a б

НОВЫЙ АРМЯНСКИЙ
МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
Том. 3 (2009), №.2, 14-32
www.ysmu.am
ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, НЕЙРОЭНДОКРИННЫЕ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ В ОРГАНАХ-МИШЕНЯХ ПРИ СИНДРОМЕ СДАВЛИВАНИЯ
Зильфян А.В.1, Саакян К.Т.2, Авагян С.А.1, Ананян А.Г.
Г 1, Байбуртян Ж.А.1
Г.
1
Научно-исследовательский центр, ЕГМУ им. М. Гераци, Ереван, Армения
2
Кафедра морфологии, ЕГМУ им. М. Гераци, Ереван, Армения
РЕФЕРАТ
Характер и особенности патологических процессов, полученные при экспериментально вызванном синдроме сдавливания (СС
(СС),
СС), были изучены с комплексных (морфологической
(
, гистоферментной, иммунопатологической, эндокринной, биохимической и бактериологической
бактериологической) точек
зрения. Впервые была установлена важная роль иммунной системы медиаторов и гормона
гипофизарного роста в патогенезе проявления СС в органах и системах.
Иммуноферментным анализом показано, что на фоне резкого угнетения медиаторной функции в иммунокомпетентных клетках центральных и периферических органов иммуногенеза
происходит структурная и функциональная реорганизация легких, печени, поджелудочной железы. Процесс ремоделирования в «органах-мишенях» во многом зависит от количественного и
качественного состава локально выделенных иммуноцитокинов (ИЛ
(ИЛ-I,
ИЛ-I, ИЛ-II,
ИЛ
ИЛ
ИЛ-VII
и γ-ИФН)
ИФН
ИФН)
и, вероятно, пролактина.
Клетки лимфомакрофагиальной линии выполняют роль источника для местного синтеза
про-воспалительных цитокинов в легких и печени, в то время как в поджелудочной железе этот
процесс осуществляется ацинозными клетками. Феномен кишечной бактериальной транслокации грамотрицательных микроорганизмов был выявлен при СС с их дальнейшим присутствием
в «органах-мишенях».
Состояние эндотоксикоза, возникающее на ранних стадиях СС
СС, в развитии которого, как
было установлено нашим исследованием, важная роль принадлежит процессу бактериальной
транслокации и активации NO, должно рассматриваться с качественно новых позиций.
Благодаря комплексным исследованиям, впервые было показано, что на ранних стадиях СС
на фоне нарушенного бактериального гомеостаза участвуют ранее неизвестные иммуноэндокринные «петли», функционирующие по паракринному и аутокринному принципу
принципу.
КЛЮЧЕВЫЕ
СЛОВА:
синдром сдавливания (краш синдром), иммунопатологические нарушения, цитокины, органы-мишени
ВВЕДЕНИЕ
Благодаря одобрению и финансовой поддержке
Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)
во многих странах мира всесторонне разработан
комплекс научно-организационных мероприятий
в рамках основного направления - «Медицина катастроф».
Медицинские аспекты, связанные с последствиями землятрясений, достаточно актуальны
также и для республики Армения. Широкая программа научно-профилактических и медицинских
мероприятий, разработанная в нашей стране уже в
1988 году,
году после природной катастрофы, служит
доказательством их важности. Эта программа проводилась под руководством Министерства здравоADDRESS FOR CORRESPONDENCE:
Yerevan State Medical University after M. Heratsi
2 Koryun Street, 0025, Yerevan, Armenia
Tel.: (+3741 0) 58 08 40
E-mail: Arto_v@mail.ru
14
охранения РА. Особое место среди осложнений,
вызванных землятрясением, занимает длительный
краш-синдром (ДКС). С этой точки зрения исследования, направленные на изучение разных аспектов патогенеза для определения характера и особенностей системных и органических повреждений при ДКС, являются многообещающими.
Социально-экономическое значение ДКС очевидно - в результате землятрясений физически
страдают молодые и люди среднего возраста, являющиеся самыми зрелыми гражданами, которые
создают материальные ценности.
За последние 50 лет клинические подходы для
разрешения этих проблем имели два направления:
радикальный хирургический подход и изучение
эффективных способов общей и местной консервативной терапии.
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
В то же время мы должны отметить, что методологические подходы, использованные при лечении
ДКС, далеко не идеальны. Послеоперационные
осложнения встречаются часто и, как правило, они
имеют отношение к развитию и/или продолжению
местного аэробно-анаэробного инфекционного
процесса. Антитоксичная терапия в силу ряда причин часто неэффектна. Во-первых, по нашему мнению, ДКС, в известной степени, это обобщенное
понятие, которое включает комплекс симптомов
общего и местного проявления, исход которого в
большей степени зависит от характера и продолжительности действующего фактора, конкретных частей поражения на теле, степени его распространения и глубины поражения мягких и твердых тканей
в сдавленных частях. Во-вторых, многие патологические аспекты местных и общих поражений при
ДКС не изучены. В частности, иммунопатологические, метаболические, микроциркуляторные и бактериологические аспекты данной проблемы полностью не выявлены. Все это препятствует лечению, выбору точного способа симптоматической и
патогенетической терапии ДКС.
В качестве более серьезных осложнений, имеющих нередко летальный исход, можно отметить болезненный эмоциональный шок и токсемию. Процесс интоксикации имеет возрастающий характер
уже на ранних стадиях ДКС. В настоящее время
точка зрения относительно того, что процесс интоксикации больше связан с быстрым поступлением токсичных продуктов в кровь (продуктов безжизненных (мертвых) тканей, тканей и микробных
токсинов) после сдавливания пораженных частей
является достаточно самостоятельной.
Ни в коем случае нельзя недооценивать тот
факт, что продукты распада частично принимают
участие в развитии эндотоксикоза, мы полагаем,
что развитие токсемии обусловлено также вовлечением в общий патологический процесс и других
провоцирующих факторов, реализация которых
может произойти на уровне органов и систем. Однако никакой информации о частичном участии
конкретных органов-мишеней в развитии шоковой реакции и токсемии при ДКС на сегодняшний
день в соответствующей литературе не нашлось.
Нашими собственными исследованиями мы показали, что на начальных стадиях ДКС в легких
происходит структурная реконструкция с важными
иммунными компонентами [Саакян
Саакян К
К., 2000]. Мы
имели в виду присутствие периферических частей
бронхолегочных тканей больших макрофагиальных и лимфолейкоцитных инфильтратов.
Не исключено, что «иммунологическое перераспределение» лимфоидного аппарата в легких
при ДКС сопровождается локальным образованием противовоспалительных цитокинов и большой концентрацией NO, что может иметь цитотоксическое воздействие на структурные компоненты бронхолегочных тканей, в большей степени
ухудшая процесс эндотоксикоза. Частичное участие печени в развитии системных иммунологических нарушений и интоксикации при ДКС не достаточно изучено, тем не менее, известно, что в
основном этот орган может служить источником
для повышенного синтеза ряда противовоспалительных иммуноцитокинов и NO в условиях дезадаптации организма.
Изучение морфофункциональных изменений в
поджелудочной железе очень важно, так как поджелудочная железа довольно рано включается в
общий патологический процесс в условиях стресса
разных генезов в результате повышенного проникновения в кровь токсичных продуктов, вследствие дистрофии и смерти экскреторных клеток
железы. В то же время проблема частичного участия «панкреатогенных ферментов» остается открытым, также как и иммуноцитокинов и NO, образующихся in situ при процессах интоксикации,
развивающихся на определенных стадиях ДКС.
Необходимость тщательного исследования
надпочечников продиктована тем, что стресс-стимулирующая и стресс-лимитирующая роль глюкокортикоидов на определенных стадиях ДКС пока
не установлена, тогда как многие проявления на
уровне органов и систем могут быть вызваны состоянием гиперкортицизма надпочечников. Следует отметить, что изучение иммунопатологических нарушений при ДКС, как правило, было проведено с точки зрения частичного участия реакций, характеризующих только состояние гуморального иммунитета. Вопросы, относящиеся к
активации Т-опосредованных иммунных реакций,
изучены недостаточно. Таким образом, несмотря
на тот факт, что медиаторам иммуногенеза придается важная роль в развитии нарушений систем и
органов при стрессе разного генеза, это важное
звено, а также нейроэндокринные изменения оказались вне поля зрения исследователей.
Целесообразность изучения гормонов роста гипофиза - пролактина и инсулиноподобного фактора
роста–1 (ИФР-1) продиктована тем, что оба нейрогормона имеют дозозависимый эффект на процессы
модуляции противовоспалительных цитокинов в организме животного [[Ярилин А., Беляков И
И., 1996;
15
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
Clapp C.
C et al., 1998; Richards S.
S et al., 1998; Zellweger R. et al., 1998; Holstad M,
M Sandler SS., 1999]. Вместе с этим в результате такой гормональной стимуляции усиленный синтез ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 сопровождается дальнейшей активацией пролактина и
синтезом ИФР-1 в гипофизе. Нельзя исключать, что
именно в этом случае, т.е. в условиях такого острого
сочетанного стресса, как ДКС, включается похожий
механизм, лежащий в основе общих и местных иммунопатологических и эндокринных нарушений.
Как известно, при ряде заболеваний инфекционного и неинфекционного происхождения, а
также в критических случаях происходит процесс
бактериальной транслокации в результате миграции микроорганизмов гематогенными и лимфогенными путями из экониш кишечника во внутренние органы [Никитенко В. и соавт., 2001;
Berg R., 1985; Wells C. et al., 1988; Deitch E., 1994;
Fukushima R. et al., 1994; De Souza L. еt al., 1996;
Lemaire L. et al., 1997; Demetriades D. et al., 1999].
Не исключено, что такая транслокация происходит и при ДКС. Изучение этого процесса с бактериологической точки зрения также было предметом настоящего исследования, поскольку эндотоксины грамотрицательной популяции микроорганизмов могут служить независимым источником
интоксикации, а также модулятором синтеза конкретных про-воспалительных иммуноцитокинов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперименты были проведены на 280 половозрелых мышах-самцах (40-50 г). Экспериментальные животные были разделены на 3 группы.
Интактные животные составили контрольную
группу На специальном приборе экспериментальгруппу.
ные животные подвергались сдавливанию в течение одного часа. Местом поражения была внутренняя поверхность бедра. Давление на указанном месте составляло 280 кРА. Животные I–III
экспериментальных групп были выведены из эксперимента через 1 час, 24 часа и 7 дней после
сдавливания соответственно.
Тимус, селезенка, лимфатические узлы, легкие,
печень, поджелудочная железа подвергались морфологическому анализу
анализу. Парафиновые срезы были
окрашены гематоксилин-эозином. Свежезамороженные срезы, полученные из этих органов, подвергались гистоферментному анализу для определения активности кислой фосфатазы (КФ), сукцинатдегидрогенезы (СДГ) и лактатдегидрогенезы
(ЛДГ). Активность аспартатаминотрансферазы
16
(АсТ) и аланинаминотрансферазы (АлТ) была
определена фотометрически с помощью соответствующего набора реактивов («Дельта», Армения). Активность α-амилазы была определена с
помощью набора реактивов «Lachema» (Чехия) и
выражалась в ед/л.
Методом иммуноферментного анализа (ELISA)
в сыворотке крови и супернатантах, приготовленных из легких, печени и поджелудочной железы,
определяли содержание цитокинов – интерлейкины ИЛ-1, 2 и 6, γ-интерферон (γ-ИФН), пролактин, инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1) и
окись азота (NO). Для осуществления реакции
ткани изучаемых органов после высушивания на
фильтровальной бумаге и взвешивания были гомогенизированы в физиологическом растворе с
использованием гомогенизатора стеклянно-тефловового типа при 1000 об/
об/мин
/мин и заморожены при
О
-4 С. Затем суспензия подвергалась центрифугированию в течение 15 мин при 15000 g в условиях
низкой температуры. Содержание цитокинов
определяли с помощью соответствующего антимышинного набора (DRG-International Inc., СШАГермания) и выражалось в пг/
пг/мл
/мл.
Содержание пролактина определяли с помощью реагентов «Syntron Bioresearch Inc.» (США),
для кортизола был использован набор DRG-International Inc. (США-Германия), для NO - набор
«Assay Design Inc.» (США). Содержание пролактина и кортизола выражалось в пг/
пг/мл
/мл, NO – ммол/
л. Уровень цитокинов, пролактина и NO измеряли
автоматическим спектофотометром «Stat-Fax 303Plus» (США) в пределах длины волны абсорбции
420-450 нм. ИФР-1 определяли с помощью счетчика радиации «Гамма 1», наборов «Amersham Bioetech Co.» (США). Содержание ИФР-1 выражалось в имп/мин
/
/мин
.
Техника основана на принципе конкуренции
эндогенного ИФР-1 в сыворотке крови с введенным ИФР-1. Поэтому высокие показатели импульсов указывают на низкий уровень в изученной
биосреде и наоборот.
Бактериологические исследования были проведены согласно общепринятой схеме с посевом содержимого больших и малых кишок, крови, региональных лимфатических узлов, поджелудочной
железы, печени на среды Эндо и Плоскирева.
Для определения роста E.coli в колониях был одновременно проведен бактериологический анализ.
Статистический анализ был проведен с использованием критерия Стьюдента согласно SPSS-12.
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
РЕЗУЛЬТАТЫ
Начальные стадии настоящей работы были посвящены изучению медиаторного звена иммунитета, определяющего уровень про-воспалительных цитокинов в сыворотке крови, а также в центральных и периферических иммунных органах.
Благодаря анализу иммунного фермента, нам удалось показать, что на относительно ранних стадиях ДКС выраженное угнетение синтеза цитоки-
нов ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и γ-ИФН имело место в тимусе, селезенке и лимфатических узлов. В то же
время была установлена прямая взаимосвязь
между уровнями ИЛ-1, ИЛ-6 и γ-ИФН в изученных тканях и сыворотке крови (табл. 1). Необходимо также отметить, что данные иммуноферментного анализа соответствовали результатам
морфологических исследований, в которых был
обнаружен процесс «случайной» дегенерации кор-
Таблица 1
Изменения в содержании иммуноцитокинов в органах иммуногенеза
и сыворотке крови на ранних стадиях ДKС
После сдавливания
Обьект
Контроль
исследования
Через 24 ч
Через 7 дней
Интерлейкин Iα (ИЛ-Iα)
3,1±0,2
1,3±0,3
Сыворотка крови
2,4±0,7
0,25>p>0,
p>0,1
p>0,
p=0,1
30,6±2,9
14,8±3,1
Тимус
131,2±14,1
p<0,0005
p<0,0
p<0,0005
p<0,0
56,7±4,9
45,4±5,6
Селезенка
83,2±7,7
0,025>p>0,
0,025>
p>0,01
p>0,
0,005>pp>0,0
0,005>
0,0005
35,9±1,8
48,0±2,1
Лимфоузлы
94,6±5,6
p<0,0005
p<0,0005
p<0,0
Интерлейкин II (ИЛ-II)
486,4±27,6
949,4±124,1
Сыворотка крови
232,0±17,6
p<0,0005
p<0,0
0,005>pp>0,0005
1985,2±193,6
1175,9±196,6
Тимус
6543,8±182,3
p<0,0005
p<0,0
p<0,0005
p<0,0
245,3±11,9
376,3±18,2
Селезенка
674,7±14,8
p<0,0005
p<0,0
0,01< p<0,0005
p<0,0
365,4±21,9
591,6±25,2
Лимфоузлы
768,6±54,1
p<0,0005
p<0,0
0,025> p>0,01
Интерлейкин VI (ИЛ-VI)
Сыворотка крови
1661,2±109,9
Тимус
1013,3±51,0
Селезенка
117,4±15,4
Лимфоузлы
103,9±9,7
290,7±25,3
p<0,0005
85,45±9,1
p<0,0005
p<0,0
48,8±3,1
0,005>pp>0,0
0,005>
0,0005
54,4±2,6
0,005>pp>0,0005
295,7±23,7
p<0,0005
433,1±12,9
p<0,0005
p<0,0
166,6±9,5
0,025>pp>0,01
0,025>
0,01
186,7±15,6
0,005>pp>0,0005
γ-Интерферон (γ -ИФН)
Сыворотка крови
6,4±0,5
Тимус
16,2±2,6
Селезенка
1,9±0,2
Лимфоузлы
2,9±0,8
0,3±0,09
p<0,0005
p<0,0
5,5±0,5
0,005>pp>0,0005
0,33±0,04
p<0,0005
p<0,0
0,56±0,06
0,01>pp>0,005
3,3±0,7
0,005>pp>0,0005
11,4±1,3
0,1>pp>0,05
0,25±0,05
p<0,0005
p<0,0
0,43±0,07
0,01>pp>0,05
17
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
a
б
Рис. 1. Структурные изменения в тимусе и селезенке через 24 ч после сдавливания. Ув. 40; ок. 10.
а процесс “случайной” инволюции тимуса. Лимфоциты теряют компактную, плотную ориентацию и
а)
характеризуются свободной локализацией в глубоких частях в кортикальном слое. Повсюду зрительно
отмечаются световые участки.
б Выраженные гипопластические процессы в лимфоидной ткани красной пульпы селезенки с “ношением”
б)
(обнажением)
(обнажением
обнажением) ретилулярной стромы.
тикального слоя в тимусе. Гипопластические процессы отмечались также в периферических органах иммуногенеза - селезенке и лимфатических
узлах (рис. 1а, б).
Таким образом, впервые нам удалось установить, что на ранних стадиях ДКС гипопластические процессы происходят в центральных и периферических органах иммуногенеза, сопровождающиеся подавлением секреторной деятельности
лимфоидных и макрофагиальных клеток в аспекте
избирательного синтеза цитокинов ИЛ-1, ИЛ-2,
ИЛ-6 и γ-ИФН.
Мы должны отметить, что высокий уровень
ИЛ-2, обнаруженный в сыворотке крови, не является результатом их повышенной секреции в иммунных органах. Исследование морфофункционального состояния определенных органов-мышеней проводилось путем сравнения результатов
иммуноферментного и морфологического анализов органов иммуногенеза, так как только благодаря такому методическому подходу стало возможным определение частичного участия опреде-
ленных органов-мишеней в развитии комплекса
симптомов системных проявлений при ДКС.
Как видно из результатов иммуноферментного
анализа, на ранних стадиях ДКС определялись достаточно высокие показатели содержания ИЛ-1,
ИЛ-2, ИЛ-6 и γ-ИФН в супернатантах, полученных
из тканей легкого; высокие уровни ИЛ-1 и ИЛ-2
отмечались в течение всего эксперимента (табл.
2).
Несколько другая картина наблюдалась при
определении γ-ИФН - через 24 ч содержание γИФН уменьшалось в 3,4 раза, в то время как на
7-й день уровень данного цитокина не отличался
от его уровня у контрольных мышей. Необходимо
отметить, что нами была установлена прямая
связь между высоким уровнем про-воспалительных иммуноцитокинов и гормонами роста. При
иммуноферментном анализе высокие показатели
пролактина и ИФР-1 были зарегистрированы в
легких на ранних стадиях ДКС (табл. 3).
Как известно, в зрелом организме наряду с соматотрофическими гормонами, пролактин и ИФР-1
Таблица 2
Изменения в содержании иммуноцитокинов в легких мышей на ранних стадиях ДКС
Результаты исследования
Группы
ИЛ-Iα
ИЛ-II
ИЛ-VI
γ-ИФН
исследивания
Контроль
46,7±3,4
631,4±34,4
11,7±1,6
19,4±2,3
Экспериментальная
179,9±19,6
1660,7±164,5
22,8±1,75
5,7±0,9
группа II (24 часа)
p<0,0005
p<0,0005
0,005>p>0,0005
0,005>p>0,0005
Экспериментальная
96,3±12,4
1661,8±89,45
68,8±3,7
22,5±2,1
группа III (7 дней)
0,005>p>0,0005
0,005>p>0,0005
p<0,0005
0,25>p>0,1
18
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
a
б
Рис. 2. Структурные изменения в бронхопульмонарном аппарате на 7-й день наблюдения после сдавливания.
Окрашивание . Ув. 40; ок. 10.
а и б)
а)
б Перибронхиальная и периальвеолярная лимфомакрофагиальная инфильтрация.
служат в качестве стимулирующих факторов, которые выборочно активизируют метаболические процессы в паренхиматозных органах [Розен В., 1994].
В то же время оба гормона роста (пролактин и
ИФР-1) являются модулирующими факторами у
млекопитающих и избирательно активируют синтез ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и γ-ИФН. Исходя из этого не
исключено, что высокий уровень исследованных
цитокинов в легких в определенной мере обусловлен локальным модулирующим воздействием пролактина и ИФР-1, поскольку на ранних стадиях
ДКС в легких нами была обнаружена прямая взаимосвязь между исследованными иммуноцитокинами и гормонами роста.
Наши дальнейшие исследования были направлены на изучение уровня NO в бронхолегочных
тканях экспериментальных животных. Необходимость такого исследования объяснялась тем, что
высокие концентрации NO у млекопитающих вызывали значительное токсичное воздействие на
паренхиматозные и стромальные клетки. Исходя
из этого не исключено, что в механизм развития
эндотоксикоза при ДКС вовлечен каскад патохимических реакций, которые в конечном счету приводят к резкому росту уровня NO.
Согласно результатам иммуноферментного
анализа (табл. 3) на ранних стадиях ДКС были зарегистрированы высокие показатели NO в легких,
которые были в прямой зависимости от уровня исследованных цитокинов и гормонов роста.
Какими являются вероятные механизмы, лежащие в основе значительного повышения уровня
про-восполительных цитокинов в легких?
В этом аспекте результаты наших морфологических исследований были очень полезными.
Таким образом, на фоне выраженной активации
катаболических процессов в бронхолегочной
ткани, строме органа, в основном в перибронхиальных участках, были обнаружены огромные
лимфо-макрофагиальные инфильтраты лимфоидно-фолликулярного типа (рис. 2 а, б). Важно
также отметить, что при гистоферментном анализе была выявлена высокая активность сукцинатдегидрогеназы в лимфоидных клетках, в то
Таблица 3
Изменение содержания пролактина, инсулиноподобного фактора роста (ИФР - 1) и окиси азота (NO)
в легких и сыворотке крови мышей на ранних стадиях ДКС
Обеькт исследования
Группа
Сыворотка
Легкие
Результаты
исследования
исследивания
Пролактин
NO
Пролактин
NO
ИФР-1
ИФР-1
5,3±1,2
318,2±24,5
1,3±0,3
3,4±1,0
519,0±24,3
1,0±0,3
Контроль
II группа
3,9±0,5
440,4±26,1
6,5±0,6
2,2±0,25
332,2±17,6
5,7±0,6
(24 часа)
0,25>p>0,1 0,01>p>0,005
p<0,0005
0,25>p>0,1
p<0,0005
p<0,0005
III группа
3,1±0,8
307,6±26,9
4,8±0,7
10,7±2,1
406,3±15,8
2,3±0,8
(7 дней)
0,1>p>0,05 0,4>p>0,25 0,005>p>0,0005 0,005>p>0,0005 0,005>p>0,0005 0,1>p>0,05
19
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
a
б
Рис. 3. Активность кислой фосфатазы в бронхопульмонарной ткани через 24 ч после сдавливания.
а Высокая активность кислой фосфатазы в перибронхиолярных и периальвеолярных участках. Ув. 10; ок. 10
а)
б Высокая активность фермента в периваскулярно локализованных лимфоцитах и макрофагов. Ув. 40, ок. 10
б)
время как в макрофагах была зарегистрирована
высокая активность и СДГ
СДГ, и кислой фосфатазы
(рис. 3а, б; рис. 4). Результаты морфологического
и гистоферментного анализов в определенной степени говорят об их высокой метаболической деятельности. Исходя из этого, на основе проведенных комплексных исследований мы можем заключить, что иммунокомпетентные клетки перибронхиальных и периальвеолярных инфильтратов служат в качестве возможных источников местного
синтеза цитокинов.
Важным аргументом в пользу нашего предложения стали результаты иммуноферментного анализа органов иммуногенеза, так как в отличие от
анализа легких, в них были зарегистрированы до-
Рис. 4. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ
(СДГ)
СДГ) в
бронхопульмонарной ткани на 7-й день наблюдения. Гистоферментный анализ. Ув. 40;
ок. 10. Обьемистые лимфо-макрофагиальные
инфильтраты в строме легких характеризуются довольно высокой активностью СДГ
СДГ.
20
вольно низкие показатели исследованных провоспалительных цитокинов. В пользу местного
синтеза определенных про-воспалительных цитокинов, в частности, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и γ-ИФН,
говорит также их низкий уровень в сыворотке крови
экспериментальных мышей. И так, про-воспалительные иммуноцитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6),
пролактин, ИФР-1 и NO играют важную роль в
процессах структурного и функционального перераспределения бронхолегочных тканей на ранних
стадиях возникновения ДКС. Сравнительный анализ иммуноцитокинов, полученных из тимуса, наряду со структурными и функциональными изменениями, обнаруженными в легких, позволил сделать заключение, что процесс ремоделирования
тканей на определенных стадиях ДКС в значительной степени зависит от количественного и качественного состава локально синтезируемых иммуноцитокинов и, возможно, также от пролактина
и ИФР-1.
Такое заключение находит свое подтверждение
в ряде научных работах, которыми показано, что
определенные структурные элементы бронхиальной ткани в условиях нормального функционирования организма служат источником синтеза цитокинов [Norman J.
J et al., 1996].
Благодаря нашим исследованиям, мы смогли
показать, что в патогенезе интоксикации при ДКС
процессы
свободнорадикальной
активности
имеют важную роль в системе каскада реакций,
способствуя повышенному синтезу NО. Однако на
основе наших исследований невозможно определить точные механизмы, приводящие к значительному повышению уровня NO в легких. Цитокины
ИЛ-1, ИЛ-2 и ИЛ-6, продуцируемые клетками ин-
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
a
б
Рис. 5. Структурные изменения в печени на ранних стадиях краш-синдрома. Гематоксилин-эозин. Ув. 40, ок. 10.
а Через 1 час после сдавливания. Процессы дискомплексации, дистрофии и деградации гепатоцитов на
а)
фоне умеренного отека.
б Через 24 ч после сдавливания. Процессы дискомплексации, дистрофии гепатоцитов на фоне выраженб)
ного геморрагического компонента. Присутствие единичных лимфоцитов в непосредственной близости и “места” дистрофически измененных гепатоцитов.
фильтрата, а также γ-ИФН могут служить потенциальным источником синтеза NO. Подобный механизм, направленный на стимуляцию NO с помощью отмеченных цитокинов, описан в научных
публикациях при ряде экстремальных состояний.
Не исключено, что высокий уровень NO в бронхолегочной ткани – это результат его гематогенного поступления из других органов-мишеней,
поскольку на ранних стадиях ДКС высокие показатели окиси азота были зарегистрированы в сыворотке крови экспериментальных животных.
С комплексной точки зрения нами были также
изучены морфофункциональные изменения в печени на ранних стадиях ДКС. Как было показано
результатами морфологических исследований, в
течение всего эксперимента в печени доминировали катаболические процессы, тогда как степень
их выраженности отмечалась более очевидно через
1 час и 24 часа после сдавливания (рис. 5а, б). На
7-й день наблюдения была отмечена определенная
активация репаративно-пролиферативных реакций
на фоне альтернативных изменений, выраженных в
очаговых протеиново-липоидных дистрофических
процессах. При сравнении результатов морфологического и гистоферментного анализов была также
обнаружена прямая взаимосвязь с данными биохимических исследований по определению АлТ и
AсТ активности в сыворотке крови, которые считаются информативными маркерами поражения гепатоцитов. Так, на фоне выраженных дистрофических изменений высокая активность КФ и ЛДГ отмечалось одновременное значительное повышение
АлТ и АсТ в сыворотке крови в обеих экспериментальных группах (табл. 4; рис. 6а, в).
На фоне выраженных дистрофических изменений через 24 часа после сдавливания в различных
частях печени были выявлены огромные лимфоцитарные инфильтраты, в которых, вероятно, как
и в легких, не исключается возможность прямого
локального синтеза цитокинов иммунокомпетентными клетками (рис. 7а, б).
Результаты иммуноферментного анализа по
определению цитокинов представлены в таблице 5.
Как видно из таблицы, на 5-й день ДКС довольно
высокие показатели ИЛ-1, ИЛ-2 и γ-ИФН были обнаружены в печени. Через 24 часа после сдавливания уровень ИЛ-6 у экспериментальных животных
понизился в 1,7 раз, в то время как на 7-й день он
практически не отличался от контрольного.
Подобная динамика наблюдалась при определении NO в печени. Так, через 24 часа после сдавливания уровень NO понизился в 2,7 раза (2,1±0,3 мкат/
мкат/л
/л
против 5,7±0,6 мкат/л
/ в контроле). На 7-й день
/л
наблюдения содержание NO у экспериментальных
животных практически не отличалось от контрольной группы (4,1±0,35 мкат/л
/ против 5,7±0,6 мкат/л
/л
/
/л
в контроле).
Таким образом, мы можем предположить, что
на ранних стадиях ДКС NO не может считаться
локальным фактором, стимулирующим как катаболические процессы, так и процессы регионального синтеза ряда про-воспалительных цитокинов, исследуемых нами.
Высокий уровень ИЛ-1, ИЛ-2 и γ-ИФН коррелировал с высоким уровнем пролактина (6,9±1,2 нг/
нг/мл
/мл против 2,5±0,6 нг/
нг/л
/л в контроле) на 7-й день наблюдения.
Показатели ИФР-1 на ранних стадиях ДКС практически не отличались от контрольныой группы
21
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
Таблица 4
Активность АЛТ и АСТ в сыворотке крови мышей на ранних стадиях ДКС
Изученные Контрольная
Экспериментальные группы (после сдавливания))
24 ч
7-ой день
группа
показатели
68,4±6,3
52,5±4,0
АЛТ
26,4±4,4
0,005 >p>0,0005
0,005 >p>0,0005
72,3±7,6
48,1±5,2
АСТ
22,0±3,9
0,005 >p>0,0005
0,005 >p>0,0005
(через 24 часа - 441,4±31,3 имп/мин
/
/мин
, на 7-ой день
– 403,9±2,9 имп/
имп/мин
/мин по сравнению с 319,1±20,4 имп/
имп/мин
/мин
в контрольной группе).
Анализируя полученные данные, мы можем
сделать заключение, что на ранних стадиях ДКС в
печени происходят изменения содержания иммуноцитокинов и пролактина. Эти изменения, в
целом, наряду с результатами морфологического и
гистоферментного анализа, позволяют определить
характер и особенности регионального патологического процесса. Благодаря комплексным исследованиям полученные результаты позволяют нам
с качественно новых позиций рассмотреть роль
определенных представителей цитокинов в возникновении патологического процесса и формировании адаптационной реакции в конкретных
органах-мышенях. Для этого мы должны в первую
очередь рассмотреть роль ИЛ-6 в печени не в качестве провоцирующего фактора, а как адаптогена. В частности, его синтез купферовскими
клетками в «физиологических концентрациях»
обусловлен стимулирующим эффектом пролактина в печени, обеспечивающего структурную и
функциональную реконструкцию органа в аспекте
a
репаративно-пролиферативного процесса активации in situ.
В чем заключается биологическая значимость
повышенного поступления пролактина в печень
на ранний стадиях ДКС.
Можно предположить, что высокие концентрации пролактина в печени способствуют репаративно-пролиферативным процессам в условиях
развитой протеино-липоидной дистрофии. В этом
аспекте воздействие пролактина на репаративнопролиферативные процессы в печени было изучено японскими исследователями [Tokada T. et al.,
1997]. Было выявлено, что при частичной резекции печени в условиях многократного введения
пролактина на фоне вызванной пролактинемии ни
активации или ингибирования процессов пролиферации гепатоцитов и элементов стромы не наблюдалось в сохранной части печени.
Важно отметить, что во время другой серии
экспериментов введение пролактина проводилось
в условиях удаленного яичника. Так, авторами исключалась возможность проникновения пролактина в печень из яичника. Исходя из этого, согласно нашим данным, в условиях ДКС «аккуму-
б
Рис. 6. Активность кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы в печени экспериментальных мышей в условиях краш-синдрома.Гистоферментный анализ. Ув. 10; ок. 10.
а Высокая активность кислой фосфатазы в цитоплазме гепатоцитов всех частей дольки вдоль единича)
ных линейно ориентированных межклеточных капилляров. Через 24 ч после сдавливания.
б Высокая активность лактатегидрогеназы в периферических частях дольки печени. На 7-й день после
б)
22
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
Таблица 5
Изменения в содержании иммуноцитокинов в печени мышей на ранних стадиях ДКС
Группы
Результаты исследования
ИЛ-Iα
ИЛ-II
ИЛ-VI
γ-ИФН
исследования
Контроль
146,0±12,3
399,0±20,5
415,9±24,3
0,8±0,07
II экспериментальная
42,3±6,6
600,6±37,9
248,8±13,7 не определено
группа (24 часа)
p<0,0005
0,005>p>0,0005 p<0,0005
III
экспериментальная
234,6±17,6
3763,0±118,7
404,5±15,8
2,8±0,51
группа (7 дней)
0,005>p>0,0005
p<0,0005
0,4>p>0,25 0,005>p>0,0005
ляция» пролактина в печени не должна считаться
фактором, обеспечивающим формирование локальных репаративно-пролиферативных процессов. Последнее подтверждается морфологическими изменениями, которые мы обнаружили в
печени на ранних стадиях ДКС, т.е. процесс протеино-липоидной дистрофии без каких-либо видимых признаков активации ни в гепатоцитах, ни
фибробластических клетках. В то же время не исключено, что высокий уровень пролактина в печени обеспечивается, в первую очередь, его поступлением из основного источника синтеза, т.е.
гипофиза, а также благодаря миграции в печень
определенных лимфоцитарных популяций, которые также синтезируют пролактин [Reber P
P., 1993;
Matera L., 1996].
Тот факт
факт, что в здоровой печени пролактин обнаруживается только в периваскулярных частях
«артериоловенулярной триады», центральных
венах и эпителии желчного тракта свидетельствует
в пользу этого факта [Kloehn S. et al., 2001].
Более того, те же авторы показали, что в паренхиматозных или стромальных клетках нормально
a
функционирующей печени не были обнаружены
какие-либо рецепторы для пролактина. Относительно этого авторы делают заключение, что, понашему мнению, очень важно - со стороны печени
пролактин не действует посредством механизмов
аутокрина и даже паракрина.
Принимая во внимание эту довольно ценную
информацию, полученную указанными авторами,
мы можем предполагать, что на ранних стадиях
ДКС «реализация» поступления пролактина в печень, вероятнее всего, происходит под воздействием иммунной системы на мишени-клетки in
situ. Локальные макрофаги, купферовские клетки,
а также чужие (другие) клетки моноцитарно-лимфоцитарной линии клеток, которые обнаруживаются в печени в качестве периваскулярного инфильтрата, служат подобно клеткам в условиях
нашего эксперимента. Следовательно, не исключено, что при ДКС на фоне поражения печени подобные иммунопатологические процессы, которые проявляются в усиленном локальном синтезе
ряда про-воспалительных иммуноцитокинов, оказывающих цитотоксичный эффект на гепатоциты,
также возможны.
б
Рис. 7. Структурные изменения в печени через 24 ч после сдавливания.
а Объемистые инфильтраты в непосредственной близи с центральной веной, напоминающие по струка)
турной организации фолликулярный аппарат селезенки. Ув. 10; ок. 10
б Деталь изображения. Ув. 40; ок.10.
б)
23
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
a
б
Рис. 8. Структурные изменения в поджелудочной железе через 1 ч после сдавливания.
а Процесс дискомплексации ацинозного аппарата на фоне перипроточного отека и умеренной лимфоциа)
тарной инфильтрации.
б Умеренная периваскулярная инфильтрация, присутствие изолированных лимфоцитов в местах ациб)
нозно-эпителиальной дистрофии. Ув. 20; ок. 10.
a
б
Рис. 9. Структурные изменения в поджелудочной железе через 24 ч после сдавливания. Гематоксилин-эозин. Ув. 40, ок
Рис
ок. 10.
а и б)
а)
б Выраженный перицеллюлярный отек на фоне дистрофии и деградации экзокринных панкреацитов.
a
б
Рис. 10. Активность кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы поджелудочной железе через 24 ч после сдавливания.
Рис
а Выраженная активность фермента в ацинозных клетках, показанная как гомогенизированные красные
а)
массы и маленькие частички в цитоплазме дистрофично измененных эпителиоцитов. Ув. 40; ок. 10.
б Высокая активность лактатдегидрогеназы в ацинозных клетках.Ув. 20; ок. 10.
б)
24
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
Как видно из результатов морфологических и
иммуноферментных анализов, у животных, подвергнутых ДКС, происходили структурно-функциональные изменения в кортикальном слое надпочечников. Являясь ответом на такой острый
стресс, как ДКС, эти изменения по характеру были
неспецифичными. Более того, на ранних стадиях
ДКС состояние гиперкотицизма надпочечных
желез развивались и сопровождались повышенным поступлением кортизола в поток крови.
Таким образом, на фоне значительной дилатации фасцикулярной зоны, в которой доминировал
оптически «гипертрофированный» свет адренокортикоцитов, через 24 часа после сдавливания
уровень кортизола в надпочечниках и сыворотке
крови повысился более чем в два раза - в надпочечниках: 275,0±19,9 нг/
нг/мл
/мл против 134,8±12,8 нг/
нг/мл
/мл
в контроле; в сыворотке крови – 34,8±3,7 нг/
нг/мл
/мл
против 16,8±0,5 нг/
нг/мл
/мл в контроле.
Следует отметить, что процесс гиперкортицизма в надпочечниках имел временный характер,
он был ответом на острый сочетанный стресс, так
как на 7-й день после сдавливания наблюдалась
тенденция к нормализации архитектоники и секреторной функции органа, а на 15-й день морфофункциональные показатели органа практически
не отличались от показателей в контрольной
группе мышей.
По результатам морфологического исследования на ранней стадии ДКС (через 1 час и 24 часа),
выраженная активация катаболических процессов
происходила в поджелудочной железе с первоначальной локализацией в экскреторной части железы. Дистрофические изменения проявлялись
признаками дискомплексирования ацинозных клеток, вакуолизации цитоплазмы, пикноза их ядра.
Повсюду были выявлены очаги микронекроза. Необходимо отметить, что вышеизложенные изменения в поджелудочных ацинозах были выявлены на
фоне микрогемоциркуляторных нарушений, которые проявлялись признаками дистрофии эндотелиоцитов, эритродиапедезом и умеренным периваскулярным лимфолейкоцитарным инфильтратом (рис. 8а, в, рис. 9а, б).
На 7-й день после сдавливания интенсивность
катаболических процессов значительно ослабевала.
На этом фоне происходила выраженная активация
репаративно-пролиферативных реакций, которые
характеризовались процессами пролиферации эпителиальных клеток междольковых и внутридольковых каналов и сопровождались формированием маленьких панкреатических долек, которые находи-
лись на разных стадиях дифференциации.
Результаты морфологического анализа коррелировали с данными гистоферментных исследований. На определенной стадии ДКС, т.е. в период,
когда в поджелудочной железе преобладали катаболические процессы (1 час и 24 часа после сдавливания) отмечалась высокая активность КФ, ЛДГ
на фоне значительного понижения СДГ (рис. 10а, б).
На 7-й день ДКС, т.е. в период, когда в поджелудочной железе имела место выраженная активация анаболических процессов, направленных на
восстановление цитоархитектоники экскреторного аппарата, активность КФ в целом значительно
уменьшилась.
Интенсивность катаболических процессов в
экскреторном аппарате коррелировала с уровнем αамилаза в сыворотке крови, а именно, в поджелудочной железе в течение всего эксперимента. Почти
одинаково высокие показатели активности амилазы
определялись в обеих экспериментальных группах.
Так, спустя 24 часа уровень амилазы в сыворотке
крови был 300,05±33,4 мкат/л
/ , на 7-й день он до/л
стиг 360,0±30,1 мкат/л
/ против 216,0±18,4 мкат/л
/л
/ в
/л
контроле. Через 24 часа содержание амилазы в поджелудочной железе у мышей было 443,8±32,3 мкат/
мкат/л
/л,
а на 7-й день эксперимента оно стало 428,4±34,5 мкат/
мкат/л
/л
против 140,0±11,8 мкат/л
/ в контроле.
/л
Как показано результатами иммуноферментного анализа, на ранних стадиях ДКС выраженное
повышение уровня ИЛ-1 отмечалось в поджелудочной железе (табл. 6).
Методом иммуноферментного анализа нам не
удалось определить другие исследуемые цитокины
в поджелудочной железе у экспериментальных и
контрольных мышей, т.е. были обнаружены только
их следовые количества. На всех стадиях ДКС в
поджелудочной железе были зарегистрированы довольно низкие показатели пролактина (табл. 8).
Показатели ИФР-1 в поджелудочной железе
практически не отличались от контрольной группы.
Через 24 часа содержание ИФР-1 отмечалось на
уровне 398,6±
398,6±32,1
±32,1 имп/
имп/мин
/мин, на 7-й день - 365,5±29,3
±
±29,3
имп/мин
имп/
/мин
против 348,0+±28,6 имп/мин
/
/мин
в контроле.
Как показывают результаты иммуноферментного анализа окиси азота, после 24 часа после
сдавливания уровень NO в поджелудочной железе
повысился в 3 раза по сравнению с контролем
(95,3±8,4 пг/
пг/мл
/мл против 31,4±6,5 пг/
пг/мл
/мл в контрольной), а на 7-й день наблюдения отмечалась только
тенденция к понижению (54,8±6,3 пг/
пг/мл
/мл).
Многие годы считали, что развитие панкреатита связано с первичной активацией пищевари-
25
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
Таблица 6
Изменения в содержании интерлейкина -1
и пролактина в панкреасе мышей на ранних
стадиях ДКС
Группы
Результаты исследования
исследования
ИЛ-Iα
Пролактин
14,6±2.8
8.2±1.6
Контроль
1.8±0.5
II экспериментальная 89.5±7.2
группа (через 24 ч)
p<0.0005 0.005>p>0.0005
2.6±0.9
III экспериментальная 62.7±7.2
группа (через 7 дней) p<0.0005 0.025>p>0.01
тельных ферментов в ацинозных клетках, что приводит к аутолизису поджелудочной железы и, соответственно, к развитию эндотоксикоза.
Однако механизмы этой «активации» изучены
недостаточно. Очевидно, они не должны быть отнесены к категории инициально-поражающих факторов, так как на фоне экстенсивного клинического и
экспериментального материала была убедительно
показана неэффективность симптоматической терапии с использованием анти-протеазы и препаратов,
ингибирующих синтез липазы и амилазы в поджелудочной железе. J.G.Norman объективно обосновал,
что направление по изучению роли воспалительных
медиаторов и, в первую очередь, про-воспалительных цитокинов в механизме поражения поджелудочной железы становится наиболее перспективным
[Norman J.
J et al., 1996]. В этом отношении важно отметить, что в условиях некоторых экстренных случаев, включая экспериментально индуцированный
панкреатит довольно высокие уровни ИЛ-1 и NO
панкреатит,
отмечаются в поджелудочной железе и сыворотке
крови. Как отмечено многими авторами, ацинозные
клетки являются источником их синтеза [Гуковская
А. и соавт., 1997; Занинович В. и соавт., 2000; Fink
G., Norman JJ., 1997; Norman J.
J et al., 1997; Klar E.,
Werner JJ., 2000].
Мы должны особенно подчеркнуть высокую
информативность результатов, полученных J.G.Norman и соавторами [Norman J.
J et al., 1996, 1997;
Norman JJ., 1998] на нескольких моделях панкреатита. Так, авторы четко константируют, что ИЛ-1
и ФНР-α, индуцируемые самыми разными стимулирующими факторами при экспериментальном
панкреатите, фактически в числе первых выделяются в паренхиму поджелудочной железы. В
пользу местного синтеза указанных источников
свидетельствуют исследования, проведенные авторами на генетическом, иммуноферментном и
иммуногистохимическом уровнях. В частности,
индукция гена панкреатического ИЛ-1 и ФНР-α и
формирование альбумина происходили уже через
26
30 минут после инициации панкреатита в экспериментальных условиях.
Особенно должно быть упомянуто следующее
обстоятельство - через определенный период времени после выраженного повышения секреции цитокинов в поджелудочной железе, ИЛ-1 и ФНР начинают продуцироваться в больших количествах в
легких, печени, селезенке, но не в почках, миокарде
и мышцах скелета. Многие авторы полагают
полагают, что
определенные концентрации ИЛ-1 и ФНР в тканях
поджелудочной железы являются токсичными для
паренхиматозных и стромальных клеток.
Следовательно, благодаря комплексным исследованиям мы можем предположить, что вероятной
причиной тяжелых дистрофических процессов в
поджелудочной железе является высокий уровень
ИЛ-1, в особенности синтезируемый in situ, т.е. в
ацинозных панкреацитах.
Высокий уровень окиси азота в поджелудочной
железе на ранних стадиях ДКС обусловлен его
притоком из крови, так как через 24 часа, на 7-й
день после сдавливания в сыворотке крови, легких и органах иммуногенеза нами были зарегистрированы довольно высокие показатели. С другой стороны, не исключен его вероятный синтез in
situ, вызванный прямым стимулирующим действием локально продуцируемого ИЛ-1. В отличие от легких и печени, в поджелудочной железе
пролактин не действует как фактор, обеспечивающий направленный синтез ИЛ-1, т.к. показатели
его концентрации довольно низкие в железе - многократно ниже, чем в контроле.
Наши бактериологические и бактериоскопические исследования позволили определить, что воздействие в течение одного часа на заднюю конечность мышей стимулировало транслокационный
процесс резидентной грамотрицательной микрофлоры из экониш дистальных частей желудочнокишечного тракта (тощая и подвздошная кишки) во
внутреннюю среду макроорганизма. Положительные результаты, полученные при посеве грамотрицательных микроорганизмов, включая также E.coli,
из тканей региональных мезентериальных лимфатических узлов, крови и паренхиматозных органов,
свидетельствуют в пользу данного обстоятельства.
Уже на ранних стадиях ДКС (через 1 час после
сдавливания) в желудочно-кишечном тракте довольно четко наблюдалась «ретроградная» транслокация грамотрицательных микроорганизмов.
Степень бактериальной диссеминации повысилась - 108 формирующих колонии единиц (ФKE)
на фоне понижения числа колоний в подвздошной
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
кишке, которое составило 107 ФKE.
Необходимо отметить, что грамотрицательная
микрофлора начинала распространяться из поджелудочной железы в течение указанного периода
наблюдения (104ФKE), в то время как посев в контрольной группе был стерильным. Грамотрицательная микрофлора в присутствии E.coli начинала распространяться также из крови (103ФKE).
Данные бактериологических исследований, полученные на относительно ранних стадиях ДКС,
косвенно свидетельствуют, что экониши резидентных грамотрицательных микроорганизмов, находящихся в соответствующих частях толстой кишки
(107ФKE против 109 ФKE в контроле) служили вероятным источником повышенной диссеминации
тощей и двенадцатиперстной кишок и колонизации поджелудочной железы.
Другая картина наблюдалась в изученных органах желудочно-кишечного тракта через 24 часа
после сдавливания. Отмечалась тенденция к
уменьшению числа колоний в толстой кишке (105ФKE) даже по сравнению с контрольными показателями (5x107ФKE).
Мы должны отметить, что подобный характер
процесса транслокации кишечной грамположительной микрофлоры наблюдался у мышей в условиях
4-часовой строгой иммобилизации [Гриценко В. и
соавт., 2000].
Согласно результатам бактериологического исследования, E.coli составила 8-10% от общего
числа грамотрицательных микроорганизмов в
подвздошной кишке.
Необходимо отметить, что при ДКС поджелудочная железа продолжала служить источником
колонизации микрофлоры, перемещенной из
тощей и толстой кишок. Более того, общее число
колоний практически не отличалось от их числа в
поджелудочной железе мышей предыдущей экспериментальной группы. Тем не менее при бактериоскопическом исследовании грамотрицательных микроорганизмов намного чаще была выявлена Е.coli - в 20% случаев. На 7-й день обследования имела место дальнейшая «колонизация»
поджелудочной железы грамотрицательными микроорганизмами (105 ФKE), среди которых Е.coli
определилась в 35-40% случаев.
В подвздошной кишке наблюдалась тенденция к
нормализации бактериальной картины. Подобная
тенденция наблюдалась и в тощей кишке (106ФKE).
Довольно низкая диссеминация (103 ФKE) была
зарегистрирована в посеве крови на питательную
среду Эндо и Плоскирева. На 14-й день наблюде-
ния бактериальная картина (имеются ввиду только
резидентные грамотрицательные микроорганизмы, которые обнаруживаются в эконишах конкретных частей желудочно-кишечного тракта)
нормализовалась - 5х107 ФКЕ в тощей кишке и 109
ФКЕ - подвздошной кишке.
Степень бактериальной диссеминации в поджелудочной железе значительно уменьшалась (102 ФKE),
тогда как в последующем бактериоскопическом анализе грамотрицательная микрофлора была представлена исключительно как монокультура E.coli.
Как показывают результаты бактериологического анализа, процесс бактериальной транслокации на ранних стадиях ДКС также сопровождался
колонизацией печени и легких грамотрицательной
микрофлорой E.coli, которая обнаруживалась в 1520% случаев. Только единичные точечные колонии
были определены в легких и печени через 1 час
после сдавливания. Через 24 часа грамотрицательная микрофлора (105ФKE) была интенсивно высеяна из легких. В последующем периоде наблюдения тенденция к уменьшению диссеминации бронхолегочной ткани (103 ФKE) наблюдалась очень
четко, в то время как на 7-й день, а также через 1
час после сдавливания только единичные точечные
колонии обнаруживались в питательной среде.
В отличие от легких, колонизация печени грамотрицательными микроорганизмами происходила только через 24 часа после сдавливания (103ФKE). В дальнейшем периоде наблюдения (на 7-й
и 14-й дни после сдавливания) высеивались только
единичные точечные колонии.
Необходимо подчеркнуть, что в региональных
(мезентериальных) лимфатических узлах на всех
стадиях ДКС была выявлена картина, схожая с бактериоскопическим анализом бронхолегочной ткани.
ОБСУЖДЕНИЕ
На основании собственных исследований и
сравнении результатов с последними литературными данными можно сделать заключение, что
ДКС может рассматриваться как синдром полиорганической недостаточности (СПОН). В этом
аспекте мы должны отметить, что частичное участие органов-мишеней в развитии ДКС и состояние эндотоксикоза не равны. Как было упомянуто
выше, до сих пор почка и мышечная ткань считались основными органами-мишенями в случае
ДКС. Благодаря нашим исследованиям, мы пришли
к выводу
выводу, что во время ДКС не существуют какиелибо «приоритетные» органы-мишени, которые
могут предопределить характер и степень тяжести
всего патологического процесса. Наши комплекс-
27
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
ные исследования свидетельствовали о том, что
легкие и печень, а также поджелудочная железа
очень рано вовлекаются в общий патологический
процесс системной воспалительной реакции, тем
самым предопределяя характер и течение ДКС и
степень тяжести усиливающейся интоксикации.
Путем сравнения данных иммунных и эндокринных исследований нам удалось определить,
что в каждом изученном органе-мишени патологический процесс различается определенным образом, который проявляется в каждом случае комплексом характерных симптомов иммунологических и эндокринных нарушений. В частности, в
некоторых частях органов-мишеней определились
про-воспалительные цитокины и NO, которые
влияют на течение эндотоксикоза, поскольку известно, что их высокие концентрации токсичны. В
других органах-мишенях наблюдалась четкая корреляционная зависимость между уровнями изучучаемых цитокинов и гормонами роста и, следовательно, впервые была показана важная роль нарушений определенного звена нейроэндокринной
системы, что предполагает формирование новых
функциональных иммунно-эндокринных петель в
случае вероятного функционирования как по паракринному так и аутокринному принципу
ракринному,
принципу.
Роль поджелудочной железы в индукции ДКС
должна рассматриваться с качественно новых позиций. На основании полученных нами данных
этот орган должен рассматриваться в качестве
одного из основных органов-мишеней в случае
данного заболевания, поскольку характер поражения и выявленная функциональная петля NO in
situ могут быть определены на самых ранних стадиях развития эндотоксикоза при ДКС. С другой
стороны, нельзя недооценивать значение существующей концепции эндотоксикоза, в развитии
которого решающая роль принадлежит обезжизненным (девитализированным) тканям и микроорганизмам, проникающим в кровь и лимфатическую систему после сдавливания, механизм нарушения органов и, особенно, развития интоксикации значительно сложнее и многосторонний.
Таким образом, по нашему мнению, состояние эндотоксикоза резко ухудшается, если не индуцируются иммунопатологические нарушения в специфических органах-мишенях, которые сопровождаются повышенным поступлением цитотоксичных
концентраций про-воспалительных цитокинов и
NO в кровь.
Следующим важным и успешным моментом
нашей работы был установленный нами трансло-
28
кационный процесс резидентных условно-патогенных микроорганизмов из кишечных экониш с
соответствующим постоянством в ряд внутренних
органов. Этим и определяется состояние эндотоксикоза, которое обусловлено транслокацией микроорганизмов не только из места сдавливания,
но также из кишечных экониш.
Кроме этого, мы установили, что процесс кишечной транслокации сопровождается относительно длительным присутствием E.coli в поджелудочной железе. Принимая во внимание тот факт,
что в организме животных липополисахарид E.coli служит как мощный иммуномодулятор, которые избирательно стимулирует синтез определенных про-воспалительных цитокинов, мы можем
предполагать, что повышенный синтез ИЛ-1 происходит в основном благодаря E.coli в поджелудочной железе.
Несомненно, что процесс транслокации, наблюдавшийся на ранних стадиях ДКС, может считаться фактором ухудшения течения интоксикации. В то же время особенности и характер присутствия E.coli в определенных органах могут
считаться локальными факторами, стимулирующими избирательный синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками. При сравнении результатов бактериологического анализа в каждом отдельном органе можно делать заключение, что
наблюдаемый процесс транслокации кишечной
микрофлоры в условиях ДКС характеризовался
относительно длительной колонизацией только в
легких и поджелудочной железе. Таким образом,
симптомы комплексных, структурных, иммунных
и эндокринных изменений, которые нам удалось
обнаружить, должны приниматься во внимание с
учетом последнего факта. Не исключено, что локальное «иммунологическое» перераспределение
вышеупомянутых органов, сопровождаемое активацией их медиаторной функции, в значительной
степени обусловлено наличием в них E.coli.
Практическая цена этого исследования заключается в том, что на основании полученных экспериментальных данных будет сделано существенное корректирование общей схемы патогенетической и симптоматической терапии ДКС.
Данные и результаты комплексных исследований позволяют определить насколько и на какой
стадии развития ДКС токсические ферменты, проникающие в кровоток при нарушении экскреторного аппарата поджелудочной железы, участвуют
также в возникновении и развитии интоксикации.
Именно по этой причине на определенной стадии
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
ДКС становится необходимой особая симптоматическая терапия с использованием препаратов, ингибирующих активность хемотрипсина, α-амилазы и липазы.
Поскольку при ДКС поджелудочная железа является источником для синтеза ИЛ-1 и NO, большие концентрации которых считаются токсическим фактором, необходимо проводить локальную
терапию препаратами, ингибирующими синтез
ИЛ-1 и NO in situ.
Нами был использован похожий методологический подход для изучения иммунопатологических
реакций и в легких тоже. Как было выявлено нами,
лимфоцитарные и макрофагиальные клетки инфильтрата были источником секреции иммуноцитокинов и про-воспалительного спектра действия;
в случае поджелудочной железы уже на ранних
стадиях ДКС необходима локальная симптоматическая терапия для угнетения синтеза про-воспалительных иммуноцитокинов в бронхолегочной
ткани, потому что они способствуют развитию локальных дистрофических процессов, в частности,
путем активации NO.
Определение характера структурно-функциональных изменений в конечном звене гипоталамогипофизарно-надпочечной системы (ГГНС) в надпочечных железах позволяет ответить на вопрос в какой степени гипоталамические процессы в
органах иммуногенеза связаны с гиперфункцией
адренокортикоцитов кортикального слоя и повышенным поступлением глюкокортикоидов (кортизола) в кровь. Не исключено, что на ранних стадиях ДКС схема комплексного лечения препаратами, угнетающими прямой синтез глюкокортикоидов с помощью надпочечных желез, становится
необходимой. С другой стороны, согласно литературным данным, на относительно поздних стадиях
ДКС, когда происходят аутоиммунные процессы,
наооборот, необходимо также введение глюкокортикоидов наряду с другими препаратами. Так, на
основании полученных данных впервые становится возможным проводить прямую гормональную терапию путем поддержания оптимального
уровня глюкокортикоидов в сыворотке крови, с
одной стороны, и, с другой стороны, - путем торможения аутоиммунных процессов с помощью
введения глюкокортикоидов в период формирования аутоагрессивных механизмов.
Выявленные изменения в содержании гипофизарных гормонов роста (пролактин, ИФР-1) позволяют планировать применение симптоматической терапии также для поддержания их опти-
мального уровня в крови и внутренних органах,
т.к. их высокое содержание, несмотря на активацию метаболических процессов во всех органах и
тканях, может одновременно вызвать активацию
синтеза про-воспалительных иммуноцитокинов
ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 при ДКС.
Феномен бактериальной транслокации и процессы синтеза NO, выявленные ранее, наравне с
панкреатогенными ферментами в значительной
степени предопределяют состояние возрастающей
интоксикации и должны рассматриваться с качественно новых позиций. Исходя из этого, на ранних стадиях ДКС (сразу после сдавливания) симптоматическая и патогенетическая терапия становится необходимой и должна быть направлена на
нормализацию уровня NO в сыворотке крови, а
также бактериального гомеостаза в кишечнике.
На основании наших собственных исследований мы считаем, что необходимо представить
обобщающую схему возможных патогенетических
связей иммунопатологических, эндокринных и
метаболических нарушений, происходящих в органах-мишенях при ДКС.
Впервые нами была установлена важная роль
иммунной системы и медиаторов гормонов роста в
проявлениях патогенеза органов и систем при ДКС.
Благодаря проведенному иммуноферментному
анализу нам удалось показать, что на фоне резанализу,
кого угнетения медиаторной функции иммунокомпетентных клеток центральных и периферических
органов иммуногенеза происходила структурнофункциональная реконструкция легких, печени и
поджелудочной железы.
Процесс ремоделирования в «органах-мишенях» в значительной степени зависит от количественной и качественной композиции локально
синтезируемых иммуноцитокинов (ИЛ-1, ИЛ -2,
ИЛ -6 и γ- ИФН) и, возможно, также пролактина.
В легких и печени клетки лимфомакрофагиальной линии служили источником локального синтеза про-воспалительных цитокинов, а в поджелудочной железе эту функцию выполняли ацинозные клетки.
При синдроме длительного сдавливания был
выявлен феномен кишечной бактериальной транслокации грамотрицательных резидентных микроорганизмов с их дальнейшим присутствием в «органах-мишенях».
В результате относительно длительного присутствия микроорганизмов в легких и поджелудочной железе их эндотоксины (липополисахариды) могут действовать наравне с пролактином
29
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
Схема
Патогенетические связи при развитии иммунопатогенных, эндокринных и метаболических нарушений в органах-мишенях на начальных стадиях краш-синдрома
ПРЛ, ИФР-1
Ацидофил
Базвфил
ИЛ-2<;
ИЛ-6<;
п
Ги
ер
ес
кс
и
ко
NO
з
,α
-а
ми
ла
за
,л
ип
E. Coli
а
NO
с
Тран
л о ка
ция
я
изиса
+ микр
И н то к
с и ка ц и
ол
ты аут
продук
аз
ИЛ-1
оорган
АЛ
измы
Т,
АС
Т
то
я
до
E. Coli
си
Эн
зм
пр
NO
ци
су
ти
но
р
ко
му
ИЛ-1, ИЛ-2,
ИЛ-6, γ-IFN
Место сдавливания
30
γ-ИФН
E. Coli
Им
с т и м у л я ц и я
ИЛ-1<;
нсло
Тра
ка ц и
я
Зильфян А.В. и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал
как стимуляторы синтеза про-воспалительных цитокинов in situ.
Состояние эндотоксикоза на ранних стадиях ДКС,
в развитии которого велика роль процессов бактериальной транслокации и активации NO, должно рассматриваться с качественно новых позиций.
Благодаря комплексным исследованиям, нами
впервые было определено, что на ранних стадиях
ДКС на фоне нарушенного бактериального гомеостаза вовлечены ранее неизвестные иммуноэндокринные петли, функционирующие по паракринному и аутокринному принципам.
Л И Т Е РА Т У РА
1. Гриценко В.А., Брудастов Ю.А., Журлов О.С.,
Чертков К.Л. Характерные черты E.coli изолированные от мышинного организма при
бактериальной транслокации после имобилизации (опубликов. На русском языке) Ж.
Микробиология, Москва, 2000, N2, 37-41.
2. Никитенко М
М.И.,
И Захаров В.В., Бородин А.В.
и соавт. Роль бактериальной транслокации
в патогенезе хирургических инфекций. Хирургия, М., 2001, №2, с. 63-66.
3. Розен В.Б. Фундаменты эндокринологии
(опубликов. На русском языке). Москва,
1994, стр. 384.
4. Саакян К.Т. Структурные изменения в легких на ранних стадиях Краш-синдрома
(опубликов. На русском языке). Трудт посвящены 70-летию
летию ЕГМУ
ЕГМУ. Ереван, 2000,
стр. 42-45.
5. Занинович В., Гуковскойа А.С., Гуковский Е.,
Мория М., Пандол С.Дж. Церулин регулируетч ИСАМ-1 в ацинозных клеток панкреаса, который посредничает адгезию нейтрофилов к этим клеткам. Ам. Ж. Физиол. Желудочнокишечн, физиол. Печени, 2000,
279(4); Г 666-676.
6. Ярилин А.А., Беляков Л
Л.М.
М Тимус как орган
эндокринной системы. Иммунология, 1996,
№1, с. 4-10.
7. Berg R.D. Bacterial translocation from the
intestines. Jikken Dobutsu 1985; 34(1): 1-16.
10. Demetriades D., Chahwan S., Gomez H., Peng
R., Velmahos G., Murray J., Asensio J., Bongard F. Penetrating injuries to the subclavian and axillary vessels. J. Am. Coll. Surg.
1999; 188(3): 290-295.
11. Deitch E.A. Bacterial translocation: the influence of dietary variables. Gut. 1994; 35 (I
Suppl.): S23-S27.
12. Fink G.W., Norman J.G. Specific changes in
the pancreatic expression of the interleukin 1
family of genes during experimental acute pancreatitis. Cytokine. 1997; 9(12): 1023-1027.
13. Fukushima R., Gianotti L., Alexander J.W.
The primary site of bacterial translocation.
Arch. Surg. 1994; 129 (1): 53-58.
14. Gukovskaya A.S., Gukovsky I., Zaninovic V.,
Song M., Sandoval D., Gukovsky S., Pandol
S.J. Pancreatic acinar cells produce, release,
and respond to tumor necrosis factor-alpha.
Role in regulating cell death and pancreatitis.
J. Clin. Invest. 1997; 100(7): 1853-1862.
15. Holstad M., Sandler S. Prolactin protects
against diabetes induced by multiple low doses of streptozotocin in mice. J. Endocrinol.
1999; 163(2): 229-242.
16. Klar E., Werner JJ. New pathophysiologic
knowledge about acute pancreatitis. Chirurg.
2000; 71(3): 253-264.
8. Clapp C., Lopez-Gomez F.J., Nava G. et al.
Expression of prolactin mRNA and of prolactin-like proteins in endothelial cells: evidence
for autocrine effects. J. Endocrinol. 1998;
158(1): 134-144.
17. Kloehn S., Otte C., Korsanke M., Arendt T.,
Clemens A., Bornstein S.R., F
Fölsch U.R.,
M nig H. Expression and distribution of the
Mö
prolactin in normal rat liver and experimental
liver cirrhosis. Horm. Metab. Res. 2001; 33
(7): 394-401.
9. De Souza L., Sampietre S.N., Figueiredo S.,
Yria Y., Machado M.C., Pinotti H.W. Bacterial translocation in acute pancreatitis. Experimental study in rats. Rev. Hosp. Clin. Fac.
Med. Sao Paulo. 1996; 51 (4): 116-120.
18. Lemaire L.C., van Lanschot J.J., Stoutenbeek C.P.,
van Deventer S.J., Wells C.L., Gouma D.J.
Bacterial translocation in multiple organ failure: cause of epiphenomenon still unproven.
31
¼ÆÈüÚ²Ü ². ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê
Review. Br. J. Surg. 1997; 84(10): 1340-1350.
19. Matera L. Endocrine, paracrine and autocrine
actions of prolactin on immune cell. Life Sci.
1996; 59 (8): 599-614.
20. Norman JJ. The role of cytokines in the pathogenesis of acute pancreatitis. Am. J. Surg.
1998; 175(1): 76-83.
21. Norman J.G., Fink G.W., Denham W., Yang J.,
Carter G., Sexton C., Falkner J., Gower W.R.,
Franz M.G. Tissue-specific cytokine production
during experimental acute pancrea
pancreatitis. A probable mechanism for distant organ dysfunction.
Dig. Dis. Sci. 1997; 42(8): 1783-1788.
22. Norman J.G., Fink G.W., Messina J., Carter G.,
Franz M.G. Timing of tumor necrosis factor
antagonism is critical in determining outcome
in murine lethal acute pancreatitis. Surgery.
1996; 120 (3): 515-521.
23. Reber P.M. Prolactin and immunomodulation.
Am. J. Med. 1993; 95(6): 637-644.
24. Richards S.M., Garman R.D., Keyes L., Kavanagh B., McPherson J.M. Prolactin is an
32
antagonist of IGF-beta activity and promotes
proliferation of murine B cell hybridomas.
Cell Immunol. 1998; 184 (2): 85-91.
25. Tokada T., Yamamoto T., Koike K., Kanda Y.,
Miyake A., Sugihara A., Tsujimura T., Terada
N. Effects of prolactin and estrogen on cell proliferation of the mouse liver induced by partial
hepatectomy. In Vivo. 1997; 11(5): 409-413.
26. Wells C.L., Maddaus M.A., Simmons R.L.
Proposed mechanisms for the translocation of
intestinal bacteria. Rev. Infect. Dis. 1988; 10
(5): 958-979.
27. Zellweger R., Wichmann M.W., Ayala D.,
Chaudry J.H. Metoclopramide: a novel and safe
immunomodulating agent for restoring the depressed macrophage immune function after
hemorrhage. J. Trauma. 1998; 44 (1): 70-77.