тестикулярных генах - Российский онкологический научный
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук. На правах рукописи Мисюрин Всеволод Андреевич Исследование особенностей экспрессии и распространённости раково-тестикулярных генов. Специальность: 14.01.12 – Онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.м.н., профессор А.Ю. Барышников МОСКВА, 2014 год 2 Оглавление Введение .............................................................................................................................................................. 5 Актуальность темы..................................................................................................................................... 5 Цель работы ................................................................................................................................................ 7 Задачи исследования .................................................................................................................................. 7 Научная новизна ......................................................................................................................................... 8 Практическая ценность .............................................................................................................................. 9 Положения, выносимые на защиту........................................................................................................... 9 Глава 1. Современный уровень знаний о раково-тестикулярных генах ..................................................... 11 1.1. Основные характеристики раково-тестикулярных генов ......................................................... 12 1.2. Раково-тестикулярные гены и их экспрессия в гематологических опухолях ........................ 17 1.3. Характеристика раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME.................................................................... 19 1.4. Опыт использования методов иммунотерапии для лечения онкогематологических заболеваний ............................................................................................................................................... 42 1.5. Некоторые представления о регуляции экспрессии раково-тестикулярных антигенов ............. 43 1.6. Возможность использования раково-тестикулярных антигенов в качестве мишеней для иммунотерапии ......................................................................................................................................... 48 1.7. Диагностическое значение экспрессии раково-тестикулярных генов при гемабластозах. ... 50 1.8. Заключение ................................................................................................................................... 50 Глава 2. Материалы и методы исследования ................................................................................................. 52 2.1. Исследованные больные .............................................................................................................. 52 2.2. Клеточные линии и методика их культивирования .................................................................. 53 2.3. Здоровые доноры .......................................................................................................................... 53 2.4. Выделение геномной ДНК для определения мутации JAK2V617F ......................................... 53 2.5. Системы для определения мРНК целевого гена в исследуемых образцах ............................. 54 2.6. Предварительная подготовка клеточного материала к выделению общей РНК .................... 55 2.7. Выделение РНК ............................................................................................................................ 56 2.8. Получение кДНК .......................................................................................................................... 56 3 2.9. Проверка специфичности работы систем .................................................................................. 57 2.10. Проведение количественной полимеразно-цепной реакции в реальном времени ............. 57 2.11. Обработка экспериментальных данных ................................................................................. 58 2.12. Проверка воспроизводимости результата .............................................................................. 58 2.13. Методы статистического анализа полученных данных........................................................ 59 Глава 3. Результаты .......................................................................................................................................... 60 3.1. Активность раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 в клетках крови здоровых доноров 60 3.2. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках крови у больных в дебюте ХМЛ и Ph’негативных хМПЗ..................................................................................................................................... 60 3.3. Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом ............................................................... 61 3.4. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных острым промиелоцитарным лейкозом ... 62 3.5. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом диффузная Bкрупноклеточная лимфома ...................................................................................................................... 65 3.6. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом лимфома Ходжкина ............ 66 3.7. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом фолликулярная лимфома ... 68 3.8. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках линий K562 и WI38.................................... 69 3.9. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клеточных линиях меланомы ................................. 69 Глава 4. Обсуждение ........................................................................................................................................ 71 4.1. Экспрессия раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 у здоровых доноров ......................... 71 4.2. Профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SLLP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и PRAME у больных ХМЛ и хМПЗ ...................................... 71 4.3. Значение величины уровня экспрессии генов PRAME и PML/RARα в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза .................................................................................................................... 74 4.4. Прогностическая значимось уровня экспрессии гена HAGE в дебюте диффузной Bкрупноклеточной лимфомы..................................................................................................................... 77 4.5. Результат исследования профиля экспрессии раково-тестикулярных генов в у больных с диагнозом лимфома Ходжкина ............................................................................................................... 77 4.6. Влияние уровня экспрессии гена PRAME у больных фолликулярной лимфомой ...................... 77 4.7. Особенности активности раково-тестикулярных генов в клеточных линиях K562, WI-38 и семи линий меланомы .............................................................................................................................. 78 4.8. Заключение ........................................................................................................................................ 81 4 Глава 5. Выводы ............................................................................................................................................... 84 Список сокращений.......................................................................................................................................... 85 Список литературы .......................................................................................................................................... 87 Приложения .................................................................................................................................................... 105 5 Введение Актуальность темы Недавно было обнаружено, что в клетках если не всех, то многих злокачественных опухолей происходит активация группы генов, которые в норме экспрессируются только в семенниках. В связи с тем, что их экспрессия характерна как для опухолей, так и для семенников, белковые продукты этих генов, определяющие в значительной степени иммуногенные свойства тех клеток, в которых они присутствуют, называют раково-тестикулярными антигенами (РТА, от английского cancer-testis antigens, CT-antigens). Исследования последних лет показали, что экспрессия РТА является универсальной особенностью малигнизированных клеток различного происхождения, и это несмотря на то, что опухолевые клетки демонстрируют значительное разнообразие на уровне генетических изменений, которые лежат в основе пусковых молекулярных механизмов злокачественной трансформации. Каков бы ни был исходный генетический дефект, запускающий программу злокачественного перерождения, одним из необходимых условий трансформации является приобретение опухолевой клеткой некоторых черт, характерных для клеток репродуктивной системы, зависящих от способности экспрессировать РТА. В процессе созревания половые клетки проходят несколько последовательных этапов, которые различаются между собой наборами активных тестикулярных генов. В клетках злокачественных опухолей экспрессируются отдельные представители РТА в различных сочетаниях, причем при переходе опухоли в более агрессивную форму может происходить ингибирование одних и активация других генов этой группы. Кроме того, экспрессия некоторых РТА чаще выявляется при более агрессивных, а других – 6 при менее агрессивных видах злокачественных опухолевых заболеваний. Например, активация генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, принадлежащих группе раковотестикулярных генов (РТГ), кодирующих РТА, была описана разными авторами в опухолях гематологического происхождения, при этом характер экспрессии этих генов был различен в острых и хронических формах гемобластозов. Это позволяет высказать предположение о том, что, во-первых, в половых клетках осуществляется эшелонированная программа последовательной активации и инактивации генов РТА, а во-вторых, вполне вероятно, что в клетках злокачественных опухолей гены РТА также могут активироваться не случайным образом, но в сочетаниях, которые соответствуют определенному этапу созревания половых клеток. Кроме того, вполне вероятно, что агрессивность злокачественной опухоли может зависеть, помимо прочих факторов, от набора РТА генов, которые в клетках данной опухоли экспрессируются. Мы предполагаем, что активность SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME относится к различным этапам программы созревания половых клеток, поэтому эти гены могут по-разному определять клинические проявления SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME- позитивных или негативных гемобластозов. Сведений об экспрессии РТГ, представленных в научной литературе, в настоящее время недостаточно для полного понимания того, каким образом раково-тестикулярные антигены могут определять клиническое разнообразие злокачественных опухолей. Для прояснения этого вопроса необходимы дополнительные исследования распространенности экспрессии РТГ в злокачественных опухолях различного генеза и степени агрессивности, в том числе генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME. 7 Раково-тестикулярные антигены рассматриваются в качестве весьма перспективных мишеней для приложения иммунологических подходов для проведения противоопухолевой терапии. У некоторых пациентов, страдающих злокачественными опухолевыми заболеваниями, иммунный ответ на эти антигены возникает естественным образом. В этом случае опухолевые клетки подвергаются иммунной атаке и уничтожаются. Но далеко не всегда срабатывают естественные механизмы презентации раково-тестикулярных антигенов иммунокомпетентным клеткам, поэтому у многих больных специфическая противоопухолевая иммунная реакция при обычных условиях не развивается. Существуют данные о том, что противоопухолевый ответ можно значительно усилить при использовании различных схем введения пациентам пептидов, синтезированных на основе РТА-последовательностей, либо РТА, выделенных из опухолевых клеток. В связи с этим весьма актуальной является задача изучения особенностей распространения РТА для выявления среди них наиболее перспективных мишеней для проведения противоопухолевой иммунотерапии. Таким образом, поводом для проведения настоящей работы послужила высокая актуальность вопроса о фундаментальной роли РТ антигенов в проявлении клинических свойств злокачественных опухолевых заболеваний, а также перспективность РТА в качестве мишеней для иммунотерапии опухолей. Цель работы Изучение особенностей экспрессии раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME при различных онкогематологических заболеваниях. Задачи исследования 1. Исследовать профиль экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME у пациентов, страдающих от опухолевых заболеваний кроветворной системы. 8 2. Оценить влияние экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME на клинические особенности гемобластозов. 3. Охарактеризовать профиль экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NYESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в клеточных линиях K562, WI-38, mel P, mel Si, mel Mtp, mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor. 4. Оценить возможность использования экспрессии данных генов в качестве диагностических маркеров и индикаторов различных стадий эволюции онкогематологических заболеваний. Научная новизна Получены данные о распространении экспрессирующихся генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME при различных онкогематологических заболеваниях. Показана зависимость клинических проявлений гемобластозов от экспрессии раковотестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME. Обнаружены различия в профилях экспрессии РТА генов между хроническими и острыми формами онкогематологических заболеваний. Кроме того, показаны различия в профилях экспрессии ранних и поздних стадий хронического миелоидного лейкоза, у первичных больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями, лимфогранулематозом, фолликулярной лимфомом, диффузной В-крупноклеточной лимфомой, и острого промиелоцитарного лейкоза. Продемонстрирована возможность проведения мониторинга гемобластозов с использованием количественной оценки уровня экспрессии данных генов методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени. Исследован профиль экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в клеточных 9 линиях K562, U-937, NOMO-1, THP1, WI-38, mel P, mel Si, mel Mtp, mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor. Практическая ценность На основе метода ПЦР в реальном времени разработаны тест-системы для количественной оценки экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в опухолевых клетках. Показана возможность использования данных тест-систем для определения спектра и интенсивности экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME при различных опухолевых заболеваниях кроветворной и лимфоидной ткани с целью выявления клинически значимых вариантов в пределах определенных нозологических форм. Кроме того, данные тест-системы могут применяться для определения уровня опухолевой нагрузки в дебюте заболевания и затем для проведения количественного мониторинга остаточных опухолевых клеток (для определения МОБ – минимальной остаточной болезни), позволяющего судить об эффективности терапии и стабильности ответа, а также для своевременного вывления молекулярного рецидива. Выявление спектра экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в первичной опухоли, а также контроль изменения профиля экспрессии этих предпосылкой генов для иммунотерапевтических в процессе опухолевой последующей разработки подходов, направленных прогрессии, является индивидуализированных на подавление роста опухолевых клеток, экспрессирующих тот или иной из перечисленных РТГ. Данные тест-системы могут быть использованы с диагностической целью в различных онкологических и онкогематологических клиниках. Положения, выносимые на защиту Степень агрессивности опухолей связана с изменением профиля экспрессии раково-тестикулярных генов, более агрессивные опухолевые клетки 10 экспрессируют более широкий спектр РТГ, имеющих повышенный уровень экспрессии. Хронические миелопролиферативные заболевания и хронический миелолейкоз в хронической стадии имеют близкий профиль экспрессии РТГ. Фаза акселерации и бластный криз хронического лейкоза отличаются от хронической фазы активацией большего числа РТГ. Онкомаркер PRAME экспрессируется в 100% случаев первичного острого промиелоцитарного лейкоза. Высокая экспрессия этого гена в дебюте ОПЛ – фактор благоприятного, а низкая экспрессия – фактор неблагоприятного прогноза. 11 Глава 1. Современный уровень знаний о раковотестикулярных генах Впервые иммунотерапия опухолей была применена на практике более ста лет назад. Вильям Коли, хирург, специалист по удалению опухолей, вводил токсин Коли больным, страдающим от онкологических заболеваний [1]. Систематически различные способы противоопухолевой иммуновакцинации применяются с начала 60х годов. С тех пор были достигнуты большие успехи в понимании механизмов процессинга и презентации антигенов, и лабораторные исследования позволили добиться настоящего прорыва в сфере иммунотерапии опухолей. Применяется широкий спектр методов: от инженерии моноклональных антител до открытия новых и регуляции презентации известных антигенов. Но, несмотря на такие успехи, за исключением рекомбинантных моноклональных антител, таких как Ритуксимаб (направленные против CD20), и Алентузумаб (действуют против CD52), иммунотерапия опухолей не оказывает значительного влияния на повседневное лечение больных гематологическими опухолями, находящихся в клиниках. Столь медленное внедрение иммунотерапии в арсенал практически применяемых методов лечения опухолей связано с тем, что положительные эффекты, наблюдаемые в лаборатории, не всегда воспроизводятся непосредственно при клинических испытаниях. Основные трудности возникают при попытках проведения активной противоопухолевой иммунизации, так как не всегда удается применить данный подход в связи с трудоемкостью создания индивидуальной вакцины. Например, для проведения идиотипической вакцинации с целью лечения B-клеточных злокачественных опухолей необходимо для каждого больного исследовать уникальную структуру гена, кодирующего иммуноглобулиновый рецептор, который экспрессируется в опухолевой клетке. 12 В этой главе изложена информация о возможностях, открывшихся в связи с обнаружением раково-тестикулярных антигенов. Показано, какое влияние они оказывают на развитие знаний об иммунологии опухолей и обсуждаются трудности, с которыми могут столкнуться исследователи и клиницисты, не располагая объективными данными о свойствах раково-тестикулярных генов. 1.1. Основные характеристики раково-тестикулярных генов Сперматогенез осуществляется в семенных канальцах, представляющих собой функциональную единицу семенной железы. Результатом эффективного сперматогенеза является образование активных сперматозоидов у мужчин [2]. В течение дня в организме взрослого мужчины формируется свыше 100 миллионов сперматозоидов. Этот процесс осуществляется непрерывно с момента наступления полового созревания в возрасте ~12-14 лет, и под влиянием фолликулостимулирующего продолжается в и течение фолликулостимулирующему лютеинизирующего десятков гормону гормонов лет [2-4]. обладают только гипофиза Рецептором клетки к Сертоли, расположенные в эпителии семенников [5-7]. Клетки Лейдинга, расположенные в промежуточном пространстве между семенными канальцами, в ответ на стимуляцию лютеинизирующим гормоном вырабатывают тестостерон и эстрадиол-17β [8-11]. Активность гипофиза, в свою очередь, регулируется тестостероном и эстрадиолом, а также гормонами, вырабатываемыми гипоталамусом, и в результате сложных функциональных взаимосвязей формируется система, известная как гипоталамно-гипофизарно-гонадная ось [1217]. Гормональные и детальные морфологические изменения, происходящие в эпителии семенников, были подробно описаны уже 80 лет назад [18]. Однако на сегодняшний день остаются малоисследованными молекулярные и биохимические механизмы регуляции процессов сперматогенеза [18-25]. При описании протекания сперматогенеза различают несколько стадий: (1) самоподдерживающее митотическое деление сперматогониальной стволовой клетки и сперматогониев, (2) митотическая пролиферация и дифференцировка 13 сперматогония в сперматоциты I и II порядка, (3) мейотическое деление сперматоцита II порядка, (4) сперматогенез (трансформация круглых сперматидов в вытянутые), и (5) созревание, сопровождающиеся выходом сперматозоида в семенной канал [26, 27]. Схема, описывающая развития половых клеток, поддерживаемых клетками Сертоли, выстилающими слизистую оболочку семенного канала, выглядит следующим образом. Tunica propria состоит из базальной мембраны (содержащей в основном коллаген типа IV) и слоя коллегановых волокон I типа, под которым находятся перитубулярные миоидные клетки (миофибробласты) и тянется лимфатический сосуд [28]. Кроме того, с внутренней стороны гемато-тестикулярного барьера эпителий семенника разделён на апикальный и базальный отсеки. Гематотестикулярный барьер формируется за счёт образования между клетками Сертоли комплекса плотных и щелевых контактов, демосом и ещё одного специализированного семенников. Эта клеточного ультраструктура контакта, создаёт характерного внутри только организма для гемато- тестикулярный барьер, внутри которого в изоляции от собственной иммунной системы осуществляются процессы сперматогенеза [29]. Фазы митотического деления I и II, и последующее созревание сперматозоидов происходит в специфическом микроокружении, названным адлюминальным компартментом [30]. Изоляция этой иммунопривилегированной зоны поддерживается не только пассивно, с помощью плотных клеточных контактов [31]. Клетки Сертоли несут на своей поверхности Fas-лиганд для запуска процессов апоптоза у лимфоцитов, случайно оказавшихся рядом. Кроме того, клетки Сертоли выделяют интерлейкины и интерфероны, затрудняющие развитие иммунного ответа в окрестностях семенных канальцев [32-34]. Барьер имеет огромное физиологическое значение, так как половые клетки на всех стадиях сперматогенеза экспрессируют разнообразные антигены, некоторые из которых локализованы на внешней мембране [35-37]. 14 Биологический смысл данной изоляции заключается в предотвращении развития аутоиммунных реакций, направленных непосредственно против половых клеток, и его отсутствие быстро приводило бы к бесплодию. Исследования, начатые не так давно, показали, что при своём развитии герминогенные клетки экспрессируют большое количество генов. Многие из этих генов были открыты в качестве онко-, или протоонкогенов, которые не активны, или же экспрессируются на очень низком уровне в немалигнизированных клетках. Однако, здоровые семенные железы per se не являются раком. К тому же, герминогенные клетки, проходящие конкретные стадии своего развития при сперматогенезе, экспрессируют эти гены в течение короткого времени, меня общий профиль экспрессии от стадии к стадии. Таким образом, экспрессия раково-тестикулярных генов в герминогенных клетках является нормальным процессом, и этот процесс подчинён жёсткому контролю. Более того, некоторые временно экспрессирующиеся белки имеют очень важные функции при сперматогенезе. В частности, они отвечают за слияние гамет. Такие белки, предназначенные для взаимодействия сперматозоида с яйцеклеткой, часто экспрессируются на поверхности клеток, выделенных из опухолевого метастаза. Из этих белки могут индуцировать спонтанную выработку антител, за что получили название раково-тестикулярных антигенов. Коротко, семенники не являются раком per se, однако отличается активностью онкогенов, экспрессия которых характерна только для малигнизированных клеток. [38-40]. Ниже приведена исследований, компиляция касающихся роли некоторых результатов раково-тестикулярных последних антигенов в сперматогенезе и канцерогенезе. Сбор базовых знаний об этой группе генов способствует не только пониманию процессов, происходящих при сперматогенезе, но и позволит быстрее развить подходы иммунотерапии рака, разработанные на основе раково-тестикулярных антигенов. 15 Впервые термин «раково-тестикулярный антиген», или РТА, был упомянут в 1997 году [41]. Список РТА, так же известных, как опухоль-герминогенные антигены, очень обширен, и пополняется с середины 80х годов [42-48] Специфическая экспрессия РТА происходит в опухолях, имеющих самое разнообразное гистологическое происхождение. В здоровых, не трансформированных клетках, случаи экспрессии данных генов крайне редки. Высокий уровень их активности характерен только для половых клеток (таких, как сперматогональные стволовые клетки, сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и созревающие сперматозоиды), находящихся в семенниках (но не в клетках Сертоли и, или Лейдинга) [49-54]. Некоторые РТА экспрессируются в клетках яичников и плаценты (обычно в трофобластах). Так, в тканях плаценты экспрессируется ген NY-ESO-1, кодирующий одноимённый РТА (антиген впервые был обнаружен у больной с диагнозом рак пищевода) [55]. Важно отметить, что гены, кодирующие РТА, спонтанно активируются и экспрессируются на высоком уровне в опухолевых тканях, и они отличаются высокой иммуногенностью у больных онкологическими заболеваниями. Огромное количество новых РТА открыто при исследовании взаимодействия тканевой жидкости с экспрессированной библиотекой кДНК человеческих семенников. [56]. Обычно РТА делят на две группы. В первой группе оказываются РТА, кодируемые генами, расположенными на Х-хромосоме. Гены из другой группы, так называемые не-Х-хромосомные антигены, располагаются на соматических хромосомах [50]. Гены из первой группы составляют более половины от общего числа генов, кодирующих РТА. Х-хромосомные гены чаще всего организованы в кластеры, содержащие мультигенные семейства, организованные в комплексы, причём описаны как прямые, так и инвертированные повторы [57]. Гены, не состоящие в группе Х-хромосомных, как правило, не имеют гомологов, и выражены единственной копией [50]. Подсчитано, что 10% генов на Х- 16 хромосоме кодируют РТА. В целом, Х-хромосомные РТА экспрессируются в сперматогониях, а группа не-Х-хромосомных РТА экспрессируется в половых клетках, находящихся на поздних стадиях дифференцировки, таких, как сперматоциты. Хотя функции большинства белков, кодируемых РТГ, остаются неизвестными, в некоторых работах показано, что эти белки участвуют в процессах клеточной дифференцировки, регуляции клеточного цикла, осуществляют контроль транскрипции, а так же задействованы в процессах апоптоза. Исследование особенностей экспрессии РТГ показало, что решающую роль в регуляции их активности играет статус метилирования ДНК. Это одинаково верно как для половых, так и для трансформированных клеток [58]. Кроме того, показано, что РТА трансформированных клеток часто подвергаются мутациям [59]. С учётом того, что экспрессия РТА вне иммунопривилегированных зон происходит в опухолевых клетках, некоторые РТА используются в качестве мишеней для иммунотерапии, что возможно благодаря их высокой иммуногенности. Наиболее изученные РТА определены как биомаркеры многих типов онкологических заболеваний, в частности рака яичников, плоскоклеточного рака шеи, рака молочной железы, лёгких, плоскоклеточного рака мочевого пузыря и остеосарком [60-66]. К сожалению, в недавно опубликованных результатах клинических испытаний показано, что специфическая иммунотерапия хотя и позволила уменьшить размер опухоли, это не привело к увеличению выживаемости по сравнению с группой плацебо [51]. Это демонстрирует высокую сложность рассматриваемой проблемы. Поскольку при любом типе рака часто наблюдается экспрессия нескольких РТГ, эффективная вакцина может работать сразу против нескольких типов РТА на поверхности одной опухолевой клетки. В обзоре литературы освещён современный уровень знаний о роли наиболее изученных РТА в процессах онкогенеза. Обсуждаемые объекты были выбраны на основании того, что, согласно литературным данным, они наиболее часто экспрессируются при 17 солидных и гематологических опухолях. Сделанные выводы показывают возможность использования РТА при создании иммунотерапевтических вакцин. Эти знания в будущем позволят выбрать направление запланированного эксперимента для исследования свойств различных РТА. 1.2. Раково-тестикулярные гены и их экспрессия в гематологических опухолях Первые основные представители РТА были открыты при изучении реакции цитотоксических Т-лимфоцитов против экспрессируемой библиотеки кДНК. Тогда было найдено целое семейство филогенетически родственных антигенов, названное семейством MAGE [67]. Эта работа была новаторской в области идентификации раково-тестикулярных антигенов. В то же время были изучены механизмы процессинга антигена и его презентации при помощи молекул MHC, что позволило заложить мощную научную базу для понимания иммунологии опухолей и разработки методов иммунотерапии злокачественных новообразований. Данный подход, однако, оказался чрезвычайно трудоёмким. Поэтому было разработано и усовершенствовано множество других подходов к исследованию РТА. Для определения новых РТА используют метод серологического скрининга экспрессии библиотек кДНК [68], анализ данных нуклеотидных последовательностей [69], биоинформатические методы исследования [70] а также использование известных РТА в качестве приманки в дрожжевой двугибридной системе [71]. В последние десять лет многие исследовательские группы сконцентрировали свои усилия на выделении новых РТА и получении их в чистом виде. Исследователи верят в то, что если они смогут найти идеальную молекулу, разработанная на её основе методика иммунотерапии будет играть важную роль в лечении различных злокачественных новообразований. Но, несмотря на достижения в области выявления антигенов и наличие длинного списка молекул, удовлетворяющих всем критериям, позволяющим отнести их к РТА, изучение большинства из этих молекул не продвинулось далее простой характеристики антигена. В целом, 18 иммунотерапия опухолей остается очень малоисследованной областью иммунологии, и это особенно касается её клинической стороны. Даже с открытием большого числа новых опухолевых антигенов и разработки методики улучшения презентации антигенов с помощью дендритных клеток, в данной области остаётся ещё очень много работы. Теоретически, раково-тестикулярные антигены являются идеальной мишенью для иммунотерапии опухолей. Как ожидается, таргетная терапия, направленная против РТА, будет высокоспецифичной и при этом малотоксичной. В отличие от большинства остальных аутоантигенов, РТА очень иммуногены, и это наблюдается даже у онкологических больных. В частности, в плазме этих больных обнаруживаются антитела, спонтанно выработанные против различных РТА. Кроме того, они не экспрессируются в здоровых тканях, за исключением тех, что скрыты за гемато-тестикулярным барьером. Клетки, экспрессирующие данные антигены, не имеют на своей поверхности молекул HLA класса 1, и их месторасположение является иммунопривилегированной зоной, в которой отсутствуют лейкоциты [72]. Также не происходит презентации данных антигенов иммунной системе [73]. Кроме этого, Т-лимфоциты, способные распознавать РТА, в процессе своего созревания уходят в апоптоз. Однако данные условия могут оказаться неприемлемыми для некоторых РТА, так как в процессе развития сперматоциты иногда оказываются на незащищённой гемато-тестикулярным барьером стороне семенного канальца. Первоначально большинство работ описывало экспрессию РТА в солидных опухолях. За последние десять лет данные антигены всё чаще выявляют в опухолях, имеющих гематологическое происхождение. Показано, что активация экспрессии РТА при онкогематологических заболеваниях происходит в целом реже, чем при солидных опухолях [74]. Считается, что появление данных антигенов коррелирует с плохим прогнозом ряда онкогематологических заболеваний [75-87] Считается, что наиболее описанным является профиль экспрессии РТГ при множественной миеломе. По мере прогрессирования 19 данного заболевания встречаемость РТА в целом увеличивается. Среди антигенов, чья экспрессия обнаруживается в опухолевых клетках при множественной миеломе, нужно подробно рассказать о MAGEA1 [77], SP17 [70], NY-ESO-1 [78], SLLP1 [79], SPANX [80], SCP1 [81] и SEMG1 [88]. При лейкозах также была обнаружена экспрессия некоторых РТА. Антигены белка HAGE [83] были обнаружены более чем в 60% образцов, полученных от пациентов с хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ). С более низкой частотой при ХМЛ встречаются антигены PRAME [84] и PASD1 [86]. При хроническом лимфоидном лейкозе экспрессируются следующие антигены:GAGE1, SP17, SLLP1 и SPANXb [81]. Эти результаты показывают, что уже на сегодняшний день известно много представителей РТА, которых можно использовать для гематологических иммунотерапии расстройствах, а опухолей так же при как злокачественных диагностические и прогностические маркеры. 1.3. Характеристика раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME. SP17 (Sperm protein 17). Впервые был выделен из мышиных семенников [89]. У человека этот белок локализован на внешней мембране хвоста зрелого сперматозоида и в акросомальной области. Нативный SP17 состоит из трёх доменов [90, 91]. N-концевой домен SP17 гомологичен регуляторной субъединице протеинкиназы А типа IIα. Благодаря этому домену SP17 способен связываться с белком AKAP3 [92]. Центральный домен зрелого SP17 содержит в себе два сайта связывания гепарина KREK и KKIR (а.о. 49-52 и 131-134 соответственно). Этот домен принято называть гепарин-связывающем [93]. 20 Наконец, C-концевой домен содержит в себе сайт связывания Ca2+ [94]. Белок AKAP3, предполагаемый партнёр SP17, способен связываться с протеинкиназой А, что активирует движение сперматозоида. AKAP3 входит в семейство РТГ, причём при раке яичников его высокий уровень экспрессии связана с низким показателем общей выживаемости [95, 96]. Предназначение белка SP17 неизвестно. Предполагается, что субъединицы SP17, находящиеся на акросоме сперматозоида, необходимы для успешного слияния с внешней оболочкой яйцеклетки во время оплодотворения [97, 98]. У трансформированных лимфоцитов этот белок, локализованный на внешней оболочке, за счёт гепарин-связывающего домена способствует клеточной адгезии и миграции, так как гепаринсульфата часто расположен во внеклеточном матриксе. Имеющийся PKA-подобный домен может определять ещё одну функцию. Связывание SP17 и белков семейства AKAP может индуцировать PKA-независимый путь передачи внутриклеточного сигнала [99]. В наиболее ранних работах отмечено, что РТГ SP17 на высоком уровне экспрессируется в опухолях различного гистологического происхождения. Так, транскрипты SP17 обнаружены при множественной миеломе, раке яичников, головного мозга, пищевода, эндометрия и шейки матки [100-104]. Можно было ожидать значительного эффекта при анти-SP17 терапии гинекологических опухолей [105]. Но результаты недавних работ демонстрируют, что SP17, в отличие от большинства РТГ, экспрессируется в соматических клетках, в том числе в клетках мерцательного эпителия дыхательных путей, а так же в каналах женских и мужских репродуктивных систем [106]. SP17-положительными оказались синовиоциты больных с ревматоидным артритом [107]. В меланофагах, и многих других клеток тканей, имеющих эпителиальное происхождение, так же была обнаружена экспрессия гена SP17 [108]. Эти данные ставят под вопрос возможность использования SP17 в целях разработки методов специфической иммунотерапии [109]. На сегодняшний день нет 21 никакой информации о начале подобных исследований. Тем не менее, мы уверены, не следует прекращать исследования биологии этого гена. Функции, выполняемые белком SP17 при сперматогенезе, позволят предугадать последствия экспрессии его гена при онкозаболеваниях. Гены GAGE1. Семейство РТА GAGE состоит из белков, несущих на своей поверхности отрицательный заряд. Для всех этих белков показано высокая степень гомологии их аминокислотных последовательностей. Функции белков GAGE остаются антиапоптотическими невыясненными, свойствами но, возможно, они [110]. Семейство было обладают первоначально идентифицировано по реакции иммунного распознавания аутологичными цитотоксическими Т-лимфоцитами антигенов, презентированных молекулами HLA-Cw6 и HLA-A29 на поверхности человеческих клеток меланомы, полученных от больного раком [111]. При скрининге образца комплементарной ДНК, выделенной из клеток меланомы, было выявлено несколько вариантов мРНК, кодируемых геном GAGE, очень сходных по нуклеотидным последовательностям. Кроме того, при скрининге человеческой геномной библиотеки, обнаружили ещё два гена семейства GAGE. Методом флуоресцентной in situ гибридизации эти гены были картированы на хромосоме X в локусе p11.2-р11.4 [110]. Последняя публикация последовательности X хромосомы человека [112] открыла возможности для всестороннего исследования генов семейства GAGE. Было выяснено, что локус GAGE состоит из четырёх контигов, которым присвоены номера в GenBank AF235097, BX649339, и AC142497 AC142496. Локус находится в положении p11.23, и перекрывает область длинной от 48,8 до 49,15 миллионов пар оснований. Пара контигов AF235097 и BX649339 и пара AC142497 AC142496 представляют собой непрерывные последовательности, но BX649339 отделён от AC142497 областью, которая на текущий момент остаётся не расшифрованной. Все повторы, за исключением повторов под номерами 1 и 16, демонстрируют высокую степень гомологии между собой, и степень этой 22 гомологии превышает 99%. Повтор номер 1 отличается от остальных тем, что в нём отсутствует вставка L1, представленная во всех остальных повторах. Кроме того, повтор 16 имеет собственную вставку из 8850 пар оснований. Предполагается, что в области между контигами BX649339 и AC142497 могут находиться дополнительные повторы, кодирующие ген GAGE. Экзон-интронная структура генов GAGE была предсказана по правилу расположения пар GT-AG, определяющих донорные и акцепторные связи при сплайсинге мРНК. Эта структура оказалась одинаковой для всех генов семейства GAGE, и, кроме того, она соответствует последовательности мРНК, последовательность которой была опубликована ранее [113]. Ген, находящийся в первом повторе, отличается тем, что в нём нет вставки L1. В связи с этим в гене отсутствует дополнительный экзон. Промоторные области всех генов очень сходны между собой, и первые 1400 пар нуклеотидов этих промоторов отличаются друг от друга только на 1-2 пары оснований. Однако, в областях инициации транскрипции, протяжённостью по 1400-1500 пар оснований, найдены взаимные отличия в последовательностях (данные не представлены). Вероятно, это объясняет обнаруженную разницу в экспрессии отдельно взятых представителей генов группы GAGE (23-25). Промоторы не имеют ТАТАпоследовательностей, и, скорее всего, инициация транскрипции определяется наличием GC- повторов, что можно наблюдать в работе других промоторов, лишённых ТАТА-последовательностей. В результате транскрипции в связи с этими особенностями получаются фрагменты, имеющие разную длину [113]. Высокое сходство последовательностей генов GAGE, а также их равномерное распределение в локусе, позволяют предположить, что это семейство возникло в результате ошибки репликации, причём это произошло совсем недавно. Предположение подтверждается тем, что не удалось найти аналоги GAGE в геноме хомяка или мыши. Поиск с использованием ресурса BLAST позволяет найти это семейство только у человека и шимпанзе. Отсюда следует, что только приматы несут в своём геноме информацию о генах 23 семейства GAGE. Эту гипотезу подтверждают данные о том, что гены GAGE содержат последовательности транспозонов Alu Sg1. Эти транспозоны появились в геноме приматов около 40 миллионов лет назад, т.е. значительно позже того момента, когда эволюционная ветвь приматов окончательно обособилась от остальных млекопитающих. Недавно было высказано предположение, что семейство генов GAGE возникло и очень быстро распространилось в популяции в результате положительного отбора [113]. На сегодняшний день номенклатура генов GAGE основывалась на данных, полученных при определении последовательностей мРНК. Однако такой подход не удовлетворителен из-за высокой идентичности членов семейства GAGE, так как невозможно различить мРНК, транскрибированные с разных генов. В наши дни представлены новые и более краткие системы классификации на основе идентифицированных генов и их продуктов. Гены названы и пронумерованы в соответствии со следующими вариациями последовательностей: 109_111insTAT, 112T>C и 136C>G, которые отличаются друг от друга кодируемой информацией о полипептидных последовательностях, Y9del, W11R и Q19E. Эти отличия могут играть роль в функционировании белков. Гены были распределены в следующих группах: GAGE1 (повтор 1) (нет вставки L1, нет мотива 109_111insTAT, 112C, 136G), GAGE2A–E (повторы 2, 9, 10, 12, 13) (нет мотива 109_111insTAT, 112C, 136G), GAGE10 (повтор 16) (нет мотива 109_111insTAT, 112T, 136G), GAGE12CJ (повтор 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11 и 15) (109_111insTAT, 112T, 136C) и GAGE13 (повтор 14) (109_111insTAT, 112C, 136G). Эта система охватила все известные члены семейства GAGE в базовые структурные группы, и позволит классифицировать новых представителей, если они будут открыты. Интересно, что последовательность двух генов, GAGE13 и GAGE10, практически воспроизводит строение подгрупп генов GAGE2 и GAGE13 соответственно, что может говорить об их совсем недавнем эволюционном расхождении. При этом GAGE1, единственный из всех, содержащий в себе вставку L1, может являться предком всей группы геном GAGE. 24 Кроме того, были найдены группы генов, названные PAGE и XAGE, гомологичные группе раково-тестикулярных генов GAGE. Последовательности, кодирующие гены PAGE и XAGE генов, находятся в 7 и 14 хромосомах соответственно. Кроме того, большинство из этих генов имеют консервативную экзон-интронную структуру, аналогичную структуре генов GAGE, а незначительная разница в строении может быть объяснена эволюционной дивергенцией. Выравнивание последовательностей мРНК GAGE, PAGE и XAGE демонстрирует общее происхождение; при этом мРНК GAGE демонстрируют 65% идентичности с мРНК XAGE, а с мРНК PAGE установлена гомология на уровне 55%. Следовательно, структура кодируемых белков отличается весьма значительно, и следует ожидать, что они выполняют очень разные функции. Сейчас проводится анализ экспрессии антигенов GAGE в здоровых и в опухолевых тканях различных типов и оценивается возможность их использования в качестве мишеней для опухоль-специфической иммунотерапии. Белки GAGE имеют более широкое распространение в клетках нормальных тканей, чем РТА других групп. Большинство РТА экспрессируются в половых клетках мужчин и в зародышевых клетках обоих полов, однако, представители группы GAGE успешно выделяются из ооцитов и из клеток яичников у взрослых женщин. Кроме того, белки GAGE нарабатываются в клетках Лейдинга и Сертоли во время второго триместра. В связи с тем, что зародышевые клетки человека обладают иммунными привилегиями (они не имеют вовсе, или же экспрессируют незначительное количество молекул HLAI, а также они защищены гемато-тестикулярным барьером), а иммунная система плода практически не развита, напрашивается вывод, что на антигены группы GAGE не формируется иммунотолерантность, а это значит, что их можно использовать как мишени для иммунотерапии. Это подтверждается тем, что при меланоме у пациентов наблюдался гуморальный и клеточный иммунный ответ против антигенов группы GAGE. 25 Транскрипция генов GAGE обнаруживается в широком спектре опухолевых заболеваний. Наиболее часто эпитопы GAGE обнаруживаются при злокачественной меланоме (от 24% до 42% исследованных случаев), раке лёгких (от 19% до 54%), опухолях щитовидной железы (30%), раке молочной железы (26%), раке печени (38%), и раке яичников (30%). Иммуногистохимические анализы также позволяют выявить GAGE в нескольких типах рака, таких как злокачественная меланома (17%), рак лёгких (16%), молочной железы (12%) и щитовидной железы (10%), но это значительно реже, чем можно наблюдать при исследовании образцов, подвергшихся реакции обратной транскрипции [110113]. Важно отметить, что иммуногистохимическое исследование выявляет различные уровни экспрессии GAGE внутри одной пробы, и случается, что образцы, в целом положительные после определения экспрессии GAGE, содержат в себе клетки, не содержащие следов GAGE. Отсутствие экспрессии GAGE в большинстве здоровых тканей позволяет рассматривать прогностический данные маркер белки раковых как возможный заболеваний, и диагностический использования их и в дальнейшем для оценки злокачественности и мониторинга опухолей для подбора тактики лечения. Показано, что уровень экспрессии GAGE коррелирует с неблагоприятным прогнозом при раке желудка, пищевода и при нейробластоме. Возможно, GAGE можно использовать в качестве маркера для определения стадии заболевания. Несмотря на это, большинство клинических исследований сосредоточено на РТА MAGE и NY-ESO-1. Эти исследования показали, что данные РТА распознаются CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами, на них же вырабатываются антитела. В некоторых случаях, подобное лечение позволило достичь значительной регрессии опухолей, а иногда и достижения полной ремиссии. HAGE. Ген HAGE кодирует белок, являющийся ATP-зависимой РНКхеликазой. Последовательность гена HAGE локализована в локусе 6q12-q13. Кодирует белок весом ~73 кДа. Синтезированная полипептидная цепь состоит из 26 649 аминокислотных остатков. Она не подвергается процессингу и гликозилированию, и после фолдинга превращается в зрелый белок HAGE. Белок входит в DEAD-box семейство ATP-зависимых хеликаз. Секвенирование генома выявило 55% гомологии с геном DDX5 (p68), который также относится к семейству белков DEAD-box. Вероятно, HAGE участвует в метаболизме РНК, контроле клеточного цикла. В норме HAGE экспрессируется в клетках слюнных желёз. В них обнаруживается мРНК, но никогда не был выявлен сам белок. Кроме слюнных желёз, HAGE экспрессируется в мужских половых клетках, в которых обнаружили как мРНК, так и белок. Есть данные, согласно которым уровень экспрессии HAGE в опухолевых клетках сопоставим с экспрессией в сперматоцитах. При опухолевой трансформации самих сперматоцитов экспрессия HAGE становится ещё больше. Антиген HAGE очень часто встречается в линиях гематологических опухолевых клеток. Существуют данные о том, что HAGE экспрессируются более чем в 50% случаев хронического миелоидного лейкоза [87], и в 20% случаев острого миелоидного лейкоза [83, 114]. При множественной миеломе мРНК HAGE обнаруживается более чем в 40% случаев [115]. В литературе подробно изложена роль HAGE в прогрессировании ХМЛ. Известно, что в ранних стадиях развития ХМЛ ген HAGE активен в клетках в среднем у 55% пациентов. Такой показатель сохраняется на протяжении всей хронической стадии ХМЛ. При прогрессировании болезни в фазу акселерации экспрессия HAGE по какой-то причине снижается. Для этой стадии показатель встречаемости мРНК HAGE в тканях пациентов составляет 20%. При дальнейшем прогрессировании ХМЛ и при переходе заболевания из стадии акселерации в бластный криз активность гена HAGE резко возрастает. По одним данным, мРНК и зрелый белок HAGE можно обнаружить в клетках у 71% больных [83] по другим – у 100% [60] 27 При любой стадии развития ХМЛ совместно с экспрессией HAGE обнаруживается активность множества других опухолевых антигенов. Часто наблюдается присутствие мРНК, а также белков семейств MAGE и LAGE, антигенов GAGE, NY-ESO-1 и RAGE. При заболеваниях крови совместно с HAGE в небольшом числе обнаруживаются антигены семейства BAGE [83]. Вполне вероятно, что HAGE является узловым звеном в каскаде активации других онкогенов. Для выяснения и построения таких каскадов требуется провести масштабное исследование. В литературе также описано исследование уровня метилирования промотора HAGE. В здоровых клетках, за исключением клеток сперматоцитов и слюнных желёз, промотор, а также вся последовательность, кодирующая мРНК, очень сильно метилированы. При ранней стадии ХМЛ промотор гена HAGE деметилируется на 22% относительно нормы. Для клеток, выделенных у пациентов, находящихся в бластном кризе, показатель деметилирования ещё выше. Промотор и вся генная последовательность деметилированы на 46%. Потеря метильных групп облегчает ассоциацию ДНК с транскрипционными факторами и приводит к активации гена. Показатель деметилирования коррелирует с активностью HAGE при разных стадиях развития ХМЛ. Предстоит выяснить причину, вызывающую этот процесс. Но можно сделать вывод о том, что статус деметилирования гена HAGE может свидетельствовать о развитии болезни и быть основанием для плохого прогноза [115, 116]. Кроме гематологических заболеваний, HAGE обнаружен в широком спектре других опухолей. мРНК HAGE найдена в образцах опухолей мозга, толстой кишки, предстательной железы, печени, желудка и молочных желёз [117]. В целом, ген HAGE не столь активен при негематологичеких заболеваниях. Нередко обнаруживается только мРНК, и может полностью отсутствовать белок. Белок HAGE найден в небольшом числе случаев заболевания раком лёгких [118]. Попытки выявить корреляцию между экспрессией HAGE и тяжестью 28 заболевания не увенчались успехом [119]. Возможно, при раке лёгких HAGE принимает участие в молекулярных каскадах, отличных от тех, в какие этот белок вовлечён в трансформированных клетках крови. Следует отметить, что при негематологических заболеваниях ген HAGE также экспрессируется совместно с другими опухолевыми антигенами. В их числе представители семейств GAGE и При MAGE. злокачественных заболеваниях кроветворной системы, коэкспрессия HAGE с генами семейства BAGE обнаруживается чаще, чем с другими генами [118]. Отметим, что в недавних исследованиях у больных хроническим миелодиным лейкозом был установлен пониженный уровень метилирования гена HAGE, что характерно для многих РТГ. Повышение уровня экспрессии HAGE напрямую связано с прогрессированием заболевания и неблагоприятным прогнозом. Всё это предполагает потенциальную роль HAGE в повышении пролиферативного потенциала клетки и/или повышения её выживаемости. Исследование свойств и распространённости при онкологических заболеваниях гена HAGE очень важно для создания лекарства от рака. Белок HAGE можно использовать как мишень для иммунотерапии. Уровень экспрессии этого антигена в слюнных железах, не имеющих барьера против Тклеточного иммунитета, незначителен, и не приведёт к заметным изменениям при иммунизации. Ген NY-ESO-1. NY-ESO-1 считается одним из самых изученных РТГ. Этот ген кодирует белок весом около 22 кДа. Впервые этот белок был выделен из опухолевых клеток пациентки с диагнозом рак пищевода [41]. Вместе с геном LAGE-1 РТГ NY-ESO-1 относится к семейству NY-ESO-1/LAGE. Представители указанного семейства не экспрессируются в здоровых тканях, за исключением семенников. Матричная РНК NY-ESO-1 экспрессируется в основном сперматогониями и сперматоцитами первого порядка, но отсутствует в постмейотических сперматидах и клетках Сертоли. Характерна экспрессия этого гена 29 при злокачественных заболеваниях, таких как меланома, рак молочной железы, желудка, лёгких, яичника, простаты и печени. Зрелый белок NY-ESO-1 отличается высокой иммуногенностью [120]. У значительного числа пациентов с различными диагнозами (к примеру: рак щитовидной железы, молочной железы, карцинома лёгких, рак яичника, пищевода и меланома) найдены антитела против этого белка [77]. Во всех описанных случаях специфический иммунный ответ вырабатывался спонтанно [121]. В данный момент во множестве лабораторий мира разрабатываются стратегии специфической терапии опухолей, экспрессирующие ген NY-ESO-1 [122]. Опубликована информация о проведении 35 независимых исследований, касающихся получения рекомбинантного белка NY-ESO-1, синтезированного с дополнительной олигогистидиновой последовательностью [123]. Проводится иммунизация пациентов смесью рекомбинантного белка и адъювантов [124]. Однако, несмотря на наличие выраженного иммунного ответа, в этих экспериментальных работах иммунотерапии меланомы не отмечено положительного влияния на исход заболевания [125, 126]. Только в одной работе удалось достичь положительного результата [127]. В этом исследовании описан эксперимент по терапии меланомы Ипилимумабом и вакциной, специфичной против антигена NY-ESO-1. Было достигнуто развитие специфического Т-клеточного иммунного ответа, направленного против клеток меланомы [45]. В другом исследовании упомянута методика создания вакцины на основе искусственно синтезированного пептида ESO-1, состоящего из аминокислотных остатков 157-165 полипептидной цепи NY-ESO-1. Этим пептидом в сочетании с адъювантами были вакцинированы пациенты с диагнозом меланома (n=7), немелколеточный рак лёгких (n=4), рак яичника (n=1), саркома (n=1) и рак молочной железы (n=1). Все больные находились в III-IV стадии заболевания. Отдельно взятый пептид позволил развить специфический Т-клеточный ответ и повысить общую выживаемость на 25% относительно группы плацебо. В другом исследовании группе пациентов с диагнозом рак пищевода (n=8) и рак простаты (n=2) была предложена анти-NYESO-1 вакцина. Указанные пациенты развили B-клеточный иммунный ответ не 30 только против NY-ESO-1, но против других опухолевых антигенов. Установлено, что в их крови циркулировали CD4+ и CD8+ лимфоциты, распознающие эпитопы белков MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, CT7/MAGEC1, CT10/MAGEC2, CT45, CT46/HORMAD1, SOX2, SSX2, XAGE1B и мутантного p53. Но предпринятые действия не позволили уменьшить размер опухоли, и большинство пациентов погибло, показав неэффективность этой вакцины. Интересно, что, несмотря на большой объём клинических исследований, роль белка NY-ESO-1 в процессах сперматогенеза остаётся неизвестной, хотя с момента его открытия прошло более 15 лет [41]. Семейство генов MAGE. Со дня открытия первого гена MAGE в 1991 году стало известно о существовании более 60 генов, гомологичных ему, и объединённых в одно семейство [45]. Название MAGE расшифровывается как melanoma-associated antigen, и означает, что экспрессия генов этой группы происходит при меланоме, и в частности, при метастатической меланоме. У здорового человека эти гены экспрессируются только в герминогенных клетках [128, 129]. Каждый белок, кодируемый генами семейства MAGE, имеет так называемый MAGE-специфический домен (МСД), имеющий длину 200 а.о. Этот домен локализован в основном в С-конце новосинтезированных белов MAGE [130]. Таким образом, различия в белках этого семейства наблюдаются только в N-концах, однако, по последним данным, они незначительны. Анализ профиля экспрессии показал, что в организме взрослого человека, не поражённого онкологическими заболеваниями, гены группы MAGE не транскрибируются. Исключение составляют ткани плаценты и семенников, в клетках которых показана экспрессия этих генов. Антигены группы MAGE являются перспективной мишенью для иммунотерапии онкологических заболеваний, поскольку они обнаружены в образцах опухолей, имеющих разнообразное гистологическое происхождение [131]. К сожалению, подобно гену SP17, некоторые представители семейства MAGE на низком уровне экспрессируются и в здоровых тканях. 31 Интересно, что гены, гомологичные генам семейства MAGE, обнаружены в геномах организмов, не относящихся к млекопитающим. Так, MAGE-подобные гены найдены у Drosophila melanogaster (плодовая мушка), Danio retrio (так же известна как Zebrafish), и даже у цветковых растений, в частности, в геноме Arabidopsis thaliana (резуховидка таля). Гены MAGE являются эволюционно консервативной группой, и, по всей видимости, выполняют какую-то важную функцию. К сожалению, их предназначение пока остается неизвестным. Сейчас семейство генов MAGE рассматриваются в виде двух подсемейств – MAGE-I и MAGE-II. Гены семейства MAGE-I расположены на X хромосоме в кластерах, названных группами генов MAGE-A, MAGE-B и MAGE-C. Большинство генов подсемейства MAGE-I проявляют свойства, типичные для РТГ, т.е., они экспрессируются только в семенниках и малигнизированных клетках, в других же тканях их экспрессия подавлена. Установлено, что белки подсемейства MAGE-I оказывают огромное влияние на выживаемость опухолевой клетки. К примеру, белок MAGE-A3, один из представителей семейства MAGE-I, способен связываться с прокаспазой 12, блокируя её конвертацию в активную каспазу 12. Таким образом, клетки, экспрессирующие ген MAGE-A3, оказываются устойчивыми к лекарственной индукции апоптоза по каспазо-12-зависимому пути. Некоторые другие белки подсемейства MAGE-I способны связываться с белками, содержащими в своей структуре мотив RING [132]. Одним из RING-содержащих белков является убиквитинлигаза E3, и её активность может нарушаться при ассоциации с белками подгруппы MAGE-I [133-135]. В мире уже ведутся работы по созданию специфических вакцин, направленных против эпитопов MAGE-I. В качестве основной мишени используют эпитопы белка MAGE-A3. Вакцины для терапии меланомы и рака лёгких уже проходят вторую фазу испытаний. Уже доведены до третьей фазы испытаний анти-MAGE-A3 вакцины, разработанные для лечения 32 немелкоклеточного рака лёгких. Во всех исследованиях использовался рекомбинантный белок MAGE-A3 [136, 137]. Члены подсемейства MAGE-II (в некоторых источниках они обозначены, как группа генов MAGE-D) отличаются тем, что некоторые из них не расположены в Х-хромосоме, и их экспрессия наблюдается во многих здоровых тканях [138]. Все эти гены кодируют консервативный домен МСД, но отличаются более длинной вариабельной N-концевой последовательностью. Отмечено, что экспрессия генов MAGE-II подсемейства заблокирована в опухолевых клетках. Имеются данные о том, что в клетках некоторых тканей гены группы MAGE-D играют роль онкосупрессоров и связаны с регуляцией циркадных ритмов [139]. Известно и о свойствах стимуляции апоптоза и остановке клеточного цикла, осуществляемой при ассоциации белков группы MAGE-D с белками XIAP и p75NTR. Одним из ярких представителей подсемейства MAGE-II является ген NDN, расположенный в 15 хромосоме. Кодируемый этим геном белок NDN описан как регулятор роста постмитотических нейронов. NDN связывает транскрипционный фактор E2F-1, и останавливает клеточный цикл. Делеция 15-й хромосомы, затрагивающая ген NDN, приводит к врождённому синдрому Прадера-Вилли. Как и многие другие члены подсемейства MAGE-II, экспрессия гена NDN подавлена в трансформированных клетках, что позволяет предположить его онкосупрессирующую роль [140, 141]. В целом, имеющиеся данные указывают, что гены подсемейства MAGE-I являются типичными РТГ, в то время как их гомологи, объединённые в подсемейство генов MAGE-II, при своей нормальной активности обладают противоопухолевым эффектом. PASD1. Не так давно при исследовании биологических особенностей Bклеточной лимфомы был выделен и изучен новый РТА, получивший название PASD1. 33 Ген, кодирующий белок PASD1, локализован в кластере Xq28. С этого гена считывается мРНК, с которой транслируется полипептидная цепь, состоящая из 639 аминокислотных остатков. При фолдинге полипептид не подвергается процессингу и не гликозилируется, образуя зрелый белок PASD1. Была найдена изоформа этого белка, названная PASD2. Эта изоформа также состоит из единственной полипептидной цепочки, длинна которой составляет 773 аминокислотных остатка. Из них первые 638 остатков являются общими для обоих белков. Существование белка PASD2 можно объяснить спонтанной ошибкой сплайсинга, при которой не происходит вырезание 14го интрона из информационной РНК. Эта информация должна быть принята к сведению при планировании исследования транскрипционной активности гена PASD. Можно специально подобрать экспериментальные системы (например, для анализа на белковых чипах), способные распознавать присутствие как PASD1 и PASD2 одновременно, так и наличие одного белка PASD2. Следует отметить, что ген PASD расположен в локусе, содержащим семейство Х-хромосомных РТГ MAGE. Очень часто при раковых заболеваниях экспрессии PASD сопутствует экспрессия некоторых представителей семейства MAGE. Кроме MAGE, в том регионе найдены последовательности других опухоль-ассоциированных антигенов. В их числе антигены NY-ESO-1, семейство антигенов LAGE, Траг-3, CSAGE и SAGE [49]. Белок PASD1 содержит в себе домен PAS. Белки, содержащие этот домен, являются регуляторами циркадного ритма у эукариот [142, 143]. Кроме того белок содержит последовательность ядерной транслокации. Этот рецептор способен взаимодействовать с рецептором эстрогена. Подобное взаимодействие может оказывать влияние на клеточную пролиферацию [144, 145]. Синтез белка PASD1 осуществляется на ранних стадиях сперматогенеза. Методом иммуноблотинга удалось установить, что белок имеет исключительно 34 ядерную локализацию [146], и это не опровергает предположение о том, что PASD1 каким-то образом может запускать транскрипцию генов. У здорового человека экспрессия этого белка обнаружена в семенниках. Ни в одной другой ткани PASD1 или PASD2 не были найдены. Экспрессии белка PASD1 был обнаружена во многих клеточных линиях, полученных из гемопоэтических злокачественных новообразований. Особенно тщательно изучена роль этого белка в прогрессировании множественной миеломы [146]. При данном заболевании изоформы PASD (чаще экспрессируется только PASD1) обнаруживаются у 50% пациентов [75]. В клетках, содержащих мРНК PASD1, часто обнаруживают активность гена MAGE-A6. Несколько реже происходит коэкспрессия гена MAGE-A2, а также генов MAGE-A3 и NY-ESO-1 [146]. Экспрессия PASD1 обнаруживается не только при гематологических заболеваниях. мРНК PASD1 была найдена в образцах опухолевых тканей кишечника, мозга, лёгких и шейки матки. Были исследованы образцы гистологически нормальных тканей, полученных от тех же пациентов. В клетках этих тканей также была выявлена активность гена PASD. Отсюда следует, что необратимой опухолевой трансформации предшествует активация этого онкогена. Факторы, вызывающие активацию, пока остаются неизвестными [145]. Опираясь на имеющуюся информацию о белке PASD1 можно начинать лабораторные исследования для испытания этого антигена как мишени для иммунотерапии. Работы можно производить только с изоформой PASD1, поскольку PASD2 является очень похожим белком, и будет участвовать в тех же иммунологических реакциях. Ген SCP1 (synaptonemal complex protein 1). Белок синаптонемального комплекса, экспрессирующийся во время профазы мейоза (начиная со стадии зиготена до стадии диплотена) человеческих сперматоцитов [147]. Является 35 одним из структурных компонентов синаптонемального комплекса [74]. В норме белок SCP1 предназначен для связывания гомологичных хромосом во время их кроссинговера. В отличие от многих РТГ, находящихся на Х-хромосоме, ген SCP1 локализован в хромосоме 1, и не имеет гомологичных генов. Спонтанная экспрессия SCP1 обнаружена в неопластических клетках различных типов. В частности, этот ген активен при злокачественной глиоме, раке молочной железы, почки и яичников [148]. Замечено, что повышение уровня экспрессии SCP1 при раке яичника связано с неблагоприятным исходом заболевания. Предпринимаются попытки проведения анти-SCP1 иммунотерапии данного заболевания [149]. При сперматогенезе экспрессия гена SCP1 строго ограничена стадиями профазы мейоза. Однако в трансформированных клетках экспрессия этого гена происходит при любой фазе митоза [74]. Влияние экспрессии гена SCP1 на опухолевую клетку требует детальных исследований. Ген SEMG1. Белок, кодируемый геном SEMG1 является главным компонентом спермы, и присутствует в высокой концентрации в выделениях семенных желёз. Состоит из единственной полипептидной цепи длинной 439 аминокислотных остатков. Общая масса зрелого белка равна 50 кДа [150]. Функция белка заключается в том, чтобы препятствовать преждевременной капацитации сперматозоидов [151]. Он играет важную роль в придании вязкости сперме. Также белок SEMG1 распадается на короткие пептиды, известные как простат-специфические антигены. Ген, кодирующий белок SEMG1, локализован в длинном плече 20-й хромосомы. Экспрессия данного гена важна в процессе сперматогенеза. Экспрессия гена не была обнаружена в здоровых тканях взрослого организма, за исключением простаты и клеток пигментного эпителия сетчатки. Делеция в длинном плече 20-й хромосомы приводит к множеству гематологических 36 расстройств, особенно к миелопролиферативным заболеваниям и миелодиспластическим синдромам [152]. Известно, что ген SEMG1 экспрессируется у ~45% пациентов, находящихся на ранней стадии развития хронического лимфоидного лейкоза. Кроме того, мРНК этого гена выявляется в ~10% случаев заболевания множественной миеломой. Имеются данные, что делеция в длинном плече 20й хромосомы приводит к спонтанной экспрессии гена SEMG1. Есть данные так же о том, что экспрессия SEMG1 может быть стимулирована попаданием в клетку гипометелирующих агентов, таких, как 5-азацидин [153]. Это возможно по той причине, что азацитидин действует неспецифически, и среди участков ДНК, подвергшихся его воздействиию, может быть и промоторная область гена SEMG1. Биоптаты солидных опухолей, взятые от пациентов, содержат в себе как мРНК гена SEMG1, так и зрелый белок. Однако уровень экспрессии белка у разных больных может существенно различаться [154]. Не было обнаружено явных связей экспрессии SEMG1 с присутствием иных опухолевых антигенов, а в сыворотке крови больных обычно не обнаруживались антитела, специфичные к эпитопам белка SEMG1. В некоторых исследованиях отмечено, что белок SEMG1 взаимодействует с тирозиновой киназой Zap70, ответственной за процесс развития и активации Тлимфоцитов [155]. Подобное взаимодействие усугубляет течение болезни, и обнаружение SEMG1 в пробах может служить основанием для неблагоприятного прогноза. SEMG1 можно использовать как мишень для иммунотерапии при онкогематологических заболеваниях. Ген SLLP1. SLLP1 был недавно выделен из обще смеси белков, полученных в результате лизиса человеческих сперматозоидов. Он является структурным 37 аналогом лизоцима, однако не способен к расщеплению клеточной стенки бактерий [156]. Ген SLLP1, кодирующий этот белок, расположен в локусе 17q11.2. В норме нативный белок локализован в акросоме сперматозоида человека. Антисыворотка к SLLP1, добавленная к яйцеклеткам хомячка, блокирует у них способность к слиянию со сперматозоидами. Это позволяет сделать предположение, что SLLP1 играет важную роль в адгезии сперматозоида и яйцеклетки. Новейшие исследования методом нозерн-блот анализа образцов нормальных тканей показали, что мРНК SLLP1 присутствует в тканях яичка и в культуре клеток Raji, полученных от больных с диагнозом лимфома Бёркитта [157]. Возможно, стоит проводить аналогичные исследования свежих образцов тканей злокачественных опухолей. Мы ожидаем, что значимые результаты будут достигнуты при исследовании образцов крови и костного мозга онкогематологических больных. Ген SPANXA1 и его гомологи. Гены семейства SPANX (sperm proteins associated with the nucleus) локализованы в Х хромосоме. Всего в этом семействе находится пять генов, чьи последовательности расположены очень близко друг к другу. Все пять генов расположены в кластере Xq27.1 [158]. Первые два представителя семейства, обозначенные как SPANXA1 и SPANXA12, имеют абсолютно идентичную последовательность. Копии этой последовательности имеют разное направление для транскрипции, и обе кодируют белок SPANXA1. Оставшиеся три гена семейства названы соответственно SPANXB, SPANXC, и SPANXD. Каждая последовательность представлена в виде единственной копии. В каждом гене содержится по два экзона и по одному интрону [159]. Сравнение нуклеотидной последовательности этих генов показывает несущественные различия. Кодируемые ими белки имеют ещё меньше различий в аминокислотном составе. Белки SPANXA1, SPANXA12, SPANXC и SPANXD отличаются между собой на пять-семь аминокислотных остатков. Каждая из их 38 полипептидных цепей содержит в себе 97 аминокислотных остатков. Молекулярный вес каждого белка составляет 19 кДа. Белок SPANXB длиннее остальных и состоит из 103 аминокислотных остатков. Разница в шесть аминокислотных вставках затрагивает N- и C-концевые области белка SPANXB [80]. На N-концевом участке полипептидной цепи находится сайт гликозилирования. Зрелый белок имеет массу 22 кДа [160]. В литературе отражены проведённые исследования по трансфекции геном SPANXA1, SPANXB и SPANXC [161] клеток млекопитающих. Методами иммунофлуоресцентной микроскопии была определена локализация новосинтезированных белков SPANXA1 и SPANXC на ядерной мембране. Для SPANXB установлено, что белок расположен в основном в клеточной цитоплазме. Выяснение локализации белков семейства SPANX может быть полезным диагностическим признаком. В здоровом организме экспрессия генов семейства SPANX происходит только в постмейотических сперматидах [73]. В литературе есть данные об активации этих генов при различных злокачественных заболеваниях крови. Экспрессия генов семейства SPANX в опухолевых тканях определялась методом RT-PCR. мРНК SPANX обнаруживалась у 20% пациентов, находящихся в различных стадиях заболевания множественной миеломой. У больных ХЛЛ экспрессия обнаруживалась в 33% случаев. Для больных ХМЛ этот показатель составляет 29%. При заболевании остром миелобластном лейкозе мРНК SPANX выявляется у 50% пациентов. У всех пациентов были также обнаружены антитела к белкам семейства SPANX. Это является показателем того, что антигены класса SPANX обладают высокой иммуногенностью. В качестве контроля использовались пробы крови, взятые у здоровых людей. Экспрессия не обнаруживалась в контрольных образцах [158]. 39 Несмотря на то, что гены SPANX находятся в Х-хромосоме, их экспрессия не зависит от пола пациентов. В том же исследовании было выяснено, что активация SPANX происходит независимо от стадии заболевания. Также было выяснено, что при заболевании множественной миеломы SPANX коэкспрессируется вместе с онкогеном Sp17 [80]. Кроме того, матричная РНК генов семейства SPANX обнаруживалась в 48% образцов меланомы. В здоровых клетках кожи экспрессия не происходит. Было выяснено, что экспрессия SPANX меняется при прогрессировании меланомы. Уже в региональных метастазах мРНК SPANX встречается в 27% образцов тканей, взятых от разных пациентов. В отдалённых метастазах гены SPANX экспрессируются только в 10% случаев. В том же исследовании [162], другой опухоль-ассоциированный антиген NY-ESO-1 был найден в большинстве проб региональных метастазов (45%), а также биоптатов отдальнённых метастазов (50%). В области первичного поражения при меланоме антиген NY-ESO-1 встречается только в 10% случаев. Возможно, это указывает на взаимодействие двух белков, при котором белки SPANX стимулируют экспрессию NY-ESO-1, который, в свою очередь, приводит к прогрессированию меланомы. Следует также отметить, что экспрессия белков семейства SPANX иногда обнаруживается в образцах клеток, выделенных из нормальной ткани (причём при любой исходной локализации в организме), и прошедших несколько пересадок в новую культуральную среду. Чем больше пересадок производилось, тем выше вероятность обнаружения мРНК любого из генов SPANX в образце [162]. В условиях протекания сперматогенеза антигены SPANX находятся в полной изоляции. Это объясняется иммуносупрессивного наличием гемато-тестикулярного микроокружения. Благодаря барьеру, барьера и созданному плотными контактами клеток Сертоли, циркулирующие в крови антитела не могут попасть в извитые канальцы и вступить во взаимодействие с мужскими 40 гаметами. Также из-за отсутствия молекул HLA на поверхности сперматоцитов становится невозможным процесс иммунопрезентации антигенов SPANX. Кроме этого, физический барьер защищает гаметы от действия Т-клеточного иммунитета. Ген SSX1 и гомологичные гены. Среди множества злокачественных новообразований, поражающих человеческий организм, существует редкое заболевание, известное как синовиальная саркома. Клетки этой агрессивной опухоли характеризуются наличием хромосомной аберрации t(X;18), при исследовании которой были открыты гены семейства SSX (synovial sarcoma X) [163-165]. В этом семействе описано 9 гомологичных генов. В человеческих семенниках транскрибируются гены SSX1, SSX2, SSX3, SSX4 и SSX5 (но не SSX6, SSX8 и SSX9). Больше нигде в человеческом организме при отсутствии онкологических заболеваний не экспрессируются гены этого семейства. В целом в опухолевых тканях чаще экспрессируются гены SSX1, SSX2 и SSX4, а экспрессия генов SSX7, SSX8 и SSX9 наблюдается очень редко. Ещё ни в одном исследованном случае (как в нормальной, так и опухолевой ткани) не отмечено экспрессии генов SSX7, SSX8 и SSX9 [166]. Подобно другим РТГ, экспрессия генов семейства SSX приводит к спонтанной выработке антител у пациентов с опухолевыми заболеваниями [167, 168]. Антитела против генов SSX1, SSX2, SSX3 и SSX4 обнаруживались в крови пациентов с меланомой, раком прямой кишки, яичников и молочной железы. Таким образом, некоторые известные факты указывают на возможное применение белков, кодируемых генами семейства SSX, в качестве мишеней для иммунотерапии [169]. Несмотря на это, интерес к дальнейшему исследованию профиля экспрессии генов SSX остаётся относительно невысоким. Сейчас пока не опубликовано ни одной работы на тему создания специфической вакцины, основанной на белках, кодируемых генами семейства SSX. 41 Одна из исследовательских групп использовала мышиные антитела для изучения локализации белков семейства SSX в герминогенных клетках. Оказалось, что зрелые белки данного семейства локализованы в ядре сперматогоний и ранних сперматоцитах (на стадиях прелептотены, лептотены и зиготены), и только на указанных стадиях сперматогенеза [170]. По всей видимости, эти белки участвуют в клеточной пролиферации и регулировке процесса мейоза. Требуются более детальные исследования функций этих белков. Чем больше будет известно о роли белков семейства генов SSX1 при мейотическом делении, тем легче будет понять последствия спонтанной экспрессии этих генов при клеточной трансформации. Ген PRAME. Ген, кодирующий данный белок, локализован в 22-й хромосоме. В 1997 году был открыт белок PRAME, описанный как инициатор противоопухолевого иммунного ответа больного меланомой [171]. Подобно другим типичным РТГ, экспрессия PRAME характерна только для герминогенных клеток, а так же для некоторых типов солидных опухолей [172]. Ген PRAME является наиболее полно изученным представителем одноимённого семейства [173]. Известно об участии генов семейства PRAME в процессах оогенеза [174], сперматогенеза [175] и самообновлении стволовой клетки [176, 177] Хотя активация гена PRAME наблюдается при самых разных злокачественных новообразованиях, попытки показать его прогностическое значение были успешными только для некоторых типов рака [178-180]. В частности, высокий уровень экспрессии PRAME при меланоме соответствует наиболее продвинутой стадии [140], а при нейробластоме коррелирует со снижением общей выживаемости [181]. Показано, что при раке молочной железы высокие уровни мРНК гена PRAME являются независимым неблагоприятным прогностическим фактором [182-184]. При хроническом миелоидном лейкозе активация транскрипции гена PRAME чаще наблюдается в 42 фазе акселерации и бластного криза, чем в хронической фазе [116, 185]. Указано, что перед спонтанной экспрессией PRAME в опухолевой клетке происходит гипометилирование локуса ДНК, содержащего в себе указанный ген [115, 186]. Есть данные об участии белка PRAME в формировании онкогенного фенотипа трансформированной клетки. В малигнизированных меланоцитах PRAME нарушает дифференцировку путём блокирования передачи сигнала ретиноевой кислотой [187]. Однако эти механизмы не играют роли в патогенезе рака молочной железы [183] и острого миелоидного лейкоза [179]. Имеющиеся данные указывают на то, что продукты экспрессии гена PRAME являются перспективной мишенью для иммунотерапии опухолей. С другой стороны, имеющаяся информация о функциях белка PRAME неполна, и это затрудняет дальнейшую разработку методов специфической иммунотерапии [188] 1.4. Опыт использования методов иммунотерапии для лечения онкогематологических заболеваний Иммунотерапия является идеальным подходом к излечению для пациентов, страдающих от онкогематологических заболеваний. Пересадка аллогенных гемопоэтических стволовых клеток убедительно показывает наличие действия трансплантанта, направленного против опухоли: что опухолевые клетки чувствительны к цитотоксическому действию Т-лимфоцитов, полученных от донора. Если подходящие опухолевые антигены будут подобраны в оптимальных клинических условиях, иммунотерапия станет высокоэффективной и практически нетоксичной. Текущие успехи, достигнутые в области молекулярной биологии, дают клиницистам возможность проводить тщательный мониторинг пациентов с различными онкогематологическими заболеваниями для выявления минимальной остаточной болезни. Можно применять иммунотерапию в случае пациентов с минимальной остаточной болезнью, выявляемой в пределах чувствительности диагностических методов. Скорее 43 всего, в данной ситуации иммунотерапия будет наиболее успешной, и это нужно изучить. Теоретически, применение иммунотерапии в такой обстановке приведёт к значительному усилению действия Т-лимфоцитов против опухолевых клеток в условиях in vivo. К несчастью, до сегодняшнего дня иммунотерапия применялась в основном для тех пациентов, которые ранее получали интенсивный курс химиотерапии, и уже развили резистентность к ней. К сожалению, работа иммунной системы таких пациентов уже была сильно нарушена. Таким образом, отсутствие видимого успеха иммунотерапии не является неожиданностью. 1.5. Некоторые представления о регуляции экспрессии раково- тестикулярных антигенов Экспрессия большинства генов находятся под контролем целого комплекса факторов, таких как последовательность ДНК, гистонов и специфических транскрипционных стимуляторов или супрессоров. На экспрессию генов оказывают влияние метилирование ДНК и посттрансляционные модификации, затрагивающие аминокислотную последовательность гистонов. Эти процессы изменяют структуру хроматина, и приводят его к такому состоянию, при котором транскрипция подавляется [189]. Кроме этого, к активации генов может приводить метилирование и ацетилирование специфических аминокислотных остатков в молекулах гистонов. В здоровых клетках большинство нуклеотидных пар CG находятся в деметилированном состоянии. В то же время ДНК таких клеток содержит в себе длинные последовательности, на всём протяжении которых динуклеотиды CG метилированы. Метилирование таких последовательностей приводит к запрету транскрипции гена. Правда, наблюдаются исключения из этого правила. CG пары в последовательностях большинства Х-хромосомных генов метилированы [190-191]. Также характер метилирования генов зависит от тканеспецифичности. Например, CG пары гена в мезенхимальных клетках могут быть метилированы, а в клетках эпителия те же самые последовательности деметилированы [192, 193]. 44 В метилировании молекулы ДНК задействовано три специальных метилтрансферазных фермента (DNMTs). В качестве донора метильных радикалов эти ферменты используют молекулу S-аденозин-метионина [194]. Все три метилтрансферазных фермента блокируются работой ДНК деметилирующих агентов, таких как азацитидин. Эти компоненты внедряются в ДНК делящихся клеток, и необратимо ингибируются активность DNMTs, тем самым предотвращая метилирование пар CG. Кроме функций, связанных с метилировнаием, DNMTs взамодействуют с рядом белков, поддерживающих гистоны в состояниях, регулирующих транскрипцию ДНК [189]. Среди таких белков известны ферменты, диацетилирующие гистоны (HDAC) и белки, удаляющие метильный радикал с CG пар (MBD1, MBD2). В целом, прогрессирование опухолей связано со снижением общего уровня метилирования геномной ДНК [195]. Снижение общего уровня метилирования в геноме трансформированных клеток начинается задолго до клинических проявлений рака [196 197]. Гипометилирование приводит к экспрессии многих опухоль-ассоциированных антигенов, среди них встречаются и РТА. При прогрессировании рака уровень метилирования только понижается, что приводит к активации всё новых опухоль-ассоциированных антигенов. Исследование антигенов семейства MAGE позволили выяснить, что гипометилирование играет ключевую роль в регуляции экспрессии РТА [198]. Другие работы демонстрируют прямую зависимость между деметилированием промоторов РТА и их последующей экспрессией. Было замечено, что при терапии опухолей ДНК деметилирующим агентом, 5-азацитидином, уровень метилирования ДНК падает, и это запускает экспрессию РТА [157, 199]. Оказалось, что регуляция гена, чей промотор деметилирован, осуществляется посредством взаимодействия этого промотора с белком MeCP2 [79, 80] 45 Несмотря на тесную связь между гипометилированием ДНК и экспрессией генов, очевидно, что существуют и другие факторы, регулирующие экспрессию РТА. Например, опухолевые клетки, выделенные при раке толстого кишечника, не экспрессируют РТА, хотя последовательность их геномной ДНК в целом гипометилирована. Это наблюдение позволило предположить, что экспрессия РТА контролируется так же и другими, вторичными факторами. Сейчас стало о том, что запуск экспрессия гена SPAN-Xb в клетках миеломы контролируется IL-7 и GM-CSF [80]. Если промотор гена SPAN-Xb метилирован, клетки миеломы при обработке IL-7 и/или GM-CSF остаются SPAN-Xbнегативными. При обработке клеток миеломы 5-азацитидином промотор гена SPAN-Xb деметилируется. После этого IL-7 и/или GM-CSF успешно запускают экспрессию гена SPAN-Xb. Подобным образом обработка 5-азацитидином клеток хронического лимфоидного лейкоза деметилирует промотор гена SEMG1. Экспрессия этого гена в последующем активируется IL-4 и IL-6 [200]. Кроме внеклеточных стимулов, таких как деметилирующие агенты, важную роль в спонтанной активации экспрессии РТГ могут играть и внутриклеточные факторы. Движущей силой онкогенеза во многих случаях (исключая гормональный канцерогенез) могут быть геномные события. Установлено, что причиной развития ХМЛ, большинства случаев эритремии и значительной доли случаев эссенциальной тромбоцитемии являются мутации, приводящие к появлению в стволовой кроветворной клетке перманентно активных тирозинкиназ. ХМЛ связан с перестройкой t(9:22), приводящей к слиянию генов ABL и BCR, в результате чего слитный ген кодирует химерную тирозинкиназу BCR-ABL [201]. Около 95% случаев эритремии и приблизительно 65% случаев эссенциальной тромбоцитемии (оба заболевания относят к хроническим 46 миелопролиферативным заболеваним, или хМПЗ) вызваны мутацией в гене JAK2 киназы. Мутация, известная как JAK2V617F, затрагивает псевдокиназный домен и проявляется на уровне зрелого белка в виде замены аминокислоты валин (V), находящийся в положении 617, считая от N-конца полипептидной цепи, на фенилаланин (F) [202]. Эти генетические дефекты приводят к тому, что новосинтезированные изменённые тирозинкиназы выходят из-под регуляторного контроля. В норме киназа Jak2 передаёт сигнал, активирующий промоторы генов, отвечающих за запуск процессов пролиферации. Функции Abl-киназы более широкие: она участвует не только в процессах регуляции пролиферации и регуляции клеточного цикла, но и в ответах на стресс, Функции тирозинкиназ Jak2 и ABL жёстко регулируются. Для инактивации фактора ABL существуют ингибиторы Pag/Msp33, Abi-1, Abi-2 и множество других [201]. Инактивацию пути передачи сигнала от киназы Jak2 осуществляют белки семейства PIAS [202]. Системы инактивации не способны нивелировать последствия повышенной передачи внутриклеточного сигнала. Как следствие, мутантные тирозинкиназы продолжают передавать сигнал своим партнёрам и дальше, превращаясь из контролируемых посредников в автономные инициаторы внутриклеточного сигналинга. Присутствие в цитоплазме киназ BCR-ABL и JAK2V617F способствует лейкемизации стволовых кроветворных клеток. Известно, что хроническое течение ХМЛ и хМПЗ связана с накоплением новых генетических дефектов, приводящих к эволюции ХМЛ от хронической фазы (ХФ) в фазу акселерации (ФА) и бластный криз (БК), и трансформации хМПЗ в острый лейкоз. Клиническим событиям могут предшествовать молекулярные изменения, в числе которых не исключена и активация экспрессии РТА. Другое онкогематологическое заболевание, острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ), характеризуется наличием у подавляющего большинства больных 47 хромосомной перестройки формированию гена t(15;17). PML/RARα, Данная перестройка образованного из приводит генов PML к (ген промиелоцитарного лейкоза) и RARα (ген рецептора ретиноевой кислоты, тип α) [203]. Описаны три варианта точек разрыва в гене PML: bcr1, bcr2 и bcr3, определяющие длину транскрипта гена PML/RARα. Наличия любого из трёх вариантов перестройки достаточно для трансформации клеток- предшественников миелоидного ряда и начала заболевания, причём у каждого пациента может быть только один тип слияния генов PML и RARα [203]. Химерный белок PML/RARα сохраняет функцию подавления транскрипции генов, регулируемых нативным белком RARα. Однако, конформационные изменения, вызванные наличием в химерном белке фрагмента полипептидной цепи PML, приводят к потере специфичности связывания с ДНК, и спектр репрессируемых генов расширяется. В результате этого белок PML/RARα, в отличие от RARα, теряет способность в присутствие ретиноевой кислоты разрывать связь с корепрессорами и присоединять к себе молекулу коактиватора. В отличие от хронического миелоидного лейкоза, демонстрирующего нарастающую резистентность к ингибиторами тирозинкиназы за счёт накопления мутаций в трансформированной клетке, для ОПЛ характерна высокая геномная стабильность, что позволяет практически не менять тактику лечения в течение многих лет [204]. Согласно одному исследованию [205], при ОПЛ экспрессируется ген PRAME. Полуколичесвтенными методами был определён уровень экспрессии этого РТГ, однако сделанные выводы относительно прогностического значения этого признака были неубедительны. Кроме того, экспрессия гена PRAME наблюдалась у многих, но не у всех больных в дебюте ОПЛ. Эти данные вступают в конфликт с утверждением о генетической стабильности ОПЛ, и требуют проверки с использованием более современных методов. 48 В литературе нет данных об экспрессии каких-либо ещё РТГ при ОПЛ, хотя условия для ах активации могут быть созданы белком PML/RARα. Актуальна проблема описания новых маркеров, характерных для B- и Тклеточных лимфомам. Эти заболевания характеризуются множественными хромосомными аномалиями, и отличаются агрессивным течением. Даже если одно из многих В-клеточных новообразований, лимфогранулематоз, или лимфома Ходжкина, в подавляющем большинстве случаев поддаётся терапии, после которой наблюдается длительная ремиссия, то другие формы, в частности, фолликулярная лимфома, излечить гораздо сложнее. Кроме того, у больных, перенёсших лимфогранулематоз, бессобытийный период ремиссии онкогематологического может прерваться заболевания (в развитием другой формы частности, диффузной B- крупноклеточной лимфомы). Представляется привлекательной возможность разработать специфическую вакцину для устранения пула опухолевых клеток, выживших после серии курсов высокодозной химиотерапии. 1.6. Возможность использования раково-тестикулярных антигенов в качестве мишеней для иммунотерапии Хотя ряд свойств делает РТА идеальной мишенью для иммунотерапии, есть и существенные препятствия для их успешного применения в клинических условиях. Главное ограничение заключается в том, что профиль экспрессии РТА гетерогенен даже в рамках отдельно взятых пациентов. Большинство исследований сосредоточено на экспрессии РТА без учёта взаимосвязей между ними, и не учитывают особенности их гетерогенного распределения при заболеваниях. Эта особенность экспрессии РТА препятствует их успешному использованию в качестве мишеней для иммунотерапии в клинических условиях. Возможна такая ситуация, когда будет создан препарат, созданный на базе одного РТА, сможет успешно работать против клеток, экспрессирующий 49 целевой антиген. Однако этот препарат окажется бессилен в борьбе с теми опухолевыми клетками, что не несут в себе следов экспрессии этого РТА. Активацию экспрессии РТГ можно индуцировать, используя деметилирующие агенты или же некоторые цитокины. Однако эти агенты действуют на все клетки организма, и экспрессия РТА может начаться и в соматических клетках, тем самым вызывая общеорганную токсичность препаратов, использующихся в иммунотерапии. Пока эта проблема не будет разрешена, вполне вероятно, что иммунотерапия на основе РТА не выйдет за пределы исследовательских лабораторий. Несмотря на большой список известных РТА, до сегодняшнего дня были опубликованы только единичные результаты клинического применения иммунотерапевтических вакцин, основой создания которых служили эти антигены. Ниже кратко описаны два клинических случая о двух пациентов, страдающих от онкогематологических заболеваний, которых лечили методом иммунотерапии, направленной против РТА. У обоих больных был установлен диагноз множественная миелома. У одного из больных после пересадки костного мозга развился рецидив. Он получал дендритные клетки, презентирующие SP17, а также низкие дозы IL-2 [206]. В результате было отмечено сокращение пула лейкемических клеток на 90%. Другой больной получил клетки своего HLAсовместимого родственника. Однако прежде чем эти клетки были получены от донора, сам донор был иммунизирован белком MAGE-A2, выделенным из линии AS02B [207]. Через год после трансплантации у пациента развился иммунный ответ против MAGE-A3. Пациент остаётся в ремиссии и через два с половиной года после трансплантации. Хотя из подробного разбора двух данных клинических случаев можно извлечь не так много информации, тем не менее, мы можем сказать, что иммунотерапия, основанная на иммунных реакциях против РТА-экспрессирующих опухолевых клеток, является как минимум безопасной. 50 1.7. Диагностическое значение экспрессии раково- тестикулярных генов при гемабластозах. При всей своей привлекательности, иммунотерапия останется очень дорогим способом лечения злокачественных новообразований. На сегодняшний день нельзя спрогнозировать, когда данный подход будет использоваться массово. Однако с исследованием экспрессии раково-тестикулярных генов открывается ещё одна возможность. Раково-тестикулярные гены могут быть применены как маркеры минимальной остаточной болезни или как маркеры прогрессирования заболевания. На прогноз у больных, имеющих солидные опухоли, влияет экспрессия некоторых раково-тестикулярных генов в дебюте заболевания. Это не исключает возможную связь между экспрессией РТГ в дебюте онкогематологических заболеваний с различными исходами болезни. 1.8. Заключение Количество опубликованных результатов экспериментальных работ в облисти исследования РТГ растёт из года в год, что говорит о большой актуальности проблемы спонтанной экспрессии этих генов при различных онкологических и онкогематологических заболеваниях. Однако подавляющее большинство исследователей не сообщают о том, на каком уровне происходит экспрессия РТГ, или какое влияние оказывает активация того или иного гена на прогноз заболевания. Выбор исследуемых РТГ основан на опубликованных данных об основных систематических характеристиках. Многие из одиннадцати исследуемых РТГ являются членами крупных генетических семейств, в высокой степени гомологичных друг другу. Поскольку контроль экспрессии этих генных семейств подчинён одним и тем же промоторам, из каждого крупного семейства для исследования выбран один ген, обладающий максимально полным набором свойств, присущих всему семейству. Выбор сделан в целях упрощения 51 поисковой работы. В то же время, этот выбор позволил охватить всех основных представителей. Судя по имеющимся литературным данным, при различных онкогематологических заболеваниях имеются условия для экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, причём в дебюте заболевания возможна активация хотя бы одного из них. Это условие кажется достаточным для того, чтобы в будущем планировать методы специфической иммунотерапии гемобластозов. Собрав больше информации об экспрессии РТГ в дебюте онкогематологических заболеваний и изучив данные о процессе терапии, мы сможем с большей точностью определить группы риска среди больных, и заложим основу использования генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в качестве диагностических и прогностических маркеров. 52 Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Исследованные больные В процессе работы были отобраны пробы крови, костного мозга и лимфатических узлов больных, страдающих от хронических и острых форм различных онкогематологических заболеваний. Среди них были больные с диагнозом: эритремия (n=22); эссенциальная тромбоцитемия (17); хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) (95); острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ) (n=90); диффузная B-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ) (n=17); лимфома Ходжкина (ЛХ) (n=27); фолликулярная лимфома (ФЛ) (n=22); Общее количество больных составило 290, причём от некоторых из них материалы для исследования были получены как в дебюте заболевания, так и после достижения ремиссии или при прохождении мониторинга заболевания. Для создания контрольной группы была отобрана кровь 15 здоровых доноров. Детальные характеристики больных и здоровых доноров изложены в главе «результаты». 53 2.2. Клеточные линии и методика их культивирования В данной работе профиль экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME был исследован в клеточных линиях K562, WI-38, mel P, mel Si, mel Mtp, mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor. Культивирование клеточных линий проводилось при 37°С в СО2-инкубаторе в среде RPMI 1640, содержащей 10% телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES и 100 мкг/мл ампициллина. Контроль числа клеток при подсчёте живых и мёртвых клеток в камере Гаряева после их окраски трипановым синим. Для дальнейшей работы с мРНК отбирались не менее 106 клеток каждой культуры. 2.3. Для Здоровые доноры создания группы отрицательного контроля была отобрана периферическая кровь 15 здоровых добровольцев. 2.4. Выделение геномной ДНК для определения мутации JAK2V617F Определение мутации в гене Jak2 необходимо проводить в обогащённой фракции гранулоцитов. В связи с этим объём венозной крови, отбираемой у больного, должен быть не менее 15 ml. В качестве антикоагулянта использовался цитрат Na. Перед осаждением эритроцитов к пробе крови добавляли равный объем 3% раствора Декстрана (Mr500000). После осаждения эритроцитов собиралась верхняя фракция, которую центрифугировали в течение 10 мин. при 1500 об/мин. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 15 ml изотонического раствора NaCl. Полученный раствор наслаивали на 5 мл фикола (Mono-Poli, ICN), после чего центрифугировали в течение 40 мин. при 1500 об/мин. Врехнюю фазу удаляли, а оставшиеся эритроциты подвергали лизису в 0,2% растворе NaCl в течение 30 сек. Полученную обогащённую фракцию гранулоцитов лизировали в растворе TRI Reagent («Sigma-Aldrich», США) и 54 производили выделение геномной ДНК согласно инструкции, предложенной разработчиком. 2.5. Системы для определения мРНК целевого гена в исследуемых образцах Системы специфических праймеров и зондов для определения уровня экспрессии раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, генов Abl, JACK2V617F, BCR-ABL и изотипов гена PML-RARα были разработаны на основе данных о последовательностях генов, (таб. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi предоставленных 2). Анализ ресурсом нуклеотидных последовательностей проводился в программе Vector NTI Advance 10 (Invitrogen, США). При составлении олигонуклеотдиных последовательностей были учтены длины интронных участков. Праймеры подобраны таким образом, чтобы они могли гибридизоваться на концевых участках соседних экзонов. Последовательность каждого флуоресцентного зонда была разработана так, чтобы срабатывание флуоресцентной метки происходило исключительно после связывания зонда по принципу комплиментарности с последовательностью кДНК. Праймеры и флуоресцентные зонды синтезировали в компании ДНКтехнология, Россия. Для флуоресцентных зондов был выбран флуорофор Hex и гаситель BHQ1. Для создания кодирующая положительного последовательность контроля каждого из проведения эксперимента исследуемых генов была клонирована в экспрессирующий вектор pET-15b (Novagen, USA) согласно протоколу, предоставленному разработчиком. 55 2.6. Предварительная подготовка клеточного материала к выделению общей РНК В зависимости от вида исследуемого материала применялись различные подходы к выделению мРНК. Периферическую кровь или костный мозг (объём 5 ml и 2 ml, соответственно), полученный от больного, или периферическую кровь здорового донора перед выделением мРНК обрабатывали гемолизирующим раствором (0,8% NH4Cl) для удаления эритроцитов. Для этого кровь (или костный мозг) смешивали с гемолизирующим раствором в объёмном соотношении 1:14. Смесь инкубировалась в течение 15 мин. при температуре +4°C. После этого смесь центрифугировали в течение 10 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 1 ml гемолизирующего раствора, затем снова центрифугировали в течение 5 мин. При 2400 об/мин. Супернатант удаляли, а выпавший осадок был готов к выделению общей РНК. Лимфатические узлы, полученные от больных, переносились на предметное стекло и измельчали скальпелем. После измельчения образец лимфатические узлы были готовы к выделению из них РНК. Клетки, инкубируемые в виде суспензионной культуры, центрифугировались в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 5 ml физиологического раствора, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а полученный осадок был готов к выделению РНК. Клетки, инкубируемые в виде прикреплённой культуры, освобождались от среды и снимались со стенки культурального флакона 2 ml 0,02% раствором Версена, содержащем 0,25% трипсина. Обработка клеток трипсином занимала 2 мин. при непрерывном наблюдении за состоянием культуры под бинокуляром при увеличении в 100 раз. После отделения клеток от стенки флакона к ним 56 добавляли 10 ml 0,02% раствора Версена, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 5 физиологического ml раствора, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. После удаления супернатанта полученный осадок клеток был готов к выделению РНК. 2.7. Выделение РНК Выделение РНК из предварительно обработанных образцов производилось по протоколу, подготовленный предложенному клеточный Chomczynski материал и лизировали Sacchi в 0,5 [208]. ml Кратко: гуанидин- тиоционатного буфера (4M гуанидан-тиоционата, 25mM цитрата Na, 0,5% Nлаурилсаркозила Na и 0,1M меркаптоэтанола). Во время лизиса материал пропускали через иглу 19G не менее 20 раз. Далее в пробирку добавляли 0,5 ml водонасыщенного фенола (pH 5,2), и 0,125 ml раствора ацетата Na (pH 4,2), встряхивали, и добавляли 0,25 ml хлороформа. Полученную смесь встряхивали до молочно-белого цвета и центрифугировали в течение 10 мин. при 1200 об/мин при охлаждении до +4°C. После центрифугирования отбирали 0,5 ml верхней водной фазы, содержащей клеточную РНК, и смешивали с 0,5 ml изопропанола. Инкубация РНК в изопропаноле проводилась в течение 20 часов при температуре -20°C. После инкубации РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин. при 12000 об/мин., удаляли супернатант, и дважды промывали в 80% этаноле. После промывок осадок РНК высушивали в термостате, растворяли в деионизованной воде, и измеряли концентрацию раствора. 2.8. Получение кДНК Матричная РНК, выделенная на предыдущем этапе, использовалась для синтеза кДНК с использованием ревертазы. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием фермента RevertAid Reverse и набора реактивов (Fermentas, США) в условиях, предложенных фирмой-производителем. Для отжига использовали смесь случайных шестичленных праймеров (Синтол, 57 Россия). В качестве отрицательного контроля использовали рабочую смесь без добавления РНК, пробу доводили до конечного объема деионизованной водой. 2.9. Проверка специфичности работы систем Если транскрипция генома и обратная транскрипция мРНК прошли безошибочно, то полученная кДНК представляет собой непрерывную последовательность гена, лишённую интронов. Теоретически, системы для проведения количественной ПЦР могут сработать и на геномной ДНК, содержащей интроны. Данная особенность потребовала проведения серии экспериментов, в которых вместо кДНК использовались пробы очищенной геномной ДНК и выделенной тотальной РНК. В результате были найдены условия, в которых не происходило неспецифического срабатывания систем праймеров и зондов. Оптимальные условия постановки реакции количесвтенной ПЦР в реальном времени изложены в следующем разделе. 2.10. Проведение количественной полимеразно-цепной реакции в реальном времени Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием двукратной реакционной смеси (40 мM трис-HCl, 100 мM KCl, 4 мM MgCl2, 1 мM каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов и 0.2 мM 2-меркаптоэтанола) и TaqДНК-полимеразы (Fermentas, США). В каждую пробу было добавлено 5 µl кДНК, 350 nM прямого, 350 nM обратного праймера и 140 nM флуоресцентного зонда (таб. 2) В каждом образце был исследован уровень экспрессии гена домашнего хозяйства Abl, РТГ SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME. В дополнение к этим генам, в образцах, полученных от больных с диагнозом ОПЛ, был определён уровень экспрессии изотипов bcr1 и bcr3 гена PML-RARα; у больных с диагнозом ХМЛ – ген BCR-ABL, вариант слияния p210; у больных с диагнозом хМПЗ – мутантный ген JACK2V617. 58 Данный эксперимент проводился на приборе DTlite, (ДНК-технология, Россия). Программа проведения реакций был следующий: «горячий старт»:5 мин. при +94°C; денатурация: 10 сек. при +94; 50 циклов отжиг праймеров и синтез: 12 сек при + 60°C. Для детекции флуоресценции был выбран канал Hex. Для надёжности каждая реакция проводилась в трёх повторах (рисунок 1). В качестве положительного контроля использовали векторы pET-15b, экспрессирующие клонированные геномные последовательности. Правильность синтезированных олигонуклеотидных последовательностей подтверждена секвенированием по Сэнгеру на анализаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). 2.11. Обработка экспериментальных данных Данные, полученные после проведения ПЦР в реальном времени, имели вид графика зависимости нарастания интенсивности флуоресценции от значения порогового цикла Ct. Для определения абсолютного числа копий молекул кДНК, соответствующих числу копий молекул мРНК в анализируемом образце, использовали 10-ти кратные разведения плазмидных контролей, при помощи которых осуществлялось построение калибровочных кривых. Показатель уровня экспрессии каждого гена определялся относительно гена Abl по следующей формуле: в которой УЭ – относительный уровень экспрессии гена. 2.12. Проверка воспроизводимости результата Согласно наблюдениям за хранением РНК, в течение длительного времени происходит постепенная деградация образца. В связи с этим был проведён 59 эксперимент по сравнению количественному сравнению профиля экспрессии генов в одном и том же образце, выделенная РНК которого была разделена на три пробирки. В первой пробирке профиль экспрессии генов был исследован сразу же после процедуры выделения РНК и синтеза кДНК. Вторая пробирка с пробой РНК хранилась при -20°C в течение одного месяца, после чего был изучен профиль экспрессии генов. Третья пробирка хранилась в течение четырёх месяцев, после чего в образце был изучен профиль экспрессии генов. За один месяц хранения количество мРНК, пригодной для проведения эксперимента, сократилось до 73% относительно исходного, и за четыре месяца – до 57%. Скорость деградации мРНК оказалась одинаковой для всех исследуемых генов, и это не оказало заметного влияния на профиль экспрессии генов относительно Abl. 2.13. Методы статистического анализа полученных данных Для таких параметров, как пол, возраст, длительность заболевания и терапии, а так же измеренный уровень экспрессии гена, представлено вычисление медианного значения и интерквантильных интервалов. Анализ времени развития рецидива проводился по методу Каплан-Мейера. Для сравнения групп больных по профилям экспрессии РТГ, времени безрецидивной выживаемости и срока достижения ремиссии применялся критерий χ2. Сравнение групп больных с разным диагнозом по такому признаку, как уровень экспрессии конкретного генов, применялся критерий Манна-Уитни. Критерий выбран в связи с тем, что в составе большинства групп было рассмотрено сопоставимое количество случаев. статистически достоверными на уровне р ≤ 0,05. Все расчёты проводились в программе Statistica 8.0. Результаты признавали 60 Глава 3. Результаты 3.1. Активность раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 в клетках крови здоровых доноров В образцах крови, полученных от 15 здоровых доноров, была обнаружена экспрессия генов HAGE и SLLP1. Не было выявлено экспрессии генов SP17, GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, не была обнаружена мРНК химерных генов BCR-ABL, PML-RARα, и не было выявлено мутации JAK2V617F. У каждого из исследованных здоровых доноров уровень экспрессии генов HAGE и SLLP1 был сопоставим. Медианное значение уровня экспрессии генов HAGE и SLLP1 относительно контрольного гена составляло 2,92% и 0,68%, соответственно. 3.2. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках крови у больных в дебюте ХМЛ и Ph’-негативных хМПЗ Для дальнейшего исследования были отобраны образцы крови 22 больных с впервые установленным диагнозом эритремия, 17 больных с диагнозом эссенциальная тромбоцитемия и 11 больных с диагнозом хронический миелоидный лейкоз. Предварительно у больных с диагнозом эритремия и эссенциальная тромбоцитемия была определена мутация JAK2V617F. Материалы, полученные от первичных больных с диагнозом хронический миелоидный лейкоз, были проверены на наличие экспрессии химерного гена BCR-ABL. Материалы, в которых не было выявлено мутация JAK2V617F или отсутствовал транскрипт гена BCR-ABL, из дальнейшего исследования были исключены. 61 Таким образом, определение профиля экспрессии РТА проводилось в образцах 22 больных с впервые установленным диагнозом эритремия, 17 больных с диагнозом эссенциальная тромбоцитемия и 11 больных с диагнозом хронический миелоидный лейкоз (таб. 3). У двух первичных больных с диагнозом эритремия и двух больных с диагнозом эссенциальная тромбоцитемия мы наблюдали спонтанную экспрессию ещё одного РТГ – PRAME. Поскольку эритремия и эссенциальная тромбоцитемия, согласно современным представлениям, отнесены к так называемым Ph’-негативным хроническим миелопролиферативным заболеваниям (хМПЗ), в дальнейшем анализе они рассмотрены как одна группа. У одного больного и диагнозом ХМЛ экспрессировался ген PRAME. Профили экспрессии РТГ в клетках крови у больных со впервые диагностированными хМПЗ и ХФ ХМЛ не отличаются друг от друга (p=0,199). Только у единичных представителей этих групп экспрессирутеся ген PRAME, причём на сопоставимом уровне относительно контрольного гена (p=0,001). Активность других рассматриваемых РТГ не выявлена. 3.3. Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом У одного из больных, находящихся в стадии ХФ ХМЛ и получающих специфическую терапию, в крови обнаружена экспрессия гена SPANXA1. Частота встречаемости активного гена PRAME у этих больных была приблизительно такой же, как у нелеченных (p=0,346). В крови больных, находящихся в стадиях ФА и БК ХМЛ, экспрессируется больше генов, чем при ХФ (достоверность отличий p=0,032 и p=0,048, соответственно). В частности, при ФА, кроме экспрессии SPANXA1 и PRAME, 62 наблюдалась активность генов GAGE1, MAGEA1, SEMG1 и SSX1. При БК экспрессировались гены GAGE1, SEMG1, SSX1 и PRAME. При рассмотрении результатов исследования крови пациентов, получающих лечение, отмечено увеличение уровня экспрессии PRAME в БК относительно стадий ХФ (p=0,001) и ФА (p=0,048) (таб. 4). В костном мозге исследованных больных в дебюте заболевания ХМЛ не обнаружено экспрессии каких-либо из исследованных генов. Однако у леченных больных стадии ХФ ХМЛ в костном мозге в единичных случаях экспрессируются гены NY-ESO-1 и SCP1, в ФА экспрессировались гены SEMG и SSX1, и в БК – GAGE1. Только один ген экспрессировался клетках костного мозга леченных больных с диагнозом ХФ, ФА и БК ХМЛ – PRAME. Наблюдаемые значения уровня экспрессии у больных в стадии БК были выше, чем при ХФ (p=0,06) и при ФА (p=0,026) (таб. 5). 3.4. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных острым промиелоцитарным лейкозом В костном мозге у каждого из 30 пациентов, ещё не получивших специфического лечения ОПЛ, были обнаружены транскрипты химерного гена PML/RARα и мРНК гена PRAME. Изотип bcr1 химерного гена был обнаружен у 16 пациентов (53% от общего числа пациентов), с медианным уровнем экспрессии относительно гена ABL 353% (разброс значений был от 230% до 985%). У остальных 14 (46%) первичных пациентов был выявлен тип перестройки гена bcr3, со среднемедианным уровнем экспрессии относительно контрольного гена 107% (при разбросе значений от 12% до 482%). У всех больных, находящихся в дебюте заболевания, в клетках костного мозга была обнаружена мРНК PRAME. Среднемедианный уровень экспрессии PRAME для больных, имеющих перестройку в точке bcr1, составил 2,9% (при 63 наблюдаемых значениях от 0,001% до 200%). Для пациентов с перестройкой bcr3 медиана уровня экспрессии гена PRAME составила 48,4% (разброс значений от 0,5% до 460%). Ни одна проба клеток костного мозга, полученная от пациентов в дебюте заболевания, не содержала мРНК генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA1 и SSX1. В крови здоровых доноров не было обнаружено присутствия мРНК гена PML/RARα (изоформы bcr1 или bcr3). Начиная с момента установки диагноза, в течение 18 месяцев проводилось наблюдение за больными. Установлено, что пациенты, имевшие хромосомную перестройку в точке bcr1, достигали морфологической и молекулярной ремиссии в среднем на 35-й день от начала терапии по протоколу AIDA. При экспрессии изоформы bcr3 химерного гена констатация костно-мозговой и молекулярной ремиссии происходила в среднем через 40 дней с момента начала терапии. Для каждого пациента было рассчитано соотношение уровня экспрессии генов PRAME и PML/RARα. В качестве граничного значения мы выбрали уровень соотношения равным 0,05, и разделили всех пациентов на четыре субгруппы (рисунок 2). Мы сопоставили соотношение уровня экспрессии PRAME к PML/RARα со временем развития Наибольшая частота клинического развития рецидива рецидивов заболевания наблюдалась (рисунок у 3). пациентов, экспрессирующих изотип bcr3 гена PML/RARα и значением соотношения уровня экспрессии гена PRAME к гену PML/RARα находящимся ниже 0,05. В этой группе из 6 человек у половины развился рецидив (p=0,0231). Что же касается пациентов, имеющих хромосомную перестройку в точке bcr1, то среди них наблюдался всего один случай рецидива. У этого больного из группы PML/RARα 64 bcr1 – позитивных отношение уровня экспрессии гена PRAME к химерному гену было ниже 0,05. Было проведено тестирование уровня экспрессии PRAME и транскриптов PML/RARα для проведения мониторинга минимальной остаточной болезни при ОПЛ. Кроме 30 пациентов, рассмотренных выше, в наше исследование были включены образцы костного мозга 60 пациентов с диагнозом ОПЛ, проходящих мониторинг МОБ. Время наблюдения пациентов из этой группы составило в среднем 9 месяцев, в течение которых четверо из всей группы развили клинический рецидив. Изотип bcr3 гена PML/RARα экспрессировался у пяти пациентов. У оставшихся трёх химерный ген сформировался в точке bcr1. С момента обнаружения молекулярного рецидива до момента выявления костно-мозгового рецидива проходило в среднем 3 месяца. При выявлении экспрессии транскрипта PML/RARα констатировался молекулярный рецидив (n=8). Ни в одном из этих образцов мы не наблюдали экспрессии гена PRAME. Его мРНК появлялась в пробе костного мозг только в тот момент, когда рецидив проявлялся уже клинически. Не было зафиксировано экспрессии PRAME в PML/RARα – отрицательных пробах. Наблюдалась динамика коэкспрессии гена PRAME и транскриптов PML/RARα. Исследования образцов, полученных при мониторинге ОПЛ, показали, что изменение соотношение количества мРНК гена PRAME и химерного PML/RARα различаются между началом заболевания и рецидивом. Все четверо больных, развившие рецидив за время нашего наблюдения, в дебюте заболевания имели показатель отношения уровней экспрессии двух генов ниже 0,05. В момент обнаружения у них костно-мозгового рецидива это соотношение менялось, и у всех четверых превысило показатель 0,05 (рисунок 4). Наблюдаемое изменение этого соотношения было вызвано повышением относительного уровня экспрессии PRAME. Это указывает на приобретение 65 лейкемической клеткой в стадии рецидива новых качеств по сравнению с теми, что обладал злокачественный клон в самом начале заболевания. 3.5. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом диффузная B-крупноклеточная лимфома Всего было исследовано 17 больных со впервые выявленным диагнозом диффузная В-крупноклеточная лимфома. Медиана возраста составила 52 года, группа состояла из 9 мужчин и 10 женщин. Для исследования были доступны пробы костного мозга, взятые от 12 больных. Кроме того, были исследованы образцы крови всех 17 пациентов. Химиотерапия больных моложе 55 лет (n=11) проводилась согласно протоколу mNHL-BFM-90. Лечение больных старше 55 лет (n=6), проводилось по протоколу R-COP. Профиль экспрессии генов был оценен до и после проведения терапии по указанным протоколам. Были получены данные о таких исходах лечения, как достижение полной ремиссии, что классифицировано нами, как благоприятный исход, и достижение частичной ремиссии, либо смерть больного во время проведения курса лечения, что принято нами как неблагоприятный исход. Нами не было установлено влияния профиля экспрессии РТГ в крови больных в момент постановки диагноза на успех проведенной терапии. Единственным статистически значимым признаком, определяющим исход заболевания, является уровень экспрессии гена HAGE в клетках костного мозга. Этот параметр оказался независимым от возраста и проводимой терапии. Установлено, что смерть больного во время лечения, или же не достижение им полной ремиссии, связано с относительно высоким уровнем экспрессии РТГ HAGE в клетках костного мозга. Среднемедианный уровень экспрессии у таких больных (n=7) составляет 10.9% относительно уровня экспрессии гена Abl. У больных, благополучно достигших полной ремиссии (n=5), уровень экспрессии 66 РТГ HAGE в клетках костного мозга составлял только 0.69%, достоверность различий была определена по критерию Манну-Уитни (p=0,093). Никакие другие гены не были столь явно связанными с прогнозом заболевания, как HAGE. Данные об экспрессии всех генов в костном мозге больных представлена в таблице 6. 3.6. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом лимфома Ходжкина Всего исследовано 27 человек, среди которых было 15 женщин и 12 мужчин. Медиана возраста составляет 36 лет. От всех больных перед началом лечения были отобраны лимфатические узлы, и образцы периферической крови. Все больные получали терапию согласно протоколу R-BEACOPP-14. В лимфоузлах разных больных наблюдалась экспрессия РТГ GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME. У разных больных были активны от одного до девяти исследуемых РТГ. Для некоторых генов был характерен большой разброс показателей экспрессии. В образцах крови, так же, как и в лимфоузлах, полученных от тех же больных, наблюдалась экспрессия GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, но при этом ни в одном случае не экспрессировался ген MAGEA1. Так же, как в лимфатических узлах, уровни экспрессии были различны, и наблюдались разннобразные сочетания экспрессирующихся РТГ. При этом у одного больного в клетках крови коэкспрессировалось семь генов (табл. 7). Проводимое лечение не всегда было результативным. В некоторых случаях после 6 курсов по программе R-BEACOPP-14 достигалась только частичная ремиссия. 67 Оценить влияние экспрессии РТГ в дебюте на прогноз заболевания не удалось из-за большого разнообразия выявленных сочетаний ко- экспрессирующихся генов. Для исследования были доступны образцы крови семи больных, достигших ремиссии. Шестеро из этих больных достигли гематологической ремиссии после проведения шести курсов по программе R-BEACOPP-14. В крови этих больных профиль экспрессии РТГ был похож на профиль экспрессии, наблюдаемый у здоровых доноров, так как наблюдалась экспрессия генов HAGE и SLLP1. Уровни экспрессии этих РТГ были соспоставимы с уровнями, характерными для здоровых доноров (согласно критерию Манна-Уитни p=0,009 и p=0,046, соответственно). Следует отметить, что в дебюте заболевания у всех этих больных в крови была обнаружена экспрессия генов HAGE, NY-ESO-1, PASD1, SPANXA1, SLLP1 и PRAME, а уровень экспрессии РТГ HAGE и SLLP1 был незначительно (p=0,11 и p=0,09, соответственно) выше нормы. Седьмой больной, согласно заключению клиницистов, достиг полной ремиссии после четырёх проведённых курсов полихимиотерапии. В дебюте у этого больного в крови наблюдалась экспрессия гена HAGE на уровне 1,9% относительно гена Abl (что на 30% уровня, характерного для здоровых доноров), и гена NY-ESO-1 на уровне 0,012% относительно Abl. После диагностирования ремиссии в крови этого больного экспрессировались гены SEMG1, SSX1 и PRAME (их уровни составляли 0,05%, 566% и 0,03% относительно Abl, соответственно), и не наблюдалась экспрессия генов HAGE и SLLP1. Таким образом, несмотря на достигнутую гематологическую ремиссию, профиль экспрессии РТГ в крови больного остался не похожим на профиль экспрессии, наблюдаемый в крови здорового донора. С момента проведения этого исследования прошло уже четыре месяца, и состояние ремиссии пока ничем не нарушено. 68 3.7. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом фолликулярная лимфома Всего исследовано 22 человека, среди которых было 12 женщин и 10 мужчин. Медиана возраста составляет 57 лет. От всех больных перед началом лечения были отобраны лимфатические узлы, образцы периферической крови и пробы костного мозга. Все больные получали терапию согласно протоколу R-B. В лимфоузлах разных больных наблюдалась экспрессия РТГ GAGE1, HAGE, MAGEA1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1 и PRAME. У разных больных были активны от одного до девяти исследуемых РТГ. Для некоторых генов был характерен большой разброс показателей экспрессии (таб. 8). В образцах костного мозга, так же, как и в лимфоузлах, полученных от тех же больных, наблюдалась экспрессия GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, но при этом ни в одном случае не экспрессировался ген MAGEA1. В крови больных ФЛ в клетках крови были активны гены HAGE, NY-ESO-1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SSX1 и PRAME. Профиль экспрессии РТГ в крови, костном мозге и лимфатическом узле, полученном от одного и того же больного, как правило, был не одинаковым. Наибольший уровень экспрессии РТГ были характерен для клеток, находящихся в лимфатическом узле. Полная ремиссия заболевания, достигнутая у 40% больных (9/22), диагностировалась после шести курсов терапии по протоколу R-B. Однако у 45% больных (10/22) после шестого курса диагностировали частичную ремиссию. Трое больных (14%) погибло от сопутствующих инфекций и осложнений, вызванных химиотерапией. Нам были доступны образцы крови девяти больных, достигших полной ремиссии. В крови этих больны экспрессировался ген HAGE на уровне, близком 69 значению, характерному для здоровых доноров (достоверность отличий согласно критерию Манна-Уитни: p=0,77). Установлена связь экспрессии гена PRAME в клетках поражённых лимфатических узлов с ответом на терапию. Так, при экспрессии РТГ PRAME выше 6% в клетках лимфатических узлов, очень редко достигалась полная ремиссия. При уровне экспрессии гена PRAME в лифматических узлах на уровне ниже 6% относительно гена Abl, в основном отмечался хороший клинический ответ, и достигалась полная ремиссия (p=0,0041, согласно критерию Манна-Уитни). В крови и отобранном костном мозге больных, достигших ремиссии, мы детектировали экспрессию генов HAGE и SLLP1. В крови уровень экспрессии этих генов был ниже на 80%, чем у здоровых доноров (p=0,02). 3.8. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках линий K562 и WI38. Линия K562 оказалась единственным клеточным материалом, продемонстрировавшим экспрессию сразу всех исследуемых РТГ (диагр. 1). В клетках линии WI38 обнаружена экспрессия генов GAGE1, MAGEA1, NYESO-1, SCP1, SLLP1, SPANXA1 и SSX1. Активности генов SP17, HAGE, PASD, SEMG1 и PRAME не наблюдалось (диагр. 2). 3.9. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клеточных линиях меланомы Мы наблюдали гетерогенность в профилях экспрессии генов, кодирующих РТА: GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в культурах клеток mel P (диагр. 3), mel Si (диагр. 4), mel Mtp (диагр. 5), mel IL (диагр. 6), mel Hn (диагр. 7), mel Ibr (диагр. 8) и mel Kor (диагр. 9). 70 Среди рассмотренных генов наибольшей активностью, выраженной в процентах относительно уровня экспрессии гена Abl, обладает ген PRAME. Его мРНК была обнаружена во всех образцах клеточных культур, и везде, за исключением культуры mel Kor, отмечен уровень экспрессии, превышающий 100% относительно гена Abl. Кроме PRAME, во всех семи культурах оказались активными гены GAGE1 и SSX1. Уровень экспрессии генов NY-ESO-1, MAGEA1 и SCP1, превышающий 30% (от уровня экспрессии гена Abl), был выявлен в линиях mel Hn, mel Ibr и mel lL. Уровни экспрессии генов PASD1 и SEMG1 были либо относительно невысокими (менее 30%), либо их транскрипты вообще не были обнаружены. Было проведено сравнение клеточных линий между собой по общему профилю экспрессирующихся генов. По сочетанию признака общего уровня экспрессии РТГ и общего количества активных линии были объединены в две группы. Достоверность отличия групп между собой определялось по критерию χ2. К первой группе, по признакам массовой гиперэкспрессией РТГ, отнесены клеточные линии mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor. Линии mel P, mel Si и mel Mtp отнесены ко второй группе, характеризующейся менее выраженной гиперэкспрессией РТГ (p=0,0049). 71 Глава 4. Обсуждение 4.1. Экспрессия раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 у здоровых доноров Два раково-тестикулярных гена, HAGE и SLLP1, экспрессировались в клетках крови у всех 15 здоровых доноров. В материалах исследования не было ни одного образца костного мозга здорового донора, чтобы проверить уровень экспрессии этих генов у одного и того же человека. Работоспособность систем, предназначенных для выявления мРНК данных генов, выделенных из проб клеток, проверялась три раза при различных условиях. Несмотря на это, всегда наблюдался положительный результат проведения опыта. Необходимо отметить, что с момента забора крови от здоровых добровольцев до изложения результатов данного исследования прошло более 18 месяцев. При этом никто из группы здоровых доноров не демонстрировал признаков онкогематологического заболевания. Можно сделать вывод о том, что экспрессия раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 действительно характерна для генетически нормальных ядерных клеток, циркулирующих в кровеносной системе здорового человека. 4.2. Профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SLLP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и PRAME у больных ХМЛ и хМПЗ PRAME оказался единственным (кроме генов HAGE и SLLP1) РТГ, экспрессия которого наблюдалась в клетках крови первичных больных с диагнозами хМПЗ и ХФ ХМЛ. Вероятной причиной спонтанной инициации транскрипции гена PRAME может быть вмешательство белков JAK2V617F и 72 BCR-ABL в нормальные регуляторные пути. До момента обращения больного за помощью обязательно существовал период развития заболевания. Так как люди не идентичны друг другу генетически, то и скрытый период заболевания может быть различен по длительности. За это время как при ХМЛ, так и при хМПЗ могут происходить события, стимулирующие экспрессию PRAME, что и было обнаружено в нашем исследовании. В отличие от первичных больных, у пациентов с диагнозом ХФ, ФА и БК ХМЛ и получающих лечение Иматинибом, профиль экспрессии РТГ клеток крови и костного мозга более сложный. Кроме наблюдаемого повышения уровня экспрессии КГТ PRAME наблюдается спонтанная активация экспрессии генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, SCP1, SEMG1, SPANXA1 и SSX1. Интересно, что при ХФ ХМЛ в костном мозге пациентов экспрессировались гены NY-ESO-1 и SCP1, активные в ранних стадиях сперматогенеза. Ген MAGEA1 экспрессируется в развивающихся герминогенных клетках до тех пор, пока они не завершат мейотическое деление. На низком уровне в крови одного больного с диагнозом ФА ХМЛ экспрессировался ген MAGEA1. Гены GAGE1 и SEMG1, чьи транскрипты были обнаружены в стадиях ФА и БК, но не в ХФ ХМЛ, в норме экспрессируются в поздних стадиях сперматогенеза. Однако ген SSX1 экспрессирующийся в БК ХМЛ, активен только в сперматогониях и сперматоцитах, выполняя функцию репрессора транскрипции. Чем длиннее срок заболевания, тем больше генетических изменений накапливается в популяции лейкемических клеток. Результаты сравнения активности нескольких тысяч генов при различных стадиях ХМЛ показали, что состояние общего профиля экспрессии генов соответствует не трём клиническим фазам заболевания, а только двум. Изменения в уровнях экспрессии генов наступают в начале ФА ХМЛ, и предшествуют увеличению числа бластных клеток (Radich et al., 2006). Наши результаты демонстрируют экспрессию множества РТГ при ФА и БК ХМЛ при низкой частоте активации РТГ в ХФ, что 73 укладывается в контекст феномена, открытого Radich et al. Активация промоторов РТГ может происходить одновременно с другими молекулярными событиями, предшествующими переходу заболевания из ХФ в ФА. Формированию того или иного фенотипа всегда предшествует экспрессия тех или иных генов. Мы рекомендуем проводить молекулярный мониторинг ХМЛ не только по признаку экспрессии гена BCR-ABL, но и исследовать профиль экспрессии РТГ PRAME и других генов. Выявление таких маркеров, как мРНК генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, SCP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в клетках крови или костного мозга больных стадии ХФ ХМЛ будет свидетельствовать о скорой трансформации заболевания в ФА и БК. Эти маркеры можно использовать для контроля успешности проведённой аллогенной трансплантации костного мозга, актуальность которой имеет значение и сегодня [209]. Хотя функции белков, кодируемых РТГ, сейчас изучены мало, имеются данные об их участии в регуляции процессов созревания сперматогональной клетки. Последствия экспрессии РТГ при злокачественных заболеваниях в точности предсказать невозможно, но мы полагаем, что их активация дополнительно дестабилизирует клеточный геном, и только способствует эволюции ХМЛ. Опубликовано множество обзорных работ, в которых обозначена возможность применения некоторых РТГ в качестве мишени для иммунотерапии онкогематологических заболеваний [100]. Но ещё не было совершено ни одного исследования профиля экспрессии РТГ по стадиям протекания ХМЛ. Мы показали, что из восьми самых обсуждаемых РТГ свойства только одного гена PRAME предоставляют возможность создания специфической вакцины, которая может подойти многим больным с диагнозом ФА и БК ХМЛ. РТГ PRAME обладает свойствами «хорошего» опухолевого антигена, а именно – с высокой 74 частотой экспрессируется при онкозаболеваниях, и неактивен в нормальных соматических клетках. Что же касается остальных РТГ, то случаи их активации слишком редки, чтобы отдавать высокий приоритет их исследованию в рамках иммунтерапии ХМЛ. Наиболее высоким уровнем экспрессии среди них отличается ген NY-ESO1, но его активность наблюдалась всего у одного из 85 исследованных больных. Задача создания направленного специального против эпитопов иммунотерапевтического белка NY-ESO-1, препарата, вновь приобретёт актуальность в случае возможности производства дешёвых индивидуальных лекарств. 4.3. Значение величины уровня экспрессии генов PRAME и PML/RARα в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза В литературе накоплены сведения о том, что экспрессия гена PRAME, участвующего в процессе сперматогенеза, в случаях солидных опухолей говорит об агрессивном характере опухолевого процесса и снижением выживаемости больных [210]. Но при рассмотрении острых миелоидных лейкозов, и особенно, острого промиелоцитарного лейкоза, отметили, что активность этого гена, а именно – количественная характеристика его экспрессии, каким-то образом связана с более благоприятным исходом болезни [211]. В настоящее время информация о связи PRAME с регуляторными путями клетки неполна. По этой причине можно только приближённо судить о вероятной причине положительного влияния этого маркера на прогноз заболевания при ОПЛ. Возможно, имеет место эффект участия белка PRAME в метаболизме ретиноевой кислоты: клетки, в которых происходит его синтез, очень чувствительны к воздействию ретиноидов [210]. Указано, что белок PRAME способен связываться с комплексом RARα. Мы предполагаем, что при связывании PRAME конкурирует с другими молекулами репрессоров транскрипции. И чем больше молекул белка PRAME внутри клетки, тем сильнее 75 может быть выражен эффект конкуренции. В результате лейкемическая клетка становится более чувствительной к терапии ретиноидами. В работе Santamaria et al. [205] для определения количественной характеристики уровня экспрессии гена PRAME использовался метод ΔΔCT, отличающийся не высокой точностью. Используя специфические праймеры и зонды, мы не смогли обнаружить следы мРНК в клетках крови здоровых доноров, хотя Santamaria et. al. сообщают, что им это удалось. Для создания надёжного положительного контроля мы использовали материалы большой референсной группы, и показали, что лишь у немногих больных, несмотря на онкогематологические расстройства, в кроветворной ткани происходит активация PRAME. При гематологических, а также солидных опухолях не было показано облигатной (у всех пациентов) экспрессии PRAME опухолевыми клетками в дебюте или в рецидиве заболевания. Даже в случае меланомы данный маркер наблюдается только у 88% пациентов. Santamaria et al, изучая профиль экспрессии генов при ОПЛ, смогли показать, что PRAME проявляет активность в дебюте заболевания у многих, но всё же не у всех пациентов. Нами впервые показано, что при ОПЛ активация экспрессии гена PRAME происходит с момента начала заболевания, что было характерно для всех рассмотренных нами случаев. С другой стороны, нам не удалось подтвердить преимущество использования PRAME как маркера для мониторинга МОБ при ОПЛ. Вероятная причина более раннего выявления изоформ гена PML/RARα связана с тем, что химерный ген экспрессируется на более высоком уровне. В связи с этим он практически всегда преодолевал порог чувствительности транскрипты гена PRAME. метода существенно Использование этого нового раньше, чем маркера для мониторинга МОБ возможно, но только в качестве дополнительного. Santamaria et al. в своей работе указывали на то, что мРНК PRAME детектировалась за 76 полгода до клинического развития рецидива. Однако они добавили, что в некоторых случаях результат оказывался ложноотрицательным, что показывает невысокую надёжность использования метода ΔΔCT. В отличие от Santamaria et al., мы показали, как ко-экспрессия генов PML/RARα и PRAME влияет на прогноз заболевания. Наш результат не противоречит классическим исследованиям, в которых было установлено, что изотип bcr3 связан с наихудшем прогнозом при ОПЛ [209]. Мы можем добавить, что в действительности худший прогноз определяется количественным отношением PRAME к PML/RARα изотипа bcr3. Таким образом, определение соотношения экспрессии PRAME к PML/RARα поможет более эффективно выявить группу риска больных ОПЛ. У больных ОПЛ в дебюте заболевания не происходило экспрессии других раково-тестикурярных генов, а именно: генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA1 и SSX1. Но мРНК каждого из этих генов хотя бы несколько раз была обнаружена у пациентов референсной группы. Как сообщали ранее, трансформированные кроветворные клетки, имеющие перестройку t(15;17), отличаются своей генетической стабильностью [212]. Согласно этому предположению мы считаем, что при ОПЛ в трансформированной клетке не происходить инактивации репрессоров транскрипции раково-тестикулярных генов. Наблюдение экспрессии гена PRAME в 100% случаях первичного ОПЛ говорит о том, что его активация практически неизбежна при появлении в клетке зрелого белка PML/RARα любой изоформы. Разницу в количественном соотношении кодируемых этими генами транскриптов мы объяснить не можем, но считаем, что регуляторный каскад, связавший эти два гена, достаточно специфичен, и выполняет свои функции в здоровой клетке. 77 4.4. Прогностическая значимось уровня экспрессии гена HAGE в дебюте диффузной B-крупноклеточной лимфомы Разбиение на группы было очень грубым, однако только в этом случае удалось выявить достоверное влияние экспрессии РТГ на успех применяемой терапии. Несмотря на это, мы показали, что высокий уровень экспрессии гена HAGE в костном мозге больных со впервые установленным диагнозом диффузная Bкрупноклеточная лимфома связан с меньшей эффективностью терапии. 4.5. Результат исследования профиля экспрессии раковотестикулярных генов в у больных с диагнозом лимфома Ходжкина Согласно нашим наблюдениям, у больных со впервые установленным диагнозом лимфома Ходжкина, наблюдается разнообразный профиль экспрессии РТГ. Прогностическая значимость экспрессии того или иного РТГ (или групп РТГ) осталась неясной, так как профиль экспрессии РТГ был индивидуальным у каждого больного. У шестерых больных, после проведения шести курсов химиотерапии, была достигнута полная ремиссия, при которой мы не обнаружили экспрессии РТГ, наблюдаемых до проведения терапии. Таким образом, нам удалось сделать независимое подтверждение элиминации трансформированных клеток у этих больных. 4.6. Влияние уровня экспрессии гена PRAME у больных фолликулярной лимфомой Мы выяснили, что при фолликулярной лимфоме прогностическое значение имеет экспрессия гена PRAME в образцах лимфатических узлов, поражённых заболеванием. Высокий уровень экспрессии РТГ в дебюте заболевания в дальнейшем сопровождался меньшей эффективностью применяемой терапии. 78 Для экспрессии остальных исследованных генов удалось установить только диагностическое значение. При диагностике клинической ремиссии в клетках крови больных мы наблюдали экспрессию гена HAGE, и не детектировали экспрессию других генов. У этих же больных до начала терапии в исследованных образцах наблюдалась активность генов GAGE1, SEMG1, и PRAME. Таким образом, если до лечения в крови больных находились клетки, экспрессирующие данные гены, то после достижения ремиссии, подтверждённой клиницистами, мы показали исчезновение этих клеток. 4.7. Особенности активности раково-тестикулярных генов в клеточных линиях K562, WI-38 и семи линий меланомы Каждая рассмотренная нами линия клеток обладала уникальным набором активных генов, кодирующих РТА. В частности, в линии K562 экспрессировались все исследуемые РТГ. Поскольку данная линия является моделью бластного криза ХМЛ, то не исключено, что при исследовании свежего материала, полученного от больных с данным диагнозом, можно будет наблюдать сходный профиль экспрессии РТГ. При этом, в клетках линии WI-38, являющейся моделью ткани лёгкого человеческого зародыша, экспорессируется меньше генов, и наблюдается меньший уровень их активности. Данный результат продемонстрировал прежде всего работоспособность экспериментальной системы. Кроме того, наблюдение экспрессии генов не противоречит мировым данным о том, что активность РТГ характерна и для эмбриональных тканей [190]. Мы наблюдали, что ген NY-ESO-1 активен лишь в 3 из 7 (43% от общего числа) рассмотренных клеточных культур меланомы. Это может служить рациональным объяснением тому, что применение Т-лимфоцитов, распознающих эпитопы антигена NY-ESO-1, результативно приблизительно в половине случаев клинических испытаний. Что касается генов PASD и SEMG1, 79 то их транскрипты в клетках культур меланомы были обнаружены лишь в небольшом числе рассмотренных случаев, либо они экспрессировались на недостаточно высоком уровне, чтобы ожидать положительного результата от терапии, направленной против белков, кодируемых этими генами. С другой стороны, нами выявлен высокий уровень экспрессии генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, SCP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME. Продукты их трансляции можно рассматривать в качестве перспективных кандидатов на роль мишени для иммунотерапии. Опубликованы данные [213], согласно которым уровень экспрессии генов, кодирующих РТА, коррелирует со степенью дифференцировки клеточной культуры, что возможно, связано с частотой митозов. Согласно данным Михайловой и др., к низкодифференцированным морфологическим формам относятся линии mel Kor, mel Ibr и mel H. Эти линии характеризуются значительными (более пяти обнаруженных хромосомных аномалий) аберрациями кариотипа, и, согласно Михайловой и др., в них была отмечена большая частота экспрессии РТА и кодирующих их РТГ. К умереннодифференцированным линиям относятся mel IL, mel P и mel Hn, которые, подобно низкодифференцированным линиям, обладают множественными хромосомными аномалиями, однако, по данным Михайловой и др., они имели морфологические отличия. Наконец, линия клеток mel Si классифицирована как высокодифференцированная культура. Настоящее исследование позволило дополнить текущие представления об экспрессии имуногенных молекул у больных с диагнозом диссеминированная меланома. Учитывая высокий уровень экспрессии генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, SCP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, представляется целесообразным и перспективным определять количественный уровень их экспрессии у больных с диагнозом диссеминированная меланома для создания противоопухолевой вакцины, специфично направленной против одного или нескольких РТА. 80 В нашей работе использовался более совершенный метод определения уровня экспрессии генов, который позволил точнее охарактеризовать три группы линий клеток меланомы. При этом, несмотря на независимую разработку систем для измерения уровня экспрессии РТГ MAGEA1 и NY-ESO-1 мы получили сходные результаты. Но, в отличие от методов, которыми оперировали Михайлова и др., мы смогли оценить уровень экспрессии гена MAGEA1 и NYESO-1 не полуколичественно, а в точности до нескольких сотен молекул в пробе, содержащей 100 000 клеток. Однако в исследовании Михайловой и др. определён уровень экспрессии многих представителей семейства генов MAGE, в то время как мы исследовали свойства единственного представителя всего семейства. Известно, что гены группы MAGE находятся в одном локусе, и их многие исследователи отмечают их коэкспрессию, указывая на то, что многие (или даже все гены) семейства контролируются одним промотором. Таким образом, мы выбрали для исследования только одного представителя, освободив возможность для исследования других РТГ, не родственных семейству MAGE. Согласно экспериментальным наблюдениям и статистическому расчёту, культуры клеток были можно разделить на две группы. Признаки первой группы – множественная активность РТГ в совокупности с их высокими уровнями экспрессии, характерны для линий mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor. Интересно, что Михайлова и др. определи линии mel Ibr и mel Kor как низкодифференцированные. С другой стороны, линии mel P, mel Si и mel Mtp, по нашим данным, характеризуются в целом более низкими уровнями экспрессии РТГ и меньшей частотой их активации. Но по данным Михайлова и др. линия mel Mtp является низкодифференцированной, линия mel P умереннодифференцированной, и линия mel Si высокодиффенецированной. Классификация по степени дифференцировки, проведенная Михайловой и др., основана на таких признаках, как клеточная морфология и экспрессия дифференцировочных антигенов меланомы, позволила разделить линии на три 81 группы. Другая классификация, основанная исключительно на уровнях экспрессии множества РТГ, выделяет только две группы среди этих линий. Высокий уровень экспрессии генов оказался характерным для двух низкодифференцированных и двух умереннодифференцированных линий. В то же время более низкий уровень экспрессии РТГ выявлен у низко-, умеренно- и высокодифференцированных линий. Следует отметить, что разделение на три группы по признаку уровня экспрессии и частоты активации РТГ оказался невозможным в силу статистической недостоверности полученных результатов. Таким образом, мы получили данные о том, что для низкодифференцированных клеток меланомы характерен как высокий, так и более низкий уровень экспрессии РТГ. При этом у высокодифференцированной линии обнаружен достоверно более низкий уровень экспрессии РТГ, чем у низкодифференцированных линий. Поскольку для человека, страдающего от меланомы, низкодифференцированные опухолевые клетки являются плохим прогностическим фактором, может иметь значение и профиль экспрессии РТГ. Для подтверждения этого вывода требуется провести работу по определению профиля экспрессии РТГ в клеточных образцах, полученных непосредственно от больных, и не прошедших ни единой стадии культивирования. 4.8. Заключение Наши результаты открывают широкие возможности для использования транскриптов раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME для первичной диагностики и последующего мониторинга некоторых хронических и острых форм онкогематологических заболеваний. Мы показали сходство на молекулярном уровне впервые выявленных случаев хронических миелопролиферативных заболеваний и хронического миелоидного лейкоза. Мы выявили молекулярные различия между хронической 82 фазой и фазой акселерации и бластным кризом при хроническом миелоидном лейкозе. Активация экспрессии генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в хронической фазе хронического миелоидного лейкоза может быть первым предвестником трансформации заболевания в терминальную стадию. Мы определили, что в дебюте заболевания B-клеточными лимфомами (диффузная B-крупноклеточная лимфома, лимфома Ходжкина и фолликулярная лимфома) профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NYESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME очень разнообразен, и целом является практически индивидуальным для каждого больного. С другой стороны, несмотря на это разнообразие, для диффузной Bкрупноклеточвной лимфомы уровень экспрессии гена HAGE в клетках костного мозга удалось установить в качестве прогностического фактора. Для фолликулярной лимфомы в качестве важного прогностического установлен высокий уровень экспрессии гена PRAME в лимфатических узлах. Ещё никем в мире не сообщалось, что существует онкологическое заболевание, при котором с такой с частотой, близкой к 100% рассмотренных случаев, экспрессируется какой-либо представитель из группы раково- тестикулярных генов. Согласно нашим результатам всех исследованных PML/RARα-положительных больных острым промиелоцитарным лейкозом в костном мозге экспрессируется ген PRAME. Интересно, что, несмотря на высокую агрессивность, присущую острому промиелоцитарному лейкозу, в дебюте заболевания совершенно не характерна множественная экспрессия РТГ. Это говорит о существовании некого высокоспецифичного механизма, срабатывающего при остром промиелоцитарном лецкозе, и приводящем к экспрессии РТГ PRAME. Важно отметить, что экспрессия гена PRAME была либо очень интенсивной, сопоставимой с уровнем экспрессии изоформ гена PML/RARα, либо наблюдалась 83 на низком уровне относительно химерного гена. Во втором случае, – при низком уровне экспрессии, у больных с высокой частотой развивался гематологический рецидив заболевания. Этого достаточно, чтобы рекомендовать определение уровня экспрессии гена PRAME у вех больных в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза. Мы исследовали клеточные линии, в частности, линии клеток меланомы. Показано, что множественная экспрессия РТГ больше характерна для линий, охарактеризованных ранее как низко- и умереннодифференцированные, но не высокодифференцированные. В случае высокодифференцированных линий, наблюдался существенно более низкий уровень экспрессии генов при меньшем количестве активированных генов. 84 Глава 5. Выводы 1. Обнаружены существенные различия профилей экспрессии генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME между разными видами гемобластозов, при этом опухолевая прогрессия сопровождается увеличением числа и интенсивности экспрессии данных генов. 2. Низкий уровень промиелоцитарного экспрессии лейкоза гена увеличивает PRAME в вероятность дебюте острого раннего развития рецидива (p=0,0231). 3. Активация экспрессии генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX, а также усиление уровня экспрессии PRAME происходит при прогрессии хронического миелолейкоза и при переходе этого заболевания из хроничекой фазы в фазу акселерации (p=0,032) и бластного криза (p=0,048). 4. Неблагоприятным фактором диффузной B-крупноклеточной лимфомы является гиперэкспрессия гена HAGE в клетках костного мозга в дебюте этого заболевания (p=0,093), а гиперэкспрессия гена PRAME в лимфатических узлах связана с резистеностью фолликулярной лимфомы к проводимой химиотерапии (p=0,0041). 5. Определение уровня экспрессии РТГ GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME можно использовать для мониторинга минимальной остаточной болезни гемобластозов. 6. Впервые охарактеризованы профили экспрессии генов GAGE1, HAGE, NYESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в клеточных линиях K562, WI-38, mel P, mel Si, mel Mtp, mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor, при этом найдены существенные отличия в экспрессии этих генов в опухолевых линиях различного гистологического происхождения. 85 Список сокращений ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; кДНК – комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота; РНК – рибонуклеиновая кислота; мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота; ml – миллилитр; mM – миллимоль; M – моль; nM – наномоль; ПЦР – полимеразно-цепная реакция; ОПЛ – острый промиелоцитарный лейкоз; МОБ – минимальная остаточная болезнь; РТА – раково-тестикулярный антиген; РТГ – раково-тестикулярный ген; хМПЗ – хронические миелопролиферативные заболевания; ХМЛ – хронический миелоидный лейкоз; ДВККЛ – диффузная B-крупноклеточная лимфома; ФЛ – фолликулярная лимфома; ЛХ – лимфома Ходжкина; ЛБ – лимфома Бёркитта; 86 MALT-лимфома – экстранодальная B-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны; ОПЛ – острый промиелоцитарный лейкоз; ХМЛ – хронический миелоидный лецкоз; хМПЗ – хронические миелопролиферативные заболевания; ХФ – хроническая фаза; ФА – фаза акcелерации; БК – бластный криз; 87 Список литературы 1. Stames, C.O. Coley's toxins in perspective. // Nature. — 1992. — Vol.357. — P.11-12. 2. de Kretser, D. The cytology of the testis. In: Knobil E, Neill J, Ewing L, Greenwald G, Markert C, Pfaff D, Eds. The Physiology of Reproduction. / J. Kerr. // New York: Raven Press. — 1988. — Vol.1. — P.837-932. 3. O’Donnell, L. Spermiation: the process of sperm release. / P.K. Nicholls, M.K. O’Bryan, R.I. McLachlan, P.G. Stanton. // Spermatogenesis. — 2011. — Vol.1. — P.14-35. 4. Bardin, C.W. The cell biology of the Sertoli cell. In: Desjardins C, Ewing L, Eds. Cell and Molecular Biology of the Testis. / G.L. Gunsalus, C.Y. Cheng. // New York: Oxford University Press—1993. — Vol.189-219. 5. Griswold, M.D. The molecular biology of the FSH receptor. / L. Heckert, C. Linder. // J Steroid Biochem Mol Biol. — 1995. — Vol.53. — P.215-8. 6. Heckert, L. Structural organization of the follicle stimulating hormone receptor gene. / M. Griswold. // Mol Endocrinol. — 1992. — Vol.6. — P.70-80. 7. Bardin, C.W. The Sertoli cell. In: Knobil E, Neill J, Ewing L, Greenwald G, Markert C, Pfaff D, Eds. The Physiology of Reproduction. / C.Y. Cheng, N.A. Musto, G.L. Gunsalus. // New York: Raven Press. — 1988. — Vol.933-74. 8. Ge, R.S. The role of the Leydig cell in spermatogenic function. / G. Chen, M.P Hardy. // Adv Exp Med Biol. — 2008. — Vol.636. — P.255-69. 9. Carreau, S. Oestrogens and spermatogenesis. / R.A. Hess. // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci—2010. — Vol.365. — P.1517-1535. 10. Carreau, S. Aromatase, estrogens and human male reproduction. / S. Wolczynski, I. GaleraudDenis. // Phil Trans R Soc Lond B Biol Sci—2010. — Vol.365. — P.1571-1579. 11. O’Donnell, L., Estrogen and spermatogenesis. / K.M. Robertson, M.E. Jones, E.R. Simpson. // Endocr Rev. — 2001. — Vol.22. — P.289-318. 12. Page, S.T., Advances in male Contraception. / J.K. Amory, W.J. Bremner. // Endocr Rev. — 2008. — Vol.29. — P.465-93. 13. Anderson, R. Male Contraception. / D. Baird. // Endocr Rev.2002. — Vol.23. — P.735-762. Nieschlag, E. Male hormonal Contraception. // Handb Exp Pharmacol. — 2010. — Vol.198. — P.197-223. 14. Liu, P.Y. Recent methodological advances in male hormonal contraception. / R.S. Swerdloff, C. Wang. // Contraception. — 2010. — Vol.82. — P.471-5. 15. Cheng, C.Y. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. / D.D. Mruk. // Physiol Rev. — 2002. — Vol.82. — P.825-74. 88 16. Nieschlag, E. The struggle for male hormonal Contraception. // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. — 2011. — Vol.25. — P.369-75. 17. Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. // Physiol Rev. 1972. — Vol.52. — P.198-235. 18. Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. // Physiol Rev. 1972. — Vol.52. — P.198-235. 19. Parvinen, M. Regulation of the seminiferous epithelium. // Endocr Rev. — 1982. — Vol.3. — P.404-17. 20. Hess, R.A. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. / L.R. de Franca. // Adv Exp Med Biol. — 2008. — Vol.636. — P.1-15. 21. Winters, S.J. Paracrine control of gonadotrophs. Semin. / J.P. Moore. // Reprod Med. — 2007. — Vol.25. — P.379-87. 22. Franca, L.R. Germ cell genotype controls cell cycle during spermatogenesis in the rat. / T. Ogawa, M.R. Avarbock, R.L. Brinster, L.D. Russell. // Biol Reprod. — 1998. — Vol.59. — P.1371-7. 23. Atiken, R.J. As the world grows: Contraception. / M.A. Baker, G.F. Doncel, M.M. Matzuk, C.K. Mauck, M.J. Harper. // J Clin Invest.2008. — Vol.118. — P.1330-1343. 24. Cheng, C.Y. New frontiers in non-hormonal male Contraception. Contraception. / D.D. Mruk. //—2010. — Vol.82. — P.476-482. Mruk, D.D. 25. Delivering non-hormonal contraceptives to men: advances and obstacles. / C.Y. Cheng. // Trends Biotechnol. — 2008. — Vol.26. — P.90-9. 26. Mruk, D.D. New perspectives in non-hormonal male Contraception. // Trends Endocrinol Metab. — 2008. — Vol.19. — P.57-64. 27. Cheng, C.Y. The biology of spermatogenesis: the past, present and future. /D.D. Mruk. // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. — 2010. — Vol.365. — P.1459-1463. O’Donnell, L. Spermiation: the process of sperm release. / P.K. Nicholls, M.K. O’Bryan, R.I. McLachlan, P.G. Stanton. // Spermatogenesis. — 2011. — Vol.1. — P.14-35 28. Dym, M. Basement membrane regulation of Sertoli cells. // Endocr Rev. — 1994. — Vol.15. — P.102-15. Siu, M.K.Y. Dynamic cross-talk between cells and the extracellular matrix in the testis. / C.Y. Cheng. // BioEssays. — 2004. — Vol.26. — P.978-92. 29. Wong, E.W.P. Biology and regulation of ectoplasmic specialization, an atypical adherens junction type, in the testis. / D.D. Mruk, C.Y. Cheng. // Biochem Biophys Acta. — 2008. — Vol.1778. — P.692-708. 89 30. Yan, H.H.N. Ectoplasmic specialization: a friend or a foe of spermatogenesis? / D.D. Mruk, W.M. Lee, C.Y. Cheng. // BioEssays. — 2007. — Vol.29. — P.36-48. 31. Lie, P.P.Y, The biology of the desmosome-like junction: A versatile anchoring junction and signal transducer in the seminiferous epithelium. / C.Y. Cheng, D.D. Mruk. // Int Rev Cell Mol Biol. — 2011. — Vol.286. — P.223-69. 32. Jegou, B. Interleukin-1, interleukin-6 and the germ cell-Sertoli cell cross-talk. / C. Cudicini, E. Gomez, J. Stephan. // Reprod Fertil Dev. — 1995. — Vol.7. — P.723-30. 33. Jegou, B. Current aspects of autocrine and paracrine regulation of spermatogenesis. / C Pineau. // Adv Exp Med Biol. — 1995. — Vol.377. — P.67-86. 34. Mruk, D.D. Sertoli-Sertoli and Sertoligerm cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. / C.Y. Cheng. // Endocr Rev. — 2004. — Vol.25. — P.747-806. 35. Dufour, J.M. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. / B. Dass, K.R. Halley, G.S. Korbutt, D.E. Dixon, R.V Rajotte. // Cell Transplant. — 2008. — Vol.17. — P.525-34. 36. Fijak, M. Immunoprivileged sites: the testis. / S. Bhushan, A Meinhardt. // Methods Mol Biol. — 2011. — Vol.677. — P.459-70. 37. Meinhardt, A. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. / M.P. Hedger. // Mol Cell Endocrinol. — 2011. — Vol.335. — P.60-68. 38. Berndtson, W.E. Changing relationships between testis size, Sertoli cell number and spermatogenesis in Sprague-Dawley rats. / Thompson T.L. // J Androl. — 1990. — Vol.11. — P.429-435. 39. Auharek, S.A. Prenatal plus postnatal exposure to Di(n-Buttyl) phthalate and/or flutamide markedly reduces final Sertoli cell number in the rat. / L.R. Franca, C. McKinnell, M.S. Jobling, H.M. Scott, R.M. Sharpe. // Endocrinology. — 2010. — Vol.151. — P.2868-2875. 40. Atanassova, N.N. Evidence that androgens and oestrogens, as well as follicle-stimulating hormone, can alter Sertoli cell number in the neonatal rat. / M. Walker, C. McKinnell, J.S. Fisher, R.M. Sharpe. // J Endocr. — 2005. — Vol.184. — P.107-117. 41. Chen, Y.T. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc Natl Acad Sci USA. / M.J. Scanlan, U. Sahin, O. Tureci, A.O. Gure, S. Tsang. //—1997. — Vol.94. — P.1914-1918. 42. Chen, Y.T. Identification of the MAGE-1 gene product by monoclonal and polyclonal antibodies. / E. Stockert, Y. Chen, P. Garin-Chesa, W.J. Rettig, P. van der Bruggen. // Proc Natl Acad Sci USA. — 1994. — Vol.91. — P.1004-1008. 90 43. Jungbluth, A.A. Expression of MAGE-antigens in normal tissus and cancer. / K.J., Busam D. Kolb, K. Iversen, K. Coplan, Y.T. Chen. // Int J Cancer. — 2000. — Vol.85. — P.460-5. 44. Boel, P. BAGE: a new gene encoding an antigen recognized on human melanomas by cytolytic lymphocytes. / C. Wildmann, M.L. Sensi, R. Brasseur, J. Renauld, P. Coulie. // Immunity. — 1995. — Vol.2. — P.167-75. 45. van der Bruggen, P. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. / C. Traversari, P. Chomez, C. Lurquin, E. de Plaen, B. van den Eynde. // Science. — 1991. — Vol.254. — P.1643-7. 46. van den Eynde, B. A new family of genes coding for an antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. / O. Peeters, O. de Backer, B. Gaugler, S. Lucas, T. Boon. // J Exp Med. — 1995. — Vol.182. — P.689-98. 47. Gaugler, B. Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognizedon a melanoma by autologous cytolytic T lymphocytes. / B. van den Eynde, P. van der Bruggen, P. Romero, J.J. Gaforio, E de Plaen. // J Exp Med. — 1994. — Vol.179. — P.921-30. 48. Chen, Y.T. Genomic cloning and localization of CTAG, a gene encoding an autoimmunogenic cancer-tesis antigen NY-ESO-1, to human chromosome Xq28. / A.D. Boyer, C.S. Viars, S. Tsang, L.J. Old, K.C. Arden. // Cytogenet Cell Genet. — 1997. — Vol.79. — P.237-240. 49. Scanlan, M.J. Cancer/testis antigens: an expanding family of targets for cancer immunotherapy. / A.O. Gure, A.A. Jungbluth, L.J. Old, Y.T. Chen. // Immunol Rev. — 2002. — Vol.188. — P.2232. 50. Simpson, A.J.G. Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. / O.L. Caballero, A. Jungbluth, Y.T. Chen, L.J. Old. // Nat Rev Cancer. — 2005. — Vol.5. — P.615-25. 51. Mirandola, L. Cancer testis antigens: novel biomarkers and targetable proteins for ovarian cancer. / Cannon M.J., E. Cobos, G. Bernardini, M.R. Jenkins, W.M. Kast. // Int Rev Immunol. — 2011. — Vol.30. — P.127-37. 52. Cebon, J. Cancer vaccines: Where are we going? Asia Pac J Clin Oncol—2010. — Vol.6. — P.9-15. 53. Akers, S.N. Regulation of cancer germline antigen gene expression: implications for cancer immunotherapy. / K. Odunsi, A.R. Karpf. // Future Oncol. — 2010. — Vol.6. — P.717-32. 54. Caballero, O.L. Cancer/testis (CT) antigens: Potential targets for immunotherapy. / Y.T. Chen. // Cancer Sci. — 2009. — Vol.100. — P.2014-2021. 55. Song, M.H. Identification of BCP-20 (FBXO39) as a cancer/testis antigen from colon cancer patients by SEREX. / J.C. Ha, S.M. Lee, Y.M. Park, S.Y. Lee. // Biochem Biophys Res Commun. — 2011. — Vol.408. — P.195-201. 91 56. Chen, Y.T. Expression of cancer testis antigen CT45 in classical Hodgkin's lymphoma and other B-cell lymphomas. / A. Chadburn, P. Lee, M. Hsu, E. Ritter, A. Chiu, S. Gnjatic. M. Pfreundschuh, D.M Knowles. L.J. Old. // Proc Natl Acad Sci USA. — 2010. — Vol.107. — P.3093-3098. 57. Zendman, A.J. Cancer/testisassociated genes: identification, experssion profile and putative function. / D.J. Ruiter, G.N. van Muijen. // J Cell Physiol. — 2003. — Vol.194. — P.272-88. 58. Fratta, E. The biology of cancer testis antigens: putative function, regulation and therapeutic potential. / S. Coral, A. Covre, G. Parisi, F. Colizzi, R Danielli. // Mol Oncol. — 2011. — Vol.5. — P.164-82. 59. Caballero, O.L. Frequent MAGE mutations in human melanoma. / Q. Zhao, D. Rimoldi, B.J. Stevenson, S. Svobodova, S. Devalle. // PLoS One. — 2010. — Vol.5. — P.127-133. 60. Chen, Y.T. Multiple cancer/testis antigens are preferentially expressed in hormone-receptor negative and high-grade brease cancers. / D.S. Ross, R. Chiu, X.K. Zhou, Y.Y. Chen, P. Lee. // PLoS One. — 2011. — Vol.6. — P.178-179. 61. Boss, D.S. Serum HCG and CA-125 as tumor markers in a patient with osteosarcoma: case report. Tumori. / H. Glen, J.H. Beijnen, D. de Jong, J. Wanders, T.R. Evans. //—2011. — Vol.97. — P.109-114. 62. Silina, K. Sperm-associated antigens as targets for cancer immunotheraphy: expression pattern and humoral immune response in cancer patients. / P. Zayakin, Z. Kalnina, L. Ivanova, I. Meistere, E. Endzelins. // J Immunother. — 2011. — Vol.34. — P.28-44. 63. Maruyama, M. Molecular expression of Ly6k, a putative glycosylphosphatidyl-inositol-anchored membrane protein on the mouse testicular germ cells. / H.T.H. Yoshitake, K. Takamori, Y. Araki. // Biochem Biophys Res Commun. — 2010. — Vol.402. — P.75-81. 64. Matsuda, R. LY6K is a novel molecular target in blader cancer on basis of integrate genomewide profiling. / H. Enokida, T. Chiyomaru, N. Kikkawa, T. Sugimoto, K. Kawakami. // Br J Cancer. — 2011. — Vol.104. — P.376-86. 65. Li, F. Sperm protein 17 is highly expressed in endometrial and cervical cancers. / Liu Q., Han Y., Wu B., Yin H. // BMC Cancer. — 2010. — Vol.10. — P.429. 66. Demento, S.L. Pathogen-associated molecular patterns on biomaterials: a paradigm for engineering new vaccines. / A.L. Siefert, A. Bandyopadhyay, F.A., Sharp T.M. Fahmy. // Trends Biotechnol. — 2011. — Vol.29. — P.294-306. 67. Van Pel, A. Genes coding for tumour antigens recognized by cytolytic T lymphocytes. / P. van der Bruggen, P.G. Coulie, V.G. Brichard, B. Lethe, B. van den Eynde, C. Uyttenhove, J.C. Renauld, T. Boon. // Immunol Rev. — 1995. — Vol.145. — P.229-250. 92 68. Old, L.J. New paths in human cancer serology. / Y.T. Chen. // J Exp Med. — 1998. — Vol.187. — P.1163-1167. 69. Scanlan, M.J. Identification of cancer/testis genes by database mining and mRNA expression analysis. / C.M. Gordon, B. Williamson, S.Y. Lee, Y.T. Chen, E. Stockert, A. Jungbluth, G. Ritter, D. Jager, E. Jager, A. Knuth, L.J. Old. // Int J Cancer. — 2002. — Vol.98. — P.485-492. 70. Lim, S.H. Sperm protein 17 is a novel cancer-testis antigen in multiple myeloma. / Z.Q. Wang, M. Chiriva-Internati, Y. Xue. // Blood. — 2001. — Vol.978. — P.1508-1510. 71. Li, Z. A yeast two-hybrid system using Sp17 identified Ropporin as a novel cancertestis antigen in hematologic malignancies. / Li W., F. Meklat, Z. Wang, J. Zhang, Y. Zhang, S.H. Lim. // Int J Cancer. — 2007. — Vol.121. — P.1507-1511. 72. Fiszer, D. Major histocompatibility complex expression on human, male germ cells: a review. / M Kurpisz. // American Journal of Reprod Immunol. — 1998. — Vol.40. — P.172-176. 73. Westbrook, V.A. Genomic organization, incidence, and localization of the SPAN-X family of cancer-testis antigens in melanoma tumors and cell lines. / P.D. Schoppee, A.B. Diekman, K.L. Klotz, M. Allietta, K.T. Hogan, C.L. Slingluff, J.W. Patterson, H.F. Frierson, W.P. Irvin, C.J. Flickinger, M.A. Coppola, J.C. Herr. // Clin Cancer Res. — 2004. — Vol.10. — P.101-112. 74. Tureci, O. Identification of a meiosis-specific protein as a member of the class of cancer/testis antigens. / U. Sahin, C. Zwick, M. Koslowski, G. Seitz, M. Pfreundschuh. // Proc Natl Acad Sci USA. — 1998. — Vol.95. — P.5211-5216. 75. Liggins, A.P. A panel of cancer-testis genes exhibiting broad-spectrum expression in haematological malignancies. / S.H. Lim, E.J. Soilleux, K. Pulford. Banham A.H. // Cancer Immun. — 2010. — Vol.10. — P.8. 76. van Baren, N. Genes encoding tumor-specific antigens are expressed in human myeloma cells. / F. Brasseur, D. Godelaine, G. Hames, A. Ferrant, F. Lehmann, M. Andre, C. Ravoet, C. Doyen, G.C. Spagnoli, M. Bakkus, K. Thielemans, T. Boon. // Blood. — 1999. — Vol.94. — P.11561164. 77. Jungbluth, A.A. The cancer-testis antigens CT7 (MAGE-C1) and MAGE-A3/6 are commonly expressed in multiple myeloma and correlate with plasma-cell proliferation. / S. Ely, M DiLiberto. // Blood. — 2005. — Vol.106. — P.167-174. 78. Van Rhee, F. NY-ESO-1 is highly expressed in poor-prognosis multiple myeloma and induces spontaneous humoral and cellular immune responses. / S.M. Szmania, F. Zhan, S.K. Gupta, M. Pomtree, P. Lin, R.B. Batchu, A. Moreno, G. Spagnoli, J. Shaughnessy, G. Tricot. // Blood. — 2005. — Vol.105. — P.3939-3944. 93 79. Wang, Z. The spermatozoa protein, SLLP1, is a novel cancer-testis antigen in hematologic malignancies. / Y. Zhang, A. Mandal, J. Zhang, F.J. Giles, J.C. Herr, S.H. Lim. // Clin Cancer Res. — 2004. — Vol.19. — P.6544-6550. 80. Wang, Z. Gene expression and immunologic consequence of SPAN-Xb in myeloma and other hematologic malignancies. / Y. Zhang, H. Liu, E. Salati, M. Chiriva-Internati., S.H. Lim. // Blood. — 2003. — Vol.101. — P.955-960. 81. Lim, S.H. Expression of testicular genes in haematological malignancies. / S. Austin, E. OwenJones. L. Robinson. // Br J Cancer. — 1999. — Vol.81. — P.1162-1164. 82. Zhang, Y. Pattern of gene expression and immune responses to Semenogelin 1 in chronic hematologic malignancies. / Z. Wang, H. Liu, F.J. Giles, S.H. Lim. // J Immunother. — 2003. — Vol.26. — P.461-467. 83. Adams, S.P. Frequent expression of HAGE in presentation chronic myeloid leukaemias. / S.S. Sahota, A. Mijovic, B. Czepulkowski, R.A. Padua, G.J. Mufti, B.A. Guinn. // Leuk. — 2002. — Vol.16. — P.2238-2242. 84. Paydas, S. PRAME mRNA levels in cases with acute leukemia: clinical importance and future prospects. / Tanriverdi K., Yavuz S., Disel U., Baslamisli F., Burgut R. // Am J Hematol. — 2005. — Vol.79. — P.257-261. 85. Paydas S. PRAME mRNA levels in cases with chronic leukemia: clinical importance and review of the literature. / K. Tanriverdi, S. Yavuz, G. Seydaoglu. // Leuk Res. — 2007. — Vol.31. — P.365-369. 86. Guinn, B. Humoral detection of leukaemia-associated antigens in presentation acute myeloid leukaemia. / E.A. Bland, U. Lodi, A.P. Liggins, K. Tobal, S. Petters, J.W. Wells, A.H. Banham, G.J. Mufti. // Biochem Biophy Res Comm. — 2005. — Vol.225. — P.1293-1304. 87. Meklat, F. Identification of protamine 1 as a novel cancer-testis antigen in early chronic lymphocytic leukaemia. / Y. Zhang, M. Shahriar, S.U. Ahmed, W. Li, N. Voukkalis, Z. Wang, J. Zhang, S. Mastulov, A. Jewell, T. Giannakouros. S.H. Lim. // Br J Haematol. — 2009. — Vol.144. — P.660-666. 88. Wang, Z. Pattern of gene expression and immune responses to Semenogelin 1 in chronic hematologic malignancies. / , H. Liu, F.J. Giles, S.H. Lim. // J Immunother. — 2003. — Vol.26. — P.461-467. 89. Kong, M. Sequence and localization of the mouse sperm autoantigenic proteins, Sp17. Biol Reprod. / R.T. Richardson, E.E. Widgren, M.G. O’Rand. //—1995. — Vol.53. — P.579-90. 94 90. Lea, I.A. Cloning and sequencing of cDNAs encoding the human sperm protein, Sp17. Biochem Biophys Acta. / R.T. Richardson, E.E. Widgren, M.G. O’Rand. //—1996. — Vol.1307. — P.263-266. 91. Chiriva-Internati, M. Sperm protein 17 is expressed in the sperm fibrous sheath. /N. Gagliano, E. Donetti, F. Costa, F. Grizzi, B. Franceschini. // J Transl Med. — 2009. — Vol.7. — P.61-67. 92. Lea, I.A. Association of sperm protein 17 with A-kinase anchoring protein 3 in flagella. Reprod Biol Endocrinol. / E.E. Widgren, M.G. O’Rand. //—2004. — Vol.2. — P.57. 93. Wen, Y. Characterization of Sp17: a ubiquitous three domain protein that binds heparin. / R.T. Richardson, E.E. Widgren, M.G. O’Rand. // Biochem J. — 2001. — Vol.357. — P.25-31. 94. Wen, Y. Processing of the sperm protein Sp17 during the acrosome reaction and characterization as a calmodulin binding protein. / R.T. Richardson, M.G. O’Rand. // Dev Biol. — 1999. — Vol.206. — P.113-122. 95. Luconi, M. How do sperm swim? Molecular mechanisms underlying sperm motility. / E. Baldi. // Cell Mol Biol. — 2003. — Vol.49. — P.357-69. 96. Vijayaraghavan, S. Isolation and molecular characterization of AKAP110, a novel, spermspecific protein kinase A-anchoring protein. /G.A. Liberty, J. Mohan, V.P. Winfrey, G.E. Olson, D.W. Carr. // Mol Endocrinol. — 1999. — Vol.13. — P.705-17. 97. McLeskey, S.B. Molecules involved in mammalian spermegg interaction. / C. Dowds, R. Carballada, R.R. White, P.M. Saling. // Int Rev Cytol. — 1997. — Vol.177. — P.346-351. 98. Primakoff, P., Penetration, adhesion and fusion in mammalian sperm-egg interaction. / D.G. Myles. // Science. — 2002. — Vol.296. — P.2183-2185. 99. Frayne, J. A re-evaluation of sperm protein 17 (Sp17) indicates a regulatory role in an A-kinase anchoring protein complex, rather than a unique role in sperm-zona pellucida binding. / L Hall. // Reproduction. — 2002. — Vol.124. — P.767-774. 100.Lim, S.H. Sperm protein 17 is a novel cancer-testis antigen in multiple myeloma. / Z.Q. Wang, M. Chiriva-Internati, Y. Xue. // Blood. — 2001. — Vol.978. — P.1508-10. 101.Straughn, J.M.J. Expression of sperm protein 17 (Sp17) in ovarian cancer. / D.R. Shaw, A. Guerrero, S.M. Bhoola, A. Racelis, Z.Q. Wang. // Int J Cancer. — 2004. — Vol.108. — P.80511. 102.de Jong, A.B.R. Characterization of sperm protein 17 in human somatic and neoplastic tissue. / D. Robbins. // Cancer Lett. — 2002. — Vol.186. — P.201-209. 103.Grizzi, F. Sperm protein 17 is expressed in human nevrous system tumours. / P. Gaetani, B. Franceschini, A. Di leva, P. Colombo, G. Ceva-Grimaldi. // MBC Cancer. — 2006. — Vol.6. — P.23-29. 95 104.Gupta, G. Clinical significance of sperm protein 17 expression and immunogenicity in esophageal cancer. Int J Cancer. / R. Sharma, T.K. Chattopadhyay, S.D. Gupta, R. Ralhan. //— 2007. — Vol.120. — P.1739-1747. 105.Chiriva-Internati, M. protein 17 is a suitable target for adoptive T-cell-based immunotheraphy in human ovarian cancer. / J.A. Weidanz, Y. Yu, E.E. Frezza, M.R. Jenkins, R.C. Kennedy. //Sperm J Immunother. — 2008. — Vol.31. — P.693-703. 106.Grizzi, F. Sperm protein 17 is expressed in human somatic ciliated epithelia. / M. ChirivaInternati, B. Fraceschini, K. Bumm, P. Colombo, M. Ciccarelli. // J Histochem Cytochem. — 2004. — Vol.52. — P.549-54. 107.Takeoka, Y. Developmental considerations of sperm protein 17 gene expression in rheumatoid arthritis synoviocytes. / T.P. Kenny, H. Yago, M. Naiki, M.E. Gershwin, D.L. Robbins. // Dev Immunol. — 2002. — Vol.9. — P.97-102. 108.Franceschini, B. Experssion of human sperm protein 17 in melanophages of cutaneous melanocytic lesions. / F. Grizzi, P. Colombo, G. Soda, K. Bumm, P.L. Hermonat. // Br J Dermatol. — 2004. — Vol.150. — P.780-782. 109.Chiriva-Internati, M. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine modle of ovarian cancer. / Y. Yu, L. Mirandola, M.R. Jenkins, C. Chapman, M. Cannon. // PLoS One. — 2010. — Vol.5. — P.104-107. 110.Gjerstorff, M.F. An overview of the GAGE cancer/testis antigen family with the inclusion of newly identified members. / Gjerstorff1, H.J. Ditzel. // Tissue Antigens. — 2007. — Vol.71. — P.187–192. 111.Nagel, H. Analysis of the tumour suppressor genes, FHIT and WT-1, and the tumour rejection genes, BAGE, GAGE-1/2, HAGE, MAGE-1, and MAGE-3, in benign and malignant neoplasms of the salivary glands. / R. Laskawi, H. Eiffert, T. Schlott. // Mol Pathol. — 2003. — Vol.56(4). — P.226-31. 112.Ross M.T. The DNA sequence of the human X chromosome. / D.V. Grafham, A.J. Coffey. // Nature. — 2005. — Vol.434. — P.325–337. 113.De Backer O. Characterization of the GAGE genes that are expressed in various human cancers and in normal testis. / K.C. Arden, M. Boretti. // Cancer Res. — 1999. — Vol.59. — P.3157– 3165. 114.Meklat, F. Identification of protamine 1 as a novel cancer-testis antigen in early chronic lymphocytic leukaemia. / Y. Zhang, M. Shahriar, S.U. Ahmed, W. Li, N. Voukkalis, Z. Wang, J. Zhang, S. Mastulov, A. Jewell, T. Giannakouros. S.H. Lim. // Br J Haematol. — 2009. — Vol.144. — P.660-666. 96 115.Condomines, M. Cancer/testis genes in multiple myeloma: expression patterns and prognosis value determined by microarray analysis. / D. Hose, P. Raynaud, M. Hundemer, J. de Vos, M. Baudard, T. Moehler, V. Pantesco, M. Moos, J.F. Schved, J.F. Rossi, T. Reme, H. Goldschmidt, B. Klein. // J Immunol. — 2007. — Vol.178. — P.3307-3315. 116.Roman-Gomez, J. Epigenetic regulation of PRAME gene in chronic myeloid leukemia. / A. Jimenez-Velasco, X. Agirre, J.A. Castillejo, G. Navarro, E.S. Jose-Eneriz, L. Garate, L. Cordeu, F. Cervantes, F. Prosper, A. Heiniger, A. Torres. // Leukemia Res. — 2007. — Vol.31. — P.1521–1528. 117.Scanlan, M.J. The cancer/testis genes: review, standardization, and commentary. / A.J.G. Simpson, L.J. Old. // Cancer Immun. — 2004. — Vol.4. — P.1. 118.Martelange, V. Identification on a human sarcoma of two new genes with tumor-specific expression. / C. de Smet, E. de Plaen, C. Lurquin, T. Boon. // Cancer Res. — 2000. — Vol.60. — P.3848-3855. 119.Sasaki, H. SAGE mRNA expression in advanced-stage lung cancers. / S. Moriyama, K. Mizuno, H. Yukiue, M. Yano, I. Fukai, Y. Yamakawa, Y. Fujii. // Eur J Surg Oncol. — 2003. — Vol.29. — P.900-903. 120.Lethe, B. LAGE-1, a new gene with tumor specificity. Int J Cancer. / Lucas S., Michaux L., de Smet C., D. Godelaine, A. Serrano. //—1998. — Vol.76. — P.903-908. 121.Gnjatic, S. NY-ESO-1: review of an immunogenic tumor antigen. / H. Nishikawa, A.A. Jungbluth, A.O. Gure, G. Ritter, E. Jager. // Adv Cancer Res. — 2006. — Vol.95. — P.1-30. 122.Wang, Y. Cancer/tesis antigen expression and autologous humoral immunity to NY-ESO-1 in gastric cancer. / X.J. Wu, A.L. Zhao, Y.H. Yuan, Y.T. Chen, A.A. Jungbluth. // Cancer Immunol. — 2004. — Vol.4. — P.11. 123.Satie, A.P. The cancer-testis gene, NY-ESO-1, is expressed in normal fetal and adult testes and in spermatocytic seminomas and testicular carcinoma in situ. / E. Rajpert-De Meyts, G.C. Spagnoli, S. Henno, L. Olivo, G.K. Jacobsen. // Lab Invest. — 2002. — Vol.82. — P.775-80. 124.Karbach, J. /Tumor-reactive CD8+ T-cell responses after vaccination with NY-ESO-1 peptide, CpG7909 and Montanide ISA-51: association with survival. S. Gnjatic, A. Bender, A., Neumann E. Weidmann, J. Yuan. // Int J Cancer. — 2010. — Vol.126. — P.909-918. 125.Nicholaou, T. Regulatory T-cellmediated attenuation of T-cell responses to the NY-ESO-1 ISCOMATRIX vaccine in patients with advanced malignant melanoma. / L.M. Ebert, I.D. Davis, G.A. McArthur, H. Jackson, N. Dimopoulos. // Clin Cancer Res. — 2009. — Vol.15. — P.21662173. 97 126.Tarhini, A.A. CTLA-4 blockade: therapeutic potential in cancer treatments. / F. Iqbal. // Onco Targets Ther. — 2010. — Vol.3. — P.15-25. 127.Yuan, J. CTLA-4 blockade enhances polyfunctional NY-ESO-1 specific T cell responses in metastatic melanoma patients with clinical benefit. / S. Gnjatic, H. Li, S. Powel, H.F. Gallardo, E. Ritter. // Proc Natl Acad Sci USA. — 2008. — Vol.105. — P.20410-20415. 128.van der Bruggen, P. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. / C. Traversari, P. Chomez, C. Lurquin, E. de Plaen, B. van den Eynde. // Science. — 1991. — Vol.254. — P.1643-7. 129.Chomez, P. An overview of the MAGE gene family with the identification of all human members of the family. / O. de Backer, M. Bertrand, E. de Plaen, T. Boon, S. Lucas. // Cancer Res. — 2001. — Vol.61. — P.5544-5551. 130.Sang, M. Melanoma-associated antigen genes—an update. / L. Wang, C. Ding, X. Zhou, B. Wang, L. Wang. // Cancer Letts. — 2011. — Vol.302. — P.85-90. 131.Zandman, A.J. Expression profile of genes coding for melanoma differentiation antigens and cancer/testis antigens in metastatic lesions of human cutaneous melanoma. / N.J. de Wit, A.A. van Kraats, U.H. Weidle, D.J. Ruiter, G.N. van Muijen. // Res. — 2001. — Vol.11. — P.451459. 132.Osterlund, C. Mage-b4, a novel melanoma antigen (MAGE) gene specifically expressed during germ cell differentiation. / V. Tohonen, K.O. Forslund, K. Nordqvist. // Cancer Res. — 2000. — Vol.60. — P.1054-1061. 133.Eng, Y. When MAGE meets RING: insights into biological functions of MAGE proteins. / J. Gao, M Yang. // Protein Cell. — 2011. — Vol.2. — P.7-12. 134.Morishima, N. An endoplasmic reticulum stress-specific caspase cascade in apoptosis. Cytochrome c-independent activation of caspase-9 by caspase-12. / K. Namanishi, H. Takenouchi, T. Shibata, Y. Tasuhiko. // J Biol Chem. — 2002. — Vol.277. — P.34287-34294. 135.Borden, K.L. The RING finger domain: a recent example of a sequence-structure family. / P.S. Freemont. // Curr Opin Struct Biol. — 1996. — Vol.6. — P.395-401. 136.Jin, X. RNF13: an emerging RING finger ubiquitin ligase important in cell proliferation. / H.C. Cheng, J. Chen, D. Zhu. // FEBS J. — 2011. — Vol.278. — P.78-84. 137.Tyagi, P. MAGRIT: the largest-ever phase III lung cancer trial aims to establish a novel tumorspecific approach to theraphy. / B. Mirakhur. // Clin Lung Cancer. — 2009. — Vol.10. — P.371-374. 138.Trerfzer, U., DERMA Phase III trial of MAGE-A3 immunotherapy as adjuvant treatment in stage III melanoma: MAGE-A3 gene expression frequency and baseline demographics. / T. 98 Jouary, C. Robert, M. Santinami, E. Levchenko, B. Smithers. // Melanoma Res. — 2010. — Vol.20. — P.34-35. 139.Wang, X. MAGED1: molecular insights and clinical implications. / X. Gao, L. Liu, Y. Xu. // Ann Med. — 2011. — Vol.43. — P.347-55. 140.Barker, P.A. The MAGE proteins: emerging roles in cell cycle progression, apoptosis and neurogenetic disease. / A. Salehi. // J Neurosci Res—2002. — Vol.67. — P.705-712. 141.Haqq, C. The Rb/E2F pathway: expanding roles and emerging paradigms. / M. Nosrati, D. Sudilovsky, J. Crothers, D. Khodabakhsh, J.W. Harbour, D.C. Dean. // Genes Dev. — 2000. — Vol.14. — P.2393-3409. 142.Dioum, E.M. NPAS2: A gas-responsive transcription factor. Science. / J. Rutter, J.R. Tuckerman, G. Gonzalez, M.A. Gilles-Gonzalez, S.L McKnight. //—2002. — Vol.298. — P.2385-2387. 143.Dunlap, J.C. Eukaryotic circadian systems: cycles in common. / J.J. Loros, Y. Liu, S.K Crosthwaite. // Genes Cells. — 1999. — Vol.4. — P.1–10. 144.Elferink, C.J. Aryl hydrocarbon receptor-mediated cell cycle control. // Prog Cell Cycle Res. — 2003. — Vol.5. — P.261–267. 145.Liggins, A.P. A novel diffuse large B-cell lymphoma-associated cancer testis antigen encoding a PAS domain protein. / P.J. Brown, K. Asker, K. Pulford, A.H. Banham. // Br J Cancer. — 2004. — Vol.91(1). — P.141-149. 146.Sahota, S.S. PASD1, a DLBCL-associated cancer testis antigen and candidate for lymphoma immunotherapy. / C.M. Goonewardena, C.D. Cooper, A.P. Liggins, K. Ait-Tahar, N. Zojer, F.K. Stevenson, A.H. Banham, K. Pulford. // Blood. — 2006. — Vol.108(12). — P.3953-3955. 147.Meuwissen, R.L.J. A coiled-coil related specific for synapsed regions of meiotic prophase chromosomes. / H.H. Offenberg, A.J.J. Dietrich, A. Riesewijk, M. van Iersel, C. Heyting. // EMBO J. — 1992. — Vol.11. — P.5091-5100. 148.Cannistra, S.A. Cancer of the ovary. // N Engl J. Med.2004. — Vol.351. — P.2519-2529. 149.Tammela, J. SCP-1 cancer/testis antigen is a prognostic indicator and a candidate target for immunotherapy in epithelial ovarian cancer. / A.A. Jungbluth, F. Qian, D. Santiago, M.J. Scanlan, B. Keitz. // Cancer Immun. — 2004. — Vol.4. — P.1-10. 150.Lilja, H. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related protein in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. / P.A. Abrahamsson, A. Lundwall. // J Biol Chem. — 1989. — Vol.264. — P.1894–1900. 99 151.de Lamirande, E. Semenogelin, the main protein of semen coagulum, inhibits human sperm capacitation by interfering with the superoxide anion generated during this process. / K. Yoshida, T.M. Yoshiike, T. Iwamoto, C. Gagnon. // J Androl. — 2001. — Vol.22(4). — P.672-679. 152.Asimakopoulos, F.A. Molecular analysis of chromosome 20q deletions associated with myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes. / N.J. White, E. Nacheva, A.R. Green. // Blood. — 1994. — Vol.84(9). — P.3086-3094. 153.Zhang, Y. Semenogelin I expression in myeloma cells can be upregulated pharmacologically. / Z. Wang, J. Zhang, B. Farmer, S.H. Lim. // Leuk Res. — 2008. — Vol.32. — P.1889-1894. 154.Ahmed, E.A. Proliferative activity in vitro and DNA repair indicate that adult mouse and human Sertoli cells are not terminally differentiated, quiescent cells. / A.D. Barten-van Rijbroek, H.B. Kal, H. Sadri-Ardekani, S.C. Mizrak, van Pelt A.M. // Biol Reprod. — 2009. — Vol.80. — P.1084-1091. 155.Meklat, F. Identification of Protamine 1 as a novel CT antigen in early CLL. / Y. Zhang, M. Shahriar, U.A. Sharif, L. Wei, N. Voukkalis, Z. Wang, J. Zhang, S. Mastulov, A. Jewell, T. Giannakouros, S.H. Lim. // Br J Haematol. — 2009. — Vol.144(5). — P.660–666. 156.Mandal, A. SLLP1, a unique, intra-acrosomal, non-bacteriolytic, c lysozyme-like protein of human spermatozoa. / K.L. Klotz, J. Shetty. // Biol Reprod. — 2003. — Vol.68. — P.1525-1537. 157.Wang, Z. Sp17 gene expression in myeloma cells is regulated by promoter methylation. / Y. Zhang, B. Ramsahoye, D. Bowen, S.H. Lim. // Br J Cancer. — 2004. — Vol.91. — P.15971603. 158.Wang, Z. SPANXb expression in myeloma cells is dependent on promoter hypomethylation and can be upregulated pharmacologically. / J. Zhang, Y. Zhang, S.H. Lim. // Int J Cancer. — 2006. — Vol.118. — P.1436-1444. 159.Wang, Z. SPAN-XB core promoter sequence is regulated in myeloma cells by specific CpG dinucleotides associated with the MeCP2 protein. / J. Zhang, Y. Zhang, K.S. Srivenugopal, S.H. Lim. // Int J Cancer. — 2006. — Vol.119. — P.2878-2884. 160.Westbrook, V.A. Spermatid-specific expression of the novel X-linked gene product SPAN-X localized to the nucleus of human spermatozoa. / A.B. Diekman, K.L. Klotz, V.V. Khole, C. von Kap-Herr, W.L. Golden, R.L. Eddy, T.B. Shows, M.H. Stoler, C.Y. Lee, C.J. Flickinger, J.C. Herr. // Biol Reprod. — 2000. — Vol.63. — P.469–481. 161.Westbrook, V.A. Differential nuclear localization of the cancer/testis associated protein, SPANX/CTp11, in transfected cells and in 50% of human spermatozoa. / A.B. Diekman, S. NaabyHansen, S.A. Coonrod, K.L. Klotz, T.S. Thomas, E.J. Norton, C.J. Flickinger, J.C. Herr. // Biol Reprod. — 2001. — Vol.64. — P.345–358. 100 162.Goydos, J.S. NY-ESO-1 and CTp11 expression may correlate with stage of progression in melanoma. / M. Patel., W. Shih. // J Surg Res. — 2001. — Vol.98. — P.76–80. 163.dos Santos, N.R. Molecular mechanisms underlying human synovial sarcoma development. / de D.R. Bruijn, A.G van Kessel. // Genes Chromosomes Cancer. — 2001. — Vol.30. — P.1-14. 164.de Bruijn, D.R. The (epi)geneticsof human synovial sarcoma. / J.P. Nap, A.G van Kessel. // Genes Chromosomes Cancer. — 2007. — Vol.46. — P.107-117. 165.Ishida, M. The SYT-SSX fusion protein downregulates the cell proliferation regulator COM1 in t(x;18) synovial sarcoma. / M. Miyamoto, S. Naitoh, D. Tatsuda, T. Hasegawa, T. Nemoto. // Mol Cell Biol. — 2007. — Vol.27. — P.1348-1355. 166.Gure, A.O. The SSX gene family: characterization of 9 complete genes. / J.J. Wei, L.J., Old Y.T. Chen. // Int J Cancer. — 2002. — Vol.101. — P.448-453. 167.Jager, D. Cancer-testis antigens and ING1 tumor suppressor gene production are breast cancer antigens: characterization of tissue-specific ING1 transcripts and a homologue gene. / E. Stockert, M.J. Scanlan, A.O. Gure, E. Jager, A. Knuth. // Cancer Res. — 1999. — Vol.59. — P.6197-6204. 168.dos Santos, N.R. Heterogeneous expression of the SSX cancer/testis antigens in human melanoma lesions and cell lines. / R. Torensma, T.J. de Vries, M.W.J. Schreurs, D.R.H. de Bruijn, E Kater-Baats. // Cancer Res. — 2000. — Vol.60. — P.1654-1662. 169.Michel, J.J. AKAP mediated signal transduction. / Scott J.D. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. — 2002. — Vol.42. — P.235-257. 170.Bodey, B. Cancer-testis antigens: promising targets for antigen directed antineoplastic immunotherapy. // Expert Opin Biol Ther. — 2002. — Vol.2. — P.577-784. 171.Ikeda, H. Characterization of an antigen that is recognized on a melanoma showing partial HLA loss by CTL expressing an NK inhibitory receptor. / B. Lethe´, F. Lehmann, N. van Baren, J.F. Baurain, C. de Smet, H. Chambost, M. Vitale, A. Moretta, T. Boon, P.G. Coulie. // Immunity. — 1997. — Vol.6. — P.199–208. 172.Kilpinen, S. Systematic bioinformatic analysis of expression levels of 17,330 human genes across 9,783 samples from 175 types of healthy and pathological tissues. / R. Autio, K. Ojala, K. Iljin, E. Bucher, H. Sara, T. Pisto, M. Saarela, R.I. Skotheim, M. Bjorkman, J.P. Mpindi, S. Haapa-Paananen, P., Vainio, H. Edgren, M. Wolf, J. Astola, M. Nees, S. Hautaniemi, O. Kallioniemi. // Genome Biol. — 2008. — Vol.9. — P.139-145. 173.Birtle, Z. Duplication and positive selection among hominin-specific PRAME genes. / L. Goodstadt, C. Ponting. // BMC Genomics. — 2005. — Vol.6. — P.120-123. 101 174.Dade, S. I. Identification of a new expanding family of genes characterized by atypical LRR domains. Localization of a cluster preferentially expressed in oocyte. / Callebaut, P. Mermillod, P. Monget. // FEBS Lett. — 2003. — Vol.555. — P.533–538. 175.Wang, P.J. An abundance of X-linked genes expressed in spermatogonia. / J.R. McCarrey, F. Yang, D.C. Page. // Nat Genet. — 2001. — Vol.27. — P.422-426. 176.Bortvin, A. Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei. / K. Eggan, H. Skaletsky, H. Akutsu, D.L. Berry, R. Yanagimachi, D.C. Page, R. Jaenisch. // Development. — 2003. — Vol.130. — P.1673–1680. 177.Cinelli, P. Expression profiling in transgenic FVB/N embryonic stem cells overexpressing STAT3. / E.A. Casanova, S. Uhlig, P. Lochmatter, T. Matsuda, T. Yokota, T. Rulicke, B. Ledermann, K. Buerki. // BMC Dev Biol. — 2008. — Vol.8. — P.57-62. 178.van Baren, N. PRAME, a gene encoding an antigen recognized on a human melanoma by cytolytic T cells, is expressed in acute leukaemia cells. / H. Chambost, A. Ferrant, L. Michaux, H. Ikeda, I. Millard, D. Olive, T. Boon, P.G. Coulie. // Br J Haematol. — 1998. — Vol.102. — P.1376–1379. 179.Steinbach, D. PRAME expression is not associated with down-regulation of retinoic acid signaling in primary acute myeloid leukemia. / N. Pfaffendorf, S. Wittig, B. Gruhn. // Cancer Genet Cytogenet. — 2007. — Vol.177. — P.51–54. 180.Tajeddine, N. Tumor-associated antigen preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) induces caspase-independent cell death in vitro and reduces tumorigenicity in vivo. / J-L. Gala, M. Louis, M. van Schoor, B. Tombal, P. Gailly. // Cancer Res. — 2005. — Vol.65. — P.7348– 7355. 181.Oberthuer, A. The tumor-associated antigen PRAME is universally expressed in high-stage neuroblastoma and associated with poor outcome. / B. Hero, R. Spitz, F. Berthold, M. Fischer. // Clin Cancer Res. — 2004. — Vol.10. — P.4307–4313. 182.Doolan, P. Prevalence and prognostic and predictive relevance of PRAME in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. / M. Clynes, S. Kennedy, J.P. Mehta, J. Crown, L. O’Driscoll. //— 2007. — Vol.109(2). — P.359–365. 183.Epping, M.T. PRAME expression and clinical outcome of breast cancer. / A.A.M. Hart, A.M. Glas, O. Krijgsman, R Bernards. // Br J Cancer. — 2008. — Vol.99. — P.398–403. 184.Radich, J.P. Gene expression changes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia. / H. Dai, M. Mao, V. Oehler, J. Schelter, B. Druker, C. Sawyers, N. Shah, W. Stock, C.L. Willman, S. Friend, P.S. Linsley. // Proc Natl Acad Sci USA. — 2006. — Vol.103. — P.2794–2799. 102 185.Roman-Gomez, J. Epigenetic regulation of PRAME gene in chronic myeloid leukemia. / A. Jimenez-Velasco, X. Agirre, J.A. Castillejo, G. Navarro, E.S. Jose-Eneriz, L. Garate, L. Cordeu, F. Cervantes, F. Prosper, A. Heiniger, A. Torres. // Leukemia Res. — 2007. — Vol.31. — P.1521–1528. 186.Schenk, T. Hypomethylation of PRAME is responsible for its aberrant overexpression in human malignancies. / S. Stengel, S. Goellner, D. Steinbach, H.P. Saluz. // Genes Chromosomes Cancer. — 2007. — Vol.46. — P.796–804. 187.Epping, M.T. The human tumor antigen PRAME is a dominant repressor of retinoic acid receptor signaling. / L. Wang, M.J. Edel, L. Carle´e, M. Hernandez, R Bernards. // Cell. — 2005. — Vol.122. — P.835–847. 188.Paydas, S. Is everything known in all faces of iceberg in PRAME? // Leukemia Res. — 2008. — Vol.32. — P.1356–1357. 189.Jones, P.A. The fundamental role of epigenetic events in cancer. / S.B. Baylin. // Nat Rev Genet. — 2002. — Vol.3. — P.415-428. 190.Li, E. Role for DNA methylation in genomic imprinting. / C. Beard. R. Jaenisch. // Nature. — 1993. — Vol.366. — P.362-365. 191.Pfeifer, G.P. In vivo footprint and methylation analysis by PCR-aided genomic sequencing: comparison of active and inactive X chromosomal DNA at the CpG island and promoter of human PGK-1. / R.L. Tanguay, S.D. Steigerwald, A.D. Riggs. // Genes Dev. — 1990. — Vol.4. — P.1277-1287. 192.Strathdee, D. Control of gene expression by CpG island methylation in normal cells. / A. Sims, R. Brown. // Biochem Soc Trans. — 2004. — Vol.32. — P.913-915. 193.Futscher, B.W. Role for DNA methylation in the control of cell type specific maspin expression. / M.M. Oshiro, R.J. Wozniak, N. Holtan, C.L. Hanigan, H. Duan, F.E Domann. // Nat Genet. — 2002. — Vol.31. — P.75-79. 194.Herman, H. Trans allele methylation and paramutation-like effects in mice. / M. Lu, M. Anggraini, A. Sikora, Y. Chang, B.J. Yoon., P.D. Soloway. // Nat Genet. — 2003. — Vol.34. — P.199-202. 195.Gama-Sosa, M.A. The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors. / V.A. Slagel, R.W. Trewyn, R. Oxenhandler, K.C. Kuo, C.W. Gehrke, M Ehrlich. // Nucleic Acids Res. 1983. — Vol.11. — P.6883-6894. 196.Christman, J.K. Reversibility of changes in nucleic acid methylation and gene expression induced in rat liver by severe dietary methyl deficiency. / G. Sheikhnejad, M. Dizik, S. Abileah, E. Wainfan. // Carcinogenesis. — 1993. — Vol.14. — P.551-557. 103 197.Pogribny, I.P. P53 gene methylation pattern during tumor progression with folate/methyl deficiency in the rat. / B.J. Miller, S.J. James. //Alterations Cancer Lett. — 1997. — Vol.115. — P.31-38. 198.de Smet, C. DNA methylation in the primary silencing mechanism for a set of germ lineand tumor-specific genes with a CpG-rich promoter. / C. Lurquin, B. Lethe, V. Martelange, T Boon. // Mol Cell Biol. — 1999. — Vol.19. — P.7327-7335. 199.Zhang, Y. Semenogelin I expression in myeloma cells can be upregulated pharmacologically. / Z. Wang, J.Zhang, B. Farmer, S.H Lim. // Leuk Res. — 2008. — Vol.32(12). — P.1889–1894. 200.Zhang, Y. Core promoter sequence of SEMG 1 spans between the two putative GATA-1 binding domains and is responsive to IL-4 and IL-6 in myeloma cells. / Z. Wang, J. Zhang, S.H. Lim. // Leuk Res. — 2008. — Vol.33. — P.186-189. 201.Deininger, M.W. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. / J.M. Goldman, J.V. Melo. // Blood. — 2000. — Vol.96(10). — P.3343-3356. 202.Gäbler, K. JAK2 mutants (e.g., JAK2V617F) and their importance as drug targets in myeloproliferative neoplasms. / I. Behrmann, C. Haan. // JAKSTAT. — 2013. — Vol.2(3). — P.25-35. 203.Pandolfi, P.P. Genomic variability and alternative splicing generate multiple PML/RAR alpha transcripts that encode aberrant PML proteins and PML/RAR alpha isoforms in acute promyelocytic leukaemia. / M. Alcalay, M. Fagioli. // EMBO J. — 1992. — Vol.11(4). — P.1397-1407. 204.Welch, T.J. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia / D.C. Link, C.A. Miller. // Cell. — 2012. — Vol.150(2). — P.264-278. 205.Santamaria, C. The relevance of preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) as a marker of disease activity and prognosis in acute promyelocytic leukemia. / M.C. Chillón, R. García-Sanz. // Haematologica. — 2008. — Vol.93(12). — P.1797-1805. 206.Dadabayev, A.R. Cancer immunotherapy targeting Sp17: when should the laboratory findings be translated to the clinics? / Z. Wang, Y. Zhang, J. Zhang, W.R. Robinson, S.H Lim. // Am J Hematol. — 2005. — Vol.80. — P.6-11. 207.Szmania, S. Immunization with a recombinant MAGE-A3 protein after high-dose therapy for myeloma. / S. Gnjatic, G. Tricot, K. Stone, F. Zhan, A. Moreno, B. Thuro, J. Melenhorst, J. Barrett, J. Shaughnessy, L.J. Old, B. Barlogie, V.G. Brichard, F. van Rhee. // J Immunother. — 2007. — Vol.30. — P.847-854. 104 208.Chomczynski, P. The singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate– phenol–chloroform extraction: Twenty something years on. / N. Sacchi. // Nat. Protoc. — 2006. — Vol.1(2). — P.581–585. 209.Шуравина, Е.Н. Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных острым промиелоцитарным лейкозом / Е.Н. Паравичникова, И.А. Демидова. // Тер. Архив. — 2006. — Т78(7). — С.25-31. 210.Bullinger, L. PRAME-induced inhibition of retinoic acid receptor signaling-mediated differentiation--a possible target for ATRA response in AML without t(15;17). / R.F. Schlenk, M. Götz. // Clin Cancer Res. — 2013. — Vol.19(9). — P.2562-71. 211.Bullinger, L. Use of gene-expression profiling to identify prognostic subclasses in adult acute myeloid leukemia. / K. Dohner, E. Bair. // N Engl J Med. — 2004. — Vol.350. — P.1605-16. 212.Welch, T.J. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia / D.C. Link, C.A. Miller. // Cell. — 2012. — Vol.150(2). — P.264-78. 213.Михайлова, И.Н. Экспрессия раково-тестируемых антигенов в клетках меланомы человека. / Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Л.Ф. Морозова, Е.С. Воронина, И.А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, С. Субраманиан, Т.Т. Кондратьева, Е.А. Черемушкин, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, Р.Ш. Бибилашвили. // Сибирский онкологический журн. 2010. — Т.31.№1. — С. 29–39. 105 Приложения Таблица 1. Краткая характеристика раково-тестикулярных генов. Ген Полное название Локус Гомологичные гены, количество Функции в норме SP17 Sperm protein 17 10q22 Нет Слияние сперматозоида и яйцеклетки GAGE1 G antigen 1 Xp11.23 15 Неизвестно HAGE DEAD (Asp-GluAla_Asp) box polypeptid 43 6q13 Нет АТФ-зависимая РНК-хеликаза NY-ESO-1 New York Esophageal Squamous protein 1 Xq28 Нет Неизвестно MAGEA1 Melanoma antgen family A, 1 Xq28 Свыше 60 Неизвестно PASD1 PAS domain containing 1 Xq28 Нет SCP1 Synaptonemal complex protein 1 1p13-12 Нет SEMG1 Semenoglein I 20q12-q13.2 Нет SLLP1 Lysozyme-like protein 1 17q11.2 Нет SPANXA1 Sperm protein associated with the nucleus, X-linked Xq27.1 Несколько SSX1 Synovial sarcoma, X breakpoint 1 Xp11.23 8 PRAME Preferentially expressed antigen in melanoma 22q11.22 Нет Возможно, транскрипционный фактор Структурный элемент синаптонемного комплекса Придаёт вязкость семенно жидкости Слияние сперматозоида и яйцеклетки Активатор транскрипции и трансляции некоторых РТГ Вероятно, репрессор транскрипции Неизвестны 106 Таблица 2. Праймеры и зонды, использованные в данной работе. Ген Abl JAK2V617F BCR-ABL PML/RARα, изотип bcr1 PML/RARα, изотип bcr3 SP17 GAGE1 HAGE NY-ESO-1 MAGEA1 SCP1 SEMG1 SLLP1 SPANXA1 SSX1 PRAME 5’-3’-последовательность праймеров и зондов TCC GGG TCT TAG GCT AT TTG CTT GGG ACC CAG CC R6G- TT(T-BHQ1) TTG GTT TGG GCT TCA CAC CAT T CTT TCТ CAC AAG CAT TTG GTT T AAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT R6G-C(T-LNA)CCA CAG A(C-LNA)ACA(T-LNA)AC-BHQ1 GCC CAA CGA TGG CGA TCA GAC CCT GAG GCT CAA R6G- TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTG A-BHQ1 ATG GCT TCG ACG AGT T GCC CAG CCC TCC CTC GC R6G- TGT AGA TGC GGG GTA GAG-BHQ1 TCT TCC TGC CCA ACA GCA A AGT GCC CAG CCC TCC CTC GC R6G-GCT TGT AGA TGC GGG GTA GAG-BHQ1 AGA TAT CTG GGA AGG AGG AA GAC AGC AGC AAC CTC TTC TT R6G-TCA CCA TCT TAG ACT CTT CTG AGG A-BHQ1 AGC TGC TCA GGA GGG AGA GGA T GGT GAC CCT GTT CCT GGC TA R6G-CAT CTG CAG GTC AAG GGC CGA AGC CTG AA-BHQ1 GCC ACA AGT GCC ATG TCA AA CCT TCA AGT CAT CCC ACG TT R6G-AGC AGA TAG TTG GAG GAA AGA AAA TTT TAA-BHQ1 TCT GAA GGA GTT CAC TGT GT AGA CAG GAG CTG ATG GAG AG R6G-AAC ATA CTG ACT ATC CGA CTG ACT GCT GCA-BHQ1 GAA GGA ACC TGA CCC AGG CT AAT CCT GTC CTC TGG GTT GG R6G-TGT GAG GAG GCA AGG TTT TCA GGG GAC-BHQ1 AAA AGG AAC AGA ACA AGA AC TGT GGT AAT GGC AGT TAA CT R6G-CCA AGC CAG AGA GAA AGA AGT ACA TGA TTT-BHQ1 TCC TCA TCT TGG AGA AGC AA TGG GAA AAT TCA CTT GGT AA R6G-ATG GGA CAA AAA GGT GGA TCA AAA GGC C-BHQ1 ACT TCG GGC TGG ACG GAT AC GCG TTG AAA CCG CTT GTG AA R6G-ATA CAG CCT GGC TGA CTG GGT CTG CCT TGC TTA-BHQ1 GAG GAG CGT CCC CTG TGA TT AGC AGG TTG CGG GTC TGA GT R6G-AGG CCA ACG AGA TGA TGC CGG AGA CCC CAA-BHQ1 GTA TAT GAA GAG AAA CTA TAA GG TAT TAC ACA TGA AAG GTG GG R6G-ATG ACT AAA CTA GGT TTC AAA GTC ACC-BHQ1 TGG AGA TAA CAC TCT AAG CAT AAC TAA AGG TAG TTG CTT GGG ACC CAG CC R6G-CCA TT(T-BHQ1) TTG GTT TGG GCT TCA CAC CAT T 107 Рисунок 1. График зависимости интенсивности флуоресценции от цикла проведения реакции. 108 Таблица 3. Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови у здоровых доноров и у больных в дебюте хронических миелоприлиферативных заболеваний (хМПЗ) и хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ ХФ, без лечения). *Уровень экспрессии указан относительн контрольного гена Abl. Гены Характеристика больных Диагноз Исследованный материал Участники исследования, n Пол, мужчины, n (%) Возраст, годы, медиана (диапазон) Длительность заболевания, мес., медиана (диапазон) Обнаружен в группе; n (%) SP17 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) GAGE1 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) HAGE Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) NY-ESO-1 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) MAGEA1 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) SCP1 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) SEMG1 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) SLLP1 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) SPANXA1 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) SSX1 Уровень экспрессии* Обнаружен в группе; n (%) PRAME Уровень экспрессии* Здоровые доноры хМПЗ ХМЛ, ХФ, без лечения 15 7; (54%) 25; (19-45) Кровь 39 11; (27%) 55; (31-79) 11 7; (64%) 43; (36-65) - - - - - - - - - 15 (100%) 2,92% 25 (63,4%) 1,67% 4 (36,4%) 1,41% - - - - - - - - - - - - 15; (100%) 0,62% 32 (80,5%) 0,12% 4 (36,4%) 0,15% - - - - - - - 4; (10%) ,5; (,1-13) 1; (9%) 5,5 109 Таблица 4. экспрессия РТГ в крови больных хроническим миелоидным лейкозом. ХМЛ, ХФ Характеристика больных Исследованный материал ХМЛ, ФА ХМЛ, БК Кровь Участники исследования, n 11 27 21 Пол, мужчины, n (%) 7; (64%) 10; (37%) 9; (43%) Возраст, годы, медиана (диапазон) 43; (36-65) 50; (23-66) 51; (27-78) Длительность заболевания, мес., медиана (диапазон) - 66; (11-195) 57; (12-168) Терапия Иматинибом, мес., медиана (диапазон) - 61; (10-74) 53; (13-81) Обнаружен в группе, n (%) - - 4; (19%) Уровень экспрессии* - - ,3; (,1-18) Обнаружен в группе, n (%) - - - Уровень экспрессии* - - - Обнаружен в группе, n (%) - - 1; (5%) Уровень экспрессии* - - ,01 Обнаружен в группе, n (%) - - - Уровень экспрессии* - - - Обнаружен в группе, n (%) - - 5; (27%) Уровень экспрессии* - - ,7; (,3-1,3) Обнаружен в группе, n (%) - 1; (4%) 1; (5%) Уровень экспрессии* - ,15 ,01 Обнаружен в группе, n (%) - - 3; (14%) Уровень экспрессии* - - ,24; (,01-,26) Обнаружен в группе, n (%) 1; (9%) 2; (7%) 6; (28%) Уровень экспрессии* 5,5 43; (38-48) 3; (,3-51) GAGE1 NY-ESO-1 MAGEA1 Гены SCP1 SEMG1 SPANXA1 SSX1 PRAME 110 Таблица 5. Экспрессия РТГ в костном мозге больных ХМЛ ХМЛ, ХФ, без лечения ХМЛ, ХФ Характеристика больных Исследованный материал ХМЛ, ФА ХМЛ, БК Костный мозг Участники исследования, n 5 10 6 5 Пол, мужчины, n (%) 3; (60%) 6; (60%) 4; (67%) 3; (60%) Возраст, годы, медиана (диапазон) 62; (33-77) 56; (23-81) 46; (32-50) 53; (36-65) Длительность заболевания, мес., медиана (диапазон) - 58; (14156) 63; (29-110) 69; (14-204) Терапия Иматинибом, мес., медиана (диапазон) - 55; (12-95) 44; (9-50) 59; (9-103) Обнаружен в группе, n (%) - - - 1; (20%) Уровень экспрессии* - - - ,1 Обнаружен в группе, n (%) - 1; (10%) - - Уровень экспрессии* - 35,36 - - Обнаружен в группе, n (%) - - - - Уровень экспрессии* - - - - Обнаружен в группе, n (%) - 1; (10%) - - Уровень экспрессии* - ,14 - - Обнаружен в группе, n (%) - - 2; (33%) - Уровень экспрессии* - - ,5 (,15-,9) - Обнаружен в группе, n (%) - - - - Уровень экспрессии* - - - - Обнаружен в группе, n (%) - - 1; (17%) - Уровень экспрессии* - - ,03 - Обнаружен в группе, n (%) - 3; (30%) 5; (83%) 4; (80%) Уровень экспрессии* - 27; (21-51) ,13; (,02-3,6) 36; (7-81) GAGE1 NY-ESO-1 MAGEA1 Гены SCP1 SEMG1 SPANXA1 SSX1 PRAME 111 Рисунок 2. Наблюдаемые соотношения уровней экспрессии гена транскриптов гена PML/RARα. Рисунок 3. Безрецидивная выживаемость больных ОПЛ. Рисунок 4.Коэкспрессия двух генов у больного ОПЛ. PRAME и 112 Таблица 6. Профиль экспрессии РТГ у первичных больных с диагнозом диффузная B- Характеристика больных крупноклеточная лимфома. Исследованный материал Кровь Костный мозг Участники исследования, n 17 12 Пол, мужчины, n (%) 7; (41%) 5; (42) Возраст, годы, медиана (диапазон) 52; (21-77) 50 (21-75) Обнаружен в группе, n (%) 3; (17%) 2; (16%) Уровень экспрессии* 2,52% 1,36 Обнаружен в группе, n (%) 13; (76%) 11; (96%) Уровень экспрессии* 1,67% 2,86 % Обнаружен в группе, n (%) 1; (6%) - Уровень экспрессии* 1,1 % - Обнаружен в группе, n (%) - - Уровень экспрессии* - - Обнаружен в группе, n (%) - - Уровень экспрессии* - - Обнаружен в группе, n (%) - 1; (8,4%) Уровень экспрессии* - 0,04% Обнаружен в группе, n (%) 4; (24%) 2; (16%) Уровень экспрессии* 3,55% 19% Обнаружен в группе, n (%) 8; (47%) 6; (50%) Уровень экспрессии* 0,78% 0,33% Обнаружен в группе, n (%) - 3; (25%) Уровень экспрессии* - 0,29% Обнаружен в группе, n (%) 3; (18%) - Уровень экспрессии* 0,064% - Обнаружен в группе, n (%) 1; (6%) 2; (16%) Уровень экспрессии* 65% 4,56% GAGE1 HAGE NY-ESO-1 MAGEA1 Гены PASD SCP1 SEMG1 SLLP1 SPANXA1 SSX1 PRAME 113 Таблица 7. Профиль экспрессии РТГ у больных с диагнозом с диагнозом лимфома Характеристика больных Ходжкинa Исследованный материал Кровь Лимфатический узел Участники исследования, n 27 27 Пол, мужчины, n (%) 12; (44%) 12; (44%) Возраст, годы, медиана (диапазон) 36; (19-72) 36; (19-72) Обнаружен в группе, n (%) 2; (7%) 2; (7%) Уровень экспрессии* 1% 1,2% Обнаружен в группе, n (%) 24; (88%) 26; (96%) Уровень экспрессии* 4,68% 2,64 % Обнаружен в группе, n (%) 6; (22%) 6; (22%) Уровень экспрессии* 0,2 % 6,4 % Обнаружен в группе, n (%) - 2; (7%) Уровень экспрессии* - 62% Обнаружен в группе, n (%) 2; (7%) 4; (15%) Уровень экспрессии* 0,25% 0,7% Обнаружен в группе, n (%) - 1; (8,4%) Уровень экспрессии* - 0,12% Обнаружен в группе, n (%) 12; (44%) 5; (27%) Уровень экспрессии* 11% 2,3% Обнаружен в группе, n (%) 13; (48%) 12; (44%) Уровень экспрессии* 0,66% 0,74% Обнаружен в группе, n (%) 3; (11%) 4; (15%) Уровень экспрессии* 1,7% 2,45% Обнаружен в группе, n (%) 6; (22%) 2; (7%) Уровень экспрессии* 0,1% 20% Обнаружен в группе, n (%) 4; (15%) 17; (63%) Уровень экспрессии* 0,06% 12,2% GAGE1 HAGE NY-ESO-1 MAGEA1 Гены PASD SCP1 SEMG1 SLLP1 SPANXA1 SSX1 PRAME 114 Таблица 8. Экспрессия РТГ у первичных больных с диагнозом фолликулярная Характеристика больных лимфома. Исследованный материал Кровь Костный мозг Лимфатический узел Участники исследования, n 22 22 22 Пол, мужчины, n (%) 10; (45%) 10; (45%) 10; (45%) Возраст, годы, медиана (диапазон) 57; (38-75) 57; (38-75) 57; (38-75) 2; (9%) - 4; (18%) 1,4% - 0,4% 22; (100%) 20; (90%) 19; (86%) 3,7% 2,3% 1,4% 2; (9%) 2; (9%) - 1,6% 1,4% - - - 1; (4,5%) - - 250% - 1; (4,5%) - - 0,02% - 1; (4,5%) 3; (13%) 3; (13%) 28% 0,27% 0,4% 9; (40%) 7; (32%) 8; (36%) 14% 11% 8,4% 13; (59%) 4; (18%) 6; (27%) 0,24% 0,7% 0,11% - 5; (23%) 7; (32%) - 1,7% 0,15% 1; (4,5%) 3; (13%) - 0,02% 0,07% - 3; (13%) 10; (45%) 14; (64%) 0,6% 0,45% 8% GAGE1 HAGE NY-ESO-1 MAGEA1 Гены PASD SCP1 SEMG1 SLLP1 SPANXA1 SSX1 PRAME Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* Обнаружен в группе, n (%) Уровень экспрессии* 115 Диаграмма 1. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры K562. Диаграмма 2. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры WI38. 116 Диаграмма 3. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel P. Диаграмма 4. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel Si 117 Диаграмма 5. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel Mtp. Диаграмма 6. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel IL. 118 Диаграмма 7. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel Hn. Диаграмма 8. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel Ibr. 119 Диаграмма 9. Профиль экспрессии РТГ в клетках культуры mel Kor.
