АКТИВАЦИЯ СИНУСОИДАЛЬНЫХ КЛЕТОК КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ ДИФФУЗНОМ
advertisement
Юшков Б.Г.1,2, Данилова И.Г.1,2, Медведева С.Ю.1,2, Казакова И.А.1,2, Абидов М.Т.3 1 Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург 2 Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург 3 Институт иммунопатологии, Москва Юшков Борис Германович E-mail: B.Yushkov@iip.uran.ru РЕЗЮМЕ В результате экспериментального исследования было установлено, что и при локальном, и при диффузном повреждении печени отмечается увеличение количества синусоидальных клеток в органе. При стимуляции этих клеток 3-аминофталгидразидом регенераторные процессы, развивающиеся в печени, активизируются, что проявляется в увеличении количества пролиферирующих гепатоцитов. Ключевые слова: синусоидальные клетки; регенерация; гепатоцит SUMMARY М ногофункциональность печени, играющая ключевую роль в формировании адаптивных реакций организма к экстремальным воздействиям, определяет ее уникальную способность к регенерации. Известно, что масса органа и его функции восстанавливаются даже при условии гибели 85–90% гепатоцитов. а печень прекращает регенерацию, как только достигается масса, необходимая для функциональных нужд организма [8]. Гепатоциты благодаря их высокой метаболической активности повреждаются в первую очередь, поскольку являются основной мишенью действия пищевых токсикантов, ксенобиотиков, продуктов эндогенной интоксикации. Повреждение печени может носить локальный (травма, гепатотомия) или диффузный характер. В первом случае репаративные процессы значительно возрастают в области, непосредственно примыкающей к месту травмы, и обусловлены репликацией зрелых сохранившихся гепатоцитов. В условиях диффузного поражения печени, вызванного токсическими или инфекционными агентами, когда пролиферативная активность клеток печени угнетена, непосредственным источником образования новых гепатоцитов являются стволовые клетки. Такими коммитированными мультипотентными предшественниками являются овальные клетки каналов Геринга, которые могут дифференцироваться в гепатоциты и холангиоциты [7]. Кроме того, восстановительный рост печени может осуществляться за счет популяции стволовых клеток костного мозга [4]. Несмотря на значительное количество экспериментальных исследований, посвященных регенерации печени, существует ряд вопросов, далеких от своего разрешения. Прежде всего это касается факторов, запускающих и поддерживающих пролиферацию клеток печени в «правильном» направлении, ограничивающем образование ложных долек, фиброзной ткани и гепатокарцином. Синусоидальные клетки печени составляют в среднем от 10 до 15% клеточной массы печени. к ним относятся клетки Купфера, эндотелиоциты синусоидальных капилляров, звездчатые липоциты, клетки Ито. Доказано, что цитокины и ростовые факторы, выделяемые этими клетками, играют 33 This article shows that at the local and diffuse liver damage observed increase in the number of sinusoidal cells. Upon 3-aminoftalgidrazid stimulation of these cells regenerative processes developing in the liver are activated that results in increasing the number of proliferating hepatocytes. Keywords: sinusoidal cells; regeneration; hepatocyte experimental gastroenterology экспериментальная гастроэнтерология АКТИВАЦИЯ СИНУСОИДАЛЬНЫХ КЛЕТОК КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ ДИФФУЗНОМ И ЛОКАЛЬНОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ E XPER I ME NTA L & CLI N ICA L GASTROE NTEROLOGY ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ №09/2012 существенную роль в пролиферации и дифференцировки гепатоцитов. Такие цитокины, как TNF-ά, IL-1, IL-6, ростовые факторы HGF, TGF-α, вырабатываемые этими клетками паракринно запускают сигнальные пути трансдукции репликации ДНК (STAT3, MAPK). Ростовые факторы PDGF, IGF-1, HGF, TGF-β, синтезируемые синусоидальными непаренхиматозными клетками, снижают степень рецепторного и нерецепторного апоптоза гепатоцитов, регулируя активность каспаз, уменьшая продукцию оксида азота и активных форм кислорода [2; 6; 7; 9]. Установлено, что вышеперечисленные факторы роста усиливают межклеточные коммуникации клеток печени, восстанавливают функциональную активность сохранившихся и вновь образованных гепатоцитов, усиливают в них синтез глюкозы и АТФ. Изменение функциональной активности этих клеток приводит к модификации репаративного потенциала органа, а модулятор функции этих клеток 3-аминофталгидразид а priori должен усиливать репаративную регенерацию печени [1; 3]. Целью настоящего исследования явилось изучение возможности регуляции регенерации при локальном и диффузном поражении печени в условиях модулирования активности синусоидальных клеток печени. Эксперимент выполнен на 50 беспородных белых крысах самцах массой 180–200 г и белых мышах в соответствии с рекомендациями международных этических комитетов по гуманному обращению с лабораторными животными. Моделирование локального повреждения печени осуществлялось частичной гепатэктомией в стандартной методике [5]. Операции проводили под эфирным наркозом. Оценку интенсивности протекания восстановительных процессов проводили через 24 часа после гепатэктомии, что соответствует времени, предшествующему пику развития регенераторных процессов в печени [3]. Для создания модели диффузного поражения печени использовали тетрахлорметан СCl4, который вводился животным однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг веса. Экспериментальных крыс выводили из эксперимента на третьи, седьмые сутки после инъекции СCl4. В качестве модулятора макрофагальной активности (активности синусоидальных клеток) был использован 3-аминофталгидразид (отечественный иммунномодулятор «Тамерит»), инъекции которого осуществлялись при гепатэктомии за час до проведения операции, а при токсическом поражении в течение всего эксперимента — внутримышечно из расчета 2 мг/кг, контрольным животным водили аналогичную дозу физиологического раствора. Подготовку образцов ткани печени для гистологического исследования осуществляли на автоматическом процессоре Leica EG 1160 с последующей заливкой в парафин. Срезы толщиной 3–5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, пирофуксином по Ван-Гизону и Вейгерту. Микроскопическое исследование производили на микроскопе Leica DM 2500, анализ изображений выполняли в программе «ВидеоТест» «Морфология» 5.0. Подсчет количества синусоидальных клеток осуществляли в единице площади в 10 полях зрения при увеличении микроскопа ×400. Выраженность репаративной регенерации печени оценивали по массе регенерата, содержанию сухого вещества и жидкости. На гистологических препаратах определяли количество гепатоцитов, размер этих клеток и их ядер, ядерно-цитоплазматический индекс. Кроме того, подсчитывали общее количество двуядерных гепатоцитов и число этих клеток, экспрессирующих маркер пролиферации Ki-67. Выявление Ki-67+клеток осуществляли непрямым иммуногистохимическим окрашиванием, применяя моноклональные антитела anti-human Ki-67 clone B56 (BD Biosciences, США). Статистический анализ данных проводили с помощью программы StatSoft Statistica 6.0. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Данные приведены как среднее плюс-минус стандартная ошибка среднего, статистически достоверные различия принимали при р < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Через 24 часа после локального повреждения печени, вызванного ее резекцией, масса оставшейся ткани органа увеличивалась по отношению к исходной послеоперационной величине в среднем на 181%. Введение 3-аминофталгидразида способствовало дополнительному приросту регенерирующего остатка (масса печени увеличивается на 212%). После частичной гепатэктомии у мышей возрастали число двуядерных гепатоцитов и ядерно-цитоплазматический индекс, что свидетельствует о развитии процессов клеточной и внутриклеточной регенерации. У животных, которым за 1 час до операции вводили 3-аминофталгидразид, отмечается более выраженное возрастание количества двуядерных гепатоцитов и числа Ki-67+-клеток, что свидетельствует об интенсификации процессов внутриклеточной и клеточной регенерации печени. Характерно, что пролиферация гепатоцитов в этой группе животных в отличие от нелеченых контрольных животных сопровождалась увеличением числа синусоидальных клеток. Количество этих клеток при введении 3-аминофталгидразида возрастало по сравнению с контрольными и интактными крысами в среднем на 39 и 30% соответственно (табл. 1). При диффузном повреждении печени в модели токсического гепатита, вызванного введением Показатель Интактные Гепатэктомия Гепатэктомия + 3-аминофталгидразид Количество гепатоцитов в 1 мм2 1392 ± 52 1101 ± 33* 1245 ± 44* ,** Общее количество двуядерных гепатоцитов в 1 мм2 243 ± 33 343 ± 14* 414 ± 12*, ** Количество Ki-67+ в 1 мм2 1,08 ± 0,46 3,10 ± 0,24* 2,48 ± 1,55* Ядерно-цитоплазматический индекс 0,270 ± 0,006 0,349 ± 0,008* 0,324 ± 0,006*, ** Количество синусоидальных клеток (1 мм2) 97,37 ± 4,47 103,71 ± 3,94 130,94 ± 3,61*, ** Достоверность отличия (p < 0,05): * — от интактной группы; **— от группы «гепатэктомия». СCl4 на фоне активации синусоидальных клеток 3-аминофталгидразидом, уже на третьи сутки эксперимента в печени крыс признаки токсического гепатита менее выражены, чем в контроле. Визуально отмечается увеличение количества митотически делящихся клеток, снижаются признаки воспаления, полиморфно-ядерные лейкоциты в инфильтратах единичны, а к седьмым суткам очаговые некрозы без перифокальной клеточной реакции сохраняются только по периферии дольки, наблюдается зернистость гепатоцитов, тогда как гепатоциты с вакуольной дистрофией не обнаруживаются (рис. 1, 2 на цветной вклейке). Морфометрический анализ показал, что на фоне высокого индекса альтерации на третьи сутки после введения ССL4 и лечения тамеритом у животных более интенсивно протекают процессы как клеточной, так и внутриклеточной регенерации гепатоцитов. Митотический индекс и количество двуядерных клеток в ткани печени возрастают по сравнению с нелечеными животными соответственно на 26 и 33%. Число гепатоцитов, экспрессирующих Ki-67, — в той же степени, как и нелеченых животных. к седьмым суткам эксперимента эти показатели снижаются, значительно превышая соответствующие значения, отмеченные у интактных здоровых крыс (табл. 2). Как и при локальном повреждении печени, восстановительный рост ткани при ее диффузном поражении сопровождается увеличением числа синусоидальных клеток. При количественной оценке этих клеток обнаружено значительное возрастание их числа на фоне введения 3-аминофталгидразида к третьим суткам эксперимента с последующим их снижением к седьмым суткам развития токсического гепатита, что соответствует максимальному увеличению темпов регенерации органа. Истощение запаса синусоидальных клеток на седьмые сутки после введения СCl4 в обеих экспериментальных группах, по-видимому, связано Таблица 2 Интактные СCl4, третьи сутки СCl4 + тамерит, третьи сутки СCl4, седьмые сутки СCl4 + тамерит, седьмые сутки Общее количество двуядерных гепатоцитов в 1 мм2 15,4 ± 1,43 51,80 ± 0,34* 69,19 ± 0,2*, ** 51,52 ± 0,15* 43,28 ± 0,47*, ** Митотический индекс 0,52 ± 0,33 43,75 ± 0,23* 55,15 ± 0,23*, ** 28,62 ± 0,11* 23,03 ± 0,15*, ** Количество Ki-67+позитивных гепатоцитов 14,3 ± 1,5 47,6 ± 10,9* 23,4 ± 9,8* 14,3 ± 2,6* 5,2 ± 1,3*,,** Индекс альтерации 21,87 ± 1,54 333,20 ± 0,95* 253,50 ± 0,86*, ** 421,52 ± 0,68* 447,28 ± 0,48*, ** Количество синусоидальных клеток 96,9 ± 0,48 130,0 ± 0,28* 243,3 ± 0,83*, ** 58,0 ± 0,37* 88,0 ± 0,46** Показатель Достоверность отличия (p < 0,05): * –от интактной группы; ** — от группы «гепатэктомия». 35 ВЛИЯНИЕ 3-АМИНОФТАЛГИДРАЗИДА НА ПОКАЗАТЕЛИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ У КРЫС ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ТЕТРАХЛОРМЕТАНА experimental gastroenterology ВЛИЯНИЕ 3-АМИНОФТАЛГИДРАЗИДА НА ПОКАЗАТЕЛИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ, КОЛИЧЕСТВО СИНУСОИДАЛЬНЫХ КЛЕТОК У МЫШЕЙ ПОСЛЕ ЧАСТИЧНОЙ ГЕПАТЭКТОМИИ экспериментальная гастроэнтерология Таблица 1 E XPER I ME NTA L & CLI N ICA L GASTROE NTEROLOGY ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ 36 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ №09/2012 с повышенной функциональной нагрузкой на макрофаги печени, направленной на уничтожение как самого тетрахлорметана, так и нейтрализацию токсических продуктов воспалительной реакции, а также фагоцитозом некротических клеток и их остатков. Таким образом, репаративные процессы в поврежденной печени происходили намного интенсивнее на фоне стимуляции синусоидальных клеток 3-аминофталгидразидом. Полученные в настоящей работе данные говорят о целесообразности проведения исследований, направленных как на уточнение механизмов выявленных биологических эффектов 3-аминофталгидразида на синусоидальные клетки печени, так и на поиск эффективных стимуляторов репаративной репарации печени среди других стимуляторов/модуляторов функции макрофагов. ЛИТЕРАТУРА 1. Данилова И.Г. Новые аспекты иммунологической регуляции регенерации органов / И.Г. Данилова, И.А. Брыкина // Вестн. Уральской мед. акад. науки. — 2010. — № 2. — С. 17. 2. Мироджов Г.К. Синусоидальные клетки печени: природа, функциональная характеристика и кооперативная взаимосвязь / Г.К. Мироджов, В.Л. Павлов // Арх. патол. — 1991. — № 4. — С. 72–76. 3. Юшков Б.Г. Модуляция репаративной регенерации и экспрессии CD 117 клетками печени после частичной гепатэктомии у мышей / Б.Г. Юшков, И.Г. Данилова, Ж.Б. Понежева, И.А. Брыкина, М.Т. Абидов, О.В. Калюжин // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2010. — № 9. — С. 321–323. 4. Guettier C. Which stem cells for adult liver? [Text] / C. Guettier// Annales de Pathologie. — 2005. — V.25, №1. — P. 33–44. 5. Higgins G.M. Experimental pathology of liver. 1. Restoration of the liver following partial surgical removal / G.M. Higgins, R.M. Anderson // Arch. Pathol. — 1931. — Vol. 272. — P. 186–202. 6. Knolle P.A. Local control of the immune response in the liver / P.A. Knolle, G. Gerken // Immunol. Rev. — 2000. — Vol. 174. — Р. 21–34. 7. Rountree C.B. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential / C.B. Rountree, L. Barsky // Stem. Cells. — 2007. — Vol. 25, № 10. — P. 2419–2429. 8. Taub R. Liver regeneration: from myth to mechanism / R. Taub // Nature Rev. Mol. Cell Biol. — 2004. — Vol. 5, № 10. — P. 836–837. 9. Wisse E. Structure and function of sinusoidal lining cells in the liver / E. Wisse, F. Braet, D. Luo // Toxicol. Pathol. — 1996. — Vol. 24, № 1. — Р. 100–111. ИЛЛЮСТРАЦИИ К СТАТЬЕ АКТИВАЦИЯ СИНУСОИДАЛЬНЫХ КЛЕТОК КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ ДИФФУЗНОМ И ЛОКАЛЬНОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ Рис. 1. Токсический гепатит, вызванный введением тетрахлорметана, 7-е сутки эксперимента. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×200. Рис. Р 2. 2 Токсический Т й гепатит, вызванный й введением д тетрахлорметана на фоне введения 3-аминофталгидразида, 7-е сутки эксперимента. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×200. ИЛЛЮСТРАЦИИ К СТАТЬЕ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОВАЯ МОДЕЛЬ ГЕПАТИТА И ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ У КРЫС Рис. 2. Ткань печени крысы при ОТГ: деструкция гепатоцитов в центральных отделах долек, инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами, жировая дистрофия гепатоцитов. × 400. Окраска гематоксилин-эозин. Рис. 11. Фотография Р Ф р ф бр брюшной й полости крысы р при р модед лировании ОТГ. Рис. 3. Ткань печени контрольной крысы: участок дольки печени с портальным трактом. ×400. Измерение диаметра ядер. Окраска гематоксилин-эозин.
