Диссертация - Институт химической биологии и

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
На правах рукописи
МАРКОВ ОЛЕГ ВЛАДИМИРОВИЧ
ПОИСК ПУТЕЙ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ
ВАКЦИН НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК
03.01.04 – биохимия
Диссертация на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
к.б.н. Миронова Н. Л.
Новосибирск – 2015
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...........................................................................................................6
ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................................10
ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ
ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУННОГО ОТВЕТА
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).............................................................................................................13
1.1. Основы функционирования ДК: связь ДК с врожденным и приобретенным типами
иммунитета ...............................................................................................................................13
1.2. Происхождение и субпопуляции ДК ..............................................................................16
1.2.1. Предшественники ДК (преДК).................................................................................16
1.2.2. Субпопуляции ДК......................................................................................................18
1.2.2.1. Плазмацитоидные ДК ........................................................................................18
1.2.2.2. Классические ДК ................................................................................................19
Классические ДК мыши ..................................................................................................19
Классические ДК человека .............................................................................................21
1.3. Функции ДК ......................................................................................................................22
1.3.1. Презентация антигенов ДК с помощью молекул MHC II .....................................22
1.3.2. Кросс-презентация АГ с помощью молекул MHC I ..............................................24
1.3.3. Процессинг АГ и образование комплексов с МНС I .............................................26
1.3.3.1. Вакуолярный путь процессинга АГ ..................................................................26
1.3.3.2. Цитозольный путь процессинга АГ ..................................................................27
1.3.4. Кросс-дрессинг ДК ....................................................................................................29
1.3.5. Индукция функции кросс-презентации ДК ............................................................30
1.4. Уход опухоли от иммунного надзора путем подавления функций ДК ......................32
1.4.1. Опухолевая строма ....................................................................................................32
1.4.2. Механизмы подавления опухолью функций ДК ....................................................32
1.4.2.1. Подавление опухолью миграции ДК ................................................................33
1.4.2.2 Роль воспаления в подавлении функции ДК и прогрессии опухоли .............34
1.4.2.3. Роль экзосом, выделяемых опухолевыми клетками, в подавлении функций
ДК ......................................................................................................................................35
1.4.3. Роль опухолевого окружения в подавлении функций ДК .....................................36
1.4.3.1. Цитокины и ростовые факторы при опухолевой прогрессии ........................36
1.4.3.2. Влияние гипоксии при опухолевой прогрессии на функции ДК ..................37
1.4.3.3. Влияние измененного метаболизма опухолевых клеток на функцию ДК ....37
1.5. Инициация противоопухолевого ответа с помощью ДК, нагруженных ОАГ ............39
2
1.5.1. Нагрузка ДК ОАГ и ко-стимулирующими молекулами или экспрессирующими
их конструкциями ................................................................................................................39
1.5.1.1. Физические методы доставки АГ в ДК ............................................................40
1.5.1.2. Вирусные системы доставки АГ в ДК ..............................................................41
1.5.1.3. Химические вектора для доставки АГ в ДК ....................................................41
1.5.1.4. Сигналы запуска противоопухолевого иммунного ответа .............................43
1.5.2.
Применение
ДК,
нагруженных
ОАГ,
в
терапии
злокачественных
новообразований ..................................................................................................................46
1.5.2.1. Эффективность ДК вакцин на мышиных моделях опухолевой прогрессии in
vivo ....................................................................................................................................46
1.5.2.2. Исследование способности ДК пациентов, страдающих опухолями
различного типа, активировать противоопухолевые Т-лимфоциты ex vivo .............51
1.5.2.3. Эффективность ДК вакцин в клинических испытаниях .................................52
Заключение...............................................................................................................................60
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .........................................................................62
2.1. МАТЕРИАЛЫ...................................................................................................................62
2.1.1. Реактивы и препараты ...............................................................................................62
2.1.2. Оборудование ............................................................................................................63
2.1.3. Плазмиды....................................................................................................................63
2.1.4. Буферы и растворы ....................................................................................................63
2.1.5. Клеточные культуры .................................................................................................64
2.1.6. Лабораторные животные ..........................................................................................64
2.1.7. Опухолевые модели...................................................................................................64
2.1.8. Липосомы ...................................................................................................................65
2.2 МЕТОДЫ............................................................................................................................65
2.2.1. Гель-электрофорез .....................................................................................................65
2.2.1.1. Электрофорез в агарозном геле.........................................................................65
2.2.1.2.Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях ......................................65
2.2.2. Получение первичных культур опухолевых клеток ..............................................65
2.2.3. Выделение суммарной клеточной РНК ...................................................................66
2.2.4. Выделение предшественников ДК мыши из костного мозга................................66
2.2.5. Получение незрелых ДК из костно-мозговых предшественников ДК ................66
2.2.6. Получение первичной культуры спленоцитов из селезенки мыши .....................67
2.2.7. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток антителами ..................................67
2.2.8. Приготовление комплексов катионных липосом и нуклеиновых кислот ...........67
3
2.2.9. Физико-химическая характеристика липосом и липоплексов ..............................68
2.2.10. Агглютинация с конканавалином А ......................................................................68
2.2.11. Трансфекция pEGFP, РНК-EGFP, РНК-Кребс-2, РНК-LLC и РНК-B16 в
предшественники ДК и незрелые ДК мыши.....................................................................68
2.2.12. Проточная цитометрия ............................................................................................69
2.2.13. Получение лизата клеток Кребс-2 и В16 и нагрузка ДК .....................................70
2.2.14. Трансплантация опухолей ......................................................................................70
2.2.15. Исследование in vivo противоопухолевой активности ДК, нагруженных РНК в
комплексах с липосомами ex vivo......................................................................................71
2.2.16. Измерение уровней цитокинов в культуральной среде и сыворотке крови
экспериментальных животных ...........................................................................................71
2.2.17. Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов in vitro методом
МТТ-теста.............................................................................................................................72
2.2.18. Реакция аллогенных смешанных лимфоцитов .....................................................72
2.2.19. Праймирование Т-лимфоцитов in vivo с помощью маннозилированных
липосом.................................................................................................................................73
2.2.20. Состав вакцин и схемы вакцинации мышей ДК...................................................73
2.2.21. ОТ-ПЦР в режиме реального времени ..................................................................75
2.2.22. Статистический анализ ...........................................................................................75
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ ..........................................................................77
3.1. Приготовление ДК вакцины ............................................................................................77
3.2. Определение способности ДК активировать противоопухолевые ответы ex vivo и in
vivo ............................................................................................................................................78
3.3. Исследование трансфекционной активности поликатионных липосом .....................79
3.3.1. Поликатионные липиды и липосомы ......................................................................79
3.3.2. Доставка плазмидной ДНК в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые
ДК с помощью катионных липосом ..................................................................................80
3.3.3. Доставка РНК-EGFP в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК
мыши с помощью катионных липосом .............................................................................83
3.3.4. Исследование противоопухолевого потенциала ДК, трансфицированных
опухолевой РНК с помощью катионных липосом ex vivo, на метастатической модели
меланомы В16 мыши ...........................................................................................................84
3.3.5. Влияние липоплексов, содержащих РНК-В16, на иммуномодулирующие
свойства ДК ..........................................................................................................................85
4
3.3.6. Исследование способности ДК, нагруженных липоплексами с РНК-В16,
активировать опухолеспецифические ЦТЛ ......................................................................88
3.4. Исследование мультикомпонентных маннозилированных липосом с целью
получения высокоэффективных противоопухолевых ДК вакцин ......................................89
3.4.1. Состав маннозилированных липосом ......................................................................90
3.4.2.
Физико-химические
характеристики
маннозилированных
липосом
и
липоплексов .........................................................................................................................91
3.4.3. Исследование специфичности взаимодействия маннозилированных липосом с
конканавалином А ...............................................................................................................94
3.4.4. Характеристика ДК ...................................................................................................96
3.4.5. Доставка плазмидной ДНК в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые
ДК с помощью маннозилированных липосом ..................................................................99
3.4.6. Доставка РНК в костно-мозговые преДК и незрелые ДК с помощью
маннозилированных липосом...........................................................................................101
3.4.7. Подавление роста метастазов на модели метастатической меланомы В16 мыши
с помощью ДК, нагруженных липоплексами МЛ/РНК-В16 ex vivo .............................102
3.4.8. Иммуномодулирующий эффект ДК, нагруженных липоплексами МЛ/РНК-В16
.............................................................................................................................................104
3.4.9. Аллостимуляторная активность ДК, нагруженных липоплексами ....................106
3.4.10. Таргетная доставка липоплексов МЛ/РНК-В16 in vivo .....................................107
3.5. Исследование эффективности профилактических и терапевтических дендритноклеточных вакцин в лечении опухолей ...................................................................................108
3.5.1. Экспериментальные модели и схемы лечения опухолей с помощью ДК .........110
3.5.2.
Сравнение
противоопухолевой
активности
профилактической
и
терапевтической схем лечения ДК на различных опухолевых моделях .....................112
3.5.3. Иммунологические характеристики организма-опухоленосителя после лечения
профилактическими и терапевтическими ДК вакцинами. ............................................116
3.5.4. Оценка экспрессии транскрипционных факторов Tbet, RORγ, GATA3 и Foxp3
.............................................................................................................................................120
ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................................123
ВЫВОДЫ ...................................................................................................................................125
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .........................................................................................................127
5
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ – антиген
АПК – антиген-представляющие клетки
в/в – внутривенно
ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
ДК – дендритные клетки
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК – комплиментарная дезоксирибонуклеиновая кислота
кДК – классические дендритные клетки
НК – нуклеиновая кислота
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
ОАГ – опухолеспецифические антигены, опухолеассоциированные антигены
ОТ-ПЦР – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
пДК – плазмациотидные дендритные клетки
преДК – предшественники дендритных клеток
ИЛ – интерлейкин
ИП – индекс пролиферации
ИФН – интерферон
КонА – конканавалин А
ЛПС - липополисахарид
М-КСФ – макрофагальный колониестимулирующий фактор
МЛ – маннозилированные липосомы
МР – маннозный рецептор
о.е. – относительная единица
6
ПГЕ – простагландин Е
ПКФ – простатическая кислая фосфатаза
РНК – рибонуклеиновая кислота
ТКР – Т-клеточный рецептор
Трег – Т регуляторные клетки
ФНО – фактор некроза опухоли
ФРО – фактор роста опухоли
ЭПР – эндоплазматический ретикулум
ЦТЛ – цитотоксические Т-лимфоциты
AFP – alphafetoprotein, альфафетопротеин
CEA – carcinoembryonic antigen, карциноэмбриональный антиген
CLIP – класс II-ассоциированный Ii пептид
CLP – common lymphoid progenitors, общие лимфоидные предшественники
CMP – common myeloid progenitors, общие миелоидные предшественники
COX – cyclooxygenase, циклооксигеназа
DMEM – Dulbecco's modified Eagle medium, среда Игла, модифицированная Дульбекко
dNTP – дезоксирибонуклеотидтрифосфаты
DOPE – 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин
DTH – delayed type hypersensitivity (IV), реакция гиперчувствительности (IV) типа
EGFP – enhanced green fluorescent protein, зеленый флуоресцирующий белок
FDA USA – Food and Drug Administration USA, Управление по контролю качества
пищевых продуктов и медикаментов США
FBS – fetal bovine serum, эмбрионическая телячья сыворотка
FITC – fluorescein isothiocyanate, флюоресцеин изотиоцианат
7
GMP
–
granulocyte-macrophage
progenitors,
гранулоцитарно-макрофагальные
предшественники
HLA – human leucocyte antigen, человеческий лейкоцитарный антиген
IMDM – Iscove's modified Dulbecco's medium, среда Дульбекко, модифицированная по
способу Исков
KLH – keyhole limpet hemocyanin, гемоцианин лимфы Fissurella aperturа
LDH – lactate dehydrogenase, лактат-дегидрогеназа
LF – Lipofectamine 2000
Lin – lineage markers, линейно-специфический маркер
LLC – Lewis lung carcinoma, карцинома легких Льюис
LSM – lymphocyte separation medium, среда для отделения лимфоцитов
MDP – macrophage-dendritic cell progenitors, предшественники макрофагов-дендритных
клеток
MDSC
–
myeloid-derived
suppressor
cells,
супрессорные
клетки
миелоидного
происхождения
MFI – mean fluorescence intensity, средняя интенсивность флуоресценции
MHC – major histocompatibility complex, главный комплекс гистосовместимости
MIIC – МНС II компартмент
N/P соотношение – соотношение количества аминогрупп в поликатионных липидах к
количеству фосфатных групп в нуклеиновой кислоте
NK – natural killer cells, натуральные (естественные) киллеры
PBS – phosphate buffered saline, фосфатно-солевой буфер
P.D.I. – polydispersity index, индекс полидисперсности
PE – phycoerythrin, фикоэритрин
RFU – relative fluorescent unit, относительная флуоресцентная единица
8
SVV – survivin, сурвивин
siРНК – малая интерферирующая РНК
ТАМ – tumor-associated macrophages, опухоль-ассоциированные макрофаги
Th1 – Т-хелперные клетки 1 типа
Th2 – Т-хелперные клетки 2 типа
Th17 – Т-хелперные клетки 17 типа
TE – transfection efficiency, эффективность трансфекции
TLR – toll-like receptor, толл-подобный рецептор
VEGF – vascular endothelial growth factor, васкулярный эндотелиальный ростовой фактор
w/s – without stimulation, без стимулирования
w/t – without treatment, без обработки
9
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в терапии онкологических заболеваний выделяются методы,
основанные на активации иммунной системы. Среди них особое место занимают подходы
на
основе
дендритных
клеток
(ДК),
способных
запускать
и
поддерживать
опухолеспецифический Т- и В-клеточный иммунные ответы [1]. ДК являются
профессиональными антиген-презентирующими клетками (АПК), главная функция
которых заключается в захвате чужеродных антигенов, их процессинге и презентации на
клеточной
поверхности
в
комплексах
с
молекулами
главного
комплекса
гистосовместимости (MHC) первого и второго типа наивным Т-клеткам. В результате
такого взаимодействия происходит созревание и активация опухолеспецифических
цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), способных проникать в места локализации
опухоли, идентифицировать опухолевые клетки и уничтожать их. Помимо этого
запускается Т-хелперные ответы первого и второго типа, стимулирующие Т- и Вклеточные звенья противоопухолевого иммунного ответа. Дополнительная стимуляция
лимфоцитов цитокинами, секретируемыми ДК, способствует пролиферации клонов
опухолеспецифических ЦТЛ. В настоящее время разработка вакцин на основе ДК,
позволяющих эффективно лечить онкологические заболевания и преодолевать вызванный
опухолью иммунодефицит, является крайне актуальной.
В
экспериментах
in
vivo
было
показано,
что
ДК,
нагруженные
опухолеспецифическими антигенами (ОАГ) в виде белков, РНК, ДНК или вирусных
конструкций, кодирующих ОАГ, способны вызывать активацию иммунной системы при
их введении в организм-опухоленоситель [2-4]. Были получены многообещающие
результаты – уменьшение скорости роста опухоли, сокращение количества метастазов,
увеличение выживаемости животных-опухоленосителей, запуск опухолеспецифического
цитотоксического Т-клеточного иммунного ответа на опухолевых моделях [5-9] и в
клинических испытаниях [10-14]. В 2010 году Управлением по контролю качества
пищевых продуктов и медикаментов США (FDA USA) была одобрена первая и пока
единственная
в
мире
терапевтическая
клеточная
вакцина
Sipuleucel-T
против
метастатической кастрат-резистентной опухоли простаты. Вакцина представляет собой
ДК, нагруженные рекомбинантным гибридным белком на основе простатической кислой
фосфатазы и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора [15]. На
сегодняшний день результаты клинических испытаний ДК и противоопухолевых вакцин
на их основе являются менее впечатляющими по своей эффективности по сравнению с
данными экспериментов in vivo и оставляют такие нерешенные проблемы, как поиск
иммуногенных источников ОАГ для ДК, векторов для доставки ОАГ в ДК, обладающих
10
высокой эффективностью и низкой собственной иммуногенностью, а также адаптация
протоколов лечения с помощью ДК опухолей различного гистологического типа.
Целью настоящей работы являлась разработка новых средств противоопухолевой
терапии на основе модифицированных дендритных клеток, способных эффективно
экспрессировать
и
презентировать
опухолеспецифические
антигены
и
запускать
высокоэффективный противоопухолевый цитотоксический Т-клеточный ответ.
В ходе исследования решались следующие задачи:
Поиск липосомальных композиций, обеспечивающих высокоэффективную
1.
доставку ОАГ в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК мыши ex vivo и
опосредующих высокий противоопухолевый потенциал ДК вакцин in vivo.
Поиск липосомальных композиций, адресованных к маннозным рецепторам
2.
на поверхности ДК, обеспечивающих эффективную избирательную доставку ОАГ в
костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК мыши ex vivo и in vivo,
опосредующих способность ДК эффективно презентировать ОАГ и генерировать клоны
противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов.
Выбор схем лечения с помощью вакцин на основе модифицированных ДК
3.
опухолей
различных
гистологических
типов,
обеспечивающих
запуск
высокоэффективного противоопухолевого иммунного ответа.
Научная
новизна
и
практическая
значимость
работы.
Разработаны
противоопухолевые ДК вакцины на основе ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК
в комплексах с катионными липосомами, состоящими из катионных липидов 2X3 (1,26бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан
тетрагидрохлорид)
или
2D3
(1,26-бис(1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерин)-7,11,16,20-
тетраазагексакозан тетрагидрохлорид), содержащих в своей структуре два остатка
холестерина или дитетрадецилглицерина, соединенных спермином, и липида-хелпера
DOPE
(1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина),
обладающих
высоким
противоопухолевым и антиметастатическим действием.
Разработаны противоопухолевые ДК вакцины на основе ДК, нагруженных
суммарной опухолевой РНК в комплексе с «адресными» липосомами, направленными к
маннозным рецепторам ДК. Липосомы состояли из катионного липида 2X3, липидахелпера
DOPE
и
маннозилированного
липоконъюгата
3-[6-(α-D-
маннопиранозилокси)гексил]амино-4-{6-[rac-2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1илоксикарбамоил]гексил}аминоциклобут-3-ен-1,2-дион. Такие ДК вакцины обладали
11
высоким
антиметастатическим
потенциалом
и
стимулировали
запуск
опухолеспецифического ЦТЛ ответа in vivo.
Впервые показано, что профилактические противоопухолевые вакцины на основе ДК,
нагруженных суммарной опухолевой РНК в комплексах с катионными липосомами, более
эффективны в отношении метастазирующих опухолей, тогда как терапевтические ДК
вакцины эффективны в отношении неметастазирующих опухолей.
Основные положения, выносимые на защиту.
1) Созданы противоопухолевые вакцины на основе ДК, нагруженных с помощью
«адресных» катионных липосом РНК, кодирующей ОАГ, и показана их высокая
противоопухолевая и антиметастатическая активности.
2) Профилактические ДК вакцины эффективны в отношении метастазирующих
опухолей, терапевтические ДК вакцины эффективны в отношении неметастазирующих
опухолей.
3) Противоопухолевая эффективность ДК вакцины определяется ее способностью
запускать и регулировать цитотоксический Т-клеточный и Th1/Th2/Th17 ответы, а также
низким уровнем активации регуляторных Т-клеток.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3
публикации в рецензируемых научных журналах, цитируемых в базах Web of Science и
SCOPUS. Результаты работы были представлены на конференциях: 11th Young Scientist
Forum “Biochemistry for Tomorrow’s Medicine” (Турин, Италия 2011); 36th FEBS Congress
“Biochemistry for Tomorrow’s Medicine” (Турин, Италия 2011); 31st European School of
Medicinal Chemistry (Урбино, Италия 2011); 38th FEBS Congress “Mechanisms in Biology”
(Санкт-Петербург, Россия 2013); Фундаментальные науки – медицине (Новосибирск,
Россия 2013), “Science of the Future” (Санкт-Петербург, Россия 2014), Russian-British
Seminar “Targeting the RNA World: The Future of Nucleic Acid Therapeutics” (СанктПетербург, Россия 2015), 4th Meeting of the CNRS Laboratoire International Associe
NUCPROT “Biogenesis, structure and reactivity of nucleic acids protein assembles important for
health and desease” (Новосибирск, Россия 2015).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения,
заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 156
страницах, содержит 36 рисунков и 4 таблицы. Библиография содержит 305 литературных
источников.
12
ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ
ФОРМИРОВАНИЯ ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ
ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУННОГО ОТВЕТА (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ)
Известно, что микроокружение опухоли подавляет иммунную систему, за счет чего
опухоль уходит от иммунного надзора. Опухоль и ее микроокружение продуцируют
разнообразные
цитокины
и
хемокины,
препятствующие
созреванию
антиген-
презентирующих клеток (АПК) и Т-лимфоцитов, что в конечном итоге, приводит к
подавлению функциональной активности Т-клеточного звена противоопухолевого
иммунного ответа. Иммуносупрессия под действием веществ, выделяемых опухолевым
окружением, приводит к неэффективности стандартных подходов лечения опухолевых
заболеваний. Поэтому в настоящее время актуальна разработка методов лечения
опухолевых заболеваний, основанных на активации иммунной системы организма. Среди
множества существующих подходов одним из наиболее эффективных способов
преодоления иммунодефицита, задействующих собственные ресурсы организма, являются
вакцины на основе дендритных клеток.
В обзоре литературы будут рассмотрены молекулярные и клеточные механизмы
активации ДК противоопухолевого иммунного ответа; противодействие опухоли и ее
окружения способности ДК к подавлению опухолевого роста, а также успехи в
применении ДК в виде вакцин на моделях опухолевой прогрессии in vivo и в клинической
практике.
1.1. Основы функционирования ДК: связь ДК с врожденным и
приобретенным типами иммунитета
Дендритные клетки (ДК) имеют костномозговое происхождение и представлены во
всех тканях организма. Основной задачей ДК является опознавание чужеродных или
собственных патогенных антигенов (АГ) и передача полученной информации клеткам
приобретенного иммунитета (наивным Т-лимфоцитам) с помощью презентации АГ в
комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности
ДК.
ДК являются ключевыми клетками, связывающими между собой древний
низкоспецифичный
врожденный
и
эволюционно
новый
высокоспецифичный
приобретенный типы иммунитета. ДК происходят из костно-мозговых предшественников,
13
являющихся общими для моноцитов, макрофагов и гранулоцитов – основных клеточных
факторов врожденного иммунитета. Поэтому становится понятным, почему ДК обладают
общими с ними свойствами, прежде всего фагоцитозом, т.е. способностью поглощать
твердые частицы (клетки, апоптотические тельца, белки и др.). Действительно,
практически все клетки врожденного иммунитета, за исключением эозинофилов и
натуральных киллеров (NK), используют фагоцитоз в качестве одного из важных
механизмов
уничтожения
мишеней
(бактерий,
чужеродных
или
собственных
инфицированных или опухолевых клеток) [16]. ДК используют фагоцитоз наряду с
пиноцитозом и рецептор-опосредованным эндоцитозом для поглощения АГ с целью
последующего процессинга и презентации.
Клетки врожденного иммунитета характеризуются неспецифическим механизмом
распознавания своих мишеней, используя для этого рецепторы, идентифицирующие не
отдельные молекулы (эпитопы АГ, как в случае клеток приобретенного иммунитета Тлимфоцитов), а группы молекул, сигнализирующих о чужеродности или агрессивности их
носителей [17]. Так, большинство клеток врожденного иммунитета экспрессируют на
своей поверхности лектины, распознающие концевые остатки сахаров протеогликанов.
ДК также имеют на своей клеточной поверхности большое количество С-лектинов,
прежде всего маннозных рецепторов (CD206), связывающихся с концевыми остатками
маннозы [18]. Интересно, что маннозные рецепторы также широко экспрессируются
макрофагами.
Другим свойством, объединяющим ДК с клетками врожденного иммунитета, а
именно с фагоцитами (моноцитами и макрофагами), является способность презентировать
АГ
в
комплексах
с
молекулами
МНС
лимфоцитам.
Однако
ДК
являются
профессиональными антиген-представляющими клетками (АПК), они в 10-100 раз более
эффективны в стимуляции Т-лимфоцитов по сравнению с другими АПК (моноцитами,
макрофагами, В-лимфоцитами) [19-21]. Только ДК способны наиболее эффективно кросспрезентировать АГ, то есть представлять экзогенные АГ в комплексах с молекулами
МНС I CD8+ Т-лимфоцитам, запуская специфичный к таким АГ цитотоксический Тклеточный ответ [22]. Кроме того, только ДК способны представлять АГ наивным Тлимфоцитам в лимфоидных органах [23].
Другим клеточным фактором врожденного иммунитета являются натуральные
киллеры (NK), имеющие лимфоцитарное происхождение, но отличающиеся от
лимфоцитов
механизмами
приобретенного
и
иммунитета
единственным
более
способом
14
примитивными
уничтожения
распознающими
клеток-мишеней
–
перфоринзависимым цитолизом с участием перфорина и гранзима, выделяемого NK [17].
В последнее время было показано, что ДК тесно взаимодействуют с NK. Так, ДК
способны стимулировать пролиферацию и продукцию цитокинов NK, а также усиливать
их цитотоксичность. Активированные NK, в свою очередь, играют большую роль в
элиминировании незрелых толерогенных ДК. С другой стороны, NK могут вызывать
созревание ДК и влиять на поляризацию Т-клеточных ответов. При узнавании мишени NK
выделяют ФНО-α и ИФН-γ, способствующие созреванию ДК и поляризации Th1 ответа.
Более того, данные цитокины способствуют усилению кросс-презентации АГ ДК Тлимфоцитам. Таким образом, взаимосвязь ДК с NK имеет большое значение для
генерации эффективного опухолеспецифического приобретенного иммунного ответа [24].
Для формирования антигенспецифического приобретенного иммунного ответа
незрелые ДК выходят из костного мозга и по кровотоку мигрируют в периферические
ткани. Там ДК захватывают чужеродные или свои АГ, процессируют их и выставляют на
своей поверхности в комплексах с молекулами MHC I и MHC II. В то же время в
периферических тканях на ДК действуют патогенные агенты и/или воспалительные
цитокины, которые приводят к созреванию ДК. Зрелые ДК, нагруженные АГ, мигрируют
в лимфатические узлы через афферентные лимфатические сосуды, где взаимодействуют с
наивными CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами [25] (Рис. 1).
Рис. 1. Взаимодействие ДК с CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами [26].
15
При взаимодействии с ДК наивные Т-лимфоциты могут дифференцироваться в
антиген-специфические эффекторные Т клетки с различными функциями. Например,
CD4+ Т-лимфоциты могут стать Т хелперами 1 (Th1), 2 (Th2) и 17 (Th17) типов, а также Т
регуляторными клетками (Трег). Их главные функции заключаются в стимуляции
цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), активации В-лимфоцитов, продуцирующих под их
действием антитела, регуляции аутоиммунных и провоспалительных ответов, а также
подавлении функции других лимфоцитов, соответственно. Наивные CD8+ Т-лимфоциты
дифференцируются в ЦТЛ, способные специфически узнавать и уничтожать опухолевые
клетки [27]. Таким образом, ДК способны как напрямую, так и опосредованно
специфически
запускать,
программировать
и
регулировать
Т-
и
В-клеточные
противоопухолевые иммунные ответы.
1.2. Происхождение и субпопуляции ДК
ДК представляют собой гетерогенную популяцию клеток, берущую начало от
отдельной
от
других
лейкоцитов
гематопоэтической
линии
костно-мозговых
предшественников [28]. Существует несколько субпопуляций ДК, различающихся
происхождением, фенотипом, локализацией, путям миграции и функциям, и, как
результат, эффектами на врожденный и приобретенный иммунитеты [29]. Эти
субпопуляции можно объединить в две главные группы: классические ДК (кДК) и
плазмацитоидные ДК (пДК).
1.2.1. Предшественники ДК (преДК)
Считается, что преДК берут начало от костно-мозговых предшественников,
теряющих по мере созревания потенциал развития в клетки других типов. Данный
процесс называется коммитированием. Наиболее ранними коммитированными преДК
являются клональные общие миелоидные предшественники (CMP), которые были
обнаружены у мыши и человека [30] (Рис. 2). СМР дают начало эритроцитам,
гранулоцитам, мегакариоцитам, моноцитам, макрофагам, ДК и плазмацитоидным ДК
[31, 32].
Коммитирование CMP приводит к потере их способности развиваться в эритроциты
– образуются гранулоцитарно-макрофагальные предшественники (GMP). Далее GMP
теряют способность дифференцироваться в гранулоциты и мегакариоциты, однако
сохраняют возможность образовывать моноциты, макрофаги, ДК и плазмацитоидные ДК.
16
Рис. 2. Костно-мозговые предшественники ДК [33].
Эти
промежуточные
предшественники,
называющиеся
предшественниками
макрофагов/ДК (MDP), дают начало общим преДК (CDP), которые в свою очередь
дифференцируются в предшественники кДК (пре-кДК) и плазмацитоидные ДК (пДК) [34].
Пре-кДК, характеризующиеся фенотипом Lin−CD11c+MHC II+, покидают костный
мозг и по кровотоку попадают в лимфоидные органы, где дифференцируются в
лимфоидно-резидентные CD8+ и CD11b+ кДК, но не в пДК и макрофаги. Они также
попадают и в нелимфоидные органы, такие как печень, почки, легкие и кишечник, где
дают начало CD103+ и CD11b+ кДК [35, 36]. Таким образом, пре-кДК являются
непосредственными предшественниками кДК, которые постоянно мигрируют из костного
мозга на периферию для дифференцировки в кДК периферических тканей и резидентные
ДК лимфоидных органов.
Ранее
предполагалось,
что
является
CD8
маркером
ДК
лимфоидного
происхождения, однако, позже было показано, что при адоптивном переносе CMP и CLP
(общих лимфоидных предшественников) в облученных животных CD8+ ДК могут
дифференцироваться из обоих типов предшественников. Поэтому термины лимфоидные и
миелоидные ДК уже не используются. В здоровом организме большинство ДК, включая
17
CD8+ и CD8− субпопуляции, имеют миелоидное происхождение, поскольку количество
СМР в этих условиях в 10 раз превышает CLP; общие лимфоидные предшественники
обеспечивают наработку около половины ДК тимуса и лишь небольшой части ДК
селезенки [37].
Клетки
Лангерганса
отличаются
от
других
субпопуляций
ДК,
поскольку
самообновляются вне зависимости от костного мозга и дифференцируются из
предшественников, заселивших кожу еще в пренатальном периоде развития [38]. Однако в
воспалительных условиях, когда популяция клеток Лангерганса сильно истощается, эти
клетки могут развиваться из моноцитов крови [39]. В условиях воспаления моноциты
также могут дифференцироваться в кДК селезенки [40].
1.2.2. Субпопуляции ДК
1.2.2.1. Плазмацитоидные ДК
пДК представляют немногочисленную
субпопуляцию ДК (0.3–0.5% клеток
периферической крови человека или клеток лимфоидных органов мыши), обладающую
сходным происхождением с классическими ДК, но отличающуюся жизненным циклом. В
основном пДК накапливаются в крови и лимфоидных органах и проникают в
лимфатические узлы по кровотоку [28]. пДК экспрессируют низкий уровень MHC II и костимулирующих
молекул.
Для
пДК
мыши
характерен
фенотип
CD11clowCD11b−CD45R/B220+ [41, 42], для пДК человека – Lin−CD11c−CD123(IL-3 Rα)+
[43].
пДК называют клетками, продуцирующими интерфероны I типа (ИФН-α/β),
поскольку они секретируют большие количества интерферонов I типа при взаимодействии
патогенных нуклеиновых кислот с толл-подобными рецепторами TLR3, TLR7, TLR8
и/или TLR9, экспрессирующимися в пДК [44-46]. Продукция интерферонов в этом случае
может быть в 1000 раз более высокой, чем в других клетках [47]. пДК способны также
секретировать цитокины: ФНО-α (человек), ИЛ-12, ИЛ-1β и ИЛ-6 (мышь) при TLRиндуцированной активации.
Большинство пДК
развиваются из
общих
костно-мозговых преДК
(CDP),
обладающих как ДК, так и лимфоидным потенциалом, и экспрессирующих цитокиновые
рецепторы Flt3 (CD135), M-CSFR (CD115) и низкие уровни c-Kit (CD117) [48] (Рис. 2).
В нормальных условиях пДК у мыши локализуются в лимфоидных органах и крови,
а также в печени, легких и коже; скорость пролиферации пДК очень низкая. У человека
пДК помимо печени и крови обнаруживаются в первичных, вторичных и третичных
18
лимфоидных органах. Они могут мигрировать из лимфоидных органов по кровотоку в Тклеточные зоны вторичных лимфоидных тканей и маргинальную зону селезенки. При
патологических состояниях пДК покидают костный мозг, органы или кровяное русло и
инфильтрируют воспаленные ткани, где взаимодействуют с сигналами опасности
(чужеродными АГ, патогенными агентами и т.д.) и высвобождают большие количества
интерферонов I типа [49]. В этом случае запускается защитный иммунитет, поскольку
интерфероны I типа усиливают кросс-презентирующую способность классических ДК, а
также активируют другие иммунные клетки, такие как В-, Т-лимфоциты и натуральные
киллеры (НК). Таким образом, активированные пДК играют важную роль для
врожденного и приобретенного типов иммунного ответа [50].
1.2.2.2. Классические ДК
Классическими ДК (кДК) называются все ДК за исключением плазмацитоидных ДК.
Их можно обнаружить в большинстве лимфоидных и нелимфоидных тканей. кДК
способны идентифицировать повреждение тканей, захватывать собственные или
чужеродные АГ, процессировать их и высокоэффективно презентировать антигены Тлимфоцитам. Таким образом, кДК способны индуцировать иммунитет к любым
чужеродным АГ, проникающим в ткани, а также запускать толерантность к собственным
АГ.
кДК конститутивно экспрессируют гематопоэтические маркеры CD45, MHC II, Flt3
и CD11c, а линейно-специфические маркеры Т- и В-лимфоцитов, натуральных киллеров,
гранулоцитов и эритроцитов у них отсутствуют [28]. Классические ДК можно
классифицировать по месту локализации на мигрирующие нелимфоидные кДК и
лимфоидно-резидентные кДК, не покидающие лимфоидные органы всю жизнь.
Классические ДК мыши
кДК нелимфоидных тканей составляют 1-5% клеток тканей в зависимости от
конкретного органа и состоят из двух субпопуляций: CD103+CD11b‾ и CD11b+ кДК (Рис.
3). CD103+CD11b‾ кДК заселяют большинство соединительных тканей. В процентном
отношении CD103+ кДК среди общего количества кДК составляют около 20-30%. Следует
отметить, что CD103+CD11b‾ ДК имеют то же происхождение, что и CD8+ лимфоиднорезидентные ДК, и выполняют схожие функции. Это главные АПК, способные наиболее
эффективно кросс-презентировать АГ наивным Т-лимфоцитам по сравнению с другими
субпопуляциями ДК [51] (Рис. 3).
19
Рис. 3. Субпопуляции классических ДК мыши.
Как нелимфоидные CD11b+ кДК, так и лимфоидно-резидентные кДК, играют
главную роль в презентации АГ с помощью молекул MHC II. По сравнению с CD8+ кДК в
них с более высокой эффективностью экспрессируются гены, которые кодируют белки,
вовлеченные в презентацию экзогенных АГ с помощью молекул МНС II [52] (Рис. 3).
В эпидермальном слое кожи существует третья субпопуляция кДК – клетки
Лангерганса. Они составляют 2-4% от общего количества эпидермальных клеток,
плотность составляет приблизительно 200-1000 клеток/мм2 [53]. Клетки Лангерганса
характеризуются низким уровнем экспрессии МНС II, средним уровнем CD11c и очень
высоким уровнем CD207 (лектиновым лангерином С-типа). Их главная функция
заключается в обеспечении противовирусного иммунитета. Клетки Лангерганса способны
запускать противовирусный CD8+ Т-клеточный ответ против разнообразных вирусных
патогенов за исключением цитолитических вирусов, таких как вирусы простого герпеса и
осповакцины, поскольку они обладают способностью индуцировать апоптоз ДК, в том
числе и клеток Лангерганса [54].
Резидентные кДК лимфоидных органов дифференцируются и проводят всю свою
жизнь внутри лимфоидных органов (селезенка, лимфатические узлы). кДК селезенки
представлены
исключительно
лимфоидно-резидентными
ДК,
в
то
время
как
лимфатические узлы помимо этих клеток также содержат мигрирующие кДК из
нелимфоидных органов. Резидентные кДК лимфоидных тканей в основном состоят из
двух субпопуляций, CD8+ и CD11b+ кДК [55] (Рис. 3).
20
CD8+ ДК составляют 20-40% от кДК селезенки и лимфатических узлов. CD8+ ДК
экспрессируют CD8α, но не CD8αβ, который в основном экспрессируется CD8+ Тлимфоцитами. В отличие от мигрирующих ДК, которые прибывают в лимфатические
узлы в зрелом состоянии, лимфоидные CD8+ кДК в нормальном состоянии являются
фенотипически
незрелыми.
Созревание
резидентных
кДК
лимфоидных
органов
происходит при их стимуляции продуктами микробного происхождения или при
выделении кДК из лимфоидных тканей и культивировании in vitro [28].
CD11b+ ДК преобладают среди лимфоидно-резидентных популяций кДК во всех
лимфоидных тканях за исключением тимуса. Эти клетки продуцируют высокие уровни
хемокинов CCL17 и CCL22, привлекающие CD4+ Т-клетки [28].
Классические ДК человека
Главное отличие кДК человека от кДК мыши заключается в совершенно
отличающемся спектре поверхностных маркеров. кДК человека подразделяются на кДК
крови и нелимфоидных тканей, а также резидентные кДК лимфоидных тканей (Рис. 4).
Человеческие кДК крови характеризуются Lin−MHC-II+CD11c+ фенотипом, хотя у
человека CD11c также экспрессируется на большинстве моноцитов и макрофагов. У
человека
в
кровотоке
представлены
две
субпопуляции
кДК,
экспрессирующие
неперекрывающиеся маркеры CD1c (BDCA1) или CD141 (BDCA3). CD1c+ ДК являются
доминирующей субпопуляцией ДК периферической крови, тогда как CD141+ ДК
формируют короткоживущую популяцию [28] (Рис. 4).
Рис. 4. Субпопуляции классических ДК человека.
21
К кДК нелимфоидных тканей относятся CD1a+CD14‾ ДК, CD1a‾CD14+ ДК [56],
отдельная субпопуляция CD141+ ДК, берущая начало от CD141+ ДК периферической
крови и экспрессирующая самые высокие уровни Flt3 среди кожных ДК [57]. Также к кДК
нелимфоидных тканей относят клетки Лангерганса, характеризующиеся экспрессией
маркеров CD45, MHC II, адгезионных молекул эпителиальных клеток (EpCAM) и
лектинового лангерина, а также CD1a, члена семейства CD1 белков, обладающих
свойством презентировать липидные антигены Т клеткам [28] (Рис. 4)
Резидентные кДК лимфоидных тканей состоят из субпопуляций CD1c+ и CD141+
кДК, имеющих сходство с ДК крови. Было показано присутствие CD141+ и CD1c+ кДК в
резидентной и мигрирующей фракции кДК лимфатических узлов. Это говорит о том, что
кожные CD141+ и CD1c+ кДК способны мигрировать в лимфатические узлы [57]. Клетки
лимфатических
узлов
также
MHC IIhighCD11cintEpCAM+CD1a+
включают
клетки,
EpCAM−CD1a+ клетки и CD206+ клетки, классифицированные, как мигрирующие клетки
Лангерганса, мигрирующие кожные CD1a+ ДК и кожные CD14+ ДК, соответственно [58]
(Рис.
4).
Большинство
кДК
тимуса
человека
характеризуются
фенотипом
CD11c+CD11b‾CD45ROlow, у них отсутствуют миелоидные маркеры, экспрессирующиеся
на CD141+ ДК человека и CD8+ ДК мыши.
1.3. Функции ДК
1.3.1. Презентация антигенов ДК с помощью молекул MHC II
Профессиональные
АПК,
такие
как
ДК,
макрофаги
и
В-лимфоциты,
характеризуются прежде всего высоким уровнем экспрессии молекул МНС II на
клеточной поверхности. Практически все субпопуляции ДК способны поглощать
экзогенные АГ, процессировать их и презентировать в комплексах с молекулами МНС II
CD4+ Т-лимфоцитам и запускать Т-хелперный иммунный ответ разных типов. Для
эффективного запуска Т хелперного ответа помимо комплексов МНС II–АГ ДК требуется
наличие ко-стимулирующих и адгезионных молекул (CD80, CD86, CD40 и др.) на
поверхности клеток, а также синтез определенных цитокинов, таких как ИЛ-12, ИФН-γ
(Th1 ответ), ИЛ-4 (Th2 ответ) или ИЛ-23 (Th17 ответ) [59] (Рис. 1, 5).
На Рис. 5 представлены события презентации экзогенных АГ ДК с помощью
MHC II. Молекула МНС II является гетеродимером и состоит из двух гомогенных
пептидов, α- и β-цепей, которые собираются в ЭПР и соединяются с инвариантной цепью
(Ii)
(Рис.
5).
Комплексы
МНС II/Ii
транспортируются
22
в
поздние
эндосомы,
Рис. 5. Презентация экзогенных АГ ДК с помощью молекул МНС класса II [60].
называемые
МНС II
компартментами
(MIIC).
Транспорт
регулируется
двумя
дилейциновыми мотивами, расположенными на цитоплазматическом конце инвариантной
цепи, которые узнаются сортировочными адаптерами АР1 (адаптор транс-аппарата
Гольджи) и АР2 (адаптор плазматической мембраны). Эндоцитозный путь транспорта
молекул МНС II с плазматической мембраны к MIIC, являющийся АР2 зависимым,
преобладает у незрелых ДК, тогда как АР1 зависимый транспорт из транс-аппарата
Гольджи характерен для зрелых ДК [60].
В MIIC инвариантная цепь отщепляется от молекулы МНС II с помощью протеаз
катепсинов S и L, причем в пептид-связывающей бороздке МНС II остается класс IIассоциированный Ii пептид (CLIP). Для обмена пептида CLIP на высокоаффинный
антигенный пептид молекулам МНС II требуется наличие белка-шаперона H2-DM у
мыши или HLA-DM у человека. Следует отметить, что при презентации АГ с помощью
молекул МНС II ДК используют вакуолярный путь процессинга АГ, где захваченные
белки расщепляются на пептиды с помощью лизосомальных протеаз.
23
Образующиеся комплексы МНС II/пептид транспортируются в везикулах к
плазматической мембране с помощью быстрого микротрубочкового транспорта с
участием моторных белков динеина (входящий транспорт) и кинезина (исходящий
транспорт), а также медленного транспорта с участием актин-миозиновых моторных
белков. ДК являются уникальными клетками, поскольку транспорт везикул, содержащих
комплексы МНС II/пептид, от MIIC к плазматической мембране регулируется сигналами
созревания, которые индуцируют формирование микротрубочек, берущих начало от MIIC,
создавая сложную сеть транспортных везикул и трубочек, сливающихся с плазматической
мембраной [61].
Следует также отметить, что эффективность презентации АГ с помощью молекул
МНС II находится в обратной зависимости от (1) чувствительности белковых АГ к
деградации и (2) концентрации и активности протеолитических ферментов в поздних
эндосомах. ДК отличаются от других фагоцитирующих клеток (например, макрофагов)
значительно более низкими уровнями экспрессии лизосомальных протеаз, а также
сниженной протеолитической активностью протеаз, связанной с высоким уровнем рН в
эндосомальных компартментах, который является результатом низкой активности VАТФазы и повышенной активности НАДФН оксидазы 2 [62].
1.3.2. Кросс-презентация АГ с помощью молекул MHC I
Кросс-презентацией называют презентацию экзогенных АГ с помощью молекул
МНС I, которая необходима для запуска цитотоксического CD8+ Т-клеточного ответа
(Рис. 6). ДК являются уникальными АПК, поскольку только они способны кросспрезентировать АГ наивным CD8+ Т-лимфоцитам [22]. Эта способность является
необходимой для иммунного надзора и позволяет иммунной системе идентифицировать
опухоли и вирусы, не инфицирующие ДК. Следует отметить, что не все субпопуляции ДК
обладают способностью к эффективной кросс-презентации. Наиболее эффективными
кросс-презентерами у мыши являются CD103+CD11b− мигрирующие ДК и CD8+CD11b−
резидентные ДК лимфоидных органов [51], у человека – CD141+ ДК [22].
Молекулы МНС I экспрессируются всеми ядросодержащими клетками. Основной
функцией MHC I молекул для всех клеток организма является презентация собственных
АГ клеткам иммунной системы с целью сигнализирования о том, что данная клетка не
чужеродна и является собственной клеткой организма. Молекула МНС I является
гетеродимерным белком, состоящим из полиморфной тяжелой цепи и легкой цепи,
называемой
β2-микроглобулином.
Полиморфизм
тяжелой
цепи
обеспечивает
разнообразие пептид-связывающих полостей на молекулах МНС I, что позволяет узнавать
24
Рис. 6. Кросс-презентация экзогенных
АГ ДК с помощью молекул МНС класса
I [60].
уникальные антигенные пептиды благодаря различиям в якорных остатках, к которым они
прикрепляются [60].
Молекулы МНС I собираются в ЭПР и перед присоединением пептидов
удерживаются там благодаря взаимодействию с белками-шаперонами, такими как
кальнексин, кальретикулин, ERp57, PDI и тапазин. Гетеродимеры МНС I по своей природе
являются неустойчивыми, и в отсутствие подходящего пептида легко диссоциируют в
физиологических условиях.
Антигенные
пептиды
для
кросс-презентации,
прошедшие
процессинг,
транспортируются ТАР белками к молекулам МНС I в ЭПР. Пептид-связывающая полость
в MHC I вмещает в себя пептиды длиной от 8 до 10 аминокислотных остатков в
зависимости
от
гаплотипа
МНС.
Пептиды
прикрепляются
к
якорным
последовательностям в молекуле МНС I преимущественно с помощью N- и C-концевых
остатков, а также с помощью некоторых боковых цепей внутримолекулярных остатков
[63]. Связывание пептида с молекулой МНС I приводит к стабилизации взаимодействия
между тяжелыми и легкими цепями молекул МНС I, высвобождению шаперонов, после
чего полностью собранный комплекс MHC I/пептид становится способным покинуть ЭПР
для презентации на клеточной поверхности. Этот механизм не позволяет пустым
молекулам MHC I транспортироваться на плазматическую мембрану и взаимодействовать
25
там с экзогенными АГ. Пептиды и молекулы MHC I, которые не связались в ЭПР,
возвращаются в цитозоль для деградации [64].
Нет прямого доказательства того, что взаимодействие пептидов с молекулами МНС I
происходит только в ЭПР. Присутствие ТАР и МНС I молекул в фагосомах и эндосомах
может свидетельствовать о том, что образование комплексов МНС I/пептид способно
происходить в этих компартментах. Таким образом, кросс-презентация и классическая
презентация эндогенных АГ может пространственно и механистически разграничиваться
в ДК [65].
1.3.3. Процессинг АГ и образование комплексов с МНС I
Существуют два основных механизма процессинга АГ при кросс-презентации –
вакуолярный и цитозольный, которые могут быть задействованы по отдельности или
сразу оба в зависимости от типа кросс-презентируемого АГ.
1.3.3.1. Вакуолярный путь процессинга АГ
При вакуолярном пути процессинга АГ, по-видимому, являющемся ТАРнезависимым, кросс-презентируемые АГ процессируются и связываются с молекулами
МНС I внутри эндосом/фагосом. Ранее считали, что молекулы МНС I, присутствующие в
эндосомах, спонтанно захватываются с плазматической мембраны. Однако позже был
установлен дополнительный механизм, в котором шаперон CD74 способствовал
транспортировке вновь синтезированных молекул МНС I из ЭПР в эндоцитозные
компартменты в ДК [66].
Генерация кросс-презентируемых пептидов при вакуолярном пути процессинга
подавляется ингибиторами цистеиновых протеаз, например лейпептином, но проявляет
устойчивость
к
ингибиторам
протеасомы.
Основной
цистеиновой
протеазой,
участвующей в фагосоме в процессинге АГ для кросс-презентации, является катепсин S.
Так показано, что катепсин S-дефицитные мыши имели дефекты в вакуолярной, но не
цитозольной кросс-презентации АГ в ДК [67]. По-видимому, катепсин S играет важную
роль, поскольку в отличие от других катепсинов обладает высокой активностью при
нейтральном рН и способен производить пептиды подходящей длины в 8-9
аминокислотных остатков [67].
Помимо катепсина S в синтезе кросс-презентируемых пептидов в цитозольном пути
процессинга АГ участвует инсулин-регулируемая аминопептидаза IRAP, родственная
аминопептидазам ЭПР ERAP1 и ERAP2. IRAP локализуется в эндосомальных
компартментах и укорачивает процессируемые пептиды с N-конца. Дефицит IRAP
26
приводил к нарушению кросс-презентации АГ в CD8+ и CD8− субпопуляциях ДК, причем
в большей степени в субпопуляции CD8+ ДК [68, 69].
1.3.3.2. Цитозольный путь процессинга АГ
Множество исследований подтверждает, что цитозольный путь играет главную роль
в процессинге АГ ДК [67]. Было показано, что блокирование вакуолярного пути
процессинга АГ слабо ингибирует кросс-презентацию и даже может усиливать ее, тогда
как ингибиторы протеасомы и транспорта аппарата Гольджи, лактацистин и брефелдин А,
соответственно, полностью ингибируют способность ДК кросс-презентировать АГ CD8+
Т-лимфоцитам [70].
При цитозольном пути АГ транспортируются из фагосом в цитозоль, где
процессируются для кросс-презентации подобно эндогенным АГ путем протеасомного
протеолиза. Механизм транспорта АГ из эндосом в цитозоль остается не до конца
установленным. Предполагается, что в нем может участвовать ЭПР-ассоциированная
машина деградации (ERAD машина), в частности, входящие в ее состав белки SEC61 и
р97 [71]. Транслокация АГ, захваченных ДК с помощью маннозных рецепторов (МР),
контролируется убиквитинированием цитозольных участков МР. Белок р97, являющийся
АТФазой,
привлекается
к
мембране
эндосом/фагосом
взаимодействием
с
полиубиквитинированными МР [72]. Альтернативным механизмом выхода АГ из эндосом
в цитозоль может служить простая дестабилизация мембраны эндосомы активными
формами кислорода, активно продуцирующимися в эндоцитозных компартментах ДК
[73].
После выхода в цитозоль АГ подвергаются протеасомному процессингу. В отличие
от большинства клеток, экспрессирующих стандартную протеасому, ДК, вне зависимости
от своего статуса зрелости, вместе со стандартной протеасомой конститутивно
экспрессируют иммунопротеасому, главным отличием которой является другой спектр
процессированных пептидов [74]. Незрелые ДК экспрессируют одинаковые уровни
стандартной протеасомы и иммунопротеасомы. При воздействии про-воспалительных
факторов (ИФН первого и второго типа, ФНОα и др.) или инфекции происходит
созревание ДК, при этом стимулируется синтез субъединиц иммунопротеасомы. Тем не
менее, ее процентное содержание относительно стандартной протеасомы слабо
изменяется в связи с тем, что иммунопротеасома обладает значительно меньшим
периодом полужизни по сравнению со стандартной протеасомой [75].
27
Рис. 7. Структура иммунопротеасомы [76].
Стандартная протеасома (20S конститутивная протеасома) имеет цилиндрическую
структуру, состоящую из двух внешних α- и двух внутренних β-колец (Рис. 7). В
стандартной протеасоме два внутренних β-кольца выполняют каталитическую функцию,
главным образом, за счет активных сайтов β1, β2 и β5 субъединиц. В иммунопротеасоме
конститутивно экспрессируемые каталитические β-субъединицы стандартной протеасомы
заменяются на индуцибельные β-аналоги: β1i (также известный, как LMP2; PSMB9); β2i
(MECL-1, PSMB10) и β5i (LMP7; PSMB8). Иммунопротеасома аггрегирует с активаторами
протеасомы PA700 (19S) или РА28α/β (11S), или с комбинацией этих активаторов,
формируя три различных типа иммунопротеасомы (см. Рис.7).
Подобно стандартным каталитическим β-субъединицам, индуцибельные β1i, β2i и
β5i субъединицы обладают каспазо-, трипсин и химотрипсин-подобной протеолитической
активностью, соответственно, и преимущественно расщепляют белковые субстраты после
кислых, основных и гидрофобных аминокислотных остатков. Однако по сравнению со
стандартной протеасомой иммунопротеасома характеризуется повышенной химотрипсини трипсин-подобной активностью и сниженной каспазо-подобной активностью. Эти
ферментативные свойства обеспечивают продукцию антигенных пептидов с высоким
сродством С-концевых остатков к якорным последовательностям молекул МНС I [76].
Помимо этих двух типов протеасом были обнаружены промежуточные протеасомы
β1β2β5i и β1iβ2β5i, содержащие субъединицы как стандартной протеасомы, так и
иммунопротеасомы. Такие протеасомы были обнаружены в человеческих опухолях, но
также широко представлены и в нормальных тканях. Обычно опухоли содержат около 2030%
промежуточных
протеасом.
Большое
количество
антигенных
пептидов
процессируется промежуточными протеасомами и иммунопротеасомой одинаковым
образом. Но некоторые пептиды уникально процессируются только промежуточными
протеасомами, например, ОАГ меланомы MAGE-A3271-279 и MAGE-A10254-262 [77].
Поэтому классические ДК, которые также экспрессируют промежуточные протеасомы,
28
способны эффективно запускать антигенспецифические реакции противоопухолевого
иммунного ответа.
Стандартная протеасома и иммунопротеасома, обладая различной специфичностью
расщепления субстрата, продуцируют отличающиеся, частично перекрывающиеся наборы
пептидов [77]. Например, в отличие от стандартной протеасомы иммунопротеасома не
способна генерировать опухолевые эпитопы, такие как RU1, Melan-A и gp100,
содержащие разветвленную цепь валина на С-конце. Это может быть связано с
отсутствием β1 субъединицы в составе иммунопротеасомы, отвечающей за расщепление
субстрата после аминокислотных остатков с разветвленной боковой цепью [74].
Работа иммунопротеасомы обеспечивает разнообразие репертуара презентируемых
пептидов, что способствует усилению реакций адаптивного иммунного ответа [76, 77].
Кроме этого, индукция иммунопротеасомы может являться механизмом контроля
развития аутоиммунитета. В месте инфекции клетками врожденной иммунной системы
выделяются про-воспалительные факторы, в том числе ИФН-γ, который способствует
индукции иммунопротеасомы в инфицированных клетках, что приводит к изменению
репертуара презентируемых собственных АГ и усилению презентации патогенных
пептидов. ДК, захватывающие антигенные белки в месте инфекции, подвергаются
созреванию под действием тех же про-воспалительных медиаторов, мигрируют в
региональные лимфатические узлы и презентируют АГ, что в итоге приводит к индукции
ЦТЛ, специфичных к пептидам, генерированным иммунопротеасомой. Эти ЦТЛ
мигрируют к сайту инфекции, уничтожают инфицированные клетки, но не действуют на
нормальные клетки, чей набор презентируемых пептидов был произведен стандартной
протеасомой, а не иммунопротеасомой. Таким способом ограничивается разрушение
нормальных тканей и индукция аутоиммунных реакций [78].
Антигенные пептиды, генерированные протеасомой и/или иммунопротеасомой,
транспортируются в просвет ЭПР с помощью ТАР белков, где гидролизуются
терминальной аминопептидазой ERAP1 до пептидов подходящей длины для нагрузки
молекул МНС I и дальнейшей кросс-презентации CD8+ Т-лимфоцитам.
1.3.4. Кросс-дрессинг ДК
Помимо прямой презентации и кросс-презентации экзогенных АГ существует
дополнительный механизм презентации АГ, называемый кросс-дрессингом, когда ДК
захватывают готовые комплексы МНС I/антигенный пептид из мертвых опухолевых
клеток. Кросс-дрессинг опосредован секретируемыми экзосомами, а также трогоцитозом –
процессом, в результате которого происходит обмен участками клеточных мембран и
29
мембранных белков между клетками. Это позволяет ДК презентировать непосредственно
захваченные АГ без дальнейшего процессинга. В отличие от кросс-презентации АГ, при
которой активируются CD8+ ЦТЛ, направленные на пептиды, процессированные ДК,
кросс-дрессинг способствует активации CD8+ Т-лимфоцитов, специфичных к пептидам,
генерированным самой опухолевой клеткой, что может усиливать антигенспецифичность
противоопухолевого иммунного ответа. В кросс-дрессинге способны принимать участие
CD8α+/CD103+ ДК, активирующие и наивные CD8+ Т-лимфоциты, и CD8+ Т-клетки
памяти [79-81].
1.3.5. Индукция функции кросс-презентации ДК
Ранние предшественники CD8+ ДК не обладают функцией кросс-презентации, эта
способность приобретается на последнем этапе созревания ДК при стимуляции
микробными продуктами, например, TLR-лигандами или цитокинами, такими как ГМКСФ.
Поэтому
эффективная
кросс-презентация
характерна
для
субпопуляций
периферических ДК при воспалении и инфекции.
Было показано, что CD8+CD103− ДК, выделенные из селезенки интактной мыши,
были малоэффективными в кросс-презентации АГ с помощью молекул МНС I в среде в
отсутствие лигандов TLR и цитокинов, но эффективно презентировали АГ с помощью
молекул МНС II [82]. Для запуска кросс-презентации требовались дополнительные
активационные факторы, что указывает на регулируемость этого свойства CD8+ ДК.
TLR-лиганды не только активируют созревание CD8+ ДК, но и способствуют
увеличению уровня экспрессии ко-стимулирующих и адгезионных молекул на их
поверхности, а также способны оказывать влияние на процессинг АГ CD8+ ДК и
усиливать кросс-презентацию АГ [82].
Помимо микробных продуктов, таких как TLR лиганды, индукцию функции кросспрезентации у ранних предшественников CD8+ ДК может запускать ГМ-КСФ. В
нормальном состоянии ГМ-КСФ продуцируется на низком базальном уровне, но при
инфекции или воспалении его продукция резко возрастает. Индукция функции кросспрезентации ДК под действием ГМ-КСФ не сопровождается увеличением экспрессии
стандартных маркеров активации ДК – МНС II, CD80, CD86 или CD40, однако
наблюдается усиление экспрессии одного поверхностного маркера ДК – CD103,
ключевого маркера мигрирующих ДК.
Механизм индукции кросс-презентации у CD8+ ДК под действием этих факторов не
до конца ясен, но может заключаться в усилении протеасомной активности ДК, индукции
30
транспорта ТАР белков к ранним эндосомам или усилении транспорта АГ из ранних
эндосом в цитозоль [82].
При отсутствии «сигналов опасности» в нормальном состоянии кросс-презентация
является важным механизмом для индукции и поддержания толерантности, направленной
на собственные АГ. Так, CD8+ ДК тимуса обладают способностью к кросс-презентации в
нормальных условиях и участвуют в уничтожении развивающихся аутореактивных Т
клеток [82].
1.3.6. Презентация липидных антигенов ДК с помощью молекул CD1
Презентация липидных АГ с помощью молекул CD1 представляет путь стимуляции
Т-лимфоцитов, не зависимый от молекул МНС I и II. По своему строению белки СD1
похожи на МНС I, поскольку представляют собой гетеродимер, состоящий из тяжелой
цепи CD1, нековалентно связанной с β2-микроглобулином. У человека экспрессируются
пять белков CD1: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d и CD1e, тогда как у мыши экспрессируется
всего лишь один белок CD1d. Строение и функции данных белков имеют небольшие
отличия, однако их общая главная функция – представлять антигены липидной природы
CD1-рестрикированным Т-лимфоцитам. Молекулы CD1 экспрессируются главным
образом на поверхности ДК и других профессиональных АПК. CD1a, CD1b, и CD1c
широко используются в качестве маркеров человеческих ДК. Клетки Лангерганса
экспрессируют CD1a и CD1c, но не CD1d. Молекулы CD1d экспрессируются ДК мыши
[83].
С помощью CD1а, CD1b, CD1c и, возможно, CD1d происходит презентация Тлимфоцитам микробных липидных и липопептидных антигенов, таких как миколовая
кислота, фосфатидилинозитол маннозид, липоарабиноманнан, дидегидроксимикобактин и
др. Кроме того, CD1d, а в некоторых случаях и CD1а, CD1b, CD1c, способны представлять
собственные липидные антигены. Т-лимфоциты опознают комплексы CD1-антиген с
помощью Т-клеточных рецепторов (ТКР), практически не отличающихся по своему
строению
от
ТКР,
взаимодействующих
с
комплексами
МНС-антиген.
CD1-
рестриктированные ТКР, распознающие чужеродные антигены, способны различать даже
небольшие изменения в структуре гидрофильной группы липидного антигена [83].
CD1-рестриктированные Т-лимфоциты принимают участие в иммунных реакциях
против бактериальных (Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Borrelia
burgdorferi и др.), паразитарных (Leishmania major, Tripanosoma cruzi, Toxoplasma gondii и
др.), вирусных (вирус простого герпеса 1 и 2 типа, вирус коксаки В3, вирус гепатита В и
31
др)
и
грибковых
(Cryptococcus
neoformans)
инфекций.
Кроме
этого,
CD1d-
рестриктированные Т-клетки потенциально обладают противоопухолевым действием, при
этом требуется дополнительное участие клеток врожденного иммунитета. АПК,
экспрессирующие
CD1,
также
обнаруживаются
при
развитии
хронических
воспалительных реакций, сопровождающих аутоиммунные заболевания [83].
1.4. Уход опухоли от иммунного надзора путем подавления функций ДК
Известно, что ДК во многих видах опухолей являются функционально аномальными
[84-86]. Более того, прямая супрессия пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов
опухолью или опухолевым окружением и подавление дифференцировки ДК составляют
важный механизм ухода опухоли от действия иммунной системы. В этой части будет
рассмотрено неблагоприятное действие опухоли и ее окружения на функциональную
активность ДК, обеспечивающую специфическую активацию эффекторных CD4 + и CD8+
Т-лимфоцитов.
1.4.1. Опухолевая строма
Важным
компонентом,
обеспечивающим
сопротивление
опухоли
иммунной
системе, является опухолевая строма. Строма состоит из фибробластов, эндотелиальных
клеток, а также компонентов внеклеточного матрикса и воспалительного инфильтрата,
локализующегося внутри опухолевой стромы, в состав которого входят, в частности,
спинно-мозговые
супрессорные
опухолеспецифические
клетки
макрофаги
миелоидного
(TAM)
[87, 88].
происхождения
Клетки
(MDSC)
опухолевой
и
стромы
продуцируют множество факторов, включающих цитокины, хемокины, ростовые
факторы,
гормоны,
простагландины,
соли
молочной
кислоты
и
ганглиозиды,
способствующих подавлению ДК-опосредованных эффекторных CD4+ и CD8+ Тклеточных ответов и индукции Т-регуляторных клеток [89, 90]. Кроме того, описаны
прямые химические или ферментативные взаимодействия между продуктами лейкоцитов
и клонами опухолеспецифических Т-лимфоцитов, как, например, нитротирозинирование
Т-клеточных рецепторов и молекул CD8, что приводит к ослаблению противоопухолевых
функций Т-лимфоцитов [91]. Взаимодействие между всеми этими факторами и
популяциями клеток определяет опухолевое окружение [85, 86].
1.4.2. Механизмы подавления опухолью функций ДК
Существует несколько механизмов подавления опухолью или даже «выключение»
функции ДК. Во-первых, опухоль может препятствовать проникновению (инфильтрации)
ДК и преДК в опухолевую ткань. Однако есть данные, что большинство опухолей
32
инфильтрированы даже большим количеством ДК, чем нормальные ткани [92, 93]. Это
объясняется тем, что опухолевые клетки могут продуцировать хемокины, такие как MIP3α,
являющиеся
«выборочно
хемотаксичными»
именно
для
незрелых
ДК,
экспрессирующих рецептор CCR6 к MIP-3α [93]. Во-вторых, опухоль может подавлять
созревание инфильтрирующих незрелых ДК, что может привести в результате к развитию
Т-клеточной толерантности. Действительно, у макрофагов и ДК в лейкоцитарном
инфильтрате определенных типов опухолей наблюдается повышенная экспрессия костимулирующих молекул, однако способность таких ДК презентировать АГ значительно
ослаблена [85, 94].
В-третьих, фагоцитоз и процессинг в ДК растворимых ОАГ могут быть подавлены
или полностью блокированы. Так у ДК, взятых у пациентов с раком почки, наблюдалось
снижение эффективности поглощения АГ [92]. Ингибирование фагоцитоза ДК часто
связывают с секрецией васкулярного эндотелиального ростового фактора (VEGF), одного
из важнейших иммуносупрессорных цитокинов, продуцируемых опухолью [95]. В
нескольких работах показана взаимосвязь между повышенным уровнем VEGF в
сыворотке пациентов, страдающих опухолевыми заболеваниями, и количеством и
функциональностью циркулирующих ДК [96, 97]. Было показано, что блокада VEGF
приводит к увеличению захвата АГ и миграционной способности опухолеспецифических
ДК [95].
В-четвертых, миграция ДК из опухоли в лимфатические узлы может быть подавлена,
что рассматривается как еще один механизм ухода опухоли от иммунного ответа [90].
1.4.2.1. Подавление опухолью миграции ДК
Предположение о негативном влиянии факторов опухолевого происхождения на
инфильтрацию опухоли ДК было высказано Беллом и коллегами, которые первыми
описали незрелый фенотип инфильтрирующих опухоль ДК [93]. Было предположено, что
высокое содержание незрелых ДК или клеток Лангерганса в опухолях связано с их
повышенной миграцией. Действительно, цитокины и ростовые факторы, такие как ИЛ-10,
ФРО-β, VEGF [85], так же хорошо гиперэкспрессируются в опухолевой ткани, как и
факторы-хемоаттрактанты MIP-3α/CCL20 [93]. С другой стороны, такие факторы, как
например, ганглиозиды, ингибирующие миграцию ДК, также представлены в опухолевой
ткани. Оба механизма могут регулировать рекрутинг и миграцию ДК в опухолевое
окружение.
33
ДК, характеризующиеся фенотипами покоящихся, неактивированных и незрелых
клеток, обнаружены в опухолевых тканях и инфильтрирующих опухоль лимфатических
узлах как у животных-опухоленосителей, так и у пациентов с раковыми заболеваниями
[76, 98-101]. Ранние исследования показали, что пациенты с высоким количеством ДК в
опухолевой строме, имели большую продолжительность жизни по сравнению с
пациентами с малым количеством ДК или их отсутствием в опухолевой ткани [102].
Однако в более поздних исследованиях было показано, что пациенты с раком кишечника с
относительно высоким количеством зрелых CD208+ ДК в опухолевом эпителии имели
заметно меньшую выживаемость [103]. Кроме того, пациенты с относительно большим
количеством CD1a+ ДК по периферии опухоли имели заметно меньший уровень
выживаемости после удаления опухоли. При раке молочной железы часто наблюдают
инфильтрацию опухолевой ткани зрелыми ДК, однако эти ДК запускают CD4 + Тхелперный ответ, связанный с секрецией ИЛ-13, что способствует росту опухоли [104]. В
противоположность этому у пациентов с прогрессирующей меланомой (фаза III B или С и
IV), получавших терапию ГМ-КСФ, который вызывает значительное увеличение
количества зрелых ДК, наблюдалась ремиссия заболевания или задержка рецидивов [105].
Иммуносупрессивное давление опухоли вызывает уменьшение количества классических
ДК, но почти не влияет на количество плазмацитоидных ДК [36, 98]. В целом, правомерно
предполагать, что незрелые костно-мозговые ДК, обнаруженные при различных видах
опухолей у человека, а также незрелые плазмацитоидные ДК имеют отрицательное
влияние на иммунную защиту организма против опухолей.
1.4.2.2 Роль воспаления в подавлении функции ДК и прогрессии опухоли
15-20% случаев злокачественных
новообразований
связаны с хроническим
воспалением. Это опухоли пищевода, желудка, печени, поджелудочной железы,
кишечника и т.д [106]. Медиаторы воспаления могут вырабатываться самими
опухолевыми клетками. В нескольких работах было показано, что развитию опухоли
способствуют клетки предопухолевой стромы, в состав которой входят различные
популяции лейкоцитов, в частности супрессорные клетки миелоидного происхождения
(MDSCs) [87] и опухолеспецифические макрофаги (TAM) [88].
Медиаторы воспаления могут вызывать лейкопению и влиять на ангиогенез, а также
влиять на выживаемость опухолевых клеток, их подвижность и хемотаксис [107]. Было
показано, что воспалительные хемокины CCL2 и CCL5, продуцируемые клетками
опухоли молочной железы, сдвигают баланс между различными популяциями лейкоцитов
в опухолевой строме в сторону «вредоносных» опухолеспецифичных макрофагов и
34
ингибируют опухолеспецифические Т-лимфоциты. Более того, оба хемокина действуют
непосредственно на опухолевые клетки и увеличивают их миграционный и инвазивный
потенциал [108]. При хроническом воспалении наблюдают активацию клеточных
онкогенов MYC, RAS, RET и BREF [107].
Известной чертой многих опухолевых клеток является гиперэкспрессия белка
STAT3, запускаемая основными онкогенами и цитокинами. STAT3 активирует
экспрессию нескольких иммуносупрессивных цитокинов, включая ИЛ-10 и ФРО-β и
супрессирует Th1 ответ. Экспрессия STAT3 опухолевыми клетками вызывает продукцию
STAT3 различными лейкоцитами, включая и ДК, взаимодействующие с опухолевыми
клетками, и приводит к различным вредным последствиям. В частности, экспрессия
STAT3 у опухолеспецифических ДК вызывает снижение экспрессии ко-стимулирующих
молекул и MHC II молекул и активирует экспрессию ФРО-β. Опухолевая прогрессия
также коррелирует с накоплением незрелых ДК, которые индуцируют пролиферацию
регуляторных Т-лимфоцитов (Tрег клеток) в инфильтрованных опухолью лимфоузлах.
1.4.2.3. Роль экзосом, выделяемых опухолевыми клетками, в подавлении функций ДК
Опухолевые
клетки
способны
секретировать
микровезикулы,
называемые
экзосомами, с помощью которых злокачественные клетки способны оказывать
разнообразные эффекты как на себя (аутокринно), так и на другие опухолевые клетки и
клетки микроокружения опухоли (паракринно), и даже клетки других органов и тканей
(эндокринно) [109]. Экзосомы представляют собой сферические или чашеобразные
везикулы размером от 30 до 100 нм, экспрессирующие на своей поверхности
специфические молекулярные маркеры (такие как тетраспанины CD9, CD81 и CD63;
молекулы CD80, CD86, MHC I, MHC II и другие) [110]. Экзосомы опухолевых клеток
являются одной из составляющих механизма подавления функции иммунных клеток и
ухода от иммунного надзора.
Было обнаружено, что экзосомы опухолевых клеток способны подавлять иммунную
систему с помощью нескольких механизмов, таких как, снижение количества и
подавление функций ДК, ослабление пролиферации и цитотоксичности натуральных
киллеров и Т-лимфоцитов, а также увеличение количества иммуносупрессивных клеток
(MDSC и Т-регуляторных клеток) [109, 110].
При
воздействии
на
ДК
опухолевые
экзосомы
способствуют
усилению
фосфорилирования STAT3 и экспрессии ИЛ-6 ДК, таким образом, снижая как активность
ДК, так и их количество путем ингибирования дифференцировки CD14+ моноцитов в
35
незрелые ДК. Более того, в этом случае CD14+ клетки дифференцируются в HLA-DR−/low
клетки, синтезирующие ФРО-β, ингибирующий функции Т-лимфоцитов [109].
1.4.3. Роль опухолевого окружения в подавлении функций ДК
1.4.3.1. Цитокины и ростовые факторы при опухолевой прогрессии
М-КСФ и ИЛ-6 являются важными факторами, участвующими в процессе
дифференцировки моноцитов [111, 112]. Оба этих цитокина обнаруживаются в сыворотке
крови онкологических больных и коррелируют с неблагоприятным прогнозом [113-115].
Эксперименты in vitro с использованием супернатантов опухолевых клеток
показали, что М-КСФ и ИЛ-6 подавляют дифференцировку ДК [116]. Неблагоприятный
эффект для ДК заключается в увеличении экспрессии рецепторов к М-КСФ параллельно
со снижением количества α-рецепторов к ГМ-КСФ у преДК. Высокий уровень ИЛ-4,
необходимого для дифференцировки ДК in vitro, может частично снизить уровень этих
неблагоприятных эффектов [117]. Тем не менее, ИЛ-4, вырабатываемый фибробластами
опухолевой стромы, переключает дифференцировку моноцитов от ДК к макрофагам [118].
Подобные явления характерны и для ИЛ-10, продуцируемого клетками опухолей
[119, 120]. In vitro ИЛ-10 ингибирует дифференцировку, созревание и функциональную
активность ДК [121-123], переключая дифференцировку в сторону фенотипа макрофагов
[124].
Halliday G. и Le S. обнаружили ИЛ-10 в регрессирующих кожных опухолях, при
этом не наблюдалось подавление миграции ДК в лимфатические узлы [125]. Наоборот,
прогрессирующие кожные опухоли секретировали высокий уровень ФРО-β, который
вызывал созревание и миграцию аномальных клеток Лангерганса. На модели, в которой
мышам
прививали
клетки
опухоли,
трансфицированные
ФРО-β,
было
продемонстрировано снижение миграционного потенциала ДК [126]. Было показано, что у
ДК, стимулированных ЛПС, ФРО-β ингибирует созревание, продукцию ИЛ-12 и
способность презентировать АГ [127].
Другим ростовым фактором, секретируемым множеством опухолей, является VEGF.
Транскрипция VEGF запускается в условиях гипоксии, которая является основным
состоянием большинства солидных опухолей. Уровень VEGF в сыворотке крови, так же
как и экспрессия белка в опухолевой ткани, коррелирует с опухолевой прогрессией
[128, 129]. Было показано, что in vitro VEGF ингибирует развитие ДК из CD34+
предшественников [130]. Более того, было обнаружено, что ДК после воздействия VEGF,
характеризуются сниженной продукцией ИЛ-12, а также сниженной способностью
36
стимулировать аллогенные Т-клетки [131]. Было показано, что VEGF ингибируют
развитие ДК посредством увеличения незрелых миелоидных клеток [132].
1.4.3.2. Влияние гипоксии при опухолевой прогрессии на функции ДК
Для микроокружения опухоли характерно низкое содержание кислорода (гипоксия),
которое является результатом сниженной микроциркуляции в опухолевой ткани [133].
Гипоксия опухоли связана с опухолевой прогрессией, устойчивостью к радио- и
химиотерапии [134], а также c изменениями фенотипа макрофагов [135, 136]. Под
действием гипоксии ДК экспрессируют нормальный уровень поверхностных маркеров и
цитокинов, но их миграционная активность подавлена [137, 138]. Физиологический ответ
на гипоксию обусловлен действием фактора HIF, который индуцируется в клетке в
условиях гипоксии [139, 140]. К генам-мишеням HIF относятся гены, кодирующие VEGFA, переносчик глюкозы 1 (Glut-1) и лактат-дегидрогеназу (LDH) [141]. LDH-5 –
изофермент лактат-дегидрогеназы, трансформирующий пируват в молочную кислоту, не
только гиперэкспрессируется во множестве опухолей, но также связан с агрессивным
фенотипом опухолевых клеток [142].
1.4.3.3. Влияние измененного метаболизма опухолевых клеток на функцию ДК
Хорошо известно, что метаболизм опухолевых клеток отличается от метаболизма
нормальных клеток. Опухолевые клетки используют гликолиз для конвертации глюкозы в
ATФ даже в присутствии кислорода. Этот феномен, названный «аэробным гликолизом»,
или «эффектом Варбурга» (впервые описанным Отто Варбургом), ведет к увеличению
продукции молочной кислоты [143]. В биопсийном материале множества типов опухолей
человека обнаружены высокие концентрации молочной кислоты (свыше 40 мкМ), что
коррелирует с метастазами [144]. В то же время низкие концентрации молочной кислоты
(около 8 мкМ) связаны с большей продолжительностью жизни или даже полным
выздоровлением [145-147]. Высокий уровень лактата в опухолевых тканях также
обнаружен и в мышиных моделях опухолей [148].
По сравнению с нормальной тканью в опухолях с высоким уровнем молочной
кислоты уровень LDH повышен [145], а в некоторых опухолях детектируется даже LDH-5
[142, 149]. При немелкоклеточном раке легких или аденокарциноме кишечника такую
гиперэкспрессию связывают с неблагопрятным прогнозом [142, 149]. В 60-75% случаев
простой карциномы кишечника высокая экспрессия LDH-5 строго коррелирует с высокой
экспрессией VEGF-R2 (KDR/Flk-1) [150].
37
Молочная кислота оказывает как негативные, так и положительные эффекты на
формирование Т-клеточного иммунного ответа [151, 152]. Натриевая соль молочной
кислоты и метаболиты глюкозы подавляют фенотипическое и функциональное созревание
ДК, которое коррелирует с подавлением активации NF-κB [153]. Молочная кислота
является важным фактором, влияющим на ДК, который может способствовать уходу
опухоли от иммунного ответа. Было показано, что под действием молочной кислоты
меняется экспрессия АГ у человеческих ДК моноцитарного происхождения и снижается
секреторный потенциал ДК [154]. Кроме этих эффектов на ДК молочная кислота может
оказывать прямой ингибирующий эффект на CD8+ Т-клетки [155]. Внеклеточный ацидоз
приводит к накоплению молочной кислоты в опухолевой ткани. Gatenby R.A. с коллегами
предположили, что измененный метаболизм глюкозы и усиленное образование молочной
кислоты в большинстве опухолей человека являются критическими для развития
высокоинвазивных
форм
опухолей
[156].
В
нескольких
работах
также
был
продемонстрирован отрицательный эффект кислого рН на функции Т-лимфоцитов и
натуральных киллеров [157-159]. Хотя некоторые исследователи при ацидозе отмечали
улучшение захвата АГ ДК мыши, а также повышение эффективности индукции
специфических ЦТЛ [160].
Помимо молочной кислоты другие метаболиты опухолевых клеток также способны
оказывать влияние на функции ДК. Метаболиты арахидоновой кислоты (простаноиды),
включая простагландин и тромбоксан, синтезируются циклооксогеназой-1 и 2 (COX-1/2)
[161]. Экспрессия циклооксигеназ изменяется во многих видах опухолей, таких как
карцинома толстой кишки, молочной железы, легких и яичников, а также меланома [162164]. Экспрессия COX-2 была обнаружена в опухолевых клетках и в клетках опухолевой
стромы [161]. Помимо прямого влияния на рост опухоли, апоптоз, межклеточные
взаимодействия и ангиогенез, простаноиды подавляют иммунный ответ организма против
опухоли [164], в частности, за счет ингибирования дифференцировки и функции ДК. Так
Sombroek C.C. с коллегами показали ингибирующий эффект простаноидов и ИЛ-6 на
дифференцировку ДК из CD34+ предшественников и моноцитов [165].
Ганглиозиды – производные липидов, синтезируемые опухолевыми клетками, также
подавляют противоопухолевый иммунный ответ [166-168], ингибируя дифференцировку
гемопоэтических клеток [166]. Для некоторых типов опухолей, таких как нейробластома,
ретинобластома, меланома, карцинома печени и толстого кишечника, а также лимфома,
характерен аномальный состав ганглиозидов [169, 170], который может быть связан с
гипоксией [171]. Ганглиозиды ухудшают созревание и миграционную активность клеток
38
Лангерганса [172], а также ингибируют дифференцировку, созревание и функции ДК
[173].
1.5. Инициация противоопухолевого ответа с помощью ДК,
нагруженных ОАГ
Уникальная способность ДК активировать CD4+ Т-хелперы и CD8+ цитотоксические
лимфоциты (ЦТЛ) и, таким образом, определять направленность иммунных реакций,
привлекает все большее внимание при создании противоопухолевых вакцин, способных
специфически действовать против определенных типов опухолей. Обнаружение ОАГ, т. е.
белков, гиперэкспрессия которых специфична для определенных типов опухолей, явилось
толчком к их использованию для трансфекции ДК. Сейчас известны ОАГ для таких типов
опухолей, как меланома (gp100, Melan-A/Mart-1, tyrosinase, MAGE-1 [174, 175]), рак
простаты (PSA [176], PSCA [177]) и другие. В данной части обзора будут рассмотрены
стратегии применения ДК, активированных под действием разных ОАГ, в терапии
опухолей на мышиных моделях опухолевой прогрессии in vivo и в клинике.
1.5.1. Нагрузка ДК ОАГ и ко-стимулирующими молекулами или экспрессирующими
их конструкциями
Для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа с помощью ДК большое
значение имеют ОАГ, которыми трансфицируют ДК. В качестве источников ОАГ для ДК
используют: лизаты опухолей [178-181], синтетические опухолеспецифические пептиды
[182-185], апоптотические тельца клеток опухолей [186], ДНК [187], суммарную РНК из
клеток опухоли [188, 189], вирусные вектора, кодирующие ОАГ [186, 190] или костимулирующие иммунный ответ молекулы (ИЛ-12 [192, 192]).
Нуклеиновые кислоты (НК) представляют собой гидрофильные полианионные
молекулы, которые, во-первых, неэффективно электростатически взаимодействуют с
отрицательно заряженной плазматической мембраной клетки, во-вторых, не способны
проникать внутрь клетки через гидрофобный липидный бислой клеточной мембраны.
Более того, в биологических жидкостях незащищенные НК быстро разрушаются
нуклеазами. Также известно, что свободные мРНК способны взаимодействовать с Tollподобными рецепторами (TLR3, TLR7, TLR8), что приводит к зачастую нежелательной
активации иммунной системы [44]. Поэтому для доставки НК в ДК используют методы,
позволяющие НК преодолевать клеточные мембраны, а также защищающие их от
воздействия нуклеаз и взаимодействия с Toll-подобными рецепторами иммунных клеток.
39
1.5.1.1. Физические методы доставки АГ в ДК
НК доставляют в клетки с помощью электропорации – метода, основанного на
действии интенсивных электрических импульсов на мембрану клетки, что временно
дестабилизирует ее структуру, и позволяет НК легко проходить через мембрану. С
помощью электрического поля можно вводить мРНК, кодирующие ОАГ, в цитоплазму
клетки. Различают также нуклеопорацию, вид электропорации, при котором доставка
осуществляется в ядро клетки (для доставки ДНК). Электропорация является самым
высокоэффективным методом доставки НК в ДК [193] и используется в клинических
испытаниях [194]. Однако, главными недостатками этого метода является довольно
высокая гибель клеток (29%) [187], а также сложность проведения доставки НК в ткани
(монослой) большой площади [195].
В 1987 г Sanford J.C. с коллегами предложили метод генной пушки для введения
генов в клетки растений [196]. В качестве переносчика НК используют частицы из
инертных биосовместимых тяжелых металлов (например, золота, серебра или вольфрама),
обладающих малым размером (1-1.5 µм). Эти частицы покрывают НК и вводятся внутрь
клетки. Требуемое ускорение частиц обеспечивается либо испарением воды под
воздействием искры высокого напряжения, либо с помощью разряда гелия. Одним из
недостатков генной пушки является малая эффективность при доставке НК, поскольку
металлические частицы обладают низкой проницающей способностью [195]. Генная
пушка является методом доставки НК в ДК, который использовался десятилетия назад
[197] и в настоящее время практически не применяется.
Внутриклеточная доставка НК
также может
осуществляться
при помощи
ультразвука (сонопорация), повышающего проницаемость клеточной мембраны. В данной
системе
доставки
микропотоки
и
микроструи,
индуцируемые
разрушением
нано/микропузырьков под воздействием ультразвука, приводят к открытию временных
пор в клеточной мембране, что способствует переносу ОАГ (белков, пептидов,
нуклеиновых кислот в составе липоплексов и т.д.) в цитоплазму клетки [198].
Эффективность данного метода зависит от множества факторов, таких как интенсивность
и частота используемого ультразвукового излучения, продолжительность ультразвуковой
обработки клеток, концентрация НК, использование различных контрастирующих агентов
и т.д. [195]. В последнее время данный метод доставки РНК в ДК активно исследуется и
дает многообещающие результаты как с точки зрения эффективности трансфекции РНК в
ДК, так и способности ДК, нагруженных опухолевой РНК с помощью ультразвука,
активировать противоопухолевые иммунные ответы [198, 199].
40
1.5.1.2. Вирусные системы доставки АГ в ДК
Природная способность вирусов эффективно проникать через плазматическую
мембрану внутрь клеток и запускать там экспрессию вирусных белков широко
используется для доставки АГ-кодирующих конструкций в клетки. Основными вирусами,
использующимися для доставки АГ в ДК, являются аденовирусы, аденоассоциированные
вирусы, ретровирусы, лентивирусы, вирус осповакцины и др. [200]. Собственные
вирусные гены (патогенные) заменяются терапевтическими генами, кодирующими
целевые АГ, которые необходимо доставить в ДК. В то же время вирусы сохраняют
непатогенные структуры (белки оболочки, фьюзогенные белки и т.д.), которые позволяют
вирусам эффективно инфицировать клетки [201]. Вирусные вектора обеспечивают
высокую эффективность трансфекции как с точки зрения большого количества
трансфицированных клеток, так и с точки зрения высокого уровня экспрессии целевого
белка внутри клетки. Было показано, что ДК, трансдуцированные вирусными векторами,
кодирующими ОАГ, индуцировали сильный противоопухолевый ответ in vitro [202, 203],
активировали защитный иммунитет в опухолевых моделях in vivo [204, 205] и давали
положительные результаты в I фазе клинических испытаний [206, 207]. Одним из
недостатков данного метода является ограниченная длина гена, который можно вставить в
вирусный вектор, определяемая размером вирусного генома [201]. Кроме того,
применение вирусных векторов для доставки АГ в ДК способно инициировать мутагенез
и канцерогенез в результате встройки генома вируса в ДНК хозяина, а также
индуцировать иммунный ответ против белков вирусной оболочки [200].
1.5.1.3. Химические вектора для доставки АГ в ДК
Невирусные вектора являются более безопасной и универсальной альтернативой
вирусным векторам. Химические вектора слабоиммуногенны, способны храниться
продолжительное время без потери своей стабильности, их легко и экономически выгодно
синтезировать и подвергать модификациям [200]. Кроме того, с помощью химических
векторов можно доставлять ОАГ в большом количестве, а также несколько ОАГ
одновременно [195]. Для доставки НК в клетки используют такие химические вектора, как
поликатионные полимеры и липосомы.
Поликатионные
полимеры
в
большинстве
случаев
состоят
из
химически
модифицированного хитозана и биоразлагаемых частиц на основе полиэтиленимина.
Преимуществом поликатионных полимеров является их малый размер и высокая
плотность, а также способность формировать комплексы с НК, имеющие положительный
заряд, что способствует электростатическому взаимодействию с клеточной мембраной и
облегчает проникновение НК в клетки. Использование поликатионных полимеров для
41
доставки
НК
имеет
свои
недостатки
–
токсичность,
слабая
эффективность,
полидисперсность полимера, отсутствие информации о механизмах транспорта [200].
Было показано, что поликатионные полимеры эффективно доставляют АГ в ДК и
способны стимулировать эффективный иммунный ответ [208-210].
Липосомальные вектора состоят из катионных липидов и нейтральных липидовхелперов. Катионные липиды необходимы для электростатического взаимодействия с НК.
Более того, они могут образовывать ионные пары с анионными фосфолипидами
клеточной мембраны, изменяя образование ламеллярной фазы (Lα) в инвертированную
гексагональную фазу (HII), что улучшает проникновение липоплексов внутрь клетки и их
выход из эндосом. Нейтральный липид помогает системному выходу липоплексов из
эндосом с помощью формирования HII фазы. Таким образом, внутренняя структура
липидов и плотность поверхностного заряда липоплексов являются очень важными для
дизайна эффективных липосомальных векторов для доставки НК в клетки [201]. Одним из
недостатков липосомальных векторов является их способность аггрегировать друг с
другом с образованием огромных частиц при высоких концентрациях, что снижает
эффективность
трансфекции
и
опасно
при
введении
высококонцентрированных
липоплексов in vivo [195]. Кроме того, липосомы менее стабильны в присутствии
сыворотки [195], однако это спорный вопрос, поскольку в некоторых работах было
показано, что наличие сыворотки не влияет на эффективность липофекции [211, 212].
Модификация поверхности липосом адресными лигандами (так называемая
таргетная доставка), связывающимися с поверхностными рецепторами клеток-мишеней,
способна обеспечить таргетную доставку и увеличить ее эффективность. В качестве
адресующих лигандов могут использоваться малые молекулы, такие как витамины,
углеводы и пептиды, поскольку они не являются иммуногенными и при конъюгации с
компонентами липосом не теряют специфичности связывания. В качестве мишени для
доставки НК в ДК часто используют маннозный рецептор, который с высокой плотностью
экспрессируется на поверхности ДК и макрофагов. Основная функция маннозного
рецептора
заключается
в
связывании
углеводных
остатков,
включая
маннозу,
интегрированных в клеточную стенку инфекционных агентов (бактерий, грибов, вирусов
и т.д.) [213]. Было показано, что введение остатков маннозы в липосомальные вектора
увеличивает эффективность доставки НК в ДК [214, 215] и усиливает индукцию
противоопухолевого ответа [216, 217]. Таким образом, таргетная доставка ОАГ в ДК
является многообещающим подходом, способствующим увеличению специфичности
доставки ОАГ в ДК и, соответственно, усилению способности ДК поляризовать
противоопухолевые иммунные ответы.
42
1.5.1.4. Сигналы запуска противоопухолевого иммунного ответа
Для достижения оптимальной активации и генерации продуктивного Т-клеточного
иммунитета опухолеспецифические Т-клетки должны получить три координирующих
сигнала. Первый сигнал обеспечивается взаимодействием Т-клеточного рецептора (ТКР) с
с комплексами молекулы MHC/пептид-ОАГ. Второй сигнал называется костимуляторным
и передается на соответствующие рецепторы Т-клеток лигандами, экспрессирующимися
АПК. Третий сигнал – поляризационный, инициированный цитокинами и/или хемокинами
и идущий от АПК к наивным Т-лимфоцитам, который определяет их дифференцировку в
эффекторные клетки.
Опухоль-ассоциированные антигены: Сигнал 1
ДК могут быть нагружены ОАГ в форме 1) опухолевых белков и пептидов, 2) лизата
опухолевых клеток, 3) НК, кодирующих ОАГ (суммарная опухолевой РНК или
синтетические ДНК и мРНК), 4) апоптотических и живых опухолевых клеток, 5) а также
могут
быть
трансдуцированы
вирусными
конструкциями,
кодирующими
ОАГ.
Преимуществом нагрузки ДК источником множества ОАГ (например, суммарная
опухолевая РНК и лизат опухолевых клеток) по сравнению с источниками одиночных
ОАГ (мРНК, вирусные вектора и др.) является презентация целого комплекса ОАГ, что в
конечном итоге может привести к запуску более широкого и эффективного
противоопухолевого иммунного ответа. Кроме того, в данном случае будет не нужна
предварительная идентификация ОАГ.
Преимуществами нагрузки ДК ОАГ в виде РНК по сравнению с пептидами являются
[218]:
1) Презентация сразу множества эпитопов ОАГ и, следовательно, отсутствие
ограничения по HLA гаплотипу пациента в случае использования РНК в качестве
источника ОАГ. При использовании пептидов или белков их эпитопы должны
быть сначала идентифицированы.
2) Увеличенная по времени презентация ОАГ, поскольку экспрессия РНК внутри
ДК позволяет провести несколько раундов презентации ОАГ. В случае с
пептидами презентация длится лишь один раунд, пока все белки/пептиды,
поглощенные ДК, не будут процессированы и выставлены на клеточной
поверхности для презентации.
3) Возможность модифицировать последовательность РНК, тогда как пептид нельзя
модифицировать без потери антигенных свойств.
43
Кроме того, преимуществом РНК по сравнению с ДНК и вирусными векторами,
кодирующими ОАГ, является большая биобезопасность, поскольку ДНК и вирусные
вектора обладают способностью встраиваться в геном клетки, что может привести к
инактивации генов ДК и к канцерогенезу [219].
На сегодняшний день наиболее известные ОАГ это, во-первых, аутоантигены,
характерные для нормальных тканей на определенных этапах развития, экспрессия
которых повышается в опухолевых клетках. Например, α-фетопротеин, характерный для
карциномы печени и тератобластом; карциноэмбриональный антиген (CEA), маркер
опухолей толстой и прямой кишки и других эпителиальных опухолей; TYR (тирозиназа);
TRP-2 и MART-1, АГ, наиболее часто синтезируемые клетками меланомы, и т.д. Вовторых, это гиперэкспрессированные онкогены, например, Her-2/neu, наблюдаемые в
карциномах различных типов (рака молочной и щитовидной желез, яичника). В-третьих,
универсальные ОАГ, т.е. биомолекулы, синтезирующиеся более чем в 50% опухолей и
необходимые для онкогенного процесса, такие как TERT (каталитическая субъединица
теломеразы), сурвивин и т.д. Четвертый тип ОАГ – это гетероорганные АГ, т.е. АГ,
специфические для других тканей, не гомологичных опухолевой ткани, например,
семейство MAGE-A (раково-тестикулярные АГ, выявляемые в различных опухолях, в
норме синтезирующиеся в сперматогониях) и другие [220].
Ко-стимулирующие и адгезионные молекулы: Сигнал 2
Ко-стимулирующие
и
адгезионные
молекулы
играют
ключевую
роль
во
взаимодействии между ДК и Т-лимфоцитами. Сами ДК экспрессируют оба класса этих
молекул, однако их дополнительная экспрессия способствует более эффективному
взаимодействию ДК с Т-лимфоцитами, что усиливает противоопухолевый иммунный
ответ. Активирующие ко-стимулирующие молекулы включают в себя CD40 лиганд
(CD40L) [221], CD70 [222], 4-1BBL [223], OX40 лиганд (OX40L) [224], и рецепторактиватор NF-κB лиганда (RANKL) [225]. Для дополнительного улучшения адгезии ДК и
Т-лимфоцитов в экспериментах in vitro и на стадии клинических испытаний используют
триаду молекул адгезии, в состав которой входят внутриклеточные адгезионные молекулы
(ICAM)-1 (CD54), лимфоцитарный антиген (LFA)-3 (CD58) и костимулирующая молекула
В7.1 (CD80). Эту триаду молекул, называемую TRICOM, доставляют в ДК путем
трансдукции с помощью рекомбинантного поксвируса [207, 226].
Цитокины и хемокины: Сигнал 3
Цитокины играют важную роль в поляризации и отклонениях адаптивных
иммунных ответов и, следовательно, в активации Т-киллеров с помощью ДК.
44
Используются две стратегии усиления секреции цитокинов ДК: (1) генетическое
кодирование одного или нескольких цитокинов; (2) генетическое кодирование домена
транскрипционного фактора NF-κB [227], в результате деятельности которого усиливается
секреция
множества
провоспалительных
цитокинов.
Влияние
дополнительно
экспрессирующихся цитокинов на индукцию противоопухолевого Т-клеточного ответа
было исследовано на пациентах и на мышиных моделях на примере ИЛ-12 [191, 228-230],
ИЛ-18 [229, 231] и ИФН-γ (поляризация Тh1 ответа) [232], ИЛ-2 (фактор пролиферации Тлимфоцитов) [233], ИЛ-7 (для генерации и поддержания Т-клеток памяти) [234-236],
ФНО-α (провоспалительный цитокин и фактор созревания ДК) [237, 238], ИФН-α
(стимулирующий кросс-перезентацию и противоопухолевый иммунный ответ) [239] и
ГМ-КСФ (фактор роста и дифференцировки ДК) [240]. В большинстве исследований
показано, что цитокины позитивно влияли на индукцию противоопухолевого иммунного
ответа.
Для некоторых цитокинов характерно плейотропное действие. Так в работе
Vujanovich L. с коллегами на модели меланомы мыши было показано, что под действием
ИЛ-12 происходит дозозависимое ингибирование противоопухолевого ответа [228].
Кроме того, было отмечено, что ИЛ-12 обладал сильным иммуностимулирующим
эффектом, действующим не только на Т-лимфоциты, но и на другие клетки [229]. Bontkes
H.J. с коллегами показал, что ко-трансфекция ДК ОАГ и ИЛ-12 приводит к развитию
противоопухолевого
иммунного
ответа,
в
котором
участвуют
Т-лимфоциты
и
натуральные киллеры, чей цитотоксический эффект усиливается под действием ИЛ-12
[229]. Более того, было показано, что секреция ИЛ-12 ДК активирует продукцию ИФН-γ
натуральными киллерами, участвующего в кросс-взаимодействии между ДК и НК, что
ведет к увеличению уровня взаимной активации ДК и НК. Таким образом, была
установлена значимость активации –гн7натуральных киллеров и кросс-взаимодействий
между натуральными киллерами и ДК, экспрессирующими ИЛ-12, для индукции
противоопухолевого иммунного ответа [240, 241]. Другие гемопоэтические клетки
(например, макрофаги и гранулоциты) также способствуют регрессии опухоли в том
случае, когда они мигрируют в место локализации опухоли под действием цитокинов и
хемокинов, высвобождающихся после активации иммунных клеток, участвующих в
реакциях врожденного и приобретенного иммунитета. С этой целью были разработаны
модифицированные ДК, способные к экспрессии хемокинов, таких как лимфотактин [242]
и вторичный лимфоидный тканевый хемокин (SLC или CCL-21) [243, 244].
45
1.5.2. Применение ДК, нагруженных ОАГ, в терапии злокачественных
новообразований
В Таблицах 1 и 2 представлен обзор опубликованных исследований in vivo и в
клинике, в которых ДК, нагруженные ОАГ, использовались в иммунотерапии рака. В
качестве источника ОАГ авторы использовали (1) белковые АГ в виде лизата клеток
опухоли или синтетических пептидов; (2) вирусные вектора, кодирующие ОАГ; (3)
суммарные или синтетические ДНК или мРНК, кодирующие ОАГ, трансфекцию которых
проводили с помощью химических векторов или электропорации; (4) апоптотические или
живые опухолевые клетки. Генная терапия с применением ДНК не представляет особого
интереса для исследователей вследствие низкой эффективности трансфекции ДНК в ДК
[245]. По этой причине во многих работах используют трансфекцию мРНК в ДК [246]
различного происхождения, например, суммарную РНК клеток опухолей (аллогенную и
аутологичную) или РНК, кодирующую ОАГ (см. Таблицы 1, 2).
Вместе с гетерогенностью типов опухолей и применяемых методов доставки ОАГ в
ДК, в различных исследованиях используют разный состав клеточной вакцины (ДК
моноцитарного или костно-мозгового происхождения, зрелые или незрелые ДК) и разные
способы введения вакцины (внутрикожно, внутривенно, в лимфатические узлы, внутрь
опухоли и др.) [247].
1.5.2.1. Эффективность ДК вакцин на мышиных моделях опухолевой прогрессии in
vivo
Эффективность ДК вакцин in vivo исследовали на нескольких опухолевых моделях,
наиболее популярные из которых меланома, карцинома легких Льюис, рак толстого
кишечника, лимфомы, опухоль молочных желез (Табл. 1).
В работе Saha A. с коллегами
было проведено исследование ДК вакцины
нагруженной синтетическими пептидами карциноэмбрионического антигена (пептид 1,
YMIGMLVGV, и пептид 2, YLSGADLNL), а также анти-идиотипическими 3Н1антителами, имитирующими карциноэмбриональный антиген на модели рака толстого
кишечника мышей (Табл. 1) [248]. В качестве стимулятора иммунного ответа
использовали
CpG-олигонуклеотид.
Было
показано
значительное
повышение
выживаемости животных, получавших комбинированное лечение с помощью ДК,
нагруженных пептидами 2, и ДК, нагруженных 3Н1-антителами, на 48-56% относительно
контроля, а также животных, получавших ту же комбинацию модифицированных ДК и
CpG-олигонуклеотид на 67-76% относительно контроля.
46
Таблица 1. Эффективность ДК вакцин на мышиных моделях опухолевой прогрессии in vivo
Тип опухоли
Рак
толстого
кишечника
Почечноклеточная
карцинома
RENCA-Ca9
Происхождение ДК /
факторы созревания
ДК
КМ* / ГМ-КСФ +ИЛ4
Тип АГ
Схема лечения**
Результат
Ссылка
Пептиды
YMIGMLVGV
(1) или YLSGADLNL (2)
(фрагменты CEA); 3Н1антитела (имитация СЕА);
CpG-олигонуклеотид
Аденовирусные векторы,
кодирующие CEA и SVV;
гибридный белок CARTAT
Подкожно,
2−3×105
кл/животное; 6 раз с
интервалом 2-3 сут
↑ выживаемости на 48-56% без CpGолигонуклеотида, на 67-76% с CpGолигонуклеотидом
Saha A. et al.,
2009 [248]
Подкожно,
1×106
кл/животное; 2-3 раза с
интервалом 7 сут
Kim H.S. et al.,
2010 [249]
КМ / ГМ-КСФ +ИЛ-4
Гибридный белок Ca9AbOmpA,
или лизат клеток RENCACa9
Подкожно,
кл/животное; 3
интервалом 7 сут
КМ / ГМ-КСФ +ИЛ-4
Лизат
клеток
EL4;
полисахарид
G1-4A
Tinospora cordifola
КМ / ГМ-КСФ +ИЛ-4
Лизат клеток 4Т1, siРНК
против IDO
Профилактическая:
подкожно,
5×105
кл/животное; 3 раза с
интервалом
7
сут;
терапевтическая:
подкожно,
5×105
кл/животное; на 3, 7 и 10
дни развития опухоли
Внутривенно,
2×106
кл/животное; 3 раза с
интервалом 7 сут
Для
ДК,
экспрессировавших
одновременно CEA и SVV:
↑ реактивности спленоцитов против
MC38/CEA2 in vitro;
↓ роста опухоли, более эффективное
в присутствии CAR-TAT
↓ роста опухоли в 1.5-3 раза
↑ секреции ИЛ-2, ИФН-γ и ФНО-α
Т-клетками in vitro;
↑ реактивности спленоцитов против
RENCA-Ca9;
↓ размера опухоли в 2.2-3.8 раз в
профилактической схеме;
↓ размера опухоли в 2.1-2.6 раз в
терапевтической схеме
Zheng X. et al.,
2013 [8]
КМ / ГМ-КСФ
Суммарный белок клеток
меланомы (сонопорация)
↓ размера опухоли в 2 раза;
↓ апоптоз CD4+ и CD8+ Тлимфоцитов;
↑ пролиферации ЦТЛ;
↓ количество Тreg клеток
↓ количества легочных метастазов в
4 раза
КМ / ГМ-КСФ +ИЛ-4
Лимфома EL4
Опухоль молочной
железы 4Т1
Меланома В16
1×106
раза с
Профилактическая:
подкожно,
1×106
кл/животное; 2 раза с
интервалом 7 сут
47
Kim B.R. et al.,
2012 [7]
Pandey V. K. et
al., 2012 [250]
Oda Y. et al.,
2012 [198]
Таблица 1 (продолжение)
Тип опухоли
Меланома В16
LL-LCMV (LLC),
B16.gp33
(меланома)
Карцинома легких
Льюис-OVA
Происхождение ДК /
факторы созревания
ДК
КМ / ГМ-КСФ
Тип АГ
Схема лечения**
Живые клетки B16; ЛПС
КМ / ГМ-КСФ +ИЛ-4
Живые
или
апоптотические
клетки
В16, пептиды gp10025-33 и
TRP181-188; ЛПС и ИФН-γ
КМ / ГМ-КСФ +ИЛ-4
пептид gp33; ЛПС
КМ / ГМ-КСФ
белок gp96 (из LLC-OVA)
КМ / ГМ-КСФ +ИЛ-4
Аденовирусный
вектор,
кодирующий
ливин
α
человека
(1) Моноцит. ДК /
ГМ-КСФ+ИЛ-4;
(2)
КМ / ГМ-
Лизат клеток LLC
Карцинома легких
Льюис
Профилактическая:
внутривенно,
5×106
кл/животное; 2 раза с
интервалом 14 сут
Внутривенно,
5×106
кл/животное; 2 раза на 3 и
10 дни развития опухоли
Подкожно/
внутривенно, 1×103-1×105
кл/животное; однократно
Подкожно,
5×105
кл/животное; 4 раза с
интервалом 4 сут
Профилактическая:
подкожно,
5×105
кл/животное; 3 раза с
интервалом
7
сут;
терапевтическая:
подкожно,
5×105
кл/животное; 3 раза с
интервалом 4 сут
Внутрибрюшинно, 1×105
кл/животное; 2 раза с
интервалом 7 сут
Результат
Ссылка
Полное отсутствие опухоли В16;
↑ количества ЦТЛ
Matheoud D. et
al., 2010 [251]
↓ количества легочных метастазов в
14.3 раза для АГ в виде живых
клеток В16;
↓ количества легочных метастазов в
2-2.7 раз для АГ в виде пептидов и
апоптотических клеток В16
↓ размеров опухолей в 2-2.5 раза;
↓ размеров опухолей в 10 раз с ЛПС
Matheoud D. et
al., 2011 [9]
↓ роста опухоли в 1.2-1.7 раз;
↑ реактивности спленоцитов против
LLC-OVA
↑ цитотоксичности спленоцитов
против LLC in vitro;
полная выживаемость животных в
профилактической схеме;
↓ роста опухоли в 2 раза и ↑
выживаемости
мышей
в
терапевтической схеме
Shinagava N. et
al., 2008 [253]
↓ количества легочных метастазов в
2-7.5 раз
Baek S. et al.,
2012 [255]
↓ количества легочных метастазов в
3.9 раз;
↑ выживаемости мышей в 2.4 раза;
↑ реактивности спленоцитов против
SCCVII
Moon J.H. et al.,
2012 [256]
Huck S.P. et al.,
2008 [252]
Xie J. et al.,
2010 [254]
КСФ+ИЛ-4+SCF
КМ / ГМ-КСФ +ИЛ-4
Плоскоклеточный
рак легких SCCVII
Апоптотические
SCCVII
клетки
Подкожно,
1×106
кл/животное; 2 раза на 3 и
10 дни развития опухоли
* – КМ – костно-мозговое происхождение ДК; ** – лечение по терапевтической схеме, если не указано другое.
48
С использованием модели рака толстого кишечника также исследовали эффективность ДК
вакцины, где в качестве источника АГ были выбраны карциноэмбриональный антиген (СЕА) и
сурвивин (SVV), часто встречающиеся в колоректальных опухолях человека [249] (Табл. 1).
ОАГ доставляли в ДК с помощью аденовирусных векторов. Для усиления противоопухолевого
действия использовали адаптерный гибридный белок CAR-TAT, состоящий из рецетора к
вирусу Коксаки и аденовирусу (CAR) и трансдукционного домена ТАТ-белка. Было показано,
что введение ДК, обработанных CAR-TAT и ко-трансдуцированных векторами, кодирующими
CEA и SVV, в 1.4-2.5 раз более эффективно ингибировало опухолевый рост у мышей по
сравнению с ДК, экспрессирующими СЕА или SVV по отдельности.
В работе Kim B.R. с коллегами [7] было проведено исследование иммунотерапии почечноклеточной карциномы мышей RENCA (RENCA-Ca9), экспрессирующей специфический
молекулярный маркер почечно-клеточной карциномы (ПКК) карбоангидразу 9 (Са9), с
помощью ДК, нагруженных гибридным белком Са9 и компонентом внешней клеточной стенки
бактерии Acinetobacter baumanii белка А (AbOmpA) – Ca9-AbOmpA. Было показано, что ДК,
нагруженные гибридным белком в 2 раза более эффективно подавляют рост опухоли, чем ДК,
нагруженные опухолевым лизатом, и стимулируют секрецию ИЛ-2, ИФН-γ и ФНО-α Тлимфоцитами (Табл. 1).
На модели лимфомы EL4 Pandey V.K. с соавторами [250] исследовали потенциал ДК
в профилактической и терапевтической схемах лечения. В данном исследовании оценивался
эффект полисахарида G1-4A, выделенного из индийского лекарственного растения Tinospora
cordifolia, на фенотипическое и функциональное созревание мышиных ДК. Было установлено,
что введение ДК, нагруженных опухолевым лизатом и обработанных G1-4A, приводило к
снижению размеров опухоли как в профилактической (в 2.2-3.8 раз), так и в терапевтической
схемах лечения (в 2.1-2.6 раз) (Табл. 1).
В работе Zheng X. с соавторами [8] на модели опухоли молочной железы 4Т1 было
проведено исследование ДК вакцины, полученной нагрузкой ДК лизатом клеток 4Т1. Кроме
того, для повышения иммуногенности в ДК с помощью siРНК «выключали» экспрессию
иммуносупрессивного
фермента
индоламин-2,3-диоксигеназы
(ИДО).
Были
получены
значительные результаты: такие ДК вызывали уменьшение размеров опухоли по сравнению с
контролем (на 50%), ослабление апоптоза CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, усиление пролиферации
опухолеспецифических Т-клеток
и активности
ЦТЛ, а также снижение количества
CD4+CD25+Foxp3+ Трег клеток (Табл. 1).
Замечательные результаты были получены на мышиной модели меланомы. Так, работе
Oda Y. с коллегами [198] было проведено исследование профилактической иммунизации ДК
49
мышей с меланомой, метастазирующей в легкие. ДК-вакцины получали путем нагрузки клеток
суммарным белком клеток меланомы с помощью перфлуоропропан газозахватывающих
липосом и ультразвука. Такая ДК вакцина приводила к четырехкратному уменьшению
количества легочных метастазов относительно контроля (Табл. 1). Полная защита от развития
метастазов была показана в работе Matheoud D. с соавторами [251] на модели меланомы и ДК
вакцины, где в качестве источника АГ использовали живые опухолевые клетки (Табл. 1). В
другой работе также было показано преимущество использования живых клеток меланомы для
ДК вакцины [9]. ДК вакцина, где в качестве источника ОАГ использовали живые опухолевые
клетки, была примерно в 7 раз более эффективной по сравнению с ДК, нагруженными
пептидами или апоптотическими опухолевыми клетками (Табл. 1).
В работе Huck S.P. с коллегами [252] было проведено исследование влияния
активационного статуса ДК и способа введения ДК вакцин на способность ДК активировать
опухолеспецифический иммунный ответ in vivo в терапевтической схеме. В работе
использовали две мышиные опухолевые модели карциномы легких Льюис LL-LCMV и
меланомы B16.gp33, экспрессирующих значимые количества gp33 антигена. ДК-вакцину
получали с помощью ГМ-КСФ и ИЛ-4 с последующей стимуляцией ЛПС и нагружали gp33
пептидом. Показано, что эффект от стимуляции ЛПС превышал эффект от нагрузки пептидом
gp33: стимуляция ДК ЛПС приводила к снижению размеров опухоли до 10 раз, тогда как в
отсутствие ЛПС эффект был всего двукратным (Табл. 1).
В работе Shinagava N. с соавторами [253] была создана гибридная модель опухоли LLCOVA, которая представляла собой клетки карциномы легких Льюис, экспрессирующие
овальбумин. ДК нагружали белком gp96 из LLC-OVA и применяли для лечения животных с
трансплантированной LLC-OVA. Такие ДК вызывали подавление роста опухоли в 1.2-1.7 раз по
сравнению с контролем и праймировали клон спленоцитов с высокой цитотоксической
активностью против клеток LLC-OVA, LLC, а также небольшой активностью против
клеточных линий мышиной лимфомы MBL-2 и YAC-1 (Табл. 1).
В работе Xie J. с коллегами [254] было проведено исследование иммунотерапии мышей с
карциномой легких Льюис ДК, нагруженными ксеногенным ливином (человека). Ливин, белок
семейства ингибиторов апоптоза, гиперэкспрессируется множеством опухолей, в том числе
раком
легкого,
однако
нормальные
полностью
дифференцированные
клетки
не
гиперэкспрессируют этот белок. ДК были трансдуцированы рекомбинантным аденовирусным
вектором, содержащим ген человеческого ливина α (rAd-hlivin α). В работе использовали
профилактическую схему лечения, где ДК вводили 3 раза с 7-дневным интервалом, а опухоль
трансплантировали подкожно через 7 дней, и терапевтическую схему, в которой мышам
50
сначала трансплантировали карциному легких Льюис и через 8 дней начинали вакцинацию ДК.
Показано, что в профилактической схеме иммунизация мышей ДК, трансдуцированными
аденовирусом,
кодирующим
ливин,
приводила
к
полной
выживаемости
мышей,
в
терапевтической схеме вакцинация ДК значительно снижала скорость роста опухоли (Табл. 1).
На модели карциномы легких Льюис также исследовали влияние типа субпопуляций ДК
на развитие противоопухолевого ответа [255]. Две субпопуляции ДК, моноцитарного и костномозгового происхождения, были нагружены лизатом клеток карциномы легких Льюис. Обе
субпопуляции ДК имели высокую иммуногенность и снижали количество легочных метастазов
крупнее 2 мм в диаметре в 1.9 и 7.5 раз, соответственно, по сравнению с контрольной группой
(Табл. 1).
В работе Moon J.H. с соавторами [256] было проведено исследование иммунотерапии ДК
на мышиной модели раннего метастатического плоскоклеточного рака легких. ДК вакцину
получали путем инкубации ДК с апоптотическими клетками SCCVII, полученными облучением
ультрафиолетом. Такая вакцина снижала количество легочных метастазов в 3.9 раза по
сравнению с контролем, причем более 60% животных в данной группе не имели метастазов в
легких вообще. Более того, только ДК-вакцина, нагруженная апоптотическими опухолевыми
клетками,
приводила
к
развитию
специфического
противоопухолевого
Т-клеточного
иммунитета (Табл. 1).
Таким образом, на мышиных опухолевых моделях были получены многообещающие
результаты как при терапевтическом, так и профилактическом лечении с помощью ДК:
значительно уменьшались размеры опухолей или наблюдалось их полное исчезновение,
снижалось количество метастазов, увеличивалась выживаемость животных-опухоленосителей,
отмечался запуск эффективных противоопухолевых Т-клеточных иммунных ответов (CD4+ Тхелперного и CD8+ ЦТЛ ответов).
1.5.2.2. Исследование способности ДК пациентов, страдающих опухолями различного
типа, активировать противоопухолевые Т-лимфоциты ex vivo
В настоящее время в Российской Федерации исследования противоопухолевого
потенциала ДК сфокусировано на животных опухолевых моделях и преклинических
исследованиях противоопухолевой активности модифицированных ДК человека. Так, в
Институте клинической иммунологии СО РАМН были проведены исследования способности
аутологичных ДК человека, нагруженных опухолевым лизатом, активировать цитотоксические
Т-лимфоциты в культуре in vitro. В исследовании использовали клинический материал
пациентов (кровь и биопсийный материал), принимали страдающих опухолями молочной
железы, яичников и колоректальным раком. Предшественники ДК и лимфоциты выделяли из
51
периферической крови пациентов. Незрелые ДК получали инкубированием предшественников
ДК в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ, нагружали их аутологичным опухолевым лизатом и
обрабатывали ФНО-α для стимуляции созревания. Активацию ДК исследовали в реакции
активации противоопухолевых Т-лимфоцитов in vitro. Модифицированные ДК инкубировали с
лимфоцитами in vitro в присутствии или отсутствии ИЛ-12 и ИЛ-18, используемых для
поляризации Th1 ответа. В результате для всех исследованных типов опухолей было показано,
что ДК, нагруженные опухолевым лизатом, праймируют ЦТЛ, обладающие большей
цитотоксичностью (в 1.5-2 раза), более высокой экспрессией перфорина и гранзима В (в 1.5-2
раза), а также более эффективным синтезом ИФН-γ (в 5 раз) по сравнению с
непраймированными
лимфоцитами
и
лимфоцитами,
стимулированными
немодифицированными ДК [257-259]. Использование цитокинов ИЛ-12 и ИЛ-18 в качестве
стимуляторов поляризации Th1 ответа в 1.5 раза усиливало цитотоксические свойства
лимфоцитов, праймированных модифицированными ДК.
Также в качестве источника опухолевых антигенов для нагрузки ДК использовали
генетические конструкции, кодирующие универсальный и HLA-A*0201-специфический
полиэпитопные иммуногены, содержащие антигенные детерминанты белка HER-2. Было
показано, что ДК, трансфицированные полиэпитопными конструкциями с помощью магнитных
наночастиц, эффективно стимулировали ЦТЛ ответ в культуре мононуклеарных лимфоцитов
HLA-A*0201+ здоровых доноров против опухолевой линии MCF-7 и повышали экспрессию
перфориновых гранул в ЦТЛ в 1.3 раза относительно непраймированных лимфоцитов и
лимфоцитов, стимулированных немодифицированными ДК [260].
1.5.2.3. Эффективность ДК вакцин в клинических испытаниях
В интенсивных преклинических и клинических исследованиях противоопухолевых
вакцин на основе ДК, ведущихся более десятилетия, была показана перспективность данного
подхода для иммунотерапии опухолей. Безопасность и толерантность иммунотерапии опухоли
дендритными клетками документированы во всех клинических исследованиях (фазах I, II, III),
проведенных до настоящего времени. Вакцинация ДК хорошо переносится организмом,
неблагоприятные исходы такой терапии обычно ограничены одной или двумя единицами
критерия общей токсичности [261]. Наиболее распространенными побочными эффектами
являются локальные воспалительные реакции в местах инъекций и лимфатических узлах
[262, 263]. В отдельных случаях наблюдались системные симптомы, сходные с симптомами
гриппа [263, 264], угнетение гемопоэза (лимфоцитопения, тромбоцитопения), которое было в
основном дозонезависимым [261, 264], развитие аутоиммунных заболеваний (временное
появление аутоантител [262, 264] и витилиго-подобных изменений кожи [264, 265]).
52
Практически во всех клинических исследованиях противоопухолевых ДК вакцин ДК
получали из мононуклеарных клеток периферической крови культивированием в присутствии
ростовых факторов ГМ-КСФ и ИЛ-4. В некоторых работах ДК получали инкубированием
моноцитарных предшественников ДК в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-13 [14]. В работах с
Sipuleucel-T [15, 266] в качестве ДК вакцины использовали клеточный препарат, выделенный из
лейкаферезного материала, в состав которого входили в том числе ДК.
В работе Yu J. с коллегами [267] была изучена иммунотерапия ДК пациентов со
злокачественной глиомой (Табл. 2). В исследование включили девять пациентов, страдающих
анапластической астроцитомой (2 пациента) и мультиформной глиомой (GBM) (7 пациентов),
после хирургического удаления опухоли, но без прохождения курса радиотерапии. ДК вакцину
получали путем нагрузки ДК пептидами, собранными с поверхности культивируемых
аутологичных клеток опухоли мозга (MHC I-ассоциированные пептиды). ДК вакцина усиливала
цитотоксичность Т-лимфоцитов in vitro (4/7) и увеличивала выживаемость больных в 1.8 раз по
сравнению с пациентами, не прошедшими терапию. У всех пациентов, у которых увеличилась
активность
Т-клеток,
цитотоксический
эффект
продержался
до
3
месяцев
после
заключительной вакцинации.
В работе Phuphanich S. с соавторами [12] вакцину, полученную нагрузкой ДК
мультиэпитопным набором пептидов MAGE1, TRP-2, gp-100, HER-2, и ИЛ-13Rα2,применяли
для лечения 21-го пациента с глиобластомой. Такая мультиэпитопная вакцина показала свою
эффективность: индуцировала опухолеспецифические Т-лимфоциты у 33% пациентов и
увеличивала выживаемость пациентов в отсутствие рецидива.
В работе Lepisto A.J. с соавторами [268] была исследована ДК вакцина, нагруженная
пептидом MUC1, для лечения 12-ти пациентов с опухолями поджелудочной железы и желчных
протоков. У небольшого числа пациентов после ДК вакцинации была обнаружена высокая
экспрессия эффекторных молекул перфорина и гранзима CD8+ Т-лимфоцитами. По окончании
терапии экспрессия этих факторов падала до претерапевтического уровня. Клинические
результаты были более значительными. Средняя выживаемость пациентов составила 26
месяцев для 8 пациентов и более 7 лет для 4-х пациентов (Табл. 2).
Многообещающие результаты были получены в работе Lesterhuis W.J. с соавторами [13],
где ДК вакцину применяли для лечения пациентов, страдающих колоректальным раком с
печеночными метастазами. ДК вакцины получали нагрузкой ДК пептидом САР-1 или
электропорацией ДК мРНК, кодирующей СЕА. В исследовании принимало участие 16
пациентов.
ДК,
нагруженные
САР-1
пептидом,
53
вводили
11-ти
пациентам,
ДК,
Таблица 2. Иммунотерапия опухолей с помощью ДК в клинических испытаниях
Тип опухоли
Глиома
I
Глиобластома
I
Опухоль
поджелудочной
железы
и
желчных
протоков
Рак
толстого
кишечника
Гепатоцеллюлярная
карцинома
Рак почки
стадия)
Фаза
(IV
I/II
I
Кол-во
пациентов
Тип АГ
MHC Iассоциированные
пептиды
поверхности
опухолевых клеток
Схема лечения
Результат
Ссылка
Подкожно, 1×106 кл, 3 раза с
интервалом 14 сут
↑
цитотоксичности
ЦТЛ
аутологичной опухоли (4/9);
↑ выживаемости в 1.8 раз
21
MAGE1, TRP-2, gp100,
HER-2,
ИЛ13Rα2,
пептиды;
ФНОα*
Внутрикожно, 1×107 кл, 3
раза с интервалом 14 сут
Медиана выживаемости 40.1 мес;
средняя выживаемость без прогрессии
16.9 мес;
средняя общая выживаемость 38.4 мес;
24-месячная
выживаемость
без
прогрессии 43.8%;
36-месячная общая выживаемость 55.6%
Phuphanich S. et
al., 2012 [12]
12
MUC1, пептид; ФНОα*, ИЛ-1β*, ИЛ-16*
Внутрикожно/подкожно,
1×106 кл, 3 раза с интервалом
21 сут и 1 раз через 6 мес
после последней вакцинации
↑ экспрессии перфорина и гранзима
CD8+ Т-лимфоцитами;
↑ средней выживаемости до 26 мес
(8/12) и более 7 лет (4/12)
Lepisto A.J. et
al., 2008 [268]
16
мРНК
СЕА
(электропорация)
(5/16) или САР-1,
пептид
(11/16);
цитокиновый
коктейль 1*
Внутрикожно/внутривенно,
5×106 кл, 3 раза с интервалом
7 сут
СЕА-специфические Т-клетки (8/11,
пептидная группа; 0/5, РНК группа);
↑ уровня СЕА в крови (7/11, пептидная
группа; 2/5, РНК группа);
средняя выживаемость без прогрессии
18 мес (пептидная группа) и 26 мес
(РНК группа)
Lesterhuis W.J.
et al., 2010 [13]
Подкожно, 4×107 кл, 4 раза с
интервалом 14 дней и 2 раза
на 12 и 14 неделях с начала
вакцинации
Опухолеспецифический
Т-клеточный
ответ (5/5);
стабильное заболевание (1/5)
Tada F. et al.,
2012 [269]
Внутривенно, 1-3-5×107 кл +
внутрикожно, 1×107 кл, 3
↑ количества опухолеспецифических Тлимфоцитов (6/10);
Su Z. et al.,
2003 [270]
9
I/II
5
I
10
с
Гибридный белок (αфетопротеин,
глипикан-3, MAGE-3,
пептид
цитоплазматической
трансдукции);
цитокиновый
коктейль 2*
Суммарная
РНК
опухоли
54
против
Yu J. et al.,
2001 [267]
Таблица 2 (продолжение)
Тип опухоли
Фаза
Кол-во
пациентов
Тип АГ
Схема лечения
Результат
раза с интервалом 14 сут
Миелоидная
лейкемия
Лимфоцитарная
лейкемия
Остеосаркома
Рак яичников
Меланома (III и
IV стадия)
I
I
4
15
Апоптотические
клетки
лейкемии,
KLH; ОК432*
Аутологичные
апоптотические
клетки; ФНОα*
В-
Внутрикожно, 5
интервалом 14 сут
раз
с
ДК: внутрикожно (1×107 кл),
4 раза с интервалом 14 дней,
1 раз спустя 14 недель после
первой ДК вакцины;
ГМ-КСФ: 4 раза; после ДК
вакцины;
ЦФ: за 2 сут до введения ДК.
когорта 1: ДК
когорта 2: ДК+ГМ-КСФ
когорта 3: ДК+ГМ-КСФ +ЦФ
Внутрикожно, 105–106 кл, 3
раза с интервалом 7 сут.
После
ДК
терапии
подкожные инъекции ИЛ-2 6
раз с интервалом 1 сут
12
Лизат аутологичной
опухоли, KLH; ПГЕ2*
I/II
11
Пептиды
hTERT
988Y,
Her2/neu
369VV2V9, Her2/neu
689
и
PADRE;
Klebsiella
pneumoniae*; ИФН-γ*
Внутрикожно, 3.5×107 кл, 4
раза с интервалом 21 сут; ЦФ
внутривенно
I
20:
5 – III
15 – IV
Лизат аутологичной
меланомы; ФНО-α*
Внутрикожно, 1-5×106 кл, 4
раза с интервалом 10 сут
I
55
смертность пациентов 3/10 после 19.8
Антилейкемический CD8+ Т-клеточный
ответ (2/4);
↓ количества лейкемических клеток в
костном мозге в 2.1 раза (1/4)
Ссылка
Kitawaki T. et
al., 2011 [271]
Антилейкемический CD8+ Т-клеточный
ответ
(1) 2/5;
(2) 3/5;
(3) 5/5
Palma M. et al.,
2012 [272]
Противоопухолевый CD8+ Т-клеточный
ответ (2/12).
Отсутствие клинического ответа.
Himoudi N et
al., 2012 [273]
Рецидив
заболевания
в
течение
вакцинации (2/11);
рецидив заболевания после вакцинации
(3/11);
отсутствие признаков заболевания в
течение >36 мес (6/11);
36-месячная общая выживаемость 90%
↑ продукции ИФН-γ (10/20);
↑ цитотоксичности ЦТЛ (4/20);
DTH+-реакция (11/20);
↑ времени опухолевой прогрессии в 4.1
раз (группа DTH+-реакция по сравнению
с группой DTH—реакцией);
↑ выживаемости в 2,9 раз (группа DTH+реакция по сравнению с DTH—реакцией)
Chu C.S. et al.,
2012 [274]
Escobar A. et
al., 2005 [275]
Таблица 2 (продолжение)
Тип опухоли
Меланома
Фаза
Кол-во
пациентов
Тип АГ
Схема лечения
24
Пептиды
gp100,
тирозиназа,
MAGEA2,
MAGE-A3,
MART-1, MAGE-A1,
KLH
Подкожно, 1-5×107 кл, 4 раза
с интервалом 7 сут, далее 1
раз через 14 сут и 5 раз с
интервалом 1 мес
33
Лизаты
клеток
аллогенных
линий
меланомы
M44,
COLO829, SK-MEL28;
ИФН-γ*
Около лимфатических узлов,
2.5×107
кл,
6
раз
с
интервалом 14 сут, далее 2
раза с интервалом 42 сут
III
127
ПКФ-ГМ-КСФ,
гибридный белок
Внутривенно, 3.7×109 кл, 3
раза с интервалом 14 сут
III
512
ПКФ-ГМ-КСФ,
гибридный белок
Внутривенно, 3.7×109 кл, 3
раза с интервалом 14 сут
II
Рак простаты
Результат
↑ опухолеспецифических CD8+ Т-клеток
(18/24);
активация Тh1 ответа (12/24);
DTH+ реакция на ОАГ – 41% пациентов;
DTH+ реакция на KLH – 64% пациентов;
↑ выживаемости пациентов в 1.9 раз;
частичный ответ (1/24);
стабильное заболевание (7/24);
прогрессирующее заболевание (16/24)
↑ опухолеспецифических CD8+ Т-клеток
в крови (26/33);
полный ответ (1/33),
частичный ответ (2/33),
стабильное заболевание (6/33)
Прогрессирующее
заболевание
(115/127);
↑ времени прогрессии заболевания в 1.2
раза;
↑ средней выживаемости в 1.2 раза
↓ риска смерти на 22%;
↑ средней выживаемости в 1.2 раза;
↑ 36-месячной выживаемости в 1.4 раза;
активация Тh1 ответа
Ссылка
Oshita C. et al.,
2012 [14]
Ribas A. et al.,
2010 [276]
Small E. et al.,
2006 [266]
Kantoff P.W. et
al., 2010 [15]
Примечания: *- факторы созревания ДК; DTH-реакция – реакция гиперчувствительности замедленного (IV) типа; KLH – keyhole limpet
hemocyanin, гемоцианин Fissurella aperturа; ОК432 – смесь группы А Streptococcus pyogenes низкой вирулентности; цитокиновый
коктейль 1 – ПГЕ2, ФНОα, ИЛ-1β, ИЛ-6; цитокиновый коктейль 2 – ПГЕ2, ФНОα, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИФН-γ, ОК432, поли I:C; ЦФ –
циклофосфамид; стабильное заболевание – нет видимых изменений в размере опухоли; прогрессирующее заболевание – увеличение
размеров опухоли на 20%; частичный ответ – снижение размеров опухоли на 30%; полный ответ – исчезновение опухоли.
56
трансфецированные СЕА-мРНК, 5-ти пациентам. В результате исследования было
показано, что у всех 16-ти пациентов наблюдался Т-клеточный ответ против KLH после
получения ДК вакцин. СЕА-специфические Т-лимфоциты были выявлены у 8-ми из 11-ти
пациентов в группе ДК/пептид и ни у одного пациента в группе ДК/РНК. Клинический
ответ, заключающийся во временном увеличении уровня СЕА в сыворотке крови по
сравнению с контролем, наблюдался у 7-ми из 11-ти пациентов в группе ДК/пептид и у 2х из 5-ти пациентов в группе ДК/РНК. Средняя выживаемость без прогрессии болезни
составила для группы ДК/пептид 18 месяцев и для группы ДК/РНК 26 месяцев.
Довольно слабые результаты были получены в работе Tada F. с коллегами [269], где
ДК вакцину, полученную нагрузкой ДК рекомбинантным гибридным белком, который
состоял из ОАГ α-фетопротеина, глипикана-3 и MAGE-3, доставленных с помощью
пептида цитоплазматической трансдукции, применяли для лечения 5-ти пациентов с
гепатоцеллюлярной карциномой. Вакцина индуцировала опухолеспецифический Тклеточный ответ у всех 5-ти пациентов, однако клинический ответ, заключающийся в
стабилизации болезни, наблюдался лишь у 1-го пациента (Табл. 2).
В работе Su Z. с соавторами [270] ДК, трансфицированные суммарной опухолевой
РНК, применяли для лечения 10-ти пациентов с метастазирующим раком почки в IV
стадии после нефрэктомии. Вакцина была достаточно эффективна и вызывала увеличение
количества опухолеспецифических Т-лимфоцитов (6/10), при этом Т клеточная
реактивность была направлена против большого количества опухоль-ассоциированных
антигенов, включая теломеразную обратную транскриптазу, G250 и онкофетальный
антиген, но не против собственных антигенов, экспрессирующихся нормальными тканями
почки. Смертность пациентов, получавших ДК вакцины, оказалась низкой – только 3 из
10-ти пациентов умерли от болезни после среднего периода наблюдения 19.8 месяцев
(Табл. 2).
В работе Kitawaki T. с соавторами [271] ДК вакцину, полученную кокультивированием с апоптотическими лейкемическими клетками, применяли для лечения
4-х пациентов с острой миелоидной лейкемией. У двух пациентов был зафиксирован
антилейкемический CD8+ Т-клеточный ответ, который коррелировал с клиническим
ответом, заключающимся в большем периоде стабилизации болезни по сравнению с
другими пациентами. У одного из пациентов процент лейкемических клеток в костном
мозге снижался с 11% до 5.2% в течение второго месяца после пятой ДК вакцины
(Таблица 2).
57
Слабая эффективность ДК вакцины была показана в работе Palma M с коллегами
[272], где ДК, нагруженные аутологичными апоптотическими В-клетками, применяли для
лечения пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией. 3 когорты пациентов (всего
15) получали либо только инъекции ДК, нагруженных апоптотическими В клетками (1
когорта), либо инъекции модифицированных ДК в сочетании с ГМ-КСФ (2 когорта) или
ГМ-КСФ и циклофосфамида до начала вакцинации (3 когорта). Иммунный ответ
наблюдался у 10-ти из 15-ти пациентов и заключался в наличии лейкемия-специфических
Т-клеток. Однако объективного клинического ответа отмечено не было. У пациентов с
иммунным ответом было отмечено статистически значимое уменьшение количества Трегуляторных клеток (Табл. 2).
Некоторые типы опухолей не реагировали на лечение с помощью ДК. Так, в работе
Himoudi N. с коллегами [273] лечение пациентов с рецидивирующей остеосаркомой с
помощью ДК, нагруженных лизатом клеток аутологичной опухоли, не приводило к
клиническому ответу, а иммунологический ответ (специфический противоопухолевый Тклеточный ответ) наблюдался лишь у 2-х из 12-ти пацинетов. Клинический ответ не был
отмечен (Табл. 2).
В работе Chu C.S. с коллегами [274] в I/II фазе клинических исследований ДК
вакцину применяли для лечения 11-ти пациентов с раком яичников. ДК вакцину получали
нагрузкой ДК опухолеспецифическими пептидами hTERT 988Y, Her2/neu 369VV2V9,
Her2/neu 689, PADRE и применяли в сочетании с химиотерапией циклофосфамидом. В
результате исследования было показано, что у 2-х из 11-ти пациентов наблюдался рецидив
рака яичников. Девять пациентов получили все четыре ДК вакцины, причем у 6-ти из них
не наблюдалось признаков болезни в течение более 36 месяцев, у 3-х пациентов рецидив
опухоли наступил на 6-ой, 16-ый и 26-ой месяцы. Общая выживаемость через 3 года
составила 90%. Однако иммунологический ответ был достаточно невысоким и
характеризовался малым количеством опухолеспецифических CD8+ Т-лимфоцитов.
Химиотерапия циклофосфамидом, сопутствующая иммунотерапии ДК, незначительно
увеличивала продолжительность жизни пациентов (Табл. 2).
В работе Escobar A. с коллегами [275] была исследована ДК вакцина, нагруженная
лизатом клеток меланомы, для лечения 20-ти пациентов, страдающих злокачественной
меланомой в стадиях III и IV. ДК вакцина индуцировала увеличение продукции ИНФ-γ у
50% исследуемых пациентов. Спустя один месяц после окончания терапии у всех
пациентов была проверена DTH-реакция, положительный результат которой определялся
как возникновение небольшого (более чем 5 мм) участка эритемы (ограниченной
58
гиперемии кожи) в ответ на внутрикожную инъекцию белка KLH или опухолевого лизата
и свидетельствовал об активации иммунной системы. Более 50% пациентов (11/20) имели
положительную DTH-реакцию. У пациентов, находившихся в IV стадии заболевания и
имеющих положительную DTH-реакцию, наблюдалось увеличение времени развития
опухоли по сравнению с пациентами, у которых DTH-реакция не проявилась (13.3
месяцев и 3.3 месяцев, соответственно). Выживаемость пациентов после прохождения
курса терапии ДК была выше у пациентов c DTH-положительным ответом, в отличие от
пациентов с отрицательным DTH-ответом (25 месяцев против 8.6 месяцев) (Табл. 2).
Хорошие результаты были получены в работе Oshita C. с соавторами [14] при
применении мультиэпитопной ДК вакцины, полученной нагрузкой ДК смесью
опухолеспецифических пептидов gp100, тирозиназы, MAGE-A2, MAGE-A3, MART-1,
MAGE-A1, для лечения 24-х пациентов с метастатической меланомой. ДК вакцина
индуцировала сильный иммунологический ответ: у 18-ти из 24-х пациентов были
обнаружены CD8+ Т-лимфоциты, специфические ко всем пяти опухолеспецифическим
пептидам; у половины пациентов наблюдалась активация Т-хелперного ответа первого
типа;
у
41%
пациентов
наблюдалась
положительная
DTH-реакция
на
опухолеспецифические пептиды и у 64% пациентов – на KLH. Клинический ответ на ДК
вакцинирование заключался в значительном увеличении выживаемости пациентов,
получавших ДК вакцины, по сравнению с контролем (13.6 и 7.3 месяца, соответственно)
(Табл. 2).
ДК вакцина, полученная нагрузкой ДК лизатом аллогенных клеточных линий
меланомы М44, COLO829 и SK-MEL28, также была эффективна в лечении пациентов с
метастатической меланомой [276]. Такая вакцина индуцировала опухолеспецифические
CD8+ Т-лимфоциты у 26-ти из 29-ти пациентов (90%). Клинический ответ наблюдался у 9ти из 33-х пациентов, получавших ДК вакцины (Табл. 2).
На сегодняшний день единственной вакциной на основе ДК, прошедшей III фазу
клинических испытаний, является так называемая Sipuleucel-T для лечения пациентов с
раком предстательной железы [266]. Не смотря на это, результаты клинических
испытаний Sipuleucel-T оказались менее впечатляющими по сравнению с другими
работами, посвященными исследованию противоопухолевых ДК вакцин в клинике.
Sipuleucel-T представляет собой клеточный препарат из продуктов лейкафереза, в состав
которого входят и ДК. Клетки нагружали гибридным белком, состоящим из
полноразмерного
человеческого
белка
простатической
кислой
фосфатазы
и
полноразмерного человеческого ГМ-КСФ (ПКФ-ГМ-КСФ). В исследовании принимало
59
участие 127 пациентов с асимптоматическим метастатическим гормонорефрактерным
раком простаты: 82 пациента получали Sipuleucel-T, 45 пациентов – плацебо. На фоне
лечения такой вакциной у большинства пациентов (115-ти из 127-ми) наблюдали
прогрессирующее заболевание. Среднее время прогрессии заболевания для группы
пациентов, получавших лечение Sipuleuсel-T, было незначительно выше по сравнению с
группой пациентов, получавших плацебо (11.7 недель и 10.0 недель, соответственно). Тем
не менее, наблюдалось небольшое увеличение средней выживаемости пациентов,
получавших лечение Sipuleucel-T в 1.2 раза по сравнению с пациентами, получавшими
плацебо (25.9 и 21.4 месяцев, соответственно) (Табл. 2).
В следующей работе, посвященной Sipuleucel-T, Kantoff P.W. с соавторами [15]
применяли Sipuleucel-T для лечения пациентов с метастазирующим кастратрезистентным
раком простаты. В исследовании была значительно расширена выборка пациентов (до
512-ти). 341 пациент получал Sipuleucel-T, 171 пациент – плацебо. Sipuleucel-T приводил
1.2-кратному увеличению средней выживаемости (25.8 месяцев по сравнению с 21.7
месяцев в группе плацебо) и 1.4-кратному увеличению 36-месячной выживаемости (31.7%
по сравнению с 23.0% в группе плацебо), а также к развитию иммунологического ответа
на иммунизированные АГ и Т клеточного ответа Th1 типа. Вскоре после опубликования
этих результатов, Sipuleucel-T был одобрен Управлением по контролю качества продуктов
и лекарств США (FDA USA) для лечения пациентов и коммерциализирован под
названием Provenge® [277].
Заключение
Несмотря на множественные механизмы уклонения опухоли от иммунного ответа,
были получены многообещающие результаты в иммунотерапии рака с помощью ДК на
мышиных
моделях опухолевой
прогрессии. Результаты клинических
испытаний
противоопухолевых ДК вакцин также были достаточно неплохими, однако они оказались
менее впечатляющими по своей эффективности по сравнению с данными экспериментов
на мышиных моделях опухолевой прогрессии in vivo. Возможно, это связано с тем, что в
большинстве случаев клинические испытания проводятся на онкологических больных,
находящихся на терминальных стадиях развития заболевания, когда любое лечение
малоэффективно. Кроме того, низкая эффективность ДК вакцин в клинике может быть
связана с более выраженным подавлением иммунной системы опухолью человека.
Остались нерешенными проблемы поиска наиболее иммуногенного источника ОАГ
и недостаточной специфичности и эффективности доставки ОАГ в ДК, что может
сказываться на недостаточной презентации процессированных ОАГ в комплексах с
60
молекулами МНС I/II на поверхности ДК и слабой поляризации противоопухолевых
иммунных ответов. Поэтому дальнейшая разработка противоопухолевых вакцин на
основе ДК, способных преодолевать негативное действие опухоли и ее окружения и
инициировать эффективный противоопухолевый иммунный ответ, остается важной
задачей.
61
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Реактивы и препараты
В работе были использованы акриламид, N,N’-метиленбисакриламид, ТЕМЕD, Трис,
ЭДТА,
диэтилпирокарбонат
(DEPC),
бромфеноловый
синий,
ксиленцианол,
формальдегид, параформальдегид производства ICN (Германия); раствор антибиотиков и
антимикотика (100 ед./мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл
амфотерицина), фосфатно-солевой буфер (PBS) производства ICN Biomedicals (США);
среда для отделения лимфоцитов LSM производства MP Biomedicals (США);
формальдегид, мочевина, персульфат аммония, агароза, конканавалин А, МТТ,
культуральные среды RPMI, DMEM и IMDM, среда для отделения моноцитарнолейкоцитарной фракции Histopaque-1083, магнитные бусы Dynabeads Mouse DC
Enrichment Kit и Dynal Mouse CD8 Negative Isolation Kit, набор реагентов для определения
концентрации белка Total Protein Kit Micro-Lowry Peterson`s Modification производства
Sigma (США); среда Opti-MEM, Lipofectamine 2000, набор реагентов для мультиплексного
анализа Mouse Cytokine 10-Plex Panel производства Invitrogen (США); EVA-Green
производства Biotium (США); 10× ПЦР мастер-микс производства Вектор-Бест (Россия);
сыворотка Hy Clone FBS, наборы реагентов для иммуноферментного анализа Mouse IFN
gamma, Mouse Interferon Alpha (Mu-IFN-), Mouse IL-6, Mouse IL-1 alpha, Mouse TNF alpha
ELISA kits производства ThermoScientific (США); трипановый синий производства BioRad
(США); бромистый этидий производства Fluka (Швейцария); рекомбинантный ГМ-КСФ,
рекомбинантный ИЛ-4 и рекомбинантный ИЛ-2 мыши производства Millipore (США);
реагент Trizol производства Ambion (США); Wizard Plus Megapreps DNA Purification
System производства Promega (США); PerfectPrep EndoFree Plasmid Maxi Kit производства
5 Prime (Германия); Mouse IFN-γ ELISPOT Set производства BD Bioscience Pharmingen
(США); моноклональные анти-мышиные антитела анти-CD4-PE производства CALTAG
(Великобритания); анти-CD206-FITC производства BioLegend (США); анти-CD8-FITC,
анти-CD11c-FITC, анти-CD83-PE производства BD Biosciences (США), анти-CD80-FITC,
анти-CD86-PE, анти-MHC II-FITC производства Life Technologies (США).
Остальные использованные в работе реактивы были отечественного производства и
имели квалификацию “о.с.ч.” и “х.ч.”.
В работе использовали ферменты: эндонуклеазы рестрикции BamH I, Vne 1
(СибЭнзим,
Россия),
а
также
ревертазу
M-MLV
производства
биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН (Россия).
62
Лаборатории
2.1.2. Оборудование
В работе использовали спектрофотометр BioMate 3 (Thermo LabSystems, США);
Axioimager Z microscope (ZEISS, Германия); pH-метр Orion 410A (США); центрифуги
Eppendorf 5810R, Eppendorf 5415R, Eppendorf MiniSpin (Eppendorf, Германия) и Contron
T42K (Centricon Instruments, Италия); многоканальный спектрофотометр Multiskan RC
(Thermo LabSystems, США); проточный цитофлуориметр Cytomics FC500 (Beckman
Coulter, США); магнитный концентратор Dynal Magnetic Particle Concentrator (Chemicon,
США); анализатор размеров и дзета-потенциалов частиц и молекул Malvern Zetasizer Nano
(Malvern Instruments, Великобритания); ультразвуковая баня Ultrasonic cleaner 08849-02
(Cole-Parmer, США); система гель-документации Infinity-1500/36M (Vilber Lourmat,
Франция); вортекс для пробирок Reax top (Heidolph, Германия), молекулярный имаджер
Pharos FX Plus Molecular Imager (Bio-Rad, США).
Для обработки полученных результатов использовали следующее программное
обеспечение: Microsoft Excel 2010, CXP Analysis, Adobe Photoshop CS3.
Для работы с клетками использовали ламинарный бокс Ламинар-С. (Ламинарные
системы, Россия), СО2-инкубатор производства Sanyo (Япония), автоматический счетчик
клеток ТС20 производства Bio-Rad (США). Для наблюдения за клетками использовали
инвертированный микроскоп Биолам П2-1 (ЛОМО, Россия). В работе использовали
культуральный пластик производства TPP (Швейцария), Costar (США).
2.1.3. Плазмиды
В работе была использована плазмида pEGFP производства Clontech (Германия),
содержащая ген зеленого флуоресцентного белка.
2.1.4. Буферы и растворы
PBS
1.47 мМ KH2PO4, 4.29 мМ Na2HPO4.7H2O, 137 мМ NaCl
TBE
2 мМ ЭДТА, 0.089 М Трис-борат, рН 8.3
Раствор
бромистого
этидия
Раствор М
Буфер ОТ
0.002%-ный бромистый этидий в воде
20% фиколл, 0.025%-ный бромфеноловый синий, 0.025%-ный
ксиленцианол
50 мМ Трис-HCl, 75 мМ КCl, 3 мМ MgCl2
Для приготовления всех буферных растворов и реакционных проб использовали
воду, очищенную на установке MilliQ (Millipore, США). Все растворы и среды
фильтровали через нитроцелюллозные фильтры с диаметром пор 0.22 или 0.45 мкм (TPP,
Щвейцария).
63
2.1.5. Клеточные культуры
Клетки В16-F10 (меланома мыши) были получены из банка клеточных культур
Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Клеточная линия BHK-IR780,
эндогенно экспрессирующая зеленый флуоресцентный белок, была получена из ВНК
клеток (почка хомяка) и любезно предоставлена профессором В. С. Прасоловым
(Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия). Клетки
инкубировали в DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 100 ед/мл
пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, и 0.25 мкг/мл амфотерицина в атмосфере,
содержащей 5%-ный СО2 при 37. °С, и регулярно пассировали для поддержания
экспоненциального роста.
2.1.6. Лабораторные животные
В работе использовали 10-14-недельных мышей линии C57Bl/6 развода вивария
конвенциональных животных ИЦиГ СО РАН и ИХБФМ СО РАН. Животных содержали
по 10 особей в клетке в хорошо освещенном помещении. Мыши имели свободный доступ
к еде и воде. Эксперименты с животными проводили согласно директиве European
Communities Council Directive 86/609/CEE.
2.1.7. Опухолевые модели
Для экспериментов использовали мышиные модели опухолей аденокарциномы
Кребс-2, карциномы легких Льюис (LLC) и меланомы В16.
Асцитная
карцинома
Кребс-2
–
линейнонеспецифическая
опухоль,
трансплантируется на все инбредные линии мышей. При подкожной и внутримышечной
прививке растет в виде солидных узлов. Слабо иммуногенна для мышей всех линий.
Метастазов не образует.
Аденокарцинома легких Льюис – линейноспецифическая опухоль для мышей линии
C57Bl.
При
любом
способе
трансплантации
метастазирует
в
легкие,
образуя
метастатические узлы, которые могут быть учтены количественно. Слабоиммуногенна.
Меланома В16-F10 (далее В16) – линейноспецифическая опухоль для мышей линии
C57Bl. При внутривенном способе трансплантации метастазирует в легкие, образуя
хорошо заметные темные метастатические
узлы, которые могут быть
учтены
количественно.
Штаммы опухолей Кребс-2 и карциномы легких Льюис постоянно поддерживаются
в виварии конвенциональных животных ИЦиГ СО РАН путем регулярного пассирования
на мышах.
64
2.1.8. Липосомы
Поликатионные липосомы, состоящие из катионных липидов с одним (X2, S1, S2 и
S3) или двумя (2X3) остатками холестерина или диалкилглицерина (2D3), связанных со
спермином, и липида-хелпера DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин),
(мольное отношение 1:1), были любезно предоставлены д.х.н., проф. М. А. Масловым
(Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В.
Ломоносова, Москва, Россия).
Маннозилированные липосомы на основе коровой липосомы 2X3-DOPE (мольное
отношение 1:2), которые содержали 2.5, 5 или 10% мол. маннозилированных
липоконъюгатов, состоящих из D-маннозы и диалкилглицерина, соединенных через
сукцинильный (липоконъюгат 1, липосомы М1, М2, М3, соответственно) или скваратный
(липоконъюгат 2, липосомы М4, М5, М6, соответственно) линкеры, были любезно
предоставлены к.х.н. Е. В. Шмендель и д.х.н., проф. М. А. Масловым (Московский
государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова,
Москва, Россия).
2.2 МЕТОДЫ
2.2.1. Гель-электрофорез
2.2.1.1. Электрофорез в агарозном геле
Качество выделенной РНК и разделение фрагментов ДНК проверяли с помощью
электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле в буфере ТВЕ и при напряжении
электрического поля 20 В/см. Гель окрашивали бромистым этидием, фотографировали
при визуализации в ультрафиолетовом свете с использованием прибора Infinity-1500/36M.
2.2.1.2.Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
Для разделения фрагментов РНК использовали электрофорез в 8%-ном ПААГ при
соотношении акриламид : N,N’-метиленбисакриламид = 20 : 1 в присутствии 8 М
мочевины в буфере ТВЕ при напряженности электрического поля 30-45 В/см. Перед
нанесением
на
гель
пробы
растворяли
в
растворе
М.
Гели
высушивали
и
радиоавтографировали с использованием экрана молекулярного имаджера Pharos FX Plus
Molecular Imager (Bio-Rad, США).
2.2.2. Получение первичных культур опухолевых клеток
На 10–12-ый день развития асцитной опухоли Кребс-2 0.5 мл физиологического
раствора вводили животным в брюшную полость. Мышь умерщвляли методом
65
дислокации шейных позвонков, далее асцитную жидкость собирали с помощью шприца и
разводили в 5 мл PBS. Солидную опухоль LLC на 14–16 дни развития гомогенизировали и
разводили в 5 мл PBS. Клетки Кребс-2 или LLC наслаивали на 3 мл среды LSM или
Histopaque-1083, центрифугировали при 450 g в течение 15 мин. Фракцию клеток,
находящуюся на границе раздела LSM или Histopaque-1083 и супернатанта, переносили в
чистую пробирку, содержащую 5–7 мл PBS, суспендировали и центрифугировали при 200
g в течение 5 мин. Клетки Кребс-2 и LLC культивировали в среде IMDM, содержащей
10% FBS и 1%-ный раствор антибиотиков и антимикотика (100 ед./мл пенициллина, 0.1
мг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина), в концентрации 3×10 5 кл/мл в
атмосфере 5%-ного СО2 при 37 С или использовали для получения суммарной РНК и
лизата непосредственно после выделения.
2.2.3. Выделение суммарной клеточной РНК
Суммарную клеточную РНК выделяли из клеток с помощью реагента TRIzol
согласно
протоколу
фирмы-изготовителя.
Клетки
(5–10106)
осаждали
центрифугированием при 450 g. в течение 5 мин. Супернатант удаляли, к осадку клеток
добавляли 1 мл TRIzol, тщательно перемешивали и инкубировали при 24 °С в течение 5
минут. Далее к образцу добавляли 0.2 мл хлороформа, встряхивали и инкубировали при
24 °С в течение 3 минут. Водную фазу отделяли от органической центрифугированием
(12000 g, 4 С, 15 мин). РНК осаждали из водной фазы 0.5 объемами изопропанола при 24
°С в течение 10 мин. Осадок РНК отделяли центрифугированием (12000 g, 4 С, 5 мин),
промывали 75%-ным этанолом, высушивали при 24 °С в течение 5-10 мин и растворяли в
Н2О milli Q, хранили при −20 С.
Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по поглощению на длине
волны 260 нм. Сохранность выделенной РНК проверяли с помощью электрофореза в 1%ной агарозе.
2.2.4. Выделение предшественников ДК мыши из костного мозга
Мышь умерщвляли методом дислокации шейных позвонков, извлекали бедренные и
большие берцовые кости. Концы костей удаляли, диафизы дважды промывали 3 мл
буфера PBS. Клетки суспендировали, костно-мозговые предшественники ДК выделяли с
помощью центрифугирования на среде Histopaque-1083, как описано в пункте 2.2.2.
2.2.5. Получение незрелых ДК из костно-мозговых предшественников ДК
К клеточной суспензии предшественников ДК мыши (106 кл/мл) в среде IMDM,
содержащей 10% FBS и 1%-ный раствор антибиотиков и антимикотика (100 ед./мл
66
пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина), добавляли ГМ-КСФ
мыши (20 нг/мл) и ИЛ-4 мыши (50 нг/мл). Каждые 48 часов клетки собирали
центрифугированием при 200 g в течение 5 мин, удаляли половину объема среды и
заменяли на свежую среду с ГМ-КСФ (20 нг/мл) и ИЛ-4 (50 нг/мл). На 6–7 день из костномозговых предшественников ДК получали незрелые ДК.
2.2.6. Получение первичной культуры спленоцитов из селезенки мыши
Мышей линии C57Bl/6 умерщвляли методом дислокации шейных позвонков,
извлекали селезенку и гомогенизировали раздавливанием между стеклами. Гомогенат
смывали со стекла 3-4 мл буфера PBS. Дальнейшее выделение спленоцитов проводили,
как описано в пункте 2.2.2. Спленоциты помещали в среду IMDM, содержащую 10% FBS
и 1%-ный раствор антибиотиков и антимикотика, в концентрации 106 кл/мл и
культивировали в атмосфере 5%-ного СО2 при 37 С.
2.2.7. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток антителами
Для характеризации спленоцитов использовали анти-CD4-PE (CALTAG) и антиCD8-FITC (BD Biosciences) антитела; ДК – анти-CD11c-FITC (BD Biosciences), антиCD206-FITC (BioLegend), анти-CD83-PE (BD Biosciences), анти-CD80-FITC, анти-CD86PE, анти-MHC II-FITC (Life Technologies) антитела. Клетки (5×106) центрифугировали при
200 g в течение 10 мин, удаляли супернатант и суспендировали в 250 мкл буфера PBS.
Центрифугировали при 200 g в течение 10 мин и удаляли супернатант. К клеткам
добавляли 95 мкл буфера PBS и 0.4 мкг моноклональных антител и инкубировали при
0 °С в течение 1 часа. Клетки дважды промывали буфером PBS, суспендировали в 400 мкл
4%-ного
раствора
формальдегида.
Анализ
проводили
с
помощью
проточной
цитофлуорометрии на приборе Cytomics FC500, результаты обрабатывали с помощью
программы CXP Analysis.
2.2.8. Приготовление комплексов катионных липосом и нуклеиновых кислот
Для трансфекции ДК использовали плазмидную ДНК pEGFP-C2 (далее pEGFP),
суммарную РНК из ВНК-IR780 клеток (далее РНК-EGFP), клеток меланомы мыши B16
(далее РНК-B16), клеток аденокарциномы Кребс-2 (далее РНК-Кребс-2) и клеток
карциномы легких Льюис (далее РНК-LLC). Суммарную РНК выделяли с помощью
TRIzol Reagent, как описано в пункте 2.2.3.
Комплексы ДНК(РНК)/липосомы формировали при следующих соотношениях N/P
(соотношение количества аминогрупп в липосомах к количеству фосфатных групп в НК):
1/1, 2/1, 4/1, 6/1, 8/1 и 10/1 для трансфекции ДНК (1 мкг ДНК соответствовал 3.08×10-9
моль фосфатов) или 1/1 и 2/1 для трансфекции РНК (1 мкг РНК соответствовал 2.94×10 -9
67
моль
фосфатов).
Комплексы
катионных
липосом
с
нуклеиновыми
кислотами
формировали в среде Opti-MEM в отсутствие сыворотки интенсивным перемешиванием
0.5 мкг ДНК или 5 мкг РНК с липосомами, взятыми в соответствующих концентрациях;
полученные смеси инкубировали 20 мин при 24 °С и использовали для трансфекции.
2.2.9. Физико-химическая характеристика липосом и липоплексов
Для измерения характеристик липосом 25 мкл липосом (1 мМ) растворяли в 975 мкл
деионизованной воды MilliQ. Для измерения характеристик липоплексов 1 мкг pEGFP-C2
смешивали
с
липосомами,
взятыми
в
концентрациях,
соответствующих
P/N
соотношениям N/P 1/2, 1/1, 2/1, 4/1, 6/1, 8/1 и 10/1, в 1 мл деионизованной воды MilliQ и
инкубировали в течение 15-ти мин при комнатной температуре. Размер частиц и ζ
потенциал измеряли с помощью прибора Malvern Zetasizer Nano.
2.2.10. Агглютинация с конканавалином А
Исследование агглютинации липосом с конканавалином А (КонА) проводили по
модифицированной методике [278]. Реакционная смесь (объем 100 мкл) содержала 25 мкг
КонА, 25 нМ липосом, PBS, рН 7.4, 1мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2. Мутность раствора
регистрировали с помощью спектрофотометра BioMate3 при 360 нм. Изменение мутности
раствора регистрировали в течение 10-ти мин 24 °С. Далее к раствору добавляли 1 мг
маннозы (в 10 мкл PBS, рН 7.4, 1мМ CaCl2, 1мМ MgCl2) и регистрировали изменение
мутности раствора еще в течение 5 мин.
Эффективную константу скорости формирования комплексов КонА с липосомами
рассчитывали по формуле (1). Все полученные корреляционные коэффициенты (R 2) были
>0.99, что указывает на корректность модели.
T (t )  a  be kt (1),
где T – мутность раствора; t – время; k – эффективная константа скорости изменения
мутности раствора.
2.2.11. Трансфекция pEGFP, РНК-EGFP, РНК-Кребс-2, РНК-LLC и РНК-B16 в
предшественники ДК и незрелые ДК мыши
Клетки высаживали в 24-х луночный планшет (предшественники ДК, 5×105
кл/лунку; незрелые ДК, 4×105 кл/лунку) в среде IMDM за 30 мин до трансфекции. Для
приготовления пДНК-содержащих липоплексов pEGFP (0.5 мкг/лунку) смешивали с
липосомами в концентрациях, соответствующих соотношениям N/P 1/1, 2/1, 4/1, 6/1, 8/1 и
10/1. Для формирования РНК-содержащих липоплексов РНК-EGFP, РНК-LLC или РНКВ16 (5 мкг/лунку) смешивали с липосомами в концентрациях, соответствующих
68
соотношениям N/P 1/1 и 2/1. Липоплексы формировали в 50 мкл среды Opti-MEM в
отсутствие сыворотки в течение 20-ти мин при 24 °С, как описано в разделе 2.2.8. Клетки
инкубировали с липоплексами в атмосфере 5%-ного СО2 при 37 °С в течение 4-х ч. После
этого к клеткам добавляли FBS до концентрации 10% и инкубировали в атмосфере 5%
СО2 при 37 °С в течение 44 ч. Трансфекцию ДНК или РНК с помощью коммерчески
доступного реагента Lipofectamine 2000 проводили в соответствии с протоколом
производителя.
Эффективность
трансфекции
оценивали
с
помощью
проточной
цитометрии на приборе FC500.
2.2.12. Проточная цитометрия
Для характеристики эффективности трансфекции липоплексов, содержащих pEGFP
ДНК и РНК-EGFP, использовали проточную цитометрию. Через 48 часов после
трансфекции клетки, трансфицированные pEGFP ДНК или РНК-EGFP, механически
открепляли от дна планшета скребком и собирали центрифугированием при 1000 об/мин в
течение 5-ти мин. Клетки промывали PBS и фиксировали 2% формальдегидом в PBS.
Полученные образцы анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием
проточного цитофлуориметра FC 500, данные обрабатывали с помощью программного
обеспечения СХР Analyze. Интенсивность флуоресценции отдельных клеток измеряли в
относительных единицах флуоресценции (RFU). Все экспериментальные точки были
повторены три раза для статистического анализа.
Эффективность трансфекции (ЭТ) характеризовалась двумя значениями: процентом
флуоресцентных клеток и средней интенсивностью флуоресценции (ИФ) в образце.
Процент pEGFP-положительных клеток в анализируемых образцах рассчитывали по
формуле: pEGFP+(%) = pEGFP+ образец (%) – pEGFP+контроль (%), где pEGFP+ образец (%) –
процент флуоресцентных клеток в анализируемом образце, pEGFP+контроль (%) – процент
флуоресцентных
клеток
в
отрицательном
контроле.
Среднюю
интенсивность
флуоресценции клеток рассчитывали по формуле: ИФ (RFU) = ИФобразец (RFU) – ИФконтроль
(RFU), где ИФобразец (RFU) – средняя флуоресценция клеток в анализируемом образце,
ИФконтроль (RFU) – средняя флуоресценция клеток в отрицательном контроле. Клетки,
инкубированные в отсутствии pEGFP ДНК или РНК-EGFP и липосом использовали в
качестве отрицательного контроля: в данных образцах процент флуоресцентных клеток и
интенсивность флуоресценции не превышали экспериментальную ошибку (1 – 3%).
Клетки, инкубированные в присутствии pEGFP ДНК или РНК-EGFP и Lipofectamine 2000
использовали в качестве положительного контроля.
69
2.2.13. Получение лизата клеток Кребс-2 и В16 и нагрузка ДК
Клетки опухоли Кребс-2 выделяли из асцита с помощью центрифугирования на
среде Histopaque-1083, как описано в пункте 2.2.3. Клетки меланомы В16 открепляли от
культурального пластика с помощью трипсина, последовательно промывали средой
IMDM, содержащей
10%-ный
FBS
и буфером PBS. Клетки Кребс-2 и
В16
ресуспендировали в среде IMDM без сыворотки и антибиотиков в плотности 5×10 6 кл/мл.
Клетки инкубировали при −70 °С в течение 20 мин и при 24 °С до полного растаивания.
Всего проводили четыре таких цикла. Лизат центрифугировали при 300 g в течение 1 мин,
и далее фильтровали супернатант через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0.22
мкм. Суммарную концентрацию белка в лизате определяли с помощью Total Protein Kit
Micro-Lowry Peterson`s Modification. Для этого аликвоты лизата объемом 10–20 мкл
доводили водой до 100 мкл. К смеси добавляли 100 мкл раствора реагента Лоури и
инкубировали в течение 20-ти мин при 24 °С. Далее добавляли 50 мкл реагента Фолина и
инкубировали в течение 30-ти мин при 24 °С для развития окраски раствора. Оптическую
плотность определяли на длине волны 550 нм. Концентрацию белков рассчитывали по
калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой использовали растворы
бычьего сывороточного альбумина в воде с концентрациями 50, 100, 200, 300 и 400
мкг/мл. Лизат хранили при температуре −20 °С. Для трансфекции ДК использовали лизат
из расчета 120 мкг белка на 1 мл клеточной суспензии ДК (106 ДК). Инкубацию ДК с
лизатом проводили в атмосфере 5% СО2 при 37 °С в течение 4 ч в отсутствие
котрансфектанта
2.2.14. Трансплантация опухолей
Аденокарцинома Кребс-2. Клетки Кребс-2 (105 кл в 0.2 мл PBS/животное)
трансплантировали внутримышечно в правую заднюю лапу мышам линии C57Bl/6
(самцам).
Карцинома легких Льюис (LLC). Клетки LLC (6×105 кл в 0.2 мл PBS/животное)
трансплантировали внутримышечно в правую заднюю лапу мышам линии C57Bl/6
(самцам).
Меланома В16. Клетки В16 (105 кл в 0.2 мл PBS/животное) в 0.2 мл
физиологического раствора трансплантировали внутривенно в хвостовую вену мышам
линии C57Bl/6 (самцам).
70
2.2.15. Исследование in vivo противоопухолевой активности ДК, нагруженных
РНК в комплексах с липосомами ex vivo
Противоопухолевую активность ДК исследовали на метастатической модели
меланомы В16. Клетки В16 трансплантировали, как описано в пункте 2.2.14.
Исследование катионных липосом. На 4-ый день после трансплантации опухоли
мышей-опухоленосителей делили на пять групп (n = 6): 1 группа, контроль, получала
физиологический раствор внутривенно; 2, 3, 4 и 5 группы – получали внутривенно зрелые
ДК (105 кл/животное), трансфицированные РНК-В16 в комплексе с Lipofectamine 2000
(LF/РНК-В16) (2), липоплексами 2X3-DOPE/РНК-В16 (3), 2D3-DOPE/РНК-В16 (4) и X2DOPE/РНК-В16 (5), соответственно.
Исследование маннозилированных липосом. На 4-ый день после трансплантации
опухоли мышей делили на семь групп (n=5): 1, контроль, получал внутривенно
физиологический раствор; 2, 3, 4, 5, 6 и 7 получали внутривенные инъекции ДК (105
кл/мышь), трансфицированных 2X3-DOPE/РНК-В16 (2), М1/РНК-В16 (3), М2/РНК-В16
(4), М4/РНК-В16 (5), М5/РНК-В16 (6) и М6/РНК-В16 (7), соответственно.
На 15-ый день развития опухоли мышей выводили из эксперимента, извлекали
легкие и фиксировали в 4% растворе формальдегида в течение 2-х недель. Количество
поверхностных
легочных
метастазов
подсчитывали
с
помощью
бинокулярного
микроскопа.
Кровь собирали и использовали для получения сыворотки. Сыворотку крови
получали методом формирования тромба при 37 °С в течение 30-ти мин с последующей
инкубацией при 4 °С в течение ночи. Тромб извлекали и сыворотку центрифугировали
(4000 об/мин, 4 °С, 20 мин). Образцы сывороток хранили при −70 °С.
2.2.16. Измерение уровней цитокинов в культуральной среде и сыворотке крови
экспериментальных животных
Уровни цитокинов ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-1α, ИФН-α и ИФН-γ измеряли в культуральной
среде, полученной после культивирования ДК, нагруженных РНК в комплексах с
липосомами, и сыворотке крови экспериментальных животных с помощью наборов
реагентов Mouse IFN gamma, Mouse IL-6, Mouse IL-1 alpha и Mouse TNF alpha
Colorimetric,
Mouse Interferon
Alpha
(Mu-IFN-)
ELISA
Kits
в
соответствии
с
рекомендациями фирмы-изготовителя. Уровни цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ6, ИЛ-10, ИЛ-12, ГМ-КСФ, ИФН-γ и ФНО-α измеряли с помощью набора реагентов Mouse
Cytokine 10-Plex Panel в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.
71
2.2.17. Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов in vitro
методом МТТ-теста
Из первичной культуры спленоцитов, полученной, как описано в пункте 2.2.6.,
изолировали CD8+ Т-лимфоциты с помощью CD8 магнитных бус. Лимфоциты
рестимулировали ДК, нагруженными РНК-В16 в комплексах с липосомами 2X3-DOPE,
2D3-DOPE, X2-DOPE (N/P=2/1) или Lipofectamine 2000 при соотношении лимфоциты:ДК
1:20 в присутствии ИЛ-2 (5 нг/мл) при 37 °С в течение 7 дней в атмосфере 5% СО2.
Праймированные Т-лимфоциты (эффекторные клетки) добавляли к клеткам меланомы
В16 (таргетные клетки) при отношениях эффекторные:таргетные клетки 1:1 и 1:5 и
инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. Специфический лизис оценивали с помощью
МТТ-теста [279]. Процент специфически лизированных клеток подсчитывали следующим
образом:
специфический
лизис
(%)
=
100 – (OD570эксп – OD620эксп) / (OD570конт –
OD620конт) × 100, где OD570эксп и OD570конт оптическая плотность экспериментальных и
контрольных лунок, соответственно, при длине волны 570 нм, и OD620эксп и OD620конт
оптическая плотность экспериментальных и контрольных лунок, соответственно, при
длине волны 620 нм.
2.2.18. Реакция аллогенных смешанных лимфоцитов
В
качестве
стимуляторных
клеток
использовали:
(1)
–
контроль
(w/t),
нестимулированные ДК; (2) – ДК, обработанные 100 нг/мл ЛПС; (3) – ДК, обработанные
10 мкг/мл РНК-В16; (4) и (5) – ДК, трансфицированные липоплексами 2X3-DOPE/РНКВ16 и М6/РНК-В16 (N/P 2/1, 10 мкг РНК на 106 ДК), соответственно; (6) и (7) – ДК,
обработанные пустыми липосомами 2X3-DOPE и М6, соответственно, в концентрациях,
соответствующих концентрациям в липоплексах. Во всех образцах ДК инкубировали с
соответствующими стимулирующими агентами при 37 °С и 5%-ном СО2 в течение 4-х ч.
Спленоциты выделяли из селезенки мыши линии C57Bl/6 (самец) с помощью
центрифугирования на среде Histopaque-1083. Спленоциты (105 кл/лун) культивировали в
96-луночном планшете в присутствии 104 стимуляторных клеток при 37 °С и 5%-ном СО2
в течение 5-ти суток. Суммарный объем составлял 150 мкл/лун. Пролиферацию
спленоцитов оценивали с помощью WST-1 теста в соответствии с протоколом фирмыпроизводителя. Индекс пролиферации (ИП) рассчитывали по формуле: ИП (о.е.) = (OD450
образец
− OD620
образец
оптические плотности в лунках с образцами при длинах волн 450 нм и 620 нм,
образец)
/ (OD450
соответственно; OD450
спленоциты
спленоциты
− OD620 спленоциты) × 100, где OD450
and OD620
спленоциты
образец
and OD620
оптическая плотность в лунках со
спленоцитами без стимуляторных ДК при длинах волн 450 нм и 620 нм, соответственно.
72
Уровень пролиферации спленоцитов в отсутствие ДК соответствовал 100% и был принят
за одну относительную единицу (о.е.).
2.2.19. Праймирование Т-лимфоцитов in vivo с помощью маннозилированных
липосом
Здоровых мышей линии C57Bl/6 (самцов) возрастом 10-12 недель делили на четыре
группы (n=3 в каждой группе): группе 1 (контроль) внутривенно вводили 200 мкл OptiMEM; группам 2, 3 и 4 – 200 мкл липоплексов 2X3-DOPE/РНК-В16, М5/РНК-В16 и
М6/РНК-В16, соответственно, приготовленных при соотношении N/P=2/1 в Opti-MEM (10
мкг РНК/животное). На 7-ой день мышей выводили из эксперимента и выделяли
спленоциты, как описано в пункте 2.2.6. Спленоциты высаживали в полной среде IMDM
(106 кл/мл) в присутствии ИЛ-2 (5 нг/мл) и активировали лизатом клеток меланомы В16
(20 мкг белка/мл) при 37 °С в атмосфере 5%-ного CO2 в течение 4 дней с реактивацией на
второй день. Полученные ЦТЛ (эффекторные клетки) добавляли к клеткам меланомы В16
(таргетные клетки, 25 тыс. кл/лунку) в соотношении эффекторные клетки/таргетные
клетки 1/1, 5/1, 10/1 и 20/1 и инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. Специфический
лизис оценивали с помощью МТТ-теста, как описано в разделе 2.2.17. В качестве
контроля
спонтанной
клеточной
смерти
использовали
клетки
меланомы
В16,
инкубированные в отсутствие эффекторных клеток.
2.2.20. Состав вакцин и схемы вакцинации мышей ДК
Состав вакцины. Тип ДК вакцины указан как: С/Т/А, где С – схема лечения 1
(профилактическая) или 2 (терапевтическая), Т- трансфектант, А – источник антигена; или
С-И/Т/А, где С – схема лечения 1 (профилактическая) или 2 (терапевтическая), И –
количество иммунизаций, Т- трансфектант, А – источник антигена. Для модели Кребс-2
ДК вакцины получали из ДК, нагруженных суммарной РНК-Кребс-2 в комплексах с
Lipofectamine 2000 (вакцины 1/LF/РНК, 2/LF/РНК) или опухолевым лизатом (вакцины
1/лизат, 2/лизат), или интактных ДК, обработанных Lipofectamine 2000 (вакцины 1/LF,
2/LF). Для модели LLC ДК вакцины получали из ДК, трансфицированных суммарной
РНК-LLC в комплексах с коммерческим препаратом Lipofectamine 2000 (вакцины
1/LF/РНК, 2/LF/РНК) или катионными липосомами 2D3-DOPE (вакцины 1/2D3/РНК,
2/2D3/РНК). Для модели меланомы В16 ДК вакцину получали из ДК, трансфицированных
суммарной РНК-В16 в комплексе с катионными липосомами 2D3-DOPE (вакцины 11/2D3/РНК, 1-2/2D3/РНК, 2-1/2D3/РНК, 2-2/2D3/РНК). Все ДК вакцины вводили
внутривенно в концентрации 105 кл/животное в 0.2 мл PBS.
Схема лечения 1 (профилактическая).
73
Модель Кребс-2: Животных делили на три группы (n=6) и вводили ДК вакцины в/в:
(1) – 1/LF; (2) – 1/LF/РНК; (3) – 1/лизат. Через 7 дней после вакцинации ДК животным
трансплантировали клетки опухоли Кребс-2, как описано в пункте 2.2.14. Мышей
выводили из эксперимента на 19-ый день развития опухоли.
Модель LLC: Животных делили на две группы (n=6-8) и вводили ДК вакцины в/в: (1)
– 1/LF/РНК; (2) – 1/2D3/РНК. Клетки опухоли LLC трансплантировали внутримышечно
через 7 дней после введения ДК вакцин, как описано в пункте 2.2.14. Животных выводили
из эксперимента на 20-ый день.
Модель меланомы В16: Животных делили на две группы (n=5) и вводили ДК
вакцины в/в: (1) – 1-1/2D3/РНК за 7 дней до трансплантации опухоли (однократная
вакцина); (2) – 1-2/2D3/РНК за 14 и 7 дней до трансплантации опухоли (двукратная
вакцина). Клетки меланомы В16 трансплантировали, как описано в пункте 2.2.14.
Животных выводили из эксперимента на 15-ый день. В профилактической схеме в
качестве контроля использовали контроль терапевтической схемы, соответствующий типу
опухоли.
Схема лечения 2 (терапевтическая).
Клетки опухолей Кребс-2, LLC и В16 трансплантировали мышам, как описано в
пункте 2.2.14.
Модель Кребс-2: На 4-ый день после трансплантации Кребс-2 животных делили на
четыре группы (n=6) и вводили ДК вакцины в/в: (1, w/t) – PBS; (2) – 2/LF; (3) – 2/LF/РНК;
(4) – 2/лизат. Животных выводили из эксперимента на 20-й день.
Модель LLC: На 4-ый день после трансплантации LLC животных делили на четыре
группы (n=6-8) и вводили ДК вакцины в/в: (1, w/t) – PBS; (2) – 2/LF/РНК; (2) – 2/2D3/РНК.
Животных выводили из эксперимента на 20-ый день.
Модель меланомы В16: На 4-ый день развития опухоли животных делили на три
группы (n=5) и вводили ДК вакцины в/в: (1, w/t) – PBS; (2) – 2-1/2D3/РНК на 4-ый день
развития опухоли (однократная вакцина); (3) – 2-2/2D3/РНК на 4-ый и 11-ый дни развития
опухоли (двукратная вакцина). Животных выводили из эксперимента на 15-ый день.
Контрольные группы (1, w/t) в терапевтической схеме лечения также являлись
контрольными группами в профилактической схеме.
Размеры
опухолей
экспериментальных
животных
измеряли
с
помощью
штангенциркуля через каждые 2-3 дня в течение эксперимента. Объем опухоли
подсчитывали, используя отношение (длина×высота×ширина)/2. После окончания
эксперимента подсчитывали количество легочных метастазов в группах мышей с
метастатическими опухолевыми моделями LLC и В16. На 5-ый, 11-ый, 19-ый дни у части
74
животных забирали селезенку и определяли соотношение CD4+/CD8+ клеток, как описано
в пункте 2.2.7.
2.2.21. ОТ-ПЦР в режиме реального времени
Для оценки относительного уровня экспрессии Tbet, GATA3, RORγ и Foxp3
использовали ОТ-ПЦР в режиме реального времени с интеркалирующим красителем
EVA-Green. Суммарную РНК выделяли из 107 спленоцитов, полученных из следующих
групп мышей: (1) w/t, мыши с В16, получавших инъекции PBS; (2-5) мыши с В16,
получавшие ДК вакцины 1-1/2D3/РНК, 1-2/2D3/РНК, 2-1/2D3/РНК и 2-2/2D3/РНК,
соответственно. Суммарную клеточную РНК выделяли с помощью реагента TRIzol
согласно протоколу фирмы-изготовителя. 1 мкг РНК использовали для приготовления
кДНК в присутствии 20 ед. обратной транскриптазы M-MLV. Обратную транскрипцию
проводили в течение 1 ч при 37 °С в присутствии 50 пМ гексануклеотидного праймера, 0.5
мМ каждого из dNTP в буфере ОТ в суммарном объеме 20 мкл. Полученную кДНК
амплифицировали с помощью ПЦР в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 5
мкл кДНК (10-2 разведение), 10 мкл 10× ПЦР мастер-микс (Вектор-Бест, Россия), 0.4 мкМ
каждого праймера в присутствии EVA-Green (Invitrogen, USA). Были использованы
следующие праймеры: Tbet прямой 5’-CGGTACCAGAGCGGCAAGT-3’, Tbet обратный
5’-CATGCTGCCTTCTGCCTTTC-3’; GATA3 прямой 5’-TACTTGCGTTTTTCGCAGGA-3’;
GATA3
обратный
5’-GATCTGTCGCTTTCGGGCCT-3’;
RORγ
прямой
5’-
GGAGCTCTGCCAGAATGACC-3’, RORγ обратный 5’-CAAGGCTCGAAACAGCTCCAC3’;
Foxp3
прямой
5’-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTA-3’,
Foxp3
обратный
5’-
CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3’; β-актин прямой 5’-TCCACCA CCACAGCTGAGAGG3’, β-актин обратный 5’-CAGCTTCTCTTTGATGTCACG-3’ [280, 281]. Амплификацию
проводили следующим образом: 40 циклов 95 °С – 15 с, 75 °С – 1 мин, 60 °С – 30 с, с
последующим определением точки плавления или кривых диссоциации. Уровень
экспрессии гена определяли по количеству циклов с использованием стандартной кривой
и нормализовали на уровень экспрессии β-актина.
2.2.22. Статистический анализ
Для статистической обработки данных, полученных ex vivo (уровни цитокинов,
индекс пролиферации, ЦТЛ тест), использовали t-тест критерия Стьюдента; значение
p≤0.05 отражало статистически достоверные отличия. Для статистической обработки
данных, полученных in vivo (размер опухоли, количество метастазов), использовали
однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием наименьшей
75
значимости Фишера (Fisher LSD). Значение p≤0.05 отражало статистически достоверные
отличия. Для статистического анализа использовали программу STATISTICA 10.0.
76
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Приготовление ДК вакцины
В качестве модельных клеток использовали костно-мозговые предшественники ДК и
полученные из них незрелые ДК. На Рис. 8 представлена схема получения ДК вакцины.
Предшественники ДК (преДК) получали из клеток костного мозга мышей линии C57Bl/6 с
помощью центрифугирования на среде Histopaque-1083. CD11c+ преДК изолировали
путем иммуносорбции с помощью иммуномагнитных бус. Незрелые ДК получали
культивированием преДК или CD11c+ преДК в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 6
дней (см. Материалы и методы). ДК вакцину получали нагрузкой незрелых ДК ОАГ в
виде опухолевого лизата (пассивным методом) или суммарной опухолевой РНК (в
комплексах с катионными липосомами). В исследовании трансфекционного потенциала
катионных липосом в качестве источника антигенов для нагрузки ДК использовали
плазмидную ДНК pEGFP-C2 и суммарную РНК клеток BHK-IR780, эндогенно
экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (EGFP).
Рис. 8. Схема получения ДК вакцины. 1 – получение преДК из клеток костного мозга; 2 –
получение CD11c+ преДК.
Костно-мозговые преДК и незрелые ДК на 6-ой день инкубации обладали
различными морфологическими характеристиками – предшественники ДК представляли
собой мелкие клетки округлой формы, тогда как незрелые ДК обладали большими
размерами и имели многочисленные разветвленные отростки плазматической мембраны,
так называемые дендриты (Рис.9, Б, В, Г, Д).
77
Рис. 9. Морфология (А) костно-мозговых предшественников сразу после выделения и (Б-Д)
незрелых ДК на 6-ой день культивирования в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4. Стрелками показаны
ДК с отличительными морфологическими свойствами. Морфология клеток оценивалась фазовоконтрастной микроскопией при увеличении 400×.
3.2. Определение способности ДК активировать противоопухолевые
ответы ex vivo и in vivo
Способность
модифицированных
ДК
запускать
противоопухолевые
ответы
оценивали ex vivo по интенсивности противоопухолевого цитотоксического Т-клеточного
ответа, запускаемого такими ДК, и in vivo по снижению размеров опухоли и количества
метастазов у экспериментальных животных.
Для оценки интенсивности опухолеспецифического ЦТЛ ответа, запускаемого
модифицированными ДК, из селезенок мышей, получавших внутривенные инъекции
модифицированных ДК или липоплексов (комплексов липосом с суммарной опухолевой
РНК), выделяли спленоциты, рестимулировали их с помощью различных ОАГ, таких как
ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК или лизата опухолевых клеток. После
рестимуляции опухолеспецифические ЦТЛ ссаживали с опухолевыми клетками и
оценивали интенсивность цитотоксического ответа с помощью МТТ-теста (Рис. 10).
Противоопухолевый потенциал ДК, нагруженных ОАГ, оценивали in vivo по
эффективности подавления роста опухоли и количества метастазов.
78
Рис. 10. Схема определения ex vivo интенсивности опухолеспецифического ЦТЛ ответа,
запускаемого модифицированными ДК. В качестве источника антигенов для рестимуляции
спленоцитов использовали ДК, нагруженные ОАГ, или лизат опухолевых клеток.
3.3. Исследование трансфекционной активности поликатионных
липосом
3.3.1. Поликатионные липиды и липосомы
Катионные липосомы состояли из поликатионных липидов на основе спермина и
липида-хелпера
DOPE
(диолеоилфосфатидилэтаноламина).
Структуры
катионных
липидов представлены на Рисунке 11. Липиды были синтезированы и любезно
предоставлены д.х.н. М. А. Масловым (МИТХТ им. М. В. Ломоносова, Москва).
Все липиды состояли из биосовместимых и нетоксичных структурных элементов,
таких как холестерин, диалкилглицерин и спермин. Поликатионные липиды содержали
один (липиды X2, S1, S2 и S3) или два (2X3) остатка холестерина или диалкилглицерина
(2D3), связанных со спермином.
Катионные липосомы состояли из поликатионных липидов и цвиттерионного
фосфолипида DOPE в молярном отношении 1:1. При данном отношении наблюдались
максимальные уровни трансфекции по целому ряду катионных липидов [282, 283].
Липоплексы, т.е. комплексы, состоящие из липосом и НК (ДНК или РНК), были
приготовлены при разных соотношениях N/P (отношение количества аминогрупп
катионных липидов к количеству фосфатных групп нуклеиновых кислот), поскольку
ранее было показано, что данная характеристика определяет эффективность трансфекции
катионных липосом и очень специфична для разных типов нуклеиновых кислот [284].
79
Рис. 11. Структуры компонентов поликатионных липосом.
3.3.2. Доставка плазмидной ДНК в костно-мозговые предшественники ДК и
незрелые ДК с помощью катионных липосом
Для оценки способности катионных липосом доставлять нуклеиновые кислоты в
клетки, была изучена доставка плазмидной ДНК, кодирующей зеленый флуоресцентный
белок (EGFP), в мышиные CD11c+ предшественники ДК и незрелые ДК с помощью
проточной цитометрии.
Для формирования липоплексов, содержащих плазмидную ДНК, pEGFP-C2
смешивали в среде Opti-MEM с заранее сформированными липосомами, состоявшими из
одного из исследуемых липидов и липида-хелпера DOPE (мол. соотн. 1:1) при различных
соотношениях N/P. Трансфекцию проводили в среде IMDM без сыворотки в течение 4
часов с последующей инкубацией в полной среде IMDM в течение 44 ч. Это время
80
необходимо для экспрессии белка EGFP в количестве, достаточном для оценки
флуоресцентного сигнала, и не превышает период полураспада EGFP, равный 48 ч [285].
В
эксперименте
оценивали
количество
трансфицированных
клеток
(процентное
отношение EGFP-позитивных клеток) и интенсивность флуоресценции клеток (см. Рис.
12).
Рис. 12. Доставка pEGFP-C2 с помощью катионных липосом в костно-мозговые предшественники
ДК (А, Б) и незрелые ДК (В, Г). Количество флуоресцентных клеток и интенсивность
флуоресценции оценивали через 48 ч после трансфекции. Уровень трансфекции pEGFP-С2 с
помощью Lipofectamine 2000 использовали в качестве контроля. Данные представлены как
MEAN±S.E.M. Представленные данные получены в трех независимых экспериментах.
Из представленных данных видно, что две липосомальные композиции из шести
исследованных, а именно липосомы 2X3-DOPE и 2D3-DOPE, обладали превосходной
эффективностью трансфекции (ТЕ) как с точки зрения числа трансфицированных клеток,
так и интенсивности флуоресценции (MFI): так ТЕ / MFI для 2X3-DOPE и 2D3-DOPE
81
составили 33% / 2RFU и 30% / 2.4 RFU при N/P 10/1, соответственно (Рис. 12, А, Б).
Липосомы X2-DOPE и S2-DOPE показали заметную эффективность доставки: ТЕ / MFI
составили 43% / 0.7 RFU и 27% / 2 RFU, соответственно. Липосомальные композиции
S1-DOPE и S2-DOPE были малоэффективны: процент трансфицированных клеток не
превышал 10% при интенсивности флуоресценции не выше 0.7 RFU. Стоит отметить, что
даже самая низкая эффективность трансфекции, наблюдаемая при использовании
катионных липосом, в 2-3 раза превышала уровни трансфекции, наблюдаемые при
доставке плазмидной ДНК с помощью коммерчески доступного трансфектанта
Lipofectamine 2000 (LF) в идентичных условиях. Процент EGFP-позитивных клеток не
превышал 5% (Рис. 12, А). Было показано, что с увеличением соотношения N/P
наблюдался рост эффективности трансфекции для липосом 2X3-DOPE, 2D3-DOPE, X2DOPE и S2-DOPE, в то время как липосомы S1-DOPE и S3-DOPE во всем интервале
концентраций
трансфицировали
менее
10%
преДК
и
обеспечивали
уровень
флуоресценции клеток схожий с уровнем, наблюдаемым для Lipofectamine 2000. Можно
предположить, что липосомы S1-DOPE и S3-DOPE либо неэффективно доставляли
плазмидную ДНК в клетки, либо липоплексы, находясь в эндосомах, были неспособны
эффективно высвобождать ДНК в цитозоль.
Липосомы, наиболее эффективно доставившие плазмидную ДНК в преДК, были
выбраны для исследования эффективности трансфекции pEGFP в незрелые ДК (липосомы
2X3-DOPE, 2D3-DOPE, X2-DOPE и S2-DOPE) (Рис. 12, В, Г). В эксперименте
использовали соотношения N/P 8/1 и 10/1, обеспечившие эффективную доставку и
экспрессию трансгена при трансфекции pEGFP в предшественники ДК. Было показано,
что три липосомальные композиции из четырех исследованных обладали высокой
эффективностью трансфекции: ТЕ / MFI для липосом 2X3-DOPE составило 36% / 1.8 RFU;
2D3-DOPE – 32-45% / 1 RFU; S2-DOPE – 27-35% / 1.4 RFU (Рис. 12, В, Г). Трансфекция
незрелых ДК с помощью липоплексов X2-DOPE/pEGFP обеспечила довольно высокий
процент EGFP-положительных незрелых ДК (до 44%, N/P 10/1), но уровень
интенсивности флуоресценции оказался минимальным (0.02 RFU), что, возможно,
объясняется недостаточным высвобождением плазмидной ДНК из эндосом или
липоплексов. Следует отметить, что исследованные липосомы доставляли pEGFP в преДК
и незрелые ДК со значительно большей эффективностью по сравнению с Lipofectamine
2000.
82
3.3.3. Доставка РНК-EGFP в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые
ДК мыши с помощью катионных липосом
Для оценки способности катионных липосом обеспечивать трансфекцию РНК в
CD11c+ предшественники ДК и незрелые ДК использовали суммарную РНК, выделенную
из клеток ВНК IR-780, экспрессирующих EGFP (далее РНК-EGFP).
Для формирования липоплексов РНК-EGFP смешивали с катионными липосомами в
среде Opti-MEM при концентрациях липосом, соответствующих соотношениям N/P 1/1
или 2/1. Трансфекцию РНК проводили в среде без сыворотки таким же образом как и
трансфекцию плазмидной ДНК, уровень экспрессии EGFP измеряли через 48 ч (Рис. 13).
Рис. 13. Доставка РНК-EGFP с помощью катионных липосом в костно-мозговые предшественники
ДК (А, Б) и незрелые ДК (В, Г). Количество флуоресцентных клеток и интенсивность
флуоресценции оценивали через 48 ч после трансфекции. Уровни трансфекции РНК-EGFP с
помощью Lipofectamine 2000 использовали в качестве контроля. Данные представлены в виде
MEAN±S.E.M.. Представленные данные получены из трех независимых экспериментов.
Было показано, что, как и в случае доставки ДНК, липосомы 2X3-DOPE, 2D3-DOPE,
S2-DOPE и S3-DOPE эффективно доставляли РНК-EGFP в предшественники ДК (Рис. 13,
А, Б): TE / MFI для 2X3-DOPE, S3-DOPE и S2-DOPE составила 30% / 3RFU; 32% / 3 RFU
и 30% / 3.1 RFU, соответственно, а для 2D3-DOPE – 33% / 5.9 RFU. Липосомы S1-DOPE
наименее эффективно доставляли РНК-EGFP в преДК. Для X2-DOPE количество
флуоресцентных клеток составляло около 60%, однако MFI было крайне низким и не
превышала 1 RFU. Следует отметить, что при увеличении соотношения N/P с 1/1 до 2/1
83
наблюдалось
значительное
усиление
эффективности
трансфекции
для
всех
липосомальных композиций, за исключением S1-DOPE.
Липосомы 2X3-DOPE, 2D3-DOPE, X2-DOPE и S2-DOPE использовали для доставки
РНК-EGFP в незрелые ДК при соотношении N/P 2/1 (Рис. 13, В, Г). Было показано, что все
исследованные липосомальные композиции обеспечивали высокую эффективность
доставки: липосомы 2D3-DOPE и S2-DOPE трансфицировали 43-47% незрелых ДК с MFI
3.1-3.5 RFU; липосомы 2X3-DOPE, в отличие от X2-DOPE, трансфицировали меньшее
количество клеток с более высоким уровнем экспрессии трансгена (TE / MFI – 35% / 3
RFU), в то время как X2-DOPE доставлял РНК-EGFP в 57% клеток с уровнем
флуоресценции 1.2 RFU. Следует отметить, что все исследуемые катионные липосомы
обеспечивали значительно более высокую эффективность доставки РНК-EGFP как в
преДК, так и в незрелые ДК по сравнению с Lipofectamine 2000, который доставлял РНКEGFP только в 10% ДК с 0.5 RFU.
3.3.4. Исследование противоопухолевого потенциала ДК, трансфицированных
опухолевой РНК с помощью катионных липосом ex vivo, на метастатической модели
меланомы В16 мыши
Противоопухолевый
потенциал
незрелых
ДК,
нагруженных
липоплексами,
содержащими суммарную опухолевую РНК, исследовали на метастатической модели
меланомы B16 мыши. В качестве источника ОАГ для нагрузки незрелых ДК использовали
суммарную РНК, выделенную из клеток меланомы В16 (РНК-B16). Метастатическую
меланому В16 трансплантировали внутривенно введением клеток меланомы В16 в
хвостовую вену мышей линии C57Bl/6. На 4-й день после трансплантации опухоли
мышей-опухоленосителей делили на пять групп, и внутривенно однократно вводили: (1)
контроль, физиологический раствор, (2) – ДК, нагруженные липоплексами LF/РНК-В16,
(3) – 2X3-DOPE/РНК-В16, (4) – 2D3-DOPE/РНК-В16 или (5) X2-DOPE/РНК-В16.
Микроскопическое исследование поверхности легких показало, что среднее
количество метастазов в группе мышей, которым вводили ДК, нагруженные LF/РНК-B16,
составило 48±11, что в 1.7 раза ниже по сравнению с контролем (85±8). Вакцинация
животных
ДК,
трансфицированными
липоплексами
2X3-DOPE/РНК-B16 и
2D3-
DOPE/РНК-B16, привела к значительному снижению количества легочных метастазов
(Рис. 14). В группах мышей, которым вводили ДК, трансфицированные 2X3-DOPE/РНКB16 и 2D3-DOPE/РНК-B16, среднее количество метастазов составило 27±7 и 17±4,
соответственно, что в 3-5 раза ниже по сравнению с контрольной группой (p=0.0003 и
p=0.00002, соответственно) и 1.9-2.8 раза ниже по сравнению с группой животных,
84
получавшей ДК, нагруженные LF/РНК-B16 (p=0.05 для 2D3-DOPE по сравнению с LF).
Мыши, инъецированные ДК, нагруженными X2-DOPE/РНК-B16, имели довольно
большое количество легочных поверхностных метастазов (75±16), близкое к показателям
контрольной группы.
Рис. 14. Изменение количества
метастазов под действием ДК,
нагруженных
РНК-В16
в
комплексах
с
катионными
липосомами.
Для
определения
уровня достоверности использовали
t-тест
критерия
Стьюдента,
различия при p≤0.05 считали
статистически достоверными
Таким образом, изучение способности ДК, нагруженных РНК-B16 в комплексах с
липосомами, активировать противоопухолевый ответ показало, что подавление уровня
развития метастазов коррелирует с числом трансфицированных незрелых ДК и
эффективностью экспрессии трансгена, что указывает на прямую зависимость между
эффективностью трансфекции ДК и уровнями презентации антигена и интенсивностью
иммунного противоопухолевого ответа.
3.3.5. Влияние липоплексов, содержащих РНК-В16, на иммуномодулирующие
свойства ДК
ДК
играют
противоопухолевого
ключевую
Т-клеточного
роль
в
ответа.
индукции
Следует
антиген-специфического
ожидать,
что
наблюдаемый
антиметастатический эффект ДК, нагруженных РНК-В16, опосредуется специфическими
клонами ЦТЛ, праймированными этими ДК in vivo. Однако сами молекулы РНК, а также
высокая концентрация положительного заряда липоплексов могут инициировать
продукцию про-воспалительных цитокинов и интерферонов ДК, что в итоге может
привести к запуску нежелательного системного воспалительного ответа после введения
таких ДК в организм. Поскольку системный воспалительный ответ может обладать
негативным влиянием на антиметастатический потенциал активированных ЦТЛ, был
исследован уровень про-воспалительных цитокинов в культуральной среде на этапе
нагрузки ДК ex vivo и в сыворотке крови экспериментальных животных на
заключительной стадии лечения меланомы мышей с помощью модифицированных ДК in
vivo.
85
Продукция ДК провоспалительных цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1α и ИЛ-6, являющийся
также маркером стимуляции ДК) и интерферонов (ИФН-α и ИФН-γ) была оценена через
48 ч после нагрузки ДК РНК-В16 с помощью катионных липосом in vitro (Рис. 15).
Рис. 15. Уровень цитокинов в культуральной среде через 48 ч после трансфекции ДК РНК-В16 в
комплексах с LF, 2X3-DOPE, 2D3-DOPE и X2-DOPE. w/s – нестимулированные ДК. Измерение
цитокинов проводили с помощью наборов ELISA (Thermo Scientific).
Уровни продукции цитокинов ДК, не обработанными липоплексами и нагруженными
комплексами LF/РНК-В16, использовали в качестве отрицательного и положительного
контролей, соответственно.
ИЛ-6 являлся единственным цитокином, чья продукция значительно увеличивалась
после трансфекции ДК. Было показано, что после обработки ДК всеми исследованными
липосомальными комопзициями, включая Lipofectamine 2000, продукция ИЛ-6 возрастала
в 6-8 раз по сравнению с ДК без стимуляции (Рис. 15, А). ИЛ-6 является высоко
86
плейотропным цитокином – помимо того, что это один из главных про-воспалительных
цитокинов, он также служит маркером ответа ДК на стимулы созревания/активации
[286, 287]. Уровень ИЛ-1α повышался в 1.6 раз в случае липоплексов X2-DOPE/РНК-В16
и незначительно повышался в случае остальных липоплексов. После обработки ДК
липоплексами c 2D3-DOPE наблюдалось повышение уровня ИФН-γ в 2.3 раза, в случае
других липосом – в 1.6 раз относительно нестимулированных ДК. После обработки ДК
исследуемыми липоплексами также увеличились уровни ФНО-α в 1.5-1.8 раз и ИФН-α в
2-3 раза по сравнению с нестимулированными ДК. Следует отметить, что в случае ИФН-α
только липоплексы LF/РНК-В16 и 2D3-DOPE/РНК-В16 стимулировали его продукцию (в
2.3 и 3 раза, соответственно), тогда как другие липоплексы не оказывали никакого
эффекта.
Уровни тех же цитокинов были определены в сыворотке крови животных с
метастатической меланомой после лечения ДК, нагруженными липоплексами (Рис. 16).
Рис. 16. Уровень цитокинов в сыворотке крови животных с метастатической меланомой после
лечения ДК, нагруженными РНК-В16 в комплексах с LF, 2X3-DOPE, 2D3-DOPE и X2-DOPE.
Сыворотку крови животных-опухоленосителей, не получавших лечение ДК, использовали в
качестве контроля (w/t). Для определения уровня достоверности использовали t-тест критерия
Стьюдента, различия при p≤0.05 считали статистически достоверными.
87
Было показано, что введение ДК, нагруженных РНК-В16 в комплексах с
липосомами 2X3-DOPE, 2D3-DOPE и X2-DOPE, приводило к увеличению уровня ИЛ-1α в
1.7, 2.3 и 3 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой (p=0.023, p=0.018 и
p=0.05, соответственно). В то же время ДК, нагруженные липоплексами LF/РНК-В16,
увеличивали уровень ИЛ-1α примерно в 2 раза относительно контрольной группы, однако
данные отличия являются статистически недостоверными. ИЛ-1α помимо провоспалительной функции играет роль сигнала, способствующего миграции ДК из
периферических тканей в лимфатические узлы [288-290], что является положительной
функцией ИЛ-1α по отношению к функциональности ДК.
Следует отметить, что статистически достоверное увеличение продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ФНО-α относительно контроля наблюдалось только в
сыворотке крови мышей, получавших инъекции ДК, нагруженных липоплексами X2DOPE/РНК-В16 (Рис. 16, А, Г), что коррелировало с отсутствием антиметастатического
эффекта у этих животных (см. Рис. 14).
Введение ДК, нагруженных липоплексами не влияло на уровень интерферонов
(данные для ИФН-γ представлены на Рис. 16, В, данные для ИФН-α не представлены,
средний уровень ИФН-α составлял 45 пг/мл и не отличался между группами).
3.3.6. Исследование способности ДК, нагруженных липоплексами с РНК-В16,
активировать опухолеспецифические ЦТЛ
Из спленоцитов здоровых мышей линии C57Bl/6 выделяли CD8+ Т-клетки и
праймировали ДК, нагруженными липоплексами с РНК-В16, в присутствии ИЛ-2 в
течение 7 дней. Цитотоксическое действие праймированных Т-лимфоцитов проверяли по
способности лизировать клетки меланомы В16. Данные анализа цитотоксического
действия Т-клеток, праймированных in vivo ДК, трансфицированными липоплексами с
РНК-В16 ex vivo, представлены на Рис. 17. Количество специфически лизированных
клеток меланомы В16 отражает интенсивность ЦТЛ ответа. Из представленных данных
видно, что интенсивности ЦТЛ ответов были одинаковыми для 2X3-DOPE, X2-DOPE и
Lipofectamine 2000: 14-18% клеток меланомы были специфически лизированы. В случае
липоплексов 2D3-DOPE/РНК-В16 12-14% клеток меланомы были специфически
лизированы.
88
Рис. 17. Цитотоксическое действие
спленоцитов, индуцированных in
vivo
под
действием
ДК,
нагруженных
РНК-В16
в
комплексах
с
катионными
липосомами,
против
клеток
меланомы В16.
Таким образом, исследования показали, что катионные липосомы 2X3-DOPE и 2D3DOPE, содержащие катионные липиды на основе спермина и двух остатков холестерина
или диалкилглицерина, соответственно, обладают высокой эффективностью трансфекции
как плазмидной ДНК, так и РНК, и опосредуют запуск эффективного противоопухолевого
ответа после введения ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК в комплексах с
данными липосомами, в животных-опухоленосителей на метастатической модели
меланомы В16. Следовательно, данные липосомы являются главными кандидатами для
разработки на их основе избирательных систем доставки, направленных на ДК.
3.4. Исследование мультикомпонентных маннозилированных
липосом с целью получения высокоэффективных противоопухолевых
ДК вакцин
Для усиления направленности доставки в состав катионных липосом можно ввести
липофильные молекулы, содержащие лиганды, способные с высокой эффективностью
взаимодействовать
с поверхностными
рецепторами
клеток-мишеней. В качестве
адресующих лигандов могут использоваться малые молекулы, такие как витамины,
углеводы и пептиды, поскольку данные молекулы не являются иммуногенными и могут
быть конъюгированы с компонентами липосом без потери специфичности связывания. ДК
и макрофаги экспрессируют маннозный рецептор (МР), способный узнавать углеводы,
включая маннозу, на клеточных стенках инфекционных агентов (бактерии, грибы, вирусы
и т.д.) [213]. Введение остатков маннозы в химические вектора может привести к
увеличению эффективности доставки НК в ДК [214, 215] и индукции сильного
противоопухолевого ответа [216, 217].Таким образом, селективная (таргетная) доставка
ОАГ в ДК является многообещающим подходом, позволяющим увеличить концентрацию
ОАГ на поверхности ДК и усилить презентацию антигенов эффекторным клеткам.
89
3.4.1. Состав маннозилированных липосом
В качестве основы для разработки таргетных маннозилированных липосом (МЛ),
направленных на маннозные рецепторы ДК, были выбраны липосомы 2X3-DOPE,
эффективно доставляющие НК в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК и
опосредующие запуск эффективного антиметастатического ответа [291]. Структуры
компонентов МЛ представлены на Рис. 18.
Рис. 18. Структуры компонентов маннозилированных липосом (МЛ). Мультикомпонентные МЛ
состояли из катионного липида 2X3, липида-хелпера DOPE (1 : 2 мол. отношение) и
маннозилированных липоконъюгатов 1 (липосомы М1, М2 и М3) или 2 (липосомы М4, М5 и М6),
взятых в молярном отношении 2.5, 5 и 10% мол., соответственно.
Липосомы 2X3-DOPE (далее контрольные липосомы), состояли из катионного
липида
2Х3
(1,26-Бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-
тетраазагексакозан тетрагидрохлорид) и цвиттер-ионного липида-хелпера DOPE (1,2диолеоил-sn-глицеро-3-фософэтаноламин), взятых в молярном отношении 1:2. Таргетные
маннозилированные липосомы состояли из липидов 2X3 и DOPE (1:2 мол. отношение) с
добавлением 2.5, 5 или 10% мол. маннозилированных липоконъюгатов 1 (липосомы М1,
М2, М3, соответственно) или 2 (липосомы М4, М5, М6, соответственно) (Рис. 18).
90
Маннозилированные липоконъюгаты состояли из биосовместимых компонентов и
содержали остаток D-маннозы, соединенный с диалкилглицерином через сукцинильный
(липоконъюгат 1) или скваратный (липоконъюгат 2) линкеры, значительно отличающиеся
друг от друга гибкостью и пространственной структурой (Рис. 18).
3.4.2. Физико-химические характеристики маннозилированных липосом и
липоплексов
Поскольку размер и заряд липоплексов имеют значительное влияние на
эффективность трансфекции (ТЕ), были оценены физико-химические характеристики
липосом и комплексов липосом с плазмидной ДНК pEGFP-C2 (липоплексов), а именно их
гидродинамический диаметр и поверхностный заряд (Рис. 19, Табл. 3).
Из представленных данных видно, что средний диаметр липосом M1 – M6 был
больше по сравнению с контрольными липосомами 2X3-DOPE. Самым большим
размером (около 120 нм) обладали липосомы M1 – M3, содержащие липоконъюгат 1,
причем количество липоконъюгата не влияло на размер липосом (Рис. 19, Табл. 3). Размер
липосом M4 – M6 постепенно уменьшался со 100 нм до 54 нм с увеличением содержания
липоконъюгата 2 в липосомах и был близок к диаметру контрольных липосом 2X3-DOPE
(Рис. 19, Табл. 3).
Было показано, что средний размер липоплексов, состоящих из контрольных
липосом 2X3-DOPE и pEGFP-C2, постепенно уменьшался с увеличением соотношения
N/P (до 57 нм при N/P 10/1) (Рис. 19, Табл. 3, 2X3-DOPE). Похожая тенденция
наблюдалась для липоплексов, состоящих из маннозилированных липосом M1 – M6 и
pEGFP-C2. Однако при соотношении N/P 2/1 наблюдалось отчетливое увеличение размера
липоплексов (до 8-9 раз). При соотношении N/P 2/1 липосомы M1 – M3 формировали с
pEGFP-C2 огромные липоплексы, чей размер снижался с ~925 нм до ~600 нм при
увеличении процентного содержания маннозилированных липоконъюгатов в МЛ (Рис. 19,
М1 – М3; Табл. 3, серые ячейки). Липосомы M4 – M6 также имели тенденцию
формировать большие частицы при N/P 2/1, однако их диаметр уменьшался до ~219 нм
для липосом М6, содержащих 10% мол. липоконъюгатов 2 (Рис. 19, М6; Табл. 3). Начиная
с соотношения N/P 4/1 размеры и индексы полидисперсности липоплексов уменьшались,
что указывает на образование более мелких и упорядоченных по размеру частиц по
сравнению с липоплексами, приготовленными при N/P 2/1. По-видимому, при
соотношении N/P 2/1 липоконъюгат 1 (гораздо в большей степени, чем 2) существенно
нарушает структуру сформированных липоплексов и не обеспечивает эффективную
91
Рис. 19. ζ-потенциал (A) и
гидродинамический
длиаметр (Б) липоплексов,
сформированных
из
катионных
маннозилированных липосом и pEGFPC2.
МЛ: 2X3-DOPE (1 / 2 мол.
отнош.) + 2.5, 5 или 10% мол.
липоконъюгатов 1 (M1, M2,
M3) или 2 (M4, M5, M6).
Для
измерения
физикохимических характеристик
липосом 25 мкл (1мM)
липосом растворяли в 975
мкл воды MilliQ. Для
измерения
физикохимических характеристик
липоплексов 1 мкг pEGFP-C2
инкубировали с соответствующими липосомами при
различных
соотношениях
N/P в 1 мл воды MilliQ при
24 °С в течение 15 мин.
N/P=1/– : пустые липосомы.
Экспериментальные данные
получены
из
трех
независимых измерений.
92
Таблица 3. Гидродинамический диаметр и ζ-потенциал катионных маннозилированных
липосом и сформированных из них липоплексов с pEGFP-C2.
Катионные
липосомыа
2X3-DOPE
M1
M2
M3
M4
M5
M6
2X3-DOPE/pDNA
M1/pDNA
M2/pDNA
M3/pDNA
M4/pDNA
M5/pDNA
M6/pDNA
Соотношение
N/Pб
–
–
–
–
–
–
–
1/2
1/1
2/1
4/1
6/1
8/1
10/1
1/2
1/1
2/1
4/1
6/1
8/1
10/1
1/2
1/1
2/1
4/1
6/1
8/1
10/1
1/2
1/1
2/1
4/1
6/1
8/1
10/1
1/2
1/1
2/1
4/1
6/1
8/1
10/1
1/2
1/1
2/1
4/1
6/1
8/1
10/1
1/2
Диаметр (распределение
по объему, нм)
39.6±2.4
107.9±24.7
101.3±22.5
122.5±26.4
99.9±22.2
73.5±8.3
54.5±19.8
323.6±35.9
201.2±38.4
335.6±120.1
82.1±2.7
61.5±0.6
57.1±0.7
57.1±2.1
166.5±23.4
155.1±42.8
925.4±844.8
252.1±3.0
158.9±9.1
136.4±4.6
122.2±26.1
135.5±2.1
178.5±13.7
590.7±52.6
218.3±4.3
188.1±84.3
122±4.4
116.9±8.2
107.2±11.9
273.2±40.1
621.0±54.5
154.2±1.1
131.3±2.7
128.0±2.1
107.8±0.7
201.6±4.9
248.1±19.9
369.8±65.0
200.9±1.6
212.3±6.0
154.4±1.0
140.1±5.0
142.4±0.8
322.2±200.0; 547.5±364.3д
695.3±328.7
115.4±1.5
91.5±1.5
91.1±4.1
84.2±1.5
192.4±13.0
93
P.D.I.в
0.23±0.01
0.33±0.03
0.23±0.02
0.18±0.01
0.28±0.02
0.23±0.01
0.32±0.03
0.23±0.01
0.21±0.10
0.25±0.03
0.20±0.01
0.21±0.01
0.23±0.02
0.26±0.02
0.36±0.03
0.31±0.02
0.61±0.10
0.10±0.02
0.15±0.02
0.20±0.02
0.30±0.03
0.36±0.02
0.39±0.08
0.82±0.12
0.13±0.01
0.33±0.03
0.24±0.01
0.26±0.03
0.23±0.05
0.30±0.01
0.36±0.06
0.12±0.10
0.11±0.03
0.12±0.03
0.13±0.01
0.24±0.03
0.33±0.03
0.30±0.02
0.09±0.01
0.07±0.01
0.12±0.01
0.15±0.02
0.20±0.01
0.41±0.04
0.56±0.03
0.18±0.01
0.08±0.03
0.06±0.03
0.13±0.02
0.23±0.02
ζ-потенциал
(мВ)
57.3±0.6
н.д.г
н.д.
н.д.
н.д.
53.0±0.2
50.4±0.4
−17.0±0.4
−13.5±1.2
37.3±1.0
47.2±0.5
48.3±0.3
53.5±0.3
50.3±2.0
−16.5±0.5
−10.1±0.5
−2.5±0.5
53.6±0.3
47.8±0.0
53.8±0.1
51.6±0.7
−15.8±0.8
−10.4±0.0
33.0±0.7
55.2±0.6
44.9±0.4
53.7±0.7
55.8±0.6
−5.7±0.2
−21.9±0.0
43.9±0.5
64.1±6.7
57.8±0.7
56.6±0.1
59.4±2.2
−15.0±0.1
−17.7±0.3
42.3±0.6
51.0±2.8
54.8±0.5
53.0±0.2
52.3±0.4
−12.5±0.7
−14.1±0.3
37.0±0.4
49.9±0.6
57.1±0.3
56.4±1.6
6.1±1.0
-21.7±5.3
Таблица 3 (продолжение)
Катионные
липосомы
M6/pDNA
Соотношение
N/P
1/1
2/1
4/1
6/1
8/1
10/1
Диаметр (распределение
по объему, нм)
258.3±32.1
219.4±10.6
156.4±60.6
117.0±5.3
111.0±8.3
77.5±9.3
P.D.I.
0.23±0.02
0.16±0.01
0.23±0.01
0.21±0.01
0.23±0.02
0.35±0.02
ζ-потенциал
(мВ)
-14.9±0.2
38.0±1.5
46.7±1.7
53.8±0.6
66.3±6.2
52.5±0.3
Катионные маннозилированные липосомы состояли из 2X3 и DOPE (1 / 2 мол.) и 2.5, 5 или
10% мол. соответствующих липоконъюгатов: М1, М2, М3 содержали липоконъюгаты 1 с
сукцинильным линкером; М4, М5, М6 содержали липоконъюгаты 2 со скваратным линкером. Для
измерения физико-химических характеристик 25 мкл липосом (1мМ) растворяли в 975 мкл воды
MilliQ.
б
Для измерения физико-химических характеристик липоплексов 1 мкг пДНК инкубировали
с соответствующими липосомами при различных соотношениях N/P в 1 мл воды milliQ при 24 °С
в течение 15 мин.
в
P.D.I. – индекс полидисперсности; г н.д. – нет данных; д Данные частицы представлены в
соотношении 1:1. Экспериментальные данные получены из трех независимых экспериментов.
a
компактизацию ДНК. С увеличением содержания липоконъюгатов 1 и 2 в липосомах это
нарушение исчезает, и образуются мелкие компактные частицы.
Исследованные липоплексы, сформированные при низких соотношениях N/P 1/2 и
1/1, имели отрицательный поверхностный заряд, который становился положительным при
увеличении N/P до 2/1 (Рис. 19, Табл. 3). Следует отметить, что при высоких
соотношениях N/P (8/1 и 10/1) формировались очень компактные липоплексы с наиболее
высокими положительными зарядами (Рис. 19, Табл. 3).
3.4.3.
Исследование
специфичности
взаимодействия
маннозилированных
липосом с конканавалином А
Конканавалин А (КонА) является растительным аналогом маннозного рецептора и
представляет собой тетрамерный белок, имеющий четыре сайта связывания с
терминальными
остатками
D-маннозы
[292,
293].
Агглютинация
таргетных
маннозилированных липосом (МЛ) с КонА позволяет исследовать доступность остатков
D-маннозы в составе МЛ для оценки взаимодействия МЛ с маннозными рецепторами ДК.
Нами была исследована кинетика агглютинации МЛ с КонА и последующей
перегруппировкой комплексов при добавлении избытка свободной D-маннозы и получены
эффективные константы скорости формирования комплексов с КонА (Рис. 20, Табл. 4).
Было показано, что все маннозилированные липосомы, а также контрольные
липосомы, эффективно связывались с КонА (Рис. 20, А, Б). С увеличением количества
маннозилированных липоконъюгатов 1 или 2 в составе МЛ с 2.5% мол. до 10% мол.
эффективная константа скорости k увеличивалась с 3.0×10-3 до 11.1×10-3 с-1 для M1 – M3
94
липосом (сукцинильный линкер) и с 3.6×10-3 до 7.4×10-3 с-1 для M4 – M6 липосом
(скваратный линкер) (Табл. 4). Контрольные липосомы 2X3-DOPE обладали практически
максимальной аффинностью к КонА среди всех исследованных липосом (k=8.7×10-3 с-1),
несмотря на отсутствие остатков маннозы в их составе (Табл. 4). Неспецифическое
связывание контрольных липосом 2X3-DOPE с КонА можно объяснить тем, что КонА
является кислым белком и содержит большое количество отрицательно заряженных
аминокислот,
способных
электростатически
взаимодействовать
с
положительно
заряженными катионными липосомами (изоэлектрическая точка КонА находится в
диапазоне рН 4.5 – 5.5 [294]). Добавление избытка D-маннозы к комплексам 2X3DOPE/КонА практически не влияло на связывание липосом с белком, что указывает на
неспецифические взаимодействия между контрольными липосомами 2X3-DOPE и КонА
(Рис. 20, А, Б). Исследованные МЛ связывались с КонА более специфично: добавление
избытка D-маннозы к смеси МЛ/КонА приводило к резкому падению мутности раствора.
Более того, величина падения мутности раствора коррелировала с содержанием
маннозилированных липоконъюгатов в составе МЛ, как это можно видеть из данных для
маннозилированных липосом М4 – М6 со скваратным линкером (Рис. 20, Б).
Рис.
20.
Кинетика
формирования комплексов
маннозилированных
липосом с КонА. Черные
квадраты – контрольные
липосомы
2X3-DOPE,
белые ромбы – липосомы
М1
или
М4,
серые
треугольники – липосомы
М2 или М5, белые круги –
липосомы М3 или М6.
95
Липосомы
k, с-1
Таблица 4. Эффективные константы
скорости формирования комплексов КонАлипосомы (k).
-3
2X3
(8.7±0.2)10
M1
(3.0±0.1)10-3
M2
(5.2±0.2)10-3
Для расчета k использовали формулу:
T(t) = a + be-kt, где k – эффективная
константа
скорости
образования
комплексов, t – время.
-3
M3
(11.1±0.3)10
M4
(3.6±0.1)10-3
M5
(6.8±0.1)10-3
M6
(7.4±0.3)10-3
Таким образом, все исследуемые маннозилированные липосомы были способны
специфично связываться с аналогом маннозного рецептора и могли быть использованы
для рецептор-опосредуемой доставки НК, кодирующих ОАГ, в ДК.
3.4.4. Характеристика ДК
Для исследования эффективности трансфекции плазмидной ДНК и РНК с помощью
МЛ в качестве модельных клеток использовали костно-мозговые предшественники ДК и
незрелые ДК. Предшественники ДК получали из клеток костного мозга мышей линии
C57Bl/6 c помощью центрифугирования на среде Histopaque-1083. Количество CD11c+
клеток среди общей популяции костно-мозговых предшественников ДК составило 6.8%.
Незрелые ДК получали из предшественников ДК культивированием в присутствии
цитокинов ГМ-КСФ и ИЛ-4 в течение 6-ти дней. На 6-ой день инкубации культура
незрелых ДК содержала около 54% CD11c+ клеток. Статус зрелости ДК определяли как с
помощью
морфологических
характеристик,
так
и
с
помощью
окрашивания
моноклональными антителами на маркеры созревания (CD80, CD83, CD86, MHC II).
Оценку содержания маннозных рецепторов на поверхности преДК и незрелых ДК
проводили с помощью проточной цитометрии с окрашиванием моноклональными
антителами к CD206. Было показано, что и костно-мозговые преДК, и незрелые ДК
экспрессируют на своей поверхности маннозные рецепторы CD206 (Рис. 21). Однако
незрелые ДК характеризуются значительно более высокой экспрессией CD206 по
сравнению
с
костно-мозговыми
предшественниками
соответственно) (Рис. 21, В).
96
ДК
(45%
и
4%
клеток,
Рис. 21. Экспрессия маннозных рецепторов на поверхности преДК (А) и незрелых ДК (Б). Клетки
инкубировали в присутствии анти-CD206 моноклональных антител, конъюгированных с FITC, и
анализировали с помощью проточной цитометрии. (В) Процентное содержание и средняя
интенсивность флуоресценции клеток, экспрессирующих CD206.
Зрелые ДК получали путем обработки незрелых ДК липосомами 2X3-DOPE и М6
или их липоплексами с РНК-В16 и оценивали фенотип зрелых ДК путем оценки
экспрессии
маркеров
созревания
CD80,
CD83,
CD86
и
MHC II.
В
качестве
положительного контроля использовали ДК, обработанные ЛПС (100 нг/мл, 24 ч) (Рис.
22).
Как видно из представленных данных обработка ДК пустыми липосомами приводит
к увеличению содержания маркеров созревания на поверхности ДК даже в большей
степени, чем ЛПС (Рис. 22, панели ЛПС, 2X3-DOPE и М6, все маркеры). Обработка ДК
липоплексами 2X3-DOPE/РНК-В16 и М6/РНК-В16 приводит к более значительному
увеличению содержания маркеров CD83 и CD86 на поверхности ДК по сравнению с ДК,
обработанными пустыми липосомами. Таким образом, наши данные показали, что
обработка ДК липосомами и липоплексами приводит к созреванию ДК.
97
Рис. 22. Статус зрелости ДК после трансфекции липоплексами 2X3-DOPE/РНК и М6/РНК. w/s –
ДК без стимуляции (негативный контроль); ЛПС – ДК, обработанные ЛПС (положительный
контроль). ДК были окрашены анти-CD80 (PE), анти-CD83 (РЕ), анти-CD86 (FITC), анти-MHC II
(FITC) антителами и проанализированы с помощью проточной цитометрии. Событий в каждом
образце не менее 10000.
98
3.4.5. Доставка плазмидной ДНК в костно-мозговые предшественники ДК и
незрелые ДК с помощью маннозилированных липосом
Для
оценки
внутриклеточную
способности
доставку
НК
маннозилированных
была
исследована
липосом
осуществлять
эффективность
трансфекции
плазмидной ДНК pEGFP-С2 в комплексах с МЛ в костно-мозговые преДК и незрелые ДК.
Эффективность
трансфекции
pEGFP
в
ДК,
выражающуюся
в
количестве
трансфицированных клеток и интенсивности флуоресценции, измеряли через 48 ч после
трансфекции с помощью проточной цитометрии (Рис. 23).
Рис. 23. Доставка pEGFP-C2 в костно-мозговые преДК (А, Б) и незрелые ДК (В, Г) с помощью
маннозилированных
липосом.
Количество
флуоресцентных
клеток
и
интенсивность
флуоресценции оценивали через 48 ч после трансфекции. Уровень трансфекции pEGFP-С2 с
помощью Lipofectamine 2000 и контрольных липосом 2X3-DOPE использовали в качестве
контроля. Данные представлены как MEAN±S.E.M. Представленные данные получены в трех
независимых экспериментах.
Следует отметить, что все исследованные липосомальные композиции обладали
значительно большей эффективностью трансфекции pEGFP как в преДК, так и незрелые
ДК по сравнению с коммерчески доступным Lipofectamine 2000, который доставлял
плазмидную ДНК в 5% клеток с интенсивностью флуоресценции 0.1 RFU.
При соотношении N/P 1/1 заряды липоплексов являются отрицательными (от −22 мВ
для М3 до −10 мВ для М2, Таблица 3), при N/P 2/1 заряд липоплексов становится близок к
нейтральному (−2.5 мВ) или умеренно положительным (от +37 мВ для М5 до +44 мВ для
99
М3). При таких зарядах предположительно больший вклад в эффективность трансфекции
будет давать рецептор-опосредованная доставка. Действительно, из представленных
данных
видно,
что
интенсивность
флуоресценции
при
доставке
pEGFP
в
предшественники ДК с помощью липосом М1, М2, М3 и М6 при N/P 1/1 и 2/1 в два раза
выше по сравнению с контрольными липосомами 2X3-DOPE (сравните белые и светлосерые столбики М1, М2, М3 и М6 с белыми и светло-серыми столбиками 2X3-DOPE, Рис.
23, Б). Очевидно, что при низких соотношениях N/P (1/1 и 2/1) будет осуществляться
таргетная рецептор-опосредованная доставка липоплексов МЛ/пДНК, несмотря на низкую
плотность маннозных рецепторов на поверхности предшественников ДК. Однако
наблюдаемая при этом интенсивность флуоресценции и, что более важно, количество
EGFP-положительных клеток слишком малы (до 0.7 RFU и 12%, соответственно) для
достижения необходимого уровня трансфекции ДК in vitro.
Липоплексы, сформированные при высоких соотношениях N/P (от 4/1 до 10/1),
имеют больший положительный заряд (до +66.3 мВ для М6, Таблица 3), поэтому доставка
pEGFP в клетки будет осуществляться прежде всего с помощью электростатических
взаимодействий между положительно заряженными липоплексами и отрицательно
заряженной
клеточной
мембраной
ДК
с
незначительным
вкладом
рецептор-
опосредованного эндоцитоза. Действительно, при данных N/P разница в эффективности
трансфекции между контрольными липосомами 2X3-DOPE и МЛ не превышала 10%
(сравните средне-серые, серые, темно-серые и черные столбики М1 – М6 с такими же
столбиками 2X3-DOPE, Рис. 23, А). Более того, было обнаружено, что при увеличении
соотношения N/P наблюдалось усиление эффективности трансфекции как с точки зрения
количества трансфицированных преДК, так и интенсивности флуоресценции. Три МЛ из
шести исследованных, а именно липосомы М4, М5 и М6, в 1.2 – 1.4 раза более
эффективно доставляли pEGFP в преДК при высоких N/P по сравнению с контрольными
липосомами 2X3-DOPE и липосомами М1 – М3 (сравните средне-серые, серые, темносерые и черные столбики М4 – М6 с такими же столбиками 2X3-DOPE и М1 – М3, Рис.
23, А, Б). Однако интенсивность флуоресценции клеток в образцах М4 – М6 при этом
оставалась на том же уровне, что и для 2X3-DOPE и М1 – М2 (сравните средне-серые,
серые, темно-серые и черные столбики М4, М5, М6 с такими же столбиками 2X3-DOPE,
М1, и М2, Рис. 23, Б).
Данные по доставке pEGFP с помощью МЛ в незрелые ДК с большим содержанием
маннозных рецепторов показали, что при соотношении N/P 4/1 МЛ обладали
одинаковыми или более низкими (для липосом М2 и М3) уровнями ТЕ по сравнению с
100
контрольными липосомами 2X3-DOPE: количество трансфицированных клеток достигало
23% с максимальной интенсивностью флуоресценции (MFI) 1.2 RFU (сравните светлосерые столбики 2X3-DOPE со всеми МЛ, Рис. 23, В, Г). При увеличении N/P наблюдалось
усиление ТЕ: до 30-36% незрелых ДК были трансфицированы с интенсивностью
флуоресценции 1.2 – 1.4 RFU для всех МЛ, однако, результаты не отличались от уровней
трансфекции контрольных липосом 2X3-DOPE (сравните серые и черные столбики 2X3DOPE со всеми МЛ, Рис. 23, В, Г).
3.4.6. Доставка РНК в костно-мозговые преДК и незрелые ДК с помощью
маннозилированных липосом
Для исследования способности МЛ доставлять РНК в преДК и незрелые ДК
использовали
суммарную
РНК,
выделенную
из
клеток
BHK-IR780,
эндогенно
экспрессирующих EGFP (Рис. 24). Доставку РНК-EGFP в комплексах с МЛ осуществляли
при низких соотношениях N/P 1/1 и 2/1. При таких N/P главным возможным механизмом
трансфекции РНК будет являться рецептор-опосредованный эндоцитоз, также как и в
случае с плазмидной ДНК. Из представленных данных видно, что при N/P 1/1 липосомы
М3 наиболее эффективно доставляли РНК-EGFP в преДК по сравнению с другими МЛ и
контрольными липосомами 2X3-DOPE как по количеству EGFP-положительных клеток
(33%), так и интенсивности флуоресценции (3.5 RFU) (сравните светло-серые столбики
М3 с 2X3-DOPE и другими МЛ, Рис. 24, А, Б). Другие липоплексы МЛ/РНК-EGFP,
сформированные при N/P 1/1, не отличались по ТЕ от 2X3-DOPE: ТЕ / MFI =
20% / 1.6 RFU. Увеличение соотношения N/P привело к повышению ТЕ для всех
исследованных МЛ (Рис. 24, А, Б), однако их ТЕ не превышала значения для контрольных
липосом 2X3-DOPE.
Доставка РНК-EGFP в незрелые ДК с помощью МЛ при соотношении N/P 2/1
показала, что липосомы М1, М4 – М6 обладали высоким уровнем ТЕ (40-45%
трансфицированных клеток), сравнимым с 2X3-DOPE (Рис. 24, В, Г). Однако уровень
интенсивности флуоресценции для клеток, трансфицированных 2X3-DOPE, был в 1.4 раза
ниже. Наименее эффективными липосомами для доставки РНК в незрелые ДК оказались
М3, содержащие 10% мол. липоконъюгата 1 с сукцинильным линкером.
Следует отметить, что доставка РНК-EGFP с помощью МЛ как в предшественники
ДК, так и в незрелые ДК была более эффективной по сравнению с доставкой pEGFP-C2.
Это можно объяснить свойствами РНК: молекулы РНК меньше по размеру и более гибкие
по сравнению с пДНК, что обусловило более легкую компактизацию РНК в липоплексы.
101
Рис. 24. Доставка РНК-EGFP в костно-мозговые преДК (А, Б) и незрелые ДК (В, Г) с помощью
маннозилированных
липосом.
Количество
флуоресцентных
клеток
и
интенсивность
флуоресценции оценивали через 48 ч после трансфекции. Уровни трансфекции РНК-EGFP с
помощью Lipofectamine 2000 и контрольных липосом 2X3-DOPE использовали в качестве
контроля. Данные представлены в виде MEAN±S.E.M.. Представленные данные получены из трех
независимых экспериментов.
Кроме того, в случае с РНК необходима лишь доставка в цитозоль, тогда как пДНК
должна быть дополнительно доставлена в ядро.
Полученные данные показали, что все исследованные МЛ обладали значительно
более высокой эффективностью трансфекции РНК в предшественники ДК и незрелые ДК
по сравнению с Lipofectamine 2000, который доставлял РНК-EGFP приблизительно в 2%
клеток с 0.1 RFU. Ранее было показано, что Lipofectamine эффективно доставлял РНК в
ДК человека моноцитароного происхождения (до 60% трансфицированных клеток) [295],
но не в костно-мозговые CD11c+ ДК мыши, как в нашем случае. Такие отличия в ТЕ
Lipofectamine 2000 могут объясняться видовыми особенностями, типом доставляемой
РНК и условиями трансфекции.
3.4.7. Подавление роста метастазов на модели метастатической меланомы В16
мыши с помощью ДК, нагруженных липоплексами МЛ/РНК-В16 ex vivo
Для исследования способности ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК в
комплексах с МЛ ex vivo, индуцировать противоопухолевый иммунный ответ, была
использована метастатическая модель меланомы В16. Меланому В16 трансплантировали
102
внутривенно мышам линии C57Bl/6 (самцам). На 4 день после трансплантации опухоли
мышей делили на семь групп, которые получали однократные внутривенные инъекции:
группа 1 (контроль, w/t) – физиологического раствора; группы 2-7 – ДК, нагруженных
РНК-В16 в комплексах с липосомами 2X3-DOPE, M1, M2, M4, M5 и М6, соответственно.
Липосомы М3 не исследовали в эксперименте in vivo вследствие низкой эффективности
трансфекции в экспериментах in vitro.
Рис. 25. Количество метастазов у животных с метастатической меланомой В16 после лечения ДК,
нагруженными РНК-В16 в комплексах с МЛ. Статистический анализ был проведен с помощью
однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием наименьшей значимости
Фишера (Fisher LSD). Данные представлены как MEAN±S.E.M. Значение p отражает
статистически достоверные отличия по сравнению с контролем.
Микроскопическое исследование поверхности легких показало, что иммунизация
мышей ДК, трансфицированными липоплексами 2X3-DOPE/РНК-B16, M5/РНК-B16 и
M6/РНК-B16, приводила к значительному снижению количества легочных метастазов
(Рис. 25). Среднее количество метастазов в группах мышей, получавших лечение ДК,
нагруженными липоплексами 2X3-DOPE/РНК-B16 составило 13±3 и было в 4.3 раза ниже
по сравнению с контролем (p=0.008, Рис. 25). Липоплексы M5/РНК-B16 и M6/РНК-B16
более эффективно снижали количество метастазов в 5 и 6.3 раза по сравнению с
контролем (p=0.007 и p=0.005, Рис. 25) и лишь чуть более эффективно по сравнению с
2X3-DOPE. Для мышей, получавших инъекции ДК, трансфицированных липоплексами
М4/РНК-В16, количество метастазов составило 24±8, что было в 2.3 раза ниже по
103
сравнению с контролем (p=0.035, Рис. 25). В группе мышей, получавших лечение ДК,
нагруженными липоплексами М1/РНК-В16 или М2/РНК-В16, среднее количество
метастазов было довольно высоким и приближалось к значению контрольной группы
(46±24 или 31±17, соответственно).
3.4.8.
Иммуномодулирующий
эффект
ДК,
нагруженных
липоплексами
МЛ/РНК-В16
ДК играют центральную роль в индукции противоопухолевого иммунного ответа.
Однако высокая плотность положительных зарядов на поверхности липоплексов и
двуцепочечная РНК внутри липоплексов может восприниматься ДК как патоген и
способствовать продукции ДК провоспалительных цитокинов, что в конечном итоге
способно привести к запуску нежелательного системного воспалительного ответа [296].
Рис. 26. Уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных с метастатической
меланомой В16 после лечения ДК, нагруженными липоплексами МЛ/РНК-В16. (А) ИЛ-1β, (Б) ИЛ6, (В) ГМ-КСФ, (Г) ФНО-α. Статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента,
отличия при p<0.05
считали статистически достоверными. Данные
MEAN±S.E.M.
104
представлены как
Для
исследования
провоспалительного
ответа
после
лечения
мышей-
опухоленосителей модифицированными ДК измеряли концентрации провоспалительных
цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ГМ-КСФ и ФНО-α) в сыворотке крови экспериментальных
животных. Исследование показало, что введение ДК не индуцировало продукцию
провоспалительных цитокинов в крови (Рис. 26).
Рис. 27. Уровень цитокинов в сыворотке крови животных с метастатической меланомой В16 после лечения
ДК, нагруженными липоплексами МЛ/РНК-В16. Т-хелперный ответ 1 типа: (А) ИЛ-12, (Б) ИЛ-2, (В) ИФН-γ.
Т-хелперный ответ 2 типа: (Г) ИЛ-4, (Д) ИЛ-10, (Е) ИЛ-5. Статистический анализ проводили с помощью tтеста Стьюдента, отличия при p<0.05 считали статистически достоверными. Данные представлены как
MEAN±S.E.M.
105
Исследование поляризации Т хелперных ответов 1 и 2 типов (Th1/Th2) после
введения ДК, нагруженных липоплексами МЛ/РНК-В16, не показало никаких изменений
в уровнях цитокинов, специфичных как для Th1 (ИЛ-12, ИЛ-2, ИФН-γ), так и для Th2
(ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-5) ответов (Рис. 27).
3.4.9. Аллостимуляторная активность ДК, нагруженных липоплексами
Поскольку ДК,
трансфицированные липоплексами
М5/РНК-В16 и
М6/РНК-В16,
продемонстрировали высокую эффективность в запуске антиметастатического ответа на
модели меланомы В16 in vivo, было исследовано влияние липофекции на стимуляторную
способность ДК в реакции аллогенных смешанных лимфоцитов in vitro с использованием
М6/РНК-В16 (Рис. 28). Для этого ДК, нагруженные липоплексами 2X3-DOPE/РНК-В16
Рис. 28. Индекс пролиферации (PI) спленоцитов после стимуляции ДК, нагруженными
липоплексами. Для стимуляции аллогенных спленоцитов в качестве стимуляторных клеток были
использованы незрелые ДК, обработанные РНК-В16, липоплексами 2X3-DOPE/РНК-В16 или
М6/РНК-В16, пустыми липосомами 2X3-DOPE или М6. В качестве отрицательного контроля
использовали уровень PI под действием нестимулированных незрелых ДК (w/s), в качестве
положительного контроля использовали уровень PI под действием ДК, обработанных ЛПС.
Спленоциты (1×105 кл/лун) культивировали в 96-луночном планшете в присутствии 104
стимуляторных клеток при 37 °С и 5% СО2 в течение 5 дней. Уровень пролиферации (PI)
спленоцитов в отсутствие стимуляторных ДК взят за 1 относительную единицу (о.е.). Данные
были статистически обработаны с помощью t-теста Стьюдента, отличия при p<0.05 считали
статистически достоверными. Данные представлены как MEAN±S.E.M.
106
или М6/РНК-В16, ссаживали с аллогенными спленоцитами и через 24 ч оценивали
пролиферацию спленоцитов. ДК, нагруженные липоплексами 2X3-DOPE/РНК-В16 или
М6/РНК-В16, обладали высокой стимуляторной активностью и усиливали пролиферацию
спленоцитов в 1.9 – 2 раза по сравнению с нестимулированными ДК (p=0.014 и p=0.02,
соответственно, Рис. 28) и с ЛПС (p=0.038 и p=0.05, соответственно, Рис. 28). ДК,
обработанные
пустыми
липосомами
2X3-DOPE
или
М6,
также
эффективно
стимулировали пролиферацию спленоцитов с эффективностью, близкой к эффективности
липоплексов с РНК-В16, однако отличия были статистически недостоверными по
сравнению с нестимулированными ДК и ДК, обработанными ЛПС (Рис. 28). Обработка
ДК суммарной опухолевой РНК не в составе липоплексов не приводила к увеличению
индекса пролиферации (PI) спленоцитов. Следовательно, можно предположить, что
катионные липосомы имеют существенное значение для стимуляторной активности ДК.
Следует также отметить, что добавление 10% мол. маннозилированных липоконъюгатов в
состав 2X3-DOPE (М6 липосомы) не влияло на стимуляторную активность ДК,
обработанных липосомами М6 по сравнению с 2X3-DOPE (Рис. 28).
3.4.10. Таргетная доставка липоплексов МЛ/РНК-В16 in vivo
Для исследования таргетной доставки ОАГ в ДК с помощью МЛ in vivo липоплексы
2X3-DOPE/РНК-B16, M5/РНК-B16 и M6/РНК-B16 вводили внутривенно здоровым мышам
линии C57Bl/6 (см. Материалы и методы). На 7 день после введения липоплексов мышей
выводили из эксперимента, выделяли спленоциты, проводили их рестимуляцию с
помощью лизата клеток меланомы В16 в присутствии ИЛ-2 в течение 4 дней и оценивали
их цитотоксичность против клеток меланомы В16 (Рис. 29). Видно, что в случае
липоплексов,
сформированных
маннозилированных
липосомами
липоконъюгатов
2
со
М6,
содержащими
скваратным
линкером,
10%
мол.
наблюдался
специфический лизис клеток меланомы В16, который был в 2.2 и 1.7 раз выше по
сравнению с непраймированными спленоцитами (контрольной базовой линией) и
контрольными липосомами 2X3-DOPE, соответственно (соотношение эффекторные
клетки / таргетные клетки = 20 / 1). Это значение статистически достоверно отличалось от
значений других групп. Интенсивность ЦТЛ ответа в случае контрольных липосом 2X3DOPE и липосом М5, содержащих 5% мол. маннозилированных липоконъюгатов 2,
значительно не отличалась от контрольного уровня: было лизировано до 13% клеток
меланомы (Рис. 29).
107
Рис. 29. Лизис клеток меланомы В16 специфически праймированными спленоцитами. Базовая
линия (пунктирная): неспецифический лизис клеток В16 спленоцитами, выделенными из
контрольных животных, получавших инъекции Opti-MEM (контроль), уровень базовой линии не
превышал 7-10%. Э/Т отношение – соотношение эффекторные клетки (спленоциты) / таргетные
клетки (клетки В16). Статистический анализ проводили с помощью т-теста Стьюдента, отличия
при p<0.05 считали статистически достоверными. Данные представлены как MEAN±S.E.M.
3.5. Исследование эффективности профилактических и терапевтических
дендритно-клеточных вакцин в лечении опухолей
В противоопухолевой терапии наиболее часто ДК используют в качестве
терапевтической
вакцины
[297].
Для
приготовления
терапевтической
вакцины
предшественники ДК выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови и/или
костного мозга пациента, незрелые ДК получают инкубированием предшественников ДК
в присутствии ростовых факторов. Незрелые ДК нагружают опухолевыми антигенами
(нуклеиновыми кислотами, белками, лизатами опухолевых клеток и т.д.) ex vivo и вводят
обратно пациенту, где ДК мигрируют в периферические лимфатические узлы и селезенку
и инициируют активацию противоопухолевого Т- и В-клеточного иммунного ответа. Этот
метод хорошо известен и широко используется [13, 270, 276, 298]. Однако для применения
таких противоопухолевых ДК вакцин необходимо знать о присутствии опухоли в
организме пациента, что на ранних этапах заболевания затруднено из-за отсутствия
симптомов.
108
На
сегодняшний
день
использование
ДК
в
качестве
профилактических
противоопухолевых вакцин менее распространено и исследуется, прежде всего, на
мышиных опухолевых моделях. Тем не менее, профилактические противоопухолевые
вакцины на основе ДК могут быть полезны пациентам с предрасположенностью к
опухолевым
заболеваниям,
когда
существует
значительный
риск
развития
злокачественных новообразований. Например, женщины носители высоко пенетрантных
мутаций BRCA1 и BRCA2 генов обладают повышенным риском развития рака молочной
железы (носители BRCA1/2 мутаций, 36–90%) и рака яичников (носители BRCA1 мутаций,
24–59%; BRCA2 мутаций, 8–35%) [299, 300]. Профилактические вакцины могут быть
также полезны для пациентов с высокими уровнями опухолевых маркеров в крови.
Например, для пациентов с высокой концентрацией простат-специфического антигена,
отражающего значительный риск возникновения рака простаты у мужчин [301]. Другие
маркеры, такие как CA125 (MUC126) and AFP (альфа фетопротеин), не являются
опухолеспецифическими, однако их высокий уровень в сыворотке крови служит ранним
маркером рака яичников и гепатоклеточной карциномы, соответственно [302]. Помимо
пациентов с предрасположенностью к опухолевым заболеваниям профилактические ДК
вакцины в комплексе с химиотерапией могут иметь потенциальное значение после
хирургического удаления опухолей и метастазов, когда визуально наличие опухолевых
клеток в организме трудно установить. Вообще, использование профилактических вакцин
необходимо в случае, когда наличие опухоли еще не установлено в организме пациента,
однако, существует значительный риск ее развития. Основным преимуществом
профилактических противоопухолевых вакцин на основе ДК является отсутствие
давления опухоли на иммунную систему пациента – так называемый «уход опухоли от
иммунного
надзора».
Профилактическая
вакцинация
позволяет
своевременно
активировать противоопухолевый иммунный надзор в отсутствие опухолевой нагрузки,
индуцировать опухолеспецифический клон цитотоксических Т-лимфоцитов и имеет
положительный эффект на гуморальный иммунитет [303].
Несмотря
на
использовании ДК
то,
что
были
получены
многообещающие
в качестве противоопухолевых
результаты
профилактических
при
вакцин
в
экспериментах на мышиных опухолевых моделях in vivo при лечении аденокарциномы
[5], карциномы легких Льюис [254], лимфомы [250] и меланомы [198, 251], направление
профилактических дендритно-клеточных вакцин только начинает развиваться.
109
В данном разделе проведено исследование двух схем лечения животных с
различными модельными опухолями с помощью ДК вакцин - профилактической и
терапевтической схем лечения.
3.5.1. Экспериментальные модели и схемы лечения опухолей с помощью ДК
В
работе
отличающиеся
использовали
наличием
три
различные
первичных
модели
опухолевых
узлов
опухолевой
и
прогрессии,
метастазированием:
аденокарцинома Кребс-2 (далее Кребс-2, неметастазирующая опухоль с первичным
узлом), меланома В16 (опухоль без первичного опухолевого узла с преимущественными
метастазами в легких) и карцинома легких Льюис (LLC, опухоль с первичным
опухолевым узлом и метастазами в легких).
ДК вакцины получали из костно-мозговых предшественников ДК культивированием
в среде в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4 с последующей нагрузкой незрелых ДК ОАГ. В
качестве ОАГ для нагрузки ДК использовали источники множества опухолевых
антигенов, а именно лизат опухолевых клеток и суммарную опухолевую РНК. Данные
источники
опухолевых
антигенов
были
выбраны,
поскольку
они
содержали
максимальный набор антигенов, представленных в опухолевых клетках, и, таким образом,
при их нагрузке в ДК существовала возможность запуска поликлональных иммунных
ответов широкого спектра [304, 305]. В качестве трансфектантов для доставки РНК в ДК
использовали коммерческий препарат Lipofectamine 2000 (LF) или катионные липосомы
2D3-DOPE, чей высокий трансфекционный потенциал был продемонстрирован ранее
(Раздел 3.3. Результатов и обсуждений, [291]). Липосомы 2D3-DOPE состояли из
поликатионного липида 2D3 на основе спермина и двух остатков диалкилглицерина и
липида-хелпера DOPE, взятых в молярном отношении 1:1 (Рис. 11).
Фенотип ДК, нагруженных суммарной РНК в комплексах с липосомами LF или 2D3DOPE исследовали путем оценки экспрессии маркеров созревания CD80, CD83, CD86 и
MHC II. В качестве положительного контроля использовали ДК, обработанные ЛПС (100
нг/мл, 24 ч) (Рис. 30). Необработанные ДК (Рис. 30, Б, панель w/s) экспрессировали низкие
уровни маркеров созревания, и их фенотип соответствовал незрелым или незначительно
зрелым ДК. В случае с ДК, обработанными ЛПС, наблюдалось увеличение уровней трех
маркеров CD80, CD83 и MHC II (Рис. 30, Б, сравните панели w/s и ЛПС). ДК,
обработанные липоплексами LF или 2D3-DOPE с РНК-В16, экспрессировали увеличенное
110
Рис. 30. Статус зрелости ДК после трансфекции липоплексами LF/РНК и 2D3/РНК. А. Мертвые
клетки исключали из популяции ДК в соответствии с размером и структурой клеток. Б.
Экспрессия CD80, CD83, CD86 и MHC II на поверхности ДК после трансфекции липоплексами
LF/РНК и 2D3/РНК. w/s – ДК без стимуляции (негативный контроль); ЛПС – ДК, обработанные
ЛПС (положительный контроль). ДК были окрашены анти-CD80 (PE), анти-CD83 (РЕ), анти-CD86
(FITC), анти-MHC II (FITC) антителами и проанализированы с помощью проточной цитометрии.
Событий в каждом образце не менее 10000.
111
количество маркеров созревания, и их фенотип наиболее вероятно соответствовал
фенотипу зрелых ДК. Стимуляция ДК LF/РНК приводила к пятикратному увеличению
экспрессии CD80, двукратному увеличению экспрессии CD86 и небольшому величению
экспрессии MHC II по сравнению с нестимулированными ДК (Рис. 30, Б, сравните панели
w/s и LF/РНК). Стимуляция ДК 2D3/РНК приводила к 4.5- и 3-кратному увеличению
экспрессии CD80 и CD83, соответственно, по сравнению с нестимулированными ДК (Рис.
30, Б, сравните панели w/s и 2D3/РНК).
Экспериментальные схемы противоопухолевого лечения мышей с помощью ДК
вакцин представлены на Рис. 31. Схема 1 (Рис. 31, А1, Б1/1, Б1/2) отражает режим
профилактической вакцинации. В моделях опухолей Кребс-2 и карциномы легких Льюис
(LLC) мыши были однократно внутривенно иммунизированы ДК вакцинами за 7 дней до
трансплантации опухоли. В модели меланомы В16 использовали одну (Рис. 31, Б1/1) или
две ДК (Рис. 31, Б1/2) вакцинации с недельным интервалом между ними – начальную
иммунизацию проводили за две недели до трансплантации опухоли, ревакцинацию
осуществляли за неделю до трансплантации опухоли. Схема 2 (Рис. 31, А2, Б2/1, Б2/2)
отражает режим терапевтического лечения опухолей с помощью ДК вакцин. Животныеопухоленосители получали внутривенные инъекции ДК вакцин на 4 день после
трансплантации опухоли, ревакцинацию мышей в модели меланомы В16 проводили на 11
день развития опухоли, через неделю после первой ДК вакцинации (Рис. 31).
3.5.2.
Сравнение
противоопухолевой
активности
профилактической
и
терапевтической схем лечения ДК на различных опухолевых моделях
Эффективность
противоопухолевого
ответа
при
профилактической
и
терапевтической ДК вакцинации представлена на Рис. 32. Тип вакцины для моделей
Кребс-2 и LLC приведен как С/Т/А – схема (1 – профилактическая, 2 –
терапевтическая)/трансфектант/источник антигена, для модели меланомы В16 тип
вакцины приведен как С-И/Т/А – схема (1 – профилактическая, 2 – терапевтическая) –
количество иммунизаций/трансфектант/источник антигена.
Было показано, что в случае опухоли Кребс-2 профилактические вакцины и на
основе РНК, и на основе лизата (1/LF/РНК и 1/лизат, соответственно) были неэффективны
и не влияли на рост опухоли (Рис. 32, А). Введение терапевтической ДК вакцины на
основе РНК (2/LF/РНК) мышам с Кребс-2 приводило к заметному подавлению роста
опухоли в 1.9 раз по сравнению с контрольной группой без лечения (w/t) (p=0.036, Рис. 32,
Б), тогда как терапевтическая вакцина на основе лизата 2/лизат была слабо иммуногенной
(Рис. 32, Б).
112
Рис. 31. Экспериментальные схемы противоопухолевого лечения мышей с помощью ДК вакцин.
(А) Лечение аденокарциномы Кребс-2 и карциномы легких Льюис (LLC). (Б) Лечение меланомы
В16. А1, Б1/1, Б1/2 – Схема 1, профилактическая схема лечения. А2, Б2/1, Б2/2 – Схема 2,
терапевтическая схема лечения. В модели меланомы В16 использовали как однократные (Б1/1,
Б2/1), так и двукратные (Б2/1, Б2/2) инъекции модифицированных ДК.
113
Рис. 32. Эффективность профилактических и терапевтических ДК вакцин. А и Б. Подавление
скорости роста Кребс-2 под действием ДК вакцин, соответственно. w/t – контроль, животные с
Кребс-2, получавшие инъекции PBS. В и Г. Подавление скорости роста и метастазирования LLC
под действием ДК вакцин. w/t – контроль, животные с LLC, получавшие инъекции PBS. Тип ДК
вакцины для А-Г представлен в виде С/Т/А – схема (1 – профилактическая, 2 –
терапевтическая)/трансфектант/источник
антигена.
Д.
Ингибирование
метастазирования
меланомы В16 под действием ДК вакцин. Тип ДК вакцины представлен в виде С-И/Т/А – схема (1
– профилактическая, 2 – терапевтическая) – количество иммунизаций/трансфектант/источник
антигена. w/t – контроль, животные с меланомой В16, получавшие инъекции PBS.
Статистический анализ был проведен с помощью однофакторного дисперсионного анализа с
апостериорным критерием наименьшей значимости Фишера (Fisher LSD). Данные представлены
как MEAN±S.E.M. Значение p отражает статистически достоверные отличия по сравнению с
контролем.
114
Поскольку на модели Кребс-2 ДК вакцины на основе суммарной опухолевой РНК
обладали заметным противоопухолевым потенциалом по сравнению с ДК на основе
опухолевого лизата, в экспериментах на модели LLC использовали ДК вакцины на основе
РНК. В качестве трансфектантов использовали Lipofectamine 2000 (LF) и катионные
липосомы
2D3-DOPE.
Было
показано,
что
в
группе
животных,
получавших
профилактическую ДК вакцину 1/2D3/РНК, наблюдалось двукратное снижение скорости
роста опухоли по сравнению с контролем (p=0.009, Рис. 32, В). В этой же группе
животных наблюдался и наиболее эффективный антиметастатический ответ – снижение
количества легочных метастазов в 4.7 раз относительно контрольной группы (p=0.0004,
Рис. 32, Г). Терапевтическая вакцинация мышей-опухоленосителей такой же вакциной
(2/2D3/РНК) приводила к 2.3-кратному снижению количества метастазов по сравнению с
контролем (p=0.003, Рис. 32, Г), однако не вызывала подавления роста первичной опухоли
(Рис. 32, В). Лечение животных как профилактической, так и терапевтической ДК
вакциной с использованием в качестве трансфектанта Lipofectamine 2000 не приводило к
достоверному снижению скорости роста опухоли, однако наблюдалось 1.5-кратное
снижение количества метастазов по сравнению с контролем (p=0.02 и p=0.045 для
1/LF/РНК и 2/LF/РНК, соответственно, Рис. 32, Г).
Для запуска высокоэффективного противоопухолевого ответа в модели меланомы
В16 помимо групп животных, получавших ДК вакцину однократно, были введены
группы, которые получали две ДК вакцины – первичную вакцинацию и ревакцинацию
(Рис. 31, Б1/2, Б2/2). В качестве ДК вакцин использовали ДК, трансфицированные
липоплексами 2D3-DOPE/РНК-В16. На данной опухолевой модели было показано, что
однократная профилактическая вакцинация 1-1/2D3/РНК оказалась наиболее эффективной
и приводила к 10-кратному снижению количества легочных метастазов по сравнению с
контролем (w/t) (р=0.018, Рис. 32, Д). Двукратная профилактическая вакцина 12/2D3/РНК, обладала меньшим антиметастатическим потенциалом: наблюдалось 1.5–2кратное
ингибирование
метастазирования
(Рис.
32,
Д),
однако,
данные
были
статистически не достоверны. Следует отметить, что как в профилактической, так и в
терапевтической схемах противоопухолевого лечения двукратная иммунизация ДК
вакцин была менее эффективной по сравнению с однократной ДК вакциной: наблюдали
незначительное (на 30%) снижение количества метастазов, однако отличия были
статистически недостоверны.
115
3.5.3. Иммунологические характеристики организма-опухоленосителя после
лечения профилактическими и терапевтическими ДК вакцинами.
На первом этапе нами было исследовано соотношение CD4+/CD8+ клеток в
селезенках животных с Кребс-2, получавших профилактические и терапевтические ДК
вакцины, которое отражало баланс между Т-хелперным и цитотоксическим Т-клеточными
ответами (Рис. 33). Количество CD4+ и CD8+ клеток в точках −7 день (Рис. 33, А-Г) и 0
день (Рис. 33, Д-З) измеряли до введения ДК вакцин и трансплантации опухоли, таким
образом, данные показатели отражали количество CD4+ и CD8+ клеток в селезенках
здоровых мышей, которое составило CD4+ (18%)/CD8+ (19%).
Количество CD4+ клеток в контрольной группе профилактической схемы (животные
с Кребс-2, получавшие инъекции PBS, 19 день развития опухоли) слабо изменялось в ходе
развития опухоли (Рис. 33, А). Все профилактические вакцины 1/LF, 1/LF/РНК, 1/лизат
вызывали двукратное увеличение содержания CD4+ клеток на 7-ой день после введения
ДК вакцин (день трансплантации опухоли) вне зависимости от источника антигена (Рис.
33, Б, В, Г). К окончанию эксперимента (день 19) количество CD4+ клеток снижалось до
уровня животных из контрольной группы и находилось в пределах 18-22% (Рис. 33, Б-Г).
Количество CD8+ клеток слабо снижалось с 19% (базовый уровень) до 13-17% на 19 день
развития опухоли во всех экспериментальных группах, включая контроль (Рис. 33, А-Г).
Количество CD4+ клеток в контрольной группе терапевтической схемы (животные с
Кребс-2, получавшие инъекции PBS, 11 день развития опухоли) слабо увеличивалось с
17% (базовый уровень) до 21% в ходе развития опухоли (Рис. 33, Д). Терапевтические ДК
вакцины 2/LF и 2/LF/РНК не влияли не содержание CD4+ клеток (Рис. 33, Е, Ж). В случае
ДК вакцины 2/лизат количество CD4+ клеток падало до 13% к концу эксперимента (Рис.
33, З).
Количество CD8+ клеток в контрольной группе терапевтической схемы значительно
росло с 19% (базовый уровень) до 29% к 11-ому дню (Рис. 33, Д). Все терапевтические ДК
вакцины 2/LF, 2/LF/РНК и 2/лизат вызывали практически полное исчезновение CD8+
клеток в первый день после введения ДК вакцин (5 день после трансплантации опухоли)
(Рис. 33, Е, Ж, З). Тем не менее, на седьмой день после иммунизации мышей ДК (11 день
после трансплантации опухоли) количество CD8+ клеток в группах 2/LF и 2/LF/РНК
возвратилось к контрольному уровню (29%). В группе 2/лизат также наблюдалось
увеличение содержания CD8+ клеток, но в меньшей степени по сравнению с
терапевтическим контролем (22% и 29%, соответственно).
116
Рис. 33. Количество CD4+ и CD8+ клеток в селезенках животных с Кребс-2, получавших лечение
профилактическими и терапевтическими ДК вакцинами. А. w/t, контроль, мыши с Кребс-2,
получавшие инъекции PBS, 19 день развития опухоли. Б, В и Г. Мыши, получавшие
профилактические ДК вакцины 1/LF, 1/LF/РНК и 1/лизат, соответственно. Д. w/t, контроль, мыши
с Кребс-2, получавшие инъекции PBS, 11 день развития опухоли. Е, Ж и З. Мыши, получавшие
терапевтические ДК вакцины 2/LF, 2/LF/РНК и 2/лизат, соответственно. Количество CD4+ и CD8+
клеток в точке -7 день отражает содержание клеток в селезенках здоровых мышей. Тип ДК
вакцины представлен в виде С-И/Т/А, где С – схема (1 – профилактическая, 2 - терапевтическая),
И – количество иммунизаций, Т – трансфектант, А – источник антигена. Данные представлены как
MEAN±S.E.M.
117
На втором этапе для оценки иммунного статуса экспериментальных животных с
меланомой В16, получавших лечение профилактическими и терапевтическими ДК
вакцинами, были исследованы три важных звена иммунного ответа – Т хелперный ответ 1
типа (Тh1), Т хелперный ответ 2 типа (Тh2) и про-воспалительный ответ. Концентрацию
специфических цитокинов измеряли в сыворотке крови экспериментальных животных на
15 день развития опухоли (см. Рис. 31, Б). Было показано, что вакцинация мышей ДК по
профилактической схеме не приводила к статистически значимым изменениям в
профилях цитокинов специфических для Тh1 типа (Рис. 34, А, Б, В). В случае
терапевтической схемы лечения наблюдалось увеличение уровней ИЛ-2 и ИЛ-12 (р40/р70)
в группах 2-1/2D3/РНК и 2-2/2D3/РНК, соответственно.
Тем не менее, в группах животных, получавших лечение профилактическими ДК
вакцинами, наблюдалось падение уровней цитокинов, специфичных для Th2 ответа (Рис.
34, Г, Д, Е). Можно отметить практически полное исчезновение ИЛ-4 (p=0.05 и p=0.041
для групп 1-1/2D3/РНК и 1-2/2D3/РНК, соответственно, Рис. 34, Г), полное падение
уровня ИЛ-10 для 1-2/2D3/РНК и шестикратное падение уровня ИЛ-10 (p=0.033 для
группы 1-1/2D3/РНК, Рис. 34, Д). Также следует отметить 1.6-кратное снижение
концентрации ИЛ-5 в группе 1-1/2D3/РНК (отличия от контроля статистически
недостоверны, Рис. 34, Е) и практически полное исчезновение ИЛ-5 в группе 1-2/2D3/РНК
(p=0.009, Рис. 34, Е). В сыворотке крови животных, получавших терапевтические ДК
вакцины
2-1/2D3/РНК
и
2-2/2D3/РНК,
изменений
в
концентрацях
цитокинов,
специфичных для Th2 ответа, обнаружено не было. Известно, что Т-хелперные ответы 1 и
2 типов находятся в постоянном балансе друг с другом, дифференцировка Тh1 и Тh2
клеток является антагонистической. Поэтому можно предполагать, что снижение уровней
Th2-специфических цитокинов в сыворотке крови мышей с меланомой В16, получавших
профилактические ДК вакцины, указывает на поляризацию Т-хелперного ответа 1 типа с
последующей активацией противоопухолевого цитотоксического Т-клеточного ответа.
Анализ про-воспалительных цитокинов в сыворотке крови экспериментальных
животных показал, что только в двух случаях наблюдается повышение их уровня: 1.3кратное повышение уровня ИЛ-1β в группе 2-1/2D3/РНК (Рис. 35, А) и трехкратное
повышение уровня ФНО-α в группе 1-1/2D3/РНК (Рис. 35, Г).
118
Рис. 34. Диаграмма типа «ящик с усами», отражающая уровень Th1- и Th2-цитокинов в сыворотке
крови мышей с меланомой В16 после профилактической и терапевтической ДК вакцинации. Th1специфические цитокины: (А) ИЛ-12 (р40/р70); (Б) ИЛ-2; (В) ИФН-γ. Th2-специфические
цитокины: (Г) ИЛ-4; (Д) ИЛ-10; (Е) ИЛ-5. Ящик отражает 25-й, 50-й и 75-й перцентили. Линия с
квадратом отражает медианное значение. Планки отражают минимум/максимум. w/t – контроль,
мыши с метастатической меланомой В16, получавшие инъекции PBS. Тип ДК вакцины приведен
как С-И/Т/А, где С – схема (1- профилактическая, 2 - терапевтическая), И – количество
иммунизаций, Т – трансфектант, А – источник антигена. Статистическая обработка данных была
проведена с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием
наименьшей значимости Фишера. Значение p отражает статистически достоверные отличия по
сравнению с контролем.
119
Рис. 35. Диаграмма типа «ящик с усами», отражающая уровень про-воспалительных цитокинов в
сыворотке крови мышей с меланомой В16 после профилактической и терапевтической ДК
вакцинации: (А) ИЛ-1β, (Б) ИЛ-6, (В) ГМ-КСФ, (Г) ФНО-α. Ящик отражает 25-й, 50-й и 75-й
перцентили.
Линия
с
квадратом
отражает
медианное
значение.
Планки
отражаютминимум/максимум. w/t – контроль, мыши с метастатической меланомой В16,
получавшие инъекции PBS. Тип ДК вакцины приведен как С-И/Т/А, где С – схема (1 –
профилактическая, 2 – терапевтическая), И – количество иммунизаций, Т – трансфектант, А –
источник
антигена.
Статистическая
обработка
данных
была
проведена
с
помощью
однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием наименьшей значимости
Фишера. Значение p отражает статистически достоверные отличия по сравнению с контролем.
3.5.4. Оценка экспрессии транскрипционных факторов Tbet, RORγ, GATA3 и
Foxp3
Анализ уровней Th1- и Th2-специфичных цитокинов в сыворотке крови мышей с
меланомой после ДК вакцинации не позволил определить точный тип Т-хелперного
ответа. Поэтому мы провели оценку уровня экспрессии транскрипционных факторов Tbet
(специфичен для Th1 ответа), GATA3 (специфичен для Th2 ответа), RORγ (специфичен
для Th17 ответа) и маркера Т-регуляторных клеток Foxp3 в спленоцитах мышей с
метастатической меланомой В16, получавших ДК вакцины, с помощью ОТ-ПЦР в режиме
120
Рис. 36. Уровни экспрессии Tbet, GATA3, RORγ и Foxp3 в спленоцитах мышей после ДК
вакцинации (данные ПЦР). А. Профилактическая схема лечения: здоровые мыши получали ДК
вакцины 1-1/2D3/РНК и 1-2/2D3/РНК (однократная и двукратная иммунизация, соответственно).
Б. Мыши с метастатической меланомой получавшие инъекции PBS. В. Терапевтическая схема
лечения: мыши с метастатической меланомой получали ДК вакцины 2-1/2D3/РНК и 2-2/2D3/РНК
(однократная и двукратная иммунизация, соответственно). Перечеркнутый квадрат на оси Y
отражает уровень экспрессии генов в здоровых интактных мышах (базовая линия). Тип ДК
вакцины указан как С-И/Т/А, где С – схема лечения 1 (профилактическая) или 2 (терапевтическая),
И – количество иммунизаций, Т – трансфектант, А – источник антигена. Экспрессию генов в
группе без лечения определяли на 9 и 16 дни развития опухоли. Экспрессию генов в группах,
получавших профилактические и терапевтические ДК вакцины, измеряли через 5 дней после
каждой иммунизации. Данные представлены в виде MEAN±S.E.M и получены их трех
независимых экспериментов. Статистический анализ был проведен с помощью однофакторного
дисперсионного анализа с апостериорным критерием наименьшей значимости Фишера (Fisher
LSD).
121
реального времени (Рис. 36). Было показано, что как однократная, так и двукратная
профилактические ДК вакцины не оказывали эффекта на уровень GATA3 (Рис. 36, А):
уровень экспрессии данного гена не отличался от базовой линии (здоровые животные,
точка пересечения с осью Y, Рис. 36, А-В) и контрольной группы (w/t, мыши с
метастатической меланомой В16, не получавшие ДК вакцины, Рис. 36, Б). Увеличение
количества профилактических ДК иммунизаций привело к исчезновению Tbet (p=0.0018)
и двукратному увеличению уровня RORγ (p=0.04), с чем может быть связано отсутствием
эффективности двукратной профилактической ДК вакцины, поскольку поляризация Th17ответа свидетельствует о развитии аутоиммунных и провоспалительных реакций в
организме. Кроме этого наблюдалось трехкратное снижение уровня Foxp3 по сравнению с
базовой линией (здоровые животные), однако отличия являлись статистически
недостоверными (Рис. 36, А).
Однократная терапевтическая иммунизация мышей-опухоленосителей ДК вакциной
приводила к увеличению уровня экспрессии Tbet, GATA3 и RORγ по сравнению с базовой
линией и группой w/t (Рис. 36, В и Б). Уровни Tbet и GATA3 увеличивались в 1.3 и 2 раза
относительно группы w/t, данные являются статистически недостоверными. Уровень
RORγ увеличивался в 5 раз (p=0.019) по сравнению с группой w/t. Таким образом,
увеличение уровней экспрессии RORγ и Tbet вместе с увеличенным содержанием
некоторых Th1-специфичных цитокинов в сыворотке крови мышей может указывать на
то, что однократная терапевтическая вакцинация модифицированными ДК приводит к
поляризации Th1/Th17 ответа. Следует отметить, что уровни экспрессии Tbet, GATA3 и
RORγ после второй терапевтической ДК иммунизации не отличались от уровней в группе
w/t (Рис. 36, В и Г). Уровень экспрессии Foxp3 снижался во всех группах животных,
однако данные являются статистически недостоверными.
122
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе исследован трансфекционный потенциал спермин-содержащих
катионных липосом. Показано, что липосомы 2X3-DOPE и 2D3-DOPE, содержащие
катионные липиды на основе двух остатков холестерина или дитетрадецилглицерина,
соответственно, высокоэффективно доставляют плазмидную ДНК и суммарную РНК в
костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК мыши. ДК, нагруженные
суммарной
опухолевой
РНК с помощью данных
липосом, обладали
высоким
антиметастатическим потенциалом и приводили к 3-5-кратному снижению количества
легочных метастазов в метастатической модели меланомы В16. На основании полученных
данных можно сделать вывод о высокой перспективности данных липосом для доставки
нуклеиновых кислот, кодирующих опухолевые антигены, в ДК человека и применении в
клинике.
Адресная доставка опухолевых антигенов является инструментом для повышения
эффективности доставки ОАГ в ДК и, следовательно, для увеличения способности ДК
представлять ОАГ наивным Т-клеткам с последующей активацией более действенного
противоопухолевого иммунного ответа. В настоящей работе исследованы адресные
липосомальные системы доставки, направленные к маннозным рецепторам ДК,
полученные на основе высокоэффективных липосом 2X3-DOPE с добавлением 2.5-10%
мол. маннозилированных липоконъюгатов, в которых остаток маннозы присоединен к
диглицериду через с сукцинильный или диэтилскваратный линкер. В результате
проведенных исследований установлено, что маннозилированные липосомы М6 на основе
катионных
липосом
2X3-DOPE
с
добавлением
10%
мол.
маннозилированного
липоконъюгата со скваратным линкером более эффективно доставляют РНК в незрелые
ДК мыши по сравнению с контрольными липосомами 2X3-DOPE. При доставке
суммарной опухолевой РНК в ДК с помощью липосом М6 ex vivo антиметастатический
потенциал как М6, так и 2X3-DOPE липосом был приблизительно одинаков и приводил к
4-6-кратному снижению количества метастазов в метастатической модели меланомы В16.
Однако, при системном введении лабораторным животным комплексов суммарной
опухолевой РНК с липосомами М6 наблюдалась в два раза более эффективная активация
анти-В16 цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с контрольными липосомами
2X3-DOPE. Таким образом, маннозилированные липосомы М6, содержащие катионный
липид 2X3, липид-хелпер DOPE и 10% маннозилированного липоконъюгата со
скваратным
линкером
могут
являться
123
перспективным
противоопухолевым
иммунотерапевтическим средством, применяемым для системной доставки РНК,
кодирующих опухолевые антигены, в ДК человека.
В настоящее время противоопухолевые ДК вакцины применяются в клинических
испытаниях для терапевтического лечения опухолей, уже присутствующих в организме
пациента. В настоящей работе показана возможность использования ДК вакцин на основе
ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК с помощью катионных липосом 2D3-DOPE
для профилактического лечения метастазирующих опухолей. Профилактические ДК
вакцины могут использоваться для предотвращения развития опухолевых заболеваний как
у людей, находящихся в группах риска (генетическая предрасположенность, возраст), так
и у пациентов после хирургического удаления опухолей как один из компонентов
комплексной терапии при опухолевых заболеваниях.
124
ВЫВОДЫ
1) Исследована трансфекционная активность шести поликатионных липосом, состоящих
их катионных липидов на основе спермина и холестерина или диглицерида, и липидахелпера DOPE, в отношении дендритных клеток и способность нагруженных таким
образом ДК модулировать эффективный противоопухолевый иммунный ответ. Показано,
что:
- Липосомы на основе липидов 2X3 (1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид) и 2D3 (1,26-бис(1,2-ди-О-тетрадецилrac-глицерин)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид) наиболее эффективно
доставляют ДНК и РНК в предшественники ДК и незрелые ДК мыши.
- Вакцины, полученные путем трансфекции дендритных клеток суммарной опухолевой
РНК в комплексах с данными липосомами, опосредуют запуск эффективного
противоопухолевого ответа у мышей с метастатической меланомой В16, что
выражается в 5-кратном снижении количества метастазов и отсутствии активации провоспалительного ответа.
2) Исследована доставка в ДК плазмидной ДНК и РНК, кодирующей опухолевые
антигены, с помощью «адресных» поликатионных липосом на основе липосом 2X3-DOPE,
направленных к маннозным рецепторам на поверхности дендритных клеток. Показано,
что:
- Добавление в состав липосом 2X3-DOPE 10% маннозилированных липоконъюгатов с
диэтилскваратным линкером (липосомы М6), приводит к повышению эффективности
доставки РНК в незрелые дендритные клетки и усилению антиметастатического
потенциала такой ДК вакцины на модели метастатической меланомы В16.
- При системном введении лабораторным животным комплексов суммарной
опухолевой РНК клеток меланомы В16 с липосомами М6 наблюдалась в два раза более
эффективная активация анти-В16 цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с
контрольными липосомами 2X3-DOPE.
3)
Исследована
противоопухолевая
эффективность
дендритно-клеточных
вакцин,
содержащих в качестве источника антигена опухолевый лизат или РНК, при лечении по
профилактической и терапевтической схемам. Показано, что:
- Наиболее эффективные дендритно-клеточные вакцины получены с использованием
в качестве источника антигена опухолевой РНК;
- Профилактическая схема лечения ДК вакцинами наиболее эффективна в отношении
высокоагрессивных метастазирующих опухолей (карцинома легких Льюис, меланома
125
В16), тогда как терапевтическая схема ДК вакцинации эффективна в отношении
неметастазирующей опухоли (Кребс-2).
- При лечении по профилактической или по терапевтической схемам происходит
поляризация Th17 или Th1/Th17 иммунных ответов, соответственно. При этом не
наблюдается активации регуляторных Т-клеток.
126
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Palucka, K., Ueno, H., Fay, J., Banchereau, J. Dendritic cells and immunity against
cancer // J. Intern. Med. – 2011. – V. 269. – P. 64-73.
2. DeMatos, P., Abdel-Wahab, Z., Vervaert, C., Hester, D., Seigler, H. Pulsing of dendritic
cells with cell lysates from either B16 melanoma or MCA-106 fibrosarcoma yields equally
effective vaccines against B16 tumors in mice // J. Surg. Oncol. – 1998. – V. 68. – P. 79-91.
3. Minami, T., Nakanishi, Y., Izumi, M., Harada, T., Hara, N. Enhancement of antigenpresenting capacity and antitumor immunity of dendritic cells pulsed with autologous tumorderived RNA in mice // J. Immunother. – 2003. – V. 26. – P. 420-431.
4. Tüting, T., Steitz, J., Brück, J., Gambotto, A., Steinbrink, K., DeLeo, A.B., et al.
Dendritic cell-based genetic immunization in mice with a recombinant adenovirus encoding
murine TRP2 induces effective antimelanoma immunity // J. Gene. Med. – 1999. – V. 1. – P.
400-406.
5. Koido, S., Kashiwaba, M., Chen, D., Gendler, S., Kufe, D., Gong, J. Induction of
antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA // J.
Immunol. – 2000. – V. 165. – P. 5713-5719.
6. Yang, B.B., Jiang, H., Chen, J., Zhang, X., Ye, J.J., Cao, J. Dendritic cells pulsed with
GST-EGFR fusion protein: effect in antitumor immunity against head and neck squamous cell
carcinoma // Head Neck. – 2010. – V. 32. – P. 626-635.
7. Kim, B.R., Yang, E.K., Kim, D.Y., Kim, S.H., Moon, D.C., Lee, J.H., Kim, H.J., Lee,
J.C. Generation of anti-tumour immune response using dendritic cells pulsed with carbonic
anhydrase IX-Acinetobacter baumannii outer membrane protein A fusion proteins against renal
cell carcinoma // Clin. Exp. Immunol. – 2012. – V. 167. – P. 73-83.
8. Zheng, X., Koropatnick, J., Chen, D., Velenosi, T., Ling, H., Zhang, X., Jiang, N.,
Navarro, B., et al. Silencing IDO in dendritic cells: a novel approach to enhance cancer
immunotherapy in a murine breast cancer model // Int. J. Cancer. – 2013. – V. 132. – P. 967-977.
9. Matheoud, D., Baey, C., Vimeux, L., Tempez, A., Valente, M., Louche, P., Le Bon, A.,
Hosmalin, A., Feuillet, V. Dendritic cells crosspresent antigens from live B16 cells more
efficiently than from apoptotic cells and protect from melanoma in a therapeutic model // PLoS
One. – 2011. – V. 6. – P. e19104.
10. Salem, M.L. The use of dendritic cells for peptide-based vaccination in cancer
immunotherapy // Methods Mol. Biol. – 2014. – V. 1139. – P. 479-503.
127
11. Vacchelli, E., Vitale, I., Eggermont, A., Fridman, W.H., Fučíková, J., Cremer, I.,
Galon, J., Tartour, E., at al. Trial watch: Dendritic cell-based interventions for cancer therapy //
Oncoimmunology. – 2013. – V. 2. – P. e25771.
12. Phuphanich, S., Wheeler, C.J., Rudnick, J.D., Mazer, M., Wang, H., Nuño, M.A.,
Richardson, J.E., Fan, X., Ji, J., et al. Phase I trial of a multi-epitope-pulsed dendritic cell vaccine
for patients with newly diagnosed glioblastoma // Cancer Immunol. Immunother. – 2012. – V.
62. – P. 125-135.
13. Lesterhuis, W.J., De Vries, I.J., Schreibelt, G., Schuurhuis, D.H., Aarntzen, E.H., De
Boer, A., Scharenborg, N.M., Van De Rakt, M., et al. Immunogenicity of dendritic cells pulsed
with CEA peptide or transfected with CEA mRNA for vaccination of colorectal cancer patients //
Anticancer Res. – 2010. – V. 30. – P. 5091-5098.
14. Oshita, C., Takikawa, M., Kume, A., Miyata, H., Ashizawa, T., Iizuka, A., Kiyohara,
Y., Yoshikawa, S., et al. Dendritic cell-based vaccination in metastatic melanoma patients: Phase
II clinical trial // Oncol. Reports. – 2012. – V. 28. – P. 1131-1138.
15. Kantoff, P.W., Higano, C.S., Shore, N.D., Berger, E.R., Small, E.J., Penson, D.F.,
Redfern, C.H., Ferrari, A.C., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castrate resistant prostate
cancer // N. Engl. J. Med. – 2010. – V. 363. – P. 411-422.
16. Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity // Curr. Opin. Immunol.
– 2002. – V. 14. – P. 136-145.
17. Ярилин, А.А. Основы иммунологии: учебник // М.: Медицина. – 1999. – C. 608.
18. Figdor, C.G., van Kooyk, Y., Adema, G.J. C-type lectin receptors on dendritic cells
and Langerhans cells // Nat. Rev. Immunol. – 2002. – V. 2. – P. 77-84.
19. Fong, L., Engleman, E.G. Dendritic cells in cancer immunotherapy // Annu. Rev.
Immunol. – 2000. – V. 18. – P. 245–273.
20. Massard, G., Tongio, M.M., Wihlm, J.M., Morand, J. The dendritic cell lineage: a
ubiquitous antigen-presenting organization // Ann. Thorac. Surgeon. – 1996. – V. 61. – P. 252258.
21. Nussenzweig, M.C., Steinman, R.M., Gutchinov, B., Cohn, Z.A. Dendritic cells are
accessory cells for the development of anti-trinitrophenyl cytotoxic T lymphocytes // J. Exp.
Med. – 1980. – V. 152. – P. 1070–1084.
128
22. Jung, S., Unutmaz, D., Wong, P., Sano, G., De los Santos, K., Sparwasser, T., Wu, S.,
Vuthoori, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T
cells by exogenous cell-associated antigens // Immunity. – 2002. – V. 17. – P. 211–220.
23. Heath, W.R., Belz, G.T., Behrens, G.M., Smith, C.M., Forehan, S.P., Parish, I.A.,
Davey, G.M., Wilson, N.S., Carbone, F.R., Villadangos, J.A. Cross-presentation, dendritic cell
subsets, and the generation of immunity to cellular antigens // Immunol. Rev. – 2004. – V. 199. –
P. 9-26.
24. Bonaccorsi, I., Pezzino, G., Morandi, B., Ferlazzo, G. Novel perspectives on dendritic
cell-based immunotherapy of cancer // Immunol. Lett. – 2013. – V. 155. – P. 6-10.
25. Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y.J., Pulendran, B.,
Palucka, K. Immunobiology of dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. – 2000. – V. 18. – P. 767811.
26. Gogolák, P., Réthi, B., Hajas, G., Rajnavölgyi, E. Targeting dendritic cells for priming
cellular immune responses // J. Mol. Recognit. – 2003. – V. 16. – P. 299-317.
27. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells // Nat. Rev.
Cancer. – 2012. – V. 12. – P. 265-77.
28. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage:
ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed
setting // Annu. Rev. Immunol. – 2013. – V. 31. – P. 563-604.
29. Ueno, H., Schmitt, N., Klechevsky, E., Pedroza-Gonzalez, A., Matsui, T., Zurawski,
G., Oh, S., Fay, J., et al. Harnessing human dendritic cell subsets for medicine // Immunol. Rev.
– 2010. – V. 234. – P. 199–212.
30. Kondo, M., Wagers, A.J., Manz, M.G., Prohaska, S.S., Scherer, D.C., Beilhack, G.F.,
Shizuru, J.A., Weissman, I.L. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications
for clinical application // Annu. Rev. Immunol. – 2003. – V. 21. – P. 759-806.
31. Manz, M.G., Traver, D., Akashi, K., Merad, M., Miyamoto, T., Engleman, E.G.,
Weissman, I.L. Dendritic cell development from common myeloid progenitors // Ann. N. Y.
Acad. Sci. – 2001. – V. 938. – P. 167–174.
32. Traver, D., Akashi, K., Manz, M., Merad, M., Miyamoto, T., Engleman, E.G.,
Weissman, I.L. Development of CD8α-positive dendritic cells from a common myeloid
progenitor // Science. – 2000. – V. 290. – P. 2152–2154.
129
33. Helft, J., Ginhoux, F., Bogunovic, M., Merad, M. Origin and functional heterogeneity
of non-lymphoid tissue dendritic cells in mice // Immunol. Rev. – 2010. – V. 234. – P. 55-75.
34. Liu, K., Victora, G.D., Schwickert, T.A., Guermonprez, P., Meredith, M.M., Yao, K.,
Chu, F.F., Randolph, G.J., Rudensky, A.Y., Nussenzweig, M. In vivo analysis of dendritic cell
development and homeostasis // Science. – 2009. – V. 324. – P. 392-397.
35. Diao, J., Winter, E., Cantin, C., Chen, W., Xu, L., Kelvin, D., Phillips, J., Cattral, M.S.
In situ replication of immediate dendritic cell (DC) precursors contributes to conventional DC
homeostasis in lymphoid tissue // J. Immunol. – 2006. – V. 176. – P. 7196–7206.
36. Ginhoux, F., Liu, K., Helft, J., Bogunovic, M., Greter, M., Hashimoto, D., Price, J.,
Yin, N., Bromberg, J., Lira, S.A., Stanley, E.R., Nussenzweig, M., Merad, M. The origin and
development of nonlymphoid tissue CD103+ DCs // J. Exp. Med. – 2009. – V. 206. – P. 31153130.
37. Manz, M.G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I.L., Akashi. K. Dendritic cell
potentials of early lymphoid and myeloid progenitors // Blood. – 2001. – V. 97. – P. 3333–3341.
38. Chorro, L., Sarde, A., Li, M., Woollard, K.J., Chambon, P., Malissen, B.,
Kissenpfennig, A., Barbaroux, J.B., Groves, R., Geissmann, F. Langerhans cell (LC)
proliferation mediates neonatal development, homeostasis, and inflammation-associated
expansion of the epidermal LC network // J. Exp. Med. – 2009. – V. 206. – P. 3089-3100.
39. Ginhoux, F., Tacke, F., Angeli, V., Bogunovic, M., Loubeau, M., Dai, X.M., Stanley,
E.R., Randolph, G.J., Merad, M. Langerhans cells arise from monocytes in vivo // Nat. Immunol.
– 2006. – V. 7. – P. 265-273.
40. Naik, S.H., Metcalf, D., van Nieuwenhuijze, A., Wicks, I., Wu, L., O'Keeffe, M.,
Shortman, K. Intrasplenic steady-state dendritic cell precursors that are distinct from monocytes
// Nat. Immunol. – 2006. – V. 7. – P. 663-671.
41. O'Keeffe, M., Hochrein, H., Vremec, D., Caminschi, I., Miller, J.L., Anders, E.M., Wu,
L., Lahoud, M.H., Henri, S., Scott, B., Hertzog, P., Tatarczuch, L., Shortman, K. Mouse
plasmacytoid cells: Long-lived cells, heterogeneous in surface phenotype and function, that
differentiate into CD8+ dendritic cells only after microbial stimulus // J. Exp. Med. – 2002. – V.
196. – P. 1207-1319.
42. Nakano, H., Yanagita, M., Gunn, M.D. CD11c(+)B220(+)Gr-1(+) cells in mouse
lymph nodes and spleen display characteristics of plasmacytoid dendritic cells // J. Exp. Med. –
2001. – V. 194. – P. 1171-1178.
130
43. Shortman, K., Liu, Y.J. Mouse and human dendritic cell subtypes // Nat. Rev.
Immunol. – 2002 . – V. 2. – P. 151-161.
44. Van Lint, S., Renmans, D., Broos, K., Dewitte, H., Lentacker, I., Heirman, C.,
Breckpot, K., Thielemans, K. The ReNAissanCe of mRNA-based cancer therapy // Expert Rev.
Vaccines. – 2015. – V. 14. – P. 235-251.
45. Hanabuchi, S., Liu, Y.-J. In vivo role of pDCs in regulating adaptive immunity //
Immunity. – 2011. – V. 35. – P. 851-853.
46. Takagi, H., Fukaya, T., Eizumi, K., Sato, Y., Sato, K., Shibazaki, A., Otsuka, H.,
Hijikata, A., Watanabe, T., Ohara, O., Kaisho, T., Malissen, B., Sato, K. Plasmacytoid dendritic
cells are crucial for the initiation of inflammation and T cell immunity in vivo // Immunity. –
2011. – V. 35. – P. 958-971.
47. Liu, Y.J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid
dendritic cell precursors // Annu. Rev. Immunol. – 2005. – V. 23. – P. 275–306.
48. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H.S., Lewis, K.L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic
cells: recent progress and open questions // Annu. Rev. Immunol. – 2011. – V. 29. – P. 163-183.
49. Pinto, A., Rega, A., Crother, T.R., Sorrentino, R. Plasmacytoid dendritic cells and their
therapeutic activity in cancer // Oncoimmunology. – 2012. – V. 1. – P. 726-734.
50. Tel, J., de Vries, I.J. Potential applications for plasmacytoid dendritic cells in cancer
immunotherapy // Immunotherapy. – 2012. – V. 4. – P. 979-982.
51. Joffre, O.P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic
cells // Nat. Rev. Immunol. – 2012. – V. 12. – P. 557-569.
52. Dudziak, D., Kamphorst, A.O., Heidkamp, G.F., Buchholz, V.R., Trumpfheller, C.,
Yamazaki, S., Cheong, C., Liu, K., Lee, H.W., Park, C.G., Steinman, R.M., Nussenzweig, M.C.
Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo // Science. – 2007. – V. 315. – P.
107-111.
53. Valladeau, J., Saeland, S. Cutaneous dendritic cells // Semin. Immunol. – 2005. – V.
17. – P. 273-283.
54. Merad, M., Ginhoux, F., Collin, M. Origin, homeostasis and function of Langerhans
cells and other langerin-expressing dendritic cells // Nat. Rev. Immunol. – 2008. – V. 8. – P.
935–947.
131
55. Vremec, D., Zorbas, M., Scollay, R., Saunders, D.J., Ardavin, C.F., Wu, L., Shortman,
K. The surface phenotype of dendritic cells purified from mouse thymus and spleen:
investigation of the CD8 expression by a subpopulation of dendritic cells // J. Exp. Med. – 1992.
– V. 176. – P. 47-58.
56. Nestle, F.O., Zheng, X.G., Thompson, C.B., Turka, L.A., Nickoloff, B.J.
Characterization of dermal dendritic cells obtained from normal human skin reveals phenotypic
and functionally distinctive subsets // J. Immunol. – 1993. – V. 151. – P. 6535-6545.
57. Haniffa, M., Shin, A., Bigley, V., McGovern, N., Teo, P., See, P., Wasan, P.S., Wang,
X.N., et al. Human tissues contain CD141hi crosspresenting dendritic cells with functional
homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells // Immunity. – 2012. – V. 37. – P. 6073.
58. Segura, E., Valladeau-Guilemond, J., Donnadieu, M.H., Sastre-Garau, X., Soumelis,
V., Amigorena, S. Characterization of resident and migratory dendritic cells in human lymph
nodes // J. Exp. Med. – 2012. – V. 209. – P. 653-660.
59. Cintolo, J.A., Datta, J., Mathew, S.J., Czerniecki, B.J. Dendritic cell-based vaccines:
barriers and opportunities // Future Oncol. – 2012. – V. 8. – P. 1273-1299.
60. Neefjes, J., Jongsma, M.L., Paul, P., Bakke, O. Towards a systems understanding of
MHC class I and MHC class II antigen presentation // Nat. Rev. Immunol. – 2011. – V. 11. – P.
823-836.
61. Kleijmeer, M., Ramm, G., Schuurhuis, D., Griffith, J., Rescigno, M., RicciardiCastagnoli, P., Rudensky, A.Y., Ossendorp, F., Melief, C.J., Stoorvogel, W., Geuze, H.J.
Reorganization of multivesicular bodies regulates MHC class II antigen presentation by dendritic
cells // J. Cell Biol. – 2001. – V. 155. – P. 53-63.
62. Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., Trombetta, E.S. Differential
lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate // Science. – 2005. – V.
307. – P. 1630-1634.
63. Rock, K.L., Goldberg, A.L. Degradation of cell proteins and the generation of MHC
class I-presented peptides // Annu. Rev. Immunol. – 1999. – V. 17. – P. 739-779.
64. Koopmann, J.O., Albring, J., Hüter, E., Bulbuc, N., Spee, P., Neefjes, J., Hämmerling,
G.J., Momburg, F. Export of antigenic peptides from the endoplasmic reticulum intersects with
retrograde protein translocation through the Sec61p channel // Immunity. – 2000. – V. 13. – P.
117-127.
132
65. Burgdorf, S., Schölz, C., Kautz, A., Tampé, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic
separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat. Immunol. – 2008. –
V. 9. – P. 558-566.
66. Basha, G., Omilusik, K., Chavez-Steenbock, A., Reinicke, A.T., Lack, N., Choi, K.B.,
Jefferies, W.A. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway //
Nat. Immunol. – 2012. – V. 13. – P. 237-245.
67. Rock, K.L., Farfan-Arribas, D.J., Shen, L. Proteases in MHC class I presentation and
cross-presentation // J. Immunol. – 2010. – V. 184. – P. 9-15.
68. Weimershaus, M., Maschalidi, S., Sepulveda, F., Manoury, B., van Endert, P.,
Saveanu, L. Conventional dendritic cells require IRAP-Rab14 endosomes for efficient crosspresentation // J. Immunol. – 2012. – V. 188. – P. 1840-1846.
69. Saveanu, L., Carroll, O., Weimershaus, M., Guermonprez, P., Firat, E., Lindo, V.,
Greer, F., Davoust, J., Kratzer, R., Keller, S.R., Niedermann, G., van Endert, P. IRAP identifies
an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation // Science. – 2009. – V.
325. – P. 213-217.
70. Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K.L. A phagosome-to-cytosol pathway for
exogenous antigens presented on MHC class I molecules // Science. – 1995. – V. 267. – P. 243246.
71. Ackerman, A.L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum
protein retrotranslocation machinery during crosspresentation by dendritic cells // Immunity. –
2006. – V. 25. – P. 607–617.
72. Zehner, M., Chasan, A.I., Schuette, V., Embgenbroich, M., Quast, T., Kolanus, W.,
Burgdorf, S. Mannose receptor polyubiquitination regulates endosomal recruitment of p97 and
cytosolic antigen translocation for cross-presentation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2011. – V.
108. – P. 9933-9938.
73. Boya, P., Kroemer, G. Lysosomal membrane permeabilization in cell death //
Oncogene. – 2008. – V. 27. – P. 6434–6451.
74. Morel, S., Lévy, F., Burlet-Schiltz, O., Brasseur, F., Probst-Kepper, M., Peitrequin,
A.L., Monsarrat, B., Van Velthoven, R., Cerottini, J.C., Boon, T., Gairin, J.E., Van den Eynde,
B.J. Processing of some antigens by the standard proteasome but not by the immunoproteasome
results in poor presentation by dendritic cells // Immunity. – 2000. – V. 12. – P. 107-117.
133
75. Chapatte, L., Ayyoub, M., Morel, S., Peitrequin, A.L., Lévy, N., Servis, C., Van den
Eynde, B.J., Valmori, D., Lévy, F. Processing of tumor-associated antigen by the proteasomes of
dendritic cells controls in vivo T-cell responses // Cancer Res. – 2006. – V. 66. – P. 5461-5468.
76. Angeles, A., Fung, G., Luo, H. Immune and non-immune functions of the
immunoproteasome // Front. Biosci. – 2012. – V. 17. – P. 1904-1916.
77. Vigneron, N., Van den Eynde, B.J. Proteasome subtypes and the processing of tumor
antigens: increasing antigenic diversity // Curr. Opin. Immunol. – 2012. – V. 24. – P. 84-91.
78. Dannull, J., Lesher, D.T., Holzknecht, R., Qi, W., Hanna, G., Seigler, H., Tyler, D.S.,
Pruitt, S.K. Immunoproteasome down-modulation enhances the ability of dendritic cells to
stimulate antitumor immunity // Blood. – 2007. – V. 110. – P. 4341-4350.
79. Yewdell, J.W., Dolan, B.P. Immunology: Cross-dressers turn on T cells // Nature. –
2011. – V. 471. – P. 581-582.
80. Dolan, B.P., Gibbs, K.D.Jr., Ostrand-Rosenberg, S. Dendritic cells cross-dressed with
peptide MHC class I complexes prime CD8+ T cells // J. Immunol. – 2006. – V. 177. – P. 60186024.
81. Li, L., Kim, S., Herndon, J.M., Goedegebuure, P., Belt, B.A., Satpathy, A.T., Fleming,
T.P., Hansen, T.H., Murphy, K.M., Gillanders, W.E. Cross-dressed CD8α+/CD103+ dendritic
cells prime CD8+ T cells following vaccination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2012. – V. 109.
– P. 12716-12721.
82. Dresch, C., Leverrier, Y., Marvel, J., Shortman, K. Development of antigen crosspresentation capacity in dendritic cells // Trends Immunol. – 2012. – V. 33. – P. 381-388.
83. Brigl, M., Brenner, M.B. CD1: antigen presentation and T cell function // Annu. Rev.
Immunol. – 2004. – V. 22. – P. 817–890.
84. Pinzon-Charry, A., Maxwell, T., Lopez, J.A. Dendritic cell dysfunction in cancer: a
mechanism for immunosupression // Immunol. Cell. Biol. – 2005. – V. 83. – P. 451-461.
85. Shurin, M.R., Shurin, G.V., Lokshin, A., Yurkovetsky, Z.R., Gutkin, D.W., Chatta, G.,
Zhong, H., Han, B., Ferris, R.L. Intratumoral cytokines/chemokines/growth factors and tumor
infiltrating dendritic cells: friends or enemies? // Cancer Metastasis Rev. – 2006. – V. 25. – P.
333-356.
86. Kusmartsev, S., Gabrilovich, D.I. Effect of tumor-derived cytokines and growth factors
on differentiation and immune suppressive features of myeloid cells in cancer // Cancer
Metastasis Rev. – 2006 – V. 25. – V. 323-331.
134
87. Marigo, I., Dolcetti, L., Sefarini, P., Zanovello, P., Bronte, V. Tumor-induced tolerance
and immune suppression by myeloid derived suppressor cells // Immunol. Rev. – 2008. – V. 222.
– P. 162-179.
88. Sica, A., Bronte, V. Altered macrophage differentiation and immune dysfunction in
tumor development // J. Clin. Invest. – 2007. – V. 117. – P. 1155-1166.
89. Töpfer, K., Kempe, S., Müller, N., Schmitz, M., Bachmann, M., Cartellieri, M.,
Schackert, G., Temme, A. Tumor evasion from T cell surveillance // J. Biomed. Biotechnol. –
2011. – V. 2011. – P. 918471.
90. Benencia, F., Sprague, L., McGinty, J., Pate, M., Muccioli, M. Dendritic cells the
tumor microenvironment and the challenges for an effective antitumor vaccination // J. Biomed.
Biotechnol. – 2012. – V. 2012. – P. 425476.
91. Nagaraj, S., Gabrilovich, D.I. Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived
suppressor cells // Cancer Res. – 2008. – V. 6. – P. 82561-82563.
92. Thurnher, M., Radmayr, C., Ramoner, R., Ebner, S., Böck, G., Klocker, H., Romani,
N., Bartsch, G. Human renal-cell carcinoma tissue contains dendritic cells // Int. J. Cancer. –
1996 – V. 68. – P. 1-7.
93. Bell, D., Chomarat, P., Broyles, D., Netto, G., Harb, G.M., Lebecque, S., Valladeau, J.,
Davoust, J., Palucka, K.A., Banchereau, J. In breast carcinoma tissue, immature dendritic cells
reside within the tumor, whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas // J. Exp.
Med. – 1999. – V. 190. – P 1417-1426.
94. Chaux, P., Moutet, M., Faivre, J., Martin, F., Martin, M. Inflammatory cells infiltrating
human colorectal carcinomas express HLA class II but not B7-1 and B7-2 costimulatory
molecules of the T-cell activation // Lab. Invest. – 1996. – V. 74. – P 975-983.
95. Ishida, T., Oyama, T., Carbone, D.P., Gabrilovich D.I. Defective function of
Langerhans cells in tumor-bearing animals is the result of defective maturation from
hematopoetic progenitors // J. Immunol. – 1998. – V. 161. – P. 4842-4852.
96. Almand, B., Resser, J.R., Lindman, B., Nadaf, S., Clark, J.I., Kwon, E.D., Carbone,
D.P., Gabrilovich, D.I. Clinical significance of defective dendritic cells differentiation in cancer
// Clin. Cancer Res. – 2000. – V. 6. – P. 1755-1766.
97. Lissoni, P., Malugani, F., Bonfanti, A., Bucovec, R., Secondino, S., Brivio, F., FerrariBravo, A., Ferrante, R., Vigoré, L., et al. Abnormally enhanced blood concentrations of vascular
endothelial growth factor (VEGF) in metastatic cancer patients and their relation to circulating
135
dendritic cells, IL-12 and endothelin-1 // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. – 2001. – V. 15. – P.
140-144.
98. Gabrilovich, D. Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendriticcell defects // Nat. Rev. Immunol. – 2004. – V. 4. – P. 941-952
99. Shuurhius, D.H., Fu, N., Ossendorp, F., Melief, C.J. Ins and outs of dendritic cells //
Int. Arch. Allergy Immunol. – 2006. – V. 140. – P. 53-72.
100. van Mierlo, G.J., Boonman, Z.F., Dumortier, H.M., der Boer, A.T., Fransen, M.F.,
Nouta, J., van der Voort, E.I., Offringa, R., Toes, R.E., Melief, C.J. Activation of dendritic cells
that cross-present tumor-derived antigen licenses CD8+ CTL to cause tumor eradication // J.
Immunol. – 2004. – V. 173. – P. 6753-6759.
101. Boonman, Z.F., van Mierlo, G.J., Fransen, M.F., de Kiezer, R.J., Jager, M.J., Melief,
C.J., Toes, R.E. Maintenance of immune tolerance depends on normal tissue homeostasis // J.
Immunol. – 2005 – V. 175. – P. 4247-4254.
102. Becker, Y. Dendritic cell activity against primary tumors: An overview // In vivo. –
1993. – V. 7. – P. 187-191.
103. Sandel, M.H., Dadabayev, A.R., Menon, A.G., Morreau, H. Melief, C.J., Offringa, R.,
van der Burg, S.H., Janssen-van Rhijn, et al. Prognostic value of tumor-infiltrating dendritic cells
in colorectal cancer: Role of maturation status and intratumoral localization // Clin. Cancer Res.
– 2005. – V. 11. – P. 2576-2582.
104. Aspord, C., Pedroza-Gonzalez, A., Gallegos, M., Tindle, S., Burton, E.C., Su, D.,
Marches, F., Banchereau, J., Palucka, A.K. Breast cancer instructs dendritic cells to prime
interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development // J. Exp. Med. – 2007. –
V. 204. – P. 1037-1047.
105. Daud, A.I., Mirza, N., Lenox, B., Andrews, S., Urbas, P., Gao, G.X., Lee, J.H.,
Sondak, V.K., Riker, A.I., Deconti, R.C., Gabrilovich, D. Phenotypic and functional analysis of
dendritic cells and clinical outcome in patient with high-risk melanoma treated with adjuvant
granulocyte macrophage colony-stimulating factor // J. Clin. Oncol. – 2008. – V. 26. – P. 32353241.
106. Mantovani, A., Pierotti, M.A. Cancer and inflammation: A complex relationship //
Cancer Lett. – 2008. – V. 267. – P. 180-181.
107. Borello, M.G., Degl`innocenti, D., Pierotti, M.A. Inflammation and cancer: the
oncogene-driven connection // Cancer Lett. – 2008. – V. 267. – P. 262-270.
136
108. Soria, G., Ben-Brauch, A. The inflammatory chemokines CCL2 and CCL5 in breast
cancer // Cancer Lett. – 2008. – V. 267. – P. 271-285
109. Zhang, H.G., Grizzle, W.E. Exosomes: a novel pathway of local and distant
intercellular communication that facilitates the growth and metastasis of neoplastic lesions //
Am. J. Pathol. – 2014. – V. 184. – P. 28-41.
110. Kharaziha, P., Ceder, S., Li, Q., Panaretakis, T. Tumor cell-derived exosomes: a
message in a bottle // Biochim. Biophys. Acta. – 2012. – V. 1826. – P. 103-111.
111. Stanley, E.R., Berg, K.L., Einstein, D.B., Lee, P.S., Pixley, F.J., Wang, Y., Yeung,
Y.G. Biology and action of colony-stimulating factor-1 // Mol. Reprod. Dev. – 1997. – V. 46. –
P. 4-10.
112. Jansen, J.H., Kluin-Nelemans, J.C., Van Damme, J., Wientjens, G.J., Willemze, R.,
Fibbe, W.E. Interleukin 6 is a permissive factor for monocytic colony formation by human
hematopoietic progenitor cells // J. Exp. Med. – 1992. – V. 175. – P. 1151-1154.
113. Suzuki, M., Ohwada, M., Sato, I., Nagatomo, M. Serum level of macrophage colonystimulating factor as a marker for gynecologic malignancies // Oncology. – 1995. – V. 52. – P.
128-133.
114. Seguchi, T., Yokohawa, K., Sugao, H., Nakano, E., Sonoda, T., Okuyama, A.
Interleukin-6 activity in urine and serum in patients with bladder carcinoma // J. Urol. – 1992. –
V. 148. – P. 791-794.
115. Yoshida, N., Ikemoto, S., Narita, K., Sugimura, K., Wada, S., Yasumoto, R.,
Kishimoto, T., Nakatani, T. Interleukin-6, tumour necrosis factor alpha and interleukin-1beta in
patients with renal carcinoma // Br. J. Cancer. – 2002. – V. 86. – P. 1396-1400.
116. Menetrier-Caux, C., Montmain, G., Dieu, M.C., Bain, C., Favrot, M.C., Caux, C.,
Blay, J.Y. Inhibition of the differentiation of dendritic cells from CD34(+) progenitors by tumor
cells: role of interleukin-6 and macrophage colony-stimulating factor // Blood. – 1998. – V. 92. –
P. 4778-4791.
117. Menetrier-Caux, C., Thomachot, M.C., Alberti, L., Montmain, G., Blay, J.Y. IL-4
prevents the blockade of dendritic cell differentiation induced by tumor cells // Cancer Res. –
2001. – V. 61. – P. 3096-3104.
118. Chomarat, P., Banchereau, J., Davoust, J., Palucka, A.K. IL-6 switches the
differentiation of monocytes from dendritic cells to macrophages // Nat. Immunol. – 2000. – V.
1. – P 510-514.
137
119. Smith, D.R., Kunkel, S.L., Burdick, M.D., Wilke, C.A., Orringer, M.B., Whyte, R.I.,
Strieter, R.M. Production of interleukin-10 by human bronchogenic carcinoma // Am. J. Pathol. –
1994. – V. 145. – P. 18-25.
120. Krüger-Krasagakes, S., Krasagakis, K., Garbe, C., Schmitt, E., Huls, C., Blankenstein
T., Diamantstein, T. Expression of interleukin-10 in human melanoma // Br. J. Cancer. – 1994. –
V. 70. – P. 1182-1185.
121. Steinbrink, K., Wölfl, M., Jonuleit H., Knop J., Enk A.H. Induction of tolerance by
IL-10-treated dendritic cells // J. Immunol. – 1997. – V. 159. – V. 4772-4780
122. Buelens, C., Verhasselt, V., De Groote, D., Thielemans, K., Goldman, M., Willems,
F. Interleukin-10 prevents the generation of dendritic cells for human peripheral blood
mononuclear cells cultured with interkeukin-4 and granulocyte/macrophage-colony-stimulating
factor // Eur. J. Immunol. – 1997. – V. 27. – P. 756-762.
123. Enk, A.H., Angeloni, V.L., Udey, V.C., Katz, S.I. Inhibition of Largenhans cell
antigen-presenting function by IL-10. A role for IL-10 in induction of tolerance // J. Immunol. –
1993. – V. 151. – P. 2390-2398.
124. Allavena, P., Piemonti, L., Longoni, D., Bernasconi, S., Stoppacciaro, A., Ruco, L.,
Mantovani, A. IL-10 prevents the differentiation of monocytes to dendritic cells but promotes
their maturation to macrophages // Eur. J. Immunol. – 1998. – V. 28. – P. 359-369.
125. Halliday, G.M., Le, S. Transforming growth factor-beta produced by progressor
tumor inhibits, while IL-10 produced by regressor tumors enhances. Langerhans cell migration
from skin // Int. Immunol. – 2001. – V. 13. – P. 1147-1154.
126. Weber, F., Byrne, S.N., Le, S., Brown, D.A., Breit, S.N., Scolyer R.A., Halliday,
G.M. Transforming growth factor-beta1 immobilises dendritic cells within skin tumours and
facilitates tumor escape from the immune system // Cancer Immunol. Immunother. – 2005. – V.
54. – P. 898-906.
127. Geissmann, F., Revy, P., Regnault, A., Lepelletier, Y., Dy, M., Brousse, N.,
Amigorena, S., Hermine, O., Durandy, A. TGF-beta 1 prevents the noncognate maturation of
human dendritic Langerhans cells // J. Immunol. – 1999. – V. 162. – P. 4567-4575.
128. Yamamoto, Y., Toi, M., Kondo, S., Matsumoto, T., Suzuki, H., Kitamura, M.,
Tsuruta, K., Taniguchi, T. et al. Concentrations of vascular endothelial growth factor in the sera
of normal controls and cancer patients // Clin. Cancer. Res. – 1996. – V. 2. – P. 821-826.
138
129. Toi, M., Matsumoto, T., Bando, H. Vascular endothelial growth factor: its prognostic,
predictive, and therapeutic implications // Lancet Oncol. – 2001. – V. 2. – P. 667-673.
130. Gabrilovich, D.I., Chen, H.L., Girgis, K.R., Cunningam, H.T., Meny, G.M., Nadaf, S.,
Kavanaugh, D., Carbone, D.P. Production of vascular endothelial growth factor by human
tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells // Nat. Med. – 1996. – V. 2. – P.
1096-1103.
131. Takahashi, A., Kono, K., Ichihara, F., Sugai. H., Fujii, H., Matsumoto, Y. Vascular
endothelial growth factor inhibits maturation of dendritic cells induced by lipopolysaccharide,
but not by proinflammatory cytokines // Cancer Immunol. Immunother. – 2004. – V. 53. – P.
543-550.
132. Gabrilovich, D.I., Ishida, T., Oyama, T., Ran, S., Kravtsov, V., Nadaf, S., Carbone,
D.P. Vascular endothelial growth factor inhibits the development of dendritic cells and
dramatically affects the differentiation of multiple hematopoietic lineages in vivo // Blood. –
1998. – V. 92. – P. 4150-4166.
133. Groebe, K., Vapuel, P. Evaluation of oxygen diffusion distances in human breast
cancer xenografts using tumor-specific in vivo data: role of various mechanisms in the
development of tumor hypoxia // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. – 1998. – V. 15. – P. 691-697.
134. Teicher, B.A. Hypoxia and drug resistance. Cancer Metastasis Rev. – 1994. – V. 13. –
P. 139-168.
135. Turner, L., Scotton, C., Negus, R., Balkwill, F. Hypoxia inhibits macrophage
migration // Eur. J. Immunol. – 1999. – V. 29. – P. 2280-2287.
136. Lewis, J.S., Lee, J.A., Underwood, J.C., Harris, A.L., Lewis, C.E. Macrophage
responses to hypoxia: relevance to disease mechanism // J. Leukoc. Biol. – 1999. – V. 66. – P.
889-900.
137. Zhao, W., Darmanin, S., Fu, Q., Chen, J., Cui, H., Wang, J., Okada, F., Hamada, J., et
al. Hypoxia suppresses the production of matrix metalloproteinases and the migration of human
monocyte-derived dendritic cells // Eur. J. Immunol. – 2005. – V. 35. – P. 3468-3477.
138. Qu, X., Yang, M.X., Kong, B.H., Qi, L., Lam, Q.L., Yan, S., Li, P., Zhang, M., Lu, L.
Hypoxia inhibits the migratory capacity of human monocyte-derived dendritic cells // Immunol.
Cell. Biol. – 2005. – V. 83. – P. 668-673.
139
139. Semenza, G.L., Wang, G.L. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein
synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a side required for transcriptional
activation // Mol. Cell. Biol. – 1992. – V. 12. – P. 5447-5454.
140. Semenza, G.L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis //
Curr. Opin. Genet. Dev. – 1998. – V. 8. – P. 588-594.
141. Wenger, R.H., Stiehl, D.P., Camenisch, G. Integration of oxygen signaling at the
consensus HRE // Sci. STKE. – 2005. – V. 306.
142. Koukourakis, M.I., Giatromanolaki, A., Simopoulos, C., Polychronidis, A., Sivridis,
E. Lactate dehydrogenase 5 (LDH5) relates to up-regulated hypoxia inducible factor pathway
and metastasis in colorectal cancer // Clin. Exp. Metastasis. – 2005. – V. 22. – P. 25-30.
143. Warburg, O. On the facultative anaerobiosis of cancer cells and its use in
chemotherapy // Munch. Med. Wochenschr. – 1961. – V. 103. – P. 2504-2506.
144. Gottfried, E., Kreutz, M., Mackensen, A. Tumor-induced modulation of dendritic cell
function // Cytokine Growth Factor Rev. – 2008. – V. 19. – P. 65-77.
145. Walenta, S., Schroeder, T., Mueller-Klieser, W. Lactate in solid malignant tumors:
potential basis of a metabolic classification in clinical oncology // Cyrr. Med. Chem. – 2004. –
V. 11. – P. 2195-2204.
146. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L.A. Metabolic
imaging in multinuclear spheroids of oncogene-transfected fibroblasts // J. Histochem.
Cytochem. – 2000. – V. 48. – P. 509-522.
147. Schwickert, G., Walenta, S., Sundfor, K., Rofstand, E.K., Mueller-Klieser, W.
Correlation of high lactate levels in human cervical cancer with incidence of metastasis // Cancer
Res. – 1995. – V. 55. – P. 4757-4759.
148. Quennet, V., Yaromina, A., Zips, D., Rosner, A., Walenta, S., Baumann, M., MuellerKlieser, W. Tumor lactate content predicts for response to fractionated irradiation of human
squamous cell carcinomas in nude mice // Radiother. Oncol. – 2006. – V. 81. – P. 130-135.
149. Koukourakis, M.I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Bougioukas, G., Didilis, V.,
Gatter, K.C., Harris, A.L., et al. Lactate dehydrogenase-5 (LDH-5) overexpression in non-smallcell lung cancer tissues is linked to tumour hypoxia, angiogenetic factor production and poor
prognosis // Br. J. Cancer. – 2003. – V. 89. – P. 877-885.
150. Koukourakis, M.I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Gatter, K.C., Harris, A.L. Lactate
dehydrogenase 5 expression in operable colorectal cancer: strong association with survival and
140
activated vascular endothelial growth factor pathway – a report of the Tumour Angiogenesis
Research Group // J. Clin. Oncol. – 2006. – V. 24. – P 4301-4308.
151. Droge, W., Roth, S., Altmann, A., Mihm, S. Regulation of T-cell functions by Llactate // Cell Immunol. – 1987. – V. 108. – P. 405-416.
152. Roth, S., Gmunder, H., Droge, W. Regulation of intracellular glutathione levels and
lymphocyte functions by lactate // Cell Immunol. – 1991. – V. 136. – P. 95-104.
153. Puig-Kroger, A., Muniz-Pello, O., Selgas, R., Criado, G., Bajo, M.A., SanchezTomero, J.A., Alvarez, V., del Peso, G., et al. Peritoneal dialysis solutions inhibit the
differentiation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells: effect of lactate and
glucose-degradation products // J. Lekoc. Biol. – 2003. – V. 73. – P. 482-492.
154. Gottfried, E., Kunz-Schughart, L.A., Ebner, S., Mueller-Kliesser, W., Hoves, S.,
Andreesen, R., Mackensen, A., Kreutz, M. Tumor-derived lactic acid modulates dendritic cell
activation and antigen expression // Blood. – 2006. – V. 107. – P. 2013-2021.
155. Fischer, K., Hoffmann, P., Voelkl, S., Meidenbauer, N., Ammer, J., Edinger, M.,
Gottfried, E., Schwarz, S., et al. Inhibitory effect of tumor cell derived lactic acid on human T
cells // Blood. – 2007. – V. 109. – P. 2812-2819.
156. Gatenby, R.A., Gawlinski, E.T., Gmitro, A.F., Kaylor, B., Gillies, R.J. Acid-mediated
tumor invasion: a multidisciplinary study // Cancer Res. – 2006. – V. 66. – P. 5216-5223.
157. Loeffler, D.A., Juneau, P.L., Heppner, G.H. Natural killer-cell activity under
conditions reflective of tumor micro-environment // Int. J. Cancer. – 1991. – V. 48. – P. 895-899.
158. Fischer, B., Muller, B., Fischer, K.G., Baur, N., Kreutz, W. Acidic pH inhibits nonMHC-restricted killer cell functions // Clin. Immunol. – 2000. – V. 96. – P. 252-263.
159. Muller, B., Fischer, B., Kreutz, W. An acidic microenvironment impairs the
generation of non-major histocompatibility complex-restricted killer cells // Immunology. –
2000. – V. 99. – P. 375-384.
160. Vermeulen, M., Giordano, M., Trevani, A.S., Sedlik, C., Gamberale, R., FernandesCalotti, P., Salamone, G., Raiden, S., et al. Acidosis improves uptake of antigens and MHC class
I-restricted presentation by dendritic cells // J. Immunol. – 2004. – V. 172. – P. 3196-3204.
161. Gately, S., Li, W.W. Multiple roles of COX-2 in tumor angiogenesis: a target for
antiangiogenic therapy // Semin. Oncol. – 2004. – V. 31. – P. 2-11.
141
162. Denkert, C., Kobel, M., Berger, S., Siegert, A., Leclere, A., Trefzer, U., Hauptmann,
S. Expression of cyclooxygenase 2 in human malignant melanoma // Cancer Res. – 2001. – V.
61. – P. 303-308.
163. Denkert, C., Kobel, M., Pest, S., Koch, I., Berger, S., Schwabe, M., Siegert, A., Reles,
A., et al. Expression of cyclooxygenase 2 is an independent prognostic factor in human ovarian
carcinoma // Am. J. Pathol. – 2002. – V. 160. – P. 893-903.
164. Tsuji, S., Tsuji, M., Kawano, S., Hori, M. Cyclooxygenase 2 upregulation as a
perigenetic change in carcinogenesis // J. Exp. Clin. Cancer Res. – 2001. – V. 20. – P. 117-129.
165. Sombroek, C.C., Stam, A.G., Masterson, A.J., Lougheed, S.M., Schakel, M.J., Meijer,
C.J., Pinedo, H.M., van den Eertwegh, A.J., et al. Prostanoids play a major role in the primary
tumor-induced inhibition of dendritic cell differentiation // J. Immunol. – 2002. – V. 168. – P.
4333-4343.
166. Sietsma, H., Nijhof, W., Donje, B., Vellenga, E., Kamps, W.A., Kok, J.W. Inhibition
of hemopoiesis in vitro by neuroblastoma-derived gangliosides // Cancer Res. – 1998. – V. 58. –
P. 4840-4844.
167. Ladisch, S., Wu, Z.L., Feig, S., Ulsh, L., Schwartz, E., Floutsis, G., Wiley, F.,
Lenarsky, C., Seeger, R. Shedding of GD2 ganglioside by human neuroblastoma // Int. J. Cancer.
– 1987. – V. 39. – P. 73-76.
168. Biswas, K., Richmond, A., Rayman, P., Biswas, S., Thornton, M., Sa, G., Das, T.,
Zhang, R, et al. GM2 expression in renal cell carcinoma: potential role in tumor induced T-cell
dysfunction // Cancer Res. – 2006. – V. 66. – P. 6816-6825.
169. Birkle, S., Zheng, G., Gao, L., Yu, R.K., Aurby, J. Role of tumor-associated
gangliosides in cancer progression // Biochimie – 2003. – V. 85. – P. 455-463.
170. Tourkova, I.L., Shurin, G.V., Chatta, G.S., Perez, L., Finke, J., Whiteside, T.L.,
Ferrone, S., Shurin, M.R. et al. Restoration by IL-15 of MHC class I antigen-processing
machinery in human dendritic cells inhibited by tumor-derived gangliosides // J. Immunol. –
2005. – V. 175. – P. 3045-3052.
171. Yin, J., Hashimoto, A., Izawa, M., Miyazaki, K., Chen, G.Y., Takematsu, H.,
Kozutsumi, Y., Suzuki, A. et al. Hypoxic culture induces expression of sialin. a sialic acid
transporter, and cancer-associated gangliosides containing non-human sialic acid on human
cancer cells // Cancer Res. – 2006. – V. 99. – P. 2937-2945.
142
172. Bennaceur, K., Popa, I., Portoukalian, J., Berthier-Vergnes, O., Peuget-Navarro, J.
Melanoma-derived gangliosides impair migratory and antigen-presenting function of human
epidermal Langerhans cells and induce their apoptosis // Int. Immunol. – 2006. – V. 18. – P. 879886.
173. Shurin, G.V., Shurin, M.R., Bykovskaya, S., Shogan, J., Lotze, M.T., Barksdale Jr,
E.M. Neuroblastoma-derived gangliosides inhibit dendritic cell generation and function // Cancer
Res. – 2001. – V. 61. – P. 363-369.
174. Slingluff, C.L.Jr., Petroni, G.R., Yamshchikov, G.V., Hibbitts, S., Grosh, W.W.,
Chianese-Bullock, K.A., Bissonette, E.A., Barnd, D.L., Deacon, D.H., Patterson, J.W., Parekh,
J., Neese, P.Y., Woodson, E.M., Wiernasz, C.J., Merrill, P. Immunologic and clinical outcomes
of vaccination with a multiepitope melanoma peptide vaccine plus low-dose interleukin-2
administered either concurrently or on a delayed schedule // J. Clin. Oncol. – 2004. – V. 22. – P.
4474–4485.
175. Terheyden, P., Schrama, D., Pedersen, L.O., Andersen, M.H., Kampgen, E., Straten,
P., Becker, J.C. Longitudinal analysis of MART-1/HLA-A2-reactive T cells over the course of
melanoma progression // Scand. J. Immunol. – 2003. – V. 58. – P. 566-571.
176. Rožková, D., Tišerová, H., Fučíková, J., Lašt'ovička, J., Podrazil, M., Ulčová, H.,
Budínský, V., Prausová, J., et al. FOCUS on FOCIS: Combined chemo-immunotherapy for the
treatment of hormone-refractory metastatic prostate cancer // Clin. Immunol. – 2009. – V. 131. –
P. 1-10.
177. Koh, Y.T., Gray, A., Higgins, S.A., Hubby, B., Kast, W.M. Androgen ablation
augments prostate cancer vaccine immunogenicity only when applied after immunization //
Prostate. – 2009. – V. 69. – P. 571-584.
178. Nestle, F.O., Aligagic, S., Gilliet, M., Sun, Y., Grabbe, S., Dummer, R., Burg, G.,
Schadendorf, D. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed
dendritic cells. Murine dendritic cells pulsed with whole tumor lysates mediate potent antitumor
immune responses in vitro and in vivo // Nat. Med. – 1998. – V. 4. – P. 328-332.
179. Fields, R.C., Shimizu, K., Mule, J. Murine dendritic cells pulsed with whole tumor
lysates mediate potent antitumor immune responses in vitro and in vivo // J. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. – 1998. – V. 95. – P. 9482-9487.
180. Geiger, J., Hutchinson, R., Hohenkirk, L., McKenna, E., Chang, A., Mule, J.
Treatment of solid tumours in children with tumour-lysate – pulsed dendritic cells // Lancet. –
2000. – V. 356. – P. 1163-1165.
143
181. Geiger, J.D., Hutchinson, R.J., Hohenkirk, L.F., McKenna, E.A., Yanik, G.A.,
Levine, J.E., Chang, A.E., Braun, T.M., Mule, J.J. Vaccination of pediatric solid tumor patients
with tumor lysate – pulsed dendritic cells can expand specific T cells and mediate tumor
regression // Cancer Res. – 2001. – V. 61. – P. 8513-8519.
182. Celluzzi, C.M., Mayordomo, J.I., Storkus, W.J., Lotze, M.T., Falo, L.D. Peptidepulsed dendritic cells induce antigen-specific CTL-mediated protective tumor immunity // J.
Exp. Med. – 1996. – V. 183. – P. 283-287.
183. Miconnet, I., Coste, I., Beermann, F., Haeuw, J.F., Cerottini, J.C., Bonnefoy, J.Y.,
Romero, P., Renno, T. Cancer vaccine design: A novel bacterial adjuvant for peptide-specific
CTL induction // J. Immunol. – 2001. – V. 166. – P. 4612-4619.
184. Wang, H.Y., Fu, T., Wang, G., Zeng, G., Perry-Laller, D.M., Yang, J.C., Restifo,
N.P., Hwu, P., Wang, R.F. Induction of CD4(+) T cell-dependent antitumor immunity by TATmediated tumor antigen delivery into dendritic cells // J. Clin. Invest. – 2002. – V. 109. – P.
1463-1470.
185. van Gisbergen, K., Aarnoudse, C., Meijer, G., Geijtenbeek, T., van Kooyk, Y.
Dendritic cells recognize tumor-specific glycosylation of carcinoembryonic antigen on colorectal
cancer cells through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3–grabbing
nonintegrin // Cancer Res. – 2005. – V. 65. – P. 5935-5944.
186. Jarnjak-Jankovic, S., Pettersen, R.D., Saeboe-Larssen, S., Wesenberg, F., Olafsen,
M.R., Gaudernack, G. Preclinical evaluation of autologous dendritic cells transfected with
mRNA or loaded with apoptotic cells for immunotherapy of high-risk neuroblastoma // Cancer
Gene Ther. – 2005. – V. 12. – P. 699-707.
187. Van Tandeloo, V., Ponsaerts, P., Lardon, F., Nijis, G., Lenjou, M., Van Broeckhoven,
C., Van Bockstaele, D.R., Berneman, Z.N. Highly efficient gene delivery by mRNA
electroporation in human hematopoetic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of
mRNA and electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells //
Blood. – 2001. – V. 98. – P. 49-56.
188. Boczkowski, D., Nair, S.K., Nam, J.H., Lyerly, H.K., Gilboa, E. Induction of tumor
immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger
RNA amplified from tumor cells // Cancer Res. – 2000. – V. 60. – P. 1028-1034.
189. Heiser, A., Maurice, M.A., Yancey, D.R., Wu, N.Z., Dahm, P., Pruitt, S.K.,
Boczkowski, D., Nair, S.K., Ballo, M.S., Gilboa, E., et al. Induction of polyclonal prostate
144
cancer – specific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA // J. Immunol.
– 2001. – V. 166. – P. 2953-2960.
190. Nair, S.K., Boczkowski, D., Morse, M., Cumming, R.I., Lyerly, H.K., Gilboa,. E.
Induction of primary carcinoembryonic antigen (CEA)-specific cytotoxic T lymphocytes in vitro
using human dendritic cells transfected with RNA // Nat. Biotechnol. – 1998. – V. 16. – P. 364369.
191. Nishioka, Y., Hirao, M., Robbins, P.D., Lotze, M.T., Tahara, H. Induction of systemic
and therapeutic antitumor immunity using intratumoral injection of dendritic cells genetically
modified to express interleukin 12 // Cancer Res. – 1999. – V. 59. – P. 4035-4041.
192. Rodriguez-Calvillo, M., Duarte, M., Tirapu, I., Berraondo, P., Mazzolini, G., Qian,
C., Prieto, J., Melero, I. Upregulation of natural killer cells functions underlies the efficacy of
intratumorally injected dendritic cells engineered to produce interleukin-12 // Exp. Hematol. –
2002. – V. 30. – P. 195-204.
193. Vari, F, Hart, D.N. Loading DCs with Ag // Cytotherapy. – 2004. – V. 6. – P. 111121.
194. Aarntzen, E.H., Schreibelt, G., Bol, K., Lesterhuis, W.J., Croockewit, A.J., de Wilt,
J.H., van Rossum, M.M., Blokx, W.A., et al. Vaccination with mRNA-electroporated dendritic
cells induces robust tumor antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells responses in stage III and IV
melanoma patients // Clin. Cancer. Res. – 2012. – V. 18. – P. 5460-5470.
195. Ibraheem, D, Elaissari, A, Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems // Int. J.
Pharm. – 2014. – V. 459. – P. 70-83.
196. Sanford, J.C., Klein, T.M., Wolf, E.D., Allen, N. Delivery of substances into cells and
tissues using a particle bombardment process // Particulate Science and Technology: An
International Journal. – 1987. – V. 5. – P. 27-37.
197. Porgador, A., Irvine, K.R., Iwasaki, A., Barber, B.H., Restifo, N.P., Germain, R.N.
Predominant role for directly transfected dendritic cells in antigen presentation to CD8+ T cells
after gene gun immunization // J. Exp. Med. – 1998. – V. 188. – P. 1075-1082.
198. Oda, Y., Suzuki, R., Otake, S., Nishiie, N., Hirata, K., Koshima, R., Nomura, T.,
Utoguchi, N., et al. Prophylactic immunization with Bubble liposomes and ultrasound-treated
dendritic cells provided a four-fold decrease in the frequency of melanoma lung metastasis // J.
Control. Release. – 2012. – V. 160. – P. 362-366.
145
199. De Temmerman, M.L., Dewitte, H., Vandenbroucke, R.E., Lucas, B., Libert, C.,
Demeester, J., De Smedt, S.C., Lentacker, I., Rejman, J. mRNA-Lipoplex loaded microbubble
contrast agents for ultrasound-assisted transfection of dendritic cells // Biomaterials. – 2011. – V.
32. – P. 9128-9135.
200. Chen, Y.Z. Yao, XL, Tabata, Y, Nakagawa, S, Gao, JQ. Gene carriers and
transfection systems used in the recombination of dendritic cells for effective cancer
immunotherapy // Clin. Dev. Immunol. – 2010. – V. 2010. – P. 565643.
201. Yang, J., Liu, H., Zhang, X. Design, preparation and application of nucleic acid
delivery carriers // Biotechnol. Adv. – 2014. – V. 32. – P. 804-817.
202. Reeves, M.E., Royal, R.E., Lam, J.S., Rosenberg, S.A., Hwu, P. Retroviral
transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene // Cancer Res. –
1996. – V. 56. – P. 5672-5677.
203. Nikitina, E.Y., Clark, J.I., Van Beynen, J., Chada, S., Virmani, A.K., Carbone, D.P.,
Gabrilovich, D.I. Dendritic cells transduced with full-length wild-type p53 generate antitumor
cytotoxic T lymphocytes from peripheral blood of cancer patients // Clin. Cancer Res. – 2011. –
V. 7. – P. 127-135.
204. Streitz, J., Tormo, D., Schweichel, D., Tuting, T. Comparison of recombinant
adenovirus and synthetic peptide for DC-based melanoma vaccination // Cancer Gene Ther. –
2006. – V. 13. – P. 318-325.
205. Murakami, T., Tokunaga, N., Waku, T., Gomi, S., Kagawa, S., Tanaka, N., Fujiwara
T. Antitumor effect of intratumoral administration of bone marrow-derived dendritic cells
transduced with wild-type p53 gene // Clin. Cancer Res. – 2004. – V. 10. – P. 3771-3880.
206. Antonia, S.J., Mirza, N., Fricke, I., Chiappori, A., Thompson, P., Williams, N.,
Bepler, G., Simon, G., et al. Combination of p53 cancer vaccine with chemotherapy in patients
with extensive stage small cell lung cancer // Clin. Cancer Res. – 2006. – V. 12. – P. 878-887.
207. Morse, M.A., Clay, T.M., Hobeika, A.C., Osada, T., Khan, S., Chui, S., Niedzwiecki,
D., Panicali, D., Schlom, J., Lyerly, H.K. Phase I study of immunization with dendritic cells
modified with fowlpox encoding carcinoembryonic antigen and costimulatory molecules // Clin.
Cancer Res. – 2005. – V. 11. – P. 3017-3024.
208. Perche, F., Benvegnu, T., Berchel, M., Lebegue, L., Pichon, C., Jaffrès, P.A., Midoux
P. Enhancement of dendritic cells transfection in vivo and of vaccination against B16F10
melanoma with mannosylated histidylated lipopolyplexes loaded with tumor antigen messenger
RNA // Nanomedicine. – 2011. – V. 7. – P. 445-453.
146
209. Moffatt, S., Cristiano, R.J. Uptake characteristics of NGR-coupled stealth PEI/pDNA
nanoparticles loaded with PLGA-PEG-PLGA tri-block copolymer for targeted delivery to human
monocyte-derived dendritic cells // Int. J. Pharm. – 2006. – V. 321. – P. 143-154.
210. Tang, R., Palumbo, R.N., Nagarajan, L., Krogstad, E., Wang, C. Well-defined block
copolymers for gene delivery to dendritic cells: probing the effect of polycation chain-length // J.
Control. Release. – 2010. – V. 142. – P. 229-237.
211. Zuhorn, I. S., Visser, W. H., Bakowsky, U., Engberts, J. B., Hoekstra, D. Interference
of serum with lipoplex–cell interaction: modulation of intracellular processing // Biochim.
Biophys. Acta. – 2002. – V. 1560. – P. 25-36.
212. Maslov, M.A., Kabilova, T.O., Petukhov, I.A., Morozova, N.G., Serebrennikova,
G.A., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Novel cholesterol spermine conjugates provide efficient
cellular delivery of plasmid DNA and small interfering RNA // J. Control. Release. – 2012. – V.
160. – P. 182-193.
213. Martinez-Pomares, L. The mannose receptor // J. Leukoc. Biol. – 2012. – V. 92. – P.
1177-1186.
214. Perche, F., Gosset, D., Mével, M., Miramon, M.L., Yaouanc, J.J., Pichon, C.,
Benvegnu, T., Jaffrès, P.A., Midoux, P. Selective gene delivery in dendritic cells with
mannosylated and histidylated lipopolyplexes // J. Drug Target. – 2011. – V. 19. – P.315-325.
215. Carrillo-Conde, B., Song, E.H., Chavez-Santoscoy, A., Phanse, Y., Ramer-Tait, A.E.,
Pohl, N.L., Wannemuehler, M.J., Bellaire, B.H., Narasimhan, B. Mannose-functionalized
"pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells //
Mol. Pharm. – 2011. – V. 8. – P. 1877-1886.
216. Pichon, C., Midoux, P. Mannosylated and histidylated LPR technology for
vaccination with tumor antigen mRNA // Methods. Mol. Biol. – 2013. – V. 969. – P. 247-274
217. Tang, C.K., Lodding, J., Minigo, G., Pouniotis, D.S., Plebanski, M., Scholzen, A.,
McKenzie, I.F., Pietersz, G.A., Apostolopoulos, V. Mannan-mediated gene delivery for cancer
immunotherapy // Immunology. – 2007. – V. 120. – P. 325-335.
218. Benteyn, D., Heirman, C., Bonehill, A., Thielemans, K., Breckpot, K. mRNA-based
dendritic cell vaccines // Expert Rev Vaccines. – 2015. – V. 14. – P. 161-176.
218. Garg, N.K., Dwivedi, P., Prabha, P., Tyagi, R.K. RNA pulsed dendritic cells: an
approach for cancer immunotherapy // Vaccine. – 2013. – V. 31. – P. 1141-1156.
220. Тюряева, И.И. Опухолевые антигены // Цитология. – 2008. – Т. 50. – C. 189-209.
147
221. Kikuchi, T., Worgall, S., Singh, R., Moore, M.A., Crystal, R.G. Dendritic cells
genetically modified to express CD40 ligand and pulsed with antigen can initiate antigenspecific humoral immunity independent of CD4+ N cells // Nat. Med. – 2000. – V. 6. – P. 11541159.
222. Bonehill, A., Van Nuffel, A.M., Corthals, J., Tuyaerts, S., Heirman, C., Francois, V.,
Colau, D., Van Der Bruggen, P., et al. Single-step anigen loading and activation of dendritic
cells by mRNA electroporation for the purpose of therapeutic vaccination in melanoma patients
// Clin. Cancer Res. – 2009. – V. 15. – P. 3366-3375.
223. Wiethe, C., Dittmar, K., Doan, T., Lindenmaier, W., Tindle, R. Provision of 4-1BB
ligand enhances effector and memory CTL responses generated by immunization with dendritic
cells expressing a human tumor-associated antigen // J. Immunol. – 2003. – V. 170. – P 29122922.
224. Dannull, J., Nair, S., Su, Z., Boczkowski, D., Debeck, C., Yang, B., Gilboa, E.,
Vieweg, J. Enhancing the immunostimulatory function of dendritic cells by transfection with
mRNA encoding OX40 ligand // Blood. – 2005. – V. 105. – P. 3206-3213.
225. Wiethe, C., Dittmar, K., Doan, T., Lindenmaier, W., Tindle, R. Enhanced effector and
memory CTL responses generated by incorporation of receptor activator of NF-κB
(RANK)/RANK ligand costimulatory molecules into dendritic cell immunogens expressing a
human tumor-specific antigen // J. Immunol. – 2003. – V. 171. – P.4121-4130.
226. Hodge, J.W., Sabzevari, H., Yafal, A.G., Gritz, L., Lorenz, M.G., Scholm, J. A triad
of costimulatory molecules synergize to amplify T-cell activation // Cancer Res. – 1999. – V. 59.
– P. 5800-5807.
227. Lee, J.M., Mahtabifard, A., Yamada, R., Crystal, R.G., Korst, R.J. Adenovirus vectormediated overexpression of a truncated form of the p65 nuclear factor κB cDNA in dendritic
cells enhances their function resulting in immune-mediated suppression of preexisting murine
tumors // Clin. Cancer Res. – 2002. – V. 8. – P. 3561-3569.
228. Vujanovich, L., Ranieri, E., Gambotto, A., Olson, W.C., Kirkwood, J.M., Storkus,
W.J. IL-12p70 and IL-18 gene-modified dendritic cells loaded with tumor antigen-derived
peptides or recombinant protein effectively stimulate specific type-1 CD4+ T-cell responses
from normal donors and melanoma patients in vitro // Cancer Gene Ther. – 2006. – V. 13. – P.
798-805.
229. Bontkes, H.J., Kramer, D., Ruizendaal, J.J., Meijer, C.J., Hooijberg, E. Tumor
associated antigen and interleukin-12 mRNA transfected dendritic cells enhance effector
148
function of natural killer cells and antigen specific T-cell // Clin. Immunol. – 2008. – V. 127. –
P. 375-384.
230. Tatsumi, T., Gambotto, A., Robbins, P.D., Storkus, W.J. Interleukin 18 gene transfer
expands the repertoire of antitumor Th-1-type immunity elicited by dendritic cell-based vaccines
in association with enhanced therapeutic efficacy // Cancer Res. – 2002. – V. 62. – P. 5853-5858.
231. Xue, G., Liu, R.Y., Li, Y., Cheng, Y., Liang, Z.H., Wu, J.X., Zeng, M.S., Tian, F.Z.,
Huang, W. Dendritic cells modified with 6Ckine/IFNγ fusion gene induce specific cytotoxic T
lymphocytes in vitro // Cancer Immunol. Immunother. – 2007. – V. 56. – P. 1831-1843.
232. Ribas, A., Butterfield, L.H., Amarnani, S.N., Dissete, V.B., Kim, D., Meng, W.S.,
Miranda, G.A., Wang, et al. CD40 cross-linking bypasses the absolute requirement for CD4 T
cells during immunization with melanoma antigen gene-modified dendritic cell vaccines //
Cancer Res. – 2001. – V. 61. – P. 8787-8793.
233. Westermann, J., Aicher, A., Qin, Z., Cayeux, Z., Daemen, K., Blankenstein, T.,
Dorken, B., Pezzutto, A. Retroviral interleukin-7 gene transfer into human dendritic cells
enhances T cell activation // Gene Ther. – 1998. – V. 5. – P. 264-271.
234. Miller, P.W., Sharma, S., Stolina, M., Butterfield, L.H., Luo, J., Lin, Y., Dohadwala,
M., Batra, R.K., et al. Intratumoral administration of adenoviral interleukin 7 gene-modified
dendritic cells augments specific antitumor immunity and achieves tumor eradication // Hum.
Gene. Ther. – 2000. – V. 11. – P. 53-65.
235. Sharma, S., Batra, R.K., Yang, S.C., Hillinger, S., Zhu, L., Atianzar, K., Strieter,
R.M., Riedl, K., et al. Interleukin-7 gene-modified dendritic cells reduce pulmonary tumor
burden in spontaneous murine bronchoalveolar cell carcinoma // Hum. Gene Ther. – 2003. – V.
14. – P. 1511-1524.
236. Chen, Z., Huang, H., Chang, T., Carlsen, S., Saxena, A., Marr, R., Xing, Z., Xiang J.
Enhanced HER-2/neu-specific antitumor immunity by cotransduction of mouse dendritic cells
with two genes encoding HER-2/neu and α tumor necrosis factor // Cancer Gene Ther. – 2002. –
V. 9. – P. 778-786
237. Ye, Z., Chen, Z., Sami, A., El Gayed, A., Xiang, J. Human dendritic cells engineered
to express α tumor necrosis factor maintain cellular maturation and T-cell stimulation capacity //
Cancer Biother. Radiopharm. – 2006. – V. 21. – P. 613-622.
238. Tuting, T., Wilson, C.C., Martin, D.M., Kasamon, Y.L., Rowles, J., Ma, D.I.,
Slingluff, C.L., Jr. Wagner, S.N., et al. Autologous human monocyte-derived dendritic cells
genetically modified to express melanoma antigens elicits primary cytotoxic T cell responses in
149
vitro: Enhancement by cotransfection of genes encoding the Th1-biasing cytokines IL-12 and
IFN-α. // J. Immunol. – 1998 – V. 160. – P. 1139-1147.
239. Ojima, T., Iwahashi, M., Nakamura, M., Matsuda, K., Naka, T., Nakamori, M., Ueda,
K., Ishida, K., Yamaue, H. The boosting effect of co-transduction with cytokine genes on cancer
vaccine therapy using genetically modified dendritic cells expressing tumor-associated antigen //
Int. J. Oncol. – 2006. – V. 28. – P. 947-953.
240. Miller, G., Lahrs, S., Dematteo, R.P. Overexpression of interleukin-12 enables
dendritic cells to activate NK cells and confer systemic antitumor immunity // FESEB J. – 2003.
– V. 17. – P. 728-730.
241. Wargo, J.A., Schumancher, L.Y., Comin-Anduix, B., Dissete, V.B., Glaspy, J.A.,
McBride, W.H., Butterfield, L.H., Economou, J.S., Ribas, A. Natural killer cells play a critical
role in the immune response following immunization with melanoma-antigen-engineered
dendritic cells // Cancer Gene Ther. – 2005. – V. 12. – P. 516-527.
242. Cao, X., Zhang, W., He, L., Xie, Z., Ma, S., Tao, Q., Yu, Y., Hamada, H., Wang, J.
Lymphotactin gene-modified bone marrow dendritic cells act as more potent adjuvants for
peptide delivery to induce specific antitumor immunity // J. Immunol. – 1998. – V. 161. – P.
6238-6244.
243. Kirk, C.J., Hartigan-O`Connor, D., Mule, J.J. The dynamics of the T-cell antitumor
respose: Chemokine-secreting dendritic cells can prime tumor-reactive T cell extranodally //
Cancer Res. – 2001. – V. 61. – P. 8794-8802.
244. Matsuyoshi, H., Senju, S., Hirata, S., Yoshitake, Y., Uemura, Y., Nishimura, Y.
Enhanced priming of antigen-specific CTLs in vivo by embryonic stem cell-derived dendritic
cells expressing chemokine along with antigenic protein: Application to antitumor vaccination //
J. Immunol. – 2004. – V. 172. – P. 776-786.
245. Ponsaerts, P., Van Tandeloo, V.F., Bernemann, Z.N. Cancer immunotherapy using
RNA-loaded dendritic cells. Clin. Exp. Immunol. – 2003. – V. 134. – P. 378-384.
246. Van Driessche, A., Ponsaerts, P., Van Bockstaele, D.R., Van Tandeloo, V.F.,
Bernemann, Z.N. Messenger RNA electroporation: An efficient tool in immunotherapy and
stem cell research // Folia Histochem. Cytobiol. – 2005. – V. 43. – P. 213-216.
247. Morrison, B.J., Steel, J.C., Gregory, M., Morris, J.C., Malyguine, A.M. Genetically
modified dendritic cells in cancer immunotherapy. In Shurin, M.R., and Satler R.D.., eds.
Dendritic Cells in Cancer // Springer Science & Business Media, New York. – 2009. – P. 347363.
150
248. Saha, A., Bhattacharya-Chatterjee, M., Foon, K.A., Celis, E., Chatterjee, S.K.
Stimulatory effects of CpG oligonucleotide on dendritic cell-based immunotherapy of colon
cancer in CEA/HLA-A2 transgenic mice // Int. J. Cancer. – 2009. – V. 124. – P. 877-888.
249. Kim, H.S., Kim, C.H., Park, M.Y., Park, J.S., Park, H.M., Sohn, H.J., Kim, H.J., Kim,
S.G., et al. Efficient co-transduction of adenoviral vectors encoding carcinoembryonic antigen
and survivin into dendritic cells by the CAR-TAT adaptor molecule enhance anti-tumor
immunity in a murine colorectal cancer model // Immunol. Lett. – 2010. – V. 131. – P. 73-80.
250. Pandey, V.K., Shankar, B.S., Sanis, K.B. G1-4 A, an arabinogalactan polysaccharide
from Tinospora cordifolia increases dendritic cell immunogenicity in a murine lymphoma model
// Int. Immunopharmacol. – 2012. – V. 14. – P. 641-649.
251. Matheoud, D., Perié, L., Hoeffel, G., Vimeux, L., Parent, I., Marañón, C.,
Bourdoncle, P., Renia, L., et al. Cross-presentation by dendritic cells from live cells induces
protective immune responses in vivo // Blood. – 2010. – V. 115. – P. 4412-4420.
252. Huck, S.P., Tang, S.C., Andrew, K.A., Yang, J., Harper, J.L., Ronchese, F. Activation
and route of administration both determine the ability of bone marrow-derived dendritic cells to
accumulate in secondary lymphoid organs and prime CD8+ T cells against tumors // Cancer
Immunol. Immunother. – 2008. – V. 57. – P. 63-71.
253. Shinagava, N., Yamazaki, K., Tamura, Y., Imai, A., Kikuchi, E., Yokouchi, H.,
Hommura, F., Oizumi, S., Nishimura, M. Immunotherapy with dendritic cells pulsed with tumorderived gp96 against murine lung cancer is effective through immune response of CD8+
cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells // Cancer Immunol. Immunother. – 2008. – V.
57. – P. 165-174.
254. Xie, J., Xiong, L., Tao, X., Li, X., Su, Y., Hou, X., Shi, H. Antitumor effects of
murine bone marrow-derived dendritic cells infected with xenogeneic livin alpha recombinant
adenoviral vectors against Lewis lung carcinoma // Lung Cancer. – 2010. – V. 68. – P. 338-345.
255. Baek, S., Lee, S.J., Kim, M.J., Lee, H. Dendritic cell (DC) vaccine in mouse lung
cancer minimal residual model; comparison of monocyte-derived DC vs. hematopoietic stem cell
derived-DC // Immune network. – 2012. – V. 12. – P. 269-276.
256. Moon, J.H., Chung, M.K., Son, Y.I. Immunotherapy with dendritic cells in an animal
model of early pulmonary metastatic squamous cell carcinoma // Laryngoscope. – 2012. – V.
122. – P. 2442-2446.
257. Шевченко, Ю.А., Хантакова, Ю.Н., Курилин, В.В., Лопатникова, Ю.А.,
Сидоров, С.В., Козлов, В.А., Сенников, С.В. Стимуляция цитотоксического иммунного
151
ответа в культуре мононуклеарных клеток больных раком молочной железы дендритными
клетками, нагруженными антигенами опухолевых лизатов // Иммунология. – 2013. – Т.
134. – №6. – С. 327-330.
258. Облеухова, И.А., Курилин, В.В., Гончаров, М.А., Тархов, А.В., Красильников,
С.Э.,
Сенников,
С.В.
Влияние
зрелых
дендритных
клеток,
праймированных
аутологичными опухолевыми антигенами, больных эпителиальным раком яичника на
стимуляцию цитотоксического иммунного ответа в культуре мононуклеарных клеток //
Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2013г. – №3. – С. 169-173.
259. Курилин, В.В., Хантакова, Ю.Н., Облеухова, И.А., Шевченко, Ю.А., Куликова,
Е.В., Якушенко, В.К., Соколов, А.В., Сенников, С.В. Стимуляция дендритными клетками
in vitro противоопухолевой цитотоксической активности мононуклеарных клеток больных
колоректальным раком // Медицинская иммунология. – 2013. – Т.15. – №3. – С. 235-246.
260. Максютов, А.З., Лопатникова, Ю.А., Курилин, В.В., Шевченко, Ю.А.,
Хантакова, Ю.Н., Гаврилова, Е.В., Максютов, Р.А., Перегудов, А.Г., Зайцев, С.А., Козлов,
В.А.,
Сенников,
С.В.
Исследование
эффективности
индукции
цитотоксического
иммунного ответа мононуклеарными клетками с помощью дендритных клеток,
трансфецированных полиэпитопными конструкциями HER2/ERBB2 // Медицинская
иммунология. – 2014. – Т.16. – №5. – С. 417-424.
261. Van Tandeloo, V.F., Ponsaerts, P., Berneman, Z.N. mRNA-based gene transfer as a
tool for gene and cell therapy // Curr. Opin. Mol. Ther. – 2007. – V. 9. – P. 423-431.
262. Su, Z., Dannull, J., Yang, B.K., Dahm, P., Coleman, D., Yancey, D., Sichi, S.,
Niedzwiecki, D., et al. Telomerase mRNA-transfected dendritic cells stimulate antigen-specific
CD8+ and CD4+ T cell responses in patients with metastatic prostate cancer // J. Immunol. –
2005. – V. 174. – P. 3798-3807.
263. Heiser, A., Coleman, D., Dannull, J., Yancey, D., Maurice, M.A., Dahm, P.,
Niedzwiecki, D., et al. Autologous dendritic cells transfected with prostate-specific antigen RNA
stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors // J. Clin. Invest. – 2002. – V. 109. –
P. 409-417.
264. Mazzolini, G., Alfaro, C., Sangro, B., Feijoo, E., Ruitz, J., Benito, A., Tirapu, I.,
Arina, A., et al. Intratumoral injection of dendritic cells engineered to secrete interleukin-12 by
recombinant adenovirus in patients with metastatic gastrointestinal carcinomas // J. Clin. Oncol.
– 2005. – V. 23. – P. 999-1010.
152
265. Tsao, H., Millman, P., Linette, G.P., Hodi, F.S., Sober, A.J., Goldberg, M.A.,
Haluska, F.G. Hypopigmentation associated with an adenovirus-mediated gp100/MART-1transduced dendritic cell vaccine for metastatic melanoma // Arch. Dermatol. – 2002. – V. 138. –
P. 799-802.
266. Small, E., Schellhammer, P.F., Higano, C.S., Redfern, C.H., Nemunaitis, J.J., Valone,
F.H., Verjee, S.S., Jones, L.A., Hershberg, R.M. Placebo-controlled phase III trial of
immunologic therapy with Sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic
hormone refractory prostate cancer // J. Clin. Oncol. – 2006. – V. 24. – P. 3089-3094.
267. Yu, J., Christopher, J., Wheeler, C., Zeltzer, P., Ying, H., Finger, D., Lee, P., Yong,
W., et al. Vaccination of malignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicits
systemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration // Cancer Res. – 2001. –V. 61. – P. 842–
847.
268. Lepisto, A.J., Moser, A.J., Zeh, H., Lee, K., Bartlett, D., McKolanis, J.R., Geller,
B.A., Schmotzer, A., et al. A phase I/II study of a MUC1 peptide pulsed autologous dendritic
cell vaccine as adjuvant therapy in patients with resected pancreatic and biliary tumors // Cancer
Ther. – 2008. – V. 6. – P. 955-964.
269. Tada, F., Abe, M., Hirooka, M., Ikeda, Y., Hiasa, Y., Lee, Y., Jung, N.C., Lee, W.B.,
et al. Phase I/II study of immunotherapy using tumor antigen-pulsed dendritic cells in patients
with hepatocellular carcinoma // Int. J. Oncol. – 2012. – V. 41. – P. 1601-1609.
270. Su, Z., Dannull, J., Heiser A., Yancey, D., Pruitt, S., Madden, J., et al. Immunological
and clinical responses in metastatic renal cancer patients vaccinated with tumor RNA-transfected
dendritic cells // Cancer Res. – 2003. – V. 63. – P. 2127-2133
271. Kitawaki, T., Kadowaki, N., Fukunaga, K., Kasai, Y., Maekawa, T., Ohmori, K., Itoh,
T., Shimizu, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells in vivo by dendritic cells pulsed with
autologous leulemic cells inn immunotherapy for elderly patients with acute myeloid leukemia //
Exp. Hematol. – 2011. – V. 39. – P. 424-433.
272. Palma, M., Hansson, L., Choudhury, A., Näsman-Glaser, B., Eriksson, I., Adamson,
L., Rossmann, E., Widén, K., Horváth, R., et al. Vaccination with dendritic cells loaded with
tumor apoptotic bodies (Apo-DC) in patients with chronic lymphocytic leukemia: effects of
various adjuvants and definition of immune response criteria // Cancer Immunol. Immunother. –
2012. – V. 61. – P. 865-879.
273. Himoudi, N., Wallace, R., Parsley, K.L., Gilmour, K., Barrie, A.U., Howe, K., Dong,
R., Sebire, N.J., et al. Lack of T-cell responses following autologous tumor lysate pulsed
153
dendritic cell vaccination, in patients with relapsed osteosarcoma // Clin. Transl. Oncol. – 2012.
– V. 14. – P. 271-279.
274. Chu, C.S., Boyer, J., Schullery, D.S., Gimotty, P.A., Gamerman, V., Bender, J.,
Levine, B.L., Coukos, G., et al. Phase I/II randomized trial of dendritic cell vaccination with or
without cyclophosphamide for consolidation therapy of advanced ovarian cancer in first or
second remission // Cancer Immunol. Immunother. – 2012. – V. 61. – P. 629-641.
275. Escobar, A., López, M., Serrano, A., Ramirez, M., Pérez, C., Aguirre, A., González,
R., Alfaro, J., et al. Dendritic cell immunizations alone or combined with low doses of
interleukin-2 induce specific immune responses in melanoma patients // Clin. and Exp. Imm. –
2005. – V. 142. – P. 555–568.
276. Ribas, A., Camacho, L.H., Lee, S.M., Hersh, E.M., Brown, C.K., Richards, J.M.,
Rodriguez, M.J., Prieto, V.G., Glaspy, J.A., et al. Multicenter phase II study of matured dendritic
cells pulsed with melanoma cell line lysates in patients with advanced melanoma // J. Transl.
Med. – 2010. – V. 8. – P. 89.
277. Galluzzi, L., Senovilla, L., Vacchelli, E., Eggermont, A., Fridman, W.H., Galon, J.,
Sautès-Fridman, C., Tartour, E., et al. Trial watch: Dendritic cell-based interventions for cancer
therapy // Oncoimmunology. – 2012. – V. 1. – P.1111-1134.
278. Engel, A., Chatterjee, S.K., Al-arifi, A., Riemann, D., Langner, J., Nuhn, P. Influence
of spacer length on interaction of mannosylated liposomes with human phagocytic cells //
Pharm. Res. – 2003. – V. 20. – P. 51-57.
279. Patutina, O., Mironova, N., Popova, N., Kaledin, V., Nikolin, V., Vlassov, V.,
Zenkova, M. The siRNA targeted tomdr1b andmdr1a mRNAs in vivo sensitizesmurine
lymphosarcoma to chemotherapy // BMC Cancer. – 2010. – V. 10. – P. 204.
280. Kong, W., Yen, J.H., Ganea, D. Docosahexaenoic acid prevents dendritic cell
maturation, inhibits antigen-specific Th1/Th17 differentiation and suppresses experimental
autoimmune encephalomyelitis // Brain Behav. Immun. – 2011. – V. 25. – P. 872-82.
281. Begum-Haque, S., Sharma, A., Kasper, I.R., Foureau, D.M., Mielcarz, D.W., Haque,
A., Kasper, L.H. Downregulation of IL-17 and IL-6 in the central nervous system by glatiramer
acetate in experimental autoimmune encephalomyelitis // J. Neuroimmunol. – 2008. – V. 204. –
P. 58-65.
282. Bajaj, A., Mishra, S., Kondaiah, P., Bhattacharya, S. Effect of the headgroup variation
on the gene transfer properties of cholesterol based cationic lipids possessing ether linkage //
Biochim. Biophys. Acta. – 2008. – V. 1778. – P. 1222–1236.
154
283. Ciania, L., Ristori, S., Salvati, A., Calamai, L., Martini, G. DOTAP/DOPE and DCChol/DOPE lipoplexes for gene delivery: zeta potentialmeasurements and electron spin
resonance spectra // Biochim. Biophys. Acta. – 2004. – V. 1664. – P. 70–79.
284. Gao, S., Chen, J., Dong, L., Ding, Z., Yang, Y.-H., Zhang, J. Targeting delivery of
oligonucleotide and plasmid DNA to hepatocyte via galactosylated chitosan vector // Eur. J.
Pharm. Biopharm. – 2005. – V. 60. – P. 327–334.
285. Corish, P., Tyler-Smith, C. Attenuation of green fluorescent protein half-life in
mammalian cells // Protein Eng. – 1999. – V. 12. – P. 1035–1040.
286. Jonuleit, H., Kühn, U., Müller, G., Steinbrink, K., Paragnik, L., Schmitt, E., Knop, J.,
Enk, A.H. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent
immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions // Eur. J. Immunol. –
1997. – V. 27. – P. 3135-3142.
287. Akira, S., Taga, T., Kishimoto, T. Interleukin-6 in biology and medicine // Adv.
Immunol. – 1993. – V. 54. – P. 1-78.
288. Sozzani, S., Allavena, P., D’Amico, G., Luini, W., Bianchi, G., Kataura, M. et al.
Differential regulation of chemokine receptors during dendritic cell maturation: a model for their
trafficking properties // J. Immunol. – 1998. – V. 161. – P. 1083–1086.
289. Dieu, M.C., Vanbervliet, B., Vicari, A., Bridon, J.M., Oldham, E., Ait-Yahia, S., et al.
Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed
in different anatomic sites // J. Exp. Med. – 1998. – V. 188. – P. 373–386.
290. Vecchi, A., Massimiliano, L., Ramponi, S., Luini, W., Bernasconi, S., Bonecchi, R.,
et al. Differential responsiveness to constitutive vs. inducible chemokines of immature and
mature mouse dendritic cells // J. Leukoc. Biol. – 1999. – V. 66. – P. 489–494.
291. Markov, O.V., Mironova, N.L., Maslov, M.A., Petukhov, I.A., Morozova, N.G.,
Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Novel cationic liposomes provided highly efficient delivery of
DNA and RNA // J. Control. Release. – 2012. – V. 160. – P.200-210.
292. Mauceri, A., Borocci, S., Galantini, L., Giansanti, L., Mancini, G., Martino, A.,
Salvati Manni, L., Sperduto, C. Recognition of concanavalin A by cationic glucosylated
liposomes // Langmuir. – 2014. – V. 30. – P. 11301-11306.
293. Muller, C.D., Schuber, F. Neo-mannosylated liposomes: synthesis and interaction
with mouse Kupffer cells and resident peritoneal macrophages // Biochim. Biophys. Acta. –
1989. – V. 986. – P. 97-105.
155
294. Entlicher, G., Koštíř, J.V., Kocourek, J. Studies on phytohemagglutinins. VIII.
Isoelectric point and multiplicity of purified concanavalin A // Biochim. Biophys. Acta. – 1971.
– V. 236. – P. 795-797.
295. De Haes, W., Rejman, J., Pollard, C., Merlin, C., Vekemans, M., Florence, E., De
Smedt, S.C., Grooten, J., Vanham, G., De Koker, S., Van Gulck, E. Lipoplexes carrying mRNA
encoding Gag protein modulate dendritic cells to stimulate HIV-specific immune responses //
Nanomedicine (Lond). – 2013. – V. 8. – P. 77-87.
296. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J.M. Cationic lipids activate intracellular
signaling pathways // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2012. – V. 64. – P. 1749-1758.
297. Ahmed, M.S., Bae, Y.S. Dendritic cell-based therapeutic cancer vaccines: past,
present and future // Clin. Exp. Vaccine Res. – 2014. – V. 3. – P. 113-116.
298. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines //
Immunity. – 2013. – V. 39. P. 38-48.
299. Frank, S.A. Genetic predisposition to cancer – insights from population genetics //
Nat. Rev. Genet. – 2004. – V. 5. – P. 764-772.
300. Tung, N. Management of women with BRCA mutations: a 41-year-old woman with a
BRCA mutation and a recent history of breast cancer // JAMA. – 2011. – V. 305. – P. 22112220.
301. Liu, T., Hossain, M., Schepmoes, A.A., Fillmore, T.L., Sokoll, L.J., Kronewitter,
S.R., et al. Analysis of serum total and free PSA using immunoaffinity depletion coupled to
SRM: correlation with clinical immunoassay tests // J. Proteomics. – 2012. – V. 75. – P. 47474757.
302. Meany, D.L., Sokoll, L.J., Chan, D.W. Early detection of cancer: immunoassays for
plasma tumor markers // Expert. Opin. Med. Diagn. - 2009. – V. 3. – P. 597-605.
303. Finn, O.J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the
cancer epidemic // Cancer Immunol. Res. – 2014. – V. 2. – P. 708-713.
304. Rizzo, M.M., Alaniz, L., Mazzolini, G. Ex vivo loading of autologous dendritic cells
with tumor antigens // Methods Mol. Biol. – 2014. – V. 1139. – P. 41-44.
305. Pan, K., Zhao, J.J., Wang, H., Li, J.J., Liang, X.T., Sun, J.C., et al. Comparative
analysis of cytotoxic T lymphocyte response induced by dendritic cells loaded with
hepatocellular carcinoma-derived RNA or cell lysate // Int. J. Biol. Sci. – 2010. – V. 6. – P. 639648.
156