ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО - МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ГИДРОКСОАПАТИТКОЛЛАГЕНОВОГО КОМПОЗИТА «ЛИТАР» ДЛЯ ЛИКВИДАЦИИ ОСТАТОЧНЫХ ПОЛОСТЕЙ В
advertisement
На правах рукописи Хижняк Ирина Игоревна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО - МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ГИДРОКСОАПАТИТКОЛЛАГЕНОВОГО КОМПОЗИТА «ЛИТАР» ДЛЯ ЛИКВИДАЦИИ ОСТАТОЧНЫХ ПОЛОСТЕЙ В ПЕЧЕНИ 14.01.17- Хирургия 03.03.04- Клеточная биология, цитология, гистология Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Третьяков Анатолий Андреевич доктор биологических наук, профессор Стадников Александр Абрамович Официальные оппоненты: Зав. каф. госпитальной хирургии с курсом реанимации, интенсивной терапии и экстремальной медицины лечебного факультета БУ «Ханты - Мансийская государственная медицинская академия» ХМАО - ЮГРы Хрячков Валерий Васильевич Зав. каф. гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России Логвинов Сергей Валентинович Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России г. Челябинск. Защита диссертации состоится « » 2015 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д.6. Зал заседаний Ученого совета. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМУ Минздрава Российской Федерации, по адресу: г. Оренбург, Парковый проспект, д.7. Автореферат разослан « 2015 г. » Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор 2 О.В.Бугрова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Закрытие остаточных полостей печени (ОПП) является актуальной проблемой современной реконструктивной хирургии (Альперович Б.И.,1999; Назыров Ф.Г.,1999; Нечитайло М.Е. с соавт., 2001; Колкин Я.Г.,2011). Остаточные полости в печени возникают в результате хирургического лечения различных кистозных образований, в том числе непаразитарной и паразитарной этиологии (эхинококкоз), опухолей, абсцессов печени и посттравматических образований. Чаще всего (до 80%) при эхинококкозе поражается печень (Аскерханов Р.П., 1976; Петровский Б.В., Милонов О.Б., 1985; Ferrari А.,1995).Часто образующиеся в результате хирургического лечения очаговых заболеваний печени остаточные полости, таят в себе угрозу развития грозных осложнений: кровотечения, формирование гнойных и желчных свищей, нагноение и прорыв инфицированной полости в желчеотводящие пути, в брюшную полость, в поддиафрагмальное и подпеченочное пространства (Аскерханов Р.П.,1984; Чернышев В.Н., Иванов С.А., 2005). Для ликвидации ОПП, в частности, после эхинококкэктомии, предлагались различные методики. Результаты их применения не могут удовлетворять хирургов, т.к. ни один из них не решает проблемы устранения инфицирования полости и формирования послеоперационных кист (Вишневский В.А. с соавт. 2003). Одним из путей решения этой проблемы, на наш взгляд, является использование для пломбировки остаточных полостей печени синтетических материалов на основе коллагена. Наноразмерный гидроксоапатитколлагеновый биополимерный композит «ЛитАр» в настоящее время используется для замещения дефектов в челюстнолицевой хирургии, травматологии и ортопедии, урологии и гинекологии, в пульмонологии (Литвинов С.Д., 2001; Марков И.И., 2003; Литвинов С.Д., Рахимов Р.И., 2005; Литвинов С.Д., Краснов А.Ф., 2006; Литвинов С.Д., Ишарина С.Е., 2007). На 70% «ЛитАр» имеет пористую структуру, тем самым способствуя интенсивному васкулогенезу и обеспечивая короткое время его биотрасформации. Однако, несмотря на обширность применения «ЛитАр», сведения о применении 3 коллагенового композита при реконструктивных операциях на печени в доступной нам литературе отсутствуют. В последние годы в схемы местной антибактериальной терапии при различных гнойно-воспалительных процессах стали вводить антибиотики совместно с окситоцином, целесообразность использования которого обоснована экспериментально-гистологическими исследованиями (Курлаев П.П., 2001; Климушкин А.В., 2003; Абрамзон О.М., 2004; Стадников Б.А., 2005; Сивожелезов К.Г., 2005; Кочкина Н.Н., 2008; Третьяков А.А. с соавт., 2009; Чумаков А.М., 2010; Стадников А.А., Бухарин О.В., 2012; Волков Ю.О., 2014). При этом показано, что положительный эффект от применения окситоцина связан не только с оптимизацией репаративного гистогенеза, но и с антимикробным воздействием данного пептида на прокариотические клетки путем включения механизмов антибактериального воздействия на бактериальные структуры расположенные как вне, так и внутриклеточно (Стадников А.А., 2001; Стадников Б.А., Шеина Е.А., 2008; Бобылев А.А., 2011). Все выше изложенное предопределило проведение настоящего исследования. Цель и задачи исследования Цель исследования - экспериментально-гистологическое обоснование возможности использования композитного материала «ЛитАр» для пломбировки и ликвидации остаточных полостей в печени, в том числе в условиях местного применения окситоцина. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать модель формирования остаточной полости в печени в экспериментальных условиях (на крысах). 2. Изучить состояние пломбировочного материала и особенности репаративных гистогенезов в остаточной полости печени и окружающих его тканях печени при имплантации «ЛитАр». 3. Исследовать в эксперименте влияние окситоцина на процессы приживления коллагенового композита при пломбировке остаточной полости печени, в том числе и в условиях инфицирования. 4 Научная новизна Впервые на основе оригинальной экспериментальной модели формирования остаточной полости печени, включая условия инфицирования, установлены гисто - и органотипические особенности структурно - функциональной реорганизации тканевых элементов печени экспериментальных животных при пломбировке остаточной полости в печени гидроксоапатитколлагеновым композитом «ЛитАр». На основе гистологических и иммуноцитохиических исследований получены новые данные о позитивном влиянии композита «ЛитАр» на процессы репаративных гистогенезов в тканевых и клеточных структурах печени и холангиол в условиях моделирования остаточной полости печени. Впервые установлено, остаточных полостей что введение окситоцина печени «ЛитАром» при пломбировке в том числе в условиях инфицирования, приводит к замещению ее органотипическим регенератом. Совместное применение комплекса «ЛитАр», окситоцина и антибиотика в моделируемых условиях лимитируют реализацию апаптотической доминанты гепатоцитов и клеток фибробластического дифферона, что приводит к структурнофункциональной перестройке фиброзной капсулы остаточной полости печени (в плане ее дедифференцировки, с образованием клеточных и межклеточных элементов, характерных для малодифференцированной волокнистой соединительной ткани, включающей сосуды микроциркуляторного русла). Научно-практическое значение Полученные результаты могут быть полезны в клинической практике абдоминальной хирургии (в частности, гепатобилиарной хирургии), решающей актуальные вопросы эффективной ликвидации остаточных полостей в печени, в том числе в условиях инфицирования. Материалы исследования существенны для понимания закономерностей репаративных гистогенезов тканей печени при использовании композита дифференцировки и «ЛитАр», включая программированной механизмы клеточной пролиферации, гибели (апоптоза), реализуемые под влиянием гипоталамических нонапептидов, секретируемых крупноклеточными ядрами гипоталамуса. 5 Установлено, что использование окситоцина в условиях инфицирования остаточных полостей в печени лимитирует развитие гнойно-некротических процессов, отграничивает зоны некроза от жизнеспособных тканей, стимулирует репаративные и органотипические потенции тканей печени, как в самой остаточной полости печени, так и в пограничных с ней зонах органа, приводит к замещению полости органотипическим регенератом, что имеет важное значение для абдоминальной хирургии. Фундаментальный аспект работы определяется полученными новыми данными, касающихся иммуноцитохимической гистогенезов печени в условиях замещения оценки репаративных остаточной полости печени композитом «ЛитАр», что вносит существенный вклад в учение о биологии тканей и их гисто - и органотипических свойств. Основные положения, выносимые на защиту. 1.Применение в экспериментально-гистологических исследованиях композита «ЛитАр» для пломбировки остаточной полости в печени приводит к частичному заполнению дефекта соединительнотканными элементами и органотипическими структурами (новообразованными печеночными клетками) без компрессии желчеотводящих путей, но не лимитирует развитие гнойно- некротических процессов в условиях инфицирования остаточной полости печени, способствуя гипертрофическим изменениям тканевых элементов фиброзной капсулы. 2.Использование в моделируемых условиях окситоцина обеспечивает реализацию адекватных репаративных гистотипических и органобластических потенций тканей печени, как в самой остаточной полости печени (при резорбции композита, структурно-функциональной реорганизации фиброзной капсулы через механизмы активизации клеток макрофагального звена, развитии малодифференцированной соединительной ткани), так и в пограничных с остаточной полостью печени зонах органа (гепатоциты, холангиоциты, кровеносные сосуды микроциркуляторного русла). 3.Экзогенно вводимый окситоцин способен модулировать основные биологические процессы репаративных гистогенезов в печени: пролиферацию, 6 цитодифференцировку паренхиматозных и стромальных элементов органа при замещении остаточной полости печени «ЛитАром», в том числе через механизмы, включающие процессы апоптоза (экспрессия про - и антиапоптотических генов и синтеза протеина Ki-67), а также потенцирует действие антибиотика в условиях инфицирования остаточной полости печени. Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре хирургии; гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургского государственного медицинского университета. Апробация работы и публикации Результаты диссертации представлены и обсуждены на Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Морфология человека в норме и при патологии», посвященной 80-летию Башкирского государственного медицинского университета (Уфа, 2012); на Ежегодной Областной молодежной научно-практической конференции, (Оренбург, 2012); в рамках VII Всероссийской итоговой студенческой конференции» (Самара, 2013); в рамках 67 Международного научно-практического конгресса студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины» (Киев, 2013); на 88–й Всероссийской научно-практическая конференции студентов и молодых ученых, посвящённая 200-летию Казанского государственного медицинского университета (Казань, 2014); на Международном научно - практическом форуме студентов и молодых ученых, посвященному 70-летию ОрГМА «Наука и культура» (Оренбург, 2014). По теме диссертации опубликовано 23 научные работы, из них 8 статей и материалов в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием материалов и методов, результатов собственных исследований и указателя литературы, включающего 279 7 источников, в том числе 221 работа на русском и 58 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 3 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Работа выполнена на базе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО ОрГМУ МЗ РФ (зав. кафедрой - д.б.н., профессор А.А.Стадников). Все исследования выполнены на 69 животных – лабораторных белых крысах – самцах линии Вистар массой 280-300 г. Сведения о сериях эксперимента представлены в таблице 1. Таблица 1. Распределение животных по сериям эксперимента. Наименование серий Количество животных 1.Моделирование ОПП 2.Имплантация «ЛитАр» в сформированную ОПП 3.Имплантация «ЛитАр», пропитанным раствором окситоцина (1 МЕ) в ОПП 4.Имплантация «ЛитАр» в инфицированную Kl.pneumoniaе ОПП 5.Имплантация «ЛитАр», пропитанным раствором окситоцина (1МЕ) инфицированную Kl. pneumoniaе ОПП. 6.Имплантация «ЛитАр», пропитанным раствором окситоцина, (1МЕ)в инфицированную Kl.pneumoniaе ОПП, введение антибиотика цефоперазона в/м по 50 мг/кг 2 раза в сутки в ОПП 1 раз в сутки Сроки наблюдений 3 сут 7 сут 14 сут 30 сут 9 3 3 3 12 3 3 3 3 12 3 3 3 3 12 3 3 3 3 12 3 3 3 3 12 3 3 3 3 Содержание и выведение животных из эксперимента соответствовало «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденным Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г., а также положениям «Европейской конвенции по защите 8 позвоночных, используемых для экспериментальных и иных научных целей». Проведение исследований разрешено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО ОрГМА МЗ России от 15.09.11 г. Из медицинского силикона вырезались шарики диаметром 6-9 мм, которые затем подвергались стерилизации автоклавированием в паровом стерилизаторе ГК100-3М при температуре +120 градусов по Цельсию при давлении в 1,1 атм., и затем хранились в растворе 0,5% хлоргексидинового спирта. Перед операцией шарик вынимали из спирта, отмывали стерильным физиологическим раствором и методом туннелизации имплантировали в правую долю печени экспериментального животного. Все операции проводили под эфирным масочным наркозом при соблюдении правил асептики и антисептики. Рану брюшной полости зашивали наглухо. Животных выводили из опыта путем передозировки эфира через 3,7,14 и 30 сут от начала эксперимента. Силиконовый шарик изымался из печени, после чего орган подвергался однотипной гистологической обработке. Гидроксоапатитколлагеновый композит смесь гидроксоапатита структурной и интеграции. ксеноколлагена Данный «ЛитАр» представляет из себя с высоким уровнем взаимной композит является цитоактивным наноразмерным материалом, предназначенным для восполнения дефектов тканей. Средние размеры кристаллов апатита в материале «ЛитАр» составляет 43-45 нм. На данный материал выдано регистрационное удостоверение 11 июня 2010 года № ФСР 2010/07994 и сертификат соответствия № 9398-001-64938703-2010. Было проведено 6 серий опытов. В 1-ой серии была создана модель остаточной полости печени путем имплантации в правую долю органа силиконового шарика диаметром 6-9 мм на срок 14 сут, после чего шарик изымался из печени. Во 2-ой серии полость, сформированная по вышеописанной методике диаметром около 8-9 мм, на стадии 14 суток эксперимента заполнялась композитом «ЛитАр» размером 0,25 см, другого лечения не проводилось. В 3-й серии опытов сформированная таким же образом полость, на стадии 14 суток опыта заполнялась «ЛитАром», который затем пропитывался раствором окситоцина (1 МЕ), при этом после пломбировки в течение 10 дней экзогенно к месту имплантации ежедневно подводился раствор окситоцина (1МЕ) через 9 установленную в ОПП хлорвиниловую трубку. В 4 –ой серии эксперимента сформированная по вышеописанной методике полость, перед заполнением предварительно инфицировалась культурой Klebsiellaе pneumoniaе, штамм ГИСК № 278; затем полость заполнялась композитным материалом. В 5-ой серии аналогичная полость, инфицированная культурой Kl.pneumoniaе, пломбировалась «ЛитАром», пропитанным раствором окситоцина (1 МЕ) и в течение 10 дней экзогенно к месту имплантации ежедневно подводился раствор окситоцина (1 МЕ). В 6 –ой серии опытов инфицированная полость заполнялась композитным материалом «ЛитАр», пропитанным раствором окситоцина (1 МЕ), в течение 10 дней после операции внутримышечно вводился антибиотик цефоперазон 2 раза в сутки по 50 мг/кг и экзогенно к месту пластики подводился раствор окситоцина (по 1 МЕ ежедневно) и цефоперазон. Участок имплантации в печень композитного материала «ЛитАр» иссекался для последующего изучения на светооптическом, иммуноцитохимическом (идентификация экспрессии синтеза про - и антиапоптотических генов р 53, Bcl-2, caspasa-3, пролиферативного протеина Ki-67) и электронномикроскопическом уровнях. Методика морфологических исследований. Материал для ультрамикроскопического исследования последовательно фиксировали при + 4С в 2,5% растворе глютарового альдегида и постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия по G.Millonig [1961], обезвоживали в ацетонах возрастающей концентрации и заливали в ЭПОН-812 и аралдит (Wikly, 1975). Полутонкие срезы (1 мкм) окрашивались метиленовым синим и основным фуксином по методике Sato T., Shamoto M. (1973). Ультратонкие срезы (40-60 нм) подвергались двойному контрастированию растворами уранилацетата и цитрата свинца по Reynolds E.S. [1963]. Исследование ультратонких срезов и их фотографирование производили в электронном микроскопе ЭВМ 100 АК при увеличениях от 4000 до 40000. Иммуноцитохимические исследования проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5-6 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полилизином (Menzel- Ylasser, Германия). Иммуноморфологический анализ осуществляли непрямым иммунопероксидазным методом с помощью реактивов, рекомендованных фирмой - изготовителем. Для 10 идентификации экспрессии синтеза проапоптотического белка р 53, caspasa-3, антиапаптотического протеина bcl-2, а также маркера пролиферации –Ki- 67 гистосрезы инкубировали с соответствующими моноклональными антителами (фирма «Дако», Дания) в рабочих разведениях. Для визуализации структур использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод («Дако»), LSAB (Kit, Дания) с дополнительной окраской ядер клеток гематоксилином Майера. Все данные, полученные использованием в результате параметрических исследования, методов были обработаны вариационной с статистики. Статистическая обработка результатов исследования заключалась в вычислении средних значений арифметической, показателей, среднего стандартного квадратического отклонения, отклонения, средней ошибки средней арифметической, критерии Стьюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Взаимосвязи параметров исследовались с применением корреляционного анализа, для чего использовалась программа Statistica 6.0. for Windows 7, Microsoft Word. Необходимая количественная информация получена в ходе морфометрических исследований парафиновых срезов с помощью винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15х У4.2. и сетки Г.Г. Автандилова (1986). Результаты исследования и их обсуждение Согласно поставленным задачам нашего исследования, были проведены разработка и обоснование техники моделирования остаточной полости в печени, и ее последующая ликвидация гидроксоапатитколлагеновым композитом «ЛитАр». Формирование модели остаточной полости в печени осуществлялось следующим образом. С соблюдением правил асептики и антисептики под масочным эфирным наркозом у крыс выполнялась верхнесрединная лапаротомия. Правая доля печени выводилась в операционную рану. Тупым и острым путем в правой доле формировался туннель, в который погружали силиконовый шарик на стерильной нитке, которую затем завязывали для фиксации шарика в печени. Место погружения укрывалось большим сальником. Печень с имплантированным в нее силиконовым объектом погружали в брюшную полость, а операционная рана послойно ушивалась наглухо. На основании анализа гистологических препаратов 11 было показано, что через 3 сут опыта по краю имплантированного объекта формируется выраженный демаркационно-некротический вал, включающий в себя макрофаги, лимфоциты и полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилы и эозинофилы). Данные клетки располагаются в отечном межклеточном веществе стромы печени. Зона некротических изменений существенно нарастала к 7 сут и являлась пролонгированным «раздражителем», обеспечивающим развитие воспалительных реакций в тканях печени, вплоть до 14 сут эксперимента. Наши экспериментально-гистологические исследования долек печени, прилежащие к фиброзной капсуле, моделируемой ОПП, показали выраженное развитие цитолитических некрозов гепатоцитов по механизму чрезмерной гидропии, наблюдаемое наиболее четко к 7 сут эксперимента. При этом регистрируются очаги геморррагических некрозов периферических зон долек печени, что отражает существенные нарушения сосудистой микроциркуляции органа в моделируемых условиях. В этой связи, полученные нами результаты, могут свидетельствовать о том, что моделируемая остаточная полость печени создает условия для хронизации воспалительного процесса в органе с переходом в цирроз печени. Таким образом, установлено, что через 7 сут опыта в ОПП присутствуют явления дисрегенерации паренхиматозных структур органа, что проявляется в интенсивном фибриллогенезе, опережающем Деструкция, некробиотические изменения пролиферацию гепатоцитов гепатоцитов. сопровождались полиморфноклеточной инфильтрацией вокруг печеночных триад и погибших гепатоцитов. Процессы гибели гепатоцитов (в краевой зоне) нарастали к 14 сут. При этом отмечается разрастание соединительной ткани не только по краю полости, но и в зонах печеночных долек. Размеры печеночных долек в области ООП существенно уменьшены. Мы еще раз отмечаем, что при создании модели остаточной полости печени не наблюдается признаков инволюции рубцовых структур, которые испытывают на себе длительное механическое воздействие со стороны имплантированного в печень силиконового шарика. Все это свидетельствует о развитии стойкого фиброза участков печеночной ткани, которые контактировали с инородным телом (силиконовым шариком). 12 В пограничной с остаточной полостью зоне доминирующими клетками являются фибробласты и фиброциты, которые располагаются в зрелой волокнистой соединительной ткани. Все вышеописанное говорит о развитии стойкого склерозирования участков печени, которые контактировали с инородным объектом. Использование в качестве лечебного средства «ЛитАр» для ликвидации ОПП показало, что через 3 сут эксперимента визуально при клиническом осмотре и гистологическом исследовании данный объект набухает и начинает заполнять все пространство остаточной полости. К 7 сут эксперимента разбухая, композит не выходит за пределы сформированной полости, и заполняя ее целиком, интимно сращен со стенками ОПП, в нем видны новообразованные сосуды. Имплантируемые структуры подвергаются лизису макрофагами. При этом создаются условия для активной пролиферации малодифференцированной соединительной ткани (грануляционной). Данный процесс пролонгирован и наблюдался и через 14 сут эксперимента. При этом выявлена гипертрофия большей части гепатоцитов в зоне, прилегающей к ОПП, повышение их митотической активности, а также повышение экспрессии синтеза протеина Ki-67 (в 3 раза по сравнению с нелеченными животными). В итоге, на фоне резорбции композита, происходило не только частичное заполнение ОПП соединительнотканными элементами, но и органотипическими структурами (новообразованными печеночными клетками, формирующими атипические балки) [рис. 1]. При отметили включение в комплекс лечебных мероприятий окситоцина мы пролонгированное формирование малодифференцированной соединительной ткани в области имплантированного композита (до 14 сут.) с признаками интенсивного васкулогенеза. При этом вся полость заполнялась скоплениями малодифференцированных фибробластов, миофибробластов, гемокапилляров, коллагеновыми и эластическими волокнами, межклеточным аморфным веществом, содержащим преимущественно несульфатированные гликозаминогликаны (типа гиалуроновой кислоты). 13 А А А Рис.1 Новообразованные печеночные клетки (А). 2 серия, 14 сут. эксперимента. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув.об.40,ок.10. Стрелками показаны эозинофилы. Указанные клеточные элементы (фибробласты, эндотелиоциты) давали позитивную окраску на идентификацию экспрессии синтеза протеина Кi- 67, при лимитировании экспрессии синтеза белка caspasa 3. Подобные изменения мы наблюдали и в капсулярной зоне ОПП, которая претерпевала гистологическую трансформацию из грубоволокнистого состояния в хорошо васкуляризованную рыхлую волокнистую соединительную ткань. В этих случаях, признаки гранулематозного воспаления не наблюдались. Это обеспечивает не только частичное заполнение ОПП соединительнотканными элементами, но и органотипическими структурами (новообразованные холангиолы и печеночные клетки, формирующие атипические балки) [рис. 2]. Увеличение массы гепатоцитов происходило за счет интенсивного синтеза белка, динамическое равновесие между процессами анаболизма и катаболизма в клетках изменялось в сторону выраженности первого. В доказательство этому явилось уменьшение аутофагических вакуолей, ламеллярных телец и лизосом в цитоплазме печеночных клеток. Наблюдалась гипертрофия ядрышка и увеличение количества гранул гликогена. При применении окситоцина замедляется разрастание внутридольковых прослоек волокнистой соединительной ткани. Напротив, по краям остаточной малодифференцированная полости соединительная микроциркуляторного русла. 14 и внутри ткань ее формируется с сосудами Б А Б Рис. 2 Органотипический регенерат в ОПП. Новообразованные холангиолы (А) и печеночные клетки (Б), формирующие атипические балки. 3 серия. Стадия: 14 сут. Здесь формируются эпителиальные тяжи, островки гепатоцитов, трубочки, кистозные структуры. Таким образом, сформированная остаточная полость заполняется тканевыми элементами органотипического регенерата (печеночные балки, окруженные гемокапиллярами). Синусоидные и желчные капилляры, как правило, сохраняли микроциркуляции свои крови просветы и и оттока не желчи. имели признаков нарушений Электронномикроскипические исследования показали, что гепатоциты имели структурно - функциональную характеристику, свойственную нормальному цитологическому статусу (рис.3). В серии опытов с добавлением к «ЛитАр» окситоцина достоверно понижалась апоптозная доминанта у гепатоцитов (в 1,5-2 раза уменьшалась экспрессия синтеза протеина р 53) пролиферативного с гена одновременным Ki-67 возрастанием (табл.2). у них Кариометрические экспрессии исследования гепатоцитов и холангиоцитов показали достоверное увеличение размеров ядер клеток и их цитоплазмы, по сравнению с аналогичными показателями, полученными в серии опытов, когда окситоцин не применялся. Эти данные могут быть оценены как проявление регенерационной гипертрофии, инициированной введением окситоцина. Но, мы подчеркивает, что визуально к 30 сут ОПП без применения окситоцина и к 14 сут с применением данного нейропептида, полностью заполнена органотипическим регенератом, внешне не отличающимся ни по цвету, ни по консистенции от паренхимы печени. 15 Рис. 3 Фрагмент гепатоцита из пограничной зоны ОПП. Электронограмма. Ув.х 28000. А - ядро Б - эндоплазматический ретикулум В-включения гликогена 14 сут. В отличие от позитивных результатов, полученных в серии (2-я), где «ЛитАр» применялся для ликвидации стерильной ОПП, использование этого композита в качестве лечебного средства для ликвидации инфицированной ОПП, не лимитирует развитие гнойно-некротического процесса, не обеспечивает реализации адекватной репаративной гистотипической потенции ткани печени. В данной серии опытов получили морфологические сведения о том, что сформированная остаточная полость печени и окружающие ее структуры органа демонстрировали признаки развития гнойно-некротического воспаления, свойственные гепатиту уже на 7 сут. При этом на «поле воспаления» основными компонентами являлись нейтрофилы, макрофаги и плазмоциты с формированием очагов гранулематозного воспаления. В данных условиях эксперимента портальные тракты были особенно расширенными с выраженной перипортальной воспалительной инфильтрацией и формированием лимфоидных фолликулов с герменативными центрами. Описанные нами факты свидетельствуют о том, что в моделируемых условиях развивается морфологическая картина лобулярного и перипортального гепатита. Мы особо подчеркиваем, что при моделировании ОПП, а также при замещении ее «ЛитАром» в условиях инфицирования всегда нарастали явления апоптоза гепатоцитов на фоне понижения у них экспрессии синтеза протеина Ki-67 (табл. 2). 16 Таблица 2. Изменение экспрессии про-, антиапоптотических протеинов и Ki-67 у гепатоцитов в пограничной зоне ОПП. Стадия: 14 сут. ОПП % ОПП+ ОПП+ ОПП+ ОПП+ «ЛитАр» «ЛитАр»+ «ЛитАр»+ «ЛитАр»+ инфиц. инфиц.+ инфиц.+ окситоцин антибиотик Р 53 0,99±0,02 1,14±0,01 2,81±0,12 0,81±0,22 0,61±0,11 Bsl-2 0,13±0,04 0,25±0,03 0,39±0,20 0,46±0,06 0,51±0,11 Caspasa 3 0,72±0,03 1,56±0.03 2,91±0,11 1,11±0,11 0,70±0,01 Ki-67 0,13±0,02 0,22±0,09 0,13±0,01 0,79±0,04 0,80±0,06 Это, в свою очередь коррелировало с вышеописанными нами гистологическими данными о дистрофических и некробиотических изменениях печеночных клеток и холангиолоцитов, что вполне возможно трактовать как зависимое от формирования ОПП торможение пролиферативных (репаративных) процессов в тканях печени. Несмотря на морфологические изменения, происходящие в ткани печени и в ОПП, визуального отторжения, имплантированного в инфицированную полость композитного материала ни в одном случае не наблюдалось. К 14-м и 30-м суткам участок печени, в который погружался «ЛитАр», визуально имел обычный цвет, мягко-эластическую плотность, без фибринозного налета на поверхности. На разрезе этот участок имел однородную структуру, темно-вишневого цвета, без признаков инфицирования (без очагов скопления гноя). Фрагменты композитного материала отсутствовали. При включении в комплекс лечебных мероприятий окситоцина при лечебной коррекции заранее инфицированной ОПП, создаются условия для адекватной пролиферации малодифференцированной ткани, формирование которой зарегистрировано, как в области имплантированного композита, так и в капсулярной зоне ОПП. Установлено, что использование окситоцина в условиях 17 инфицирования ОПП лимитирует развитие гнойно-некротических процессов, отграничивает зоны некроза от жизнеспособных тканей, стимулирует репаративные и органотипические потенции тканей печени как в самой ОПП, так и в пограничных с ней зонах органа, приводит к замещению полости органотипическим регенератом. К 30 сут ОПП заполняется визуально гистиотипической тканью печени, которая не отличается по цвету и консистенции от окружающей паренхимы. Капсулярная зона ОПП претерпевала гистологическую трансформацию из грубоволокнистого состояния в хорошо васкуляризованную соединительную ткань. В гранулематозного воспаления, отмеченные нами этих случаях признаки в серии опытов, где для заполнения инфицированной полости применяли только «ЛитАр», отсутствовали. Иммуноцитохимические исследования паренхиматозных структур печени показали, что применение окситоцина в условиях пломбировки композитом инфицированной полости приводит к существенным изменениям экспрессии прои антиапоптотических протеинов и пролиферативного гена Ki-67 у гепатоцитов в пограничной зоне ОПП: к понижению экспрессии синтеза про - (р 53, caspasa-3) и повышению антиапоптотических (bcl-2) белков, а также протеина Ki -67, продукция которого инициирует фазу пролиферации в ходе репаративных гистогенезов органа (табл.2). Сочетанное использование окситоцина с антибиотиком существенно потенцирует позитивные антиапоптотический и пролифератогенный эффекты, реализуемые паренхиматозными элементами печени. Электронно- микроскопические исследования показали, что гепатоциты имели структурно функциональную характеристику, свойственную нормальному цитологическому статусу. Таким образом, применение коллагенового композита «ЛитАр» в сочетании с окситоцином и антибиотиком при пломбировке ОПП оказывает максимально позитивное влияние на процессы репаративного гистогенеза в гистоструктурах печени и холангиолах ОПП, в том числе в условиях инфицирования полости, обеспечивая оптимальные условия для активной пролиферации малодифференцированной ткани, регенерационной гипертрофии гепатоцитов в 18 зоне, прилегающей к ОПП, повышения их митотической активности и заполнения остаточной полости как соединительнотканными элементами, так и органотипическими структурами. ВЫВОДЫ 1.Структурно - функциональные особенности формирования остаточной полости в паренхиме печени при экспериментальной имплантации в нее силиконового объекта характеризуются интенсивным фибриллогенезом краевых участков и лимитировании репаративных процессов тканевых и клеточных элементов печени, гетероморфизмом гепатоцитов, холангиоцитов и сосудов микроциркуляторного русла. 2.Имплантация и последующая соединительнотканная фиксация силиконового объекта в остаточную полость печени не исключает структурно-функциональной дезорганизации паренхимы печени. Интенсивное разрастание соединительной ткани усугубляет дистрофические изменения в гепатоцитах, холангиоцитах и сосудах микроциркулярного русла. 3.Имплантация гидроксоапатитколлагенового композита «ЛитАр» в остаточную полость печени стимулирует процессы репаративных гистогенезов в пограничных зонах органа и в области имплантации композита, что приводит к частичному заполнению дефекта соединительнотканными элементами и органотипическими структурами (новообразованными печеночными клетками), но не лимитирует развитие гнойно-некротичеких процессов в условиях инфицирования остаточной полости печени. 4.Применение окситоцина при пломбировке остаточной полости печени «ЛитАром» обеспечивает адекватные условия для реализации гисто - и органотипических потенций паренхиматозных и стромальных структур, как в области имплантированного композита, так и в пограничных с остаточной полостью зонах печени (гепатоциты, холангиоциты, кровеносные сосуды микроциркуляторного русла), что приводит к полному замещению полости органотипическим регенератом. 5.Использование окситоцина в условиях инфицирования остаточной полости печени лимитирует развитие гнойно-некротических процессов, ограничивает 19 зоны некроза от жизнеспособных тканей, оптимизирует репаративные органотипические и органобластические потенции тканей печени, приводит к замещению полости органотипическим регенератом. Данный морфофункциональный эффект наиболее отмечен при совместном применении окситоцина и антибиотика. 6.Под воздействием окситоцина происходит значительная активация пролиферации малодифференцированной ткани, как в области имплантированного композита, так и в краевой зоне остаточной полости печени, которая претерпевает гистологическую трансформацию из грубоволокнистого состояния в хорошо васкуляризованную соединительную ткань. 7.Применение окситоцина как в условиях заполнения «ЛитАром» стерильной остаточной полости печени, так и инфицированной приводит к существенному понижению апоптотической доминанты (по показателям экспрессии синтеза р 53 и caspasa-3) и повышению антиапоптотического белка (bcl-2), а также синтеза протеина Ki-67, продукция которого инициирует фазу пролиферации в ходе репаративных гистогенезов органа. 8. Проведенные экспериментально-гистологические исследования позволяют рекомендовать способ коррекции остаточных полостей печени гидроксоапатитколлагеновым композитом для апробации и внедрения в работу отделений общехирургического профиля и гепатологических центров. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Модель остаточной полости печени может быть использована в экспериментальной морфологии, в том числе, при изучении нейроэндокринной регуляции репаративных процессов в печени, в прикладном отношении при изучении закономерностей лечебной коррекции остаточных полостей печени и их ликвидации в хирургической гепатологии. 2.При создании модели остаточной полости в печени животным в правую долю органа путем туннелизации рекомендуется имплантировать силиконовый шарик сроком на 14 сут на стерильный нитке с последующей фиксацией и укрытием силиконового объекта сальником. 20 3.К месту имплантации силиконового шарика, для дальнейшего местного введения окситоцина и антибиотика подводится тонкая хлорвиниловая трубочка, которая фиксируется к коже животного. 4.Применение нейропептида –окситоцина можно рекомендовать как эффективный способ стимуляции регенеративной регенерации тканей печени в условиях применения композита «ЛитАр». 5.Результаты исследования целесообразно использовать в учебном процессе на кафедрах хирургии, гистологии и НИИ морфологического и клинического профилей, а также при написании соответствующих разделов учебных пособий. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Хижняк, И.И. Использование «ЛитАр» для ликвидации остаточных полостей печени в эксперименте / И.И. Хижняк // Вопросы медицины: теория и практика: материалы междунар. заоч. науч.- практ. конф. - Новосибирск, 2012. – С. 117-119. 2.Хижняк, И.И. Морфологическая характеристика остаточных полостей печени у животных в эксперименте / И.И. Хижняк // Актуальные вопросы теоретической и практической медицины: материалы междунар. интернет-конф., посвящ. 75-летию со дня рождения д.м.н., проф. А. Хусейновича. - Нальчик, 2012.- С.134-136. 3.Хижняк, И.И. Структурно-функциональное использования «ЛитАр» для замещения обоснование эффективности остаточной полости печени / И.И.Хижняк, А.М.Яковлева // Морфология человека в норме и при патологии: материалы всерос. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых, посвящ. 80-летию Баш. гос. мед. университета. - Уфа, 2012.-С.17. 4.Хижняк, И.И. Морфологическое обоснование применения композита «ЛитАр» для лечения остаточной полости печени в эксперименте / И.И. Хижняк, А.М. Яковлева // Материалы областной молодежной научно-практической конференции. - Оренбург, 2012. - С. 149. 5. Хижняк, И.И. Структурно-функциональная характеристика остаточных полостей печени у крыс в эксперименте / И.И. Хижняк, А.М. Яковлева // Материалы областной молодежной научно-практической Оренбург, 2012.- С.150. 21 конференции. - 6. Способы ликвидации остаточных полостей печени при операции по поводу паразитарных и непаразитарных кист печени (обзор литературы) / И.И. Хижняк, А.А. Третьяков, А.Ф. Щетинин, А.Н. Неверов, А.Г. Петренко // Актуальные вопросы хирургии. - Челябинск, 2012. - Вып. 9. - С. 74-78. 7. Закрытие остаточных полостей печени / А.А. Третьяков, И.И. Хижняк, О.Б. Дронова, А.Ф. Щетинин// Вестник хирургии. - 2012. - № 6. - Т.171. -С. 97-99. 8.Хижняк, И.И. Композит «ЛитАр» как способ ликвидации остаточных полостей печени / И.И.Хижняк, А.А.Третьяков, А.А. Стадников. – Б. м.: Изд-во: Lambert Academic Publishing, 2013. - 52 с. 9.Хижняк, И.И. Опыт использования композит «ЛитАр» для коррекции остаточных полостей печени (экспериментально-гистологическое исследование) / И.И.Хижняк, А.А. Третьяков, А.А. Стадников // Хирург. 2014. - № 8. - С. 75-81. 10.Хижняк, И.И. Структурно-функциональная характеристика остаточных полостей печени у экспериментальных животных / И.И. Хижняк, А.М. Яковлева // Молодежная наука и современность: материалы 77 всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, проводимой в рамках «Недели молодежной науки». - Курск, 2012. - С. 263. 11. Хижняк, И.И. Композит «ЛитАр» как способ ликвидации остаточной полости печени в эксперименте / И.И. Хижняк, А.М. Яковлева // Материалы VII Всероссийской итоговой студенческой конференции. - Самара, 2013.- С. 240-241. 12. Хижняк, И.И. Лечение остаточных полостей печени в эксперименте при использовании композита «ЛитАр» / И.И. Хижняк, А.Н. Неверов // Морфология. - 2014. - № 5.- С. 124-125. 13.Хижняк, И.И. Композитный имплантат «Литар» как способ коррекции остаточных полостей печени / И.И. Хижняк, А.А. Третьяков, А.А. Стадников // Украинский научно-медицинский журнал молодых ученых. - 2013.- № 2: Актуальные проблемы современной медицины: материалы 67 Междунар. науч.-практ. конгресса студентов и молодых ученых, 21-22 окт., Киев. - С.19. 22 14.Хижняк, И.И. «ЛитАр» как метод лечебной коррекции остаточных полостей печени / И.И. Хижняк, А.А. Третьяков, А.А. Стадников // Материалы Международной конференции «Летние научные чтения». - Киев, 2013. - С. 56-60. 15. Третьяков, А.А. Результаты применения композита «ЛитАр» для ликвидации остаточных полостей печени в эксперименте / А.А. Третьяков, И.И. Хижняк, А.А. Стадников // Анналы хирургической гепатологии. - 2013. Т. 18, № 4. - С. 61-65. 16.Третьяков, А.А. Морфологическое обоснование эффективности использование «ЛитАр» для ликвидации остаточных полостей печени в эксперименте / А.А. Третьяков, И.И. Хижняк // Актуальные проблемы хирургии: материалы 11 межобл. науч. - практ. конф. хирургов. - Бугуруслан, 2012.- С. 114-118. 17.Хижняк, И.И Опыт применения композита «ЛитАр» как способа биокоррекции остаточных полостей печени в эксперименте [Электронный ресурс] / И.И. Хижняк // Электрон. мед. журн.- Режим доступа: http://sciencepractice.com.ua.- в рамках проведения заочной научной конференции: Естественные и медицинские науки.Киев, 2014.-С. 35-38. 18.Хижняк, И.И. Способ закрытия ОПП в эксперименте с помощью биоматериала «ЛитАр» / И.И. Хижняк // Материалы 88–й Всероссийской научно-практическая конференции студентов и молодых ученых, посвящённой 200-летию Казанского государственного медицинского университета. - Казань, 2014. - С. 430. 19.Хижняк, И.И. Метод ликвидации остаточных полостей в печени с помощью композита «ЛитАр» в эксперименте / И.И. Хижняк // Материалы IX (XXVIII Всероссийской) Международной Пироговской студенческой научной конференции. – М., 2014. - С. 177. 20.Третьяков, А.А. Применение биокомпозита «ЛитАр» для ликвидации остаточных полостей печени (ОПП) в условиях эксперимента / А.А. Третьяков, И.И. Хижняк, А.А. Стадников // Креативная хирургия и онкология. - 2014. - № 3. - С. 71-74. 21. Хижняк, И.И. «ЛитАр» как способ закрытия остаточных полостей печени (ОПП) в эксперименте в комбинации с окситоцином / И.И. Хижняк, А.А. Третьяков, А.А. Стадников // Наука и культура: материалы Междунар. науч.23 практ. форума студентов и молодых ученых, посвящ. 70-летию ОрГМА. Оренбург, 2014. - С. 320-321. 22.Третьяков, А.А. Применение «ЛитАр» для закрытия ОПП в эксперименте / А.А. Третьяков, И.И. Хижняк, А.Н. Неверов // Морфология. - 2014. - Т. 145, № 3. - С. 196-197. 23.Хижняк, И.И. Композит «ЛитАр» в комбинации с окситоцином для ликвидации остаточных полостей в печени (ОПП) в эксперименте / И.И. Хижняк, А.Н. Неверов // Актуальные вопросы хирургии: материалы обл. конф. хирургов, посвящ. 70-летию ОрГМА и 90-летию проф. З.К. Забегальской. - Оренбург, 2014. - С. 139-140. 24 Хижняк Ирина Игоревна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО - МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ГИДРОКСОАПАТИТКОЛЛАГЕНОВОГО КОМПОЗИТА «ЛИТАР» ДЛЯ ЛИКВИДАЦИИ ОСТАТОЧНЫХ ПОЛОСТЕЙ В ПЕЧЕНИ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 25 26
