молекулярная и прикладная генетика

ISSN 1999-9127
Государственное научное учреждение
«ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ
НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ»
МОЛЕКУЛЯРНАЯ И ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА
СБОРНИК НАУЧНЫХ ТРУДОВ
Том 14
Издается с 2005 года
Выходит два раза в год
Минск
2013
УДК [577.21 + 575] (082)
Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Институт генетики и цитологии
НАН Беларуси; редколл.: А.В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. – Минск: ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», 2013. – Т. 14. – 146 с. – ISSN 1999-9127.
В сборнике научных трудов публикуются обзорные и экспериментальные статьи в области молекулярной и
прикладной генетики растений, микроорганизмов, животных, человека, отражающие исследования генетических
процессов на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях. Особое внимание уделяется наиболее актуальным проблемам геномики, генетической и клеточной инженерии. Публикуются результаты
изучения генетических основ селекции растений, животных и микроорганизмов, разработки эффективных биотехнологий для сельского хозяйства, здравоохранения, охраны окружающей среды, биобезопасности.
Сборник предназначен для специалистов, работающих в области генетики, преподавателей, аспирантов и студентов ВУЗов биологического, сельскохозяйственного и медицинского профиля.
Редакционная коллегия:
А.В. Кильчевский – главный редактор, Л.В. Хотылева – зам. главного редактора;
К.У. Вильчук, С.И. Гриб, О.Г. Давыденко, А.Н. Евтушенков, А.П. Ермишин,
М.А. Кадыров, Н.В. Казаровец, Н.А. Картель, А.И. Ковалевич, Г.И. Лазюк,
В.А. Лемеш, С.А. Лихачев, Н.П. Максимова, С.Б. Мельнов, М.Е. Михайлова,
И.Б. Моссэ, М.Е. Никифоров, В.Е. Падутов, В.Н. Решетников, Е.А. Сычева,
В.В. Титок, И.П. Шейко, О.Н. Харкевич – члены редколлегии;
И.В. Широкая – ответственный секретарь.
Рецензенты:
Л.В. Хотылева, академик, д.б.н., проф.,
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»;
Н.А Картель, академик д.б.н., проф.,
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»;
С.И. Гриб, академик д.с-х.н., проф.,
РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию».
УДК [577.21 + 575] (082)
ISSN 1999-9127
ГНУ «Институт генетики
и цитологии НАН Беларуси», 2013
Содержание
Л.В. Хотылева, Р.И. Гончарова
Академик Н.В. Турбин – основатель современной белорусской генетической школы.......... 7
В.П. Ямскова, М.С. Краснов, Е.Ю. Рыбакова, В.В. Богданов, А.П. Ильина, О.Г. Куликова,
Д.И. Мальцев, И.А. Ямсков
Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов:
идентификация, физико-химические свойства и биологическое действие........................... 14
Е.Э. Хейдорова, Г.Г. Хрисанфова, Е.И. Бычкова, С.К. Семенова, М.Е. Никифоров
Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод Bilharziella
polonica (сем. Schistosomatidae), паразитирующих у водоплавающих птиц
на озере Нарочь............................................................................................................................ 24
Е.А. Волуевич
Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине...... 36
Е.А. Волуевич
Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе...... 46
В.А. Кунах, Л.П. Можилевская
Длительность жизни человека и биотехнология растений...................................................... 56
А.И. Шапошников, Т.С Азарова, Л.В. Кравченко, А.А. Бажанова, Д.П. Бажанов,
О.Г. Бабак, Н.А. Некрашевич, А.В. Кильчевский
Корневые выделения генотипов томата (Solanum lycopersicum L.), отличающихся
отзывчивостью на бактеризацию............................................................................................... 63
М.Е. Михайлова, Е.Л. Романишко
Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи
домашней (Sus Scrofa domesticus)............................................................................................... 69
О.А. Орловская, Л.В. Хотылева
Оценка устойчивости к биотическим и абиотическим факторам гибридов озимой тритикале,
созданных на основе образцов различного эколого-географического происхождения.............. 77
С.Е. Дромашко
Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси ..................................... 84
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич
конъюгационный перенос генов деградации симазина Herbaspirillum huttiense В601
в родственные бактерии.............................................................................................................. 95
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
4
Содержание
Л.А. Кундас, К.В. Жур, Н.И. Бышнев, Т.Н. Прохорова, Е.А. Лосицкий, П.Н. Малашевич,
И.Б. Моссэ
Анализ молекулярно-генетических маркеров, ответственных за устойчивость к физическим нагрузкам, у представителей академической гребли................................................ 101
Н.В. Савина, Т.Д. Кужир, А.И. Ролевич, С.Л. Поляков, С.А. Красный, Р.И. Гончарова
Особенности дестабилизации генома лимфоцитов периферической крови при раке
мочевого пузыря........................................................................................................................ 106
О.В. Квитко, А.С. Сапун, Н.А. Балашенко, Я.И. Шейко, И.И. Конева, С.Е. Дромашко
Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины.............................................. 113
М.И. Федорова, С.А. Ветрова, Е.Г. Козарь
Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции
на гетерозис................................................................................................................................ 121
А.Ф. Стельмах
Идеи Н.В. Турбина для развития генетических работ Селекционно-генетического
института.................................................................................................................................... 130
Рефераты..................................................................................................................................... 135
Правила оформления статьи..................................................................................................... 144
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
CONTENTS
L. Khotyleva, R. Goncharova
Academician N.V. Turbin – the founder of the modern Belarusian genetic school........................ 7
V. Yamskova, M. Krasnov, E. Rybakova, V. Bogdanov, A. Il’ina, O. Koulikova, D. Maltsev,
I. Yamskov
A new group of membrane-acting tissue-specific homeostatic bioregulators: identification,
physicochemical properties and biological action......................................................................... 14
E. Kheidorova, G. Chrisanfova, E. Bychkova, S. Semenova, M. Nikiforov
Polymorphism of mitochondrial gene cox1 in the population of maritas Bilharziella polonica
(family Schistosomatidae) parasitizing in wildfowl of Lake Naroch’........................................... 24
E. Voluevich
Genetic approaches in common wheat breeding for resistance to brown rust.............................. 36
E. Voluevich
Genetic approaches in common wheat breeding for resistance to powdery mildew..................... 46
V. Kunakh, L. Mozhylevskaya
Human lifespan and plant biotechnology...................................................................................... 56
A. Shaposhnikov, T. Azarova, L. Kravchenko, A. Bazhanova, D. Bazhanov, O. Babak,
N. Nekrashevich, A. Kilchevsky
Root exudates of tomato (Solanum lycopersicum l.) genotypes differing in responsiveness to
bacterization................................................................................................................................... 63
M. Mikhailova, H. Ramanishka
Polymorphism genes somatotropic axic (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) in the pig domestic
(Sus Scrofa domesticus)................................................................................................................. 69
O. Orlovskaya, L. Khotyleva
Evaluation of resistance to biotic and abiotic factors of winter triticale hybrids, obtained by
crossing between forms of different ecological-geographic origin............................................... 77
S. Dromashko
Development of mathematical genetics and bioinformatics in Belarus........................................ 84
D. Bazhanov, K. Yatsevich
Conjugational transfer of the Herbaspirillum huttiense B601 genes for simazine degradation to
related bacteria............................................................................................................................... 95
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
6
Contents
L. Kundas, K. Zhur, N. Byshnev, T. Prohorova, Y. Lasitski, P. Malashevich, I. Mosse
Analysis of genetic markers for resistance to a physical stress in elite collegiate rowers ......... 101
N. Savina, T. Kuzhir, A. Rolevich, S. Polyakov, S. Krasnyi, R. Goncharova
The features of genome destabilization in peripheral blood lymphocytes in bladder cancer...... 106
O. Kvitko, A. Sapun, N. Balashenko, I. Koneva, Y. Sheiko, S. Dromashko
Telomere concept of aging and oncogenesis for medicine.......................................................... 113
M. Fedorova, S. Vetrova, Е. Кozar
Features of reproduction of inbred progeny of red beet for heterosis breeding.......................... 121
A. Stelmakh
N.V. Turbin’s ideas for the evolution of genetic investigations in Plant Breeding
and Genetics Institute.................................................................................................................. 130
Summaries................................................................................................................................... 135
Instructions to authors................................................................................................................. 144
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 575/576(476)(092)+929
Л.В. Хотылева, Р.И. Гончарова
Академик Н.В. Турбин – основатель современной
белорусской генетической школы
(обзорная статья)
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
3 декабря 2012 года исполнилось 100 лет со
дня рождения Николая Васильевича Турбина – академика Национальной академии наук
Беларуси и Российской сельскохозяйственной
академии, выдающегося ученого генетика,
основателя школы белорусских генетиков,
создателя Института генетики и цитологии
Национальной академии наук Беларуси и его
первого директора.
Родился Н.В. Турбин в 1912 г. в рабочем
поселке Тума Рязанской области. В 1929 г.
окончил Тумскую школу 9-летку и в 1930 г.
поступил на агрономический факультет Воронежского сельскохозяйственного института. Уже в студенческие годы проявился его
большой интерес к научной работе, и после
окончания института Николая Васильевича
оставляют в аспирантуре при кафедре генетики и селекции. В 1938 г. он успешно защищает кандидатскую диссертацию, посвященную
разработке методики селекции сортов яровой
пшеницы, и зачисляется на должность доцента
кафедры генетики и селекции этого же института. Будучи аспирантом, Николай Васильевич
проходит годичную стажировку в Московском
государственном университете им. М.В. Ломоносова, где слушает лекции выдающихся ученых биологов того времени – И.И. Шмальгаузена, А.Н. Серебровского, М.М. Завадовского,
Н.К. Кольцова и др.
В 1939 г. Н.В. Турбин поступает в докторантуру Академии наук СССР, которую проходит
в лаборатории эволюционной экологии растений под руководством академика Б.А. Келлера, крупного ученого в области геоботаники
и экологии растений. В 1942 г. в г. Ашхабаде,
будучи курсантом военно-медицинского училища, в возрасте 30 лет Николай Васильевич
успешно защищает докторскую диссертацию
(это были годы Великой отечественной войны
1941–1945 гг.). После защиты Николай Васильевич в течение двух лет заведует отделом
Московского ботанического сада Академии
наук СССР и одновременно работает профессором в Московском областном педагогическом институте.
В 1945 г. Н.В. Турбин возглавил кафедру
генетики Ленинградского государственного
университета, а с 1948 по 1951 год – он декан
биолого-почвенного факультета и директор
Биологического научно-исследовательского
института ЛГУ.
Этот период в научной деятельности Николая Васильевича был очень плодотворным.
Под его руководством сотрудники кафедры и
многочисленные ученики за короткое время
накопили богатый экспериментальный материал, анализ которого позволил прояснить
биологические особенности протекания процесса оплодотворения.
Результаты работ Н.В. Турбина по биологии
оплодотворения получили широкую известность среди ученых биологов. Они были доложены и опубликованы в трудах международных
конгрессов (ботанического и генетического) в
г. Стокгольме (Швеция, 1953 г.) и г. Монреале
(Канада, 1958 г.), вошли в учебники и сводки
по вопросам общей биологии, генетики и селекции, изданные в СССР и за рубежом.
В 50–60-е годы ХХ столетия в Академии
наук БССР начинается многостороннее развитие современных научных направлений
естественных наук, для чего в г. Минск на
работу приглашаются известные ученые из
ведущих научных центров и университетов
СССР. В числе приглашенных для руководства Институтом биологии Академии наук
БССР был и Николай Васильевич Турбин,
который в 1953 г. избирается академиком Академии наук БССР.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
8
Л.В. Хотылева, Р.И. Гончарова. Академик Н.В. Турбин – основатель современной белорусской генетической школы
В исторических сводках о путях формирования генетики в нашей республике упоминаются работы по теории селекции, выполнявшиеся на рубеже ХХ столетия в Горы-Горецком
земледельческом училище выдающимся агробиологом М.В. Рытовым. Позже, уже в Белорусской сельскохозяйственной академии проводятся исследования по генетике и селекции
растений и животных профессорами К.Г. Ренардом, Н.В. Найденовым, Б.А.   Вакаром,
А.Н. Ипатьевым. Выдающиеся теоретические
разработки по генетике пшеницы, получившие
мировую известность, были выполнены в сороковые годы ХХ столетия академиком Академии наук Беларуси А.Р. Жебраком.
Приезд Николая Васильевича Турбина в
Беларусь определил дальнейший путь развития генетических исследований в республике.
В рамках Института биологии в 1955 г. создается Отдел генетики. К работе привлекаются
ученики Николая Васильевича – ленинградцы
А.Н. и А.И. Палиловы, Е.И. Заливская, И.М. Суриков, Ю.Б. Вахтин. В аспирантуру, которую
открывают по специальности «генетика», зачисляются первые аспиранты Николая Васильевича – В.Е. Бормотов, В.Г. Володин, Н.В. Атрашенок и В.Н. Загрекова, которые продолжают
начатые еще в Ленинградском университете
исследования по вопросам биологии оплодотворения сельскохозяйственных растений.
В этот период в СССР началось повсеместное
увлечение культурой кукурузы как эффективного способа укрепления кормовой базы животноводства. Академии наук БССР также поручили
заняться решением этой проблемы. Небольшой,
но очень увлеченный и дружный коллектив Отдела генетики с энтузиазмом включился в разработку генетических проблем. Жаркие споры,
обсуждение каждой новой работы, поиски оригинальных путей решения поставленных задач,
активное изучение английского языка (без этого
уже было немыслимо движение вперед) – такой
была атмосфера в отделе в те годы. Все с нетерпением ждали появления Николая Васильевича,
ибо он обладал той завидной способностью щедро делиться богатством своих знаний, которая
присуща одаренным людям, безгранично преданным своему делу.
Необходимость заниматься выращиванием
кукурузы на многие годы определила основное
научное направление Отдела генетики ИнстиМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
тута биологии АН БССР. Николай Васильевич
направил наши усилия на решение в научном
плане биологической проблемы гетерозиса
(гибридной мощности). Кукуруза была именно тем генетическим объектом, на котором
решались многие теоретические вопросы, связанные с этим явлением, и именно на кукурузе была показана перспектива использования
гетерозиса для повышения продуктивности
растений. Одновременно начались работы по
изучению гетерозиса у томата, сахарной свеклы, зерновых культур.
За очень короткий срок, благодаря инициативе Николая Васильевича, Отдел генетики, в
рамках которого были выполнены разносторонние генетические исследования, решением Президиума Академии наук CССР преобразовывается в 1965 г. в Институт генетики и
цитологии Академии наук БССР и становится
центром научных исследований по проблемам
генетики в республике. Результаты, полученные к этому времени коллективом и доложенные Николаем Васильевичем и сотрудниками
на различных форумах в СССР и за рубежом,
выдвигают Институт на передовые позиции.
Первые теоретические результаты исследований Н.В. Турбина, и руководимого им коллектива были обобщены в книге «Гетерозис»,
вышедшей в 1961 г. в Издательстве академии
наук Белорусской ССР и сразу же ставшей библиографической редкостью. Кроме сотрудников
Института среди авторов монографии были известные иностранные ученые – А. Мюнтцинг
(Швеция), Х. Даскалов (Болгария), А. Балинт и
Г. Ковач (Венгрия), Л. Ржиман (Чехословакия).
В результате обобщения и критического
анализа итогов собственных исследований
и данных литературы Николай Васильевич
предложил новую концепцию для объяснения причин гетерозиса, основанную на теории генетического баланса. Главная ценность
этой концепции состоит в правильном подходе к выяснению причинно-следственных
связей между наследственными факторами
и контролируемыми признаками. Она выражает собой общий подход к объяснению причин гетерозиса и исходит из представления
о разнонаправленном действии на развитие
признака многих наследственных факторов.
Согласно этой концепции, при скрещивании
линий, специально подобранных по комбина-
Л.В. Хотылева, Р.И. Гончарова. Академик Н.В. Турбин – основатель современной белорусской генетической школы
ционной способности, образуются гибриды,
у которых число генов, вызывающих плюсэффекты, существенно возрастает, а число
генов с минус-эффектами уменьшается по
сравнению с обеими родительскими формами.
Изменение баланса в действии генов, стимулирующих развитие данного признака, проявляется в возрастании его количественного
выражения, т.е. в виде гетерозисного эффекта.
В ходе дальнейших исследований были сделаны теоретические обобщения данных по
генетике гетерозиса, принципам и методам
селекции на комбинационную способность,
генетике цитоплазматической мужской стерильности, методам получения полиплоидных
форм сахарной свеклы и гетерозисных гибридов на их основе, методам периодического отбора на комбинационную способность, математическим проблемам гетерозиса.
Одним из важных этапов работы в селекции на
гетерозис является оценка комбинационной способности родительских форм гибридов, так как
от ее уровня зависит величина гетерозиса. Под
руководством Н.В. Турбина впервые в Советском Союзе разрабатываются экспериментальные методы оценки комбинационной способности на основе диаллельного анализа, которые
после опубликования монографии «Диаллельный анализ в селекции растений» (Турбин,
Хотылева, Тарутина, 1974) получили широкое
распространение в различных селекционногенетических центрах Советского Союза.
В плане развития исследований по гетерозису, по инициативе Н.В. Турбина, сотрудниками Отдела генетики разрабатывается
модификация метода периодического отбора
линий для получения высокопродуктивного
межлинейного гибрида на основе оценки их
комбинационной способности при межсортовых скрещиваниях. Результаты этой работы доложены на ХIII Международном генетическом конгрессе (г. Беркли, США, 1973)
и опубликованы в монографии «Периодический отбор в селекции растений» (Турбин,
Хотылева, Каминская, 1976). Разработан алгоритм статистических расчетов и выведены
рабочие формулы, позволяющие оценивать
комбинационную способность генетически
разнокачественных наборов родительских
форм (Савченко, 1984, 1986). Исследованы
генетические основы и принципы селекции
9
на комбинационную способность компонентов гибридизации, выявлены типы действия
генов при гетерозисе и роль среды в его проявлении у различных культур, показана возможность многократного использования эффекта гетерозиса (Палилов, 1976; Хотылева,
Тарутина, 1982; Каминская, 1985; Тарутина,
Хотылева, 1990). Для исследования механизмов гетерозисного эффекта привлекаются
методы биохимии и молекулярной генетики.
Результаты изучения биоэнергетических процессов при гетерозисе позволили реализовать
системный физиолого-биохимический подход
к оценке селекционного материала и установить причинно-следственные связи между
биоэнергетическими показателями и продуктивностью (Хотылева, Разумович, Титок,
Юренкова, Русинова, Лемеш, 1991).
Под руководством Н.В. Турбина теоретически обоснованы и методически разработаны
новые программы селекции озимой ржи на
основе гетероплоидных скрещиваний, предложен метод переноса доминантных генов с
диплоидного на тетраплоидный уровень, получена низкостебельная тетраплоидная форма,
созданы уникальные коллекции инбредных
самофертильных линий и трисомная серия
линий озимой ржи (Кедров-Зихман, Шилко, 1979). При разработке теории и методов
формирования генетически сбалансированных
гетерозисных популяций растений (синтетических сортов) предложена оригинальная математическая модель, позволяющая определять
зависимость относительной продуктивности
формируемых популяций от показателя общей комбинационной способности, степени
инбридинга и числа объединяемых компонентов для полигенно контролируемого признака
(Кедров-Зихман, 1974).
Проблеме гетерозиса Н.В. Турбин придает всесоюзное звучание. Он организовывает
проблемный совет по гетерозису и формирует
всесоюзную программу, для участия в разработке которой приглашает ведущих генетиков
и селекционеров страны. На объединенной
сессии ВАСХНИЛ и Отделения общей биологии АН СССР, состоявшейся в Москве в
1966 году, Институт генетики и цитологии
был признан ведущим научным центром генетических исследований по проблеме гетерозиса в СССР.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
10
Л.В. Хотылева, Р.И. Гончарова. Академик Н.В. Турбин – основатель современной белорусской генетической школы
Для практического использования явления
гетерозиса необходимо было выяснить возможность создания гибридов на цитоплазматически стерильных материнских растениях,
что значительно удешевило бы и упростило
процесс получения гибридных семян. Н.В. Турбин совместно с профессором А.Н. Палиловой
организует пионерские исследования процесса взаимодействия ядерной и цитоплазматической генетических систем. На основании
комплексного изучения микроспорогенеза у
стерильных форм и их фертильных аналогов
была разработана теоретическая модель взаимодействия ядерных генов и плазмогенов при
формировании цитоплазматической мужской
стерильности. Данные исследования получили
широкий отклик за рубежом и стали началом
выяснения аналогичного механизма у разных
сельскохозяйственных растений. Результаты исследований по этой важной генетической проблеме изложены в монографии Н.В. Турбина и
А.Н. Палиловой «Генетические основы цитоплазматической мужской стерильности у растений» (Мн., 1975). Дальнейшее развитие этих
исследований учениками Н.В. Турбина привело
к получению новой информации по проблемам
взаимодействия ядерных и цитоплазматических
генетических систем у растений, что высоко
оценено научной общественностью, а авторы
работы А.Н. Палилова, Е.А. Волуевич, П.А. Орлов удостоены Государственной премии республики Беларусь 2002 г.
Совместно со своим учеником, ныне членомкорреспондентом НАН Беларуси В.Е. Бормотовым, Н.В. Турбин начинает исследования в
области экспериментальной полиплоидии и
гетерозиса. Создается первая в СССР коллекция тетраплоидных форм сахарной свеклы. На
основе лучших тетраплоидных линий начато
получение триплоидных гибридов, которые
высеваются не только на полях Беларуси, но
и в других республиках СССР. В процессе работы изучены особенности роста и развития
тетраплоидных и триплоидных растений свеклы, дана характеристика их морфологических,
анатомических и физиологических признаков,
изучена цитогенетика полиплоидных форм.
Н.В. Турбин высказывает мысль, что повышение продуктивности полиплоидных гибридов
является не только результатом полиплоидии,
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
но достигается в большей степени за счет гетерозисного эффекта, возникающего при правильном подборе родительских компонентов.
Результаты этих исследований опубликованы
в книге В.Е. Бормотова и Н.В. Турбина «Экспериментальная полиплоидия и гетерозис у
сахарной свеклы» (1972). Работы в этом направлении увенчались созданием и районированием ряда высокоурожайных и высокосахаристых триплоидных гибридов.
Теоретические и методические разработки по проблеме гетерозиса нашли широкое
практическое использование при выведении
гетерозисных гибридов в Беларуси и других
странах СНГ. По вопросам генетики гетерозиса Н.В.Турбин неоднократно выступал с докладами и лекциями за рубежом – в Лондоне.
За цикл работ «Генетика гетерозиса и пути его
использования в селекции растений» сотрудникам Института – Н.В. Турбину, Л.В. Хотылевой, В.Е. Бормотову, О.О. Кедрову-Зихману,
В.К. Савченко, Е.А. Бычко, Л.Н. Каминской,
Л.А. Тарутиной, Б.Ф. Матросову, А.И. Палилову – в 1984 г. присуждена Государственная
премия республики Беларусь.
Н.В. Турбин развивает разносторонние генетические исследования мутационного процесса
на растениях, микроорганизмах и животных.
Длительное время в Институте проводилось
изучение закономерностей мутационной изменчивости зерновых культур под воздействием
радиации и лазерного облучения. Выявлено и
изучено явление генетической нестабильности
радиационных мутантов (Володин, 1975; Володин и др., 1982). В этот же период выходит в свет
монография «Гетерозис и радиоустойчивость
растений» (Турбин, Володин, Гордей, 1977).
В связи с пуском в БССР атомного реактора
Николай Васильевич инициирует изучение генетической эффективности нейтронов промежуточных энергий. Совместно с профессором
Н.А. Троицким на микроорганизмах, растениях,
дрозофиле и мышах исследована относительная биологическая эффективность нейтронного
облучения и после проведенных экспериментов
были внесены соответствующие коррективы в
нормативы радиационной защиты. Материалы
этих исследований опубликованы Н.А. Троицким, Н.В. Турбиным и М.А. Арсеньевой в монографии «Генетические эффекты промежуточных нейтронов» (Минск, 1971).
Л.В. Хотылева, Р.И. Гончарова. Академик Н.В. Турбин – основатель современной белорусской генетической школы
По инициативе Н.В.  Турбина Р.И. Гончаровой была начата работа по выявлению
антимутагенов, по разработке структурнофункционального подхода для поиска антимутагенов, по выяснению закономерностей
и механизмов защитного действия антимутагенов в половых и соматических клетках различных организмов, результаты которой были
опубликованы в монографии «Антимутагенез»
(Минск, 1974). Развитие этого направления
привело к созданию концепции антимутагенеза как генетически обусловленного процесса,
который осуществляется многокомпонентной
антимутагенной системой на клеточном и организменном уровнях, способствуя поддержанию стабильности генома и нормальному
функционированию организма (Гончарова,
1984, 1993). В дальнейших исследованиях
лаборатории антимутагенеза (с 2006 г. лаборатория генетической безопасности) разрабатывается концепция действия антимутагенов как
триггеров эндогенных защитных механизмов
(репарации ДНК, биотрансформации ксенобиотиков, поли-АДФ-рибозилирования и др.),
вовлеченных в координированную регуляцию
генных сетей организма. Установлено, что
антимутагены являются стимуляторами жизнеспособности и продуктивности. Тем самым
создана основа для использования антимутагенов в здравоохранении и сельском хозяйстве,
в частности для повышения продуктивности
аквакультуры. Так, разработаны технологии по
повышению продуктивности некоторых видов
рыб путем использования антимутагена «Дилудин» в виде кормовой биодобавки.
При поддержке Николая Васильевича группой сотрудников во главе с Г.В. Красковским
проведены исследования по онкогенетике, в
процессе которых сформулирована генетическая концепция раковой анергии и предложен
оригинальный подход к диагностике рака.
В 70-е годы в Институте получают развитие
исследования по генетической трансформации
растений, молекулярной генетике и биотехнологии. По инициативе Н.В. Турбина, сначала
совместно с Институтом прикладной молекулярной биологии и генетики ВАСХНИЛ, а
затем самостоятельно были развернуты исследования по генетической трансформации
растений – совершенно новому в то время
направлению мировой науки (Турбин и др.,
11
1975). Для решения этих проблем в нашем
институте была создана лаборатория молекулярной генетики под руководством академика
Н.А. Картеля, одним из основных направлений
которой являются исследования структурнофункциональной организации геномов и молекулярное картирование генов у сельскохозяйственных растений.
Сотрудниками лаборатории разработана
технология создания трансгенных растений,
толерантных к широкому спектру тяжелых
металлов и нефтепродуктов, и на ее основе получены трансгенные растения табака, способные успешно расти на почвах, загрязненных
нефтепродуктами, а также содержащих высокие концентрации меди, свинца, цезия, алюминия и других металлов. Технология может
быть использована для селекции трансгенных
сельскохозяйственных и древесных растений,
пригодных для выращивания на загрязненных
тяжелыми металлами и нефтепродуктами территориях. Также развернуты исследования по
получению трансгенных растений рапса и картофеля, устойчивых к гербицидам и грибным
болезням (Картель, 1981, Урбанович, Картель,
1998, Картель и др., 1999, 2000, 2002).
Сегодня, спустя много лет, со всей остротой
просматриваются незаурядные способности и
талант Николая Васильевича Турбина как руководителя научного коллектива. Он обладал
необыкновенным даром зажечь интерес сотрудника к проблеме, предлагаемой к разработке. Без преувеличения можно сказать, что
многие направления научных исследований,
выполняемых в институте до последнего времени – это продукты его идей. Удивительная
научная интуиция, способность инициировать
идеи, широкий диапазон мыслей и интересов,
умение поделиться этим богатством с учениками и коллегами были очень ценным даром
руководителя. Сегодня мы развиваем свои научные школы – по проблемам гетерозиса, нехромосомной наследственности, молекулярной генетики, антимутагенеза, но в исходной
точке лежат те исследования, которые начинались еще при Николае Васильевиче Турбине.
Огромная эрудиция и большой научный
опыт позволили Н.В. Турбину, наряду с теоретическими и экспериментальными трудами в области генетики и селекции растений,
опубликовать ряд широко известных работ
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
12
Л.В. Хотылева, Р.И. Гончарова. Академик Н.В. Турбин – основатель современной белорусской генетической школы
по вопросам видообразования, философским
проблемам генетики, прогнозирования направлений и методов селекции растений. Так, одна
за другой выходят его статьи: «Дарвинизм и
новое учение о виде» (Ботанический журнал,
1952 , т. 37, № 6), «О некоторых спорных вопросах теории видообразования» (Вестник
ЛГУ, 1953, № 7), «Когда нечего сказать по
существу» (Журнал общей биологии, 1953,
т.15, № 3), « О современной концепции гена»
(Вестник АН СССР, 1957, № 4), «О философских вопросах современной генетики» (Вопросы философии, 1958, № 2). Следует напомнить, что это было очень непростое время
в отечественной биологии, поэтому каждая из
названных публикаций представляет собой
отражение общей ситуации в биологии. Так,
в вышедшей в 1952 г. на страницах «Ботанического журнала» статье «О спорных вопросах теории видообразования», впервые, после
печально знаменитой августовской сессии
ВАСХНИЛ 1948 г., прозвучала критика взглядов Т.Д. Лысенко, открывшая дискуссию по
вопросам видообразования. Не менее острой
была статья «О философских вопросах современной генетики» (1958 г.), в которой Николай Васильевич по приглашению редколлегии
журнала «Вопросы философии» и руководства
Института философии Академии наук СССР
выступил в защиту молекулярной биологии.
Это новое по тем временам направление, получившее признание в мировой науке и успешно развивавшееся в научных центрах Запада,
в нашей стране (бывшем Советском Союзе)
было объявлено «псевдонаучным извращением, порожденным буржуазной идеологией».
С течением времени руководимый Николаем
Васильевичем коллектив успешно завоевывал
признание своих коллег в стране и за ее пределами. Публикация трудов Института, выступления Н.В. Турбина на генетических конгрессах
и различного рода генетических форумах, активная позиция в вопросах использования достижений генетики для сельскохозяйственного
производства способствовали высокой оценке
руководством страны незаурядных организаторских способностей Николая Васильевича.
В 1967 г. он избирается академиком Всесоюзной академии сельскохозяйственных наук, а в
1968 г. – академиком-секретарем Отделения
растениеводства и селекции – крупнейшего
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
подразделения ВАСХНИЛ. В 1971 г. Николай
Васильевич оставляет Институт генетики и
цитологии в Минске и переезжает на работу
в Москву. Его талант ученого, организатора и
активная научная деятельность явились предпосылкой значительного повышения теоретического уровня исследований, выполняемых в
Институтах ВАСХНИЛ, в более эффективной
организации прикладных исследований по
растениеводству в СССР. В 1974 г. он создает
в Москве Всесоюзный институт прикладной
молекулярной биологии и генетики ВАСХНИЛ,
которым руководит до 1980 г.
В последние годы своей жизни Николай
Васильевич возглавлял лабораторию генетики и физиологии продуктивности Всесоюзного (ныне Всероссийского) института растениеводства им. Н.И. Вавилова. Последним
его научным увлечением стали исследования
по генетике и селекции тритикале, которые
он начинал в Беларуси, когда этой культуры
еще в республике не знали. Все, к чему он
прикасался, приобретало особое значение и
масштабность. Работа по тритикале развертывалась в разных районах СССР. Исследования проводились в России, Беларуси, Украине, Узбекистане, Киргизии и Таджикистане.
Были созданы, испытаны и районированы в
разных зонах Союза высокоурожайные сорта
этой культуры, изучены особенности нового
морфофизиологического типа гексаплоидного
тритикале, отличающегося резко повышенной
продуктивностью колоса, наиболее отзывчивого на интенсивную технологию выращивания, с потенциальной урожайностью при
озимом посеве до 110–120 ц/га. Выведенный
под руководством Н.В. Турбина и при его непосредственном участии в процессе селекции
сорт ярового тритикале «Немига 2» был зарегистрирован Государственным агропромышленным комитетом СССР в 1982 г. и районирован в Киргизии и Таджикистане.
После отъезда в Москву Николай Васильевич не прерывал связи с созданным им Институтом генетики и цитологии Академии
наук Беларуси. Он был частым его гостем.
В период отпуска, который Н.В. Турбин, как
правило, проводил у себя на даче под Минском, мы организовывали деловые встречи в
институте – обсуждали свои проблемы с Николаем Васильевичем, который оставался на-
Л.В. Хотылева, Р.И. Гончарова. Академик Н.В. Турбин – основатель современной белорусской генетической школы
шим учителем и большим другом. Несмотря
на переезд в Москву, он сохранил членство в
Белорусском обществе генетиков и селекционеров, участвовал в его работе, и был постоянным делегатом наших съездов. В 1997 году
Н.В. Турбин принял участие в работе VII-го
съезда Общества генетиков и селекционеров
Беларуси, который проходил в г. Горки Могилевской области в Белорусской сельскохозяйственной академии. Это был его последний
визит в Беларусь. Летом 1998 г. Николай Васильевич ушел из жизни.
Как ученый, Н.В. Турбин всегда был преисполнен новыми идеями, рабочими гипотезами,
он был неиссякаемым источником научных
знаний. Людей, близко знавших его, поражала разносторонность его интересов. Николая
Васильевича занимали вопросы самых разнообразных областей естествознания, он любил и
хорошо знал философию, историю, русскую и
зарубежную литературу, поэзию, искусство.
С ним было очень интересно работать и об-
13
щаться. Он привлекал своей безграничной
влюбленностью в науку. И нам, его ученикам
и последователям, очень дороги слова, прозвучавшие в одной из последних публикаций
(«Неман», 1993, № 4), где он пишет: «Большое
удовлетворение испытываю я также от создания и успешной деятельности Института генетики и цитологии НАН Беларуси, директором
и организатором которого я был, и в котором,
после переезда в Москву, оставил свое сердце.
Горжусь тем, что Институт, в составе которого
работают многие мои ученики, стал важным
центром генетических исследований…»
Нынешний Х съезд Белорусского общества генетиков и селекционеров проходил
9–11 октября 2012 г. в г. Минске в год 100-летия со дня рождения академика Н.В.Турбина.
Доброй памятью нашей о Николае Васильевиче будет дальнейшее успешное развитие тех
научных начинаний, идей и замыслов, в которые он вложил свою душу и вдохновителем
которых был на протяжении всей своей жизни.
Дата поступления статьи 17 декабря 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 547.96:543:51:543.54:543.4:576.3
В.П. Ямскова1, М.С. Краснов2, Е.Ю. Рыбакова1, В.В. Богданов2, А.П. Ильина2, О.Г. Куликова2,
Д.И. Мальцев2, И.А. Ямсков2
Новая группа мембранотропных гомеостатических
тканеспецифических биорегуляторов: идентификация,
физико-химические свойства и биологическое действие
ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Россия, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26
2
ФГБУН Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН
Россия, 119991, Москва, ул. Вавилова, 28
1
Введение
В настоящее время известно большое количество биологически активных молекул, влияющих на различные процессы метаболизма
в организме (цитокины, гормоны, различные
медиаторы). Но, поиск новых молекул является актуальным, особенно в аспекте исследования регуляторных веществ в межклеточном
пространстве тканей, которые ответственны
за фактор регуляции клеток опосредованно
через клеточную адгезию. Предметом данной работы являлось исследование новых
биологически активных веществ, которые
изначально были выделены как молекулы адгезии, а далее было показано их влияние на
основные биологические процессы в живых
системах.
Материалы и методы
Биорегуляторы были выделены из различных
тканей по разработанной методике при пониженной температуре в физиологическом растворе.
Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы (МГТБ) обычно
сосредоточены в надосадочной жидкости (супернатанте) при высаливании тканевых экстрактов в насыщенном растворе сернокислого
аммония. Далее данная фракция супернатанта могла быть разделена с помощью методов
изоэлектрофокусирования либо обращеннофазовой ВЭЖХ. Детекцию фракций белков
проводили спектрофотометрически при 280 нм.
Для обращено-фазовой ВЭЖХ применяли хроматограф Agilent 1100 Series (США), колонку
Биохиммак С8-200 (4,6 мм × 150 мм), градиент
вода (0,1% ТФА)–ацетонитрил, скорость элюции
0,5 мл/мин. Размер белковых частиц в растворах
определяли методом лазерного динамического
светорассеивания [1] либо с помощью метода
атомно-силовой микроскопии [2]. Для биотестирования фракций биорегуляторов использовали ранее разработанный адгезиометрический
метод [3], на органотипической культуре печени
мышей оценивали параметр, отражающий мембранотропную активность. Определение вторичной структуры проводили с помощью метода
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
кругового дихроизма. Спектры кругового дихроизма в УФ-области (195–260 нм) снимали на
КД-спектрометре Jasco 720 (Япония) при 20 оС
в кварцевых кюветах с длиной оптического пути
1 мм. Скорость сканирования – 50 нм/мин, шаг –
1 нм, накопление каждого шага – 2 сек. Концентрация исследуемого белка в водном растворе
составляла 60–400 мкг/мл. Итоговый спектр
получали по результатам усреднения данных
трех сканирований и вычитания спектра базовой
линии (контроля). Содержание элементов вторичной структуры оценивали с помощью программы CDNN (http://bioinformatik.biochemtech.
uni-halle.de/cdnn). Анализ молекулярной массы белков проводили методом MALDI-TOF на
время-пролетном масс-спектрометре UltraFlex 2
(Bruker Daltonic, Германия). Время-пролетные
масс-спектры фиксировали в линейном режиме
и режиме рефлектора. Для проведения массспектрометрического анализа образцы упаривали досуха, остаток растворяли в 70%-ном
ацетонитриле, содержащем 0,1% ТФУ, до образования раствора с концентрацией не менее
10 пмоль/мкл. В работе использовали следующие матрицы: синапиновая кислота, 2-циано-4гидроксикоричная кислота. Для исследования
специфической биологической активности био-
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
регуляторов был разработан ряд новых моделей
органотипического культивирования тканей и
органов позвоночных животных [4–8]. Особенно
яркое действие биорегуляторов наблюдали при
роллерном органотипическом культивировании
15
тканей. Локализацию в тканях биорегуляторов
проводили с помощью получения поликлональной антисыворотки к соответствующим биорегуляторам и последующей иммуногистохимической реакции на срезах тканей.
Результаты и обсуждение
Биорегуляторы данной группы, которая получила название «мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы»,
были обнаружены нами в различных тканых
животных позвоночных и беспозвоночных,
растений, грибов [9].
МГТБ проявляют ряд достаточно оригинальных свойств, их изучение способствовало разработке определенного экспериментального подхода к изучению биорегуляторов данной группы
[3]. Его основу составляют экстракция МГТБ из
тканей, их очистка, изучение состава и биологического действия. Например, для изучения биологической активности МГТБ был разработан
метод их биотестирования, основанный на оценке мембранотропного действия биорегуляторов.
Для исследования влияния биорегуляторов на
состояние клеток и тканей были разработаны
экспериментальные модели роллерного органотипического культивирования, в основном, тканей амфибий, поскольку они лучше тканей мле-
копитающих выдерживают условия длительного
культивирования, а активность МГТБ характеризуется отсутствием видовой специфичности.
На данных моделях было продемонстрировано влияние МГТБ в сверхмалых дозах, соответствующих 10-8–10-15мг белка/мл (СМД),
на ход и направленность таких важнейших
биологических процессов как адгезия и миграция клеток, клеточная пролиферация и
дифференцировка, апоптоз. Было показано,
что биорегуляторы данной группы стимулируют восстановление и репарацию в поврежденныз тканях за счет дополнительной
активации клеточных источников регенерации в ткани [9].
Иммуногистохимическими методами была
показана их внеклеточная локализация (рис. 1).
Полученные результаты свидетельствуют в
пользу высказанного нами предположения об
участии данных биорегуляторов в образовании
структуры «малого» матрикса.
Рис. 1. Локализация биорегуляторов в тканях. Локализация биорегулятора, выделенного из сыворотки крови на
поверхности клеток печени тритона: а) гепатоцитов; б) клеток кроветворения (указано стрелками) (Ув. ок.×10,
об.×100); в) локализация биорегулятора, выделенного из луковиц чеснока, в ткани отростка чеснока на поверхности клеток эпидермиса и округлых клеток губчатого мезофилла (указано стрелками) (Ув. ок.×10, об.×20);
г) локализация биорегулятора, выделенного из роговицы – на поверхности клеток эпителия и эндотелия роговицы (указано стрелками): а) тритона (Ув . ок.×10, об.×20); б) крысы (Ув. ок.×10, об.×10).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
16
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
Результаты исследований показали, что
МГТБ имеют сложный состав: они представляют собой комплексы биологически активных пептидов (регуляторные пептиды, РП),
в том числе углеводсодержащих, и белков,
которые модулируют активность РП. Ионы
кальция играют большую роль в организации МГТБ – они участвуют во взаимодействии отдельных компонентов МГТБ между
собой (рис. 2). Экспериментально показано,
взаимодействие РП с белками-модуляторами
происходит по принципу углевод-белкового
взаимодействия: белок-модулятор, подобно
лектину «узнает» углеводную компоненту
(остатки маннозы) пептидов, образуется комплекс в присутствии ионов кальция (рис. 2).
Образование такого комплекса приводит к
изменению активности РП. В некоторых случаях происходит значительное уменьшение
активности РП, например, это показано для
биорегулятора, выделенного из сыворотки
крови [10]. В случае других биорегуляторов,
например, выделенных из тканей заднего сектора глаза, образование комплекса вызывает
увеличение активности РП и проявление ее в
СМД [11].
Рис. 2. Механизм взаимодействия регуляторных пептидов с их модуляторами, лежащий в основе образования
и функционирования биорегуляторов данной группы
Согласно нашим представлениям, взаимодействие между РП и белками-модуляторами
лежит в основе самосборки структуры МГТБ,
которые являются «тонкими настройщиками»
органо-тканевого гомеостаза, то есть обеспечивают регуляцию биологических процессов,
проявляя свойства тканевой, но не видовой
специфичности действия. В этом аспекте следует привести экспериментально полученные
данные об исследовании пептидной компоненты, выделенной из различных тканей глаза быка. Несмотря на то, что эти ткани глаза:
роговица, хрусталик, стекловидное тело, радужка, сетчатка и др., выполняют различные
функции и имеют разное строение, в состав
биорегуляторов, выделенных из каждой ткани глаза, входят несколько одинаковых пептидов (табл. 1).
Таблица 1
Пептидный состав биорегуляторов, выделенных из различных тканей глаза.
Перечень сигналов масс-спектров пептидов
№
Источник
1
2
3
Сетчатка глаза быка Bos taurus taurus
Хрусталик глаза быка Bos taurus taurus
Стекловидное тело глаза быка Bos taurus taurus
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
М (m/z)
4302, 4528, 4819, 8603
4302, 4529, 4817, 8604
4300, 4370, 4420
Концентрация
(мг/мл)
0,068
0,0041
0,081
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
17
Продолжение Табл. 1
№
Источник
М (m/z)
4
5
6
7
Радужка глаза быка Bos taurus taurus
Цилиарное тело глаза быка Bos taurus taurus
ПЭ глаза быка Bos taurus taurus
Склера глаза быка Bos taurus taurus
8
Роговица глаза быка Bos taurus taurus
Важно отметить, что в литературе отсутствуют данные о синтезе гликопептидов в тканях высших животных. В связи с этим, можно
предположить, что РП являются продуктами
постоянно протекающего в межклеточном
пространстве тканей протеолиза белков, в том
числе гликопротеинов.
Известно, что суперсемейство матричных
металлопротеаз (MMP), включающее в себя
более 28 представителей, а также семейство
ингибиторов данных ферментов (TIMP) постоянно осуществляют модификацию ВКМ
за счет протеолиза его белков [12]. В литературе имеются данные, показывающие, что
продукты протеолиза белков ВКМ играют
3944, 4301
4301
4303, 4532, 4819
4171, 4302, 4531, 4819
1442, 3376, 3973, 4302, 4418,
4531, 4817, 8604
Концентрация
(мг/мл)
0,083
0,068
0,0017
0,039
0,0105
большую роль в дифференцировке и пролиферации клеток [13]. Согласно предложенной нами концепции, продукты протеолиза
собираются в ассоциаты, которые являются
биологически активными. Большую роль
в этом процессе играют белки-модуляторы.
Мы предполагаем, что белки-модуляторы
(в некоторых случаях они представлены неизученными изоформами сывороточного
альбумина) проявляют свойства шаперонов – осуществляют организацию и «упаковку» пептидов, которые приобретают
вторичную структуру, преимущественно
содержащую различные β-элементы и статистический клубок (табл. 2).
Таблица 2
β-складки
(параллельные), %
β-изгибы,
%
Статистический
клубок, %
Пигментный
эпителий глаза
Сетчатка
Хрусталик
Сыворотка крови
Легкое
Печень
Желчь
Молоко
Предстательная
железа
β-складки
(антипараллельные),
%
Источник
выделения
биорегуляторов
(из тканей
крупного рогатого
скота)
α-спираль, %
Вторичная структура регуляторных пептидов, входящих в состав биорегуляторов
7,6 ± 0,5
37,4 ± 0,5
5,7 ± 0,5
18,9 ± 0,5
30,4 ± 0,5
7,4 ± 0,5
6,8 ± 0,5
8,0 ± 0,5
2,2 ± 0,5
2,2 ± 0,5
2,2 ± 0,5
6,2 ± 0,5
40,0 ± 0,5
40,4 ± 1,0
40,1 ± 0,5
48,1 ± 0,5
48,1 ± 0,5
48,3 ± 0,5
45,7 ± 0,6
5,2 ± 0,5
5,2 ± 0,5
2,0 ± 0,5
3,7 ± 0,5
3,7 ± 0,5
3,7 ± 0,5
3,6 ± 0,8
18,4 ± 0,5
18,5 ± 1,0
16,9 ± 0,5
16,7 ± 0,5
16,7 ± 0,5
16,7 ± 0,5
16,0 ± 1,1
31,0 ± 0,5
30,8 ± 1,0
33,0 ± 0,5
29,3 ± 0,5
29,3 ± 0,5
29,1 ± 0,5
28,5 ± 3,2
6,4 ± 0,1
47,1 ± 0,2
3,7 ± 0,3
14,1 ± 0,1
28,7 ± 1,5
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
18
Следует отметить особую роль изоформ
альбумина сыворотки крови, которые были
обнаружены как белки-модуляторы, входящие в состав нескольких МГТБ. Известно,
что семейство сывороточного альбумина
включает в себя несколько десятков членов.
До сих пор их функция оставалась совершенно неизученной. Согласно предложенной
нами концепции, многочисленные изоформы
сывороточного альбумина могут быть ответственны за регуляцию процессов органнотканевого гомеостаза, входя в состав МГТБ
и функционируя как шапероны в межклеточном пространстве соответствующей ткани.
Такое поведение сывороточного альбумина
(подобно шаперону) показано в литературе
[14]. Мы полагаем, что изоформы альбумина
могут проникать избирательно в межклеточа
1,0
1,0
0,8
ное пространство соответствующего органа
через гемато-органные барьеры, которые пропускают только специфический для данного
органа альбумин. Это предположение подкрепляется результатами исследования альбуминов, входящих в состав МГТБ. Так, например, методами масс-спектрометрии было
показано, что альбумины, входящие в состав
нескольких МГТБ, имели различные значение
молекулярных весов [4, 15].
Важнейшим свойством МГТБ является их
способность образовывать крупные наноразмерные частицы даже в очень разбавленных
растворах (рис. 3, 4) [4–7, 16]. Надо отметить, что экспериментально была показана
зависимость между наноразмерным состоянием МГТБ и проявлением их активности в
СМД [11].
б
в
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
0,8
0,6
0,6
0,4
Rh × A(Rh)
Функция распределения
R × A(Rh)
Ф у н к ц и яh р а с п
ределения
0,8
0,2
0,2
0,0
0,0
0,1
1
10
100
Rh, nm
1000
10000
0,01
0,4
0,1
1
10
Rh, nm
100
1000
10000
0,01
0,1
1
10
100
1000
10000
Rh, nm
Рис. 3. Лазерное динамическое светорассеивание растворов, содержащих биорегулятор, выделенных из:
а) молока (Rh = 87,8 ± 10,1 нм); б) ПЭ (Rh = 205,5 ± 11,3 нм); в) роговицы (Rh = 130,5 ± 12,4 нм); Rh – величина
гидродинамического радиуса при величине угла рассеяния 0°
Рис. 4. Атомно-силовая микроскопия растворов биорегуляторов, выделенных из: а) хрусталика (110–200 нм);
б) ПЭ (150–300 нм); в) сетчатки (120–170 нм)
Очевидно, это свойство МГТБ непосредственно связано с их способностью влиять
на структуру воды. Это было показано ранее различными физико-химическими меМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
тодами: ИК-спектроскопия, ЯМР, лазерное
динамическое светорассеивание [17]. Было высказано предположение о том, что в
основе механизма действия биорегуляторов
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
данной группы в СМД лежит способность
изменять структуру воды в растворе [18].
Согласно нашим представлениям, МГТБ,
присутствующие в виде «малого» матрикса
в межклеточном пространстве, обеспечивают прохождение регуляторного сигнала по
ткани за счет перевода воды в определенное
состояние. Именно в этом состоянии вода
функционирует как «информационная матрица». Любое воздействие небольшого количества сигнальных молекул вызывает локально
ее изменение – образование новых структур
воды, которое быстро распространяется по
межклеточному пространству тканей, вызывая изменения конформации соответствующих рецепторов. Через некоторое время это
«возмущение» в виде образования локальной
новой структуры воды исчезает, и вода вновь
переходит за счет взаимодействия с МГТБ в
свое постоянное состояние «информационной матрицы».
Результаты этого исследования объясняют
также уникальное свойство биорегуляторов
данной группы дополнительно активировать
клеточные источники регенерации, вызывая
тем самым стимуляцию процессов восстановления и репарации [9].
Поэтому в настоящем исследовании была
предпринята попытка изучить мембранотропную активность двух экстрактов, выделенных из печени и легкого крыс, в состоянии «мнимых» растворов, полученных
при разведении соответствующего тканевого
экстракта в 1050 раз. Исследование проводили
на свежеприготовленной органной культуре
ткани печени или легкого мыши после кратковременной инкубации (20 мин). На первом
этапе данной экспериментальной серии были
исследованы растворы тканевых экстрактов в
СМД, которые были получены разбавлением
исходных растворов в 1012 раз.
Результаты этого исследования показывают, что экстракты тканей печени и легкого
крыс в СМД проявляют мембранотропную
активность (табл. 1).
Как видно из результатов, приведенных
в табл. 2, оба экстракта проявляли этот вид
биологической активности, причем сохранялся ее тканеспецифический характер.
Полученные данные указывают на присутствие в «мнимых» растворах экстрак-
19
тов печени и легкого крыс структур воды,
оказывающих биологическое действие. Это
согласуется с современными представлениями о способности молекул воды образовывать структуры под действием физикохимических факторов.
В пользу этого предположения свидетельствуют результаты следующей экспериментальной серии, в которой действию ультразвука были подвергнуты растворы экстрактов
в СМД и в «мнимых» растворах. Было показано, что после ультразвукового воздействия растворы экстрактов в СМД сохраняли мембранотропную активность, имеющую
тканеспецифический характер. Однако в состоянии «мнимых» растворов тканевые экстракты утрачивали способность оказывать
влияние на свойства плазматической мембраны клеток после ультразвукового воздействия. Полученные данные предполагают,
что биорегуляторы, присутствующие в экстрактах печени и легкого, способствуют образованию биологически активных структур
воды, которые могут необратимо разрушаться при ультразвуковом воздействии.
Следует отметить очень важный экспериментальный результат, который был получен
в этом исследовании. Работа на двух тканевых культурах позволила оценить биологическую активность образующихся в «мнимых»
растворах структур воды, которые оказывают такое же тканеспецифическое действие,
как и биорегуляторы данной группы в СМД.
В данном случае, возможно, что тканеспецифические кластеры обладают различной
организацией, свойственной данному типу
ткани. Также вероятно, что существует несколько видов «стандартных» кластеров,
присутствующих во всех растворах, и их
сочетание определяет тканеспецифический
характер биологически активных веществ.
На основании полученных результатов
можно предположить, что в основе биологического действия биорегуляторов данной
группы как в СМД, так и в «мнимых» растворах, лежит их способность участвовать в
образовании кластеров воды, различающихся
по структуре.
Мембранотропная активность тоже тканеспецифична – это показано для печени и
легкого крыс.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
20
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
Таблица 3
Мембранотропная активность (Ма) экстрактов печени и легкого крыс
в сверхмалых дозах на органных культурах ткани
Исследуемый
раствор
Экстракт печени
крысы
Экстракт легкого
крысы
Мембранотропная активность экстрактов печени и легкого крыс в сверхмалых
дозах на органных культурах ткани (Ма, %)
Воздействие ультразвуком
Через 1 час
Через неделю
Печень
Легкое
Печень
Легкое
До озвучивания
Печень
Легкое
141,0* ± 7,06
104,24 ± 5,16
138,34* ± 5,16
—**
—**
—**
108,36 ± 5,25
162,0* ± 8,1
—**
16,7 ± 0,5
29,3 ± 0,5
—**
* – отмечены статистически достоверные результаты (p < 0,05);
** – мембранотропную активность не определяли.
Таблица 4
Мембранотропная активность (Ма) экстрактов печени и легкого крыс
в «мнимых» растворах
Исследуемый
раствор
Органная
культура ткани
Экстракт печени
крысы
Экстракт легкого
крысы
Мембранотропная экстрактов печени и легкого крыс в «мнимых» растворах (%)
Воздействие ультразвуком
Через неделю после
После воздействия
воздействия
До озвучивания
Печень
Легкое
Печень
Легкое
Печень
Легкое
139,87* ± 6,95
102,24 ± 5,62
103,11 ± 5,15
—**
105,3 ± 5,76
—**
105,28 ± 5,25
144,31* ± 7,12
—**
102,15 ± 4,54
—**
108,37 ± 5,42
Таким образом, мы показали, что биологическое действие изучаемых биорегуляторов тканеспецифично, но не видоспецифично.
В качестве примера далее приведена тканеспецифическая активность ранозаживления
кожи мыши in vivo. Оказалось, что из исследуемых биорегуляторов, как показано на рис. 5,
активными являются биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови, подорожника, алоэ,
хрусталика, жемчужницы; в случае же применения биорегуляторов, выделенных из роговицы, кабачков, почек, сетчатки эффект был как
в контрольной группе с физиологическим раствором. Причем действие различных биорегуляторов было акцентрировано на определенные
структуры кожи при применении различных
биорегуляторов, что говорит о тканеспецифичности их действия.
В контроле в центральной части раны наблюдали образование очага хронического воспаления и формирование соединительнотканного
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
рубца в дерме, отмечали отсутствие полной
реэпителизации, отмечалось нарушение адгезионных взаимодействий между эпителием и
дермой, не наблюдалось восстановления протоков желез. В дерме происходило образование
рубцовой ткани; подкожная жировая ткань была
плохо выражена (рис. 5 а, д, е).
В опытных группах с активными биорегуляторами наблюдали совершенно иную картину
репарации кожи: сильное стягивание краев раны и практически полную ее реэпителизацию
(кроме использования биорегулятора из хрусталика), более выраженную, чем у животных
контрольной группы (восстанавливались все
слои многослойного эпителия).Отмечали отсутствие очагов воспаления.
Структура дермы почти восстановлена, отмечено поддержание адгезивных взаимодействий
между эпителием и дермой, соединительная
ткань была менее уплотненной по сравнению
с тканью мышей контрольной группы.
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
21
Рис. 5. Модель экспериментальной кожной раны у мышей in vivo при обработке раны: а) физ. раствором;
б) биорегулятором сыворотки крови в дозе 10–12 мг белка/мл; в) биорегулятором жемчужницы в дозе 10–10 мг
белка/мл; г) биорегулятором хрусталика в дозе 10–12 мг белка/мл; д) биорегулятором роговицы в дозе
10–11 мг белка/мл; е) биорегулятором сетчатки в дозе 10–10 мг белка/мл; ж) биорегулятором подорожника
в дозе 10–12 мг белка/мл; з) биорегулятором алоэ в дозе 10–10 мг белка/мл (Ув. ок. ×10, об. ×10);
1 – эпидермис; 2 – дерма; 3 – подкожная жировая ткань; 4 – струп; 5 – волосяные фолликулы;
6 – сальные железы; 7 – очаг воспаления; 8 – фиброзный рубец
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
22
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
В дерме (особенно под раной) и в подкожной ткани отмечено восстановление многочисленных протоков потовых желез (в случае
применения биорегуляторов подорожника,
алоэ, хрусталика и сыворотки крови) и волосяных фолликулов (в случае биорегуляторов
из сыворотки крови и хрусталика). В случае
применения биорегуляторов из сыворотки
крови, хрусталика и жемчужницы происходило восстановление сальных желез в дерме.
Жировая ткань сильно развита (особенно в
случае применения биорегуляторов из подорожника и алоэ). В отдельных участках под
раной отмечено частичное восстановление
мышечных элементов (в случае применения
биорегулятора из сыворотки крови). То есть,
в случае действия активных биорегуляторов
наблюдалось полное восстановление нормальной структуры ткани кожи (рис. 5 б, в, г,
ж, з). Эти данные полностью соответствуют
результатам ранее проведенного исследования, свидетельствующего о ранозаживляющем
действии сывороточного МГТБ [8]. У мышей с
использованием биорегулятора из жемчужницы наблюдали стимуляцию ранозаживления,
восстановительные процессы происходили по
иному механизму, чем у мышей с биорегулятором из сыворотки крови, подорожника и алоэ.
В дерме наблюдали сальные железы и эпителиальные структуры, которые мигрировали к
эпидермису, образуя характерные «столбики»
эпителия (отмечено стрелкой). Следует отметить, что картина регенерации кожи у мышей данной группы была сходной с таковой у
мышей мутантной линии Hrhr/ Hrhr на модели
экспериментального ожога in vivo [19]. Мутация в гене Hr вызывает нарушение волосяных
фолликулов, образовавшихся в эмбриогенезе,
и приводит к полному облысению животных.
Обнаруженная аналогия может быть объяснена отсутствием волосяных фолликулов у
моллюсков, вследствие чего наблюдается другой механизм репарации кожи, в отличие от
млекопитающих, у которых стволовой отдел
эпителиальных и мезенхимных клеток связан
с волосяными фолликулами.
Заключение
Таким образом, результаты проведенных
нами исследований свидетельствуют в пользу
высказанной нами ранее концепции о присутствии во всех живых организмах определенного механизма биорегуляции, основанного
на структурных перестройках воды. На наш
взгляд, данный механизм лежит в основе феномена действия физико-химических факторр\
ов в СМД. Значительная сложность в исследовании этого вопроса связана с тем, что вода в
живых организмах принципиально отличает-
ся от воды «свободного» объема – предмета
многих исследований, проводимых физикохимическими методами. Тем не менее, обнаружение данной группы биорегуляторов, которые, на наш взгляд, участвуют в образовании
«малого» матрикса межклеточного пространства тканей, позволяет моделировать многие
процессы, происходящие в живых организмах,
и, тем самым, более глубоко изучать данный
механизм биорегуляции.
Список использованных источников
1. Stepanek, P. Dynamic Light Scattering. The
method and some applications // Ed. By Brown
W. – Oxford: Clarendron Press, 1993. – P. 177.
2. Filinov, A.S., Dubrovin, E.V., Gavrilko, D.Yu.,
Meshkov, G.B., Yaminsky, I.V. FemtoScan
Online – A Combination of Probe Microscopy
and Internet Technologies // Proceedings of
International Workshop “Scanning Probe
Microscopy-2002”, Nizhny Novgorod, Russia,
March 3–6. – 2002. – Р. 64–66.
3. Ямскова, В.П., Резникова, М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови
теплокровных: влияние на клеточную адгеМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
зию и пролиферацию // Журнал общей биологии. – 1991. – Т. 52, № 2. – С. 181–191.
4. Borisenko, A.V., Yamskova, V.P., Krasnov, M.S., Blagodatskikh, I.V., Vecherkin, V.V.,
Yamskov, I.A. Regulatory proteins from the
mammalian liver that display biological activity
at ultra low doses / Ed. by Varfolomeev S.D.
[et al.] // Biochemical Physics Frontal Research. –
Hauppauge NY: Nova Science Publishers Inc.,
2007. – Р. 35–45.
5. Krasnov, M.S., Gurmizov, E.P., Yamskova, V.P., Yamskov, I.A. Analysis of a
Regulatory Peptide from the Bovine Eye Lens:
В.П. Ямскова и др. Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов...
Physicochemical Properties and Effect on
Cataract Development in vitro and in vivo / Ed.
by Varfolomeev S.D. [et al.] // Biochemical
Physics Frontal Research. – Hauppauge NY:
Nova Science Publishers Inc, 2007. – P. 21–33.
6. Margasyuk, D.V., Krasnov, M.S., Blagodatskikh, I.V., Grigoryan, E.N., Yamskova, V.P.,
Yamskov, I.A. Regulatory Protein from Bovine
Cornea: Localization and Biological Activity /
Ed. by Varfolomeev S.D. [et al.] // Biochemical
Physics Frontal Research. – Hauppauge NY:
Nova Science Publishers Inc. – 2007. – P. 47–59.
7. Nazarova, P.A., Yamskova, V.P., Krasnov, M.S., Filatova, A.G., Yamskov, I.A. Regulatory proteins biologically active in ultralow doses
from mammalian glands and their secretions /
Ed. by Varfolomeev S.D. [et al.] // New Trends in
Biochemical Physics Research. – Hauppauge NY:
Nova Science Publishers Inc., 2007. – P. 73–82.
8. Yamskova, V.P., Krasnov, M.S., Rybakova, E.Yu., Vecherkin, V.V., Borisenko, A.V.,
Yamskov, I.A. Analysis of regulatory proteins
from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 2. Tissue localization and role in wound healing / Ed. by Varfolomeev S.D. [et al.] // Biochemical Physics Frontal
Research. – Hauppauge NY: Nova Science Publishers Inc., 2007. – P. 71–78.
9. Ямскова, В.П., Краснов, М.С., Ямсков, И.А.
Новые экспериментальные и теоретические
аспекты в биорегуляции. Механизм действия
мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов. – Saarbrucken: Lambert Academic Publishing, 2012. – 127 с.
10.Ямскова, В.П., Рыбакова, Е.Ю., Виноградов, А.А., Вечеркин, В.В., Ямсков, И.А.
Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови
млекопитающих // Прикладная биохимия
и микробиология. – 2004. – Т. 40, № 4. –
С. 407–413.
11.Ямскова, В.П., Скрипникова, В.С, Молявка, А.А., Ильина, А.П., Краснов, М.С.,
Маргасюк, Д.В., Борисенко, А.В., Березин, Б.Б., Кузнецова, Е.С., Буряк, А.К., Ямсков, И.А. Структурно-функциональные особенности нового биорегулятора, выделенного
из ткани пигментного эпителия глаза быка //
Биохимия. – 2009. – Т. 74, № 9. – С. 1195–1203.
23
12. Pytliak, M., Vargova, V., Mechirova, V. Matrix metalloproteinases and their role in oncogenesis:
a review // Onkologie. – 2012. – V. 35. – P. 49–53.
13.Chaussain, C., Eapen, A.S., Huet, E.,
Floris, C., Ravindran, S., Hao, J., Menashi, S.,
George, A. MMP2-cleavage of DMP1 generates
a bioactive peptide promoting differentiation of
dental pulp stem/progenitor cell // Eur Cell Mater. – 2009. – V. 18. – P. 84–95.
14.Marini, I., Moschini, R., A. Del Corso,
Muka, U. Chaperone-like features of bovine serum
albumin: a comparison with alpha-crystallin // Cell.
Mol. Life Sci. – 2005. – V. 62. –P. 3092–3099.
15. Ильина, А.П.,
Куликова, О.Г.,
Мальцев, Д.И., Краснов, М.С., Рыбакова, Е.Ю., Скрипникова, В.С., Кузнецова, Е.С., Буряк, А.К., Ямскова, В.П., Ямсков, И.А. Идентификация новых
пептидов из межклеточного пространства
методом MALDI-TOF масс-спектрометрии
// Прикладная биохимия и микробиология. –
2011. – Т. 47, № 2. – С. 135–140.
16.Yamskova, V.P., Rybakova, E.Yu., Vecherkin, V.V., Berezin, B.B., Filatova, A.G., Blagodatskikh, I.V., Yamskov, I.A. Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display
biological activity at ultra low doses: 1. Isolation,
purification and physicochemical properties / Ed.
by Varfolomeev S.D. [et al.] // Biochemical Physics Frontal Research. – Hauppauge NY: Nova Science Publishers Inc., 2007. – P. 61–70.
17.Ямсков, И.А., Ямскова, В.П., Даниленко, А.Н., Клеменкова, З.С., Антипов, Б.Г.,
Черников, Ф.Р., Гусынина, М.М., Рыбакова, Е.Ю. Экспериментальные доказательства
роли физико-химических факторов в
механизме биологического действия сверхмалых доз // Российский химический журнал
(ЖРХО им. Д.И. Менделеева). – 1999. – Т. 43,
№ 5. – С. 34–39.
18. Ямскова, В.П., Ямсков, И.А. Механизм
биологического действия физико-химических
факторов в сверхмалых дозах // Российский
химический журнал ЖРХО им. Д.И. Менделеева.
1999. – Т. 43, № 2. – С. 74–79.
19.Колокольчикова, Е.Г.
Жиркова, Е.А.,
Головатенко-Абрамов, П.К., Платонов, Е.С.,
Бочарова, В.С., Хватов, В.Б. // Клеточные
технологии в биологии и медицине. – 2010. –
№ 1. – С. 47–54.
Дата поступления статьи 17 сентября 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 575.174.015.3:598.2:591.69
*Е.Э. Хейдорова1, *Г.Г. Хрисанфова2, Е.И. Бычкова1, С.К. Семенова2, М.Е. Никифоров1
ПОЛИМОРФИЗМ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНА COX1
В ПОПУЛЯЦИИ МАРИТ ТРЕМАТОД BILHARZIELLA POLONICA
(СЕМ. SCHISTOSOMATIDAE), ПАРАЗИТИРУЮЩИХ У ВОДОПЛАВАЮЩИХ
ПТИЦ НА ОЗЕРЕ НАРОЧЬ
ГНПО «Научно-практический центр НАН Беларуси по биоресурсам»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
2
Институт биологии гена Российской академии наук
Россия, 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5
*– оба автора внесли равный вклад в данное исследование
1
Введение
Полиморфизм митохондриальной ДНК широко используется в филогенетических исследованиях животных различных таксономических групп. В отличие от ядерной ДНК,
митохондриальные гены (мт гены) наследуются по материнской линии и обладают более
быстрыми темпами эволюции, что приводит
к накоплению различий между популяциями
одного вида и даже между близкородственными видами [1, 2, 3], которые были разделены
лишь в течение короткого промежутка времени [4]. Именно на этих особенностях мт генов
базируется филогеография, основной задачей
которой является выявление генеалогических
групп или линий и исследование их географического распространения [5, 6]. Наиболее
популярными молекулярными маркерами для
данных исследований являются последовательности генов цитохрома b (сyt b) и одной из
субъединиц цитохромоксидазного комплекса –
сох1. Оба эти гена предложено использовать в
международной программе по идентификации
всех видов растений и животных “Barcoding
of life” [7].
Данная работа посвящена молекулярногенетическому анализу внутрипопуляционной
структуры взрослых особей (марит) одного из
наименее изученных видов кровяных сосальщиков – птичьей шистосомы Bilharziella polonica – озера Нарочь, впервые проводимому
на основе полиморфизма митохондриального
гена сох1 (COI).
Род Bilharziella, относящийся к семейству
Schistosomatidae (класс Trematoda), является
монотипическим с единственным представителем – видом Bilharziella polonica (KoМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
walewsky, 1895) Looss, 1899. Показано, что для
отдельных популяций этого вида характерна
морфологическая и генетическая неоднородность. Так, в отдельных европейских популяциях отмечалась высокая морфологическая сезонная изменчивость в размерах и пропорциях
тела паразита, форме и вооруженности присосок, структуре полового аппарата и др. [8],
которая может быть связана с изменением
гормонального фона у дефинитивных хозяев
[9–11], временем инфекции, зрелостью и возрастом самих гельминтов, а также с размерами
их хозяев [8]. Кроме того, выявлена генетическая неоднородность церкариальных изолятов
B. polonica из нескольких водоемов Беларуси,
заключающаяся в наличии двух гаплотипических линий по гену сох1 [12].
Патогенный статус данного вида также вызывает споры. Фуркоцеркарии бильхарциелл
описаны как возбудители церкариальных дерматитов в Германии [13], Чехии [14], России
[15] и Беларуси [16]. Петр Хорак и Любуше
Коляржова [17] наблюдали проникновение
церкарий этого вида в кожу хвоста и конечностей мышей, причем шистосомулы не погибали и мигрировали в легкие экспериментальных животных. С другой стороны, участие
B. polonica в функционировании очагов церкариальных дерматитов в Польше не было подтверждено [18].
Таким образом, данный вид является недостаточно изученным по многим важным биологическим аспектам, выяснение которых может способствовать оптимизации конкретных
мер по борьбе с очагами бильхарциоллеза и
церкариоза.
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
25
Материалы и методы
Взрослые особи (мариты) B. polonica
(n = 36 экз.) были собраны в 2007–2009 гг. от
11 водоплавающих птиц 3 видов, гнездящихся
на озере Нарочь. 22 мариты B. polonica получены от 6 особей кряквы (Anas platyrhynchos),
6 марит – из 2 особей хохлатой чернети (Aythya
fuligula) и 8 марит – от 3 особей большой поганки (Podiceps cristatus). Марит фиксировали
в 96% этаноле и хранили при +4 ºС.
Амплификацию митохондриального гена cox1
проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 62 мМ Трис-HCl; 15,4 мМ (NH4)2SO4;
0,01% Tween-20; 5 мМ MgCl2; 0,36 мМ каждого dNTP; по 0,6 pmol предложенных А. Локер
с соавторами [19] праймеров Cox1_schist_5ab
(5'-TCTTTRGATCATAAGCG-3' (R- G/A)) и Cox1_
schist_3ab (5'-TAATGCATMGGAAAAAAACA-3'
(M- A/C)); 0,6 единиц Taq-полимеразы (“Dialat”,
Москва) и 10–100 нг ДНК. Условия проведения
ПЦР представлены в табл. 1.
Таблица 1
Температурный и временной режимы проведения ПЦР
Название этапа ПЦР
Предварительная денатурация
Денатурация
Отжиг
Элонгация
Достройка цепей
Температура (°С), количество циклов
94
94
52
40 циклов
72
72
Амплифицированные фрагменты ДНК
элюировали из геля с использованием набора
реагентов Illustra GFX PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (GE Healthcare, USA). Секвенирование ДНК осуществляли с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDyeTM Terminator
v.3.1 и последующим анализом на Автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100-Avant
Genetic Analyzer в Межинститутском Центре
коллективного пользования «ГЕНОМ» Института молекулярной биологии РАН (г. Москва).
Выравнивание нуклеотидных последовательностей, определение нуклеотидного и
аминокислотного состава, оценка нуклеотид-
Время
2 мин
30 с
30 с
2 мин
7 мин
ного (π) и гаплотипического (h) разнообразия,
D- и Z- тесты на нейтральность нуклеотидных
замен и определение возможного времени дивергенции, а также реконструкцию филогенетических деревьев методом максимального
правдоподобия (ML) осуществляли с помощью
пакета программ MEGA ver. 5.05 [20]. Для построения парсимониальной сети использовали
программу TCN 1.21 [21]. Для сравнительного
анализа привлечены депонированные в GenBank последовательности coх1 одной мариты
B. polonica (AY157186) из Украины, а также
Trichobilharzia regenti (HM439504.1), T. szidati
(JF838202.1).
Результаты и обсуждение
Длина исследованного фрагмента coх1 для
всех 36 марит B. polonica составила 1125 п.н.
(375 аминокислот). В нуклеотидных последовательностях не обнаружено инсерций, делеций и стоп-кодонов, что свидетельствует об
отсутствии среди изученных образцов ДНК
ядерных копий coх1.
В нуклеотидном составе данного гена показано значительное преобладание АТ-оснований, соотношение АТ/GС-пар составило
68,9/31,1%. Нуклеотидная последовательность coх1 содержит 32 полиморфных сай-
та, что составляет 2,84% от общей длины анализируемого фрагмента. Из них
только девять (0,8%) являются парсимониально информативными. На изученном ареале среди 36 марит обнаружено 19 гаплотипов
(табл. 2).
В полученных нуклеотидных последовательностях наиболее часто наблюдаются транзиции пуриновых оснований (А→G – 41,57%;
G→A – 45,3%). Значительно реже отмечаются пиримидин-пиримидиновые замещения
(Т→С – 0,13%; С→Т – 0,59%).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
81
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
225
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
229
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
237
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
312
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
321
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
339*
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
.
366
A
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
387*
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
A
A
A
A
A
A
492
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
A
A
A
A
A
A
495
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
.
516
T
.
.
.
.
.
.
С
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
567*
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
603
A
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
681
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
G
G
G
G
G
G
С
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
.
682
A
.
.
.
.
.
.
.
.
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
Примечание:
1. Жирным шрифтом выделены парсимониально информативные сайты;
2. Звездочкой отмечены сайты, мутации по которым вызваны трансверсиями;
3. Затемнением выделены сайты, мутации в которых привели к несинонимичным заменам;
4. В скобках после названия гаплотипа указано число особей с этим гаплотипом.
G1 (9)
G2 (3)
G3 (2)
G4 (1)
G5 (1)
G6 (1)
G7 (1)
G8 (1)
G9 (1)
G10 (3)
G11 (1)
G12 (1)
G13 (4)
G14 (1)
G15 (1)
G16 (2)
G17 (1)
G18 (1)
G19 (1)
∑=19
Гаплотип
684
СОХ1
702
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
С
.
717*
G
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
726
T
.
.
.
С
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
738
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
G
.
.
G
.
.
784
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
А
.
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
.
.
G
G
G
G
G
G
G
.
G
G
819
Полиморфизм гаплотипов cox1 среди марит B. рolonica озера Нарочь
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
С
.
.
.
.
.
.
.
.
849*
876
С
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
885
С
.
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
899
G
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
906*
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
.
A
.
945
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
Таблица 2
963
G
.
A
.
.
.
.
.
.
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
1053
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
A
1101
A
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
G
.
.
26
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
Частоты трансверсий не превышают 3%
(А/G→Т – 2,85%; А/G→С – 0,62%; Т/С→А –
1,43%; Т/С→G – 1,31%). Общее соотношение
транзиции/трансверсии составляет 6,3. На
нейтральность обнаруженных замен в последовательностях cox1 указывают результаты
сравнения средних значений числа нуклеотидных различий (D = -1,368) и отношения
синонимичных и несинонимичных замен
(Z < 0,05) при попарном сравнении последовательностей.
В большинстве случаев нуклеотидные замены вызваны транзициями в третьем положении кодонов и являются синонимичными.
Однако транзиции G→A в положениях 229
(G19), 784 (G12), 899 (G2) и трансверсия G→Т
в сайте 339 (G12) приводят к несинонимичным заменам. Так, замена гуанина на аденин
в первом положении кодона в гаплотипе G19
(марита Рс8) привела к замещению валина
метионином в 77 положении аминокислотной
последовательности. Результатом транзиции
во втором положении кодона, ответственного
за аргинин, в гаплотипе G2 (3 мариты – Ар4а,
Ар4b, Ар4c) было появление аминокислоты
гистидина в 300 положении. Следует особо отметить, что в нуклеотидной последовательности гаплотипа G12 (марита Рс1d) произошли
сразу 2 несинонимичные замены. Трансверсия
в третьем положении кодона (339 сайт) и транзиция в первом положении (784 сайт) привели
к замене лейцина на фениналанин и валина на
изолейцин в положениях 113 и 262 полипептидной последовательности, соответственно.
Наиболее часто в популяции водоплавающих птиц оз. Нарочь встречается гаплотип G1
(25,0%), идентичный известной последовательности AY157186 из Украины, а также три
гаплотипа: G13 (11,11%), G2 и G10 (по 8,33%).
Частота встречаемости остальных 15 гаплотипов не превышает 3%.
Следует отметить, что большинство гаплотипов B. рolonica обладали приуроченностью
к определенному виду водоплавающих птиц.
Так, пять гаплотипов G9, G12, G17, G18, G19
отмечены только у большой поганки; десять
других гаплотипов G2-G5, G7, G8, G11, G14–
G16 – только у кряквы; и один гаплотип G6 –
только у хохлатой чернети. При этом, только
два гаплотипа – G1 и G13 – были представлены у всех трех обследованных видов птиц,
27
а один гаплотип – G10 – найден и у кряквы,
и у хохлатой чернети. Возможно, такая не до
конца выраженная гостальная специфичность
связана с географической разобщенностью
популяций специфических хозяев трематод
B. polonica – моллюсков Planorbarius corneus
и Planorbis planorbis.
Изоляция промежуточных хозяев обуславливает микроэволюционные процессы, происходящие в популяциях трематод. Можно предположить, что на географически удаленных друг
от друга водоемах, посещаемых разными видами птиц, в популяциях местных моллюсков возникают и поддерживаются специфические географические расы церкарий B. polonica. Связь
между изолированными популяциями моллюсков на отдельных водоемах поддерживается
благодаря определенным видам птиц, которые в
силу выраженности хоминга мигрируют между
«родными» водоемами, объединяя их в единый ареал распространения марит B. polonica
с характерными только для этих мест гаплотипами cox1. Для более определенных заключений по вопросам генетической дифференциации и микроэволюции птичьих шистосоматид
B. polonica полученные нами результаты требуют дальнейшего подтверждения. Во-первых, на
более объемных выборках марит из бόльшего
числа видов птиц. Во-вторых, необходимо провести специальные исследования различных
популяций моллюсков на территории Беларуси
и сопредельных стран из водоемов, расположенных по направлению основных пролетных
путей водоплавающих птиц, с целью выяснения
характера изменения соотношения различных
гаплотипов cox1. Распределение гаплотипов
в выборке марит B. рolonica, обнаруженных у
трех видов водоплавающих птиц, представлено в табл. 3.
В суммарной выборке марит B. polonica, выделенных из крякв (A. platyrhynchos), обнаружено 13 гаплотипов, и средняя величина гаплотипического разнообразия достигает 72,2%.
Наибольшую представленность в инфрапопуляциях (группы особей паразита одного вида,
обитающих в организме одной особи хозяина)
марит у данного вида птиц имеют гаплотипы
G1 (22,7% от общей выборки; обнаружен у
5 марит из 4 особей кряквы), G2 (13,6%; у 3 марит из 1 ос.), G16 (9,1%; у 2 марит из 1 ос.), G3
и G13 (по 9,1%; по 2 мариты из 2 особей).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
28
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
Таблица 3
Распределение гаплотипов cox1 в выборке марит B. рolonica, собранных от трех видов
водоплавающих птиц (кряква, хохлатая чернеть, большая поганка) на озере Нарочь
Гаплотип
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
G13
G14
G15
G16
G17
G18
G19
Мариты паразитов
Ap1d, Ap1b, Ap2b, Ap3a, Ap5a
Af1a, Af1c
Pc1b, Pc2a
Ap4a, Ap4b, Ap4c
Ap1a, Ap3b
Ар2a
Ар6c
Аf1b
Ар2c
Ар6b
Рс1c
Ap5b
Af2b, Af2c
Ар3c
Рс1d
Ap1c, Ap4e
Af2a
Pc1a
Ар5c
Ар6a
Ap4d, Ap4f
Рс2b
Рс2c
Рс3
Вид хозяина
Кряква 1, 2, 3, 5
Хохлатая чернеть 1
Большая поганка 1, 2
Кряква 4
Кряква 1, 3
Кряква 2
Кряква 6
Хохлатая чернеть 1
Кряква 2
Кряква 6
Большая поганка 1
Кряква 5
Хохлатая чернеть 2
Кряква 3
Большая поганка 1
Кряква 1,4
Хохлатая чернеть 2
Большая поганка 1
Кряква 5
Кряква 6
Кряква 4
Большая поганка 2
Большая поганка 2
Большая поганка 3
Представленность
Мариты, экз.
%
9
25,0
3
2
1
1
1
1
1
1
8,33
5,56
2,78
2,78
2,78
2,78
2,78
2,78
3
8,33
1
1
2,78
2,78
4
11,11
1
1
2
1
1
1
2,78
2,78
5,56
2,78
2,78
2,78
Ap – кряква Anas platyrhynchos, Af – хохлатая чернеть Aythya fuligula, Pc – большая поганка Podiceps cristatus
Остальные 8 гаплотипов (G4, G5, G7, G8,
G10, G11, G14 и G15 – по 4,5%) лишь единожды
регистрировались в инфрапопуляциях марит у
птиц данного вида. Как видно из табл. 3, мариты, полученные нами от каждой кряквы, имели
разные гаплотипы, т.е. инфрапопуляции марит
оказались гетерогенными. В нуклеотидных последовательностях cox1 у марит B. polonica из
крякв, обнаружено 18 полиморфных сайтов, что
составляет 1,6% от общей длины исследованного локуса, а нуклеотидное разнообразие π в
данной выборке достигает 0,38%.
Из двух хохлатых чернетей (A. fuligula) было
выделено 6 марит, причем обе инфрапопуляции также были гетерогенными. У паразитов
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
одной из чернетей обнаружены два гаплотипа – G1 (33,3% от общей выборки; 2 мариты)
и G6 (16,7%; 1 марита), в другой – два других
гапотипа G10 (33,3%; 2 мариты) и G13 (16,7%;
1 марита). Указанные гаплотипы отличаются
между собой по восьми полиморфным сайтам,
что составляет среднее нуклеотидное и гаплотипическое разнообразие в данной выборке
0,31 и 66,7%, соответственно.
Из трех больших поганок (P. cristatus) было
выделено 8 марит. В суммарной выборке обнаружено 7 гаплотипов (G1 – 25% от общей
выборки, 2 мариты из 2 особей; G9, G12, G13,
G17-G19 – по 12,5%, по 1 марите), т.е. практически каждая взрослая особь B. polonica име-
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
ла свой индивидуальный гаплотип, что нашло
выражение в высоком значении гаплотипического разнообразия (87,5%). Нуклеотидное
разнообразие, также как и в выборках марит
из других видов птиц, невысокое – 0,64%, однако в выборке паразитов из больших поганок
обнаружено наибольшее число полиморфных
сайтов (21).
29
Суммарная выборка паразитов из 11 птиц,
относящихся к 3 видам, содержит 36 марит
B. рolonica, представляющих 19 гаплотипов,
для которых характерно невысокое среднее нуклеотидное разнообразие (π = 0,4%), а средняя
величина гаплотипического разнообразия для
последовательностей cox1 достигает 52,78%
(табл. 4).
Таблица 4
Полиморфизм cox1 в выборках марит B. polonica, паразитирующих у водоплавающих
птиц разных видов на озере Нарочь
Вид
птицы
Кряква
(Ар)
Хохлатая
чернеть
(Аf)
Большая
поганка
(Рс)
Общая
выборка
N
22
AT/
GC
68,9/
31,1
V
Pi, %
R
π, %
h, %
Ns
Nn
D
18
9
(0,8)
14,8
0,38
72,2
17
1
-0,53
8
3
(0,3)
4,23
0,31
66,7
8
0
-0,06
4,54
0,64
87,5
18
3
-0,55
6,30
0,40
52,8
28
4
-1,368
6
69,0/
31,0
8
68,9/
31,1
21
7
(0,6)
36
68,9/
31,1
32
9
(0,8)
Z
<0,05
N – число последовательностей; AT/GC – соотношение AT и GC-оснований; V – число вариабельных сайтов;
Pi (%) – число парсимониально информативных сайтов; R – отношение числа транзиций/трансверсий; π – среднее
нуклеотидное разнообразие; h – среднее гаплотипическое разнообразие; Ns – число синонимичных замен и Nn –
число несинонимичных замен; D, Z – значение D и Z- статистик
Дендрограмма генетических различий
(рис. 1), построенная с помощью метода максимального правдоподобия (ML) с использованием модели Тамуры-Неи, указывает на
надежное разделение всех рассматриваемых
нами гаплотипов на две линии – А и В.
Линия А имеет в своем составе две достаточно обособленные подгруппы (ИБ = 56%).
Подгруппа А1 включает 9 гаплотипов (G1–
G9) и состоит из 20 последовательностей, 18
из которых надежно кластеризуются вместе с
последовательностью AY157186 из Украины.
В подгруппу А2, которую можно рассматривать как промежуточную между линиями А и
В, входят 5 последовательностей (Ap3c, Ap5b,
Af2b, Af2c, Pc1d), относящиеся к трем гаплотипам – G10, G11, G12. Таким образом, линия
А состоит из 25 последовательностей и представлена 12 гаплотипами (G1–G12). Входящие
в нее последовательности получены от марит
B. polonica из 6 крякв, 2 хохлатых чернетей и
2 больших поганок.
Линию В (ИБ = 80%) образуют 7 гаплоти-
пов (G13–G19). Она включает 11 последовательностей, шесть из которых принадлежат
маритам B. polonica, полученным из четырех
крякв, четыре – из трех больших поганок и
одна – из хохлатой чернети. Линия В подразделяется на 4 подгруппы (В1–В4), две из
которых представлены уникальными гаплотипами (G15 и G19, мариты Ap6а и Pc3 соответственно), а две другие (ИБ > 60%) состоят из 3 и 5 последовательностей (Ар4d, Ap4f,
Pc2c и Ap1c, Ap5c, Ap4e, Af2a, Pc1a, Pc2b)
и представлены 5 гаплотипами (G16, G18 и
G13, G14, G17).
Наличие в популяции марит B. polonica
озера Нарочь двух гаплотипических линий
гена cox1 с разветвленной подструктурой,
отражающей промежуточное положение подгруппы А2 (G10–G12), более наглядно подтверждается при использовании для филогенетической реконструкции парсимониальной
сети (рис. 2).
Согласно этим построениям, наибольшая
частота встречаемости характерна для гаплоМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
30
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
Ap6b (G8)
Pc2a (G1)
Pc1с (G9)
Af1b (G6)
Ap6c (G5)
Ap2c (G7)
Ap4a (G2)
64
Ap4b (G2)
Ap4c (G2)
Ap2a (G4)
Ap1d (G1)
Ap2b (G1)
A1
Ap1b (G1)
AY 157186
100
A
Ap3a (G1)
Ap5a (G1)
Af1a (G1)
Af1c (G1)
Pc1b (G1)
Ap1a (G3)
Ap3b (G3)
Pc1c (G12)
Ap3c (G11)
Af2c (G10)
Ap5b (G10)
A2
Af2b (G10)
Pc3 (G19)
Ap6a (G15)
80
Ap4f (G16)
Pc2c (G18)
Ap4d (G16)
Pc2b (G17)
Ap5с (G14)
Pc1a (G13)
64 Ap1c (G13)
Ap4e (G13)
}
}
B1
B2
B3
B
B4
Af2a (G13)
Trichobilharzia regenti (HM439504.1)
Trichobilharzia szidati (JF838202.1)
0.02
Рис. 1. Дендрограмма генетических различий между маритами B. polonica, построенная на основании полиморфизма нуклеотидных последовательностей гена cox1 (ML, модель Тамуры-Неи). В узлах ветвления обозначены только ИБ > 50%. Обозначения окончательных хозяев-птиц: кряква (Ap), хохлатая чернеть (Af)
и большая поганка (Pc).
типа G1, идентичного последовательности
AY157186 из Украины. Он обнаружен у 9 из
36 половозрелых шистосом, паразитирующих
в птицах всех обследованных нами видов. Все
остальные гаплотипы либо уникальны, либо
идентичны для 2–4 марит (табл. 2). Значения
генетических дистанций между последовательностями cox1, входящими в состав линий
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
А и В, варьируют от 0,001 до 0,011, составляя
в среднем 0,004 ± 0,001. При этом отмечается
низкое значение среднего уровня аминокислотной дивергенции (0,001).
Таким образом, среди обнаруженных гаплотипов можно выделить, по крайней мере, две
четко дивергировавшие линии – А и В, расхождение между которыми (d = 0,4%) уже
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
31
G8
G7
G6
G5
G9
G1
G4
G2
G3
G12
G10
G11
G15
G16
G13
G17
G19
G14
G18
Рис. 2. Парсимониальная сеть, построенная на основании полиморфизма гена cox1 марит B.polonica от трех видов водоплавающих птиц озера Нарочь. Размеры овалов соответствуют представленности гаплотипов в выборке
привело к незначительной аминокислотной
дивергенции (0,1%). Разнообразие гаплотипов выше в линии А (12 гаплотипов), чем в
линии В (7 гаплотипов). Представленность
линии А среди марит B. polonica составляет
69,44%, линии В – 30,56%. Несмотря на то,
что некоторые гаплотипы были получены от
марит только из одного вида птиц и не встречались у других видов, гостальной специфичности в распределении гаплотипических линий обнаружено не было. Обе линии марит
в различном соотношении были зарегистри-
рованы у птиц всех обследованных видов.
Бильхарциеллы линии А обнаружены у всех
крякв и хохлатых чернетей и у 66,7% больших поганок (у 2 из 3-х особей). Гаплотипы
линии В зарегистрированы у всех больших
поганок. Частота встречаемости гаплотипов
данной линии у крякв составила 66,7%, а у
хохлатых чернетей – 50,0%. Смешанные инвазии одной особи хозяина бильхарциеллами обеих линий отмечены у 66,7% крякв, и
больших поганок, и у 50% хохлатых чернетей. Следует отметить, что «звездообразная
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
32
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
структура» в линии А выражена более заметно по сравнению с линией В, что свидетельствует о значительном и быстром возрастании
генетического разнообразия («экспансия»
А-последовательностей).
Генетическая внутривидовая дифференциация трематод Bilharziella polonica могла
возникнуть в результате действия изоляционных механизмов. Как уже отмечалось выше,
уровень дивергенции между последовательностями из двух групп достигает 0,4%. Исходя из результатов исследований в области
молекулярной филогенетики, приведших к
обоснованию идеи молекулярных часов [22,
23], дивергенция наиболее быстро мутирующих участков митохондриальной ДНК
происходит у разных видов животных со
средней скоростью 1,4–2,6% за миллион лет
[24]. В таком случае время образования двух
линий гаплотипов B. polonica предположительно составляет 285–150 тыс. лет назад, что
достаточно уверенно позволяет отнести его
ко времени Днепровского, или Рисского оледенения (250–135 тысяч лет назад) в позднем
плейстоцене [25, 26]. В эти времена немногочисленные остатки прежней европейской фауны могли сохраниться лишь в изолированных друг от друга рефугиумах на территории
Северо-Западной (или Северной) Африки,
Малой Азии и Ближнего Востока, а также юге
Среднерусской возвышенности. Таким образом, ледник мог сыграть роль изоляционного
механизма, препятствующего генетическому
обмену внутри и между популяциями водоплавающих птиц, что на какой-то период разобщило и популяции специфичных к ним паразитов – бильхарциелл. Вполне очевидно, что
длительная изоляция в отдельных рефугиумах
должна была отразиться и на генетическом
разнообразии самих хозяев.
Попытка связать образование гаплотипических линий с внутривидовой дивергенцией
окончательных хозяев была сделана нами на
основе данных литературы по основному носителю шистосоматидной инвазии – крякве.
Филогеографическая структура данного вида
исследована довольно подробно и позволяет
детализировать процессы радиации утиных
птиц [27, 28]. В этом отношении особый интерес представляют исследования Куликовой
с соавторами [29]. На основе анализа полиМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
морфизма ядерного (шестой субъединицы
орнитиндекарбоксилазы, ООС-6, 255 п.н.) и
митохондриального (контрольный регион,
667 п.н.) локусов у крякв из Азии, Америки
и северной части Евразии были обнаружены
две группы гаплотипов мтДНК. Они соответствовали двум классам гаплотипов мтДНК,
А и В, обнаруженных ранее Эвайсом с соавторами исключительно на основании ПДРФ
митохондриальной ДНК. Однако выявленная
внутривидовая генетическая дифференциация, произошедшая в регионе Берингии, не
затронула европейскую и основную азиатскую
части популяции кряквы. Вследствие этого,
группировки с наличием гаплотипов обеих
групп в том или ином соотношении отмечены
только во внутренней Аляске, на Алеутских и
других островах региона, а также в Приморье.
Ввиду генетической однородности в евроазиатской части ареала популяции кряквы, у нас
нет пока объективных оснований связывать
наличие двух гаплотипических линий у шистосом B. polonica в северной части Беларуси
с филогеографией данного вида водоплавающих птиц. Очевидно, что для дальнейшего
анализа необходимы более многочисленные
выборки инфицированных птиц из разных
частей Евразии.
Вместе с тем, учитывая, что вид B. polonica является полигостальным и, как показали
наши исследования, строгой специфичности
и приуроченности к определенным видам
птиц в распределении линий гаплотипов сох
1 не существует, то теоретически любой вид
дефинитивного хозяина потенциально мог
иметь отношение к эволюции данного паразита. А это широкий спектр видов водоплавающих птиц, причем относящихся к разным семействам и даже отрядам. Согласно
литературным данным, территорию Европы
многие виды Anatidae населяли еще в доплейстоценовую эпоху. По крайней мере, субфоссильные остатки таких видов, как Anser
anser, Anas strepera, Anas querquedula, Anas
clypeata, Aythya ferina известны для Западной
и Центральной Европы для периода, относимого к эоплейстоцену – порядка 800 тыс. лет
назад [30]. Несмотря на то, что есть много
свидетельств существования определенной
изоляции друг от друга популяций многих
видов птиц в восточном и западном секторах
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
европейского юга в период оледенения, практически все рецентные виды водоплавающих
птиц, как более холодоустойчивые, не имели
жесткой изоляции и обитали практически на
всем протяжении от Атлантики до Черного
и Каспийского морей. Иными словами, для
Anatidae, являющихся основными хозяевами
B. polonica, внутривидовая таксономическая
и генетическая дифференциация в Западной
Палеарктике, которая могла бы быть вызвана
изолирующим действием плейстоценовых
ледников, не прослеживается [31].
Таким образом, причины дифференциации паразита логичнее искать в возможных
территориально-географических различиях
ареалов разных видов-хозяев. То есть в период
оледенений географически разделены и изолированы были не популяции кого-то одного из
видов-хозяев, а ареалы разных видов утиных
(или других отрядов водоплавающих), которые в настоящее время оказались опять расположены на одной территории либо более или
менее перекрываются. Для облегчения поиска
основного вида птиц, имеющего отношение к
произошедшей генетической дифференциации паразита, важно установить географические параметры, в пределах которых это могло
произойти. При этом целесообразно рассмотреть как вектор запад-восток, так и вектор
север-юг, особенно в их сочетании, так как
юго-западное и северо-восточное направления соответствуют основным миграционным
векторам водоплавающих птиц Европы [32].
Изменение этих путей в прошлом также могло повлиять на внутривидовую дивергенцию
33
B. polonica. К тому же, в период оледенений
именно северные криофильные виды и более
теплолюбивые южные могли иметь изолированные друг от друга территории обитания.
Впоследствии умеренную зону Европы постепенно заселили и те и другие виды, что и привело к образованию простирающегося на все
Северное полушарие ареала вида B. polonica,
обладающего двумя линиями гаплотипов по
гену сох1.
Следует отметить, что эволюция паразитов могла проходить и вне условий изоляции
видов хозяев, а, наоборот, благодаря концентрированию в рефугиумах птиц и моллюсков
различных видов, ранее до этого не контактирующих друг с другом. Инвазия чужеродных
видов и вызванные ею перестройки в сложившихся плейстоценовых экосистемах могли
послужить толчком для освоения паразитами B. polonica или их предковыми формами
новых видов дефинитивных и промежуточных хозяев. В этом случае наличие в составе
современной популяции паразитов данного
вида двух гаплотипических линий является
следствием незаконченной сортировки предкового генного пула. Не исключено также, что
гибридизация между предковыми формами
B. polonica, специализировавшимися на паразитировании у птиц различных видов, ранее
разобщенных территориально по причине
различий в местах гнездования и миграционных путях, могла привести к появлению современной формы B. polonica, сохранившей
в своем генофонде гаплотипические линии
обоих предков.
Заключение
Таким образом, анализ полиморфизма митохондриального гена сох1 выявил генетическую
неоднородность внутрипопуляционной структуры B. polonica, паразитирующих у водоплавающих птиц на озере Нарочь. Для корректного и обоснованного объяснения дивергенции
гаплотипических линий гена сох1 у марит
B. polonica необходимо провести более масштабные филогеографические исследования
как самих паразитов, так и их дефинитивных
хозяев. Изучение различных аспектов коэволюции данных организмов имеет значение как
для понимания механизмов приспособления
птичьих шистосом к своим хозяевам, так и как
инструмент изучения миграционных путей водоплавающих птиц.
Авторы благодарят Т.В. Жукову за предоставление помещений и оборудования для проведения исследований в УНЦ «Нарочанская
биологическая станция им. Г.Г. Винберга».
Работа частично финансировалась грантами РФФИ (12-04-01153-а, 12-04-90034-Бел_а),
БРФФИ № Б10Р-176, ФЦП ГК № П1043,
Программой по молекулярной и клеточной
биологии.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
34
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
Список используемых источников
1. Brown, W.M. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA / W.M. Brown,
M.Jr. George, A.C. Wilson // Proceedings of the
National Academy of Sciences, USA. – 1979. –
Vol. 76. – P. 1967–1971.
2. Moore, W.S. Inferring phylogenies from
mtDNA variation: Mitochondrial-gene trees
versus nuclear-gene trees /W.S. Moore // Evolution. – 1995. – Vol. 49. – P. 718–726.
3. Mindell, D.P. Phylogenetic relationships
among and within select avian orders based on
mitochondrial DNA // D.P. Mindell [et al.] //
Avian moleculae evolution and systematic
(D.P. Mindell, editor). – New York: Academic
Press, 1997. – P. 214–247.
4. Avise, J.C. Intraspecific phylogeography:
The mitochondrial bridge between population genetics and systematic / J.C. Avise [et al.] // Annu
Rev Ecol Syst. – 1987. – Vol. 18. – P. 489–522.
5. Avise, J.C. Phylogeography: the History
and Formation of Species / J.C. Avise. – Harvard University Press, Cambridge, MA, USA,
2000. – P. 447.
6. Абрамсон, Н.И. Филогеография: итоги,
проблемы, перспективы / Н.И. Абрамсон //
Вестник ВОГиС. – 2007. – T. 11, № 2. –
С. 307–331.
7. Hebert, P.D.N. Biological identifications
through DNA barcodes / A. Cywinska, S.L. Ball,
J.R. de Waard // Proc.R.Soc. London Ser.B. –
2003. – Vol. 270. – P. 313–321.
8. Seasonal morphological variations in bird
schistosomes / C. Bayssade-Dufour [et al.] //
Parasite. – 2006. – Vol. 13. – P. 205–214.
9. Dorst, J. Les migrations des oiseaux /
J. Dorst // Payot. – Paris, 1956. – 419 p.
10.Stunkard, H.W. Induced gametogenesis
in a Monogenetic Trematode, Polystoma stellai
Vigueras, 1955 / H.W. Stunkard. // Journal of
Parasitology. – 1959. – Vol. 45. – P. 389–394.
11.Combes, C. Correlations entre les cycles
sexuels des Amphihiens Anoures et des Polystomatidae (Monogenea) / C. Combes // Comptes
Rendus de l’Academie des Sciences. – Paris,
1967. – Serie D, Vol. 264. – P. 1051–1052.
12.Хрисанфова, Г.Г. Полиморфизм гена
сох1 мтДНК церкариальных изолятов птичьих
шистосом Bilharziella polonica (Класс Trematoda, сем. Schistosomatidae) из водоемов
Беларуси / Г.Г. Хрисанфова, А.А. Лопаткин,
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
А.Г. Шестак, В.А. Мищенков, Т.В. Жукова,
Л.Н. Акимова, С.К, Семенова // Генетика. –
2011. – т. 47, № 5. – С. 684–690.
13.Szidat, L. Uber Haunnfektionen bei Blutrremato-den insbesondere bei Bilharziella polonica Kow. / L. Szidat // Archivfur Dermatologie
und Syphilis. – 1930. – Vol. 160. – P. 304–308.
14.Cercarial dermatitis in focus: schistosomes
in the Czech Republic / L. Kolarova [et al.] //
Helminthologia. – 1997. – Vol. 34. – P. 127–139.
15.Беэр, С.А. Церкариозы в урбанизированных системах / С.А. Беэр, М.В. Воронин. –
М.: Наука, 2007. – 240 с.
16.Бычкова, Е.И. Шистосомные церкариозы в Беларуси / Е.И. Бычкова // Ветеринарная
медицина Беларуси. – № 3. – 2003. – С. 23–24.
17.Horace, P. Survival of bird schistosomes
in mammalian lungs / P. Horace, L. Kolafova //
International Journal for Parasitology. – 2000. –
Vol. 30. – P. 65–68.
18.Zbikowska, E. Is there a potential danger
of ‘swimmer’s itch’ in Poland? / E. Zbikowska // Parasitology Research. – 2003. – Vol. 89. –
P. 59–62.
19.The phylogeny of the Schistosomatidae
based on three genes with emphasis on the interrelationships of Schistoioma Weinland, 1858
/ A.E. Lockyer [et al.] // Parasilology. – 2003. –
Vol. 26. – P. 203–224.
20.MEGA: A biologist-centric software for
evolutionary analysis of DNA and protein sequences / S. Kumar [et al.] // Briefings in bioinformatics. – 2008. – Vol 9, № 4. – Р. 299–306.
21.TCS: a computer program to estimate
gene genealogies / M. Clement, D. Posada,
K.A. Crandall // Molecular Ecology. – Vol. 9. –
2000. – P. 1657–1660.
22.Kimura, M., Ohta, T. Eukaryotes-prokaryotes divergence estimated by 5S ribosomal RNA
sequences / M. Kimura, T. Ohta // Nat. New.
Biol. – 1973. – Vol. 243. – P. 199–200.
23.Хедрик, Ф. Генетика популяций. – М.:
Техносфера, 2003. – 592 c.
24.Hewitt, G.M. Post-glacial re-colonization
of European biota / G.M. Hewitt // Biological Journal of the Linnean Society. – 1999. –
Vol. 68. – P. 87–112.
25.Гричук, В.П. История флоры и растительности Русской равнины в плейстоцене. –
М.: Наука, 1989. – 183 с.
Е.Э. Хейдорова и др. Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод...
26.Четвертичная система. – М.: Недра,
1984. – т. 2. – 556 с.
27.Avise, J.C. Mitochondrial gene trees and
the evolutionary relationship between mallard and black ducks / J.C. Avise, C.D. Ankney,
W.S. Nelson // Evolution. – 1990. – Vol. 44. –
Р. 1109–1119.
28.Jonson, K.P., Sorenson, M.D. Phylogeny and
biogeography of dabbling ducks (genus: Anas): a
comparison of molecular and morphological evidence // Auk. – 1999. – Vol. 116. – Р. 792–805.
29.Kulikova, I.V. Phylogeography of the
Mallard (Anas platyrhynchos): hybridization,
dispersal, and lineage sorting contribute to
35
complex geographic structure / I.V. Kulikova
[et al.] // The Auk. – 2005. – Vol. 122, Issue 3. –
P. 949–965.
30.Lambrecht, K. Handbuch der Palaeornithologie. – Berlin.: Borntraeger, 1933. – 1024 p.
31.Никифоров, М.Е. Формирование и структура орнитофауны Беларуси / М.Е. Никифоров. – Минск: «Белорусская наука»,
2008. – 297 с.
32.The Epidemiology of Plant Diseases
(B.M. Cooke, D.G. Jones, B. Kaye, etc.) /
ed. M.R. Finckh, M.S. Wolfe // Chapter 10. Diversification Strategies. – Springer. The Netherlands. – 2006. – P. 269–307.
Дата поступления статьи 26 сентября 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 631.524.86:633.11:632.3
Е.А. Волуевич
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В СЕЛЕКЦИИ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ
НА УСТОЙЧИВОСТЬ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ
(обзорная статья)
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Для предотвращения «генетической эрозии»
сельскохозяйственных растений в результате
катастрофического сужения их генетического
разнообразия предложены диверсификационные стратегии селекции современных сортов
на болезнеустойчивость. К этому привело понимание взаимодействий между растениемхозяином и популяциями патогенов.
Диверсификационные стратегии предполагают переход от монокультуры к разнообразию,
что обеспечивает более устойчивые формы
земледелия и дает ряд преимуществ по сравнению с монокультурой. На первичном уровне
следует диверсифицировать гены устойчивости
в монокультуре, на более сложном – создавать
системы, которые способны обеспечить многие
экологические преимущества одновременно,
например, контроль эрозии, сорняков, вредителей и болезней при сохранении или повышении
масштаба и эффективности производства [1].
Стратегии диверсификации необходимо рассматривать с точки зрения управления целым
рядом абиотических и биотических проблем,
стоящих перед производством продукции в определенной местности. Однако в настоящее время
в основном используется стратегия диверсификации только на первичном уровне. Она предполагает расширение генетического разнообразия
сортов сельскохозяйственной культуры по факторам устойчивости обычно к одному патогену.
В настоящей статье будет рассмотрена диверсификационная стратегия селекции мягкой пшеницы, основанная на генетическом разнообразии
сортов по генам устойчивости к бурой ржавчине.
Биологические особенности возбудителя бурой ржавчины пшеницы
и вредоносность
Возбудитель листовой (бурой) ржавчины
пшеницы _ биотрофный грибной патоген
Puccinia triticina Erikss. (синоним _ Puccinia
recondita f. sp. tritici Dietel & Holw). Симптомы поражения проявляются в основном на
листовой пластинке и влагалищах в виде беспорядочно разбросанных урединиопустул
бурого цвета, которые содержат урединиоспоры. Размножение преимущественно вегетативное урединиоспорами, которые переносятся ветром и дождем на зеленые участки
листьев и способны распространяться ветром
на большие расстояния [2]. Споры могут передвигаться на высоте до 3000 м в виде облака,
преодолевая большие расстояния. В течение
вегетационного периода выращивания пшеницы в условиях умеренного климата формируется до 10 урединиальных генераций гриба.
Подсчитано, что при поражении одного проМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
цента листовой поверхности бурой ржавчиной
число сформировавшихся урединиоспор на
1 га посевов в сутки составляет 1011, что может
приводить к ежедневному появлению 100 тыс.
мутантов или 1000 мутаций на локус. Патоген
перезимовывает даже в суровые зимы в виде
урединиоспор в урединиях на отмерших листьях [3], а также телиоспор на стерне. В некоторых районах он зимует в виде уредомицелия в узлах кущения озимой пшеницы. Таким
образом, жизненная стратегия этого патогена
базируется на быстром инфекционном цикле,
большой споруляционной способности и высокой эффективности инфекции.
Бурая ржавчина является одним из вредоносных и распространенных заболеваний
мягкой пшеницы в мире и в условиях Беларуси. Эта болезнь при сильном поражении посевов может снижать урожай зерна до 70% [4].
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
Регулярное поражение пшеницы бурой ржавчиной приводит к более высоким потерям
зерна, чем от стеблевой и желтой ржавчины
[5]. На пораженных растениях развиваются мелкие зерновки, в колосе снижается завязываемость семян, особенно в колосках у
верхушки и основания колосьев [6]. Резко
37
ухудшается и качество продукции, полученной с пораженных растений [5]. Выход муки
из зерна уменьшается на 40%, в клейковине
содержится меньше белков [7], обедняется
аминокислотный состав [8], снижается натура и стекловидность зерна, показатели седиментации и силы муки [9].
Научная основа стратегии селекции
Стратегия селекции мягкой пшеницы на
устойчивость к бурой ржавчине предполагает
использование главных генов устойчивости и
малых генов. Основное распространение получила стратегия использования известных
эффективных главных генов и их комбинаций
(пирамид). Пирамидирование («укладка генов») может применяться и при использовании
преодоленных главных генов. В этом случае
приемлемый уровень устойчивости достигается за счет остаточных эффектов на устойчивость, проявляемых каждым преодоленным
геном и их аддитивного действия. Затраты на
пирамидирование качественных генов устойчивости к болезням низкие [10]. Аккумуляция
в сорте многих малых генов устойчивости (полигенов), обусловливающих количественную
неспецифическую устойчивость, применяется реже. Создание сортов с такой устойчивостью – более сложный и длительный процесс.
Однако если вертикальная устойчивость сорта,
основанная на использовании главных генов,
сочетается с горизонтальной (нерасоспецифической) устойчивостью, то появление новой вирулентной расы патогена вряд ли будет
иметь катастрофические последствия в случае
преодоления генов вертикальной устойчивости. Кроме того, имеются наблюдения и о более продолжительной эффективности главных
генов, если они введены в сорт с неспецифической устойчивостью.
Для использования главных генов устойчивости в селекции, прежде всего, важно знать
их эффективность к популяциям патогенов,
распространенных на той территории, где будут возделываться создаваемые сорта. В связи
с этим большое значение приобретает мониторинг генов вирулентности, который должен
проводится для возбудителя бурой ржавчины
пшеницы не реже 1 раза в 3–4 года. Наблюдения за вирулентностью популяций позволяют
предсказывать уязвимость сорта к мутацион-
ному изменению патогена. Своевременное
выявление патотипов с вирулентностью к
используемым генам устойчивости является
основой для уменьшения площади посева под
сортами, несущими такие гены, и дает возможность быстро рекомендовать использование
фунгицидов.
Признание мутации, как главного источника
вариабельности возбудителя бурой ржавчины,
привело к развитию упреждающей селекции
[11]. Она основана на мониторинге вирулентности популяции патогена, который позволяет
предсказать эффективность генов устойчивости во времени, обеспечивая при этом необходимой информацией селекционеров. В связи
с этим гены устойчивости, применяемые в
коммерческих сортах, должны быть представлены в наборе дифференциаторов, используемых для определения патотипов возбудителя
болезни.
Установление путей миграции патогена с
целью определения ареалов сходных по вирулентности популяций также имеет большое значение. Так, на территории бывшего
СССР ранее было выделено пять изолированных популяций возбудителя бурой ржавчины
пшеницы: 1) европейская (Северный Кавказ,
Украина, Центрально-Черноземная зона); 2)
закавказская; 3) западно-сибирская (Урал, Западная Сибирь, Казахстан); 4) среднеазиатская
(горные районы средней Азии) и 5) дальневосточная (Хабаровский, Приморский край) [12].
Однако в дальнейшем по данным 20-летнего
исследования Михайловой Л.А. были выделены ареалы трех изолированных популяций
Puccinia triticina Erikss.: европейской, закавказской, азиатской (Зауралье, Северный Казахстан, Западная Сибирь) [13]. Проведенное недавно исследование изолятов Puccinia triticina
Erikss. по фенотипам вирулентности и RAPD
подтвердило, что изоляты из Северного Кавказа и Ленинградской области принадлежат к
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
38
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
обширной европейской популяции [14]. Территория Республики Беларусь также входит в
ареал европейской популяции гриба.
В связи с таким обширным ареалом распространения возбудителя необходимо создание
генетически разнородных сортов пшеницы,
которые в случае появления соответствующих генов вирулентности в популяции гриба,
не будут поражены одновременно. При этом
важнейшее значение для селекции имеет политика территориального размещения генов
устойчивости. Российскими учеными она уже
разработана. Так, с учетом заноса инфекции
из южных районов России в северном и восточном направлениях, селекцию в этих зонах
предложено вести с использованием различных генов [15]. Поволжский район занимает
промежуточное положение на пути распространения ржавчины в Западную Сибирь и Северный Казахстан. Генетическая основа сортов
в этом районе должна отличаться от сортов Европейской и Азиатской частей России, а также
Северного Казахстана [16]. Однако, как указывает Сурин Н.А., Поволжье и Башкирия до
сих пор продолжают оставаться ржавчинным
коридором, и отсутствует сортовой контроль
бурой ржавчины в основных очагах ее развития _ на Северном Кавказе и Украине [17].
Кроме больших пространственных мозаик
сортов с разными генами, возможно также создание мозаик генов во времени на территории
одного района. При этом озимым и яровым
сортам придают разную устойчивость. При
такой мозаике возникающая инфекция на озимых сортах не передается весной на яровые,
защищенные другими генами. А осенью, напротив, после уборки яровых, в случае развития на них вирулентных клонов, эти изоляты
не попадают на всходы озимых сортов, содержащих иные гены устойчивости.
Гены устойчивости и их эффективность
Эффективных к современной популяции
Puccinia triticina Erikss. генов устойчивости
немного. Сортообразцы мягкой пшеницы,
представленные в мировой коллекции ВНИИ
растениеводства им. Н.И. Вавилова, из эффективных проростковых генов устойчивости
содержат только Lr9, Lr19, Lr24, Lr41 (=Lr39)
[18]. По данным Гультяевой с сотрудниками,
среди районированных в России 100 озимых
и 131 яровых сортов пшеницы обнаружено
низкое генетическое разнообразие по эффективным Lr-генам: подавляющее большинство
устойчивых сортов имеют Lr9 и Lr19 [19].
Однако не было выявлено российских сортов
с высоко эффективными возрастным геном
Lr37 и проростковыми генами Lr21, Lr25,
Lr29, Lr39, что показывает их значимость для
дальнейшего использования в селекции [19].
Также ген Lr37 идентифицирован как наиболее эффективный из генов устойчивости, используемых в настоящее время в европейских
сортах пшеницы, хотя к нему и наблюдается
некоторая частота вирулентных изолятов в
зависимости от местонахождения популяции
гриба [20]. Проведенный мониторинг вирулентности белорусской популяции гриба показал неэффективность генов Lr25 Lr29, Lr39
[21], а в северо-западной российской популяции – гена Lr37 [22].
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
В ряде регионов России, в частности на
Северном Кавказе, эффективны гены устойчивости Lr9, Lr19, Lr24, Lr29, Lr42, а к генам
Lr52 (LrW) и Lr45 наблюдается низкая частота
встречаемости вирулентных изолятов (около
2–3%) [23]. Тем не менее, к северо-западной
российской популяции ген Lr52 не эффективен [22]. По последним данным изучения вирулентности популяции гриба на Северном
Кавказе для селекции в этом регионе предложены гены Lr9 и Lr24 [24]. В Нечерноземной
зоне России эффективны проростковые гены
Lr9, Lr24, Lr27 + Lr31, Lr28, Lr29, Lr45, Lr50,
Lr51 и возрастные Lr22a, Lr35, Lr37, Lr46 [25].
Высокоэффективным во всем мире является ген Lr9. Он включен в селекционные
программы многих стран, несмотря на то,
что присутствие чужеродной транслокации с
этим геном снижает урожайность [26, 27]. До
2007 года ген был эффективен во всех регионах России [28]. Широкое его использование
началось в Западной Сибири в 2008 г. [29].
Сейчас районированные сорта с этим геном
возделываются в ряде экономических районов России (Северо-Западном, Центральном,
Волго-Вятском, Уральском) и Западной Сибири. Однородность сортов по устойчивости на
такой большой территории недопустима, так
как создает угрозу для производства пшеницы
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
в будущем. Уже показано, что ген Lr9 начал
терять свою эффективность в Западной Сибири, на Урале и в США [18, 30, 31]. Анализ
структуры белорусской популяции патогена
показал, что в период с 1980 по 2009 гг. частота встречаемости изолятов с вирулентностью
к гену Lr9 не превышала 3% [32].
Ген Lr19 в России и странах СНГ сохранял
свою эффективность более 40 лет [28]. В связи с этим сорта с геном Lr19 получили массовое распространение в Поволжье, начиная с
конца 1990 – начала 2000 гг. [29]. Сейчас они
районированы преимущественно в Поволжских, Уральских районах России, Западной
и Восточной Сибири [19, 29]. В связи с широким возделыванием сортов с геном Lr19 на
этой территории, он утратил свою эффективность. Кроме того, изоляты с вирулентностью
к Lr19 ежегодно выявляются в ЦентральноЧерноземном, Центральном, Северо-Западном
регионах, что подтверждает недопустимость
возделывания генетически однородных сортов. В Беларуси также встречаются изоляты с
вирулентностью к этому гену с частотой не более 3% [32]. Однако показано, что комбинация
гена Lr19 с утратившим эффективность геном
Lr26 обеспечивает устойчивость [33]. Присутствие гена Lr19 повышает урожайность [34].
Изоляты с вирулентностью к гену Lr24
встречаются в популяциях, распространенных
в Северо-Западном [14], Центральном и Центрально – Черноземном регионах [25], Западной Сибири [29, 31]. В российских сортах ген
Lr24 не выявлен, поэтому считается, что наличие к нему вирулентных изолятов может быть
вызвано миграцией из европейских стран [29],
где они были обнаружены более 30 лет назад
[20]. В Республике Беларусь частота встречаемости генотипов гриба с геном вирулентности
к Lr24 за последние 30 лет увеличилась с до
2,4% (1980 г.) до 51% (2009 г.) [32].
По данным Коваленко с соавторами, в разных регионах России эффективны проростковые гены Lr24, Lr29, Lr38, Lr39, Lr42, Lr45,
Lr47, Lr51, Lr52(LrW), Lr53, LrTr и возрастной
ген Lr22а [28]. Ко всем патотипам во всех регионах возделывания пшеницы в России эффективны проростковые гены Lr24, Lr29, Lr38,
Lr39, Lr42, Lr45, Lr47 и возрастные Lr12, Lr13,
Lr35, Lr37, Lr22а [35]. Однако в Западной Сибири уже были выявлены вирулентные к Lr38
39
изоляты на сорте Чернява в 2010 г. [36]. Некоторые из этих генов могут быть сцеплены с
нежелательными признаками или оказывать
плейотропный эффект на хозяйственно ценные свойства. Так, например, ген Lr38 снижает урожай зерна [37, 38], ген Lr47 ухудшает качественные и агрономические признаки
[39]. В то же время многие интрогрессивные
гены устойчивости успешно использованы в
селекции [40].
Лапочкиной с соавторами создана коллекция пшеницы «Арсенал», которая включает
более 200 генотипов пшеницы с генетическим
материалом Aegilops speltoides, Ae. triuncialis,
Triticum kiharae, Secale cereale [41]. В интрогрессивных линиях выявлены комбинации
генов, которые гарантируют полевую устойчивость к бурой ржавчине (Lr1+Lr10+Lr21;
Lr10+Lr21+Lr35; Lr21+Lr12+Lr34) [42]. Комбинация проростковых генов Lr27+Lr31 и возрастных Lr12, Lr34, Lr35 обусловливает иммунитет и долговременную устойчивость. Были
отобраны также образцы с уникальными комбинациями 5–6 генов устойчивости: Lr1, Lr9,
Lr21, Lr12, Lr37 и Lr1, Lr9, Lr10, Lr21, Lr24,
Lr37; Lr24, Lr26+++. Такой материал может
быть использован для пирамидирования генов
в элитных сортах. Предлагается комбинирование проростковых генов с возрастными генами
и хорошо изученным геном медленного развития ржавчины Lr46. Особую ценность представляют полученные растения с комбинацией
генов Lr9+Lr46+Lr37 [41]. Сочетание 2–3 генов расоспецифической и возрастной устойчивости позволяет увеличить длительность
устойчивости. Так, в России высоким уровнем частичной устойчивости характеризуются образцы с генами Lr46, Lr44, Lr27+Lr31,
Lr25+Lr28, Lr10+Lr20, Lr26+Lr46, Lr9+Lr46,
Lr13+Lr34, Lr12+Lr37 и др. [28]. Однако на
территории Центрального, Волго-Вятского,
Западно-Сибирского регионов комбинация
генов Lr27+Lr31 и ген Lr39 неэффективны,
они восприимчивы к более чем 50% изолятов
возбудителя бурой ржавчины [43].
В условиях Беларуси из исследованных
проростковых генов более эффективны, как
уже отмечалось ранее, гены Lr9 и Lr19 [32].
Однако при создании новых сортов пшеницы
необходимо использовать другие эффективные гены, пока редко применяемые в сортах,
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
40
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
выращиваемых на европейской территории, в
частности, новые интрогрессивные гены, которые рекомендованы российскими учеными
для защиты сортов пшеницы от европейской
популяции гриба.
Наряду с проростковыми генами, экспрессирующимися на протяжении всего онтогенеза
растений, перспективно использование генов
возрастной устойчивости (APR – adult plant
resistance). Гены APR вызывают повышенный
интерес, так как они контролируют частичную, неполную устойчивость, которая обычно проявляется на флаговом и подфлаговом
листьях в виде медленного развития болезни.
Медленное развитие ржавчины (сдерживание
скорости развития болезни) является результатом более длинного латентного периода,
меньшего размера пустул и их более слабого
спороношения. В поле этот тип устойчивости
может быть оценен как снижение площади под
кривой нарастания болезни или более низкой
конечной степенью поражения в сравнении с
восприимчивым контролем [45–47]. Селекция
на медленное развитие ржавчины на взрослых
растениях и применение сортов, которые имеют достаточные уровни такой устойчивости,
является лучшей стратегией на устойчивость
к ржавчине [47]. Медленное развитие ржавчины – не обязательно стабильный признак и
не является диагностическим для длительной
устойчивости. Однако некоторые сорта с медленным развитием ржавчины обладают длительной устойчивостью, и они представляют
наиболее ценный материал для анализа генетической природы длительности и селекции
[48]. Так, например, в стратегии, где используется APR, чтобы разработать длительно устойчивые сорта, ценным генетическим ресурсом
для селекции является ген Lr67 [49]. На сортах
с медленным развитием ржавчины может наблюдаться расоспецифичность, в этих случаях устойчивость не будет длительной. Генами
APR к бурой ржавчине являются Lr12, Lr13,
Lr22a, Lr22b, Lr34, Lr46, Lr48, Lr49, Lr67,
Lr68 и др. [50, 51]. Такие гены используют в
селекции путем введения в местные адаптированные сорта.
Для достижения большего эффекта в одном
сорте необходимо сочетать несколько генов,
контролирующих медленное развитие ржавчины, так как обычно использования одного
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
гена недостаточно, чтобы существенно ограничить развитие болезни. В некоторых случаях гены этого типа устойчивости обусловливают высокий уровень устойчивости при их
комбинировании в одном генотипе, и иногда
это было описано почти как иммунитет [52,
53]. Желательно, чтобы гены медленного развития ржавчины обусловливали длительную
устойчивость. Так, сорта селекции CIMMYT
(Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz
y Trigo – Maize and Wheat Improvement Center,
Центр по улучшению кукурузы и пшеницы)
с возрастными генами Lr13 и Lr34, дополненные 2–3 генами с аддитивным эффектом,
сохраняли устойчивость к бурой ржавчине в
некоторых странах более 30 лет [54]. Известно, что приобретение патотипом возбудителя
болезни мутаций вирулентности к нескольким
генам устойчивости происходит не быстро
[55]. В образцах яровой пшеницы селекции
CIMMYT из присутствующих 10–12 генов
медленного развития бурой ржавчины хорошо охарактеризованы только два: Lr34 и Lr46
[56]. Ген Lr34 является одним из важных компонентов медленной или частичной устойчивости к бурой ржавчине пшеницы. Он был
назван «истинным геном частичной устойчивости» [57]. Ген медленного развития бурой
ржавчины Lr34 был клонирован [58], что дало
возможность лучше понять его генетическую
природу и разработать ДНК-маркеры [59].
Они позволяют использовать Lr34 в селекции
на длительную устойчивость в присутствии
главных проростковых генов, а также в условиях окружающей среды, неблагоприятных
для отбора по этому признаку. Этот ген весьма эффективен, если в одном генотипе пирамидируют 4 или более малых генов, что было
показано в CIMMYT. Около 55% европейских
сортов пшеницы имели возрастную устойчивость, обусловленную количественными генами (QTLs) и (или) Lr34 [60].
Однако в разных странах могут наблюдаться различия в поражаемости одних и тех
же генотипов пшеницы, что обусловлено не
идентичностью популяций патогена, а также
различной экспрессией генов устойчивости в
разных окружающих условиях. Известно, например, что ген Lr34 лучше экспрессируется
при более низких температурах [61]. По данным Плотниковой и Штубей, на юге Западной
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
Сибири ген Lr34 был мало эффективен при
температуре выше 20 °С, но снижал скорость
развития болезни при среднесуточной температуре ниже 16 °С [62]. К северо-западной популяции возбудителя бурой ржавчины России
ген Lr34 не обеспечивает достаточного уровня устойчивости [22], но при его сочетании с
возрастным, также индивидуально неэффективным геном Lr13, достигается хорошая защита, которая наблюдается у сортов Chris и
Cocoraque 75, несущих комбинацию двух этих
генов [22]. Исследование сорта озимой пшеницы Безостая 1, который длительное время
сохранял устойчивость к бурой ржавчине, показало, что он имеет комплекс проростковых и
возрастных генов: Lr3а, Lr10, Lr34 [63]; Lr25,
Lr28, Lr47 [65].
В настоящее время хорошо охарактеризованными генами медленного развития бурой
ржавчины являются Lr34, Lr46, Lr67 [65].
Плейотропное действие этих генов на другие
болезни увеличивает их значимость для селекции на устойчивость ко многим патогенам [66,
67]. Неспецифическая устойчивость, контролируемая этими генами, не связана с реакцией
сверхчувствительности и проявляется до внедрения гаусториев в клетки растения [49, 62,
41
68–70]. Возрастной ген сверхчувствительности Lr48 является рецессивным и обусловливает устойчивость ко всем местным патотипам
возбудителя бурой ржавчины в Индии [50].
Сейчас для основных районов возделывания
озимой пшеницы в России (Северного Кавказа, Центрального и Центрально-Черноземного
регионов) предлагается создавать сорта с возрастной устойчивостью, в том числе устойчивостью с медленным развитием болезни [35].
Это будет способствовать снижению уровня инфекции и уменьшению ее миграции на
яровую пшеницу в Поволжье. В Поволжском
регионе выращивается озимая и яровая пшеницы, поэтому сорта разных типов развития
предлагается защищать различающимися генами устойчивости. В Поволжье наиболее часто наблюдаются эпифитотии бурой ржавчины
(6 раз за период 2001–2008 гг.), поэтому и в
данный регион рекомендуется вводить сорта с
генами возрастной устойчивости [35, 71]. В Западной и Восточной Сибири, где превалирует
яровая пшеница, сорта можно защищать разными эффективными проростковыми генами.
В Беларуси наиболее перспективно создавать
сорта с сочетанием возрастной и проростковой
устойчивости.
Заключение
Использование известных главных генов
устойчивости, как возрастных, так и проростковых, к которым разработаны молекулярные
маркеры, облегчает их комбинирование в
одном сорте и представляет собой идеальную
генетическую устойчивость, которая снижает вероятность того, что весь комплекс генов
устойчивости, имеющийся у сорта, будет быстро преодолен независимыми мутациями
патогена. В связи с непрерывным расообра-
зовательным процессом в популяции патогена
необходим мониторинг генов вирулентности.
Скорость накопления новых вирулентных
изолятов к возделываемым сортам зависит от
занимаемой ими площади, поэтому для предотвращения быстрой потери устойчивости,
должно поддерживаться генетическое разнообразие возделываемых сортов пшеницы, и
площадь посева под каждым из них не должна
превышать 9–10% [12].
Список используемых источников
1. The Epidemiology of Plant Diseases
(B.M. Cooke, D.G. Jones, B. Kaye, etc.) /
ed. M.R. Finckh, M.S. Wolfe // Chapter 10. Diversification Strategies. – Springer. The Netherlands. – 2006. – P. 269–307.
2. McDonald, B.A. Pathogen population
genetics, evolutionary potential, and durable resistance / B.A. McDonald, C. Linde //
Ann. Rev. Phytopathol. – 2002. – Vol. 40. –
P. 349–379.
3. Winter and early spring survival of Puccinia recondita on Kansas wheat during 1980–
1986 / M.G. Eversmeyer [et al.] // Plant Disease. – 1988. – Vol. 72. – P. 1074–1076.
4. Дмитриев, А.П. Исследование внутрипопуляционных процессов у Puccinia recondita Rob.
exDesmf.sp.triticiErikss.игенофондаустойчивости
пшениц Закавказья к бурой ржавчине: автореф.
дис. ... канд. биол. наук: 03.00.15 / А.П. Дмитриев;
ВНИИР. – Л., 1975. – 26 с.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
42
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
5. Воронкова, А.А. Генетико-иммунологи
ческие основы селекции пшеницы на
устойчивость к ржавчине. – М.: Колос,
1980. – 191с.
6. Mains, E.B. Effect of leaf rust (Puccinia
triticina Erikss.) on yield of wheat / E.B. Mains
// J. Agr. Res. – 1930. – Vol. 40, № 5. –
P. 417–446.
7. Степанов, К.М. Ржавчина зерновых культур / К.М. Степанов. – Л.: Колос, 1975. – 75 с.
8. Берлянд-Кожевников, В.М. Селекция
пшеницы на устойчивость к основным грибным заболеваниям / В.М. Берлянд-Кожевников, М.А. Федин. – М.: ВНИИТЭИСХ,
ВАСХНИЛ, 1977. – 57 с.
9. Мочалова, Л. Вредоносность бурой
ржавчины пшеницы / Л. Мочалова // Сборник
научных трудов Мироновского НИИСХ. –
1978. – Вып. 2. – С. 136–141.
10.The powdery mildews. A comprehensive
treatise (Bélanger R.R., Bushnell W.R., Dik A.J.,
Carver T.L.W., etc.) / J.K.M. Brown // Comparative Genetics of Avirulence and Fungicide Resistance in the Powdery Mildew Fungi. APS Press,
St. Paul, M.N. – 2002. – P. 36–65.
11.Using race survey outputs to protect wheat
from rust / R.F. Park [et al.] // Proc. of Oral Papers
and Posters, Technical Workshop, BGRI, Cd. Obregon, Sonora, Mexico. – 2009. – P. 25–32.
12.Использование эффективных Lr-генов в
селекции пшеницы на устойчивость к бурой
ржавчине: методические рекомендации /
Г.К. Сорокина [и др.]; ВАСХНИЛ. – М.,
1990. – 32 с. .
13.Mikhailova, L.A The Puccinia recоndita
f.sp.tritici populations in Russia and neighbouring countries // L.A. Mikhailova // Abstracts
Adaptation in Plant Breeding XIV EUCARPIA
Congress. – Jyvaskyla, Finland. – 1995. – P. 47.
14.Вирулентность и ДНК-полиморфизм
изолятов Puccinia triticina из Северного
Кавказа и Ленинградской области /
О.А. Кудинова [и др.] // Научный журнал
КубГАУ. – 2010. – № 62 (08). – С. 1–13.
15.Михайлова, Л.А.
Закономерности
изменчивости
популяций
возбудителя
бурой ржавчины и генетический контроль
устойчивости пшеницы к болезни: автореф.
дис. ... доктора биол. наук: 06.01.11 /
Л.А. Михайлова; РАСХН, ВНИИЗР. – СПб,
1996. – 63 с.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
16.Одинцова, И.Г. Пути селекции на
устойчивость в связи с миграцией возбудителя
бурой ржавчины пшеницы / И.Г. Одинцова,
Л.Ф. Шеломова // Труды по прикладной
ботанике, генетике и селекции. – 1977. – Т. 58,
вып. 3. – С. 41–44.
17.Сурин, Н.А. Адаптивный потенциал
сортов зерновых культур сибирской селекции
и пути его совершенствования (пшеница,
ячмень, овес) / Н.А. Сурин // Селекция
на иммунитет к грибным заболеваниям. –
Новосибирск, 2011. – С. 90–120.
18.Тырышкин, Л.Г. К вопросу о возможности использования ДНК-маркеров для
постуляции генов устойчивости пшеницы
к листовой ржавчине // Л.Г. Тырышкин //
Проблемы защиты растений в условиях
современного
сельскохозяйственного
производства / Всерос. науч.-исслед. ин-т
защиты растений, СПб. – 2009. – С. 152–155.
19.Молекулярные подходы в идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у
российских сортов пшеницы / Е.И. Гультяева
[и др.] // Доклады Российской академии
сельскохозяйственных наук. – 2009. – № 5. –
С. 23–26.
20.European virulence survey for leaf rust in
wheat / A. Mesterhazy [et al.] // Agronomie. –
2000. – № 20. – P. 793–804.
21.Частота генов вирулентности в
белорусских популяциях Puccinia triticina Erikss. / А.А. Булойчик [и др.] // Молекулярная
и прикладная генетика: сб. научн. трудов. –
Минск, 2010. – Т. 11. – C. 69–74.
22.Курбанова, П.М. Генетическое разнообразие яровой мягкой пшеницы по
эффективной возрастной устойчивости к
листовой ржавчине: автореф. дис. ... канд.
биол. наук: 03.02.07 / П.М. Курбанова;
ВНИИР. – СПб, 2011. – 20 с.
23.Population structure of wheat disease
pathogens causing epiphytotics in Southern Russia / G. Volkova // Proc. of Oral Papers and Posters, Technical Workshop, BGRI, Cd. Obregon,
Sonora, Mexico. – 2009. – P. 230.
24.Кудинова, О.А. Взаимосвязь вирулентности и RAPD-полиморфизма северокавказской
популяции возбудителя бурой ржавчины
пшеницы: Автореф. дис. … канд. биол. наук:
06.01.07 / Кудинова О.А.; ГНУ ВНИИБЗР
РАСХН. – Краснодар, 2012. – 24 с.
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
25.Доноры устойчивости яровой мягкой
пшеницы к бурой ржавчине и мучнистой
росе с генетическим материалом видов Aegilops speltoides L., Ae. Triuncialis L., Triticum kiharae Dorof. et Migusch. / С.В. Дженин
[и др.] // Доклады Российской академии
сельскохозяйственных наук. – 2009. – № 5. –
С. 3–7.
26.Leaf rust resistance gene Lr9 and winter
wheat yield reduction: I. Yield and yield components / S. Ortelli // Crop Science. – 1996. – Vol.
36. – P. 1590–1595.
27.Characterization of wheat-alien translocations conferring resistance to diseases and pests:
current status / B. Friebe // Euphytica. – 1996. –
Vol. 91. – P. 59–87.
28.Коваленко, Е.Д. Современное состояние
популяций возбудителя бурой ржавчины и
создание генбанка источников и доноров
устойчивости пшеницы / Е.Д. Коваленко
[и др.] // Иммунологическая защита сельскохозяйственных культур от болезней и
вредителей: материалы Междунар. науч. –
практ. конф., посвящ. 125-летию со дня рожд.
Н.И. Вавилова, Большие Вяземы Московской
области 17–21 июля 2012 г. – Большие
Вяземы, 2012. – С. 69–80.
29.Гультяева, Е.И. Генетическое разнообразие российских сортов мягкой пшеницы
по устойчивости к возбудителю бурой
ржавчины // Доклады Российской академии
сельскохозяйственных наук. – 2012. – № 2. –
С. 29–32.
30.Мешкова, Л.В. Тенденция увеличения
вирулентности возбудителя бурой ржавчины
пшеницы к эффективным генам устойчивости
в Омской области / Л.В. Мешкова, Л.П. Россеева // Современные средства, методы и
технологии защиты растений: материалы
Междунар. науч.-практ. конф. – Новосибирск,
2008. – С. 149–153.
31.Сочалова, Л.П. Изучение устойчивости
пшеницы к листовым патогенам в условиях
Западной Сибири / Л.П. Сочалова, Е.И. Лихенко // Растениеводство и селекция. – 2011. –
№ 1. – С. 18–25.
32.Частота встречаемости генов вирулентности в белорусских популяциях Puccinia
triticina / А.А. Булойчик [и др.] // Микология
и фитопатология. – 2011. – Т. 45, № 5. –
С. 436–442.
43
33.Зубов, Д.Е. Селекционная ценность
доноров устойчивости яровой мягкой
пшеницы к листовой ржавчине в Среднем
Поволжье: автореф. дис. ... канд. биол. наук:
06.01.05 / Д.Е. Зубов; ФГОУ ВПО «Самарская
государственная сельскохозяйственная акаде
мия». – Кинель, 2011. – 19 c.
34.Agronomic effects from chromosome
translocations 7DL.7Ag and 1BL.1RS in spring
wheat / R.P. Singh [et al.] // Crop Science. –
1998. – Vol. 38. – P. 27–33.
35.Методы оценки и отбора исходного
материала при создании сортов пшеницы
устойчивых к бурой ржавчине: методические
рекомендации / Е.Д. Коваленко [и др.];
РАСХН, ВНИИФ. – Москва. – 2012. – 93 с.
36.Оценка и характеристика образцов коллекции синтетической пшеницы (2n=42) как
новых источников устойчивости к бурой
ржавчине и мучнистой росе в условиях
Нечерноземной зоны РФ / И.Ф. Лапочкина
[и др.] // Известия ТСХА. – Вып. 6. – 2011. –
С. 39–48.
37.Dyck, L. Evaluation of leaf rust resistance
from wheat chromosomal translocation lines /
L. Dyck, B. Friebe // Crop Science. – 1993. –
Vol. 33. – P. 687–690.
38.Mapping of the leaf rust resistance gene
Lr38 on wheat chromosome arm 6DL using SSR
markers / S.A. Mebrate // Euphytica. – 2008. –
Vol. 162, № 3. – Р. 457–466.
39.Agronomic and quality evaluation ofcommon wheat near-isogenic lines carrying the leaf
rust resistance gene Lr47 / C. Brevis [et al.] //
Crop Science. – 2008. – Vol. 48. – P. 1441–1451.
40.Влияние отдельных участков хромосом
Triticum timopheevii на формирование
устойчивости к болезням и количественные
признаки мягкой пшеницы // Е.М. Тимонова
[и др. ] // Вавиловский журнал генетики и
селекции. – 2012. – Т. 16, № 1. – C. 142–159.
41. Лапочкина, И.Ф. Разнообразие коллекции мягкой пшеницы «Арсенал» и его
использование в селекционно-генетических
исследованиях / И.Ф. Лапочкина // Иммунологическаязащитасельскохозяйственныхкультур
от болезней и вредителей: материалы Междунар.
науч.-практ.конф.,посвящ.125-летиюсоднярожд.
Н.И. Вавилова, Большие Вяземы Московской
обл. 17-21 июля 2012 г. – Большие Вяземы, 2012. –
С. 401–408.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
44
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
42.Lapochkina, I.F. Diversity of genes of resistance to leaf rust in “Arsenal” wheat collection / I.F. Lapochkina // 8th International Wheat
Conference: Abstracts of oral and poster presentations, St. Peterburg, Russian 1–4 June 2010. –
St. Peterburg, 2010. – P. 280–281.
43.Эффективность ювенильных генов
устойчивости в 2009-2010 годах против бурой
ржавчины пшеницы на территории РФ /
А.И. Жемчужина [и др.] // Иммунологическая
защита сельскохозяйственных культур от
болезней и вредителей: материалы Междунар.
науч.-практ. конф., посвященной 125-летию
со дня рожд. Н.И. Вавилова (17–21 июля
2012 г. Большие Вяземы Московской обл.). –
Большие Вяземы. – 2012. – С. 376–379.
44.Ohm, H.W. Three components of slow
leaf-rusting at different growth stages in wheat
/ H.W. Ohm, G.E. Shaner // Phytopathology. –
1976. – Vol. 66. – P. 1356–1360.
45.Wilcoxson, R.D. Genetics of slow rusting
in cereals / R.D. Wilcoxson // Phytopathology. –
1981. – Vol. 71. – P. 898–992.
46.Associations and genetics of three components of slow rusting in leaf rust of wheat
/ M.K. Das [et al.] // Euphytica. – 1993. –
Vol. 68. – P. 99–109.
47.Global status of wheat leaf rust caused by
Puccinia triticina / J. Huerta-Espino [et al.] //
Euphytica. – 2011. – Vol. 179. – P. 143–160.
48.Johnson, R. A critical analysis of durable
resistance / R. Johnson // Annual Review of Phytopathology. – 1984. – Vol. 22. – P. 309–330.
49.Leaf rust resistance gene Lr67, a third adult
plant slow-rusting gene conferring resistance to
multiple pathogens of wheat / C. Hiebert [et al.]
// Abstracts of oral and poster presentations of
8th international wheat conference St. Petersburg, Russia 1–4 June 2010. – St. Petersburg,
2010. – P. 264.
50.Identification of microsatellite markers
linked to leaf rust adult plant resistance (APR)
gene Lr48 in wheat / A. Singh [et al.] // Plant
Breeding. – 2011. – Vol. 130. – P. 31–34.
51.Lr68: a new gene conferring slow rusting
resistance to leaf rust in wheat / S.A. HerreraFoessel [et al.] // Theoretical and Applied Genetics. – 2012. – Vol. 124, № 8. – Р. 1475–1486.
52.Achieving nearimmunity to leaf and
stripe rusts in wheat by combining slow rusting resistance genes / R.P. Singh [et al.] // Acta
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
phytopathologica et entomologica hungarica. –
2000. – Vol. 35. – P. 133–139.
53.Multiple rust resistance and gene additivity in wheat: lessons from multi-location case
studies in the cultivars Parula and Saar / M. Lillemo [et al.] // Global Rust Initiative Meeting,
St. Paul. – 2011. – P. 111–120.
54.Genetics and breeing for durable resistance to leaf and stripe rusts of wheat / R.P. Singh
[et al.] // Increasing Wheat Production in Central Asia through Science and International cooperation: Proc. 1st Central Asian Wheat Conf.
Almaty, Kazakhstan 10–13 June 2003. – Almaty,
2003. – Р. 127–132.
55.Schafer, J.F. Estimated relation between
numbers of urediniospores of Puccinia graminis
f. sp. tritici and rates of occurrence of virulence
/ J.F. Schafer, A.P. Roelfs // Phytopathology. –
1985. – Vol. 75. – P. 749–750.
56.Molecular and pathological characterization of slow rusting against leaf rust in common
wheat / S. Kumar [et al.] // Proc. of Oral Papers
and Posters, Technical Workshop, BGRI, Cd.
Obregon, Sonora, Mexico. – 2009. – P. 245.
57.Rubiales, D. Characterization of Lr34, a
major gene conferring nonhypersensitive resistance to wheat leaf rust / D. Rubiales, R.E. Niks //
Plant Disease. – 1995. – Vol. 79. – P. 1208–1212.
58.A putative ABC transporter confers durable resistance to multiple fungal pathogens
in wheat / S.C. Krattinger [et al.] // Science. –
2009. – Vol. 323, № 5919. – P. 1360–1363.
59.Gene-specific markers for the wheat gene
Lr34/Yr18/Pm38 which confers resistance to
multiple fungal pathogens / E.S. Lagudah [et al.]
// Theoretical and Applied Genetics. – 2009. –
Vol. 119, № 5. – P. 889–898.
60.Resistance of European winter wheat
germplasm to leaf rust / M. Winzeler [et al.] //
Agronomie. – 2000. – Vol. 20. – P. 783–792.
61.Differential exprssion of partial rеsistance
to wheat leaf rust in Mexico and The Southern
Cone of America / S. German [et al.] // Abstracts
of oral and poster presentations of 8th international wheat conference St. Petersburg, Russia 1–4
June 2010. – St. Petersburg, 2010. – P. 285–286.
62.Плотникова, Л.Я.
Эффективность
генов возрастной устойчивости пшеницы к
бурой ржавчине Lr22b, Lr34, Lr37 в Западной
Сибири и цитофизиологическая основа их
действия / Л.Я. Плотникова, Т.Ю. Штубей //
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине
Вавиловский журнал генетики и селекции. –
2012. – Т. 16, № 1. – C. 123–131.
63.Global incidence of wheat rusts and powdery mildew during 1969–2010 and durability of
resistance of winter wheat variety Bezostaya 1 /
A. Morgounov [et al.] // European Journal of Plant
Pathology. – 2012. – Vol. 132, № 3. – P. 323–340.
64.Tracking of powdery mildew and leaf
rust resistance genes in Triticum boeoticum
and T. urartu, wild relatives of common wheat
/ N.A. Hovhannisyan [et al.] // Czech. J. Genet.
Plant Breed. – 2011. – Vol. 47, № 2. – P. 45–57.
65.Analysis of leaf and stripe rust severities
reveals pathotype changes and multiple minor
QTLs associated with resistance in an Avocet
3 Pastor wheat population / G.M. Rosewarne
[et al.] // Theoretical and Applied Genetics. –
2012. – Vol. 124, № 7. – Р. 1283–1294.
66.The adult plant rust resistance loci Lr34/Yr18
and Lr46/Yr29 are important determinants of partial resistance to powdery mildew in bread wheat
line Saar / M. Lillemo [et al.] // Theoretical and Applied Genetics. – 2008. – Vol. 116. – P. 1155–1166.
45
67.A multiple resistance locus on chromosome arm 3BS in wheat confers resistance to
stem rust (Sr2), leaf rust (Lr27) and powdery mildew / R. Mago [et al.] // Theoretical and Applied
Genetics. – 2011. – Vol. 123, № 4. – P. 615–623.
68.Niks, E. Haustorium formation by Puccinia hordei in leaves of hypersensitive, partially resistant, and nonhost genotypes / E. Niks //
Phytopathology. – 1983. – Vol. 73. – P. 64–66.
69.Niks, R.E. Potentially durable resistance
mechanisms in plants to specialized fungal
pathogens / R.E. Niks, D. Rubiales // Euphytica. – 2002. – Vol. 124, № 2. – P. 201–216.
70.Identification and validation of markers
linked to broad-spectrum stem rust resistance
gene Sr2 in wheat (Triticum aestivum L.) /
W. Spielmeyer [et al.] // Crop Science. – 2003. –
Vol. 43. – P. 333–336.
71.Санин, С.С. Фитосанитарная обстановка
на посевах пшеницы в Российской Федерации
(1991–2008 гг.) (аналитический обзор) /
С.С. Санин, Л.Н. Назарова // Защита и карантин растений. – 2010. – № 2. – С. 70–80.
Дата поступления статьи 22 октября 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 631.524.86:633.11:632.3
Е.А. Волуевич
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В СЕЛЕКЦИИ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ
НА УСТОЙЧИВОСТЬ К МУЧНИСТОЙ РОСЕ
(обзорная статья)
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Болезни и вредители сельскохозяйственных
культур наносят значительный ущерб растениеводческой отрасли, снижая урожай и качество
продукции. Использование химических средств
защиты растений приводит к увеличению пестицидной нагрузки на окружающую среду.
Кроме того, в популяциях вредоносных организмов накапливаются генотипы с мутациями
резистентности к разным химическим классам
фунгицидов и инсектицидов, что снижает эффективность их применения и требует разработки новых препаратов. В этой связи, менее
дорогостоящим и экологически чистым способом борьбы с болезнями и вредителями является создание устойчивых сортов. Для успешной селекции необходим мониторинг частоты
генов вирулентности в популяциях патогенов
с учетом путей их миграции, а также создание
сортов на основе диверсификационных стратегий. На современном уровне пока возможны диверсификационные стратегии селекции
только для некоторых культур и к небольшому
числу патогенов, то есть диверсификационные стратегии на первичном уровне, который
предполагает создание сортов, различающихся
по генам устойчивости, и их территориальное
размещение. В связи с биологическими особенностями разных видов вредоносных патогенов
используются определенные генетические подходы к выведению резистентных сортов, направленные на увеличение длительности сохранения устойчивости. В настоящей статье будет
рассмотрена диверсификационная стратегия
селекции мягкой пшеницы на устойчивость к
вредоносной и распространенной болезни этой
культуры – мучнистой росе.
Биологические особенности возбудителя мучнистой росы пшеницы и вредоносность
Мучнистая роса встречается на пшенице
во всех районах мира, где возделывается эта
культура. Возбудитель мучнистой росы – биотрофный грибной патоген Blumeria graminis
DC. f. sp. tritici Marchal (синоним Erysiphe
graminis DC. f. sp. tritici Marchal) относится к
классу Ascomycetes, порядку Erysiphales, семейству Erysiphaceae. Мучнистая роса, как
правило, развивается на листьях, но гриб может поражать все надземные части растения.
На поверхности пораженных органов патоген
появляется в виде белого налета, который постепенно превращается в плотные колонии мицелия грязно-серовато-коричневого цвета. В
условиях умеренного климата в течение вегетации растений гриб дает около 10 генераций
путем бесполого размножения гаплоидными
конидиями. При этом на поверхности листа
в 1 см2 может сформироваться до 100 тыс. конидий, что обусловливает возникновение 2000
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
мутаций на локус в сутки на 1 га площади
посева пшеницы. Патоген легко преодолевает большие расстояния с помощью ветра. На
примере возбудителя мучнистой росы ячменя было зарегистрировано, что по основному
направлению ветра популяция B. graminis f.
sp. hordei распространилась на 110 км за 36
дней [1]. Споры также разносятся с дождем
и брызгами.
Патоген имеет регулярный половой процесс,
в результате которого образуются аскоспоры.
Их фомирование начинается при повышении
температуры и старении растения-хозяина,
в то время как бесполое размножение конидиями в этот период уменьшается, а затем
прекращается. Аскоспоры разносятся ветром
даже при высокой влажности воздуха после дождя, то есть в условиях, которые неблагоприятны для рассеивания конидий [2].
Смесь аскоспор и конидий, образовавшихся
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
на яровой пшенице, формирует инокулюмом
для озимой пшеницы. Популяция возбудителя мучнистой росы увеличивается в течение
осени на озимой пшенице до наступления холодов, ограничивающих ее дальнейшее развитие. Гриб зимует обычно в узлах кущения
в виде мицелия. В морозные зимы, вызывающие серьезное повреждение озимой пшеницы,
численность популяции патогена значительно
снижается. Клейстотеции – плодовые тела с
сумками, содержащими аскоспоры, – сохраняются на пожнивных остатках. Весной гриб
развивается на озимой пшенице и конидии
переносятся ветром на яровую пшеницу. С
августа по октябрь созревают и высвобождаются аскоспоры, которые поражают всходы
озимых. В засушливых районах тех стран, где
выращивается только яровая пшеница, сумки
формируются медленно, и аскоспоры созревают только после перезимовки, весной они
поражают яровую пшеницу.
Возбудитель мучнистой росы принадлежит
к патогенам высокого эволюционного риска,
так как имеет половое и бесполое размножение [3]. В результате ежегодного полового процесса производится много новых комбинаций
аллелей. Последующие циклы бесполого размножения могут быстро увеличить частоту
отобранных комбинаций аллелей, поэтому разрушение эффективности генов устойчивости
и чувствительности к фунгицидам происходит
достаточно быстро. Стратегия эпифитотии
гриба в основном базируется на быстром инфекционном цикле, большой споруляционной
способности и высокой эффективности инфек-
47
ции. Увеличение степени развития болезни
происходит не только вследствие появления
новых поражений на растениях, но что более
важно, путем увеличения размеров уже присутствующих колоний. Имея такие биологические особенности, возбудитель мучнистой росы быстро преодолевает устойчивость сорта,
контролируемую главными генами: обычно
в течение 3–4 лет возделывания на больших
площадях, но это может происходить и быстрее – за 1–3 года [4].
Мучнистая роса является одной из наиболее
вредоносных болезней пшеницы в странах с
умеренным климатом, бурное развитие этой
болезни наблюдается в Великобритании, Германии, Китае, России, Северной и Восточной
Африке, на Юго-Востоке США, в Южной и
Западной Азии, Японии [5]. Более сильно она
распространена. В Европе споры возбудителя
мучнистой росы пшеницы разносятся с Запада
на Восток. Их распространение происходит
по западно-европейскому пути (из Марокко и
Испании – в Скандинавию), а также восточноевропейскому пути (из Турции и Румынии – в
Скандинавию) [6]. В связи с этим на местные
популяции гриба воздействует приток спор из
отдаленных районов.
Потери урожая от мучнистой росы составляют от 13 до 34% [7, 8], при сильном поражении
посевов – до 50% [9]. В Беларуси эта болезнь
практически ежегодно достигает эпифитотийного уровня [10]. Мучнистая роса уменьшает
ассимиляционную площадь листьев и разрушает хлорофилл, снижает кустистость растений и задерживает колошение.
Генетические подходы в селекции на расоспецифическую устойчивость
Селекция сортов пшеницы ведется на расоспецифическую и нерасоспецифическую
устойчивость. Селекция на расоспецифическую устойчивость предполагает использование в скрещиваниях доноров с эффективными главными Pm-генами резистентности
(Pm – powdery mildew). Устойчивость обычно
проявляется в виде реакции сверхчувствительности на листьях [5]. Сорта с генами расоспецифической устойчивости характеризуются
резистентностью на протяжении всего вегетационного периода растений, начиная со стадии
проростков. Однако они быстро становятся
восприимчивыми. Основная причина эрозии
их устойчивости – адаптация популяции возбудителя мучнистой росы в результате половой
рекомбинации, мутаций, миграции на дальние
расстояния и сильного давления отбора, оказываемого главными генами резистентности,
содержащимися в сортах.
Считается, что пирамидирование эффективных главных генов обеспечивает более
длительную устойчивость. Однако пирамиды
оказываются уязвимыми, если включенные
в них гены используются одиночно в других
сортах и в популяции патогена присутствует
комплементарная к ним вирулентность [11].
Если при мониторинге популяции патогена
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
48
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
обнаружено появление новых фенотипов вирулентности, преодолевающих используемую
пирамиду генов, то можно предполагать, что
в целях предотвращения потери устойчивости следует увеличить численность генов пирамиды. Однако предсказать длительность
устойчивости сорта в зависимости от числа
присутствующих у него генов резистентности
невозможно. Самая большая опасность при
включении новых главных генов в генные пирамиды заключается в том, что сильное однонаправленное давление отбора в отношении
соответствующих аллелей вирулентности в
популяции патогена может приводить к эволюции патотипа, преодолевающего комплекс
этих генов [12]. Если одна и та же комбинация
генов устойчивости используется широко, то
будет наблюдаться более сильное давление отбора на соответствующую комбинацию аллелей вирулентности в популяции возбудителя.
Если это происходит, то эффективность пирамиды данных генов устойчивости будет разрушена. Таким образом, несмотря на то, что
присутствие в сорте нескольких эффективных
генов должно обеспечивать более длительную
устойчивость [12], такая устойчивость может
способствовать накоплению генотипов патогена, несущих многие гены вирулентности, если
осуществляется высокое давление отбора на
возбудителя болезни [13].
Для успешной селекции на расоспецифическую устойчивость необходимо располагать информацией об эффективности главных
генов резистентности, а также их наличии в
донорах. Кроме того, для целенаправленного
отбора предпочтительных генотипов в грибридных поколениях желательно использовать ДНК-маркеры, разработанные к генам
устойчивости.
Для исследования эффективности генов
устойчивости впервые в 2010 году был проведен мониторинг частоты встречаемости генов вирулентности в белорусской популяции
гриба. Инфекционный материал возбудителя
мучнистой росы собирали на коллекционном
участке в Минской области, где произрастали
около 500 яровых и озимых сортообразцов
различного географического происхождения.
Встречаемость генов вирулентности исследовали, используя набор, включающий 21 тестер
с одиночными генами (8 изогенных линий и
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
13 сортов), а также 5 сортообразцов, содержащих от двух до пяти генов устойчивости.
Оказалось, что только пшеничный ген Pm3b
и ген от ржи Pm20 были среднеэффективными. Частота вирулентных к ним клонов составляла 8,7% при оценке изогенной линии
Chul/8*Chancellor и образца KS93WGRC28
соответственно [14]. Низкоэффективными
оказались гены Pm1а, Pm3а, Pm3d, Pm6, Pm7,
Pm16, Pm17 с частотой вирулентности в пределах 21–50%. Неэффективны гены устойчивости Pm1а, Pm1е, Pm2, Pm3с, Pm3f, Pm3g,
Pm4а, Pm4b, Pm5а, Pm5b, Pm10, к которым в
белорусской популяции гриба присутствовало более 50% вирулентных изолятов. Среднеэффективной оказалась комбинация четырех
генов у сорта Sappo (Pm1а+2+4b+9); низкоэффективными были комбинации трех генов
у сорта Normandie (Pm1а+2+9) и пяти генов
у сорта Nemares (Pm1а+2+4b+6+9); неэффективной – комбинация двух генов у сорта Chinese Spring (Pm11+15).
В некоторых европейских странах, из которых не исключен занос спор гриба в Республику Беларусь, также проводятся исследования
структуры популяции патогена по признаку
вирулентности с целью изучения эффективности генов устойчивости и прогноза их использования в селекции. Так, в Дании частота
вирулентности составляла 100% к гену Pm5,
80–90% к Pm8 и 40–90% к Pm2 (по данным
оценки 1985–1986 гг.) [15]. Комбинация генов
Pm4b+6 обеспечивала хороший уровень защиты. Сорта Kosack (Pm4b+u) (u – unknown),
Sleipner (Pm2+6+8) и Holger (Pm6+u) были
наиболее устойчивы. Отмечалась некоторая вирулентность к Pm1, Pm4a, Pm3a, Pm3b, Pm3c,
несмотря на то, что сорта с этими генами устойчивости в Дании не выращивались широко. В
Голландии в 1970-х годах частота вирулентных
изолятов к генам Pm1a, Pm2, Pm3b, Pm6 и Pm8
была небольшой. Наиболее распространенными оказались изоляты с вирулентностью к
Pm5, наименее – к Pm4b [16]. Отмеченная в
1980–1990 гг. вирулентность к генам Pm1a,
Pm2, Pm3a-d, Pm4a, Pm4b, Pm5a, Pm6, Pm8 и
Pm9 обусловлена увеличением выращивания
сортов пшеницы, содержащих эти гены [15–17].
В Германии гены Pm4b и Pm5 потеряли эффективность, также как и гены Pm2, Pm6, Pm8 и все
их совместные комбинации [18].
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
В Венгрии за период с 1970-х годов по 2007год
было показано, что 60% изменений в частоте вирулентных генов объясняется набором культивируемых сортов [19]. В 2001–2008 гг. меньшую
частоту вирулентности выявили по отношению к
гену Pm3b (24,7%), в то время как к Pm3d она составляла 27,3%; к комбинации генов Pm1+2+9 –
41,3%; к гену Pm1 – 48,7%. Около 100% составляла частота вирулентных изолятов к генам Pm2,
Pm3с, Pm4а, Pm5, Pm6 и Pm8 [19]. В Беларуси
ген Pm3d был низкоэффективным при анализе
частоты встречаемости изолятов в 2010 году [14].
В Болгарии изучение структуры популяции
возбудителя мучнистой росы в 2001–2003 гг.
показало наибольшую эффективность генов
Pm7, Pm3b, Pm3c и Pm1+2+9 [20]. По результатам изучения в 2004–2006 гг. высокую эф-
49
фективность имели гены Pm7, Pm3b, Pm3c и
комбинация генов Pm1+2+9 [21]. Однако в
Беларуси эта комбинация генов оказалась низкоэффективной, по данным мониторинга популяции гриба в 2010 году было выявлено 44,4%
вирулентных изолятов к сорту Normandie [14].
В Литве исследование структуры популяции
патогена с использованием дифференциаторов с генами Pm1, Pm2, Pm3a, Pm3b, Pm3c,
Pm4a, Pm4a+, Pm4b, Pm4b+, Pm5, Pm6, Pm7,
Pm8, Pm17, Pm1+Pm4b, Pm1+Pm2+Pm9,
Pm2+Pm6, Pm2+ PmMld показало их неэффективность. Сравнительно меньшую частоту
вирулентных изолятов наблюдали только к генам Pm4a (Khapli), Pm4a+ (Tp 309/A) и Pm17
(Amigo): в диапазоне от 20,7% до 37% (средние данные за 3 года) [22].
Генетические подходы в селекции на возрастную устойчивость
Сорта с медленным развитием болезни,
частичной, возрастной (APR – adult plant
resistance) устойчивостью характеризуются
задержкой проявления болезни, уменьшением роста и репродукции патогена на взрослых
растениях [23]. Она обычно оценивается по
снижению развития болезни на флаговом (и
подфлаговом) листе, так как возрастные гены
начинают экспрессироваться с периода появления этого листа. Если сорта имеют только
этот тип устойчивости, то проростки могут
поражаться в слабой или средней степени [24,
25]. Возрастная устойчивость обычно нерасоспецифическая и в таких случаях является
длительной, но она может быть также расоспецифической, что было доказано экспериментально [26]. С нерасоспецифической устойчивостью к мучнистой росе связаны локусы
частичной устойчивости к листовой и желтой
ржавчине (Lr34/Yr18/Pm38 и Lr46/Yr29/Pm39)
(Lr – leaf rust, Yr – yellow rust) [27–29]. Они
присутствуют в различной зародышевой плазме и контролируют частичную устойчивость к
трем грибным патогенам в течение нескольких
десятилетий [29–32].
Медленное развитие мучнистой росы чаще
всего наследуется как количественный признак [33, 34]. Например, генетический анализ
с использованием двух серий моносомных
линий показал участие 14 хромосом в детерминации полевой устойчивости к мучнистой
росе немецкого сорта Diplomat [35]. Однако
возможно и простое наследование при проведении генетического анализа в строго контролируемых условиях среды, например, у сорта Genesee был выявлен один доминантный
расоспецифический ген частичной устойчивости [36]. Отбор по фенотипу на частичную
полевую устойчивость к мучнистой росе часто
затруднен в присутствии генов расоспецифической устойчивости, которые могут маскировать эффект генов частичной устойчивости,
если являются эффективными. Кроме того,
гены расоспецифической устойчивости могут
обусловливать реакции частичного поражения
болезнью в поле, когда частота соответствующей вирулентности в популяции патогена является низкой [37].
Возрастная устойчивость длительна благодаря нерасоспецифичности, вследствие чего
оказывается менее сильное давление отбора на
популяцию гриба [38]. Однако длительность
устойчивости может быть определена лишь
после продолжительного времени выращивания сорта на большой площади в регионе,
где патоген вызывает регулярные эпифитотии
[39]. Так, например, британский сорт Maris
Huntsman постоянно проявлял больший уровень устойчивости к мучнистой росе, чем другие сорта, несущие аналогичную комбинацию
неэффективных генов Pm2+6 [5]. Немецкие
сорта, имеющие неэффективную комбинацию
Pm-генов, такие как реализованные в 1995
году Tambor (Pm2+5) и в 1970 году Habicht
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
50
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
(Pm5+6), а также Ramiro (1989 г.), Miras (1984
г.) и Zentos (1989 г.) без главных Pm-генов
характеризуются хорошей количественной
устойчивостью, несмотря на интенсивное использование в практическом земледелии. Известно, что сорта Zentos, Ramiro и Miras (TAW)
имеют в своей родословной российский сорт
Мироновская 808. Мироновская 808 обладает
количественной устойчивостью к мучнистой
росе, которая сохранялась в Германии в течение длительного периода времени (1970–1982
гг.) несмотря на то, что в этой стране 43%
площади под пшеницей было занято данным
сортом [40]. Ранее сообщалось о высокой
стабильности количественной устойчивости
к мучнистой росе сорта Knox и его производных, которая не изменилась в течение 20 лет
[23]. Сорт Massey, производный Knox 62, начали выращивать в Вирджинии в 1981 году [41]
и до сих пор он устойчив к мучнистой росе на
стадии взрослых растений [42]. Выявлено, что
долговременную возрастную устойчивость
американских сортов Knox 62 и Massay обеспечивают 2–3 гена [43].
Создание сортов с частичной (количественной) устойчивостью возможно за счет остаточного эффекта преодоленных генов расоспецифической устойчивости. Так, установлено, что
некоторые неэффективные расоспецифические
гены устойчивости (Pm3c, Pm3g, Pm4b) вносят
остаточный эффект в возрастную устойчивость
[44, 45]. Сообщалось также, что расоспецифический ген Pm5a, возможно, обусловливает возрастную устойчивость в сочетании с другими
Pm-генами [46]. В условиях Словакии выявили
два сорта (Century и Vercors) с количественной
устойчивостью, которые имеют частично эффективные (к некоторой доле изолятов в популяции гриба) главные гены Pm17 и Pm3a в
комбинации с геном pm5c соответственно [47].
В полевых условиях Беларуси также была
оценена эффективность одиночных генов и
их комбинаций по проценту поражения третьего листа сверху и флагового листа растений [48]. Высокую устойчивость в 2001–2002
гг. наблюдали у сортообразцов с одиночными генами: Aristide (Pm3g), Transec (Pm7),
Haven/T. dicoccoides (Pm16), Amigo (Pm17),
KS93WGRC28 (Pm20), Fresco (MlFr), Spark
(PmMlTo). Слабое поражение болезнью имели сорта с комбинацией 2–5 генов: Compal
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
(Pm2+4b), Maris Huntsman (Pm2+6), Булава
(Pm2+6), Brock (Pm2+MlTa2), Sorbas (Pm4b+6),
Mercia (Pm5b+MlTa2), Hereward (Pm8+MlHe2),
Normandie (Pm1a+2+9), Axona (Pm2+3d+Mld),
Kenja Civet (Pm2+3c+6), Apollo (Pm2+4b+8),
Crossbow (Pm2+5+6), Knirps (Pm2+4b+6+8),
Nemares (Pm1а+2+4b+6+9).
Проведенная в 2012 году полевая оценка также выявила высокую устойчивость некоторых
сортов с известными генами и их комбинациями. Такой устойчивостью характеризовались
яровые сортобразцы Transec (Pm7), Тулайковская 5 (PmAg), Тулайковская 10 (PmAg),
Maris Dave (Pm2+Mld), Wembley/Ae. speltoides
(Pm12+MlSo), Axona (Pm2+3d+Mld), Banti
(Pm1+2+3d+6). Высокий уровень полевой
устойчивости наблюдали у озимых сортов
Soissons (Pm3g), Amigo (Pm17), KS93WGRC28
(Pm20), Spark (PmMlTo), Tambor (Pm2+5),
Estica (Pm2+6), Булава (Pm2+6), Mercia
(Pm5b+MlTa2).
Некоторые сортообразцы, несущие гены
Pm7, Pm17, Pm20, PmMlTo, сохраняли хороший уровень полевой устойчивости к белорусской популяции возбудителя мучнистой
росы более 10 лет. Высоко устойчивы, по
данным оценки ряда лет, были сорта Тулайковская 5 и Тулайковская 10 с геном PmAg
(2009–2012 гг.), Tambor с Pm2+5 (2008–2012
гг.), Булава с Pm2+6 (2001–2012 гг.), Mercia с
Pm5b+MlTa2 (2001–2012 гг.). Эти сорта характеризовались устойчивостью как третьего листа сверху, так и флагового листа. Сорта Axona
с Pm2+3d+Mld (оценки 2001–2012 гг.) и Banti
с Pm1+2+3d+6 (2009– 2012 гг.) были более
устойчивы на флаговом листе, чем на третьем
листе сверху, то есть проявляли устойчивость
по типу медленного развития мучнистой росы.
Такую же устойчивость в условиях Беларуси
имел сорт Estica с комбинацей генов Pm2+6
по данным оценок 2008–2012 гг.
Сортобразцы с некоторыми генами или комбинациями генов имеют высокий уровень полевой устойчивости, начиная со стадии колошения растений, хотя частота вирулентных к
ним клонов при лабораторной оценке проростков была существенной. Это имеет отношение,
в частности, к носителям генов Pm3g, Pm7,
Pm17, из которых только Pm7 – возрастной
расоспецифический ген частичной устойчивости. Высокий уровень полевой устойчивости
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
к белорусской популяции наблюдали у озимого сорта Vlasta по данным оценок 2008–2012
гг. Это лучший по устойчивости к мучнистой
росе чешский сорт, полученный от скрещивания Brimstone/S13//Hana и реализованный
в 1999 [49]. Сорт Vlasta имеет ген Pm1b, интрогрессированный от Triticum monococcum
в S13 [50]. Однако с помощью фитотеста ген
Pm1b в сорте Vlasta найден не был, но были
постулированы гены Pm2 и Pm6, очевидно,
полученные от Brimstone (неопубликованные данные Zeller, цит. по [50]). Присутствие
только комбинации этих двух генов Pm2+6 не
может объяснить высокую полевую устойчивость сорта Vlasta к мучнистой росе, так как
другие сорта (например, Estica) с этими же генами были неустойчивы в Чехии в 2002–2005
гг. [49]. В условиях Беларуси сорта Estica и
Булава, имеющие комбинацию генов Pm2+6,
как уже отмечалось, характеризовались хорошим уровнем полевой устойчивости, хотя
по данным мониторинга 2010 г. к каждому из
этих генов наблюдалась значительная частота
вирулентных изолятов [14].
Пирамидирование расоспецифических главных генов, которые уже преодолены, все-таки
не является эффективным решением проблемы
генетической защиты сортов пшеницы от мучнистой росы. Ранее об этом сообщалось при
анализе устойчивости английских [5] и немецких сортов [18]. Было выявлено, что сочетания
малых генов устойчивости к мучнистой росе,
которые селекционеры смогли получить в некоторых сортах в прошлом, являются намного
более эффективными для достижения экологически стабильной устойчивости к болезни,
чем пирамидирование преодоленных генов
расоспецифической устойчивости. Так, на протяжении 10-летнего изучения немецких сортов
озимой пшеницы с частичной устойчивостью
к мучнистой росе, степень их поражения была
ниже 10%, несмотря на эпифитотии [18]. Только
в особенно благоприятные для гриба годы развитие болезни достигало 20%, что требовало
применения фунгицидов. Такая устойчивость
не была обусловлена присутствием у некоторых исследованных сортов известных преодоленных генов расоспецифической устойчивости, поскольку аналогичные сочетания генов у
других сортов не давали приемлемого уровня
частичной устойчивости. В связи с этим мож-
51
но предположить, что и выявленная в условиях
Беларуси высокая полевая устойчивость некоторых сортов с неэффективными расоспецифическими генами или их комбинациями может
быть обусловлена и другими (малыми) генами.
В последнее время особое значение приобретает изучение частичной устойчивости, которая, как количественный признак, контролируется полигенами. Если признак является
результатом многочисленных малых аддитивных эффектов, то в селекции такую устойчивость использовать сложно. Однако выявление
QTLs (quantitative trait loci – количественных
локусов), ассоциированных с устойчивостью
к мучнистой росе, особенно у сортов с длительной частичной устойчивостью, позволяет
использовать их при выведении сортов, адаптированных к местным условиям. Такие исследования были проведены в Норвегии: была
изучена генетика резистентности шведского сорта мягкой озимой пшеницы Folke, имеющего
долговременную частичную неспецифическую
полевую устойчивость к мучнистой росе [37].
Этот сорт адаптирован к условиям Норвегии
[51], и он широко культивировался в Норвегии
и Швеции в 1980-х и 1990-х годах соответственно. Недавно проведенные тесты на проростках
подтвердили нерасоспецифическую природу
его устойчивости [52, 53]. Также ни один из
QTLs, ассоциированных с длительной устойчивостью к мучнистой росе у сорта Folke, не был
картирован в позиции любых известных генов
расоспецифической резистентности [54]. Это
является дополнительным подтверждением нерасоспецифичности Folke при высоком уровне
возрастной устойчивости растений в полевых
условиях [51]. Селекция, основанная на QTLs
(количественных генах), которые имеет Folke,
перспективна в связи с тем, что новые сорта
будут иметь устойчивость, которую трудно
преодолеть генетическими изменениями в популяции возбудителя мучнистой росы.
Ценным источником для селекции на частичную устойчивость к мучнистой росе является немецкий сорт яровой пшеницы Naxos,
который проявляет высокий уровень нерасоспецифической полевой устойчивости. Lu
с сотрудниками выявили у Naxos большой
QTL -локус количественной устойчивости в
хромосоме 1AS вблизи гена Pm3 в экспериментах, проведенных в 6 разных местностях
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
52
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
в Норвегии и Китае. Этот локус объясняет до
35% фенотипической вариации [55]. Naxos
имеет еще один важный локус количественной
устойчивости в хромосоме 2DL и два малых –
в 2BL и 7DS. Кроме Naxos и Folke, высоким
уровнем частичной полевой устойчивости обладают немецкий сорт яровой пшеницы Paros
и шведский озимый сорт Mjølner. Все эти 4
сорта на ювенильной стадии являются восприимчивыми к изолятам патогена, то есть не
несут генов расоспецифической устойчивости,
поэтому представляют собой высокоценные
источники частичной и потенциально длительной устойчивости к мучнистой росе [56].
Заключение
Распространение возбудителя мучнистой росы на длинные дистанции требует организации
интродукции эффективных генов устойчивости
поперек пути основного направления ветра в Европе – с Запада на Восток. Существует необходимость расширения генетического разнообразия
устойчивости к мучнистой росе в возделываемых сортах пшеницы. Поиск и интродукция
новых генов устойчивости от родственных и
чужеродных видов в адаптированные сорта
пшеницы – первичные задачи селекционных
программ по выведению сортов для выращивания в тех районах, где эта болезнь является проблемой, в том числе в Беларуси. Чем более широкий спектр генетической устойчивости будет
создан в адаптированных сортах, тем успешнее
может использоваться стратегия диверсификации для контроля болезни, причем, озимые и
яровые сорта должны иметь различающиеся гены устойчивости. Прогноз использования генов
устойчивости в селекции должен основываться
на мониторинге популяции возбудителя мучнистой росы по генам вирулентности.
Для создания устойчивых сортов пшеницы к
мучнистой росе исследователями предложены
программы селекции, включающие использование эффективных главных генов устойчивости,
их пирамидирование, пирамиды преодоленных
главных генов, а также создание сортов с частичной (количественной) устойчивостью. В то
же время селекция сортов с частичной устойчивостью предлагается в качестве более надежного направления [5, 23]. Изучение генетики
количественной устойчивости или медленного
развития болезни на взрослых растениях является важной задачей. Без знания генетической
основы этой ценной формы устойчивости, эффективную стратегию селекции на устойчивость к мучнистой росе разработать трудно.
В настоящее время провести различие между
количественной и длительной устойчивостью
возможно только ретроспективно. Сорта с количественной или сочетанием количественной
и качественной устойчивости для условий, где
имеет значение проростковая устойчивость,
могут быть легко разработаны с использованием молекулярных маркеров [57]. Пирамиды
количественных генов с качественными генами увеличат длительность устойчивости [58].
Пирамидирование генов имеет большие
перспективы для достижения длительной
устойчивости сельскохозяйственных культур
к биотическим и абиотическим стрессам [59].
Пирамидирование с использованием молекулярных маркеров к генам устойчивости позволяет осуществлять «укладку» многих генов, что
приводит к одновременной экспрессии более
одного гена и длительной устойчивости. Генные пирамиды приобретают большое значение
для создания генетических источников широкого спектра устойчивости. Эта стратегия должна
быть интегрирована в обычные селекционные
программы. Повысить эффективность такой
селекции позволяет маркер-сопутствующий
отбор, который должен использоваться и в Республике Беларусь.
Список используемых источников
1. Limpert, E. Barley mildew in Europe: Evidence of wind-dispersal of the pathogen and its
implications for improved use of host resistance
and of fungicides for mildew control / E. Limpert
// Integrated Control of Cereal Mildews: Monitoring the Pathogen; ed. M.S. Wolfe, E. Limpert. – Dortrecht: Martinus Nijhof Publishers,
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
1987. – Р. 31–33.
2. Development of cleistothecia and early ascospore release of Erysiphe graminis DC. f. sp.
tritici in winter wheat in relation to host age and
climatic conditions / M. Götz [et al.] // Zeitschrift
für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz. –
1996. – Vol. 103. – P. 134–141.
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
3. McDonald, B.A. Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance / B.A. McDonald, C. Linde // Ann. Rev.
Phytopathol. – 2002. – Vol. 40. – P. 349–379.
4. Skinnes, H. Breakdown of race specific
resistance to powdery mildew in Norwegian
wheat / H. Skinnes // Cereal Rusts Powdery Mildew Bull 30. – 2002. – Mode of access: http://
www.crpmb.org. – Date of access: 12.11.2012.
5. Bennett, F.G.A. Resistance to powdery
mildew in wheat: A review of its use in agriculture and breeding programmes / F.G.A. Bennett // Plant Pathology. – 1984. – Vol. 33. –
P. 279–300.
6. Zadoks, J.C. International dispersal of fungi
/ J.C. Zadoks // Netherlands Journal of Plant Pathology. – 1967. – Vol. 73, Suppl. 1. – P. 61–80.
7. Effectiveness of adult-plant resistance in
reducing grain yield loss to powdery mildew in
winter wheat / C.A. Griffey [et al.] // Plant Disease. – 1993. – Vol. 77. – P. 618–622.
8. Leath, S. Effects of powdery mildew, triadimenol seed treatment, and triadimefon foliar
sprays on yield of winter wheat in North Carolina / S. Leath, K.L. Bowen // Phytopathology. –
1989. – Vol. 79. – № 2. – Р. 152–155.
9. Рачински, Т. Съвременната селекция
и борбата с ръждите и бряшнестата мана
на пшеница / Т. Рачински // Раст. защита. –
1980. – Т. 28. – № 8. – С. 5–10.
10.Коптик, И.К. Селекция озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) в условиях
Беларуси: дисс. … доктора с.-х. наук: 06.01.05
/ И.К. Коптик; БелНИИЗиК. – Жодино,
1996. – 304 с.
11. Parlevliet, J.E. Resistance of Crop Plants
against Fungi / J.E. Parlevliet // Durable resistance;
ed. H. Hartleb, R. Heitfuss, H.-H. Hoppe. – Jena:
Gustav Fisher Publishers, 1997. – P. 238–253.
12.Pink, D.A.C. Strategies using genes for
non-durable disease resistance / D.A.C. Pink //
Euphytica. – 2002. – Vol. 124. – P. 227–236.
13.Groth, J.V. Multilines and “super-races”, a
simple model / J.V. Groth // Phytopathology. –
1976. – Vol. 66. – P. 937–939.
14.Булойчик, А.А. Анализ белорусской
популяции возбудителя мучнистой росы
пшеницы по признаку вирулентности /
А.А. Булойчик, В.С. Борзяк // Генетика
и биотехнология ХХI века: проблемы,
достижения,
перспективы:
материалы
53
Междунар. науч. конф., посвящ. 100-летию со
дня рожд. акад. Н.В. Турбина, Минск, 8–11 окт.
2012 г. / Институт генетики и цитологии НАН
Беларуси, Х съезд Белорус. общ-ва генетиков
и селекционеров; редкол.: А.В. Кильчевский
[и др.]. – Минск, 2012. – С. 45.
15.Hovmøller, M.S.
Virulensundersøgelser af byg- og hvedemeldug i Danmark 1987 /
M.S. Hovmøller // Tidskr. Planteavl. – 1987. –
Vol. 91. – P. 375–386.
16.Karjalainen, R. The powdery mildew situation on barley and wheat in Finland // Integrated Control of Cereal Mildews: Monitoring
the pathogen / R. Karjalainen; ed. M.S. Wolfe,
E. Limpert. – The Netherlands: Martinus Nijhoff
Publishers, 1987. – P. 61–66.
17.Wiik, L. Mildew populations of barley and
wheat in Sweden / L. Wiik // Integrated Control
of Cereal Mildews: Virulence Patterns and Their
Change; ed. J. Helms-Jørgensen. – Roskilde:
Risø National Laboratory, 1991. – P. 33–37.
18.Miedaner, T. Effectiveness and environmental stability of quantitative powdery mildew
(Blumeria graminis) resistance among winter
wheat cultivars / T. Miedaner, K. Flath // Plant
Breeding. – 2007. – Vol. 126. – P. 553–558.
19.Virulence of the wheat powdery mildew
population and the efficiency of Pm resistance
genes / G. Vida [et al.] // 8th International Wheat
Conference, Abstracts of oral and poster presentations, St. Peterburg, 1–4 June 2010. – St. Peterburg, 2010. – P. 325–326.
20.Iliev, I. Вирулентност на причинителя
на брашнестата мана по пщиницата през
периода 2001–2003 г. / I. Iliev // Растениевъдни
Науки. – 2006. – Vol. 43, № 4. –P. 344–351.
21.Iliev, I. Virulence Diversity in the Population of the Cause Agent of Powdery Mildew in
Wheat – Blumeria gramnis tritici / I. Iliev // Bulgarian Journal of Ecological Science. – 2011. –
Vol. 10, № 3. – P. 3–13.
22.Liatukas, Z. Wheat powdery mildew population in Lithuania / Z. Liatukas, V. Ruzgas //
Agronomijas Vestis. – 2005. – № 8. – P. 124–128.
23.Shaner, G. Evaluation of slow-mildewing
resistance of Knox wheat in the field / G. Shaner //
Phytopathology. – 1973. – Vol. 63. – P. 867–872.
24.A major QTL effect controlling resistance
to powdery mildew at the adult plant stage /
Y. Bougot [et al.] // Plant Breeding. – 2006. –
Vol. 125. – P. 550–556.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
54
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
25.Quantitative trait loci mapping of adultplant resistance to powdery mildew in Chinese
wheat cultivar Lumai 21 / C.X. Lan [et al.] // Molecular Breeding. – 2010. – Vol. 25. – P. 615–622.
26.Hsam, S.L.K. Breeding for powdery
mildew resistance in common wheat (T. aestivum L. em Thell.) / S.L.K. Hsam, F.J. Zeller //
The Powdery Mildews: A Comprehensive Treatise; ed. R.R. Belanger [et al.]. – St. Paul, USA:
PS Press, 2002. – Р. 219–238.
27.Mapping Yr28 and other genes for resistance
to stripe rust in wheat / R.P. Singh [et al.] // Crop
Science. – 2000. – Vol. 40, № 4. – Р.1148–1155.
28.Powdery mildew resistance and Lr34/Yr18
genes for durable resistance to leaf and stripe
rust co-segregate at a locus on the short arm of
chromosome 7D of wheat / W. Spielmeyer //
Theoretical and Applied Genetics. – 2005. –
Vol. 111. – P. 731–735.
29.The adult plant rust resistance loci Lr34/
Yr18 and Lr46/Yr29 are important determinants
of partial resistance to powdery mildew in bread
wheat line Saar / M. Lillemo [et al.] // Theoretical and Applied Genetics. – 2008. – Vol. 116. –
P. 1155–1166.
30.Kolmer, J.A. Genetics of resistance to
wheat leaf rust / J.A. Kolmer // Annual Review
of Phytopathology. – Vol. 34. – P. 435–455.
31.Lr46: a gene conferring slow-rusting resistance to leaf rust in wheat / R.P. Singh [et al.] //
Phytopathology. – 1998. – Vol. 88, № 9. –
P. 890–894.
32.Molecular marker mapping of leaf rust resistance gene Lr46 and its association with stripe
rust resistance gene Yr29 in wheat / M. William
[et al.] // Phytopathology. – 2003. – Vol. 93. –
P. 153–159.
33.Roberts, J.J. General resistance (slow mildewing) to Erysiphe graminis f. sp. tritici in
Knox wheat / J.J. Roberts, R.M. Caldwell // Phytopathology. – 1970. – Vol. 60. – P. 1310.
34.Effectiveness of adult-plant resistance in
reducing grain yield loss to powdery mildew in
winter wheat / C.A. Griffey [et al.] // Plant Disease. – 1993. – Vol. 77. – P. 618–622.
35.Chae, Y.-A. Genetic analysis of powdery
mildew resistance in wheat cultivar ‘Diplomat’
/ Y.-A. Chae, G.W. Fischbeck // Zeitschrift fiir
Pflanzenziichtung. – 1979. – Vol. 83. – P. 272–280.
36.Ellingboe, A.H. Genetics of host-parasite
interactions / A.H. Ellingboe // Physiological Plant
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Pathology; ed. R. Heitefuss, P.H. Williams. – Berlin: Springer-Verlag, 1976. – P. 761–778.
37.Molecular mapping of partial resistance to
powdery mildew in winter wheat cultivar Folke / M. Lillemo [et al.] // Euphytica. – 2012. –
Vol. 185. – P. 47–59.
38.Parlevliet, J.E. Durable resistance in self-fertilizing annuals / J.E. Parlevliet // Durable Resistance in Crops; ed. F. Lamberti [et al.]. – New York,
USA: Plenum Press, 1983. – P. 347–360.
39.Johnson, R. Durable resistance: definition
of genetic control and attainment in plant breeding / R. Johnson // Phytopathology. – 1981. –
Vol. 22. – P. 309–330.
40.Meinel, A. Breeding aspects of partial resistance to airborne pathogens in wheat / A. Meinel, O. Unger // Czech. J. Genet. Plant Breed. –
1998. – Vol. 34. – P. 103–106.
41.Registration of Massey wheat / T.M. Starling [et al.] // Crop Science. – 1984. – Vol. 24. –
P. 1000.
42.Powdery mildew resistance genes in
wheat: identification and genetic analysis /
M.A. Alam [et al.] // Journal of Molecular Biology Research. – 2011. – Vol. 1, № 1. – Р. 20–39.
43.Griffey, C.A. Inheritance of adult-plant
resistance to powdery mildew in Knox 62 and
Massey winter wheats / C.A. Griffey, M.K. Das
// Crop Scitnce. – 1994. – Vol. 34. – P. 641–646.
44.Mapping QTL involved in adult plant resistance to powdery mildew in the winter wheat
line RE714 in two susceptible genetic backgrounds / D. Mingeot [et al.] // Plant Breeding. –
2002. – Vol. 121. – P. 133–140.
45.Evolution of resistance against powdery
mildew in winter wheat populations conducted
under dynamic mana-gement. II. Adult plant resistance / S. Paillard [et al.] // Theoretical and
Applied Genetics. – 2002. – Vol. 101, № 3. –
P. 457–462.
46.Chromosomal location of genes for resistance to powdery mildew in common wheat
(Triticum aestivum L. em. Thell.). 6. Alleles at
the Pm5 locus / S.L.K. Hsam [et al.] // Theoretical and Applied Genetics. – 2001. – Vol. 102. –
P. 127–133.
47.Bojnanska, K. Resistance and genes of
resistance against powdery mildew of selected
wheat genetic resources / K. Bojnanska // Agriculture (Poľnohospodárstvo). – 2009. – Vol. 55,
№ 1. – Р. 42–48.
Е.А. Волуевич. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе
48.Эффективность генов устойчивости
к мучнистой росе мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) в Беларуси / Е.А. Волуевич
[и др.] // Весцi НАН Беларусi. Сер.бiял.
навук. – 2006. – № 3. – С. 51–56.
49.Theoretical Bases and Sources for Breeding Wheat for Combined Disease Resistance /
Sip V. [et al.] // Czech J. Genet. Plant Breed. –
2005. – Vol. 41, № 4. – Р. 127–143.
50.Zeller, F.J. Progress in breeding for resistance to powdery mildew in common wheat
(Triticum aestivum L.) / F.J. Zeller, S.L.K. Hsam
// Proc. 9th Int. Wheat Genetics Symp., Saskatoon, 2–7 August 1998. / University of Saskatchewan; ed. A.E. Slinkard. – Saskatoon, Canada,
1998. – Vol. 1. – Р. 178–180.
51.Fajerson, F. Weibulls Folke høsthvete /
F. Fajerson, G. Svensson // Agri Hortique Genetica. – 1982. – Vol. 40. – P. 5–28.
52.Powdery mildew resistance in 155 Nordic
bread wheat cultivars and landraces / S.C. Hysing [et al.] // Hereditas. – 2007. – Vol.144. –
P. 102–119.
53.Race specific resistance to powdery mildew in Scandinavian wheat cultivars, breeding
lines and introduced genotypes with partial resistance / M. Lillemo [et al.] // Plant Breeding. –
2010. – Vol. 129. – P. 297–303.
55
54.Huang, X.Q. Molecular mapping of powdery mildew resistance genes in wheat: a review / X.Q. Huang, M.S. Roder // Euphytica. –
2004. – Vol. 137. – P. 203–223.
55.Partial resistance to powdery mildew in
German spring wheat ‘Naxos’ is based on multiple genes with stable effects in diverse environments / A. Lu [et al.] // Theor Appl Genet. –
2012. – Vol. 125. – P. 297–309.
56.Race specific resistance to powdery mildew in Scandinavian wheat cultivars, breeding
lines and introduced genotypes with partial resistance / M. Lillemo [et al.] // Plant Breeding. –
2010. – Vol. 129. – P. 297–303.
57.MlAG12: a Triticum timopheevii-derived
powdery mildew resistance gene in common
wheat on chromosome 7AL / J.J. Maxwell
[et al.] // Theoretical and Applied Genetics. –
2009. – Vol. 119. – P. 1489–1495.
58.Seedling and adult plant resistance to powdery mildew in Chinese Bread Wheat Cultivars
and Lines / Z.L.Wang [et al.] // Plant Disease. –
2005. – Vol. 89. – P. 457–463.
59.Joshi, R.K. Gene pyramiding-A broad
spectrum technique for developing durable stress
resistance in crops / R.K. Joshi, S. Nayak // Biotechnology and Molecular Biology Review. –
2010. – Vol. 5, № 3. – P. 51–60.
Дата поступления статьи 29 октября 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 581.1+581.6+615.2
В.А. Кунах, Л.П. Можилевская
Длительность жизни человека и биотехнология растений
(обзорная статья)
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
Украина, 03627, г. Киев, ул. Академика Заболотного, 150
Максимальная длительность жизни человека сегодня оценивается приблизительно в
115–120 лет. Считается, что это и есть тот срок,
когда организм даже при самых благоприятных
условиях жизни при отсутствии болезней, серьезных травм, экстремальных состояний и т.п.
исчерпывает свои генетически запрограммированные витальные потенции: эффективность
систем энергопродукции, систем сохранения
и экспрессии генетической информации, свои
адаптивные возможности; то есть способность
поддерживать иерархически сопряженные гомеостатические системы (клетка – ткань – орган –
система – целостный организм), активность
репарационных механизмов, имунный потенциал, свою личностную психоэмоциональную
и интеллектуальную идентичность на уровне,
совместимом с жизнью. Увеличение длительности человеческой жизни сверх максимальной
черты, очевидно, должно быть следствием радикального вмешательства в многочисленные
генетические факторы долголетия [1].
За последние две тысячи лет средняя длительность жизни человека неуклонно возрастала [1], что, без сомнения, стало следствием
экономического, социального и научного прогресса человечества. Если в Древнем Риме в
начале новой эры средняя длительность жизни едва достигала 25 лет, то на сегодня она
составляет в развитых странах для мужчин
74–78 лет, для женщин – 81–85 лет.
Согласно данным Всемирной организации
здравоохранения (ВОЗ), среди причин смертности населения первое место устойчиво сохраняют сердечно-сосудистые заболевания, далее идут
злокачественные опухоли и заболевания дыхательной системы. Бурное развитие производства
синтетических препаратов и их не всегда достаточно рационально обоснованное применение
привели к тому, что сотни тысяч людей ежегодно
умирают от вредного действия фармакологичеМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
ских препаратов. Смертность по этой причине
вышла на пятое место после травм. Это, а также
ряд других причин (настороженное отношение к
химическим препаратам, все возрастающая аллергизация населения, быстрое изменение условий жизни, демографической ситуации, причин
смертности) обусловливают переход прежде всего к препаратам растительного происхождения,
как к современной (иногда – умышленно прочно
забытой) альтернативе синтетическим.
75% всех больных, считают эксперты ВОЗ,
правильнее лечить не синтетическими лекарствами, а препаратами растительного происхождения. В связи с этим еще в 2000 году на
Международном фармакологическом конгрессе
в Мюнхене было провозглашено: будущее фармакологии – натуральные (природные) препараты. Тогда же во всем мире начался настоящий
бум препаратов растительного происхождения,
в том числе биологически активных добавок –
БАД. Подобные препараты эффективны и более
безопасны, чем химические соединения, и могут
влиять не на следствия болезни, а на ее причины.
Для лечения и профилактики упомянутых
выше и других заболеваний, а также в качестве антистрессовых препаратов и адаптогенов используются главным образом растения
и препараты растительного происхождения.
Фитопрепараты все шире используются и в
качестве противовирусных, антибактериальных, а также гормональных, в том числе контрацептивных средств. К примеру, сегодня
при лечении сердечно-сосудистых заболеваний и злокачественных опухолей препараты,
полученные из растений, составляют более
50%. В развитых странах общее количество
лекарственных веществ, получаемых из природных продуктов, составляет более 50% всех
лекарств, а в Японии – почти 90%. Возрастание интереса к лекарственным средствам на
основе биологически активных соединений
В.А. Кунах, Л.П. Можилевская. Длительность жизни человека и биотехнология растений.
природного, прежде всего, растительного происхождения обусловлено, как уже отмечалось,
также возрастанием аллергизации населения,
в том числе вследствие использования синтетических медицинских препаратов, которые
нередко являются ксенобиотиками.
Преимущества лекарственных препаратов
растительного происхождения детально рассмотрены в монографии [2]. Здесь отметим
лишь следующее.
В медицине сегодня используется около
300 видов растений, из них приблизительно
100 специально выращивается, а остальные –
дикорастущие. При этом большинство ценных
лекарственных растений – редкие или исчезающие виды; а к сырью из тропических, субтропических, альпийских и некоторых других
видов, преимущественно эндемичных, доступ
достаточно ограниченный. Кроме того, резко сократились и продолжают сокращаться ресурсы
обычных для центрально- и восточноевропейских стран лекарственных растений, которые
в свое время позволяли быть им (в том числе
и прежде всего – Украине, европейской части
России, Беларуси) ведущими в выращивании и
заготовке растительного сырья. Это происходит,
с одной стороны, вследствие резкого сокращения
территории для сбора дикорастущих трав из-за
химического и радиационного загрязнения, а
также часто варварских методов заготовки сырья
и, с другой – из-за невозможности выращивания
многих лекарственных растений в культуре изза их биологических особенностей или неблагоприятных климатических условий. Именно
поэтому дефицитными стали даже ландыш или
валериана. Подобная ситуация сложилась и с
тропическими и горными растениями в местах
их естественного призрастания.
Современным направлениям биологической науки – клеточной биологии и биотехнологии – удалось найти пути решения этой
проблемы. Используя методы выращивания
клеток, тканей и органов растений в контролируемых условиях на искусственных питательных средах, возможно получать растительную
биомассу в неограниченном количестве. Эта
биомасса может использоваться (и уже широко используется, о чем ниже) как лекарственное сырье, т.к. является экологически чистой,
не загрязненной химическими удобрениями,
пестицидами, гербицидами, тяжелыми ме-
57
таллами, радиоактивными изотопами и т.п.
Для получения биомассы, по качественным
параметрам близкой, а в некоторых случаях
и более качественной по сравнению с сырьем, заготавливаемым в природе, не нужны
какие-либо особые почвенно-климатические
условия. Выращивать изолированные клетки,
ткани или органы возможно в любом месте
Земли или даже в Космосе, независимо от
вида растения – дальневосточный женьшень,
тропическую раувольфию, сибирский элеутерококк, алтайский золотой корень или обычную валериану. Как свидетельствуют уже полученные, в том числе и в производственных
условиях, данные, многие клеточные линии
являются весьма производительными, например, с одного грамма каллусной ткани женьшеня клеточной линии БІО-2МК или каллуса
раувольфии змеиной штамма К-27 за один
год можно получить более 100 тонн (!) биомассы, превышающей по всем качественным
параметрам сырье, заготавливаемое в природе
(детальнее см. [2]). Таким образом, на сегодня
решен главный вопрос – доказана принципиальная возможность получения растительного
лекарственного сырья из биомассы культивируемых клеток не только в лабораторных
условиях, но и в промышленных масштабах.
Первой в мире промышленной клеточной
биотехнологией лекарственных растений стало получение биомассы культуры тканей женьшеня настоящего Panax ginseng, начатое на заводах СССР в 1972 г. Промышленный штамм
культуры тканей женьшеня БИО-2 был создан
на основе каллуса, полученного Р.Г. Бутенко в
1960 г. Детальное фармакологическое изучение
клеточной биомассы женьшеня, проведенное
Л.И. Слепян в 1960-х годах в Ленинградском
химико-фармацевтическом институте, оптимизация условий выращивания и состава питательной среды, проведенные Н.Ф. Писецкой,
разработка технологии крупномасштабного выращивания биомассы, выполненная И.В. Александровой во Всесоюзном НИИ «Биотехника», завершились созданием промышленного
регламента, широко внедренного в 70-х годах
прошлого века на заводах Главмикробиопрома
СССР. В 1991 г. клеточную биомассу женьшеня
получали на 15 заводах (в том числе на четырех – в Украине) ежегодно, начиная с 1988 г., в
количестве более 2500 кг в пересчете на сухую
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
58
В.А. Кунах, Л.П. Можилевская. Длительность жизни человека и биотехнология растений
биомассу. В эти годы на мировом рынке стоимость сухого корня дикорастущего женьшеня
была в пределах 200–300 тыс. долларов США,
плантационного – 20–30 тыс. долл., цена 1 кг
сухой биомассы культурального женьшеня
на внутреннем рынке СССР была примерно
1500 долл. США (в пределах 1300–1500 руб.).
Это позволило использовать экстракт клеточной биомассы женьшеня не только для выпуска лекарственного препарата «Биоженьшень»
(с 1989 г.), но и, начиная с 1972 г., выпускать
широкий спектр косметических и пищевых
товаров, в частности, кремов и напитков, с добавками такого экстракта. В конце 80-х годов
мы завершили создание нового клеточного
штамма женьшеня, БІО-2МК, который накапливает тритерпеновых гликозидов в несколько
раз больше, чем штамм БИО-2. Штамм БІО2МК использовался на нескольких заводах и
малых предприятиях Украины как источник
растительного сырья для фармакологического и
косметического производств в промышленных
масштабах [2–4].
С конца 1970-х гг. в СССР, в том числе на двух
заводах Украины, внедрена технология получения клеточной биомассы родиолы розовой
Rhodiola rosea. Эта технология разработана во
Всесоюзном НИИ «Биотехнология» на основе
клеточного штамма, полученного И.В. Александровой и А.Н. Данилиной, охарактеризованном и паспортизованном в отделе генетики
клеточных популяций Института молекулярной
биологии и генетики НАН Украины (В.А. Кунах, А.И. Свидченко). Клеточную биомассу родиолы использовали главным образом в парфюмерном и косметическом производствах [2–4].
В Японии в 1983 г. получена первая промышленная партия чистого вещества - нафтохинонового красителя шиконина из биомассы культивируемых клеток воробейника краснокорневого
Lythospermum erithrorhizon массой 40 кг для изготовления губной помады высшего качества.
Второй в мире технологией получения чистого
вещества было производство в Украине с 1987 г.
на Харьковском производственном химикофармацевтическом объединении «Здоровье»
алкалоида аймалина, который используется для
изготовления противоаритмических лекарственных препаратов. Эта технология разработана на
основе штаммов К-20 и К-27 культуры тканей
раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina, поМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
лученных сотрудниками отдела генетики клеточных популяций Института молекулярной
биологии и генетики НАН Украины совместно
с Ленинградским химико-фармацевтическим
институтом (ныне Санкт-Петербургская химикофармацевтическая академия) [2–5].
Сегодня клеточные биотехнологии лекарственных растений бурно развиваются в разных странах, в промышленных масштабах
получают убихинон, антоцианы, алкалоиды,
гликозиды и другие биологически активные
вещества. Например, по доступным для анализа данным, в Японии еще в 1990 г. получено
таких веществ на сумму свыше 90 млн. долл.
США, в 1995 г. – более чем на 250 млн. долл.
США. Можно сказать, что использование клеточных культур стало рутинной технологией
получения многих биологически активных
веществ растительного происхождения для
использования в медицинской, вкусопищевой,
косметичесой и др. видах промышленности.
На сегодня известно более 100 000 вторичных метаболитов растительного происхождения, в культуру in vitro введено подавляющее
большинство растений-продуцентов этих веществ. Например, только в серии монографий
под общим названием «Biotechnology in Agriculture and Forestry» издательства «Шпрингер»
(Springer-Verlag), начиная с 1986 г. подробно
описаны особенности культуры тканей лекарственных растений – представителей около
300 родов [6]. Некоторые из таких культур накапливают в 10–30 раз больше целевого продукта,
чем природные растения. Известны примеры,
когда количество вторичного метаболита в биомассе культивируемых клеток превышает его
содержание в растении на два порядка. Например, культивируемые клетки раувольфии змеиной способны накапливать до 20% алкалоида
аймалина, что в 80–100 раз больше, чем накапливает кора корня природного растения (см.
[2, 5, 7]). При достаточной производительности
культуры тканей и цены конечного биотехнологического продукта (аймалицина – 1500. долл.
США/кг, шиконина – 4000 долл./кг, камптотецина и его производных – 5000–25 000 долл./
кг) технологии рентабельны (следует отметить, что цена противоопухолевого алкалоида
таксола, который накапливается некоторыми
древесными растениями рода тис Taxus, превышает 200 000 долл./кг). Культуры таких клеток
В.А. Кунах, Л.П. Можилевская. Длительность жизни человека и биотехнология растений.
выращивают в промышленных масштабах, а
полученное сырье используют для производства лекарственных препаратов. Сейчас, разрабатывая новый фитопрепарат или препарат на
основе природных соединений растительного
происхождения, как источник сырья указывают
одновременно на интактные растения и на клеточную биомассу, выращенную in vitro.
Несмотря на ряд преимуществ, есть много
причин, сдерживающих промышленное производство биологически активных веществ растительного происхождения в биореакторах. Основными среди них, по нашему мнению, являются:
• практически в большинстве описанных случаев органы, ткани или клетки, продуцирующие в живом растении соответствующие
вещества, при введении в культуру in vitro
вследствие, прежде всего, их дедифференцирования не синтезируют эти вещества
или синтезируют их в незначительных количествах. Требуется длительная селекционная работа на клеточном уровне, а также
разработка оптимальных условий выращивания для того, чтобы культура изолированных клеток или тканей смогла достичь
оптимального уровня производства биологически активных веществ;
• по сравнению с микроорганизмами растительные клетки растут гораздо медленнее.
Для удвоения количества растительных клеток в культуре in vitro в среднем требуется
в 20 раз больше времени, чем для удвоения
количества клеток микроорганизмов. В результате, производство в больших масштабах осложняется вследствие того, что следует придерживаться специальных мер для
предотвращения инфекции при длительном
процессе производства;
• для промышленного производства нужны
клеточные культуры, характеризующиеся
высокой стабильностью продукции, однако у
многих клеточных культур при производстве
проявляется нестабильность. Часто способность отселектированных линий клеток вырабатывать целевой продукт в необходимом
количестве уменьшается после нескольких
субкультивирований. Механизмы, способствующие стабильному протеканию процессов вторичного метаболизма (накопления
веществ специализированного обмена), разнообразны и все еще изучаются;
59
• суспензионные культуры растений состоят, в основном, из агрегатов клеток различного размера. Это означает, что клетки
на поверхности агрегата и в его центре не
идентичны, что затрудняет оптимизацию
процесса производства целевого продукта. Установлено, что во время образования агрегатов различного размера между
клетками возникают морфологические
различия, которые в условиях массового производства усугубляются еще больше и вызывают высокую гетерогенность
культуры и усложняют культивирование в
ферментерах (биореакторах). Кроме того,
некоторые культуры клеток превращают
внеклеточную сахарозу в полисахариды, которые увеличивают агрегирование клеток;
• производство соответствующего вторичного
продукта в нужном количестве часто связано с индукцией органогенеза в клеточной
культуре. Например, у женьшеня получены
клоны, имеющие высокое содержание гликозидов при переходе к ризогенезу, а у мака
только в органогенных культурах происходит
биосинтез морфиновых алкалоидов (см., например, [2, 8, 9]). Это создает немало трудностей в условиях массового культивирования;
• вещества специализированного обмена,
или вторичные продукты, большинством
растительных культур не выделяются в среду, а остаются внутри клеток. Например,
это свойственно культурам, синтезирующим алкалоиды (раувольфия змеиная), что
усложняет экстрагирование целевого продукта. Часто методы экстрагирования из
клеточной биомассы и очистки конечного
продукта отличаются от методов, применяемых для растительного сырья, заготавливаемого в природе;
• вследствие крупных размеров, высокой степени обводнения и сравнительно хрупких
клеточных стенок культивируемые клетки
растений чувствительны к перемешиванию
и снабжению кислородом. Все это требует
конструирования специальных ферментеров (биореакторов).
Для повышения производительности культивируемых клеток широко и во многих случаях
успешно применяют:
• клеточную селекцию, основанную как на
спонтанной, так и на индуцированной разМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
60
В.А. Кунах, Л.П. Можилевская. Длительность жизни человека и биотехнология растений
личными мутагенами изменчивости культивируемых клеток;
• оптимизацию условий выращивания и состава
ростовых и продукционных питательных сред;
• культивирование дифференцированных
тканей или органов или индукцию дифференцировки при выращивании на продукционных питательных средах;
• использование элиситоров [2, 3, 5, 7–10].
В последнее время с этой целью применяют методы клеточной и генетической инженерии. Самым распространенным является
трансформация клеток с помощью бактерии
Agrobacterium rhizogenes и получение так называемых «бородатых корней» (hairy roots),
производительность которых в ряде случаев
значительно выше, чем обычных недифференцированных культур. Повышают синтез вторичных метаболитов также усиливая активность
соответствующего фермента. Это возможно:
• путем введения гетерологичного гена с той
же функцией от микроорганизмов или других видов растений;
• подстановкой собственного гена под более
сильный промотор;
• введением гена, кодирующего ферменты,
нечувствительные к ретроингибированию,
или гена, кодирующего антитела против энзима, являющегося конкурентом за тот же
субстрат, что и желаемый ген;
• снижением уровня катаболизма целевых
вторичных соединений.
Задачами будущих исследований, способных
превратить биотехнологию растений, в частности, лекарственных, на рутинную промышленную технологию, по нашому мнению, являются:
• углубленное изучение генетики вторичного
метаболизма;
• выделение и клонирование соответствующих генов (как структурных, так и регуляторных), что позволит создавать высокопроизводительные клеточные штаммы и
трансгенные растения с применением современных методов генетической инженерии (метаболическая инженерия биосинтеза вторичных метаболитов);
• дальнейшее совершенствование промышленных технологий выращивания изолированных органов, тканей и клеток растений
путем их упрощения;
• удешевления технологического оборудоваМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
ния биотехнологических производств.
За время изучения биосинтеза вторичных метаболитов в культуре клеток растений накоплен большой объем информации, который свидетельствует
о существовании следующих закономерностей:
• культивируемые клетки способны к синтезу практически всех классов соединений
вторичного (специализированного) обмена
(алкалоиды, стероиды, терпеноиды и др.);
• первичные культуры клеток часто содержат
незначительное количество соединений
специализированного обмена или не содержат их вовсе; однако содержание этих
соединений можно значительно повысить
путем оптимизации состава питательной
среды и подбора условий выращивания,
методами клеточной селекции, искусственного мутагенеза и др.;
• синтез некоторых конкретных соединений
(димерных индольных и морфиновых алкалоидов, карденолидов и некоторых других)
в дедифференцированных культивируемых клетках практически не происходит;
при этом выявляется четкая тенденция:
чем сложнее строение вещества и больше
специфических этапов его синтеза (после
«ответвления» от первичного метаболизма),
тем менее вероятен синтез этого соединения в клеточной культуре;
• синтез вторичных соединений, как правило, улучшается в случае замедления или
приостановки роста клеточной культуры;
• во многих случаях синтез вторичных соединений начинается только в случае появления в клеточной культуре дифференцированных (морфогенных) структур;
• стабильность синтеза вторичных соединений неодинакова для разных классов веществ и для различных клеточных культур:
синтез стероидных гликозидов, как правило, стабилен, тогда как синтез многих типов
алкалоидов нестабилен (за исключением,
например, индолиновых алкалоидов в полученных нами клеточных штаммах раувольфии змеиной, см. [2, 5, 7, 10, 11]);
• для метаболизма вторичных соединений в
культуре клеток растений часто свойственны
регрессивные изменения как в онтогенетическом, так и в филогенетическом направлении;
т.е. специализированный обмен в культуре
имеет признаки филогенетически архаичных
В.А. Кунах, Л.П. Можилевская. Длительность жизни человека и биотехнология растений.
групп растений или ювенильной стадии интактного растения; например, в культивируемых клетках мака прицветникового Papaver
bracteatum (многолетнее растение) есть в наличии сангвинарин, но отсутствует тебаин
(последний характерен для взрослого растения, сангвинарин же отсутствует в сформировавшемся растении и проявляется в листьях
растения только на первом году его жизни
[8, 9]); в культуре клеток живокости найдены
Δ7-стерины, отсутствующие в интактном растении, но характерные для филогенетически
более ранних групп растений (более детально
информация изложена в работах [2, 8, 9, 12]).
С учетом этих закономерностей создаются клеточные штаммы путем получения адекватного
генотипа (генофонда) клеточных популяций, способных к высокоэффективному синтезу желаемых
соединений и полной реализации этой способности. Технология создания высокопродуктивных
штаммов и разработки оптимальных условий их
выращивания включает следующие этапы:
• подбор вида растения-донора: различные
виды растений имеют неодинаковую способность к синтезу в культуре клеток целевого вещества, например, разные виды
мака в культуре in vitro имеют неодинаковую потенциальную способность к синтезу
целевых алкалоидов;
• подбор конкретного высокопроизводительного растения-донора для получения
клеточной культуры (исходного генотипа);
• генетические манипуляции с культурой
тканей, включая получение мутантов, сомаклонов и другие подходы клеточной
селекции, направленные на получение генетически измененных высокопроизводительных штаммов (клеточных популяций
с измененным генофондом);
• разработку состава питательной среды,
условий и способов выращивания, оптимальных для стабильной реализации генетически обусловленной способности к
синтезу целевых веществ;
• влияние на рост (пролиферацию) клеток
в культуре с целью приостановления или
замедления роста, что может изменять метаболизм клеток в направлении синтеза
веществ специализированного обмена: например, успешно применяют с этой целью
ингибиторы транскрипции и трансляции;
61
• поиск сигналов, с помощью которых в растениях происходит управление синтезом вторичных метаболитов в клетках (элиситоров,
неспецифических стрессовых факторов и т.д.)
и использование их для повышения выхода
целевого продукта в клеточных культурах;
• получение органогенных культур, например,
культуры корней, в том числе и трансформированных культур, в частности «бородатых корней» (hairy roots), что во многих случаях упрощает условия культивирования и повышает
содержание целевых вторичных метаболитов;
• получение трансгенных культур (как клеточных и тканевых, так и целостных растений) с целью синтеза целевого продукта,
например, животного происхождения, вакцин, специфических белков человека и т.п.
(молекулярное фермерство) (детальнее см.,
например, [2, 4, 12–14]).
Таким образом, на сегодня накоплено большое количество данных, свидетельствующих
о том, что в культуре тканей возможен синтез
любых известных веществ не только растительного, но и животного и даже человеческого
происхождения. Клеточные технологии получения фитопрепаратов, начиная с 1980-х годов,
все шире и все более успешно используются в
промышленном производстве. Изучение возможностей вовлечения в такое производство
все большего числа видов растений с целью
расширения арсенала получаемых ценных
соединений возрастает. В частности, только в
серии монографий «Биотехнология в сельском
хозяйстве и лесоводстве» (Biotechnology in
Agriculture and Forestry, Springer), из вышедших
с 1986 г. 64 томов 18 посвящены лекарственным и ароматическим растениям. В этих томах
описаны конкретные результаты биотехнологических исследований с лекарственными растениями различных видов, относящихся к почти
300 родам растений из различных семейств. А
некоторым лекарственным растениям посвящены отдельные выпуски, в которых детально
рассмотрены различные аспекты их биотехнологий, как клеточных так и генных [6].
«Здоровье – это состояние полного физического, психологического и социального благополучия, а не только отсутствие болезней или физических недостатков» – определение Всемирной
организации здравоохранения, предложенное
в свое время философом Сигерестом. Данное
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
62
В.А. Кунах, Л.П. Можилевская. Длительность жизни человека и биотехнология растений
классическое определение здоровья имеет в виду
и благоприятные условия проживания, и полноценное питание, и адекватное лечение. Сегодня
для улучшения условий проживання, питания,
профилактики и лечения заболеваний широко
используются современные методы биотехнологии. В ближайшем будущем едва ли не единственным источником экологически чистого и
качественного растительного сырья для пищевой, фармакологической, косметической и даже
перерабатывающей, текстильной, строительной
и др. промышленностей могут быть только растительные биотехнологии. По крупному счету,
биотехнологи готовы решать эти проблемы.
Таким образом, создание благоприятных условий проживания, полноценного питания, адек-
ватного лечения, профилактики и коррекции
стрессов, старения и тесно связаных со старением возрастных болезней, в основе которых
лежит, прежде всего, использование природных
соединений преимущественно растительного
происхождения при соответствующем их использовании могут способствовать приближению к максимально возможной длительности
жизни настолько, чтобы ее средняя длительность
в 90–100 и даже 110–115 лет стала реальностью.
И эти преклонные годы не должны быть убогим
старческим существованием, а, напротив, стать
полноценными, продуктивными и не лишенными радостей жизни. Именно на это была и будет
направлена биотехнология в целом и биотехнология лекарственных растений в частности.
Список использованной литературы
1. Тодоров, И.Н. Стресс, старение и их
биохимическая коррекция / И.Н. Тодоров,
Г.И. Тодоров. – М.: Наука, 2003. – 479 с.
2. Кунах, В.А. Біотехнологія лікарських
рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні
основи. – Київ: Логос, 2005. – 730 с.
3. Продуктивность и генетическая структура
клеточных популяций женьшеня Panax ginseng
C.A.Mey в культуре in vitro / В.А. Кунах [и др.]
// Биотехнология. – 2003. – № 3. – С. 25–35.
4. Кунах, В.А. Біотехнологія рослин для
поліпшення умов життя людини //
Біотехнологія. – 2008. – Т. 1, № 1. – С. 101–106.
5. Kunakh, V.A. Twenty five years long stable biosynthesis of ajmaline by related hormoneindependet Rauwolfia serpentina cell lines // Euromedica – Hannover – 2005, Hannover, 16–17
Juni 2005, International Congress and Exhibition, Programm. – Abstracts, P.22.
6. Biotechnology in Agriculture and Forestry. – Berlin etc.: Springer, 1986–2012. – V. 1–64.
7. Kunakh, V.A. Somaclonal variation in
Rauwolfia // Biotechnology in Agriculture and
Forestry, Somaclonal Variation in Crop Improvement II. Ed. Y.P.S. Bajaj. – Berlin etc.: Springer,
1996. – V.36. – P. 315–332.
8. Кунах, В.А. Биосинтез изохинолиновых
алкалоидов мака в природе и в культуре in vitro. 1. Мак снотворный, Papaver somniferum L.
/ В.А. Кунах, В.А. Кацан // Украинский биохимический журнал. – 2003. – Т. 75, № 5. – С. 41–54.
9. Кунах, В.А. Биосинтез изохинолиновых
алкалоидов мака в природе и в культуре
in vitro. 1. Мак прицветниковый, Papaver
bracteatum Lindl. / В.А. Кунах, В.А. Кацан
// Украинский биохимический журнал. –
2004. – Т. 76, № 5. – С. 29–44.
10. Кунах, В.А. Особенности получения
и продуктивность суспензионных культур и
клеточных клонов Rauwolfia serpentina Benth. in
vitro / В.А. Кунах, Л.П. Можилевская, С.И. Губарь
// Биотехнология. – 2001. – № 4. – С. 9–21.
11.Стабильность генома высокопродуктивных клеточных линий раувольфии
змеиной при длительном выращивании in
vitro / И.О. Андреев [и др.] // Доповіді НАН
України. – 2007. – № 10. – С. 147–152.
12.Носов, А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений.
// Биология культивируемых клеток и
биотехнология растений. – М.: Наука, 1991. –
С. 5–20.
13.Кучук, Н.В. Способы получения рекомбинантных фармацевтических белков в
растениях // Вісник Українського тов-ва
генетиків і селекціонерів. – 2003. – Т. 1. –
С. 55–61.
14.Кунах, В.А. Еволюція геному рослин в
культурі клітин in vitro: особливості, причини,
механізми та наслідки // Генетика і селекція
в Україні на межі тисячоліть. – Київ: Логос,
2001. – Т. 1 – С. 53–67.
Дата поступления статьи 6 ноября 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 635.64:631.523:581.192.2
А.И. Шапошников1, Т.С Азарова1, Л.В. Кравченко1, А.А. Бажанова2, Д.П. Бажанов2, О.Г. Бабак2,
Н.А. Некрашевич2, А.В. Кильчевский2
Корневые выделения генотипов томата
(SOLANUM LYCOPERSICUM L.), отличающихся
отзывчивостью на бактеризацию
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт
сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии,
Россия, 196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин, ш. Подбельского,3
2
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»,
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
1
Введение
Корневые выделения высших растений являются неотъемлемой частью ризосферы – зоны,
где создаются благоприятные условия для развития микроорганизмов [1]. Низкомолекулярные органические вещества, которые в процессе жизнедеятельности растения постоянно
поступают в ризосферу, выполняют как трофическую функцию, так и являются источником
физиологически активных веществ [2]. Роль
корневых экзометаболитов в развитии и функционировании микробных сообществ почвы
особо следует учитывать при интродукции в
ризосферу бактерий – продуцентов биопрепаратов для защиты и стимуляции роста растений.
Применение бактериальных биопрепаратов,
получивших широкое распространение в сельском хозяйстве, к сожалению, не всегда дает
стабильные положительные результаты. В связи с этим чрезвычайно актуальными являются исследования, направленные на селекцию
генотипов растений, наиболее отзывчивых на
интродукцию полезных микроорганизмов [3],
а также изучение генетических и биохимических механизмов, приводящих к формированию продуктивных растительно-микробных
ассоциаций. Так, в литературе известны данные о хромосомном контроле формирования
азотфиксирующей ассоциации у замещенных
линий пшеницы при инокуляции двумя видами
диазотрофов [4]. При изучении влияния корневых экзометаболитов пшеницы с различной
плоидностью генома на рост Azospirillum brasilense показано, что повышенная численность
бактерий в ризосфере диплоидных генотипов
связана с преобладанием в составе корневых
выделений органических кислот [5]. Именно
органические кислоты являются наилучшим
источником углерода для быстрого развития
азоспирилл. В работе по изучению влияния
ряда бактериальных штаммов на рост редиса и
томата, показано, что положительное влияние
бактерий связано с продукцией индолилуксусной кислоты, которая синтезируется бактериями в ризосфере при потреблении триптофана [6]. Успешное применения биоконтрольного
штамма Pseudomonas fluorescens WCS365 в ризосфере томата сорта Кармелло связано с повышенной способностью колонизировать корни,
причем конкурентная способность WCS365
в ризосфере определялась способностью утилизировать органические кислоты, являющиеся
доминирующей фракцией корневых выделений
данного сорта томата [7].
Цель настоящей работы – изучение взаимосвязи состава корневых выделений различных
генотипов томата и отзывчивости растений
на инокуляцию ростстимулирующими ризобактериями.
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования использовали образцы томата Solanum lycopersicum L. Зорка, Калинка, Линия 7, Линия 164.
Методология полевого опыта заключалась
в экспериментальных исследованиях ото-
бранных генотипов томата в двух вариантах:
1) обработка штаммом ризосферной бактерии
Burkholderia sp.418 (В 418); 2) контроль – без
обработки (К). В контроле обработку проводили средой для выращивания бактерий, развеМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
64
А.И. Шапошников и др. Корневые выделения генотипов томата (Solanum lycopersicum L.)...
денной в 0,1М MgSO4. Инокуляцию проводили погружением семян в суспензию бактерий
в 0,1М MgSO4 (титр около 108) на 15 минут.
После инокуляции для удаления излишка
влаги семена помещали на фильтровальную
бумагу. Обработанные семена раскладывали
в ящики для посева.
Для анализа состава корневых выделений
семена стерилизовали в 5% растворе гипохлорита натрия в течение 3-х минут, затем многократно промывали в стерильной воде общим
объемом 0,5 л. Контроль стерильности проводили, выкладывая контрольную партию семян в чашки Петри на богатую агаризованную
питательную среду. Растения выращивали в
условиях фитотрона при 21 °С с 16-часовым
периодом освещения (10 000 люкс) [8].
Молекулярный состав органических кислот, углеводов и аминокислот определяли
методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ). Для анализов корневых экссудатов использовали ВЭЖХ систему
JASCO LC-900 (Jasco International CO., LTD,
Япония). Органические кислоты разделяли на
ионообменной хроматографической колонке
SUPELCOGEL C-610H (Supelco Gland, Швейцария). В качестве подвижной фазы применяли раствор 10.0 мМ H3PO4, длина волны ультрафиолетового детектора составляла 220 нм.
Детектирование редуцирующих сахаров осуществляли методом послеколоночной реакции.
В качестве окрашиваемого реактива использовали раствор 2,3,5-трифенил-тетразолия хлорида. Сахара разделяли на хроматографической колонке SUPELCOSIL LC-NH2 (Supelco
Gland, Швейцария). В качестве подвижной
фазы использовали смесь ацетонитрил/вода
(85/15 об/об). Поглощение окрашенного комплекса измеряли при длине волны 487 нм. Молекулярный состав аминокислот определяли
высокочувствительным методом AccQ-Tag
(Waters, США), который основан на анализе
специфичных флуоресцирующих производных
аминокислот.
Все эксперименты проводили в трехкратной
повторности, в таблицах даны средние арифметические величины. Величина ошибок измерений представлена стандартным отклонением.
Результаты и обсуждение
Результаты полевых экспериментов 2007–
2010 гг. выявили сортовую специфику по отзывчивости томата на обработку штаммом
ризосферной бактерии Burkholderia sp.418 по
ряду признаков [9]. Показана возможность
использования отношения значения признака
в варианте с обработками микроорганизмами
к контролю для определения степени эффективности растительно-микробного взаимодействия. Кроме того, выявлена возможность
оценки эффективности такого взаимодействия
и отбора отзывчивых форм на ранних стадиях
развития по признаку «высота сеянцев».
Оценку влияния инокуляции семян томата
бактериальным штаммом на высоту сеянцев
проводили в день пикировки. Несмотря на достаточно сильное влияние факторов окружающей среды на устойчивость и эффективность
ассоциации «растение-штамм», отмечена различная реакция изучаемых генотипов томата
на бактеризацию (табл. 1).
Сорт Зорка охарактеризовал себя как генотип,
отзывчивый на инокуляцию семян штаммом
Burkholderia sp.418. В течение трех лет образец Зорка показывал достоверное увеличение
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
признака «высота сеянцев» при бактеризации и
только в последний год наблюдения это значение
признака «высота сеянцев» было близким к контрольному. Линия 7, как правило, отрицательно
реагировала на обработку изучаемым штаммом.
Однако, в 2009 году достоверной разницы по
признаку «высота сеянцев» между контрольным
и вариантом с бактеризацией не обнаружено.
Наиболее подверженными влиянию условий
окружающей среды оказались растительномикробные ассоциации с участием образцов Линия 164 и Калинка, реакция на бактеризацию по
признаку «высота сеянцев» у которых менялась
в зависимости от года исследования.
У генотипов томата, различавшихся по отзывчивости на обработку ростстимулирующим
штаммом Burkholderia sp. 418, наблюдались
различия в качественном составе и интенсивности выделения основных углеродных соединений, являющихся питательными субстратами
для ризосферных микроорганизмов. В результате хроматографического анализа корневых выделений изучаемых образцов томата было обнаружено девять органических кислот (табл. 2).
В наибольшем количестве корнями образцов
А.И. Шапошников и др. Корневые выделения генотипов томата (Solanum lycopersicum L.)...
Зорка, Линия 164 и Калинка выделялась молочная кислота, тогда как в корневых выделениях
формы Линия 7 доминировали фумаровая, молочная и лимонная кислоты. При этом лимонная кислота присутствовала только у образцов
Линия 7 и Линия 164 и ее количество составляло соответственно 19,5% и 13,1% от общего
количества выделяемых органических кислот.
65
У форм Зорка и Линия 7 не обнаружено янтарной кислоты, тогда как ее содержание во
фракции органических кислот у образцов Линия 164 и Калинка составляло в среднем около 6%. Суммарно больше всего органических
кислот в среднем выделяли корни сорта Зорка,
а у остальных исследуемых форм данный показатель был в 1,7–3,1 раза ниже.
Таблица 1
Изменение высоты сеянцев образцов томата при взаимодействии со штаммом
Burkholderia sp.418, 2007–2010 гг.
Генотипы
Калинка
Зорка
Линия 164
Линия 7
Высота
сеянцев
К*, мм
В 418, мм
% к контролю
К*, мм
В 418, мм
% к контролю
К*, мм
В 418, мм
% к контролю
К*, мм
В 418, мм
% к контролю
2007
2008
2009
2010
81,3 ± 4,8
71,4 ± 3,3
87,8
61,3 ± 5,5
68,8 ± 4,9
112,2
56,2 ± 8,0
94,2 ± 7,9
167,6
77,5 ± 4,1
66,9 ± 4,4
86,2
65,1 ± 2,8
50,2 ± 2,7
77,1
57,4 ± 3,0
65,2 ± 1,8
113,6
59,6 ± 2,3
56,4 ± 3,7
94,6
63,2 ± 2,2
53,8 ± 2,6
85,1
41,5 ± 3,8
73,0 ± 3,6
175,8
45,8 ± 2,7
60,6 ± 4,1
132,1
65,5 ± 2,0
76,9 ± 4,2
117,4
56,1 ± 2,6
58,8 ± 3,5
104,8
45,9 ± 6,5
47,6 ± 4,0
103,6
43,4 ± 4,9
42,5 ± 4,8
98,1
52,2 ± 2,3
49,2 ± 2,4
94,2
63,0 ± 2,7
50,9 ± 3,6
80,9
Среднее
значение
58,5
60,6
111,1
52,0
59,3
114,0
58,4
69,2
118,5
65,0
57,6
89,3
* – контроль; В 418 – Burkholderia sp.418
Таблица 2
Органические кислоты в корневых выделениях, мкг/растение
Органическая
кислота
Кетоглутаровая
Лимонная
Пировиноградная
Аконитовая
Янтарная
Молочная
Фумаровая
Пироглутамовая
Сумма
Калинка
Зорка
Линия 164
Линия 7
0,44 ± 0,23
–
0,39 ± 0,13
0,01 ± 0,01
0,17 ± 0,09
1,52 ± 0,96
0,01 ± 0,001
0,04 ± 0,03
2,60 ± 1,37
0,32 ± 0,17
–
0,26 ± 0,09
0,02 ± 0,01
–
7,33 ± 3,90
0,03 ± 0,01
0,07 ± 0,04
8,02 ± 3,31
0,04 ± 0,02
0,63 ± 0,27
0,21 ± 0,06
0,01 ± 0,01
0,28 ± 0,15
3,49 ± 1,66
0,01 ± 0,006
0,13 ± 0,10
4,80 ± 1,44
0,06 ± 0,04
0,72 ± 0,48
0,23 ± 0,04
0,01 ± 0,01
–
1,31 ± 0,81
1,35 ± 0,63
0,01 ± 0,01
3,69 ± 1,92
В корневых выделениях исследуемых форм
томата присутствовали семь сахаров (табл. 3).
Основную часть фракции сахаров во всех вариантах составляли фруктоза, глюкоза и мальтоза, а у образца Линия 7 также мелибиоза, отсутствовавшая у других форм. Максимальное
количество фруктозы в среднем выделяли корни сорта Зорка, глюкозы и мальтозы – образца
Линия 7. Суммарное выделение сахаров было
наибольшим у форм Зорка и Линия 7, тогда как
генотипы Линия 164 и Калинка выделяли сахаров в 3–3,5 раза меньше.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
66
А.И. Шапошников и др. Корневые выделения генотипов томата (Solanum lycopersicum L.)...
Таблица 3
Сахара в корневых выделениях, мкг/растение
Сахар
Рибоза
Ксилоза
Арабиноза
Фруктоза
Глюкоза
Мальтоза
Мелибиоза
Сумма
Калинка
0,05 ± 0,03
0,04 ± 0,02
0,05 ± 0,03
1,30 ± 0,85
0,38 ± 0,04
0,35 ± 0,18
–
2,16 ± 1,11
Зорка
0,11 ± 0,06
0,03 ± 0,02
0,03 ± 0,02
4,25 ± 2,12
2,81 ± 1,95
0,39 ± 0,14
–
7,63 ± 3,92
Качественный состав аминокислот был
идентичен у всех исследуемых генотипов
томата (табл. 4). Суммарная доля аспарагиновой и глутаминовой кислот составляла от
43% (Линия 7) до 56.9% (Линия 164), от общего количества выделяемых аминокислот.
Образцы томата значительно различались по
содержанию пролина и L-триптофана. Количество пролина в корневых выделениях сорта
Зорка было в 6,5 раза выше, чем у образца
Линия 164
0,07 ± 0,03
0,08 ± 0,01
–
1,21 ± 0,37
0,37 ± 0,05
0,57 ± 0,23
–
2,31 ± 0,68
Линия 7
0,07 ± 0,01
0,11 ± 0,07
0,03 ± 0,02
1,86 ± 0,70
3,72 ± 2,48
0,94 ± 0,67
0,50 ± 0,30
7,22 ± 4,07
Линия 164 и 18 раз выше, чем в выделениях сорта Калинка. Сорт Калинка выделял в
31,7 раза, а образец Линия 164 – в 11,5 раз
меньше пролина, чем образец Линия 7. Наименьшее содержание L-триптофана отмечено
у сорта Калинка, наибольшее – у сорта Зорка
и образца Линия 7. Максимальное количество
аминокислот наблюдалось в корневых выделениях сорта Зорка и образца Линия 7, наименьшее – у образца Линия 164.
Таблица 4
Аминокислоты в корневых выделениях, нг/растение
Аминокислота
Аспарагиновая
Серин
Глутаминовая
Глицин
Гистидин
Аргинин
Треонин
Аланин
Пролин
Тирозин
Валин
Метионин
Лизин
Изолейцин
Лейцин
Фенилаланин
Триптофан
Сумма
Калинка
254,9 ± 74,4
105,6 ± 53,2
239,8 ± 79,1
19,9 ± 6,9
78,4 ± 43,0
34,7 ± 19,3
25,6 ± 21,0
12,5 ± 1,3
1,2 ± 1,2
12,7 ± 5,1
48,6 ± 17,4
9,0 ± 7,2
43,8 ± 9,3
19,1 ± 11,0
84,0 ± 76,1
17,4 ± 10,5
0,4 ± 0,2
1007,3 ± 538,3
Зорка
276,5 ± 110,2
75,4 ± 38,7
515,7 ± 212,4
41,9 ± 28,1
13,6 ± 9,2
43,6 ± 26,2
40,8 ± 19,6
49,8 ± 24,3
21,6 ± 12,9
47,6 ± 27,1
164,1 ± 79,2
2,6 ± 1,9
55,0 ± 30,0
146,8 ± 76,5
161,0 ± 85,4
75,6 ± 40,2
25,8 ± 15,3
1757,2 ± 842,3
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Линия 164
128,9 ± 68,3
14,6 ± 8,2
137,7 ± 74,8
14,6 ± 8,4
6,2 ± 3,9
19,2 ± 10,0
10,3 ± 4,7
17,1 ± 9,4
3,3 ± 2,1
8,3 ± 5,9
33,1 ± 15,8
1,1 ± 0,8
13,2 ± 8,6
14,6 ± 8,9
29,5 ± 11,8
10,1 ± 5,6
6,7 ± 3,9
468,4 ± 222,1
Линия 7
204,8 ± 101,2
64,9 ± 26,3
393,5 ± 233,3
20,1 ± 6,2
11,3 ± 7,1
68,8 ± 35,8
36,3 ± 19,4
42,8 ± 21,5
38,0 ± 23,1
14,1 ± 7,2
141,7 ± 68,5
1,1 ± 0,7
42,2 ± 27,4
81,0 ± 45,2
132,7 ± 81,0
70,4 ± 41,0
23,6 ± 16,8
1387,0 ± 778,5
А.И. Шапошников и др. Корневые выделения генотипов томата (Solanum lycopersicum L.)...
Данные анализа корневых экссудатов были
получены на ранних сроках культивирования
растений, в период формирования микробного комплекса ризосферы, когда интродуцированные бактерии при благоприятных условиях могут оказывать существенное влияние на
рост и развитие растений. Анализ суммарных
значений трех энергетически ценных фракций корневых выделений исследуемых генотипов томата позволил предположить, что
наибольшая отзывчивость на бактеризацию
сорта Зорка связана с повышенной интен-
67
сивностью выделения органических кислот
и наиболее высоким средним значением суммарной экссудации (табл. 5). Ранее проведенные исследования (2007–2010 гг.) показали
высокий уровень отзывчивости сорта Зорка
на обработку ризосферным штаммом Burkholderia sp. 418. На ранних стадиях в момент
пикировки высота сеянцев в варианте с бактеризацией составляла 112–132% по отношению к контрольному варианту в 2007–2009 годах, только в 2010 г. значение признака было
на уровне контроля
Таблица 5
Суммарное количество корневых выделений, мкг/растение
Компонент корневых
выделений
Органические кислоты
Сахара
Аминокислоты
Сумма
Калинка
Зорка
Линия 164
Линия 7
2,60 ± 1,37
2,16 ± 1,11
1,01 ± 0,54
5,77 ± 3,00
8,02 ± 3,31
7,63 ± 3,92
1,76 ± 0,84
17,41 ± 7,32
4,80 ± 1,44
2,31 ± 0,68
0,47 ± 0,22
7,58 ±2 ,25
3,69 ± 1,92
7,22 ± 4,07
1,39 ± 0,78
12,30 ± 5,95
Следует отметить, что в отдельные годы высота сеянцев образцов Линия 164 и Калинка
превышала контроль на 68–78%, в то время
как результаты экспериментов по определению корневых экссудатов показали более низкий уровень корневой экссудации (в среднем в
2,3 и 3,0 раза), чем у сорта Зорка. Повышенная
экссудация молочной кислоты корнями отзывчивых генотипов Зорка и Линия 164 (табл. 2)
позволяет предположить о существенном ее
влиянии на эффективность взаимодействия
растений томата с ризосферным штаммом
Burkholderia sp. 418. Значения признаков, по
которым учитывали степень отзывчивости
томатов на бактеризацию в полевых исследованиях, значительно варьировали по годам
наблюдения, хотя в среднем различия по степени отзывчивости проявились достаточно
четко. Отмечена высокая степень вариабельности и при количественном анализе индивидуальных компонентов корневых экссудатов, не смотря на проведение экспериментов
по культивированию растений в одинаковых
контролируемых условиях. Возможно, вариабельность интенсивности корневой экссудации может влиять на степень реакции растений при интродукции ростостимулирующих
ризобактерий.
Заключение
Таким образом, проведенный анализ взаимодействия различных образцов томата с ризосферным штаммом Burkholderia sp. 418 позволил выявить контрастные по отзывчивости
на интродукцию бактерий генотипы. Исследование состава и интенсивности экссудации
органических кислот, сахаров и аминокислот
у изучаемых сортов и линий томата показало
характерные отличия корневой экссудации у
положительно отзывчивых форм и неотзыв-
чивых. У отзывчивых на бактеризацию образцов (Зорка, Линия 164) отмечена повышенная
экссудация органических кислот, особенно
молочной кислоты. Кроме того, в корневых
выделениях сорта Зорка наблюдалось высокое содержание фруктозы (4,25 мкг/растение).
Максимальное суммарное количество аминокислот отмечено в корневых экссудатах сорта
Зорка и образца Линия 7, наименьшее – образца Линия 164.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
68
А.И. Шапошников и др. Корневые выделения генотипов томата (Solanum lycopersicum L.)...
Список использованной литературы
1. Bais, H.P., Weir, T.L., Perry, L.G., Gilroy, S., Vivanco, J.M. The role of root exudates
in rhizosphere interactions with plants and other
organisms // Annual Review of Plant Biology. –
2006. – V. 57. – P. 233–266.
2. Walker, T.S., Bais, H.P., Grotewold, E., Vivanco, J.M. Root exudation and rhizosphere biology // Plant physiol. – 2003. – V. 132. – P. 44–51.
3. Rengel, Z. Genetic Control of Root Exudation // Plant and Soil. – 2002. – V. 245. – P. 59–70.
4. Rennie, R.J., Larson, R.I. Dinitrogen fixation associated with disomic chromosome substitution lines of spring wheat // Can. J. Bot. –
1979. – V. 57. – P. 2771–2775.
5. Кравченко, Л.В., Азарова, Т.С., Достанко, О.Ю. Влияние корневых экзометаболитов
пшеницы с различной плоидностью генома на
рост Azospirillum brasilense // Микробиология. –
1993. – Т. 62, № 5. – С. 863–868.
6. Кравченко, Л.В., Азарова, Т.С., Макаро
ва, Н.М., Тихонович, И.А. Роль триптофана в корневых экзометаболитах для
фитостимулирующей
активности
ризобактерий // Микробиология. – 2004. – Т. 73,
№ 2. – С. 195–198.75. – № 1. – P. 146–148.
7. Lugtenberg, B.J.J., Dekkers, L., Bloemberg, G.V. Molecular Determinants of the Rhizosphere Colonization by Pseudomonas // Annu.
Rev. Phytopathol. – 2001. – V. 39. – P. 461–490
8. Кравченко, Л.В., Азарова, Т.С., ЛеоноваЕрко, Е.И., Шапошников, А.И., Макарова, Н.М., Тихонович, И.А. Корневые выделения томатов и их влияние на рост и
антифунгальную активность штаммов Pseudomonas // Микробиология. – 2003. – Т. 72,
№ 1. – С. 48–53.
9. Кильчевский, А.В., Некрашевич, Н.А.,
Бабак, О.Г., Бажанов, Д.П., Бажанова, А.А.
Анализ эффективности взаимодействия коллекционных образцов томата со штаммом
ризосферной бактерии Burkholderia sp.418 /
Плодоовощеводство и декоративное садоводство. Состояние и перспективы развития:
Материалы
междунар.
научно-практич.
конференции, посвящ. 90-летию кафедры
плодоовощеводства и 170-летию Белорусской
государственной сельскохозяйственной академии. – Горки: Белорусская государственная
сельскохозяйственная академия, 2011. –
C. 105–109.
Дата поступления статьи 7 декабря 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК: 575.174.015.3
М.Е. Михайлова, Е.Л. Романишко
Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2,
pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи домашней (Sus Scrofa domesticus)
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, Академическая, 27
Введение
Каждый живой организм уникален, и его уникальность отражена в генетическом коде, носителем которого являются гены. Явление существования в популяции полиморфных локусов
получило название генетического полиморфизма. Масштабы полиморфизма ДНК таковы, что
между последовательностями ДНК двух особей
существуют миллионы различий, которые и обуславливают их индивидуальные различия [1].
В основе полиморфизма ДНК лежат вставки, делеции и изменение числа тандемных повторов. Также причиной различий (полиморфизма) генов являются изменения отдельных
нуклеотидов в молекуле ДНК, что приводит
к изменению свойств гена. Функциональная
значимость полиморфизмов связана с тем, что
они расположены в кодирующих (экзоны, гены
микроРНК и некоторые интроны, содержащие
в себе гены микроРНК) и регуляторных (промоторы, энхансеры, инсуляторы) регионах
ДНК. Вариации, затрагивающие кодирующие
фрагменты генов и отражающиеся на аминокислотной последовательности их продуктов,
встречаются относительно редко. Поэтому
именно эти, наименее представленные типы
полиморфизмов, являются предметом ассоциативных исследований генетиков [2, 3].
Одним из приоритетных направлений научнотехнической деятельности в Республике Беларусь является получение особей животных,
обладающих повышенной продуктивностью, и
исследование генетических, физиологических
и биохимических механизмов формирования
продуктивности. С этой целью в мировой прак-
тике животноводства интенсивно внедряются
методы маркер-сопутствующей селекции (MASселекции), которая является одним из современных направлений, сочетающих информацию о
молекулярно-генетических полиморфизмах или
маркерных генах (marker loci) с данными об их
фенотипическом проявлении. Поиск потенциальных генов-кандидатов активно ведется среди
генов, белковые продукты которых отвечают за
проявление количественных признаков [4].
Известно, что на ростовые процессы организма влияет комплекс эндокринных, аутокринных
и паратипических факторов. Наиболее важную
роль в этих процессах играет гормон роста
(GH – соматотропин). Регуляция синтеза гормона роста представляет собой многоуровневый каскад взаимодействий белок-рецепторов,
тесно связанных между собой. Изменение, нарушение, и тем более выпадение любого из звеньев влечет за собой изменения в работе данной
системы, которые могут привести к различиям
в фенотипических проявлениях количественных признаков продуктивности у сельскохозяйственных животных.
Современная эффективная селекционноплеменная работа в свиноводстве требует
проведения исследований, направленных на
выявление полиморфизма потенциальных
ДНК-маркеров у свиней различных пород в
Республике Беларусь.
Цель данной работы заключалась в изучении полиморфизма генов гормонального ряда
соматропиновой оси рGH/MspI, pIGF-1/HhaI,
рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI.
Материалы и методы
Исследован полиморфизм генов пролак- лая, белорусская черно-пестрая, разводимых
тинового рецептора рGH/MspI, pIGF-1/HhaI, в хозяйствах Республики Беларусь.
Ядерную ДНК выделяли из отщипа ушной
рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI, в выборке популяции (n = 134) хряков и свиноматок пород раковины животных солевым методом [5]. Исландрас и йоркшир, белорусская крупная бе- следование фрагмента генов рGH/MspI, pIGF-1/
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
70
М.Е. Михайлова и др. Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи...
HhaI, рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI проводили руемом термоциклере С 1000TM Thermal Cycler.
методом ПЦР-ПДРФ анализа. Амплификация Праймеры и режимы амплификации для каждого
осуществлялась на автоматическом программи- гена для проведения ПЦР представлены в табл. 1.
Таблица 1
Праймеры и режимы полимеразной цепной реакции по генам соматропиновой оси
у свиньи домашней (Sus Scrofa domesticus)
Ген
Последовательность праймеров
рGH/MspI
F: 5′–GCCAAGTTTTAAATGTCCCTG–3′
R: 5′–GTGTCCCTCCGGGATGTAG–3′
рIGF2/NciI
(2 intron)
F: 5′–AGACTCTGTGCGGCGGGGAGCT–3′
R: 5′–CGAGTGCGGTCCCCAATGGAT–3′
pIGF-1/HhaI
F: 5′–AGCCCACAGGGTACGGCTC–3′
R: 5′–CGAGTGCGGTCCCCAATGGAT–3′
pIGF-1R/SacII
F: 5’–AGCTATCTCTACCGGCATAA–3’
R: 5’–TCTCGAAGACCTTGCGGTACT–3’
Режим ПЦР
«Горячий
старт»:
денатурация
(95 °С – 5 мин.). 35 циклов: 95 °С –
45 c, 57 °С – 45 c, 72 °С – 2 мин.
Элонгация 10 мин. – 72 °С.
«Горячий
старт»:
денатурация
(95 °С – 5 мин.). 35 циклов: 94 °С –
30 , 68 °С – 30 с, 72 °С – 2 мин.
Элонгация 10 мин. – 72 °С.
«Горячий
старт»:
денатурация
(95 °С – 5 мин). 35 циклов: 94 °С –
45 с, 59 °С – 45 с, 72 °С – 1 мин.
Элонгация 8 мин – 72 °С.
«Горячий
старт»:
денатурация
(95 °С – 5 мин). 35 циклов: 94 °С
– 30 с, 53 °С – 30 с, 72 °С – 45 мин.
Элонгация 8 мин. – 72 °С.
В нашем исследовании мы изучили поли- длине рестрикционного фрагмента определяморфизм гена рGH/MspI. Амплификаты фраг- ли генотип животного (табл. 2).
На рис. 1 представлены аллельные варианты
мента гена рGH подвергались рестрикции
эндонуклеазой MspI (Fermentas, Литва). По гена рGH/MspI.
Таблица 2
Длина рестрикционнного фрагмента гена рGH/MspI в зависимости от генотипа особи
Генотип особи
Величина рестрикционного фрагмента, п.н.
AA
222, 147, 137
АВ
284, 222, 147, 137
ВВ
284, 222
Рис. 1. Аллельные варианты гена рGH/MspI свиньи домашней (Sus scrofa domesticus). Стрелками указаны длины рестрикционных фрагментов; М – маркер GeneRuler Low Range DNA Ladder #SM1191; АА, АВ, ВВ – генотипы животных
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
М.Е. Михайлова и др. Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи...
71
Амплификаты фрагмента гена рIGF-2 По длине ре стрикционного фрагмента
во 2 интроне подвергались рестрикции определяли генотип животного (табл. 3,
эндонуклеазой NciI (Fermentas, Литва). рис. 2).
Таблица 3
Длина рестрикционнного фрагмента гена рIGF-2/NciI в зависимости от генотипа особи
Генотип особи
Величина рестрикционного фрагмента, п.н.
AA
900, 450
АВ
900, 800, 450
ВВ*
800, 450
* – желательный генотип
А
АА
АВ
ВВ
ВВ АА
М
АА
ВВ
900 п.н.
800 п.н.
450 п.н.
Рис. 2. Аллельные варианты гена рIGF-2/ NciI свиньи домашней (Sus scrofa domesticus). М – маркер;
АА, АВ, ВВ – генотипы животных
В данном исследовании мы также изучили
полиморфизм гена pIGF-1/HhaI и рецептора
инсулиноподобного фактора роста (pIGF-1R/
SacII) у разных пород свиней, разводимых в
Республике Беларусь. Амплификаты фрагмента гена рIGF-1 и pIGF-1R подвергались
рестрикции эндонуклеазами HhaI и SacII
(Fermentas, Литва). По длине рестрикционного фрагмента определяли генотип животного
(табл. 4, 5). На рис. 3, 4 представлены аллельные варианты генов рIGF-1/Hha и pIGF-1R/
SacII.
Таблица 4
Длина рестрикционнного фрагмента гена рIGF-1/HhaI в зависимости от генотипа особи
Генотип особи
Величина рестрикционного фрагмента, п.н.
AA
151, 28
АВ
151, 116, 35, 28
ВВ
116, 35, 28
Таблица 5
Длина рестрикционнного фрагмента гена pIGF-1R/SacII в зависимости от генотипа особи
Генотип особи
Величина рестрикционного фрагмента, п.н.
AA
379
АВ
379, 235, 144
ВВ
235, 144
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
72
М.Е. Михайлова и др. Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи...
Рис. 3. Аллельные варианты гена рIGF-1/HhaI свиньи домашней (Sus scrofa domesticus). М – маркер
(FastRulerUltra Low Range DNA Ladder #SM1233); АА, АВ, ВВ – генотипы животных; А – амплификат
Рис. 4. Аллельные варианты гена рIGF-1R/SacII свиньи домашней (Sus scrofa domesticus). М – маркер
(FastRulerUltra Low Range DNA Ladder #SM1233); АА, АВ, ВВ – генотипы животных
Результаты и обсуждение
Гормон роста – это полифункциональный
эндогенный фактор, главная функция которого
направлена на стимуляцию роста и развитие
животного [9]. Ген гормона роста отвечает за
синтез соматотропина. Ген рGH локализован
на 12 хромосоме p1.4 и включает 5 экзонов и
4 интрона [6, 7, 8]. Кодирующая область состоит из пяти экзонов, общая площадь транскрипции, около 1,7 Кб. рGH – один из наиболее
исследованных среди QTL-генов. Его можно
считать прямым молекулярно-генетическим
маркером, поскольку он является структурным геном.
В нашем исследовании мы изучили полиморфизм фрагмента гена рGH/MspI длиной
506 п.о. Данные о распределении частот аллелей и генотипов по локусу гена рGH/MspI
у хряков породы белорусская черно-пестрая
(n = 17) представлены в табл. 6.
В выборке из популяции свиней белорусской
Таблица 6
Частоты аллелей и генотипов по локусу гена рGH/MspI
Предприятия
СГЦ
«Заречье,
«Вихра»,
п/з «Ленино»
Группа
животных
Количество
особей
Хряки
17
Всего генотипов
Частота
генотипов, %
АА
АВ
ВВ
АА
АВ
ВВ
14
3
–
82,35
17,65
–
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Частота
встречаемости
аллелей
А
В
0,912
±0,069
0,088
±0,069
М.Е. Михайлова и др. Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи...
черно-пестрой породы выявлен полиморфизм
гена рGH/MspI. Частота гомозигот АА-рGH/
MspI была выше, чем гетерозигот АВ-рGH/
MspI. Животных с гомозиготным генотипом
ВВ-рGH/MspI выявлено не было. Аллель А
встречался с частотой 0,912, а аллель В – 0,088.
У свиньи ген инсулиноподобного фактора
роста-2 (рIGF2) локализован на 2-й хромосоме. Этот ген определен как ген-кандидат увеличения мышечной массы и отложения жира
[10]. Ген IGF2 в геномах свиней может быть
представлен несколькими аллельными вариантами, появление которых связано с одиночными нуклеотидными заменами во втором
интроне (замена G→A), аллели А и В [11, 12].
Влияние полиморфизма, находящегося вне
кодирующей области гена, на хозяйственноценные качества свиней объясняется способ-
73
ностью аллеля дикого типа (G) связываться с
репрессорными ядерными белками и, таким
образом, подавлять транскрипцию гена IGF2.
Замена нуклеотида ингибирует это взаимодействие, что в результате сказывается на
экспрессии гена. В наследовании гена IGF-2
проявляется патернальный эффект – у потомства проявляется действие только отцовского
аллеля, что значительно облегчает селекцию
по данному гену, так как для достижения положительного эффекта у потомства достаточно
тестировать только хряков.
В нашем исследовании изучена выборка из
популяции (n = 174) хряков-производителей
по гену рIGF-2/NciI (intron2). В табл. 7 приведены данные о распределении частот аллелей
и генотипов рIGF-2/NciI в зависимости от породы свиньи.
Таблица 7
Частоты аллелей и генотипов гена pIGF-2/NciI в выборках популяций свиней
разных пород в Республике Беларусь
Порода
Количество
особей
Частота встречаемости
генотипов, %
Всего генотипов
Частота
аллелей
АА
АВ
ВВ
АА
АВ
ВВ
А
В*
Ландрас
41
1
7
33
2,44
17,07
80,49
0,110
0,890
Йоркшир
5
–
4
1
–
80,0
20,0
0,4
0,6
Белорусская крупная
белая
26
16
6
4
61,54
23,08
15,38
0,731
0,269
Белорусская чернопестрая
20
14
3
3
70,00
15,00
15,00
0,775
±0,093
0,225
±0,093
Белорусский
заводской тип
породы йоркшир
21
–
4
17
–
19,05
80,95
0,095
±0,064
0,905
±0,604
Всего
113
31
24
58
27,43
21,24
51,33
0,381
±0,046
0,619
±0,046
* – желательный аллель гена
Предпочтительным является генотип ВВрIGF-2/NciI. Согласно литературным данным,
для популяции свиней крупной черной породы,
отличающейся относительно высоким уровнем осаленности туши, характерны животные
только с генотипом АА-рIGF-2/NciI, а в ультрамясной породе пьетрен аллель А не обнаруживается вовсе [11]. В нашем исследовании гено-
тип ВВ-рIGF-2/NciI встречается с наибольшей
частотой 80,49 % у хряков породы ландрас канадской селекции. И напротив, частота генотипа АА-рIGF-2/NciI была выше у пород крупная
белая и йоркшир белорусской селекции и составляла соответственно 61,54% и 70%.
Инсулиноподобный фактор роста IGF-1 –
еще один из важнейших представителей сеМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
М.Е. Михайлова и др. Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи...
74
мейства инсулиноподобных факторов роста,
осуществляющих эндокринную, аутокринную
и паракринную регуляцию процессов роста,
развития и дифференцировки клеток и тканей
организма. Инсулиноподобными эти факторы
названы в связи с их способностью стимулировать поглощение глюкозы мышечной и жировой тканью аналогично инсулину. Одним из
важных эффектов IGF-1 является стимуляция
роста костей в длину. Рост-стимулирующий
эффект гормона роста (GH) опосредуется IGFгормонами, которые образуются под влиянием
GH в печени и других тканях. Выделены два
вида IGF: инсулиноподобный фактор роста 1
(IGF-1) и инсулиноподобный фактор роста 2
(IGF-2). Это близкие по строению белки, сходные с проинсулином. IGF-1 и IGF-2 присутствуют в сыворотке крови преимущественно
в виде комплексов со связывающими белками.
Так же как и гормон роста, оба IGF действуют
на гипоталамус и аденогипофиз по принципу
обратной связи, контролируя синтез соматолиберина и соматостатина и секрецию гормона роста. При низком уровне IGF-1 в крови
секреция соматолиберина и соматотропина
возрастает, при высоком – снижается. Таким
образом, гормон роста осуществляет биологическое действие через секрецию соматомединов (IGF-1 и IGF-2), которые образуются
в печени и других периферических тканях и
являются посредниками анаболического и ростового влияния соматотропного гормона [13,
14]. Ген рIGF-1 у свиньи находится на хромосоме 5q23–24 [15].
В нашем исследовании изучена замена
G201A в 3 экзоне рIGF-1/HhaI. В табл. 8 преведены данные о распределении частот аллелей и генотипов рIGF-1/HhaI.
Таблица 8
Частоты аллелей и генотипов гена рIGF-1/HhaI в выборках популяций свиней
разных пород в Республике Беларусь
Порода
Количество
особей
Всего генотипов
Частота встречаемости
генотипов, %
Частота
аллелей
АА
АВ
ВВ
АА
АВ
ВВ
А
В
Ландрас
40
–
–
40
–
–
100
–
1
Йоркшир
38
–
–
38
–
–
100
–
1
Белорусская крупная
белая
26
–
2
24
–
7,69
92,31
0,038
±0,038
0,962
±0,038
Белорусская чернопестрая
19
1
2
16
5,26
10,53
84,21
0,105
±0,07
0,895
±0,07
Белорусский
заводской тип
породы йоркшир
11
–
–
11
–
–
100
–
1
Всего
134
1
4
129
0,75
2,98
96,27
0,022
±0,013
0,978
±0,013
Как показал анализ генетической структуры популяций Sus Scrofa domesticus по гену рIGF-1/HhaI
у свиней пород йоркшир и ландрас канадской
селекции, полиморфизм по данному локусу гена
рIGF-1/HhaI не выявлен. В популяциях свиней
пород белорусская черно-пестрая и белорусская
крупная белая был выявлен полиморфизм рIGF-1/
HhaI. Частота аллели А составила 0,022. Частота
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
генотипа АА-рIGF-1/HhaI равна 0,75 (n = 1), АВрIGF-1/HhaI соответственно равна 2,98 (n = 4).
Согласно литературным данным, аллель А
рIGF-1/HhaI, является нежелательным и его
частота превышает частоту аллеля В в популяции тибетских свиней. Аллель А предположительно связан с низкой скоростью роста
у карликовых свиней [16].
М.Е. Михайлова и др. Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи...
Ген, кодирующий рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 (рIGF1R), локализован
на хромосоме 1 в области q1.7–p2.1 [17]. IGFIR состоит из 1367 остатков аминокислот. Ген
рIGF1R – новый маркер для репродуктивных
качеств свиноматок. Согласно результатам исследований польских ученых, у свиноматок с
75
генотипом ВВ приплод был выше по сравнению
со свиноматками с генотипами АВ и АА [18].
В нашем исследовании мы изучили полиморфизм в 9 интроне локуса гена рIGF-1R/
SacII. Данные о распределении частот аллелей
и генотипов по локусу гена рIGF-1R/SacII по
отдельным хозяйствам представлены в табл. 9.
Таблица 9
Частоты аллелей и генотипов по локусу гена рIGF-1R/SacII
Предприятие
Группа
животных
Порода
Всего
генотипов
Количество
особей
Частота
встречаемости
генотипов, %
Частота
аллелей
АА
АВ
ВВ
АА
АВ
ВВ
А
В
Йоркшир
4
4
–
–
100
–
–
1
–
Ландрас
4
2
2
–
50
50
–
0,75±
0,216
0,25±
0,216
Йоркшир
1
1
–
–
100
–
–
1
–
Ландрас
1
1
–
–
100
–
–
1
–
10
8
2
–
80
20
–
0,9±
0,095
0,1±
0,095
10
5
4
1
50
40
10
0,7±
0,145
0,3±
0,145
20
13
6
1
65
30
5
0,8± 0,978
0,089 ±0,013
Свиньи
ОАО
«Журавлиное»
Хряки
В среднем по хозяйству
СГЦ
«Заднепровский»
Всего
Хряки
Белорусская
крупная
белая
Как показал генетический анализ, в выборке
из популяции свиней пород йоркшир и ландрас
канадской селекции частота гомозиготного генотипа АА-рIGF-1R/SacII была выше (80%), чем
частота гетерозиготного генотипа (20%). Особей
с гомозиготным генотипом ВВ-рIGF-1R/SacII обнаружено не было. У породы белорусская крупная белая выявлены все возможные генотипы.
Заключение
Изучен полиморфизм генов гормонального
ряда соматропиновой оси рGH/MspI, pIGF-1/
HhaI, рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI. Определены частоты аллелей и генотипов изученных
генов в выборках пород свиньи домашней,
разводимых в Республике Беларусь. Изученные гены потенциально могут быть использованы в качестве маркеров. Такой подход
является оправданным, когда выявленные
гены имеют функции, связанные с чертами,
представляющими интерес в свиноводстве.
Поэтому в дальнейшем нами планируется
поиск ассоциаций аллельных вариантов изученных генов с хозяйственно-полезными
признаками у свиньи домашней (Sus Scrofa
domesticus).
Работа частично финансировалась грантом Б11-БРУ-014.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
76
М.Е. Михайлова и др. Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи...
Список использованных источников
1. Алтухов, Ю.П. Полиморфизм ДНК в
популяционной генетике / Ю.П. Алтухов,
Е.А. Салменкова // Генетика. – 2002. – Т. 38,
№, 9. – С. 1173–1195.
2. Ibeagha-Awemu, E.M. A critical analysis of disease-associated DNA polymorphisms in the genes of cattle, goat, sheep, and
pig / E.M. Ibeagha-Awemu, P. Kgwatalala,
А.Е. Ibeagha, X. Zhao // Mamm. Genome. –
2008. – V. 19. – P. 226–245.
3. Smith, C. The use of genetic polymorphisms in livestock improvement / C. Smith,
S.P. Simpson // Journal of Animal Breeding and
Genetics. – 1986. – V. 103. – P. 205–217.
4. Калашникова, Л.А. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий /
Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко. – Московская обл, Лесные Поляны,
ВНИИплем, 2000. – 31 с.
5. Miller, S. A simple salting out procedure
for extracting DNA from human nucleated cells /
S. Miller, D. Dykes, H.F. Polesky // Nucleic Acids Research. – 1988. – V. 16. – P. 12–15.
6. LI Jing. Identification and function of
the growth hormone gene in Rongjiang pig of
China / LI Jing, Ran Xue-Qin, Wang Jia-Fu //
Acta Physiologica Sinica. – 2006. – V. 58 (3). –
P. 217–224.
7. Location of the porcine hormone gene to
chromosome 12p1.2~p1.5 / M. Yerle [et al.] //
Journal of Animal Genetics. – 1993. – V. 24. –
P. 129–131.
8. Growth hormone gene polymorphisms and
growth performance traits in Duroc, Landrace
and Tao-Yuan pigs / W.T.K. Cheng, C.H. Lee,
C.M. Hung, I.T.J. Chang, C.M. Chen // Theriogenology. – 2000 – V. 54. – P. 1225–1237.
9. Балацкий, В.Н. Полиморфный BsuRI –
сайт рестрикции гормона роста свиньи /
В.Н. Балацкий, К.Ф. Почерняев // Цитология
и генетика. – 1995. – Т. 29, № 1. – С. 45–48.
10.An imprinted QTL with majoreffect on
muscle mass and fat deposition maps to the IGF2
locus in pigs / C. Nezer, [et al.] // Nature Genetics. – 1999. – V. 21. – P. 155–156.
11.Балацкий, В.Н. Распеделение IGF2аллелей и генотипов в породах свиней разного
направления продуктивности / В.Н. Балацкий,
Т.В. Овсяник // 7-я Международная научная
конференция-школа: «Современные дости
жения и проблемы биотехнологии сельско
хозяйственных животных: роль нано
технологий в реализации приоритетных
задач биотехнологии», БиоТехЖ. – 2008. –
Дубровицы. – 2008. – C. 125–129.
12.A NciI PCR-RFLP within intron 2 of the
porcine insulin-like growth factor 2 (IGF2) gene
/ A. Knoll [et al.] // Journal of Animal Genetics. – 2000. – V. 31. – P. 150–151.
13.Possible role of growth hormone, IGFs,
and IGF-binding proteins in the regulation
of ovarian function in large farm animals /
D. Schams [et al.] / Domestic Animal Endocrinology. – 1999. – V. – 17. – P. 279–285.
14.Developmental expression and location
of IGF-I and IGF-II mRNA and protein in skeletal muscle / D.E. Gerrard [et al.] // Journal of
Anim. – 1998. V. 76. – P. 1004–1011.
15.Assignment of the gene for porcine insulinlike growth factor 1 (IGF1) to chromosome 5 by
linkage mapping / A.K. Winteroe [et al. // Journal
of Animal Genetics. – 1994. – V. 25. – P. 37–39.
16.Polymorphisms of the Porcine Growth
Hormone Gene (pGH) in Tibet Pig / Zhang Hao
[et. al.] // Acta Agriculturae Boreali-accidentalis
Sinica. – 2010. – V. 19 (2). – P. 15–19.
17.Localization of IGF1R and EDN genes to
pig chromosomes 1 and 7 by in situ hybridization / Y. Lahbib-Mansais, M. Yerle, J. Gellin //
Cytogenetic Cell Genetics. – 1995. – V. 71 (3). –
P. 225–227.
18.Terman, A. The IGF1R gene: A new marker for reproductive performance traits in sows?
/ A. Terman // Acta Agriculturae Scandinavica,
Section A – Animal Science. – 2011. – V. 61. –
P. 67–71.
Дата поступления статьи 14 декабря 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК [633.11+633.14]:631.524.86
О.А. Орловская, Л.В. Хотылева
ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ К БИОТИЧЕСКИМ И АБИОТИЧЕСКИМ
ФАКТОРАМ ГИБРИДОВ ОЗИМОЙ ТРИТИКАЛЕ, СОЗДАННЫХ НА
ОСНОВЕ ОБРАЗЦОВ РАЗЛИЧНОГО ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Тритикале – пшенично-ржаной гибрид, сочетающий качества обоих родительских видов, и перспективная культура для производства комбикорма, крахмала, солода и спирта.
Благодаря достижениям мировой селекции,
тритикале играет все более заметную роль в
сельскохозяйственном производстве. Анализ
мировых генетических ресурсов показывает,
что в последние 10–15 лет сорта этой культуры неузнаваемо изменились. Селекционеры
преодолели многие присущие ей недостатки:
частичную стерильность цветков, морщинистость зерна, высокорослость, изреженность
стеблестоя к уборке и др. Современные сорта
тритикале успешно конкурируют по урожайности зерна и зеленой массы с лучшими сортами ржи, ячменя, овса и пшеницы. В то
же время культура не лишена ряда недостатков, к которым, в частности, относятся низкие хлебопекарные качества, склонность к
полеганию и прорастанию зерна на корню.
Наблюдается также постепенное снижение
устойчивости тритикале к воздействиям биотических и абиотических стрессов. Для решения этих вопросов необходимо расширение и
обогащение генофонда тритикале за счет вовлечения нового исходного материала [1, 2].
Ускорить создание ценных образцов помогает
сотрудничество с зарубежными партнерами
и селекционерами, обмен информацией и материалом между учеными различных стран,
расположенных в разных климатических и
почвенных зонах.
В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси имеется коллекция элитных линий озимой тритикале из Международного центра по
улучшению кукурузы и пшеницы (CIMMYT,
Мексика), которая является носителем новых
генетических источников. Из данной коллек-
ции нами отобраны 15 перспективных образцов для возделывания в условиях Беларуси [3].
Также в исследование включены 3 сорта тритикале: Михась (Беларусь), Вольтарио, Гренадо (Польша); 7 линий тритикале, созданных
в Институте генетики и цитологии на основе
изогенных по генам Vrn 1-3 линий мягкой пшеницы и озимой ржи сорта Восход [4].
Известно, что при скрещивании генетически отдаленных форм вероятность получения высокопродуктивных гибридов возрастает. В связи с этим, ранее нами была изучена
молекулярно-генетическая гетерогенность 24
образцов озимой тритикале на основе ISSRи RAPD- анализа с использованием высокополиморфных праймеров, отобранных на
основании литературных данных [5, 6]. Анализ полиморфизма фрагментов ДНК при использовании этих ISSR- и RAPD- праймеров
позволил различить образцы озимой тритикале и подобрать генетически дивергентные
родительские пары для скрещиваний [7]. По
данным молекулярного анализа, существенные различия обнаружены между линиями
тритикале, созданными в Институте генетики
и цитологии, и образцами из коллекции CIMMYT. Значения генетических дистанций, выявленные между ними, варьировали от 15,2
до 33,8. С целью расширения генофонда и
получения гетерозисных гибридов для скрещивания по схеме топкросса 6 × 4 в качестве
материнских форм использовали образцы из
Мексики и 4 линии, созданные нами. Цель
данного исследования состояла в оценке зимостойкости и устойчивости к наиболее распространенным грибным патогенам гибридов
F1 озимой тритикале, созданных на основе образцов различного эколого-географического
происхождения.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
78
О.А. Орловская, Л.В. Хотылева. Оценка устойчивости к биотическим и абиотическим факторам...
Материалы и методы
у родителей (Нср) и к лучшему родителю (истинный гетерозис – Нл).
Оценка устойчивости гибридов тритикале F1
и родительских форм к мучнистой росе (Blumeria tritici), септориозу (Septoria nodorum,
Septoria tritici) и к листовой ржавчине (Puccinia triticina) осуществлена на естественном
инфекционном фоне в полевых условиях на
Биологической опытной станции ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси».
Учет поражения грибными патогенами проводили по проценту развития болезни на флаговом листе (фаза «молочно-восковая спелость»)
по шкале Гешеле [8]. На основе полученных
данных по устойчивости проведен кластерный
анализ по методу невзвешенного попарного
арифметического среднего (UPGMA) с использованием программы Statistica, версия 7.
Материалом для исследования служили гибриды тритикале F1, полученные в результате
скрещивания в системе топкросса шести сортообразцов из коллекции CIMMYT (Мексика) – 2м, 4м, 16м, 29м, 42м, 44м и четырех
высокопродуктивных форм, синтезированных
в ИГЦ НАН Беларуси – М13/Восход, 105/12-1,
Опал/Восход, 105/12-2. Анализировали зимостойкость полученных гибридов F1 в сравнении с родительскими формами. Для оценки
зимостойкости осенью и весной подсчитывали число растений на делянках и по соотношению числа перезимовавших растений к
числу взошедших осенью определяли процент перезимовки каждого образца. Для количественной оценки гетерозиса по признаку
«зимостойкость» использовали 2 метода: по
отношению к среднему выражению признака
Результаты и обсуждение
цы коллекции CIMMYT показали зимостойкость
выше, чем у стандарта – сорта Михась, процент
перезимовки которого составил 71,7%. Исключением был только образец 16м, который характеризовался небольшим значением по данному
показателю (40%). Среди форм, полученных
нами, можно выделить Опал/Восход, степень
перезимовки которой составила 96,3%.
Воздействие низких температур – один из наиболее распространенных стрессовых факторов,
лимитирующих рост, развитие и продуктивность
культурных злаков, в связи с чем нами проведена оценка зимостойкости полученных гибридов
тритикале F1. Степень перезимовки родительских образцов тритикале колебалась от 20,0% до
100% (рис. 1). Необходимо отметить, что образ-
13 44м
/В
ос
х
10 од
5/
О
па 12
л/
Во 1
сх
10 од
5/
12
-2
М
42
м
29
м
16
м
4м
2м
М
их
ас
ь
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
стандарт
родительская форма тритикале
Рис. 1. Степень перезимовки (%) родительских форм озимой тритикале в сравнении со стандартом – сортом Михась
Процент перезимовки гибридов тритикале 24 гибридных образцов анализируемый поF1 колебался в значительных пределах – от казатель превышал стандарт – сорт тритикале
20,4 до 100%. Можно отметить, что у 12 из Михась (табл. 1).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
О.А. Орловская, Л.В. Хотылева. Оценка устойчивости к биотическим и абиотическим факторам...
79
Таблица 1
Степень перезимовки и гетерозис у гибридов тритикале F1
Гибридные комбинации
Перезимовка, %
Гср , %
Гл, %
65,52
2м × 105/12-1
80,10
31,54
14,43
2м × Опал / Восход
54,55
-34,45
-43,43
2м ×105/12-2
75,0
66,67
7,14
4м × М13 / Восход
50,0
-27,95
-34,89
4м × 105/12-1
54,0
-16,01
-29,68
4м × Опал / Восход
83,33
-3,79
-13,58
4м × 105/12-2
60,29
24,58
-21,49
16м × М13 / Восход
66,67
30,73
7,53
16м × 105/12-1
50,0
8,94
-3,46
16м × Опал / Восход
82,96
21,62
-13,97
16м × 105/12-2
58,07
93,57
45,18
29м × М13 / Восход
60,0
-25,93
-40,0
29м × 105/12-1
80,0
5,41
-20,0
29м × Опал / Восход
94,96
-3,31
-5,04
29м × 105/12-2
73,0
21,67
-27,0
42м × М13 / Восход
100
32,55
12,5
42м × 105/12-1
64,29
-8,6
-27,67
42м × Опал / Восход
83,33
-10,07
-13,58
42м × 105/12-2
80,0
46,94
-10,0
44м × М13 / Восход
66,67
-11,75
-25,17
44м × 105/12-1
87,50
24,22
-1,78
44м × Опал / Восход
82,22
-11,36
-14,74
44м × 105/12-2
20,37
-62,65
-77,14
Высокие значения по зимостойкости наблюдались в комбинациях, созданных на основе
тритикале 42м (табл. 1). Из отцовских компонентов скрещивания можно выделить Опал/
Восход. Гибриды, у которых данная линия
выступала в роли опылителя, как правило, демонстрировали зимостойкость выше 80%. Так,
у 16м × Опал/Восход степень перезимовки составила 82,9%, у 42м × Опал/Восход – 83,3%,
у 29м × Опал/Восход – 94%. Необходимо отметить, что сами родительские формы (42м и
Опал/Восход) характеризовались высокими
значениями по степени перезимовки (рис. 1).
Гетерозис по отношению к среднему
значению признака у родителей выявлен у
12 гибридных комбинаций из 24 (табл. 1).
-5,27
-6,4
2м × М13 / Восход
Уровень гетерозиса варьировал в зависимости
от комбинации скрещивания от 5,41% (29м ×
105/12-1) до 93,57% (16м × 105/12-2). Можно
отметить, что гетерозисный эффект по зимостойкости наблюдался во всех комбинациях,
созданных с участием мексиканского образца 16м. Превышение над лучшим родителем
(истинный гетерозис) по данному признаку
проявлялось несколько реже (у 5 гибридных
комбинаций из 24) и составило 7,14–48,18%
(табл. 1).
На основании полученных результатов можно выделить комбинации 2м × 105/12-1, 16м ×
105/12-2 и 42м × М13/Восход, которые по степени перезимовки значительно превосходили
обоих родителей (табл. 1).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
80
О.А. Орловская, Л.В. Хотылева. Оценка устойчивости к биотическим и абиотическим факторам...
Еще одна актуальная проблема для тритикале – создание сортов с комплексной устойчивостью к патогенам, так как патогенные
микроорганизмы наносят существенный
урон культивируемым сортам злаков, а использование химических средств защиты
требует значительных материальных затрат
и приносит большой ущерб экологии. Наиболее распространенные грибные патогены,
поражающие посевы тритикале на территории Беларуси – септориоз (Septoria nodorum,
Septoria tritici), мучнистая роса (Blumeria
tritici), бурая ржавчина (Puccinia triticina).
С целью выделения устойчивых к данным
патогенам генотипов была осуществлена
оценка гибридов озимой тритикале F1, созданных на основе образцов различного экологогеографического происхождения.
Таблица 2
Степень поражения родительских форм тритикале мучнистой росой
(патоген – B. tritici), септориозом (патогенны – S. nodorum и S. tritici)
и бурой ржавчиной (патоген – P. triticina)
Степень поражения флагового листа, %
Мучнистой росой
Септориозом
Листовой
ржавчиной
2м
0
5
0
4м
0
5
0
16м
5
5
0
29м
15–25
15
0
42м
0
0
0
44м
0
0
5
М13 / Восход
0
0
50
105/12-1
0
5
5
Опал / Восход
0
5–10
0
105/12-2
0
5
0
Генотип
Анализ устойчивости родительских форм к
мучнистой росе показал, что все линии тритикале, полученные нами, не поражались данным
патогеном (табл. 2). Большинство образцов
коллекции CIMMYT также обладало высокой
устойчивостью (степень поражения растений
не превышала 5%). Средний уровень восприимчивости к B. tritici (до 25% поражения флагового листа) отмечен только для образца 29м.
Родительские формы тритикале проявили достаточно высокую устойчивость к септориозу.
Степень поражения данным патогеном не превышала 15%, причем 70% родительских линий
характеризовались высокой резистентностью.
Восприимчивость к бурой ржавчине отмечена
только для линии М13/Восход, степень поражения листовой пластинки у которой достигала 50%. Остальные исходные генотипы были
устойчивы к P. triticina (табл. 2).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Из 24 оцененных гибридов тритикале большинство генотипов продемонстрировало высокую устойчивость к мучнистой росе (рис. 2а),
причем у 50% из них патоген не был обнаружен.
Наибольшая степень поражения флагового листа данным патогенном составила 15% и отмечена только для 8,3% генотипов, созданных на
основе чувствительного к B. tritici образца 29м.
Исследованные генотипы проявили определенную степень резистентности к септориозу: 25%
гибридных образцов характеризовались высокой
устойчивостью к данному патогену, 41,7% – относительной устойчивостью, 33,3% – средней
устойчивостью (рис. 2б). Большая часть гибридного материала характеризовалась относительной
устойчивостью к септориозу (степень поражения до 10%). Наибольшая устойчивость обнаружена для комбинаций, у которых в качестве отцовской формы использовалась линия 105/12-2
81
О.А. Орловская, Л.В. Хотылева. Оценка устойчивости к биотическим и абиотическим факторам...
а
8,3
б
8,3
8,3
25
8,3
33,3
3
83,3
1
2
83,3
41,7
1
3
2
13 2
3
Рис. 2. Оценка устойчивости гибридов тритикале F1 к мучнистой росе (а) и септориозу (б): 1 – высокоустойчивые,
2 – устойчивые, 3 – среднеустойчивые
8,3
25
8,3
33,3
83,3
1
2
3
41,7
1
2
3
Рис. 3. Оценка устойчивости гибридов тритикале F1 к бурой ржавчине: 1 – высокоустойчивые, 2 – устойчивые,
3 – среднеустойчивые
(4м × 105/12-2, 42м × 105/12-2, 44м × 105/12-2).
Среди оцененных гибридов в условиях естественного инфекционного фона бурой ржавчиной в той или иной степени поражались только
9 из 24 образцов, причем степень поражения
флагового листа большинства из них не превышала 5%. Чувствительность к данному патогену (степень поражения листовой пластинки – 50%) проявил только один гибрид 16м ×
М13/Восход. На дендрограмме, построенной
на основании результатов оценки устойчивости к трем грибным патогенам, видно, что
данный генотип сформировал отдельную
ветвь кластера. Гибриды 2м × М13/Восход и
2м × 105/12-2, обладающие средним уровнем
устойчивости к P. triticina, также значительно
отличались от изученных генотипов и объединены в отдельный кластер (рис. 4). Остальные
гибриды сгруппировались в один большой
кластер, в котором одна группа представлена
7 образцами, характеризующимися высокой
устойчивостью к мучнистой росе и ржавчине
и относительной устойчивостью к септориозу
(рис. 4). Еще одну группу сформировали генотипы, высокоустойчивые ко всем трем заболеваниям (4м × Опал/Восход, 4м × 105/12-2,
42м × М13/Восход, 44м × М13/Восход, 44м ×
105/12-2). Для гибридов 4м × М13/Восход, 29м
× Опал/Восход, 29м × 105/12-2, 44м × 105/12-1
выявлена высокая устойчивость к мучнистой
росе и бурой ржавчине, средний уровень резистентности к септориозу. 16м × 105/12-1,
16м × Опал/Восход, 29м × М13/Восход и 29м ×
105/12-1 характеризовались средней степенью
поражения флагового листа мучнистой росой
и септориозом (не более 15%).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
82
О.А. Орловская, Л.В. Хотылева. Оценка устойчивости к биотическим и абиотическим факторам...
Tree Diagram for 24 Cases
Unweighted pair-group average
Euclidean distances
2м × М13 / Восход
2м ×105/12-2
2м × 105/12-1
4м × 105/12-1
44м × Опал / Восход
2м × Опал / Восход
16м × 105/12-2
42м × Опал / Восход
42м × 105/12-1
4м × Опал / Восход
42м × 105/12-2
4м × 105/12-2
42м × М13 / Восход
44м × М13 / Восход
44м × 105/12-2
4м × М13 / Восход
29м × Опал / Восход
29м × 105/12-2
44м × 105/12-1
16м × 105/12-1
16м × Опал / Восход
29м × М13 / Восход
29м × 105/12-1
16м × М13 / Восход
0
10
20
30
40
50
Linkage Distance
Рис. 4. Дендрограмма, построенная на основании полученных данных по устойчивости к мучнистой росе,
септориозу и бурой ржавчине гибридов тритикале F1
Заключение
В результате проведенного исследования гибридов тритикале F1, созданных на основе образцов различного эколого-географического
происхождения, выявлены генотипы с высокой
устойчивостью к мучнистой росе (83,3%), бурой ржавчине (87,5%) и септориозу (25%). Резистентность одновременно к двум заболеваниям
проявило 50% изученных гибридов, к трем –
16,7%. По изученным показателям выделялись
комбинации, созданные на основе образца 42м
из коллекции CIMMYT. Гибриды 42м × М13/
Восход и 42м × 105/12-2 наряду с комплексной
устойчивостью к патогенам характеризовались
высокой степенью перезимовки, 42м × Опал/
Восход не поражался мучнистой росой, бурой
ржавчиной и проявил высокую зимостойкость
(рис. 4, табл. 1.). Полученные данные свидетельствуют о перспективности вовлечения в
гибридизацию образцов из мирового генофонда
для создания ценного исходного материала тритикале с повышенной устойчивостью к воздействиям биотических и абиотических стрессов.
Работа выполнена при финансовой поддержке БРФФИ (№ Б11-066).
Список использованных источников
1. Gruszecka, D. Yield structure of triticale
strains achieved due to crossbreeding with Aegilops / D. Gruszecka, K. Kowalczyk // Proc.
5th Inter. Triticale Symp., Radzikow, Poland,
June 30. – July 5 2002. – Vol. 2. – P. 345–349.
2. Sodkiewicz, W. Chromosomal location in
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
triticale of leaf rust resistance genes introduced
from Triticum monococcum / W. Sodkiewicz, A.
Strzembicka, B. Apolinarska // Plant Breeding. –
2008. – V. 127. – P. 364–367.
3. Орловская, О.А. Оценка продуктивности и зимостойкости элитных линий
О.А. Орловская, Л.В. Хотылева. Оценка устойчивости к биотическим и абиотическим факторам...
тритикале из коллекции Международного
центра по улучшению кукурузы и пшеницы
в условиях Беларуси / О.А. Орловская,
Л.В. Корень, Л.В. Хотылева // Материалы
Международной конференции «Интродукция,
сохранение и использование биологического
разнообразия мировой флоры», посвященной
80-летию
Центрального
ботанического
сада
Национальной
академии
наук
Беларуси», Минск, Беларусь. 19–22 июня
2012 г. – Ч. 2. – С 333–335.
4. Khotyljova, L.V. Development and study of spring triticale lines with Vrn genes /
L.V. Khotyljova, L.V. Koren, L.N. Kaminskaya // 4th International Triticale Symposium, Alberta, Canada. – 1998. – P. 21–23.
5. Sozen, E. Evaluation of ISSR markers to
assess genetic variability and relationship among
83
winter triticale (× Triticosecale Wittmack) cultivars / E. Sozen // Pak. J. Bot. – 2010. – V. 42. –
№ 4. – P. 2755–2763.
6. Nimbal, S. RAPD analysis for genetic
polymorphism in bread wheat (Triticum aestivum L.) genotypes varying for grain protein
content / S. Nimbal, R.K. Behl, A.K. Chhabra //
The South Pacific Journal of Natural Science. –
2009. – V. 27. – P. 49–56.
7. Орловская, О.А. ISSR-анализ образцов
озимой тритикале (× Triticosecale Wittmack) различного эколого-географического
происхождения / О.А. Орловская, Л.В. Корень, Л.В. Хотылева // Доклады НАН
Беларуси. – 2012. – Т. 56. – № 2. – С. 78–81.
8. Гешеле, Э.Э. Основы фитопатологической оценки в селекции растений / Э.Э. Гешеле. – М.: Колос, 1978. – 208 с.
Дата поступления статьи 14 декабря 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК [57:61+575]:004
С.Е. Дромашко
РАЗВИТИЕ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ ГЕНЕТИКИ
И БИОИНФОРМАТИКИ В БЕЛАРУСИ
(обзорная статья)
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Развитие методов прикладной математики,
возникновение кибернетики и совершенствование компьютерной техники и программного
обеспечения привело к тому, что моделирование,
применявшееся ранее в основном в физических
науках, нашло свое приложение в биологии, геологии, химии и других отраслях естествознания.
Математическое моделирование позволяет этим
наукам заглянуть вглубь явлений, описать их
точным языком формул и уравнений.
Математико-статистические методы, применяемые в биологии, разрабатываются иногда
вне зависимости от биологических исследований, но чаще в связи с задачами, возникающими в биологии, сельском хозяйстве и медицине.
Таковы работы Ф. Гальтона, внесшего большой
вклад в создание корреляционного и регрессионного анализа, и К. Пирсона – основателя
крупнейшей биометрической школы, проанализировавшего основные типы распределений,
встречающиеся в биологии. Он также предложил один из самых распространенных статистических методов – критерий «хи-квадрат»,
и развил теорию корреляции. Методология
современной биометрии создана главным образом Р. Фишером. Р. Фишер впервые показал,
что планирование экспериментов и наблюдений и обработка их результатов – неразрывно
связанные задачи статистического анализа. Он
заложил основы теории планирования эксперимента, предложил ряд эффективных статистических методов (прежде всего, дисперсионный анализ), которые широко используются
в генетико-статистических моделях или в биометрической генетике.
Генетика вообще является прекрасным примером применения математики для решения чисто биологических задач. Уже законы наследования, открытые основоположником генетики
Г. Менделем, были сформулированы на строгом математическом уровне и лежат в основе
современной генетики, являющейся, пожалуй,
наиболее математизированной наукой из всех
биологических дисциплин.
Развитие и совершенствование компьютерной техники и программного обеспечения в последней трети XX в. привели к возникновению биоинформатики – науки, занимающейся
изучением организации, функционирования,
развития, а также патологических состояний
живых систем различного уровня методами
и средствами математики и информатики.
В статье анализируется развитие математической биологии и биоинформатики в нашей стране на примере математической генетики и ряда
информационных приложений, используемых в
генетике и селекции растений, медицинской генетике, цитологии, лесоведении, онкологии и т.д.
Биометрическая генетика
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси является ведущим учреждением республики в области математической генетики и
биометрического моделирования генетикоселекционного процесса. Становление в Беларуси исследований по математической
генетике и биометрии связано с именем академика П.Ф. Рокицкого. Он – автор многократно переиздававшегося учебника «БиологичеМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
ская статистика» [1], по которому училось не
одно поколение советских биологов, а также
фундаментального руководства «Введение в
статистическую генетику» [2]. За разработку
проблем статистической генетики, внедрение
математических методов в различные области
биологии П.Ф. Рокицкому в 1974 г. была присуждена Государственная премия БССР. Его
учеником, членом-корреспондентом В.К. Сав-
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
ченко, в 1970–1977 гг. создан ряд математических и компьютерных моделей генетической
структуры диплоидных и полиплоидных популяций по качественным и количественным
признакам, предложена система сетевых пробных скрещиваний [3, 4].
В течение многих лет в Институте генетики и цитологии изучаются математические вопросы гетерозиса, совершенствования количественных методов его оценки.
В лаборатории гетерозиса и генетики количественных признаков (ныне лаборатория
экологической генетики и биотехнологии)
академиком Л.В. Хотылевой и к.б.н. Л.А. Тарутиной предложена математическая модель
и схемы анализа комбинационной способности, степени ее взаимодействия с условиями
окружающей среды при диаллельных скрещиваниях [5, 6].
85
В Белорусской государственной сельскохозяйственной академии на протяжении
многих лет биометрический подход использовался учеником Л.В. Хотылевой членомкорреспондентом А.В. Кильчевским. Им разработаны принципы и методы экологической
селекции растений с применением биотехнологии для создания высокопродуктивных,
экологически стабильных сортов, предложены
соответствующие алгоритмы и компьютерные
программы [7, 8]. В соавторстве с российскими
коллегами из Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева им также
написан ряд учебников по применению биометрии в селекционном процессе [9, 10]. В настоящее время этот подход развивается им и его
учениками также в лаборатории экологической
генетики и биотехнологии Института генетики
и цитологии НАН Беларуси.
Разработка пакетов генетико-статистических программ
Более 30 лет в институте разрабатываются
прикладные программы для ЭВМ по генетикостатистическому анализу экспериментальных
данных и математическому моделированию.
В конце 1980-х–начале 1990-х гг. в двух разных
группах независимо были созданы два пакета
прикладных биометрических программ: АБСТАТ (к.б.н. Б.Ю. Аношенко – работа начиналась
в БелНИИ земледелия и кормов) [11] и РИШОН
(д.б.н. С.Е Дромашко, С.Р. Мац, Г.И. Френкель
и др., группа автоматизации научных исследований – ныне лаборатория моделирования генетических процессов) [12, 13]. Актуальность
этих разработок подкрепляется тем, что в настоящее время на компьютерном рынке отсутствуют современные объектно-ориентированные
программные средства для обработки генетикоселекционных данных и оптимизации и ускорения процесса количественной оценки нового
генофонда растений по показателям продуктивности с учетом влияния факторов среды (общая
и специфическая комбинационная способность,
коэффициенты наследуемости, зависимость
урожайности от эколого-генетических факторов, устойчивость к основным биотическим и
абиотическим стрессам, минимизация приемов
интенсификации выращивания).
Имеющиеся статистические пакеты, например SYSTAT, STATGRAPH или STATISTICA,
нацелены на обработку обезличенных дан-
ных и поэтому не включают блока генетикостатистического анализа, учитывающего специфику требований селекционера. В отличие от
других программных биометрических продуктов того периода, таких как DAVEP-PC (Германия), БИОСТАТ (Молдова) [9], пакет РИШОН
ориентирован на запросы генетиков и селекционеров, в первую очередь растениеводов,
уступая только более позднему российскому
программному продукту AGROS [14].
Непосредственная нацеленность на генетику сельскохозяйственных растений позволила
внедрить пакет в практику учебного и научноисследовательского процессов на биологическом факультете Гомельского государственного университета, ряде кафедр Белорусской
государственной сельскохозяйственной академии. Пакет был также передан для использования на Опытную станцию по птицеводству
НАН Беларуси, в Институт генетики и физиологии хлопчатника АН Таджикистана и др.
Однако за 10 прошедших лет дизайн пакетов
АБ-Стат и РИШОН, ориентированный на MS
DOS, морально устарел. Многие программы
из этих пакетов не работают даже в среде Windows 95–98 и XT, не говоря уже о Windows 7.
Назрела необходимость их перевода на более
современную платформу. Учитывая опыт российских коллег, можно представить себе обновленный пакет в виде автоматизированного
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
86
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
рабочего места генетика-селекционера (АРМ
«АГРОПЛАНТ»), соединяющего все преимущества как генетических, так и селекционных
программ, базирующихся на биометрических
моделях.
С середины 1990-х гг. д.б.н. С.Е. Дромашко
разрабатывает теоретико-информационный
подход к анализу генетических данных
[15, 16] (в настоящее время совместно с
к.б.н. Я.И. Шейко [17]). Эту наработку также
имело бы смысл включить в новый пакет.
Кроме того, вызывают большой интерес и
могут оказаться полезными для построения и
верификации биометрических генетических
моделей компьютерные программы статистического анализа данных, разрабатываемые под
руководством члена-корреспондента Ю.С. Харина в НИИ прикладных проблем математики
и информатики Белгосуниверситета [18]. В
этом институте ведется создание математического и программного обеспечения в области
робастного (устойчивого к искажениям модельных предположений) статистического анализа
многомерных данных и временных рядов [19].
При биометрической обработке экспериментальных данных, как правило, a priori
предполагается, что они подчиняются нормальному, или Гауссову распределению, что
в биологии выполняется далеко не всегда [20,
21]. В этой связи следует напомнить работы
д.б.н. О.О. Кедрова-Зихмана (лаборатория генетики озимой ржи Института генетики и цитологии НАН Беларуси), который много внимания
уделял проверке нормальности распределений
биологических данных. Он показал, что в значительном числе случаев наблюдается сильное
отклонение от нормального распределения,
что можно определить по величине статистических моментов порядка выше второго: коэффициентов эксцесса и асимметрии (в случае
нормального распределения они равны 3 и 0
соответственно). Например, нельзя ожидать
нормального распределения при создании синтетических гибридных популяций [22].
В развитие этих представлений нами создана
программа BIODIS (BIOmetrical DIStribution)
для персональных ЭВМ, предоставляющая
биологам удобный в использовании инструмент для быстрой и надежной оценки вида
распределения экспериментальных данных
вне зависимости от их характера [23]. ПроМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
грамма позволяет сделать выбор между семью
следующими распределениями: нормальное,
биномиальное, Пуассона, t-распределение
(Стьюдента), Максвелла, геометрическое,
равномерное. При этом учитывается характер экспериментальных данных, т.е. величина
выборки (больше или меньше 20 измерений в
обрабатываемом массиве) и наличие так называемых «выбросов» (или грубых ошибок
измерений), так что экспериментатор может
задать соответствующий режим обработки.
Для оценки достоверности гипотезы о виде
распределения на выбор предлагаются три
критерия: χ2 , Колмогорова и ω2. При этом в
программу встроены рекомендации по применению того или иного критерия согласия.
Таким образом, в программное обеспечение АРМ «АГРОПЛАНТ» будут входить как
стандартные биометрические методы, так и
специализированные программы генетикостатистического анализа, распределенные по
следующим блокам:
• элементарная статистика: проверка характера распределеня, определение необходимого размера выборки для альтернативного
признака, первичная обработка генетикоселекционных данных, вычисление критериев Стьюдента и Фишера, сравнение распределений по критериям Манна-Уитни и
хи-квадрат, робастные оценки сдвига и масштаба, разбиение по классам;
• корреляционный и регрессионный анализ:
определение матрицы коэффициентов корреляции, полный корреляционный анализ,
вычисление корреляционного отношения,
нахождение линейных корреляций, вычисление корреляций по Спирмену, робастных
коэффициентов корреляции, выбор уравнения регрессии, в том числе множественной
линейной регрессии, определение нелинейной регрессии и др.;
• дисперсионный анализ: одно-, двух-, трехфакторный анализ, включая его вариации
(план рандомизированных блоков, латинский
квадрат (прямоугольник), расщепленные делянки и блоки и др.), дисперсионный анализ
альтернативных признаков и многофакторый
(до 6 факторов) дисперсионный анализ;
• многомерный анализ: построение дендрограммы, ковариационный анализ для повышения точности опыта, компонентный анализ,
-
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
87
и пластичности, вычисление путевых коэфразные виды кластерного анализа, подсчет мафициентов Райта, оценка кросс-корреляции,
трицы расстояний Махаланобиса и др.;
оценка генотипических и средовых корреля• теоретико-информационный анализ: скриций, анализ сопряженной изменчивости, понинг наиболее значимых факторов, опредестроение селекционных индексов и др.;
ление информационных потоков и их силы,
оптимизация многомерных взаимодействий • селекционное планирование и анализ: двукомпонентный метод планирования скрев малых и уникальных выборках;
щиваний, коррекция по скользящей средней,
• генетический анализ: тесты масштабности
анализ прибавки урожайности по Ильину,
Mather, объединенный тест Cavalli, двутестеринтегральная оценка селекционных номеный анализ по Perkins et al., тройной тест-кросс
ров, анализ взаимодействия генотип-среда,
F2, вычисление общей и специфической комвключая оценку стабильности по Мартынову
бинационной способности по Griffing, анализ
и вычисление эковалент по Wricke, и оценку
комбинационной способности по Campthorn,
пластичности сортов по Eberhart, Russel, учет
анализ диаллельных скрещиваний по Hayman,
пестроты почвенного плодородия и др.
определение экологической стабильности
Разработка методов анализа изображений растительных объектов
Ряд важных разработок под руководством
к.с.-х.н. А.И. Ковалевича создан к.б.н. А.П. Кончицем в лаборатории лесной селекции и семеноводства Института леса НАН Беларуси. Среди них – оригинальный программнотехнологический комплекс по компьютерной
биометрии BioCom для оценки количественных признаков древесных растений на основе
биометрического анализа изображений [24],
база данных «Селекционный фонд лесных
древесных пород Беларуси» [25] и др.
В частности, программно-технологический
комплекс BioCom позволяет более подробно
описать фенотипические признаки растений
и может быть использован при проведении
популяционно-генетических исследований.
В его состав входит ряд функциональных
блоков, позволяющих описать фенотипические признаки объектов, связанные с формой
метамерных органов (BioShape), текстуры и
окраски метамерных органов (BioTexture),
формы, окраски и текстуры микроскопических
объектов (пыльцевых зерен, пыльцевых трубок, клеточных структур) (BioMicro); провести
анализ крон деревьев, корневых систем, ветвей, сеянцев (BioRoot), проанализировать приростные керны и определить ход роста деревьев (BioKern); дать количественное описание
развития биологических объектов (BioMov).
В лаборатории хромосомной инженерии растений Института генетики и цитологии НАН
Беларуси м.н.с. О.М. Люсиковым под руководством д.б.н. И.А. Гордея разработана компьютерная программа «Кариомастер», предназначенная для накопления, представления
и анализа информации в области кариологии
растений. Данная программа является универсальным средством автоматизированного
анализа хромосомных наборов произвольного
типа. Она реализует основные интерфейсные
функции пользователя, необходимые для работы с базами данных и выполнения автоматического и полуавтоматического анализа объектов
на изображении метафазной пластинки (рис. 1).
Рис. 1. Пример работы программы «Кариомастер»
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
88
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
Программа обеспечивает следующие функции:
• настройку процедуры анализа под любой
хромосомный набор (кариотип);
• ввод изображения метафазной пластинки
в компьютер;
• автоматическую сегментацию изображения
с выделением изолированных объектов;
• автоматическую разметку выделенных объектов в предположении, что они являются
хромосомами;
• ручной режим разметки изображения отдельной хромосомы и автоматический расчет ее морфометрических параметров;
• ручной режим объединения разорванных
объектов и разделения слипшихся или перекрывающихся объектов;
• автоматическую классификацию хромосомы по рассчитанным морфометрическим
параметрам;
• автоматическое построение кариограммы
по размеченным объектам пластинки;
• возможность ручной классификации хромосом методом перетаскивания изображения хромосомы на ячейку кариограммы при
помощи мыши;
• расчет статистических параметров хромосом по множеству метафазных пластинок
с возможностью использования этих результатов для корректировки параметров
эталонного кариотипа;
• сохранение результатов измерения в базе
данных;
• возможность просмотра и редактирования
данных, хранящихся в базе данных;
• возможность обмена данными с другими приложениями через системный буфер обмена;
• настройку параметров, внешнего вида программы и панелей, представляющих результаты измерений;
• предоставление пользователю пояснений и
подсказок по работе с программой во всех
режимах при помощи встроенной контекстной справочной системы.
В качестве особенностей данной программы следует также отметить удобную систему представления информации, записанной в
базе данных, в форме древовидной структуры
вложенных папок и страниц данных. Такая система делает наглядной организацию данных,
упрощает работу с ними и дает возможность
пользователю самому определять структуру
представления данных. Еще одной особенностью программы является реализация так называемого плавающего интерфейса, который
дает возможность перемещать, изменять размеры и прятать большинство элементов программного интерфейса. Это значительно расширило возможности настройки интерфейса
в соответствии с запросами пользователя и
аппаратурными ограничениями.
Медицинские приложения биоинформатики
Важным направлением биоинформатики
является разработка методов и систем интеллектуального анализа данных и создания на
этой основе информационных технологий
поддержки принятия решений в биологии и
медицине. В Объединенном институте проблем информатики НАН Беларуси этими проблемами занимается целый ряд лабораторий.
В частности, здесь под руководством академика НАН Беларуси С.В. Абламейко и д.ф.м.н. А.В. Тузикова разработан ряд информационных систем и технологий, использующихся
в медицине [26]:
• автоматизированная система управления
медицинского учреждения, предназначенная для создания и управления информационными потоками сбора, анализа и обработки данных на основе ведения компьютерной
медицинской карты стационарного (амМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
булаторного) больного, истории болезни
и сопутствующих документов, обработки
информации по ресурсному материальнотехническому обеспечению;
• система НЕФРОН для поддержки распределенных баз данных, содержащих как графические данные (рентгенограммы, УЗИ,
томограммы), так и сопровождающие их
сведения о нефрологических больных в
Республике Беларусь; дистанционного
уточнения диагноза; прогнозирования состояния больных и выдачи рекомендаций
по их дальнейшему лечению;
• система дифференциальной диагностики
рака щитовидной железы по цитологическим изображениям.
В ряде учреждений Министерства здравоохранения Республики Беларусь ведутся исследования в области медицинского приложения
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
математического моделирования и биоинформатики – фактически разрабатываются АРМ
врача-диагноста.
В области таких медицинских приложений биоинформатики следует назвать работы
д.м.н. В.Н. Ростовцева (Белорусский центр
медицинских технологий, информатики, уп-
89
равления и экономики здравоохранения) по
созданию информационных систем для генетического анализа данных (ППС ОМЕГА
и ПРАГ-ОЗФ). В последние годы им создан
программно-аппаратный комплекс КМСД (комплекс медицинский спектрально-динамический) [27] (рис. 2).
Рис. 2. Программно-аппаратный диагностический комплекс КМСД
Комплекс позволяет оперативно проводить
пассивную, без какого-либо воздействия на
организм, диагностику:
• манифестных, латентных и предпатологических состояний и процессов по всем
органам и системам организма пациента;
• предпатологии и рисков по всем органам и
системам организма пациента;
• этиологических агентов: вирусов, бактерий, патогенных грибов, микропаразитов
и гельминтов;
• экологических факторов: аллергенов, токсикантов, физических факторов и продуктов питания;
• индивидуального соответствия организму пациента лечебно–профилактических
средств: аллопатических лекарственных
средств, фитопрепаратов, биологически
активных добавок, изопатических и гомеопатических препаратов.
КМСД и реализованная в нем технология
получили высокую оценку специалистов, а
также положительные отзывы на V Форуме
проектов Союзного государства.
В РНПЦ «Мать и дитя» (д.м.н. Е.Г. Ильина) в сотрудничестве с Белорусским государственным университетом информатики и радиоэлектроники (к.т.н. С.В. Колосов) ведутся
работы по созданию компьютерных средств
диагностики в клинической генетике (программа SynDiag и др.). В частности, SynDiag
(версия 4.2) является диагностической программой, работающей под операционными
системами семейства Windows (98–2000 (NT)–
XP) [28]. Программа SynDiag предназначена
для диагностики:
• MCA/MR синдромов, т.е. синдромов множественных врожденных аномалий/психической отсталости, различной этиологии
(моногенной, хромосомной, тератогенной
и т.д.);
• эктодермальных и скелетных дисплазий;
• некоторых системных аномалий.
Программа также может быть использована
в качестве учебника по синдромологии и предназначена для любого врача, который в своей
практике сталкивался с пациентами с нарушениями развития.
В НИИ прикладных проблем математики
и информатики Белгосуниверситета ведется
разработка математического и программного обеспечения медицинской диагностики. В
частности, в НИЛ статистического анализа
и моделирования разработан и внедрен в онкодиспансерах Министерства здравоохранения Республики Беларусь программный комМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
90
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
плекс диагностики злокачественных опухолей
основных локализаций с использованием робастных статистических решающих правил,
а также компьютерная система диагностики
метастатического поражения регионарных
лимфатических узлов у больных меланомой
кожи [29].
В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси к.б.н. О.В. Квитко, к.б.н. Я.И. Шейко и
к.б.н. И.И. Коневой (лаборатория моделирования генетических процессов) разработаны
оборудование и технология долговременной
компьютерной видеомикроскопии живых
клеток [30–32]. Компьютерная система для
видеонаблюдения живых клеток состоит из
инвертированного микроскопа с присоединенной видеокамерой, которая подключена к
компьютеру. Для видеозаписи и анализа полученных видеофильмов наряду со стандартным
программным обеспечением, используются
оригинальные компьютерные программы, разработанные к.б.н. Я.И. Шейко.
С использованием витальной компьютерной
видеозаписи микроскопических изображений
клеточных культур in vitro получена серия
видеофильмов, демонстрирующих процесс
формирования индивидуального клеточного
клона на протяжении ряда последовательных
митотических делений. Анализ полученной
родословной позволил изучить на уровне единичных клеток и их потомства процесс формирования гетерогенности клеток в предраковой
(иммортализированной) клеточной линии фибробластов мыши.
На основе предложенного ими прототипа в
рамках ГНТП «Эталоны и научные приборы»
ГНПО «Планар» (НТЦ «Микроскопия» –
структурное подразделение ОАО «Оптоэлектронные системы») совместно с академическими Институтами генетики и цитологии и тепло- и массообмена создан автоматизированный комплекс «Цитомир»,
способный обеспечить многократное компьютерное фотографирование многих (до
нескольких сотен) различных участков ростовой поверхности долговременных клеточных культур (рис. 3). Видеокомплекс
«Цитомир» обладает экономическим эффектом по импортозамещению 150 тысяч евро,
а также имеет значительный экспортный потенциал, что позволяет рекомендовать его к
серийному производству.
Рис. 3. Компьютерный видеокомплекс «Цитомир» для изучения живых клеток
С помощью технологии компьютерной
видеомикроскопии в 2011–2012 гг. удалось
подтвердить данные начала 1990-х гг. об
антираковом эффекте ДНК, выделенной из
эритроцитов цыпленка [33]. В свете явления
РНК-интерференции это открывает новые перспективы в разработке методов онкотерапии
с использованием специфических олигонуклеотидов [34].
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Говоря о нейроинформатике – науке, изучающей нейроподобные способы обработки информации при помощи компьютеров,
необходимо сказать, что в Объединенном
институте проблем информатики НАН Беларуси работает лаборатория биоинформатики
(к.т.н. И.Э. Том), одним из направлений исследований которой является развитие интеллектуальных методов обработки и анализа дан-
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
91
ных, основанное на нейросетевых моделях ся методы и алгоритмы обучения нейрон[35]. В лаборатории идентификации систем ных сетей в задачах распознавания и управ(д.т.н. Р.Х. Садыхов) ОИПИ разрабатывают- ления [36].
Создание информационных ресурсов и компьютерных программ
в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси
С 2005 г. в Институте генетики и цитологии
НАН Беларуси большое внимание уделяется
созданию информационных ресурсов. Всего
их насчитывается уже свыше 40, в том числе:
• Электронная энциклопедия по генетике
(академик Н.А. Картель, д.б.н. С.Е. Дромашко, к.б.н. Е.Н. Макеева и др., 2005);
• С и с т е м ы « М а р к ё р » и « Б е т а - г а л »
(к.б.н. Я.И. Шейко, 2006);
• Веб-сайт, посвященный изучению клеточного старения (к.б.н. Я.И. Шейко,
к.б.н. О.В. Квитко, к.б.н. И.И. Конева, 2007);
• База данных «Генетический полиморфизм популяций этнических белорусов»
(к.б.н. Л.Н. Сивицкая, к.б.н. Е.И. Кушнеревич, к.б.н. Н.Г. Даниленко и др., 2008);
• База данных морфологических признаков у
отдаленных гибридов F1–F2 от скрещивания
сортов мягкой пшеницы с дикорастущими
видами трибы Triticeae (к.б.н. Л.В. Корень,
к.б.н. О.А. Орловская, академик Л.В. Хотылева, 2009);
• База данных анатомических и физикохимических маркеров качества льноволокна селекционных образцов льна-
долгунца (Т.В. Никитинская, В.Н. Леонтьев,
д.б.н. В.В. Титок, 2009);
• Справочно-информационная система для
молекулярно-генетической паспортизации карпа (д.б.н. С.Е. Дромашко, к.б.н.
Я.И. Шейко, О.Ю. Конева, 2010);
• База данных «Генетическая коллекция тетраплоидных пшенично-ржаных амфидиплоидов» (к.б.н. Н.И. Дубовец, к.б.н.
Е.А. Сычева, Л.А. Соловей, Т.И. Штык,
Е.Б. Бондаревич, 2010);
• Электронный ресурс «Генетический мониторинг на примере популяций моллюсков
Lymnaea stagnalis из регионов с различной
экологической нагрузкой» (О.Ю. Конева,
2012) и многие другие.
В 2012 г. началась регистрация таких объектов интеллектуальной собственности, как
компьютерные программы. Национальным
центром интеллектуальной собственности
уже выданы свидетельства на 3 программы
(диагностика митохондриальных синдромов
“Belmitocombat”, к.б.н. Н.Г. Даниленко и др.,
обработка данных компьютерной видеомикроскопии «Маркёр» и “Stain”, к.б.н. Я.И. Шейко).
Заключение
Математическая биология и биоиноформатика относятся к числу высоких технологий
современной биологии, биомедицины и биотехнологии, обеспечивая информационнокомпьютерные и теоретико-математические
основы генетики и селекции, молекулярной
биологии, генетической и белковой инженерии, медицинской генетики, нейробиологии,
иммунологии и эпидемиологии, популяционной биологии и экологии [37].
В ряде учреждений Беларуси ведутся исследования в этом направлении, имеются высококвалифицированные специалисты и соответствующие научные подразделения, но
нет объединяющего или координирующего
центра. В БГУ кафедрой биофизики физического факультета ведется чтение ряда предметов (компьютерный эксперимент в биофизике,
генетическая инженерия, протеомика, биофизика сложных систем, нанобиотехнологии,
клеточная информатика и др.) [38], имеющих
непосредственное отношение к математической биологии и биоинформатике, но специалистов этого профиля официально в стране
не готовят. Не существует и ученого совета, в
котором можно было бы защитить диссертацию
по специальности «Математическая биология,
биоинформатика», до сих пор не разработан
ее паспорт, хотя в Номенклатуре специальностей научных работников Республики Беларусь
она значится под шифром 03.01.09 (физикоматематические, биологические и медицинские
науки) [39]. В республике отсутствуют учебники
и учебные пособия по этой дисциплине, первая и
пока единственная монография появилась только
в 2009 г. [40], и охватывает она преимущественно
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
92
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
биологические и медицинские аспекты, т.е.
не способна дать полноценную информацию
для соискателей степени кандидата физикоматематических наук.
Справедливости ради надо сказать, что недавно генеральный директор Объединенного
института проблем информатики НАН Беларуси д.ф.-м.н. А.В. Тузиков выступил с предложением создать рабочую группу по подготов-
ке паспорта этой специальности и программы
экзамена кандидатского минимума. Если к
этому добавить еще и подготовку соответствующего учебного пособия, можно было бы высказать уверенность, что опыт и достижения
белорусских ученых в области математического
моделирования и информационных технологий
будут реализованы и страна сможет занять
достойное место в современной биотехнологии.
Список использованных источников
1. Рокицкий, П.Ф. Биологическая статистика / П.Ф. Рокицкий. – Минск: Вышэйшая
школа, 1973. – 319 с.
2. Рокицкий, П.Ф. Введение в статистическую генетику / П.Ф. Рокицкий. – Минск:
Вышэйшая школа, 1974. – 448 с.
3. Савченко, В.К. Генетика полиплоидных
популяций / В.К. Савченко. – Минск: Наука и
техника, 1976. – 240 с.
4. Савченко, В.К. Генетический анализ
в сетевых пробных скрещиваниях /
В.К. Савченко. – Минск: Наука и техника,
1984. – 223 с.
5. Турбин, Н.В. Диаллельный анализ
в селекции растений / Н.В. Турбин,
Л.В. Хотылева, Л.А. Тарутина. – Минск:
Наука и техника, 1974. – 181 с.
6. Хотылева, Л.В. Взаимодействие генотипа и среды / Л.В. Хотылева, Л.А. Тарутина. –
Минск: Наука и техника, 1982. – 109 с.
7. Кильчевский, А.В. Генотип и среда
в селекции растений / А.В. Кильчевский,
Л.В. Хотылева. – Минск: Наука и техника,
1989. – 191 с.
8. Кильчевский, А.В. Экологическая гене
тика растений / А.В. Кильчевский, Л.В. Хотылева. – Минск: Тэхналогія, 1997. – 372 с.
9. Смиряев, А.В. Биометрия в генетике и
селекции растений / А.В. Смиряев, С.П. Мартынов, А.В. Кильчевский. – М.: Изд-во
МСХА, 1992. – 269 с.
10.Смиряев, А.В. Генетика популяций и
количественных признаков / А.В. Смиряев,
А.В. Кильчевский. – М.: КолосС, 2007. –
269 с.
11.Аношенко, Б.Ю. Программы анализа
и оптимизации селекционного процесса
растений / Б.Ю. Аношенко // Генетика. –
1994. – Т. 30 (прил.). – С. 8–9.
12.Дромашко, С.Е. О логической схеме
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
и структуре пакета прикладных программ
по генетико-статистическим расчетам /
С.Е. Дромашко, С.Р. Мац, Г.И. Френкель //
Генетика. – 1995. – Т. 31, № 9. – С. 1314–1316.
13.Дромашко, С.Е. Пакет прикладных генетико-статистических программ для персональных ЭВМ РИШОН: пути совершенствования / С.Е. Дромашко, О.М. Пятковская,
Е.М. Клевченя // Весцi АН Беларусi. Сер.
бiял. навук. – 1997. – № 1. – С. 67–70.
14.Мартынов, С.П. Статистический и биометрико-генетический анализ в растениеводстве и селекции. Пакет программ
AGROS,
версия
2.09.:
руководство
пользователя / С.П. Мартынов. – Тверь,
1999. – 90 с.
15.Дромашко, С.Е. О возможности исследования генетических систем с помощью
информационно-логического
подхода
/ С.Е. Дромашко, Г.И. Френкель, Б.О. Дубовской // Генетика. – 1995.– Т. 31, № 1. –
С. 139–143.
16.Дромашко, С.Е. Теоретико-информационный анализ генетических процессов.
Новая компьютерная программа в формализме
Excel / С.Е. Дромашко, А.В. Мащиц //
Генетика и селекция в XXI веке. – Минск,
2002. – С. 364–365.
17.Дромашко, С.Е. Разработка метода
компьютерного анализа данных на основе
теоретико-информационного формализма /
С.Е. Дромашко, Я.И. Шейко // Молекулярные,
мембранные
и
клеточные
основы
функционирования биосистем: Междунар.
научн. конф.; 8-й съезд Бел. обществ. об-ния
фотобиол. и биофиз., 25–27 июня 2008 г.,
Минск, Беларусь: сб. статей. – Минск: Изд.
центр БГУ, 2008. – Ч. II. С. 292–294.
18.НИИ прикладных проблем математики и информатики БГУ [Электрон.
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
ресурс] / Белорусский государственный
университет. – Режим доступа: http://www.
bsu.by/ru/main.aspx?guid=7281.
–
Дата
доступа: 27.11.2012.
19.Математическая и прикладная статистика [Электрон. ресурс] / НИИ прикладных
проблем математики и информатики БГУ. –
Режим доступа: http://apmi.bsu.by/research/
statistics.html. – Дата доступа: 27.11.2012.
20.Реброва, О.Ю. Описание процедуры и
результатов статистического анализа медицинских данных в научных публикациях.
Часть I. Описание статистического анализа в разделе «Материалы и методы».
Представление данных в разделе «Результаты»
/ О.Ю. Реброва // Международный журнал
медицинской практики. – 2000. – № 4. –
С. 43–46.
21.Леонов, В. Логистическая регрессия
в медицине и биологии / В. Леонов // Биометрика – журнал для медиков и биологов,
сторонников
доказательной
медицины
[Электрон. ресурс]. – Режим доступа: http://
www.biometrica.tomsk.ru/logit_1.htm. – Дата
доступа: 27.11.2012.
22.Кедров-Зихман, О.О. Поликросс-тест в
селекции растений / О.О. Кедров-Зихман. –
Минск: Наука и техника, 1974. – 128 с.
23.Дромашко, С.Е. Новая компьютерная
программа для подбора вида распределения
биологических данных / С.Е. Дромашко,
О.М. Громыко // Весцi НАН Беларусі, сер.
бiял. навук. – 1999. – № 1. – С. 28–30.
24.Ковалевич, А.И.
Программно-технологический
комплекс
компьютерной
биометрии BioCom и результаты его опытной
эксплуатации / А.И. Ковалевич, А.П. Кончиц
// Трансграничное сотрудничество в области
охраны окружающей среды: состояние и перспективы развития: материалы международной
научно-практической
конференции. – Гомель, 2006. – С. 316–320.
25.Кончиц, А.П. База данных по учету
селекционно-генетических ресурсов лес-ных
древесных пород / А.П. Кончиц, А.И. Ковалевич, Е.И. Сукач // Леса Беларуси
и
их
рациональное
использование:
Международная научно-техническая конференция. – Минск, 2000. – С. 19–21.
26.Разработки ОИПИ НАН Беларуси
[Электрон. ресурс] / Объединенный институт
93
проблем информатики. – Режим доступа:
http://uiip.bas-net.by/work/dev_uiip/index.
php. – Дата доступа: 27.11.2012.
27.Комплекс медицинский спектральнодинамический
[Электрон.
ресурс].
–
Режим доступа: http://www.kmsd.su/about/
annotation/. – Дата доступа: 27.11.2012.
28.SynDiag is the best syndromal diagnosis computer program [Электрон. ресурс]. –
Режим доступа: http://kolosov.tripod.com/. –
Дата доступа: 27.11.2012.
29.НИЛ статистического анализа и моделирования [Электрон. ресурс]. / НИИ прикладных проблем математики и информатики
БГУ. – Режим доступа: http://apmi.bsu.by/structure/stam.html. – Дата доступа: 27.11.2012.
30.Анализ пролиферации и дифференцировки нормальных (стареющих) фибробластов человека и мыши с помощью
прижизненной
видеомикроскопии
/
Я.И. Шейко [и др.] // Доклады НАН
Беларуси. – 2002. – Т. 46, № 1. – С. 90–94.
31.Hunting the mechanisms of self-renewal
of immortal cell populations by means of realtime imaging of living cells / O.V. Kvitko [et al.]
// Cell Biology International. – 2005. – Vol. 29. –
P. 1019–1024.
32.Time-lapse microscopy of living cells in
vitro / O.V. Kvitko [et al.] // Proceedings of the
International Conference “Optical Techniques
and Nanotools for Material and Life Sciences”. –
Minsk, 2010. – Vol. 2. – P. 220–223.
33.Квитко, О.В. Антираковый эффект экзогенных нуклеиновых кислот / О.В. Квитко,
Л.Н. Жукова, И.И. Конева // Доклады АН
Беларуси. – 1992. – Т. 36, № 7–8. – С. 652–655.
34. Биологические эффекты экзогенных
полинуклеотидов
и
перспективы
их
использования в медицине (обзорная статья) /
О.В. Квитко [и др.] // Молекулярная и прикладная
генетика. – 2012. – Т. 13. – С. 126–135.
35.Лаборатория биоинформатики [Электрон. ресурс] / Объединенный институт
проблем информатики. – Режим доступа:
http://uiip.bas-net.by/structure/l_bi/index.php. –
Дата доступа: 27.11.2012.
36.Лаборатория идентификации систем
[Электрон. ресурс] / Объединенный институт
проблем информатики. – Режим доступа:
http://uiip.bas-net.by/structure/l_is/index.php. –
Дата доступа: 27.11.2012.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
94
С.Е. Дромашко. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси...
37.Институт математических проблем
биологии РАН [Электрон. ресурс] / Пущинский
научный центр РАН. – Режим доступа: http://
www.psn.ru/index.php?option=com_conten
t&view=article&id=55&Itemid=60. – Дата
доступа: 27.11.2012.
38.Кафедра биофизики [Электрон. ресурс] / Официальный cайт Физического
факультета Белорусского государственного
университета. – Режим доступа: http://www.
physics.bsu.by/biophys/index.html. – Дата
доступа: 27.11.2012.
39.Номенклатура специальностей научных работников Республики Беларусь
[Электрон. ресурс] / Высшая аттестационная
комиссия Республики Беларусь. – Режим
доступа: http://www.vak.org.by/index.php?go=
Pages&in=view&id=102. – Дата доступа:
27.11.2012.
40.Дромашко, С.Е. Очерки биоинформатики / С.Е. Дромашко. – Минск: Беларуская
навука, 2009. – 400 с.
Дата поступления статьи 30 ноября 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 573.6:579.64.071
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич
конъюгационный перенос генов деградации симазина
Herbaspirillum huttiense В601 в родственные бактерии
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Хлорированные симм-триазиновые гербициды (симазин, атразин, пропазин) десятилетиями использовались в борьбе с сорняками
на посевах кукурузы, ряда полевых и овощных
культур. Широкое применение хлорированных симм-триазинов в практике интенсивного
земледелия привело к их накоплению в обрабатываемых почвах, затруднив или сделав невозможным чередование культур [1]. Длительное использование этих гербицидов приводит
к их проникновению в грунтовые воды [2].
Перспективный подход для восстановления загрязненных почв ─ применение биопрепаратов
на основе микроорганизмов, осуществляющих
минерализацию симм-триазинов, в том числе рекомбинантных штаммов-деструкторов [3].
Ранее из ризосферы кукурузы нами была изолирована бактерия Herbaspirillum
huttiense В601, способная к деградации симмтриазиновых гербицидов благодаря присут-
ствию генов smzA, -B и ‑C, локализованных на
крупной плазмиде и гомологичных соответственно генам atzА, -В, и -С из Pseudomonas sp.
ADP [4]. Известно, что плазмида утилизации
атразина бактерии Pseudomonas sp. ADP легко переносится и экспрессируется в E.coli [5],
а ключевые гены его деградации у различных
бактерий обладают высокой степенью сходства [6]. Гены smzA, -B и ‑C при конъюгации
передаются из штамма В601 в его Smz- производные как за счет мобилизации второй резидентной плазмидой меньшего размера, так и
с помощью плазмиды pSa [7,8]. Тем не менее,
перенос способности утилизовать симазин из
H. huttiense В601 в неродственные грамотрицательные бактерии оказался затруднительным
[9]. Целью данной работы было исследование
закономерностей конъюгационного переноса
smz генов H. huttiense В601 в бактерии других
видов рода Herbaspirillum.
Материалы и методы
При проведении скрещиваний в качестве донора использовали минерализующую симазин
бактерию Herbaspirillum huttiense В601 (дикий
тип), в качестве реципиентов – спонтанные
устойчивые к рифампицину (Rifr) мутанты
штаммов Herbaspirillum huttiense DSM 10281T,
Herbaspirillum seropedicae A95, Herbaspirillum
seropedicae A57, Herbaspirillum seropopodicae
SmcI [10] и Herbaspirillum frisingense B416 [11].
Культуры бактерий рода Herbaspirillum выращивали в среде TY (триптон – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 1 г/л, СaCl2 – 0,2 г/л, pH 7,0) или
S (глюкоза – 4 г/л, симазин – 0,5 г/л, K2HPO4 –
0,5 г/л, MgSO4∙7H2O – 0,2 г/л, CaCl2 – 0,02 г/л,
pH 7,3–7,5) при 28˚С. Для получения твердых
сред использовали бактериологический агар
Difco (15 г/л) или аналогичного качества.
Скрещивания проводили на твердой среде
TY. Смешивали свежие суточные культуры
донора и реципиента в логарифмической фазе роста в соотношении 1:10 и 50 мкл смеси
переносили на стерильный фильтр Millipore
(ø ≈ 0,2μ), помещенный на поверхность среды.
После инкубирования чашек при 28 °С в течение ночи бактерии с фильтров смывали 0,1 М
раствором MgSO4. Для отбора трансконъюгантов полученную суспензию и ее последовательные разведения высевали на селективную
среду S с добавлением 50 мкг/мл рифампицина.
Идентификацию плазмид осуществляли по модифицированной методике Экхардта [12]. Очищенную ДНК плазмид получали путем ее вырезания из 0,7% агарозного геля и дальнейшей
экстракции с помощью GFX PCR DNA and Gel
Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech).
Присутствие генов деградации симазина в
плазмидной ДНК обнаруживали с помощью
ПЦР, используя предложенные de Souza специМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
96
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич. Конъюгационный перенос генов деградации симазина...
фичные праймеры [6]. Нуклеотидные последовательности, обладающие сходством с геном
pilA из Pseudomonas putida WCS358 [13] обнаруживали с помощью ПЦР, используя праймеры pilAf (5’ TCACCCTGATCGAACTGATG 3’),
pilA‑1r (5’ GGTGCAGCCCCACCC 3’) и pilA‑3r
(5’ ATGGCTGTCTTCAGCGC 3’).
Реакционная смесь (30 мкл) содержала 3 мкл
10Х буфера (Диалат Ltd., Россия), 200 мкМ
каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, по
60 пкмолей каждого из пары праймеров, 1 единицу
BioTaq-полимеразы (Диалат Ltd., Россия) и 10 нг
очищенной ДНК плазмид в качестве матрицы.
ПЦР проводили в термоциклере MJ MiniTM
(“Bio-Rad”) по следующей схеме: первичная
денатурация – 95 оС в течение 4 минут; затем
30 циклов, состоящих из инкубаций: 95 оС –
30 секунд, 55 оС (65 оС при амплификации
smzB) – 30 секунд, 72 оС – 2 минуты; и завершающая элонгация – 72 оС в течение 10 минут. Продукты ПЦР анализировали с помощью
электрофореза в 1,2% агарозном геле.
Генетическое типирование бактерий осуществляли с помощью ERIC-ПЦР, придерживаясь ранее изложенной нами методики [11].
Элиминацию Smz+ фенотипа при росте культур трансконъюгантов в бульоне TY определяли высевом на агар S. Smz− колонии отличались меньшими размерами и отсутствием зоны
растворения суспензии симазина.
Результаты и обсуждение
В скрещиваниях между Smz + штаммом
H. huttiense В601 и Rifr мутантами бактерий
рода Herbaspirillum Smz+Rifr трансконъюганты выявлялись лишь при использовании в качестве реципиента штамма H. huttiense DSM
10281T. Частота переноса способности утилизировать симазин при этом составляла около
10-6 на клетку реципиента. Возникновение
спонтанных Rifr мутантов донора наблюдали
с частотой около 10-8, что в 100 раз меньше
частоты появления колоний Smz+ Rifr трансконъюгантов, морфологически неотличимых
от колоний донора. В результате генотипирования с помощью ERIC-ПЦР было установлено, что фингерпринты всех проверенных
Smz+ Rifr бактерий и реципиента полностью
совпадали, но отличались от фингерпринтов
донора присутствием дополнительного дифференцирующего единичного фрагмента размером около 1000 п.н. (рис. 1).
Д Р Т1 Т2 Т3 Т4 Т5 М Т6 Т7 Т8 Т9 Т10 Т11 Д Р
3000 п.о.
1000 п.о.
500 п.о.
100 п.о.
Рис. 1. Генотипирование штаммов H. huttiense DSM 10281T (Р), H. huttiense В601 (Д) и Smz+ Rifr
трансконъюгантов (Т1-Т11) с помощью ERIC-ПЦР
Дорожки: Д – донор H. huttiense В601; Р – реципиент H. huttiense DSM 10281T; Т1-Т10 ─ Smz+ Rifr трансконъюганты. резидентные плазмиды донора: Smz ─ плазмида деградации симазина (210 т.п.н.); R2 ─ трансмиссивная
плазмида (60 т.п.н.). М ─ маркер молекулярной массы - Gene RulerTM 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Литва).
При идентификации плазмид у всех Smz+ Rifr
трансконъюгантов выявлялась крупная плазмида размером около 210 т.п.н., что соответствовало размеру Smz плазмиды донора
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
(рис.2). При этом в геноме реципиента присутствия плазмид обнаружено не было, а у
донора выявлялись обе характерные для него
плазмиды [7].
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич. Конъюгационный перенос генов деградации симазина...
Д
97
Р Т1 Т2 Т3 Т4 Т5 Т6 Т7 Т8 Т9 Т10
Smz
R2
Рис. 2. Идентификация плазмидной ДНК родительских штаммов и трансконъюгантов
Дорожки: Д – донор H. huttiense В601; Р – реципиент H. huttiense DSM 10281T; Т1–Т10 ─ Smz+ Rifr трансконъюганты. резидентные плазмиды донора: Smz ─ плазмида деградации симазина (210 т.п.н.);
R2 ─ трансмиссивная плазмида (60 т.п.н.).
В результате проведения геноспецифичной
ПЦР амплификация всех трех фрагментов,
соответствующих центральным областям генов atzА, -В и –С, происходила лишь при использовании в качестве матрицы ДНК плазмид Smz+ Rifr трансконъюгантов либо Smz
1 2
3 4 5 6
плазмиды донора H. huttiense В601 (рис. 3).
Таким образом, появление у трансконъюгантов способности к утилизации симазина в качестве единственного источника азота было
обусловлено переносом плазмиды, несущей
все три ключевые гены его деградации.
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
1000 п.о.
500 п.о.
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
1000 п.о.
500 п.о.
Рис. 3. Обнаружение генов деградации симазина в плазмидной ДНК с помощью ПЦР
В качестве матрицы для ПЦР использовали: ДНК плазмид R2 (дорожки 1–3) и Smz донора H. huttiense В601 (дорожки
4–5), ДНК плазмиды Smz+ трансконъюгантов T1 (дорожки 8–10), T2 (дорожки 11–13), T3 (дорожки 14–16), Т4 (дорожки 17–19), Т5 (дорожки 20–22), Т6 (дорожки 23–25), Т7 (дорожки 26–28), Т8 (дорожки 30–32), Т9 (дорожки 33–35),
Т10 (дорожки 36–38). Для анализа использовали специфичные праймеры к генам smzA (дорожки 1, 4, 8, 11, 14, 17, 20,
23, 26, 30, 33, 36), smzB (дорожки 2, 5, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 31, 34, 37), smzC (дорожки 3, 6, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28,
32, 35, 38). Дорожки 7 и 29 – маркер молекулярной массы – Gene RulerTM 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Литва).
При росте в среде с легко доступными ис- ность утилизировать симазин с частотой около
точниками азота Smz+ Rifr трансконъюганты 5–6% за пассаж, что в 3–5 раз превышало чаштамма H. huttiense 10281T теряли способ- стоту спонтанной элиминации этого признака
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
98
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич. Конъюгационный перенос генов деградации симазина...
у бактерии H. huttiense В601 дикого типа [4, 7].
Электрофоретический анализ независимых
Smz- производных трансконъюгантов штамма H. huttiense 10281T установил, что у всех
исследованных штаммов потеря способности к утилизации симазина сопровождалась
уменьшением размера приобретенной плаз-
миды, выраженным в различной степени
(рис. 4). У двух из шестнадцати проанализированных Smz- производных размер уменьшенной приобретенной плазмиды соответствовал размеру трансмиссивной плазмиды
донорного штамма H. huttiense В601 (рис. 4,
дорожки Э5, Э6).
Т1 Д Д Э1 Э2 Э3 Э4 Э5 Э6 Э7 Э8 Э9 Э10Э11Э12Э13 Э14 Э15 Э16
Smz
R2
Рис. 4. Идентификация плазмидной ДНК Smz- производных Smz+ Rifr трансконъюгантов
H. huttiense DSM 10281T
+
r
T1 – Smz Rif трансконъюгант штамма H. huttiense DSM 10281T; Д – донор H. huttiense В601; Э1–Э16 – Smzспонтанные производные Smz+Rifr трансконъюгантов. Резидентные плазмиды донора: Smz – плазмида деградации симазина (210 т.п.н.); R2- трансмиссивная плазмида (60 т.п.н.).
Уменьшение размера приобретенных плазмид свидетельствовало о том, что наиболее
вероятной причиной утраты способности
утилизовать симазин у Smz- производных
трансконъюгантов штамма H. huttiense DSM
10281T являлась делеция фрагмента, несущего гены утилизации симазина. Для проверки
данного предположения провели сравнительный ПЦР-анализ ДНК плазмид с использованием праймеров, позволяющих избирательно
амплифицировать центральные участки генов деградации симазина smzА, –В или –С.
1
2 3
При использовании в качестве матрицы ДНК
наименьших по размеру плазмид Smz- производных Э5 и Э7 не было обнаружено амплификации фрагментов генов smzА, –В или –С,
что свидетельствует об их сцепленной утрате
(рис. 5, дорожки 7–12). В то же время, делеция в плазмиде штамма Э1 привела к утрате
генов генов smzА и –С, но не затронула ген
smzB (дорожки 4–6). В плазмиде штамма Э14
отсутствовал ген smzА, но сохранились smzВ и
–С, а в плазмиде штамма Э15 были утрачены
гены smzВ и –С но сохранился smzA.
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 М 16 17 18
1000 п.о.
500 п.о.
Рис. 5. Обнаружение генов деградации симазина в ДНК плазмид Smz- производных Smz+ Rifr трансконъюгантов штамма H. huttiense DSM 10281T
В качестве матрицы для ПЦР использовали: ДНК плазмиды Smz донора H. huttiense В601 (дорожки 1–3) и плазмид Smz- производных Smz+ Rifr трансконъюгантов Э1 (дорожки 4–6), Э5 (дорожки 7–9), Э7 (дорожки 10–12),
Э14 (дорожки 13–15) и Э15 (дорожки 16–18). Для анализа использовали специфичные праймеры к генам smzA
(дорожки 1, 4, 7, 10, 13, 16), smzB (дорожки 2, 5, 8, 11, 14, 17), smzC (дорожки 3, 6, 9, 12, 15, 18).
М – маркер молекулярной массы – Gene RulerTM 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Литва). т.п.н.).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич. Конъюгационный перенос генов деградации симазина...
К
Smz
Smz
Обнаружение у части Smz- производных
трансконьюгантов плазмиды размером около
60 т.п.н. указывало на возможность участия
меньшей резидентной плазмиды H. huttiense
В601, имеющей тот же размер, в мобилизации
генов деградации симазина в H. huttiense DSM
10281T так же, как это было ранее обнаружено
при их переносе в Smz- производные самого
штамма В601 [4, 7]. Ранее с помощью блотанализа было установлено, что эта плазмида
имеет участки, гибридизующиеся с геном pilA
из P. putida WCS358 [4, 7], что дает возможность
99
ее обнаружения в составе гибридных плазмид.
При проведении ПЦР со специфичными к гену pilA праймерами образование характерных
продуктов происходило при использовании в
качестве матриц экстрагированной из агарозного геля ДНК меньшей плазмиды бактерии
H. huttiense B601, плазмид Smz+ Rifr трансконъюгантов штамма H. huttiense DSM 10281T
и их Smz- производных Э5 и Э6. (рис. 6). При
использовании в качестве матрицы ДНК крупной Smz плазмиды штамма H. huttiense B601
продукты реакции выявлены не были.
R2 M T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Э5 Э6
1000 п.о.
500 п.о.
pilA(340 п.о.)
A
Б
1000 п.о.
500 п.о.
pilA(140 п.о.)
Рис. 6. Обнаружение присутствия в плазмидной ДНК нуклеотидных последовательностей, обладающих сходством с геном pilA из P. putida WCS358, с помощью ПЦР
В качестве матрицы для ПЦР использовали: ДНК плазмиды pAG2, несущей ген pilA из P. putida WCS358 (К);
ДНК резидентной Smz плазмиды штамма H. huttiense B601 (Smz); ДНК резидентной трансмиссивной плазмиды
(60 т.п.н.) штамма H. huttiense (R2); ДНК плазмид Smz+ Rifr трансконъюгантов штамма H. huttiense DSM 10281T
(T1–T10); ДНК плазмид спонтанных Smz- производных Smz+ Rifr трансконъюгантов штамма H. huttiense
DSM 10281T (Э5, Э6).
Для анализа использовали специфичные праймеры к гену pilA из P. putida WCS358: pilAf и pilA-1r (A)
или pilAf и pilA-3r (Б).
Таким образом, хотя плазмиды Smz+ Rifr перенос генов деградации симазина в H. hutтрансконъюгантов штамма H. huttiense DSM tiense DSM 10281T при конъюгации обусловлен
10281T сходны по размеру между собой и с Smz не переносом Smz плазмиды, а их мобилизациплазмидой донорного штамма H. huttiense B601, ей второй резидентной плазмидой донора.
Заключение
Установлено, что способность использовать
симазин в качестве единственного источника
азота передается при конъюгации из бактерии H. huttiense В601 в типовой штамм вида
H. huttiense DSM 10281T с частотой около 10-6
на клетку реципиента. Не удалось обнаружить
передачи способности катаболизировать симазин из H. huttiense В601 в бактерии, принадлежащие к родственным видам H. frisingense
и H. seropedicae. Так же как и в скрещиваниях
с Smz- производными самого штамма H. huttiense В601 [4,7] способность к утилизации
симазина передавалась в H. huttiense DSM
10281T не вследствие самостоятельного переноса крупной Smz плазмиды донора, а за счет
мобилизации расположенных на ней генов деградации smzА, –В и –С второй резидентной
плазмидой.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
100
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич. Конъюгационный перенос генов деградации симазина...
Список использованных источников
1. Коляда, Т.И. Токсическое последействие
симазина и атразина на сельскохозяйственные
культуры / Т.И. Коляда, Н.И. Туренков,
И.А. Добровольская // Почвоведение и
агрохимия.
2. Chemical Contamination of California
Drinking Water / H.H. Russell [et al.] // The
Western Journal of Medicine. – 1987. – V. 147. –
P. 615–622.
3. Field-scale remediation of atrazine contaminated soil using recombinant Escherichia coli expressing atrazine chlorohydrolase /
L.S. Strong [et al.] // Environ. Microbiol. –
1999. – № 2 – P. 91–98.
4. Бажанов, Д.П. Плазмидная локализация
генов деградации хлорированных симмтриазинов / Д.П. Бажанов, К.И. Забенькова //
Тез. межд. симп. «Молекулярные механизмы
генетических процессов и биотехнология»
(18-21 ноября 2001 г., г. Москва; 22–24 ноября
2001 г., г. Минск). – Минск, 2001. – С. 11–13.
5. De Souza, M.L. The atzABC genes encoding atrazine catabolism are located on a selftransmissible plasmid in Pseudomonas sp. strain
ADP / M.L. de Souza, L.P. Wackett, M.J. Sadowsky // Appl. Environm. Microbiol. – 1998. –
V. 64. – P. 2323–2326.
6. The atrazine catabolizm genes atzABC are
widespread and highly concerved / M.L. de Souza [et al.] // J. Bacteriol. – 1998. – V. 180. –
P. 1951–1954.
7. Бажанов, Д.П. Плазмиды ризосферной
бактерии В601, утилизирующей симазин /
Д.П. Бажанов, К.И. Забенькова // Генетика
и селекция в ХХI веке. Мат. VIII съезда
генетиков и селекционеров Республики
Беларусь. Минск, 23–25 июля 2002 г. – С. 239.
8. Бажанов, Д.П., Мобилизация генов
деградации симазина плазмидой pSa /
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич // Цитология и
генетика. – 2007. – № 1. – С.16–22.
9. Яцевич, К.К. Перенос способности
утилизировать симазин в грамотрицательные
бактерии при конъюгации. / К.К. Яцевич,
Д.П. Бажанов // Современное состояние и
перспективы развития микробиологии и
биотехнологии. Мат. межд. конф. (26–28 мая
2004 г., Минск). – Минск, 2004. – С.176–177.
10.16S ribosomal DNA characterization of
nitrogen-fixing bacteria isolated from Banana
(Musa spp.) and Pineapple (Ananas comosus (L.)
Merril). / L.M. Cruz [et al.] // Appl. Environm.
Microbiol. – 2001. – V. 67. – P. 2375–2379.
11. Бажанов, Д.П. Филогенетическая идентификация трех штаммов ризосферных
бактерий на основании анализа нуклеотидных
последовательностей гена 16S рРНК и
генетического типирования / Д.П. Бажанов,
К.К. Яцевич, А.А. Бажанова // Микробиология. –
2010. – Т. 79, № 3. – С. 394–404.
12.Плазмиды. Методы / ред. К. Харди. –
М.: Мир, 1990. – C. 82–83.
13.Characterization of type IV pilus genes in
plant growth-promoting Pseudomonas putida
WCS358 / A. de Groot [et al.] // J. Bacteriol. –
1994. – V. 176. – P. 642–650.
Дата поступления статьи 15 ноября 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 577.21:796
Л.А. Кундас1, К.В. Жур1, Н.И. Бышнев1, Т.Н. Прохорова2, Е.А. Лосицкий2, П.Н. Малашевич2, И.Б. Моссэ1
АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ,
ОТВЕТСТВЕННЫХ за устойчивость к физическим нагрузкам,
у ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ академической греблИ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
2
ГУ «Республиканский центр спортивной медицины» МСиТ
Республика Беларусь, 220030, г. Минск, ул. Свердлова, 9
1
Введение
Академическая гребля представляет собой
циклический вид спорта, требующий от спортсмена не только развития дыхательной системы и системы кровообращения, но и совершенствования точной координации в работе
почти всех мышечных групп, а также развития
скоростно-силовых возможностей.
Академическая гребля относится к тем видам спорта, которые повышают авторитет нашей страны на международной арене. Тем не
менее, усиливающаяся конкуренция требует
постоянного роста результатов. В современных
условиях спорта высших достижений особую
значимость приобретает выявление наиболее
одаренных и перспективных спортсменов.
Исследования в области спортивной генетики убедительно показывают, что особое внимание следует уделять генетически обусловленным качествам и способностям спортсмена.
К их числу следует отнести быстроту и силу,
антропометрические показатели, способность
к максимальному потреблению кислорода,
экономичность функционирования вегетатив-
ных систем организма, психические особенности личности, продолжительность и качество
восстановительных процессов после выполнения значительных тренировочных нагрузок.
Для проведения исследования нами были
отобраны функционально значимые полиморфизмы 7 генов, белковые продукты которых
оказывают значительное влияние на адаптацию спортсменов к интенсивным нагрузкам
путем регуляции взаимосвязанных процессов
в организме (обмен жиров и углеводов [1],
обмен инсулина [2], увеличение скелетных
мышц и миокарда, ангиогенез, термогенез
и др.) [3, 4, 5].
Цель данной работы – установление частот полиморфных вариантов генов АСЕ
(I/D), VEGF (G634C), MB (A79G), PPARG
(Pro12Ala), BDKRB2 (I/D), HIF1A (C1772T),
UCP2 (Ala55Val) в генотипах элитных спортсменов для выявления наиболее информативных маркеров, определяющих выраженность
и стойкость адаптационных реакций к интенсивным физическим нагрузкам.
Материалы и методы
Проведено генетическое тестирование 24 высококвалифицированных спортсменов (мастера спорта (n = 6), заслуженные мастера спорта
(n = 3), мастера спорта международного класса (n = 15)) Национальной команды Беларуси
по академической гребле и 150 человек контрольной группы, профессионально не занимающихся спортом.
В качестве биологического материала использовали ДНК, выделенную из лейкоцитов периферической крови с помощью набора реагентов
для выделения ДНК (Синтол, Россия). Концентрацию образца измеряли с помощью мини-
флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Генотипирование по полиморфизму C1772T HIF1A,
G634C VEGF, Ala55Val UCP2 осуществляли методом количественной ПЦР с использованием
праймеров и TaqMan-зондов собственного дизайна и набора реагентов для проведения ПЦР
в реальном времени (Синтол, Россия). Детекция
флюоресценции, а также первичная обработка
результатов осуществлялись программным обеспечением прибора CFX96 (BIO-RAD, США)
в автоматическом режиме.
Для выявления однонуклеотидных замен генов
MB (A79G), PPARG (Pro12Ala), АСЕ (I/D) и девяМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
102
Л.А. Кундас и др. Анализ молекулярно-генетических маркеров, ответственных за устойчивость к физическим...
тинуклеотидной делеции/инсерции гена BDKRB2
проводился анализ длин амплификационных продуктов электрофоретическим разделением в 8%
полиакриламидном геле с последующей окраской
бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.
Статистический анализ данных проводили с
помощью непараметрического критерия χ2(хиквадрат) с использованием пакета Microsoft Office
Excel. Для оценки значимости вклада каждого
генотипа и аллеля вычислялся статистический
показатель отношения шансов (OR, odds ratio).
Результаты и обсуждение
Распределение генотипов и аллелей
гена HIF1A
Транскрипционный фактор HIF1a играет
ключевую роль в долгосрочной адаптации организма к нагрузке. Наличие полиморфизмов
в последовательности ДНК гена, кодирующего HIF1a, может влиять на структуру мРНК
фактора, его функциональное состояние и стабильность. По данным литературы, одним из
таких полиморфизмов является однонуклеотидная замена цитозина на тимин, в результате
которой происходит замещение аминокислоты
пролин в 582 кодоне на серин (C1772T). Носительство HIF1A 1772T аллеля ассоциируется
с повышенной экспрессией генов гликолиза,
в результате чего происходит сдвиг в сторону анаэробного обеспечения мышечной деятельности, что является благоприятным для
развития и проявления скоростно-силовых
качеств [1].
При анализе распределения генотипов и
аллелей полиморфизма C1772T гена HIF1A
в группе спортсменов, занимающихся академической греблей, установлена более высокая частота аллеля 1772T по сравнению с
контрольной выборкой (12,5% против 4,4%;
p < 0,05). Носителей редкого аллеля 1772Т в
гомозиготном состоянии обнаружено не было
(см. таблицу).
Распределение генотипов и аллелей
гена PPARG
Полиморфизм Pro12Ala гена PPARG представляет собой замену нуклеотида C на G в
34 положении экзона B, что приводит к замещению в 12 кодоне пролина на аланин. Пониженная активность гена, ассоциируемая с носительством Ala аллеля, приводит к повышению
чувствительности мышечной и жировой тканей
к инсулину, (оказывающему анаболическое
действие на скелетные мышцы) и увеличению
утилизации глюкозы [2, 3]. Обнаружен гипертрофический эффект Ala-аллеля гена PPARG в
отношении мышечных волокон [4]. На основаМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
нии этих данных Ala аллель можно рассматривать как маркер, ассоциированный с развитием
и проявлением скоростно-силовых качеств [5].
При анализе распределения частот аллельных
вариантов полиморфизма Pro12Ala гена PPARG
в генотипах гребцов-академистов установлена
более высокая частота генотипа Ala/Ala по сравнению с контрольной выборкой (12,5% против
2,2%; p < 0,05).
Распределение генотипов и аллелей
гена UCP2
Ген UCP2, кодирующий митохондриальный
разобщающий белок 2, участвует в термогенезе, регулирует обмен жиров, затраты энергии,
а также влияет на секрецию инсулина и нейропротекцию.
Полиморфизм Ala55Val гена UCP2 является
наиболее изученным и ассоциируется с высокой метаболической эффективностью мышечной деятельности и физической активностью,
а также с пониженным расходом энергии в покое, низкой утилизацией жирных кислот. Установлено, что экспрессия гена UCP2 увеличивается в скелетных мышцах человека в ответ
на тренировку аэробной направленности [6].
При анализе распределения аллельных вариантов полиморфизма Ala55Val UCP2 отмечалась отчетливая тенденция к преобладанию
генотипа Val/Val (OR = 2,20) в группе спортсменов, по сравнению с контролем (33,3%
против 18,5%).
Распределение генотипов и аллелей
гена VEGF
По данным литературы, C аллель гена VEGF
ассоциирован с увеличением максимального
потребления кислорода в результате аэробных тренировок. Установлено, что в культуре
миобластов человека VEGF C аллель экспрессируется в большей степени, чем G аллель,
что предполагает более выраженный адаптационный рост эндотелиев сосудов у носителей аллеля С в ответ на физические нагрузки
аэробного характера [7].
Л.А. Кундас и др. Анализ молекулярно-генетических маркеров, ответственных за устойчивость к физическим...
103
Распределение частот аллельных вариантов генов, ответственных за устойчивость
к физическим нагрузкам, в группе гребцов-академистов и в контрольной выборке
Гены
МВ
Генотипы
PPARG
Аллели
Генотипы
HIF1A
Аллели
Генотипы
UCP2
Аллели
Генотипы
BDKRB2
Аллели
VEGF
Гребцы,
%
Контрольная
выборка, %
OR
95% CI
GG
25,0
23,0
1,12
0,40–3,10
GA
58,3
73,5
0,51
0,20–1,26
AA
16,7
3,5
5,45
1,26–23,60
G
54,2
59,7
0,80
0,43–1,49
A
45,8
40,3
1,26
0,67–2,35
Ala/Ala
12,5
2,2
6,38
1,21–33,73
Pro/Ala
16,7
22,6
0,68
0,22–2,15
Pro/Pro
70,8
75,2
0,80
0,31–2,10
Ala
20,8
13,5
1,69
0,77–3,67
Pro
79,2
86,5
0,59
0,27–1,29
CC
75,0
91,3
0,29
0,10–0,85
CT
25,0
8,7
3,49
1,18–10,32
TT
0,0
0,0
0,00
–
C
87,5
95,6
0,32
0,12–0,89
T
12,5
4,4
3,13
1,13–8,69
Val/Val
33,3
18,5
2,20
0,83–5,85
Val/Ala
41,7
60,2
0,47
0,19–1,16
Ala/Ala
25,0
21,3
1,23
0,44–3,46
Val
54,2
48,6
1,25
0,67–2,34
Ala
45,8
51,4
0,80
0,43–1,50
I/I
16,7
30,6
0,45
0,14–1,49
I/D
50,0
56,9
0,76
0,30–1,91
D/D
33,3
12,5
3,50
1,17–10,51
I
41,7
59,0
0,50
0,26–0,96
D
58,3
41,0
2,02
1,04–3,91
GG
66,7
55,9
1,58
0,64–3,89
GC
25,0
40,6
0,49
0,18–1,29
CC
8,3
3,5
2,48
0,47–13,08
G
79,2
76,2
1,19
0,57–2,49
C
20,8
23,8
0,84
0,40–1,76
II
25,0
20,0
1,33
0,47–3,77
ID
45,8
46,7
0,97
0,40–2,35
DD
29,2
33,3
0,82
0,31–2,17
I
47,9
43,3
1,20
0,64–2,26
D
52,1
56,7
0,83
0,44–1,56
варианты
Генотипы
Аллели
Генотипы
Аллели
ACE
Генотипы
Аллели
χ2
Р
6,51
0,04
0,51
0,48
6,21
0,04
1,76
0,18
5,60
0,06
5,28
0,02
3,34
0,19
0,48
0,49
5,85
0,05
4,38
0,04
2,93
0,23
0,21
0,65
0,34
0,84
0,33
0,56
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
104
Л.А. Кундас и др. Анализ молекулярно-генетических маркеров, ответственных за устойчивость к физическим...
В группе исследуемых спортсменов отмечалась отчетливая тенденция к преобладанию генотипа С/C гена VEGF (OR = 2,48)по сравнению
с контролем (8,3% против 3,5%), однако указанные различия не являлись статистически значимыми (см. таблицу).
Распределение генотипов и аллелей
гена BDKRB2
Брадикинин – это биологически активное вещество, сосудорасширяющий фактор, который
улучшает микроциркуляцию крови и повышает
ударный объем желудочков сердца, опосредуя
свое действие через соответствующий рецептор. Наличие девятинуклеотидной делеции/
инсерции в гене BDKRB2, кодирующем данный
рецептор, может оказывать значительное влияние на его функциональное состояние.
В работах различных авторов выявлена ассоциация аллеля D гена BDKRB2 с высоким
уровнем экспрессии мРНК рецептора, увеличивающего активность брадикинина, а также
с более активным аэробным энергообеспечением у спортсменов видов спорта, преимущественно направленных на развитие кардиореспираторной функции [8, 9].
Частота генотипа D/D гена BDKRB2 в группе
спортсменов, занимающихся академической
греблей, значимо отличалась от контрольной
выборки (33,3% против 12,5%; p = 0,05).
Распределение генотипов и аллелей
гена MB
Миоглобин – аналог гемоглобина эритроцитов крови, железосодержащий белок мышечных клеток, отвечающий за транспорт
кислорода в скелетных мышцах и в мышце
сердца [10]. В гене МВ, кодирующем белок
миоглобин, нами протестирован полиморфизм A79G, однонуклеотидная замена, которая предположительно может влиять на
сродство миоглобина к кислороду и, следовательно, влиять на адаптацию спортсмена к
физическим нагрузкам.
По результатам исследования было выявлено статистически значимое преобладание
генотипа A/A в группе спортсменов по сравнению с контрольной группой (16,7% против
3,5%; p < 0,05).
Распределение генотипов и аллелей гена ACE
Ген АСЕ, кодирующий ангиотензинконвертирующий фермент (АКФ), играет ключевую
роль в ренин-ангиотензиновой и калликреинкининовой системах – важнейших гуморальных регуляторов артериального давления.
Под действием АКФ происходит образование
ангиотензина II – наиболее активного сосудосуживающего вещества и деградация брадикинина – важного сосудорасширяющего
фактора [11].
Заключение
В результате проведенного анализа полиморфных вариантов генов, определяющих
эффективность энергообеспечения и функционирование сердечнососудистой системы,
показана существенно более высокая частота генотипов A/A MB (OR = 5,45; p < 0,05),
Ala/Ala PPARG (OR = 6,38; p < 0,05), а также аллеля Т гена HIF1A (OR = 3,13; p < 0,05) и аллеля D гена BDKRB2 (OR = 2,02; p < 0,05) в группе спортсменов по сравнению с контрольной
группой. Кроме того, отмечалась отчетливая
тенденция к преобладанию генотипов С/C
гена VEGF (OR = 2,48) и Val/Val (OR = 2,20)
гена UCP2 в группе спортсменов, однако указанная динамика не являлась статистически
значимой. В то же время различий в частотах
аллельных вариантов гена АСЕ в генотипах
исследованных групп обнаружено не было.
Высокая частота генотипа Ala/Ala PPARG,
ассоциированного с гипертрофическим роМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
стом мышечных волокон, в группе гребцовакадемистов свидетельствует о том, что кроме
общей выносливости, для гребцов имеет большое значение максимальная мышечная сила.
Преобладание генотипов A/A гена MB, С/C гена VEGF, Val/Val гена UCP2, а также аллеля Т
гена HIF1A и аллеля D гена BDKRB2 в группе
гребцов подтверждает литературные данные о
важности скоростно-силовых способностей и
силовой выносливости для достижения успеха
в данном виде спорта [13]. Наличие перечисленных генотипов увеличивает сократительные, энергетические и окислительные способности мышц при выполнении длительной
нагрузки и способствует увеличению максимальной скорости путем повышения мощности и емкости анаэробного алактатного энергообразования.
Полученные нами данные позволяют включить
исследуемые полиморфизмы генов MB, PPARG,
Л.А. Кундас и др. Анализ молекулярно-генетических маркеров, ответственных за устойчивость к физическим...
HIF1A, BDKRB2 в диагностический комплекс
для отбора перспективных гребцов-академистов.
В то же время для оценки вклада полиморфных
вариантов генов АСЕ, VEGF и UCP2 требуется
проведение дальнейших исследований.
Идентификация генетических маркеров,
обеспечивающих адаптацию к физическим
105
нагрузкам, позволяет не только прогнозировать развитие физических качеств человека,
что имеет большое значение для отбора начинающих спортсменов, но и повысить эффективность профессиональной подготовки
с учетом индивидуальных генотипических
возможностей.
Список использованных источников
1. McPhee, J.S., Perez-Schindler, J., Degens, H., Tomlinson, D., Hennis, P., Baar, K.,
Williams, A.G. HIF1A P582S gene association
with endurance training responses in young
women // Eur J Appl Physiol. – 2011. – № 111
(9). – С. 2339–2347.
2. Deeb, S.S. Pro12Ala substitutionin PPAR
gamma2 associated with decreased receptor
activity, lower body mass index and improved
insulin sensitivity / S.S. Deeb [et al.] // Nat Genet. – 1998. – № 20 (3). – С. 284–287.
3. Masud, S., Ye, S. Effect of the peroxisome
proliferator-activated receptor-γ gene Pro12Ala
variant on body mass index: a meta-analysis. /
S. Masud, S. Ye // J med genet. – 2003. – № 40. –
С. 773–780.
4. Рогозкин, В.А. Полиморфизм гена
PPARG и двигательная деятельность человека. / В.А. Рогозкин [и др.] // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. –
2008. – № 11. – С. 567–569.
5. Ахметов, И.И. Ассоциация полиморфизмов генов-регуляторов с аэробной и
анаэробной работоспособностью спортсменов / И.И. Ахметов [и др.] // Рос. физиол.
журн. им. И.М. Сеченова. – 2007. – T. 93. –
С. 837–843.
6. Ахметов, И.И. Молекулярная генетика
спорта / И.И. Ахметов. – М.: Советский
спорт, 2009. – С. 126–128, 144–146.
7. Prior, S.J. DNA sequence variation in the
promoter region of the VEGF gene impacts
VEGF gene expression and maximal oxygen
consumption. / S.J. Prior [et al.] // Am J Physiol
Heart Circ Physiol. – 2006. – 290 p.
8. Ma, J.X. Structure and chromosomal localization of the gene (BDKRB2) encoding human bradykinin B2 receptor / J.X. Ma [et al.] //
Genomics. – 1994. – 23. – P. 362–369.
9. Синелев, В.А. Связь полиморфизма генов BDKRB2 и NOS3 с физической работоспособностью человека / В.А. Синелев [и др.] //
Научно-практические проблемы спорта высших достижений: материалы Междунароной
конференции г. Минск, 4–5 декабря 2008 г. /
НИИ физической культуры и спорта Республики Беларусь; под ред. А.В. Григорова –
г. Минск, 2008. – C. 241–245.
10.Wu, J., Hu, Y., Liu, G. SNP A79G in the
second exon of the myoglobin gene in elite long
distance runners // Br J Sports Med. – 2005. –
V. 39. – P. 781–782.
11.Астратенкова, И.В. Анализ полиморфизма гена АСЕ у спортсменов/ И.В. Астратенкова, А.И. Комкова // Сб. науч. тр. / Федеральное агентство по физической культуре
и спорту, Санкт-Петербургский научноисследовательский институт физической
культуры; под ред. В.А. Рогозкина. – СПб,
2006. – C. 33–44.
12.Dias, R.G. Genetic polymorphisms determining of the physical performance in elite
athletes / R.G. Dias [et al.] // Rev Bras Med
Esporte. – 2007. – Vol. 13. – № 3 (Mai/Jun). –
Р. 186–192.
13.Иссурин, В.Б., Давыдов, В.Ю. Сравнительный анализ телосложения представителей
мировой элиты гребцов на байдарках и каноэ
// Теория и практика физической культуры. –
1994. – № 10. – С. 16–19.
Дата поступления статьи 21 декабря 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 631.524.86:633.111:632.4
Н.В. Савина1, Т.Д. Кужир1, А.И. Ролевич2, С.Л. Поляков2, С.А. Красный2, Р.И. Гончарова1
Особенности дестабилизации генома лимфоцитов
периферической крови при раке мочевого пузыря
1
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220027, г. Минск, ул. Академическая, 27
2
ГУ «Республиканский научно-практический центр онкологии
и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова»
Беларусь, 223040, Минский район, п. Лесной-2
Введение
Известно, что канцерогенез ассоциирован
с геномной нестабильностью соматических
клеток. Так, на больших когортах населения
европейских стран показано, что увеличение
частоты аберраций хромосом и микроядер в
лимфоцитах периферической крови указывает на повышенный риск возникновения рака
[1, 2]. Кроме того, на примере длительного
мониторинга цитогенетических нарушений в
опухолевой ткани при раке мочевого пузыря
показано, что повышенная частота митотической рекомбинации наблюдается уже на самых
ранних стадиях развития онкопатологии [3].
И, наконец, при изучении клеточного ответа
на повреждения ДНК при раке различной локализации установлено, что сигнальный путь
ATM-Chk2-p53 активизируется на пресимптоматических стадиях образования злокачественной опухоли [4], что в свою очередь свидетельствует о накоплении повреждений ДНК
в клетках. Поэтому оценка уровня повреждений ДНК может способствовать выявлению
первичных признаков развивающейся геномной нестабильности и малигнизации клеток.
Нами предложена технология диагностики геномной нестабильности в лимфо-
цитах человека на основе применения метода ДНК-комет, которая апробирована на
образцах периферической крови пациентов
с предполагаемым диагнозом синдромов
хромосомной нестабильности и микроделеций [5, 6], а также работников автомобильной промышленности [7, 8]. Эта технология
позволяет выявлять признаки геномной
нестабильности не только как общий феномен,
присущий целой группе людей (например,
в связи со специфическим заболеванием),
но и у отдельных лиц, что обусловлено
индивидуальными особенностями организма.
На основании анализа данных, полученных
на выборке из 172 здоровых представителей
населения Беларуси, определены референтные
интервалы, отражающие норму для каждого
изучаемого параметра (уровня эндогенных/
фоновых повреждений ДНК, чувствительности
генома лимфоцитов к дополнительному
мутагенному воздействию, кинетики и эффективности репарации ДНК) [8, 9]. В рамках
данного исследования предложенная технология использована для оценки целостности и
стабильности генома лимфоцитов при онкологической патологии.
Материалы и методы
Образцы периферической венозной крови
получены от пациентов Отдела онкоурологической патологии РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова после
подписания ими информированного согласия.
Забор биологического материала проводился в
соответствии с международными требованиями, анализировали образцы только от больных с
гистологически установленным раком мочевого
пузыря (РМП). Объект исследования – изоМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
лированные лимфоциты. Выделение клеток
из гепаринизированной крови проводили по
общепринятой методике. В качестве модельного мутагена, индуцирующего окислительный
стресс, использовали пероксид водорода (Н2О2)
в концентрации 100 мкМ. Выживаемость лимфоцитов, определяемая методом прижизненной
окраски клеток трипановым синим, составляла
96–98% и не снижалась под влиянием использованной концентрации прооксидантного агента.
Н.В. Савина и др. Особенности дестабилизации генома лимфоцитов периферической крови при раке...
Для выявления повреждений ДНК использовали метод ДНК-комет (щелочную версию). Более подробное описание методики
и условий эксперимента in vitro дано в предыдущих работах [5–8]. Визуальный анализ
препаратов, окрашенных бромистым этидием, выполняли с помощью флуоресцентного
микроскопа Olympus BX-50. Уровни повреждений ДНК выражали в условных единицах
(arbitrary units, a.u.). Для исследования процесса репарации ДНК учитывали уровень повреждений ДНК на 0, 30, 60 и 180-й минуте
после мутагенного воздействия. Эффективность репарации ДНК (ЭР) определяли как
процент элиминированных за определенное
время повреждений ДНК по отношению к
первоначально индуцированному уровню.
Скорость репарации ДНК сравнивалась по
коэффициентам линейной регрессии β, указывающим на угол наклона регрессионной
прямой [6, 7].
107
Среднегрупповые параметры (уровни эндогенных и экзогенных повреждений ДНК, эффективность репарации ДНК) сравнивали с аналогичными показателями в контрольной группе
здорового населения с помощью двустороннего
t-критерия Стьюдента или непараметрического U-критерия Манн-Уитни. Группу больных с
РМП дополнительно сравнивали с группой пожилых людей (старше 60-ти лет) и группой пациентов, указавших в своих анкетах наличие
хронических воспалительных заболеваний. Кроме того, индивидуальные показатели в группах
обследования сопоставляли с определенными
заранее референтными интервалами [8, 9] для
выявления лиц, лимфоциты которых отличаются от «нормальных» клеток по своему ответу на
повреждения ДНК. Доля таких индивидуумов
в разных группах сравнивалась по критерию χ2.
Статистический анализ результатов выполнен в
соответствии с рекомендованными подходами
для медико-биологических исследований [10, 11].
Результаты и обсуждение
Характеристика групп обследования.
Группа пациентов с гистологически установленным диагнозом РМП включала
40 человек. Средний возраст обследованных
69,55 ± 1,57 лет; 85% составляли мужчины;
89% – курящие. Контрольная группа клинически здоровых доноров включала 35 человек
в возрасте от 22 до 63 лет, не контактирующих по роду профессиональной деятельности или месту проживания с мутагенами
окружающей среды, без вредных привычек и
хронических заболеваний, не подвергавшихся в течение последних 6-ти месяцев рентгенологическому обследованию и какому-либо
лечению. В группе пожилых людей насчитывалось 15 клинически здоровых человек
в возрасте старше 60-ти лет, среди которых
73% составляли мужчины. Группа лиц с хроническими воспалительными заболеваниями также включала 15 человек: 4 – с хроническим пиэлонефритом; 9 – с хроническим
деструктивным бронхитом; 2 – с ревматическими болезнями и полиартритом; все – в
состоянии длительной ремиссии. Средний
возраст обследуемых в этой группе составлял
48,87 ± 2,86 лет, среди них – 53% мужчин.
Оценка целостности и стабильности генома лимфоцитов у больных РМП по сравнению
с группой здоровых доноров. Результаты этого
сравнения, представленные на рис. 1, показывают, что средние уровни индуцированных
повреждений ДНК существенно выше у больных относительно здоровых. Статистически
значимые различия доказаны как с помощью
двустороннего теста Стьюдента (p = 0,00035,
0,045, 0,037 и 0,026 соответственно 0, 30, 60 и
180-й мин анализа), так и непараметрическим
методом Манна-Уитни (0,01 < p < 0,05).
Небольшо е превышение среднего
уровня эндогенных повреждений ДНК над
контрольным не подтверждено статистически,
так же как анализ коэффициентов линейной
регрессии β не выявил каких-либо нарушений репарационного процесса в лимфоцитах
больных РМП по сравнению с контрольной
группой здоровых доноров.
Результаты исследования показывают, что
при РМП наблюдается аномальный ответ лимфоцитов на окислительный стресс in vitro, возможно, за счет нарушения антиоксидантной
защиты. Наблюдаемый эффект совпадает с
тем, что известно из литературы о нарушении
редокс-гомеостаза при канцерогенезе [12].
Однако сходные нарушения происходят при
старении и болезнях пожилого возраста [13,
14], а также при воспалительных процессах,
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
108
Н.В. Савина и др. Особенности дестабилизации генома лимфоцитов периферической крови при раке...
которые обязательно предшествуют и/или
сопутствуют раку [15]. Известно, что стадия промоции рака тесно связана с генерацией активных форм кислорода и острой
воспалительной реакцией, которая характеризуется повышенной экспрессией и освобождением провоспалительных цитокинов, включая TNF-α [16], простагландинов
(гормоно-подобных эндогенных медиаторов
воспаления) и провоспалительных энзимов,
прежде всего, циклооксигеназы-2 (COX-2)
[17]. Характерно, что этот энзим не образуется в норме, а индуцируется цитокинами, митогенами, ростовыми факторами и промото140
РМП
рами рака, являясь маркером патологического
состояния. Эпидемиологические исследования показывают, что COX-2 экспрессирована в 71% случаев рака толстой кишки и 81%
случаев рака молочной железы [18]. В наших
собственных исследованиях обнаружено, что
доля чувствительных индивидуумов, лимфоциты которых проявляют аномальный ответ
на повреждения ДНК, существенно выше в
группе пожилых лиц (старше 60 лет) по сравнению с когортой здоровых людей до 60-ти
лет; такие индивидуумы также чаще встречаются среди лиц с хроническими воспалительными заболеваниями [7]).
здоровые 2,5
Повреждения ДНК (a.u.)
120
здоровые
2
РМП
y = -0,39x + 2,11
100
1,5
80
y = -0,36x + 1,93
1
60
0
0,5
1
1,5
2
2,5
40
20
0
0 мин
30 мин
60 мин
180 мин
Индуцированные повреждения
180 мин
эндогенные
Время инкубации лимфоцитов
Рис. 1. Уровень повреждений ДНК (эндогенных и индуцированных H2O2) в лимфоцитах
периферической крови больных РМП по сравнению с контролем
На вставке
представлены
данные
в логарифмической
системе
координат.
Сравнение
коэффициентов
На вставке
представлены
данные
в логарифмической
системе
координат.
Сравнение
коэффициентов
линейной
линейнойβрегрессии
β (–0,39
и –0,36) показывает,
скоростьДНК
репарации
ДНК в лимфоцитах
регрессии
(–0,39 и –0,36)
показывает,
что скоростьчто
репарации
в лимфоцитах
больных не больных
измененане
по
изменена
по сравнению
с нормальным
репарационным
процессом
у здоровых
доноров
сравнению
с нормальным
репарационным
процессом
у здоровых
доноров
Рисунок 1 – Уровень повреждений ДНК (эндогенных и индуцированных H2O2) в лимфоцитах
новыми
красителями,
сажей, хлорированными
Оценка целостности
и стабильности
гено- РМП
периферической
крови больных
по сравнению
с контролем
ма лимфоцитов у онкологических больных по алифатическими углеводородами и многими
сравнению с людьми пожилого возраста и ли- альдегидами [21]. Однако если риск развития
цами с хроническими воспалительными забо- РМП под воздействием профессиональных
леваниями. Следует учитывать, что рак моче- вредностей в индустриально развитых странах
вого пузыря тесно ассоциирован с возрастом, составляет 5–10%, то вклад курения в эту
полом, курением и профессиональными вред- патологию достигает 50% [20]. Поэтому втоностями [19–21]. РМП встречается в 2,6 раза рой задачей данного исследования было сравчаще у мужчин, чем у женщин, развивается нение ответа лимфоцитов на повреждения
преимущественно после 50 лет, среди внешних ДНК у больных с РМП, пожилых людей без
причин к основополагающим относятся онкопатологии и лиц с хроническими воспакурение и профессиональный контакт с лительными заболеваниями. Данные представароматическими аминами и амидами, анили- лены в табл. 1.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Н.В. Савина и др. Особенности дестабилизации генома лимфоцитов периферической крови при раке...
109
Таблица 1
Ответ лимфоцитов на повреждения ДНК в группах больных РМП, пожилых людей
и лиц с хроническими воспалительными заболеваниями
Группа РМП
(n = 40)
Группа ≥ 60 лет
(n =15)
Группа лиц с
хроническими
воспалениями (n = 15)
69,55 ± 1,571
62,8 ± 0,74
48,87 ± 2,86
6/34 (85)
4/11 (73,33)
7/8 (53,33)
5/35 (89)
6/9 (60)
2/13 (13,33)
11,38 ± 1,09
9,93 ± 2,61
6,0 ± 1,32
117,13 ± 7,012
89,33 ± 11,55
92,47 ± 7,97
Остаточный уровень
индуцированных
повреждений ДНК (a.u.),
180 мин
17,7 ± 1,59
18,2 ± 4,21
12,77 ± 3,03
Эффективность репарации ДНК
(ЭР30)
(ЭР180)
65,24 ± 2,08
84,25 ± 1,33
69,91 ± 3,82
81,27 ± 3,27
66,23 ± 4,03
84,72 ± 3,22
Анализируемые
параметры
Средний возраст
Соотношение по полу
жен/муж (% мужчин)
Курит/не курит
(% курящих)
Эндогенные
повреждения ДНК (a.u.),
180 мин
H 2O 2- и н д у ц и р о в а н н ы е
повреждения ДНК
(a.u.), 0 мин
П р и м е ч а н и е . 1Существенные различия по возрасту (p = 0,0004 – для пожилых людей и p < 0,0001 – для
пациентов с хроническими воспалениями). 2Существенные различия по начальному уровню индуцированных
повреждений ДНК между группой РМП, лицами пожилового возраста (p = 0,05) и пациентами с хроническими
воспалительными заболеваниями (p = 0,027). ЭР30, ЭР180 – эффективность репарации за 30 мин и 180 мин инкубации обработанных лимфоцитов при 37 °C.
Сравниваемые группы различались по возрасту, несмотря на то, что из контрольной
выборки клинически здоровых лиц в группу
пожилых людей отобраны индивидуумы не
моложе 60 лет. В группах пожилых людей и
больных РМП обследованы преимущественно мужчины и курящие. Группа лиц с хроническими воспалительными заболеваниями по
этим параметрам отличалась как от больных
РМП, так и пожилых людей. Альтернативными факторами, по которым, собственно, и проводилось сравнение, являлись: наличие/отсутствие РМП; наличие/отсутствие хронических
воспалений. Отметим, что при наличии РМП
увеличивалась чувствительность лимфоцитов
к окислительному стрессу, при этом начальный уровень индуцированных повреждений
ДНК в группе людей с онкологической патологией был существенно выше, чем в группах
пожилых людей и лиц с хроническими воспалительными заболеваниями. Эффективность
репарации ДНК оставалась на одном уровне
во всех группах и не отличалась от этого показателя у представителей здорового населения Беларуси.
Частота встречаемости индивидуумов с
повышенной чувствительностью лимфоцитов
к дополнительному мутагенному воздействию
в группе пациентов с РМП по сравнению с
группами лиц без онкологической патологии.
В качестве другого подхода проанализирована частота «чувствительных» индивидуумов с использованием ранее установленных референтных интервалов для всех
изучаемых параметров [8, 9]. Напомним, что
в качестве пограничных значений установлены 15 a.u. для уровня эндогенных повреждений ДНК, 110 a.u. для начального уровня
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
110
Н.В. Савина и др. Особенности дестабилизации генома лимфоцитов периферической крови при раке...
H2O2-индуцированных повреждений, 25 a.u.
для остаточного уровня H2O2-индуцированных
повреждений ДНК. Показатели, превышающие эти значения, свидетельствуют о повышенной чувствительности лимфоцитов к повреждениям ДНК у обследуемого человека.
Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что половина пациентов с РМП
проявляет повышенную чувствительность
лимфоцитов к окислительному стрессу in vitro, тогда как доля таких «чувствительных»
индивидуумов в конт рольной группе
составляет 14%, а в группах пожилых людей и
пациентов с хроническими воспалительными
заболеваниями – 26%, то есть вдвое меньше,
чем в группе онкологических больных.
Несмотря на очевидные различия между
частотами «чувствительных» индивидуумов
в обследованных группах, их статистическая
значимость пока доказана при сравнении
группы пациентов с РМП с группой здоровых
доноров.
Таблица 2
Доля индивидуумов с повышенной чувствительностью лимфоцитов
к повреждениям ДНК в различных группах
Частота «чувствительных» индивидуумов (%)
по отношению к:
Группа
эндогенным
повреждениям
ДНК
H2O2-индуцированным
повреждениям ДНК
начальному
остаточному
уровню
уровню
Всего
Пациенты с РМП
(n = 40)
17,5
501
10
62,5
Группа ≥ 60 лет
(n = 15)
20,0
26,67
26,67
46,67
Группа лиц
с хроническими
воспалениями (n = 15)
6,67
26,67
6,67
46,67
Контроль
(n = 35)
8,57
14,29
5,71
40,0
П р и м е ч а н и е . 1Существенные различия между всеми группами по критерию χ2 (p = 0,009), а также между
группой пациентов с РМП и контролем (p = 0,001). 2Существенные различия между группой пациентов с РМП
и контролем (p = 0,05).
Таким образом, с помощью двух подходов
установлено, что при РМП повышается
чувствительность лимфоцитов к воздействию
пероксида водорода. Сходные тенденции
наблюдаются при старении и хронических
воспалительных заболеваниях, но в соответствии с представленными данными,
канцерогенез отличается более выраженной
геномной нестабильностью. Учитывая данные
A.A.G. van Tiborn с соавторами [3], которые
показали, что накопление генетических повреждений в виде увеличенной частоты митоМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
тической рекомбинации происходит в течение
всего процесса развития РМП, можно ожидать
увеличения уровня геномной нестабильности при прогрессии опухоли. Однако следует
осознавать, что опухолевая ткань находится
в состоянии разбалансировки всех физиологических процессов и по своему ответу на
повреждения ДНК должна существенно отличаться от лимфоцитов крови, которые отражают состояние генома всего организма.
Поэтому эта проблема требует специального
изучения.
Н.В. Савина и др. Особенности дестабилизации генома лимфоцитов периферической крови при раке...
111
Заключение
На примере пациентов с гистологически установленным раком мочевого пузыря
(РМП) изучена взаимосвязь канцерогенеза
с дестабилизацией генома лимфоцитов периферической крови. В работе использована
технология, позволяющая с помощью метода
ДНК-комет учитывать повышенные уровни
эндогенных повреждений ДНК, повышенную
чувствительность лимфоцитов к дополнительному мутагенному воздействию и пониженную репарационную способность клеток
в качестве индикаторов развивающейся геномной нестабильности. Сравнение целостности и стабильности генома лимфоцитов в
группах пациентов с РМП и здоровых доноров позволило установить аномальный ответ
лимфоцитов на воздействие пероксида водорода in vitro при онкопатологии. Показано,
что начальный уровень индуцированных
повреждений ДНК при РМП также существенно выше по отношению к группе
пожилых людей и пациентов с хроническими
воспалительными заболеваниями. Обнаружено
значительное повышение доли индивидуумов,
лимфоциты которых более чувствительны
к окислительному стрессу, среди пациентов
с РМП по сравнению с контрольной группой
здоровых лиц. Оба подхода (сравнение среднегрупповых показателей и доли индивидуумов
с аномальным ответом лимфоцитов на
индукцию повреждений ДНК пероксидом
водорода) позволили выявить признаки
дестабилизации генома в связи с нарушением
редокс-гомеостаза клеток крови при наличии
рака. Следовательно, повышенная чувствительность лимфоцитов к окислительному
стрессу in vitro может служить ранним биомаркером канцерогенеза.
Список использованных источников
1. Chromosomal aberration frequency in
lymphocytes predicts the risk of cancer: results
from a pooled cohort study of 22 358 subjects in
11 countries / S. Bonassi [et al.] // Carcinogenesis. – 2008. – Vol. 29, No. 6. – P. 1178–1183.
2. Micronuclei frequency in peripheral blood
lymphocytes and cancer risk: evidence from human studies / S. Bonassi [et al.] // Mutagenesis. –
2011. – Vol. 26, No. 1. – P. 93–100.
3. Molecular evolution of multiple recurrent
cancers of the bladder / A.A.G van Tiborn [et al.]
// Hum. Mol. Genet. – 2000. – Vol. 9, No. 20. –
P. 2973–2980.
4. DNA damage response as a candidate anticancer barrier in early human tumorigenesis /
J. Bartkova [et al.] // Nature. – 2005. – Vol. 434
(7035). – P. 864–870.
5. Chromosomal instability at the 7q11.23
region impacts on DNA damage response in
lymphocytes from Williams-Beuren syndrome
patients / N.V. Savina [et al.] // Mutation Research. – 2011. –Vol. 724. – P. 46–51.
6. Biomarkers for genome instability in some
genetic disorders: a pilot study / N.V. Savina
[et al.] // Biomarkers. – 2012 a. – Vol. 17 (3). –
P. 201–208.
7. DNA-damage response associated with
occupational exposure, age and chronic inflammation in workers in the automotive industry /
N.V. Savina [et al.] // Mutat Res. – 2012 b. –
Vol. 748. – P. 21–28.
8. Оценка стабильности генома лимфоцитов у людей, занятых в автомобильном
производстве / Т.Д. Кужир [и др.] // Доклады
НАН Беларуси. – 2012. – Т. 56, № 4. – С.72–76.
9. Савина, Н.В. Параметры нормального
ответа лимфоцитов на повреждения ДНК:
референтные интервалы / Н.В. Савина,
Т.Д. Кужир // Молекулярная и прикладная
генетика: Сб. науч. тр. – Минск, 2012. –
Т. 13. – С. 74–81.
10.Реброва, О.Ю. Статистический анализ
медицинских данных. Применение пакета
прикладных
программ
STATISTICA
/
О.Ю. Реброва. / М.: Медиа Сфера, 2002. – 312 с.
11.Эпидемиология и статистика как
инструменты доказательной медицины. Издание второе, исправленное и дополненное /
Е.А. Корнышева [и др.]. – Тверь, 2009. – 80 с.
12.Klaunig, J.E. The role of oxidative stress
in carcinogenesis / J.E. Klaunig, L.M. Kamendulis // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 2004. –
Vol. 44. – P. 239–267.
13.Oxidative stress and the aging brain: from
theory to prevention / C. Gemma in: Brain Aging:
Models, Methods, and Mechanisms. (D.R. Riddle, ed.) // Boca Raton (FL): CRC Press, 2007. –
Chapter 15.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
112
Н.В. Савина и др. Особенности дестабилизации генома лимфоцитов периферической крови при раке...
14.Age-related changes in an antioxidant
defense system in elderly patients with essential hypertension compared with healthy controls / J. Rybka [et al.] // Redox. Rep. – 2011. –
Vol. 16. – P. 71–77.
15.Bartsch, H. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of
cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage,
and repair / H. Bartsch, J. Nair // Langenbecks
Arch. Surg. – 2006. – Vol. 391. – P. 499–510.
16.Discrete role of cytokines, TNFα, IL-1,
IL-6 in tumor promotion and cell transformation
/ M. Suganuma [et al.] // Int. J. Oncol. – 2002. –
Vol. 20. – P. 131–136.
17.Expression of cyclooxygenase-1 and –2 in
human colorectal cancer / H. Sano [et al.] // Can-
cer Res. – 1995. – Vol. 55. – P. 3785–3789.
18.Moran, E.M. Epidemiological and clinical
aspects of non-steroidal anti-inflammatory drugs
and cancer risk / E.M. Moran // Proceedings of
ICMAA-VIII, Pisa, Italy, 4–8 October, 2003. –
P. 98.
19.Epidemiology and etiology of premalignant and malignant urothelial changes / S.M. Cohen [et al.] // Scand. J. Urol. Nephrol. Suppl.–
2000. – No. 205. – P. 105–115.
20.Janković, S. Risk factors for bladder cancer / S. Janković, V. Radosavljević // Tumori. –
2007. – Vol. 93. – P. 4–12.
21.Prevention of bladder cancer: a review
/ J.T. Leppert [et al.] // Eur. Urol. – 2006. –
Vol. 49. – P. 226–234.
Дата поступления статьи 4 декабря 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 577.21:616.71 – 007.234-07
О.В. Квитко, А.С. Сапун, Н.А. Балашенко, Я.И. Шейко, И.И. Конева, С.Е. Дромашко
Теломерная концепция старения и онкогенеза
для медицины
(обзорная статья)
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Сокращение теломер как механизм клеточного старения
Открытие теломер связано с именами лауреатов Нобелевской премии генетиков Германа Меллера и Барбары Мак-Клинток. В исследованиях, выполненных в тридцатые годы
ХХ столетия, они показали, что на концевых
хромосомных участках находятся структуры,
предотвращающие слияние хромосом [1, 2].
Название «теломеры» предложил Меллер.
В 1972 г. Джеймс Уотсон сформулировал
«проблему концевой недорепликации ДНК»
(end-replication problem), в соответствии с которой ДНК-полимераза не может полностью
синтезировать 3’-конец линейной молекулы
ДНК [3]. В этот же период Алексей Матвеевич
Оловников (независимо от Уотсона) пошел в
своих предположениях дальше и предсказал,
что концевая недорепликация ведет к укорочению теломер (маргинотомии) в каждом раунде
синтеза ДНК во время клеточного деления, и
что этот процесс является причиной репликативного старения, то есть утраты клетками способности к делению, обнаруженной Леонардом
Хайфликом [4, 5]. Предсказания Оловникова
оказались удивительно точными. Для инициации синтеза ДНК-полимеразой в направлении
5'-3' требуется РНК-праймер. ДНК-полимераза
синтезирует лидирующую цепь до самого конца
хромосомы, но в отстающей цепи (lagging strand)
ДНК-полимераза синтезирует фрагменты, называемые фрагментами Оказаки, причем каждый
фрагмент требует наличия РНК-праймера. В отсутствие ДНК, которая служила бы матрицей для
нового праймера, репликация концевого участка
невозможна, и поэтому происходит его утрата
при каждом раунде синтеза ДНК.
Еще до открытия теломеразы было известно, что укорочение теломер происходит при
старении фибробластов человека [6], и сокращение теломер стали называть молекулярными
часами, отсчитывающими клеточные деления.
Теломераза – это обратная транскриптаза, которая удлиняет теломеры [7]. Она состоит из
теломеразной РНК (TR или TERC – telomerase
RNA component) и белковой каталитической
субъединицы – TERT (telomerase reverse transcriptase) [8, 9]. Каталитическую единицу теломеразы человека обозначают как hTERT. В
соответствии с предсказаниями Оловникова
теломераза активно работает в иммортализированных (нестареющих) клеточных линиях
[10]. При трансгенном введении hTERT в нормальные (стареющие) фибробласты они иммортализировались, что проявлялось в отсутствии
репликативного старения и окрашивания на
бета-галактозидазу, которая является маркером
клеточного старения [11]. Впрочем, работа теломеразы – не единственный механизм удлинения теломер, поскольку существуют иммортализированные клеточные линии с отсутствием
теломеразной активности [12]. Появился термин «альтернативное удлинение теломер», механизм которого может быть основан на процессах рекомбинации [13]. У человека ДНК
теломер представляют собой многократно повторяющуюся (от сотен до тысяч раз) гексануклеотидную последовательность TTAGGG [14].
Критически короткие теломеры вызывают
остановку клеточного цикла на стадии G1/S.
При этом дисфункция теломер активизирует
каскад сигнальных путей, связанных с повреждением ДНК, включая активацию белка
p53 [15]. p53, в свою очередь, активирует p21,
блокирующий действие циклин-зависимых
киназ (CDKs), предотвращающих фосфорилирование белка ретинобластомы pRb. Без фосфорилирования pRb не транскрибируются гены, работа которых важна для перехода G1/S,
и клеточный цикл блокируется [15] .
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
114
О.В. Квитко и др. Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины
Следует отметить, что длина теломер – не
единственная характеристика, от которой зависит способность клеток к делению. Об этом
свидетельствует то, что в иммортализированных клетках теломеры короче, чем в контролях
с остановленным ростом [16]. Кроме того, у
дрожжей штаммы с отсутствием теломеразной
активности стареют с более длинными теломерами, чем иммортализированные штаммы, позитивные по теломеразе [17]. С использованием
электронной микроскопии было показано, что
теломеры формируют дуплексы, называемые
Т-петлями (t-loops), в состав которых входят
связывающиеся с теломерными повторами
белковые факторы TRF1 [18] и TRF2 [19]. Повидимому, Т-петли (теломерные кэпы), а не
только длина теломер, важны для предотвращения теломерной дисфункции и клеточного
старения.
Несмотря на очевидную связь старения
с теломерами важно помнить, что имеются
свидетельства в пользу того, что сокращение
теломер является не единственным механизмом старения клеток: культуральный стресс
активирует p16 и индуцирует старение клеток независимо от теломер [20]. Кроме того,
представляют интерес данные о межвидовых
различиях (например, при сравнении клеток
человека и мыши) взаимосвязи репликативного старения и теломерной дисфункции [21, 22]
У человека соматические ткани большей
частью (но не все) не имеют заметной теломеразной активности [23]. При этом особо
интересно, что в ряде тканей человека наблю-
дается временная (транзиентная) активизация теломеразы, что резко контрастирует с ее
конститутивной активацией в большей части
раковых опухолей [23]. В этой связи, на наш
взгляд, существует возможность, что даже в
тех тканях, в которых не была зарегистрирована теломеразная активность (или синтез матричной РНК гена hTERT), при определенных
условиях возможно транзиентное стимулирование теломеразы. Это определяет целесообразность поиска методов регуляции теломеразы в соматических клетках человека. При
этом репрессия теломеразы для подавления
роста опухолей должна быть сбалансирована
с активизацией теломеразы для противодействия старению и возобновления способности
тканей к восстановлению. В связи с этим интересно отметить, что стволовые клетки крови и
кожи демонстрируют лишь слабую теломеразную активность, которая по крайней мере на
порядок меньше, чем у раковых клеток in vitro;
вместе с тем, некоторые митотически гиперактивные потомки этих стволовых клеток проявляют высокую теломеразную активность,
позволяющую остановить или даже обратить
вспять сокращение теломер [23].
Имеются данные о связи происходящего с
возрастом укорочения теломер в некоторых
тканях человека со смертностью. Так, в клетках крови найдена обратная корреляция между
смертностью и длиной теломер после 60 лет
[24]. Стрессовые условия жизни способствовали ускоренному укорочению теломер клеток
крови [25].
Определение активности теломеразы в онкодиагностике
Выявление активности теломеразы в тканях является одним из способов выявления
злокачественных новообразований. Метод
ТRАР (telomeric repeat amplification protocol)
позволяет выявлять даже самую слабую теломеразную активность. Данный метод может быть основан на авторадиографическом
детектировании продуктов теломеразной активности. Однако высокая чувствительность
этого метода может приводить к ложноположительным результатам. С целью увеличения
диагностической ценности метода ТRАР Kim
и соавторы разработали модифицированный
метод, обладающий меньшей чувствительностью и позволяющий выявлять теломеразную
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
активность, характерную для раковых клеток
[26]. Кроме того, данный метод не требует
специального оборудования для работы с радиоактивными метками, что делает его более
доступным. Данная методика основана на
PCR-амплификации продуктов теломеразной
реакции, полученных при удлинении ферментом специфического праймера.
В работе [27] проведено определение длины теломер, уровня теломеразной активности,
характера экспрессии белковой субъединицы
hTERT и РНК-компонента hTR теломеразы
у детей с острым лимфобластным лейкозом.
Установлено, что уровень теломеразной активности значительно выше при острых лим-
О.В. Квитко и др. Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины
фобластных лейкозах в первый острый период и рецидивах по сравнению с пациентами в
ремиссии и здоровыми людьми. Отмеченная
обратная корреляция может регулироваться как на уровне экспрессии каталитической
субъединицы hTERT, так и на уровне альтернативного сплайсинга транскриптов этого гена. Выявлены различия в соотношении вари-
115
антов транскриптов мРНК hTERT у больных
в первый острый период и в стадии ремиссии.
Сделано заключение о том, что определение
длины теломер, уровня теломеразной активности и экспрессии hTERT и вариантов его
транскриптов может служить характеристикой
опухолевого клона у детей с острым лимфобластным лейкозом [27].
Антираковые ингибиторы теломеразы
Идея использования ингибиторов теломеразы для лечения онкозаболеваний основана
на подавлении пролиферации раковых клеток
посредством сокращения теломер. При этом
следует учитывать, что антителомеразные препараты по механизму действия должны отличаться от существующих лекарств тем, что они
не уничтожают раковые клетки немедленно, и
что заметные антипролиферативные эффекты
ингибиторов теломеразы могут проявиться
через недели или месяцы регулярного приема
[28]. Это также свидетельствует о целесообразности их использования скорее для профилактики и терапии вторичных, а не первичных
сильно развившихся опухолей, причем желательно их применение для адьювантной терапии совместно со средствами, действующими
посредством иных механизмов [29].
Олигонуклеотиды, комплементарные к РНКкомпоненту теломеразы, могут ингибировать
ее активность [29]. Два антителомеразных
олигонуклеотида одобрены, и еще несколько проходят клинические испытания [30].
Компания Geron Corporation разрабатывает
ингибирующие теломеразу олигомеры, содержащие фосфорамидный каркас [31]. Исследователи полагают, что терапевтические
олигонуклеотиды не могут эффективно проникать в культивируемые клетки в отсутствие
трансфецирующих агентов. Однако, фосфорамидные олигомеры являются сильными ингибиторами теломеразы без трансфекции [31].
2’-метоксиэтиловые олигонуклеотиды также
хорошо поглощались клетками [32]. Добавление липидной группы еще более улучшило
эффективность тиофосфорамидных олигомеров [33]. Липид-содержащие олигонуклеотиды
GRN163L уменьшали рост опухоли у животных [34]. GRN163L также находился в клинических испытаниях при ряде онкологических
заболеваний у людей [35].
Дисульфид-содержащие (биоредуцируемые)
катионные полимеры, в частности, дисульфидсодержащий полиэтиленимин, использовали
для доставки малых интерферирующих РНК
с целью подавления hTERT. При этом происходило значительное подавление роста разных
раковых линий in vitro и опухолей in vivo [36].
Нарушения теломерного гомеостаза при атеросклерозе
Атеросклероз является лидирующей причиной смертности, даже опережая онкологические заболевания. Экспериментальные и
клинические данные свидетельствуют о том,
что этиология этой группы ассоциированных с
возрастом заболеваний связана с нарушениями
теломерного гомеостаза [37]. Длина теломер
определяется не только числом клеточных репликаций, но и подвержена наследственным
и средовым факторам риска. Так, у потомства
родителей с коронарной болезнью теломеры
короче, чем у здоровых людей [38]. Курение,
ожирение, резистентность к инсулину и диабет 2 типа связаны с ускоренным укорочением
теломер [39–41].
Вместе с тем, установлено, что активизация
теломеразы может быть достигнута изменением образа жизни, включая здоровую диету,
снятие стресса посредством медитации, регулярные высокоинтенсивные аэробные физические упражнения и некоторые фармакологическими препараты (см. ниже).
Таким образом, длина теломер и активности теломеразы являются уникальными
молекулярно-генетическими маркерами, позволяющими оценивать комбинированное
влияние наследственных и средовых факторов
в развитии коронарных заболеваний, а также
при разработке средств их профилактики и
терапии.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
116
О.В. Квитко и др. Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины
Средства сохранения и восстановления теломер
Сохранению длины теломер способствовали
интенсивные и регулярные аэробные физические упражнения, выполняемые 5 дней в неделю по 45 минут ежедневно в течение 5 лет
[42]. Молекулярные механизмы защитного
влияния упражнений на сердце посредством
активизации теломеразы были исследованы
на экспериментальных животных. Показано,
что упражнения способствуют выживанию
клеток и повышают активность теломеразы
и экспрессию белкового фактора TRF2, стабилизирующего структуру Т-петли на концах
теломер. Повышение теломеразной активности было опосредовано инсулиноподобным
фактором 2 (IGF2) и эндотелиальной синтазой
оксида азота. Кроме того, при упражнениях
снижались уровни маркеров остановки роста
и апоптоза, такие как р16, р53 и киназа клеточного цикла 2 [37].
Вещества, повышающие активность теломеразы, могут быть использованы для предотвращения утраты теломерной ДНК. Компоненты, экстрагируемые из растений Astragalus и
Ginkgo biloba, а также ресвератрол активизируют теломеразу, причем действие ресвератрола опосредовано сигнальным путем PI3k/
Akt. N-ацетилцистеин и альфа-токоферол
также повышают активность теломеразы [43,
44]. У пациентов с коронарной болезнью при
пятилетнем наблюдении обнаружена обратная зависимость между содержанием в крови жирных кислот омега-3 (получаемых при
употреблении морепродуктов) и скоростью
сокращения теломер [45]. Аспирин, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента и,
в частности, статиновая терапия благоприятно
влияют на сосудистый эпителий посредством
противодействия клеточному старению. Помимо антитромботических и антивоспалительных эффектов аспирин понижает образование
диметиларгинина, который является эндогенным ингибитором синтазы оксида азота и посредством этого уменьшает окислительный
стресс и замедляет старение клеток эндотелия
[46]. Содержащие сульфгидрильные группы
ингибиторы ангиотензин-превращающего
фермента также замедляют эндотелиальное
старение посредством стимуляции фосфорилирования протеин-киназой Akt, ведущей
к повышению экспрессии синтазы оксида
азота и активизации теломеразы [47]. Статины повышали миграционную способность
клеток-предшественников эндотелия путем
ап-регуляции связывающегося с теломерами
белка TRF2 [48]. Интенсивная статиновая терапия в течение 12 месяцев предотвращала
эрозию хромосом у пациентов с коронарной
болезнью [49], а также положительно коррелировала с длиной теломер у больных инфарктом
миокарда в возрасте до 64 лет [50].
Доступность количественной полимеразной цепной реакции, которая проще, дешевле
и требует меньшего труда по сравнению со
стандартным саузерн-блоттингом, определяет
удобство ее использования для анализа длины
теломер [51–52]. Оценка теломерной динамики может служить нескольким целям [37].
Во-первых, измерение длин теломер в первые
годы жизни может выявлять индивидуумов с
генетической предрасположенностью к некоторым заболеваниям для индивидуальной
профилактики. Во-вторых, длина теломер является мерой кумуляции повреждений ДНК
под воздействием средовых факторов риска в течение индивидуальной жизни и, повидимому, позволяет оценивать вероятность
наступления заболеваний. В-третьих, хотя развитие и прогрессирование некоторых болезней
(например, атеросклероза) происходит в течение десятилетий, результат этого процесса
становится клинически значимым только при
полном проявлении заболеваний. Поскольку
скорость сокращения теломер до начала болезни ускоряется, лонгитудинальные измерения длины теломер могут использоваться для
определения риска. Наконец, количественное
определение состояния теломер и теломеразной активности требуется для оценки эффективности новых методов профилактики и терапии заболеваний.
Неканонические функции теломеразы
Теломераза выполняет критическую роль в
поддержании свойств стволовых клеток и в
тканевом гомеостазе [53]. Представляет осоМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
бый интерес то, что эта роль определяется
не только восстановлением длины теломерных повторов посредством обратной транс-
О.В. Квитко и др. Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины
крипции, но и еще слабо изученными неканоническими функциями [54]. Эти функции
можно разделить на 2 группы [54]. К первой
относятся функции, требующие наличия активной теломеразы, но не связанные с удлинением теломер (неканоническая функция 1 –
NC I). Для осуществления NC II не требуются
ни теломеразная активность, ни удлинение
теломер, хотя требуется наличие белковой
субъединицы фермента hTERT. Функции NC
I связаны с корректной реакцией на повреждения ДНК и нечувствительностью к трансформирующему фактору роста beta, а также с
индукцией неоплазий эпидермиса и молочной
железы [54]. Интересно, что осуществление
функций NC II, напротив, не приводит к развитию неоплазий. Функции NC II связаны с
активацией сигнальных путей WNT и MYC
(это показано, в частности, на кератиноцитах), а также с возрастанием резистентности
к индукции апоптоза (клеточной гибели), запускаемого разнообразными стимулами. Повидимому, сверхэкспрессия как TERT, так и
TERC обеспечивает NC I, но NC II не требуют
ни TERC, ни целостности каталитического
сайта TERT. Молекулярные механизмы NC I
и NC II в основном неизвестны, но имеются данные об изменениях профилей транскрипции. Представляется важным изучение
этих механизмов в связи с их значением для
функционирования нормальных и малигнизированных клеток.
Эктопическая сверхэкспрессия hTERT приводила к уменьшению спонтанной дифференцировки и усилению стволовоклеточных
свойств в линиях мезенхимальных стволовых
клеток человека [55]. При этом понижался
уровень метилирования ДНК, что было показано анализом профиля метилирования
CpG-островков, причем деметилированные
117
CpG-островки были в высокой степени ассоциированы с генами развития и дифференцировки. Компонентный анализ показал, что
профиль экспрессии генома в высокой степени
сходен с таковым у эмбриональных стволовых
клеток. Следовательно, важнейшей функцией
теломеразы, наряду с поддержанием длины теломер, является глобальная перестройка эпигенетического статуса клеточного генома. Из
этих данных следует важный вывод о том, что
изменение экспрессии единственного гена (в
данном случае гена hTERT) может запускать
процесс глобального эпигенетического репрограммирования в сторону плюрипотентности
и, возможно, более молодого состояния клеток.
С точки зрения задач разработки технологий
сингенной клеточной трансплантации для регенеративной медицины представляется важным направление исследований, связанное с
модификацией функционирования теломеразы
в культурах клеток из тканей взрослого организма. В частности, регулируемая экспрессия
трансгенной TERT в клетках из волосяных
фолликулов вызывала быстрый переход из
телогена (стадия покоя цикла волосяного фолликула) в анаген (активная фаза), тем самым
способствуя интенсивному росту волос [56].
Сверхэкспрессия TERT способствует этому
развитийному переходу путем индуцирования
пролиферации покоящихся мультипотентных
стволовых клеток в районе “bulge”. Эта новая
функция TERT не требует РНК-ового компонета теломеразы и, следовательно, работает
посредством механизма, не зависящего от
синтеза теломерных повторов. Эти данные
также указывают на то, что наряду с известной ролью в удлинении теломер TERT может
способствовать пролиферации покоящихся
стволовых клеток посредством неканонического сигнального пути.
Заключение
Теломеры – концевые участки хромосом,
формирующие дуплексы – Т-петли, препятствующие слиянию с другими хромосомами. В состав теломер входят многократно
повторяющиеся повторы олигонуклеотида
(у человека – гексануклеотида TTAGGG)
и белковые факторы TRF1 и TRF2. Укорочение теломерной ДНК (маргинотомия)
в результате концевой недорепликации и
накопления повреждений является одним
из механизмов клеточного старения и связанных с возрастом заболеваний. Процессу сокращения теломер противодействуют
фермент теломераза и мало изученные альтернативные механизмы восстановления
длины теломерной ДНК. Теломераза состоит из каталитической белковой субъединицы
(TERT) и РНК-матрицы, с помощью которой
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
118
О.В. Квитко и др. Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины
TERT достраивает теломерные повторы и
удлиняет теломеры. Теломераза выполняет
также некоторые неканонические функции,
включая глобальное эпигенетическое репрограммирование в сторону плюрипотентности и, возможно, более молодого состояния
клеток. Конститутивная активизация теломеразы характерна для большей части раковых
опухолей. Поэтому ингибирование теломеразы используется в онкотерапии. В то же
время регулируемое временное повышение
теломеразной активности перспективно для
замедления старения и омоложения клеток,
что может найти применение в лечении связанных с возрастом заболеваний и способствовать продлению жизни людей.
Список использованных источников
1. Muller, H. The remaking of chromosomes
// Collecting Net. – 1938. – Vol. 13, № 8. –
P. 182–198.
2. McClintock, B. The stability of broken
ends of chromosomes in Zea mays // Genetics. –
1941. – Vol. 26. – P. 234–282.
3. Watson, J. Origin of concatemeric T7
DNA // Nat. New Biol. – 1972. – Vol. 239,
№ 94. – P. 197–201.
4. Olovnikov, A. Principle of marginotomy
in template synthesis of polynucleotides // Dokl.
Akad. Nauk SSSR. – 1971. – Vol. 201, № 6. –
P. 1496–1499.
5. Olovnikov, A. A theory of marginotomy.
The incomplete copying of template margin in
enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon // J. Theor. Biol. – 1973. – Vol. 41, № 1. – P. 181–190.
6. Telomeres shorten during ageing of human
fibroblasts / C. Harley [et al.] // Nature. – 1990. –
Vol. 345, № 6274. – P. 458–460.
7. Greider, C. Identification of a specific
telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts / C. Greider, E.H. Blackburn //
Cell. – 1985. – Vol. 43, № 2. – P. 405–413.
8. The RNA component of human telomerase / J. Feng [et al.] // Science. – 1995. – Vol.
269, № 5228. – P. 1236–1241.
9. Telomerase catalytic subunit homologs
from fission yeast and human / T. Nakamura
[et al.] // Science. – 1997. – Vol. 277, № 5328. –
P. 955–959.
10.Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells
which express telomerase activity / C. Counter [et al.] // Embo J. – 1992. – Vol. 11, № 5. –
P. 1921–1929.
11.Extension of life-span by introduction of
telomerase into normal human cells / A. Bodnar
[et al.] // Science. – 1998. – Vol. 279, № 5349. –
P. 349–352.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
12.Telomere elongation in immortal human
cells without detectable telomerase activity /
T. Bryan [et al.] // Embo J. – 1995. – Vol. 14,
№ 17. – P. 4240–4248.
13.Telomere maintenance by recombination
in human cells / M. Dunham [et al.] // Nat. Genet. – 2000. – P. 26, № 4. – P. 447–450.
14.A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres
of human chromosomes / R. Moyzis [et al.] //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1988. – Vol. 85. –
P. 6622–6626.
15.De Magalhaes, J. From cells to ageing: a
review of models and mechanisms of cellular senescence and their impact on human ageing //
Exp. Cell Res. – 2004. – Vol. 300, № 1. – P. 1–10.
16.Telomere dynamics, end-to-end fusions
and telomerase activation during the human fibroblast immortalization process / C. Ducray
[et al.] // Oncogene 1999. – Vol. 18, № 29. –
P. 4211–4223.
17.Specific telomerase RNA residues distant
from the template are essential for telomerase
function / J. Roy [et al.] // Genes Dev. – 1998. –
Vol. 12, №. 20. – P. 3286–3300.
18.Van Steensel, B. Control of telomere
length by the human telomeric protein TRF1 /
B. Van Steensel, T. de Lange // Nature. – 1997. –
Vol. 385, № 6618. – P. 740–743.
19.Control of human telomere length by TRF1
and TRF2 / A. Smogorzewska [et al.] // Mol. Cell
Biol. – 2000. – Vol. 20, № 5. – P. 1659–1668.
20.A two-stage, p16(INK4A)- and p53-dependent keratinocyte senescence mechanism
that limits replicative potential independent of
telomere status / J.G. Rheinwald [et al.] // Mol
Cell Biol. – № 22 (14). – 2002. – P. 5157–5172.
21.Distinct requirements for Ras oncogenesis in human versus mouse cells / N. Hamad
[et al.] // Genes Dev. – 2002. – Vol. 16, № 16. –
P. 2045–2057.
О.В. Квитко и др. Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины
22.Expression profiles of p53-, p16(INK4a)-,
and telomere-regulating genes in replicative senescent primary human, mouse, and chicken fibroblast cells / H. Kim [et al.] // Exp. Cell Res. –
2002. – Vol. 272, №. 2. – P. 199–208.
23.Collins, K. Telomerase in the human organism / K. Collins, J. Mitchell // Oncogene. –
2002. – Vol. 21, №. 4. – P. 564–579.
24.Association between telomere length in
blood and mortality in people aged 60 years or
older / R. Cawthon [et al.] // Lancet. – 2003. –
Vol. 361, № 9355. – P. 393–395.
25.Accelerated telomere shortening in response to life stress / E. Epel [et al.] // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. – 2004. – Vol. 101, №. 49. –
P. 17 312–17 315.
26.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer / N. Kim [et
al.] // Science. – 1994 – Vol. 266. –P. 2011–2015.
27.Telomerase activity and telomere length in
malignant cells of children with acute limphoblastic leukemia / A. Kustanovich [et al.] // Experimental Oncology 2003. – Vol. 25. – P. 69–73.
28.Telomeres shorten during aging of human
fibroblasts / C. Harley [et al.] // Nature. – 1990. –
Vol. 345. – P. 458–460.
29.Telomerase inhibitors for the treatment of
cancer: the current perspective / P. Perry [et al.]
// Expert Opin. Investig. Drugs. – 2001 – Vol. 10,
№ 12. – P. 2141–2156.
30.Corey, D. Chemical Modification: The
Key to the Clinical Application of RNA Interference? // J. Clin. Invest. 2007. – Vol. 117. –
P. 3615–3622.
31.Oligonucleotide N3’-P5’ phosphoramidates as efficient telomerase inhibitors / B-S. Herbert [et al.] // Oncogene. – 2002. – Vol. 21. –
P. 638–642.
32.Effect of Telomerase Inhibition and Combination Treatments on Cancer Cell Proliferation / Z. Chen [et al.] // Cancer Research. –
2003. – Vol. 63. – P. 5917–5925.
33.Lipid modification of GRN163, an N3’-P5’
thio-phosphoramidate oligonucleotide, enhances
the potency of telomerase inhibition / B-S. Herbert [et al.] // Oncogene – 2005. – Vol. 24. –
P. 5262–5268.
34.In vivo inhibition of lung cancer by
GRN153L: A novel human telomerase inhibitor / Z. Dikmen [et al.] // Cancer Res. – 2005. –
Vol. 65. – P. 7866–7873.
119
35.Harley, C. Telomerase and cancer therapeutics // Nature Reviews Cancer. – 2008. –
Vol. 8. – P. 167–179.
36.Xia, W. Bioreducible polymer-delivered
siRNA targeting human telomerase reverse
transcriptase for human cancer gene therapy /
W. Xia, C. Lin // Ther. Deliv. – 2012. – Vol. 3,
№. 4. – P. 439–442.
37.Telomeres and atherosclerosis / S. Khan
[et al.] // Cardiovasc. J. Afr. – 2012. – Vol. 23,
№ 10. – P. 563–571.
38.Telomere length is shorter in healthy offspring of subjects with coronary artery disease:
support for the telomere hypothesis / S. Brouilette [et al.] // Heart. – 2008. – Vol. 94. –
P. 422–425.
39.Obesity, cigarette smoking, and telomere
length in women / A. Valdes [et al.] // Lancet. –
2005. – Vol. 366. – P. 662–664.
40.Insulin resistance, oxidative stress, hypertension, and leukocyte telomere length in men
from the Framingham Heart Study / S. Demissie [et al.] // Aging Cell. – 2006. – Vol. 5. –
P. 325–330.
41.Telomere shortening occurs in Asian
Indian Type 2 diabetic patients / A. Adaikalakoteswari [et al.] // Diabet. Med. – 2005. –
Vol. 22. – P. 1151–1156.
42.Leukocyte telomere length is preserved
with aging in endurance exercise-trained adults
and related to maximal aerobic capacity /
T. La Rocca [et al.] // Mechan. Ageing Develop. – 2010. – Vol. 131. – P. 165–167.
43.Tarkanyi, I. Pharmacological intervention
strategies for affecting telomerase activity: Future prospects to treat cancer and degenerative
disease / I. Tarkanyi, J. Aradi // Biochimie. –
2008. – Vol. 90. – P. 156–172.
44.Resveratrol reduces endothelial progenitor
cells senescence through augmentation of telomerase activity by Akt-dependent mechanisms
/ L. Xia [et al.] // Br. J. Pharmacol. – 2008. –
Vol. 155. – P. 387–394.
45.Association of marine omega-3 fatty acid
levels with telomeric aging in patients with coronary heart disease / R. Farzaneh-Far [et al.] // J. Am.
Med. Assoc. – 2010. – Vol. 303, № 3. – P. 250–257.
46.Aspirin reduces endothelial cell senescence / S. Bode-Boger [et al.] // Biochem.
Biophys. Res. Commun. – 2005. – Vol. 334. –
P. 1226–1232.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
120
О.В. Квитко и др. Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины
47.Sulfhydryl angiotensin-converting enzyme inhibitor promotes endothelial cell survival through nitric-oxide synthase, fibroblast
growth factor-2, and telomerase cross-talk /
S. Donnini [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. –
2010. – Vol. 332, № 3. – P. 776–784.
48.Statins enhance migratory capacity by upregulation of the telomere repeat-binding factor
TRF2 in endothelial progenitor cells / I. Spyridopoulos [et al.] // Circulation – 2004. – Vol. 110. –
P. 3136–3142.
49.Effect of intensive lipid-lowering therapy
on telomere erosion in endothelial progenitor
cells obtained from patients with coronary artery
disease / M. Satoh [et al.] // Clin. Sci. – 2009. –
Vol. 116. – P. 827–835.
50.Circulating leucocyte telomere length and
oxidative stress: A new target for statin therapy /
S. Saliques // Atherosclerosis. – 2011. – Vol. 219,
№ 2. – P. 753–760.
51.Cawthon, R. Telomere measurement by
quantitative PCR // Nucleic Acids Res. – 2002. –
Vol. 30. – e47.
52.Measurement of telomere length by the
Southern blot analysis of terminal restriction
fragment lengths / M. Kimura [et al.] // Nature
Protocols. – 2010. – Vol. 5, № 9. – P. 1596–1607.
53.TERT promotes epithelial proliferation
through transcriptional control of a Myc- and
Wnt-related developmental program / J. Choi
[et al.] // PLoS. Genet. – 2008 – Vol. 4. – e10.
54.Dissecting the non-canonical functions of
telomerase / E. Parkinson [et al.] // Cytogenet.
Genome Res. – 2008. – Vol. 122. – P. 273–280.
55.Overexpression of TERT increases stem-like
properties and decreases spontaneous differentiation in human mesenchymal stem cell lines / C. Tsai
[et al.] // J. Biomed. Sci. – Vol. 2010 – P. 17–64.
56.Conditional telomerase induction causes
proliferation of hair follicle stem cells / K. Sarin [et al.] // Nature. – 2005 – Vol. 436 –
P. 1048–1052.
Дата поступления статьи 5 декабря 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК 631.526:635.11
М.И. Федорова, С.А. Ветрова, Е.Г. Козарь
Особенности размножения инбредных потомств
свеклы столовой при селекции на гетерозис
(обзорная статья)
ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур, РАСХН»
Россия, 143080, Московская обл., Одинцовский р-н, п. ВНИИССОК, ул. Селекционная, 14
Введение
Генеративная система свеклы столовой по своему устройству и возможностям переопыления
среди овощных корнеплодных растений является наиболее высоковоспроизводящей. Свекла –
выраженный перекрестник. Кроме опыления
пыльцой других растений (ксеногамия) у свеклы
наблюдается опыление пыльцой других цветков
в пределах одного растения (гейтеногамия) и
пыльцой своего цветка (аутогамия).
Цветение начинается через 50–60 суток после посадки маточных корнеплодов. Соцветие – колос, цветки обоеполые, пятичленные
мелкие, зеленые, красноватые или беловатые,
одиночные или по два–пять и более, впоследствии образующие соплодия клубочки.
Сначала закладывается центральный цветок,
затем у его основания второй, третий и т.д. Прицветники линейно-ланцетные, длиннее соплодий. Одиночные цветки можно найти в пазухах
боковых ветвей или же на верхушках цветущих
осей, особенно на осях второго и третьего порядков. Околоплодник чашеобразный сросшийся с завязью, затвердевающий при плодах,
в начале цветения широко раскрытый, а после
опыления и перед созреванием сходящийся над
плодом. Тычинок 5, тычиночные нити такой
же длины или короче, чем доли околоплодника. Завязь полунижняя, развивается наполовину из цветоложа, а верхняя куполообразная ее
часть образуется за счет плодолистиков. Рыльце трех-, иногда двухлопастное, почти сидячее.
Попав на рыльце пестика, пыльца прорастает
через 10–15 минут, а через несколько часов происходит оплодотворение [1].
В настоящее время одно из приоритетных
направлений селекции свеклы столовой –
получение гетерозисных межлинейных гибридов. Наибольший эффект гетерозиса достигается при максимальной гибридности
потомства. Перспективным направлением для
достижения этой цели является использование
различных генетических систем размножения
растений, в частности цитоплазматической
мужской стерильности. Благодаря ЦМС обоеполое растение свеклы превращается в однополое – функционально-женское, что исключает кастрацию цветков при гибридизации.
Впервые явление стерильности на растениях свеклы сахарной описано в 1928 году
соотечественником В. Фаворским [2]. Позднее о «стерильных расах», выделенных среди
инцухт-линий этой культуры, и полученных с
их участием гибридах, сообщил в 1939 году
О.Ф. Гельмер [3]. В США первую информацию
о цитоплазматической стерильности (ЦМС)
сахарной свеклы опубликовал F.W. Owen в
1942 году, где описал ядерную и цитоплазматическую стерильность пыльцы [4].
Проявление признака ЦМС на семенных растениях свеклы сахарной носит различный характер: от отдельных пыльников в цветке до полностью стерильных растений. С.И. Малецкий [5]
объясняет это наличием двух типов митохондриальной ДНК, соответствующей известным
N- и S- типам цитоплазмы сахарной свеклы. В
процессе клеточных делений происходит перераспределение митохондрий и возникает разнокачественность тканей (гетероплазмия). Данное
явление отмечено и на свекле столовой.
В инбредном потомстве фертильного растения возможно появление генотипов с различной степенью ЦМС. Возникновение полностью стерильных растений генотипа Sxxzz
может происходить в результате гомозиготизации при инбридинге ядерных локусов X-x
и Z-z у гетерозиготных растений, а также под
действием ядерного гена-мутатора, индуцирующего переход N-цитоплазмы в S-состояние
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
122
М.И. Федорова и др. Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции...
у фертильного генотипа Nxxzz [5]. Появление
в инбредном потомстве частично-стерильных
растений автор связывает с явлением гетероплазмии. Варьирование в соотношении органелл двух типов (N и S) в клеточной популяции материнских клеток микроспор создает
изменчивость признака мужской стерильности
в потомствах отдельных растений независимо
от степени их стерильности. Если предположить, что частично-стерильное растение имеет
генотип (aN + bS)xxzz, где a < b, то в его инбредном потомстве должны встречаться стерильные (a = 0), частично-стерильные (a < b)
и фертильные растения (a > b).
По мнению ряда ученых у ЦМС-растений сахарной свеклы нарушены поздние этапы формирования пыльцы [6, 7, 8, 9]. В фертильных
пыльниках после распада тетрад секреторный
тапетум постепенно перерождается в плазмодиальный и равномерно выстилает стенки
пыльников, питая микроспоры. Микроспора
увеличивается, накапливает большое количество питательных веществ (сахаров, ферментов,
витаминов, каротиноидов), после чего тапетум
постепенно лизирует, вокруг микроспоры начинают возникать собственные оболочки и она
превращается в пыльцевое зерно. Фертильные
пыльники и пыльцевые зерна окрашиваются
в желтый цвет за счет каротиноидов, переходящих из тапетума. В стерильных пыльниках,
начиная с распада тетрад, происходит постепенное разрушение клеток секреторного тапетума
и неравномерное образование периплазмодия,
в результате чего нарушаются цитоплазматические связи между клетками тапетума и микроспорами. Достигнув диаметра 10–13 мкм,
микроспора прекращает свое дальнейшее развитие, происходит постепенное отслаивание
цитоплазмы от стенок и лизирование. От микроспор остаются слипшиеся пустые оболочки.
Пыльники стерильных растений свеклы сахарной белые, слегка зеленоватые.
Особенности проявления признака ЦМС у свеклы столовой
При изучении проявления признака ЦМС
у свеклы столовой наблюдается широкий спектр
окраски пыльников стерильных растений – от
прозрачных до частично или полностью окрашенных в различные оттенки красного, что является удобным маркерным признаком при опре-
делении степени стерильности растения [1, 11,
12]. Красящим веществом служит характерный
только для данной культуры красный пигмент
бетанин, с пиком поглощения при длине волны
530 нм (рис. 1), который начинает накапливаться
в стерильных пыльниках еще в бутонах.
Рис. 1. Спектры поглощения водных вытяжек корнеплода и пыльников свеклы столовой (λ= 450–600нм): 1 – корнеплод; 2 – темно-бордовые ms-пыльники I группы; 3 – розово-красные ms-пыльники II группы; 4 – желтые mf-пыльники
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
М.И. Федорова и др. Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции...
По характеру окрашивания различных частей стерильных (ms) пыльников выделены
четыре фенотипические группы (рис. 2), в
каждой из которых соответственно варьирует
интенсивность их окраски:
I – не окрашены – прозрачные, слегказеленоватые или сероватые пыльники (по типу сахарной свеклы);
II – окрашены равномерно – все части
пыльника имеют одинаковую розовую, крас-
I
123
ную, бордовую, коричневую окраску с широким
спектром оттенков;
III – окрашены неравномерно – наиболее
ярко в различные оттенки от розового до бордового окрашена центральная часть пыльника
в районе связника, половинки окрашены менее
интенсивно либо частично;
IV – окрашен только связник пыльника –
от бледно-розового до красного цвета, остальная
4
часть имеет бледно- или ярко-желтую окраску.
IV
ms-пыльники
II
III
mf-пыльники
Рис. 2.
Группы
пыльников
степении и
характеру
их окрашивания
Рис.
2. Группы
пыльников по
по степени
характеру
их окрашивания
Группа
В трех последних
группах отмечена
взаимосвязь
степени окраски
характеризуются
только единичные
пыльВ трех последних
группах отмечена
опреде- определенная
с
диаметром
ms-пыльников,
наличием
в
них
пыльцевых
зерен
и
стерильностью
пыльленная взаимосвязь степени окраски с диаме- цевые зерна пыльников II группы окраски
(табл.пыльника
1).
тром
наличием
в них пыльцецы:ms-пыльников,
по мере снижения
интенсивности
окраски
диаметр пыльника и число
Признак
ЦМС снижается.
в пределах При
индивидуального
выхпыльцевых
зерен и стерильностью
пыльцы: поамере
зерен в нем возрастает,
стерильность
пыльцы
этом средрастения
проявлялся
по-разному:
снижения
интенсивности
окраски
пыльника
ний диаметр пыльцы в зависимости от интенсивности окраски изменяется несущестсоотношениепыльцевые
стерильныхзерна
и фердиаметр
пыльцевых
зерен • различное
венно;пыльника
меньшими число
диаметром
характеризуются
только единичные
тильных
пыльников
(4:1;
3:2;
2:3)
внутри
в нем
возрастает,
а
стерильность
пыльцы
снипыльников II группы окраски (табл. 1).
одного
цветка;свеклы столовой в зависижается.
При1этом
средний диаметр
пыльцы
в и msпыльников
Таблица
– Изменение
параметров
пыльцы
•
отдельные,
полностью стерильные цветки
зависимости
от
интенсивности
окраски
измемости от интенсивности и группы их окраски
(от 1 до 3 штук) в соцветиях;
няется несущественно; меньшим диаметром
ms-пыльник
Пыльца
Молекулярная
и прикладная Средний
генетика. ТомСтериль14, 2013 г.
Характер окрашивания,
Средний
Продуктивинтенсивность окраски
диаметр,
ность,
диаметр, ность, %
мм
шт/пыльник
о-мкм
М.И. Федорова и др. Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции...
124
• отдельные ветви (преимущественно цен- • полностью стерильное растение имеет все
ms-пыльники (Cms=100%).
тральные ветви первого порядка), несущие
только стерильные цветки;
Таблица 1
Изменение параметров пыльцы и ms-пыльников свеклы столовой в зависимости
от интенсивности и группы их окраски
ms-пыльник
Группа
Характер окрашивания,
интенсивность окраски
Пыльца
Средний
диаметр, мм
Продуктивность,
шт/пыльник
Средний
диаметр, о-мкм
Стерильность,
%
–
100
Не окрашен:
I
Прозрачные,
слегка зеленоватые
0,43 ± 0,08
Нет пыльцы
Окрашены равномерно все части пыльника:
II
Темно-бордовый
0,46 ± 0,12
Нет пыльцы
–
100
Темно-коричневый
0,48 ± 0,05
Пустые оболочки
–
100
Красный, темно-розовый
0,62 ± 0,14
72 ± 31
37,3 ± 2,8
100
Окрашен неравномерно – более интенсивно в районе связника:
III
Связник темно-бордовый
0,74 ± 0,07
170 ± 56
46,3 ± 1,2
100
Связник красно-бордовый
0,85 ± 0,05
255 ± 94
41,5 ± 5,7
100
Связник темно-розовый
0,91 ± 0,09
560 ± 115
46,1 ± 4,4
100
0,95 ± 0,25
740 ± 136
45,1 ± 7,6
90–94
Окрашен только связник:
IV
От красного
до бледно-розового
Для получения форм с ЦМС используют
метод инбридинга. Самоопыление позволяет
получить ряд линий, гомозиготных по отдельным признакам, которые наряду с депрессией
обладают ценными качествами [14]. Установлено, что если растения свеклы сахарной имеют стерильную цитоплазму, то их потомства от
самоопыления дают свободное расщепление
на полностью стерильные, частично стерильные и фертильные растения [15, 16].
При оценке различных инбредных потомств на
ЦМС учитывают степень стерильности индивидуальных растений (Cms – процент ms-цветков),
которая варьирует в пределах 1≤ Cms ≥100%.
У растений со степенью стерильности до 20%,
отдельные ms-цветки располагаются в верхней
части соцветий, чаще всего на ветвях второго
порядка; со степенью стерильности 30–70%,
имеются как полностью стерильные ветви, так
и отдельные ms-цветки на фертильных ветвях.
Растения со степенью стерильности 80–90%
характеризуются наличием в стерильных соцветиях отдельных фертильных цветков на ветвях
любых порядков. У полностью стерильных растений (Cms-100%) пыльники всех цветков имеют маркерные признаки ЦМС [12, 13].
Признак ЦМС в инбредных потомствах различного происхождения
При сравнительной оценке характера проявления признака стерильности в инбредных
потомствах, полученных из сортовых и гибридных популяций, отмечены определенные
особенности (табл. 2). Семенные растения
сортовой популяции, не зависимо от степени
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
стерильности, имели равномерно окрашенные
пыльники (красные, коричневые). У инбредных потомств с разной степенью стерильности, полученных из гибридных популяций,
этот признак варьирует.
М.И. Федорова и др. Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции...
125
Таблица 2
Проявление мужской стерильности на семенных растениях инбредных потомств
свеклы столовой и качественная характеристика пыльцы mf-цветков
Пыльца mf-цветков
Группа окраски пыльников
Инбредное
потомство
Cms,
%
I
II
III
IV
Фертильная
Диаметр,
о-мкм
Жизнеспособность, %
Длина
пыльцевой
трубки,
о-мкм
Стерильная,
%
Сортовая популяция
274/1-2-15
100
–
+
–
–
–
–
–
100
274/1-7-3
50
–
+
–
–
53 ± 4
3
314 ± 47
8
274/1-7-1
40
–
+
–
–
61 ± 8
20
475 ± 33
27
274/2-2-10
15
–
+
–
–
56 ± 15
28
462 ± 51
6
274/5-6-12
10
–
+
–
–
60 ± 11
32
472 ± 38
26
Гибридные популяции
300/1-4-5
100
+
+
–
–
–
–
–
100
300/1-3-1
80
–
+
+
+
49 ± 3
0
0
85
300/1-3-3
60
–
+
+
+
53 ± 4
5
538 ± 39
47
305/3
30
–
+
+
–
56 ± 7
37
605 ± 52
8
Полностью стерильные семенные растения
отличались наличием цветков с прозрачными или полностью окрашенными стерильными пыльниками (преимущественно красные
или розовые); пыльники в цветках растений
со степенью стерильности (60–80%) характеризовались равномерной и неравномерной
окраской (розовые, красные, темно-бордовые),
а также наблюдали пыльники, окрашенные
только в зоне связника. Растения со степенью
стерильности 30% характеризовались наличием в цветках равномерно и неравномерно
окрашенных пыльников (розовые, красные).
Степень стерильности влияет на функциональные параметры пыльцы mf-цветков
частично-стерильных растений (табл. 2). В
потомствах, полученных на основе гибридных
популяций, отмечен рост числа стерильных
пыльцевых зерен в фертильных цветках по
мере увеличения Cms растения; в потомствах,
полученных из сортовой популяции, подобной
закономерности не наблюдается [12, 13].
С увеличением степени стерильности инбредных растений I1–I2 уменьшаются диаметр
и жизнеспособность фертильной пыльцы mfцветков (r = -0,84 и r = -0,88 соответственно),
снижается скорость роста пыльцевой трубки
(r = -0,85) [12]. В потомствах, полученных на
основе гибридных популяций, при увеличении
Cms с 30 до 60% диаметр фертильных пыльцевых зерен снизился на 5%; жизнеспособность
пыльцы – на 32%; а длина пыльцевой трубки – на 11%. У растения с Cms-80% количество
фертильной пыльцы, которая не прорастала,
в среднем составляло 15%. В потомствах, полученных из сортовой популяции, увеличение
Cms с 15 до 50% также приводило к снижению
аналогичных параметров: диаметра пыльцевых
зерен на 5%, жизнеспособности пыльцы на
25%, длины пыльцевой трубки на 32% (табл. 2).
В инбредных потомствах I3–I4 средние значения изучаемых параметров пыльцы в группах
ms-растений достоверно отличаются от групп
mf-растений, но характер отмеченных ранее
взаимосвязей изменяется. В группе инбредных
ms-растений гибридных популяций сохраняются
тесные связи между степенью стерильности растений и параметрами пыльцы mf-цветков, тогда
как в инбредном потомстве сортовой популяции
большинство связей значительно ослабевает:
Cms/стерильность r = 0,79 и r = 0,65; Cms/диаметр пыльцевых зерен r = -0,88 и r = -0,25; Cms/
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
М.И. Федорова и др. Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции...
126
ление ЦМС и взаимосвязей функциональных параметров, обусловлены перестройкой генотипа и
влиянием депрессии в расщепляющихся инбредных потомствах, что в свою очередь влияет и на
их репродуктивную способность.
жизнеспособность r = 0,64 и r = -0,13; Cms/длина
пыльцевой трубки r = -0,67 и r = 0,20 соответственно. Исходя из общеизвестного толкования
генетического контроля ЦМС свеклы сахарной,
предполагаем, что такое фенотипическое прояв-
Семенная продуктивность инбредных потомств свеклы столовой
при различных способах размножения
ными биотипами у 24% растений урожай семян
составил более 30 г/раст. В потомствах гибридных популяций у большинства растений (41%)
получено 5–15 г/раст.; 13% растений – с урожаем семян менее 1 грамма. Остальные растения
сформировали до 30 граммов семян, а с одного
растения получено 55 граммов (табл. 3).
В результате анализа семенной продуктивности отмечены некоторые различия между потомствами различного происхождения. В потомствах сортопопуляции наибольшую долю (48%)
от числа изученных составляли растения с урожаем семян менее 5 г/раст., из них у 26% получено семян до 1 г/раст. Наряду с низкопродуктив-
Таблица 3
Структура инбредных потомств по семенной продуктивности растений
Популяции
Процент растений с продуктивностью семян
≤ 1,0 г
1,1–5,0 г
5,1–15,0 г
15,1–30,0 г
30,1–60,0 г
> 60,0 г
Сортовая
26
22
12
16
14
10
Гибридные
13
26
41
19
1
0
7 7
При
сравнительной
оценке
семенной
продуктивности
биотипов
с различной
стеПри
сравнительной
оценке
семенной
продуктивности
биотипов
с различной
стедостаточное
количество
семян
[12].
В
потомствах
При
сравнительной
оценке
семенной
пропенью
мужской
стерильности
установлено,
что
при
самоопылении
продуктивность
распенью мужской стерильности установлено, что при самоопылении продуктивность рассортопопуляции
способность
завязывать
семена
дуктивности
биотипов
сЦМС
различной
степенью
тений
с признаком
ЦМС
значительно
ниже,
чем
фертильных
растений,
независимо
от от
тений
с признаком
значительно
ниже,
чем
фертильных
растений,
независимо
при самоопылении
отмечена
у растений,
стерильмужской
стерильности
установлено,
чточастично-стерильных,
при
происхождения,
припри
этом
каккак
среди
так
и среди
фертильных
происхождения,
этом
среди
частично-стерильных,
так
и среди
фертильных
ность
которых
не превышала
15%.
Растения
самоопылении
продуктивность
растений с при- растения
биотипов
встречаются
низкопродуктивные
и растения,
завязавшие
достаточбиотипов
встречаются
низкопродуктивные
растения
и растения,
завязавшие
достаточ-со
степенью
стерильности
20–90%
не
завязывали
знаком
ЦМС
значительно
ниже,
чем
фертильноеное
количество
семян
[12].
В потомствах
сортопопуляции
способность
завязывать
се-секоличество
семян
[12].
В потомствах
сортопопуляции
способность
завязывать
семена.
В
гибридных
потомствах
завязываемость
ных
растений,
независимо
от
происхождения,
мена
припри
самоопылении
отмечена
у растений,
стерильность
которых
не не
превышала
мена
самоопылении
отмечена
у растений,
стерильность
которых
превышала
семяннепри
самоопылении
наблюдали
как у распри
этом
как
среди
так 20–90%
и 20–90%
15%.
Растения
со частично-стерильных,
степенью
стерильности
завязывали
семена.
В гибридных
15%.
Растения
со
степенью
стерильности
не
завязывали
семена.
В гибридных
среди фертильных биотипов встречаются низко- тений с низкой стерильностью, так и у растений,
потомствах
завязываемость
семян
припри
самоопылении
наблюдали
каккак
у растений
с низпотомствах
завязываемость
семян
самоопылении
наблюдали
у растений
с низпродуктивные растения и растения, завязавшие стерильность которых достигала 80% (рис. 3).
койкой
стерильностью,
тактак
и уирастений,
стерильность
которых
достигала
80%
(рис.3).
стерильностью,
у растений,
стерильность
которых
достигала
80%
(рис.3).
90 90
Сортопопуляция
Нежность
Сортопопуляция
Нежность
Сортопопуляция
Нежность
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0
0
5–10
15
mf
5-10 5-10
15 1515
15 1515
15 1515
15 15
mf mf
степень
стерильности,
Степень
стерильности,
% % %
степень
стерильности,
80 80
80
семенная продуктивность, г/раст.
семенная продуктивность, г/раст.
Семенная
семеннаяпродуктивность,
продуктивность,г/раст.
г/раст.
80 80
Гибридные
популяции
Гибридные
популяции
Гибридные
популяции
Семеннаяпродуктивность,
продуктивность, г/раст.
семенная
г/раст.
90 90
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0
00
10 10
30
80 80
10 10
10 10
1015 15 30 30
30 30
3080 80
80 mf mf
mf
Степень
стерильности,
%
степень
стерильности,
% %
степень
стерильности,
Рис.
3. Семенная
продуктивность
растений
инбредных
(двулетняя
культура)
Рис.
3. Семенная
продуктивность
растений
инбредных
потомств
(двулетняя
культура)
Рис. 3. Семенная
продуктивность
растений
инбредныхпотомств
потомств
(двулетняя
культура)
При
выращивании
растений
через
культуру
штеклингов
по по
схеме:
посадка
маточПри
выращивании
растений
через
культуру
штеклингов
схеме:
посадка
маточМолекулярная
и
прикладная
генетика.
Том
14,
2013 г.
ных
корнеплодов
(февраль)
→→
получение
инбредных
семян
I1 иI1 их
посев
длядля
выращиных
корнеплодов
(февраль)
получение
инбредных
семян
и их
посев
выращивания
штеклингов
(I–II
декада
июля)
→→
уборка
и яровизация
штеклингов
(ноябрьвания
штеклингов
(I–II
декада
июля)
уборка
и яровизация
штеклингов
(ноябрьфевраль)
→→
посадка
штеклингов
(февраль)
→→
получение
инбредных
семян
I2 (I–II
декафевраль)
посадка
штеклингов
(февраль)
получение
инбредных
семян
I2 (I–II
дека-
20 20
с
се
се
се
20 20
10 10
10 10
0
0
1010
10 1015 1530 30
30 3080 80
80 80mf mf
10 10
степень
стерильности,
степень
стерильности,
% %
0
0
5-10 5-10
15 1515 1515 1515 15
mf mf
степень
стерильности,
степень
стерильности,
% %
М.И. Федорова и др. Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции...
127
Рис.
3. Семенная
продуктивность
растений
инбредных
потомств
(двулетняя
культура)
Рис.
3. Семенная
продуктивность
растений
инбредных
потомств
(двулетняя
культура)
При
выращивании
растений
через
культуру
штеклингов
схеме:
посадка
маточПри
выращивании
растений
через
культуру
штеклингов
по по
схеме:
посадка
маточклингов (февраль)
→ихполучение
инбредных
При
выращивании
растений
через
культуру инбредных
и
посев
для
выращиных
корнеплодов
(февраль)
→
получение
семян
I
ных корнеплодов (февраль) → получение инбредных семян I1 и1 их посев для выращиштеклингов по схеме: посадка маточных кор- семян I2 (I–II декада июля), получены нескольвания
штеклингов
(I–II
декада
июля)
уборка
и яровизация
штеклингов
(ноябрьвания
штеклингов
декада
июля)
→→
уборка
и яровизация
(ноябрьнеплодов
(февраль) (I–II
→ получение
инбредных
ко другие
результатыштеклингов
(рис. 4). В инбредных
пофевраль)
→
посадка
штеклингов
(февраль)
→
получение
инбредных
семян
I
(I–II
декафевраль)
(февраль)
→ получение
инбредных
семян
I2 (I–II
дека2
семян I1 и →
томствах всех
популяций
способность
завязыих посадка
посев дляштеклингов
выращивания
штеклиниюля),
получены
другие
результаты
(рис.
4).
В инбредных
потомствах
да
июля),
получены
результаты
(рис.
4).
В инбредных
потомствах
вать семена
отмечена
у частично
стерильных
говда
(I–II
декада
июля)несколько
→несколько
уборка идругие
яровизация
всех
популяций
способность
завязывать
семена
отмечена
у
частично
стерильных
расвсех
популяций
способность
завязывать
семена
отмечена
у
частично
стерильных
расштеклингов (ноябрь-февраль) → посадка ште- растений со степенью стерильности 10–90%.
тений
степенью
стерильности
10–90%.
тений
со со
степенью
стерильности
10–90%.
С ортопопулция
Не жность
С ортопопулция
Не
жность
Сортопопуляция
Нежность
семенная продуктивность, г/раст.
семенная продуктивность, г/раст.
Семенная
продуктивность, г/раст.
г/раст.
семенная продуктивность,
35
35 35
30
30 30
25 25
25
20 20
20
15 15
15
10 10
10
5
0
5
0
10 20
10 20
20 30
20 40
30 50
40 50
50 80
50 80 mf
10 10
20
mf mf
80
20
30
40
50
Степень
стерильности,
%
степень
стерильности,
степень
стерильности,
% %
40
40
40
35
35
35
Семеннаяпродуктивность,
продуктивность, г/раст.
семенная
г/раст.
40
40 40
30
30
30
25
25
25
20
20
20
15
15
15
10
10
10
5
5
0
0
1060
10 10
Гибридные
популяции
Гибридные
популяции
Гибридные
популяции
6070
7090
90
mf
mf mf
Степень
стерильности,
степень
стерильности,
степень
стерильности,
% %%
Рис.
4. Семенная
продуктивность
растений
инбредных
потомств
(культура
штеклингов)
Рис.
4. Семенная
продуктивность
растений
инбредных
потомств
(культура
штеклингов)
Рис. 4. Семенная продуктивность растений инбредных потомств (культура штеклингов)
В сортовой
популяции
семенная
продуктивность
частично-стерильных
растений
В сортовой
популяции
семенная
продуктивность
частично-стерильных
растений
средним показателям
даже
выше,
растений
стерильностью
5–15%,
полученпоВпо
средним
даже
выше,
чемчем
растений
со со
стерильностью
5–15%,
получендвулетней
культурой. В потомствах
гибридных
сортовойпоказателям
популяции семенная
продуктивных
через
двулетнюю
культуру.
В
группе
фертильных
биотипов
сортопопуляции
проных
через
двулетнюю
культуру.
В
группе
фертильных
биотипов
сортопопуляции
растениность частично-стерильных растений по сред- популяций, наоборот, по сравнению спроисходит
снижение
семенной
продуктивности,
по
сравнению
с через
двулетней
культурой.
исходит
снижение
семенной
продуктивности,
сравнению
с двулетней
культурой.
В В
ями,
полученными
двулетнюю
культуру,
ним
показателям
даже
выше, чем
растений со по
стерильностью 5–15%, полученных через дву- отмечено снижение семенной продуктивности
летнюю культуру. В группе фертильных био- частично-стерильных растений и увеличение
типов сортопопуляции происходит снижение этого показателя в группе mf-растений, полусеменной продуктивности, по сравнению с ченных через культуру штеклингов (табл. 4).
Таблица 4
Сравнительная оценка инбредных потомств по семенной продуктивности
при разных технологиях выращивания
Семенная продуктивность, г/растения
Продолжительность
цикла выращивания
Двулетний
(корнеплоды)
Однолетний
(штеклинги)
Значение
признака
Среднее
Сортопопуляция
Частичностерильные
mf-растения
растения
3,6
23,6
Гибридные популяции
Частичностерильные
mf-растения
растения
9,9
9,3
min-max
0,2–12,4
0,5–94,0
0,5–26,5
0,3–55,0
Среднее
6,0
6,2
1,8
13,9
min-max
0,24–22,7
0,62–33,6
0,3–3,5
2,1–31,2
Использование защищенного грунта для культуры штеклингов свеклы столовой вполне оправдано для ускорения селекционного процесса и
является одним из способов создания инбредных
потомств свеклы столовой, что дает возможность получать семенной материал у биотипов
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
(штеклинги)
min-max
0,24–22,7
0,62–33,6
0,3–3,5
2,1–31,2
35
I1
I1
30
I2
I2
25
20
15
10
55
300/2/3
300/2/3
295/2/7
295/2/7
274/5/6
274/5/6
274/2/3
274/2/3
274/2/2
274/2/2
274/1/9
274/1/9
274/1/7
274/1/7
274/1/6
274/1/6
227/4/1
227/4/1
300/2/4
300/2/4
274/5/7
274/5/7
274/5/5
274/5/5
274/1/3
274/1/3
300/5/1
300/5/1
300/2/2
300/2/2
295/2/9
295/2/9
295/2/3
295/2/3
295/2/2
295/2/2
295/2/1
295/2/1
00
274/1/2
274/1/2
Семенная продуктивность, г/раст.
семенная продуктивность, г/раст.
Использование защищенного грунта для культуры штеклингов свеклы столовой
вполне оправдано для ускорения селекционного процесса и является одним из способов
создания
потомств
свеклы
столовой,
что дает
возможность
получать
семен128
М.И.инбредных
Федорова и др.
Особенности
размножения
инбредных
потомств
свеклы столовой
при селекции...
ной материал у биотипов с различным проявлением ЦМС, а также поддерживать фертильные инбредные потомства.
нескольких
сотен [17]. Растения,
завязавшие
с различным
проявлением
ЦМС,параметра
а также подВысокая
вариабельность
«семенная
продуктивность»
свеклы столовой,
до
50
семян
автор
относит
к
самостерильдерживать
фертильные
инбредные
потомства.
вероятно, объясняется системой самонесовместимости. Как считает Балков И.Я., на сеВысокая вариабельность параметра «семен- ным, от 100 семян и выше – определяет как
менных растениях свеклы самонесовместимость может иметь различную степень выная продуктивность» свеклы столовой, веро- склонные к самофертильности. Также было
раженности;
завязываемость
семян составляетустановлено,
от нуля до нескольких
сотен
[17]. Растечто признак
самофертильности
ятно,
объясняется
системой самонесовместиния,
завязавшие
до
50
семян
автор
относит
к
самостерильным,
от
100
семян
и выше –
мости. Как считает Балков И.Я., на семенных сохраняется в потомстве.
определяет
как склонные
к самофертильности.
Также
было
установлено,
что признак
Как
видно
на рис.
5, у большинства
растений
растениях
свеклы
самонесовместимость
мосамофертильности
сохраняется
в
потомстве.
жет иметь различную степень выраженности; в I2 произошло снижение семенной продуктивпроизошло
снижение семенной
Как видносемян
на рис.
5, у большинства
растений
I2 0,7–33,2
завязываемость
составляет
от нуля до
ности в(на
г/растение).
продуктивности (на 0,7–33,2 г/растение).
Потомства
потомства
Рис.
продуктивность
инбредных
потомств
Рис.5.5.Семенная
Семенная продуктивность
растений
инбредных
потомств(I(I11–I
–I22))
Однако были выделены потомства 274/1/2; 295/2/1; 295/2/2; 295/2/3; 295/2/9;
300/2/2;
в которых
растения274/1/2;
завязали но
достаточное
количество
семян какк всамоферперОднако 300/5/1,
были выделены
потомства
характеризовать
как склонные
вом
(9,3–31,2
г/растение)
так
и
во
втором
(6,8–21,9
г/растение)
инбредных
поколениях.
295/2/1; 295/2/2; 295/2/3; 295/2/9; 300/2/2; тильности. Потомства 274/1/3; 274/5/5; 274/5/7;
Данныев потомства
можнозавязали
характеризовать
склонные
к самофертильности.
Потом300/5/1,
которых растения
достаточ- как
300/2/4
характеризовались
стабильно
низкой
ное количество семян как в первом (9,3–31,2 г/ семенной продуктивностью (0,4–2,1 г/растение),
растение) так и во втором (6,8–21,9 г/растение) не зависимо от поколения инбридинга и условий
инбредных поколениях. Данные потомства мож- выращивания, и отнесены к самостерильным.
Заключение
Таким образом, для селекционной работы при
создании гетерозисных гибридов свеклы столовой к перспективным относятся самофертильные
потомства частично-стерильных и mf-растений,
способные стабильно формировать достаточное
количество семян (> 5 г) в разных поколениях ин-
бридинга, а также потомства со стабильно низкой
семенной продуктивностью (< 2 г).
Использование культуры штеклингов позволяет не только ускорить селекционный процесс, но и увеличить выход генетически разнообразного инбредного материала.
Список использованной литературы
1. Еременко, Л.Л. Морфологические особенности овощных растений в связи с
семенной продуктивностью. – Новосибирск:
Наука, 1975. – 470 с.
2. Фаворский, В. – Тр. ВНИС. – Вып. 2. –
1928.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
3. Гельмер, О.Ф. Основные выводы из
работ свекловичной секции Ивановской
станции за 1937 г. //Основные выводы научноисследовательских работ ВНИС за 1937 г. –
М.–Л.: Пищепроиздат, 1939. – С. 288–292.
4. Owen, F.W. Cytoplasmically inherited
М.И. Федорова и др. Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции...
malt sterility in Sugar beets // Journ. Of Agris.
Research. – 1945. – V. 71, № 10. – P. 423–440.
5. Малецкий, С.И. Варьирование цитоплазматически контролируемой стерильности
пыльцы у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.)
и ее связь с гетероплазмией митохондрий в
клетках // Генетика. – 1995. – Т. 31, № 11. –
С. 1461–1467.
6. Артшвагер, Е. Дегенерация пыльцы у
сахарной свеклы с мужской стерильностью в
связи с развитием тапетального плазмодия //
Стерильность
сахарной
свеклы:
Сб.
переводов. – М., 1964. – С.91–97.
7. Зайковская, Н.Э. Достижения науки и
передового опыта по свекле.–М.: Сельхозгиз,
1961. – С. 8–11.
8. Зайковская, Н.Э. Изучения микроспорогенеза и развитие семян у сахарной свеклы с
ЦМС // Селекция растений с использованием
ЦМС.– Киев: Урожай, 1966. – С.354–368.
9. Атабекова, А.И. Цитология растений /
А.И. Атабекова, Е.И. Устинова. – М.: Колос,
1971. – С. 136–151.
10.Заячковский, В.А., Селин, И.В., Старцев, В.И. Исследование мужского гаметофита
свеклы столовой // Гетерозис с.-х. растений.
Международный симпозиум. – М., 1997. –
С.110–112.
129
11.Балашова, Н.Н., Заячковский, В.А., Старцев, В.И. Разработка элементов гетерозисной
селекции столовой свеклы // Гавриш. – 1999. –
№ 3. – С. 24–25.
12.Федорова, М.И., Ветрова, С.А., Козарь, Е.Г. Особенности фенотипического проявления признака ЦМС семенных растений
свеклы столовой. // Овощи России. – 2011. –
3 (12). – С. 18–23.
13.Ветрова, С.А. Оценка и отбор исходного
материала для селекции на гетерозис свеклы
столовой (Beta vulgaris L.). / Автореф. дис …
канд. с.-х. наук.– М., 2011.– 25 с.
14.Ващенко, Т.Г. Создание и использование
самоопыленных линий сахарной свеклы в
селекции на гетерозис / Автореф. дис … канд.
с.-х. наук. – Л.: ВИР, 1986. – 17 с.
15.Owen, F.W. Cytoplasmikalli inherited
male-sterility in sugar beets. // J. Agric. Res. –
№ 71. – 1975.
16.Бабьяж, И.А. К вопросу использования
инцухт-линий у сахарной свеклы для
получения форм с ЦМС // В кн.: Селекция
растений
с
использованием
цитоплазматической мужской стерильности. –
Киев, 1966.
17. Балков, И.Я. Селекция сахарной свеклы на
гетерозис. – М.: Россельхозиздат, 1978. – 166 с.
Дата поступления статьи 13 ноября 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
УДК [631.523+633.1](001.9+091)
А.Ф. Стельмах
ИДЕИ Н.В. ТУРБИНА ДЛЯ РАЗВИТИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РАБОТ
селекционно-генетического института
(обзорная статья)
Селекционно-генетический институт – Национальный центр семеноведения и сортоизучения НААН Украины
Украина, 65036, г. Одесса, Овидиопольская дорога, 3
Чтобы понять влияние Николая Васильевича
Турбина на исследования по генетике сельскохозяйственных растений в нашем институте,
кстати, который в этом году также официально отмечает свой 100-летний юбилей, следует
в общих чертах остановиться на его предыстории. За это время институт прошел несколько
принципиально различающихся этапов в направленности своих работ. Но все годы своего
функционирования институт занимал лидирующие позиции среди аграрных учреждений
(и по результативности селекции, и в теоретическом отношении) как бывшего СССР, так и
в независимой Украине.
В 1912 году при Одесском опытном поле
(основанном Южнороссийским товариществом сельского хозяйства в 1895 году) был
организован отдел селекции, руководство которым было поручено Андрею Афанасьевичу Сапегину. И с этого времени начинается
история селекционно-генетического института как научного учреждения. На базе данного
селекционного отдела в 1918 году была организована Одесская селекционная станция, которая в 1928 году была преобразована в Украинский генетико-селекционный институт
(УГСИ) (позже Всесоюзный селекционногенетический институт ВАСХНИЛ, а теперь
Селекционно-генетический институт – Национальный центр семеноведения и сортоизучения НААНУ). Непростой путь, который
пришлось пройти институту за 90 лет, детально описан академиком НААНУ С.Ф. Лыфенко [1]. А история отдела генетики, как
самостоятельного научного подразделения,
началась с 1928 года, то есть со времени образования УГСИ.
Один из непревзойденных ученых своего
времени А.А. Сапегин, как руководитель научМолекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
ного учреждения, с самого начала его организации полностью осознавал, что достижения
в селекционной работе неразрывно связаны с
генетическими исследованиями. Уже в первые
годы он ярко заявил о себе опубликованной
книгой о роли генетики для развития селекции
сельскохозяйственных растений [2] и сборником статей по генетике [3]. На протяжении
всех лет селекционной работы он (позже вместе с сыном Л.А. Сапегиным и рядом сотрудников) интенсивно занимается генетическими
исследованиями, о чем свидетельствуют его
отдельные статьи. Впоследствии они были изданы в сборнике его работ [4] и имеют прямое
отношение к цитологическому и генетическому (гибридологическому) анализам, изучению
внутривидовых и отдаленных гибридов пшениц, получению и характеристике рентгеномутаций мягкой и твердой пшениц, а также
взаимоотношениям хромосом, расщепления
и гибридной мощности.
Послесапегинский период генетических
исследований в институте (как и в стране в
целом) проходит под влиянием господства
так называемой «мичуринской биологии».
Основным направлением исследований становится «управление наследственностью путем воспитания несвойственными условиями
внешней среды» – то есть главным образом,
«переделки», или «направленное изменение»
яровых культур в озимые и, наоборот, озимых
в яровые путем посевов их в несвойственные
сроки для «расшатывания и воспитания» наследственности. После «знаменитой» августовской сессии ВАСХНИЛ 1948 года (31 июля–7 августа) это направление становится
доминирующим не только в институте, но и
в большинстве селекционно-генетических
учреждений всего СССР.
А.Ф. Стельмах. Идеи Н.В. Турбина для развития генетических работ Селекционно-генетического института
К сожалению, полное неприятие хромосомной теории наследственности, ошибочное
идеологическое (философское) обоснование и
жесткое административное давление на длительное время затормозили прогресс в данном
направлении.
Пленум ЦК КПСС 14 октября 1964 года
осудил субъективизм в руководстве наукой
и обществом, предусмотрев мероприятия по
преодолению отставания в биологической и
аграрной науке. Одним из первых шагов в данном направлении была переквалификация преподавателей кафедр генетики всех университетов страны. На базе МГУ в феврале–марте
1965 года для них были организованы курсы
лекций и практические занятия по разным
направлениям классической генетики. Для
обучения привлекаются отечественные генетики высшей квалификации. Изменяются программы генетических курсов в университетах
и аграрных вузах, постепенно пересматриваются тематики генетических работ в исследовательских учреждениях.
В 1967 году академиком-секретарем отделения растениеводства и селекции ВАСХНИЛ назначается новоизбранный академик
Н.В. Турбин (до этого академик АН БССР,
директор ИГЦ и заведующий кафедрой дарвинизма и генетики БГУ). Вместе с ним руководство ВСГИ принимает решение о дальнейшем
усилении и совершенствовании генетического
направления в институте. На должность заведующего отделом генетики (по согласованию с
сельхозотделом ЦК КПСС и ВАСХНИЛ) приглашается с кафедры дарвинизма и генетики
БГУ ученик Н.В. Турбина, автор данной статьи
А.Ф. Стельмах, первоочередной задачей которого предполагается повышение генетической
грамотности сотрудников всего института и
постепенная перестройка научных программ.
В своем напутствии Н.В. Турбин высказал две рекомендации, сыгравшие основную
роль для последующей работы: первое - для
убеждения сотрудников института в правильности хромосомной теории наследственности
развернуть исследования по использованию
явления анеуплоидии у пшеницы, тогда входившего в моду направления исследований.
Что же касается прежней тематики – не просто прекратить эти работы, а попытаться в
методически чистых экспериментах проде-
131
монстрировать их «результативность», разобраться в механизмах выявляемых прежними
авторами изменений, и ни в коем случае «не
выплеснуть из шайки вместе с грязной водой и
ребенка (истины)». Эти рекомендации и стали
отправной точкой нашей дальнейшей работы,
и именно они сыграли основную роль в дальнейшем становлении и развитии генетических
исследований не только в отделе генетики, но
и во всем институте.
Начав работу с повышения генетической
грамотности сотрудников института (для
аспирантов и всех сотрудников института читаются лекции, проводятся семинарские занятия…, кстати, на протяжении 3 лет мы были привлечены и к ведению курса генетики
на 3 отделениях двух факультетов Одесского
сельскохозяйственного института), сразу же
была осуществлена попытка перевести исследования по «переделкам и инъекциям» на
методически безукоризненную основу: соблюдение генетической чистоты исходного материала, исключение засорения, устранение (или
учет) действия отбора и эффектов спонтанного
мутагенеза и т.д. Для проведения этих работ
из выпускников БГУ были приглашены научная сотрудница А.И. Синкевич и аспирантка
С.Ф. Лукьянюк.
Для оценки эффективности «переделок»
яровых пшениц в озимые в качестве исходного материала были избраны линии
яровой пшеницы, прошедшие длительное
поддержание путем самоопыления под изоляторами при их цитологическом контроле
(дисомные выщепенцы из набора моносомных линий пшеницы Chinese spring). Осенние посевы их осуществлялись в разные
сроки в холодном парнике, для предотвращения гибели (действия отбора) в течение
зимы использовали утепление соломенными
матами, при колошении применяли искусственную изоляцию пергаментными изоляторами. Подобное «воспитание» в течение
нескольких сезонов не привело в результате к получению озимых потомков! Следовательно, основными причинами выявления
подобных «изменений» другими авторами
могли быть не учитываемые ими генетическая неоднородность исходного материала
(механическое и/или биологическое засорение), спонтанная гибридизация (возможное
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
132
А.Ф. Стельмах. Идеи Н.В. Турбина для развития генетических работ Селекционно-генетического института
перекрестное опыление) при совмещении
сроков цветения посеянных осенью яровых
и размещенных по соседству озимых генотипов, спонтанный мутагенез.
Первая причина была устранена в наших
опытах выбором линейного материала. Возможность второй была подтверждена впоследствии выявлением возрастания частоты
открытого цветения пшениц при посевах в
необычные сроки, достоверной частотой выявления в потомстве маркерных признаков от
материала из соседних посевов (в том числе
и при ретроспективном анализе компонентного состава запасных белков эндосперма во
многих полученных ранее другими авторами
«яровых линиях» из озимой Мироновской
808). Однако и эта причина была исключена
в наших опытах применением искусственной
изоляции. Что касается возможности спонтанного мутагенеза генов типа развития, то
она представляется сомнительной при «переделках» озимых в яровые (требуется мутация
рецессивного гена в доминантный, что маловероятно), обратный же процесс мутации
доминантного гена яровости в рецессивный
озимости теоретически возможен, но его вероятность оказалась на порядки ниже по сравнению с констатируемыми прежними авторами частотами «переделок». Хотя сам процесс
некоторого достоверного повышения частот
спонтанного мутирования маркерных генов
при посевах в несвойственных условиях был
подтвержден на классическом тесте ячменя
waxy. Кстати, этот же тест позволил выявить
также и достоверный мутагенный эффект дополнительного чужеродного опыления.
Работы по «переделкам» потребовали детального изучения генетики различий пшеницы по типу развития (озимость/яровость). Используя как тестеры полученный из Австралии
набор почти изогенных по Vrn-локусам линий
пшеницы Triple Dirk, были созданы аналогичные полные наборы по 8 гомозиготных линий
(3 локуса с двумя аллелями) в генофоне 6 озимых сортов, идентифицированы генотипы около 1500 образцов мировой коллекции, показаны зональные различия географии конкретных
аллелей и генотипов, свидетельствующие об
их неодинаковой селекционной ценности.
Охарактеризовать ее было возможным, лишь
оценив величины эффектов конкретных генов
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
по основному признаку скорости развития и
сопряженным с нею селектируемым элементам структуры урожая.
В этом существенную помощь оказал опыт
работы по анеуплоидии пшениц, позволяющий определять эффекты отдельных хромосом на уровень развития конкретных количественных признаков (по аналогии с анализом
замещенных линий, после стажировки в Plant
Breeding Institute, Кембридж-Трампингтон,
Англия). Используя методы подобных расчетов, были оценены величины эффектов аллелей Vrn-генов по дате колошения, элементам
структуры и конечному урожаю в оптимальных и моделируемых условиях фитотрона и
естественных условиях Одессы и Тюмени.
Далее работы строились по аналогичной схеме у твердой пшеницы, а у мягкой – было развернуто такое же изучение остальных влияющих на скорость развития озимой пшеницы
генетических систем локусов Ppd (контроль
различий по чувствительности к продолжительности фотопериода), Vrd (по продолжительности потребности в яровизации у озимых
генотипов) и Eps (по скороспелости per se, не
связанной с фотопериодическими и яровизационными реакциями), причем по последним
двум – впервые в мире, об этом шла речь на
предыдущей юбилейной конференции ИГЦ
НАНБ 2010 года [5, 6]. И все эти работы до
сегодняшнего дня интенсивно продолжаются в отделе (в т. ч. и по эффектам на уровень
морозостойкости) под руководством бывшего
аспиранта, теперь уже доктора биологических
наук по генетике В.И. Файта.
В работах по анеуплоидии пшеницы помимо
создания «своего» анеуплоидного цитологически маркированного материала был использован моносомный анализ ряда интересующих селекционеров признаков: тип развития,
устойчивость к ряду грибных заболеваний,
восстановительная способность фертильности при ЦМС, полукарликовость, биосинтез
отдельных компонентов запасных белков эндосперма (глиадинов и глютенинов, участвующих в формировании особенностей качества
зерна). И именно работа по моносомному
анализу различий по последнему признаку
постепенно стала основой широкого развития
направления так называемой «биохимической
генетики» (точнее, генетики биохимических
А.Ф. Стельмах. Идеи Н.В. Турбина для развития генетических работ Селекционно-генетического института
признаков у сельскохозяйственных культур,
или использования генетического разнообразия компонентного состава запасных белков и
ферментов как биохимических маркеров различных признаков) не только в институте, а во
всей стране и за рубежом. Эта работа придала
генетическую направленность исследованиям
в институте по качеству зерна и способствовала преобразованию лаборатории качества в
отдел генетических основ селекции, который
теперь (после А.А. Созинова и Ф.А. Поперели) возглавляет доктор биологических наук
по генетике А.И. Рыбалка, осуществлявший
ранее как аспирант в отделе генетики выше
указанный моносомный анализ компонентного состава запасных белков.
Что касается работ по инъекциям растительных гомогенатов в недозрелые семена гороха
(как модификации вегетативной гибридизации), то в методически выдержанных экспериментах было подтверждено превышение в
потомстве у реципиента частоты выявления
маркерных признаков от донора гомогената
(доминант → рецессив) над частотой ненаправленных мутаций. Само повышение частоты ненаправленного мутирования различных
генов после инъекций не вызывало сомнения и
подтверждалось цитологически возрастанием
частот хромосомных перестроек у потомков по
сравнению с контролем. Однако достоверная
«направленность» в изменении маркерных локусов (донор → реципиент) стимулировала попытку определить активную биохимическую
фракцию гомогената, приводящую к такому
результату.
Фракционирование гомогената на углеводную, белковую и нуклеиновую фракции и раздельное их инъецирование показало наличие
подобного эффекта только в варианте введения нуклеиновой фракции. Данный факт на
фоне «нашумевших» в тот период публикаций
Д. Хесса по возможности трансформации у
растений послужил дополнительным стимулом для организации в институте специальной
лаборатории (а затем отдела) по молекулярной
генетике вернувшимся со стажировки в США
Ю.М. Сиволапом (ныне д.б.н., академик НААНУ). Интенсивное изучение структуры генома у различных видов сельскохозяйственных
растений привело к выделению отдела в самостоятельный Южный биотехнологический
133
центр в растениеводстве (правда, при последней недавней реорганизации аграрной науки в
Украине данный центр в полном составе вновь
присоединен к СГИ).
С другой стороны, продолжение работ по
инъекциям стимулировало идею перевода их на
уровень культуры in vitro. Как модель предполагалось использовать культуру клеток безалкалоидного люпина для возможного восстановления в регенерируемом потомстве биосинтеза
алкалоидов путем введения в культуральную
среду нуклеиновой фракции гомогената алкалоидных доноров. И после освоения соответствующих методик у Р.Г. Бутенко в ИФР АН
СССР аспирантка отдела С.Ф. Лукьянюк начала разворачивать исследования по культуре
растительных клеток и тканей. Правда, со временем работы по «инъекциям» прекратились,
зато были широко развернуты разнообразные
исследования по возможности использования
методик in vitro в селекционно-генетических
программах института у ячменя, пшеницы,
кукурузы, подсолнечника и др.). В результате
эти работы привели к организации в институте самостоятельной лаборатории биотехнологии. После преждевременного ухода из жизни
С.Ф. Лукьянюк данную лабораторию возглавляет до настоящего времени ее соратница ныне доктор биологических наук С.А. Игнатова.
Таким образом, именно те два указанные
выше напутствия Н.В. Турбина (напомню:
использование исследований по анеуплоидии
пшеницы для убеждения сотрудников в истинности хромосомной теории наследственности
и сохранение и перевод на методически безукоризненный уровень прежних исследований
«лысенковской направленности» по переделкам и инъекциям растительных гомогенатов)
при моем переезде на работу в отдел генетики
данного института способствовали не просто
повышению общего генетического уровня
всех сотрудников. Они привели в результате
к кардинальной перестройке теоретической
направленности исследований и структуры
всего института, позволив ему сохранить ведущие позиции в стране (как в СССР в целом,
так и в независимой Украине) в роли координационного центра и по селекции основных
сельскохозяйственных культур, и по генетике,
и по биотехнологии сельскохозяйственных
растений.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
134
А.Ф. Стельмах. Идеи Н.В. Турбина для развития генетических работ Селекционно-генетического института
Список использованной литературы
1. Лифенко, С.П. Селекційно-генетичний
інститут. Нариси з історії / СГІ. – Одесса,
2002. – 122 с.
2. Сапегин, А.А. Законы наследственности, как основа селекции сельскохозяйственных
растений. Изложено по книге E. Bauer'а «Einfuhrung in die experimentelle Vererbungslehre»
/ Об-во сельского хозяйства южной России. –
Одесса, 1912. – 105 с.
3. Этапы менделизма / Сб. статей под ред.
и с предисл. А.А. Сапегина. – Одесса, 1923. –
132 с.
4. Сапєгін, А.О. Вибрані праці / Наукова
думка – Київ, 1971. – 318 с.
5. Стельмах, А.Ф., Генотипы современных
сортов озимой мягкой пшеницы по потребности в яровизации и фоточувствительности /
А.Ф. Стельмах, В.И. Файт // Молекулярная и
прикладная генетика – Минск, 2010. – 5 с.
6. Стельмах, А.Ф., Файт, В.І., Моцний, І.І.,
Ламарі, Н.П. Генетичні системи адаптації
та розширення різноманіття зернових колосових культур // Зб. наукових праць СГІНЦНС – Одеса, 2010. – вип. 15 (35). – 9 с.
Дата поступления статьи 30 июля 2012 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Рефераты
Summaries
УДК 575/576(476)(092)+929
Хотылева, Л.В., Гончарова, Р.И. Академик Н.В. Турбин – основатель современной белорусской генетической
школы / Л.В. Хотылева // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 7–13.
Статья посвящена памяти Н.В. Турбина – академика Национальной академии наук Беларуси, академика Российской сельскохозяйственной академии, лауреата Государственной премии Белорусской ССР, заслуженного деятеля
науки Белорусской ССР, выдающегося ученого в области генетики, селекции и растениеводства, основателя школы
генетиков Беларуси, создателя Института генетики и цитологии Национальной академии наук и его первого директора. В статье оценивается роль Н.В. Турбина как ученого и организатора науки, который создал институт, определил его основные направления исследований, ясно предвидел перспективу их развития в будущем.
Н.В. Турбин оставил большое наследие в генетической науке и благодарную память в сердцах многих людей.
ключевые слова: академик Н.В. Турбин.
Khotyleva, L., Goncharova, R. Academician N.V. Turbin – the founder of the modern Belarusian genetic school /
L. Khotyleva // Molecular and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 7–13.
The article is dedicated to the memory of N.V. Turbin – Academician of the National Academy of Sciences of Belarus,
Academician of the Russian Agricultural Academy, a State prizewinner of the Byelorussian SSR, a Honoured Science Worker
of the Byelorussian SSR, an eminent scientist in the field of genetics, breeding and plant growing, the founder of the school
of Byelorussian geneticists, the founder of the Institute of Genetics and Cytology at the National Academy of Sciences of
Belarus and it's first director. The role of N.V. Turbin as a scientist and an organizer of science who has established the
Institute, defined its major research trends and foreseen the prospect of their development in future is estimated in the article.
N.V. Turbin has left the great heritage in genetic science and grateful memories in hearts of many people.
key words: аcademician N.V. Turbin.
УДК 547.96:543:51:543.54:543.4:576.3
Новая группа мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов: идентификация,
физико-химические свойства и биологическое действие / В.П. Ямскова [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 14–23. – Соавт.: М.С. Краснов, Е.Ю. Рыбакова, В.В. Богданов,
А.П. Ильина, О.Г. Куликова, Д.И. Мальцев, И.А. Ямсков
В данной работе рассмотрены эндогенные биорегуляторы, обнаруженные в различных тканях млекопитающих.
Биорегуляторы имеют сложный состав и состоят из регуляторных пептидов и белков модуляторов. В растворах
биорегуляторы представлены в виде крупных наноразмерных ассоциатов (50–300 нм). Была показана их локализация на поверхности клеток. В сверхмалых дозах (10-8–10-15 мг/мл) они участвуют в регуляции репаративных и
восстановительных процессов в различных тканях. Их действие тканеспецифическое, но при этом отсутствует
видовая специфичность. Среди множества молекулярных факторов, влияющих в низких концентрациях на различные биологические процессы, данные биорегуляторы можно выделить в отдельную группу на основании их
оригинальных физико-химических свойств и специфической биологической активности. Данные биорегуляторы
опосредуют прохождение регуляторного сигнала по межклеточному пространству тканей.
Ключевые слова: биорегуляторы, адгезия, ранозаживление.
A new group of membrane-acting tissue-specific homeostatic bioregulators: identification, physico-chemical properties
and biological action / V. Yamskova [et al.] // Molecular and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. –
P. 14–23. – M. Krasnov, E. Rybakova, V. Bogdanov, A. Il’ina, O. Koulikova, D. Maltsev, I. Yamskov
In this article the endogenous bioregulators were found in various mammalian tissues. Bioregulators have a complex
composition and consist of regulatory peptides and protein modulators. In solutions bioregulators presented as major associates
nanoscale (50–300 nm). Their localization on the cell surface was shown. In ultra low doses (10-8–10-15 mg/ml), they are involved
in the regulation of reparative and regenerative processes in different tissues. Their effect is tissue-specific, but there is no
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
136
Рефераты
species specificity. Among the many molecular factors that influence in low concentrations in the various biological processes,
data bioregulators can be identified as a separate category on the basis of their original physical and chemical properties and
the specific biological activity. These bioregulators mediate passage regulatory signal for intercellular space of tissues.
Key words: bioregulators, adhesion, wound healing.
УДК 575.174.015.3:598.2:591.69
Полиморфизм митохондриального гена cox1 в популяции марит трематод Bilharziella polonica (сем.
Schistosomatidae), паразитирующих у водоплавающих птиц на озере Нарочь / Е.Э. Хейдорова, Г.Г. Хрисанфова
[и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 24–35. – Соавт.: Е.И. Бычкова, С.К. Семенова, М.Е. Никифоров.
Статья посвящена молекулярно-генетическому анализу внутрипопуляционной структуры шистосом Bilharziella
polonica, паразитирующих у водоплавающих птиц на озере Нарочь, впервые проводимому на основе полиморфизма митохондриального гена сох1. Из 11 птиц, относящихся к 3 видам (кряква, хохлатая чернеть и большая
поганка), было выделено 36 марит B. рolonica, для последовательностей cox1 которых характерно невысокое
нуклеотидное разнообразие (π = 0,4%). В выборке марит выявлено 19 гаплотипов и средняя величина гаплотипического разнообразия достигает 52,78%.
Среди обнаруженных гаплотипов были выделены две четко дивергировавшие (d = 0,004 ± 0,001) группы последовательностей – А и В. При этом отмечается низкий уровень аминокислотной дивергенции – 0,001. Разнообразие
гаплотипов выше в линии А (12 гаплотипов), чем в линии В (7 гаплотипов). Представленность линии А среди
марит B. polonica составляет 69,44%, линии В – 30,56%. Гостальной специфичности в распределении гаплотипических линий обнаружено не было. Время образования двух линий гаплотипов B. polonica предположительно
составляет 285–150 тыс. лет назад, что достаточно уверенно позволяет отнести его ко времени Днепровского,
или Рисского, оледенения (250–135 тысяч лет назад) в позднем плейстоцене.
Ключевые слова: сох1, Bilharziella polonica, птицы, церкариоз, Нарочь.
Polymorphism of mitochondrial gene cox1 in the population of maritas Bilharziella polonica (family Schistosomatidae)
parasitizing in wildfowl of Lake Naroch / E. Kheidorova, G. Chrisanfova [et al.] // Molecular and Applied Genetics:
Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 24–35. – E. Bychkova, S. Semenova, M. Nikiforov.
The article is devoted to detailed molecular-genetic analysis of intrapopulation structure of bird schistosomes Bilharziella
polonica of Lake Naroch which first is carried out on basis of polymorphism of mitochondrial gene cox1. It was picked
out 36 maritas B. рolonica from 11 birds belonging to 3 species (the Mallard, the Tufted duck, the Great-crested grebe).
Low nucleotide diversity (π = 0,4%) is typical of their cox1 sequences. 19 gaplotypes is discovered in marita extracts
and mean haplotypical diversity is 52,78%.
Two neatly diverged (d=0,004 ± 0,001) groups of sequences (A and B lineages) is revealed among the haplotypes.
However, level of aminoacid divergence is low (0,1%). Diversity of gaplotypes is higher in lineage A (12 gaplotypes)
than in B (7 gaplotypes). Occurrence of line A among maritas B. polonica is 69,44%, line B – 30,56%. There is no hostspecificity in distribution of haplotypical lines. Formation time of two lineages is likely 285–150 thousand years ago, in
the Dnieper, or Riss, glaciations period (250–135 thousand years ago) in late pleistocene.
Key words: cox1, Bilharziella polonica, birds, cercariosis, Naroch.
УДК 631.524.86:633.11:632.3
Волуевич, Е.А. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине / Е.А. Волуевич // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 36–45.
Современные генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине предполагают создание сортов с разнородной генетической основой по генам устойчивости и разработку политики
их территориального размещения. Для этого необходимо установление ареалов популяций патогена, сходных
по факторам вирулентности, и наличие к ним эффективных генов устойчивости. В статье приводятся данные
по мониторингу европейской популяции патогена, эффективности генов устойчивости и их комбинаций к этой
популяции и генетические подходы для создания устойчивых сортов. Они включают использование генов проростковой и возрастной устойчивости, в том числе генов медленного развития болезни.
Ключевые слова: мягкая пшеница, листовая бурая ржавчина, гены устойчивости, генетические подходы в селекции.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Summaries
137
Voluevich, E. Genetic approaches in common wheat breeding for resistance to brown rust / E. Voluevich // Molecular
and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 36–45.
The current genetic approaches in wheat breeding for leaf rust imply development of cultivars with diverse genetic
basis for resistance genes and working out of their location policy. This requires determination of pathogen population
areas similar in virulence factors and availability of effective resistance genes to them. The article presents the data
on monitoring of the European pathogen population, the efficiency of resistance genes and their combinations for this
population and genetic approaches to development of resistance cultivars. They include use of seedling and adult resistance
genes, with genes of slow disease development.
Key words: bread wheat, leaf brown rust, resistance genes, genetic approaches in breeding.
УДК 631.524.86:633.11:632.3
Волуевич, Е.А. Генетические подходы в селекции мягкой пшеницы на устойчивость к мучнистой росе / Е.А. Волуевич // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 46–55.
Возбудитель мучнистой росы пшеницы является патогеном высокого эволюционного риска, что обусловлено
особенностями его биологии, включая наличие регулярного полового процесса. Генетические подходы в
селекции на устойчивость к этой болезни должны предусматривать создание сортов, разнородных по генам
устойчивости, и их территориальное размещение. Выбор главных генов устойчивости для использования
в селекционных программах должен основываться на периодическом мониторинге популяций патогена
по генам вирулентности. В статье приводятся результаты изучения эффективности генов устойчивости к
мучнистой росе, в том числе и к белорусской популяции патогена. Рассматриваются генетические подходы
для создания резистентных сортов, включая пирамидирование главных генов (как эффективных, так и
преодоленных) и количественных локусов, ассоциированных с частичной устойчивостью, что позволяет
продлить длительность устойчивости.
Ключевые слова: мягкая пшеница, мучнистая роса, гены устойчивости, генетические подходы в селекции.
Voluevich, E. Genetic approaches in common wheat breeding for resistance to powdery mildew / E. Voluevich // Molecular and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 46–55.
The wheat powdery mildew pathogen is a pathogen of a high evolutionary risk due to peculiarities of its biology,
including the presence of regular sexual process. The genetic approaches in breeding for resistance to this disease should
provide development of cultivars diverse in resistance genes and their location. The choise of major resistance genes
for use in breeding programs should be based on periodic monitoring of pathogen populations for virulence genes. The
article presents the results of studying the efficiency of resistance genes to powdery mildew. including the Belarusian
pathogen population. The genetic approaches for developing resistant cultivars, including pyramiding of major genes
(both effective and defeated) and quantitative loci associated with partial resistance to extend the resistance duration.
Key words: bread wheat, powdery mildew, resistance genes, genetic approaches in breeding.
УДК 581.1+581.6+615.2
Кунах, В.А. Длительность жизни человека и биотехнология растений / В.А. Кунах, Л.П. Можилевская // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 56–62.
Изложены современные данные о длительности жизни человека, причинах смертности, рассмотрены факторы, определяющие длительность жизни и роль растительных препаратов в повышении показателя средней длительности жизни до уровня 110–115 лет. Проанализировано состояние природных источников растительного
лекарственного сырья, показано, что единственным реальным источником экологически чистого растительного
сырья является культура тканей. На примере результатов собственных исследований, выполненных в течение
1980–2012 гг., в обобщенном виде рассмотрены: причины, сдерживающие производство биологически активных
веществ растительного происхождения в промышленных масштабах (в биореакторах); подходы, используемые
для повышения уровня синтеза целевых продуктов и повышения производительности культивируемых клеток;
задачи будущих исследований в области разработки промышленных биотехнологий лекарственных растений.
Установлен ряд закономерностей биосинтеза вторичных метаболитов в культуре in vitro, используя которые создают биотехнологии путем получения адекватного генотипа (генофонда) клеточных популяций, способных к
высокоэффективному синтезу целевых продуктов, и разработки условий для максимально полной реализации
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
138
Рефераты
этой способности. Рассмотрены основные этапы создания клеточных штаммов – продуцентов биологически активных веществ и технологий их выращивания.
ключевые слова: длительность жизни человека, биотехнология лекарственных растений, получение вторичных
метаболитов растений.
Kunakh, V. Human lifespan and plant biotechnology / V. Kunakh, L. Mozhylevskaya // Molecular and Applied Genetics:
Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 56–62.
Current data on human lifespan and reasons underlying death rate have been presented and determinants of lifespan
and role of plant preparations in increasing average lifespan to 110-115 years of age have been considered. State of
natural plant raw material sources was examined to demonstrate that the only real environmentally friendly source
may be a tissue culture. As exemplified by own results to be performed during 1980-2012 there were reviewed in most
generalized aspect: causes counteracting production of biologically active compounds of plant origin in industrial scale (in
bioreactors); approaches used to increase the level of target product synthesis and improving performance of cultured cells;
tasks of future researches in the field of development of industrial technologies for medicinal plants. There were found
series of regularities for biosynthesis of the secondary metabolites in culture in vitro whose using allows development of
biotechnologies through generation of cell populations with adequate genotype (gene pool) capable to high-performance
synthesis of target products and specifying conditions for maximally complete realization of this potential. Major steps
in creating such cell strains and technologies for their maintenance were reviewed.
Key words: human lifespan, biotechnology of medicinal plants, production of plant secondary metabolites.
УДК 635.64:631.523:581.192.2
Корневые выделения генотипов томата (Solanum lycopersicum l.), отличающихся отзывчивостью на бактеризацию / А.И. Шапошников [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. –
С. 63–68. – Соавт.: Т.С. Азарова, Л.В. Кравченко, А.А. Бажанова, Д.П. Бажанов, О.Г. Бабак, Н.А. Некрашевич,
А.В. Кильчевский.
В результате оценки эффективности взаимодействия коллекционных линий и сортов томата с ризосферным ростстимулирующим штаммом Burkholderia sp.418, были отобраны контрастные по отзывчивости на бактеризацию
формы томата. Анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) выявил существенные различия позитивно отзывчивых и неотзывчивых форм томата по количеству и составу корневых выделений.
Повышенное количество органических кислот, прежде всего молочной, наблюдалось в экссудатах у отзывчивых
форм. В корневых выделениях наиболее отзывчивого сорта Зорка обнаружено высокое содержание фруктозы.
ключевые слова: томат, корневые экссудаты, ризоферные бактерии, растительно-микробные ассоциации.
Root exudates of tomato (Solanum lycopersicum l.) genotypes differing in responsiveness to bacterization /
A. Shaposhnikov [et.al.] // Molecular and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 63–68. – T. Azarova,
L. Kravchenko, A. Bazhanova, D. Bazhanov, O. Babak, N. Nekrashevich, A. Kilchevsky.
Tomato (Solanum lycopersicum L.) forms contrasting for response to bacterization were selected as a result of the
efficacy evaluation of the interaction between PGPR strain Burkholderia sp. 418 and tomato collection lines and cultivars.
Analysis by HPLC has revealed substantial differences between the positively responsive tomato forms and non-responsive
ones in the quantity and composition of root exudates. An increased amount of organic acids, in particular lactic acid,
was observed in the exudates of the responsive forms. A high fructose content was found in root exudates of the most
responsive cultivar Zorka.
Key words: tomato, root exudates, PGPR, plant-microbial associations.
УДК 575.174.015.3
Михайлова, М.Е. Полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи домашней (Sus Scrofa domesticus) / М.Е. Михайлова, Е.Л. Романишко // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн.
тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 69–76.
Известно, что на ростовые процессы организма влияет комплекс эндокринных, аутокринных и паратипических факторов. Наиболее важную роль в этих процессах играет гормон роста. Регуляция синтеза гормона роста представляет собой многоуровневый каскад взаимодействий белок-рецепторов, тесно связанных
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Summaries
139
между собой. Изменение в работе любого из звеньев влечет за собой изменения в работе соматропиновой оси,
которые могут привести к различиям в фенотипических проявлениях количественных признаков продуктивности у сельскохозяйственных животных. В данной статье представлены результаты анализа генетического полиморфизма генов гормонального ряда соматропиновой оси рGH/MspI, pIGF-1/HhaI, рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI
у свиньи домашней (Sus Scrofa domesticus).
ключевые слова: полиморфизм, соматропиновая ось, полимеразная цепная реакция, ген, рецептор, свинья домашняя.
Mikhailova, M. Polymorphism genes somatotropic axic (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) in the pig domestic (Sus
Scrofa domesticus) / M. Mikhailova, H. Ramanishka // Molecular and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk,
2013. – P. 69–76.
It is known that on the growth processes of the body affect complex endocrine, autocrine and paratypic factors. The
most important role in this process plays a growth hormone. The regulation of the synthesis of growth hormone is a
multilevel cascade of interactions of protein receptor, which is closely linked. The change of the work of any of the links
leads to a change in the somatotropic axis, which may lead to differences in the phenotype of a quantitative productivity
traits in farm animals. This article presents the results of analysis of the genetic polymorphism genes somatotropic axis
рGH/MspI, pIGF-1/HhaI, рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI in the pig domestic (Sus Scrofa domesticus).
Key words: polymorphism, somatotropic axis, polymerase chain reaction, gene, receptor, pig domestic.
УДК: [633.11+633.14]:631.524.86
Орловская, О.А. Оценка устойчивости к биотическим и абиотическим факторам гибридов озимой тритикале,
созданных на основе образцов различного эколого-географического происхождения / О.А. Орловская, Л.В. Хотылева // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14 – Минск, 2013. – С. 77–83.
Проведена оценка зимостойкости и устойчивости к наиболее распространенным грибным патогенам 24 гибридов
F1 озимой тритикале, созданных на основе образцов различного эколого-географического происхождения. Установлено, что у 12 из 24 гибридных образцов процент перезимовки превышал стандарт – сорт тритикале Михась. Выявлены
генотипы с высокой устойчивостью к мучнистой росе (83,3%), бурой ржавчине (87,5%) и септориозу (25%). Резистентность одновременно к двум заболеваниям проявило 50% изученных гибридов, к трем – 16,7 %. По изученным
показателям выделялись комбинации, созданные на основе образца 42м из коллекции CIMMYT. Полученные данные
свидетельствуют о перспективности вовлечения в гибридизацию образцов из мирового генофонда для создания ценного
исходного материала тритикале с повышенной устойчивостью к воздействиям биотических и абиотических стрессов.
Ключевые слова: тритикале, зимостойкость, устойчивость к грибным патогенам.
Orlovskaya, O. Estimation of winter triticale hybrid resistance to biotic and abiotic factors developed by crossing
accessions of different ecological-geographic origin / O. Orlovskaya, L. Khotyleva // Molecular and Applied Genetics:
Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 77–83.
Winter hardiness and resistance to fungal pathogens was estimated in 24 winter triticale F1 hybrids, developed by
crossing accessions of different ecological-geographic origin. Percentage of overwintering exceeded the standard (triticale
Michas) in 12 of 24 hybrid accessions. Genotypes with high resistance to powdery mildew (83,3%), leaf rust (87,5%)
and septoria (25%) were identified. 50% of the studied hybrids showed resistance to two diseases, 16,7 % – to three.
Combinations that are based on an accession of 42m from the CIMMYT collection were the best.
The data obtained show the outlook of involving accessions from the world gene pool in the hybridization for developing
valuable initial triticale material with increased resistance to biotic and abiotic stresses.
Key words: triticale, winter hardiness, resistance to fungal pathogens.
УДК [57:61+575]:004
Дромашко, С.Е. Развитие математической генетики и биоинформатики в Беларуси / С.Е. Дромашко // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 84–94.
В статье анализируются работы по математической биологии и биоинформатике, выполненные учеными Беларуси, в первую очередь исследования Института генетики и цитологии НАН Беларуси по биометрической генетике, компьютерной видеомикроскопии и созданию информационных ресурсов и компьютерных программ.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
140
Рефераты
Ключевые слова: биоинформатика, биометрическая генетика, компьютерная биометрия, компьютерная видеомикроскопия, медицинская информатика, пакеты прикладных генетико-статистических программ, распознавание
образов, теоретико-информационный подход.
Dromashko, S. Development of mathematical genetics and bioinformatics in Belarus / S. Dromashko // Molecular
and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 84–94.
The article deals with an analysis of the works in mathematical biology and bioinformatics, made by Belarus scientists,
primarily investigations of the Institute of Genetics and Cytology of the NAS of Belarus on biometric genetics, computer
videomicroscopy and development of information resources and computer programs.
Key words: applied genetic-statistical program packages, bioinformatics, biometrical genetics, computer biometry,
computer videomicroscopy, information theory approach, medical informatics, pattern recognition.
УДК 573.6:579.64.071
Бажанов, Д.П. Конъюгационный перенос генов деградации симазина Herbaspirillum huttiense В601 в родственные бактерии / Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск,
2013. – С. 95–100.
Установлено, что способность использовать симазин в качестве единственного источника азота передается при
конъюгации из бактерии H. huttiense В601 в типовой штамм вида H. huttiense DSM 10281T с частотой около 10-6
на клетку реципиента. Не удалось обнаружить передачи способности катаболизировать симазин из H. huttiense
В601 в бактерии, принадлежащие к родственным видам H. frisingense и H. seropedicae. Cпособность к утилизации симазина передавалась в H. huttiense DSM 10281T не вследствие самостоятельного переноса крупной Smz
плазмиды донора, а за счет мобилизации расположенных на ней генов деградации smzА, –В и –С второй резидентной плазмидой.
Ключевые слова: Herbaspirillum, симазин, биодеградация, конъюгация, smz гены.
Bazhanov, D. Conjugational transfer of the Herbaspirillum huttiense B601 genes for simazine degradation to related
bacteria / D. Bazhanov, K. Yatsevich // Molecular and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 95–100.
The capability to utilize simazine as sole nitrogen source was found to be transferred by conjugation from H. huttiense
В601 to the type strain of the species H. huttiense DSM 10281T with the frequency of 10-6 per cell of recipient. No transfer
of the capability to catabolize simazine was observed from H. huttiense В601 to the bacteria, belonging to the related
species H. frisingense and H. seropedicae. The capability to utilize simazine was transferred to the H. huttiense DSM
10281T not due to the self-transmission of the large Smz plasmid of the donor, but through mobilization of the located
on it degradation genes smzА, –В and –С by the other resident plasmid.
Key words: Herbaspirillum, simazine, biodegradation, conjugation, smz genes.
УДК 577.21:796
Анализ молекулярно-генетических маркеров, ответственных за устойчивость к физическим нагрузкам, у представителей академической гребли / Л.А. Кундас [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. –
Т. 14. – Минск, 2013. – С. 101–105. – Соавт.: К.В. Жур, Н.И. Бышнев, Т.Н. Прохорова, Е.А. Лосицкий, П.Н. Малашевич, И.Б. Моссэ.
С целью выявления наиболее информативных генетических маркеров, определяющих выраженность и стойкость адаптационных реакций к интенсивным физическим нагрузкам, проведено исследование образцов ДНК
членов Национальной команды Беларуси по академической гребле. Выполнен молекулярно-генетический анализ полиморфизмов 7 генов: АСЕ (I/D), VEGF (G634C), MB (A79G), PPARG (Pro12Ala), BDKRB2 (I/D), HIF1A
(C1772T), UCP2 (Ala55Val).
Показана существенно более высокая частота генотипов A/A MB (OR = 5,45; p < 0,05), Ala/Ala PPARG (OR =
6,38; p < 0,05), а также аллеля Т гена HIF1A (OR = 3,13; p < 0,05) и аллеля D гена BDKRB2 (OR = 2,02; p < 0,05) в
группе гребцов-академистов по сравнению с контрольной группой. Кроме того, отмечалась отчетливая тенденция
к преобладанию генотипов С/C гена VEGF (OR = 2,48) и Val/Val (OR = 2,20) гена UCP2 в группе исследованных
спортсменов. В то же время, различий в частотах аллельных вариантов гена АСЕ в генотипах протестированных
групп обнаружено не было.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Summaries
141
Полученные нами данные позволяют включить полиморфизмы генов MB, PPARG, HIF1A, BDKRB2 в диагностический комплекс для отбора перспективных гребцов-академистов.
Ключевые слова: ПЦР-анализ, ДНК-полиморфизмы, спортивный отбор, аэробные и анаэробные нагрузки.
Analysis of genetic markers for resistance to a physical stress in elite collegiate rowers / L. Kundas [et. al.] // Molecular
and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 101–105. – K. Zhur, N. Byshnev, T. Prohorova,
Y. Lasitski, P. Malashevich, I. Mosse.
The aim of this study was to identify the most informative genetic markers of resistance to intensive physical stress.
Genotypes of the Belarus National team members for rowing were analysed. Genetic analysis of ACE (I/D), VEGF (G634C),
MB (A79G), PPARG (Pro12Ala), BDKRB2 (I/D), HIF1A (C1772T), UCP2 (Ala55Val) gene polymorphisms was performed.
Frequencies of MB A/A (OR = 5.45; p < 0.05), PPARG Ala/Ala (OR = 6.38; p < 0.05) genotypes, HIF1A gene T allele
(OR = 3,13; p < 0,05) and BDKRB2 gene D allele (OR = 2,02; p < 0,05) were significantly higher in rowers compared to
controls. Besides there was a tendency to the prevalence of VEGF gene C/C genotype (OR = 2,48) and UCP2 gene Val/
Val genotype (OR = 2,20) for athletes. There was no difference in ACE I/D genotypes or alleles frequencies distribution
between analyzed groups.
Screening of MB, PPARG, HIF1A, BDKRB2 gene polymorphisms can be used in the diagnostic system for the purposes
of young rowers’ selection.
Key words: PCR analysis, DNA polymorphisms, athlete selection, aerobic and anaerobic exercise.
удк 575.224.46:577.2.08: 616.62.006.6
Особенности дестабилизации генома лимфоцитов периферической крови при раке мочевого пузыря / Н.В. Савина [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 106–112. – Соавт.:
Т.Д. Кужир, А.И. Ролевич, С.Л. Поляков, С.А. Красный, Р.И. Гончарова.
С помощью метода ДНК-комет проанализирована целостность и стабильность генома лимфоцитов, выделенных из
образцов крови от пациентов с подтвержденным диагнозом «рак мочевого пузыря» (РМП), здоровых доноров, пожилых
людей и лиц с хроническими воспалительными заболеваниями. Оценены уровни эндогенных и H2O2-индуцированных
повреждений ДНК, кинетика и эффективность репарации ДНК за 3-часовой период инкубации обработанных лимфоцитов. У пациентов с РМП средний уровень индуцированных повреждений ДНК сразу после мутагенной обработки
in vitro, был существенно повышен по сравнению с контролем и другими группами без онкопатологии. Частота индивидуумов с повышенной чувствительностью лимфоцитов к окислительному стрессу, оказалась также выше среди
пациентов с РМП, что вместе с предыдущими данными указывает на ассоциацию некоторых признаков геномной нестабильности с канцерогенезом, что обусловлено нарушениями редокс-гомеостаза в клетках крови человека.
Ключевые слова: повреждения ДНК, репарация ДНК, лимфоциты, метод ДНК-комет, рак мочевого пузыря.
The features of genome destabilization in peripheral blood lymphocytes in bladder cancer / N. Savina [et al.] // Molecular
and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 106–112. – T. Kuzhir, A. Rolevich, S. Polyakov,
S. Krasnyi, R. Goncharova.
Using the comet assay, the genome integrity and stability were analyzed in lymphocytes collected from patients
with verified diagnosis of bladder cancer (BC), healthy donors, elderly persons and subjects with chronic inflammatory
diseases. The levels of endogenous DNA damage, H2O2-induced DNA damage, kinetics and efficiency of DNA repair for
3-h period of exposed lymphocyte incubation were estimated. In BC patients, the average levels of DNA damage induced
immediately after mutagenic treatment of lymphocytes in vitro was significantly increased as compared to control and
other non-cancer groups. The proportion of individuals with increased lymphocyte sensitivity to oxidative stress was
also higher among BC patients. Along with the previous data this finding indicated the association of some features of
genome instability with carcinogenesis due to disturbances in redox homeostasis in human blood cells.
Key words: DNA damage, DNA repair, lymphocytes, Comet-assay, bladder cancer.
УДК 631.524.86:633.111:632.4
Теломерная концепция старения и онкогенеза для медицины / О.В. Квитко [и др.] // Молекулярная и прикладная
генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. – С. 113–120. – Соавт.: А.С. Сапун, Н.А. Балашенко, Я.И. Шейко,
И.И. Конева, С.Е. Дромашко.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
142
Рефераты
Открытие предсказанного А.М. Оловниковым процесса маргинотомии (сокращения концевых участков ДНК
хромосом во время клеточного деления) явилось началом нового направления молекулярной генетики. Эта область исследований, успехи которой отмечены Нобелевской премией 2009 года, приобретает все большую практическую значимость для медицины. Сокращение теломер является одним из важнейших механизмов клеточного старения, приводящего к ряду заболеваний, включая такую распространенную болезнь как атеросклероз. С
другой стороны, аномальная активизация фермента теломеразы или альтернативных процессов восстановления
теломерных участков наблюдается при канцерогенезе. Определение активности теломеразы является тестом в
онкодиагностике, а ингибирование теломеразы используется в онкотерапии. В то же время, регулируемое повышение активности теломеразы является перспективным подходом к омоложению клеток с целью противодействия
старению и сопутствующим заболеваниям.
Ключевые слова: теломеры, теломерные повторы, теломераза, маргинотомия, клеточное старение, онкодиагностика, атеросклероз, диабет.
Telomere concept of aging and oncogenesis for medicine / O. Kvitko [et al.] // Molecular and Applied Genetics:
Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 113–120. – A. Sapun, N. Balashenko, I. Koneva, Y. Sheiko, S. Dromashko.
The discovery of the process of marginotomy (shortening of DNA regions at the ends of chromosomes during cell
division) predicted by A.M. Olovnikov has become a start of the new field of molecular genetics. This area of research,
which was awarded the Nobel Prize in 2009, gains an increasing practical significance for medicine. Telomere shortening is
one of the major mechanisms of cellular aging, which leads to a number of illnesses, including such a common diseases as
atherosclerosis. On the other hand, the abnormal activation of the enzyme telomerase or alternative processes of the recovery
of telomeric regions occur during carcinogenesis. Determination of telomerase activity is a test in oncological diagnostics,
and inhibition of telomerase is used in cancer therapy. At the same time, the regulated increase of telomerase activity is a
promising approach to the rejuvenation of cells aimed at the slowing of aging and prevention of age-related diseases.
Key words: telomere, telomeric repeats, telomerase, marginotomy, cellular aging, oncodiagnostics, atherosclerosis,
diabetes.
УДК 631.526:635.11
Федорова, М.И. Особенности размножения инбредных потомств свеклы столовой при селекции на гетерозис /
М.И. Федорова, С.А. Ветрова, Е.Г. Козарь // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск,
2013. –С. 121–129.
На основе сортовых и гибридных популяций свеклы столовой получены инбредные линии с различной степенью проявления цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС), маркерным признаком которой является
характерная окраска пыльников. По степени окрашивания выделено четыре группы стерильных пыльников, различных по диаметру, числу и диаметру пыльцевых зерен. Фенотипические проявления признака ЦМС семенных
растений отличаются и определяют степень стерильности растения (Сms). Высокая вариабельность семенной
продуктивности инбредных растений обусловлена степенью проявления ЦМС, системой самонесовместимости,
наличием самофертильных и самостерильных генотипов, условиями и технологией выращивания. Использование
культуры штеклингов позволяет не только ускорить селекционный процесс, но и увеличить выход генетически
разнообразного инбредного материала.
Ключевые слова: свекла, инбридинг, потомство, стерильность, линия.
Fedorova, М. Features of reproduction of inbred progeny of red beet for heterosis breeding / M. Fedorova, S. Vetrova,
Е. Кozar // Molecular and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 121–129.
Based on cultivar and hybrid populations, the red beet inbred lines with different intensity of appearance of cytoplasmic
male sterility (CMS) were developed. The marker for trait of male sterility is anther color. Four groups of anther were
developed based on color grade, diameters, amount and diameters of pollen grains. The rate of appearance of cytoplasmic male sterility (Сms) trait is varied. The high variability of seed production of inbred lines depends on the following
factors: rate of intensity of appearance of CMS, system of self-incompatibility, presence of self-fertile and self-sterile
biotypes, condition and technology of growing. Utilization of steckling culture allows to speed up the breeding process
and increase the yield of genetically diverse inbred material.
Key words: beetroot, inbreeding, progeny, cytoplasmic sterility, line.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Summaries
143
УДК [631.523+633.1](001.9+091)
Стельмах, А.Ф. Идеи н.в. турбина для развития генетических работ Селекционно-генетического института /
А.Ф. Стельмах // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. – Т. 14. – Минск, 2013. –С. 130–134.
При переводе автора на работу в ВСГИ (1968 г.) Н.В. Турбин высказал две рекомендации: развернуть исследования по анеуплоидии пшениц и перевести исследования по «переделкам наследственности и инъекциям растительных гомогенатов» на методически безукоризненную основу. Именно эти рекомендации существенно повлияли на дальнейшее развитие генетических работ в институте. Помимо выявления механизмов «изменчивости
при переделках и инъекциях», они стимулировали широкое изучение генетики типа и скорости развития пшениц,
явились поводом для развертывания работ по культуре клеток in vitro, по направлению генетики биохимических
признаков (запасных белков) и даже в какой-то мере по молекулярной генетике.
Ключевые слова: идеи Н.В. Турбина, генетические исследования, современное состояние.
Stelmakh, A. N.V. Turbin’s ideas for the evolution of genetic investigations in Plant Breeding and Genetics Institute /
A. Stelmakh // Molecular and Applied Genetics: Proceedings. – Vol. 14. – Minsk, 2013. – P. 130–134.
When the author was invited to work in PB&GI (1968) N.V. Turbin gave two recommendations: to develop investigation
on wheat aneuploidy and to transfer the studies on “autumnization and plant homogenate injection” into irreproachable
methodology. Just those recommendations affected significantly further genetic programmes at the institute. In addition
to elucidation the mechanisms of genetic variability at “autumnization and injection” they stimulated intensive studies
on growth habit and rate of development genetics, on tissue culture in vitro, on the direction of biochemical genetics
(genetics of storage protein biosynthesis) and even on molecular genetics in some measure.
Key words: N.V. Turbin’s advices, genetic research, actual state.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ СТАТЬИ
Статьи должны быть написаны в сжатой и ясной форме и содержать:
• соответствующий индекс универсальной десятичной классификации литературы (УДК);
• название на русском и английском языках;
• инициалы и фамилии авторов на русском и английском языках;
• полное название учреждений, в которых выполнялось исследование и их почтовые адреса;
• ключевые слова (3…5 слов);
• аннотацию на русском и английском языках (100–150 слов). Аннотация должна ясно излагать содержание статьи и быть пригодной для опубликования в аннотациях к журналам отдельно от статьи;
• текст статьи (стандартизировать, используя подзаголовки «введение», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение»);
• список использованных источников (оформляется в соответствии с Правилами ВАК, Приложение 2);
• дату поступления статьи в редакцию.
Объем статьи должен составлять не менее 14 000 знаков, включая пробелы, до 10–12 страниц. Последняя
страница статьи должна быть заполнена не менее чем на 4/5(!). После распечатки статья должна быть вычитана автором (авторами). На последней ее странице должна(ы) быть подпись(и) автора(ов). Текст статьи
идентичного содержания представляется в электронном виде (по e-mail или на дискете) и на бумажном
носителе в 2 экз. В виде отдельного документа представляются краткие сведения о каждом из авторов,
включающие фамилию, имя, отчество, год рождения, сведения об образовании, служебные адреса, адрес
электронной почты, ученую степень, ученое звание, должность, область научных интересов. Необходимо
представить АКТ ЭКСПЕРТИЗЫ о возможности опубликования открытой печати (для статей).
1. Сдаваемый документ должен быть представлен в электронном виде в формате MS-Word. Название
файлов – фамилия первого автора латинскими буквами.
2. Формат бумаги А4 (297x210 мм), ориентация – книжная.
3. Поля: верхнее – 2,5 см, нижнее – 2,5 см, левое – 2,5 см, правое – 2,5 см.
4. Основной текст статьи набирается шрифтом Times New Roman, размером 12 пт, в одну колонку с одинарным межстрочным интервалом. Не допускается использование табуляции или пробелов для обозначения первой строки абзаца.
5. Автоматическая расстановка переносов обязательна.
6. Название статьи набирать полужирным начертанием шрифта по центру. Переносы в заголовках не допускаются.
7. Все таблицы, содержащиеся в документе, должны быть реализованы средствами работы с таблицами
редактора MS-Word. Не допускается вложение таблиц, созданных в других программах. Таблицы и графики должны быть пронумерованы и иметь названия. Не допускается размещение таблиц и рисунков в конце
статьи (непосредственно перед списком литературы).
8. Вставка в текст символов (например, β, €) производится только через опцию «Вставка\Символ». Выключку вверх и вниз (С2, С4) выполнять через меню «Формат\Шрифт\Верхний индекс\Нижний индекс».
Греческие символы должны быть прямыми, латинские буквы набираются курсивом. Математические формулы (lim, sum, sin, и т.д.) и цифры набираются прямым начертанием.
9. Печатать в сложных словах дефис (минерал-индикатор, К-пространство). Тире отбивают с обеих сторон неразрывным пробелом как знак препинания между словами: система «человек — машина», «май — июнь». Тире
между цифрами, напр., 20–30 чел. — не отбивается.
10. Кавычки по всему тексту должны быть одного «рисунка». Кавычки не отбивают от заключенных в
них слов.
11. При подготовке к печати графиков, блок-схем, диаграмм, файлы должны быть поименованы таким
образом, чтобы было понятно, к какой статье они принадлежат и какими по порядку рисунками статьи являются. Графики должны иметь толщину всех линий не менее 0,2 пункта для четкого воспроизведения. Все
надписи на рисунках должны быть набраны на компьютере и сгруппированы с рисунком, не допускается
использование сканированного текста.
12. Необходимо предоставить электронные файлы фотоматериалов, а также распечатки лазерным принтером всех иллюстраций на листе формата А4. Отсканированные фотоиллюстрации серой, черно-белой
цветовой модели должны иметь разрешение 600 dpi и формат TIFF.
13. Список цитированных источников располагается в конце текста, ссылки нумеруются согласно порядку
цитирования в тексте. Порядковые номера ссылок д.б. написаны внутри квадратных скобок. (напр.: [1]).
Молекулярная и прикладная генетика. Том 14, 2013 г.
Научное издание
МОЛЕКУЛЯРНАЯ И ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА
СБОРНИК НАУЧНЫХ ТРУДОВ
Том 14
Ответственный за выпуск И.В. Широкая
Переводчик О.А. Лазаренко
Верстка Е.А. Клевец
Корректор И.В. Широкая
Технический редактор Е.А. Клевец
Подписано в печать 28.02.2013. Формат 60×84 1/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Печать цифровая.Усл. печ. л. 16,97. Уч.изд. л. 11,46. Тираж 100 экз. Заказ №
Отпечатано в типографии ООО «Поликрафт»
лп № 02330/0494199 от 03.04.2009
220103, г. Минск, ул. Кнорина, 50, корп. 4
Оригинал-макет подготовлен ГНУ «Инcтитут генетики и цитологии НАН Беларуси»