Диссертационная работа Отарбаева М
advertisement
Казахский национальный университет им. аль-Фараби УДК: 57.089.36 На правах рукописи ОТАРБАЕВ МАРАТ КАЛДЫБАЕВИЧ Исследование процессов ангиогенеза овариальной ткани человека после криоконсервации и трансплантации 6D060700 - Биология Диссертация на соискание ученой степени доктора философии (PhD) Отечественный научный руководитель д.б.н., профессор Шалахметова Т.М. (КазНУ им. аль-Фараби) Зарубежный научный руководитель PhD, Владимир Исаченко (Кельнский университет, г. Кельн, Германия) Республика Казахстан Алматы, 2014 Работа выполнена на кафедре биоразнообразия и биоресурсов Казахского национального университета имени аль-Фараби (Алматы, Казахстан) и в научно-исследовательском отделении репродуктивной медицины Кельнского университета (Кельн, Германия). Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Шалахметова Т.М.; доктор философии (Ph.D.), профессор Исаченко Владимир; Официальные рецензенты: Тойшибеков Ержан Макенович Заместитель директора Института экспериментальной биологии им. Ф. М. Мухамедгалиева, д.б.н., Всеволодов Эдуард Борисович главный научный сотрудник Института общей генетики и цитологии, д.б.н., профессор Защита диссертации состоится «29» декабря 2014 года в 10:00 ч. на заседании диссертационного совета 6D060000 при Казахском Национальном Университете имени аль-Фараби по адресу: г. Алматы, п-т. Аль-Фараби, 71, корпус № 6 (ГУК), зал заседаний ученого совета факультета биологии и биотехнологии, ауд. 214. С диссертацией можно ознакомиться в национального университета имени аль-Фараби 2 библиотеке Казахского СОДЕРЖАНИЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ……………………….…... ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………. 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………. 1.1 Анатомия женской репродуктивной системы………...……............ 1.2 Гистология яичников……………………….…………….…………. 1.3 Онтогенез и физиология яичников ………………...………………. 1.4 Современное состояние заболеваемости раком в мире и Казахстане …………………………………….……………………... 1.5 Сохранение репродуктивной функции в пост-раковом периоде ... 1.6 Морфологические характеристики ооцитов……………………….. 1.6.1 Экстрацитоплазматические аномалии ооцита…………………….. 1.6.2 Интрацитоплазматические аномалии ооцита……………………… 1.7 Отротопическая и гетеротопическая трансплантация овариальной ткани…………………………………………………………………... 1.8 Ангиогенез и его особенности…………………………………...…. 1.8.1 Ангиогенез в женской репродуктивной системе………………….. 1.8.2 Использование маркеров и хориоаллантоисной мембраны для исследования процессов ангиогенеза………………………………. 1.9 Трансплантация целого яичника…………………………………… 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ……………... 2.1 Объекты и условия исследований …………………...…………….. 2.2 Исследование морфологических характеристик ооцитов в криоциклах…………………………………………………………… 2.3 Исследование овариальной ткани человека.……………....….…… 2.3.1 Забор и иссечение ткани…………………………………………….. 2.3.2 Криоконсервация овариальной ткани……………………………… 2.3.3 Оттаивание овариальной ткани……………………………………... 2.3.4 In vitro культивирование ОФ………………………………………... 2.3.5 САМ-культивирования ОФ – технология Ксенотрансплантации... 2.3.5.1 Общая информация про САМ-культивирование………………….. 2.3.5.2 Протокол САМ-культивирования………………………………….. 2.3.5.3 Подготовка к гистологии…………………………..…………..……. 2.3.6 Гистологическое исследование………………………………...…… 2.3.7 Иммуногистология для исследования ангиогенеза………….……. 2.4 Исследование условий перфузии целых яичников………………... 2.4.1 Получение и подготовка яичников к перфузии…………...……….. 2.4.2 Оценка перфузия яичников с разной скоростью и интервалом начала………………………………………………………………… 2.5 Статистический анализ……………………………………………… 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ …. 3.1 Исследование морфологических характеристик ооцитов в криоциклах............................................................................................ 3.2 Исследование эффективности технологии криоконсервации 3 5 6 10 10 12 13 17 20 22 23 25 28 30 33 34 37 39 39 39 40 40 40 42 44 44 44 45 51 53 54 54 54 55 55 56 56 3.3 3.4 3.5 3.6 овариальной ткани................................................................................ Иммуногистология для ангиогенеза и неоангиогенеза…..……….. Исследование инициации процесса ангиогенеза и влияния фазы менструального цикла на ангиогенную активность ткани............... Исследование перфузии интактного коровьего яичника как модели человека................................................................................... Исследование перфузии интактного овечьего яичника как модели человека................................................................................................. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………………………………………….... СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ …………... 4 61 67 70 73 82 85 87 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ A CAM EGFR flk-1 GV KDR MAPK MI MII NRP PBS PI3K PLGF PTEN SSS VEGF VHL ZP ВКМ ВРТ ГЭР ДМСО ЗН ЗО ИКСИ ИЯ КТЯ МАИР ОФ РНК СИЯ ТОТ ТЯ УЗИ ФВ ХГ ЦНС ЭГ ЭКО ЭР Я – ангиогенез – хорион-аллантоисная-мембрана – фактор роста эпидермиса – fetalliverkinase 1 – герминальная визикула – kinase-insert domain–containing receptor – митоген-активированной протеин киназы – метафаза I – метафаза II – нейропилина – фосфатный буфер – фосфатидилинозитол 3'–киназа – плацентарный ростовой фактор – гомолог фосфатазыитензина – SerumSubstituteSupplement – фактор роста эндотелия сосудов – вонГиппель-Ландау – зона пеллюцида – внеклеточный матрикс – вспомогательнымирепродуктивными технологиями – гладкий эндоплазматический ретикулум – диметилсульфоксид – злокачественные новообразования – злокачественные опухоли – интроцитоплазматическая инъекция единичного сперматозоида – инкубационные яйца – криоконсервация ткани яичников – Международное агентство по исследованию рака – овариальные фрагменты – Рибонуклеиновая кислота – синдроме истощѐнных яичников – трансплантация овариальной ткани – ткань яичника – ультразвуковое исследование – Фактор Виллебранда – хорионический гонадотропин – центральная нервная система – этиленгликоль – экстракорпоральное оплодотворение – эндоплазматический ретикулум – яичники 5 ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена изучению процессов ангиогенеза овариальной ткани человека после криоконсервации и трансплантации Актуальность темы. В настоящее время интенсивно развиваются методы сохранения генетического материала человека для отсроченной реализации репродуктивной функции. Предпосылкой к началу исследований в этой области стали успехи современной онкологии, позволившие значительно повысить показатель выживаемости после лечения. Значительную долю онкологических больных, прошедших противоопухолевое лечение, составляют лица репродуктивного возраста и дети, рассчитывающие на высокую продолжительность и качество жизни. Согласно результатам эпидемиологических прогнозов в США в 2010 г. каждый двухсотый человек имел в анамнезе успешно излеченное в детском возрасте онкологическое заболевание. В Казахстане смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в структуре смертности населения. Ежегодно от рака умирает порядка 17 тысяч человек, из которых 42% - лица трудоспособного возраста. Показатель смертности от злокачественных новообразований за последние пять лет в Казахстане также снизился. Доказан тот факт, что репродуктивная функция пациентов, лечившихся по поводу злокачественных новообразований, существенно страдает из-за высокой гонадотоксичности современной лучевой и химиотерапии. Воздействие радиации и противоопухолевых препаратов на репродуктивную систему женщины приводит к уменьшению овариального резерва и развитию синдрома преждевременного истощения яичников, в конечном итоге приводящего к бесплодию. Поэтому создание криобанка яичниковой ткани в целях сохранения генетического материала для отсроченной реализации репродуктивной функции и преодоления бесплодия, вызванного как самим бластоматозным процессом, так и противоопухолевым лечением, считается важным этапом комплексного подхода к оказанию медицинской помощи пациентам со злокачественными новообразованиями. Одним из перспективных экспериментальных методов считается криоконсервация яичниковой ткани, существенным преимуществом которой является возможность сохранить большое количество примордиальных и первичных фолликулов и выполнить забор ткани в любую фазу менструального цикла. Кроме того, это единственный метод, позволяющий сохранить генетический материал при детской онкологии. Основной причиной атрофии функциональной активности яичниковой ткани после криоконсервации и трансплантации является ишемия трансплантата. Ишемия способна привести к гибели более трети примордиальных фолликулов. Поэтому для восстановления репродуктивного потенциала очень важно сокращение временного интервала ишемии и 6 ускорение реваскуляризации трансплантатов. В этой связи исследование процессов ангиогенеза имеет актуальное значение для выполнения успешной процедуры криоконсервации и трансплантации овариальной ткани. Цель и задачи исследования: целью работы явилось исследование процессов ангиогенеза овариальной ткани человека после криоконсервации путем медленного замораживания и ксенотрансплантации. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: изучить морфологические особенности ооцитов человека при криоконсервации; установить характер индукции и особенностей процесса ангиогенеза при ксенотрансплантации (САМ-культивировании); исследовать ангиогенную активность овариальной ткани человека после криоконсервации и размораживания, а также кратковременного культивирования; оценить характер неоангиогенеза овариальной ткани человека при САМ-культивировании; выявить условия перфузии целого яичника коровы и овцы, как модели возможной криоконсервации яичников человека. Объект исследования: ооциты человека как производные овариальной ткани, яичниковая ткань человека, а также целые яичники коровы и овцы, как модельные объекты. Предмет исследования: ангиогенез овариальной ткани человека после криоконсервации и трансплантации. Методология диссертационной работы базируется на цитологических и гистологических исследованиях, основанных на использовании методов: световой микроскопии, криоконсервации и размораживания, in vitro культивирования, САМ-культивирования, перфузии, гистологии и иммуногистохимии. Научная новизна диссертационной работы заключается в применении комплексного подхода в исследовании процессов ангиогенеза при криоконсервации овариальной ткани человека, выявлении особенностей инициации и характера нео-ангиогенеза, а также условий проведения успешной перфузии интактных яичников в целях криоконсервации целого органа. Теоретическое значение диссертационной работы заключается в установлении морфологических особенностей ооцитов человека при криоконсервации, позволяющее глубже понять характер взаимодействия внеи внутриклеточных структур при диффузии криопротекторов, а также воздействии криогенных температур. Выявленные особенности инициации процессов ангиогенеза в условиях in vivo, характер нео-ангиогенеза и различная ангиогенная активность овариальной ткани в зависимости от биологических циклов женщины, расширяют наши знания о закономерностях процессов ангиогенеза в овариальной ткани человека. Результаты настоящего исследования значительно расширяют границы 7 сохранения репродуктивного потенциала у женщин разного возраста и состояния соматического здоровья. Практическое значение диссертационной работы заключается в том, что полученные результаты позволяют прогнозировать успешность циклов криоконсервации ооцитов человека, оценивать потенциал овариальной ткани для трансплантации, а также определить фазу забора ткани с наибольшей ангиогенной активностью для облегчения проблем ишемии трансплантатов. Кроме того, выявленные условия эффективной перфузии яичников коровы и овцы в целях криоконсервации и дальнейшей трансплантации целого органа, могут стать основой для разработки методов сохранения и восстановления репродуктивной функции человека. Полученные материалы могут быть включены в курсы лекций по эмбриологии, физиологии, онтогенезу, репродуктологии, трансплантологии и криобиологии для студентов, магистрантов и докторантов высших учебных заведений медицинского биологического профиля. Основные положения, выносимые на защиту: криотолерантность ооцитов человека зависит от экстра- и интрацитоплазматических аномалий; индуктором процесса ангиогенеза при САМ-культивировании овариальной ткани человека является жизнеспособная ткань, прошедшая этапы криоконсервации и размораживания; ангиогенная активность овариальной ткани человека зависит от фазы менструального цикла; неоангиогенез в овариальной ткани человека в поздней лютеиновой фазе менструального цикла не выявлен; успешная перфузия целых яичников коров и овец проходит при использовании замораживающего раствора при комнатной температуре со скоростью перфузии 25-50 мл/час и времени начала перфузии не более 3 часов. Связь работы с научно-исследовательскими программами. Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательской программы Института репродукции человека и эмбриологии «Криоконсервация гамет и эмбрионов человека», 2011-2014 годы. Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации были доложены и представлены на различных международных и республиканских научных конференциях: «Гигиена, эпидемиология и иммунобиология» №3 (53) (Алматы, Казахстан, 2012 год); Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы физиологии, биофизики и медицины», посвященная 75-летию основания научных школ по физиологии человека и животных и биофизике и 80-летию Казахского Национального университета имени аль-Фараби (Алматы, Казахстан, 2013 год); Международная научная конференция студентов и молодых ученных «Фараби әлемі» посвященная 80-летию КазНУ им. аль-Фараби (Алматы, Казахстан, 2014 год); Вестник КазНУ, серия биологическая №2 (61) 8 (Алматы, Казахстан, 2014 год); XXIV Международная конференция Российской Ассоциации Репродукции Человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Ярославль, Россия, 2014 год); «Clinical Laboratory» №59 (Mainz, Germany, 2013year); «BioMed Research International» 2014 (NewYork, USA, 2014 year). Публикации. Основные положения, результаты, выводы и заключения диссертации изложены в 12 печатных работах, из них 2 статьи в международном научном журнале, входящем в базу данных ThompsonScientific, Scopus с импакт фактором;4 статьи в журналах Республики Казахстан, рекомендованных ККСОН МОН РК; 2 тезиса в материалах международных конференций ближнего зарубежья (Россия); 4 тезиса в материалах международной конференции РК. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение в 6 разделах, заключение. Список использованных источников из 196 наименований, работа содержит 50 рисунков, 5 таблиц. 9 1 1.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Анатомия женской репродуктивной системы Яичники (ovaria) — парная женская половая железа, расположенная в полости малого таза. Яичник взрослой женщины (рисунок 1) имеет овальную форму, длину 2,5-3,5 см, ширину 1,5-2,5 см, толщину 1-1,5 см, массу 5-8 г. Правый яичник всегда больше левого. Медиальная поверхность яичника обращена в сторону полости малого таза, латеральная — соединена связкой, подвешивающей яичник с боковой стенкой малого таза. Рисунок – 1 Схематическое изображение яичников, маточных труб, матки и влагалища (вид сзади; левые яичник и маточная труба, левая половина матки и влагалища вскрыты, брюшина справа между маточной трубой и яичником частично удалена): 1 - свободный край яичника; 2 - строма яичника; 3 брыжеечный край яичника, 4 - трубный конец яичника; 5 - придаток яичника (epoophoron); 6 - брыжейка маточной трубы; 7 - маточный конец яичника; 8 дно матки; 9 - собственная связка правого яичника; 10 - яичниковая ветвь маточной артерии; 11 - маточная труба; 12 - нервные волокна, иннервирующие яичник; 13 - яичник; 14 - связка, подвешивающая яичник; 15- яичниковые артерия и вены; 16 - маточные артерия и вены; 17 влагалище; 18 - шейка матки; 19 - широкая связка матки. 10 Задний край яичника свободный, передний — брыжеечный — фиксирован складкой брюшины (брыжейкой яичника) к заднему листку широкой связки матки. Большая часть яичника брюшиной не покрыта. В области брыжеечного края яичника имеется углубление, через которое проходят сосуды и нервы — ворота яичника. Один конец яичника (трубный) подходит к воронке маточной трубы, другой (маточный) соединен с маткой собственной связкой яичнника. Рядом с яичником между листками широкой связки матки находятся рудиментарные образования — придаток яичника. (epoophoron) и околояичник (paroophoron) [9]. Кровь в яичники поступает из яичниковых артерий (ветвей брюшной части аорты) и яичниковых ветвей маточных артерий. Венозная кровь оттекает по одноименным венам, правая яичниковая вена впадает в нижнюю полую вену, левая — в левую почечную вену. Лимфоотток осуществляется в поясничные и крестцовые лимфатические узлы. Яичник иннервируются из спинномозговых узлов нижнегрудных и поясничных сегментов, брюшного аортального и нижнего подчревных сплетений [10]. Рисунок 2 – Схематическое изображение микроскопического строения яичника: 1-примордиальные фолликулы; 2-преантральные фолликулы; 3строма яичника; 4-антральный фолликул; 5-атретический фолликул; 6преовуляторный фолликул; 7-овуляция; 8-формирующееся желтое тело; 9зрелое желтое тело; 10-покровный эпителий; 11-беловатое тело; 12кровеносные сосуды в воротах яичника. 11 1.2 Гистология яичников В зрелом яичнике выделяют три четко разграниченные части: ворота, корковое и мозговое вещество. В области ворот яичника вокруг кровеносных и лимфатических сосудов, нервных стволов располагаются соединительнотканные элементы, сеть яичника и хилусные клетки, секретирующие андрогены. К воротам яичника примыкает мозговое вещество, состоящее из рыхлой соединительной ткани, окружающей сосуды и нервы. Рисунок 3 – Различные стадии развития фолликула яичника: апримордиальный фолликул; б-преантральный фолликул; в-антральный фолликул; г-преовуляторный фолликул (1-ооцит, 2-гранулезные клетки; 3базальная мембрана; 4-текаклетки). Над ним находится корковое вещество, занимающее 2/3 объема яичника. Оно окружено соединительнотканной белочной оболочкой и покровным эпителием целомического происхождения. Строму коркового вещества образуют соединительнотканные элементы и интерстициальные клетки, 12 секретирующие андрогены. В ней располагаются фолликулы, различной степени зрелости и атретические, желтые и беловатые тела (рисунок 2). В соответствии со стадией развития различают примордиальные, преантральные (первичные), антральные (вторичные) и преовуляторные (третичные) фолликулы (рисунок 3). Примордиальные фолликулы имеют диаметр 50 мкм и состоят из ооцита I порядка — яйцеклетки, вступившей в профазу I мейотического деления — и окружающего его слоя гранулезных клеток. В преантральных фолликулах диаметром 150-200 мкм ооцит I порядка окружен 2-4 слоями гранулезных клеток, расположенных на базальной мембране, вокруг которой находятся единичные текаклетки. Антральные (вторичные, большие зреющие) фолликулы диаметром 500 мкм имеют содержащую фолликулярную жидкость полость, в которую вдается яйценосный бугорок — ооцит I порядка и окружающие его гранулезные клетки. Число слоев гранулезных клеток в антральных фолликулах больше, чем в преантральных, вокруг базальной мембраны располагается несколько слоев текаклеток. В преовуляторных фолликулах (граафовых), средний диаметр которых равен 20 мм, яйценосный бугорок расположен эксцентрично, гранулезные клетки гипертрофированы, содержат липидные включения, слой текаклеток васкуляризирован. Количество фолликулярной жидкости в преовуляторном фолликуле в 100 раз больше, чем в антральном. В стенке преовуляторного фолликула образуется бессосудистое выпячивание (так называемая стигма), которое разрывается, и яйцеклетка выбрасывается в брюшную полость — овуляция. Во время овуляции заканчивается I мейотическое деление яйцеклетки — образуется ооцит II порядка. Созревание яйцеклетки завершается после окончания II мейотического деления в момент оплодотворения. Если оплодотворения не происходит, яйцеклетка погибает, не закончив деления [11,12]. В течение одного менструального цикла заканчивает развитие только один фолликул, его называют доминантным. Фолликулы, не достигшие преовуляторной стадии, подвергаются регрессии (атрезии). На месте овулировавшего фолликула формируется желтое тело, цвет которого обусловлен лютеинизацией гранулезных клеток — накоплением в них липидных включений. Если оплодотворение не произошло, желтое тело замещается соединительной тканью, в результате чего образуется беловатое тело. На белочной оболочке яичника в месте разрыва фолликула формируются рубцы [13]. 1.3 Онтогенез и физиология яичников Первичные гонады закладываются у зародыша на 3-й нед. развития на внутренней поверхности первичных почек. До 6-7 недели гонады не имеют половых различий (индифферентная стадия) и состоят из наружного (коркового) эпителиального слоя внутреннего (мозгового) мезенхимального 13 слоя, оогонии — первичные женские половые клетки — располагаются в основном в мозговом слое. С 7-8 недели внутриутробного развития у зародыша, имеющего женский набор половых хромосом (XX), начинается дифференцировка первичных гонад в яичники: мозговой слой их истончается, толщина коркового слоя увеличивается, в него перемещаются оогонии. Оогонии интенсивно размножаются путем митоза. В их ядрах происходят процессы, подготавливающие редукцию генетического материала, в результате чего образуются ооциты I порядка. С 12-й нед. вокруг ооцитов I порядка из мезенхимы образуются первичные гранулезные клетки — формируются примордиальные фолликулы. В дальнейшем единичные примордиальные фолликулы развиваются до антральных. Число примордиальных фолликулов достигает максимума у плода 28 неделе. В последующие периоды онтогенеза (до 5-го года постменопаузы) 98-99% фолликулов подвергаются атрезии. К 20-й неделе внутриутробного развития образуется белочная оболочка яичника, к 25-й неделе формирование морфологических структур яичника в основном заканчивается. Яичник новорожденной девочки имеет веретенообразную форму, массу 0,30,5 г, длину 1,5 см, ширину 0,5 см и толщину 0,1 см, поверхность его гладкая. В корковом слое содержится 700 тыс.-1 млн. примордиальных фолликулов. Единичные фолликулы достигают антральной и даже преовуляторной стадии. Процесс созревания фолликулов носит хаотический характер. К 8-10-му году жизни масса яичника достигает 2 г, количество примордиальных фолликулов уменьшается до 300-400 тыс. Значительное число фолликулов достигает антральной и преовуляторной стадии, но овуляции не происходит. С 12-14 лет начинаются циклические процессы роста, созревания фолликулов, овуляции, образования желтого тела, повторяющиеся через 21—32 дня, чаще через 28 дней. Частота овуляторных менструальных циклов в первый год после менархе достигает 60-75%, к 1618 годам 92-98%. К концу периода полового созревания масса яичника увеличивается до 5-8 г. за счет созревания фолликулов, число примордиальных фолликулов уменьшается до 150-100 тыс. В репродуктивном периоде жизни (16—45 лет) процессы роста, созревания фолликулов и образования желтого тела имеют четкий циклический характер. Овуляция происходит в середине менструального цикла — в большинстве случаев на 13-14 день от начала развития доминантного фолликула. В полость лопнувшего фолликула врастают капилляры, проникают фибробласты, гранулезные клетки подвергаются лютеинизации. Желтое тело достигает расцвета через 7 дней после овуляции, в последующие 7 дней оно замещается соединительной тканью. С 40 лет увеличивается частота менструальных циклов без овуляции, циклов с образованием неполноценного желтого тела, лютеинизацией гранулезных клеток неовулировавшего фолликула [14]. В пременопаузе (в возрасте 45-50 лет) преобладают ановуляторные менструальные циклы и циклы с персистенцией неовулировавшего 14 фолликула; процессы атрезии фолликулов усиливаются, число примордиальных фолликулов уменьшается до нескольких тысяч. В постменопаузе размеры яичника уменьшаются, масса его составляет около 3 г, белочная оболочка сморщивается, корковое вещество истончается, интерстициальные клетки замещаются соединительной тканью. В течение 5 лет после менопаузы в яичнике еще обнаруживаются единичные примордиальные и атрезирующиеся фолликулы. В первые 8 недель беременности желтое тело увеличивается за счет васкуляризации, гипертрофии и лютеинизации гранулезных клеток, на 8-й неделе беременности по размерам оно в 3 раза превосходит желтое тело, образующееся во время менструального цикла. После 8 недель беременности начинается медленная регрессия желтого тела, к моменту родов оно в 3 раза меньше желтого тела в стадии расцвета. Созревание фолликулов прекращается в начале I триместра беременности, они подвергаются атрезии на стадии антрального фолликула, при этом гранулезные клетки лютеинизируются. Основными гормонами яичника являются эстрогены, прогестерон и андрогены. Все они синтезируются из холестерина под влиянием определенных ферментов. Местом синтеза андрогенов в яичнике являются текаклетки, небольшое количество этих гормонов образуется в интерстициальных клетках стромы коркового вещества яичника. В зрелом яичнике андрогены являются промежуточным продуктом на пути синтеза эстрогенов. Из андрогенов (тестостерона и андростендиона) в гранулезных клетках доминантного фолликула образуются эстрогены эстрадиол и эстрон соответственно. Прогестерон вырабатывается в лютеинизированных гранулезных клетках желтого тела [15]. Эстрогены обладают широким спектром биологического действия: способствуют росту и развитию наружных и внутренних половых органов, в пубертатном периоде стимулируют рост молочных желез, рост и созревание костей, обеспечивают формирование скелета и перераспределение жировой ткани по женскому типу. Андрогены способствуют росту и созреванию костей, оволосению лобка и подмышечных впадин. Эстрогены и прогестерон вызывают циклические изменения в слизистой оболочке матки и влагалища, эпителии молочных желез. Прогестерону принадлежит определяющая роль в подготовке матки и молочных желез к беременности, родам и лактации. Половые гормоны участвуют в водном и электролитном обмене. Эстрогены и прогестерон обладают выраженным иммунодепрессивным свойством. Гормональная функция яичника меняется в разные периоды онтогенеза и определяется степенью морфологической зрелости яичника и системы, регулирующей его гормональную функцию. В яичнике плода образуется ничтожное количество эстрогенов и андрогенов. После рождения до начала периода полового созревания (8-10 лет) продукция этих гормонов очень мала, содержание их в плазме крови соответствует порогу чувствительности радиоиммунологического метода. В пубертатном периоде, когда начинаются 15 циклические процессы роста и созревания фолликулов, синтез эстрогенов и андрогенов увеличивается. С началом процессов овуляции и образования желтого тела в яичнике секретируется прогестерон. В репродуктивном периоде гормональная функция яичника достигает расцвета, синтез половых гормонов имеет четко выраженный циклический характер и зависит от фазы менструального цикла В пременопаузе образование эстрогенов и прогестерона снижается, т.к. большинство фолликулов не достигает преовуляторной стадии, увеличивается число ановуляторных менструальных циклов и циклов с неполноценным желтым телом. В постменопаузе эстрогены (преимущественно эстрон) синтезируются в небольшом количестве вне яичника — в жировой ткани, содержание их в плазме крови ниже базального уровня женщин репродуктивного возраста. Концентрация прогестерона в плазме крови в постменопаузе стабильно низкая, он синтезируется в коре надпочечников. Секреция эстрогенов и прогестерона впервые 6-8 недель беременности в яичнике резко возрастает, затем снижается, и гормональное «обеспечение» беременности с 12-14 нед. осуществляется плацентой. Помимо половых гормонов в яичнике образуются ингибин — гормон белковой природы, тормозящий выделение фоллитропина из передней доли гипофиза, и релаксин — биологически активное вещество, расслабляющее миометрий. В клетках желтого тела обнаружен окситоцин, оказывающий лютеолитическое действие и способствующий инволюции желтого тела. В яичнике образуются также простагландины, которые участвуют в овуляции, обеспечивая разрыв стенки фолликула. Регуляция гормональной функции яичника осуществляется сложной многокомпонентной нейроэндокринной системой, включающей нейротрансмиттеры — передатчики нервных импульсов из высших отделов ц.н.с. (эндогенные опиаты, дофамин, норадреналин, серотонин); рилизинггормоны или гонадолиберины (люлиберин-рилизинг-гормон лютропина, фоллиберин — рилизинг-гормон фоллитропина), секретируемые нервными клетками гипоталамуса и стимулирующие выделение из передней доли гипофиза гонадотропных гормонов: гонадотропные гормоны (лютропин и фоллитропин) и пролактин, гормоны яичника, прежде всего эстрадиол, в зависимости от количества которого стимулируется или тормозится выделение гонадолиберинов из гипоталамуса и гонадотропных гормонов из передней доли гипофиза по механизму обратной связи, рецепторы к половым и гонадотропным гормонам в клетках и тканях репродуктивной системы (в т.ч. рецепторы лютропина на мембране текаклеток и рецепторы фоллитропина на мембране гранулезных клеток); стероидсвязывающие глобулины — особые белки плазмы, контролирующие доступ гормонов к их рецепторам (рецепторы взаимодействуют только с гормонами, не связанными со специфическими глобулинами). 16 Гонадолиберины, выделяющиеся из срединной области гипоталамуса в цирхоральном (часовом) ритме, по отросткам нервных клеток поступают в воротные вены гипофиза и с кровью достигают его передней доли. Под влиянием гонадолиберинов из гипофиза в определенном ритме выделяются гонадотропные гормоны (лютропин и фоллитропин) с максимумом (овуляторный пик) в момент наибольшего содержания эстрадиола в преовуляторном фолликуле. Гонадолиберины способствуют также увеличению выработки ингибина в фолликулах, тормозящего выделение фоллитропина; образованию прогестерона и уменьшению синтеза эстрадиола в гранулезных клетках овулировавшего фолликула, что вновь стимулирует выделение гонадотропных гормонов. [15]. На протяжении жизни женщины яичник подвергается возрастным изменениям, как никакой другой орган. К тому же, как указывалось выше, яичники закладываются «в утробе матери», и все неблагоприятные воздействия окружающей среды аккумулируясь, могут отрицательно воздействовать на способности к зачатию и на качестве потомства. Из множества факторов, влияющих на репродуктивную функцию женщин, основную угрозу представляют онкологические заболевания. В настоящее время риск потери репродуктивной функции яичников у женщин при онкологической патологии, ввиду применения системной химиотерапии и лучевого лечения в лучшем случае оценивается в 15-20%; это означает, что каждая пятая женщина бесплодна после прохождения комплексного лечения рака. В худших случаях речь идет о кастрации – т.е. о полной потере функции яичников [16-19]. 1.4 Современное состояние заболеваемости раком в мире и Казахстане По данным ВОЗ сердечно-сосудистые и онкологические заболевания в совокупности явились причиной 71% случаев смерти в Европейском регионе. По прогнозам ВОЗ заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований до 2020 года во всем мире увеличатся в 1,5-2 раза. Схожие данные предоставляет Международное агентство по исследованию рака. По их данным в 2000 году в мире, было зарегистрировано более 10 млн. случаев заболевания злокачественными опухолями, а в 2020 году число вновь выявленных случаев ЗО достигнет 16 млн. [20]. Ситуация в Казахстане аналогична ситуации в мире. Смертность от онкологических заболеваний в Казахстане занимает второе место в структуре смертности населения. Ежегодно от рака умирает порядка 17 тысяч человек, из которых 42% - лица трудоспособного возраста [21]. В течение последних пяти лет в республике увеличилось абсолютное число заболевших злокачественными новообразованиями: если в 2006 году было зарегистрировано 28573 заболевших, то к концу 2011 года их число 17 возросло до 30 299. Ежегодный прирост числа больных со злокачественными новообразованиями составляет 5% (рисунок 4) [2, 21]. 33000 32000 31000 30000 29000 28000 27000 26000 2006 год 2011 год 2012 год Рисунок 4 – Заболеваемость онкологией в Казахстане. Наиболее часто встречающимися злокачественными новообразованиями в 2011 году в Казахстане были рак молочной железы (11,6%), рак легкого (11,4%), рак кожи (10,7%), далее – рак желудка (8,8%), рак шейки матки (4,8%), рак пищевода (4,4%), гемобластозы (4,4%), рак ободочной (4,4%) и прямой кишки (4,1%) (рисунок 5) [2]. 4.40% 4.40% 11.60% рак молочной железы рак легкого рак кожи 4.40% рак желудка рак шейки матки 4.40% 11.40% 4.80% рак пищевода гемобластозы рак ободочной кишки 8.80% рак прямой кишки 10.70% Рисунок 5 – Заболеваемость онкологией за 2011 год в Казахстане. 18 При этом в структуре заболеваемости среди мужчин лидирующие места занимают опухоли трахеи, бронхов, легкого (20,4%), желудка (12,0%), кожи (9,6%), далее следуют опухоли предстательной железы (6%), пищевода (5,3%), гемобластозы (4,9%), прямой кишки (4,6%), ободочной кишки (4,1%), мочевого пузыря (3,7%). Первое место по распространенности рака в женской популяции принадлежит новообразованиям молочной железы (21,4%), далее следуют опухоли кожи (11,6%), шейки матки (8,8%), желудка (6,2%), яичников (5,7%), тела матки (5,5%), ободочной кишки (4,6%), гемобластозы (3,9%), рак легкого (3,9%) [2]. Между тем показатель смертности от злокачественных новообразований за последние пять лет снизился на 11,9% с 113,7 на 100 тысяч населения в 2006 году до 101,6 на 100 тысяч населения в 2011 году (рисунок 6) [2]. 115 110 105 *на 100 тысяч населения 100 95 90 2006 год 2011 год 2012 год Рисунок 6 – Смертность от онкологии в Казахстане. Все большей проблемой становится омоложение лиц, с диагностирующимися злокачественными новообразованиями. В большинстве развитых стран снижаются стандартизованная по возрасту заболеваемость и смертность на 100 тыс. населения от многих форм ЗО. В настоящее время показатели заболеваемости детей в возрасте от 0 до 15 лет колеблется 12-15% в год [22-27]. Так, в Германии этот показатель в 1980 г. составил 10,0%, в 1985 г. -13,1%, в 1990г. -13,9%, а в 1992 г. – 14,6%, подобная тенденция просматривается, как в европейских странах, так и в США [28, 29]. При этом у детей, в структуре злокачественных опухолей 19 первое место занимает лейкозы (32-34,0%), второе - опухоли ЦНС (1417,0%), третье – Ходжкинские и Неходжкинские лимфомы (11-14,0%) а четвертое – солидные опухоли, из них – нефробластома (6-7,0%), нейробластома (4-6,0%), остеогенные саркомы (5-6,0%), опухоли мягких тканей (4-6,0%) и др. В целом солидные опухоли составляют до 40,0% всех злокачественных новообразований у детей, но необходимо учитывать более редкую встречаемость отдельных нозологических форм в детской онкологической практике [30-33]. В РК, как и в других, экономически развитых странах отмечается тенденция к росту заболеваемости ЗН у детей. Анализ заболеваемости ЗН детей РК выявил тенденцию к ее плавному росту с 7,2% (в 1997 г.) до 8,7% детей в в 2006 г. Из них гемобластозы составили 44-45,0%, что составляет от 220 до 250 случаев в год. Наибольший удельный вес в этой структуре принадлежат лейкозам, причем регистрируется 185-220 случаев в год [34,35]. Международная тенденция также свидетельствует о неуклонном снижении показателя смертности детей от ЗН. Показатель смертности детей от ЗН в США в настоящее время ниже 2,0% детей в год и продолжает неуклонно снижаться. Одновременно, происходит постоянное накопление больных, перенесших ЗН. Считается, что около 1,0% трудоспособного населения планеты будет состоять из людей, излеченных от опухолевых заболеваний [36,37]. Официальные статистические данные относительно смертности детей в РК от злокачественных новообразований показывают, что смертность детей от 0 до 14 лет снижается с 3,8% (1995 г.) до 2,7% в 2005 году т.е. в 1,1 раза и имеет тенденцию к дальнейшему снижению [38]. Ежегодно рак диагностируется у 12 400 детей и подростков, излечиваемость детского рака достигает 75% [39]. Выживаемость при лечении лимфомы Ходжкина – 80-90% [40]. Таким образом, достижения современной онкологии позволили увеличить эффективность лечения многочисленных форм рака в независимости от возраста. Гонадотоксический эффект при лучевой или химиотерапии может привести к функциональной гибели яичников, поэтому для женщин, перенесших злокачественные заболевания и желающих продолжить полноценную жизнь, все более остро встает вопрос сохранения репродуктивной функции [41, 42]. Последние исследования показали особую важность обсуждения данного вопроса у пациентов с онкологическими заболеваниями [43-45]. 1.5 Сохранение репродуктивной функции в пост-раковом периоде Существует три основных возможности для сохранения репродуктивной функции: криоконсервация ткани яичников, то есть фрагментов кортикального слоя, изолированных фолликулов или целого яичника; криоконсервация яйцеклеток; криоконсервация эмбрионов. 20 В 1996 году была произведена самая первая процедура успешной криоконсервации овариальной ткани человека с хорошей выживаемостью фолликулов после размораживания [46]. В литературе имеются данные о случаях с преждевременной недостаточностью функции яичников у женщин после лечения опухолевых заболеваний и дальнейшим восстановлением репродуктивной функции после ретрасплантации корковой ткани яичников [47-52]. Эти данные доказывают, что после криоконсервации и размораживания овариальная ткань, может быть использована, как для только терапевтического, так и для восстановления репродуктивного потенциала. Сегодня рождение детей после криоконсервации и трансплантации ткани яичников уже реальность [51,52,53,54]. Для криоконсервации овариальной ткани можно использовать один из двух методов: традиционное, «медленное» замораживание и криоконсервация путем прямого погружения объекта в жидкий азот так называемая витрификация или «быстрое» замораживание. Сравнительные исследования эффективности витрификации и медленной заморозки, проведенные на овариальных тканях млекопитающих ограничены, но авторы в своих выводах указывают на преимущество медленной заморозки. Например, было показано, что для человеческой овариальной ткани, медленное замораживание является предпочтительным методом для криоконсервации данного типа клеток по сравнению с витрификацией, которая является менее эффективной [55]. Также проводились другие сравнительные исследования витрификации и медленной заморозки овариальной ткани человека [56,57]. В результате этих исследований было установлено, что медленное замораживание является более подходящим методом криоконсервации ткани яичников [58]. Однако было сообщение об отсутствии каких-либо различий между медленной и быстрой заморозкой по качеству фолликулов и гормональной активности [59]. В настоящее время основной задачей репродуктологии, является рациональное использование человеческих гамет и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Целенаправленно эту проблему можно преодолеть двумя путями. Первое ограничить выход биоматериала используя мягкие/минимальные протоколы стимуляции суперовуляции или обходясь без стимуляции в натуральных циклах, где выход гамет является минимальным соответственно эмбрионов тоже. Однако, этот путь имеет свои недостатки (сравнительно более низкая результативность, селективный отбор пациентов, недостаточность биоматериала в программах предимплантационной генетической диагностики, несовершенство индивидуализации протоколов и др.). В этой связи в последние десятилетия бурно начали развиваться технологии криоконсервации гамет и эмбрионов [60,61]. Прогрессивное развитие этой области криобиологии привело к появлению методов витрификации. С помощью витрификации удалось добиться успешной заморозки и разморозки, таких «капризных», хрупких объектов, как человеческие ооциты. 21 Так в феврале 1997 г. Итальянская клиника сообщила о рождении здоровой девочки после интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) в замороженный и размороженный ооцит [62,63]. Технология криоконсервации дает не только возможность рационального использования биоматериала, но и в случае витрификации ооцитов открывает перспективу сохранения репродуктивного потенциала на неопределенный промежуток времени, при риске утраты овариальной функции, как в случае злокачественных новообразований, так и в силу определенных социальных причин [64,65]. Однако она имеет свои ограничения в виду того, что успешность реализации витрификации зависит от качественных показателей ооцитов [66]. 1.6 Морфологические характеристики ооцитов Качество ооцита является важным прогностическим фактором, так как ядерная и цитоплазматическая зрелость клетки напрямую связаны с эффективностью не только витрификации, но и в целом программ ВРТ [67]. Ооцит человека с «идеальными» параметрами имеет светлую умеренно гранулярную цитоплазму, небольшое перивителлиновое пространство, интактное первое полярное тело, круглую и бесцветную зону пеллюцида (ZP) (рисунок 7). Все встречающиеся в клинической практике аномалии ооцита можно условно разделить на две группы: экстрацитоплазматические и цитоплазматические. Рисунок 7 – Зрелые ооциты (М II) человека без морфологических аномалий (увеличение 400). К экстрацитоплазматическим аномалиям относят нарушение строения и формы зоны пеллюцида, дебрис в перивителлиновом пространстве и его резкое увеличение, аномалии первого полярного тела (увеличение в размере, 22 дегенерация, мультифрагментация), а также нарушение симметрии оолеммы ооцита. К интрацитоплазматическим аномалиям, определяемым на световом уровне при оценке ооцита, относят гранулярность цитоплазмы клетки, агрегаты ГЭР, рефрактерные тела, вакуоли, нарушение вязкости цитоплазмы [67-73]. 1.6.1 Экстрацитоплазматические аномалии ооцита Аномалии первого полярного тела. Мейоз в женских половых клетках человека включает два последующих асимметричных мейотических дробления, которые приводят к экструзии первого и второго полярных тел. По наличию/отсутствию первого полярного тела в циклах ИКСИ можно судить о степени готовности ооцита к оплодотворению. Только ооциты на стадии профазы I второго мейотического деления (MII) пригодны для оплодотворения методом ИКСИ. Часто при стимуляции суперовуляции можно видеть женские половые клетки с аномалиями первого полярного тела: фрагментация, увеличение размера, нарушение формы. Рисунок 8 – Ооциты с аномалий первого полярного тела (увеличение 400). Рисунок 9 – Ооциты с аномалией перевителинового пространства (увеличение 400). 23 Перивителлиновое пространство. Перивителлиновое пространство ооцитов человека может варьировать как по размеру (увеличено или нет), так и содержанию гранулярности (присутствует или нет). Увеличенное перивителлиновое пространство чаще всего, присутствует в ооцитах женщин старшего репродуктивного возраста. Данная аномалия всегда сочетается с резко увеличенным первым полярным телом, что служит прогностическим фактором низкого потенциала развития таких клеток. Гранулярность перивителлинового пространства можно наблюдать только в ооцитах на стадии MII, в клетках MI и GV дебрис не обнаруживается. Причина его появления в настоящий момент не выяснена. Некоторые исследователи связывают гранулярность с преждевременным экзоцитозом секреторных гранул при больших дозах гонадотропинов в циклах ВРТ [74]. Рисунок 10 – Ооциты с дебрисом (увеличение 400). Зона пеллюцида. ZP (zonapellucida) – внешняя оболочка ооцита, конгломерат из гликопротеинов, синтезируемых и секретируемых растущим ооцитом и клетками гранулезы, который утолщается по мере роста ооцита. ZP защищает ооцит во время раннего развития до момента имплантации, когда эмбрион движется по фаллопиевым трубам в матку. Рисунок 11 – Ооциты с аномалией зоны пеллюцида (увеличение 400). 24 У человека ZP состоит из четырех гликопротеинов, названных ZP1, ZP2, ZP3 и ZP4 [75,76]. ZP играет существенную роль при естественном оплодотворении гамет, во время которого сперматозоиды связываются с ооцитом после акросомальной реакции посредством рецепторов, находящихся на поверхности ZP. Показано, что гликопротеины зоны вызывают гиперактивацию сперматозоидов [77]. Аномальная продукция или секреция гликопротеинов ZP1–4 может приводить к изменению структуры зоны и неспособности связывания с ней сперматозоидов, что приводит к нарушению оплодотворения. В циклах ВРТ часто наблюдают появление ооцитов с нарушенной ZP: уплотнение, деформация, изменение строения, которые успешно преодолеваются с помощью техники ИКСИ и хэтчинг. При этом необходимо понимать, что неправильный рост и созревание ооцита с вовлечением нарушений продукции или секреции гликопротеинов ZP может приводить к нарушению оплодотворения, то есть аномальная ZP – прогностический признак аномального ооцита. 1.6.2 Интрацитоплазматические аномалии ооцита Цитоплазматическая зрелость – процессы, которые подготавливают ооцит для активации и оплодотворения: выброс кальция, продукция глютатиона, компетентный экзоцитоз. Клинические эмбриологи могут анализировать цитоплазматическое созревание лишь по некоторым аспектам, чаще всего по видимым дефектам цитоплазмы (агрегаты ГЭР, гранулярность, цитоплазматические включения, вакуоли). Нарушения цитоплазматической организации могут быть связаны с нарушением оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона. Цитоплазматическая незрелость женской половой клетки не преодолевается методом ИКСИ. Гранулярность.Грубозернистая деструкция цитоплазмы ооцита – достаточно редко встречаемая аномалия женских половых клеток. В настоящий момент опубликовано несколько работ, посвященных изучению ооцитов с центрально расположенной гранулярностью [78-80]. S.Kahraman и соавт. (2008 г.) не выявили корреляции между центрально расположенной гранулярностью ооцитов и дальнейшим развитием эмбрионов, за исключением количества развивающихся беременностей, которое оказалось значительно ниже в группе ооцитов с гранулярностью. Авторы предполагают, что гранулярность служит признаком цитоплазматической незрелости. Данная аномалия может поражать как все ооциты пациентки, так и некоторые из полученной когорты, при этом у некоторых женщин во всех попытках ЭКО ооциты были с данной патологией независимо от протокола стимуляции суперовуляции [81]. B.Balaban и соавт., напротив, отмечали снижение выживаемости после криоконсервации и нарушение развития эмбрионов, полученных из ооцитов с центральной гранулярностью [78]. J.VanBlerkom показал, что ооциты MII с 25 грубозернистой деструкцией цитоплазмы имеют более низкий внутриклеточный рН, содержание аденозинтрифосфорной кислоты и часто анеуплоидный набор хромосом с их рассеиванием. Авторы связывают появление гранулярности внутри ооцита с гипоксией фолликулов в процессе фолликулярного роста [80]. Гранулярность цитоплазмы ооцита относят к наиболее серьезным повреждениям клетки. Оплодотворение таких клеток, а также их дальнейшее развитие всегда зависят от степени распространенности гранулярности. Вакуолизация. Под вакуолизацией понимают цитоплазматические включения, окруженные мембраной и заполненные жидкостью, иногда вместе с дегенерирующими органеллами клетки (лизосомы, митохондрии и пр.). Вакуоли могут появляться в ооците или бластомерах на любом этапе развития, быть единичными или многочисленными. Жидкость, заполняющая вакуоли, по своему составу близка содержимому перивителлинового пространства [82]. Часто вакуоли можно обнаружить в дегенерирующих и незрелых ооцитах. Жидкость обычно отсутствует в зрелых ооцитах на стадии MII. Рисунок 12 – Ооциты грануляцией цитоплазмы (увеличение 400). Рисунок 13 – Ооциты с вакуолями (увеличение 400). 26 Потенциал дальнейшего развития ооцитов и эмбрионов с вакуолями очень снижен. Согласно зарубежным данным только 12,5% вакуолизированных ооцитов достигают стадии бластоцисты по сравнению с 48,6% в контроле, также существенно снижен процент оплодотворения таких ооцитов (с 65,3 до 48,9%). Оплодотворение ооцита отсутствует при вакуолях, размер которых превышает 14 мкм. Авторы объясняют это явление следующим образом. Большая вакуоль смещает веретено деления с позиции близ первого полярного тела, а также вызывает нарушение архитектоники цитоплазмы (смещение микротрубочек), что препятствует нормальному движению пронуклеусов [82]. В любом случае как при множестве мелких, так и при одной крупной вакуоли ооцит имеет сниженный потенциал оплодотворения и дальнейшего развития. Агрегаты ГЭР. Круглые гладкие прозрачные диски, находящиеся, как правило, в центре ооцита, принято идентифицировать как агрегаты ГЭР. Их появление снижает вероятность оплодотворения клетки. При проникновении в ооцит сперматозоида последний запускает цепь событий, тесно связанных с выбросом внутриклеточного Ca2+. Выброс Ca2+ существенен для протекания кортикальной реакции, завершения мейоза и формирования пронуклеусов. Более того, способность оплодотворенного ооцита развиваться до стадии бластоцисты регулируется именно амплитудой выброса Ca2+. В клетке основной органеллой, накапливающей Ca2+, служит ГЭР, поэтому изменения внутриклеточного распределения данной органеллы может влиять на выброс Ca2+, оплодотворение и раннее эмбриональное развитие. Рисунок 14 – Ооциты с АЭР и рефрактерными телами (увеличение 400). В литературе отмечено также снижение процента наступления беременности для ооцитов с данной аномалией [83]. Появление агрегатов ГЭР авторы не связывают ни с возрастом пациентки, ни с числом полученных ооцитов. При этом у таких пациенток уровень эстрадиола в сыворотке крови на день введения триггера овуляции значительно выше по сравнению с женщинами 27 без агрегатов ГЭР. Показано, что ооциты с агрегатами ГЭР в 3 раза чаще появляются в коротких протоколах стимуляции суперовуляции [83]. В отличие от рефрактерных тел, которые могут появляться на любой стадии развития ооцита (GV, MI, MII), агрегаты ГЭР наблюдают только в зрелых ооцитах на стадии MII. Криоконсервация ооцитов не является основным подход сохранения репродуктивного потенциала женщин в пост-раковом периоде, а больше сопутствующая технология при криоконсервации овариальной ткани. Криоконсервация овариальной ткани имеет преимущества перед криоконсервацией ооцитов, так кортикальный слой яичников содержит примордиальные фолликулы, число которых, как указывалось выше при рождении более 100 тысяч, несколько десятков тысяч у молодых женщин и в пределах нескольких тысяч у женщин старше 40 лет [84]. Забор овариальной ткани для криоконсервации может быть произведен в любую фазу менструального цикла [85]. Кроме того это едиственная технология сохранения репродуктивного потенциала в детской онкологии. Основным методом использования замороженной и размороженной ткани яичника является аутотрансплантация или реимплантация. Аутологичная трансплантация кортекса яичниковой ткани успешно применяется с демонстрацией восстановления функции яичников, в том числе достижением беременности и эндогенной продукции гормонов. Аутотрансплантацию можно проводить двумя способами: первая включает в себя трансплантацию жизнеспособной корковой ткани яичника в тазовую (ортотопическая) область; вторая в внетазовую (гетеротопическая) область. Необходимо более подробно изучить положительные и отрицательные стороны этих вариантов аутотрансплантации. 1.7 Отротопическая овариальной ткани и гетеротопическая трансплантация Ортотопическая трансплантация ткани яичников включает в себя трансплантацию очень маленького, <1,0-1,5 мм, фрагмента ткани яичников, которые были успешно разморожены в любую медуллярную часть оставшегося яичника или брюшину. К преимуществам этого метода можно отнести вероятность получения естественной беременности у женщины, так как овариальная ткань находится в непосредственной близости от маточной трубы, и в благоприятном окружении для развития фолликулов. К недостаткам можно отнести ограниченное количество фрагментов пересаживаемых из-за малых размеров яичника и необходимость проведения инвазивной хирургической процедуры. Возобновление нормальных овуляторных менструальных циклов, как сообщается, происходят в течение 4-9 месяцев после трансплантации, которая совпадает с временем, необходимым для начала роста фолликулов и полного созревания [86-90]. Первый случай успешной ортотопической аутотрансплантации ткани яичника после криоконсервации и размораживания была проведена 28 женщине, которая ранее подверглась двусторонней овариэктомии [86]. Овариальная ткань была пересажена в перитонеальные карманы тазовой брюшины. Индукция овуляции гонадотропинами показала развитие фолликулов и овуляцию, однако женщина не забеременела. Сообщение о первой беременности было зарегистрировано в 2004 году у женщины, которая прошла химиотерапию и терапию радиацией для борьбы с лимфомой Ходжкина на IV стадии [87]. Последующие исследования ортотопической аутотрансплантации корковой ткани яичников после замораживания и размораживания продемонстрировали возобновление менструальных циклов, ультразвукового подтверждения роста фолликулов, а в нескольких случаях беременностей, которые были достигнуты без вмешательства или в рамках программы ЭКО [87, 91, 92]. В одном из исследований в результате проведения ортотопической аутотрансплантации было зарегистрировано рождение 24 детей во всем мире за последние 10 лет [93]. В другом исследований было сообщение об 11 беременностях из 60 циклов трансплантаций (18,3%). Однако, определить точную эффективность ортотопической аутотрансплантации корковой ткани яичников очень сложно, так как непонятно, сколько женщин прошли эту процедуру после замораживания и размораживания без достижения, беременности. Есть данные о восстановлении функции яичников и развития фолликулов при гетеротопической трансплантации корковой ткани яичника в предплечье, брюшную стенку, грудную стенку [94, 95]. Этот способ аутотрансплантации, позволяет достичь беременности только с помощью программы ЭКО и вспомогательных репродуктивных технологий. Стоит отметить, что хотя было успешное получение ооцитов и оплодотворение при этой технологии не было зафиксировано ни одного случая живорождения. Потенциальными преимуществами гетеротопической трансплантации ткани яичников являются легкий доступ к мониторингу и пункции фолликулов для программы ЭКО, а также мониторинга рецидива рака. К недостаткам можно отнести, угрозу потери функциональной активности трансплантатов, поскольку гетеротопические сайты имеют низкий потенциал на нормальную неоваскуляризации, не естественное окружение развития фолликулов для проведения программы ЭКО [94, 95, 96, 97, 98, 99]. Итак, основной проблемой для обоих способов аутотрансплантации овариальной ткани человека, является ишемия тканей с потерей примордиальных фолликулов в трансплантатах, которая зависит от процессов ангиогенеза и неоваскуляризации. Исследования показали, изменчивость жизнеспособности трансплантата и функции яичников, от нескольких месяцев до нескольких лет, в зависимости от количества, пересаженной ткани и возраста женщины, когда ткани яичников были получены. Самая длинная жизнеспособность трансплантата была ровна 7 годам [88, 92, 95, 100-104] 29 1.8 Ангиогенез и его особенности Ангиогенез представляет собой образование новых капилляров из уже существующих сосудов. Процессы, включенные в понятие ангиогенеза, были подробно изучены [105, 106] и схематически могут быть представлены в виде следующей последовательности. Ангиогенез начинается с секреции растворимого ангиогенного фактора, воздействующего на близрасположенный кровеносный сосуд и приводящего к изменениям в капиллярной стенке в виде деградации базальной мембраны, митотическому делению эндотелиоцитов, их последующей миграцией в строму и протеолитической деградацией экстрацеллюлярного матрикса. На следующем этапе происходит организация сосудистых эндотелиоцитов в трубчатую структуру и инициализация кровотока во вновь сформированном участке. Регуляция неоваскуляризации представляет собой динамический процесс тонкого взаимодействия ингибиторов и активаторов ангиогенеза. При физиологических условиях ингибиторы ангиогенеза необходимы для контроля над ростом кровеносных сосудов, предотвращая тем самым развитие неоваскуляризации. Большинство из известных регуляторов ангиогенеза приведены в таблице 1. Таблица 1 Эндогенные регуляторы ангиогенеза (по A.Augustin, 1998, с изм.) Стимуляторы ангиогенеза Пептидные факторы роста Сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР); Фактор роста плаценты (ФРП); Фактор роста фибробластов кислый (к ФРФ); Фактор роста фибробластов основной (оФРФ); Фактор роста тромбоцитов (ФРТ); Трансформирующий фактор роста-a (aТФР); Трансформирующий фактор роста-b (bТФР); Фактор роста гепатоцитов (ФРГ); Ингибиторы ангиогенеза Протеолитические пептиды Ангиотензин; Эндостатин; 16 кДа фрагмент пролактина; Ламинин; Фибронектин; Ингибиторы ферментной активности Ингибиторы тканевых металлопротеиназ -1, -2, -3, -4; Ингибитор активатора плазминогена (-1; -2); Инсулиноподобный фактор роста (ИпФРI); Цито- и хемокины Цито- и хемокины Фактор некроза опухолей (ФНО), высокие дозы; Фактор некроза опухолей (ФНО), низкие дозы; Интерфероны; 30 Интерлейкин-8 Ферменты Интерлейкин-12; Тромбоцитарный фактор 4; Молекулы экстрацеллюлярного матрикса Ангиогенин Тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток Гормоны Эстрогены Тромбоспандин Гормоны/метаболиты 2-Метоксиэстрадиол (2-MЭ); Белок, связанный с пролиферином Олигосахариды Гиалуронан, высокомолекулярные фракции Простагландины Е1, Е2 Фоллистатин Пролиферин Олигосахариды Гиалуронан, олигосахариды; Ганглиозиды Гемопоэтические факторы роста Эритропоэтин; Гранулоцитарныйколониестимулирующий фактор; Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; Физиологический ангиогенез представляет собой тканевый ответ либо на гормональную стимуляцию (ангиогенез в репродуктивной системе), либо на изменение окружающей среды (ткань способна расширять сосудистую сеть в ответ на ишемию). Учитывая, что фактор роста эндотелия сосудов (endothelialgrowthfactor = VEGF) – это стрессиндуцированный белок, его регуляция сравнивается с другими кислород- и глюкозорегулируемыми белками, поэтому физиологический и ростовой ангиогенез можно рассматривать как адаптационный ответ на дефицит кислорода. Для того чтобы кислород и питательные вещества поступали в достаточном количестве, каждая клетка макроорганизма должна быть близко расположена к капилляру [107]. Недостаточное кровоснабжение ведет к гипоксии вследствие уменьшения диффузии кислорода. Гипоксия – главный стимул А. Происходит активация метаболических путей, регулируемых такими белками, как индуцируемый гипоксией фактор 1, что ведет к увеличению экспрессии проангиогенных факторов, включая VEGF и факторы роста фибробластов. VEGF – гомодимерный, сильно гликолизированный белок, митогенный только для эндотелиальных клеток, уровень его повышается в тканях, где активно идет А., его рецепторы экспрессируются на эндотелиальных клетках-мишенях в близлежащих кровеносных сосудах. Основными 31 биологически активными формами являются молекулы размером 121 и 165 аминокислотных остатков. В 1989 г. несколько независимых групп ученых получили данные в пользу индукции VEGF гипоксией и гипогликемией. По данным ряда авторов, А. функционирует в динамическом сочетании с цитокинами, их растворимыми рецепторами и антагонистами, протеолитическими ферментами, регулирующими их освобождение из внеклеточного матрикса [107]. Рисунок 15 – Схема факторов развития А. [108]. В тот момент, когда действие проангиогенных факторов превышает действие антиангиогенных, эндотелиальные клетки переходят из обычного дремлющего состояния в активное. Этот момент называется «включением ангиогенеза». После включения А. происходит разрыв базальных мембран и внеклеточного матрикса (ВКМ), главным образом, в результате повышения активности матричных металлопротеаз. Эти изменения матрикса способствуют миграции эндотелиальных клеток во внесосудистое пространство, где они начинают размножаться. Затем клетки организуются в трубочки с просветом, образуя новую капиллярную сеть. По ходу этого процесса привлекаются перициты, которые прикрепляются к новым сосудам 32 и стабилизируют их. До этой точки созревания целостность и выживание эндотелиальных клеток зависят от VEGF [109,110]. Процесс роста капилляров продолжается, пока не будет достигнута достаточная близость с клеткой. Затем А. вступает в фазу покоя за исключением ангиогенных циклов в женской репродуктивной системе. 1.8.1 Ангиогенез в женской репродуктивной системе Женская репродуктивная система – это единственное место во взрослом организме, где происходит физиологически нормальный A. Он протекает в матке, плаценте, молочной железе и яичниках. В яичниках, каждая специфическая фаза гормонального цикла сопряжена с радикальными изменениями в кровеносном русле. Яичники, являющиеся цитогенными и гормоно-секретирующими органами, проходят несколько различных функциональных стадий: они предоставляют среду для созревания ооцитов; после овуляции образуется новое желтое тело, которое затем созревает, а желтое тело предшествующего цикла регрессирует и рассасывается. А. в репродуктивной системе женщины запускается факторами роста и цитокинами, а подавляется специфическими ингибиторами. Он опосредуется теми же проангиогенными факторами, что опухолевой А., но характеризуется высокой степенью организации контрольной регуляции, осуществляемой организмом [111]. Развитие желтого тела – это сложный процесс, вовлекающий механизмы, подобные заживлению раневой поверхности и образованию опухоли. Уровень активности пролиферации эндотелиальных клеток в развивающимся желтом теле значительно выше, чем в быстро растущей опухоли [112]. Еще в 1906 году, Loeb предложил концепцию подобия желтого тела «транзиторным опухолям». Neeman и соавт., 1997 высказали идею о сравнении роста желтого тела с разрастанием солидной опухоли [113]. Однако для нормального А. в желтом теле свойственным является его транзиторный характер и ограничения развития, обусловленные четкой физиологической регуляцией [111]. Результаты научных исследований, проведенных в последние годы, выявили тесную взаимосвязь между процессами ангиогенеза и активностью факторов роста (ФР) при нормальных и патологических состояниях репродуктивной системы у женщин [114, 115]. Наиболее изученными активаторами ангиогенеза, происходящего в органах репродуктивной системы женщины, являются сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР) и основной фактор роста фибробластов (оФРФ). СЭФР, известный также как фактор сосудистой проницаемости или васкулотропин, представляет гликопротеин, с массой 40–50 килодальтон, способствующий росту эндотелиоцитовinvitro и индуцирующий ангиогенезinvivo [116]. 33 Показано, что СЭФР и оФРФ также являются важнейшими факторами, стимулирующими сосудистый рост в яичнике и обеспечивающими быстрый рост капиллярной сети в процессе роста и селекции фолликулов, формирования и функционирования желтого тела [117,118]. Ангиогенная активность была продемонстрирована в экстрактах тека-клеток [119], преовуляторнолютеинизированных гранулезных клетках [120], фолликулярной жидкости [121]. J.D. Gordon и соавт., изучавшие локализацию данного ФР, показали, что СЭФР имеется в слоях тека-клеток, а гранулезные клетки содержат минимальное количество СЭФР [122]. Данные результаты отражают нормальную сосудистую архитектонику в яичнике, а именно мало васкуляризированный характер слоев прелютеинизирующих гранулезных клеток и богато васкуляризированный – слоев тека-клеток. Экспрессии СЭФР не наблюдается в атретичных фолликулах и дегенерирующем желтом теле. В то же время интенсивное окрашивание, свидетельствующее о высокой концентрации СЭФР, наблюдалось в высоковаскуляризированных желтых телах. В постменопаузальный период экспрессия СЭФР обнаруживалась лишь в кистах яичника, содержащих эпителий, и серозных цистаденомах. Экспрессия СЭФР регулируется лютеинизирующим гормоном (ЛГ) и, следовательно, отражает циклическую природу овариального ангиогенеза [123, 124]. Установлено, что экспрессия СЭФР при беременности осуществляется несколькими компонентами фетоплацентарного комплекса: железистым эпителием, фетальными и материнскими макрофагами, а также цитотрофобластом [125,126]. Исследования в рамках программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) позволили показать, что концентрация СЭФР возрастает уже спустя 30 суток после подсадки эмбриона и в дальнейшем продолжает увеличиваться, положительно коррелируя с уровнями хорионического гонадотропина и эстрадиола [127]. За последнее время наши знания о биологических процессах, вовлеченных в формирование новых микрососудов, значительно расширились. И хотя прогностические и терапевтические принципы еще только формируются, достижения в понимании процессов ангиогенеза уже используются в практике и, возможно, оценка ангиогенеза будет применяться в качестве маркера различных физиологических и патологических состояний организма. 1.8.2 Использование маркеров и хориоаллантоисной мембраны для исследования процессов ангиогенеза Широко используемым методом оценки ангиогенеза человека является подсчет микрососудов в первичном объекте с помощью специфических маркеров эндотелиальных клеток, таких как VIII-фактор, CD31, CD34, и стандартной иммунопероксидазной техники окраски сосудов [128-130]. 34 Фактор VIII, или фактор, фон Виллебранда – тромбопластический фактор плазмы, образует связь между субэндотелиальными волокнами коллагена и рецептором тромбоцитов – гликопротеидом Ib/IX. Фактор Виллебранда (VWF) - плазменный гликопротеин, играющий центральную роль в гемостазе. Фактор Виллебранда выполняет две функции. С одной стороны фактор Виллебранда играет существенную роль в прикреплении кровяных пластинок к поврежденным местам кровеносных сосудов. Специфические рецепторы к фактору Виллебранда выявлены как в мембране кровяных пластинок, так и в субэндотелии. С другой стороны фактор Виллебранда является носителем антигемофилического фактора 8 (F VIIIC) [131]. Фактор Виллебранда синтезируется в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах, как внутриклеточный протеин в форме пропротеина с молекулярным весом 240 kD. Перед секрецией из клеток предшественник зрелого белка проходит стадии протеолитического расщепления, гликозилирования, карбоксилирования, сульфатирования. В плазме крови фактор Виллебранда циркулирует в виде ряда самоагрегирующих структур от димеров, образованных из субъединиц с молекулярным весом 225 kD, до полимеров из 50 субъединиц и выше с молекулярным весом более 10 000 000 D [132,133]. Известно, что фактор фон Виллебранда ( vWF ), белок плазмы крови человека, содержит 4 типа повторяющихся доменов (A - D), присутствующих в 2-5 копиях каждый, причем С и D - домены найдены в некоторых секретируемых белках, в том числе в муцинах [134]. Название фактора VIII связывают с именем финского доктора Эрика Адольфа фон Вилебранда (Erik Adolf von Willebrand), прежде всего благодаря впервые описанному им геморрагическому синдрому, обусловленному дефицитом фактора VIII свертывания крови. Э.А. фон Виллебранд предложил для обозначения нового заболевания термин ―псевдогемофилия‖, подчеркнув, что основным и наиболее постоянным признаком его является увеличение времени свертывания крови [135]. Фактор фон Виллебранда играет важную роль в обеспечении взаимодействия между компонентами сосудистой стенки, в т. ч. эндотелиоцитом, и тромбоцитами [136]. В норме высокомолекулярные мультимеры фактора фон Виллебранда присутствуют преимущественно в эндотелиальных клетках; их обнаружение в плазме крови свидетельствует о повреждении эндотелия. Таким образом, фактор фон Виллебранда является отличным маркером исследования эндотелиального ангиогенеза. Другим маркером ангиогенеза, в частности неоангиогенеза является Десмин фактор, который синтезируется в перицитах. Перициты играют ведущую роль в ангиогенезе. В яичниковой модели ангиогенеза, они являются первичными ангиогенными клетками, которые могут внедряться в обычный безсосудистый Граафов фолликул, и таким образом, являются предшественниками прорастания кончиков сосудов (Amselgruberetal., 1999). Перициты также, появляются за пределами прорастания кончика сосудов в ряде, исследованных опухолей мыши с помощью CD31, αSMA и десмин 35 маркеров, а также конфокальной микроскопии (Морикавы и др., 2002). Эта модель предполагает, что перициты, так же как межклеточные контакты, получают VEGF и могут влиять на способности выживания эндотелия и направления его миграции (Darlandetal., 2003; Kaleetal, 2005). Эта роль, однако, противоречива с другими исследованиями, которые предполагают, что перициты отстают от эндотелиальной миграции. Наблюдения, проведенные в течении постнатального развития сосудов сетчатки, показывают, что обнаженные кровеносные сосуды, прорастая, представляют собой временное окно пластичности, позволяющий эндотелиальным клеткам реконструироваться. Последующее включение в это перицитов (Benjaminetal., 1998) и экспрессии Ang-1/PDGF (Гофмана и др., 2005) закрывает окно, указывающее на переход к созреванию сосудов. Эта точка зрения поддерживается исследованиями в in vitro, показывающими, что за образованием эндотелиальной трубки следует его охват перицитами, а также, что перициты используют развивающиеся сосуды, как сигналы направления миграция (Никосии и Vallashi, 1995; Hashizume и Ushiki, 2002). Классические методы для изучения ангиогенеза в in vivo включают ткань уха кролика, спинную кожу и альвеолы мыши, хориоаллантоисную мембрану (CAM) куриного яйца, радужную оболочку и безсосудистую роговицу глаза грызунов и рыбки данио [137]. CAM-система используется для изучения ангиогенеза в опухоли [138] и эндометриоза тканей [139]. CAM также использовались для культуры человеческой кожи [140], печени [141] и скелетной мышечной ткани [142], для хирургического сетчатки исследований [143], для тестирования различных биоматериалов в тканевой инженерии [144], а также для исследований яркий спектр на биологические объекты [145]. В CAM-культуры крупного рогатого скота и мышиного ткани яичников, сообщает Cushman соавт. [146], и Гигли и соавт. [147] соответственно, первичные фолликулы в пересаженной ткани яичников сохраняется способность активировать и расти. Эти авторы считают, что внеклеточный матрикс строение CAM похожа на брюшину, к которой человек яичников ткани можно пересаживать с помощью внутрибрюшинной ксенотрансплантации и ортотопической аутотрансплантации. Исследование ангиогенеза в in vivo позволили достичь важного прогресса в понимании механизма воздействия некоторых факторов и ингибиторов ангиогенеза. Основными критериями в пользу выбора этого метода, являются его стоимость, простота проведения исследования, воспроизводимость и надежность. Тем не менее, исследование ангиогенеза в in vivo могут быть очень чувствительны к факторам окружающей среды, также существуют трудности в биохимическом анализе. Кроме того, интерпретация часто осложняется тем фактом, что экспериментальные условия могут провоцировать воспаление. В этом случае ангиогенная реакция будет вызвана косвенно или по крайней мере частично, через активацию воспалительных или других типов не эндотелиальных клеток. 36 CAM является внезародышевой мембраной, которая формируется на 4-й день инкубации путем слияния хориона и аллантоиса. Незрелые кровеносные сосуды, с недостатком готовой базальной мембраны и гладкомышечных клеток, разбрасываясь в мезодерме растут очень быстро до 8-го дня, и приводят к возникновению капиллярных сплетений, которые тесно связаны с вышележащим хорионом эпителиальных клеток для осуществления газообмена с внешней средой. На 14-й день, капиллярное сплетение находится на поверхности эктодермы, которая примыкает к оболочке скорлупы. Быстрое распространение капиллярных сосудов продолжается до 11-го дня; После этого митотический индекс эндотелиальных клеток быстро снижается, и сосудистая система достигает своего окончательного расположения на 18 день, как раз перед вылуплением [148]. САМ культивирование производят либо in ovo либо ex ovo, как без оболочечного культивирования в чашках Петри и пластиковой посуде. Нет четких доказательств о существовании значительной разницы между данными, полученными in ovo либо ex ovo метода культивирования. Было продемонстрировано, что частота выживаемости в культивируемых яйцах ex ovo, является очень важным аспектом, ограничивающим успех этой техники культивирования [148]. Как указывалось выше, для восстановления репродуктивного потенциала важно сокращение временного интервала ишемии и ускорение реваскуляризации трансплантатов. Самый перспективный подход в решении этой проблемы это криоконсервация целого яичника с последующей сосудистой трансплантацией, что позволит избежать потери фолликулов изза ишемии и отсутствия реваскуляризации. 1.9 Трансплантация целого яичника Сосудистая трансплантация была предложена в качестве наиболее логичного подхода по сравнению с трансплантацией кортикального слоя яичников. Криоконсервация и трансплантация целого яичника с сосудами является эффективным решением предотвращения посттрансплантационной ишемии. Однако, полученные данные показывают, что после криоконсервации целых яичников, их жизнеспособность уменьшается [149,150]. Несмотря на техническую сложность этой процедуры, она обеспечивает непосредственное кровоснабжение овариальной ткани после пересадки, таким образом, минимизируя опасность возникновения ишемии. Как было показано на животных, единственным решением этой проблемы является трансплантация целого интактного яичника с микрохирургической пересадкой сосудистых анастомозов. Исследованием и развитием технологии криоконсервации целых органов, так же как и хирургическими методами аутотрансплантации всего яичника с сосудистой ножкой, активно занимаются разные группы учѐных. 37 Эксперименты с криоконсервацией целого коровьего яичника с сосудистой ножкой актуальна для сохранения некоторых исчезающих видов жвачных животных, а также для медицины, когда эти яичники являются моделью человека.В отличие от исследования различных вопросов, связанных с криоконсервацией, осуществляемых на мелких видах жвачных животных, данные о криоконсервации, проводимых на крупных видах жвачных ограничены [151]. Десять лет назад впервые был описан протокол криоконсервацииинтактного яичника человека и показана высокая выживаемость фолликулов [152]. После процедуры оттаивания ткань имела нормальную гистологическую структуру, функционировали мелкие сосуды, были жизнеспособны клетки стромы. Успешная аллогенная трансплантация целого яичника была проведена на паре монозиготных близнецов. Одна из сестер имела нормальную функцию яичников и родила двоих детей. У второй же сестры было преждевременное истощение фолликулов. После пересадки ей целого яичника от сестры на 101 день возобновился менструальный цикл, а через 11 регулярных циклов была выявлена спонтанная беременность, в результате которой на 40 неделе гестации родилась здоровая девочка. В недавней публикации исследовательской группы из Франции, которая является одним из лидеров криоконсервации целого яичника млекопитающих [153], было отмечено, что диффузия криопротектора в перфузированных яичниках является потенциально ограничивающим фактором, который не достаточно исследован [153] . Разработка технологии продолжительной перфузии интактных яичников криопротекторами при низких температурах актуальна, поскольку ранее было установлено, что 24 часовое охлаждение до 5°С перед криоконсервацией благоприятно влияет на замораживание фрагментов человеческих яичиков [154]. Было установлено, что качество фолликулов и интенсивность неоваскуляризации резко возрастает в тканях яичников, предварительно охлажденных и до культивирования и до криоконсервации. На сегодняшний день нет никаких данных об успешной трансплантации человеческих интактных яичников с сосудистой ножкой после криоконсервации. Тем не менее, криоконсервация целого яичника с сосудистыми анастомозами и ретрансплантацией после размораживания может рассматриваться как перспективная стратегия для больных раком. Были описаны случаи трансплантации незамороженных яичников с сосудистыми анастомозами человека, и была зафиксирована одна беременность [155]. Проблема криоконсервации яичников с нетронутой сосудистой ножкой у животных еще далеко не решена. Несмотря на многочисленные попытки и доказательства восстановления долгосрочного развития фолликулов, были зафиксированы только три случая рождения ягнят после ретрансплантации замороженных овечьих яичников [149,150]. 38 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объекты и условия исследований Исследования проводились в трех направлениях: 1. Объекты исследований: ооциты человека. Были изучены морфологические характеристики ооцитов в криоциклах, как производных овариальной ткани; 2. Объекты исследований: овариальная ткань человека. Были проведены серии экспериментальных исследований процесса ангиогенеза в зависимости от условий подготовки и режима замораживания с помощью двух различных систем культивирования; 3. Объекты исследований: яичники коровы и овцы, как модель человека. Были изучены условия перфузии целых интактных яичников в целях криоконсервации целого органа. 2.2 Исследование криоциклах морфологических характеристик ооцитов в Был проведен ретроспективный анализ 60 циклов криоконсервации ооцитов у 60 супружеских пар прошедших различные программы ВРТ в период 2011-2012 года на базе клиники «Экомед». Возраст женщин варьировал в пределах от 22 до 38 лет. Стимуляцию суперовуляции у женщин проводили по схеме гонадотропинами, контролировали развитие фолликулов с помощью ультразвукового исследования. При достижении доминантными фолликулами размера 18-20 мм вводили триггер овуляции – хорионический гонадотропин (ХГ) в дозе 510 тыс.МЕ. Преовуляторные ооциты получали посредством трансвагинальной пункции фолликулов через 35-36 часов после инъекции ХГ. Оценка морфологических показателей ооцитов производилась через 3,54,0 часа после трансвагинальной пункции, путем энзиматического очищения в растворе гиалуронидазы ооцит/кумулюсных комплексов По выявленным морфологическим аномалиям ооциты были резделены на следующие группы и подгруппы: I. Морфологический нормальные ооциты; II. Экстрацитоплазматические аномалии: 1. Ооциты с аномалиями формы (аномалии зоны пеллюцида, аномалии периветелинового пространства); 2. Ооциты с аномалиями полярных телец; 3. Ооциты с дебрисом. III. Интрацитоплазматические аномалии: 1. Ооциты с вакуолизацией; 2. Ооциты с гранулированной и окрашенной цитоплазмой; 39 3. Ооциты с агрегацией ЭР и рефрактерными телами. IV. Смешанные аномалии (экстрацитоплазматические и интрацитоплазматические). Витрификация и размораживание ооцитов производилась по технологии доктора М. Куваямы с использованием растворов фирмы CryoTech [156]. 2.3 Исследование овариальной ткани человека 2.3.1 Забор и иссечение ткани Для исследований использовалась ткань, полученная от 20 женщин в возрасте от 24 до 40 (31 + 2,3) лет. Овариальная ткань была получена оперативной лапароскопией. 10% от полученной ткани использовалась для определения качества фолликулов и ангиогенной активности ткани. В качестве основной среды использовалась среда Лейбовиц L-15 с 5% фетальной сыворотки теленка для манипуляции над тканью далее «основная среда». Полученная ткань яичника, была перевезена из хирургической комнаты в лабораторию в течение 20 мин с температурой, поддерживаемой при 32-34 °С. С помощью пинцета и скальпеля № 22, кусочки яичника были разделены на фрагменты двух типов, с содержанием медулы и без медулы (1,5-2,0 х 1,01,2 х 1,2-1,5 мм для фрагментов с медулой и 1,5-2,0 х 1,0-1,2 х0,8-1,2 мм для фрагментов без медулы) и замораживали методом медленной заморозки (рисунок 8). После последующего размораживания, кусочки были случайным образом разделены на четыре группы: Группа 1: Кортекс без медулы культивировали invitro в большом объеме среды с механическим перемешиванием; Группа 2: Кортекс c медулой культивировали invitro в большом объеме среды с механическим перемешиванием; Группа 3: Кортекс без медулы культивировали в CAM-системе; Группа 4: Кортекс c медулой культивировали в CAM-системе; В общем от каждой женщины, было взято по восемь фрагментов для исследования. 2.3.2 Криоконсервация овариальной ткани Протокол замораживания был основан на опубликованном Госденом соавт. [51-53] с внесенными изменениями. Фрагменты овариальной ткани были размещены при комнатной температуре в 20 мл среды состоящей из основной среды с добавлением 6% диметилсульфоксида, 6% этиленгликоля и 0,15 М сахарозы. Затем фрагменты перекладывали в стандартные 4,5-мл крио-пробирки зранее заполненной замораживающей средой и предварительно опущенным на дно тампоном. Для медленной заморозки использовали газовый замораживатель IceCube 14S (SyLab, Neupurkersdorf, 40 а б в Рисунок 16 – Стадии подготовки овариальной ткани: а — овариальная ткань после извлечения; б — начало разделения на фрагменты; в — готовые фрагменты овариальной ткани. 41 Австрия). Программа замораживания без предварительного охлаждения ткани состояла из пяти этапов: (1) стартовая температура 22 °С; (2) охлаждение от 22 °C до 4 °С со скоростью -5 °C/мин; (3) охлаждение от 4 °C до -7 °С со скоростью -1 °С/мин; (4) охлаждение от -7 ° C до -34 °C со скоростью -0,3 °С/мин; (5) погружение в жидкий азоте. При предварительном охлаждении ткани яичника готовые пробирки оставляли в холодильнике на 24 часа, тогда программа замораживания состояла из четырех этапов: (1) стартовая температура 4 °С; (2) охлаждения от 4 до - 6 °С со скоростью - 1 °С/мин; (3) охлаждение от - 6 до - 34 ° С со скоростью - 0,3 °С/мин (4) погружение криопробирок в жидкий азот. Было отмечено, что при температуре ниже -10 °С происходило спонтанное образование кристаллов в месте локализации ОФ. Для предотвращения спонтанного образования кристаллов проводили ручной сидинг при температуре от -6 ° C до -9 °C (рисунок 9). 2.3.3 Оттаивание овариальной ткани Процедура оттаивания была достигнута путем проведения криопробирки в течение 30 сек. при комнатной температуре с последующим погружением в 100 °C водяную баню. Время экспозиции в кипящей воде визуально контролируется присутствием льда в пробирке; как только лед был истончен до 1 или 2 мм, пробирку удаляли из кипящей воды, после чего конечная температура среды внутри пробирки находилась в промежутке от 4 до 10 °С. В течение 5-10 секунд после оттаивания, фрагменты овариальной ткани из пробирки перекладывали в 100 мл контейнер с содержанием 10 мл раствора для размораживания (основная среда, содержащая 0,5 М сахарозу). Ступенчатое выведение криопротекторов было достигнуто, помещением контейнера на шейкер и непрерывное перемешивание с частотой 200 колебаний в мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Ступенчатую регидратацию фрагментов ткани проводили в течение 30 мин при комнатной температуре также с использованием «капельной методики». Для медленного добавления основной среды на фрагменты овариальной ткани в растворе сахарозыиспользовали 50 мл пробирку с 50 мл основной среды. Конечная концентрация сахарозы была равна 0.083M, в результате чего достигались почти изотонические условия. Затем фрагменты ткани были промыты трижды в свежей основной среде в течение 10 мин. После этого фрагменты ткани были перенесены в условия in vitro или CAMкультивирования. 42 Рисунок 17 - Схема ступенчатой регидратации овариальной ткани. (1) туба, (2) крышка, (3) основная среда, (4) инъекционная игла, (5)воздушный нипель, (6) отверстие, (7) контейнер с овариальними частицами, (8) питательная среда, (9) мешалка. Рисунок 18 – Технология invitroкультивировании овариальной ткани. 43 2.3.4 invitro культивирование ОФ Размороженные фрагменты двух экспериментальных групп (рис 1).были помещены во флаконы объемом 200-мл для клеточных культур (Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Германия) с 30 мл культуральной среды (Гибко, Invitrogen, США). Инкубация проводилась в течение 8 дней при 37 ° С в 5% СО2 при помешивании шейкера с частотой 75 колебаний в минуту (рисунок 10-11). Рисунок 19 – Образец invitro культивирования овариальной ткани. 2.3.5 САМ-культивирования ОФ – технология ксенотрансплантации 2.3.5.1 Общая информация про САМ-культивирование В качестве инкубационных яиц (ИЯ) необходимо использовать оплодотворенные куриные яйца, которые можно взять в любой птицефабрике. ИЯ должны быть по возможности свежими, но уже после хранения в холоде (8-10°C). После доставки с фабрики, ИЯ могут храниться в холодильнике еще 8 дней (максимум) в температуре 8-10°C. Период развития цыплят составляет 21 день. На 21-й день цыплята вылупляются. Этапы развития оплодотворенных яиц показаны на (рисунок 12). САМ-культивирование можно проводить только в маленьком окошке между 8-м (раннее 7-го дня) и 12-м днем инкубации. Это зависит от еще не развитой хорион-аллантоисной-мембранны (CAM) до 8-ого дня инкубации и развития собственной иммунной системы после 12-го дня инкубации. 44 Рисунок 20 – Этапы развития оплодотворенных яиц. 2.3.5.2 Протокол САМ-культивирования Инкубационный день 0 - положить яйца в инкубатор при 37-38°C. Яйца должны быть размещены острым полюсом (Рисунок 2) в специальных подставках (Рисунок 3). В этом случае тупой полюс яйца будет на вершине (рисунок 2). На 4-й – 5-й день инкубации вытащить яйца из инкубатора, положите его на тупой-полюс и с помощью буровой машины (например AEG: Fa: Bohler, используется для измельчения или для гравировки (рис 4)) сделать на остром-полюсе яйца маленькое отверстие (рисунок 5), а затем поместить снова в инкубатор на 10 минут. Для одного эксперимента нужно брать от 5-6 до 8-10 яиц (особенно в начале эксперимента). Для этого используют специальные подставки для яиц (Рисунок 5) их можно приобрести у производителей холодильников. Яйца должны в этих подставках стоять достаточно плотно. липкой лентой размером ~ 2х2 см (Leukosilk). Откройте оболочку яйца, используя небольшие изогнутые ножницы (заранее простерилизованные спиртом или автоклавом) следующим образом: кончик ножниц ввести аккуратно в оболочку-открытия и разрезать отверстие диаметром ~ 10 мм (рисунок 6). 45 Рисунок 21 – Размещение яиц. Рисунок 22 – Подставка для яиц. 46 Рисунок 23 – Шлифовальный станок для бурения яичной скорлупы. Рисунок 24 – Отверстия на остром-полюсе яиц. 47 Через 10 минут после инкубации яиц, обратно их вытаскиваем и плотно запечатываем оболочку с небольшим отверстием в верхней части яйца Рисунок 25 – Отверстие с липкой лентой. Покрыть сделанное отверстие липкой лентой ~ 2x2 см (Leukosilk) и положить обратно в инкубатор. Липкая лента должна закрывать отверстие только по краю (рис 7). Рисунок 26 –Липкая лента закрывающее отверстие по краю. 48 Инкубационный день 7 - 8. В этот день, утром, проверить яйца и выбросить протухшие. Тухлые яйца выглядят мутными. Положите стерильные силиконовые кольца с помощью стерильного небольшого пинцета в живые яйца по возможности в центр крупных кровеносных сосудов (рисунок 8). Рисунок 27 – Силиконовое кольцо. Положите одновременно с силиконовым кольцом или на 30-60 минут позже кусок ткани яичника (1-2 мм) с использованием анатомических небольших щипцов или капнуть 20 мкл клеточной суспензии с помощью пипетки. Не прикасайтесь к CAM пинцетом! После открытия оболочки все последующие работы должны быть проведены под холодным светом лампы. Силиконовые кольца можно использовать несколько раз. Снимите кольцо после вложения САМ с культивированной тканью в парафин, промойте в ксилоле (5 мин), затем в 96% - 70% - и 50% спирте по 5 минут каждый шаг, затем смойте би-дистиллированной воде, затем ополосните снова, высушите и автоклавируйте. В ксилоле кольцо изменит форму, но это нормально и в конце очистки кольцо обратно вернется в свой первоначальный размер. При работе с яйцами, необходимо использовать стерильные, очищенные инструменты, но условиями стерильности можно пренебрегать. 49 Рекомендуется использовать инкубатор от фирмы Memmet с воздухом (рисунок 9). После окончания эксперимента, очистить инкубатор с 70% спиртом или биоцидами. Инкубация яиц должна быть произведена при 37 ° - 38 °С. Температура должна проверяться каждый день. Контроль жизнеспособности яиц и рост клеточной суспензии. Жизнеспособность инкубационных яиц необходимо проверять каждый день. Протухшие яйца выглядят мутными и эмбрион не двигается. Живой эмбрион реагирует на свет активным движением. Рисунок 28 – Инкубатор фирмы Memmet. 50 Такая конструкция позволяет предотвратить конденсацию воды из лотка инкубатора (рисунок 10) и появления грибов. В первый день инкубации живая культура клеток имеет оптическую опалесценцию внутри кольца. Рисунок 29 – Конструкция для предотвращения конденсации воды в инкубаторе. 2.3.5.3 Подготовка к гистологии На 12-й день инкубации извлеките CAM вместе с куском овариальной ткани и силиконовым кольцом или твердую суспензию клеток с помощью небольших микроскопических прямых ножниц и небольших щипцов из яйца следующим образом: Яйцо расположите так, чтобы ткань в кольце оказалась в 12:00 часах (Рисунок 11). Извлеките образец близко к CAM с использованием малых изогнутых ножниц (фиг.11, 12). Разрезать CAM с 3 сторон (справа, снизу, слева, рис. 11), затем удерживая CAM хирургическим пинцетом сделать разрез выше. Каждая сторона должна быть сокращена с одного разреза. Аккуратно поместите с помощью хирургического пинцета отрезанный CAM вместе с кольцом и тканью на поверхность раствора в 35 мм чашки Петри (с ~ 3 мл 4% формалина или раствора Боуэн) и окунуть его с помощью хирургических щипцов полностью в раствор (Рисунок 13). Фиксация происходит в течение по крайней мере 3 часов (максимум 5 дней) при комнатной температуре. Вложите осторожно фиксированную ткань в кассету между двумя кусками бумаги (Рисунок 13) с помощью пинцета избегая складок, закройте кассету, положите его в PBS (после фиксации в растворе Боуэна промыть 3 раза в 70% спирте) и отнесите в парафинную машину. Разрежьте CAM с кольцом и тканью следующим образом: 51 Рисунок 30 – Образец подготовки. Рисунок 31 – Кровеносные сосуды. 52 Рисунок 32 – Отрезанный САМ вместе с кольцом и тканью. 2.3.6 Гистологическое исследование Блоки залитые парафином были порезаны на срезы толщиной по 5 мкм с помощью микротома LeicaRM 2135, окрашены гематоксилином и эозином. Гистологический анализ производили на микроскопе NikonDiafot 300 под увеличением 200 и 400. Подсчитывали количество жизнеспособных и подвергшихся к дегенерации фолликулов. Морфологию фолликулов оценивали на основании параметров, ранее описанных Paynter соавт. [57]. Были оценены два типа фолликулов: 1) примордиальные фолликулы, состоящие из ооцита, окруженной слоем уплощенных фолликулярных клеток; 2) первичных и вторичных фолликулов, которые похожи на примордиальные фолликулы, но в которох ооцит окружен одним или двумя слоями сферических клеток гранулезы. Качество фолликулов оценивали по шкале от одного до трех: Фолликулы 1 класса имеют сферическую форму и содержат сферический ооцит, который окружен равномерно распределенными зернистыми клетками, имеет однородную цитоплазму и слегка гранулированное ядро, с конденсированным хроматином в виде плотной сферической структуры обнаруживаемого в центре ядра. Фолликул 2 класса имеет такие же характеристики, но ооцит без конденсированного хроматина в ядре и часто неправильной формы, 53 окружающие клетки гранулезы могут быть плоскими и оторванными от края фолликула. Фолликул 3 класса содержит деформированный ооцит с или без ядерной вакуолизации, тека и зернистые клетки оторваны от края фолликула и имеются частично или полностью разрушенные гранулезные клетки с пикнотичными ядрами. Фолликулы 1 и 2 класса были оценены как нормальные, а класса 3, были оценены как дегенерированные. 2.3.7 Иммуногистология для исследования ангиогенеза Для иммуногистологического исследования процесса ангиогенеза использовали два фактора: Фактор VIII (Виллебранда) – используется для идентификации эндотелиальных клеток (старых кровеносных сосудов и их целостности); Десмин фактор – нео-ангиогенез; Для этого фрагменты яичниковой ткани после культивирования фиксировали в 4,0% формальдегиде, заливали парафином, затем делали срезы толщиной 4 мкм и окрашивали антителами (Dako, Hamburg, Германия), направленных против фактора фон Виллебранда (1: 100) и десмина (1: 100) , Интенсивность иммунореактивности была оценена полуколичественно поХан-Дауд и др. [58] следующим образом: отсутствие иммунореактивности (-), слабая иммунореактивность (+), средняя иммунореактивность (++), сильная иммунореактивность (+++). Таким образом, скорость васкуляризации с использованием фактора фон Виллебранда оценивалась в соответствии с видимой площадью поверхности кровеносных сосудов в фрагментах ткани и выражались в процентах. При оценке нео-васкуляризации или Десмин фактора, было принято правило наличия экспрессии в фрагментах ткани как "1", отсутствия экспрессии как "0". 2.4 Исследование условий перфузии целых яичников 2.4.1 Получение и подготовка яичников к перфузии Современные технологии в скотобойнях позволяют получить яичники в течение от 10 до 15 минут после смерти животных. Яичники с сосудами были вырезаны из дорсальной аорты помещены в термос без жидкости ,и доставлены в лабораторию в течение от 30 до 40 минут. В лаборатории, все манипуляции при подготовке яичников к перфузии, среды для перфузии и процесс перфузии выполнялись при комнатной температуре (22 °С). Яичники были изолированы один за другим, но соединительная ткань (mesoovarium) не была удалена. Фазы яичника (фолликулярная или лютеиновая) определяли после постперфузионного рассечения яичника на отсутствие или наличие 54 свежих (красный или оранжевый) желтых тел. Сосуды (овариальная артерия и вена) были перерезаны на расстоянии приблизительно 20-25 см под яичниками. Овариальная артерия (внутренний диаметр 0,8-1,2 мм) была подготовлена введением катетера 22 G и фиксированием при помощи нейлоновой нити Перфузию проводили смесью среды Лейбовица L-15 + 100 МЕ/мл гепарина + 5% телячьей сыворотки + 6% диметилсульфоксида + 6% этиленгликоля + 0,15 М сахарозы + 25% туши. 2.4.2 Оценка перфузия яичников с разной скоростью и интервалом начала Для исследования эффективности перфузии интактных коровьих яичников, было изучено влияние различной скорости перфузии и времени прошедшего между извлечением этих яичников от животного и началом перфузии. Для достижения этой цели яичники (n=145) были перфузированы в течении 60 минут и интервалом от 1 до 1,5 часов после извлечения яичников на скотобойне. Скорость перфузии составляла 150 мл/час (2,5 мл/мин), 100 мл/час (1,67 мл/мин), 75 мл/час (1,25 мл/мин), 50 мл/час (0,83 мл/мин), 25 мл/час (0,42 мл/мин), и 12,5 мл/час (0,21 мл/мин) для групп 1, 2, 3, 4, 5 и 6 соответственно. Во втором цикле экспериментов, перфузию яичников (n=29) проводили с помощью Перфузатора SecuraFT (B.BraunMelsungenAG, Melsungen, Germany) со скоростью 25 мл/час (0,42 мл/мин) в течение 60 минут после извлечения яичников и их хранения при комнатной температуре 3 часа (N = 18 ), 4 часа (N = 5), 5 часов (N = 3 ) и 6 часов (N = 3) для групп 1, 2, 3 и 4 соответственно . Яичники в лютеиновой и фолликулярных фазах развития были распределены в группы случайным образом. Успешная перфузия кровяных сосудов была определена визуально окрашиванием в синий цвет сосудистой ножки и овариальной ткани. По интенсивности цвета туши выявлялась перфузия тканей. Интенсивность разрушения сосудов и повреждения тканей оценивали микроскопическим методом и отмечали следующее: отсутствие нарушения (-), слабое разрушение (+), умеренное разрушение (++), а также сильное разрушение (+++). 2.5 Статистический анализ Статистическую обработку данных проводили с применением программы ANOVA. Разность считалась статистически достоверной при Р 0,05. 55 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Исследование криоциклах морфологических характеристик ооцитов в Ооциты человека особенно чувствительны к повреждениям при замораживании и размораживании вследствие их размеров (самая большая клетка человеческого тела), сложного строения и особенностей клеточного цикла (незавершенный мейоз). Оценить полученные ооциты в программах ЭКО затруднительно и возможно лишь после энзиматического удаления клеток кумулюса и короны. На световом уровне (максимальное увеличение 400) по выбросу первого полярного тела определяют мейотическое состояние ооцитов (GV, MI, MII), а также можно различить некоторые цитоплазматические аномалии – гранулярность цитоплазмы, вакуолизацию, агрегацию гладкого эндоплазматического ретикулума (ЭР), рефрактерные тела []. Каждая из таких аномалий по-своему влияет на выживаемость ооцитов в криоциклах. Технология витрификации доктора М.Куваямы [156], является успешно используемой и наиболее бережной по отношению к ооцитам, однако, она тоже имеет свои ограничения зависимые от качества гамет до замораживания, которые определенным образом влияют на их криотолерантность и интактность внутриклеточных структур после размораживания. В таблице №2 приведены общие данные наших исследований. Количество и соотношение зрелых, незрелых и дегенеративных ооцитов было нормальным, а значит все манипуляции направленные на получение ооцитов (гормональная стимуляция, аспирация фолликулов, поиск ооцитов) в циклах ВРТ проводились адекватно. Таблица 2 – Общая характеристика данных полученных в циклах криоконсерваций ооцитов в рамках программ ВРТ. Показатели Количество циклов Количество ооцитов Количество зрелых Количество незрелых Количество дегенеративных Количество витрифицированных ооцитов Количество интактных ооцитов после размораживания Количество зрелых ооцитов на ИКСИ 56 Абсолютное число 60 598 564 26 18 570 541 536 Считается, что нужно замораживать только зрелые ооциты на стадии МII, так как известно, что MII ооциты более устойчивы при замораживании к повреждениям, чем ооциты на GV- стадии или МI. Мы считаем, что это может быть связано с различиями в свойствах элементов цитоскелета []. Одним из важных отличий является то, что конфигурация микротрубочек и микрофиламентов отличается в стадиях созревания ооцитов. Элементы цитоскелета в GV- ооцитах кажутся прямыми и жесткими, в то время как появление микрофиламентов и микротрубочек в ооцитах стадии MII делает их волнистыми и гибкими. На основе гипотезы о сложном взаимодействии липидной фазы клеток и элементов цитоскелета можно предположить, что затвердевание этих липидов может привести к деформации и разрушению цитоскелета. В случае незрелых ооцитов в их жестком цитоскелете, видимо происходят необратимые повреждениям в то время, как у MII-ооцитов более гибкий цитоскелет препятствует появлению необратимых повреждений []. Однако, мы замораживали и ооциты на стадии МI. Частота выживаемости ооцитов составила 96%, при этом, как и ожидалось зрелые ооциты лучше поддавались витрификации, чем незрелые. Но даже при этом из 16 незрелых ооцитов на стадии МI выжило 9 и к нашему удивлению 4 из них самостоятельно дозрели до стадии МII после размораживания, что указывает на сохранность такой хрупкой структуры как веретено деления ооцитов. Морфологическая оценка проводилась только у зрелых ооцитов. Результаты выявленных морфологических аномалий показаны на рисунке-1. Частота ооцитов с нормальной морфологией составила 45%. В проведенных нами исследованиях среди ооцитов с аномальной морфологией встречались интрацитоплазматические аномалии 15%, с небольшой разницей экстрацитоплазматические аномалии 13% и сочетанная патология была выявлена у 27%. Эти данные показывают, что каждый второй ооцит имеел какую-либо аномалию. Эти изменения мы отнесли к специфическим аномалиям ооцитов в силу их периодических появлений у различных женщин, разного возраста и региона проживания [про сперму]. Среди дисморфизмов ооцитов объеденненных в группу экстрацитоплазматических аномалий были отмечены: ооциты с аномалиями формы, ооциты с аномалиями полярных телец и ооциты с дебрисом. А в группе интрацитоплазматических аномалий ооцитов были отмечены:ооциты с вакуолизацией, ооциты с гранулированной и окрашенной цитоплазмой, а также ооциты с агрегацией ЭР и рефрактерными телами. Частота встречаемости этих аномалий показаны на рисунке 2. Для удобства расчетов распределение дисморфизмов показатели приведены в сумме общей встречаемости той или иной группы аномалий. Как видно из рисунка 2 в группе экстрацитоплазматических аномалий распределение дисморфизмов было сравнительно одинаковым в отличие от группы интрацитоплазматических аномалий, где преобладали ооциты с гранулированной цитоплазмой. Это очень интересное явление, если брать во внимание, что в группе смешанных аномалий частота ооцитов с 57 гранулированной цитоплазмой практический была равна нулю (0,41%), а остальные нарушения встречались в привычных пределах. Смешанные аномалии ооцита 27% Экстрацитоплазматические аномалии ооцита 13% Интрацитоплазматические аномалии ооцита 15% Нормальная морфология 45% Рисунок 33 – Общая частота различных аномалий ооцитов в циклах криоконсерваций ооцитов в рамках программ ВРТ. Ооциты с дебрисом 4% Ооциты с аномалиями полярных телец 5% Ооциты с аномалиями формы 4% Ооциты с агрегацией ЭР 2% Ооциты с гранулированной цитоплазмой 10% Ооциты с вакуолизацией 3% Рисунок 34 – Частота различных дисморфизмов внутри группы. Возможно, появление этого дисморфизма у ооцитов блокирует появление других морфологических отклонений, либо в сочетании с другими аномалиями оно приводит к наиболее серьезным повреждением клеток, 58 которое заставляет ооциты дегенерировать в процессе оогенеза и в результате их элиминации общая частота ооцитов с гранулированной цитоплазмой снижается в группе смешанных аномалий. Итоговым критерием наших исследований было сопоставление морфологических характеристик ооцитов с частотой выживаемости после криоконсервации и нормальным оплодотворением после процедуры ИКСИ Морфологический нормальные ооциты 100% Экстрацитоплазматические аномалии 96% Ооциты с аномалиями формы 93% Ооциты с аномалиями полярных телец 100% Ооциты с дебрисом 95% Интрацитоплазматические аномалии 89% Ооциты с вакуолизацией 89% Ооциты с гранулированной и окрашенной цитоплазмой Ооциты с агрегацией ЭР и рефрактерными телами Смешанные аномалии 91% 87% 95% Рисунок 35 – Частота выживаемости ооцитов после криоконсервации. . На рисунке 3 показана частота выживаемости ооцитов после криоконсервации и размораживания. Видна положительная корреляция между морфологическими показателями ооцитов и их криотолерантностью. Чем лучше морфология ооцитов, тем лучше их выживаемость после криоконсерваций. Различные дисморфизмы ооцитов по разному оказывали влияние на криотолерантность ооцитов. Если сравнивать интрацитоплазматические и экстрацитоплазматические аномалии ооцитов, первые оказались более криолабильными в силу своих особенностей. В подавляющем большинстве работ, по изучению влияния охлаждения на ооциты и эмбрионы млекопитающих отрицательное влияние криогенных температур объясняется с точки зрения влияния на элементы цитоскелета. 59 Например, охлаждение ооцитов человека вызывает деполимеризацию структуры белка цитоскелета, а у большинства ооцитов мыши охлажденных до 25 °С в течение 10 минут имелись нарушения в цитоскелете [15]. Нарушения цитоскелета клеток в проведенных исследованиях в случае экстрацитоплазматических аномалий возможно менее критичны при замораживании, по сравнению с нарушениями метаболизма, представленными при интрацитоплазматических аберрациях ооцитов. Необходимо, также учитывать, особенность соотношения проникающих и непроникающих криопротекторов, используемых для витрификации ооцитов. Морфологический нормальные ооциты 88% Экстрацитоплазматические аномалии 84% Ооциты с аномалиями формы 90% Ооциты с аномалиями полярных телец 82% Ооциты с дебрисом 80% Интрацитоплазматические аномалии 58% Ооциты с вакуолизацией 52% Ооциты с гранулированной и окрашенной цитоплазмой Ооциты с агрегацией ЭР и рефрактерными телами 77% 44% Смешанные аномалии 72% Рисунок 36 – Частота нормального оплодотворения после процедуры ИКСИ. Главным образом, которые направлены на стабилизацию цитоскелета, как самого уязвимого звена криоконсервации ооцитов. Данные полученные в ходе исследований подтверждают эффективность использования, сочетания проникающих и непроникающих криопротекторов []. Наиболее неблагоприятной аномалией ооцитов при криоконсервации оказалось, появление агрегации ЭР и рефрактерных тел. 1992 году Sathananthan соавторами, [14] показали, что в клеточном комплексе под называнием "гладкой эндоплазматической сети - липидных глобул - митохондрий" существует связь. Они также показали, что эти связи могут быть повреждены 60 после охлаждения или замораживания ооцитов. Однако, даже при этой аномалии частота выживаемости ооцитов составила 87%. На последнем этапе для подтверждения интактности, не только морфологических, но и физиологических, биохимических и генетических структур, мы провели исследование частоты нормального оплодотворения ооцитов после процедуры ИКСИ. Как видно на рисунке 4 самая низкая частота нормального оплодотворения, как и ожидалось была в группе интрацитоплазматических аномалий ооцитов, но общая частота нормального оплодотворения ооцитов составила почти 76%, что является высоким показателем не только успешной криоконсервации но и сохранности внутриклеточных структур ооцитов. Таким образом, в проведенных исследованиях выявлена зависимость между морфологическими показателями ооцитов и их криотолерантностью. Чем лучше морфология ооцитов, тем лучше их выживаемость после криоконсерваций. Если сравнивать интрацитоплазматические и экстрацитоплазматические аномалии ооцитов, первые оказались более криолабильными. Наиболее неблагоприятной аномалией ооцитов оказалось, появление агрегации ЭР и рефрактерных тел. Высокие показатели нормальной фертилизации ооцитов являются потверждением, не только успешной криоконсервации но и сохранности внутриклеточных структур ооцитов после размораживания. Изучение аномалий ооцитов человека в криоциклах имеет значение не только в сохранении репродуктивной функции женщин и селекции гамет, но и в понимании роли, а также взаимодействии внутриклеточных структур клеток для нормального завершения процессов оогенеза, оплодотворения и дробления эмбрионов. 3.2 Исследование эффективности технологии криоконсервации овариальной ткани в зависимости от условий культивирования и наличия или отсутствия медулы На втором этапе наших исследований, была проведена оценка эффективности технологии криоконсервации овариальной ткани [?]. Для этого использовали критерий оценки качества овариального резерва и морфологии пула фолликулов после криоконсервации (7,9). В настоящее время имеется три способа оценки качества и количества фолликулов после криоконсервации. 1) непосредственно после размораживания (10); 2) после in vitro культивирования (11-14); 3) после ксенотрансплантации (15-18). Первый метод наиболее простой и не позволяет ответить на вопрос о потенциале развития фолликулов. Второй метод длительного in vitro культивирования требует наличия эффективной технологии. Последний метод является наиболее информативным. В наших исследованиях мы использовали последние два метода. 61 Рисунок 37 – Результаты in vitro культивирования. Рисунок 38 – Результаты САМ культивирования. 62 Через 8 дней in vitro культивирования, а также 5 дней после ксенотрансплантации на хориоаллантоисной мембране, фрагменты овариальной ткани приобретали более округлую форму (Рисунок 29). В результате проведения гистологических исследований было выявлено, что после 8 дней in vitro культивирования и 5-дневного CAM-культивирования яичниковой ткани преантральные фолликулы были жизнеспособны. Результаты этих исследований приведены в таблице 3. Таблица 3 Результаты исследования эффективности технологии криоконсервации овариальной ткани человека. Показатель Группа 1 Средняя плотность преантральных (исконный, 14,0 + 3,1* первичный и вторичный) фолликулов на 1 мм3 Количество фолликулов нормального 85,0 + 1,8%* качества (класса 1 и 2) *-P> 0,1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 12,7 + 2,2* 13,7 + 4,4* 12,0 + 1,2* 85,0 + 3,7%* 87,0 + 2,8%* 84,0 ± 0,9%* Как было, установлено, что средние плотности преантральных фолликулов на 1 мм3 для групп 1, 2, 3 и 4, были сравнимы. Также, не было статистически значимых различий в процентах от нормальных фолликулов между четырьмя группами (р> 0,1), следовательно, морфологические качества фолликулов не зависят от используемой системы культивирования и наличия или отсутствия медулы (рис. 3, 4). Кроме того, эти результаты указывают на высокую эффективность применяемой технологии криоконсервации овариальной ткани человека, так как в литературных источниках указывается средняя выживаемость фолликулов в овариальной ткани после криоконсервации на уровне 70% []. Итак, при сравнении двух методов культивирования, а также влияния содержания медулы на успешное выживание кортекса после криоконсервации и размораживания [50], наши результаты показали, что морфологические качества фолликулов не зависят от условий культивирования и наличия медулы. Таким образом, система САМ культивирования не имеет недостатков в этом отношении. 63 Рисунок 39 – Результаты гистологического исследования in vitro и САМ культивирования после криоконсервации и размораживания. А, а - in vitro культивирование; В, b - САМ культивирование. Рисунок 40 – Результаты гистологического исследования in vitro и САМ культивирования после криоконсервации и размораживания овариальной ткани без медулы. Рисунок 41 – Результаты гистологического исследования in vitro и САМ культивирования после криоконсервации и размораживания овариальной ткани с медулой. 66 3.3 Иммуногистология для ангиогенеза и нео-ангиогенеза В других наших исследованиях были проведены иммуногистохимические анализы гистологических срезов для определения особенностей ангиогенеза в исследуемых группах. При этом не было никаких различий, обнаруженных между группами 1 и 3 по отношению к наличию развитых сосудов выявленных с помощью фактора фон Виллебранда. Были отмечены следующие интенсивности иммунореактивности гистологических срезов в исследуемых группах: Группа 1: слабая (+); Группа 2: умеренная (++); Группа 3: умеренная (++); Группа 4: сильные (+++). В группах 1 и 3, степень васкуляризации (по оценке с площадью поверхности срезов, занимаемой кровеносными сосудами) была на уровне 40%, тогда как этот показатель в группах 2 и 4 достигали 70%, (р <0,05) (рис. 5). Нео-ангиогенез (Десмин фактор) наблюдался только в группе 4 (CAMкультивирование кортекса с медулой) (рис. 32). В ткани из групп 1, 2 и 3 этот фактор не был обнаружен. Наличие медулы в фрагментах кортекса яичниковой ткани повышает шансы на реваскуляризацию после трансплантации ткани яичников, что было выявлено при иммуногистохимическом исследовании фактора фон Виллебранда и десмина. В последних исследованиях, было высказано предположение, что фактора фон Виллебранда регулирует ангиогенез [83]. Однако, в иммуногистохимии, интенсивность окрашивания фактора фон Виллебранда зависит от размера кровеносных сосудов; наиболее выраженная экспрессия фактора фон Виллебранда выявлена в венах, затем в артериях, артериолах, капиллярах и венулах [84, 85]. Процессы нео-васкуляризации начинаются с образования очень мелких сосудов. Поэтому, для обнаружения образование этих сосудов, мы использовали фактор Десмин. Десмин представляет раннее развитие роста сосудов и проявление дифференциального окрашивания образцов во время васкуляризации [86]. Перициты, являются клетками соединительных тканей, которые образовываются в мелких кровеносных сосудах [87] и принимает участие в ранних стадиях капиллярного прорастания и находится над и перед кончиками эндотелиальных ростков сосудов. Кроме этого, исследовано участие микрососудистых перицитов в процессе капиллярного прорастания. Капиллярные ростки были визуализированы с помощью окрашивания родамин-конъюгированного фаллоидином, после чего перициты окрашивались антителами к десминам. Установлено, что развивающиеся перициты были реактивными для десмина [88]. Рисунок 42 – результаты васкуляризации в замороженных и размороженных тканей по in vitro и САМ культивированию. . 68 Рисунок 43 – результаты Нео-ангиогенеза при САМ культивировании кортекса с медулой. 69 При наличии десмин-позитивных клеток на ранней стадии васкуляризации получены следующие результаты [89]. Установлено, что ангиогенез индуцируется после имплантации фрагментов карциномы. Развитие сосудов, которые сосредоточены в плотной оправе вокруг опухоли, представляет образование сосудов опухоли через регистрации сосудов. Впервые, десмин-позитивные клетки были обнаружены развивающимся ангиогенного оправа. После, они были обнаружены как перициты с помощью электронного микроскопа, находящиеся вокруг сосудов и образовывая связь между эндотелиальными клетками. После введения в peritumourный сосудистую оправу опухоля, количество перицитов уменьшалось [89]. Наши наблюдения показали, что независимо от системы культуры скорость васкуляризации (обнаруженная анти-фактором Виллебранда) была выше в коре яичника содержащего мозгового вещества, чем в коре не содержащих мозгового вещества. Кроме этого, исследовано нео-ангиогенез (обнаруженный с анти-десминами) в CAM-культивированного коры содержащих мозгового вещества. Представленные результаты, привели к трем выводам. Во-первых, система-САМ может быть использован для культивирования криоконсервированных человеческого ткани яичника. Вовторых, присутствие мозгового вещества в яичниках приводит к улучшению васкуляризации, а так же необходимым для нео-ангиогенеза. Исследуя из этого, включение мозгового вещества имеет особое преимущество, когда они имплантируются в женских яичниках. В-третьих, культура в системе-CAM привело к нео-ангиогенезу коры содержащих мозгового вещества. Таким образом, система-CAM требует дальнейшего исследования в качестве средства культивирования человеческого ткани яичника, так как это является ценной альтернативой для ксенотрансплантации. 3.4 Исследование инициации процесса ангиогенеза и влияния фазы менструального цикла на ангиогенную активность ткани Дальнейшие этапы исследования процессов ангиогенеза были связаны с изучением характера инициации васкуляризации и ангиогенной активности овариальной ткани на разных фазах менструального цикла. Для этого на первом этапе исследований были проведены эксперименты по САМкультивированию трех различных объектов: жизнеспособной ткани успешно прошедшей этапы криоконсервации и размораживания; функционально неактивной ткани, опущенной в кипящую воду; неживой материи в виде поршня апирогенного медицинского шприца. В результате проведения 10 циклов этого эксперимента было выявлено, что неживая материя, так же как и функционально неактивная ткань не вызвали индукцию процессов ангиогенеза на хорионалантоисной мембране. Жизнеспособная ткань каждый раз инициировала процессы васкуляризации 70 на хорионалантоисной мембран. Самый ранний ангиогенез был зафиксирован на вторые сутки, а самый поздний на 4 сутки культивирования. Это показывает, что процессы ангиогенеза при САМ-культивировании инициируются факторами, испускаемыми только жизнеспособной овариальной тканью человека успешно прошедшей этапы замораживания и размораживания. Для исследования влияния фазы менструального цикла, в которой был произведен забор овариальной ткани на ее ангиогенную активность, были проведены серии экспериментов САМ-культивирования кортекса овариальной ткани содержащей медулу. Ранее было показано, что это система является благоприятной для выявления интенсивной реваскуляризации в трансплантантах. Общие данные и результаты этих экспериментов приведены в таблице 4. Как видно из таблицы 4 в исследуемой группе не было женщин на ранней и средней фолликулярных фазах. Средние плотности преантральных фолликулов на 1 мм3 для исследуемых групп были сравнимы. Также, не было статистически значимых различий в процентах от нормальных фолликулов между группами (р>0,1). При исследовании фактора Виллибранда выявилась дифференциальная иммунореактивность на разных фазах менструального цикла. Дальнейшее сранение ангиогенной активности овариальной ткани с циклическими уровнями гормонов менструального цикла выявилась связь с эстрадиолом (рисунок 33, 34). Рисунок 44 – уровни гормонов в менструальном цикле женщины. 71 Таблице 4. Результаты исследования влияния фазы менструального цикла на ангиогенную активность овариальной ткани человека. Показатель Фолликулярная фаза ранняя средняя поздняя Лютеиновая фаза Овуляторная фаза ранняя средняя поздняя Количество женщин - - 8 4 8 7 3 Количество фрагментов овариальной ткани - - 16 8 16 14 6 Средняя плотность преантральных (исконный, первичный и вторичный) фолликулов на 1 мм3 - - 11,4 + 2,7* 12,6 + 3,2* 14,1 + 2,4* 13,3 + 2,2* 14,0 + 4,2* Количество фолликулов нормального качества (класса 1 и 2) - - 88,1 + 1,2%* 83,0 + 2,4%* 84,0 + 3,8%* 89,3 ± 1,1%* 86,0 + 2,2%* Фактор фон Виллибранда - - +++ ++ ++ +++ + Десмин фактор - - + + + + - *-P> 0,1 Рисунок 45 – уровни гормонов в менструальном цикле женщины. Таким образом, было установлено, что ангиогенная активность овариальной ткани человека зависит от фазы менструального цикла. Высокая ангиогенная активность в овариальной ткани наблюдается, на поздней фолликулярной и средней лютеиновой фазах менструального цикла; Средняя ангиогенная активность выявлена в овуляторную и раннюю лютеиновую фазы, а низкая ангиогенная активность – в поздней лютеиновой фазе; Кроме того, фактор Десмин, характеризующий неоангиогенез в овариальной ткани человека, не был выявлен в поздней лютеиновой фазе менструального цикла; 3.5 Исследование перфузии интактного коровьего яичника как модели человека Ишемия серьезная проблема, сопровождающая процесс извлечения ткани яичников для криоконсервации и ретрансплантации. Известно, что наличие кровеносных сосудов является очень важным фактором для успешной трансплантации ткани яичников [7]. Было показано, что пересаженные яичники у крыс стали усиленно васкуляризироваться повторно в течение 48 часов после аутотрансплантации [7]. В коре, развитие первичных фолликулов полностью зависит от сосудов стромы [8]. При повторной васкуляризации, трансплантанты уязвимы к ишемии, которая является главным препятствием для выживания тканей после трансплантации. Такое повреждение может привести к снижению размера трансплантата от 30 до 70% сопровождающегося фиброзными изменениями [9]. Гипоксия наблюдается в течении первых 5 дней после пересадки и ишемические повреждения, происходящие в этот период могут вызвать потерю примордиальных фолликулов [10] и нарушению фолликулярной активации [11, 12]. При криоконсервации целого яичника с размораживанием и ретрансплантацией через сосудистый анастомоз, проблема неоваскуляризации будет решена "автоматически". Поэтому на третьем этапе исследований были проведены серии экспериментов для выявления эффективных условий перфузии интактных целых яичников коровы и овцы в целях дальнейшей криоконсервации. Эксперименты по определению времени начала перфузии и скорости перфузии были проведены на коровьих яичниках, которые являются хорошей моделью криоконсервации целого яичника человека с сосудистой ножкой. Мы выбрали два вида млекопитающих по следующим двум причинам. Первым является анатомические и физиологические факторы. Мы полностью разделяем точку зрения Gerritse соавторов [2], которые выполняли свои эксперименты с использованием коровьих яичников в качестве модельной системы для человека. Авторы пояснили, что они использовали коровьи яичники из-за следующих причин: (I) яичники сравнимы по размеру с человеческими яичниками; (II) в них созревает только один или два фолликула за цикл, созревание нескольких фолликулов существенно влияет на объем яичников и, следовательно, на исход процесса замораживания; и (III) у коров есть месячный цикл. Они [2] для своих исследований рассматривали яичники крупного рогатого скота, свиней, овец и коз в качестве возможных кандидатов для модельной системы. Измерение объемов показали, что свиные яичники сопоставимы по размерам с яичниками человека, коровьи яичники немного больше, яичники овец и коз гораздо меньше. Однако у свиней созревают несколько фолликулов за цикл, что может привести к изменению формы и/или сосудистой функции яичников по сравнению с яичниками, в которых каждый месяц созревает только один или два фолликула. Таким образом, они [2] выбрали коровьи яичники в качестве модельной системы человека [2] также как и мы. Во-вторых, мы выбрали коровьи яичники в качестве модели для наших исследований по «криобиологическим» причинам. Как правило, криоисследования на тканях человека основаны на успешно используемых протоколах появляющиеся от аналогичных экспериментов, проведенных на лабораторных и сельскохозяйственных животных. Прежде, чем что-либо использовать для замораживания клеток человека, оно должно пройти успешное испытание на животных тканях. Однако, стоит принять во внимание, что человеческие клетки имеют свои особенности. Одним из таких особенностей, является наличие внутриклеточных липидов. Оптимальный протокол криоконсервации должен предотвращать изменение физикохимических свойств охлажденных липидов, избежать необратимых повреждений липидов в мембранах и везикулах, а также защитить от разрушения при охлаждении ретикулум-липидной связи. Известно, что ооциты коров в значительной степени более криостабильны, чем ооциты свиней. Существует также информация о том, что диаметры коровьих и свинных внутриклеточных липидных везикул различны. Характеристики внутриклеточных мембран, гранул липидов также является темой для обсуждения. 74 Сравнение ультраструктуры липидных капель и эффекта охлаждения на внутриклеточные липидные везикулы коровьих и свиных GV-ооцитов [16], показало, что липидные капельки коровьих клеток имеют однородную структуру. Использование липидов происходит непосредственно от этих везикул без образования промежуточных соединений липидов. В противоположность этому, существуют два вида липидных капель в свинных GV-ооцитах: «темные» и «серые». Пузырьки каждой конкретной группы соединены друг с другом. После 12–часового культивирования формируется слой цистерн эндоплазматического ретикулума, этот слой всегда ассоциируется с «серыми» липидными везикулами. Это свидетельствует о том, что во время оогенеза липолиз происходит только в «серых» пузырьках. Предполагается, что цитоплазматический липолиз имеет два этапа: «темный» пузырьки превращаются в «серые» с последующим использованием этих «серых» липидов. Кроме того, морфология обоих типов липидных капель в ооцитах свиней меняется при охлаждении: они преобразуются от круглых в сферические формы со светящимися полосами. В липидных каплях коровьих GV-ооцитов не были выявлены никаких видимых морфологических изменений после охлаждения [16]. Свежие липидные капли в обоих видах, (человека и коровьих ооцитах) по стуктуре однородны. Было отмечено, что после витрификации внутриклеточные липиды в криоконсервированных эмбрионах человека не претерпевали видимых морфологических изменений в то время, как различные изменения наблюдались в липидных каплях в эмбрионах овец. Эти изменения, связанные с процессом витирификации отражают изменения в физических и химических свойствах липидов, таких как стабильность. Специфика человеческих клеток, отражающая их высокую чувствительность к осмотическим процессам связана со спецификой, как внутриклеточных липидов, так и цитоплазматических и органойдных мембран. Липиды являются наиболее криолабильными внутриклеточными соединениями ооцитов и эмбрионов. Действительно, специфика внутриклеточных липидов в ооцитах свиней делает их практически непригодными для криоконсервации, особенно для витрификации. Было установлено, что внутриклеточные липиды в свежих клетках человека до и после витрификации не имеют никаких изменений. Сравнение этих липидов с теми которые в овечьих клетках, применяя для них такой же протокол, который был использован для ооцитов человека с прямой регидратацией в наших предыдущих исследованиях, показали ультраструктурные изменения после витрификации, не выявленные в ооцитах человека [18]. Учитывая отрицательную роль липидов в процессе криоконсервации, криостабильность липидов и напротив осмотическая нестабильность клеток человека еще далеко не полностью изучены. Прямая регидратация после размораживания вызывает летальный осмотический эффект в человеческих ооцитах, но этот подход успешно используется на овечьих ооцитах. [26]. 75 Принимая во внимание все вышеприведенные, данные коровьи яичники являются наиболее подходящей моделью для человека, поскольку внутриклеточные и мембранные липиды являются наиболее чувствительны к осмотическому влиянию, как у клеток человека. Только поэтому, коровья модель была использована в наших экспериментах. В наших экспериментах после успешной перфузии, примерно 95% ткани и сосудов яичников коровы окрасились в синий цвет. Ткань яичников с неокрашенными областями, свидетельствовала о неполной перфузии средой замораживания (таблица 1). Таблица 5 - Эффективность перфузии целых яичников коровы средой для замораживания. Интенсивность Скорость Количество разрушения перфузии Насыщение Группы яичников в сосудов и ткани, % повреждения мл/час мл/мин группе, n тканей 1 150 2,5 6 95 +++ 2 100 1,67 12 95 ++ 3 75 1,25 12 95 + 4 50 0,83 50 95 5 25 0,42 50 95 6 12,5 0,21 15 15 Нарушение сосудов и повреждение тканей в результате высокого давления перфузии (замораживающей средой) с различной интенсивностью (сильное (+ + +), недостаточное (+ +), и слабое (+)) наблюдались в различных скоростях перфузии, а именно 150, 100 и 75 мл/час для групп 1, 2 и 3 соответственно (таблица 1). В первом цикле экспериментов оптимальная скорость перфузии была установлена для яичников 4 и 5 групп (50 и 25 мл/час, соответственно) (таблица 1). Во втором цикле экспериментов, успешная перфузия яичников со скоростью перфузии 25 мл/ч была установлена только для яичников группы 1 (3 часа после извлечения). Эффективность перфузии в группе 2 (4 часа после извлечения) резко снижалась. Была показана важная роль среды с криопротекторами в перфузии целого яичника овцы [3]. Было проведено обширное исследование на 360 яичниках овец, окрашенных in vitro путем перфузии с качественным маркером кровоснабжения тканей. Модель логистической регрессии была построена, чтобы определить факторы, связанные с неполным окрашиванием яичника. Целые яичники овец с их сосудистой ножкой были перфузированы при 0,35 мл/мин в течение 2 часов при 39°C в 19 различных экспериментальных условиях. Ножки были удалены, яичники разрезали и сфотографировали. 76 Неокрашенные места на разрезанной поверхности были измерены. У 64,4% яичников наблюдались неокрашенные участки. Многомерный анализ показал, что неполное окрашивание яичников было независимо от малого опыта экспериментатора, меньшей поверхности среза яичников, и наличия желтого тела. Наличие неокрашенных участков не зависело от экспериментальных условий. Частота неполного окрашивания яичников снизилась с 83% до 60% [3]. Рисунок 46 – Подготовка интактных коровьих яичников с сосудистой ножкой к перфузии. а – начало перфузии яичников; б – овариальная артерия (белая стрелка), овариальная вена (черные стрелки); с, d, е – введение и фиксация катетера в овариальную артерию. Бар = 1 см. Из этих экспериментов можно сделать следующий вывод, что нарушения кровоснабжения, которые приводят к неполной перфузии, могут отрицательно сказаться на последующих результатах криоконсервации целого яичника. Улучшенные метода перфузии должно положительно 77 повлиять на успех криоконсервации [3]. Перфузия тушью в исследованиях Gerritse соавт. [2] проводилась на интактных коровьих яичниках. Авторы отметили, что более крупные сосуды были хорошо перфузированы, в то время как более мелкие и капилляры были менее хорошо перфузированы. Авторы предположили, что относительно меньшая молекулярная масса криопротекторов, таких как диметилсульфоксид и сахароза, позволяет, быть менее подверженными молекулярным механизмам фильтрации эндотелиальными клетками и базальными мембранами [2]. Рисунок 47 – Окончание перфузии интактных коровьих яичников с сосудистой ножкой. а, б – яичник после успешной перфузии (~ 95% тканей), и с, d – яичника после неудачного перфузии (~ 15% тканей). Бар = 1 см. В наших экспериментах в качестве раствора для перфузии была использована смесь, которая включает в себя 5% телячьей сыворотки + 6% диметилсульфоксида + 6% этиленгликоля + 0,15 М сахарозы являющейся средой для замораживания. В самом деле, присутствие из этих компонентов не приводит к увеличению проницаемости перфузирующей среды в мелкие капилляры. Наличие криопротекторов (особенно непроникающего криопротектора сахарозы) и сыворотки теленка в перфузирующем растворе 78 а б с Рисунок 48 - in vivo перфузия овечьего целого яичника с замораживающим раствором а - яичник (белая стрелка) с конечностью (черная стрелка), б - перфорация артерии ovarica с использованием катетера 24 G для перфузии замораживающего раствора, с - начало перфузии яичников через артерию ovarica с использованием катетера 18 G с замораживающим раствором Бар=1 см Рисунок 49 - in vitro перфузия целого овечьего яичника с замораживающим раствором а, б - аорта с артерией ovarica (внутри катетер 24 G), с, d, е - перфузия с замораживающим раствором: проведенный от начала перфузии, через вену ovarica (белые стрелки) и яичников (черная стрелка) в течении 3 мин (с), 5 мин (d) и 10 мин (е). Замораживающий раствор включает Leibovitz L-15 + 100 МЕ/мл гепарина + 5% бычьей сывороткой теленка + 6% диметилсульфоксида + 6% этиленгликоля + 0,15M сахарозы + Индийской чернилы. Бар = 1 см. а б с Рисунок 50 – Перфузия целого овечьего яичника с сосудистой конечностью с замораживающим раствором а, б - яичник после успешной перфузии (~ 95% ткани, за исключением желтого тела), с - яичник после неудачной перфузии (~ 10% ткани), желтое тело показаны стрелкой). Обратите внимание на неудачную перфузию желтого тела. Замораживающий раствор включает Leibovitz L-15 + 100 МЕ/мл гепарина + 5% бычьей сывороткой теленка + 6% диметилсульфоксида + 6% этиленгликоля + 0,15M сахарозы + Индийской чернилы. Бар = 0,5 см. можно объяснить тем, что это для успешной перфузии мелких кровеносных сосудов и особенно капилляров [2] (2.5мл / мин). Увеличение скорости перфузии в яичниках группы 3 (1,25 мл/мин) приводит к разрывам сосудов и повреждению тканей. Время, прошедшее между гибелью животных в бойне и извлечением яичников, а также началом процесса перфузии является важным параметром технологии криоконсервации, поскольку это влияет на ишемическое повреждение яичников. Мы показали, что этот период при комнатной температуре не должен превышать 3 часов, потому что за это время, начинается закупорка маленьких и больших сосудов коагулированными эритроцитами. Конечно, это время может быть увеличено с помощью более низких температур для транспортировки яичников. Таким образом для проведения эффективной перфузии коровьих интактных яичников с сосудистой ножкой необходимо использовать замораживающую среду (6 % этиленгликоль + 6% диметилсульфоксид + 0,15 М сахарозы) при комнатной температуре, со скорость перфузии 25-50 мл/час. Кроме того, яичники должны быть перфузированы в течение 3 часов после смерти животных. 3.6 Исследование перфузии интактного овечьего яичника как модели человека Эксперименты по выявлению температурного режима замораживающего раствора для перфузии были проведены на овечьих яичниках. Целью перфузии яичников является не насыщение клеток криопротекторами, а вытеснение клеток крови из кровеносных сосудов до криоконсервации яичников. Если перед замораживанием, кровеносные сосуды и капилляры яичников, будут наполнены свернувшимися клетками, то после размораживания восстановление нормального кровообращения ткани яичника будет не возможно. Клетки крови без отдельного замораживания не могут быть заморожены в сосудах, вместе с тканьями яичника. Технологически провести такой эксперимент очень сложно. Так как, овариальная ткань и клетки крови должны быть заморожены различными методами, вследствие присутствия клеток крови необходимо вытиснить клетки из сосудов до охлаждения овариальной ткани для предотвращения ишемии. Для перфузии яичников была использована замораживающая среда, включающая ДМСО, жидкость с очень высокой проницаемостью. Наличие ДМСО и гепарина в перфузионной среде повышает ее способность вытиснения клеток крови из сосудов перед замораживанием. Кроме того, перфузия ткани с замораживающим раствором является решением проблемы насыщения овариальной ткани проницаемыми криопротекторами. Показано, что наличие кровеносных сосудов и восстановление кровообращения являются важными компонентами успешной трансплантации ткани яичника и выживания фолликулов яичников [8]. Отмечено, что после аутотрансплантации, незрелые яичники крыс реваскуляризируются в течение 48 часов [8]. После трансплантации и до реваскуляризации трансплантанты уязвимы к ишемии и это является основным препятствием для выживания ткани. Трансплантация целых яичников с сосудистой ножкой в отличии от трансплантации кортекса может косвенно устранить ишемию. Следующие полученные результаты были основой гипотетического предположение при выполнении сравнительного анализа экспериментов. Предположено, что вытеснение крови из капилляров ткани яичника in vivo эффективнее, чем invitro. Если соединить артерии ovarica через перфузатор с криоконсервирующим раствором, то давление этого раствора будет устойчиво нарастать, и постепенно кровь будет заменена замораживающим раствором. По завершению изоляции артерии ovaricaи вены ovarica из системы циркуляции, будет получен яичник, освобожденный от крови и готовым к замораживанию. Также предположено, что манипуляцию перфузии in vivo нужно выполнить, когда в яичнике от вены ovarica наблюдается нормальное физиологическиое отрицательное давление. Теоретически, перфузия яичника in vivo является дополнительным насосом для перфузии раствора, так как оно поможет раствору перфузии проникнуть через капилляры яичника. Были проведены серии экспериментов по исследованию роли ДМСО во время криоконсервации путем прямого погружения человеческих GV-ооцитов в жидкий азота (витрификация). В одном из экспериментов, была изучена возможность использования витрификации без присутствия ДМСО [31], так как после криоконсервации ооцитов мыши ДМСО влияет на организацию микрофиламентов [32] и индуцирует хромосомные аномалии (то есть, увеличение темпов вырождения и полиплоидные эмбрионы) [33]. Тем не менее, по нашим исследованиям, отсутствие ДМСО в витрификационной среде вызвало значительное снижение созревания ооцитов. С другой стороны, 5-минутн контакт ооцитов с ДМСО при 37°С было достаточно, чтобы вызвать самопроизвольную активацию и партеногенетическое развитие ооцитов [31]. Таким образом, решением этой проблемы является использование в медицинской практике протокола, который рекомендован нами, так как компромисс между наличием ДМСО в витрификационном растворе и партеногенетической активации остается. На основании полученных результатов, было предложено (1) короткий (1 минутный) контакт с ДМСО, который входит в витрификационный раствор, и (2) контакт с ДМСО при комнатной температуре, которая теоретически может уменьшить негативное влияние на ооциты. Высокие темпы созревания и отсутствие партеногенеза являются прямым доказательством того, что этот способ использования ДМСО (уменьшение времени и температуры контакта) подходит для витрификации GV-ооцитов человека. 83 Таким образом, в перфузионной среде (затем в замораживающей среде) 6% ДМСО не токсичен для тканей яичников. Во-первых, когда концентрация ДМСО составляет до 20% в случае витрификации ооцитов и эмбрионов он является токсичным. Поэтому концентрация ДМСО в перфузии и замораживающем растворе должна составить 6%. В медицинской практике 6% ДМСО используется для криоконсервации ряда различных тканей [7, 3443]. Во-вторых, потенциал токсического эффекта ДМСО может быть компенсирован детергентным свойством ДМСО, из-за высокой проницаемости перфузионной среды через небольшие капилляры. Установлено, что проведение манипуляции перфузии in vitro бараньих интактных яичников с сосудистыми конечностями с использованием замораживающего раствора эффективнее, чем выполнение манипуляции in vivo. 84 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Диссертационная работа посвящена изучению процессов ангиогенеза овариальной ткани человека после криоконсервации и трансплантации. Новизна диссертационной работы заключается в применении комплексного подхода в исследовании процессов ангиогенеза при криоконсервации овариальной ткани человека, выявлении особенностей инициации и характера нео-ангиогенеза, а также условий проведения успешной перфузии интактных яичников в целях криоконсервации целого органа. Установление морфологических особенностей ооцитов человека при криоконсервации, позволяющее глубже понять характер взаимодействия внеи внутриклеточных структур при диффузии криопротекторов, а также воздействии криогенных температур. Выявленные особенности инициации процессов ангиогенеза в условиях in vivo, характер нео-ангиогенеза и различная ангиогенная активность овариальной ткани в зависимости от биологических циклов женщины, расширяют наши знания о закономерностях процессов ангиогенеза в овариальной ткани человека. Результаты настоящего исследования значительно расширяют границы сохранения репродуктивного потенциала у женщин разного возраста и состояния соматического здоровья. Полученные результаты позволяют прогнозировать успешность циклов криоконсервации ооцитов человека, оценивать потенциал овариальной ткани для трансплантации, а также определить фазу забора ткани с наибольшей ангиогенной активностью для облегчения проблем ишемии трансплантатов. Кроме того, выявленные условия эффективной перфузии яичников коровы и овцы в целях криоконсервации и дальнейшей трансплантации целого органа, могут стать основой для разработки методов сохранения и восстановления репродуктивной функции человека. Таким образом, проведенные исследования и полученные на их основе научные результаты позволяют сделать следующие выводы: 1. впервые выявлена зависимость криотолерантности ооцитов человека от морфологических особенностей их организации. Наиболее криолабильными являются ооциты с интрацитоплазматическими аномалиями: агрегация эндоплазматического ретикулума и образование рефрактерных тел; 2. впервые установлено, что инициация процесса ангиогенеза при САМкультивировании вызывается фрагментом жизнеспособной овариальной ткани человека успешно прошедшей этапы криоконсервации и размораживания; 3. впервые установлено, что ангиогенная активность овариальной ткани человека зависит от фазы менструального цикла. Высокая ангиогенная активность в овариальной ткани наблюдается, на поздней фолликулярной и средней лютеиновой фазах менструального цикла; Средняя ангиогенная активность выявлена в овуляторную и раннюю лютеиновую фазы, а низкая ангиогенная активность – в поздней лютеиновой фазе; 85 4. показано, что при ксенотрансплантации фактор Десмин, характеризующий неоангиогенез в овариальной ткани человека, не выявлен в поздней лютеиновой фазе менструального цикла; 5. установлено, что эффективными условиями для проведения успешной перфузии целых коровьих и овечьих яичников является использование замораживающей среды при комнатной температуре, со скоростью перфузии 25-50 мл/час и времени начала перфузии не более 3 часов. 86 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Blatt J. Pregnancy outcome in long-term survivors of childhood cancer. Med Pediatr Oncol 1999;33:1:29—33 2. Нургазиев К.Ш., Сейтказина Г.Д., Байпеисов Д.М., Сейсенбаева Г.Т., Ажмагамбетова А.Е. Показатели онкологической службы Республики Казахстан за 2011 год (статистические материалы). – Алматы, 2012, 108 с. 3. Klock S.C., Zhang J.X., Kazer R.R. Fertility preservation for female cancer patients: early clinical experience. Fertil Steril 2009. 4. Meirow D., Nugent D. The effects of radiotherapy and chemotherapy on female reproduction. Hum Reprod Update 2001;7:6:535—543. 5. Kim S.S., Hwang I.T., Lee H.C. Heterotopic autotransplantation of cryobanked human ovarian tissue as a strategy to restore ovarian function. Fertil Steril 2004;82:4:930—932. 6. Oktay K., Oktem O. Ovarian cryopreservation and transplantation for fertility preservation for medical indications: report of an ongoing experience. Fertil Steril 2008 7. Tomer Israely, Nava Nevo, Alon Harmelin, Michal Neeman, Alex Tsafriri Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Hum Reprod 2006 Jun 3;21(6):1368-79. 8. Demeestere I, Simon P, Emiliani S, Delbaere A, Englert Y. Orthotopic and heterotopic ovarian tissue transplantation. Hum Reprod Update. 2009 NovDec;15(6):649-65. 9. Малая медицинская энциклопедия. — М.: Медицинская энциклопедия. 1991—96 гг. 10. Первая медицинская помощь. — М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 11. Энциклопедический словарь медицинских терминов. — М.: Советская энциклопедия. — 1982—1984 гг 12. Анатомия человека. В 2-х томах // Под ред. М.Р. Сапина.– М.: Медицина, 2001. – 544 с. 13. Акушерство и гинекология: Учебник для вузов (пер. с англ. Шур А.А., Плешакова Ф.И., Климовой М.Л. и др. под ред. Занько С.Н.), М.: Медицинская литература, 2001 14. Атлас оперативной гинекологии (пер. с англ. Климовой М.Л., Шур А.А., Шиленка Д.В. и др.), изд. 2-е, перераб., доп. М.: Медицинская литература, 2004 15. Гинекология Уч.д/вузов (ред.Савельева Г.М., Бреусенко В.Г.). М.: ГЭОТАР МЕДИА, 2001 16. 1. Быстрова О.В Калугина А.С., Цыбатова Е.В., Тапильская Н.И. и соавт. Способы восстановления фертильности у онкологических больных. Практическая онкология. Т. 10, № 4- 2009, С. 245-253. 17. Damewood MD and Grochow LB. Prospects for fertility after chemotherapy or radiation for neoplastic disease. Fertil Steril 1986; 45: 443-59. 87 18. Donnez MMD, Demylle D, Jaboul P, Pirard C, Squifflet J, MartinezMadrid B, Van Langendonckt A. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet 2004; 364. 19. Tilly JL. Apoptosis and ovarian function. Rev Reprod 1996; 1: 162-72. 20. de Martel C, Ferlay J, Franceschi S, et al. Global burden of cancers attributable to infections in 2008: a review and synthetic analysis. The Lancet Oncology 2012;13: 607-615. 21. Арзыкулов Ж.А., Сейтказина Г.Ж., Махатаева А.Ж. и др. Показатели онкологической службы Республики Казахстан за 2006 год (стат.материалы).-Алматы, 2007.- 56с 22. Мерабишвили В.М., Старинский В.В. Организация раковых регистров в России//Тезисы докладов IV Всероссийского съезда онкологов. «Проблемы современной онкологии». Ростов н/Д, 1995 .-С. 70-71. 23. De Caterina R., Lanza M., Manca G. et al. Bleeding time and bleeding: an analysis of the relationship of the bleeding time test with parameters of surgical bleeding // Blood. -1994. – Vol.84. -P. 3363-3370. 24. Simaoka K., Akiba S. Malignancies in atomic bomb survivors in Hiroshima- and Nagasaki // J. Nucl. Med Allied. Sci.-1990. –Vol. 34, №4.- P. 254-258. 25. Kaatsh P., Haaf H.G., Michaels J. Jahresbericht 1993 des Deutshen Kinderkrebsregisters. Mainz, 1994. -S.10.- P. 22-23. 26. Злокачественные новообразования в Российской Федерации в 1993 г. 1994. -С. 6-11 27. Злокачественными новообразования в России и стран СНГ в 1996 году (заболеваемость смертность), 1997. -С. 70-83. 28. Курмашев В.И. Возможности и пути ранней диагностики гемобластозов у детей // Лечащий врач. 1998. -№2. -С. 38-40. 29. Муратова Е.Ю. Стандартизация в медицине (отечественный изарубежный опыт) // Проблемы оценки качества медицинской помощи. СПб., 1996.-С 9-10. 30. Смулевич В.Б., Соленова Л.Г., Белякова С.В. Злокачественным новообразования у детей // Итоги науки и техники. Онкология. М., 1988. – Т.17. -С. 78-93. 31. Аксель Е.М., Двойрин В.В., Трапезников Н.Н. Заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований населения России и некоторых других стран СНГ в 1992 г.-М..1994.-С. 17-25. 32. Двойрин В.В., Аксель Е.М., Трапезников Н.Н. Статистика злокачественных новообразований в России и некоторых других стран СНГ в 1994 г. М., 1995.с. 43-49. 33. Карачунский А.И., Беликова Л.Ю.. Штакельберг А., и др. Лечение рецидивов острого лимфобластного лейкоза у детей: основные итоги в группе ВFМ и анализ собственного 7-летнего опыта // Гематология и трансфузиология 1998. -Т. 43. -№6. -С.8-13. 88 34. Арзыкулов Ж.А., Сейтказина Г.Ж., Жумашев У.К. Проблемы в детской онкологии// Сб. научных трудов международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы онкологии». Алматы, 2003. – С. 50-52. 35. Кук. Д., Малроу С., Хайнес Б. Систематические обзоры: синтез наиболее обоснованных фактов, важных для принятия клинических решений // Международный журнал медицинской практики. -1997.-№4. -С.13-17. 36. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. / Пер. с англ. М., 1998. 213с. 37. Simpson C.L., Hempelman L.HL The association of tumors and roentgenrays treatment of the thorax in infancy // Cancer. 1957.-Vol.10. №1. -P.42 -56. 38. Арзыкулов Ж.А. Онкологическая помощь населению РК. Современнная ситуация и перспектива. Материалы IV съезда онкологов, рентгенологов и радиологов республики Казахстан (13-14 сентября 2001). Алматы. 2001. -С. 4-6. 39. T.K. Woodruff and K.A. Snyder (eds.) Oncofertility. Springer 2007 261 p. 40. von Wolff M, et al. Eur J Cancer. 2009;45:1547–1553. 41. Grovas A, Fremgen A, Rauck A et al. 1997 The national cancer data base report on patterns of childhood cancers in the United States. Cancer 80, 2321–2332 42. Jemal, A. Cancer statistics, 2008 / A. Jemal, R. Siegel, E. Ward // Cancer J. Clin. 2008. - Vol. 58, № 2. - P. 71 - 96. 43. Демина Е. А., Махова Е. Е., Сусулева Н. А., Ильященко В. А. Возможности сохранения детородной функции у женщин с лимфомой Ходжкина // РМЖ. - 2005. - № 1. - С. 26-28. 44. Шмаков Р. Г. Репродуктивное здоровье женщин с онкогематологическими заболеваниями: Автореф. дис. - д-ра мед. наук. - М., 2008. - 46 с. 45. Maltaris T., Seufert R., Fischl F. et al. The effect of cancer treatment on female fertility and strategies for preserving fertility // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 2007. - Vol. 130. - P. 148-155. 46. Hovatta O. Methods for cryopreservation of human ovarian tissue. Reprod Biomed Online 2005; 10:729-734. 47. Oktay K, Buyuk E, Veeck L, Zaninovic N, Xu K, Takeuchi T, Opsahl M, Rosenwaks Z. Embryo development after heterotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 2004; 363:9412. 48. Donnez J, Martinez-Madrid B, Jadoul P, Van Langendonckt A, Demylle D, Dolmans MM. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation: a review. Hum Reprod Update 2006a; 12:519-535. 49. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, Martinez-Madrid B, Van Langendonckt A. Restoration of ovarian function after orthotopic (intraovarian and periovarian) transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a woman treated by bone marrow transplantation for sickle cell anaemia: case report. Hum Reprod 2006b; 21:183-188. 89 50. Donnez J, Squifflet J, Van Eyck AS, Demylle D, Jadoul P, Van Langendonckt A, Dolmans MM. Restoration of ovarian function in orthotopically transplanted cryopreserved ovarian tissue: a pilot experience. Reprod Biomed Online 2008; 16:694-704 51. Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T, Hardan I, Fridman E, Yemini Z, Dor J. Monitoring the ovaries after autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue: endocrine studies, in vitro fertilization cycles, and live birth. Fertil Steril 2007a; 87:418.e7-418.e15. 52. Meirow D, Baum M, Yaron R, Levron J, Hardan I, Schiff E, Nagler A, Yehuda DB, Raanani H, Hourvitz A, Dor J. Ovarian tissue cryopreservation in hematologic malignancy: ten years' experience. Leuk Lymphoma 2007b; 48:15691576. 53. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 2004; 364:1405-1410. 54. Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. New Engl J Med 2005; 353:318-321. 55. Gandolfi F, Paffoni A,. Brambilla E.P,. Bonetti S,. Brevini T.A.L, Ragni G., Efficiency of equilibrium cooling and rapid freezing procedures for the cryopreservation of ovarian tissue: comparative analysis between human and animal models. Fertil Steril 2006; 85:1150-1156. 56. Isachenko V, Isachenko E, Rahimi G, Krivokharchenko A, Alabart JL, Nawroth F. Cryopreservation of human ovarian tissue by direct plunging into liquid nitrogen: negative effect of disaccharides in vitrification solution. CryoLetters 2002; 23:333-44. 57. Bordes A, Lornage J, Demirci B, Franck M, Courbiere B, Guerin JF, Salle B. Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrified-warmed hemiovaries into ewes. Hum Reprod 2005; 20:2745-2748. 58. Isachenko V, Isachenko E, Reinsberg J, Montag M, van der Ven K, Dorn C, Roesing B, van der Ven H. Cryopreservation of human ovarian tissue: comparison of rapid and conventional freezing. Cryobiology 2007a, 55:261-268. 59. Li YB, Zhou CG, Yang GF, Wang O, Dong Y, Modified rapid freezing method for cryopreservation of human ovarian tissue, Chin Med J 2007; 120:110114. 60. Bernard A., Fuller B.J. Cryopreservation of human oocytes: a review of current problems and perspectives // Human Reproduction Update. – 1996. – № 3. – P. 193-207. 61. Mandelbaum J., Junca A.M., Plachot M. et al. Cryopreservation of human embryos and oocytes // Human Reproduction. – 1988. – № 1. – P. 117-119. 62. Porcu E., Fabbri R., Seracchioli R. et al. C. Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes // Fertility and Sterility. – 1990. – № 68. – P. 724-726. 90 63. Nawroth F., Kissing K. Pregnancy after intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) of cryopreserved human oocytes // Acta Obstet Gynecol Scand. – 1998. – № 77. – P. 462-463. 64. Noyes N., Labella P.A., Grifo J., Knopman J. Oocyte cryopreservation: a feasible fertility preservation option for reproductive age cancer survivors // J Ass Reprod Genet. – 2010. – № 27. – P. 495-499. 65. Manipalviratn S., Decherney A. Clinical application of human oocyte cryopreservation // Rev Recent Clin Trials. – 2008. – № 3. – P. 104-110. 66. Mandelbaum J., Anastasiou O., Levy R. et al. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human oocytes // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. – 2004. – № 113. – P. 17-23. 67. Макарова Н.П., Калинина Е.А. Критерии оценки качества ооцита в циклах ИКСИ: взгляд клинического эмбриолога // Гинекология. – 2012. – № 14. – C. 24-28. 68. Курило Л. Закономерности овариогенеза и оогенеза млекопитающих. Хронология и динамика развития гонад, гамет и фолликулов человека и млекопитающих животных. LAP Lambert Academic Publishing; 2012. 292 с. 69. Rienzi L., Vajta G., Ubaldi F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature // Human Reproduction. – 2011. – № 17. – P. 34-45. 70. Hinduja I., Kumar A., Kumar T.C. Ultrastructure of the cortex in the human egg // Human Reproduction. – 1989. – № 5. – P. 66-70. 71. Balaban B, Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation // Reproductive Biomedicine Online. – 2006. – № 12. – P. 608-615. 72. Ebner T et al. Prognosis of oocytes showing aggregation of smooth endoplasmic reticulum // Reproductive Biomedicine Online. – 2008. – № 16. – P. 801-807. 73. Wells D., Hiller S.G. Polar bodies: their biological mystery and clinical meaning // Molecular Human Reproduction. – 2011. – № 17. – P. 273-274. 74. Hassan-Ali H, Hisham-Saleh A, El-Gezeiry D et al. 1998 Perivitelline space granularity: a sign of human menopausal gonadotrophin overdose in intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction 13, 3425–3430. 75. Lefievre, L., Conner, S. J., Salpekar, A., Olufowobi, O., Ashton, P., Pavlovic, B., Lenton, W., Afnan, M., Brewis, I. A., Monk, M., Hughes, D. C., Barratt, C. L. R. Four zona pellucida glycoproteins are expressed in the human. Hum. Reprod. 19: 1580-1586, 2004 76. Conner, S.J., Lefievre, L., Hughes, D.C., and Barratt, C.L. (2005). Cracking the egg: Increased complexity in the zona pellucida. Hum Reprod 20: 1148-52 77. Caballero-Campo P, Chirinos M, Fan XJ, González-González ME, GaliciaChavarría M, Larrea F, Gerton GL. Biological effects of recombinant human zona pellucida proteins on sperm function.Biol Reprod. 2006;74:760–768. 91 78. Balaban, B., Ata, B., Isiklar, A., Yakin, K., Urman, B. 2008. Severe cytoplasmic abnormalities of the oocyte decrease cryosurvival and subsequent embryonic development of cryopreserved embryos. Hum. Reprod. 23: 1778-1785. 79. Kahraman S, Yakin K, Donmez E, Samli H, Baçhe M, Cengiz G, Sertyel S, Samil M, Imirzalioglu N. Relationship between granular cytoplasm of oocytes and pregnancy outcome following intracytoplasmic sperm injection Hum Reprod 2000;15:2390 intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 2000;15:2390-2393 80. J.VanBlerkom., Davis, P. and Lee, J. (1995b) ATP content of human oocytes and developmental potential and outcome after in-vitro fertilization and embryo transfer. Hum. Reprod., 10, 415-424. 81. Benkhalifa M, Kahraman S, Caserta D, Domez E, Qumsiyeh MB.Morphological and cytogenetic analysis of intact oocytes and blocked zygotes. Prenat Diagn. 2003 May;23(5):397-404. 82. Ebner T, Moser M, Sommergruber M et al. 2005 Occurrence and developmental consequences of vacuoles throughout preimplantation development. Fertility and Sterility 83, 1635–1640. 83. Otsuki J, Okada A, Morimoto K, Nagai Y, Kubo H. The relationship between pregnancy outcome and smooth endoplasmic reticulum clusters in MII human oocytes. Hum Reprod 2004;19:1591– 1597. 84. Faddy M, Gosden R, Gougeon A, Richardson SJ and Nelson JF. Accelerated disappearance of ovarian follicles in mid-life: implications for forecasting menopause. Hum Reprod 1992;7:1342-1346. 85. Shaw JM, Bowles J, Koopman P, Wood EC and Trounson OA. Fresh and cryopreserved ovarian tissue samples from donors with lymphoma transmit the cancer to graft recipients. Hum Reprod 1996;11:1668-1676. 86. Oktay K, Karlikaya G. Ovarian function after transplantation of frozen, banked autologous ovarian tissue. N Engl J Med 2000;342:1919. 87. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, et al. Live birth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 2004;364:1405–10. 88. Radford JA, Lieberman BA, Brison D, Smith AR, Critchlow JD, Russell SA, et al. Orthotopic reimplantation of cryopreserved ovarian cortical strips after high-dose chemotherapy for Hodgkin's lymphoma. Lancet 2001; 357:1172–5. 89. Donnez J, Jadoul P, Squifflet J, van Langendonckt A, Donnez O, van Eyck AS, et al. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in cancer patients. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2010;24:87–100. 90. Silber S, DeRosa M, Pineda J, Lenahan K, Grenia D, Gorman K, et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Hum Reprod 2008; 23:1531– 7. 91. Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T, Hardan I, Firdman E, Zalel Y, et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med 2005;353:318–21. 92 92. Schmidt KT, Rosendahl M, Ernst E, Loft A, Andersen AN, Dueholm M, et al. Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue in 12 women with chemotherapy-induced premature ovarian failure: the Danish experience. Fertil Steril 2011;95:695–701. 93. Donnez J, Dolmans MM, Pellicer A, Diaz-Garcia C, Serrano MS, Schmidt KT, et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril 2013;99:1503–13. 94. Kim SS, Lee WS, Chung MK, Lee HC, Lee HH, Hill D. Long-term ovarian function and fertility after heterotopic autotransplantation of cryobanked human ovarian tissue: 8-year experience in cancer patients. Fertil Steril 2009; 91:2349. 95. Oktay K, Buyuk E, Veeck L, Zaninovic N, Xu K, Takeuchi T, et al. Embryo development after heterotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 2004;363:837–40. 96. Wolner-Hanssen P, Hagglund L, Ploman F, Ramirez A, Manthorpe R, Thuring A. Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue to the right forearm 4(1/2) years after autologous stem cell transplantation. Acta Obstet Gynecol Scand 2005;84:695–8. 97. Oktay K, Economos K, Kan M, Rucinski J, Veek L, Rosenwaks Z. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. JAMA 2001;286:1490–3. 98. Donnez J, Dolmans MM, Pellicer A, Diaz-Garcia C, Serrano MS, Schmidt KT, et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril 2013;99:1503–13. 99. Rosendahl M, Loft A, Byskov AG, Ziebe S, Schmidt KT, Andersen AN, et al. Biochemical pregnancy after fertilization of an oocyte aspirated from a heterotopic autotransplant of cryopreserved ovarian tissue: case report. Hum Reprod 2006;21:2006–9. 100. Andersen C, Silber S, Berghold S, Jorgensen J, Ernst E. Long-term duration of function of ovarian tissue transplants: case reports. Reprod Biomed Online 2012;25:128–32. 101. Bedaiwy MA, El-Nashar SA, El Saman AM, Evers JL, Sandadi S, Desai N, et al. Reproductive outcome after transplantation of ovarian tissue: a systematic review. Hum Reprod 2008;23:2709–17. 102. Janse F, Donnez J, Anckaert E, de Jong FH, Fauser BC, Dolmans MM. Limited value of ovarian function markers following orthotopic transplantation of ovarian tissue after gonadotoxic treatment. J Clin Endocrinol Metab 2011; 96: 1136–44. 103. Kim SS. Assessment of long term endocrine function after ovarian transplantation of frozen-thawed human ovarian tissue to the heterotopic site: 10 year longitudinal follow-up study. J Assist Reprod Genet 2012;29:489–93. 104. McLaren JF, Bates GW. Fertility preservation in women of reproductive age with cancer. Am J Obstet Gynecol 2012;207:455–62. 93 105. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other desease. Nature Med 1995; 1: 27–31 106. Risau V. Mechanisms of angiogenesis. Nature 1997; 386: 671–674 107. Петрова Л.В., Кушлинский Н.Е., Ильина Л.В. Фактор роста эндотелия сосудов как показатель гипоксии тканей, его возможная роль в патогенезе плоского лишая слизистой оболочки рта. Вестник дерматологии и венерологии. 2004, №5. 108. Forough R., SpringerLink (Online service). New Frontiers in Angiogenesis. Edited by Dordrecht, Springer. 2006, P.344. 109. A.D. Thornton, P. Ravn, M. Winslet, K. Chester. Angiogenesis inhibition with bevacizumab and the surgical management of colorectal cancer. British Journal of Surgery Society Ltd. 2006, Vol.93, Issue 12, P.1456-63. 110. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature medicine. 2000, Vol.6, №4, P.389-395. 111. Plendl J. Angiogenesis and Vascular Regression in the Ovary* // Anatomia, Histologia, Embryologia. 2000. Vol.29, N 5, P.257-266 112. Machelon V, Emilie D. Production of ovarian cytokines and their role in ovulation in the mammalian ovary. European Cytokine Network. 1997;8:137–143. 113. Schiffenbauer YS, Abramovitch R, Meir G, Nevo N, Holzinger M, Itin A, Keshet E, Neeman M. Loss of ovarian function promotes angiogenesis in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA.1997;94:13203–13208 114. Gordon J., Shifren J.L., Foulk R.A. et al. Angiogenesis in the human female reproductive tract. Obstet Gynecol Surv 1995; 50: 688–697. 115. Morgan K.G., Wilkinson N., Buckley C.H. Angiogenesis in normal, hyperplastic, and neoplastic endometrium. J Pathol 1996; 179: 317–320 116. Jakeman L.B., Winer J., Bennett G.L. et al. Binding sites for vascular endothelial growth factor are localized on endothelial cells in adult rat tissues. J Clin Invest 1992; 89: 249–253 117. Gospodarowicz D., Cheng J., Lui G.M. et al. Corpus luteum angiogenic factor is related to fibroblast growth factor. Endocrinology 1985; 117: 2383–2391 118. Redmer D.A., Reynolds L.P. Angiogenesis in the ovary. Rev Reprod 1996; 3: 182–192 119. Makris A., Ryan K.J., Yasumizu T. et al. The nonluteal porcine ovary as a sourse of angiogenic activity. Endocrinology 1984; 115: 1672–1677 120. Rone J.D., Goodman A.L. Preliminary characterization of angiogenic activity in media conditioned by cells from luteinized rat ovaries. Endocrinology 1990; 127: 2821–2828 121. Frederick J.L., Shimanuki T., di Zerega G.S. Initiation of angiogenesis by human follicular fluid. Science 1984; 244: 389–390 122. Gordon J.D., Mesiano S., Zaloudek C.J., Jaffe R.B. Vascular endothelial growth factor localization in human ovary and fallopian tubes: possible role in reproductive function and ovarian cyst formation. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: 353–359 94 123. Ravindranath N., Little-Ihrig L., Phillips H.S. et al. Vascular endothelial growth factor mRNA expression in the primate ovary in relation to follicular growth and corpus luteum function. Endocrinology 1992; 131: 254–260 124. Sweiki D., Itin A., Neufeld G. et al. Patterns of expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptors in mice suggest a role in hormonally regulated angiogenesis. J Clin Invest 1993; 91: 2235–2243 125. Sharkey A.M., Charnock J.D., Boocock C.A. et al. Expression of mRNA for vascular endothelial growth factor in human placenta. J Reprod Fertil 1993; 99: 609–615 126. Shore V.H., Wang T.H., Wang C.L. et al. Vascular endothelial growth factor, placenta growth factor and their receptors in isolated human trophoblast. Placenta 1997; 18: 657–665 127. Evans P.W., Wheeler T., Anthony F.W., Osmond C.A. Longitudinal study of maternal serum vascular endothelial growth factor in early pregnancy. Hum Reprod 1998; 13:1057–1062 128. Jahroudi N.. Lvnch D.C. // Mol. Cell. Biol. 1994. V.14. P. 999. 129. Parums D., Cordell J.. Macklem K.. Herye: A.R., GatteK.C.. Mason D. // J. Clin. Pathol. 1990. V. 43. P. 752. 130. Weidner N., Semple J.P., Welch W., Folkman J. // New England J. Med. 1991. V. 324. P. 1. 131. Berkowitz S.D., Ruggeri Z.M., Zimmerman T.S. von Willebrand Disease. In: Coagulation and Bleeding Disorders. The Role of Factor VIII and von Willebrand Factor. Ed. Zimmerman T.S., Ruggeri Z.M. New York, Marcel Dekker. 1989, p. 215-259. 132. Dent J.A., Galbusera M., Ruggeri Z.M. Heterogeneity of plasma von Willebrand factor multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit. J.Clin.Invest., 1991, v. 88, p. 774-782. 133. Sadler J.E. Von Willebrand factor. - J.Biol.Chem., 1991, v. 266, p. 2277722780. 134. Guyonnet Duperat,V., Audie,J.P., Debailleuue,V., Laine,A., Buisine,MP., Galiegue-Zoitina,S., Pigny,P., Aubert,J-P., Porchet,N. (1995) Characterization of the human mucin gene MUC5AC: a consensus cystein-rich domain for 11p15 mucin genes? Biochem.J., 305, 211-219 135. Keeney S, Cumming AM. The molecular biology of von Willebrand disease. Clin Lab Haematol 2001;23(4):209–30. 136. Мухин Н.А., Полянцева Л.Р., Козловская Л.В. и др. Клиническое значение изучения гемостаза в нефрологии // Терапевтический архив. 1988. № 6. С. 7–12. 137. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 2006, 10, 588–612. 138. Berube M, Deschambeault A, Boucher M, Germain L, Petitclerc E, et al. (2005) MMP-2 expression in uveal melanoma: differential activation status dictated by the cellular environment. Mol Vis 11: 1101–1111. 95 139. Nap AW, Dunselman GA, de Goeij AF, Evers JL, Groothuis PG (2004) Inhibiting MMP activity prevents the development of endometriosis in the chicken chorioallantoic membrane model. Hum Reprod 19: 2180–2187. 140. Kunzi-Rapp K, Ru¨ck A, Kaufmann R (1999) Characterization of the chick chorioallantoic membrane model as a short-term in vivo system for human skin. Arch Dermatol Res 291: 290–295. 141. Katoh M, Nakada K, Miyazaki J (2001) Liver regeneration on chicken chorioallantoic membrane. Cells Tissues Organs 169: 125–133. 142. Nakada K, Yao Y, Mashima J, Katoh M, Miyazaki J, et al. (1998) Skeletal muscle regeneration induced by chorio-allantoic grafting. J Muscle Res Cell Motil 19: 169–177. 143. Leng T, Miller JM, Bilbao KV, Palanker DV, Huie P, et al. (2004) The chick chorioallantoic membrane as a model tissue for surgical retinal research and simulation. Retina 24: 427–434. 144. Valdes TI, Kreutzer D, Moussy F (2002) The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. J Biomed Mater Res 62: 273–282. 145. Ribatti D, Vacca A, Roncali L, Dammacco F (2000) The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on antiangiogenesis. Curr Pharm Biotechnol 1: 73–82. 146. Cushman RA, Wahl CM, Fortune JE (2002) Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: a model for studies on the activation of primordial follicles. Hum Reprod 17: 48–54. 147. Gigli I, Cushman RA, Wahl CM, Wahl CM, Fortune JE (2005) Evidence of a role for antimullerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Mol Reprod Dev 71: 480–488. 148. Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 2008, 270, 181–224. 149. Grazul-Bilska A.T., Banerjee J., Yazici I., et al. Morphology and function of cryopreserved whole ovine ovaries after heterotopic autotransplantation // Reproduction Biology and Endocrinology. – 2008. – № 6. – P. 16-18. 150. 5. Onions V.J., Mitchell M.R., Campbell B.K., Webb R. Ovarian tissue viability following whole ovine ovary cryopreservation: assessing the effects of sphingosine-1-phosphate inclusion // Human Reproduction. – 2008. – № 23. – P. 606-618. 151. Gerritse R., Beerendonk C.C., Tijink M.S., et al. Optimal perfusion of an intact ovary as a prerequisite for successful ovarian cryopreservation // Human Reproduction. – 2008. – № 23. – P. 329-335. 152. Martinez-Madrid B, Dolmans MM, Van Langendonckt A et al. Freezethawing intact human ovary with its vascular pedicle with a passive cooling device. Fertil Steril 2004;82:1390–94. 96 153. Torre A., Ben Brahim F., Popowski T., et al. Factors related to unstained areas in whole ewe ovaries perfused with a metabolic marker // Human Reproduction. – 2013. – № 28. – P. 423-429. 154. Isachenko V., Isachenko E., Mallmann P., Rahimi G. Long-time cooling of human ovarian tissue before cryopreservation as obvious procedure: stimulation of follicular development and neo-vascularisation // Clinical Laboratory. – 2012. – № 58. – P. 1293-300. 155. S. J. Silber, G. Grudzinskas, and R. G. Gosden, ―Successful pregnancy after microsurgical transplantation of an intact ovary,‖ New England Journal of Medicine, vol. 359, no. 24, pp. 2617–2618, 2008. 156. Kuwayama M., Vajta G., Kato O., Leibo S.P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes // Reproductive Biomedicine Online. – 2005. – № 11. – P. 300-308. 157. Hinduja I., Kumar A., Kumar T.C. Ultrastructure of the cortex in the human egg // Human Reproduction. – 1989. – № 5. – P. 66-70. 158. Balaban B, Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation // Reproductive Biomedicine Online. – 2006. – № 12. – P. 608-615. 159. Ebner T et al. Prognosis of oocytes showing aggregation of smooth endoplasmic reticulum // Reproductive Biomedicine Online. – 2008. – № 16. – P. 801-807. 160. Wells D., Hiller S.G. Polar bodies: their biological mystery and clinical meaning // Molecular Human Reproduction. – 2011. – № 17. – P. 273-274. 161. Hassan-Ali H, Hisham-Saleh A, El-Gezeiry D et al. 1998 Perivitelline space granularity: a sign of human menopausal gonadotrophin overdose in intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction 13, 3425–3430. 162. Lefievre, L., Conner, S. J., Salpekar, A., Olufowobi, O., Ashton, P., Pavlovic, B., Lenton, W., Afnan, M., Brewis, I. A., Monk, M., Hughes, D. C., Barratt, C. L. R. Four zona pellucida glycoproteins are expressed in the human. Hum. Reprod. 19: 1580-1586, 2004 163. Conner, S.J., Lefievre, L., Hughes, D.C., and Barratt, C.L. (2005). Cracking the egg: Increased complexity in the zona pellucida. Hum Reprod 20: 1148-52 164. Caballero-Campo P, Chirinos M, Fan XJ, González-González ME, Galicia-Chavarría M, Larrea F, Gerton GL. Biological effects of recombinant human zona pellucida proteins on sperm function.Biol Reprod. 2006;74:760–768. 165. Balaban, B., Ata, B., Isiklar, A., Yakin, K., Urman, B. 2008. Severe cytoplasmic abnormalities of the oocyte decrease cryosurvival and subsequent embryonic development of cryopreserved embryos. Hum. Reprod. 23: 1778-1785. 166. Kahraman S, Yakin K, Donmez E, Samli H, Baçhe M, Cengiz G, Sertyel S, Samil M, Imirzalioglu N. Relationship between granular cytoplasm of oocytes and pregnancy outcome following intracytoplasmic sperm injection Hum Reprod 2000;15:2390 intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 2000;15:2390-2393 97 167. J.VanBlerkom., Davis, P. and Lee, J. (1995b) ATP content of human oocytes and developmental potential and outcome after in-vitro fertilization and embryo transfer. Hum. Reprod., 10, 415-424. 168. Benkhalifa M, Kahraman S, Caserta D, Domez E, Qumsiyeh MB.Morphological and cytogenetic analysis of intact oocytes and blocked zygotes. Prenat Diagn. 2003 May;23(5):397-404. 169. Ebner T, Moser M, Sommergruber M et al. 2005 Occurrence and developmental consequences of vacuoles throughout preimplantation development. Fertility and Sterility 83, 1635–1640. 170. Otsuki J, Okada A, Morimoto K, Nagai Y, Kubo H. The relationship between pregnancy outcome and smooth endoplasmic reticulum clusters in MII human oocytes. Hum Reprod 2004;19:1591– 1597. 171. Faddy M, Gosden R, Gougeon A, Richardson SJ and Nelson JF. Accelerated disappearance of ovarian follicles in mid-life: implications for forecasting menopause. Hum Reprod 1992;7:1342-1346. 172. Shaw JM, Bowles J, Koopman P, Wood EC and Trounson OA. Fresh and cryopreserved ovarian tissue samples from donors with lymphoma transmit the cancer to graft recipients. Hum Reprod 1996;11:1668-1676. 173. Oktay K, Karlikaya G. Ovarian function after transplantation of frozen, banked autologous ovarian tissue. N Engl J Med 2000;342:1919. 174. Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, Jadoul P, Pirard C, Squifflet J, et al. Live birth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 2004;364:1405–10. 175. Radford JA, Lieberman BA, Brison D, Smith AR, Critchlow JD, Russell SA, et al. Orthotopic reimplantation of cryopreserved ovarian cortical strips after high-dose chemotherapy for Hodgkin's lymphoma. Lancet 2001; 357:1172–5. 176. Donnez J, Jadoul P, Squifflet J, van Langendonckt A, Donnez O, van Eyck AS, et al. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in cancer patients. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2010;24:87–100. 177. Silber S, DeRosa M, Pineda J, Lenahan K, Grenia D, Gorman K, et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Hum Reprod 2008; 23:1531– 7. 178. Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T, Hardan I, Firdman E, Zalel Y, et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med 2005;353:318–21. 179. Schmidt KT, Rosendahl M, Ernst E, Loft A, Andersen AN, Dueholm M, et al. Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue in 12 women with chemotherapy-induced premature ovarian failure: the Danish experience. Fertil Steril 2011;95:695–701. 180. Donnez J, Dolmans MM, Pellicer A, Diaz-Garcia C, Serrano MS, Schmidt KT, et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril 2013;99:1503–13. 98 181. Kim SS, Lee WS, Chung MK, Lee HC, Lee HH, Hill D. Long-term ovarian function and fertility after heterotopic autotransplantation of cryobanked human ovarian tissue: 8-year experience in cancer patients. Fertil Steril 2009; 91:2349. 182. Oktay K, Buyuk E, Veeck L, Zaninovic N, Xu K, Takeuchi T, et al. Embryo development after heterotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet 2004;363:837–40. 183. Wolner-Hanssen P, Hagglund L, Ploman F, Ramirez A, Manthorpe R, Thuring A. Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue to the right forearm 4(1/2) years after autologous stem cell transplantation. Acta Obstet Gynecol Scand 2005;84:695–8. 184. Oktay K, Economos K, Kan M, Rucinski J, Veek L, Rosenwaks Z. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. JAMA 2001;286:1490–3. 185. Donnez J, Dolmans MM, Pellicer A, Diaz-Garcia C, Serrano MS, Schmidt KT, et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril 2013;99:1503–13. 186. Rosendahl M, Loft A, Byskov AG, Ziebe S, Schmidt KT, Andersen AN, et al. Biochemical pregnancy after fertilization of an oocyte aspirated from a heterotopic autotransplant of cryopreserved ovarian tissue: case report. Hum Reprod 2006;21:2006–9. 187. Andersen C, Silber S, Berghold S, Jorgensen J, Ernst E. Long-term duration of function of ovarian tissue transplants: case reports. Reprod Biomed Online 2012;25:128–32. 188. Bedaiwy MA, El-Nashar SA, El Saman AM, Evers JL, Sandadi S, Desai N, et al. Reproductive outcome after transplantation of ovarian tissue: a systematic review. Hum Reprod 2008;23:2709–17. 189. Janse F, Donnez J, Anckaert E, de Jong FH, Fauser BC, Dolmans MM. Limited value of ovarian function markers following orthotopic transplantation of ovarian tissue after gonadotoxic treatment. J Clin Endocrinol Metab 2011; 96: 1136–44. 190. Kim SS. Assessment of long term endocrine function after ovarian transplantation of frozen-thawed human ovarian tissue to the heterotopic site: 10 year longitudinal follow-up study. J Assist Reprod Genet 2012;29:489–93. 191. McLaren JF, Bates GW. Fertility preservation in women of reproductive age with cancer. Am J Obstet Gynecol 2012;207:455–62. 192. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other desease. Nature Med 1995; 1: 27–31 193. Risau V. Mechanisms of angiogenesis. Nature 1997; 386: 671–674 194. Петрова Л.В., Кушлинский Н.Е., Ильина Л.В. Фактор роста эндотелия сосудов как показатель гипоксии тканей, его возможная роль в патогенезе плоского лишая слизистой оболочки рта. Вестник дерматологии и венерологии. 2004, №5. 99 195. Forough R., SpringerLink (Online service). New Frontiers in Angiogenesis. Edited by Dordrecht, Springer. 2006, P.344. 196. A.D. Thornton, P. Ravn, M. Winslet, K. Chester. Angiogenesis inhibition with bevacizumab and the surgical management of colorectal cancer. British Journal of Surgery Society Ltd. 2006, Vol.93, Issue 12, P.1456-63. 100
