«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ» На правах рукописи СИДОРОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ» На правах рукописи СИДОРОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА IN VIVO АДАПТОГЕННЫХ СВОЙСТВ ФИТОЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩЕГО ЭКСТРАКТА СЕРПУХИ ВЕНЦЕНОСНОЙ 03.01.04. – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук , профессор, Мазо Владимир Кимович Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ _______________________________________________________________ 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ _______________________________ 11 1.1 Понятие об адаптогенах ____________________________________ 12 1.2. Общая характеристика экдистероидов ________________________ 15 1.3 Молекулярные механизмы действия __________________________ 20 1.4. Экдистероидсодержащие препараты и БАД к пище _____________ 27 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ _________ 35 2.1. Экспериментальные животные ______________________________ 35 2.2 Характеристика используемых материалов ____________________ 38 2.3 Получение фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев серпухи венценосной. _________________________________________ 39 2.4. Моделирование стресса путем электрокожного раздражения на лапы ____________________________________________________________ 39 2.5. Дизайн экспериментов in vivo. ______________________________ 40 2.6. Физико-химические методы исследования ____________________ 45 2.6.1. ВЭЖХ методы количественного анализа содержания фитоэкдистероидов в экстрактах. ______________________________ 45 2.6.2 Определение молекулярно-массового распределения белковопептидных фракций _________________________________________ 48 2.6.3. Определение содержания щавелевой кислоты в экстрактах ___ 49 2.7.Биохимические методы. ____________________________________ 49 2.7.1. Иммуноферментные методы анализа. _____________________ 49 2.7.2 Определение содержания норадреналина в плазме крови _____ 50 2.7.3 Определение содержания норадреналина в моче _____________ 51 2.7.4 Определение содержания кортикостерона в моче ____________ 51 2.7.5 Определение содержания окисленной и неокисленной формы 8гидрокси-2’дезоксигуанозина в моче ___________________________ 51 2.7.6 Определение активности апоптоза ________________________ 52 3 2.7.7 Исследование апоптоза лимфоцитов крыс методом проточной цитометрии ________________________________________________ 52 2.8. Физиологические методы___________________________________ 54 2.8.1 Обучение крыс инструментальному пищедобывательному навыку __________________________________________________________ 54 2.8.2. Определение порога острой болевой чувствительности ______ 55 2.9. Статистическая обработка результатов исследований ___________ 56 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ____________________ 57 И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ___________________________________________ 57 3.1. Экспериментальное обоснование применимости болевого электрокожного раздражение на лапы крыс линии Вистар в качестве модели стрессорного воздействия. _______________________________ 57 3.1.1 Влияние электрокожного раздражения на некоторые биомаркеры ОАС.______________________________________________________ 57 3.1.2 Влияние витаминной обеспеченности растущих крыс-самцов линии Вистар на их устойчивость к воздействию электрическим током на лапы. ___________________________________________________ 61 3.2. Характеристика фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев серпухи венценосной. _________________________________________ 62 3.3 Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на некоторые биомаркеры ОАС у интактных (не стрессированных) крыс. 64 3.4. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на некоторые биомаркеры ОАС у крыс после стрессорного воздействия. _ 71 3.5. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на изменение порога острой болевой чувствительности и потенциальные анальгезирующие эффекты в ответ на термическое раздражение. _____ 77 3.6. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на способность лабораторных животных (крыс) к обучению инструментальному пищедобывательному навыку. ________________ 79 4 3.7. Получение и характеристика фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев шпината огородного ________________________ 84 ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. _____________________________________ 90 ВЫВОДЫ _______________________________________________________________ 100 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ___________________________ 102 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы Повышение эффективности использования специализированных пищевых продуктов в питании для существенного улучшения здоровья населения и снижения потерь от социально значимых заболеваний предполагает проведение физиолого-биохимических исследований, направленных на комплексную оценку биологически-активных компонентов пищи [49]. Одним из инновационных подходов к созданию нового поколения специализированных продуктов может стать использование в их составе в качестве «микроингредиентов» растительных минорных биологически активных веществ адаптогенного действия - фитоадаптогенов, повышающих резистентность организма к стрессам, препятствующих формированию иммунодефицитных антиоксидантной состояний, защиты, нарушению хронизации функции болезней, повышению систем риска развития распространенных заболеваний [10, 21, 31]. Обоснованием перспективности такого подхода является положение о том, что, в отличие от эффектов различных допинговых средств, адаптогены не вызывают отрицательного последействия, характеризуется неспецифичностью и множественностью проявляемых эффектов, а также отсутствием токсичности при условии правильно подобранных низких дозировок [15, 56]. Фитоадаптогены, получаемые обычно из лекарственных растений (женьшеня, элеутерококка, аралии, левзеи и многих других), формально не являются пищевыми веществами, и их использование в специализированном питании в настоящее время существенно ограничено. Однако скрининговые целенаправленные исследования позволяют выявлять фитоадаптогены, содержащиеся и в составе пищевых растений, хотя и в существенно меньших количествах, чем в дикорастущих лекарственных растениях [59, 65, 77, 79]. Особый интерес для использования в специализированном питании могут представлять растительные источники фитоэкдистероидов - полигидроксилированных стеринов, являющихся структурными аналогами 6 гормонов линьки и метаморфоз членистоногих [12, 51]. В научной литературе представлены множественности публикации, (плейотропности) свидетельствующие биологического действия о этих соединений [3, 35, 43, 52, 88, 99, 115]. Фитоэкдистероиды, воздействуя на растительноядных беспозвоночных и участвуя, таким образом, в регуляции численности фитофагов, не оказывают гормонального действия на млекопитающих и обладают низкой токсичностью. За последние годы достигнут большой прогресс в изучении фитоэкдистероидов: выявлены виды растений, в которых обнаружены новые экдистероиды, закономерности распространения фитоэкдистероидов высокопродуктивные растений, линии разработаны экдистероидов в культур новые царстве клеток методы и научные основы растений, получены экдистероидсодержащих химической модификации получения фитоэкдистероидов из растительного сырья [13, 53, 60, 75, 90, 91, 92, 98]. Исследования in vivo и с использованием культур клеток свидетельствуют о коррегирующем воздействии фитоэкдистероидов на процессы белкового, углеводного и жирового обмена [78, 91]. Что касается полученных в клинических условиях и с привлечением добровольцев-спортсменов относительно немногочисленных сведений о влиянии фитоэкдистероидов на когнитивные функции, то они указывают на снижение нервной утомляемости, улучшение памяти и внимания [7, 10, 45]. Активно ведутся исследования по идентификации молекулярных мишеней экдистероидов у млекопитающих [58, 84, 90, 103]. Можно предположить определенное сходство адаптации на уровне клетки под действием глюкокортикостероидов и этого же процесса под влиянием структурно - сходного с ними 20-гидроксиэкдизона. Для проверки этого предположения представляется актуальным проведение экспериментальных исследований влияния фитоэкдистероидов на биомаркеры общего адаптационного синдрома (ОАС) Селье, как при отсутствии стрессорного воздействия, так и при его последующем проявлении. Одним из наиболее широко изучаемых фитоэкдистероидов 7 является - 20-гидроксиэкдизон (20Е), содержащийся в некоторых видах дикорастущих растений, а также шпинате. Множественность фармакологических эффектов в сочетании с низкой токсичностью 20гидроксиэкдизона позволяет использовать его (преимущественно как индивидуальное соединение) в составе лекарственных препаратов и БАД к пище [1, 23, 107,108, 121]. Перспективным природным источником фитоэкдистероидов являются растения рода Serratula L (сем. Asteraceae), в частности серпуха венценосная (Serratula coronata L), в наземной части которой содержание 20гидроксиэкдизона составляет около 2% в пересчете на сухую массу. В водном экстракте наземных частей серпухи венценосной помимо 20гидроксиэкдизона присутствует другой мажорный экдистероид- 25Sинокостерон. В листьях шпината содержание 20-Е на порядок ниже. Однако могут быть разработаны современные высокотехнологичные физико-химические и биотехнологические методы препаративного выделения и концентрирования для получения сухих растительных экстрактов пищевых растений с относительно высоким содержанием фитоадаптогенов. Растительные экстракты, содержащие фитоэкдистероиды и другие биологически активные вещества, могут найти свое применение в качестве компонентов отвечает широкого задачам спектра специализированных рационального продуктов, природопользования что уникальных растительных ресурсов России [117]. Цель и задачи исследования Цель настоящей работы: в опытах in vivo (крысы линии Вистар) охарактеризовать влияние фитоэкдистероидсодержащего экстракта из серпухи венценосной на некоторые биомаркеры общего адаптационного синдрома и когнитивные функции. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 8 1.Экспериментально обосновать применимость выбранных параметров болевого электрокожного раздражения лап крыс линии Вистар (ток 0,4 мА в течение 8 сек) в качестве модели стрессорного воздействия. 2.В опытах in vivo охарактеризовать влияние перорального приема различных доз фитоэдистероидсодержащего экстракта из cерпухи венценосной на некоторые биомаркеры общего адаптационного синдрома у интактных крыс. 3.В опытах in vivo изучить изменения некоторых биомаркеров ОАС у стрессированных электрокожным раздражением крыс при потреблении ими экстракта серпухи венценосной. 4. В опытах in vivo охарактеризовать влияние экстракта серпухи венценосной на изменение порога острой болевой чувствительности у крыс линии Вистар и потенциальные анальгезирующие эффекты экстракта в ответ на термическое раздражение животных. 5.В опытах in vivo путем обучения крыс линии Вистар инструментальному пищедобывательному навыку охарактеризовать влияние экстракта серпухи венценосной на некоторые когнитивные и поведенческие показатели этих животных. 6.Разработать метод получения сухого экстракта из листьев шпината пищевого с повышенным содержанием фитоэкдистероидов и предельно низким содержанием щавелевой кислоты. Научная новизна работы В экспериментах in vivo установлено, что однократное принудительное электрокожное раздражение силой тока 0,4 мА и продолжительностью 8 секунд на лапы крыс линии Вистар вызывает достоверное увеличение уровня медиаторов стресса кортикостерона и бета-эндорфина в плазме крови крыс, которое сопровождается достоверным увеличением активности апоптоза в клетках тимуса животных. 9 Показано, что потребление различных дозировок фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев растения серпуха венценосная не влияет на ростовые показатели крыс линии Вистар в экспериментах продолжительностью 15-30 суток. Впервые отмечено достоверное увеличение массы тимуса, сочетающееся со снижением активности апоптоза в этом органе, у стрессированных животных, получавших экстракт в дозе 2 мг фитоэкдистероидов/кг массы тела в течение 30 суток, по сравнению с контрольными стрессированными крысами. Показано, что потребление экстракта в дозе 5 мг фитоэкдистероидов /кг массы тела в течение 15 суток достоверно снижает у крыс после электрокожного раздражения экскрецию с мочой биомаркеров ОАС: кортикостерона и норадреналина. Установлено, что потребление экстракта серпухи венценосной в дозе 2мг фитоэкдистероидов/кг массы тела в течение 25 суток способствует адаптации организма к новым условиям и ускоряет процессы обучения и памяти у животных при обучении инструментальному пищедобывательному навыку. В тесте горячая пластина обнаружено, что потребление экстракта серпухи венценосной в течение 30 суток в дозе 5мг экдистероидов /кг массы тела крысы достоверно увеличивает время до возникновения болевого оборонительного рефлекса в 1,9 раза, и повышает способность крыс к обучению избегания опасности. Практическая значимость работы Результаты исследований in vivo влияния водного экстракта из листьев серпухи венценосной на некоторые показатели ОАС у стрессированных животных могут быть использованы для обоснования дальнейшего клинического исследования экстракта в профилактическом питании. Предложен и апробирован новый экспериментальный комплексный подход для выявления адаптогенных свойств у минорных биологически 10 активных веществ растительного происхождения с использованием биохимических и физиологических методов. Значимым научно - практическим приложением работы является разработка метода получения из листьев шпината экстракта с повышенным содержанием фитоэкдистероидов и практическим отсутствием щавелевой кислоты. Положения, выносимые на защиту 1. Экспериментальный метод оценки адаптогенных свойств фитоэкдистероидов, включающий определение экскреции с мочой биомаркеров общего адаптационного синдрома (кортикостерона и норадреналина) и активности апоптоза в тимусе стрессированных электрокожным раздражением крыс линии Вистар. 2. Экстракт из листьев серпухи венценосной как фитоадаптоген, повышающий устойчивость к стрессорному воздействию электрическим током 0,4 мА в течение 8 сек и коррегирующий развитие общего адаптационного синдрома у крыс линии Вистар. Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на: ХХ международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф, 2012; III Международной междисциплинарной конференции "Современные проблемы системной регуляции физиологических функций", Кипр, Греция, 2013; V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 2013; ХХI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф, 2013; 11 XV Всероссийском международным участием конгрессе диетологов и нутрициологов питание: от фундаментальных «Здоровое с исследований к инновационным технологиям», Москва, 2014. Апробация работы состоялась 25 сентября 2014 г. на межлабораторной научной конференции ФГБНУ «НИИ питания». Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 6 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации. Личный вклад соискателя Все изложенные в диссертации результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций. Объём и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, разделов материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения и выводов. Список литературы содержит 125 источников, из них 56 российских и 69 зарубежных источников. Объем работы составляет 115 страниц машинописного текста, содержит 27 рисунков, 18 таблиц. 12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Понятие об адаптогенах Растительные адаптогены относятся к биологически-активным веществам (БАВ) – природным регуляторам метаболизма, повышающим способность организма адаптироваться к условиям окружающей среды и неблагоприятным ее изменениям. Основное и определяющее отличие адаптогенов от других БАВ связано с их неспецифическим эффектом, заключающимся повреждающих в увеличении факторов устойчивости физической, к химической широкому и кругу биологической природы. Адаптогены характеризуются проявлением широкого круга терапевтических эффектов, не вызывая отклонений (даже минимальных) нормального функционирования организма [56]. Термин адаптоген самым тесным образом связан с понятиями «стресс» и «фаза резистентности к стрессорному воздействию», а также понятием «состояние неспецифически повышенной сопротивляемости» (СНПС) организма [24]. Состояние стресса является одним из защитных приспособительных механизмов организма на любое сильное раздражение из вне, так называемым общим адаптационным синдромом (ОАС) [22, 112, 112]: изменением деятельности центральной нервной системы, эндокринных желез, метаболических процессов. Фаза резистентности при стрессе, которая и «является собственно адаптацией» при стрессорном воздействии, характеризуется активацией процессов, протекающих на тканевом и клеточном уровнях, обеспечивающих новый уровень гомеостазиса [29, 36]. Изменение гормонального фона осуществляется системой АКТГ-глюкокортикоиды, происходит мобилизация цАМФ, повышается синтез ряда структурных белков и ферментов, реагирует иммунная система, нарастает глюконеогенез. Однако при достаточно мощном по силе и длительности дисстрессорном воздействи не происходит перехода адаптивного процесса в стадию относительной резистентности с нормализацией 13 признаков напряжения, а формируется стадия истощения, характеризующаяся серьезными нарушениями гормонального баланса и тканевого обмена веществ. В результате стрессовая реакция организма из неспецифического звена адаптации может превратиться в общее неспецифическое звено патогенеза, способствуя развитию целого ряда болезненных проявлений, и в предельном случае может привести даже к летальному исходу [9, 28, 29]. Состояние организма, позволяющее ему «избежать» стадии истощения вследствие повышенной устойчивости организма к различным неблагоприятным воздействиям было определено в конце пятидесятых годов прошлого века отечественным ученым Н.В. Лазаревым как «Состояние Неспецифически Повышенной Сопротивляемости» (СНПС) [24]. В современной отечественной научной литературе понятию СНПС обычно соответствуют термины «высокий (повышенный) уровень адаптационного потенциала» или «повышенная резистентность к неблагоприятным воздействиям различной природы». СНПС имеет определенное сходство со стадией резистентности однако, в отличие от неё СНПС оказывает регулирующее воздействие, оптимизирующее развитие ОАС [56, 112, 112], не являясь следствием (фазой) стресса. В СНПС, то есть в оптимальном для организма состоянии, существуют значительно большие возможности, чем в стадии резистентности ОАС, избежать избыточного напряжения и, как следствие, перехода в стадию истощения. Как было показано многочисленными работами советских исследователей в пятидесятых-шестидесятых годах прошлого века, достаточно быстрое достижение состояния СНПС может быть достигнуто путем поступления в организм целого ряда различных соединений растительного, животного или искусственного происхождения, которые и получили в отечественной научной литературе общее название адаптогенов. Физиологическая активность адаптогенов отвечает трем критериям: 1) адаптогены должны быть безвредны для организма, обладать широким спектром терапевтического действия, но при этом вызывать минимальные сдвиги в организме в норме; 2) неспецифическое действие адаптогенов 14 определяется увеличением устойчивости организма к вредному действию широкого спектра факторов физической, химической и биологической природы; 3) адаптогенам свойственно нормализующее действие, которое не зависит от направленности предшествующих сдвигов [56]. Ключевыми при обсуждении фармакологических эффектов адаптогенов являются вопросы о том, чем адаптогены отличаются от хорошо известных стимуляторов (допингов) и какими механизмами определяется общий принцип их действия в качестве регуляторов метаболизма. Как отмечается в обзорной работе [103] различие между адаптогенами и стимуляторами было наглядно продемонстрировано в серии биохимических исследований в конце шестидесятых годов прошлого века. В этой же работе наглядно графически показано (рис.1.1), что если при использовании допинга за начальным повышением работоспособности наступает её резкий спад (относительно базового уровня), то при применении адаптогена работоспособность «после достижения максимума» не снижается до минимального уровня. Рисунок 1.1.1 Различие воздействия адаптогенов и стимуляторов Вещества-адаптогены согласно [102, 104]:могут быть разделены на группы по близости их структуры к эндогенным медиаторам стресса той или иной природы. Фенольные соединения, структурно подобны катехоламинам (эндогенным стрессовым медиаторам симпато-адреналовой системы), 15 тритерпеновые гликозиды структурно близки гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой кортизолу системы, так (медиатору называемому гормону стресса). Оксилипины, будучи окисленными жирными кислотами, проявляют действие, свойственное простагландинам. Можно предположить, что специфика фармакологического действия препаратов на основе различных растений - адаптогенов непосредственно связана с их структурной близостью вышеперечисленным медиаторам стресса. В связи с вышеизложенным среди биологически-активных веществ растительного фитоэкдистероиды происхождения - особое полигидроксилированные внимание стерины, привлекают являющиеся структурными аналогами гормонов линьки и метаморфоз членистоногих [51]. О соответствии фитоэкдистероидов критериям, характеризующим биологически-активные соединения как адаптогены свидетельствует и структурная схожесть этих соединений с глюкокортикостероидами основными стресс-медиаторами, защищающим организм млекопитающих от чрезмерной (истощающей) реакции на сстрессорное воздействие. Существует гипотеза, что наблюдаемый адаптогенный эффект связан со сбалансированным адекватным изменением уровня наиболее важных стресс медиаторов - активаторов стресса (в первую очередь, таких как катехоламины, кортикотропин–рилизинг гормон, аргинин – вазопрессин гормон) и его ингибиторов (глюкокортикоиды, простагландин Е2, опиоидные пептиды) [102-104]. Согласно этой гипотезе адаптоген выступает в роли «мягкого прострессора», снижающего «избыточное» возрастание стрессмедиаторов при последующем стрессорном воздействии. 1.2. Общая характеристика экдистероидов Первые работы по выделению из растений стероидных веществ с активностью гормонов линьки и метаморфоза насекомых, были проведены в семидесятых годах прошлого века [76, 97]. Регулирующее влияние 16 экдистероидов на белоксинтезирующие процессы в организме насекомых связано в основном со стимуляцией синтеза определенных ферментов на уровне транскрипции, способствующих склеротизации кутикулы личинок в процессе их превращения в куколки [43]. К настоящему времени известно, что соединения экдистероидной природы широко распространены в растительном мире. Встречаются они как в низших растениях: водорослях, грибах, что свидетельствует в пользу очень древнего происхождения молекул экдистероидов [19], так и в высших папоротникообразных, голосемянных и покрытосемянных. Впервые экдистероиды были обнаружены в растениях японским исследователем К. Наканиси в 1966 г. во время этноботанической экспедиции на о. Тайвань [97]. Из листьев Podocarpus nakai, которые местные жители использовали в качестве противоопухолевого средства, было выделено соединение понастерон А, обладающее активностью гормона линьки насекомых. Вслед за открытием К. Наканиси понастеронов А, В и С из другого австралийского вида Podocaгpus elatus был выделен 20гидроксиэкдизон (20Е). Согласно результатам исследований, проведенных в 70-80-е годы прошлого века представителями различных научных школ, считалось, что экдистероиды характерны главным образом для папоротников и голосеменных, а у цветковых растений они встречаются реже [82, 109, 110]. Однако результаты исследований, полученные в 90-е годы ХХ века и в наши дни, показывают, что экдистероиды широко распространены и среди цветковых растений [26, 51]. Наибольшее количество экдистероидсодержащих видов обнаружено в семействах Amaranthaceae (23 вида из 9 родов), Asteraceae (23 вида, в основном из родов Stemmacantha и Serratula), Caryophyllaceae (125 видов, в основном из родов Silene и Lychnis), Chenopodiaceae (13 видов из 8 родов), Lamiaceae (14 видов, причем 13 - из рода Ajuga), Ranunculaceae (30 видов, из них 11- из рода Helleborus). Всего к настоящему времени экдистероиды обнаружены у растений из более чем 100 17 семейств (отделы Polypodiophyta, Pinophyta и Magnoliophyta). Большой практический интерес представляет обнаружение экдистероидов в пищевом растении шпинат (Spinacia oleracea) [61], некоторых сорных видах растений родов Chenopodiuт и Atriplex [73], употреблявшихся населением в пищу в военные и голодные годы [50]. Другие родственные шпинату пищевые растения, такие как киноа или рисовая лебеда (Chenopodium quinoa) и спаржа (Asparagus) можно рассматривать в качестве потенциальных источников фитоэкдистероидов. Содержание фитоэкдистероидов в некоторых видах растений относительно высоко и может составлять до 1-2% (на сухой вес). В основе строения экдизонов лежит циклопентанпергидрофенантрен, в 17-м положении которого присоединяется цепочка из восьми углеродных атомов. Это стероиды с общим количеством углеродных атомов 27,28, 29, 30. Общими элементами в структуре фитоэкдистероидов являются циссочленение колец А/В в стероидном ядре, ∆7-6 сопряженная кетогруппировка в кольце В и 14α-OH-группа [2]. Наиболее широко распространены экдизон и 20-гидроксиэкдизон (устаревшее название экдистен), для которого принято сокращение 20-Е. Общая структурная формула фитоэкдистероидов представлена на рисунке 1. Рисунок 1.2.1 – Общая структурная формула фитоэкдистероидов 18 Предполагается существование более 1000 различных структур этого класса соединений, но пока выделено и подтверждено строение лишь их незначительной части [6]. Исторический путь изучения биологического действия фитоэкдистероидов начинался с постановки вопроса об их возможности как гормонов насекомых «оказывать какое-либо физиологическое действие на организмы, не способные к их эндогенному продуцированию и стоящие по сравнению с беспозвоночными животными на более высокой ступени эволюции». Когда было установлено отсутствие гормонального действия экдистероидов на млекопитающих и одновременно были выявлены их многочисленные фармакологические эффекты, стали очевидными широкие потенциальные возможности практического использования этих соединений [12, 90]. Очень важно подчеркнуть низкую токсичность экдистероидов. Например, при хроническом введении 20Е в течение 6 мес. крысам-самцам в дозах 0.05, 0.5 и 5 мг/кг два раза в сутки отмечено увеличение их массы на 14, 25 и 17% соответственно с сохранением хорошего общего состояния и отсутствием нарушений в поведении. В указанных дозах не обнаружено структурных изменений морфологической картины периферической крови и мочи, что также свидетельствует о крайне низкой токсичности 20Е [4, 15]. Вскоре после обнаружения экдистероидов в растениях были получены результаты, свидетельствующие о благоприятном влиянии фитоэкдистероидов на липидный и углеводный обмен у теплокровных животных [119]. Также достаточно давно и хорошо документировано стимулирующее влияние на синтез белка в печени для экдистероидов, структура которых содержит гидроксильную группу в 20,22 положениях, [100]. Однако спектр проявления фармакологической активности экдистероидов существенно шире, о чем, свидетельствуют многочисленные экспериментальные исследования, в которых экдистероиды или экдистероидсодержащие растительные экстракты вводились лабораторным животным перорально или внутрибрюшинно. Так, повышение 19 работоспособности у лабораторных животных (мышей) при оральном введении им экстракта левзии сафлоровидной или серпухи венценосной было продемонстрировано в опытах с моделированием принудительного бега и плавания [88]. Увеличение содержания белка в мышцах, на фоне увеличения мышечной массы и повышения физической работоспособности (плавательный тест) после ежедневного внутрибрюшинного введения 20-Е мышам в дозе 5мг/кг массы тела имело место, как при использовании физической нагрузки, так и в её отсутствие [54]. Под действием 20-Е в работе [89] установлена повышенная ретенция азота пищи. Исследование, представленное в работах [42, 77] также свидетельствует об увеличении мышечной силы и индукции синтеза белка в скелетных мышцах 20гидроксиэкдизоном или содержащими его экстрактами из экдистероидсодержащих растений, в том числе шпината, однако без увеличения мышечной массы. В работе [43] 20-гидроксиэкдизон, выделенный из Rhaponticum integrifolium, и препарат сравнения Ретаболил вводили мышам орально в дозах 5.0 и 10.0 мг/кг соответственно за 4ч до начала эксперимента. Установлено возрастание абсолютной скорости синтеза белков под действием обоих стероидов. Однако принципиальным отличием между ними оказалось то, что этот процесс при введении мышам 20-Е не связан с включением новых генов и индукцией синтеза мРНК, в отличие от механизма действия Ретаболила, который в первую очередь зависит от его активирующего влияния на транскрипционные процессы, усиление синтеза рибонуклеиновых кислот и прежде всего мРНК. Действие экдистероидов у млекопитающих также принципиально отлично от действия стероидных анаболических препаратов − синтетических аналогов мужских половых гормонов. Таким образом, по мнению авторов цитированной статьи [43] у млекопитающих белково-анаболическое действие 20-Е не определяется его влиянием на пути передачи генетической информации, как у насекомых, а является отражением ускорения трансляционных процессов. Благоприятное 20 влияние 20-Е на липидный и углеводный обмен у теплокровных животных было установлено в ряде экспериментальных исследований, например, было выявлено, что 20Е, введенный per os крысам, снимает гипергликемию, вызванную либо глюкагоном, либо аллоксаном [94, 118], а также стимулирует включение глюкозы в гликоген в печени мышей [122] и регулирует расход глюкозы в тканях [44] Множественность проявляемых фитоэкдистероидами эффектов, направленных на «нормализацию всего симптомокомплекса негативных сдвигов, возникающих в организме под воздействием многих дестабилизирующих факторов как общестрессирующего характера, так и относительно избирательно поражающих отдельные органы и системы заставляет предположить их стресс-протекторное действие» [11] К настоящему времени достигнут фармакологических значительный свойств высокопродуктивных линий прогресс в фитоэкдистероидов, культур клеток изучении получении экдистероидсодержащих растений, разработке методов химической модификации экдистероидов, в получении фитоэкдистероидов из растительного сырья и клеточных культур. Результаты проведенных исследований обобщены в ряде обзоров и монографий [5, 13, фармакологических 53]. Так, эффектов например, различных всесторонний препаратов анализ экдистероидов, выявленных в исследованиях на млекопитающих, представлен в обзоре Р. Лафона (Франция) подчеркивается и Л. Дайнана значительный вклад (Великобритания), в эту проблему в котором советских исследователей [90]. 1.3 Молекулярные механизмы действия Существенный прогресс достигнут к настоящему времени в понимании природы молекулярных механизмов, обеспечивающих множественность биологических эффектов фитоэкдистероидов, в том числе влияние на белковый, углеводный обмен и клеточный апоптоз. Имеются экспериментальные доказательства участия 20-Е (или его метаболитов) в 21 PI3K пути активации обозначаемой также серин-треониновой как PKB/Akt протеинкиназы или просто В (РКВ) Аkt-сигнальной макромолекулы, являющаяся ключевой в регуляции клеточной активности. [77]. Akt участвует во многих важных клеточных процессах, включая рост клеток, их выживание и метаболизм глюкозы (Whiteman et al. 2002) [120], что объясняет столь широкий спектр эффектов фитоэкдистероидов. 20-Е (или возможно его метаболит) взаимодействует с рецептором клеточной мембраны, молекулярная природа которого не определена (рисунок 1.3.1). Обозначения: 20Е – 20-гидроксиэкдизон IP3-инозитолтрифосфат G– G белок PLC – фосфолипаза С PIP2- фосфотидилинозитол - бифосфат SR – цитоплазматический ретикулум PI3K – фосфотидилинозитол – 3 - киназа AKT – протеинкиназа В PDK1 – фосфоинозитид-зависимая протеинкиназа 1 Рисунок 1.3.1.Механизм действия 20Е [77]. 22 Рецептор в свою очередь взаимодействует с G-белком, субъединицы которого (Gαq или Gβγ) активируют фосфолипазу С (PLCβ) (рис.1.3.2). Находясь в составе комплекса: рецептор-G-белок, фосфолипаза С катализирует расщепление мембранного фосфолипида фосфатидилинозитол4,5-дифосфата (PIP2) на два вторичных медиатора: инозитолтрифосфат (IP3) и диацилглицерин (DAG). (Уравнение 1.3.1). Эти медиаторы вовлекаются в последующие этапы сигнальных путей Рисунок 1.3.2. – Активация фосфолипазы С Примечание: Активация PLCβ требует дополнительно взаимодействия с субъединицами Gβγ или Gα G-белка. Во всех PLC каталитический домен разделен на две части обозначенные как X и Y, длинный С конец (tail) (примерно 500 аминокислот) PLC β связывает ее с мембраной для регуляции α- субъединицей G-белка. 23 Уравнение 1.3.1.- Расщепление мембранного фосфолипида PIP2 на два вторичных медиатора. IP3 модулирует кальциевые каналы саркоплазматического ретикулума: в результате связывания IP3 с активируемым им Са2+ каналом (IP3 рецептором) происходит выход кальция из саркоплазматического ретикулума, который служит депо ионов кальция (концентрация Са2+может достигать 10−3 моль). При увеличении уровня ионов Са2+ от 10-7М до микромолярных концентраций в цитоплазме повышается активность фосфатидилинозит-3киназы (PI3K), которая является одним из важнейших регуляторных белков, находящихся на пересечении различных сигнальных путей, контролирующих ключевые функции клетки. Фосфатидилинозитол-3-киназа представляет собой гетеродимер, состоящий из регуляторной субъединицы с молекулярной массой 85 кДа (р85) и каталитической субъединицы 110 кДа (р110) [67, 96]. При клонировании с ДНК было выявлено не менее пяти форм каждой из субъединиц [74, 83, 101, 105, 113]. Фосфатидилинозит-3-киназа (PI3K) активирует протеинкиназу В (PKB) следующим образом: фермент фосфорилирует фосфатидилинозит-4- монофосфат (PI4Р) и фосфатидилинозит-4,5- дифосфат (PI4,5Р2) по 3 ОН группе спирта (рисунок 1.2.3). 24 Рисунок 1.2.3. - Возможные превращения PI3 под действием PI3-киназы Образовавшиеся фосфатидилинозитдифосфат (PI3,4Р2) и фосфатидилинозиттрифосфат (PI3,4,5Р3) выступают в качестве посадочной площадки для неактивной формы протеинканазы В и, взаимодействуя с неактивной РКВ через PH-домен (Pleckstrin Homology domain, 120 остатков аминокислот), выполняющий функции заякоривания фермента, прикрепляют РКВ к мембране. Фиксированная на мембране PKB фосфорилируется фосфоинозитидзависимой протеинкиназой 1 (PDK-1) по остатку треонина 308 (Т308) и неидентифицированной PDK-2 протеинкиназой 2 по остатку серина 473 (S 473). Это дифосфорилирование приводит к активации PKB и её диссоциации в цитозоль (рисунок 1.3.4) . 25 Фосфорилирование и активация PKB Синтез белка Транспорт глюкозы Синтез гликогена Рисунок 1.2.4 Активация протеинкиназы В В цитозоле активированная PKB осуществляет фосфорилирование разнообразных белков-субстратов, тем самым модулируя их функции и играя центральную роль в многообразных клеточных процессах. Семейство протеинкиназ B (PKB) человека включает в себя три внутриклеточных белка, кодируемых генами Akt1, Akt2, Akt3. 1)RAC-альфа серин/треониновая протеинкиназа (продукт гена Аkt1) участвует в путях, которые обеспечивают выживание клеток, путём ингибирования апоптоза. Также способна индуцировать биосинтез белка, таким образом, косвенно участвует в гипертрофии скелетных мышц и общем росте тканей. Из-за блокирования апоптоза выступает причиной многих типов рака. Киназа Akt1 состоит из 480 аминокислотных остатков. По своей структуре она очень близка к двум другим членам семейства протеинкиназ B (Akt2 и Akt3) и включает следующие домены: N-концевой домен гомологичный PH домену, киназный домен и C-концевой регуляторный домен, содержащий гидрофобный мотив. Регуляция активности киназы 26 происходит за счёт фосфорилирования/дефосфорилирования двух аминокислотных остатков — Thr-308 в киназном домене и Ser-473 в гидрофобном мотиве. В настоящее время различают несколько независимых механизмов, активируемых через РKВ и способных привести к ингибированию апоптоза (рис.1.2.5). Следует отметить, что среди прямых мишеней РКВ не было обнаружено основных белков семейства Всl-2, относящихся к одним из наиболее распространенных негативных регуляторов апоптоза [85]. Исключение составляет лишь Bad, фосфорилирование которого киназой РКВ предотвращает его связывание с Всl-2 [123, 125]. Рисунок 1.2.5 Механизмы, активируемые через РKВ, способные привести к ингибированию апоптоза 2) RAC-бета серин/треониновая протеинкиназа (продукт гена Akt2) участвует в инсулиновом сигнальном пути, индуцирует транспорт глюкозы из цитоплазматических везикул в плазмалемму. Гипогликемический эффект 20-Е связан с изменением активности в печени некоторых ключевых ферментов метаболизма углеводов, а именно снижением уровня глюкозы-6-фосфатазы, стимуляцией гликоген синтазы и 27 глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [119]. Эти изменения приводят, как известно, к повышению синтеза гликогена, снижению высвобождения глюкозы из печени в кровь, повышению конверсии глюкозы в липиды. In vitro на культурах клеток гепатоцитов показано, что влияние 20-Е на углеводный обмен, также как и его анаболическое действие, опосредовано системой PI3K/Akt. Фосфорилированная (активированная) Akt стимулирует перемещение везикул, содержащих транспортер глюкозы Glut-4 к клеточным мембранам гепатоцита, что приводит к повышению поглощения глюкозы из крови [86]. Также снижается транскрипция генов, кодирующих глюкозо-6фосфатазу и фосфоэнолпируват карбоксикиназу: ключевых ферментов глюконеогенеза. 3) Функции RAC-гамма серин/треониновой протеинкиназы (продукт гена Аkt3) достоверно неизвестны; показано, что она стимулируется тромбоцитарным фактором роста (PDGF), инсулином и инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF-1). У взрослых экспрессируется в основном в мозгу, лёгких и почках. 1.4. Экдистероидсодержащие препараты и БАД к пище О весомых достижениях Российских исследователей в изучении фитоэкдистероидов и их авторитете в этой области свидетельствует проведение Первого (1996г) и Второго (2010г) международных совещаний по фитоэкдистероидам в Сыктывкаре на базе Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Экдистероидсодержащие препараты адаптогенного действия начали использоваться в практической медицине СССР еще с 1961 г., когда экстракт корневищ рапонтикума сафлоровидного вошел в Государственную Фармакопею СССР. Корневища растения стандартизовались по сумме экстрактивных веществ еще до установления того факта, что тонизирующие свойства рапонтикума сафлоровидного связаны с наличием экдистероидов, 28 которые были обнаружены в растении только в 1974 г. Первым отечественным экдистероидсодержащим препаратом тонизирующего действия, стал лекарственный препарат «Экдистен», выделенный из корневищ рапонтикума сафлоровидного и разрешенный к медицинскому применению с 1987 г. Фармакологическая активность «Экдистена» определяется наличием в его составе 20-Е. Препарат находит применение в качестве тонизирующего средства; у спортсменов во время интенсивных тренировок в качестве средства, повышающего скоростно-силовые качества в период подготовки к соревнованиям, а также при дисфункциях сердечнососудистой системы особенно с выраженными признаками перенапряжения миокарда и усилением белкового катаболизма [23]. Кроме использования в спортивной медицине препарат может быть эффективно применен при лечении лямблиоза у больных с выраженными нарушениями иммунного статуса (больные туберкулезом и ВИЧ-инфицированные) [21]. Терапевтическая доза составляет 30 мг/сут [27]. Высокая эффективность и одновременно безвредность данного препарата при использовании в период подготовки высококвалифицированных спортсменов привели к разработке и регистрации в 2007 г. новых отечественных экдистероидсодержащих БАД к пище для спортивной медицины; в том числе обогащенных комплексом витаминов группы В, витаминами-антиоксидантами (витамины А, С и Е), комплексом витаминов - С, В1, Е, В2, В6, А, D3, фолиевая кислота, никотиновая кислот. Эти БАД к пище по мнению разработчиков могут быть использованы в питании людей, испытывающих большие физические и умственные нагрузки в повседневной жизни, как профилактическое средство и в спорте для ускоренного набора мышечной массы, увеличения мышечной силы, значительного ускорения восстановления после любого вида нагрузок, для увеличения скоростно-силовых показателей, во время интенсивных тренировок. В 2013 г. зарегистрирован еще один специализированный пищевой продукт для питания спортсменов, содержащий в своем составе экстракт корня рапонтикума сафлоровидного, экстракты винограда и яблока, 29 растительные полифенолы, витамины В2, В6, В1. Следует отметить также многолетние экспериментальные исследования и разработки узбекскими учеными препаратов на основе экдистероидов, стимулирующих психическую и физиологическую активность [52]. Ими созданы лекарственные препараты, а также БАД к пище, содержащие экдистерон, туркестерон, циастерон и другие фитоэкдистероиды, выделенные из Рапонтикума Сафлоровидного и Живучки туркестанской (Ajuga turkestanica). При применении этих средств в клинических условиях у пациентов имело место улучшение психоэмоционального статуса, астенических синдромов, повышались умственная и физическая работоспособность, ускорялся процесс реабилитации после заболеваний. Установлена эффективность этих препаратов в практике спортивной медицины в плане ускорения процесса адаптации и восстановления после максимальных и субмаксимальных физических нагрузок [45]. Препарат на основе экстракта Живучки туркестанской также повышал адаптационные возможности организма женщин к стрессовым ситуациям [1]. В течение длительного времени основным источником 20гидроксиэкдизона было лекарственное растение рапонтикум сафлоровидный (Rhaponticum carthamoides). Необходимость поиска новых растительных источников этого фитоэкдистероида диктовалась основными причинами. Во-первых, содержание следующими 20Е в тремя корневищах рапонтикума сафлоровидного относительно невелико – не более 0,2%. Вовторых, использование в качестве сырья подземных органов растений не является оптимальным и с точки зрения истощения запасов рапонтикума сафлоровидного в природных популяциях, и с позиций необходимости возобновления плантаций каждые три года при его выращивании в культуре. В-третьих, с технологической точки зрения переработка корневищ более трудоемка, чем переработка надземной части растений (например, листьев). Получение в широких масштабах 20-Е из рапонтикума сафлоровидного тормозится также ограниченными запасами лекарственного сырья в природных популяциях (вид является эндемиком Горного Алтая и занесен в 30 Красную книгу Российской Федерации [13]. В результате широкого скрининга, основанного этноботанических на принципах исследований, и хемосистематики, проведенных в нашей данных стране исследований специалистами лаборатории биохимии и биотехнологии ИБ Коми НЦ УрО РАН в качестве растительного источника 20-Е были предложены, растения рода Serratula L. (сем. Asteraceae), в частности серпуха венценосная Serratula coronata L. Установлено, что в надземной части растений, находящихся в фазе бутонизации и начала цветения, содержание 20Е составляет около 2% в расчете на сухую массу, что на порядок выше, чем в корневищах рапонтикума сафлоровидного. Была разработана схема получения экдистероидсодержащей субстанции из надземной части серпухи венценосной, состоящая из следующих стадий: 1) водная экстракция растительнонго сырья; 2) извлечение из сгущенного водного экстракта конечного продукта смесью этилацетат- метанол или хлороформ-метанол; 3) упаривание органических извлечений досуха; 4) хроматографическая очистка экдистероидов на оксиде алюминия в системе хлороформ-метанол или этилацетат- метанол возрастающей полярности; 5) перекристаллизация конечного продукта в системе этилацетат- метанол при соотношении 9:1. Авторы разработки считают возможным применение этого способа и для выделения экдистероидов из других видов растительного сырья [13]. В соответствии с вышеописанным способом из надземной части серпухи венценосной была получена субстанция «Серпистен», представляющая смесь 20Е и 25S-инокостерона, в соотношении 8:1. Как уже отмечалось во введении, в растительном экстракте серпухи венценосной содержится два мажорных экдистероида: 20-Е и 25S-инокостерон, отличающийся от 20Е положением одной гидроксильной группы в боковой цепи. Оба этих экдистероида обладают очень низкой токсичностью: при внутрибрюшинном и пероральном ведении 20E в опытах на мышах LD50 составляла 6.4 и 9.0 г/кг соответственно, а при введении инокостерона – соответственно 7.8 и 9.0 г/кг. [99]. Использование новой технологии 31 выделения фитоэкдистероидов и наличие в листьях серпухи венценосной дополнительного компонента-25S- инокостерона обусловили проведение ряда исследований, подтвердивших безопасность использования «Серпистена» в питании. В изученном диапазоне доз, которые на порядки превышают рекомендуемые терапевтические дозы, «Серпистен» не обладал острой и хронической токсичностью и мутагенными свойствами [51]. По результатам проведенных исследований в 2008 г. Федеральной службой Роспотребнадзора (г. Москва) субстанция «Серпистен» была зарегистрирована в качестве БАД к пище. В этом же году зарегистрированы на основе субстанции «Серпистен» три капсулированные формы БАД Кардистен, Диастен и Адастен.. К настоящему времени проведены различные экспериментальные и клинические исследования фармакологической активности этой субстанции. Дозозависимое профилактическое и терапевтическое действие «Серпистена» по отношению к хроническому низкоинтенсивному гаммаизлучению установлено в работе [30]. Использование «Серпистена» в дозе 50 мг/кг массы тела животного после действия облучения приводило к нормализации ряда показателей, характеризующих состояние фосфолипидов клеточных мембран печени и эритроцитов, а также «кортикостероидной функции надпочечников». И до и после облучения прием «Серпистена» снижал мутагенный эффект, вызванный облучением, что позволило позиционировать его как потенциальный гематопротектор при гемолитических анемиях. Положительное влияние приема БАД «Серпистен» в сочетании с витаминно-минеральным комплексом на физическую работоспособность лыжников высокой квалификации отмечается в работе [7]. В клинических условиях исследовано влияние экдистероидсодержащей БАД «Серпистен» на продуктивность памяти. В исследовании принимали участие 23 человека в возрасте от 43 до 73 лет: девять мужчин и 14 женщин, у которых наблюдали органические изменения стенок коронарных сосудов, 32 выраженные в разной степени – от начальных до артеросклеротических, а также отмечали явления ангиоспазма и венозного застоя. Оценивая состояние коронарных сосудов мозга, авторы работы обследовали обе общие сонные артерии в продольной и поперечной проекциях для выявления сечения, в котором атеросклеротическая бляшка имела наибольший размер, области бифуркаций общих сонных артерий, внутренние и наружные сонные артерии, позвоночные и подключичные артерии. Установлены позитивные эффекты «Серпистена» на параметры кратковременной и долговременной памяти пациентов с органическими поражениями коронарных сосудов [10]. Результаты исследований достаточно субстанции многочисленных «Серпистен», фармакологических представляющей смесь 20- гидроксиэкдизона и его структурного изомера 25S - инокостерона в соотношении 8:1 свидетельствуют о соответствии входящих в его состав фитоэкдистероидов критериям, характеризующим биологически-активные соединения как адаптогены [3, 11, 31]. Адаптогенные свойства субстанции «Серпистен» охарактеризованы в опытах in vivo в работах [31, 43, 52]. Влияние «Серпистена» на поведенческую активность (тест «открытое поле») крыс Вистар и содержание в тканях печени, сердца и мозга двух белков теплового шока семейства 70 было исследовано в условиях теплового стресса, моделируемого помещением животных в течение 15 минут в воду, нагретую до 43.5 оС. Курсовое зондовое введение «Серпистена» в суммарной дозе 12 мг/кг активировало двигательную и исследовательскую активность крыс. Увеличенное содержание в тканях индуцибельного защитного белка Hsp70, указывало на срочную клеточную адаптацию, а увеличение в печени содержания конститутивного белка Hsc70, по мнению авторов работы, отражало процессы долговременной структурно-функциональной адаптации [3]. Снижение чрезмерной (истощающей) активации симпато-адреналовой системы при действии субстанции «Серпистен» в тесте на 33 адренореактивность эритроцитов крыс в условиях дистресса, моделируемого принудительной иммобилизацией, установлено в работе [31]. В этой же работе было охарактеризовано влияние приема «сСерпистена» на показатели периферической крови и состояние симпатоадреналовой системы у здоровых добровольцев, испытывавших в качестве стрессорного воздействия физическую нагрузку. Результаты этих исследований позволили авторам работы утверждать, центральные что механизмы действие «Серпистена», формирования реализуется стресс-реакции и через стресс- устойчивости и имеет место активация фитоэкдистероидами лимитирующих стресс-механизмов «с переключением энергетической компоненты на белковый синтез и формированием систем с более мощной энергетической емкостью и высокими функциональными резервами». Стресс-протекторное действие «Серпистена» обсуждается в публикации [11], в которой представлены результаты исследований in vivo с использованием различных экспериментальных моделей стресса. При использовании модели шестнадцатичасового иммобилизационного стресса введение Серпистена крысам препятствовало гипертрофии надпочечников у этих животных, а также уменьшению в них запасов аскорбиновой кислоты и холестерина, обеспечивало защиту тимуса и селезенки от инволюции, препятствовало резкому уменьшению массы печени и значительно ослабляло трофические нарушения в слизистой желудка. В условиях принудительного плавания животных (крыс) введение Серпистена препятствовало изменениям в массе надпочечников, нормализуя в них содержание аскорбиновой кислоты и холестерина, сдерживало уменьшение массы тимуса и селезенки. На основании полученных результатов снижение Серпистеном неблагоприятных последствий дисстресса на организм животных авторы статьи объясняют способностью нормализовать обмен веществ, носящий в условиях стресса катаболический характер. Завершая данный раздел обзора, можно отметить, что многоплановые исследования фитоэкдистероидов, широко ведущиеся во всем мире, 34 способствовали в настоящее время появлению на мировом рынке значительного количества различных экдистероидсодержащих препаратов и БАД к пище на основе экстрактов экдистероидсодержащих растений [73]. К большому сожалению, в нашей стране производство экдистероидсодержащих субстанций в сколько-нибудь значимых масштабах практически прекращено. Заключение по обзору литературы. Анаболическое действие, другие фармакологические эффекты и отсутствие гормонального воздействия экдистероидов на млекопитающих открывают широкие перспективы использования этих соединений в восстановительной медицине. Плейотропность проявлений биологической активности экдистероидов сочетается с их очень низкой токсичностью. Экдистероиды структурно схожи с глюкокоротикоидами, ограничивающими чрезмерную (истощающую) реакции организма к дисстресу. Соответственно особый научно-практический интерес представляет исследование влияния экдистероидсодержащих субстанций на биомаркеры общего адаптационного счиндрома после стрессорных воздействий. Недостаточно изучено влияние экдистероидов на улучшение когнитивных функций у лабораторных животных и человека. Анализ современных тенденций в исследовании фармакологической активности фитоэкдистероидов, как индивидуальных соединений, косвенно свидетельствует о возможности эффективного использования растительных экстрактов в профилактическом и/или лечебном питании. Тем не менее, нельзя исключить, что эффекты фитоэкдистероидов могут усиливаться или снижаться при наличии других биологическиактивных соединений в составе экстрактов. Соответственно самостоятельный интерес представляет биохимическая оценка эффектов проявляемых экстрактами на процесс протекания общего адаптационного синдрома у интактных и стрессированных животных (крыс) и влияния на процессы памяти и поведения для выявления адаптогенных свойств. 35 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Экспериментальные животные Исследования выполнены на 182 крысах-самцах линии Вистар с различной исходной массой тела. Крысы линии Вистар относятся к наиболее часто используемой инбредной линии крыс альбиносов, которые известны своей устойчивостью к стрессу [37]. Животные получены из питомника НЦБМТ РАМН «Столбовая» и исследования на них выполнены согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010г. N 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики» и требованиями, изложенными в Национальном стандарте РФ ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Содержание лабораторных животных осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г). На основании этической экспертизы планируемых в диссертационной работе исследований на лабораторных животных Комитетом по этике ФГБНУ «НИИ питания» принято положительное заключение. На протяжении эксперимента животные содержались в индивидуальных клетках из прозрачного полимерного материала (высокотемпературного естественном освещении (средняя полисульфона) при продолжительность приглушенном светового дня составила 12,1 ч), относительной влажности воздуха 40-60%, температуре 23±2оС. Животные получали корм ad libitum и имели постоянный доступ к воде. При проведении экспериментов с кормлением были использованы стандартный общевиварный рацион [32], сбалансированный по содержанию основных макро- и микронутриентов (таблица 1), полноценный полусинтетический рацион [48] состав, которого представлен в таблице 2 и коммерческий полусинтетический рацион, который представлял собой 36 «комбикорм для лабораторных животных ПК 120-1240» в виде экструдированных гранул (ЗАО «Гатчинский ККЗ» Ленинградской обл.). Комбикорм изготовлен согласно ГОСТ Р 50258-92 «Комбикорма полноценные для лабораторных животных». Содержание пищевых веществ, витаминов и минеральных веществ в корме соответствует международным стандартам, и позволяет полностью обеспечить все физиологические потребности животных. Таблица 2.1.1 Состав общевиварного рациона ФГБНУ «НИИ питания» РАМН Наименование ингредиента общевиварного рациона Крупа овсяная Зерновая смесь Хлеб 2сорта Творог Рыбная мука Мясо 2 категории Морковь Зелень Рыбий жир Дрожжи NaCl Основные нутриенты Белки (г) Жиры (г) Углеводы (г) Энергия (ккал) Масса ингредиента общевиварного рациона, г в день на крысу 2,5 14,0 4,0 2,0 0,5 4,0 8,0 8,0 0,1 0,1 0,15 3,69 1,28 12,42 76,0 Таблица 2.1.2 37 Состав полусинтетического казеинового рациона (ПКР) Количество, Г Белок, Г Жир, г Углеводы, Г Казеин Крахмал Масло подсолнечное нерафинированное Лярд Солевая смесь1 25,0 58,0 20,20 0,58 0,38 - 5,0 - 5,0 4,0 Смесь в/р витаминов 2,3 1,0 Ингредиенты Калорийность 50,20 Ккал 84,22 203,12 % 22,1 53,3 4,99 - 44,91 11,8 - 4,98 - - 44,82 - 11,8 - - - 1,0 4,0 1,0 Смесь ж/р витаминов3 0,1 0,10 Микрокристаллическая 2,0 целлюлоза ИТОГО 100,1 20,78 10,45 51,20 381,07 Примечание : 1 состав солевой смеси ПКР представлен в табл. 3 2 в состав в/р витаминов ПКР входит L-метионин в количестве 500 мг/кг рациона 3 состав витаминной смеси ПКР представлен в табл. 4 100 Таблица 2.1.3. Состав солевой смеси ПКР № Название соли 1 Химическая формула NaCl Хлористый натрий Калий фосфорнокислый 2 KH2PO4 однозамещенный 3 Магний сернокислый MgSO4 4 Кальций углекислый CaCO3 5 Железо сернокислое FeSO4×7H2O 6 Калий йодистый KI 7 Марганец сернокислый MnSO4×7H20 8 Цинк сернокислый ZnSO4×7H2O 9 Медь сернокислая CuSO4×5H2O 10 Кобальт хлористый CoCl2×6H2O 11 Натрий фтористый NaF 12 Алюмокалиевые квасцы K2SO4Al2(SO4)3×24H2O ИТОГО Количество, г 139,3 388,8 57,4 380,4 26,4 0,77 4,55 0,53 0,48 0,024 0,50 0,11 1000 Таблица 2.1.4. Состав витаминной смеси ПКР 38 № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Количество, мг/кг рациона 4,0 6,0 4,0 30,0 15,0 2,0 0,03 1,0 50,0 8000 700 Витамин Тиамин (В1) Рибофлавин (В2) Пиридоксин (В6) Никотиновая кислота Пантотенат кальция Фолиевая кислота Цианкобаламин (В12) Викасол (менадион, K3) D-биотин Токоферол (МЕ) Ретинол (МЕ) Эргокальциферол (МЕ) Рекомендуемые нормы [62] 4,0-5,0 3,0-4,0 5,0-6,0 ≥15,0 ≥10 ≥1,0 0,03-0,05 1,0 0,2 ≥27,0 ≥2300 ≥1000 Животных выводили из экспериментов декапитацией под легким эфирным наркозом и подвергали патолого-анатомическому вскрытию для извлечения и взвешивания внутренних органов и получения сыворотки или плазмы крови. 2.2 Характеристика используемых материалов. Высушенные листья растения серпухи венценосной (Seratulla coronata L), были предоставлены сотрудниками лаборатории биохимии и биотехнологии (заведующий профессор В.В. Володин) Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар). Семена шпината сортов «Викинг», «Годри», «Мариска», «Виктория», «Нафис», «Стоик», «Застольный», «Маркиза», «Жирнолистный», «Матадор», «Паганель», «Исполинский» предоставлены сотрудниками Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур. Свежезамороженные предоставлены листья сотрудниками шпината сорт Всероссийского «Маркиза» НИИ были селекции и семеноводства овощных культур. Из листьев растения получали экстракт как описано в разделе 3.7. 39 2.3 Получение фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев серпухи венценосной. Тщательно измельченные высушенные листья серпухи венценосной помещали в сосуд для настаивания и заливали рассчитанным количеством дистиллированной воды комнатной температуры в соотношении 1:20 (по массе). Раствор медленно нагревали до кипения и выдерживали в течение 40 минут при периодическом перемешивании, остужали 20 минут. Супернатант отделяли центрифугированием и лиофильно высушивали. Экстракт из листьев серпухи венценосной представлял собой порошок зеленого цвета со слабым растительным запахом хорошо растворимый в воде [38]. 2.4. Моделирование стресса путем электрокожного раздражения на лапы Животных подвергали стрессорному воздействию, используя установку (PanLab, Испания), представляющую собой большое освещенное белое отделение и маленькое черное отделение, разделенные опускными моторизированными воротами (рис.2.3.1.). Рис.2.4.1. Установка для выработки стрессорного воздействия Решетчатый пол малого черного отделения электрифицирован (выход 0-2мА). Крысу помещали в светлый отсек камеры спиной к тёмному отсеку. Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала 40 электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 секунд), затем животное возвращали в клетку. 2.5. Дизайн экспериментов in vivo. Эксперимент №1. Эксперимент проведен с использованием 16 половозрелых крыс самцов линии Вистар, разделенных на 2 группы по 8 особей в каждой. Средние значение исходной массы тела животных контрольной группы и опытной группы достоверно не отличались и составили 127,3 ±1,3 и 127,3±1,2г соответственно. Животные обеих групп получали стандартный общевиварный рацион. Продолжительность эксперимента составила 2 суток. В первые сутки животных опытной группы подвергали электрокожному раздражению (ток 0,4 мА в течение 8 секунд) и через 16 часов на следующие сутки животных обеих групп выводили из эксперимента и определяли содержание кортикостерона, простагландина Е2 и бета-эндорфина в плазме крови. Эксперимент №2. Исследование выполнено с использованием 16 животных, разделенных на 2 группы по 8 особей в каждой. Средние значение исходной массы тела животных контрольной группы и опытной группы достоверно не отличались и составили 179,4 ± 5,9, 176,3 ± 4,5 г соответственно. Животные обеих групп получали полусинтетический рацион. Продолжительность эксперимента составила 16 суток. В предпоследний день эксперимента животных опытной группы подвергали электрокожному раздражению (ток 0,4 мА в течение 8 секунд). На следующие сутки животных обеих групп выводили из эксперимента, взвешивали тимус и определяли активность апоптоза в этом органе. 41 Эксперимент №3.1 Исследования выполнены на крысах-самцах Вистар (n=20) с исходной массой тела 53,5±0,9 г, полученных из питомника НЦБМТ РАМН «Столбовая». Животные были разделены по массе тела на 2 группы: контрольную (10 крыс) и опытную (10 крыс). Общая продолжительность эксперимента составила 22 сут. Крысы контрольной группы получали полноценный полусинтетический рацион, обеспечивающий поступление с рационом витаминов в адекватном количестве. Полигиповитаминоз у крыс опытной группы вызывали уменьшением в корме количества витаминной смеси в 5 раз и полным исключением из неё витамина Е [14]. На 21-й день, за сутки до завершения эксперимента, крыс подвергали стрессорному воздействию электрокожным раздражением на лапы (сила тока 0,4 мА в течение 8 с). Животных, подвергнутых стрессу, помещали на 16 ч в метаболические клетки для сбора мочи. По окончании сбора мочу хранили при -20о С. Предварительно анестезированных эфиром крыс выводили из эксперимента путем декапитации. В моче оценивали концентрацию кортикостерона. Эксперимент №4. 20 крыс-самцов линии Вистар с исходной массой 130,1±1,6г, были разделены на 2 равные группы: контрольную и опытную. Все животные получали в течение эксперимента ОВР, при этом животным опытной группы в воду добавляли экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 2 мг суммы фитоэкдистероидов на килограмм массы тела крысы в индивидуальных поилках. Ежедневно производили контроль потребления животными опытной группы водного раствора экстракта и животными контрольной группы воды. Через 15 суток всех животных выводили из эксперимента и определяли в плазме крови содержание кортикостерона, простагландина Е2 и бетаэндорфина. 1 Приготовление гипополивитаминного рациона, дизайн эксперимента и кормление животных проведены научными сотрудниками лаборатории витаминов и минеральных веществ ФГБНУ «НИИ питания» Переверзевой О.Г. и Кошелевой О.В. 42 Эксперимент №5. Эксперимент проведен с использованием 22 животных, разделенных на 2 группы по 11 особей в каждой. Средние значение исходной массы тела животных обеих групп (контрольной и опытной) достоверно не отличались и составили соответственно 104,8± 2,3и 104,6± 1,4 г. Крысы опытной группы получали ежесуточно водный раствор экстракта из листьев серпухи венценосной из расчета 5 мг фитоэкдистероидов (суммарно) на кг массы тела крысы в индивидуальных поилках. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. Крыс ежедневно осматривали, фиксировали объем выпитой жидкости и регулярно через сутки производили взвешивание. На 14 сутки животных эксперимента животных помещали в метаболические клетки на 22 часа для сбора мочи. Продолжительность эксперимента составила 15 суток. Животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом, взвешивали тимус. В моче оценивали концентрацию норадреналина, кортикостерона и неокисленной формы 8-гидрокси- 2’дезоксигуанозина. Проводили исследование апоптоза лимфоцитов крыс методом проточной цитометрии. Эксперимент №6. Эксперимент проведен с использованием 24 животных, разделенных на 3 группы по 8 особей в каждой. Средние значения исходной массы тела животных контрольной группы №1 и опытных групп №2 и №3 перед началом эксперимента составили 127,6 ±2,5; 127,9±2,6 и 127,9±2,4г соответственно. Все животные получали ОВР, при этом животным опытных групп №2 и №3 ежедневно в воду добавляли сухой экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 5 и 15 мг фитоэкдистероидов (суммарно) на кг массы тела. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. Ежедневно фиксировали объем жидкости, выпитой животным. Продолжительность эксперимента составила 15 суток и по его окончании животных выводили из эксперимента, извлекали и взвешивали тимус, определяли активность апоптоза в тимусе. В плазме крови 43 определяли содержание кортикостерона, простагландина Е2, бета-эндорфина и норадреналина. Эксперимент №7. Крысы-самцы линии Вистар, получавшие стандартный общевиварный рацион были разделены на две группы контрольную и опытную по 8 особей в каждой. Средние значения исходной массы тела животных контрольной группы и опытной группы перед началом эксперимента составили 111,0 ± 2,1 и 109,8 ± 1,8 г., соответственно. Животным опытной группы ежедневно в воду добавляли сухой экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 2 мг фитоэкдистероидов (суммарно) на кг массы тела. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. Крыс ежедневно осматривали, фиксировали объем выпитой жидкости и регулярно через сутки производили взвешивание. Продолжительность эксперимента составила 30 суток. В предпоследний день эксперимента животных подвергали электрокожному раздражению (ток 0,4 мА в течение 8 секунд). Затем крыс возвращали в клетку и через 16 часов выводили из эксперимента, взвешивали тимус, в плазме простагландина Е2, крови определяли бета-эндорфина и содержание норадреналина кортикостерона, и определяли активность апоптоза в тимусе. Эксперимент №8. Эксперимент проведен с использованием 16 животных, разделенных на 2 группы по 8 особей в каждой. Для животных контрольной и опытной групп средние значения исходной массы тела достоверно не отличались и составили соответственно 165,5 ± 4,1 и 169,0± 3,4г. Крысы опытной группы получали ежесуточно водный раствор экстракта из листьев серпухи венценосной из расчета 5 мг фитоэкдистероидов (суммарно) на кг массы тела крысы в индивидуальных поилках. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. В предпоследний день эксперимента животных подвергали стрессорному воздействию: электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 44 секунд). Затем животных помещали в метаболические клетки на 22 часа для сбора мочи. На 15 сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом, взвешивали тимус. В плазме крови определяли содержание бета-эндорфина и простагландина Е2; в моче оценивали концентрацию норадреналина и кортикостерона; в тимусе определяли активность апоптоза. Эксперимент №9. Эксперимент длительностью 30 суток проводили на 16 половозрелых крысах-самцах линии Вистар, которые были разделены на 2 группы, по 8 животных в каждой. Средние значения исходной массы тела животных контрольной группы и опытной группы перед началом эксперимента достоверно не отличались и составили 126,0±1,2 и 124,3±3,3г., соответственно. Животным опытной группы №2 ежедневно в воду добавляли экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 5 мг фитоэкдистероидов на кг массы тела. Животные контрольной группы №1 получали в течение всего эксперимента воду. C 27-29 сутки проводились исследования острой болевой чувствительности в тесте горячая пластина согласно разделу 2.6.2 Эксперимент №10. Исследование проведено на 16 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой 130,1±1,6г, которые были разделены на 2 равные группы контрольную и опытную. Все животные получали в течение эксперимента коммерческий полусинтетический рацион, при этом животным опытной группы в воду добавляли экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 2 мг суммы фитоэкдистероидов на килограмм массы тела крысы в индивидуальных поилках. Ежедневно производили контроль потребления животными опытной группы водного раствора экстракта и животными контрольной группы воды. Общая длительность эксперимента составила 25 суток. С 15 по 25 сутки проводилось исследование потребления кислорода, двигательной активности и скорости обучения крыс инструментальному пищедобывательному навыку в комплексной аппаратно-компьютерной 45 системе (TSE-systems, Германия). Первые три дня эксперимент проводили по одному часу в сутки, для ознакомления животных с новыми условиями среды. В последующие дни эксперимента, животных после суточной депривации голодом помещали в боксы системы на 24 часа. Исследование проводили в течение 3 суток. Протокол проведения исследования включал часовые (1,2,3 час) и суточные (I, II, III сутки) сеансы наблюдений. 2.6. Физико-химические методы исследования. 2.6.1. ВЭЖХ методы количественного анализа содержания фитоэкдистероидов в экстрактах. 1. Количественный анализ содержания фитоэкдистероидов на различных стадиях получения фитоэкдистероидсодежащих экстрактов из листьев серпухи венценосной проводили методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 Series» (AgilentTechnology,США) согласно [124]. Для хроматографического разделения использовали градиентный режим элюирования с применением 2-х компонентной подвижной фазы: компонент А – деионизированная вода; компонент В – ацетонитрил марки “для ВЭЖХ”. С 0 мин – 20% В, 15 мин – 50% В, 15,5 мин – 20% В, 21 мин – 20% В. Температура термостата колонки 35°С. Объем вводимой пробы составил 10 мкл (объем петли 100 мкл), скорость потока - 900 мкл/мин. Детектирование проводилось при длине волны 247 нм. Время анализа 21 минута. Хроматограмма стандартного образца представлена на рис 2.6.1.1. 46 Рисунок. 2.6.1.1. Хроматограмма стандартного образца фитоэкдистероидов Точную навеску экстракта (50 мг) отвешивали в колбу на 25 мл, добавляли 15 мл смеси воды дистиллированной и метанола (1:1), встряхивали на шейкере и озвучивали на ультразвуковой ванне (Bandelin Sonorex) до полного растворения, затем доводили до метки. Полученный экстракт центрифугировали (Eppendorf Centrifuge 5424) 15000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант переносили в виалу и исследовали. Пробу наносили на колонку AtlantisC18 длинной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, с размером сорбента 5 мкм.2 2. Количественный анализ содержания 20-гидроксиэкдизона на различных стадиях получения фитоэкдистероидсодежащего экстракта из листьев шпината проводили методом ВЭЖХ на колонке Luna С18 250х4.6, 5 мкм с форколонкой. Готовили 2% раствор исследуемого препарата в 50% этиловом спирте (в течение 1 часа при комнатной температуре и перемешивании), обрабатывали в ультразвуковой ванне УВЗ-2,8 (ЗАО «ПКФ «Сапфир», РФ) в течение 15 минут при комнатной температуре и отфильтровывали через шприцевой фильтр 0,45 мкм. Использовали градиентную жидкостную систему высокого давления «Стайер» (компания «Аквилон» 2 Москва) и проточный спектрофотометричсекий детектор Выполнено совместно с сотрудниками лаборатории химии пищевых продуктов Богачук М. Н., Комендантовой А.С. и Малинкиным А.Д. 47 «UV/VIS-151» (компания «GILSON», США) с длиной волны 254 нм. Определение проводили в линейном градиенте от 20% ацетониртрила в воде до 50% в течение 25 минут при скорости элюирования 0,75 мл/мин. Обработку хроматографических данных проводили с использованием программного обеспечения «Мультихром 3». 3. Подтверждение принадлежности пика 20-гидроксиэкдизону, определяемого ВЭЖХ на различных стадиях получения экстрактов, проводили с помощью время - пролетного масс-спектрометра (Bruker maxis impact, Германия), по времени удерживания (12,3 мин), а так же путем регистрации характерной молекулярной массы 20-гидроксиэкдизона – 481,3102 с высокой точностью (хроматограмма, построенная определенной молекулярной массе – 481,32- представлена на рис.2.6.1.2.) Рисунок 2.6.1.2.- Хроматограмма, построенная по определенной молекулярной массе 20Е равной 481,32 Характерный масс-спектр 20-гидроксиэкдизона представлен на рис.2.6.1.3. по 48 Intens. x105 calibr4_P1‐E‐4_01_213.d: +MS, 12.2min #1465 481.3102 6 445.2894 4 2 371.2172 581.2346 0 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Рисунок 2.6.1.3.- Характерный масс-спектр 20Е 2.6.2 Определение молекулярно-массового распределения белковопептидных фракций3 Определение молекулярно-массового распределения белково- пептидных фракций в составе субстанций, получаемых в результате ультрафильтрации водного экстракта из листьев шпината, проводили методом эксклюзионной хроматографии среднего давления на колонке Superose 12 (1,6х50 см), («Pharmacia», Швеция). Колонка была откалибрована по стандартным водорастворимым белкам и пептидам производства фирмы Serva (ФРГ) в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема. Оптическую плотность элюируемого раствора регистрировали, используя проточный ультрафиолетовый детектор с длиной волны 280 нм. В качестве элюента использовали буферный раствор (рН 6,8) 0,05М KH2PO4, содержащий 0,15M NaCl и NaN3 или раствор (рН 6,5), содержащий 0,2М NaCl и NaN3. Скорость элюирования составляла 2мл/мин. Количественное содержание фракций различных молекулярных масс в анализируемых образцах оценивали интегрированием полученных хроматограмм весовым методом в диапазоне от свободного до полного объема хроматографической колонки [20]. 3 Консультант старший научный сотрудник лаборатории пищевых биотехнологий и специализированных продуктов Зорин С.Н. 49 2.6.3. Определение содержания щавелевой кислоты в экстрактах Определение содержания щавелевой кислоты на различных стадиях получения фитоэкдистероидсодежащего экстракта из листьев шпината проводили методом перманганатометрического титрования как описано в [41, 46] с некоторыми модификациями. Для осаждения щавелевой кислоты в колбу на 250 мл отбирали 50 мл предварительно профильтрованного образца экстракта, приливали 12% раствор аммиака до слабощелочной реакции (pH =8). Затем для осаждения щавелевой кислоты добавляли 10 мл буферного раствора хлористого кальция (pH=4,6) и оставляли на 48 часов при температуре 3-7°C. Выпавший осадок щавелевокислого кальция отделяли от супернатанта центрифугированием 15 мин при 3000 об/мин, промывали горячей (70 - 90°C) водой до отрицательной реакции на хлор, смывали в коническую колбу для титрования и растворяли в 15 мл горячей 10% серной кислоты. При затруднении растворения колбу нагревали. Полученный фильтрат титровали 0,1 н раствором перманганата до появления розовой окраски. По результатам титрования рассчитывали содержание щавелевой кислоты в анализируемых образцах (в г.). Точность метода +/- 10% . Минимально определяемая концентрация - 10 мг/л. 2.7.Биохимические методы. 2.7.1. Иммуноферментные методы анализа. Концентрацию кортикостерона в плазме крови крыс определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора «Corticosterone EIA kit, Immunodiagnostic System» (Великобритания) по методике фирмы изготовителя. Концентрацию простагландина Е2 в плазме крови крыс определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора 50 «Rat Prostaglandin E2 (PGE2) ELISA Kit,CUSABIO» (Китай) по методике фирмы изготовителя Концентрацию бета-эндорфина в плазме крови крыс определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора «Peptide Enzyme immunoassay (EIA) kit, Peninsula lab.immunoassay» (США) по методике фирмы-изготовителя. 2.7.2 Определение содержания норадреналина в плазме крови Содержание норадреналина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ согласно [39] c некоторыми модификациями. Пробоподготовку тестируемых образцов проводили следующим образом: плазму крови (1-2 мл) фильтровали через шприцевой фильтр (0,2 мкм), затем 1,0 М Трис-HCl буфером (рН 8,6) доводили рН образца до 8,5 по универсальному индикатору, добавляли 30 мкл раствора внутреннего стандарта - 3,4дигидробензиламина гидробромида («ALDRICH», США) и количественно наносили на стеклянную микроколонку (0,5х1,0 см) с окисью алюминия. Сорбент промывали дистиллированной водой (2х2мл) и элюировали норадреналин и 3,4-дигидробензиламина гидробромид 1,0 М раствором уксусной кислоты. Полученный смыв наносили на хроматографическую колонку (Nucleodur C18, 5 мкм, 250х5 мм), предварительно откалиброванную по внутреннему стандарту и норадреналину («ALDRICH», США). Состав подвижной фазы: 0,1М фосфатно-цитратный буфер рН 4,0, содержащий 50 мг/л ион-парного реагента (1-октансульфоновая кислота натриевая соль для ВЭЖХ, «Dudley Chemical», США) и 2,5% ацетонитрила (квалификации «для ВЭЖХ»). Объем элюирования 1,0 вводимого мл/мин. образца В составлял качестве 100 детектора мкл. Скорость использовали амперометрический детектор (НПО «Химавтоматика, Россия, программное обеспечение «Мультихром 3», Россия) со стеклоуглеродным электродом и рабочим напряжением +1,0 В. 51 2.7.3 Определение содержания норадреналина в моче Содержание норадреналина в моче определяли методом ВЭЖХ также согласно [39]. 2.7.4 Определение содержания кортикостерона в моче Содержание в моче кортикостерона определяли методом ВЭЖХ согласно [106] c некоторыми модификациями. К 0,75 мл мочи добавляли 0,1 мл раствора внутреннего стандарта (дексаметазон) с концентрацией 10 мкг/мл, затем 5,0 мл этилового спирта. Пробу встряхивали в течение 30 мин при комнатной температуре, фильтровали через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, затем упаривали на роторном испарителе. Анализируемый образец растворяли в 0,5 мл 50% этилового спирта и вводили на колонку с помощью петли объемом 0,1 мл. Хроматографический анализ проводили на колонке «Нуклеосил С18» (250х5мм, 5 мкм) в условиях линейного градиента концентрации ацетонитрила (в воде) 20-60% в течение 45 мин при скорости элюирования 0,75 мл/мин. В качестве детектора использовали спектрофотометрический проточный детектор «UV/VIS-151» («GILSON», США) при длине волны 254 нм. 2.7.5 Определение содержания окисленной и неокисленной формы 8-гидрокси-2’дезоксигуанозина в моче4 Концентрацию окисленной и неокисленной формы 8-гидрокси2’дезоксигуанозина в моче определяли с помощью обращённофазовой ВЭЖХ согласно [17] на колонке «Supersphere 100 RP18» (125×2 мм, 4 мкм) с предколонкой «Supersphere 100 RP18» (10×2 мм) («Merck», Германия), 4 Выполнено совместно с научным сотрудником лаборатории химии пищевых продуктов Селифановым А.В. 52 уравновешенной 10 мМ ацетат-аммонийным буфером, рН 4,3, в градиенте концентрации трехуровневый метанола 1-80%. квадрупольный В качестве детектора масс-спектрометр «API использовали 3000» («PE Biosystems», Германия), на котором определяли содержание иона с M/Z=168. Подготовку пробы проводили, как указано в работе [34, 71]. 2.7.6 Определение активности апоптоза5 В изолированных клетках тимуса методом щелочного гель- электрофореза (метод ДНК-комет) определяли уровень ДНК повреждений, а также процент апоптотических клеток (индекс апоптоза) согласно [68]. Микроскопический анализ проводили на микроскопе Zeiss Axio Imager Z1 при увеличении 400х. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I) анализировали с использованием программного обеспечения Comet Imager system, «Metasystems GmbH». В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте). Апоптотическими считали клетки с содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы ≥30%. С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток [16, 114] и рассчитывали индекс апоптоза по формуле: где А+ - количество апоптических клеток. 2.7.7 Исследование апоптоза лимфоцитов крыс методом проточной цитометрии6 Суспензию клеток тимуса получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани BD Medimachine Выполнено совместно с научным сотрудником лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи Селяскиным К.Е. 6 Выполнено ведущим научным сотрудником лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии Трушиной Э.Н. 5 53 производства Becton Dickenson and Company, США. Однократно отмывали клетки забуференными фосфатами 0,15М раствором хлорида натрия, рН 7,27,4 (PBS) и готовили пробу с концентрацией клеток 1х106см3. Окрашивание тимоцитов производили коньюгированным с флуорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) (Beckman Coulter, США) с последующей детекцией на проточном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, США). Иссеченные кусочки тимуса и клеточная суспензия в процессе работы хранились на льду. Результаты представлены в виде процентного соотношения живых клеток и лимфоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза, на 10 000 просчитанных объектов в каждом образце. Принцип метода изучения степени апоптоза лимфоцитов основан на свойстве аннексина V связываться с фосфатидилсерином клеточной мембраны и способности 7-AAD (7-аминоактиномицин) встраиваться между цитозином и гуанином двухцепочечной ДНК клеток с нарушенной целостностью мембраны. На ранних стадиях апоптоза целостность клеточной мембраны сохраняется, но происходит конверсия мембранных фосфолипидов и появление фосфатидилсерина на поверхности клетки. Аннексин V с высокой аффинностью связывается с фосфатидилсерином и идентифицирует «ранний» апоптоз. Поздняя фаза апоптоза сопровождается не только утратой ассиметрии фосфолипидов мембраны, но и нарушением целостности мембраны, фрагментацией ДНК и резким возрастанием мембранной проницаемости для катионных красителей. Комбинированная окраска аннексин V-FITC и 7- ААD позволяет идентифицировать неапоптозные - живые клетки (при сочетании аннексин V-негативные/7ААD-негативные), ранние проапоптотические изменения (при сочетании аннексин V-позитивные/7- ААD-негативные), поздние варианты клеточной гибели (при сочетании аннексин V-позитивные /7- ААD-позитивные клетки) и мертвые клетки (аннексин V-негативные /7- ААD-позитивные клетки). 54 2.8. Физиологические методы7 2.8.1 Обучение крыс инструментальному пищедобывательному навыку Для обучения использовали комплексную аппаратно-компьютерную систему, представленную на рисунке 2.8.1.1 (TSE-systems, Германия). Рисунок 2.8.1.1.- Комплексная аппаратно-компьютерная система (TSEsystems, Германия). В состав системы входят 8 герметичных индивидуальных боксов, с принудительным протоком воздуха и анализом изменений концентрации кислорода и углекислого газа. Боксы оснащены автоматизированной регистрацией горизонтальной и вертикальной активности животных. Одна из сторон экспериментальных боксов представляет собой оперантную стенку, которая оснащена кормушкой и 2 подсвеченными педалями, нажатие на которые приводило к автоматической подаче 1 пищевой гранулы (45 мг). Во всех боксах крысы получали свободный доступ к поилкам. Эксперименты по обучению инструментальному пищедобывательному навыку проводились после суточных 7 пищевых деприваций. Регистрировались временная Все физиологические исследования выполнены на базе лаборатории общей физиологии функциональных систем ФАНО «НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина». 55 динамика и количество нажатий на обе педали, каждый час измерялась горизонтальная (Х, см) и вертикальная (Z, см) двигательная активность, а также потребление кислорода (VO2 мл/час/кг). Анализ процесса обучения инструментальному пищедобывательному поведению проводился на основе динамики количества нажатий на педали оперантной стенки. 2.8.2. Определение порога острой болевой чувствительности Для измерения порога острой болевой чувствительности животного при термическом раздражении использовали тест «Горячая пластина» (Hot plate) [8]. Тест является щадящей моделью исследования аналгезии по отношению к животному и в то же время позволяет исследовать изменения болевой чувствительности практически на пороговом уровне. Для тестирования использовали Hot plate-метр (Hotplate Analgesia Meter, Columbus Instruments, USA), который представляет собой термостатически контролируемую, электронагреваемую поверхность (254 мм x 254 мм x 19 мм), ограниченную прозрачными акриловыми стенками (19 см высотой, с открытым верхом). Передняя панель прибора оборудована кнопками для контроля времени с точностью до 0,1 секунды и температурного режима с точностью до 0,1°C. Температурный диапазон нагреваемой пластины от 30°C до 79,9°C (рисунок 2.8.2.1). 56 Рисунок 2.8.2.1. Установка для проведения тестирования «Горячая пластина» До начала испытания в течение 10 минут тест-система акклиматизируется в комнате для проведения исследования. Термостат анальгезиметра устанавливали на уровне температуры 55°С. Животное аккуратно помещали на нагревательную пластину и в тот же момент нажимали кнопку «старт» на панели прибора. В первый день эксперимента регистрировали латентное время облизывания передних и задних лап (с момента помещения животного на поверхность прибора до первого облизывания), количество вертикальных стоек. После этого нажимали на кнопку «стоп» и животное убирали с горячей поверхности. На вторые сутки эксперимента фиксировали латентное время выпрыгивания животного из установки. При этом остальные поведенческие реакции игнорировали. Для уменьшения вероятности теплового повреждения подушечек лап максимальное время эксперимента не превышало 180сек. Если животное не проявляло активности в течение 180секундного интервала, то его убирали с горячей поверхности, а за латентное время принимали 180сек. Поверхность прибора протирали салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, перед помещением на нее очередного животного. 2.9. Статистическая обработка результатов исследований Обработка результатов исследования выполнена с использованием пакета программ прикладного статистического анализа SPSS Statistics 20. согласно тесту Стьюдента и непараметрическому тесту Манна-Уитни. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05. Вычисляли среднее значение (М), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (m). Данные представлены как M±m и min-max. 57 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Экспериментальное обоснование применимости болевого электрокожного раздражение на лапы крыс линии Вистар в качестве модели стрессорного воздействия. 3.1.1 Влияние электрокожного раздражения на некоторые биомаркеры ОАС. Проведение опытов in vivo по характеристике адаптогенных свойств фитоэкдистероидов, содержащихся в экстракте серпухи венценосной, предполагало наличие экспериментального обоснования использования модели стрессорного воздействия. Поэтому на первом этапе наших исследований возможность in vivo стояла корректного задача применения экспериментально в качестве обосновать модели стресса электрокожного раздражения током 0,4мА в течение 8 секунд на лапы лабораторного животного (крысы). С этой целью проведено два эксперимента по оценке влияния этого болевого воздействия на некоторые общепризнанные биомаркеры общего адаптационного синдрома (ОАС), характеризующие представлены реакцию результаты, организма животного полученные в на стресс. Ниже эксперименте №1 продолжительностью двое суток, по оценке таких биомаркеров ОАС, как кортикостерон, бета-эндорфин и простагландин Е2 в плазме крови крыс линии Вистар после воздействия электрическим током интенсивностью 0,4 мА в течение 8 сукунд. 58 Примечание: *Различия по сравнению с контролем достоверны согласно критерию Стъюдента при Р<0,05 Контроль - интактные крысы (n=8) Опыт - крысы, стрессированные электрокожным воздействием (n=8) Рисунок 3.1.1.1 Содержание кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина E2 в плазме крови крыс. Данные, приведенные на рисунке 3.1.1.1, свидетельствуют о достоверном (более чем трехкратном) увеличении уровня кортикостерона в плазме крови крыс опытной группы (17,0±4,4 нг/мл), получивших электрокожное воздействие, по сравнению с аналогичным показателем, определяемым у интактных животных, контрольной группы (5,4±2,2 нг/мл). Этот результат функционирования указывает на значительное гипоталамо-гипофиз-адреналовой напряжение системы, возникающее, как известно, в ответ на стрессорное воздействие. Раздражение электрическим током выбранных параметров также приводило к достоверному увеличению уровня бета-эндорфина в плазме крови животных, 59 то есть оказывало стимулирующее влияние на активность эндогенной опиоидной системы. Участвуя в процессах адаптации, опиоидные гормоны повышают свою активность в условиях развивающегося стресса [25]. Среднее содержание в крови простагландина Е2 достоверно не различалось для интактных животных и особей, подвергшихся болевому воздействию электрическим током. Однако достоверно более высокое соотношение концентрация кортикостерона/ концентрация простагландина Е2 в плазме крови животных опытной группы (5,69±1,77) по сравнению с контрольной группой (1,58±0,57) убедительно свидетельствует о выраженности стрессорного воздействия и соответствующем проявлении ОАС в ответ на электрокожное раздражение. Примечание: *Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стъюдента при Р<0,05 Контроль - интактные крысы (n=8) Опыт - крысы, стрессированные электрокожным воздействием (n=8) Рисунок 3.1.1.2 Соотношение концентрация концентрация простагландина Е2 в плазме крови крыс кортикостерона/ 60 Общий адаптационный синдром (ОАС) в условиях стресса может сопровождаться выраженными изменениями интенсивности процессов апоптоза в различных органах и в первую очередь в тимусе [95, 116]. Поэтому был проведен эксперимент №2 продолжительностью 16 суток с целью получения данных о влиянии принудительного электрокожного раздражения на активность апоптоза в тимусе лабораторных животных. Таблица 3.1.1.1 Показатели состояния тимуса у крыс, M±m, min-max (эксперимен№2). Группа животных Контрольная группа (n=8) Опытная группа (n=8) Прирост массы тела, ∆% Относительная Степень Масса масса тимуса, фрагментации тимуса, г % от массы ДНК тела крысы (% ДНК) Индекс апоптоза, % 57,2±4,0 0,74±0,09 0,26±0,03 7,45±0,09 1,04±0,01 (39,5-69,0) (0,52-1,15) (0,17-0,39) (7,18-7,98) (1,00-1,12) 59,7±2,8 0,67±0,03 0,24±0,01 7,66±0,06 1,13±0,09* (43,9-67,2) (0,54-0,81) (0,21-0,29) (7,37-7,98) (1,09-1,19) *Различия по сравнению с контрольной группой №1 достоверны согласно критерию Стъюдента и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни при Р<0,05 Результаты эксперимента, представленные в таблице 3.1.1.1, свидетельствовали о достоверном увеличении индекса апоптоза в клетках тимуса животных опытной группы, подверженных воздействию электрическим током, по сравнению с интактными животными контрольной группы, что служило дополнительным аргументом в пользу применимости принудительного электрокожного раздражения ( ток 0,4 мА 8 сек) на лапы крыс линии Вистар для моделирования развития у этих животных стресса. 61 3.1.2 Влияние витаминной обеспеченности растущих крыс-самцов линии Вистар на их устойчивость к воздействию электрическим током на лапы. Дополнительным свидетельством в пользу корректной применимости модели электрокожного раздражения выбранных параметров явились данные эксперимента №3, продолжительностью 22 суток, характеризующего влияние витаминной обеспеченности на некоторые биомаркеры ОАС. Участие в процессах регуляции и адаптации витаминов как естественных метаболитов, способных усиливать функции защитных систем организма при стрессе является установленным фактом [47, 55]. Диетическая коррекция витаминного статуса способствует восстановлению адаптационного потенциала организма – его неспецифической способности сопротивляться неблагоприятным факторам различной природы [70]. В нашем исследовании не было обнаружено у животных сравниваемых групп сколько-нибудь значимых различий в соотношениях окисленной и неокисленной форм 8-гидрокси-2’деоксигуанозина (для контрольной группы 0,0111±0,0024 и для опытной группы 0,0094±0,0031при(n=10)). Как известно, 8-гидрокси-2’деоксигуанозин основание, представляющее – это модифицированное побочный продукт нуклеозидное повреждения ДНК, экскретируемый с мочой при репарации ДНК. Однако о неблагоприятном влиянии витаминной недостаточности организма на адаптационную устойчивость у животных к стрессу, моделируемому электрокожным раздражением, свидетельствовало достоверное (р ≤ 0,05) повышение в 2,5 раза экскреции кортикостерона с мочой животных опытной группы (122,8±30,6 нг/мл) с полигиповитаминозом по сравнению с крысами контрольной группы (49,9±18,3нг/мл). Этот результат согласуется с данными о том, что при глубоком дефиците витамина А уровень свободного кортикостерона в плазме крови крыс увеличивался на 38% [63]. Двадцатикратное обогащение диеты витамином Е само по себе вызывало 62 достоверное снижение уровня кортикостерона в сыворотке крови у мышей [93], у подвергнутых воздействию стресса крыс дополнительный прием витамина Е снижал концентрацию этого гормона в сыворотке крови [81], а также предотвращал вызванное гипероксией увеличение его секреции [87]. Таким образом, в нашем исследовании было установлено, что адекватная витаминная обеспеченность ограничивала характерное для общего адаптационного синдрома увеличение в крови крыс важнейшего для этих животных кортикостероидного гормона - стресс-биомаркера и стрессмедиатора – кортикостерона. Это свидетельствует о снижении интенсивности протекания общего адаптационного синдрома, вызванного стрессом, моделируемым воздействием электрического тока интенсивностью 0,4 мА в течение 8 секунд и являются дополнительным подтверждением обоснованности использования предложенных параметров модели стресса для оценки влияния исследуемых субстанций на биомаркеры ОАС. 3.2. Характеристика фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев серпухи венценосной. Фитоэкдистероидсодержащий сухой экстракт из листьев серпухи венценосной был получен согласно разделу 2.3. Суммарное содержание фитоэкдистероидов в данном сухом экстракте составило 6,15% (на сухую массу), из них 66% приходится на 20 - гидроксиэкдизон и 23% на 25Sинокостерон. На рисунке 3.2.1 представлены хроматограммы стандартного образца сравнения с известным содержанием фитоэкдистероидов (80%) и сухого экстракта серпухи венценосной. 63 а) б) Рисунок 3.2.1 – Хроматограммы: а) стандартного образца; б) экстракта серпухи венценосной Водные растворы этого экстракта были использованы в опытах in vivo 64 3.3 Влияние экдистероидсодержащего экстракта Серпухи Венценосной на некоторые биомаркеры ОАС у интактных (не стрессированных) крыс. Экспериментальное обоснование электрокожного раздражения интенсивностью тока 0,4 мА продолжительностью 8 сек на лапы крыс как модели стрессорного воздействия позволило перейти к следующему этапу исследования, включающему оценку возможного влияния потребления фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на некоторые основные биомаркеры ОАС у крыс-самцов линии Вистар, находящихся в условиях нормы (интактные животные) и/или после перенесенного ими стресса. Влияние потребления экстракта на содержание кортикостерона, бетаэндорфина и простагландина Е2 в плазме крови интактных крыс исследовано в эксперименте № 4. Животные опытной группы получали водный раствор экстракта серпухи венценосной из расчета 2 мг фитоэкдистероидов/кг, животные контрольной группы получали воду. Продолжительность эксперимента составила 15 суток. Прирост массы тела за 15 дней эксперимента достоверно не изменился у животных опытной группы, получавших экстракт, по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. Как следует из данных, представленных в таблице 3.3.1, содержание кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина E2 в плазме крови крыс опытной и контрольной групп на 15 сутки эксперимента достоверно не отличались. 65 Таблица 3.3.1 Содержание кортикостерона, простагландина E2 и бета-эндорфина в плазме крови крыс (эксперимент №4). Группа животных Кортикостерон, нг/мл Бетаэндорфин, нг/мл Простагландин Е2, пкг/мл Контрольная группа (n=10) 54,7±12,4 (10,4-106,2) 0,110±0,050 (0,001-0,463) 4,0±0,1 (3,5-4,3) Опытная группа (n=10) 41,4±12,2 (10,6-109,0) 0,066±0,027 (0,001-0,254) 3,9±0,2 (3,0-4,3) В эксперименте №5 крысы опытной группы ежесуточно получали раствор экстракта серпухи венценосной из расчета 5 мг фитоэкдистероидов/ кг массы тела крысы в индивидуальных поилках. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. Продолжительность эксперимента составила 15 суток. В моче определяли содержание двух основных биомаркеров стресс - системы: кортикостерона и норадреналина. Не было выявлено отличий у животных, потреблявших фитоэкдистероидсодержащий экстракт в большей, чем в эксперименте №4 дозировке, по сравнению с животными контрольной группы. Прирост массы тела крыс обеих групп соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста. Относительный прирост массы тела животных по окончании эксперимента для контрольной и опытной групп достоверно не различался (табл.3.3.2). Визуальная оценка и взвешивание тимуса не выявили каких-либо неблагоприятных изменений этого органа у животных обеих групп. 66 Таблица 3.3.2. Общая характеристика групп крыс (эксперимент№5) Группа животных Прирост массы тела, ∆% Масса тимуса, г Относительная масса тимуса, % от массы крысы Контрольная группа (n=11) 72,5±1,9 (65,3-78,2) 0,58±0,02 (0,45-0,66) 0,32±0,01 (0,27-0,38) Опытная группа (n=11) 71,1±2,5 (61,3-79,4) 0,55±0,02 (0,46-0,68) 0,31±0,01 (0,26-0,4) В табл. 3.3.3 представлены результаты определения средних значений содержания кортикостерона, норадреналина и соотношение окисленной и неокисленной форм 8-гидрокси-2’деоксигуанозина в моче крыс обеих групп по окончании эксперимента. Таблица 3.3.3 Содержание в моче крыс основных медиаторов ОАС M±m, min-max (Эксперимент №5) Группа животных Контрольная группа (n=11) Опытная группа (n=11) Согласно 8-гидрокси2’дезоксигуанозин, окисленная форма/ неокисленная форма Кортикостерон, Норадреналин, нг/мл нг/сутки 87,3±16,5 989± 82 0,058±0,014 (33,2-227) (546-1349) (0,02-0,17) 121,2±14,9 908±91 0,068±0,009 (37,5-184,6) (432-1580) (0,02-0,11) полученным данным содержание кортикостерона и норадреналина в моче крыс достоверно не различалось для контрольной и опытной групп. В нашем исследовании также не было обнаружено у животных сравниваемых групп сколько-нибудь значимых различий в 67 соотношениях окисленной и неокисленной форм 8-гидрокси- 2’деоксигуанозина. Процесс апоптоза в этом эксперименте в силу технических причин в отличие от определений активности апоптоза в других экспериментах тестировали методом, представленным в разделе 2.7.7. позволившим охарактеризовать степень апоптоза лимфоцитов тимуса крыс. Результаты, полученные при исследовании апоптоза лимфоцитов крыс в тимусе, свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий относительного содержания лимфоцитов тимуса без признаков апоптоза у крыс контрольной и опытной групп (98,66 ± 0,09% и 98,74±0,02% соответственно), равно как и мертвых клеток (0,15±0,03% и 0,16±0,03% соответственно). При этом следует отметить, что среди лимфоцитов тимуса крыс опытной группы обнаружено статистически достоверное снижение относительного числа клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза с сохранением целостности клеточной мембраны, по сравнению с данным показателем у крыс контрольной группы (рисунок 3.3.1). Примечание: * Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стъюдента при Р<0,05 Рисунок 3.3.1 «Ранний» апоптоз лимфоцитов в тимусе у крыс, M±m (эксперимент№5) 68 При проведении эксперимента №6 животным опытных групп №2 и №3 ежесуточно в воду добавляли сухой экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 5 и 15 мг фитоэкдистероидов/ кг массы тела. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. Продолжительность эксперимента составила 15 суток. Увеличение дозировки потребляемого крысами экстракта до 5 и 15 мг экдистероидов/кг массы тела также достоверно не изменяло прироста массы тела по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. В отличие от эксперимента №4 нами было дополнительно определено содержание в плазме крови норадреналина. В табл. 3.3.4 представлены результаты определения средних значений содержания кортикостерона, норадреналина, бета-эндорфина и простагландина Е в плазме крови крыс контрольной и опытных групп по окончании эксперимента. Таблица 3.3.4. Содержание кортикостерона, бета-эндорфина, простагландина E2 и норадреналина в плазме крови крыс M±m, min-max (эксперимент№6) Группа Кортикостерон, нг/мл β-эндорфин, нг/мл Норадреналин, нг/мл Простагландин Е2, пг/мл №1 (n=8) 17, 2 ± 7,1 (1,6-61,1) 0,296 ± 0,061 (0,085-0,616) 20,4 ± 3,4 (9,7-40,9) 6,65 ± 1,13 (2,59-10,40) №2 (n=8) 26,9 ± 8,8 (1,1-63,4) 0,250 ± 0,097 (0,055-0,870) 10,3* ± 1,1 (5,9-13,9) 7,74 ± 0,90 (4,18-12,36) №3 (n=8) 26,7 ± 4,4 (11-47,6) 0,460 ± 0,163 (0,032-1,431) 7,2*,** ± 0,8 (4,8-10,4) 8,93 ± 1,07 (3,19-12,68) Примечание: * - достоверность различий (Р<0,05) от показателя контрольной группы согласно критерию Стъюдента и непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни; ** - достоверность различий (Р<0,05) от показателя группы № 2 согласно критерию Стъюдента и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни. Как и в предыдущем эксперименте с потреблением меньшей дозировки фитоэкдистероидов содержание кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс не различалось для контрольной и 69 обеих опытных групп. Однако при определении норадреналина достоверно более низкие значения концентраций этого катехоламина по сравнению с аналогичным обнаружены показателем в плазме фитоэкдистероидов/кг норадреналина у крови массы. отмечено животных у животных, При крыс, этом контрольной группы получавших самое потреблявших низкое 5мг и были 15мг содержание наибольшую дозу экдистероидов. Дозозависимое снижение содержания норадреналина в крови обусловило повышение соотношения бета-эндорфин/норадреналин, достоверно выявляемое для обеих доз фитоэкдистероидов, как это показано на рисунке 3.3.2. Примечание: * достоверность различий (Р<0,05) от показателя контрольной группы согласно критерию Стъюдента и непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни ** достоверность различий (Р<0,05) от показателя опытной группы №1 согласно критерию Стъюдента и непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни К- контрольная группа№1, интактные крысы О1- опытная группа№2, получавшая 5мг фитоэкдистероидов/кг массы тела О2 - опытная группа№3, получавшая 15мг фитоэкдистероидов/кг массы тела Рисунок 3.3.2 - Влияние экстракта из листьев серпухи венценосной на соотношение концентрация бета-эндорфина/концентрация норадреналина в плазме крови, M±m (эксперимет №6) 70 О чем может свидетельствовать выявленный феномен? Как уже ранее отмечалось нами, 20-гидроксиэкдизон и 25S – инокостерон - это полигидроксилированные стерины, химическая структура, которых близка структуре кортикостерона - основного и наиболее активного глюкокортикостероида у крысы, классифицируемого как биомаркер АОС. Их поступление в составе экстракта в дозировках 5 и 15 мг фитоэкдистероидов /кг массы тела в организм животного (всасывание как таковых или в форме метаболитов), по-видимому, может влиять на баланс активаторов стресса, к которым относится норадреналин, и соединений стресс-лимитирующих систем, в частности бета-эндорфина. Таким образом, увеличение соотношения бета-эндорфин/норадреналин, характеризующее выраженность воздействие, метаболических может функционирования изменений свидетельствовать стресс-лимитирующих об в ответ на стрессорное относительном систем при усилении потреблении животными фитоэкдистероидсодержащего экстракта в условиях нормы. В этом же эксперименте потребление в течение 15 суток 20гидроксиэкдизона (20Е) и 25S-инокостерона в составе экстракта серпухи венценосной животными опытных групп не оказывало неблагоприятного влияния на тимус и не повышало активность апоптоза в клетках тимуса по сравнению с животными контрольной группы, как это следует из данных, представленных на рисунке 3.3.3. Отсутствие достоверных различий в ростовых показателях, а также в степени фрагментации ДНК и индексе апоптоза у крыс, получавших фитоэкдистероидсодержащий экстракт Serratula coronata, по сравнению с животными контрольной группы является одним из экспериментально полученных свидетельств в пользу безопасности его использования в питании. 71 Примечание: Различия по сравнению с контрольной группой недостоверны согласно критерию Стъюдента и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни ( Р>0,05) Рисунок 3.3.3. Активность апоптоза в органах крыс, в %, M±m (эксперимент№6) 3.4. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на некоторые биомаркеры ОАС у крыс после стрессорного воздействия. Следующий этап нашего исследования был связан с оценкой in vivo адаптогенного действия экстракта серпухи венценосной в условиях стресса, вызванного болевым электрокожным воздействием силой тока 0,4 мА продолжительностью 8 секунд (эксперименты № 7, 8). При проведении эксперимента №7 животным опытной группы ежесуточно в воду добавляли сухой экстракт из листьев Серпухи Венценосной из расчета 2 мг фитоэкдистероидов/ на кг массы тела. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. 72 В предпоследний день эксперимента животных подвергали электрокожному раздражению на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 секунд). Продолжительность эксперимента составила 30 суток. Прирост массы тела крыс обеих групп соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста. Средние значения относительного увеличения массы тела животных за 30 суток эксперимента для контрольной и опытной групп составили 158,3 ±5,8% и 167,6 ± 9,9 % соответственно (различия недостоверны p>0.05). В таблице 3.4.1. представлены средние значения содержания в плазме крови кортикостерона, бета-эндорфина, норадреналина и простагландина Е2, определенные после электрокожного воздействия током 0,4мА в течение 8 секунд на животных контрольной группы и животных, получавших ежесуточно экстракт в дозе 2 мг фитоэкдистероидов/кг массы тела. Таблица 3.4.1 Содержание некоторых биомаркеров стресса в плазме крови крыс, M±m, min-max (эксперимент№7) Показатель Группа Животных Контрольная группа (n=8) Опытная группа (n=8) Кортикостерон β-эндорфин Норадреналин, Простагландин Е2, нг/мл нг/мл нг/мл пг/мл 5,7 ± 2,9 0,74± 0,15 7,4 ± 1,0 8,76± 0,76 (0,9-25,2) (0,19-1,44) (1,8-11,9) (5,76-12,67) 9,3 ± 3,9 0,52± 0,19 6,1 ± 1,6 8,95± 0,7 (0,9-30,0) (0,06-1,40) (1,8-13,0) (7,03-12,6) При использованной низкой дозировке фитоэкдистероидов не выявлено достоверных различий средних значений биохимических биомаркеров 73 центральной стресс-системы и стресс-лимитирующих систем. Более информативным в этом исследовании оказалось определение массы тимуса и активности апоптоза в этом органе у стрессированных животных. Средние значения абсолютной и относительной массы тимуса животных сравниваемых групп по окончании эксперимента отличались статистически достоверно, как это следует из данных, представленных в таблице 3.4.2. Таблица 3.4.2. Показатели состояния тимуса у крыс, испытавших стрессорное воздействие электрокожным раздражением, M±m, min-max (эксперимент №7). Относительная Группа Прирост Масса животных массы тела, % тимуса, г 158,3±5,8 0,46±0,03 0,163±0,012 (134-183) (0,36-0,64) (0,122-0,232) Опытная группа 167,6±10,0 0,56±0,03* 0,193±0,010* (n=8) (119-208) (0,45-0,74) (0,155-0,264) Контрольная группа (n=8) масса тимуса, % от массы крысы Примечание: *Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стъюдента при p<0,05 и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни У стрессированных крыс, получавших экстракт в течение 30 суток, было обнаружено статистически достоверное снижение активности апоптоза в тимусе, характеризуемое уровнем ДНК-повреждений и количеством апоптических клеток, по сравнению со стрессированными животными контрольной группы (рисунок 3.4.2). 74 Примечание: *Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стъюдента при Р<0,05 и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни Рисунок 3.4.2. Активность апоптоза в тимусе крыс, подвергнутых стрессорному воздействию, M±m, min-max (эксперимент №7) Влияние фитоэкдистероидов на процесс апоптоза, как обсуждалось нами ранее в аналитическом обзоре литературы, может быть объяснено участием этих соединений в качестве медиатора сигнального пути активации протеинкиназы В (РКВ) - сигнальной макромолекулы, являющейся ключевой в регуляции констатировать, клеточной что активности даже [64]. весьма Таким низкое образом, можно потребление фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной (2 мг/кг массы тела), не влияя на уровень биохимических маркеров в крови, оказывало адаптогенное действие, снижая активность апоптоза в клетках этого органа у стрессированных животных. Влияние потребления более высокой дозы фитоэкдистероидов на активность апоптоза и биомаркеры ОАС у стрессированных крыс было исследовано нами в эксперименте №8, который отличался от предыдущего 75 не только дозировкой экстракта, но и исходной массой тела животных и длительностью их кормления. Крысы опытной группы получали ежесуточно водный раствор экстракта из листьев Серпухи Венценосной из расчета 5 мг фитоэкдистероидов/кг массы тела крысы. В предпоследний день эксперимента животных подвергали стрессорному воздействию (ток 0,4 мА в течение 8 секунд). Продолжительность эксперимента составила 15 суток. В этом исследовании, в отличие от результатов эксперимента № 7, не было показано достоверных различий в массе тимуса и активности апоптоза у получавших экстракт стрессированных крыс по сравнению с контрольной группой (таблица 3.4.2.). Однако условия проведения сравниваемых экспериментов (возраст животных, длительность кормления, дозировка экстракта) существенно отличались, что, по видимому, могло определить различную «информативность» используемых биомаркеров для выявления адаптогенного действия фитоэкдистероидсодержащего экстракта. Таблица №3.4.2. Показатели состояния тимуса у крыс, испытавших стрессорное воздействие электрокожным раздражением, M±m, min-max (эксперимент №8) Группа животных Контрольная группа (n=8) Опытная группа (n=8) Увеличение массы тела, % Относительная Степень Масса масса тимуса, фрагментации тимуса, г % от массы ДНК крысы (% ДНК) Индекс апоптоза, % 24,8±2,4 0,489±0,06 0,237±0,03 7,57±0,10 1,08±0,04 (12,7-33,1) (0,34-0,88) (0,15-0,39) (7,01-7,87) (1,05-1,14) 23,9±2,8 0,401±0,04 0,192±0,02 7,75±0,12 1,12±0,02 (15,1-36,8) (0,30-0,69) (0,15-,032) (7,09-8,13) (1,05-1,19) 76 Действительно, представленные в таблице 3.4.3 результаты определения кортикостерона в моче получавших экстракт стрессированных крыс, показали значительное достоверное снижение его содержания по сравнению с аналогичным показателем у стрессированных контрольных животных. Также у стрессированных животных, получавших экстракт, была достоверно снижена экскреция с мочой норадреналина. Таблица 3.4.3 Содержание биомаркеров ОАС у стрессированных крыс, M±m, min-max (эксперимент №8). Показатель Группа животных Кортикостерон нг/мл β-эндорфин нг/мл Простагландин Е2, пг/мл Норадренали, нг/сутки 47,6± 6,8 (30,4-93,2) 0,88± 0,38 (0,22-1,93) 5,58± 0,87 (2,22-9,71) 968±176 (363-2082) 17,9±4,2* (2,7-35,1) 1,01±0,31 (0,35-2,83) 8,34±1,67 (2,4-16,37) 523±82* (185-935) Контрольная группа Опытная группа Примечание: *Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стъюдента и согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни при Р<0,05. Таким образом, потребление экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной в дозировке 5мг/кг массы оказывало адаптогенное действие, снижая экскрецию с мочой биомаркеров ОАС: кортикостерона и норадреналина. Обобщая результаты, полученные в опытах in vivo c использованием в качестве экспериментальных животных устойчивых к стрессу крыс-самцов линии Вистар, можно констатировать, что потребление 77 экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной ограничивало напряженность протекания у этих животных ОАС, вызываемого стрессорным воздействием электрокожным раздражением. В зависимости от дозировки потребляемого экстракта показателями его адаптивного действия были или снижение экскреции с мочой основных медиаторов стресса – кортикостерона и норадреналина или активнсти апоптоза в тимусе. Потребление экстракта в дозах 2-15 мг фитоэкдистероидов/ кг массы тела не оказывало неблагоприятного воздействия на ростовые показатели крыс в экспериментах продолжительностью 15-30 суток. 3.5. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на изменение порога острой болевой чувствительности и потенциальные анальгезирующие эффекты в ответ на термическое раздражение. Результаты, свидетельствующие об адаптогенных эффектах фитоэкдистероидсодержащего растительного экстракта серпухи венценосной при болевом электрокожном воздействии, обусловили проведение эксперимента №9, в котором животным опытной группы ежесуточно в воду добавляли экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 5 мг фитоэкдистероидов/ кг массы тела. В интервале 27-29 суток проводились исследования острой болевой чувствительности в тесте горячая пластина. Общая продолжительность эксперимента составила 30 суток. Анализ результатов эксперимента по оценке анальгетической активности в первый день тестирования показал, что экстракт Серпухи Венценосной обладает способностью увеличивать время до возникновения болевого оборонительного рефлекса у крыс (таблица 3.5.1). 78 Таблица 3.5.1 Параметры, характеризующие болевую чувствительность крыс к термическому раздражению Группа Латентный период от болевого Число вертикальных раздражения до оборонительного стоек рефлекса, сек Облизывание Облизывание передних лап задних лап Контрольная 8,8±0,7 42,8±20,2 18,9±3,8 Опытная 16,7±2,0* 92,1±26,5 10,3±2,0* Примечание: * Различия по сравнению с контролем достоверны согласно критерию Стъюдента при Р<0,05 Было выявлено, что достоверно увеличивалось время до возникновения болевого оборонительного рефлекса, а именно облизывание передних лап у животных опытной группы. Также было показано достоверное уменьшение числа вертикальных стоек, которые можно отнести к оборонительному поведению. На второй день тестирования исследовали способность тех же животных к обучению избегания опасности на модели активного оборонительного поведения в тесте горячая пластина. Анализ полученных данных показал значительное достоверное уменьшение латентного периода до оборонительного поведения (выпрыгивание из системы) у крыс, получавших экстракт по сравнению с контрольными животными (рис.3.5.1). 79 Примечание: * Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стъюдента при Р<0,05 Рисунок 3.5.1. Латентный период выпрыгивания животных из установки на второй день исследования. Таким образом, результаты экспериментального исследования показали, что фитоэкдистероидсодержащий экстракт обладает определенной анальгетической активностью и повышает способность животных к обучению избегания опасности. 3.6. Влияние экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на способность лабораторных животных (крыс) к обучению инструментальному пищедобывательному навыку. Представленные в предыдущих разделах (3.4. и 3.5) результаты исследований in vivo указывали на то, что потребление крысами фитоэкдистероидсодержащего способствовало их адаптации экстракта к новым серпухи венценосной неблагоприятным условиям. 80 Существенный интерес вызывает вопрос о том, будет ли влиять потребление экстракта на процессы памяти и обучения, в частности, на способность обучения пищедобывательному навыку. Анализ процесса обучения инструментальному пищедобывательному поведению проводился на основе оценки динамики количества нажатий на педали оперантной стенки. Было выявлено, что в опытной группе крыс преобладает количество обучающихся животных по сравнению с контрольной группой в 1-й и 3-й сеансы часового обучения и далее в первые и вторые сутки (I и II сутки) содержания в оперантном боксе (рис.3.6.1). К третьим суткам (III) суткам различие между контрольной и опытной группам по количеству обучившихся крыс нивелируется. 12,5 30 25,0 25,0 40 25,0 37,5 50 37,5 50,0 60 20 75,0 опытная группа 75,0 70 75,0 контрольная группа 62,5 80 12,5 %, обучившихся животных 90 10 0 1 2 3 I II III Сеансы обучения Примечание: По оси ординат - % обучающихся крыс По оси абсцисс – сеансы обучения, часовые: 1, 2, 3; суточные: I, II, III. Рисунок 3.6.1 Динамика изменений в % обучающихся крыс. Количество нажатий в час было достоверно больше у животных опытной группы на первые и третьи (I и III) суточные сеансы обучения крыс (рис.3.6.2) 81 30 25* число нажатий на педали/час контрольная группа 25 опытная группа 18 * 20 16 16 18 15 10 6 5 0 I II III Сеансы обучения Примечание: * Различия по сравнению с контрольной группой достоверны согласно критерию Стъюдента при р<0,05 По оси ординат – число нажатий на педали в час По оси абсцисс – сеансы обучения, суточные: I, II, III. Рисунок. 3.6.2 Число нажатий на педали в час Динамика потребления кислорода крысами в процессе обучения представлена на рис.3.6.3. В первые сутки обучения у крыс опытной группы в ночные часы (с 22 до 05 часов), а также в 15-16 часов дня потребление кислорода было достоверно выше по сравнению с животными контрольной группы. На вторые (II) сутки этот показатель на протяжении всего сеанса обучения был значительно выше у животных опытной группы. К третьим (III) суткам различия нивелировались за счет возрастания потребления кислорода крысами контрольной группы до уровня крыс опытной группы. 82 Примечание: По оси ординат- потребление кислорода животными, мл/час/кг массы тела По оси абсцисс – сеансы обучения (часовые: 1, 2, 3; суточные: I, II, III) и время. ** и *** - обозначения периодов достоверных различий с p<0.05 и p<0.001, соответственно. Рисунок 3.6.3- Динамика потребления кислорода крысами в процессе обучения в индивидуальных экспериментальных боксах. Выявлено, что в первые (I) сутки обучения уровень горизонтальной активности у крыс опытной группы был достоверно выше по сравнению с животными контрольной группы практически на всём протяжении сеанса: 709,6±73,7см и 486,2 ± 112,0см, соответственно. Вертикальная активность у опытных крыс превышала значения у контрольных в ночные часы первых (I) суток наблюдений (с 22 до 4 часов). На вторые - третьи (II-III) сутки обучения межгрупповые различия в двигательной активности снижались и наблюдались только два периода достоверных отличий: более высокая активность крыс контрольной группы в первые 5 часов вторых (II) суток (с 15 до 20 часов) и более высокая активность крыс опытной группы на третьи (III) сутки наблюдений (с 8 до 10 часов). В дальнейшем были проанализированы корреляционные взаимосвязи количества нажатий на инструментальные педали в процессе обучения с 83 динамикой потребления кислорода и двигательной активности крыс в экспериментальном боксе (таб.3.6.1.). Таблица 3.6.1. - Коэффициенты корреляции (КК) между количеством нажатий на педали (Инстр.), потреблением кислорода (VO2) и двигательной активностью (горизонтальной – X, вертикальной - Z) КК 1 Инстр. / VO2 Инстр. / X Инстр. / Z VO2 /X К 0,38 0,27 2 О 0,74 *** 0,40 3 К 0,15 О 0,21 0,49 0,77 *** 0,82 *** 0,66 ** 0,60 ** 0,31 К 0,25 0,35 I О 0,54 ** 0,65 *** 0,64 ** 0,56 ** 0,6 ** К 0,87 *** 0,91 *** 0,86 *** 0,58 ** 0,63 ** II О 0,82 *** 0,37 К 0,88 *** 0,53 III О 0,26 0,76 *** 0,71 *** 0,28 К 0,91 *** 0,13 О 0,83 *** 0,74 *** 0,76 *** 0,39 0,80 0,35 0,77 0,75 0,63 0,82 *** ** *** ** *** 0,68 0,48 0,83 0,03 0,25 0,59 0,46 *** * *** ** * 2 0,84 0,76 0,92 0,50 0,60 0,39 0,61 0,41 VO /Z *** *** *** 0,02 * ** ** Примечание: ** и *** - обозначение достоверно высоких значений КК с p<0.05 и 0.001, соответственно. К – животные контрольной группы О – животные опытной группы Было выявлено, что достоверные корреляционные взаимосвязи потребления кислорода с активностью оперантного поведения в процессе обучения пищедобывательному навыку наблюдались у животных контрольной группы только в суточных экспериментах, а у животных, получавших экстракт фитоэкдистероидов, уже с первых часовых сеансов обучения. Потребление кислорода положительно коррелирует с двигательной активностью животных: в контрольной группе практически на протяжении всех экспериментов, а в опытной группе в первых часовых сеансах и первом суточном сеансе. Перекрестный анализ корреляционных связей двигательной активности и инструментального поведения также показал, что горизонтальная и особенно вертикальная активность животных с самого начала обучения у крыс, получавших экстракт, взаимосвязана с количеством нажатий на педали. 84 Таким образом, двигательная активность контрольных и опытных животных может контрольной различаться группы - она своей на направленностью: первых стадиях у животных может отражать ориентировочно-исследовательскую деятельность, а у крыс опытной группы в большей степени связана с обучением целенаправленному пищедобывательному инструментальному навыку. Следовательно, можно предполагать, что и возрастающее потребление кислорода обеспечивает разные формы поведения и целенаправленной деятельности у этих животных. 3.7. Получение и характеристика фитоэкдистероидсодержащего экстракта из листьев шпината огородного Совокупность полученных в опытах in vivo экспериментальных данных об ингибирующем воздействии экстракта серпухи венценосной на проявления ОАС у стрессированных животных, анальгетических свойствах и благоприятному влиянию экстракта на способность обучения животных пищедобывательному навыку, является основанием для дальнейших клинических исследований этого природного источника фитоэкдистероидов. Однако ассортимент специализированных пищевых продуктов требует постоянного расширения, в связи с этим особый интерес представляет использование в составе таких продуктов фитоэкдистероидосодержащих пищевых растений. Это обстоятельство определило задачу завершающего этапа нашего исследования: разработать современный высокотехнологичный метод препаративного выделения и концентрирования фитоэкдистероидов для получения сухого экстракта шпината с относительно высоким содержанием этих соединений и предельно низким содержанием щавелевой кислоты. Для скрининга по определению содержания фитоэкдистероидов в семенах шпината были использованы сорта «Викинг», «Годри», «Мариска», 85 «Виктория», «Нафис», «Стоик», «Застольный», «Маркиза», «Жирнолистный», «Матадор», «Паганель», «Исполинский». Тщательно измельченные семена помещали в сосуд для настаивания и заливали рассчитанным количеством дистиллированной воды комнатной температуры в соотношении 1:20 (по массе). Раствор доводили на медленном огне до кипения и выдерживали перемешивании, в остужали течение 20 40 минут минут. при периодическом Супернатант отделяли центрифугированием и лиофильно высушивали. Полученные результаты свидетельствовали, что суммарное содержание фитоэкдистероидов в отобранных для скрининга семенах варьирует от (1.4мг до 3,0 мг) / г семян. Для дальнейших исследований был выбран сорт шпината Маркиза, содержание фитоэкдистероидов в семенах которого составило 3 мг/г. На рисунке 3.7.1 приведена схема получения фитоэкдистероидсодержащего сухого экстракта из листьев шпината 86 Рисунок 3.7.1– Схема получения фитоэкдистероидсодержащего продукта из листьев шпината. Стадию водной экстракции фитоэкдистероидов из измельченных листьев шпината проводили, как описано в разделе 2.3, за исключением соотношения измельченные листья/вода, которое составляет в этом случае 40:1 (по массе). Ультрафильтрацию водного экстракта проводили на установке «MINITAN» («Millipore», США) в тангенциальном потоке с использованием мембран с диаметром пор 10 кД. На рисунке 3.7.2 представлены хроматограммы образцов водного экстракта листьев шпината и фракций, получаемых в результате 87 ультрафильтрации, а в таблице 3.7.1 приведено их молекулярно-массовое распределение, определенное методом весового интегрирования. Экстракт шпината водный Высокомолекулярная фракция Низкомолекулярная фракция Рисунок 3.7.2- Эксклюзионные хроматограммы водного экстракта шпината и его фракций после ультрафильтрации 88 Таблица 3.7.1. Молекулярно-массовое белково-пептидное распределение исходного экстракта шпината и его фракций после ультрафильтрации. № Диапазон мол. фракции масс, кД Образец, % Исходный экстракт ВМФ НМФ шпината 1 >149 2,4 10,4 0,0 2 149-46,5 1,9 6,9 0,0 3 46,5-21,1 4,3 15,9 0,0 4 21,1-11,3 10,8 26,9 2,5 5 11,3-5,9 25,2 20,3 23,9 6 5,9-2,4 26,8 9,7 34,0 7 <2,4 28,6 9,9 39,6 Полученные данные свидетельствовали о существенном снижении содержания высокомолекулярных «балластных» структур в составе НМФ. Низкомолекулярную фракцию лиофильно высушивали и адсорбировали на гидрофобной обращенной фазе С16. Супернатант, содержащий щавелевую кислоту, удаляли центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин). Фитоэкдистероидсодержащую субстанцию десорбировали с гидрофобного носителя С16 70-% раствором этилового спирта, отгоняли спирт на роторном испарителе и лиофильно высушивали экстракт. В таблице 3.7.2 представлены результаты определения суммарного содержания фитоэкдистероидов в образцах, получаемых на различных этапах получения сухого экстракта из листьев шпината. Показано, что по сравнению с исходным сырьем (сырые листья шпината) содержание в конечном продукте (сухом экстракте) возрастает в 490 раз. 89 Таблица 3.7.2. Результаты определения суммарного содержания фитоэкдистероидов и щавелевой кислоты в образцах на разных этапах. Содержание Содержание щавелевой кислоты фитоэкдистероидов (мг/г) (мг/г) Листья шпината сырые - 0,022±0,001 Листья шпината сухие - 0,31±0,02 134,8±2,2 0,80±0,04 - 1,13±0,06 0,020±0,001 10,80±0,3 Образец Водный экстракт шпината НМФ Сухой фитоэкдистероидсодержащий экстракт Высокое содержание фитоэкдистероидов, сочетающееся с предельно низким содержанием щавелевой кислоты, определяет перспективность использования полученного в работе сухого экстракта диетическом (лечебном или профилактическом) питании. шпината в 90 ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Как уже отмечалось нами в аналитическом обзоре литературы отечественных и зарубежных множественность научных проявлений публикаций, имеет биологической место активности фитоэкдистероидов, как отдельных соединений с очень низкой токсичностью [99], что указывает на возможности эффективного использования растительных экстрактов в профилактическом и/или лечебном питании. Эффекты фитоэкдистероидов могут усиливаться или снижаться при наличии других биологически-активных соединений в составе экстрактов. Это обстоятельство определило задачу первого этапа нашего исследования: для проведения экспериментов in vivo препаративно получить и охарактеризовать фитоэкдистероидсодержащий сухой экстракт серпухи венценосной. В соответствии с этой задачей из листьев серпухи венценосной был получен сухой фитоэкдистероидов, экстракт а с именно высоким суммарным 61,5мг/г, где содержанием концентрации 20- гидроксиэкдизона и 25S-инокостерона были равны 40,6 и 14,2 мг/г соответственно. Проведению опытов по тестированию адаптогенных свойств фитоэкдистероидов, содержащихся в экстракте из серпухи венценосной, должно предшествовать экспериментальное обоснование и биохимическая характеристика предложенных параметров общепринятой модели стресса электрокожного раздражения током интенсивностью 0,4 мА продолжительностью 8 секунд на лапы лабораторного животного (крысы). Соответственно на первом этапе исследований in vivo в опытах на крысахсамцах линии Вистар были проведены эксперименты по влиянию моделируемого болевого воздействия на биомаркеры общего адаптационного синдрома, характеризующие ответную реакцию организма этих животных на стрессорное воздействие. Как известно, степень изменений, произошедших в организме после стрессорного воздействия, зависит также от вида и линии 91 животных, в нашем исследовании для этих целей использовали крыс самцов линии Вистар, как известно, достаточно устойчивых к стрессу. Более чем трехкратное увеличении уровня кортикостерона и достоверное увеличение концентрации нейромедиатора бета-эндорфина в плазме крови крыс, получивших электрокожное раздражение, указывало на явную выраженность стрессорного воздействия. Эти данные были подтверждены и дополнены результатами по тестированию активности апоптоза в клетках тимуса крыс, подвергнутых электрокожному раздражению силой тока 0,4 мА в течение 8 секунд. Так, имело место достоверное увеличение активности апоптоза, характеризуемое индексом апоптоза в клетках тимуса животных опытной группы, подверженных воздействию электрическим током, по сравнению с интактными животными контрольной группы. Совокупность полученных результатов позволила обосновать применимость принудительного электрокожного раздражения выбранных параметров на лапы крыс линии Вистар при моделировании развития у них стресса для выявления адаптогенных свойств экстракта из серпухи венценосной. В отдельном эксперименте с электрокожным раздражением (0,4 мА в течение 8 сек) животных было установлено, что адекватная витаминная обеспеченность ограничивала характерное для ОАС увеличение в крови стресс-биомаркера и стресс-медиатора – кортикостерона. Этот результат явился дополнительным подтверждением обоснованности использования и информативности предложенной модели для оценки влияния фитоэкдистероидов на биомаркеры ОАС. Влияние перорального введения различных доз (от 2 до 15 мг фитоэкдистероидов/ кг массы тела животного) экдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной на ростовые показатели и биомаркеры ОАС у интактных лабораторных животных (крыс-самцов Вистар) было исследовано в серии экспериментов продолжительностью 15 суток. Так у животных опытной группы, получавших экстракт в течение 15 дней в суточной дозировке 2 мг экдистероидов/кг массы тела, прирост массы тела и 92 содержание кортикостерона, бета-эндорфина и простагландина E2 в плазме крови были такими же, как и у животных контрольной группы, не получавших экстракт. В следующем эксперименте, в котором крысы потребляли экстракт в течение 15 суток в дозе 5мг фитоэкдистероидов/кг массы тела, определение содержания кортикостерона и норадреналина в моче не выявило отличий у животных, потреблявших фитоэкдистероидсодержащий экстракт в большей суточной дозировке (5мг/кг массы), чем в предыдущем эксперименте, по сравнению с животными контрольной группы, экстракт не получавшими. Также не было обнаружено у животных сравниваемых групп сколько-нибудь значимых различий в соотношениях окисленной и неокисленной форм 8-гидрокси2’деоксигуанозина. Прирост массы тела крыс обеих групп соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста. Относительное увеличение массы тела животных по окончании эксперимента для контрольной и опытной групп достоверно не различалось. Визуальная оценка и взвешивание тимуса не выявили каких-либо неблагоприятных изменений этого органа. Результаты, полученные при исследовании апоптоза лимфоцитов крыс в тимусе, свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий у крыс контрольной и опытной групп. Увеличение ежесуточной дозировки потребляемого крысами экстракта до 5 и 15 мг экдистероидов/кг массы тела животного на протяжении 15 суток также не изменяло прироста массы тела, не оказывало неблагоприятного влияния на тимус, не повышало активность апоптоза в клетка тимуса и не увеличивало содержания в крови кортикостерона, бета-эндорфина, простагландина Е2 по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. Однако было установлено дозозависимое снижение содержания норадреналина в плазме крови, обусловившее повышение соотношения бета-эндорфин/норадреналин, достоверно выявляемое для обеих суточных доз фитоэкдистероидов равных 5 и 15мг/кг массы крысы в 93 сутки. Этот факт может свидетельствовать об относительной активации стресс-лимитирующих систем у животных, находящихся в нормальных условиях при потреблении ими фитоэкдистероидсодержащего экстракта, и согласуется с высказываемой в научных публикациях гипотезой, согласно которой наблюдаемый адаптогенный эффект связан со сбалансированным адекватным изменением уровня наиболее важных стресс медиаторов активаторов стресса и его ингибиторов. То есть адаптоген выступает в роли «мягкого прострессора», снижающего «избыточное» возрастание стрессмедиаторов при последующем стрессорном воздействии. Наряду с уже упоминавшимися представленными в научной литературе данными о низкой токсичности фитоэкдистероидов, результаты нашего исследования о влиянии экдистероидсодержащего венценосной на ростовые показатели и экстракта серпухи биомаркеры ОАС крыс свидетельствуют в пользу безопасности его потребления лабораторными животными, находящимися в нормальных условиях. Предположения о потенциальном адаптогенном действии фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной получили свое подтверждение в опытах in vivo по оценке влияния экстракта на некоторые биомаркеры ОАС у крыс в условиях моделируемого стресса. При проведении относительно продолжительного эксперимента (30 суток) прирост массы тела крыс, получавших фитоэкдистероидов/кг экстракт массы тела, в суточной соответствовал дозировке уровню 2 мг прироста, характерному для животных данного вида и возраста. После электрокожного раздражения, проведенного в конце эксперимента, было определено содержание в крови кортикостерона, бета-эндорфина, норадреналина и простагландина Е2, у животных контрольной группы и животных, получавших экстракт. Не было выявлено достоверных различий средних значений биохимических маркеров центральной стресс-системы и стресслимитирующих систем у стрессированных животных, как получавших экстракт, так и не получавших его 94 Однако даже при использованной низкой дозировке фитоэкдистероидов средние значения абсолютной и относительной массы тимуса стрессированных животных сравниваемых групп отличались статистически достоверно. Снижение массы тимуса, как уже отмечалось нами, является общепризнанным показателем стресса достаточной интенсивности. В проведенном эксперименте снижение массы тимуса у стрессированных крыс, получавших экстракт, сочеталось со снижением в тимусе активности апоптоза, характеризуемой уровнем ДНК-повреждений и количеством апоптических клеток. Средние значения абсолютной и относительной массы тимуса животных опытной и контрольной групп отличались статистически достоверно и составили 0,46±0,03 г, 0,163±0,012% и 0,56±0,030г, 0,193±0,010% соответственно. Выявлено достоверное снижение в тимусе активности апоптоза у стрессированных крыс, а именно ДНК-повреждений (7,61±0,14 %ДНК) и количества апоптических клеток (1,08±0,10 %), по сравнению с контрольной группой (8,14±0,16 %ДНК и 1,34±0,07 % соответственно). По-видимому, при низком потреблении фитоэкдистероидсодержащего экстракта тестирование показателей, характеризующих апоптоз в клетках тимуса, является более информативным по сравнению с определением уровня биохимических маркеров ОАС в крови стрессированного животного. При другой дозировке и продолжительности потребления фитоэкдистероидов, а также другом возрасте животных (и соответственно другой массы тела) ситуация может существенно измениться. Об этом свидетельствуют результаты менее продолжительного эксперимента в 15 суток, в котором животные потребляли ежесуточно более высокую дозу фитоэкдистероидов в 5 мг/кг массы тела. Исходная масса тела использованных в этом эксперименте крыс также заметно отличалась по сравнению с животными предыдущего эксперимента. В этом исследовании было показано значительное достоверное снижение экскреции с мочой кортикостерона и норадреналина (47,6±6,8 и 968±176 нг/сутки 95 соответственно) по сравнению с аналогичными показателями у стрессированных животных контрольной группы (17,9±4,2 нг/мл и 523±82 нг/сутки соответственно). В методическом плане сравнение результатов, полученных в этих двух экспериментах, указывает на то, что для получения достоверной информации об адаптогенных свойствах фитоэкдистероидов в составе растительных экстрактов необходима комплексная оценка их влияния на биомаркеры ОАС у стрессированных крыс, включающая (в первую очередь) определение экскреции с мочой кортикостерона и норадреналина, а также показатели, характеризующие процесс апоптоза в клетках тимуса. В рамках проведенного исследования не ставилась задача расшифровать механизмы, посредством которых фитоэкдистероды и, в первую очередь, 20-гидроксиэкдизон в составе экстракта серпухи венценосной влияют на биомаркеры ОАС. Тем не менее для возможного гипотетического объяснения на молекулярно-клеточном уровне выявленного в нашей работе снижения активности апоптоза в тимусе стрессированнных крыс, получавших экстракт, может быть привлечена представленная в обзоре научной литературы схема (рис.2.1.5). Эта схема отражает имеющиеся экспериментально полученные данные об участии 20-гидроэкдизона (или его метаболитов) в PI3K пути активации белков семейства серин-треониновой протеинкиназы-РКВ - сигнальной макромолекулы, играющей ключевую роль в регуляции клеточной активности (росте клеток и их выживаемости [?]. Различают несколько независимых механизмов, активируемых через РKВ и способных привести к ингибированию апоптоза. Так установлено, что медиаторами РКВ являются протеазы семейства каспаз, активируемые в процессе апоптоза. РКВ подавляет активность этих протеаз, что может лежать в основе его антиапоптического эффекта [85]. К другим возможным эффекторам РКВ относят р70 S6-киназу (семейство рибосомальных S6 киназ весом 70 kDa), которая обладает выраженным антиапоптическим действием, и активность которой возрастает 96 при прямом фосфорилировании РКВ [57, 66]. Выявлена важная роль в индукции программированной клеточной гибели фермента киназы-3 гликогенсинтетазы (GSK 3), одним из путей регуляции которого является его прямое фосфорилирование РКВ, что вызывает резкое снижение активности данного фермента [69, 72]. Следует отметить, что РКВ фосфорилирует особые мишени, многие из которых играют ключевую роль в активации пролиферации, роста клетки и подавления апоптоза, в том числе mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих). Результаты, свидетельствующие о наличии у фитоэкдистероидсодержащего экстракта серпухи венценосной адаптогенных свойств, обусловили проведение эксперимента по оценке возможного анальгетического эффекта экстракта для этих животных. В эксперименте in vivo длительностью 30 суток установлено достоверное увеличение времени до возникновения болевого оборонительного рефлекса в тесте «Горячая пластина» у крыс, ежедневно потреблявших экстракт серпухи венценосной в дозе 5 мг/кг массы тела, по сравнению с контрольной группой. Показано достоверное увеличение времени до возникновения первого болевого рефлекса (облизывание передних лап) и числа вертикальных стоек у животных, потреблявших экстракт (16,7±2,0сек и 10,3±2,0 соответственно), по сравнению с аналогичными показателями у контрольных животных (8,8±0,7сек и 18,9±3,8 соответственно). На вторые сутки проводилось тестирование способности крыс к обучению избегания опасности на модели активного оборонительного поведения в тесте «Горячая пластина», в котором было зафиксировано значительное достоверное уменьшение латентного периода до оборонительного поведения более чем в 2 раза у крыс, получавших экстракт по сравнению с контрольными животными. Таким образом, совокупность полученных данных свидетельствует о наличии у фитоэкдистероидсодержащего экстракта определенных анальгетических свойств и демонстрирует способность экстракта, содержащего 97 фитоэкдистероиды, активизировать животных к обучению избегания опасности. Согласно данным, представленным в работах [3, 33], у животных, получавших 20-гидроксиэкдизон исследовательское поведение, усиливалось возрастали ориентировочно- параметры физической работоспособности, стимулировались механизмы памяти, что проявлялось в сокращении времени пробега лабиринта взрослыми животными и выработке условно-оборонительного рефлекса. Обоснованием возможного для влияния проведения физиологических фитоэкдистероидсодержащего исследований экстракта серпухи венценосной на поведенческие и когнитивные функции служили данные о том, что одним из возможных проявлений фармакологической активности фитоэкдистероидов является их выраженное антиоксидантное действие [80]. Известно, что вещества с антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами могут благоприятно влиять на процессы обучения и памяти [18]. Также показано, что фитоэкдистероиды могут индуцировать синтез глутаминовой декарбоксилазы (фермент, участвующий в биосинтезе ГАМК) и ацетилхолинэстеразы в головном мозге крыс. Обнаружено, что экдистероиды могут играть защитную роль при ишемии мозга за счет уменьшения глутамат-индуцированной клеточной гибели нейронов коры головного мозга крыс. Воздействие фитоэкдистероидов на поведение животных может быть также объяснено наличием у некоторых из них анксиолитического («противотревожного») действия [90], которое взаимосвязано и с центрально-периферическими звеньями опиатной системы организма [40]. Снижение уровня тревожности может способствовать увеличению общей активности животных, ориентировочно- исследовательского и поискового поведения и как одно из следствий улучшению когнитивных способностей. Поэтому на следующем этапе наших исследований особый интерес представляло изучение in vivo курсового воздействия перорального введения 98 экстракта серпухи венценосной (в дозировке 2 мг экдистероидов/ кг массы тела животного) на изменение поведенческих реакций крыс линии Вистар, позволяющих судить об адаптации организма к новым условиям, двигательной и исследовательской активности, а также скорости обучения инструментальному пищедобывательному навыку. В результате проведенных исследований было выявлено, что при использованной достаточно низкой дозировки фитоэкдистероидов крысы опытной группы достоверно быстрее обучались инструментальному пищедобывательному навыку по сравнению с животными контрольной группы, что отражалось достоверно более высоким числом нажатий на педали оперантной стенки. Выявлено, что у опытных животных по сравнению с контрольными, наблюдался повышенный уровень потребления кислорода, при этом горизонтальная и вертикальная двигательная активность не различались. Анализ корреляционных взаимосвязей метаболических, двигательных и оперантных показателей при обучении у крыс контрольной и опытной групп показал, что потребление кислорода коррелировало у контрольных крыс с общей двигательной активностью, тогда как у опытных крыс потребление кислорода и двигательная активность в большей степени коррелировали проведенное с инструментальной исследование деятельностью. указывало фитоэкдистероидсодержащего на экстракта то, Таким что серпухи образом, потребление венценосной способствовало адаптации организма к новым условиям и ускоряло процессы обучения и памяти у животных. Суммируя результаты исследований, свидетельствующие об адаптогенных и анальгетических свойствах экстракта и о благоприятном влиянии на процессы обучения и памяти, можно сделать заключение о перспективности его дальнейших клинических исследований. Тем не менее, существует необходимость расширения ассортимента специализированных пищевых продуктов, в первую очередь, профилактического назначения. В соответствии с этой задачей был проведен 99 скрининг различных сортов семян шпината на содержание фитоэкдистероидов, результаты которого показали, что содержание фитоэкдистероидов в семенах шпината варьирует от (1.4 до 3,0) мг / г семян. В соответствии с результатами этого скрининга был выбран сорт шпината Маркиза. Из листьев шпината сорта Маркиза получен сухой экстракт, содержание фитоэкдистероидов (10,8 мг/г), в котором по сравнению с исходным сырьем (0,022мг/г) увеличилось в 490 раз. Экстракт характеризуется предельно низким содержанием щавелевой кислоты (0,020мг/г), что определяет перспективность промышленного масштабирования использованного метода. Таким образом, проведенного резюмируя исследования, отметим, экспериментальные что они результаты свидетельствуют о достоверном снижении биомаркеров ОАС у стрессированных лабораторных животных (крысах линии фитоэкдистероидсодержащий экстракт Вистар), из серпухи потреблявших венценосной. Вышесказанное позволяет сделать заключение об адаптогенных свойствах тестируемого экстракта и целесообразности проведения дальнейших клинических исследований для обоснования его возможного использовании в составе специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище. 100 ВЫВОДЫ 1. Принудительное электрокожное раздражение интенсивностью тока 0,4мА в течение 8 секунд на лапы крыс линии Вистар достоверно увеличивало в плазме крови этих животных содержание кортикостерона (более чем в 3 раза), содержание бета-эндорфина (в 1,7 раза) и индекс апоптоза в тимусе (на 8%). В опытах in vivo электрокожное раздражение выбранных параметров может быть использовано в качестве модели стрессорного воздействия для оценки влияния исследуемых субстанций на биомаркеры общего адаптационного синдрома у крыс линии Вистар. 2. У интактных экстракт из крыс, серпухи потреблявших венценосной фитоэкдистероидсодержащий (интервал дозировок 2-15 мг фитоэкдистероидов/кг массы тела животного в сутки; продолжительностью 15 суток), не выявлено неблагоприятных изменений ростовых показателей, а также изменений содержания в крови и/или моче кортикостерона, бетаэндорфина и простагландина Е2, степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе. Установлено дозозависимое снижение содержания норадреналина в плазме крови. 3. У стрессированных крыс, потреблявших в течение 30 дней экстракт серпухи венценосной в дозе 2мг экдистероидов/кг массы тела в сутки, показано достоверное увеличение массы тимуса (на 18%) и снижение активности апоптоза (на 7% для степени ДНК повреждений и 24% для индекса апоптоза) в этом органе по сравнению со стрессированными крысами контрольной группы. Ежесуточное потребление в течение 15 дней в дозировке 5мг экдистероидов/кг массы тела экстракта серпухи венценосной достоверно снижало экскрецию с мочой кортикостерона более чем в 2,5 раза и норадреналина в 1,9 раз. 4. В тесте «Горячая пластина» установлено достоверное увеличение времени до возникновения болевого оборонительного рефлекса у крыс, 30 суток потреблявших экстракт серпухи венценосной в дозе 5 мг/кг массы тела 101 по сравнению с контрольной группой животных (8,8±0,7сек и 16,7±2,0 сек соответственно). 5. При потреблении в течение 25 суток экстракта серпухи венценосной в дозе 5 мг экдистероидов/кг массы тела крысы достоверно быстрее обучались инструментальному животными, не пищедобывательному получавшими экстракт: навыку по сравнению соответственно с количество обучившихся животных в первые сутки составило 62,5 и 25%, во вторые сутки 75 и 50% соответственно. 6. Разработан метод получения сухого экстракта из листьев шпината, включающий стадии водной экстракции, ультрафильтрации и адсорбции на гидрофобном носителе. Суммарное содержание фитоэкдистероидов в экстракте составило 10,8 мг/г, (степень очистки в 490 раз по сравнению с исходным сырьем), содержание щавелевой кислоты 0,020мг/г. 7. В модельных экспериментах in vivo установлено адаптогенное и анальгетическое действие фитоэкдистероидсодержащего экстракта из серпухи венценосной и охарактеризовано его влияние на процессы обучения и памяти. В лабораторных условиях разработан метод выделения и очистки экстракта из шпината с повышенным содержанием фитоэкдистероидов. 102 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абдукадиров И. Т. Разработка технологии производства препаратов аюстан, эксумид, гарпахол из растения Ajuga Turkestanica: автореферат диссертации на соискание ученой степени к.т.н.,- Ташкент.- 2007. - 22 с 2. Алексеева Л. И. Экдистероиды Serratula coronata и Ajuga reptans L.: Дис. кан. хим. наук.: Спец.: 02.00.03/ Л. И. Алексеева; Томск, 2003. - С. 130. 3. Андреева Л.И Воздействие нового экдистероидсодержащего препарата Серпистен на поведенческую активность и формирование клеточной адаптации у крыс при тепловом стрессе./ А.А. Бойкова, А.А Быкова, Л.И Андреева // Теоретическая и прикладная экология.- 2012.- №1.С.36-43. 4. Ахрем А.А, Ковганко Н.В. Экдистероиды: Химия и биологическая активность/ А.А Ахрем, Н.В.Ковганко - Минск: Наука и техника, 1989. - 327 с. 5. Ашихмина Т.Я. Второе международное совещание по фитоэкдистероидам (4-7 июля 2010 г., Сыктывкар, Россия)/ Т.Я. Ашихмина, В.В. Володин, С.И. Матаев // Теоретическая и прикладная экология.- 2012.-№1.-с.4-5 6. Балтаев У.А. Фитоэкдистероиды – структура, источники и пути биосинтеза в растениях // Биоорганическая химия.- 2000. – Т. 26; № 12. – С. 892-925. 7. Бойко Е.Р., Володин В.В., Мартынов Н.А., Потолицына Н.Н., Людинина А.Ю., Володина С.О. Сочетанное влияние витаминноминерального комплекса Витабаланс-мультивит и БАД «Серпистен» на физическую работоспособность лыжников-гонщиков высокой квалификации. IV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием/ В.В.Володин, Н.А. Мартынов, Е.Р.Бойко// «Спорт и медицина. Сочи-2013» Сборник материалов,19-22 июня 2013.- С. 34-36. 103 8. Бондаренко Д.А In vivo модели для изучения анальгетической активности/ И.А. Дьяченко, Д.А Бондаренко //Биомедицина.- № 2.2011, С. 84-94. 9. Брехман Н.И. Элеутерококк.- Л.: Наука, 1968.- 188 с. 10. Ветошева В.И. Влияние Серпистена на продуктивность памяти пациентов c ограниченными изменениями коронарных сосудов мозга/ Ветошева В.И., А.Е. Попов, С.О. Володина, В.В. Володин// Теоретическая и прикладная экология. -2012. №1.- С.62-65. 11. Володин В.В. Стресс-протекторное действие экдистероидсодержащей субстанции Серпистен/ Сыров В.Н., Хушбактова З.А., В.В. Володин // Теоретическая и прикладная экология,2012.- №1.- с.18-24. 12.Володин В.В. Экдистероидсодержащие растения - источники новых адаптогенов/ С.И.Матаев, В.В.Володин//Вестник Биотехнологии.- 2011.- Т.7.-№2.- С.52-59. 13. Володин В.В. Экдистероидсодержащие растения: ресурсы и биотехнологическое использование/ С.О.Володина, И.Ф Чадин В.В. Володин - Екатеринбург: УрО РАН, 2007.- 127с. 14. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. Экспериментальная модель алиментарного полигиповитаминоза разной степени глубины у крыс/ В.М. Коденцова, Н.А. Бекетова, О.А.Вржесинская // Вопр. питания.- 2012. – Т. 81, № 2. – С. 51-56 15. ГОСТ 12.1.007-76 Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности 16. Дурнев А. Д., Жанатаев А. К., Анисина Е. А. и др. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. – М., 2006. – 27 с. 17. Жанатаев А.К. Перспективы определения 8-гидрокси-2- дезоксигуанозина в качестве биомаркера окислительного стресса в 104 эксперименте и клинике/ А.Д.Дурнев, С.Б. Середенин, А.К. Жанатаев //Вестник РАМН. – 2002. – № 2. – С.45-49., 18. Журавлев Б.В. Пищедобывательное и оборонительное поведение: роль иммуномодуляторов в системной организации/ Е.П. Муртазина, Б.В.Журавлев // Успехи физиологических наук.- 1996. -Т. 27.- № 2.- С. 90-101. 19. Зибарева Л.Н., Еремина В.И., Иванова Н.А. Новые экдистероидоносные виды рода Silene L. и динамика содержания в них экдистерона/В.И. Еремина, Н.А.Иванова, Л.Н. Зибарева // Раст. ресурсы. - 1997. - Т. 33, вып. 3. - С. 73 - 76. 20. Зорин С.Н. Получение и характеристика ферментативного гидролизата изолята соевых белков. / М. Баяржаргал, Е.А. Бурдза, В.К. Мазо, С.Н. Зорин //Вопр. Питания.-2006. – Т. 76. - №1. – С. 10-12 21.Исламова Ж.И. Перспективы использования препаратов, созданных на основе фитоэкдистероидов, в лечении лямблиоза / Н.А. Давие, В.Н. Сыров, С.О. Осипова, Ж.И. Исламова // Теоретическая и прикладная экология.- 2012.- № 1.- С. 57-61 22. Кириллов, О.И. К механизму адаптогенного действия элеутерококка / О.И. Кириллов // Матер. научн. совещания по вопр. фармакол. регуляции остаточной резистентности Л.,1963.- 43-44 с 23.Куракина И.О., Булаев В.М. Экдистен – тонизирующее средство в таблетках по 0.005 г/ В.М. Булаев, И.О.Куракина//Новые лекарственные препараты. М., 1990.- Вып. 6.- С. 16-18. 24. Лазарев, Н.В. Пат.физиол. и эксперим. терапия /Н.В. Лазарев, Е.И. Люблина, М.А. Розин.-Медиздат,1959.-16-21 с. 25.Лишманов Ю.Б. Бета-эндорфин и стресс-гормоны плазмы крови при состояниях напряжения и адаптации/Ю.Б. Лишманов// Бюлл. эксперим. биол. и медицины.-1987.-№4.- с.422-424 105 26. Лафон Р. Фитоэкдистероиды и мировая флора: разнообразие, распределение и эволюция/ Р. Лафон //Физиол.растений.- 1998.-Т.45.№3.-с.326-346 27. Машковский М.Д. «Лекарственные средства».- М. «Новая волна».- 16 издание.- 2010.- с.135. 28. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца/ Ф.З. Меерсон.-М.: Медицина, 1984. -270 с. 29. Меерсон, Ф.З. Адаптивная медицина/ Ф.З. Меерсон.-М.,1993.-331с. 30. Патент № 2326672, Россия МПК C2, А61К 31/565 А61Р 39/00. Противолучевое средство / А.Г. Кудяшева, В.В. Володин, О.Г. Шевченко, Н.Г. Загорская, С.О. Володина, Л.А. Башлыкова, О.В. Ермакова; Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; № 2006108965/15; заявл. 21.03.06; опубл. 20.06.08. Бюл. № 17. 31. Петрова Н.Б. Антиагрегационное и стресс-лимитирующее действие экдистероидсодержащей субстанции серпистен/Н.Б. Петрова// Теоретическая и прикладная экология. -2012. -№1.- С.48-54. 32. Приказ МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения» 33. Пчеленко Л.Д. Адаптогенный эффект экдистероидсодержащей фракции Serratula coronata L./Л.Г. Метелкина, С.О. Володина, Л.Д. Пчеленко // Химия растительного сырья.- 2002. - №Т. - С. 69-80. 34. Распопов Р.В. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц диоксида титана, вводимых в виде дисперсии в желудочно-кишечный тракт крыс. Сообщение 1. Интегральные, биохимические и гематологические показатели, степень всасывания макромолекул в тонкой кишке, повреждение ДНК/ В.М.Верников, А.А.Шумакова, Т.Б. Сенцова, Р.В. Распопов и др.// Вопросы питания.–2010.– Т.79, № 4.– С.21-30. 106 35.Репина Е.Н. Влияние 20-гидроксиэкдизона из растений Serratula coronata L. на свойства белой и красной крови кроликов породы шиншилла/ Н.А. Мойсеенко, Ж.Е. Иванкова, Е.Н. Репина //Фундаментальные исследования.- 2004.- № 2.- С. 151-153. 36. Селье, Г. Очерки об адаптационном синдроме/ Г.Селье.- М.:Медицина, 1960.-254с 37. Сергутина А.В. Влияние L-ДОФА на мозг в зависимости от индивидуальных особенностей поведения/Л.М. Герштейн, А.В. Сергутина // Журнал неврологии и психиатрии.- 2014.-№12.-с.56-59 38. Сидорова Ю.С. Влияние внутрижелудочного введения фитоэкдистероидов на некоторые показатели гормонального статуса крыс линии Вистар/ С.Н. Зорин, Л.С.Василевская, В.К. Мазо, Ю.С.Сидорова // Вопросы питания.-2013.- том 82, №4, с. 22-26 39. Сидорова А. Хроматографическое и электрофоретическое определение катехоламинов, метанефринов и 3,4-дигидроксифенилаланина в моче и плазме крови/ А.А. Сидорова, Л.А Карцова//Сорбционные и хроматографические процессы.- 2009.- Т. 9.- Вып. 6.- с. 774-782 40. Судаков С.К. Влияние периферического введения пептидных лигандов d-опиоидных рецепторов на уровень тревожности и двигательную активность крыс/,Г.А.Назарова, К.Н. Колясникова, А. А. Колпаков, С.К.Судаков //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011.- Т. 151.- № 6.- С. 604-606 41. Сусленникова В.М. Руководство по приготовлению титрованных растворов /Е.К. Киселева, В.М. Сусленникова. - Москва: Химия, 1967. С.144. 42. Сыров Н.В. Сравнительное изучение анаболической активности фитоэкдистероидов и стеранаболов в эксперименте/ Н.В. Сыров //Химико-фармацевтический журнал, 2000.-Том 34.-с.193-197. 43. Сыров В.Н. Сравнительное изучение регулирующего влияния экдистерона и ретаболила на белоксинтезирующие процессы в 107 организме высших животных/Г.А. Шахмурова, З.А. Хушбактова, В.Н.Сыров // «Теоретическая и прикладная экология».- 2012.- №1.- с. 13-17 44. Сыров В.Н. Результаты фитоэкдистероидов в экспериментального качестве стимуляторов изучения эритропоэза у лабораторных животных /С.С.Насыров, З.А. Хушбактова, В.Н.Сыров// Эксперим. клинич. фармакол.- 1997.- № 3.- С. 41-44 45.Сыров Н.В. Фармокологическая оценка фитоэкдистероидов и созданных на их основе препаратов как потенциальных стимуляторов психической и физиологической активности в нормальных и осложненных условиях/ Н.В.Сыров //5-я международная конференция «Биологические основы индвидуальной чувствительност к психотропным средствам».- 2010.- с.84-85 46. Торосян В.Ф. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа. Практическое руководство: учебно-методическое пособие /В.Ф. Торосян. - Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2010. - С.179 47.Тутельян В.А., Гаппаров М.Г. Стресс и питание человека / В кн.: Руководство по реаби-литации лиц, подвергшихся стрессовым нагрузкам / Под ред. В.И. Покровского.- М.: Медицина, 2004.- С. 81-85. 48.Тышко Н.В. экспериментальных Сравнительная рационов на характеристика рост и развитие влияния крыс/В.М. Жминченко, В.А.Пашорина, К.Е. Селяскин, Н.В. Тышко // Вопросы питания. – 2011. – Т. 80.-№ 5. – с. 30 – 38 49. Тутельян В.А. Пищевые ингредиенты в создании современных продуктов питания/,А.П. Нечаев , О.В. Багрянцева, В.А..-М: изд. ДеЛи плюс.-2013.-520стр. 50. Флора Северо - Востока европейской части СССР/ Под ред. А.И. Томачева. В 4-х томах. Семейства Nymphaeaceae – Hyppuridaceae. –Л: Наука, 1976.-Т.3.-293 с. 108 51.«Фитоэкдистероиды» под редакцией Володина В.В. //Спб., Наука//, 2003,-293с; 52. Хушбактова З.А. Иммуномодулирующая и стресс-протективная активность фитоэкдистероидов экдистерона и туркестерона при иммобилизационном стрессе у мышей/,В. Н.Сыров, Г. А.Шахмурова, З. А.Хушбактова // Химико-фармацевтический журнал.- 2010.-№ 1.- с.9- 11. 53. Чадин И.Ф. Распределение 20-гидроксиэкдизона в генеративных растениях Serratula coronata L./,Н.А. Колегова, И.Ф. Чадин // Сиб. экол. журн.- 2003.- № 1.- С. 49-53 54. Черных Н.С. Влияние метандрастена и экдистерона на физическую выносливость животных и белковый обмен в скелетных мышцах/ Н.Л.Шимановский, Г.В Шутко, Н.С. Черных//Фармакология и токсикологии.- 1988. – № 6. – с. 57-62 55.Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах/ Н.А.Бекетова, Е.Д. Бендер, Л.А. Харитончик, Л.М .Якушина // Вопр. питания.- 1993.- № 1.С.43-48. 56.Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены / К.В. Яременко.- СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2008.- с.129. 57. Alessi D.R. The role of PI 3-kinase in insulin action//Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/C.P. Downes, D.R. Alessi //Molecular and Cell Biology of Lipids, Volume 1436, Issues 1–2, 8 December 1998, Pages 151164. 58. Arthur ST Ajuga turkestanica increases Notch and Wnt signaling in aged skeletal muscle/ KA Zwetsloot , MM Lawrence, ST Arthur // Eur Rev Med Pharmacol Science.- 2014/-18(17).- p. 2584-92. 109 59. Bakrim A. Ecdysteroids in spinach (Spinacia oleracea L.): biosynthesis, transport and regulation of levels/ A Maria ,F Sayah ,A Bakrim //Plant Physiol Biochem.- 2008.-46(10).-p.844-54. 60. Bakrim A. Ecdysteroid profiles of two Ajuga species, A. iva and A. remota/J Ngunjiri , S Crouzet, A Bakrim //Nat Prod Commun.- 2014.-9(8).-p.106974. 61. Bathori M. HPLC Screening of plant extracts for ecdysteroids/K. Szendrei, M. Bathori et al //J. High Resol. Chromatogr. Commun., 1988.-No. 9.P.539-541 62. Benevenca N. Nutrient Requirements of Laboratory Animals, Fourth Revised Edition/C.Calvert, C.Eckhert N.Benevenca et al. – Washington: National Academy Press, 1995. – 192 p. 63. Bonhomme D., Minni A. M., Alfos S., Roux P., E. R. P. Higueret, Moisan M.-P., Pallet V., Touyarot K. //Front Behav Neurosci.-2014.- V 8.- Р. 64. Brazil D.P. Ten years of protein kinase B signalling: a hard Akt to follow/ B.A. Hemmings, D.P. Brazil // Trends Biochem. Sci. – 2001 – Vol. 26. – P. 657 65. Brittany L. Graf Quinoa seeds leach phytoecdysteroids and other compounds with anti-diabetic properties/Alexander Poulev, Peter Kuhn, L. Graf Brittany //Food Chemistry.- 2014.- Volume 163.-p. 178–185 66. Burgering BM Protein kinase B (c-Akt) in phosphatidylinositol-3-OH kinase signal transduction/,PJ Coffer, BM Burgering // Nature.- 1995 Aug 17.376(6541):599-602. 67. Carpenter C.L. A tightly associated serine/threonine protein kinase regulates phosphoinositide 3-kinase activity/K R Auger, B C Duckworth, W M Hou, B Schaffhausen, C L Carpenter // Mol Cell Biol.- Mar 1993.- 13(3).-p. 1657–1665. 68. Chandna S. Single-cell gel electrophoresis assay monitors precise kinetics of DNA fragmentation induced during programmed cell death/ S Chandna //Cytometry A. – 2004. Vol. 61 – № 2. – P. 127-133. 110 69. Cross D. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B /D. Aless, P.Cohen, M. Andjelkovich, D. Cross, //Nature.1995.-№ 378, 785-789. 70. Da Costa L.A Nutrigenetics and modulation of oxidative stress/ A. Badawi , A. El-Sohemy , L.A Da Costa // Ann Nutr Metab.-2012.-60 Suppl 3.-р.2736. 71. De Martinis B.S. Methodology for urinary 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection/M.L.P Bianchi., B.S. De Martinis // Pharmacol.Res.–2002.–V.46, N 2.–P.129-131 72. Delcommenne M. Phosphoinositide-3-OH kinase-dependent regulation of glycogen synthase kinase 3 and protein kinase B/AKT by the integrin-linked kinase/, C Tan ,V Gray ,L Rue, M Delcommenne //Proc. Natl. Acad. Sci.,U S A.- 1998.- Sep 15.- 95(19):11211-6. 73. Dinan L., Whiting P., Scott A Taxonomic distribution of phytoecdysteroids in seeds of members of the Chenopodiaceae/P.Whiting, A Scott, L. Dinan // Biochem. systematics and ecology, 1998.- Vol.6.- P.553-576 74. Escobedo J. Distinct phosphotyrosines on a growth factor receptor bind to specific molecules that mediate different signaling pathways/, S.Navakasattusas, W.Kavanaugh, J. Escobedo //Cell.- 1992.-Volume 69.Issue 3, p.413–423 75. Foucault Anne-Sophie Quinoa extract enriched in 20-hydroxyecdysone affects energy homeostasis and intestinal fat absorption in mice fed a highfat diet/Patrick Even, René Lafont,Anne-Sophie Foucault //Physiology & Behavior.- 2014.-Volume 128.-p. 226–231 76. Galbraith M.N. An Insect-moulting hormone from a plant/Horn D.H.S., M.N.Galbraith // J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1966. Vol. 24. Р. 905−906 77. Gorelick-Feldman J. «Phytoecdysteroids. Understanding teier anabolic activity» Dissertation/ 2009 New Brunswick, New Jersey, 143p 78. Gorelick-Feldman J., Cohick W., Raskin I. Ecdysteroids elicit a rapid Ca(2+) flux leading to Akt activation and increased protein synthesis in 111 skeletal muscle cells /W.Cohick, I.Raskin, J.Gorelick-Feldman // Steroids.‐ 2010. ‐Vol. 75.‐№ 10.‐ Р. 632-637 79. Graf BL Quinoa seeds leach phytoecdysteroids and other compounds with anti-diabetic properties/A Poulev , P Kuhn, BL Graf //Food Chem.- 2014.163.-178-85. 80. Hu J 20-Hydroxyecdysone Protects against Oxidative Stress-Induced Neuronal Injury by Scavenging Free Radicals and Modulating NF-κB and JNK Pathways/ CX Luo, WH Chu, YA Shan, Z-M Qian, J Hu // PLoS ONE.-20012.- 7(12): e50764. 81. Ibrahim A. A.I The effects of palm vitamin E on stress hormone levels and gastric lesions in stress-induced rats/ Y. Kamisah, M. I. Nafeeza, M. F.Nur Azlina, Ibrahim A. A.I //Arch Med Sci. .- 2012.- V. 8, № 1.- Р. 22–29. 82. Imai S. Screening results of plants for phytoecdysones/ T. Toyosato, M. Sakai, S. Imai //Chem.Pharm.Bull.‐ 1969.‐Vol.17.‐P.335-339 83. Inukai K A novel 55-kDa regulatory subunit for phosphatidylinositol 3kinase structurally similar to p55PIK Is generated by alternative splicing of the p85alpha gene/ M Anai, E Van Breda, T Hosaka, H Katagiri, M Funaki, Y Fukushima, T Ogihara, Y Yazaki, Kikuchi, K Inukai et al. //J Biol Chem.1996.-271(10).-p.5317–5320. 84. Jing Ren G-protein αq participates in the steroid hormone 20hydroxyecdysone nongenomic signal transduction/Xiang-Ru Li, PengCheng Liu, Ren Jing // The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology.- 2014.-Volume 144, Part B.-p.313–323 85. Kennedy S G The PI 3-kinase/Akt signaling pathway delivers an antiapoptotic signal/A J Wagner, S D Conzen, S G Kennedy // Genes & Dev.‐ 1997.‐ 11.‐р. 701-713. 86. Kizelsztein P., Govorko D., Komarnytsky S., Evans A., Wang Z., Cefalu W.T., Raskin I. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. – 2009 – Vol. 296. – P. E433-E439. 112 87. Kobayashi N. Elevation by Oxidative Stress and Aging of HypothalamicPituitary-Adrenal Activity in Rats and Its Prevention by Vitamin E/ T.Machida, T. Takahashi, N.Kobayashi et al.//J Clin Biochem Nutr.- 2009.V.45.‐ № 2.- Р. 207–213 88. Koudela K. Stimulation of growth and development in Japanese quails after oral administration of ecdysteroid-containing diet /K. Koudela et. al./-Eur.J. Entomol, 1995.-Vol.92.-p.349.-354; 89. Kratky F. Effect of 20-hydroxyecdysone on the protein synthesis of / L. Opletal, J. Hejhalek, S. Kucharova, F. Kratky // Zivocisna Vyroba – 1997 – Vol. 42. – P. 445-451 90. Lafont R Practical uses for ecdysteroids in mammals including humans: an update/L. Dinan, R Lafont // Journal of Insect Science.- 2003.- 3: 7.- p30. 91. Lafont R. Recent progress in ecdysteroid pharmacology/ R.Lafont //Теоретическая и прикладная экология.‐ 2012.‐ №1.‐ с.6-12 92. Lafont Rene 4–Ecdysteroid Chemistry and Biochemistry/C. DauphinVillemant, Rene Lafont //Insect Endocrinology.- 2012.-p. 106–176 93. Lim T S Effect of vitamin E on cell-mediated immune responses and serum corticosterone in young and maturing mice/ N. Putt, D Safranski, C.Chung, R. R. Watson, T S Lim// Immunology.- 1981.- V. 44, № 2.- Р. 289–295. 94. Matsuda H. Effect of ecdysterone on experimental atherosclerosis in rabbit / Kawaba T., Yamamoto Y., Matsuda H. et al. // Folia Pharmacol. Jap.-1974.Vol. 70.- P. 325-339. 95. Morishita S. Cold–stress induces thymocyte apoptosis in the rat / S. Morishita //Pathophysiology. – 1997. – Vol. 4. – P. 213-219 96. Nakamura M. Class IA phosphatidylinositol 3-kinases are indispensable for osteoclast function by regulating cytoskeletal organization and cell death /H. Masuda, M. Iwasawa, M.Nakamura // Bone.-Volume 44.- Supplement 1.May 2009, P. S49-S50 97. Nakanishi K. Insect hormones. I. The structure of ponasteron A an insectmoulting hormone from the leaves of Podocarpus nakaii Hay / K. Nakanishi, 113 M. Koreeda, S. Sasaki et al. // J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1966. Vol. 24. P. 915−917. 98. Ochieng CO Phytoecdysteroids from the stem bark of Vitex doniana and their anti-inflammatory effects/ IO Ishola , SA Opiyo, CO Ochieng //Planta Med.- 2013.-79(1).-52-59. 99. Ogawa S., Nishimoto N., Matsuda H. Pharmacology of ecdysones in vertebrates // Invertebrate endocrinology and hormonal heterophylly / Ed. W.J. Burdette. Berlin: Springler, 1974. P. 341-344. 100. Otaka T. Stimulation of protein synthesis in mouse lever by ecdysterone/ T.Otaka, S. Okui, M. Uchiyama // Chem. Pharm. Bull.‐ 1969. Vol. 17.‐ № 1.‐ Р. 75-81 101. Otsu, M. Characterization of two 85 kDa proteins that associate with receptor tyrosine kinases, middle-T/pp60-src complexes, and PI3-kinase / M.Otsu et al. //Cell.-1991.-№65.- P. 91-104. 102. Panossian A Effekt of adaptogens on the central nervous system/G Wikman , A Panossian //Arquivos Brasileiros de Fitomedicina Cientifica.2005.- Vol.3.- numero1.- p.29-51 103. Panossian A. Plant adaptogens III. Earlier and more recent aspects and concepts on their mode of action /,G.Wikman, H.Wagner, A.Panossian // Phytomedicine.- 1999.- Vol. 6 (4),- p. 287-300 104. Panossian AG Adaptogens: A historical overview and perspective/ AG Panossian // Natural pharmacy.-2003.- 7(4):1.- p.19-20 105. Pons S The structure and function of p55PIK reveal a new regulatory subunit for phosphatidylinositol 3-kinase/ T Asano, E Glasheen, M Miralpeix, S Pons et al // Mol Cell Biol.- 1995.-15(8).-р.4453–4465. 106. Quillfeld Р. Measuring corticosterone in seabird egg yolk and the presence of high yolk gestagen concentrations/Poisbleau M., Р.Quillfeld// General and comparative endocrinology.- 2011.- V.173.- p.11-14 107. Ramalingam Sundaram Ameliorative effect of 20-OH ecdysone on streptozotocin induced oxidative stress and β-cell damage in experimental 114 hyperglycemic rats/Rajendran Naresh, Palanivelu Shanthi Sundaram Ramalingam //Process Biochemistry.-2012.- Volume 47, Issue 12.-p. 2072– 2080 108. Rajendran Naresh Kumar Protective role of 20-OH ecdysone on lipid profile and tissue fatty acid changes in streptozotocin induced diabetic rats/Ramalingam Sundaram,Palanivelu Shanthi, Naresh Kumar Rajendran // European Journal of Pharmacology.-2013.- Volume 698, Issues 1–3.-p. 489– 498 109. Russell G.B. Insect moulting activity of some New Zealand Gymnosperms/P.G. Fenemore, G.B.Russell //New Zealand J.Sci., 1970.-No 13.- p.61-68 110. Russell G.B Insect moulting hormone activity in some New Zealand Ferns/P.G. Fenemore, G.B.Russell // New Zealand J.Sci., 1971.-No 13.p.61-68 111. Selye H. The stress of life.- N.Y., 1956. 325 p 112. Selye, H.A. syndrome produced by diverse nocious agents/H.A. Selye//Nature.-1936.- №3479.- 32 р 113. Skolnik E.Y. Cloning of PI3 kinase-associated p85 utilizing a novel method for expression/cloning of target proteins for receptor tyrosine kinases/B.Margolis, M.Mohammadi, E.Y.Skolnik // Cell.- 1991.- Volume 65.- Issue 1.-р. 83-90 114. Smith C.C. Recommendations for design of the rat comet assay/ D.J.Adkins, E.A. Martin, M.R O'Donovan, C.C. Smith // Mutagenesis. – 2008. -Vol. 23 – № 3. – P. 233-240 115. Syrov VN Estimation of the hypoglycemic effect of phytoecdysteroids/ NKh Iuldasheva , FR Égamova , VN Syrov //Eksp Klin Farmakol.- 2012.-75(5).-p.28-31 116. Tarcic N. Restraint stress–induced thymic involution and cell apoptosis are dependent on endogenous glucocorticoids /H Ovadia, D.W. Weiss, N.Tarcic et. al. // J Neuroimmunol. – 1998. – Vol.82(1). – P. 40–6. 115 117. Tsanko S. Natural products from resurrection plants: Potential for medical applications/ Jacques Gechev , HilleHerman J. Woerdenbag, Tsanko S.//Biotechnology Advances.- 2014.-Volume 32, Issue 6.- p. 1091–1101 118. Uchiyama M., Effect of ecdysterone on carbohydrate and lipid metabolism/,T.Yoshida, M.Uchiyama // Invertebrate endocrinology and hormonal heterophylly / Ed. W.J. Burdette. Berlin: Springer, 1974. P. 401416. 119. Uchiyama M., Yoshida, T. // In (Burdette W.J., Ed.) “Invertebrate Endocrinology and Hormonal Heterophylly”, Springer-Verlag, Berlin – 1974. – P. 401-416. 120. Whiteman Eileen L Role of Akt/protein kinase B in metabolism/Han Cho, Morris J Birnbaum, Eileen L Whiteman // Trends in Endocrinology & Metabolism.-Volume 13.- Issue 10.- 1 December 2002.-Pages 444-451. 121. Xichao Xia Effects of 20-hydroxyecdysone on improving memory deficits in streptozotocin-induced type 1 diabetes mellitus in rat/Qingyuan Zhang, Rongzhi Liu, Xia Xichao //European Journal of Pharmacology.2014.-Volume 740.-p. 45–52 122. Yoshida T. Effect of ecdysterone on hyperglycemia in experimental animals / T. Yoshida, T. Otaka, M. Ushiyama et al. // Biochem. Pharmacol.1971. -Vol. 20.- P. 3263-3268 123. Zha J. Serine phosphorylation of death agonist BAD in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not BCL-XL./H.Harada, E.Yang, J.Jockel, S Kosmeyer, J.Zha //Cell.-1996, 87, 619-628. 124. Zimmer Aline R., Bruxel Fernanda HPLC method for the determination of ecdysterone in extractive solution from Pfaffia glomerata / Fernanda Bruxel, Aline R Zimmer // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.-2006. - №40.-p.450–453 125. Zundel W. Inhibition of the anti-apoptotic PI(3)K/Akt/Bad pathway by stress/ A.Giaccia, W. Zundel//Genes Development.- 1998.- 12, p.19411946.
