяет рассматривать их как перспективную
основу для создания лекарственных препаратов. Однако, возможности
применения АМП в медицине ограничены их гемолитическими и
цитотоксическими свойствами. С целью получения антибиотиков с
оптимальными свойствами изучаются эффекты структурной модификации
природных соединений – замены аминокислотных остатков, расположения
дисульфидных связей в молекулах и др. Целью настоящего исследования
было оценить антибиотическую активность синтетических вариантов
природного АМП индолицидина, обладающих внутримолекулярными
дисульфидными связями. Установлено, что синтетические аналоги с
дисульфидными связями обладают, как и природный индолицидин, высокой
антимикробной активностью в отношении E.coli, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus. С помощью маркеров проницаемости мембран E.coli
показано, что и природный пептид, и его синтетические варианты повышают
проницаемость внешней мембраны, а в концентрациях, многократно
превышающих минимальные ингибирующие, вызывают разрушение
внутренней мембраны. Ранее нами было установлено, что синтетические
АМП с различным расположением дисульфидных связей могут обладать
более низкой, чем природный пептид, токсичностью в отношении клеток
человека. Поскольку изученные синтетические варианты индолицидина
сохранили высокую антимикробную активность, можно заключить, что
данная группа соединений является перспективной для дальнейшего изучения
с целью получения антибиотиков с оптимальными свойствами.
51
ПОИСК БЕЛКОВ-ПАРТНЕРОВ ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ В СИСТЕМЕ
ДВУГИБРИДНОГО СКРИНИНГА
Оккельман И.А.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: korn@mail.ibch.ru
Тел.: (495) 330-65-56
Лизилоксидазы – это семейство медь-зависимых аминооксидаз,
участвующих в формировании кросс-сшивок в белках внеклеточного
матрикса, таких как коллаген, эластин и другие. Недавние исследования
показали, что лизилоксидаза играет важную роль в метастазировании
опухолей. Поэтому поиск новых интеракторов лизилоксидазы имеет важное
биомедицинское значение. Для этого нами была проведена процедура
двугибридного скрининга в дрожжах Saccharomyces cerevisiae с
использованием универсальной нормализованной библиотеки кДНК
человека. В качестве целевого белка использовали зрелую форму
лизилоксидазы человека, кодирующую последовательность которой
клонировали в вектор GBKT7. После процедуры скрещивания библиотеки в
дрожжевом штамме Y187 со штаммом PJ69-2A, трансформированным
конструкцией, кодирующей исследуемый белок, проводили отбор гибридных
клонов на селективной среде, дефицитной по триптофану, лейцину, гистидину
и аденину. Далее выделяли плазмидные ДНК клонов, давших положительный
сигнал, и проводили идентификацию ДНК последовательности
секвенированием. Дополнительную проверку взаимодействий проводили в
штамме AH109, проверяя котрансформанты на способность расти в виде
голубых колоний на селективных средах, содержащих хромогенный субстрат
-галактозидазы. После исключения ложноположительных клонов было
выбрано 12 белков-интеракторов с высокой степенью конфидентности в
соответствии с выработанными критериями. Среди них наибольший интерес
представляет SOS2 (son of sevenless 2) – белок, который способствует
диссоциации ГДФ от ГТФазы ras, что стимулирует сигнальную трансдукцию
при действии ряда ростовых факторов. Известно, что лизилоксидаза влияет
на активность этого проонкогена in vitro, поэтому взаимодействие
лизилоксидаза-SOS2 может играть большую роль в механизме этого
малоизученного явления.
52
ЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО
ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БТШ70 ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
СЕПСИСЕ У КРЫС
Остров В.Ф.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: ostrov@fibkh.serpukhov.su
Тел./факс: (4967) 73-37-53
Изучение защитных свойств рекомбинантного человеческого белка
теплового шока 70 кДа (БТШ70) представляет интерес не только для
фундаментальной науки, но и для клинической медицины. В данном
эксперименте исследовали эффекты БТШ70 при однократном внутривенном
введении крысам с моделируемым грамположительным и
грамотрицательным сепсисом.
Использовали бодрствующих самцов крыс Sprague-Dawley массой
300-350 г. Грамотрицательный сепсис моделировали с помощью
липополисахарида (ЛПС) из E.coli (i.v., 2 мг/кг), а грамположительный – с
помощью липотейхоевой кислоты ЛТК из S. aureus (i.v., 3 мг/кг).
Лабораторный препарат БТШ70 был получен генно-инженернми методами
из культуры эукариотических клеток. Животным вводили БТШ70 однократно
внутривенно за 10 минут до ЛПС или ЛТК в дозах 266 и 133 мкг/кг. В течение
3 суток регистрировали параметры гемодинамики, показатели гемостаза,
показатели биохимии крови, а также выживаемость животных.
При предварительном внутривенном введении БТШ70 проявляет
протекторные свойства и предотвращает проявление токсических эффектов
ЛПС или ЛТК. Не наблюдается резкого падения артериального давления,
характерного для септического шока, стабилизируются параметры систем
свертывания и фибринолиза крови. Не отмечено значительных отклонений
в значениях биохимических параметров. Выживаемость животных
увеличивается с 17% в группе ЛПС до 70% в группах с БТШ70 и с 50% в
группе с ЛТК до 90% в группе с БТШ70. При этом сам БТШ70 при введении
здоровым крысам не оказывает заметного влияния на изучаемые
физиологические параметры.
Полученные нами результаты являются очередным шагом к
исследованию нового подхода в борьбе с сепсисом. По результатам
исследования экспериментальный лабораторный препарат БТШ70 может
быть рекомендован для проведения дальнейших доклинических испытаний
как эффективное средство профилактики септических процессов, вызванных
как грамположительной, так и грамотрицательной микрофлорой.
53
ЛИЗИЛОКСИДАЗА – ПЕРСПЕКТИВНАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ
РАЗРАБОТКИ АНТИМЕТАСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Пестов Н.Б.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: korn@mail.ibch.ru
Тел.: (495) 330-65-56
Лизилоксидаза (LOX) катализирует окисление -аминогрупп остатков
лизина во многих белках до соответствующего альдегида, что, в свою очередь,
приводит к образованию ковалентных кросс-сшивок и стабилизации
внеклеточного матрикса. LOX представляет собой белок, который прекрасно
иллюстрирует теорию антагонистической плейотропии: в молодом возрасте
этот фермент абсолютно необходим для нормальной жизнедеятельности, а
по мере старения ее активность становится избыточной и сопутствует
патологическим состояниям: метастазированию опухолей и эксфолиативному
синдрому при глаукоме. Метастазирование - основная причина смерти среди
онкобольных – многоступенчатый процесс, на который оказывают влияние
межклеточные взаимодействия и взаимодействия клетка-матрикс; важная
роль LOX в нем убедительно показана группой Гиаччия.
В этом свете перспективным является поиск новых специфических
ингибиторов и регуляторов активности LOX. Для этого мы создали несколько
ингибиторов LOX различной молекулярной природы: низкомолекулярные
вещества, аптамеры и пептиды, а также получили специфические антитела,
при помощи которых удалось показать неизвестное ранее наличие LOX в
тромбоцитах человека.
Помимо разработки ингибиторов LOX для фармакологических
приложений важно исследовать и нормальные физиологические функции
LOX, выявлять все более тонкие аспекты патологических механизмов, в
которые вовлечен исследуемый белок-мишень. Проведенные нашей группой
эксперименты привели к идентификации ряда неизвестных ранее белковинтеракторов. Некоторые из установленных фактов представляются довольно
неожиданными, например, взаимодействие гликолитического фермента
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и каталитического домена LOX.
Важно, что эта информация может быть полезна как для наилучшего
понимания молекулярных путей, которые влияют на скорость
метастазирования опухолей, так и для выяснения перспектив создания новых
препаратов на основе естественных интеракторов LOX.
54
ФОТОТОКСИЧНЫЙ КРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК
KillerRed. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА НА АТОМНОМ
УРОВНЕ
Плетнев В.З., Гурская Н.Г., Плетнева Н.В., Горячева Е.А.,
Мартынов В.И., Чудаков Д.М., Лукьянов К.А.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: pletnev@ibch.ru
Тел.: (495) 330-75-10
Красный флуоресцентный белок KillerRed (эм = 610нм) при облучении
светом демонстрирует исключительно высокую фототоксичность, более чем
в 1000 раз превышающую токсичность других известных флуоресцентных
белков. Данный генетически кодируемый биомаркер представляет интерес
в качестве инструмента для инактивации интересующих белков или
направленного уничтожения клеточных популяций (в частности раковых
опухолей) при фотодинамической терапии. Природа токсичности KillerRed
в значительной степени оставалась неясной. Методом рентгеноструктурного
исследования высокого разрешения установлена пространственная структура
KillerRed в активном флуоресцентном и фото-инактивированном
нефлуоресцентном состояниях. Уникальной особенностью структуры
KillerRed является наличие заполненного водой канала, идущего от торца
-цилиндрической архитектуры белка к центральной области хромофора.
Эта особенность, по-видимому, является ключевым структурным фактором,
отвечающим за наблюдаемые свойства белка. Изучение структурнофункциональной взаимосвязи KillerRed, поддержанное рациональным сайтнаправленным мутагенезом, позволило выявить наиболее вероятные
аминокислотные остатки, ответственные за фототоксический эффект. В
частности, установлено, что расположенные вблизи хромофора остатки Glu68
и Ser119 являются инициаторами соответствующей цепи реакций при
генерации реакционно-активных форм кислорода.
55
ВЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ФЕНОЛЬНОЙ
ПРИРОДЫ НА СИНТЕЗ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ QUORUM
SENSING СИСТЕМ И ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНОК У
БАКТЕРИЙ
Плюта В.А., Зайцева Ю.В., Кузнецов А.Е., Хмель И.А.
Институт молекулярной генетики РАН, Москва
Электронный адрес: plyutaba@gmail.com
Тел.: (499) 196-00-16, факс: (499) 196-02-21
Бактерии способны "чувствовать" повышение плотности популяции и
отвечать на него быстро и скоординированно индукцией определенных
наборов генов. Этот тип регуляции получил название Quorum Sensing (QS);
он основан на действии низкомолекулярных сигнальных молекул различной
природы, которые накапливаются в культуре при высоких плотностях
популяции бактерий и взаимодействуют с рецепторными регуляторными
белками.
Более 90% бактерий существуют в природных экосистемах в виде
специфически организованных, прикрепленных к твердым поверхностям
биопленок; биопленки имеют характерную архитектуру и заключены в
экзополимерный матрикс. Известно, что у ряда бактерий процесс
формирования биопленок зависит от QS.
В настоящей работе мы исследовали действие фенольных соединений
растительного происхождения на способность бактерий Pseudomonas
aeruginosa (условный патоген человека, который может проявлять себя и
как фитопатоген) и Agrobacterium tumefaciens (фитопатоген, вызывающий
образование опухолей у двудольных растений) синтезировать сигнальные
молекулы QS систем (N-ацил-гомосерин-лактоны, АГЛ) и формировать
биопленки.
Фенолы широко распространены в растительном царстве. Обнаружено
их регулирующее действие на ряд физиологических и биохимических
процессов в растениях; кроме того, они важны для защиты растений от
патогенных бактерий. Мы показали, что большинство исследованных нами
производных фенола растительного происхождения в концентрациях, не
подавляющих рост бактерий, оказывают стимулирующее действие на
способность бактерий P. aeruginosa PAO1 и A. tumefaciens С58 формировать
биопленки; с использованием различных биосенсоров для P. aeruginosa PAO1
было показано также увеличение синтеза сигнальных молекул QS систем
АГЛ. Стимуляция образования биопленок, возможно, была связана с
увеличением функционирования QS систем P. aeruginosa.
Было проверено также действие фенольных соединений на способность
бактерий к миграции (swarming, swimming и twitching motility), которая в
ряде случаев связана с QS-регуляцией. Изученные вещества в концентрациях,
не подавляющих рост бактерий, не оказывали стимулирующего действия на
их миграцию.
56
ИОН-ТРАНСПОРТИРУЮЩАЯ СИСТЕМА МЕМБРАН
МИТОХОНДРИЙ ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ
Позилов М.К., Эргашев Н.А., Асраров М.И.
Институт физиологии и биофизики АН РУз, Ташкент, Узбекистан
Электронный адрес: mamurjon.8122@mail.ru
Сахарный диабет занимает третье место в мире по распространенности
после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Он
характеризуется абсолютной или относительной недостаточностью инсулина,
постоянной повышенной концентрацией глюкозы в крови и нарушением всех
видов обмена веществ (Хавинсон, Малинин, 2010). Нарушение обмена
веществ в организме при сахарном диабете приводит к развитию негативных
изменений в структуре и функции различных органов и систем, в том числе
печени. Повышается гликолиз, что приводит к дефициту макроэргических
фосфатов, а это, в свою очередь, способствует развитию митохондриальной
дисфункции (Жилюк и др., 2010).
Цель данной работы – изучение пассивной проницаемости мембран
митохондрий печени крыс при аллоксановом диабете.
В экспериментах использовали белых крыс линии Вистар весом 180220 г. В опытных группах экспериментальный диабет вызывали введением
внутрибрюшинно аллоксана моногидрата в дозе 15 мг/100 г веса, а в
контрольных группах вводили такое же количество физиологического
раствора. Через 11-12 суток после развития стойкого диабета забивали крыс,
у которых показания глюкозы в крови составляли больше 11 ммоль/л.
Митохондрии печени крыс выделяли методом дифференциального
центрифугирования по Шнайдеру (1948). Пассивную проницаемость
внутренней мембраны митохондрий для различных ионов исследовали
методом Брайерли (1974) на фотометре ЛМФ-69 путем регистрации
изменения оптической плотности суспензии митохондрий при 540 нм. Также
мы изучали Са 2+ -проницаемость мембран митохондрий на фоне
изотонического раствора KSCN (150 мМ) по Халестрапу (1990).
Было обнаружено, что при аллоксановом диабете пассивная
проницаемость мембран митохондрий для одновалентных катионов Н+ и Na+
не изменялась, а ионов К + по сравнению с контрольными группами
уменьшалась. При определении пассивной проницаемости митохондрий
мембран для двухвалентных катионов Ba2+, Mg2+ и Ca2+ было выявлено
уменьшение только Ca2+-проницаемости. В изотоническом растворе KSCN
пассивная проницаемость митохондрий мембран для ионов К+ по сравнению
с контрольными группами снижалась. На фоне изотонического раствора
KSCN ионы Са2+ (250 мкМ) вызывали сильное набухание митохондрий
печени у подопытных животных.
В заключение можно сказать, что при аллоксановом диабете
повреждается пассивная ионная проницаемость мембран митохондрий.
Механизмы этих процессов еще обсуждаются.
57
РЕКОМБИНАНТНАЯ L-АСПАРАГИНАЗА RHODOSPIRILLUM
RUBRUM
Покровский В.С., Покровская М.В., Омельянюк Н.М.,
Александрова С.С., Соколов Н.Н.
Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва
Электронный адрес: vadimpokrovsky@yandex.ru
Тел.: (499) 246-33-80
ЛЕТУЧИЕ ВЕЩЕСТВА ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ
ДЕЙСТВИЕ НА РАЗЛИЧНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
Попова А.А., Липасова В.А., Кокшарова О.А., Хмель И.А.
Институт молекулярной генетики РАН, Москва
Электронный адрес: khmel@img.ras.ru
Тел.: (499) 196-00-16
Ген RrA из штамма Rhodospirillum rubrum (коллекция кафедры
микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова) клонирован в векторе pET23a
("Novagen") и экспрессирован в штамме E. coli BL21 (DE3) ("Stratagene",
США). Стабильность полученной конструкции подтверждена
рестрикционным анализом и секвенированием. Уровень L-аспарагиназной
активности сохранялся высоким в течение 20 пересевов. Подобраны
оптимальные условия культивирования штамма-продуцента.
Аспарагиназную активность определяли методом прямой несслеризации и
выражали в МЕ, продуктивность – в МЕ/ОП600 нм. Максимальная
активность продуцента составляет 27,3 МЕ/мл, продуктивность – 5,4 МЕ/ОЕ,
доля RrA от общего клеточного белка в полученном продуценте составляет
15-25%. Показано, что в продуценте фермент локализуется внутриклеточно.
Разработан быстрый и эффективный способ выделения фермента.
Молекулярная масса рекомбинантнoго белка, определенная
электрофоретически в 12% ПААГ и масс-спектрометрически,
соответствовала теоретически рассчитанной 19,1 кДа.
Km RrA для L-аспарагина составляет 0,22 мM, температурный оптимум
действия RrA 54-55°C, при 36-37°С активность составляет не менее 72% от
максимальной. Оптимум pH – 9,2, при рН7,4 активность – 20-30% от
максимальной. L-Аспарагиназная активность сохраняется на уровне >95%
от начальной в течение 3 сут при инкубации в диапазоне температур от 4 до
37°С. При -70…-20°С в буфере (10 мМ К2HPO4, 10 мМ KH2PO4, 1 M глицин,
1 мМ ЭДТА, 0,28 M КСl и 0,5% глюкоза) активность RrA не снижается в
течение 4 мес. L-Глутаминазная активность составляет не более 0,1% от
L-аспарагиназной. Цитотоксичность RrA показана на культурах клеток
хронического миелолейкоза К562, рака предстательной железы DU145, рака
молочной железы MDA-MB231 и MCF7. На модели лимфаденоза Фишера
L5178 у мышей по критериям излечения и торможения роста опухоли
подтверждено наличие достоверного противоопухолевого эффекта.
Бактерии-антагонисты играют важную роль в подавлении заболеваний
растений, вызванных фитопатогенными микроорганизмами. Было
обнаружено, что на рост фитопатогенов могут оказывать влияние летучие
органические соединения почвенных бактерий. Кроме того, известно, что
летучие вещества, образуемые бактериями, могут стимулировать рост
растений. Большой интерес вызывает никогда ранее не исследовавшаяся
генетическая регуляция синтеза летучих соединений бактерий, играющих
важную роль в механизме антагонизма.
Изучение способности бактерий синтезировать летучие вещества
активно развивается, получены данные о природе некоторых летучих веществ
бактериального происхождения. Нами было проведено исследование
действия летучих веществ бактерий Pseudomonas и Serratia и их мутантов
на фитопатогенные бактерии Agrobacterium tumefaciens и Erwinia carotovora,
фитопатогеннные грибы Fusarium solani, Fusarium moniliforme, Pericularia
oryzae, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae, Helminthоsporium sativum,
Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia rolfsii, Colletotrichum sp., цианобактерии
Synechococcus sp. и Anabaena, а также на дрозофил. Было показано, что
летучие вещества бактерий Pseudomonas и Serratia подавляют рост
фитопатогенных бактерий и грибов, высоко чувствительны к ним были
цианобактерии и дрозофилы. Изучено влияние мутаций в генах ряда
глобальных регуляторов экспрессии генов бактерий на синтез летучих
органических соединений.
Для штамма P. chlororaphis 449 и ряда штаммов бактерий рода Serratia
в совместной работе с сотрудниками Иерусалимского университета (Израиль)
с помощью масс-спектраметрического анализа были определены компоненты
смеси летучих веществ. Показано, что летучие соединения имеют
органическую природу, в наибольшем количестве синтезируется
диметилдисульфид (ДМДС), а также ряд кетонов и алкенов. В настоящее
время анализируется действие отдельных летучих соединений на различные
микроорганизмы. Показано, что ДМДС подавляет рост всех изучаемых нами
объектов.
58
59
КОРРЕКЦИЯ СОСТОЯНИЯ ТИМУСА
КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫМИ ФЕТАЛЬНЫМИ НЕРВНЫМИ
КЛЕТКАМИ ПРИ РАЗВИТИИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ АУТОИММУННОЙ ПРИРОДЫ
Порожан Е.А., Гольцев А.Н.
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины,
Харьков, Украина
Электронный адрес: janepor@yandex.ru
Тел. (+38) 068 617-01-57
Физиологическое состояние центрального органа иммунной системы
тимуса является залогом стабильного функционирования "золотого
треугольника" гомеостаза – нейроиммунноэндокринного блока. Нарушения
в тонких взаимосвязях этого блока приводят к развитию нейродегенеративных
патологий аутоиммунной природы, например, рассеянного склероза (РС).
Поэтому для лечения необходимо использовать модуляторы надсистемного
воздействия, комплексно влияющие на механизмы иммунного ответа,
например, фетальные нервные клетки (ФНК). Биотехнологическим
компонентом их клинического применения является процесс
криоконсервирования, который также рассматривается как фактор
управления intrinsic state биообъекта.
Исходя из сказанного, целью данного исследования было изучение
популяционного состава клеток тимуса в динамике развития
экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ), аналога РС,
до и после применения криоконсервированных ФНК.
Исследования проводили в соответствии с "Общими принципами
экспериментов на животных", одобренными III Национальным конгрессом
по биоэтике (Киев, 2007) и согласованными с положениями "Европейской
конвенции о защите позвоночных животных, используемых для
экспериментов или других научных целей" (Страсбург, 1985 г.). ЭАЭ
индуцировали у крыс по методу Давыдовой. Суспензию ФНК из мозга
эмбрионов крыс 11 суток гестации криоконсервировали по двум режимам и
вводили животным внутрибрюшинно на 14-е сутки развития ЭАЭ. Методом
проточной цитофлюориметрии (FACS Calibur, BD, США) на 7-35-е сутки
развития патологии в тимусе определяли CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD25+, DC+,
Ia+, IFN-+, IL-10+, p53+, AnPI+ клетки.
Полученные данные продемонстрировали непосредственное участие
тимуса при развитии ЭАЭ. Степень экспрессии CD3+, CD4+, CD4+CD25+, Ia+,
DC+, IFN-+ повышалась на пике патологии. Но при этом количество CD8+,
IL-10+ клеток, а также апоптотические процессы были снижены. Введенные
криоконсервированые ФНК обеспечивали нормализацию исследуемых
клеточных показателей как соединительнотканной стромы тимуса, так и его
лимфоидных компонентов, тем самым проявляя иммунокоригирующий
эффект.
60
МНОГОЦЕНТРОВАЯ ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ КВАНТОВЫХ
ТОЧЕК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ КОНЪЮГАТОВ С ДНК
Прохоренко И.А.1, Кочергинская П.Б.1,2, Романова А.В.1,3,
Образцова Е.А.1, Клинов Д.В.1, Устинов А.В.1, Зацепин Т.С.3,
Рязанцев Д.Ю.1, Гудилин Е.А.2, Формановский А.А.1
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: synorg@mx.ibch.ru
2
Факультет наук о материалах МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
3
Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Тел.: (495) 335-39-30
Квантовые точки, являющиеся люминофорами из полупроводниковых
нанокристаллов, обладают потенциально новыми свойствами по сравнению
с традиционными флуоресцентными органическими красителями и
открывают новые возможности для биологических исследований. Однако
их функционализация осложняется невысокой прочностью связывания
поверхностных молекул стабилизатора и не позволяет получать достаточно
стабильные конъюгаты с белками и нуклеиновыми кислотами из-за
равновесия обмена лигандов на поверхности кристалла.
Метод синтеза квантовых нанокристаллов CdTe в водной среде при
повышенной температуре позволил нам получить частицы заданного размера
с небольшим гидрофильным поверхностным слоем стабилизирующего
лиганда, который затем был заменен на липоевую кислоту. С целью
увеличения стабильности конъюгатов был разработан метод многоцентрового
связывания линкера для дальнейшего присоединения олигомеров ДНК. В
присутствии конденсирующих реагентов модифицировали карбоксильные
группы на поверхности нанокристалла триамином, содержащим
алифатическую азидогруппу. Остаток терминального алкина вводили в
синтетические ДНК-олигомеры; с помощью ПЦР получен (около 300 п.н.)
протяженный ацетиленсодержащий фрагмент двуцепочечной ДНК.
Алкинсодержащие фрагменты ДНК вводили в реакцию с
азидомодифицированными CdTe-нанокристаллами в присутствии комплекса
Cu(I) в качестве катализатора. Полученные конъюгаты очищены гельхроматографией и охарактеризованы физико-химическими методами, в том
числе с помощью атомно-силовой микроскопии.
Работа выполнена при поддержке фонда "Династия" и гранта
Президента РФ для молодых ученых.
61
ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ –
ПРОДУЦЕНТОВ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В
Рукавцова Е.Б., Пучко Е.Н., Руденко Н.В., Бурьянов Я.И.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: ruk@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 33-09-70
Целью данной работы явилось получение биобезопасных трансгенных
растений нового поколения без селективных генов устойчивости к
антибиотикам и гербицидам. Настоящее поколение трансгенных растений
содержит в своем геноме данные гены, что представляет потенциальную
опасность из-за возможности их неконтролируемого переноса другим
растениям или микроорганизмам. Разработаны различные подходы
получения трансгенных растений без селективных маркеров. Однако в
большинстве случаев эти методы являются достаточно трудоемкими и
длительными.
Нами создана плазмида для трансформации растений pBM-Ag,
содержащая ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под
контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты
CaMV 35SS без селективного гена устойчивости к канамицину nptII. С
помощью разработанных методов агробактериальной инфильтрации
различных эксплантов растений картофеля, томата и табака достигнуто
повышение эффективности трансформации растений до 10-20%. Для отбора
безмаркерных растений проведен скрининг трансформантов с помощью
прямой количественной оценки синтеза продуктов целевых генов с
использованием иммуноферментного анализа. При этом сокращается время
отбора трансгенных растений и одновременно появляется возможность
прямой детекции синтеза продукта целевого гена.
На лабораторных мышах проведены испытания иммуногенности
клубней картофеля, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита
В. Показано значительное повышение уровня антител к HBsAg в сыворотке
крови иммунизированных животных, сохраняющееся в течение более года
после начала иммунизации. До настоящего времени не существовало данных
о мониторинге иммунитета к вирусу гепатита В такой продолжительности
при использовании трансгенных растений в качестве съедобной вакцины.
Полученные данные подтверждают перспективность использования
безмаркерных растений в качестве безопасной субстанции для производства
съедобной вакцины против гепатита В.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РФФИ
№ 11-08-00413.
62
ДЕТЕКЦИЯ ТОКСИНА VIBRIO CHOLERAE МЕТОДОМ
ИММУНО-ПЦР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСФЕР
Рязанцев Д.Ю., Петрова Е.Э., Валякина Т.И., Гришин Е.В., Завриев С.К.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: d.yu.ryazantsev@gmail.com
Метод иммуно-ПЦР (иПЦР) (Sano et al., 1992) является комплексным
подходом, объединяющим в себе технологии полимеразной цепной реакции
(ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА). Проведение ПЦР в формате
"реального времени" позволяет многократно увеличить чувствительность
определения антигенов по сравнению с ИФА (до 103-105 раз). Было показано,
что минимальный уровень чувствительности иПЦР соответствует
10-50 аттомоль антигена (на примере нейротоксина А Clostridium butulinum,
Wu et al., 2001).
Ранее нами была разработана тест-система для детекции токсина Vibrio
cholerae с использованием надмолекулярного комплекса биотинилированного
с двух концов одноцепочечного ДНК-маркера размером 60 н. и стрептавидина
в молярном соотношении 1/1. Несмотря на то, что чувствительность метода
достигла 1 пг/мл, он не лишен недостатков. Самый существенный из них –
это небольшая разница между пороговым циклом (Ct) в отрицательных
контрольных образцах (OK) с концентрацией антигена ниже 50 пг/мл
(порядка 0,2-0,5 цикла). Такое незначительное превышение можно надежно
выявить только при низком разбросе значений Ct.
Для решения этой проблемы нам удалось модифицировать методику
следующим образом. Для проведения реакции использовали покрытые
связывающими антителами полистирольные микросферы. При этом удалось
на порядок повысить чувствительность (до 100 фг/мл), а разница в значениях
Ct в OK и образцах с концентрацией антигена ниже 50 пг/мл составила 1,5-3
цикла. Во время анализа инкубацию с микросферами, раствором антигена и
детектирующими биотинилированными антителами проводили
одновременно, что позволило сократить время анализа. Также в этой методике
нет необходимости использовать ПЦР-планшеты с повышенной сорбционной
способностью (поликарбонатные), которые не всегда хорошо подходят для
проведения ПЦР в "реальном времени", так как связывание антигена
происходит не на поверхности планшета, а на микросферах.
63
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА БАКТЕРИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ
ЛАТАРЦИНА LTC5
Самсонова О.В., Феофанов А.В., Кирпичников М.П.
МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: olgsamsonova@yandex.ru
Тел.: (495) 336-64-55
ПОДХОДЫ К ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ХИРУРГИИ РАКА
Свердлов Е.Д.
Институт молекулярной генетики РАН, Институт биоорганической химии
им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Повсеместное распространение бактериальных штаммов, резистентных
к действию химиопрепаратов, представляет серьезную проблему
современной медицины. Эндогенные антимикробные пептиды с
бактерицидным эффектом, не допускающим развития устойчивости, - весьма
многообещающее направление поиска прототипов антибиотиков нового
поколения. Учитывая перспективу широкомасштабного производства,
целесообразно ограничить сферу разработки короткими линейными
пептидами без сложных посттрансляционных модификаций. Ltc5 является
одним из представителей подобной группы соединений, сравнительно
недавно обнаруженной в яде паука Lachesana tarabaevi, и обладает широким
спектром антибактериального действия в микромолярных концентрациях.
В целях углубления понимания механизмов этого действия мы
исследовали эффекты, которые оказывает Ltc5 на клетки грамотрицательных
(Escherichia coli) и грамположительных (Rhodococcus equi, Staphylococcus
aureus) штаммов. Методами лазерной сканирующей конфокальной
микроскопии установлено, что в условиях, приводящих к тотальной гибели
бактериальной популяции, пептид концентрируется в области клеточной
оболочки. На этой стадии плазматическая мембрана непроницаема для
небольших (около 1 нм) гидрофильных молекул, однако мембранный
потенциал, оцененный с применением специфичного флуоресцентного зонда,
снижен, что позволяет прийти к заключению о формировании
субнаноразмерных дефектов в мембране бактерии. В дальнейшем нарушение
целостности мембраны прогрессирует и ведет к необратимому повреждению
клетки. Обнаружено также, что начальное накопление пептида сенситизирует
грамотрицательные бактерии для гидрофобных соединений, усиливая их
способность преодолевать липополисахаридный барьер. Методами
флуориметрии и спектроскопии кругового дихроизма показано, что Ltc5
эффективно взаимодействует с липидными и липополисахаридными
компонентами бактериальной мембраны. Методами, основанными на
индуктивно-резонансном переносе энергии, получены доказательства
образования межмолекулярных комплексов Ltc5 в оболочке бактериальной
клетки и в липидных системах, моделирующих мембрану бактерии.
Результаты нашего исследования подтверждают гипотезу о том, что
основой бактерицидного действия Ltc5 является необратимая деструкция
плазматической мембраны вследствие формирования в ней стабильных
пептидно-липидых комплексов.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Carl Zeiss.
У генетиков нет ни малейшего намерения или надежды заменить
хирургов за операционным столом. Речь пойдет об одном из подходов генной
терапии, который уничтожает опухоль, отвлекаясь от ее детальных
механизмов, так же как хирург вырезает опухоль, не вдаваясь в интимные
механизмы ее возникновения. Противоопухолевый удар направляется на
самое фундаментальное и самое общее свойство любых опухолей способность к неограниченной быстрой пролиферации. Поэтому подход
обещает дать метод, который, так же как хирургия, универсален и применим
к любому виду рака.
Рак – широко распространенная болезнь. Он занимает второе место по
смертности в США и, вероятно, перейдет на первое место в ближайшем
будущем. Несмотря на громадные федеральные и индустриальные вложения
и громадное число фундаментальных открытий, рак обычно рассматривается,
в лучшем случае, как только минимально поддающийся контролю средствами
современной медицины, особенно когда его сравнивают с другими
распространенными болезнями. Действительно, смертность от рака в 21 веке
такая же, как и 50 лет назад, тогда как смертность от сердечных,
церебрососудистых и инфекционных болезней уменьшилась за это время на
2/3.
Открытия различных генетических детерминант рака, происходившие
на протяжении многих лет, оказали только НЕЗНАЧИТЕЛЬНОЕ ВЛИЯНИЕ
на клиническую эффективность лечения (Varmus H. (2006). The new era in
cancer research. Science 312: 1162-5).
Проблема в том, что рак не просто сложная болезнь – это болезнь
суперсложная, которая сочетает в себе сложность клеточной организации,
присущую и другим болезням, о которых говорил Varmus, со сложностью
растущей эвольвирующей системы, способной адаптироваться к
воздействиям лекарств путем существования микрогетерогенности внутри
опухоли. Среди множества клеток в этой микрогетерогенной популяции
всегда находятся такие, которые устойчивы к воздействиям, не погибают в
результате них, и дают рост нового, устойчивого к данному воздействию
клона опухоли [1]. В довершение ко всему, опухоль активно взаимодействует
с окружением, модифицирует его и метастазирует в другие органы организма.
В настоящее время терапия рака вошла в новую эру, характеризующуюся
развитием таргетной терапии. Идея заключается в том, что направленное
воздействие на ключевые молекулярные узлы, вовлеченные в развитие
опухоли, будет приводить к тому, что опухоль будет лучше поддаваться
лечению.
Однако, как бы изощренны и изящны ни были терапевтические методы,
направленные на конкретные звенья сигнальных систем, измененных в
данном виде опухоли, они вряд ли приведут к радикальному и
универсальному методу лечения именно в силу ее гетерогенности и
64
65
изменчивости. Кроме того, опухоли одного и того же типа отличаются
генетически у разных пациентов [2]. Безусловно, при этом таргетные подходы
могут приводить и приводят к успехам в частных случаях.
Таргетная терапия и варианты генной терапии, основанные на таргетном
принципе, неадекватны многослойной сложности рака. Впечатление такое,
что чем глубже мы проникаем в интимные молекулярные детали и чем более
фокусируемся на конкретных мишенях, тем более методы лечения становятся
неадекватными комплексности проблемы. Однако, все клетки данной
опухоли, как бы гетерогенны они ни были, имеют одно общее
фундаментальное свойство – они все непрерывно пролиферируют,
реплицируя ДНК. Это же общее свойство клеток разных опухолей. Это то
общее, что может быть универсальной мишенью в любой опухоли и в ее
метастазах.
Основные положения концепции генетической хирургии:
1. Удар должен наноситься непосредственно по реплицирующейся ДНК.
2. Клетка, где осуществляется удар, должна распространять его на
окружающие клетки.
Данный подход является не редукционистским, а целостным, он
направлен на убийство любой быстро реплицирующейся клетки.
В докладе будут показаны способы экспериментального осуществления
этих принципов с использованием генов-убийц (suicide gene therapy, Genetic
prodrug activation therapy; Gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT)).
Ссылки на обзоры автора
1. E.D. Sverdlov. Not gene therapy, but genetic surgery – the right strategy to
attack cancer. Molecular Genetic, Microbiology and Virology. (2009). 24. 93-113
(English version).
2. Свердлов Е.Д. Биологический редукционизм и "медицина XXI века".
Патологическая физиология и экспериментальная медицина. (2010). 3.
3-23.
Цитированная литература (сверх прямых цитат в тексте):
1. Merlo L.M., Pepper J.W., Reid B.J., Maley C.C. Cancer as an evolutionary and
ecological process. Nat. Rev. Cancer. (2006). 6(12). 924-935.
2. Wood L.D., Parsons D.W., Jones S., Lin J., Sjoblom T., Leary R.J., Shen D.,
Boca S.M., Barber T., Ptak J. et al. The genomic landscapes of human breast
and colorectal cancers. Science. (2007). 318(5853). 1108-1113.
66
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ MADS-БОКС ГЕНА НАМ59
ПОДСОЛНЕЧНИКА В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА
Сизенёва Е.С., Щенникова А.В., Шульга О.А.
Центр "Биоинженерия" РАН, Москва
Электронный адрес: sizeneva@yandex.ru
Тел.: (499) 135-62-19
Факторы транскрипции MADS-семейства играют ключевую роль в
онтогенезе растений. Наиболее изучена модель их работы у Arabidopsis
thaliana. Известно, что белки группы AGAMOUS (AG) регулируют не только
закладку тычинок, плодолистиков и семязачатков, но и определяют
завершение развития цветковой меристемы (ЦМ) на стадии образования
гинецея, угнетая активность стволовых клеток в ЦМ.
Структурный анализ полноразмерной кДНК MADS-гена HAM59
подсолнечника Helianthus annuus показал, что HAM59 является гомологом
AG. Поскольку структурная гомология белков сопровождается
функциональным сходством, мы предположили, что HAM59 играет в
развитии растения подсолнечника роль, подобную роли AG в Arabidopsis
thaliana. Для подтверждения этой гипотезы мы получили модельные
трансгенные растения табака Nicotiana tabacum с эктопической экспрессией
кДНК HAM59 под контролем промотора гена петунии FBP1 и терминатора
NOS. Согласно литературным данным, использованный промотор должен
обеспечивать транскрипцию гена в лепестках и тычинках.
Несколько поколений трансгенных растений прошли отбор на
селективной среде, ПЦР анализ, а также фенотипическое исследование. В
этих растениях отмечены изменения места закладки лепестков, их
количества, размеров и цвета. Наблюдалось формирование дополнительных
отдельно стоящих лепестков в местах закладки тычинок. Пыльцы
образовывалось мало, в результате чего цветки не могли самостоятельно
опыляться. Иногда менялось количество плодолистиков (вместо двух
формировалось от трех до шести), а в завязи наблюдалось полное или
частичное перерождение семяпочек в структуры, подобные плодолистикам,
что свидетельствует о нарушении D-функции.
Полученные данные подтверждают принадлежность HAM59 к группе
AG и свидетельствуют о том, что HAM59 запускает гены, отвечающие за
формирование и развитии лепестков, тычинок, плодолистиков и семязачатков.
67
РОЛЬ ГОМЕОЗИСНОГО MADS-ГЕНА CDM37 ХРИЗАНТЕМЫ В
МОРФОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ
Сизенёва Е.С., Щенникова А.В., Шульга О.А.
Центр "Биоинженерия" РАН, Москва
Электронный адрес: shulga@biengi.ac.ru
Тел.: (499) 135-62-19
Считается, что эволюция предшественников MADS-генов и механизмов
контроля их экспрессии может быть причиной эволюционных
морфологических перестроек, повлекших за собой возникновение цветка.
Настоящая работа посвящена функциональному исследованию белка CDM37
из Chrysanthemum morifolium, который является гомологом MADS-фактора
AGAMOUS (AG), определяющего идентичность репродуктивных органов у
Arabidopsis thaliana.
С помощью агробактериальной трансформации листовых дисков нами
были получены трансгенные растения табака Nicotiana tabacum с
конститутивной экспрессией гена CDM37 под контролем двойного промотора
35S CaMV и терминатора NOS. Посредством ПЦР было отобрано двадцать
девять трансгенных линий, пятнадцать из которых демонстрировали
характерный фенотип. В сравнении с контролем цветков было в 1,2-1,4 раза
больше, стеблевых листьев – на 4-5 меньше, высота – в среднем на 25 см
ниже, цветение – в среднем на неделю раньше, стеблевые листья –
асимметричны и слегка скручены. Органы околоцветника приобретали
признаки репродуктивных. На верхних долях лепестков возникали структуры,
подобные пыльникам. Основание каждого чашелистика превратилось в
функционирующий нектарник, а верхнюю часть местами заменили ткани,
подобные столбику и рыльцу. В поздних цветках линии 37-21 венчики
преобразовались в пять тычинко-лепестков. ОТ-ПЦР подтвердила наличие
мРНК гена CDM37 во всех тканях первичных трансформантов. Поколение
Т1 имело тот же фенотип. Одно из десяти трансгенных растений Т2 выглядело
нетрансгенным. ОТ-ПЦР выявила отсутствие мРНК гена CDM37 в данном
растении, хотя наличие кассеты экспрессии этого гена было подтверждено с
помощью ПЦР анализа. Следовательно, трансгенный фенотип является
результатом именно эктопической экспрессии CDM37.
Экспериментальные данные подтвердили принадлежность гена CDM37
к группе AG. Нами обнаружено, что эктопической активности белка CDM37
достаточно для инициации программы развития функциональных
нектарников в области закладки чашелистиков табака.
68
ПРИМЕНЕНИЕ ТЕХНОЛОГИИ xMAP В РАЗРАБОТКЕ
ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИММУНО-ХИМИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ
БЕЛКОВЫХ ТОКСИНОВ
Симонова М.А., Валякина Т.И., Петрова Е.Э., Комалева Р.Л.,
Шошина Н.С., Гришин Е.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: valyakina@ibch.ru
Тел.: (495) 335-35-33
В последнее время развитие тест-систем детекции различных
биомолекул происходит в направлении одновременного определения ряда
аналитов в одной пробе (так называемый мультиплексный анализ). К числу
таких технологий относится xMAP-технология, основанная на проточной
цитометрии. Она позволяет проводить одновременный анализ до 500
аналитов различной природы. Принцип данной технологии заключается в
применении микросфер, окрашенных комбинациями двух флуоресцентных
красителей в различных концентрациях. Микросферы, имеющие дискретное
соотношение интенсивностей флуоресценции двух красителей, принадлежат
к одному типу, и каждый такой тип микросфер имеет свой так называемый
спектральный адрес. Разные типы микросфер можно объединять с
сохранением их спектральных адресов. Наличие различных функциональных
групп на поверхности микросфер позволяет ковалентно присоединять к ним
белки, пептиды, олигонуклеотиды и поли-/олигосахариды. Такая технология
делает возможным проведение целого ряда анализов, основанных, в
частности, на ПЦР и иммуноанализе.
В лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов в настоящее время
разработана тест-система на основе "сэндвич"-xMAP-анализа, позволяющая
одновременно детектировать 8 белковых токсинов: стафилококковые
энтеротоксины A и B (SEA и SEB), токсин тканевого шока стафилококков
(TSST), холерный и дифтерийный токсины (CT и DT), термолабильный
энтеротоксин E. coli (LT), рицин, а также ботулинический нейротоксин А
(BoNTA) и рицин. Из панели полученных нами моноклональных антител к
токсинам были отобраны пары, позволяющие определять токсины в
мультиплексном анализе с максимальной чувствительностью и не
проявляющие при этом неспецифической активности. Пределы детекции
SEA, CT, BoNTA и рицина с помощью разработанной тест-системы составили
0,01 нг/мл, SEB – 0,1 нг/мл, TSST – 0,05 нг/мл, LT – 0,05 нг/мл, DT –
0,03 нг/мл. Для сравнения пределы детекции данных токсинов в "сэндвич"ИФА с использованием тех же пар моноклональных антител составили для
CT, TSST и рицина 0,2 нг/мл, для SEA – 1 нг/мл, для BoNTA – 2 нг/мл, для LT
и DT – 2 нг/мл, для SEB – 8 нг/мл. Продолжительность мультиплексного
иммуноанализа составляет 3-4 часа. Таким образом, мультиплексный
"сэндвич"-анализ токсинов по технологии xMAP, по длительности не
превосходящий "сэндвич"-ИФА, обладает существенными преимуществами
– он позволяет одновременно определять несколько токсинов в одной пробе
с существенно более высокой чувствительностью.
69
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАНСДУЦИРУЮЩИХ
БАКТЕРИОФАГОВ E.COLI ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПОСТОТЪЁМНОЙ ДИАРЕИ ПОРОСЯТ
Скобликов Н.Э.1,2, Зимин А.А.1
1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов, Пущино,
Московская обл.
2
Научно-исследовательский институт животноводства, Краснодар
Электронный адрес: skoblikow@yandex.ru, zimin@ibpm.pushchino.ru
Тел.: (916) 298-41-70; (918) 498-98-91
Нами изучалась эффективность применения экспериментальных
фаговых препаратов, сконструированных на основе нетрансдуцирующих
бактериофагов, на модели профилактики пост-отъёмной диареи поросят,
вызываемой энтеропатогенными штаммами E. coli (EPEC).
В ходе предварительных работ по изучению собранной коллекции из
286 коли-фагов, выделенных из различных природных источников разных
регионов РФ, нами были отобраны 4 нелизогенизирующих и одновременно
нетрансдуцирующих бактериофага (условные лабораторные номера: 6, 8, 9,
15). По результатам ПЦР-анализа было установлено, что все фаги
принадлежат к Т4-типу семейства Myoviridae. Они отличались высокой
продуктивностью и хорошими биотехнологическими характеристиками при
культивировании (необходимом для препаративного получения) на
непатогенных лабораторных штаммах E.coli.
Для проведения опыта были сформированы 5 групп животных (по 14-18
голов в каждой группе) в возрасте 29-30 дней; животные 1-й – 4-й групп
получали взвеси фагов №№ 6, 8, 9, 15 (в дозе 5,0х10 9 PFU на голову
трёхкратно, с интервалом три дня), соответственно; животные из группы
№ 5 служили контролем. Ранее нами были получены экспериментальные
данные, согласно которым оптимальной схемой применения коли-фаговых
препаратов являлось их трёхкратное (с интервалом в три дня) применение в
дозировке 1,0х1010 PFU на голову животным 28-дневного возраста. Общий
период наблюдения за животными составил 13 дней. В течение всего периода
эффективность фагового препарата оценивалась по сохранности поголовья
в гнёздах, клиническому состоянию поросят и лабораторным данным титра
энтеробактерий и фагов E.coli в фекалиях поросят.
По результатам исследования наилучшие сохранность поголовья и
клиническое состояние показали животные 2-й группы (получавшие фаг
№ 8). При этом титр энтеробактерий в наибольшей степени корректировался
у животных этой же группы (с 1,0х108 до 1,5х106 CFU/g) параллельно с
нарастанием титра фагов (с 4,0х102 до 5,4х106 CFU/g). Таким образом,
установлено, что наибольшую профилактическую эффективность на
основании клинических и микробиологических данных демонстрировал
фаг № 8.
Работа была поддержана грантом РФФИ № 11-04-96575-р_юг_ц.
70
СТРЕСС-БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА БТШ70 – ПРОТЕКТОРНОЕ
СРЕДСТВО ОТ ЭНДОТОКСИНОВОГО ШОКА
Слащёва Г.А.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: kustanova@rambler.ru
Тел.: (4967) 73-37-53
Эндотоксины являются главной причиной патологических состояний,
вызываемых грамотрицательными бактериями. Физиологические эффекты
эндотоксинов приводят к развитию системной воспалительной реакции,
которая при генерализации инфекции может приводить к септическому шоку.
Известно, что белки теплового шока (БТШ) являются универсальным
средством защиты клетки от стресса, обнаружена корреляция между уровнем
их экспрессии и выживаемостью грызунов в условиях эндотоксинового шока.
В настоящей работе исследовали способность экзогенного белка
теплового шока БТШ70, освобожденного от примесей ЛПС, предупреждать
in vivo у крыс развитие эндотоксического шока, индуцированного
внутривенным введением ЛПС Esherichia coli и Salmonella typhimurium.
Эксперименты были выполнены на бодрствующих самцах крыс CD.
Регистрировали среднее АД и ЧСС в исходном состоянии и в течение 5 часов
после введения препаратов, а также определяли следующие показатели
гемостаза: тромбопластиновое и протромбиновое время свёртывания крови,
концентрацию фибриногена, время фибринолиза.
Проведенные опыты показали, что предварительное введение БТШ70
снижало смертность, вызванную введением эндотоксинов, с 50% до 20% в
случае с ЛПС из E.coli и с 80% до 40% в случае с ЛПС из S.typhimurium. При
введении как ЛПС E.coli, так и ЛПС S.typhimurium наблюдали увеличение
всех изучаемых параметров. Эффект инъекции ЛПС E.coli и S.typhimurium,
приводящий к повышению всех изучаемых параметров гемостаза, полностью
предотвращался с помощью предварительного введения БТШ70.
Продемонстрированный в нашей работе антисептический эффект БТШ70,
приводящий к снижению смертности животных от эндотоксина разного
происхождения и предотвращающий гиперактивацию системы коагуляции,
на молекулярном уровне, вероятно, может быть связан со способностью
БТШ70 вовлекаться в процессы распознавания ЛПС и, как следствие,
тормозить развитие патологических процессов путем блокирования
продукции провоспалительных цитокинов, а также с известной способностью
БТШ70 активировать собственную иммунную систему организма.
71
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕГРАДАЦИИ
ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
Смирнов И.В., Габибов А.Г.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: smirnov@mx.ibch.ru
Тел.: (495) 727-38-60
КЛЕТОЧНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В
ИНФЕКЦИОННОМ ОТВЕТЕ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ
УФ ОБЛУЧЕНИЙ В СУБЭРИТЕМНЫХ ДОЗАХ
Снопов С.А.
Институт цитологии РАН, С.-Петербург
Электронный адрес: snopov@mail.cytspb.rssi.ru
Тел.: (812) 297-42-34
Проблема терапии и профилактики отравлений фосфорорганическими
соединениями (ФОС) остро стоит перед современной фармацевтикой.
Ежегодно интоксикации ФОС уносят жизни более 200 тысяч человек.
Создание и изучение механизма действия биологического антидота (БА),
каталитически деградирующего ФОТ, является не только фундаментальной
научной, но и прикладной задачей. Для решения такой задачи были
использованы методы комбинаторного подхода и рационального дизайна.
При использовании синтетического арилфосфоната из библиотеки
иммуноглобулинов человека получена панель антител, имеющих
нуклеофильный остаток в активном центре. Эффективность ковалентной
модификации наиболее активного A.17 с исходным арилфосфонатом
составляет kcat/Kd = 40300 M-1мин-1, что более чем в десять раз превышает
аналогичную с бутирилхолинэстеразой (kcat/Kd = 3000 M-1мин-1). Анализ
кристаллов немодифицированного и фосфонилированного антител показал
наличие глубокого (15 Å) двухсекционного кармана с активным
нуклеофильным остатком Тир37 на дне активного центра. Размер и глубина
активного центра нетипичны для антител и сравнимы с активными центрами
холинэстераз. Структурно подвижная петля третьего гипервариабельного
региона тяжелой цепи стабилизируется в процессе фосфорилирования, что
совместно с данными изучения кинетики в быстром потоке свидетельствует
о реализации механизма индуцированного соответствия в реакции антитела
A.17 с арилфосфонатом. Показана стереоспецифичность и рассчитаны
термодинамические параметры реакции. Антитело A.17 способно
гидролизовать пестицид параоксон через стадию образования ковалентного
интермедиата (k2 1.1 ± 0.1 x10-1 мин-1; k3 1.6 ± 0.2 x10-2 мин-1). Другим БА
является бутирилхолинэстераза (БуХЭ). Обнаружена высокая реакционная
способность БуХЭ стехиометрически связывать разнообразные токсины,
ингибирующие ацетилхолинэстеразу. Создание каталитически
деградирующего ФОТ-биологического антидота на основе БуХЭ позволит
уменьшить дозу вводимого препарата. Было продемонстрировано, что
введение электрофильного аминокислотного остатка в активный центр
фермента вблизи оксианионной полости способно привести к образованию
каталитически активного препарата БуХЭ. В результате сайт-направленного
мутагенеза удалось получить мутант G117H, способный гидролизовать
дифторфосфат, параоксон, зарин, зоман и экотиофат.
Эффекты ультрафиолетового (УФ) излучения в отношении
инфекционного иммунитета человека изучены недостаточно. С одной
стороны, показано, что УФ лучи солнца или искусственных источников могут
изменять содержание цитокинов в человеческой коже, численность
субпопуляций лимфоцитов в периферической крови, синтез ДНК и
пролиферативный ответ лимфоцитов на митогены. С другой стороны,
имеются лишь единичные указания на то, что УФ облучения (УФО) могут
влиять на течение инфекционного процесса: например, в эритемных дозах
стимулировать рецидив везикулярных высыпаний, вызываемых вирусом
герпеса. Изучение же УФО в субэритемных дозах, традиционно
используемых в отечественной профилактической медицине, велось лишь
до 1970-х гг., став с тех пор невостребованным. В настоящей работе мы
выясняли, могут ли проводимые в детских коллективах профилактические
УФО изменять иммунный ответ детей на инфекционный конъюнктивит, на
совместное введение полиомиелитной и коревой вакцин или полиомиелитной
и АДС/АДСМ вакцин. В периферической крови определяли количественные
сдвиги в представительстве главных типов лейкоцитов (моноциты,
нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты), основных классов лимфоцитов (T-,
B- и NK-клетки), регуляторных субпопуляций лимфоцитов (CD4+ и CD8+),
активированных клеток (CD25+ и HLADR+), ДНК-синтетическую активность
лимфоцитов, продукцию ими провоспалительных цитокинов и
иммуномедиаторов (IL-1 бета и TNF-альфа, IFN-гамма и IL-10), а также
коревых и дифтерийных антител. Полученные результаты указывают на
модуляцию субэритемными УФО формирующегося ответа на инфекционные
антигены с увеличением представительства в крови CD25+ и HLADR+ клеток
и концентраций IL-1 бета и IL-10, повышением PWM-индуцированного
синтеза ДНК лимфоцитами без ослабления специфического
антителообразования.
72
73
ВЛИЯНИЕ ЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН НА
ИНДУЦИРУЕМУЮ АРЕНИЦИНАМИ ПРОВОДИМОСТЬ БЛМ
Суханов С.В.1, Баландин С.В.1, Носкова М.Н.2, Барсуков Л.И.1,
Овчинникова Т.В.1
1
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
2
Московский государственный университет тонких химических
технологий им. М.В. Ломоносова, Москва
Электронный адрес: ssv@ibch.ru
Тел.: (495) 335-78-33
Изучено действие рекомбинантных антимикробных пептидов
ареницина-1 и ареницина-2 из морских полихет Arenicola marina на ионную
проводимость бислойных липидных мембран (БЛМ) различного состава,
моделирующих клеточные мембраны грамотрицательных и
грамположительных бактерий. БЛМ были приготовлены из смесей
фосфатидилэтаноламин-фосфатидилглицерин-дифосфатидилглицерин
(67:23:10, PL-G – ) и дифосфатидилглицерин-фосфати-дилглицеринфосфатидилинозит (66:24:10, PL-G+).
Установлено, что БЛМ, приготовленные из смеси PL-G+, намного более
чувствительны к ареницинам по сравнению с БЛМ, приготовленными из
смеси PL-G–. При этом существенных различий между ареницином-1 и
ареницином-2 в действии на БЛМ не обнаружено. С использованием пакета
программ для сбора и анализа данных электрофизиологических измерений
проведен анализ записей тока через БЛМ обоих типов. В результате были
выявлены индуцируемые ареницинами флуктуации проводимости, наиболее
характерные для мембран каждого типа, определены их основные
характеристики и рассчитаны наиболее вероятные размеры пор и каналов,
образующихся в мембране под действием ареницинов.
Полученные данные показывают, что имеется четкая корреляции между
восприимчивостью бактериальных клеток к действию ареницинов и
липидным составом их мембран. Отсюда следует, что мембранные липиды
должны принимать непосредственное участие в формировании пор,
ответственных за мембранолитическую активность ареницинов.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки
РФ в рамках реализации ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России" на 2009-2013 годы (госконтракт П1159).
74
ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ACIP-1 И АУРЕЛИНА НА
ПРОВОДИМОСТЬ БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН
(БЛМ) РАЗЛИЧНОГО СОСТАВА
Суханов С.В., Пантелеев П.В., Баландин С.В., Барсуков Л.И.,
Овчинникова Т.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: ssv@ibch.ru
Тел.: (495) 335-78-33
Изучено действие рекомбинантных антимикробных пептидов аурелина
(4296,95 Да) из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita и Acip-1
(5294,1 Да) из лейкоцитов осетра Acipenser guldenstadti на ионную
проводимость искусственных мембран, моделирующих клеточные мембраны
грамположительных и грамотрицательных бактерий. В качестве
искусственных мембран были использованы плоские бислойные липидные
мембраны (БЛМ), приготовленные из фосфолипидных смесей
фосфатидилэтаноламин-фосфатидилглицерин-дифосфатидилглицерин
(67:23:10, PL-G –) дифосфатидилглицерин-фосфатидилглицеринфосфатидилинозит (66:24:10, PL-G+). Установлено, что пептид Acip-1 даже
в максимально высоких концентрациях не способен индуцировать
электрический ток через БЛМ из смеси PL-G–. В случае БЛМ из смеси PL-G+
удалось наблюдать всплески трансмембранного тока при концентрации
пептида Acip-1 равной 7х10-5 М. С течением времени частота появления
всплесков возрастала, что приводило к их наложению и, соответственно,
росту интегрального тока. Индуцируемый пептидом Acip-1 трансмембранный
ток достигал 2040 пА через 30 минут после формирования БЛМ. Таким
образом, пептид Acip-1 в концентрации 7х10-5 М способен индуцировать
электрический ток через БЛМ, приготовленные из смеси PL-G+. Однако
концентрация, в которой он действует на БЛМ, существенно выше
минимальных ингибирующих концентраций этого пептида в отношении
протестированных бактериальных культур (0,51,5х10-5 М).
Эксперименты, проведенные с аурелином, показали, что даже в
концентрациях до 6х10-5 М этот пептид не индуцирует электрический ток
через БЛМ, приготовленные из фосфолипидных смесей PL-G– и PL-G+. Это
дает основание полагать, что антимикробное действие аурелина, скорее всего,
не связано с мембранолитической активностью.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки
РФ в рамках реализации ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России" на 2009-2013 годы (госконтракт П1159).
75
АРЕНИЦИН-2 ИНДУЦИРУЕТ ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ПЕРЕНОС
ПРОТОНОВ ПРИ НИЗКИХ ГРАДИЕНТАХ рН
Сычев С.В., Баландин С.В., Ковальчук С.И., Барсуков Л.И.,
Овчинникова Т.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: ssv@ibsh.ru
Тел.: (495) 335-78-33
ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ НУКЛЕОЗИДОВ
ТЕРМОСТАБИЛЬНЫМИ НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗАМИ
GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS
Таран С.А., Феофанов С.А.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: corresponder@rambler.ru
Тел.: (4967) 73-17-80
Ареницин-2 – антимикробный пептид (АМП) из морского кольчатого
червя Arenicola marina, состоящий из 21 аминокислотного остатка и по
данным ЯМР имеющий в растворе структуру -шпильки. Проведено
сравнительное исследование протон-переносящей активности ареницина-2
и -спирального АМП мелиттина в липосомах, сформированных из ФХ,
ФХ/ФЭ или ФХ/ФЭ/ФИ (ФХ – фосфатидилхолин, ФЭ –
фосфатидилэтаноламин, ФИ – фосфатидилинозит).
Предложен новый подход к исследованию протонного транспорта,
индуцируемого АМП, с использованием липосом, содержащих
бактериородопсин (БР). БР создает небольшую индуцированную светом
разность потенциалов на мембране (~6 мВ). Добавление пептидов к
липосомам уменьшает создаваемый БР градиент рН, что указывает на
формирование пор. Проведен количественный анализ полученных
сигмоидных зависимостей рН от концентрации АМП.
Показано, что при низких неразрушающих липосомы концентрациях
ареницин-2 и мелиттин образуют протон-переносящие поры при
соотношениях липид : пептид ~2х103, однако зависимость порообразования
от липидного состава мембраны для этих АМП принципиально различна.
При переходе от ФХ к бислоям, содержащим ФЭ, который имеет
отрицательную собственную кривизну, эффективность порообразования
-спирального мелиттина снижается, тогда как в случае -структурного
ареницина-2 она возрастает, что указывает на существенные различия в
структуре пор, образуемых ареницином-2 и мелиттином в мембранах.
Дальнейшее увеличение протон-переносящей активности ареницина-2
происходит в бислое из ФХ/ФЭ/ФИ.
Предложенный метод исследования АМП-индуцированного транспорта
протонов позволяет также наблюдать полиморфизм порообразования и
оценивать концентрации пептидов, при которых в мембранах формируются
поры различного типа.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки
РФ в рамках реализации ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России" на 2009-2013 годы (госконтракт П1159).
Нуклеозидфосфорилазы – одна из групп ключевых ферментов синтеза
и обмена пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов в живых организмах от
бактерий до млекопитающих. В присутствии ортофосфата эти ферменты
катализируют обратимый фосфоролиз рибо-, арабино- и
дезоксирибонуклеозидов до пентозо-1-фосфата и соответствующих
оснований, а также фосфатзависимый перенос пентозы между пуриновыми
и
пиримидиновыми
основаниями
или
нуклеозидами
(трансгликозилирование) с образованием нуклеозидов, отличных от
исходных, по схеме:
76
77
Нуклеозид + P  Пентозо-1-фосфат + Основание
В работе впервые показан ряд преимуществ использования ферментных
препаратов термостабильных нуклеозидфосфорилаз по сравнению с
ферментами мезофильных микроорганизмов или целых клеток, применяемых
в известных технологиях получения нуклеозидов ферментативным
трансгликозилированием. Проведены исследования по клонированию генов
и получению штаммов-продуцентов пуриннуклеозидфосфорилазы II и
пиримидиннуклеозидфосфорилазы из G. stearothermophilus B-2194.
Разработан способ получения ферментных препаратов из созданных
штаммов-продуцентов и охарактеризована их активность в реакциях
фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных
нуклеозидов. Показана возможность эффективного применения ферментных
препаратов
иммобилизованных
нуклеозидфосфорилаз
для
биотехнологического получения ряда фармацевтических субстанций.
Получены базовые конструкции с геном пуриннуклеозидфосфорилазы
G. stearothermophilus, обеспечивающие секрецию фермента в
периплазматическое пространство рекомбинантных штаммов-продуцентов
E. coli. Разработана методика контроля ферментативной активности фермента
в периплазматической фракции в формате 96-луночных планшетов. Создан
"биотехнологический инструментарий", который может использоваться для
получения широкого спектра как уже исследованных, так и новых препаратов
нуклеозидной природы для нужд медицины и других целей.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных
исследований (проекты РФФИ №№ 11-04-01164, 10-04-05031, 09-04-05095).
КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В РАСТЕНИЯХ РЯСКИ
МАЛОЙ (LEMNA MINOR L.) ГИРУДИНА
Таранов А.И.1,2, Фирсов А.П.2, Долгов С.В.2
1
Пущинский государственный университет, Пущино, Московская обл.
2
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: taranovemva@rambler.ru
Тел.: (496) 773-17-79
Гирудин – высокоспецифический прямой ингибитор тромбина,
обнаруженный в слюнных железах медицинской пиявки Hirudo medicinalis.
Препараты гирудина используются при лечении широкого спектра
заболеваний. На данный момент существуют два источника получения
гирудина – природный из слюнных желез пиявки и синтез рекомбинантного
гирудина в дрожжах. Нами исследуется возможность синтеза гирудина в
растительных экспрессионных системах. Преимуществом такого подхода
является низкая стоимость конечного продукта, а также наличие в растениях
биохимических систем, необходимых для формирования корректной
вторичной структуры гирудина.
Аминокислотная последовательность гирудина была получена из базы
данных GenBank (P01050). К N-концу аминокислотной последовательности
гирудина в трансляционном слиянии был добавлен сигнальный пептид
-амилазы риса для транспорта белка в апопласт. Для усиления экспрессии
гирудина в растениях была проведена оптимизация кодонного состава ДНК
с помощью программы Gene Composer. Дизайн наборов перекрывающихся
олигонуклеотидов выполнен программой Primo Optimum 3.6 Optimal Gene
Synthesis And Expression. Полученная нуклеотидная последовательность была
клонирована в векторе pBI121 под контролем 35S промотора вируса мозаики
цветной капусты CaMV. Идентичность синтезированной нуклеотидной
последовательности заданной была подтверждена секвенированием. Вектор
pBI121-Hir был перенесен в Agrobacterium tumefaciens CBE21 и использован
для трансформации растений ряски малой (Lemna minor L.).
Одной из перспективных платформ для биофарминга является
картофель. С целью оптимизации экспрессии гирудина в картофеле был
клонирован промотор гена запасного белка картофеля пататина I в векторе
pUC18 с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК картофеля сорта
Д езире. Секвенирование показало идентичность полученной
последовательности имеющейся в GenBank с незначительными заменами.
В дальнейшем для синтеза гирудина в картофеле предполагается
клонирование последовательности промотора гена запасного белка картофеля
пататина I в растительном экспрессионном векторе pBI121.
78
МОЩНОСТЬ МАКЕТА МИКРОБНОГО БИОТОПЛИВНОГО
ЭЛЕМЕНТА НА ОСНОВЕ КЛЕТОК GLUCONOBACTER,
УТИЛИЗИРУЮЩИХ ГЛИЦЕРИН
Томашевская Л.Г.1, Коваленко Г.А.2, Решетилов А.Н.1
1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина
РАН, Пущино, Московская обл.
2
Институт катализа СО РАН, Новосибирск
Электронный адрес: anatol@ibpm.pushchino.ru
Тел.: (4967) 31-86-00
Микробные биотопливные элементы (МБТЭ), в которых преобразование
энергии химических связей органических молекул в электрическую энергию
производится с помощью недорогих универсальных биокатализаторов микроорганизмов, наряду с использованием в качестве альтернативного
источника энергии могут быть введены в процесс утилизации отходов,
например, глицерина как отхода биодизельного производства.
Исследованы параметры макета компартментализованного "глицерин/
гексацианоферрат(III)"-МБТЭ с Gluconobacter-ДХФИФ-анодом. ДХФИФ –
2,6-дихлорофенолиндофенол – медиатор транспорта электронов.
Исследовали возможности увеличения мощности МБТЭ за счет изменения
физико-химических условий. Состав электролитов и условия эксплуатации
приблизили к физиологическим условиям соответствующих
биотехнологических процессов. Сравнительные значения мощности
получали путем анализа вольт-амперных характеристик. Эксплуатация БТЭ
проводилась в малозатратных условиях – при комнатной температуре, на
воздухе, с невысоким содержанием компонентов, без применения
дорогостоящих металлических катализаторов и высокотоксичных
материалов.
Увеличение кислотности электролита от рН 6.0 до 4,5 привело к
увеличению токового показателя, что выразилось в увеличении величины
максимального достигнутого тока вдвое, однако мощность МБТЭ при этом
не повысилась. Увеличение содержания неорганических солей в реакционной
среде путем повышения концентрации калий-фосфатного буфера выше
физиологической (50 мМ) не привело к увеличению мощности МБТЭ.
Величина максимальной мощности увеличивалась с повышением
температуры вдвое в интервале от 25 до 36°C.
Максимальная мощность, полученная при сканировании потенциала со
скоростью 0.5 мВ/с, составила 3 мкВт/см2 рабочей поверхности анода или
0.3 Вт/кг сырой биомассы.
В модификации макета с анодом из спектрального графита с углеродным
слоем из нановолокон с иммобилизованными на нем клетками бактерий
максимальная мощность при сканировании потенциала со скоростью 1 мВ/с
составила 1.4 мкВт/см 2 рабочей поверхности анода без учета площади
поверхности волокон, или 2 Вт/кг сырой биомассы.
79
СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЙ КОМПЛЕКС ПРИРОДНЫХ
ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ
Трубецкая О.Е.1, Шалойко Л.А.1, Ришар К.2, Демин Д.В.3, Трубецкой О.А.3
1
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Лаборатория молекулярной фотохимии Национального центра научных
исследований Франции
3
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино,
Московская обл.
Электронный адрес: trub@fibkh.serpukhov.su
Тел: (4967) 73-08-59
Гуминовые вещества (ГВ), обязательные и стабильные компоненты
природных сухопутных сред и водных источников, являются одним из
главных и практически неисчерпаемых ресурсов органического углерода на
планете. Однако до сих пор не существует единого мнения ни о механизмах
образования, ни о базовых принципах строения ГВ. Долгое время
предполагали, что ГВ представляют собой гетерогенную смесь
рандомизированных гетерополимеров, молекулярная масса которых
достигает 300 кДа. Сравнительно недавно была выдвинута новая концепция
их молекулярной организации, основанная на базовых представлениях
супромолекулярной химии, в соответствии с которыми ГВ представляют
собой ансамбль органических молекул относительно небольших размеров,
соединённых между собой нековалентными связями в стабильный
устойчивый к деградации комплекс. Однако прямых экспериментальных
данных в пользу последней теории до сих пор представлено не было.
Многолетние исследования, проведённые совместно с лабораторией
фотохимии макромолекул НЦНИ (Франция) по изучению структурных
характеристик и фотохимической активности ГВ различного генезиса,
выявили наличие стабильных фракций ГВ, обладающих различной
химической структурой и функциональной фотохимической активностью и
связанных в единый комплекс с помощью нековалентных связей, что служит
экспериментальным подтверждением супрамолекулярной организации ГВ
(1). Полученные фундаментальные данные могут быть полезными для
объяснения экологических функций ГВ в биосфере.
Работа выполнена на базе проекта CNRS – РАН №23962 и поддержана
грантом РФФИ № 10-05-00243-а.
Литература
1. Trubetskaya O., Shaloiko L., Demin D., Marchenkov V., Proskuryakov I.,
Coelho C., Trubeskoj O. Combining electrophoresis with detection under light
and multiple ultrafiltration for isolation of humic fluorescence fractions.
Analytica Chimica Acta (2011), 690, 263-268.
80
ЭФФЕКТЫ ДСИП ПРИ ФОКАЛЬНОМ ИНСУЛЬТЕ У КРЫС CD
Туховская Е.А.1, Скобцова Л.А.1, Мурашев А.Н.1, Прудченко И.А.2,
Румш Л.Д.2, Фельдман Б.М.3, Марквичева Е.А.2
1
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
3
ФГУП "Государственный научный центр "НИОПИК", Москва
Электронный адрес: lenoktuk@rambler.ru
Тел.: (926) 256-72-15
В настоящее время все больше внимания привлекает к себе дельта-сон
индуцирующий пептид (ДСИП). Изучаются его адаптогенные и защитные
свойства. В нашем исследовании мы изучали влияние сочетания
предварительного и терапевтического интраназального введения пептида
ДСИП (всего 8 дней) крысам CD на последствия фокального инсульта на
модели окклюзии средней мозговой артерии. Животных делили на группы:
ОСМА+растворитель, ОСМА+ДСИП и ложнооперированные. Крысам
интраназально вводили ДСИП или растворитель за 60 (±15) минут до
окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) и в течение семи дней после
реперфузии в дозе 120 мкг/кг. На протяжении 21 дня после операции
животные подвергались поведенческому тестированию: тестирование
моторной координации на приборе "вращающийся стержень" и тестирование
билатеральной асимметрии ("кетамининдуцированное вращение"). По
окончании периода тестирования животных подвергали эвтаназии, головной
мозг перфузировали, получали серийные коронарные криосрезы, в которых
рассчитывали объем инфаркта головного мозга. Хотя объем инфаркта правого
полушария головного мозга у животных, получавших ДСИП, был меньше,
чем у животных, получавших растворитель, это различие не было достоверно
значимым. Различий в тесте "кетамининдуцированное вращение" также не
наблюдалось. Однако тестирование моторной координации в тесте
"вращающийся стержень" выявило значительное улучшение этого показателя
у животных, получавших ДСИП, – скорость восстановления моторной
координации была значимо выше по сравнению с животными, не
получавшими пептид. Целесообразно дальнейшее изучение
нейропротекторных эффектов ДСИП.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы "Разработка
и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств
профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и
других опасных заболеваний" на 2010-2012 гг."
81
ОСОБЕННОСТИ САМООРГАНИЗАЦИИ ПЕПТИДОВ В
ФИЛАМЕНТНЫЕ СТРУКТУРЫ
Удовиченко И.П.1,3, Соболев Е.В.2, Тихонов Д.А.2, Данилкович А.В.1,3,
Липкин В.М.1,3
1
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Институт математических проблем биологии РАН, Пущино,
Московская обл.
3
Пущинский государственный университет, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: iudovichenko@rambler.ru
Тел.: (4967) 73-08-93
Самоформирующиеся пептиды способны образовывать из мономеров
сложные упорядоченные олигомерные структуры, имеющие потенциал
использования в технике и медицине. Так, филаменты, образуемые пептидами
(RADA) 4 и (RLDL) 4, могут найти применение в качестве среды для
пролиферации клеток в тканевой инженерии, в частности, при лечении
сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ишемией.
Процесс образования филаментов из (RADA)4 и (RLDL)4 был исследован
in silico моделированием молекулярной динамики в Amber11 в явном водном
окружении и силовом поле ff03 пептидных мономеров, димеров, тетрамеров
и октамеров с использованием докинга в HEX6.1 в режиме учета геометрии
модели и поверхностных зарядов, а также GRAMM-X.
Анализ энергии образования комплексов G, µGBSA, E MM
демонстрирует тенденцию к образованию олигомерных структур. Данные
по RMSd и RMSf, а также карты Рамачандрана доказывают уверенную
стабилизацию структур, начиная с тетрамера.
Показано, что лимитирующей стадией, определяющей эффективность
образования филаментов, является формирование димеров, чьи стабильность
и способность сохранять -конформацию определяют скорость образования
филаментов. Димеры (RLDL) 4 стабильнее димеров (RADA) 4 (длины
сегментов -складки 6,4±2,0 и 2,6±0,7 аминокислотных остатков,
соответственно).
Показано, что ядром образования филамента, вкладывая в это понятие
наиболее стабильную минимальную структуру, можно считать тетрамер
[длины сегментов -складки 10,8±1,9 аминокислотных остатков для (RLDL)4
и 12,5±0,7 для (RADA)4], в котором -антипараллельные структуры димеров
стабилизируются гидрофобными взаимодействиями остатков Ala или Leu
между димерами, а сам филамент представляет собой двухслойную структуру,
где внутри каждого слоя присутствуют -антипараллельные структуры, а слои
связаны между собой гидрофобными взаимодействиями.
Работа поддержана грантами №№02.740.11.5224, 14.740.11.0170,
16.512.11.2066 Министерства образования и науки Российской Федерации в
рамках Федеральных целевых программ "Научные и научно-педагогические
кадры инновационной России на 2009-2013 годы" и "Исследования и
разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы".
82
СОЗДАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОТЕРАПИИ СПИДА С
ПОМОЩЬЮ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ: ИСПЫТАНИЕ
КАССЕТНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ,
ПОРАЖАЮЩИХ НЕСКОЛЬКО МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИЧ-1
Федосеева Д.М., Кретова О.В., Алембеков И.Р., Чуриков Н.А.
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва
Электронный адрес: dfedoseeva86@yandex.ru
Тел.: (499) 135-97-02.
Целью работы является разработка технологии генотерапии СПИДа с
помощью РНК-интерференции. В ходе работы отобраны шесть
высококонсервативных и одновременно уязвимых для РНК-интерференции
мишеней в геноме ВИЧ-1, а также мишень в мРНК человеческого гена корецептора CCR5. Эффективность конструкций, экспрессирующих
направленные против данных мишеней 27-членные шпильки РНК (shРНК),
которые процессируются в siRNA, проверена в невирусной системе и
составила от 60% до 96%. Обнаружено, что эти 27-членные shРНК не
вызывают неспецифический интерфероновый ответ. Получены четыре
кассетные конструкции, одновременно экспрессирующие три siRNA – две
анти-ВИЧ-1 и одну анти CCR5-shРНК. Эти конструкции являются более
эффективными в генотерапии по сравнению с конструкциями,
экспрессирующими одну siRNA, и позволяют преодолеть эффект быстрого
мутирования ВИЧ. Разработан оригинальный, быстрый и удобный протокол
создания кассетных конструкций, позволяющий избежать трудностей
клонирования шпилек. Эффективность данных кассетные конструкций
протестирована в невирусной и псевдовирусной системах. В невирусной
системе эффективность РНК-интерференции этими кассетными
конструкциями составляет от 70% до 80%. В псевдовирусной системе
эффективность действия данных кассет составляет от 80% до 100%. Для
оценки вариабельности шести выбранных мишеней РНК-интерференции в
клинических формах вируса в России проводится анализ этих мишеней с
помощью глубокого секвенирования препаратов вируса, выделенных из
образцов крови больных СПИДом с разными клиническими проявлениями.
83
РАЗРАБОТКА СЪЕДОБНЫХ ВАКЦИН МЕДИЦИНСКОГО И
ВЕТЕРИНАРНОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ
РАСТИТЕЛЬНЫХ ПЛАТФОРМ НА ПРИМЕРЕ ПЕПТИДА М2е
ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ
Фирсов А.П., Тарасенко И.В., Митюшкина Т.Ю., Таранов А.И.,
Долгов С.В.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: aleksey_firsov@mail.ru
Тел.: (4967) 73-17-79
Целью исследования являлась экспрессия пептида М2е вируса гриппа
птиц A/chicken/Kurgan/5/2005(H5N1) в растениях ряски малой (Lemna minor)
для последующей разработки съедобной вакцины. Последовательность ДНК,
соответствующая пептиду М2е, была оптимизирована для экспрессии в ряске
и синтезирована методом лигирования синтетических олигонуклеотидов.
Полученная последовательность была клонирована в вектор pBI121 в
трансляционном слиянии с 5'-концом гена -глюкуронидазы (вектор
pBIM130). Для использования в качестве орального адъюванта и повышения
эффективности иммунизации была клонирована нуклеотидная
последовательность субъединицы Б рицина (RTB). Пептид М2е был
трансляционно слит с С-концом RTB, к С-концу пептида М2е был добавлен
хитин-связывающий домен хитиназы А арабидопсиса (CBD). К N-концу RTB
добавили сигнальный пептид PR1 табака, служащий для транспорта слитого
протеина RTB-M2е-CBD в апопласт растений (вектор pBI-RТBM2е).
В результате агробактериальной трансформации ряски векторами
pBIM130 и pBI-RТBM2е были получены трансгенные растения. Экспрессию
слитого белка М2е--глюкуронидаза анализировали методом Вестерн блот
(WB) анализа с использованием антител против пептида М2е вируса гриппа.
В препаратах белка из трансгенных растений детектировалась
иммунореактивная полоса ожидаемого размера, экспрессия пептида М2е
наблюдалась в 6 из 13 изученных линий. Слитый белок RTB-M2е-CBD также
обнаружен в большинстве трансгенных линий ряски методом WB анализа с
использованием антител как против пептида М2е, так и RTB. Методом ELISA
показано, что накопление слитых белков М2е--глюкуронидаза и RTB-M2еCBD превысило в некоторых трансгенных линиях 3 и 1% общего
растворимого белка, соответственно.
Таким образом, пептид М2е вируса гриппа птиц был успешно
экспрессирован в трансгенных растениях ряски, что позволяет использовать
полученные растения как экспрессионные платформы для последующей
разработки съедобной вакцины.
84
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНИЦИИРУЮЩИХ КОДОНОВ ГЕНА speA
ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ИНИЦИАЦИИ
ТРАНСЛЯЦИИ
Чернышов С.В.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: svch2@rambler.ru
Тел.: (4967) 33-09-70
Ген speA супрессирует патогенность батерий Erwinia carotovora.
Особенностью открытой рамки считывания этого гена является наличие
шести кодонов АUG, потенциально претендующих на роль инициирующих.
Перед тремя из них (start 2, start 4 и start 6) располагаются пурин-богатые
участки, в различной степени обладающие гомологией с
последовательностью Шайна-Дальгарно, SD1, SD2 и SD3. Ранее с целью
проверки функциональной активности in vivo этих SD был создан ряд
генетических конструкций, содержащих в качестве репортерного гена ген
зелёного флуоресцирующего белка, egfp. Полученные экспериментальные
данные свидетельствовали о различной функциональной активности всех
трех исследуемых структур. В одной из конструкций ген egfp был поставлен
после инициирующего кодона start 6 гена speA. Вестерн-блот анализом с
использованием поликлональных антител к GFP было показано наличие ряда
сигналов разной интенсивности, соответствующих белкам, обладающим
различными молекулярными массами. Это свидетельствовало об
одновременном, но неравнозначном участии в инициации трансляции всех
трех структур SD. Для дополнительного подтверждения факта
альтернативной инициации трансляции была создана конструкция, в которой
полноразмерный ген speA соединён с геном egfp. Продукт этого
рекомбинантного гена представляет собой химерный белок, состоящий из
двух доменов: N-концевого домена, SpeA, и C-концевого, GFP. Достоинством
данной конструкции является присутствие всех потенциальных стартовых
кодонов и регуляторных элементов инициации трансляции. Наличие GFPдомена позволяло визуализировать инициацию трансляции при биосинтезе
химерного белкового продукта. Проведен сайт-направленный мутагенез
инициирующих кодонов start 2 и start 6 в гене speA-egfp, в результате чего
произошло превращение триплета АUG в триплет CUG и, соответственно,
замена метионина лейцином. Получены конструкции, в которых
последовательно элиминированы инициирующие кодоны start 2, start 6 и
оба вместе. Клетки E. coli, трансформированные этими конструкциями, были
способны к флуоресценции, как и клетки, содержащие исходную плазмиду,
что свидетельствовало об инициации трансляции с нескольких стартов.
Вестерн-блот анализом белков мутантных клонов было показано изменение
спектра сигналов по сравнению с контролем. У мутанта с удаленным кодоном
start 6 отмечено исчезновение одного сигнала. Удаление кодона start 2 не
привело к ожидаемому исчезновению белка соответствующего размера. У
двойного мутанта также зафиксировано исчезновение лишь одного сигнала.
Этот результат требует дальнейшего изучения.
85
КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ pPF1
ДЛЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО АНАЛИЗА ДИВЕРГЕНТНЫХ
ПРОМОТОРОВ
Чернышов С.В.
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
Электронный адрес: svch2@rambler.ru
Тел.: (4967) 33-09-70
Дивергентные промоторы представляют собой особый случай
генетической организации регуляторных участков в геномах прокариот, при
котором промоторные области располагаются на разных цепях ДНК и
обеспечивают инициацию транскрипции в противоположных направлениях.
Для ряда генов такие промоторы были охарактеризованы экспериментально.
Компьютерное картирование промоторов показало, что явление дивергентной
транскрипции может иметь более широкое распространение, чем это
предполагалось ранее. Представляют бесспорный интерес исследование
механизмов взаимного влияния для известных противонаправленных
промоторов и проверка активности in vivo для предсказанных дивергентных
промоторов. Для одновременной детекции транскрипционной активности в
разных направлениях была применена стратегия использования двух
флуоресцирующих репортёрных белков, максимумы флуоресценции которых
находятся в различных областях спектра, что позволяет дискриминировать
их друг от друга. Произведены дизайн и конструирование плазмиды pPF1,
пригодной для анализа как дивергентных, так и обычных промоторов. В
состав плазмиды включены два репортёрных гена, egfp и mcherry, способных
экспресироваться в противоположных направлениях и лишенных
собственных промоторов, терминаторы транскрипции этих генов,
высокоэффективные сигналы инициации трансляции, набор сайтов
рестрикции для клонирования анализируемых фрагментов ДНК. Для
предотвращения преждевременной инициации трансляции репортёрных
генов были введены также дополнительные стоп-кодоны во всех рамках
считывания. С целью проверки полученной плазмиды в неё был встроен ряд
фрагментов ДНК, содержащих как известные, так и предсказанные
дивергентные промоторы. Одним из таких промоторов, в частности, является
промотор Pch гена speA, расположенного на плазмиде pAM28,
супрессирующей патогенность Erwinia carotovora, компьютерный анализ
нуклеотидной последовательности которой выявил наличие в её составе
подобной структуры. В качестве других анализируемых фрагментов ДНК
были использованы межгенный участок fepA/fes E. coli и участки,
предшествующие генам sapA и appY, содержащие экспериментально
обнаруженные промоторы этих генов и противоположно направленные
промоторы с неизвестной функцией. После трансформации бактериальных
клеток полученными генетическими конструкциями были отобраны колонии,
флуоресцирующие как в красной, так и в зеленой областях спектра. При
клонировании проксимального участка гена appY зарегистрирована
флуоресценция обоих репортёрных белков. Таким образом, эффективно
продемонстрирована возможность поиска и функционального анализа
дивергентных промоторов.
86
ГЛИКОПОЛИМЕРЫ С КОНЦЕВЫМИ БИОТИНОВЫМИ
ГРУППАМИ. СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ В
ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ
Чинарев А.А., Галанина О.Е., Бовин Н.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: сhinarev@carb.ibch.ru
Тел.: (495) 330-03-00
Нами были синтезированы линейные полиакриламиды (pAA) с
концевыми биотиновыми группами (biot) и "боковыми" остатками гликанов
(Glyc). Для этого под действием специально сконструированного
радикального инициатора проводили полимеризацию 4-нитрофенилакрилата; биотиновые группы вводились в состав полимера вместе с
фрагментом инициатора. С полученным поли(4-нитрофенилакрилатом)
конденсировали -аминоалкил гликозиды, после чего оставшиеся
активированные эфирные группы амидировали с помощью этаноламина.
Синтезированные гликополимеры с концевыми биотиновыми группами,
biot1-pAA30-Glyc44 (нижние индексы обозначают число соответствующих
групп в составе молекулы полимера; верхний индекс – молекулярный вес
полимера-носителя), а также "стандартные" гликополимеры с "боковым"
прикреплением биотиновых остатков к носителю, pAA 30-Glyc44-biot 5, и
биотинилированные мономерные гликозиды, Glyc-spacer-biot, были
иммобилизованы на поверхности покрытых стрептавидином
полистирольных планшетов. Методом иммуноферментного анализа (ИФА)
изучалось взаимодействие моноклональных антител (mAb) к
соответствующим остаткам Glyc с поверхностью модифицированных
планшетов. Высокая интенсивность аналитического сигнала наблюдалась
только для планшетов, покрытых гликанами в мультивалентной форме. Это
объясняется прочным многоточечным связыванием гликополимеров с mAb,
при этом полимер выступает не просто в роли носителя, но и как гибкий
линкер между остатками гликанов, позволяя им оптимальным образом
подстроиться для взаимодействия с mAb. В связи с этим не удивительно, что
в случае biot1-pAA30-Glyc44, связанного с поверхностью планшетов только
через один остаток биотина, аналитический сигнал оказывался в 2-8 раз
выше, чем для pAA30-Glyc44-biot5. Наибольшая разница в величине сигналов
наблюдалась при минимальной нагрузке Glyc, 1-10 пмоль/ячейка.
Полученные результаты были использованы для конструирования
различных биоаналитических платформ от планшетов для ИФА до сенсорных
чипов и гликановых "микроэрреев", необходимых при проведении
исследований в обратной гликомике. В частности, в докладе будут
представлены результаты применения т.н. "suspension glycan array" для
изучения естественных антител человека.
87
ВЛИЯНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СЕМЕЙСТВА
КАТЕЛИЦИДИНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ
СПЛЕНОЦИТОВ
Шамова О.В., Ямщикова Е.В., Орлов Д.С., Кокряков В.Н.
НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, С.-Петербург
Электронный адрес: oshamova@yandex.ru
Антимикробные пептиды (АМП) из нейтрофильных гранулоцитов
являются эффекторными молекулами системы врожденного иммунитета,
участвующими в противоинфекционной защите, инактивируя патогенные
микроорганизмы, а также обладающими многонаправленными эффектами
в отношении эукариотических клеток.
Циркулирующие в кровяном русле или присутствующие в различных
тканях нейтрофилы находятся в контакте с другими клетками системы
врожденного и приобретенного иммунитета, в частности, с теми, которые
на настоящий момент рассматриваются как основные участники
противоопухолевой защиты организма – натуральными киллерами и
цитотоксическими Т-лимфоцитами. Они, осуществляя свои защитные
функции, могут вступать во взаимодействие с биологически активными
молекулами, в том числе АМП, секретируемыми нейтрофилами. Задачей
нашей работы было изучение способности двух АМП из семейства
кателицидинов – протегрина 1 (PG1) из нейтрофилов свиньи и бактенецина 5
(Вас5) из нейтрофилов козы модулировать активность этих защитных клеток.
Нами было исследовано влияние PG1 и Вас5 на цитотоксическую активность
спленоцитов крысы в отношении двух типов клеток-мишеней: К-562 (клетки
эритроидной лейкемии человека) и U-937 (клетки гистиоцитарной лимфомы
человека) в культуре. Использовали различные соотношения
мишень:эффектор – 1:50; 1:20 и 1:5. С применением набора Cell-Mediated
Cytotoxicity (Invitrogen, США) и флюоресцентной микроскопии было
показано, что при добавлении пептидов к клеткам-мишеням (до конечной
концентрации 2 мкМ) за 30 минут до внесения спленоцитов (при
соотношении мишень/эффектор 1:5) достоверно увеличивалась
цитотоксическая активность спленоцитов как в случае PG1 (примерно в два
с половиной раза для К-562 и в 2 раза для U-937), так и в случае с Вас5 (в
полтора раза для K-562 и U-937) по сравнению с контрольными пробами,
где клетки-мишени инкубировались со спленоцитами без пептидов, а также
пробами, в которых клетки-мишени инкубировались с пептидами, но без
добавления спленоцитов. При других соотношениях мишень/эффектор (1:20
и 1:50) добавление как PG1, так и Вас5 не вызывало достоверных изменений
цитотоксической активности спленоцитов для обеих клеточных линий.
Таким образом, полученные экспериментальные данные
свидетельствуют в пользу предположения о возможном вовлечении АМП в
механизмы противоопухлевой защиты, связанные со спленоцитами, в состав
которых входят натуральные киллерные клетки и цитотоксические
Т-лимфоциты.
Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-01655.
88
НОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ И ИХ РОЛЬ В
ВОЗНИКНОВЕНИИ И ЭВОЛЮЦИИ РОДА HOMO
Шематорова Е.К., Шпаковский Д.Г., Долудин Ю.В., Словохотов И.Ю.,
Шпаковский Г.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: gvs@ibch.ru
Тел.: (495) 330-65-83
Изучение молекулярной эволюции генов POLR2J системы транскрипции
и PMS2 системы репарации MMR показало, что появление и
совершенствование генетической структуры обоих этих генных семейств
чётко коррелируют с основными этапами биологической эволюции высших
приматов. Это позволяет рассматривать семейства генов PMS2 и POLR2J в
качестве удобных и достоверных молекулярных маркеров антропогенеза
(Генетика, 2010, 46: 1254-1257). Для того чтобы понять роль новых генов
РНК-полимеразного хозяйства POLR2J2 и POLR2J3 в дивергенции систем
регуляции генной экспрессии у человека, мы с помощью генетического
(дрожжевая двухгибридная система) и биохимического (соосаждение белков
из клеточных лизатов) подходов провели поиск белков-партнёров целого ряда
специфических для человека белков (hRPB11b, hRPB11b и hRPB11с),
продуцируемых в результате экспрессии этих эволюционно молодых генов
в нервной (эмбриональный мозг) и иммунной (клеточная линия Jurkat) тканях
Homo sapiens.
Наличие среди партнёров близкородственных белков hRPB11b и
hRPB11с ряда субъединиц ядерных РНК-полимераз (hRPB3, hRPB6,
hRPC40), общих и специализированных факторов транскрипции (ATF4,
ART-27, BTF3, COMMD4d), а также белков, связанных с хроматином и РНК
(Cullin 4a, POLA1, гистон с "макро"-доменом H2A1, L1-ORF1p), указывает
на то, что эти белки являются минорными изоформами субъединицы
РНК-полимеразы II hRPB11 и входят в состав специфических
РНК-полимеразных комплексов. Впервые обнаружены взаимодействия
hRPB11b и hRPB11c сразу с несколькими субъединицами фактора
инициации трансляции hEIF3 (eIF3a, eIF3i, eIF3m и eIF3m), что указывает
на существование у Homo sapiens нового типа координации транскрипции с
последующими этапами генной экспрессии (транспорт мРНК из ядра в
цитоплазму к транслирующим рибосомам) и на возможное существование
ядерных субкомплексов hEIF3 (Биохимия, 2011, 76: 1195-1200).
Среди белков-партнёров изоформы hRPB11b нами обнаружены:
субъединица РНК-полимеразы II hRPB6, новый, ранее не описанный вариант
ядерной рибонуклеазы III DROSHA, кóровый компонент белкового комплекса
экзонных сочленений EJC (Exon-exon Junction Complex) Y14 (RBM8A), а
также белки DCAF и EIF6. Наличие в этом списке особого варианта
инициирующей нуклеазы процессинга микроРНК (miRNAs) DROSHA и
участвующих в биогенезе и регуляции функционирования микроРНК белков
EIF6 и Y14 (RBM8A) указывает на новый тип сопряжения процессов
транскрипции и РНК-интерференции у Homo sapiens.
89
ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ ОСИНЫ
С МОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТАБОЛИЗМОМ АЗОТА
Шестибратов К.А.1, Булатова И.В.1, Лебедев В.Г.1, Лисов А.В.2,
Леонтьевский А.А.2, Канарский А.В.3, Новиков П.С.3
1
Филиал Института биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл.
2
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина
РАН, Пущино, Московская обл.
3
Марийский государственный технический университет, Йошкар-Ола
Электронный адрес: schestibratov@fibkh.serpukhov.su
Тел.: (4967) 33-09-66
Недоступность неорганического азота в лесных почвах для древесных
растений часто является ограничивающим фактором в их росте и развитии.
Важную роль в ассимиляции азота играет глутаминсинтетаза,
конвертирующая аммонийный азот в органический (глутамин).
Суперэкспрессия рекомбинантной глутаминсинтетазы в трансгенных
растениях может привести к значительной модификации метаболизма азота
и повысить эффективность его ассимиляции.
Проведена серия генетических трансформаций осины Populus tremula
(генотипы Pt, PtV22 и F2) с использованием бинарного вектора pGS, несущего
ген gs1 глутаминсинтетазы сосны под контролем 35S промотора. Получено
37 трансформантов. ПЦР анализ на наличие целевого гена gs1 подтвердил
его присутствие в 34 линиях. ОТ-ПЦР анализ препаратов тотальной РНК
позволил обнаружить транскрипцию гена gs1 у 32 из 34 линий. Оценка
содержания белкового азота показала его повышенный уровень в 5 из 7
анализируемых GS линиях. Содержание белкового азота в трансгенных
линиях варьировало от 1,92 до 4,14%, тогда как в контрольных растениях от
1,3 до 1,5%. Следует отметить, что в листьях данных различий обнаружено
не было. Тест на основе ризогенеза in vitro в присутствии сублетальной дозы
(0,5 мг/л) фосфинотрицина (ингибитор глутаминсинтетазы) показал
повышенную устойчивость трансгенных растений к данному гербициду.
Аналогичные результаты дал тест в условиях защищенного грунта при
точечном нанесении гербицида на листья. Обнаружены незначительные, но
достоверные изменения в содержании целлюлозы и лигнинов в древесине
GS линий осины. Удельное содержание целлюлозы у GS линий на основе
генотипа PtV22 варьировало от 29 до 34%, а лигнинов – от 30,7 до 33,2%,
тогда как у нетрансгенных растений осины PtV22 целлюлоза содержалась
на уровне 29,7%, а лигнины – 33,6%. Трехлетний вегетационный эксперимент
с участием пяти GS-линий позволил выявить превышение объема стволовой
части относительно контроля на 43-59%.
Для дальнейшего исследования растений с геном gs1 планируется
проведение вегетационного эксперимента в условиях защищенного грунта
на субстратах с дефицитом азота, а также проведение полевых испытаний
на почвах с различным уровнем доступности минерального азота.
90
НОВЫЙ ХИТОЛЕКТИН КРЫСЫ В ЖИВОТНЫХ МОДЕЛЯХ С
СИНДРОМОМ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА
Шуваева Т.М., Ильницкая Е.В., Радченко В.В., Липкин В.М.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Электронный адрес: shuvaeva@mx.ibch.ru
Тел.: (495) 336-51-11
В слизистой оболочке респираторного эпителия, являющейся барьерной
тканью, контактирующей с окружающей средой и ассоциированной с
периферической иммунной системой, нами был выделен новый
водорастворимый белок с молекулярной массой ~45 кДа, имеющий в своем
составе Sec-14-домен, или, как принято его обозначать, rSec14p. Показаны
его липидсвязывающая активность важная роль в обеспечении нормального
функционирования эпителиальных тканей. В результате двугибридного
поиска партнеров изучаемого белка вероятными оказались несколько белков
иммунной системы, чей синтез резко возрастает при воспалении и
нейродегенеративных изменениях. Поэтому было решено исследовать
rSec14p на моделях животных с длиннодистантными (болезнь Альцгеймера)
и короткодистантными (острый эндотоксикоз) эффектами.
При электрофоретическом анализе белкового экстракта обонятельной
выстилки животных с моделью болезни Альцгеймера наряду с rSec14p
совыделялся неизвестный ранее белок с молекулярной массой ~43 кДа.
Определена аминокислотная последовательность и установлена его
принадлежность к подгруппе хитолектинов. Известно, что в организме
млекопитающих, не содержащих хитин, присутствуют хитиназы и
хитолектины, которые являются регуляторами врожденного и
приобретенного иммунитета, и их можно рассматривать как маркеры
воспаления при заболеваниях воздухоносных путей. Новый белок назван
нами "rYM-1olf". Установлена и депонирована в GenBank (JF781276)
последовательность полноразмерной кДНК белка rYM-1olf (включающая
1545 п.о.), экспрессирующейся в обонятельной выстилке крыс с острым
эндотоксикозом.
Нами впервые показано, что rSec14p и rYM-1olf являются участниками
процессов развития иммунологических реакций. Уровни экспрессии генов
изучаемых белков резко увеличиваются в обонятельной выстилке крыс в
моделях болезни Альцгеймера и острого эндотоксикоза по сравнению с
контрольными животными.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы
фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и
клеточная биология" и гранта РФФИ №11-04-00761.
91
ВЛИЯНИЕ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА БАКТЕНЕЦИНА 5
ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ КОЗЫ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ
ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА, А ТАКЖЕ НА ПРОЦЕСС
РАНОЗАЖИВЛЕНИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
Ямщикова Е.В., Орлов Д.С., Кокряков В.Н., Шамова О.В.
НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, С.-Петербург
Электронный адрес: oshamova@yandex.ru
Бактенецины – катионные обогащенные пролином пептиды (ОПП)
системы врожденного иммунитета млекопитающих. Благодаря высокому
содержанию пролина ОПП могут вступать во взаимодействие и модулировать
функциональную активность разнообразных белковых молекул, в том числе
белков, участвующих в ключевых биохимических процессах, протекающих
как в микробных, так и в эукариотических клетках. Поэтому кроме
антимикробной активности для некоторых ОПП показана способность влиять
на целый ряд важнейших защитных реакций, протекающих при разных видах
патологии, например, для PR-39 из лейкоцитов свиньи в литературе описана
способность индуцировать ангиогенез, ускорять заживление ран,
ингибировать активность NADPH-оксидазной системы нейтрофилов. Задачей
нашей работы было изучение влияния бактенецина 5 из лейкоцитов козы
(Вас5) на пролиферацию фибробластов кожи человека in vitro, а также на
процесс заживления кожной раны у мышей. Фибробласты инкубировали с
Вас5, взятым в разных концентрациях (1.25 мкМ, 2.5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ,
20 мкМ) в течение 72 часов. Пролиферативная активность клеток достоверно
повышалась (на 18-20%) в пробах, содержащих 2.5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ
Вас5, по сравнению с контрольными пробами, инкубировавшимися в тех же
условиях, но без добавления пептида. Влияние пептида на процесс
заживления ран у мышей изучали на следующей модели: экспериментальным
животным наносили две полнокожные раны диаметром 6 мм и обрабатывали
раневую поверхность водным раствором Вас5 (0.5 мкМ, 2 мкМ и 10 мкМ)
на 1-й, 2-й, 4-й, 6-й и 9 дни. Площадь раневой поверхности измеряли,
фотографируя животных цифровой фотокамерой и анализируя полученные
изображения с помощью программы ImageJ 1.44p (NIH, USA). Было
показано, что уже на второй день после воздействия площадь раневого
поражения была достоверно ниже у мышей, раны которых обрабатывались
пептидом в концентрации 10 мкМ, по сравнению с контрольной группой, в
которой раны обрабатывали водой без пептида (p<0.05, t-критерий
Стьюдента). На 4-й и 9-й дни площадь раневой поверхности также была
примерно на 30% ниже при обработке ран 10 мкМ раствором Вас5, в то
время как пептид в концентрации 0.5 мкМ и 2 мкМ не влиял на заживление
ран на всем промежутке времени наблюдения за течением раневого процесса.
Таким образом, получены данные, подтверждающие представления об
антимикробных пептидах как о многофункциональных молекулах,
обладающих свойствами биомодуляторов и участвующих в реализации
различных защитных реакций в организме.
92
АВТОРСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ
Акимов М.Г.
Аксенова Е.В.
Алекперов Э.А.
Александрова С.С.
Алексеева Л.Г.
Алембеков И.Р.
Алтухов Д.А.
Андреев Я.А.
Андронова Т.М.
Аралов А.В.
Арсеньев А.С.
Артемов В.В.
Архипова О.В.
Асеев Л.В.
Асраров М.И.
Бабич О.О.
Баландин С.В.
Баранник А.П.
Барсуков Л.И.
Безуглов В.В.
Белогуров А.А.
Берлов М.Н.
Бобров М.Ю.
Бовин Н.В.
Богданов И.В.
Богомолова Е.Г.
Боженко В.К.
Бозиев Х.М.
Бойко А.А.
Болдырев И.А.
Бони И.В.
Бровко Ф.А.
Булатова И.В.
Бурьянов Я.И.
Былинкина Н.С.
Валякина Т.И.
Василевский А.А.
Водовозова Е.Л.
Габибов А.Г.
Гайнутдинов Р.В.
Галанина О.Е.
Гарбер М.Б.
Гизатуллина А.К.
3
40
28
58
4
83
5
6
18
7
5, 15
19
8
9
57
10
15, 74-76
11
74-76
3
12
13
3
38, 87
15
13
50
43
28
38
9
43
90
14, 22, 62
9
63, 69
35, 37
38
12, 72
19
87
36
15
Гилажев А.И.
16
Гольцев А.Н.
60
Горячева Е.А.
55
Грецкая Н.М.
3
Гречихина М.В.
17
Гришин Е.В.
6, 63, 69
Гудилин Е.А.
61
Гурская Н.Г.
55
Гурьянов С.Г.
43
Гурьянова С.В.
18
Данилевич В.Н.
19
Данилкович А.В. 20, 82
Дементьева Д.В. 4
Демин Д.В.
80
Долгов С.В.
47, 48, 78, 84
Долудин Ю.В.
89
Дубровский Я.А. 13
Дьяченко О.В.
22
Дьячкова Л.Г.
17
Елисеева И.А.
43
Есипов Р.С.
23
Ефимов В.А.
7
Ефремов Р.Г.
35
Журавлева А.Е.
24
Завриев С.К.
63
Зайнобиддинов А.Э. 25, 26
Зайцева Ю.В.
27, 56
Захарченко Н.С.
14, 22
Зацепин Т.С.
61
Зимин А.А.
45, 70
Зинченко Г.Н.
3
Зяблицин А.В.
28
Иванов В.Т.
43
Ильницкая Е.В.
91
Канарский А.В.
90
Каневский Л.М.
33
Карлинский Д.М. 29
Карпов В.Л.
39
Кесаева Л.А.
40
Ким Е.Р.
43
Кирпичников М.П. 64
Клинкова А.В.
28
93
Клинов Д.В.
61
Клинова К.И.
30
Ковалевская Ж.И. 31
Коваленко Г.А.
79
Коваленко Е.И.
33, 44
Ковальчук С.И.
76
Кокряков В.Н.
13, 88, 92
Кокшарова О.А.
59
Колтунова А.А.
11
Комалева Р.Л.
69
Корнеенко Т.В.
34
Королькова Ю.В. 6
Коромыслова А.Д. 35
Костарева О.С.
36
Кочергинская П.Б. 61
Кретова О.В.
83
Кудряшова К.С.
37
Кузнецов А.Е.
56
Кузнецова Н.Р.
38
Кузьменко Ю.В.
39
Кузьменков А.И. 37
Кузьмичев С.А.
40
Куликова О.И.
42
Лаврова Н.В.
11
Ламан А.Г.
43
Лебедев В.Г.
90
Лебедева А.А.
14
Леонтьевский А.А. 90
Летарова М.А.
24
Липасова В.А.
59
Липкин В.М.
20, 82, 91
Лисов А.В.
90
Лукьянов К.А.
55
Луценко Г.В.
17, 44
Лысанская В.Я.
45
Люкманова Е.Н.
5
Лябин Д.Н.
43
Маклецова М.Г.
42
Марквичева Е.А. 81
Мартынов В.И.
55
Мельникова Д.Н. 15
Микулинская Г.В. 8, 45, 46
Минеев К.С.
15
Мирошниченко Д.Н. 47
Мисюрин А.В.
40
Митюшкина Т.Ю. 48, 84
Михайлова А.Г.
49
Моисеева Е.В.
50
Молотковский Ю.Г. 38
Мурашев А.Н.
81
Мушинская Е.В. 51
Назаров К.С.
4
Некрасов А.Н.
16
Некрасова О.В.
37
Новиков П.С.
90
Носкова М.Н.
74
Образцова Е.А.
61
Овчинников Л.П. 43
Овчинникова Т.В. 5, 15, 74-76
Одинокова И.В.
45
Озолиня Л.А.
11
Оккельман И.А.
52
Омельянюк Н.М. 58
Орлов Д.С.
51, 88, 92
Остров В.Ф.
53
Пантелеев П.В.
75
Парамонов А.С.
5
Патрушев Л.И.
11
Пестов Н.Б.
34, 54
Петрова Е.Э.
63, 69
Пиголева С.В.
14
Плетнев В.З.
55
Плетнева Н.В.
55
Плюта В.А.
56
Позилов М.К.
57
Покровская М.В. 58
Покровский В.С. 58
Полянский А.А.
35
Попов М.Е.
29
Попова А.А.
59
Порожан Е.А.
60
Прохоренко И.А. 61
Прудченко И.А.
81
Пучко Е.Н.
14, 62
Радченко В.В.
91
Решетилов А.Н.
79
Решетов П.Д.
4
Рихирева Г.Т.
42
Ришар К.
80
Родионов И.Л.
43
94
Романова А.В.
Руденко Н.В.
Рукавцова Е.Б.
Румш Л.Д.
Румянцев А.Г.
Рязанцев Д.Ю.
Савинов Г.В.
Салимов Б.Т.
Самсонова О.В.
Сапожников А.М.
Свердлов Е.Д.
Семушина С.Г.
Сизенёва Е.С.
Симонова М.А.
Скобликов Н.Э.
Скоблов Ю.С.
Скобцова Л.А.
Скрябин К.Г.
Слащёва Г.А.
Словохотов И.Ю.
Смирнов И.В.
Снопов С.А.
Соболев Е.В.
Соколов Н.Н.
Солонин А.С.
Стародубова Е.С.
Стволинский С.Л.
Степанова Е.В.
Степная О.А.
Суханов С.В.
Сычев С.В.
Таран С.А.
Таранов А.И.
Тарасенко И.В.
Тарлачков С.В.
Тимофеев А.В.
Тин У.Ф.
Тихонов Д.А.
Тищенко С.В.
Томашевская Л.Г.
Троянова Н.И.
Трубецкая О.Е.
Трубецкой О.А.
Трунова О.А.
Туховская Е.А.
61
62
14, 62
81
40
61, 63
43
25, 26
64
28, 44
65
50
67, 68
69
70
46
81
48
71
89
72
73
82
58
31
39
42
38
45
74, 75
76
46, 77
78, 84
84
22
39
36
82
36
79
28
80
80
42
81
Удовиченко И.П. 20, 82
Усманов П.Б.
25, 26
Устинов А.В.
61
Федосеева Д.М.
83
Фельдман Б.М.
81
Феофанов А.В.
37, 64
Феофанов С.А.
45, 46, 77
Филиппов И.В.
4
Финкина Е.И.
15
Фирсов А.П.
78, 84
Формановский А.А. 61
Хмель И.А.
27, 56, 59
Хушматов Ш.С.
25, 26
Чахмахчева О.Г.
7
Червоненкис А.Я. 16
Чернышов С.В.
85, 86
Чинарев А.А.
87
Чугунов А.О.
35
Чудаков Д.М.
55
Чулин А.Н.
31, 43
Чуриков Н.А.
83
Шалойко Л.А.
80
Шамова О.В.
88, 92
Шарыгин В.В.
42
Шахпаронов М.И. 34
Шевченко М.А.
18
Шевчук Т.В.
22
Шематорова Е.К. 89
Шенкарёв З.О.
5, 15
Шепеляковская А.О. 43
Шестибратов К.А. 90
Шилов И.А.
11
Шингарова Л.Н.
5
Шошина Н.С.
69
Шпаковский Г.В. 89
Шпаковский Д.Г. 89
Шуваева Т.М.
91
Шульга О.А.
48, 67, 68
Щенникова А.В. 48, 67, 68
Щепинов Ф.Б.
51
Эргашев Н.А.
57
Ямщикова Е.В.
88, 92
95
СОДЕРЖАНИЕ
ОТ АЦИЛДОФАМИНОВ К ПРОСТАМИДАМ: ЛИПИДНАЯ ВСЕЛЕННАЯ
ПРОДОЛЖАЕТ РАСШИРЯТЬСЯ
Акимов М.Г., Грецкая Н.М., Бобров М.Ю., Зинченко Г.Н., Безуглов В.В. .. 3
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ КОНЪЮГАТОВ Т- И В-ЭПИТОПОВ
БЕЛКОВ С ОЛИГОСАХАРИДАМИ ХИТОЗАНА
Алексеева Л.Г., Решетов П.Д., Филиппов И.В., Назаров К.С.,
Дементьева Д.В. ...................................................................................... 4
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТОКСИНА VSTx1 С ВОЛЬТСЕНСОРНЫМ ДОМЕНОМ ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО К+ КАНАЛА
KVAP МЕТОДАМИ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ
Алтухов Д.А., Парамонов А.С., Шенкарев З.О., Люкманова Е.Н.,
Шингарова Л.Н., Арсеньев А.С., Овчинникова Т.В. ................................. 5
ПОЛИПЕПТИДЫ С АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ИЗ МОРСКОЙ
АНЕМОНЫ HETERACTIS CRISPA
Андреев Я.А., Королькова Ю.В., Гришин Е.В. ......................................... 6
УДОБНЫЙ МЕТОД СИНТЕЗА ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ДНКМИМЕТИКОВ НА ОСНОВЕ 4-ГИДРОКСИПИРРОЛИДИН-2ФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ
Аралов А.В., Чахмахчева О.Г., Ефимов В.А. ........................................... 7
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АМИНОКОНЦА МЕТАКРИЛАТРЕДУКТАЗЫ
АНАЭРОБНОЙ БАКТЕРИИ GEOBACTER SULFURREDUCENS AM-1
Архипова О.В., Микулинская Г.В. ............................................................ 8
НЕОБХОДИМОСТЬ (p)ppGpp ДЛЯ ВЫЖИВАНИЯ ESCHERICHIA COLI ПРИ
ВОЗДЕЙСТВИИ ИНГИБИТОРОВ АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗ
Асеев Л.В., Былинкина Н.С., Бони И.В. ................................................... 9
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКПРЕССИЯ ГЕНА
L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ RHODOSPORIDIUM TORULOIDES
В E. COLI
Бабич О.О. ............................................................................................. 10
СТРУКТУРА ГЕНА CYP21A2, КОДИРУЮЩЕГО 21-ГИДРОКСИЛАЗУ, У
ПАЦИЕНТОК С ПРИЗНАКАМИ ГИПЕРАНДРОГЕНИИ: ВОЗМОЖНАЯ
РОЛЬ ГАПЛОТИПОВ ГЕНА В РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО
ФЕНОТИПА
Баранник А.П., Колтунова А.А., Озолиня Л.А., Лаврова Н.В.,
Шилов И.А., Патрушев Л.И. ................................................................. 11
ДЕГРАДАЦИЯ И ПРЕЗЕНТАЦИЯ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА ПРИ
АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЯХ
Белогуров А.А., Габибов А.Г. ................................................................. 12
96
NK-ЛИЗИН-ПОДОБНЫЙ ПЕПТИД ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕСЦА
ALOPEX LAGOPUS
Богомолова Е.Г., Берлов М.Н., Дубровский Я.А., Кокряков В.Н. ........... 13
ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ РАСТЕНИЙ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ
БИОТЕХНОЛОГИИ
Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Лебедева А.А.,
Пиголева С.В., Пучко Е.Н. ..................................................................... 14
ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩИХ БЕЛКОВ
ЧЕЧЕВИЦЫ
Гизатуллина А.К., Богданов И.В., Минеев К.С., Шенкарёв З.О.,
Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин С.В., Арсеньев А.С.,
Овчинникова Т.В. ................................................................................... 15
ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ МИНИМАЛЬНЫХ СТРУКТУРОФОРМИРУЮЩИХ ЭЛЕМЕНТОВ (SF-IU) БЕЛКОВ
Гилажев А.И., Червоненкис А.Я., Некрасов А.Н. .................................. 16
РОЛЬ АУТОКРИННОГО ФАКТОРА ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ В
РЕГУЛЯЦИИ ГЛИКОЛИЗА ПРИ ГИПОКСИИ
Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г., Луценко Г.В. ........................................ 17
МОДУЛИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ МУРАМИЛ ДИПЕПТИДА ПРИ
АЛЛЕРГИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
Гурьянова С.В., Шевченко М.А., Андронова Т.М. ................................. 18
СТРУКТУРА И УЛЬТРАСТРУКТУРА МИКРО- И НАНОЧАСТИЦ
КОНДЕНСИРОВАННОЙ ДНК, ОБРАЗУЮЩИХСЯ В ПЦР
Данилевич В.Н., Артемов В.В., Гайнутдинов Р.В. ................................ 19
О СПОСОБЕ КЛАССИФИКАЦИИ ПЕРВИЧНЫХ СТРУКТУР ПОЛИПЕПТИДОВ
Данилкович А.В., Удовиченко И.П., Липкин В.М. .................................. 20
ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ MESEMBRYANTHEMUM CRYSTALLINUM,
ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН БАКТЕРИАЛЬНОЙ
ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ EcoRII
Дьяченко О.В., Шевчук Т.В., Тарлачков С.В., Захарченко Н.С.,
Бурьянов Я.И. ........................................................................................ 22
СОЗДАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ
ПОЛИПЕПТИДОВ НА ОСНОВЕ ЭКСПРЕССИОННЫХ ИНТЕИНОВЫХ
СИСТЕМ
Есипов Р.С. ............................................................................................ 23
ПЛАЗМИДА pST-S1 ТЕРМОАЦИДОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ ПРИ
ЭКСТРЕМАЛЬНО ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ ЦИНКА В СРЕДЕ
Журавлева А.Е., Летарова М.А. ............................................................ 24
97
ЗАВИСИМОСТЬ АНТИАРИТМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ
ДИТЕРПЕНОВОГО АЛКАЛОИДА АТИЗИНА – 15-ГИДРОКСИАЗОМЕТИН
АТИЗИНА И 15-АЦЕТОКСИАЗОМЕТИН АТИЗИНА ОТ ИХ СТРУКТУРЫ
Зайнобиддинов А.Э., Хушматов Ш.С., Усманов П.Б., Cалимов Б.Т. .... 25
ДЕЙСТВИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО АЛКАЛОИДА 15-АЦЕТОКСИАЗОМЕТИН
АТИЗИНА НА ТРАНСПОРТ Са2+ В САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОМ
РЕТИКУЛУМЕ КАРДИОМИОЦИТОВ КРЫСЫ
Зайнобиддинов А.Э., Хушматов Ш.С., Усманов П.Б., Cалимов Б.Т. .... 26
QS СИСТЕМА LuxI/LuxR ТИПА У SERRATIA PROTEAMACULANS 94
Зайцева Ю.В., Хмель И.А. ..................................................................... 27
СТРЕСС СТИМУЛИРУЕТ ЭКЗОЦИТОЗ БТШ70 В ПОПУЛЯЦИЯХ КЛЕТОК
ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
Зяблицин А.В., Алекперов Э.А., Бойко А.А., Клинкова А.В.,
Троянова Н.И., Сапожников А.М. ......................................................... 28
ПОИСК НЕИЗВЕСТНОГО САЙТА СВЯЗЫВАНИЯ – ДОКИНГ ПРИХОДИТ НА
ПОМОЩЬ QSAR
Карлинский Д.М., Попов М.Е. ............................................................... 29
ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОДУКЦИЯ ГОМОЛОГА ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ ИЗ
ТЕРМОФИЛЬНОЙ ЭУБАКТЕРИИ TRUEPERA RADIOVITRIX
Клинова К.И. ......................................................................................... 30
ИНГИБИТОРЫ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ
Ковалевская Ж.И., Чулин А.Н., Солонин А.С. ....................................... 31
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА NK-КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ
КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
Коваленко Е.И., Каневский Л.М. ........................................................... 33
МАТРИЦИД У CAENORHABDITIS ELEGANS КАК ПРИМЕР
ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ ЖИВОТНОГО ОРГАНИЗМА: РОЛЬ
МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Корнеенко Т.В., Шахпаронов М.И., Пестов Н.Б. .................................. 34
АСИММЕТРИЯ ГИДРОФОБНЫХ СВОЙСТВ ПОВЕРХНОСТИ -ТОКСИНОВ
СКОРПИОНОВ
Коромыслова А.Д., Василевский А.А., Полянский А.А., Чугунов А.О.,
Ефремов Р.Г. .......................................................................................... 35
ПОЛУЧЕНИЕ GoLocoI ФРАГМЕНТА БЕЛКА Pins ИЗ ДРОЗОФИЛЫ
Костарева О.С., Тин У.Ф., Тищенко С.В., Гарбер М.Б. ........................ 36
НОВАЯ СИСТЕМА ПОИСКА ЛИГАНДОВ КАЛИЕВОГО КАНАЛА Kv1.3
Кудряшова К.С., Кузьменков А.И., Василевский А.А., Некрасова О.В.,
Феофанов А.В. ....................................................................................... 37
АНТИАНГИОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛИПОСОМ С
ЛИПОФИЛЬНЫМИ ПРОЛЕКАРСТВАМИ И УГЛЕВОДНЫМ ЛИГАНДОМ
СЕЛЕКТИНОВ
Кузнецова Н.Р., Степанова Е.В., Болдырев И.А., Бовин Н.В.,
Молотковский Ю.Г., Водовозова Е.Л. ................................................... 38
ВЛИЯНИЕ СИГНАЛОВ ПРОТЕАСОМНОГО ПРОЦЕССИНГА НА
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НЕСТРУКТУРНОГО БЕЛКА NS1 ВИРУСА
КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В КЛЕТКЕ
Кузьменко Ю.В., Стародубова Е.С., Тимофеев А.В., Карпов В.Л. ....... 39
ФРАГМЕНТЫ ГЕНОВ PRV-1 И Jak-2 В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПРИ
МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (МПЗ)
Кузьмичев С.А., Аксенова Е.В., Кесаева Л.А., Мисюрин А.В.,
Румянцев А.Г. ........................................................................................ 40
ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ НА СОСТОЯНИЕ ТКАНЕЙ МЫШЕЙ ЛИНИЙ SAMR И
SAMP, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ РАЗНЫМИ ТЕМПАМИ СТАРЕНИЯ
Куликова О.И., Рихирева Г.Т., Трунова О.А., Шарыгин В.В.,
Стволинский С.Л., Маклецова М.Г. ...................................................... 42
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕПТИДНОГО
МИМЕТИКА ГМДП. ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНЫХ МИШЕНЕЙ
Ламан А.Г., Савинов Г.В., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М.,
Бровко Ф.А., Родионов И.Л., Чулин А.Н., Елисеева И.А., Ким Е.Р.,
Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П., Лябин Д.Н., Иванов В.Т. .................... 43
НОВЫЙ ЦИТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД РЕГИСТРАЦИИ АПОПТОЗА С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРОФОРА 10-N-НОНИЛ-АКРИДИНОВОГО
ОРАНЖЕВОГО
Луценко Г.В., Коваленко Е.И., Сапожников А.М. ................................. 44
ЭНДОЛИЗИН БАКТЕРИОФАГА Т5: НОВАЯ МЕТАЛЛОПЕПТИДАЗА
СЕМЕЙСТВА М15
Микулинская Г.В., Одинокова И.В., Зимин А.А., Лысанская В.Я.,
Феофанов С.А., Степная О.А. .............................................................. 45
ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ АКТИВНОГО ЦЕНТРА
ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДМОНОФОСФАТКИНАЗЫ БАКТЕРИОФАГА Т5
МЕТОДОМ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
Микулинская Г.В., Таран С.А., Скоблов Ю.С., Феофанов С.А. ............. 46
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ПШЕНИЦА: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СОВРЕМЕННОМ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОМ
ПРОИЗВОДСТВЕ
Мирошниченко Д.Н., Долгов С.В. .......................................................... 47
УЧАСТИЕ ГЕНОВ, ГОМОЛОГИЧНЫХ АРETALA1, В РЕГУЛЯЦИИ
ИНИЦИАЦИИ ЦВЕТЕНИЯ У АСТРОВЫХ
Митюшкина Т.Ю., Шульга О.А., Щенникова А.В., Скрябин К.Г.,
Долгов С.В. ............................................................................................ 48
98
99
ПРОБЛЕМЫ ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПРОТЕИНАЗ
ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ. ВИДОВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ
ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ
Михайлова А.Г. ...................................................................................... 49
ОСОБЕННОСТИ НОВОЙ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ ПАРАДИГМЫ В
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИММУНООНКОЛОГИИ: КОНЦЕПЦИЯ "3С"
Моисеева Е.В., Семушина С.Г., Боженко В.К. ...................................... 50
ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ
АНАЛОГОВ ИНДОЛИЦИДИНА
Мушинская Е.В., Щепинов Ф.Б., Орлов Д.С. ......................................... 51
ПОИСК БЕЛКОВ-ПАРТНЕРОВ ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ В СИСТЕМЕ
ДВУГИБРИДНОГО СКРИНИНГА
Оккельман И.А. ...................................................................................... 52
ЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БТШ70
ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СЕПСИСЕ У КРЫС
Остров В.Ф. .......................................................................................... 53
ЛИЗИЛОКСИДАЗА – ПЕРСПЕКТИВНАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ
АНТИМЕТАСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Пестов Н.Б. ........................................................................................... 54
ФОТОТОКСИЧНЫЙ КРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК KillerRed.
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА НА АТОМНОМ УРОВНЕ
Плетнев В.З., Гурская Н.Г., Плетнева Н.В., Горячева Е.А.,
Мартынов В.И., Чудаков Д.М., Лукьянов К.А. ..................................... 55
ВЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ФЕНОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ НА СИНТЕЗ
СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ QUORUM SENSING СИСТЕМ
И ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНОК У БАКТЕРИЙ
Плюта В.А., Зайцева Ю.В., Кузнецов А.Е., Хмель И.А. ........................ 56
ИОН-ТРАНСПОРТИРУЮЩАЯ СИСТЕМА МЕМБРАН МИТОХОНДРИЙ ПРИ
АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ
Позилов М.К., Эргашев Н.А., Асраров М.И. .......................................... 57
РЕКОМБИНАНТНАЯ L-АСПАРАГИНАЗА RHODOSPIRILLUM RUBRUM
Покровский В.С., Покровская М.В., Омельянюк Н.М.,
Александрова С.С., Соколов Н.Н. .......................................................... 58
ЛЕТУЧИЕ ВЕЩЕСТВА ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА
РАЗЛИЧНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
Попова А.А., Липасова В.А., Кокшарова О.А., Хмель И.А. ................... 59
КОРРЕКЦИЯ СОСТОЯНИЯ ТИМУСА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫМИ
ФЕТАЛЬНЫМИ НЕРВНЫМИ КЛЕТКАМИ ПРИ РАЗВИТИИ
НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ АУТОИММУННОЙ
ПРИРОДЫ
Порожан Е.А., Гольцев А.Н. ................................................................. 60
100
МНОГОЦЕНТРОВАЯ ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ КВАНТОВЫХ ТОЧЕК ДЛЯ
ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ КОНЪЮГАТОВ С ДНК
Прохоренко И.А., Кочергинская П.Б., Романова А.В., Образцова Е.А.,
Клинов Д.В., Устинов А.В., Зацепин Т.С., Рязанцев Д.Ю., Гудилин Е.А.,
Формановский А.А. ................................................................................ 61
ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ –
ПРОДУЦЕНТОВ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В
Рукавцова Е.Б., Пучко Е.Н., Руденко Н.В., Бурьянов Я.И. .................... 62
ДЕТЕКЦИЯ ТОКСИНА VIBRIO CHOLERAE МЕТОДОМ ИММУНО-ПЦР С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСФЕР
Рязанцев Д.Ю., Петрова Е.Э., Валякина Т.И., Гришин Е.В.,
Завриев С.К. .......................................................................................... 63
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА БАКТЕРИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ ЛАТАРЦИНА
LTC5
Самсонова О.В., Феофанов А.В., Кирпичников М.П. ............................ 64
ПОДХОДЫ К ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ХИРУРГИИ РАКА
Свердлов Е.Д. ........................................................................................ 65
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ MADS-БОКС ГЕНА НАМ59
ПОДСОЛНЕЧНИКА В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА
Сизенёва Е.С., Щенникова А.В., Шульга О.А. ....................................... 67
РОЛЬ ГОМЕОЗИСНОГО MADS-ГЕНА CDM37 ХРИЗАНТЕМЫ В
МОРФОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ
Сизенёва Е.С., Щенникова А.В., Шульга О.А. ....................................... 68
ПРИМЕНЕНИЕ ТЕХНОЛОГИИ xMAP В РАЗРАБОТКЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ
ИММУНО-ХИМИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ БЕЛКОВЫХ ТОКСИНОВ
Симонова М.А., Валякина Т.И., Петрова Е.Э., Комалева Р.Л.,
Шошина Н.С., Гришин Е.В. .................................................................. 69
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАНСДУЦИРУЮЩИХ
БАКТЕРИОФАГОВ E.COLI ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПОСТ-ОТЪЁМНОЙ
ДИАРЕИ ПОРОСЯТ
Скобликов Н.Э., Зимин А.А. ................................................................... 70
СТРЕСС-БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА БТШ70 – ПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО ОТ
ЭНДОТОКСИНОВОГО ШОКА
Слащёва Г.А. .......................................................................................... 71
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕГРАДАЦИИ
ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
Смирнов И.В., Габибов А.Г. ................................................................... 72
КЛЕТОЧНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ИНФЕКЦИОННОМ
ОТВЕТЕ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ УФ ОБЛУЧЕНИЙ В СУБЭРИТЕМНЫХ
ДОЗАХ
Снопов С.А. ........................................................................................... 73
101
ВЛИЯНИЕ ЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН НА ИНДУЦИРУЕМУЮ
АРЕНИЦИНАМИ ПРОВОДИМОСТЬ БЛМ
Суханов С.В., Баландин С.В., Носкова М.Н., Барсуков Л.И.,
Овчинникова Т.В. ................................................................................... 74
ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ACIP-1 И АУРЕЛИНА НА ПРОВОДИМОСТЬ
БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН (БЛМ) РАЗЛИЧНОГО СОСТАВА
Суханов С.В., Пантелеев П.В., Баландин С.В., Барсуков Л.И.,
Овчинникова Т.В. ................................................................................... 75
АРЕНИЦИН-2 ИНДУЦИРУЕТ ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ПЕРЕНОС ПРОТОНОВ
ПРИ НИЗКИХ ГРАДИЕНТАХ рН
Сычев С.В., Баландин С.В., Ковальчук С.И., Барсуков Л.И.,
Овчинникова Т.В. ................................................................................... 76
ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ НУКЛЕОЗИДОВ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫМИ
НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗАМИ GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS
Таран С.А., Феофанов С.А. ................................................................... 77
КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В РАСТЕНИЯХ РЯСКИ МАЛОЙ
(LEMNA MINOR L.) ГИРУДИНА
Таранов А.И., Фирсов А.П., Долгов С.В. ................................................ 78
МОЩНОСТЬ МАКЕТА МИКРОБНОГО БИОТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА НА
ОСНОВЕ КЛЕТОК GLUCONOBACTER, УТИЛИЗИРУЮЩИХ ГЛИЦЕРИН
Томашевская Л.Г., Коваленко Г.А., Решетилов А.Н. ............................. 79
СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЙ КОМПЛЕКС ПРИРОДНЫХ ГУМИНОВЫХ
ВЕЩЕСТВ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ
Трубецкая О.Е., Шалойко Л.А., Ришар К., Демин Д.В., Трубецкой О.А. .... 80
ЭФФЕКТЫ ДСИП ПРИ ФОКАЛЬНОМ ИНСУЛЬТЕ У КРЫС CD
Туховская Е.А., Скобцова Л.А., Мурашев А.Н., Прудченко И.А.,
Румш Л.Д., Фельдман Б.М., Марквичева Е.А. ....................................... 81
ОСОБЕННОСТИ САМООРГАНИЗАЦИИ ПЕПТИДОВ В ФИЛАМЕНТНЫЕ
СТРУКТУРЫ
Удовиченко И.П., Соболев Е.В., Тихонов Д.А., Данилкович А.В.,
Липкин В.М. ........................................................................................... 82
СОЗДАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОТЕРАПИИ СПИДа С ПОМОЩЬЮ
РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ: ИСПЫТАНИЕ КАССЕТНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ
КОНСТРУКЦИЙ, ПОРАЖАЮЩИХ НЕСКОЛЬКО МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ
ВИЧ-1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНИЦИИРУЮЩИХ КОДОНОВ ГЕНА speA ДЛЯ
ИЗУЧЕНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ
Чернышов С.В. ...................................................................................... 85
КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ pPF1 ДЛЯ
ФУНКЦИОНАЛЬНОГО АНАЛИЗА ДИВЕРГЕНТНЫХ ПРОМОТОРОВ
Чернышов С.В. ...................................................................................... 86
ГЛИКОПОЛИМЕРЫ С КОНЦЕВЫМИ БИОТИНОВЫМИ ГРУППАМИ.
СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ
Чинарев А.А., Галанина О.Е., Бовин Н.В. .............................................. 87
ВЛИЯНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СЕМЕЙСТВА
КАТЕЛИЦИДИНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ
СПЛЕНОЦИТОВ
Шамова О.В., Ямщикова Е.В., Орлов Д.С., Кокряков В.Н. ................... 88
НОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ И ИХ РОЛЬ В
ВОЗНИКНОВЕНИИ И ЭВОЛЮЦИИ РОДА HOMO
Шематорова Е.К., Шпаковский Д.Г., Долудин Ю.В., Словохотов И.Ю.,
Шпаковский Г.В. .................................................................................... 89
ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ ОСИНЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ
МЕТАБОЛИЗМОМ АЗОТА
Шестибратов К.А., Булатова И.В., Лебедев В.Г., Лисов А.В.,
Леонтьевский А.А., Канарский А.В., Новиков П.С. .............................. 90
НОВЫЙ ХИТОЛЕКТИН КРЫСЫ В ЖИВОТНЫХ МОДЕЛЯХ С СИНДРОМОМ
СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА
Шуваева Т.М., Ильницкая Е.В., Радченко В.В., Липкин В.М. ................ 91
ВЛИЯНИЕ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА БАКТЕНЕЦИНА 5 ИЗ
ЛЕЙКОЦИТОВ КОЗЫ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ
ЧЕЛОВЕКА, А ТАКЖЕ НА ПРОЦЕСС РАНОЗАЖИВЛЕНИЯ У
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
Ямщикова Е.В., Орлов Д.С., Кокряков В.Н., Шамова О.В. ................... 92
АВТОРСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ ............................................................................................ 93
СОДЕРЖАНИЕ .................................................................................................................. 96
Федосеева Д.М., Кретова О.В., Алембеков И.Р., Чуриков Н.А. ............ 83
РАЗРАБОТКА СЪЕДОБНЫХ ВАКЦИН МЕДИЦИНСКОГО И ВЕТЕРИНАРНОГО
НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПЛАТФОРМ НА ПРИМЕРЕ
ПЕПТИДА М2е ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ
Фирсов А.П., Тарасенко И.В., Митюшкина Т.Ю., Таранов А.И.,
Долгов С.В. ............................................................................................ 84
102
103
Компьютерная верстка: Т.И. Яковлева
Отпечатано на полиграфическом участке ИБХ РАН
Печать офсетная. Печ. л. 6,0. Тираж 100 экз.
©Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической
химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Москва, 2011 г.
104