Сессия 4 - Выделение и очистка ДНК - EU
advertisement
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК М.Сомма WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО Выделение и очистка ДНК 2 Содержание Сессия 4 Выделение и очистка ДНК Введение 3 Методы выделения 4 Методы очистки 4 Выделение с использованием CTAB и методы очистки 7 Количественное определение ДНК с помощью спектрофотометрии 10 Принципы спектрофотометрического определения ДНК 11 Определение концентрации нуклеиновых кислот 12 Экспериментальная часть 15 Литература 19 Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 3 Введение Выделение и очистка нуклеиновых кислот – это первый шаг в большинстве молекулярно-биологических исследований и во всех методиках, связанных с рекомбинантными ДНК. В нашем случае, задачей методов выделения нуклеиновых кислот является получение очищенных нуклеиновых кислот из различных источников с целью проведения ГМ-специфического скрининга с использование полимеразной цепной реакции (ПЦР). Качество и чистота нуклеиновых кислот относятся к наиболее важным факторам ПЦР анализа. Для того, чтобы получить высокоочищенные нуклеиновые кислоты, не содержащие ингибирующих примесей, необходимо использовать наиболее подходящие методы выделения. Возможные примеси, которые могут ингибировать проведение анализа с использованием ПЦР, перечислены в Таблице 1. Для того, чтобы избежать появления ложноотрицательного результата вследствие присутствия в образце ингибиторов ПЦР, рекомендуется проводить контрольные эксперименты для анализа ингибиторов ПЦР. Для этих целей обычно используется растение-специфичный (эукариотический или хлоропластный), или видо-специфичный ПЦР анализ. Таблица 1. Некоторые ингибиторы процесса ПЦР Ингибитор SDS Фенол Этанол Изопропанол Ацетат натрия Хлористый натрий EDTA Гемоглобин Гепарин Мочевина Реакционная смесь Концентрация ингибитора > 0.005% > 0.2% > 1% > 1% > 5 mМ > 25 mМ > 0.5 mМ > 1 мг/мл > 0.15 i.m/ мл > 20 mМ > 15% В связи с тем, что существуют разнообразные методы выделения и очистки нуклеиновых кислот, выбор наиболее подходящей методики базируется на следующих критериях: • целевая нуклеиновая кислота • организм – источник нуклеиновых кислот • первичный материал (растительные ткани, листья, семена, продукты переработки и прочее) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК • 4 ожидаемые результаты (выход, чистота, время, требующееся для очистки, и прочее) • дальнейшее использование нуклеиновых кислот (ПЦР, клонирование, введение метки, блот-гибридизация, ПЦР в реальном времени (RT-PCR), синтез кДНК и прочее) Принципы некоторых наиболее обычных методологий, используемых в настоящее время для выделения и очистки нуклеиновых кислот, описываются в следующих разделах. Методы выделения Для выделения нуклеиновых кислот из биологических материалов необходимо провести лизис клеток, инактивацию клеточных нуклеаз и отделение искомых нуклеиновых кислот от клеточной массы. Часто идеальная процедура лизиса является компромиссом нескольких методик; она должна быть достаточно жесткой, чтобы разрушить структуры сложного исходного материала (например, тканей), и при этом достаточно деликатной, чтобы оставить в неприкосновенности целевые нуклеиновые кислоты. Обычная процедура лизиса включает: • Механическое разрушение (например, измельчение, гипотонический лизис) • Химическую обработку (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов, или тиоловое восстановление) • Ферментативное расщепление белков (например, с помощью протеиназы К) Процессы разрушения клеточных мембран и инактивации внутриклеточных нуклеаз могут быть совмещены. Например, один раствор может содержать детергенты для растворения клеточной мембраны и хаотропные соли для инактивации внутриклеточных ферментов. После лизиса клеток и инактивации нуклеаз, клеточная масса может быть легко удалена с помощью фильтрации или осаждения. Методы очистки Методики очистки нуклеиновых кислот из клеточных экстрактов обычно являются комбинацией двух или более из следующих методов: • выделение/осаждение • хроматография • центрифугирование • аффинное разделение Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 5 Краткое описание этих методик приводится в следующих параграфах (Zimmermann et al., 1998). Выделение/осаждение Экстракция растворителями часто используется для удаления примесей из нуклеиновых кислот. Например, комбинация растворителей: фенол - хлороформ часто используется для удаления белков. Осаждение изопропанолом, или этанолом обычно применяется для концентрирования нуклеиновых кислот. Если содержание целевых нуклеиновых кислот небольшое, к смеси может быть добавлен инертный носитель (такой как гликоген) для того, чтобы увеличить эффективность преципитации. Другие методы осаждения нуклеиновых кислот включают селективную преципитацию с использованием высоких концентраций солей («высаливание»), либо осаждение белков с использованием переменного рН. Хроматография Хроматографические методики могут использовать различные технологии разделения, такие как гель-фильтрация, ионообменная хроматография, селективная адсорбция, либо аффинное связывание. Гель-фильтрация использует свойство молекулярного сита, которым обладают пористые частицы геля. Матрикс с определенным размером пор позволяет молекулам меньшего размера проникать в поры под действием диффузии, в то время как молекулы большего размера минуют поры и элюируются в свободном объеме. Таким образом, молекулы элюируются в порядке уменьшения их размера. Ионообменная хроматография, - еще один метод, который использует электростатическое взаимодействие между целевыми молекулами и функциональными группами носителя в хроматографической колонке. Нуклеиновые кислоты (имеющие высокий отрицательный заряд, линейные полианионы) могут быть элюированы с ионообменной колонки с помощью простого солевого буфера. В адсорбционной хроматографии нуклеиновые кислоты селективно адсорбируются на кремниевом или стеклянном носителе в присутствии определенных солей (например, хаотропных солей), в то время как другие биологические молекулы не способны к такой адсорбции. В этом случае слабые солевые растворы или вода способны элюировать нуклеиновые кислоты, в результате чего получаются образцы, которые могут быть непосредственно использованы в дальнейших процедурах. Центрифугирование Селективное центрифугирование является мощным методом, используемым для очистки. Например, ультрацентрифугирование в само-формирующихся градиентах Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 6 хлористого цезия при больших ускорениях уже давно используется для очистки плазмид. Часто центрифугирование комбинируют с каким-либо другим методом. Например, колоночная хроматография при вращении, которая объединяет гельфильтрацию и центрифугирование для очистки ДНК или РНК от низкомолекулярных примесей (солей, нуклеотидов и пр.), для смены буфера или для селекции по размеру. Некоторые методики совмещают селективную адсорбцию на хроматографическом матриксе (см. выше параграф «Хроматография») с центрифужным элюированием для селективной очистки какого-то одного типа нуклеиновых кислот. Аффинное разделение В последние годы все больше методик очистки объединяют аффинную иммобилизацию нуклеиновых кислот с магнитным разделением. Например, poly (A) + мРНК может быть привязана к магнитным частицам, покрытым стрептавидином, с помощью меченных биотином олигонуклеотидов (oligo (dT)), после чего комплекс частиц может быть удален из раствора (как и несвязанные примеси) с помощью магнита. Твердофазная техника упрощает очистку нуклеиновых кислот, так как способна заменить несколько этапов: центрифугирования, экстракции органическими растворителями и фазового разделения, одним быстрым этапом магнитного разделения. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 7 Выделение с использованием CTAB и методы очистки Методика с использованием СТАВ - бромистого цетилтриметиламмония (cetyltrimethylammonium bromide), впервые разработанная Мюррэем и Томпсоном в 1980 г. (Murray and Thompson, 1980), была впоследствии опубликована Вагнером и сотрудниками (Wagner et al., 1987). Этот метод хорошо подходит для выделения и очистки ДНК из растений и пищевых продуктов растительного происхождения; и особенно удобен для удаления полисахаридов и полифенольных соединений, которые отрицательно влияют на чистоту ДНК и, следовательно, на ее качество. Эта процедура широко применяется в молекулярной генетике растений; и уже была испытана в специальных опытах, для проверки возможности ее утверждения в качестве методики для выявления ГМО (Lipp et al., 1999, 2001). Разработано несколько вариантов с целью адаптации данной методики к широкому спектру исходного материала пищевых продуктов, как не переработанных, так и подвергшихся переработке (Hupfer et.al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al., 2001). Принципы метода с использованием СТАВ: лизис, выделение и осаждение Растительные клетки могут быть лизированы с помощью ионного детергента СТАВ бромистого цетилтриметиламмония (cetyltrimethylammonium bromide), который образует нерастворимый комплекс с нуклеиновыми кислотами в слабо-солевой среде. При этих условиях полисахариды, фенольные соединения и другие примеси остаются в супернатанте и могут быть слиты. ДНК комплекс растворяют путем повышения концентрации солей, и осаждают этанолом или изопропанолом. В данном разделе будут описаны принципы трех основных этапов – лизиса клеточной мембраны, выделения геномной ДНК и ее осаждения. Лизис клеточной мембраны. Как уже упоминалось, первым этапом выделения ДНК является разрушение клеточных и ядерных стенок. Для этих целей, гомогенизированный образец обрабатывают сначала буфером для экстракции, содержащим EDTA, Tris/HCl и СТАВ. Все биологические мембраны имеют в целом одинаковую структуру, включающую липидные и белковые молекулы, которые удерживаются вместе под действием нековалентных связей. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 8 Рисунок 1. Упрощенное изображение клеточных мембран 1 Как показано на Рисунке 1, липидные молекулы организуют протяженный двойной слой, в котором «растворены» белковые молекулы. Липидные молекулы состоят из гидрофильного конца, называемого «головой» и гидрофобного конца, называемого «хвостом». В методе с использованием СТАВ, лизис мембран осуществляется детергентом (СТАВ), содержащимся в буфере для экстракции. В связи с тем, что химический состав липидов и детергента сходен, компоненты СТАВ в буфере для экстракции могут осуществлять «захват» липидов, образующих мембраны клеток и ядер. Механизм солюбилизации липидов, с использованием детергентов, показан на Рисунке 2. Рисунок 2 Солюбилизация липидов Рисунок 3 иллюстрирует, каким образом при взаимодействии клеточных мембран с буфером для экстракции, содержащим СТАВ, детергент захватывает липиды и белки, освобождая геномную ДНК. При определенной концентрации соли (NaCl) детергент 1 Рисунки на этой и следующей странице взяты из: “Genetic Science Learning Center, University of Utah, http://gslc.genetics.utah.edu” Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 9 образует нерастворимый комплекс с нуклеиновыми кислотами. EDTA является хелатным агентом, который, наряду с другими металлами, способен связывать магний. Магний является кофактором фермента ДНКазы. При связывании магния с EDTA снижается активность имеющихся ДНКаз. Tris/HCl придает раствору способность поддерживать рН (в связи с тем, что и низкие, и высокие значения рН повреждают ДНК). Важно отметить, что вследствие того, что нуклеиновые кислоты могут легко разрушаться на стадии очистки, время между гомогенизацией пробы растительного материала и добавлением СТАВ-содержащего буферного раствора должно быть минимизировано. После того, как мембраны клеток и органелл (таких как митохондрии и хлоропласты) будут разрушены, можно осуществлять очистку ДНК. Рисунок 3. Разрушение клеточной мембраны и выделение геномной ДНК Выделение. На этом этапе полисахариды, фенольные соединения, белки и другие компоненты клеточного лизата, находящиеся в водном растворе, отделяются от СТАВ-комплекса нуклеиновых кислот. Удаление полисахаридов, а также фенольных соединений особенно важно из-за их способности ингибировать значительное количество ферментативных реакций. При низкой концентрации соли (< 0.5 М NaCl) примеси из комплекса нуклеиновых кислот не осаждаются и могут быть удалены из водного раствора экстракцией хлороформом. Хлороформ денатурирует белки и облегчает разделение водной и органической фаз. Обычно водная фаза формирует верхнюю фазу. Однако, если водная фаза обладает значительной плотностью вследствие высокой концентрации солей (> 0.5 М), она может образовывать нижнюю фазу. В дополнение, нуклеиновые кислоты могут иметь тенденцию к перераспределению в органическую фазу, если рН водного раствора не был надежно доведен до значений рН 7.8 – 8.0. Если необходимо, экстракция хлороформом повторяется два или три раза для того, чтобы полностью удалить загрязнения из водного слоя. Что добиться наилучшего выхода нуклеиновых кислот, органическую Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 10 фазу можно повторно экстрагировать водным раствором, который затем можно добавить к первому экстракту. Когда комплекс нуклеиновых кислот очищен, можно проводить заключительную стадию всей процедуры – осаждение. Осаждение. На заключительном этапе нуклеиновые кислоты освобождают от детергента. Для этой цели водный раствор сначала обрабатывают раствором для осаждения, представляющим собой смесь СТАВ с NaCl в высокой концентрации (> 0.8 М NaCl). Соль необходима для образования осадка нуклеиновых кислот. Ацетат натрия может быть предпочтительнее, чем NaCl, из-за его буферных свойств. При этих условиях детергент, который лучше растворяется в спирте, чем в воде, может быть отмыт, в то время как нуклеиновые кислоты осядут. Последовательная обработка 70% этанолом позволяет провести дополнительную очистку, или отмывку нуклеиновых кислот от остатка соли. Количественное определение ДНК с помощью спектрофотометрии. Количественное содержание ДНК, РНК, олигонуклеотидов и даже мононуклеотидов может быть определено непосредственно в водном растворе в разведенном, или не разведенном виде путем измерения величины поглощения А (также определяемой, как оптическая плотность, OD) в ультрафиолетовом свете (а также и в видимой части спектра). Если определяемый образец достаточно очищен (то есть, без значительного количества примесей, таких как белки, фенол или агароза), спектрофотометрическое определение количества ультрафиолетового света, поглощаемого основаниями, является простым и точным. Для этого метода идеальным является буфер с низкой ионной концентрацией (например, ТЕ буфер). Концентрация нуклеиновых кислот обычно определяется при длине волны 260 нм, в сравнении со стандартным раствором. Влияние примесей на результат может быть выявлено по вычислению «отношения». Так как белки поглощают при длине волны 280 нм, отношение А260/А280 используется для определение чистоты нуклеиновых кислот. Чистая ДНК должна иметь величину отношения, равную приблизительно 1.8, в то время как чистая РНК дает соответствующую величину, равную приблизительно 2.0. Поглощение при 230нм отражает загрязнение образца такими веществами, как углеводы, пептиды, фенолы или ароматические соединения. В случае чистых образцов, отношение А260/А230 должно составлять приблизительно 2.2. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 11 Альтернативный метод с использованием окрашивания бромистым этидием на пластинах с агарозой может быть полезен, когда нуклеиновые кислоты доступны лишь в небольших количествах; в этом случае количество нуклеиновых кислот может быть установлено при сравнении с набором стандартных концентраций, по интенсивности флуоресценции, испускаемой бромистым этидием при облучении УФ светом. Принципы спектрофотометрического определения ДНК Спектрофотометр использует прохождение света через раствор для определения концентрации растворенного в растворе вещества. Прибор работает на основе простого принципа, по которому свет с известной длиной волны проходит через образец, и количество пропущенной энергии света измеряется в фотоэлементе с другой стороны от образца. Как показано на Рисунке 4, конструкция однолучевого спектрофотометра включает источник света, призму, держатель образца и фотоэлемент. К каждому из элементов прибора подсоединены соответствующие электрические или механические системы для контроля интенсивности освещения, длины волны и для превращения полученной фотоэлементом энергии в колебания напряжения. Колебания напряжения фиксируются на метрической шкале, либо записываются на подсоединенный компьютер для дальнейших исследований. Рисунок 4. Схема прохождения света Все молекулы поглощают энергию излучения при специфической длине волны, на основании чего возможно экстраполировать концентрацию растворенного вещества. Согласно закону Беера-Ламберта, существует линейная зависимость Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов между Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 12 поглощением (А) (называемым также оптической плотностью, OD) и концентрацией макромолекул, которая приводится в следующем уравнении: A = OD = εlc (1), где ε – это коэффициент молярной экстинкции, с – это концентрация и l – это длина пути прохождения света через кювету. Белки и нуклеиновые кислоты поглощают свет в ультрафиолетовом спектре в пределах длин волн между 210 и 300 нм. Как уже объяснялось ранее, поглощение растворов ДНК и РНК максимально при 260 нм, в то время как максимальная поглощение для белковых растворов - при 280 нм. Так как растворы ДНК и РНК фактически также частично поглощают свет при 280 нм, а растворы белков частично поглощают свет при 260 нм, отношение между значениями при 260 нм и 280 нм (А260/А280) дает представление о чистоте нуклеиновых кислот. Чистые препараты ДНК и РНК характеризуются величинами отношения А260/А280 1.8 и 2.0 соответственно. Для пути прохождения, равного 10 мм, и длины волны 260 нм, поглощение А = 1 соответствует приблизительно 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК, приблизительно 37 мкг/мл одноцепочечной ДНК, 40 мкг/мл РНК или приблизительно 30 мкг/мл олигонуклеотидов. Если имеется загрязнение примесями белков, отношение А260/А280 будет значительно меньше, чем значения, приведенные выше, и точное определение количественного содержания нуклеиновых кислот будет невозможно. Важно отметить тот факт, что примеси РНК в растворе ДНК не могут быть выявлены методом спектрофотометрии. Поглощение при 325 нм может быть использовано для выявления присутствия клеточного гомогената в растворе, либо для выявления того факта, что загрязнена сама кювета. Определение концентрации нуклеиновых кислот Выбор кюветы. Количество раствора нуклеиновой кислоты, используемое для измерения абсорбции А, зависит от емкости кюветы. Подходящую кювету следует выбирать, исходя из предполагаемого порядка величины концентрации образца, фактора разведения и доступного объема образца. В большинстве процедур, используемых для выявления ГМО, объем собранной геномной ДНК находится в пределах 50 – 100 мкл. Некоторые типы микрокювет с емкостью от 5 до 70 мкл используются для спектроскопического количественного определения малых объемов нуклеиновых кислот. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 13 Порядок действий. Для того, чтобы откалибровать спектрофотометр, важно следующее: • Установить правильную длину пути светового луча • Установить правильный фактор (выбрать между двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК, РНК) • Измерить контрольный раствор (установить стандарт для отсчета), представляющий собой либо воду, либо буферный раствор (А260 = 0). • Следить, чтобы стандартный раствор периодически обновлялся • Провести измерение раствора, содержащего известное количество чистой нуклеиновой кислоты, для того, чтобы проверить надежность стандарта Измерение количества в неизвестном образце. В зависимости от объема используемой кюветы, используют определенное количество раствора ДНК для определения концентрации (например, для кювет с объемом меньшим, чем 0.2 мл, 5 мкл ДНК растворяют в 195 мкл воды). После калибровки спектрофотометра и добавления раствора нуклеиновой кислоты, кювету закрывают крышкой, раствор перемешивают, и измеряют величину поглощения. Для того, чтобы уменьшить ошибки при пипетировании, измерения следует повторять, по крайней мере, дважды; при этом всегда следует использовать не менее 5 мкл раствора ДНК. Показания поглощения А260 меньшие, чем 0.02, или между 1 и 1.5 (в зависимости от прибора) не рекомендуется использовать, вследствие возможности высокой погрешности. Концентрация с специфических нуклеиновых кислот, присутствующих в растворе, вычисляется, согласно следующему уравнению: • Одноцепочечная ДНК: c (пМол/мкл) = А260/ 0.027 • Двухцепочечная ДНК: c (пМол/мкл) = А260/ 0.020 • Одноцепочечная РНК: c (пМол/мкл) = А260/ 0.025 • Олигонуклеотиды: c (пМол/мкл) = А260 100/1.5NA+0.71Nc+1.20NG+0.84NT где А260 - это величина поглощения, измеренная при 260 нм. В Таблице 2 приведен пример чтения результата измерения величины поглощения высокоочищенной ДНК из тимуса теленка, суспендированной в 1х TNE буфере, принимая, что стандартной ДНК является двухцепочечная ДНК с А260 = 1 для 50мкг/мл в кювете с длиной прохождения света 10мм. Концентрация ДНК номинально составляла 25 мкг/мл. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 14 Таблица 2. Чтение результатов абсорбции высокоочищенной ДНК тимуса теленка в 1х TNE буфере Длина волны Абсорбция А260/А280 325 280 260 230 0.01 0.28 0.56 0.30 2.0 - Концентрация (мкг/мл) 28 - Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 15 Экспериментальная часть Оборудование Замечание Все используемое оборудование должно быть стерилизовано перед использованием, и все остаточные количества ДНК должны быть удалены. Для того, чтобы избежать загрязнения, следует использовать наконечники пипеток, которые защищены от аэрозолей • Инструменты для уменьшения размера, такие как стерильные хирургические скальпели или ступка • Водяная баня или емкость для нагревания • Микроцентрифуга • Микропипетки • Встряхиватель типа Vortex • Пробирки для микроцентрифуги на 1.5 мл • Лодочка для взвешивания или эквивалентное приспособление • Шпатели • Весы для взвешивания 0.01 г • Петли • Штатив для микроцентрифужных пробирок • Желательно: вакуумная сушка для высушивания осадков ДНК Реактивы Замечание Все химические реактивы должны быть по качеству пригодны для молекулярнобиологических исследований. Деионизованная вода и буферы должны быть автоклавированы перед использованием. В дополнение, все химические реактивы не должны содержать ДНК и ДНКаз. • Бромистый цетилтриметиламмоний (СТАВ) • Хлороформ • Изопропанол CAS 124-03-8 Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 16 • Na2EDTA • Этанол • NaCl • Протеиназа К • РНКаза • Tris [оксиметил] аминометан гидрохлорид (Tris-HCl) • Стерильная деионизованная вода CAS 6381-92-6 СТАВ – буфер 20 г/л СТАВ 4г 1.4 М NaCl 16.4 г 0.1 М Tris-HCl 3.15 г 20 мМ Na2EDTA 1.5 г • Добавить 100 мл деионизованной воды • Довести рН раствора до значения 8.0 с помощью 1М NaОН • Довести объем до 200 мл и автоклавировать • Хранить буфер при 4º С максимально в течение 6 месяцев СТАВ-раствор для осаждения 5 г/л СТАВ 1г 0.04 М NaCl 0.5 г • Добавить 100 мл деионизованной воды • Довести рН раствора до значения 8.0 с помощью 1М NaОН • Довести объем до 200 мл и автоклавировать • Хранить раствор при 4 º С в течение 6 месяцев максимально NaCl 1.2 М • Растворить 7.0 г NaCl в 100 мл деионизованной воды • Автоклавировать и хранить при комнатной температуре Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 17 Раствор этанола 70% (v/v) 70 мл чистого (неразбавленного) этанола смешать с 30 мл стерильной деионизованной воды РНКаза А 10мг/мл – хранить при –20 º С Протеиназа К мг/мл – хранить при –20 º С Процедура Процедура требует стерильных условий. Загрязнения примесями при приготовлении образца можно избежать путем использования одноразового оборудования, обеззараживания растворов и предотвращения образования пыли. • Перенести 100 мг гомогенного образца в стерильную пробирку для микроцентрифугирования на 1.5 мл • Добавить 300 мкл стерильной деионизованной воды, перемешать петлей • Добавить 500 мкл СТАВ-буфера, перемешать петлей • Добавить 20 мкл протеиназы К (20 мг/мл), перемешать встряхиванием и инкубировать при 65 º С в течение 30-90 минут * • Добавить 20 мкл РНКазы (10 мг/мл), перемешать встряхиванием и инкубировать при 65 º С в течение 5-10 минут * • Центрифугировать в течение 10 минут при 16 000 х g • Перенести супернатант в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 мкл хлороформа, перемешивать встряхиванием в течение 30 сек. • Центрифугировать в течение 10 минут при 16 000 х g, пока не произойдет разделение фаз • Перенести 500 мкл верхнего слоя в новую микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 мкл хлороформа, перемешать встряхиванием • Центрифугировать в течение 5 минут при 16 000 х g ________________________________ * Эти дополнительные этапы в настоящее время повсеместно вводятся в метод СТАВ-экстракции, чтобы увеличить выход геномной ДНК из сложных комплексных биологических материалов (матриксов) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 18 • Перенести верхний слой в новую микроцентрифужную пробирку • Добавить 2 объема СТАВ-раствора для осаждения, перемешать пипетированием • Инкубировать 60 минут при комнатной температуре • Центрифугировать в течение 5 минут при 16 000 х g • Слить супернатант • Растворить осадок в 350 мкл NaCl (1.2 М) • Добавить 350 мкл хлороформа и перемешивать встряхиванием в течение 30 сек. • Центрифугировать в течение 10 минут при 16 000 х g, пока не произойдет разделение фаз • Перенести верхний слой в новую микроцентрифужную пробирку • Добавить 0.6 объема изопропанола, перемешать встряхиванием • Центрифугировать в течение 10 минут при 16 000 х g • Слить супернатант • Добавить 500 мкл 70% раствора этанола и тщательно перемешать встряхиванием • Центрифугировать в течение 10 минут при 16 000 х g • Слить супернатант • Высушить осадок и снова растворить ДНК в 100 мкл стерильной деионизованной воды Раствор ДНК может храниться в холодильнике максимумально в течение двух недель, либо в морозильнике при –20 º С в течение более длительного периода Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 19 Литература Hotzel, H., Müller, W., Sachse, K. (1999). Recovery and characterization of residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified ingredients. European Food Research and Technology 209, 192-196. Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 206, 203-207. Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504. Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928. Meyer, R., Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in processed food products: development and validation of PCR assay for the specific detection of glyphosate-tolerant soybeans. In Amadò, R. Battaglia (Eds.). Proceedings of the ninth European conference on food chemistry (Vol. 1). Authenticity and adulteration of food-the analytical approach. 24-26 September 1997. Interlaken 1, 23-28. ISBN : 3-9521414-0-2. Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325. Poms, R.E., Glössl, J., Foissy, H. (2001) Increased sensitivity for detection of specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research and Technology 213, 361-365. Wagner, D.B., Furnier, G.R., Saghay-Maroof, M.A., Williams, S.M., Dancik, B.P. and Allard, R.W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4 Выделение и очистка ДНК 20 and their hybrids. Proceedings of the National Academy of Science USA 84, 2097–2100. Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207, 81–90. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 4