ВЛИЯНИЕ РЕТАБОЛИЛА (ДИГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОНА) НА

УДК 616.89-008.431:612.42:612.018
ВЛИЯНИЕ РЕТАБОЛИЛА (ДЕГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОНА)
НА КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ У КРЫС ВИСТАР
И ГК (ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К КАТАЛЕПСИИ)
Наталья Григорьевна ПАНТЕЛЕЕВА, Анна Вениаминовна ШУРЛЫГИНА,
Валерий Алексеевич ТРУФАКИН
НИИ физиологии СО РАМН
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Проведен сравнительный анализ субпопуляционного состава лимфоцитов лимфоидных органов крыс ГК (генетическая каталепсия) и Вистар после введения ретаболила. Обнаружено, что у крыс ГК ретаболил вызывает
снижение общего количества клеток в тимусе и абсолютного числа тимоцитов CD8+. У крыс Вистар под влиянием ретаболила в тимусе увеличилось общее количество клеток и тимоцитов CD4+, но снизилось количество
клеток CD8+. Таким образом, направленность изменений клеточного состава тимуса крыс ГК под влиянием
инъекции ретаболила оказалась противоположной таковой у крыс Вистар. Введение ретаболила снижает выраженность каталептической реакции у крыс ГК, а у крыс Вистар, напротив, время застывания достоверно
увеличилось. Полученные данные показывают, что у крыс ГК и Вистар существуют особенности реакции иммунной системы и поведения на гормональный стимул (дегидроэпиандростерон). Особенности поведенческого и нейроэндокринного статуса у крыс ГК сочетаются с определенными изменениями показателей иммунной
системы.
Ключевые слова: каталепсия, лимфоидные органы, ретаболил.
Нервная и иммунная системы в комплексе с эндокринной системой выполняют совместную функцию сохранения и поддержания динамического
гомеостаза в организме. Они объединяются в нейроиммуноэндокринную систему и взаимодействуют
по принципу взаимной регуляции, осуществляемой
нейромедиаторами, нейропептидами, трофическими факторами, гормонами, лимфокинами через
соответствующий рецепторный аппарат. Эта взаиморегуляция и определяет надежность их совместной деятельности, с другой стороны, создает риск
развития функциональных расстройств общей системы при первичном нарушении какой-либо из
подсистем. Такого рода расстройства можно определить как дизрегуляционную патологию, патогенез которой может быть связан с нервными, эндокринными или иммунными механизмами [1].
Линия крыс, генетически предрасположенная к
каталепсии (ГК), выведенная в Институте цитологии и генетики СО РАН В.Г. Колпаковым c сотр.
из исходной популяции Вистар, рассматривается
в качестве модели функциональных психозов. Ранее было показано, что эта линия характеризуется
нарушениями поведения в виде нервозности, повышенной раздражительной агрессивности, снижением общей двигательной, ориентировочной и
волевой активности, нарушениями межполушарной
асимметрии, дефицитом дельта-сна, изменениями спектра белковых фракций некоторых структур
мозга и содержания нейромедиаторов [2–4].
Изучение морфофункциональных характеристик лимфоцитов крыс ГК в сравнении с исходной
популяцией Вистар могло бы пролить свет на некоторые аспекты иммунонейроэндокринных взаимоотношений, особенно в связи с развитием психопатологических проявлений. Ранее нами было
показано, что у крыс ГК наблюдаются нарушения
в иммунной системе, которые можно расценивать
как свидетельство измененной центральной дифференцировки Т-лимфоцитов и, возможно, сниженной функции Т-клеточного звена иммунитета на
уровне вторичных лимфоидных органов. Сделано
предположение, что изменения в иммунном статусе данных животных опосредуются нейромедиаторными и гормональными сдвигами [5]. В связи
с этим встает вопрос о возможности комплексной
коррекции нейроиммунных нарушений у крыс ГК
путем воздействий, влияющих на нейроэндокринный статус.
В литературе есть данные о снижении андрогенпродуцирующей функции надпочечников при некоторых психических заболеваниях, в частности,
при шизофрении. Для крыс ГК также характерен
дефицит продукции андрогенов [4]. Поэтому, учитывая имеющуюся у самцов ГК андрогенную недостаточность [6], для коррекции их иммунологических и поведенческих характеристик был выбран
анаболический стероид – ретаболил. Ретаболил
является синтетическим аналогом дегидроэпиандростерона (ДЭА) – слабого андрогена, продуци-
Пантелеева Н.Г. – н.с., e-mail: panteleeva@ngs.ru
Шурлыгина А.В. – д.м.н., проф., гл.н.с., e-mail: anna_v_s@mail.ru
Труфакин В.А. – академик РАМН, директор
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 30, № 4, 2010 Г.
51
Пантелеева Н.Г. и др. Влияние ретаболила (дигидроэпиандростерона) на клеточный состав... / с. 51–55
руемого сетчатой зоной коры надпочечников. Известны стресспротекторные, анксиолитические и
иммуномодулирующие свойства ДЭА [7], в связи
с чем мы предположили, что ретаболил окажется
эффективным в комплексном воздействии на нейроиммунные нарушения у крыс ГК. Кроме того,
представляет интерес выявление особенностей реакции на гормональный стимул поведенческих и
иммунных параметров «нормальных» животных
(крысы Вистар) и крыс с генетически обусловленной каталепсией (ГК).
Материал и методы
Все эксперименты были выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ
Минздрава СССР от 12.08.1977).
В эксперименте были использованы взрослые
самцы крыс Вистар и ГК весом около 200 г. Внутрибрюшинные однократные инъекции ретаболила
животным проводили после взвешивания из расчета 25 мг/кг веса. В качестве активного контроля
использовали крыс, которым вводили стерильное
оливковое масло в том же объеме. Все показатели
регистрировали в утренние часы. В группах было от
10 до 15 животных.
Животных забивали декапитацией с 900 до 1000
часов утра на 14 сутки после введения ретаболила.
Забирали тимус, селезенку и паховые лимфатические узлы, из которых готовили клеточную суспензию. Из суспензии делали мазки на предметных
стеклах методом высушенной капли, фиксировали
их в ацетоне и определяли субпопуляции лимфоцитов CD4+ и CD8+ и активированных лимфоцитов иммуноцитохимическим методом [8], с помощью соответствующих моноклональных антител
(«Biosource», США). В качестве второго слоя использовали экстравидин-биотиновый kit, меченный пероксидазой («Sigma», США). Пероксидазу
выявляли с использованием диаминобензидина
(«Sigma»). Ядра клеток докрашивали 1%-ным раствором метилового зеленого. Препараты исследовали в световом микроскопе при увеличении окуляра
× 10, объектива × 100, с использованием масляной
иммерсии. В препаратах подсчитывали процентное
содержание клеток, давших положительную реакцию на пероксидазу.
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (m) и представляли в виде M ± m
(пакет прикладных программ «Statistica 5»). Различия между группами оценивали с помощью непараметрического критерия Смирнова – Колмогорова,
достоверными считались результаты при р < 0,05.
Для определения кататонической реакции использовали метод, описанный в монографии В.Г. Колпакова «Кататония у животных» [4]. Если приподнять
животное палочкой за передние лапы в углу клетки
или у стенки, оно сохраняет в некоторых случаях
вертикальную позу, с более или менее выраженной
восковой гибкостью (каталепсия), после того, как
палочка убрана. Степень выраженности такой каталепсии оценивается по 3-балльной системе:
1 – после убирания палочки крыса немного оседает, не доставая пола передними лапами;
2 – крыса сохраняет вертикальную позу с поднятыми передними лапами и мордой;
3 – крысу удается положить на спину или, по
крайней мере, заставить коснуться пола клетки
крестцом.
У лабораторных крыс можно различить 2 типа
каталептической реакции – собственно каталепсия
с мышечным тонусом типа «пластилин» и застывание с мышечной ригидностью типа «бревно». При
этом резко снижается двигательная активность.
Крыса лежит на полу клетки, не ходит, а ползает.
Таблица 1
Клеточный состав лимфоидных органов у крыс Вистар после введения ретаболила (M ± m)
Показатель
Активный контроль
Ретаболил
Общее количество клеток в органе
359,5 ± 1,8
563,4 ± 48,1*
Количество клеток CD4
44,3 ± 3,6
96,4 ± 5,3*
Количество клеток CD8+
189,7 ± 34,4
22,9 ± 5,3*
Количество активированных лимфоцитов
184,8 ± 5,6
232,3 ± 41,4
Общее количество клеток в органе
459,4 ± 100,2
673,8 ± 84,7
Количество клеток CD4+
242,4 ± 26,3
283,7 ± 39,5
Количество клеток CD8+
195,5 ± 23,4
207,5 ± 46,5
209,4 ± 32,5
215,9 ± 41,9
Тимус (× 106)
+
Селезенка (× 106)
Количество активированных лимфоцитов
Примечание: здесь и в табл. 2, 3: * – отличие от контроля достоверно при р < 0,05.
52
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 30, № 4, 2010 Г.
Пантелеева Н.Г. и др. Влияние ретаболила (дигидроэпиандростерона) на клеточный состав... / с. 51–55
Когда делается попытка приподнять животное палочкой, ощущается сильная мышечная ригидность.
Очень трудно оторвать крысу от пола клетки. У таких животных трудно вызвать вертикальную кататоническую позу, но если крысу перевернуть на спину, она долго сохраняет положение лежа на спине.
Время сохранения насильственно приданной позы
оценивают в секундах.
Результаты и обсуждение
Для комплексной коррекции поведенческих и
иммунных параметров мы исследовали возможность
использования инъекций ретаболила – синтетического аналога дегидроэпиандростерона. Особую
значимость представляют его эффекты, связанные
со стресслимитирующими механизмами и реализующиеся через нейроэндокринные каналы [9].
C другой стороны, показано непосредственное
влияние данного гормона на функции иммунной
системы, причем в ряде случаев это влияние носит
модулирующий характер, проявляясь в действии на
нарушенные параметры и не изменяя нормальные
показатели [10].
В таблице 1 представлены данные, полученные
после введения крысам Вистар ретаболила. Из таблицы 1 видно, что введение ретаболила крысам
Вистар вызывает достоверное увеличение общего
количества клеток в тимусе. Количество клеток с
фенотипом CD4+ оказалось достоверно больше,
чем в активном контроле (р < 0,05), а вот количество клеток CD8+ резко уменьшилось (р < 0,05).
Количество активированных лимфоцитов достоверно не изменилось.
Введение ретаболила не оказало никакого влияния на общее количество клеток в селезенке и субпопуляционный состав.
Крысам ГК ретаболил и растворитель вводили
в той же дозе и в те же часы, что и крысам Вистар.
Полученные данные представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 видно, в тимусе крыс ГК введе-
ние ретаболила вызывает достоверное уменьшение общего количества клеток по сравнению с
активным контролем. Количество лимфоцитов с
фенотипом CD4+ и активированных лимфоцитов достоверных различий с контролем не имеет.
Количество лимфоцитов с фенотипом CD8+ достоверно уменьшилось по сравнению с активным
контролем (р < 0,05). Таким образом, направленность изменений ряда показателей клеточного
состава тимуса крыс ГК под влиянием инъекции
ретаболила оказалась противоположной таковой
у крыс Вистар.
В селезенке крыс ГК по всем исследуемым параметрам достоверных различий с контролем после
введения ретаболила мы не обнаружили. Имеется
лишь слабо выраженная тенденция к увеличению
всех исследуемых показателей.
Поскольку предполагается, что у крыс ГК иммунные и поведенческие аномалии, по крайней мере,
частично, имеют единый механизм, заключающийся в особенностях нейроэндокринноиммунных взаимодействий, необходимо было установить
влияние инъекций ретаболила и на выраженность
каталепсии.
В таблице 3 представлены данные о влиянии
ретаболила на время застывания у крыс Вистар и
ГК. Из таблицы 3 видно, что животные разных линий по-разному реагируют на введение препарата:
у крыс ГК ретаболил приводит к достоверному сокращению времени застывания относительно активного контроля (р < 0,05) – по-видимому, это
можно расценивать как коррекцию поведенческой
аномалии, а у крыс Вистар, напротив, время застывания достоверно увеличилось.
Таким образом, представленные данные показывают, что иммунная система и поведенческие характеристики крыс Вистар и ГК по-разному реагируют на введение ретаболила. У крыс ГК в тимусе
ретаболил приводит к уменьшению всех исследуе-
Таблица 2
Клеточный состав лимфоидных органов у крыс ГК после введения ретаболила (M ± m)
Показатель
Активный контроль
Ретаболил
Общее количество клеток в органе
423,9 ± 58,6
338,2 ± 49,2*
Количество клеток CD4+
294,9 ± 50,5
192,4 ± 41,8
Количество клеток CD8+
242,8 ± 28,6
129,5 ± 41,8*
Количество активированных лимфоцитов
164,9 ± 21,2
200,5 ± 30,1
Общее количество клеток в органе
713,8 ± 54,0
720,3 ± 80,9
Количество клеток CD4+
297,4 ± 33,7
303,2 ± 22,3
Количество клеток CD8+
232,8 ± 40,4
278,3 ± 22,3
Количество активированных лимфоцитов
200,8 ± 20,2
202,7 ± 18,7
Тимус (× 106)
Селезенка (× 106)
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 30, № 4, 2010 Г.
53
Пантелеева Н.Г. и др. Влияние ретаболила (дигидроэпиандростерона) на клеточный состав... / с. 51–55
Таблица 3
Влияние ретаболила на время застывания (секунды)
у крыс ГК и Вистар
Линия крыс
Активный
контроль
Ретаболил
ГК
11,8 + 3,4
4,9 + 2,4*
Вистар
1,9 + 0,6
8,4 + 3,5*
мых параметров с различной степенью выраженности (с достоверностью р < 0,05 или с тенденцией
к снижению) относительно активного контроля, а
у крыс Вистар – наоборот, к увеличению всех этих
показателей за исключением содержания лимфоцитов с фенотипом CD8+ (р < 0,05). Интересно, что
на выраженность каталепсии у животных ГК и Вистар воздействие также оказало противоположное
влияние, что позволяет предположить единый механизм поведенческих и иммунных аномалий при
генетически обусловленной каталепсии. Возможно,
что это связано с особенностями нейроэндокринного статуса животных: есть данные, указывающие
на повышенную серотонинергическую активность
и дефицит дофамина у крыс ГК [2, 4]. Известно,
что ДЭА и ДЭА-сульфат могут модулировать активность серотонин- и дофаминергических систем
мозга [11, 12], которые играют значительную роль
в формировании психических, неврологических и
иммунных расстройств. Вполне вероятно, что ретаболил оказывает комплексное влияние на показатели иммунной системы и поведение животных через изменение нейромедиаторного спектра мозга,
хотя нельзя исключить и его прямое воздействие на
пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток.
Заключение
Таким образом, полученные данные показывают, что у крыс ГК и Вистар существуют особенности реакции иммунной системы и поведения на
гормональный стимул (дегидроэпиандростерон).
Применение ретаболила (синтетический аналог
дегидроэпиандростерона) оказывает комплексное
воздействие на показатели иммунного статуса и
выраженность каталепсии у крыс ГК, что может
служить основанием для отработки методов применения ретаболила при психонейроиммунных нарушениях в клинике.
Благодарности
Мы благодарим коллег из Института цитологии
и генетики СО РАН В.Г. Колпакова, Т.А. Алехину и Н.Н. Барыкину за представленных животных
и помощь в тестировании кататонической реакции у крыс.
Список литературы
1. Крыжановский Г.Н., Магаева С.В., Макаров С.В. Нейроиммунопатология. М., 1997. 283 с.
54
Kryzhanovsky G.N., Magaeva S.V., Makarov S.V.
Neuroimmunopathology. M., 1997. 283 p.
2. Voitenko N.N., Kolpakov V.G., Popova N.K.,
Alekhina T.A. Predisposition to catatonic reactions,
monoamine oxidase and delta-sleepinducing peptide in
rats // Biogenic Amines. 1995. 11. 63–76.
3. Колпаков В.Г., Куликов А.В., Алехина Т.А.
и др. Кататония или депрессия? Линия крыс ГК –
генетическая животная модель психопатологии //
Генетика. 2004. 40.(6). 827–834.
Kolpakov V.G., Kulikov A.V., Alekhina T.A. et al.
Catatonia or depression? The GC rat strain as an animal model of psychopathology // Genetika. 2004. 40.
(6). 827–834
4. Колпаков В.Г. Кататония у животных. Новосибирск, 1990. 169 с.
Kolpakov V.G. Katatonia in animals. Novosibirsk, 1990. 169 p.
5. Пантелеева Н.Г., Грязева Н.И., Вербицкая Л.В.
и др. Сравнительный анализ суточной динамики
субпопуляционного состава лимфоцитов лимфоидных органов крыс с генетической каталепсией и
Вистар // Бюл. экспер. биол. мед. 2004. 137. (3).
325–328.
Panteleeva N.G., Gryazeva N.I., Verbitskaya L.V.
et al. Comparative analysis of diurnal variations in lymphocyte subpopulations in lymphoid organs of rats with
genetic catalepsy and Wistar rats // Byul. exper. biol.
med. 2004. 137. (3). 325–328.
6. Шульга В.А., Барыкина Н.Н., Алехина Т.А.,
Колпаков В.Г. Некоторые физиологические характеристики генетической предрасположенности к каталепсии у крыс в зависимости от стадии селекции //
Рос. физиол. журн. 1996. 82. (10–11). 77–83.
Shulga V.A., Barykina N.N., Alekhina T.A., Kolpakov V.G. The physiological characteristics of genetic
predisposition to catalepsy in rats depending on the
stage of selection // Ros. fiziol. zhurn. 1996. 82. (10–
11). 77–83.
7. Обут Т.А. Андрогены в адаптации организма: биологическая значимость надпочечниковых
андрогенов. Новосибирск, 2004. 104 с.
Obut T.A Androgens in individual adaptation:
biological significance of the adrenal androgens.
Novosibirsk, 2004. 104 p.
8. Полак Д.М., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы.
М., 1987. 74 с.
Polak D.M., Van Norden S. An introduction to
immunocytochemistry: current techniques and problems. M., 1987. 74 p.
9. Ebeling T., Kovisoto V. Physiological importance
of dehydroepiandrosterone // Lancet. 1994. 343. (8911).
1479–1481.
10. Pérez-Neri I., Montes S., Ojeda-López C. et al.
Modulation of neurotransmitter systems by dehydroepiandrosterone and dehydroepiandrosterone sulfate:
mechanism of action and relevance to psychiatric disorders // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry.
2008. 32. (5). 1118–1130.
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 30, № 4, 2010 Г.
Пантелеева Н.Г. и др. Влияние ретаболила (дигидроэпиандростерона) на клеточный состав... / с. 51–55
INFLUENCE OF RETABOLIL (DEHYDROEPIANDROSTERNE)
ON CELL CONTENT OF LYMPHOID ORGANS IN WISTAR
AND GK RATS (GENETICALLY PREDISPOSED TO CATALEPSYA)
Natalija Grigorjevna PANTELEEVА, Anna Veniaminovna SHURLYGINA, Valeriy Alekseevich TRUFAKIN
Instituite of Physiology SB RAMS
6330117, Novosibirsk, Timakov st., 4
Comparative analysis of subpopulation structure of lymphocytes of lymphoid organs of rats GK (genetic catalepsy) and
Wistar after introduction of retabolil has been carried out. It has been revealed that retabolil causes the decrease in the
total amount of cells in thymus and absolute number of thymocytes CD8+. The total amount of cells and thymocytes CD4+
in Wistar rats thymus increased under the influence of retabolil although the number of cells CD8+ reduced. Depression
of various parameters of the immune status at GK rats in comparison with Wistar has been revealed. Introduction of
retabolilum reduces an expression of cataleptic reaction in GK rats and causes the increase in some reduced parameters
of the immune status. Obtained data show, that features of the behavioural and neuroendocrinal status at GK rats are
combined with the certain changes of parameters of immune system.
Key words: catalepsy, lymphoid organs, retabolil.
Panteleeva N.G. – researcher, e-mail: panteleeva@ngs.ru
Shurlygina A.V. – doctor of medical sciences, professor, leading researcher, e-mail: anna_v_s@mail.ru
Trufakin V.A. – academician of RAMS, director
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 30, № 4, 2010 Г.
55