Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» На правах рукописи Гордова Валентина Сергеевна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПОСТУПЛЕНИИ СОЕДИНЕНИЯ КРЕМНИЯ С ПИТЬЕВОЙ ВОДОЙ Специальность 03. 03. 04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Сергеева Валентина Ефремовна, доктор биологических наук, профессор Чебоксары – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структурно-функциональное состояние лимфоидных органов 12 1.2. Биологическая роль кремния 20 1.3. Биологически активные органические соединения кремния 24 1.4. Источники кремния для человека 25 1.5. Физиологическая роль кремния и биологические эффекты от поступления его соединений в избыточном количестве 30 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материал исследования 40 2.2. Методы исследования 42 ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Структурно-функциональное состояние тимуса лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой 3.1.1. Общеморфологическая характеристика тимуса 50 3.1.2. Тучные клетки тимуса 52 3.1.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки тимуса 57 3.1.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки тимуса 63 3.1.5. Гистаминсодержашие структуры тимуса 67 3.2. Структурно-функциональное состояние селезенки лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой 3.2.1. Общеморфологическая характеристика селезенки 71 3 3.2.2. Тучные клетки селезенки 74 3.2.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки селезенки 75 3.2.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки селезенки 81 3.2.5. Гистаминсодержашие структуры селезенки 85 3.2.6. Пролиферативные процессы в герминативных центрах лимфоидных узелков селезенки 89 3.3. Структурно-функциональное состояние пейеровых бляшек (подслизистых агрегированных лимфоидных узелков тонкого кишечника) лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой 3.3.1. Общеморфологическая характеристика пейеровых бляшек 92 3.3.2. Тучные клетки пейеровых бляшек 95 3.3.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки пейеровых бляшек 95 3.3.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки пейеровых бляшек 98 3.3.5. Гистаминсодержашие структуры пейеровых бляшек 101 3.3.6. Пролиферативные процессы в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек 104 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 107 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 121 ВЫВОДЫ 123 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 125 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 159 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА 160 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Кремний содержится во всех тканях и органах растений, животных и человека (Матыченков В. В., 2008, Голохваст К. С., 2010; Currie H. A. et al., 2007, Maehira F. et al., 2008). В животном организме он входит в состав гликозаминогликанов, принимает участие в формировании костной ткани (Мансурова Л. А. и соавт., 2009; Kim M. Н. et al., 2009; Macdonald H. M. et al., 2012). Соединения кремния не являются биологически инертными. Вопросы, связанные с поступлением в организм кремния в его различных соединениях и формах, остаются актуальными в мировой науке. Интерес ученых разных стран, касающийся действия соединений кремния на организм, в том числе и на иммунную систему, возрос за последние годы. Многочисленные витральные исследования показывают, что соединения кремния действуют на макрофаги, пролиферацию Тлимфоцитов, вызывают апоптоз дендритных клеток, влияют на синтез интерлейкинов клетками иммунной системы (Smalley D. et al., 1998; Migliaccio C. et al., 2005; Brown J. М. et al., 2007; Winter M. et al., 2011). Опыты на животных представлены интратрахеальным, внутривенным, алиментарным (пищевые добавки) поступлением в организм диоксида кремния (Сапожников С. П. и соавт., 2013). Изучение действия кремния на организм человека связано с ретроспективными исследованиями больных силикозом легких, носителей силиконовых имплантатов и страдающих аутоиммунными заболеваниями (Авцын А. П. и соавт., 1991; Teuber S. S. et al., 1995; Ojo-Amaize E. A., et al., 1996). Независимо от способа поступления в организм, диоксид кремния, асбест, силикон и наночастицы кремния способны оказывать сходное выраженное воздействие на звенья иммунной системы, вплоть до участия в патогенезе аутоиммунных заболеваний (Murakami S. et al., 2009; Speck-Hernandez C. A., Montoya-Ortiz G., 2012). 5 Согласно нормам физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации (Методические рекомендации. МР 2.3.1.2432-08), суточное потребление кремния человеком составляет 30–50 мг в сутки, однако, биодоступность соединений кремния при этом не учитывается. Некоторое количество биодоступной ортокремниевой кислоты образуется при контакте с водой и биологическими жидкостями диоксида кремния, считающегося нерастворимым (Jurkić L. M. et al., 2013). Диоксид кремния входит в состав зубной пасты, декоративной косметики, присутствует в пищевых добавках как разрыхлитель, входит в состав антацидных препаратов (Николаев В. Г. и соавт., 2005; Ердакова В. П., 2007; Акулович А. В. и соавт., 2011; Powell J. J. et al., 2007). Источником ортокремниевой кислоты (H4SiO4), главной формы биодоступного кремния для человека и животных, выступают, в основном, растворимые соединения кремниевых кислот. Превращение силикатов природных вод, в частности, метасиликата натрия, в биодоступную ортокремниевую кислоту происходит под действием соляной кислоты желудка (Jurkić L. M. et al., 2013). С питьевой водой поступает от 50 до 80 процентов всего кремния, и его содержание в природных источниках может превышать 70 мг/л (Сапожников С. П., 2001; Jugdaohsingh R., 2007; Li Zh. et al., 2010). Содержание силикатов в питьевой воде в Российской Федерации строго регламентировано и составляет 10 мг/л в пересчете на кремний (ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02). Имеются исследования, подтверждающие связь концентрации водорастворимых соединений кремния в водно-пищевых рационах жителей различных биогеохимических провинций с возникновением дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта, изменениями иммунного статуса, включая формирование аутоиммунных заболеваний (Сапожников С. П., 2001; Сусликов В. Л. и соавт., 2009; Толмачева Н. В., 2011; Ефейкина Н. Б. и соавт., 2012, 2013; Junnila S. K., 2011). 6 Показано, что под воздействием соединений кремния, поступающего с питьевой водой, происходит морфологическая перестройка и перераспределение биогенных аминов в главном органе иммунитета – тимусе (Дьячкова И. М., 2011; Сергеева В. Е. и соавт., 2013). Однако, имеющихся литературных данных недостаточно для того, чтобы восполнить пробел в исследованиях, посвященных кремнию, и утверждать, что при поступлении в организм соединений кремния с питьевой водой морфофункциональные изменения имеют системный характер и происходят не только в тимусе, но и в других органах иммунной системы. В связи с этим, вполне обоснован поиск морфологического субстрата адаптационных реакций на поступление водорастворимых соединений кремния со стороны центральных и периферических лимфоидных органов. Цель работы – изучение морфо-физиологического состояния лимфоидных органов (тимуса, селезенки, пейеровых бляшек) лабораторных крыс при длительном поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой. Задачи исследования: 1. Изучить микроморфологические изменения тимуса, селезенки, пейе- ровых бляшек у лабораторных крыс при длительном поступлении соединения кремния с питьевой водой в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний. 2. Исследовать гистаминсодержащие структуры изучаемых лимфоид- ных органов в моделируемых условиях эксперимента. 3. Определить состояние тучноклеточной популяции в изучаемых лим- фоидных органах. 4. Изучить воздействие водного кремния на состояние популяций кле- ток, имеющих моноцитарно-макрофагальное происхождение (Iba-1-позитивных), в структурах тимуса, селезенки, пейеровых бляшек. 7 5. Исследовать воздействие водного кремния на состояние популяций антигенпредставляющих (MHС-II-позитивных) клеток в изучаемых лимфоидных органах. 6. Оценить пролиферативную активность в герминативных зонах лим- фоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек при поступлении кремния с питьевой водой. Научная новизна Впервые при комплексном исследовании показаны микроморфологические особенности тимуса, селезенки и пейеровых бляшек у лабораторных крыс при длительном поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой. Проведена оценка изменения обеспеченности гистаминсодержащих структур изучаемых лимфоидных органов в моделируемых условиях эксперимента. Получены новые научные данные, отражающие количественные и качественные изменения тучных, антигенпредставляющих клеток (MHC-II позитивных клеток) и моноцитарно-макрофагальных (Iba-1 позитивных) клеток тимуса, селезенки и пейеровых бляшек исследуемых животных при воздействии на организм кремния, поступающего с питьевой водой. Впервые с помощью маркеров пролиферации PCNA и Ki-67 показаны пролиферативные изменения в герминативных центрах пейеровых бляшек при длительном поступлении кремния с питьевой водой. Теоретическая и практическая значимость работы Научные положения и выводы диссертационного исследования в значительной степени расширяют представления о возможных механизмах иммуномодулирующего действия кремния, в течение длительного времени поступающего ad libitum с питьевой водой, и дополняют современные данные о соcтоянии структурно-функционального статуса лимфоидных органов (тимуса, селезенки, пейе- 8 ровых бляшек) лабораторных животных при адаптации к хроническим воздействиям. Результаты и практические рекомендации диссертации применяются в учебном процессе и могут быть использованы при написании учебных пособий по клеточной биологии, цитологии, гистологии, общей иммунологии, а также в профилактической медицине. Реализация результатов исследований Научные разработки и положения диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова», в работе БУ «Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики», БУ «Чебоксарская районная больница Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики». Рационализаторское предложение № 1171 «Способ описания морфологического и функционального состояния тучноклеточной популяции в гистологических препаратах», выданное 9 сентября 2013 года Гордовой В. С., применяется в работе научного студенческого кружка кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии Чувашского государственного университета им. И. Н. Ульянова. Степень достоверности и апробация результатов В литературном обзоре подвернуто критическому анализу большое количество источников. Выбранная модель хронического поступления соединения кремния в организм с питьевой водой соответствует поставленной цели диссертационного исследования. Фактический экспериментальный материал получен на сертифицированном оборудовании. Примененные иммуногистохимические маркеры широко используются для оценки морфо-функционального состояния лимфоидных органов. Адекватно выбранные современные методы исследования с исполь- 9 зованием методов параметрической и непараметрической статистики для последующей обработкой полученных данных обеспечивают достоверность результатов проведенных экспериментов. Основные научные положения, выводы и результаты работы доложены и обсуждены на: Международном конгрессе «Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов» (Тбилиси, Грузия, 23–26 сентября 1999 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Морфология в теории и практике», посвященная 90-летию со дня рождения профессора Д. С. Гордон (Чебоксары, 14 ноября 2012 г.); XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммуннореабилитации (ОАЭ, Дубай, 11–15 октября 2013 г.); Международной научной школе «Наука и инновации – 2013» ISS «SI2013» (Йошкар-Ола, 7–12 июля 2013 г.); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Современные проблемы естественнонаучных исследований» (Чебоксары, 2012, 2013, 2014 гг.); IV Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Россия, Санкт Петербург, 18–21 июня, 2013 г.) и расширенном заседании кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» (Чебоксары, 23 мая 2014 г.). Научные положения, выносимые на защиту: 1. Структурно-функциональные особенности лимфоидных органов лабораторных крыс при поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой заключаются в изменении строения долек тимуса, абсолютном и относительном увеличении площадей герминативных центров лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек. 2. Происходят количественные и качественные изменения популяции антигенпрезентирующих клеток при участии гистамина в селезенке и 10 лимфоидных узелках пейеровых бляшек, что отражает процессы пролиферации в морфо-функциональных зонах, ответственных за формирование пула антигенспецифических лимфоцитов при поступлении с питьевой водой кремния. Публикации Основные положения диссертационной работы отражены в 14 опубликованных работах, из них 4 – в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, входящих в перечень, определенный ВАК Российской Федерации. Структура и объем диссертации Диссертационный материал изложен на 164 страницах компьютерного исполнения и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы, списка сокращений, списка иллюстративного материала. В работе представлено 14 таблиц и 29 рисунков, из которых 24 – микрофотографии. Список литературы содержит 167 отечественных и 128 иностранных источников. Личное участие автора Автором самостоятельно собрана и подвергнута анализу научная литература для написания литературного обзора и обсуждения результатов исследований. При непосредственном участии автора проводилась формулировка задач исследования, выбор иммуногистохимических маркеров, планирование эксперимента, проведение экспериментов с животными с последующим выделением лимфоидных органов (тимуса, селезенки, пейеровых бляшек), приготовление криостатных срезов с постановкой реакции по методу Кросса, заливка органов в парафин с приготовлением препаратов, окрашенных гематоксилином-эозином и толуидиновым синим по методу Унна. Фотографирование полученных препаратов с после- 11 дующей морфометрией, статистической обработкой с применением методов параметрической и непараметрической статистики, интерпретация результатов экспериментов, написание текстов научных статей по полученным данным осуществлялось лично автором. 12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структурно-функциональное состояние лимфоидных органов Морфологическая оценка функциональных изменений, в частности, в лимфоидных органах, является неотъемлемой частью фундаментальных исследований, поскольку структура и функция неразрывно связаны друг с другом. Системный подход, подкрепленный методологическим обоснованием, позволяет выявить общие черты, некоторые закономерности адаптации организма при различных воздействиях (Труфакин В. А., Робинсон М. В., 1996; Робинсон М. В., Труфакин В. А., 1998). Считается, что необратимое вмешательство в организм (спленэктомия, тестэктомия, овариоэктомия) приводит к морфологическим и функциональным изменениям в следующих тимусных зонах: субкапсулярной, внутренней кортикальной, кортикомедуллярной, медуллярной; а также во внутридольковых периваскулярных пространствах (Петрова Т. Л., 1999; Стручко Г. Ю., 1999, Сарилова И. Л. и соавт, 2008; Артемьева И. Л., Сергеева В. Е., 2012; Москвичев Е. В., 2013). Под влиянием внешних факторов (стресс, сезон, магнитное излучение, КВЧ, иглоукалывание) также происходит одновременное изменение как морфологических структур тимуса, так и изменение функционирования этих структур (Гордон Д. С., Сергеева В. Е., Зеленова И. Г., 1982; Гордон Б. М., 2000; Гурьянова Е. А. и соавт., 2011; Любовцева Л. А. и соавт., 2011). При воздействии многих веществ изменения претерпевают как функциональные свойства тимусных структур, так и морфологические компоненты тимусных зон (Бибик Е. Ю., Берест А. Ю., 2011). Многочисленные работы школы профессора Д. С. Гордон показали, что к таким веществам относятся катехоламины (Гордон Д. С., Сергеева В. Е., Зеленова И. Г., 1982), брадикинин, гистамин (Любовцева Л. А., 1980; 1994), хорионический гонадотропин (Петрова Т. Л., 1999; 13 Ильина Л. Ю., 2002; Ялалетдинова Л. Р., Ястребова С.А., 2013),глюкокортикоиды (Ястребова С. А., Сергеева В.Е., 1999), соматотропный гормон (Спирин И. В., 2007), мелатонин (Шатских О. А., 2013), адренокортикотропный гормон (Лузикова Е. М., 2005), микроэлементы (Агафонкина Т. В., 2006; Дьячкова И. М., 2011), полиоксидоний (Захид М., 2012; Стручко Г. Ю. и соавт., 2012; Москвичев Е.В., 2013), Следует заметить, что морфо-функциональные изменения, наблюдаемые вышеперечисленными авторами в тимусе, всегда сопровождались перераспределением катехоламинов, серотонина, гистамина между биоаминсодержащими структурами тимуса и их микроокружением. Периферический лимфоидный орган – селезенка, отличается по структуре других органов иммунной системы. Специфические морфологические особенности селезенки заключаются в наличии красной и белой пульпы, периартериальных лимфатических влагалищ, окутывающих все пульпарные артерии, лимфоидных узелков, находящихся на разных стадиях развития, а также в ангиоархитектонике сосудистого русла (Стаценко Е. А., 2009; Кащенко С.А. и соавт., 2013; Макалиш Т. П., 2013). Селезенка чувствительна к различного рода внешним воздействиям. Так, изучено влияние на селезенку глюкокортикоидов (Сикора В. З. 2010; Лузикова Е. М. и соавт., 2011) мелатонина (Перцов С. С., 2010; Шатских О. А., Лузикова Е. М., 2012), толуола (Голубцова Н. Н., 2001), иммуномодуляторов (Кириллов Н. А., 2001), иглоукалывания (Гурьянова Е. А., 2011). При введении наночастиц золота в селезенке наблюдается морфологическая перестройка белой пульпы с увеличением в лимфоидных узелках количества клеток с фигурами митоза (Злобина О. В. и соавт., 2011). При удалении селезенки наблюдаются изменения в морфологии и функциональной активности тимуса лабораторных животных (Стручко Г. Ю., 1999; Москвичев Е. В. и соавт., 2012) сходные изменения иммунного статуса зафиксированы и у человека (Масляков В. В. и соавт., 2010). 14 Как и в тимусе, морфо-функциональные изменения в селезенке сопровождаются перераспределением нейромедиаторных биогенных аминов между белой и красной пульпой (Сысоева Л. А., 1986; Винокур Л. И., 1991; Кириллов Н.А., 2001; Голубцова Н. Н. и соавт, 2000; Кроткова О. С. и соавт., 2014). Большое значение в этом плане приобретают исследования лимфатических узлов, проведенные при помощи люминесцентно-гистохимических методов. Исследованиями Зеленовой И. Г. (1971) и Анчиковой И. В. (1983) описан ряд люминесцирующих структур, в частности, внутрифолликулярные и береговые клетки, сеть адренергических нервных волокон. Впервые количественные и качественные изменения обеспеченности биогенными аминами лимфатических узлов при введении антигенов представлены в работах А. Т. Смородченко (1996). Введение наночастиц золота также отражается на морфологии лимфатических узлов (Злобина О. В. и соавт., 2011). Пейеровы бляшки, подслизистые агрегированные лимфоидные узелки тонкого кишечника, как и любые лимфоидные образования, состоят из Т- и В-зон с наличием герминативных центров в В-зоне. Их клеточный состав практически не отличается от такового любого периферического лимфоузла (Хаитов Р. М. и соавт., 2002). Для них характерна уникальная морфологическая структура – фолликулярно-ассоциированный эпителий, состоящий из М-клеток с короткими цитоплазматическими отростками. За счет этих отростков образуются как бы интраэпителиальные карманы, в которых находятся макрофаги, Т- и В-лимфоциты, дендритные клетки (Гусейнов Т. С., Гусейнова С. Т., 2012). Показано, что морфометрические показатели (высота и ширина узелков, высота куполов бляшек, размеры межузелковых зон) и клеточный состав (соотношение количества малых, средних, больших лимфоцитов, бластных форм, макрофагов) пейеровых бляшек изменяются в зависимости от видов воздействия (Мелехин С. В., 2003; Бахмет А. А., 2008). Через час после эмоционального стресса в центрах размножения лимфоид- 15 ных бляшек тонкого кишечника крыс наблюдается уменьшение процентного содержания малых форм лимфоцитов, увеличение числа клеток с картиной митозов, увеличение количества клеток с картиной деструкции, рост числа макрофагов (Бахмет А. А., 2008). В опытах с облучением родительских пар мышей, у потомства происходит уменьшение высоты куполов бляшек, уменьшается количество фолликулов с центрами размножения, уплощается мантийная зона вокруг центров размножения. Претерпевает изменение и клеточный состав пейеровой бляшки – в межузелковых зонах снижается количество макрофагов, лимфоцитов и плазмоцитов, в центрах размножения уменьшается количество бластных клеток и больших лимфоцитов (Мелехин С. В., 2003). Лимфоидная ткань и лимфоидные органы желудочно-кишечного тракта теснейшим образом функционально связаны с другими компонентами иммунной системы, поскольку иммуноциты обладают уникальной способностью к миграции и циркуляции (Хаитов Р. М., 1998). Расстояние между пейеровыми бляшками имеет обратную зависимость от их количества во всех возрастных группах лабораторных крыс. Количество и размеры пейеровых бляшек достигают у этих животных максимального значения к половозрелому возрасту (Кащенко С. А., 2012). В литературных обзорах последних лет, посвященных вторичным лимфоидным органам, селезенке и лимфатическим узлам (Randall T. D. et al., 2008; Ruddle N. H., Akirav E. M. (2009), сопоставлены морфо-функциональные зоны этих органов при развитии, в норме и при различных воздействиях. Параллельные изменения в тимусе, селезенке и бурсе серебристой чайки показаны при глистной инвазии в работе Фоминой А. С. (2011). Особенности морфо-функциональных изменений клеточного состава и компонентов микроциркуляторного русла органов иммунной системы лабораторных животных (тимуса, селезенки, лимфатических узлов) подробно описаны после применения антираби- 16 ческой вакцины (Кузин А. В. и соавт, (2004), препарата «Иммуновак ВП-4» (Лебединская Е. А. и соавт., 2011), иммуномодуляторов (Лимонов В. Л. и соавт., 2005, Разумов А. Н. и соавт., 2010), введения олигопептидов (Бахмет А. А., 2010), а также при воздействии на акупунктурные точки (Гурьянова Е. А., 2011). Отравления (Забродский П. Ф., Киричук В. Ф., 1998; Никитенко О. В., 2010), стресс различной продолжительности (Журавлева Т. Б. и соавт., 1995; Fukui Y. et al., 1997; Dominguez-Gerpe L. et al., 2001) и физические нагрузки (Сапин М. Р. и соавт, 1999; 2012) также приводят к параллельным морфо-функциональным изменениям тимуса и вторичных лимфоидных органов. В современной научной литературе в качестве морфологического субстрата адаптационных физиологических реакций в лимфоидных органах рассматриваются макрофаги и антигенпрезентирующие клетки. Изменение их морфофункциональных характеристик находится в прямой зависимости от вида воздействия на организм. Антигенпрезентирующие клетки – это клетки лимфогемопоэтической системы, в которых антигенные пептиды связываются молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) для их презентации Т-лимфоцитам (Тотолян А. А., Фрейдлин И. С., 2000). Они участвуют в важнейших для формирования иммунной системы процессах тимической селекции и Т-клеточного гомеостаза, являясь ключевым звеном в регуляции адаптивного иммунного ответа (Ахматова Н. К., Киселевский М. В., 2008). Исследование антигенпрезентирующих клеток стало неотъемлемой частью оценки деятельности иммунной системы в целом, в связи с этим возросла актуальность определения функциональной активности этих клеток. Кроме того, вопрос о возможности экстаполяции данных, полученных для антигенпрезентирующих клеток в экспериментах на животных, на человека, является принципиальным. Антигенпрезентирующие клетки тимуса участвуют в позитивной и негативной селекции тимоцитов, играют важную роль в процессах их развития и диффе- 17 ренцировки. К ним относят эпителиальные клетки, дендритные клетки и макрофаги (Liu Y.-J., 2010; McKenna K. et al., 2005). При этом, чем выше фагоцитарная активность макрофагов, тем выше степень экспрессии MHC II (Varas V. A. et al., 1995). Дендритные клетки образуют розетки с незрелыми Т-лимфоцитами (Hemandez-Verdun D., Roussel P., 1995). Дендритные клетки в тимусе локализуются в кортико-медуллярной зоне и в мозговом слое тимуса и участвуют в отрицательной селекции Т-лимфоцитов, вызывая их апоптоз (Ярилин А. А. и соавт., 1991). От типичных макрофагов дендритные клетки отличает неспособность к фагоцитозу, специфический маркер белок S-100 и отрицательная реакция на лизоцим (Гордон Д. С. и соавт., 2001). Дендритные клетки – это гетерогенная группа клеток, которые отличаются по фенотипу, локализации и функциям, однако, многочисленные исследования позволили выделить ряд общих черт, представленных в обзоре M. F. Lipscomb и B. J. Masten (2002). Во-первых, предшественники этих клеток, образующиеся из стволовых клеток костного мозга, с током крови попадают в органы, где из них образуются незрелые дендритные клетки (будущие клетки Лангерганса и интерстинальные (дермальные) дендритные клетки). Во-вторых, незрелые дендритные клетки способны захватывать антигены (опосредованно и неопосредованно через рецепторы), подвергать их деградации в эндосомах и связывать антигенные пептиды с МНС-II. В-третьих, в ответ на повреждение тканей или действие воспалительных цитокинов дендритные клетки созревают и мигрируют в лимфоидные органы, где они взаимодействуют с CD-4 Т-лимфоцитами и инициируют иммунный ответ. В-четвертых, хемокиновые рецепторы зрелых и незрелых дендритных клеток отличаются, и этим обеспечивается миграция дендритных клеток в ткани в ответ на выделение воспалительных хемокинов. В-пятых, у зрелых дендритных клеток наблюдается более высокая плотность молекул MHC-II, связанных с антигеном, для распознавания последних рецепторами Т-лимфоцитов. Продукция 18 дендритными клетками IL-12 определяет направление Т-клеточного ответа. Продукция этого интерлейкина инициирует Тh-1 (клеточный) ответ, а в случае, когда синтез IL-12 подавляется, происходит активация Th2 (гуморального) ответа (Lipscomb M. F., Masten B. J., 2002). До некоторого времени определение различных видов клеток моноцитарномакрофагального происхождения, вносящих существенный вклад в процессы созревания Т-лимфоцитов, представляло некоторые трудности. Так, например, дендритные клетки могут и не иметь отросчатую форму (Ахматова Н. К., Киселевский М. В., 2008), только 50% макрофагов находятся в активной стадии (содержат множество фагосом), для каждого их вида существуют собственные ферментные маркеры. В связи с этим привлекательными являются иммуногистохимические методы, позволяющие одномоментно выявить как макрофаги, так и дендритные клетки. К этим методам относятся непрямые иммуноферментные методы с использованием антител к белкам МНС класса II и антител к Iba-1 – кальций связывающим адапторным молекулам (Лузикова Е. М. и соавт., 2009; Rehg J. E. et al., 2012). Антитела к Iba-1 являются широко используемыми гистохимическими маркерами клеток моноцитарно-макрофагального ряда в парафинированных тканях человека, обезьяны, лошади, мыши и крысы. Так, в тканях человека, герминативном центре миндалин и периваскулярной белой пульпе селезенки, Iba1позитивными являются только макрофаги и дендритные клетки (Ahmed Z. et al., 2007). Белок Iba-1 вносит вклад в образование мембранных складок макрофагов при индуцированном фагоцитозе, причем концентрация его в мембранных складках при фагоцитозе тесно сопряжена с концентрацией F-актина. В ответ на введение макрофаг-колониестимулирующего фактора Iba-1, диффузно распределенный в цитоплазме белок перемещается в образующиеся мембранные складки, где он локализуется в непосредственной близости с F-актином (Imai Y., Kohsaka S., 2002; 19 Ohsawa K. et al., 2004). Иммуноцитохимический маркер Iba-1 позволяет осуществлять точную идентификацию микроглиоцитов в головном мозге, так как для этого белка характернa преимущественно мембранная (или субмембранная) локализация. При этом прослеживается сложная отросчатая организация клеток (Кирик О. В. и соавт., 2010; Коржевский Д. Э. и соавт., 2011). Было обнаружено присутствие белка Iba-l в типичных макрофагах красной пульпы селезенки крыс, макрофаги маргинальной зоны так же были иммунопозитивными для этого иммуногистохимического маркера (Utans U. et аl., 1995; Chen Z. et al., 1997; Kohler С., 2007). У иммунизированных крыс клетки маргинальной зоны селезенки, по сравнению со слабым окрашиванием в контрольной группе животных, окрашиваются ярче, что предполагает увеличение Iba-1 в макрофагах маргинальной зоны во время иммунного ответа (Pashenkov M. et al., 2000). Макрофаги маргинальной зоны селезенки важны для ранних стадий иммунного ответа (Aichele P. et al. 2003; Kraal G., Mebius R., 2006). Удаление из маргинальной зоны макрофагов способствует развитию аутоиммунных заболеваний у мышей, что поддерживает гипотезу о том, что макрофаги маргинальной зоны занимают центральное место в очищении организма от апоптотических клеток для минимизации иммунной реакции на аутоантигены (McGaha T. L. et al., 2011). Относительно экспрессии белка Iba-1 в лимфатических узлах известно, что Iba-l иммунореактивность найдена в цитоплазматических отростках субкапсулярных синусных макрофагах. Субкапсулярные синусные макрофаги в лимфатических узлах функционально эквивалентны макрофагам маргинальной зоны селезенки, оба вида клеток локализуются на стороне внедрения антигена в соответствующий орган. Антигены захватываются цитоплазматическими отростками субкапсулярных синусных макрофагов (Szakal A. K. et al. 1989). Их сильная иммунореактивность может быть объяснена ролью Iba-l в изменении цитоскелета. Iba-l может служить хорошим маркером для визуализации этой субпопуляции клеток в течение иммун- 20 ного ответа или при патологических состояниях. Выявлена экспрессия Iba-l дендритными клетками в тонком кишечнике и в кортексе тимуса крыс (Chen Z. et al., 1997). Исследование C. Kohler (2007) демонстрирует относительно высокое число Iba-l-позитивных клеток с дендритной морфологией в Т-зоне селезенки крыс и лимфатических узлах, что так же характерно и для селезенки человека (Ahmed Z. et al. 2007). Реакции клеток моноцитарно-макрофагального происхождения в лимфоидных органах, как в норме, так и при различных воздействиях описаны в многочисленных работах школы Д. С. Гордон (Гордон Д. С. И соавт., 1982–2001; Сергеева В. Е. и соавт., 1992–2013; Гордон Б. М., 1990; Олангин О. И., 1999; Стручко Г. Ю., 1999; Ястребова С. А., 1999; Ильина Л. Ю., 2002; Лузикова Е. М., 2005; Спирин, И. В., 2007; Гурьянова Е. А. и соавт., 2008–2011; Любовцева Л. А. и соавт., 2011; Кроткова О. С. и соавт., 2014), однако, во всех этих работах воздействие внешних факторов являлось кратковременным. При хроническом эксперименте возможно выявить устойчивую структурную перестройку, которая и обеспечивает адаптацию организма к внешним факторам. 1.2. Биологическая роль кремния В 1823 г. Берцелиус из кремнефторида калия выделил новый элемент и превратил его путем сожжения в диоксид, что, в свою очередь, доказывает сложность состава кремнезема. Ученый дал новому элементу название «silicium», производное от латинского «silex» – кремень. Русское название «кремний» было принято в 1834 г. (Мышляева Л. В., Краснощеков В. В., 1972). Известно, что кремний является вторым по распространенности в земной коре элементом после кислорода. Соединения кремния составляют 87% всей литосферы, а минералов, богатых кремнием, насчитывается более восьмисот. Кремний содержится во всех тканях и органах растений, животных и человека (Воронков М. Г., Кузнецов И. Г., 1984; Колесников М. П., 2001; Матыченков В. В., 2008; 21 Голохваст К. С., 2010; Epstein E., 1994; Currie H. A. et al., 2007). В природе минеральный кремний в элементном состоянии не встречается. В четырехвалентном состоянии (Si4+) он входит преимущественно в состав двуокиси кремния, а также ее гидрата – кремнезема (SiO2•nH2O), олиго- и поликремниевых кислот. В анионной форме Si присутствует в солях метакремниевой кислоты (H2SiO3) – силикатах. Диоксид кремния имеет большое число природных и искусственно полученных кристаллических и аморфных разновидностей (кварц, тридимит, кристобалит, яшмы, опал, коэсит, стишовит) (Айлер Р. А., 1982). Кремний содержится во всех водах, как пресных, так и соленых, спектрально кремний обнаружен на солнце (Мышляева Л. В., Краснощеков В. В., 1972; Воронков М. Г. и соавт., 1984). Кремнийсодержащие минералы – полевые шпаты, слюды, оливины, пироксены и многие другие – присутствуют во всех важнейших горных осадочных и изверженных породах. К кремнистым породам относятся породы, сложенные кремнеземом хемогенного или хемобиогенного происхождения, а также скелетами и раковинами кремниевых организмов. Современные исследования показывают, что кремнистые осадки на 90 % образовались в биосфере в результате концентрационной функции живого вещества (Айлер Р. А., 1982; Корсунов В. М., Красеха Е.Н., 2010). Процесс биосилификации, или биологического формирования аморфного кремнезёма, довольно широко распространён в природе. Биосилификацию определяют как «движение ортокремниевой кислоты из окружающей среды, в которой ее концентрация не превышает порога растворимости (< 2 mM) во внутриклеточное или организменное пространство, в котором она аккумулируется с последующим осаждением в виде аморфного гидрата двуокиси кремния» (Law S. et al., 2011). Усваивать неорганический кремнезём из окружающей среды способны некоторые простейшие, диатомеи, губки, моллюски и высшие растения (Голохваст К. С., Памирский И. Э., 2011). Гидробиогеохимическая ветвь круговорота кремне- 22 зема характерна для вод Мирового океана. Она осуществляется в основном жизнедеятельностью диатомовых водорослей, активных концентраторов кремнезема (Безруков Ю. Ф., 2006; Овчинникова С. И. и соавт, 2012; Хоружий Д. С., Коновалов С. К., 2010). Для гидробиогеохимического цикла свойственно исключительно биогенное осаждение кремнезема в форме скелетов диатомовых, в меньшей степени – радиолярий и спикул губок. Континентальная ветвь круговорота кремнезема сложна и богата разнообразными преобразованиями кремнийсодержащих соединений в природных ландшафтах, почвах, растительности, грунтовых водах. Биогенное осаждение диатомовых происходит в озерах и реках. Мощным механизмом круговорота кремнезема является растительный покров суши (Айлер Р. А., 1982; Корсунов В. М., Красеха Е. Н., 2010). Выделяют несколько путей биосилификации. Один из них, характерный для диатомей, заключается в отложении соединений кремния внутри клеток при участии силлафинов – специальных пептидов, богатых лизином. Другой, описанный для фирмикутных бактерий, заключается в осаждении кремневых соединений на поверхности клеточной стенки (Zurzolo C., Bowler C., 2001; Poulsen N. et al., 2003; Thamatrakoln K., 2008; Law С. et al., 2011). Сравнение силлафинов диатомовых водорослей с последовательностями, находящихся в базе белков показало, что белки, идентичные силаффинам на 30– 40 %, широко представлены в животном мире и обнаружены также и в организме человека. К разнообразным биологическим функциям этих белков в том числе относится и биоминерализация. Например, сиалофосфопротеины участвуют в формировании зубной ткани (цит по: Голохваст К. С., 2010). Кремнезем образуется также в речных и морских губках при участии специальных ферментов силикатеинов и силиказ (Cha J. N. et al., 1999; Schröder H. S. et al., 2003; Müller W. E. G. et al., 2007; Калюжная О. В. и соавт., 2011). Проведенное Голохвастом К. С. (2010) компьютерное исследование пока- 23 зало, что высокогомологичные силикатеинам и силиказам белки встречаются не только у животных, но и у людей. К биоминерализации кремния способны также ресничные инфузории, синезеленые водоросли, спорообразующие и термофильные бактерии (Сороковикова Е. Г. и соавт., 2005; Соколова М. Г, Акимова Г. П., 2009; Foissner W. et al., 2009; Hirota R. et al., 2010; Mera M. U., Beveridge T. J., 1993; Saw J. H. et al., 2008). Наиболее важными растворимыми формами кремния в тканях растений, природных водах, грунтах, почвах, участвующими в биогеохимическом круговороте, являются неорганические соединения – монокремниевая и поликремниевые кислоты, которые всегда присутствуют в природных водных растворах (Матыченков В. В., 2008). Кремниевая кислота в щелочных растворах (рН > 8,0) существует в форме силиката (аниона метакремниевой кислоты – SiO32–). При рН 1–8 в разбавленных растворах (~0,1 мг Si/мл) устойчива растворимая в воде мономерная форма ортокремниевой кислоты – H4SiO4. При увеличении концентрации (в том же диапазоне рН) ортокремниевая кислота полимеризуется, образуя олиго- и поликремниевые кислоты, и, наконец, переходит в коллоидное состояние. Концентрация SiO2 в почвенных растворах в среднем составляет 30–40 мг/л, а в клеточном соке «кремниефильных» растений – значительно выше. В клеточном соке растений по мере увеличения в нем содержания кремния наблюдается аналогичный процесс. В клеточном соке мономерная ортокремниевая кислота превращается в гели SiO2•nH2O, которые откладываются на поверхности клеточных стенок, связываясь с полисахаридами и протеинами (цит. по: Колесников В. К., 2001). Максимальное содержание органогенного кремния наблюдается в злаках, осоках, представителях семейства ситниковых, ячмене обыкновенном, кукурузе, клещевине обыкновенной, рисе обыкновенном, мускатной тыкве и других растениях, а также в хвощах (Колесников В. К., 2001; Ma J. F. et al., 2007, 2011; MitaniUeno N. et al., 2011; Law C., Exley C., 2011). Большое содержание кремния отмеча- 24 ется в лекарственных растениях: хвоще, листьях элеутерококка, буквицы олиственной, горечавки лежачей, горца птичьего (Колесников М. П., Гинс В. К., 2001, Мондодоев А. Г. и соавт., 2010). Кремний повышает уровень сопротивляемости наземных и водных растений к стрессам различной природы, как биотическим, так и абиотическим (Матыченков В. В., 2008; Epstein E., 1994; Ma J. F., 2007, 2011; Currie H. A., 2007; Cai K. et al., 2009; Mizuta H. et al., 2012). Биофильный кремний – это та часть растительного (органогенного) кремния, которая химически (в форме ортокремниевых эфиров) связана с фосфолипидами, белком и пектинами, то есть с теми компонентами растительной ткани, которые в первую очередь усваиваются организмом. Именно этот кремний (на правах микроэлемента) и вовлекается в метаболизм липидов, фосфора и кальция. Поэтому, полагает М. П. Колесников (2001), наличие биофильного кремния должно входить в число показателей, определяющих кормовую, пищевую и фармакологическую ценность растительного сырья. 1.3. Биологически активные органические соединения кремния С развитием кремнийорганической химии стало возможным синтезирование ряда биологически активных соединений кремния, в частности, силатранов – внутрикомплексных трициклических кремниевых эфиров триэтаноламина и их производных. Широкий спектр их биологической активности позволяет применять эти вещества одновременно в медицине, косметологии, животноводстве и растениеводстве (Воронков М. Г., Барышок В. П., 2005; Глазко В. И., 2007; Колесникова О. П. и соавт., 2009; Puri J. K. et al., 2011). Наиболее изучен силимин (I-(хлорметил)силатран), вызывающий повышение концентрации коллагена и гликозаминогликанов и ускоряющий тем самым развитие грануляционной ткани и заживление переломов (Мансурова Л. А. и соавт., 1983). В стоматологии модифицированные силимином имплантаты усили- 25 вают пролиферацию остеобластов и их биосинтетическую деятельность, повышают содержание кальция и фосфора, снижают концентрацию сиаловых кислот, повышают синтез гликозаминогликанов (Мансурова Л. А. и соавт., 2009). Доказано, что 1-хлорметилсилатран стимулирует рост волос, что позволяет использовать его в составе линиментов в различных прописях (Воронков М. Г., Барышок В. П., 2005; Овчаренко Ю. С., 2009). В животноводстве 1-хлорметилсилатран используется под названием «Мивал-Зоо» (Паймерова И. С., 2011; Приходько Е. В., 2012), а в сельском хозяйстве применяется содержащий силатран препарат «Мивал-Агро» (Козлов Ю. В., 2010; Медведева И. Н., Черномордик А. О., 2011; Лякина О. А., 2012). Несмотря на то, что силатраны обладают противоопухолевым действием, вследствие участия кремния во многих стадиях деятельности естественных киллеров, попытки добиться усиления эффекта путем увеличения дозового режима не увенчались успехом из-за высокой токсичности силатранов (Кудрин А. В., Скальный А. В., 2001; Puri J. K. et al., 2011). Органические соединения кремния, содержащие Si−O−C группировки, например, полиолаты кремния, также проявляют определенную биологическую активность. Так, был разработан кремнийсодержащий глицеро-гидрогель «Силативит», проявляющий выраженную ранозаживляющую, регенерирующую, транскутанную и трансмукозную активность (Хонина Т. Г., 2012). Следует отметить, что в настоящее время идет как активный поиск новых типов потенциально биологически активных кремнийорганических соединений, так и изучение физиологических свойств этих веществ (Солдатенко А. С., 2011; Сурменева М. А. и соавт., 2012). 1.4. Источники кремния для человека Ежедневная потребность человеческого организма в кремнии составляет 20–30 мг, из поступающего в сутки кремния (с пищей и водой – 3,5 мг, из воздуха 26 – 15 мг) усваивается 9–14 мг. Балансовые опыты на животных показали, что почти весь кремний, поступающий с пищей, проходит через пищеварительный тракт транзитом и выводится с калом, а всосавшийся кремний выводится с мочой. У человека в сутки с мочой выводится 9 мг кремния (Авцын А. П. и соавт., 1991). Согласно нормам физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации (Методические рекомендации. МР 2.3.1.2432-08), суточное потребление кремния составляет 30–50 мг в сутки, при этом биодоступность соединений кремния не учитывается. С воздухом в организм человека поступает 15 мг кремния (Авцын А.П. и соавт., 1991). Считается, что кремний, поступающий в дыхательные пути с пылью, не принимает участия в общем метаболизме кремния в организме, однако, это утверждение можно считать справедливым, если речь не идет о промышленном производстве. Содержание кремния в плазме крови человека составляет 0,5 мг/л (Авцын А. П. и соавт., 1991). Биодоступность кремния из питьевой воды составляет 50–80%, с водой ежедневно поступает 20-30% суточного кремния (Jugdaohsingh R., 2007). Однако, содержание кремния в питьевой воде открытых источников не является постоянной величиной и зависит от глубины и характера водоносных горизонтов (Sivasankaran M. A. et al., 2004; Камбалина М. Г., Пикула Н. П., 2012). Неравномерное насыщение питьевой воды силикатами отмечено в Англии, в которой северные провинции характеризуются низким содержанием кремния, а южные – высоким (Jugdaohsingh R., 2007). В минеральной воде кремниевых источников на островах Фиджи, концентрация кремния составляет 86 мг/литр (Li Zh. et al., 2010). В природных водах термальных источников содержание кремневой кислоты достигает 150–200 мг/л. (Камбалина М. Г., Пикула Н. П., 2012). В Чувашской республике были выделены «кремневые» провинции, на территории которых содержание кремния в природных водах превышало 20 мг/литр (Сапожников С. П., 2001). В Российской Федерации содержание силикатов в питьевой воде, в пересчете на 27 кремний, строго регламентировано и составляет 10 мг/л (ГОСТ Р 51232-98 (2002), СанПиН 2.1.4.1074-01, ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02). Пищевые продукты также являются существенными источниками кремния. Так, кремнием богаты зеленые бобы, кенийская и стручковая фасоль, шпинат, кориандр, высоко его содержание в однодольных растениях – овсе, ячмене, пшенице, особенно в рисе (Currie H. A. et al., 2007, Jugdaohsingh R, 2007, Шаззо А. А., 2010). В европейских странах в организм человека с пищей ежесуточно поступает в среднем 13–62 мг кремния, в Индии – 143–204 мг, в Китае – 139 мг (Jugdaohsingh R., 2007). Существенная разница в показателях легко объясняется тем, что в рационе жителей Индии и Китая превалирует рис, который относят к «кремниефильным» растениям (Ma J. F. et al., 2007, 2011; Mitani-Ueno N., et al., 2011). Кремнезем органического происхождения обладает большей биодоступностью, чем неорганический. Биодоступный кремний в концентрации 9–17 мг/г содержится также в биодобавках на основе хвоща, около 50% биодоступного кремния содержит препарат «Monomethyltrisilano» (Ирландия), около 30% – препарат «BioSil» (Бельгия) (Jugdaohsingh R., 2007). Разрыхлитель двуокись кремния (Е551) отнесен к «пищевым добавкам, не оказывающим вредного воздействия на здоровье человека при использовании, для изготовления пищевых продуктов» (СанПиН 2.3.2.,1078-01), «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», М., 2002, Приложение 7). Прошедшая государственную регистрацию синбиотическая добавка к пище «Нормобакт», в состав которой в качестве разрыхлителя входит двуокись кремния, разрешена к применению для детей, достигших шестимесячного возраста (Боровик Т. Э. и соавт., 2010). В виде диоксида кремний входит в состав зубной пасты и декоративной косметики, присутствует в пищевых добавках как разрыхлитель, входит в состав антацидных препаратов (Николаев В. Г. и соавт., 2005., Ердакова В. П., 2007; Акулович А. В. и соавт., 2011; Jugdaohsingh R, 2007; Williams H. D. et al., 2013). 28 Представителями синтетических кремнийсодержащих энтеросорбентов являются энтеросгель (гель гидроокиси метилкремниевой кислоты), силикс (полисорб, силлард), разработанный на основе аэросила – высокодисперсного аморфного пирогенного кремнезема, который по сравнению с кристаллическим SiO2 (кварцем), считается нетоксичным, неканцерогенным и немутагенным веществом (Николаев В. Г. и соавт., 2005; Johnston C. J. et al., 2000). Аэросил широко применяется в фармации для стабилизации суспензий и линиментов, а также в качестве загустителя мазевых основ, наполнителя таблеток и суппозиториев, он входит в состав композиции пломбировочных материалов, применяется как диспергатор и антистатическое средство, снижает гигроскопичность сухих экстрактов, замедляет выход биологически активных веществ из различных лекарственных форм (Николаев В. Г. и соавт., 2005; Величковский Б. Т., 2009). Считалось, что соединения кремния, входящие в состав антацидов и энтеросорбентов, практически не всасываются в желудочно-кишечном тракте, однако, при контакте с водой и биологическими жидкостями диоксида кремния, считающегося нерастворимым, возможно образование некоторого количества биодоступной ортокремниевой кислоты (Николаев В. Г. и соавт., 2005; Jurkić L. M. et al., 2013). Имеются данные, что из общей дозы силикатов, включая алюмосиликаты, поступающей в организм человека за день, в среднем 34 мг/кг, на пищевые продукты приходится 14%, а на зубную пасту и лекарственные средства – 42% и 44% соответственно (Powell J. et al., 2007). Источником ортокремниевой кислоты (H4SiO4), главной формы биодоступного кремния для человека и животных, выступают, в основном, растворимые соединения кремниевых кислот. Так, один из силикатов природных вод, метасиликат натрия, под действием соляной кислоты желудка превращается в биодоступную ортокремниевую кислоту (Jurkić L.M. et al., 2013). Механизм всасывания кремния из желудочно-кишечного тракта в настоящее время не до конца изучен, однако экскреция кремния почками и содержание его в плазме крови прямо про- 29 порциональны содержанию кремния в пищевых продуктах и питьевой воде (Jugdaohsingh R., 2007). Примечательно, что питьевая вода является наиболее доступным источником кремния, поскольку хорошо растворимые соли ортокремниевой кислоты (мономерные силикаты) почти не взаимодействуют со слизистой оболочкой и легко проникают сквозь слизистый слой, преимущественно в проксимальном отделе тонкого кишечника. Полимерные соединения кремния, напротив, сильнее взаимодействуют со слизистой, образуя катионные мостики, и, следовательно, проникновению через слизистую этим соединениям мешают малоподвижность и размеры (Jugdaohsingh R. et al, 2000; Sripanyakorn S. et al., 2009). Силиконы – это семейство синтетических полимеров, состоящих из цепей кремний-кислород с боковыми цепями. Силиконовыми производными являются жидкости, гели, каучуки, губки, пены, и смолы. Жидкости и гель используются в качестве полимера в имплантатах молочной железы. Силиконы, используемые в разнообразных медицинских изделиях, не являются однородными в отношении длины полимеров, радикалов боковых цепей. Таким образом, существует большой разброс биологических и физико-химических свойств этих веществ и для беспокойства имеются существенные теоретические и клинические основания (Teuber S. S. et al., 1995; Ojo-Amaize E. A. et al., 1996). Вытекание геля из имплантата, разрыв имплантата и биодеградация имплантата подвергает пациентов определенным рискам. Клиническая важность адъювантных свойств многих компонентов имплантатов неизвестна (Teuber S. S. et al., 1995). Кремнезем – это классический образец вещества с гидратированной поверхностью, обладающей способностью к специфическим электростатическим взаимодействиям, ориентированным в пространстве за счет образования водородных связей (А–ОН···В). Кварцевая пыль даже в вакууме в считанные минуты адсорбирует остаточные молекулы воды. Образуется гидроксилированная поверхность, покрытая силанольными группами (Si–OH), которая обеспечивает химическую инертность и устойчивость кремнезема в обычных условиях земной атмо- 30 сферы, но она же обуславливает его высокую фиброгенность и невысокую, но уже доказанную, канцерогенность (Величковский Б. Т., 2009). Наночастицы кремния производятся в промышленных масштабах и имеют огромный потенциал для использования в медицине (Ксенофонтова О. И. и соавт., 2014; Vivero-Escoto J. L., Huang Y.-T., 2011;). Микро- и нано- мезопористые частицы кремния рассматриваются как потенциальные системы доставки лекарственных препаратов внутрь клеток, при этом утверждать, что все они являются биосовместимыми, нельзя (Hudson S. et al., 2008). Попытка обобщить физико-химические свойства наноразмерных кремнеземных материалов привела к интересным результатам – цитотоксичные в экспериментах in vitro частицы способны вызывать обратимые изменения в живых организмах (Napierska D. et al., 2010). Таким образом, человек ежедневно пребывает в контакте с различными соединениями и производными кремния и, соответственно, подвергается их воздействию. 1.5. Физиологическая роль кремния и биологические эффекты от поступления его соединений в избыточном количестве В организме человека и млекопитающих кремний входит в состав соединительной ткани. Связанный с гликозаминогликанами и компонентами коллагена, он ускоряет синтез гликозаминогликанов, способствует развитию архитектуры фиброзных элементов соединительной ткани, вносит вклад в их структурную целостность, обеспечивая упругость и эластичность соединительнотканных элементов (Авцын А. П. и соавт., 1991; Мансурова Л. А. и соавт., 2009; Nielsen F. H., 1991, 2008; Seaborn C. D., Nielsen F. H., 2002; Jugdaohsingh R. et al, 2008). Метаболизм кремния в костной ткани тесно связан с метаболизмом кальция (Kim M. N. et al., 2009). Избыточное поступление соединений кремния неблагоприятно отражается на всех системах организма. 31 Многочисленные опыты in vitro позволяют получить представление о патогенетических основах изменений, происходящих с лабораторными животными при воздействии соединений кремния. Обращает на себя внимание тот факт, что биологический эффект от воздействия кремния наступает вне зависимости от путей их поступления, либо при однократном воздействии высоких доз, либо при хроническом воздействии низких доз. Для лабораторных животных биологические эффекты соединений кремния зависят от способа введения и дозировки. Считается, что первичный ответ организма на действие нерастворимых частиц стереотипен и заключается в мобилизации неспецифических бактерицидных систем фагоцитов (Величковский Б. Т., 2009). В легких мышей частицы кремния, поступающие с пылью, контактируют с альвеолярными макрофагами, и впоследствии могут быть обнаружены в медиастинальных лимфоузлах и в тимусе (Vacek Р. М. et al., 1991). Кремнезем потенцирует рост патогенных микобактерий в макрофагах in vitro, однако не оказывает влияния на рост в макрофагах атеннуированного штамма микобактерий (Allison A. C. et al., 1968). Было доказано, что инкубация с кремнеземом в течение 1-3 ч снижает жизнеспособность макрофагов и нейтрофилов у мышей. Кремнезем уменьшает способность макрофагов и нейтрофилов к фагоцитозу эритроцитов и бактерий, подавляет способность клеток к уничтожению факультативно-внутриклеточных бактерий Listeria monocytogenes (Zimmermani B. T. et al., 1986). Под воздействием диоксида кремния мыши, резистентные к микобактериям туберкулеза, становятся чувствительными к этому возбудителю, что авторы расценивают как появление под воздействием диоксида кремния новой популяции альвеолярных макрофагов (Pasula R. et al., 2009). Доказано, что внутривенное введение диоксида кремния мышам при системном кандидозе активирует макрофагальное звено (Lee K. W., Balish E., 1983). При интраназальном введении диоксида кремния мышам в интерстинальных и альвеолярных макрофагах значительно увеличивается экспрессия маркеров анти- 32 генпрезентирующих клеток (Cassela S. L. et al., 2008). Кроме того, при воздействии диоксида кремния in vitro, экспрессия этих маркеров увеличивается в макрофагах, извлеченных из костного мозга, (Migliaccio C. T. et al., 2005). Было обнаружено, что инкубация макрофагов с асбестом приводит к увеличением количества в них ядерного белка Ref-1 (Flaherty D. M. et al., 2002). Как известно, белок Ref-1 выполняет функцию экзонуклеазы, вырезающей участки ДНК и может модифицировать активность белка р53 за счет восстановления одного из цистеинов в случае его окисления (Чумаков П. М., 2007). Внутритрахеальное введение частиц диоксида кремния мышам приводит к увеличению количества в легочной ткани Т-лимфоцитов (хелперов и супрессоров) через три недели, В-лимфоцитов – через 6 недель. Была выдвинута гипотеза, что лимфокины, секретируемые Т-лимфоцитами, могут вызывать поликлональные пролиферации В-лимфоцитов и стимулировать синтез иммуноглобулинов этими клетками. Это могло бы объяснить неупорядоченный синтез иммуноглобулинов, который наблюдается при развитии силикоза у человека (Kumar R. K., 1989). На основании того, что при инкубации Т-лимфоцитов периферической крови человека с хризотилом (силикат магния) в них повышается концентрация внутриклеточного кальция, увеличивается синтез IL-2 (в CD4+ клетках), японскими учеными было выдвинуто предположение, что диоксид кремния способен выступать в качестве суперантигена (Ueki A. et al., 1994). Несколько позднее обнаружилось, что Т-клеточный ответ на диоксид кремния зависит от моноцитарномакрофагального звена (Smalley D. L. et al., 1998, Migliaccio C. T. et al., 2005). Это исследование подтвердило, что для реакции Т-лимфоцитов на хризотил необходимо участие продуктов главного комплекса гистосовместимости МНС класса II. При инкубации эпителиальных бронхиальных клеток человека с кристаллическим кремнием в них происходит изменение экспрессии некоторых генов, ответственных за воспалительный ответ, например, IL-6 и IL-8, однако, аморфный кремний таких изменений не вызывает (Perkins T. N. et al., 2012). 33 При инкубации тучных клеток с кристаллическим кремнием наблюдается увеличение их протеазной активности, выделение ими медиаторов воспаления, однако на дегрануляцию окрашенных азуром тучных клеток кремний влияния не оказал (Brown J. M. et al., 2007). Изучение острого и хронического силикоза легких у крыс показало, что острый процесс связан с повышенной активацией каспазы-3 и других молекулярных маркеров апоптоза, в то время как хронический силикоз характеризуется уменьшением воспалительного процесса и повышенной экспрессией антимаркеров апоптоза и снижением активности каспазы-3 (Langley R.J. et al., 2010). Небезучастными к поступлению кремния оказались регуляторные CD4+CD25+ Т-лимфоциты (Tregs). Как известно, эти клетки принимают участие в подавлении продукции провоспалительных цитокинов и антигенпрезентирующих функций дендритных клеток и макрофагов, в индукции апоптоза, снижении генерации Т-хелперов первого и второго типов (Th1 и Th2), а также продукции ими цитокинов, подавлении цитотоксической активности естественными киллерами и CD8+ цитотоксическими лимфоцитами (цит. по: Железникова Г. Ф., 2011). Супрессорная активность Tregs очень тесно связана с наличием внутриклеточного фактора транскрипции – молекулы Foxp3 (Ярилин А. А., Донецкова А. Д., 2006). Так, CD4+CD25+Foxp3+Treg и продуцируемый ими цитокин-ингибитор TGF-β играют ведущую роль в формировании иммуносупрессии при диссеминированном туберкулезе легких (Чурина Е. Г. и соавт., 2013). Исследования показали, что при развитии кремнезем-индуцированного фиброза легких мышей Tregs могут способствовать дифференцировке Th17 (Т-лимфоциты, способные продуцировать интерлейкины IL-17A, IL-17F, IL-22) клеток посредством цитокина TGF-β1 (Song L. et al. 2012). Имеются работы разных авторов, свидетельствующие о том, что поступление кремния стимулирует Th1-зависимый (клеточный) ответ (Van Ziverden M. et al., 2000, Davis J. S. et al., 2001, Weissman D.N. et al., 2001). При фиброзе легких, индуцированном кремнеземом, CD4+CD25+Foxp3+Treg мо- 34 гут модулировать Th1/Th2 баланс, причем направление ответа зависит от стадии фиброза – на ранних стадиях Th1-зависимый ответ усиливается, на поздних – подавляется (Liu F. et al., 2010). Поскольку соединения кремния широко используются в пищевых добавках, группа немецких ученых выдвинула гипотезу, что мишенью для этих соединений могут стать дендритные клетки кишечника. В эксперименте in vitro было показано, что наночастицы как диоксида кремния, так и кристаллического кремния, оказывают сильное влияние на статус активации дендритных клеток кишечника мышей – в них увеличивается экспрессия MHC II, CD80, CD86. Кроме того, эти частицы индуцируют апоптоз дендритных клеток и значительно увеличивают секрецию ИЛ-1β (Winter M. et al., 2011). Необходимый компонент для сборки IL-1, IL-1β высвобождается из клеток с участием каспазы-1, активация которой регулируется мультимерным цитозольным белковым комплексом, называемым «инфламмасома». Одним из компонентов этого комплекса является цитозольный сенсорный белок, принадлежащий к семейству NOD-подобных рецепторов (криопирин или NALP3). Иммунная система может подавлять функцию NALP3 инфламмасомы и секрецию IL-1β макрофагами путем сигналов по типу отрицательной обратной связи, поступающих от членов семейства фактора некроза опухоли (ФНО, TNF), например CD40-лиганда, экспрессированного на Т-клетках-эффекторах и клетках памяти, имеющих на поверхности CD4+ (Ильина А. Е. и соавт., 2011). В параллельных опытах in vitro и in vivo (на мышах) было установлено, что формирование NALP3-зависимого механизма активации каспазы-1 играет ключевую роль в патогенезе пневмокониоза, вызванного как диоксидом кремния, так и асбестом. Кроме того, было доказано, что активизация NALP3 инфламмасомы требуется для кремнезем-индуцированной продукции активных форм кислорода (Cassela S. L. et al., 2008). Известно, что при длительном поступлении с пылью силикаты различных 35 металлов вызывают такие заболеваний легких, как силикоз, биссиноз, пневмокониоз и фиброз не только у животных, но и у человека (Авцын А. П. и соавт., 1991). Кроме того, существуют работы по сбору и обобщению материала, в которых кварцевая пыль рассматривается в качестве риска развития и прогрессирования таких аутоиммунных заболеваний, как склеродермия, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, системные васкулиты и т. д. (Klockars M. et al., 1987; Parks S. J. et al., 1999, Mulloy K. B., 2003). Под воздействием соединений кремния в организме человека и грызунов происходит перераспределение биогенных аминов, в частности, увеличивается содержание гистамина (Ainsworth S. K. et al., 1979; Religa Z., Malinski S., 1970). Роль этого биогенного амина в патогенезе аутоиммунных заболеваний была подробно обоснована (Zampeli E., Tiligada E., 2009). У больных силикозом обнаружены такие иммунологические нарушения, как появление антинуклеарных антител и возникновение аутоиммунных заболеваний. В крови больных силикозом, по сравнению со здоровыми лицами, абсолютное число циркулирующих лимфоцитов уменьшается, а доля активированных Т-клеток возрастает, как возрастает и титр антинуклеарных антител (Tomokuni A. et al., 1999; Subra J. F. et al., 2001). При взаимодействии асбеста, диоксида кремния, наночастиц кремния и силикона с живыми организмами, а также экспериментах in vitro, происходят сходные процессы (Otsuki T. et al., 2007, Speck-Hernandez C. A., Montoya-Ortiz G., 2012). При поступлении в организм твердых соединений кремния (кварца, асбеста, силикона, наночастиц), они подвергаются захвату фагоцитами (нейтрофилами и макрофагами). Внутри фагоцитов происходит генерация активных форм кислорода с последующим апоптозом макрофагов. Активизация NALP3 инфламмасомы приводит к повышенной продукции цитокинов, вследствие чего наблюдается усиление Th1 ответа. Вместе с тем происходит снижение регуляторной функции Tregs, появление аутоантител, увеличивается синтез коллагена миофибробластами, что приводит к фиброзу и повреждению тканей, воспаление становится хро- 36 ническим. Совокупность рассмотренных процессов приводит к развитию аутоиммунного заболевания (Таблица 1). Таблица 1 Свойства кремнийсодержащих соединений (цит. с изменениями по: SpeckHernandez C. A., Montoya-Ortiz G., 2012) Биологический эффект Источники Активизация NALP3 инфламмасомы Высвобождение воспалительных цитокинов Продукция аутоантител Клеточный ответ (инфильтрация, продукция АФК, апоптоз) Исход (тканевой фиброз) Диоксид Асбест Силикон кремния Горная промышлен- Имплантаты ность, строительство груди + + + + + + + + + + + + Нет данных + + Нет данных Наночастицы кремния Нанотехнологии, лекарства + + + + Сохранение ответа длительное время Ревматоидный артрит Важным является понимание того, что, кварц, асбест, наночастицы кремния, независимо от путей поступления в организм, оказывают выраженное действие на иммунную систему в целом, активируя, в первую очередь, макрофагальное звено. Медицинские и социальные проблемы, связанные с ростом аутоиммунных заболеваний и злокачественных опухолей, индуцированных асбестом и кристаллическим кварцем, вызвали общенациональную тревогу в Японии (Otsuki T. et al., 2007). У женщин с силиконовыми имплантатами груди от места имплантирования в лимфатические сосуды и лимфатические узлы поступают либо собственно силикон, либо продукты его деградации (диоксид кремния, силикаты). Медленное постоянное поступление этих соединений приводит к продукции антител к силикону, а также к локальному и системному повышению уровня интерлейкинов и других цитокинов (Teuber S. S. et al., 1995; Shen G.-Q. et al., 1996). Высокие концентрации IL-1β и антагониста его рецептора IL-1ra были обнаружены в плазме 37 женщин с силиконовыми грудными имплантатами, что послужило прямым доказательством активации цепи моноциты –макрофаги – T-лимфоциты (Ojo-Amaize E. A. et al., 1996). Перепроизводство или дефицит некоторых цитокинов, как полагают, способствует развитию аутоиммунных заболеваний. Так, в синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным артритом обнаружены высокие концентрации IL-1β (Beauliu A. D., McColl S. R., 1994). Отдельного внимания заслуживает хроническое поступление кремния в низких концентрациях. У крыс, в течение пяти недель получавших в качестве пищевой добавки органический и неорганический кремний (силикат натрия) в дозе 35 мг/кг, реакция на инъекционное введение коллагена сопровождалась увеличением количества лимфоцитов и снижением количества нейтрофилов в периферической крови (Nielsen F. H., 2008). Водорастворимые соединения кремния рассматривают в качестве фактора, приводящего к появлению в микрофлоре кишечника человека и лабораторных крыс кишечной палочки с гемолитической активностью (Сусликов В. Л. и соавт., 2009; Ефейкина Н. Б. и соавт., 2012, 2013). Было обнаружено, что избыток в питьевой воде соединений кремния приводит к развитию уролитиаза у человека и млекопитающих (Ковальский В. В., Сусликов В. Л., 1980; Keeler R. F., 1963). Примечательно, что японские ученые связали образование силикатных камней в почках 10-месячного мальчика с повышенным содержанием кремния в воде, которой разбавляли молоко (Nishizono T. et al., 2004). Не меньшего интереса заслуживают сообщения о том, что у лиц, систематически употребляющих антациды и пищевые добавки с кремнием, также происходит формирование в почках силикатных камней, причем эти явления наблюдались в разное время в разных странах (Cruz G. et al, 2000, Inahara M. et al., 2002; Lee M. H. et al., 1993; Flythe J. E. et al., 2009; Dagenais M. et al., 2012). Что касается влияния кремния на процессы пищеварения, то различными авторами зафиксировано следующее: перевариваемость растительной пищи об- 38 ратно пропорциональна содержанию в просвете кишечника кремния, независимо от того, поступает он с питьевой водой в виде силикатов, или входит в состав клеточных стенок употребляемых в пищу растений (Абатуров Б. Д., 1999; Smith G. S., Nelson Ar. B., 1975). Однако, как было замечено выше, кремний оказывает системное действие и при поступлении с питьевой водой. В связи с этим заслуживает пристального внимания позиция В. Т. Мазаева и Т. Г. Шлепниной (2011), которые считают, что степень санитарной опасности соединений кремния в природной и питьевой воде может быть завышена, поскольку результаты опытов in vitro и in vivo на животных с интраназальным и перитонеальным введением кремнийсодержащих соединений сложно экстраполировать на возможные результаты действия солей кремниевой кислоты, растворенных в питьевой воде. По их мнению, нет отечественных исследований, в которых была бы дана адекватная оценка специфического физиологического действия конкретных концентраций силикатов с учетом таких параметров питьевой воды, как жесткость и солевой состав (Мазаев В. Т., Шлепнина Т. Г., 2011). Прямо противоположного мнения, подкрепленного эпидемиологическими исследованиями и опытами на животных, придерживаются другие авторы (Сапожников С. П., 2001; Сапожников С. П., Гордова В. С., 2013). Имеются работы, посвященные влиянию поступления в организм кремния на репродуктивные функции крыс (Smith G. S. et al., 1973). Установлена связь повышенного содержания кремния в водно-пищевых рационах жителей различных биогеохимических провинций и возникновения заболеваний неинфекционной патологии, например, сахарного диабета (Сапожников С. П., Голенков А. В., 2001). Совсем недавно финские ученые выдвинули гипотезу о том, что наноколлоидный аморфный кремний, поступающий с питьевой водой, является триггером такого заболевания, как аутоиммунный гипотиреоз (Junnila S. K., 2011). Довольно подробно было изучено действие силиката, поступающего с питьевой водой, на главный орган иммунитета – тимус (Дьячкова И. М. и соавт., 2010, 39 Дьячкова И. М., 2011). Оказалось, что у крыс, получавших питьевую воду, соответствующую требованиям ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02 с добавлением метасиликата натрия в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний, морфологическая структура тимуса претерпевает изменения, характерные для активации клеточного иммунитета. Таким образом, вопросы, связанные с поступлением в организм кремния в различных его соединениях и формах и влиянием его на иммунную систему, считаются актуальными в мировой науке. Для каждого вещества (диоксид кремния, асбест, силикон, наночастицы) было определено как системное действие на весь организм, так и изолированное действие на определенные клеточные культуры. Важным является понимание того, что, независимо от путей поступления в организм, соединения кремния оказывают выраженное действие на иммунную систему в целом, а не только на одно из ее звеньев. Изучение процесса на всех уровнях организации живого вещества при сопоставлении с данными, полученными ранее, позволило обозначить патогенетическую линию развития иммунного ответа при поступлении в организм твердых соединений кремния. Однако, в имеющихся на сегодняшний день литературных данных нами обнаружен существенный пробел, касающийся системного действия кремния, поступающего с питьевой водой, на иммунную систему, а именно изменений, происходящих с периферическими лимфоидными органами – селезенкой и пейеровыми бляшками. Кроме того, нами не обнаружено работ, которые проливали бы свет на параллели морфо-функциональных изменеий лимфоидных органов при поступлении с питьевой водой кремния. Вопрос, насколько можно экстраполировать данные, касающиеся водного кремния, при том, что твердые его частицы оказывают одинаковое действие как на людей, так и на животных, также остается открытым. 40 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Материал исследования Работа выполнялась в 2009–2014 гг. в научных лабораториях кафедр ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова»: медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии; цитологии, эмбриологии, гистологии; патофизиологии, патологической анатомии с клинической патологической анатомией и судебной медицины согласно государственному плану по теме «Гистохимия биогенных аминов в морфо-функциональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте (№ 0120.0851887 от 10 сентября 2008 г.)». Объектом исследования являлись тимус, селезенка и пейеровы бляшки 60 белых нелинейных беспородных крыс-самцов одного возраста и одинаковой массы (150–200 г), содержавшихся в обычных условиях вивария. Уход за ними осуществлялся согласно правилам и нормам обращения с лабораторными животными (Западнюк И. П. и соавт, 1983). Животные были разделены на 2 группы. Первая (контрольная) группа – 30 крыс, получавших ad libitum питьевую воду, соответствующую требованиям ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02. Вторая (опытная) группа – 30 крыс, получавших ad libitum питьевую воду, соответствующую требованиям ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02 с добавлением метасиликата натрия в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний (Таблица 2). Ежедневно в течение двух месяцев опытные животные получали с питьевой водой в среднем 0,4–0,6 мг/кг кремния. Свободный доступ к питьевой воде был обусловлен моделированием поступления кремния в естественных условиях с питьевой водой. Выбор метасиликата натрия девятиводного для изменения концентрации кремния в питьевой воде был обусловлен его растворимостью и опытом использования другими ис- 41 следователями (Сапожников С. П., 2001, Дьячкова И. М., 2011). Таблица 2 Химический состав питьевой воды, употребляемой животными контрольной и опытной групп. Показатель, мг/л Минерализация Гидрокарбонаты Кальций Магний Калий Натрий Кремний Фтор Хлориды Сульфаты Фосфаты Жесткость Контрольная группа 223,6 150,0 35,0 9,0 5,0 0,6 10,0 14,0 <0,01 2,4 Опытная группа 250,02 150,0 35,0 9,0 5,0 16,42 10 0,6 10,0 14,0 <0,01 2,4 Поскольку концентрации биологически активных веществ у лабораторных крыс подвержены сезонным и суточным колебаниям (Сергеева В. Е., 1992; Смирнова Т. Л. и др., 2009; Судеева В. С., 2009), экспериментальный материал забирался в одно и то же время суток с 16 до 18 часов. Выведение животных из эксперимента проводилось путем декапитации (Западнюк И. П. и соавт., 1983). Извлекались тимус, селезенка, пейеровы бляшки подвздошной кишки. Часть каждого органа шла на заморозку, часть фиксировали в 10% нейтральном формалине для последующей заливки в парафин. Пейеровы бляшки забирались по методике, описанной Л. М. Яковлевой и соавторами (2009). Все действия, предусматривавшие контакты с экспериментальными животными, осуществлялись согласно «Правилам проведения работ с использованием 42 экспериментальных животных» (приказ №755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР) (Каркищенко Н. Н., 2004) и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.13.1986 г. Депарафинированные срезы (Артишевский А. А. и соавт., 1999) обрабатывались общими морфологическими и иммуногистохимическими методами. 2.2. Методы исследования 1. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста (Cross, Ewen, Rost, 1971) применялся для выявления гистаминсодержащих структур лимфоидных органов. Между парами ортофталевого альдегида и гистамином в тканях происходит реакция, в ходе которой образуются флуоресцирующие производные имидазолилэтиламина. Под люминесцентным микроскопом образовавшийся комплексный продукт дает в срезах при большом содержании лимонножелтое, при среднем – зеленое, при малом – голубое свечение. Криостатные срезы тимуса, селезенки, пейеровых бляшек обрабатывались в предварительно разогретой камере парами ортофталевого альдегида в термостате при температуре 100оС в течение 10 секунд. Затем срезы при той же температуре на две минуты помещались в другую камеру, содержащую пары воды. Далее срезы высушивались в течение 5 мин в термостате при 70оС. 2. Метод цитоспектрофлуориметрии использовался для идентификации и количественного выражения уровня гистамина в тканевых структурах лимфоидных органов (Карнаухов В. Н., 1978). На люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-4 была установлена дополнительная насадка ФМЭЛ-1А с выходным напряжением 900 В. Для определения гистамина использовался светофильтр №7 с длиной волны 515 нм. Показания снимались с табло усилителя У-5 в условных единицах флуоресценции (у. е.). 3. Окраска полихромным толуидиновым синим по методу Унна (Артишев- 43 ский А. А. и соавт., 1999) применялась для контроля состояния тканевых мукополисахаридов и гепарина в тучных клетках лимфоидных органов. Голубую αортохромную окраску дает несульфатированный незрелый гепарин; β- метахроматичную (чернильно-фиолетовую) – более сульфатированный созревающий; γ-метахроматичную (пурпурную) – зрелый гепарин (Гордон Д. С., 1981, 1982). При окраске полихромным толуидиновым синим тучные клетки классифицировались по двум критериям, с помощью которых они подразделялись на следующие виды: 1. По состоянию мукополисахаридов: а) α-ортохромные виды тучных клеток с голубой окраской цитоплазмы и несульфатированным, незрелым гепарином в ней; б) β1-метахроматичные тучные клетки с фиолетовым окрашиванием гранул в цитоплазме и с более сульфатированным, незрелым гепарином в ней; в) β2-метахроматичные тучные клетки, имеющие фиолетовую цитоплазму с красноватым оттенком за счет созревания сульфатированного гепарина; г) β3-метахроматичные тучные клетки с красно-фиолетовой цитоплазмой и почти зрелым гепарином; д) γ-метахроматичные тучные клетки с пурпурной окраской и с полностью сульфатированным, зрелым гепарином в гранулах; 2. По степени дегрануляции согласно классификации Д. П. Линднер и соавт., (1980) и Г. Ю. Стручко (1999) выделяют следующие формы тучных клеток: а) Т0-формы – гранулы плотно расположены в цитоплазме, ядро визуально не определяется; б) Т1-формы – ядро хорошо просматривается, гранулы располагаются внутри клетки, за пределы цитоплазматической мембраны не выходят; в) Т2-формы – гранулы частично выходят за пределы неповрежденной цитоплазматической мембраны; 44 г) Т3-формы – полностью дегранулированные виды тучных клеток с разорванной цитоплазматической мембраной. При оценке тучноклеточной популяции использовалось также рационализаторское предложение, принятое Чувашским государственным университетом имени И. Н. Ульянова № 1171 «Способ описания морфологического и функционального состояния тучноклеточной популяции в гистологических препаратах», выданное 9 сентября 2013 года Гордовой В. С. 5. Иммуногистохимический метод непрямого иммуноферментного анализа с использованием антител к кальций связывающим адапторным молекулам (Iba-1) был использован для выявления клеток, имеющих моноцитарно-макрофагальное происхождение (Smorodchenko A. et al., 2007). Срезы обрабатывались по стандартному протоколу: эндогенная пероксидазная активность подавлялась путем инкубации срезов в 3% растворе H2O2 в течение 30 минут с последующей трехкратной промывкой 0,1М фосфатным буфером; блок неспецифического связывания проводился при инкубировании срезов в течение 1 часа при комнатной температуре в 10% козьей сыворотке. В качестве первичных антител для выявления кальций связывающих адапторных молекул (Iba-1) были применены антитела против белка Iba-1 (1:500; Rabbit, Wako, Japan). Инкубация с первичными антителами проводилась в течение 18 часов при температуре 4°С. В качестве вторичных антител использовались биотилинированные антитела (1:250; goat anti-rat IgG; Vector Laboratories). Для выявления биотиновой метки срезы обрабатывались авидин-пероксидазным комплексом (ABC, Vector Laboratories). Инкубация с 3,3-диаминобензидин тетрахлоридом (Sigma-Aldrich) придавала специфическое коричневое окрашивание структурам, содержащим белок Iba-1. 6. Иммуногистохимический метод непрямого иммуноферментного анализа с использованием антител к белкам главного комплекса гистосовместимости второго класса (МНС-II) применялся для выявления антигенпредставляющих клеток лимфоидных органов (Sarilova I. L. et al., 2008). Срезы обрабатывались по стан- 45 дартному протоколу: эндогенная пероксидазная активность подавлялась путем инкубации срезов в 3% растворе H2O2 в течение 30 минут с последующей трехкратной промывкой 0,1М фосфатным буфером; блок неспецифического связывания проводился при инкубировании срезов в течение 1 часа при комнатной температуре в 10% козьей сыворотке. В качестве первичных атител для выявления главного комплекса гистосовместимости второго класса (МНС-II) были применены антитела против белков MHC-II класса (1:4; rat anti-rat RT1Bu, Class II polymorphic; Serotec, Germany). В качестве вторичных антител использовались биотилинированные антитела (1:250; goat anti-rat IgG; Vector Laboratories). Для выявления биотиновой метки срезы обрабатывались авидин-пероксидазным комплексом (ABC, Vector Laboratories). Инкубация с 3,3-диаминобензидин тетрахлоридом (Sigma-Aldrich) придавала специфическое коричневое окрашивание структурам, содержащим белки МНС-II. 7. Люминесцентно-иммуногистохимический метод непрямого иммуноферментного анализа с использованием антител к белку PCNA применялся для выявления клеток, содержащих белок циклин А, функционирующий в S-фазе клеточного цикла как кофактор ДНК-полимеразы, в герминативных зонах лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек лабораторных крыс. После депарафинирования предметные стекла промывались в трисбуферном растворе (pH=7,4) в течение 5 мин по 3 раза при комнатной температуре. Далее для блокирования участков неспецифического связывания срезы инкубировались с 10% раствором нормальной козьей сыворотки 15 мин при комнатной температуре, после этого избыток сыворотки удалялся без промывания срезов. В качестве первичных антител применяли моноклональные антитела к белку PCNA (PCNA (PC10) Mouse mAb (Cell Signaling Technology, Inc., США), которые наносили на срезы в разведении 1:100 с последующей инкубацией при температуре +4ºС в течение 12–16 часов, после этого стекла с тканью трижды промывались в трис-буферном растворе (pH=7,4) в течение 5 мин по 3 раза. 46 В качестве вторичных антител использовались антитела, конъюгированные с флюоресцирующей меткой (Cy3® goat anti-mouse IgG (Life Technologie, США) которые наносили на срезы в разведении 1:200 с последующей инкубацией в течение 45 мин при температуре +37 о С. После промывки в трис-буферном растворе (pH=7,4) срезы заключались в глицерольную среду VECTASHIELD with DAPI (Vector Laboratories, Inc, США) для идентификации клеточных ядер. Структуры, содержащие белок PCNA, люминесцировали (в диапазоне длины волны 553–565 нм) синим, и красным, а клетки, не содержащие этого белка, люминесцировали только синим. Препараты исследовали под флюоресцентным микроскопом (Nikon Eclipse 50I , USA). 8. Иммуногистохимический метод непрямого иммуноферментного анализа с использованием антител к белку Ki-67 применялся для выявления пролиферативных процессов в герминативных зонах лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек лабораторных крыс. Белок Ki-67 выявляли с помощью двойного непрямого метода окрашивания антител с использованием полимерной системы детекции. После депарафинирования и регидратации срезов подавление эндогенной пероксидазной активности и блокирование неспецифического связывания проводили реагентами из системы детекции Reveal – Biotin-Free Polyvalent HPR DAB Detection System SPD-015 (Spring Bioscience, США) согласно протоколу производителя системы. В качестве первичных антител применяли моноклональные антитела к белку Ki-67 (clone SP6, Spring Bioscience, США), которые наносили на срезы в разведении 1:200 с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. В качестве вторичных реагентов использовали HRP Conjugate из набора Reveal – Biotin-Free Polyvalent HPR DAB Detection System SPD-015 (Spring Bioscience, США). Визуализацию Ki-67-позитивных клеток проводили с помощью мультимерной безбиотиновой системы детекции с применением 3'3- диаминобензидина (Reveal – Biotin-Free Polyvalent HPR DAB Detection System 47 SPD-015, Spring Bioscience, США) согласно протоколу производителя системы. Инкубация с 3,3-диаминобензидином придавала специфическое коричневое окрашивание ядрам клеток, содержащим белок Ki-67. При анализе экспрессии маркеров пролиферации (Ki-67, PCNA), подсчетом не менее чем в 10 полях зрения при иммерсионном (х900) увеличении, определяли индекс пролиферативной активности клеток для каждого маркера по формуле: I = N / N1 х 100% , где N – количество позитивных ядер в поле зрения, N1 – общее количество ядер в поле зрения (Тищенко Д. В. и соавт., 2012). Положительным контролем специфичности иммуногистохимических реакций на маркеры пролиферации служили ткани, рекомендованные производителями антител, отрицательным контролем являлись неиммунизированные срезы. Часть исследования, включающая иммуногистохимические методы непрямого иммуноферментного анализа, была проведена в лаборатории на базе патологоанатомического отделения ГАУЗ «Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения республики Татарстан». 9. Окраска гематоксилином и эозином, а также гематоксилином, эозином и альциановым синим применялась для общегистологической характеристики структур лимфоидных органов и проведения морфометрического анализа (Луппа Х., 1980). 10. Морфометрический анализ включал измерение размеров коркового и мозгового вещества долек тимуса, в лимфоидных узелках селезенки измерялись площади герминативных центров, маргинальной и мантийной зон, в фолликулах пейеровых бляшках измеряли высоту и длину фолликулов, ширину межузелковых зон, площадь герминативных центров. Измерение проводилось после фотографирования препаратов при увеличении объектива 4 и окуляра 10. Количество тучных клеток в тимусе и селезенке подсчитывалось в каждом препарате на поле зрения при иммерсионном увеличении в 30-50 полях зрения, количество Iba-1-позитивных клеток, MНС-II-позитивных клеток в лимфоидных 48 органах подсчитывалось при увеличении объектива 40 и окуляра 10 светового микроскопа МИКМЕД-5 Определение размеров клеточных структур проводилось после фотографирования препаратов при увеличении объектива 40 или 90 и окуляра 10 с использованием светового микроскопа МИКМЕД-5. Линейные морфометрические измерения, измерения площадей клеток и структур, а также количественные морфометрические измерения интенсивности мембранных и цитоплазматических иммуногистохимических реакций выполнены с применением демо-версии программы «Sigma Scan Pro 5.0» (Москвичев Е. В., 2013). Распределение размеров клеток на группы осуществлялось с помощью метода сигмальных отклонений, размеры для каждого вида клеток принимались: М± σ – средние, > М+ σ – большие, < M–σ – малые. (Дьячкова И. М., 2011). Для обеспечения репрезентативности морфологические выборки производились случайным отбором, объем выборки для определения размеров клеточных структур составлял 400 клеток, и количество клеточных элементов, подвергавшихся подсчету, от каждого животного, определялось с применением дисперсионного анализа (Автандилов Г. Г., 1990). 9. Статистический анализ полученных цифровых данных проводился с помощью программы Microsoft Office Excel. Рассчитывалось среднее арифметическое значение площадей структурно-функциональных зон лимфоидных органов, количества тучных клеток, Iba-1-позитивных клеток, МНС-II-позитивных клеток как по каждому животному, так и в группе. Определялось также среднее арифметическое значение интенсивности люминесценции гистамина (двадцать замеров для каждой исследуемой структуры по каждому животному) как по каждому животному, так и в группе. Для всех средних рассчитывалась стандартная ошибка среднего значения (m). Среднее X арифметическое значение рассчитывалось по формуле: x1 x 2 ... x n , где xi – варианты (значения признака); n – объем выборки. n 49 Стандартная ошибка среднего значения рассчитывалась по формуле: mX , а стандартное отклонение: n (x i X )2 (n 1) . Средние величины приводятся в тексте со стандартной ошибкой среднего значения. Мы остановились на элементарных методах обработки, позволивших получить результаты, доказывающие статистическую значимость проведенных исследований. При статистической обработке данных анализ различий между исследованной группой и контрольной группой экспериментальных животных проводили проверку вариационных рядов на нормальность распределения. В случае, когда гипотеза о нормальности распределения отвергалась, использовали непараметрические критерии Вилкоксона-Манна-Уитни. В остальных случаях статистическая значимость различий средних величин рассчитывалась с помощью программы Microsoft Office Excel через статистические методы ТТЕСТ, при установке хвосты = 2 (использовалось двустороннее распределение), тип = 3 (для неравных отклонений). Для оценки различий качественных признаков использовался z- критерий. Различия считались статистически значимыми при значениях p ≤ 0,05 (Медик В. А. и соавт., 2000). 11. Корреляционный анализ проводился для установления корреляционных взаимосвязей между показателями интенсивности светопропускания цитоплазматической мембраны, цитоплазмы и площадью клеток в Iba-1-позитивных и MHCII-позитивных структурах изучаемых органов. Оценка силы связи между переменными проводилось с учетом следующих критериев: коэффициент корреляции меньше 0,3 – связь слабая или отсутствует; в интервале 0,3–0,7 – связь средняя; в интервале 0,7–1,0 – связь сильная или полная (Славин М. Б., 1989). Положительный коэффициент корреляции означает одновременное возрастание средних значений в исследуемой паре, отрицательный – снижение средних значений в одном члене пары при возрастании в другом (Медик В. А. и соавт., 2000). 50 ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Структурно-функциональное состояние тимуса лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой 3.1.1. Общеморфологическая характеристика тимуса При окраске срезов тимуса гематоксилином-эозином в тимусе животных обеих групп выявляются дольки, разделенные корковыми перегородками. В дольках четко различимы более светлое мозговое вещество и более темное корковое. Мозговое вещество в дольках тимуса животных контрольной группы имеет округло-полигональную форму, располагается преимущественно в центре дольки. Исследуемые срезы визуально отличались по расположению в дольках мозгового вещества (Рисунок 1). Фрагментарное расположение мозгового вещества у лабораторных крыс опытной группы характеризуется наличием одной более крупной структуры в центре дольки и нескольких, меньшего размера, по периферии, как правило, меньшие фрагменты имеют округлую форму. Наблюдается слияние долек в более крупные структуры, при этом мозговое вещество как бы «перетекает» из дольки в дольку – на несколько долек одно мозговое вещество вытянутой формы, с отростками. У животных контрольной группы в тимусе наблюдается 52,2% долек, в которых мозговое вещество одно на дольку, у животных опытной группы таких долек 29,7% (p < 0,05). У животных опытной группы, соответственно, наблюдалось превалирование долек, в которых мозговое вещество располагалось фрагментарно (70,3% против 47,8% в контрольной группе, (p < 0,05). Длительный прием с питьевой водой кремния приводит к незначительному увеличению размеров долек тимуса: площадь мозгового вещества долек тимуса составила у животных контрольной группы 0,50±0,05 мм2, коркового – 1,68±0,11 мм2, общая площадь дольки составила 2,18±0,15 мм2. 51 Рисунок 1. Дольки тимуса лабораторных крыс. Окраска гематоксилин-эозином. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 4. Ок. 10. А – тимус животного контрольной группы. Б – тимус животного, получавшего кремний с питьевой водой. 1 – мозговое вещество долек тимуса. 52 Для животных опытной группы эти показатели равны 0,57±0,05мм2, 2,04±0,13 мм2, 2,61±0,15 мм2 соответственно. Происходит незначительное увеличение общей площади долек тимуса за счет увеличения площади коркового вещества при статистически значимом увеличении (в 1,3 раза, p < 0,05) соотношения площади коркового к площади мозгового вещества в дольках тимуса (в контроле Sк.в./Sм.в. – 4,64, а в опыте – 5,93). Таким образом, в тимусе белых лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой, наблюдается морфологическая перестройка долек. 3.1.2. Тучные клетки тимуса Для изучения популяции тучных клеток срезы тимуса окрашивались полихромным толуидиновым синим по методу Унна. У животных обеих групп лимфоцитарная паренхима железы имеет голубую окраску, корковое вещество долек темнее мозгового. Соединительная ткань корковых перегородок окрашивалась слабо. В корковых перегородках тимуса обнаруживались тучные клетки, они имели разные тинкториальные свойства и разные размеры (Рисунок 2). Употребление животными питьевой воды с добавлением соединения кремния не отражается на количестве тучных клеток тимуса – в корковых перегородках тимуса животных контрольной группы при иммерсионном увеличении (х900) оно составило в среднем 2,32±0,19 клетки на поле зрения, для опытной группы – 2,19±0,21 клетки. Характеристика популяции тучных клеток тимуса контрольной и опытной групп по количеству и размерам представлена в таблице 3. 53 Таблица 3 Характеристики тучных клеток тимуса крыс контрольной и опытной групп. Параметры Количество тучных клеток в поле зрения, шт Доля малых (менее 41,39 мкм2) тучных клеток, % Доля средних (41,40–104,26 мкм2) тучных клеток, % Доля больших (104,27–135,56 мкм2) тучных клеток, % Доля очень больших (более 135,57 мкм2) тучных клеток, % Средняя площадь тучных клеток, мкм2 Контрольная Опытная группа группа 2,32±0,19 2,19±0,21 13,78 25,78* 72,98 59,86 9,46 10,88 3,78 3,74 72,83±1,63 67,86±2,05* * – различия с контрольной группой статистически значимы, p < 0,05 Поступление с питьевой водой кремния отражается на распределении тучных клеток по размерам – происходит увеличение количества тучных клеток малых размеров. Это отражается на средней площади тучных клеток – в контрольной группе средняя площадь составляет 72,83±1,63 мкм2, а в опытной – 67,86±2,05 мкм2 (p < 0,05). Качественные характеристики тучных клеток тимуса отличались по нескольким параметрам. Так, для животных контрольной и опытной групп доля ортохромных тучных клеток составила 14,6 % и 13,7%, с метахромазией β-1 – 25,92% и 10,8 % (р <0,001), β-2 – 36,2% и 31,6 %, β-3 – 23,3% и 43,9% соответственно (р < 0,001). Доля тучных клеток с плотным расположением гранул составила для контрольной и опытной групп 30,9% и 24,7%, с рыхлым расположением гранул – 19,3% и 47,5 % соответственно (р < 0,001), клетки, в которых гранулы не визуализировались – 40,3% и 6,3% (р < 0,001) соответственно. В тучных клетках тимуса можно было увидеть ядро, оно визуализировалось не во всех клетках, преимущественно в тех, в которых гранулы были расположены рыхло. 54 Рисунок 2. Тучные клетки в корковых перегородках тимуса лабораторных крыс. Окраска толуидиновым синим по Унна. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. А – тимус животного контрольной группы. Б – тимус животного, получавшего кремний с питьевой водой. 55 Доля тучных клеток с полной дегрануляцией и нарушением целостности мембраны у животных, получавших кремний, составила 21,0% (у контрольных – 9,4% (p < 0,05). Таким образом, тучные клетки тимуса крыс адаптируются к поступлению водного кремния как изменением внутреннего расположения гранул и созревания кислых гликозаминогликанов в них, так и усилением дегрануляции с нарушением целостности цитоплазматической мембраны. Как размеры, так и тинкториальные свойства тучных клеток (Гусельникова В. В. и соавт., 2013; Lorentz, A. et al., 2012) могут отражать их функциональную активность, поэтому соотношение между этими признаками тучных клеток представляет определенный интерес (Таблица 4). Таблица 4 Средние размеры тучных клеток, проявляющих разные тинкториальные свойства при окраске по методу Унна Контрольная Степень метахромазии тучных клеток ортохромные β1 β2 β3 68,17±4,45 73,67±2,67 76,47±2,54 69,18±4,11 Опытная 53,83±4,39* Группа крыс 81,22±6,20 74,50±3,45 64,11± 5,64 * – различия с контрольной группой статистически значимы, p < 0,05 Из таблицы видно, что ортохромные тучные клетки тимуса крыс опытной группы имеют меньшие размеры, чем ортохромные тучные клетки в контрольной группе. Со степенью увеличения метахромазии увеличивается площадь тучных клеток, а потом, с переходом с β2 на β3 метахромазию, площадь тучных клеток уменьшается. Тучные клетки, в которых ядро не визуализируется, имеют меньшие размеры как в опытной, так и в контрольной группе. Употребление кремния с питьевой водой приводит к уменьшению среднего размера тучных клеток, в которых не вы- 56 является ядро. Имеются различия между размерами клеток с плотно расположенными гранулами между опытной и контрольной группами, а также различия для опытной группы между клетками с рыхло и плотно расположенными гранулами. Зависимость размера тучных клеток от других видимых признаков представлена в таблице 5. Таблица 5 Некоторые особенности тучных клеток экспериментальных животных Признаки тучных клеток Характер расположения гранул Визуализация ядра Плотно расположены Рыхло расположены Ядро визуализируется Ядро не визуализируется Размеры тучных клеток, мкм2 Значимость различий Контрольная Опытная 71,13±1,83 66,16±2,58* р < 0,001 76,57±3,31 73,03±2,91 р=0,32 79,50±2,13** 75,19±2,52** р=0,13 63,17±2,35 р < 0,05 52,74 ± 3,02 * – различия с контрольной группой статистически значимы, p < 0,05 ** – различия с контрольной группой статистически значимы, p < 0,001 Итак, вне зависимости от визуализации ядра и расположения гранул тучные клетки тимуса животных, получавших с питьевой водой кремний, имеют меньшие размеры по сравнению с тучными клетками животных контрольной группы. Таким образом, при неизменном количестве тучных клеток в корковых перегородках тимуса крыс, подвергшихся воздействию соединения кремния, поступающего с питьевой водой, происходит изменение их средних размеров, меняется расположение гранул внутри клетки (становится рыхлым), увеличивается доля как ортохромных, так и β3 метахроматичных клеток. 57 3.1.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные клетки) тимуса При постановке реакции на Iba-1-позитивные структуры (имеющие моноцитарно-макрофагальное происхождение) в срезах тимуса животных обеих групп четко различаются корковое и мозговое вещество долек. Однако, по сравнению с окраской гематоксилин-эозином, наблюдается противоположная картина – корковое вещество долек тимуса выглядит светлее мозгового, а в мозговом веществе можно выделить более темную границу между корковым и мозговым веществом долек тимуса и светлую зону собственно мозгового вещества. Наибольшая концентрация Iba-1-позитивных клеток отмечается на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. Под соединительнотканной капсулой тимуса также выявляются цепочки Iba-1-позитивных клеток. В корковом веществе долек тимуса лабораторных крыс контрольной группы клетки моноцитарно-макрофагального происхождения располагаются достаточно равномерно, имеют разную форму и размеры, в подавляющем большинстве это клетки с неровными краями и ярко выраженными выростами. Расположение в них исследуемого белка неравномерное – цитоплазматическая мембрана окрашена более интенсивно, чем цитоплазма (Рисунок 3, А). В корковом веществе долек тимуса лабораторных крыс, получавших с питьевой водой кремний, Iba-1-позитивные клетки располагаются достаточно равномерно, имеют разную форму и размеры, в подавляющем большинстве это клетки с неровными краями и ярко выраженными выростами (Рисунок 3, Б). Расположение в них исследуемого белка неравномерное, однако, по сравнению с животными контрольной группы, в некоторых клетках наблюдается равномерное гомогенное окрашивание цитоплазмы. Наибольшая концентрация Iba-1-позитивных клеток также отмечается на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. 58 Рисунок 3. Iba-1-позитивные клетки коркового вещества долек тимуса. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. А – контроль. Б – опыт. 59 При сравнении препаратов тимуса контрольной и опытной групп визуально отмечается, что у животных контрольной группы граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса представлена четким «ободком» вокруг мозгового вещества, а у животных опытной группы нет перехода между границей, разделяющей корковое и мозговое вещество долек тимуса и собственно мозговым веществом (Рисунок 4). Морфометрия Iba-1-позитивных клеток коркового вещества и Iba-1-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса показала интересные результаты (Таблица 6). Таблица 6 Признаки Iba-1-позитивных клеток тимуса лабораторных крыс Морфо-функциональные зоны долек тимуса Корковое вещество долек тимуса Граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса Показатели Контрольная группа Опытная группа Значимость различий Площадь 77,31±7,46 76,03±4,4 р=0,88 клеток, мкм2 ИСП мем105,50 ±1,29 90,58±1,14 p<0,001 браны ИСП цито113,74±1,89* 114,91±1,37** р=0,62 плазмы Площадь 88,37±4,37 клеток, мкм2 ИСП мем94,23±0,68 браны ИСП цито124,64±0,99 плазмы 123,79±8,48 p<0,001 90,56 ±1,12 p<0,05 125,21±1,53 р=0,75 *– различия интенсивности мембраны и цитоплазмы Iba-1-позитивных клеток коркового вещества долек тимуса статистически значимы для контрольной группы, p < 0,001 ** – различия интенсивности интенсивности мембраны и цитоплазмы Iba-1позитивных клеток коркового вещества долек тимуса статистически значимы для опытной группы, p < 0,001 При поступлении с питьевой водой кремния происходит изменение интенсивности светопропускания мембраны (90,58±1,14 у.е. и 105,50±1,29 у.е. для опытной и контрольной групп соответственно, p < 0,001). 60 Рисунок 4. Iba-1-позитивные клетки на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. А – контроль. Б – опыт. 61 Интенсивность светопропускания цитоплазмы Iba-1-позитивных клеток коркового вещества тимуса не изменяется (114,91±1,37 у.е. и 113,74±1,89 у.е. для опытной и контрольной групп соответственно), средняя площадь этих клеток также не претерпевает изменений (76,03±4,4 мкм2 и 77,31±7,46 мкм2 для опытной и контрольной групп соответственно). На границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса также происходит изменение интенсивности светопропускания мембраны (90,56±1,12 у. е. и 94,23±0,68 у. е. для опытной и контрольной групп соответственно, p < 0,001) при неизменных показателях для цитоплазмы (125,21±1,53 у. е. и 124,64±0,99 у. е. для опытной и контрольной групп соответственно). Кроме того, отмечается значительное увеличение площади Iba-1-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса (123,79±8,48 мкм2 и 88,37±4,37 мкм2 для опытной и контрольной групп соответственно, p < 0,001). Обращает на себя внимание, что корреляционные связи между характеристиками Iba-1-позитивных клеток претерпевают определенные изменения (Рисунок 5). Так, в корковом веществе долек тимуса показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,41, 0,65 и 0,41, а для опытной – 0,04, 0,22 и 0,24. То есть, у животных опытной группы наблюдается уменьшение силы корреляционных связей между всеми характеристиками Iba-1-позитивных клеток: значимая положительная связь слабой силы между площадью клетки и интенсивностью светопропускания мембраны и цитоплазмы, а также положительная связь средней силы между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и цитоплазмы мембраны прекращают свое существование. 62 Ц-М 0,6 Ц-М 0,8 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 А М-П 0 Ц-П Б контроль М-П Ц-П опыт Рисунок 5. Корреляционные связи между характеристиками Iba-1позитивных клеток. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. А – корковое вещество долек тимуса. Б – граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса. На границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,07, 0,41 и 0,03, а для опытной – 0,10, 0,04 и 0,28 соответственно. Наблюдается исчезновение положительно направленной связи слабой силы между интенсивностью светопропускания в мембране и в цитоплазме Iba-1-позитивных клеток. Таким образом, Iba-1-позитивные клетки, располагающиеся на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса, реагируют на поступление кремния увеличением площади, изменением интенсивности светопропускания как в мембране, так и в цитоплазме, а также изменением корреляционных связей между этими показателями. 63 3.1.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки тимуса При постановке реакции на MHC-II-позитивные (антигенпрезентирующие)структуры в срезах тимуса животных обеих групп корковое и мозговое вещества долек тимуса мало отличаются друг от друга по цвету, определить их можно благодаря рядам из темно окрашенных клеток на границе между корковым и мозговым веществом. При сопоставлении между собой срезов тимуса, обработанных иммуногистохимическими маркерами на Iba-1 и MHC-II, для обоих методов мозговое вещество долек выглядит темнее коркового, а самая большая концентрация позитивных клеток в обоих случаях наблюдается на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса (Рисунок 6). На границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса животных обеих групп обнаруживаются единичные MHC-II-позитивные макрофаги, подавляющее большинство Iba-1-позитивных макрофагов MHC-II-негативны. MHCII-позитивные макрофаги имеют интенсивную, темно-коричневую окраску цитоплазматической мембраны и неокрашенную светлую цитоплазму. Граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса, представленная MHC-II-позитивными клетками, в дольках тимуса лабораторных крыс контрольной группы ровная, состоит из одного ровного протяженного ряда, представленного овально-округлыми клетками, располагающимися на некотором расстоянии друг от друга (Рисунок 7). Цитоплазма этих клеток равномерно окрашена в коричневый цвет, цитоплазматическая мембрана клеток имеет чуть более выраженный коричневый цвет. У крыс, получавших воду с кремнием, граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса состоит из двух-трех рядов клеток, также располагающихся на некотором расстоянии друг от друга (Рисунок 8). Однако, в некоторых участках наблюдается как бы прерывание этого барьера. 64 Рисунок 6. Морфологическая параллель. Тимус животного контрольной группы. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. А – иммуногистохимический метод, выявляющий Iba-1-позитивные клетки. Б – иммуногистохимический метод, выявляющий MHC-II-позитивные клетки. 65 Рисунок 7. MHC-II-позитивные клетки на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса животных контрольной группы. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. Рисунок 8. MHC-II-позитивные клетки на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса животных опытной группы. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. 66 Визуально МНС-II-позитивные клетки на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса крыс опытной группы отличаются от таковых в контрольной группе – обнаруживается контраст между четко окрашенной в интенсивно-коричневый цвет цитоплазматической мембраной и светло-коричневой цитоплазмой. Обратило на себя внимание то, что у животных опытной группы в маленьких островках мозгового вещества между корковым и мозговым веществом долек тимуса не наблюдается границы как таковой – MHC-II-позитивные клетки пронизывают всю толщу фрагмента. Количество МНС-II-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса на единицу длины (на 100 мкм) четко выраженной границы между корковым и мозговым веществом долек тимуса полностью отразило визуальную картину. Так, у животных контрольной группы это количество составило 1,29±0,10 клетки, а у животных опытной группы – 1,62±0,05 клетки (p < 0,05). Средняя площадь МНС-II-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса, составила 30,23±2,13 мкм2 для контрольной группы и 35,58±1,94 мкм2 для опытной (p < 0,05). Происходит статистически значимое, по сравнению с контролем, изменение интенсивности светопропускания цитоплазмы (102,26±1,35 и 96,52±1,8 соответственно, p < 0,05) при неизменных показателях для мембраны (98,99±9,01 у. е. и 94,03±1,18 у. е. соответственно). Корреляционные связи между характеристиками MHC-II-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса следующие: М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,05, 0,64, –0,15, а для опытной – 0,25, 0,67, 0,16. Несмотря на то, что связи между площадью клетки и интенсивностью светопропускания мембраны и цитоплазмы не являются значимыми для клеток обеих групп, однако, обращает на себя внимание тенденция к их усилению. Таким образом, употребление с питьевой водой кремния приводит к увеличению количества и размеров MHC-II-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса лабораторных крыс. 67 3.1.2. Гистаминсодержащие структуры тимуса Для выявления гистаминсодержащих структур лимфоидных органов применялся люминесцентно-гистохимический метод Cross, Ewen, Rost (1971). Люминесцентная микроскопия с последующей цитоспектро-флуориметрией позволила идентифицировать тканевые структуры тимуса, содержащие гистамин, а также оценить интенсивность люминесценции этого диамина в морфо-функциональных структурах тимуса. При сопоставлении между собой срезов тимуса, обработанных по методу Cross и срезов тимуса,окрашенных гематоксилин-эозином, четко просматриваются морфологические параллели для животных как контрольной, так и опытной групп (Рисунок 9, 10). Мозговое вещество в дольках тимуса животных контрольной группы имеет округло-полигональную форму, располагается преимущественно в центре дольки, у животных опытной группы мозговое вещество долек тимуса представлено несколькими небольшими фрагментами. В тимусе контрольных животных выявляются следующие люминесцирующие гистаминсодержащие структуры: гранулосодержащие клетки на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса, гранулосодержащие клетки, прилежащие к корковым перегородкам, гранулосодержащие клетки коркового вещества. Граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса лабораторных крыс контрольной группы представлена ярко-желтыми, с лимонным оттенком, люминесцирующими гранулосодержащими клетками с четко различимыми отдельными гранулами. Мозговое вещество долек железы имеет овально-полигональную форму и обладает слабым свечением. В корковом веществе долек, прилежащем к корковым перегородкам, параллельно перегородкам выявляются цепочки чуть менее ярких охристо-желтых гранулосодержащих. 68 Рисунок 9. Тимус лабораторной крысы контрольной группы. Метод CrossEwen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-1. Об. 4. Ок. 10. Рисунок 10. Тимус лабораторной крысы опытной группы. Метод CrossEwen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-1. Об. 4. Ок. 10. 69 В корковом веществе в хаотичном порядке обнаруживаются охристожелтые люминесцирующие клетки коркового вещества долек, яркость свечения которых визуально сопоставима с таковой клеток, прилежащих к корковым перегородкам. В тимусе животных опытной группы, получавших соединение кремния с питьевой водой, также различаются вышеисследованные структуры, однако имеются некоторые отличия по сравнению с животными контрольной группы. Так, мозговое вещество долек, ограниченное рядом ярко-желтых, с лимонным оттенком, гранулосодержащих клеток, имеет неправильную форму, его края могут вплотную подходить к корковым перегородкам. Форма мозгового вещества долек тимуса крыс опытной группы не поддается односложному описанию. По периферии дольки появляются несколько небольших округлых островков, располагающихся вплотную, как бы перетекая из одного в другой. Островки ограничены ярко-желтыми, с лимонным оттенком, люминесцирующими гранулосодержащими клетками с четко различимыми отдельными гранулами. В корковом веществе долек, прилежащем к корковым перегородкам, выявляются чуть менее яркие охристо-желтые гранулосодержащие клетки, составляющие непрерывистую цепь. Люминесцирующие охристо-желтые клетки коркового вещества долек располагаются хаотично. Корковое вещество долек равномерно заполнено люминесцирующими охристо-желтыми клетками. Для животных обеих групп наибольшая интенсивность люминесценции гистамина наблюдается в люминесцирующих клетках на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. Интенсивность свечения гистамина в люминесцирующих клетках вблизи корковых перегородок сопоставима со свечением в гистаминсодержащих клетках коркового вещества для животных обеих групп. У животных опытной группы можно наблюдать некоторую тенденцию к увеличению интенсивности люминесценции гистамина в микроокружении гистаминсодержащих клеток (Таблица 7). 70 Таблица 7 Интенсивность люминесценции гистамина в структурах тимуса экспериментальных животных (М±m, у.е.) Название люминесцирующих структур Клетки на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса Микроокружение клеток на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса Клетки коркового вещества долек тимуса Микроокружение клеток коркового вещества долек тимуса Клетки вблизи корковых перегородок Микроокружение клеток вблизи корковых перегородок Мозговое вещество долек тимуса Контрольная группа Опытная группа Значимость различий 20,88±0,82 21,75±0,78 р=0,48 5,90±0,88 7,79±0,77 13,02 ±1,17 14,67±1,16 р=0,36 4,11±0,99 6,45±0,84 13,34±1,61 13,34±0,89 р=0,99 4,29±0,94 5,87±0,68 р=0,22 5,77±1,02 7,48±0,75 р=0,22 р=0,15 р=0,11 Поскольку гистаминсодержащие структуры тимуса могут быть как аминопоглощающими, так и аминопродуцирующими (Любовцева Л. А., 1993), имеют значение не только абсолютные показатели интенсивности люминесценции гистамина, но и относительные. Соотношение интенсивности люминесценции гистамина между микроокружением гистаминсодержащих структур тимуса и этими структурами в обеих группах экспериментальных животных, выраженное в процентах, составило для клеток на границе коркового и мозгового вещества 29,54±3,60% и 37,64±3,15%, для клеток коркового вещества 31,08±6,18% и 43,23±2,52%, для клеток вблизи корковых перегородок 31,61±4,69% и 43,64±2,77%. Наблюдается тенденция к некоторому относительному увеличению интенсивности люминесценции гистамина в микроокружении всех групп люминесцирующих клеток тимуса у животных опытной группы, однако различия с контрольной группой не являются статистически значимыми. 71 Резюме: В дольках тимуса лабораторных крыс при длительном поступлении с питьевой водой соединения кремния происходит морфологическая перестройка с участием гистаминсодержащих клеток; увеличение размеров Iba-1-позитивных клеток и MHC-II-позитивных клеток на границе коркового и мозгового вещества. 3.2. Структурно-функциональное состояние селезенки лабораторных крыс при поступлении соединения кремния с питьевой водой 3.2.1. Общеморфологическая характеристика селезенки При окраске срезов селезенки гематоксилином-эозином в органах как контрольных, так и опытных животных, выявляется белая и красная пульпа. Красная пульпа представлена скоплениями клеточных элементов крови, ретикулярными волокнами и резидентными макрофагами. Белая пульпа представлена совокупностью лимфоидных узелков на разных стадиях развития, которые отличаются между собой размерами, формой, наличием центра размножения различной степени выраженности (Рисунок 11). В большинстве лимфоидных узелков различима центральная артериола, располагающаяся эксцентрично. Центральную артериолу окутывает «муфта» из лимфоцитов. В лимфоидных узелках различим также светлый герминативный центр, который окружен более темной мантийной зоной, захватывающей и центральную артериолу. Мантийная зона окружена маргинальной зоной белой пульпы, граничащей с красной пульпой. В некоторых узелках между мантийной и маргинальной зонами визуализируются синусоиды. 72 Рисунок 11. Селезенка лабораторных крыс. Окр. Гематоксилин-эозин и альциановый синий. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. A – селезенка животного контрольной группы. Б – селезенка животного опытной группы. 73 В препаратах селезенки животных обеих групп среди сформированных, с маргинальной зоной белой пульпы, лимфоидных узелков преобладают узелки с ярко выраженными герминативными центрами. Их доля в селезенке животных опытной группы составила 80,1±4,42%, контрольной – 62,65±8,95% (p < 0,05). При микроскопии препаратов обратило на себя внимание то, что ВТОричные лимфоидные узелки селезенки опытных животных, по сравнению с животными контрольной группы, имеют, при сопоставимых размерах, больший герминативный центр и более узкую мантийную зону. Наблюдаемое явление подтвердилось после проведения морфометрии (Таблица 8). Таблица 8 Морфометрические показатели вторичных лимфоидных узелков селезенки лабораторных крыс (М±m) Морфометрические Контрольная Опытная Значимость показатели группа группа различий Площадь гермина23407,19±1672,50 29323,71±2312,92 р < 0,05 тивной зоны, мкм2 Площадь мантийной 74711,86±4926,84 70502,90±4787,01 p=0,05 зоны, мкм2 Площадь марги0,14±0,01 0,14±0,01 p=0,22 нальной зоны, мм2 Общая площадь вторичного лимфо0,24±0,02 0,23±0,01 p=0,09 2 идного узелка, мм Из таблицы видно, что у животных обеих групп средняя общая площадь лимфоидных узелков и площадь в них маргинальной зоны не изменяются. У животных опытной группы площадь герминативного центра лимфоидного узелка селезенки увеличивается в 1,25 раза, а площадь мантийной зоны несколько снижается, что отражается в конечном итоге на соотношении площадей этих зон. Для контрольной группы соотношение площадей мантийной и герминативной зон составляет 3,56, для опытной – 2,27 (p < 0,05). Таким образом, при поступлении 74 кремния с питьевой водой в селезенке крыс наблюдаются изменения, связанные с абсолютным и относительным увеличением площади герминативного центра во вторичных лимфоидных узелках. 3.2.2. Тучные клетки селезенки У животных контрольной группы при окраске срезов селезенки толуидиновым синим по методу Унна выявляются ортохромно окрашенные (голубые) участки белой пульпы – периартериолярные муфты лимфоидных узелков. Поиски тучных клеток под соединительнотканной капсулой селезенки завершились обнаружением 1–2 клеток во всех срезах органа (40–50 полей зрения при увеличении х400) для 20% крыс контрольной группы, у остальных животных тучные клетки в селезенке не обнаруживаются. Единичные клетки овальной формы имеют метахроматичную окраску с β2 и β3 степенью метахромазии. Таким образом, можно констатировать, что тучные клетки в селезенке крыс контрольной группы обнаруживаются достаточно редко. У животных опытной группы, получавшей с питьевой водой кремний, при окраске срезов селезенки по методу Унна, выявляются ортохромно окрашенные (голубые) участки белой пульпы – периартериолярные муфты лимфоидных узелков. Тучные клетки в селезенке визуализируются также не у всех животных (60% группы), однако, при увеличении х400, они обнаруживаются в количестве в среднем 1 клетка на 10 полей зрения. У остальных животных тучных клеток в селезенке нами не найдено. Иммерсионное увеличение (х900) показало, что тучные клетки селезенки животных обеих групп метахроматичны. Подавляющее большинство клеток (80% от всех найденных) имеют степень метахромазии β3, остальные – β2. Таким образом, при поступлении с питьевой водой кремния, наблюдается тенденция к увеличению количества тучных клеток в селезенке лабораторных крыс. 75 3.2.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные клетки) селезенки В селезенке животных как контрольной, так и опытной групп Iba-1позитивные клетки можно наблюдать и в красной, и в белой пульпе. В сплошь Iba-1-позитивной, светло-коричневого цвета, красной пульпе выявляются неокрашенные «островки» лимфоидной ткани (Рисунок 12). Однако, при микроскопировании под большим увеличением (х400) красная пульпа крайне неоднородна. Iba-1-позитивные клетки располагаются в ней неравномерно, хаотичными скоплениями, больше выраженными в областях образования новых лимфоидных узелков. Цитоплазматическая мембрана этих клеток окрашена в темно-коричневый цвет, цитоплазма имеет либо светло-коричневый оттенок, либо вообще не окрашивается. В некоторых узелках возможно четко выделить маргинальную зону благодаря тому, что Iba-1-позитивные клетки равномерно, в один ряд, заполняют собой синусоид между мантийной и маргинальной зоной. В гистологических препаратах визуализируются периартериальные макрофагальные муфты – Iba-1-позитивные клетки, располагающиеся вокруг артерий красной пульпы. В лимфоидных узелках селезенки животных обеих групп Iba-1-позитивные клетки обнаруживаются в маргинальной зоне, где располагаются, преимущественно концентрируясь по наружному ее краю.Они имеют разную форму и размеры, в подавляющем большинстве это клетки с неровными краями и ярко выраженными выростами. Расположение в них исследуемого белка неравномерное – цитоплазматическая мембрана окрашена более интенсивно, чем цитоплазма. Цитоплазматическая мембрана этих клеток коричневого цвета, цитоплазма имеет светло-коричневый оттенок или не окрашивается. Iba-1-позитивные клетки находятся также в герминативных центрах лимфоидных узелков. Визуально маргинальные зоны лимфоидных узелков селезенки животных контрольной и опытной групп не отличаются друг от друга (Рисунок 13). 76 Рисунок 12. Iba-1-позитивные клетки селезенки экспериментальных животных. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. А – селезенка животного контрольной группы. Б – селезенка животного из группы, получавшей питьевую воду с кремнием. 1 – красная пульпа, 2 – маргинальная зона лимфоидных узелков. 77 Рисунок 13. Iba-1-позитивные клетки селезенки экспериментальных животных. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. А – селезенка животного контрольной группы. Б – селезенка животного из группы, получавшей питьевую воду с кремнием. 1 – Iba-1-позитивные клетки маргинальной зоны белой пульпы, 2 – Iba1-позитивные клетки красной пульпы. 78 Видимое отсутствие отличий не подтверждается морфометрическими данными (Таблица 9). Таблица 9 Сравнительная характеристика Iba-1-позитивных клеток селезенки лабораторных крыс Локализация Показатели клеток Марги- Площадь клеток, мкм2 нальная ИСП мембраны, у.е. зона ИСП цитоплазмы, у.е. Контрольная группа Опытная группа 73,45±2,38* 102,81±0,79* 124,00±0,92** 62,01±1,8** 102,29±0,99* 121,99±1,02* Значимость различий p < 0,001 р=0,65 р=0,14 Красная Площадь клеток, мкм2 пульпа ИСП мембраны, у.е. ИСП цитоплазмы, у.е. 83,86±2,45 95,37±0,73 130,43±0,07 74,74±2,64 93,02±0,85 126,36±1,22 p < 0,05 p < 0,05 p < 0,05 * – различия с показателями клеток данной группы для красной пульпы статистически значимы, p < 0,001 ** – различия с показателями клеток данной группы для красной пульпы статистически значимы, p < 0,05 Для обеих групп Iba-1-позитивные клетки маргинальной зоны, по сравнению с клетками красной пульпы, меньше по размерам. Для обеих групп интенсивность светопропускания мембраны Iba-1-позитивных клеток в красной пульпе меньше, а цитоплазмы – больше. Это согласуется с литературными данными (Cesta M. F., 2006) о том, что макрофаги маргинальной зоны белой пульпы и макрофаги красной пульпы принадлежат к разным субпопуляциям. Сравнение Iba-1-позитивных клеток в контрольной и в опытной группе животных показывает, что в красной пульпе они статистически значимо отличаются по размеру, интенсивности светопропускания в мембране и в цитоплазме, а в маргинальной зоне – только по размеру (p < 0,001). При этом количество Iba-1позитивных клеток на 10000 мкм2 площади маргинальной зоны составляет 7,94±0,38 клеток для животных контрольной группы и 8,91±0,46 клеток для жи- 79 вотных опытной группы. Таким образом, поступление кремния с питьевой водой приводит к уменьшению средних размеров Iba-1-позитивных клеток как в красной пульпе селезенки, так и в маргинальной зоне, а также к уменьшению интенсивности светопропускания в цитоплазме и цитоплазматической мембране Iba-1позитивных клеток красной пульпы. Обращает на себя внимание то, что корреляционные связи между характеристиками Iba-1-позитивных клеток претерпевают определенные изменения. Корреляционные связи между площадями Iba-1-позитивных клеток и интенсивностями светопропускания цитоплазмы и цитоплазматической мембраны в них для разных зон селезенки представлены на рисунке 14. Ц-М 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 -0,10 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 М-П A Ц-П контроль опыт М-П Ц-М Ц-П Б Рисунок 14. Корреляционные связи между характеристиками Iba-1позитивных клеток селезенки. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. А – красная пульпа. Б – маргинальная зона белой пульпы. Так, в красной пульпе показатели корреляционной связи М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,11, 0,47 и 0,17, а для опытной – 0,15, 0,68 и 0,20 соответственно, то есть направление и сила связей не изменяются. В маргинальной зоне показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,31 и 0,36, 80 0,01 а для опытной –0,01, 0,42 и -0,04 соответственно. Слабая связь положительной направленности между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, наблюдаемая для контрольной группы, в опытной группе перестает проявляться. Происходит не только уменьшение абсолютных значений средних размеров Iba-1-позитивных клеток селезенки в маргинальной зоне и в красной пульпе, но и перераспределение клеток по размерам. С учетом метода сигмальных отклонений маргинальная зона красная пульпа были построены графики, отражающие это перераспределение (Рисунок 15). 22 опыт 65,3 12,9* контроль 69,7 опыт 18,4 контроль 17,5 0% 8,5 10% 14,1** 78,1 3,5 66,9* 20% малые 30% 40% средние 50% 13** 60% большие 70% 80% 90% 100% очень большие * – различия статистически значимы, p < 0,05, ** – различия статистически значимы, p < 0,001 Рисунок 15. Распределение по размерам Iba-1-позитивных клеток в функцииональных зонах селезенки. Анализ графиков показывает, во-первых, что распределение клеток по размерам для контрольных животных сопоставимо для маргинальной зоны белой пульпы и для красной пульпы. Во-вторых, изменения, наблюдаемые под воздействием водорастворимого соединения кремния в распределении клеток по разме- 81 рам, неодинаковы для красной пульпы и маргинальной зоны белой пульпы. При этом, как в маргинальной зоне, так и в красной пульпе снижается доля больших клеток, в маргинальной зоне увеличивается доля клеток среднего размера, а в красной пульпе увеличивается доля клеток малого размера. Таким образом, поступление кремния с питьевой водой приводит к уменьшению средних размеров Iba-1-позитивных клеток в красной пульпе селезенки и в маргинальной зоне белой пульпы, а также к уменьшению интенсивности светопропускания в цитоплазме и цитоплазматической мембране Iba-1-позитивных клеток красной пульпы. В красной пульпе и в маргинальной зоне белой пульпы также наблюдается значительное уменьшение доли Iba-1-позитивных клеток большого размера. 3.2.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки селезенки В красной пульпе селезенки животных обеих групп МНС-II-позитивные клетки, имеющие овально-округлую форму, располагаются вокруг или вдоль сосудов, а также скоплениями в местах образования новых лимфоидных узелков. Цитоплазма и цитоплазматическая мембрана этих клеток равномерно окрашены в коричневый цвет одного тона. Визуально МНС-II-позитивные клетки красной пульпы селезенки животных обеих групп не различаются между собой. В красной пульпе селезенки животных обеих групп встречаются единичные MHC-IIпозитивные макрофаги, подавляющее большинство Iba-1-позитивных макрофагов MHC-II-негативны. В лимфоидных узелках овально-округлые МНС-II-позитивные клетки имеют овально-округлую форму с некоторыми небольшими выростами, цитоплазма и цитоплазматическая мембрана этих клеток равномерно окрашены в коричневый цвет одного тона. В лимфоидных узелках селезенки животных опытной группы визуализируется большее количество МНС-II-позитивных клеток, однако, по дру- 82 гим признакам МНС-II-позитивные клетки селезенки животных обеих групп не различаются между собой. Морфометрия показала, что MHC-II-позитивные клетки в лимфоидных узелках селезенки крыс контрольной группы, при неизменной интенсивности светопропускания в мембране и в цитоплазме, имеют большую площадь по сравнению с таковыми красной пульпы (Таблица 10). Таблица 10 Сравнительная характеристика MHC-II-позитивных клеток селезенки лабораторных крыс Локализация Показатели Контрольная группа Опытная группа Значимость различий Лимфо- Площадь клеток, мкм2 идный ИСП мембраны, у.е. узелок ИСП цитоплазмы, у.е. 23,04±0,85* 22,40±0,86 88,70±1,16 86,78±0,92** 115,07±2,63 96,82±1,63* p=0,59 p=0,20 p < 0,001 Красная Площадь клеток, мкм2 пульпа ИСП мембраны, у.е. ИСП цитоплазмы, у.е. 20,86±0,54 90,25±0,85 110,02±1,41 p=0,90 p=0,43 p < 0,001 21,44±0,52 90,12±0,65 101,47±1,02 * – различия с показателями клеток данной группы для красной пульпы статистически значимы, p < 0,05 ** – различия с показателями клеток данной группы для красной пульпы статистически значимы, p < 0,001 MHC-II-позитивные клетки лимфоидных узелков и красной пульпы для каждой группы лабораторных крыс не отличаются по размеру, однако, они различаются по таким признакам, как интенсивность светопропускания в цитоплазме и цитоплазматической мембране. Сравнение признаков MHC-II-позитивных клеток в лимфоидных узелках в контрольной и в опытной группе не обнаруживает различий. Количество клеток на один узелок составляет для контрольной группы 51,08±4,80 клеток, а для опытной – 95,53±8,09 клеток (p < 0,001). MHC-II-позитивные клетки красной пульпы опытных и контрольных крыс отличаются только интенсивностью светопропускания цитоплазмы (p < 0,001). 83 Обращает на себя внимание изменение корреляционных связей между площадями MHC-II-позитивных клеток и интенсивностью светопропускания цитоплазмы и цитоплазматической мембраны в них для разных зон селезенки (Рисунок 16). Так, в белой пульпе показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,08, 0,24 и 0,18, а для опытной – -0,05, 0,63 и 0,12. В красной пульпе показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны: -0,21, 0,24 и 0,16, а для опытной: – 0,11, 0,62 и 0,21 соответственно. Для MHC-II-позитивных клеток лимфоидных узелков появляется положительная связь средней силы между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и цитоплазмы. Интересно, что точно такая же по направленности и силе связь появляется между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и цитоплазмы в MHC-II-позитивных клетках красной пульпы. Ц-М Ц-М 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 -0,20 М-П А 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 -0,20 -0,40 М-П Ц-П Ц-П Б контроль опыт Рисунок 16. Корреляционные связи между характеристиками MHC-IIпозитивных клеток. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. А – лимфоидный узелок. Б – красная пульпа. 84 С учетом метода сигмальных отклонений были построены графики, отра- белая пульпа красная пульпа жающие распределение клеток по размерам (Рисунок 17). опыт 19,32 контроль 17,57 59,61 66,22 24,32 опыт 0% малые 12,16 66,21 17,7 контроль 13,73 9,47 64,5 20% средние 40% 16,1 60% большие 80% 100% очень большие Рисунок 17. Распределение по размерам MHC-II-позитивных клеток в функцииональных зонах селезенки. Анализ полученных графиков позволяет сделать заключение, что подавляющее большинство MHC-II-позитивных клеток в белой и красной пульпе животных контрольной группы имеет средние размеры. Распределение клеток по размерам в белой и красной пульпе сопоставимо для контрольных и опытных животных. Следовательно, поступление с питьевой водой кремния не оказывает существенного влияния на распределение по размерам MHC-II-позитивных клеток в селезенке. Таким образом, поступление с питьевой водой кремния отражается на увеличении количества МНС-II-позитивных клеток в лимфоидных узелках селезенки в 1,9 раза (p < 0,001) без изменения их размеров. 85 3.2.5. Гистаминсодержащие структуры селезенки Лимфоидные узелки в препаратах селезенки, обработанных по методу Кросса, можно отличить по зелено-изумрудному приглушенному свечению на фоне неравномерного зелено-желто-оранжевого свечения красной пульпы (Рисунок 18). Синусоиды представлены в виде слабо люминесцирующих ободков. В лимфоидных узелках различима желтовато-зеленого цвета эксцентрично расположенная узелковая артериола. В селезенке как контрольных, так и опытных животных различаются следующие гистаминсодежащие структуры: гранулосодержащие клетки, располагающиеся внутри лимфоидных узелков, гранулосодержащие клетки синусоидов белой пульпы, гранулосодержащие клетки красной пульпы (Рисунок 19). Внутри лимфоидных узелков видны скопления ярко-желтых, с лимонным оттенком, люминесцирующих гранулосодержащих клеток с четко различимыми отдельными яркими светлыми гранулами. Цвет гранул беловато-желтый, яркожелтый, лимонно-желтый. Формы клеток разнообразны – округлые, вытянутые, неправильной формы. Люминесцирующие клетки синусоидов белой пульпы располагаются выраженными «цепочками» окружают лимфоидные узелки, которые имеют померанцевый оттенок. Они тусклые, вытянуто-овальной формы, равномерного свечения. Люминесцирующие клетки красной пульпы светятся менее ярко, чем люминесцирующие клетки внутри лимфоидных узелков, имеют померанцевокирпичный оттенок, содержат в себе желто-оранжевые гранулы. Форма люминесцирующих гранулосодержащих клеток красной пульпы неправильная, «лапчатая». 86 Рисунок 18. Лимфоидные узелки селезенки животного опытной группы. Метод Cross-Ewen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-1. Об. 4. Ок. 10. 1 –лимфоидный узелок с люминесцирующими клетками. 2 – «пустой» лимфоидный узелок. 3 – люминесцирующие клетки красной пульпы. Рисунок 19. Лимфоидный узелок селезенки животного опытной группы. Метод Cross-Ewen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-1. Об. 20. Ок. 10. 1 – центральная артериола, 2 – люминесцирующие клетки лимфоидного узелка, 3 – люминесцирующие клетки синусоида белой пульпы, 4 – люминесцирующие клетки красной пульпы. 87 Совокупность признаков позволяет выделить два вида лимфоидных узелков. Лимфоидные узелки первого вида не содержат люминесцирующих структур, из-за чего выглядят «пустыми», центральная артериола в них не всегда визуализируется. Лимфоидные узелки второго вида содержат люминесцирующие гранулосодержащие клетки, компактно располагающиеся в центре узелка. Люминесценция этих клеток визуально самая яркая, цвет люминесценции колеблется от беловатожелтого до лимонно-желтого. В этих узелках четко выражена центральная артериола, по периферии узелка расположены менее яркие померанцевые клетки синусоида. В гистаминсодержащих люминесцирующих структурах селезенки лабораторных крыс обеих групп была измерена интенсивность люминесценции гистамина (Таблица 11). Таблица 11 Интенсивность люминесценции гистамина в структурах селезенки экспериментальных животных (М±m, у.е.) Гистаминсодержащие клетки Контрольная Опытная Значимость в морфо-функциональных группа группа различий зонах селезенки Клетки внутри лимфоидного 20,96±3,05 22,57±1,75 p=0,66 узелка Микроокружение клеток 7,08±1,60 10,07±0,98 p=0,16 внутри лимфоидного узелка Клетки синусоидов белой 14,54±1,95 18,22±0,95 p=0,14 пульпы Микроокружение клеток си7,94±1,63 11,07±0,96 p=0,14 нусоидов белой пульпы Клетки красной пульпы 23,74±2,97 21,68±1,31 p=0,55 Микроокружение клеток 10,98±1,93 12,38±0,94 p=0,53 красной пульпы Клетки периартериолярной 7,59±1,84 9,65±0,87 p=0,35 (Т-зависимой) зоны 88 Отметим, что для животных обеих групп наибольшая интенсивность люминесценции гистамина наблюдается в люминесцирующих клетках внутри лимфоидных узелков и в люминесцирующих клетках красной пульпы. Интенсивность люминесценции гистамина в микроокружении клеток синусоидов белой пульпы, в микроокружении клеток внутри лимфоидных узелков и в микроокружении клеток красной пульпы сопоставима с интенсивностью люминесценции в периартериолярной зоне лимфоидных узелков селезенки для животных как контрольной, так и опытной групп. Обратим внимание на некоторую тенденцию к увеличению интенсивности люминесценции гистамина в гистаминсодержащих клетках селезенки и их микроокружении для животных опытной группы, однако наблюдаемые различия не являются статистически значимыми ни для одной популяции клеток. Поскольку гистаминсодержащие структуры селезенки могут быть как аминопоглощающими, так и аминопродуцирующими (Гурьянова Е. А., 2011), имеют значение не только абсолютные показатели интенсивности люминесценции гистамина, но и относительные. Соотношение интенсивности люминесценции гистамина между микроокружением гистаминсодержащих структур селезенки и этими структурами контрольных и опытных животных, выраженное в процентах, составило для клеток лимфоидного узелка 34,40±3,12% и 46,29±2,49% соответственно (p < 0,05), для клеток синусоидов белой пульпы 53,21±4,42% и 61,76±3,18% соответственно, для клеток красной пульпы 46,94±2,93% и 58,65±2,11% соответственно (p < 0,001). Таким образом, наблюдается статистически значимое увеличение интенсивности люминесценции гистамина в микроокружении люминесцирующих клеток лимфоидных узелков селезенки и клеток красной пульпы. 89 3.2.6. Пролиферативные процессы в герминативных центрах лимфоидных узелков селезенки В препаратах селезенки, полученных при использовании маркера (ядерного антигена) клеточной пролиферации PCNA, в лимфоидных узелках выявляются клетки, содержащие циклин А, белок, функционирующий в S-фазе клеточного цикла как кофактор ДНК-полимеразы, связанный с синтезом и репарацией ДНК. Эти клетки светятся синим и красным цветом. Клетки, которые не содержат этого белка, флуоресцируют только синим цветом. Герминативные центры в основном представлены PCNA-позитивными клетками, в маргинальной зоне белой пульпы PCNA-позитивные клетки представлены в меньших количествах. Сопоставление серийных срезов селезенки животных контрольной и опытной групп подтверждает, что пролиферативные процессы, выявляемые с помощью маркера PCNA, занимают всю площадь герминативных центров лимфоидных узелков, различаемых при окраске срезов гематоксилин-эозином (Рисунок 20, 21). Индекс пролиферации в герминативных центрах лимфоидных узелков селезенки для метода, выявляющего маркер PCNA, составил для контрольной группы животных – 78,54±2,22%, для опытной – 74,13±1,68%. При изучении препаратов селезенки, полученных при использовании маркера клеточной пролиферации Ki-67, в селезенке выявляются клетки, цитоплазма которых окрашена в коричневый цвет разной степени интенсивности. Такие клетки располагаются преимущественно в герминативных центрах лимфоидных узелков, единичные Ki-67-позитивные клетки встречаются в маргинальной зоне. Индекс пролиферации в герминативных центрах лимфоидных узелков селезенки, для метода, выявляющего маркер Ki-67, составил для контрольной группы животных 10,15±0,08%, для опытной – 10,98±0,07%. 90 Рисунок 20. Морфологическая параллель. Лимфоидные узелки селезенки животного, получавшего кремний с питьевой водой. А– двойной иммунофлуоресцентный метод, выявляющий белок PCNA. Микроскоп Nikon Eclipse 50I . Об. 10. Ок. 10. Б – окраска гематоксилин-эозином. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. 91 Рисунок 21. Лимфоидный узелок селезенки. Иммунофлюоресцирующий метод для выявления PCNA. Микроскоп Nikon Eclipse 50I. Об. 10 Ок. 20. А – животное контрольной группы. Б – животное из группы, получавшей питьевую воду с кремнием. 92 Таким образом, можно заключить, что у животных, получавших с питьевой водой соединение кремния, в селезенке происходит увеличение общей площади, занятой пролиферативными процессами без изменения интенсивности этих процессов. Резюме: В селезенке лабораторных крыс, получавших водорастворимое соединение кремния, происходят морфологические изменения лимфоидных узелков, связанные, в первую очередь, с увеличением площадей герминативных центров без изменения в этих центрах интенсивности пролиферативных процессов. Также наблюдается уменьшение абсолютных значений средних размеров Iba-1-позитивных клеток селезенки в маргинальной зоне белой пульпы и в красной пульпе. В лимфоидных узелках происходит увеличение количества МНС-IIпозитивных клеток. Наблюдается повышение соотношения интенсивности люминесценции гистамина между клетками лимфоидных узелков и гистаминсодер- жащими клетками красной пульпы и их микроокружением. 3.3. С ТРУКТУРНО-ФУНЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЙЕРОВЫХ БЛЯШЕК (ПОДСЛИЗИСТЫХ АГРЕГИРОВАННЫХ ЛИМФОИДНЫХ УЗЕЛКОВ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА) ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС ПРИ ПОСТУПЛЕНИИ КРЕМНИЯ С ПИТЬЕВОЙ ВОДОЙ 3.3.1. Общеморфологическая характеристика пейеровых бляшек Макропрепараты пейеровых бляшек животных контрольной и опытной групп существенно отличаются друг от друга. В увеличенных, более выпуклых, пейеровых бляшках животных опытной группы, напоминающих тутовые ягоды, можно различить четко выделить отдельные лимфоидные узелки (Рисунок 22). 93 При окраске срезов лимфоидных узелков пейеровых бляшек гематоксилиномэозином в органах контрольных, и опытных животных различимы лимфоидные узелки с выраженными герминативными центрами, имеющими более светлую окраску. Обращает на себя внимание увеличение герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек у животных, получавших с питьевой водой соединение кремния (Рисунок 23). Визуальные изменения как макро-, так и микропрепаратов пейеровых бляшек полностью подтверждаются морфометрическими данными (Таблица 12). Таблица 12 Морфометрические показатели лимфоидных узелков пейеровых бляшек лабораторных крыс (М±m) Морфометрические показатели лимфоидных узелков пейеровых бляшек Высота лимфоидного узелка, мкм Длина лимфоидного узелка, мкм Расстояние между герминативными центрами, мкм Площадь герминативного 4 центра, х 10 мкм2 Общая площадь лимфоидного узелка, х 104 мкм2 Соотношение площади герминативного центра и общей площади лимфоидного узелка, % Контрольная группа Опытная группа Значимость различий 598,26±13,02 738,06±26,38 р < 0,001 814,93±15,85 932,46±27,05 р < 0,001 321,55±11,65 386,41±12,95 p=0,09 13,39±0,52 20,68±1,19 р < 0,001 38,16±11,68 54,49±2,68 p=0,32 0,35±0,01 0,38±0,01 р < 0,001 Из приведенной таблицы видно, что у животных опытной группы увеличивается средняя высота и длина лимфоидного узелка, расстояние между герминативными центрами, что отражается на средней площади лимфоидных узелков. Средняя площадь герминативного центра лимфоидного узелка у животных опытной группы увеличивается в 1,5 раза (р < 0,001). 94 Рисунок 22. Пейеровы бляшки подвздошной кишки лабораторных крыс. Макропрепараты. А – пейерова бляшка животного контрольной группы. Б – пейерова бляшка животного опытной группы. Рисунок 23. Лимфоидные узелки пейеровых бляшек. Окр. Гематоксилинэозин и альциановый синий. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 4. Ок. 10. А – животное контрольной группы. Б – животное опытной группы. 95 Таким образом, употребление с питьевой водой кремния приводит к макрои микроморфологическим изменениям лимфоидных узелков пейеровых бляшек, которые заключаются в увеличении их размеров, главным образом, увеличении площадей герминативных центров в лимфоидных узелках. 3.3.2. Тучные клетки пейеровых бляшек При исследовании препаратов пейеровых бляшек, окрашенных толуидиновым синим по методу Унна, нами не было обнаружено тучных клеток ни в одной группе экспериментальных животных. 3.3.3. Моноцитарно-макрофагальные (Iba-1-позитивные) клетки пейеровых бляшек При постановке реакции на моноцитарно-макрофагальные (Iba-1- позитивные) клетки в срезах пейеровых бляшек животных как контрольной, так и опытной группы данные структуры наблюдаются во всех их морфо- функциональных зонах. Поскольку под воздействием соединения кремния, поступающим с питьевой водой, наибольшему влиянию подвержены герминативные центры, мы сосредоточили внимание на Iba-1-позитивных структурах в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек (Рисунок 24). В герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек крыс контрольной группы Iba-1-позитивные структуры в основном представлены фагоцитирующими макрофагами, содержащими внутри апоптотические тельца. Цитоплазматическая мембрана этих макрофагов имеет коричневый цвет, их цитоплазма не окрашена. У крыс опытной группы Iba-1-позитивные структуры герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек представлены как фагоцитирующими макрофагами, содержащими внутри апоптотические тельца, так и большими клетками неправильной формы. 96 Рисунок 24. Iba-1-позитивные клетки в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10.А – контроль. Б – опыт. 1 – макрофаги с апоптотическими тельцами. 97 Цитоплазматическая мембрана Iba-1-позитивных структур имеет коричневый цвет, их цитоплазма либо не окрашена, либо окрашена в светло-коричневый цвет. Визуально фагоцитирующие макрофаги с апоптотическими тельцами меньше макрофагов, наблюдаемых у животных контрольной группы, по размерам. Наблюдаемая картина подтверждается статистической значимостью различий в средних размерах Iba-1-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек. Так, для животных контрольной группы этот показатель составил 222,80±16,87 мкм2, а для животных опытной группы – 173,27±16,57мкм2 (р < 0,05). При неизменной интенсивности светопропускания цитоплазматической мембраны (109,25±1,3 у. е. для клеток животных контрольной группы и 108,91±1,6 у. е. для клеток животных опытной группы) наблюдается некоторое уменьшение плотности светопропускания цитоплазмы (143,06±1,89 у. е. для клеток животных контрольной группы и 137,90±1,59 у. е. для клеток животных опытной группы, р < 0,05). Кроме того, имеется статистическая значимость различий в количестве Iba1-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек на поле зрения. Для животных контрольной группы это число составило 17,71±0,32, а для животных опытной группы – 24,17±0,03 (р < 0, 001). Обращает на себя внимание то, что претерпевают определенные изменения корреляционные связи между площадями Iba-1-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек и интенсивностями светопропускания цитоплазмы и цитоплазматической мембраны в них (Рисунок 25). Так, показатели М-П, Ц-М и Ц-П для контрольной группы равны 0,23, 0,48 и 0,15, а для опытной – 0,37, 0,52 и 0,62 соответственно. У лабораторных крыс, получавших с питьевой водой соединение кремния, наблюдается появление связи средней силы положительной направленности между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. 98 Ц-М 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 М-П Ц-П контроль опыт Рисунок 25. Корреляционные связи между характеристиками Iba-1позитивных клеток герминативных зон лимфоидных узелков пейеровых бляшек. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. Таким образом, при воздействии соединения кремния, поступающего с питьевой водой, в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек лабораторных крыс параллельно с увеличением количества Iba-1-позитивных клеток происходит уменьшение их средней площади и изменение интенсивности светопропускания в их цитоплазме. 3.3.4. Антигенпрезентирующие (MHC-II-позитивные) клетки пейеровых бляшек При постановке реакции на МНС-II-позитивные клетки в срезах пейеровых бляшек животных как контрольной, так и опытной группы данные структуры наблюдаются во всех морфо-функциональных зонах: в герминативных центрах, в межфолликулярных зонах, а также по краю лимфоидных узелков, прилежащем к соединительнотканной оболочке тонкой кишки. Морфометрия не выявила различий в изменениях MНС-II-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных узелков – их средние размеры, интен- 99 сивность светопропускания цитоплазмы и цитоплазматической мембраны не отличаются для контрольной и опытной групп животных (Таблица 13). Таблица 13 Характеристика MНС-II-позитивных клеток пейеровых бляшек лабораторных крыс (М±m) Морфофункциональная зона Показатели Площадь клеток, мкм2 Гермина- ИСП мембраны, у. е. тивный ИСП цитоплазмы, у. е. центр Количество клеток в поле лимфозрения, шт идного Доля макрофагов с апопузелка тотическими тельцами, % Площадь клеток, мкм2 ИСП мембраны, у. е. Межузелковая ИСП цитоплазмы, у. е. зона Количество клеток в поле зрения, шт Контрольная группа Опытная группа Значимость различий 19,11±0,7 99,36±2,01 96,29±3,11 19,96±0,87 95,93±0,98 95,66±2,82 р=0,73 р=0,58 р=0,94 2,43±0,16 12,87±0,60 р < 0,001 11,9±0,02 35,04±0,03 р=0,05 17,98±0,99 96,87±1,13 25,69±0,98 97,81±0,98 р < 0,001 р=0,53 97,20±1,7 101,81±1,75 р=0,06 25,00±1,24 38,6±3,33 р < 0,05 Было выявлено увеличение средних размеров MНС-II-позитивных клеток межузелковых зон в 1,3 раза (р < 0,05). Интенсивность светопропускания цитоплазматической мембраны не отличается для контрольной и опытной групп животных, плотность светопропускания цитоплазмы приблизительно одинакова для клеток животных обеих групп. Количество клеток MНС-II-позитивных клеток межузелковых зон в поле зрения при увеличении х400 в группе опытных животных увеличивается в 1,3 раза (p < 0,05). Обращает на себя внимание, что корреляционные связи между площадями MHC-II-позитивных клеток и интенсивностями светопропускания цитоплазмы и цитоплазматической мембраны в них для разных зон пейеровых бляшек претерпевают определенные изменения (Рисунок 26). 100 Ц-М Ц-М 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 -0,20 -0,40 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 -0,20 А М-П Ц-П контроль Б М-П Ц-П опыт Рисунок 26. Корреляционные связи между характеристиками MHC-IIпозитивных клеток пейеровых бляшек. А – герминативные центры лимфоидных узелков. Б – межузелковые зоны. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. Так, для герминативных центров лимфоидных узелков показатели М-П, ЦМ и Ц-П для контрольной группы равны 0,21, 0,78 и 0,49, а для опытной – -0,02, 0,50 и 0,30. В межфолликулярных зонах пейеровых бляшех показатели М-П, ЦМ и Ц-П для контрольной группы равны: -0,12, 0,53 и -0,04, а для опытной – 0,23, 0,61 и -0,04. В герминативных центрах сильная положительная связь между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и цитоплазмы ослабляется до связи средней силы. Таким образом, при поступлении с питьевой водой кремния в пейеровых бляшках лабораторных крыс происходит увеличение количества МНС-IIпозитивных клеток в герминативных центрах лимфоидных узелков и межузелковых зонах, а также увеличение их размеров в межузелковых зонах. 101 3.3.5. Гистаминсодержащие структуры пейеровых бляшек В пейеровых бляшках тонкого отдела кишечника лабораторных крыс контрольной и опытной групп определяются лимфоидные узелки, в которых четко различимы герминативные зоны – они имеют более приглушенное свечение, чем другие морфо-функциональные зоны (Рисунок 27, 28). Люминесцирующие структуры: гранулярные люминесцирующие клетки герминативных центров лимфоидных узелков, люминесцирующие клетки лимфатических синусов, люминесцирующие клетки межузелковой зоны. Лимфоидные узелки пейеровых бляшек контрольных животных имеют округлую форму и обладают слабым свечением. В центре лимфоидного узелка различима менее яркая герминативная зона, имеющая округлые очертания. В герминативной зоне расположены люминесцирующие клетки лимонно-желтого цвета, они могут располагаться группами по нескольку клеток. Внутри этих клеток четко определяются светящиеся желтобеловатые гранулы. В межузелковой зоне пейеровых бляшек выявляются люминесцирующие клетки, которые имеют меньший размер и светятся менее ярко. Клетки лимфатических синусов пейеровых бляшек имеют разнообразные формы, в них нет скоплений ярких гранул, свечение их приглушенное и имеет желтооранжевый оттенок. Лимфоидные узелки пейеровых бляшек лабораторных крыс, употреблявших питьевую воду с добавлением соединения кремния, имеют округлую форму и обладают слабым свечением. В центре узелка различима менее яркая герминативная зона, имеющая вытянутую либо шаровидную форму. В герминативной зоне расположены юминесцирующие клетки лимонно-желтого цвета, которые могут располагаться группами по нескольку клеток. Внутри этих клеток четко определяются светящиеся желто-беловатые гранулы. Цвет свечения колеблется от беловатолимонного до ярко-желтого. Вокруг самых ярких клеток с неразличимыми гранулами виден светложелтый ободок диффузного свечения. 102 Рисунок 27. Морфологическая параллель. Лимфоидный узелок пейеровой бляшки животного опытной группы. А. Гематоксилин-эозин. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 4. Ок. 10. Б. Метод Cross-Ewen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-2. Об. 4. Ок. 10. Рисунок 28. Лимфоидный узелок пейеровой бляшки животного опытной группы. Метод Cross-Ewen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-2. Об. 10. Ок. 10. 103 В межузелковой зоне люминесцирующие клетки имеют менее выраженное беловато-желтое свечение. Клетки лимфатических синусов имеют разнообразные формы, в них нет скоплений ярких гранул, свечение их приглушенное с желтооранжевым оттенком. Сравнительные показатели интенсивности люминесценции гистамина в гистаминсодержащих клетках пейеровых бляшек и их микроокружении представлены в таблице 14. Таблица 14 Интенсивность люминесценции гистамина в структурах пейеровых бляшек экспериментальных животных (М±m, у. е.) Морфо-функциональная зона Клетки герминативных центров лимфоидных узелков Микроокружение клеток герминативных центров лимфоидных узелков Клетки лимфатических синусов Микроокружение клеток лимфатических синусов Клетки межузелковой зоны Микроокружение клеток межузелковой зоны Контрольная группа Опытная группа Значимость различий 21,21±1,90 25,9±1,44 р=0,09 6,93±0,87 8,48±1,02 р=0,29 19,25±1,14 22,06 ±2,69 р=0,39 7,26±0,78 10,09±1,41 р=0,13 10,37±0,58 16,02±1,82 p < 0,05 4,94±0,21 8,22±0,52 p < 0,05 Можно отметить, что наблюдается существенное увеличение интенсивности люминесценции гистамина в люминесцирующих клетках межузелковых зон (в 1,5 раза, p < 0,05) и в микроокружении этих люминесцирующих клеток (в 1,6 раза, p < 0,05) для животных опытной группы. Отношение интенсивности люминесценции гистамина между микроокружением гистаминсодежащих структур и гистаминсодержащими структурами пейеровых бляшек, выраженное в процентах, в контрольной группе составляет 0,34±0,03% для клеток герминативных центров, 0,44±0,03% для клеток лимфатических синусов и 0,46±0,03% для клеток межузелковой зоны, в опытной группе 104 эти значения равны 0,36±0,05%, 0,48±0,02% и 0,52±0,02% соответственно, причем различия с контрольной группой для межузелковых клеток являются статистически значимыми (р < 0,05). Таким образом, в люминесцирующих клетках межузелковой зоны пейеровых бляшек лабораторных крыс, получавших кремний с питьевой водой, и их микроокружении происходит как статистически значимое повышение интенсивности люминесценции гистамина, так и статистически значимое повышение соотношения интенсивности люминесценции гистамина между вышеперечисленными структурами. 3.3.6. Пролиферативные процессы в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек В препаратах пейеровых бляшек, полученных при использовании маркера (ядерного антигена) клеточной пролиферации PCNA, в лимфоидных фолликулах выявляются клетки, содержащие циклин А, белок, функционирующий в S-фазе клеточного цикла как кофактор ДНК-полимеразы, связанный с синтезом и репарацией ДНК. Эти клетки светятся и синим, и красный цветом. Клетки, которые не содержат этого белка, флуоресцируют только синим цветом. Герминативные центры в основном представлены PCNA-позитивными клетками, единичные PCNAпозитивные клетки располагаются в межузелковой зоне. Сопоставление серийных срезов пейеровых бляшек животных контрольной и опытной групп подтверждает, что пролиферативные процессы, выявляемые с помощью маркера PCNA, занимают всю площадь герминативных центров лимфоидных узелков при окраске срезов гематоксилин-эозином (Рисунок 29). 105 Рисунок 29. Морфологическая параллель. Лимфоидный узелок пейеровой бляшки тонкого кишечника животного контрольной группы. А – окраска гематоксилин-эозином и альциановым синим. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. Б – двойной иммунофлуоресцентный метод PCNA. Микроскоп Nikon Eclipse 50I. Об. 10. Ок. 10. 106 Индекс пролиферации для метода, выявляющего маркер PCNA, составил для контрольной группы животных – 81,56±2,09%, для опытной – 88,29±0,08% (р < 0,05). Индекс пролиферации для метода, выявляющего маркер Ki-67, составил для контрольной группы животных 21,20±0,02%, для опытной – 28,31±0,11% (р < 0,05). Таким образом, при использовании двух маркеров пролиферации, нами найдено статистически значимое увеличение показателей, отражающих степень процессов пролиферации в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек при поступлении с питьевой водой соединения кремния. Резюме: Выявлено увеличение площадей герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек с возрастанием в них количества как Iba-1-позитивных клеток, параллельно с уменьшением их размеров, так и MHC-II-позитивных клеток при поступлении кремния с питьевой водой в организм лабораторных крыс. При этом в межузелковой зоне отмечено увеличение количества и размеров MHCII-позитивных клеток, что сопровождается значительным повышением соотношения интенсивности люминесценции гистамина между гистаминсодержащими клетками межузелковых зон и их микроокружением. 107 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В дольках тимуса лабораторных крыс при поступлении с питьевой водой соединения кремния, происходит изменение морфологии тимусной дольки, которая заключается в перераспределении мозгового вещества: у животных опытной группы наблюдается превалирование долек, в которых мозговое вещество располагается фрагментарно (70,3% против 47,8% в контрольной группе, p < 0,05). Расположение мозгового вещества долек тимуса небольшими «островками» по периферии дольки было расценено как инверсия мозгового вещества долек тимуса в корковое (Сергеева В. Е., Гордон Д. С. (1992). Появление «лапчатой» формы мозгового вещества долек тимуса было замечено Б. М. Гордоном (2000) в первые минуты после введения крысам противокоревого гамма-глобулина, а также Л. Ю. Ильиной (2001) после введения крысам человеческой эритроцитарной массы в качестве стимулятора клеточного иммунитета, и при введении циклофосфана в качестве супрессора гуморального иммунитета. В литературе имеются сообщения, что поступление диоксида кремния приводит к стимуляции Th1-зависимого (клеточного) ответа (Van Ziverden M. et al., 2000, Davis G. S. et al., 2001, Weissman D. N. et al., 2001). Происходит незначительное увеличение общей площади долек за счет увеличения площади коркового вещества при статистически значимом увеличении (p < 0,05) в 1,3 раза соотношения площади коркового к площади мозгового вещества в дольках тимуса (в контроле Sк.в./Sм.в. – 4,64, а в опыте – 5,93). Наши данные согласуются с результатами, касающимися морфологических изменений, полученные ранее И. М. Дьячковой (2011) и соавторами при сходных условиях постановки эксперимента, следовательно, конкретные морфологические изменения, происходящие в тимусе, являются результатом длительного поступления водорастворимого соединения кремния с питьевой водой ad libitum. 108 По имеющимся данным, Iba1-позитивными являются как макрофаги, так и дендритные клетки (Ahmed Z. et al., 2007). Макрофаги обнаруживаются во всех зонах тимуса, располагаясь среди лимфоидных клеток (Hoefsmit Е. С. et al., 1980; Ginaldi L. et al., 1999). При изучении роли макрофагов тимуса человека выявлено, что в корковом веществе макрофаги представлены крупными клетками с небольшими отростками, интенсивной иммуногистохимической-реакцией (Стельмах И. А., Беловешкин А. Г, 2011). Установлено, что CD68-положительные макрофаги в паренхиме тимуса человека располагаются как в корковом, так и мозговом веществе, с более высокой плотностью распределения на корково-медуллярной границе (Луговцова П. А и соавт., 2012). Подтипы тимусных макрофагов у крыс описаны Varas V. A. и соавт. (1995). Бипотентные предшественники макрофагов способны при созревании образовывать две популяции – ED1+ и ED2+. Популяция ED1+ представлена клетками округлой формы, фагоцитирующими и способными к экспрессии MHC-II, преимущественно располагающимися в мозговом веществе и на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. Причем, чем больше фагоцитарная активность, тем выше степень экспрессии MHC-II. Эти клетки принимают непосредственное участие в отрицательной селекции Т-лимфоцитов. Популяция ED2+ клеток представлена макрофагами звездчатой, отростчатой формы, эти клетки располагаются в корковом веществе долек тимуса, взаимодейтсвуя с незрелыми Т-лимфоцитами. Интересно, что нефагоцитирующие ED1+ клетки способны к превращению в отростчатые ED2+. В тимусе животных, получавших кремний, значительно увеличилась средняя площадь Iba-1-позитивных клеток на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. Увеличение площади макрофагов расценивают как свидетельство увеличения их метаболической активности (Федорова Н. П., 2009). Таким образом, увеличение площади макрофагов на границе коркового и мозгового вещества 109 долек тимуса может свидетельствовать об усилении функций, выполняемых этими клетками – фагоцитоза и антигепрезентации. Иммунореактивность макрофагов напрямую зависит от белка Iba-1. Распределенный в цитоплазме, при активации макрофагов он перемещается в образующиеся мембранные складки, принимая участие в реорганизации актинового цитоскелета, особенно при индуцированном фагоцитозе (Szakal A. K. et al. 1989; Ohsawa K. et al., 2004; Imai Y., Kohsaka S., 2002). На цитоплазматической мембране Iba-1 позитивных клеток в корковом веществе долек тимуса крыс, получавших кремний с питьевой водой, наблюдается снижение интенсивности светопропускания по сравнению с контролем (90,58±1,14 у. е. и 105,50±1,29 у. е. соответственно, p < 0,001). На цитоплазматической мембране Iba-1 позитивных клеток на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса крыс, получавших кремний с питьевой водой, также наблюдается снижение интенсивности светопропускания по сравнению с контролем (90,56±1,12 у. е. и 94,23±0,68 у. е. соответственно, p < 0,05). Известно, что величина интенсивности светопропускания находится в обратной зависимости от количества на мембране рецепторов (Автандилов Г. Г., 1990), что косвенным образом свидетельствует об увеличении количества белка Iba-1 в мембранных складках. Кроме того, исчезновение положительной корреляционной связи между интенсивностью пропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью пропускания цитоплазмы в макрофагах тимуса (коркового вещества долек тимуса и на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса) также может быть расценено как следствие перемещения белка Iba-1 из цитоплазмы в складки цитоплазматической мембраны. Следовательно, при поступлении кремния с питьевой водой, в пользу усиления функциональной активности макрофагов на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса, расширяющей их адаптационные возможности, свидетельствуют как изменения их морфологических характеристик (увеличение площади клеток), так и перераспределение в них белка Iba-1, 110 принимающего участие в их активации. Сопоставление результатов обработки срезов тимуса гистохимическими маркерами белков МНС-II и Iba-1 показывает, что популяция МНС-II позитивных клеток не столь многочисленна, как популяция Iba-1 позитивных клеток. Совпадение топографического расположения клеток обоих типов наблюдается на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса, причем, если для метода, выявляющего белок Iba-1, визуализируется большое количество клеток, то МНС-IIпозитивные клетки располагаются в виде четкой линии, отграничивающей корковое вещество долек тимуса от мозгового. Совсем недавно (Студеникина Т. М., Беловешкин А. Г., 2011) было установлено, что в тимусе человека дендритные клетки имеют максимальную плотность расположения на кортико-медуллярной границе и возле телец Гассаля. При этом они могут иметь как округлую форму без отростков, так и неправильную отростчатую, что отражает различные стадии их дифференцировки. Кроме того, известно, что дендритные клетки, имеющие на своей поверхности антигены МНС-II, локализуются на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса и в мозговом слое тимуса и принимают участие в отрицательной селекции Т-лимфоцитов, вызывая их апоптоз (Ярилин А. А. и соавт., 1991, Сарилова И. Л., 2009, Артемьева И. Л., Сергеева В. Е., 2012). Увеличение количества этих клеток на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса у животных, получавших с питьевой водой кремний, свидетельствует об усилении отрицательной селекции в тимусе. При поступлении с питьевой водой соединения кремния количество MHCII-позитивных клеток на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса увеличивается в 1,3 раза на 100 мкм длины границы между корковым и мозговым веществом (p < 0,05). Средняя площадь MHC-II-позитивных клеток тимуса на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса составила 30,23±2,13 мкм2 для контрольной группы и 35,58±1,94 мкм2 для опытной группы (p < 0,05). 111 Увеличение количества и размеров МНС-II-позитивных клеток на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса позволяет предполагать, что происходит активация дендритных клеток и усиление отрицательной селекции в тимусе, что в итоге сказывается на изменении функциональной активности макрофагов на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса (увеличением их размеров и перераспределением белка Iba-1 в их цитоплазме). В экспериментах было показано, что наночастицы как диоксида кремния, так и кристаллического кремния, оказывают сильное влияние на статус активации дендритных клеток кишечника мышей – в них увеличивается экспрессия MHC-II, CD80, CD86 (Winter A.M. et al., 2011). Дьячковой И. М. и Смородченко А. Т. (2012) в структурах тимуса были исследованы каспаз-9-позитивные клетки, количество которых находится в обратной зависимости от выраженности апоптотических процессов. Интересно отметить, что после употребления животными питьевой воды с метасиликатом натрия у них наблюдается тенденция к уменьшению количества этих клеток на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. Таким образом, количество каспаз9 и MHC-II- позитивных клеток с разных сторон характеризует одни и те же процессы, что делает весомым предположение об усилении апоптотических процессов, протекающих на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. Гистаминсодержащие люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества долек тимуса, судя по характеру их распределения, имеют моноцитарномакрофагальное происхождение. В 2001 году Гордон Д.С. и соавторы идентифицировали гистаминсодержащие люминесцирующие гранулярные клетки на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса с дендритными макрофагами, однако, мы можем с уверенностью говорить о том, что МНС-II-позитивные клетки на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса относятся к лимфоидному ряду, а не к миелоидному, поскольку не наблюдается морфологической идентичности Iba-1- и МНС-II-позитивных клеток. Согласно литературным дан- 112 ным, именно лимфоидные дендритные клетки принимают участие в отрицательной селекции в тимусе (Ахматова Н. К., Киселевский М. В., 2008; Lipscomb M. F. et al., 2002;). Гистаминовая реакция тимуса на В-зависимый антиген является механизмом формирования супрессии Т-иммунитета в ответ на стимуляцию В– зависимого иммунитета (Дюговская Л. А., Тимченко С. В., 1981). Это происходит потому, что гистамин, при участии дендритных клеток, переключает Т-хелперы с Тh1 на Тh2 путь (Mazzoni А. et al., 2003) и, напротив, в отсутствии гистамина дендритные клетки вырабатывают цитокины Тh1 профиля (Jelinek I. et al., 2006). Установлено, что гистамин увеличивает экспрессию CD86 незрелыми дендритными клетками, действуя через Н1- и Н2- рецепторы, при этом наблюдается дозозависимый эффект (Caron G. et al., 2001; Amaral M. M. et al., 2007). Дендритные клетки имеют и Н4 рецепторы, как и моноциты и натуральные киллеры (Damaj B. B. et al., 2006). Кроме того, гистамин увеличивает экспрессию МНС-II и индуцирует увеличение продукции IL-6, IL-8, незрелыми дендритными клетками (Caron G. et al., 2001). Известно, что важным депо гистамина являются тучные клетки, которые обнаруживаются практически во всех органах и располагаются в соединительной ткани. Благодаря секреции гистамина тучные клетки регулируют проницаемость сосудов, участвуют в поддержании биоаминного гомеостаза в ходе обмена веществ (Быков В. Л., 2000; Бережная Н. М. с соавт., 2003; Гусельникова В. В. и соавт., 2013). Тучные клетки принимают участие в процессах опухолевого роста (Лазарев А. Ф. и соавт., 2011), а также в развитии многих воспалительных и аутоиммунных заболеваний (Brown M. A., Hatfield J. K., 2012; Theoharides T. C. et al., 2012). Высказывается мнение, что на метахромазию, или степень связывания красителя с кислыми окончаниями гликозамингликана (COO или SO3H группами), влияет количество свободных самих кислых радикалов, количество сульфатных 113 групп, сила связи комплекса мукополисахарид – белок (в данном случае – гепарин – белок) (Пирс Э., 1962). Существует мнение, что при патологии любого генеза возможно замещение нормальной популяции тучных клеток незрелыми тучными клетками с совершенно другими цитофизиологическими признаками (Кондашевская М. В., 2010). Вполне вероятно, что уменьшение размеров тучных клеток при поступлении с питьевой водой кремния может быть косвенным свидетельством появления новой популяции. Повышение интенсивности люминесценции гистамина в структурах тимуса при поступлении кремния с питьевой водой можно связать с его высвобождением из тучных клеток. В пользу этого свидетельствуют высокая степень метахромазии обнаруженных клеток, показатель наличия в них высокосульфатированных гликозаминогликанов, в том числе и гепарина (Гордон Б. М., 2000). Из литературных данных известно, что содержание гепарина и гистамина в тучных клетках прямо пропорционально, и что гистамин способен выделяться из тучных клеток без их классической дегрануляции (Кондашевская М. В., 2010; Гусельникова В. В. и соавт., 2013; Rönnberg E. et al., 2012). Однако, не исключено, что высокая степень метахромазии обусловлена тем, что кремний способен ускорять синтез гликозаминогликанов, в том числе и гепарина. Это предположение подтверждается исследованием Дьячковой И. М. (2011), в котором тучные клетки тимуса животных, получавших питьевую воду с кремнием, окрашенные метиленовым и толуидиновым синим, имели более высокую степень метахромазии, чем тучные клетки животных контрольной группы. Обнаруженное нами увеличение интенсивности люминесценции гистамина в клетках на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса, и в их микроокружении, позволяет предположить, что поступление с питьевой водой кремния приводит к активации антигенпрезентирующих клеток, в данном случае, дендритных клеток лимфоидного ряда посредством гистамина, выделяемого из туч- 114 ных клеток, что, в свою очередь, отражается на функциональных свойствах макрофагов на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. В пользу выделения гистамина из тучных клеток свидетельствует также увеличение интенсивности его люминесценции в микроокружениях всех исследуемых нами тимусных структур. При воздействии факторов химической или биологической природы в селезенке наблюдается усиление пролиферации и дифференцировки клеток, увели- чение количества лимфоидных узелков с герминативными центрами или их слияние (Макалиш Т. П., 2013). При активации процессов миграции, пролиферации и дифференцировки иммуннокомпетентных клеток наблюдается морфологическая перестройка белой пульпы селезенки (Бахмет А. А., 2010). Кремнезем уменьшает способность макрофагов и нейтрофилов мышей к завершенному фагоцитозу, снижает их жизнеспособность (Allison A.C., D'A Hart P., 1968; Zimmermani et al., 1986; Голохваст К. С., Чайка В. В., 2011). Под воздействием диоксида кремния мыши, резистентные к микобактериям туберкулеза, становятся чувствительными к этому возбудителю, что объясняют появление под воздействием диоксида кремния новой популяции альвеолярных макрофагов (Pasula et al., 2009). Таким образом, обнаруженное нами уменьшение площади Iba1-позитивных клеток селезенки и перераспределение популяций этих клеток по размерам в красной пульпе и в маргинальной зоне белой пульпы может свидетельствовать о снижении их функциональных возможностей (Федорова Н. П., 2009) и возможном снижении их способности к завершенному фагоцитозу. У иммунизированных крыс клетки маргинальной зоны селезенки, по сравнению со слабым окрашиванием в контрольной группе животных, окрашиваются ярче, что предполагает увеличение Iba-1 в макрофагах маргинальной зоны во время иммунного ответа (Pashenkov M. et al., 2000). Мы наблюдали статистически значимое уменьшение интенсивности светопропускания цитоплазмы и цитоплазматической мембраны Iba-1-позитивных клеток красной пульпы, что косвенным образом 115 может свидетельствовать об увеличении в них белка Iba-1. Если при поступлении с питьевой водой кремния уменьшение площади макрофагов маргинальной зоны белой пульпы селезенки связано с уменьшением их функциональной активности, то, возможно, не исключается роль этих макрофагов, занимающих центральное место в очищении организма от апоптотических клеток для минимизации иммунной реакции на аутоантигены (McGaha T. L. et al., 2011), в формировании аутоиммунных заболеваний у людей из «кремневых» биогеохимических провинций. В селезенке при воздействии кремния, поступающего с питьевой водой, наблюдается увеличение количества тучных клеток, что позволяет предполагать об увеличении количества выделяемого ими гистамина. Полученные нами данные для контрольной группы животных полностью согласуются с имеющимися данными о видовых различиях тучных клеток селезенки грызунов: у крыс, в отличие от мышей, в селезенке тучные клетки при окраске толуидиновым синим по Унна не обнаруживаются (Винокур Л. И., 1991). В связи с этим характеристика тучноклеточной популяции селезенки при поступлении кремния представляет особенный интерес. Можно, пусть и с некоторым допущением, утверждать, что при поступлении кремния с питьевой водой в селезенке крыс увеличивается количество тучных клеток. По данным Wagner M. M. et al. (1984) при длительном интратрахеальном поступлении кремнийсодержащего соединения (асбеста), в легочной ткани количество тучных клеток возрастает в десятки раз. Гистамин, выделяемый тучными клетками, способствует превращению незрелых дендритных клеток в эффекторные дендритные клетки, стимулирующие созревание Т-хелперов Th2 посредством рецепторов H1 and H2 (Caron G. et al., 2001). Повышение содержания гистамина в люминесцирующих структурах селезенки наблюдалось при иммуномодуляции иглоукалыванием (Гурьянова Е. А. и соавт., 2011; Кроткова О. С. и соавт., 2014). Увеличение интенсивности люминесценции гистамина в микроокружении всех исследуемых нами структур селезенки позволяет считать тучные клетки одними из источников гистамина в селезенке. 116 Средняя площадь герминативных центров лимфоидных узелков селезенки составила 23407,19±1672,507мкм2 и 29323,71±2312,92 мкм2 соответственно, (p < 0,05), при этом количество антигенпрезентирующих клеток на один лимфоидный узелок селезенки составляет для контрольной группы 51,08±4,80 клеток, а для опытной – 95,53±8,09 клеток (p < 0,001), и в гистаминсодержащих клетках лимфоидных узелков селезенки возрастает интенсивность люминесценции гистамина, а площадь герминативных зон в лимфоидных узелках существенно увеличивается при неизменной площади узелка в целом. Следовательно, увеличение размеров герминативных центров в лимфоидных узелках селезенки можно связать с увеличением количества антигенпрезентирующих клеток и интенсивностью свечения в люминесцирующих клетках лимфоидных узелков селезенки и их микроокружении гистамина. Увеличение площади сечения герминативных центров, мантии и периартериальной зоны свидетельствует, при воздействии пирогенала, об увеличение числа клеток лимфоидного ряда (Кузин А. В. и соавт., 2004). Дендритные клетки селезенки и пейеровых бляшек являются ответственными за соотношение субпопуляций Т-хелперов (Grainger J. et al., 2010; Nepom G. T., 2012). Дендритные клетки пейеровых бляшек обладают более выраженной способностью к стимуляции Т-лимфоцитов по сравнению с дендритными клетками селезенки (Jung C., 2010). Показано, что не все популяции дендритных клеток лимфоузла являются зависимыми от гистамина тучных клеток, так, ответ плазмацитоидных дендритных клеток и дендритных клеток с фенотипом CD8+ зависит от гистамина, а ответ дендритных клеток с фенотипом CD11b+ не зависит (Dawicki W. et al., 2010). Гистамин, воздействуя через Н2 рецепторы, повышает селективный инфлюкс как плазмацитоидных, так и CD11b+ дендритных клеток в лимфоузле, но не клеточность в лимфоузле (Dawicki W. et al., 2010). Площадь герминативного центра лимфоидного узелка пейеровых бляшек у лабораторных крыс, получавших с питьевой водой кремний, значительно увели- 117 чивается (206861,6±11907,22 мкм2 и 133876,9±5264,19 мкм2 соответственно (p < 0,001). Количество МНС-II-позитивных клеток в межузелковых зонах пейеровых бляшек в поле зрения при увеличении х400 для животных контрольной группы оно составило в среднем 25,0±1,24 клетки, а для животных опытной группы – 38,6±3,33 (р<0,05). МНС-II-позитивные клетки в межузелковых зонах пейеровых бляшек крыс опытной группы имеют большую площадь по сравнению с таковыми крыс контрольной группы (25,69±0,98 мкм2 и 17,98±0,99 мкм2 соответственно, p<0,05). Известно, что межузелковая зона пейеровых бляшек является Тзависимой (Гусейнов Т. С., Гусейнова С. Т, 2012). Количество МНС-II-позитивных клеток в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек в поле зрения при увеличении х400 для животных контрольной группы составило в среднем 2,43±0,16 клетки, а для животных опытной группы – 12,87± 0,6 (р<0,001), причем доля макрофагов с апоптотическими тельцами среди этих клеток составила в контрольной группе животных 11,9±0,02%, а в опытной – 35,04±0,03% (р<0,05). Имеются сообщения, что увеличение экспрессии MHC-II в микроглиоцитах свидетельствует об увеличении реактивности клеток глии (Wynne et al., 2009). Lee S. и соавторы (2012) показали, что антигены второго класса гистосовместимости в значительной степени отражают секреторную, фагоцитарную и антигенпрезентирующую способности активированных макрофагов. Обнаружение нами в пейеровых бляшках увеличение среди MHC-II-позитивных клеток доли макрофагов с апоптотическими тельцами, свидетельствует об увеличении их реактивности. Следовательно, увеличение размеров герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек можно связать с увеличением количества в них антигенпрезентирующих клеток и интенсивностью люминесценции гистамина. Таким образом, лимфоидные узелки периферических лимфоидных органов реагируют на поступление с питьевой водой кремния сходным образом. 118 Соотношение интенсивности люминесценции гистамина между микроокружением гистаминсодежащих структур и гистаминсодержащими структурами в контрольной группе составляет 0,46±0,03 для люминесцирующих клеток межузелковой зоны, в опытной группе это значение равно 0,52±0,02, (р < 0,05). Признано, что гистамин участвует в развитии аутоиммунных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита (Woolley D. E., Tetlow L. C., 1997). Считается, что гистамин выступает провоспалительным медиатором в развитии ревматоидного артрита, кроме того, показано участие Н4 рецепторов в патологической физиологии ревматоидного артрита (Zampeli E., Tiligada E. 2009). Тщательное сопоставление эпидемиологических доказательств, патофизиологических процессов и экспериментальных данных позволило авторам SpeckHernandez C. A. и Montoya-Ortiz G. выявить роль соединений кремния в развитии аутоиммунных заболеваний, особенно в развитии ревматоидного артрита, а также их потенциал в активации популяций иммунокомпетентных клеток, производстве цитокинов и формировании дисбаланса между регуляторными Т-лимфоцитами и Тh1 лимфоцитами. Анализ многочисленных литературных данных позволил им выделить общие свойства. При взаимодействии асбеста, диоксида кремния, наночастиц кремния и силикона живыми организмами, а также в витральных экспериментах, происходит высвобождение провоспалительных цитокинов. Так, общими цитокинами для диоксида кремния и его наночастиц явились такие цитокины, как IL-1β, IL-8, TNFα, IL-6 (Speck-Hernandez C.A., Montoya-Ortiz G., 2012). Гистамин модулирует выделение IL-2 Т-клетками, изменением синтеза IL-1 макрофагами, IL-6 Т-лимфоцитами, моноцитами и фибробластами, TNFα и TNFβ, продуцируемых макрофагами, Т- и В-лимфоцитами, естественными клеткамикиллерами и нейтрофилами, простагландина Е2 и других цитокинов. Указанные цитокины, простагландин и гистамин существенно изменяют физиологическую регуляцию иммунного гомеостаза и, как правило, в результате довольно сложных взаимодействий вызывают формирование вторичного иммунодефицитного со- 119 стояния или/и аутоиммунных реакций (цит. по Забродский П.Ф., Бирибин В. С., 2012). Разные ученые в разное время сообщали, что воздействие кремния переводит иммунный ответ на путь Th2 (гуморальный) (Pilette C. et al., 2002). Рецепторы H4, обладающие более высоким сродством к гистамину, по сравнению с H1рецепторами, локализованы преимущественно на клетках иммунной системы, в том числе на тучных и дендритных клетках, в таких органах, как тимус, селезенка и модулируют секрецию цитокинов в процессе Th1/Th2 дифференцировки, сдвигая ответ в сторону Th2-ответа. Экспрессия этих рецепторов зависит от различных воздействий (Zampeli E., Tiligada E., 2009). Таким образом, литературные данные, касающиеся иммуномодуляции, соединений кремния и гистамина, дают нам основание предположить, что тенденция к увеличению интенсивности люминесценции гистамина, обнаруженная нами в подавляющем большинстве структур тимуса, селезенки и пейеровых бляшек при поступлении кремния с питьевой водой, обусловлена тем, что, вероятно, гистамин является одним из «звеньев» в модуляции иммунного ответа соединениями кремния. Изменение корреляционной связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью Iba-1-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек свидетельствует о том, что чем больше макрофаг, тем меньше белка Iba-1 в его цитоплазме. Вместе с этим наблюдается уменьшение площади макрофагов герминативных центров пейеровых бляшек и увеличение их количества. У крыс, получавших питьевую воду с добавлением кремния, возрастает количество Iba-1-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек в поле зрения (24, 17±0,03 шт. против 17,71±0,32 шт. (р < 0,001) и уменьшаются средние размеры этих клеток (173,27±16,57мкм2 против 222,80±16,87 мкм2, р < 0,05). Уменьшение площади Iba-1-позитивных клеток герминативных центров лимфоидных 120 узелков пейеровых бляшек может быть объяснено, как и в селезенке, уменьшением их функциональных возможностей (Федорова Н. П., 2009) и возможным снижением их способности к завершенному фагоцитозу, а увеличение количества Iba-1-позитивных клеток – компенсаторной реакцией на это снижение. Как для селезенки, так и для пейеровых бляшек мы получили разные данные для двух маркеров пролиферации. В данном случае, индекс пролиферации был существенно выше для маркера PCNA, чем для маркера Ki-67. Эту разницу при использовании данных маркеров для серийных срезов одного органа наблюдали, в частности, при изучении различных типов амелобластомы и амелобластической карциномы, а также при исследовании пролиферативных процессов в двенадцатиперстной кишке (Тищенко Д. В. и соавт., 2012; Bologna-Molina R. et al., 2013). Так, для разных видов опухолей в препаратах, обработанных маркером PCNA, индекс пролиферации был свыше 80%, в то время как данные по маркеру Ki-67 варьировали от 2 до 45%. Такая существенная разница для двух маркеров объясняется тем, что белок Ki-67 присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2, и митоза) и разрушается в течение 1–1,5 часа после митоза. Напротив, циклин А является долгоживущим белком и период его полураспада составляет 20 часов (Miura M., 1999). 121 ЗАКЛЮЧЕНИЕ При длительном поступлении в организм лабораторных крыс соединения кремния с питьевой водой ad libitum в концентрации 10 мг/л происходит изменение структурно-функционального состояния лимфоидных органов – тимуса, селезенки и пейеровых бляшек. В тимусе наблюдается морфологическая перестройка долек, в лимфоидных узелках селезенки и пейеровых бляшек происходит увеличение размеров герминативных центров лимфоидных узелков. Эти процессы сопровождаются количественными и качественными изменениями гистаминсодержащих, тучных, антигенпредставляющих и Iba-1-позитивных клеток. Обобщая полученные нами результаты, можно выделить некоторые особенности, касающиеся реакций лимфоидных органов лабораторных крыс на поступление в организм водорастворимого соединения кремния. Во-первых, чем ближе к месту проникновения кремния (по данным Sripanyakorn S. et al. (2009), всасывание кремния происходит в тонком кишечнике) в организм находится лимфоидный орган, тем большие изменения, касающиеся пролиферативных процессов и антигенпрезентации, в нем происходят. Во-вторых, реакция иммунокомпетентных клеток на поступление с питьевой водой кремния зависит как от их происхождения (клетки моноцитарно-макрофагального звена пейеровых бляшек и селезенки реагируют сходным образом), так и от их принадлежности к различным морфо-функциональным зонам лимфоидных органов. В-третьих, сопоставление повышения интенсивности люминесценции гистамина в микроокружении всех гистаминсодержащих структур в тимусе, селезенке и пейеровых бляшек с количественными и качественными характеристиками антигенпрезентирующих клеток в этих органах, позволяет предполагать, что гистамин является одним из ключевых звеньев в реакции адаптации лимфоидных органов к поступлению водорастворимых соединений кремния. 122 Полученные нами данные не лишают нас возможности предположить, что растворимые силикаты обладают на иммунную систему действием, сходным с таковым кварца, асбеста и наночастиц: во вторичных лимфоидных органах кремний индуцирует созревание дендритных клеток при участии гистамина, что отражается на увеличении их количества и размеров. При этом количество В-лимфоцитов, являющееся следствием взаимодействия дендритных клеток и лимфоцитов Th2, закономерно увеличивается, что в конечном итоге приводит к увеличению площадей герминативных центров лимфоидных узелков селезенки и пейеровых бляшек. 123 ВЫВОДЫ 1. Выявлены морфо-физиологические особенности тимуса, селезенки и пейеровых бляшек лабораторных крыс при длительном поступлении в организм соединения кремния с питьевой водой ad libitum в концентрации 10 мг/л, сопровождающиеся количественными и качественными изменениями гистаминсодержащих, тучных, антигенпредставляющих и Iba-1-позитивных клеток. 2. В дольках тимуса лабораторных крыс происходит морфологическая перестройка с участием гистаминсодержащих клеток; увеличение размеров Iba-1позитивных и MHC-II-позитивных клеток на границе коркового и мозгового вещества (в 1,4 раза (p < 0,001) и в 1,2 раза (p < 0,05) соответственно) при длительном поступлении с питьевой водой соединения кремния. 3. В моделируемых экспериментальных условиях в селезенке лабораторных животных наблюдается увеличение в 1,25 раза (p < 0,05) площадей герминативных центров лимфоидных узелков с возрастанием в них количества MHC-IIпозитивных клеток и усилением люминесценции гистамина во люминесцирующих гранулярных клетках лимфоидных узелков и их микроокружении. В маргинальной зоне белой пульпы и красной пульпе селезенки наблюдается уменьшение средних размеров моноцитарно-макрофагальных клеток. 4. Выявлено повышение индекса пролиферативной активности в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек, увеличение в 1,5 раза (p < 0,001) площадей герминативных центров лимфоидных узелков пейеровых бляшек с возрастанием в них количества как Iba-1-позитивных клеток, параллельно с уменьшением их размеров, так и MHC-II-позитивных клеток при поступлении кремния с питьевой водой в организм лабораторных крыс. При этом в межузелковой зоне отмечено увеличение количества и размеров MHC-II-позитивных клеток (в 1,5 (p < 0,05) и в 1,4 раза (p < 0,001) соответственно), что сопровождается зна- 124 чительным повышением уровня люминесценции гистамина в гистаминсодержащих клетках и их микроокружении. 5. Тучные клетки тимуса лабораторных крыс адаптируются к поступлению с питьевой водой кремния как изменением внутреннего расположения гранул и созревания кислых гликозаминогликанов в них, так и усилением дегрануляции с нарушением целостности цитоплазматической мембраны. 6. Количественные и качественные изменения антигенпрезентирующих клеток в изучаемых лимфоидных органах свидетельствуют об изменении их активности в зонах, ответственных за формирование пула антигенспецифических лимфоцитов под воздействием соединения кремния, поступающего с питьевой водой. 125 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абатуров, Б. Д. Критические параметры качества растительных кормов для сайгаков (Saiga Tatarica) на естественном пастбище в полупустыне / Б. Д. Абатуров // Зоологический журнал. – 1999 – Т. 78. – № 8. – С. 999–1010. 2. Автандилов, Г. Г. Медицинская морфометрия / Г. Г. Автандилов. – М. : Медицина, 1990. – 381 с. 3. Авцын, А. П. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология / А. П. Авцын, А. А. Жаворонков, М. А. Риш, Л. С. Строчкова. – М. : Медицина, 1991. – 496 с. 4. Агафонкина, Т. В. Морфофункциональные изменения тимуса и иммуно- биохимические показатели крови при воздействии цеолитсодержащим трепелом : автореф. дис. … канд. мед. наук : 03.00.25 / Агафонкина Татьяна Всеволодовна. – Чебоксары. – 2006. – 21 с. 5. Айлер, Р. А. Химия кремнезема / Р. А. Айлер. – М. : Мир, 1982. – Ч. 1. – 416 с. 6. Айлер, Р. А. Химия кремнезема / Р. А. Айлер. – М. : Мир, 1982. – Ч. 2. – 712 с. 7. Акулович, А. В. Cравнительное исследование отбеливающих зубных паст с умеренной абразивностью / А. В. Акулович, О. Г. Акулович, Д. И. Горохова, Т. В. Купец // Современная стоматология. – 2011. – № 3. – С. 17–20. 8. Анчикова, И. В. Количественное люминесцентно-гистохимическое иссле- дование лимфатических узлов / И. В. Анчикова // Морфология и люминесцентная гистохимия. – Чебоксары : Изд-во ЧГУ. – 1983. – С. 60–62. 9. Артемьева, И. Л. Морфофункциональная характеристика структур тимуса при экспериментальной тестэктомии / И. Л. Артемьева, В. Е. Сергеева. – Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 2012. – 96 с. 126 10. Артишевский, А. А. Гистология с техникой гистологических исследований / А. А. Артишевский, А. С. Леонтюк, Б. А. Слука. – Минск : Вышэйш. шк., 1999. – 236 с. 11. Ахматова, Н. К. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противоинфекционный / Н. К. Ахматова, М. В. Киселевский – М. : Практическая медицина, 2008. – 256 с. 12. Бахмет, А. А. Влияние некоторых иммунопептидов на иммунные структуры лимфоидных бляшек тонкой кишки (экспериментальное исследование) / А. А. Бахмет // Российский журнал Гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2008. – Т. 18. – № 5. – С. 38–44. 13. Бахмет А. А. Морфологическая характеристика селезёнки, паховых лимфатических узлов и лимфоидных бляшек тонкой кишки крыс при эмоциональном стрессе, а также в условиях воздействия некоторых олигопептидов (экспериментально-морфологическое исследование) : автореф. дис. ... д-ра мед. наук : 14.03.01 / Бахмет Анастасия Анатольевна. – М., 2010. – 28 с. 14. Безруков, Ю. Ф. Океанология. Часть I. Физические явления и процессы в океане / Ю. Ф. Безруков. – Симферополь : Таврический национальный университет им. В. И. Вернадского, 2006. – 159 с. 15. Бережная, Н. М. Тучные клетки и гистамин / Н. М. Бережная, Р. И. Сепиашвили // Аллергология и иммунология. – 2003. – Т. 4. – № 3. – С. 64–70. 16. Бибик, Е. Ю. Современные представления о морфогенезе первичного лимфоидного органа / Е. Ю. Бибик, А. Ю. Берест // Украинский морфологический альманах. – 2011. – Т. 9. – № 3. – С. 43–46. 17. Боровик, Т. Э. Оценка клинической эффективности биологически активной добавки к пище синбиотического действия «Нормобакт» у детей с хирургической и соматической патологией / Т. Э. Боровик, Н. Н. Семенова, Е. К. Кутафина, С. П. Яцык, Л. К. Катосова, И. А. Дюсекеев // Педиатрия. – 2010. – Т. 89. – № 5. – С. 124–129. 127 18. Величковский, Б. Т. Об экспресс-методе прогнозирования возможного патологического влияния наночастиц на организм / Б. Т. Величковский // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2009. – № 4 (68). – С. 72−76. 19. Винокур Л. И. Люминесцентно-гистохимическое исследование моноаминов селезенки на ранних сроках иммуногенеза и при беременности : автореф. дисс. ... канд. мед. наук : 14.00.23. / Винокур Леонид Иосифович. – Новосибирск. – 1991. – 22 с. 20. Воронков, М. Г. Силатраны в медицине и сельском хозяйстве. / М. Г. Воронков, В. П. Барышок // Новосибирск : Изд–во СО РАН, 2005. – 258 с. 21. Воронков, М. Г. Кремний в живой природе / М. Г. Воронков, И. Г. Кузнецов. – Новосибирск : Наука, 1984. – 157 c. 22. Глазко В. И. Нанотехнологии в сельском хозяйстве // Информационный бюллетень Министерства сельского хозяйства Российской Федерации № 11–12. – 2007. – С. 77–80. 23. Голохваст К. С. Взаимодействие организмов с минералами: монография / К. С. Голохваст; отв. ред. А. М. Паничев. – Владивосток : Изд-во ДВГТУ, 2010. – 115 с. 24. Голохваст, К. С. Альвеолярный макрофаг / К. С. Голохваст, В. В. Чайка // Вестн. новых мед. технологий. – 2011. – Т. ХVIII. – № 2. – С. 23–26. 25. Голохваст, К. С. Молекулярные основы биоминерализации / К. С. Голохваст, И. Э. Памирский // Успехи наук о жизни. – 2011. – №3. – С.78–93. 26. Голубцова, Н. Н. Морфофункциональное исследование биогенных аминов в селезенке и печени белых мышей в условиях токсичного воздействия толуолом : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.13 / Голубцова Наталья Николаевна. – Чебоксары. – 2001. – 24 с. 27. Голубцова, Н. Н. Биоаминное обеспечение структур селезёнки после введения толуола / Н. Н. Голубцова, Л. А. Любовцева, А. О. Лойт // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2000. – Т. 130. – № 12. – С. 643–647. 128 28. Гордон, Б. М. Цитобиоаминная система тимуса и адаптация / Б. М. Гордон. – Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 2000. – 242 с. 29. Гордон, Д. С. Нейромедиаторы лимфоидных органов / Д. С. Гордон, В. Е. Сергеева, И. Г. Зеленова. – Л. : Наука, 1982. – 128 с. 30. Гордон, Д. С. Тинкториальные параллели тучных клеток / Д. С. Гордон // Макро-микроструктура тканей в норме, патологии и эксперименте. – Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 1981. – С. 97–101. 31. Гордон, Д. С. Идентификация люминесцирующих гранулярных клеток тимуса с дендритными макрофагами / Д. С. Гордон, В. Е. Сергеева, А. Т. Смородченко, Н. А. Кириллов, Т. Л. Петрова, О. И. Олангин, И. В. Спирин // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 2001. – Т. 132. – № 7. – С. 118–120. 32. Гордон, Д. С. Тучные клетки в эксперименте. Методические указания. / Д. С. Гордон // Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 1982. – 29 с. 33. ГОСТ Р 51232-98 (2002). Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества. 34. ГОСТ Р 52109-2003. Вода питьевая, расфасованная в емкости. Общие технические условия. 35. Гурьянова, Е. А. Морфофункциональные аспекты влияния акупунктуры на взаимодействие нейромедиаторов в структурах органов иммуногенеза и кожи : автореф. дис. … д-ра мед. наук : 03.03.04 / Гурьянова Евгения Аркадьевна. – Саранск. – 2011. – 41 с. 36. Гурьянова, Е. А. Морфологические и иммуногистохимические особенности селезенки крыс после иглоукалывания / Е. А. Гурьянова, О. С. Кроткова, Е. В. Любовцева // Морфологические ведомости. – 2011. – № 1. – С. 89–94. 37. Гурьянова, Е. А. Люминесцентно гистохимические исследования биоаминсодержащих структур тимуса после иглоукалывания / Е. А. Гурьянова, Е. В. Любовцева, Л. А. Любовцева // Морфология. – 2008. – Т. 133. – № 4. – С. 64. 38. Гусейнов, Т. С. Дискуссионные вопросы анатомии пейеровых бляшек 129 тонкой кишки / Т. С. Гусейнов, С. Т. Гусейнова // Саратовский научномедицинский журнал. – 2012. – Т. 8. – № 3. – С. 687–691. 39. Гусельникова, В. В. Тучные клетки тимуса как посредники в системе нейроиммунных взаимодействий / В. В. Гусельникова, Е. Г. Сухорукова, Д. Э. Коржевский, А. В. Полевщиков // Медицинский академический журнал. – 2013. – Т. 13. – № 3. – С. 53–63. 40. Дьячкова, И. М. Структурно-функциональное состояние тимуса лабораторных крыс, употребляющих питьевую воду с добавлением соединений кальция и кремния : автореф. дис. ... кандид. биол. наук : 03.03.04, 03.03.01 / Дьячкова Ираида Михайловна. – Чебоксары . – 2011. – 20 с. 41. Дюговская, Л. А. Роль гистамина в функции супрессорной активности тимоцитов / Л. А. Дюговская, С. В. Тимченко // Актуальные проблемы современной патофизиологии. – 1981. – С. 126–127. 42. Дьячкова, И. М. Исследование популяции тучных клеток тимуса при длительном воздействии соединений кремния и кальция / И. М. Дьячкова, В. Е. Сергеева, С. П. Сапожников // Вестник Чувашского государственного педагогического университета имени И. Я. Яковлева. – 2010. – № 4 (68). – С. 5055. 43. Дьячкова, И. М. Изучение каспаз-9 позитивных клеток в тимусе лабораторных крыс при поступлении в организм хлорида кальция и метасиликата натрия с питьевой водой / И. М. Дьячкова, А. Т. Смородченко // Морфология в теории и практике: сб. материалов и тезисов (к 90-летию со дня рождения Д. С. Гордон). – Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 2012. – С. 185186. 44. Ердакова, В. П. Современные косметические товары: ассортимент, потребительские свойства, экспертиза качества. Часть 2. Средства по уходу за зубами и полостью рта / В. П. Ердакова // Бийск : Изд-во Алт. гос. тех. ун-та, 2007. 164 с. 45. Ефейкина, Н. Б. Частота дисбиотических нарушений у лиц с заболеваниями желудочно-кишечного тракта у лиц с заболеваниями желудочнокишечного тракта, проживающих в различных эколого-биогеохимических зонах 130 Чувашской Республики / Н. Б. Ефейкина, В. С. Гордова // Морфология в теории и практике: сб. материалов и тезисов (к 90-летию со дня рождения Д. С. Гордон). – Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 2012. – С. 122123. 46. Ефейкина, Н. Б. Влияние соединения кремния на лимфоидные органы и пристеночную микрофлору кишечника лабораторных животных / Н. Б. Ефейкина, В. С. Гордова, И. М. Дьячкова, А. С. Семенова // Современные проблемы естественнонаучных исследований : сборник научных статей Чуваш. гос. пед. ун-т; под ред. Ю. Ю. Пыльчиковой. – Чебоксары : Чуваш. гос. пед. ун-т, 2013. – С. 68– 70. 47. Железникова, Г. Ф. Регуляторные Т-лимфоциты в иммунном ответе на инфекцию / Г. Ф. Железникова // Журнал инфектологии. – 2011. – Т. 3. – № 1. – С. 6–13. 48. Журавлева Т. Б. Функциональная морфология селезёнки и лимфоидного аппарата кишечника при стрессе / Т. Б. Журавлева, О. Д. Ягмуров, Р. П. Огурцов // Архив патологии. – 1995. – Т. 57. – № 1. – С. 56–59. 49. Забродский, П. Ф. Иммунопатология при сочетанном действии ядов общетоксического действия и механической травмы. Коррекция нарушений иммунного гомеостаза / П. Ф. Забродский, В. С. Бирибин // Монография. – Саратов. – 2012. – 175 с. 50. Забродский, П. Ф. Изменение показателей неспецифической резистентности организма, гуморальных и клеточных иммунных реакций после острого отравления ацетонитрилом / П. Ф. Забродский, В. Ф. Киричук // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1998. – Т. 125. – № 5. – С. 548–550. 51. Западнюк, И. П. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. / И. П. Западнюк, В. И. Западнюк, Е. А. Захария, Б. В. Западнюк. – Изд. 3-е, перераб. и доп. – Киев : Вища школа, 1983. – 383 с. 52. Захид М. Морфологические изменения тимуса и иммунобиохимические показатели крови после применения полиоксидония : автореф. дис. ... канд. биол. 131 наук : 03.03.04 / Мухаммад Захид. – Чебоксары. – 2012. – 18 с. 53. Зеленова, И. Г. Адренергическая иннервация селезенки кошки / И. Г. Зеленова // Архив анатомии. – 1971. – Т. 60. – Вып. 2. – С. 88–90. 54. Злобина, О. В. Морфофункциональное состояние белой пульпы селезенки при пероральном введении наночастиц золота в эксперименте / О. В. Злобина, С. С. Фирсова, А. Б. Бучарская, И. О. Бугаева, Г. Н. Маслякова // Морфология. – Т. 140. – № 5. – 2011. – С. 88. 55. Злобина, О. В. Морфокинетика клеточных популяций мезентериальных лимфатических узлов под влиянием золотых наночастиц в эксперименте / О. В. Злобина, И. О. Бугаева, Г. Н. Маслякова, С. С. Фирсова и др. // Саратов. научмед. журнал. – 2011. – Т. 7. – № 2. – С. 354–357. 56. Ильина, А. Е. Интерлейкин 1 как медиатор воспаления и терапевтическая мишень / А. Е. Ильина, М. Л. Станислав, Л. Н. Денисов, Е. Л. Насонов // Научно практическая ревматология. – 2011. – № 3. – С. 62–71. 57. Ильина, Л. Ю. Люминесцентно-гистохимическое исследование биоаминсодержащих структур тимуса при иммуномодуляции : автореф. дис. … канд. мед. наук : 03.00.25 / Ильина Лилия Юрьевна. – М., 2002. – 17 с. 58. Калюжная О. В. Силикатеины пресноводных губок: сравнение последовательностей и экзон-интронных структур генов / О. В. Калюжная, А. Г. Красько, В. А. Гребенюк, В. Б. Ицкович и др. // Молекулярная биология. – 2011. – Т. 45. – № 4. – С. 617–626. 59. Камбалина, М. Г. Атомно-абсорбционное определение содержания кремния в природных водах / М. Г. Камбалина, Н. П. Пикула // Известия Томского политехнического университета. – 2012. – Т. 320. – № 3. – С. 120–124. 60. Каркищенко, Н. Н. Основы биомоделирования / Н. Н. Каркищенко. – М. : Изд-во ВПК, 2004. – 608 с. 61. Карнаухов В. Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки. – М. : Наука, 1978. – 208 с. 132 62. Кащенко, С. А. Корреляционная взаимозависимость линейных параметров агрегированных лимфоидных узелков тонкой кишки крыс после воздействия имунофана / С. А. Кащенко, Е. Н. Морозова, О. Н. Петизина, М. В. Золотаревская, М. А. Нагорный // Морфология. – 2012. – Т. 141. – № 3. – С. 74. 63. Кащенко, С. А. Строение селезенки белых крыс подсосного возраста / С. А. Кащенко, М. В. Золотаревская, Н. В. Станишевская, Л. Г. Войновская // Таврический медико-биологический вестник. – 2013. – Т. 16. – №1, ч.1. – С. 104–106. 64. Кирик, О. В. Кальций-связывающий белок Iba-1/AIF1 в клетках головного мозга крысы / О. В. Кирик, Е. Г. Сухорукова, Д. Э. Коржевский // Морфология. – 2010. – Т. 136. – № 2. – С. 5–7. 65. Кириллов, Н. А. Физиологический анализ воздействия биологически активных веществ на морфофункциональные структуры иммунокомпетентных органов животных : автореф. дис. … д-ра биол. наук : 03.00.13 / Кириллов Николай Александрович. – Нижний Новгород. – 2001. – 35 с. 66. Ковальский, В. В. Кремниевые субрегионы биосферы СССР / В. В. Ковальский, В. Л. Сусликов // Труды биогеохим. лаб. – М. : Наука, 1980. – Т. 18. – С. 3−58. 67. Козлов Ю. В. Эффективность соединений кремния при возделывании зерновых культур в условиях Смоленской области : автореф. дис. … канд. биол. наук : 06.01.04 / Козлов Юрий Владимирович. – М., 2010. – 18 с. 68. Колесников, М. П. Формы кремния в лекарственных растениях / М. П. Колесников, В. К. Гинс // Прикладная биохимия и микробиол. – 2001. – Т. 37. – № 5. – С. 616–620. 69. Колесников, М. П. Формы кремния в растениях / М. П. Колесников // Успехи биологической химии. – 2001. – Т. 41. – С. 301–332. 70. Кондашевская, М. В. Тучные клетки и гепарин – ключевые звенья в адаптивных и патологических процессах / М. В. Кондашевская // Вестник РАМН. – 2010. – № 6. – С. 49–54. 133 71. Колесникова, О. П. Скрининг иммуноактивных свойств комплексов триэтаноламина с солями биомикроэлементов / О. П. Колесникова, А. Н. Мирскова, С. Н. Адамович, Г. А. Кузнецова и др. // Бюллетень СО РАМН. – 2009. – № 6 (140). – С.73–79. 72. Коржевский, Д. Э. Современные методы иммуноцитохимии – основа для изучения структурной организации глиоцитов и оценки глиальной реакции в органах нервной системы / Д. Э. Коржевский, Е. Г. Сухорукова, О. В. Кирик // Материалы 8-й Всерос. конф. «Ретиноиды» – Бабухинские чтения в Орле. – М., 2011. – Вып. 32. – С. 71–76. 73. Корсунов, В. М. Педосфера Земли. / В. М. Корсунов, Е. Н. Красеха // Улан-Удэ : Изд-во БНЦ СО РАН, 2010. – 472 с. 74. Кроткова, О. С. Люминесцентно-морфологические особенности селезенки мыши после иглоукалывания / О. С. Кроткова, Е. А. Гурьянова, С. В. Николаев, Л. А. Любовцева и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2014. – Т. 157. – № 6. – С. 791– 795. 75. Ксенофонтова, О. И. Пористый кремний и его применение в биологии и медицине / О. И. Ксенофонтова, А. В. Васин, В. В. Егоров, А. В. Бобыль и др. // Журнал технической физики. – 2014. – Т. 84. – Вып. 1 – С. 67–78. 76. Кудрин А. В., Скальный А. В. Микроэлементы в онкологии. Часть 2. Микроэлементы и противоопухолевый иммунитет // Микроэлементы в медицине. – 2001. – № 2 (2). – С. 31–39. 77. Кузин, А. В. Влияние антирабической вакцины на морфофункциональное состояние органов иммунной системы (морфо-экспериментальное исследование) / А. В.Кузин, А. И. Марков, В. М. Чучков, С. В. Шалаев. – Ижевск : Изд-во «АНК», 2004. – 104 с. 78. Лазарев, А. Ф. Тучные клетки и опухолевый рост / А. Ф. Лазарев. И. П. Бобров, Т. М. Черданцева, В. В. Климачев и др. // Сиб. Онкологический журнал. – 2011. – № 4 (46). – С. 59–63. 134 79. Лебединская, О. В. Морфологические изменения лимфоидных и паренхиматозных органов мышей на фоне введения иммуномодуляторо бактериального происхождения / О. В. Лебединская, А. В. Годовалов, Н. К. Ахматова // Морфология. – 2011. – Т. 140. – № 5. – С. 97. 80. Лимонов, В. Л. Весовые, морфометрические и цитологические характеристики лимфоидных органов мышей при воздействии производного индолилтиоалканкарбоновой кислоты (соединения ВЛ-11-02) / В. Л. Лимонов, А. В. Шурлыгина, М. В. Робинсон, Л. В. Вербицкая и др. // Бюллетень СО РАМН. – 2002. – № 2 (116) – С. 55–58. 81. Линднер, Д. П. Морфометрический анализ популяции тучных клеток / Д. П. Линднер, И. А. Поберий, М. Я. Розкин, В. С. Ефимов // Архив патологии. – 1980. – Т. 42. – № 6. – С. 60–64. 82. Луговцова, П. А. Изучение локализации CD68-положительных макрофагов в тимусе человека в норме / П. А. Луговцова, Н. А. Луговцов, А. Н. Платонов // Тез. докл. 51-й итоговой студенч. науч. конф. с междунар. участием «Время смотреть в будущее…». – ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия». – Минздравсоцразвития РФ, 2012. – С. 71–72. 83. Лузикова, Е. М. Морфо-физиологическая реакция аминсодержащих структур тимуса на введение АКТГ : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.13 / Лузикова Елена Михайловна. – Чебоксары. – 2005. – 25 с. 84. Лузикова, Е. М. Влияние глюкокортикоидов на морфотипы NSEпозитивных клеток селезенки / Е. М. Лузикова, В. Е. Сергеева, О. Н. Кириллова, М. М. Скворцова, К. О. Иванова // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 11. – С. 103–106. 85. Лузикова, Е. М. Исследование нейроспецифической энолазы, белков МНС II класса кальций-связывающих молекул макрофагов тимуса / Е. М. Лузикова, И. М. Дьячкова, В. Е. Сергеева, А. Т. Смородченко // Морфология. – 2009. – Т. 136. –№4. – С. 90–91. 135 86. Луппа, Х. Основы гистохимии / Луппа Х. – М. : Мир, 1980. – 343 с. 87. Любовцева, Л. А. Локализация гистамина в структурах вилочковой железы в норме и условиях эксперимента у лабораторных животных : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.11. /Любовцева Любовь Алексеевна. – М., 1980. – 21 с. 88. Любовцева, Л. А. Реакция биоаминсодержащих структур тимуса на введение нейромедиаторов / Л. А. Любовцева, Е. В. Любовцева, В. В. Любовцев // Здравоохранение Чувашии. – Чебоксары. – № 3. – 2011. – С. 56–60. 89. Любовцева, Л. А. Функциональная активность аминосодержащих структур костного мозга, тимуса и крови при действии нейромедиаторов и антигенов : автореф. дис. … д-ра биол. наук : 14.00.23 / Любовцева Любовь Алексеевна. – М., 1994. – 34 с. 90. Лякина, О. А. Использование фосфатов пониженной растворимости и соединений кремния при выращивании сельскохозяйственных культур в условиях дерново-подзолистых почв : автореф. дис. … канд. сельскохоз. наук : 06.01.04 / Лякина Ольга Александровна. – М., 2012. – 26 с. 91. Мазаев, В. Т. Оценка степени санитарной опасности соединений кремния в природной и питьевой воде / В. Т. Мазаев, Т. Г. Шлепнина // Водоснабжение и санитарная техника. – 2011. – № 7. – С. 13−20. 92. Макалиш, Т. П. Морфофункциональные особенности селезенки при воздействии на организм факторов различного генеза // Таврический медикобиологический вестник. – 2013. – Т. 16. – № 1, ч.1 – С. 265–269. 93. Мансурова, Л. А. Силатраны как стимуляторы развития грануляционной ткани / Л. А. Мансурова, М. Г. Воронков, Л. И. Слуцкий, Л. Э. Домбровска, Т. П. Бумагина // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1983. – Т. 96. – № 9. – С. 97–99. 94. Мансурова, Л. А. Физиологическая роль кремния. / Л. А. Мансурова, О. В. Федчишин, В. В. Трофимов, Т. Г. Зеленина, Л. Е. Смолянко // Сибирский медицинский журнал. – 2009. – № 7. – С. 16–18. 95. Масляков, В. В. Травма селезенки: особенности иммунного статуса в от- 136 даленном послеоперационном периоде / В. В. Масляков, В. Ф. Киричук, А. Ю. Чуманов // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2010. – Т. 6. – № 3. – С. 716–719. 96. Матыченков В. В. Роль подвижных соединений кремния в растениях и системе почва-растение : автореф. дис. … д-ра биол. наук : 03.00.12, 03.00.27 / Матыченков Владимир Викторович. – Пущино.– 2008. – 34 с. 97. Мелехин, С. В. Морфология групповых лимфоидных узелков тонкой кишки у мышей первого поколения, родившихся от облученных родителей / С. В. Мелехин // Успехи современного естествознания. – 2003. – № 10. – С. 79. 98. Медведева, И. Н. Эффективная защита семенного картофеля в период вегетации с использованием регуляторов роста растений от основных инфекционных болезней в Предуралье / И. Н. Медведева, А. О. Черномордик //Аграрный вестник Урала. – 2011. –№ 4 (83). – С. 67–68. 99. Медик, В. А. Статистика в медицине и биологии. Том 1. – Теоретическая статистика. / В. А. Медик, М. С. Токмачёв, Б. Б. Фишман // М. : Медицина, 2000. – 412 с. 100. Мондодоев, А. Г. Противовоспалительная активность сухого экстракта горца птичьего / А. Г. Мондодоев, Л. Н. Шантанова, И. Б. Багинова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2010. – № 2 (72). – С. 185–188. 101. Москвичев, Е. В. Иммуногистохимическая характеристика акцидентальной инволюции тимуса после спленэктомии / Е. В. Москвичев, Л. М. Меркулова, Г. Ю. Стручко и др. // Вестник Национального медико-хирургического центра им. Н. И. Пирогова. – 2012. – Т. 7. – № 2. – С. 40–43. 102. Москвичев, Е. В. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика вилочковой железы при экспериментальгном канцерогенезе в условиях вторичной иммунной недостаточности : автореф. дис. … д-ра мед. наук : 03.03.04 / Москвичев Евгений Васильевич. – Оренбург. – 2013. – 30 с. 103. Мышляева, Л. В. Аналитическая химия кремния / Л. В. Мышляева, В. В. 137 Краснощеков. – М. : Наука, 1972. – 212 с. 104. Никитенко, О. В. Структурно-функциональная организация лимфоидных органов в условиях экспериментального токсического селенового воздействия : автореф. дис. … канд. мед. наук : 14.03.01 / Никитенко Ольга Викторовна. – Тюмень. – 2010. – 23 с. 105. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. Методические рекомендации. МР 2.3.1.2432–08. 106. Овчаренко, Ю. С. Болезни волос: клинические аспекты / Ю. С. Овчаренко // Международный медицинский журнал. – 2009. – № 3. – С. 111–115. 107. Овчинникова. С. И. Основные тенденции изменения гидрохимических показателей водной экосистемы Кольского залива (2000-2011 годы) / С. И. Овчинникова, Т. А. Широкая, О. И. Пашкина // Вестник МГТУ. – 2012. – Т. 15. – № 3. – С. 544–550. 108. Олангин, О. И. Гистохимия макрофагов тимуса при усиленном и подавленном иммунном ответе на модели 1, 2 и 3 триместров беременности : автореф. дис … канд. мед. наук : 14.00.23 / Олангин Олег Иосифович. – Чебоксары. – 2000. – 24 с. 109. Николаев, В. Г. Cовременные энтеросорбенты и механизмы их действия (обзор) / В. Г. Николаев, С. В. Михаловский, Н. М. Гурина // Эфферентная терапия. – 2005. – Т. 11. – № 4. – C. 3–17. 110. Паймерова, И. С. Применение комплекса биоэлементов в мицеллярной форме отдельно и в сочетании с биокремнийорганической кормовой добавкой при выращивании поросят : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.01.04 / Паймерова Инна Сергеевна. – Дубровицы. – 2011. – 17 с. 111. Перцов, С. С. Влияние мелатонина на состояние тимуса, надпочечников и селезенки у крыс при острой стрессорной нагрузке / С. С. Перцов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 141. – № 3. – С. 263–266. 138 112. Петрова, Т. Л. Нейромедиаторное обеспечение микроструктур тимуса при овариоэктомии и эстрогенном воздействии : автореф. дис. … канд. мед. наук : 14.00. 23 / Петрова Татьяна Львовна. – М., 1999. – 20 с. 113. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. – М. : Изд-во иностр. лит., 1962. – 962 с. 114. Приходько, Е. В. Рост и мясные качества свиней при скармливании им препарата «Мивал-зоо» в период откорма : автореф. дис. … канд. сельскохоз. наук : 06.02.10 / Приходько Евгений Владимирович. – Курск. – 2012. – 17 с. 115. Разумов, А. Н. Влияние геля из бурых морских водорослей на иммунную систему / А. Н. Разумов, В. И. Михайлов, А. Г. Одинец // Физиотерапевт. – 2010. – № 2. – С. 38–50. 116. Робинсон М. В. Морфолог в иммунологическом мире / М. В. Робинсон, В. А. Труфакин // Бюлл. СОРАМН. – 1998. – № 2. – С. 20–24. 117. СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. 118. СанПиН 2.1.4.1116-02. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества. 119. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. – М., 2002. Приложение 7. 120. Сапин, М. Р. Лимфатическая система и ее роль в иммунных процессах / М. Р. Сапин // Морфология. – 2012. – Т. 141. – № 3. – С. 139. 121. Сапин, М. Р. Влияние физических нагрузок различной интенсивности на некоторые элементы лимфоидной ткани тимуса и селезёнки / М. Р. Сапин, Г. Г. Аминова, Д. Е. Григоренко // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1999. – Т. 126. – № 11. – С. 539–540. 122. Сапожников, С. П. Роль соединений кремния в развитии аутоиммунных процессов / С. П. Сапожников, В. С. Гордова // Микроэлементы в медицине. – 139 2013. – N 3. – C. 3–13. 123. Сапожников, С. П. Влияние эколого-биохимических факторов среды обитания на функциональное состояние и здоровье населения Чувашии : автореф. дис. … д-ра мед. наук : 03.00.13, 14.00.07 / Сапожников Сергей Павлович. – М., 2001. – 32 с. 124. Сапожников, С. П. Эколого-биогеохимические факторы среды обитания и здоровья / С. П. Сапожников. – Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 2001. – 96 с. 125. Сапожников, С. П. Роль биогеохимических факторов в развитии краевой патологии / С. П. Сапожников, А. В. Голенков // Микроэлементы в медицине. – 2001. – № 2 (3). – С. 70–72. 126. Сарилова, И. Л. Эффект тестэктомии на структуры вилочковой железы, экспрессирующие главный комплекс гистосовместимости II класса / И. Л. Сарилова, В. Е. Сергеева, А. Т. Смородченко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т. 146. – № 1. – С. 103–106. 127. Сергеева, В. Е. Гистаминсодержащие структуры вторичных лимфоидных органов крыс при длительном поступлении кремния с питьевой водой / В. Е. Сергеева, В. С. Гордова, Л. А. Басова // Современные проблемы естественнонаучных исследований : сборник научных статей Чуваш. гос. пед. ун-т; под ред. Ю. Ю. Пыльчиковой. – Чебоксары : Чуваш. гос. пед. ун-т, 2013. – С. 65–68. 128. Сергеева, В. Е. Люминесцентно-гистохимическая характеристика ранней реакции моноаминсодержащих структур тимуса на антигенные воздействия / В. Е. Сергеева, Д. С. Гордон. – Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 1992. – 352 с. 129. Сергеева, В. Е. Сезонные изменения аминосодержащих структур тимуса в первый час антигенного воздействия / В. Е. Сергеева // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 1992. – № 3. – С. 311–314. 130. Сикора, В. З. Органогенез селезенки половозрелых крыс при введении им гидрокортизона // Український морфологічний альманах. – 2010. – Том 8. – № 4. – С. 103–104. 140 131. Славин, М. Б. Методы системного анализа в медицинских исследованиях / М. Б. Славин. – М. : Медицина, 1989. – 304 с. 132. Смирнова, Т. Л. Нейромедиаторное обеспечение лимфоидных и нелимфоидных органов в условиях экспериментальной нейромодуляции / Т. Л. Смирнова, С. П. Сапожников, В. Е. Сергеева, И. М. Дьячкова // Аллергология и иммунология. – 2009. – № 1 – Т. 10. – С. 32–33. 133. Смородченко, А. Т. Лимфатические узлы в норме и при антигенных воздействиях. Учебное пособие / А. Т. Смородченко // Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 1996. – 76 с. 134. Соколова, М. Г. Адаптогенное влияние препаратов, содержащих ризосферные бактерии, на рост проростков гороха в условиях гипотермии / М. Г. Соколова, Г. П. Акимова // Вестник Харьковского национального аграрного университета. – 2009. – Вып. 3 (18). – С. 55–63. 135. Солдатенко, А. С. Синтез новых внутри- и межмолекулярных комплексных соединений гипервалентного кремния : автореф. дис. … канд. хим. наук : 02.00.08. / Солдатенко Анастасия Сергеевна. – Иркутск. – 2011. – 17 с. 136. Сороковикова, Е. Г. Биоминерализация кремния цианобактериями из термальных источников / Е. Г. Сороковикова, Е. В. Лихошвай, О. И. Белых, А. Т. Титов // Происхождение и эволюция биосферы : тез. докл. Междунар. рабочего совещания. – Новосибирск, 2005. – С. 175–176. 137. Спирин, И. В. Морфофункциональная характеристика биоаминсодержащих структур тимуса при введении соматотропного гормона : автореф. дис. … канд. мед. наук : 03.00.25 / Спирин Игорь Васильевич. – Саранск. – 2007. – 26 с. 138. Способ описания морфологического и функционального состояния тучноклеточной популяции в гистологических препаратах / В. С. Гордова, В. Е. Сергеева, С. П. Сапожников. – Удостоверение № 1171 от 09.09.2013. 139. Стаценко, Е. А. Современные представления об анатомии селезенки человека. – Український медичний альманах. – 2009. – Т. 12. – № 3. – С. 229–232. 141 140. Стельмах, И. А. Участие макрофагов в процессе разрушения телец Гассаля тимуса человека / И. А. Стельмах, А. Г. Беловешкин // 90 лет в авангарде медицинской науки и практики. – Минск : Белорус. гос. мед. ун-т, 2011. – Т. 1. – С. 88–89. 141. Стручко, Г. Ю. Морфологические изменения тимуса после применения полиоксидония / Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, Е. В. Москвичев, О. Ю. Кострова и др. // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 5 (1). – С. 197–202. 142. Стручко, Г. Ю. Морфо-функциональное исследование биоаминсодержащих структур тимуса в условиях антигенного воздействия и спленэктомии : автореф. дис. … канд. мед. наук : 14.00.23 / Стручко Глеб Юрьевич. – Чебоксары. – 1999. – 20 с. 143. Студеникина, Т. М. Топография S-100-положительных дендритных клеток, ассоциированных с тельцами Гассаля в тимусе человека / Т. М. Студеникина, А. Г. Беловешкин // 90 лет в авангарде медицинской науки и практики. – Минск : Белорус. гос. мед. ун-т, 2011. – Т. 1. – С. 89–90. 144. Судеева, В. С. Морфология и тинкториальные изменения мастоцитов тимуса у интактных животных во время экстиивации / В. С. Судеева // Сохранение здоровья семьи. – Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 2009. – С. 219–221. 145. Сурменева, М. А. Исследование фазового и элементного состава покрытий на основе кремнийсодержащего гидроксиапатита для медицинских имплантатов, полученных методом ВЧ-магнетронного распыления / М. А. Сурменева, Р. А. Сурменев, М. В. Чайкина, А. А. Качаев и др. // Физика и xимия обработки материалов. – 2012. – № 3. – С. 51–60. 146. Сусликов, В. Л. Особенности колонизационной резистентности микрофлоры кишечника в различных эколого-биогеохимических условиях постоянного проживания на территории Чувашской республики / В. Л. Сусликов, Н. В. Толмачева, Н. Б. Ефейкина // Мед. альманах. – Н. Новгород. – 2009. – № 2 (7). – С. 127– 131. 147. Сысоева, Л. А. Люминесцентно-гистохимическая характеристика ранней 142 реакции моноаминсодержащих структур селезенки на антигенное воздействие : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.11 / Сысоева Лидия Алексеевна. – М., 1986. – 20 с. 148. Тищенко, Д. В. Клинико-морфологическое исследование хронического дуоденита у детей / Д. В. Тищенко, О. В. Матвеева, Ю. В. Черненков, Г. Н. Маслякова, А. Б. Бучарская // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2012. – Т. 8. – № 3. – С. 799–803. 149. Толмачева, Н. В. Эколого-физиологическое обоснование оптимальных уровней макро- и микроэлементов в питьевой воде и пищевых рационах : автореф. дис. … д-ра мед. наук : 03.03.01 / Толмачева Наталия Викентьевна. – М., 2011. – 36 с. 150. Тотолян, А. А. Клетки иммунной системы / А. А. Тотолян, И. С. Фрейдлин. – СПб. : Наука, 2000. – 231 с. 151. Труфакин В. А. Иммуноморфология – вчера, сегодня, завтра / В. А. Труфакин, М. В. Робинсон // Вестник Российской академии медицинских наук. – 1996. – № 6. – С. 38–43. 152. Федорова, Н. П. Морфологические основы защитно-приспособительных реакций соединительной ткани кожи и тимуса при повреждающих и корригирующих воздействиях : автореф. дис. … канд. мед. наук : 03.00.25 / Федорова Наталья Петровна. – М., 2009. – 25 с. 153. Фомина, А. С. Морфофункциональные реакции иммунокомпетентных органов серебристой чайки при экспериментальном заражении цестодой Diphyllobothrium dendriticum : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.02.11 / Фомина Анастасия Сергеевна. – М., 2011. – 20 с. 154. Хаитов, P. M. Современные представления о защите организма от инфекции / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин // Иммунология. – М. : Медицина, 2002. – № 1. – С. 61–64. 155. Хаитов, Р. М. Особенности организации и функционирования иммунной 143 системы желудочно-кишечного тракта и заболевания, связанные с нарушением ее функционирования (лекция) / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин // Анналы хирургической гепатологии. – 1998 – Т. 3. – № 1. – С. 112–116. 156. Хонина Т. Г. Фармакологически активные полиолаты кремния и титана и гидрогели на их основе: синтез, свойства, применение : автореф. дис. … д-ра хим. наук : 14.14.02 / Хонина Татьяна Григорьевна. – Казань. – 2012. – 48 с. 157. Хоружий, Д. С. Кремний в водах Севастопольской бухты весной 2008 года / Д. С. Хоружий, С. К. Коновалов // Мор. гидрофиз. журн. – 2010. – № 3. – С.40– 51. 158. Шаззо, А. А. Разработка технологии получения и изучение потребительских свойств БАД функционального назначения на основе краснозерного риса : автореф. дис. … канд. техн. наук : 05.18.15. / Шаззо Азамат Айдомирович. – Краснодар. – 2010. – 26 с. 159. Чумаков, П. М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме / П. М. Чумаков // Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 3–52. 160. Чурина, Е. Г. Иммуносупрессорные эффекты т-лимфоцитов крови при диссеминированном туберкулезе легких с множественной лекарственной устойчивостью M. Tuberculosis / Е. Г. Чурина, О. И. Уразова, В. В. Новицкий, Т. Е. Кононова // Бюллетень сибирской медицины. – 2013. – Т. 12. – № 1. – С. 143–146. 161. Шатских, О. А. Морфофункциональная реакция натуральных киллеров и макрофагов селезенки на введение мелатонина животным, содержащимся при различных световых режимах / О. А. Шатских, Е. М. Лузикова // Морфология. – 2012. – Т. 141. – № 1. – С. 43–46. 162. Шатских, О. А. Реакция аминосодержащих структур тимуса на введение мелатонина / О. А. Шатских // Вестник Чуваш. ун-та. – 2013. – № 3. – 568–572. 163. Яковлева, Л. М. Морфофункциональные изменения слизистой оболочки тонкого кишечника у экспериментальных животных при хронической алкоголь- 144 ной интоксикации / Л. М. Яковлева, П. Б. Карышев, С. П. Сапожников // Здравоохранение Чувашии. – № 3. – 2009. – С. 52–55. 164. Ялалетдинова, Л. Р. СД4-позитивные клетки тимуса при введении хорионического гонадотропина / Л. Р. Ялалетдинова, С. А. Ястребова // Вестник Чуваш. ун-та. – 2013. – № 3. – С. 572–579. 165. Ярилин, А. А. Структура тимуса и дифференцировка Т-лимфоцитов / А. А. Ярилин, В. Г. Пинчук, Ю. А. Гриневич. – Киев : Наукова думка, 1991. – 244 с. 166. Ярилин, А. А. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор FOXP3 / А. А. Ярилин, А. Д. Донецкова // Иммунология. – 2006. – № 3. – С. 176–188. 167. Ястребова, С. А. Механизмы гидрокортизоновой иммуномодуляции биоаминной клеточной системы тимуса / С. А. Ястребова, В. Е. Сергеева. – Чебоксары : Изд-во «Мир Детектива», 1999. – 83 с. 168. Ahmed, Z. Actin–binding proteins coronin–1a and IBA–1 are effective microglial markers for immunohistochemistry / Z. Ahmed, G. Shaw, V. P. Sharma, C. Yang, E. McGowan, D. W. Dickson // J. Histochem. Cytochem. – 2007. – V. 55. – № 7. – Р. 687– 700. 169. Aichele, P. Macrophages of the splenic marginal zone are essential for trapping of blood-borne particulate antigen but dispensable for induction of specific T-cell responses / P. Aichele, J. Zinke, L. Grode, R. A. Schwendeneret al. // J. Immunol. – 2003. – V. 171. – Р. 1148–1155. 170. Ainsworth, S. K. Histamine release from platelets for assay of byssinogenic substances in cotton mill dust and related materials / S. K. Ainsworth, R. E. Neuman, R. A. Harley // Br J Ind Med. – 1979. – V. 36. – №. 1. – P. 35–42. 171. Allison, A. C. Potentiation by silica of the growth of Mycobacterium tuberculosis in macrophage cultures / A. C. Allison, P. D'A Hart // Br J Exp Pathol. – 1968. – V. 49. – P. 465−476. 172. Amaral, M. M. Histamine improves antigen uptake and cross-presentation by dendritic cells / M. M. Amaral, C. Davio, A. Ceballos, G. Salamone et al. // The Journal 145 of Immunology. – 2007. – V. 179. – C. 3425–3433. 173. Beauliu, A. D. Differential expression of two major cytokines produced by neutrophils, interleukin-8 and the interleukin-1 receptor antagonist, in neutrophils isolated from the synovial fluid and peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis / A. D. Beauliu, S. R. McColl // Arthritis Rheum. – 1994. – V. 6. – P. 855–859. 174. Bologna-Molina, R. Comparison of the value of PCNA and Ki–67 as markers of cell proliferation in ameloblastic tumors / R. Bologna-Molina, A. Mosqueda-Taylor, N. Molina-Frechero, A. D. Mori-Estevez, G. Sánchez-Acuña // Med Oral Patol Oral Cir Bucal. – 2013. – V. 18. – №. 2. – P. 174–179. 175. Brown, J. M. Silica-directed mast cell activation is enhanced by scavenger receptors / J. M. Brown, E. J. Swindle, N. M. Kushnir-Sukhov, A. Holian, D. D. Metcalfe // Am J Respir Cell Mol Biol. – 2007. – V. 36 – P. 43−52. 176. Brown, M. A. Mast cells are important modifiers of autoimmune disease: with so much evidence, why is there still controversy? / M. A. Brown, J. K. Hatfield // Front. Immun. – 2012. – V. 3. – P. 147. doi:10.3389/fimmu.2012.00147. 177. Cai, K. Probing the mechanisms of silicon-mediated pathogen resistance / K. Cai, D. Gao, J. Chen, S. Luo // Plant Signaling & Behavior. – 2009. – V. 4. – № 1. – P. 1–3. 178. Caron, G. Histamine induces CD86 expression and chemokine production by human immature dendritic cells / G. Caron, Y. Delneste, E. Roelandts, C. Duez, et al. // J. Immunol. – 2001. – V. 166. – P. 6000–6006. 179. Cassela, S. L. The Nalp3 inflammasome is essential for the development of silicosis / S. L. Cassela, C. Stephanie, B. C. Eisenbarth, S. Shankar et al. // PNAS. – 2008. – V. 105. – № 26. – P. 9035–9040. 180. Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen / M. F. Cesta // Toxicol Pathol. – 2006. – V. 34. – P. 455–465. 181. Cha, J. N. Silicatein filaments and subunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro / J. N. Cha, K. Shimizu, Y. Zhou, 146 S. C. Christiansen et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1999. – V. 96. – P. 361–365. 182. Chen, Z. Identification, isolation, and characterization of daintan, a macrophage polypeptide witn effects on insulin secretion and abundantly present in the pancreas of prediabetic BB rats / Z. Chen, B. Ahzen, C. Ostenson, T. Bergman, et al. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 1997. – № 97. – P. 13879–13884. 183. Cross, S. A. A study of methods available for cyto–chemical localization of histamine by fluorescence induced with ophtaldehyde or acetaldehyde / S. A. Cross, S. W. Even, F. W. Rost // Histochem. J. – 1971. – V. 3. – № 6. – P. 471–476. 184. Cruz Guerra, N. A. Silica urolithiasis: report of a new case / N. A. Cruz Guerra, M. A. Gómez García, F. Lovaco Castellano, J. C. Saez Garrido et al. // Actas Urol. Esp. – 2000. – V. 24. – № 2. – Р. 202–204. 185. Currie, H. A. Silica in plants: biological, biochemical and chemical studies. / H. A. Currie, C. C. Perry // Ann Bot. – 2007. – 100. – P.1383–1389. 186. Dagenais, M. The inflammasome: in memory of Dr. Jurg Tschopp / M. Dagenais, A. Skeldon, M. Saleh // Cell Death Differ. – 2012. – V. 19. – № 1. – Р. 5–12. 187. Damaj B. B. Functional expression of H4 histamine receptor in human natural killer cells, monocytes, and dendritic cells / B. B. Damaj, C. B. Becerra, H. J. Esber, Y. Wen et al. // J. Immunol. – 2007. – V. 179. – № 11. – P. 7907–7915. 188. Davis, G. S. Lymphocytes, lymphokines, and silicosis / G. S. Davis, C. E. Holmes, L. M. Pfeifer, D. R. Hemenway // J Environ Pathol Toxicol Oncol. – 2001. – V. 20. – Suppl. 1 – P. 53–65. 189. Dawicki, W. Mast cells, histamine, and Il-6 regulate the selective influx of dendritic cell subsets into an inflamed lymph node / W. Dawicki, D. Jawdat, N. Xu, J. Marshall // J. Immunol. – 2010. – V. 184. – P. 2116–2123. 190. Dominguez-Gerpe, L. Alterations induced by chronic stress in lymphocyte subsets of blood and primary and secondary immune organs of mice / L. Domin-guezGerpe, M. Rey-Mendez // BMC Immunol. – 2001. – V. 2. – № 1. – P. 7. 191. Epstein E. The anomaly of silicon in plant biology // Proc. Natl. Acad. Sci. 147 USA. – 1994. – V. 91. – P. 11–17. 192. Flaherty, D. M. Oxidant–mediated increases in redox factor-1 nuclear protein and activator protein–1 DNA binding in asbestos–treated macrophages / D.M. Flaherty, M. M. Monick, A. B. Carter, M. W. Peterson et al. // Journal of Immunology. – 2002. – V. 168. – P. 5675–5681. 193. Flythe, J. E. Silicate nephrolithiasis after ingestion of supplements containing silica dioxide / J. E. Flythe, J. F. Rueda, M. K. Riscoe, S. Watnick // Am J Kidney Dis. – 2009. – V. 54. – № 1. – Р. 127−130. 194. Foissner, W. Cover of Glass: First Report of Biomineralized Silicon in a Ciliate, Maryna umbrellata (Ciliophora: Colpodea) / W. Foissner, B. Weissenbacher, W. Krautgartner, U.A. Lütz-Meindl // J. Eukaryot. Microbiol. – 2009. – V. 56. – № 6. – P. 519– 530. 195. Fukui, Y. The restraint stressinduced reduction in lymphocyte cell number in lymphoid organs correlates with the suppression of in vivo antibody production / Y. Fukui, N. Sudo, X. N. Yu et al. // J. Neuroimmunol. – 1997. – V. 79. – № 2. – P. 211–217. 196. Ginaldi, L. The immune system in the elderly: IT. Specific cellular immunity / L. Ginaldi, M. De Martinis, A. De Ostilio // Immunol Res. – 1999. – V. 20. – № 2. – P. 109–115. 197. Grainger, J. Microbe-dendritic cell dialogue controls regulatory T–cell fate / J. Grainger, J. Hall, N. Bouladoux, G. Oldenhove et al. // Immunol Rev. – 2010. – Vol. 234(1) . – P. 305–316. doi:10.1111/j.0105–2896.2009.00880.x. 198. Hemandez-Verdun, D. Cell biological basis of AgNOR stain / D. HemandezVerdun, P. Roussel // Virchows Archiv B. – 1995. – V. 427. – P. 326–327. 199. Hirota, R. the silicon layer supports acid resistance of bacillus cereus spores / R. Hirota, Y. Hata, T. Ikeda, T. Ishida et al. // Journal of Bacteriology. – 2010. – V. 192. – №. 1. – P. 111–116. 200. Hoefsmit, E. С. Reticulum cells and macrophages in the immune response mononuclear phagocytes, edit. / E. C. Hoefsmit, E. W. Kamperdijk, B. M. Balfour // 148 Martinus Nijhoff Publishers. – 1980. – P. 1809–1836. 201. Hudson, S. The biocompatibility of mesoporous silicates / S. Hudson, R. F. Padera, R. Langer, D. S. Kohane // Biomaterials. – 2008. – V. 29. – № 30. – P. 4045– 4055. 202. Imai, Y. Intracellular signaling in M-CSF-induced microglia activation: role of Iba1 / Y. Imai. S. Kohsaka // Glia. – 2002. – V. 40. – № 2. – Р. 164–74. 203. Inahara, M. Silicate calculi: report of four cases / M. Inahara, M. Amakasu, M. Nagata, K. Yamaguchi // Hinyokika Kiyo. – 2002. – V. 48. – № 6. – P. 359–362. 204. Jelinek, I. Increased antigen presentation and Th1 polarization in genetically histamine–free mice / I. Jelinek, V. Laszlo, E. Buzas, E. Pallinger, B. Hangya, Z. Horvath, A. Falus // International Immunology. – 2006. – V. 19. – № 1. –P. 51–58. 205. Johnston, C. J. Pulmonary chemokine and mutagenic responses in rats after subchronic inhalation of amorphous and crystalline silica / C. J. Johnston, K. E. Driscoll, J. N. Finkelstein, et al. // Toxicol Sci. – 2000. – V. 56. – № 2 – P. 405–413. 206. Jugdaohsingh, R. Increased longitudinal growth in rats on a silicon-depleted diet / R. Jugdaohsingh M. R. Calomme, K. Robinson, F. Nielsen, S. H. C. Anderson, P. D'Haese, P. Geusens, N. Loveridge, R. P. H.Thompson, J. J. Powell // Bone. – 2008. – V. 43 – № 3 – P. 596–606. 207. Jugdaohsingh, R. Oligomeric but not monomeric silica prevents aluminum absorption in humans. / R. Jugdaohsingh, D. M. Reffitt, C. Oldham, J. P. Day et al. // Am J Clin Nutr. – 2000. – V. 71. – № 4. – P. 944–949. 208. Jugdaohsingh, R. Silicon and bone health / R. Jugdaohsingh // J Nutr Health Aging. – 2007. –V. 11. – № 2. – P. 99–110. 209. Jung, C. Peyer’s patches: the immune sensors of the intestine / C. Jung, J.-P. Hugot, F. Barreau // International Journal of Inflammation. – V. 2010. Article ID 823710, 12 pages. doi:10.4061/2010/823710. 210. Junnila, S. K. Nanocolloidal amorphous silica in drinking water as an autoimmunity trigger in Finland / S. K. Junnila // Med Hypotheses. – 2011. – V. 77. – № 5. – 149 P. 815−817. 211. Jurkić, L. M. Biological and therapeutic effects of ortho-silicic acid and some ortho-silicic acid-releasing compounds: New perspectives for therapy / L. M. Jurkić, I. Cepanec, S. K. Pavelić, K. Pavelić // Nutrition & Metabolism. – 2013. – V.10:2. doi:10.1186/1743–7075–10–2. 212. Keeler, R. F. Silicon metabolism and silicon-protein matrix interrelationship in bovine urolithiasis / R. F. Keeler // Ann N. Y. Acad Sci. – 1963. – V. 5. – № 104. – P. 592−611. 213. Kim, M. H. Silicon supplementation improves the bone mineral density of calcium-deficient ovariectomized rats by reducing bone resorption / M. H. Kim, Y. J. Bae, M. K. Choi, Y. S. Chung // Biol Trace Elem Res. – 2009. – V. 128. – № 3. – P. 239−247. 214. Klockars, M. Silica exposure and rheumatoid arthritis: a follow up study of granite workers 1940–81 / M. Klockars, R.-S. Koskela, E. Jarvinen, P. J. Kolari, et al. // British Medical Journal. – 1987. – V. 294. – P. 997−1000. 215. Kohler, С. Allograft inflammatory factor-1/Ionized calcium-binding adapter molecule I is specifically expressed by most subpopulations of macrophages and spermatids in testis / С. Kohler // Cell Tissue Res. – 2007. – V. 330. – P. 291–302. 216. Kraal, G. New insights into the cell biology of the marginal zone of the spleen / G. Kraal, R. Mebius // Int Rev Cytol. – 2006. – Vol. 250. – P. 175–215. 217. Kumar, R. K. Quantitative immunohistologic assessment of lymphocyte populations in the pulmonary inflammatory response to intratracheal silica / R. K. Kumar // American Journal of Pathology. – 1989. – V. 135. – № 4. – P. 605−614. 218. Langley R. J. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an antiapoptotic response in Lewis rats / R. J. Langley, N.C. Mishra, J. C. Peña-Philippides, J. A. Hutt, M. L. Sopori // J Toxicol Environ Health A. – 2010. – V. 73. – № 10. – P. 669–683. 219. Law, C. New insight into silica deposition in horsetail (Equisetum arvense) / C. 150 Law, C. Exley // BMC Plant Biology. – 2011. – V. 11. – P. 112. 220. Lee, K. W. Systemic candidosis in silicatreated athymic and euthymic mice / K. W. Lee, E. Balish // Infect Immun. – 1983. – V. 41. – № 3. – P. 902. 221. Lee, M. H. Silica stone-development due to long time oral trisilicate intake / M. H. Lee, Y. H. Lee, T. H. Hsu, M. T. Chen, L. S. Chang // Scand. J. Urol. Nephrol. – 1993. – V. 27. – № 2. – P. 267–269. 222. Li, Zh. Absorption of silicon from artesian aquifer water and its impact on bone health in postmenopausal women: a 12 week pilot study / Zh. Li, H. Karp, A. Zerlin, T. Y. A. Lee, C. Carpenter, D. Heber // Nutrition Journal. – 2010. – V. 9. – P. 44. 223. Lipscomb, M. F. Dendritic cells: immune regulators in health and disease / M. F. Lipscomb, B. J. Masten // Physiol Rev. – 2002. – V. 82. – Р. 97–130. 224. Liu, F. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica–induced lung fibrosis in mice / F. Liu, J. Liu, D. Weng, Y. Chen, L. Song et al. // PLoS ONE. – 2010. – V. 5. – P. 11:e15404. 225. Ma, J. F. Genotypic difference in silicon uptake and expression of silicon transporter genes in rice / J. F. Ma, N. Yamaji, K. Tamai, N. Mitani // Plant Physiology. – 2007. – V. 145. – P. 919–924. 226. Ma, J. F. Transport of silicon from roots to panicles in plants / J. F. Ma, N. Yamaji, N. Mitani-Ueno // Proc. Jpn. Acad. – 2011. – V. 87. – P. 377–385. 227. Macdonald, H. M. Dietary silicon interacts with oestrogen to influence bone health: evidence from the aberdeen prospective osteoporosis screening study / H. M. Macdonald, A. C. Hardcastle, R. Jugdaohsingh, W. D. Fraser et al. // Bone. – 2012. – V. 50. – № 3. – P. 681–687. 228. Maehira, F. Effects of soluble silicon compound and deep–sea water on biochemical and mechanical properties of bone and the related gene expression in mice / F. Maehira, Y. Iinuma, Y. Eguchi, I. Miyagi et al. // J Bone Miner Metab. – 2008. – V. 26. – № 5. – P.446−455. 229. Mazzoni, A. Histamine regulates cytokine production in maturing dendritic 151 cells, resulting in altered T cell polarization. / A. Mazzoni, H. A. Young, J. H. Spitzer, A. Visintin et al. // J. Clin. Invest. – 2001. – V. 108. – P. 1865. 230. McGaha, T. L. Marginal zone macrophages suppress innate and adaptive immunity to apoptotic cells in the spleen / T. L. McGaha, Y. Chen, B. Ravishankar, N. van Rooijen et al. // Blood. – 2011. – V. 117. – 20. – P. 5403–5412. 231. McKenna. K. Innate and adaptive immunity plasmacytoid dendritic cells: linking / K. McKenna, A.-S. Beignon, N. Bhardwaj // J. Virol. – 2005. – V. 79. – №. 1. – Р. 17–27. 232. Mera, M. U. Mechanism of silicate binding to the bacterial cell wall in Bacillus subtilis / M. U. Mera, T. J. Beveridge // J. of Bacteriology. – 1993. – V. 175. – № 7. – P. 1936–1945. 233. Migliaccio, C. T. Increase in a distinct pulmonary macrophage subset possessing an antigen-presenting cell phenotype and in vitro APC activityfollowing silica exposure / C. T. Migliaccio, R. F.(Jr.) Hamilton, A. Holian // Toxicol Appl Pharmacol. – 2005. –V. 1:205. – № 2. – P. 168−176. 234. Mitani-Ueno, N. Silicon efflux transporters isolated from two pumpkin cultivars сontrasting in Si uptake / N. Mitani-Ueno, N. Yamaji, J. F. Ma // Plant Signaling & Behavior. – 2011. – V. 6:7. – P. 991–994. 235. Miura, M. Detection of chromatin-bound PCNA in mammalian cells and its use to study DNA excision repair / M. Miura // J. Radiat. Res. – 1999. – V. 40. – P. 1–12. 236. Mizuta H. Protective function of silicon deposition in Saccharina japonica sporophytes (Phaeophyceae) / H. Mizuta, H. Yasui // J. Appl. Phycol. – 2012. – V. 24. – P. 1177–1182. 237. Mueller, W. E. G. Silicateins, the major biosilica forming enzymes present in demosponges: Protein analysis and phylogenetic relationship / W. E. G. Mueller, A. Boreiko, X. Wang, S. I. Belikov et al. // Gene. – 2007. – V. 395. – P. 62–71. 238. Mulloy, K. B. Silica exposure and systemic vasculitis / K. B. Mulloy // Environmental Health Perspectives. – 2003. – 111. – № 16. – P. 1933−1938. 152 239. Murakami, S. Cytokine alteration and speculated immunological pathophysiology in silicosis and asbestos-related diseases / S. Murakami, Y. Nishimura, M. Maeda, N. Kumagai et al. // Environ Health Prev Med. – 2009. – V. 14. – P. 216–222. doi 10.1007/s12199–008–0063–8. 240. Napierska, D. The nanosilica hazard: another variable entity / D. Napierska, L. C. J. Thomassen, D. Lison, J. A. Martens et al. // Particle and Fibre Toxicology. – 2010. – V. 7. – P. 39. 241. Nepom G. T. MHC Class II Tetramers / G. Nepom // The Journal of Immunology. – 2012. – V. 188. – P. 2477–2482. 242. Nielsen, F. H. A novel silicon complex is as effective as sodium metasilicate in enhancing the collagen-induced inflammatory response of silicon-deprived rats / F. H. Nielsen // J Trace Elem Med Biol. – 2008. – V. 22. – № 1. – P. 39−49. 243. Nielsen, F. H. Nutritional requirements for boron, silicon, vanadium, nickel, and arsenic: current knowledge and speculation / F. H. Nielsen // FASEB J. – 1991. – V. 5. – P. 2661−2667. 244. Nishizono, T. Renal silica calculi in an infant / T. Nishizono, S. Eta, H. Enokida, K. Nishiyama et al. // Int J Urol. – 2004. – V. 11. – № 2. – Р. 119−121. 245. Ohsawa, K. Microglia/macrophage–specific protein Ibal binds to fimbrin and enhances its actin–binding activity / K. Ohsawa, Y. Imai, Y. Sasaki, S.Kohsaka // J. Neurochem. – 2004. – V. 88. – P. 844–856. 246. Ojo-Amaize, E. A. Elevated concentrations of interleukin–1b and interleukin– receptorantagonist in plasma of women with silicone breast implants / E. A. OjoAmaize, O. J. Lawless, J. B. Peter // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. – 1996. – P. 257–259. 247. Otsuki, T. Pathophysiological development and immunotoxicology: what we have found from research related to silica and silicate such as asbestos / T. Otsuki, Y. Miura, M. Maeda, H. Hayashi et al. // Environmental Health and Preventive Medicine. – 2007. – V. 12. – P. 153 –160. 153 248. Parks, C. G. Occupational exposure to crystalline silica and autoimmune disease / C. G. Parks, K.Conrad, G. S. Cooper // Environ Health Perspect. – 1999. – V. 107. – № 5. – P. 793−802. 249. Pashenkov, M. Augmented expression of daintain/allograft inflammatory factor-1 is associated with clinical disease: dynamics of daintain/allograft inflammatory factor-1 is expression in spleen, peripheral nerves and sera during experimental autoimmune neuritis / M. Pashenkov, S. Efendic, J. Zhu, L. P. Zou, et al. // Scand J. Immunol. – 2000. – V. 52. – P. 117–122. 250. Pasula, R. Macrophages mice: potential role of repopulating susceptibility to mycobacterial infection in airway delivery of silica / R. Pasula, B. E. Britigan, J. Turner, W. J. II Martin // Increases J Immunol. – 2009. – V. 182. –7102−7109. 251. Perkins, T. N. Differences in gene expression and cytokine production by crystalline vs. amorphous silica in human lung epithelial cells / T. N. Perkins, A. Shukla, P. M. Peeters, J. L. Steinbacher et al. // Particle and Fibre Toxicology. – 2012. – V. 9. – P. 6. 252. Pilette, C. Oxidative burst in lipopolysaccharide–activated human alveolar macrophages is inhibited by interleukin-9 / C. Pilette, Y. Ouadrhiri, J. Van Snick, J.-C. Renauld et al. // Eur Respir J. – 2002. – V. 20. – P. 1198–1205. 253. Poulsen, N. Biosilica formation in diatoms: characterization of native silaffin-2 and its role in silica morphogenesis / N. Poulsen, M. Sumper, N. Kröger // PNA. – 2003. – V. 100. – № 21. – P. 12075–12080. 254. Powell, J. J. Dietary microparticles and their impact on tolerance and immune responsiveness of the gastrointestinal tract / J. J. Powell, V. Thoree, L. C. Pele // Br J Nutr. – 2007. – V. 98. – № 1. – P. 59–63. 255. Puri, J. K. Silatranes: a rewiew on their synthesis, structure, reactivity and applications / J. K. Puri, R. Singh, V. K. Chahal // Chem Soc Rev. – 2011. – V. 40. – № 3. – P. 1791–840. 256. Randall, T. D. Development of secondary lymphoid organs / T. D. Randall, D. 154 M. Carragher, J. Rangel-Moreno // Annu Rev Immunol. – 2008. – V. 26. – P. 627–650. doi:10.1146/annurev.immunol.26.021607.090257. 257. Rehg, J. E. The utility of immunohistochemistry for the identification of hematopoietic and lymphoid cells in normal tissues and interpretation of proliferative and inflammatory lesions of mice and rats / J. E. Rehg, D. Bush, J. M. Ward // Toxicol Pathol. – 2012. – 40. – P. 345–374. doi:10.1177/0192623311430695. 258. Religa, Z. Histamine metabolism in experimental silicosis. Experiments on the isolated rat lung and on guinea pig lung homogenates and sections / Z. Religa, C. I. Malinski // Life Sciences. – 1970. – V. 9. – P. 689–700. 259. Rönnberg, E. Mast cell proteoglycans / E. Rönnberg, F. R. Melo, G. Pejler // Journal of Histochemistry & Cytochemistry. – 2012. –V. 60. – № 12. – P. 950–962. 260. Ruddle, N. H. Secondary lymphoid organs: responding to genetic and environmental cues in ontogeny and the immune response / N. H. Ruddle, E. Akirav // J. Immunol. – 2009. – V. 183. – P. 2205–2212. doi:10.4049/jimmunol.0804324. 261. Sarilova, I. L. Effect of orchiectomy on structures of the thymus expressing major histocompatibility complex class II molecules / I. L. Sarilova, V. E. Sergeeva, A. T. Smorodchenko // Bull Exp Biol Med. – 2008. – V. 145. – № 1. – P. 96–98. 262. Saw, J. H. Encapsulated in silica: genome, proteome and physiology of the thermophilic bacterium Anoxybacillus flavithermus / J. H. Saw, W. Mountain Bruce, L. Feng, M. V. Omelchenko et al. // Genome Biology. – 2008. –V. 9. – Р. R161.1– R161.12. 263. Schroeder, H. C. Silicase, an enzyme which degrades biogenous amorphous silica: contribution to the metabolism of silica deposition in the demosponge Suberites domuncula / H. C. Schroeder, A. Krasko, G. LePennec, T. Adell et al. // Prog. Mol. Subcell. Biol. – 2003. – Vol. 33. – P. 249–268. 264. Seaborn, C. D. Dietary silicon and arginine affect mineral element composition of rat femur and vertebra / C. D. Seaborn, F. H. Nielsen // Biol Trace Elem Res. – 2002. – V. 89. – № 3. – P. 239−250. 155 265. Seaborn, C. D. Silicon deprivation decreases collagen formation in wounds and bone, and ornithine transaminase enzyme activity in liver / C. D. Seaborn, F. H. Nielsen // Biol Trace Elem Res. – 2002. – V. 89. – № 3. – P. 251−261. 266. Shen, G.-Q. Silicate antibodies in women with silicone breast implants: development of an assay for detection of humoral immunity / G.-Q. Shen, E. A. Ojo-Amaize, M. S. Agopian, J. B. Peter // Clinical And Diagnostic Laboratory Immunology. – 1996. – V. 3. – № 2. – P. 162−166. 267. Sivasankaran, M. A. Nutrient concentration in groundwater of Pondicherry region / M. A. Sivasankaran, R. S. Sivamurthy, R. Ramesh // J Environ Sci Eng. – 2004. – V. 46. – № 3. – P. 210−216. 268. Smalley, D. L. Monocyte dependent stimulation of human T cells by silicon dioxide / D. L. Smalley, D. R. Shanklin, M. F. Hall // Pathobiology. – 1998. – V. 66. – № 6. – P. 302−305. 269. Smith, G. S. Digestion, with interactions of glucose, urea and minerals effects of sodium silicate added to rumen cultures on forage / G. S. Smith, Ar. B. Nelson // J Anim Sci. – 1975. – V. 41. – Р. 891−899. 270. Smith, G. S. Effects of «soluble silica» on growth, nutrient balance and reproductive performance of albino rats / G. S. Smith, A. L. Neumann, V. H. Gledhill, C. A. Arzola // J Anim Sci. – 1973. – V. 36. – P. 271−278. 271. Smorodchenko, A. CNS-irrelevant T-cells enter the brain, cause blood-brain barrier disruption but no glial pathology / A. Smorodchenko, J. Wuerfel, E. E. Pohl, J. Vogt et al. // Eur J Neurosci. – 2007. – V. 26. – № 6. – P. 1387–1398. 272. Song, L. Tregs promote the differentiation of Th17 cells in silica-induced lung fibrosis in mice / L. Song, D. Weng, F. Liu, Y. Chen et al. // PLoS ONE. – 2012. – V. 7. – № 5. – P. e37286. 273. Speck-Hernandez, C. A. Silicon, a possible link between environmental exposure and autoimmune diseases: the case of rheumatoid arthritis / C.A. Speck– Hernandez, G. Montoya-Ortiz // Hindawi Publishing Corporation Arthritis – Vol. 2012. 156 – Article ID 604187. – 11 pages. doi:10.1155/2012/604187. 274. Sripanyakorn, S. The comparative absorption of silicon from different foods and food supplements / S. Sripanyakorn, R. Jugdaohsingh, W. Dissayabutr, S. H. C. Anderson et al. // Br J Nutr. – 2009. – V. 102. – № 6. – P. 825–834. 275. Subra, J. F. Lymphopenia in occupational pulmonary silicosis with or without autoimmune disease / J. F. Subra, G. Renier, P. Reboul, F. Tollis et al. // Clin Exp Immunol. – 2001. – V. 126. – P. 540−544. 276. Szakal, A. K. Microanatomy of lymphoid tissue during humoral immune responses: structure function relationships / A. K. Szakal, M. H. Kosco, J. G. Tew // Ann Rev Immunol. – 1989. – V. 7. – P. 91–109. 277. Teuber, S. S. Immunopathologic effects of silicone breast implants / S. S. Teuber, S. H. Yoshida, M. E. Gershwin // West J Med. – 1995. – V. 162. – P. 418−425. 278. Thamatrakoln, K. Silicon uptake in diatoms revisited: a model for saturable and nonsaturable uptake kinetics and the role of silicon transporters / K. Thamatrakoln, M. Hildebrand // Plant Physiology. – 2008. – V.146. – P. 1397–1407. 279. Theoharides, T. C. Mast cells and inflammation / T. C. Theoharides, K.–D. Alysandratos, A. Angelidou, D.-A. Delivanis et al. // Biochim Biophys Acta. – 2012. – V. 1822. – № 1. – P. 21–33. doi:10.1016/j.bbadis.2010.12.014. 280. Tomokuni, A. Serum levels of soluble Fas ligand in patients with silicosis / A. Tomokuni, T. Otsuki, Y. Isozaki, S. Kita et al. // Clin Exp Immunol. – 1999. – V. 118. – P. 441−444. 281. Ueki, A. Polyclonal human Ticell activation by silicate in vitro / A. Ueki, M. Yamaguchi, H. Ueki, Y. Watanabe et al. // Immunology. – 1994. – V. 82. – № 2. – P. 332–335. 282. Utans, U. Cloning and characterization of allograft inflammatory factor-1: a novel macrophage factor identified in rat cardiac allografts with chronic rejection / U. Utans, R. Arceci, Y. Yamashita, M. Russell // J Clin Invest. – 1995. – V. 95. – P. 2954– 2962. 157 283. Vacek, P. M. The translocation of inhaled silicon dioxide: an empirically derived compartmental model / P. M. Vacek, D. R. Hemenway, M. P. Absher, G. Goodwin // Fundam Appl Toxicol. – 1991. – V. 17. – №. 3. – P. 614−626. 284. Van Ziverden, M. Diesel exhaust, carbon black, and silica particles display distinct Th1/Th2 modulating activity / M. van Ziverden, A. van der Pijl, M. Bol, F. A. van Pinxteren et al. // Toxicol Appl Pharmacol. – 2000. – V. 168. – № 2. – P. 131–139. 285. Varas, V. A. The role of calcium in lymphocyte proliferation (an interpretive review) / V. A. Varas, J. Moreno, R. Sacedon, E. Jimenez et al. // Blood. – 1983. – V. 61. – № 3. – P. 413–422. 286. Vivero-Escoto, J. L. Inorganic-organic hybrid nanomaterials for therapeutic and diagnostic imaging applications / J. L. Vivero-Escoto, Y.-T. Huang // Int J Mol Sci. – 2011. – V. 12. – P. 3888−3927. 287. Wagner, M. M. F. Mast cells and inhalation of asbestos in rats / M. M. F. Wagner, R. E. Edwards, C. B. Moncrieff, J. C. Wagner // Thorax. – 1984. – V. 39. – P. 539– 544. 288. Weissman, D. N. IgG subclass responses in experimental silicosis. / D. N. Weissman, A. F. Hubbs, S. H. Huanq, C. F. Stanley et al. // J Environ Pathol Toxicol Oncol. – 2001. – V. 20. – Suppl.1 – P. 67–74. 289. Williams, H. D. Strategies to address low drug solubility in discovery and development / H. D. Williams, N. Trevaskis, S. Charman, R. Shanker et al. // Pharmacol Rev. – 2013. – V. 65. – P. 315–499. http://dx.doi.org/10.1124/pr.112.005660. 290. Winter, M. Activation of the inflammasome by amorphous silica and TiO2 nanoparticles in murine dendritic cells / M. Winter, H. D. Beer, V. Hornung, U. Krämer et al. // Nanotoxicology. – 2011.– V. 5. – № 3. – P. 326–340. 291. Woolley, D. E. Observations on the microenvironmental nature of cartilage destruction in rheumatoid arthritis / D. E. Woolley, L. C. Tetlow // Ann Rheum Dis. – 1997. – V. 56. – P. 151–161. 292. Wynne, A. M. Immune and behavioral consequences of microglial reactivity in 158 the aged brain / A. M. Wynne, C. J. Henry, J. P. Godbout // Integr Comp Biol. – 2009. – V. 49. – № 3. – P. 254–266. 293. Zampeli, E. The role of histamine H4 receptor in immune and inflammatory disorders / E. Zampeli, E. Tiligada // British Journal of Pharmacology. – 2009. – V. 157. – P. 24–33. 294. Zimmermani, B. T. Silica decreases phagocytosis and bactericidal activity of both macrophages and neutrophils in vitro / B. T. Zimmermani, B. P. Canono, P. A. Campbell // Immunology. – 1986. – V. 59. – P. 521−525. 295. Zurzolo, C. Exploring bioinorganic pattern formation in diatoms. A Story of Polarized Trafficking / C. Zurzolo, C. Bowler // Plant Physiology. – 2001. –V. 127. – P. 1339–1345. 159 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода; ИСП – интенсивность светопропускания; М-П – связь между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки; Ц-М – связь между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы; Ц-П – связь между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки; CD (cluster of differentiation) –кластер дифференцировки; CD4 – антигенный маркер Т-хелперов; CD8 – антигенный маркер цитотоксических Т-лимфоцитов; Iba-1 – кальций связывающий белок; иммуногистохимический маркер клеток моноцитарно-макрофагального происхождения; MHC (major histocompaltibility complex) – главный комплекс гистосовместимости; MHC-II – главный комплекс гистосовместимости второго класса; Th1 –Т-хелперы первого типа; Th2 –Т-хелперы второго типа. 160 ПЕРЕЧЕНЬ ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА Перечень таблиц № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Название таблицы Свойства кремнийсодержащих соединений (цит. с изменениями по: Speck-Hernandez C. A., Montoya-Ortiz G., 2012). Химический состав питьевой воды, употребляемой животными контрольной и экспериментальных групп. Характеристики тучных клеток тимуса крыс контрольной и опытной групп. Средние размеры тучных клеток, проявляющих разные тинкториальные свойства при окраске по методу Унна Некоторые особенности тучных клеток экспериментальных животных. Признаки Iba-1-позитивных клеток тимуса лабораторных крыс. Интенсивность люминесценции гистамина в структурах тимуса экспериментальных животных (М±m, у.е.). Морфометрические показатели вторичных лимфоидных узелков селезенки лабораторных крыс (М±m). Сравнительная характеристика Iba-1-позитивных клеток селезенки лабораторных крыс. Сравнительная характеристика MHC-II-позитивных клеток селезенки лабораторных крыс. Интенсивность люминесценции гистамина в структурах селезенки экспериментальных животных (М±m, у.е.). Морфометрические показатели лимфоидных узелков пейеровых бляшек лабораторных крыс (М±m). Характеристика MНС-II-позитивных клеток пейеровых бляшек лабораторных крыс (М±m). Интенсивность люминесценции гистамина в структурах пейеровых бляшек экспериментальных животных (М±m, у. е.). Страница 36 41 53 55 56 59 70 73 78 82 87 93 99 103 161 Перечень рисунков № п/п 1 2 3. 4. 5 6 7 8 9 Подпись к рисунку Дольки тимуса лабораторных крыс. Окраска гематоксилинэозином. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 4. Ок. 10. А – тимус животного контрольной группы. Б – тимус животного, получавшего кремний с питьевой водой. 1 – мозговое вещество долек тимуса. Тучные клетки в корковых перегородках тимуса лабораторных крыс. Окраска толуидиновым синим по Унна. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. А – тимус животного контрольной группы. Б – тимус животного, получавшего кремний с питьевой водой. Iba-1-позитивные клетки коркового вещества долек тимуса. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. А – контроль. Б – опыт. Iba-1-позитивные клетки на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. А – контроль. Б – опыт. Корреляционные связи между характеристиками Iba-1позитивных клеток. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. А – корковое вещество долек тимуса. Б – граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса. Морфологическая параллель. Тимус животного контрольной группы. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. А – иммуногистохимический метод, выявляющий Iba-1-позитивные клетки. Б – иммуногистохимический метод, выявляющий MHC-IIпозитивные клетки. MHC-II-позитивные клетки на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса животных контрольной группы. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. MHC-II-позитивные клетки на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса животных опытной группы. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. Тимус лабораторной крысы контрольной группы. Метод Cross-Ewen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-1. Об. 4. Ок. 10. Страница 51 54 58 60 62 64 65 65 68 162 10 11 12 13 14 15 16 17 Тимус лабораторной крысы опытной группы. Метод CrossEwen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-1. Об. 4. Ок. 10. Селезенка лабораторных крыс. Окр. Гематоксилин-эозин и альциановый синий. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. A – селезенка животного контрольной группы. Б – селезенка животного опытной группы. Iba-1-позитивные клетки селезенки экспериментальных животных. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. А – селезенка животного контрольной группы. Б – селезенка животного из группы, получавшей питьевую воду с кремнием. 1 – красная пульпа, 2 – маргинальная зона лимфоидных узелков. Iba-1-позитивные клетки селезенки экспериментальных животных. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. А – селезенка животного контрольной группы. Б – селезенка животного из группы, получавшей питьевую воду с кремнием. 1 – Iba-1позитивные клетки маргинальной зоны белой пульпы, 2 – Iba1-позитивные клетки красной пульпы. Корреляционные связи между характеристиками Iba-1позитивных клеток селезенки. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. А – красная пульпа. Б – маргинальная зона белой пульпы.. Распределение по размерам Iba-1-позитивных клеток в функцииональных зонах селезенки.. Корреляционные связи между характеристиками MHC-IIпозитивных клеток. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. А – лимфоидный узелок. Б – красная пульпа. Распределение по размерам MHC-II-позитивных клеток в функцииональных зонах селезенки. 68 72 76 77 79 80 83 84 163 18 19 20 21 22 23 24 25 Лимфоидные узелки селезенки животного опытной группы. Метод Cross-Ewen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-1. Об. 4. Ок. 10. 1 –лимфоидный узелок с люминесцирующими клетками. 2 – «пустой» лимфоидный узелок. 3 – люминесцирующие клетки красной пульпы. Лимфоидный узелок селезенки животного опытной группы. Метод Cross-Ewen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-1. Об. 20. Ок. 10. 1 – центральная артериола, 2 – люминесцирующие клетки лимфоидного узелка, 3 – люминесцирующие клетки синусоида белой пульпы, 4 – люминесцирующие клетки красной пульпы. Морфологическая параллель. Лимфоидные узелки селезенки животного, получавшего кремний с питьевой водой. А– двойной иммунофлуоресцентный метод, выявляющий белок PCNA. Микроскоп Nikon Eclipse 50I . Об. 10. Ок. 10. Б – окраска гематоксилин-эозином. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. Лимфоидный узелок селезенки. Иммунофлюоресцирующий метод для выявления PCNA. Микроскоп Nikon Eclipse 50I. Об. 10 Ок. 20. А – животное контрольной группы. Б – животное из группы, получавшей питьевую воду с кремнием. Пейеровы бляшки подвздошной кишки лабораторных крыс. Макропрепараты. А – пейерова бляшка животного контрольной группы. Б – пейерова бляшка животного опытной группы. Лимфоидные узелки пейеровых бляшек. Окр. Гематоксилинэозин и альциановый синий. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 4. Ок. 10. А – животное контрольной группы. Б – животное опытной группы. Iba-1-позитивные клетки в герминативных центрах лимфоидных узелков пейеровых бляшек. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10.А – контроль. Б – опыт. 1 – макрофаги с апоптотическими тельцами. Корреляционные связи между характеристиками Iba-1позитивных клеток герминативных зон лимфоидных узелков пейеровых бляшек. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки 86 86 90 21 94 94 96 98 164 26 27 28 29 Корреляционные связи между характеристиками MHC-IIпозитивных клеток пейеровых бляшек. А – герминативные центры лимфоидных узелков. Б – межузелковые зоны. М-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и площадью клетки, Ц-М – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазматической мембраны и интенсивностью светопропускания цитоплазмы, Ц-П – сила связи между интенсивностью светопропускания цитоплазмы и площадью клетки. Морфологическая параллель. Лимфоидный узелок пейеровой бляшки животного опытной группы. А. Гематоксилин-эозин. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 4. Ок. 10. Б. Метод Cross-EwenRost. Микроскоп ЛЮМАМ-2. Об. 4. Ок. 10. Лимфоидный узелок пейеровой бляшки животного опытной группы. Метод Cross-Ewen-Rost. Микроскоп ЛЮМАМ-2. Об. 10. Ок. 10. Морфологическая параллель. Лимфоидный узелок пейеровой бляшки тонкого кишечника животного контрольной группы. А – окраска гематоксилин-эозином и альциановым синим. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 10. Ок. 10. Б – двойной иммунофлуоресцентный метод PCNA. Микроскоп Nikon Eclipse 50I. Об. 10. Ок. 10. 100 102 102 105